TW201718647A - 抗-cll-1抗體及使用方法 - Google Patents

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Abstract

本發明係關於抗-CLL-1抗體，包括包含CLL-1結合域及CD3結合域之抗-CLL-1抗體(例如抗-CLL-1/CD3 T細胞依賴性雙特異性(TDB)抗體)，及其使用方法。

Description

抗-CLL-1抗體及使用方法 【相關申請案之交互參照】
無
本發明係關於抗-CLL-1抗體，包括包含CLL-1結合域及CD3結合域之抗-CLL-1抗體(例如抗-CLL-1/CD3 T細胞依賴性雙特異性(TDB)抗體)，及使用方法。
諸如癌症之細胞增生性病症的特徵在於細胞子群體之不受控生長。其為發達世界死亡之主要病因，且為發展中國家死亡之第二病因，其中每年診斷出超過1200萬新癌症病例，且發生700萬例癌症死亡。國家癌症研究所估計2013年超過50萬美國人將死於癌症，佔該國每4例死亡中之幾乎1例。隨著老年人口增長，癌症之發生率同時上升，因為發展癌症之概率在70歲後高兩倍多。因此，癌症護理代表顯著且日益增加之社會負擔。
CLL-1(亦稱為CLEC12A、MICL及DCAL2)編碼C型凝集素/C型凝集素樣域(CTL/CTLD)超家族之成員。此家族之成員共用共有蛋白折疊，且具有多種多樣之功能，諸如細胞附著、細胞-細胞信號傳導、糖蛋白轉換及在炎症及免疫反應中之作用。已針對II型跨膜受體示出CLL-1，該受體包含單一C型凝集素樣域(其經預測不結合鈣或糖)、柄區、跨膜域及含有ITIM基元之短胞質尾。另外，CLL-1存在於正常外周血及骨髓(BM)中之單核細胞及粒細胞上，而不存在於非血液學組織中。CLL-1亦表現於急性骨髓性白血病(AML)、骨髓發育不良症候群(MDS)及慢性髓細胞性白血病(CML)細胞上。詳言之，CLL-1為與白血病幹細胞(LSC)相關聯之表面抗原，其在CD34陽性(CD34+)AML中表現於一部分CD34+CD38- AML細 胞上。
基於單株抗體(mAb)之療法已成為癌症之重要治療形式。由於血液、骨髓、脾及淋巴結中惡性細胞之可及性，及允許識別抗原標靶之各種造血分化譜系及階段之充分限定的免疫表型，白血病極適於此方法。針對急性骨髓性白血病(AML)之多數研究聚焦於CD33。然而，未結合抗-CD33 mAb林妥珠單抗之反應針對AML具有適度單一藥劑活性，且在與習知化學療法組合時在兩個隨機化試驗中未能改善患者結果。
此項技術中需要靶向AML(包括CLL-1)之安全且有效之藥劑，以用於診斷及治療與CLL-1相關聯之病狀，諸如癌症。本發明滿足彼需要且提供其他益處。
本發明提供包含CLL-1結合域及CD3結合域之抗-CLL-1抗體，及其使用方法。在一些實施例中，本文提供經分離之抗-CLL-1抗體，其中該抗體包含(i)CLL-1結合域，其中該CLL-1結合域結合包含SEQ ID NO：49之胺基酸的CLL-1抗原決定基且/或結合包含SEQ ID NO：49之胺基酸的重疊CLL-1抗原決定基，且不結合包含SEQ ID NO：50及/或SEQ ID NO：51之抗原決定基；及(ii)CD3結合域，其中該CD3結合域結合人類CD3 ε多肽及cyno CD3 ε多肽，該CD3結合域結合人類CD3 ε多肽之由人類CD3 ε之胺基酸1-26(SEQ ID NO：86)或1-27(SEQ ID NO：87)組成的片段內之CD3抗原決定基，且不要求人類CD3ε多肽之胺基酸殘基Glu5用於CD3結合域之結合。
在一些實施例中，抗-CLL-1抗體之CLL-1結合域結合包含SEQ ID NO：49之胺基酸的CLL-1抗原決定基且/或結合包含SEQ ID NO：49之胺基酸的重疊CLL-1抗原決定基，且不結合包含SEQ ID NO：50及/或SEQ ID NO：51之CLL-1抗原決定基。在一些實施例中，抗-CLL-1抗體之CLL-1結合域結合包含SEQ ID NO：49之胺基酸的CLL-1抗原決定基。在一些實施例中，抗-CLL-1抗體之CLL-1結合域結合由SEQ ID NO：49之胺基酸組成或基本上由其組成的CLL-1抗原決定基。在一些實施例中，藉由羥基自由基足跡法確定CLL-1抗原決定基。
例如，本文提供抗-CLL1抗體，其包含(i)CLL-1結合域，該CLL-1結合域包含以下6個高變區(HVR)：(a)HVR-H1，其包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列；(b)HVR-H2，其包含SEQ ID NO：45之胺基酸序列；(c)HVR-H3，其包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列；(d)HVR-L1，其包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列；(e)HVR-L2，其包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列；及(f)HVR-L3，其包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列；及(ii)CD3結合域，其中該CD3結合域結合人類CD3 ε多肽及cyno CD3 ε多肽，該CD3結合域結合人類CD3 ε多肽之由人類CD3 ε之胺基酸1-26(SEQ ID NO：86)或1-27(SEQ ID NO：87)組成的片段內之CD3抗原決定基，且不要求人類CD3 ε多肽之胺基酸殘基Glu5用於CD3結合域之結合。在一些實施例中，抗-CLL-1抗體包含CLL-1結合域，其包含包含SEQ ID NO：46之序列的重鏈可變區及包含SEQ ID NO：32之序列的輕鏈可變區。
此外，例如，本文提供抗-CLL1抗體，其包含(i)CLL-1結合域，該CLL-1結合域包含以下6個HVR：(a)HVR-H1，其包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列；(b)HVR-H2，其包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列；(c)HVR-H3，其包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列；(d)HVR-L1，其包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列；(e)HVR-L2，其包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列；及(f)HVR-L3，其包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列；及(ii)CD3結合域，其中該CD3結合域結合人類CD3 ε多肽及cyno CD3 ε多肽，該CD3結合域結合人類CD3 ε多肽之由人類CD3 ε之胺基酸1-26(SEQ ID NO：86)或1-27(SEQ ID NO：87)組成的片段內之CD3抗原決定基，且不要求人類CD3 ε多肽之胺基酸殘基Glu5用於CD3結合域之結合。在一些實施例中，抗-CLL-1抗體包含CLL-1結合域，其包含包含SEQ ID NO：33之序列的重鏈可變區及包含SEQ ID NO：32之序列的輕鏈可變區。
另外，例如，本文提供抗-CLL1抗體，其包含(i)CLL-1結合域，該CLL-1結合域包含以下6個HVR：(a)HVR-H1，其包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列；(b)HVR-H2，其包含SEQ ID NO：47之胺基酸序列；(c)HVR-H3，其包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列；(d)HVR-L1，其包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列；(e)HVR-L2，其包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列； 及(f)HVR-L3，其包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列；及(ii)CD3結合域，其中該CD3結合域結合人類CD3 ε多肽及cyno CD3 ε多肽，該CD3結合域結合人類CD3 ε多肽之由人類CD3 ε之胺基酸1-26(SEQ ID NO：86)或1-27(SEQ ID NO：87)組成的片段內之CD3抗原決定基，且不要求人類CD3 ε多肽之胺基酸殘基Glu5用於CD3結合域之結合。在一些實施例中，抗-CLL-1抗體包含CLL-1結合域，其包含包含SEQ ID NO：48之序列的重鏈可變區及包含SEQ ID NO：32之序列的輕鏈可變區。
例如，本文提供抗-CLL1抗體，其包含(i)CLL-1結合域，該CLL-1結合域包含以下6個HVR：(a)HVR-H1，其包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列；(b)HVR-H2，其包含SEQ ID NO：11之胺基酸序列；(c)HVR-H3，其包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列；(d)HVR-L1，其包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列；(e)HVR-L2，其包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列；及(f)HVR-L3，其包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列；及(ii)CD3結合域，其中該CD3結合域結合人類CD3 ε多肽及cyno CD3 ε多肽，該CD3結合域結合人類CD3 ε多肽之由人類CD3 ε之胺基酸1-26(SEQ ID NO：86)或1-27(SEQ ID NO：87)組成的片段內之CD3抗原決定基，且不要求人類CD3 ε多肽之胺基酸殘基Glu5用於CD3結合域之結合。在一些實施例中，抗-CLL-1抗體包含CLL-1結合域，其包含包含SEQ ID NO：34之序列的重鏈可變區及包含SEQ ID NO：32之序列的輕鏈可變區。
此外，例如，本文提供抗-CLL1抗體，其包含(i)CLL-1結合域，該CLL-1結合域包含以下6個HVR：(a)HVR-H1，其包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列；(b)HVR-H2，其包含SEQ ID NO：43之胺基酸序列；(c)HVR-H3，其包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列；(d)HVR-L1，其包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列；(e)HVR-L2，其包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列；及(f)HVR-L3，其包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列；及(ii)CD3結合域，其中該CD3結合域結合人類CD3 ε多肽及cyno CD3 ε多肽，該CD3結合域結合人類CD3 ε多肽之由人類CD3 ε之胺基酸1-26(SEQ ID NO：86)或1-27(SEQ ID NO：87)組成的片段內之CD3抗原決定基，且不要求人類CD3 ε多肽之胺基酸殘基Glu5用於CD3結合域之結合。
例如，本文提供抗-CLL1抗體，其包含(i)CLL-1結合域，該CLL-1結合域包含以下6個HVR：(a)HVR-H1，其包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列；(b)HVR-H2，其包含SEQ ID NO：44之胺基酸序列；(c)HVR-H3，其包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列；(d)HVR-L1，其包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列；(e)HVR-L2，其包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列；及(f)HVR-L3，其包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列；及(ii)CD3結合域，其中該CD3結合域結合人類CD3 ε多肽及cyno CD3 ε多肽，該CD3結合域結合人類CD3 ε多肽之由人類CD3 ε之胺基酸1-26(SEQ ID NO：86)或1-27(SEQ ID NO：87)組成的片段內之CD3抗原決定基，且不要求人類CD3 ε多肽之胺基酸殘基Glu5用於CD3結合域之結合。
例如，本文提供抗-CLL1抗體，其包含(i)CLL-1結合域，該CLL-1結合域包含以下6個HVR：(a)HVR-H1，其包含SEQ ID NO：21之胺基酸序列；(b)HVR-H2，其包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列；(c)HVR-H3，其包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列；(d)HVR-L1，其包含SEQ ID NO：18之胺基酸序列；(e)HVR-L2，其包含SEQ ID NO：19之胺基酸序列；及(f)HVR-L3，其包含SEQ ID NO：20之胺基酸序列；及(ii)CD3結合域，其中該CD3結合域結合人類CD3 ε多肽及cyno CD3 ε多肽，該CD3結合域結合人類CD3 ε多肽之由人類CD3 ε之胺基酸1-26(SEQ ID NO：86)或1-27(SEQ ID NO：87)組成的片段內之CD3抗原決定基，且不要求人類CD3 ε多肽之胺基酸殘基Glu5用於CD3結合域之結合。在一些實施例中，抗-CLL-1抗體包含CLL-1結合域，其包含(a)包含SEQ ID NO：40之序列的重鏈可變區及(b)包含SEQ ID NO：39之序列的輕鏈可變區。
在任一抗-CLL1抗體的一些實施例中，抗體包含CLL-1結合域，該CLL-1結合域具有以下特徵中之一或多個：a)結合重組人類CLL-1；b)結合重組獼猴CLL-1；c)結合人類外周血單核細胞(PBMC)表面上之內源性CLL-1；d)結合獼猴PBMC表面上之內源性CLL-1；e)結合癌細胞表面上之內源性CLL-1；f)結合AML癌細胞表面上之內源性CLL-1；g)結合HL-60細胞表面上之內源性CLL-1；h)結合EOL-1細胞表面上之內源性CLL-1；i)結合包含K244Q突變之CLL-1；j)與R&D純系687317抗體競爭 結合人類CLL-1；k)結合內源性人類CLL-1，其Kd小於15nM、小於10nM、小於7nM、小於5nM或小於3nM；l)結合重組人類CLL-1，其Kd小於10nM、小於7nM、小於5nM或小於3nM；及/或m)結合重組獼猴CLL-1，其Kd小於10nM、小於7nM、小於5nM，或小於3nM、小於2nM，或小於1nM。
在任一抗-CLL1抗體之一些實施例中，抗體包含CD3結合域，其結合包含人類CD3ε多肽之Glu6及/或由其組成的CD3抗原決定基。在某些態樣中，CD3抗原決定基進一步包含一或多個額外胺基酸殘基，該或該等胺基酸殘基選自由CD3之Gln1、Asp2及Met7組成之群。在任一抗-CLL1抗體之一些實施例中，抗體包含CD3結合域，其結合包含人類CD3ε多肽之Gln1、Asp2及Glu6及/或由其組成的CD3抗原決定基。在任一抗-CLL1抗體之一些實施例中，抗體包含CD3結合域，其結合包含人類CD3ε多肽之Gln1、Asp2、Glu6及Met7及/或由其組成的CD3抗原決定基。在另一態樣中，CD3抗原決定基不包含人類CD3ε多肽之胺基酸殘基Glu5。在另一態樣中，CD3抗原決定基不包含人類CD3ε多肽之胺基酸殘基Gly3及Glu5。在某些態樣中，CD3抗原決定基由人類CD3ε多肽之胺基酸殘基Gln1、Asp2、Glu6及Met7組成。
在一些實施例中，抗-CLL1抗體之CD3結合臂結合人類CD3，其親和力小於50nM且大於1nM。在一些實施例中，抗-CLL1抗體之CD3結合臂結合人類CD3，其親和力小於1nM且大於0.1nM。在一些實施例中，抗-CLL1抗體之CD3結合臂結合人類CD3，其親和力小於0.1nM且大於0.01nM。在一些實施例中，藉由Biacore測定CD3結合臂之親和力。在一些實施例中，人類CD3為hCD3 ε γ。在一些實施例中，人類CD3為hCD3 ε 1-27 Fc。
在任一抗-CLL1抗體之一些實施例中，抗體包含CD3結合域，該CD3結合域包含以下6個HVR：(a)HVR-H1，其包含SEQ ID NO：88之胺基酸序列；(b)HVR-H2，其包含SEQ ID NO：89之胺基酸序列；(c)HVR-H3，其包含SEQ ID NO：90之胺基酸序列；(d)HVR-L1，其包含SEQ ID NO：74之胺基酸序列；(e)HVR-L2，其包含SEQ ID NO：91之胺基酸序 列；及(f)HVR-L3，其包含SEQ ID NO：92之胺基酸序列。例如，本文提供抗-CLL1抗體，其包含(i)CLL-1結合域，該CLL-1結合域包含以下6個HVR：(a)HVR-H1，其包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列；(b)HVR-H2，其包含SEQ ID NO：11之胺基酸序列；(c)HVR-H3，其包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列；(d)HVR-L1，其包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列；(e)HVR-L2，其包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列；及(f)HVR-L3，其包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列；及(ii)CD3結合域，該CD3結合域包含以下6個HVR：(a)HVR-H1，其包含SEQ ID NO：88之胺基酸序列；(b)HVR-H2，其包含SEQ ID NO：89之胺基酸序列；(c)HVR-H3，其包含SEQ ID NO：90之胺基酸序列；(d)HVR-L1，其包含SEQ ID NO：74之胺基酸序列；(e)HVR-L2，其包含SEQ ID NO：91之胺基酸序列；及(f)HVR-L3，其包含SEQ ID NO：92之胺基酸序列。在一些實施例中，抗-CLL-1抗體包含CLL-1結合域，其包含包含SEQ ID NO：34之序列的重鏈可變區及包含SEQ ID NO：32之序列的輕鏈可變區。
在任一抗-CLL1抗體之一些實施例中，CD3結合域包含：(a)HVR-H1，其包含SEQ ID NO：71之胺基酸序列；(b)HVR-H2，其包含SEQ ID NO：72之胺基酸序列；(c)HVR-H3，其包含SEQ ID NO：73之胺基酸序列；(d)HVR-L1，其包含SEQ ID NO：74之胺基酸序列；(e)HVR-L2，其包含SEQ ID NO：75之胺基酸序列；及(f)HVR-L3，其包含SEQ ID NO：76之胺基酸序列。在一些實施例中，抗-CLL-1抗體包含CD3結合域，其包含包含SEQ ID NO：82之序列的重鏈可變區及包含SEQ ID NO：83之序列的輕鏈可變區。例如，本文提供抗-CLL1抗體，其包含(i)CLL-1結合域，該CLL-1結合域包含以下6個HVR：(a)HVR-H1，其包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列；(b)HVR-H2，其包含SEQ ID NO：11之胺基酸序列；(c)HVR-H3，其包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列；(d)HVR-L1，其包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列；(e)HVR-L2，其包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列；及(f)HVR-L3，其包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列；及(ii)CD3結合域，該CD3結合域包含(a)HVR-H1，其包含SEQ ID NO：71之胺基酸序列；(b)HVR-H2，其包含SEQ ID NO：72之胺基酸序列；(c)HVR-H3，其包含SEQ ID NO：73之胺基 酸序列；(d)HVR-L1，其包含SEQ ID NO：74之胺基酸序列；(e)HVR-L2，其包含SEQ ID NO：75之胺基酸序列；及(f)HVR-L3，其包含SEQ ID NO：76之胺基酸序列。在一些實施例中，抗-CLL-1抗體包含(i)CLL-1結合域，該CLL-1結合域包含包含SEQ ID NO：34之序列的重鏈可變區，及包含SEQ ID NO：32之序列的輕鏈可變區；及(ii)CD3結合域，該CD3結合域包含包含SEQ ID NO：82之序列的重鏈可變區，及包含SEQ ID NO：83之序列的輕鏈可變區。
在任一抗-CLL1抗體之一些實施例中，CD3結合域包含：(a)HVR-H1，其包含SEQ ID NO：77之胺基酸序列；(b)HVR-H2，其包含SEQ ID NO：78之胺基酸序列；(c)HVR-H3，其包含SEQ ID NO：79之胺基酸序列；(d)HVR-L1，其包含SEQ ID NO：74之胺基酸序列；(e)HVR-L2，其包含SEQ ID NO：80之胺基酸序列；及(f)HVR-L3，其包含SEQ ID NO：92之胺基酸序列。例如，本文提供抗-CLL1抗體，其包含(i)CLL-1結合域，該CLL-1結合域包含以下6個HVR：(a)HVR-H1，其包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列；(b)HVR-H2，其包含SEQ ID NO：11之胺基酸序列；(c)HVR-H3，其包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列；(d)HVR-L1，其包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列；(e)HVR-L2，其包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列；及(f)HVR-L3，其包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列；及(ii)CD3結合域，該CD3結合域包含(a)HVR-H1，其包含SEQ ID NO：77之胺基酸序列；(b)HVR-H2，其包含SEQ ID NO：78之胺基酸序列；(c)HVR-H3，其包含SEQ ID NO：79之胺基酸序列；(d)HVR-L1，其包含SEQ ID NO：74之胺基酸序列；(e)HVR-L2，其包含SEQ ID NO：80之胺基酸序列；及(f)HVR-L3，其包含SEQ ID NO：92之胺基酸序列。在一些實施例中，抗-CLL-1抗體包含CLL-1結合域，其包含包含SEQ ID NO：34之序列的重鏈可變區及包含SEQ ID NO：32之序列的輕鏈可變區。
在任一抗-CLL1抗體之一些實施例中，CD3結合域包含：(a)HVR-H1，其包含SEQ ID NO：77之胺基酸序列；(b)HVR-H2，其包含SEQ ID NO：78之胺基酸序列；(c)HVR-H3，其包含SEQ ID NO：79之胺基酸序列；(d)HVR-L1，其包含SEQ ID NO：74之胺基酸序列；(e)HVR-L2，其包 含SEQ ID NO：80之胺基酸序列；及(f)HVR-L3，其包含SEQ ID NO：81之胺基酸序列。在一些實施例中，抗-CLL-1抗體包含CD3結合域，其包含包含SEQ ID NO：84之序列的重鏈可變區及包含SEQ ID NO：85之序列的輕鏈可變區。例如，本文提供抗-CLL1抗體，其包含(i)CLL-1結合域，該CLL-1結合域包含以下6個HVR：(a)HVR-H1，其包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列；(b)HVR-H2，其包含SEQ ID NO：11之胺基酸序列；(c)HVR-H3，其包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列；(d)HVR-L1，其包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列；(e)HVR-L2，其包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列；及(f)HVR-L3，其包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列；及(ii)CD3結合域，該CD3結合域包含(a)HVR-H1，其包含SEQ ID NO：77之胺基酸序列；(b)HVR-H2，其包含SEQ ID NO：78之胺基酸序列；(c)HVR-H3，其包含SEQ ID NO：79之胺基酸序列；(d)HVR-L1，其包含SEQ ID NO：74之胺基酸序列；(e)HVR-L2，其包含SEQ ID NO：80之胺基酸序列；及(f)HVR-L3，其包含SEQ ID NO：81之胺基酸序列。在一些實施例中，抗-CLL-1抗體包含(i)CLL-1結合域，該CLL-1結合域包含包含SEQ ID NO：34之序列的重鏈可變區，及包含SEQ ID NO：32之序列的輕鏈可變區；及(ii)CD3結合域，該CD3結合域包含包含SEQ ID NO：84之序列的重鏈可變區，及包含SEQ ID NO：85之序列的輕鏈可變區。
在任一抗-CLL1抗體之一些實施例中，CD3結合域包含：(a)HVR-H1，其包含SEQ ID NO：77之胺基酸序列；(b)HVR-H2，其包含SEQ ID NO：78之胺基酸序列；(c)HVR-H3，其包含SEQ ID NO：79之胺基酸序列；(d)HVR-L1，其包含SEQ ID NO：74之胺基酸序列；(e)HVR-L2，其包含SEQ ID NO：80之胺基酸序列；及(f)HVR-L3，其包含SEQ ID NO：76之胺基酸序列。在一些實施例中，抗-CLL-1抗體包含CD3結合域，其包含包含SEQ ID NO：84之序列的重鏈可變區及包含SEQ ID NO：93之序列的輕鏈可變區。例如，本文提供抗-CLL1抗體，其包含(i)CLL-1結合域，該CLL-1結合域包含以下6個HVR：(a)HVR-H1，其包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列；(b)HVR-H2，其包含SEQ ID NO：11之胺基酸序列；(c)HVR-H3，其包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列；(d)HVR-L1，其包含SEQ ID NO：5之胺基 酸序列；(e)HVR-L2，其包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列；及(f)HVR-L3，其包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列；及(ii)CD3結合域，該CD3結合域包含(a)HVR-H1，其包含SEQ ID NO：77之胺基酸序列；(b)HVR-H2，其包含SEQ ID NO：78之胺基酸序列；(c)HVR-H3，其包含SEQ ID NO：79之胺基酸序列；(d)HVR-L1，其包含SEQ ID NO：74之胺基酸序列；(e)HVR-L2，其包含SEQ ID NO：80之胺基酸序列；及(f)HVR-L3，其包含SEQ ID NO：76之胺基酸序列。在一些實施例中，抗-CLL-1抗體包含(i)CLL-1結合域，該CLL-1結合域包含包含SEQ ID NO：34之序列的重鏈可變區，及包含SEQ ID NO：32之序列的輕鏈可變區；及(ii)CD3結合域，該CD3結合域包含包含SEQ ID NO：84之序列的重鏈可變區，及包含SEQ ID NO：93之序列的輕鏈可變區。
在任一抗-CLL-1抗體之一些實施例中，抗-CLL-1抗體為單株、人類、人類化或嵌合抗體。在任一抗-CLL-1抗體之一些實施例中，抗-CLL-1抗體為IgG抗體。在任一抗-CLL-1抗體之一些實施例中，抗體為雙特異性抗體。在任一抗-CLL-1抗體之一些實施例中，抗-CLL-1抗體為結合CLL-1及CD3之抗體片段。在一些實施例中，抗-CLL-1抗體片段為Fab、Fab’-SH、Fv、scFv及/或(Fab’)2片段。在任一抗-CLL-1抗體之一些實施例中，抗-CLL-1抗體為全長抗體。
在任一抗-CLL-1抗體之一些實施例中，抗-CLL-1抗體包含去糖基化位點突變。在一些實施例中，去糖基化位點突變為取代突變。
在任一抗-CLL-1抗體之一些實施例中，抗-CLL-1抗體包含降低的效應子功能。在任一抗-CLL-1抗體之一些實施例中，抗-CLL-1抗體包含取代突變，根據EU編號，該取代突變處於胺基酸殘基N297、L234、L235、D265及/或P329G。在一些實施例中，取代突變選自由N297G、N297A、L234A、L235A、D265A及P329G(根據EU編號)組成之群。在一些實施例中，根據EU編號，抗-CLL-1抗體在胺基酸殘基297處包含N297G取代突變。在一些實施例中，根據EU編號，抗-CLL-1抗體在胺基酸殘基234、235及329處包含L234A、L235A及P329G突變。
在任一多特異性抗-CLL-1抗體之一些實施例中，抗-CLL-1 抗體包含一或多個重鏈恆定域，其中該或該等重鏈恆定域選自：第一CH1(CH1 1 )域、第一CH2(CH2 1 )域、第一CH3(CH3 1 )域、第二CH1(CH1 2 )域、第二CH2(CH2 2 )域及第二CH3(CH3 2 )域。在一些實施例中，該或該等重鏈恆定域中之至少一者與另一重鏈恆定域配對。在一些實施例中，CH3 1 和CH3 2 域各自包含突出或空穴，且其中CH3 1 域中之突出或空穴可分別定位在CH3 2 域中之空穴或突出中。在一些實施例中，CH3 1 和CH3 2 域在該突出與空穴之間的介面處交會。在一些實施例中，CH2 1 和CH2 2 域各自包含突出或空穴，且其中CH2 1 域中之突出或空穴可分別定位在CH2 2 域中之空穴或突出中。在一些實施例中，CH2 1 和CH2 2 域在該突出與空穴之間的介面處交會。
在任一抗-CLL-1抗體之一些實施例中，(a)CD3結合域包含Fc域，其中根據EU編號，該Fc域包含T366S、L368A、Y407V及N297G取代突變；且(b)CLL-1結合域包含Fc域，其中根據EU編號，該Fc域包含T366W及N297G取代突變。在任一抗-CLL-1抗體之一些實施例中，(a)CD3結合域包含Fc域，其中根據EU編號，該Fc域包含L234A、L235A、P329G、T366S、L368A及Y407V取代突變；且(b)CLL-1結合域包含Fc域，其中根據EU編號，該Fc域包含L234A、L235A、P329G及T366W取代突變。
本文進一步提供經分離之核酸，其編碼本文所述之抗-CLL-1抗體。本文亦提供包含經分離之核酸的載體，該核酸編碼本文所述之抗-CLL-1抗體。本文亦提供包含載體之宿主細胞，該載體包含編碼本文所述之抗-CLL-1抗體的經分離之核酸。亦提供產生本文所述之抗-CLL-1抗體的方法，該方法包括在培養基中培養包含載體之宿主細胞，該載體包含編碼本文所述之抗-CLL-1抗體的經分離之核酸。
另外，本文提供包含本文所述之抗-CLL-1抗體的醫藥組合物。
在任一抗-CLL-1抗體之一些實施例中，抗-CLL-1抗體具有小於約200ng/mL，例如小於約150、100、50、25、20或15ng/mL中之任一者的細胞殺傷EC50。在一些實施例中，細胞殺傷為人類自體CD14+。在一些實施例中，細胞殺傷為細胞株細胞殺傷，例如U937細胞株、HL-60細 胞株、PL-21細胞株、NOMO-1細胞株、EOL-1細胞株、THP-1細胞株、ML-2細胞株、Molm-13細胞株。在任一多特異性抗-CLL-1抗體之一些實施例中，抗-CLL-1抗體具有小於約50ng/mL，例如小於約25ng/mL或20ng/mL中之任一者的細胞毒性T細胞活化EC50。在一些實施例中，細胞毒性T細胞活化係藉由CD8+ T細胞中CD69+CD25+ T細胞之%來量測。
本文提供如本文所述用作藥劑之抗-CLL-1抗體。本文提供本文所述用於治療或延遲有需要之受檢者之細胞增生性病症或自體免疫病症或延遲其進展之抗-CLL-1抗體。本文提供如本文所述用於增強患有細胞增生性病症或自體免疫病症之受檢者的免疫功能之抗-CLL-1抗體。在一些實施例中，細胞增生性病症為癌症。在一些實施例中，細胞增生性病症為急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)及/或骨髓增生異常症候群(MDS)。在一些實施例中，細胞增生性病症為CLL-1陽性。在任一細胞增生性病症之一些實施例中，細胞增生性病症對用抗-AML抗體藥物結合物(例如抗-CLL1、抗-CD123及/或抗-CD33抗體藥物結合物)治療具有抗性。在一些實施例中，抗體藥物結合物之藥物為DNA損傷劑(例如PBD)。
本文提供本文所述之任一抗-CLL-1抗體的用途，其用於製造以供治療細胞增生性病症或自體免疫病症或延遲其進展之藥劑。本文提供本文所述之任一抗-CLL-1抗體的用途，其用於製造以供增強患有細胞增生性病症或自體免疫病症之受檢者的免疫功能。在一些實施例中，細胞增生性病症為癌症。在一些實施例中，細胞增生性病症為AML、CML及/或MDS。在一些實施例中，細胞增生性病症為CLL-1陽性。在任一細胞增生性病症之一些實施例中，細胞增生性病症對用抗-AML抗體藥物結合物(例如抗-CLL1、抗-CD123及/或抗-CD33抗體藥物結合物)治療具有抗性。在一些實施例中，抗體藥物結合物之藥物為DNA損傷劑(例如PBD)。
本文提供治療有需要之受檢者之細胞增生性病症或自體免疫病症或延遲其進展之方法，該方法包括向受檢者投與本文所述之抗-CLL-1抗體。本文提供增強患有細胞增生性病症或自體免疫病症之受檢者的免疫功能之方法，該方法包括向受檢者投與有效量之本文所述之抗-CLL-1抗體。在一些實施例中，細胞增生性病症為癌症。在一些實施例中， 細胞增生性病症為AML、CML及/或MDS。在一些實施例中，細胞增生性病症為CLL-1陽性。在任一細胞增生性病症之一些實施例中，細胞增生性病症對用抗-AML抗體藥物結合物(例如抗-CLL1、抗-CD123及/或抗-CD33抗體藥物結合物)治療具有抗性。在一些實施例中，抗體藥物結合物之藥物為DNA損傷劑(例如PBD)。
在任一方法之一些實施例中，抗-CLL-1抗體結合(a)位於免疫效應細胞上之CD3分子；及(b)位於細胞上之CLL-1分子。在一些實施例中，抗-CLL-1抗體結合(a)及(b)之後活化免疫效應細胞。在任一方法之一些實施例中，所活化免疫效應細胞能夠對標靶細胞施加細胞毒性作用及/或細胞凋亡作用。
在任一方法之一些實施例中，該方法進一步包括向受檢者投與PD-1軸結合拮抗劑或另一治療劑。在一些實施例中，PD-1軸結合拮抗劑為PD-1結合拮抗劑。在一些實施例中，PD-1軸結合拮抗劑為PD-L1結合拮抗劑。在一些實施例中，PD-1軸結合拮抗劑為PD-L2結合拮抗劑。
在任一方法之一些實施例中，該方法進一步包括向受檢者投與糖皮質激素。在一些實施例中，糖皮質激素為***。
在任一方法之一些實施例中，該方法組合幹細胞移植使用。
在任一方法之一些實施例中，該方法進一步包括向受檢者投與第二治療劑。在一些實施例中，第二治療劑包含阿糖胞苷及/或柔紅黴素。在一些實施例中，第二治療劑包含阿糖胞苷。在一些實施例中，第二治療劑包含抗-AML抗體藥物結合物(例如抗-CLL1、抗-CD123及/或抗-CD33抗體藥物結合物)。
圖1A-B示出鼠類(m)6E7、m21C9、m20B1及m28H12之輕鏈可變區序列(A)及重鏈可變區序列(B)的比對。
圖2A-B示出K1H1、m6E7、人類化(h)6E7.L4H1e及h6E7.L4H1e.A54之輕鏈可變區序列(A)及重鏈可變區序列(B)的比對。
圖3A-B示出K1H1、m21C9及h21C9.L2H3之輕鏈可變區序列(A)及重鏈可變區序列(B)的比對。
圖4A-C示出抗-CLL-1/CD3 TDB之活體外殺傷表徵。(A)示出在各種TDB濃度(μg/mL)下EOL-1之殺傷百分比(gD、h6E7(6E7.L4H1e)、h6E7D(6E7.L4H1eD54)、h6E7A(6E7.L4H1eA54)、m20B1及m28H12組合38E4v1)。(B)及(C)分別示出使用各種TDB濃度(μg/mL)之gD、6E7(6E7.L4H1e)及h21C9(h21C9.L2H3)組合38E4v1，細胞殺傷百分比(PBMC、EOL-1及THP-1)及CD8(CD8+、CD69+、CD25+)T細胞活化。
圖5A-D示出抗-CLL-1 TDB對各種AML腫瘤細胞株之效力，其使用gD×38E4v1、h21C9(h21C9.L2H3)×38E4v1及h6E7(6E7.L4H1e)×38E4v1在各種TDB濃度(μg/mL)下比較針對藥物標準化之存活百分比。
圖6A-B示出在含有所有亞型之T細胞的自體獼猴PBMC及CD8(CD8+、CD69+、CD25+)T細胞活化存在下、在各種TDB濃度(μg/mL)下殺傷獼猴CD14+細胞之h6E7(6E7.L4H1e)×38E4v1及h21C9(h21C9.L2H3)×38E4v1之活體外表徵。
圖7A-B示出使用h6E7(6E7.L4H1e)×38E4v1及gD×38E4v1，抗-CLL-1 TDB對AML患者骨髓之活體外效力。
圖8A-D示出使用HL60、THP-1及EOL-1細胞株，抗-gD×38E4v1對照、具有低親和力CD3臂(h6E7(6E7.L4H1e)×40G5c)、高親和力抗-CD3臂(h6E7(6E7.L4H1e)×38E4v1)及極高親和力抗-CD3臂(h6E7(6E7.L4H1e)×38E4v11)之抗-CLL-1 TDB之活體外表徵。圖8E-G示出與低親和力抗-CD3 Fab(h40G5c)或高親和力抗-CD3 Fab(38E4v1)配對之h6E7.L4H1e N54-A或-S或-E或-Q或-D人類化Fab變異體之活體外表徵。圖8H-I示出回應於與高親和力抗-CD3臂(38E4v1)或低親和力抗-CD3臂(h40G5c)配對之h6E7N54變異體，CD8T細胞活化。
圖9A-B示出hCLL-1及hCD3e轉殖基因在雙重BAC-Tg(hCL-1/hCD3ε)小鼠中之表現。
圖10A-D示出與純合親本相比，hCLL-1及hCD3e轉殖基因在雜合雙重BAC-Tg(hCL-1/hCD3ε)小鼠中之表現。
圖11示出CD8+ T細胞在用抗-CLL-1 TDB、gD×38E4v1、 6E7(6E7.L4H1e)×38E4v1、N54A(6E7.L4H1eA54)×38E4v1及N54A(6E7.L4H1eA54)×40G5(40G5c)處理之雙重BAC-Tg(hCL-1/hCD3e)中之離體活化。
圖12示出CD8+ T細胞在用抗-CLL-1 TDBs、gD×38E4v1、gD×40G5c、h6E7A(6E7.L4H1eA54)×40G5c、h6E7A(6E7.L4H1eA54)×38E 4v1及h6E7A(6E7.L4H1eA54)×38E4v11處理之雙重BAC-Tg(hCL-1/hC D3e)中之活體內活化。
