TW202306985A - 降低抗體－脂酶結合之結構 - Google Patents

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雪尼克 契坦 梅塔
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Abstract

本申請涉及重組抗體，該等重組抗體經工程化以改變該等抗體與用於生產該等抗體的宿主細胞之一種或多種內源性脂酶之間的相互作用。在一些情況下，該等抗體在重鏈恆定區中，例如在 CH1、CH2 及/或 CH3 處經突變。在其他情況下，該等抗體經突變以改變它們的醣基化圖譜。

Description

降低抗體-脂酶結合之結構
本申請涉及重組抗體，該等重組抗體經工程化以改變該等抗體與用於生產該等抗體的宿主細胞之一種或多種內源性脂酶之間的相互作用。在一些情況下，該等抗體在重鏈恆定區中，例如在 CH1、CH2 及/或 CH3 處經突變。在其他情況下，該等抗體經突變以改變它們的醣基化圖譜。
由於宿主細胞蛋白的豐度低，檢測宿主細胞蛋白 (HCP) 作為宿主細胞表現的異源蛋白的純化組成物中的污染物歷來一直具有挑戰性。例如，HCP 不純物可能導致各種產物問題，並且其持久性以及與生物治療劑相互作用的機械表徵對於精煉工藝至關重要。脂酶代表 HCP 之一類其被認為在調配物保存期限中起一定作用。酯酶類中的脂酶具有作用於賦形劑聚山梨醇酯 20 (PS-20) 的能力，其降解可以導致次可見顆粒於組成物中，該組成物包含亦包含聚山梨醇酯 20 作為賦形劑的純化蛋白質。雖然在下游細胞加工過程中脂酶基本上已耗盡，但例如低於 0.1% 量的脂酶仍可能對藥物調配物的穩定性產生不利影響。例如，表面電漿子共振 (SPR) 的努力表明磷脂酶 B 樣蛋白 2 (PLBL2) 直接與抗體結合，但 SPR 沒有檢測到某些其他脂酶-抗體複合物。使用羥基自由基足跡 (FPOP)、天然質譜法及離子遷移率的新方法首次用於直接建立、表徵及排序多種脂酶及抗體的相互作用。此外，研究了脂酶及抗體的更高級結構對其結合親和力的影響。
在這裡，對對照或脂酶:抗體 (Ab) 莫耳比溶液進行 FPOP，以定位參與結合的胺基酸。基於此等預測設計了抗體突變體，並且所有蛋白質均在 CHO 細胞株中表現。在 Q-TOF (Agilent Technologies) 上的 HPLC-Chip Cube 及 PGC 柱上進行脂酶的 N-聚醣分析。就在質譜 (MS) 或離子遷移率 (IM) 分析之前，在脫鹽離心柱上交換樣品。開發靜態噴霧天然 MS 及減少電荷的非 MS IM 定量分析來篩選複合物，並在 Q Exactive™ UHMR (Thermo Fisher Inc.) 或 IMgenius™ (IonDX Inc.) 上進行分析。在 Unidec 3.1 中進行天然 MS 解捲積，用 R 分析結合解離曲線。
發現靶向分析對於確定結構、序列及修飾在複合相互作用中的作用至關重要。SEC 及 SPR 造成複合物的破壞，導致藉由微尺度熱泳動 (MST) 評估脂酶 PLBL2 及溶體磷脂酶 A2 (LPLA2) 與幾種不同的單株抗體的複合物。希望透過非固定/標記、溶液狀態的天然檢定來確認低親和力 (1-30 µM Kd) 並獲得結構上的了解。FPOP 將保守的相互作用定位於 Ab 重鏈，並且據此產生了點突變。低解析度的天然 MS 用於檢測以克服由 ＞ 5 個醣基化位點/脂酶導致的高異質性。藉由 MS (~ 110 kDa) 及 IM (~51 逆遷移率 (1/K) 單位) 確定複合物具有 1:1 的化學計量比。抗體結合親和力的等級順序在不同方法中是相同的。MS 及 IM 兩者均檢測到對於 MST 分析太弱的脂酶-Ab 相互作用 (脂酶-C 及 D)。進行 PRM MS 實驗以生成作為 HCD 能量函數的結合解離曲線，以對抗體及突變體進行排序。複合 IM 峰的相對面積亦被量化並在物種之間進行比較。在篩選的六個突變體中，一個具有幾乎完全的結合破壞，而其他的則降低了 17-77% 的複合物。突變體排名順序的趨勢大致相同，最弱及最強的剔除在方法之間是一致的。進一步探索 IM 資料以深入了解複合物中採用的蛋白質確認。通過時間進程及外切醣苷酶實驗證實，在複合物形成前後的游離脂酶峰中觀察到的位移支持了脂酶-抗體相互作用的二級醣基化介導機制。總之，此項工作是第一份關於脂酶-Ab 結合的深入結構報導，亦證明了正交 MS 及新建立的 IM 技術在評估複合物方面的實用性。
在一個實施例中，本發明包括由經過工程改造 (例如，用核酸轉形或轉導) 以表現該抗體的細胞（例如，哺乳動物宿主細胞）產生的抗體（例如，重組抗體），其中該抗體具有 CH1 區、CH2 區或 CH3 區中至少 1 個胺基酸的修飾（取代、缺失或添加），並且其中修飾導致抗體與由細胞表現的一個或多個脂酶 (例如，內源性脂酶) 的相互作用改變。在一個實施例中，改變的相互作用係由於該抗體之改變的醣基化圖譜 (glycosylation profile)。考慮任何特定抗體可包含一個或多個修飾，例如僅單個修飾，或在兩個、三個、四個或更多個位置處的修飾。
本發明亦包括醫藥組成物，該亦要組成物包含本文所描述之任何抗體，以及編碼此類抗體之分離的核酸，包含此類分離的核酸的表現載體，以及含有該分離的核酸、用該分離的核酸轉形或轉導的細胞。亦包括治療有需要的人類個體的方法，包含向個體投予醫藥上有效劑量的本發明的醫藥組成物，以及產生抗體的方法。
因此，例如，本揭露包括一種重組抗體，其係由經工程化以表現該抗體之宿主細胞所生產，其中該抗體在該抗體之重鏈 CH1 區、CH2 區或 CH3 區中具有至少一個胺基酸殘基之修飾 (取代、缺失或添加)，其中該修飾導致該抗體與由該宿主細胞所表現的一種或多種內源性脂酶之改變的相互作用。在一些情況下，改變的相互作用係由於該抗體之改變的醣基化圖譜。在一些情況下，該修飾導致與由該宿主細胞所表現的一種或多種內源性脂酶之降低的相互作用程度，該等內源性脂酶為諸如溶體磷脂酶 A2 (LPLA2)、磷脂酶 B 樣蛋白 (PLBL2)、硫酯酶 (thioesterase)、棕櫚醯基蛋白硫酯酶 (palmitoyl protein thioesterase,PPT)、磷脂酶 D3 (PLD3) 或神經鞘磷脂磷酸二酯酶 (sphingomyelin phosphodiesterase,SP)。在一些情況下，該修飾導致與 LPLA2 及/或 PLBL2 之降低的相互作用程度。在一些情況下，修飾導致該抗體對由該宿主細胞表現的該一種或多種內源性脂酶的結合親和力 (即，K D增加) 降低至少 5 倍、10 倍、20 倍、30 倍、50 倍或 100 倍，視情況其中結合親和力藉由表面電漿子共振 (SPR)、微尺度熱泳動 (MST) 及/或 ELISA 確定。在一些情況下，修飾導致該抗體對該一種或多種內源性脂酶的相互作用程度降低至少 5 倍、10 倍、20 倍、30 倍、50 倍或 100 倍，視情況藉由 ESI-MS (例如，藉由 VC50) 或藉由藉由 SEC-MS 或大氣離子遷移率 (例如，IM-MS) 檢測的抗體-脂酶複合物的量來確定。
在一些實施例中，抗體包含人類 IgG 恆定區。在一些情況下，抗體包含人類 IgG4 恆定區，其中修飾是 P149 至 S197 (Kabat 編號) 的至少一個胺基酸的取代。在一些情況下，抗體包含人類 IgG1 恆定區，其中修飾是選自 V152 至 P214 (Kabat 編號) 的胺基酸的​取代。在一些情況下，修飾包含選自由以下所組成之群組的至少一個胺基酸的取代：G170、V171、T173、F174、P175、V177、L178、Q179、S180、S181、G182、L186、F154、P155、V189、V190、T191、V192、P193、S194、S195、S196、L198、K200、P157、V158 及 TI59 (Kabat 編號)。在一些情況下，該修飾包含選自由以下所組成之群組的胺基酸的取代：F174、P175、Q179、V192、L198 及 K200 (Kabat 編號)。在一些情況下，取代係選自由以下所組成之群組：G170A、V171A、T173A、F174A、P175A、V177A、L178A、Q179A、S180A、S181A、G182A、L186A、F154A、P155A、V189A、V190A、T191A、V192A、P193A、S194A、S195A、S196A、L198A、K200A、P157A、V158A 和 TI59A (Kabat 編號)。在一些情況下，取代係選自由以下所組成之群組：F174A、P175A、Q179A、V192A、L198A 及 K200A。
可替代地，在一些情況下，G170、V171、T173、F174、P175、V177、L178、Q179、S180、S181、G182、L186、F154、P155、V189、V190、T191、V192、P193、S194、S195、S196、L198、K200、P157、V158 及 TI59 之至少一者之至少一個取代是以選自由以下所組成之群組的胺基酸所取代:丙胺酸 (A)、白胺酸 (L) 及異白胺酸 (I)。在一些情況下，至少一個取代是以丙胺酸 (A) 取代。在其他情況下，至少一個取代是以選自由以下所組成之群組的胺基酸所取代:***酸 (F)、色胺酸 (W) 及酪胺酸 (Y)。在一些情況下，至少一個取代是以色胺酸 (W) 所取代，而在其他情況下，至少一個取代是以酪胺酸 (Y) 所取代。在一些情況下，G170、V171、T173、F174、P175、V177、L178、Q179、S180、S181、G182、L186、F154、P155、V189、V190、T191、V192、 P193、S194、S195、S196、L198、K200、P157、V158 及 TI59 之一個或多個處的至少一個取代是以選自由以下所組成之群組的胺基酸所取代:天冬胺酸 (D) 及麩胺酸 (E)。在其他情況下，至少一個取代是以選自由以下所組成之群組的胺基酸所取代:精胺酸 (R) 及離胺酸 (K)。
在一些實施例中，該抗體包含在該 CH1 區中的一個胺基酸中之修飾。在一些情況下，該抗體包含在該 CH1 區中的兩個胺基酸中之修飾。在一些情況下，該抗體包含在該 CH1 區中的三個胺基酸中之修飾。在一些情況下，該抗體包含在該 CH1 區中的四個或更多個胺基酸中之修飾。在一些情況下，除了上述修飾之外，該抗體包含在重鏈恆定區中的至少一個其他修飾，諸如在 Fc 區中的修飾、在 N297 處的突變、IgG1 Fc 之 LALAPG 修飾、及在殘基 265、269、270、297、327、333、334 及 335 (EU 編號) 中之一者或多者處的取代。
在一些情況下，抗體重鏈不包含在選自殘基 203 至 256 (Kabat 編號) 的胺基酸中之修飾，不包含在選自殘基 203 至 243 (Kabat 編號) 的胺基酸中之修飾，或不包含選自殘基 197 及 198 及 203 至 243 及 246 至 251 (Kabat 編號) 的胺基酸之修飾。在一些情況下，該抗體是人類 IgG4 抗體，並且不包含選自 S197、L198、K203、T207、D211、R222、E226、S227、L229、G230、P237、P238、E246、F247、G249、G250 或 P251中之任何一個或多個的胺基酸的修飾。在一些情況下，該宿主細胞為中國倉鼠卵巢 (CHO) 細胞。在一些情況下，該宿主細胞經修飾以：突變、下調或剔除 α-Man-1 或 α-Man-2 中之一者或兩者；抑制 Asn 連接的 Man 9GlcNac 2聚醣前驅物之處理及/或相對於 Man3-5 增加高分子量甘露糖種類，諸如 Man6 或更高、Man7 或更高、或 Man7-9；及/或增加一種或多種增加聚醣之鏈長的酵素之表現，諸如 GNT-1、GNT-2、GNT-3、GNT-4abc、GNT-5 或 GalT。
本揭露亦涉及包含上述抗體的醫藥組成物。本揭露進一步涉及一種治療有需要的人類個體的方法，包含向該個體投予醫藥上有效劑量的醫藥組成物。本揭露亦涉及表現此類抗體的分離的核酸，或表現抗體的重鏈及輕鏈的一組核酸，包含核酸的表現載體，以及含有分離的核酸、用分離的核酸轉形或轉導的分離的宿主細胞或表現載體。本揭露進一步涉及產生抗體的方法，包含在產生抗體的條件下培育含有分離的核酸、用分離的核酸轉形或轉導的宿主細胞，該分離的核酸表現所述抗體。
本揭露亦涉及減少重組抗體與在用於表現抗體的宿主細胞中表現的一種或多種內源性脂酶之間的相互作用的方法，包含對抗體的重鏈 CH1 區、CH2 區或 CH3 區中的至少一個胺基酸殘基的修飾 (取代、缺失或添加) 進行工程改造。在一些情況下，該方法進一步包含檢測該抗體與該一種或多種內源性脂酶之間的相互作用或確定該一種或多種內源性脂酶對該抗體之結合親和力。在一些情況下，脂酶與抗體之相互作用係在使用純化的脂酶及抗體之測定中檢測。在一些情況下，脂酶與抗體之該相互作用係由例如藉由 SPR、羥基自由基足跡、天然質譜法 (例如，ESI-MS 或 SEC-MS)，及/或離子遷移率分析該宿主細胞中所生產的抗體來檢測。在一些情況下，該方法進一步包含例如藉由表面電漿子共振 (SPR)、微尺度熱泳動 (MST) 及/或 ELISA 來確定脂酶與抗體之結合親和力。
在一些此類方法中，該修飾導致與由該宿主細胞所表現的一種或多種內源性脂酶之降低的相互作用程度，該等內源性脂酶為諸如溶體磷脂酶 A2 (LPLA2)、磷脂酶 B 樣蛋白 (PLBL2)、硫酯酶、棕櫚醯基蛋白硫酯酶 (PPT)、磷脂酶 D3 (PLD3) 或神經鞘磷脂磷酸二酯酶 (SP)。在一些情況下，該修飾導致與 LPLA2 及/或 PLBL2 之降低的相互作用程度。在一些情況下，修飾導致該抗體對由該宿主細胞表現的該一種或多種內源性脂酶的結合親和力 (即，K D增加) 降低至少 5 倍、10 倍、20 倍、30 倍、50 倍或 100 倍，視情況其中結合親和力藉由表面電漿子共振 (SPR)、微尺度熱泳動 (MST) 及/或 ELISA 確定。在一些情況下，修飾導致該抗體對該一種或多種內源性脂酶的相互作用程度降低至少 5 倍、10 倍、20 倍、30 倍、50 倍或 100 倍，視情況藉由 ESI-MS (例如，藉由 VC50) 或藉由藉由 SEC-MS 或大氣離子遷移率 (例如，IM-MS) 檢測的抗體-脂酶複合物的量來確定。
在一些此類方法中，抗體包含人類 IgG 恆定區。在一些情況下，抗體包含人類 IgG4 恆定區，其中修飾是 P149 至 S197 (Kabat 編號) 的至少一個胺基酸的取代。在一些情況下，抗體包含人類 IgG1 恆定區，其中修飾是選自 V152 至 P214 (Kabat 編號) 的胺基酸的​取代。在一些情況下，修飾包含選自由以下所組成之群組的至少一個胺基酸的取代：G170、V171、T173、F174、P175、V177、L178、Q179、S180、S181、G182、L186、F154、P155、V189、V190、T191、V192、P193、S194、S195、S196、L198、K200、P157、V158 及 TI59 (Kabat 編號)。在一些情況下，該修飾包含選自由以下所組成之群組的胺基酸的取代：F174、P175、Q179、V192、L198 及 K200 (Kabat 編號)。在一些情況下，取代係選自由以下所組成之群組：G170A、V171A、T173A、F174A、P175A、V177A、L178A、Q179A、S180A、S181A、G182A、L186A、F154A、P155A、V189A、V190A、T191A、V192A、P193A、S194A、S195A、S196A、L198A、K200A、P157A、V158A 和 TI59A (Kabat 編號)。在一些情況下，取代係選自由以下所組成之群組：F174A、P175A、Q179A、V192A、L198A 及 K200A。
可替代地，在此等方法的一些中，G170、V171、T173、F174、P175、V177、L178、Q179、S180、S181、G182、L186、F154、P155、V189、V190、T191、V192、P193、S194、S195、S196、L198、K200、P157、V158 及 TI59 之至少一者之至少一個取代是以選自由以下所組成之群組的胺基酸所取代:丙胺酸 (A)、白胺酸 (L) 及異白胺酸 (I)。在一些情況下，至少一個取代是以丙胺酸 (A) 取代。在其他情況下，至少一個取代是以選自由以下所組成之群組的胺基酸所取代:***酸 (F)、色胺酸 (W) 及酪胺酸 (Y)。在一些情況下，至少一個取代是以色胺酸 (W) 所取代，而在其他情況下，至少一個取代是以酪胺酸 (Y) 所取代。在一些情況下，G170、V171、T173、F174、P175、V177、L178、Q179、S180、S181、G182、L186、F154、P155、V189、V190、T191、V192、 P193、S194、S195、S196、L198、K200、P157、V158 及 TI59 之一個或多個處的至少一個取代是以選自由以下所組成之群組的胺基酸所取代:天冬胺酸 (D) 及麩胺酸 (E)。在其他情況下，至少一個取代是以選自由以下所組成之群組的胺基酸所取代:精胺酸 (R) 及離胺酸 (K)。
在一些方法中，該抗體包含在該 CH1 區中的一個胺基酸中之修飾。在一些情況下，該抗體包含在該 CH1 區中的兩個胺基酸中之修飾。在一些情況下，該抗體包含在該 CH1 區中的三個胺基酸中之修飾。在一些情況下，該抗體包含在該 CH1 區中的四個或更多個胺基酸中之修飾。在一些情況下，除了上述修飾之外，該抗體包含在重鏈恆定區中的至少一個其他修飾，諸如在 Fc 區中的修飾、在 N297 處的突變、IgG1 Fc 之 LALAPG 修飾、及在殘基 265、269、270、297、327、333、334 及 335 (EU 編號) 中之一者或多者處的取代。
在一些此類方法中，抗體重鏈不包含在選自殘基 203 至 256 (Kabat 編號) 的胺基酸中之修飾，不包含在選自殘基 203 至 243 (Kabat 編號) 的胺基酸中之修飾，或不包含選自殘基 197 及 198 及 203 至 243 及 246 至 251 (Kabat 編號) 的胺基酸之修飾。在一些情況下，該抗體是人類 IgG4 抗體，並且不包含選自 S197、L198、K203、T207、D211、R222、E226、S227、L229、G230、P237、P238、E246、F247、G249、G250 或 P251中之任何一個或多個的胺基酸的修飾。在一些情況下，該宿主細胞為中國倉鼠卵巢 (CHO) 細胞。在一些情況下，該宿主細胞經修飾以：突變、下調或剔除 α-Man-1 或 α-Man-2 中之一者或兩者；抑制 Asn 連接的 Man 9GlcNac 2聚醣前驅物之處理及/或相對於 Man3-5 增加高分子量甘露糖種類，諸如 Man6 或更高、Man7 或更高、或 Man7-9；及/或增加一種或多種增加聚醣之鏈長的酵素之表現，諸如 GNT-1、GNT-2、GNT-3、GNT-4abc、GNT-5 或 GalT。
本揭露亦考慮產生重組蛋白質或抗體的方法，包含: (a) 於宿主細胞中表現蛋白質或抗體，該宿主細胞經修飾以:突變、下調或剔除 α-Man-1 或 α-Man-2 中之一者或兩者；抑制 Asn 連接的 Man 9GlcNac 2聚醣前驅物之處理及/或相對於 Man3-5 增加高分子量甘露糖種類，諸如 Man6 或更高、Man7 或更高、或 Man7-9；及/或增加一種或多種增加聚醣之鏈長的酵素之表現，諸如 GNT-1、GNT-2、GNT-3、GNT-4abc、GNT-5 或 GalT；以及 (b) 確定該蛋白質或抗體相較於自未經修飾的宿主細胞所表現的抗體，是否具有與由該宿主細胞所表現的一種或多種內源性脂酶之降低的相互作用。在此類方法中，在一些情況下宿主細胞是 CHO 細胞。在一些情況下，確定該蛋白質或抗體相較於自未經修飾的宿主細胞所表現的抗體，是否具有與一種或多種內源性脂酶之降低的相互作用係藉由自該宿主細胞所表現的該蛋白質或抗體之 SPR、羥基自由基足跡、天然質譜法 (例如，ESI-MS 或 SEC-MS) 及/或離子遷移率分析。
本揭露進一步包含產生重組蛋白質或抗體的方法，包含: (a) 在相對於整體甘露糖化種類，顯著增加高分子量甘露糖種類，諸如 Man6 或更高、Man7 或更高、或 Man7-9 之濃度的條件下，於宿主細胞中表現蛋白質或抗體，以及 (b) 確定該蛋白質或抗體相較於自未經修飾的宿主細胞所表現的抗體，是否具有與由該宿主細胞所表現的一種或多種內源性脂酶之降低的相互作用。在一些此類情況下，條件包含增加培養基之滲透壓例如至少 100 或至少 200 mOsm/kg，添加氯化錳或氯化銨至該培養基，增加或添加棉子糖、莫能菌素 (monensin)、甘露糖、半乳糖、果糖及/或麥芽糖，或添加高甘露糖促進抑制劑諸如基夫鹼 (Kifunensine) 至該培養基。在此類方法中，在一些情況下宿主細胞是 CHO 細胞。在一些情況下，確定該蛋白質或抗體相較於自未經修飾的宿主細胞所表現的抗體，是否具有與一種或多種內源性脂酶之降低的相互作用係藉由自該宿主細胞所表現的該蛋白質或抗體之 SPR、羥基自由基足跡、天然質譜法 (例如，ESI-MS 或 SEC-MS) 及/或離子遷移率分析。
本揭露亦涉及產生重組蛋白質或抗體的方法，包含：(a) 於宿主細胞中表現該蛋白質或抗體，該宿主細胞經修飾以消除至少一種內源性脂酶上的至少一個醣基化位點；以及 (b) 確定該蛋白質或抗體相較於自未經修飾的宿主細胞所表現的抗體，是否具有與由該宿主細胞所表現的一種或多種內源性脂酶之降低的相互作用。在一些情況下，宿主細胞經修飾以消除 LPLA2 及/或 PLBL2 上的至少一個醣基化位點。在一些情況下，該修飾包含在該宿主細胞之至少一種脂酶酵素中的至少一個 N-X-S/T 位點內之至少一個胺基酸取代。在此類方法中，在一些情況下宿主細胞是 CHO 細胞。在一些情況下，確定該蛋白質或抗體相較於自未經修飾的宿主細胞所表現的抗體，是否具有與一種或多種內源性脂酶之降低的相互作用係藉由自該宿主細胞所表現的該蛋白質或抗體之 SPR、羥基自由基足跡、天然質譜法 (例如，ESI-MS 或 SEC-MS) 及/或離子遷移率分析 (例如，IM-MS)。
在一些情況下，當宿主細胞是包含經修飾的脂酶的 CHO 細胞時，修飾包含： 在 LPLA2 (SEQ ID NO: 2) 中的位置 39 至 41、99 至 101、273 至 275 及 289 至 291 中之一者或多者處的一個或多個胺基酸取代，在 LPLA2 (SEQ ID NO: 2) 中的位置 125 至 131、133 至 145、146 至 177、229 至 247 及 248 至 260 中之一者或多者處的一個或多個胺基酸取代 在 LPLA2 (SEQ ID NO: 2) 中的位置 146 至 177 中之一者或多者處的一個或多個胺基酸取代， 在 PLBL2 (SEQ ID NO: 3) 中的位置 47、65、69、190、395 及 474 中之一者或多者處的一個或多個胺基酸取代， 在 PLBL2 (SEQ ID NO: 3) 中的位置 67 至 78、79 至 98、173 至 187、359 至 371、372 至 388、389 至 400、401 至 407、424 至 459、211 至 236、241 至 253、287 至 333、340 至 352、513 至 530、539 至 546、573 至 599、56 至 64、485 至 512 及 548 至 572 中之一者或多者處的一個或多個胺基酸取代， 在 PLBL2 (SEQ ID NO: 3) 中的位置 79 至 98、424 至 459、573 至 599、372 至 388 及 548 至 572 中之一者或多者處的一個或多個胺基酸取代， 在硫酯酶 (SEQ ID NO: 1) 中的位置 298 至 300 及 422 至 424 中之一者或多者處的一個或多個胺基酸取代， 在 PPT (SEQ ID NO: 4) 中的位置 197 至 199、212 至 214 及 232 至 234 中之一者或多者處的一個或多個胺基酸取代， 在 PLD3 (SEQ ID NO: 5) 中的位置 97 至 99、102 至 104、132 至 134、234 至 236、282 至 284、385 至 387 及 430 至 432 中之一者或多者處的一個或多個胺基酸取代，及/或 在 SP (SEQ ID NO: 6) 中的位置 84 至 86、173 至 175、333 至 335、393 至 395、518 至 520 及 611 至 613 中之一者或多者處的一個或多個胺基酸取代。
定義
應理解，除非另外指示，否則根據本揭露所用之下列術語具有下列含義：
本文之術語「抗體」指代一種分子，其包含重鏈之至少互補決定區 (CDR) 1、CDR2 及 CDR3 以及輕鏈之至少 CDR1、CDR2 及 CDR3，其中該分子能夠結合至抗原。該術語在最寬廣意義上使用且涵蓋各種抗體結構，包括但不限於單株抗體、多株抗體、多特異性抗體 (例如雙特異性抗體、雙抗體等)、全長抗體、單鏈抗體、抗體結合物及抗體片段，只要其等展現出所欲結合活性即可。
「經分離之」抗體為以及自其天然環境之組分中分離出來的抗體。在一些態樣中，將抗體純化至大於 95% 或 99% 純度，藉由 (例如) 電泳 (例如 SDS-PAGE、等電聚焦 (IEF)、毛細管電泳) 或層析 (例如，離子交換或反相 HPLC) 方法測定。關於評估抗體純度之方法的綜述，參見例如 Flatman 等人， J. Chromatogr. B848:79-87 (2007)。
「重組抗體」是在宿主細胞中由異源核酸產生的抗體，該異源核酸已經引入宿主細胞以產生抗體，諸如載體。
「抗原」指代抗體的標靶，亦即，抗體所特異性地結合的分子。術語「表位 (epitope)」表示蛋白質或非蛋白質抗原上抗體結合的位點。蛋白質上之表位可由連續的胺基酸延伸形成 (線性表位) 或包含非連續的胺基酸 (構形表位)，例如，由於抗原的折疊，亦即，藉由蛋白質抗原的三級折疊而在空間上接近。線性抗原決定位通常在蛋白抗原暴露於變性劑後仍被抗體結合，而構形抗原決定位通常在變性劑處理後被破壞。
「親和力」或「結合親和力」係指分子 (例如抗體) 之單一結合位點與其結合配偶體 (例如抗原或脂酶蛋白質) 之間的非共價相互作用總和的強度。除非另有說明，否則如本文中所使用的「結合親和力」，係指反映結合對成員 (例如抗體及抗原) 之間 1:1 交互作用之內在結合親和力。分子 X 與其配偶體 Y 的親和力通常可藉由解離常數 (K D) 來表示。可以藉由本領域已知的常規方法測量親和力，包括彼等本文所述之方法。
在本揭露中，「結合 (binds)」或「結合 (binding)」或「特異性結合」及類似術語，當指代例如蛋白質及其配位體或抗體及其抗原標靶時，意謂結合親和力足夠強烈，使得結合對成員之間的相互作用不能歸因於隨機分子結合 (亦即，「非特異性結合」)。此類結合通常需要 1μM 或更小的解離常數 (K D)，並且通常可能涉及 100 nM 或更小的 K D。
在一些情況下，使用質譜檢測結合，諸如藉由離子遷移率及天然質譜法 (IM-MS)。在一些實施例中，可藉由確定複合物的碰撞誘導之解離電壓「VC50」來評估結合量。「VC50」是在 MS 中觀察到的解離 50% 給定複合物所需的電壓。
術語「重鏈」指代包含至少重鏈可變區、具有或不具有前導序列的多肽。在一些實施例中，重鏈包含重鏈恆定區，諸如至少 CH1 區之至少一部分。術語「全長重鏈」係指包含重鏈可變區及完整重鏈恆定區、具有或不具有前導序列的多肽。IgG 同型抗體的全長重鏈可包含或可不包含 C-端離胺酸殘基或 C-端甘胺酸-離氨酸殘基。
術語「輕鏈」指代包含至少輕鏈可變區、具有或不具有前導序列的多肽。在一些實施例中，輕鏈包含輕鏈恆定區之至少一部分。術語「全長輕鏈」指代包含輕鏈可變區及輕鏈恆定區、具有或不具有前導序列的多肽。
術語「全長抗體」、「完整抗體」及「全抗體」在本文中可互換使用，係指具有與天然抗體結構實質上類似的結構之抗體或包含全長重鏈 (完整 Fc 序列) 及全長輕鏈之抗體。
如本文所用，術語「高變區」或「HVR」指代抗體可變區中序列高變並決定抗原結合特異性的各個區，例如「互補決定區」(「CDR」)。通常，抗體包含六個 CDR：三個在 VH 中 (CDR-H1 或重鏈 CDR1、CDR-H2、CDR-H3)，及三個在 VL 中 (CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3)。在本文中，例示性 CDR 包括： (a) 「Chothia CDR」：高度可變環存在於胺基酸殘基 26-32 (L1)、50-52 (L2)、91-96 (L3)、26-32 (H1)、53-55 (H2)，及 96-101 (H3) 處 (Chothia 及 Lesk， J. Mol. Biol.196:901-917 (1987))； (b) 「Kabat CDR」：CDR 存在於胺基酸殘基 24-34 (L1)、50-56 (L2)、89-97 (L3)、31-35b (H1)、50-65 (H2)，及 95-102 (H3) 處 (Kabat 等人 ， Sequences of Proteins of Immunological Interest，第 5 版 Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda, MD (1991))；以及 (c) 「McCallum CDR」：抗原接觸存在於胺基酸殘基 27c-36 (L1)、46-55 (L2)、89-96 (L3)、30-35b (H1)、47-58 (H2)，及 93-101 (H3) 處 (MacCallum 等人 J. Mol. Biol.262: 732-745 (1996))。
「框架」或「FR」指代不作為互補決定區 (CDR) 之一部分的可變區殘基的殘基。可變區之 FR 通常由四個 FR 組成：FR1、FR2、FR3、及 FR4。因此，CDR 及 FR 序列通常以如下順序出現在 VH (或 VL) 中：FR1-CDR-H1(CDR-L1)-FR2-CDR-H2(CDR-L2)-FR3-CDR-H3(CDR-L3)-FR4。就本文目的而言，「接受者人骨架 (acceptor human framework)」為包含衍生自人免疫球蛋白骨架或人共通骨架的輕鏈可變域 (VL) 骨架或重鏈可變域 (VH) 骨架的胺基酸序列的骨架，如下定義。「衍生自 (derived from)」人免疫球蛋白骨架或人共通骨架的受體人骨架可包含與此等為相同的胺基酸序列，或其可含有胺基酸序列的變更。在一些態樣中，胺基酸變更數目為 10 或更少、9 或更少、8 或更少、7 或更少、6 或更少、5 或更少、4 或更少、3 或更少、或 2 或更少。在一些態樣中，VL 受體人框架與 VL 人免疫球蛋白框架序列或人共同框架序列的序列相同。
