KR100743287B1 - 피롤기로 치환된 2-인돌리논 단백질 인산화 효소 억제제 - Google Patents

피롤기로 치환된 2-인돌리논 단백질 인산화 효소 억제제 Download PDF

Info

Publication number
KR100743287B1
KR100743287B1 KR1020007013863A KR20007013863A KR100743287B1 KR 100743287 B1 KR100743287 B1 KR 100743287B1 KR 1020007013863 A KR1020007013863 A KR 1020007013863A KR 20007013863 A KR20007013863 A KR 20007013863A KR 100743287 B1 KR100743287 B1 KR 100743287B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
group
dimethyl
pyrrol
unsubstituted
cancer
Prior art date
Application number
KR1020007013863A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20010083039A (ko
Inventor
펭조 탕
리 선
제랄드 맥마혼
Original Assignee
수젠, 인크.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 수젠, 인크. filed Critical 수젠, 인크.
Publication of KR20010083039A publication Critical patent/KR20010083039A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR100743287B1 publication Critical patent/KR100743287B1/ko

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D403/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00
    • C07D403/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00 containing two hetero rings
    • C07D403/06—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00 containing two hetero rings linked by a carbon chain containing only aliphatic carbon atoms
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D209/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings, condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom
    • C07D209/02—Heterocyclic compounds containing five-membered rings, condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom condensed with one carbocyclic ring
    • C07D209/04—Indoles; Hydrogenated indoles
    • C07D209/30—Indoles; Hydrogenated indoles with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, directly attached to carbon atoms of the hetero ring
    • C07D209/32—Oxygen atoms
    • C07D209/34—Oxygen atoms in position 2

Abstract

본 발명은 피롤기로 치환된 2-인돌리논 신규 화합물과 생리학적으로 허용되는 염 그리고 종양과 같은 단백질 인산화 효소에 관련된 세포 질환의 예방과 치료에 효과를 갖는 것으로 기대되는 단백질 인산화 효소의 활성도를 조절하는 전구약물에 관한 것이다.
2-인돌리논, 피롤, 인산화 효소, 전구약물