圖13A-B示出hCLL-1+細胞在用抗-CLL-1 TDB、gD×CD3高(38E4v1)、gD×CD3低(40G5c)、CLL1(A)(6E7.L4H1eA54)×CD3低(40G5c)、CLL1(A)(6E7.L4H1eA54)×CD3高(38E4v1)及CLL1(A)(6E7.L4H1eA54)×CD3極高(38E4v11)處理之hCLL-1/hCD3e BAC-Tg小鼠中之活體內消耗。
圖14A-B示出CLL-1(A)及(B)及CD33(B)在正常及AML人類白細胞上之表現概況。
圖15A-C示出用抗-CLL-1h6E7A(6E7.L4H1eA5)×38E4v1 TDB處理人類骨髓細胞後，對造血作用之影響。
圖16A-B示出38E4v1、38E4v11及40G5C之輕鏈可變區序列(A)及重鏈可變區序列(B)的比對。
圖17A-D示出用抗-CLL-1 TDB處理之SCID.beige小鼠(A及B)及hCLL-1/hCD3e BAC-Tg小鼠(C及D)中的藥物代謝動力學(PK)資料。
圖18A-C示出用h6E7A(6E7.L4H1eA54)×h40G5c TDB處理之hCLL-1/hCD3e BAC-Tg小鼠之外周血(A)、骨髓(B)及脾(C)中的藥效學(PD)資料。
圖19A-C示出用h6E7N54A(6E7.L4H1eA54)×38E4v1 TDB處理之hCLL-1/hCD3e BAC-Tg小鼠之外周血(A)、骨髓(B)及脾(C)中的PD資料。
圖20A-C示出用h6E7N54A(6E7.L4H1eA54)×38E4v11 TDB處理之hCLL-1/hCD3e BAC-Tg小鼠之外周血(A)、骨髓(B)及脾(C)中的PD 資料。
圖21A-F示出小鼠CD8+細胞上CD69上調，其與用h6E7A(6E7.L4H1eA54)×h40G5c TDB(A及D)、h6E7N54A(6E7.L4H1eA54)×38E4v1 TDB(B及E)及h6E7N54A(6E7.L4H1eA54)×38E4v11 TDB(C及F)處理之hCLL-1/hCD3e BAC-Tg小鼠中與最大目標消減有關之時間點相關聯。
圖22A-B示出用h6E7N54A(6E7.L4H1eA54)×h40G5c及抗-PD-L1處理之hCLL-1/hCD3e BAC-Tg小鼠中髓細胞減少。圖22C-D示出用抗-CLL-1/CD3 TDB抗體處理之hCLL-1/hCD3e BAC-Tg小鼠的單核細胞及粒細胞上PD-L1上調。
圖23A-D示出用低親和力抗-CLL-1/CD3 TDB抗體((6E7.L4H1eA54)×h40G5c)處理之獼猴中的髓細胞數或CLL-1陽性細胞數。
圖24示出用低親和力抗-CLL-1/CD3 TDB抗體((6E7.L4H1eA54)×h40G5c)處理之獼猴中的循環淋巴細胞數。
圖25示出用抗-CLL-1/CD3 TDB抗體處理之獼猴中的PK參數。
I.定義
如本文所用之術語「CLL-1」係指可由在細胞中加工CLL-1前體蛋白產生之任何天然成熟CLL-1。除非另外指示，否則該術語包括來自任何脊椎動物來源之CLL-1，該脊椎動物來源包括哺乳動物，諸如靈長類動物(例如人類及獼猴)；及齧齒動物(例如小鼠及大鼠)。該術語亦包括CLL-1之天然存在之變異體，例如拼接變異體或對偶基因變異體。示範性人類CLL-1蛋白序列之胺基酸序列示於SEQ ID NO：1中。在一些實施例中，人類CLL-1蛋白序列包含K244Q SNP(SEQ ID NO：1，其中K244為Q)。示範性胞外域之胺基酸序列為SEQ ID NO：2之胺基酸。示範性C型凝集素樣域(CTLD)之胺基酸序列為SEQ ID NO：3之胺基酸。示範性獼猴CLL-1蛋白之胺基酸序列示於SEQ ID NO：4中。
術語「CLL-1之糖基化形式」係指藉由添加碳水化合物殘基 而經轉譯後修飾的CLL-1之天然存在之形式。
除非另外指示，否則如本文所用之術語「分化簇3」或「CD3」係指來自任何脊椎動物來源之任何天然CD3，該脊椎動物來源包括哺乳動物，諸如靈長類動物(例如人類)；及齧齒動物(例如小鼠及大鼠)，該術語包括例如CD3ε、CD3γ、CD3α及CD3β鏈。該術語涵蓋「全長」未經加工CD3(例如未經加工或未經修飾CD3ε或CD3γ)以及由細胞中加工產生之任何形式之CD3。該術語亦涵蓋CD3之天然存在之變異體，包括例如拼接變異體或對偶基因變異體。CD3包括例如207個胺基酸長之人類CD3ε蛋白(NCBI RefSeq No.NP_000724)及182個胺基酸長之人類CD3γ蛋白(NCBI RefSeq No.NP_000064)。
術語「抗-CLL-1抗體」及「結合CLL-1之抗體」係指能夠以足以使抗體在靶向CLL-1時適用作診斷劑及/或治療劑之親和力結合CLL-1之抗體。在一實施例中，抗-CLL-1抗體結合無關非CLL-1蛋白之程度小於抗體與CLL-1之結合之約10%，如例如藉由放射免疫分析(RIA)所量測。在某些實施例中，結合CLL-1之抗體之解離常數(Kd)為1μM、100nM、10nM、1nM、0.1nM、0.01nM或0.001nM(例如10-8M或以下，例如10-8M至10-13M，例如10-9M至10-13M)。在某些實施例中，抗-CLL-1抗體結合CLL-1之在來自不同物種之CLL-1中保守的抗原決定基。
術語「抗-CD3抗體」及「結合CD3之抗體」係指能夠以足以使抗體在靶向CD3時適用作診斷劑及/或治療劑之親和力結合CD3之抗體。在一實施例中，抗CD3抗體結合無關非CD3蛋白之程度小於抗體與CD3之結合之約10%，如例如藉由放射免疫分析(RIA)所量測。在某些實施例中，結合CD3之抗體之解離常數(Kd)為1μM、100nM、10nM、1nM、0.1nM、0.01nM或0.001nM(例如10-8M或以下，例如10-8M至10-13M，例如10-9M至10-13M)。在某些實施例中，抗CD3抗體結合CD3之在來自不同物種之CD3中保守的抗原決定基。
術語「抗體」在本文中係以最廣泛意義使用且涵蓋各種抗體結構，包括但不限於單株抗體、多株抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗 體)及抗體片段，只要其展現所需抗原結合活性即可。
「抗體片段」係指除完整抗體以外之分子，其包含完整抗體之一部分，該部分結合完整抗體所結合之抗原。抗體片段之實例包括但不限於Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2；雙功能抗體；線性抗體；單鏈抗體分子(例如scFv)；及由抗體片段形成之多特異性抗體。
抗體之「類別」係指抗體重鏈所具有之恆定域或恆定區之類型。存在五個主要抗體類別：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，且此等類別中之若干類別可進一步分成子類(同型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2。對應於不同免疫球蛋白類別之重鏈恆定域分別稱為α、δ、ε、γ及μ。
「經分離之抗體」為已自天然環境之組分分離之抗體。在一些實施例中，將抗體純化至大於95%或99%純度，如藉由例如電泳(例如SDS-PAGE、等電聚焦(IEF)、毛細管電泳)或層析(例如離子交換或逆相HPLC)所測定。對於評定抗體純度之方法之評述，參見例如Flatman等人,J.Chromatogr.B 848：79-87(2007)。
術語「全長抗體」、「完整抗體」及「全抗體」在本文中可互換使用且係指具有實質上與天然抗體結構類似之結構或具有含有如本文定義之Fc區之重鏈的抗體。
如本文所用之術語「單株抗體」係指自實質上同源抗體之群體獲得之抗體，亦即除可能之變異型抗體(例如含有天然存在之突變或在製造單株抗體製劑之期間產生之突變，此等變異體通常以少量存在)之外，構成該群體之個別抗體相同及/或結合相同抗原決定基。與通常包括針對不同決定子(抗原決定基)之不同抗體之多株抗體製備物不同，單株抗體製備物之各單株抗體係針對抗原上之單個決定子。因此，修飾語「單株」指示抗體係獲自實質上同源之抗體群體的特徵，且不應解釋為需要藉由任何特定方法來產生抗體。舉例而言，欲根據本發明使用之單株抗體可藉由多種技術製備，該等技術包括但不限於融合瘤方法、重組DNA方法、噬菌體呈現方法及利用含有全部或一部分人類免疫球蛋白基因座之轉殖基因動物之方法，此等方法及製備單株抗體之其他示範性方法在本文中加以描述。
「人類化」抗體係指包含來自非人類HVR之胺基酸殘基及 來自人類FR之胺基酸殘基的嵌合抗體。在某些實施例中，人類化抗體將包含實質上全部至少一個且通常兩個可變域，其中全部或實質上全部HVR(例如CDR)對應於非人類抗體之HVR，且全部或實質上全部FR對應於人類抗體之FR。人類化抗體視情況可包含源於人類抗體之抗體恆定區之至少一部分。例如非人類抗體之抗體之「人類化形式」係指已進行人類化之抗體。
術語「嵌合」抗體係指重鏈及/或輕鏈之一部分源於特定來源或物種，而重鏈及/或輕鏈之其餘部分源於不同來源或物種之抗體。
「人類抗體」為具有對應於由人類或人類細胞所產生或源於利用人類抗體譜系或其他人類抗體編碼序列之非人類來源之抗體胺基酸序列之胺基酸序列的抗體。人類抗體之此定義明確排除包含非人類抗原結合殘基之人類化抗體。
「裸抗體」係指未結合於異源部分(例如細胞毒性部分)或放射性標記之抗體。裸抗體可存在於醫藥調配物中。
「天然抗體」係指具有不同結構之天然存在之免疫球蛋白分子。舉例而言，天然IgG抗體為約150,000道爾頓(dalton)之雜四聚醣蛋白，由經二硫鍵鍵結之兩個相同輕鏈及兩個相同重鏈構成。自N端至C端，各重鏈具有可變區(VH)，亦稱為可變重域或重鏈可變域，之後為三個恆定域(CH1、CH2及CH3)。類似地，自N端至C端，各輕鏈具有可變區(VL)，亦稱為可變輕域或輕鏈可變域，之後為恆定輕(CL)域。抗體之輕鏈可基於其恆定域之胺基酸序列指定為稱為κ及λ之兩種類型中之一者。
術語「可變區」或「可變域」係指抗體重鏈或輕鏈中涉及抗體與抗原結合之結構域。天然抗體之重鏈可變域及輕鏈可變域(分別為VH及VL)通常具有類似結構，其中各結構域包含四個保守構架區(FR)及三個高變區(HVR)。(參見例如Kindt等人.Kuby Immunology,第6版,W.H.Freeman and Co.,第91頁(2007))。單一VH或VL域可足以賦予抗原結合特異性。此外，可分別使用來自結合特定抗原之抗體之VH或VL域篩檢互補VL或VH域之文庫來分離結合該抗原之抗體。參見例如Portolano等人,J.Immunol.150：880-887(1993)；Clarkson等人,Nature 352：624-628(1991)。
「構架」或「FR」係指除高變區(HVR)殘基以外之可變域殘 基。可變域之FR通常由四個FR域組成：FR1、FR2、FR3及FR4。因此，HVR及FR序列通常按以下順序出現在VH(或VL)中：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
如本文所用之術語「高變區」或「HVR」係指抗體可變域中序列高變(「互補決定區」或「CDR」)及/或形成結構確定之環(「高變環」)及/或含有抗原接觸殘基(「抗原觸點」)之各區域。一般而言，抗體包含六個HVR；三個在VH中(H1、H2、H3)，且三個在VL中(L1、L2、L3)。本文之示範性HVR包括：(a)在胺基酸殘基26-32(L1)、50-52(L2)、91-96(L3)、26-32(H1)、53-55(H2)及96-101(H3)處存在之高變環(Chothia及Lesk,J.Mol.Biol.196：901-917(1987))；(b)在胺基酸殘基24-34(L1)、50-56(L2)、89-97(L3)、31-35b(H1)、50-65(H2)及95-102(H3)處存在之CDR(Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991))；(c)在胺基酸殘基27c-36(L1)、46-55(L2)、89-96(L3)、30-35b(H1)、47-58(H2)及93-101(H3)處存在之抗原觸點(MacCallum等人.J.Mol.Biol.262：732-745(1996))；及(d)(a)、(b)及/或(c)之組合，包括HVR胺基酸殘基46-56(L2)、47-56(L2)、48-56(L2)、49-56(L2)、26-35(H1)、26-35b(H1)、49-65(H2)、93-102(H3)及94-102(H3)。
除非另外指示，否則HVR殘基及可變域中之其他殘基(例如FR殘基)在本文中係根據Kabat等人(同上)加以編號。
術語「Fc區」在本文中用於定義免疫球蛋白重鏈之含有至少一部分恆定區之C端區域。該術語包括天然序列Fc區及變異型Fc區。在一實施例中，人類IgG重鏈Fc區自Cys226或Pro230延伸至重鏈之羧基端。然而，Fc區之C端離胺酸(Lys447)可存在或可不存在。除非本文另外規定，否則Fc區或恆定區中之胺基酸殘基之編號係根據EU編號系統，亦稱為EU索引，如Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5th版.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD,1991中所述。
「變異型Fc區」包含由於至少一胺基酸修飾、較佳一或多個胺基酸取代而與天然序列Fc區不同之胺基酸序列。較佳地，與天然序列Fc區或親本多肽之Fc區相比，變異型Fc區具有至少一胺基酸取代，例如約一至約十個胺基酸取代，且較佳地在天然序列Fc區或在親本多肽之Fc區中有約一至約五個胺基酸取代。本文之變異型Fc區將較佳地與天然序列Fc區及/或親本多肽之Fc區具有至少約80%同源性，且最佳與其具有至少約90%同源性、更佳與其具有至少約95%同源性。
「人類一致構架」為表示在人類免疫球蛋白VL或VH構架序列之選擇中最常出現之胺基酸殘基的構架。一般而言，人類免疫球蛋白VL或VH序列係選自可變域序列之亞群。一般而言，序列亞群為如Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,NIH Publication 91-3242,Bethesda MD(1991),第1-3卷中之亞群。在一實施例中，對於VL，亞群為如Kabat等人(同上)中之亞群κI。在一實施例中，對於VH，亞群為如Kabat等人(同上)中之亞群III。
出於本文之目的，「接受體人類構架」為以下構架，其包含源於如以下定義之人類免疫球蛋白構架或人類一致構架之輕鏈可變域(VL)構架或重鏈可變域(VH)構架的胺基酸序列。「源於」人類免疫球蛋白構架或人類一致構架之接受體人類構架可包含與人類免疫球蛋白構架或人類一致構架相同之胺基酸序列，或其可含有胺基酸序列變化。在一些實施例中，胺基酸變化數目為10處或10處以下、9處或9處以下、8處或8處以下、7處或7處以下、6處或6處以下、5處或5處以下、4處或4處以下、3處或3處以下，或2處或2處以下。在一些實施例中，VL接受體人類構架之序列與VL人類免疫球蛋白構架序列或人類一致構架序列一致。
「親和力」係指分子(例如抗體)之單個結合位點與其結合搭配物(例如抗原)之間非共價相互作用的強度總和。除非另外指示，否則如本文所用之「結合親和力」係指反映結合對(例如抗體與抗原)成員之間1：1相互作用的固有結合親和力。分子X對其搭配物Y之親和力通常可由解離常 數(Kd)表示。親和力可藉由此項技術中已知之常用方法(包括本文所述者)加以量測。在下文中描述量測結合親和力之特定說明性及示範性實施例。
「親和力成熟」抗體係指在一或多個高變區(HVR)中具有一或多處改變之抗體，與不具有該等改變之親本抗體相比，該等改變改良該抗體對抗原之親和力。
「結合域」意謂特異性結合標靶抗原決定基、抗原、配體或受體之化合物或分子的一部分。結合域包括但不限於抗體(例如單株、多株、重組、人類化及嵌合抗體)、抗體片段或其部分(例如Fab片段、Fab’2、scFv抗體、SMIP、域抗體、雙功能抗體、小型抗體、scFv-Fc、親和體、奈米體，及抗體之VH及/或VL域)、受體、配體、適體及具有經識別結合搭配物之其他分子。
術語「抗原決定基」係指抗體所結合之在抗原分子上之特定位點。在一些實施例中，藉由羥基自由基足跡法確定抗體所結合之在抗原分子上之特定位點(例如CLL-1結合域)。在一些實施例中，藉由結晶學確定抗體所結合之在抗原分子上之特定位點(例如CD3結合域)。
「效應功能」係指可歸因於抗體之Fc區之彼等生物活性，其隨抗體同型而變化。抗體效應功能之實例包括：C1q結合及補體依賴性細胞毒性(CDC)；Fc受體結合；抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)；吞噬作用；細胞表面受體之下調；及B細胞活化。
「免疫結合物」為結合於一或多個異源分子(包括但不限於細胞毒性劑)之抗體。
如本文所用之術語「細胞毒性劑」係指抑制或阻止細胞功能及/或導致細胞死亡或破壞之物質。細胞毒性劑包括但不限於放射性同位素(例如At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212及Lu之放射性同位素)；化學治療劑或藥物(例如甲胺喋呤(methotrexate)、阿德力黴素(adriamicin)、長春花生物鹼(長春新鹼(vincristine)、長春花鹼(vinblastine)、依託泊苷(etoposide))、多柔比星(doxorubicin)、美法侖(melphalan)、絲裂黴素C(mitomycin C)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、道諾黴素(daunombicin)或其他嵌入劑)；生長抑制劑；酶及其片段，諸如核分解酶；抗生素；毒素， 諸如細菌、真菌、植物或動物來源之小分子毒素或酶活性毒素，包括其片段及/或變異體；及以下揭示之各種抗腫瘤劑或抗癌劑。
「經分離核酸」係指已與其自然環境之組分分離之核酸分子。經分離核酸包括通常含有核酸分子之細胞中含有之核酸分子，但該核酸分子係存在於染色體外或存在於不同於其天然染色體位置之染色體位置處。
「編碼抗-CLL-1抗體之經分離核酸」係指一或多個編碼抗體重鏈及輕鏈(或其片段)之核酸分子，包括在單一載體或各別載體中之此(等)核酸分子及存在於宿主細胞中之一或多個位置上之此(等)核酸分子。
「編碼抗CD3抗體之經分離核酸」係指一或多個編碼抗體重鏈及輕鏈(或其片段)之核酸分子，包括在單一載體或各別載體中之此(等)核酸分子及存在於宿主細胞中之一或多個位置上之此(等)核酸分子。
如本文所用之術語「載體」係指能夠使其所連接之另一核酸增殖之核酸分子。該術語包括呈自我複製核酸結構形式之載體以及併入當中已引入有其之宿主細胞之基因組中的載體。某些載體能夠導引與其可操作地連接之核酸表現。此等載體在本文中稱為「表現載體」。
術語「宿主細胞」、「宿主細胞系」及「宿主細胞培養物」可互換使用且係指其中已引入外源性核酸之細胞，包括此等細胞之子代。宿主細胞包括「轉型體」及「轉型細胞」，其包括初級轉型細胞及源於其之子代而不考慮繼代數目。子代在核酸內含物方面可能與母細胞不完全相同，而可能含有突變。本文包括具有與在原始轉型細胞中所篩檢或選擇相同之功能或生物活性之突變型子代。
關於參照多肽序列之「胺基酸序列一致性百分比(%)」定義為在比對序列且必要時引入間隙以達成最大序列一致性百分比，且不考慮任何保守性取代作為序列一致性之一部分之後，候選序列中與參照多肽序列中之胺基酸殘基相同的胺基酸殘基之百分比。可以此項技術中之技能範圍內之多種方式，例如使用可公開獲得之電腦軟體，諸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)軟體來比對以便測定胺基酸序列一致性百分比。熟習此項技術者可確定適用於比對序列之參數，包括在所 比較之序列之全長範圍內達成最大比對所需之任何演算法。然而，出於本文目的，使用序列比較電腦程式ALIGN-2產生胺基酸序列一致性百分比值。ALIGN-2序列比較電腦程式由Genentech公司創造，且原始程式碼已與使用說明書一起在美國版權局(U.S.Copyright Office,Washington D.C.,20559)存檔，其中其以美國版權登記號TXU510087登記。ALIGN-2程式可自Genentech公司(South San Francisco,California)公開獲得，或可自原始程式碼編譯。ALIGN-2程式應編譯用於UNIX操作系統(包括數位UNIX V4.0D)。所有序列比較參數皆由ALIGN-2程式設定且不改變。
在採用ALIGN-2進行胺基酸序列比較之情形下，既定胺基酸序列A對於、與或相對於既定胺基酸序列B之胺基酸序列一致性百分比(或者可稱為既定胺基酸序列A對於、與或相對於既定胺基酸序列B具有或包含某一胺基酸序列一致性百分比)係如下加以計算：100×分數X/Y
其中X為藉由序列比對程式ALIGN-2在彼程式進行A與B比對時計分為相同匹配之胺基酸殘基數，且其中Y為B中之胺基酸殘基總數。應瞭解當胺基酸序列A之長度不等於胺基酸序列B之長度時，A對於B之胺基酸序列一致性百分比將不等於B對於A之胺基酸序列一致性百分比。除非另外明確陳述，否則本文使用之所有胺基酸序列一致性百分比值皆係使用ALIGN-2電腦程式如前一段中所述來獲得。
術語「醫藥調配物」係指以下製劑：其呈允許其中所含之活性成分之生物活性有效之形式，且不含對將投與調配物之受檢者具有不可接受毒性之額外組分。
「醫藥學上可接受之載劑」係指醫藥調配物中之除活性成分以外的成分，其對受檢者無毒。醫藥學上可接受之載劑包括但不限於緩衝劑、賦形劑、穩定劑或防腐劑。
藥劑(例如醫藥調配物)之「有效量」係指在必需劑量下且持續必需時期，有效達成所要治療或預防結果之量。本文之有效量可根據諸如患者之疾病病況、年齡、性別及體重、及抗體於個體中引發所要反應之能力等因素變化。有效量亦為其中治療有益作用勝過治療之任何毒性或有 害作用的量。對於預防用途，有益或所需結果包括諸如以下之結果：消除或降低風險、減輕嚴重性或延遲疾病發作，包括疾病之生物化學、組織學及/或行為症狀，在疾病發展過程中呈現之併發症及中間病理學表型。對於治療用途，有益或所需結果包括諸如以下之臨床結果：降低由疾病產生之一種或多種症狀、提高罹患疾病者之生活品質、降低治療疾病所需之其他藥劑之劑量、增強另一藥劑之作用，諸如經由靶向、延遲疾病進展及/或延長存活期。在癌症或腫瘤之情形下，有效量之藥物在以下方面可具有作用：減少癌細胞之數目；降低腫瘤尺寸；抑制(亦即在某種程度上減慢且合意地停止)癌細胞浸潤至外周器官中；抑制(亦即在某種程度上減慢且合意地停止)腫瘤轉移；在某種程度上抑制腫瘤生長；及/或在某種程度上減輕與癌症相關之一或多種症狀。有效量可分一或多次投藥來投與。出於本發明之目的，藥物、化合物或醫藥組合物之有效量為足以直接或間接完成預防或治療性治療之量。如在臨床背景下應理解，藥物、化合物或醫藥組合物之有效量可或可不結合另一藥物、化合物或醫藥組合物達成。因此，可在投與一或多種治療劑之背景下考慮「有效量」，且若結合一種或多種其他藥劑可達成或達成所需結果，則認為單一藥劑可以有效量給予。
如本文所用之「治療(treatment)」(及其語法變化形式，諸如「治療(treat)」或「治療(treating)」)係指試圖改變所治療個體之自然病程，且可為達成預防目的或在臨床病理過程中進行之臨床介入。合乎需要之治療作用包括但不限於防止疾病發生或復發、減輕症狀、減弱疾病之任何直接或間接病理學結果、防止轉移、降低疾病進展速率、改善或緩解疾病病況及緩和或改善預後。在一些實施例中，本發明之抗體用於延遲疾病發展或減緩疾病進展。
如本文所用之「延遲病症或疾病進展」意謂推遲、阻礙、減緩、阻滯、穩定及/或推遲疾病或病症(例如細胞增生性病症，例如癌症)之發展。視病史及/或所治療之個體而定，此延遲可具有不同時間長度。如對於熟習此項技術者顯而易見，充分或顯著延遲可實際上涵蓋預防，因為個體未發展疾病。例如，可延遲後期癌症，諸如轉移發展。
「降低」或「抑制」意謂能夠引起20%或更大、50%或更大、 或75%、85%、90%、95%或更大之總體降低。在某些實施例中，降低或抑制可係指藉由抗體Fc區介導之抗體之效應子功能，此等效應子功能具體而言包括補體依賴性細胞毒性(CDC)、抗體依賴性細胞毒性(ADCC)及抗體依賴性細胞吞噬作用(ADCP)。
「化療劑」係指適用於治療癌症之化學化合物。化療劑之實例包括烷基化劑類，諸如噻替哌(thiotepa)及環磷醯胺(CYTOXAN®)；烷基磺酸酯類，諸如白消胺(busulfan)、二丙胺磺酯(improsulfan)及哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶類，諸如苯佐替派(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、美妥替派(meturedopa)及烏瑞替派(uredopa)；乙烯亞胺類及甲基蜜胺類，包括六甲蜜胺(altretamine)、三亞乙基蜜胺、三亞乙基磷醯胺、三亞乙基硫代磷醯胺及三羥甲蜜胺；多聚乙醯類(尤其布拉他辛(bullatacin)及布拉他辛酮(bullatacinone))；Δ-9-四氫***酚(屈***酚(dronabinol)，MARINOL®)；β-拉帕酮(lapachone)；拉帕醇(lapachol)；秋水仙鹼(colchicines)；樺木酸(betulinic acid)；喜樹鹼(camptothecin)(包括合成類似物托泊替康(topotecan)(HYCAMTIN®)；CPT-11(依立替康(irinotecan)，CAMPTOSAR®)、乙醯基喜樹鹼、東莨菪素(scopolectin)及9-胺基喜樹鹼)；草苔蟲素(bryostatin)；卡里司他汀(callystatin)；CC-1065(包括其阿多來新(adozelesin)、卡折來新(carzelesin)及比折來新(bizelesin)合成類似物)；鬼臼毒素(podophyllotoxin)；足葉草酸(podophyllinic acid)；替尼泊甙(teniposide)；隱藻素(cryptophycins)(尤其隱藻素1及隱藻素8)；朵拉司他汀(dolastatin)；倍癌黴素(duocarmycin)(包括合成類似物，KW-2189及CB1-TM1)；軟珊瑚醇(eleutherobin)；潘克替司它汀(pancratistatin)；匍枝珊瑚醇(sarcodictyin)；海綿抑制素(spongistatin)；氮芥類，諸如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、氯磷醯胺(chlorophosphamide)、雌莫司汀(estramustine)、異磷醯胺(ifosfamide)、雙氯乙基甲胺(mechlorethamine)、鹽酸氧氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法侖(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥膽留醇(phenesterine)、潑尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)及烏拉莫司汀(uracil mustard)；硝基脲類，諸如卡莫司汀(carmustine)、氯脈菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀 (lomustine)、尼莫斯汀(nimustine)及雷莫司汀(ranimnustine)；抗生素，諸如烯二炔(enediyne)抗生素(例如刺孢黴素(calicheamicin)，尤其刺孢黴素γ1I及刺孢黴素ωI1(參見例如Nicolaou等人,Angew.Chem Intl.Ed.Engl.,33：183-186(1994))；CDP323，一種口服α-4整合素抑制劑；達內黴素(dynemicin)，包括達內黴素A；埃斯培拉黴素(esperamicin)；以及新抑癌蛋白生色團(neocarzinostatin chromophore)及相關色蛋白稀二炔抗生素生色團、阿克拉黴素類(aclacinomysins)、放線菌素(actinomycin)、胺茴黴素(authramycin)、重氮絲胺酸(azaserine)、博來黴素(bleomycins)、放線菌素C(cactinomycin)、卡柔比星(carabicin)、洋紅黴素(carminomycin)、嗜癌黴素(carzinophilin)、色黴素(chromomycins)、放線菌素D(dactinomycin)、柔紅黴素、地托比星(detorubicin)、6-重氮基-5-側氧基-L-正白胺酸、多柔比星(doxorubicin)(包括ADRIAMYCIN®、嗎啉基-多柔比星、氰基嗎啉基-多柔比星、2-吡咯啉基-多柔比星、多柔比星HCI脂質體注射劑(DOXIL®)、脂質體多柔比星TLCD-99(MYOCET®)、聚乙二醇化脂質體多柔比星(CAELYX®)及去氧多柔比星(deoxydoxorubicin))、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊達比星(idarubicin)、麻西羅黴素(marcellomycin)、絲裂黴素(mitomycin)諸如絲裂黴素C、麥考酚酸(mycophenolic acid)、諾拉黴素(nogalamycin)、橄欖黴素(olivomycin)、培洛黴素(peplomycin)、泊非黴素(porfiromycin)、嘌羅黴素(puromycin)、三鐵阿黴素(quelamycin)、羅多比星(rodorubicin)、鏈黑黴素(streptonigrin)、鏈佐星(streptozocin)、殺結核菌素(tubercidin)、烏苯美司(ubenimex)、新制癌菌素(zinostatin)及佐柔比星(zorubicin)；抗代謝物，諸如甲胺蝶呤(methotrexate)、吉西他濱(gemcitabine)(GEMZAR®)、替加氟(tegafur)(UFTORAL®)、卡培他濱(capecitabine)(XELODA®)、埃坡黴素(epothilone)及5-氟脲嘧啶(5-FU)；葉酸類似物，諸如二甲葉酸(denopterin)、甲胺蝶呤、蝶羅呤(pteropterin)及三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤類似物，諸如氟達拉濱(fludarabine)、6-巰基嘌呤(6-mercaptopurine)、硫咪嘌呤(thiamiprine)及硫鳥嘌呤(thioguanine)；嘧啶類似物，諸如安西他濱(ancitabine)、阿紮胞苷(azacitidine)、6-氮雜尿苷(6-azauridine)、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、二去氧尿苷 (dideoxyuridine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、伊諾他濱(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)；雄激素，諸如卡普睾酮(calusterone)、丙酸甲雄烷醇酮(dromostanolone propionate)、環硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾內酯(testolactone)；抗腎上腺素劑(anti-adrenal)，諸如胺魯米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；葉酸補充劑，諸如亞葉酸(frolinic acid)；醋葡醛內醋(aceglatone)；醛磷醯胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；胺基乙醯丙酸(aminolevulinic acid)；恩尿嘧啶(eniluracil)；安吖啶(amsacrine)；貝塔布辛(bestrabucil)；比生群(bisantrene)；伊達曲殺(edatraxate)；地磷醯胺(defofamine)；秋水仙胺(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；埃鳥胺酸(elfornithine)；依利醋銨(elliptinium acetate)；埃坡黴素(epothilone)；依託格魯(etoglucid)；硝酸鎵；羥基脲；香菇多糖(lentinan)；氯尼達明(lonidainine)；美登木素生物鹼(maytansinoid)，諸如美登素(maytansine)及安絲菌素(ansamitocin)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫皮達莫(mopidanmol)；硝惡林(nitraerine)；噴司他丁(pentostatin)；蛋胺氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；2-乙基醯肼(2-ethylhydrazide)；丙卡巴肼(procarbazine)；PSK®多糖複合物(JHS Natural Products,Eugene,OR)；雷佐生(razoxane)；根黴素(rhizoxin)；西佐喃(sizofiran)；鍺螺胺(spirogermanium)；細交鏈抱菌酮酸(tenuazonic acid)；三亞胺醌(triaziquone)2,2’,2’-三氯三乙胺；單端孢黴烯(trichothecene)(尤其T-2毒素、瓦克素(verracurin)A、桿抱菌素A(roridinA)及安胍啶(anguidine))；烏拉坦(urethan)；長春地辛(vindesine)(ELDISINE®、FILDESIN®)；達卡巴嗪(dacarbazine)；甘露莫司汀(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴衛矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；加胞嘧啶(gacytosine)；阿糖胞苷(arabinoside)(「Ara-C」)；噻替哌；紫杉烷(taxoid)，例如紫杉醇(paclitaxel)(TAXOL®)、紫杉醇之白蛋白工程改造之奈米顆粒調配物(ABRAXANETM)及多西他賽(docetaxel)(TAXOTERE®)；苯丁酸氮芥(chloranbucil)；6-硫鳥嘌呤；巰基嘌呤；胺甲蝶呤；鉑試劑諸如順鉑(cisplatin)、奧沙利鉑(oxaliplatin)(例如ELOXATIN®)及卡鉑(carboplatin)；長春花(vincas)，其防止微管蛋白聚合，免於形成微管，包括長春鹼(vinblastine) (VELBAN®)、長春新鹼(vincristine)(ONCOVIN®)、長春地辛(vindesine)(ELDISINE®、FILDESIN®)及長春瑞濱(vinorelbine)(NAVELBINE®)；依託泊苷(etoposide)(VP-16)；異磷醯胺；米托蒽醌；甲醯四氫葉酸(leucovorin)；諾安托(novantrone)；依達曲沙(edatrexate)；柔紅黴素(daunomycin)；胺蝶呤(aminopterin)；伊班膦酸鹽(ibandronate)；拓撲異構酶抑制劑RFS2000；二氟甲基鳥胺酸(DMFO)；類視色素，諸如視黃酸，包括貝沙羅汀(bexarotene)(TARGRETIN®)；雙膦酸鹽，諸如氯膦酸鹽(clodronate)(例如BONEFOS®或OSTAC®)、依替膦酸鹽(etidronate)(DIDROCAL®)、NE-58095、唑來膦酸/唑來膦酸鹽(ZOMETA®)、阿侖膦酸鹽(alendronate)(FOSAMAX®)、帕米膦酸鹽(pamidronate)(AREDIA®)、魯膦酸鹽(tiludronate)(SKELID®)或利塞膦酸鹽(risedronate)(ACTONEL®)；曲沙他濱(troxacitabine)(1,3-二氧雜環戊烷核苷胞嘧啶類似物)；反義寡核苷酸，尤其抑制異常細胞增殖中所牽涉之信號傳導途徑中基因表現之彼等反義寡核苷酸，諸如例如PKC-α、Raf、H-Ras及表皮生長因子受體(EGF-R)；疫苗，諸如THERATOPE®疫苗，及基因治療疫苗，例如ALLOVECTIN®疫苗、LEUVECTIN®疫苗及VAXID®疫苗；拓撲異構酶1抑制劑(例如LURTOTECAN®)；rmRH(例如ABARELIX®)；BAY439006(索拉菲尼(sorafenib)；Bayer)；SU-11248(舒尼替尼(sunitinib)，SUTENT®，Pfizer)；哌立福辛(perifosine)、COX-2抑制劑(例如塞來昔布(celecoxib)或艾托考昔(etoricoxib))、蛋白酶體抑制劑(例如PS341)；硼替佐米(bortezomib)(VELCADE®)；CCI-779；替吡法尼(tipifarnib)(R11577)；索拉非尼(orafenib)、ABT510；Bcl-2抑制劑，諸如奧利莫森鈉(oblimersen sodium)(GENASENSE®)；匹杉瓊(pixantrone)；EGFR抑制劑(參見以下定義)；酪胺酸激酶抑制劑；絲胺酸-酥胺酸激酶抑制劑，諸如雷帕黴素(rapamycin)(西羅莫司(sirolimus)，RAPAMUNE®)；法尼基轉移酶抑制劑，諸如洛那法尼(lonafarnib)(SCH 6636，SARASARTM)；及上述藥物中任一者之醫藥學上可接受的鹽、酸或衍生物；以及上述藥物中兩種或兩種以上之組合，諸如CHOP──環磷醯胺、多柔比星、長春新鹼及潑尼松龍之組合療法的縮寫；及FOLFOX，奧沙利鉑(ELOXATINTM)與5-FU及甲醯四氫葉酸之組合的治療方案之縮寫。
如本文所定義之化療劑包括「抗激素劑」或「內分泌治療劑」，其起作用以調控、降低、阻斷或抑制可促進癌症生長之激素之作用。其可為激素本身，包括但不限於，具有混合促效劑/拮抗劑概括之抗***，包括他莫昔芬(tamoxifen)(NOLVADEX®)、4-羥基他莫昔芬、托瑞米芬(toremifene)(FARESTON®)、吲哚昔酚(idoxifene)、屈洛昔芬(droloxifene)、雷洛昔芬(raloxifene)(EVISTA®)、曲沃昔芬(trioxifene)、克奧昔芬(keoxifene)及選擇性***受體調節劑(SERM)諸如SERM3；無激動劑性質之純抗***，諸如氟維司群(fulvestrant)(FASLODEX®)及EM800(此等藥劑可阻斷***受體(ER)二聚化、抑制DNA結合、增大ER轉化及/或抑制ER水準)；芳香酶抑制劑，包括類固醇芳香酶抑制劑，諸如福美坦(formestane)及依西美坦(exemestane)(AROMASIN®)，及非類固醇芳香酶抑制劑，諸如安美達(anastrazole)(ARIMIDEX®)、來曲唑(letrozole)(FEMARA®)及胺魯米特(aminoglutethimide)，及其他芳香酶抑制劑，包括伏氯唑(vorozole)(RIVISOR®)、醋酸甲地孕酮(MEGASE®)、法倔唑(fadrozole)及4(5)-咪唑；促黃體激素釋放激素促效劑，包括亮丙瑞林(leuprolide)(LUPRON®及ELIGARD®)、戈舍瑞林(goserelin)、布舍瑞林(buserelin)及曲普瑞林(tripterelin)；性類固醇，包括孕酮，諸如醋酸甲地孕酮(megestrol acetate)及醋酸甲羥孕酮(medroxyprogesterone acetate)，***諸如二乙基乙烯雌酚(diethylstilbestrol)及倍美力(premarin)，及雄激素/類視色素諸如氟***(fluoxymesterone)，全反維甲酸及芬維A胺(fenretinide)；奧那司酮(onapristone)；抗孕酮；***受體下調劑(ERD)；抗***諸如氟他胺(flutamide)、尼魯米特(nilutamide)及比卡魯胺(bicalutamide)；及上述藥物中任一者之醫藥學上可接受的鹽、酸或衍生物；以及上述藥物中兩種或兩種以上之組合。