術語「可變區 (variable region)」或「可變域 (variable domain)」可互換地係指參與抗體與抗原結合之抗體重鏈或輕鏈之域。天然抗體之重鏈及輕鏈 (分別為 VH 及 VL) 之可變域通常具有類似的結構，且每個域均包含四個保守性框架區 (FR) 及三個互補決定區 (CDR)。參見例如 Kindt 等人， Kuby Immunology，第 6 版，W.H. Freeman and Co.，第 91 頁 (2007)。可變域可包含：重鏈 (HC) CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3，其含有或不含 FR1 及/或FR4 之全部或一部分；及輕鏈 (LC) CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3，其含有或不含 FR1 及/或FR4 之全部或一部分。即，可變域可缺少 FR1 及/或 FR4 的一部分，只要其保留抗原結合活性即可。單個 VH 或 VL 域可能足以賦予抗原結合特異性。此外，可以使用 VH 或 VL 域從結合抗原的抗體中分離結合特定抗原的抗體，以分別篩選互補 VL 或 VH 域的文庫。參見，例如，Portolano 等人， J. Immunol.150:880-887 (1993); Clarkson 等人， Nature352:624-628 (1991)。
抗體的輕鏈及重鏈「恆定區」指代在 FR 及 CDR 及可變區之外的額外序列部分。某些抗體片段可能缺少全部或一些恆定區。從 N 端至 C 端，每條重鏈具有可變域 (VH)，亦稱為重鏈可變域或重鏈可變區，接著係三個重鏈恆定域 (CH1、CH2 及 CH3)。類似地，從 N 端至 C 端，每條輕鏈具有可變域 (VL)，亦稱為輕鏈可變域或輕鏈可變區，接著為輕鏈恆定 (CL) 域。
本文中的術語「Fc 區」用於定義包含恆定區的至少 CH2 及 CH3 部分的免疫球蛋白重鏈的 C 端區。該術語包括天然序列 Fc 區域和變異 Fc 區域。由宿主細胞產生的重組抗體可能經歷重鏈 C 端的一種或多種，特定而言一種或兩種胺基酸之轉譯後切割。因此，由宿主細胞透過表現編碼全長重鏈的特定核酸分子而產生的抗體可包括全長重鏈，或者可包括全長重鏈的切割變體。這可能是重鏈的最後兩個 C 端胺基酸為甘胺酸及離胺酸的情況。因此，在具有全長重鏈的重組抗體中，Fc 區的 C 端離胺酸或 C 端甘胺酸及離胺酸可能存在或不存在。除非本文另有說明，Fc 區或重鏈恆定區中胺基酸殘基的編號是根據 Kabat 編號。
「效應功能 (effector function)」，係指歸因於抗體的 Fc 區域的那些生物活性，其隨抗體同種型而變化。抗體效應功能的實例包括：C1q 結合和補體依賴性細胞毒性 (CDC)；Fc 受體結合；抗體依賴性細胞媒介的細胞毒性 (ADCC)；吞噬作用；細胞表面受體 (例如 B 細胞受體) 的下調；以及 B 細胞活化。
抗體之「類別 (class)」係指為其重鏈所具有的恆定域或恆定區之類型。有五大類抗體：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，且此等類別中之若干者可進一步分成子類（同型），例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2。在某些態樣，抗體屬於人類 IgG1、IgG2、IgG3 或 IgG4 同型。對應於不同類別之免疫球蛋白的重鏈恆定域分別稱為 α、δ、ε、γ 及 μ。基於其恆定域之胺基酸序列，抗體之輕鏈可被歸類為兩種類型中的一種，稱為卡帕 (κ) 及蘭姆達 (λ)。
「抗體片段」係指除完整抗體以外的分子，其包含結合完整抗體所結合抗原之完整抗體的一部分。抗體片段之實例包括 (但不限於) Fv、Fab、Fab'、Fab’-SH、F(ab') 2；從抗體片段所形成之雙功能抗體 (diabody)、線性抗體；單鏈抗體分子 (例如 scFv 及 scFab)；單域抗體 (dAb)；及多特異性抗體。關於某些抗體片段的綜述，參見 Holliger 及 Hudson, Nature Biotechnology 23:1126-1136 (2005)。
本文中的術語「多特異性」係指可以結合於多於一種不同標靶或抗原，諸如結合於兩種或三種或更多種不同標靶或抗原的分子。本文中的術語「雙特異性」係指能夠特異性結合於兩種不同標靶或抗原的分子，諸如結合蛋白質或抗體。本文中的「多特異性」或「雙特異性」抗體可包括用於結合兩種不同抗原的合適的全長重鏈及輕鏈，或其可包括用於結合於兩種不同抗原的合適的抗體片段。
如本文所用的術語「單株抗體」係指獲自實質上同源抗體群體之抗體，即群體中包含的個別抗體係相同的且/或結合相同表位，但不包括，例如，含有天然生成之突變或產生於單株抗體製劑生產過程中的可能的變異體抗體，此等變異體通常係以少量存在。與通常包括針對不同決定位 (表位) 之不同抗體之多株抗體製劑相反，單株抗體製劑之每個單株抗體係針對於抗原上的單一決定位。因此，修飾詞「單株」表示抗體之特徵係獲自實質上同質之抗體群體，且不應解釋為需要藉由任何特定方法產生抗體。例如，意欲根據本發明使用的單株抗體可藉由多種技術來製造，包括但不限於融合瘤方法、重組 DNA 方法、噬菌體展示方法、及利用包含全部或部分人免疫球蛋白基因座之轉殖基因動物之方法，本文描述此等方法及用於製備單株抗體之其他例示性方法。
術語「嵌合」抗體是指其中重鏈及/或輕鏈的一部分源自特定來源或物種，而重鏈及/或輕鏈的其餘部分源自不同來源或物種的抗體。
「人源化 (humanized)」抗體係指包含來自非人 CDR 之胺基酸殘基及來自人 FR 之胺基酸殘基之嵌合抗體。在某些態樣中，人源化抗體將包括實質上所有至少一個 (且通常兩個) 可變域，其中所有或實質上所有 CDR 對應於非人抗體之其等，及所有或實質上所有 FR 對應對於人抗體之其等。人源化抗體視情況可包含衍生自人抗體之抗體恆定區之至少一部分。抗體 (例如非人抗體) 之「人源化形式 (humanized form)」係指已經歷人源化之抗體。
「人抗體 (human antibody)」為具有胺基酸序列之抗體，該胺基酸序列對應於由人或人體細胞產生或自利用人抗體譜系 (antibody repertoire) 或其他人抗體編碼序列之非人來源衍生之抗體之胺基酸序列。人抗體的該定義特定地排除包含非人抗原結合殘基之人源化抗體。
術語「核酸分子」或「核酸」或「多核苷酸」包括任何包含核苷酸聚合物的化合物及/或物質。每個核苷酸由鹼基具體而言嘌呤或嘧啶鹼基 (即，胞嘧啶 (C)、鳥嘌呤 (G)、腺嘌呤 (A)、胸腺嘧啶 (T) 或尿嘧啶 (U))、糖 (即，去氧核糖或核糖) 及磷酸基團構成。通常，核酸分子通過鹼基序列進行描述，其中該鹼基代表核酸分子的一級結構 (線性結構)。鹼基序列通常由 5’ 至 3’ 表示。在本文中，術語核酸分子包括：去氧核糖核酸 (DNA)，其包括例如互補 DNA (cDNA) 和基因組 DNA；核糖核酸 (RNA)，特定而言信使 RNA (mRNA)；DNA 或 RNA 的合成形式；以及包含兩個或更多個這些分子的混合聚合物。核酸分子可以是線性或環狀的。另外，術語核酸分子包括有義股和反義股，以及單股和雙股形式。此外，本文所述之核酸分子可包含天然存在或非天然存在之核苷酸。非天然存在之核苷酸的例子包括帶有衍生醣、磷酸鹽連接或化學修飾殘基的經修飾之核苷酸鹼基。核酸分子還包括適於在體外及/或體內例如在宿主或患者體內直接表現本發明之抗體的載體的 DNA 和 RNA 分子。此等 DNA (例如，cDNA) 或 RNA (例如，mRNA) 載體可以是未修飾的或經過修飾的。例如，mRNA 可經化學修飾以增強 RNA 載體之安定性及/或所編碼之分子的表現，使得 mRNA 可被注射入個體體內以生成抗體（參見例如 Stadler 等人，Nature Medicine 2017，在綫發表于 2017 年 6 月 12 日，doi:10.1038/nm.4356 或 EP 2 101 823 B1）。在本文的一些實施例中，核酸分子編碼重組抗體。
「分離的」核酸係指已經與其天然環境的組分分離的核酸分子。分離的核酸包括通常包含核酸分子之細胞中所含之核酸分子，但是核酸分子存在於染色體外或與自然染色體位置不同之染色體位置。
「編碼抗體的分離的核酸」係指編碼本文抗體的抗體重鏈及輕鏈 (或其片段) 之一種或多種核酸分子，包括在單個載體或個別載體中的該等核酸分子，且該等核酸分子存在於宿主細胞中的一個或多個位置。
如本文所用，術語「載體」係指一種核酸分子，其能夠傳送與其連接之另一種核酸。該術語包括作為自我複製核酸結構之載體以及併入已引入該宿主細胞的基因體中的載體。某些載體能夠指導與其可操作地連接的核酸的表現。這些載體在本文中稱為「表現載體」。
術語「宿主細胞」、「宿主細胞株」及「宿主細胞培養物」可互換使用，並且係指已向其中引入至少一個外源性核酸的細胞，包括此等細胞的子代細胞。宿主細胞包括「轉化子」和「轉化細胞」，其包括原代轉化細胞及由其衍生的子代細胞，而與傳代次數無關。子代細胞之核酸含量可能與親代細胞不完全相同，但可能含有突變。本文中包括具有與原始轉化細胞中篩選或選擇的功能或生物學活性相同的功能或生物學活性的突變子代細胞。「分離的」宿主細胞是自自然環境中分離出來的細胞，例如存在於實驗室諸如細胞培養系統中，或例如以其他方式在體外或離體，而不是在其天然的活體內環境。
相對於參比多肽序列所述之「胺基酸序列同一性百分比 (%)」，是指候選序列中胺基酸殘基與參比多肽序列中之胺基酸殘基相同之百分比，在比對序列並引入差異後 (如有必要)，可實現最大的序列同一性百分比，並且不考慮將任何保守取代作為序列同一性之一部分。為確定胺基酸百分比序列同一性之目的而進行的比對可透過本領域中技術範圍內之各種方式實現，例如，使用公開可用的電腦軟體，諸如 BLAST、BLAST-2、Clustal W、Megalign (DNASTAR) 軟體或 FASTA 程式包。本領域之技術人員可確定用於比對序列之合適參數，包括在所比較之序列全長上實現最大比對所需之任何算法。可替代地，可使用序列比較計算機程式 ALIGN-2 生成同一性百分比值。ALIGN-2 序列比較計算機程式由建南德克公司開發，並且其源代碼已與用戶文檔一起歸檔在位於美國華盛頓特區 20559 的美國著作權局，其已經注冊 (美國版權註冊號 TXU510087) 並在 WO 2001/007611 中有所描述。
除非另有說明，否則出於本文之目的，使用 FASTA 封裝 36.3.8c 版或更高版本的 ggsearch 程式及 BLOSUM50 比較矩陣來生成胺基酸序列同一性百分比值。FASTA 程式包由以下作者開發：W. R. W. R. Pearson and D. J. Lipman (1988), “Improved Tools for Biological Sequence Analysis”, PNAS 85:2444-2448；W. R. Pearson (1996) “Effective protein sequence comparison” Meth. Enzymol. 266:227- 258；及 Pearson et. al.(1997) Genomics 46:24-36，且可自 www.fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/fasta_down.shtml 或 www. ebi.ac.uk/Tools/sss/fasta 公開獲取。可替代地，可使用透過 fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/index.cgi 存取的公用伺服器，使用 ggsearch (global protein:protein) 程式和預設選項 (BLOSUM50; open: -10; ext: -2; Ktup = 2) 比較序列，以確保執行全局而不是局部比對。胺基酸同一性百分比提供於輸出比對標題中。
「減少」是指導致整體減少的能力。在一些實施例中，降低或抑制可以指與參考相比相對降低 ( 例如，生物活性或結合親和力的參考量，諸如脂酶結合親和力)。在一些實施例中，結合親和力降低至少 2 倍，例如，或更大程度，諸如至少 5 倍、至少 10 倍、至少 20 倍、至少 30 倍，至少 50 倍，或至少 100 倍。請注意，結合親和力的降低可藉由分子之間解離常數或 K D的增加或 IC50 的增加來測量，例如，藉由諸如表面電漿子共振 (SPR)、微尺度熱泳動 (MST) 或 ELISA 等測定來測量。
如本文所用，術語「約」係指數值 (包括例如整數、分數及百分比)，無論是否明確指出皆如此。術語「約」一般係指本領域普通技術人員將認為等同於所述值 (例如，具有相同之功能或結果) 的數值範圍 (例如，所述範圍 +/-5-10%)。當諸如「至少」及「約」等術語位於數值或範圍列表之前時，此等術語將修改列表中所提供之所有值或範圍。在一些情況下，術語「約」可包括四捨五入到最接近之有效數字的數值。
除非另外定義，否則結合本發明使用之科學及技術術語應具有熟習此項技術者通常所理解的含義。此外，除非上下文另有要求，否則單數術語應包括複數，且複數術語應包括單數。
在本申請案中，除非另外陳述，否則所用之「或」意指「及/或」。在多重附屬請求項之背景中，所用之「或」僅以替代形式重新提及多於一個前述獨立或附屬請求項。同樣，除非另外具體陳述，否則諸如「要素」或「組分」等術語涵蓋包含一個單元之要素及組分以及包含多於一個次單元之要素及組分兩種情況。
與重組 DNA、寡核苷酸合成、組織培養及轉化 (例如，電穿孔、脂轉染)、酶促反應及純化技術結合使用的示例性技術在例如 Sambrook 等人 Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(1989)) 等中有所描述。
術語「醫藥組成物」或「醫藥調配物」係指以下製劑，其形式為允許其中所含之活性成分的生物活性有效，並且不含對組成物將投予之個體具有不可接受之毒性的其他組分。
「醫藥上可接受之載劑」係指醫藥組成物或調配物中除對個體無毒之活性成分以外的成分。醫藥上可接受之載劑包括但不限於緩衝劑、賦形劑、穩定劑或防腐劑。
除非另有說明，否則「受試者」或「個體」是人。在一些情況下，若指定，「受試者」或「個體」是非人類哺乳動物或包括非人類哺乳動物 (例如「哺乳動物個體」或「非人類哺乳動物個體」)。哺乳動物包括但不限於馴養的動物 (例如牛、綿羊、貓、狗和馬)、靈長類動物 (例如人及非人類靈長類動物諸如猴)、兔以及囓齒動物 (例如小鼠及大鼠)。
如本文中所使用的「治療」(及其語法變異體，諸如「治療過程」或「治療中」)，係指試圖改變受治療個體之疾病自然病程的臨床干預，並且可進行預防或在臨床病理過程中執行。期望之治療效果包括但不限於預防疾病之發生或複發、減輕症狀、減輕疾病之任何直接或間接病理後果、預防轉移、降低疾病進展之速度、改善或減輕疾病狀態、緩解或改善預後。
藥劑例如包含抗體的醫藥組成物的「有效量」係指在所需之給藥劑量及時段內有效實現所需的治療或預防效果的量。 示例性抗體
本揭露部分涉及經修飾以改變抗體與用於表現抗體的宿主細胞所表現的一種或多種內源性脂酶的相互作用的抗體。例如，許多抗體在細胞培養物的宿主細胞中以高濃度產生，然後自細胞培養基中分離及純化。然而，宿主細胞亦產生內源性蛋白質，根據條件，這些內源性蛋白質可能以低量或痕量保留在分離及純化的抗體調配物中，例如，因為其可能與抗體相互作用或可能與抗體共同純化，或可能與打算通過其他機制純化的蛋白質一起存在。此等宿主細胞蛋白不純物，即使處於極低的痕量水平，亦可能引發患者的免疫反應，其中抗體用於治療，亦可能縮短抗體的保存期限、降低其效力或使抗體調配物不穩定，特別是在抗體以極高的濃度調配的情況下。此等可能最終保留在自宿主細胞分離的抗體中的潛在宿主細胞蛋白的一個實例是內源性脂酶蛋白，例如脂酶磷脂酶 B 樣蛋白 2 (PLBL2) 及溶體磷脂酶 A2 (LPLA2)，其被表現，例如，在宿主細胞中，諸如中國倉鼠卵巢 (CHO) 細胞。
本揭露部分涉及經修飾以改變或減少與來自宿主細胞的內源性脂酶的相互作用的抗體，諸如下文「示例性脂酶」部分及其中的表格中列出的任何一種或多種脂酶，其包括 PLBL2、LPLA2 等。
在一些實施例中，抗體經修飾以改變其醣基化圖譜。在一些實施例中，抗體在其恆定區諸如 CH1、CH2 及/或 CH3 區中經修飾，以減少與外源脂酶的相互作用。例如，本文的實例描述了人類 IgG4 抗體可與 CH1 區中宿主細胞的內源性脂酶相互作用，諸如在自 P149 至 S197 的部分中，並且人類 IgG1 抗體可與 CH1 區中宿主細胞的內源性脂酶相互作用，諸如在自 V152 至 P214 的部分中 (Kabat 編號)。因此，在一些實施例中，CH1 區的彼等段內的一個或多個胺基酸殘基可經修飾 (即，藉由取代、***或缺失)。在一些情況下，CH1 區或人類 IgG4 重鏈恆定區的 P149-S197 部分或人類 IgG1 重鏈恆定區的 V152-P214 部分 (Kabat 編號) 中的一個或多個殘基可經另一個胺基酸殘基取代，諸如丙胺酸、甘胺酸、纈胺酸、異白胺酸等。在一些情況下，取代是針對丙胺酸、白胺酸或異白胺酸。在一些情況下，取代是針對丙胺酸。在其他情況下，取代是針對***酸、色胺酸或酪胺酸 (例如，針對 Phe、Trp 或 Tyr 的較小殘基取代)。在其他情況下，取代是針對天冬胺酸或麩胺酸 (例如，針對 Asp 或 Glu 的中性、鹼性或疏水性殘基取代)。在更多情況下，取代是針對精胺酸或離胺酸 (例如，針對 Arg 或 Lys 的中性、酸性或疏水性殘基取代)。
在一些實施例中，抗體經修飾使得該修飾導致抗體與由細胞表現的一個或多個脂酶 (例如脂酶 PLBL2) 的結合親和力降低至少 5 倍、10 倍、20 倍、30 倍、50 倍或 100 倍，如藉由表面電漿子共振 (SPR)、微尺度熱泳動 (MST) 及/或 ELISA 測定的。在另一個實施例中，藉由 MS 或 IM 實驗確定修飾導致與至少一種內源性脂酶的結合量的統計學顯著差異，例如，導致該抗體與該一種或多種內源性脂酶的相互作用量降低至少 5 倍、10 倍、20 倍、30 倍、50 倍或 100 倍，例如，藉由結合解離測定，如藉由質譜法諸如電噴霧電離 (ESI) MS (ESI-MS)，(例如，藉由 VC50) 或藉由 SEC-MS 或大氣離子遷移率檢測到的抗體-脂酶複合物的量所測量。(參見 Hofstadler 及 Sannes-Lowery, Nature Reviews 5: 585-595 (2006)，用於描述 ESI-MS。)
抗體 CH1 修飾的實例包括以下任何胺基酸的取代 (單字母縮寫及 Kabat 編號)：G170、V171、T173、F174、P175、V177、L178、Q179、S180、S181、G182、L186、F154、P155、V189、V190、T191、V192、P193、S194、S195、S196、L198、K200、P157、V158 及 TI59。在某些情況下，取代存在於 F174、P175、Q179、V192、L198 及 K200 中之至少一者中。取代可為與除最初在該位置的胺基酸以外的任何胺基酸。例如，取代可以選自由以下所組成之群組的胺基酸所取代:丙胺酸 (A)、白胺酸 (L) 及異白胺酸 (I)；在具體實施例中，取代是以丙胺酸 (A) 所取代。作為另一個實例，取代可以選自由以下所組成之群組的胺基酸所取代:***酸 (F)、色胺酸 (W) 及酪胺酸 (Y)；在具體實施例中，取代是以色胺酸 (W) 或酪胺酸 (Y) 所取代。作為另一個實例，取代可以選自由以下所組成之群組的胺基酸所取代:天冬胺酸 (D) 及麩胺酸 (E)。作為另一個實例，取代可以選自由以下所組成之群組的胺基酸所取代:精胺酸 (R) 及離胺酸 (K)。
在一些情況下，該修飾包含選自由以下所組成之群組的至少一個胺基酸的取代：G170、V171、T173、F174、P175、V177、L178、Q179、S180、S181、G182、L186、F154、P155、V189、V190、T191、V192、P193、S194、S195、S196、L198、K200、P157、V158 及 TI59 (Kabat 編號)。在一些情況下，修飾為選自由以下所組成之群組的胺基酸的取代：F174、P175、Q179、V192、L198 及 K200 (Kabat 編號)。在一些情況下，取代位於選自由以下所組成之群組的殘基處：G170A、V171A、T173A、F174A、P175A、V177A、L178A、Q179A、S180A、S181A、G182A、L186A、F154A、P155A、V189A、V190A、T191A、V192A、P193A、S194A、S195A、S196A、L198A、K200A、P157A、V158A 及 TI59A (Kabat 編號)。在一些情況下，取代係選自由以下所組成之群組：F174A、P175A、Q179A、V192A、L198A 及 K200A。
在一些情況下，抗體的醣基化修飾或胺基酸修飾導致與未經修飾的抗體相比結合親和力 (K D) 降低至少 2 倍、至少 5 倍、至少 10 倍、至少 20 倍、至少 30 倍、至少 50 倍，或至少 100 倍。(參閱，例如，下文表 4。)例如，IgG4 抗體的殘基 F174、P175、Q179、V192、L198 及 K200 (Kabat 編號) 處的修飾，諸如丙胺酸取代，可能導致一種或多種脂酶 (諸如 PLBL2)的 K D增加至少 30 倍 (即親和力較弱)，例如藉由 SPR，並且在一些情況下，增加至少 50 倍。在彼等殘基處以及在 G182、P155 及 V189 (Kabat 編號) 處的取代，諸如丙胺酸取代，可使 K D增加至少 20 倍，諸如增加至少 25 倍。並且 F174、P175、Q179、V192、L198、K200、G182、P155 及 V189 以及 V171、T173、V177、L178、S180、S181、F154、V190、T191、P193、S195、S196 及 T159 處的修飾，諸如丙胺酸取代，可能導致 K D增加至少 10 倍。
在任何上述情況下，在一些實施例中，僅一個 CH1 殘基經取代。在其他實施例中，兩個 CH1 殘基經取代。在其他實施例中，三個或四個 CH1 殘基經取代。
在一些實施例中，抗體重鏈恆定區不包含選自殘基 203-256 (Kabat 編號) 的胺基酸中的修飾，不包含選自殘基 203-243 (Kabat 編號) 的胺基酸中的修飾，或不包含選自殘基 197 及 198 以及 203-243 及 246-251 (Kabat 編號) 的胺基酸的修飾。在一些情況下，該抗體是人類 IgG4 抗體，並且不包含選自 S197、L198、K203、T207、D211、R222、E226、S227、L229、G230、P237、P238、E246、F247、G249、G250 或 P251中之任何一個或多個的胺基酸的修飾。
在一些實施例中，抗體在重鏈恆定區中不包含除上述彼等中之一個或多個修飾之外的修飾。然而，在其他情況下，抗體的重鏈恆定區亦包含其他修飾，例如，以修飾抗體的 ADCC 活性或其他性質，其實例在下文進一步描述。在一些情況下，抗體在 CH2 或 CH3 區，即在 Fc 區中不包含修飾，並且因此包含野生型 Fc 區，諸如野生型人類 Fc 區。在其他情況下，抗體包含一個或多個 Fc 區修飾，諸如以下部分中所描述之彼等 Fc 區修飾。
因此，除了上文所論述之修飾之外，可能需要改變抗體對其抗原標靶的結合親和力及/或修飾抗體的其他生物學特性。可藉由將適當的修飾引入編碼抗體之核苷酸序列中，或藉由肽合成來製備抗體之胺基酸序列變異體。此等修飾包括例如抗體之胺基酸序列中的殘基的缺失及/或***及/或取代。可實施缺失、***和取代之任意組合以得到最終構建體，前提條件是最終構建體具有所需之特徵，例如抗原結合特徵。
由於抗體的模塊化性質，以及本文所描述之修飾位於重鏈恆定區的事實，本文的修飾與任何類型的抗體可變區相容，並且可施加至具有不同抗原標靶、功能以及 CDR 及可變區序列的多種抗體。 醣基化變異體
抗體的 Fc 部分的醣基化以及某些其他胺基酸序列修飾可能會影響抗體的效應子功能。在某些態樣中，本揭露考慮了一種具有一部分但非全部效應子功能的抗體變異體，使其成為以下應用中所需之候選抗體：其中抗體 體內半衰期很重要，但某些效應子功能 (諸如補體依賴性細胞毒性 (CDC) 及抗體依賴性細胞介導的細胞毒性 (ADCC)) 是不必要或有害的。可實施 活體外及/或 活體內細胞毒性測定，以確認 CDC 及/或 ADCC 活性之下降/耗竭。舉例而言，可實施 Fc 受體 (FcR) 結合測定以確保抗體缺乏 FcγR 結合 (因此可能缺乏 ADCC 活性)，但保留 FcRn 結合能力。介導 ADCC 的主要細胞 NK 細胞僅表現 FcγRIII，而單核細胞表現 FcγRI、FcγRII 和 FcγRIII。FcR 在造血細胞上之表現匯總於 Ravetch 和 Kinet 的論文 ( Annu. Rev. Immunol.9:457-492 (1991)) 之第 464 頁的表 3 中。用於評估目標分子之 ADCC 活性的體外分析方法的非限制性實例描述於美國專利號 5,500,362 中 (參見例如 Hellstrom, I. 等人， Proc. Nat’l Acad. Sci. USA83: 7059-7063 (1986)) 和 Hellstrom, I 等人， Proc. Nat’l Acad. Sci. USA82: 1499-1502 (1985)；5,821,337 (參見 Bruggemann, M. 等人， J. Exp. Med.166: 1351-1361 (1987))。可替代地，可採用非放射性分析方法 (參見例如用於流式細胞術之 ACTI™ 非放射性細胞毒性分析 (CellTechnology, Inc. Mountain View, CA；及 CytoTox 96 ®非放射性細胞毒性分析 (Promega, Madison, WI)。用於此等分析的有用的效應細胞包括周邊血單核細胞 (PBMC) 及自然殺手 (NK) 細胞。可替代地或此外，可 體內評估所關注分子之 ADCC 活性，例如在動物模型中，諸如 Clynes 等人 Proc. Nat'l Acad. Sci. USA95:652-656 (1998) 中所揭示之動物模型。還可實施 C1q 結合測定以確認該抗體無法結合 C1q 並因此缺乏 CDC 活性。參見例如 WO 2006/029879 及 WO 2005/100402 中的 C1q 和 C3c 結合 ELISA。為評估補體活化，可實施 CDC 測定 (參見例如：Gazzano-Santoro 等人， J. Immunol. Methods202:163 (1996)；Cragg, M.S. 等人， Blood101:1045-1052 (2003)；及 Cragg, M.S. 和 M.J. Glennie， Blood103:2738-2743 (2004))。FcRn 結合及 體內清除率/半衰期測定亦可以使用本領域已知的方法進行 (參見，例如，Petkova, S.B.等人， Int’l. Immunol.18(12):1759-1769 (2006); WO 2013/120929 Al)。在某些態樣中，進一步改變本文提供的抗體以增加或減少抗體醣基化的程度。抗體中添加或缺失醣基化位點可透過改變胺基酸序列以使得產生或去除一個或多個醣基化位點而方便地實現。例如，某些醣基化位點的改變可改變與 Fc γ 受體的相互作用，並且可改變抗體的效應子功能。在一些實施例中，除了旨在改變與宿主細胞蛋白質諸如脂酶的相互作用的改變之外，亦可進行此等改變。
例如，由哺乳動物細胞產生的天然 IgG 抗體通常包含分支的雙觸角寡醣，該寡醣通常藉由 N-鍵聯附接至 Fc 區之 CH2 域的 Asn297。例如參見 Wright 等人， TIBTECH15:26-32 (1997)。寡醣可包括各種碳水化合物，例如甘露糖、N-乙醯基葡醣胺 (GlcNAc)、半乳糖及唾液酸以及在雙觸角寡醣結構之「莖」中附接至 GlcNAc 的岩藻醣。在一些態樣中，可對本發明之抗體中的寡醣進行修飾，以產生具有某些改善之特性的抗體變異體。
在一個態樣中，提供了具有非岩藻醣基化寡醣的抗體變異體，即缺少 (直接或間接地) 連接至 Fc 區域的岩藻醣的寡醣結構。此等非岩藻醣基化寡醣 (也稱為「去岩藻醣基化」寡醣) 特定而言在雙天線型寡醣結構的莖中缺少與第一 GlcNAc 連接之岩藻醣殘基的 N-連接寡醣。在一個態樣中，提供了與天然或親本抗體相比在 Fc 區域中具有增加比例的非岩藻醣基化寡醣的抗體變異體。例如，非岩藻醣基化寡醣的比例可以為至少約 20%、至少約 40%、至少約 60%、至少約 80% 或甚至約 100% (即不存在岩藻醣基化寡醣)。非岩藻醣基化寡醣之百分比是缺少岩藻糖殘基之寡醣相對於連接至 Asn 297 (例如復合物、雜合和高甘露糖結構) 的所有寡醣的總和之 (平均) 量，該百分比透過 MALDI-TOF 質譜法測得，例如 WO 2006/082515 中所述。Asn297 係指位於 Fc 區域位置 297 附近之天冬醯胺酸殘基 (Fc 區域殘基的 EU 編號)；但是，Asn297 也可以位於位置 297 上游或下游大約 ±3 個胺基酸處，即由於抗體之微小序列變化而介於位置 294 和 300 之間。此等在 Fc 區域中具有增加的比例的非岩藻醣基化寡醣的抗體可具有改善的 FcγRIIIa 受體結合及/或改善的效應功能，特定而言改善的 ADCC 功能。參見例如 US 2003/0157108；US 2004/0093621。
能夠產生具有減少的岩藻醣基化抗體之細胞株的實例包括缺乏蛋白質岩藻醣基化之 Lec13 CHO 細胞 (Ripka 等人， Arch. Biochem. Biophys.249:533-545 (1986)；US 2003/0157108；及 WO 2004/056312，尤其是在實例 11 中)；和敲除細胞株，諸如敲除 α-1,6-岩藻糖基轉移酶基因 FUT8的 CHO 細胞 (參見例如 Yamane-Ohnuki 等人 Biotech. Bioeng.87:614-622 (2004)；Kanda, Y. 等人 , Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006)；及 WO 2003/085107)；或 GDP-岩藻糖合成或轉運蛋白活性降低或消失的細胞 (參見例如 US2004259150、US2005031613、US2004132140、US2004110282)。