Description

피롤기로 치환된 2-인돌리논 단백질 인산화 효소 억제제{Pyrrole Substituted 2-Indolinone Protein kinase Inhibitors}
이건 출원은 본 명세서에 그 내용 전부를 참고문헌으로 인용하고 있는 1998년 5월 29일자의 미합중국 예비특허출원 제60/087,310호와 1999년 1월 15일자의 미합중국 예비특허출원 제60/116,106호에 관련되며 이들에 기초한 우선권을 주장하는 출원이다.
본 발명은 일반적으로는 유기화학, 생화학, 약학 및 의약에 관한것이다. 보다 구체적으로는, 피롤기로 치환된 신규한 2-인돌리논 화합물및 이들의 생리학적으로 허용되는 염과, 단백질 인산화 효소의 활성을 조절함으로써 단백질 인산화 효소의 비정상적 활성에 관련된 질병에 대하여 유익한 효과를 가질것으로 기대되는 전구약물(prodrug)에 관한 것이다.
이하의 내용은 본 발명의 선행기술은 아니며 단순한 배경 기술로서 제공되는 것이다.
단백질 인산화 효소(PTK)는 단백질의 티로신, 세린 및 트레오닌 잔기에 있는 히드록시기를 인산화시키는 반응의 촉매 작용을 하는 효소이다. 이러한 겉보기에는 간단한 작용에 따른 효과는 매우 대단하며, 세포의 성장, 분화, 증식, 즉 사실 상 세포의 일생의 모든 면이 하나의 경로 또는 또 다른 경로를 통하여 단백질 인산화 효소의 작용에 의해 좌우된다. 나아가, 단백질 인산화 효소의 비정상적인 작용은 마른버짐과 같이 비교적 치명적이지 않은 질병으로 부터 교모세포종(뇌종양)과 같은 치명적인 질병에 이르는 다수의 질병들에 관여한다.
단백질 인산화 효소는 단백질 티로신 인산화 효소(PTKs)와 세린-트레오닌 인산화 효소의 두가지 종류로 구분된다.
단백질 티로신 인산화 효소의 주요 작용의 하나는 성장인자 수용체에 관여하는 것이다. 성장인자 수용체는 세포 표면 단백질이다. 성장인자 수용체는 성장인자 리간드에 결합되는 경우, 세포막의 내면 단백질과 상호 작용을 하는 활성 상태로 전환된다. 이는 수용체와 기타 다른 단백질의 티로신 잔기를 인산화 시키며, 세포 분열(증식), 세포 분화, 세포 성장 또는 세포외 미세환경에 대한 대사 효과의 발현등과 같은 수많은 세포 반응을 순차적으로 일으키는 다양한 세포질 신호 전달 물질들과의 세포내 복합체의 형성을 유도한다. 이에 대한 보다 상세한 사항은, 본 명세서에 기재된 바와 같이 도면을 포함한 내용 전부가 참고자료로 인용되고 있는 뉴런(Neuron)지 1992년판 제9호의 303 내지 391페이지에 실린 슈레싱거 (Schlessinger)와 율리리히(Ullirich)의 논문의 내용에 설명되어 있다.
단백질 티로신 인산화 효소 작용을 보여주는 성장인자 수용체들은 수용체 티로신 인산화 효소라고 알려져 있다. 이들은 광범위한 생물 활성을 갖는 거대한 군의 막투과성 수용체들을 포함한다. 현재까지는 겨우 19가지의 수용체 티로신 인산화 효소 특이 아군들이 규명되어 있다. 이들의 예를 들면, "HER" 수용체 티로신 인산화 효소라고 구분된 아군이 있으며 이는 상피 성장인자 수용체(EGFR), HER2, HER3와 HER4를 포함한다. 이러한 수용체 티로신 인산화 효소는 세포외 당부가 리간드 결합 부위와 막 투과 부위 그리고 세포내에서 단백질의 티로신 잔기를 인산화시키는 반응의 세포질 촉매로 작용하는 부위로 이루어진다.
또 다른 수용체 단백질 티로신 인산화효소 아군은 인슐린 수용체 (IR), 인슐린 유사 성장 인자 I 수용체 (IGF-1R)와 인슐린 수용체 관련 수용체 (IRR)로 이루어져 있다. 인슐린 수용체와 인슐린 유사 성장 인자 I 수용체는 인슐린 및 인슐린 유사 성장 인자 I과 인슐린 유사 성장 인자 II와 상호작용하여 하나의 이형 사중합체를 형성한다. 이 사중합체는, 당쇄가 달려 있으면서 완전히 세포외부에 위치하는 α아단위 2 개와, 티로신 인산화 효소 부위가 있으면서 세포막을 관통하는 β아단위 2개로 이루어져 있다.
세 번째의 수용체 단백질 티로신 인산화효소 아군는 혈소판 유래 성장 인자 수용체 ("PDGFR") 군이라고 불린다. 이 군에는 혈소판 유래 성장 인자 수용체 α, 혈소판 유래 성장 인자 수용체 β, CSFIR, c-kit, 그리고 c-fms가 포함된다. 이 수용체들은 모두 다양한 개수의 세포외 부위들과 하나의 세포내 부위로 이루어져 있다. 이 수용체들의 세포외 부위는 당쇄가 부가되어 있으며 면역글로빈과 유사한 다양한 길이의 루프들로 이루어져 있고, 이 수용체들의 세포내 부위는 티로신 인산화 효소 부위가 인산화 효소와 관계가 없는 아미노산 서열들로 중간 중간에 끊어져 있는 구조로 이루어져 있다.
또 다른 아군은 태아 간 인산화 효소 ("flk") 수용체 아군으로, 이 아군은 혈소판 유래 성장 인자 수용체 아군와 유사하여 혈소판 유래 성장 인자 수용체 아군에 포함시키기도 한다. 이 아군은 인산화 효소 삽입 부위-수용체인 태아 간 인산화효소-1 (KDR/FLK-1), flk-1R, flk-4, 그리고 fms-유사 티로신 인산화효소-1 (flt-1)으로 이루어져 있다고 생각되고 있다.
티로신 인산화 효소 성장 인자 수용체 군의 또 다른 구성원으로 섬유아세포 성장 인자 ("FGF") 수용체 아군이 있다. 이 군은 섬유아세포 성장 인자 수용체 1에서 4까지의 네 개의 수용체와 섬유아세포 성장 인자 1에서 7까지의 일곱개의 리간드로 이루어져 있다. 아직 확실하게 밝혀진 것은 아니지만, 이 수용체들은 다양한 개수의 면역글로빈-유사 루프들을 가지면서 당쇄가 부가되어 있는 세포외 부위 한 개와, 티로신 인산화효소 서열이 이 서열과 관계없는 아미노산 서열로 중간 중간에 끊어져 있는 구조의 세포내 부위 한 개로 이루어져 있는 것으로 보인다.
티로신 인산화효소 성장 인자 수용체 종의 또 다른 구성원은 혈관 내피세포 성장 인자 ("VEGF") 수용체 아군이다. 혈관 내피세포 성장 인자는 이량체로 작용하는 당단백질로, 혈소판 유래 성장 인자와 비슷하나 생체내에서 혈소판 유래 성장인자와는 다른 생물학적 기능을 하며 그 표적이 되는 세포에 대한 특이성도 다르다. 특히, 혈관 내피세포 성장 인자는 혈관신생(vasculogenesis)과 혈관형성(angiogenesis)에 중요한 역할을 하는 것으로 현재 생각되고 있다.
현재 알려져 있는 수용체 단백질 티로신 인산화효소 아군들에 대한 좀 더 완전한 목록은 "Plowman et al., DN&P 7(6):334-339 (1994)"에 나와 있다. 이 문헌은 완전한 도면을 포함하여 본 명세서에 전문이 인용되어 있다.
수용체 단백질 티로신 인산화효소 외에도, "비수용체 단백질 티로신 인산화효소", 또는 "세포질 티로신 인산화효소"라 불리는, 완전히 세포내에 존재하는 단백질 티로신 인산화효소들로 이루어진 군도 존재한다. 여기에서는 "CTK"로 약칭되는 "세포질 티로신 인산화효소"라는 용어를 사용하기로 하겠다. 세포질 티로신 인산화효소에는 세포외 부위와 세포막 관통 부위가 없다. 현재까지 11 아군(Src, Frk, Btk, Csk, Abl, Zap70, Fes, Fps, Fak, Jak, 그리고 Ack)에 걸쳐서 24개의 세포질 티로신 인산화 효소가 동정되어 있다. Src 아군은 현재 세포질 티로신 인산화효소중 가장 큰 군을 형성하고 있는 것으로 보이며, 이 아군에는 Src, Yes, Fyn, Lyn, Lck, Blk, Hck, Fgr, 그리고 Yrk가 포함되어 있다. 세포질 티로신 인산화효소에 대한 좀 더 자세한 내용은 "Bolen, Oncogene, 8:2025-2031 (1993)"에 기재되어있다. 이 문헌은 완전한 도면을 포함하여 본 명세서에 전문이 인용되고 있다.
비록 소수의 수용체 인산화효소가 세린/트레오닌 인산화효소의 형을 띠고 있기는 하지만, 세린/트레오닌 인산화효소(STK)들은 세포질 인산화효소들과 마찬가지로 대부분 세포내에 존재한다. 세린/트레오닌 인산화효소들은 시토질 인산화 효소(세포질 소기관이나 세포골격이 아닌 세포질의 액상 부분에서 작용하는 인산화효소)들 중 가장 흔한 형이다. 시토졸은 세포 내에서 일어나는 대사활동과 생합성활동의 중간단계중 많은 부분이 이루어지는 지역이다. 리보좀에 의해 단백질이 합성되는 곳도 시토졸이다.
수용체 단백질 티로신 인산화효소, 세포질 티로신 인산화효소, 그리고 세린/트레오닌 인산화효소는 모두 암을 포함하는 많은 병과 관련되어 있다. 단백질 인산 화효소와 관련되어 있는 다른 병으로는 건선, 간경화, 당뇨, 혈관형성이상, 협착증, 여러가지의 눈병, 류머티스성 관절염과 기타 염증성 질병, 자가면역질환과 같은 면역성 질환, 아테롬성 동맥 경화증과 같은 심장혈관질환, 그리고 다양한 신장질환들이 있으며, 관련 질환의 범위는 여기에 기술된 것으로 한정되는 것은 아니다.
암과 관련된 측면에서 볼 때, 종양의 성장을 일으키는 과도한 세포 증식을 설명하기 위하여 제출된 가설들 중, 두 개의 주요한 가설이 단백질 인산화효소에 의해 조절되는 것으로 알려진 작용과 관련되어 있다. 즉, 악성 세포 성장은 세포분열 및/또는 세포분화를 조절하는 기작의 붕괴로부터 일어난다는 것이다. 몇 가지의 원시 종양 유전자(proto-oncogene)들의 단백질 산물이 세포 성장과 분화를 조절하는 신호 전달 경로에 관련되어 있다는 것이 밝혀졌다. 이들 원시 종양 유전자에는 위에서 논의된 세포외 성장 인자, 세포관통 성장 인자 단백질 티로신 인산화효소 수용체(RTK), 세포질 티로신 인산화효소(CTK), 그리고 세포질 세린/트레오닌 인산화효소(STK)들이 포함되어 있다.
단백질 인산화효소가 관련되어 있는 세포 활동과 넓고 다양한 범위의 인간의 질병과의 명백한 관련을 생각해 볼 때, 단백질 인산화효소의 활성을 조절하는 방법을 알아내기 위하여 엄청난 노력이 시도되고 있다는 것은 전혀 놀랄 일이 아니다. 이 방법들 중 생모방(biomimetic) 방식을 사용한 방법으로는, 실제 세포내 작용들에 관련된 분자들을 주형으로하여 만든 고분자를 사용하는 방법(예를 들어 변종 리간드 (U.S. App. No. 4,966,849)), 수용성 수용체와 항체를 이용하는 방법(App. No. WO 94/10202, Kendall and Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci., 90:10705-09 (1994), Kim, et al., Biochemistry, 33:10450-56), RNA 리간드를 사용하는 방법(Jelinek, et al., Biochemistry, 33:10450-56, Takano, et al., Mol. Bio. Cell 4:358A (1993), Kinsella, et al., Exp. Cell Res. 199:56-62 (1992), Wright, et al., J. Cellular Phys., 152, 448-57), 그리고 티로신 인산화효소 저해제를 사용하는 방법(WO 94/03427, WO 92/21660, WO 91/15495, WO 94/14808, U.S. Pat. No. 5,330,992, Mariani, et al., Proc. Am. Assoc. Cancer Res., 35:2268 (1994))이 있다.
위의 방법들 외에 단백질 인산화효소 저해제로 작용하는 저분자물질을 찾으려는 시도들도 있었다. 예를 들면, 비스-모노시클릭, 바이시클릭, 그리고 헤테로시클릭 아릴 화합물들(PCT WO 92/20642), 비닐렌-아자인돌 유도체들(PCT WO 94/14808), 그리고 1-시클로프로필-4-피리딜퀴놀론들(U.S. Pat. No. 5,330,992)은 티로신 인산화효소의 저해제로 기술되어 있다. 스타이릴 화합물들(U.S. Pat. No. 5,217,999), 스타이릴-치환(substituted) 피리딜 화합물들(U.S. Pat. No. 5,302,606), 퀴나졸린 유도체들(EP App. No. 0 566 266 A1), 셀레나인돌들과 셀레니드들(PCT WO 94/03427), 트라이시클릭 폴리하이드록실릭 화합물들(PCT WO 92/21660), 그리고 벤질포스포닉산 화합물들(PCT WO 91/15495)은 모두 암의 치료에 유용한 단백질 티로신 인산화효소의 저해제로 기술되어 있다.
본 발명에서는 단백질 인산화효소의 활성을 조절하고, 따라서 비정상적인 단 백질 인산화효소의 활성을 치료하고 예방하는 데에 유용할 것으로 예상되는 작은 유기분자들을 찾으려 하였다. 그 결과, 단백질 인산화효소의 활성을 조절하는 성질을 보이며 따라서 비정상적인 단백질 인산화효소 활성과 관련된 질병에 대해 좋은 효과를 보일 것으로 기대되는 일군의 새로운 피롤기로 치환된 2-인돌리논 화합물들을 발견하게 되었다. 이 화합물들이 본 발명의 대상이다.
따라서, 본 발명은 일반적으로 수용체 단백질 티로신 인산화효소(RTK)들, 비수용체 단백질 티로신 인산화효소(CTK)들, 그리고 세린/트레오닌 단백질 인산화효소(STK)들의 활성을 조절하는 새로운 피롤기로 치환된 2-인돌리논들과 관련되어 있다. 덧붙여, 본 발명은 암, 당뇨, 간경화, 아테롬성 동맥경화증과 같은 심혈관질환, 혈관형성이상, 자가면역질환과 같은 면역성 질환, 그리고 신장 질환과 같은 (예를 든 것일 뿐 이 질환만으로 한정하는 것은 아님) 단백질 인산화효소의 이상으로 발생하는 질병의 치료 또는 예방에 있어서 사용되는, 본 발명에서 공개되는 화합물들과 그 화합물들의 생리학적인 염들의 제약조성물들의 조제 및 사용과 관련되어 있다.
"2-인돌리논", 인돌린-2-온, 그리고 "2-옥신돌"이라는 용어들은 모두 다음과 같은 화학구조를 가진 분자를 말한다.
Figure 112000537758212-pct00001
"피롤"은 다음의 화학구조를 가진 분자를 말한다.
Figure 112000537758212-pct00002
"피롤기로 치환된 2-인돌리논"과 "3-피롤리데닐-2-인돌리논"은 모두 식1에 보인 일반적인 구조를 가진 화합물을 말한다.
"의약 조성물"은 여기에 기술된 화합물들의 혼합물을 지칭하거나, 생리학적 담체나 부형제들과 같은 다른 화합물과 여기에 기술된 화합물들로 이루어진 생리학적 염이나 전구의약물을 말한다.
"전구약물"(prodrug)란 생체내에서 원래의 약물으로 변환되는 약제를 말한다. 전구약물은 원래의 약물보다 투여하기가 용이한 경우가 있기때문에 유용하다. 예를 들어 원래의 약물은 경구투여가 불가능하지만 전구약물은 가능한 경우가 있다. 또한 전구약물은 원래의 약물에 비해 제약조성물에 더 잘 녹을 수 있다. 이러한 전구약물의 한 가지 예로, (이 경우로 한정하는 것은 아님) 본 발명에서 공개되는 어떤 화합물은 에스테르 형태("전구약물")로 경구투여되면 낮은 수용성으로 인해 세포막을 쉽게 통과하여 그 뒤 세포내에서 대사활동에 의해 가수분해되어 카르복시산의 형태가 되는데, 이 형태가 활성을 나타내는 물질이며, 이 때 이 형태의 높은 수용성은 활성에 도움이 된다.
전구약물의 또 다른 예로는 (예를 드는 것일 뿐 이 경우로 한정하는 것은 아님) 2개에서 10개의 아미노산으로 이루어진 짧은 폴리펩타이드가 있다. 이 폴리텝타이드는 말단의 아미노기가 본 발명에서 공개되는 어떤 화합물의 카르복실기에 결합되어 있으며, 생체내에서 이 폴리펩타이드는 가수분해 또는 대사되어 활성분자를 방출하게 된다.
"피롤 알데히드"는 다음과 같은 구조의 화합물을 말한다.
Figure 112000537758212-pct00003
"생리학적으로 허용된 담체"란 생체에 현저한 자극을 주지 않으면서 투여된 화합물의 생물학적 활성과 특성을 손상시키지 않는 담체 또는 희석제를 말한다.
"부형제"란 화합물의 투여를 촉진하기 위해 제약조성물에 첨가되는 불활성 물질을 말한다. 부형제들의 예를 들면, (여기에 든 것으로 한정하는 것은 아님) 칼슘 카보네이트, 칼슘 포스페이트, 다양한 당과 형태의 전분, 셀룰로오스 유도체, 젤라틴, 식물성 기름, 그리고 폴리에틸렌 글라이콜이 있다.
1. 화학
A. 일반적인 구조상 특징
본 발명의 한면은, 자체가 적어도 하나의 극성기로 치환된 하나 이상의 탄화수소가 반드시 피롤기에 치환되어 있거나 그렇지 않다면 2-인돌리논 부분과 피롤기 양쪽 모두에 선택적으로 치환된, 피롤기로 치환된 2-인돌리논에 관한 것이다. 특 청구된 화합물의 생리학적으로 허용되는 염과 전구약물 역시 본 발명의 범위에 속 한다.
본 발명에서 "탄화수소 사슬"이라 함은 알킬, 알케닐 또는 알키닐기를 의미한다.
본 발명에서 "극성"기라 함은 기를 형성하기 위해 서로 공유 결합하는 원자들의 핵들이 그들을 결합시키는 공유결합(들)의 전자들을 균등하게 분배하지 아니하는 기를 말한다. 즉, 하나의 원자의 전자 밀집도가 다른 하나의 그것에 비하여 높은 것을 의미한다. 그 결과 공유결합의 한 쪽은 상대적으로 양성을 띄며 다른 한쪽은 상대적으로 음성이 된다. 즉 음극과 양극을 갖게 된다. 극성기의 예를들면 히드록시, 알콕시, 카르복시, 니트로, 시아노, 아미노, 암모늄, 아미도, 우레이도, 술폰아미도, 술피닐, 술포닐, 포스포노, 몰폴리노, 피페라지닐 그리고 테트라졸로를 포함하며 이들로만 제한되는 것은 아니다.
어떠한 특별한 이론에 구애되는 것은 아니지만, 극성기는 예를들면, 이들로 한정되는 것은 아니지만, 수소결합, 반데르발스 힘, 및/또는 이온결합(공유결합이 아닌)을 통하여 단백질 인산화 효소(PTK)의 활성부위에 있는 아미노산과 전자적으로 상호작용을 갖는다고 알려져 있다. 이 상호작용은 본 발명의 분자가 자연에 존재하는 기질이 활성부위에 결합하는 것을 방지하거나 방해하기에 충분한 강도로 활성부위에 결합하는 데에 기여한다. 극성기는 또한 화합물의 선택성에 기여하는데 즉, 어떤 극성기는 다른 극성기보다 단백질 티로신 인산화 효소(PTK)의 결합 부위에 대한 친화도가 더 커서 첫 번째의 특정 극성기를 갖는 화합물이 기타 다른 극성기를 갖는 화합물 보다 더 효과적이게 한다.
따라서, 본 발명의 한면은 하기의 화학 구조식을 갖는 화합물에 관한 것이다.
Figure 112000537758212-pct00004
여기에서, R1 은 수소, 알킬, 알케닐, 알키닐, 시클로알킬, 아릴, 히드록시, 알콕시, C-카르복시, O-카르복시, 아세틸, C-아미노, C-티오아미도, 술포닐 그리고 트리할로메탄술포닐로 이루어진 군에서 선택된다.
R2 은 수소, 할로겐, 알킬, 시클로알킬, 아릴, 헤테로아릴 그리고 헤테로알리시클릭기로 이루어진 군에서 선택된다.
R3 ,R4, R5 그리고 R6은 수소, 알킬, 트리할로알킬, 시클로알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로알리시클릭, 히드록시, 알콕시, 아릴록시, 머캅토, 알킬티오, 아릴티오, 술피닐, 술포닐, S-술폰아미도, N-술폰아미도, 트리할로메탄-술폰아미도, 카르보닐, C-카르복시, 0-카르복시, C-아미도, N-아미도, 시아노, 니트로, 할로겐, O-카르바밀, N-카르바밀, O-티오카르바밀, N-티오카르바밀, 아미노 및 -NR11R12 기로 이루어진 군에서 독립적으로 선택된다.
R11 과 R12는 수소, 알킬, 시클로알킬, 아릴, 카르보닐, 아세틸, 술포닐, 트리플루오로메탄술포닐 및 5-원 또는 6-원의 헤테로알리시클릭 복합 고리로 이루어진 군에서 독립적으로 선택된다.
R3 과 R4, R4 와 R6 또는 R4 와 R5는 결합하여 6-원 아릴고리, 메틸렌디옥시기 또는 에틸렌디옥시기를 형성한다.
R7은 수소, 알킬, 시클로알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로알리시클릭, 히드록시, 알콕시, 아릴록시, 카르보닐, 아세틸, C-아미도, C-티오아미도, 아미디노, C-카르복시, O-카르복시, 술포닐과 트리할로메탄-술포닐기로 이루어진 군에서 선택된다.
R8, R9 그리고 R10은 수소, 알킬, 트리할로알킬, 시클로알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로알리시클릭, 히드록시, 알콕시, 아릴록시, 머캅토, 알킬티오, 알릴티오, 술피닐, 술포닐, S-술폰아미도, N-술폰아미도, 카르보닐, C-카르복시, O-카르복시, 시아노, 니트로, 할로겐, O-카르바밀, N-카르바밀, O-티오카르바밀기, N-티오카르바밀, C-아미도, N-아미도, 아미노 및 -NR11R12로 이루어진 군에서 독립적으로 선택된다. 그러나 이때 R8,R9 또는 R10중 적어도 하나는 화학식-(alk1)Z를 갖는 기이어야 하며, 여기서 Alk1는 알킬, 알케닐 또는 알키닐로 이루어 진 군에서 선택되며 Z는 극성기이다.
본 발명에서 사용된 "알킬"은 분지쇄와 직쇄상을 포함하는 포화 지방족 탄화수소를 의미한다. 바람직하게는, 알킬기는 1 내지 20개의 탄소원소(본 명세서에서의 수자의 범위는: 항상 예를 들어 "1 내지 20"은 이 경우에서는 알킬기에 있어서 1개의 탄소원자, 2개의 탄소원자, 3개의 탄소원자 등으로 출발해서 20개의 탄소원자에 이르는 탄소로 이루어진 기를 의미한다). 보다 바람직하게는, 1 내지 10개의 탄소원자를 갖는 중간 크기의 알킬기이다. 가장 바람직하게는 1 내지 4개의 탄소원자를 갖는 저급 알킬기이다. 또한, 여기서의 알킬기는 치환된 것일 수도 있고 비치환 된 것일 수도 있다. 치환된 경우에 치환기는 바람직하게는 1개 또는 그 이상의 시클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로알리시클릭, 히드록시, 알콕시, 알릴로시, 머캅토, 알킬티오, 아릴티오, 시아노, 할로겐, 카르보닐, 티오카르보닐, 0-카르바밀, N-카르바밀, O-티오카르바밀, N-티오카르바밀, C-아미도, N-아미도, C-카르복시, O-카르복시, 니트로, 실릴, 아미노 그리고 앞서 정의한 R11 과 R12를 갖는 -NR11R12에서 독립적으로 선택된다.
"시클로알킬"기라 함은 모두가 탄소로 구성되는 단일고리 또는 복합고리기(즉, 인접한 탄소 원자쌍과 공유하는 고리)들 중에 하나 이상이 완전히 공액되는 파이-전자계를 갖지 아니하는 기를 말한다. 예를들어, 이들로만 한정되는 것은 아니지만, 시클로알킬기는 시클로프로판, 시클로부탄, 시클로펜탄, 시클로펜텐, 시클로헥산, 어드맨탄(adamantane), 시클로헥사디엔, 시클로헵탄 및 시클로헵타트리엔이 다. 시클로알킬기는 치환되거나 비치환된 것일 수 있다. 치환된 것일 경우 치환기는 바람직하게는 알킬, 아릴. 헤테로아릴, 헤테로알리시클릭, 히드록시, 알콕시, 아릴록시, 머캅토, 알킬티오, 아릴티오, 시아노, 할로겐, 카르보닐, 티오카르보닐, C-카르복시, O-카르복시, O-카르바밀, N-카르바밀, C-아미도, N-아미도, 니트로, 아미노 그리고 앞서 정의한 R11과R12를 갖는 -NR11R12에서 하나 이상 독립적으로 선택된다.
본 명세서에서 정의된 "알케닐"기라 함은 적어도 두개의 탄소 원자와 적어도 한개의 탄소-탄소 이중결합으로 이루어진 알킬기를 말한다.
본 명세서에서 정의된 "알키닐"이라 함은 적어도 두개의 탄소원자와 적어도 한개의 탄소-탄소 삼중결합으로 이루어진 알킬기를 말한다.
본 명세서에서 정의된 "아릴"기라 함은 모두가 탄소로 이루어진 단일고리 또는 다환복합고리(즉, 인접한 탄소쌍을 공유하는 고리)기로서 완전히 공액된 파이-전자계를 갖는것을 말한다. 예를들어, 이들에 한정되는 것은 아니지만, 아릴기는 페닐, 나프탈레닐 및 안트라세닐이다. 여기서, 아릴기는 치환되거나 비치환된 것일수 있다. 치환된 것일 때의 치환기(들)는 바람직하게는, 할로겐, 트리할로메틸, 알킬, 히드록시, 알콕시, 아릴로시, 머캅토, 알킬티오, 아릴티오, 시아노, 니트로, 카르보닐, 티오카르보닐, C-카르복시, O-카르복시, O-카르바닐, N-카르바밀, O-티오카르바밀, N-티오카르바밀, C-아미도, N-아미도, 술피닐, 술포닐, 아미노 그리고 본 명세서에서 정의한 R11과R12를 갖는-NR11R12에서 하나 이상 선택된다.
여기서 사용된 "헤테로아릴"기라 함은 단일고리 또는 복합고리(즉, 인접한 원자쌍을 공유하는 고리)기는 완전히 공액된 파이-전자계를 이룬다. 이들은 질소, 산소 및 황으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 원자를 고리안에 가지며, 이들은 예를 들어, 이들에 한정되는 것은 아니지만, 헤테로아릴기는 피롤, 퓨란, 트리오펜, 이미다졸, 옥사졸, 티아졸, 피라졸, 피리딘, 피리미딘, 퀴놀린, 이소퀴놀린, 퓨린 그리고 카바졸이다. 헤테로아릴기는 치환되거나 비치환된 것일 수 있다. 치환된 것일 때, 치환기는 바람직하게는 알킬, 시클로알킬, 할로겐, 트리할로메틸, 히드록시, 알콕시, 아릴록시, 머캅토, 알킬티오, 아릴티오, 시아노, 니트로, 카르보닐, 티오카르보닐, 술폰아미도, C-카르복시, O-카르복시, 술피닐, 술포닐, O-카르바밀, N-카르바밀, O-티오카르바밀, N-티오카르바밀, C-아미도, N-아미도, 아미노 그리고 본 명세서에 정의된 R11과 R12를 갖는 -NR11R12 에서 하나 이상 선택된다.
"헤테로알리시클릭"기라 함은 단일 고리 또는 복합 고리 화합물로, 질소, 산소 그리고 황으로 이루어진 군에서 선택되는 원소를 하나 이상 가지는 것을 말한다. 이러한 고리도 역시 하나 이상의 이중 결합을 갖는 것일 수 있다. 그러나, 이 고리는 완전히 공액된 파이-전자계를 갖지는 않는다. 헤테로알리시클릭 고리는 치환되거나 비치환된 것일 수 있다. 치환된 것일 때, 치환기(들)는 바람직하게는, 알킬, 시클로알킬, 할로겐, 트리할로메틸, 히드록시, 알콕시, 아릴록시, 머캅토, 알킬티오, 아릴티오, 시아노, 니트로, 카르보닐, 티오카르보닐, C-카르복시, O-카르복시, O-카르바밀, N-카르바밀, O-티오카르바밀, N-티오카르바밀, 술피닐, 술포 닐, C-아미도, N-아미도, 아미노 그리고 본 명세서에서 정의된 R11 과 R12 를 갖는 -NR11R12에서 하나 이상 선택된다.
"히드록시"기라 함은 -OH기를 말한다.
"알콕시"기라 함은 여기서는 -O-알킬과 -O-시클로알킬기를 모두 의미한다.
"아릴록시"기라 함은 여기서는 -O-아릴과 -O-헤테로아릴기를 모두 의미한다.
"머캅토"기라 함은 -SH기를 말한다.
"알킬티오"기라 함은 S-알킬과 -S-시클로알킬기 모두를 의미한다.
"아릴티오"기라 함은 S-아릴과 -S-헤테로아릴기 모두를 말한다.
"카르보닐"기라 함은 -C(=O)-R"기를 말하며, 여기서 R"는 수소, 알킬, 시클로알킬, 아릴, 헤테로아릴(고리 탄소를 통하여 결합되어 있는) 그리고 헤테로알리시클릭(고리 탄소를 통해 결합되어 있는)로 이루어진 군에서 선택된다.
"알데히드"기라 함은 R"이 수소인 카르보닐기를 말한다.
"티오카르보닐"이라 함은 본 명세서에서 정의된 R"를 가지는 C-(=S)-R"기를 말한다.
"C-카르복시"기라 함은 본 명세서에서 정의된 R"를 가지는 -C(=O)O-R"기를 말한다.
"O-카르복시"기라 함은 본 명세서에서 정의된 R"기를 가지는 -OC(=O)R"기를 말한다.
"에스테르"라 함은 R"이 수소가 될 수 없는 경우를 제외하고, 본 명세서에서 정의된 R"를 가지는 -C(=O)O-R"기를 말한다.
"아세틸"이라함은 -C(=O)CH3 기를 말한다.
"카르복시산"기는 R"가 수소인 C-카르복시기를 말한다.
"할로겐"기는 불소, 염소, 브롬 또는 요오드를 말한다.
"트리할로메틸"기는 X가 본 명세서에서 정의된 할로겐기인 -CX3기를 말한다.
"시아노"기는 -C≡N기를 말한다.
"술피닐"기는 -S(=O)R"기를 말하며, 이상에서 정의된 것에 추가하여, R"는 히드록시기일 수도 있다.
"술포닐"기는 -S(=O)2R"기를 말하며, 이상에서 정의된 것에 추가하여, R"는 히드록시기일 수도 있다.
"메틸렌디옥시"기는 -OCH2O-기를 말하며, 두개의 산소원자가 인접 탄소에 결합되어 있는 것을 말한다.
"에틸렌디옥시"기는 -OCH2CH2O-를 말하며, 이때 두개의 산소는 인접 탄소에 결합되어 있다.
"S-술폰아미도"기는 -S(=O)2NR11R12기를 말하며, 이때 R11 , R12는 본 명세서에서 정의된 바와 같다.
"N-술폰아미도"기는 -NR11S(=O)2R12기를 말하며, 이때 R11 , R12는 본 명세서에서 정의된 바와 같다.
"O-카르바밀"기는 -OC(=O)NR11R12기를 말하며, 이때 R11, R12 는 본 명세서에서 정의된 바와 같다.
"N-카르바밀"기는 R12OC(=O)NR11-기를 말하며, 이때 R11, R12 는 본 명세서에서 정의된 바와 같다.
"O-티오카르바밀"기는 -OC(=S)NR11R12기를 말하며, 이때 R11, R12는 본 명세서에서 정의된 바와 같다.
"N-티오카르바밀"기는 R12OC(=S)NR11-기를 말하며, 이때 R11, R12는 본 명세서에서 정의된 바와 같다.
"아미노"기는 -NR11R12기를 말하며, 여기서의 R11, R12 은 모두 수소이다.
"C-아미도"기는 -C(=O)NR11R12기를 말하며, 이때 R11, R12 는 본 명세서에서 정의된 바와 같다.
"N-아미도"기는 R12C(=O)NR11-기를 말하며, 이때 R11, R12 는 본 명세서에서 정의된 바와 같다.
"암모늄"기는 -+NHR11R12기를 말하며, 이 때 R11, R12는 알킬, 시클로알킬, 아릴 그리고 헤테로아릴로 이루어진 군에서 독립적으로 선택된다.
"우레이도"기는 -NR11C(=O)NR12R13기를 말하며, 이때 R11 , R12는 본 명세서에서 정의된 바와 같으며 R13는 R11, R12과 동일하게 정의 된다.
"구아니디노(quanidino)"기는 -R11NC(=N)NR12R13기를 말하며 여기서의 R11, R12 그리고 R13는 본 명세서에서 정의된 바와 같다.
"아미디노"기는 R11R12NC(=N)-기를 말하며, 이때 R11, R12 는 본 명세서에서 정의된 바와 같다.
"니트로"기는 -NO2기를 말한다.
"포스포닐"기는 -OP(=O)2OR"기를 말하며, 이때 R"는 본 명세서에서 정의된 바와 같다.
"몰폴리노"기는 하기의 화학구조식을 갖는 것을 말한다.
Figure 112000537758212-pct00005
"피페라지닐"기는 하기의 화학 구조식을 갖는 것을 말한다.
Figure 112000537758212-pct00006
"테트라졸로"기는 하기의 화학구조식을 갖는 것을 말한다.
Figure 112000537758212-pct00007
B. 바람직한 구조적 특징.
현재 본 발명의 R1의 바람직한 태양은 수소이다.
또한 현재까지 본 발명의 R2의 바람직한 태양은 수소이다.
마찬가지로 현재까지 본 발명의 R7의 바람직한 태양은 수소이다.
현재까지 본 발명의 바람직한 태양은 상기한 3가지의 조건을 하나의 분자가 모두 만족시키는 경우, 예를 들어 R1, R2, R7 가 모두 수소일 때이다.
또한 본 발명의 바람직한 태양은 R3, R4, R5 과 R6 는 수소, 비치환된 저급 알킬과 비치환된 저급 알킬, 수소로 이루어진 군에서 선택되는 기로 치환된 C-카르복시, -NR11R12 또는 아미노, 할로겐 또는 히드록시로 이루어진 군에서 선택되는 기로 치환된 저급 알킬; 또, 비치환된 저급 알킬 알콕시, 하나 이상의 할로겐기로 치환된 저급 알콕시; 또, -NR11R12, 또는 비치환된 저급 알킬 S-술폰아미도, 아미노, 할로겐, 비치환된 저급 알킬 알콕시, 히드록시 또는 비치환된 저급 알킬로 이루어진 군에서 독립적으로 선택되는 하나이상의 기로 치환된 아릴 또는 비치환된 아릴로 이루어진 군에서 선택되는 저급 알콕시, 또, -NR11R12, 비치환된 저급 알킬 S-술폰아미도, 아미노, 할로겐, 비치환된 저급 알킬 알콕시, 히드록시 또는 비치환된 저급 알킬로 이루어진 군에서 독립적으로 선택되는 하나이상의 기로 치환된 아릴 또는 비치환된 아릴로 이루어진 군에서 선택되는 기로 치환된 저급 알콕시, 또, 히드록시, 아미노, 비치환된 저급 알킬 술폰아미도, 수소 또는 비치환된 저급 알킬로 이루어진 군에서 선택되는 기로 치환된 C-카르복시, 몰폴리노, -NR11R12, 트리할로메틸, 아릴, 또, 수소 또는 비치환된 저급 알킬로 이루어진 군에서 선택되는 기로 치환된 C-카르복시, 술폰아미도, -NR11R12, 아미노, 트리할로메틸, 할로겐, 비치환된 저급 알킬, 수소 또는 비치환된 저급 알킬로 이루어진 군에서 선택되는 기로 치환된 C-카르복시, 할로겐, 아미노, -NR11R12 또는 할로겐으로 이루어진 군으로 부터 선택되는 기로 치환된 저급 알킬, 또는 히드록시기로 이루어진 군에서 독립적으로 선택된 하나 이상의 기로 치환된 아릴, 비치환된 헤테로알리시클릭, 하나 이상의 할로겐으로 치환된 알콕시, 비치환된 저급 알킬 알콕시, 히드록시, 비치환된 저급 알킬 카르보닐, 비치환된 저급 알킬, 히드록시 또는 할로겐으로 이루어진 군에서 독립적으로 선택되는 하나 이상의 군으로 선택되는 헤테로알리시클릭, 또 비치환된 아릴록시, 또 -NR11R12, 아미노, 히드록시, 할로겐, 트리할로메틸 또는 비치환된 저급 알킬로 이루어진 군에서 독립적으로 선택되는 하나 이상의 기로 치환되어진 아릴록시, 또 머캅토, 비치환된 저급 알킬 알킬티오, 비치환된 아릴티오, 또 -NR11R12, 아미노, 히드록시기 또는 할로겐으로 이루어진 군에서 선택되는 하나이상의 기로 치환된 아릴티오, 또 수소와 비치환된 저급 알킬로 이루어진 기에서 선택되는 기로 치환된 C-카르복시, 또, 비치환된 저급 알킬 O-카르복시, 비치환된 저급 알킬 S-술폰아미도, 니트로, 비치환된 저급 알킬 C-아미도, 비치환된 저급 알킬 N-아미도, 아미노 그리고 -R11R12 또는 하나이상의 할로겐으로 치환된 저급 알콕시, 비치환된 저급알킬 알콕시 또는 비치환된 저급알킬기를 포함하고 있는 군에서 독립적으로 선택되는 하나이상의 기로 치환된 아릴 또는 비치환된 아릴로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 바람직한 태양은, R3, R4, R5 및 R6은 수소, 할로겐, 비치환된 저급 알킬, 수소나 비치환된 저급 알킬기로 이루어진 군에서 선택된 기로 치환된 C-카르복시, -NR11R12, 아미노, 할로겐, 또는 히드록시기로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 기로 치환된 저급 알킬 또, 비치환된 저급 알킬 알콕시, 하나이 상의 할로겐기로 치환된 저급 알킬 알콕시, 또, 비치환된 아릴록시, -NR11R12, 아미노, 할로겐, 비치환된 저급 알킬 알콕시, 히드록시기 또는 하나 이상이 할로겐기로 치환된 저급 알킬로 치환된 저급 알킬, 또, R11과 R12가 수소와 비치환된 저급 알킬로 이루어진 군에서 독립적으로 선택된 S- 술폰아미도, 또, 비치환된 아릴, 하나 이상의 할로겐기로부터 치환된 저급 알킬, -NR11R12, 아미노, 비치환된 저급 알킬 알콕시, 비치환된 저급 알킬 또는 할로겐으로 이루어진 군에서 독립적으로 선택된 하나 이상의 기로 치환된 아릴, 비치환된 헤테로아릴, 또, 하나이상의 할로겐으로 치환된 저급 알킬, -NR11R12, 아미노, 할로겐, 히드록시, 비치환된 저급 알킬 알콕시 또는 비치환된 저급 알킬기로 이루어진 군에서 독립적으로 선택되는 하나 이상의 기로 치환된 헤테로아릴, 또, 비치환된 헤테로알리시클릭, 하나 이상의 할로겐기로 치환된 저급 알킬, -NR11R12, 아미노, 비치환된 저급 알킬 알콕시, 비치환된 저급 알킬, 히드록시 또는 할로겐으로 이루어진 군에서 독립적으로 선택되는 하나 이상의 기로 치환된 헤테로알리시클릭, 또, 비치환된 저급 알킬 O-카르복시, 또, R11과R12가 비치환된 아릴, 비치환된 저급 알킬 그리고 수소로 이루어진 군에서 독립적으로 선택된 것을 특징으로 하는 C-아미도, 또, R11과R12가 비치환된 알릴, 비치환된 저급 알킬 그리고 수소로 이루어진 군에서 독립적으로 선택된 것을 특징으로 하는 N-아미도, 또는 저급 알킬로 이루어진 군에서 독립적으로 선택된 하나이상의 기로 치환 된 아릴록시로 이루어진 군에서 독립적으로 선택된 것을 특징으로 한다.
본 발명의 바람직한 태양은 R8,R9 및 R10중 하나가 -(alk1)Z인 경우에 나머지 두개는 수소, 히드록시, 비치환된 저급 알킬, 비치환된 저급 알케닐, 비치환된 저급 알키닐, 비치환된 저급 알킬 알콕시, 하나 이상의 할로겐으로 치환된 저급 알콕시, 비치환된 아릴 알콕시, 아미노, -NR11R12, 할로겐, 수소 또는 비치환된 저급 알킬로 이루어진 군에서 선택된 기로 치환된 C-카르복시, 비치환된 저급 알킬 O-카르복시, 비치환된 저급 알킬 C-아미도, 비치환된 저급 알킬 N-아미도, 아세틸, 비치환된 저급 알킬 S-술폰아미도, 또, 히드록시, 비치환된 알킬 알콕시, 하나 이상의 할로겐기로 치환된 알콕시, 또, 수소 또는 비치환된 저급 알킬기로 이루어진 군에서 선택되는 기로 치환된 C-카르복시, 또, 비치환된 저급 알킬 O-카르복시, 아미노, 비치환된 저급 알킬 S-술폰아미도 그리고 -NR11R12 또는 할로겐으로 이루어진 군에서 선택되는 기로 치환된 아릴 또는 비치환된 아릴로 이루어진 군에서 독립적으로 선택된다.
본 발명의 바람직한 태양은 R8과 R10이 수소와 비치환된 저급 알킬로 이루어진 군에서 선택된다.
또한, 본 발명의 바람직한 태양은 alk1이 비치환된 저급 알킬기를 말한다.
또한, 본 발명의 바람직한 태양은 Z는 히드록시, 아미노, -NR11R12, 4차 암모 늄, 수소 또는 비치환된 저급 알킬로 이루어진 군에서 선택되는 기로 치환된 C-카르복시, 수소와 비치환된 저급 알킬로 이루어진 군에서 선택된 기로 치환된 C-아미도, 몰폴리노, 피페라디닐, 테트라졸과 포스포닐로 이루어진 군에서 선택되는 것을 말한다.
바람직하게는 본 발명에서 alk1은 탄소가 2개에서 4개의 비치환된 저급 알킬기를 말하며 Z는 카르복시산을 말한다.
본 발명의 바람직한 태양의 R9는 alk1Z 이다.
마찬가지로 본 발명에서의 R11과 R12는 수소, 비치환된 저급 알킬, 히드록시, 비치환된 저급 알킬 알콕시, 비치환된 저급 알킬 카르보닐, 비치환된 저급 알킬 0-카르복시와 아세틸로 이루어진 군에서 독립적으로 선택되는 것을 말한다.
본 발명의 바람직한 태양의 R1, R2 ,R3 ,R4 ,R5 ,R 6 그리고 R7은 수소이며, R8 과 R10은 메틸 그리고 R9는 -CH2CH2C(=O)OH이다.
본 발명의 바람직한 태양의 R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7그리고 R8은 수소이며 R10은 메틸 그리고 R9는 -CH2CH2C(=O)OH이다.
본 발명의 바람직한 태양의 R7은 수소, 비치환된 저급 알킬, 그리고 비치환된 시클로알킬, 비치환된 아릴로 이루어진 군에서 선택되는 기로 치환된 저급 알킬, 그리고, 히드록시, 비치환된 저급 알킬 알콕시와 할로겐으로 선택되는 군으로 치환된 아릴로 이루어진 군에서 선택된다.
본 발명의 바람직한 태양의 Z는 R13 와 R14 가 수소, 비치환된 저급 알킬, 아미노와 -NR11R12로 이루어진 군에서 선택되는 기로 치환된 저급 알킬로 이루어진 군에서 독립적으로 선택된 -C(=O)NR13R14, 또, 비치환된 아릴, 또, 할로겐, 히드록시, 비치환된 저급 알킬 알콕시와 트리할로메틸로 이루어진 군에서 하나 이상의 기로 치환된 아릴, 비치환된 헤테로 아릴, 비치환된 헤테로알리시클릭 그리고 5-원 또는 6-원의 비치환된 헤테로알리시클릭 복합고리기 및 R11 과 R12 가 비치환된 저급 알킬과 5-원 또는 6-원의 비치환된 헤테로알리시클릭 복합고리기로 이루어진 군에서 독립적으로 선택된 -NR11R12로 이루진 군에서 선택된다.
본 발명의 또다른 바람직한 태양의 R7은 비치환된 저급 알킬 카르복시알킬 그리고 비치환된 저급 알킬 알콕시 그리고 할로겐으로 이루어진 군으로 부터 독립적으로 선택된 하나이상의 기로 치환된 아릴, 비치환된 C-카르복시와 비치환된 저급 알킬 C-카르복시로 이루어진 군에서 선택된 Z, 비치환된 아릴, 비치환된 시클로알킬로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 기로 치환된 저급 알킬과 비치환된 저급 알킬로 이루어진 군에서 선택된다.
마지막으로 본 발명의 또 다른 바람직한 태양의 R3,R4,R5 그리고 R6 은 수소, 할로겐, 비치환된 저급 알킬, 하나이상의 히드록시기로 치환된 저급 알킬, 비치환된 저급 알콕시, 비치환된 아릴, 하나 이상의 비치환된 저급 알콕시기로 치환된 아릴기 그리고 -S(O)2 NR11R12로 이루어진 군에서 독립적으로 선택되는 것을 특징으로 한다. 이때 R5는 수소 , R6은 -NR11R12, 그리고 R11 과 R12는 수소, 비치환된 저급 알킬 그리고 5-원 또는 6-원의 헤테로알리시클릭 복합 고리기로 이루어진 군에서 독립적으로 선택된다.
본 명세서에서 언급된 화학식은 호별이성(tautomerism)의 현상들과 이성질체의 구조를 나타낼 수 있다. 예를 들면, 여기서 기술한 화합물들은 2-인돌리논의 일부와 피롤일부분이 연결된 이중 결합에 대해 E 또는 Z배치를 선택할 수 있으며, 이들은 E 와 Z배치가 섞인 것일 수도 있다.
본 발명은 어떤 호별이성 또는 구조적 이성질 형을 포함하고 있으며 그것은 수용체 티로신 인산화 효소(RTK), 세포질 티로신 인산화 효소(CTK) 및/또는 세린/트레오닌 인산화 효소(STK)의 반응성을 조절하는 능력을 가지고 있다. 그리고 본 발명은 하나의 호별이성 또는 구조적 이성질 형에 국한되지는 않는다.
2.합성/조합 라이브러리(Combinational libraries)
본 발명의 또 하나의 목적은, 화학식 2의 옥신돌과 화학식 3의 알데히드를 반응시킴으로서 제조될 수 있는 적어도 10개의 3-피롤리디닐-2-인돌리논 화합물로 이루어지는 화합물 조합 라이브러리이다.
Figure 112000537758212-pct00008
여기서의 R1 내지 R10은 이상에서 정의된 바와 같다.
본 명세서에서의 "조합 라이브러리"라 함은 여러 종류의 화합물 배열들에 있어서 어느 한 배열의 화합물들이 이와 다른 배열의 화합물들과 반응하여 생성시킬수 있는 모든 화합물들을 의미한다. 본 발명에 있어서의 화합물의 배열은 2종류이며, 첫번째 배열은 본 발명의 모든 옥신돌을 나타내며, 두번째 배열은 본 발명의 모든 알데히드를 나타낸다. 각각의 옥신돌은 3-피롤리디닐-2-인돌리논을 생성하기 위해 각각의 또는 모든 알데히드와 반응할 수 있다. 이 방법에 의해 형성된 모든 3-피롤리디닐-2-인돌리논 화합물은 본 발명의 범위에 속한다. 또한, 몇 가지의 옥신돌과 모든 알데히드, 모든 옥신돌과 몇가지 알데히드 또는 몇가지의 옥신돌과 모든 알데히드를 반응시켜 생성되는 더 축소된 조합 라이브러리로 본 발명의 범위내에 속한다. 라이브러리상에서의 옥신돌은 다음의 예와 같이 한정되는 것은 아니지만, 옥신돌 자체와 6-브로모옥신돌, 5-히드록시옥신돌, 5-메톡시옥신돌, 6-메톡시옥신돌, 5-페닐아미노술포닐옥신돌, 4-[2-(2-이소프로필페녹시)-에틸]옥신돌, 4-[2-(3-이소프로필페녹시)에틸]옥신돌, 4-[2-(4-이소프로필페녹시)-에틸]옥신돌, 5-플루오로옥신돌, 6-플루오로옥신돌, 7-플루오로옥신돌, 6-트리플루오로메틸옥신돌, 5-클로로옥신돌, 6-클로로옥신돌, 인돌-4-카르복시산, 5-브로모옥신돌, 6-(N-아세트아미도)-옥신돌, 4-메틸옥신돌, 5-메틸옥신돌, 4-메틸-5-클로로옥신돌, 5-에틸옥신돌, 6-히드록시옥신돌, 5-아세틸옥신돌, 옥신돌-5-카르복시산, 5-메톡시옥신돌, 6-메톡시옥신돌, 5-아미노옥신돌, 6-아미노옥신돌, 4-(2-N-몰폴리노에틸)옥신돌, 7-아자옥신돌, 옥신돌-4-카르바믹산 t-부틸에스테르, 옥신돌-6-카르바믹산 t-부틸 에스테르, 4-(2-카르복시에틸)옥신돌, 4-n-부틸옥신돌, 4,5-디메톡시옥신돌, 6-(메탄술폰아미도)옥신돌, 6-(벤즈아미도)옥신돌, 5-에톡시옥신돌, 6-페닐옥신돌, 6-(2-메톡시펜-1-일)옥신돌, 6-(3-메톡시펜-1-일)옥신돌, 6-(4-메톡시펜-1-일)옥신돌, 5-아미노술포닐옥신돌, 5-이소프로필아미노술포닐옥신돌, 디메틸아미노술포닐옥신돌, 5-(N-몰폴리노술포닐)옥신돌 그리고 4-(2-히드록시에틸)옥신돌과 같은 치환된 옥신돌로 이루어진 군에서 선택되는 것이 바람직하다.
상기 조합 라이브러리상에서의 알데히드들은 다음의 예로만 한정되는 것은 아니지만, 3-(5-포르밀-2,4-디메틸-1H-피롤-3-일)프로피온산, 3-(5-포르밀-4-메틸-1H-피롤-3-일)프로피온산, 3-(1-벤질-5-포르밀-2,4-디메틸-1H-피롤-3-일)프로피온산, 3-(5-포르밀-1-메톡시카르보닐메틸-2,4-디메틸-1H-피롤-3-일)프로피온산, 3-(5-포르밀-1,2,4-트리메틸-1H-피롤-3-일)프로피온산, 3-[5-포르밀-1-(3-메톡시-벤질)-2,4-디메틸-1H-피롤-3-일]프로피온산 메틸 에스테르, 3-(1-시클로헥실메틸-5- 포르밀-2,4-디메틸-1H-피롤-3-일)프로피온산 메틸 에스테르, 3-[1-(2,2-디메틸-프로필 )-5-포르밀-2,4-디메틸-1H-피롤-3-일]프로피온산 메틸 에스테르, 1,3,5-트리메틸-4-(3-몰폴린-4-일-3-옥소-프로필)-1H-피롤-2-카르발데히드, 3-(5-포르밀- 1,2,4-트리메틸-1H-피롤-3-일)-N-(2-몰폴린-4-일-에틸)프로피온아미드, 3-(5-포르밀-1,2,4-트리메틸-1H-피롤-3-일)-N-페닐프로피온아미드, 1,3,5-트리메틸-4-(3-옥소-3-피페리딘-1-일-프로필)-1H-피롤-2-카르발데히드, 1,3,5-트리메틸-4-(3-옥소-3-피롤리딘 -1-일-프로필)-1H-피롤-2-카르발데히드, 3-(5-포르밀-1,2,4-트리메틸-1H-피롤-3-일)-N-(4-메톡시-페닐)프로피온아미드, 3-(5-포르밀-1,2,4-트리메틸-1H-피롤-3-일) -N-(4-메톡시-페닐)프로피온아미드, N-(4-플루오로-페닐)-3-(5-포르밀-1,2,4-트리메틸-1H-피롤-3-일)프로피온아미드, 3-(5-포르밀-1,2,4-트리메틸-1H-피롤-3-일)-N-(4-트리플루오로메틸-페닐)프로피온아미드, 3-[5-포르밀-1-(3-메톡시-벤질)-2,4-디메틸-1H-피롤-3-일]프로피온산, 3-[1-시클로헥실메틸-5-포르밀-2,4-디메틸-1H-피롤 -3-일]프로피온산, 3-[1-(3-플루오로-벤질)-5-포르밀-2,4-디메틸-1H-피롤-3-일]프로피온산 메틸 에스테르, 3-(1-벤질-5-포르밀-2,4-디메틸-1H-피롤-3-일)프로피온산, 3-[1-(4-플루오로벤질)-5-포르밀-2,4-디메틸-1H-피롤-3-일]프로피온산 메틸 에스테르, 3-[1-(4-플루오로-벤질)-5-포르밀-2,4-디메틸-1H-피롤-3-일]프로피온산, 3-[1-(3-플루오로-벤질)-5-포르밀-2,4-디메틸-1H-피롤-3-일]프로피온산, 3,5-디메틸-4-(3-몰폴린-4-일-프로필)-1H-피롤-2-카르발데히드, 4-(3-디메틸아미노-프로필) -3,5-디메틸-1H-피롤-2-카르발데히드, 5-포르밀-2,4-디메틸-1H-피롤-3-카르복시산, 3,5-디메틸-4-(4-메틸-피페라진-1-카르보닐)-1H-피롤-2-카르발데히드, 5-포르밀-2,4-디메틸-1H-피롤-3-카르복시산(2-디메틸아미노에틸)아미드로 이루어진 군에서 선택되는 것이 바람직하다.
본 발명의 다른 목적은, 용매내에서, 바람직하게는 염기의 존재하에서, 화학 식 2의 옥신돌과 화학식 3의 알데히드를 반응시키는 것을 포함하는 화학식 1의 3-피롤리디닐-2-인돌리논의 합성방법을 제공하는 것이다.
화학식 3의 알데히드와 반응하여 화학식 1의 3-피놀리디닐-2-인돌리논을 생성시키는 화학식 2의 옥신돌은, 그 자체와 이에 한정되는 것은 아니지만, 6-브로모옥신돌, 5-히드록시옥신돌, 5-메톡시옥신돌, 6-메톡시옥신돌, 5-페닐아미노술포닐옥신돌, 4-[2-(2-이소프로필페녹시)-에틸]옥신돌, 4-[2-(3-이소프로필페녹시)에틸]옥신돌, 4-[2-(4-이소프로필]페녹시)에틸]옥신돌, 5-플루오로옥시돌, 6-플루오로옥시돌, 7-플로오로옥신돌, 6-트리플루오로메틸옥신돌, 5-클로로옥신돌, 6-클로로옥신돌, 인돌-4-카르복시산, 5-브로모옥신돌, 6-(N-아세트아미도)-옥신돌, 4-메틸옥신돌, 5-메틸옥신돌, 4-메틸-5-클로로옥신돌, 5-에틸옥신돌, 6-히드록시옥신돌, 5-아세틸옥신돌, 옥신돌-5-카르복시산, 5-메톡시옥신돌, 6-메톡시옥신돌, 5-아미노옥신돌, 6-아미노옥신돌, 4-(2-N-몰폴리노에틸)옥신돌, 7-아자옥신돌, 옥신돌-4-카르밤산 t-부틸 에스테르, 옥신돌-6-카르밤산 t-부틸 에스테르, 4-(2-카르복시에틸)옥신돌, 4-n-부틸옥신돌, 4,5-디메톡시옥신돌, 6-(메탄술폰아미도)옥신돌, 6-(벤즈아미도)옥신돌, 5-에톡시옥신돌, 6-페닐옥신돌, 6-(2-메톡시펜-1-일)옥신돌, 6-(3-메톡시펜-1-일)옥신돌, 6-(4-메톡시펜-1-일)옥신돌, 5-아미노술포닐옥신돌, 5-이소프로필아미노술포닐옥신돌, 디메틸아미노술포닐옥신돌, 5-(N-몰폴리노술포닐)옥신돌 그리고 4-(2-히드록시에틸)옥신돌과 같은 치환된 옥신돌들이다.
화학식 2의 옥신돌과 반응할 수 있는 화학식 3의 알데히드는, 이들로만 한정되는 것은 아니지만, 3-(5-포르밀-2,4-디메틸-1H-피롤-3-일)프로피온산, 3-(5-포르 밀-4-메틸-1H-피롤-3-일)프로피온산, 3-(1-벤질-5-포르밀-2,4-디메틸-1H-피롤-3-일)프로피온산, 3-(5-포르밀-1-메톡시카르보닐메틸-2,4-디메틸-1H-피롤-3-일)프로피온산, 3-(5-포르밀-1,2,4-트리메틸-1H-피롤-3-일)프로피온산, 3-[5-포르밀-1-(3-메톡시-벤질)-2,4-디메틸-1H-피롤-3-일]프로피온산 메틸 에스테르, 3-(1-시클로헥실메틸-5-포르밀-2,4-디메틸-1H-피롤-3일)프로피온산 메틸 에스테르, 3-[1-(2,2-디메틸-프로필) -5-포르밀-2,4-디메틸-1H-피롤-3-일]프로피온산 메틸 에스테르, 1,3,5-트리메틸-4-(3-몰폴린-4-일-3-옥소-프로필)-1H-피롤-2-카르발데히드, 3-(5-포르밀-1,2,4-트리메틸-1H-피롤-3-일)-N-(2-몰폴린-4-일-에틸)프로피온아미드, 3-(5-포르밀-1,2,4-트리메틸-1H-피롤-3-일)-N-페닐프로피온아미드, 1,3,5-트리메틸-4-(3-옥소-3-피페리딘-1-일-프로필)-1H-피롤-2-카르발데히드, 1,3,5-트리메틸-4-(3-옥소-3-피롤리딘-1-일-프로필)-1H-피롤-2-카르발데히드, 3-(5-포르밀-1,2,4-트리메틸-1H-피롤-3-일)-N-(4-메톡시-페닐)프로피온아미드, 3-(5-포르밀-1,2,4-트리메틸-1H-피롤-3-일)-N-(4-메톡시-페닐)프로피온아미드, N-(4-플루오로-페닐)-3-(5-포르밀-1,2,4-트리메틸-1H-피롤-3-일)프로피온아미드, 3-(5-포르밀-1,2,4-트리메틸 -1H-피롤-3-일)-N-(4-트리플루오로메틸-페닐)프로피온아미드, 3-[5-포르밀-1-(3-메톡시-벤질)-2,4-디메틸-1H-피롤-3-일]프로피온산, 3-(1-시클로헥실메틸-5-포르밀-2,4-디메틸-1H-피롤-3-일)프로피온산, 3-[1-(3-플루오로-벤질)-5-포르밀-2,4-디메틸-1H-피롤-3-일]프로피온산 메틸 에스테르, 3-(1-벤질-5-포르밀-2,4-디메틸-1H-피롤-3-일)프로피온산, 3-[1-(4-플루오로벤질)-5-포르밀-2,4-디메틸-1H-피롤-3-일]프로피온산 메틸 에스테르, 3-[1-(4-플루오로-벤질)-5-포르밀-2,4-디메틸-1H-피롤-3- 일]프로피온산, 3-[1-(3-플루오로-벤질)-5-포르밀-2,4-디메틸-1H-피롤-3-일]프로피온산, 3,5-디메틸-4-(3-몰폴린-4-일-프로필)-1H-피롤-2-카르발데히드, 4-(3-디메틸아미노 -프로필)-3,5-디메틸-1H-피롤-2-카르발데히드, 5-포르밀-2,4-디메틸-1H-피롤-3-카르복시산, 3,5-디메틸-4-(4-메틸-피페라진-1-카르보닐)-1H-피롤-2-카르발데히드, 5-포르밀-2,4-디메틸-1H-피롤 -3-카르복시산(2-디메틸아미노에틸)아미드이다.
본 반응은 염기의 존재하에서 진행될 수 있다. 이때 염기는 유기 또는 무기염기이다. 유기 염기가 사용되는 경우에는 질소 염기가 바람직하다. 유기 질소 염기의 예를들면, 이에 한정되는 것은 아니지만, 디이소프로필아민, 트리메틸아민, 트리에틸아민, 아닐린, 피리딘, 1,8-디아자바이시클로[5,4,1]운데크-7-엔, 피롤리딘과 피페리딘이 있다.
무기염기인 경우는, 이에 한정되는 것은 아니지만, 암모니아, 알칼리 금속 또는 알카리 토류 금속의 수산화물, 인산염, 탄산염, 중탄산염, 중황산염 그리고 아미드이다. 알칼리 금속은 리튬, 나트륨 그리고 칼륨을 포함하며, 알칼리 토류 금속은 칼슘, 마그네슘 그리고 바륨을 포함한다.
본 발명의 바람직한 용매는 물이나 알코올과 같은 수소 이온 제공(protic)용매이며, 염기는 알카리 금속이나 알칼리 토류 무기 염기이며, 보다 바람직하게는 알칼리 금속이나 알칼리 토류 금속 수산화물이다.
당업자라면, 유기합성의 일반적인 원칙과 본 명세서의 개시 내용에 기초하여 본 어떠한 염기가 본 반응에 적합한 염기인지 쉽게 알 수 있을 것이다.
본 반응에서 용매는 수소 이온 제공(protic)용매 또는 수소 이온 비제공 (aprotic)용매에서 수행될 수 있으며 바람직하게는 수소 이온 제공 용매가 사용된다.
"수소 이온 제공(protic)용매"는 수소 원자를 상당히 산성기로 만들어 주는 산소 원자 또는 질소 원자에 공유 결합된 수소 이온을 가지는 용매로서, 수소결합을 통하여 용질과 수소 이온을 공유할 수 있는 용매다. 예를 들어, 수소 이온 제공 용매는, 이에 한정되는 것은 아니지만, 물과 알코올을 포함한다.
"수소 이온 비제공(aprotic)용매"는 극성일 수도 있고 비극성일 수도 있으나 두 경우 모두 산성인 수소를 포함하지 않으므로 그 결과 용질과 수소 결합을 할 수가 없다. 예를들면, 이에 제한되는 것은 아니지만, 비극성이면서 수소 이온 비제공 용매들은 펜탄, 헥산, 벤젠, 톨루엔, 메틸렌 클로라이드 및 사염화탄소가 있다.
극성이면서 수소이온을 제공할 수 없는 용매의 예로는 클로로포름, 테트라하이드로퓨란, 디메틸술폭시드 및 디메틸포름아미드가 있다.
본 발명에서 바람직한 용매는 수소 이온을 제공하는 용매를 말하며, 바람직하게는 물이나 에탄올과 같은 알코올을 의미한다.
반응은 상온보다 높은 온도에서 수행된다. 반응 온도는 일반적으로 약 30℃에서 약 150℃까지이며, 바람직하게는 약 80℃에서 약 100℃, 더 바람직하게는 에탄올의 끓는점인 약 75℃에서 약 85℃이다. "약"이라는 것은 바람직하게는 표시된 온도에서 섭씨 10℃ 내외의 범위를 말하며, 더 바람직하게는 표시된 온도에서 섭씨 5℃ 내외의 범위, 가장 바람직하게는 표시된 온도에서 섭씨 2도의 범위를 말한다. 따라서, 예를 들어 "약 75℃"는 75℃±10℃, 바람직하게는 75℃±5℃, 보다 바람직하게는 75℃±2℃를 의미한다.
3. 생화학적/약물 치료
본 발명의 또 다른 측면은 본 발명의 화합물이나 그 생리학적인 염 또는 전구약물과 단백질 인산화효소를 접촉시킴으로써 그 단백질 인산화효소의 촉매활성을 조절하는 방법에 관한 것이다.
여기에서의 "단백질 인산화 효소(PK)"란 수용체 단백질 티로신 인산화효소(RTK), 비수용체 또는 "세포질" 티로신 인산화 효소(CTK), 그리고 세린/트레오닌 인산화효소(STK)를 의미한다.
여기에서의 "방법"이란 어떤 과제를 완수하기 위한 방식, 수단, 기술, 그리고 절차를 의미하며, 여기에는 (기술된 것으로 한정하는 것은 아님) 화학, 제약, 생물학, 생화학, 그리고 의학에 종사하는 사람들에게 알려져 있거나 또는 이 종사자들이 알려진 방식, 수단, 기술, 그리고 절차로부터 쉽게 개발해 낼 수 있는 방식, 수단, 기술, 그리고 절차가 포함된다.
여기에서의 "조절" 또는 "조절함"이란 수용체 단백질 티로신 인산화효소, 비수용체 또는 "세포질" 티로신 인산화효소, 그리고 세린/트레오닌 인산화효소의 촉매활성을 변화시킴을 뜻한다. 특히 "조절함"이란 수용체 단백질 티로신 인산화효소, 비수용체 또는 "세포질" 티로신 인산화효소, 그리고 세린/트레오닌 인산화효소의 촉매활성을 활성화함을 의미하고, 바람직하게는 수용체 단백질 티로신 인산화효소, 비수용체 또는 "세포질" 티로신 인산화효소, 그리고 세린/트레오닌 인산화효소 가 노출되는 화합물이나 염의 농도에 따라 그 수용체 단백질 티로신 인산화효소, 비수용체 또는 "세포질" 티로신 인산화효소, 그리고 세린/트레오닌 인산화효소의 촉매활성이 활성화되거나 억제되는 것을 의미하며, 더 좋게는 수용체 단백질 티로신 인산화효소, 비수용체 또는 "세포질" 티로신 인산화효소, 그리고 세린/트레오닌 인산화효소의 촉매활성을 억제함을 의미한다.
여기에서의 "촉매활성"이란 수용체 단백질 티로신 인산화효소 및/또는 세포질 티로신 인산화효소의 직간접적인 영향을 받아 티로신이 인산화되는 속도, 또는 세린/트레오닌 인산화효소의 직간접적인 영향을 받아 세린과 트레오닌이 인산화되는 속도를 의미한다.
여기에서의 "접촉시킴"이란 본 발명의 화합물이 표적 단백질 인산화효소의 촉매활성에 직접적으로(예를 들어 인산화효소 자체와 상호작용함으로써) 또는 간접적으로(예를 들어 인산화효소의 촉매활성을 조절할 수 있는 다른 분자와 상호작용함으로써) 영향을 미칠수 있도록 본 발명의 화합물과 표적 단백질 인산화효소를 가까이 위치시킴을 의미한다. 이런 "접촉시킴"은 "생체외"(예를 들어 시험관, 페트리 접시등)에서 이루어질 수 있다. 시험관에서의 접촉에는 화합물과 표적 단백질 인산화효소만이 관련되어 있거나 세포들이 관련되어 있을 수 있다. 세포들은 또한 세포 배양 접시에서 유지되거나 배양될 수 있으며 그 환경에서 화합물과 접촉될 수 있다. 이런 맥락에서, 어떤 특정한 화합물이 어떤 단백질 인산화효소와 관련된 질병에 영향을 미치는 능력(예를 들어 아래에 정의된 그 화합물의 IC50)이 좀 더 복잡한 살아있는 유기체를 대상으로 한 생체내 사용을 시도하기 전에 결정될 수 있다. 유기체 외부의 세포에 대해서는 단백질 인산화효소들을 화합물들과 접촉시키기 위한 여러 가지의 방법(세포에 직접 미세주입하는 방법과 다양한 막 통과 담체 기술등-이것들로 한정하는 것은 아님)이 존재하며, 이 방법들은 당업자에게 잘 알려져 있는 것이다.
본 발명의 또 다른 측면은 단백질 인산화효소의 촉매활성을 본 발명의 화합물을 사용하여 조절하는 것은 생체외 또는 생체내에서 이루어질 수 있다는 것이다.
"생체외(in vitro)"란 시험관이나 배양액(이것들로 한정하는 것은 아님)과 같은 인공적인 환경에서 수행되는 절차를 의미한다.
여기에서의 "생체내(in vivo)"란 생쥐, 쥐, 또는 토끼(이것들로 한정하는 것은 아님)와 같은 살아있는 유기체내에서 수행되는 절차를 의미한다.
본 발명의 또 다른 측면은 그 촉매활성이 본 발명의 화합물로 조절되는 단백질 인산화효소는 수용체 단백질 티로신 인산화효소, 세포질 티로신 인산화효소, 그리고 세린/트레오닌 인산화효소로 이루어진 집단으로부터 선별된다는 것이다.
그 촉매활성이 본 발명의 화합물에 의해 조절되는 수용체 단백질 인산화효소가 EGF, HER2, HER3, HER4, IR, IGF-1R, IRR, PDGFRα, PDGFβ, CSFIR, C-Kit, C-fms, Flk-1R, Flk4, KDR/Flk-1, Flt-1, FGFR-1R, FGFR-2R, FGFR-3R, 그리고 FDFR-4R로 이루어진 집단으로부터 선별된다는 것도 본 발명의 한 측면이다.
덧붙여, 그 촉매활성이 본 발명의 화합물에 의해 조절되는 세포질 티로신 인산화효소가 Src, Frk, Btk, Csk, Abl, ZAP70, Fes/Fps, Fak, Jak, Ack, Yes, Fyn, Lyn, Lck, Blk, Hck, Fgr, 그리고 Yrk로 이루어진 집단으로부터 선별된 것도 본 발 명의 한 측면이다.
본 발명의 또 다른 측면은 그 촉매활성이 본 발명의 화합물에 의해 조절되는 세린/트레오닌 단백질 인산화효소가 CDK2와 Raf로 이루어진 집단으로부터 선별된 것이다.
생리학적 담체와 본 발명의 화합물로 만든 의약 조성물은 본 발명의 또다른 측면이다. 이런 의약 조성물은 부형제들도 포함하고 있을 수 있다.
치료에 효과적인 양의 화합물, 염, 또는 전구약물(본 발명의 3-피롤리데닐-2-인돌리논)을 유기체에 투여하는 것으로 이루어져 있는, 유기체에서 단백질 인산화효소와 관련된 질병의 치료 또는 예방을 위한 방법은 본 발명의 또 다른 측면이다.
여기에서의 "단백질 인산화효소와 관련된 질병", "단백질 인산화효소에 의한 질병", 그리고 "비정상적인 단백질 인산화효소 활성"이란 모두 부적절한(예를 들어, 낮거나 더 흔하게는 더 높은) 단백질 인산화효소 촉매활성이라는 특징을 지닌 상태를 의미하며, 여기에서의 단백질 인산화효소에는 수용체 단백질 티로신 인산화효소, 세포질 티로신 인산화효소, 그리고 세린/트레오닌 인산화효소가 될 수 있다. 부적절한 촉매활성은; (1) 보통은 단백질 인산화효소를 발현하지 않는 세포에서의 단백질 인산화효소의 발현, (2) 원하지 않는 세포 증식, 분화 및/또는 성장을 일으키는 증가한 단백질 인산화효소의 발현, 또는 (3) 원하지 않는 세포 증식, 분화 및/또는 성장을 일으키는 감소한 단백질 인산화효소의 발현의 결과로 발생할 수 있다. 어떤 단백질 인산화효소의 과다활성이란, 어떤 특정한 단백질 인산화효소의 유전자의 증폭이나, 세포의 증식, 분화 및/또는 성장 질환과 관련될 수 있는 단백질 인산화효소의 활성 수준의 증가(즉 그 단백질 인산화효소의 수준이 늘어나면, 그 세포질환의 징후가 더 악화된다)를 말한다. 저활성이란, 물론 그 반대를 의미하며 그 단백질 인산화효소의 수준이 줄어듦에 따라 세포질환의 징후가 더 악화되는 상태를 의미한다.
여기에서의 "예방", "예방함", 그리고 "예방하다"란, 애초에 유기체가 단백질 인산화효소와 관련된 질병을 얻지 못하도록 하는 방법을 의미한다.
여기에서의 "치료", "치료함", 그리고 "치료하다"란, 단백질 인산화효소에 의해 중개되는 세포질환 및/또는 그에 수반되는 징후를 경감시키거나 없애는 방법을 의미한다. 특히 암과 관련해서는, 이 용어들은 단순히 암에 걸린 사람의 평균여명이 길어지거나 그 질병의 징후들이 경감되는 것을 의미한다.
"유기체"란 적어도 하나 이상의 세포로 구성되는 모든 살아있는 개체를 의미한다. 살아있는 유기체는 하나의 진핵세포처럼 간단할 수도 있고, 사람을 포함한 포유동물처럼 복잡할 수도 있다.
여기에서의 "치료에 효과적인 양"이란 치료의 대상이 되는 질병의 징후를 경감시킬 수 있는 투여량을 의미한다. 암의 치료에 관련해서는, 치료에 효과적인 양이란; (1) 종양 크기의 감소, (2) 종양 전이의 억제(어느 정도 느리게 하거나 더 좋게는 정지시키는), (3) 종양 성장의 어느 정도의 억제(즉 어느 정도 느리게 하거나 더 좋게는 정지시키는) 및/또는 (4) 암과 관련된 징후들의 어느 정도의 경감(또는 더 좋게는 제거)를 의미한다.
위에 언급된 단백질 인산화효소와 관련된 질병이 하나의 수용체 단백질 티로신 인산화효소와 관련된 질병, 하나의 세포질 티로신 인산화효소와 관련된 질병, 그리고 하나의 세린/트레오닌 인산화효소와 관련된 질병으로 이루어진 집단으로부터 선택되었다는 것이 본 발명의 측면이다.
본 발명의 또 다른 측면에서, 위에 언급된 단백질 인산화효소와 관련된 질병은 하나의 상피세포 성장 인자 수용체와 관련된 질병, 하나의 혈소판 유래 성장 인자 수용체와 관련된 질병, 하나의 인슐린 유사 성장 인자 수용체와 관련된 질병, 그리고 하나의 flk와 관련된 질병으로 이루어진 집단으로부터 선택되었다.
본 발명의 또 다른 측면에서 위에 언급된 단백질 인산화효소와 관련된 질병은 편평상피세포암종, 카포시 육종과 같은 육종들, 성상세포암, 글라이오블래스토마, 폐암, 방광암, 직장암, 위장암, 후두암, 흑색종, 난소암, 전립선암, 소세포폐암, 그리고 신경교종으로부터 선택된 암이다.
본 발명의 또 다른 측면에서, 위에 언급된 단백질 인산화효소와 관련된 질병은 당뇨병, 이상증식질환, 폰히펠-린다우 질병, 협착증, 섬유증, 건선, 골관절염, 류머티스성 관절염, 하나의 염증성 질환과 혈관형성이상으로 이루어진 집단으로부터 선택되었다.
본 발명의 화합물들을 사용하여 치료하거나 예방이 가능할 수 있는 추가적인 질병들에는 자가면역성 질환(AIDS)과 같은 면역성 질환과 아테롬성 동맥 경화증과 같은 심혈관계질환이 있다.
어떤 단백질 인산화효소의 촉매활성을 조절하는 화합물을 찾아내기 위해 그 단백질 인산화효소를 발현하는 세포와 화합물, 염, 또는 본 발명의 3-피롤리데닐-2-인돌리논인 전구약물을 접촉시키고 그 세포에 어떤 영향이 있는가를 감시하는 것도 본 발명의 한 측면이다.
"감시"란 특정한 단백질 인산화효소를 발현하는 세포와 어떤 화합물의 접촉의 영향을 관찰하거나 검출함을 뜻한다. 관찰되거나 검출되는 영향으로는, 세포 형질의 변화, 어떤 단백질 인산화효소의 촉매활성의 변화, 또는 어떤 단백질 인산화효소와 그 효소의 자연적인 결합대상과의 상호작용의 변화가 있을 수 있다. 이런 영향을 관찰하거나 검출하는 기술들은 이 기술분야에서 잘 알려져 있다.
본 발명의 마지막 측면에서, 위에 언급된 영향은 세포 형질의 변화나 변화없음, 언급된 단백질 인산화효소의 촉매활성의 변화나 변화없음, 또는 언급된 단백질 인산화효소와 그 효소의 자연적인 결합대상과의 상호작용의 변화나 변화없음으로부터 선택되었다.
"세포형질"이란 세포나 조직 또는 세포나 조직의 생물학적인 기능의 겉으로 드러난 형태를 뜻한다. 세포형질의 예를 들면(이것으로 한정하는 것은 아님), 세포의 크기, 세포의 성장, 세포의 증식, 세포의 분화, 세포의 생존, 세포고사(apoptosis), 그리고 영양분의 섭취와 사용이 있다. 이런 형질적 특징은 이 기술분야에서 잘 알려진 기술들을 사용하여 측정할 수 있다.
"자연적인 결합대상"이란 세포에서 특정한 단백질 인산화효소와 결합하는 폴리펩타이드를 의미한다. 자연적인 결합대상은 단백질 인산화효소에 의해 매개되는 신호전달과정에서 신호를 전파시키는 역할을 할 수 있다. 자연적인 결합대상과 단 백질 인산화효소의 상호작용의 변화는 단백질 인산화효소/자연적인 결합대상 복합체의 농도의 증가 또는 감소로 나타날 수도 있고, 그 결과로 그 단백질 인산화효소가 신호전달을 매개하는 능력이 관찰 가능하게 변화하는 것으로 나타날 수도 있다.
여기 기술된 화합물 또는 그 염이나 전구약물이 다른 화학약물과 결합되어 위에 논의된 질병과 질환의 치료에 사용될 수도 있다는 것도 본 발명의 한 측면이다. 예를 들어, 본 발명의 화합물, 염 또는 전구약물은 알킬화 약물인 플루오로유라실(5-FU) 단독과 조합하여, 또는 류코보린을 더 첨가하여, 또는, 이것들에 한정하는 것은 아니지만 유에프티(UFT), 카페치타빈, 젬치타빈, 그리고 시타라빈과 같은 피리미딘 동류물이나 부설판(만성 과립구성 백혈병 치료에 사용됨)과 같은 알킬 설포네이트, 임프로설판 과 피포설판; 벤조데파, 카르보쿠온, 메투레데파와 우레데파와 같은 아지리딘들; 알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포아미드, 트리에틸렌치오포스포아미드, 그리고 트리메틸롤멜라민과 같은 에틸렌이민들과 메틸멜라민들; 그리고 클로람뷰실(만성 임파구성 백혈병, 1차 고분자글로불린혈증, 그리고 비호지킨씨 임파종의 치료에 사용됨), 시클로포스파마이드(호지킨병, 다발성 골수종, 신경아세포종, 유방암, 난소암, 폐암, 빌름씨 종양, 그리고 횡문근육종의 치료에 사용됨), 에스트라머스틴, 아이포스파마이드, 노벰브리친, 프레드니머스틴, 그리고 우라실 머스타드(1차 혈소판증가증, 비호지킨씨 임파종, 호지킨병, 그리고 난소암의 치료에 사용됨)과 같은 질소 머스타드; 그리고 다카바진(연조직 육종의 치료에 사용됨)과 같은 프리아진들과 조합하여 사용될 수 있다.
마찬가지로 본 발명의 화합물, 염, 또는 전구약물은, (이것들로 한정하는 것 은 아님) 메소트렉세이트(급성 임파구성 백혈병, 융모막암, 균상식육증성유방암, 두경부암, 그리고 골형성원성육종의 치료에 사용됨)과 프테로프테린과 같은 엽산 동류물; 그리고 머켑토퓨린과 시오구아닌과 같은 퓨린 동류물들(급성 과립구성, 급성 임파구성, 그리고 만성 과립구성 백혈병의 치료에 사용됨)과 같은 다른 대사길항 화학요법제와 함께 유익한 효과를 낼 것으로 기대할 수 있다.
본 발명의 화합물, 염, 또는 전구약물은 또한, (이것들로 한정하는 것은 아님) 빈블라스틴(유방암과 고환암의 치료에 사용됨), 빈크리스틴, 그리고 빈데신과 같은 빈카 알칼로이드들; 에토포시드와 테니포시드(둘 다 고환암과 카포시씨 육종의 치료에 유용함)와 같은 에피포도필로톡신들; 다우노루비신, 독소루비신, 에피루비신, 마이토마이신(위암, 자궁경부암, 직장암, 유방암, 방광암, 그리고 췌장암의 치료에 사용됨), 닥티노마이신, 테모졸로마이드, 플리카마이신, 블레오마이신(피부암, 식도암, 그리고 비뇨생식기관암의 치료에 사용됨)과 같은 항생 화학요법제들; 그리고 L-아스파라기네이즈와 같은 효소 화학요법제들과의 조합에서 효과가 있는 것이 증명될 것을 기대할 수도 있다.
위에 덧붙여, 본 발명의 화합물, 염, 또는 전구약물은, 백금착화합물들(시스플라틴등); 히드록시유레아등과 같은 치환된 유레아들; 프로카바진과 같은 메칠하이드라진 유도체들; 마이토탄과 아미노글루테티미드와 같은 부신피질 억제제(adrenocortical suppressant)들; 아드레노코르티코스테로이드(프레드니손등), 프로게스틴(히드록시프로게스테론 카프로에이트등); 에스트로겐(다이에틸스틸베스테롤등); 타목시펜과 같은 안티에스트로겐; 테스토스테론 프로피오네이트와 같 은 안드로겐과 같은 호르몬과 호르몬 길항제들; 그리고 아나스트로졸과 같은 아로마테이즈 억제제들과 조합되어 유익한 효과를 내는 것을 기대할 수 있다.
마지막으로, 본 발명의 화합물 조합은 마이토크산트론이나 파클리탁셀과 조합할 때, (이것들로 한정하는 것은 아님) 고형종양이나 급성 골수성 백혈병과 같은 백혈병에 특히 효과가 있을 것으로 기대할 수 있다.
본 발명에서 위에 언급된 하나 이상의 화학요법제와의 조합으로 유익한 효과를 볼 수 있을 것으로 기대할 수 있는 화합물로 현재 선호되는 것은 3-[2,4-디메틸-5-(2-옥소-1,2-다이하이드로인돌-3-일리덴메틸)-1H-피롤-3-일]프로피온산이다.
4. 표에 대한 간단한 설명
표1에 본 발명의 몇가지 본보기 화합물들의 화학구조와 생물학적 활성을 나타내었다. 화합물 번호는 보기의 절에 있는 보기 번호에 해당한다. 즉, 표 1에 있는 화합물 1의 합성은 보기 1에 나타나 있다. 사용된 생분석은 아래에 자세히 기술되어 있다. 결과는 IC50(검사 화합물이 들어있지 않은 대조구에 비해 목표 단백질 티로신 인산화효소의 활성에 50%의 변화를 일으키는 검사대상 화합물의 마이크로몰 농도 (μM))으로 표시되어 있다. 보다 엄밀히 말하면, 표시된 결과는 목표 단백질 티로신 인산화효소의 활성을 50% 감소시키기 위해 필요한 검사대상 화합물의 농도를 나타낸다. 표 1에 보이는 화합물들은 단지 본보기일 뿐이며 본 발명의 범위를 어떤 방식으로도 한정짓는 것으로 해석되어서는 안된다.
표1.
Figure 112000537758212-pct00009
Figure 112000537758212-pct00010
Figure 112000537758212-pct00011
Figure 112000537758212-pct00012
표 2.
Figure 112000537758212-pct00013
Figure 112000537758212-pct00014
Figure 112000537758212-pct00015
표 2에는 본 발명의 몇 가지 추가적인 화합물들의 화학구조들을 나타내었다. 표 1에서와 마찬가지로, 화합물 번호는 보기 번호에 해당한다. 생분석에 대한 위의 일반적인 기술은 표 2에 나타나는 생분석에 대해서도 마찬가지로 적용된다.
5. 징후(Indications)/목표 질환
본 발명의 화합물들에 의해 그 촉매활성이 조절되는 단백질 인산화효소에는 단백질 티로신 인산화효소(수용체 티로신 인산화효소와 세포질 티로신 인산화효소의 두 가지 형이 포함됨)와 세린/트레오닌 인산화효소가 포함된다. 수용체 티로신 인산화효소에 의해 매개되는 신호전달은 특정한 성장 인자(리간드)와의 세포외적인 상호작용에 의해 개시된다. 그 뒤 수용체의 이량체화가 일어나고 수용체 내부의 단백질 티로신 인산화효소 활성의 일시적인 촉진과 인산화가 일어난다. 이렇게 해서 세포내 신호전달 분자들을 위한 결합부위가 만들어지고, 적절한 세포질 반응(예를 들면 세포 분열, 세포외부의 미소환경에의 대사적인 영향등)을 촉진하는 다양한 세포질성 신호 분자들과의 복합체가 형성된다 (Schlessinger and Ullrich, 1992, Neuron 9:303-391).
성장 인자 수용체의 티로신 인산화 부위들은 신호 분자들의 SH2(src 유사) 부위를 위한 높은 친화도의 결합 부위로 작용한다는 것이 밝혀져 있다(Fantl et al., 1992, Cell 69:413-423, Songyang et al., 1993, Cell 72:767-778, 그리고 Koch et al., 1991, Science 252;668-678.). 수용체 티로신 단백질 인산화효소들과 결합하는 몇 개의 세포내 기질 단백질들이 밝혀져 있다. 이들은 (1) 촉매부위를 가진 기질들과 (2) 그런 부위는 없지만 촉매작용을 활발히 하는 분자들과 결합할 수 있는 어댑터로 작용할 수 있는 기질들의 두 가지 주요군으로 나뉠 수 있다 (Songyang et al., 1993, Cell 72:767-778.). 수용체와 그 기질의 SH2 부위간의 상호작용의 특이성은 인산화되는 티로신 잔기 바로 주변의 아미노산 잔기들에 의해 결정된다. SH2 부위들과 특정 수용체들의 인산화된 티로신 잔기들 주위의 아미노산 서열들간의 결합강도의 차이들은, 이들이 기질을 인산화하는 능력에 관해서 관 찰된 차이들과 일치한다(Songyang et al., 1993, Cell 72:767-778.). 이 관찰들은, 각 수용체 티로신 인산화효소의 작용은 그 발현패턴과 리간드의 가용성뿐만이 아니라 특정 수용체에 의해 활성화되는 아래쪽의 신호 전달 경로들에 의해서도 결정된다는 것을 암시하고 있다. 따라서 인산화는, 분화 인자 수용체들과 함께 특정 성장 인자 수용체들에 의해서도 모집되는 신호 전달 경로들의 선택도(selectivity)를 결정하는 하나의 중요한 조절 단계를 제공한다.
세린/트레오닌 인산화효소들(주로 세포질에 존재한다)은, 흔히 단백질 티로신 인산화효소에 의해 일어나는 사건의 하부 반응으로 세포의 내부 생화학에 영향을 미친다. 세린/트레오닌 인산화효소들은 DNA 합성과 이어서 세포 증식으로 이어지는 유사분열을 개시하는 신호전달 과정에 관여되어 있는 것으로 생각되어 왔다.
따라서, 단백질 인산화효소를 거치는 신호 전달에는 다른 것들 중에서 세포 증식, 세포 분화, 세포 성장, 그리고 대사작용이 있다. 비정상적인 세포 증식은 다양한 종류의 질병과 질환을 일으킬 수 있는데, 여기에는 암종, 육종, 신경교아세포종, 그리고 혈관종과 같은 신형성(neoplasia), 백혈병, 건선, 아테롬성 동맥경화증, 관절염, 그리고 당뇨병성 망막증등과 같은 질병과 조절이 안되는 혈관형성 및/또는 혈관신생과 관련되어 있는 다른 질병들이 포함된다.
본 발명을 실제에 적용하는 데에는 본 발명의 화합물이 단백질 인산화효소들을 억제하는 기작에 대한 정확한 이해는 필요하지 않다. 그러나, 여기에서 어떤 특정한 기작이나 이론에 얽매여 있지는 않지만, 화합물들은 단백질 인산화효소들의 촉매부위의 아미노산들과 상호작용하는 것으로 생각된다. 단백질 인산화효소들은 전형적으로 이열편적인 구조를 가지고 있는데, 이 구조 내에서 ATP가 두 개의 열편들 시에 존재하는 틈의 어떤 지역(단백질 인산화효소들 시에 아미노산 서열이 보존되어 있는)에 결합하는 것으로 보인다. 단백질 인산화효소들의 억제제들은 수소결합, 반 데르 발스 결합, 그리고 이온 결합과 같은 비공유결합적인 상호작용을 이용하여 앞서 말한 ATP가 단백질 인산화효소들과 결합하는 데에 사용된 동일한 지역에 결합하는 것으로 생각되고 있다. 좀 더 명확하게 말하면, 본 발명의 화합물들의 2-인돌리논 성분이 ATP의 아데닌 고리에 의해 보통 점유되는 일반적인 공간에 결합하는 것으로 생각되고 있다. 그렇다면 특정한 단백질 인산화효소에 대한 특정한 분자의 특이성은, 그 단백질 인산화효소에 특이적인 아미노산 부위들과, 2-인돌리논 핵에 대한 다양한 치환분들간의 추가적인 상호작용에 의해 일어나는 결과일 것이다. 따라서, 서로 다른 인돌리논 치환분들은 서로 다른 특정한 단백질 인산화효소들에 대한 선택적인 결합에 기여할 것이다. 서로 다른 ATP(또는 다른 뉴클레오티드) 결합 부위들에서 화합물들을 선택할 수 있는 능력은 본 발명의 화합 물들이 그런 부위를 가진 어떤 단백질도 표적화할 수 있도록 한다. 여기에 공개되는 화합물들은 따라서 그런 단백질들을 위한 생체외 분석에 유용할 뿐만 아니라 그런 단백질들과의 상호작용을 통해 생체내 치료효과를 보이는 데에도 유용할 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명의 화합물과의 접촉에 의해 그 촉매활성이 조절되는 단백질 인산화효소는 단백질 티로신 인산화효소이며, 좀 더 자세히 말해서 수용체 단백질 티로신 인산화효소이다. 그 촉매활성이 본 발명의 화합물 또는 그 염으로 조절될 수 있는 수용체 단백질 티로신 인산화효소들 중에는, (이것들로 한정짓 는 것은 아님) EGF, HER2, HER3, HER4, IR, IGF-1R, IRR, PDGFRα, PDGFRβ, CSFIR, C-Kit, C-fms, Flk-1R, Flk4, KDR/Flk-1, Flt-1, FGFR-1R, FGFR-2R, FGFR-3R, 그리고 FGFR-4R이 있다.
그 촉매활성이 본 발명의 화합물 또는 그 염 또는 전구의약물과 접촉함으로써 조절되는 단백질 티로신 인산화효소는 또한 비수용체 단백질 티로신 인산화효소 또는 세포질 단백질 티로신 인산화효소가 될 수 있다. 따라서, (이것들로 한정짓는 것은 아님) Src, Frk, Btk, Csk, Abl, ZAP70, Fes, Fps, Fak, Jak, Ack, Yes, Fyn, Lyn, Lck, Blk, Hck, Fgr, 그리고 Yrk와 같은 세포질 단백질 인산화효소의 촉매활성은 본 발명의 화합물 또는 염과 접촉함으로써 조절될 수도 있을 것이다.
그 촉매활성이 본 발명의 화합물과 접촉함으로써 조절될 수도 있는 또 다른 단백질 인산화효소군으로는 (이것으로 한정짓는 것은 아님) CDK2와 Raf와 같은 세린/트레오닌 단백질 인산화효소들이 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 단백질 인산화효소와 관련된 질병을 본 발명의 화합물 또는 그 염 또는 전구의약물을 유기체에 치료에 효과적인 양을 투여함으로써 치료하거나 예방하는 방법과 관련이 있다.
본 발명의 화합물 또는 그 염 또는 전구의약물을 포함하는 제약조성물을 단백질 인산화효소와 관련된 질병을 예방하거나 치료하기 위하여 유기체에 투여하는 것도 또한 본 발명의 한 측면이다.
따라서 본 발명은 수용체 단백질 티로신 인산화효소, 세포질 단백질 티로신 인산화효소, 그리고/또는 세린/트레오닌 인산화효소들의 효소활성에 영향을 미침으로써 단백질 인산화효소 신호 전달을 조절하여 위의 단백질들에 의해 전달되는 신호를 간섭하는 것을 지향하고 있다. 좀 더 자세히 말하면, 본 발명은 (이것들로 한정하는 것은 아님) 암종, 카포시씨 육종, 적아구종, 신경교아세포종, 수막종, 성상세포종, 흑생종, 그리고 근원세포종을 포함하는 많은 종류의 solid 종양들을 치유하기 위한 한 가지의 치료 방법으로서의, 수용체 단백질 티로신 인산화효소, 세포질 단백질 티로신 인산화효소, 그리고/또는 세린/트레오닌 인산화효소에 의해 매개되는 신호 전달 경로들을 조절하는 화합물들을 지향하고 있다. 백혈병과 같은 비-고형종양암의 치료 또는 예방 또한 본 발명에 의해 예상된다. 징후들은 (이것들로 한정하는 것은 아님) 뇌암, 방광암, 난소암, 위암, 췌장암, 직장암, 혈액암, 폐암, 그리고 골암들을 포함한다.
여기에 기술된 화합물들이 그 예방, 치료, 그리고 연구에 도움이 될 수 있는, 비정상적인 단백질 인산화효소 활성과 관련된 질병들의 유형들의 또 다른 예들로는, 세포 증식 질환, 섬유성 질환, 그리고 대사 질환들이 있다.
본 발명에 의해 예방, 치료, 또는 더 연구될 수 있는 세포 증식 질환들에는, 혈관세포 증식 질환들과 맥관막세포 증식 질환들이 있다.
혈관 세포 증식 질환들은 비정상적인 혈관신생(새로운 혈관의 형성)과 비정상적인 혈관형성(기존의 혈관의 확장)을 의미한다. 혈관신생과 혈관형성이 배아 발생, 황체 형성, 상처 치유, 그리고 기관 재생과 같은 다양한 정상적인 생리 작용에서 중요한 역할을 담당하고 있지만, 이들은 또한 종양이 계속 살아있게 만드는 데 필요한 새로운 모세혈관들을 형성함으로써 암의 발달에 중추적인 역할을 한다. 혈관 증식 질환의 다른 예들에는, 새로운 모세혈관이 관절로 침투하여 연골을 파괴하는 관절염과 새로운 모세혈관이 망막으로 침투하여 출혈을 일으키고 눈을 멀게하는 당뇨성 망막증가 포함된다.
Fms-유사 티로신 1 (fit-1) 수용체 (Shibuya et al., 1990, Oncogene 5:519-524; De Vries et al., 1992, Science 255:989-991)와 혈관 내피세포 성장 인자-수용체 2로도 알려져 있는 KDR/FLK-1 수용체라는, 구조적으로 연관이 있는 두 가지의 수용체 단백질 티로신 인산화효소들이 VEGF와 높은 친화도로 결합하는 것으로 알려져 있다. 혈관 내피세포 성장 인자(VEGF)는 생체외에서 내피세포의 성장을 촉진하는 활성이 있는 내피세포 특이 유사분열물질로 보고되어 있다(Ferrara & Henzel, 1989, Biochein. Biophys. Res. Comm., 161:851-858; Vaisman et al., 1990, J. Biol. Chem., 265:19461-19566. 미합중국 특허 출원 제 08/193,829로 제 08/038,596호 및 제 07/975,750로에 기술된 바에 의하면, 혈관 내피세포 성장 인자가 내피세포의 증식을 초래할 뿐만 아니라, 또한 정상적인 혈관형성과 병적인 혈관형성의 주요한 조절인자라는 것을 보여준다 (Klagsburn & Soker, 1993, Current Biology, 3(10):699-702; Houck, et al., 1992, J. Biol. Chem., 267:26031-26037.).
정상적인 혈관신생과 혈관형성은 배아 발생, 상처 치유, 기관 재생, 그리고 배란기에 황체에서의 난포 발달이나 임신 중의 태반 성장과 같은 여성 생식 과정들에서 중요한 역할들을 한다(Folkman & Shing, 1992, J. Biol. Chem., 267(16):10931-34.). 조절되지 않은 혈관신생 및/또는 혈관형성은 당뇨병과 같은 질환이나 성장을 위해 혈관신생을 필요로 하는 악성 고형종양들과 관련되어 있다(Klagsburn & Soker, 1993, Current Biology, 3(10):699-702; Folkman, 1991, J. Natl. Cancer Inst., 82:4-6; Weidner, et al., 1991, New Engl. J. Med., 324:1-5.).
혈관신생과 혈관형성의 과정에서 혈관 내피세포 성장 인자가 내피세포 증식과 이동에 관련되어 있을 것이라는 추측은 이 과정들에서의 KDR/FLK-1 수용체의 역할이 중요할 것이라는 것을 의미하고 있다. 진성 당뇨병 (Folkman, 198, in XIth Congress of Thrombosis and Haemostasis (Verstraeta, et al., eds.), pp. 583-596, Leuven University Press, Leuven)과 관절염, 그리고 악성 종양의 성장은 조절되지 않은 혈관형성의 결과일 것이다. 예를 들어 혈관 내피세포 성장 인자가 특이적으로 결합하는 수용체들은, 혈관신생 및/또는 혈관형성의 조절과 조정을 하기 위한, 그리고 이런 과정들에 의해 비정상적인 세포 성장이 야기되는 것과 관련된 갖가지의 심각한 질병들을 치료하기 위한 중요하고 유력한 목표들이 된다 (Folkman, 1971, N. Engl. J. Med., 285:1182-1186. 그리고 Plowman, et al., 1994, DN&P, 7(6):334-339.). 좀 더 엄밀히 말하면, KDR/FLK-1 수용체의 신혈관생성에서 맡고 있는 고도로 특이적인 역할은 조절되자않은 혈관 형성과 관련되어 있는 암과 기타 질병들을 치료하기 위한 치료법 연구에서 목표물로 선택된다.
따라서, 본 발명의 한 가지 측면은 혈관신생 및/또는 혈관형성을 억제하거나 촉진하기 위해 KDR/FLK-1 수용체 신호 전달을 포함하는 티로신 인산화효소 신호 전달을 조절 및/또는 조정할 수 있는 화합물들과 관련되어 있다. 즉, 본 발명의 한 가지 측면은 혈관 내피세포 성장 인자와 같은 리간드들에 의해 활성화될 때 KDR/FLK-1에 의해 전달되는 신호를 억제, 예방, 또는 간섭할 수 있는 화합물들과 관련되어 있다. 비록 본 발명의 화합물들이 티로신 인산화효소 신호 전달 경로상의 하나의 수용체 또는 다른 성분에 작용하는 것으로 생각되고 있지만, 이들은 조절안된 혈관형성의 결과로 발생한 종양세포에 대해 직접적으로 작용할 수도 있다.