如本文用於輔助療法之術語「免疫抑制劑」係指起作用以抑制或掩蔽本文所治療之哺乳動物的免疫系統之物質。此將包括抑制細胞因子產生、下調或抑制自身抗原表現或掩蔽MHC抗原之物質。此等試劑之實例包括2-胺基-6-芳基-5-取代之嘧啶(參見國美專利第4,665,077號)；非類固醇消炎藥物(NSAID)；更昔洛韋(ganciclovir)、他克莫司(tacrolimus)、糖皮質 激素諸如皮質醇(cortisol)或醛固酮(aldosterone)、消炎劑諸如環氧合酶抑制劑、5-脂氧合酶抑制劑或白三烯受體拮抗劑；嘌呤拮抗劑諸如咪唑硫嘌呤(azathioprine)或麥考酚酸莫酯(mycophenolate mofetil，MMF)；烷基化劑，諸如環磷醯胺；溴隱亭(bromocryptine)；達那唑(danazol)；胺苯碸(dapsone)；戊二醛(其掩蔽MHC抗原，如美國專利第4,120,649所述)；MHC抗原及MHC片段之抗獨特型抗體；環孢黴素A；類固醇諸如皮質類固醇或糖皮質類固醇或糖皮質類固醇類似物，例如強的松、甲基強的松龍，包括SOLU-MEDROL®甲基強的松龍丁二酸鈉及***；二氫葉酸還原酶抑制劑諸如甲胺喋呤(口服或皮下)；抗瘧疾劑諸如氯喹及羥氯喹；柳氮磺吡啶(sulfasalazine)；來氟米特(leflunomide)；細胞因子或細胞因子受體抗體，包括抗干擾素α、β或γ抗體，抗腫瘤壞死因子(TNF)α抗體(英利昔單抗(infliximab)(REMICADE®)或阿達木單抗(adalimumab))、抗TNFα免疫黏合素(依那西普(etanercept))、抗-TNF β抗體、抗-白細胞介素-2(IL-2)抗體及抗-IL-2受體抗體，及抗-白細胞介素-6(IL-6)受體抗體及拮抗劑(諸如ACTEMRATM(塔西單抗(tocilizumab)))；抗-LFA-1抗體，包括抗-CD11a及抗-CD18抗體；抗-L3T4抗體；異源抗淋巴細胞球蛋白；pan-T抗體，較佳抗-CD3或抗-CD4/CD4a抗體；含有LFA-3結合域之可溶性肽(7/26/90公佈之WO 90/08187)；鏈激酶；轉型生長因子β(TGF-β)；鏈道酶；來自宿主之RNA或DNA；FK506；RS-61443；苯丁酸氮芥；去氧精胍菌素(deoxyspergualin)；雷帕黴素；T細胞受體(Cohen等人,美國專利第5,114,721號)；T細胞受體片段(Offner等人,Science,251：430-432(1991)；WO 90/11294；Ianeway,Nature,341：482(1989)；及WO 91/01133)；BAFF拮抗劑，諸如BAFF抗體及BR3抗體，及ZTNF4拮抗劑(對於評述，參見Mackay及Mackay,Trends Immunol.,23：113-5(2002)，亦參見以下定義)；干擾輔助T細胞傳導信號之生物學藥劑，諸如抗-CD40受體或抗-CD40配體(CD154)，包括阻斷針對CD40-CD40配體之抗體(例如Durie等人,Science,261：1328-30(1993)；Mohan等人,J.Immunol.,154：1470-80(1995))及CTLA4-Ig(Finck等人,Science,265：1225-7(1994))；及T細胞受體抗體(EP 340,109)，諸如T10B9。本文中一些優選免疫抑制劑包括環磷醯胺、苯丁酸氮芥、咪唑硫嘌 呤、來氟米特MMF或甲胺喋呤。
術語「PD-1軸結合拮抗劑」係指抑制PD-1軸結合搭配物與其一種或多種結合搭配物之相互作用、以便去除由PD-1信號傳導軸上之信號傳導導致之T細胞功能異常、結果恢復或增強T細胞功能(例如增殖、細胞因子產生、標靶細胞殺傷)之分子。如本文所用之PD-1軸結合拮抗劑包括PD-1結合拮抗劑、PD-L1結合拮抗劑及PD-L2結合拮抗劑。
術語「PD-1結合拮抗劑」係指降低、阻斷、抑制、消除或干擾由PD-1與其一種或多種結合搭配物諸如PD-L1、PD-L2相互作用產生之信號轉導之分子。在一些實施例中，PD-1結合拮抗劑為抑制PD-1與其一種或多種結合搭配物之結合的分子。在一特定態樣中，PD-1結合拮抗劑抑制PD-1與PD-L1及/或PD-L2之結合。例如，PD-1結合拮抗劑包括抗-PD-1抗體、其抗原結合片段、免疫黏合素、融合蛋白、寡肽及降低、阻斷、抑制、消除或干擾由PD-1與PD-L1及/或PD-L2相互作用產生之信號轉導的其他分子。在一實施例中，PD-1結合拮抗劑降低藉由或經由T淋巴細胞上表現之細胞表面蛋白(其經由PD-1介導信號傳導)介導的負共刺激信號，以便使功能異常性T細胞具有較低功能異常性(例如增強效應子對抗原識別之反應)。在一些實施例中，PD-1結合拮抗劑為抗-PD-1抗體。在一特定態樣中，PD-1結合拮抗劑為本文所述之MDX-1106(尼沃魯單抗(nivolumab))。在另一特定態樣中，PD-1結合拮抗劑為本文所述之MK-3475(蘭布株單抗(lambrolizumab))。在另一特定態樣中，PD-1結合拮抗劑為本文所述之CT-011(匹利株單抗(pidilizumab))。在另一特定態樣中，PD-1結合拮抗劑為本文所述之AMP-224。
術語「PD-L1結合拮抗劑」係指降低、阻斷、抑制、消除或干擾由PD-L1與其一種或多種結合搭配物諸如PD-1、B7-1相互作用產生之信號轉導之分子。在一些實施例中，PD-L1結合拮抗劑為抑制PD-L1與其結合搭配物之結合的分子。在一特定態樣中，PD-L1結合拮抗劑抑制PD-L1與PD-1及/或B7-1之結合。在一些實施例中，PD-L1結合拮抗劑包括抗-PD-L1抗體、其抗原結合片段、免疫黏合素、融合蛋白、寡肽及降低、阻斷、抑制、消除或干擾由PD-L1與其一種或多種結合搭配物諸如PD-1、B7-1 相互作用產生之信號轉導的其他分子。在一實施例中，PD-L1結合拮抗劑降低藉由或經由T淋巴細胞上表現之細胞表面蛋白(其經由PD-L1介導信號傳導)介導的負共刺激信號，以便使功能異常性T細胞具有較低功能異常性(例如增強效應子對抗原識別之反應)。在一些實施例中，PD-L1結合拮抗劑為抗-PD-L1抗體。在一特定態樣中，抗-PD-L1抗體為本文所述之YW243.55.S70。在另一特定態樣中，抗-PD-L1抗體為本文所述之MDX-1105。在另一特定態樣中，抗-PD-L1抗體為本文所述之MPDL3280A(CAS登記號1380723-44-3)。在另一特定態樣中，抗-PD-L1抗體為本文所述之MEDI4736。
術語「PD-L2結合拮抗劑」係指降低、阻斷、抑制、消除或干擾由PD-L2與其一種或多種結合搭配物諸如PD-1相互作用產生之信號轉導之分子。在一些實施例中，PD-L2結合拮抗劑為抑制PD-L2與其一種或多種結合搭配物之結合的分子。在一特定態樣中，PD-L2結合拮抗劑抑制PD-L2與PD-1之結合。在一些實施例中，PD-L2結合拮抗劑包括抗-PD-L2抗體、其抗原結合片段、免疫黏合素、融合蛋白、寡肽及降低、阻斷、抑制、消除或干擾由PD-L2與其一種或多種結合搭配物諸如PD-1相互作用產生之信號轉導的其他分子。在一實施例中，PD-L2結合拮抗劑降低藉由或經由T淋巴細胞上表現之細胞表面蛋白(其經由PD-L2介導信號傳導)介導的負共刺激信號，以便使功能異常性T細胞具有較低功能異常性(例如增強效應子對抗原識別之反應)。在一些實施例中，PD-L2結合拮抗劑為免疫黏合素。
術語「腫瘤」係指所有贅生性細胞生長及增殖，無論惡性或良性，及所有癌前及癌細胞及組織。如本文所提及之術語「癌症」、「癌性」、「細胞增生性病症」、「增生性病症」及「腫瘤」並不相互排斥。
術語「細胞增生性病症」及「增生性病症」係指與某種程度之異常細胞增生有關之病症。在一實施例中，細胞增生性病症為癌症。
術語「癌症」及「癌性」係指或描述典型地特徵在於哺乳動物之不受調控細胞生長/增殖的生理學病狀。在一些實施例中，癌症為CLL-1陽性癌症。CLL-1陽性癌症之癌症的實例包括但不限於癌瘤、淋巴瘤(例如 霍奇金及非霍奇金淋巴瘤)、胚細胞瘤、肉瘤及白血病。此等癌症之更特定實例包括急性骨髓性白血病(AML)、骨髓增生異常症候群(MDS)、慢性髓細胞性白血病(CML)、慢性骨髓單核細胞性白血病、急性前髓細胞性白血病(APL)、慢性骨髓增生性病症、血小板性白血病、前體B細胞急性淋巴母細胞性白血病(前B-ALL)、前體T細胞急性淋巴母細胞性白血病(前T-ALL)、多發性骨髓瘤(MM)、肥大細胞疾病、肥大細胞白血病、肥大細胞肉瘤、骨髓性肉瘤、淋巴性白血病及未分化白血病。在一些實施例中，癌症為骨髓性白血病。在一些實施例中，癌症為急性骨髓性白血病(AML)。
術語「CLL-1陽性細胞」係指在其表面上表現CLL-1之細胞。
術語「CLL-1陽性癌症」係指在其表面上表現CLL-1之癌症。在一些實施例中，例如在諸如免疫組織化學、FACS等之方法中使用針對CLL-1之抗體測定CLL-1在細胞表面上之表現。或者，認為CLL-1 mRNA表現與細胞表面上之CLL-1表現相關聯，且可藉由選自原位雜交及RT-PCR(包括定量RT-PCR)之方法測定。
「個體」或「受檢者」為哺乳動物。哺乳動物包括但不限於馴養動物(例如牛、陽、貓、犬及馬)、靈長類動物(例如人類及非人類靈長類動物，諸如猴)、兔及齧齒動物(例如小鼠及大鼠)。在某些實施例中，在某些實施例中，個體或受檢者為人類。
術語「包裝插頁」用於指慣常包括在治療性產品之商業包裝中之說明書，其含有關於與使用此等治療性產品相關之適應症、用法、劑量、投藥、組合療法、禁忌症及/或警告的資訊。
除非上下文另外明確規定，否則如本文及隨附申請專利範圍中所用之單數形式「一(a/an)」、「或」及「該(the)」包括複數個參考物。
本文中提及「約」某值或參數包括(且描述)針對彼值或參數本身之變化。舉例而言，提及「約X」之描述包括對「X」之描述。
應瞭解本文所述之本發明之態樣及變化形式包括「由態樣及變化形式組成」及/或「基本上由態樣及變化形式組成」。
II.組合物及方法
在一態樣中，本發明係部分基於抗-CLL-1抗體。在某些實施例中，提供包含CLL-1結合域及CD3結合域之抗-CLL-1抗體。在某些實施例中，抗-CLL-1抗體為抗-CLL-1 T細胞依賴性雙特異性(TDB)抗體。本發明之抗體適用於例如診斷或治療癌症，諸如急性骨髓性白血病(AML)。
A.示範性抗-CLL-1抗體
本發明提供包含CLL-1結合域及CD3結合域之抗-CLL-1抗體，及其使用方法。在一些實施例中，本文提供經分離之抗-CLL-1抗體，其中該抗體包含(i)CLL-1結合域，其中該CLL-1結合域結合包含SEQ ID NO：49之胺基酸的CLL-1抗原決定基且/或結合包含SEQ ID NO：49之胺基酸的重疊CLL-1抗原決定基，且不結合包含SEQ ID NO：50及/或SEQ ID NO：51之抗原決定基；及(ii)CD3結合域，其中該CD3結合域結合人類CD3 ε多肽及cyno CD3 ε多肽，該CD3結合域結合人類CD3 ε多肽之由人類CD3 ε之胺基酸1-26(SEQ ID NO：86)或1-27(SEQ ID NO：87)組成的片段內之CD3抗原決定基，且不要求人類CD3 ε多肽之胺基酸殘基Glu5用於CD3結合域之結合。
a)抗-CLL1抗體之CLL-1結合域
在一些實施例中，抗-CLL-1抗體之CLL-1結合域結合包含SEQ ID NO：49之胺基酸的CLL-1抗原決定基且/或結合包含SEQ ID NO：49之胺基酸的CLL-1重疊抗原決定基，且不結合包含SEQ ID NO：50及/或SEQ ID NO：51之CLL-1抗原決定基。在一些實施例中，抗-CLL-1抗體之CLL-1結合域結合包含SEQ ID NO：49之胺基酸的CLL-1抗原決定基。在一些實施例中，抗-CLL-1抗體之CLL-1結合域結合由SEQ ID NO：49之胺基酸組成或基本上由其組成的CLL-1抗原決定基。在一些實施例中，藉由羥基自由基足跡法確定CLL-1抗原決定基。在一些實施例中，如藉由羥基自由基足跡法確定之CLL-1抗原決定基具有大於約1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9或3.0中之任一者的[抗原速率常數]/[抗原及抗體複合物速率常數]比率。在一些實施例中，如藉由羥基自由基足跡法確定之CLL-1抗原決定基具有大於約2.0之[抗原速率常數]/[抗原及抗體複合物速率常數]比率。
羥基自由基足跡法可如實例中所述進行。例如，在Brookhaven National Laboratory使用X28c光束線使樣品暴露至羥基自由基持續0、10、15及20毫秒(ms)之間隔。可使用PNG酶F使所標記樣品經受去糖基化。可使樣品在丙酮中使用三氯乙酸進行沉澱，且經受LC-MS分析。然後，可使樣品經受還原及烷基化，使用胰蛋白酶消化，之後液相層析法聯合高解析度質譜法(LC-MS)。可使用ProtMapMS分析MS資料，得到各肽之劑量反應曲線圖。可將游離抗原之結果與各複合形式進行比較。可使用Swiss-Model軟體產生抗原之基於同源性的模型，且針對三種複合物中之每一者進行溶劑保護區域定位。可針對非氧化及所有氧化形式之肽離子(具有特定m/z)提取所選離子層析圖(SIC)且積分。此等峰面積值可用於以劑量反應(DR)曲線圖形式表徵反應動力學，該等曲線圖量測作為羥基自由基暴露之函數，完整肽之損失。與游離抗原相反，複合物中之溶劑保護區域經歷逐漸氧化反應，且氧化速率(稱為速率常數，RC)之差異可用來凸顯抗原決定基之位置(例如CLL-1抗原決定基)。
在任一抗-CLL1抗體之一些實施例中，CLL-1結合域結合重組人類CLL-1。在任一抗-CLL1抗體之一些實施例中，CLL-1結合域結合重組獼猴CLL-1。在任一抗-CLL1抗體之一些實施例中，CLL-1結合域結合人類外周血單核細胞(PBMC)表面上之內源性CLL-1。在任一抗-CLL1抗體之一些實施例中，CLL-1結合域結合獼猴PBMC表面上之內源性CLL-1。在任一抗-CLL1抗體之一些實施例中，CLL-1結合域結合癌細胞表面上之內源性CLL-1。在任一抗-CLL1抗體之一些實施例中，CLL-1結合域結合AML癌細胞表面上之內源性CLL-1。在任一抗-CLL1抗體之一些實施例中，CLL-1結合域結合HL-60細胞表面上之內源性CLL-1。在任一抗-CLL1抗體之一些實施例中，CLL-1結合域結合EOL-1細胞表面上之內源性CLL-1。在任一抗-CLL1抗體之一些實施例中，CLL-1結合域結合包含K244Q突變之CLL-1(SEQ ID NO：1具有K244Q)。在任一抗-CLL1抗體之一些實施例中，CLL-1結合域結合包含SEQ ID NO：49之胺基酸的CLL-1抗原決定基且/或結合包含SEQ ID NO：49之胺基酸的重疊CLL-1抗原決定基。在任一抗-CLL1抗體之一些實施例中，CLL-1結合域不結合包含SEQ ID NO：50及/或SEQ ID NO：51之CLL-1抗原決定基。在任一抗-CLL1抗體之一些實施例中，CLL-1結合域與R&D System純系687317抗體競爭結合人類CLL-1。在任一抗-CLL1抗體之一些實施例中，CLL-1結合域結合內源性人類CLL-1，其Kd小於15nM、小於10nM、小於7nM、小於5nM或小於3nM。在任一抗-CLL1抗體之一些實施例中，CLL-1結合域結合重組人類CLL-1，其Kd小於10nM、小於7nM、小於5nM或小於3nM。在任一抗-CLL1抗體之一些實施例中，CLL-1結合域結合重組獼猴CLL-1，其Kd小於10nM、小於7nM、小於5nM或小於3nM、小於2nM或小於1nM。在一些實施例中，Kd藉由本文、詳言之實例中所述的任何方法來測定。在一些實施例中，Kd藉由BIACORE測定。在一些實施例中，Kd藉由以低密度固定至CLL-1測定。
在任一抗-CLL-1抗體之一些實施例中，抗-CLL-1抗體具有小於約200ng/mL、例如小於約150、100、50、25、20或15ng/mL中之任一者的細胞殺傷EC50。在一些實施例中，細胞殺傷為人類自體CD14+。在一些實施例中，細胞殺傷為細胞株細胞殺傷，例如U937細胞株、HL-60細胞株、PL-21細胞株、NOMO-1細胞株、EOL-1細胞株、THP-1細胞株、ML-2細胞株、Molm-13細胞株。在任一多特異性抗-CLL-1抗體之一些實施例中，抗-CLL-1抗體具有小於約50ng/mL，例如小於約25ng/mL或20ng/mL中之任一者的細胞毒性T細胞活化EC50。在一些實施例中，細胞毒性T細胞活化係藉由CD8+ T細胞中CD69+CD25+ T細胞之%來量測。
在一些實施例中，如本文在以下實例中所述測定CLL-1結合域及/或CLL-1抗體之特徵。
CLL-1結合域6E7及其他實施例
在任一CLL-1抗體之一些實施例中，本發明提供一種抗-CLL-1抗體，其包含CLL-1結合域，該CLL-1結合域包含至少一、兩個、三個、四個、五個或六個選自以下之HVR：(a)HVR-H1，其包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列；(b)HVR-H2，其包含SEQ ID NO：45之胺基酸序列；(c)HVR-H3，其包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列；(d)HVR-L1，其包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列；(e)HVR-L2，其包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列； 及(f)HVR-L3，其包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列。在一些實施例中，HVR-H2包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列。在一些實施例中，HVR-H2包含SEQ ID NO：47之胺基酸序列。在一些實施例中，HVR-H2包含SEQ ID NO：11之胺基酸序列。在一些實施例中，HVR-H2包含SEQ ID NO：43之胺基酸序列。在一些實施例中，HVR-H2包含SEQ ID NO：44之胺基酸序列。
在一態樣中，本發明提供一種抗-CLL-1抗體，其包含CLL-1結合域，該CLL-1結合域包含選自以下之至少一、至少兩個或全部三個VH HVR序列：(a)HVR-H1，其包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列；(b)HVR-H2，其包含SEQ ID NO：45之胺基酸序列；及(c)HVR-H3，其包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列。在一實施例中，CLL-1結合域包含HVR-H3，其包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列。在另一實施例中，CLL-1結合域包含HVR-H3，其包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列；及HVR-L3，其包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列。在另一實施例中，CLL-1結合域包含HVR-H3，其包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列；HVR-L3，其包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列；及HVR-H2，其包含SEQ ID NO：45之胺基酸序列。在另一實施例中，CLL-1結合域包含(a)HVR-H1，其包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列；(b)HVR-H2，其包含SEQ ID NO：45之胺基酸序列；及(c)HVR-H3，其包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列。在一些實施例中，HVR-H2包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列。在一些實施例中，HVR-H2包含SEQ ID NO：47之胺基酸序列。在一些實施例中，HVR-H2包含SEQ ID NO：11之胺基酸序列。在一些實施例中，HVR-H2包含SEQ ID NO：43之胺基酸序列。在一些實施例中，HVR-H2包含SEQ ID NO：44之胺基酸序列。
在另一態樣中，本發明提供一種抗-CLL-1抗體，其包含CLL-1結合域，該CLL-1結合域包含選自以下之至少一、至少兩個或全部三個VL HVR序列：(a)HVR-L1，其包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列；(b)HVR-L2，其包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列；及(c)HVR-L3，其包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列。在一實施例中，CLL-1結合域包含(a)HVR-L1，其包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列；(b)HVR-L2，其包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列；及(c)HVR-L3，其包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列。
在另一態樣中，抗-CLL-1抗體包含CLL-1結合域，該CLL-1結合域包含(a)VH域，其包含選自以下之至少一、至少兩個或全部三個VH HVR序列：(i)HVR-H1，其包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列，(ii)HVR-H2，其包含SEQ ID NO：45之胺基酸序列，及(iii)HVR-H3，其包含選自SEQ ID NO：10之胺基酸序列；及(b)VL域，其包含選自以下之至少一、至少兩個或全部三個VL HVR序列：(i)HVR-L1，其包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列，(ii)HVR-L2，其包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列，及(c)HVR-L3，其包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列。
在另一態樣中，本發明提供一種抗CLL-1抗體，其包含CLL-1結合域，該CLL-1結合域包含：(a)HVR-H1，其包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列；(b)HVR-H2，其包含SEQ ID NO：45之胺基酸序列；(c)HVR-H3，其包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列；(d)HVR-L1，其包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列；(e)HVR-L2，其包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列；及(f)HVR-L3，其包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列。在一些實施例中，抗體包含(a)HVR-H1，其包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列；(b)HVR-H2，其包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列；(c)HVR-H3，其包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列；(d)HVR-L1，其包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列；(e)HVR-L2，其包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列；及(f)HVR-L3，其包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列。在一些實施例中，CLL-1結合域包含(a)HVR-H1，其包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列；(b)HVR-H2，其包含SEQ ID NO：47之胺基酸序列；(c)HVR-H3，其包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列；(d)HVR-L1，其包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列；(e)HVR-L2，其包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列；及(f)HVR-L3，其包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列。在一些實施例中，CLL-1結合域包含(a)HVR-H1，其包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列；(b)HVR-H2，其包含SEQ ID NO：11之胺基酸序列；(c)HVR-H3，其包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列；(d)HVR-L1，其包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列；(e)HVR-L2，其包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列；及(f)HVR-L3，其包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列。在一些實施例中，CLL-1結合域包含(a)HVR-H1，其包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列；(b)HVR-H2，其包含SEQ ID NO：43之胺基酸序列；(c)HVR-H3，其包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列；(d)HVR-L1，其包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列；(e)HVR-L2，其包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列；及(f)HVR-L3，其包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列。在一些實施例中，CLL-1結合域包含(a)HVR-H1，其包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列；(b)HVR-H2，其包含SEQ ID NO：44之胺基酸序列；(c)HVR-H3，其包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列；(d)HVR-L1，其包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列；(e)HVR-L2，其包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列；及(f)HVR-L3，其包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列。
在任一以上實施例中，包含CLL-1結合域之抗-CLL-1抗體經人類化。在一實施例中，包含CLL-1結合域之抗-CLL-1抗體包含如任何以上實施例中之HVR，且進一步包含人類接受體構架，例如人類免疫球蛋白構架或人類一致構架。在某些實施例中，人類接受體構架為人類VL κI一致(VLKI)構架及/或VH構架VH1。在某些實施例中，人類接受體構架為人類VL κI一致(VLKI)構架及/或VH構架VH1，其包含以下突變中之任一者。
在另一態樣中，包含CLL-1結合域之抗-CLL-1抗體包含與SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：46及/或SEQ ID NO：48之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之重鏈可變域(VH)序列。在某些實施例中，與SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：46及/或SEQ ID NO：48之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性之VH序列相對於參考序列含有取代(例如保守性取代)、***或缺失，但包含彼序列之CLL-1結合域保留結合CLL-1之能力。在某些實施例中，在SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：46及/或SEQ ID NO：48中取代、***及/或缺失總計1至10個胺基酸。在某些實施例中，在SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：46及/或SEQ ID NO：48中取代、***及/或缺失總計1至5個胺基酸。在某些實施例中，取代、***或缺失發生在HVR外的區域中(亦即，FR中)。視情況地，包含CLL-1結合域之抗-CLL-1抗體包含 SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：33及/或SEQ ID NO：34之VH序列，包括彼序列之轉譯後修飾。在一特定實施例中，VH包含一、兩個或三個選自以下之HVR：(a)HVR-H1，其包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列；(b)HVR-H2，其包含SEQ ID NO：45之胺基酸序列；及(c)HVR-H3，其包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列。在一些實施例中，HVR-H2包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列。在一些實施例中，HVR-H2包含SEQ ID NO：47之胺基酸序列。在一些實施例中，HVR-H2包含SEQ ID NO：11之胺基酸序列。在一些實施例中，HVR-H2包含SEQ ID NO：43之胺基酸序列。在一些實施例中，HVR-H2包含SEQ ID NO：44之胺基酸序列。
在另一態樣中，提供一種包含CLL-1結合域之抗-CLL-1抗體，其中該CLL-1結合域包含與SEQ ID NO：30及/或SEQ ID NO：32之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之輕鏈可變域(VL)。在某些實施例中，與SEQ ID NO：30及/或SEQ ID NO：32之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性之VL序列相對於參考序列含有取代(例如保守性取代)、***或缺失，但包含彼序列之CLL-1結合域保留結合CLL-1之能力。在某些實施例中，在SEQ ID NO：30及/或SEQ ID NO：32中取代、***及/或缺失總計1至10個胺基酸。在某些實施例中，在SEQ ID NO：30及/或SEQ ID NO：32中取代、***及/或缺失總計1至5個胺基酸。在某些實施例中，取代、***或缺失發生在HVR外的區域中(亦即，FR中)。視情況地，包含CLL-1結合域之抗-CLL-1抗體包含SEQ ID NO：30及/或SEQ ID NO：32之VL序列，包括彼序列之轉譯後修飾。在一特定實施例中，VL包含一、兩個或三個選自以下之HVR：(a)HVR-L1，其包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列；(b)HVR-L2，其包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列；及(c)HVR-L3，其包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列。
在另一態樣中，提供一種包含CLL-1結合域之抗-CLL-1抗體，其中該CLL-1結合域包含如任何以上所提供實施例中之VH及如任何以上所提供實施例中之VL。
在一實施例中，CLL-1結合域包含分別在SEQ ID NO：31及 SEQ ID NO：30中之VH及VL序列，包括彼等序列之轉譯後修飾。在一實施例中，CLL-1結合域包含分別在SEQ ID NO：33及SEQ ID NO：32中之VH及VL序列，包括彼等序列之轉譯後修飾。在一實施例中，CLL-1結合域包含分別在SEQ ID NO：34及SEQ ID NO：32中之VH及VL序列，包括彼等序列之轉譯後修飾。在一實施例中，CLL-1結合域包含分別在SEQ ID NO：46及SEQ ID NO：32中之VH及VL序列，包括彼等序列之轉譯後修飾。在一實施例中，CLL-1結合域包含分別在SEQ ID NO：48及SEQ ID NO：32中之VH及VL序列，包括彼等序列之轉譯後修飾。
在另一態樣中，本文提供與本文提供之CLL-1結合域結合相同抗原決定基的抗體。例如，在某些實施例中，提供與CLL-1結合域結合相同抗原決定基之抗體，該CLL-1結合域分別包含SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：46及/或SEQ ID NO：48之VH序列，及SEQ ID NO：30及/或SEQ ID NO：32之VL序列。
本文提供抗-CLL-1抗體，其包含CLL-1結合域，該CLL-1結合域包含如圖2A所繪示、根據Kabat編號包含HVR1-LC、HVR2-LC及HVR3-LC序列之輕鏈可變域，及如圖2B所繪示、根據Kabat編號包含HVR1-HC,HVR2-HC及HVR3-HC序列之重鏈可變域。在一些實施例中，包含CLL-1結合域之抗-CLL-1抗體包含輕鏈可變域，該輕鏈可變域包含HVR1-LC、HVR2-LC及/或HVR3-LC序列，及FR1-LC、FR2-LC、FR3-LC及/或FR4-LC序列，如圖2A所繪示。在一些實施例中，抗體包含重鏈可變域，該重鏈可變域包含HVR1-HC、HVR2-HC及/或HVR3-HC序列，及FR1-HC、FR2-HC、FR3-HC及/或FR4-HC序列，如圖2B所繪示。
在本發明之另一態樣中，根據任一以上實施例包含CLL-1結合域之抗-CLL-1抗體為單株抗體，包括人類抗體。在一實施例中，包含CLL-1結合域之抗-CLL-1抗體為抗體片段，例如Fv、Fab、Fab’、scFv、雙功能抗體或F(ab’)2片段。在另一實施例中，包含CLL-1結合域之抗-CLL-1抗體為實質上全長抗體，例如IgG1抗體、IgG2a抗體或如本文所定義之其他抗體類或同型。
CLL-1結合域21C9及其他實施例
在一些實施例中，本發明提供一種抗-CLL-1抗體，其包含CLL-1結合域，該CLL-1結合域包含至少一、兩個、三個、四個、五個或六個選自以下之HVR：(a)HVR-H1，其包含SEQ ID NO：21之胺基酸序列；(b)HVR-H2，其包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列；(c)HVR-H3，其包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列；(d)HVR-L1，其包含SEQ ID NO：18之胺基酸序列；(e)HVR-L2，其包含SEQ ID NO：19之胺基酸序列；及(f)HVR-L3，其包含SEQ ID NO：20之胺基酸序列。
在一態樣中，本發明提供一種抗-CLL-1抗體，其包含CLL-1結合域，該CLL-1結合域包含選自以下之至少一、至少兩個或全部三個VH HVR序列：(a)HVR-H1，其包含SEQ ID NO：21之胺基酸序列；(b)HVR-H2，其包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列；及(c)HVR-H3，其包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列。在一實施例中，CLL-1結合域包含HVR-H3，其包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列。在另一實施例中，CLL-1結合域包含HVR-H3，其包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列；及HVR-L3，其包含SEQ ID NO：20之胺基酸序列。在另一實施例中，CLL-1結合域包含HVR-H3，其包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列；HVR-L3，其包含SEQ ID NO：20之胺基酸序列；及HVR-H2，其包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列。在另一實施例中，CLL-1結合域包含(a)HVR-H1，其包含SEQ ID NO：21之胺基酸序列；(b)HVR-H2，其包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列；及(c)HVR-H3，其包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列。
在另一態樣中，本發明提供一種抗-CLL-1抗體，其包含CLL-1結合域，該CLL-1結合域包含選自以下之至少一、至少兩個或全部三個VL HVR序列：(a)HVR-L1，其包含SEQ ID NO：18之胺基酸序列；(b)HVR-L2，其包含SEQ ID NO：19之胺基酸序列；及(c)HVR-L3，其包含SEQ ID NO：20之胺基酸序列。在一實施例中，CLL-1結合域包含(a)HVR-L1，其包含SEQ ID NO：18之胺基酸序列；(b)HVR-L2，其包含SEQ ID NO：19之胺基酸序列；及(c)HVR-L3，其包含SEQ ID NO：20之胺基酸序列。
在另一態樣中，本發明之包含CLL-1結合域的抗-CLL-1抗體包含(a)VH域，其包含選自以下之至少一、至少兩個或全部三個VH HVR 序列：(i)HVR-H1，其包含SEQ ID NO：21之胺基酸序列，(ii)HVR-H2，其包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列，及(iii)HVR-H3，其包含選自SEQ ID NO：23之胺基酸序列；及(b)VL域，其包含選自以下之至少一、至少兩個或全部三個VL HVR序列：(i)HVR-L1，其包含SEQ ID NO：18之胺基酸序列，(ii)HVR-L2，其包含SEQ ID NO：19之胺基酸序列，及(c)HVR-L3，其包含SEQ ID NO：20之胺基酸序列。