在另一個態樣中，抗體變異體被提供有二等分之寡醣，例如，其中連接至抗體之 Fc 區域的雙天線型寡醣被 GlcNAc 平分。此等抗體變異體可具有如上文所述之減少的岩藻醣基化及/或改善的 ADCC 功能。此等抗體變異體之實例描述於例如：Umana 等人，Nat Biotechnol 17，176-180 (1999)；Ferrara 等人，Biotechn Bioeng 93，851-861 (2006)；WO 99/54342；WO 2004/065540、WO 2003/011878。
亦提供了在寡醣上具有至少一個連接至 Fc 區域之半乳糖殘基的抗體變異體。此等抗體變體可具有改善的 CDC 功能。此等抗體變異體描述於例如 WO 1997/30087、WO 1998/58964 及 WO 1999/22764 中。 Fc 區域變異體
在某些態樣中，可在本文所提供之抗體的 Fc 區中引入一個或多個額外胺基酸修飾，從而產生 Fc 區變異體。例如，在一些態樣中，本文的抗體具有效應子功能。在其他態樣中，本文的抗體缺乏效應子功能。在一些態樣中，進一步修飾抗體以改變效應子功能。
效應子功能下降的抗體包括一個或多個 Fc 區域殘基 238、265、269、270、297、327 和 329 被取代之抗體 (美國第 6,737,056 號專利)。此等 Fc 突變體包括具有在胺基酸位置 265、269、270、297 及 327 中的兩者或更多者處的取代之 Fc 突變體，包括所謂的「DANA」Fc 突變體，其中殘基 265 及 297 被丙胺酸取代 (美國專利號 7,332,581)。描述了某些與 FcR 之結合得到改善或減弱的抗體變體。(參見例如，美國專利號 6,737,056；WO 2004/056312 及 Shields 等人， J. Biol. Chem.9(2): 6591-6604 (2001)。)
在某些態樣中，抗體變異體包含具有一個或多個胺基酸取代的 Fc 區域，這些取代改善了 ADCC，例如 Fc 區域的位置 298、333 及/或 334 (殘基的 EU 編號) 處之取代。
在某些態樣中，抗體變異體包含具有一個或多個胺基酸取代的 Fc 區域，這些取代減弱了 FcγR 結合，例如 Fc 區域的位置 234 和 235 (殘基的 EU 編號) 處之取代。在一個態樣中，取代為 L234A 和 L235A (LALA)。在某些態樣中，抗體變異體進一步包含 Fc 區域中之 D265A 及/或 P329G，其來源於人 IgG 1Fc 區域。在一個態樣中，取代為 Fc 區中的 L234A、L235A 及 P329G (LALAPG)，其源自於人類 IgG 1Fc 區。參見例如 WO 2012/130831。在另一態樣中，取代為 Fc 區域中的 L234A、L235A 和 D265A (LALA-DA)，其來源於人 IgG 1Fc 區域。
在一些態樣中，抗體可在位置 N297 處具有修飾以降低或消除 ADCC 活性，諸如 N297G 或 N297Q。在一些此類情況下，抗體缺乏效應子功能。
在某些態樣中，在 Fc 區域中進行修改，得到修改 (即改善或減少) 之 C1q 結合及/或補體依賴性細胞毒性 (CDC)，例如美國專利號 6,194,551、WO 99/51642 及 Idusogie 等人 J. Immunol.164: 4178-4184 (2000) 所述。
具有更長半衰期並改善了與新生兒 Fc 受體 (FcRn) (其負責將母體 IgG 轉移給胎兒，見 Guyer 等人 J. Immunol.117:587 (1976) 和 Kim 等人 J. Immunol.24:249 (1994)) 之結合的抗體描述於 US2005/0014934 (Hinton 等人) 中。那些抗體包含其中具有一個或多個取代之 Fc 區域，其改善了 Fc 區域與 FcRn 之結合。此類 Fc 變體包括在一個或多個 Fc 區域殘基上發生取代之 Fc 變體：238、252、254、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424 或 434，例如 Fc 區域殘基 434 之取代 (參見例如美國專利號 7,371,826；Dall'Acqua, W.F. 等人，J. Biol. Chem. 281 (2006) 23514-23524)。
通過定點誘變已經識別出對小鼠 Fc-小鼠 FcRn 相互作用至關重要之 Fc 區域殘基 (參見例如，Dall’Acqua, W.F. 等人 J. Immunol 169 (2002) 5171-5180)。殘基 I253、H310、H433、N434 和 H435 (EU 指數編號) 參與相互作用 (Medesan, C. 等人，Eur. J. Immunol. 26 (1996) 2533；Firan, M. 等人，Int. Immunol. 13 (2001) 993；Kim, J.K. 等人，Eur. J. Immunol. 24 (1994) 542)。已發現殘基 I253、H310 和 H435 對於人 Fc 與小鼠 FcRn 之相互作用至關重要 (Kim, J.K. 等人，Eur. J. Immunol. 29 (1999) 2819)。對人 Fc-人 FcRn 複合物的研究表明，殘基 I253、S254、H435 和 Y436 對於相互作用至關重要 (Firan, M. 等人，Int. Immunol. 13 (2001) 993；Shields, R.L. 等人，J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604)。在 Yeung, Y.A. 等人 (J. Immunol. 182 (2009) 7667-7671) 中，已經報導並研究了殘基 248 至 259 及 301 至 317 及 376 至 382 及 424 至 437 的各種突變體。
在某些態樣中，抗體變異體包含具有一個或多個胺基酸取代的 Fc 區域，這些取代減少 FcRn 結合，例如 Fc 區域之位置 253、及/或 310、及/或 435 (殘基的 EU 編號) 處之取代。在某些態樣中，抗體變異體包含 Fc 區域，該 Fc 區域具有在位置 253、310 和 435 處之胺基酸取代。在一個態樣中，取代為 Fc 區域中之 I253A、H310A 和 H435A，其來源於人 IgG1 Fc 區域。參見例如 Grevys, A 等人，J. Immunol. 194 (2015) 5497-5508。
在某些態樣中，抗體變異體包含具有一個或多個胺基酸取代的 Fc 區域，這些取代減少 FcRn 結合，例如 Fc 區域之位置 310、及/或 433、及/或 436 (殘基的 EU 編號) 處之取代。在某些態樣中，抗體變異體包含 Fc 區域，該 Fc 區域具有在位置 310、433 和 436 處之胺基酸取代。在一個態樣中，取代為 Fc 區域中之 H310A、H433A 和 Y436A，其來源於人 IgG1 Fc 區域。(參見例如 WO 2014/177460 Al)。
在某些態樣中，抗體變異體包含具有一個或多個胺基酸取代的 Fc 區域，這些取代增加 FcRn 結合，例如 Fc 區域之位置 252、及/或 254、及/或 256 (殘基的 EU 編號) 處之取代。在某些態樣中，抗體變異體包含 Fc 區域，該 Fc 區域具有在位置 252、254 和 256 處之胺基酸取代。在一個態樣中，取代為 Fc 區域中之 M252Y、S254T 和 T256E，其來源於人 IgG 1Fc 區域。另參見 Duncan & Winter, Nature322:738-40 (1988)；美國專利號 5,648,260；美國專利號 5,624,821；及 WO 94/29351 涉及 Fc 區變異體的其他實例。
如本文所報導之抗體的重鏈的 C 端可以是以胺基酸殘基 PGK 結尾的完整 C 端。重鏈的 C 端可以是縮短的 C 端，其中一個或兩個 C 端胺基酸殘基已被去除。在一個優選態樣中，重鏈之 C 端是縮短的 C 端結尾 PG。在本文所報告的所有態樣中中之一態樣中，一種包含重鏈的抗體包括本文所指定之 C 端 CH3 域，其包含 C 端甘胺酸-離胺酸二肽 (G446 和 K447，胺基酸位置的 EU 指數編號)。在本文所報告的所有態樣中中之一態樣中，一種包含重鏈的抗體包括本文所指定之 C 端 CH3 域，其包含 C 端甘胺酸殘基 (G446，胺基酸位置的 EU 指數編號)。 半胱胺酸工程化抗體變異體
在某些態樣中，可能希望創建半胱胺酸工程化抗體，例如 THIOMAB TM抗體，其中抗體之一個或多個殘基被半胱胺酸殘基取代。在特定態樣中，取代殘基出現在抗體之可進入的位點。透過用半胱胺酸取代那些殘基，反應性硫醇基團由此被定位在抗體之可進入的位點，並可用於使抗體與其他部分 (例如藥物部分或連接子-藥物部分) 結合，以形成免疫結合物，如本文進一步所述。半胱胺酸工程化抗體可按照例如美國專利號 7,521,541、8,30,930、7,855,275、9,000,130 或 WO 2016040856 所屬的方法產生。 抗體衍生物
在某些態樣中，可進一步修飾本文所提供之抗體，以使其包含本技術領域中已知且容易獲得的附加的非蛋白質部分。適用於抗體之衍生化的部分包括但不限於水溶性聚合物。水溶性聚合物之非限制性實例包括但不限於聚乙二醇 (PEG)、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纖維素、葡聚醣、聚乙烯醇、聚乙烯基吡咯啶酮、聚-1,3-二氧戊環、聚-1,3,6-三㗁𠮿、乙烯/馬來酸酐共聚物、聚胺基酸 (均聚物或隨機共聚物) 以及葡聚醣或聚(n-乙烯基吡咯啶酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚環氧丙烷/環氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化多元醇 (例如甘油)、聚乙烯醇及其混合物。聚乙二醇丙醛由於其水中之穩定性而可能在製造中具有優勢。該聚合物可具有任何分子量，且可聚支鏈或無支鏈。連接至抗體的聚合物之數量可以變化，並且如果連接的聚合物超過一種，則它們可以為相同或不同之分子。通常，用於衍生化的聚合物之數量及/或類型可基於以下考慮因素來確定，此等考慮因素包括但不限於待改善之抗體的特定性質或功能、抗體衍生物是否將用於指定條件下的治療中等。 重組方法和組成物
本文的蛋白質可使用重組方法及組成物來生產，例如 US 4,816,567 中所描述。對於這些方法，提供了一個或多個編碼抗體的經分離的核酸。
如果是天然抗體或天然抗體片段，則需要兩個核酸，一個用於輕鏈或其片段，且另一個用於重鏈或其片段。此等核酸編碼包含 VL 之胺基酸序列及/或包含抗體的 VH 的胺基酸序列 (例如，抗體之輕鏈及/或重鏈)。這些核酸可以在同一表現載體上，也可以在不同表現載體上。
如果是包含異源二聚體重鏈的雙特異性抗體，需要四個核酸，一個用於第一輕鏈，一個用於包含第一異源 Fc 區域片段的第一重鏈，一個用於第二輕鏈，且一個用於第二重鏈 (其包含第二個異聚 Fc 區域多肽)。這四個核酸可包含在一個或多個核酸分子或表現載體中。
在一個態樣中，提供一種製備重組抗體之方法，其中該方法包含在適合於抗體表現的條件下培養包含如上文所提供之編碼抗體或抗體組分的核酸的宿主細胞，並視情況自宿主細胞 (或宿主細胞培養基) 中回收該抗體。在重組生產抗體時，將例如如上所述之編碼抗體之核酸分離並***一種或多種載體中，以在宿主細胞中進一步克隆及/或表現。此等核酸可通過常規方法 (例如，使用能夠與編碼抗體重鏈和輕鏈的基因特異性結合的寡核苷酸探針) 輕易地分離並序列化，或通過重組方法或化學合成進行生產。 示例性宿主細胞及脂酶
適用於選殖或表現編碼蛋白質之載體的宿主細胞包括原核或真核細胞。例如，抗體可能在細菌中產生，特別是在無需醣基化和 Fc 效應子功能的情況下。有關抗體片段和多肽在細菌中之表現，參見例如 US 5,648,237、US 5,789,199 及 US 5,840,523。(另見 Charlton, K.A.，在：Methods in Molecular Biology，第 248 卷，Lo, B.K.C. (主編)，Humana Press，Totowa，NJ (2003) 第 245-254 頁，其中描述了抗體片段在大腸桿菌中之表現。)在表現後，抗體可與細菌細胞糊中的可溶性部分分離，並可經過進一步純化。
然而，哺乳動物宿主細胞通常用於表現蛋白質，諸如抗體，然而特別是那些用於治療用途的。例如，可使用適於在懸浮液中生長的哺乳動物細胞株。可用的哺乳動物宿主細胞株的實例為：由 SV40 (COS-7) 轉形的猴腎 CV1 系；人類胚胎腎系 (如 Graham, F.L. 等人，J. Gen Virol. 36 (1977) 59-74 中所描述之 293 或 293T 細胞)；幼地鼠腎細胞 (BHK)；小鼠睾丸支持細胞 (如 Mather, J.P.，Biol. Reprod. 23 (1980) 243-252 中所描述之 TM4 細胞)；猴腎細胞 (CV1)；非洲綠猴腎細胞 (VERO-76)；人宮頸癌細胞 (HELA)；犬腎細胞 (MDCK)；Buffalo 大鼠肝細胞 (BRL 3A)；人肺細胞 (W138)；人肝細胞 (Hep G2)；小鼠乳腺腫瘤細胞 (MMT 060562)；TRI 細胞 (如 Mather, J.P. 等人，Annals N.Y.Acad. Sci. 383 (1982) 44-68 所述)；MRC 5 細胞；及 FS4 細胞。其他可用的哺乳動物宿主細胞株包括中國倉鼠卵巢 (CHO) 細胞，包括 DHFR- CHO 細胞 (Urlaub, G. 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980) 4216-4220)；及骨髓瘤細胞株，例如 Y0、NS0 和 Sp2/0。有關某些適用於抗體生產的哺乳動物宿主細胞株的綜述，參見例如：Yazaki, P. 和 Wu, A.M.，Methods in Molecular Biology，第 248 卷，Lo, B.K.C. 主編，Humana Press，Totowa，NJ (2004)，第 255-268 頁。
在一個態樣中，該宿主細胞為中國倉鼠卵巢 (CHO) 細胞或淋巴樣細胞 (例如，Y0、NS0、Sp20 細胞)。在一些情況下，宿主細胞是 CHO 細胞。在一些情況下，CHO 細胞經修飾，例如，以產生具有改變的醣基化狀態的抗體。
如本文所描述，宿主細胞包含可與重組蛋白或抗體相互作用的內源性脂酶，導致低量的脂酶作為污染物包括在純化的抗體及抗體調配物中。以下是本文針對 Ab-脂酶結合測試的示例性脂酶序列，以粗體顯示預測的醣基化位點，示例性相關天冬醯胺殘基加底線：
硫酯酶 (G3HNG5) 聚醣位置，298、422 (SEQ ID NO: 1) MAQRLAPNIPEGFKAVTASLGRPRSTKAQPDSEAMQASTAQDQMAPIMILEPADGCLCDQPVLISVHGLAPEQPVTLRAA   80 LRDEKGALFRAHARYRADDHGGLDLARAPALGGSFAGIEPMGLLWALEPERPFWRLIKRDVQTPFVVELEVLDGHEPDGG  160 RLLARAVHERHFMAPGVRRVPVREGRVRATLFLPPGNGPFPGIVDLFGVGGGLLEYRASLLAGKGFAVMALAYYNYDDLP  240 KGMDIFHLEYFEEAVNYLLSHPQVKGPGIGLLGISKGGELGLAMASFLKGIKAAVII NGSVAAVGNTIHYKDETIPPVSL  320 LRNRVKMTKDGLKDVVEGLQSPLVEEKSFIPVERPDTAFLLLVGQDDHNWKSEFYANEISKRLEAHGKEKPQIICYPEAG  400 HYIEPPYFPLCKAGMHLLVGA NITFGGEPKPHAVAQVDAWQQLQTFFHKHLGGEERTIPSKL
LPLA2（Q8NCC3，顯示人類序列）聚醣位置，99、273、289、398 (SEQ ID NO: 2) MGLHLRPYRVGLLPDGLLFLLLLLMLLADPALPAGRHPPVVLVPGDLGNQLEAKLDKPTVVHYLCSKKTESYFTIWLNLE  80 LLLPVIIDCWIDNIRLVY NKT SRATQFPDGVDVRVPGFGKTFSLEFLDPSKSSVGSYFHTMVESLVGWGYTRGEDVRGAP  160 YDWRRAPNENGPYFLALREMIEEMYQLYGGPVVLVAHSMGNMYTLYFLQRQPQAWKDKYIRAFVSLGAPWGGVAKTLRVL  240 ASGDNNRIPVIGPLKIREQQRSAVSTSWLLPY NYT WSPEKVFVQTPTI NYT LRDYRKFFQDIGFEDGWLMRQDTEGLVEA  320 TMPPGVQLHCLYGTGVPTPDSFYYESFPDRDPKICFGDGDGTVNLKSALQCQAWQSRQEHQVLLQELPGSEHIEMLA NAT400  TLAYLKRVLLGP
PLBL2 (G3I6T1，未列出信號序列) 聚醣位置，47、65、69、190、395、474 (SEQ ID NO：3) LPTQGPGRRRQNLDPPVSRVRSVLLDAASGQLRLVDGIHPYAVAWA NLT NAIRETGWAYLDLGT NGS Y NDS LQAYAAGVV  80 EASVSEELIYMHWMNTMVNYCGPFEYEVGYCEKLKSFLEINLEWMQREMELSQDSPYWHQVRLTLLQLKGLEDSYEGRLT  160 FPTGRFTIKPLGFLLLQIAGDLEDLEQAL NKT STKLSLGSGSCSAIIKLLPGARDLLVAHNTWNSYQNMLRIIKKYQLQF  240 RQGPQEAYPLIAGNNLVFSSYPGTIFSGDDFYILGSGLVTLETTIGNKNPALWKYVQPQGCVLEWIRNIVANRLALDGAT  320 WADIFKQFNSGTYNNQWMIVDYKAFIPNGPSPGSRVLTILEQIPGMVVVADKTEDLYKTTYWASYNIPFFEIVF NASGLQ  400 DLVAQYGDWFSYTKNPRAQIFQRDQSLVEDMNSMVRLIRYNNFLHDPLSLCEACIPKPNAENAISARSDLNPA NGS YPFQ  480 ALYQRPHGGIDVKVTSFSLAKRMSMLAASGPTWDQLPPFQWSLSPFRSMLHMGQPDLWTFSPISVPWD
PPT (G3HN89) 聚醣位置，197、212、232 (SEQ ID NO: 4) MASPGSRWLLAVSLLPWCCAAWSLGHLNPPSLTPLVIWHGMGDSCCNPISMGAIKKMVEKEIPGIYVLSLEIGKNMMEDV  80 ENSFFLNVNSQVMMVCQILEKDPKLQQGYNAIGFSQGGQFLRAVAQRCPSPRMINLISVGGQHQGVFGLPRCPGESSHVC  160 DFIRKMINAGAYSKVVQLRLVQAQYWHDPIKEDVYR NHS IFLADINQERCV NET YKKNLMALNKFVMVKFL NDS IVDPVD  240 SEWFGFYRSGQAKETIPLQESTLYTEDRLGLKQMDKAGKLVFLAKEGDHLQLSKEWFNAYIIPFL
PLD3 (G3HNQ5) 聚醣位置 97、102、132、234、282、385、430 (SEQ ID NO: 5) MKPKLMYQELKVPVEEPAGELPVNEIEAWKAAEKKARWVLLVLILAVVGFGALMTQLFLWEYGDLHLFGPNQRPAPCYDP  80 CEAVLVESIPEGLEFP NAT TS NPS TSQAWLGLLAGAHSSLDIASFYWTLTN NDT HTQEPSAQQGEEILQQLQALAPRGVK  160 VRIAVSKPNGPLADLQSLLQSGAQVRMVDMQKLTHGVLHTKFWVVDQTHFYLGSANMDWRSLTQVKELGVVMY NCS CLAR  240 DLTKIFEAYWFLGQAGSSIPSTWPRPFDTRYNQETPMEICL NGTPALAYLASAPPPLCPSGRTPDLKALLSVVDSARSFI  320 YIAVMNYLPTMEFSHPRRFWPAIDDGLRRAAYERGVKVRLLVSCWGHSEPSMRSFLLSLAALRD NHT HSDIQVKLFVVPA  400 DEAQARIPYARVNHNKYMVTERAVYIGTS NWSGSYFTETAGTSLLVTQNGHDGLRSQLEDVFLRDWNSLYSHNLDTAADS  480  VGNACRLL
SP (A0A061IEQ5) 聚醣位置 84、173、333、393、518、611 (SEQ ID NO: 6) MPRHGVSSGQGHLRADLELRLESSLPAPKLGLLWMGLVLALVLTLFDSTVLWTPARAYPLPAQGHPVKFSAIVPPLQNAF  80 VWR NLS CPACKVLFTALNYGLKKEPNVARVGSVAIKMCKMLNIAPLNVCQSAVHLFEDDVVEVWTRSVLSPSEACGLLLG  160 PSCGHWDIFSSW NIS LPSVPKPPPKPPSPPAPGAPVSRVLFLTDLHWDHDYLEGTDPNCADPLCCRRSSGWPPNSQAGAG  240 YWGEYSKCDLPLRTLESLLKGLGPAGPFEMVYWTGDIPAHDVWQQSRQDQLRALTTVTDLVRKFLGPVPVYPAVGNHEST  320 PVNGFPPPFIKG NQS SQWLYEAMAKAWEPWLPADALHTLRIGGFYALTPRPGLRLISLNMNFCSRENFWLLI NST DPAGQ  400 LQWLVEELQAAENRGDKVHIIGHIPPGHCLKSWSWNYYKIVARYENTLAGQFFGHTHVDEFEIFYDEETLSRPLAVAFLG  480 PSATTYINLNPGYRVYQIDGNYPGSSHVVLDHETYIL NLT QANAPEATPHWKRLYRARETYGLPDALPASWHNLVYRMRD  560 NEQLFQTFWFLYHKGHPPSEPCGTPCRLATLCAQLSARADSPALCRHLMP NGS LPDAHSLWSRTLLC
另外的示例性脂酶包括 Clusterin、脂蛋白脂酶、含有 Patatin 樣磷脂酶域的蛋白 5、磷脂酶 DDHD1、溶血磷脂酶、單醯基甘油脂酶 ABHD12、溶血磷脂酶樣蛋白 1、溶體酸性脂酶/膽固醇酯水解酶、脂酶成熟因子 2、含有 Patatin 樣磷脂酶域的蛋白 5、單醯基甘油脂肪酶 ABHD12 及溶體酸性脂酶/膽固醇酯水解酶。
亦包括下表中總結的脂酶：
Uniprot 條目 條目名稱 蛋白質名稱 基因名稱 生物體 長度
A0A3L7H5I5 A0A3L7H5I5_CRIGR 激素敏感脂酶 CgPICR_018531 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 843
A0A061HW32 A0A061HW32_CRIGR 激素敏感脂酶 H671_20969 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 592
A0A3L7HAZ7 A0A3L7HAZ7_CRIGR 溶血磷脂酶 CgPICR_006350 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 1,439
A0A3L7IKX6 A0A3L7IKX6_CRIGR 脂蛋白脂酶 CgPICR_019757 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 474
G3GRM1 G3GRM1_CRIGR 肝三醯基甘油脂酶 I79_000173 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 470
A0A061I1V4 A0A061I1V4_CRIGR 肝三醯基甘油脂酶 H671_4g13339 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 412
A0A3L7HTB5 A0A3L7HTB5_CRIGR 肝三醯基甘油脂酶 CgPICR_005213 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 502
A0A061IKA1 A0A061IKA1_CRIGR 脂蛋白脂酶 H671_1g2493 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 487
G3H6V7 G3H6V7_CRIGR 脂蛋白脂酶 I79_006077 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 450
A0A3L7HY34 A0A3L7HY34_CRIGR 三醯基甘油脂酶 CgPICR_007694 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 469
A0A3L7HXX8 A0A3L7HXX8_CRIGR 三醯基甘油脂酶 CgPICR_007698 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 466
G3H6Z2 G3H6Z2_CRIGR 2-花生四烯酸甘油水解酶 AB... I79_006116 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 300
A0A061IL50 A0A061IL50_CRIGR ABHD6 CgPICR_004910, H671_1g3077 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 337
G3HQY6 G3HQY6_CRIGR 脂酶 I79_013245 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 397
G3IFK5 G3IFK5_CRIGR DAGLA CgPICR_006759, I79_022528 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 1,043
G3IL04 G3IL04_CRIGR 三醯基甘油脂酶 I79_024562 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 758
G3IN33 G3IN33_CRIGR 三醯基甘油脂酶 I79_025345 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 463
A0A3L7HXU7 A0A3L7HXU7_CRIGR 三醯基甘油脂酶 CgPICR_007696 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 476
A0A061I462 A0A061I462_CRIGR 載脂蛋白 A-IV 樣蛋白 H671_4g12453 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 414
A0A3L7HYQ8 A0A3L7HYQ8_CRIGR 脂酶 CgPICR_006565 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 396
A0A3L7I0B5 A0A3L7I0B5_CRIGR 脂酶 CgPICR_006567 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 399
A0A3L7HYQ0 A0A3L7HYQ0_CRIGR 胃三醯基甘油脂酶 CgPICR_006570 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 441
G3I731 G3I731_CRIGR NR1H2 CgPICR_019340, I79_019312 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 445
A0A3L7HAG1 A0A3L7HAG1_CRIGR 載脂蛋白 H CgPICR_012123 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 345
A0A3L7GMF6 A0A3L7GMF6_CRIGR NLGN2 CgPICR_003667 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 836
A0A3L7IAJ0 A0A3L7IAJ0_CRIGR 脂酶成熟因子 CgPICR_000068 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 704
G3IKG6 G3IKG6_CRIGR 三醯基甘油脂酶 I79_024369 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 386
G3HQJ0 G3HQJ0_CRIGR 磷脂酶 A1 I79_013092 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 543
A0A3L7IBZ9 A0A3L7IBZ9_CRIGR 磷脂酶 A1 CgPICR_017566 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 494
G3I2W3 G3I2W3_CRIGR 脂酶成熟因子 I79_017758 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 699
G3HBV6 G3HBV6_CRIGR 脂酶成熟因子 I79_007907 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 355
A0A061I960 A0A061I960_CRIGR 脂酶 CgPICR_006562, H671_3g9853 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 422
A0A3L7HYR2 A0A3L7HYR2_CRIGR 脂酶 CgPICR_006563 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 400