비록 일반적인 "flk-I" 수용체의 인간과 설치류의 해당물에 대한 명칭들이 다르지만, 이들은 많은 면에서 교환이 가능하다. 설치류의 수용체인 Flk-1과 인간의 해당물인 KDR은 세포내 부위에서 93.4%의 서열 유사성이 있다. 마찬가지로, 설치류의 FLK-I는 생쥐의 혈관 내피세포 성장인자와 결합하는 것과 동일한 친화도로 인간의 혈관 내피세포 성장 인자와 결합하며, 따라서 인간이나 생쥐 어느 쪽의 리간드에 의해서도 활성화된다(Millauer et al., 1993, Cell, 72:835-846; Quinn et al., 1993, Proc. Natl. Aca. Sci. USA, 90:7533-7537.). FLK-1 또한 293 세포(인간 배아 신장 섬유아세포)에서 공동발현되었을 때 인간의 수용체 단백질 티로신 인산화효소(예를 들어 PLC-γ나 p85)와 결합하여 티로신 인산화를 일으킨다.
FLK-1 수용체라고 여겨지는 모형들은 KDR 수용체로 직접 사용할 수 있다. 예를 들어, 설치류의 신호 전달 경로를 조절하는 화합물로 동정된 설치류 FLK-1 수용체를, KDR 수용체의 활성을 조절하는 인간 신호 전달 경로의 조절에 직접 사용가능하다. 따라서, 생체외 실험에서 KDR/FLK-1의 저해제로 동정된 화학적 화합물은 생체내 모형에서도 적합하다고 확인할 수 있다. 생쥐와 쥐 등의 동물을 사용한 생체내 실험은 신호 전달 경로에서 발생한 KDR/FLK-1에 작용하는 작용물의 임상적 잠 재력 검사에서 우수한 수치를 나타내었다.
따라서, 본 발명의 태양은 KDR/FLK-1 수용체의 효소활성에 영향을 미치고 신호가 변화된 KDR/FLK-1로 효소활성을 방해하여 혈관신생성 그리고/또는 혈관형성을 조절하거나, 조장 혹은 저해하는 화합물을 나타낸다. 본 발명의 다른 태양은 뇌종양, 흑색종과 카포시 육종, 난소암, 폐암, 유방암, 전립선암, 췌장암, 대장암과 상피세포암을 포함하는, 그러나 제한되는 것은 아닌, 다양한 고형종양의 치료를 위한 치료적 접근으로서 KDR/FLK-1 이 중재하는 신호 전달 경로를 조절하거나, 조장 혹은 저해하는 화합물을 나타낸다. 첨가적으로, KDR/FLK-1이 중재하는 신호 전달 경로를 저해하는 화합물의 투약은 혈관종, 협착증, 당뇨성 신장이상의 치료에도 사용될 수 있다.
본 발명의 추가적인 태양은 flt-1 수용체를 포함하는 경로로 이루어진 다른 수용체가 중재된 경로에 의한 혈관신생성과 혈관형성의 저해에 관한 것이다.
수용체 티로신 인산화효소가 중재하는 신호 전달은 특이적 성장 인자(리간드)와 세포외 상호작용에 의해 개시되고, 수용체의 이합체화, 고유 단백질 티로신 인산화효소 활성과 자동인산화의 순간적인 자극에 의해 계속된다, 결합부위는 세포분열과 세포외 미세환경의 대사적 효과인 세포반응을 일으키는 세포질 신호 발생 분자 무리의 복합체 형성을 일으키는 세포내 신호전달 분자에 의해 생성된다(Schlessinger와 Ullrich, 1992, Neuron, 9:1-20).
KDR/FLK-1의 세포내 부위는, PDGF-β수용체(50.3% 상동) 그리고/혹은 신호 전달 경로의 중첩의 유도를 지시하는 flt-1 수용체와 밀접한 상동관계에 있다. 예 를 들어, src-군의 일원인, PDGF-β수용체(Twamley et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:7696-7700), 포스파티딜이노시톨-3'-키나제(Hu et al., 1992, Mol. Cell. Biol., 12:981-990), 포스포리파제 cγ(Kashishian & Cooper, 1993, Mol. Cell. Biol., 4:49-51), ras-GTPase-를 활성화시키는 단백질, (Kashishian et al., 1992, EMBO J., 11:1373-1382), PTP-ID/syp(Kazlauskas et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 10 90:6939-6943), Grb2 (Arvidsson et al., 1994, Mol. Cell. Biol., 14:6715-6726), Shc와 Nck의 어댑터 분자(Nishimura et al., 1993, Mol. Cell. Biol., 13:6889-6896)는 상이한 자동인산화 부위를 포함하는 영역과 결합함을 나타내고 있다(Claesson-Welsh, 1994, Prog. Growth Factor Res., 5:37-54.). 따라서, KDR/FLK-1에 의해 활성화되는 신호 전달 경로는 ras 경로(Rozakis et al., 1992, Nature, 360:689-692), PI-3'-키나제, src가 중재하고 plcγ가 중재하는 경로를 포함한다. 이들 각각의 경로는 내피세포에서 KDR/FLK-1의 혈관형성적 그리고/혹은 혈관신생성적 효과에 중요한 역할을 한다. 결과적으로, 본 발명의 또다른 태양은, 본 발명에서 설명한 이 경로들에 의해 조절되는 과정인 혈관형성과 혈관신생성을 조절하는 유기화합물의 사용에 관한 것이다.
바꿔말하면, 축소, 혈관의 수축이나 폐색, 협착증 같은 질병과 관계있으며, 또한 본 발명의 방법에 의해서 치료하거나 예방하는 것과 밀접한 관계가 있다.
섬유성 질병은 기질의 비정상적인 형성을 의미한다. 섬유성 질병의 예는 간경변과 맥관막성 세포 과다증식성 질병을 포함한다. 간경변은 간세포 손상으로 인해 기질 구성요소가 증가됨으로서 발생한다. 간세포 손상에서 발생한 기질의 증가 는 간염같은 세포감염에 의해 일어날 수 있다. 임파구는 간경변에서 중요한 역할을 한다. 또다른 섬유성 질병은 동맥경화와 밀접한 관련이 있다.
맥관막성 세포 과다증식성 질병은 맥관막성 세포의 비정상적인 과다증식때문에 발생하는 질병을 의미한다. 맥관막성 세포 과다증식은 사구체신염, 당뇨성 신장병증과 악성 신경화 뿐만 아니라, 혈전 세관이상 증후군, 장기이식 거부, 사구체이상 같은 다양한 인간의 신장 질병을 포함한다. 수용체 티로신 인산화효소 PDGFR은 맥관막성 세포 과다증식의 지속과 밀접한 관련이 있다(Floege et al., 1993, Kidney International 43:47s-54s.).
많은 암들은 상기에 기술한 것처럼, 세포 과다증식성 질병과 단백질 인산화 효소는 세포 과다증식성 질병과 관계되어 왔다. 따라서, 예를 들어, 단백질 인산화 효소같은 수용체 티로인 인산화 효소군의 일원이 암의 진전과 관련되는 것은 놀랍지 않다. EGFR (Tuzi et al., 1991, Br. J. Cacer 63: 227-233, Torp et al., 1992, APMIS 100:713-719), HER2/neu(Slamon et al., 1989, Science 244: 707-712)와 PDGF-R (Kumaba et al., 1992, Oncogene, 7:627-633)같은 수용체의 일부들은 많은 종양에서 과다 발현되거나/혹은 오토크라인 루프에 의해 지속적으로 활성화한다. 사실, 대부분의 일반적이고 심각한 암은 이러한 수용체의 과다 발현(Akbasak 과 Suner-Akbasak et al., 1992, J. Neurol. Sci., 111:119-133, Dickson et al., 1992, Cancer Treatment Res. 61:249-273, Korc et al., 1992, J. Clin. Invest. 90:1352-1360)과 오토크라인 루프(Lee and Donoghue, 1992, J. Cell. Biol., 118:1057-1070, Korc et al., supra, Akbasak 과 Suner-Akasak et al., supra)로 나타낸다. 예를 들어, EGFR은 스쿠아무스 세포 발암물질, 신경교성상세포종, 뇌종양, 머리와 목의 암, 폐암, 방광암과 관련된다. HER2는 유방암, 난소암, 위암, 폐암, 전립선암과 방광암과 관련된다. PDGFR은 뇌종양과 폐암, 난소암, 전립선암 뿐만 이나라 흑색종과 관련된다. 수용체 티로신 인산화효소 c-met은 또한 악성 종양 세포 형성과 관련된다. 예를 들어, c-met은, 다른 암에서도 마찬가지로, 결장-직장염, 갑상선, 췌장, 위장과 간세포의 발암물질과 임파종과 관련된다. 첨가적으로 c-met는 백혈병과 관련된다. c-met 유전체의 과다발현은 또한 홉킨스병(Hodgkins disease)과 버키트병(Burkitts disease)환자에게서 나타난다.
IGF-IR는 첨가적으로 식이처방에의한 보조(nutritional support)와 관련된 제2형 당뇨병과 관련되며, 심각한 암의 형태와 관련된다. 예를 들어, IGF-I은 심각한 종양의 형태, 즉 인간의 유방암 발암물질 세포(Arteaga et al., 1989, J. Clin. Invest. 84:1418-1423)와 소형 폐종양세포(Macauley et al., 1990. Cacer Res., 50:2511-2517)인 오토크라인 성장 자극제와 밀접한 관련이 있다. 첨가적으로, IGF-I은 반면, 정상적인 성장과 신경계의 분화에도 관련이 되며, 또한 인간 신경교종의 오토크라인 자극제로서 작용한다(Sandberg-Nordgvist et al., 1993, Cancer Res. 53:2475-2478.). IGF-IR과 IGF-IR의 세포 과다증식에서의 리간드는 많은 형태의 배양 세포(섬유원세포, 상피세포, 불수의성 근육세포, T-임파구, 미엘린 세포, 연골세포와 골수의 간세포(stem cell)인 조골세포)는 IGF-I에의해 성장이 촉진된다( Gordring 과 Gordring, 1991, Eukaryotic Gene Expression, 1:301-326). 일련의 최근 간행물에서 Baserga는 IGF-IR이 변형의 기작에서 중심적인 역할을 하 며, 인간의 악성질병의 광범위한 양상에 치료효과를 내는 바람직한 중재물질이 될 수 있다고 제안했다(Baserga, 1995, Cancer Res., 55:249-252, Baserga, 1994, Cell 79:927-930, Coppola et al., 1994, Mol. Cell. Biol., 14:4588-4595).
STKs는 특히 유방암(Cance, et al., Int. J. Cancer, 54:571-577(1993))을 포함하는 다양한 종류의 암과 관련된다.
비정상적 단백질 인산화 효소 활성과 질병시의 관계는 암에만 제한적인것은 아니다. 예를 들어, 수용체 단백질 인산화효소는 건선, 당뇨병, 자궁내막염, 혈관형성, 죽상 프라그 형성, 알츠하이머 병, 폰 히펠-린두 질병(von Hippel-Lindau disease), 피부세포 과다증식증, 신경 퇴행성 질병, 노화관련 검버섯 형성(age-related macular degeneration), 혈관종 같은 질병과 관련된다. 예를 들어, EGFR은 각막과 피부 상처의 치료를 나타낸다. 인슐린-R과 IGF-1R의 결함은 제2형 당뇨병을 나타낸다. 특이적 수용체 티로신 인산화효소와 이들의 치료적 조치 시의 더욱 완벽한 상호관계는 "Plowman et al., 1994, DN&P 7:334-339"에 설명되어 있다.
상기한대로, 수용체 티로신 인산화효소 뿐만 아니라 CTKs가 src, abl, fps, yes, fyn, lyn, lck, blk, hck, fgr과 yrk(Bolen et al., 1992, FASEB J., 6:3403-3409에서 재조사되었음.)를 포함하지만 제한되는 것은 아닌, 과다증식성 신호 전달 경로와 신진대사성 신호 전달 경로와 관련되며, 본 발명에서 설명한 단백질 티로신 인산화 효소가 중재하는 질병을 포함한 많은 질병을 예상할 수 있고, 나타낼 수 있다. 예를 들어, 변이된 src(v-src)는 닭에 있어서 발암성단백질 (pp60v-src)이다. 또한, v-src의 세포단위의 상동기관인 초기 발암유전자 pp60`는 많은 수용체에 발암성 신호를 전달한다. 종양세포에서 EGFR 이나 HER2/neu의 과량 발현은 정상세포에는 존재하지 않고 악성 세포에서 특징적으로 나타나는 pp60v-src의 본질적인 활성화를 유발한다. 반면에, 골화석증의 표현형을 저해하는 c-src의 발현이 결핍된 생쥐는 c-src가 파골 기능에 주요 역할을 하고 질병과 관련됨을 나타낸다.
유사하게, Zap70 은 자가면역 질병에 관련될 수 있는 T-세포의 신호발생과 관련이 있다.
STKs는 염증, 자가면역질병, 면역반응과 협착증, 섬유종, 골관절염과 류머티스성 관절염 같은 과다증식 질병과 관련되어왔다.
단백질 인산화 효소는 또한 배이식과 관련있다. 따라서, 본 발명의 화합물은 이러한 배 이식을 방지하는 효과적인 방법을 제공할 수 있어 산아 조절제로 유용하게 사용할 수 있다.
마지막으로, RTK와 CTKs 양자는 최근 과다 면역 질병과 관련된다고 추측하고 있다.
하나 혹은 그 이상의 상기한 단백질 인산화 효소의 촉매적 활성을 조장하는 화학적 화합물을 동정하는 방법은 본 발명의 또다른 태양이다. 방법은 본 발명의 화합물 또는 화합물의 염이나 전구약물(prodrug)을 함유한 바람직한 단백질 인산화효소가 접촉한 세포를 발현시키고, 화합물이 세포에 일으킬 수 있는 다른 효과에 대해 세포를 감시하는 것과 관련된다. 효과는 육안이나 기구를 사용하여 세포 표 현형의 변화 혹은 변화가 일어나지 않음을 관찰할 수 있다. 세포 표현형의 변화 혹은 변화가 일어나지 않음을 감시할 수 있으며, 예를 들어, 이하로 제한하는 것은 아닌, 세포내에서 단백질 인산화 효소의 촉매적 활성의 변화 혹은 변화가 일어나지 않음이나 자연적 결합 상대를 가지는 단백질 인산화 효소의 상호작용에서 변화 혹은 변화가 일어나지 않음을 감시할 수 있다. 본 발명의 다수의 전형적 화합물 효과의 예로서 몇몇 단백질 티로신 인산화효소를 표1, 표2와 아래의 생물학적 예 부위에 나타낸다. 나타낸 화합물과 자료는 어떤 방법으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석할 수는 없다.
6. 의약 조성물과 사용
본 발명의 화합물은, 전구약물, 즉, 화합물이나 화합물의 전구약물이 생리학적으로 수용가능한 염으로서 환자에게 투약할 수 있거나 상기한 물질들을 적합한 담체나 부형제로 혼합하여 의약 조성물로 투약될 수 있다. 약으로서 조성하거나 투약하는 기술은 "Remington's Pharmacological Science," Mack Publishing Co., Easton, PA" 최신판에서 찾을 수 있다.
투약의 경로
본 발명에서 사용한, "약을 주다"나 "투약"은 본 발명의 화합물, 염 혹은 전구약물 또는 본 발명의 화합물, 염 혹은 전구약물을 함유한 의약 조성물을 단백질 인산화효소 관련 질병의 예방이나 치료의 목적으로 유기체에 전달함을 의미한다.
투약의 적절한 경로는 경구, 직장, 점막이나 장으로 투약하는 것과 근육주사, 피하주사, 수질내부주사(intramedullary), 포막내부주사(intrathecal), 위장으 로 직접투약(direct intraventricular), 정맥주사, 초자체 내 투약(intravitreal), 복막내 투약(intraperitoneal), 비막내 투약(intranasal) 혹은 눈 내부로 직접 투약 (intraocular)하는 주사를 포함할 수 있지만 이것으로 제한하는 것은 아니다. 선호하는 투약의 경로는 경구투약이나 장관이외의 비경구적 투여이다.
선택적으로, 화합물을 국부적으로보다 전신으로 투여하면, 예를 들어, 직접 고형 종양세포에 화합물을 주사하면, 화합물은 종종 정체(depot)하거나 지속적으로 조성물을 방출한다.
또한, 약을 목적한 약의 전달계로 투약할 수 있다. 예를 들어, 리포좀에 종양세포-특이적 항체를 코팅하여 투약할 수 있다. 리포좀은 종양세포를 목표로 하여 종양세포에 선택적으로 흡수된다.
조성물/제형(Composition/Formulation)
본 발명의 의약 조합물은 이 분야, 즉, 통상적인 혼합, 용해, 과립화, 당의정으로 만들기, 가루등으로 매끄럽게 만들기, 유제화, 캡슐에 담기, 인트래핑과 동결건조 공정 등의 잘 알려진 공정으로 제조할 수 있다.
본 발명에 따라 사용하기 위한 의약 조합물은 하나 혹은 더이상의 생리학적으로 수용가능한 부형제와 활성 화합물이 의약으로 사용될 수 있도록 조합물을 만드는 공정을 촉진하는 보조물을 포함하는 운반체를 통상적인 방법으로 사용하여 조성할 수 있다. 적합한 조성물은 선택한 투약의 경로에 따라 달라진다.
주사로 사용하기 위해서, 본 발명의 화합물은 수용액, 바람직하게는 행크스 용액(Hank's solution), 링거 용액이나 생리 식염수 같은 생리학적으로 적합한 완 충액으로 조성하여야 한다. 비점막을 통하여 투여하도록 하기 위해서, 장벽을 투과할 수 있게 하는 표면활성제가 조성물내에 사용되어야 한다. 이러한 표면활성제는 이 분야에서 일반적으로 알려진 것이다.
경구 투약을 위해서, 화합물은 의약으로 수용가능한 운반체인 이 분야에서 잘 알려진 활성 화합물과 결합하여 조성하여야 한다. 운반체는 본 발명의 화합물을 정제, 알약, 함당정제, 당의정, 캡슐, 액상, 겔, 시럽, 비용해성 물질이 물과 같은 형태로 만들어진 슬러리, 현탁액과 그 유사물로 조성하여 환자에게 입을 통하여 섭취하게 하여야 한다. 경구투약을 위한 의약 준비물은 고형 부형제를 사용하여 만들수 있으며, 선택적으로 만들어진 혼합물을 가루로 만들수 있고, 혼합물을 과립으로 만들기도 하고, 필요하다면 다른 적당한 보조제를 첨가한 후, 정제나 중심부위를 당으로 코팅한 당의정을 얻을 수 있다. 유용한 부형제로서 특히, 락토즈, 수크로스, 만니톨 이나 솔비톨을 포함하는 당류와 예를 들어, 옥수수 전분, 밀전분, 쌀전분과 감자전분 같은 섬유질 조제물과 젤라틴, 검류, 고무수액, 메틸 셀룰로스, 히드록시프로필메틸-셀룰로스, 소디움 카르복시메틸셀룰로스, 그리고/혹은 폴리비닐-피롤리돈(PVP) 같은 충진제를 사용한다. 원한다면, 가교결합한 폴리비닐-피롤리돈, 한천 혹은 알긴산같은 분해제를 첨가할 수도 있다. 또한, 알긴산 나트륨같은 염을 첨가할 수도 있다.
당의정의 중심부위는 적절히 코팅하여 제공한다. 이러한 목적으로, 선택적으로 아라비안 검, 탤크, 폴리비닐 피롤리돈, 카보폴 젤, 폴리에틸렌 글리콜 그리고/혹은 티타늄 디옥시드, 라커 용액을 함유하는 농축한 당용액과 적절한 유기용매 혹은 유기용매 혼합물을 사용한다. 염료 혹은 색소를 활성 화합물 1회 분량의 상이한 조합을 특징짓거나 구별하기위해 정제나 당의정 코팅물에 첨가할 수 있다.
경구적으로 사용할 수 있는 의약 조성물은 젤라틴으로 만든 푸쉬-피트(push-fit) 캡슐, 부드럽고 젤라틴과 글리세롤이나 솔비톨 같은 가소제로 만든 밀봉한 캡슐로 만든 것을 포함한다. 푸쉬-피트 캡슐은 락토즈같은 충진제를 함유하는 혼합물 내에 활성성분과 전분같은 교결제, 그리고/혹은 탤크나 마그네슘 스테아레이트 같은 윤활제와 선택적으로 안정제를 함유한다. 연질 캡슐에서 활성 화합물은 패티오일(fatty oils), 액체 파라핀이나 액체 폴리에틸렌 글리콜 같은 적절한 용액에 용해하거나 현탁할 수 있다. 안정제는 이러한 조성물에 또한 첨가할 수 있다.
흡입에 의한 투여로, 본 발명에 따른 화합물을 사용하기위해 압축한 용기를 사용한 연무제 스프레이의 형태나 안개모양으로 약액를 뿜어내거나 적절한 추진제, 예를 들어, 제한되는 것은 아닌, 디클로로디프루오로메탄, 트리크로로프루오로메탄, 디클로로테트라-프루오로에탄과 이산화탄소로 편하게 전달할 수 있다. 압축한 용기를 사용한 연무제 스프레이의 경우, 1회 사용량은 계량된 분량을 전달하기 위한 밸브를 제공하여 조절할 수 있다. 예를 들어, 흡입기나 취분기로 사용하는 젤라틴의 캡슐과 카트리지는 화합물의 가루 혼합물과 락토즈나 전분같은 적절한 가루 베이스를 함유하여 조성할 수 있다.
화합물은 또한, 예를 들어, 둥근 덩어리로 주입하거나 연속적으로 정맥으로 주입하는 장관외 비경구적 투약을 위해서 조성할 수 있다. 주사를 위한 조성물은 1회 주입량의 형태, 즉, 보존제를 첨가한 앰플이나 수회 분량의 용기로 제공할 수 있다. 구성물은 현탁액, 용액, 에멀젼의 유상이나 수용액인 담체의 형태나 현탁제, 안정제 그리고/혹은 분산제같은 조성 물질을 함유하여 만들수 있다.
장관외 비경구적 투약을 위한 의약 구성물은 물에 용해되는 수용액의 형태, 예를 들어, 제한되는 것은 아닌, 활성 화합물의 염을 포함한다. 첨가적으로, 활성 화합물의 현택액은 친유성 담체로 준비한다. 적절한 친유성 담체는 패티오일(fatty oil), 참기름, 에틸 올레이트와 트리글세라이드 같은 합성 지방산 에스테르, 리포좀 같은 물질을 포함한다. 수용성 주사 현탁액은 소디움 카르복시메틸 셀루로스, 솔비톨 혹은 덱스트란 같은 현탁액의 점도를 증가시키는 물질을 함유할 수 있다. 선택적으로, 현탁액은 또한 적절한 안정제 그리고/혹은 화합물의 용해성을 증가시켜 고농축의 용액을 만들 수 있는 물질을 함유할 수 있다.
선택적으로, 활성 구성요소는 사용하기전에 적절한 담체인, 스테릴, 피로겐을 제거한 물과 사용할 수 있는 가루의 형태로 만들 수 있다.
화합물은 또한 직장에 사용할 수 있는 조성물로 통상적인 좌약의 베이스로 코코아버터나 다른 글리세라이드를 사용한 좌약 또는 보유 관장제를 만들 수 있다.
상기한 조성물에 첨가하여, 화합물은 준비물의 저장소(depot)로서 만들 수 있다. 이러한 장시간 작용하는 조성물은 예를 들어, 피하내부나 근육내부같은 피하주입이나 근육주사로 투약한다. 본 발명의 화합물을 적절한 중합성 혹은 소수성 물질(예를 들어, 의약으로 수용가능한 기름으로 만든 에멀젼)과 이온 교환 수지 혹은 물에 아주 녹지 않는 유도체, 예를 들어, 제한하는 것은 아닌, 물에 아주 녹지 않는 염으로 이러한 경로의 투약을 위해 조성할 수 있다.
본 발명의 소수성 화합물을 위한 의약 담체의 비제한적 예는 벤질 알코올, 비극성 계면활성제, 물과 혼합할 수 있는 유기성 중합체를 포함하는 공용매와 VPD 공용매계의 수용상으로 구성된다. VPD는 3%의 w/v 벤질 알코올, 8%의 w/v의 비극성 계면활성제 폴리솔베이트 80TM와 65% w/v 폴리에틸렌글리콜 300 용액이며, 에탄올로 부피를 벌충한다. VPD 공용매계(VPD:D5W)는 5% 덱스트로스 수용액에 1:1로 희석한 VPD로 구성된다. 이 공용매계는 소수성 화합물을 용해하며, 이 자체로서 전신 투약에 대해 낮은 독성을 나타낸다. 자연적으로, 이 자체의 특유한 용해성과 독성파괴하지 않고 사용하는 이러한 공용매계의 비율은 아주 다양하다. 더우기, 공용매 구성요소의 동일성(identity)은 변경할 수 있다: 예를들면, 낮은 독성을 가진 다른 비극성 계면활성제는 폴리솔베이트 80TM대신 사용할 수 있고, 폴리에틸렌 글리콜 분획물의 크기는 다양하며, 다른 생물학적으로 동화할 수 있는(biocompatible) 중합체는 폴리에틸렌 글리콜, 즉, 폴리비닐 피롤리돈으로 대체할 수 있고, 다른 당류나 다당류는 덱스트로스로 치환할 수 있다.
선택적으로, 소수성 의약 화합물의 다른 전달계를 사용할 수 있다. 리포좀과 에멀젼은 잘 알려진 소수성 약제를 전달하는 담체 혹은 운반체의 실예이다. 첨가적으로, 높은 독성을 나타내더라도 디메틸술폭시드 같은 유기 용매를 사용할 수도 있다.
첨가적으로, 약제를 포함하는 고형 소수성 중합체의 반투과성 기질 같은 지속적-분비계를 사용하여 화합물을 전달할 수 있다. 다양한 지속적- 분비물질은 확 인되어지며 이분야에서 숙련자들에게는 잘 알려져 있다. 지속적-분비 캡슐은 이들의 화학적 특성에 따라 달라지며, 수주내지 100 일 이상 동안 구성요소들을 분비할 수 있다. 치료에 사용하는 반응물의 화학적 특성과 생물학적 안정성에 따라 단백질을 안정화하는 방법을 사용한다.
여기의 의약 조성물은 또한 적절한 고형 혹은 젤상의 운반체나 부형제를 함유한다. 이러한 운반체나 부형제의 예는 탄산칼슘, 인산칼슘, 다양한 당류, 전분, 셀루로스 유도체, 젤라틴, 폴리에틸렌 글리콜 같은 중합체를 포함하며 제한적인 적은 아니다.
본 발명의 많은 단백질 인산화효소 조절 화합물은 생리학적으로 수용가능한 염으로서 청구한 바의 화합물은 음으로 혹은 양으로 하전된 종류의 화합물을 형성한다. 염의 예는 화합물이 양으로 하전된 일부분을 갖지만 제한되는 것은 아닌, 제4차(tert.) 암모늄 (이문서에서 정의되어져 있다), 하이드로클로라이드, 황산염, 탄산염, 유산염, 주석산염, 말산염, 제4차 암모늄의 질소원자가 사용된 산과 반응하는 본 발명의 선택한 화합물의 질소인 숙신산염 같은 염을 형성한다. 본 발명의 화합물의 염은 음으로 하전된 일부분을 포함하지만 제한되는 것은 아닌, 화합물의 카르복시기와 사용된 염기(예를 들어, 수산화 나트륨(NaOH), 수산화 칼륨(KOH), 수산화 칼슘(Ca(OH)2) 등)가 반응하여 형성한 나트륨, 칼슘과 마그네슘 염을 포함한다.
1회의 사용량
본 발명의 적절한 사용을 위한 의약 조성물은 활성 구성요소가 의도한 목적 을 충분히 달성할 수 있는 분량, 즉, 단백질 인산화효소와 관련되는 질병을 치료하거나 예방하느 단백질 인산화효소 활성을 조정할 수 있는 분량을 함유한 조성물로 구성된다.
더욱 특이적으로, 치료적으로 효과적인 분량은 질병의 증후를 예방, 완화 또는 개선하거나, 처방된 환자의 생존을 연장할 수 있는 분량을 의미한다.
치료적으로 효과적인 분량의 결정은 당업자의 재량으로 잘 알 수 있으며 특히 본 발명의 상세한 설명에서 명백하게 나타낸다.
본 발명의 방법에서 사용된 화합물의 치료에 효과적인 분량 혹은 투여량은 세포 배양 분석으로 초기에 추정할 수 있다. 그 후, 1회 분량을, 세포 배양에서 결정되는 IC50 즉, 단백질 인산화효소 활성의 최대치를 반으로 저해하는 실험용 화합물의 농도를 포함한 순환 농도 범위를 결정하기 위한 동물모델에 사용하기 위해 만든다. 이러한 정보는 이후 인간에게 유용한 1회분량을 더욱 정확하게 결정하기 위해서 사용한다.
이 문서에서 설명한 화합물의 독성과 치료적 효율성은 세포배양이나 실험 동물에서 표준 의약 절차, 즉, 목적한 화합물의 IC50와 LD50 (양자모두 본 문서에서 검토되었다.)의 결정에 의해 결정될 수 있다. 세포 배양 분석과 동물 연구에 의해 얻어진 자료는 인간에게 사용하기 위한 투여량의 범위를 결정할 때 사용될 수 있다. 1회 투여량은 투여하는 형태와 이용하는 투여 경로에 따라서 다양하다. 정확한 조성물, 투여의 경로와 1회 투여량은 환자의 상태에 대한 내과의사의 개인적인 견해에 따라 선택할 수 있다(Fingl, et al., 1975, in"The Pharmacological Basis of Therapeutics", Ch. 1 p. 1.).
1회 투여량과 투여간격은 인산화 효소가 조절하는 효과를 지속하기에 충분한 활성 종의 혈장 수준에 따라 개인적으로 조정된다. 이러한 혈장의 수준은 최소 효과 농도(MECs)로 나타낸다. 최소 효과 농도는 각각의 화합물에 따라 다양하며 생체외 실험 자료, 즉, 본 발명에서 설명한 분석을 이용하여 정할 수 있는, 인산화 효소를 50-90% 저해하기위해 필요한 농도 등의 자료에 의해 추정할 수 있다. 최소 효과 농도를 이루기 위해 필수적인 1회 투여량은 개인적인 특성과 투여 경로에 따라 달라진다. HPLC 분석이나 바이오 에세이는 혈장 농도를 결정하기 위해 사용할 수 있다.
투여 간격은 또한 최소 효과 농도 수치를 사용하여 결정할 수 있다. 화합물은 투여 시간동안 최소 효과 농도수치 10-90%인 혈장 수준을 유지하도록, 바람직하게는 30-90%, 더욱 바람직하게는 50-90% 를 유지하도록 다량 투여하여야 한다.
국부 투여나 선택적 사용의 경우, 효과적인 국부적 약의 농도는 혈장 농도와 관련되지 않을 수 있으며 이 분야에서 알려진 다른 절차가 정확한 투여량과 투여간격을 결정하기위해 사용될 수 있다.
투여할 조성물의 분량은 또한 치료될 환자, 고통의 심각성, 투약방법, 상기한 서술한 내과의사의 판단 등에 따라 달라진다.
포장
바란다면, 조성물은 FDA가 승인한 키트 같은 하나 혹은 그 이상의 단위로 활 성 구성요소의 1회 투여량을 함유하는 팩이나 약사가 사용하는 용기로 제공된다. 팩은 예를 들어, 금속이나 플라스틱 호일, 발포 팩 같은 팩을 포함한다. 팩이나 약사가 사용하는 용기는 투약을 위한 도구에 따라 다르다. 팩이나 용기는 정부 기관이 제조자, 조제용이나 판매를 통제하기 위해 서술한 관련 주의사항에 따라 다르며 주의사항은 조성물의 형태나 인간에게 혹은 동물에게 투약되는 형태에 대한 기관의 승인을 나타낸다. 이러한 주의사항은 예를 들어, 미합중국 식품 의약물국에 의한 승인은 조제약이나 승인한 제품을 첨가한 것을 표지로 나타낸다. 조성물은 발명의 화합물이 조성한 적합한 의약 운반체를 포함하며, 또한 준비되고, 적절한 용기에 담기며, 지시한 상태의 처방이 표지된다. 적절한 상태는 표지에 나타내며 처방이나 종양세포, 배아 상태에서의 혈관신생성의 억제, 섬유증의 치료, 당뇨병과 유사한 병의 치료를 포함한다.
7. 합성
본 발명의 화합물은 2-옥신돌의 전구체와 알데히드 뿐만 아니라, 이 화학의 분야에서 잘 알려진 기술을 사용하여 빨리 합성할 수 있다. 이는 당업자에의해 정확하게 인식되어 있으며, 본 발명의 화합물을 형성하는 다른 합성 경로도 사용가능하며 아래에서 실시예를 제공하지만 이것으로 한정되는 것은 아니다.
A. 일반적인 합성 절차
이하에서 본 발명의 화합물을 준비하기 위해 사용한 일반적인 방법을 사용한다.
적절하게 치환된 1당량의 2-옥신돌과 적절하게 치환된 1.2당량의 알데히드 와 0.1 당량의 피페리딘을 에탄올(1-2l/mmol 1-옥신돌)과 혼합하고, 혼합물을 90℃에서 3내지 5시간동안 가열한다. 냉각시킨 후, 반응 혼합물을 농축하고, pH3으로 산성화한다. 형성된 침전물을 여과하고 물로 세척하여 pH 7로 조정한 후, 냉각한 에탄올, 에틸아세테이트 그리고/혹은 헥산으로 세척한 후 진공 건조하여 목적한 화합물을 얻는다. 생성물은 크로마토그래피 분석으로 선택적으로 더욱 정제할 수 있다.
B. 2-옥신돌
이하 실시예는 본 발명의 화합물의 전구체인 2-옥신돌의 합성을 나타낸다. 이 2-옥신돌은 본 발명의 화합물로 상기 일반적인 합성 절차나 이하 C. 에서 구체화한 절차에서 적정하게 치환된 피롤 알데히드와 반응하여 특허를 청구하고 있는 화합물을 형성한다. 이하 합성에서 나타낸 사항을 합성경로나 구체적으로 옥신돌을 합성함에 있어 제한한다고 추정할 수는 없다.
5-아미노-2-옥신돌
5-니트로-2-옥신돌(6.3g)을 10%이상의 팔라듐을 포함한 탄소를 함유한 메탄올로 수소화하여 3g(60% 수율)의 백색 고형물인 표제의 화합물을 얻었다.
5-브로모-2-옥신돌
2-옥신돌(1.3g)을 함유한 20ml의 아세토니트릴을 -10℃까지 냉각하고 2.0g의 N-브로모숙신이미드를 천천히 교반하면서 첨가한다. -10℃에서 1시간동안 교반하여 반응시키고, 2시간동안 0℃에서 교반한다. 침전물을 수집하고, 물로 세척하여 1.9g (90%수율)이 될때까지 건조하여 표제화합물을 얻는다.
4-메틸-2-옥신돌
디에틸 옥살레이트(30ml)를 함유한 20ml의 건조 에테르를 교반하면서 50ml의 건조 에테르로 현탁한 19g의 칼슘에톡시드를 첨가한다. 혼합물을 얼음수조에서 냉각하고 20ml의 3-니트로-O-자일렌을 함유한 20ml의 건조 에테르를 천천히 첨가한다. 점도가 높고 어두운 붉은 색의 혼합물을 5시간동안 가열하여 환류반응시켜, 어두운 붉은 색의 고체로 농축하고, 10% 수산화 나트륨으로 고체가 거의 녹을 때까지 반응시킨다. 어두운 붉은색의 혼합물을 30% 과산화 수소수로 붉은 색이 노란색으로 바뀔때까지 반응시킨다. 혼합물을 10% 수산화 나트륨과 30% 과산화 수소수로 어두운 붉은 색이 나타나지 않을 때까지 번갈아 반응시킨다. 고형물은 여과하여 제거하고 여과액을 6N-염산으로 산성화시킨다. 결과 침전물을 진공 여과하여 수집하고, 물로 세척한 후, 진공상태에서 건조하여 9.8g(45% 수율)의 2-메틸-6-니트로페닐아세트산을 회색 고형물을 얻는다. 고형물은 10% 이상의 팔라듐을 함유한 탄소를 함유한 메탄올로 수소화하여 9.04g의 백색 고체물인 표제화합물을 얻는다.
7-브로모-5-클로로-2-옥신돌
5-클로로-2-옥신돌(16.8g)과 19.6g의 N-브로모숙신이미드를 140ml의 아세토니트릴로 현탁하고 3시간동안 환류반응시킨다. 얇은 막크로마토그래피(실리카, 에틸아세테이트)에서 2시간동안 환류반응하여 5-클로로-2-옥신돌이나 N-브로모숙신이미드(Rf 0.8), 생성물(Rf 0.85)과 2차 생성물(RF 0.9)을 얻는다. 얻어진 비율은 다른 시간동안 환류반응한 후에도 변하지 않았다. 혼합물을 10℃까지 냉각하고, 진공 여과하여 침전물을 수집한 후, 20ml의 에탄올로 세척하고 20분동안 펀넬(funnel)로 감압 여과하여 14.1g의 젖은 생성물(56% 수율)을 얻었다. 고형물은 200ml의 변성한 에탄올에 현탁하고 슬러리로 세척한 후 10분동안 교반하고 환류반응시킨다. 혼합물은 얼음수조에서 10℃까지 냉각한다. 고형 생성물은 진공 여과로 수집하고 40℃에서 진공건조하여 12.7g(51%수율)의 7-브로모-5-클로로-2-옥신돌을 얻는다.
5-플루오로-2-옥신돌
5-플루오로이사틴(8.2g)을 50ml의 히드라진 하이드라이트와 1시간동안 환류반응시킨다. 반응 혼합물을 얼음수조로 부어넣는다. 침전물을 여과하여, 물로 세척한 후 진공오븐에서 건조하여 표제화합물을 얻는다.
5-니트로-2-옥신돌
2-옥신돌(6.5g)을 25ml의 농축 황산으로 용해하고 2.1ml의 기체가 발생하는 질산을 한방울씩 첨가하면서 혼합물을 -10℃내지 -15℃로 유지한다. 질산의 첨가 후 반응 혼합물을 0℃에서 0.5시간동안 교반한 후 얼음물로 부어넣는다. 침전물을 여과하여 수집하고 물로 세척하여 50% 아세트산으로 결정화한다. 결정화 생성물을 여과하고 물로 세척한 후 진공상태에서 건조하여 6.3g(70%수율)의 5-니트로-2-옥신돌을 얻는다.
5-요도-2-옥신돌
2-옥신돌(82.9g)을 함유한 630ml의 아세트산을 기계적으로 교반하여 현탁하고 혼합물을 얼음물 수조에서 10℃까지 냉각한다. 고형 N-요오도숙신이미드(175g)의 일부를 10분동안 첨가한다. 첨가가 끝난 후 혼합물을 1시간동안 10℃에서 교반 한다. 현탁한 고형물은 항상 존재하며, 이때에는 점도가 매우 높아진다. 고형물을 진공 여과하여 수집하고, 50% 아세트산 수용액 100ml로 세척한 후 200ml의 물로 20 분간 깔때기에서 감압 건조한다. 생성물을 진공상태에서 건조하여 93.5g(36%수율)의 5-요오도-2-옥신돌을 함유하는 약 5%의 2-옥신돌을 프로톤 NMR로 분석하여 얻는다.
5-메틸-2-옥신돌
5-메틸-2-옥신돌(15.0g)과 60ml의 히드라진 하이드레이트를 140내지 160℃까지 4시간동안 가열한다. 얇은 막크로마토그래피(에틸아세테이트:헥산 1:2, 실리카 겔)를 시작 물질이 남아있지 않을 때까지 분석한다. 반응 혼합물을 실온에서 냉각하고, 300ml의 얼음물에 부어넣고 6N-염산으로 pH2까지 산성화 시킨다. 침전물을 2일 동안 실온에 방치한 후 진공여과하여 수집하고, 물로 세척한 후 진공 상태에서 건조하여 6.5g(47%수율)의 5-메틸-2-옥신돌을 얻는다.
5-브로모-4-메틸옥신돌 과 5,7-디브로모-4-메틸옥신돌
4-메틸-2-옥신돌(5g)을 함유한 40ml의 아세토니트릴을 7.26g의 N-브로모숙신이미드와 반응시켜 실온에서 4시간동안 교반한다. 얇은 막크로마토그래피(에틸아세테이트:헥산 1:2, 실리카 겔)로 5-브로모(Rf 0.3)와 5,7-디브로모(Rf 0.5)생성물의 혼합물을 분석한다. 또다른 7.26g의 N-브로모숙신이미드를 첨가하고 혼합물을 추가로 4시간동안 더 교반한다. 고형물은 진공여과하여 수집하고, 20ml의 아세토니트릴로 세척하고 건조하여 모노브로모와 디브로모의 비율이 1:1인 화합물의 혼합물을 얻는다. 여과물을 농축하고 실리카 겔(에틸 아세테이트: 헥산 (1:2))에서 크로마토그래피로 분석하여 베이지 색 고형물인 1.67g의 5-브로모-4-메틸-2-옥신돌을 얻는다. 고형물의 나머지 1:1 혼합물을 빙초산에서 2회 재결정화하여 3.2g의 옅은 오렌지 색 고형물인 5,7-디브로모-4-메틸-2-옥신돌을 얻는다. 이 물질의 여과액을 크로마토그래피로 분석하여 상기한 0.6g의 5-브로모-4-메틸-2-옥신돌과 옅은 오렌지색 고형물인 0.5g의 5,7-디브로모-4-메틸-2-옥신돌을 얻는다.
6-플루오로-2-옥신돌
소디움 하이드리드(2.6g)과 14.5g의 디메틸말로네이트를 함유한 160ml의 디메틸설프옥시트를 1시간동안 교반하면서 100℃까지 가열한다. 혼합물을 실온으로 냉각하여 7.95g의 2,5-디플루오로니트로벤젠을 첨가한 후, 혼합물을 30분동안 교반한다. 상기 혼합물을 100℃에서 1시간동안 가열하고, 실온으로 냉각한후 400ml의 포화 암모늄 클로라이드 용액으로 부어넣는다. 혼합물을 200ml의 에틸아세테이트로 추출하고 유기물층을 염류용액으로 세척한 후, 무수 황산나트륨으로 건조하고 진공상태에서 농축한다. 잔여물을 메탄올에서 결정화하여 흰색 고형물인 24.4g(80%수율)의 디메틸 4-플루오로-2-니트로페닐말로네이트를 얻고, Rf 0.2의 얇은 막크로마토그래피(에틸아세테이트: 헥산 1:6, 실리카 겔)로 분석한다. 여과물을 농축하고 실리카 겔(에틸아세테이트: 헥산 1:8) 칼럼에서 크로마토그래피로 분석하여 5.03g의 디메틸 4-플루오로-2-니트로페닐말로네이트를 첨가적으로 얻어 총 29.5g(96%수율)의 디메틸 4-플루오로-2-니트로페닐말로네이트을 얻었다.
디메틸 4-플루오로-2-니트로페닐말로네이트(5g)을 20ml의 6N-염산으로 24시간동안 환류반응하였다. 반응물을 실온으로 냉각하여 진공여과하여 백색 고형물을 얻었고, 물로 세척하고 건조하여 3.3g(87%수율)의 4-플루오로-2-니트로페닐아세트 산을 얻고, Rf 0.6의 얇은 막크로마토그래피(에틸아세테이트: 헥산 1:2, 실리카 겔)로 분석한다.
4-플루오로-2-니트로페닐아세트 산(3.3g)을 0.45g 이상의 10%팔라듐을 함유한 탄소 60 psi H2로 15ml의 아세트산에서 2시간동안 용해하여 수소화시킨다. 여과에 의해 촉매를 제거하고 15ml의 메탄올로 세척한다. 얻어진 여과액을 농축하고 물로 희석한다. 침전물을 진공여과하여 수집하고 물로 세척한 후, 건조하여 1.6g(70%수율)의 6-플루오로-2-옥신돌을 얻고, Rf 0.24인 얇은 막크로마토그래피로 분석한다. 여과액을 농축하여 NMR 스펙트럼으로 첫번째 유사한 무리(crop)들인 자주색 고형물을 얻었다. 자주색 고형물을 크로마토그래피(에틸아세테이트: 헥산 1:2, 실리카 겔)로 분석하여 두번째 무리들인 백색 고형물로서 6-플루오로-2-옥신돌을 얻는다.
5-아미노술포닐-2-옥신돌
100ml 플라스크에 27ml의 클로로술폰산을 넣고 13.3g의 2-옥신돌을 천천히 첨가한다. 반응온도는 첨가동안 30℃이하로 유지한다. 첨가후, 반응 혼합물은 실온에서 1.5시간동안 교반하고, 68℃에서 1시간동안 가열하고 냉각한 후 물속으로 부어 넣는다. 침전물은 물로 세척하고 진공 오븐에서 건조하여 더이상의 정제없이 사용하는 11.0g의 5-클로로술포닐-2-옥신돌(50% 수율)을 얻는다.
5-클로로술포닐-2-옥신돌(2.1g)을 10ml의 암모늄 히드록시드를 함유하는 10ml의 에탄올에 첨가하고 실온에서 밤새도록 교반한다. 혼합물은 농축하고, 진공 여과하여 고형물을 수집하여 0.4g(20%수율)의 회색 고형물인 표제화합물을 얻는다.
5-메틸아미노술포닐-2-옥신돌
10ml의 2M 메틸아민이 함유된 테트라하이드로푸란과 3.38g의 5- 클로로술포닐-2-옥신돌로 이루어진 현탁액을 실온에서 4시간동안 교반하여 생성한 백색 고형물을 얻는다. 침전물은 진공 여과하여 수집하고, 5ml의 물로 2회 세척한 후 진공상태, 40℃에서 밤새도록 건조하여 3.0g(88% 수율)의 5-메틸아미노설포닐-2-옥신돌을 얻는다.
5-(4-트리플루오로메틸페닐아미노설포닐)-2-옥신돌
2.1g의 5-클로로설포닐-2-옥신돌을 함유한 20ml의 디클로로메탄 현탁액과 1.6g의 4-트리플루오로메틸아닐린과 1.4g의 피리딘을 4시간동안 실온에서 교반하였다. 형성된 침전물을 진공여과하여 수집하고 5ml의 물로 2회 세척하고 진공상태, 40℃에서 밤새도록 건조하여 미정제된 물질을 포함하는 2.4g의 가공되지 않은(crude) 생성물을 얇은 막크로마토그래피로 분석하여 얻었다. 가종되지 않은 생성물을 에틸아세테이트: 헥산 (1:2)로 용출되는 실리카 겔로 크로마토그래피 분석하여 1.2g(37%수율)의 5-(4-트리플루오로메틸페닐아미노설포닐)-2-옥신돌을 얻는다.
5-(몰포리노서포닐)-2-옥신돌
2.3g의 5-클로로설포닐-2-옥신돌과 2.2g의 몰포린을 함유하는 50ml의 디클로로메탄 현탁액을 실온에서 3시간동안 교반하였다. 백색 침전물을 진공여과하여 수집하고 에틸아세테이트와 헥산으로 세척하고 진공상태, 40℃에서 밤새도록 건조하 여 2.1g(74%수율)의 5-(몰포리노술포닐)-2-옥신돌을 얻는다.
6-트리플루오로메틸-2-옥신돌
디메틸설폭시드(330ml)를 7.9g의 소디움 하이드라이드에 첨가한 후 43.6g의 디에틸옥살레이트를 한방울씩 첨가한다. 혼합물은 100℃에서 1시간동안 가열하고 실온으로 냉각한다. 2-니트로-4-플루오로메틸톨루엔(31.1g)을 첨가하고, 실온에서 30분간 교반하여 반응시킨 후, 100℃에서 1시간동안 가열한다. 반응물을 냉각한 후 혼합물을 에틸 아세테이트, 헥산, 포화 암모늄 클로라이드 수용액에 부어넣는다. 유기물 층을 포화 암모늄 클로라이드, 물과 염용액으로 세척하고 건조한 후 농축하여 디메틸 2-(2-니트로-4-트리플루오로메틸페틸)말로네이트를 얻는다.
6.4g의 리튬 클로라이드와 2.7ml 물을 함유한 100ml의 디메틸설폭시드 혼합물에 디에스테르를 첨가하여 100℃에서 30분간 가열한다. 반응물을 냉각하여 에틸아세테이트와 염류용액에 부어넣는다. 유기물을 염류용액으로 세척하고 소디움 설페이트로 건조한 후, 농축하고 실리카 겔(헥산에 10%의 에틸아세테이트가 함유되어있다)에서 크로마토그래피한다. 분획물을 함유하는 생성물을 얻은 후 증류하여 25.7g의 메틸-2-니트로-4-트리풀루로메틸페닐아세테이트 를 얻는다.
메틸-2-니트로-4-트리풀루로메틸페닐아세테이트(26g)를 10% 이상의 팔라듐을 함유한 탄소로 수소화하고 100℃에서 3시간동안 가열한다. 촉매는 여과하여 제거하고 용매는 증류하여 표제화합물을 얻는다.
5-(2-클로로에틸)옥신돌
얼음 수조에 있는 5-클로로아세틸-2-옥신돌(4.18g)을 함유한 30ml의 트리플 루오로아테트산을 4.65g의 트리에틸실란과 반응시키고 실온에서 3시간동안 교반한다. 혼합물을 150ml의 물속으로 부어넣고 침전물을 진공여과하여 수집한 후, 50ml의 물로 세척하고 건조하여 적갈색 고형물인 2.53g(65%수율)의 5-(2-클로로에틸)-2-옥신돌을 얻는다.
5-메톡시카르보닐-2-옥신돌
5-요도-2옥신돌(17g)을 2g의 팔라듐 디마세테이트, 18.2g의 트리에틸아민, 150ml의 메탄올, 15ml의 디메틸설폭시드와 일산화탄소를 충진한 2.6g의 DPPA를 환류반응시킨다. 24시간 후, 반응물을 여과하여 촉매를 제거하고 여과액을 농축한다. 농축물을 실리카 겔(헥산에 30%의 에틸아세테이트가 함유)로 크로마토그래피하여 분석한다. 생성물을 함유한 분획물을 농축하고 방치한다. 침전한 생성물을 진공여과하여 회색 고형물인 0.8g(7%수율)의 표제화합물을 얻는다.
4-카르복시-2-옥신돌
트리메틸시릴디아조메탄을 함유한 2M의 헥산용액에 2.01g의 2-클로로-3-카르복시-니트로벤젠을 함유한 20ml의 메탄올용액을 실온에서 기체가 발생하지 않을 때까지 한방울씩 첨가한다. 과량의 트리메틸시릴디아조벤젠-메탄을 아세트산으로 제거한다. 반응 혼합물을 회전식 펌프로 건조하고 잔사를 진공 오븐에서 밤새도록 더욱 건조한다. 생성물(2-클로로-3-메톡시카르보닐-니트로벤젠)을 다음 반응을 위해 충분히 부어넣는다.
디메틸 말로네이트(6.0ml)를 2.1g의 소디움 하이드라이트를 함유하는 얼음처럼 차가운 15ml의 DMSO에 첨가한다. 반응 혼합물을 100℃에서 1시간동안 교반한 후 실온까지 냉각한다. 2-클로로-3-메톡시카르보닉-니트로벤젠(2.15g)을 혼합물의 일부를 100℃에서 1.5시간동안 가열한 상기한 혼합물에 첨가한다. 반응 혼합물을 그 후 실온까지 냉각하고 얼음물 속으로 부어 넣고, pH 5까지 산성화한 후, 에틸아세테이트로 추출한다. 유기층을 염류용액으로 세척하고, 안하이드로스소디움설페이트로 건조한 후 농축하여 3.0g의 디메틸 2-메톡시카르보닐-6-니트로페닐마로네이트를 얻는다.
디메틸 2-메톡시카르보닐-6-니트로페닐마로네이트(3.0g)를 50ml의 6N-염산과 밤새도록 환류반응시킨다. 혼합물은 건조할때까지 농축하고 1.1g의 틴(II) 크로라이드를 함유하는 20ml의 에탄올과 2시간동안 환류반응시킨다. 혼합물을 셀라이트를 사용하여 여과하고, 농축한 후 실리카 겔(에틸아세테이트:헥산:아세트산)로 크로마토그래피분석하여 백색 고형물인 0.65g(37%수율)의 4-카르복시-2-옥신돌을 얻는다.
5-카르복시-2-옥신돌
2-옥신돌(6.7g)을 얼음수조내에 있는 교반중인 23g의 알루미늄 클로라이드를 함유한 30ml의 디클로로에탄 현탁액에 첨가한다. 클로로아세틱 클로라이드(11.3g)를 천천히 첨가하여 염산 기체를 발생시킨다. 10분간 교반한 후, 반응물을 1.5시간동안 40-50℃로 따뜻하게 한다. 얇은 막크로마토그래피(에틸아세테이트, 실리카 겔)로 출발물질이 남지 않도록 분석한다. 혼합물을 실온으로 냉각하고 얼음물속으로 부어넣는다. 침전물을 진공여과하여 수집하고, 물로 세척한 후 진공상태에서 건조하여 회색 고형물인 10.3g(98%수율)의 5-클로로아세틸-2-옥신돌을 얻는다.
9.3g의 5-클로로아세틸-2-옥신돌 현탁액을 80-90℃에서 3시간동안 90ml의 피리딘내에서 교반한 후 실온으로 냉각한다. 침전물은 진공여과하여 수집하고 20ml의 에탄올로 세척한다. 고형물은 90ml의 2.5N 수산화나트륨으로 용해하고 70-80℃에서 3시간동안 교반한다. 혼합물은 실온으로 냉각하고 0.5N 염산으로 pH2까지 산성화시킨다. 침전물은 진공여과하여 수집하고 물로 전체적으로 세척하여 정제되지 않은 암갈색 고형물인 5-카르복시-2-옥신돌을 얻는다. 여과액을 밤새도록 방치한 후 노란색 고형물인 2g의 5-카르복시-2-옥신돌을 얻는다. 정제되지 않은 암갈색 생성물을 뜨거운 메탄올로 용해하고 불용성 물질을 여과하여 제거한 후 여과액을 농축하여 갈색 고형물인 5.6g의 5-카르복시-2-옥신돌을 얻는다. 총 수율은 97%이다.
5-카르복시에틸-2-옥신돌
5-카르복시에틸-2-옥신돌(4.02g)을 25ml의 농축한 염산을 함유하는 10ml의 물에 첨가하여 4시간동안 환류반응시킨다. 혼합물을 냉각하고 물을 첨가한 후 진공여과하여 고형결과물을 얻은 후, 물로 세척하고 건조하여 노란색 고형물인 1.9g(44%수율)의 표제화합물을 얻는다.
5-요도-4-메틸-2-옥신돌
얼음수조에 있는 2g의 4-메틸-2-옥신돌을 함유하는 40ml의 빙초산에 3.67g의 N-요도숙신이미드를 첨가한다. 혼합물을 1시간동안 교반하고 50% 아세트산을 함유하는 100ml의 물로 희석한 후 여과한다. 백색 고형 결과물을 높은 진공 상태에서 건조하여 회색 고형물인 3.27g(88% 수율)의 표제화합물을 얻는다.
5-클로로-4-메틸-2-옥신돌
3.3 g의 N-클로로석시니미드를 나누어 넣으면서 3.0 g 의 4-메틸-2-옥신돌 현탁액을 상온에서 50 mL의 아세토나이트릴 안에서 교반하였다. 그 다음 트리플루오로아세트산 (1 mL)을 넣었다. 그 현탁액을 3일간 상온에서 교반하였는데 그 기간동안 언제나 고체가 존재하였다. 흰색 고체를 진공여과법으로 회수하고, 소량의 찬 아세톤으로 씻은 뒤 40℃의 진공 오븐에서 하룻밤동안 말렸다. 그 결과 2.5 g (68%)의 5-클로로-4-메틸-2-옥신돌을 얻었다.
5-부틸-2-옥신돌
상온의 20 mL의 트리플루오로아세트산 속에서 트리에틸신란 (2.3 g)을 2 g의 4-부타노일-2-옥신돌에 첨가하여 현탁액을 3 시간동안 교반하였다. 이 반응액을 얼음물에 쏟아부어서 방치하면 고형화되는 붉은 기름을 얻었다. 그 고체를 진공여과법으로 회수하여, 물과 헥산으로 씻고 말려서 1.7 g (수율 91%)의 표제의 화합물을 회색이 도는 흰색의 고체로 얻었다.
5-에틸-2-옥신돌
얼음 욕조에 있는 15 mL의 트리플루오로아세트산 속에 있는 5-아세틸-2-옥신돌 (2 g)에 천천히 1.8 g의 트리에틸실란을 첨가하였다. 이 반응액을 상온에서 5 시간동안 교반하였다. 1 mL의 트리에틸실란을 첨가하고 하룻밤동안 교반하였다. 이 반응혼합액을 얼음물에 쏟아 부어 그 결과로 생기는 침전물을 진공여과법으로 회수한 뒤, 많은 양의 물로 씻고 진공상태에서 말려 1.3 g (수율 71%)의 표제의 화합물을 노란 고체로 얻었다.
5-(몰폴린-4-에틸)-2-옥신돌
5-클로로에틸-2-옥신돌 (2.3 g), 1.2 mL의 몰폴린, 그리고 1.2 mL의 다이이소프로필에틸아민을 10 mL의 디메틸설폭시드 속에서 100℃로 하룻밤동안 가열하였다. 이 반응액을 식히고, 물에 부어서 에틸 아세테이트를 사용하여 추출하였다. 유기층을 소금물(염류용액)으로 씻은 뒤, 말리고 수분을 증발시켰다. 잔여물을 실리카겔(클로로포름 안에 5 % 메탄올)에서 색층분석하여 0.9 g의 표제의 화합물을 흰색 고체로 얻었다.
5-(4-메톡시카르보닐벤자미도)-2-옥신돌
82.0 mg의 5-아미노-2-옥신돌과 131.0 mg의 4-메톡시카르보닐벤조일 클로라이드의 혼합물을 상온에서 3 시간동안 교반한 뒤 얼음물에 쏟아 부었다. 침전물을 여과한 뒤 증류수로 씻고 진공 오븐에서 말려 138.0 mg의 5-(4-메톡시카르보닐벤자미도)-2-옥신돌 (수율 81%)을 얻었다.
5-(4-카르복시벤자미도)-2-옥신돌
5-(4-메톡시카르보닐벤자미도)-2-옥신돌 (0.9 g)과 0.4 g의 소디움 히드록시드를 25 mL의 메탄올에서 3 시간동안 환류반응시켰다. 이 혼합물을 농축하고 물을 첨가한 뒤 6N 염산으로 산성화하였다. 침전물을 진공여과접으로 회수하여 0.75 g (87%)의 표제의 화합물을 흰색 고체로 얻었다.
5-메톡시-2-옥신돌
클로랄 하이드레이트 (9.6 g)을 83 g의 소디움 설페이트를 포함한 200 mL의 물에 녹였다. 이 용액을 60℃로 가열하고, 50 mL의 물에 11.4 g의 히드록시아민 하 이드로클로라이드를 녹인 용액을 첨가한 뒤 이 혼합물의 온도를 60℃로 유지하였다. 또 다른 플라스크에서, 80 mL의 물에 6.4 g의 4-아니시딘과 4.3 mL의 농축염산을 섞은 용액의 온도를 80℃로 맞추었다. 첫번째의 용액을 두번째의 용액에 첨가하고 이 혼합물을 2 분동안 환류반응시킨 뒤 상온으로 천천히 냉각시키고 그 다음에 얼음 욕조에서 냉각시켰다. 황갈색의 침전물을 진공여과법으로 회수하고, 물로 씻은 뒤 진공상태에서 말려 8.6 g (수율 85%)의 N-(2-히드록시미노-아세틸)아니시딘을 얻었다.
5 mL의 물을 함유한 농축 황산 (45 mL)을 60℃로 데우고 8.6 g의 N-(2-히드록시미노아세틸)아니시딘을 한 번에 첨가하였다. 교반된 혼합물을 10 분동안 93℃로 가열한 뒤 상온에서 식혔다. 이 혼합물을 500 g의 얼음에 쏟아 붇고 에틸 아세테이트로 3 번 추출하였다. 화합한 추출물을 무수 황산 나트륨 위에서 건조시키고 농축시켜 5.1 g (수율 65%)의 5-메톡시이사틴을 어둡고 붉은 고체로 얻었다. 5-메톡시이사틴 (5.0 g)과 30 mL 히드라진 수산화물을 가열하여 15 분동안 환류반응시켰다. 이 반응혼합물을 상온에서 식히고 50 mL의 물을 첨가하였다. 이 혼합물을 각각 25 mL의 에틸 아세테이트를 사용하여 3 번 추출한 뒤, 유기층들을 모아 무수 황산 나트륨 위에서 건조시키고 농축하여 황색 고체를 얻었다. 이 고체를 에틸 아세테이트에서 교반하고 1.1 g의 불용성 물질을 진공여과법으로 모아 저장하였다. 이 물질은 2-히드라지노카로닐메틸-4-아니시딘으로 판명되었다. 여과액을 농축하여 실리카겔 상의 색층분석에서 에틸 아세테이트:헥산 (1:1)로 용출하여 0.7 g의 5-메톡시-2-옥신돌을 황색 고체로 얻었다. 이 1.1 g의 2-히드라지노-카보닐메틸-4-아니시 딘은 20 mL의 1N 가성 소다에서 1 시간동안 환류반응하였다. 이 혼합물을 냉각하고 농축 염산으로 pH 2로 산성화시킨 뒤 25 mL의 에틸 아세테이트로 3 번 추출하였다. 유기 추출물들을 모아 염류용액으로 씻고 무수 황산 나트륨 위에서 말리고 농축하여 0.8 g의 5-메톡시-2-옥신돌을 황색 고체로 얻었다. 연합수율은 1.5 g 또는 33%이었다.
7-아자옥신돌
3.3-디브로모-7-아자옥신돌 (2.9 g)을 20 mL 아세트산과 30 mL 아세토니트릴의 혼합물에 녹였다. 이 용액에 6.5 g의 아연 가루를 첨가하였다. 이 혼합물을 상온에서 2 시간동안 교반하였다. 생성된 고체를 혼합물로부터 여과하여 용매를 증발시켰다. 잔여물을 에틸 아세테이트로 현탁(slurry)하였다. 불용성 물질을 포함한 이 에틸 아세테이트 용액을 실리카겔의 짧은 컬럼으로 통과시켰다. 회수된 에틸 아세테이트 용액을 증발시키고 잔여물을 진공상태에서 말려 1.8 g (수율 91%)의 7-아자옥신돌 아세트산염을 얻었다.
5-디메틸아미노설포닐-2-옥신돌
메탄올에 10 mL의 2M 디메틸아민을 넣은 용액 속에 2.3 g의 5-클로로설포닐-2-옥신돌을 넣은 용액을 상온에서 4 시간동안 교반하였다. 이 때 흰색 고체가 형성되었다. 이 침전물을 진공여과법으로 회수하여 5 mL의 1N 가성 소다와 5 mL의 1N 염산으로 씻은 뒤 40℃의 진공상태에서 하룻밤동안 말려 1.9 g (수율 79%)의 5-디메틸아미노-술포닐-2-옥신돌을 얻었다.
6-페닐-2-옥신돌
25 mL의 디메틸설폭시드에 디메틸 말로네이트 (10 mL)을 첨가한 용액을 25 mL의 디메틸술폭시드에 3.5 g의 수산화 나트륨이 녹은 용액에 한 방울씩 떨어뜨리면서 첨가하여 이 혼합물을 100℃에서 10분동안 가열하였다. 이 혼합물을 상온에서 식힌 뒤 25 mL의 디메틸술폭시드에 4.7 g의 4-플루오로-3-니트로바이페닐이 녹은 용액을 첨가하였다. 이 혼합물을 100℃에서 2 시간동안 가열한 뒤 300 mL의 포화 염화 암모늄 용액으로 식히고 냉각하였다. 이 혼합물을 에틸 아세테이트로 3 번 추출하여 유기층들을 합친 뒤 물과 염류용액으로 씻고 증발시켜 거친(crude) 디메틸-3-니트로바이페닐-4-말로네이트를 황색 기름으로 얻었다.
거친(crude) 디메틸-3-니트로바이페닐-4-말로네이트를 30 mL의 6N 염산에서 24 시간동안 환류반응시켰다. 생성된 침전물을 여과법으로 회수하고 물로 씻은 뒤 말려 4.5 g의 3-니트로바이페닐-4-아세트산을 담황색의 고체로 얻었다.
40 mL의 아세트산에 4.5 g의 3-니트로바이페닐-4-아세트산이 녹은 용액에 철가루 (2.6 g)를 한 번에 첨가하였다. 이 혼합물을 2 시간동안 환류반응시키고 건조시킨 뒤 에틸 아세테이트에 녹였다. 고체들을 여과법으로 제거하고 여과액을 1N 염산과 염류용액으로 두 번 씻고 무수 황산 나트륨 위에서 건조시켰다. 여과액은 농축되어 3.4 g (수율 93%)의 6-페닐-2-옥신돌을 연갈색의 고체로 얻었다.
6-(2-메톡시페닐)-2-옥신돌
50 mL의 톨루엔과 50 mL의 에탄올에 5 g의 2-메톡시페닐보론산, 6.6 g의 5-브로모-2-플루오로니트로벤진, 그리고 30 mL의 2 M 탄산 소다를 녹인 용액에 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라디움 (I g)을 첨가하였다. 이 혼합물을 2 시간동안 환 류반응한 뒤 농축하고, 잔여물을 에틸 아세테이트로 두 번 추출하였다. 에틸 아세테이트층을 증류수와 염류용액으로 씻은 뒤 말리고 농축하여, 거친 4-플루오로-2'-메톡시-3-니트로바이페닐을 방치하면 고형화하는 암녹색의 기름으로 얻었다.
50 mL의 디메틸술폭시드에 2.9 g의 수산화 나트륨을 녹인 용액에 디메틸 말로네이트 (14 mL)을 첨가하였다. 이 혼합물을 100℃에서 15분간 가열하고 상온에서 냉각하였다. 60 mL의 디메틸술폭시드에 녹인 거친 4-플루오로-2'-메톡시-3-니트로바이페닐을 첨가하고 이 혼합물을 100℃에서 2 시간동안 가열하였다. 이 반응혼합물을 300 mL의 포화 염화 나트륨 용액으로 식히고 냉각한 뒤 에틸 아세테이트로 두 번 추출하였다. 추출물들을 모아 물, 염류용액, 그리고 포화 염화 암모늄으로 두 번 씻고 무수 황산 암모늄 위에서 말린 뒤 농축하여 거친 디메틸 2'-메톡시-3-니트로바이페닐-4-말로네이트를 황색 기름으로 얻었다.
거친 디메틸 2'-메톡시-3-니트로바이페닐-4-말로네이트를 50 mL의 6 N 염산에서 100℃로 24시간동안 가열하였다. 생성된 침전물을 여과법으로 회수한 뒤 물과 헥산으로 씻고, 건조시켜 9.8 g의 2'-메톡시-2-니트로바이페닐-4-아세트산을 연한 황갈색 고체로 얻었다. 철가루(Iron powder) 5g을 50 mL의 빙초산(glacial acetic acid)에 녹인 2′-메톡시-3-니트로바이페닐-4-아세테이트산에 조금씩 첨가하고, 3시간동안 100℃까지 가열하였다. 상기 반응 혼합물을 농축, 건조하고, 에틸 아세테이트에 녹여 초음파분해를 행한 후, 불용성물질을 제거하기 위해 여과하였다. 여과액은 1N 염산과 물로 두번 세척하고, 다시 염류용액로 세척하였다. 그리고, 무수 황산 나트 륨를 사용하여 건조, 농축하였다. 잔류물은 에틸 아세테이트:헥산 (1:2)혼합용매를 용출제로 사용하는 실리카겔 관 크로마토그래피로 분리하여 장미빛깔의 고체인 6-(2-메톡시페닐)-2-옥신돌 5.4g을 얻었다.
6-(3-메톡시페닐)-2-옥신돌
테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐 0.8g을 100mL 톨루엔에 녹인 5g의 3-메톡시페닐보론산 , 5g의 5-브로모-2-플루오로-니트로벤젠 및 11mL의 2M 탄산 나트륨 의 혼합물에 첨가하였다. 상기 혼합물을 2시간동안 환류반응시키고, 증류수로 희석한 후, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 에틸 아세테이트는 중탄산 나트륨 포화 용액과 염류용액로 세척한 후, 건조, 농축하여 유분기가 있는 고체를 얻었다. 상기 고체를 에틸 아세테이트: 헥산(1:6)혼합용매를 용출제로 하는 실리카 겔 크로마토그래피로 분리하여 4-플루오로-3′-메톡시-3-니트로바이페닐 4.3g(수율 77%)을 얻었다.
9.7mL의 디메틸 말로내이트를 디메틸술폭사이드 50mL에 현탁시킨 수산화 나트륨 2.0g에 천천히 첨가하였다. 상기 혼합물을 35분간 100℃까지 가열한 후, 실온으로 냉각하였다. 50mL의 디메틸설폭사이드에 녹인 4-플루오로-2′-메톡시-3-니트로바이페닐 4.2g을 첨가하고, 100℃에서 1시간동안 가열하였다. 상기 반응 혼합물을 냉각시키고, 300mL의 암모늄 클로라이드 포화 용액에 담지한 후, 에틸 아세테이트로 2번 추출하였다. 상기 추출물을 합하고, 염류용액로 세척하고, 무수 황산 나트륨으로 건조한 후, 농축하여 옅은 노란색 고체인 가공하지 않은 3′-메톡시-3-니트로바이페닐-4-말로내이트를 얻었다.
가공하지 않은 3′-메톡시-3-니트로바이페닐-4-말로내이트를 6N 염화 수소산 45mL에 녹여 4일동안 110℃에서 가열한 후, 냉각하였다. 침전물을 여과를 통해 회수하고, 물과 헥산으로 세척하고, 건조시켜 밝은 담갈색의 고체인 3′-메톡시-2-니트로바이페닐-4-아세테이트 5.3g을 얻었다.
3′-메톡시-2-니트로바이페닐-4-아세테이트 5.2g을 메탄올에 용해시키고, 3시간동안 실온에서 팔라듐을 10%이상 함유한 탄소 0.8g으로 수소화시켰다. 여과를 통해 촉매를 제거하고, 메탄올로 세척한 후, 여과액을 합하여 건조하여 갈색고체를 얻었다. 상기 고체는 에틸 아세테이트:헥산:아세트산(33:66:1) 혼합 용매를 용출제로 하는 실리카겔 크로마토그래피로 분리하여 분홍색 고체인 6-(3-메톡시페닐)-2-옥신돌 3.0g을 얻었다.
6-(4-메톡시페닐)-2-옥신돌
테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐 Ig을 5g의 4-메톡시페닐보론산 ,6.6g의 5-브로모-2-플루오로-니트로벤젠 및 2M 탄산 나트륨 30mL을 50mL 톨루엔과 50mL의 에탄올에 녹인 혼합물에 첨가하였다. 상기 혼합물을 2시간동안 환류반응시키고, 농축한 후, 에틸 아세테이트를 사용하여 2번 추출하였다. 에틸 아세테이트층은 물과 염류용액으로 세척한 후, 건조하고 농축하여 갈색의 유분기가 있는 고체를 얻었다. 상기 고체를 실리카 겔 (헥산에 녹인 5% 에틸 아세테이트) 크로마토그래피로 분리하여 옅은 노란색의 고체인 4-플루오로-4′-메톡시-3-니트로바이페닐 4.3g(수율 77%)을 얻었다.
디메틸 말로내이트 10mL를 디메틸술폭사이드 60mL에 현탁시킨 2.0g의 수산 화 나트륨에 천천히 첨가하였다. 상기 혼합물을 100℃까지 10분간 가열한 후, 실온으로 냉각하였다. 50mL의 디메틸술폭사이드에 녹인 가공하지 않은 4- 플루오로-2′-메톡시-3-니트로바이페닐 5.2g을 첨가하고, 100℃에서 2시간동안 가열하였다. 상기 반응 혼합물을 냉각시키고, 300mL의 암모늄 클로라이드 포화 용액에 담지한 후, 에틸 아세테이트로 3번 추출하였다. 상기 추출물을 합하고, 염화 암모늄 포화 용액으로 세척하고, 무수 황산 나트륨을 사용하여 건조한 후, 농축하여 노란색 기름인 가공하지 않은 디메톡시-4′-니트로바이페닐-4-말로내이트를 얻었다.
가공하지 않은 4′-메톡시-3-니트로바이페닐-4-말로내이트를 6N 염화 수소산 45mL에 녹여 15시간동안 100℃에서 가열한 후, 냉각하였다. 침전물을 여과를 통해 회수하고, 물과 헥산으로 세척한 후, 건조시켜 밝은 담갈색의 고체인 4′-메톡시-3-니트로바이페닐-4-아세테이트 7.2g을 얻었다.
철가루 3.6g을 50 mL의 빙초산(glacial acetic acid)에 녹인 4′-메톡시-3-니트로바이페닐-4-아세테이트산을 일부분씩 첨가하고, 100℃에서 24시간동안 가열하였다. 상기 반응 혼합물을 농축하여 건조하게 하고, 에틸 아세테이트에 녹여 초음파분해를 행한 후, 불용성물질을 제거하기 위해 여과하였다. 여과액은 1N 염산과 염류용액로 2번 세척하였다. 그리고 나서, 무수 황산 나트륨를 사용하여 건조시키고, 농축하여 장미 빛깔의 고체인 6-(4-메톡시페닐)-2-옥신돌 2.7g을 얻었다.
6-(3-에톡시페닐)-2-옥신돌
테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐 0.8g을 3-에톡시페닐보론산 4.2g, 5-브로모-2-플루오로-니트로벤젠 5.0g 및 2M 탄산 나트륨 22mL을 50mL 톨루엔과 50mL의 에탄올에 녹인 혼합물에 첨가하였다. 상기 혼합물을 2시간동안 환류반응시키고, 농축한 후, 증류수를 첨가하고, 상기 혼합물을 에틸 아세테이트를 사용하여 2번 추출하였다. 에틸 아세테이트 막은 물과 염류용액로 세척한 후, 건조하고 농축하였다. 상기 잔류물을 실리카 겔(에틸 아세테이트:헥산= 1:20) 크로마토그래피로 분리하여 옅은 노란색의 기름인 4-플루오로-3′-에톡시-3-니트로바이페닐 5.3g(수율 90%)을 얻었다.
디메틸 말로내이트 11.4mL를 디메틸설폭사이드 20mL에 현탁시킨 수산화 나트륨 4.0g에 한방울씩 첨가하였다. 상기 혼합물을 100℃까지 10분간 가열한 후, 실온으로 냉각하였다. 25mL의 디메틸설폭사이드에 녹인 가공하지 않은4- 플루오로-3′-에톡시-3-니트로바이페닐 5.3g을 첨가하고, 100℃에서 2시간동안 가열하였다. 상기 반응 혼합물을 냉각시키고, 300mL의 암모늄 클로라이드 포화 용액에 담지한 후, 에틸 아세테이트로 3번 추출하였다. 상기 추출물을 합하고, 물과 염류용액로 세척하고, 무수 황산 나트륨을 사용하여 건조한 후, 농축하여 노란색 기름인 가공하지 않은 디메톡시-3′-에톡시-3-니트로바이페닐-4-말로내이트를 얻었다.
가공하지 않은 3′-에톡시-3-니트로바이페닐-4-말로내이트를 6N 염화 수소산 45mL에 녹여 4시간동안 100℃에서 가열한 후, 냉각하였다. 침전물을 여과를 통해 회수하고, 증류수와 헥산으로 세척한 후, 건조시켜 밝은 담갈색의 고체인 3′-에톡시-3-니트로바이페닐-4-아세테이트 4.7g을 얻었다.
철가루 2.4g을 40 mL의 빙초산(glacial acetic acid)에 녹인 3′-에톡시-3-니트로바이페닐-4-아세테이트산에 조금씩 첨가하고, 2시간동안 환류반응을 시켰다. 상기 반응 혼합물을 농축하여 건조하게 하고, 에틸 아세테이트를 되풀이하여 처리하고, 불용성물질을 제거하기 위해 여과하였다. 여과액은 1N 염산과 염류용액으로 2번 세척하였다. 그리고, 무수 황산 나트륨를 사용하여 건조시키고, 농축하여 밝은 갈색의 고체인 6-(3-에톡시페닐)-2-옥신돌 3.5g(수율 91%)을 얻었다.
6-브로모-2-옥신돌
디메틸 말로내이트 13mL를 디메틸설폭사이드 20mL에 현탁시킨 수산화 나트륨 2.7g에 한방울씩 첨가하였다. 상기 혼합물을 100℃까지 10분간 가열한 후, 실온으로 냉각하였다. 25mL의 디메틸설폭사이드에 녹인 가공하지 않은 5-브로모-2-플루오로니트로벤젠 5.0g을 첨가하고, 상기 혼합물을 100℃에서 2시간동안 가열하였다. 상기 반응 혼합물을 냉각시키고, 300mL의 암모늄 클로라이드 포화 용액에 담지한 후, 에틸 아세테이트로 3번 추출하였다. 상기 추출물을 합하고, 암모늄 클로라이드 포화 용액, 물과 염류용액으로 세척하고, 무수 황산 나트륨을 사용하여 건조한 후, 농축하여 옅은 노란색 기름인 가공하지 않은 디메틸-4-브로모-2-니트로바이페닐말로내이트를 얻었다.
가공하지 않은 4-브로모--니트로바이페닐말로내이트를 6N 염화 수소산 45mL에 녹여 4시간동안 110℃까지 가열한 후, 냉각하였다. 침전물을 여과를 통해 회수하고, 물로 세척한 후, 건조시켜 회색의 고체인 4-브로모-2-니트로페닐아세테이트 5.3g(수율 89%)을 얻었다.
에탄올 5mL에 녹인 4-브로모-2-니트로페닐 아세테이트 0.26g, 아연 파우더 0.26g 및 50% 황산 3mL를 100℃에서 24시간동안 가열하였다. 상기 반응 혼합물을 여과하고 소량의 아세테이트를 사용하여 희석하고, 농축하여 에탄올을 제거하였다. 물로 희석하고, 에틸 아세테이트를 사용하여 2번 추출하였다. 혼합한 추출물은 염류용액로 세척하고, 무수 황산 나트륨을 사용하여 건조하고, 농축하여 노란색 고체인 6-브로모-2-옥신돌 0.19g(수율 90%)을 얻었다.
5-아세틸-2-옥신돌
1,2- 디클로로에탄에 현탁시킨 2-옥신돌 3g을 아세틸을 아세틸 클로라이드 3.2mL에 천천히 첨가하였다. 상기 현탁액을 50℃까지 5시간동안 가열하고, 냉각한 후, 물에 부었다. 그 결과 생성된 침전물을 진공여과를 통해 회수하고, 물로 충분히 세척한 후, 진공하에서 건조하여, 갈색 고체인 표제 화합물 2.9g (수율 73%)을 얻었다.
5-부타노일-2-옥신돌
냉각 장치내에서 1,2-디클로로-에탄 30mL에 현탄된 알루미늄 클로라이드 15g에 2-옥신돌 7.5g을 첨가한 후, 부타노일 클로라이드 12g을 첨가하였다. 상기 현탁액을 24시간동안 50℃까지 가열하였다. 혼합물을 얼음물에 붓고, 에틸 아세테이트를 사용하여 3번 추출하였다. 혼합한 에틸 아세테이트 막은 염류용액으로 세척하고, 황산 나트륨으로 건조시키고, 농축하여 갈색 고체를 얻었다. 이 고체를 에틸 아세테이트:헥산(1:20)혼합 용매를 용출제로 하는 실리카겔 크로마토그래피로 분리하여 노란색 고체인 표제 화합물 3g(수율 25%)를 얻었다.
5-시아노에틸-2-옥신돌
디메틸설폭사이드 15mL에 첨가한 시안화 칼륨 2.0g을 90℃까지 가열하였다. 5mL 디메틸 설폭사이드에 용해시킨 5-클로로에틸-2-옥신돌 3.0g을 교반하면서 천천히 첨가하였다. 상기 반응물을 2시간동안 150℃까지 가열한 후, 냉각하고 얼음물에 부었다. 진공여과를 통해 침전물을 회수하고, 물로 세척하여 건조한 다음, 메실리카겔(클로로포름에 녹인 5% 에탄올) 크로마토그래피로 분리하여 표제 화합물 1.2g(수율 42%)를 얻었다.
6-몰포린-4-일-2-옥신돌
6-아미노-2-옥신돌 2.2g, 2,2′-디브로모메틸 에테르 4.0g및 탄산 나트륨 7.9g을 20mL 에탄올내에서 2시간동안 환류반응을 하고, 농축하고, 물 50mL를 가하여 희석하였다. 상기 혼합물을 에틸 아세테이트 50mL를 사용하여 3번 추출하고, 상기 추출물을 합하고, 염류용액 20mL로 세척하고, 무수 황산 나트륨을 사용하여 건조하고 농축하여 고체화 하였다. 상기 고체를 0.7% 아세트산을 함유하는 에틸 아세테이트:헥산(1:1) 혼합 용매를 용출제로 하는 실리카 겔 관 크로마토그래피로 분리하여 베이지 색의 표제 화합물 1.2g(수율 37%)을 얻었다.
6-(3-트리플루오로아세틸페닐)-2-옥신돌
50mL 톨루엔에 녹인 3-아미노페닐보론산 3.9g, 5-브로모-2-플루오로-니트로벤젠 5g, 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐 0.8g 및 2M의 중탄산 나트륨 23mL를 2.5시간동안 질소 존재하에서 환류반응시켰다. 상기 반응 혼합물을 얼음물 200mL에 붓고, 에틸 아세테이트 50mL를 사용하여 3번 추출하였다. 합한 유기층을 물 50mL와 염류용액 20mL로 세척하고, 무수 황산 나트륨으로 건조하고, 농축하여 어두운 갈색 오일인 2- 플로오로-5-(3-아미노페닐)-니트로벤젠 9.7g(수율 92%)를 얻었 다.
트리플루오로 아세트산 5.4mL를 50mL의 디클로로메탄에 녹인 2-플로오로-5-(3-아미노페닐)-니트로벤젠 9.7g 과 트리에틸라민 5.3mL의 교반된 용액에 0℃ 에서천천히 첨가하였다. 상기 혼합물을 20분 더 교반하고, 농축하고, 잔류물을 에틸 아세테이트:헥산(1:10)혼합용매를 용출제로 사용한 실리카겔 관 크로마노그래피로 분리하여 실온에서 방치하면 고체가 되는 옅은 오렌지색 기름 인 2-플루오로-5-(3-트리플로오로아세트아미도페닐)니트로벤젠을 8.6g(수율65%)를 얻었다.
디메틸 말로내이트 9.6mL를 질소의 존재하에서 무수 디메틸술폭사이드 40mL에 녹인 미네랄 오일내에 용해된 60% 수산화 나트륨 3.2mg를 교반한 현탁액에 서서히 첨가하였다. 상기 혼합물을 10분간 교반하고, 디메틸술폭사이드 20mL에 녹인 2-플루오로-5-(3-트리플루오로아세트아미도-페닐)니트로벤젠을 첨가하였다. 생성된 어두운 붉은색의 혼합물을 100℃까지 2시간동안 가열하였다. 상기 반응물을 염화암모늄 포화 용액 100mL에 부어서 담지하고, 50mL의 에틸 아세테이트를 사용하여 2번 추출하였다. 유기층은 염화 암모늄 포화 용액, 물과 염류용액 각각 50mL로 세척하고, 무수 황산 나트륨을 사용하여 건조하고, 농축하여 노란색의 오일을 얻었다. 상기 오일은 실리카겔관 (에틸 아세테이트:헥산=1:4) 크로마토그래피로 분리하여 옅은 노란색 고체인 디메틸 2-[2-니트로-4-(3-트리플루오로아세트아미도페닐)페닐]-말로내이트 4.4g(수율 50)를 얻었다.
디메틸 2-[2-니트로-4-(3-트리플루오로아세느아미도페닐)-페닐]말로내이트 4.4g을 6N 염산 50mL에서 24시간동안 환류반응을 시켰다. 상기 반응 혼합물을 실 온으로 냉각하고, 진공 여과를 통해 고체를 회수하고, 물로 세척하고, 진공에서 건조하여 2-[2-니트로-4-(3-트리플루오로아세트아미도페닐)페닐]아세트산 2.7g(수율 73%)를 얻었다.
아세트산 3mL에 녹인 2-[2-니트로-4-(3-트리플로오로아세트아미도페닐)페닐]아세트산 100mg 과 철가루(iron powder) 50mg을 100℃에서 2시간동안 가열하였다. 싱기 반응 혼합물을 농축하고, 잔류물은 5mL의 에틸 아세테이트를 사용하여 초음파로 분쇄하였다. 불용성 물질은 진공여과를 통해 제거하고, 여과액은 1N 염산, 물 과 염류용액로 세척하고 무수 황산 나트륨으로 건조, 농축하여 장미빛을 띄는 고체인 표제 화합물 10mg(수율 14%)를 얻었다.
B. 알데하이드
5-포밀-2,4-디메틸-1H-포밀-3-카르복실산
t-부틸-3-옥소뷰티레이트 158g (1mol)을 온도계, 첨가(additional)깔대기 및 기계 교반기가 장착된 3-목 둥근 바닥 플라스크에서 아세트산 200mL에 용해시켰다. 상기 혼합물은 냉각 장치에서 약 10℃로 냉각시킨 후, 온도를 15℃이하로 유지하면서 75분동안 질산 나트륨 69g(1mol)를 첨가하였다. 냉각장치를 제거하고, 반응 혼합물을 30분간 교반한 후, 3.5시간동안 방치하여 t-부틸-2-하이드로시이미노-3-옥소부티레이트를 얻었다.
에틸-3-옥소뷰티레이트 130g(1mol)를 온도계, 첨가깔대기 및 기계 교반기가 장착된 3-목 둥근 바닥 플라스크에서 아세트산 2L에 용해시키고, 기름 중탕기(oil bath)에 방치하였다. 아연 가루(zinc dust) 50g(70.6몰)을 첨가하고, 상기 혼합물 을 교반하면서 60℃에서 가열하였다. 위에서 준비된 t-부틸- 히드록시가미노-3-옥소뷰티레이트를 천천히 첨가하고, 반응 혼합물의 온도를 65℃로 유지하였다. 그리고 나서, 전량의 t-부틸 에스테르를 첨가하는 마지막 부분에서 아연 가루(zinc dust) 50g(3.06mol)씩 4번 첨가하였다. 마지막 첨가의 온도는 64℃였다. 온도를 70℃내지 75℃까지 상승시키고, 1시간동안 교반하고 나서 5L의 물을 부었다.
진공 여과를 통해 유동성의 회색 침전물을 회수하고 물 2L로 세척하여 습기가 있는 천연 생성물을 얻었다. 상기 생성물을 1L의 뜨거운 메탄올에 용해시키고, 아연을 제거하기 위해 여과하였다. 여과액은 침전물이 형성될 때까지 냉각시켰다. 진공 여과를 통해 회수한 침전물을 건조하여 생성물의 118g을 얻었다. 침전물을 냉장고 안에 보관하여 또 다른 생성물이 침전되었다. 총 173.2g의 3,5-디메틸-1H-피롤-2,4-디카르복실-산 2-테르트-부틸-에스테르 4-에틸-에스테르를 얻었다.
3,5-디메틸-1H-피롤-2,4-디카르복실산 2-tert-부틸-에스테르 4-에틸 에스테르 80.1g(0.3mol)과 트리플로오로아세트산 400mL를 온도계, 첨가깔대기 및 기계 교반기가 장착된 3-목 둥근 바닥 플라스크에서 5분간 교반하고, 기름 중탕내에서 40℃까지 가열하였다. 그리고 나서, 상기 혼합물을 -5℃로 냉각하고, 트리에틸 오소포메이트 (orthoformate) 67.0g(0.45mol)를 즉시 첨가하였다. 그리고, 온도를 15℃로 상승시켰다. 상기 혼합물을 약 1시간동안 교반하고, 냉각 장치(cold bath)에서 꺼내고 나서 다시 1시간동안 교반하였다. 트리플루오로아세트산을 회전식 증발기를 통해 제거하고, 잔류물을 냉장고에 방치하여 고체화하였다. 상기 고체를 따뜻하게 하여 용해시키고, 얼음 500g을 부었다. 상기 혼합물을 800mL 디클로로메탄 을 사용하여 추출하여 붉은색 용액과 갈색 침전물을 얻었으며, 이를 저장하였다. 침전액을 분리하고, 중탄산 나트륨 150mL로 세척하였다. 디클로로메탄 층 역시 중탄산 나트륨 150mL로 세척하였다. 그리고 나서, 디클로로메탄 용액은 물 100mL로 3번더 세척하였다. 디클로로메탄 용액을 증발시켜 건조시켰다. 남아있는 어두운 빛깔의 잔류물은 Darco 흑색탄소(carbon black)로 이루어진 에틸 아세테이트로부터 2번 재결정되어 황금빛을 띤 노란색 침상결정을 얻었다. 갈색의 침전액은 Darco를 함유하는 350mL의 에틸 아세테이트로부터 재결정되어졌다. 모든 재결정되어진 고체들은 혼합하고, 에탄올 500mL로부터 재결정되어 노란색 침상결정인 (mp 165.6-166.3℃, lit. 163-163℃) 5-포밀-2,4-디메틸-1H-피롤-3-카르복실산 에틸 에스테르 37.4g(수율63.9%)로 얻었다. 에틸 아세테이트 와 잔류된 에탄올을 증발시키고 남은 잔류물을 결합하고, 에탄올 500mL로부터 재결정하여 탁한 노란색 침상 결정인 두번째 결과물을 10.1g 또는 생성물을 얻었다.
5-포밀-2,4-디메틸-1H-피롤-3-카르복실산 에틸 에스테르 2g(10mmol)을 메탄올3mL와 물 10mL에 용해된 수산화나트륨3g(53mmol) 용액에 첨가하였다. 상기 혼합물을 3시간동안 환류시키고, 실온으로 냉각하고, 6N 염산을 첨가하여 pH3으로 산성화하였다. 형성된 상기 고체를 여과를 통해 회수하고, 물로 세척하고, 진공오븐에서 24시간동안 건조하여 5-포밀-2,4-디메틸-1H-피롤-3-카르볼실산 1.6g(수율93%)를 얻었다.
1H NMR(300 MHz, DMSO-d6): δ12.09 (s, br, 2H, NH & COOH), 9.59 (s, 1H, CHO), 2.44 (s, 3H, CH3), 2.40 (s, 3H, CH3)
5-포밀-2,4-디메틸-1 H -피롤-3-카르복실산-(2-디메틸아미노에틸)-아미드
디메틸폴아미드(dimethylforamide) 10mL에 녹인 5-포밀-2,4-디메틸-1H-카르복실산 1.67g(10mmol)을 벤조트리아졸-1-일옥시트리스(디메틸아미노)-포스포니움 헥사플루오로포스페이트 (BOP reagent, 13.5mmol)을 첨가하고, 디이소프로필에틸아민 3mL을 첨가하였다. 상기 혼합물을 5분간 교반한 후, N,N-디메틸에틸렌디아민 1mL를 첨가하고, 실온에서 24시간동안 교반하였다. 상기 반응 혼합물에 1N의 수산화나트륨 25mL와 염류용액 25mL을 첨가하였다. 상기 혼합물을 30분간 교반한 후에, 물100m에 붓고, 디클로로메탄에 녹인 10% 메탄 200mL를 가지고 3번 추출하였다. 유기층을 화합하고, 무수 황산 나트륨으로 건조하고, 회전식 증발기를 사용하여 증발시켰다. 남아있는 잔류물을 크로마토그래피(실리카겔 관, 디클로로메탄에 녹인 5%-10% 메탄올)로 분리하여 5-포밀-2,4-디메틸-1H-피롤-3-카르복실산 (2-디메틸아미노-에틸)-아미드 1g(수율 42%)를 얻었다.
1H NMR(360 MHz, DMSO-d6): δ11.77 (s, 1H, NH), 9.53 (s, 1H, CHO), 7.34 (t, J = 5.6 Hz, 1H, CONH), 3.27 (m, 2H, CONCH 2 CH2), 2.37 (t, J = 6.8 Hz, 2H, CONCH 2 CH 2), 2.35 (s, 3H, CH₃), 2.3 (s, 3H, CH₃), 2.17 (s, 6H, 2 x CH3)
MS m/z 283.3 [M+1]+.
3,5-디메틸-4-(4-메틸-피페라진-1-카르보닐)-1 H -피롤-2-카르복시알데하이드
벤조트리아졸-1-일옥시트리스(디메틸아미노)-포스포니움 헥사플루오로포스페이트 (BOP reagent, 6g, 13.5mmol)을 10mL 디메틸포름아미드에 녹인 5-포밀-2,4-디메틸-1H-피롤-3-카르복실산 1.67g(1mmol)에 첨가하고, 디이소프로필에틸아민 3mL을 첨가하였다. 5분간 교반한 후에, 1-메틸피페라진 2mL를 첨가하고, 상기 반응 혼합물을 실온에서 24시간동안 교반하였다. 그리고, 반응 후에 1N 수산화나트륨 25mL와 염류용액 25mL를 첨가하였다. 30분간 교반한 후에, 상기 반응 혼합물을 100mL의 물에 붓고, 디클로메탄에 녹인 10% 메탄 200mL을 가지고 3번 추출했다. 유기 막을 화합하고, 무수 황산 나트륨으로 건조하고, 회전식 증발기를 사용하여 증발시켰다. 남아있는 잔류물은 크로마토그래피(실리카 겔 관, 디클로로메탄에 녹인 5%-10% 메탄)로 분리하여 3,5-디메틸-4-(4-메틸-피페라진-1H-카르보닐)-1H- 피롤-2- 카르복시알데하이드 1g(수율 40%)를 얻었다.
1H NMR(360 MHz, DMSO-d6): δ11.82 (s, 1H, NH), 9.50 (s, 1H, CHO), 3.14 (br, m, 4H, 2xCH2), 2.29 (br m, 4H, 2xCH2), 2.19 (s, 3H, CH3), 2.17 (s, 3H, CH3), 2.14 (s, 3H, CH3)
MS EI 249 [M]+.
피롤기로 치환된 2-인돌리논
본 발명의 대표적인 화합물의 합성방법은 다음과 같은 실시예를 통해 보다 구체화되어진다. 그러나, 본 발명을 구성하는 합성물이나 합성 방법에 관한 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되어지는 것은 아니다.
실시예 1
3-[5-(5-클로로-2-옥소-1,3-디하이드로인돌-3-일리덴메틸)-4-메틸-1H-피롤-3-일]-프로피온산
50mL의 에탄올에 녹인 4-(2-카르복시에틸)-2-포밀-3-메틸피롤 4.5g, 5-클로로-2-옥신돌 4.2g 및 피페리딘 2.9mL을 5시간동안 95℃까지 가열하였다. 상기 반응 혼합물을 냉각,농축하였다. 잔류물을 아세톤에 현탁시키고, 노란색의 침전물을 여과시킨 후, 차가운 에탄올, 2N 염산 수용액 및 증류수로 세척하여 pH6의 상태에 이르게 한 후, 진공 오븐에서 24시간동안 건조하여 노란색 고체인 표제 화합물 7.2g(수율 88%)를 얻었다.
1H NMR(360 MHz, DMSO-d6): δ13.31 (s, br, 1H, NH-1′), 12.06(s, br, 1H, COOH), 10.88 (s, br, 1H, NH-1), 7.93 (d, J = 1.88 Hz, 1H, H-4), 7.75 (s, 1H, H-vinyl), 7.19 (d, J = 3.1 Hz, 1H, H-2′), 7.1 (dd, b, J = 1.88, 8.40 Hz, 1H, H-6), 6.84 (d, J = 8.40 Hz, 1H, H-7), 2.65 (t, J = 7.44 Hz, 2H, CH2CH2COOH), 2.46 (t, J = 7.44 Hz, 2H, CH2CH2COOH), 2.28 (s, 3H, CH₃).
실시예 2
3-[5-(6-메톡시-2-옥소-1,3-디하이드로인돌-3-일리덴메틸)-4-메틸-1H-피롤-3-일]-프로피온산
50mL의 에탄올에 녹인 4-(2-카르복시에틸)-2-포밀-3-메틸피롤 190mg, 6-메톡시-2-옥신돌 163mg 및 피페리딘 2.9mL을 90℃까지 3시간동안 가열하였다. 상기 반응 혼합물을 냉각,농축하였다. 잔류물을 6N 염산 수용액에 현탁시키고, 침전물을 여과시키고, 증류수로 세척하여 pH6의 상태에 이르게 한 후, 진공 오븐에서 건조하여 갈색 고체인 표제 화합물 140mg(수율 43%)를 얻었다.
1H NMR(360 MHz, DMSO-d6): δ13.1 (s, br, 1H, NH-1′), 12.04 (s, br, 1H, COOH), 10.76 (s, br, 1H, NH-1), 7.63 (d, J = 8.29 Hz, 1H, H-4), 7.46 (s, 1H, H-vinyl), 7.07 (d, J = 3.03 Hz, 1H, H-2′), 6.55 (dd, J = 2.32, 8.29 Hz, 1H, H-5), 6.43 (d, J = 2.32 Hz, 1H, H-7), 3.74 (s, 3H, OCH₃) 2.63 (t, J = 7.31 Hz, 2H, CH2CH2COOH), 2.45 (t, J = 7.31 Hz, 2H, CH2CH2COOH), 2.23 (s, 3H, CH₃); MS m/z (상대 강도, %) 327 ([M+1]+, 100).
실시예 3
3-[5-(5-클로로-2-옥소-1,2-디하이드로인돌-3-일리덴메틸)-2,4-디메틸-1H-피롤-3-일]-프로피온산
50mL의 에탄올에 녹인 3-(2-카르복시에틸)-2,4-디메틸-5-포밀피롤 220mg, 5-클로로-2-옥신돌 147mg 과 피페리딘 2.9mL를 90℃까지 3시간동안 가열하였다. 상기 반응 혼합물을 냉각,농축하였다. 잔류물을 6N 염산 수용액에 현탁시키고, 침전물을 여과시키고, 증류수로 세척하여 pH6의 상태에 이르게 한 후, 진공 오븐에서 건조하여 갈색 고체인 표제 화합물 172mg(수율 50%)를 얻었다.
1H NMR(360 MHz, DMSO-d6): δ13.42 (s, br, 1H, NH-1′), 12.03 (s, br, 1H, COOH), 10.80 (s, br, 1H, NH-1), 7.87 (d, J = 2.06 Hz, 1H, H-4), 7.67 (s, 1H, H-vinyl), 7.06 ( dd, J = 2.06, 8.3 Hz, 1H, H-6), 6.83 (d, J = 8.3 Hz, 1H, H-7), 2.64 (t, J = 7.6 Hz, 2H, CH2CH2COOH), 2.34 (t, J = 7.6 Hz, 2H, CH2CH2COOH), 2.29 (s, 3H, CH₃), 2.27 (s, 3H, CH₃); MS m/z (상대 강도, %) 345 ([M+1]+, 64).
실시예 4
3-[4-메틸-5-(2-옥소-1,2-디하이드로인돌-3-일리덴메틸)-1H-피롤-3-일]-프로피온산
1.5g의 금속인 나트륨을 온도계, 환류반응 컨덴서(reflux condenser) 및 자동 교반기가 장착된 3-목 둥근 바닥 플라스크에 담고, 기름 중탕에 방치하였다. 엡솔루트 에탄올 1L을 교반하면서 첨가하였다. 나트륨이 다 용해되었을때, 350g의 펜탄-2,4-디온을 즉시 첨가하고, 30여분에 걸쳐 에틸 아세테이트 310g을 첨가하였다. 상기 혼합물을 2.5시간동안 환류반응시키고, 24시간동안 실온으로 냉각하였다. 빙초산 3mL을 첨가하고 회전식 증발기를 사용하여 용매를 제거하였다. 잔류물을 규조토 패드로 여과하고 세척된 0.1mm 필름 증류기로 증류하였다. 증류액을 10인치 진공으로 포피된 비그럭스 칼럼(Vigreux column)을 사용하여 재증류하여 0.2mm-0.7mm에서 끓는점이 84℃ 내지 92℃인 에틸 5-아세틸-4-옥소헥사노에이트 518g을 얻었다.