在另一態樣中，本發明提供一種抗CLL-1抗體，其包含CLL-1結合域，該CLL-1結合域包含：(a)HVR-H1，其包含SEQ ID NO：21之胺基酸序列；(b)HVR-H2，其包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列；(c)HVR-H3，其包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列；(d)HVR-L1，其包含SEQ ID NO：18之胺基酸序列；(e)HVR-L2，其包含SEQ ID NO：19之胺基酸序列；及(f)HVR-L3，其包含SEQ ID NO：20之胺基酸序列。在一些實施例中，抗體包含(a)HVR-H1，其包含SEQ ID NO：21之胺基酸序列；(b)HVR-H2，其包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列；(c)HVR-H3，其包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列；(d)HVR-L1，其包含SEQ ID NO：18之胺基酸序列；(e)HVR-L2，其包含SEQ ID NO：19之胺基酸序列；及(f)HVR-L3，其包含SEQ ID NO：20之胺基酸序列。
在任一以上實施例中，包含CLL-1結合域之抗-CLL-1抗體經人類化。在一實施例中，包含CLL-1結合域之抗-CLL-1抗體包含如任何以上實施例中之HVR，且進一步包含人類接受體構架，例如人類免疫球蛋白構架或人類一致構架。在某些實施例中，人類接受體構架為人類VL κI一致(VLKI)構架及/或VH構架VH1。在某些實施例中，人類接受體構架為人類VL κI一致(VLKI)構架及/或VH構架VH1，其包含以下突變中之任一者。
在另一態樣中，包含CLL-1結合域之抗-CLL-1抗體包含與SEQ ID NO：38及/或SEQ ID NO：40之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之重鏈可變域(VH)序列。在某些實施例中，與SEQ ID NO：38及/或SEQ ID NO：40之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、 98%或99%一致性之VH序列相對於參考序列含有取代(例如保守性取代)、***或缺失，但包含彼序列之CLL-1結合域保留結合CLL-1之能力。在某些實施例中，在SEQ ID NO：38及/或SEQ ID NO：40中取代、***及/或缺失總計1至10個胺基酸。在某些實施例中，在SEQ ID NO：38及/或SEQ ID NO：40中取代、***及/或缺失總計1至5個胺基酸。在某些實施例中，取代、***或缺失發生在HVR外的區域中(亦即，FR中)。視情況地，包含CLL-1結合域之抗-CLL-1抗體包含SEQ ID NO：38及/或SEQ ID NO：40之VH序列，包括彼序列之轉譯後修飾。在一特定實施例中，VH包含一、兩個或三個選自以下之HVR：(a)HVR-H1，其包含SEQ ID NO：21之胺基酸序列；(b)HVR-H2，其包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列；及(c)HVR-H3，其包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列。
在另一態樣中，提供一種包含CLL-1結合域之抗-CLL-1抗體，其中該抗體包含與SEQ ID NO：37及/或SEQ ID NO：39之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之輕鏈可變域(VL)。在某些實施例中，與SEQ ID NO：37及/或SEQ ID NO：39之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性之VL序列相對於參考序列含有取代(例如保守性取代)、***或缺失，但包含彼序列之CLL-1結合域保留結合CLL-1之能力。在某些實施例中，在SEQ ID NO：37及/或SEQ ID NO：39中取代、***及/或缺失總計1至10個胺基酸。在某些實施例中，在SEQ ID NO：37及/或SEQ ID NO：39中取代、***及/或缺失總計1至5個胺基酸。在某些實施例中，取代、***或缺失發生在HVR外的區域中(亦即，FR中)。視情況地，包含CLL-1結合域之抗-CLL-1抗體包含SEQ ID NO：37及/或SEQ ID NO：39之VL序列，包括彼序列之轉譯後修飾。在一特定實施例中，VL包含一、兩個或三個選自以下之HVR：(a)HVR-L1，其包含SEQ ID NO：18之胺基酸序列；(b)HVR-L2，其包含SEQ ID NO：19之胺基酸序列；及(c)HVR-L3，其包含SEQ ID NO：20之胺基酸序列。
在另一態樣中，提供一種包含CLL-1結合域之抗-CLL-1抗體，其中該抗體包含如任何以上所提供實施例中之VH及如任何以上所提 供實施例中之VL。
在一實施例中，包含CLL-1結合域之抗-CLL-1抗體包含分別在SEQ ID NO：38及SEQ ID NO：37中之VH及VL序列，包括彼等序列之轉譯後修飾。在一實施例中，抗體包含分別在SEQ ID NO：40及SEQ ID NO：39中之VH及VL序列，包括彼等序列之轉譯後修飾。
在另一態樣中，本文提供包含CLL-1結合域、與本文提供之抗-CLL-1抗體結合相同抗原決定基之抗-CLL-1抗體。例如，在某些實施例中，提供與包含CLL-1結合域之抗-CLL-1抗體結合相同抗原決定基之抗體，該CLL-1結合域分別包含SEQ ID NO：38及/或SEQ ID NO：40之VH序列及SEQ ID NO：37及/或SEQ ID NO：39之VL序列。
本文提供抗-CLL-1抗體，其包含CLL-1結合域，該CLL-1結合域包含如圖3A所繪示、根據Kabat編號包含HVR1-LC、HVR2-LC及HVR3-LC序列之輕鏈可變域，及如圖3B所繪示、根據Kabat編號包含HVR1-HC,HVR2-HC及HVR3-HC序列之重鏈可變域。在一些實施例中，包含CLL-1結合域之抗-CLL-1抗體包含輕鏈可變域，該輕鏈可變域包含HVR1-LC、HVR2-LC及/或HVR3-LC序列，及FR1-LC、FR2-LC、FR3-LC及/或FR4-LC序列，如圖3A所繪示。在一些實施例中，包含CLL-1結合域之抗-CLL-1抗體包含重鏈可變域，該重鏈可變域包含HVR1-HC、HVR2-HC及/或HVR3-HC序列及FR1-HC、FR2-HC、FR3-HC及/或FR4-HC序列，如圖3B所繪示。
在本發明之另一態樣中，根據任一以上實施例包含CLL-1結合域之抗-CLL-1抗體為單株抗體，包括人類抗體。在一實施例中，包含CLL-1結合域之抗-CLL-1抗體為抗體片段，例如Fv、Fab、Fab’、scFv、雙功能抗體或F(ab’)2片段。在另一實施例中，抗體為實質上全長抗體，例如IgG1抗體、IgG2a抗體或如本文所定義之其他抗體類或同型。
b)抗-CLL1抗體之CD3結合域
在一些實施例中，抗-CLL-1抗體之CD3結合域結合人類CD3多肽或獼猴(cyno)CD3多肽。在一些實施例中，人類CD3多肽或cyno CD3多肽分別為人類CD3ε多肽或cyno CD3ε多肽。在一些實施例中，人 類CD3多肽或cyno CD3多肽分別為人類CD3γ多肽或cyno CD3γ多肽。在某些實施例中，提供包含CD3結合域之抗-CLL-1抗體，該CD3結合域結合CD3(例如人類CD3ε)片段內之由人類CD3ε之胺基酸1-26或1-27組成的抗原決定基。在一些實施例中，抗-CLL-1抗體為雙特異性抗體。在一些實施例中，抗-CLL-1抗體為雙特異性IgG抗體。
在一些實施例中，CD3結合域結合人類CD3ε多肽，其Kd為250nM或更低。在一些實施例中，CD3結合域結合人類CD3ε多肽，其Kd為100nM或更低。在一些實施例中，CD3結合域結合人類CD3ε多肽，其Kd為15nM或更低。在一些實施例中，CD3結合域結合人類CD3ε多肽，其Kd為10nM或更低。在一些實施例中，CD3結合域結合人類CD3ε多肽，其Kd為5nM或更低。在一些實施例中，抗-CLL1抗體之CD3結合臂結合人類CD3，其親和力小於50nM且大於1nM。在一些實施例中，抗-CLL1抗體之CD3結合臂結合人類CD3，其親和力小於1nM且大於0.1nM。在一些實施例中，抗-CLL1抗體之CD3結合臂結合人類CD3，其親和力小於0.1nM且大於0.01nM。在一些實施例中，藉由Biacore測定CD3結合臂之親和力。在一些實施例中，人類CD3為hCD3 ε γ。在一些實施例中，人類CD3為hCD3 ε 1-27 Fc。
在一些實施例中，抗-CLL-1抗體之CD3結合域以3.5埃、3.25埃、3.00埃、2.75埃或以下之距離結合與人類CD3 ε之胺基酸之觸點。在某些實施例中，提供CD3結合域，其以3.5埃、3.25埃、3.00埃、2.75埃或以下之距離結合由人類CD3 ε之一、兩個、三個、四個或五個胺基酸組成的抗原決定基。在一實施例中，抗-CLL-1抗體之CD3結合域以3.5埃或以下之距離與人類CD3 ε之胺基酸獨特接觸。在某些實施例中，提供CD3結合域，其以3.5埃或以下之距離結合由人類CD3 ε之一、兩個、三個、四個或五個胺基酸組成的抗原決定基。例如，在某些實施例中，提供CD3結合域，其結合由人類CD3 ε之選自Gln1、Asp2、Asn4、Glu6及Met7的胺基酸組成之抗原決定基。在一特定實施例中，CD3結合域結合具體而言包括Glu6之抗原決定基。在某些其他實施例中，提供不結合包括人類CD3 ε胺基酸Glu5之抗原決定基的CD3結合域。在某些其他實施例中，提供不結 合包括人類CD3 ε胺基酸Gly3及Glu5之抗原決定基的CD3結合域。
可藉由結合抗原決定基之肽片段之CD3結合域確定CD3抗原決定基。或者，可藉由丙胺酸掃描誘變確定CD3抗原決定基。在一實施例中，CD3結合域與突變CD3之結合降低20%、30%、50%、80%或更大指示在丙胺酸掃描誘變分析中突變之CD3的胺基酸殘基為彼CD3結合域之抗原決定基殘基。或者，可藉由質譜法確定CD3抗原決定基。在一些實施例中，藉由結晶學(例如結晶學方法)確定抗原決定基。
在一些實施例中，使用CD3之胺基酸Q1-M7確定如藉由結晶學確定之CD3抗原決定基。在一些實施例中，使用CD3之胺基酸QDGNEEMGGITQTPYK(SEQ ID NO：94)確定如藉由結晶學確定之CD3抗原決定基。
在一些實施例中，可藉由組合以10mg/ml溶解於0.15M NaCl、25mM tris，pH 7.5中之抗-CD3抗體Fab與2倍莫耳過量(1mg)之CD3 ε肽，且以直滴蒸氣擴散形式形式初始篩檢沉澱物之稀疏基質，進行如藉由結晶學確定之CD3抗原決定基。經優化之晶體可自含有70 v/v%甲基戊二醇之貯備液與0.1M HEPES緩衝劑pH 7.5之1：1混合物生長。貯備液可用作防凍劑。可藉由突然浸入液氮中而將晶體轉移至低溫下。
可使用MAR300 CCD偵測器，在Advanced Photon Source束線22ID收集晶體之繞射資料。可使用程式HKL2000對所記錄之繞射進行積分及定標。
可藉由分子置換(MR)法使用程式相位器對結構進行相位調整。例如，MR檢索模型為源自HGFA/Fab(PDB代碼：2R0L)複合物之晶體結構的Fab亞基。CD3ε肽經基於Fo-Fc圖構築成該結構。該結構可隨後使用最大似然目標函數、各向異性個體B因子細化法及TLS細化法用程式REFMAC5及PHENIX進行細化，以達成收斂。
在任一抗-CLL1抗體之一些實施例中，CD3結合域包含高變區(HVR)：(a)HVR-H1，其包含SEQ ID NO：88之胺基酸序列；(b)HVR-H2，其包含SEQ ID NO：89之胺基酸序列；(c)HVR-H3，其包含SEQ ID NO：90之胺基酸序列；(d)HVR-L1，其包含SEQ ID NO：74之胺基酸序 列；(e)HVR-L2，其包含SEQ ID NO：91之胺基酸序列；及(f)HVR-L3，其包含SEQ ID NO：92之胺基酸序列。在一些實施例中，CD3結合域包含(a)VH域，其包含(i)HVR-H1，其包含SEQ ID NO：88之胺基酸序列，(ii)HVR-H2，其包含SEQ ID NO：89之胺基酸序列及(iii)HVR-H3，其包含選自SEQ ID NO：90之胺基酸序列；及(b)VL域，其包含(i)HVR-L1，其包含SEQ ID NO：74之胺基酸序列，(ii)HVR-L2，其包含SEQ ID NO：91之胺基酸序列及(iii)HVR-L3，其包含SEQ ID NO：92之胺基酸序列。
例如，在任一抗-CLL1抗體之一些實施例中，抗-CLL1抗體包含(i)CLL-1結合域，其包含以下6個HVR：(a)HVR-H1，其包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列；(b)HVR-H2，其包含SEQ ID NO：11之胺基酸序列；(c)HVR-H3，其包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列；(d)HVR-L1，其包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列；(e)HVR-L2，其包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列；及(f)HVR-L3，其包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列；及(ii)CD3結合域，該CD3結合域包含以下6個HVR：(a)HVR-H1，其包含SEQ ID NO：88之胺基酸序列；(b)HVR-H2，其包含SEQ ID NO：89之胺基酸序列；(c)HVR-H3，其包含SEQ ID NO：90之胺基酸序列；(d)HVR-L1，其包含SEQ ID NO：74之胺基酸序列；(e)HVR-L2，其包含SEQ ID NO：91之胺基酸序列；及(f)HVR-L3，其包含SEQ ID NO：92之胺基酸序列。在一些實施例中，抗-CLL-1抗體包含CLL-1結合域，其包含包含SEQ ID NO：34之序列的重鏈可變區及包含SEQ ID NO：32之序列的輕鏈可變區。
在任一抗-CLL1抗體之一些實施例中，CD3結合域包含高變區(HVR)：(a)HVR-H1，其包含SEQ ID NO：71之胺基酸序列；(b)HVR-H2，其包含SEQ ID NO：72之胺基酸序列；(c)HVR-H3，其包含SEQ ID NO：73之胺基酸序列；(d)HVR-L1，其包含SEQ ID NO：74之胺基酸序列；(e)HVR-L2，其包含SEQ ID NO：75之胺基酸序列；及(f)HVR-L3，其包含SEQ ID NO：76之胺基酸序列。在一些實施例中，CD3結合域包含(a)VH域，其包含(i)HVR-H1，其包含SEQ ID NO：71之胺基酸序列，(ii)HVR-H2，其包含SEQ ID NO：72之胺基酸序列及(iii)HVR-H3，其包含選自SEQ ID NO：73之胺基酸序列；及(b)VL域，其包含(i)HVR-L1，其包含SEQ ID NO：74 之胺基酸序列，(ii)HVR-L2，其包含SEQ ID NO：75之胺基酸序列及(iii)HVR-L3，其包含SEQ ID NO：76之胺基酸序列。在一些情況下，CD3結合域可具有重鏈可變(VH)域，該域包括與SEQ ID NO：82或其序列具有至少90%序列一致性(例如至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性)之胺基酸序列，及/或輕鏈可變(VL)域，該域包含與SEQ ID NO：83或其序列具有至少90%序列一致性(例如至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性)之胺基酸序列。在一些情況下，CD3結合域可具有包含SEQ ID NO：82之胺基酸序列的VH域，及包含SEQ ID NO：83之胺基酸序列的VL域。在特定情況下，CD3結合域可為40G5c或其衍生物或純系親緣物(relative)。
例如，本文提供抗-CLL1抗體，其包含(i)CLL-1結合域，該CLL-1結合域包含以下6個HVR：(a)HVR-H1，其包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列；(b)HVR-H2，其包含SEQ ID NO：11之胺基酸序列；(c)HVR-H3，其包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列；(d)HVR-L1，其包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列；(e)HVR-L2，其包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列；及(f)HVR-L3，其包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列；及(ii)CD3結合域，該CD3結合域包含(a)HVR-H1，其包含SEQ ID NO：71之胺基酸序列；(b)HVR-H2，其包含SEQ ID NO：72之胺基酸序列；(c)HVR-H3，其包含SEQ ID NO：73之胺基酸序列；(d)HVR-L1，其包含SEQ ID NO：74之胺基酸序列；(e)HVR-L2，其包含SEQ ID NO：75之胺基酸序列；及(f)HVR-L3，其包含SEQ ID NO：76之胺基酸序列。在一些實施例中，抗-CLL-1抗體包含(i)CLL-1結合域，該CLL-1結合域包含包含SEQ ID NO：34之序列的重鏈可變區，及包含SEQ ID NO：32之序列的輕鏈可變區；及(ii)CD3結合域，該CD3結合域包含包含SEQ ID NO：82之序列的重鏈可變區，及包含SEQ ID NO：83之序列的輕鏈可變區。
在任一抗-CLL1抗體之一些實施例中，CD3結合域包含：(a)HVR-H1，其包含SEQ ID NO：77之胺基酸序列；(b)HVR-H2，其包含SEQ ID NO：78之胺基酸序列；(c)HVR-H3，其包含SEQ ID NO：79之胺基酸序列；(d)HVR-L1，其包含SEQ ID NO：74之胺基酸序列；(e)HVR-L2，其包 含SEQ ID NO：80之胺基酸序列；及(f)HVR-L3，其包含SEQ ID NO：92之胺基酸序列。在一些實施例中，CD3結合域包含(a)VH域，其包含(i)HVR-H1，其包含SEQ ID NO：77之胺基酸序列，(ii)HVR-H2，其包含SEQ ID NO：78之胺基酸序列及(iii)HVR-H3，其包含選自SEQ ID NO：79之胺基酸序列；及(b)VL域，其包含(i)HVR-L1，其包含SEQ ID NO：74之胺基酸序列，(ii)HVR-L2，其包含SEQ ID NO：80之胺基酸序列及(iii)HVR-L3，其包含SEQ ID NO：92之胺基酸序列。
例如，本文提供抗-CLL1抗體，其包含(i)CLL-1結合域，該CLL-1結合域包含以下6個HVR：(a)HVR-H1，其包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列；(b)HVR-H2，其包含SEQ ID NO：11之胺基酸序列；(c)HVR-H3，其包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列；(d)HVR-L1，其包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列；(e)HVR-L2，其包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列；及(f)HVR-L3，其包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列；及(ii)CD3結合域，該CD3結合域包含(a)HVR-H1，其包含SEQ ID NO：77之胺基酸序列；(b)HVR-H2，其包含SEQ ID NO：78之胺基酸序列；(c)HVR-H3，其包含SEQ ID NO：79之胺基酸序列；(d)HVR-L1，其包含SEQ ID NO：74之胺基酸序列；(e)HVR-L2，其包含SEQ ID NO：80之胺基酸序列；及(f)HVR-L3，其包含SEQ ID NO：92之胺基酸序列。在一些實施例中，抗-CLL-1抗體包含CLL-1結合域，其包含包含SEQ ID NO：34之序列的重鏈可變區及包含SEQ ID NO：32之序列的輕鏈可變區。
在任一抗-CLL1抗體之一些實施例中，CD3結合域包含：(a)HVR-H1，其包含SEQ ID NO：77之胺基酸序列；(b)HVR-H2，其包含SEQ ID NO：78之胺基酸序列；(c)HVR-H3，其包含SEQ ID NO：79之胺基酸序列；(d)HVR-L1，其包含SEQ ID NO：74之胺基酸序列；(e)HVR-L2，其包含SEQ ID NO：80之胺基酸序列；及(f)HVR-L3，其包含SEQ ID NO：81之胺基酸序列。在一些實施例中，CD3結合域包含(a)VH域，其包含(i)HVR-H1，其包含SEQ ID NO：77之胺基酸序列，(ii)HVR-H2，其包含SEQ ID NO：78之胺基酸序列及(iii)HVR-H3，其包含選自SEQ ID NO：79之胺基酸序列；及(b)VL域，其包含(i)HVR-L1，其包含SEQ ID NO：74之胺基酸 序列，(ii)HVR-L2，其包含SEQ ID NO：80之胺基酸序列及(iii)HVR-L3，其包含SEQ ID NO：81之胺基酸序列。在一些情況下，CD3結合域可具有VH域，該域包含與SEQ ID NO：84或其序列具有至少90%序列一致性(例如至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性)之胺基酸序列，及/或VL域，該域包含與SEQ ID NO：85或其序列具有至少90%序列一致性(例如至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性)之胺基酸序列。在一些情況下，CD3結合域可具有包含SEQ ID NO：84之胺基酸序列的VH域，及包含SEQ ID NO：85之胺基酸序列的VL域。在特定情況下，CD3結合域可為38E4v1或其衍生物或純系親緣物。
例如，本文提供抗-CLL1抗體，其包含(i)CLL-1結合域，該CLL-1結合域包含以下6個HVR：(a)HVR-H1，其包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列；(b)HVR-H2，其包含SEQ ID NO：11之胺基酸序列；(c)HVR-H3，其包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列；(d)HVR-L1，其包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列；(e)HVR-L2，其包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列；及(f)HVR-L3，其包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列；及(ii)CD3結合域，該CD3結合域包含(a)HVR-H1，其包含SEQ ID NO：77之胺基酸序列；(b)HVR-H2，其包含SEQ ID NO：78之胺基酸序列；(c)HVR-H3，其包含SEQ ID NO：79之胺基酸序列；(d)HVR-L1，其包含SEQ ID NO：74之胺基酸序列；(e)HVR-L2，其包含SEQ ID NO：80之胺基酸序列；及(f)HVR-L3，其包含SEQ ID NO：81之胺基酸序列。在一些實施例中，抗-CLL-1抗體包含(i)CLL-1結合域，該CLL-1結合域包含包含SEQ ID NO：34之序列的重鏈可變區，及包含SEQ ID NO：32之序列的輕鏈可變區；及(ii)CD3結合域，該CD3結合域包含包含SEQ ID NO：84之序列的重鏈可變區，及包含SEQ ID NO：85之序列的輕鏈可變區。
在任一抗-CLL1抗體之一些實施例中，CD3結合域包含：(a)HVR-H1，其包含SEQ ID NO：77之胺基酸序列；(b)HVR-H2，其包含SEQ ID NO：78之胺基酸序列；(c)HVR-H3，其包含SEQ ID NO：79之胺基酸序列；(d)HVR-L1，其包含SEQ ID NO：74之胺基酸序列；(e)HVR-L2，其包 含SEQ ID NO：80之胺基酸序列；及(f)HVR-L3，其包含SEQ ID NO：76之胺基酸序列。在一些實施例中，CD3結合域包含(a)VH域，其包含(i)HVR-H1，其包含SEQ ID NO：77之胺基酸序列，(ii)HVR-H2，其包含SEQ ID NO：78之胺基酸序列及(iii)HVR-H3，其包含選自SEQ ID NO：79之胺基酸序列；及(b)VL域，其包含(i)HVR-L1，其包含SEQ ID NO：74之胺基酸序列，(ii)HVR-L2，其包含SEQ ID NO：80之胺基酸序列及(iii)HVR-L3，其包含SEQ ID NO：76之胺基酸序列。在一些情況下，CD3結合域可具有VH域，該域包含與SEQ ID NO：84或其序列具有至少90%序列一致性(例如至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性)之胺基酸序列，及/或VL域，該域包含與SEQ ID NO：93或其序列具有至少90%序列一致性(例如至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性)之胺基酸序列。在一些情況下，CD3結合域可具有包含SEQ ID NO：84之胺基酸序列的VH域，及包含SEQ ID NO：93之胺基酸序列的VL域。在特定情況下，CD3結合域可為38E4v11或其衍生物或純系親緣物。
例如，本文提供抗-CLL1抗體，其包含(i)CLL-1結合域，該CLL-1結合域包含以下6個HVR：(a)HVR-H1，其包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列；(b)HVR-H2，其包含SEQ ID NO：11之胺基酸序列；(c)HVR-H3，其包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列；(d)HVR-L1，其包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列；(e)HVR-L2，其包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列；及(f)HVR-L3，其包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列；及(ii)CD3結合域，該CD3結合域包含(a)HVR-H1，其包含SEQ ID NO：77之胺基酸序列；(b)HVR-H2，其包含SEQ ID NO：78之胺基酸序列；(c)HVR-H3，其包含SEQ ID NO：79之胺基酸序列；(d)HVR-L1，其包含SEQ ID NO：74之胺基酸序列；(e)HVR-L2，其包含SEQ ID NO：80之胺基酸序列；及(f)HVR-L3，其包含SEQ ID NO：76之胺基酸序列。在一些實施例中，抗-CLL-1抗體包含(i)CLL-1結合域，該CLL-1結合域包含包含SEQ ID NO：34之序列的重鏈可變區，及包含SEQ ID NO：32之序列的輕鏈可變區；及(ii)CD3結合域，該CD3結合域包含包含SEQ ID NO：84之序列的重鏈可變區，及包含SEQ ID NO：93 之序列的輕鏈可變區。
在一些實施例中，抗-CLL1抗體之CD3結合臂為嵌合抗鼠類CD3結合臂。在一些實施例中，嵌合抗鼠類CD3結合臂為2C11(Leo等人Proc Natl Acad Sci USA.84：1374-1378,1987)。在一些實施例中，抗-CLL1抗體之CD3結合臂為小鼠抗-人類CD3結合臂。在一些實施例中，小鼠抗-人類CD3結合臂為SP34(Pessano等人The EMBO Journal.4：337-344,1985)。在一些實施例中，抗-CLL1抗體之CD3結合臂為OKT3。(Fernandes,R.A.等人2012.J.Biol.Chem.287：13324-13335)。在一些實施例中，抗-CLL1抗體之CD3結合臂為UCHT1(同前)。在一些實施例中，抗-CLL1抗體之CD3結合臂為莫羅單抗(Muromonab)-CD3(CAS寄存編號：140608-64-6)。在一些實施例中，抗-CLL1抗體之CD3結合臂描述於美國專利申請公開案2010/0150918中。
c)多特異性抗-CLL1抗體
在某些實施例中，本文提供之抗-CLL-1抗體為多特異性抗體，例如雙特異性抗體。多特異性抗體為對至少兩個不同位點具有結合特異性之單株抗體。在某些實施例中，一結合特異性係針對CLL-1且另一係針對任何其他抗原。在某些實施例中，雙特異性抗體可結合CLL-1之兩個不同抗原決定基。雙特異性抗體亦可用於使細胞毒性劑定位於表現CLL-1之細胞。雙特異性抗體可製備成全長抗體或抗體片段。
製備多特異性抗體之技術包括(但不限於)重組共表現具有不同特異性之兩對免疫球蛋白重鏈-輕鏈(參見Milstein及Cuello,Nature 305：537(1983))；WO 93/08829；及Traunecker等人,EMBO J.10：3655(1991))及「孔中鈕(knob-in-hole)」工程改造(參見例如美國專利第5,731,168號)。多特異性抗體亦可藉由以下進行製備：工程改造靜電操控效應以製備抗體Fc-雜二聚分子(WO 2009/089004A1)；交聯兩個或更多個抗體或片段(參見例如美國專利第4,676,980號及Brennan等人,Science,229：81(1985))；使用白胺酸拉鍊來產生雙特異性抗體(參見例如Kostelny等人,J.Immunol.,148(5)：1547-1553(1992))；使用「雙功能抗體」技術以製備雙特異性抗體片段(參見例如Hollinger等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90：6444-6448(1993))； 及使用單鏈Fv(sFv)二聚體(參見例如Gruber等人,J.Immunol.,152：5368(1994))；及製備三特異性抗體，如例如Tutt等人J.Immunol.147：60(1991)中所述。多特異性抗體亦可使用免疫球蛋白交換(亦稱為Fab域交換或CrossMab形式)技術(參見例如WO2013026833、WO2009/080253；Schaefer等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,108：11187-11192(2011))進行工程改造。
經工程改造具有三個或三個以上抗原結合位點之抗體，包括「章魚抗體」亦包括在本文中(參見例如US 2006/0025576A1、WO2013026833及WO2012073985)。
本文之抗-CLL-1抗體或片段亦包括「雙重作用性FAb」或「DAF」，其包含結合CLL-1以及另一不同抗原之抗原結合位點(參見例如US 2008/0069820)。
在另一態樣中，根據任一以上實施例之CLL-1結合域、CD3結合域及/或CLL-1抗體可單一或組合併入如以下1-6部分中所述之任何特徵。
1.抗體親和力
在某些實施例中，本文提供之抗體的解離常數(Kd)1μM、100nM、50nM、10nM、5nM、1nM、0.1nM、0.01nM或0.001nM，且視情況10-13M(例如10-8M或以下，例如10-8M至10-13M，例如10-9M至10-13M)。
在一實施例中，Kd係藉由用相關抗體之Fab型式及其抗原進行放射性標記抗原結合分析(RIA)來量測，如以下分析所述。Fab對抗原之溶液結合親和力係藉由在一滴定系列之未標記抗原存在下，使Fab與最小濃度之(125I)標記抗原平衡，接著用抗Fab抗體塗佈之板捕捉所結合抗原來量測(參見例如Chen等人,J.Mol.Biol.293：865-881(1999))。為建立分析條件，將MICROTITER®多孔板(Thermo Scientific)用含5μg/ml捕捉抗Fab抗體(Cappel Labs)之50mM碳酸鈉(pH 9.6)塗佈隔夜，且隨後在室溫(約23℃)下用含2%(w/v)牛血清白蛋白之PBS阻斷2-5小時。在非吸附板(Nunc #269620)中，將100pM或26pM[125I]-抗原與相關Fab之連續稀釋液混合(例如與Presta等人,Cancer Res.57：4593-4599(1997)中對抗VEGF抗體Fab-12 之評定一致)。接著將相關Fab培育隔夜；然而，培育可持續較長時期(例如約65小時)以確保達到平衡。此後，將混合物轉移至捕捉板中以在室溫下培育(例如1小時)。接著移除溶液且用含0.1%聚山梨醇酯20(TWEEN-20®)之PBS將板洗滌八次。當板已乾燥時，每孔添加150μl閃爍體(MICROSCINT-20TM；Packard)，且在TOPCOUNTTM γ計數器(Packard)上對板持續10分鐘計數。選擇各Fab之達成小於或等於最大結合之20%的濃度以用於競爭性結合分析中。
根據另一實施例，使用BIACORE®-2000、BIACORE®-T200或BIACORE®-3000(BIAcore公司,Piscataway,NJ)，用固定之抗原CM5晶片在約10反應單位(RU)下在25℃下使用表面電漿子共振分析來量測Kd。簡言之，根據供應商說明書用N-乙基-N’-(3-二甲基胺基丙基)-碳化二亞胺鹽酸鹽(EDC)及N-羥基丁二醯亞胺(NHS)活化羧甲基化葡聚糖生物感測器晶片(CM5，BIACORE公司)。在注射前，以5μl/分鐘及/或30μl/分鐘之流速用10mM乙酸鈉pH 4.8稀釋抗原至5μg/ml(約0.2μM)及/或用HBS-P(0.01M Hepes pH7.4，0.15M NaCl，0.005%介面活性劑P20)稀釋，以取得大約10反應單位(RU)之偶聯蛋白。在注射抗原之後，注射1M乙醇胺以阻斷未反應基團。對於動力學量測，在25℃下以大約25μl/min之流速，注射Fab在含0.05%聚山梨醇酯20(TWEEN-20TM)介面活性劑(PBST)之PBS中之2倍連續稀釋液(0.78nM至500nM)。藉由同時擬合締合及解離感測圖(sensorgram)，使用簡單一對一朗繆爾結合模型(BIACORE®評估軟體3.2版)計算締合速率(kon)及解離速率(koff)。平衡解離常數(Kd)計算為比率koff/kon。參見例如Chen等人,J.Mol.Biol.293：865-881(1999)。若由以上表面電漿子共振分析獲得之締合速率超過106M-1 s-1，則可藉由使用螢光淬滅技術來測定締合速率，該技術量測在如在分光計(諸如停流配備分光光度計(Aviv Instruments)或具有攪拌比色皿之8000系列SLM-AMINCOTM分光光度計(ThermoSpectronic))中量測之遞增濃度之抗原存在下，在25℃下於PBS(pH 7.2)中之20nM抗抗原抗體(Fab形式)之螢光發射強度(激發=295nm；發射=340nm，16nm帶通)的增加或降低。
2.抗體片段
在某些實施例中，本文提供之抗體為抗體片段。抗體片段包括但不限於Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)2、Fv及scFv片段及下述其他片段。對於某些抗體片段之評述，參見Hudson等人.Nat.Med.9：129-134(2003)。對於scFv片段之評述，參見例如Pluckthün,於The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,第113卷,Rosenburg and Moore編,(Springer-Verlag,New York),第269-315頁(1994)；亦參見WO 93/16185；及美國專利第5,571,894號及第5,587,458號。對於包含結合抗原決定基殘基之補救受體且活體內半衰期增加之Fab及F(ab')2片段之論述，參見美國專利第5,869,046號。
雙功能抗體為可為二價或雙特異性之具有兩個抗原結合位點之抗體片段。參見例如EP 404,097；WO 1993/01161；Hudson等人,Nat.Med.9：129-134(2003)；及Hollinger等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448(1993)。三功能抗體及四功能抗體亦描述於Hudson等人,Nat.Med.9：129-134(2003)中。
單域抗體為包含抗體之全部或一部分重鏈可變域或全部或一部分輕鏈可變域之抗體片段。在某些實施例中，單域抗體為人類單域抗體(Domantis公司,Waltham,MA；參見例如美國專利第6,248,516號)。
抗體片段可藉由各種技術製備，包括但不限於蛋白水解消化完整抗體以及如本文所述，藉由重組宿主細胞(例如大腸桿菌(E.coli)或噬菌體)產生。
3.嵌合及人類化抗體
在某些實施例中，本文提供之抗體為嵌合抗體。某些嵌合抗體例如描述於美國專利第4,816,567號；及Morrison等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81：6851-6855(1984))中。在一實例中，嵌合抗體包含非人類可變區(例如源於小鼠、大鼠、倉鼠、兔或非人類靈長類動物(諸如猴)之可變區)及人類恆定區。在另一實例中，嵌合抗體為「類別轉換」抗體，其中類別或子類已自親本抗體之類別或子類發生改變。嵌合抗體包括其抗原結合片段。
在某些實施例中，嵌合抗體為人類化抗體。通常，非人類抗 體經人類化以降低對人類之免疫原性，同時保留親本非人類抗體之特異性及親和力。一般而言，人類化抗體包含一或多個可變域，其中例如CDR之HVR(或其部分)源於非人類抗體，且FR(或其部分)源於人類抗體序列。人類化抗體視情況亦將包含至少一部分人類恆定區。在一些實施例中，人類化抗體中之一些FR殘基經來自非人類抗體(例如HVR殘基所來源之抗體)之相應殘基取代，例如以恢復或改良抗體特異性或親和力。
人類化抗體及其製備方法評述於例如Almagro及Fransson,Front.Biosci.13：1619-1633(2008)中，且進一步描述於例如Riechmann等人,Nature 332：323-329(1988)；Queen等人,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 86：10029-10033(1989)；美國專利第5,821,337號、第7,527,791號、第6,982,321號及第7,087,409號；Kashmiri等人,Methods 36：25-34(2005)(描述特異性決定區(SDR)移植)；Padlan,Mol.Immunol.28：489-498(1991)(描述「表面重整」)；Dall’Acqua等人,Methods 36：43-60(2005)(描述「FR改組」)；及Osbourn等人,Methods 36：61-68(2005)及Klimka等人,Br.J.Cancer,83：252-260(2000)(描述FR改組之「引導選擇」法)中。
可用於人類化之人類構架區包括但不限於：使用「最佳擬合」方法選擇之構架區(參見例如Sims等人.J.Immunol.151：2296(1993))；源於輕鏈或重鏈可變區之特定子組之人類抗體的一致序列之構架區(參見例如Carter等人.Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89：4285(1992)；及Presta等人.J.Immunol.,151：2623(1993))；人類成熟(體細胞突變)構架區或人類生殖系構架區(參見例如Almagro及Fransson,Front.Biosci.13：1619-1633(2008))；及由篩檢FR文庫獲得之構架區(參見例如Baca等人,J.Biol.Chem.272：10678-10684(1997)及Rosok等人,J.Biol.Chem.271：22611-22618(1996))。