A0A3L7HZD7 A0A3L7HZD7_CRIGR 脂酶 CgPICR_006556 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 402
G3GYM8 G3GYM8_CRIGR 脂肪酸醯胺水解酶 I79_002933 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 579
G3I5R0 G3I5R0_CRIGR ANGPTL4 C-端鏈 CgPICR_001128, I79_018815 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 411
A0A3L7HYM5 A0A3L7HYM5_CRIGR 含Abhydro_脂酶域蛋白 CgPICR_006574 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 359
A0A061HX37 A0A061HX37_CRIGR RNA 聚合酶 II 反 (trans)...之媒介蛋白 H671_xg20514 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 2,793
G3IAQ4 G3IAQ4_CRIGR 含自水解酶域蛋白 I79_020680 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 425
G3HKV9 G3HKV9_CRIGR 第 XV 組磷脂酶 A2 CgPICR_005649, I79_011341 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 412
G3HZU4 G3HZU4_CRIGR 輔脂酶 CgPICR_020526, I79_016608 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 113
G3HTY7 G3HTY7_CRIGR 載脂蛋白 A-II H671_5g13744, I79_014389 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 101
A0A3L7HYV3 A0A3L7HYV3_CRIGR 含Abhydro_脂酶域蛋白 CgPICR_006569 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 386
G3HBV7 G3HBV7_CRIGR 脂酶成熟因子 1 I79_007908 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 168
G3IIM8 G3IIM8_CRIGR 羧酸酯水解酶 I79_023701 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 646
G3I7K0 G3I7K0_CRIGR 神經連接蛋白-3 (Neuroligin) I79_019492 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 828
A0A3L7HDS6 A0A3L7HDS6_CRIGR 羧酸酯水解酶 CgPICR_012466 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 654
A0A061IKL2 A0A061IKL2_CRIGR 羧酸酯水解酶 H671_1g2413 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 603
A0A3L7H4J2 A0A3L7H4J2_CRIGR NLGN3 CgPICR_018248 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 841
A0A061I7T5 A0A061I7T5_CRIGR Sn1-特異性二醯基甘油脂酶... H671_4g11902 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 537
A0A061I7P8 A0A061I7P8_CRIGR 脂酶成員 K H671_3g10704 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 402
Q8R4V8 Q8R4V8_CRIGR 磷脂酶 A1    灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 200
G3I3H3 G3I3H3_CRIGR PNPLA2 CgPICR_009656, I79_017981 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 486
A0A061IDI1 A0A061IDI1_CRIGR 脂酶成員 K 樣蛋白 H671_3g10468 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 187
A0A3L7HYM1 A0A3L7HYM1_CRIGR 含Abhydro_脂酶域蛋白 CgPICR_006571 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 229
A0A3L7HZE7 A0A3L7HZE7_CRIGR 含Abhydro_脂酶域蛋白 CgPICR_006566 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 272
A0A061I822 A0A061I822_CRIGR 脂酶成員 N H671_3g9852 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 327
A0A061HWK1 A0A061HWK1_CRIGR 激素敏感脂酶樣蛋白 H671_21698 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 196
G3HKM8 G3HKM8_CRIGR 脂酶成員 H I79_011257 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 347
G3H1I9 G3H1I9_CRIGR 磷脂酶 DDHD2 I79_004016 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 697
G3GY86 G3GY86_CRIGR 神經連接蛋白-2 (Neuroligin) I79_002759 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 635
G3IGT0 G3IGT0_CRIGR 羧酸酯水解酶 I79_023006 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 575
G3H6H1 G3H6H1_CRIGR 芳基乙醯胺脫乙醯酶樣蛋白 1 I79_005931 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 408
A0A3L7IPE5 A0A3L7IPE5_CRIGR 甲狀腺球蛋白 CgPICR_011560 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 3,665
A0A3L7H125 A0A3L7H125_CRIGR NLGN4X CgPICR_023230 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 826
A0A3L7HZX3 A0A3L7HZX3_CRIGR CES2 CgPICR_005602 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 1,012
A0A061HVH1 A0A061HVH1_CRIGR 激素敏感脂酶樣蛋白 H671_21249 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 335
G3HEB4 G3HEB4_CRIGR 神經連接蛋白-1 (Neuroligin) I79_008895 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 385
A0A061I8R9 A0A061I8R9_CRIGR 羧酸酯水解酶 H671_3g9584 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 275
A0A3L7IH61 A0A3L7IH61_CRIGR NLGN1 CgPICR_002421 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 611
G3I1J5 G3I1J5_CRIGR 磷脂酶 A1 成員 A I79_017256 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 442
A0A3L7HXV9 A0A3L7HXV9_CRIGR PNLIP CgPICR_007697 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 428
A0A3L7HR81 A0A3L7HR81_CRIGR PLA1A CgPICR_002041 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 442
A0A3L7HQI6 A0A3L7HQI6_CRIGR LIPI CgPICR_001909 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 520
A0A3L7IJN1 A0A3L7IJN1_CRIGR AADAC CgPICR_009978 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 398
G3I5L2 G3I5L2_CRIGR 羧酸酯水解酶 I79_018765 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 507
G3HQX5 G3HQX5_CRIGR 胃三醯基甘油脂酶 I79_013234 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 302
G3HQX8 G3HQX8_CRIGR 胃三醯基甘油脂酶 I79_013237 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 299
A0A061I8V8 A0A061I8V8_CRIGR 羧酸酯水解酶 H671_4g12801 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 461
A0A061I9X1 A0A061I9X1_CRIGR 羧酸酯水解酶 H671_3g11044 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 551
A0A061IAT4 A0A061IAT4_CRIGR 羧酸酯水解酶 H671_3g11044 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 560
A0A061I5M8 A0A061I5M8_CRIGR 蛋白 ADP-核糖基精胺酸水解... H671_4g13178 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 797
G3IIG1 G3IIG1_CRIGR 羧酸酯水解酶 I79_023630 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 561
G3I766 G3I766_CRIGR 羧酸酯水解酶 I79_019351 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 561
A0A061I8D9 A0A061I8D9_CRIGR 羧酸酯水解酶 CgPICR_005503, H671_3g10206 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 575
A0A061ID38 A0A061ID38_CRIGR 醯氧基醯基水解酶同功型 1 H671_3g9294 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 575
G3IIG0 G3IIG0_CRIGR 羧酸酯水解酶 I79_023629 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 529
A0A061I9Z6 A0A061I9Z6_CRIGR 羧酸酯水解酶 H671_3g9073 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 560
A0A061IEJ2 A0A061IEJ2_CRIGR 羧酸酯水解酶 CgPICR_005591, H671_3g9072 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 558
A0A061I734 A0A061I734_CRIGR 羧酸酯水解酶 CgPICR_005604, H671_3g11292 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 564
G3I7X7 G3I7X7_CRIGR 羧酸酯水解酶 I79_019629 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 564
A0A061IBF9 A0A061IBF9_CRIGR 羧酸酯水解酶 H671_3g10418 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 559
A0A061I6L1 A0A061I6L1_CRIGR 羧酸酯水解酶 H671_3g10650 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 558
G3HQX3 G3HQX3_CRIGR 胃三醯基甘油脂酶 I79_013232 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 248
A0A3L7I1B2 A0A3L7I1B2_CRIGR 羧酸酯水解酶 CgPICR_005498 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 583
A0A061I5X0 A0A061I5X0_CRIGR ***酯酶樣同功型 1 H671_3g11294 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 1,189
A0A3L7HZW4 A0A3L7HZW4_CRIGR 羧酸酯水解酶 CgPICR_005592 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 560
G3I5K6 G3I5K6_CRIGR 羧酸酯水解酶 I79_018759 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 516
A0A3L7I011 A0A3L7I011_CRIGR 羧酸酯水解酶 CgPICR_005593 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 549
A0A061I9H4 A0A061I9H4_CRIGR 羧酸酯水解酶 H671_3g11292 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 498
A0A3L7I042 A0A3L7I042_CRIGR 羧酸酯水解酶 CgPICR_005590 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 560
A0A061IAM3 A0A061IAM3_CRIGR 羧酸酯水解酶 H671_3g10323 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 529
A0A3L7HZM5 A0A3L7HZM5_CRIGR 羧酸酯水解酶 CgPICR_005502 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 578
A0A3L7I2N6 A0A3L7I2N6_CRIGR 羧酸酯水解酶 CgPICR_005599 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 449
A0A3L7I0Q0 A0A3L7I0Q0_CRIGR 羧酸酯水解酶 CgPICR_005597 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 627
A0A3L7I0P0 A0A3L7I0P0_CRIGR 羧酸酯水解酶 CgPICR_005587 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 548
A0A3L7HYP5 A0A3L7HYP5_CRIGR 含Abhydro_脂酶域蛋白 CgPICR_006572 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 210
A0A061HUZ2 A0A061HUZ2_CRIGR 血小板活化因子乙醯... H671_21690 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 231
A0A3L7I017 A0A3L7I017_CRIGR LCAT CgPICR_005642 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 458
G3I9K8 G3I9K8_CRIGR 芳基乙醯胺脫乙醯酶樣蛋白 2 I79_020257 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 363
A0A3L7IIN6 A0A3L7IIN6_CRIGR AADACL2 CgPICR_009977 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 401
G3HQX9 G3HQX9_CRIGR 脂酶成員 M I79_013238 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 484
G3HQX2 G3HQX2_CRIGR 胃三醯基甘油脂酶 I79_013231 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 185
A0A3L7I2M8 A0A3L7I2M8_CRIGR 羧酸酯水解酶 CgPICR_005589 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 498
G3GVB7 G3GVB7_CRIGR Sn1-特異性二醯基甘油脂酶... I79_001652 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 154
G3I0M0 G3I0M0_CRIGR 激素敏感脂酶 I79_016908 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 326
A0A061I5N2 A0A061I5N2_CRIGR 含DUF676域蛋白 H671_4g12871 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 1,082
A0A061IQA8 A0A061IQA8_CRIGR 含DUF676域蛋白 H671_1g1584 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 1,609
A0A061I6F9 A0A061I6F9_CRIGR 含DUF676域蛋白 H671_4g12871 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 1,172
A0A3L7HYS2 A0A3L7HYS2_CRIGR 含 AB 水解酶-1 域蛋白 CgPICR_006573 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 449
A0A061IEN9 A0A061IEN9_CRIGR Patatin 樣磷脂酶域... H671_3g9878 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 429
A0A061I428 A0A061I428_CRIGR 第 XV 組磷脂酶 A2 樣蛋白 H671_4g12540 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 201
G3I769 G3I769_CRIGR 羧酸酯水解酶 I79_019354 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 545
G3HZJ6 G3HZJ6_CRIGR 羧酸酯水解酶 I79_016502 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 240
G3IIG3 G3IIG3_CRIGR 羧酸酯水解酶 I79_023632 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 511
G3HZJ8 G3HZJ8_CRIGR 羧酸酯水解酶 I79_016504 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 393
G3I7X4 G3I7X4_CRIGR 羧酸酯水解酶 I79_019625 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 514
G3I765 G3I765_CRIGR 羧酸酯水解酶 I79_019350 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 128
A0A061IDX0 A0A061IDX0_CRIGR 羧酸酯水解酶 H671_3g10207 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 554
A0A061IGP0 A0A061IGP0_CRIGR 羧酸酯水解酶 H671_3g9072 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 545
A0A061IEJ6 A0A061IEJ6_CRIGR 羧酸酯水解酶 H671_3g9076 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 543
A0A061IDC4 A0A061IDC4_CRIGR 羧酸酯水解酶 H671_3g10598 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 531
A0A061IAS9 A0A061IAS9_CRIGR 羧酸酯水解酶 H671_3g10207 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 466
A0A061IBR3 A0A061IBR3_CRIGR 羧酸酯水解酶 H671_3g10207 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 541
G3I770 G3I770_CRIGR 羧酸酯水解酶 I79_019355 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 420
G3I773 G3I773_CRIGR 羧酸酯水解酶 I79_019358 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 393
A0A3L7I051 A0A3L7I051_CRIGR 羧酸酯水解酶 CgPICR_005600 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 558
A0A3L7I1A1 A0A3L7I1A1_CRIGR 羧酸酯水解酶 CgPICR_005488 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 584
G3HII7 G3HII7_CRIGR 羧酸酯水解酶 I79_010458 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 451
G3I774 G3I774_CRIGR 羧酸酯水解酶 I79_019359 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 352
G3I5K9 G3I5K9_CRIGR 羧酸酯水解酶 I79_018762 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 370
A0A3L7HLV1 A0A3L7HLV1_CRIGR ACHE CgPICR_017300 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 929
A0A3L7I019 A0A3L7I019_CRIGR 羧酸酯水解酶 CgPICR_005594 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 535
A0A061I790 A0A061I790_CRIGR 羧酸酯水解酶 H671_3g10206 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 496
A0A061IDA6 A0A061IDA6_CRIGR 羧酸酯水解酶 H671_3g10649 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 352
G3I5K8 G3I5K8_CRIGR 羧酸酯水解酶 I79_018761 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 448
A0A3L7HZX1 A0A3L7HZX1_CRIGR 羧酸酯水解酶 CgPICR_005595 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 560
G3HII8 G3HII8_CRIGR 羧酸酯水解酶 I79_010459 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 411
G3I768 G3I768_CRIGR 羧酸酯水解酶 I79_019353 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 449
A0A3L7HZQ0 A0A3L7HZQ0_CRIGR 羧酸酯水解酶 CgPICR_005491 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 569
A0A3L7HZV5 A0A3L7HZV5_CRIGR 羧酸酯水解酶 CgPICR_005500 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 529
A0A3L7I1I7 A0A3L7I1I7_CRIGR 羧酸酯水解酶 CgPICR_005588 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 611
A0A3L7HZU5 A0A3L7HZU5_CRIGR 羧酸酯水解酶 CgPICR_005490 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 304
A0A061IGP5 A0A061IGP5_CRIGR 羧酸酯水解酶 H671_3g9077 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 398
A0A3L7HZM4 A0A3L7HZM4_CRIGR 羧酸酯水解酶 CgPICR_005495 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 419
G3HFM0 G3HFM0_CRIGR 單醯基甘油脂肪酶 ABHD6 I79_009382 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 330
G3HSU0 G3HSU0_CRIGR Protein FAM135B I79_013937 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 1,174
A0A061IFE2 A0A061IFE2_CRIGR 肝羧酸酯酶 1 樣蛋白 H671_3g9583 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 882
A0A061I6Q8 A0A061I6Q8_CRIGR 肝羧酸酯酶 B-1 樣蛋白 H671_3g10564 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 820