5-아세틸-4-옥소헥사노이드 350g 에틸 아미노말로내이트 하이드로클로라이드 329g, 소디움 아세테이트 133g 및 아세트산 1.2L를 온도계, 자동 교반기 및 열증기 중탕기가 장착된 5L용 3목 둥근 바닥 플라스크에 첨가하였다. 상기 혼합물을 37분에 걸쳐 99℃까지 가열하였다. 62℃까지는, 이산화탄소가 빠르게 증발되었다. 99℃ 가스상태에서 총 35분이 지나면, CO2 증발이 현저하게 느려졌다. 1시간 후에, 상기 혼합물을 냉각시키고, 진공 여과를 통해 염화나트륨을 제거하고, 용매를 증발시켰다. 잔류물을 냉수 1L와 섞었다. 침전물을 진공여과를 통해 회수하고, 400mL로 세척하고, 뜨거운 95% 에탄올 1L에 용해시켰다. 상기 용액을 Darco G-60의 20g으로 처리하 고, 열여과한 후, 실온에서 냉각하였다. 진공 여과를 통해서 결정 조직을 가진 고체를 회수하고, 필터를 50% 에탄올 20mL를 사용하여 2번 세척하고, 70℃ 에서 진공하에서 건조하여 2-에톡시카르보닐-4-(2-에톡시카르보닐에틸)-3,5-디메틸피롤 285g(수율 11.9%)를 얻었다. 여과액은 24시간동안 냉장보관하여 또다른 생성물 53.1g (수율 11.9%)를 얻어 총 수율이 75.9%가 되었다.
2-에톡시카르보닐-4-(2-에톡시카르보닐에틸)-3,5-디메틸피롤 285g과 에틸 에테르 3500mL를 온도계, 자동 교반기, 환류반응용 컨덴서 및 첨가 깔대기 (additional funnel)를 장착한 5L용 3목 플라스크에 넣고, 얼음중탕에서 냉각하였다. 슬포릴 클로라이드 435g을 145분에 걸쳐 천천히 첨가하였다. 첨가과정이 진행되어짐에 따라, 상기 반응물은 흐려지고 녹색빛을 띤 후, 투명해졌다. 마지막 첨가과정때에는 , 반응물은 투명하고, 살짝 노란빛을 나타냈다. 반응물을 1시간 더 교반한 후, 가열하여 1시간 동안 환류반응시켰다. 상기 반응물을 냉각시키고, 회전식 증발기를 사용하여 증발시키고, 에테르 150mL를 사용하여 희석한 후, 다시 회전식 증발기를 사용하여 증발시켰다. 희석과 증발과정이 다시 되풀이되었다. 잔류믈에 아세트산 802g과 수산화 나트륨 535g을 함유하는 증류수 8L를 첨가하였다. 상기 혼합물을 85℃까지 간단히 가열한 후, 24시간동안 교반하면서 냉각하였다. 고체를 함유하는 수성막은 분리하고 , 에테르 800mL를 사용하여 추출하였다. 고체와 에테르 막을 탄산나트륨 300g을 함유하는 물 2.5L에 첨가하고, 1시간동안 교반하고, 여과하여 소량의(~7g) 고체를 제거하였다. 상기 혼합물에 아황산 56.4g을 첨가하고 , 생성된 침전물을 250ml의 물로 세척하고, 진공하에서 건조하여 생성물 56.4g을 얻었다. 침전액에 아황산 92g을 참가하고 생성된 침전물을 0.5L의 물로 두번 세척하고, 진공하여서 건조하여 2-카르복시-3-에톡시-카르보닐-3- (2-에톡시카르보닐에틸)-4-메틸피롤을 총 274.6g(수율 86.8%)를 얻었다.
2-카르복시-5-에톡시카르보닐-3-(2-에톡시카르보닐에틸)-4-메틸피롤 50.5g과 100% 수산화나트륨 400mL를 파르오토클레이브(Parr autoclave)내에서 90분동안 180℃까지 가열하였다. 2-카르복시-5-에톡시카르보닐-3(2-에톡시카르보닐에틸)-4-메틸피롤의 총 252.5g을 모두 처리할때까지 이 과정을 4번더 되풀이하였다. 5가지의 용액을 혼합하여 회전식 증발을 행하여 걸쭉한 검은색 잔여물의 부피가 약 1.8L이 되었다. 상기 혼합물을 물중탕으로 10℃까지 냉각하고, pH2의 상태가 될 때까지 온도를 20℃이하로 유지하기 위하여 50% 황산을 천천히 첨가하였다. 에틸 에테르 1400mL를 첨가하고, 상기 혼합물을 여과하고, 침전물을 저장하였다. 상기 침전물 을 Soxhlet 추출기를 사용하여 에테르 50mL로 추출하였다. 혼합된 에테르층 250mL로 세척하고, 다시 증류수 150mL로 세척하였다. 혼합된 물층은 다시 에테르 150mL로 추출하였다. 모든 에테르 층은 회전식으로 증발시키고, 잔류물을 건조하여 3-(2-카르복시에틸)-4-메틸피롤을 123.5g을 얻었다.
3-(2-카르복시에틸)-4-메틸피롤 123g을 에틸에테르 1500mL와 메탄 250mL를 자성으로 교반되는 리시버 플라스크내에서 혼합하였다. 자석 교반기, 증류기 입구와 회수 플라스크의 입구로 연결된 컨덴서가 장착된 3L용 둥근 바닥 플라스크와 3목 둥근바닥 플라스크 각각을 물중탕에서 가열하였다. 3L 플라스크 내에 에틸 에테르 1800mL에 용해시킨 디아잘드(Diazald) 240g과 95% 에탄올 360mL와 물 112mL에 용해된 수산화나트륨 용액 73g을 방치하였다. 3 L 플라스크를 교반시키고, 물중탕에서 65 - 75℃까지 가열하였다. 다이아존메탄(diazomethane)-에테르 혼합물을 약 2.5시간에 걸쳐 교반된 회수 플라스크로 증류하였다. 에틸 에테르 200mL을 3L 플라스크에 첨가하고, 반응이 완료될 때까지 증류를 행한다. 회수 플라스크을 30분간 교반시키고 나서 아세트산 10mL를 첨가하였다. 상기 혼 합물을 500mL의 증류수 로 두번 여과한 후에 중탄산나트륨 포화용액 200mL로 2번 추출하였다. 에테르 층을 무수 황산 나트륨으로 건조하고, 증류하여 어두운 액체 잔류물을 얻었다. 잔류물을 4 인치 비그럭스 칼럼을 사용하여 2번 증류하고, 10 인치 진공으로 포피된 비그럭스 칼럼을 사용하여 1번더 증류하여 3-(2-에톡시카르보닐에틸)-4- 메틸피롤 (0.5mm에서 BP 108-113℃)의 108g(수율 80.6%)를 얻었다.
디메틸포름아미드를 자동 교반기, 온도계 및 투하 깔대기가 부착된 500mL용, 3 목둥근 바닥 플라스크에 담고, 질소 가스 존재하에서 방치하였다. 플라스크를 0℃로 냉각시키고, 포시포로스 옥시클로라이드의 58.4mL를 80분에 걸쳐 한방울씩 첨가하였다. 디클로로에탄 280mL를 첨가하고, 상기 반응물을 실온으로 데우고 나서, -10℃까지 냉각하였다. 80mL 디클롤로에탄에 용해시킨 3-(2-메톡시카르보닐-에틸) -4-메틸피롤 55.7g을 1시간에 걸쳐 소량씩 첨가하고, 35분간 상기 혼합물을 교반하였다. 상기 혼합물을 30℃이하에서 회전식으로 증발시켰다. 액체 잔류물을 차가운 2N 수산화나트륨 용액 2700mL에 부었다. 상기 용액을 88℃까지 20분에 걸쳐 가열한 후, 30분 동안 이 온도를 유지시켰다. 상기 용액을 실온으로 냉각하고, 에틸 에테르 200mL를 사용하여 추출하였다. 수성 용액을 0℃까지 냉각시키고, 5N염산을 천천히 첨가함으로써 pH3.5까지 산성화하였다. 노란색의 침전물은 진공 여과를 통해 회수하고, 증류수 100mL로 4번 세척하고, 진공 오븐내에서 실온에서 건조하여 가공하지 않은4-(2-카르복실에틸)-2-포밀-3-메틸피롤 54.4g(수율 90.2%)를 얻었다.
가공하지 않은 물질을 에탄올 425mL와 에틸 에테르 700mL의 환류 혼합물에 첨가하고, 고온으로 여과하여 불용성잔류물을 제거하였다. 여과액은 냉동기에 보관하고, 그 결과 생긴 침전물은 진공 여과를 통해 회수하고, 에테르 50mL로 세척하였다. 여과액은 불용성 잔류물을 제거하기 위한 추출 및 고온 여과에 다시 사용되었다. 그 결과 생기는 침전물과 첫번째 침전물을 합하여 갈색 가루인 4-(2-카르복실에틸)-2-포밀-3-메틸피롤(MP 149.0-150.3℃) 26.1g을 얻었다. 여과액을 이전의 준비로부터 얻어진 여과액과 합하고 농축하여 갈색 고체 43g을 얻었다. 상기 고체는 에테르 500mL와 에탄올 100mL의 환류 혼합물에 넣고, 여과하였다. 상기 여과액은 환류반응시에 노리트(Norit)로 처리하고, 고온으로 다시 여과하였다. 여과액은 냉동기에 보관하여 4-(2-카르복시에틸)-2-포밀-3-에틸피롤의 또다른 3가지의 화합물, 7.7g, MP 148-151℃, 3.2g, MP 128-134℃, 4.1g, MP 148.2-150.0℃, 을 얻었다.
50mL 에탄올에 녹인 4-(2-카르복시에틸)-2-포밀-3-메틸피롤 9.0g과 2-옥신돌 6.0g을 온도계, 환류반응용 컨덴서 및 자성 교반기가 부착된 250ml용, 3-목 둥근 바닥 플라스크에 넣고 70℃까지 가열하였다. 대부분의 고체가 용해되었을때, 피페리딘 4.5g을 천천히 가하고, 상기 반응 혼합물을 4 시간동안 환류반응을 시켰다. 아세트산 12mL을 서서히 첨가하면 많은 양의 침전물이 생겨 났다. 상기 혼합물을 5분간 환류반응시키고, 실온으로 냉각하고, 진공여과를 통해 침전물을 회수하고, 에탄올 30mL로 세척하였다. 침전물을 30mL에탄올으로 슬러리-환류 세척방법으로 세척하고, 실온으로 냉각한 후, 진공 여과를 통해 건조하여 오렌지색 고체인 3-[4-(2-카르복시에틸)-3-메틸피롤-2-메틸리이데닐]-2-인돌린, SU6663을 11.9g(수율 80%)를 얻었다.
1H NMR (360 MHz, DMSO-d6) : δ 13.29(s, br, 1H, NH-1′), 12.05 (s, br, 1H, COOH), 10.78 (s, br, 1H, NH-1), 7.73 (d, J = 7.43 Hz, 1H, H-4 ), 7.61 (s, 1H, H-vinyl), 7.13 (d, J = 2.75 Hz, 1H, H-2′ ), 7.10 (t, J = 7.43 Hz, 1H, H-6 ), 6.97 (t, J = 7.43 Hz, 1H, H-5 ), 6.85 (d, J = 7.43 Hz, 1H, H-7), 2.59 (t, J = 7.38 Hz, 2H, CH2CH2COOH), 2.46(t, J = 7.38 Hz, 2H, CH2CH2 COOH), 2.25 (s, 3H, CH3) ;MS m/z (상대 강도, %) 297 ([M+1]+,100).
실시예 5
3-[2,4-디메틸-5-(2-옥소-1,2-디하이드로인돌-3-일리덴메틸)-1H-피롤-3-일]-프로피온산
1.07kg의 2,4-디메틸-5-에톡시크르보닐-3-(2-에톡시카르보닐에틸)-피롤 과 5 N 수산화나트륨 3.2L을 역류 콘덴서 및 여분의 깔대기가 부착된 12L 3목 둥근 바닥 플라스크에서 자동 교반한 후, 기름 중탕에서 가열하였다. 내부의 온도가 96℃에 도달한 후에, 상기 반응 혼합물을 3 시간동안 환류반응을 시키고, 모든 고체를 용해시키고, 얇은 막 크로마토그래피를 행하여 가수분해가 종결되었음을 확인하였다. 가열 장치를 제거하고, 상기 혼합물을 물중탕에서 50℃로 냉각하였다. 약 1.3L의 12N 염산을 서서히 첨가한다. 산의 약 50%가 첨가된 후, 가스 증발이 시작되었고, 온도가 60℃에 이르렀다. 여기에 더 많은 산이 첨가되어짐에 따라, 가스 증발이 증가하고 노란색 침전물이 형성되었다. 최종 pH는 염산을 처리하여 pH3.5가 되었다. 상기 혼합물을 냉각 장치에서 8℃로 냉각하였다. 상기 고체를 진공 여과를 통해 회수하고, 증류수 0.5L로 2번 세척하고, 진공 오븐에서 55-60℃에서 48시간동안 건조하여 3-(2-카르복시에틸)-2,4-디메틸피롤 677g(수율 101%)를 얻었다.
1H NMR (DMSO-d6) : δ 11.9(s, 1H, COOH), 9.9 (s,1H, NH), 6.2 (s, 1H, 방 향족), 2.5 (t, 2H, CH2 ), 2.2 (t, 2H, CH2 ), 2.0 (s, 3H, CH3), 1.9 (s, 3H, CH3) ;MP 134-136 ℃
디클로로메탄 250mL에 녹인 디메틸포름아미드 28.5g을 자석 교반기, 온도계 및 투하 깔대기가 부착된 1L 3목 둥근 바닥 플라스크에 넣고 얼음-염 장치에 넣고 -1℃까지 냉각시켰다. 포스포러스 옥시클로라이드 59.3g을 투하(drapping)깔대기에 넣고, 천천히 반응 혼합물에 첨가하였다. 포스포러스 옥시클로라이드가 전량 첨가된 것의 확인 후, 깔대기를 통해 디클로로메탄을 흘려 보내고 혼합물에 의해서 최대 온도가 5℃에 도달하였다. 상기 혼합물을 온도가 -3℃일 때, 15분간 교반시켰다. 고체 3-(2-카르복시에틸)-2,4-디메틸피롤 32.6g을 15분에 걸쳐 일부분씩 첨가하였다. 상기 반응 물의 최대 온도가 7℃에 도달하였다. 검붉은 혼합물을 30분에 걸쳐 교반시키고, 가열하여 1시간동안 환류반응을 하였다. 상기 혼합물을 15℃로 냉각시키고, 온도가 상승하는 동안에 활발한 반응이 일어나도록 300mL의 물을 첨가하였다. 상기 혼합물을 교반시키고, 22℃로 냉각하고, 층을 분리하고 저장하였다. 유기층은 물 100mL로 추출하고, 수용막층은 합하여 디클로로메탄 50mL로 세척하였다. 유기층은 버리고, 수용막층은 10N 수산화 나트륨 약 120mL로 처리하여 pH11의 상태에 이르게 하였다. 온도가 40℃까지 상승하였다. 상기 혼합물을 온도가 27℃일 경우에 30분간 교반시켰다. 혼합물에 10N 염산 120 mL를 처리 하여 pH2의 상태에 이르게 하여 혼합물을 온도를 30℃로 증가시켰다. 에틸 아세테이트 150mL를 첨가하고, 상기 혼합물을 교반하여 생성물을 추출하였다. 상기 고체를 진공 여과를 통해 회수하고, 물로 철저히 세척하고, 40℃에서 진공하에서 건조하여 갈색빛이 나는 검은색 고체인 3-(2-카르복시에틸)-2,4-디메틸-5-포밀피롤을 12g(수율 31%)얻었다. 얇은 막 크로마토그래피(디클로로메탄:아세트산, 95:5, 실리카 겔)로 분리하여 Rf 0.7 위치에 스팟을 확인하고, 기시점의 위치에 색을 가진 스팟을 확인하였다. 에틸 아세테이테 층을 합하고, 무수 황산 나트륨을 사용하여 건조하고, 40℃에서 진공하에서 건조하여 갈색빛을 띠는 검은 고체를 증발시켜 얇은 막 크로마토그래피에 의해 분리된 이전의 고체와 외형이 유사한 3-(2-카르복시에틸)-2,4-디메틸-5-포밀피롤을 21g(수율 55%, 총 수율 86%)을 얻었다.
또한, 다른 방법으로 디클로로메탄 750mL에 녹인 디메틸폼아미드 124mL을 자석 교반기, 온도계 및 낙하 깔대기가 부착된 5L 3목 둥근 바닥 플라스크에 넣고 얼음-염 장치에 넣고 -9℃까지 냉각시켰다. 포스포러스 옥시클로라이드 114mL을 디클로로벤젠 50ml를 반응 혼합물에 흘려 보내는 투하깔대기를 통해 빠르게 첨가했다. 혼합물의 최대 온도가 -4℃에 도달했다. 고체 3-(2-카르복시에틸)-2,4-디메틸피롤 114.6g을 20분에 걸쳐 첨가하였다. 혼합물의 최대 온도가 3℃에 도달했다. 어두운 붉은색의 혼합물알 가열하여 1분간 환류 반응을 행한 후, -1℃로 냉각하였다. 상기 혼합물을 1℃로 냉각시키고, 얼음물 800mL을 재빨리 첨가하였다. 혼합물의 최대 온도가 15℃에 도달했다. 유기층을 분리하여 폐기하였다. 수성층은 온도 조절을 위해 얼음을 첨가하면서 10N 수산화나트륨 약 800mL를 첨가하여 서서히 pH12의 상태에 이르게 하였다. 온도가 37℃까지 상승하였다. 상기 혼합물은 90분간 얇은 막 크로마토그래피 가 Rf 0.3과 생성물의 기시점에서 밝은 색의 물질의 존재를 보여주었던 실온에서 교반시켰다. 그리고 나서, 0℃로 냉각하였다. 상기 혼합물은 온도를 조절하기 위하여 얼음을 첨가함과 동시에, 10N 염산 약 600mL를 처리하여 pH3으로 산성화하였다. 최대 온도가 10℃에 이르렀다. 상기 혼합물을 1시간동안 냉각 상태에서 교반시켰다. 진공 여과를 통해 고체를 회수하고, 증류수 100mL로 4번 세척하고, 50-60℃에서 진공하에서 건조하여 갈색 고체인 3-(2-카르복시에틸)-2,4-디메틸-5-포밀피롤 140.6g(수율 90%)를 얻었다.
1H NMR(DMSO-d6): δ12.0 (s,1H, COOH), 11.3 (s, 1H, NH), 9.4 (s, 1H, CHO), 2.6 (t, 2H, CH₂), 2.3 (t, 2H, CH2), 2.2 (s, 3H, CH₃), 2.1 (s, 3H, CH3). MP 145-147℃.
3-(2-카르복시에틸)-2,4-디메틸-5-포르밀피롤 (18.2 g)과 11.7 g의 2-옥신돌을, 기름 욕조에서 자석교반기와 환류반응 컨덴서가 달린 250 mL 둥근바닥 플라스크에서 가열함으로써 100 mL의 에탄올에 녹였다. 피롤리딘(7.0 g)을 첨가하여 반응혼합물을 2 시간동안 환류반응하였다. 이 때 많은 양의 갈색빛를 띤 검은색의 고체가 존재했다. 얇은 막 크로마토그래피(에틸 아세테이트:에탄올:아세트산 96:2:2, 실리카겔)로 분리한 결과, 옥신돌 시작물질(starting material)이 없음을 알 수 있었다. 8 mL의 아세트산을 첨가하고 혼합물을 15 분동안 환류반응하였다. 진한 혼합물을 50 mL의 에탄올로 희석하고 10℃로 냉각하였다. 고체를 진공여과법으로 회수하여 50 mL의 에탄올로 씻었다. 고체를 125 mL의 에탄올을 환류반응하면서 10 분동안 교반하고, 10℃로 냉각한 뒤, 진공여과법으로 회수하고 50 mL의 에탄올로 씻었다. 생성물을 진공상태에서 45℃로 24시간동안 말려서 25.5 g (수율 88%)의 3- [2,4-디메틸-3-(2-카르복시에틸) 피롤-5-메틸이데닐]-2-인돌리논을 오렌지색 고체로 얻었다.
다른 방법으로는, 3-(5-프로밀-2,4-디메틸-1H-피롤-3-일)-프로피온산 (10 g, 51 mmol), 2-옥신돌 (6.5 g, 49 mmol), 그리고 수산화 나트륨 (40 g, 58 mmol)의 혼합물을 50 mL의 물에 녹여 50℃에서 4 시간동안 교반하였다. 반응혼합물을 상온에서 식힌 뒤 여과하고 여과액을 12 N 염산으로 pH3에 이르게 하였다. 침전된 고체를 진공 여과를 통해 여과하고, 10mL의 증류수로 세척하고, 진공하에서 24시간동안 건조하였다. 가공하지 않은 고체 슬러리(slurry)를 고온의 에탄올로 2번 세척하고, 진공하에서 건조하여 3-[2,4-디메틸-5-(2-옥소-1,2-디하이드로 -인돌-3-일리덴메틸)-1H-피롤-3-일]-프로피온 산 13.8g(수율 91%)을 얻었다.
1H NMR (360 MHz, DMSO-d6) : δ 13.38 (s, br, 1H, NH-1′), 12.05 (s, br, 1H, COOH), 10.70 (s, br, 1H, NH-1), 7.69 (d, J = 7.39 Hz, 1H, H-4), 7.53 (s, 1H, H-vinyl), 7.06 (t, J = 7.39 Hz, 1H, H-6), 6.95 (t, J = 7.39 Hz, 1H, H-5), 6.85 (d, J = 7.39 Hz, 1H, H-5), 6.85 (d, J = 7.39 Hz, 1H, H-7), 2.63 (t, J = 7.45 Hz, 2H, CH2CH2COOH), 2.34 (t, J = 7.45 Hz, 2H, CH2CH2 COOH), 2.28 (s, 3H, CH3), 2.24 (s, 3H, CH3) ;MS m/z 311 ([M+1]+ , 100).
실시예 6
3-[5-(5-브로모-2-옥소-1,2-디하이드로인돌-3-일리덴메틸)-4-메틸-1H-피롤- 3-일]-프로피온산
2-옥신돌 (53.3g)을 640mL의 아세토니트릴(acetonitrile)에 현탁하고, 상기 혼합물을 기계 교반장치가 장착된 냉각 장치에서 7℃로 냉각하였다. 고체 N-브로모숙시니미드(74.8g)을 20분여에 걸쳐 조금씩 첨가하였다. N-브로모숙시니미드의 1/3을 5분여에 걸쳐 첨가한 후에, 온도를 12℃로 상승시켰다. 혼합물의 온도가 10℃로 떨어질 때까지 첨가를 중지하였다. 첨가과정을 온도를 12℃이하로 유지하면서 다시 시작하였다. 첨가 과정의 종결후에, 상기 혼합물을 10℃에서 1시간동안 교반시키고 나서 , 혼합물의 온도가 실온까지 데워지는 동안 다시 1시간동안 교반시켰다. 침전물을 진공 여과를 통해 회수하고, 89mL의 에탄올로 세척하고, 20분간 여과 깔대기에서 흡수하여 건조시켜 HLPC를 통해 2-옥신돌 6.4%를 함유하는 생성물을 얻었다. 고체를 1440mL의 변성된 에탄올(denaturated ethanol)에 현탁하고, 교반함으로써 슬러리(slurry)를 세척하고, 대부분의 고체가 용해되어지는 5분간 환류반응을 행하였다. 혼합물을 냉각 장치에서 13℃까지 냉각하였다. 고체 생성물을 진공 여과를 통해 회수하고, 80mL의 에탄올로 세척하고, 진공하에서 건조하여 HLPC를 통해 2-옥신돌 1.13%를 함유하는 5-브로모-2-옥신돌 57.7g (68.0%)을 얻었다. 30%이하의 에탄올로 슬러리 세척의 경우에, 더 좋은 수율로 생성물을 얻었으나, 2-옥신돌(1.76%)을 더 많이 함유하였다.
1H NMR(360 MHz, DMSO-d6): δ10.44 (s, br, 1H, NH-1), 7.32-7.36 (m, 2H), 6.76 (d, J = 8.50 Hz, 1H, H-7), 3.5 (s, 2H, CH2) ; MS m/z 212.1/214.1 (M+/[M+2]+)
2mL 의 에탄올에 녹인 4-(2-카르복시에틸)-2-포밀-3-메틸피롤(90mg), 106mg의 5-브로모-2-옥신돌 과 75μL의 피페리딘을 5분간 95℃에서 가열하였다. 반응 혼합물을 냉각, 농축하였다. 잔류물을 2N 염산 수용액에 현탁시켰다. 침전물을 여과하고 물로 세척하여 pH6 상태에 이르게 하고, 진공 오븐에서 건조하여 갈색 고체인 표제 화합물 120mg(수율 64%)를 얻었다.
1H NMR (360 MHz, DMSO-d6) : δ 13.31 (s, br, 1H, NH-1′), 12.06 (s, br, 1H, COOH), 10.90 (s, br, 1H, NH-1), 8.06 (s,br,1H, H-4) 7.75 (s, 1H, H-vinyl), 7.23(d, br, J = 8.50 Hz, 1H, H-6), 7.19 (d, J = 2.84 Hz, 1H, H-2′), 6.80 (d, br, J = 8.50 Hz, 1H, H-7), 2.65 (t, J = 7.65 Hz, 2H, CH2CH2COOH), 2.46 (t, J = 7.65 Hz, 2H, CH2CH2COOH), 2.28 (s, 3H, CH3); MS m/z 375.1/377.2 (M+/[M+2]+).
실시예 7
3-[5-(5-요오도-2-옥소-1,2-디하이드로인돌-3-일리덴메틸)-4-메틸-1H-피롤-3-일]-프로피온산
2-옥신돌 (82.9g)을 630mL의 아세트산에 현탁하고, 이 혼합물을 기계적으로 교반하고, 얼음물 중탕에서 10℃까지 냉각하였다. 고체 N-요오도숙시니미드 (N-iodosuccinimide)175g을 10여분에 결쳐 조금씩 첨가하였다. 첨가 과정이 끝난 후 에, 상기 혼합물을 10℃에서 1시간동안 교반하였다. 항상 존재하는 현탁된 고체는 이 때 진해진다. 그 고체를 진공 여과를 통해 회수하고, 100mL의 50% 아세트산으로 세척하고, 나서 200mL의 물로 다시 세척하고 여과 깔대기를 사용하여 흡수하여 건조시켰다. 상기 생성물을 진공하에서 건조하여 프로톤 NMR을 통하여 약 5%의 2-옥신돌을 함유하는 5-요오도-2-옥신돌 93.5g(수율 36%)를 얻었다.
1H NMR(360 MHz, DMSO-d6): δ10.45 (s, 1H, NH-1), 7.49 (s, 1H, H-4), 7.48 (d, J = 8.10 Hz, 1H, H-6), 6.64 (d, J = 8.10 Hz, 1H, H-7), 과 3.46 (s, 3H, CH₃-3); MS m/z 258 [M-1]+.
2mL 의 에탄올에 녹인 4-(2-카르복시에틸)-2-포밀-3-메틸피롤(90mg), 130mg의 5-요오도-2-옥신돌 과 75μL의 피페리딘을 5분간 95℃에서 가열하였다. 반응 혼합물을 냉각, 농축하였다. 잔류물을 2N 염산 수용액에 현탁시켰다. 침전물을 여과하고 물로 세척하여 pH6 상태에 이르게 하고, 진공 오븐에서 건조하여 갈색 고체인 표제 화합물 162mg(수율 77%)를 얻었다.
1H NMR (360 MHz, DMSO-d6) : δ 13.30 (s, br, 1H, NH-1′), 12.06 (s, br, 1H, COOH), 10.88 (s, br, 1H, NH-1), 8.18 (s, br, 1H, H-4), 7.73 (s, 1H, H-vinyl), 7.40 (d, br, J = 8.03 Hz, 1H, H-6), 7.19 (d, J = 2.94 Hz, 1H, H-2′), 6.69 (d, br, J = 8.03 Hz, 1H, H-7), 2.65 (t, J = 7.40 Hz, 2H, CH2CH2COOH), 2.46 (t, J = 7.40 Hz, 2H, CH2CH2COOH), 2.28 (s, 3H, CH3) ;MS m/z 423 [M+1]+.
실시예 8
3-[4-메틸-5-(4-메틸-2-옥소-1,2-디하이드로인돌-3-일리덴메틸)-1H-피롤-3-일]-프로피온산
20mL의 건조 에테르에 녹인 디에틸 옥살레이트(30mL)를 50mL의 건조 에테르에 현탁시킨 19g의 포타슘 에톡사이드를 교반하면서 첨가하였다. 상기 혼합물을 냉각장치내에서 냉각하고, 20mL의 건조 에테르에 녹인 20mL의 3-니트로-O-자일렌을 서서히 첨가하였다. 진한 검붉은 색의 혼합물을 0.5시간동안 환류반응시키기 위해 가열하고. 농축하여 검붉은 고체를 얻었다. 여기에, 거의 모든 고체가 용해될 때까지 10% 수산화나트륨으로 처리하였다. 붉은색이 노란색으로 변할 때까지, 검붉은색을 띤 고체에 30% 과산화수소 처리를 하였다. 상기 혼합물의 검붉은 색이 더이상 나타나지 않을 때까지, 10% 수산화나트륨과 30% 과산화수소를 교대로 처리하였다. 이 고체를 여과하고, 여과액을 6N 염산으로 처리하여 산성화하였다. 생성된 침전물을 진공여과를 통해 회수하고, 물로 세척하고, 진공하에서 건조하여 회색의 고체인 2-메틸-6-니트로페닐아세트산 9.8g (수율 45%)을 얻었다.
1H NMR(360 MHz, DMSO-d6): δ10.27 (s, br, 1H, NH-1), 7.06 (t, J = 7.71 Hz, 1H, H-6), 6.74 (d, J = 7.73 Hz, H-5), 6.63 (d, J = 7.73 Hz, 1H, H-7), 3.36 (s, 2H, CH2), 2.18(s, 3H, CH₃).
2mL의 에탄올에 녹인 4-(2-카르복시에틸)-2-포밀-3-메틸피롤(90mg), 74mg의 4-메틸-2-옥신돌 과 75μL의 피페리딘을 5분간 95℃에서 가열하였다. 반응 혼합물을 냉각, 농축하였다. 잔류물을 2N 염산수용액에 현탁시켰다. 침전물을 여과하고 물로 세척하여 pH6 상태에 이르게 하고, 진공 오븐에서 건조하여 갈색 고체인 표제 화합물 80mg(수율 52%)를 얻었다.
1H NMR (360 MHz, DMSO-d6) : δ13.33 (s, br, 1H, NH-1′), 10.84 (s, br, 1H, NH-1), 7.54 (s, 1H, H-vinyl), 7.12 (d, J = 2.0 Hz, 1H, H-2′), 7.01 (t, J = 7.75 Hz, 1H, H-6), 6.79 (d, J = 7.75 Hz, H-5), 6.74 (d, J = 7.75 Hz, 1H, H-7), 2.64 (t, J = 7.65 Hz, 2H, CH2CH2COOH), 2.57 (s, 3H, CH3), 2.42 (t, J = 7.65 Hz, 2H, CH2CH2COOH), 2.19 (s, 3H, CH3) ;MS m/z (상대강도, %) 311 ([M+1]+, 100).
실시예 9
3-[4-메틸-5-(5-메틸-2-옥소-1,2-디하이드로인돌-3-일리덴메틸)-1H-피롤-3-일]-프로피온산
5-메틸리잔틴(5-Methylisatin) 15.0g과 하이드라진 수화물(hydrazine hydr ate) 60ml를 4시간동안 140℃ 내지 160℃에서 가열하였다. 얇은 막 크로마토그래피(에틸 아세테이트:헥산 1:2, 실리카 겔) 반응 혼합물을 실온으로 냉각시킨 후, 얼음물 30mL를 붙고, 6N의 염산(hydrochloric acid)을 첨가하여 pH2로 산성화시켰 다. 이틀동안 실온에서 방치한 후에, 진공 여과기를 사용하여 침전물을 회수하여, 증류수로 세척한 후, 진공상태에서 건조시켜 5-메틸-2-옥신돌 6.5g(수율 47%)를 얻었다.
1H NMR(360 MHz, DMSO-d6): δ10.20 (s, br, 1H, NH-1), 6.99 (s, 1H, H-4), 6.94 (d, J = 8.11 Hz, 1H, H-6), 6.68 (d, J = 8.11 Hz, 1H, H-6), 6.68 (d, J = 8.11Hz, 1H, H-7), 3.39 (s, 2H, CH2-3) 과 2.22 (s, 3H, CH3-5)
에탄올 2mL에 녹인 4-(2-카르복실에틸)-2-포밀-3-메틸피롤 90mg, 5-메틸-2-옥신돌 74mg과 피페리딘 75㎕을 5시간동안 95℃로 가열하였다. 반응혼합물을 냉각, 농축하였다. 잔류물을 6N의 염산 수용액(aqueous hydrochloric acid)현탁시켰다. 침전물이 여과되어지고, 증류수로 세척하여 pH6 상태가 되게 하여, 진공오븐안에서 건조시켜 갈색 고체인 표제화합물 65mg( 수율42%)를 얻었다.
1H NMR (360 MHz, DMSO-d6) : δ 13.30(s, br, 1H, NH-1′), 12.05 (s, br, 1H, COOH), 10.67 (s, br, 1H, NH-1), 7.57 (s, 2H, H-vinyl, H-4), 7.12 (d, J = 2.65 Hz, 1H, H-2′), 6.91 (d, J = 7.82 Hz, 1H, H-6), 6.74 (d, J = 7.82 Hz, 1H, H-7), 2.65 (t, J = 7.43 Hz, 2H, CH2CH2COOH), 2.46 (t, J = 6.94 Hz, 2H, CH2CH2COOH), 2.30 (s, 3H, CH3), 2.25 (s, 3H, CH3) ;MS m/z (상대 강도) 311 ([M+1]+, 100).
실시예 10
3-[5-(5,6-디메톡시-2-옥소-1,3-디하이다로인돌-3-일리덴메틸)-4-메틸-1H- 피롤-3-일]-프로피온산
2mL 에탄올에 녹인 4-(2-카르복실에틸)-2-포밀-3-메틸피롤 90g, 5,6-디메톡시-2-옥시인돌 97mg과 75㎕의 피페리딘을 5시간동안 95℃로 가열하였다. 반응 혼합물을 냉각, 농축시켰다. 잔여물을 6N의 염산 수용액에 현탁시켰다. 침전물을 여과하고, 증류수로 세척하여 pH6 상태가 되게 하고, 진공오븐안에서 건조시켜 갈색 고체인 표제화합물 104mg(수율58%)을 얻었다.
1H NMR (360 MHz, DMSO-d6) : δ 13.19(s, br, 1H, NH-1′), 12.05 (s, br, 1H, COOH), 10.53 (s, br, 1H, NH-1), 7.46 (s, 1H), 7.41 (s, 1H), 7.02 (s, 1H, H-2′), 6.45 (s, 1H), 3.74 (s, 3H, OCH3), 2.59 (t, J = 7.43 Hz, 2H, CH2CH2COOH), 2.44 (t, J = 7.43 Hz, 2H, CH2CH2COOH), 2.22 (s, 3H, CH3) ;MS m/z 357 [M+1]+.
실시예 11
3-[5-(6-클로로-2-옥소-1,2-디하이드로인돌-3-일리덴메틸)-4-메틸-1H-피롤-3-일]-프로피온산
2mL 에탄올에 녹인 4-(2-카르복시에틸)-2-포밀-3-메틸피롤 200mg, 6-클로로-2-옥소인돌 167.6mg과 피페리딘 166 ㎕을 5시간동안 냉각시키고 농축하였다. 잔류물을 6N의 염산 수용액에 현탁시켰다. 침전물을 여과하고, 증류수로 세척하여 pH6 상태가 되게 하고, 진공 오븐안에서 건조시켜 갈색 고체인 표제화합물 246mg(수율74%)을 얻었다.
1H NMR (360 MHz, DMSO-d6) : δ 13.22(s, br, 1H, NH-1′), 12.09 (s, br, 1H, COOH), 10.95 (s, br, 1H, NH-1), 7.78 (d, J = 7.95 Hz, 1H, H-4), 7.66(s, 1H, H-vinyl), 7.18 (d, J = 2.64 Hz, 1H, H-2′), 7.01 (dd, J = 1.90, 7.95 Hz, 1H, H-5), 6.86 (d, J = 1.90Hz, 1H, H-7), 2.65 (t, J = 7.14 Hz, 2H, CH2CH2COOH), 2.45 (t, J = 7.14 Hz, 2H, CH2CH2COOH), 2.26 (s, 3H, CH3).
실시예 12
3-[4-(2-카르복실에틸)-3-메틸-1H-피롤-2-일메틸렌]-2-옥소-2,3-다하이드로-1H-인돌-5-카르복실산 케틸 에스테르
5-요도-2-옥신돌 17g을 팔라듐 디아세테이트 2g, 트리에틸라민 18.2g, 메탄올 150mL, 디메틸설폭사이드 150mL 및 2.6g의 DPPP를 일산화탄소로 포화된 기압에서 환류반응시켰다. 24시간 후에, 여과를 통해 촉매제를 제거하였으며, 여과액을 농축하였다. 농축액은 헥산에 녹인 30% 에탄올을 사용하여 실리카겔 크로마토그래피로 분리하였다. 생성물을 포함하는 부분을 농축하여 방치하였다. 침전된 생성물을 진공여과를 통해 회수하여 회색의 고체인 5-메톡시카르보닐-2-옥신돌 0.8g (수율 7%)을 얻었다.
1H NMR (360 MHz, DMSO-d6) : δ 10.70 (s, br, 1H, NH-1), 7.83 (dd, J = 1.77, 8.29 Hz, 1H, H-6), 7.77 (s, br, 1H, H-4), 6.89 (d, J = 8.29 Hz, 1H, H-7), 3.80 (s, 3H, COOCH3-5), 3.51 (s, 2H, CH2-3).
2mL 에탄올에 녹인 4-(2-카르복시에틸)-2-포밀-3-메틸피롤 90.6mg, 5-메톡시카르보닐-2-옥시인돌 88.6mg 과 피페리딘 75㎕을 5시간동안 95℃로 가열하였다. 반응 혼합물을 냉각시킨 후, 농축시켰다. 상기 잔여물을 6N의 염산 수용액 (aqueous hydrochloric acid)에 현탁시켰다. 침전물을 여과시키고, 증류수로 세척하여 pH6의 상태가 되게 한 후, 진공 오븐에서 건조시켜 노란색 고체인 표제화합물 123mg(수율 69%)을 얻었다.
1H NMR (360 MHz, DMSO-d6) : δ 13.27(s, br, 1H, NH-1′), 12.0 (s, vbr, 1H, COOH), 11.16 (s, br, 1H, NH-1), 8.36(s, br, 1H, H-4), 7.80(s, 1H, H-vinyl), 7.40(dd, J = 1.80, 8.14 Hz, 1H, H-6), 7.20(d, J = 2.91Hz, 1H, H-5′), 6.96(d, J = 8.14Hz, 1H, H-7), 3.84(s, 3H, COOCH3), 2.66(t, J = 7.55 Hz, 2H, CH2CH2COOH), 2.46 (t, J = 7.55 Hz, 2H, CH2CH2COOH), 2.30(s, 3H, CH3); MS m/z (상대 강도, %) 355 ([M+1]+, 100).
실시예 13
3-[4-(2-카르복시-에틸)-3-메틸-1H-피롤-2-일메틸렌]-2-옥소-2,3-디하이드로-1H-인돌-5-카르복실산
2-옥시인돌 6.7g을 얼음 수조안에서 30mL의 디클로로에탄에 알루미늄 클로 라이드 23g을 교반시킨 현탁액에 첨가하였다. 11.3g의 클로로아세틸 클로라이드 (Chloroacetyl Chloride)을 서서히 첨가하고, 염화수소가스를 증발시켰다. 상기 용액을 10분정도 교반시킨 후, 반응물을 1.5시간동안 40℃ 내지 50℃까지 가열하였다. 얇은 막 크로마토그래피(Thin Layer Chromatography,에틸 아세테이트, 실리카 겔)을 행한 결과, 시발 물질이 존재하지 않았다. 혼합물은 실온으로 냉각시킨 후, 얼음물에 부었다. 침전물을 진공 여과를 통해 회수하고, 증류수로 세척한 후, 진공하에서 건조시켜 회색을 띤 흰 고체인 5-클로로아세틸-2-옥시인돌 10.3g (수득율 98%)을 얻었다.
9.3g의 5-클로로아세틸-2-옥시인돌의 현탁액을 3시간동안 80℃ 내지 90℃에서 90mL 피리딘과 교반시킨 후, 실온으로 냉각하였다. 침전물을 진공여과를 통해 회수하고, 에탄올 20mL로 세척하였다. 상기 고체를 2.5N 수산화나트륨(Sodiun Hydroxide) 90mL에 용해시키고, 3시간동안 70℃ 내지 80℃ 교반하였다. 상기 혼합물을 실온까지 냉각시킨 후, 0.5N 염산을 첨가하여 pH2상태로 산성화하였다. 침전물을 진공 여과를 통해 회수하고, 증류수로 철저하게 세척한 후, 진공하에서 건조시켜 갈색 고체인 5-카르복시-2-옥시인돌을 얻었다. 24시간동안 방치한 후에 , 여과액은 노란색 고체인 5-카르복시-2-옥시인돌 2g을 얻었다. 초기의 진갈색의 생성물은 뜨거운 메탄올에 용해시키고, 여과를 통해 불용성 물질은 제거한다. 그 후, 침전액을 농축시켜 갈색 고체 5-카르복시-2-옥시인돌 5.6g을 얻었다. 복합 수율이 97%였다.
1H NMR (360 MHz, DMSO-d6) : δ 12.56(s, br, 1H, COOH-5), 10.70 (s, 1H, 1H, NH-1), 7.82 (dd, J = 1.57, 7.79 Hz, 1H, H-6), 7.74(s, br, 1H, H-4), 6.87(d, J = 7.79 Hz, 1H, H-7)과 3.53 (s, 2H, CH2-3 ). MS m/z (상대 강도, %) 178 ([M+1]+, 100)).
2mL 에탄올에 용해시킨 4-(2-카르복시에틸)-2-포밀-3-메틸피롤 90.6mg, 5-메톡시카르보닐-2-옥시인돌 88.6mg 과 피페리딘 75㎕을 5시간동안 95℃로 가열하였다. 상기 반응 혼합물을 냉각시킨 후, 농축시켰다. 반응 잔여물을 6N의 염산 수용액에 현탁시켰다. 침전물을 여과시키고, 증류수로 세척하여 pH6의 상태가 되게 한 후, 진공 오븐에서 건조시켰다. 천연 생성물은 에틸 아세테이트- 헥산- 아세테이트를 용출제로 사용한 실리카 겔 관 크로마토그래피를 통하여 정제하여 노란색 고체인 표제화합물 51mg(수율 30%)을 얻었다.
1H NMR (360 MHz, DMSO-d6) : δ 13.27 (s, br, 1H, NH-1), 12.28 (s, vbr, 2H, 2xCOOH), 11.11 (s, br, 1H, NH-1), 8.34 (d, J = 1.36Hz, 1H, H-4), 7.78 (s, 1H, H-vinyl), 7.40 (dd, J = 1.36, 8.20 Hz, 1H, H-6), 7.19 (d, J = 3.07 Hz, 1H, H-5′), 6.93 (d, J = 8.20 Hz, 1H, H-7), 2.65 (t, J = 7.56 Hz, 2H, CH2CH2COOH), 2.46(t, J = 7.56 Hz, 2H, CH2CH2COOH), 2.29 (s, 3H,CH3); MS m/z 341.0 ([M+1]+,
실시예 14
3-[4-메틸-5-(2-옥소-5-설퍼모일-1,2-다히아드로인돌-3-일리덴-메틸)-1H-피롤-3-일]-프로피온 산
클로로술폰산 27mL로 채워진 100mL 플라스크에 2-옥신돌 13.3g을 천천히 첨가한다. 첨가하는 동안 온도는 30℃이하로 유지되게 한다. 첨가 후에, 반응 혼합물은 1.5시간동안 교반한 후, 68℃에서 1시간동안 가열한 후, 냉각시켜 물에 부었다. 침전물을 증류수로 세척하고 진공 오븐에서 건조시켜 정제 과정을 거치지 않고 5-클로로설포닐-2-옥신돌 11g(수율 50%)을 얻었다.
2.1g의 5-클로로설포닐-2-옥신돌을 10mL 에탄올에 용해시킨 10mL 수산화 암모늄에 첨가하고, 실온에서 24시간 교반시켰다. 혼합물을 농축하고 진공 여과를 통해서 회색빛을 띤 흰색 고체인 5-아미노설포닐-2-옥시인돌 0.4g(수율 20%)을 얻었다.
1H NMR (360 MHz, DMSO-d6) : δ 10.67(s, br, 1H, NH-1), 7.63 - 7.66 (m, 2H, H-4,6), 7.13 (s, 2H, 5-SO2NH2), 6.91(d, J = 8.04 Hz, 1H, H-7′)과 3.56(s, 2H, CH2-3); MS m/z (상대 강도, %) 211 ([M+1]+, 100)).
2mL 에탄올에 용해시킨 4-(2-카르복시에틸)-2-포밀-3-메틸피롤 90.6mg, 5-아미노설포닐-2-옥시인돌 106mg 과 피페리딘 75㎕을 5시간동안 95℃로 가열하였다. 상기 반응 혼합물을 냉각시킨 후, 농축시켰다. 반응 잔여물을 6N의 염산 수용액에 현탁시켰다. 침전을 여과시키고, 증류수로 세척하여 pH6의 상태가 되게 한 후, 진공 오븐에서 건조시켜 노란색 고체인 표제 화합물 132mg (수율 70%)을 얻었다.
1H NMR (360 MHz, DMSO-d6) : δ 13.28 (s, br, 1H, NH-1′), 12.0 (s, vbr, 1H, COOH), 11.15 (s, br, 1H, NH-1), 8.20 (d, J = 1.60 Hz, 1H, H-4), 7.73 (s, 1H, H-vinyl), 7.59 (dd, J = 1.60, 8.17 Hz, 1H, H-6), 7.22 (d, J = 2.85 Hz, 1H, H-2′), 7.10 (s, 2H, NH2), 6.98 (d, J = 8.17 Hz, 1H, H-7), 2.67 (t, J = 7.41 Hz, 2H, CH2CH2COOH), 2.46 (t, J = 7.41 Hz, 2H, CH2CH2COOH)과 2.29(s, 3H, CH3).
실시예 15
3-[4-메틸-5-(5-메틸설퍼모일-2-옥소-1,2-디하이드로인돌-3-일리덴메틸)-1H-피롤-3-일]-프로피온산
테트라하이드로푸란내에 녹인 2M 메틸라민 10mL에 용해된 5-클로로술포닐-2-옥시인돌 3.38g의 현탁액을 실온에서 흰색 고체가 나타날때까지 4시간동안 교반시켰다. 진공여과를 통해 침전물을 회수하고, 증류수 5mL로 두 번 세척하고, 진공하에서 24시간동안 40℃에서 건조하여 5-메틸아미노설포닐-2-옥시인돌 3.0g(수득율 88%)를 얻었다.
1H NMR(360 MHz, DMSO-d6): δ10.87 (s, br, 1H, NH-1), 7.86(s, br, 1H, NH-1), 7.86 (s, br, 1H, 5-SO2NHCH3 ) 7.61 (d, J = 7.80 Hz, 1H, H-6), 7.32 (d, J = 4.67 Hz, 1H, H-4), 과 2.36(s, 3H, 5-SO2NHCH3 ); MS m/z(상대 강도, %) 226 (M′,100)
2mL의 에탄올에 용해시킨 4-(2-카르복실에틸)-2-포밀-3-메틸피롤(90.6g), 5-메틸아미노술포닐-2-옥신돌 113mg과 피페리딘 75㎕을 5시간동안 95℃로 가열하였다. 상기 반응 혼합물을 냉각시킨 후, 농축시켰다. 반응 잔여물을 6N의 염산 수용액에 현탁시켰다. 침전을 여과시키고, 증류수로 세척하여 pH6의 상태가 되게 한 후, 진공 오븐에서 건조시켜 노란색 고체인 표제 화합물 163mg(수율 83%)을 얻었다.
1H NMR (360 MHz, DMSO-d6) : δ 13.30(s, br, 1H, NH-1′), 12.0 (s, vbr, 1H, COOH), 11.19 (s, br, 1H, NH-1), 8.18 (d, J = 1.60 Hz, 1H, H-4), 7.80(s, 1H, H-vinyl), 7.53(dd, J = 1.64, 8.17 Hz, 1H, H-6), 7.23(d, J = 2.80 Hz, 1H, H-2′), 7.13 (q, J = 5.15 Hz, 1H, NHCH3), 7.02 (d, J = 8.17 Hz, 1H, H-7), 3.84 (s, 3H, COOCH3), 2.66 (t, J = 7.54 Hz, 2H, CH2CH2COOH), 2.47(t, J = 7.54 Hz, 2H, CH2CH2COOH), 2.41 (d, J = 5.15 Hz, 3H, NCH3), 2.30 (s, 3H, CH3 ); MS m/z 390 [M+1]+.
실시예 16
3-{3-[4-(2-카르복시-에틸)-3-메틸-1H-피롤-2-일메틸렌]-2-옥소-2,3-디하이드로-1H-인돌-5-일}-프로피온산
얼음수조내에서 30mL 트리플로로아세트산에 용해된 4.18g의 5-클로로아세틸-2-옥신돌에 트리에틸실란 4.65g을 처리하고, 실온에서 3시간동안 교반하였다. 상기 혼합물에 153mL의 증류수를 섞고 진공 여과를 통해 침전물을 회수하였다. 50mL의 증류수로 세척하고, 건조하여 붉은 갈색고체인 5-(2-클로로에틸)-2-옥시인돌 2.53g(수득율 65%)를 얻었다.
시안화나트륨 2.0g을 술폭사이드 15mL에 첨가하고, 90℃로 가열하였다. 디메틸설폭사이드 5mL에 용해된 5-클로로에틸-2-옥신돌 3.0g을 상기 반응물에 교반하면서 천천히 첨가한 후, 2시간동안 150℃로 가열하였다. 그 혼합물을 냉각하고, 얼음물을 부가한 후, 건조시켜 가공하지 않은 생성물을 얻었다. 천연 물질을 클로로포름에 녹인 5%메탄올을 사용한 실리카 겔 관 크로마토그래피로 분리하여 표제 화합물 1.2g (수율 42%)를 얻었다.
5-시아노에틸-2-옥신돌 4.02g 을 농축된 염산 25mL를 이루어진 용액내에서 4시간동안 환류시켰다. 상기 혼합물은 냉각시키고, 증류수를 부가한 후에 진공여과하여 결과물을 회수하여 증류수로 세척하여 건조시켜 노란색 고체인 5-카르복시에틸-2-옥신돌 1.9g(수율 44%)을 얻었다.
1H NMR(360 MHz, DMSO-d6): δ12.00 (s, br, 1H, 5-CH2CH2COOH), 10.21(s, 1H, NH-1), 7.05 (s, 1H, H-4) 6.99 (d, J = 8.68 Hz, 1H, H-6), 6.69 (d, J = 8.68 Hz, 1H, H-7), 3.40 (s, 2H, CH2-3), 2.74(t, J = 7.44 Hz, 2H, 5-CH2CH2 COOH)과 2.46 (t, J = 7.44 Hz, 2H, -CH2CH2COOH).
에탄올 2mL에 녹인 4-(2-카르복시에틸)-2-포밀-3-메틸피롤 90.6mg, 5-카르복실에틸-2-옥시인돌 102.6g 과 피페리딘 75μL을 5시간동안 95℃로 가열하였다. 상기 반응 혼합물을 냉각시킨 후, 농축시켰다. 반응 잔여물을 6N의 염산 수용액 (aqueous hydrochloric acid)에 현탁시켰다. 침전물을 여과하고, 증류수로 세척하여 pH6의 상태가 되게 한 후, 진공 오븐에서 24시간동안 건조하였다. 가공하지 않은생성물을 에틸 아세테이트 헥산-아세트산을 용출제로 사용한 실리카 겔 판 크로마토그래피로 분리하여 노란색 고체인 표제 화합물 121mg(수율 66%)을 얻었다.
1H NMR (360 MHz, DMSO-d6) : δ 13.30(d, J = 2.38 Hz, 1H, NH-1′), 12.03 (s, vbr, 2H, 2xCOOH), 10.68 (s, br, 1H, NH-1), 7.63 (s, 1H, H-4), 7.59 (s, 1H, H-vinyl), 7.12 (d, J = 2.64 Hz, 1H, H-2′), 6.96 ( dd, J = 1.22, 7.93 Hz, 1H, H-6), 6.75 (d, J = 7.93 Hz, 1H, H-7), 2.81 (t, J = 7.75 Hz, 2H, CH2CH2COOH), 2.65 (t, J = 7.75 Hz, 2H, CH2CH2COOH), 2.46(t, J = 7.42 Hz,CH2CH2COOH)과 2.26 (s, 3H, CH3).
실시예 17
3-[5-(5-에틸-2-옥소-1,2-디하이드로-인돌-3-일리덴메틸)-4-메틸-1H-피롤-3-일]-프로피온산
2-옥시인돌 3g을 1,3-디클로에탄에 현탁하고, 아세틸 클로라이드 3.2g을 천천히 처리하였다. 상기 현탁액을 5시간 동안 50℃까지 가열하고, 냉각한 후, 물에 부었다. 생성된 침전물을 진공 여과를 통해 회수하고, 증류수로 충분히 세척하고 진공하에서 건조하여 갈색 고체인 5-아세틸-2-옥신돌 2.9g (수율 73%)를 얻었다.
냉각 장치(ice bath)내에서 트리플루오르 아세트산 15mL에 용해시킨 5-아세틸-2-옥신돌 2g을 1.8g의 트리에틸실란으로 천천히 처리하고, 5시간동안 실온에서 천천히 교반하였다. 트리에틸실란 1mL를 첨가하고 24시간동안 교반하였다. 반응 혼합물을 얼음물에 부은 후, 생성된 참전물을 진공 여과를 통해 회수하여, 증류수로 충분히 세척하여 진공하에서 건조하여 노란색 고체인 표제화합물 1.3g (수율 71%)을 얻었다.
1H NMR (360 MHz, DMSO-d6) : δ 10.25(s, br, 1H, NH-1), 7.03 (s, 1H, H-4), 6.97 (d, J = 8.05 Hz, 1H, H-6), 6.69 (d, J = 8.05 Hz, 1H, H-7), 3.40 (s, 2H, CH2-3), 2.51( q, J = 7.69 Hz, 2H, CH2CH3-5)과 1.12 (t, J = 7.42 Hz, 3H, CH2CH3-5).
에탄올 2mL에 녹인 4-(2-카르복시에틸)-2-포밀-3-메틸피롤 90.6mg, 5-에틸-2-옥신돌 80.5mg과 피페리딘 75μL을 5시간동안 95℃로 가열하였다. 상기 반응 혼합물을 냉각시킨 후, 농축시켰다. 반응 잔여물을 6N의 염산 수용액에 현탁시키고, 증류수로 세척하여 pH6 상태에 이르게 하고, 침전물을 여과하고, 증류수로 세척하여 pH6의 상태가 되게 한 후, 진공 오븐에서 24시간동안 건조하였다. 가공하지 않은 생성물을 에틸 아세테이트 헥산-아세트산을 용출제로 사용한 실리카 겔 판 크로마토그래피로 분리하여 표제 화합물 52mg(수율 32%)을 얻었다.
1H NMR (360 MHz, DMSO-d6) : δ 13.31 (s, br, 1H, NH-1′), 12.04 (s, vbr, 1H, COOH), 10.66 (s, 1H, NH-1), 7.59 (s, 2H, H-4 와 H-vinyl), 7.11 (d, J = 3.29 Hz, 1H, H-2′), 6.94 ( d, J = 7.85 Hz, 1H, H-6), 6.75 (d, J = 7.85 Hz, 1H, H-7), 2.65 (t, J = 7.66 Hz, 2H, CH2CH2COOH), 2.57 (q, J = 7.83 Hz, 2H, CH3CH2), 2.46 (t, J = 7.66 Hz, CH2CH2COOH), 1.20 (t, J = 7.83, 3H, CH3CH2 ), 2.26 (s, 3H, CH3); MS m/z 325 [M+1]+.
실시예 18
3-[5-(5-메톡시-2-옥소-1,2-디하이드로인돌-3-일리덴메틸)-4-메틸-1H-피롤-3-일]-프로피온 산
수화 클로랄(Choral hydrate) 9.6g을 황산 나트륨 83g 을 함유하는 물 200mL에 용해시킨다. 상기 용액을 60℃로 데운 다음, 50mL의 증류수에 용해된 11.4g의 하디드록시아민 하이드로클로라이드를 부가하고, 그 혼합물을 60℃로 유지하였다. 다른 플라스크에, 4-아니시딘(anisidine) 6.4g 과 80mL의 증류수에 용해시킨 농축 염산 4.3mL을 60℃로 데운다. 첫번째 수용액을 두번째 수용액에 첨가하고, 상기 혼합물을 2분동안 환류시킨 후, 서서히 실온으로 냉각시키고, 진공하에서 건조하여 N-(2-하이드로시이미노아세틸)아니시딘 8.6g(수율 85%)를 얻었다.
5mL의 물에 포함된 농축된 황산 45mL를 60℃로 데운 다음, N-(2-하이드로시이미노아세틸)아니시딘 8.6g을 일부분을 첨가하였다. 교반된 혼합물을 10분간 93 ℃에서 가열하고 나서, 실온으로 냉각시켰다. 상기 혼합물을 얼음 500g에 붓고, 에틸 아세테이트를 사용하여 3번 추출하였다. 얻어진 추출물을 무수화 황산 나트륨으로 건조하고, 농축하면 어두운 붉은색 고체인 5-메틸옥시산틴 5.1g (수율 65%)를 얻었다.
5-메톡시이산틴 5.0g 과 하이드라진 하이드레이트 30mL을 가열하여 15분동안 환류반응을 시켰다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각하고, 증류수 50mL를 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 25mL의 에틸 아세테이트를 사용하여 3번 추출하고, 유기층을 결합한 후, 무수화 황산 나트륨을 사용하여 건조하고 농축시켜 노란색 고체를 얻었다. 그 고체를 에틸 아세테이트와 교반한 후, 진공 여과를 통해 불용성 물질 1.1g을 제거하고, 저장하였다. 이 물질은 2-하이드라지노-카르보닐메틸-4-아니시딘으로 판명되었다. 이 여과액을 농촉시킨 후, 에틸아세테이트:헥산이 1:1인 용출제를 사용하여 실리카 겔 관 크로마토그래피로 분리하여 칙칙한 노란색의 고체인 5-메톡시-2-옥시인돌 0.7g을 얻었다. 2-하이드라지노카르보닐메틸-4-아니시딘 1.1g을 1N 수산화나트륨용액 2mL내에서 1시간동안 환류반응을 시켰다. 상기 혼합물을 냉각시키고, 농축된 염산으로 처리하여 pH2상태로 산성화한 후, 에틸 아세테이트 25mL를 사용하여 3번 추출하였다. 유기 추출물들을 반응 시키고, 염류용액로 세척하고, 무수황산나트륨으로 건조한 후, 농축시켜 칙칙한 노란색 고체인 5-메톡시-2-옥신돌 0.8g을 얻었다. 총수율은 1.5g 또는 33%였다.
1H NMR (360 MHz, DMSO-d6) : δ 10.13 (s, br, 1H, NH-1), 6.84 (s, 1H,H- 4), 6.72 (d, J = 8.68 Hz, 1H, H-6), 6.69 (d, J = 8.68 Hz, 1H H-7), 3.68 (s, 3H, OCH3-5), 3.41 ( s, 2H, CH2-3). MS m/z (상대 강도, %) 163 ([M+1]+, 100).
4-(2-카르복시에틸)-2-포밀-3-메틸피롤 90mg, 5-메톡시-2-옥신돌 82mg 과 피페리딘 2방울을 에탄올 2mL에 용해시킨 후, 24시간동안 95℃에서 가열하였다. 상기 반응 혼합물을 냉각하고, 농축하였다. 잔여물을 6N 염산 수용액에 현탁시켰다. 침전물을 여과하고, 증류수로 세척하여 pH6 상태를 만든 후, 24시간동안 진공하에서 건조하여 갈색 고체인 표제 화합물 110mg(수율 67%)을 얻었다.
1H NMR (360 MHz, DMSO-d6) : δ 13.38 (s, br, 1H, NH-1′), 12.03 (s, vbr, 1H, COOH), 10.57 (s, 1H, NH-1), 7.63 (s, 1H, H-vinyl), 7.42 (d, J = 2.46 1H, H-4), 7.12 ( d, J = 3.08 Hz, 1H, H-2′), 6.74 (d, J = 8.26 Hz, 1H, H-6), 6.75 (dd, J = 2.46, 8.26 Hz, 1H, H-7), 3.77 (s, 3H, OCH3), 2.65 (t, J = 7.40 Hz, 2H, CH2CH2COOH), 2.46 (t, J = 7.40 Hz, CH2CH2COOH), 2.27(s, 3H, CH3); MS m/z (상대 강도, %) 327 ([M+1]+, 100).
실시예 19
3-[5-(5-브로모-2-옥소-1,2-디하이드로인돌-3-일리덴메틸)-2,4-디메틸-1H-피롤-3-일]-프로피온 산
에탄올 2mL에 녹인 3-(2-카르복시에틸)-2,4-디메틸-5-포밀피롤 97.5g, 5-브로모-2-옥시인돌 및 피페리딘 75μL을 5시간동안 95℃로 가열하였다. 상기 반응 혼합물을 냉각시킨 후, 농축시켰다. 반응 잔여물을 6N의 염산 수용액 (aqueous hydrochloric acid)에 현탁시키고, 증류수로 세척하여 pH6 상태에 이르게 하고, 침전물을 여과하고, 물로 세척하여 pH6의 상태가 되게 한 후, 진공 오븐에서 24시간동안 건조하여 주황색 고체인 표제 화합물 171mg(수율 88%)을 얻었다.
1H NMR (360 MHz, DMSO-d6) : δ 12.04 (s, vbr, 1H, COOH), 10.08 (s, br, 1H, NH-1), 8.0 (d, J = 2.06 Hz 1H, H-4), 7.67 ( s, 1H, H-vinyl), 7.19 (dd, J = 2.06, 8.04 Hz, 1H, H-6), 6.79 (d, J = 8.40, Hz, 1H, H-7), 2.65 (t, J = 7.63 Hz, 2H, CH2CH2COOH), 2.35 (t, J = 7.63 Hz, 2H, CH2CH2COOH), 2.29(s, 3H, CH3), 2.27 (s, 3H, CH3); MS m/z (상대 강도, %) 389 ([M+1]+, 100).
3-[5-(5-요오도-2-옥소-1,2-디하이드로인돌-3-일리덴메틸)-2,4-디메틸-1H-피롤-3-일]-프로피온산
3-(2-카르복시에틸)-2,4-디메틸-5-포밀피롤 130mg, 5-요도-2-옥시인돌 130mg 및 피페리딘 75μL을 에탄올 3mL에 첨가하고, 5시간동안 95℃로 가열하였다. 상기 반응 혼합물을 냉각시킨 후, 농축시켰다. 반응 잔여물을 6N의 염산 수용액에 현탁시키고, 침전물을 여과하고, 증류수로 세척하여 pH6의 상태가 되게 한 후, 진공 오븐에서 24시간동안 건조하여 주황색 고체인 표제 화합물 155mg(수율 71%)을 얻었다.
1H NMR (360 MHz, DMSO-d6) : δ 13.41 (s, br, 1H, NH-1′), 12.03 (s, br, 1H, COOH), 10.79 (s, br, 1H, NH-1), 8.12 (d, J = 1.70 Hz, 1H, H-4), 7.65 (s, 1H, H-vinyl), 7.36 (dd, J = 1.70, 7.93 Hz, 1H, H-6), 6.79 (d, J = 7.93 Hz, 1H, H-7), 2.64 (t, J = 7.76 Hz, 2H, CH2CH2COOH), 2.34 (t, J = 7.76 Hz, 2H, CH2CH2COOH), 2.29(s, 3H, CH3), 2.27 (s, 3H, CH3); MS m/z (상대 강도, %) 437 ([M+1]+, 100).
실시예 20
3-[5-(5-요오도-2-옥소-1,2-디하이드로인돌-3-일리덴메틸-2,4-디메틸-1H-피롤-3-일]-프로피온산
에탄올 3mL에 녹인 3-(2-카르복시에틸)-2,4-디메틸-5-포밀피롤 97.5g, 5-요도-2-옥시인돌 130mg 및 피페리딘 75μL을 5시간동안 95℃로 가열하였다. 상기 반응 혼합물을 냉각시킨 후, 농축시켰다. 반응 잔여물을 6N의 염산 수용액에 현탁시키고, 침전물을 여과하고, 증류수로 세척하여 pH6의 상태가 되게 한 후, 진공 오븐에서 24시간동안 건조하여 주황색 고체인 표제 화합물 155mg(수율 71%)을 얻었다.
1H NMR (360 MHz, DMSO-d6) : δ 13.41 (s, br, 1H, NH-1′), 12.03 (s, br, 1H, COOH), 10.79 (s, br, 1H, NH-1), 8.12 (d, J = 1.70 Hz, 1H, H-4), 7.65 (s, 1H, H-vinyl), 7.36 (dd, J = 1.70, 7.93 Hz, 1H, H-6), 6.79 (d, J = 7.93 Hz, 1H, H-7), 2.64 (t, J = 7.76 Hz, 2H, CH2CH2COOH), 2.34 (t, J = 7.76 Hz, 2H, CH2CH2COOH), 2.29(s, 3H, CH3), 2.27 (s, 3H, CH3).
MS m/z (상대 강도, %) 437 ([M+1]+, 100).
실시예 21
3-[2,4-디메틸-5-(4-메틸-2-옥소-1,2-디하이드로인돌-3-일리덴-메틸)-1H-피롤-3-일]--프로피온산
에탄올 3mL에 녹인 3-(2-카르복시에틸)-2,4-디메틸-5-포밀피롤 97.5g, 4-메틸-2-옥시인돌 74mg 및 피페리딘 75μL을 5시간동안 95℃로 가열하였다. 상기 반응 혼합물을 냉각시킨 후, 농축시켰다. 반응 잔여물을 6N의 염산 수용액 (aqueous hydrochloric acid)에 현탁시키고, 침전물을 여과하고, 증류수로 세척하여 pH6의 상태가 되게 한 후, 진공 오븐에서 24시간동안 건조하여 녹색 고체인 표제 화합물 60mg(수율 37%)을 얻었다.
1H NMR (360 MHz, DMSO-d6) : δ 13.41 (s, br, 1H, NH-1′), 12.03 (s, br, 1H, COOH), 10.72 (s, br, 1H, NH-1), 7.50 (s, 1H, H-vinyl), 7.01 (t, J = 7.82 Hz, 1H, H-6), 6.79 (d, J = 7.82 Hz, H-5), 6.74 (d, J = 7.82 Hz, 1H, H-7), 2.64 (t, J = 7.76 Hz, 2H, CH2CH2COOH), 2.56 (s, 3H, CH3), 2.34 (s, 3H, CH3); MS m/z (상대 강도, %) 325 ([M+1]+, 100).]
실시예 22
3-[2,4-디메틸-5-(5-메틸-2-옥소-1,2-디하이드로인돌-3-일리덴메틸)-1H-피롤 -3-일]--프로피온산
에탄올 3mL에 녹인 3-(2-카르복시에틸)-2,4-디메틸-5-포밀피롤 97.5g, 4-메틸-2-옥시인돌 74mg 및 피페리딘 75μL을 5시간동안 95℃로 가열하였다. 상기 반응 혼합물을 냉각시킨 후, 농축시켰다. 반응 잔여물을 6N의 염산 수용액 (aqueous hydrochloric acid)에 현탁시키고, 침전물을 여과하고, 증류수로 세척하여 pH6의 상태가 되게 한 후, 진공 오븐에서 24시간동안 건조하여 노란색 고체인 표제 화합물 104mg(수율 64%)을 얻었다.
1H NMR (360 MHz, DMSO-d6) : δ 13.38 (s, br, 1H, NH-1′), 12.02 (s, br, 1H, COOH), 10.57 (s, br, 1H, NH-1), 7.52 (s, br, 1H, H-4), 7.50 (s,1H, H-vinyl), 6.87 (d, J = 7.86 Hz, 1H, H-6), 6.73 (d, J = 7.86 Hz, 1H, H-7), 2.63 (t, J = 7.49 Hz, 2H, CH2CH2COOH), 2.34(t, J = 7.49 Hz, 2H, CH2CH2 COOH) 2.29 (s, 3H, CH3), 2.28 (s, 3H, CH3)와 2.24 (s, 3H, CH3); MS m/z (상대 강도, %) 325 ([M+1]+, 66).
실시예 23
3-[5-(6-히드록시-2-옥소-1,2-디하이드로인돌-3-일리덴메틸)-2,4-디메틸-1H-피롤-3-일]-프로피온산
60mL 디클로로메탄에 용해된 6-메톡시-2 옥신돌 3.26g을 -2℃로 냉각하고, 디클로로메탄에 용해된 1M의 보론 트리브로마이드 용액을 소량씩 첨가하였다. 반 응 혼합물을 냉각 장치에서 1시간동안 교반시키고 나서 실온에서 1시간동안 교반하였다. 그 후, 얼음물에 상기 혼합물을 붓고, 에틸 아세테이트를 사용하여 추출하였다. 유기층을 증류수와 염류용액으로 세척하고, 무수의 황산 나트륨을 사용하여 건조시키고, 농축한 후, 형성된 침전물을 여과한 후, 진공 오븐내에서 24시동안 건조하여 6-히드록시-2-옥신돌 2.56g(수율 86%)를 얻었다.
1H NMR (360 MHz, DMSO-d6) : δ 10.13 (s, 1H, NH-1), 9.22 (s, 1H, OH-6), 6.93 (d, J = 7.76 Hz, 1H, H-4), 6.27-6.31 (m, 2H, H-5,7)과 3.29 (s, 2H, CH3-3); MS m/z 150 [M+1]+.
3-(2-카르복시에틸)-2,4-디메틸-5-포밀피롤 97.5g, 6-히드록시-2-옥시인돌 63mg 및 피페리딘 48μL을 에탄올 2mL에 첨가하고, 이틀동안 90℃로 가열하였다. 상기 반응 혼합물을 냉각시킨 후, 농축시켰다. 에틸 아세테이트-헥산-아세트산을 용출제로 사용한 실리카겔 관 크로마토그래피를 사용하여 정제하여 진한 갈색 고체인 표제 화합물 55mg(수율 40%)을 얻었다.
1H NMR (360 MHz, DMSO-d6) : δ 13.10 (s, br, 1H, NH-1′), 12.0 (s, vbr, 1H, COOH), 10.51 (s, br, 1H, NH-1), 9.41 (s, 1H, OH), 7.44 (d, J = 7.83, 1H, H-4), 7.29 (s, 1H, H-vinyl), 6.37 (dd, J = 2.16, 7.83 Hz, 1H, H-5), 6.33(d, J = 2.16 Hz, 1H, H-7), 2.62 (t, J = 7.75 Hz, 2H, CH2CH2COOH), 2.32 (t, J = 7.75 Hz, 2H, CH2CH2COOH),2.25 (s, 3H, CH3), 2.20 (s, 3H, CH3); MS m/z 325 [M+1]+.
실시예 24
3-[5-(6-메톡시-2-옥소-1,2-디하이드로인돌-3-일리덴메틸)-2,4-디메틸-1H-피롤-3-일]-프로피온산
에탄올 2mL에 녹인 3-(2-카르복시에틸)-2,4-디메틸-5-포밀피롤 97.5mg, 6-메톡시-2-옥시인돌 130mg 및 피페리딘 2방울을 24시간동안 95℃로 가열하였다. 상기 반응 혼합물을 냉각시킨 후, 농축시켰다. 반응 잔여물을 2N의 염산 수용액 (aqueous hydrochloric acid)에 현탁시키고, 침전물을 여과하고, 증류수로 세척하여 pH6의 상태가 되게 한 후, 진공 오븐에서 24시간동안 건조하여 노란색 고체인 표제 화합물 130mg(수율 76%)을 얻었다.
1H NMR (360 MHz, DMSO-d6) : δ 13.15 (s, br, 1H, NH-1′), 11.75 (s, vbr, 1H, COOH), 10.65 (s, br, 1H, NH-1), 7.58 (d, J = 8.27 Hz, 1H, H-4), 7.29 (s, 1H, H-vinyl), 6.37 (dd, J = 2.26, 8.27 Hz, 1H, H-5), 6.33 (d, J = 2.26 Hz, 1H, H-7), 3.74 (s, 3H, OCH3), 2.62 (t, J = 7.67 Hz, 2H, CH2CH2COOH), 2.33 (t, J = 7.67 Hz, 2H, CH2CH2COOH), 2.26 (s, 3H, CH3)와 2.22 (s, 3H, CH3); MS m/z (상대 강도, %) 341 ([M+1]+, 100).
실시예 25
3-[5-(6-히드록시-2-옥소-1,2-디하이드로인돌-3-일리덴메틸)-4-메틸-1H-피롤 -3-일]-프로피온산
에탄올 10mL에 녹인 4-(2-카르복시에틸)-2-포밀-3-메틸피롤 543mg, 6-히드록시-2-옥시인돌 450mg 및 피페리딘 450μL을 24시간동안 95℃로 가열하였다. 상기 반응 혼합물을 냉각시킨 후, 농축시켰다. 반응 잔류물을 2N의 염산 수용액 (aqueous hydrochloric acid)에 현탁시키고, 침전물을 여과하고, 증류수로 세척하여 pH6의 상태가 되게 한 후, 진공 오븐에서 24시간동안 건조하여 갈색 고체를 얻었다.
1H NMR (360 MHz, DMSO-d6) : δ 13.15 (s, br, 1H, NH-1′), 10.60 (s, br, 1H, NH-1), 9.4 (s, 1H, OH), 7.49 (d, J = 8.08, 1H, H-4), 7.35 (s, 1H, H-vinyl), 7.02 (d, J = 3.22 Hz, 1H, H-2′), 6.38 (dd, J = 2.28, 8.08 Hz, 1H, H-5), 6.32 (d, J = 2.28Hz, 1H, H-7), 2.62 (t, J = 7.67 Hz, 2H, CH2CH2COOH), 2.44 (t, J = 7.67 Hz, 2H, CH2CH2COOH)과 2.21 (s, 3H, CH3); MS m/z (상대 강도, %) 313 ([M+1]+, 60).
실시예 26
3-[5-(6-히드록시-2-옥소-1,2-디하이드로인돌-3-일리덴메틸)-4-메틸-1H-피롤-3-일]-프로피온 산- 3,5-디메톡시-벤질에스테르
2mL의 무수 디메틸포름아미드에 녹인 3-[5-(6-히드록시-2-옥소-1,2-디하이드로인돌-3-일리덴메틸)-4-메틸-1H-피롤-3-일]-프로피온 산 100mg, 3,5-디메톡시- 벤질클로라이드 56mg과 탄산칼륨 207mg을 24시간동안 90℃로 가열하였다. 상기 반응 혼합물을 냉각시킨 후, 증류수를 가하고 에틸 아세테이트를 사용하여 추출하였다. 유기층을 증류수과 염류용액로 세척하여, 무수 황산 나트륨을 사용하여 건조시켜 농축하였다. 가공하지 않은 생성물을 에틸 아세테이트-헥산-아세트산을 용출제로 사용하는 실리카 겔 관 크로마토크래피로 분리하여 정제하여 갈색 고체인 표제 화합물 39mg을 얻었다.
1H NMR (360 MHz, DMSO-d6) : δ 13.06 (s, br, 1H, NH-1′), 10.60 (s, br, 1H, NH-1), 9.4 (s, br, 1H, OH), 7.49 (d, J = 8.03, 1H, H-4), 7.35 (s, 1H, H-vinyl), 7.01 (d, J = 3.08 Hz, 1H, H-2′), 6.47 (d, J = 2.29 Hz, 2H, aroamtic), 6.42 (t, J = 2.29Hz, 1H, aromatic), 6.38 (dd, J = 2.15, 8.03 Hz, 1H, H-5), 6.33 (d, J = 2.15 Hz, 1H, H-7), 5.01 (s, 2H, CH2-Ph), 3.70 (s, 6H, 2xOCH3), 2.59-2.72 (m, 4H, CH2CH2COOH)와 2.20 (s, 3H, CH3).
실시예 27
3-{5-[6-(3-메톡시-페놀)-2-옥소-1,2-디하이드로인돌-3-일리덴메틸]-2,4-디메틸-1H-피롤-3-일]-프로피온산
테트라키스(트리페닐포스핀) 팔라듐 0.7g을 3-메톡시페닐보론산을 톨루엔 100mL에 녹인 2M 탄산 나트륨 11mL와 5-브로모-2-플루오로니트로벤젠에 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 2시간동안 환류시키고, 증류수을 첨가하여 희석하고, 에틸 아세테이트를 가하여 추출하였다. 에틸 아세테이트를 포화된 소디움 카보네이트로세척한 후, 다시 염류용액로 세척하고, 건조시킨 후 농축하여 유성의 고체를 얻었다. 상기 고체를 에틸 아세테이트:헥산(1:6)을 용출제로 사용하는 실리카 겔 관 크로마토크래피로 분리하여 정제하여 4-플루오로-3′-메톡시-3-니트로바이페닐 4.3g (수율 77%)을 얻었다.
디메틸 말로내이트 9.7mL를 디메틸설폭사이드 50mL에 현탁된 수소화나트륨 2.0g에 소량씩 첨가하고 100℃에서 35분동안 가열한 후, 실온으로 냉각하였다. 50mL 디메틸설폭사이드에 용해된 4-플루오로-2′-메톡시-3-니트로바이페닐 4.2g을 첨가하고, 상기 혼합물을 100℃에서 1시간동안 가열하였다. 반응 혼합물을 냉각하고, 암모늄클로라이드 포화 용액 300mL에 담그고, 에틸 아세테이트로 2번 추출하였다. 상기 추출물을 혼합하고, 염류용액로 세척하고, 무수 황산 나트륨을 사용하여 건조시킨 후, 농축하여 담황색의 고체인 천연 디메틸 3′-메톡시-3-니트로바이페닐-4-말로내이트를 얻었다.
천연 디메틸 3′-메톡시-3-니트로바이페닐-4-말로내이트를 6N 염산 45mL에 넣고, 4일동안 110℃에서 가열하였다. 여과를 통해 침전물을 회수하고, 증류수와 헥산으로 세척한 후, 건조하여 밝은 황갈색 고체인 3′-메톡시-3-니트로바이페닐-4-아세테이트 5.3g 을 얻었다.
3′-메톡시-3-니트로바이페닐-4-아세테이트 5.2g 을 메탄올에 용해시키고, 실온에서 3시간동안 10%이상의 팔라듐이 첨가된 탄소 0.8g의 존재하에서 수소화반응을 시켰다. 상기 결정을 여과를 통해 제거하고, 메탄올로 세척하고, 여과액을 부가하고 농척하여 갈색고체를 얻었다. 상기 고체는 에틸 아세테이트:헥산:아세트 산의 비율이 33:66:1인 용출제를 사용한 실리카 겔 관 크로마토그래피로 분홍색 고체인 6-(3-메톡시페닐)-2-옥신돌 3.0g(4-플루오로-3′-메톡시-3-니트로바이페닐에 기초한)수율 75%)을 얻었다.
1H NMR (360 MHz, DMSO-d6) : δ 10.39 (s, br, 1H, NH), 7.35 (t, J = 7.85 Hz, 1H), 7.26 (d, J = 7.78 Hz, 1H), 7.19 (dd, J = 7.85 Hz, 1H), 7.13-7.16 (m, 1H), 7.09-7.1 (m, 1H), 7.01 (d, J = 1.48 Hz, 1H), 6.90-6.93 (m, 1H), 3.8 (s, 3H, OCH3), 3.49 (s, 2H, CH2); MS m/z (상대 강도, %) 240.0 ([M+1]+, 100).
3-(2-카르보닐에틸)-2,4-디메틸-5-포밀피롤 117mg, 6-(3-메톡시페닐)-2-옥신돌 120mg 및 피페리딘 3방울을 에탄올 3mL에 용해시키고, 90℃에서 24시간동안 가열하였다. 상기 혼합물을 냉각시키고, 농축하였다. 잔류물은 6N염산 수용액에 현탁시켰다. 침전물을 여과하고, 증류수로 세척하여 pH6의 상태에 이르게 하여, 진공 오븐내에서 24시간동안 건조하여 갈색고체인 표제 화합물 190mg(수율 91%)를 얻었다.
1H NMR (360 MHz, DMSO-d6) : δ 13.38 (s, br, 1H, NH-1′), 12.04 (s, br, 1H, COOH), 10.79 (s, br, 1H, NH-1), 7.77 (d, J = 8.05, 1H, H-4), 7.58 (s, 1H, H-vinyl), 7.27 (dd, J = 1.49, 8.05 Hz, 1H, H-5), 7.09 (d, J = 1.49, 1H, H-7), 6.89-7.59 (m, 4H), 3.81 (s, 3H, OCH3), 2.65 (t, J = 7.62 Hz, 2H, CH2CH2COOH), 2.35 (t, J = 7.62 Hz, 2H, CH2CH2COOH), 2.30(s, 3H, CH3)와 2.27(s, 3H, CH3); MS m/z (상대 강도, %) 417 ([M+1]+, 75).
실시예 28
3-[5-(6-브로모-2-옥소-1,2-디하이드로인돌-3-일리덴메틸)-4-메틸-1H-피롤-3-일]-프로피온 산
디메틸 말로내이트 13mL를 디메틸술폭사이드 20mL에 현탁된 수소화나트륨 2.7g에 소량씩 첨가하고 100℃에서 10분동안 가열한 후, 실온으로 냉각하였다. 25mL 디메틸술폭사이드에 용해된 5-브로모-2-플루오로니트로벤젠 5.0g을 첨가하고, 상기 혼합물을 100℃에서 2시간동안 가열하였다. 반응 혼합물을 냉각하고, 암모늄클로라이드 포화 용액 300mL에 담그고, 에틸 아세테이트로 3번 추출하였다. 상기 추출물을 혼합하고, 암모늄 클로라이드 포화 용액, 증류수와 염류용액로 세척하고, 무수 황산 나트륨을 사용하여 건조시킨 후, 농축하여 담황색의 고체인 천연 디메틸 4-브로모-2-니트로바이페닐말로내이트를 얻었다.
천연 디메틸 4-브로모-2-니트로바이페닐말로내이트를 6N 염산 40mL에 넣고, 24시간동안 110℃에서 가열하였다. 여과를 통해 침전물을 회수하고, 증류수로 세척한 후, 건조하여 회색 고체인 4-브로모-2-니트로바이페닐아세테이트 5.3g(수율 89%)을 얻었다.
4-브로모-2-니트로바이페닐아세테이트 0.26g 아연가루 0.26g과 50% 술폰산 30g을 5 mL 에탄올에 용해시키고, 24시간동안 100℃에서 가열하였다. 반응 혼합물 을 여과시키고, 소량의 아세테이트로 희석한 다음, 에탄올을 제거하기 위해 농축시킨 후, 물로 희석하고, 에틸 아세테이트로 2번 추출하였다. 혼합된 추출물을 염류용액로 세척하고, 무수 황산 나트륨을 사용하여 건조하고, 농축하여 노란색 고체인 6-브로모-2-옥신돌 0.19g (수율 90%)를 얻었다.
1H NMR (360 MHz, DMSO-d6) : δ 10.45 (s, br, 1H, NH-1), 7.14 (d, J = 7.89 Hz, 1H, H-4), 7.09 (dd, J = 1.53, 7.89 Hz, 1H, H-5), 6.93 (d, J = 1.53 Hz, 1H, H-7)과 3.43 (s, 2H, CH2-3); MS m/z (상대 강도, %) 210.0 ([M-2]+, 100) 과 212 (M+, 100).
에탄올 3mL에 용해시킨 4-(2-카르보실에틸)-2-포밀-3-메틸피롤 90mg, 6-브로모-2-옥신돌 106mg 및 피페리딘 3방울을 90℃에서 4시간동안 가열하였다. 상기 혼합물을 냉각시키고, 농축하였다. 잔류물은 6N염산 수용액에 현탁시켰다. 침전물을 여과하고, 증류수로 세척하여 pH6의 상태에 이르게 하여, 진공 오븐내에서 24시간동안 건조하여 노란색 고체인 표제 화합물 172mg(수율 92%)를 얻었다.
1H NMR (360 MHz, DMSO-d6) : δ 13.22 (s, br, 1H, NH-1′), 12.04 (s, br, 1H, COOH), 10.92 (s, br, 1H, NH-1), 7.73 (d, J = 8.37, 1H, H-4), 7.67 (s, 1H, H-vinyl), 7.18 (d, J = 3.22 Hz, 1H, H-2′), 7.14 (dd, J = 1.33, 8.37 1H, H-5), 6.99 (d, J = 1.33 Hz, 1H, H-7), 2.64 (t, J = 7.39 Hz, 2H, CH2CH2COOH), 2.46 (t, J = 7.39 Hz, 2H, CH2CH2COOH), 2.25 (s, 3H, CH3); MS (APCI) m/z 375.0 [M+1]+.
실시예 29
3-{5-[6-(3-메톡시-페닐)-2-옥소-1,2-디하이드로인돌-3-일리덴메틸]-4-메틸-1H-피롤-3-일}-프로피온 산
에탄올 3mL에 용해시킨 4-(2-카르보실에틸)-2-포밀-3-메틸피롤 90.5mg, 6-3-메톡시페닐-2-옥신돌 120mg 및 피페리딘 3방울을 90℃에서 24시간동안 가열하였다. 상기 혼합물을 냉각시키고, 농축하였다. 잔류물은 6N염산 수용액에 현탁시켰다. 침전물을 여과하고, 증류수로 세척하여 pH6의 상태에 이르게 하여, 진공 오븐내에서 24시간동안 건조하여 갈색 고체인 표제 화합물 195mg(수율 97%)를 얻었다.
1H NMR (360 MHz, DMSO-d6) : δ 13.29 (s, br, 1H, NH-1′), 12.07 (s, br, 1H, COOH), 10.88 (s, br, 1H, NH-1), 7.82 (d, J = 7.77, 1H, H-4), 7.65 (s, 1H, H-vinyl), 7.27 (dd, J = 1.41 Hz, 1H, H-7), 6.89-7.36 (m, 5H), 3.82(s, 3H, OCH3), 2.65 (t, J = 7.55 Hz, 2H, CH2CH2COOH), 2.47 (t, J = 7.55 Hz, 2H, CH2CH2COOH), 2.27 (s, 3H, CH3); MS (APCI) m/z 401 [M-1]+.
실시예 30
3-{5-[6-(3-에톡시-페놀)-2-옥소-1,2-디하이드로인돌-3-일리덴메틸]-2,4-디메틸-1H-피롤-3-일]-프로피온산
테트라키스(트리페닐포스핀) 팔라듐 0.8g을 톨루엔 50mL와 에탄올 50mL에 용해된 3-에톡시페닐보론산 4.2g과 5-브로모-2-플루오로니트로벤젠 5.0g에 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 2시간동안 환류시킨 후 농축하였다. 물을 첨가하고, 에틸 아세테이트를 가하여 2번 추출하였다. 혼합된 에틸 아세테이트 막을 물과 염류용액로 세척한 후, 건조하고 농축하였다. 잔류물은 에틸 아세테이트:헥산 (1:5)의 혼합용매를 용출제로 사용하는 실리카 겔 관 크로마토크래피로 분리하여 노란색 기름인 4-플루오로-3′-에톡시-3-니트로바이페닐 5.3g (수율 90%)을 얻었다.
디메틸 말로내이트 11.4mL를 디메틸술폭사이드 20mL에 현탁된 수소화나트륨 4.0g에 소량씩 첨가하고 100℃에서 10분동안 가열한 후, 실온으로 냉각하였다. 25mL 디메틸술폭사이드에 용해된 4-플루오로-3′-에톡시-3-니트로바이페닐 5.3g을 첨가하고, 상기 혼합물을 100℃에서 2시간동안 가열하였다. 반응 혼합물을 냉각하고, 암모늄클로라이드 포화 용액 300mL에 담지하고, 에틸 아세테이트로 3번 추출하였다. 상기 추출물을 화합하고, 증류수와 염류용액로 세척하고, 무수 황산 나트륨을 사용하여 건조시킨 후, 농축하여 노란색을 띤 기름인 천연 디메틸 3′-에톡시-3-니트로바이페닐-4-말로내이트를 얻었다.
천연 디메틸 3′-에톡시-3-니트로바이페닐-4-말로내이트를 6N 염산 60mL에 넣고, 4일동안 110℃에서 가열한 후, 냉각시켰다. 여과를 통해 침전물을 회수하고, 증류수와 헥산으로 세척한 후, 건조하여 밝은 황갈색 고체인 3′-에톡시-3-니트로바이페닐-4-아세테이트 4.7g(5-브로모-2-플루오로니트로벤젠에 기초한)을 얻었다.
아이언 칩(Iron chips) 2.4g을 40mL 빙초산에 첨가한 3′-에톡시-3-니트로바이페닐-4-아세테이트 4.6 g에 첨가하고, 2시간동안 환류반응시켰다. 상기 반응 혼합물을 농축하여 건조하게 하고, 에틸 아세테이트로 반복하여 처리하고, 불용성물질을 제거하기 위해 여과하였다. 여과액을 1N 염산으로 2번 세척한 후, 염류용액로 다시 세척하고, 무수 황산 나트륨으로 건조하고, 농축하여 밝은 갈색 고체인 6-(3-에톡시페닐)-2-옥신돌 3.5 g(수율 91 %)를 얻었다.
1H NMR (360 MHz, DMSO-d6) : δ 10.4 (s, br, 1H, NH), 7.33 (t, J = 8.4 Hz, 1H, H-3′), 7.35 (d, J = 7.77 Hz, 1H), 7.19 (dd, J = 1.3, 7.66 Hz, 1H), 7.13 (d, J = 7.69 Hz, 1H), 7.07-7.08 (m, 1H), 7.0 (s, br, 1H), 6.9 (dd, J = 2.82, 8.08 Hz, 1H), 4.08 (q, J = 7 Hz, 2H, OEt), 3.49 (s, 2H, CH2), 1.34 (t, J = 7 Hz, 3H, OEt), 3.49 (s, 2H, CH2), 1.34 (t, J = 7 Hz, 3H, OEt); MS m/z (상대 강도, %) 254.2 ([M+1]+, 100).
3-(2-카르복시에틸)-2,4-디메틸-5-포밀피롤 97.6mg을, 6-3-에톡시페닐-2-옥신돌 127mg 및 피페리딘 2방울을 에탄올 2mL에 용해시키고, 90℃에서 24시간동안 가열하였다. 상기 혼합물을 냉각시키고, 농축하였다. 잔류물은 6N염산 수용액에 현탁시켰다. 침전물을 여과하고, 증류수로 세척하여 pH6의 상태에 이르게 하여, 진공 오븐내에서 24시간동안 건조하여 갈색 고체인 표제 화합물(~ 100%) 227mg을 얻었다.
1H NMR (360 MHz, DMSO-d6) : δ 13.38 (s, br, 1H, NH-1′), 12.06 (s, br, 1H, COOH), 10.81 (s, br, 1H, NH-1), 7.77 (d, J = 7.97, 1H, H-4), 7.58 (s, 1H, H-vinyl), 7.26 (dd, J = 1.35 Hz, 1H, H-7), 6.89-7.36 (m, 4H), 4.09 (q, J = 7.0 Hz, 2H, CH3CH2), 2.65 (t, J = 7.54 Hz, 2H, CH2CH2COOH), 2.47 (t, J = 7.54 Hz, 2H, CH2CH2COOH), 2.27 (s, 3H, CH3), 2.26 (s, 3H, CH3), 1.34 (t, J = 7.0 Hz, 3H, CH3CH2); MS m/z (상대 강도, %)431 ([M+1]+, 21).
실시예 31
3-{5-[6-(3-에톡시-페닐)-2-옥소-1,2-디하이드로인돌-3-일리덴메틸]-4-메틸-1H-피롤-3-일}-프로피온 산
에탄올 2mL에 녹인 4-(2-카르복시에틸)-2-포밀-3-메틸피롤 90.5mg, 6-3-메톡시페닐-2-옥신돌 127mg 및 피페리딘 2방울을 90℃에서 24시간동안 가열하였다. 상기 혼합물을 냉각시키고, 농축하였다. 잔류물은 6N 염산 수용액에 현탁시켰다. 침전물을 여과하고, 증류수로 세척하여 pH6의 상태에 이르게 하여, 진공 오븐내에서 24시간동안 건조하여 갈색 고체인 표제 화합물 200mg(수율 96%)를 얻었다.
1H NMR (360 MHz, DMSO-d6) : δ 13.29 (s, br, 1H, NH-1′), 12.07 (s, br, 1H, COOH), 10.88 (s, br, 1H, NH-1), 7.82 (d, J = 7.97, 1H, H-4), 7.65 (s, 1H, H-vinyl), 7.28 (dd, J = 1.20, 7.97 Hz, 1H, H-5), 7.08 (d, J = 1.20 Hz, 1H, H- 7), 6.87-7.36(m, 5H), 4.09 (q, J = 6.98 Hz, 2H, CH3CH2), 2.65 (t, J = 7.47 Hz, 2H, CH2CH2COOH), 2.47 (t, J = 7.47 Hz, 2H, CH2CH2COOH), 2.27 (s, 3H, CH3), 1.34 (t, J = 6.98 Hz, 3H, CH3CH2).
실시예 32
3-[2,4-디메틸-5-(2-옥소-6-페닐-1,2-디하이드로인돌-3-일리덴메틸)-1H-피롤-3-일]-프로피온산
테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐 0.8g을 톨루엔 50mL와 에탄올 50mL에 용해된 2M 탄산 나트륨 22mL와 벤젠보론산 3.1g에 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 2시간동안 환류시키고, 농축하고, 잔여물을 에틸 아세테이트를 가하여 2번 추출하였다. 에틸 아세테이트막을 증류수와 염류용액로 세척하고, 건조시킨 후 농축하여 노란색의 오일을 얻었다. 상기 오일일 에틸 아세테이트:헥산(1:20) 혼합용매를 용출제로 사용하는 실리카 겔 관 크로마토크래피로 분리하여 정제하여 4-플루오로-3-니트로바이페닐 4.75g (수율 96%)을 얻었다.
디메틸술폭사이드 25mL에 용해된 디메틸 말로내이트 10mL를 디메틸술폭사이드 25mL에 현탁된 수소화나트륨 2.0g에 소량씩 첨가하고 100℃에서 10분동안 가열한 후, 실온으로 냉각하였다. 디메틸술폭사이드 25mL에 용해된 4-플루오로-3-니트로바이페닐 4.7g을 첨가하고, 상기 혼합물을 100℃에서 2시간동안 가열하였다. 반응 혼합물을 냉각하고, 암모늄클로라이드 포화 용액 300mL에 담지하고, 에틸 아세테이트로 2번 추출하였다. 상기 화합된 유기층을 물과 염류용액로 세척하고, 증발 시켜 노란색 기름인 천연 디메틸 3-니트로바이페닐-4-말로내이트를 얻었다.
천연 디메틸-3-니트로바이페닐-4-말로내이트는 6N 염화수소한 30mL내에서 24시간동안 환류시켰다. 여과를 통해 침전물을 회수하고, 증류수로 세척한 후, 건조하여 크림색 고체인 3-니트로바이페닐-4-아세테이트 4.5g( 4-플루오로-3- 니트로바이페닐에 기초한 수율 80%) 을 얻었다.
아이언 칩(iron chips) 2.6g을 40mL 아세트산에 첨가한 3-니트로바이페닐-4-아세테이트 4.5 g에 한꺼번에 첨가하고, 2시간동안 환류반응시켰다. 상기 반응 혼합물을 농축하여 건조하게 하여 에틸 아세테이트를 흡수시켰다. 불용성물질을 제거하기 위해 여과하였다. 여과액을 1N 염산으로 2번 세척한 후, 염류용액로 다시 세척하고, 무수 황산 나트륨으로 건조하고, 농축하여 밝은 갈색 고체인 6-페닐-2-옥신돌 3.4 g(수율 93 %)를 얻었다.