4.人類抗體
在某些實施例中，本文提供之抗體為人類抗體。人類抗體可使用此項技術中已知之各種技術產生。人類抗體一般性地描述於van Dijk及van de Winkel,Curr.Opin.Pharmacol.5：368-74(2001)及Lonberg,Curr.Opin.Immunol.20：450-459(2008)中。
人類抗體可藉由向已經修改以回應於抗原攻擊而產生完整 人類抗體或具有人類可變區之完整抗體之轉殖基因動物投與免疫原來製備。此等動物通常含有全部或一部分人類免疫球蛋白基因座，其置換內源性免疫球蛋白基因座或存在於染色體外或隨機整合至動物之染色體中。在此等轉殖基因小鼠中，內源性免疫球蛋白基因座通常已不活化。對於自轉殖基因動物獲得人類抗體之方法之評述，參見Lonberg,Nat.Biotech.23：1117-1125(2005)。亦參見例如描述XENOMOUSETM技術之美國專利第6,075,181號及第6,150,584號；描述HuMab®技術之美國專利第5,770,429號；描述K-M MOUSE®技術之美國專利第7,041,870號，及描述VELOCIMOUSE®技術之美國專利申請公開案第US 2007/0061900號)。來自由此等動物產生之完整抗體之人類可變區可例如藉由與不同人類恆定區組合而進一步修飾。
人類抗體亦可藉由基於融合瘤之方法製備。用於產生人類單株抗體之人類骨髓瘤及小鼠-人類異源骨髓瘤細胞株已有描述。(參見例如Kozbor J.Immunol.,133：3001(1984)；Brodeur等人,Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,pp.51-63(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987)；及Boerner等人,J.Immunol.,147：86(1991))。經由人類B細胞融合瘤技術產生之人類抗體亦描述於Li等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,103：3557-3562(2006)中。其他方法包括例如描述於美國專利第7,189,826號(描述自融合瘤細胞株產生單株人類IgM抗體)及Ni,Xiandai Mianyixue,26(4)：265-268(2006)(描述人類-人類融合瘤)中之方法。人類融合瘤技術(三源融合瘤技術)亦描述於Vollmers及Brandlein,Histology and Histopathology,20(3)：927-937(2005)及Vollmers及Brandlein,Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology,27(3)：185-91(2005)中。
人類抗體亦可藉由分離自人類來源噬菌體呈現文庫選擇之Fv純系可變域序列來產生。此等可變域序列可接著與所要人類恆定域組合。用於自抗體文庫選擇人類抗體之技術在以下描述。
5.文庫來源之抗體
本發明之抗體可藉由篩檢組合文庫中具有一或多種所要活性之抗體來分離。舉例而言，此項技術中已知多種用於產生噬菌體呈現文 庫及篩檢此等文庫中具有所要結合特徵之抗體之方法。此等方法評述於例如Hoogenboom等人,Methods in Molecular Biology 178：1-37(O’Brien等人編,Human Press,Totowa,NJ,2001)中，且進一步描述於例如McCafferty等人,Nature 348：552-554；Clackson等人,Nature 352：624-628(1991)；Marks等人,J.Mol.Biol.222：581-597(1992)；Marks及Bradbuty,Methods in Molecular Biology 248：161-175(Lo編,Human Press,Totowa,NJ,2003)；Sidhu等人,J.Mol.Biol.338(2)：299-310(2004)；Lee等人,J.Mol.Biol.340(5)：1073-1093(2004)；Fellouse,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(34)：12467-12472(2004)；及Lee等人,J.Immunol.Methods 284(1-2)：119-132(2004)中。
在某些噬菌體呈現方法中，藉由聚合酶鏈反應(PCR)分別選殖VH及VL基因之譜系且隨機重組於噬菌體文庫中，可接著篩檢該等文庫中之抗原結合噬菌體，如Winter等人,Ann.Rev.Immunol.,12：433-455(1994)中所述。噬菌體通常呈現呈單鏈Fv(scFv)片段形式或呈Fab片段形式之抗體片段。來自經免疫來源之文庫提供對免疫原具有高親和力之抗體而無需構築融合瘤。或者，可選殖(例如自人類選殖)天然譜系以提供單一來源之針對廣泛範圍之非自體抗原以及自體抗原的抗體而不進行任何免疫，如Griffiths等人,EMBO J,12：725-734(1993)中所述。最後，天然文庫亦可藉由以下方式合成製備：自幹細胞選殖未重排V基因區段，及使用含有隨機序列之PCR引子以編碼高度可變CDR3區及在活體外達成重排，如Hoogenboom及Winter,J.Mol.Biol.,227：381-388(1992)中所述。描述人類抗體噬菌體文庫之專利公開案包括例如美國專利第5,750,373號，及美國專利公開案第2005/0079574號、第2005/0119455號、第2005/0266000號、第2007/0117126號、第2007/0160598號、第2007/0237764號、第2007/0292936號及第2009/0002360號。
自人類抗體文庫分離之抗體或抗體片段在本文中被視為人類抗體或人類抗體片段。
6.抗體變異體
在某些實施例中，涵蓋本文提供之抗體之胺基酸序列變異體。舉例而言，可能需要改良抗體之結合親和力及/或其他生物性質。抗體 之胺基酸序列變異體可藉由將適當修飾引入編碼抗體之核苷酸序列中或藉由肽合成來製備。此等修飾包括例如抗體之胺基酸序列內之殘基的缺失及/或***及/或取代。可對缺失、***及取代進行任何組合以獲得最終構築體，其限制條件為最終構築體具有所要特徵，例如抗原結合性。
a)取代、***及缺失變異體
在某些實施例中，提供具有一或多個胺基酸取代之抗體變異體。用於取代性突變誘發之相關位點包括HVR及FR。保守性取代示於表1中之標題「較佳取代」下。更實質性變化提供於表1中之標題「示範性取代」下，且如以下關於胺基酸側鏈類別進一步所述。胺基酸取代可引入相關抗體中且篩檢具有所要活性(例如維持/改良之抗原結合性、降低之免疫原性或改良之ADCC或CDC)之產物。
可根據共同側鏈性質對胺基酸分組：(1)疏水性：正白胺酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile； (2)中性親水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；(3)酸性：Asp、Glu；(4)鹼性：His、Lys、Arg；(5)影響鏈定向之殘基：Gly、Pro；(6)芳族：Trp、Tyr、Phe。
非保守性取代將需要將此等類別之一之成員更換成另一類別。
一種類型之取代變異體涉及取代親本抗體(例如人類化或人類抗體)之一或多個高變區殘基。一般而言，選用於進一步研究之所得一種或多種變異體相對於親本抗體將在某些生物性質方面具有改變(例如改良)(例如親和力增加、免疫原性降低)及/或將實質上保留親本抗體之某些生物性質。一示範性取代變異體為親和力成熟抗體，其可例如使用基於噬菌體呈現之親和力成熟技術(諸如本文所述者)便利地產生。簡言之，使一或多個HVR殘基突變且使變異型抗體呈現在噬菌體上並針對特定生物活性(例如結合親和力)加以篩檢。
可在HVR中進行改變(例如取代)例如以改良抗體親和力。可在HVR「熱點」(亦即由在體細胞成熟過程期間以高頻率經受突變之密碼子編碼之殘基(參見例如Chowdhury,Methods Mol.Biol.207：179-196(2008)及/或接觸抗原之殘基)中進行此等改變，且測試所得變異型VH或VL之結合親和力。藉由構建且自二級文庫重新選擇之親和力成熟已描述於例如Hoogenboom等人.Methods in Molecular Biology 178：1-37(O’Brien等人編,Human Press,Totowa,NJ,(2001))中。在親和力成熟之一些實施例中，藉由多種方法(例如易出錯PCR、鏈改組或寡核苷酸定向突變誘發)中之任一者將多樣性引入選用於成熟之可變基因中。接著產生二級文庫。接著篩檢文庫以識別具有所要親和力之任何抗體變異體。引入多樣性之另一方法涉及HVR定向方法，其中使若干HVR殘基(例如一次4-6個殘基)隨機化。可例如使用丙胺酸掃描突變誘發或模型化來特異性識別抗原結合中涉及之HVR殘基。特定言之，通常以CDR-H3及CDR-L3為標靶。
在某些實施例中，取代、***或缺失可發生在一或多個HVR 內，只要此等改變不實質上降低抗體結合抗原之能力即可。舉例而言，可在HVR中進行不實質上降低結合親和力之保守性改變(例如如本文提供之保守性取代)。此等改變可例如在HVR中抗原接觸殘基之外部。在以上提供之變異型VH及VL序列之某些實施例中，各HVR未改變或含有不超過一、兩個或三個胺基酸取代。
一種適用於識別抗體之可作為突變誘發標靶之殘基或區域的方法稱為「丙胺酸掃描突變誘發」，如Cunningham及Wells(1989)Science,244：1081-1085所述。在此方法中，識別某一殘基或一組標靶殘基(例如帶電荷殘基，諸如Arg、Asp、His、Lys及Glu)且置換為中性或帶負電荷胺基酸(例如丙胺酸或聚丙胺酸)以確定抗體與抗原之相互作用是否受到影響。可在對初始取代顯示功能敏感性之胺基酸位置上引入進一步取代。或者或另外，使用抗原-抗體複合物之晶體結構來識別抗體與抗原之間的接觸點。此等接觸殘基及相鄰殘基可作為取代候選物而靶向或消除。可篩檢變異體以確定其是否含有所要性質。
胺基酸序列***包括長度在一個殘基至含有一百個或一百個以上殘基之多肽之範圍內的胺基末端及/或羧基末端融合、以及具有單一或多個胺基酸殘基之序列內***。末端***之實例包括具有N端甲硫胺醯基殘基之抗體。抗體分子之其他***變異體包括抗體之N端或C端與增加抗體之血清半衰期之酶(例如用於ADEPT)或多肽的融合。
b)糖基化變異體
在某些實施例中，改變本文提供之抗體以增加或降低抗體糖基化之程度。對抗體添加糖基化位點或使抗體缺失糖基化位點可藉由改變胺基酸序列以使得產生或移除一或多個糖基化位點來便利地達成。
當抗體包含Fc區時，可改變與其連接之碳水化合物。由哺乳動物細胞產生之天然抗體通常包含通常藉由N-鍵聯連接於Fc區之CH2域之Asn297的分支雙觸角寡醣。參見例如Wright等人.TIBTECH 15：26-32(1997).寡醣可包括各種碳水化合物，例如甘露糖、N-乙醯基葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖及唾液酸、以及連接於雙觸角寡醣結構之「主幹」中之GlcNAc的海藻糖。在一些實施例中，可對本發明之抗體中之寡醣進行修飾 以產生具有某些改良性質之抗體變異體。
在一實施例中，提供具有缺乏(直接或間接)連接於Fc區之海藻糖之碳水化合物結構的抗體變異體。舉例而言，海藻糖在此抗體中之量可為1%至80%、1%至65%、5%至65%或20%至40%。如藉由MALDI-TOF質譜法所量測，藉由相對於連接於Asn297之所有糖結構(例如複合、雜合及高甘露糖結構)之總和計算Asn297上之糖鏈內海藻糖的平均量來測定海藻糖之量，如例如WO 2008/077546中所述。Asn297係指位於Fc區中約位置297(Fc區殘基之Eu編號)上之天冬醯胺殘基；然而，Asn297亦可由於抗體中之微小序列變化而位於位置297之上游或下游約±3個胺基酸處，亦即在位置294與300之間。此等海藻糖基化變異體可具有改良之ADCC功能。參見例如美國專利公開案第US 2003/0157108(Presta,L.)號，第US 2004/0093621號(Kyowa Hakko Kogyo Co.,Ltd)。與「去海藻糖基化」或「海藻糖缺乏」抗體變異體相關之公開案之實例包括：US 2003/0157108；WO 2000/61739；WO 2001/29246；US 2003/0115614；US 2002/0164328；US 2004/0093621；US 2004/0132140；US 2004/0110704；US2004/0110282；US 2004/0109865；WO 2003/085119；WO 2003/084570；WO2005/035586；WO 2005/035778；WO2005/053742；WO2002/031140；Okazaki等人.J.Mol.Biol.336：1239-1249(2004)；Yamane-Ohnuki等人.Biotech.Bioehg.87：614(2004)。能夠產生去海藻糖基化抗體之細胞株之實例包括缺乏蛋白質海藻糖基化作用之Lec13 CHO細胞(Ripka等人.Arch.Biochem.Biophys.249：533-545(1986)；美國專利申請案第US 2003/0157108 A1號,Presta,L；及WO 2004/056312 A1,Adams等人,尤其實例11)及基因剔除細胞株，諸如α-1,6-海藻糖基轉移酶基因FUT8基因剔除CHO細胞(參見例如Yamane-Ohnuki等人.Biotech.Bioeng.87：614(2004)；Kanda,Y.等人,Biotechnol.Bioeng.,94(4)：680-688(2006)；及WO2003/085107)。
進一步提供具有二等分寡醣之抗體變異體，例如其中連接於抗體之Fc區之雙觸角寡醣係由GlcNAc二等分。此等抗體變異體可具有降低之海藻糖基化及/或改良之ADCC功能。此等抗體變異體之實例例如描述於WO 2003/011878(Jean-Mairet等人)；美國專利第6,602,684號(Umana等 人)；及US 2005/0123546(Umana等人)中。亦提供在連接於Fc區之寡醣中具有至少一個半乳糖殘基之抗體變異體。此等抗體變異體可具有改良之CDC功能。此等抗體變異體例如描述於WO 1997/30087(Patel等人)；WO 1998/58964(Raju,S.)；及WO 1999/22764(Raju,S.)中。
c)Fc區變異體
在某些實施例中，可將一或多個胺基酸修飾引入本文提供之抗體之Fc區中，藉此產生Fc區變異體。Fc區變異體可包含在一或多個胺基酸位置上包含胺基酸修飾(例如取代)之人類Fc區序列(例如人類IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc區)。
在某些實施例中，本發明涵蓋具有一些而非所有效應功能之抗體變異體，該等效應功能使該抗體變異體成為抗體之活體內半衰期較為重要但某些效應功能(諸如補體及ADCC)不必要或有害之應用所需要的候選物。可進行活體外及/或活體內細胞毒性分析以確認CDC及/或ADCC活性之降低/去除。舉例而言，可進行Fc受體(FcR)結合分析以確保抗體缺乏FcγR結合性(因此可能缺乏ADCC活性)，但保留FcRn結合能力。用於介導ADCC之初級細胞NK細胞僅表現FcγRIII，而單核細胞表現FcγRI、FcγRII及FcγRIII。((((FcR在造血細胞上之表現概述於Ravetch及Kinet,Annu.Rev.Immunol.9：457-492(1991)第464頁上之表3中。活體外分析以評定相關分子之ADCC活性之非限制性實例描述於美國專利第5,500,362號中(參見例如Hellstrom,I.等人.Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 83：7059-7063(1986))及Hellstrom,I等人,Proc.Natl Acad.Sci.USA 82：1499-1502(1985)；5,821,337(參見Bruggemann,M.等人,J.Exp.Med.166：1351-1361(1987))。或者，可採用非放射性分析方法，(參見例如用於流動式細胞測量術之ACTITM非放射性細胞毒性分析(CellTechnology公司Mountain View,CA)；及CytoTox 96®非放射性細胞毒性分析(Promega,Madison,WI)。適用於此等分析之效應細胞包括周邊血液單核細胞(PBMC)及自然殺手(NK)細胞。或者或另外，相關分子之ADCC活性可例如在動物模型，諸如Clynes等人.Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 95：652-656(1998)中揭露之動物模型中進行活體內評定。亦可進行C1q結合分析以確認抗體不能結合C1q且因此缺乏CDC活性。參見例如WO 2006/029879及WO 2005/100402中之C1q及C3c結合ELISA。為評定補體活化，可進行CDC分析(參見例如Gazzano-Santoro等人,J.Immunol.Methods 202：163(1996)；Cragg,M.S.等人,Blood 101：1045-1052(2003)；及Cragg,M.S.and M.J.Glennie,Blood 103：2738-2743(2004))。亦可使用此項技術中已知之方法對FcRn結合及活體內清除率/半衰期進行測定(參見例如Petkova,S.B.等人,Int’l.Immunol.18(12)：1759-1769(2006))。
效應功能降低之抗體包括Fc區殘基238、265、269、270、297、327及329中之一或多者經取代之抗體(美國專利第6,737,056號)。此等Fc突變體包括在胺基酸位置265、269、270、297及327中之兩者或兩者以上處具有取代之Fc突變體，包括殘基265及297取代成丙胺酸之所謂「DANA」Fc突變體(美國專利第7,332,581號)。
在一些態樣中，抗-CLL-1抗體(例如抗-CLL-1 TDB抗體)包含包含N297G突變之Fc區。在一些實施例中，根據EU編號，抗-CLL-1抗體在胺基酸殘基234、235及329處包含L234A、L235A及P329G突變。
在一些實施例中，包含N297G突變之抗-CLL-1抗體包含一或多個重鏈恆定域，其中該一或多個重鏈恆定域選自第一CH1(CH1 1 )域、第一CH2(CH2 1 )域、第一CH3(CH3 1 )域、第二CH1(CH1 2 )域、第二CH2(CH2 2 )域及第二CH3(CH3 2 )域。在一些情況中，該或該等重鏈恆定域中之至少一者與另一重鏈恆定域配對。在一些情況中，CH3 1 及CH3 2 域各自包含突出或空穴，且其中CH3 1 域中之突出或空穴可分別定位在CH3 2 域中之空穴或突出中。在一些情況中，CH3 1 及CH3 2 域在該突出與空穴之間的介面處交會。在一些情況中，CH2 1 及CH2 2 域各自包含突出或空穴，且其中CH2 1 域中之突出或空穴可分別定位在CH2 2 域中之空穴或突出中。在其他情況中，CH2 1 及CH2 2 域在該突出與空穴之間的介面處交會。在一些情況中，抗-CD3抗體為IgG1抗體。
在任一抗-CLL-1抗體之一些實施例中，(a)CD3結合域包含Fc域，其中根據EU編號，該Fc域包含T366S、L368A、Y407V及N297G取代突變；且(b)CLL-1結合域包含Fc域，其中根據EU編號，該Fc域包含T366W及N297G取代突變。在任一抗-CLL-1抗體之一些實施例中，(a) CD3結合域包含Fc域，其中根據EU編號，該Fc域包含L234A、L235A、P329G、T366S、L368A及Y407V取代突變；且(b)CLL-1結合域包含Fc域，其中根據EU編號，該Fc域包含L234A、L235A、P329G及T366W取代突變。
與FcR之結合改良或削弱之某些抗體變異體已有描述。(參見例如美國專利第6,737,056號；WO 2004/056312及Shields等人,J.Biol.Chem.9(2)：6591-6604(2001))。
在某些實施例中，抗體變異體包含具有一或多個改良ADCC之胺基酸取代(例如在Fc區之位置298、333及/或334(EU殘基編號)處之取代)之Fc區。
在一些實施例中，在Fc區中進行導致C1q結合及/或補體依賴性細胞毒性(CDC)改變(亦即改良或削弱)之改變，例如如美國專利第6,194,551號、WO 99/51642及Idusogie等人.J.Immunol.164：4178-4184(2000)中所述。
半衰期增加且與負責將母體IgG轉移至胎兒之新生兒Fc受體(FcRn)(Guyer等人,J.Immunol.117：587(1976)及Kim等人,J.Immunol.24：249(1994))描述於US2005/0014934A1(Hinton等人)中。彼等抗體包含其中具有一或多個改良Fc區與FcRn之結合之取代的Fc區。此等Fc變異體包括在以下一或多個Fc區殘基處具有取代之變異體：238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434，例如Fc區殘基434之取代(美國專利第7,371,826號)。亦參見Duncan及Winter,Nature 322：738-40(1988)；美國專利第5,648,260號；美國專利第5,624,821號；及WO 94/29351，涉及Fc區變異體之其他實例。
d)半胱胺酸工程改造抗體變異體
在某些實施例中，可能需要產生半胱胺酸工程改造抗體，例如「硫基單抗(thioMAb)」，其中抗體之一或多個殘基經半胱胺酸殘基取代。在特定實施例中，經取代殘基存在於抗體之可及位點處。藉由用半胱胺酸取代彼等殘基，反應性硫醇基藉此定位在抗體之可及位點處且可用於使抗 體結合於其他部分(諸如藥物部分或連接子-藥物部分)以產生免疫結合物，如本文進一步所述。在某些實施例中，任一或多個以下殘基可經半胱胺酸取代：輕鏈之V205(Kabat編號)；重鏈之A118(EU編號)；及重鏈Fc區之S400(EU編號)。可如例如美國專利第7,521,541號中所述來產生半胱胺酸工程改造抗體。
e)抗體衍生物
在某些實施例中，本文提供之抗體可經進一步修飾以含有此項技術中已知且容易獲得之其他非蛋白質部分。適於使抗體衍生化之部分包括但不限於水溶性聚合物。水溶性聚合物之非限制性實例包括但不限於聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇之共聚物、羧甲基纖維素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯啶酮、聚-1,3-二氧雜環戊烷、聚-1,3,6-三噁烷、乙烯/順丁烯二酸酐共聚物、聚胺基酸(均聚物或無規共聚物)、及葡聚糖或聚(n-乙烯基吡咯啶酮)聚乙二醇、聚丙二醇均聚物、聚環氧丙烷/環氧乙烷共聚物、聚氧乙基化多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇及其混合物。聚乙二醇丙醛由於其在水中之穩定性而可具有製造優勢。聚合物可具有任何分子量，且可分支或未分支。連接於抗體之聚合物之數目可變化，且若連接一個以上聚合物，則其可為相同或不同分子。一般而言，用於衍生化之聚合物之數目及/或類型可基於包括但不限於欲改良之抗體之特定性質或功能、抗體衍生物是否將在確定條件下用於療法中等考慮因素加以確定。
在另一實施例中，提供抗體與可藉由曝露於輻射而選擇性加熱之非蛋白質部分的結合物。在一個實施例中，非蛋白質部分為碳奈米管(Kam等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102：11600-11605(2005))。輻射可具有任何波長，且包括但不限於不損害普通細胞但會將非蛋白質部分加熱至鄰近於抗體-非蛋白質部分之細胞被殺死之溫度的波長。
B.重組方法及組合物
可使用例如如美國專利第4,816,567號中所述之重組方法及組合物來產生抗體。在一實施例中，提供編碼本文所述之抗-CLL-1抗體之經分離核酸。此核酸可編碼包含抗體之VL之胺基酸序列及/或包含抗體之VH之胺基酸序列(例如抗體之輕鏈及/或重鏈)。在另一實施例中，提供一或 多種包含此核酸之載體(例如表現載體)。在另一實施例中，提供一種包含此核酸之宿主細胞。在一個此實施例中，宿主細胞包含(例如已用以下轉型)：(1)包含編碼包含抗體之VL之胺基酸序列及包含抗體之VH之胺基酸序列的核酸之載體，或(2)包含編碼包含抗體之VL之胺基酸序列的核酸之第一載體及包含編碼包含抗體之VH之胺基酸序列的核酸之第二載體。在一實施例中，宿主細胞為真核的，例如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或淋巴樣細胞(例如Y0、NS0、Sp20細胞)。在一實施例中，提供一種製備抗-CLL-1抗體之方法，其中該方法包含在適於表現該抗體之條件下培養如以上提供之包含編碼該抗體之核酸的宿主細胞，及視情況自該宿主細胞(或宿主細胞培養基)回收該抗體。
對於重組產生抗-CLL-1抗體，分離編碼例如如上所述之抗體之核酸且將其***一或多種載體中以用於進一步在宿主細胞中選殖及/或表現。此核酸可易於使用習知程式(例如藉由使用能夠特異性結合編碼抗體之重鏈及輕鏈之基因之寡核苷酸探針)進行分離及定序。
適於選殖或表現抗體編碼性載體之宿主細胞包括本文所述之原核或真核細胞。舉例而言，抗體可在細菌中產生，特定言之當不需要糖基化及Fc效應功能時。對於在細菌中表現抗體片段及多肽，參見例如美國專利第5,648,237號、第5,789,199號及第5,840,523號。(亦參見Charlton,Methods in Molecular Biology,第248卷(B.K.C.Lo編,Humana Press,Totowa,NJ,2003),第245-254頁,描述抗體片段在大腸桿菌中之表現。)表現後，抗體可以可溶性部分自細菌細胞糊分離，且可進一步純化。
除原核生物之外，諸如絲狀真菌或酵母之真核微生物亦為適於抗體編碼性載體之選殖或表現宿主，包括糖基化路徑已經「人類化」，從而產生具有部分或完全人類糖基化型態之抗體之真菌及酵母菌株。參見Gerngross,Nat.Biotech.22：1409-1414(2004)及Li等人,Nat.Biotech.24：210-215(2006)。
適於表現糖基化抗體之宿主細胞亦源於多細胞生物體(無脊椎動物及脊椎動物)。無脊椎動物細胞之實例包括植物及昆蟲細胞。已識別眾多可連同昆蟲細胞一起使用之桿狀病毒株，尤其用於轉染草地黏蟲 (Spodoptera frugiperda)細胞。
植物細胞培養物亦可用作宿主。參見例如美國專利第5,959,177號、第6,040,498號、第6,420,548號、第7,125,978號及第6,417,429號(描述用於在轉殖基因植物中產生抗體之PLANTIBODIESTM技術)。
脊椎動物細胞亦可用作宿主。例如，適合於懸浮生長之哺乳動物細胞株可為適用的。適用哺乳動物宿主細胞株之其他實例為藉由SV40(COS-7)轉型之猴腎CV1株；人類胚腎株(293或293細胞，如例如Graham等人,J.Gen Virol.36：59(1977)中所描述)；小倉鼠腎細胞(BHK)；小鼠塞爾托利細胞(TM4細胞，如例如Mather,Biol.Reprod.23：243-251(1980)中所描述)；猴腎細胞(CV1)；非洲綠猴腎細胞(VERO-76)；人類宮頸癌細胞(HELA)；犬腎細胞(MDCK)；布法羅大鼠肝細胞(BRL3A)；人類肺細胞(W138)；人類肝細胞(Hep G2)；小鼠乳腺癌腫瘤(MMT 060562)；TRI細胞，如例如Mather等人,Annals N.Y.Acad.Sci.383：44-68(1982)中所述；MRC5細胞；及FS4細胞。其他適用哺乳動物宿主細胞株包括中國倉鼠卵巢(CHO)細胞，包括DHFR-CHO細胞(Urlaub等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216(1980))；及骨髓瘤細胞株，諸如Y0、NS0及Sp2/0。對於適於抗體製造之某些哺乳動物宿主細胞株之評述，參見例如Yazaki及Wu,Methods in Molecular Biology,第248卷(B.K.C.Lo,ed.,Humana Press,Totowa,NJ),第255-268頁(2003)。
C.分析
可藉由此項技術中已知之各種分析來鑑別、篩檢或表徵本文提供之抗-CLL-1抗體之物理/化學性質及/或生物活性。
1.結合分析及其他分析
可藉由此項技術中已知之各種分析來鑑別、篩檢或表徵本文提供之抗-CLL-1抗體之物理/化學性質及/或生物活性。
在一態樣中，例如藉由已知方法，諸如ELISA、BIACore®、FACS或西方墨點法(Western blot)來測試本發明之抗體及/或結合域之抗原結合活性。
在另一態樣中，競爭分析可用於鑑別與本文所述之任何抗體競爭結合CLL-1或CD3之抗體及/或結合域。在某些實施例中，該種競爭性 抗體結合由本文所述之抗體所結合之同一抗原決定基(例如線性或構形抗原決定基)。定位抗體所結合之抗原決定基之詳述示範性方法提供於Morris(1996)「Epitope Mapping Protocols,」見Methods in Molecular Biology第66卷(Humana Press,Totowa,NJ)中。
在一示範性競爭分析中，在包含結合CLL-1或CD3之第一經標記抗體(例如本文所述之任何抗體)及第二未標記抗體(將測試其與該第一抗體競爭結合於CLL-1或CD3之能力)的溶液中培育經固定之CLL-1或CD3。第二抗體可存在於融合瘤上清液中。作為對照，在包含第一經標記抗體而無第二未標記抗體之溶液中培育經固定CLL-1或CD3。在容許第一抗體結合CLL-1或CD3之條件下培育之後，移除過量未結合抗體，且量測與經固定CLL-1或CD3締合之標記之量。若相對於對照樣品，與經固定CLL-1或CD3締合之標記之量在測試樣品中實質上降低，則指示第二抗體與第一抗體競爭結合CLL-1或CD3。參見Harlow及Lane(1988)Antibodies：A Laboratory Manual第14章(Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY)。
2.活性分析
在一態樣中，提供用於鑑別具有生物活性之抗-CLL-1抗體(例如抗-CLL-1/CD3 TDB抗體)的分析。生物活性可包括例如抑制細胞生長或增殖之能力(例如「細胞殺傷」活性)、誘導細胞死亡(包括程式化細胞死亡)(細胞凋亡)之能力或抗原結合活性。亦提供在活體內及/或活體外具有此生物活性之抗體。
在一些實施例中，活性包含支持標靶細胞(例如CLL-1陽性細胞)殺傷及/或細胞毒性T細胞活化之能力。在某些實施例中，藉由本文、特定言之實例中所述之任何方法，測試本發明抗-CLL-1抗體(例如抗-CLL-1/CD3 TDB抗體)之此標靶細胞(例如CLL-1陽性細胞)殺傷及/或T細胞細胞毒性作用活化生物活性。在一些實施例中，諸如AML腫瘤細胞株、PBMC或AML患者骨髓細胞之標靶細胞可在37℃下在含有10% FCS、2mM谷胺醯胺及0.3mg/ml經純化低內毒素人類IgG(Molecular Innovations，HU-GF-ED)之RPMI培養基中預孵育1-2小時，以防止TDB與表面表現Fc γ R之細胞的非特異性結合。在一些實施例中，可自正常人類供體分離PBMC，且使用來自Miltenyi Biotec GmbH(Miltenyi；130-096-495)之套組富集PBMC中之未接觸CD8+ T細胞。分析可在含有60,000個細胞/孔之人類CD8+ T細胞及20,000個細胞/孔之經hIgG阻斷之標靶細胞的96孔圓底板(Costar 3799)中進行；效應子與標靶比(E：T)為3：1。抗-CLL-1抗體(例如抗-CLL-1/CD3 TDB抗體)可作為10×工作溶液來添加，其被連續3倍稀釋至跨度為0-10ug/ml或0-1ug/ml之最終分析濃度。添加順序可如下：50ul 2×標靶細胞、11ul 10×3倍連續稀釋之TDB及50ul 2×CD8+ T細胞。內容物可在滴定板振盪器(Thermo)上在設置6下混合15sec，且在37℃下孵育約40h。板每天混合一次。在一些實施例中，可使用抗-CD123-APC(BD Pharmingen；560087)或抗-CD33-APC試劑(BD Pharmingen；551378)及碘化丙錠藉由FACS監控表現hCLL-1之EOL-1、THP-1、HL-60、Nomo-1、ML-2、PL-21、U937及Molm-13細胞之消耗。可使用抗-CD8-FITC(BD Pharmingen；555634)、抗-CD69-PE(BD Pharmingen；555531)及抗-CD25(BD Pharmingen；555434)之組合監控CD8+ T細胞之活化。
在一些實施例中，人類或獼猴PBMC可藉由Hypaque-Ficoll梯度濃縮(Ficoll-Paque Plus，GE Healthcare)分離，在低速下洗滌以去除血小板，且重懸於含有hIgG之RPMI中，以阻斷TDB非特異性結合至Fc γ R。分析可如以上所述進行，除了用10×3倍連續稀釋之抗-CLL-1抗體(例如抗-CLL-1/CD3 TDB抗體)孵育濃度為200,000/孔之PBMC。可藉由FACS在40小時時評估靶細胞殺傷(CD14+單核細胞)及效應T細胞(CD8+)活化。表現hCLL-1之CD14+單核細胞的消耗可使用抗-CD14-APC試劑(Human BD Pharmingen；555399，Cyno Miltenyi：130-091-243)及碘化丙錠進行監控。
D.免疫結合物
本發明亦提供包含本文之經結合至一或多種細胞毒性劑之抗-CLL-1抗體(例如抗-CLL-1/CD3 TDB抗體)的免疫結合物，該或該等細胞毒性劑諸如化療劑或藥物、生長抑制劑、毒素(例如蛋白毒素，細菌、真菌、植物或動物來源之酶活性毒素，或其片段)或發射性同位素。
在一實施例中，免疫結合物為抗體-藥物結合物(ADC)，其 中抗體經結合至一或多種藥物，包括但不限於美登木素生物鹼(參見美國專利第5,208,020號、第5,416,064號及歐洲專利EP 0 425 235 B1)；奧瑞斯他汀(auristatin)，諸如單甲基奧瑞斯他汀藥物部分DE及DF(MMAE及MMAF)(參見美國專利第5,635,483號及第5,780,588號，及第7,498,298)號；朵拉司他汀；刺孢黴素或其衍生物(參見美國專利第5,712,374號、第5,714,586號、第5,739,116號、第5,767,285號、第5,770,701號、第5,770,710號、第5,773,001號及第5,877,296號；Hinman等人,Cancer Res.53：3336-3342(1993)；及Lode等人,Cancer Res.58：2925-2928(1998))；蒽環黴素，諸如柔紅黴素或多柔比星(參見Kratz等人,Current Med.Chem.13：477-523(2006)；Jeffrey等人,Bioorganic & Med.Chem.Letters 16：358-362(2006)；Torgov等人,Bioconj.Chem.16：717-721(2005)；Nagy等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97：829-834(2000)；Dubowchik等人,Bioorg.& Med.Chem.Letters 12：1529-1532(2002)；King等人,J.Med.Chem.45：4336-4343(2002)；美國專利第6,630,579號)；甲胺喋呤；長春地辛；紫杉烷諸如多西他賽、紫杉醇、拉羅他賽(larotaxel)、特西他賽(tesetaxel)及奧特他賽(oitataxel)；單端孢黴烯；及CC1065。
在另一實施例中，免疫結合物包含經結合至酶活性毒素或其片段之本文所述的抗體，該酶活性毒素或其片段包括但不限於白喉A鏈、白喉毒素之非結合活性片段、外毒素A鏈(來自綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒素A鏈、相思豆毒素A鏈、蒴蓮根毒素A鏈、α-帚麴菌素、油桐(Aleurites fordii)蛋白、石竹素(dianthin)蛋白、美洲商陸(Phytolaca americana)蛋白(PAPI、PAPII及PAP-S)、苦瓜(momordica charantia)抑制劑、瀉果素、巴豆毒素、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制劑、白樹毒素(gelonin)、絲裂吉菌素(mitogellin)、局限麴菌素(restrictocin)、酚黴素(phenomycin)、伊諾黴素(enomycin)及單端孢黴烯(tricothecene)。
在另一實施例中，免疫結合物包含如本文所述之經結合至放射性原子以形成放射性結合物之抗體。多種放射性同位素可用於產生放射性結合物。實例包括At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212及Lu之放射性同位素。當免疫結合物用於偵測時，其可包含用於閃爍 攝影研究之放射性原子，例如tc99m或I123；或用於核磁共振(NMR)成像(亦稱為磁共振成像mri)之自旋標記，諸如碘-123、碘-131、銦-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、釓、錳或鐵。
抗體及細胞毒性劑之結合物可使用多種雙功能蛋白偶聯劑，諸如N-琥珀醯亞胺基-3-(2-吡啶基二硫醇)丙酸酯(SPDP)、琥珀醯亞胺基-4-(N-馬來醯亞胺基甲基)環己烷-1-甲酸酯(SMCC)、胺基硫烷(IT)、亞胺酸酯之雙功能衍生物(諸如二亞胺代己二酸二甲酯HCl)、活性酯(諸如辛二酸二琥珀醯亞胺基酯)、醛(諸如戊二醛)、雙-疊氮基化合物(諸如雙(對疊氮基苯甲醯基)己二胺)、雙-重氮鎓衍生物(諸如雙-(對重氮鎓苯甲醯基)-乙二胺)、二異氰酸酯(諸如甲苯2,6-二異氰酸酯)及雙-活性氟化合物(諸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)來製備。舉例而言，蓖麻毒素免疫毒素可如Vitetta等人,Science 238：1098(1987)中所述來製備。碳-14-標記之1-異硫氰酸酯基苯甲基-3-甲基二伸乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)為一種用於使放射性核苷酸結合於抗體之示範性螯合劑。參見WO94/11026。連接基可為「可裂解連接基」，其促進細胞毒性藥物在細胞中之釋放。例如，可使用酸不穩定性連接基、肽酶敏感性連接基、光不穩定性連接基、二甲基連接基或含有二硫化物之連接基(Chari等人,Cancer Res.52：127-131(1992)；美國專利第5,208,020號)。
本文之免疫結合物或ADC明確涵蓋(但不限於)用交聯試劑製備之此等結合物，該等交聯試劑包括(但不限於)BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、磺基-EMCS、磺基-GMBS、磺基-KMUS、磺基-MBS、磺基-SIAB、磺基-SMCC及磺基-SMPB，及SVSB(琥珀醯亞胺基-(4-乙烯基碸)苯甲酸酯)，其可商購獲得(例如自Pierce Biotechnology,Inc.，Rockford,IL.,U.S.A)。