A0A061IAA7 A0A061IAA7_CRIGR 肝羧酸酯酶 B-1 樣蛋白 H671_3g10564 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 704
A0A061I7X9 A0A061I7X9_CRIGR 肝羧酸酯酶 B-1 樣蛋白 H671_3g10564 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 704
A0A3L7HRB9 A0A3L7HRB9_CRIGR LIPH CgPICR_002185 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 196
A0A3L7IHZ7 A0A3L7IHZ7_CRIGR AADACL2 CgPICR_009975 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 401
G3GW90 G3GW90_CRIGR 磷脂酶 B1，膜結合... I79_002010 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 995
G3I9K7 G3I9K7_CRIGR 芳基乙醯胺脫乙醯酶 I79_020256 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 392
A0A061I741 A0A061I741_CRIGR 肝羧酸酯酶樣蛋白 H671_3g11295 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 981
A0A061ID92 A0A061ID92_CRIGR 肝羧酸酯酶 1 樣蛋白 H671_3g9582 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 905
G3GUE1 G3GUE1_CRIGR Protein FAM135A I79_001298 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 1,546
A0A3L7HRF9 A0A3L7HRF9_CRIGR LIPH CgPICR_002186 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 208
G3IM61 G3IM61_CRIGR 甲狀腺球蛋白 I79_024992 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 241
G3IHH9 G3IHH9_CRIGR 乙酸異戊酯-水解酯... I79_023269 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 280
A0A3L7IHB1 A0A3L7IHB1_CRIGR NCEH1 CgPICR_002419 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 237
A0A3L7HP21 A0A3L7HP21_CRIGR FAM135B CgPICR_014371 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 1,270
A0A3L7H5L4 A0A3L7H5L4_CRIGR LIPE CgPICR_018531 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 444
A0A3L7HQ89 A0A3L7HQ89_CRIGR DAGLB CgPICR_011708 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 655
G3HKW5 G3HKW5_CRIGR 磷脂醯膽鹼-甾醇醯基轉移... I79_011347 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 183
A0A3L7HZQ8 A0A3L7HZQ8_CRIGR CES1D CgPICR_005484 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 1,211
A0A3L7HYL8 A0A3L7HYL8_CRIGR LIPK CgPICR_006564 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 223
G3HQX7 G3HQX7_CRIGR 胃三醯基甘油脂酶 I79_013235 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 151
G3HQX6 G3HQX6_CRIGR 胃三醯基甘油脂酶 I79_013236 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 252
A0A061HVA0 A0A061HVA0_CRIGR Patatin 樣磷脂酶域... H671_xg19912 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 58
A0A3L7IGW9 A0A3L7IGW9_CRIGR FAM135A CgPICR_013396 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 1,183
G3I0M2 G3I0M2_CRIGR 血小板活化因子乙醯... I79_016910 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 228
A0A3L7HBC2 A0A3L7HBC2_CRIGR IAH1 CgPICR_006476 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 245
A0A3L7HT19 A0A3L7HT19_CRIGR PAFAH1B2 CgPICR_005977 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 214
G3I767 G3I767_CRIGR 肝羧酸酯酶 I79_019352 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 795
G3I7X9 G3I7X9_CRIGR 肝羧酸酯酶 1 I79_019630 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 765
A0A3L7I0E5 A0A3L7I0E5_CRIGR CES1 CgPICR_005497 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 1,118
A0A3L7I003 A0A3L7I003_CRIGR CES2C CgPICR_005601 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 825
G3H7V6 G3H7V6_CRIGR 甘油單酯脂酶 I79_006450 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 328
G3HQX4 G3HQX4_CRIGR 脂酶成員 K I79_013233 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 159
G3GVB6 G3GVB6_CRIGR Sn1-特異性二醯基甘油脂酶... I79_001651 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 167
A0A3L7IGK4 A0A3L7IGK4_CRIGR FAM135A CgPICR_013395 灰倉鼠 (Cricetulus griseus) (中國倉鼠 (Chinese hamster)) (黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis griseus)) 320
例如，上表的脂酶可在 CHO 細胞中找到。
脂酶代表已在發現實驗中鑑定的一類 HCP，並被認為在調配物保存期限中起重要作用。酯酶類中的脂酶具有作用於聚山梨醇酯 20 (PS20) 的能力，導致產生可能形成固體顆粒的降解物。
在鑑定的脂酶中，磷脂酶 B 樣蛋白 2 (PLBL2) 的特徵最為明顯。雖然顯示與抗體藥物產物結合，但不再認為它在 PS20 降解中起重要作用。然而，該類的其他成員被發現為具有較低豐度，代表表徵感興趣的標靶。
本揭露亦考慮了宿主細胞的修飾，例如以減少蛋白質-脂酶，例如抗體-脂酶相互作用，以及細胞培養條件中的修飾以減少此類相互作用，以及在此類細胞中產生蛋白質或抗體的方法或條件，視情況包括確定蛋白質-脂酶或抗體-脂酶相互作用的步驟。在一些實施例中，本揭露包括用於表現重組蛋白的哺乳動物宿主細胞，其中該細胞經修飾以相對於未經修飾的細胞中的內源性脂酶的表現改變參與內源性脂酶醣基化的一種或多種內源性酵素的表現。實例包括酵素的突變、下調或剔除，諸如 α-Man-1 及 2，以防止 Asn 連接的 Man 9GlcNac 2聚醣前驅物的加工及/或增加高 MW 高甘露糖種類；產生更高鏈長聚醣的代謝方法，諸如調節進料來源以增加棉子糖、莫能菌素、甘露糖、半乳糖、果糖及麥芽糖的比例；添加高甘露糖促進抑制劑，例如基夫鹼；及/或過表現酵素上調以增加聚醣的鏈長，諸如 GNT-1、2、3、4abc、5 及 GalT。在一些實施例中，宿主細胞經修飾以減少內源性脂酶中低數量甘露糖聚醣的相對量。例如，如以下實例中所描述，與抗體結合更緊密的脂酶富含低數量的甘露糖聚醣，諸如 Man3-5 或 Man6 或更小。不太容易結合抗體的脂酶傾向於具有大於 1200 道爾頓的甘露醣基化種類或 Man7-9。因此，在一些實施例中，宿主細胞經修飾以產生具有相對較高分子量諸如 ＞1200 Da 的甘露醣基化醣基化修飾的脂酶，或產生具有與 Man3-5 相比相對較高量的 Man6 或更高或 Man7 或更高或 Man7-9 的甘露醣基化醣基化修飾。(參見，例如，Clausen 等人，Glycosylation Engineering – in Essentials of Glycobiology，Varki 等人，編，Cold Spring Harbor Laboratory Press, doi: 10.1101/glycobiology.3e.056 (2015-2017)。)
在一個實施例中，本發明包括哺乳動物細胞，其包含一種或多種內源性脂酶，該內源性脂酶在至少一個胺基酸中已發生突變 (取代、缺失或添加)，並且其中該修飾導致與蛋白質或抗體的相互作用發生改變。例如，內源性脂酶可發生突變以減少或消除醣基化。脂酶的醣基化可能發生在 N-連接的醣基化模體「N-X-S/T」處，其中第一個胺基酸殘基是 N，第三個胺基酸殘基是 S 或 T，並且第二個胺基酸殘基 (X) 是除了脯胺酸 (P) 以外的任何胺基酸。在一個實例中，對應於 N-連接的醣基化 (模體 N-X-S/T) 的位置的野生型 (WT) Asn 殘基經突變為任何其他胺基酸。在另一個實例中，第二個胺基酸殘基可以突變為 P。在另一個實例中，第三個胺基酸殘基 (S 或 T) 可以突變為不同的殘基。或在一些情況下，可以進行超過一個此等取代。適合此類突變的脂酶的具體實例包括上文及上表中列出的任何脂酶，諸如硫酯酶、脂蛋白相關磷脂酶 A2、磷脂酶 B 樣蛋白 2、棕櫚醯基蛋白硫酯酶、磷脂酶 D3 及神經鞘磷脂磷酸二酯酶，例如，如上所述。對於在中國倉鼠卵巢 (CHO) 細胞中發現的特定脂酶，此等 N-X-S/T 模體的位置顯示於 SEQ ID Nos: 1-6 中，位於上述每個序列之上。在一些情況下，宿主細胞是 CHO 細胞。例如，硫酯酶在位置 298-300 及 422-424 處具有 N-X-S/T 位點；LPLA2 在位置 99-101、273-275、289-291 及 398-401 處具有此類位點；PLBL2 在 47-49、65-67、69-71、190-192、395-397 及 474-476 處；PPT 在 197-199、212-214 及 232-234 處；PLD3 在 97-99、102-104、132-134、234-236、282-284、385-387 及 430-432 處；以及 SP 在 84-86、173-175、333-335、393-395、518-520 及 611-613 處 (分別參見 SEQ ID No: 1-6，如上所示，在每種情況下 N 殘基加底線)。
在其他情況下，N-連接的醣基化模體可為「N-X-C」，其中 X 是除脯胺酸之外的任何殘基。例如，對於脂酶中的此類 N-連接的醣基化位點，N 或 C 可經修飾為不同的胺基酸，及/或 X 可經修飾為脯胺酸。
因此，本揭露的實施例包括在 PLBL2 及/或 LPLA2 或另一種上述脂酶中之一個或多個上述胺基酸殘基處具有胺基酸取代的經修飾的宿主細胞，諸如 CHO 細胞，以及自此類細胞產生抗體的方法，包括視情況在產生抗體後測定脂酶-抗體相互作用的量。
例如，本揭露亦考慮藉由改變宿主細胞的細胞培養條件來產生具有減少的脂酶相互作用的蛋白質或抗體的方法。例如，可使用與 Man3-5 相比可提高 Man6 或更高或 Man7 或更高或 Man7-9 的甘露醣基化醣基化修飾量的培養條件。參見，例如，Pacis 等人, Biotechnology and Bioengineering, 108(10): 2348-58 (2011)；Rameez 等人, Biotechnology Progress, 37(5): e3176, DOI: 10.1002/ptpr.3176 (2021)。實例包括增加培養基的滲透壓，例如增加至少 100 或至少 200 mOsm/kg，向培養基中添加氯化錳或氯化銨，或改變 pH 或糖和胺基酸濃度。其他實例包括增加或添加棉子糖、莫能菌素、甘露糖、半乳糖、果糖及/或麥芽糖，以及將高甘露糖促進抑制劑諸如基夫鹼 (Kifunensine) 添加到培養基中。在一些情況下，細胞培養條件的變化導致 Man7-9 百分比與整個甘露醣基化種類相比顯著增加。在一些情況下，細胞培養條件的變化導致總體 Mann7-9 百分比與總體甘露醣基化種類相比為例如至少 15% 或至少 20%。
此外，如實施例中所示，當與單株抗體 mAb1 複合時，LPLA2 的肽 125-131、133-135 及 146-177 顯示出氧化顯著降低 (圖 10A)。作為另一個實例，LPLA2 與過量的單株抗體 mAb2、肽 133-135、146-177、229-247 及 248-260 一起培育顯示出減少的氧化，表明參與與 mAb2 的結合 (圖 10B)。特別是，肽 146-177 是兩種抗體的共同相互作用區。(參見下文之實例 1。) 類似地，PLBL2 的肽 67-78、79-98、173-187、211-236、241-253、287-333、340-352、359-371、372-388、389-400、401-407、424-459、513-530、539-546 及 573-599 顯示在 PLBL2-mAb1 複合物中的氧化減少，及肽 56-64、67-78、79-98、173-187、359-371、372-388、389 -400、401-407、424-459、485-512 及 548-572 顯示在 PLBL2-mAb2 複合物中的氧化減少 (圖 11A-B)。肽 379-414 被鑑定為 PLBL2 上 mAb1 及 mAb2 的共同結合表位 (圖 11C)。肽 79-98、424-459 及 573-599 是與兩種抗體共同相互作用的區域。(參見下文之實例 1。) 此等脂酶區之一的突變亦可以作為修飾宿主細胞 (諸如 CHO 細胞) 的手段，以減少抗體與內源性脂酶 PLBL2 及 LPLA2 之間的相互作用。因此，本文進一步考慮的是根據本文的方法確定顯示降低的氧化量的內源性宿主細胞脂酶的特定區域的方法，表明與抗體產物的接觸，並在彼等區域內製備至少一個胺基酸中的胺基酸取代。 檢測脂酶 - 抗體結合及確定結合親和力的方法
在抗體調配物中共同純化的宿主細胞蛋白 (HCP)，諸如脂酶，傳統上是通過沉澱及富集實驗來鑑定的。可藉由過度表現感興趣的蛋白質，並直接評估標靶是否結合來進行驗證。然而，感興趣的 HCP 可能小於已鑑定的總蛋白質的 1%，這使得發現變得困難。
依靠固定化的技術 (例如表面電漿子共振) 觀察非天然狀態的蛋白質。同樣，結合分析可能會改變蛋白質的行為。天然質譜生物物理測定 (天然 MS、HDX、FPOP) 代表分析的金標準。
以下工作使用多種技術來建立幾種脂酶跨不同抗體的結合。通過該分析，揭示了抗體及脂酶上對介導結合很重要的感興趣的結構區域。這項工作首次展現了藉由天然質譜法及非 MS 離子遷移率對抗體-脂酶進行表徵，從而能夠以獨特的方式檢查化學計量及結構。
因此，在一些實施例中，檢測抗體與至少一種源自宿主細胞的脂酶之間的結合，視情況亦測量結合親和力。在一些情況下，將結合量及/或親和力與未經修飾以改變脂酶相互作用但在其他方面結構相同的抗體的量進行比較。(即，當抗體重鏈恆定區包含胺基酸修飾時，將結合與缺乏修飾但具有相同胺基酸序列的抗體進行比較，或當抗體具有經修飾的醣基化狀態時，將結合與缺乏醣基化修飾但在其他方面沒有差異的抗體進行比較)。在一些情況下，藉由表面電漿子共振 (SPR)、微尺度熱泳動 (MST) 及/或 ELISA 檢測結合及/或確定親和力，例如，與在體外純化的脂酶蛋白。在一些情況下，結合藉由 SPR、羥基自由基足跡、天然質譜及/或離子遷移率測定來檢測。 示例性調配物及賦形劑
本文的揭露亦涉及包含本文的抗體的調配物，其在一些實施例中可用於治療用途。本文的調配物可包含至少一種賦形劑，諸如一種或多種醫藥上可接受之酸或鹼、緩衝劑、鹽、凍乾保護劑 (若要凍乾調配物)、糖、糖醇、胺基酸、其他蛋白質種類，稀釋劑、防腐劑、多價金屬鹽，並且在一些情況下亦包含界面活性劑。在一些情況下，調配物可包含界面活性劑，諸如聚山梨醇酯、泊洛沙姆、普朗尼克、Brij 或烷基糖苷界面活性劑。界面活性劑的實例包括聚山梨醇酯，諸如聚山梨醇酯 20 (PS20) 及聚山梨醇酯 80 (PS80)。其他額外界面活性劑可包括泊洛沙姆及普朗尼克，諸如泊洛沙姆 188 或普朗尼克 F68，或 Brij。其他額外界面活性劑可包括烷基糖苷，諸如辛基麥芽糖苷、癸基麥芽糖苷、十二烷基麥芽糖苷或辛基葡糖苷。
本文中的「穩定劑」意謂添加至調配物中以幫助將其保持在穩定或不變狀態的任何添加的賦形劑。在一些情況下，可添加穩定劑以幫助防止聚集、氧化、顏色變化等。
「醫藥上可接受之酸」包括在其調配濃度及方式下無毒的無機酸及有機酸。例如，合適的無機酸包括鹽酸、高氯酸、氫溴酸、氫碘酸、硝酸、硫酸、磺酸、亞磺酸、磺胺酸、磷酸、碳酸等。合適的有機酸包括直鏈及分支鏈烷基、芳族、環狀、脂環族、芳脂族、雜環的、飽和的、不飽和的、單羧酸、二羧酸及三羧酸，包括例如甲酸、乙酸、2-羥基乙酸、三氟乙酸、苯乙酸、三甲基乙酸、乙酸三級丁酯、鄰胺苯甲酸、丙酸、2-羥基丙酸、2-側氧基丙酸、丙二酸、環戊烷丙酸、環戊烷丙酸、3-苯基丙酸、丁酸、丁二酸、苯甲酸、3-(4-羥基苯甲醯基)苯甲酸、2-乙醯氧基苯甲酸、抗壞血酸、肉桂酸、月桂基硫酸、硬脂酸、黏康酸、苦杏仁酸、琥珀酸、撲酸、反丁烯二酸、蘋果酸、順丁烯二酸、羥基順丁烯二酸、丙二酸、乳酸、檸檬酸、酒石酸、乙醇酸、醣酸、葡萄糖酸、丙酮酸、乙醛酸、草酸、甲磺酸、琥珀酸、水楊酸、苯二甲酸、棕櫚酸 (palmoic)、棕櫚酸 (palmeic)、硫氰酸、甲磺酸、乙磺酸、1,2-乙二磺酸、2-羥乙基磺酸、苯磺酸、4-氯苯磺酸、萘-2-磺酸、對甲苯磺酸、樟腦磺酸、4-甲基雙環[2.2.2]-辛-2-烯-1-羧酸、葡萄糖庚酸、4,4'-亞甲基雙-3-(羥基-2-烯-1-羧酸)、羥基萘酸。
「醫藥上可接受之鹼」包括在其調配濃度及方式下無毒的無機鹼及有機鹼。例如，合適的鹼包括由無機鹼形成金屬諸如鋰、鈉、鉀、鎂、鈣、銨、鐵、鋅、銅、錳、鋁、N-甲基葡糖胺、口末啉、哌啶及有機無毒鹼形成的鹼，該有機無毒鹼包括一級胺、二級胺及三級胺、取代胺、環狀胺及鹼性離子交換樹脂，[ 例如，N(R') 4+ (其中 R’ 獨立地為 H 或 C 1-4烷基， 例如，銨、Tris)]，例如，異丙胺、三甲胺、二乙胺、三乙胺、三丙胺、乙醇胺、2-二乙胺基乙醇、三甲胺、二環己胺、離胺酸、精胺酸、組胺酸、咖啡鹼、普魯卡因、海巴胺、膽鹼、甜菜鹼、乙二胺、葡糖胺、甲基葡糖胺、可可鹼、嘌呤、哌口井、哌啶、N-乙基哌啶、聚胺樹脂等。特定較佳有機無毒鹼為異丙胺、二乙胺、乙醇胺、三甲基胺、二環己胺、膽鹼及咖啡鹼。
可用於本發明的其他醫藥上可接受之酸及鹼包括衍生自胺基酸的彼等，例如組胺酸、甘胺酸、***酸、天冬胺酸、麩胺酸、離胺酸及天冬醯胺。
本文的調配物亦可包括一種或多種緩衝劑或鹽。緩衝劑及鹽包括衍生自上述酸及鹼的酸及鹼加成鹽的彼等緩衝劑及鹽。具體的緩衝劑及/或鹽包括精胺酸、組胺酸、琥珀酸鹽及乙酸鹽。
若要凍乾調配物，可添加凍乾保護劑。「凍乾保護劑」是一種分子，當與感興趣的蛋白質結合時，可顯著防止或降低蛋白質在凍乾及隨後儲存時的物理化學不穩定性。示例性凍乾保護劑包括糖及其相應的糖醇；胺基酸，諸如麩胺酸一鈉或組胺酸；甲胺，諸如甜菜鹼；易溶鹽，諸如硫酸鎂；多元醇，諸如三元或更高分子量的糖醇， 例如甘油、葡聚醣、赤蘚糖醇、甘油、***膠醇、木糖醇、山梨醇及甘露醇；丙二醇；聚乙二醇；Pluronics®；及其組合。其他示例性凍乾保護劑包括甘油及明膠，以及糖蜜二糖、松三糖、棉子糖、甘露三糖及水蘇糖。還原糖的實例包括葡萄糖、麥芽糖、乳糖、麥芽酮糖、異麥芽酮糖及乳果糖。非還原糖的實例包括選自糖醇及其他直鏈多元醇的多羥基化合物的非還原糖苷。較佳糖醇是單糖苷，尤其是藉由還原雙醣諸如乳糖、麥芽糖、乳果糖及麥芽酮糖獲得的彼等化合物。糖苷側基可以是糖苷或半乳糖苷。糖醇的其他實例是葡萄糖醇、麥芽糖醇、乳糖醇及異麥芽酮糖。較佳凍乾保護劑是非還原糖海藻糖或蔗糖。
「醫藥上可接受之糖」是當與感興趣的蛋白質結合時顯著防止或降低蛋白質在儲存時的物理化學不穩定性的分子。當打算將調配物凍乾然後再調配時，「醫藥上可接受之糖」亦可稱為「凍乾保護劑」。示例性的糖及其相應的糖醇包括：胺基酸，諸如麩胺酸一鈉或組胺酸；甲胺，諸如甜菜鹼；易溶鹽，諸如硫酸鎂；多元醇，諸如三元或更高分子量的糖醇， 例如甘油、葡聚醣、赤蘚糖醇、甘油、***膠醇、木糖醇、山梨醇及甘露醇；丙二醇；聚乙二醇；Pluronics®；及其組合。其他示例性凍乾保護劑包括甘油及明膠，以及糖蜜二糖、松三糖、棉子糖、甘露三糖及水蘇糖。還原糖的實例包括葡萄糖、麥芽糖、乳糖、麥芽酮糖、異麥芽酮糖及乳果糖。非還原糖的實例包括選自糖醇及其他直鏈多元醇的多羥基化合物的非還原糖苷。較佳糖醇是單糖苷，尤其是藉由還原雙醣諸如乳糖、麥芽糖、乳果糖及麥芽酮糖獲得的彼等化合物。糖苷側基可以是糖苷或半乳糖苷。糖醇的其他實例是葡萄糖醇、麥芽糖醇、乳糖醇及異麥芽酮糖。較佳醫藥上可接受之糖是非還原糖海藻糖或蔗糖。
「防腐劑」是可以添加至本文調配物中以降低細菌活性的化合物。例如，添加防腐劑可促進多用途 (多劑量) 調配物的生產。潛在防腐劑的實例包括十八烷基二甲基芐基氯化銨、氯化六甲銨、苯扎氯銨 (烷基芐基二甲基氯化銨的混合物，其中烷基為長鏈化合物) 及芐索氯銨。其他類型的防腐劑包括芳香醇，諸如苯酚、丁醇及苯甲醇，對羥基苯甲酸烷基酯，諸如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯、兒茶酚、間苯二酚、環己醇、3-戊醇和間甲酚。
可添加額外蛋白質，諸如白蛋白 (例如人血清白蛋白或牛血清白蛋白) 或免疫球蛋白 (例如 IgG 恆定區) 以進一步穩定感興趣的蛋白質。
緩衝劑用於將 pH 值控制在最佳化治療效果的範圍內，特別是在穩定性取決於 pH 值的情況下。緩衝劑較佳以約 50 mM 至約 250 mM 的濃度存在。適用於本發明的合適緩衝劑包括有機酸及無機酸及其鹽。例如，檸檬酸鹽、磷酸鹽、琥珀酸鹽、酒石酸鹽、反丁烯二酸鹽、葡萄糖酸鹽、草酸鹽、乳酸鹽、乙酸鹽。此外，緩衝劑可包含組胺酸及三甲胺鹽諸如 Tris。
例如，亦可包括張力劑以調節或維持液體組成物之張力。在與較大、帶電生物分子 (諸如蛋白質及抗體)一起使用時，此類張力劑可與胺基酸側鏈之帶電基團相互作用，由此減小分子間及分子內相互作用之可能。考慮到其他成分之相對量，張力劑可以介於 0.1 重量 % 至 25 重量 %，較佳 1% 至 5% 之間的任何量存在。例示性張力劑包括多元糖醇，較佳三元或更多元糖醇，諸如甘油、赤蘚糖醇、***糖醇、木糖醇、山梨醇及甘露醇。
其他賦形劑包括可以用作以下一種或多種的藥劑：(1) 填充劑，(2) 溶解增強劑，(3) 穩定劑及 (4) 以及防止變性或黏附至容器壁上的試劑。此類賦形劑包括：多元糖醇 (上文所列舉)；胺基酸，例如丙胺酸、甘胺酸、麩醯胺酸、天門冬醯胺酸、組胺酸、精胺酸、離胺酸、鳥胺酸、白胺酸、2-***酸、麩胺酸、蘇胺酸等；有機糖或糖醇，諸如蔗糖、乳糖、乳糖醇、海藻糖、水蘇糖、甘露糖、山梨糖、木糖、核糖、核糖醇、肌糖、肌醇、半乳糖、半乳糖醇、甘油、環多醇 ( 例如肌醇)、聚乙二醇；含硫還原劑，諸如脲、麩胱甘肽、硫辛酸、巰基乙醇酸鈉、硫基甘油、a-單硫基甘油及硫代硫酸鈉；低分子量蛋白質，諸如人血清白蛋白、牛類血清白蛋白、明膠或其他免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯基吡咯啶酮；單醣 ( 例如木糖、甘露糖、果糖、葡萄糖；二醣 ( 例如乳糖、麥芽糖、蔗糖)；三醣，諸如棉子糖；及多醣，諸如糊精或右旋糖酐。
本文所描述之調配物亦可含有所治療的特定適應症所需的多於一種活性化合物，較佳地具有互補活性成分但相互無不利影響的彼等化合物。因此，例如，其可包含多於一種抗體或多於一種蛋白質。
活性成分亦可包埋在例如藉由凝聚技術或藉由介面聚合製備的微囊 (例如，分別為羥甲基纖維素微囊或明膠微囊及聚(甲基丙烯酸甲酯)微囊) 中、膠體藥物遞送系統 (例如脂質體、白蛋白微球、微乳、奈米顆粒及奈米微囊 (nanocapsule)) 中或粗滴乳狀液中。此等技術揭示於 Remington's Pharmaceutical Sciences第 18 版, supra。脂質體或類蛋白質組成物亦可用於調配本文揭露之蛋白質或抗體。參見美國專利第 4,925,673 號；及第 5,013,556 號。
本文所描述之蛋白質及抗體的穩定性可通過使用無毒的「水溶性多價金屬鹽」來增強。實例包括 Ca 2+、Mg 2+、Zn 2+、Fe 2+、Fe 3+、Cu 2+、Sn 2+、Sn 3+、Al 2+及 Al 3+。可以與上述多價金屬陽離子形成水溶性鹽的陰離子實例包括由無機酸及/或有機酸形成的陰離子。此類水溶性鹽在水中 (在20℃) 的溶解度為至少約 20 mg/ml，可替代地至少約 100 mg/ml，或者至少約 200 mg/ml。可以用於形成「水溶性多價金屬鹽」的合適無機酸包括鹽酸、乙酸、硫酸、硝酸、硫氰酸及磷酸。可以使用的合適的有機酸包括脂族羧酸及芳族酸。該定義中的脂族酸可定義為飽和或不飽和的 C 2-9羧酸 ( 例如，脂族單、二及三羧酸)。例如，該定義內的示例性一元羧酸包括飽和 2-9單羧酸乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、己酸、庚酸、辛酸壬酸及辛酸，以及不飽和 C 2-9單羧酸丙烯酸、丙酸甲基丙烯酸、巴豆酸及異巴豆酸。示例性二羧酸包括飽和 C 2-9二羧酸丙二酸、琥珀酸、戊二酸、己二酸及庚二酸，而不飽和 C 2-9二羧酸包括順丁烯二酸、反丁烯二酸、檸康酸及中康酸。示例性的三羧酸包括飽和的 C 2-9三羧酸三烯丙基酸及 1,2,3-丁烷三羧酸。此外，該定義的羧酸亦可含有一個或兩個羥基以形成羥基羧酸。示例性的羥基羧酸包括乙醇酸、乳酸、甘油酸、丙醇二酸、蘋果酸、酒石酸及檸檬酸。該定義中的芳族酸包括苯甲酸及水楊酸。 治療方法及投予途徑
本文提供的任何抗體及抗體調配物可用於治療方法，其中治療的類型例如部分取決於抗體的抗原結合特性或抗原標靶。通常，抗體可用於多種治療適應症，諸如自身免疫病況、神經障礙及神經退行性疾​​病、癌症及傳染病等的治療。
本文的抗體可以單獨投予或用於聯合治療。例如，聯合治療包括投予抗體並投予至少一種另外的治療劑 (例如，一種、兩種、三種、四種、五種或六種另外的治療劑)。上面提到的此等聯合療法涵蓋聯合施用 (其中兩種或多種治療劑包含在同一或單獨的醫藥組成物中)，以及單獨施用，在這種情況下，本發明之抗體的施用可在施用附加的一種或多種治療劑之前、同時和/或之後發生。
抗體可以藉由任何合適的方式投予，包括腸胃外、肺內及鼻內，且若需要局部治療，可藉由病灶內投予。腸胃道外輸注包括肌肉內、靜脈內、動脈內、腹膜內或皮下投予。給藥可透過任何合適的途徑進行，例如透過注射，例如靜脈內或皮下注射，部分取決於短暫給藥還是長期給藥。 套組及製品
在本揭露的另一個態樣，本文的重組抗體可用於體外，即在實驗室中以改變細胞的行為，或用於例如診斷。例如，在許多情況下，分析細胞或組織樣品的行為可能是有益的，其中特定抗原的量有助於確定。因此，本揭露亦涵蓋包含一種或多種本揭露的重組抗體的套組。套組可包含抗體，視情況亦包含使用說明、適當的緩衝劑及/或標記分子。 實例 實例 1 LPLA2 及 PLBL2 複合多種抗體
為了確定抗體二硫鍵結構對結合的影響，使用 SPR 評估一組 IgG1、IgG2 及 IgG4 抗體以產生平衡解離常數 (K D) 並評估相對親和力。與 IgG1 及 IgG2 抗體相比，IgG4 類抗體與 PLBL2-01 (PLBL2 批次 1) 的結合最強 (表 1)。當嘗試對 LPLA2-01 (LPLA2 批次 1) 進行 SPR 分析時，未觀察到結合。MST 被用作 SPR 的替代品，並且能夠檢測 LPLA2-01 及硫酯酶的結合。雖然 IgG4 抗體仍然是 MST 最緊密的 PLBL2-01 結合劑，但藉由 MST 檢測將類別之間的差異降至最低 (表 2)。對於 LPLA2-01，MAb2 (IgG1)、MAb5 (IgG1) 及 MAb1 (IgG4) 是最緊密的結合劑，其 K d值 ＜5 µM。硫酯酶僅與 MAb2 及 MAb5 緊密結合，K d值 ＜10 µM。
表 1.mAb 與 PLBL2-01 的 Biacore 結合。
mAb 亞類 K D(uM); SPR K D(uM); MST
mAb1 IgG4 1.2 ± 0.4 1.3 ± 0.3
mAb2 IgG1 67 1.5
mAb3 IgG1 82 ± 11 22 ± 9
mAb4 IgG1 55 ± 25 ＞5uM
mAb5 IgG1 73 N.D.