1H NMR (360 MHz, DMSO-d6) : δ 10.4 (s, br, 1H, NH-1), 7.57-7.6 (m, 2H), 7.42-7.46 (m, 2H), 7.32-7.37 (m, 1H), 7.27 (d, J = 7.7 Hz, 1H, H-4), 7.19 (dd, J = 1.6, 7.7 Hz, 1H, H-5), 7.01 (d, J = 1.6 Hz, 1H, H-7), 3.49 (s, 2H, CH2); MS m/z (상대 강도, %) 210 ([M+1]+, 100).
에탄올 2mL에 녹인 3-(2-카르보실에틸)-2,4-디메틸-5-포밀피롤 97.6mg을, 6-페닐-2-옥신돌 105mg 및 피페리딘 2방울을 90℃에서 24시간동안 가열하였다. 상기 혼합물을 냉각시키고, 농축하였다. 잔류물은 6N 염산 수용액에 현탁시켰다. 침전물을 여과하고, 증류수로 세척하여 pH6의 상태에 이르게 하여, 진공 오븐내에 서 24시간동안 건조하여 갈색 고체인 표제 화합물(수율 78%) 138mg을 얻었다.
1H NMR (360 MHz, DMSO-d6) : δ 13.38 (s, br, 1H, NH-1′), 12.05 (s, br, 1H, COOH), 10.81 (s, br, 1H, NH-1), 7.78 (d, J = 7.84, 1H, H-4), 7.58 (s, 1H, H-vinyl), 7.25-7.63 (m, 6H), 7.09 (s, br, 1H, H-7), 2.64 (t, J = 7.71 Hz, 2H, CH2CH2COOH), 2.35 (t, J = 7.71 Hz, 2H, CH2CH2COOH), 2.30 (s, 3H, CH3); MS m/z (상대 강도, %) 387 ([M+1]+, 100).
실시예 33
3-[4-메틸-5-(2-옥소-6-페닐-1,2-디하이드로-인돌13-일리덴메틸)-1H-피롤-3-일]-프로피온산
3-(2-카르보실에틸)-2-포밀-3-메틸피롤 90.5mg을 6-페닐-2-옥신돌 105mg 및 피페리딘 2방울을 에탄올 2mL에 용해시키고, 90℃에서 24시간동안 가열하였다. 상기 혼합물을 냉각시키고, 농축하였다. 잔류물은 6N염산 수용액에 현탁시켰다. 침전물을 여과하고, 증류수로 세척하여 pH6의 상태에 이르게 하여, 진공 오븐내에서 24시간동안 건조하여 갈색 고체인 표제 화합물(수율 78%) 146mg을 얻었다.
1H NMR (360 MHz, DMSO-d6) : δ 13.29 (s, br, 1H, NH-1′), 12.01 (s, br, 1H, COOH), 10.89 (s, br, 1H, NH-1), 7.83 (d, J = 7.92, 1H, H-4), 7.65 (s, 1H, H-vinyl), 7.30-7.65 (m, 5H), 7.16 (d, J = 2.83 Hz, 2H, H-2′), 7.28 (dd, J = 1.58, 7.92 Hz, 1H, H-5), 7.09 (d, J = 1.58 Hz, 1H, H-7), 2.66(t, J = 7.76 Hz, 2H, CH2CH2COOH), 과 2.27 (s, 3H, CH3); MS m/z (상대 강도, %) 373 ([M+1] +, 100).
실시예 34
3-{5-[6-(4-메톡시-페닐)-2-옥소-1,2-디하이드로인돌-3-일리덴메틸]-4-메틸-1h-피롤-3-일]-프로피온산
테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐 1g을 톨루엔 50mL와 에탄올 50mL에 용해된 30mL의 2M 탄산 나트륨, 5g의 4-메톡시페놀 보론산 과 5-브로모-2-플로로니트로벤젠 6.6g의 혼합물에 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 2시간동안 환류시키고, 농축하고, 잔여물을 에틸 아세테이트를 가하여 2번 추출하였다. 에틸 아세테이트막을 물과 염류용액로 세척하고, 건조시킨 후 농축하여 갈색의 유분기가 있는 고체를 얻었다. 상기 고체를 에틸 아세테이트:헥산(1:20) 혼합용매를 용출제로 사용하는 실리카 겔 관 크로마토크래피로 분리하여 정제하여 옅은 노란색 고체인 4-플루오로-4′-메톡시-3-니트로바이페닐을 얻었다.
디메틸 말로내이트 10mL를 디메틸설폭시드 60mL에 현탁된 수소화나트륨 2.0g에 소량씩 첨가하고 10분동안 100℃까지 가열한 후, 실온으로 냉각하였다. 4-플루오로-2′-메톡시-3-니트로바이페닐 5.2g을 첨가하고, 상기 혼합물을 100℃에서 2시간동안 가열하였다. 반응 혼합물을 냉각하고, 암모늄클로라이드 포화 용액 300mL에 담지하고, 에틸 아세테이트로 3번 추출하였다. 추출물을 혼합하고, 염화암모늄 포화용액, 증류수와 염류용액로 세척하고, 무수 황산 나트륨을 사용하여 증발시켜 노란색 오일인 가공의 4′-메톡시-3-니트로바이페닐-4-말로내이트를 얻었다.
가공의 디메틸-4′-메톡시-3-니트로바이페닐-4-말로내이트는 6N 염산 60mL내에서 15시간동안 가열하고 냉각하였다. 여과를 통해 침전물을 회수하고, 증류수와 헥산으로 세척한 후, 밝은 담갈색 고체인 천연 4′-메톡시-3-니트로바이페닐-4-아세테이트 7.2g를 얻었다.
아이언 칩(iron chips) 3.6g을 50mL의 빙초산에 첨가한 4′-메톡시3-니트로바이페닐-4-아세테이트 7.2 g에 한꺼번에 첨가하고, 24시간동안 가열하였다. 상기 반응 혼합물을 농축하여 건조하게 하여 에틸 아세테이트와 함께 초음파로 분해하고, 불용성 물질을 제거하기 위해 여과하였다. 여과액을 1N 염산으로 2번 세척한 후, 염류용액으로 다시 세척하고, 무수 황산 나트륨으로 건조하고, 농축하여 장미 빛깔 고체인 6-(4-메톡시페닐)-2-옥신돌 2.7 g( 5-브로모-2-플로오로니트로벤젠에 기초한 수율 54 %)를 얻었다.
1H NMR (360 MHz, DMSO-d6) : δ 10.38 (s, br, 1H, NH-1), 7.52 (d, J = 9 Hz, 2H), 7.23 (d, J = 7.3 Hz, 1H, H-4), 7.14 (dd, J = 1.38, 7.3 Hz, 1H, H-5), 7.0 (d, J = 9 Hz, 2H), 6.96 (d, J = 1.38 Hz, 1H, H-7), 3.78 (s, 3H, OCH3), 3.47 (s, 2H, OCH2); MS m/z (상대 강도, %) 214.0 ([M+1]+, 100).
에탄올 2mL에 녹인 4-(2-카르보실에틸)-2-포틸-3-메틸피롤 90.5mg을 6-(4-메톡시페닐)-2-옥신돌 120mg 및 피페리딘 2방울을 90℃에서 24시간동안 가열하였 다. 상기 혼합물을 냉각시키고, 농축하였다. 잔류물은 6N 염산 수용액에 현탁시켰다. 침전물을 여과하고, 증류수로 세척하여 pH6으로 하고, 진공 오븐내에서 24시간동안 건조하여 갈색 고체인 표제 화합물(수율 59%) 118mg을 얻었다.
1H NMR (360 MHz, DMSO-d6) : δ 13.26 (s, br, 1H, NH-1′), 10.83 (s, br, 1H, NH-1), 7.78 (d, J = 8.07 Hz, 1H, H-4), 7.61 (s, 1H, H-vinyl), 7.56 (d, J = 8.97 Hz, 2H), 7.22 (dd, J = 1.44, 8.07 Hz, 1H, H-5), 7.13 (d, J = 3.09 Hz, 1H, H-2′), 7.04 (d, J = 1.44 Hz, 1H, H-7), 7.0 (d, J = 8.97 Hz, 2H), 3.79 (s, 3H, OCH3), 2.65 (t, J = 7.54 Hz, 2H, CH2CH2COOH), 2.44 (t, J = 7.54 Hz, 2H, CH2CH2COOH), 와 2.27(s, 3H, CH3); MS m/z (상대 강도, %) 404 ([M+1] +, 100).
실시예 35
3-{5-[6-(4-메톡시-페닐)-2-옥소-1,2-디하이드로인돌-3-일리덴메틸]-2,4-디메틸-1H-피롤-3-일]-프로피온산
에탄올 2mL에 녹인 3-(2-카르보실에틸)-2,4-디메틸-5-포밀피롤 98mg을 6-(4-메톡시페닐)-2-옥신돌 120mg 및 피페리딘 3방울을 90℃에서 24시간동안 가열하였다. 상기 혼합물을 냉각시키고, 농축하였다. 잔류물은 6N 염산 수용액(aqueous hydrochoric acid)에 현탁시켰다. 침전물을 여과하고, 증류수로 세척하여 pH6의 상태로 하고, 진공 오븐내에서 24시간동안 건조하여 갈색 고체인 표제 화합물(수율 57%) 118mg을 얻었다.
1H NMR (360 MHz, DMSO-d6) : δ 13.35 (s, br, 1H, NH-1′), 12.02 (s, br, 1H, COOH), 10.75 (s, br, 1H, NH-1), 7.73 (d, J = 6.75 Hz, 1H, H-4), 7.56 (d, J = 9.01 Hz, 2H), 7.54 (s, 1H, H-vinyl), 7.21 (dd, J = 1.59, 6.75 Hz, 1H, H-5), 7.04 (d, J = 1.59 Hz, 1H, H-7), 7.01 (d, J = 9.01 Hz, 2H), 3.79 (s, 3H, OCH3) 2.65 (t, J = 7.54 Hz, 2H, CH2CH2COOH), 2.35 (t, J = 7.54 Hz, 2H, CH2CH2COOH), 2.29 (s, 3H, CH3),와 2.26 (s, 3H, CH3); MS m/z (상대 강도, %) 417 ([M+1]+, 100).
실시예 36
3-{5-[6-(2-메톡시-페닐)-2-옥소-1,2-디하이드로인돌-3-일리덴메틸]-4-메틸-1H-피롤-3-일]-프로피온산
테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐 1g을 톨루엔 50mL와 에탄올 50mL에 용해시킨 30mL의 2M의 탄산 나트륨 용액 , 5g의 2-메톡시페닐 보론산 과 6.6g의 5-브로모-2-플로로니트로벤젠의 혼합물에 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 2시간동안 환류반응시키고, 농축하고, 잔여물을 에틸 아세테이트를 가하여 2번 추출하였다. 합해진 에틸 아세테이트막을 증류수와 염류용액로 세척하고, 건조시킨 후 농축하여 어두운 녹색의 오일을 얻었다. 이를 고체화하여 4-플루오로-2′-메톡시-3-니트로바이페닐을 얻었다.
디메틸 말로내이트 14mL를 디메틸술폭시드 50mL에 현탁시킨 수소화나트륨 2.9g에 소량씩 첨가하고 100℃에서 15분동안 가열한 후, 실온으로 냉각하였다. 4-플루오로-2′-메톡시-3-니트로바이페닐 5.2g을 첨가하고, 상기 혼합물을 100℃에서 2시간동안 가열하고, 실온으로 냉각하였다.
60mL의 디메틸술폭시드에 용해시킨 천연 4-플루오로-2′-메톡시-3-니트로바이페닐을 첨가하고, 상기 혼합물을 100℃에서 2시간동안 가열하였다. 반응 혼합물을 냉각하고, 암모늄클로라이드 포화 용액 300mL에 담지하고, 에틸 아세테이트로 2번 추출하였다. 추출물을 혼합하고, 염화암모늄 포화용액, 증류수와 염류용액로 세척하고, 무수 황산 나트륨을 사용하여 건조하고 농축하여 노란색 오일인 천연 디메틸 2′-메톡시-3-니트로바이페닐-4-말로내이트를 얻었다.
천연 2′-메톡시-3-니트로바이페닐-4-말로내이트는 6N 염화수소한 50mL내에서 24시간동안 100℃에서 가열하고 냉각하였다. 여과를 통해 침전물을 회수하고, 물과 헥산으로 세척한 후, 밝은 담갈색 고체인 2′-메톡시-3-니트로바이페닐-4-아세테이트 9.8g를 얻었다.
아이언 칩(iron chips) 5g을 50mL 빙상 결정을 갖는 아세트산에 첨가한 2′-메톡시3-니트로바이페닐-4-아세테이트 9.8 g에 일부분 첨가하고, 3시간동안 100℃에서 가열하였다. 상기 반응 혼합물을 농축하여 건조하게 하여 에틸 아세테이트와 함께 고주파에 의해 분해하고, 불용성물질을 제거하기 위해 여과하였다. 여과액을 1N 염산, 증류수와 염류용액로 세척하고, 무수 황산 나트륨으로 건조하고, 농축하였다. 잔류물은 에틸 아세테이트: 헥산(1:2) 혼합용매를 용출제로 하는 실리카겔 관 크로마토그래피로 분리하여 장미 빛깔 고체인 6-(2-메톡시페닐)-2-옥신 돌 5.4 g( 5-브로모-2-플로오로니트로벤젠에 기초한 수율 69 %)를 얻었다.
1H NMR (360 MHz, DMSO-d6) : δ 10.32 (s, br, 1H, NH), 7.29-7.34 (m, 1H), 7.19-7.25 (m, 2H), 7.08 (d, J = 8 Hz, 1H, H-4), 6.97-7.02 (m, 2H), 6.91 (d, J = 1.05 Hz, 1H, H-7), 3.8 (s, 3H, OCH3) 3.47 (s, 2H, OCH2); MS m/z (상대 강도, %) 239.8 (100, [M+1]+).
에탄올 2mL에 녹인 4-(2-카르보시에틸)-2-포밀-3-메틸피롤 217mg을 6-(2-메톡시페닐)-2-옥신돌 239mg 및 피페리딘 3방울을 90℃에서 24시간동안 가열하였다. 상기 혼합물을 냉각시키고, 농축하였다. 잔류물은 6N 염산 수용액에 현탁시켰다. 침전물을 여과하고, 증류수로 세척하여 pH6의 상태에 이르게 하여, 진공 오븐내에서 24시간동안 건조하여 잔류물은 에틸 아세테이트: 헥산(1:2) 혼합용매를 용출제로 하는 실리카겔 관 크로마토그래피로 분리하여 장미 빛깔 고체인 6-(2-메톡시페닐)-2-옥신돌 5.4 g( 5-브로모-2-플로오로니트로벤젠에 기초한 수율 69 %)를 얻었다.갈색 고체인 표제 화합물(수율 86%) 348mg을 얻었다.
1H NMR (360 MHz, DMSO-d6) : δ 13.29 (s, br, 1H, NH-1′), 11.59 (s, br, 1H, COOH), 10.78 (s, br, 1H, NH-1), 7.75 (d, J = 8.13 Hz, 1H, H-4), 7.62 (s, 1H, H-vinyl), 7.0-7.34 (m, 7H), 3.76 (s, 3H, OCH3) 2.66 (t, J = 7.46 Hz, 2H, CH2CH2COOH), 2.46 (t, J = 7.46 Hz, 2H, CH2CH2COOH),와 2.27 (s, 3H, CH3); MS m/z (상대 강도, %) 401 ([M+1]+, 100).
실시예 37
3-{5-[6-(2-메톡시-페닐)-2-옥소-1,2-디하이드로인돌-3-일리덴메틸]-2,4-디메틸-1H-피롤-3-일]-프로피온산
에탄올 2mL에 용해시킨 3-(2-카르복시에틸)-2,4-디메틸-5-포밀피롤 234mg, 6-(4-메톡시페닐)-2-옥신돌 239mg 및 피페리딘 3방울을 90℃에서 24시간동안 가열하였다. 상기 혼합물을 냉각시키고, 농축하였다. 잔류물은 6N염산 수용액에 현탁시켰다. 침전물을 여과하고, 증류수로 세척하여 pH6의 상태에 이르게 하여, 진공 오븐내에서 24시간동안 건조하였다.
이렇게 얻어진 고체를 0.1%의 아세트산을 함유하는 아세테이트:헥산(1:1)의 혼합 용매를 용출제로 하는 실리카 겔 관 크로마토그래피로 분리하여 갈색 고체인 표제 화합물(수율 44%) 182mg을 얻었다.
1H NMR (360 MHz, DMSO-d6) : δ 13.38(s, br, 1H, NH-1′), 12.0 (s, br, 1H, COOH), 10.7 (s, br, 1H, NH-1), 7.71 (d, J = 6.75 Hz, 1H, H-4), 7.55 (s, 1H, H-vinyl) 7.0-7.33 (m, 1H) 3.76 (s, 3H, OCH3), 2.65 (t, J = 7.6 Hz, 2H, CH2CH2COOH), 2.3 (s, 3H, CH3), 와 2.26 (s, 3H, CH3); MS (APCI) m/z (상대 강도, %) 415 ([M-1], 100).
실시예 38
3-[2,4-디메틸-5-(6-몰포린-4-일-2-옥소-1,2-디하이드로인돌-3-일리덴메틸)-1H-피롤-3-일]-프로피온산
주석 클로라이드 디하이드레이트 225g을 450mL의 에탄올에 2,4-디니트로페닐 아세트산 22.6g을 용해시킨 용액에 첨가하였다. 상기 혼합물을 90℃에서 10시간동안 가열한 후,12M의 염화나트륨을 첨가하여, pH11로 중성화였다. 고체는 여과하고, 침전액은 농축하였다. 잔류물은 에탄올 30mL를 처리하고, 불용성물질은 여과하고 60mL의 에탄올로 5번 세척하였다. 혼합된 에탄올 세척액은 증발시키고, 잔공하에서 건조하여 갈색 가루인 6-아미노-2-옥신돌 15g을 얻었다.
1H NMR (360 MHz, DMSO-d6) : δ 10.03 (s, br, NH), 6.78 (d, J = 8.55 Hz, 1H, H-4), 6.09-6.11 (m, 2H) 4.95 (s, br, 2H, NH2), 3.22 (s, 2H, H-3); MS (+ APCI) m/z (상대 강도, %) 147 ([M-1]+, 100).
2.2g의 6-아미노-2-옥신돌 , 4.0g의 2,2′디브로모에틸 에테르 과 7.9g의 탄산 나트륨 을 24시간동안 에탄올 20mL와 함께 환류시키고, 농축시켜, 50mL의 물로 희석하였다. 상기 혼합물을 50mL의 에틸 아세테이트로 3번 추출하였다. 합해진 유기 추출물을 염류용액 20mL로 세척하고, 무수 황산 나트륨을 사용하여 건조하고 농축하였다. 상기 고체를 10%의 아세트산을 함유하는 에틸 아세테이트:헥산 (1:1) 혼합용매를 용출제로 사용하는 실리카 겔 관 크로마토그래피로 분리하여 베이지색 고체인 6-(몰포린-4-일)-2-옥신돌 1.2g (수율 37%)을 얻었다.
1H NMR (360 MHz, DMSO-d6) : δ 10.2 (s, br, 1H, NH-1), 7.02 (d, J = 7.87 Hz, 1H, H-4), 6.47 (dd, J = 2.11, 7.87 Hz, 1H, H-5), 6.37 (d, J = 2.11 Hz, 1H, H-7), 3.69-3.72 (m, 4H) 3.32 (s, 2H, OCH2), 3.01-3.04 (m, 4H); MS (APCI) m/z (상대 강도, %) 219 ([M+1]+, 100).
에탄올 60mL에 녹인 3-(2-카르복시에틸)-2,4-디메틸-5-포밀피롤 3.3g, 6-(몰포린-4-일)-2-옥신돌 4g 및 피페리딘 1.8mL을 90℃에서 7시간동안 가열하였다. 상기 혼합물을 냉각시키고, 농축하였다. 잔류물은 6N염산 수용액에 현탁시켰다. 침전물을 여과하고, 증류수로 세척하여 pH6의 상태에 이르게 하여, 진공 오븐내에서 24시간동안 건조하여 잔류물은 에틸 아세테이트-헥산-아세테이트 혼합용매를 용출제로 하는 실리카겔 관 크로마토그래피로 분리하여 갈색고체인 표제 화합물을2.78g(수율 38%)을 얻었다.
1H NMR (360 MHz, DMSO-d6) : δ 13.13 (s, br, 1H, NH-1′), 12.02 (s, br, 1H, COOH), 10.57 (s, br, 1H, NH-1), 7.52 (d, J = 8.46 Hz, 1H, H-4), 7.32 (s, 1H, H-vinyl), 6.58 (dd, J = 1.99,8.46 Hz, 1H, H-5), 6.41 (d, J = 1.99 Hz, 1H, H-7), 3.71-3.74 (m, 4H), 3.06-3.09 (m, 4H) 2.62 (t, J = 7.57 Hz, 2H, CH2CH2COOH), 2.33 (t, J = 7.57 Hz, 2H, CH2CH2COOH), 2.26 (s, 3H, CH3)와 2.21 (s, 3H, CH3); MS m/z (상대 강도, %) 396 ([M+1]+, 100).
실시예 39
3-[5(5-클로로-메틸-2-옥소-1,2-디하이드로인돌-3-일리덴메틸)-2,4-디메틸-1H-피롤-3-일]-프로피온산
4-메틸-2-옥시인돌 3.0g의 현탁액을 N-클로로-숙신이미이드를 서서히 가하면서 실온에서 50mL 아세토니트릴에 교반하였다. 그리고 나서, 트리플로오로 아세트산 1mL를 첨가하였다. 고체가 계속 존재하는 3일동안 현탁액을 실온에서 교반하였다. 진공 여과를 통해 회색 고체를 회수하고, 소량의 차가운 아세톤으로 세척한 후, 40℃에서 진공 오븐으로 24시간동안 건조하여 5-클로로-4-메틸-2-옥신돌 2.5g을 얻었다.
1H NMR (360 MHz, DMSO-d6) : δ 10.38 (s, br, 1H, NH), 7.19 (d, J = 8 Hz, 1H, 방향성), 6.64 (d, J = 8 Hz, 1H, 방향성), 3.46 (s, 2H, H-3), 2.19 (s, 3H, CH3)
에탄올 60mL에 녹인 3-(2-카르복시에틸)-2,4-디메틸-5-포밀피롤 98mg을 5-클로로-4-메틸-2-옥신돌 91mg 및 피페리딘 2방울을 90℃에서 4시간동안 가열하였다. 상기 혼합물을 냉각시키고, 농축하였다. 잔류물은 6N 염산 수용액에 현탁시켰다. 침전물을 여과하고, 증류수로 세척하여 pH6의 상태에 이르게 하여, 진공 오븐에서 24시간 건조하여 표제 화합물을 100mg을 얻었다.
1H NMR (360 MHz, DMSO-d6) : δ 13.47 (s, br, 1H, NH-1′), 12.03 (s, br, 1H, COOH), 10.83 (s, br, 1H, NH-1), 7.61 (s, 1H, H-vinyl), 7.14 (d, J = 8.17 Hz, 1H, 방향족), 2.64 (s, 3H, CH3), 2.64 (t, J = 7.62 Hz, 2H, CH2CH2COOH), 2.34 (t, J = 7.62 Hz, 2H, CH2CH2COOH), 2.3 (s, 3H, CH3), 와 2.20 (s, 3H, CH3).
실시예 40
3-[5-(5-클로로-메틸-2-옥소-1,2-디하이드로인돌-3-일리덴메틸)-4-메틸-1H-피롤-3-일]-프로피온산
에탄올 60mL에 용해시킨 4-(2-카르복시에틸)-2-포밀-3-메틸피롤 91mg, 5-클로로-4-메틸-2-옥신돌 91mg 및 피페리딘 2방울을 90℃에서 4시간동안 가열하였다. 상기 혼합물을 냉각시키고, 농축하였다. 잔류물은 6N염산 수용액에 현탁시켰다. 침전물을 여과하고, 증류수로 세척하여 pH6의 상태에 이르게 하여, 진공 오븐에서 24시간 건조하여 표제 화합물을 95mg을 얻었다.
1H NMR (360 MHz, DMSO-d6) : δ 13.36 (s, br, 1H, NH-1′), 11.98 (s, br, 1H, COOH), 10.92 (s, br, 1H, NH-1), 7.68 (s, 1H), 7.19 (d, J = 7.14 Hz, 1H, 방향족), 7.17 (s, 1H), 6.75 (d, J = 7.14 Hz, H, 방향족), 2.66 (s, 3H, CH3-4), 2.66 (t, J = 7.51 Hz, 2H, CH2CH2COOH), 2.45 (t, J = 7.51 Hz, 2H, CH2CH 2COOH), 2.21 (s, 3H, CH3); MS m/z (상대 강도,%) 345 ([M+1]+, 100).
실시예 41
3-[2,4-디메틸-5-(2-옥소-1,2-디하이드로인돌-3-일리덴메틸)-1H-피롤-3-일]- 프로피온산, 나트륨 염
60mL의 물에 녹인 3-[2,4-디메틸-5-(2-옥소-1,2-디하이드로인돌-3-일리덴메틸)-1H-피롤-3-일]-프로피온 산 8g의 현탁액을 10mL의 물에 녹인 수산화나트륨 0.98g을 첨가하였다. 상기 혼합물을 30분동안 RT에서 현탁하고, 여과하였다. 여과액을 동결시키고, 동결건조하여 표제 화합물 9g을 얻었다.
또 다른 방법으로, 물 470mL에 녹인 318-005의 117g의 현탁액을 74mL의 물에 녹인 수산화나트륨 16.47g에 첨가하였다. 상기 반응물을 실온에서 15분간 교반하고, 여과하였다. 상기 여과액을 에탄올 210mL에 첨가하고 형성된 침전물을 흡입 여과를 통해 회수하였다. 염색후, 총 106g의 표제 화합물을 얻었다.
1H NMR (360 MHz, DMSO-d6) : δ 13.34 (s, br, 1H, NH-1′), 10.82 (s, br, 1H, NH-1), 7.65 (d, J = 7.52 Hz, 1H, H-4), 7.5 (s, 1H, H-vinyl), 7.04 (t, J = 7.52 Hz, 1H, H-6), 6.93 (t, J = 7.52 Hz, 1H, H-5), 6.85(d, J = 7.52 Hz, 1H, H-7) 2.55 (t, J = 6.95 Hz, 2H, CH2CH2COOH), 2.28 (s, 3H, CH3), 2.24 (s, 3H, CH3)와 1.99 (t, J = 6.95 Hz, 2H, CH2CH2COOH).
실시예 42
3-[3,5-디메틸-4-(3-몰포린-4-일프로필)-1H-피롤-2-일메틸렌]-1,3-디하이드로인돌-2-원
단계 1: 60mL의 디클로로메탄 60mL에 녹인 3-(2,4-디메틸-1H-피롤-3-일)-프로피온 산 현탁액 10g (60.8mmol)을 1,1′-카르보닐디이미다졸(carbonyldiimdazol) 11.6g 그런 후 몰포린(5.5ml, 60.8 mmol)과 N,N-디이소프로필에틸라민 10mL (Hunig's 염기, 60.8mmol)에 첨가하였다. 어두운 적색 반응 혼합물을 실온에서 24시간동안 교반시키고, 얼음물을 부었다. 세척액의 pH가 약 pH6이 될때까지 염류용액로 유기층을 세척하고, 무수 황산나트륨으로 건조시키고, 농축하였다. 가공하지 않은 생성물을 디클로로메탄-메탄올 (98:2)혼합 용액을 용출제로 하는 실리카겔 관으로 정제하여 3-(2,4-디메틸-1H-피롤-3-일)-1-몰포린-4-일-프로팬-1-온을 얻었다:
단계 2: 100mL의 테트라하이드로푸란에 녹인 리듐 알루이늄 하이드라이드의 현탁액 2.67g(70몰)에 50mL의 테트라하이드로푸란에 녹인 3-(2,4-디메틸-1H-피롤-3-일)-1-몰포린-4-일-프로판 -1-온 13.84g (59몰)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 80℃에서 1시간동안 교반하고, 냉각 장치내에서 냉각하였다. 가스의 방출이 멈출때까지, 상기 반응 혼합물에 얼음을 첨가하였다. 2N의 수산화나트륨의 몇 방울을 첨가하고, 반응 혼합물을 상온에서 30분간 교반하였다. 그리고 나서, 반응 혼합물을 에틸 아세테이트로 추출하여 무수 황산 나트륨으로 건조하고, 농축하여, 그 이상의 정제 과정없이 밝은 갈색 오일인 4-[3-(2,4-디메틸-1H-피롤-3-일)-프로필]-몰포린 10.37g (수득율 79%)을 얻었다:
단계 3: 30mL 의 디클로로메탄 30mL에 녹인 N,N-디메틸포름아미드 5.5mL (70 mmol)의 냉각 용액에 인산염화물을 천천히 첨가하였다. 첨가를 완료하였을때, 20mL 디클로로메탄에 녹인 3,5-디메틸-4-(3-몰포린-4-일-프로필)-1H-피롤-2-카르복시알데하이드 용액 10.37g (46.6 mmol)을 0℃에서 첨가한 후, 반응 혼합물을 15분간 실온에서 교반하였다. 최후의 반응 혼합물을 60℃에서 4시간동안 환류 반응을 시킨 후, 냉각 장치에서 냉각하였다. pH 12의 상태가 될 때까지, 2N 수산화나트륨을 첨가한 후에 얼음을 천천히 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 30분간 실온에서 교반한 후, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 유기층을 염류용액로 세척하고, 무수 황산 나트륨으로 건조하고, 농축하고, 디클로로메탄:메탄올:암모늄 히드록시드 (9.5:0.5) 혼합 용매를 용출제로 하는 실리카 겔 관으로 정제하여 어두운 붉은색 오일인 3,5-디메틸-4-(3-몰포린-4-일-프로필)-1H-피롤-2-카르발알데하이드 4.57g (39%)를 얻었다:
1H NMR (360 MHz, DMSO-d6) : δ 11.34 (s, br, 1H, NH-1), 9.40 (s, 1H, CHO-2), 3.55 (t, J = 4.68 Hz, 4H, O(CH2CH 2)2NCH2CH 2CH2-4), 2.28-2.34 (m, 6H, O(CH2CH 2)2NCH2CH2CH 2-4), 2.21 (t, 2H, J = 7.10 Hz, 2H, O(CH2CH2)2NCH 2CH2 CH2-4), CH3-3), 2.19 (s, 3H, CH3-5), 2.14 (s, 3H, CH3-3), 1.51 (quint., J = 7.10 Hz, 2H, O(CH2CH2)2NCH 2CH2CH2-4).
MS m/z (상대 강도, %) 251 ([M+1]+., 100).
단계 4: 2.0mL 에탄올에 녹인 1,3-디하이드로인돌-2-온 133mg(1.0mml), 3,5-디메틸-4-(3-몰포린-4-일-프로필)-1H-피롤-2-키르복시알데하이드 250mg(1.0mmol) 및 피롤리딘 3방울의 혼합물을 90℃에서 4시간동안 환류 반응을 시킨 후, 실온으로 냉각하였다. 상기 침전액을 여과하고, 차가운 에탄올과 헥산으로 세척하고 진공 오븐에서 24시간동안 건조하여 노란색 고체인 3-[3,5-디메틸-4-(3-몰포린-4-일-프로 필)-1H-피롤-2-일메틸렌]-1,3-디하이드로인돌-2-온을 얻었다:
1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) : δ 13.37 (s, br, 1H, NH-1′), 10.71 (s, 1H, NH-1), 7.68 (d, J = 7.47 Hz, 1H, H-4), 7.53 (s, 1H, H-vinyl) 7.06 (dt, J = 7.47 Hz, 1H, H-6), 6.94 (dt, J = 7.74 Hz, 1H, H-5), 6.84 (d, J = 7.47 Jz, 1H, H-7), 3.55 (t, J = 4.37 Hz, 4H, O(CH 2CH2)2NCH2CH 2CH2-4′), 2.40 (t, J = 7.31 Hz, 2H, O(CH2CH2)2NCH2CH2CH 2-4′), 2.31 (t, J = 4.37 Hz, 4H, O(CH2CH 2)2NCH2CH2CH2-4′ ), 2.28 (s, 3H, CH3-3′), 2.23 (s, 3H, CH3-5′), 2.23 (t, J = 7.31 Hz, 2H, O(CH2CH 2)2NCH2CH2CH 2-4), 1.56 (quint,. J = 7.31 Hz, 2H, O(CH2CH2)2NCH2CH 2CH2-4′),
MS m/z (상대 강도, %) 365 (M+, 100).
실시예 43
5-브로모-3-[3,5-디메틸-4-(3-몰포린-4-일-피롤)-1H-피롤-2-일메틸렌]-1,3-디하이드로인돌-2-온
2.0mL 에탄올에 녹인 5-브로모-1,3-디하이드로인돌-2-온 212mg(1.0mml), 3,5-디메틸-4-(3-몰포린-4-일-프로필)-1H-피롤-2-카르발데히드 250mg (1.0mmol) 및 피롤리딘 3방울의 혼합물을 90℃에서 4시간동안 환류 반응을 시킨 후, 실온으로 냉각하였다. 상기 침전액을 여과하고, 차가운 에탄올과 헥산으로 세척하고 진공 오븐에서 24시간동안 건조하여 붉은색 고체인 5-브로모-3-[3,5-디메틸-4-(3-몰포린-4- 일-프로필)-1H-피롤-2-일메틸렌]-1,3-디하이드로인돌-2-원을 399.8mg (수율 90%)를 얻었다:
1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) : δ 13.43 (s, 1H, NH-1′), 10.81 (s, 1H, NH-1), 7.99 (d, J = 2.07 Hz, 1H, H-4), 7.66 (s, 1H, H-vinyl) 7.18 (dd, J = 2.07, 7.58 Hz, 1H, H-6), 6.79 (d, J = 7.58 Hz, 1H, H-5), 3.55 (t, J = 4.39 Hz, 4H, O(CH 2CH2)2NCH2CH2CH2-4′), 2.40 (t, J = 7.32 Hz, 2H, O(CH2CH2)2NCH2CH2C H 2-4′), 2.31 (t, J = 4.39 Hz, 4H, O(CH2CH 2)2NCH2CH2 CH2-4′), 2.29 (s, 3H, CH3-3′), 2.26 (s, 3H, CH3-5′), 2.23 (t, J = 7.32 Hz, 2H, O(CH2CH2)2NC H 2CH2CH2-4′ ), 1.56 (quint,. J = 7.32 Hz, 2H, O(CH2CH2)2NCH2CH 2CH2-4), MS m/z (상대 강도, %) 443 (M+, 100), 445 ([M+2]+, 100]).
실시예 44
3-[3,5-디메틸-4-(3-몰포린-4-일-프로필)-1H-피롤-2-일메틸렌]-6-페닐-1,3-디하이드로인돌-2-온
실시예 2와 동일한 방법을 사용하여, 노란색 고체인 표제 화합물을 수율 88%로 얻었다:
1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) : δ 13.37 (s, br, 1H, NH-1′), 10.81 (s, 1H, NH-1), 7.77 (d, J = 8.20 Hz, 1H, H-4), 7.62 (d, J = 7.39 Hz, 2H, H-2″,6″) 7.58 (s, 1H, H-vinyl), 7.44 (t, J = 7.39 Hz, 2H, H-3″,5″), 7.32 (t, br, J = 7.39 Hz, 1H, H-4″), 7.26 (dd, J = 1.49, 8.29 Hz, 1H, H-5), 7.09 (d, J = 1.49 Hz, 1H, H-7), 3.56 (t, J = 4.48 Hz, 4H, O(CH2CH 2)2NCH2 CH2CH2-4′ ), 2.41 (t, J = 7.18 Hz, 2H, O(CH2CH2)2NCH2CH2CH 2 -4′) 2.31 (t, J = 4.48 Hz, 4H, O(CH2CH 2)2NCH2CH2CH2-4′), 2.29 (s, 3H, CH3-3′), 2.26 (s, 3H, CH3-5′) 2.24(t, J = 7.18 Hz, 2H, O(CH2CH2)2NCH 2CH2CH2 -4′), 1.56 (quint,. J = 7.18 Hz, 2H, O(CH2CH2)2NCH2CH 2CH2-4′),
MS m/z (상대 강도, %) 441 (M+, 100).
실시예 45
3-[3,5-디메틸-4-(3-몰포린-4-일-프로필)-1H-피롤-2-일메틸렌]-6-페닐-1,3-디하이드로인돌-2-온
실시예 2와 동일한 방법을 사용하여, 노란색 고체인 표제 화합물을 수율 88%로 얻었다:
1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) : δ 13.37 (s, br, 1H, NH-1′), 10.81 (s, 1H, NH-1), 7.77 (d, J = 8.20 Hz, 1H, H-4), 7.62 (d, J = 7.39 Hz, 2H, H-2″,6″) 7.58 (s, 1H, H-vinyl), 7.44 (t, J = 7.39 Hz, 2H, H-3″,5″), 7.32 (t, br, J = 7.39 Hz, 1H, H-4″), 7.26 (dd, J = 1.49, 8.29 Hz, 1H, H-5), 7.09 (d, J = 1.49 Hz, 1H, H-7), 3.56 (t, J = 4.48 Hz, 4H, O(CH2CH 2)2NCH2 CH2CH2-4′ ), 2.41 (t, J = 7.18 Hz, 2H, O(CH2CH2)2NCH2CH2CH 2 -4′) 2.31 (t, J = 4.48 Hz, 4H, O(CH2CH 2)2NCH2CH2CH2-4′), 2.29 (s, 3H, CH3-3′), 2.26 (s, 3H, CH3-5′) 2.24(t, J = 7.18 Hz, 2H, O(CH2CH2)2NCH 2CH2CH2 -4′), 1.56 (quint,. J = 7.18 Hz, 2H, O(CH2CH2)2NCH2CH 2CH2-4′),
MS m/z (상대 강도, %) 441 (M+, 100).
실시예 46
3-[3,5-디메틸-4-(3-몰포린-4-일-프로필)-1H-피롤-2-일메틸렌]-6-(3-메톡시페닐)-1,3-디하이드로인돌-2-온
실시예 2와 동일한 방법을 사용하여, 노란색 고체인 표제 화합물을 87%의 수율로 얻었다:
1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) : δ 13.38 (s, 1H, NH-1′), 10.80 (s, 1H, NH-1), 7.76 (d, J = 7.93 Hz, 1H, H-4), 7.57 (s, 1H, H-vinyl), 7.35 (t, J = 8.08 Hz, 1H, H-5″), 7.26 (dd, J = 1.73, 7.93 Hz, 1H, H-5), 7.18 (d, br, J = 8.08 Hz, 1H, H-4″), 7.13 (t, br, J = 1.94 Hz, 1H, H-2″), 7.08 (d, J = 1.73 Hz, 1H, H-7), 6.90 (dd, J = 1.94, 8.08 Hz, 1H, H-6″), 3.81 (s, 3H, OCH3-3″), 3.56(t, J = 4.38 Hz, 4H, O(CH 2CH2)2NCH2CH2CH 2-4′), 2.41 (t, J = 7.19 Hz, 2H, O(CH2CH2)2NCH2CH2CH 2-4′) 2.31 (t, J = 4.38 Hz, 4H, O(CH2CH 2)2NCH2CH2CH 2-4′), 2.29 (s, 3H, CH3-3′), 2.26 (s, 3H, CH3-5′) 2.24(t, J = 7.19 Hz, 2H, O(CH2CH2)2NCH2CH2CH2-4′), 1.56 (quint,. J = 7.19 Hz, 2H, O(CH2CH2)2NCH2CH 2CH2 -4′),
MS m/z (상대 강도, %) 471 (M+, 100).
실시예 47
3-[3,5-디메틸-4-(3-몰포린-4-일-프로필)-H-피롤-2-일메틸렌]-6-(3-메톡시페닐)-1,3-디하이드로인돌-2-온
실시예 2와 동일한 방법을 사용하여, 노란색 고체인 표제 화합물을 52%의 수율로 얻었다:
1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) : δ 13.35(s, 1H, NH-1′), 10.77 (s, 1H, NH-1), 7.72 (d, J = 7.97 Hz, 1H, H-4), 7.55 (d, J = 8.57 Hz, 2H, H-2″,6″), 7.54 (s, 1H, H-vinyl), 7.20 (dd, J = 1.35, 7.97 Hz, 1H, H-5), 7.04 (d, J = 1.35 Hz, 1H, H-7), 6.99 (d, J = 8.57 Hz, 1H, H-3″, 5″), 3.78 (s, 1H, OCH3-4″) 3.55 (t, J = 4.57 Hz, 4H, O(CH 2CH2)2NCH2CH2 CH2-4′), 2.40 (t, J = 6.97 Hz, 2H, O(CH2CH2)2NCH2CH2CH 2-4′),2.30 (t, J = 4.57 Hz, 4H, O(CH 2CH2)2NCH2CH2C H 2-4′), 2.28 (s, 3H, CH3-3′), 2.24 (s, 3H, CH3-5′), 2.23 (t, J = 6.97 Hz, 2H, O(CH2CH2)2NCH 2CH2CH2-4′), 1.55 (quint,. J = 6.97 Hz, 2H, O(CH2CH2)2NCH2CH 2CH2-4′),
MS m/z (상대 강도, %) 471 (M+, 100).
실시예 48
3-[4-(3-디메틸아미노프로필)-3,5-디메틸-1H-피롤-2-일메틸렌]-1,3-디하이드로인돌-2-온
실시예 1의 단계 1,2 및 3과 동일한 방법을 사용하여, 어두운 붉은색 오일인 4-(3-디메틸아미노프로필)-3,5-디메틸-1H-피롤-2-카르복살데히드)를 63%의 수율로 얻었다:
1H NMR (360 MHz, DMSO-d6) : δ11.33 (s, br, 1H, NH-1), 9.40 (s, 1H, CHO-2), 2.30 (t, J = 7.42 Hz, 2H, (CH3)2NCH2CH2CH 2-4 ), 2.18 (s, 3H,CH3-3), 2.15 (t, J = 7.42 Hz, 2H, (CH3)2NCH 2CH2CH2-4), 2.14 (s, 3H,CH3-5), 2.10 (s, 6H, (CH 3)2NCH2CH2CH2-4), 1.47 (quint., J = 7.42 Hz, 2H, (CH3)2NCH2CH2CH 2-4),
MS m/z (상대 강도, %) 208 ([M+1]+ , 10).
실시예 1의 단계 4와 동일한 방법을 사용하여, 노란색 고체인 표제 화합물을 수율 52%로 얻었다:
1H NMR (360 MHz, DMSO-d6) : δ11.38 (s, br, 1H, NH-1′), 10.70 (s, 1H, NH-1), 7.68 (d, J = 7.54 Hz, 1H, H-4), 7.53 (s, 1H, H-vinyl) 7.06 (t, J = 7.54 Hz, 1H, H-6), 6.94 (t, J = 7.54 Hz, 1H, H-5), 6.85 (d, J = 7.54 Hz, 1H, H-7) 2.38 (t, J = 7.25 Hz, 2H, (CH3)2NCH2CH2CH 2-4′), 2.27 (s, 3H, CH3-3′), 2.23 (s, 3H, CH3-5′), 2.17 (t, J = 7.25 Hz, 2H (CH3)2NCH 2CH2CH2-4′), 2.11 (s, 6H, (CH3)2NCH2CH2CH 2-4′), 1.52 (quint., J = 7.25 Hz, 2H, (CH3)2NCH2CH 2CH2-4′),
MS m/z (상대 강도, %) 323 ([M+1]+, 100).
실시예 49
5-브로모-3-[4-(3-디메틸아미노프로필)-3,5-디메틸-1H-피롤-2-일메틸렌]-1,3-디하이드로인돌-2-온
실시예 2와 동일한 방법을 사용하여, 붉은색 고체인 표제 화합물을 71%의 수율로 얻었다:
1H NMR (360 MHz, DMSO-d6) : δ13.42 (s, 1H, NH-1′), 10.81 (s, 1H, NH-1), 7.98 (d, J = 1.89 Hz, 1H, H-4), 7.66 (s, 1H, H-vinyl), 7.17 (dd, J = 1.89, 8.23 Hz, 1H, H-6), 6.79 (d, J = 8.23 Hz, 1H, H-7), 2.38 (t, J = 7.23Hz, 2H, (CH3)2NCH2CH2CH 2-4′), 2.27 (s, 3H, CH3-3′), 2.25 (s, 3H, CH3-5′) 2.16(t, J = 7.23 Hz, 2H, (CH3)2NCH 2CH2CH2-4′), 2.10 (s, 6H, (CH 3)2NCH 2CH2CH2-4′), 1.51 (quint., J = 7.23 Hz, 2H, (CH3)2NCH2CH 2CH2-4′),
MS m/z (상대 강도, %) 401 ([M+1]+, 100) 과 403 ([M+1]+, 100).
실시예 50
3-[4-(3-디메틸아미노프로필)-3,5-디메틸-1H-피롤-2-일메틸렌]-6-페닐-1,3-디하이드로인돌-2-온
실시예 2와 동일한 방법을 사용하여, 오렌지색 고체인 표제 화합물을 83%의 수율로 얻었다:
1H NMR (360 MHz, DMSO-d6) : δ13.38 (s, 1H, NH-1′), 10.81 (s, 1H, NH-1), 7.77 (d, J = 7.82 Hz, 1H, H-4), 7.62 (d, J = 7.59 Hz, 2H, H-2″,5″) 7.58 (s, 1H, H-vinyl), 7.44 (t, J = 7.59 Hz, 2H, H-3″,5″), 7.32 (t, J = 7.59 Hz, 1H, H-4″), 7.27 (dd, J = 1.11, 7.82 Hz, 1H, H-5), 7.09 (d, J = 1.11 Hz, 1H, H-7), 2.39 (t, J = 7.18 Hz, 2H (CH3)2NCH2CH2CH 2-4′), 2.29 (s, 3H, CH3-3′), 2.25 (s, 3H, CH3-5′), 2.17 (t, J = 7.18 Hz, 2H (CH3)2NCH 2CH2CH2-4′), 2.11 (s, 6H, (CH3)2NCH2CH2CH 2-4′),
MS m/z (상대 강도, %) 399 ([M+1]+, 100).
실시예 51
3-[4-(3-디메틸아미노프로필)-3,5-디메틸-1H-피롤-2-일메틸렌]-6-페닐-2-디메틸렌-6-(2-메톡시페닐)-1,3-디하이드로인돌-2-온
실시예 2와 동일한 방법을 사용하여, 노란색 고체인 표제 화합물을 83%의 수 율로 얻었다:
1H NMR (360 MHz, DMSO-d6) : δ13.38 (s, 1H, NH-1′), 10.72 (s, 1H, NH-1), 7.70 (d, J = 8.06 Hz, 1H, H-4), 7.55 (s, 1H, H-vinyl) 7.28-7.36 (m, 2H, H-4″,5″ ) 7.14 (d, J = 8.32 Hz, 1H, H-6″), 7.04 (dd, J = 1.21, 8.06 Hz, 1H, H-5), 6.99 (d, J = 7.42 Hz, 1H, H-3″), 6.99 (d, J = 1.21 Hz, 1H, H-7), 3.76 (s, 3H, OCH3-2″), 2.39 (t, J = 7.24 Hz, 2H (CH3)2NCH2CH 2CH 2-4′), 2.28 (s, 3H, CH3-3′), 2.25 (s, 3H, CH3-5′), 2.18 (t, J = 7.24 Hz, 2H, (CH3)2NCH 2CH2CH2-4′), 2.11 (s, 6H, (C H 3)2NCH2CH2CH2-4′), 1.53 (quint., J = 7.24 Hz, 2H, (CH3)2NCH2CH 2CH2-4′)
MS m/z (상대 강도, %) 429 (M+, 100).
실시예 52
3-[4-(3-디메틸아미노프로필)-3,5-디메틸-1H-피롤-2-일메틸렌]-6-(3-메톡시페닐)-1,3-디하이드로인돌-2-온
실시예 2와 동일한 방법을 사용하여, 붉은색 고체인 표제 화합물을 83%의 수율로 얻었다:
1H NMR (360 MHz, DMSO-d6) : δ13.38 (s, 1H, NH-1′), 10.80 (s, 1H, NH-1), 7.60 (d, J = 8.06 Hz, 1H, H-4), 7.57 (s, 1H, H-vinyl) 7.35 (t, J = 8.15 Hz, 1H, H-5″), 7.26 (dd, J = 8.06 Hz, 1H, H-5), 7.19 (d, br, J = 8.15 Hz, , H-6″), 7.13(m, 1H, H-2″), 7.09 (d, J = 1.39 Hz, 1H, H-7), 6.90 (dd, J = 2.57, 8.15 Hz, 1H, H-4″), 3.81 (s, 3H, OCH3-3″), 2.39 (t, J = 7.17 Hz, 2H (CH3)2NCH2CH2CH 2-4′), 2.29 (s, 3H, CH 3-3′), 2.25 (s, 3H, CH3-5′), 2.17 (t, J = 7.17 Hz, 2H, (CH3)2NCH 2CH2CH2-4′), 2.11 (s, 6H, (CH 3)2NCH2CH2CH2-4′), 1.53 (quint., J = 7.17 Hz, 2H, (CH3)2NCH2CH 2CH2-4′)
MS m/z (상대 강도, %) 429 (M+, 100).
실시예 53
3-[4-(3-디메틸아미노프로필)-3,5-디메틸-1H-피롤-2-일메틸렌]-6-(4-메톡시페닐)-1,3-디하이드로인돌-2-온
실시예 2와 동일한 방법을 사용하여, 갈색 고체인 표제 화합물을 83%의 수율로 얻었다:
1H NMR (360 MHz, DMSO-d6) : δ13.35 (s, 1H, NH-1′), 10.77 (s, 1H, NH-1), 7.73 (d, J = 7.82 Hz, 1H, H-4), 7.56 (d, J = 8.83 Hz, 1H, H-2″,6″) 7.54 (s, 1H, H-vinyl), 7.20 (dd, J = 1.64, 7.82 Hz, 1H, H-5), 7.04 (d, J = 1.64 Hz, H-7), 7.00 (d, J = 8.83 Hz, 2H, H-3″,5), 3.78 (s, 3H, OCH3-2″), 2.39 (t, J = 7.24 Hz, 2H, (CH3)2NCH2CH2CH 2-4′), 2.28 (s, 3H, CH3-3′), 2.25 (s, 3H, CH3-5′), 2.17 (t, J = 7.24 Hz, 2H, (CH3)2NCH 2CH 2CH2-4′), 2.11 (s, 6H, (CH 3)2NCH2CH2CH2-4′), 1.52 (quint., J = 7.24 Hz, 2H, (CH3)2NCH2CH 2CH2-4′)
MS m/z (상대 강도, %) 429 (M+, 100).
실시예 54
5-클로로-3-[4-(3-디메틸아미노프로필)-3,5-디메틸-1H-피롤-2-일메틸렌] -1,3-디하이드로인돌-2-온
실시예 1에서와 같은 방법을 사용하여 표제 화합물을 갈색고체형태로 53%의 수율로 얻었다:
1H NMR (360 MHz, DMSO-d6) d 13.43 (s, 1H, NH-1'), 10.84 (s, 1H, NH-1), 7.87 (d, J = 1.85 hz, 1H, H-4), 7.66 (s, 1H, H-vinyl), 7.05 (dd, J = 1.85, 8.15 Hz, 1H, H-6), 6.83 (d, J = 8.15 Hz, 1H, H-7), 2.36-2.45 (m, 4H, (CH3)2NCH2CH2CH2-4'), 2.30 (s, 6H, (CH3 )2NCH2CH2CH2-4'), 2.28 (s, 3H, CH3-3'), 2.26 (s, 3H, CH3-5'), 1.58 (퀸트., J = 7.52 Hz, 2H, (CH3)2NCH2 CH2CH2-4'), MS m/z (상대적 강도, %) 357 ([M-1]+, 100).
실시예 55
5-클로로-3-[4-(3-디메틸아미노프로필)-3,5-디메틸-1H-피롤-2-일메틸렌]-1,3-디하이드로인돌-2-온
실시예 2에서와 같은 방법을 사용하여 표제 화합물을 77%의 수율로 얻었다:
MS EI 357 [M-1]+.
실시예 56
3-[4-(3-디메틸아미노프로필)-3,5-디메틸-1H-피롤-2-일메틸렌]-5-메톡시-1,3-디하이드로인돌-2-온
실시예 2에서와 같은 방법을 사용하여 표제 화합물을 77%의 수율로 얻었다:
MS EI 353 [M-1]+.
실시예 57
3-[4-(3-디메틸아미노프로필)-3,5-디메틸-1H-피롤-2-일메틸렌]-6-메톡시-1,3-디하이드로인돌-2-온
실시예 2에서와 같은 방법을 사용하여 표제 화합물을 74%의 수율로 얻었다:
실시예 58
3-[4-(3-디메틸아미노프로필)-3,5-디메틸-1H-피롤-2-일메틸렌]-5-메톡시-1,3-디하이드로인돌-2-온
실시예 2에서와 같은 방법을 사용하여 표제 화합물을 45%의 수율로 얻었다:
MS EI 337 [M]+.
실시예 59
3-[4-(3-디메틸아미노프로필)-3,5-디메틸-1h피롤-2-일메틸렌]-4-메틸-1,3-디하이드로인돌-2-온
실시예 2에서와 같은 방법을 사용하여 표제 화합물을 99%의 수율로 얻었다:
1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) d 13.45 (s, br, 1H, NH), 10.78 (s, br, 1H, NH), 7.50 (s, 1H, H-vinyl), 6.98 (t, J = 8.1 Hz, 1H, H-6), 6.76 (t, J = 8.1Hz, 1H, H-6), 6.76 (t, J = 8.1 Hz, 2H, H-5 & H-7), 2.88 (m, 2H, CH2), 2.64 (s, 6H, 2XCH3), 2.56 (s, 3H, CH3), 2.43 (t, J = 7.4 Hz, 2H, CH2), 2.29 (s, 3H, CH3), 2.19 (s, 3H, CH3), 1.65-1.75 (m, 2H, CH3),
MS EI 337 [M]+.
실시예 60
3-[4-(3-디메틸아미노프로필)-3,5-디메틸-1H-피롤-2-일메틸렌]-4-(2-히드록시-에틸)- 1,3-디하이드로인돌-2-온
실시예 2에서와 같은 방법을 사용하여 표제 화합물을 98%의 수율로 얻었다:
실시예 61
3-[4-(3-디메틸아미노프로필)-3,5-디메틸-1H-피롤-2-일메틸렌]-2-옥소-2,3-디하이드로-1H-인돌-5-술포닉엑시드 아미드
실시예 2에서와 같은 방법을 사용하여 표제 화합물을 59%의 수율로 얻었다:
1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) d 13.41 (s, 1H, NH-1'), 11.12 (s, 1H, NH-1), 8.16 (d, J = 1.78 Hz, 1H, H-4), 7.66 (s, 1H, H-vinyl), 7.55 (dd, J = 1.78, 8.18 Hz, 1H, H-6), 7.11 (s, br, 2H, H2NSO2-5), 6.98 (d, J = 8.18 Hz, 1H, H-7), 2.47-2.50 (m, 2H, (CH3)2NCH2CH2CH2-4'), 2.41 (t, J = 7.37 Hz, 2H, (CH3)2NCH2CH2CH2-4'), 2.36 (s, 6H, (CH3 )2NCH2CH2CH2-4'), 2.30 (s, 3H, CH3-3'), 2.28 (s, 3H, CH3-5'), 1.61 (퀸트., J = 7.37 Hz, 2H, (CH3)2NCH2 CH2CH2-4').
실시예 62
3-[4-(3-디메틸아미노프로필)-3,5-디메틸-1H-피롤-2-일메틸렌]-2-옥소-2,3-디하이드로-1H-인돌-5-술포닉엑시드 이소프로필아미드
실시예 2에서와 같은 방법을 사용하여 표제 화합물을 64%의 수율로 얻었다:
MS EI 444 [M]+.
실시예 63
3-[4-(3-디메틸아미노프로필)-3,5-디메틸-1H-피롤-2-일메틸렌]-5-(몰포라인-4-술포닐)-1,3-디하이드로인돌-2-원
실시예 2에서와 같은 방법을 사용하여 표제 화합물을 90%의 수율로 얻었다:
MS EI 472 [M]+.
실시예 64
3-[4-(3-디메틸아미노프로필)-3,5-디메틸-1H-피롤-2-일메틸렌]-2-옥소-2,3-디하이드로-1H-인돌-5-술포닉엑시드 디메틸아미드
실시예 2에서와 같은 방법을 사용하여 표제 화합물을 92%의 수율로 얻었다:
1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 13.5 (s, br, 1H, NH), 12.21 (s, br, 1H, NH), 8.18 (d, J = 1.8 Hz, 1H, H-4), 7.84 (s, 1H, H-vinyl), 7.44 (dd, J = 1.8, 8.4 Hz, 1H, H-6), 7.05 (d, J = 8.4Hz, 1H, H-7), 2.59 (s, 6H, 2XCH3), 2.59-2.64 (m, 2H, CH2), 2.44 (s, 6H, 2XCH2), 2.59-2.64 (m, 2H, CH2), 2.44 (s, 6H, 2XCH3), 2.38-2.44 (m, 2H, CH2), 2.31 (s, 6H, 2XCH3), 1.59-1.69 (m. 2H, CH2),
MS EI 430 [M]+.
8. 생물학적 평가
본 발명에서 사용된 각 화합물에는 생물학적 활성도에 대한 분광값이 주어진다. 현재까지의 실험결과에 의하면, 본 발명의 화합물은 새로운 피롤 치환 2-인돌리논스이며, RTK, CTK, STK의 활성도를 조절하는 기능을 갖는다. 하기의 에세이과정들은 최적의 활성도를 나타내는 화합물을 선택하기 위한 방법이다.
에세이 과정
하기의 인 비트로상에서의 에세이는 한개이상의 단백질 인산화효소에대한 본 발명의 서로다른 화합물들의 활성도와 효과를 측정하는 방법이다. 이미 공지된 기술을 사용하여 유사한 방법이 고안될 수 있다.
본 발명의 세포질/촉매 에세이는 엘리자방법을 이용하여 수행된다. 일반적인 방법은 다음과 같다: 본 발명의 화합물을 시험하고자하는 인산화효소가 자연적으로 혹은 인위적으로 발현되는 세포에 주입하고, 시간이 지난 후 시험하고자하는 인산화효소가 수용체라면 수용체를 활성화시킨다고 알려진 리간드를 첨가한다. 세포를 분해시키고 분해물을 인산화반응의 기질을 인식하는 항체로 코팅된 엘리자플레이트의 각 웰에 옮긴다. 세포분해물중 기질이 될수 없는 구성물은 제거하고 기질에 대한 인산화정도를 포스포타이로신을 특이하게 인식하는 항체를 사용하여 측정한다. 측정시 시험하고자하는 화합물을 처리하지 않은 대조군과 비교한다. 본 발명에 명시된 세포질/촉매 에세이는 시험하고자하는 인산화효소의 활성으로 생산되는 DNA의 양을 측정하며, 증식반응의 측정에 일반적으로 이용된다. 본 에세이의 일반적인 과정은 다음과 같다. 본 발명의 화합물을 시험하고자하는 인산화효소가 자연적으로 혹은 인위적으로 발현되는 세포에 주입하고, 시간이 지난 후 시험하고자하는 인산화효소가 수용체라면 수용체를 활성화시킨다고 알려진 리간드를 첨가한다. 24시간 이상 반응시킨뒤, 브로모디옥시우리딘 (BrdU) 또는 3H-티미딘과 같은 DNA 표지 시약을 첨가한다. 표지된 DNA양은 BrdU항체에 대한 항체나 방사선 측정에 의해 검출하고, 시험하고자하는 화합물이 처리되지 않은 대조군 세포와 비교한다.
세포질/촉매 에세이
본 발명의 단백질 인산화효소 활성을 측정하기 위해 효소 결합 면역흡수 에세이(엘리자) 방법이 사용된다. 엘리자방법은 이미 공지되어있다(Voller, et al., 1980, "Enzyme-Linked Immunosorbent Assay", Manual of Clinical Immunology, 2ded., edited by Rose and Friedman, pp 359-371 Am. Soc. Of Microbiology, Washington, D.C.).
본 발명에서 명시된 과정은 특이한 단백질 인산화효소와 관련된 활성도를 측 정하는데 적용된다. 단백질 인산화효소에 대한 엘리자실험을 수행하는데 바람직한 과정은 하기와 같다. 그러나, RTK 군이나 CTK, STK군에 대한 화합물 활성도의 측정도 본 발명의 방법 범위내에 있다.
FLK-1 에세이
엘리자에세이는 FLK-1의 인산화효소 활성도를 측정하는데 이용되며 보다 바람직하게는, FLK-1 수용체에 대한 TK활성도의 억제 또는 유발을 측정하는데 이용된다. 특별하게, 다음의 에세이는 fLK-1을 발현하도록 유전적으로 조작된 세포에서의 FLK-2 수용체의 인산화효소 활성도를 측정하는데 사용될 수 있다.
재료 및 시약:
1. 코닝제품의 96-웰 엘리자 플레이트: 코닝 Cat. # 25805-96
2. Cappel제품의 래비 항체에 대한 고우트 항체: Cat. # 55641
3. PBS: 깁코 Cat # 450-1300EB
4. TBS버퍼: 50mM 트리스 pH 7.2, 150mM NaCl, 0.1% Tween-20
5. 에탄올라민 농축액: 10% 에탄올라민 pH 7.0, 4℃보관
6. HNTG버퍼: 20mM 헤페스 버퍼 pH 7.5, 150mM NaCl, 0.2% 트리톤 X-100, 10% 글리세롤
7. EDTA: 0.5M 100X농축액 pH 7.0
8. 올소반데이트 나트륨: 0.5M 100X 농축액
9. 파이로포스페이트 나트륨: 0.2M 100X 농축액
10. 눈크제품의 96웰 V형 바닥 폴리프로필렌 플레이트: Applied Scientific Cat. # AS-72092
11. NIH3T3 C7#3 세포주: FLK-1발현 세포
12. 높은양의 글루코즈로 제공된 L-글루타민이 포함된 DMEM배지: Cat. # 11965-050
13. FBS: 깁코, Cat. # 16000-028
14. L-글루타민: 깁코, Cat. # 25030-016
15. VEGF: PeproTech, Inc. Cat. # 100-201 1μg/100μl 농축액으로 준비하고 -20℃에서 보관
16. 정제된 FLK-1항혈청에 대한 항체
17. 포스포타이로신에 특이한 UB40단일클론 항체 (Fendly, et al., 1990, Cancer Research 50:1550-1558)
18. EIA 등급의 마우스 항체-POD에 대한 고우트 항체 (BioRad Cat. # 172-1011
19. 2,2-아지노-비스(3-에틸벤즈-티아졸린-6-술포닉 엑시드 (ABST))용액: 100mM 시트릭산(무수화), 250mM Na2HPO4 pH 4.0, 0.5mg/ml ABST (시그마 Cat.# A-1888), 용액은 사용직전까지 4℃에서 보관한다.
20. 과산화수소: 30%, 피셔 Cat. # H325
21. ABTS/과산화수소 (15ml ABST, 2μl 과산화수소), 사용하기 5분전 준비하고 실온에서 보관한다.
22. 0.2 M HCl 농축액
23. 디메틸술폭시드: 100%, 시그마 Cat. # D-8418
24. 트립신-EDTA: 깁코 BRL Cat. # 25200-049
실험과정:
1. 엘리자플레이트(코닝, 96well, Cat. #25805-96)에 0.1 M Na2CO3 pH 9.6에 녹아있는 래빗 IgG 항체에 대한 Cappel항체 1.0μg을 처리하여 각웰의 최종 부피가 150μl가 되게하고 4℃에서 24시간 반응시킨다. 이렇게 코팅처리된 플레이트는 4℃에서 2주간 보관이 가능하다.
2. 2.0mM L-글루타민과 10% FBS가 포함된 DMEM배지상에서 37℃, 5% C02조건하에서 세포를 배양한다.
3. 트립신을 사용하여 세포를 수확하고 코닝제품(Cat. # 25850)의 폴리스티렌 96-웰 둥근 바닥 플레이트에 약 25,000개의 세포를 각 웰에 분주한다.
4. 37℃, 5% C02조건하에서 24시간이상 세포를 배양한다.
5. D-PBS 1X용액으로 세척한다.
6. 각 웰에 스타베이션 배지(DMEM, 2.0mM L-글루타민, 0.1% FBS) 200μl씩을 첨가하고, 37℃, 5% C02조건하에서 24시간 배양한다.
7. 폴리프로필렌 96웰 플레이트상에서 배지를 사용하여 화합물을 20배로 희석한다. 대조군웰에는 디메틸술폭시드를 20배 희석한다.
8. 플레이트상의 배지를 제거하고 162μl의 새 배지를 첨가해준다.
9. 각 웰에 20배 희석한 화합물(7번 과정) 18μl를 첨가하고 대조군웰에는(+/- VEGF) 20배 희석한 디메틸술폭시드를 첨가하여 세포 자극 이후의 최종 200배 희석되게 한다. 최종 디메틸술폭시드 농도는 0.5%이다. 37℃, 5% C02 조건하에서 2시간동안 반응시킨다.
10. 엘리자플레이트상의 반응하지 않은 항체를 제거한다. TBSW와 0.5%에탄올라민이 혼합된 용액으로 3회 세척해준다. 여분의 물기와 공기방울은 페이퍼 타월을 사용하여 제거해준다.
11. TBSW와 0.5%에탄올라민이 혼합된 용액 150μl를 각웰에 처리하여 블로킹시킨다. 교반기에서 흔들어주면서 30분간 반응시킨다.
12. 10번 과정과 같이 3회 세척해준다.
13. 정제된 다클론 래빗 항혈청에 대한 FLU-1 항체 0.5μg을 첨가한다. 최종 부피는 TBSW 150μl, 에탄올라민 0.5%(pH 7.0)가 되게한다. 30분간 교반하면서 반응시킨다.
14. 세포에 배지 180μl를 첨가하고 올바나데이트 나트륨 10.0mM, VEGF 500ng/ml(최종농도는 각 웰당 1.0mM 올바나데이트 나트륨, 50ng/ml VEGF)으로 세포를 자극시킨 후, 37℃, 5% C02조건하에서 8분동안 반응시킨다. - 대조군웰에는 스타베이션 배지만을 첨가한다.
15. 8분후 배지를 제거하고 PBS 200μl를 처리하여 1회 세척한다.
16. 실온에서 5분동안 교반하면서 각웰에 HNTG 150μl를 처리하여 세포를 분해시킨다. HNTG조성물은 올소바나데이트 나트륨, 파이로포스페이트 나트륨, EDTA 를 포함한다.
17. 10번 과정과 같이 엘리자플레이트를 3회 세척한다.
18. 세포 플레이트로부터 엘리자플레이트로 세포 분해물을 옮긴 후, 2시간동안 교반하면서 배양한다. 세포 분해물을 옮기기 전 파이펫으로 업다운시킨다.
19. 10번 과정과 같이 엘리자플레이트를 3회 세척한다.
20. 엘리자플레이트에 TBSW와 0,5% 에탄올라민에 녹아있는 UB40 0.02μg을 처리하고 반응시킨다. 최종부피는 각 웰당 150μl로 맞추고 30분동안 교반하면서 반응시킨다.
21. 10번 과정과 같이 엘리자플레이트를 3회 세척한다.
22. 엘리자플레이트에 10,000배 희석된 EIA등급의 TBSW와 0,5% 에탄올라민(pH7.0)에 녹아있는 홀스래디쉬 페록시데이즈(horseradish peroxidase)가 결합된 마우스 항체에 대한 고우트 항체를 처리한다. 최종부피는 각 웰당 150μl로 맞추고 30분동안 교반하면서 반응시킨다.
23. 10번 과정과 같이 엘리자플레이트를 3회 세척한다.
24. 웰에 ABST/과산화수소 100μl를 처리하고 10분동안 교반하면서 반응시킨다.
25. 0.2 M HCl을 100μl첨가하여 최종농도가 0.1M이되게하여 발색반응을 종결시킨다. 실온에서 1분동안 흔들어준 후, 공기방울을 제거하였고 엘리자플레이트 판독기를 사용하여 410nm에서 엘리자플레이트를 판독힌다.
전체세포에서의 EGF 수용체-HER2 키메릭 수용체 에세이
EGFR-NIH3T3 세포주의 HER2 인산화효소 활성도를 다음과같이 측정하였다:
재료와 시약:
1. EGF: 농축액 16.5 ILM, EGF 201, TOYOBO, Co., Ltd. Japan.
2. 05-101 (UBI) (EGFR의 세포외 도메인을 인식하는 단일크론 항체).
3. 포스포타이로신 항체에 대한 항체 (anti-Ptyr) (polyclonal) (Fendly, et al., supra).
4. 검출 항체: 래빗 항체에대한 고우트항체 horseradish peroxidase conjugate, TAGO, INC., Burlingame, CA.
5. TBST buffer:
트리스-HCl, pH 7.2 50mM
NaCl 150mM
트리톤 X-100 0.1%
6. HNTG 5X 농축액:
헤페스 0.1 M
NaCl 0.75 M
글리세롤 50%
트리톤 X-100 1.0%
7. ABTS 농축액:
Citric Acid 100mM
Na2HPO4 250mM
HCl 0.5mM
ABTS* 0.5mg/ml
* (2,2'-아지노비스(3-에틸벤즈타이아졸린술포닉엑시드), 4℃에서 사용전까지 보관한다.
8. 농축 용액:
EDTA 100mM pH 7.0
Na3VO4 0.5 M
Na4(P207) 0.2 M
실험과정:
전처리된 엘리자 플레이트:
1. 엘리자플레이트(코닝, 96well, Cat. #25805-96)에 PBS용액에 녹아있는 05-101항체 0.5μg을 처리하여 각웰의 부피가 100μl가 되게하고 4℃에서 24시간 보관한다. 이렇게 코팅처리된 플레이트는 4℃에서 10일간 보관이 가능하다.
2. 상기 플레이트를 사용시에는 코팅용액을 제거하고 블로킹버퍼 100μl(5% Carnation Instant Non-Fat Dry Milk in PBS)로 대치한다. 플레이트를 실온에서 흔들어주면서 30분동안 배양시킨다 (23 - 25℃). 사용직전에 상기의 블로킹버퍼를 제거하고 TBST용액으로 4회 세척해준다.
세포분주:
1. EGFR 의 새포외부로 돌출된 도메인을 포함하고 있는 카이메릭(chimeric) 수용체와 새포내 HER2 인산화효소 도메인을 과량발현하는 NIH3T3세포주를 본 발명의 에세이에 사용하였다.
2. 세포가 80-90% 성장했을때 선택한다. 트립신 처리를 하여 세포를 분리시키고 10% FBS처리를하여 트립신의 작용을 종결시킨다. 세포를 DMEM(10% CS DMEM)배지에 현탁시키고 1500rpm으로 실온에서 5분간 원심분리를 수행한다.
3. 세포를 분주배지(DMEM, 0.5% FBS)에 재현탁시키고 트리판 블루를 사용하여 세포수를 측정하되 90%이상의 세포가 살아있어야한다. DMEM배지(0.5% FBS)상에 있는 세포를 96웰 마이크로타이터 플레이트의 각 웰에 약10,000개씩 분주하였고, 웰의 총 부피가 100μl가 되게한 후, 5% CO2의 존재하에 37℃에서 40분간 배양한다.
에세이과정:
1. 역방향현미경을 사용하여 분주된 세포의 오염유무를 확인한다. 약물농축액(10mg/ml, DMSO에 희석)을 DMEM배지에 10배로 희석되게 처리한 후, 이중 5μl를 TBST 용액이 포함된 웰에 옮겨 최종약물농도가 1/200희석되게하였고 최종 DMSO농도는 1%가 된다. 대조군으로는 약물처리하지않은 DMSO를 사용한다. 5% CO2존재하에 37℃에서 2시간동안 배양한다.
2. EGF-리간드의 준비: DMEM에 있는 EGF농축액중 10μl를 옮겨(1:12 희석), 최종농도가 100nM이 되게한다.
3. 신선한 HNTG*를 각웰에 적당하게 첨가한 후, 얼음에서 방치한다.
HNTG* (10ml):
HNTG 농축액 2.0ml
증류수 7.3ml
EDTA, 100nM, pH 7.0 0.5ml
Na3VO4 (0.5 M) 0.1ml
Na4(P207) (0.2M) 0.1ml
4. 약물처리와 함께 120분 반응시킨 후 각웰에 SGF 리간드 10μl를 처리하고 최종농도가 100nM이 되게한다. 대조군으로는 DMSO를 사용한다. 실온에서 5분간 흔들어주면서 배양한다.
5. 약물, EGF 그리고 DMEM을 제거하고 PBS완충용액으로 두번 세척한다. 각웰에 HNTG*를 100μl 첨가한 후 얼음에서 5분간 방치한다. 그동안 다른 엘리자플레이트의 블로킹버퍼(blocking buffer)를 제거하고 상기와 같이 TBST완충용액으로 세척한다.
6. 마이크로파이페터에 꼭 맞는 파이펫팁을 사용하여 플레이트로보터 세포를 모아서 HNPG*분해용액을 첨가하고 제거하는 과정을 반복하면서 세포를 균질화한다. 상기의 세포 분해물을 코팅처리되고, 블로킹 시킨 후 여러번 세척해준 엘리자플레이트에 옮긴 후, 실온에서 1시간동안 흔들어주면서 반응시킨다.
7. 세포 분해물을 제거하고 TBST용액으로 4회 세척한 뒤, Ptry 항체에 대한 항체(1:3000 이 되도록 TBST용액으로 희석)를 희석하여 엘리자플레이트의 각 웰에 처리하여 최종 부피가 100μl가 되게한다. 실온에서 30분간 반응시킨다.
8. Ptry 항체에 대한 항체를 제거하고 TBST용액으로 4회 세척한 후, 각웰에 TAGO제품의 래빗 IgG 항체에 대한 항체를 희석하여 (1:3000배 희석)100μl씩 처리해준다. 실온에서 30분간 흔들어주면서 반응시킨다.
9. TAGO제품의 검출 항체(detection antibody)를 제거하고 TBST용액으로 4회 세척한다. 엘리자플레이트의 각 웰에 ABST/과산화수소 용액을 처리하여 실온에서 20분간 반응시킨다 (ABST/과산화수소 용액: 10ml ABST용액에 30% 과산화수소 1.0μl첨가).
10. 5N H2SO4 를 50μl처리하여 반응을 종결시키고, 410nm에서 흡광도를 측정한다.
11. 포스포타이로신 최대 신호(signal)값은 +대조군값에서 -대조군값을 뺀값으로 정했다. 추출물이 포함된 웰에 대한 포스포타이로신 양의 억제도는 -대조군값을 뺀후에 %로 나타냈다.
PDGF-R 에세이
모든 세포배양 배지, 글루타민, 그리고 태아소혈청(fetal bovine serum)은
깁코 Life Technologies (Grand Island, NY)제품을 사용하였다. 모든 세포는 90-95%의 습도와 5-10% CO2, 37℃의 조건하에서 배양하였다. 모든 세포주는 2주마다 재배양하였고 Mycotect 방법(깁코)으로 마이코플라즈마 음성임을 확인하였다.
엘리자에세이를 수행하기 위해서, 세포(U1242, Joseph Schlessinger, NYU에서얻음)가 배지(10% FBS, NEAA, LmM NaPyr, 2mM 글루타민이 포함된 엠이엠배지)상에 서 80 - 90% 성장한 후, 0.5% 시럼이 포함되어있는 96-웰 조직배양플레이트의 각 웰에 25,000개에서 30,000개의 세포를 분주하였다. 0.5%시럼이 포함된 배지상에서 24시간 배양 후, 시럼이 포함되지 않은 배지로 갈아주고, 시험하고자하는 화합물을 첨가하고 5% CO2, 37℃의 조건하에서 2시간 배양하였다. 세포에 HNTG(20mM 헤페스, 150mM NaPyr)를 처분하여 분해한 뒤, 리간드를 처리하여 5-10분동안 반응시켜 자극을 주었다. 세포 분해물을(0.5mg/well in PBS) 수용체 특이 항체로 코팅되고 TBST 용액으로 희석된 0.5% 밀크용액(50mM 트리스-HCI, pH7.2, 150mM NaCl, 0.1% 트리톤 X-100)으로 실온에서 30분간 전처리되어 있는 엘리자플레이트에 옮긴 후, 실온에서 1시간동안 흔들어주면서 배양시켰다. 플레이트를 TBST용액으로 4회 반복하여 세척한 후 다클론 포스포타이로신 항체에 대한 항체를 처리하여 실온에서 30분간 반응시켰다. 반응에 참여하지 않고 잔류된 항체는 TBST용액으로 4회 반복하여 세척하여 제거하였다. 엘리자플레이트를 TBST 용액으로 4회 더 세척한 후 래빗 IgG항체에 대한 고우트 항체를 처리하고 실온에서 30분간 더 반응시켰다. 발색반응을 위해 상기 플레이트에 ABTS(100mM 시트릭산, 250mM Na2HPO4, 0.5mg/mL 2,2'-아지노-비스(3-에틸벤즈타이오졸린-6-술포닉엑시드)와 과산화수소 혼합액을 처리하였다. ABTS처리 후, 참고파장을 630nm로 하여 410nm에서 흡광도를 약 15-30분간 측정하여 기록하였다.
IGF-1 수용체 에세이
다음의 과정은 IGF-1수용체에대한 포스포타이로신 활성도를 측정하기 위한 것으로써 IGF-1수용체 타이로신 인산화효소 활성도를 나타낸다.
재료와 시약:
1. 본 에세이에 사용된 세포주는 3T3/IGF-1R로서, IGF-1수용체를 과량 생산할 수 있도록 유전적으로 변형된 세포주이다.
2. 3T3/IGF-1R세포주를 5% CO2, 37℃의 조건하에서 10% FBS와 2mM 글루타민이 포함된 DMEM배지상에서 배양한다.
3. 정제된 IGF-1R항체에 대한 항체 17-69.
4. D-PBS:
KH2PO4 0.20g/l
KH2PO4 2.16g/l
KCl 0.20g/l
NaCl 8.00g/l (pH 7.2)
5. 블로킹 버퍼: TBST 와 5% 밀크용액 (Carnation Instant Non-Fat Dry Milk)
6. TBST 버퍼:
트리스-HCl 50mM
NaCl 150mM (pH 7.2/HCl 10N)
트리톤 X-100 0.1%
TBS농축액(10X) 준비하고, 희석시마다 트리톤 X-100을 첨가해준다.
7. HNTG 버퍼:
헤페스 20mM
NaCl 150mM (pH 7.2/HCl 1N)
글리세롤 10%
트리톤 X-100 0.2%
농축액(5X)을 준비해두고 4℃에서 보관한다.
8. EDTA/HCl: 100X 농축액 준비 0.5M pH 7.0 (NaOH)
9. Na3VO4: 100X 농축액 준비 0.5M 분주해서 80℃에서 보관한다.
10. Na4P2O7: 0.2M을 100X 농축액으로 준비한다.
11. 인슐린 유사 성장 인자(Insulin-like growth factor-1), Promega제품(Cat# G5111).
12. 포스포타이로신 항체에 대한 래빗 다클론 항체.
13. 래빗 항체에 대한 고우트 항체, POD 접합 (검출 항체), Tago 제품(Cat. No. 4520, Lot No. 1802): Tago, Inc., Burlingame, CA.
14. ABTS (2,2'-아지노비스(3-에틸벤즈타이아졸린술포닉엑시드)) 용액:
Citric acid 100mM
Na2HPO4 250mM (pH 4.0/1N HCl)
ABTS 0.5mg/ml
ABTS용액은 어두운곳에서 보관하고 4℃를 유지해주어야한다. 초록색으로 변 하면 폐기한다.
15. 과산화수소액은 어둡고 4℃가 유지되는 곳에서 보관한다.
실험과정:
특별한 사항이 없는한 모든 단계는 실온에서 행한다. 엘리자플레이트는 TBST를 사용하여 1회 세척해주고, 다시 물로 3회 세척해준다. 페이퍼 타월을 이용하여 가볍게 물을 제거하고 건조시킨다.
세포 분주:
1. 세포가 배양 디쉬(코닝 25020-100)상에서 80-90% 자랐을때 트립신-EDTA (0.25%, 0.5ml/D-100, 깁코)을 사용하여 세포를 분리한다.
2. 세포를 10% FBS, 2mM L-글루타민이 포함된 DMEM배지에 분산시킨 후 96웰 플레이트(코닝 25020-100)의 각 웰에 세포 약 20,000개씩을 분주한다 (100μl/웰). 24시간 배양한 후, 시럼이 들어가지않은 배지(90/μl)로 갈아주고 5% CO2와 37℃의 조건하에서 24시간동안 배양한다.
엘리자 플레이트의 코팅(coating)과 블로킹(blocking):
1. 엘리자플레이트(코닝 25805096)에 PBS 용액 100μl 에 희석된 IGF-1R 항체에 대한 항체 0.5μg을 각웰에 처리하고 2시간동안 반응시킨다.
2. 코팅용액을 제거하고 블로킹 용액 100μl를 처리하여 30분간 교반한다. 블로킹 용액을 제거하고 세포분해물을 첨가하기 직전에 플레이트를 씻어준다.
에세이 과정:
1. 약물시험은 시럼이 없는 상태에서 수행한다.
2. 약물 농축액 (100% DMSO에 희석)을 DMEM배지로 1:10이 되도록 희석한 후, 96웰 플레이트의 각웰에 10μl씩 처리하여 최종 약물농도가 1:100 으로 희석되게 하고 최종 DMSO농도는 1.0%가 되도록한다. 세포를 5% CO2 존재하에 37℃에서 2시간동안 배양한다.
3. 새포 용해 버퍼 준비 (HNTG*)
HNTG 농축액 2.0ml
EDTA 0.1ml
Na3VO4 (0.5 M) 0.1ml
Na4(P207) 0.1ml
증류수 7.3ml
4. 약물을 처리하고 2시간 후, PBS 용액에 희석된 200nM IGF-1리간드를 각웰에 10μl씩 처리하고 (최종 농도는 20nM) 5% CO2 존재하에 37℃에서 10분동안 배양한다.
5. 배지를 제거하고 각웰에 HNTG 100μl를 첨가하고 10분간 교반한다. 세포가 충분히 분해되었는지 확인하기 위하여 현미경하에서 세포를 관찰한다.
6. 12-채널 파이펫을 사용하여 세포를 플레이트로부터 모으고, 흡입과 분출과정을 반복하면서 세포를 분해시킨다. 상기의 세포분해물을 항체로 코팅된 엘리자플레이트에 옮기고, 1시간동안 교반한다.
7. 분해물을 제거하고 플레이트를 씻어준 후, 각웰에 pTyr에대한 항체 (TBST 로 1:3000희석) 100μl씩 처리하고, 30분간 교반한다.
8. pTyr에 대한 항체를 제거하고 플레이트를 씻어준 후, TAGO 100μl를 각웰에 처리하고 20분간 교반한다.
9. 상기의 검출 항체를 제거하고 플레이트를 씻어준후, ABST/과산화수소(ABTS 10ml 당 H2O2 1.2μl) 100μl를 각웰에 처리하여 발색반응을 시작한다.
10. Dynatec MR5000을 사용하였으며, 630nm를 참고파장으로 하여 410nm에서 Optical Density를 측정하였다.
EGFR 에세이
인간 EGF-R을 과량발현하도록 유전적으로 조작된 세포주에서의 EGF 수용체 인산화효소 활성도를 다음과 같이 측정하였다:
재료와 시약:
1. EGF 리간드: 농축액 16.5 μM, EGF 201, TOYOBO, Co., Ltd. Japan.
2. 05-101 (UBI) (EGFR의 세포밖 도메인을 인식하는 단일크론 항체).
3. 포스포타이로신 항체에 대한 항체 (anti-Ptyr) (polyclonal) (Fendly, et al., supra).
4. 검출 항체: 래빗 항체에 대한 고우트 항체 (horseradish peroxidase conjugate), TAGO, INC., Burlingame, CA.
5. TBST 버퍼:
트리스-HCl, pH 7.2 50mM
NaCl 150mM
트리톤 X-100 0.1
6. HNTG 5X 농축액:
헤페스 0.1 M
NaCl 0.75 M
글리세롤 50%
트리톤 X-100 1.0%
7. ABTS stock:
Citric Acid 100mM
Na3VO4 250mM
HCl 4.0mM
ABTS* 0.5mg/ml
4℃, 어두운곳에서 사용전까지 보관한다.
8. 농축 용액:
EDTA 100mM pH 7.0
Na3VO4 0.5 M
Na4(P207) 0.2 M
전처리된 엘리자 플레이트:
1. 엘리자플레이트(코닝, 96웰, Cat. #25805-96)에 PBS용액에 녹아있는 05- 101항체 0.5μg을 처리하여 각웰의 부피가 150μl가 되게하고 4℃에서 24시간 보관한다. 이렇게 코팅처리된 플레이트는 4℃에서 10일간 보관이 가능하다.
2. 상기 플레이트를 사용시에는 코팅용액을 제거하고 블로킹버퍼 100μl(5% Carnation Instant Non-Fat Dry Milk, PBS에 희석)로 대치한다. 플레이트를 실온에서 흔들어주면서 30분동안 배양한다(23 - 25℃). 사용직전에 상기의 블로킹버퍼를 제거하고 TBST용액으로 4회 세척한다.
세포분주:
1. NIH3T3세포주 (Honegger, et al., Cell 51:199-209, 1987)를 본 발명의 에세이에 사용하였다.
2. 배양 디쉬에서 세포가 80-90% 자랐을때 실험을 시작한다. 트립신 처리를 하여 세포를 분리시키고 10% FBS처리를하여 트립신의 작용을 종결시킨다. 세포를 DMEM(10% CS DMEM)배지에 현탁시키고 1500rpm으로 실온에서 5분간 원심분리를 수행한다.
3. 세포를 분주배지(DMEM, 0.5% FBS)에 재현탁시키고 트리판 블루를 사용하여 세포수를 측정하되 90%이상의 세포가 살아있어야한다. DMEM배지(0.5% bovine serum)상에 있는 세포를 96웰 마이크로타이터 플레이트의 각 웰에 약10,000개씩 분주하였고, 웰의 총 부피가 100μl가 되게한 후, 5% CO2의 존재하에 37℃에서 40분간 배양한다.
에세이과정:
1. 역방향현미경을 사용하여 분주된 세포의 오염유무를 확인한다. 약물농축 액(10mg/ml, DMSO에 희석)을 DMEM배지에 10배로 희석되게 처리한 후, 이중 5μl를 TBST 웰에 옮겨 최종약물농도가 1/200희석되게 하였고 최종 DMSO농도는 1%가 되었다. 대조군으로는 약물처리하지않은 DMSO를 사용하였다. 5% CO2존재하에 37℃에서 2시간동안 배양하였다.
2. EGF-리간드의 준비: DMEM에 있는 EGF농축액중 10μl를 옮겨(1:12 희석), 최종농도가 25nM이 되게하였다.
3. 신선한 HNTG* 10ml을 준비하고 각웰에 100μl씩 적당하게 첨가한 후, 얼음에서 방치하였다.
HNTG* (10ml):
HNTG 농축액 2.0ml
증류수 7.3ml
EDTA, 100nM, pH 7.0 0.5ml
Na3VO4 (0.5 M) 0.1ml
Na4(P207) (0.2M) 0.1ml
4. 얼음에 방치한다.
5. 약물처리와 함께 2시간동안 반응시킨 후 각웰에 EGF 리간드 10μl를 처리하고 최종농도가 25nM이 되게하였다. 대조군으로는 DMSO를 사용하였다. 실온에서 5분간 흔들어주면서 배양하였다.
6. 시험하고자하는하려는 화합물, EGF 그리고 DMEM을 제거하고 PBS완충용액 으로 두번 씻어주었다. 각웰에 HNTG*를 100μl 첨가한 후 얼음에서 5분간 방치하였다. 그동안 다른 엘리자플레이트의 블로킹버퍼(blocking buffer)를 제거하고 상기와 같이 TBST완충용액으로 세척한다.
7. 마이크로파이페터에 꼭 맞는 파이펫팁을 사용하여 플레이트로보터 세포를 모아서 HNPG*분해용액을 첨가하고 제거하는 과정을 반복하면서 세포를 균질화하였다. 상기의 세포 분해물을 코팅처리되고, 블로킹 시킨 후 여러번 세척한 후 엘리자플레이트에 옮기고 실온에서 1시간동안 흔들어주면서 반응시켰다.
8. 분해물을 제거하고 TBST용액으로 4회 세척한 뒤, Ptry 항체에 대한 항체(1:3000 이 되도록 TBST용액으로 희석)를 희석하여 엘리자플레이트의 각 웰에 처리하여 최종 부피가 100μl가 되게하였다. 실온에서 30분간 반응시켰다.
9. Ptry 항체에 대한 항체를 제거하고 TBST용액으로 4회 세척한 후 각웰에 TAGO제품의 토끼 IgG 항체에 대한 항체를 희석하여 (1:3000배 희석)100μl씩 처리해주었다. 실온에서 30분간 흔들어주면서 반응시켰다.
10. TAGO제품의 검출 항체(detection antibody)를 제거하고 TBST용액으로 4회 세척하였다. 엘리자플레이트의 각 웰에 ABST/H2O2용액을 처리하여 실온에서 20분간 반응시켰다. (ABST/과산화수소 용액: 10ml ABST용액에 30% 과산화수소 1.0μl첨가)
11. 5N H2SO4 를 50μl처리하여 반응을 종결시키고, 410nm에서 Optical Density를 측정하였다.
12. 포스포타이로신 최대 신호(signal)값은 +대조군값에서 -대조군값을 뺀값 으로 정했다. 추출물이 포함된 웰에 대한 포스포타이로신 양의 억제도는 -대조군값을 뺀후에 %로 나타냈다.
Met 오토포스포릭레이션 (Autophosphorylation) 에세이
본 에세이는 Met수용체에 대한 Met 단백질 타이로신 인산화효소양을 측정하여 Met 타이로신 인산화효소 활성도를 측정하기 위한것이다.
재료및 시약:
1. HNTG (5X 농축액): 23.83g 헤페스과 43.83g NaCl을 350ml 물에 녹인다. HCl과 NaOH로 pH를 맞추고 글리세롤 500ml, 트리톤 X-100 10ml을 첨가하여 최종 부피가 1L가 되도록 물로 혼합한다. 1X용액 1L를 만들기 위해서 5X 농축액 200ml과 물 800ml을 혼합한다. 필요에 따라 pH를 맞추고 4℃에서 보관한다.
2. PBS (Dulbecco의 포스페이트-버퍼드-살린), 깁코 Cat. # 450-1300EB (1X 용액).
3. 블로킹 버퍼: 물 500ml에 BSA 100g, 12.1g 트리스-pH7.5, 58.44g NaCl, Tween-20 10ml을 녹이고 최종 1L가 되도록 물을 첨가.
4. 인산화효소 버퍼: 12.1g 트리스 (pH 7.2), NaCl 58.4g, MgCl2 40.7g, EGTA 1.g을 물 500ml에 녹이고 최종 부피가 1L가 되도록 물을 첨가하였다.
5. PMSF (페닐메틸술포닐 플루오라이드), 시그마 Cat. # P7626: 435.5mg을 100% 에탄올에 녹여 최종 부피가 25ml이 되도록하였다.
6. ATP (Bacterial Source), 시그마 Cat. # A-7699, -20℃에서 보관하고 사용시 3.31mg을 물 1ml에 녹인다.
7. 포스포타이로신 항체가 붙어있는 RC-20H HRPO, Transduction Laboratories Cat. # E120H.
8. Pierce 1-Step TM Turbo TMB-엘리자 (3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘, Pierce Cat. # 34022.
9. H2SO4, 농축액(18N) 1ml을 물 35ml에 혼합한다.
10. 트리스-HCl, 피셔 Cat. # BP152-5, 121.14g을 증류수 600ml에 녹이고 HCl을 사용하여 pH를 7.5 (또는 7.2)로 맞춘 후, 최종 부피가 1L가 되도록 증류수를 첨가한다.