E.用於診斷及偵測之方法及組合物
在一態樣中，本文提供之抗-CLL-1抗體(例如抗-CLL-1/CD3 TDB抗體)適用於偵測生物樣品中CLL-1之存在。如本文所用之術語「偵測」涵蓋定量或定性偵測。在某些實施例中，生物樣品包含細胞或組織。在某些實施例中，此等組織包括正常及/或相對於其他組織以較高水準表現CLL-1之癌性組織。
在一個實施例中，提供一種用於診斷或偵測方法中之抗-CLL-1抗體。在另一態樣中，提供一種偵測生物樣品中CLL-1之存在之方法。在某些實施例中，該方法包含使生物樣品與如本文所述之抗-CLL-1抗體在容許該抗-CLL-1抗體結合CLL-1之條件下接觸，及偵測在該抗-CLL-1抗體與CLL-1之間是否形成複合物。此方法可為活體外或活體內方法。在一實施例中，抗-CLL-1抗體用於選擇適於用抗-CLL-1抗體治療之受檢者，例如當CLL-1為用於選擇患者之生物標記時。
可根據任何以上實施例進行診斷或偵測之示範性病症包括CLL-1陽性癌症，諸如CLL-1陽性AML、CLL-1陽性CML、CLL-1陽性MDS、CLL-1陽性慢性骨髓單核細胞性白血病、CLL-1陽性APL、CLL-1陽性慢性骨髓增生性病症、CLL-1陽性血小板性白血病、CLL-1陽性前B-ALL、CLL-1陽性前T-ALL、CLL-1陽性多發性骨髓瘤、CLL-1陽性肥大細胞疾病、CLL-1陽性肥大細胞白血病、CLL-1陽性肥大細胞肉瘤、CLL-1陽性骨髓性肉瘤、CLL-1陽性淋巴性白血病及CLL-1陽性未分化白血病。在一些實施例中，CLL-1陽性癌症為得到大於「0」之抗-CLL-1免疫組織化學(IHC)或原位雜交(ISH)計分之癌症，計分「0」對應於在本文於實例B中所述之條件下，在>90%之腫瘤細胞中染色極微弱或無染色。在另一實施例中，CLL-1陽性癌症以如本文於實例B中所述之條件下所定義之1+級、2+級或3+級表現CLL-1。在一些實施例中，CLL-1陽性癌症為根據偵測CLL-1 mRNA之逆轉錄酶PCR(RT-PCR)分析，表現CLL-1之癌症。在一些實施例中，RT-PCR為定量RT-PCR。
某些其他方法可用於偵測抗-CLL-1抗體與CLL-1之結合。此等方法包括但不限於在此項技術中熟知之抗原結合分析，諸如蛋白免疫印跡、放射免疫分析、ELISA(酶聯免疫吸附分析)、「夾心」免疫分析、免疫沉澱分析、螢光免疫分析、蛋白A免疫分析及免疫組織化學(IHC)，在某些實施例中，提供經標記之抗-CLL-1抗體。標記包括但不限於可直接偵測之標記或部分(諸如螢光標記、發色標記、電子密集標記、化學發光標記及放射性標記)以及例如經由酶促反應或分子相互作用間接偵測之部分，諸如酶或配體。示範性標記包括(但不限於)放射性同位 素32P、14C、125I、3H及131I，螢光團(諸如稀土螯合物或螢光素及其衍生物)、若丹明(rhodamine)及其衍生物、丹醯基、傘形酮(umbelliferone)、螢光素酶(例如螢火蟲螢光素酶及細菌螢光素酶(美國專利第4,737,456號))、螢光素(luciferin)、2,3-二氫呔嗪二酮、辣根過氧化酶(HRP)、鹼性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡糖澱粉酶、溶菌酶、醣氧化酶(例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶及葡萄糖-6-磷酸去氫酶)，與採用過氧化氫以氧化染料前驅體之酶(諸如HRP、乳過氧化酶(lactoperoxidase)或微過氧化酶(microperoxidase))偶聯之雜環氧化酶(諸如尿酸酶(uricase)及黃嘌呤氧化酶)，生物素/抗生蛋白、自旋標記、噬菌體標記、穩定自由基及其類似標記。
F.醫藥調配物
如本文所述之抗-CLL-1抗體(例如抗-CLL-1/CD3 TDB抗體)的醫藥調配物係藉由混合具有所要純度之此抗體與一或多種視情況選用之醫藥學上可接受之載劑(Remington's Pharmaceutical Sciences第16版,Osol,A.編(1980))製備成凍乾調配物或水溶液形式。醫藥學上可接受之載劑通常在所用劑量及濃度下對接受者無毒，且包括但不限於：緩衝劑，諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸及甲硫胺酸；防腐劑(諸如氯化十八烷基二甲基苯甲基銨；氯化六羥季銨；氯化苯甲烴銨；苄索氯銨；苯酚、丁醇或苯甲醇；對羥基苯甲酸烴酯，諸如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯；兒茶酚(catechol)；間苯二酚；環己醇；3-戊醇；及間甲酚)；低分子量(少於約10個殘基)多肽；蛋白質，諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯啶酮；胺基酸，諸如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺、組胺酸、精胺酸或離胺酸；單醣、二醣及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，諸如EDTA；糖，諸如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；成鹽相對離子，諸如鈉；金屬錯合物(例如Zn-蛋白質錯合物)；及/或非離子介面活性劑，諸如聚乙二醇(PEG)。本文之示範性醫藥學上可接受之載劑進一步包括間質藥物分散劑，諸如可溶性中性活性玻尿酸酶醣蛋白(sHASEGP)，例如人類可溶性PH-20玻尿酸酶醣蛋白，諸如rHuPH20(HYLENEX®，Baxter International公司)。某些示範性sHASEGP(包括rHuPH20)及使用方法描述於美國專利公開案第 2005/0260186號及第2006/0104968號中。在一態樣中，sHASEGP與一或多種其他葡糖胺聚糖酶，諸如軟骨素酶(chondroitinase)組合。
示範性凍乾抗體調配物描述於美國專利第6,267,958號中。水性抗體調配物包括美國專利第6,171,586號及WO2006/044908中所述者，後述調配物包括組胺酸-乙酸鹽緩衝劑。
本文中之調配物亦可含有所治療之特定適應症所需要之一種以上活性化合物，較佳為具有互補活性且不會對彼此有不利影響者。例如，除抗-CLL-1抗體外，在一調配物中可能需包括另一抗體，例如結合CLL-1多肽上之不同抗原決定基的第二抗-CLL-1抗體，或針對某一其他標靶諸如影響特定癌症生長之生長因子之抗體。或者或另外，該組合物可進一步包含化療劑、細胞毒性劑、細胞因子、生長抑制劑、抗激素劑及/或心臟保護劑。此等分子適當地以對預期之目的有效之量組合存在。
可例如藉由凝聚技術或藉由介面聚合將活性成分截留於所製備之微膠囊中，例如分別於膠狀藥物傳遞系統(例如脂質體、白蛋白微球體、微乳液、奈米粒子及奈米膠囊)中或於***液中之羥甲基纖維素或明膠-微膠囊及聚(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊。此等技術揭示於Remington's Pharmaceutical Sciences第16版,Osol,A.編.(1980)中。
可製備持續釋放製劑。持續釋放製劑之適合實例包括含有抗體之固體疏水性聚合物之半透性基質，該等基質呈成形物件例如膜、或微膠囊之形式。
欲用於活體內投藥之調配物通常無菌。可易於例如藉由經無菌過濾膜過濾來達成無菌。
G.治療方法及組合物
本文提供之任何抗-CLL-1抗體(例如抗-CLL-1/CD3 TDB抗體)可用於治療方法中。
在一態樣中，提供用作藥劑之抗-CLL-1抗體(例如抗-CLL-1/CD3 TDB抗體)。在另一態樣中，提供用於治療或延遲細胞增生性病症(例如癌症及/或AML)進展之抗-CLL-1抗體(例如抗-CLL-1/CD3 TDB抗體)。在某些實施例中，提供用於治療方法之抗-CLL-1抗體(例如抗-CLL-1/ 抗-CD3雙特異性抗體)。在某些實施例中，本發明提供用於治療患有細胞增生性病症之個體的方法中之抗-CLL-1抗體(例如抗-CLL-1/CD3 TDB抗體)，該方法包括向該個體投與有效量之抗-CLL-1抗體(例如抗-CLL-1/CD3 TDB抗體)。在一此實施例中，該方法進一步包括向該個體投與有效量之例如至少一種如下所述之其他治療劑。在其他實施例中，本發明提供用於增強患有細胞增生性病症(例如AML)之個體的免疫功能之抗-CLL-1抗體(例如抗-CLL-1/CD3 TDB抗體)。在某些實施例中，本發明提供用於增強患有細胞增生性病症(例如AML)之個體的免疫功能之方法中的抗-CLL-1抗體(例如抗-CLL-1/CD3 TDB抗體)，該方法包括向該個體投與有效量之抗-CLL-1抗體(例如抗-CLL-1/CD3 TDB抗體)，以活化效應細胞(例如T細胞，例如CD8+及/或CD4+ T細胞)、擴充(增大)效應細胞群體及/或殺傷標靶細胞(例如標靶細胞)。根據任何以上實施例之「個體」可為人類。
在另一態樣中，本發明提供抗-CLL-1抗體(例如抗-CLL-1/CD3 TDB抗體))在製造或製備藥劑中之用途。在一實施例中，藥劑用於治療細胞增生性病症(例如癌症及/或AML)。在另一實施例中，藥劑用於治療細胞增生性病症(例如AML)之方法中，其包括向患有細胞增生性病症(例如AML)之個體投與有效量之治療劑。在一此實施例中，該方法進一步包括向該個體投與有效量之例如至少一種如下所述之其他治療劑。在另一實施例中，藥劑用於活化個體中之效應細胞(例如T細胞，例如CD8+及/或CD4+ T細胞)、擴充(增大)效應細胞群體及/或殺傷標靶細胞(例如標靶細胞)。在另一實施例中，藥劑用於增強患有細胞增生性病症(例如AML)或自體免疫病症之個體的免疫功能之方法中，該方法包括向該個體投與有效量之藥劑，以活化效應細胞(例如T細胞，例如CD8+及/或CD4+ T細胞)、擴充(增大)效應細胞群體及/或殺傷標靶細胞(例如標靶細胞)。根據任何以上實施例之「個體」可為人類。
在另一態樣中，本發明提供一種治療細胞增生性病症(例如癌症及/或AML)之方法。在一實施例中，該方法包括向患有此細胞增生性病症(例如AML)之個體患有此細胞增生性病症(例如AML)之投與有效量之抗-CLL-1抗體(例如抗-CLL-1/CD3 TDB抗體)。在一此實施例中，該方法進 一步包括向該個體投與有效量之例如至少一種如下所述之其他治療劑。根據任何以上實施例之「個體」可為人類。
在另一態樣中，本發明提供一種用於增強患有細胞增生性病症(例如AML)之個體的免疫功能之方法。在一實施例中，該方法包括向該個體投與有效量之抗-CLL-1抗體(例如抗-CLL-1/CD3 TDB抗體)，以活化效應細胞(例如T細胞，例如CD8+及/或CD4+ T細胞)、擴充(增大)效應細胞群體及/或殺傷標靶細胞(例如標靶細胞)。在一實施例中，「個體」為人類。
本發明之抗-CLL-1抗體(例如抗-CLL-1/CD3 TDB抗體)可用於例如活體外、離體及活體內治療方法中。在一態樣中，本發明提供用於活體內或活體外抑制細胞生長或增殖之方法，該方法包括在容許結合至CLL-1之條件下使細胞暴露至抗-CLL-1抗體。「抑制細胞生長或增殖」意謂使細胞生長或增殖降低至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或100%，且包括誘導細胞死亡。在某些實施例中，細胞為腫瘤細胞。在其他實施例中，細胞為單核細胞、粒細胞及/或單核細胞/粒細胞譜系之祖細胞。在一些實施例中，細胞對於FLT3內部串聯重複之存在呈陽性。在一些實施例中，細胞對於MLL-AF9融合基因(例如MLL-AF9易位)之存在呈陽性。在一些實施例中，細胞對於染色體11q23易位之存在呈陽性。在一些實施例中，細胞對於易位t(9；11)(p22；q23)之存在呈陽性。
本文提供之任何抗-CLL-1抗體(例如抗-CLL-1/CD3 TDB抗體)可用於方法例如治療方法中。
在一態樣中，本文提供之抗-CLL-1抗體(例如抗-CLL-1/CD3 TDB抗體)用於抑制CLL-1陽性細胞(CLL-1陽性細胞增生性病症)增殖之方法中，該方法包括在容許抗-CLL-1抗體(例如抗-CLL-1/CD3 TDB抗體)結合至細胞表面上之CLL-1之條件下使細胞暴露至抗-CLL-1抗體(例如抗-CLL-1/CD3 TDB抗體)，從而抑制細胞增殖。在某些實施例中，該方法為活體外或活體內方法。在其他實施例中，細胞為單核細胞、粒細胞及/或單核細胞/粒細胞譜系之祖細胞。在一些實施例中，細胞對於FLT3內部串聯重複之存在呈陽性。在一些實施例中，細胞對於MLL-AF9融合基因(例如MLL-AF9易位)之存在呈陽性。在一些實施例中，細胞對於染色體11q23 易位之存在呈陽性。在一些實施例中，細胞對於易位t(9；11)(p22；q23)之存在呈陽性。
可使用可自Promega(Madison,WI)購得之CellTiter-GloTM發光細胞活力分析來分析在活體外對細胞增殖之抑制作用。彼分析基於對存在之ATP進行定量來測定培養物中之活細胞數，ATP為具有代謝活性之細胞之指示物。參見Crouch等人(1993)J.Immunol.Meth.160：81-88，美國專利第6602677號。分析可以96孔或384孔形式進行，從而使得可進行自動高通量篩檢(HTS)。參見Cree等人.(1995)AntiCancer Drugs 6：398-404。分析程式涉及向培養細胞中直接添加單一試劑(CellTiter-Glo®試劑)。此會導致細胞溶解及產生藉由螢光素酶反應所產生之發光信號。發光信號與存在之ATP之量成比例，存在之ATP之量與培養物中存在之活細胞數成正比。資料可由光度計或CCD攝影機成像裝置記錄。發光輸出值係表示為相對光單位(RLU)。
在另一態樣中，提供用作藥劑之抗-CLL-1抗體(例如抗-CLL-1/CD3 TDB抗體)。在其他態樣中，提供用於治療方法之抗-CLL-1抗體(例如抗-CLL-1/CD3 TDB抗體)。在某些實施例中，提供用於治療細胞增生性病症(例如CLL-1陽性癌症)之抗-CLL-1抗體(例如抗-CLL-1/CD3 TDB抗體)。在某些實施例中，本發明提供用於治療患有細胞增生性病症(例如CLL-1陽性癌症)之個體的方法中之抗-CLL-1抗體(例如抗-CLL-1/CD3 TDB抗體)，該方法包括向該個體投與有效量之抗-CLL-1抗體(例如抗-CLL-1/CD3 TDB抗體)。在一此實施例中，該方法進一步包括向該個體投與有效量之例如至少一種如下所述之其他治療劑。
在另一態樣中，本發明提供抗-CLL-1抗體(例如抗-CLL-1/CD3 TDB抗體))在製造或製備藥劑中之用途。在一實施例中，藥劑用於治療細胞增生性病症(例如CLL-1陽性癌症)。在一些實施例中，癌症為AML。在另一實施例中，藥劑用於治療細胞增生性病症(例如CLL-1陽性癌症)之方法中，其包括向患有CLL-1陽性癌症之個體投與有效量之藥劑。在一此實施例中，該方法進一步包括向該個體投與有效量之例如至少一種如下所述之其他治療劑。
在另一態樣中，本發明提供一種用於治療CLL-1陽性癌症之方法。在一實施例中，該方法包括向患有此CLL-1陽性癌症之個體投與有效量之抗-CLL-1抗體(例如抗-CLL-1/CD3 TDB抗體)。在一此實施例中，該方法進一步包括向該個體投與有效量之至少一種如下所述之其他治療劑。
根據任何以上實施例之細胞增生性病症(例如CLL-1陽性癌症)可為例如CLL-1陽性AML、CLL-1陽性慢性骨髓性白血病(CML)、CLL-1陽性骨髓增生異常症候群(MDS)、CLL-1陽性慢性骨髓單核細胞性白血病、CLL-1陽性APL、CLL-1陽性慢性骨髓增生性病症、CLL-1陽性血小板性白血病、CLL-1陽性前-B-ALL、CLL-1陽性前T-ALL、CLL-1陽性多發性骨髓瘤、CLL-1陽性肥大細胞疾病、CLL-1陽性肥大細胞白血病、CLL-1陽性肥大細胞肉瘤、CLL-1陽性骨髓性肉瘤、CLL-1陽性淋巴性白血病及CLL-1陽性未分化白血病。在一些實施例中，CLL-1陽性癌症為得到大於「0」之抗-CLL-1免疫組織化學(IHC)或原位雜交(ISH)計分之癌症，計分「0」對應於在本文於實例B中所述之條件下，在>90%之腫瘤細胞中染色極微弱或無染色。在另一實施例中，CLL-1陽性癌症以如本文於實例B中所述之條件下所定義之1+級、2+級或3+級表現CLL-1。在一些實施例中，CLL-1陽性癌症為根據偵測CLL-1 mRNA之逆轉錄酶PCR(RT-PCR)分析，表現CLL-1之癌症。在一些實施例中，RT-PCR為定量RT-PCR。
在一些實施例中，根據任何以上實施例之細胞增生性病症可為例如AML、CML及/或MDS。在一些實施例中，CLL-1陽性細胞增生性病症為CLL-1陽性AML、CLL-1陽性CML、CLL-1陽性MDS。在一些實施例中，AML為以下各項中之一或多種：AML亞型1、AML亞型2、AML亞型3、AML亞型4、AML亞型5、AML亞型6及AML亞型7。在一些實施例中，AML為AML亞型3(急性前髓細胞性白血病，APML)。在一些實施例中，AML為以下各項中之一或多種：AML亞型1、AML亞型2、AML亞型4、AML亞型5、AML亞型6及AML亞型7，且不為AML亞型3。
在一些實施例中，細胞增生性病症(例如CLL-1陽性癌症及 /或AML)FLT3中突變、核磷蛋白(NPM1)、CCAAT/增強子結合蛋白α(C/EBP α)(CEBPA)及/或c-KIT之存在呈陽性。在一些實施例中，細胞增生性病症(例如CLL-1陽性癌症及/或AML)對於FLT3內部串聯重複之存在呈陽性。在一些實施例中，細胞增生性病症(例如CLL-1陽性癌症及/或AML)對於FLT3酪胺酸激酶域點突變之存在呈陽性。在一些實施例中，細胞增生性病症(例如CLL-1陽性癌症及/或AML)異檸檬酸脫氫酶1及/或2(IDH1及/或IDH2)中突變之存在呈陽性。在一些實施例中，細胞增生性病症(例如CLL-1陽性癌症及/或AML)對於DNA甲基轉移酶3A(DNMT3A)中突變之存在呈陽性。在一些實施例中，細胞增生性病症(例如CLL-1陽性癌症及/或AML)對於NPM1及FLT3中突變、(b)野生型NPM1及突變型FLT3及/或(c)野生型NPM1及FLT3之存在為NK-AML陽性。
在一些實施例中，細胞增生性病症(例如CLL-1陽性癌症及/或AML)為陽性細胞遺傳異常，諸如以下各項中之一或多者：t(15；17)、t(8；21)、inv(16)、t(16；16)、t(9；11)(p22；q23)、t(6；9)(p23；q34)、inv(3)(q21 q26.2)、inv(3；3)(q21；q26.2)、t(1；22)(p13；q13)、t(8；21)(q22；q22)、inv(16)(p13；1q22)、t(16；16)(p13.1；q22)及/或t(15；17)(q22；q12)。在一些實施例中，細胞增生性病症(例如CLL-1陽性癌症及/或AML)對於MLL-AF9融合基因(例如MLL-AF9易位)之存在呈陽性。在一些實施例中，細胞增生性病症(例如CLL-1陽性癌症及/或AML)對於染色體11q23易位之存在呈陽性。在一些實施例中，細胞增生性病症(例如CLL-1陽性癌症)為對於易位t(9；11)(p22；q23)之存在呈陽性之細胞增生性病症(例如CLL-1陽性癌症及/或AML)。
在一些實施例中，細胞增生性病症((例如CLL-1陽性癌症及/或AML)為抗-AML抗體藥物結合物難治性的及/或對其具有抗性。在一些實施例中，抗-AML抗體藥物結合物為抗-CD33抗體藥物結合物、抗-CLL1抗體藥物結合物及/或抗-CD123抗體藥物結合物。在一些實施例中，抗-CLL-1抗體藥物結合物為抗-CLL-1抗體藥物結合物(例如抗-CLL-1吡咯并苯并二氮呯(PBD)抗體藥物結合物)。在一些實施例中，抗-CLL-1抗體藥物結合物為抗-CD33抗體藥物結合物(例如抗-CD33吡咯并苯并二氮呯(PBD) 抗體藥物結合物)。在一些實施例中，抗-CD123抗體藥物結合物為抗-CD123抗體藥物結合物(例如抗-CD123吡咯并苯并二氮呯(PBD)抗體藥物結合物)。在一些實施例中，抗-CLL-1抗體藥物結合物描述於U.S.8,088,378及/或US 2014/0030280任一者中，其特此以引用方式整體併入本文中。
根據任何以上實施例之「個體」可為人類。
在另一態樣中，本發明提供包含本文提供之任何抗-CLL-1抗體(例如抗-CLL-1/CD3 TDB抗體)之醫藥調配物，其係例如用於任何以上治療方法中。在一實施例中，醫藥調配物包含本文提供之任何抗-CLL-1抗體及醫藥學上可接受之載劑。在另一實施例中，醫藥調配物包含本文提供之任何抗-CLL-1抗體(例如抗-CLL-1/CD3 TDB抗體)及至少一種例如如下所述之其他治療劑。
在本文所述之任何方法、用途及/或醫藥調配物之一些實施例中，抗-CLL-1/CD3 TDB抗體可用作治療誘導療法。在本文所述之任何方法、用途及/或醫藥調配物之一些實施例中，抗-CLL-1/CD3 TDB抗體可用作鞏固療法。在本文所述之任何方法、用途及/或醫藥調配物之一些實施例中，抗-CLL-1/CD3 TDB抗體可用作補救療法。
在療法中，本文所述之抗體(例如抗-CLL-1/CD3 TDB抗體)可單獨或與其他藥劑組合使用。例如，本文所述之抗體(例如抗-CLL-1/CD3 TDB抗體)可與至少一種其他治療劑共投與。在一些實施例中，另一治療劑為蒽環黴素。在一些實施例中，蒽環黴素為柔紅黴素或伊達比星。在一些實施例中，另一治療劑為阿糖胞苷。在一些實施例中，另一治療劑為克拉屈濱(cladribine)。在一些實施例中，另一治療劑為氟達拉濱或托泊替康。在一些實施例中，另一治療劑為降低甲基化試劑，諸如5-氮雜胞苷或地西他濱(decitabine)或胍地西他濱(guadecitabine)。在一些實施例中，另一治療劑為ATRA(全反視黃酸)。在一些實施例中，另一治療劑為三氧化二砷(亦稱為三氧化二砷(trisenox))。在一些實施例中，另一治療劑為柔紅黴素鹽酸鹽(亦稱為舍侞比定(cerubidine)或乳多黴素(rubidomycin))。在一些實施例中，另一治療劑為環磷醯胺(亦稱為克拉分(clafen)、癌得星(cytoxan)或紐砂(neosar))。在一些實施例中，另一治療劑為阿糖胞苷(亦稱為賽德薩 (cytosar)-u、塔拉濱(tarabine)pfs或Ara-C)。在一些實施例中，另一治療劑為多柔比星鹽酸鹽。在一些實施例中，另一治療劑為伊達比星亞酸鹽(亦稱為伊達黴素(idamycin))。在一些實施例中，另一治療劑為硫鳥嘌呤(亦稱為他布德(tabloid))。在一些實施例中，另一治療劑為長春新鹼硫酸鹽(亦稱為長春星(vincasar)pfs)。在一些實施例中，另一治療劑為沙培他濱(sapacitabine)。在一些實施例中，另一治療劑為拉莫斯汀(laromustine)。在一些實施例中，另一治療劑為替吡法尼。在一些實施例中，另一治療劑為硼替佐米(亦稱為VELCADE)。在一些實施例中，另一治療劑為羥基脲。在一些實施例中，另一治療劑為依託泊苷。在一些實施例中，另一治療劑為米托蒽醌。在一些實施例中，另一治療劑為克羅拉濱(clofarabine)。在一些實施例中，另一治療劑為羥基脲。在一些實施例中，另一治療劑為FLT3抑制劑，諸如奎紮替尼(quizartinib)或米多托瑞(midostaurin)。在一些實施例中，另一治療劑為抗癌症喹諾酮衍生物。在一些實施例中，另一治療劑為沃沙羅星(vosaroxin)。在一些實施例中，另一治療劑為IDH1抑制劑或IDH2抑制劑。在一些實施例中，另一治療劑為CHK1抑制劑。在一些實施例中，CHK1抑制劑為GDC-0575。在一些實施例中，另一治療劑為Plk抑制劑，諸如伏拉塞替(volasertib)。
在任何方法之一些實施例中，另一治療劑為BCL2抑制劑。在一些實施例中，BCL2抑制劑為文妥克拉(venetoclax)。
在任何方法之一些實施例中，另一治療劑為表觀遺傳修飾劑。在一些實施例中，表觀遺傳修飾劑為組蛋白脫乙醯酶抑制劑。在一些實施例中，表觀遺傳修飾劑為DNA甲基轉移酶I抑制劑。在一些實施例中，表觀遺傳修飾劑為組蛋白甲基轉移酶抑制劑。在一些實施例中，表觀遺傳修飾劑為BET抑制劑。在一些實施例中，BET抑制劑選擇性地靶向第一溴結構域(BD1)。在一些實施例中，BET抑制劑選擇性地靶向第二溴結構域(BD2)。在一些實施例中，BET抑制劑為GSK1210151A、GSK525762、OTX-01、TEN-010、CPI-203及CPI-0610中之一種或多種。
在一些實施例中，本文所述之抗體(例如抗-CLL-1/CD3 TDB抗體)可與化療劑共投與。在一些實施例中，化療劑為阿糖胞苷、柔紅黴素 鹽酸鹽及依託泊苷。在一些實施例中，化療劑為柔紅黴素鹽酸鹽及阿糖胞苷。在一些實施例中，化療劑為氟魯達拉(fludara)及奧氟他(oforta)。在一些實施例中，化療劑為阿糖胞苷及蒽環黴素。在一些實施例中，蒽環黴素為柔紅黴素、伊達比星、多柔比星或表柔比星。在一些實施例中，化療劑為米托蒽醌、依託泊苷及阿糖胞苷。在一些實施例中，化療劑為阿糖胞苷、蒽環黴素及克羅拉濱。
在一些實施例中，本文所述之抗體(例如抗-CLL-1/CD3 TDB抗體)可與化療劑及粒細胞集落刺激因子共投與。在一些實施例中，化療劑為氟達拉濱及阿糖胞苷。在一些實施例中，化療劑為氟達拉濱、阿糖胞苷及伊達比星。
在一些實施例中，該等方法可進一步包含另一療法。該另一療法可為輻射療法、手術、化療法、基因療法、DNA療法、病毒療法、RNA療法、免疫療法、骨髓移植、奈米療法、單株抗體療法或前述各項之組合。另一療法可呈輔助或新輔助療法形式。在一些實施例中，另一療法為投與小分子酶抑制劑或抗轉移藥劑。在一些實施例中，另一療法為投與副作用限制劑(例如旨在減少治療副作用發生及/或嚴重性之藥劑，諸如抗噁心劑等)。在一些實施例中，另一療法為輻射療法。在一些實施例中，另一療法為手術。在一些實施例中，另一療法為輻射療法與手術之組合。在一些實施例中，另一療法為γ照射。在一些實施例中，另一療法為幹細胞移植。在一些實施例中，另一療法可為單獨投與以上所述之一或多種治療劑。
在任何方法之一些實施例中，另一治療劑為糖皮質激素。在一些實施例中，糖皮質激素選自以下各項組成之群：***、氫化可的松(hydrocortisone)、可的松、潑尼松龍、強的松、甲基強的松、去炎松(triamcinolone)、帕拉米松(paramethasone)、培他米松(betamethasone)、氟氫可的松(fludrocortisone)及其醫藥學上可接受之酯、鹽及複合物。在一些實施例中，糖皮質激素為***。在一些實施例中，糖皮質激素為***之醫藥學上可接受之酯、鹽或複合物。在一些實施例中，糖皮質激素為強的松。
在一些實施例中，另一療法進一步包含抗-AML抗體藥物結 合物。在一些實施例中，抗-AML抗體藥物結合物為抗-CD33抗體藥物結合物、抗-CLL1抗體藥物結合物及/或抗-CD123抗體藥物結合物。在一些實施例中，抗-CD33抗體藥物結合物為吉妥珠單抗奧唑米星(gemtuzumab ozogamicin)(亦稱為MYLOTARG)。在一些實施例中，抗-CLL-1抗體藥物結合物為抗-CLL-1抗體藥物結合物(例如抗-CLL-1吡咯并苯并二氮呯(PBD)抗體藥物結合物)。在一些實施例中，抗-CLL-1抗體藥物結合物為抗CD33抗體藥物結合物(例如抗CD33吡咯并苯并二氮呯(PBD)抗體藥物結合物)。在一些實施例中，抗-CD33抗體藥物結合物為瓦達司單抗塔立林(vadastuximab talirine)(亦稱為SGN-CD33A)。在一些實施例中，抗-CD123抗體藥物結合物為抗-CD123抗體藥物結合物(例如抗-CD123吡咯并苯并二氮呯(PBD)抗體藥物結合物)。在一些實施例中，抗-CLL-1抗體藥物結合物描述於U.S.8,088,378及/或US 2014/0030280任一者中，其特此以引用方式整體併入本文中。
在該等方法中之任一者之一些實施例中，另一療法包含癌症免疫療法。在該等方法中之任一者之一些實施例中，癌症免疫療法包含PD-1軸結合拮抗劑。在該等方法中之任一者之一些實施例中，癌症免疫療法包含PD-1結合拮抗劑。在一些實施例中，PD-1結合拮抗劑為抗-PD-1抗體。在一些實施例中，抗-PD-1抗體結合人類PD-1。在一些實施例中，抗-PD-1抗體為單株抗體。在一些實施例中，抗-PD-1抗體為MDX-1106(亦稱為BMS-936558/ONO-4538、尼沃魯單抗或OPDIVO)。在一些實施例中，抗-PD-1抗體為MK-3475(亦稱為SCH 900475、哌木株單抗(pembrolizumab)、蘭布株單抗(lambrolizumab)或KEYTRUDA)。在一些實施例中，抗-PD-1抗體為匹地株單抗(pidilizumab)(亦稱為CT-011)。
在該等方法中之任一者之一些實施例中，癌症免疫療法包含PD-L1結合拮抗劑。在一些實施例中，PD-L1結合拮抗劑為抗-PD-L1抗體。在一些實施例中，抗-PD-L1抗體結合人類PD-L1。在一些實施例中，抗-PD-L1抗體為單株抗體。可用於本文所述之方法中之抗-PD-L1抗體的實例描述於PCT專利申請案WO 2010/077634 A1及美國專利第8,217,149號中，其以引用方式整體併入本文中。可用於本文所述之方法中之抗-PD-L1抗體 的其他實例描述於PCT專利申請案WO 2007/005874、WO 2011/066389及US 2013/034559中，其以引用方式整體併入本文中。
在一些實施例中，抗-PD-L1抗體能夠抑制PD-L1與PD-1及/或PD-L1與B7-1之間的結合。在一些實施例中，抗-PD-L1抗體為選自以下各項組成之群的抗體片段：Fab、Fab’-SH、Fv、scFv及(Fab’)2片段。在一些實施例中，抗-PD-L1抗體為人類化抗體。在一些實施例中，抗-PD-L1抗體為人類抗體。
WO 2010/077634 A1及US 8,217,149中所述之抗-PD-L1抗體可用於本文所述之方法中。在一些實施例中，抗-PD-L1抗體為BMS-936559。在一些實施例中，抗-PD-L1抗體為MEDI4736。在一些實施例中，抗-PD-L1抗體為MPDL3280A(CAS登記號1380723-44-3)。在某些實施例中，抗-PD-L1抗體包含SEQ ID NO：94之重鏈可變區序列及SEQ ID NO：95之輕鏈可變區序列。在另一實施例中，提供一種經分離之抗-PD-L1抗體，其包含重鏈可變區及/或輕鏈可變區序列，其中：(a)重鏈序列與以下重鏈序列具有至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%序列一致性：EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：94)，且(b)輕鏈序列與以下輕鏈序列具有至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%序列一致性：DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYLYHPATFGQGTKVEIKR(SEQ ID NO：95)。
在一實施例中，抗-PD-L1抗體包含重鏈可變區，其包含HVR-H1、HVR-H2及HVR-H3序列，其中：(a)HVR-H1序列為GFTFSX1SWIH(SEQ ID NO：96)； (b)HVR-H2序列為AWIX2PYGGSX3YYADSVKG(SEQ ID NO：97)；且(c)HVR-H3序列為RHWPGGFDY(SEQ ID NO：98)；另外，其中：X1為D或G；X2為S或L；X3為T或S。
在一特定態樣中，X1為D；X2為S，且X3為T，使得(a)HVR-H1序列為GFTFSDSWIH(SEQ ID NO：99)；(b)HVR-H2序列為AWISPYGGSTYYADSVKG(SEQ ID NO：100)；且(c)HVR-H3序列為RHWPGGFDY(SEQ ID NO：98)；在另一態樣中，重鏈多肽進一步與包含HVR-L1、HVR-L2及HVR-L3之可變區輕鏈進行組合，其中：(a)HVR-L1序列為RASQX4X5X6TX7X8A(SEQ ID NO：101)；(b)HVR-L2序列為SASX9LX10S(SEQ ID NO：102)；且(c)HVR-L3序列為QQX11X12X13X14PX15T(SEQ ID NO：103)；其中：X4為D或V；X5為V或I；X6為S或N；X7為A或F；X8為V或L；X9為F或T；X10為Y或A；X11為Y、G、F或S；X12為L、Y、F或W；X13為Y、N、A、T、G、F或I；X14為H、V、P、T或I；X15為A、W、R、P或T。在另一態樣中，X4為D；X5為V；X6為S；X7為A；X8為V；X9為F；X10為Y；X11為Y；X12為L；X13為Y；X14為H；X15為A，使得(a)HVR-L1序列為RASQDVSTAVA(SEQ ID NO：104)；(b)HVR-L2序列為SASFLYS(SEQ ID NO：105)；且(c)HVR-L3序列為QQYLYHPAT(SEQ ID NO：106)。
因此，在某些實施例中，抗-PD-L1抗體包含包含以下HVR-H1、HVR-H2及HVR-H3序列之重鏈可變區，且包含包含以下HVR-L1、HVR-L2及HVR-L3序列之輕鏈可變區：(a)HVR-H1序列為GFTFSDSWIH(SEQ ID NO：99)；(b)HVR-H2序列為AWISPYGGSTYYADSVKG(SEQ ID NO：100)；(c)HVR-H3序列為RHWPGGFDY(SEQ ID NO：98)；(d)HVR-L1序列為RASQDVSTAVA(SEQ ID NO：104)；(e)HVR-L2序列為SASFLYS(SEQ ID NO：105)；且 (f)HVR-L3序列為QQYLYHPAT(SEQ ID NO：106)。
在該等方法中之任一者之一些實施例中，癌症免疫療法包含PD-L2結合拮抗劑。在一些實施例中，癌症免疫療法包含PD-L2/IgG1融合蛋白(AMP-224)。
在一些實施例中，癌症免疫療法包含針對活化共刺激分子之促效劑。在一些實施例中，活化共刺激分子可包括CD40、CD226、CD28、OX40、GITR、CD137、CD27、HVEM或CD127。在一些實施例中，針對活化共刺激分子之促效劑為結合CD40、CD226、CD28、OX40、GITR、CD137、CD27、HVEM或CD127之促效劑抗體。在一些實施例中，癌症免疫療法包含針對抑制性共刺激分子之拮抗劑。在一些實施例中，抑制性共刺激分子可包括CTLA-4(亦稱為CD152)、TIM-3、BTLA、VISTA、LAG-3、B7-H3、B7-H4、IDO、TIGIT、MICA/B或精胺酸酶。在一些實施例中，針對抑制性共刺激分子之拮抗劑為結合CTLA-4、TIM-3、BTLA、VISTA、LAG-3(例如LAG-3-IgG融合蛋白(IMP321))、B7-H3、B7-H4、IDO、TIGIT、MICA/B或精胺酸酶之拮抗劑抗體。
在該等方法中之任一者之一些實施例中，癌症免疫療法包含CTLA-4(亦稱為CD152)抑制。在一些實施例中，癌症免疫療法包含CTLA-4拮抗劑。在一些實施例中，CTLA-4拮抗劑為抗-CTLA-4抗體。在一些實施例中，抗-CTLA-4抗體為易普利單抗(ipilimumab)(亦稱為MDX-010、MDX-101或Yervoy®)。在一些實施例中，抗-CTLA-4抗體為曲美木單抗(tremelimumab)(亦稱為替西木單抗(ticilimumab)或CP-675,206)。
在一些實施例中，癌症免疫療法包含針對B7-H3(亦稱為CD276)之拮抗劑，例如阻斷抗體。在一些實施例中，癌症免疫療法包含MGA271(亦稱為伊諾株單抗(enoblituzumab))。
在一些實施例中，癌症免疫療法包含針對TGFβ之拮抗劑，例如美普木單抗(metelimumab)(亦稱為CAT-192)、氟索木單抗(fresolimumab)(亦稱為GC1008)或LY2157299。在該等方法中之任一者之一些實施例中，癌症免疫療法包含免疫促效劑。
在一些實施例中，另一療法包含表現嵌合抗原受體(CAR) (例如CART細胞)之T細胞(例如細胞毒性T細胞或CTL)的過繼轉移(adoptive transfer)。在一些實施例中，另一療法包含針對WT1之CART細胞。在一些實施例中，針對WT1之CART細胞為WT128z。在一些實施例中，另一療法包含針對LeY之CART細胞。在一些實施例中，另一療法包含針對CD33之CART細胞。在一些實施例中，另一療法包含針對CD123之CART細胞。在一些實施例中，另一治療包含T細胞的過繼轉移，該T細胞包含顯性陰性TGFβ受體，例如顯性陰性TGFβII型受體。
在一些實施例中，另一療法包含針對CD47之拮抗劑。在一些實施例中，針對CD47之拮抗劑為抗-CD47抗體。在一些實施例中，抗-CD47抗體為Hu5F9-G4。
在一些實施例中，另一療法包含針對CD137(亦稱為TNFRSF9、4-1BB或ILA)之促效劑，例如活化抗體。在一些實施例中，另一療法包含烏瑞魯單抗(urelumab)(亦稱為BMS-663513)。在一些實施例中，另一療法包含針對CD40之促效劑，例如活化抗體。在一些實施例中，另一療法包含CP-870893或RO7009789。在一些實施例中，另一療法針對OX40(亦稱為CD134)之激動劑，例如活化抗體。在一些實施例中，另一療法包含針對CD27之促效劑，例如活化抗體。在一些實施例中，另一療法包含CDX-1127(亦稱為瓦利魯單抗(varlilumab))。在一些實施例中，另一療法包含針對吲哚胺-2,3-二去氧酶(IDO)之拮抗劑。在一些實施例中，IDO拮抗劑為GDC-0919(亦稱為NLG919及RG6078)。在一些實施例中，IDO拮抗劑為1-甲基-D-色胺酸(亦稱為1-D-MT)。在一些實施例中，IDO拮抗劑為WO2010/005958(其內容以記錄方式明確併入本文)中所示之IDO拮抗劑。在一些實施例中，IDO拮抗劑為4-({2-[(胺基磺醯基)胺基]乙基}胺基)-N-(3-溴-4-氟苯基)-N’-羥基-1,2,5-噁二唑-3-苯甲脒(例如，如WO2010/005958之實例23中所述)。在一些實施例中，IDO拮抗劑為
在一些實施例中，IDO拮抗劑為INCB24360。在一些實施 例中，IDO拮抗劑為伊多莫德(Indoximod)(1-甲基-色胺酸之D異構體)。
在一些實施例中，另一療法包含抗腫瘤劑。在一些實施例中，另一療法包含靶向CSF-1R(亦稱為M-CSFR或CD115)之藥劑。在一些實施例中，另一療法包含抗-CSF-1R抗體(亦稱為IMC-CS4或LY3022855)。在一些實施例中，另一療法包含抗-CSF-1R抗體、RG7155(亦稱為RO5509554或艾瑪株單抗(emactuzumab)。在一些實施例中，另一療法包含干擾素，例如干擾素α或干擾素γ。在一些實施例中，另一療法包含羅干擾素(Roferon)-A(亦稱為重組干擾素α-2a)。在一些實施例中，另一療法包含GM-CSF(亦稱為重組人類粒細胞巨噬細胞集落刺激因子，rhu GM-CSF，沙格司亭(sargramostim)或Leukine®)。在一些實施例中，另一療法包含IL-2(亦稱為阿地白介素(aldesleukin)或Proleukin®)。在一些實施例中，另一療法包含IL-12。在一些實施例中，另一療法包含IL27。在一些實施例中，另一療法包含IL-15。在一些實施例中，另一療法包含ALT-803。在一些實施例中，另一療法包含靶向GITR之抗體。在一些實施例中，靶向GITR之抗體為TRX518。在一些實施例中，靶向GITR之抗體為MK04166(Merck)。
在一些實施例中，另一療法包含布魯頓酪胺酸激酶(BTK)之抑制劑。在一些實施例中，另一療法包含伊布替尼(ibrutinib)。在一些實施例中，另一療法包含異檸檬酸脫氫酶1(IDH1)及/或異檸檬酸脫氫酶2(IDH2)之抑制劑。在一些實施例中，另一療法包含AG-120(Agios)。