mAb6 IgG2 91 ± 27 6 ± 2
mAb7 IgG4 2.3 ± 0.2 0.76
表 2.mAb 與脂酶的 MST 結合。
mAb 同型 PLBL2 LPLA2 硫酯酶
mAb1 IgG4 1.3 ± 0.3 1.7 ± 0.7 ＞100
mAb2 IgG1 1.5 4.4 ± 1 1.3 ± 2.5
mAb3 IgG1 22 ± 9 29 ± 11.3 72.8 ± 3.8
mAb4 IgG1 ＞ 5.5 - -
mAb5 IgG1 - 2.3 7.6
mAb6 IgG2 6 ± 2 20 -
mAb7 IgG4 0.8 20.3 ± 4.7 46.9 ± 1.8
選擇天然質譜法作為驗證複合物形成的正交策略，因為其提供了檢測非固定或未標記複合物並確定化學計量的機會。天然 MS 的初始表徵用於首先單獨表徵脂酶 (圖 1) 及抗體 (圖 2)。觀察到脂酶具有廣泛的醣基化模式，導致光譜不均勻。LPLA2 及 PLBL2 的解卷積質量範圍分別為 62 – 76 kDa 及 66-80 kDa。藉由最佳化 MS 傳輸參數實現了對複合物的檢測 (圖 3)。以 1:10 及 10:1 的脂酶：抗體莫耳比測試複合物的形成 (圖 4)。即使在 10:1 的脂酶:Ab 比率下，與脂酶相比，抗體電荷態分佈的強度亦更高，因為其首選 MS 電離及由糖型產生的***脂酶信號。因此，所有工作均以 10:1 的比例進行。LPLA2-01 及 PLBL2 與抗體的複合物顯示出高異質性 (圖 3)，表明多種脂酶糖型與抗體複合。觀察到 1:1 的化學計量比，PLBL2 的複合物平均質量約為 218 kDa，並且 LPLA2 抗體複合物的複合物平均質量約為 213 kDa。
脂酶的異質性給質譜資料的解捲積帶來了挑戰。此外，與 Triversa NanoMate™ (Advion, Inc., Ithaca, NY) 或 LC 注入實驗相比，複合物僅通過靜態噴霧 MS 保存，這限制了該方法的通量。因此，非 MS 電噴霧離子遷移率譜儀被評估為首創的非共價蛋白質複合物篩選技術。在 IM 中，電噴霧蛋白質是由單一電荷產生的，並根據其碰撞橫截面積 (22)在給定的電場中遵循圍繞中心棒的軌跡。對掃描電壓範圍內離子的逆遷移率 (1/K) 進行建模，其中較高的反向遷移率通常與較大的種類相關。對於每個實驗，對照脂酶、抗體及複合物種類均進行了標準化及比較 (圖 5)。PLBL2-01 (25.3 1/K) 與 MAb1 (IgG4)、MAb2 (IgG1) 及 MAb3 (IgG1) 的結合在 51.4 1/K 在單體 Ab (40.9 1/K) 及電噴霧氣相二聚體 (60.2 1/K)之間產生峰。觀察到 PLBL2-01-MAb3 複合物的小峰，表明 IM 的檢測限制 (LOD) 可能低於 MST。複合物的量與先前的結果一致，其中 PLBL2-01 複合物在 MAb1＞MAb2＞MAb3 的形成中顯示出明顯的排列順序。 LPLA2 結構對複合物結合的影響
大氣離子遷移率分析提供直接評估不同脂酶構形異構物與抗體結合的機會。在複合前後比較單體 PLBL2-01 峰的平均逆遷移率。若脂酶的所有糖型均等地結合至抗體，預計峰值的幅度會降低，但保持相同的寬度及平均 1/K 值。觀察到的脂酶峰向右移動 (圖 5) 表明，與較大的對應物相比，較小尺寸或較少醣基化的脂酶優先與 mAb 複合。為了驗證這一觀察結果，藉由更傳統的分析，包括完整質量、聚醣組成物及外切醣苷酶處理，進一步探索了脂酶醣基化對複合的影響。
天然質譜法用於評估是否可以在外切醣苷酶處理後形成複合物。PNGaseF 對脂酶 LPLA2-01 及 PLBL2-01 的去醣基化阻止了與所有測試抗體的結合。有趣的是，神經胺糖酸酶對脂酶的去唾液酸化對結合沒有影響 (圖 6)。神經胺糖酸酶處理的脂酶亦顯示出適合解卷積的不太均勻的光譜，其中分配了 22 種糖型 (圖 7)。
已知蛋白質的醣基化在不同的生產批次中有所不同。純化第二批脂酶樣品以進行游離聚醣組成物分析。如圖 1F 所示，與 LPLA2-02 相比，LPLA2-01 及 -03 具有顯著不同的糖型，尤其是在質量較低的區域。總體而言，LPLA2-02 具有顯著較少的質量為 65-70 kDa 的糖型，並富含 74-80 kDa 的高質量形式。(圖 1F)。與 PLBL2-01 相比，PLBL2-02 在質量範圍內的糖型分佈更均勻，PLBL2-01 的種類濃度在 72-77 kDa 之間。(圖 1G。)有趣的是，MST 或天然 MS 未觀察到 LPLA2-02 與抗體的結合，而 PLBL2-02 與 PLBL2-01 相比結合更緊密。在樣品之間檢測到甘露糖、唾液酸化及岩藻糖化種類的相對比例存在差異 (圖 8，表 3)。PLBL2-02 檢測到的甘露醣基化種類比例最高，為 43%。LPLA2-02 與 PLBL2-01 相比，具有更高的岩藻糖與唾液酸聚醣總比例，量分別為 2:1 及 1:1，儘管兩者的甘露醣基化程度相似，分別佔其總組成的 13% 及 15%。有趣的是，MST 或天然 MS 未觀察到 LPLA2-02 與 mAb 的結合，而 PLBL2-02 結合更緊密。
表 3.PLBL2-01 、 PLBL2-02 及 LPLA2-01 在時間點零及六個月 ( 非活性 ) 的聚醣組成物。
LPLA2-01
聚醣名稱 Rel.T0 % Rel.% T6 mo. 質量 組成物 唾液酸化 甘露醣基化 岩藻醣基化
T0 T6 mo. T0 T6 mo. T0 T6 mo.
Man3 2.91 0.00 910.3 Hex3HexNAc2     2.91 0.00    
Man4 1.12 0.33 1072.4 Hex4HexNAc2     1.12 0.33    
Man5 4.37 0.00 1234.4 Hex5HexNAc2     4.37 0.00    
2000 0A 0G 0.82 0.59 1316.5 Hex3HexNAc4 G0            
2100 0A 0G 9.97 0.00 1462.5 Hex3HexNAc4dHex1 G0F         9.97 0.00
2010 0A 0G 0.00 1.62 1478.5 Hex4HexNAc4 G1   0.00 0.00 0.00   0.00
Man7 0.87 0.00 1558.5 Hex7HexNAc2     0.87 0.00    
2110 0A 0G 1.82 1.30 1624.6 Hex4HexNAc4dHex1 G1F         1.82 1.30
3100 0A 0G 16.31 0.00 1665.6 Hex3HexNAc5dHex1         16.31 0.00
2120 0A 0G 0.00 0.94 1786.7 Hex5HexNAc4dHex1 G2F     0.00 0.00 0.00 0.94
3110 0A 0G 6.96 11.54 1827.7 Hex4HexNAc5dHex1         6.96 11.54
Man9 3.40 5.48 1882.6 Hex9HexNAc2     3.40 5.48    
2111 1A 0G 0.99 1.75 1915.7 Hex4HexNAc4dHex1NeuAc1 0.99 1.75     0.99 1.75
2021 1A 0G / 2111 0A 1G 0.00 1.36 1931.7 Hex5HexNAc4NeuAc1 / Hex4HexNAc4dHex1NeuGc1 0.00 1.36     0.00 1.36
3011 1A 0G 2.79 1.78 1972.7 Hex4HexNAc5NeuAc1 2.79 1.78        
3120 0A 0G 5.13 0.58 1989.7 Hex5HexNAc5dHex1         5.13 0.58
Man9Glc1 0.00 1.56 2044.7 Hex10HexNAc2 0.00   0.00 1.56 0.00  
2121 1A 0G 14.26 0.00 2077.7 Hex5HexNAc4dHex1NeuAc1 14.26 0.00     14.26 0.00
3111 1A 0G 0.00 19.91 2118.8 Hex4HexNAc5dHex1NeuAc1 0.00 19.91 0.00   0.00 19.91
3021 1A 0G / 3111 0A 1G 0.00 0.33 2134.8 Hex5HexNAc5NeuAc1 / Hex4HexNAc5dHex1NeuGc1 0.00 0.33 0.00   0.00 0.33
3130 0A 0G 2.69 2.89 2151.8 Hex6HexNAc5dHex1         2.69 2.89
3121 1A 0G 6.22 5.39 2280.8 Hex5HexNAc5dHex1NeuAc1 6.22 5.39     6.22 5.39
3031 1A 0G / 3121 0A 1G 0.00 0.78 2296.8 Hex6HexNAc5NeuAc1 / Hex5HexNAc5dHex1NeuGc1 0.00 0.78 0.00   0.00 0.78
3131 1A 0G 19.36 41.88 2442.9 Hex6HexNAc5dHex1NeuAc1 19.36 41.88     19.36 41.88
PLBL2-01
聚醣名稱 Rel.T0 % Rel.% T6 mo. 質量  組成物 唾液酸化 甘露醣基化 岩藻醣基化
T0 T6 mo. T0 T6 mo. T0 T6 mo.
Man3 1.59 0.00 910.3 Hex3HexNAc2     1.59 0.00    
Man4 3.45 2.12 1072.4 Hex4HexNAc2     3.45 2.12    
Man5 3.41 0.00 1234.4 Hex5HexNAc2     3.41 0.00    
1100 0A 0G 0.00 1.62 1259.5 Hex3HexNAc3dHex1   0.00   0.00 0.00 1.62
1010 0A 0G 0.00 3.29 1275.5 Hex4HexNAc3 非特異性己醣是 Man 或 Gal   0.00   0.00    
2000 0A 0G 1.47 1.15 1316.5 Hex3HexNAc4 G0            
Man6 3.91 2.51 1396.5 Hex6HexNAc2     3.91 2.51    
2100 0A 0G 1.28 0.00 1462.5 Hex3HexNAc4dHex1 G0F         1.28 0.00
2010 0A 0G 2.17 0.00 1478.5 Hex4HexNAc4 G1            
Man7 1.82 0.00 1558.5 Hex7HexNAc2     1.82 0.00    
1011 1A 0G 0.90 2.71 1566.6 Hex4HexNAc3NeuAc1 0.90 2.71        
2110 0A 0G 2.21 2.32 1624.6 Hex4HexNAc4dHex1 G1F         2.21 2.32
2020 0A 0G 13.24 13.09 1640.6 Hex5HexNAc4 G2            
Man8 0.62 0.00 1720.6 Hex8HexNAc2     0.62 0.00    
1111 0A 1G 2.06 0.00 1728.6 Hex4HexNAc3dHex1NeuGc1 2.06 0.00     2.06 0.00
2011 1A 0G 0.78 0.00 1769.6 Hex4HexNAc4NeuAc1 0.78 0.00        
2120 0A 0G 3.24 11.25 1786.7 Hex5HexNAc4dHex1 G2F         3.24 11.25
2111 1A 0G 1.22 2.84 1915.7 Hex4HexNAc4dHex1NeuAc1 1.22 2.84     1.22 2.84
2021 1A 0G / 2111 0A 1G 23.36 48.70 1931.7 Hex5HexNAc4NeuAc1 / Hex4HexNAc4dHex1NeuGc1 23.36 48.70     23.36 48.70
2021 0A 1G 0.93 0.00 1947.7 Hex5HexNAc4NeuGc1 0.93 0.00        
2130 0A 0G 0.00 1.48 1948.7 Hex6HexNAc4dHex1   0.00   0.00 0.00 1.48
2121 1A 0G 22.65 0.00 2077.7 Hex5HexNAc4dHex1NeuAc1 22.65 0.00     22.65 0.00
3130 0A 0G 0.00 0.81 2151.8 Hex6HexNAc5dHex1   0.00   0.00 0.00 0.81
2022 2A 0G 4.50 0.00 2222.8 Hex5HexNAc4NeuAc2 4.50 0.00        
2122 2A 0G 3.87 0.00 2367.9 Hex5HexNAc4dHex1NeuAc2 3.87 0.00     3.87 0.00
3131 1A 0G 1.32 6.10 2442.9 Hex6HexNAc5dHex1NeuAc1 1.32 6.10     1.32 6.10
PLBL2-02
聚醣名稱 Rel.T0 % Rel.% T6 mo. 質量  組成物 唾液酸化 甘露醣基化 岩藻醣基化
T0 T6 mo. T0 T6 mo. T0 T6 mo.
Man3 8.59 0.00 910.3 Hex3HexNAc2     8.59 0.00    
0100 0A 0G 0.00 0.31 1056.4 Hex3HexNAc2dHex1       0.00 0.00 0.31
Man4 15.14 0.00 1072.4 Hex4HexNAc2     15.14      
1000 0A 0G 0.00 0.34 1113.4 Hex3HexNAc3 0.00     0.00 0.00  
Man5 16.26 0.00 1234.4 Hex5HexNAc2     16.26 0.00    
1100 0A 0G 0.00 4.51 1259.5 Hex3HexNAc3dHex1 0.00     0.00 0.00 4.51
1010 0A 0G 0.95 0.00 1275.5 Hex4HexNAc3 非特異性己醣是 Man 或 Gal            
2000 0A 0G 3.33 0.00 1316.5 Hex3HexNAc4 G0            
Man6 2.20 0.00 1396.5 Hex6HexNAc2     2.20      
2100 0A 0G 0.90 0.00 1462.5 Hex3HexNAc4dHex1 G0F         0.90 0.00
2010 0A 0G 1.58 0.00 1478.5 Hex4HexNAc4 G1            
3000 0A 0G 0.00 0.25 1519.6 Hex3HexNAc5 0.00     0.00 0.00  
1011 1A 0G 0.00 3.10 1566.6 Hex4HexNAc3NeuAc1 0.00 3.10   0.00 0.00  
2110 0A 0G 3.68 0.00 1624.6 Hex4HexNAc4dHex1 G1F         3.68  
2020 0A 0G 14.36 0.00 1640.6 Hex5HexNAc4 G2            
3010 0A 0G 0.00 0.66 1681.6 Hex4HexNAc5 0.00     0.00 0.00  
Man8 0.83 0.00 1720.6 Hex8HexNAc2     0.83 0.00    
1111 0A 1G 1.15 0.00 1728.6 Hex4HexNAc3dHex1NeuGc1 1.15 0.00     1.15 0.00
2120 0A 0G 3.80 0.00 1786.7 Hex5HexNAc4dHex1 G2F         3.80  
3110 0A 0G 0.00 0.85 1827.7 Hex4HexNAc5dHex1 0.00     0.00 0.00 0.85
2111 1A 0G 1.35 0.00 1915.7 Hex4HexNAc4dHex1NeuAc1 1.35       1.35  
2021 1A 0G / 2111 0A 1G 16.31 0.00 1931.7 Hex5HexNAc4NeuAc1 / Hex4HexNAc4dHex1NeuGc1 16.31       16.31  
2130 0A 0G 0.00 0.28 1948.7 Hex6HexNAc4dHex1 0.00     0.00 0.00 0.28
2121 1A 0G 7.18 0.00 2077.7 Hex5HexNAc4dHex1NeuAc1 7.18 0.00     7.18 0.00
3111 1A 0G 0.00 0.73 2118.8 Hex4HexNAc5dHex1NeuAc1 0.00 0.73   0.00 0.00 0.73
3130 0A 0G 0.00 2.71 2151.8 Hex6HexNAc5dHex1 0.00     0.00 0.00 2.71
2022 2A 0G 1.39 0.00 2222.8 Hex5HexNAc4NeuAc2 1.39          
2122 2A 0G 1.00 0.00 2367.9 Hex5HexNAc4dHex1NeuAc2 1.00 0.00     1.00 0.00
3131 1A 0G 0.00 10.76 2442.9 Hex6HexNAc5dHex1NeuAc1 0.00 10.76   0.00 0.00 10.76
評估了 PNGase F 釋放聚醣的組成，以了解可以解釋脂酶結合差異的趨勢。(圖 19。)與參考相比，PLBL2-批次 2 (PLBL2-02) 唾液酸化降低約 20%，甘露醣基化增加 30%，並且岩藻醣基化降低 10%。雖然剩餘的樣品不足以分析 LPLA2 參考中釋放的聚醣，但沒有結合活性的 LPLA2-批次 2 (LPLA2-02) 樣品主要由岩藻醣基化種類構成 (相對豐度為 60%)。由於已知唾液酸化與天然 MS 結合實驗的結合無關，因此比較岩藻醣基化及甘露醣基化聚醣 (圖 9)。沒有觀察到岩藻醣基化趨勢。雖然 LPLA2-02 及 PLBL2-01 的總甘露醣基化量相似，但其檢測到的種類大小不同，其中 LPLA2-02 幾乎包含所有 Man9 或 Man9Glc1 種類，而 PLBL2-01 僅包含 Man4 或 Man6 種類。同樣，PLBL2-02 僅包含較小的甘露糖聚醣 Man4 及 Man6。與 PLBL2 相比，LPLA2-01 存在較小的岩藻醣基化種類，並以相似的量對約八個種類進行了採樣。PLBL2-01 及 PLBL2-02 均存在大量的 Hex5HexNAc4NeuAc1 / Hex4HexNAc4dHex1NeuGc1 (等壓聚醣) 及 Hex5HexNAc4dHex1NeuAc1。LPLA2 批次 2 的 50% 的甘露醣基化種類 ＞ 1200 Da (Man 7-9)，而兩個 PLBL2 樣品中 ＞ 80% 的聚醣大小為 Man6 或更小。PLBL2-批次 2 在三個樣品中小甘露糖種類的百分比最高。
將脂酶在其 4°C 時的純化緩衝劑中儲存六個月導致溶液中某些糖型富集，而其他種類則崩潰 (crashing out)。在所有情況下，冷藏的脂酶未能與抗體結合 (在 -80 °C 下儲存樣品保留了形式/活性)，從而產生了偽「剔除」實驗。在六個月時，與儲存前條件相比，每個樣品中的甘露糖種類顯著減少 (圖 7，表 3)。岩藻醣基化及唾液酸化量保持大致相同，或與甘露醣基化減少成比例增加。批次變體及時間過程處理之間的差異，再加上在醣基化中觀察到的變化，有力地說明了醣基化在介導結合中的作用。 脂酶抗體結合區的測定
蛋白質的快速光化學氧化提供了評估複合前後蛋白質溶劑暴露表面積 (SASA) 差異的機會。雖然 FPOP 無法將結合界面與結合誘導的構形變化區分開來，但其提供了可以進一步審視其在結合中精確作用的區域 (23)。在兩個實驗中研究每個 mAb-脂酶對，其中 mAb 過量 (mAb:脂酶的莫耳比為 10:1) 以使脂酶完全飽和，而脂酶過量 (mAb:脂酶為1:10) 則相反，以使 mAb 結合位點完全飽和。
LPLA2 的肽 125-131、133-145 及 146-177 在與 mAb1 複合後顯示氧化減少 (圖 10A)。這表明此等肽在複合時不受溶劑影響，因此可能參與與 mAb1 的結合。在與過量 mAb2 培育後，LPLA2 的肽 133-145、146-177、229-247 及 248-260 顯示指示結合的氧化減少 (圖10B)。因此，LPLA2 的肽 133-145 及 146-177 是 IgG4 同型 mAb1 與 IgG1 同型 mAb2 兩者的共同結合表位，而其他肽分別是每種 mAb 獨有的。特別是，LPLA2 的肽 146-177 在與 mAb1 及 mAb2 兩者複合後氧化顯著減少。(圖 10A 及 10B。) 對於 PLBL2，PLBL2 的肽 67-78、79-98、173-187、359-371、372-388、389-400、401-407 及 424-459 涉及與 mAb1 及 mAb2 兩者的結合，而肽 211-236、241-253、287-333、340-352、513-530、539-546、573-599 及肽 56-64、485-512、548-572 分別是 mAb1 及 mAb2 的相互作用區域 (圖 11A 及 B)。特別是，肽 79-98、424-459 及 573-599 是與 mAb1 及 mAb2 的常見相互作用區域，而肽 372-388 及 548-572 僅顯示減少與 mAb2 複合的氧化作用，並且肽 424-459 僅顯示減少與 mAb1 複合的氧化作用。
使用過量脂酶的相反實驗允許鑑定 mAb 上的結合表位 (圖 12 及 13)。當與 LPLA2 複合時，輕鏈的 mAb1 肽 131-146、154-173、174-187 及重鏈的肽 6-38、57-64、76-122、123-134、149-197、300-315 及 369-390 顯示在複合時氧化減少，因此與 LPLA2 結合有關。類似地，輕鏈的 mAb1 肽 113-130、131-146、154-173、195-211 及重鏈的 6-38、57-64、76-122、149-197、220-246、254-286、325-332、343-358 與結合於 PLBL2 有關。對於 mAb2-LPLA2 複合物，參與結合的 mAb1 肽是輕鏈的 1-18 及 127-142 以及重鏈的 46-67、126-137、152-214、306-321、331-338、375-396、397-413。對於 mAb2-PLBL2 複合物，參與結合的 mAb1 肽是輕鏈的 150-169 以及重鏈的 47-67、85-100、126-137、152-214、260-278、279-292、375-396、397-413。
特別是，當與 LPLA2 複合時，輕鏈 (LC) 的 mAb1 肽 66-100 以及重鏈 (HC) 的 6-38 相對於對照具有顯著較少的氧化。對於 PLBL2，mAb1 LC 肽 50-65、131-146、154-173 及 HC 肽 6-38 及 76-122 顯示氧化減少。HC 肽 149-197 經鑑定為 LPLA2 及 PLBL2 的常見 mAb1 結合界面。對於 mAb2 複合物，LPLA2 的 LC 肽 1-18 及 127-142 或 PLBL2 的 150-169 顯示氧化減少。對於兩種脂酶，LC 肽 25-42 及 46-53 以及 HC 肽 47-67 及 152-214 均顯示出變化，這表明由於結合而發生了變化。(參見圖 12 及 13。)
mAb1 肽 149-197 以及 mAb2 肽 152-214 的氧化變化表明，共同的結合界面落在 mAb 恆定 CH1 區上。由於該區域在不同抗體 (包括亞型) 中很大程度上是保守的，我們假設該界面可能是宿主細胞產生並在不同藥物產物中發現的各種脂酶的共同結合位點。為了測試結合是否會被破壞，製備了 mAb1 的 32 個 CH1 域殘基的單一丙胺酸突變，並首先通過 SPR 針對 PLBL2 進行篩選 (表 4)。K D的倍數減少範圍為 0-70 倍，其中 84% 具有至少 5 倍的效果。
表 4. 藉由 SPR 篩選針對 PLBL2 的 mAb1 丙胺酸突變體。
ka kd KD KD 的倍數減少
mAb1 WT 4.73E+03 0.01671 3.53E-06  
G170A 5.69E+02 0.009909 1.74E-05 5
V171A 2.04E+02 0.01245 6.12E-05 17
T173A 1.83E+02 0.009921 5.42E-05 15
F174A 1.53E+02 0.0378 2.47E-04 70
P175A 9.78E+01 0.01397 1.43E-04 40
V177A 2.45E+02 0.01264 5.17E-05 15
L178A 2.64E+02 0.01197 4.53E-05 13
Q179A 1.02E+02 0.02355 2.32E-04 66
S180A 2.62E+02 0.01583 6.04E-05 17
S181A 1.99E+02 0.01292 6.51E-05 18
G182A 1.47E+02 0.0143 9.71E-05 27
Y184A 6.60E+02 0.008499 1.29E-05 4
L186A 6.37E+02 0.01634 2.57E-05 7
S187A 1.09E+03 0.01262 1.16E-05 3
F154A 5.47E+02 0.01908 3.49E-05 10
P155A 4.60E+02 0.04123 8.96E-05 25
V189A 1.46E+02 0.01302 8.95E-05 25
V190A 1.71E+02 0.007244 4.25E-05 12
T191A 1.23E+02 0.00831 6.78E-05 19
V192A 1.48E+02 0.01682 1.14E-04 32
P193A 1.27E+02 0.007293 5.73E-05 16
S194A 3.59E+02 0.006978 1.94E-05 5
S195A 1.56E+02 0.006177 3.95E-05 11
S196A 1.58E+02 0.008049 5.11E-05 14
L197A 1.05E+03 0.01176 1.12E-05 3
L198A 1.88E+02 0.02024 1.08E-04 30
T199A 8.24E+02 0.007519 9.13E-06 3
K200A 1.12E+02 0.0129 1.16E-04 33
E156A 6.12E+04 0.09252 1.51E-06 0
P157A 4.03E+02 0.007351 1.82E-05 5
V158A 4.36E+02 0.007987 1.83E-05 5
TI59A 1.67E+02 0.008762 5.24E-05 15