11. NaCl, 피셔 Cat. # S337-500.
12. Tween-20, 피셔 Cat. # S337-500
m. Na3VO4, 피셔 Cat. # S454-50, 1.8mg을 증류수 80ml에 녹인 후 HCl 또는 NaOH를 사용하여 pH를 10.0으로 맞추고 가열한뒤 식힌다. pH가 10.0으로 안정화될때까지 위의 과정을 반복하고, 총 부피가 100ml이 되도록 증류수를 첨가해준다. 1ml씩 분주한 뒤 -80℃에서 보관한다.
13. MgCl2, 피셔 Cat. # M33-500, 1M용액으로 만든다.
14. 헤페스, 피셔 Cat. # BP310-500, 59.6g을 200ml 증류수에 녹인 후, pH를 7.5로 맞추고, 총 부피가 250ml이 되도록 하였다. 필터를 멸균한다.
15. Albumin, Bovine (BSA), 시그마 Cat. # A-4503, 30g을 멸균된 증류수에 녹이고 총 부피가 300ml이 되도록하고, 4℃에서 보관하였다.
16. TBST 버퍼: 900ml 증류수에 트리스 6.057g, NaCl 8.766g을 녹이고 최종 1L로 맞춘뒤, HCl로 pH가 7.2가 되도록하고 Trion X-100 1.0ml을 첨가하였다.
17. 정제된 래빗항체에 대한 고우트 항체 (전체 분자), Cappel Cat. # SC-161.
18. h-Met 항체 (C-280 rabbit polyclonal IgG antibody, Santa Cruz Chemical Cat. # SC-161.
19. EGFR/Met 유전자를 일시적으로 삽입시킨 카이메릭 세포 (EMR) (Komada, et al., Oncogene, 8:2381-2390, 1993).
20. 카르보닉엑시드 나트륨 버퍼, (Na2CO4, 피셔 Cat. # S495): 10.6g을 증류수 800ml에 녹이고 NaOH를 사용하여 pH를 맞춘다. 최종부피가 1L되도록 증류수를 첨가하고 4℃에서 보관한다.
실험과정:
특별히 지시하는바가 없으면 모든과정은 실온에서 수행한다. 엘리자플레이트는 TBST 용액으로 4회 반복하여 세척한다.
EMR 분해:
본 과정은 수용체를 회수하기 직전에 수행한다.
1. 세포분해물은 크리스탈 결정이 없어질까지 37℃ 중탕기에서 녹인다.
2. 1mM PMSF가 포함된 1X HNTG를 사용하여 세포를 분해한다.
15cm크기의 디쉬 각각에 HNTG 3ml을 처리하되 1/2 부피를 먼저 처리하고 1분간 잘 흔들어준 후, 나머지 양을 첨가하고 다시 1분간 흔들어준다.
3. 4℃, 10,000g에서 10분간 원심분리한다.
4. 상층액을 취하고, 소량을 단백질양 측정을 위해 분주해둔다.
5. 상기 상층액을 드라이아이스와 에탄올로 채워진 용기에 옮겨 동결시킨다.
이 과정은 다음 과정의 착수 여부에 상관없이 행하여진다.
6. BCA 방법을 이용하여 단백질 양을 측정한다 (BCA reagent kit은 Pierce Chemical 로부터 구입 Cat. #23225).
엘리자 과정:
1. 엘리자플레이트의 각 웰을 카르보네이트 버퍼에 녹아있는 래빗 항체에 대한 고우트 항체 5μg으로 코팅하고 총 부피가 50μl가 되게하여 4℃에서 24시간 방치하였다.
2. 각 웰의 표면에 붙지않은 상기항체는 플레이트내의 액체와 함께 제거하였다.
3. 각 웰에 블로킹 버퍼 150μl를 첨가하고 30분간 교반하면서 반응시켰다.
4. TBST용액으로 4회 세척하였다. 페이퍼 타월을 사용하여 여분의 물기를 제거하였다.
5. 각 웰에 Met 항체에 대한 래빗 항체 1μg을 처리하고 총 부피가 100μ가 되게하였다.
6. 분해물을 HNTG에 희석하였다 (90μg분해물/100μl).
7. 각웰에 상기의 희석된 분해물 100μl를 첨가하고 60분간 교반하였다.
8. TBST용액으로 4회 세척한 뒤 페이퍼 타월을 사용하여 여분의 물기를 제거하였다.
9. 각 웰에 1X 분해 버퍼 50μl를 처리하였다.
10. 1X 인산화효소 버퍼를 사용하여 96웰 폴리프로필렌 웰 플레이트에서 화합물과 추출물을 1:10으로 희석하였다.
11. 희석된 상기의 화합물 5.5μl를 엘리자플레이트의 각 웰에 옮겼다.
12. 각웰에 60μM ATP 5.5μl를 첨가해주고, 90분동안 교반하면서 반응시켰다.
13. TBST용액으로 4회 세척하였다. 페이퍼 타월을 사용하여 여분의 물기를 제거하였다.
14. RC20 100μl(블로킹 버퍼로 1:3000 희석)를 각웰에 처리하였다. 30분간 교반하면서 반응시켰다.
15. TBST용액으로 4회 세척하였다. 페이퍼 타월을 사용하여 여분의 물기를 제거하였다.
16. 각웰에 Turbo-TMB 100μl를 처리하고 30-60분간 교반하면서 반응시켰다.
17. Dynatech MR7000 엘리자 reader를 사용하여 에세이 결과를 읽었다.
시험하고자하는 필터 = 450nm, 참고 필터 = 410nm.
생화학적 src 에세이
본 에세이는 바이오티닐화된 펩타이드의 인산화를 측정하기위해 src 단백질 인산화효소 활성도를 결정하는 방법이다.
재료와 시약:
1. 이스트에 src유전자를 삽입하였다 (Sugen, Inc., Redwood City, California).
2. 세포 분해물: src를 발현하는 이스트 세포를 침전시키고 증류수로 1회 씻어주었다. 다시 침전시켜 -80℃에서 사용직전까지 보관하였다.
3. 공지된 기술을 사용하여 N-말단을 EEEYEEYEEEYEEEYEEEY로 바이오티닐화 하였다.
4. DMSO: 시그마, St. Louis, MO.
5. 96웰 엘리자플레이트: 코닝 96 Well Essay Wash, 변형된 플랫 바텀 플레이트, 코닝 Cat. # 25805-96.
6. 화합물 희석용으로는 눈크제품의 96웰 V-바텀 폴리프로필렌 플레이트 : Applied Scientific Cat. # A-72092.
7. Vecastain ELITE ABC 시약: Vector, Burlingame, CA.
8. src (327) 단일클론항체에대한 항체: 시조사카로마이세스 폼브(Schizosaccharomyces Pombe) 가 재조합 Src를 발현하는데 사용되었다 (Superti-Furga, et al., EMBO J., 12:2625-2634, Superti-Furga, et al., Nature Biochem., 14:600-605). S. Pomb족인 SP200 (h-s leul.32 ura4 ade210)를 상기 방법과 같이 배양하고, 형질전환에는 pRSP 발현 플라스미드를 사용하고, 리튬아세테이트 방법을 이용하였다(Superti-Furga, supra). 세포 배양시 nmtl 프로모터로부터의 발현을 억제하기 위하여 1μM의 티아민을 배지에 첨가하고, 발현을 유도하기 위해서는 티아민을 첨가한다.
9. 포스포타이로신에대한 단일클론항체, UBI 05-321 (UB40 으로 대체가능).
10. Turbo TMB-엘리자 페록시데이즈 기질: Pierce Chemical.
버퍼 용액:
1. PBS (Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline): 깁코 PBS, 깁코 Cat. # 450-1399eb.
2. 블로킹 버퍼: PBS용액으로 희석된 5% 저지방 밀크 (Carbation)
3. 카르보네이트 버퍼: Na2CO4, 피셔 Cat. # S495, 100mM 농축액 준비.
4. 인산화효소 버퍼:
MgCl2 (1M 농축액) 1.0ml
MnCl2 (1M 농축액) 0.2ml
DTT (1M 농축액) 0.2ml
헤페스 (1M 농축액) 5.0ml
TX-100 0.1ml
증류수로 총 부피 100ml로 만든다.
5. 분해 버퍼:
NaCl (5M 농축액) 2.74ml
글리세롤 10 ml
EDTA (100mM 농축액) 0.4ml
헤페스 (1M 농축액) 5.0ml
TX-100 1.0ml
PMSF (1M 농축액) 1.0ml
Na3VO4(0.1M농축액) 0.1ml
증류수로 총 부피 100ml로 만든다.
6. ATP: 시그마 Cat. # A-7699, 10mM 농축액준비 (5.51mg/ml)
7. 트리스-HCl: 피셔 Cat. # BP 152-5, 121.14g을 증류수 600ml에 녹이고 HCl로 pH 7.5로 맞춘뒤 증류수를 첨가하여 최종부피 1L가 되게한다.
8. NaCl: 피셔 Cat. # S271-10, 5M농축액 준비.
9. Na3VO4: 피셔 Cat. # S454-50, 1.8g을 증류수 80ml에 녹이고 HCl로 pH 10.0으로 맞춘다. 열을가하고 다시 식힌 후 pH를 다시 측정해본 후, 최종 부피 100ml로 맞춘다. 1ml씩 분주하여 -80℃에 보관한다.
10. MgCl2: 피셔 Cat. # M33-500, 1M농축액 준비.
11. 헤페스: 피셔 Cat. # BP 310-500, 59.6g을 증류수 200ml에 녹이고 HCl로 pH 7.5로 맞춘뒤 증류수를 첨가하여 최종부피 250ml이 되게한다. 멸균된 필터 사용(1M 농축액)
12. TBST 버퍼: 트리스 6.057g과 NaCl 8.766g을 증류수 900ml에 녹이고 HCl로 pH 7.2로 맞춘뒤, 트리톤 X-100 1.0ml을 첨가하고 증류수를 첨가하여 최종부피 1L가 되게한다.
13. MnCl2: 피셔 Cat. # M87-100, 1M농축액 준비.
14. DTT: 피셔 Cat. # BP172-5.
15. TBS (트리스 Buffered Saline): 트리스 6.057g 과 NaCl 8.766g을 증류수 900ml에 녹이고 증류수를 첨가하여 최종부피 1L가 되게한다
16. 인산화효소 반응 혼합물: 100웰 기준, 인산화효소 버퍼 1.0ml, GST-ζ 200μg, 증류수로 최종부피 8.0으로 만든다.
17. 바이오틴 표지된 EEEYEEEYEEEYEEEYEEEY: 사용직전 펩티드 농축액(1mM, 2.98 mg.ml) 준비.
18. Vectastain ELITE ABC 시약: 14ml용액을 만들기 위해, TBST 용액 15ml에 시약 A를 1방울 떨어뜨리고, 여러번 혼합해준다. 다시 시약 B를 1방울 첨가해준다. 튜브를 교반기를 사용하여 실온에서 30분간 혼합해준다.
실험과정:
src로 코팅된 엘리자 플레이트 준비.
1. 엘리자플레이트의 각웰을 pH 9.6 카르보닉엑시드 나트륨 100μl에 녹아있는 0.5μg src단일클론항체에 대한 항체로 코팅해주고 4℃에서 24시간 방치한다.
2. PBS용액으로 1회 씻어준다.
3. PBS용액에 녹인 5% 저자방 밀크용액 0.15ml을 플레이트에 처리하고 실온에서 30분간 방치해 블로킹시킨다.
4. PBS용액으로 5회 씻어준다.
5. 분해 용액으로 희석된 src고 형질전환된 이스트 분해물 10μg을 각 웰에 첨가한다 (각웰의 총부피는 100μl, 세포분해물의 양은 각 베취마다 다름). 실온에 서 20분간 교반시킨다.
포스포타이로신에대한 항체로 코팅시킨 엘리자플레이트 준비:
1. 4G10 플레이트: 100 μl PBS에 녹아있는 4G10 0.5μg으로 코팅한 뒤 4℃에서 24시간 방치한 후, PBS용액으로 희석시킨 5% 우유 150μl로 블로킹 시키고 실온에서 30분간 방치시킨다.
인산화효소 에세이 과정
1. 여분의 단백질은 제거하고 PBS용액으로 5회 세척한다.
2. 각 웰에 0.08ml 인산화효소 반응 혼합물을 첨가하고(10X 인산화효소 버퍼 10μl포함) 증류수로 희석된 바이오틴-EEEYEEEYEEEYEEEYEEEY 10μM을 처리해준다.
3. 10% DMSO 가 포함된 희석된 화합물 10μl를 첨가하고 실온에서 15분간 반응시킨다.
4. 각 웰에 0.05mM ATP 10μl를 첨가하여 인산화효소 반응을 시작시킨다 (최종농도 5μM ATP).
5. 엘리자 플레이트를 실온에서 15분간 교반한다.
6. 각 웰에 0.5M EDTA 10μl를 첨가하여 인산화효소 반응을 종결시킨다.
7. 상층액 90μl를 블로킹되고 4G10으로 코팅된 엘리자플레이트에 옮긴다.
8. 실온에서 30분간 교반하면서 반응시킨다.
9. TBST용액으로 5회 세척해준다.
10. Vectastain ELITE ABC 시약을 각 웰당 100μl 처리하고 실온에서 30분간 반응시킨다.
11. TBST용액으로 5회 세척해준다.
12. Turbo TMB로 현상시킨다.
생화학적 lck 에세이
본 에세이는 GST-ζ의 인산화를 측정하기위해 lck 단백질 인산화효소 활성도를 결정하는 방법이다.
재료와 시약:
1. 이스트에 lck유전자를 삽입하였다. 시조사카로마이세스 폼브(Schizosaccharomyces Pombe) 가 재조합 Src를 발현하는데 사용되었다 (Superti-Furga, et al., EMBO J., 12:2625-2634, Superti-Furga, et al., Nature Biotech., 14:600-605). S. Pomb족인 SP200 (h-s leul.32 ura4 ade210)를 상기 방법과 같이 배양하고, 형질전환에는 pRSP 발현 플라스미드를 사용하고, 리튬아세테이트 방법을 이용하였다(Superti-Furga, supra). 발현을 유도하기 위해서는 티아민을 첨가한다.
2. 세포 분해물: lck를 발현하는 이스트 세포를 침전시키고 증류수로 1회 세척해주고 다시 침전시켜 -80℃에서 사용직전까지 보관하였다.
3. GST-ζ: 박테리아세거 발현시키기 위한 GST-ζ 융합 단백질을 암호화는 디옥시리보뉴클레익엑시드(DNA)는 Arthur Weiss(Howard Hughes Medical Institute, California University, San Francisco)로부터 공급받았다. 형질전환된 박테리아는 25℃에서 교반하면서 배양하였다. GST-ζ단백질은 그루타타이온 친화 크로마토그래피 (Pharmacis, Almeda, CA)로 정제한다.
4. DMSO: 시그마, St. Louis, MO.
5. 96웰 엘리자플레이트: 코닝 96 Well Essay Wash, 변형된 플랫 바텀 플레이트, 코닝 Cat. # 25805-96.
6. 화합물 희석용으로는 눈크제품의 96웰 V-바텀 폴리프로필렌 플레이트 : Applied Scientific Cat. # A-72092.
7. 정제된 GST 항혈청에 대한 토끼 항체: Amrad Corporation (Australria) Cat. # 90001605.
8. Goat anti-Rabbi-IgG-HRP: Amersham Cat. # V010301.
9. Sheep anti-mouse IgG (H+L): Jackson Labs Cat. # 5215-005-003.
10. Anti-Lck (3A5) mab: Santa Cruz Biotechnology Cat. # sc-433.
11. 단일클론 anti-포스포타이로신 UBI 05-321 (UB40 으로 대체 가능).
버퍼용액:
1. PBS (Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline): 깁코 PBS, 깁코 Cat. # 450-1300EB.
2. 블로킹 버퍼: BSA 100g, 12.1g 트리스 pH7.5, 58.44g NaCl, Tween-20 10ml을 녹이고 최종 1L가 되도록 증류수를 첨가.
3. 카르보네이트 버퍼: Na2CO4, 피셔 Cat. # S495, 100mM 농축액 준비.
4. 인산화효소 버퍼:
MgCl2 (1M 농축액) 1.0ml
MnCl2 (1M 농축액) 0.2ml
DTT (1M 농축액) 0.2ml
헤페스 (1M 농축액) 5.0ml
TX-100 0.1ml
증류수로 총 부피 10ml로 만든다.
5. 분해 버퍼:
NaCl (5M 농축액) 2.74ml
글리세롤 10 ml
EDTA (100mM 농축액) 0.4ml
헤페스 (1M 농축액) 5.0ml
TX-100 1.0ml
PMSF (1M 농축액) 1.0ml
Na3VO4(0.1M농축액) 0.1ml
증류수로 총 부피 100ml로 만든다.
6. ATP: 시그마 Cat. # A-7699, 10mM 농축액준비 (5.51mg/ml)
7. 트리스-HCl: 피셔 Cat. # BP 152-5, 121.14g을 증류수 600ml에 녹이고 HCl로 pH 7.5로 맞춘뒤 증류수를 첨가하여 최종부피 1L가 되게한다.
8. NaCl: 피셔 Cat. # S271-10, 5M농축액 준비.
9. Na3VO4: 피셔 Cat. # S454-50, 1.8g을 증류수 80ml에 녹이고 HCl로 pH 10.0으로 맞춘다. 열을가하고 다시 식힌 후 pH를 다시 측정해본 후, 최종 부피 100ml로 맞춘다. 1ml씩 분주하여 -80℃에 보관한다.
10. MgCl2: 피셔 Cat. # M33-500, 1M농축액 준비.
11. 헤페스: 피셔 Cat. # BP 310-500, 59.6g을 증류수 200ml에 녹이고 HCl로 pH 7.5로 맞춘뒤 증류수를 첨가하여 최종부피 250ml이 되게한다. 멸균된 필터 사용(1M 농축액)
12. BSA: 시그마 Cat. # A4503, 30g을 증류수 150ml에 녹이고 총 부피 300ml로 맞춘다. 0.22μm 필터로 여과, 4℃에 보관.
13. TBST 버퍼: 트리스 6.057g과 NaCl 8.766g을 증류수 900ml에 녹이고 HCl로 pH 7.2로 맞춘뒤, 트리톤 X-100 1.0ml을 첨가하고 증류수를 첨가하여 최종부피 1L가 되게한다.
14. MnCl2: 피셔 Cat. # M87-100, 1M농축액 준비.
15. DTT: 피셔 Cat. # BP172-5.
16. TBS (트리스 Buffered Saline): 트리스 6.057g 과 NaCl 8.777g을 증류수 900ml에 녹이고 증류수를 첨가하여 최종부피 1L가 되게한다
17. 인산화효소 반응 혼합물: 100웰 기준: 인산화효소 버퍼 1.0ml, GST-ζ 200μg, 증류수로 최종부피 8.0으로 만든다.
실험과정:
Lck로 코팅된 엘리자플레이트 준비.
1. 엘리자플레이트의 각웰을 pH 9.6 카르보닉엑시드 나트륨 100μl에 녹아있는 2.0μg 쥐 IgG항체에 대한 양항체(Sheep anti-mouse IgG)로 코팅해주고 4℃에서 24시간 방치한다.
2. PBS용액으로 1회 씻어준다.
3. PBS용액에 녹인 5% 밀크용액 0.15ml을 플레이트에 처리하고 실온에서 30분간 방치해 블로킹시킨다.
4. PBS용액으로 5회 씻어준다.
5. PBS 0.1ml에 녹아있는 anti-lck (mab 3A5) 0.5μg 을 각 웰에 처리하고 실온에서 1-2시간동안 반응시킨다.
6. PBS용액으로 5회 씻어준다.
7. 분해 용액으로 희석된 lck고 형질전환된 이스트 분해물 20μg을 각 웰에 첨가한다 (각웰의 총부피는 100μl). 4℃에서 24시간 교반시킨다.
포스포타이로신에대한 항체로 코팅시킨 엘리자플레이트 준비.
1. UB40 플레이트: 100 μl PBS에 녹아있는 UB40 1.0μg으로 코팅한 뒤 4℃에서 24시간 방치한 후, 블로킹용액으로 1시간동안 블로킹시킨다.
인산화효소 에세이 과정.
1. 여분의 단백질은 제거하고 PBS용액으로 5회 세척한다.
2. 각 웰에 0.08ml 인산화효소 반응 혼합물을 첨가하고(10X 인산화효소 버퍼 10μl와 GST-ζ 2μg포함).
3. 10% DMSO 가 포함된 희석된 화합물 10μl를 첨가하고 실온에서 15분간 반 응시킨다.
4. 각 웰에 0.1mM ATP 10μl를 첨가하여 인산화효소 반응을 시작시킨다 (최종농도 10μM ATP).
5. 엘리자 플레이트를 실온에서 60분간 교반한다.
6. 각 웰에 0.5M EDTA 10μl를 첨가하여 인산화효소 반응을 종결시킨다.
7. 상층액 90μl를 블로킹되고 4G10으로 코팅된 엘리자플레이트에 옮긴다.
8. 실온에서 30분간 교반하면서 반응시킨다.
9. TBST용액으로 5회 세척해준다.
10. TBST용액 100μl에 희석된 (1:20,000) Rabbit anti-GST 항체를 처리하고 실온에서 30분간 반응시킨다.
11. TBST용액으로 5회 세척해준다.
12. TBST용액 100μl에 희석된 (1:20,000) Goat anti-Rabbit-IgG-HRP를 처리하고 실온에서 30분간 반응시킨다.
13. TBST용액으로 5회 세척해준다.
14. Turbo TMB로 현상시킨다.
RAF의 인산화 기능을 측정하기위한 에세이.
하기의 에세이결과는 RAF의 촉매에 의해 인산화 되는 MEK 단백질의 양뿐만아니라 MEK의 촉매대상이되는 MAPK양도 보여준다. RAF 유전자 서열은 공지되어있으며(Bonner et al., 1985, Molec.Cell.Biol., 5:1400-1407) 유전자 서열 기록은행에 기록되어있다. 본 발명에 사용된 핵산벡터의 구축과 세포주는 발표된 논문에 기록 되어있다(Morrison et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:8855-8859.
재료 및 시약:
1. Sf9 (Sposoptera frugiperda) 세포주, 깁코-BRL, Gaithersburg, MD.
2. 리파버퍼(RIPA buffer):
트리스/HCl pH 7.4 20mM
NaCl 137mM
글리세롤 10%
PMSF 1mM
아프로테닌 5mg/L
트리톤 X-100 0.5%
3. 타이오리독신(Thioredoxin)-MEK 융합 단백질(T-MEK): T-MEK단백질의 발현과 정제는 공지된 친화 크로마토그라피(affinity chromatography)방법을 이용하였다. Cat. # K350-01과 R 350-40, Invitrogen Corp., San Diego, CA.
4. His-MAPK (ERK 2), His가 인식되어있는 MAPK 단백질은 His-MAPK유전자가 삽입된 pUC18벡터로 형질전환된 XL1 Blue세포에서 발현시켰다. His-MAPK단백질은 Ni-친화 크로마토그라피 방법으로 정제하였다. Cat. # 27-4949-01, Pharmacia, Alameda, CA.
5. 마우스 항체에 대한 쉽 항체: Jackson laboratories, West Grove, PA. Cat. # 515-006-008, Lot# 28563.
6. RAF-1 단백질에 특이한 항체: UBI사의 URP2653.
7. 코팅 버퍼: PBS, 포스페이트 버퍼 살린, 깁코-BRL, Gaithersburg, MD.
8. 세척 용액: TBST (50mM 트리스-HCl pH 7.2, 150mM NaCl, 0.1% 트리톤 X-100).
9. 블로킹 버퍼: TBST, 0.1% 에탄올라민 pH 7.4
10. DMSO, 시그마, St. Louis, MO
11. 인산화효소 버퍼 (KB):
헤페스/HCl pH 7.2 20mM
NaCl 150mM
트리톤 X-100 0.1%
PMSF 1mM
아프로테닌 5mg/mL
올소바나데이트 나트륨 75mM
DTT 0.5mM
MgCl2 10mM
12. ATP혼합물:
MgCl2 100mM
ATP 300mM
γ33P ATP (Dupont-NEN) 10mCi/mL
13. 종결 용액: 1% 포스포릭산, 피셔, Pittsburgh, PA.
14. 왈락 셀룰로즈 포스페이트 필터 매트, 왈락, Turku, Finnland.
15. 필터 세척 용액: 1% 포스포릭산, Fisher, Pittsburgh, PA.
16. Tomtec 플레이트 수확기, 왈락, Turku, Finnland.
17. 왈락 베타 플레이트 리더 # 1205, 왈락, Turku, Filland.
18. 눈크 96-웰 V 바텀 폴리프로필렌 플레으트, Applied Scientific Act. # AS-72092.
실험과정:
특별한 사항이 없는한 모든 단계는 실온에서 행한다.
1. 엘리자 플레이트 코팅: 각웰에 정제된 마우스 항혈청에 대한 쉽 항체(1mg/100mL 코팅버퍼)를 처리하고 4℃에서 24시간 반응시킨다. 이렇게 처리된 플레이트는 4℃에서 2주간 보관이 가능하다.
2. 여분의 물기를 제거한다. 블로킹 용액 100mL을 첨가하고 30분간 반응시킨다.
3. 블로킹 용액을 제거하고 세척용액으로 4회 세척한다. 페이퍼 타월을 사용하여 여분의 물기를 제거한다.
4, 각 웰에 RAF-1에 특이한 항체 1mg을 처리하고 1시간 동안 반응시킨다. 3번과정과 같이 세척한다.
5. RAS/RAF가 삽입된 Sf9세포로부터 생긴 분해물을 녹인 후, TBST용액(10mg/ml)에 희석한다. 이렇게 희석된 분해물 10mg을 각 웰에 첨가하고 1시간동안 교반하면서반응시킨다. 분해물을 첨가하지 않은 웰을 - 대조군(negative control)로 사용한다. 제조합된 바큘로바이러스 5 MOI 처리후, RAS.RAF가 삽입된 세포를 준비하고 48시간 후 수확한다. PBS용액으로 1회 세척한뒤, RIPA버퍼로 세포를 용해시킨다. 불용성 물질은 원심분리(10,000g에서 5분)하여 제거한다. 용해물을 분주하여 드라이아이스/에탄올로 동결시키고 -80℃에서 사용직전까지 보관한다.
6. 플레으트의 바닥에 붇지않은 물질은 제거하고 상기 3번과정과 같이 세척한다.
7. 각 웰에 T-MEK 2mg과 His-MAEPK 2mg을 첨가하고 총 부피는 인산화효소 버퍼를 사용하여 40ml로 맞췄다. 세포 추출물로부터 T-MEK와 MAPK를 정제하는 과정은 번 발명의 실시예에 나와있는 방법을 사용한다.
8. 1% DMSO와 TBST용액으로 희석한 화합물(농축액 10mg/ml DMSO) 또는 추출물. 각웰에 희석된 화합물/추출물 5ml을 첨가하고 20분간 반응시킨다. 약물처리하지 않은 웰을 대조군로 사용한다.
9. ATP 5ml을 처리하여 인산화효소 반응을 시작시키고 엘리자플레이투 쉐이커상에서 흔들어 주면서 반응시킨다.
10. 60분 후 종결 용액 30ml을 처리하여 반응을 종결시킨다.
11. 포스포셀룰로즈 매트와 엘리자플레이트를 Tomtec 플레이트 수확기 장치한다. 수확한 후 제품사용방법에 따라 필터 세척용액으로 필터를 세척한다. 필터 매트를 건조시킨다. 필터매트를 봉한 후 홀더에 장착한다. 홀더를 방사선 검출 장치에 넣고 필터 매트의 인산 방사능을 검출한다.
선택적으로, 에세이 플레이트의 각 웰에서 40ml을 분주하여 플레이트에 대응하는 포스포셀룰로즈 필터 매트의 각 위치에 옮긴다. 필터를 건조시킨 후, 필터를 트레이에 넣는다. 트레이를 가볍게 흔들어주면서 15분간격으로 1시간 동안 세척액을 갈아준다. 필터 매트를 건조시킨다. 필터매트를 봉하고 시료에 있는 인산 방사능을 측정하기에 적합한 홀더에 장착한다. 홀더를 갖지 장치에 넣고 필터 매트의 방사능을 측정한다.
CDK2/Cyclin A-억제 에세이
본 에세이는 외인성 기질에 존재하는 CDK2의 단백질 인산화효소 활성도를 분석하는 방법이다.
재료 및 시약:
1. 버퍼 A: (트리스 80mM pH 7.2, MgCl2 40mM), 4.84 g. 트리스 (F.W. = 121.1g/mol), 4.07 g. MgCl2 (F.W. = 203.31 g/mol)을 증류수 500ml에 녹인다. HCl을 사용하여 pH 7.2로 맞춘다.
2. Histon H1 용액 (Histon H1 0.45mg/ml 과 헤페스 20mM pH 7.2): 20mM 헤페스, pH 7.2(477mg 헤페스 F.W. = 238.3g/mol) 11.111ml에 녹아있는 Histon H1 (Boehinger Mannheim) 5mg을 증류수 100ml에 녹이고 1ml을 분주하여 -80℃에 보관한다.
3. ATP 용액(ATP 60μM, BSA 300μg/ml, DTT 3mM): 10mM ATP 120μl, 10mg/ml BSA 600μl를 총 부피 20ml로 만든 후 1ml씩 분주하여 -80℃에 보관한다.
4. CDK2 용액: 10mM 헤페스 pH 7.2, 25mM NaCl, 0.5mM DTT에 있는 cdk2/cyclin A, 9μl씩 분주하여 -80℃에 보관한다.
실험과정:
1. 원하는 농도의 세배가 되도록 억제용액을 준비하고 DMSO가 15%되게한다.
2. 96웰 폴리프로필렌 플레이트의 웰에 억제제 20μl씩 분배한다. (-,+ 대조군로는 15% DMSO 20μl사용)
3. Histone H1 용액(1ml/플레이트), ATP용액 (1ml/플레이트,- 대조군용), CDK2 용액 (9μl/플레이트)를 녹인다. CDK는 사용직전까지 얼음에 방치한다. 분주한 CDK2용액은 사용시마다 얼리고 녹이는 과정의 반복을 피한다.
4. 9μl CDK2용액을 버퍼 A 2.1ml에 녹인다 (플레이트당). 혼합한 후 각웰에 20μl씩 분배한다.
5. 10ml 나사뚜껑 튜브에서 Histone H1 용액 1ml과 ATP용액 1ml을 혼합하고, γ33P ATP의 농도가 0.15μCi/20μl가 되도록한다 (0.15μCi/웰). 각웰에 BSA 20μl를 첨가하고 거품이 생기지 않도록 잘 혼합하여준다. 플레이트 세이커를 이용하여 플레이트를 흔들어준다. - 대조군로는 ATP 용액, 20mM 헤페스 pH 7.2를 동량 혼합하고 γ33P ATP의 농도가 0.15μCi/20μl되도록 첨가하고 이 용액 20μl 를 각 웰에 처리한다.
6. 60분동안 반응시킨다.
7. 각 웰에 10% TCA 35μl를 첨가한다. 플레이트를 흔들어준다.
8. 각 시료를 P30필터 매트에 40μl씩 스팟팅하고 매트를 10-20분동안 건조시킨다.
9. 1% 포스포릭엑시드 (10ml 포스포릭엑시드/증류수 1L) 250ml을 사용하여 매트를 10분씩 4회 반복하여 세척한다.
10. 베타 플레이트 리더를 이용하여 매트의 방사능 양을 측정한다.
생물학적 에세이
PDGF로 유도된 BrdU 삽입 에세이
재료 및 시약:
1. PDGF: 인간 PDGF B/B, 1276-956, Boehringer Mannheim, Germany.
2. BrdU 라벨링 시약: 10mM, PBS에 녹임 (pH 7.4), Cat. # 1 647 229, Boehringer Mannheim, Germany.
3. FixDenat: 고정 용액 (사용직전 준비), Cat. # 1 647 229, Boehringer Mannheim, Germany.
4. Anti-BrdU-POD: 페록시데이즈가 결합된 마우스 단일클론 항체, Ca. # 1 647 229, Boehringer Mannheim, Germany.
5. TMB 기질 용액: 테트라메틸벤지딘 (TMB) (사용직전 준비), Ca. # 1 647 229, Boehringer Mannheim, Germany.
6. PBS 세척 용액: 1X PBS pH 7.4 (Sugen, Inc., Redwood City, California).
7. 보바인 알부민 (BSA): 프랙션 V 파우더, A-8551, 시그마 Chemical Co., USA.
8. 인간 PDGF-R 단백질을 발현하도록 유전적으로 조작된 3T3세포주.
실험과정:
1. 세포를 10% CS, 2mM 글루타민이 포함된 DMEM배지에 희석하고 96웰 플레이트의 각 웰에 8000개씩 분주한다. 5% CO2존재하에 37℃에서 배양한다.
2. 24시간 후, 세포를 PBS용액으로 세척한 후, 시럼이 첨가되지 않은 배지(0% CS 와 0.1% BSA가 포함된 DMEM)로 갈아주고 24시간 배양한다.
3. 3일 후, 리간드(PDGF, 3.8nM, 0.1% BSA가 포함된 DMEM배지에 준비)와 시험하고자하는 화합물을 세포에 동시에 첨가하여준다. - 대조군웰에는 0.1% BSA와 시럼미첨가 배지의 혼합물을 사용하고, + 대조군로는 시험하고자하는 화합물이 첨가되지 않은 리간드(PDGF)를 사용한다. 시험하고자하는 화합물은 리간드가 포함된 시럼미첨가 배지를 사용하여 96웰 플렝이트의 각 웰에 7번 순차적으로 희석한다.
4. 리간드 활성 20시간 후, 희석된 BdsU 라벨링 시약 (0.1% BSA가 포함된 DMEM배지에 1:100으로 희석)을 첨가하고 세포를 BrdU를 처리하여 1.5시간 배양한다 (최종 농도 = 10μM).
5. 라벨링 시약으로 반응시킨 후, 페이퍼 타월을 사용하여 여분의 배지를 제거한다. FisDenar용액을 각 웰당 50μl씩 첨가해주고 플레이트를 실온에서 45분간 플레이트 쉐이커를 사용하여 반응시킨다.
6. 페이퍼 타월을 사용하여 여분의 FixDenat용액을 제거한다. PBS에 녹아있느 5% 밀크용액을 각 웰에 200μl씩 첨가하여 블로킹시킨다. 플레이트를 플레이트 쉐이커를 이용하여 실온에서 30분간 반응시킨다.
7. 블로킹 용액을 제거하고 각 웰을 PBS용액으로 세척한다. Anti-BrdU-POD용액(1% BSA가 첨가된 PBS로 1:100희석)를 각웰에 100μl씩 첨가해주고 플레이트 쉐이커를 이용하여 실온에서 90분간 반응시킨다.
8. 반응에 참여하지 않은 항체를 제거하고 PBS를 사용하여 각웰을 5회 세척한뒤 페이퍼 타월을 사용하여 여분의 물기를 제거한다.
9. TMB 기질 용액을 각웰당 100μl씩 첨가해주고 발색이 충분히 되어 측정할 수 있을때까지 실온에서 20분간 반응시킨다.
10. Dynatech 엘리자 플레이트 리더를 사용하여 410nm에서 시료의 흡광도를 측정한다(참조 파장은 490nm으로 한 "이중파장" 모드).
EFG로 유도된 BrdU 삽입 에세이
재료 및 시약:
1. EGF: 마우스 EGF, 201, Toyobo, Co., Ltd. Japan.
2. BrdU 라벨링 시약: 10mM, PBS에 녹임 (pH 7.4), Cat. # 1 647 229, Boehringer Mannheim, Germany.
3. FixDenat: 고정 용액 (사용직전 준비), Cat. # 1 647 229, Boehringer Mannheim, Germany.
4. Anti-BrdU-POD: 페록시데이즈가 결합된 마우스 단일클론 항체, Ca. # 1 647 229, Boehringer Mannheim, Germany.
5. TMB 기질 용액: 테트라메틸벤지딘 (TMB) (사용직전 준비), Ca. # 1 647 229, Boehringer Mannheim, Germany.
6. PBS 세척 용액: 1X PBS pH 7.4 (Sugen, Inc., Redwood City, California).
7. 보바인 알부민 (BSA): 프랙션 V 파우더, A-8551, 시그마 Chemical Co., USA.
8. 인간 EGF-R 단백질을 발현하도록 유전적으로 조작된 3T3세포주.
실험과정:
1. 세포를 10% CS, 2mM 글루타민이 포함된 DMEM배지에 희석하고 96웰 플레이트의 각 웰에 8000개씩 분주한다. 5% CO2존재하에 37℃에서 배양한다.
2. 24시간 후, 세포를 PBS용액으로 세척한 후, 시럼이 첨가되지 않은 배지(0% CS 와 0.1% BSA가 포함된 DMEM)로 갈아주고 24시간 배양한다.
3. 3일 후, 리간드(EGF, 2nM, 0.1% BSA가 포함된 DMEM배지에 준비)와 시험하고자하는 화합물을 세포에 동시에 첨가하여준다. - 대조군웰에는 0.1% BSA와 시럼미첨가 배지의 혼합물을 사용하고, + 대조군로는 시험하고자하는 화합물이 첨가되지 않은 리간드(EGF)를 사용한다. 시험하고자하는 화합물은 리간드가 포함된 시럼미첨가 배지를 사용하여 96웰 플렝이트의 각 웰에 7번 순차적으로 희석한다.
4. 리간드 활성 20시간 후, 희석된 BdsU 라벨링 시약 (0.1% BSA가 포함된 DMEM배지에 1:100으로 희석)을 첨가하고 세포를 BrdU를 처리하여 1.5시간 배양한다 (최종 농도 = 10μM).
5. 라벨링 시약으로 반응시킨 후, 페이퍼 타월을 사용하여 여분의 배지를 제거한다. FisDenar용액을 각 웰당 50μl씩 첨가해주고 플레이트를 실온에서 45분간 플레이트 쉐이커를 사용하여 반응시킨다.
6. 페이퍼 타월을 사용하여 여분의 FixDenat용액을 제거한다. PBS에 녹아있느 5% 밀크용액을 각 웰에 200μl씩 첨가하여 블로킹시킨다. 플레이트를 플레이트 쉐이커를 이용하여 실온에서 30분간 반응시킨다.
7. 블로킹 용액을 제거하고 각 웰을 PBS용액으로 세척한다. Anti-BrdU-POD용액(1% BSA가 첨가된 PBS로 1:100희석)를 각웰에 100μl씩 첨가해주고 플레이트 쉐이커를 이용하여 실온에서 90분간 반응시킨다.
8. 반응에 참여하지 않은 항체를 제거하고 PBS를 사용하여 각웰을 5회 세척한뒤 페이퍼 타월을 사용하여 여분의 물기를 제거한다.
9. TMB 기질 용액을 각웰당 100μl씩 첨가해주고 발색이 충분히 되어 측정할 수 있을때까지 실온에서 20분간 반응시킨다.
10. Dynatech 엘리자 플레이트 리더를 사용하여 410nm에서 시료의 흡광도를 측정한다(참조 파장은 490nm으로 한 "이중파장" 모드).
EGF로 유도되고 Her2에 의해 운영되는 BrdU 삽입 에세이
재료 및 시약:
1. EGF: 마우스 EGF 201, Toyobo, Co., Ltd. Japan.
2. BrdU 라벨링 시약: 10mM, PBS에 녹임 (pH 7.4), Cat. # 1 647 229, Boehringer Mannheim, Germany.
3. FixDenat: 고정 용액 (사용직전 준비), Cat. # 1 647 229, Boehringer Mannheim, Germany.
4. Anti-BrdU-POD: 페록시데이즈가 결합된 마우스 단일클론 항체, Ca. # 1 647 229, Boehringer Mannheim, Germany.
5. TMB 기질 용액: 테트라메틸벤지딘 (TMB) (사용직전 준비), Ca. # 1 647 229, Boehringer Mannheim, Germany.
6. PBS 세척 용액: 1X PBS pH 7.4 (Sugen, Inc., Redwood City, California).
7. 보바인 알부민 (BSA): 프랙션 V 파우더, A-8551, 시그마 Chemical Co., USA.
8. EGF-R의 세포밖 도메인과 Her2의 세포안 도메인을 함유하는 카이메릭 수용체를 발현하도록 유전적으로 조작된 3T3세포주.
실험과정:
1. 세포를 10% CS, 2mM 글루타민이 포함된 DMEM배지에 희석하고 96웰 플레이트의 각 웰에 8000개씩 분주한다. 5% CO2존재하에 37℃에서 배양한다.
2. 24시간 후, 세포를 PBS용액으로 세척한 후, 시럼이 첨가되지 않은 배지(0% CS 와 0.1% BSA가 포함된 DMEM)로 갈아주고 24시간 배양한다.
3. 3일 후, 리간드(EGF = 2nM, 0.1% BSA가 포함된 DMEM배지에 준비)와 시험하고자하는 화합물을 세포에 동시에 첨가하여준다. - 대조군웰에는 0.1% BSA와 시럼미첨가 배지의 혼합물을 사용하고, + 대조군로는 시험하고자하는 화합물이 첨가되지 않은 리간드(PDGF)를 사용한다. 시험하고자하는 화합물은 리간드가 포함된 시럼미첨가 배지를 사용하여 96웰 플레이트의 각 웰에 7번 순차적으로 희석한다.
4. 리간드 활성 20시간 후, 희석된 BdsU 라벨링 시약 (0.1% BSA가 포함된 DMEM배지에 1:100으로 희석)을 첨가하고 세포를 BrdU를 처리하여 1.5시간 배양한다 (최종 농도 = 10μM).
5. 라벨링 시약으로 반응시킨 후, 페이퍼 타월을 사용하여 여분의 배지를 제거한다. FisDenat용액을 각 웰당 50μl씩 첨가해주고 플레이트를 실온에서 45분간 플레이트 쉐이커를 사용하여 반응시킨다.
6. 페이퍼 타월을 사용하여 여분의 FixDenat용액을 제거한다. PBS에 녹아있느 5% 우유를 각 웰에 200μl씩 첨가하여 블로킹시킨다. 플레이트를 플레이트 쉐이커를 이용하여 실온에서 30분간 반응시킨다.
7. 블로킹 용액을 제거하고 각 웰을 PBS용액으로 세척한다. Anti-BrdU-POD용액(1% BSA가 첨가된 PBS로 1:100희석)를 각웰에 100μl씩 첨가해주고 플레이트 쉐이커를 이용하여 실온에서 90분간 반응시킨다.
8. 반응에 참여하지 않은 항체를 제거하고 PBS를 사용하여 각웰을 5회 세척한뒤 페이퍼 타월을 사용하여 여분의 물기를 제거한다.
9. TMB 기질 용액을 각웰당 100μl씩 첨가해주고 발색이 충분히 되어 측정할 수 있을때까지 실온에서 20분간 반응시킨다.
10. Dynatech 엘리자 플레이트 리더를 사용하여 410nm에서 시료의 흡광도를 측정한다(참조 파장은 490nm으로 한 "이중파장" 모드).
IGF1로 유도된 BrdU 삽입 에세이
재료 및 시약:
1. IFG1 리간드: 재조합된 인간 IFG1 리간드, G511, Promega Corp., USA.
2. BrdU 라벨링 시약: 10mM, PBS에 녹임 (pH 7.4), Cat. # 1 647 229, Boehringer Mannheim, Germany.
3. FixDenat: 고정 용액 (사용직전 준비), Cat. # 1 647 229, Boehringer Mannheim, Germany.
4. Anti-BrdU-POD: 페록시데이즈가 결합된 마우스 단일클론 항체, Ca. # 1 647 229, Boehringer Mannheim, Germany.
5. TMB 기질 용액: 테트라메틸벤지딘 (TMB) (사용직전 준비), Ca. # 1 647 229, Boehringer Mannheim, Germany.
6. PBS 세척 용액: 1X PBS pH 7.4 (Sugen, Inc., Redwood City, California).
7. 보바인 알부민 (BSA): 프랙션 V 파우더, A-8551, 시그마 Chemical Co., USA.
8. 인간 IGF-1 수용체 단백질을 발현하도록 유전적으로 조작된 3T3세포주.
실험과정:
1. 세포를 10% CS, 2mM 글루타민이 포함된 DMEM배지에 희석하고 96웰 플레이트의 각 웰에 8000개씩 분주한다. 5% CO2존재하에 37℃에서 배양한다.
2. 24시간 후, 세포를 PBS용액으로 세척한 후, 시럼이 첨가되지 않은 배지(0% CS 와 0.1% BSA가 포함된 DMEM)로 갈아주고 24시간 배양한다.
3. 3일 후, 리간드(IGF1 = 3.3nM, 0.1% BSA가 포함된 DMEM배지에 준비)와 시험하고자하는 화합물을 세포에 동시에 첨가하여준다. - 대조군웰에는 0.1% BSA와 시럼미첨가 배지의 혼합물을 사용하고, + 대조군로는 시험하고자하는 화합물이 첨가되지 않은 리간드(IFG1)를 사용한다. 시험하고자하는 화합물은 리간드가 포함된 시럼미첨가 배지를 사용하여 96웰 플렝이트의 각 웰에 7번 순차적으로 희석한다.
4. 리간드 활성 16시간 후, 희석된 BdsU 라벨링 시약 (0.1% BSA가 포함된 DMEM배지에 1:100으로 희석)을 첨가하고 세포를 BrdU를 처리하여 1.5시간 배양한다 (최종 농도 = 10μM).
5. 라벨링 시약으로 반응시킨 후, 페이퍼 타월을 사용하여 여분의 배지를 제거한다. FisDenar용액을 각 웰당 50μl씩 첨가해주고 플레이트를 실온에서 45분간 플레이트 쉐이커를 사용하여 반응시킨다.
6. 페이퍼 타월을 사용하여 여분의 FixDenat용액을 제거한다. PBS에 녹아있느 5% 밀크용액을 각 웰에 200μl씩 첨가하여 블로킹시킨다. 플레이트를 플레이트 쉐이커를 이용하여 실온에서 30분간 반응시킨다.
7. 블로킹 용액을 제거하고 각 웰을 PBS용액으로 세척한다. Anti-BrdU-POD용액(1% BSA가 첨가된 PBS로 1:100희석)를 각웰에 100μl씩 첨가해주고 플레이트 쉐이커를 이용하여 실온에서 90분간 반응시킨다.
8. 반응에 참여하지 않은 항체를 제거하고 PBS를 사용하여 각웰을 5회 세척한뒤 페이퍼 타월을 사용하여 여분의 물기를 제거한다.
9. TMB 기질 용액을 각웰당 100μl씩 첨가해주고 발색이 충분히 되어 측정할 수 있을때까지 실온에서 20분간 반응시킨다.
10. Dynatech 엘리자 플레이트 리더를 사용하여 410nm에서 시료의 흡광도를 측정한다(참조 파장은 490nm으로 한 "이중파장" 모드).
FGF1로 유도된 BrdU 삽입 에세이
본 에세이는 내인성 FGF 수용체를 발현하는 3Tc7/EGFr세포에서의 FGF로 유도되는 DNA합성을 측정하기 위한것이다.
재료 및 시약:
1. FGF: 인간 FGF2/bFGF (깁코 BRL, Cat. # 13256-029).
2. BrdU 라벨링 시약: 10mM, PBS에 녹임 (pH 7.4), Cat. # 1 647 229, Boehringer Mannheim, Germany.
3. FixDenat: 고정 용액 (사용직전 준비), Cat. # 1 647 229, Boehringer Mannheim, Germany.
4. Anti-BrdU-POD: 페록시데이즈가 결합된 마우스 단일클론 항체, Ca. # 1 647 229, Boehringer Mannheim, Germany.
5. TMB 기질 용액: 테트라메틸벤지딘 (TMB) (사용직전 준비), Ca. # 1 647 229, Boehringer Mannheim, Germany.
6. PBS 세척 용액: 1X PBS pH 7.4 (Sugen, Inc., Redwood City, California).
7. 보바인 알부민 (BSA): 프랙션 V 파우더, A-8551, 시그마 Chemical Co., USA.
8. 인간 IGF-1 수용체 단백질을 발현하도록 유전적으로 조작된 3T3세포주.
실험과정:
1. 세포를 10% CS, 2mM 글루타민이 포함된 DMEM배지에 희석하고 96웰 플레이트의 각 웰에 8000개씩 분주한다. 5% CO2존재하에 37℃에서 배양한다.
2. 24시간 후, 세포를 PBS용액으로 세척한 후, 시럼이 첨가되지 않은 배지(0% CS 와 0.1% BSA가 포함된 DMEM)로 갈아주고 24시간 배양한다.
3. 3일 후, 리간드(FGF2 = 1.5nM, 0.1% BSA가 포함된 DMEM배지에 준비)와 시험하고자하는 화합물을 세포에 동시에 첨가하여준다. - 대조군웰에는 0.1% BSA와 시럼미첨가 배지의 혼합물을 사용하고, + 대조군로는 시험하고자하는 화합물이 첨가되지 않은 리간드(FGF2)를 사용한다. 시험하고자하는 화합물은 리간드가 포함된 시럼미첨가 배지를 사용하여 96웰 플렝이트의 각 웰에 7번 순차적으로 희석한다.
4. 리간드 활성 20시간 후, 희석된 BdsU 라벨링 시약 (0.1% BSA가 포함된 DMEM배지에 1:100으로 희석)을 첨가하고 세포를 BrdU를 처리하여 1.5시간 배양한다 (최종 농도 = 10μM).
5. 라벨링 시약으로 반응시킨 후, 페이퍼 타월을 사용하여 여분의 배지를 제거한다. 픽스덴트(FisDenat)용액을 각 웰당 50μl씩 첨가해주고 플레이트를 실온에서 45분간 플레이트 쉐이커를 사용하여 반응시킨다.
6. 페이퍼 타월을 사용하여 여분의 픽스덴트(FixDenat)용액을 제거한다. PBS에 녹아있느 5% 우유를 각 웰에 200μl씩 첨가하여 블로킹시킨다. 플레이트를 플레이트 쉐이커를 이용하여 실온에서 30분간 반응시킨다.
7. 블로킹 용액을 제거하고 각 웰을 PBS용액으로 세척한다. Anti-BrdU-POD용액(1% BSA가 첨가된 PBS로 1:100희석)를 각웰에 100μl씩 첨가해주고 플레이트 쉐이커를 이용하여 실온에서 90분간 반응시킨다.
8. 반응에 참여하지 않은 항체를 제거하고 PBS를 사용하여 각웰을 5회 세척한뒤 페이퍼 타월을 사용하여 여분의 물기를 제거한다.
9. TMB 기질 용액을 각웰당 100μl씩 첨가해주고 발색이 충분히 되어 측정할 수 있을때까지 실온에서 20분간 반응시킨다.
10. Dynatech 엘리자 플레이트 리더를 사용하여 410nm에서 시료의 흡광도를 측정한다(참조 파장은 490nm으로 한 "이중파장" 모드).
생화학적 EGFR 에세이
본 에세이는 엘리자 방법을 이용하여 EGFR의 인산화효소 활성도를 생체외실험(in vitro)상에서 측정하기 위한것이다.
재료 및 시약:
1. 코닝 제품의 96웰 엘리자플레이트 (코닝 Cat. # 25805-96).
2. 수모1 EGFR항체에 대한 단일클론 항체 (Biochemistry Lab., SUGEN, Ins.).
3. PBS (Dulbecco's Phosphate-Buffered-Saline, 깁코 Cat. # 450-1300EB).
4. TBST 버퍼:
시약 M.W. 사용농도 리터당 양
트리스 121.14 50mM 6.057 g
NaCl 58.44 150mM 8.766 g
트리톤 X-100 0.1% 1.0ml
5. 블로킹 버퍼:
시약 M.W. 사용농도 리터당 양
카네이션 인스턴트 5% 5.0 g
우유분말
PBS 100ml
6. A431 세포 분해물 (Screening Lab, SUGEN, Inc.).
7. TBS 버퍼:
시약 M.W. 사용농도 리터당 양
트리스 121.14 50mM 6.057 g
NaCl 58.44 150mM 8.766 g
8. TBS + 10% DMSO
시약 M.W. 사용농도 리터당 양
트리스 121.14 50mM 6.057 g
NaCl 58.44 150mM 8.766 g
DMSO 10% 25ml
9. 아데노신-5'트리포스페이트 (말 근육으로부터 추출한 ATP, 시그마 Cat. # A-5394). 1.0mM농축액을 준비해두고 사용직전 만들며 얼음에 보관한다.
10. MnCl2: 1.0M 농축액으로 준비.
11. ATP/MnCl2 인산화 혼합물.
시약 농축액 10ml당 양 사용농도
ATP 1.0mM 300μl 30μM
MnCl2 1.0M 500μl 50mM
증류수 9.2ml
사용직전 만들며 얼음에 보관한다.
12. 눈크제품의 96웰 V 바텀 폴리프로필렌 플레이트 (Applied Scientific Cat. # AS-72092).
13. 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA).
사용농도는 200mM이며, 10N NaOH를 사용하여 pH 8.0으로 맞춘다.
14. 포스포티로신 항체에 대한 래빗 항체 (Biochemistry Lab., SUGEN, Inc.).
15. 래빗항체에 대한 고우트 항체, 페록시데이즈 접합 (Biosource Cat. # ALI0404).
16. ABTS (2,2'-아지노-비스)3-에틸벤즈티아졸린-6-술포닉산), 시그마 Cat. # A-1888).
시약 M.W. 사용농도 리터당 양
시트릭산 192.12 100mM 19.21 g
Na2HPO4 141.96 250mM 35.49 g
ABTS 0.5 mg/ml 500 mg
처음 두 물질을 900ml증류수에 녹인뒤, 포스포릭산으로 pH 4.0으로 맞춘다. ABTS를 첨가하고 뚜껑을 덮은뒤 30분간 방치하고 여과한다. 본 용액은 사용직전까지 4℃ 어두운곳에서 보관하여야 한다.
17. 과산화수소 30%용액 (피셔 Cat. # H325).
18. ABTS/과산화수소
ABTS 15ml과 과산화수소 2.0μl를 혼합한다. 사용전까지 5분간 둔다.
19. 0.2 M HCl
실험과정:
1. 엘리자 플레이트의 각 웰을 100μl PBS에 녹아있는 0.5μg 수모1를 처리하고 4℃에서 24시간 방치한다.
2. 붙지않은 여분의 수모1는 제거하고 증류수로 1회 세척한다. 페이퍼타월을 사용하여 여분의 물기를 제거한다.
3. 각 웰에 블로킹 버퍼 150μl씩을 첨가하고 실온에서 흔들어주면서 30분간 반응시킨다.
4. 증류수로 3회 세척한 후, TBST용액으로 1회 세척해준다. 페이퍼타월을 사용하여 여분의 물기와 공기방울을 제거한다.
5. 분해물을 PBS용액에 희석한다(7μg 분해물을 100μl PBS에 녹임).
6. 희석된 분해물을 각 웰에 100μl씩 첨가하고 실온에서 60분간 교반시킨다.
7. 4번과정과 같이 세척한다.
8. EGFR이 함유된 엘리자플레이트에 TBS 120μl를 첨가한다.
9. 96웰 폴리프로필렌 플레이트상에서 시험하고자하는 화합물을 TBS용액을 사용하여 1:10으로 희석한다 (10μl 화합물 + 90μl TBS).
10. 희석된 시험하고자하는 화합물 13.5μl를 엘리자플레이트에 첨가한다. 대조군웰(어떠한 시험하고자하는 화합물도 함유하지 않음)에는 TBS 13.5μl 와 10% DMSO를 첨가한다.
11. 실온에서 30분간 교반하면서 반응시킨다.
12. ATP/MnCl2가 처리되지 않은 -대조군을 제외한 나머지 웰에 인산화 혼합물 15μl 씩을 처리한다(각웰의 최종 부피는 150μl 이며 3μM ATP, 5mM MnCl2이다). 5분간 교반하면서 반응시킨다.
13. 5분 후, 200mM EDTA (pH 8.9) 16.5μl를 첨가하여 반응을 종결시며, EDTA가 첨가된 후에도 1분간 더 교반시킨다.
14. 증류수로 4회 세척한 후, TBST용액으로 1회 세척해준다.
15. 각웰에 포스포타이로신에 대한 항체 (TBST로 1:3000희석) 100μl를 첨가해주고, 실온에서 교반하면서 30-45분동안 반응시킨다.
16. 4번 과정과 같이 세척해준다.
17. Biosiurce제품의 Goat anti-rabbit IgG peroxidase conjugate (TBST로 1:2000GMLTJR) 를 각웰에 100μl씩 첨가한다. 실온에서 교반하면서 30분동안 반응 시킨다.
18. 4번 과정과 같이 세척해준다.
19. ABTS/과산화수소 용액을 100μl씩 첨가한다.
20. 교반하면서 5-10분간 반응시킨다. 공기방울을 제거해준다.
21. 종결반응이 필요하다면, 각웰에 0.2 M HCl 100μl씩 첨가한다.
22. Dynatech MR7000 엘리자 리더를 사용하여 결과를 측정한다. 시험하고자하는 필터: 410nM 참조 필터: 630 nM.
생화학적 PDGFR 에세이
본 에세이는 엘리자 방법을 이용하여 PDGFR의 인산화효소 활성도를 인비트로(in vitro)상에서 측정하기 위한것이다.
재료 및 시약:
특별한 지시사항이 없으면 하기 시약의 사용농도는 생화학적 EGFR 에세이와 같다.
1. 코닝 제품의 96웰 엘리자플레이트 (코닝 Cat. # 25805-96).
2. 28D4C10 PDGFR항체에 대한 단일클론 항체 (Biochemistry Lab., SUGEN, Inc.).
3. PBS (Dulbecco's Phosphate-Buffered-Saline, 깁코 Cat. # 450-1300EB).
4. TBST 버퍼
5. 블로킹 버퍼
6. PDGFR-β를 발현하는 NIH3T3 세포 분해물 (Screening Lab, SUGEN, Inc.).
7. TBS 버퍼
8. TBS + 10% DMSO
9. 아데노신-5'트리포스페이트 (말 근육으로부터 추출한 ATP, 시그마 Cat. # A-5394).
10. MnCl2: 1.0M 농축액으로 준비.
11. 인산화효소 버퍼 인산화 혼합물.
시약 농축액 10ml당 양 사용농도
트리스 1M 250μl 25mM
NaCl 5M 200μl 100mM
MnCl2 1M 100μl 10mM
TX-100 100mM 50μl 0.5mM
12. 눈크제품의 96웰 V 바텀 폴리프로필렌 플레이트 (Applied Scientific Cat. # AS-72092).
13. 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA).
14. 포스포티로신 항체에 대한 래빗 다클론항체 (Biochemistry Lab., SUGEN, Inc.).
15. 래빗 항체에 대한 고우트 항체 peroxidase conjugate (Biosource Cat. # ALI0404).
16. ABTS (2,2'-아지노-비스)3-에틸벤즈티아졸린-6-술포닉산), 시그마 Cat. # A-1888).
17. 과산화수소 30%용액 (피셔 Cat. # H325).
18. ABTS/과산화수소
19. 0.2 M HCl
실험과정:
1. 엘리자 플레이트의 각 웰을 100μl PBS에 녹아있는 0.5μg 28D4C10를 처리하고 4℃에서 24시간 방치한다.
2. 붙지않은 여분의 28D4C10는 제거하고 증류수로 1회 세척한다. 페이퍼타월을 사용하여 여분의 물기를 제거한다.
3. 각 웰에 블로킹 버퍼 150μl씩을 첨가하고 실온에서 흐들어주면서 30분간 반응시킨다.
4. 증류수로 3회 세척한 후, TBST용액으로 1회 세척해준다. 페이퍼타월을 사용하여 여분의 물기와 공기방울을 제거한다.
5. 분해물을 HNTG용액에 희석한다(10μg 분해물을 100μl HNTG에 녹임).
6. 희석된 분해물을 각 웰에 100μl씩 첨가하고 실온에서 60분간 교반시킨다.
7. 4번과정과 같이 세척한다.
8. PDGFR이 함유된 엘리자플레이트에 인산화효소 버퍼 80μl를 첨가한다.
9. 96웰 폴리프로필렌 플레이트상에서 시험하고자하는 화합물을 TBS용액을 사용하여 1:10으로 희석한다 (10μl 화합물 + 90μl TBS).
10. 희석된 시험하고자하는 화합물 13.5μl를 엘리자플레이트에 첨가한다. 대조군웰(어떠한 시험하고자하는 화합물도 함유하지 않음)에는 TBS 10μl 와 10% DMSO를 첨가한다.
11. 실온에서 30분간 교반하면서 반응시킨다.
12. -대조군을 제외한 나머지 웰에 인산화 혼합물 15μl 씩을 처리한다(각웰의 최종 부피는 100μl 이며 10μM ATP). 30분간 교반하면서 반응시킨다.
13. 30분 후, 200mM EDTA (pH 8.9) 10μl를 첨가하여 반응을 종결시킨다.
14. 증류수로 4회 세척한 후, TBST용액으로 2회 세척해준다.
15. 각웰에 포스포타이로신에 대한 항체 (TBST로 1:3000희석) 100μl를 첨가해주고, 실온에서 교반하면서 30-45분동안 반응시킨다.
16. 4번 과정과 같이 세척해준다.
17. Biosiurce제품의 래빗 항체에 대한 고우트 항체 peroxidase conjugate (TBST로 1:2000GMLTJR) 를 각웰에 100μl씩 첨가한다. 실온에서 교반하면서 30분동안 반응시킨다.
18. 4번 과정과 같이 세척해준다.
19. ABTS/과산화수소 용액을 100μl씩 첨가한다.
20. 교반하면서 10-30분간 반응시킨다. 공기방울을 제거해준다.
21. 종결반응이 필요하다면, 각웰에 0.2 M HCl 100μl씩 첨가한다.
22. Dynatech MR7000 엘리자 리더를 사용하여 결과를 측정한다. 시험하고자 하는 필터: 410nM 참조 필터: 630 nM.
생화학적 FGFR에세이
본 에세이는 엘리자 방법을 이용하여 Myc-GyrB-FGFR 융합 단백질의 인산화효소 활성도를 인비트로(in vitro)상에서 측정하기 위한것이다.
재료 및 시약:
1. HNTG
시약 분자량 5X 농축액 리터당 양 1X 사용농도
헤페스 238.3 100mM 23.83g 20mM
NaCl 58.44 750mM 43.83g 150mM
글리세롤 50% 500ml 10%
트리톤 X-100 5% 10ml 1.0%
5X 농축액 1l를 만들기 위해 헤페스와 NaCl을 증류수 350ml에 녹인 후, HCl과 NaOH로 pH 7.2로 맞춘다 (사용한 헤페스의 종류에 따라). 글리세롤과 트리톤 X-100을 첨가하고 증류수로 부피를 맞춘다.
2. PBS: Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, 깁코 Ct. # 450-1300EB).
3.블로킹버퍼.
4. 인산화효소 버퍼.
시약 분자량 10X 농축액 1X 사용농도
헤페스 (pH7.2) 238.3 500mM 50mM
MnCl2 20mM 2mM
MgCl2 203.32 200mM 10mM
DTT 380.35 5mM 0.5mM
트리톤 X-100 1% 0.1%
5. 페닐메틸술포닐 프루오라이드: PMSF, 시그마, Cat. # P-7626
사용농도: 에탄올에 100mM로 녹여 사용.
6. ATP: 박테리아 근원, 시그마 Cat. # A-7699
6mM 농축액을 만들기 위해 증류수 1ml당 3.31mg을 녹인다.
7. 바이오틴 접합 포그포타이로신 단일클론 항체에 대한 항체: 클론 4G10, Upstate Biotechnology Inc. Cat. No. 16-103, Seer. No. 14495
8. Vectastain Elite ABC 시약: 아비딘 페록시데이즈 접합, Vector Laboratories Cat. # PK-6 100.
9. ABTS 용액
10. 30% 과산화수소 용액: Fiacher Cat. # H325.
11. ABTS/과산화수소
12. 0.2M HCl
13. 트리스 HCl: 피셔 Cat. # BP 152-5
증류수로 희석한 1.0mM 용액을 만든 후 HCl을 사용하여 pH 7.2로 맞춘다.
14. NaCl: 피셔 Cat. # S271-10
증류수로 희석한 5M 용액 준비
15. MgCl2: 피셔 Cat. # M33-500
증류수로 희석한 1M 용액 준비
16. 헤페스: 피셔 Cat. # BP310-500
증류수로 희석한 1M용액을 만든 후 pH 7.5로 맞추고 여과한다.
17. TBST용액
18. 카르보네이트 나트륨 버퍼: 피셔 Cat. # S495
증류수로 희석한 1M용액을 준비한 후, NaOH로 pH 9.6을 맞춘뒤 여과한다.
19. 디타이오트레아톨(DTT): 피셔 Cat. # BP172-25
사용 직전 증류수로 0.5mM농도 용액으로 준비한다. 사용전까지 -20℃에 보관한다. 남은 용액은 버린다.
20. MnCl2
21. 트리톤 X-100
22. 래빗 항체에 대한 고우트 항체: Cappel
23. 정제된 래빗 α GST GyrB: Biochemistry Lab. SUGEN, Inc.
실험과정:
하기의 모든 과정은 특별한 사항이 없는한 실온에서 수행된다.
1. 엘리자 플레이트의 각 웰을 카르보네이트 버퍼에 녹인 래빗 항체에 대한 고우트 항체 2μg으로 처리하고 4℃에서 24시간 방치한다.
2. 붙지않은 여분의 래빗 항체에 대한 고우트 항체는 제거하고 증류수로 1회 세척한다. 페이퍼타월을 사용하여 여분의 물기와 공기방울을 제거한다.
3. 각 웰에 블로킹 버퍼 150μl씩을 첨가(PBS용액에 녹인 로펫밀크 5%)하고 실온에서 흐들어주면서 30분간 반응시킨다.
4. TBST용액으로 4회 세척한 후, 페이퍼타월을 사용하여 여분의 물기와 공기방울을 제거한다.
5. 각웰에 GyrB 항체에대한 래빗 항체 0.5μg 을 처리한다. PBS 100μl를 첨가하여 항체를 희석시킨다. 실온에서 1시간동안 흔들어주면서 반응시킨다.
6. TBST용액으로 4회 세척한다.
7. HTNG용액에 녹인 COS/FGFR 세포 분해물 (Myc-GyrB-FGFR 근원)2μg 을 첨가하여 최종 부피가 100μl되게한다. 1시간동안 흔들어주면서 반응시킨다.
8. TBST용액으로 4회 세척한다.
9. 각웰에 1X 인산화효소 버퍼 80μl를 첨가한다.
10. 시험하고자하는 화합물을 폴리프로필렌 96웰 플레이트상에서 1% DMSO와 1X 인산화효소 버퍼를 사용하여 10배 희석한다.
11. 희석한 화합물 10μl를 옮긴 후,
12. ATP/MnCl2가 처리되지 않은 -대조군을 제외한 나머지 웰에 인산화 혼합물 15μl 씩을 처리한다(각웰의 최종 부피는 150μl 이며 3μM ATP, 5mM MnCl2이다). 5분간 교반하면서 반응시킨다.
13. 5분 후, 200mM EDTA (pH 8.9) 16.5μl를 첨가하여 반응을 종결시며, EDTA가 첨가된 후에도 1분간 더 교반시킨다.
14. 증류수로 4회 세척한 후, TBST용액으로 1회 세척해준다.
15. 각웰에 바이오틴이 결합된 포스포타이로신에 대한 단일항체에 대한 항체 (b4G10) 100μl를 첨가해주고, 실온에서 교반하면서 30분동안 반응시킨다.
16. Vectastaine ABC 시약을 준비한다. TBST 15ml에 시약 A를 한방울 덜어뜨린다. 잘 혼합한 뒤 다시 시약 B를 한방울 떨어뜨리고 혼합한다.
17. 4번 과정과 같이 세척해준다.
18. 각웰에 ABC HRP시약 100μl을 첨가하고, 30분간 흔들어주면서 반응시킨다.
19. 4번 과정과 같이 세척해준다.
20. ABTS/과산화수소 용액을 100μl씩 첨가한다.
21. 교반하면서 5-10분간 반응시킨다. 공기방울을 제거해준다.
22. 종결반응이 필요하다면, 각웰에 0.2 M HCl 100μl씩 첨가한다.
23. Dynatech MR7000 엘리자 리더를 사용하여 결과를 측정한다. 시험하고자하는 필터: 410nM 참조 필터: 630 nM.
생화학적 FLK-1에세이
본 에세이는 인비트로상에서 엘리자를 사용하여 flk-1의 오토포스포릴레이션 작용을 측정하기 위한것이다.
재료 및 방법:
1. 15cm 조직 배양 플레이트
2. Flk-1/NIH 세포주: 인간 flk-1 클론 3을 과량발현하는 NIH 피브로블라스트 세포주 (SUGEN, Inc., MPI, Martinsried, Germany로부터 얻음).
3. 성장 배지: 10% 글루타민과 열불활성화시킨 10% FBS가 첨가된 DMSM배지 (깁코 BRL).
4. 비영양배지 (starvation meida): 10% 글루타민과 열불활성화시킨 0.5% FBS가 첨가된 DMSM배지 (깁코 BRL).
5. 코닝제품의 엘리자플레이트: 코닝 Cat. # 25805-96
6. flk-1에 특이한 L4또는 E38단일클론 항체, 단백질-A 아가로즈 친화 크로마토그래피에 의해 정제. (SUGEN, Inc.)
7. PBS: Dulbecco's phosphate-buffered saline): Gobco Cat. # 450-1300EB
8. HNTG
9. Pierce BCA 단백질 측정 키트
10. 블로킹 버퍼
11. TBST (pH 7.0)
12. 인산화효소 버퍼
13. 인산화효소 종결 용액: 200mM EDTA
14. 바이오틴기가 결합된 4G10, 포스포타이로신에 특이: UBI, Cat. # 16-103
15. AB 키트: Vector Laboratories Cat. # PK 4000
16. DMSO
17. 눈크제품의 96웰 V바닥형 폴리프로필렌 플레이트: Applied Scientific Cat. # AS-72092
18. Turbo-TMB: Pierce
19. Turbo-TMB 종결 용액: 1M H2SO4
20. ATP: 시그마 Cat. # A-7699
21. TBS용액에 녹아있는 20% DMSO (pH 7.0)
실험과정:
세포성장과 분해물 준비
1. 세포를 성장배지에 분주하고 세포가 90-100% 자랄때까지 37℃, 5%CO2 조건하에 2-3일 배양시킨다. 분주횟수가 20회를 넘지않도록한다.
2. 배지를 제거하고 PBS용액으로 2회 세척해준다. HNTG분해용액으로 세포를 분해한 후 세포 분해물을 얻어 20-30초동안 잘 혼합해 준다.
3. 불용해된 물질은 원심분리하여 제거한다 (5-10분, 10,000xg).
4. BCA키트를 사용하여 단백질 농도를 결정한다.
5. 분해물을 1mg씩 분주하여 -80℃에 보관한다.
실험과정:
1. 엘리자 플레이트의 각 웰을 100μl PBS에 녹아있는 2μg의 정제된 L4(또는 E38)를 처리하고 4℃에서 24시간 방치한다.
2. 붙지않은 여분의 단백질은 제거하고 증류수로 1회 세척한다. 페이퍼타월을 사용하여 여분의 물기를 제거한다.
3. 각 웰에 블로킹 버퍼 150μl씩을 첨가하고 4℃에서 흔들어주면서 45-60분간 반응시킨다.
4. 블로킹 버퍼를 제거하고 증류수로 3회 세척한 후, TBST용액으로 1회 세척해준다. 페이퍼타월을 사용하여 여분의 물기와 공기방울을 제거한다.
5. 분해물을 PBS용액에 희석한다(50μg 분해물을 100μl PBS에 녹임). 희석된 분해물을 각 웰에 100μl씩 첨가하고 4℃에서 24시간동안 교반시키며 반응시킨다.
6. 반응에 참여하지않은 단백질은 제거하고 4번과정과 같이 세척한다.
7. 각웰에 인산화효소 버퍼 80μl씩 첨가한다 (-대조군 웰에는 90μl).
8. TBS에 녹아있는 20%의 DMSO가 함유된 폴리프로필렌 플레이트상에서 시험하고자하는 화합물을 희석한다 (정상적으로 10배).
9. 희석된 시험하고자하는 화합물 10μl를 이모빌라이즈화된 flk-1이 함유된 엘리자플레이트에 첨가한다. 대조군웰에는 어떠한 시험하고자하는 화합물도 함유하지 않는다.
10. 1mM ATP농축액을 희석하여 0.3mM ATP용액을 준비한다 (인산화효소버퍼로 희석).
11. -대조군을 제외한 나머지 웰에 0.3mM ATP용액 10μl 씩을 처리한다. 실온에서 60분간 교반하면서 반응시킨다.
12. 60분 후, 200mM EDTA (pH 8.9) 11μl를 첨가하여 인산화효소반응을 종결시킨다. 1-2분간 흔들어준다.
13. 증류수로 4회 세척한 후, TBST용액으로 2회 세척해준다.
14. 각웰에 바이오티닐기가 결합된 4G10을 5000배로 희석하여 100μl를 첨가해주고, 실온에서 교반하면서 45분동안 반응시킨다.
15. 반응시키는 동안 TBST용액 10ml에 ABC 키트의 용액 A, B각각 50μl씩을 첨가한다. 본 용액은 사용 30분전에 혼합한다.
16. 4번 과정과 같이 세척해준다.
17. 모든 웰에 A & B 혼합용액 100μl를 첨가해준다.
18. 4번 과정과 같이 세척해준다.
19. Turbo-TMB 100μl를 첨가해준다. 실온에서 교반하면서 10-15분동안 반응시킨다.
20. +대조군웰의 색이 흡광도 약 0.35-0.4에 도달할때, Turbo-TMB 종결용액 100μl를 처리하여 반응을 종결시킨다.
22. Dynatech MR7000 엘리자 리더를 사용하여 결과를 측정한다. 시험하고자하는 필터: 450nM 참조 필터: 410 nM.
HUV-EC-C 에세이
다음의 방법은 PDGF-R, FGF-R, VEFG, aFGF 또는 Flk-1/KDR에 대한 화합물의 활성도를 측정하기 위한 것이며, 모두 HUV-EC-C세포에 의해 자연적으로 발현된다.
0일:
1. HUV-EC-C(인간 탯줄 내피 세포, ATCC, Cat. # 1730 CRL)세포를 트립신 처리하고 세척한다. PBS버퍼(깁코 BRL. Cat. # 14190-029)로 2회 세척한다. 0.05% 트립신-EDTA(시그마 Cat. # C-1544)으로 세포를 탈착시킨다. 0,05% 트립신은 0.25% 트립신과 1mM EDTA(깁코 BRL. Cat. # 25200-049)를 혼합하여 사용한다. 트립신 반응은 트립신 1ml을 처리하고 37℃에서 5분간 반응하여 수행된다. 세포를 조직배양 플라스크로부터 떼어낸 후, 에세이 배지 동량을 첨가하고 50ml 멸균된 원심분리 튜브에 옮긴다(피셔 Scientific, Cat. # 05-539-6).
2. 50ml 멸균된 원심분리 튜브에 35ml 에세이 배지를 첨가하여 200g에서 10분간 원심분리하여 세척한다. 상층액을 제거하고 침전물은 35ml PBS로 분산시킨다. PBS로 2회 더 세척하고, 1ml의 에세이 버퍼에 녹인다. 에세이 배지는 F12K 배지(깁코 BRL, Cat. # 21127-014)와 0.5% FBS로 구성된다. 세포수를 쿨터 카운터기ⓡ (Coulter Electronics, Inc.)로 측정하고 에세이 배지를 첨가하여 배지 1ml당 0.8-1.0 X 105 개의 세포가 존재하는 농도로 만든다.
3. 96웰 플랫 바닥 플레이트의 각 웰에 세포를 각각 100μl 또는 0.8-1.0 X 105 개씩 첨가하고 37℃, 5% CO2의 조건하에서 24시간 배양한다.
1일째:
1. 분리된 96웰 플레이트에 2종류의 시험하고자하는 화합물 적정을 0μM에서 50μM까지 준비한다. 0일째의 2단계와 같은 배지를 사용한다. 플레이트의 상단웰에 시험하고자하는 화합물 90μl를 처리하고 최종 200μM(4X 최종 웰 농도)가 되게하여 적정을 준비한다. 농축된 시험하고자하는 화합물은 일반적으로 20mM DMSO농도를 갖고있으므로, 200μM 시약농도는 2% DMSO를 함유한다.
에세이 배지 (2% DMSO)(F12K + 0.5% FBS)로 만들어진 희석액은 시험하고자하는 화합물을 희석하는데 사용되며, DMSO농도는 변하지 않는다. 이 희석액을 플레이트 세로열의 남은 웰에 60μl씩 첨가한다. 세로열의 첫번재 웰상의 200μM 시험 하고자하는 화합물 희석액에서 60μl를 취하여 세로열의 두번째 웰에 옮긴다. 다시 두번째 웰에서 60μl를 취하여 세로열의 세번째 웰에 옮긴다. 이렇게 2배 희석과정을 반복한다. 최종 웰에서 60μl를 취하여 버리고, 60μl의 DMSO/배지 희석액을 첨가하여 시험하고자하는 화합물의 들어가지 않은 대조군으로 사용한다. 9열로 적정된 시험하고자하는 화합물웰을 각각 3웰씩을 준비하여: 1) VEGF (Pedro Tech Inc., Cat. # 100-200, 2) ECGF(내피 세포 성장 인자, 또는 산성 프브로블라스트 성장 인자, aFGF)(Boehringer Mannheim Biochemica. Cat. # 1439 600), 또는, 3) 인간 PDGF B/B (1276-956, Boehringer Mannheim Biochemica, Germany)와 에세이 배지 대조군로 이용한다. ECGF는 헤파린 나트륨과 같이 준비한다.
2. 0일째에서 준비한 HUV-EC-C세포가 0.8-1.0 X 105 개 포함되어있는 96웰 플레이트에 시험하고자하는 화합물 희석액 50μl씩을 처리하고 37℃, 5% CO2조건하에 2시간동안 배양한다.
3. 각각 3세트의 웰에는 80μg/ml VEGF, 20ng/ml ECGF, 대조군배지 50μl씩이 포함되어 있다. 시험하고자하는 화합물로서, 성장인자 농도는 4X가 바람직한 최종 농도이다. 0일째 사용된 배지를 사용하여 성장 인자의 농도를 조절한다. 37℃, 5% CO2조건하에 24시간동안 배양한다. 각웰은 시험하고자하는 화합물 50μl, 성장인자 또는 배지 50μl 그리고 세포 100μl를 포함하여 총 200μl가 된다. 그러므로 4X 시험하고자하는 화합물과 성장인자는 1X가 된다.
2일째:
1. 3H-티미딘(Amersham, Cat. # TRK-686) 을 각웰당 1μCi(100μCi/ml용액을 RPMI 배지와 10% FBS롤 준비하여 각웰당 10μl씩 첨가하고 37℃, 5% CO2조건하에 24시간동안 배양한다. RPMI: 깁코 BRL. Cat. # 11875-051
3일째:
플레이트를 -20℃에서 24시간 동안 동결시킨다.
4일째:
플레이트를 녹이고 필터 매트(왈락, Cat. # 1205-401)상에서 96웰 플레이트 수확기(Tmatec Harvester 96)로 수확한다. 왈락 Betaplate제품의 방사능측정장치로 카운트한다.
생체외 동물모델 실험
이종동물모델:
인간 종양세포의 아시믹(athymic) 마우스종(e.g., Balb/c, nu/nu)에서의 성장능력은 인간 종양의 치료를 위한 생물학적 연구에 대한 생체외 연구에 유용하다. 인간 종양의 아시믹 마우스로의 이종이식이 성공적으로 이루어진 이래 (Rygaard and Povlsen, 1969, Acta Pathol. Microbial. Scand. 77:758-760), 다양한 종류의 인간 종양세포주 (e.g., 유방, 폐, 생식기, 위장, 머리, 목, 신경, 뼈 그리고 악성흑생종)가 이식되고 누드마우스에서 성장하게 되었다. 다음의 에세이는 본 발명의 다양한 화합물의 활성도, 특이성, 효과 정도를 측정하기 위한 방법이다. 화합물을 평가하기 위해 3종류의 에세이 과정 즉, 세포적/촉매, 세포적/생물학적, 생체외 실 험이 이용된다.
세포적/촉매 에세이의 목적은 세포내 알려진 기질에 티로신을 인산화시키는 TK에 대한 상기 화합물의 효과를 측정하기 위한 것이다. 세포적/생물학적 에세이의 목적은 세포내 TK에 의해 자극된 생물학적 반응에 대한 상기 화합물의 효과를 측정하기 위한 것이다. 생체외 에세이의 목적은 암과 같은 특별한 질병을 가진 동물 모델에서의 상기 화합물의 효과를 측정하기 위한것이다.
피하 이종이식실험에 사용된 적당한 세포주는 C6(신경, ATCC # CCL 107), A375(근종, ATCC # CRL 1619), A431(표피암, ATCC # CRL 1555), Calu 6(폐, ATCC # HTB 56), PC3(전립선, ATCC # CRL 1435), SKOV3TP5과 EGFR, FDGFR, IGF-1R 혹은 다른 인산화효소를 과량발현하도록 유전적으로 조작된 NIH3T3 섬유아세포주를 포함한다. 다음의 과정은 이종이식 실험에 사용될 수 있다:
암컷 아시믹 마우스(BALB/c, nu/nu)는 Simonsen Laboratories(Gilroy, CA)로 부터 구입하였다. 모든 동물은 알파-드라이 베딩이 설치된 마이크로-아이솔레이터 케이지에 있는 청정실내에서 사육한다. 모든 마우스에 멸균된 사료와 리비튬이 첨가된 물을 제공한다.
세포주는 적당한 배지(예를 들면, 5-10% FBS, 2mM 글루타민이 포함된 MEM, DMEM, Ham's F10 또는 Ham's F12배지)상에서 배양한다. 모든 세포배양 배지, 글루타민, FBS는 깁코 Life Technologies (Grand Island, NY)에서 구입하여 사용하였다. 모든 세포는 90-95% 습도, 5-10% CO2, 37℃의 조건하에서 배양하였다. 2주마다 재배양하고, 마이코텍트(Mycotect, 깁코)로 마이코플라즈마 감염여부를 확인하 였다.
90%이상 자랐을때 세포에 0.05% 트립신-EDTA를 처리하여 수확하고, 450g에서 10분간 원심분리하여 침전물을 얻었다. 침전물을 멸균된 PBS용액 또는 배지(FBS미첨가)로 분산시키고 이 세포를 마우스(한 그룹에 8-10마리, 동물당 2-10 X 106 개의 세포)에 주입하였다. 종양의 크기는 3-6주까지 베니어 칼리퍼를 사용하여 측정하였다. 종양 부피는 특별한 사항이 없는한 길이 X 넓이 X 높이로 계산하였다. Student-test방식으로 P 값을 계산하였다. 50-100μl의 부형제(DMSO, 또는 VPD:D5W)에 포함된 시험하고자하는 화합물을 종양 주입 후 1일째부터 시작하여 다른 농도로 복박내 주사(IP)를 수행하였다.
종양 침입 모델 실험
다음의 종양 침입 모델은 KDR/FLK- 수용체를 선택적으로 억제하는 것으로 알려진 화합물의 치료적 가치와 효과를 평가하기 위한 방법이다.
실험과정:
8주된 암컷 누드 마우스 (Simonsen Inc.)가 본 실험의 동물로 사용된다. 종양세포의 주입은 후드에서 수행된다. 마취를 위해, 자일라진/케타민 칵테일(케타민 100mg/kg, 자일라진 5mg/kg)이 투약되었다. 복식강이 노출되게 절개한 후, 100μl 배지에 있는 약 107 개의 종양 세포를 주입하였다. 세포는 췌장옆이나 결장막으로 주입한다. 복막과 근육을 6-0실크 봉합실로 봉합하고 피부는 클립을 사용하여 폐쇄한다. 매일 동물을 관찰한다.
분석:
2-6주 후, 동물의 상태에 따라 쥐를 죽인후, 다른 기관 (폐, 간, 뇌, 위, 지라, 심장, 근육)으로 전이된 종양을 절개하고 분석한다 (종양의 크기측정, 침투 등급, 면역화학실험, 인 시튜 하이브리다이제이션(in situ hybridization) 실험 등).
세포 독성 측정:
치료 화합물은 세포독성 효과를 발휘하는 것보다 수용체 인산화효소 활성도를 억제하는 역할을 한다. 화합물의 세포독성과 효과에 대한 측정은 치료 지표, 즉, IC50/LD50을 결정함으로써 이루어진다. IC50은 50%를 억제할 수 있는 용량이며, 하기에 명시된 것과 같은 기본적인 기술에 의해 측정된다. LD50은 50% 독성을 유발할 수 있는 용량을 말하며, 방출되는 LDH의 양을 측정하거나(Korzeniewski and Callewaert, 1983, J.Immunol. Methods, 64:313, Decker and Lohmann-Matthes, 1988, J.Immunol. Methods, 115:61), 동물 모델에 치명적인 용량을 측정하거나, 기본적인 기술을 이용함으로써 (Mossman, 1983, J.Immunol. Methods, 65:55-63) 측정될 수 있다. 높은 치료 지표를 갖는 화합물이 바람직하게 사용된다. 치료 지표는 2이상 이어야하며, 바람직하게는 적어도 10, 보다 바람직하게는 적어도 50이어야한다.
생물학적 활성도:
본 발명의 화합물의 생체외(in vitro)상에서의 효능을 표 1과 2에 나타냈다. 화합물들은 일반적으로 생체외실험에서 다양한 종류의 PTK에 매우 효능이 있음을 보여준다. 본 화합물들은 또한, 생체외 실험을 수행했을때도 탁월한 활성도를 보였다. 본 발명의 몇가지의 화합물들을 예로들면, 구강내 투약했을 경우, 마우스에 주입된 C-6 신경암의 평균 크기가 줄어들었다. 그러나, 화합물 5는 본발명의 다른 화합물보다 월등한 효과를 나타내었다. 한 실시예에서, C6 인간 신경암 세포(3 X 106 개, n =10 - 20마리/1군) 를 0일째 암컷 BALB/c nu/nu 마우스에 주입하였다. 주입 후 1일째 화합물 3, 5, 19, 20의 구강내투약을 시작하였고, 용량은 하루에 kg당 200mg이었다. 종양 크기는 베니어 칼리퍼로 측정하였고 종양 부피는 길이 X 넓이 X 높이로 측정하였다.
Figure 112000537758212-pct00016
하기의 도표에서와 같이, 모든 화합물이 담체만을 투여한 대조군에 비해 높은 종양 억제 효과를 보인다. 그러나, 화합물 5가 가장 뚜렷하며, 시험하고자하는한 화합물들의 구조적 유사성을 고려해볼때, 나머지 화합물들보다 효능이 높음을 알 수 있다. 즉, 화합물 3, 19, 20이 종양 세포 주입 18일째 40-45%의 종양 억제를 보인 반면, 화합물 5는 그 시점에서 80-85%의 종양 억제를 보였다.
Figure 112000537758212-pct00017
화합물 5의 생체외 실험에서의 효능은, 특별히 구강내 투약을 하고 화합물 65와 비교하였을 때 알 수 있다:
Figure 112000537758212-pct00018
화합물 65는 생체외실험에서 화합물 5보다 높은 효능을 보인다 (자료 미첨 가). 그러나, 서로 다른 2종류의 종양 세포인 SF763T와 SF767T를 마우스에 주입하였을때, 화합물 5는 21일째 5% - 14%의 억제롤 보여 화합물 65보다 더 효과적임을 보인다.
화합물 5와 65간의 이러한 차이점은 두 화합물이 구강내로 투약되었을때 더 뚜렷해진다. 화합물 65와 여러개의 유사화합물들인 화합물 66-69의 구강내 효능은 하기의 그래프상에 나타내었다.
Figure 112000537758212-pct00019
Figure 112000537758212-pct00020
그래프에서 볼 수 있듯이, 화합물 65는 하루에 kg당 200mg투약되었고, 마우스에 종양을 주입하고 18일째되는 날 C6종양의 65% 억제도를 보인다. 이 화합물은 유사 화합물보다 뚜렷한 효과를 보이고, 14-16%의 종양 억제도를 보인다. 그러나, 화합물 65의 구강내 효능은 화합물 5보다 현저히 떨어진다. 화합물 5는 상기와 같이 같은 종양 모델에서 같은 날 80-85% 종양 억제도를 보였다.
화합물 70과 비교하였을때, 화합물 5는 FGF-R1(화합물 70에 대해서는 19.49화합물 5에 대해서는 1.2)과 PDGFR(자료 미첨가)에 대한 낮은(높은 효능) Ki (억제 상수)값을 보인다.
Figure 112000537758212-pct00021
화합물 5의 이러한 우월성은 유사화합물인 화합물 71의 구강내 투약시와 비교하였을 때 알 수 있다.
Figure 112000537758212-pct00022
구조적으로 유사함에도 불구하고, BALB/c nu/nu마우스에 C6 인간 흑색종세포를 주입하고 하루에 kg당 화합물 200mg씩 구강내 투여를 한 뒤, 18일째에 화합물 71은 57% 종양 억제도를 보였으나(자료 미첨가), 화합물 5는 80-85%의 종양 억제도를 보였다.
구강내 투약 후 상기 화합물 5의 효능에 기초하여, 화합물 5는 본 발명의 바람직한 물질임을 알 수 있다.
이상과 같이, 본 발명의 화합물, 방법 및 의약 조성물은 단백질 인산화 효소의 활성을 조절하는데 효과적이므로 수용체 티로신 인산화 효소(RTK), 세포질 인산 화 효소(CTK), 세린/트레오닌 인산화효소(STK)에 관련된 질병에 대한 치료제로서 효과가 있을 것으로 기대됨을 알 수 있다.
당업자라면, 본 발명의 목적을 달성하기 위해 본 발명을 용이하게 변경하여 이상에서 언급된 효과나 결과 뿐만 아니라 이들에 내재된 사항들을 얻어낼 수 있음을 쉽게 이해할 수 있을 것이다. 본 명세서에 기재된 분자 복합체와 그 방법, 과정, 처리, 분자, 구체적인 화합물들은 현재까지의 바람직한 실시예를 나타내지만 하나의 예시일 뿐이고 본 발명의 범위를 이들로만 한정하기 위한 것은 아니다. 이 기술 분야의 숙련된 자에게 인식되는 본 발명의 변경과 도 다른 용도는 특허 청구 범위에 의해 정의되는 본 발명의 요지내에 포함된다.
본 발명의 범위와 요지를 벗어나지 아니하고도 여기에 개시된 본 발명에 대한 변경 및 대체 수단의 변화가 당업자에게는 용이할 것이다.
본 명세서에 언급된 모든 특허들과 문헌들은 본 발명이 속하는 분야의 당업자 기술의 수준을 나타낸다. 본 명세서에 인용된 모든 특허들과 문헌들은 각각의 출판물들이 개별적으로, 구체적으로 명시하고 있는 것과 동일 정도로 상세하게 인용되었다.
본 명세서에 상세하게 설명되어 있는 본 발명은, 본 명세서에 구체적으로 명시되지 아니한 어떠한 조건 또는 조건들, 어떠한 구성요소 및 구성요소들 없이도 적절하게 실시될 수도 있다. 예를 들면, "포함하는", "필수적으로 구성되는", 그리고 "구성되는" 의 각각의 용어들은 서로 상호 교환될 수 있다.
여기에서 사용된 용어와 표현들은 설명을 위한 것일 뿐이며 어떠한 제한을 하려는 것은 아니므로 그러한 용어와 표현들을 사용한 것은 설명하고 입증한 특성등의 균등물 또는 이들의 일부를 본 발명에서 배제하고자 하는 것은 아니며, 오히려 본 발명의 특허 청구 범위내에서 다양한 변형이 가능하다는 점을 알 수 있다. 따라서, 본 발명이 바람직한 실시예와 선택적 특징들에 의해 아주 구체적으로 기재되었다 하더라도, 당업자라면 본 명세서에 기재된 개념을 변형하거나 변화시킬 수 있으나 그러한 변화와 변형은 첨부된 특허 청구 범위에 나타낸 본 발명의 범위에 속하는 것임을 인식해야 할 것이다.
또한, 본 발명의 특징과 요소를 마쿠쉬 형식으로 기재한 부분에 대하여는 당업자라면 마쿠쉬 형식의 아군 요소 또는 각각의 요소들에 의하여 본 발명이 설명되는 내용을 알 수 있을 것이다. 예를 들면, X가 브롬, 염소 그리고 요오드로 이루어진 군에서 선택되는 것으로 기술되었다면, X가 브롬으로 구성되어 있는 청구항들과 X가 브롬과 염소로 구성된 청구항들을 모두 기재하는 것이다.
기타 태양들도 다음의 특허 청구 범위내에 속한다.