在一些實施例中，另一療法包含癌症疫苗。在一些實施例中，癌症疫苗為個性化癌症疫苗。在一些實施例中，癌症疫苗為肽癌症疫苗。在一些實施例中，肽癌症疫苗為多價長肽、多肽、肽混合物、雜合肽或肽衝擊(peptide-pulsed)之樹突細胞疫苗(參見例如Yamada等人,Cancer Sci,104：14-21,2013)。在一些實施例中，癌症疫苗為基於DNA之癌症疫苗。在一些實施例中，基於DNA之癌症疫苗包含裸DNA。在一些實施例中，基於DNA之癌症疫苗包含經DNA轉染之細胞。在一些實施例中，細胞為樹突細胞。在一些實施例中，癌症疫苗為基於RNA之癌症疫苗。在一些實施例中，基於RNA之癌症疫苗為基於mRNA之癌症疫苗。在一些實施例中，基於mRNA之癌症疫苗包含裸RNA。在一些實施例中，基於RNA之癌症 疫苗為包含經RNA轉染之細胞。在一些實施例中，RNA經塗覆在顆粒上。在一些實施例中，RNA在樹突細胞中活體外轉染。在一些實施例中，mRNA經定製以充當刺激先天性免疫系統之佐劑。在一些實施例中，癌症疫苗包含佐劑。在一些實施例中，佐劑包含TLR促效劑，例如聚ICLC(亦稱為Hiltonol®)、LPS、MPL或CpG ODN。在一些實施例中，癌症疫苗包含脂質體。
在一些實施例中，另一療法包含IL-10拮抗劑。在一些實施例中，另一療法包含IL-4拮抗劑。在一些實施例中，另一療法包含IL-13拮抗劑。在一些實施例中，另一療法包含IL-17拮抗劑。在一些實施例中，另一療法包含HVEM拮抗劑。在一些實施例中，另一療法包含ICOS促效劑，例如藉由投與ICOS-L或針對ICOS之促效性抗體。在一些實施例中，另一療法包含靶向CX3CL1之治療。在一些實施例中，另一療法包含靶向CXCL9之治療。在一些實施例中，另一療法包含靶向CXCL10之治療。在一些實施例中，另一療法包含靶向CCL5之治療。在一些實施例中，另一療法包含LFA-1或ICAM1促效劑。在一些實施例中，另一療法包含選擇蛋白促效劑。
在一些實施例中，另一療法包含MEK諸如MEK1(亦稱為MAP2K1)及/或MEK2(亦稱為MAP2K2)之抑制劑。在一些實施例中，另一療法包含庫美替尼(cobimetinib)(亦稱為GDC-0973或XL-518)。在一些實施例中，另一療法包含曲美替尼(trametinib)(亦稱為Mekinist®)。在一些實施例中，另一療法包含比美替尼(binimetinib)。
在一些實施例中，另一療法包含磷脂醯肌醇3激酶(PI3K)之δ選擇性抑制劑。在一些實施例中，另一療法包含伊德利斯(idelalisib)(亦稱為GS-1101或CAL-101)。在一些實施例中，另一療法包含塔舍利斯(taselisib)(亦稱為GDC-0032)。在一些實施例中，另一療法包含BYL-719。
在一些實施例中，另一療法包含LSD1(亦稱為KDM1A)之抑制劑。在一些實施例中，另一療法包含ORY-1001。在一些實施例中，另一療法包含GSK2879552。
在一些實施例中，另一療法包含MDM2之抑制劑。在一些 實施例中，另一療法包含RG7112。在一些實施例中，另一療法包含伊達特林(idasanutlin)(亦稱為RG7388或RO5503781)。在一些實施例中，另一療法包含DS-3032b。在一些實施例中，另一療法包含SAR405838。在一些實施例中，另一療法包含CGM-097。在一些實施例中，另一療法包含MK-8242。在一些實施例中，另一療法包含AMG-232。
在一些實施例中，另一療法包含BCL2之抑制劑。在一些實施例中，另一療法包含文妥克拉。
在一些實施例中，另一療法包含CHK1之抑制劑。在一些實施例中，另一療法包含GDC-0575(亦稱為ARRY-575)。在一些實施例中，另一療法包含GDC-0425(亦稱為RG7602)。在一些實施例中，另一療法包含LY2606368。
在一些實施例中，另一療法包含活化刺蝟信號傳導途徑之抑制劑。在一些實施例中，另一療法包含ERIVEDGE。
在一些實施例中，另一療法包含募集T細胞至腫瘤之藥劑。在一些實施例中，另一療法包含利魯單抗(lirilumab)(IPH2102/BMS-986015)。在一些實施例中，另一療法包含伊德利斯。
以上所述之此等組合療法涵蓋組合投藥(其中兩種或兩種以上治療劑包括在同一或各別調配物中)，及單獨投藥，在該情況下，可在投與其他治療劑及/或佐劑之前、同時及/或之後投與CLL-1/CD3 TDB抗體。
在任何方法之一些實施例中，本發明之抗體(及任何其他治療劑)可藉由任何適合手段投與，包括非經腸、肺內及鼻內投藥，且必要時，對於局部治療而言，包括病變內投藥。非經腸輸注包括肌肉內、靜脈內、動脈內、腹膜內或皮下投藥。可藉由任何適合途徑進行給藥，例如藉由注射，諸如靜脈內或皮下注射進行給藥，在某種程度上視投藥為短期抑或長期而定。本文涵蓋各種給藥時程，包括但不限於單次投藥或歷經各個時間點多次投藥、快速注射投藥及脈衝輸注。在一些實施例中，投藥為皮下。
本發明之抗體將以符合優良醫學規範之方式調配、給藥及投與。在此情形下考慮之因素包括所治療之特定病症、所治療之特定哺乳動物、個別患者之臨床病狀、病症之病因、藥劑傳遞部位、投藥方法、投藥 時程及醫學從業者已知之其他因素。抗體無需但視情況與一或多種當前用於預防或治療所討論病症之藥劑一起調配。此等其他藥劑之有效量取決於調配物中存在之抗體之量、病症或治療之類型、及以上論述之其他因素。此等藥劑係通常以與本文所述相同之劑量及用如本文所述之投藥途徑，或以本文所述劑量之約1%至99%，或以憑經驗/臨床上確定為適當之任何劑量且藉由憑經驗/臨床上確定為適當之任何途徑加以使用。
對於預防或治療疾病，本發明之抗體(當單獨或與一或多種其他額外治療劑組合使用時)之適當劑量將取決於欲治療疾病之類型、抗體之類型、疾病之嚴重性及病程、投與抗體係出於預防目的抑或治療目的、先前療法、患者之臨床病史及對抗體之反應、及主治醫師之判斷。抗體適合一次性或歷經一系列治療投與患者。
作為一般性提議，投與人類之抗-CLL-1抗體(例如抗-CLL-1/CD3 TDB抗體)的治療有效量將在約0.01至約100mg/kg患者體重範圍內，無論係藉由一次抑或多次投藥。在一些實施例中，所用抗體為例如每天投與約0.01至約45mg/kg、約0.01至約40mg/kg、約0.01至約35mg/kg、約0.01至約30mg/kg、約0.01至約25mg/kg、約0.01至約20mg/kg、約0.01至約15mg/kg、約0.01至約10mg/kg、約0.01至約5mg/kg或約0.01至約1mg/kg。在一實施例中，在21天週期之第一天以約100mg、約200mg、約300mg、約400mg、約500mg、約600mg、約700mg、約800mg、約900mg、約1000mg、約1100mg、約1200mg、約1300mg或約1400mg之劑量向人類投與本文所述之抗-CLL-1抗體(例如抗-CLL-1/CD3 TDB抗體)。劑量可作為單一劑量或多個劑量(例如2或3個劑量)投與，諸如輸注。對於歷經數天或更長時間之重複投藥，視病狀而定，治療將通常持續直至對疾病症狀產生所需抑制作用為止。抗體之一示範性劑量將在約0.05mg/kg至約10mg/kg範圍內。因此，可向患者投與一或多個約0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg或10mg/kg(或其任何組合)劑量。此等劑量可間歇投與，例如每週或每三週(例如使得患者接受約2至約20個，或例如約6個劑量之抗-CLL-1抗體(例如抗-CLL-1/CD3 TDB抗體)。最初可投與較高之起始劑量，接著可投與一或多種較低劑量。此療法之進展易於藉由習知 技術及分析加以監測。
H.製品
在本發明之另一態樣中，提供一種含有適用於治療、預防及/或診斷上述病症之材料之製品。該製品包含容器及在該容器上或與該容器相伴之標籤或包裝插頁。合適容器包括例如瓶、小瓶、注射器、IV溶液袋等。容器可由諸如玻璃或塑膠之多種材料形成。容器容納單獨或與有效治療、預防及/或診斷病症之另一組合物組合之組合物且可具有無菌存取口(例如容器可為具有可由皮下注射針刺穿之塞的靜脈內溶液袋或小瓶)。組合物中之至少一種活性劑為本發明之抗體。標籤或包裝插頁指示組合物用於治療所選病狀。此外，製品可包含(a)其中含有組合物之第一容器，其中該組合物包含本發明之抗體；及(b)其中含有組合物之第二容器，其中該組合物包含另一細胞毒性劑或另外的治療劑。本發明之此實施例中之製品可進一步包含指示組合物可用於治療特定病狀之包裝插頁。或者或另外，製品可進一步包含第二(或第三)容器，其包含醫藥學上可接受之緩衝液，諸如注射用抑菌水(BWFI)、磷酸鹽緩衝生理食鹽水、林格氏溶液(Ringer's solution)或右旋糖溶液。其可進一步包括自商業及使用者觀點看來合乎需要之其他物質，包括其他緩衝劑、稀釋劑、過濾器、針及注射器。
應理解任何以上製品均可包括抗-CLL-1抗體，其中該抗體包含本發明之CLL-1結合域及CD3結合域。在一些實施例中，抗-CLL-1抗體為雙特異性抗體。
III.實施例
以下為本發明之方法及組合物之實例。應瞭解鑒於以上提供之一般性描述，可實施各種其他實施例。
實例1-抗-CLL-1抗體
A.單株抗體產生
使用以下程式，藉由用融合至哺乳動物表現系統中表現之N末端旗標(DYKDDDDK)的重組hu及cyno CLL-1胞外域(ECD，65-265huCLL-1及65-265 cynoCLL-1之胺基酸)使動物免疫，產生針對人類(hu)及獼猴(cyno)CLL-1之單株抗體。huCLL1 ECD蛋白(胺基酸65-265)包含SNP, AAA(Lys,K)244->CAA(GLN,Q)，其具有29%之微小等位元基因頻率(MAF)。
擴充陽性純系且藉由ELISA及FACS再次篩檢與huCLL-1及cynoCLL-1之結合。鑑別出5個純系：m3H10、m6E7、m20B1、m21C9及m28H12，藉由螢光活化細胞分選(FACS)，其與表現重組hu及cyno CLL-1之穩定細胞株且與急性骨髓性白血病腫瘤細胞株上表現之腫瘤來源之CLL-1強烈反應。鼠類重鏈及輕鏈可變域之胺基酸序列的比對示於圖1A及B中。m3H10及m21C9共用同一重鏈及輕鏈CDR，只有m21C9重鏈及輕鏈可變區之胺基酸序列示於圖1中。
B.物種交叉反應性及結合親和力
測試單株抗體以測定其是否與cynoCLL-1胞外域(ECD)(與huCLL-1蛋白ECD 85.07%一致且87.35%相似)交叉反應。藉由CM5感測器晶片上塗覆之小鼠抗-人類IgG捕獲嵌合抗-CLL-1人類IgG。對於動力學量測，注射人類或cyno CLL-1於HBS-EP緩衝液之三倍連續稀釋液(4.1nM至1000nM)。使用簡單一對一朗繆爾結合模型計算締合速率(kon)及解離速率(koff)。平衡解離常數(KD)計算為比率koft/kon。下表2示出五種抗體(m3H10、m6E7、m20B1、m21C9及m28H12)之嵌合形式識別重組hu與cynoCLL-1，且提供關於與hu及cyno-CLL-1相互作用之動力學之細節。藉由FACS分析來自獼猴(Mauritian來源)之血液(資料未示出)，進一步確認與cyno CLL-1之交叉反應性。
遵循標準程式(Holmes等人,Science 256：1205-1210(1992))進行斯卡查德(Scatchard)分析以測定包括ch6E7及ch21C9之抗體的相對結合親和力。
用間接Iodogen法使抗抗-CLL-1抗體經[I125]標記。使用NAP5管柱(GE Healthcare)，藉由凝膠過濾自游離125I-Na純化經[I125]標記之抗-CLL-1抗體；經純化之碘化抗-CLL-1抗體之比活性在8-10μCi/μg範圍內。將50μL體積之含有固定濃度之經[I125]標記之抗體及遞減濃度之經連續稀釋之未標記抗體的競爭分析混合物置放於96孔板中。在生長培養基中在37℃、5% CO2下培養穩定表現重組hu或cynoCLL-1之HEK293AD細胞或表現內源性CLL-1之HL-60腫瘤細胞。使用Sigma細胞解離溶液使細胞自燒瓶脫壁且用結合緩衝液洗滌，該結合緩衝液由含1%牛血清白蛋白(BSA)、300mM人類IgG及0.1%疊氮化鈉之杜氏經改良依格培養基(Dulbecco's Modified Eagle Medium，DMEM)組成。以在0.2mL結合緩衝液中含100,000個細胞之密度將經洗滌之細胞添加至96孔板中。經[I125]標記之抗體在各孔中之最終濃度為約250pM。經由10步2倍稀釋使得未標記抗體在競爭分析中之最終濃度在1000nM至0nM僅含緩衝液之分析之範圍內。一式三份進行競爭分析。在室溫下培育競爭分析物2小時。在培育2小時之後，將競爭分析物轉移至Millipore多重篩檢過濾培養盤(Billerica,MA)中且用結合緩衝液洗滌4次以使游離抗體與結合之經[I125]標記之抗體分離。在Wallac Wizard 1470 γ計數器(PerkinElmer Life and Analytical Sciences公司；Wellesley,MA)上對過濾器計數。使用NewLigand軟體(Genentech)評估結合資料，該軟體使用Munson及Robard之擬合演演算法來確定抗體之結合親和力(Munson及Robard,1980)。
表3示出對HEK293AD CLL-1穩定細胞表現之重組hu及cynoCLL-1及對HL-60細胞之親和力(kD範圍為0.45-1.2nM)。
C.單株抗體抗原決定基分組
亦使用基於細胞之競爭結合FACS分析確定抗原決定基分組。在存在或不存在50-100倍過量之未經標記競爭抗體情況下孵育HL-60細胞，接著用直接標記之偵測抗體染色，來自偵測抗體之信號減少指示未經標記競爭抗體與偵測抗體結合CLL-1上之相同或相似區域，此在同一抗體用作偵測劑及競爭劑時應發生。當不存在不同未經標記抗體阻斷偵測信號時，該未經標記抗體結合CLL-1中之不同區域。
表4示出針對CLL-1之抗體的抗原決定基分組。ch6E7及ch21C9與R&D Systems-PE(純系687317)同倉(bin)，但ch20B1及ch28H12並非如此。R&D Systems亦阻斷eBioscience HB3，但ch6E7及ch21C9未能阻斷eBioscience純系HB3結合。ch20B1及ch28H12無法與任何其他抗體競爭，表明各抗體結合相異抗原決定基。所有抗體均無法與BD Biosciences純系50C1競爭，亦表明其結合相異抗原決定基。
D.抗-CLL-1抗體之人類化
如以下所述將單株抗體6E7及21C9人類化。殘基編號係根據Kabat等人,Sequences of proteins of immunological interest,第5版,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991)中。
以IgG形式評定在6E7及21C9之人類化期間構築之變異體。將來自鼠類6E7及21C9之VL及VH域與人類VL κ I(VLKI)及人類VH亞群I(VHI)一致序列比對。將來自鼠類抗體之高變區工程改造至VLKI及VHI接受體構架中。具體言之，位置24-34(L1)、50-56(L2)及89-97(L3)自mu6E7及mu21C9 VL域移植至VLKI，且位置26-35(H1)、50-65(H2) 及93-102(H3)自mu6E7及mu21C9 VH域移植至VHI。
藉由BIAcoreTM T200形式測定此部分之抗體的結合親和力。簡言之，根據供應商之說明書，用1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳化二亞胺(EDC)及N-羥基丁二醯亞胺(NHS)試劑活化BLAcoreTM研究級CM5晶片。將山羊抗-人類Fc IgG偶聯至晶片，以在各流動單元中達成約10,000個反應單位(RU)。用1M乙醇胺阻斷未反應之偶聯基團。對於動力學量測，捕捉抗體以達成約300 RU。在25℃下以30μl/min之流速注射人類CLL-1於HBS-P緩衝液(0.01M HEPES pH7.4，0.15M NaCl，0.005%介面活性劑P20)中之三倍連續稀釋液。使用1：1朗繆爾結合模型(BLAcoreTMT200評估軟體第2.0版)計算締合速率(kon)及解離速率(koff)。平衡解離常數(Kd)計算為比率koff/kon。
將CDR移植物人類化6E7抗體之結合親和力與嵌合6E7進行比較。製備CDR移植物人類化6E7抗體之其他變異體以評估游標(vernier)位置對結合CLL-1之貢獻。對於6E7，首先4個其他輕鏈(L1：CDR移植物+(L4、L48及K49)；L2：CDR移植物+L4；L3：CDR移植物+K49；及L4：CDR移植物+K49)及5個其他重鏈(H1：CDR移植物+(A67、L69、V71、K73)；H2：CDR移植物+A67；H3：CDR移植物+L69；H4：CDR移植物+V71；及H5：CDR移植物+K73)。基於突變分析(資料未示出)，輕鏈上之K49為關鍵小鼠游標殘基，且重鏈上之L69及V71經確定為關鍵小鼠游標殘基。嵌合6E7以9.59E-10M之KD進行結合，而CDR移植物+K49(LC)+(A67、L69、V71、K73(HC))、CDR移植物+K49(LC)+(L69、V71(HC))分別以1.40E-9M及1.37E-9M之KD進行結合。
將CDR移植物人類化21C9抗體之結合親和力與嵌合21C9進行比較。製備CDR移植物人類化21C9抗體之其他變異體以評估游標位置對結合CLL-1之貢獻。對於21C9，首先3個其他輕鏈(L1：CDR移植物+(F36及S43)；L2：CDR移植物+F36；L3：CDR移植物+S43)及5個其他重鏈(H1：CDR移植物+(A67、L69、V71、K73)；H2：CDR移植物+A67；H3：CDR移植物+L69；H4：CDR移植物+V71；及H5：CDR移植物+K73)。輕鏈上之F36為關鍵小鼠游標殘基。嵌合21C9以8.615E-9M之KD進行 結合，而CDR移植物+(F36及S43(LC))+L69(HC)及CDR移植物+F36(LC)+L69(HC)分別以1.053E-8M及9.785-9M之KD進行結合。重鏈上之L69為關鍵小鼠游標殘基。
除在cyno結合分析中cynoCLL-1取代huCLL-1以外，如以上所述，測試人類化6E7.L4H1e及21C9.L2H3之結合人類及cyno CLL-1的能力，下表5中示出人類化抗體之結合性質。人類化6E7.L4H1e之結合親和力為0.34、0.29、0.22及0.35 Kd(nM)，如藉由斯卡查德法分別使用HL-60、EOL-1、293AD/cynoCLL1及293AD/huCLL-1細胞所測定。人類化21C9.L2H3之結合親和力為1.3、0.74、2.4及3.6 Kd(nM)，如藉由斯卡查德法分別使用HL-60、EOL-1、293AD/cynoCLL1及293AD/huCLL-1細胞所測定。
在熱應激(40℃，pH 5.5，2週)及2,2'-偶氮基雙(2-脒基丙烷)鹽酸鹽(AAPH)分析下測試人類化抗體6E7.L4H1e及21C9.L2H3。對樣品進行熱應激，以類比產品歷經儲存期之穩定性。將樣品緩衝液交換至20mM His乙酸鹽、240mM蔗糖(pH 5.5)中，且稀釋成濃度為1mg/mL。使1mL樣品在40℃下應激2週，且第二樣品儲存在-70℃作為對照。接著，使用胰蛋白酶消化兩個樣品，以產生肽，其可使用液相層析(LC)-質譜(MS)分析進行分析。對於樣品中之各肽，在MS中獲得來自LC之保留時間以及高解析度準確品質及肽離子碎裂資訊(胺基酸序列資訊)。以+-10ppm之視窗自資料集獲取相關肽(天然及修飾之肽離子)之萃取離子層析圖(XIC)，且對峰積分以測定面積。藉由(經修飾肽之面積)除以(經修飾肽之面積+天然肽之面積)乘以100計算各樣品之修飾的相對百分比。
6E7.L4H1e與h21C9.L2H3在DR-H2中均具有N54G55，其對脫胺基作用敏感(對於6E7.L4H1e，t0=13.2%且t2wk為14.5%，且r0=11%，且t2wk=11.9%)。測試兩種抗體之N54變異體以測定是否可降低潛在脫胺 基作用，而不影響結合hu及cynoCLL-1。參見表6。
對於人類化6E7.L4H1e CDR-H2 N54抗體變異體，A54具有與N54最相似之可接受的結合特徵。對於人類化21C9.L2H3 CDR-H2 N54抗體變異體，所有變異體均示出與huCLL-1(以解離速率計，10-30倍)及cynoCLL-1(以締合速率計，60-500倍)之親和力下降。人類化6E7.L4H1e之結合親和力為0.67、0.68、0.6及0.25 Kd(nM)，如藉由斯卡查德法分別使用293AD/cynoCLL1、293AD/huCLL-1、HL-60及EOL-1細胞所測定。人類化6E7.L4H1eN54A之結合親和力為0.9、0.89、0.64及0.32 Kd(nM)，如藉由斯卡查德法分別使用293AD/cynoCLL1、293AD/huCLL-1、HL-60及EOL-1細胞所測定。人類化6E7及21C9抗體之重鏈及輕鏈可變域胺基酸序列之比對分別示出在圖2A-B及圖3A-B中。
E.抗原決定基定位
為確定CLL-1之結合抗原決定基，使用羥基自由基足跡(HRF)技術檢查(a)游離抗原CLL-1及(b)三種不同抗原-mAb複合物。在Brookhaven National Laboratory使用X28c光束線使樣品暴露至羥基自由基持續0、10、15及20毫秒(ms)之間隔。使用PNG酶F使經標記樣品經受去糖基化作用。首先對去糖基化樣品進行預實驗，以便優化實驗方案。使用MS進行之預研究揭示樣品含有顯著量之聚合物污染，要求額外清除。為去除聚合物污染，使用含三氯乙酸之丙酮沉澱樣品，經經受LC-MS分析。沉澱步驟成功，且MS內之聚合物污染信號顯著削弱。使清潔樣品經受還原 及烷基化，使用胰蛋白酶消化，之後液相層析法聯合高解析度質譜法(LC-MS)。使用ProtMapMS分析MS資料，得到各肽之劑量反應曲線圖。將游離抗原之結果與各複合形式進行比較。使用Swiss-Model軟體產生抗原之基於同源性的模型，且針對三種複合物中之每一者進行溶劑保護區域定位。
使用胰蛋白酶定位獲得之總序列覆蓋率為90.05%。缺失區域主要包含長度短於4個殘基之胰蛋白酶消化肽，由於其在LC柱上之若保留性質，其可固有地難以檢測。HRF過程引入穩定側鏈氧化性修飾，產生特定品質位移，其可自串聯質譜資料鑑別。針對非氧化及所有氧化形式之肽離子(具有特定m/z)提取所選離子層析圖(SIC)且積分。此等峰面積值用於以劑量反應(DR)曲線圖形式表徵反應動力學，該等曲線圖量測作為羥基自由基暴露之函數，完整肽之損失。與游離抗原相反，複合物中之溶劑保護區域經歷逐漸氧化反應。氧化速率(稱為速率常數RC)之差異用來凸顯抗原決定基之位置。
使用ProtMapMS處理MS資料，得到各肽之RC值。最終結果示出在表6中。肽位置和對應序列示出在第1行及第2行。第3行示出複合物1(6E7.L4H1eA54抗體及CLL-1抗原)之保護比PR(=RC抗原/RC複合物)。相似地，第4行及第5行示出複合物2(經工程改造具有在K149處包含半胱胺酸殘基(K149C)(根據Kabat編號)之輕鏈的21C9.L2H3抗體及CLL-1抗原)及複合物3(R&D Systems單株抗-CLL1抗體(純系687317)及CLL-1抗原)之對應保護比。若既定肽之PR值小於1，則由於在複合物形成過程中所引入之結構變化，對應區域之溶劑可及性增加。PR值接近1指示區域之溶劑可及性保持不變，而PR>1表明作為複合物形成之函數，對應區域顯示出保護免於溶劑。對於各複合物，大多數肽之PR值接近1，指示對應區域之溶劑可及性之最小變化。對於所有三種抗體，肽142-158一致地示出最高PR值，暗示對該區域之顯著保護。除對肽142-158之保護作用外，不同於6E7.L4H1eAG及21C9.L2H3，R&D Systems單株抗-CLL1抗體(純系687317亦示出對區域103-116之顯著保護作用，如藉由重疊肽103-116及105-116所證明。
F.抗-CLL-1抗體之內化作用
為測定抗-CLL-1抗體在結合時是否內化，將HL-60或HL-60細胞在37℃下用含0.3mg/ml hIgG之RPMI培養基預孵育2小時，以在接種在經細胞培養物處理之4孔室載玻片(Nalge Nunc International)之前減少與FcR之非特異性結合。用hIgG阻斷之細胞在冰上在黑暗中將最終濃度為1μg/mL之直接結合至Dylight 488之抗體孵育30分鐘。使細胞立即成像以示出膜染色(T0)，接著用Leica SP5共焦顯微鏡在37℃下經10小時時間段進行延時攝影。代表性實例ch21C9在30分鐘內藉由HL-60細胞快速內化(資料未示出)。使用活體外基於細胞之分析確認ch21C9定位至溶酶體。
實例2：CLL1 T細胞依賴性雙特異性(TDB)抗體之功效
以下實例示出在一條臂上包含抗-人類CLL-1之結合決定簇且在另一臂上包含抗-人類CD3e之經工程改造的T細胞依賴性雙特異性抗體為可重新導引個體之免疫系統殺傷來自人類供體之急性骨髓性白血病腫 瘤細胞及正常CD14+單核細胞之有效免疫調節分子。藉由監控人類PBMC群體中未接觸人類CD8+ T細胞對AML腫瘤細胞株(EOL-1、HL-60、THP-1、U937、Nomo-1、PL-21、ML-2及Molm-13)之殺傷或藉由監控自體CD14+單核細胞經自體T細胞之殺傷來證明TDB功效。
用於以下實例中之TDB含有CLL-1結合決定簇：其來自抗-CLL-1小鼠及來自以下三個不同抗原決定基倉(bin)之人類化單株抗體純系：1)6E7及/或21C9，2)20B1及3)28H12；及來自以下各項之結合決定簇：人類化抗-CD3ε純系、高親和力抗體38E4v1及低親和力抗體40G5c，如藉由Biacore所確定(hCD3ε 1-27Fc(分別為1.0及13nM)、hCD3εγ(分別為0.5及12nM)及cynoCD3εγ(分別為0.7及14nM)以及具有hCD3之極高親和力抗體38E4v11(0.05nM；對hCD3 ε之Fab Biacore量測值為-5.00E+07 ka(1/Ms)、1.60E-03 kd(1/s)及0.032 KD(nM))。對38E4v1之hCD3 ε的Fab Biarcore量測值為8.15E+06 ka(1/Ms)、3.17E-03 kd(1/s)及0.389KD(nM)。38E4v1、38E4v11及40G5c結合人類CD3 ε多肽(人類CD3 ε多肽之由胺基酸1-26(SEQ ID NO：86)或1-27(SEQ ID NO：87)組成的片段)，且不要求CD3 ε之胺基酸殘基Glu5用於結合(資料未示出，亦參見PCT/US14/70951，其通過引用整體併入)。
A.材料及方法
在所有實驗中，標靶細胞、AML腫瘤細胞株、PBMC或AML患者骨髓細胞在37℃下在含有10% FCS、2mM谷胺醯胺及0.3mg/ml經純化低內毒素人類IgG(Molecular Innovations，HU-GF-ED)之RPMI培養基中預孵育1-2小時，以防止TDB與表面表現FcγR之細胞的非特異性結合。在第一實例中，自正常人類供體分離PBMC，且使用來自Miltenyi Biotec GmbH(Miltenyi；130-096-495)之套組富集PBMC中之未接觸CD8+ T細胞。分析在含有60,000個細胞/孔之人類CD8+ T細胞及20,000個細胞/孔之經hIgG阻斷之標靶細胞的96孔圓底板(Costar 3799)中進行；效應子與標靶比(E：T)為3：1。TDB(例如h6E7(6E7.L4H1e)-38E4v1、h21C9(h21C9.L2H3)-38E4v1或陰性對照抗-gD-38E4v1)作為10×工作溶液來添加，其被連續3倍稀釋至跨度為0-10ug/ml或0-1ug/ml之最終分析濃 度。添加順序如下：50ul 2×標靶細胞、11ul 10×3倍連續稀釋之TDB及50ul 2×CD8+ T細胞。內容物在滴定板振盪器(Thermo)上在設置6下混合15sec，且在37℃下孵育約40h。板每天混合一次。使用抗-CD123-APC(BD Pharmingen；560087)或抗-CD33-APC試劑(BD Phatmingen；551378)及碘化丙錠藉由FACS監控表現hCLL-1之EOL-1、THP-1、HL-60、Nomo-1、ML-2、PL-21、U937及Molm-13細胞之消耗。使用抗-CD8-FITC(BD Pharmingen；555634)、抗-CD69-PE(BD Pharmingen；555531)及抗-CD25(BD Pharmingen；555434)之組合監控CD8+ T細胞之活化。添加Fluoresbrite校準微球(Polysciences，Warrington,PA)至各樣品，以確保獲取一致數目之事件。使用Flowjo v9.7.5進行資料分析，且使用程式PRISM-4(GraphPad軟體)測定EC50。
對於第二實例，人類或獼猴PBMC藉由Hypaque-Ficoll梯度濃縮(Ficoll-Paque Plus，GE Healthcare)分離，在低速下洗滌以去除血小板，且重懸於含有hIgG之RPMI中，以阻斷TDB非特異性結合至FcγR。分析如以上所述進行，除了用11ul 10×3倍連續稀釋之TDB孵育濃度為200,000/孔之PBMC。E：T比未測定，且其為供體依賴性的。藉由FACS在40小時時評估靶細胞殺傷(CD14+單核細胞)及效應T細胞(CD8+)活化。表現hCLL-1之CD14+單核細胞的消耗使用抗-CD14-APC試劑(Human BD Pharmingen；555399，Cyno Miltenyi：130-091-243)及碘化丙錠進行監控。如以上部分所概括進行CD8+ T細胞之活化。
產生TDB-作為人類IgG1，以孔中鈕形式產生作為全長抗體之TDB抗體，如先前所述(Atwell等人.J.Mol.Biol.270：26-35,1997)。在大腸桿菌或中國倉鼠卵巢(CHO)細胞中表現半抗體，藉由蛋白A親和力層析法純化，且如先前所述使適當半抗體對活體外退火(Spiess等人,Nat.Biotechnol.2013)。若在CHO細胞中進行TDB抗體產生，則抗體可包括去糖基化突變，例如在殘基N297(例如N297G)處，使得TDB抗體為低效應變異體且不能啟始抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)。
退火後，藉由疏水相互作用層析法純(HIC)化抗-CLL-1/CD3 TDB抗體，且藉由分析型凝膠過濾、質譜及聚丙烯醯胺凝膠電泳進行表徵。 所純化之抗體在凝膠過濾中作為單一峰(>99%之信號)操作，具有小於0.2%聚集體。未藉由質譜偵測到均二聚體。
B.結果
以TDB形式測試不同抗-CLL1抗體組之功效。倉1包括親本h6E7及h6E7變異體及親本h21C9，倉2包括20B1，且倉3包括28H12。如圖4A所示，親本h6E7(6E7.L4H1eN54)以及變異體6E7.L4H1eA54(倉1)與38E4v1之組合導致顯著腫瘤細胞(EOL-1)殺傷，與非靶向抗-gD臂與38E4v1之組合相比，其為劑量依賴性與抗原特異性的。此外，對hCLL-1(113.2nM)之親和力顯著降低的h6E7之脫胺基化形式之產物(6E7.L4H1eD54)與的38E4v1組合示出可忽略細胞殺傷。抗原決定基倉2，抗-CLL-1抗體20B1，儘管對人類CLL-1具有與6E7.L4H1eA54相似之親和力，但與相同抗-CD3臂(38E4v1)之組合具有顯著降低之腫瘤細胞(EOL-1)殺傷。抗原決定基倉3，抗-CLL-1抗體28H12，其與38E4v1之組合示出可忽略腫瘤細胞殺傷。參見圖4A。結果之概述提供在下表7中。基於此等結果，進一步探索人類/cyno CLL-1抗原決定基倉1。
h6E7與h21C9均為CLL-1抗原決定基倉1之一部分。如圖4B所示進行實驗，以測試h6E7及h21C9抗-CLL-1 TDB殺傷來一單一供體之表現人類CLL-1之AML腫瘤細胞株(EOL-1/THP-1)或自體CD14+細胞的功效。與陰性對照TDB抗-gD×38E4v1(其在最大TDB濃度1μg/ml下未示出特異性殺傷或CD8+ T細胞活化)相比，CLL-1 TDB h6E7(6E7.L4H1e)×38E4v1與h21C9(h21C9.L2H3)×38E4v1均以劑量依賴性方式示出標靶細胞之顯著殺傷。此外，引出最大殺傷之TDB濃度與最大CD8+ T細胞活化一致(圖4C)。藉由h6E7(6E7.L4H1e)×38E4v1殺傷標靶細胞之 EC50為9.1ng/ml(EOL-1)、5.4ng/ml(THP-1)、2.8ng/ml(人類CD14+單核細胞)，且藉由h21C9(h21C9.L2H3)×38E4v1殺傷標靶細胞之EC50為14.8ng/ml(人類CD14+單核細胞)。
在使用其他供體之實驗(圖5A)中，h21C9(h21C9.L2H3)×38E4v1示出對EOL-1之顯著殺傷(EC50為16.3ng/ml)，及對HL-60之極弱活性，而h6E7(6E7.L4H1e)×38E4v1顯示對EOL-1(EC50為7.4ng/ml)及HL-60(EC50為95.6ng/ml)之顯著殺傷。來自表示疾病之不同亞型的AML細胞株之CLL-1表現及殺傷資料示出在第三供體上(圖5B & C)，包括缺少hIgG Fc區域之Bis-Fab TDB h6E7(6E7.L4H1e)×38E4v1，其對EOL-1細胞(虛線)具有與h6E7(6E7.L4H1e)×38E4v1 hIgG TDB相似之殺傷。總之，h6E7(6E7.L4H1e)×38E4v1示出優良活體外效能，且甚至對低細胞表面CLL-1表現細胞株Molm-13亦有效。
如圖6A所示，h6E7(6E7.L4H1e)×38E4v1及在較低程度上h21C9(h21C9.L2H3)×38E4v1能夠在含有所有亞型之T細胞的自體獼猴PBMC存在下殺傷獼猴CD14+細胞。另外，自PBMC分離之pan-T細胞在EOL-1標靶細胞及6E7(6E7.L4H1e)×38E4v1存在下示出顯著標靶細胞殺傷，其EC50為約5ng/ml，此於對於人類T細胞所觀察相似。引出最大殺傷之TDB濃度與最大CD8+ T細胞活化一致(圖6B)。
由多個供體測定之EC50之概述示出在表8中。如使用HL-60細胞、EOL-1細胞及人類自體CD14+之表7所示，h6E7(6E7.L4H1e)之功效比具有相同抗-CD3臂(38E4v1)之h21C9(h21C9.L2H3)大約5至17倍。
在另一實例中，藉由流動式細胞測量術對確診AML且在CD34+上顯著表現CD33及CLL-1之患者樣品測試h6E7(6E7.L4H1e)×38E4v1 TDB之效力(圖7A)。如以上所述，使用來自AML患者之經分離初生同種異體人類CD8+ T細胞及冷凍密度梯度純化之骨髓細胞(Stanford Blood Bank，Stanford,CA)進行活體外殺傷分析。在含有以下補充物以支持造血幹細胞/祖細胞之以下培養基中進行實驗：Iscove氏經改良杜氏培養基(Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium，IMDM)、10%熱滅活FCS、2mM谷胺醯胺、1× StemSpan CC100細胞因子混合物(StemCell Technologies)、20ng/ml人類GM-CSF、20ng/ml人類G-CSF及0.3mg/ml低內毒素人類IgG(Molecular Innovations，Novi,MI)。分別使用150,000及50,000個細胞，E：T比率為3：1，且如上所述進行約40h。
圖7B示出與Ig匹配之非靶向TDB抗-gD×38E4v1相比相比，h6E7×38E4v1能夠以劑量依賴性方式殺傷AML胚細胞。在用抗-gD×38E4v1 TDB孵育40h過程中，活AML胚細胞之數目保持不變，表明藉由h6E7(6E7.L4H1e)×38E4v1進行之殺傷為TDB特異性的，並非由於生長條件。
C.抗-CLL-1 TDB之活體內功效
用於以下實例之T細胞依賴性雙特異性(TDB)抗體包含人類CLL-1及人類CD3e抗原結合決定簇。抗-人類CLL-1臂包含6E7(6E7.L4H1e)或優化變異型h6E7(N54-A或-S或-E或-Q或-D)人類化Fab之序列，及包含h40G.5c、38E4v1或38E4v11(對應於對hCD3ε之低、高或極高親和力)人類化Fab之抗-人類CD3e臂序列。
如以上對於活體外殺傷分析所述進行h6E7N54A(亦稱為 6E7.L4H1eA54)之活體外表徵。圖8A-D示出攜帶低親和力(h40G5c)或高(38E4v1)或極高(38E4v11)親和力hCD3e臂之6E7.L4H1eA54 TDB能夠以類似效力以劑量依賴性方式殺傷AML腫瘤細胞株。另外，對與抗-人類CD3ε Fab(包含38E4v1或h40G5c)配對之h6E7.L4H1e N54-A或-S或-E或-Q或-D人類化Fab之經優化變異體進行活體外評定，以測定hCLL-1臂之效力。圖8E-G示出與N54D變異體(天冬胺酸(D)為天門冬醯胺(N)脫醯胺基作用之產物，且N54之此修飾導致與CLL-1之較低親和力結合)相比，h6E7臂對人類CLL-1之較高親和力與經改良活體外效力相關聯。h6E7變異體之效力排序相似，而不管人類CD3ε臂為38E4v1抑或h40G5c。然而，如圖8H-I所示，與低親和力人類CD3臂h40G5c相比，利用高親和力抗-人類CD3e臂(38E4v1)在較低雙特異性抗體濃度下導致T細胞活化水準升高。總之，對於h6E7變異體(N54-A或-S或-E或-Q)在38E4v1存在下且對於h6E7變異體(N54-A或-E或-Q)在h40G5c存在下EC50為相似的。
表徵經遺傳工程改造之共表現人類CLL-1及人類CD3ε之小鼠且使用其來活體內測試抗-人類CLL-1 TDB之功效。在Genentech產生人類CLL-1(CLEC12a)BAC轉殖基因C57BL/6N小鼠(Charles River,Wilmington,MA)及人類CD3ε BAC轉殖基因C57BL/6N小鼠，且根據美國實驗動物護理協會(American Association of Laboratory Animal Care)之指南進行維持。另外，藉由使親本hCLL-1與hCD3ε BAC轉殖基因動物動物交配達成共表現人類CLL-1與人類CD3ε之雙重BAC轉殖基因小鼠。在Genentech依照國立衛生研究院實驗動物護理及使用指南(Guide for the Care and Use of Laboratory Animal)進行研究以證明抗-人類CLL-1×抗-CD3ε TDB活體內之效力，且研究經研究所動物護理與使用委員會(Institutional Animal Care and Use Committee)批准。
藉由流動式細胞測量術表徵雙重BAC-Tg(2xBAC-Tg)小鼠，且示出其表現轉殖基因：人類CLL-1及人類CD3ε。來自轉殖基因小鼠之血液用ACK溶解緩衝液進行處理以去除紅血球，且用阻斷溶液(含5%小鼠、5%大鼠及0.2mg/ml人類IgG、0.5% BSA、2mM EDTA之PBS)在冰上預孵育20分鐘，以減少與FcγR之非特異性結合。藉由用大鼠抗小鼠 CD8-FITC(Miltenyi)及小鼠抗-人類CD3-PE(BD Biosciences)染色來確定對人類CD3ε表面表現在2xBAC-Tg CD8+效應T細胞上之確認，且藉由用大鼠抗小鼠CD11b-FITC(BD Biosciences)及變異型h6E7A(6E7L4H1eA54-Dylight 650(Genentech)染色來證明對人類CLL-1表現在2xBAC-Tg CD11b+單核細胞上之確認。圖9示出來自雙重BAC-Tg(hCLL-1/hCD3ε)小鼠之血液在小鼠CD8+ T細胞上表現人類CD3，且在小鼠CD11b+單核細胞、但不在小鼠粒細胞上表現人類CLL-1。另外，圖10示出任一種轉殖基因之表現水平均與其對應親本相似。
為證明嵌合CD8+ T細胞(表現小鼠與人類CD3)能夠藉由包含抗-人類CD3ε臂之TDB活化，用各種濃度之TDB將血液離體刺激20-40小時，如A部分中所述。在此實驗中，藉由密度梯度離心使用Histopaque-1083(Aldrich-Sigma,St Louis,MO)，接著低速旋轉以去除血小板來分離2xBAC-Tg小鼠之PBMC。TDB之最終濃度範圍為0.3-3000ng/ml，其亦包括無TDB對照用於各測試品。所用TDB為：抗-gD×38E4v1(同型匹配之陰性對照)或親本h6E7(6E7.L4H1eN54)×38E4v1或變異型h6E7N54A(6E7.L4H1eA54)×38E4v1或變異型h6E7N54A(6E7.L4H1eA54)×h40G5c。約20或約40小時後，用抗小鼠CD8-FITC及抗小鼠CD69(eBioscience，San Diego,CA)對細胞進行染色，以藉由流動式細胞測量術量化T細胞效應活化。圖11示出CLL-1特異性TBD能夠在3000ng/ml達成最大活化。