然後藉由天然 MS 及 IM 在 LPLA2-mAb1 系統中測試最顯著降低結合 (30-70 倍) 的突變子集，因為 LPLA2 與 SPR 不兼容。與化學計量及完整質量解捲積實驗相比，藉由更改為較低的分辨能力，重新調整 MS 以優先增加複合物峰的信噪比 (表 5a)。然後在 MS 中分離每個 LPLA2 或 PLBL2 – mAb1 複合物的 +29 電荷狀態並經歷解離實驗以推斷其與 mAb WT 的相對結合親和力，其中 VC50 代表解離 50% 複合物的 HCD 裂解能量量 (表 5b，圖 14-15)。對於剔除結合從而無法測量完整複合物信號的突變體 (即質譜儀中可能的最低能量落在 S 曲線斜率上)，未報導 VC50 (圖 15)。針對 WT mAb1，PLBL2-02 是一種比 LPLA2-03 顯著更穩定的結合劑，VC50 約高 2.5 倍，並且 MS1 S/N 約高 7 倍 (112.6 相對於 15.6)，反映其藉由 MST 揭示的相對結合親和力的差異 (表 1)。因此，每單位 HCD 裂解電壓，與 PLBL2 相比，預計 LPLA2-IgG4-B 複合物將經歷增加的解離。與其各自的野生型相比，在 mAb1 突變體種類針對 PLBL2 或 LPLA2 的結合能量 (VC50) 中觀察到降低顯示出相似的趨勢 (表 5b，圖 16)。當與 LPLA2 複合時，突變體 L198A 太不穩定而無法進行分析，並且對 PLBL2 的活性同樣降低了 50% 以上。突變體 P175A 顯著降低了針對兩種脂酶的結合，信賴度為 95%，PLBL2 降低 77%，並且 LPLA2 降低 17%。雖然 Q179A 及 V192A 對 PLBL2 的穩定性顯著降低，但 Q179A VC50 對 LPLA2 沒有顯著變化，並且突變體 V192A 降低 6% 僅在 90% 信賴區間內顯著。與 LPLA2-WT 樣品相比，VC50 中的突變體 K200A 及 F174A 分別降低 16% 及 13%。沒有觀察到兩種種類針對 PLBL2 複合物的差異。
表 5a.MS 參數針對 17,500 RP 處的游離脂酶、游離抗體、脂酶抗體複合物的檢測及 4375 RP 處的 SIM 實驗進行了最佳化 ( 用於結合解離實驗的設置 ) 。
游離脂酶 游離抗體 複合物 @ 17,500 RP SIM 複合物 @ 4375 RP
注射時間 100 50 100 1000
MS2 分離窗 N/A N/A N/A 20
S-透鏡電壓 21 21 21 21
Skimmer 電壓 15 15 15 15
源內捕獲 -50 -150 -50 -10
注射 flatapole 偏移 (V) 5 5 5 8
彎曲 flatapole DC 2 2 2 2
四極傳輸 RF 模式 高 高 高 高
反式多極 DC 0 0 0 0
C-trap 射透鏡 2 2 2 2
Orbitrap 檢測器模式 低 低 低 低
擴展捕獲電壓 10 3 0 3-300
壓力 4 1 6 1
表 5b. 結合解離天然 MS 實驗 LPLA2-03 及 PLBL2-03 針對 mAb1 突變體的 VC50 值及信賴區間 (CI) 。
LPLA2 PLBL2
突變體 VC50 較低的 CI，VC50 較低的 CI，VC50 VC50 較低的 CI，VC50 較低的 CI，VC50
174 39.28 37.23 41.44 58.18 44.71 75.71
175 37.4 36.04 38.82 25.49 16.72 38.87
179 44.05 41.91 46.3 47.29 32.28 69.3
192 42.21 40.59 43.88 46.63 33.83 64.27
198 太低而無法量化 51.18 38.23 68.52
200 37.65 36.01 39.36 94.52 49.56 180.28
WT 45.18 43.35 47.09 111.43 68.76 171.98
為了驗證 MS 資料並比較形成的複合物的相對濃度，對 LPLA2-mAb1 種類進行 IM 分析 (表 6，圖 17)。與 WT 相比，突變體 47L198A 形成的複合物量減少約 90%，證實了天然 MS 檢測到的低量。與 WT 相比，突變體 23F174A、24P175A 及 28Q179A 減少 50% 以上。對於突變體 41V192A 及 49K200A，觀察到 36% 及 12% 的小幅下降。
表 6. 對於每個脂酶突變體， LPLA2-03- 抗體複合物峰面積的比率，相對於總 IM 光譜面積進行歸一化。
174 175 179 192 198 200 WT
歸一化複合物面積 0.63 0.55 0.54 0.88 0.18 1.21 1.38
相對於實驗確定的去醣基化完整質量 (44491.5 Da) 報導質量偏移。由於四個 N-醣基化位點允許 14 種不同聚醣的大組合空間而無法進行鑑定，因此給出了與最強烈的質量 (標記為參考 A) 相比的相對聚醣單位偏移。在 38 個解卷積質量中，只有三個未發現與預測的醣基化模式相關。
表 7. 去唾液酸化的 LPLA2 降低的異質性允許光譜解卷積。
鑑別 平均質量 強度 去醣基化完整蛋白質的 Δ 質量
Ref A 51919.13 2.87E+04 7427.63
A+Hex 52286.90 2.01E+04 7795.40
A+2Hex-HexNac 52042.92 1.96E+04 7551.42
A+2Hex-2HexNac 51840.66 1.75E+04 7349.16
A+2HexNac-Hex 52161.78 1.75E+04 7670.28
A+2Hex+HexNac 52448.30 1.72E+04 7956.80
A+2Hex+2HexNac 52651.66 1.60E+04 8160.16
A-2Hex-HexNac-Fuc 51245.45 1.54E+04 6753.95
A+3Hex-HexNac 52204.03 1.52E+04 7712.53
A-2Hex+2HexNac 52000.66 1.49E+04 7509.16
A+Hex 52082.84 1.38E+04 7591.34
A+2Hex+HexNac+Fuc 52594.37 1.27E+04 8102.87
A-Hex-HexNac 51554.44 1.25E+04 7062.94
A+3Hex+2HexNac+Fuc 52960.11 1.24E+04 8468.61
A+HexNac 52122.14 1.09E+04 7630.64
A-Fuc 51775.95 1.07E+04 7284.45
A+4Hex+Fuc 51121.84 1.03E+04 6630.34
A+3Hex+3HexNac 52814.34 1.02E+04 8322.84
A-2HexNac+Hex 51677.66 1.01E+04 7186.16
A+4Hex+3HexNac+Fuc 53324.30 1.00E+04 8832.80
A+4Hex 52570.86 9.64E+03 8079.36
A-3Hex-2HexNac-Fuc 50878.42 8.97E+03 6386.92
A-Hex 51756.77 8.97E+03 7265.27
A-3Hex 52408.32 8.72E+03 7916.82
A-Hex-HexNac-Fuc 51409.79 8.36E+03 6918.29
A+2Hex+HexNac+2Fuc 52736.13 7.83E+03 8244.63
A+HexNac-Fuc 51979.77 7.60E+03 7488.27
A+5Hex+4HexNac+Fuc 53690.83 6.68E+03 9199.33
A-3Hex+HexNac 51636.53 6.44E+03 7145.03
A-3HexNac 51312.33 6.14E+03 6820.83
A-HexNac 51716.11 5.84E+03 7224.61
A-4Hex-HexNac 52772.68 5.62E+03 8281.18
A+2Hex+HexNac+3Fuc 52883.36 4.35E+03 8391.86
   56709.13 4.32E+03 12217.63
A+3Hex+3HexNac+Fuc 53160.52 4.07E+03 8669.02
   57375.51 3.36E+03 12884.01
Hex3HexNAc4G0 & Hex4HexNAc5NeuAc1 47458.06 1.82E+03 2966.56
   47594.05 1.50E+03 3102.55
討論
通過靶向及次世代方法對脂酶-抗體相互作用的假設通知測試為觀察低親和力宿主細胞蛋白-抗體結合提供了新的機會。在這項研究中，脂酶的重組表現及純化允許開發用於篩選針對多種抗體的新方法。此外，我們探討了抗體脂酶複合物形成的機制態樣，並且揭示了脂酶醣基化介導複合的新作用，並確定了位於 Ab 恆定重鏈中影響結合的共同結構區域。
檢測宿主細胞蛋白質不純物的傳統方法受到共純化蛋白質的動態範圍大而受到阻礙。各種複雜的二維技術，包括 MS/2D-凝膠電泳 (9, 24) 及 2D-LC-MS (25, 26) 已經證明在檢測新不純物 (27) 方面最為成功，包括脂酶，諸如凝聚素、PLBL2 及脂蛋白脂酶 (LPL)。雖然在 LC-MS 檢定中檢測到的蛋白質由於其豐度而成為製造問題，但低量不純物諸如 LPLA2 仍然可以具有酶活性。當使用靶向 PRM 檢定而不是以發現 LC-MS 方法進行研究時，觀察到 LPLA2 的量低於 1 ppm，這證明與聚山梨醇酯的水解具有功能相關性 (11)。
用於靶向分析的脂酶的選擇可以基於實驗蛋白質組學資料集 (28)、預測的蛋白質組資料庫 (TrEMBL 資料庫中 CHO 細胞中脂酶搜索結果的 193 個結果)，以及跨任何系統的脂酶-抗體相互作用的先前知識，而不是在製造產物中檢測。基於這種方法，亦篩選另外三種脂酶、棕櫚醯基蛋白硫酯酶 (PPT)、磷脂酶 D3 (PLD3) 及神經鞘磷脂磷酸二酯酶 (SP)，以藉由天然 MS 進行結合 (圖 18)。未檢測到 SP，並且 PPT 及 PLD3 複合物只能在 100 mM 而不是 50 mM 乙酸銨中觀察到，這表明靜電排斥可能在介導結合中起作用。對於 PPT，發現相對豐度為 0.6%，僅在 100:1 的蛋白質：mAb 溶液比率下實現結合 (圖 18A)，支持顯示濃度依賴性結合作用的先前工作 (29)。對於作為二聚體自然存在的 PLD3 (圖 18B)，在 10:1 的溶液比中觀察到 0.8% 量的 2:1 化學計量複合物。在 mAb1 突變體及 PPT 或 PLD3 之間未觀察到結合，儘管由於 WT 觀察到的低豐度，結合減少小至 5% 可能會阻止檢測。
PPT 及 PLD3 複合物的檢測突出表徵結合的正交及天然溶液技術的要求。正如 MST 可以篩選在 SPR 實驗中未檢測到的 LPLA2 結合一樣，天然 MS 觀察到 MST 未檢測到的 PPT 及 PLD3 複合物。檢定之間的差異可能由導致結構變化的蛋白質的固定或標記引起，或由檢測器的靈敏度引起，諸如在比較天然 MS 與大氣壓離子遷移率時。雖然天然 MS 及 FPOP 實驗提供高量的結構細節，但 MST 及大氣離子遷移率更適合於更高通量的檢定，將其定位為突變體測試或剔除實驗的第一篩選。
建立 PLBL2-mAb1 結合的早期工作是使用 SPR (9) 進行的，這表明 F(ab')2 域的作用，並且此等相互作用在本研究中針對多種脂酶及抗體新詳述。藉由 FPOP 分析，脂酶及 mAb 上特定區域的 SASA 受到結合的影響，導致 mAb CDR-L2、CDR-H1 及 CDR-H3 區觀察到的氧化百分比顯著降低。CH1 域是 FPOP 所涉及的抗體中的一個共同模體，導致假設這是脂酶結合的特定相互作用位點。保守的相互作用可為結合提供基線親和力，而抗體或脂酶特異性結合區可能會降低或增強親和力，這是給定脂酶與不同 mAb 之間不同結合解離常數的原因。
CH1 區的誘變顯著降低了與 LPLA2 及 PLBL2 的結合，支持該區在結構上對結合很重要的作用。此等丙胺酸掃描實驗的結果在 SPR、離子遷移率及天然 MS 之間是一致的。已知抗體的蛋白 A 結合發生在抗體的 Fc 部分，在 CH2 與 CH3 域之間 (30)。若脂酶抗體複合物在柱上形成，在純化過程中，F(ab')2 域將是脂酶結合最易受溶劑影響的區域。一項檢查抗體負載對蛋白 A 柱影響的研究支持層析管柱中珠粒上抗體定向的重要性，其中顯示 PLBL2 洗脫以與抗體負載不成比例地更大的速率增加 (31)。作者提出，柱上越來越多的交互位點可能是原因，並且本文報導的工作表明，具體而言，F(ab')2 域定向可能是關鍵參數。有趣的是，本研究中測試的 CH1 區與涉及 PLBL2 與 mAb 結合的區域相鄰，如藉由 SPR 確定，並在 2018 年 PCT 出版物中報導 (32)。然而，該區域並未作為本研究中測試的脂酶及 mAb 的共同表位出現。可能的差異包括每項研究的緩衝劑組成或表現的脂酶中的結構差異。
在 Fc 區亦鑑定了脂酶結合位點，儘管該區域不是誘變的目標。Fc 區在脂蛋白結合中的作用首先在醣蛋白凝聚素中得到證實 (29、33)。在那項工作中，木瓜酶生成的 Fc 及 FAb 片段 (來自 IgG1 及 IgG3 混合物) 顯示出使用顯示與完整 IgG1 結合最強的 ELISA 檢定分別以相似的親和力結合於 IgG2 及 IgM 同型。自那時起，Fc 參與 PLBL2 與抗體的結合 (32、34、35) 及 LPL (36)。
藉由 FPOP、MS 及 IM 評估脂酶結構如何影響結合，然後藉由外切醣苷酶實驗進一步研究以確定醣基化的影響。雖然去醣基化抑制複合物的形成，但去唾液酸化對天然 MS 的結合沒有影響。若岩藻醣基化促進結合，則第二批生產的 LPLA2 (其 60% 由岩藻醣基化種類構成) 預計會形成 mAb 複合物；同樣，岩藻糖種類減少 10% 的 PLBL2-02 比 PLBL2-01 結合更緊密。因此，脂酶結合活性似乎對甘露糖聚醣的量及類型最敏感。最緊密的結合劑 PLBL2-01 及 PLBL2-02 富含低數量的甘露糖聚醣 (Man3-5)。此等亦對應於最小分子量的聚醣，與顯示低分子量完整脂酶糖型複合的 IM 結果相關。有趣的是，在 LPLA2 及 PLBL2 樣品中發現的常見表位與醣基化位點重疊，表明可能有一個聚醣位於結合界面。我們假設太大的聚醣可能會干擾蛋白質-mAb 定向，但消除聚醣可能會去除氫鍵結配偶體。
雖然在 mAb 生產過程中脂酶的表現有助於宿主細胞存活，但此處提供的結果表明，有可能通過天冬醯胺誘變產生具有部分去醣基化脂酶的細胞株的機會。經醣基化工程改造的脂酶可以使非共價 mAb-脂酶複合物的形成最小化，並最終降低此等類型的酵素在調配物緩衝劑中持續存在的傾向，從而導致可見顆粒。反之亦然，在抗原結合中不發揮核心作用的 CH1 域的誘變可能會限制共純化抗體。本文描述的兩種策略均代表在製造中控制 HCP 表現及純化的新機會，並且仍然是進一步測試及探索的重要途徑。 方法 材料
本研究中使用的治療性 mAb 由建南德克公司 (Genentech, Inc.) 生產。醋酸銨 (AMAC)、甲酸 (FA)、二硫蘇糖醇 (DTT)、HCl 胍、甲醇 (MeOH) 及 三 HCl 係購自 Sigma-Aldrich (St Louis, MO)。乙腈 (ACN)、三氟乙酸 (TFA) 及水係購自 Fisher Scientific (Hampton, NH)。所有溶劑均為 HPLC 級或 ＞ 99.9 % 純度。 蛋白質及抗體表現
質體由 Genewiz Inc. (South Plainfield, NJ) 通過基因合成及次選殖製備。所有脂酶、mAb 及丙胺酸突變體均在 CHO 細胞中表現。脂酶通過使用 Ni NTA 柱 (Cytiva, Marlborough, MA) 的親和力層析純化，然後是凝膠過濾層析。使用蛋白 A 柱 (Cytiva, Marlborough, MA) 純化 mAb，然後進行凝膠過濾層析。使用 SDS-PAGE 及分析 SEC 對蛋白質進行表徵。
以下符號用於在多個批次的不同時間點生成的蛋白質，並給出了其相關的生產日期：PLBL2-01 (2020 年 11 月)、PLBL2-02 = (批次 cr003 2020 年 11 月)、LPLA2-01 = 2019 年 2 月、LPLA2-02 = 2020 年 11 月、LPLA2-03 = 2020 年 6 月。 表面電漿子共振檢定
感興趣的脂酶經由胺偶合固定在 CM5 芯片上。使用 PBS 作為運行緩衝劑及 10 mM Glycine pH 2.0 作為再生緩衝劑在 Biacore® T200 儀器 (Uppsala, Sweden) 上進行實驗。將至少 8 種不同濃度的 mAb 注射至固定有脂酶的芯片上，並且結合曲線全局擬合至 1:1 Langmuir 結合模型。 微尺度熱泳動 (MST)
為了使用 MST 測量結合，使用與脂酶上的 his-標籤 結合的 Red-tris-NTA 染料 (NanoTemper Technologies Inc., South San Francisco, CA) 標記脂酶。簡而言之，將過量染料與脂酶一起培育，並使用具有 7k 截留分子量的 Zeba Spin 脫鹽柱 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) 純化標記的脂酶。將 1-5 nM 的標記脂酶與不同濃度的 mAb 一起培育並經歷熱泳。使用 MO.Screening 分析軟體 (NanoTemper Technologies Inc., South San Francisco, CA) 分析資料。 蛋白質的快速光化學氧化 (FPOP)
以 1:10 或 10:1 的比例製備抗體：脂酶溶液。如前所述 (37)，在與過氧化氫不對稱混合之前，將精胺酸自由基清除劑添加至溶液中。樣品流過 150 µm 毛細管並暴露於 248 nm KrF 準分子激光 (GAM Laser Inc. Orlando, FL)，脈衝頻率為 30 mJ/脈衝。將樣品收集在 10 µL 的 50 nM 過氧化氫酶及 200 mM 甲硫胺酸中，以清除殘留的過氧化物。使用分子量截止過濾器對蛋白質進行淨化、還原、烷基化及胰蛋白酶消化。將肽加載到配備 BEH300 C18 (1.7 µm 2.1 x 150 mm) 柱的 Agilent 1200 HPLC 上。使用 0.3 mL/min 的流速，溶劑 B (乙腈，0.8% 三氟乙酸) 在 45 分鐘時增加至 55%。在 Orbitrap™ Elite (Thermo Fisher, Bremen, Germany) 上以全掃描正離子模式以 60,000 分辨率在資料相關採集模式下檢測到肽。使用 Byos® Software Suite (Protein Metric Inc., Cupertino, CA) 對每種肽的氧化百分比進行峰鑑定及定量。使用感興趣的抗體或脂酶對使用 Mascot 及客製資料庫 (包括反相資料庫 (decoy database)) 鑑定的肽進行了搜索。所有基於氧化的修飾均作為可變修飾啟用，並且質量公差設置為 10 ppm。修飾強度取自 MS1 量的肽提取離子色譜圖。 用於 MS 及 IM 的蛋白質樣品的脫鹽及製備
將蛋白質或抗體樣品緩衝劑交換至 50 mM 乙酸銨 (pH 7) 中，並根據製造商流程在 Micro Bio-Spin TM6 柱 (Bio-Rad, Hercules, CA) 上進行交換。樣品在脫鹽後三天內使用並在 4°C 下儲存。然後將脫鹽樣品分開用於天然 MS 及 IM 分析。分別以 10:1 的脂酶：抗體 (2.7:0.27 μM) 莫耳比製備複合物用於 MS 分析，並在分析前分別以 2:1 莫耳比 (400:200 nM) 製備用於 IM 分析，最終乙酸銨濃度分別為 50 mM 及 25 mM。 用醣苷酶處理脂酶
對於去唾液酸化，脂酶與 α2-3,6,8 神經胺糖酸酶 (New England Biolabs, Ipswich, MA) 以 100 單位/40 µg 脂酶在 37°C 下培育 3 小時。對於天然去醣基化，將樣品與不含甘油的 PNGaseF 以 1 單位/5 µg 脂酶在 37°C 下培育過夜。 天然質譜分析
硼矽酸鹽玻璃 (1.2 mm OD，0.69 mm ID) 使用先前描述的方法 (38) 在 P-1000 拉拔器 (Sutter Instruments, Novato, CA) 上拉動。使用 Ace600 高真空濺射涂佈機 (Leica Microsystems Inc. Buffalo Grove, IL) 用 80:20 Au/Pd 將尖端濺射涂佈至 6 nm。將每個尖端裝入 2-5 μL 樣品，*** Nanospray Flex 源，並連接至 Q Exactive TMUHMR (Thermo Fisher Scientific, Bremen, DE)。毛細管電壓設置在 1.2 – 1.3 kV 之間以保持穩定的噴霧，入口溫度設置為 200°C。使用前面描述的方法最佳化 MS 傳輸及檢測條件 (39)。對照樣品 (游離脂酶、游離抗體) 及低分辨率及高分辨率複合物光譜的最終條件見表 5a。使用 UniDec 3.1 (40) 對所有光譜進行解卷積分析。
對於質譜結合能解離實驗，使用質心峰 m/z 及 20 m/z 分離窗分離每個 +29 蛋白質複合物。使用固定注射時間自 3 – 300 V 掃描 HCD 碰撞能量電壓。使用內部 python 程序自動提取分離窗內峰的基峰強度及相關的 HCD 能量。此等值隨後被導入 R Studio v1.3 並與 dr4pl 包 (41) 擬合。基於 Tukey 方法對資料進行歸一化、清除異常值，並通過計算 Hessian 方法使用 Mead 方法進行初始參數選擇、Broyden–Fletcher–Goldfarb–Shanno (BFGS) 方法進行參數最佳化以及特徵值選擇以擬合四參數邏輯增長函數。提取 VC50 值，作為將複合物降低至其初始強度的 50% 的電壓，並對每條曲線下的面積進行積分。 大氣離子遷移率分析
使用非 MS 獨立大氣離子遷移率設備 IMgenius™ (IonDX, Inc.) 比較不同抗體與抗體突變體之間的形成複合物。尚未在文獻中描述的 IMgenius (圖 A6) 基於測量脂蛋白顆粒大小的工作 (22)，根據其碰撞橫截面積在電場中分離單電荷電噴霧離子。使用適用於流動注射並配備有安定的熔合二氧化矽毛細管 (220 μm OD，50 μm ID) 的 nanoLC 系統以 300 nL/min 的速度輸注樣品。在具有 1.9 SLM 空氣及 0.1 SLM CO 2的腔室中，電噴霧起始電壓為 2.7-3 kV。中心幹電壓自 0 至 4 kV 掃描，並且在 3 mm 寬的環上檢測到電流，用 4 通道 12 位 Pico-Scope (模型 4424，Pico Technologies，UK) 數字化。在 SIMION (Scientific Instrument Services, Inc., Ringoes, NJ) 中生成的單電荷離子軌蹟的流體動力學模型用於構建電壓與遷移率查找表。
獲得的光譜是五次掃描的平均值，減去背景，並用三點移動平均值平滑。對於對照資料集，將資料歸一化並導入 Magicplot Pro 2.9.3 (Sydney, AU) (42)。對於複合物蛋白質資料集，自歸一化複合物蛋白質光譜中減去歸一化抗體對照 IM 光譜。對照光譜使用兩個或四個高斯-A 曲線 (y(x) = a * exp(-ln(2) * (x-x0)^2 / dx^2)) 的自動擬合和方法進行擬合，用於控制或複合物資料集，分別自中導出平均逆遷移率及曲線面積。Mason-Schamp 方程用於使用球形顆粒的假設將逆遷移率轉換為顆粒直徑。 藉由 LC-MS 分析的全局 N- 連接的聚醣組成分析
10 μg 蛋白質用 8 M HCl 胍以 1:1 的體積比變性，並在 95°C 下用 100 mM 二硫蘇糖醇還原 10 分鐘。樣品用 100 mM Tris HCl，pH 7.5 稀釋至最終濃度為 2 M 的HCl 胍，接著在 37°C 下用 2 μl 無甘油 PNGase F (New England BioLabs, Ipswich, MA) 消化 18 小時。將去醣基化樣品 (150 ng) 注射至配備有 43 mm PGC-Chip II 柱 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) 的 1260 Infinity HPLC-Chip Cube。使用二元泵以在 6 分鐘內為 2% 至 32% B、在 1.5 分鐘內為 32 % B、在 0.5 分鐘內為 32 至 85% 及在 1 分鐘內為 85 % B 的梯度以 500 nL/min 的速度遞送溶劑 A (99.88% 水、0.1% 甲酸及 0.02% 三氟乙酸) 及溶劑 B (90% 乙腈、9.88% 水、0.1% 甲酸及 0.02% 三氟乙酸)。柱在 2% B 下重新平衡 3 分鐘。
使用以下參數將聚醣電噴霧至 Agilent 6520 Q-TOF 質譜儀中：1.9 kV 噴霧電壓；325°C 氣體溫度；5 l/min 乾燥氣體流量；160 V 碎裂電壓；65 V 撇渣器電壓；750 V oct 1 RF Vpp 電壓；400 至 3,000 m/z 掃描範圍；正極性；使用展動態範圍 (2 GHz) 儀器模式的 MS1 質心資料採集；3 光譜/秒；333.3 ms/光譜； 3243 瞬變/光譜；及設置為 0 的 CE。
在 Agilent MassHunter 定性分析軟體中針對多醣文庫搜索採集的資料。該軟體算法利用精確質量與 10 ppm 的質量容差及預期的聚醣鑑定滯留時間的結合。計算提取的 N-聚醣的 AUC，並確定了與每次運行的總聚醣面積相比的相對百分比。 實例 2 測試脂酶與去醣基化抗體的複合物形成
每種抗體的製備如下-用糖緩衝劑 2 (自 10 倍稀釋) 及 20 mM 乙酸銨將 20-150 µg 抗體稀釋至 1 µg/mL。將不含甘油的 PNGas F (New England Biolabs) 添加至抗體中，PNGase F:抗體的比例為 1:5。對照樣品製備如下-用糖緩衝劑 2 (自 10 倍稀釋) 及 20 mM 乙酸銨將 20-150 µg 抗體稀釋至 1 µg/mL。不添加 PNGase F。
每個抗體及對照樣品在 37°C 下培育 16 小時。
若將 50 mM 乙酸銨添加至 100 kDa 分子量截留離心過濾器 (Amicon Ultra) 中，則為 500 µL。將離心過濾器在 25°C 下以 14,000 xg 離心 10 分鐘。排出流體。
每個抗體及對照樣品均被添加至其自己的離心過濾器中。每個離心過濾器最多可添加 500 µL 抗體或對照。將離心過濾器在 25°C 下以 14,000 xg 離心 10 分鐘。排出流體。此等離心步驟再進行三次以濃縮抗體及對照樣品。
收集每種濃縮的抗體及對照。每個離心過濾器均倒置在一個新的小瓶中。每個離心過濾器在 25°C 下以 1,000 xg 離心 2 分鐘。排出流體。丟棄過濾器，並將小瓶封閉並用封口膜密封。
每個抗體及對照樣品中的抗體濃度使用 Bradford 檢定來確定。