Claims (28)

  1. 피롤기로 치환된 하기 화학식의 2-인돌리논:
    Figure 112006007480278-pct00024
    상기식에서, R1,R2 그리고 R7은 수소이고;
    R3,R4,R5과 R6이
    수소;
    히드록시기;
    할로겐기;
    비치환된 C1-C4 알킬기;
    카르복시 산으로 치환된 C1-C4 알킬기;
    비치환된 C1-C4 알콕시기;
    카르복시 산;
    비치환된 아릴기;
    하나 이상의 비치환된 C1-C4 알킬기와 C1-C4 알콕시기로 치환된 아릴기;그리고
    몰폴리노기;
    로 이루어진 군에서 독립적으로 선택되고,
    R8은 비치환된 C1-C4 알킬기;
    R9은 -(CH2)(CH2)C(=O)OH; 그리고
    R10은 비치환된 C1-C4 알킬기이며,
    여기서 아릴기는 페닐기, 나프탈렌기 또는 안트라세닐기로 정의된다.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. 삭제
  15. 피롤기로 치환된 하기 화학식의 2-인돌리논과 생리학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 포함하는 항종양제 조성물.
    Figure 712006001989564-pct00025
    상기식에서, R1,R2 그리고 R7은 수소이고;
    R3,R4,R5과 R6이
    수소;
    히드록시기;
    할로겐기;
    비치환된 C1-C4 알킬기;
    카르복시 산으로 치환된 C1-C4 알킬기;
    비치환된 C1-C4 알콕시기;
    카르복시 산;
    비치환된 아릴기;
    하나 이상의 비치환된 C1-C4 알킬기와 C1-C4 알콕시기로 치환된 아릴기;그리고
    몰폴리노기;
    로 이루어진 군에서 독립적으로 선택되고,
    R8은 비치환된 C1-C4 알킬기;
    R9은 -(CH2)(CH2)C(=O)OH; 그리고
    R10은 비치환된 C1-C4 알킬기이며,
    여기서 아릴기는 페닐기, 나프탈렌기 또는 안트라세닐기로 정의된다.
  16. 삭제
  17. 삭제
  18. 삭제
  19. 삭제
  20. 제 15항에 있어서, 상기 항종양제 조성물이 수쿠아무스 세포 종양(squamous cell carcinoma), 신경교증 (astrocytoma), 카포시육종(Kaposi's sarcoma), 뇌종양(glioblastoma), 폐암(lung cancer), 방광암(bladder cancer), 두경부암(head and neck cancer), 흑색종(melanoma), 난소암(ovarian cancer), 전립선암(prostate cancer), 유방암(breast cancer), 소세포 폐암(small-cell lung cancer), 신경교종(glioma), 결장-직장암(colorectal cancer), 비뇨기 암(genitourinary cancer)과 위장관 암(gastrointestinal cancer)으로 이루어지는 군에서 선택되는 질환의 예방제 또는 치료제인 항종양제 조성물.
  21. 피롤기로 치환된 하기 화학식의 2-인돌리논과 생리학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 함유하는 약학 조성물이 당뇨병(diabetes), 자가면역질환(autoimmune disorder), 과다세포증식질환(hyperproliferation disorder), 협착증(restenosis), 섬유종(fibrosis), 건선(psoriasis), 골관절염 (osteoarthritis), 류마티스성 관절염(rheumatoid arthritis), 혈관형성 (angiogenesis), 염증질환 (inflammatory disorder), 면역계 질환 (immunological disorder) 및 심혈관계 질환 (cardiovascular disorder)으로 이루어지는 군에서 선택되는 질환의 예방제 또는 치료제인 약학 조성물.
    Figure 712006001989564-pct00026
    상기식에서, R1,R2 그리고 R7은 수소이고;
    R3,R4,R5과 R6이
    수소;
    히드록시기;
    할로겐기;
    비치환된 C1-C4 알킬기;
    카르복시 산으로 치환된 C1-C4 알킬기;
    비치환된 C1-C4 알콕시기;
    카르복시 산;
    비치환된 아릴기;
    하나 이상의 비치환된 C1-C4 알킬기와 C1-C4 알콕시기로 치환된 아릴기;그리고
    몰폴리노기;
    로 이루어진 군에서 독립적으로 선택되고,
    R8은 비치환된 C1-C4 알킬기;
    R9은 -(CH2)(CH2)C(=O)OH; 그리고
    R10은 비치환된 C1-C4 알킬기이며,
    여기서 아릴기는 페닐기, 나프탈렌기 또는 안트라세닐기로 정의된다.
  22. 삭제
  23. 제 1항에 있어서, 상기 화합물이,
    3-[5-(5-클로로-2-옥소-1,2-디하이드로인돌-3-일리덴메틸)-2,4-디메틸-1H-피롤-3-일]-프로피온 산,
    3-[2,4-디메틸-5-(2-옥소-1,2-디하이드로인돌-3-일리덴메틸)-1H-피롤-3-일]-프로피온 산,
    3-[5-(5-브로모-2-옥소-1,2-디하이드로인돌-3-일리덴메틸)-2,4-디메틸-1H-피롤-3-일]-프로피온 산,
    3-[5-(5-요오도-2-옥소-1,2-디하이드로인돌-3-일리덴메틸)-2,4-디메틸-1H-피롤-3-일]-프로피온 산,
    3-[2,4-디메틸-5-(4-메틸-2-옥소-1,2-디하이드로인돌-3-일리덴메틸)-1H-피롤-3-일]-프로피온 산,
    3-[2,4-디메틸-5-(5-메틸-2-옥소-1,2-디하이드로인돌-3-일리덴메틸)-1H-피롤-3-일]-프로피온 산,
    3-[5-(6-히드록시-2-옥소-1,2-디하이드로인돌-3-일리덴메틸)-2,4-디메틸-1H-피롤-3-일]-프로피온 산,
    3-[5-(6-메톡시-2-옥소-1,2-디하이드로인돌-3-일리덴메틸)-2,4-디메틸-1H-피롤-3-일]-프로피온 산,
    3-{5-[6-(3-메톡시-페닐)-2-옥소-1,2-디하이드로인돌-3-일리덴메틸]-2,4-디메틸-1H-피롤-3-일}-프로피온 산,
    3-{5-[6-(3-에톡시-페닐)-2-옥소-1,2-디하이드로인돌-3-일리덴메틸]-2,4-디메틸-1H-피롤-3-일]-프로피온 산,
    3-[2,4-디메틸-5-(2-옥소-6-페닐-1,2-디하이드로인돌-3-일리덴메틸)-1H-피롤-3-일]-프로피온 산,
    3-{5-[6-(4-메톡시-페닐)-2-옥소-1,2-디하이드로인돌-3-일리덴메틸]-2,4-디메틸-1H-피롤-3-일}-프로피온 산,
    3-{5-[6-(2-메톡시-페닐)-2-옥소-1,2-디하이드로인돌-3-일리덴메틸]-2,4-디메틸-1H-피롤-3-일}-프로피온 산,
    3-[2,4-디메틸-5-(6-몰폴린-4-일-2-옥소-1,2-디하이드로인돌-3-일리덴메틸)-1H-피롤-3-일]-프로피온 산, 그리고
    3-[5-(5-클로로-4-메틸-2-옥소-1,2-디하이드로인돌-3-일리덴메틸)-2,4-디메틸-1H-피롤-3-일]-프로피온 산으로 이루어진 군에서 선택되는 것인 피롤기로 치환된 2-인돌리논 화합물.
  24. 삭제
  25. 하기 화학식의 3-[2,4-디메틸-5-(2-옥소-1,2-디하이드로인돌-3-일리덴메틸)-1H-피롤-3-일]-프로피온 산 화합물:
    Figure 112006007480278-pct00027
  26. 하기 화학식의 3-[2,4-디메틸-5-(2-옥소-1,2-디하이드로인돌-3-일리덴메틸)-1H-피롤-3-일]-프로피온 산 화합물과 생리학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 함유하는 항종양제 조성물.
    Figure 112006007480278-pct00028
  27. 제 26항에 있어서, 상기 항종양제 조성물이 수쿠아무스 세포 종양(squamous cell carcinoma), 신경교증 (astrocytoma), 카포시육종(Kaposi's sarcoma), 뇌종양(glioblastoma), 폐암(lung cancer), 방광암(bladder cancer), 두경부암(head and neck cancer), 흑색종(melanoma), 난소암(ovarian cancer), 전립선암(prostate cancer), 유방암(breast cancer), 소세포 폐암(small-cell lung cancer), 신경교종(glioma), 결장-직장암(colorectal cancer), 비뇨기 암(genitourinary cancer) 과 위장관 암(gastrointestinal cancer)으로 이루어지는 군에서 선택되는 질환의 예방제 또는 치료제인 항종양제 조성물.
  28. 하기 화학식의 3-[2,4-디메틸-5-(2-옥소-1,2-디하이드로인돌-3-일리덴메틸)-1H-피롤-3-일]-프로피온 산 화합물과 생리학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 함유하는 약학 조성물이 당뇨병(diabetes), 자가면역질환(autoimmune disorder), 과다세포증식질환(hyperproliferation disorder), 협착증(restenosis), 섬유종(fibrosis), 건선(psoriasis), 골관절염 (osteoarthritis), 류마티스성 관절염(rheumatoid arthritis), 혈관형성 (angiogenesis), 염증질환 (inflammatory disorder), 면역계 질환 (immunological disorder) 및 심혈관계 질환 (cardiovascular disorder)으로 이루어지는 군에서 선택되는 질환의 예방제 또는 치료제인 약학 조성물.
    Figure 712006001989564-pct00029
KR1020007013863A 1998-05-29 1999-05-28 피롤기로 치환된 2-인돌리논 단백질 인산화 효소 억제제 KR100743287B1 (ko)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US8731098P 1998-05-29 1998-05-29
US60/087,310 1998-05-29
US11610699P 1999-01-15 1999-01-15
US60/116,106 1999-01-15