使用2xBAC-Tg小鼠進行活體內功效研究，以測試含有抗-人類CLL-1與抗-人類CD3之不同壁組合的TDB抗體之效力。將小鼠隨機化至5個組中，且在第0天給予0.1mg/kg或0.5mg/kg之單次靜脈內劑量。如下，將小鼠隨機化至各組中：組1(媒劑；組胺酸緩衝液)、組2(抗-gD×38E4v1，0.5mg/kg)、組3(抗-gD×h40G5，0.5mg/kg)、組4(h6E7N54A(6E7.L4H1eA54)×38E4v1，0.1mg/kg)、組5(h6E7N54A(6E7.L4H1eA54)×38E4v1，0.5mg/kg)、組6(h6E7N54A(6E7.L4H1eA54)×h40G5，0.1mg/kg)、組7(h6E7N54A(6E7.L4H1eA54)×h40G5，0.5mg/kg)及組8(h6E7N54A(6E7.L4H1eA54)×38E4v11，0.5mg/kg)；抗-gD TDB表示非CLL-1靶向同型匹配之抗體對照。在隨機化及給藥之前，藉由流動式細胞測量術對 所有動物進行抗原決定基分析，以確認兩種轉殖基因之預期表現概況及CD8+細胞未如藉由表面CD69表現所判斷般加以活化。在第-6、1、7及14天藉由流動式細胞測量術進行CD8+細胞之活化及CD11b+單核細胞計數。在分析時，使用來自個別未經試驗之2xBAC-Tg小鼠之血液來設置BD FACS游標及確立基線。結束時(第15天)，自小鼠收集血液用於PK分析。
圖12示出給藥後(第1天)，僅第4-8組之動物具有顯著升高之CD69表現水準。藉由使用經示出不會交叉阻斷治療性抗體h6E7或h21C9之抗小鼠CD11b-FITC及抗-人類CLL-1-Alexa 647抗體(50C1；BD Biosciences,San Jose,CA)監控mCD11b+/hCLL-1+細胞之消耗來量測效力。給藥後次日，用(G5)h6E7N54A(6E7.L4H1eA54)×38E4v1 TDB在0.5mg/kg下及(G8)h6E7N54A(6E7.L4H1eA54)×38E4v11 TDB在0.5mg/kg下處理之小鼠達成作為hCLL-1+細胞之最大消耗的與CD8+效應細胞之抗原特異性活化相關聯之效力，且在用(G4)h6E7N54A(6E7.L4H1eA54)×38E4v1 @ 0.1mg/kg或(G7)h6E7N54A(6E7.L4H1eA54)×h40G5c在0.5mg/kg下或(G6)h6E7(6E7.L4H1eN54)×h40G5c在0.1mg/kg下處理之小鼠中顯著消耗(圖13)。在實驗過程中，抗-CLL-1特異性TDB在0.5mg/kg下最有效，而不管TDB包含低、高抑或極高親和力hCD3ε結合臂。在第14天，組5及7中之小鼠維持至少約25-50%消耗。在媒劑或非CLL-1靶向同型匹配之TDB對照組中未觀察到CD8+ T細胞之活化或hCLL-1+細胞之消耗。在相似實驗中，親本及h6E7變異體之效力為極其相似的(資料未示出)。
D.抗-CLL-1 TDB之活體外安全性評定
人類造血幹細胞(HSC；CD34+，CD38-)表現CD33，但似乎不表現CLL-1。因此，為測定CLL-1特異性TDB是否為有效且比靶向CD33之TDB更安全之療法，用抗-gD×38E4v1 TDB或h6E7(6E7.L4H1e)×38E4v1 TDB處理人類骨髓細胞，接著計數源自HSC及祖細胞之所得GEMM(粒細胞、紅血球、單核細胞、巨核細胞)集落形成單元。藉由定義，HSC具有自我更新且形成祖細胞及分化譜系特異性細胞之性質，而祖細胞具有形成分化譜系特異性細胞之能力，但不能自我更新。HSC(CD34+及CD38-)及祖細胞/分化(CD34+CD38+)細胞之抗原決定基分析示出僅後者表現CLL-1，相比 之下，CD33在CD34+/CD38-及祖細胞/分化細胞上偵測到(圖14)。
在以下實例中，使用人類集落形成細胞(CFU)分析MethoCult(StemCell Technologies,Vancouver,BC,Canada)來測定抗-人類CLL-1 TDB處理對人類骨髓源HSC在培養物中增殖且分化之能力的影響。在此分析中，可預測缺乏CLL-1表現之不成熟造血細胞(HSC)不應受到藉由CLL-1 TDB處理所致之消耗，而在細胞表面表現CLL-1之譜系定型祖細胞及分化細胞應藉由該處理除去。
自ALLCELLS(Alameda,CA)獲得來自同一供體之新鮮人類骨髓及血液，且藉由密度梯度分離進行處理。自血液PBMC分離人類CD8+ T細胞且如以下A部分所述與骨髓白細胞一起用於活體外殺傷分析。效應(CD8+ T細胞)與標靶(BM白細胞)比為3(150,000個細胞)：1(50,000個細胞)。將標靶細胞重懸於含有以下補充物以支援HSC之Iscove氏經改良杜氏培養基(IMDM)：10%熱滅活FCS、2mM谷胺醯胺、StemSpan CC100細胞因子混合物(StemCell Technologies)、20ng/ml人類GM-CSF、20ng/ml人類G-CSF及0.3mg/ml低內毒素人類IgG(Molecular Innovations，Novi,MI)，且在37℃下預孵育1h，以在添加CD8+ T細胞及TDB之前阻斷Fc B於100ul分析體積中之最終濃度為5或50ng/ml。測試品為h6E7(6E7.L4H1e)×38E4v1 TDB，且IgG匹配之非靶向陰性對照為抗-人類gD×38E4v1 TDB。將細胞孵育40h。對兩個重複藉由FACS檢查CD14+單核細胞之消耗，將其餘3個重複收集、洗滌且重懸於3ml MethoCult中。將1.1ml等分試樣自具有16g鈍端針之3ml注射器分配至35mm盤(StemCell Technologies)中，每個處理組鋪板(plating)兩個。將該等盤孵育14天，且自第7天監控直至第14天。
殺傷分析示出與抗-人類gD×38E4v1陰性對照TDB相比，CD14+骨髓單核細胞藉由5及50ng/ml濃度之h6E7(6E7.L4H1e)×38E4v1 TDB的特異性消耗(圖15A)。此證實抗-CLL-1 TDB具有功能。在第10天對CFU-GM、-M及-GEMM進行計數，且結果示於圖15B中。與用抗-人類gD×38E4v1處理或無處理之細胞相比，對於用h6E7(6E7.L4H1e)×38E4v1在5ng/ml及50ng/ml下處理之細胞觀察到CFU-GM、-M及GEMM下降約 80%。認為CFU之此損失表示表現人類CLL-1之造血骨髓祖細胞及成熟譜系分化細胞的消耗。其餘CFU最有可能為人類CLL-1(-)HSC之自我更新及分化能力之結果。此結果提供靶向表現人類CLL-1之細胞的TDB不顯著影響造血能力之證據。使用多200倍之h6E7(6E7.L4H1e)×38E4v1 TDB的相似實驗得到相似結果。另外，在第14天接取紅細胞之再生。用h6E7(6E7.L4H1e)×38E4v1 TDB處理示出與未處理細胞相比，CFU-E及BFU-E有約25%之輕微減少，且有約16%減少，與抗-人類gD×38E4v1 TDB相比(圖15C)。結果表明HSC之紅細胞樣再生最為完整。最後，表現CD33或CLL-1且在MethoCult分析中鋪板之人類骨髓CD34+細胞的分選示出僅CD34+/CLL-1+群體之CFU-GM、CFU-G或CFU-M重構，而CD34+/CD33+群體產生指示更原始之造血細胞的其他細胞譜系(CFU-E及CFU-GEMM)(資料未示出)。
E.抗-CLL-1 TDB之活體內藥物代謝動力學及藥效學
活體內研究抗-人類CLL-1 h6E7N54A(6E7.L4H1eA54)與抗-人類CD3ε(h40G5c或38E4v1或38E4v11)雙特異性抗體之組合，以在外周血、骨髓及脾中測定PK及PD。分別在SCID beige及2XBAC-Tg小鼠中表徵非特異性及標靶特異性PK。將小鼠隨機化至3個組中，且在第0天給予0.5mg/kg之單次靜脈內劑量。將小鼠分成以下組：組1(h6E7N54A(6E7.L4H1eA54)×h40G5c)、組2(h6E7N54A(6E7.L4H1eA54)×38E4v1)及組3(h6E7N54A(6E7.L4H1eA54)×38E4v11)。如以上所述使用hCLL-1×hCD3e BAC-Tg小鼠(2xBAC-Tg)進行研究，且在以下時間點收集血液及組織：第-7天(給藥前)及給藥後15min、2h、6h、第1天、第7天及第14天。除給藥前之所有時間點均為終點。量測血液中之雙特異性抗體濃度及細胞因子濃度。量測血液及組織中之T細胞活化及標靶細胞數目之減少。在8色BD LSR Fortessa細胞分析儀上進行流動式分析。
圖17A示出在SCID小鼠(缺乏表現人類CLL-1之T細胞(CD3)及髓細胞)中，與非CLL-1靶向同型匹配之抗體對照(抗-gD×h40G5c及抗-gD×38E4v1)相比，雙特異性抗體(組1-3)隨時間具有相似抗體濃度。PK參數概括於圖17B中，且說明在標靶不存在下，抗-hCLL-1×抗-CD3ε雙特 異性抗體證明與抗-gD對照相當之相似PK及清除性。當在表現兩種標靶(人類CD3ε及人類CLL-1)之小鼠中檢查此等雙特異性抗體時，hCLL-1×抗-CD3ε分子之間的Cmax值相當。然而，在暴露中觀察到CD3臂親和力依賴性差異(圖17C)。與包含38E4v1(CL=23.5mL/d/Kg，AUC=21.3d.μg/mL)或38E4v11(CL=37.4mL/d/Kg，AUC=18.1d.μg/mL)之雙特異性抗體相比，h6E7N54A×h40G5c具有最慢清除率(CL=10.6mL/d/Kg)，其轉化成隨時間較高之藥物暴露(AUC=47.1d.μg/mL)(圖17D)。
表現人類CLL-1之小鼠細胞的減少用作外周血、骨髓及脾中PD之度量。圖18示出單一0.5mg/kg劑量之h6E7A(6E7.L4H1eA54)×h40G5c導致大約7天時外周血中有最大標靶減少，同時骨髓及脾中之標靶細胞減低。對於h6E7N54A(6E7.L4H1eA54)×38E4v1(圖19)及h6E7N54A(6E7.L4H1eA54)×38E4v11(圖20)觀察到相似且更顯著之影響。小鼠CD8+細胞上CD69之上調亦與與最大標靶減低有關之時間點相關聯(圖21)。血液、骨髓及脾中標靶細胞之缺少表明表現hCLL-1之標靶細胞的減低並非由於邊集(margination)至血液、骨髓或脾。在彙集之淋巴結中觀察到相似結果(資料未示出)。
在另一實驗中，用媒劑或抗-PD-L1(6E11)或h6E7N54A(6E7.L4H1eA54)×h40G5c 0.1mg/kg或h6E7N54A(6E7.L4H1eA54)×h40G5c 0.5mg/kg或h6E7N54A(6E7.L4H1eA54)×h40G5c與抗-PD-L1之組合處理2x BAC-Tg小鼠。在第0天以10mg/kg IV投與抗-PD-L1，且之後以5mg/kg每週IP給藥兩次。兩個獨立活體內研究之結果示出與用任一單一藥劑處理小鼠相比，用h6E7N54A(6E7.L4H1eA54)×h40G5c 0.5mg/kg與抗-PD-L1 10mg/kg組合處理導致較佳總髓細胞減少(圖22A-B)。然而，在此小鼠模型中，僅單核細胞及粒細胞、嗜酸性粒細胞之子群體表現藉由流動式細胞測量術可偵測水準之人類CLL-1。在2X-BAC-Tg模型中有可能大多數粒細胞表現人類CLL-1，但低於流動式細胞測量術之偵測限。在獼猴和人類中，單核細胞及粒細胞上有CLL-1之顯著細胞表面表現。2xBAC-Tg模型中粒細胞減少方面之改良可藉由以下事實來解釋：h6E7N54A(6E7.L4H1eA54)×h40G5c可上調髓細胞上之PD-L1。為解決此假設，在第7天(研究結束)， 分析用媒劑或h6E7N54A(6E7.L4H1eA54)×h40G5c 0.1mg/kg或h6E7N54A(6E7.L4H1eA54)×h40G5c 0.5mg/kg處理之小鼠的血液中細胞表面PD-L1在CD11b+髓細胞上之存在。圖22C-D示出與陰性對照組(媒劑)相比，用單一藥劑h6E7N54A(6E7.L4H1eA54)×h40G5c處理之小鼠顯示出粒細胞上PD-L1表現顯著上調。單核細胞上明顯有類似反應。總之，PD-L1上調之水準與h6E7N54A(6E7.L4H1eA54)×h40G5c之劑量相關聯。此等結果證明h6E7N54A(6E7.L4H1eA54)×h40G5c具有調節免疫檢查點分子如PD-L1之能力，且組合抗-PD-L1療法與抗-CLL-1定向之雙特異性抗體如h6E7N54A(6E7.L4H1eA54)×h40G5c或h6E7N54A(6E7.L4H1eA54)×h38E4v1或h6E7N54A(6E7.L4H1eA54)h38E4v11為AML之另一治療策略。
實例3：獼猴中毒性、毒理動力學(TK)及PD研究
在獼猴中評定以上所述之抗-CLL-1/CD3 TDB抗體(h6E7A(6E7.L4H1eA54)×h40G5c(低親和力抗-人類CD3ε臂及h6E7A(6E7.L4H1eA54)×h38E4v1(高親和力抗-人類CD3ε臂))，以測定毒性、毒理動力學(TK)及藥效學(PD)。使用毛里求斯(Mauritius)來源之飼育未經試驗食蟹獼猴(Macaca fascicularis)進行此研究。藉由流動式細胞測量術證明經選擇用於該研究之動物在循環CD11b+髓細胞(粒細胞及單核細胞)上表現CLL-1。經由單一靜脈內輸注向4組雄性獼猴投與媒劑或抗-CLL-1/CD3 TDB抗體，且如表9中所概括針對標靶細胞消耗及恢復研究8-29天。
在多個時間點收集血清，且儲存在-70℃下用於ELISA以測定各血清樣品中各測試品之量。使用WinNonlin軟體(Pharsight；Mountain View,CA)使用血清濃度-時間曲線來評估PK參數。藉由標準血液學評定(白細胞差分計數)且藉由流動式細胞測量術量測外周血及骨髓中CD11b+髓細胞之減少來測定PD作用。骨髓流動式細胞測量術進行如下：藉由梯度濃縮 使用90% Hypaque-Ficoll處理新鮮骨髓抽出物以去除污染性紅血球。隨後，使用以上所述之活細胞染色條件，將純化之骨髓細胞用非人類靈長類CD4(Pe-Cy7)、CD8(Pacific Blue)、C20(FITC)、CD11b(APC)及CLL-1(PE)特異性抗體在生存力染料7AAD存在下染色。用多重分析分析血清細胞因子水準，且使用標準分析評定血清組織化學。
在預定驗屍之前使4只動物安樂死(組4中之所有三隻動物及組2中之一只)。給予具有高親和力CD3臂之抗-CLL-1/CD3 TDB抗體(h6E7A(6E7.L4H1eA54)×h38E4v1)(0.5mg/kg)的組4中之所有三隻動物展現出發燒及瀕死狀態，其與顯著升高之血清細胞因子水準(包括TNF-α、IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-5及IL-6)相關聯。在第1天(N=1)或第2天(N=2)使此等動物安樂死且其具有與細胞因子釋放症候群一致之循環衰竭之顯微鏡檢證據。由於此毒性，不進一步評估具有高親和力CD3臂之抗-CLL-1/CD3 TDB抗體(h6E7A(6E7.L4H1eA54)×h38E4v1)。
組2中之動物在給藥後4至8天之間展現出發燒。此等動物中之一者發展不良食欲及不適，從而要求在第6天及早安樂死。未鑑別此動物發病之具體原因，且在組3中研究0.2mg/kg較低劑量之具有低親和力CD3臂的抗-CLL-1/CD3 TDB抗體(h6E7A(6E7.L4H1eA54)×h40G5c)。此劑量在所有動物中均良好耐受，在研究持續過程中無發燒或其他臨床徵象。與投與具有高親和力CD3臂之抗-CLL-1/CD3 TDB抗體(h6E7A(6E7.L4H1eA54)×h38E4v1)之彼等動物相比，在投與具有低親和力CD3臂之抗-CLL-1/CD3 TDB抗體(h6E7A(6E7.L4H1eA54)×h40G5c)之動物中觀察到細胞因子反應降低，其中所評估之大多數促因子細胞因數均具有少許升高。組3之所有動物存活至第8天(N=3)及第22天(N=3)之預定預定驗屍。
總體而言，針對具有低及高親和力CD3臂之抗-CLL-1/CD3 TDB抗體的臨床病理學變化與骨髓及淋巴樣細胞之標靶有關顯著降低、細胞因子釋放及相關急性期炎性反應相似且一致。組4動物及組2中要求非預定驗屍之動物具有相似血液學(PD)作用大小，但與給予0.2mg/kg之具有低親和力CD3臂的抗-CLL-1/CD3 TDB抗體(h6E7A(6E7.L4H1eA54)×h40G5c)且存活至預定驗屍之猴相比通常具有更顯著急性 期反應。
由於雙特異性抗體之藥理學活性，接受具有低親和力CD3臂之抗-CLL-1/CD3 TDB抗體(6E7.L4H1eA54)×h40G5c)的動物展現出預期髓細胞減少。主要分別在第2-4天及第4-8天有單核細胞及嗜中性白細胞之顯著減少(圖23A及B)，其與第6天(非預定)及第8天驗屍時，骨髓中顯著下降之晚期髓細胞及脾臟中顯著下降之嗜中性白細胞相關聯。在第8天安樂死之動物的骨髓之流動式細胞測量術評定確認總CD11b+髓細胞顯著減少(圖23C)。另外，所有CD11b+細胞均共表現獼猴CLL-1(見圖23D)，因此證明標靶特異性，同時有血液與骨髓髓細胞消耗。在第2天循環淋巴細胞開始減少(圖24)。截至第12天，嗜中性白細胞、單核細胞及淋巴細胞有反彈性恢復，其中嗜中性白細胞在0.2mg/kg下在第15天顯著增加，認為其為反彈性反應之繼續且與第8天發生之G-CSF增加相關聯。截至第22天或第29天，個別動物之所有白細胞計數均取向或接近基線，且截至第22天及第29天，脾臟及骨髓分別有完全恢復之顯微鏡檢變化。
與高親和力形式相比，臨床信號、發病率下降及細胞因子釋放減低指示與具有高親和力CD3臂之抗-CLL-1/CD3 TDB抗體(h6E7A(6E7.L4H1eA54)×h38E4v1)相比，具有低親和力CD3臂之抗-CLL-1/CD3 TDB抗體(h6E7A(6E7.L4H1eA54)×h40G5c)的安全性概括改良。
藥物暴露在治療組之所有動物得以確認。濃度時間曲線及PK參數概括示出在圖25中。在0.2與0.5mg/kg之間，對於h6E7A×h40G5cTDB抗體((6E7.L4H1eA54)×h40G5c)觀察到與劑量成比例之Cmax。陽性抗-治療性抗體(「ATA」)在所有樣品中在第15天得以確認。儘管上述本發明已出於清楚理解之目的藉由說明及實例方式相當詳細地加以描述，但描述及實例不應解釋為限制本發明之範疇。本文引用之所有專利及科學文獻之揭示內容皆以全文引用的方式明確併入本文中。
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<220>
<221> 來源
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<221> 變異體
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<220>
<221> 變異體
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<221> MISC_FEATURE
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<212> PRT
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<221> 來源
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<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(7)
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<212> PRT
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<221> 來源
<223> /注釋=「人工序列之說明：合成肽」
<220>
<221> 變異體
<222> (1)..(1)
<223> /取代=「Thr」
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<212> PRT
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<220>
<221> 來源
<223> /注釋=「人工序列之說明：合成多肽」
<400> 93
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋=「人工序列之說明：合成多肽」
<400> 94
<210> 95
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋=「人工序列之說明：合成多肽」
<400> 95
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<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋=「人工序列之說明：合成肽」
<220>
<221> 變異體
<222> (6)..(6)
<223> /取代=「Gly」
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(10)
<223> /注釋=「對於變異位置,序列中所給之變異型殘基關於注解中之彼等無偏好」
<400> 96
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋=「人工序列之說明：合成肽」
<220>
<221> 變異體
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<221> 變異體
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<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(18)
<223> /注釋=「對於變異位置,序列中所給之變異型殘基關於注解中之彼等無偏好」
<400> 97
<210> 98
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋=「人工序列之說明：合成肽」
<400> 98
<210> 99
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋=「人工序列之說明：合成肽」
<400> 99
<210> 100
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋=「人工序列之說明：合成肽」
<400> 100
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<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋=「人工序列之說明：合成肽」
<220>
<221> 變異體
<222> (5)..(5)
<223> /取代=「Val」
<220>
<221> 變異體
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<223> /取代=「Ile」
<220>
<221> 變異體
<222> (7)..(7)
<223> /取代=「Asn」
<220>
<221> 變異體
<222> (9)..(9)
<223> /取代=「Phe」
<220>
<221> 變異體
<222> (10)..(10)
<223> /取代=「Leu」
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(11)
<223> /注釋=「對於變異位置,序列中所給之變異型殘基關於注解中之彼等無偏好」
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
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<221> 變異體
<222> (4)..(4)
<223> /取代=「Thr」
<220>
<221> 變異體
<222> (6)..(6)
<223> /取代=「Ala」
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<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(7)
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 注源
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<221> 變異體
<222> (3)..(3)
<223> /取代=「Gly」或〞Phe」或〞Ser」
<220>
<221> 變異體
<222> (4)..(4)
<223> /取代=「Tyr」或「Phe」或「Trp」
<220>
<221> 變異體
<222> (5)..(5)
<223> /取代=「Asn」或「Ala」或「Thr」或「Gly」或「Phe」或「Ile」
<220>
<221> 變異體
<222> (6)..(6)
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<221> 變異體
<222> (8)..(8)
<223> /取代=「Trp」或「Arg」或「Pro」或「Thr」
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<222> (1)..(9)
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
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<211> 107
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<213> 人工序列
<220>
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<212> PRT
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<220>
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<223> /注釋=「人工序列之說明：合成多肽」
<400> 110

Claims (54)

  1. 一種經分離之抗-CLL-1抗體，其中該抗體包含(i)CLL-1結合域，其中該CLL-1結合域結合包含SEQ ID NO：49之胺基酸的CLL-1抗原決定基及/或結合包含SEQ ID NO：49之胺基酸的重疊CLL-1抗原決定基，且不結合包含SEQ ID NO：50及/或SEQ ID NO：51之抗原決定基；及(ii)CD3結合域，其中該CD3結合域結合人類CD3ε多肽及cyno CD3ε多肽，該CD3結合域結合該人類CD3ε多肽之由人類CD3 ε之胺基酸1-26(SEQ ID NO：86)或1-27(SEQ ID NO：87)組成的片段內之CD3抗原決定基，且不要求該人類CD3ε多肽之胺基酸殘基Glu5用於該CD3結合域之結合。
  2. 如申請專利範圍第1項之抗-CLL-1抗體，其中藉由羥基自由基足跡法確定該CLL-1抗原決定基。
  3. 如申請專利範圍第1項或第2項中任一項之抗-CLL-1抗體，其中該CLL-1結合域包含以下6個高變區(HVR)：(a)HVR-H1，其包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列；(b)HVR-H2，其包含SEQ ID NO：45之胺基酸序列；(c)HVR-H3，其包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列；(d)HVR-L1，其包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列；(e)HVR-L2，其包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列；及(f)HVR-L3，其包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列。
  4. 如申請專利範圍第3項之抗-CLL-1抗體，其中該CLL-1結合域包含HVR-H2，其包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列。
  5. 如申請專利範圍第3項之抗-CLL-1抗體，其中該CLL-1結合域包含HVR-H2，其包含SEQ ID NO：47之胺基酸序列。
  6. 如申請專利範圍第5項之抗-CLL-1抗體，其中該CLL-1結合域包含HVR-H2，其包含SEQ ID NO：11之胺基酸序列。
  7. 如申請專利範圍第5項之抗-CLL-1抗體，其中該CLL-1結合域包含HVR-H2，其包含SEQ ID NO：43之胺基酸序列。
  8. 如申請專利範圍第5項之抗-CLL-1抗體，其中該CLL-1結合域包含HVR-H2，其包含SEQ ID NO：44之胺基酸序列。
  9. 如申請專利範圍第3項之抗-CLL-1抗體，其中該抗體包含CLL-1結合域，其包含：a)包含SEQ ID NO：33之序列的重鏈可變區及包含SEQ ID NO：32之序列的輕鏈可變區；b)包含SEQ ID NO：34之序列的重鏈可變區及包含SEQ ID NO：32之序列的輕鏈可變區；c)包含SEQ ID NO：46之序列的重鏈可變區及包含SEQ ID NO：32之序列的輕鏈可變區；或d)包含SEQ ID NO：48之序列的重鏈可變區及包含SEQ ID NO：32之序列的輕鏈可變區。
  10. 如申請專利範圍第1項或第2項中任一項之抗-CLL-1抗體，其中該CLL-1結合域包含以下6個HVR：(a)HVR-H1，其包含SEQ ID NO：21之胺基酸序列；(b)HVR-H2，其包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列；(c)HVR-H3，其包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列；(d)HVR-L1，其包含SEQ ID NO：18之胺基酸序列；(e)HVR-L2，其包含SEQ ID NO：19之胺基酸序列；及(f)HVR-L3，其包含SEQ ID NO：20之胺基酸序列。
  11. 如申請專利範圍第9項之抗-CLL-1抗體，其中該抗體包含CLL-1結合域，其包含：(a)包含SEQ ID NO：40之序列的重鏈可變區及(b)包含SEQ ID NO：39之序列的輕鏈可變區。
  12. 如申請專利範圍第1或2項之抗-CLL-1抗體，其中該抗體包含具有以下特徵中之一或多個的CLL-1結合域：a.結合重組人類CLL-1；b.結合重組獼猴CLL-1；c.結合人類外周血單核細胞(PBMC)表面上之內源性CLL-1；d.結合獼猴PBMC表面上之內源性CLL-1；e.結合癌細胞表面上之內源性CLL-1；f.結合AML癌細胞表面上之內源性CLL-1；g.結合HL-60細胞表面上之內源性CLL-1；h.結合EOL-1細胞表面上之內源性CLL-1：i.結合包含K244Q突變之CLL-1； j.與R&D純系687317抗體競爭結合人類CLL-1；k.結合內源性人類CLL-1，其Kd小於15nM、小於10nM、小於7nM、小於5nM或小於3nM；l.結合重組人類CLL-1，其Kd小於10nM、小於7nM、小於5nM或小於3nM；及/或m.結合重組獼猴CLL-1，其Kd小於10nM、小於7nM、小於5nM，或小於3nM、小於2nM，或小於1nM。
  13. 如申請專利範圍第1或2項之抗-CLL-1抗體，其中該抗體包含CD3結合域，其結合包含人類CD3ε多肽之Gln1、Asp2、Glu6及Met7及/或由其組成的CD3抗原決定基。
  14. 如申請專利範圍第1或2項之抗-CLL-1抗體，其中該抗體包含CD3結合域，該CD3結合域包含以下6個HVR：(a)HVR-H1，其包含SEQ ID NO：88之胺基酸序列；(b)HVR-H2，其包含SEQ ID NO：89之胺基酸序列；(c)HVR-H3，其包含SEQ ID NO：90之胺基酸序列；(d)HVR-L1，其包含SEQ ID NO：74之胺基酸序列；(e)HVR-L2，其包含SEQ ID NO：91之胺基酸序列；及(f)HVR-L3，其包含SEQ ID NO：92之胺基酸序列。
  15. 如申請專利範圍第14項之抗-CLL-1抗體，其中該CD3結合域包含(a)HVR-H1，其包含SEQ ID NO：71之胺基酸序列；(b)HVR-H2，其包含SEQ ID NO：72之胺基酸序列；(c)HVR-H3，其包含SEQ ID NO：73之胺基酸序列；(e)HVR-L2，其包含SEQ ID NO：75之胺基酸序列；及(f)HVR-L3，其包含SEQ ID NO：76之胺基酸序列。
  16. 如申請專利範圍第14項之抗-CLL-1抗體，其中該CD3結合域包含(a)HVR-H1，其包含SEQ ID NO：77之胺基酸序列；(b)HVR-H2，其包含SEQ ID NO：78之胺基酸序列；(c)HVR-H3，其包含SEQ ID NO：79之胺基酸序列；及(e)HVR-L2，其包含SEQ ID NO：80之胺基酸序列。
  17. 如申請專利範圍第16項之抗-CLL-1抗體，其中該CD3結合域包含(f)HVR-H3，其包含SEQ ID NO：81之胺基酸序列。
  18. 如申請專利範圍第16項之抗-CLL-1抗體，其中該CD3結合域包含(f)HVR-H3，其包含SEQ ID NO：76之胺基酸序列。
  19. 如申請專利範圍第14項之抗-CLL-1抗體，該抗體包含CD3結合域，其包含：a)包含SEQ ID NO：82之序列的重鏈可變區及包含SEQ ID NO：83之序列的輕鏈可變區；b)包含SEQ ID NO：84之序列的重鏈可變區及包含SEQ ID NO：85之序列的輕鏈可變區；或c)包含SEQ ID NO：84之序列的重鏈可變區及包含SEQ ID NO：93之序列的輕鏈可變區。
  20. 如申請專利範圍第1或2項之抗-CLL-1抗體，其中該抗-CLL-1抗體為單株、人類、人類化或嵌合抗體。
  21. 如申請專利範圍第1或2項之抗-CLL-1抗體，其中該抗-CLL-1抗體為IgG抗體。
  22. 如申請專利範圍第1或2項之抗-CLL-1抗體，其中該抗體為雙特異性抗體。
  23. 如申請專利範圍第1或2項之抗-CLL-1抗體，其中該抗-CLL-1抗體為結合CLL-1及CD3之抗體片段。
  24. 如申請專利範圍第23項之抗-CLL-1抗體，其中該抗-CLL-1抗體片段為Fab、Fab’-SH、Fv、scFv及/或(Fab’)2片段。
  25. 如申請專利範圍第1或2項之抗-CLL-1抗體，其中該抗-CLL-1抗體為全長抗體。
  26. 如申請專利範圍第1或2項之抗-CLL-1抗體，其中該抗-CLL-1抗體包含去糖基化位點突變。
  27. 如申請專利範圍第26項之抗-CLL-1抗體，其中該去糖基化位點突變為取代突變。
  28. 如申請專利範圍第1或2項之抗-CLL-1抗體，其中該抗-CLL-1抗體包含降低之效應功能。
  29. 如申請專利範圍第1或2項之抗-CLL-1抗體，其中該抗-CLL-1抗體包含取代突變，根據EU編號，該取代突變處於胺基酸殘基N297、L234、L235、D265及/或P329G。
  30. 如申請專利範圍第29項之抗-CLL-1抗體，其中根據EU編號，該取代 突變選自由N297G、N297A、L234A、L235A、D265A及P329G組成之群。
  31. 如申請專利範圍第29項之抗-CLL-1抗體，其中根據EU編號，該抗體在胺基酸殘基297處包含N297G取代。
  32. 如申請專利範圍第1或2項之抗-CLL-1抗體，其中(a)該CD3結合域包含Fc域，其中根據EU編號，該Fc域包含T366S、L368A、Y407V及N297G取代突變；且(b)該CLL-1結合域包含Fc域，其中根據EU編號，該Fc域包含T366W及N297G取代突變。
  33. 一種經分離之核酸，其編碼如申請專利範圍第1項至第32項中任一項之抗-CLL-1抗體。
  34. 一種載體，其包含如申請專利範圍第33項之經分離之核酸。
  35. 一種宿主細胞，其包含如申請專利範圍第34項之載體。
  36. 一種產生如申請專利範圍第1項至第32項中任一項之抗-CLL-1抗體的方法，該方法包括在培養基中培養如申請專利範圍第35項之宿主細胞。
  37. 一種醫藥組合物，其包含如申請專利範圍第1項至第32項中任一項之抗-CLL-1抗體。
  38. 如申請專利範圍第1或2項之抗-CLL-1抗體，其用作藥劑。
  39. 如申請專利範圍第1或2項之抗-CLL-1抗體，其用於治療有需要之受檢者之細胞增生性病症或自體免疫病症或延遲其進展。
  40. 如申請專利範圍第1或2項之抗-CLL-1抗體，其用於增強患有細胞增生性病症或自體免疫病症之受檢者的免疫功能。
  41. 如申請專利範圍第39項之抗-CLL-1抗體，其中該細胞增生性病症為癌症。
  42. 如申請專利範圍第39項之抗-CLL-1抗體，其中該細胞增生性病症為急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)及/或骨髓增生異常症候群(MDS)。
  43. 如申請專利範圍第39項之抗-CLL-1抗體，其中該細胞增生性病症為AML。
  44. 一種如申請專利範圍第1項至第32項中任一項之抗-CLL-1抗體的用途，其係用於製造以供治療細胞增生性病症或自體免疫病症或延遲其 進展之藥劑。
  45. 一種如申請專利範圍第1項至第32項中任一項之抗-CLL-1抗體的用途，其係用於製造以供增強患有細胞增生性病症或自體免疫病症之受檢者的免疫功能之藥劑。
  46. 如申請專利範圍第44或45項之用途，其中該細胞增生性病症為癌症。
  47. 如申請專利範圍第44或45項之用途，其中該細胞增生性病症為AML、CML及/或MDS。
  48. 如申請專利範圍第44或45項之用途，其中該藥劑與柔紅黴素(daunorubicin)及/或阿糖胞苷(cytarabine)共同投與。
  49. 如申請專利範圍第44或45項之用途，其中該藥劑與與糖皮質激素(諸如***(dexamethasone))共同投與。
  50. 如申請專利範圍第44或45項之用途，其中該藥劑與PD-1軸結合拮抗劑(諸如抗-PD-L1抗體)共同投與。
  51. 如申請專利範圍第50項之用途，其中該PD-1軸結合拮抗劑為抗-PD-L1抗體。
  52. 如申請專利範圍第50項之用途，其中該抗-PD-L1抗體包含：(a)HVR-H1序列為GFTFSDSWIH(SEQ ID NO：99)；(b)HVR-H2序列為AWISPYGGSTYYADSVKG(SEQ ID NO：100)；(c)HVR-H3序列為RHWPGGFDY(SEQ ID NO：98)；(d)HVR-L1序列為RASQDVSTAVA(SEQ ID NO：104)；(e)HVR-L2序列為SASFLYS(SEQ ID NO：105)；且(f)HVR-L3序列為QQYLYHPAT(SEQ ID NO：106)。
  53. 如申請專利範圍第50項之用途，其中該抗-PD-L1抗體包含SEQ ID NO：94之重鏈可變區及SEQ ID NO：95之輕鏈可變區。
  54. 如申請專利範圍第50項之用途，其中該抗-PD-L1抗體為MPDL3280A。
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