對於藉由靜態噴霧天然 MS 進行的測量，抗體-複合物以 1:10 的抗體：複合物莫耳比製備。對於藉由 LC-MS 進行的測量，抗體-複合物以 1:2 的抗體:複合物莫耳比製備。對於藉由離子遷移率進行的測量，抗體-複合物以 1:1 的抗體:複合物莫耳比製備。比較脂酶及對照抗體形成的複合物的量，以及脂酶及去醣基化抗體形成的複合物的量。 實例中引用之參考文獻1.   M. Vanderlaan et al., Experience with host cell protein impurities in biopharmaceuticals. Biotechnology Progress 34, 828-837 (2018). 2.   M. Jones et al., “High-risk” host cell proteins (HCPs): A multi-company collaborative view. Biotechnol. Bioeng. 118, 2870-2885 (2021). 3.   S. K. Fischer et al., Specific Immune Response to Phospholipase B-Like 2 Protein, a Host Cell Impurity in Lebrikizumab Clinical Material. The AAPS Journal 19, 254-263 (2017). 4.   N. A. Hanania et al., Lebrikizumab in moderate-to-severe asthma: pooled data from two randomised placebo-controlled studies. Thorax 70, 748-756 (2015). 5.   S. X. Gao et al., Fragmentation of a highly purified monoclonal antibody attributed to residual CHO cell protease activity. Biotechnol. Bioeng. 108, 977-982 (2011). 6.   N. Dixit, N. Salamat-Miller, P. 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圖 1A-1I顯示以下之質量控制質譜：圖 1A，LPLA2-01 (LPLA 批次 1)，圖 1B，LPLA2-02 (LPLA2 批次 2)，圖 1C，LPLA2-03，圖 1D，PLBL2-01，圖 1E，PLBL2-02，以及來自以下之 1-3 個生產批次的解卷積質量的疊加：圖 1F，LPLA2 及圖 1G，PLBL2。圖 1H 顯示 LPLA2-01 (LPLA2 參考) 及 LPLA2-02 (LPLA2 批次 2) 樣品中 LPLA2 的去醣基化質量。其顯示 RPLC-MS 實驗的原始資料。圖 1I 顯示 PLBL2-01 (「參考」；如上圖所示) 及 PLBL2-02 (「批次 2」及下圖) 樣品的去醣基化質量。 圖 2A-2C顯示以下之質量控制質譜：圖 2A，抗體 mAb1 (IgG4 同型抗體)，圖 2B，mAb2，及圖 2C，mAb3。 圖 3A-3C顯示 10:1 脂酶與 mAb1 結合至 LPLA2-01 (圖 3A)、PLBL2-01 (圖 3B) 及 PLBL2-02 (圖 3C) 的天然質譜法。HCD 細胞中的壓力較高以穩定 LPLA2 複合物，導致光譜中抗體二聚體偽影增加。 圖 4A 及 4B顯示在 (圖 4A) 10:1 莫耳比與 (圖 4B) 1:10 莫耳比下 LPLA2-01-mAb1 複合物形成。無論溶液比例如何，抗體峰仍然是最強的種類。然而，圖 4B 中 1:10 莫耳比的降低濃度阻止 Ab 及 Ab 二聚體的顯著重疊分佈。 圖 5A-5C顯示 mAb2 (IgG1 同型抗體；圖 5A)、mAb3 (IgG1 同型抗體，圖 5B；) 及 mAb1 (IgG4-B 同型抗體；圖 5C) 與 PLBL2-01 複合導致在約 52 1/K 處檢測到不同數量的 1:1 複合物的離子遷移率譜。 圖 6顯示去唾液酸化的 LPLA2 以如藉由天然 MS 檢測到的相似親和力與 mAb1 (IgG4 同型) 結合。 圖 7顯示去唾液酸化 LPLA2 或糖型分析的註釋。 圖 8A-8C顯示以其活性 T0 形式及非活性 T6mo 形式表示的每種脂酶中唾液酸化、甘露醣基化及岩藻醣基化 N-聚醣種類 (圖 8A 中的 LPLA2-02、圖 8B 中的 PLBL2-02 及圖 8C 中的 PLBL2-03) 的相對豐度。 圖 9A-B顯示 LPLA2-02、PLBL2-02 及 PLBL2-03 之間的甘露醣基化 (圖 9A) 或岩藻醣基化 (圖 9B) 聚醣的比較。 圖 10A-C顯示: 圖 10A，具有及不具有 mAb1 (IgG4 同型) 的 LPLA2 肽的氧化程度的變化，圖 10B，具有及不具有 mAb2 (IgG1 同型) 的 LPLA2 肽的氧化程度的變化，以及圖 10C，映射至 LPLA2 的結構的 mAb1 及 mAb2 的結合表位。 圖 11A-C顯示: 圖 11A，具有及不具有 mAb1 (IgG4 同型) 的 PLBL2 肽的氧化程度的變化，圖 11B，具有及不具有 mAb2 (IgG1 同型) 的 PLBL2 肽的氧化程度的變化，以及圖 11C，映射至 PLBL2 的結構的 mAb1 及 mAb2 的結合表位。 圖 12A-B顯示具有及不具有 LPLA2 (圖 12A) 或 PLBL2 (圖 12B) 的 mAb1 中肽的氧化程度的變化。 圖 13A-B顯示具有及不具有 LPLA2 (圖 13A) 或 PLBL2 (圖 13B) 的 mAb2 中肽的氧化程度的變化。 圖 14A-B顯示 PLBL2 (圖 14A) 及 LPLA2-03 (圖 14B) 與分別在位置 174、175、179、192、198 及 200 處以丙胺酸取代的 mAb1 突變體結合的低分辨能力 (4375 RP @ 200 m/z) 。所有強度均相對於游離抗體的最大電荷狀態的基峰。在約 7095 m/z 處之 mAb1 的 +21 峰及 7450 m/z 處的 +20 峰與複合物分佈重疊，但可根據精確質量及峰***的差異進行區分，其中脂酶糖型產生極寬的光譜峰。使用 20 m/z 窗口分離突變體 L198A-LPLA2-03 複合物的 +29 電荷狀態，SIM 可以觀察到 +29 峰，但複合物分佈在全光譜中不高於雜訊。 圖 15A-B使用四參數邏輯生長曲線顯示 (圖 15A) LPLA2-03-mAb1 突變體複合物或 (圖 15B) PLBL2-03-mAb1 突變體複合物的結合解離曲線，藉由 Tukey 方法檢測的異常值自計算 (以紅色突出顯示) 中去除。mAb1 突變體分別為 F174A、P175A、Q179A、V192A、L198A、K200A。亦評估未突變的 mAb1 (WT)。 圖 16A-16B顯示自天然 MS 結合解離曲線中提取的 VC50 值。信賴區間顯示在誤差條中，在 95% 或 90% 信賴量下與 WO 的顯著差異分別顯示為 * 或 +。圖 16A：PLBL2 複合物；圖 16B：LPLA2 複合物 圖 17A-17G顯示突變體 mAb1 種類 (圖17A-F) 或野生型 (WT) mAb1 (圖 17G) 針對 LPLA2-03 的離子遷移率分析。mAb1 突變體分別為 F174A (圖 17A)、P175A (圖 17B)、Q179A (圖 17C)、V192A (圖 17D)、L198A (圖 17E)、K200A (圖 17F)。擬合曲線標記有峰分配，其中 LPLA2 是剩餘的游離脂酶，Ab 是剩餘的游離 Ab，2xAb 是氣相二聚體偽影，2xLPLA2 是氣相二聚體偽影，並且複合物是感興趣的峰。擬合總和是自 Gaussian-A 圖的疊加創建的曲線，並且繪製的粗線顯示東逆遷移率的平均值 +/- 標準偏差。如實例中所描述，在 MagicPlot Pro® 中進行擬合。 圖 18A-B顯示 (圖 18A) 在 100:1 相對莫耳濃度的溶液中形成的 1:1 PPT:mAb1 化學計量複合物及 (圖18B) 在 10:1 相對莫耳濃度的溶液中形成的 2:1 PLD3:mAb1 複合物。PLD3 在溶液中以二聚體的形式自然存在。6439 m/z (+23) 處的 mAb 峰在每個光譜中設置為 100% 相對豐度以進行規模化。抗體濃度為 0.27 µM。 圖 19A-B顯示 (圖 19A) 每種脂酶中唾液酸化、甘露醣基化及岩藻醣基化 N-聚醣種類的相對豐度，以及 (圖 19B) 脂酶之間甘露糖種類的分解。對於同時含有岩藻糖及唾液酸種類的聚醣，其在圖 19A 中的豐度被視為對岩藻醣基化及唾液酸化基團均有貢獻。 圖 20顯示用於檢測天然狀態蛋白質及複合物的非 MS 大氣離子遷移率技術的示意圖。樣品以 300 nL/min 的速度流過電噴霧發射器，產生帶電液滴，該等液滴通過電荷減少場。液滴以單電荷出現並蒸發產生單電荷離子。在給定的電壓下，不同碰撞橫截面積的蛋白質圍繞中心棒採取不同的軌跡，其中只有具有一定逆遷移率的離子才會撞擊在環上並被檢測到。電壓掃描能夠在單次兩分鐘的運行中鑑定樣品組分的相對比例。
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Claims (70)

  1. 一種重組抗體，其係由經工程化以表現該抗體之宿主細胞所生產，其中該抗體在該抗體之重鏈 CH1 區、CH2 區或 CH3 區中具有至少一個胺基酸殘基之修飾 (取代、缺失或添加)，其中該修飾導致該抗體與由該宿主細胞所表現的一種或多種內源性脂酶之改變的相互作用。
  2. 如請求項 1 之抗體，其中該改變的相互作用係由於該抗體之改變的醣基化圖譜 (glycosylation profile)。
  3. 如請求項 1 或 2 之抗體，其中該修飾導致與由該宿主細胞所表現的一種或多種內源性脂酶之降低的相互作用程度，該等內源性脂酶為諸如溶體磷脂酶 A2 (LPLA2)、磷脂酶 B 樣蛋白 (PLBL2)、硫酯酶 (thioesterase)、棕櫚醯基蛋白硫酯酶 (palmitoyl protein thioesterase，PPT)、磷脂酶 D3 (PLD3) 或神經鞘磷脂磷酸二酯酶 (sphingomyelin phosphodiesterase，SP)。
  4. 如請求項 3 之抗體，其中該修飾導致與 LPLA2 及/或 PLBL2 之降低的相互作用程度。
  5. 如請求項 1 至 4 中任一項之抗體，其中該修飾導致該抗體對由該宿主細胞所表現的該一種或多種內源性脂酶之結合親和力降低至少 5 倍、10 倍、20 倍、30 倍、50 倍或 100 倍 (即，K D增加)，視情況其中結合親和力係藉由表面電漿子共振 (SPR)、微尺度熱泳動 (microscale thermophoresis，MST) 及/或 ELISA 來確定；或其中該修飾導致該抗體對該一種或多種內源性脂酶之該相互作用程度降低至少 5 倍、10 倍、20 倍、30 倍、50 倍或 100 倍，視情況依藉由 ESI-MS (例如，藉由 VC50) 或藉由由 SEC-MS 或大氣離子遷移率 (例如，IM-MS) 所檢測的抗體-脂酶複合物的量所確定。
  6. 如請求項 1 至 5 中任一項之抗體，其中該抗體包含人類 IgG 恆定區。
  7. 如請求項 1 或請求項 3 至 6 中任一項之抗體，其中該抗體包含人類 IgG4 恆定區，且其中該修飾為來自 P149 至 S197 (Kabat 編號) 的至少一個胺基酸之取代。
  8. 如請求項 1 或請求項 3 至 6 中任一項之抗體，其中該抗體包含人類 IgG1 恆定區，且其中該修飾為選自 V152 至 P214 (Kabat 編號) 的胺基酸之取代。
  9. 如請求項 1 或請求項 3 至 6 中任一項之抗體，其中該修飾包含選自由以下所組成之群組的至少一個胺基酸之取代：G170、V171、T173、F174、P175、V177、L178、Q179、S180、S181、G182、L186、F154、P155、V189、V190、T191、V192、P193、S194、S195、S196、L198、K200、P157、V158 及 TI59 (Kabat 編號)。
  10. 如請求項 1 或請求項 3 至 6 中任一項之抗體，其中該修飾包含選自由以下所組成之群組的胺基酸之取代：F174、P175、Q179、V192、L198 及 K200 (Kabat 編號)。
  11. 如請求項 9 之抗體，其中該取代係選自由以下所組成之群組：G170A、V171A、T173A、F174A、P175A、V177A、L178A、Q179A、S180A、S181A、G182A、L186A、F154A、P155A、V189A、V190A、T191A、V192A、P193A、S194A、S195A、S196A、L198A、K200A、P157A、V158A 及 TI59A (Kabat 編號)。
  12. 如請求項 11 之抗體，其中該取代係選自由以下所組成之群組：F174A、P175A、Q179A、V192A、L198A 及 K200A。
  13. 如請求項 7 至 12 中任一項之抗體，其中至少一個取代是以選自由以下所組成之群組的胺基酸所取代：丙胺酸 (A)、白胺酸 (L) 及異白胺酸 (I)。
  14. 如請求項 13 之抗體，其中該至少一個取代是以丙胺酸 (A) 取代。
  15. 如請求項 7 至 9 中任一項之抗體，其中該至少一個取代是以選自由以下所組成之群組的胺基酸所取代：***酸 (F)、色胺酸 (W) 及酪胺酸 (Y)。
  16. 如請求項 15 之抗體，其中該至少一個取代以色胺酸 (W) 取代。
  17. 如請求項 15 之抗體，其中該至少一個取代以酪胺酸 (Y) 取代。
  18. 如請求項 7 至 9 中任一項之抗體，其中該至少一個取代是以選自由以下所組成之群組的胺基酸所取代：天冬胺酸 (D) 及麩胺酸 (E)。
  19. 如請求項 7 至 9 中任一項之抗體，其中該至少一個取代是以選自由以下所組成之群組的胺基酸所取代：精胺酸 (R) 及離胺酸 (K)。
  20. 如請求項 1 至 19 中任一項之抗體，其中該抗體包含在該 CH1 區中的一個胺基酸中之修飾。
  21. 如請求項 1 至 19 中任一項之抗體，其中該抗體包含在該 CH1 區中的兩個胺基酸中之修飾。
  22. 如請求項 1 至 19 中任一項之抗體，其中該抗體包含在該 CH1 區中的三個胺基酸中之修飾。
  23. 如請求項 1 至 19 中任一項之抗體，其中該抗體包含在該 CH1 區中的四個或更多個胺基酸中之修飾。
  24. 如請求項 1 至 23 中任一項之抗體，其中該抗體包含在重鏈恆定區中的至少一個其他修飾，諸如在 Fc 區中的修飾、在 N297 處的突變、IgG1 Fc 之 LALAPG 修飾、及在殘基 265、269、270、297、327、333、334 及 335 (EU 編號) 中之一者或多者處的取代。
  25. 一種醫藥組成物，其包含如請求項 1 至 24 中任一項之抗體。
  26. 一種分離的核酸，其編碼如請求項 1 至 24 中任一項之抗體。
  27. 一種表現載體，其包含如請求項 26 之分離的核酸。
  28. 一種分離的宿主細胞，其含有、經轉形有或經轉導有如請求項 26 之分離的核酸或如請求項 27 之表現載體。
  29. 一種治療有需要之人類個體的方法，其包含向該個體投予醫藥上有效劑量之如請求項 25 之醫藥組成物。
  30. 一種生產如請求項 1 至 24 中任一項之抗體的方法，其包含在生產該抗體的條件下培養宿主細胞，該宿主細胞含有、經轉形有或經轉導有表現該抗體之分離的核酸。
  31. 一種降低重組抗體與表現於用於表現該抗體之宿主細胞中的一種或多種內源性脂酶之間的相互作用之方法，其包含工程化在該抗體之重鏈 CH1 區、CH2 區或 CH3 區中的至少一個胺基酸殘基之修飾 (取代、缺失或添加)。
  32. 如請求項 31 之方法，其中該方法進一步包含檢測該抗體與該一種或多種內源性脂酶之間的相互作用或確定該一種或多種內源性脂酶對該抗體之結合親和力。
  33. 如請求項 32 之方法，其中脂酶與抗體之相互作用係在使用純化的脂酶及抗體之測定中檢測。
  34. 如請求項 32 之方法，其中脂酶與抗體之該相互作用係由例如藉由 SPR、羥基自由基足跡、天然質譜法 (例如，ESI-MS 或 SEC-MS)，及/或離子遷移率分析該宿主細胞中所生產的抗體來檢測。
  35. 如請求項 32 或 33 或 34 之方法，其中該方法進一步包含例如藉由表面電漿子共振 (SPR)、微尺度熱泳動 (MST) 及/或 ELISA 來確定脂酶與抗體之結合親和力。
  36. 如請求項 31 至 35 中任一項之方法，其中該修飾導致與該宿主細胞之該一種或多種內源性脂酶的降低的相互作用程度，該等內源性脂酶為諸如溶體磷脂酶 A2 (LPLA2)、磷脂酶 B 樣蛋白 (PLBL2)、硫酯酶、棕櫚醯基蛋白硫酯酶 (PPT)、磷脂酶 D3 (PLD3) 或神經鞘磷脂磷酸二酯酶 (SP)。
  37. 如請求項 36 之方法，其中該修飾導致與 LPLA2 及/或 PLBL2 之降低的相互作用程度。
  38. 如請求項 31 至 37 中任一項之方法，其中該修飾導致該抗體對由該宿主細胞所表現的該一種或多種內源性脂酶之結合親和力降低至少 5 倍、10 倍、20 倍、30 倍、50 倍或 100 倍 (即，K D增加)，視情況其中結合親和力係藉由表面電漿子共振 (SPR)、微尺度熱泳動 (MST) 及/或 ELISA 來確定；或其中該修飾導致該抗體對該一種或多種內源性脂酶之該相互作用程度降低至少 5 倍、10 倍、20 倍、30 倍、50 倍或 100 倍，例如依藉由由質譜法所測量的結合解離 (例如，藉由 VC50) 或藉由由 SEC-MS 或大氣離子遷移率 (例如，IM-MS) 所檢測的抗體-脂酶複合物的量所確定。
  39. 如請求項 31 至 38 中任一項之方法，其中該抗體包含人類 IgG 恆定區。
  40. 如請求項 31 至 38 中任一項之方法，其中該抗體包含人類 IgG4 恆定區，且其中該修飾為來自 P149 至 S197 (Kabat 編號) 的至少一個胺基酸之取代。
  41. 如請求項 31 至 38 中任一項之方法，其中該抗體包含人類 IgG1 恆定區，且其中該修飾為選自 V152 至 P214 (Kabat 編號) 的胺基酸之取代。
  42. 如請求項 31 至 38 中任一項之方法，其中該修飾包含選自由以下所組成之群組的至少一個胺基酸之取代：G170、V171、T173、F174、P175、V177、L178、Q179、S180、S181、G182、L186、F154、P155、V189、V190、T191、V192、P193、S194、S195、S196、L198、K200、P157、V158 及 TI59 (Kabat 編號)。
  43. 如請求項 42 之方法，其中該修飾包含選自由以下所組成之群組的胺基酸之取代：F174、P175、Q179、V192、L198 及 K200 (Kabat 編號)。
  44. 如請求項 42 之方法，其中該取代係選自由以下所組成之群組：G170A、V171A、T173A、F174A、P175A、V177A、L178A、Q179A、S180A、S181A、G182A、L186A、F154A、P155A、V189A、V190A、T191A、V192A、P193A、S194A、S195A、S196A、L198A、K200A、P157A、V158A 及 TI59A (Kabat 編號)。
  45. 如請求項 44 之方法，其中該取代係選自由以下所組成之群組：F174A、P175A、Q179A、V192A、L198A 及 K200A。
  46. 如請求項 40 至 43 中任一項之方法，其中該至少一個取代是以選自由以下所組成之群組的胺基酸所取代：丙胺酸 (A)、白胺酸 (L) 及異白胺酸 (I)。
  47. 如請求項 46 之方法，其中該至少一個取代是以丙胺酸 (A) 取代。
  48. 如請求項 40 至 43 中任一項之方法，其中該至少一個取代是以選自由以下所組成之群組的胺基酸所取代：***酸 (F)、色胺酸 (W) 及酪胺酸 (Y)。
  49. 如請求項 48 之方法，其中該至少一個取代是以色胺酸 (W) 取代。
  50. 如請求項 48 之方法，其中該至少一個取代是以酪胺酸 (Y) 取代。
  51. 如請求項 40 至 43 中任一項之方法，其中該至少一個取代是以選自由以下所組成之群組的胺基酸所取代：天冬胺酸 (D) 及麩胺酸 (E)。
  52. 如請求項 40 至 43 中任一項之方法，其中該至少一個取代是以選自由以下所組成之群組的胺基酸所取代：精胺酸 (R) 及離胺酸 (K)。
  53. 如請求項 31 至 52 中任一項之方法，其中該抗體包含在該 CH1 區中的一個胺基酸中之修飾。
  54. 如請求項 31 至 52 中任一項之方法，其中該抗體包含在該 CH1 區中的兩個胺基酸中之修飾。
  55. 如請求項 31 至 52 中任一項之方法，其中該抗體包含在該 CH1 區中的三個胺基酸中之修飾。
  56. 如請求項 31 至 52 中任一項之方法，其中該抗體包含在該 CH1 區中的四個或更多個胺基酸中之修飾。
  57. 如請求項 31 至 56 中任一項之方法，其中該抗體包含在重鏈恆定區中的至少一個其他修飾，諸如在 Fc 區中的修飾、在 N297 處的突變、IgG1 Fc 之 LALAPG 修飾、及在殘基 265、269、270、297、327、333、334 及 335 (EU 編號) 中之一者或多者處的取代。
  58. 如請求項 1 至 24 中任一項之抗體或如請求項 31 至 57 中任一項之方法，其中抗體重鏈不包含在選自殘基 203 至 256 (Kabat 編號) 的胺基酸中之修飾，不包含在選自殘基 203 至 243 (Kabat 編號) 的胺基酸中之修飾，或不包含選自殘基 197 及 198 及 203 至 243 及 246 至 251 (Kabat 編號) 的胺基酸之修飾。
  59. 如請求項 58 之抗體或方法，其中該抗體為人類 IgG4 抗體，且不包含在選自 S197、L198、K203、T207、D211、R222、E226、S227、L229、G230、P237、P238、E246、F247、G249、G250 或 P251 中之任一者或多者的胺基酸中之修飾。
  60. 如請求項 1 至 59 中任一項之抗體或方法，其中該宿主細胞為中國倉鼠卵巢 (CHO) 細胞。
  61. 如請求項 1 至 60 中任一項之抗體或方法，其中該宿主細胞經修飾以：突變、下調或剔除 α-Man-1 或 α-Man-2 中之一者或兩者；抑制 Asn 連接的 Man 9GlcNac 2聚醣前驅物之處理及/或相對於 Man3-5 增加高分子量甘露糖種類，諸如 Man6 或更高、Man7 或更高、或 Man7-9；及/或增加一種或多種增加聚醣之鏈長的酵素之表現，諸如 GNT-1、GNT-2、GNT-3、GNT-4abc、GNT-5 或 GalT。
  62. 一種生產重組蛋白質或抗體之方法，其包含： a. 於宿主細胞中表現該蛋白質或抗體，該宿主細胞經修飾以：突變、下調或剔除 α-Man-1 或 α-Man-2 中之一者或兩者；抑制 Asn 連接的 Man 9GlcNac 2聚醣前驅物之處理及/或相對於 Man3-5 增加高分子量甘露糖種類，諸如 Man6 或更高、Man7 或更高、或 Man7-9；及/或增加一種或多種增加聚醣之鏈長的酵素之表現，諸如 GNT-1、GNT-2、GNT-3、GNT-4abc、GNT-5 或 GalT；以及 b. 確定該蛋白質或抗體相較於自未經修飾的宿主細胞所表現的蛋白質或抗體，是否具有與由該宿主細胞所表現的一種或多種內源性脂酶之降低的相互作用。
  63. 一種生產重組蛋白質或抗體之方法，其包含： a. 在相對於整體甘露糖化種類，顯著增加高分子量甘露糖種類，諸如 Man6 或更高、Man7 或更高、或 Man7-9 之濃度的條件下，於宿主細胞中表現該蛋白質或抗體，以及 b. 確定該蛋白質或抗體相較於自未經修飾的宿主細胞所表現的蛋白質或抗體，是否具有與由該宿主細胞所表現的一種或多種內源性脂酶之降低的相互作用。
  64. 如請求項 63 之方法，其中該等條件包含增加培養基之滲透壓例如至少 100 或至少 200 mOsm/kg，添加氯化錳或氯化銨至該培養基，增加或添加棉子糖、莫能菌素 (monensin)、甘露糖、半乳糖、果糖及/或麥芽糖，或添加高甘露糖促進抑制劑諸如基夫鹼 (Kifunensine) 至該培養基。
  65. 一種生產重組蛋白質或抗體之方法，其包含： a. 於宿主細胞中表現該蛋白質或抗體，該宿主細胞經修飾以消除至少一種內源性脂酶上的至少一個醣基化位點；以及 b. 確定該蛋白質或抗體相較於自未經修飾的宿主細胞所表現的蛋白質或抗體，是否具有與由該宿主細胞所表現的一種或多種內源性脂酶之降低的相互作用。
  66. 如請求項 65 之方法，其中該宿主細胞經修飾以消除 LPLA2 及/或 PLBL2 上的至少一個醣基化位點。
  67. 如請求項 65 或 66 之方法，其中該修飾包含在該宿主細胞之至少一種脂酶酵素中的至少一個 N-X-S/T 位點內之至少一個胺基酸取代。
  68. 如請求項 62 至 67 中任一項之方法，其中該宿主細胞為 CHO 細胞。
  69. 如請求項 67 之方法，其中該宿主細胞為 CHO 細胞，且其中該修飾包含： a. 在 LPLA2 (SEQ ID NO: 2) 中的位置 39 至 41、99 至 101、273 至 275 及 289 至 291 中之一者或多者處的一個或多個胺基酸取代， b. 在 LPLA2 (SEQ ID NO: 2) 中的位置 125 至 131、133 至 145、146 至 177、229 至 247 及 248 至 260 中之一者或多者處的一個或多個胺基酸取代， c. 在 LPLA2 (SEQ ID NO: 2) 中的位置 146 至 177 中之一者或多者處的一個或多個胺基酸取代， d. 在 PLBL2 (SEQ ID NO: 3) 中的位置 47、65、69、190、395 及 474 中之一者或多者處的一個或多個胺基酸取代， e. 在 PLBL2 (SEQ ID NO: 3) 中的位置 67 至 78、79 至 98、173 至 187、359 至 371、372 至 388、389 至 400、401 至 407、424 至 459、211 至 236、241 至 253、287 至 333、340 至 352、513 至 530、539 至 546、573 至 599、56 至 64、485 至 512 及 548 至 572 中之一者或多者處的一個或多個胺基酸取代， f. 在 PLBL2 (SEQ ID NO: 3) 中的位置 79 至 98、424 至 459、573 至 599、372 至 388 及 548 至 572 中之一者或多者處的一個或多個胺基酸取代， g. 在硫酯酶 (SEQ ID NO: 1) 中的位置 298 至 300 及 422 至 424 中之一者或多者處的一個或多個胺基酸取代， h. 在 PPT (SEQ ID NO: 4) 中的位置 197 至 199、212 至 214 及 232 至 234 中之一者或多者處的一個或多個胺基酸取代， i. 在 PLD3 (SEQ ID NO: 5) 中的位置 97 至 99、102 至 104、132 至 134、234 至 236、282 至 284、385 至 387 及 430 至 432 中之一者或多者處的一個或多個胺基酸取代，及/或 j. 在 SP (SEQ ID NO: 6) 中的位置 84 至 86、173 至 175、333 至 335、393 至 395、518 至 520 及 611 至 613 中之一者或多者處的一個或多個胺基酸取代。
  70. 如請求項 62 至 69 中任一項之方法，其中確定該蛋白質或抗體相較於自未經修飾的宿主細胞所表現的蛋白質或抗體，是否具有與一種或多種內源性脂酶之降低的相互作用係藉由自該宿主細胞所表現的該蛋白質或抗體之 SPR、羥基自由基足跡、天然質譜法 (例如，ESI-MS 或 SEC-MS) 及/或離子遷移率分析 (例如，IM-MS)。
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