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20010083039A KR20010083039A (ko) 2001-08-31
KR100743287B1 true KR100743287B1 (ko) 2007-07-26

Family

ID=26776832

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020007013863A KR100743287B1 (ko) 1998-05-29 1999-05-28 피롤기로 치환된 2-인돌리논 단백질 인산화 효소 억제제

Country Status (24)

Country Link
US (2) US6395734B1 (ko)
EP (2) EP2020408B1 (ko)
JP (1) JP4528440B2 (ko)
KR (1) KR100743287B1 (ko)
CN (1) CN1250526C (ko)
AR (1) AR018408A1 (ko)
AU (1) AU759226B2 (ko)
BR (1) BR9910792A (ko)
CA (1) CA2314156C (ko)
CO (1) CO5031249A1 (ko)
DK (1) DK2020408T3 (ko)
EA (1) EA005032B1 (ko)
ES (1) ES2429573T3 (ko)
HK (1) HK1126770A1 (ko)
HU (1) HUP0103617A2 (ko)
IL (2) IL139934A (ko)
NO (1) NO318083B1 (ko)
NZ (1) NZ508815A (ko)
PL (1) PL344477A1 (ko)
PT (1) PT2020408E (ko)
SK (1) SK287132B6 (ko)
TR (1) TR200003514T2 (ko)
TW (1) TWI229073B (ko)
WO (1) WO1999061422A1 (ko)

Families Citing this family (242)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5880141A (en) 1995-06-07 1999-03-09 Sugen, Inc. Benzylidene-Z-indoline compounds for the treatment of disease
US6906093B2 (en) * 1995-06-07 2005-06-14 Sugen, Inc. Indolinone combinatorial libraries and related products and methods for the treatment of disease
US6316429B1 (en) * 1997-05-07 2001-11-13 Sugen, Inc. Bicyclic protein kinase inhibitors
US6051593A (en) * 1997-06-20 2000-04-18 Sugen, Inc. 3-(cycloalkanoheteroarylidenyl)-2- indolinone protein tyrosine kinase inhibitors
US6569868B2 (en) 1998-04-16 2003-05-27 Sugen, Inc. 2-indolinone derivatives as modulators of protein kinase activity
CA2314156C (en) * 1998-05-29 2010-05-25 Sugen, Inc. Pyrrole substituted 2-indolinone protein kinase inhibitors
BR9916223A (pt) 1998-12-17 2001-09-04 Hoffmann La Roche 4-ariloxindóis como inibidores de cinases de proteìna jnk
TR200101860T2 (tr) 1998-12-17 2001-12-21 F.Hoffmann-La Roche Ag Sikline bağlı kinaz inhibitörleri olarak 4-alkenil (ve alkinil) oksidoller
US6153634A (en) 1998-12-17 2000-11-28 Hoffmann-La Roche Inc. 4,5-azolo-oxindoles
US20030119895A1 (en) * 1998-12-23 2003-06-26 Pharmacia Corporation Methods using a combination of a 3-heteroaryl-2-indolinone and a cyclooxygenase-2 inhibitor for the treatment of neoplasia
US6689806B1 (en) * 1999-03-24 2004-02-10 Sugen, Inc. Indolinone compounds as kinase inhibitors
UA74803C2 (uk) 1999-11-11 2006-02-15 Осі Фармасьютікалз, Інк. Стійкий поліморф гідрохлориду n-(3-етинілфеніл)-6,7-біс(2-метоксіетокси)-4-хіназолінаміну, спосіб його одержання (варіанти) та фармацевтичне застосування
US6878733B1 (en) 1999-11-24 2005-04-12 Sugen, Inc. Formulations for pharmaceutical agents ionizable as free acids or free bases
JP5336686B2 (ja) * 1999-11-24 2013-11-06 スージェン， インク． 遊離酸または遊離塩基としてイオン化可能な医薬品のための処方
US6313310B1 (en) 1999-12-15 2001-11-06 Hoffmann-La Roche Inc. 4-and 5-alkynyloxindoles and 4-and 5-alkenyloxindoles
MXPA02006263A (es) * 1999-12-22 2004-02-26 Sugen Inc Metodos de modulacion de la funcion de la cinasa de tirosina c-kit de la proteina con compuestos de indolinona.
US6339100B1 (en) * 1999-12-29 2002-01-15 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Methods for inhibiting mastocytosis
WO2001049287A1 (en) * 1999-12-30 2001-07-12 Sugen, Inc. 3-heteroarylidenyl-2-indolinone compounds for modulating protein kinase activity and for use in cancer chemotherapy
AR034118A1 (es) * 2000-02-15 2004-02-04 Sugen Inc Compuestos de 2-indolinonas sustituidas con pirroles inhibidoras de proteinquinasas; sus composiciones farmaceuticas e intermediarios de sintesis
WO2001083450A2 (en) * 2000-05-02 2001-11-08 Sugen, Inc. (2-oxindol-3-ylidenyl)acetic acid derivatives and their use as protein kinase inhibitors
TWI270545B (en) * 2000-05-24 2007-01-11 Sugen Inc Mannich base prodrugs of 3-(pyrrol-2-ylmethylidene)-2-indolinone derivatives
WO2001094312A2 (en) 2000-06-02 2001-12-13 Sugen, Inc. Indolinone derivatives as protein kinase/phosphatase inhibitors
CA2414468A1 (en) 2000-06-30 2002-01-10 Sugen, Inc. 4-heteroaryl-3-heteroarylidenyl-2-indolinones and their use as protein kinase inhibitors
EP1349852A2 (en) 2000-12-20 2003-10-08 Sugen, Inc. 4-(hetero)aryl substituted indolinones
KR100830082B1 (ko) 2001-01-05 2008-05-20 화이자 인크. 인슐린 유사 성장 인자 ι수용체에 대한 항체
AR042586A1 (es) 2001-02-15 2005-06-29 Sugen Inc 3-(4-amidopirrol-2-ilmetiliden)-2-indolinona como inhibidores de la protein quinasa; sus composiciones farmaceuticas; un metodo para la modulacion de la actividad catalitica de la proteinquinasa; un metodo para tratar o prevenir una afeccion relacionada con la proteinquinasa
WO2002070478A1 (en) 2001-03-06 2002-09-12 Astrazeneca Ab Indolone derivatives having vascular-damaging activity
WO2002081466A1 (en) * 2001-04-09 2002-10-17 Sugen, Inc. Prodrugs of 3-(pyrrol-2-ylmethylidene)-2-indolinone derivatives
CA2448076A1 (en) * 2001-05-24 2002-11-28 Masahiko Hayakawa 3-quinoline-2-(1h)-ylideneindolin-2-one derivatives
US6599902B2 (en) 2001-05-30 2003-07-29 Sugen, Inc. 5-aralkysufonyl-3-(pyrrol-2-ylmethylidene)-2-indolinone derivatives as kinase inhibitors
US6995171B2 (en) 2001-06-21 2006-02-07 Agouron Pharmaceuticals, Inc. Bicyclic pyrimidine and pyrimidine derivatives useful as anticancer agents
US20040266771A1 (en) * 2001-06-29 2004-12-30 Alain Moussy Use of tyrosine kinase inhibitors for treating bone loss
ES2266553T3 (es) 2001-06-29 2007-03-01 Ab Science Utilizacion de derivados de la n-fenil-2-pirimidina-amina para tratar las enfermedades inflamatorias.
WO2003004007A2 (en) 2001-06-29 2003-01-16 Ab Science Use of tyrosine kinase inhibitors for treating inflammatory bowel diseases (ibd)
EP1434991B1 (en) 2001-06-29 2007-10-17 AB Science New potent, selective and non toxic c-kit inhibitors
DK1401413T3 (da) 2001-06-29 2007-03-26 Ab Science Anvendelse af tyrosinkinaseinhibitorer til behandling af allergiske sygdomme
AR038957A1 (es) 2001-08-15 2005-02-02 Pharmacia Corp Terapia de combinacion para el tratamiento del cancer
CA2462950A1 (en) 2001-10-10 2003-04-17 Sugen, Inc. 3-[4-(substituted heterocyclyl)-pyrrol-2-ylmethylidene]-2-indolinone derivatives as kinase inhibitors
TWI259081B (en) * 2001-10-26 2006-08-01 Sugen Inc Treatment of acute myeloid leukemia with indolinone compounds
AR039067A1 (es) 2001-11-09 2005-02-09 Pfizer Prod Inc Anticuerpos para cd40
US6797825B2 (en) 2001-12-13 2004-09-28 Abbott Laboratories Protein kinase inhibitors
US20030187026A1 (en) 2001-12-13 2003-10-02 Qun Li Kinase inhibitors
CA2470480C (en) 2001-12-27 2010-12-14 Theravance, Inc. Indolinone derivatives useful as protein kinase inhibitors
JP2005527511A (ja) 2002-03-01 2005-09-15 ファイザー インコーポレイテッド 抗血管形成剤として有用なチエノピリジンのインドリル−尿素誘導体およびその使用法
EP1501357A4 (en) * 2002-05-06 2009-10-21 Genentech Inc USE OF VEGF FOR THE TREATMENT OF BONE DEFECTS
UA77303C2 (en) 2002-06-14 2006-11-15 Pfizer Derivatives of thienopyridines substituted by benzocondensed heteroarylamide useful as therapeutic agents, pharmaceutical compositions and methods for their use
CA2525994C (en) 2002-06-24 2012-10-16 Tufts University Silk biomaterials and methods of use thereof
US20050032871A1 (en) * 2002-09-03 2005-02-10 Sugen, Inc. Sulfonylated pyrrole-2-indolinone derivatives as kinase inhibitors
AR042042A1 (es) * 2002-11-15 2005-06-08 Sugen Inc Administracion combinada de una indolinona con un agente quimioterapeutico para trastornos de proliferacion celular
CA2506546A1 (en) 2002-11-15 2004-06-17 Exelixis, Inc. Kinase modulators
WO2004048366A1 (ja) * 2002-11-22 2004-06-10 Yamanouchi Pharmaceutical Co., Ltd. ２−オキソインドリン誘導体
JP4879492B2 (ja) * 2002-11-27 2012-02-22 アラーガン、インコーポレイテッド 疾患の治療のためのキナーゼ阻害剤
CN1747950A (zh) 2002-12-19 2006-03-15 美国辉瑞有限公司 用于治疗眼病的作为蛋白激酶抑制剂的2－(1h－吲唑－6－基氨基)－苯甲酰胺化合物
EA010727B1 (ru) 2003-02-26 2008-10-30 Суджен, Инк. Аминогетероарильные соединения в качестве ингибиторов протеинкиназ
US20040266843A1 (en) * 2003-03-07 2004-12-30 Sugen, Inc. Sulfonamide substituted indolinones as inhibitors of DNA dependent protein kinase (DNA-PK)
US7157577B2 (en) * 2003-03-07 2007-01-02 Sugen Inc. 5-sulfonamido-substituted indolinone compounds as protein kinase inhibitors
EP1613796B1 (en) 2003-04-10 2017-03-22 Tufts University Concentrated aqueous silk fibroin solution and use thereof
MXPA06000508A (es) 2003-07-18 2006-04-05 Amgen Inc Agentes de union especifica al factor del crecimiento de los hepatocitos.
US7105562B2 (en) * 2003-08-06 2006-09-12 Sugen, Inc. Geometrically restricted 3-cyclopentylidene-1,3-dihydroindol-2-ones as potent protein tyrosine kinase inhibitors
DE602004017479D1 (de) 2003-08-29 2008-12-11 Pfizer Als neue antiangiogene mittel geeignete thienopyridinphenylacetamide und derivate davon
AR045563A1 (es) 2003-09-10 2005-11-02 Warner Lambert Co Anticuerpos dirigidos a m-csf
CA2541460A1 (en) 2003-10-24 2005-05-06 Schering Aktiengesellschaft Indolinone derivatives and their use in treating disease-states such as cancer
JP4864719B2 (ja) * 2003-11-26 2012-02-01 ファイザー・プロダクツ・インク Ｇｓｋ−３インヒビターとしてのアミノピラゾール誘導体
NZ547009A (en) 2003-12-23 2009-09-25 Pfizer Novel quinoline derivatives
EP1765313A2 (en) 2004-06-24 2007-03-28 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Compounds for immunopotentiation
CA2578066C (en) 2004-08-26 2011-10-11 Pfizer Inc. Enantiomerically pure aminoheteroaryl compounds as protein kinase inhibitors
GT200500321A (es) 2004-11-09 2006-09-04 Compuestos y composiciones como inhibidores de proteina kinase.
EP1827434B1 (en) 2004-11-30 2014-01-15 Amgen Inc. Quinolines and quinazoline analogs and their use as medicaments for treating cancer
WO2006101925A2 (en) 2005-03-16 2006-09-28 Osi Pharmaceuticals, Inc. Biological markers predictive of anti-cancer response to epidermal growth factor receptor kinase inhibitors
EP1863848A4 (en) 2005-03-31 2009-09-23 Agensys Inc CORRESPONDING ANTIBODIES AND MOLECULES THAT ATTACH PROTEINS 161P2F10B
EP2444419A1 (en) 2005-04-26 2012-04-25 Pfizer Inc. P-Cadherin antibodies
US7960548B2 (en) * 2005-04-29 2011-06-14 The Ohio State University Research Foundation Keratinocyte growth factor receptor—tyrosine specific inhibitors for the prevention of cancer metastatis
JP5161777B2 (ja) 2005-09-07 2013-03-13 アムジェン フレモント インク． アクチビン受容体様キナーゼ−１に対するヒトモノクローナル抗体
WO2007035744A1 (en) 2005-09-20 2007-03-29 Osi Pharmaceuticals, Inc. Biological markers predictive of anti-cancer response to insulin-like growth factor-1 receptor kinase inhibitors
US20080108664A1 (en) 2005-12-23 2008-05-08 Liu Belle B Solid-state form of AMG 706 and pharmaceutical compositions thereof
JO2660B1 (en) 2006-01-20 2012-06-17 نوفارتيس ايه جي Pi-3 inhibitors and methods of use
AR059066A1 (es) * 2006-01-27 2008-03-12 Amgen Inc Combinaciones del inhibidor de la angiopoyetina -2 (ang2) y el inhibidor del factor de crecimiento endotelial vascular (vegf)
KR101452520B1 (ko) * 2006-01-27 2014-10-21 샹하이 헨그루이 파마수티컬 컴퍼니 리미티드 피롤로[3,2-ｃ]피리딘-4-온 2-인돌린온 단백질 키나제 억제제
WO2007092178A1 (en) 2006-02-10 2007-08-16 Amgen Inc. Hydrate forms of amg706
KR100647350B1 (ko) * 2006-04-03 2006-11-23 김상민 시밍장치
AR060358A1 (es) 2006-04-06 2008-06-11 Novartis Vaccines & Diagnostic Quinazolinas para la inhibicion de pdk 1
WO2007124288A1 (en) 2006-04-19 2007-11-01 Novartis Ag Indazole compounds and methods for inhibition of cdc7
UA91129C2 (ru) 2006-05-09 2010-06-25 Пфайзер Продактс Инк. Производные циклоалкиламинокислот и фармацевтическая композиция, которая их содержит
PE20121506A1 (es) 2006-07-14 2012-11-26 Amgen Inc Compuestos triazolopiridinas como inhibidores de c-met
US8217177B2 (en) 2006-07-14 2012-07-10 Amgen Inc. Fused heterocyclic derivatives and methods of use
WO2008118133A2 (en) 2006-09-26 2008-10-02 Trustees Of Tufts College Silk microspheres for encapsulation and controlled release
AU2007314521A1 (en) * 2006-10-06 2008-05-08 Merck Sharp & Dohme Corp. Non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors
CA2672438A1 (en) 2006-12-20 2008-07-03 Amgen Inc. Substituted heterocycles and methods of use
US7759344B2 (en) 2007-01-09 2010-07-20 Amgen Inc. Bis-aryl amide derivatives and methods of use
JP2010519204A (ja) 2007-02-16 2010-06-03 アムジエン・インコーポレーテツド 窒素含有複素環ケトン類およびそれらのｃ−Ｍｅｔ阻害薬としての使用
US9102916B2 (en) 2007-02-27 2015-08-11 Trustees Of Tufts College Tissue-engineered silk organs
US8642067B2 (en) 2007-04-02 2014-02-04 Allergen, Inc. Methods and compositions for intraocular administration to treat ocular conditions
AU2008239594B2 (en) 2007-04-13 2013-10-24 Beth Israel Deaconess Medical Center Methods for treating cancer resistant to ErbB therapeutics
WO2009023615A1 (en) 2007-08-10 2009-02-19 Trustees Of Tufts College Tubular silk compositions and methods of use thereof
BRPI0815368A2 (pt) 2007-08-21 2015-02-10 Amgen Inc "proteinas c-fms humanas a antigeno"
WO2009030270A1 (en) * 2007-09-03 2009-03-12 Novartis Ag Dihydroindole derivatives useful in parkinson's disease
JP2011506560A (ja) 2007-12-20 2011-03-03 ノバルティス アーゲー Ｐｉ３キナーゼ阻害剤として用いられるチアゾール誘導体
WO2010017541A2 (en) * 2008-08-08 2010-02-11 The Johns Hopkins University Compositions and methods for treatment of neurodegenerative disease
CA2737597C (en) 2008-10-16 2017-03-14 University Of Pittsburgh-Of The Commonwealth System Of Higher Education Fully human antibodies to high molecular weight-melanoma associated antigen and uses thereof
CN101397295B (zh) * 2008-11-12 2012-04-25 深圳微芯生物科技有限责任公司 作为组蛋白去乙酰化酶抑制剂的2-吲哚满酮衍生物、其制法和用途
CN102307875A (zh) 2009-02-09 2012-01-04 苏伯俭股份有限公司 吡咯并嘧啶基axl激酶抑制剂
US20120189641A1 (en) 2009-02-25 2012-07-26 OSI Pharmaceuticals, LLC Combination anti-cancer therapy
JP2012519170A (ja) 2009-02-26 2012-08-23 オーエスアイ・ファーマシューティカルズ，エルエルシー 生体内の腫瘍細胞のｅｍｔステータスをモニターするためのｉｎｓｉｔｕ法
US8465912B2 (en) 2009-02-27 2013-06-18 OSI Pharmaceuticals, LLC Methods for the identification of agents that inhibit mesenchymal-like tumor cells or their formation
TW201035088A (en) 2009-02-27 2010-10-01 Supergen Inc Cyclopentathiophene/cyclohexathiophene DNA methyltransferase inhibitors
WO2010099138A2 (en) 2009-02-27 2010-09-02 Osi Pharmaceuticals, Inc. Methods for the identification of agents that inhibit mesenchymal-like tumor cells or their formation
WO2010099363A1 (en) 2009-02-27 2010-09-02 Osi Pharmaceuticals, Inc. Methods for the identification of agents that inhibit mesenchymal-like tumor cells or their formation
US8293753B2 (en) 2009-07-02 2012-10-23 Novartis Ag Substituted 2-carboxamide cycloamino ureas
CA2766403A1 (en) 2009-07-13 2011-01-20 Genentech, Inc. Diagnostic methods and compositions for treatment of cancer
JP2013500991A (ja) 2009-07-31 2013-01-10 オーエスアイ・ファーマシューティカルズ，エルエルシー ｍＴＯＲ阻害剤および血管新生阻害剤併用療法
US20120157471A1 (en) 2009-09-01 2012-06-21 Pfizer Inc. Benzimidazole derivatives
EP2475996A1 (en) 2009-09-11 2012-07-18 F. Hoffmann-La Roche AG Method to identify a patient with an increased likelihood of responding to an anti-cancer agent
AU2010297344A1 (en) 2009-09-17 2012-02-23 F. Hoffmann-La Roche Ag Methods and compositions for diagnostics use in cancer patients
WO2011073521A1 (en) 2009-12-15 2011-06-23 Petri Salven Methods for enriching adult-derived endothelial progenitor cells and uses thereof
TWI402265B (zh) 2009-12-25 2013-07-21 Taiho Pharmaceutical Co Ltd A Method for Predicting the Therapeutic Effect of Chemotherapy for Patients with Hepatocellular Carcinoma
US20130116298A1 (en) 2009-12-25 2013-05-09 Taiho Pharmaceutical Co., Ltd. Antitumor agent or postoperative adjuvant chemotherapeutic agent for hepatocellular carcinoma treatment
ES2607806T3 (es) 2010-02-12 2017-04-04 Pfizer Inc Sales y polimorfos de 8-fluoro-2-{4-[(metilamino}metil]fenil}-1,3,4,5-tetrahidro-6H-azepino[5,4,3-cd]indol-6-ona
EP2542893A2 (en) 2010-03-03 2013-01-09 OSI Pharmaceuticals, LLC Biological markers predictive of anti-cancer response to insulin-like growth factor-1 receptor kinase inhibitors
US20110275644A1 (en) 2010-03-03 2011-11-10 Buck Elizabeth A Biological markers predictive of anti-cancer response to insulin-like growth factor-1 receptor kinase inhibitors
WO2011153224A2 (en) 2010-06-02 2011-12-08 Genentech, Inc. Diagnostic methods and compositions for treatment of cancer
CA2802857C (en) 2010-06-16 2018-09-11 University Of Pittsburgh-Of The Commonwealth System Of Higher Education Antibodies to endoplasmin and their use
WO2011161217A2 (en) 2010-06-23 2011-12-29 Palacký University in Olomouc Targeting of vegfr2
EP2848940A1 (en) 2010-07-19 2015-03-18 F. Hoffmann-La Roche AG Method to identify a patient with an increased likelihood of responding to an anti-cancer therapy
MX2013000676A (es) 2010-07-19 2013-02-27 Hoffmann La Roche Metodo para identificar pacientes con probabilidad incrementada de responder a una terapia anti-cancer.
WO2012012750A1 (en) 2010-07-23 2012-01-26 Trustees Of Boston University ANTI-DEsupR INHIBITORS AS THERAPEUTICS FOR INHIBITION OF PATHOLOGICAL ANGIOGENESIS AND TUMOR CELL INVASIVENESS AND FOR MOLECULAR IMAGING AND TARGETED DELIVERY
AR082418A1 (es) 2010-08-02 2012-12-05 Novartis Ag Formas cristalinas de 1-(4-metil-5-[2-(2,2,2-trifluoro-1,1-dimetil-etil)-piridin-4-il]-tiazol-2-il)-amida de 2-amida del acido (s)-pirrolidin-1,2-dicarboxilico
WO2012042421A1 (en) 2010-09-29 2012-04-05 Pfizer Inc. Method of treating abnormal cell growth
JP5802756B2 (ja) 2010-10-20 2015-11-04 ファイザー・インク スムーズンド受容体モジュレーターとしてのピリジン−２−誘導体
AP2013007043A0 (en) 2011-01-31 2013-08-31 Novartis Ag Novel heterocyclic derivatives
WO2012116040A1 (en) 2011-02-22 2012-08-30 OSI Pharmaceuticals, LLC Biological markers predictive of anti-cancer response to insulin-like growth factor-1 receptor kinase inhibitors in hepatocellular carcinoma
MY161199A (en) 2011-03-23 2017-04-14 Amgen Inc Fused tricyclic dual inhibitors of cdk 4/6 and flt3
US9150644B2 (en) 2011-04-12 2015-10-06 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Human monoclonal antibodies that bind insulin-like growth factor (IGF) I and II
ES2724801T3 (es) 2011-04-19 2019-09-16 Pfizer Combinaciones de anticuerpos anti-4-1BB y anticuerpos inductores de ADCC para el tratamiento del cáncer
US10335519B2 (en) 2011-04-20 2019-07-02 Trustees Of Tufts College Dynamic silk coatings for implantable devices
WO2012149014A1 (en) 2011-04-25 2012-11-01 OSI Pharmaceuticals, LLC Use of emt gene signatures in cancer drug discovery, diagnostics, and treatment
EP3812387A1 (en) 2011-07-21 2021-04-28 Sumitomo Dainippon Pharma Oncology, Inc. Heterocyclic protein kinase inhibitors
US9745288B2 (en) 2011-08-16 2017-08-29 Indiana University Research And Technology Corporation Compounds and methods for treating cancer by inhibiting the urokinase receptor
CN103814030A (zh) 2011-09-22 2014-05-21 辉瑞大药厂 吡咯并嘧啶及嘌呤衍生物
AU2011378675B2 (en) 2011-10-04 2017-10-05 Epsilogen Ltd IgE anti -HMW-MAA antibody
JP6059731B2 (ja) 2011-10-28 2017-01-11 ノバルティス アーゲー 新規プリン誘導体および疾患の処置におけるその使用
AU2012335247A1 (en) 2011-11-08 2014-05-29 Pfizer Inc. Methods of treating inflammatory disorders using anti-M-CSF antibodies
AR090263A1 (es) 2012-03-08 2014-10-29 Hoffmann La Roche Terapia combinada de anticuerpos contra el csf-1r humano y las utilizaciones de la misma
CA2867464A1 (en) 2012-03-20 2013-09-26 Trustees Of Tufts College Silk reservoirs for drug delivery
WO2013152252A1 (en) 2012-04-06 2013-10-10 OSI Pharmaceuticals, LLC Combination anti-cancer therapy
MX2014012208A (es) 2012-04-13 2015-05-08 Tufts College Metodo y composiciones para preparar una microesfera de seda.
WO2013158367A1 (en) * 2012-04-20 2013-10-24 Annji Pharmaceutical Co., Ltd. Cyclopropanecarboxylate esters of purine analogues
CA2872526A1 (en) 2012-05-16 2013-11-21 Novartis Ag Dosage regimen for a pi-3 kinase inhibitor
US10034945B2 (en) 2012-07-13 2018-07-31 Trustees Of Tufts College Silk powder compaction for production of constructs with high mechanical strength and stiffness
WO2014036022A1 (en) 2012-08-29 2014-03-06 Amgen Inc. Quinazolinone compounds and derivatives thereof
JP6243918B2 (ja) 2012-10-16 2017-12-06 トレロ ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド Ｐｋｍ２調節因子およびそれらの使用方法
CN102887851B (zh) * 2012-11-02 2014-03-19 天津希恩思生化科技有限公司 化合物3,5-二甲基-1h-吡咯-2,4-二甲醛及其制备方法
US9260426B2 (en) 2012-12-14 2016-02-16 Arrien Pharmaceuticals Llc Substituted 1H-pyrrolo [2, 3-b] pyridine and 1H-pyrazolo [3, 4-b] pyridine derivatives as salt inducible kinase 2 (SIK2) inhibitors
CA2905993C (en) 2013-03-14 2022-12-06 Tolero Pharmaceuticals, Inc. Substituted 4-amino-pyrimidinyl-2-amino-phenyl derivatives and pharmaceutical compositions thereof for use as jak2 and alk2 inhibitors
KR20230021768A (ko) 2013-03-15 2023-02-14 트러스티즈 오브 터프츠 칼리지 저분자량 실크 조성물 및 안정화 실크 조성물
US11376329B2 (en) 2013-03-15 2022-07-05 Trustees Of Tufts College Low molecular weight silk compositions and stabilizing silk compositions
US9206188B2 (en) 2013-04-18 2015-12-08 Arrien Pharmaceuticals Llc Substituted pyrrolo[2,3-b]pyridines as ITK and JAK inhibitors
WO2014176458A2 (en) 2013-04-24 2014-10-30 Trustees Of Tufts College Bioresorbable biopolymer anastomosis devices
KR20160058960A (ko) 2013-10-04 2016-05-25 압토스 바이오사이언시스 인코포레이티드 암을 치료하기 위한 조성물과 방법
UA115388C2 (uk) 2013-11-21 2017-10-25 Пфайзер Інк. 2,6-заміщені пуринові похідні та їх застосування в лікуванні проліферативних захворювань
US20170000778A1 (en) 2013-12-06 2017-01-05 Emmanuelle di Tomaso Dosage regimen for an alpha-isoform selective phosphatidylinositol 3-kinase inhibitor
EP3126528B1 (en) 2014-04-04 2021-08-18 Crown Bioscience, Inc. (Taicang) Methods for determining responsiveness to mek/erk inhibitors
WO2015155624A1 (en) 2014-04-10 2015-10-15 Pfizer Inc. Dihydropyrrolopyrimidine derivatives
NZ725496A (en) 2014-04-30 2019-11-29 Pfizer Cycloalkyl-linked diheterocycle derivatives
WO2016001789A1 (en) 2014-06-30 2016-01-07 Pfizer Inc. Pyrimidine derivatives as pi3k inhibitors for use in the treatment of cancer
EP3177320B1 (en) 2014-07-31 2021-01-06 The Government of the United States of America as represented by the Secretary of the Department of Health and Human Services Human monoclonal antibodies against epha4 and their use
WO2016100721A1 (en) 2014-12-17 2016-06-23 Tufts University Injectable, flexible hydroxyapatite-silk foams for osteochondral and dental repair
WO2016097918A1 (en) 2014-12-18 2016-06-23 Pfizer Inc. Pyrimidine and triazine derivatives and their use as axl inhibitors
WO2016112111A1 (en) 2015-01-08 2016-07-14 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Factors and cells that provide for induction of bone, bone marrow, and cartilage
EP3611506B1 (en) 2015-04-20 2021-11-17 Sumitomo Dainippon Pharma Oncology, Inc. Predicting response to alvocidib by mitochondrial profiling
WO2016178876A2 (en) 2015-05-01 2016-11-10 Cocrystal Pharma, Inc. Nucleoside analogs for treatment of the flaviviridae family of viruses and cancer
CA2985804A1 (en) 2015-05-18 2016-11-24 Tolero Pharmaceuticals, Inc. Alvocidib prodrugs having increased bioavailability
WO2017009751A1 (en) 2015-07-15 2017-01-19 Pfizer Inc. Pyrimidine derivatives
JP6811232B2 (ja) 2015-07-20 2021-01-13 タフツ・ユニバーシティ 生分解性シルク耳チューブ
US10568887B2 (en) 2015-08-03 2020-02-25 Tolero Pharmaceuticals, Inc. Combination therapies for treatment of cancer
JP2018532750A (ja) 2015-11-02 2018-11-08 ノバルティス アーゲー ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ阻害剤の投薬レジメン
US20180371551A1 (en) 2015-12-03 2018-12-27 Agios Pharmaceuticals, Inc. Mat2a inhibitors for treating mtap null cancer
US10864299B2 (en) 2016-04-29 2020-12-15 Trustees Of Tufts College Artificial silk based innervated cornea
WO2018006037A1 (en) 2016-07-01 2018-01-04 Trustees Of Tufts College Innervated artificial skin
US11248313B2 (en) 2016-08-01 2022-02-15 Trustees Of Tufts College Biomimetic mechanical tension driven fabrication of nanofibrillar architecture
WO2018060833A1 (en) 2016-09-27 2018-04-05 Novartis Ag Dosage regimen for alpha-isoform selective phosphatidylinositol 3-kinase inhibitor alpelisib
WO2018094275A1 (en) 2016-11-18 2018-05-24 Tolero Pharmaceuticals, Inc. Alvocidib prodrugs and their use as protein kinase inhibitors
CA3047557A1 (en) 2016-12-19 2018-06-28 Tolero Pharmaceuticals, Inc. Profiling peptides and methods for sensitivity profiling
SG11201906223TA (en) 2016-12-22 2019-08-27 Amgen Inc Benzisothiazole, isothiazolo[3,4-b]pyridine, quinazoline, phthalazine, pyrido[2,3-d]pyridazine and pyrido[2,3-d]pyrimidine derivatives as kras g12c inhibitors for treating lung, pancreatic or colorectal cancer
US20200000713A1 (en) 2017-01-20 2020-01-02 Massachusetts Institute Of Technology Injectable polymer micro-depots for controlled local drug delivery
JOP20190272A1 (ar) 2017-05-22 2019-11-21 Amgen Inc مثبطات kras g12c وطرق لاستخدامها
EP3679040B1 (en) 2017-09-08 2022-08-03 Amgen Inc. Inhibitors of kras g12c and methods of using the same
US11497756B2 (en) 2017-09-12 2022-11-15 Sumitomo Pharma Oncology, Inc. Treatment regimen for cancers that are insensitive to BCL-2 inhibitors using the MCL-1 inhibitor alvocidib
WO2019075367A1 (en) 2017-10-13 2019-04-18 Tolero Pharmaceuticals, Inc. PKM2 ACTIVATORS IN COMBINATION WITH OXYGEN REACTIVE SPECIES FOR THE TREATMENT OF CANCER
WO2019089567A1 (en) 2017-10-30 2019-05-09 Massachusetts Institute Of Technology Layer-by-layer nanoparticles for cytokine therapy in cancer treatment
US20210236644A1 (en) 2017-11-10 2021-08-05 Cocoon Biotech Inc. Ocular applications of silk-based products
MA52501A (fr) 2018-05-04 2021-03-10 Amgen Inc Inhibiteurs de kras g12c et leurs procédés d'utilisation
JP7361722B2 (ja) 2018-05-04 2023-10-16 アムジエン・インコーポレーテツド Ｋｒａｓ ｇ１２ｃ阻害剤及び同一物の使用方法
WO2019217691A1 (en) 2018-05-10 2019-11-14 Amgen Inc. Kras g12c inhibitors for the treatment of cancer
AU2019278998B2 (en) 2018-06-01 2023-11-09 Amgen Inc. KRAS G12C inhibitors and methods of using the same
US20190375749A1 (en) 2018-06-11 2019-12-12 Amgen Inc. Kras g12c inhibitors and methods of using the same
MX2020012261A (es) 2018-06-12 2021-03-31 Amgen Inc Inhibidores de kras g12c que comprenden un anillo de piperazina y uso de estos en el tratamiento del cancer.
CN112512597A (zh) 2018-07-26 2021-03-16 大日本住友制药肿瘤公司 用于治疗与acvr1表达异常相关的疾病的方法以及用于此的acvr1抑制剂
JP2020090482A (ja) 2018-11-16 2020-06-11 アムジエン・インコーポレーテツド Ｋｒａｓ ｇ１２ｃ阻害剤化合物の重要な中間体の改良合成法
JP7377679B2 (ja) 2018-11-19 2023-11-10 アムジエン・インコーポレーテツド がん治療のためのｋｒａｓｇ１２ｃ阻害剤及び１種以上の薬学的に活性な追加の薬剤を含む併用療法
US11053226B2 (en) 2018-11-19 2021-07-06 Amgen Inc. KRAS G12C inhibitors and methods of using the same
AU2019391097A1 (en) 2018-12-04 2021-05-20 Sumitomo Pharma Oncology, Inc. CDK9 inhibitors and polymorphs thereof for use as agents for treatment of cancer
MX2021007104A (es) 2018-12-20 2021-08-11 Amgen Inc Inhibidores de kif18a.
CA3123871A1 (en) 2018-12-20 2020-06-25 Amgen Inc. Kif18a inhibitors
EP3898592A1 (en) 2018-12-20 2021-10-27 Amgen Inc. Heteroaryl amides useful as kif18a inhibitors
MA54546A (fr) 2018-12-20 2022-03-30 Amgen Inc Amides d'hétéroaryle utiles en tant qu'inhibiteurs de kif18a
KR20210146290A (ko) 2019-02-12 2021-12-03 스미토모 다이니폰 파마 온콜로지, 인크. 헤테로시클릭 단백질 키나제 억제제를 포함하는 제제
US20230148450A9 (en) 2019-03-01 2023-05-11 Revolution Medicines, Inc. Bicyclic heteroaryl compounds and uses thereof
CN113727758A (zh) 2019-03-01 2021-11-30 锐新医药公司 双环杂环基化合物及其用途
JP2022525149A (ja) 2019-03-20 2022-05-11 スミトモ ダイニッポン ファーマ オンコロジー， インコーポレイテッド ベネトクラクスが失敗した急性骨髄性白血病（ａｍｌ）の処置
US11712433B2 (en) 2019-03-22 2023-08-01 Sumitomo Pharma Oncology, Inc. Compositions comprising PKM2 modulators and methods of treatment using the same
EP3738593A1 (en) 2019-05-14 2020-11-18 Amgen, Inc Dosing of kras inhibitor for treatment of cancers
US11236091B2 (en) 2019-05-21 2022-02-01 Amgen Inc. Solid state forms
CA3142608A1 (en) 2019-06-04 2020-12-10 Cocoon Biotech Inc. Silk-based products, formulations, and methods of use
JP2022542967A (ja) 2019-08-02 2022-10-07 アムジエン・インコーポレーテツド Ｋｉｆ１８ａ阻害剤
JP2022542394A (ja) 2019-08-02 2022-10-03 アムジエン・インコーポレーテツド Ｋｉｆ１８ａ阻害剤として有用なヘテロアリールアミド
CN114391012A (zh) 2019-08-02 2022-04-22 美国安进公司 作为kif18a抑制剂的吡啶衍生物
MX2022001296A (es) 2019-08-02 2022-02-22 Amgen Inc Inhibidores de kif18a.
WO2021081212A1 (en) 2019-10-24 2021-04-29 Amgen Inc. Pyridopyrimidine derivatives useful as kras g12c and kras g12d inhibitors in the treatment of cancer
PE20221278A1 (es) 2019-11-04 2022-09-05 Revolution Medicines Inc Inhibidores de ras
KR20220109407A (ko) 2019-11-04 2022-08-04 레볼루션 메디슨즈, 인크. Ras 억제제
BR112022008534A2 (pt) 2019-11-04 2022-08-09 Revolution Medicines Inc Compostos, composição farmacêutica, conjugado e métodos para tratar câncer e para tratar um distúrbio relacionado à proteína ras
CR20220200A (es) 2019-11-08 2022-07-28 Revolution Medicines Inc Compuestos de heteroarilo bicíclicos y usos de estos
BR112022009390A2 (pt) 2019-11-14 2022-08-09 Amgen Inc Síntese melhorada de composto inibidor de kras g12c
WO2021097207A1 (en) 2019-11-14 2021-05-20 Amgen Inc. Improved synthesis of kras g12c inhibitor compound
CN114980976A (zh) 2019-11-27 2022-08-30 锐新医药公司 共价ras抑制剂及其用途
CA3163703A1 (en) 2020-01-07 2021-07-15 Steve Kelsey Shp2 inhibitor dosing and methods of treating cancer
WO2021155006A1 (en) 2020-01-31 2021-08-05 Les Laboratoires Servier Sas Inhibitors of cyclin-dependent kinases and uses thereof
EP4168002A1 (en) 2020-06-18 2023-04-26 Revolution Medicines, Inc. Methods for delaying, preventing, and treating acquired resistance to ras inhibitors
EP4208261A1 (en) 2020-09-03 2023-07-12 Revolution Medicines, Inc. Use of sos1 inhibitors to treat malignancies with shp2 mutations
US11690915B2 (en) 2020-09-15 2023-07-04 Revolution Medicines, Inc. Ras inhibitors
CN112661639A (zh) * 2020-12-07 2021-04-16 浙江工业大学 一种4-乙酰丁酸酯类化合物合成方法
WO2022140427A1 (en) 2020-12-22 2022-06-30 Qilu Regor Therapeutics Inc. Sos1 inhibitors and uses thereof
EP4334324A1 (en) 2021-05-05 2024-03-13 Revolution Medicines, Inc. Covalent ras inhibitors and uses thereof
CN117616031A (zh) 2021-05-05 2024-02-27 锐新医药公司 用于治疗癌症的ras抑制剂
AU2022270116A1 (en) 2021-05-05 2023-12-21 Revolution Medicines, Inc. Ras inhibitors
AR127308A1 (es) 2021-10-08 2024-01-10 Revolution Medicines Inc Inhibidores ras
WO2023081923A1 (en) 2021-11-08 2023-05-11 Frequency Therapeutics, Inc. Platelet-derived growth factor receptor (pdgfr) alpha inhibitors and uses thereof
WO2023114954A1 (en) 2021-12-17 2023-06-22 Genzyme Corporation Pyrazolopyrazine compounds as shp2 inhibitors
EP4227307A1 (en) 2022-02-11 2023-08-16 Genzyme Corporation Pyrazolopyrazine compounds as shp2 inhibitors
WO2023172940A1 (en) 2022-03-08 2023-09-14 Revolution Medicines, Inc. Methods for treating immune refractory lung cancer
US20230399313A1 (en) * 2022-06-10 2023-12-14 Advenchen Pharmaceuticals, LLC Biological activities of 5-(2-(4-(4-fluoro-2-methyl-1h-indol-5-yloxy)-6-methoxyquinolin-7-yloxy)ethyl)-5-azaspiro[2.4]-heptan-7-ol crystalline, phosphoric acid salt and its enantiomers
WO2023240263A1 (en) 2022-06-10 2023-12-14 Revolution Medicines, Inc. Macrocyclic ras inhibitors

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998007835A2 (en) * 1996-08-21 1998-02-26 Sugen, Inc. Crystal structures of a protein tyrosine kinase

Family Cites Families (36)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3308134A (en) 1965-10-22 1967-03-07 Mcneilab Inc Spiro(indan-2, 3'-indoline)-1, 2'-diones
US3859693A (en) 1973-06-12 1975-01-14 Charles P Breed Sliding snap shackle
US4002749A (en) 1975-08-12 1977-01-11 E. R. Squibb & Sons, Inc. Substituted indolinones
US4053613A (en) 1975-09-17 1977-10-11 E. R. Squibb & Sons, Inc. 1,3,thiazolinyl and 1,3 thiazinyl substituted indolinones
US4966849A (en) 1985-09-20 1990-10-30 President And Fellows Of Harvard College CDNA and genes for human angiogenin (angiogenesis factor) and methods of expression
CA1284681C (en) 1986-07-09 1991-06-04 Alcan International Limited Methods and apparatus for the detection and correction of roll eccentricity in rolling mills
US5217999A (en) 1987-12-24 1993-06-08 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Styryl compounds which inhibit EGF receptor protein tyrosine kinase
GB9004483D0 (en) 1990-02-28 1990-04-25 Erba Carlo Spa New aryl-and heteroarylethenylene derivatives and process for their preparation
ATE114661T1 (de) 1990-04-02 1994-12-15 Pfizer Benzylphosphonsäure-tyrosinkinaseinhibitoren.
US5302606A (en) 1990-04-16 1994-04-12 Rhone-Poulenc Rorer Pharmaceuticals Inc. Styryl-substituted pyridyl compounds which inhibit EGF receptor tyrosine kinase
WO1992007830A2 (en) 1990-10-29 1992-05-14 Pfizer Inc. Oxindole peptide antagonists
ES2108120T3 (es) 1991-05-10 1997-12-16 Rhone Poulenc Rorer Int Compuestos bis arilicos y heteroarilicos mono- y biciclicos que inhiben tirosina quinasa receptora de egf y/o pdgf.
US5480883A (en) 1991-05-10 1996-01-02 Rhone-Poulenc Rorer Pharmaceuticals Inc. Bis mono- and bicyclic aryl and heteroaryl compounds which inhibit EGF and/or PDGF receptor tyrosine kinase
EP0586608A1 (en) 1991-05-29 1994-03-16 Pfizer Inc. Tricyclic polyhydroxylic tyrosine kinase inhibitors
AU661533B2 (en) 1992-01-20 1995-07-27 Astrazeneca Ab Quinazoline derivatives
DE69329240D1 (de) 1992-05-20 2000-09-21 Merck & Co Inc 17-ether und thioether von 4-aza-steroiden
SK283413B6 (sk) 1992-08-06 2003-07-01 Warner-Lambert Company 2-Tioindoly, 2-indolíntióny a polysulfidy, ich selénové analógy a farmaceutické prostriedky na ich báze
US5330992A (en) 1992-10-23 1994-07-19 Sterling Winthrop Inc. 1-cyclopropyl-4-pyridyl-quinolinones
ES2173873T5 (es) 1992-10-28 2007-03-01 Genentech, Inc. Utilizacion de anticuerpos anti-vegf para el tratamiento del cancer.
US6177401B1 (en) 1992-11-13 2001-01-23 Max-Planck-Gesellschaft Zur Forderung Der Wissenschaften Use of organic compounds for the inhibition of Flk-1 mediated vasculogenesis and angiogenesis
GB9226855D0 (en) 1992-12-23 1993-02-17 Erba Carlo Spa Vinylene-azaindole derivatives and process for their preparation
WO1995024190A2 (en) 1994-03-07 1995-09-14 Sugen, Inc. Receptor tyrosine kinase inhibitors for inhibiting cell proliferative disorders and compositions thereof
GB9412719D0 (en) 1994-06-24 1994-08-17 Erba Carlo Spa Substituted azaindolylidene compounds and process for their preparation
GB9423997D0 (en) * 1994-11-28 1995-01-11 Erba Carlo Spa Substituted 3-arylidene-7-azaoxindole compounds and process for their preparation
GB9501567D0 (en) 1995-01-26 1995-03-15 Pharmacia Spa Hydrosoluble 3-arylidene-2-oxindole derivatives as tyrosine kinase inhibitors
US5786488A (en) 1996-11-13 1998-07-28 Sugen, Inc. Synthetic methods for the preparation of indolyquinones
US5880141A (en) * 1995-06-07 1999-03-09 Sugen, Inc. Benzylidene-Z-indoline compounds for the treatment of disease
WO1998007695A1 (en) * 1996-08-23 1998-02-26 Sugen, Inc. Indolinone combinatorial libraries and related products and methods for the treatment of disease
WO1998024432A2 (en) 1996-12-05 1998-06-11 Sugen, Inc. Use of indolinone compounds as modulators of protein kinases
EP1014953B1 (en) 1997-03-05 2012-04-25 Sugen, Inc. Formulations for hydrophobic pharmaceutical agents
AU6887698A (en) 1997-04-08 1998-10-30 Sugen, Inc. Study and treatment of diseases related to specific cellular functions of receptor protein tyrosine kinases
ES2239393T3 (es) 1997-05-07 2005-09-16 Sugen, Inc. Derivados de 2-indolinona utilizados como moduladores de la actividad de la proteina-quinasa.
EP1007042A4 (en) 1997-06-13 2001-07-04 Sugen Inc NEW HETEROCYCLIC COMPOUNDS FOR MODULATING THE PROTEIN-TYROSIN-ENZYME-RELATED CELLULAR SIGNAL TRANSDUCTION
GB9716557D0 (en) 1997-08-06 1997-10-08 Glaxo Group Ltd Benzylidene-1,3-dihydro-indol-2-one derivatives having anti-cancer activity
WO1999048868A2 (en) 1998-03-26 1999-09-30 Sugen, Inc. Heterocyclic classes of compounds for the modulating tyrosine protein kinase
CA2314156C (en) 1998-05-29 2010-05-25 Sugen, Inc. Pyrrole substituted 2-indolinone protein kinase inhibitors

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998007835A2 (en) * 1996-08-21 1998-02-26 Sugen, Inc. Crystal structures of a protein tyrosine kinase

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
J Med Chem 1998, 41, 2588-2603
Science, Vol.276, P.955-960, 1997

Also Published As

Publication number Publication date
EP1082305A1 (en) 2001-03-14
HUP0103617A2 (hu) 2002-02-28
IL139934A (en) 2007-10-31
JP4528440B2 (ja) 2010-08-18
AU4410299A (en) 1999-12-13
NZ508815A (en) 2005-02-25
EA200001258A1 (ru) 2001-08-27
EP2020408B1 (en) 2013-06-26
EP1082305A4 (en) 2001-09-26
TR200003514T2 (tr) 2002-05-21
NO20005916D0 (no) 2000-11-22
IL139934A0 (en) 2002-02-10
HK1126770A1 (en) 2009-09-11
BR9910792A (pt) 2002-01-29
CA2314156C (en) 2010-05-25
CO5031249A1 (es) 2001-04-27
KR20010083039A (ko) 2001-08-31
NO20005916L (no) 2001-01-29
CN1311775A (zh) 2001-09-05
JP2002516310A (ja) 2002-06-04
NO318083B1 (no) 2005-01-31
PL344477A1 (en) 2001-11-05
TWI229073B (en) 2005-03-11
CN1250526C (zh) 2006-04-12
ES2429573T3 (es) 2013-11-15
CA2314156A1 (en) 1999-12-02
US6395734B1 (en) 2002-05-28
WO1999061422A1 (en) 1999-12-02
AR018408A1 (es) 2001-11-14
US7119090B2 (en) 2006-10-10
PT2020408E (pt) 2013-09-13
SK18062000A3 (sk) 2001-06-11
US20030105151A1 (en) 2003-06-05
DK2020408T3 (da) 2013-09-30
EA005032B1 (ru) 2004-10-28
EP2020408A1 (en) 2009-02-04
SK287132B6 (sk) 2009-12-07
AU759226B2 (en) 2003-04-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR100743287B1 (ko) 피롤기로 치환된 2-인돌리논 단백질 인산화 효소 억제제
US6316429B1 (en) Bicyclic protein kinase inhibitors
US6642251B1 (en) Geometrically restricted 2-indolinone derivatives as modulators of protein kinase activity
WO2000008202A2 (en) 3-methylidenyl-2-indolinone modulators of protein kinase
JP2002511852A (ja) 蛋白質キナーゼ活性の調節剤としての２−インドリノン誘導体
KR20010108063A (ko) 단백질 인산화 효소의 조절 및 암의 화학적 치료를 위한3-헤테로아릴리데닐-2-인돌리논 화합물
US20030069421A1 (en) 3-(Piperazinylbenzylidenyl)-2-indolinone compounds and derivatives as protein tyrosine kinase inhibitors
US7214700B2 (en) (2-Oxindol-3-ylidenyl) acetic acid derivatives and their use as protein kinase inhibitors
US6531502B1 (en) 3-Methylidenyl-2-indolinone modulators of protein kinase
MXPA00011770A (en) Pyrrole substituted 2-indolinone protein kinase inhibitors
CZ20004412A3 (cs) Pyrrolem substituované 2-indoIinony jako inhibitory proteinkinázy

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
AMND Amendment
E902 Notification of reason for refusal
AMND Amendment
E601 Decision to refuse application
AMND Amendment
J201 Request for trial against refusal decision
E902 Notification of reason for refusal
B701 Decision to grant
GRNT Written decision to grant
G170 Re-publication after modification of scope of protection [patent]
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20130628

Year of fee payment: 7

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20140627

Year of fee payment: 8

LAPS Lapse due to unpaid annual fee