SK18062000A3 - Pyrolom substituované 2-indolinóny ako inhibítory proteínkináz - Google Patents

Description

Predložený vynález sa všeobecne týka organickej chémie, biochémie, farmakológie a medicíny. Predovšetkým sa týka na nových pyrolom substituovaných 2-indolinónov a ich fyziologicky prijateľných solí a prekurzorov liečiv, ktoré modulujú aktivitu proteínkináz („PK“), z čoho je možné usudzovať, že vykazujú pozitívne účinky pri ochoreniach, ktoré sú spojené s abnormálnou aktivitou PK.

Doterajší stav techniky

Nasledujúci text je tu uvedený len ako opis doterajšieho stavu techniky a nemá byť chápaný ako stav techniky predloženého vynálezu.

PK sú enzýmy, ktoré katalyzujú fosforyláciu hydroxy skupín na tyrozínovom, serínovom a treonínovom zvyšku proteínov. Následky tejto zdanlivo jednoduchej činnosti sú enormné; rast buniek, diferenciácia a proliferácia, tzn. prakticky všetky aspekty bunkového života závisia na aktivite PK. Okrem toho bola abnormálna aktivita PK spojovaná s ochoreniami hostiteľa, v rozmedzí od relatívne život neohrozujúcich ochorení, napr. psoriáza, až po extrémne virulentné ochorenia, napr. glioblastóm (rakovina mozgu). PK môžu byť prakticky rozdelené na dve triedy, proteín tyrozínkinázu (PTK) a serín/treonín kinázu (STK).

Jeden z hlavných aspektov aktivity PTK je ich participácia s receptormi rastového faktoru. Receptory rastového faktoru sú povrchové proteíny bunky. Pokiaľ sa naviažu ligandom rastového faktoru, sú receptory rastového faktoru konvertované na aktívne formy, ktoré interagujú s proteínmi na vnútornom po·· • · ···· · · · · · • · · · · · · • ···· · · · · • · · · · · · ···· ···· ·· ···· ·· · vrchu bunkovej membrány, čo vedie k fosforylácii na tyrozínovom zvyšku receptoru a ďalších proteínoch a k tvoreniu komplexov vo vnútri bunky s rôznymi cytoplazmatickými signálnymi molekulami, ktoré ovplyvňujú mnoho bunkových reakcií, napr. bunkové delenie (proliferáciu), bunkovú diferenciáciu, rast bunky, expresiu metabolických účinkov do extracelulárneho mikropriestoru, atď. Detailnejší opis viď Schlessinger and Ullrich, Neurón, 9:303-391 (1992), tu je uvedený ako odkaz.

Receptory rastového faktoru, ktoré majú PTK aktivitu, sú známe ako tyrozínkinázové receptory (RTK). Obsahujú veľkú skupinu transmembránových receptorov s rozdielnou biologickou aktivitou. V súčasnosti bolo identifikovaných aspoň devätnásť (19) odlišných podskupín RTK, napr. podskupina označená „HER“ RTK, ktorá zahrnuje EGFR (epiteiiálny receptor rastového faktoru), HER2, HER3 a HER4. Tieto RTK sa skladajú z väzbovej domény extracelulárneho glykozylovaného ligandu, transmembránovej domény a intracelulárnej cytoplazmatickej katalytickej domény, ktorá môže fosforylovať tyrozínové zvyšky na proteínoch.

Ďalšie podskupiny RTK sa skladajú z receptora inzulínu (IR), receptora rastového faktoru I (IGF-1R), ktorý je podobný receptoru inzulínu, a receptoru príbuzného receptoru inzulínu (IR). IR a IGF-1R interagujú s inzulínom, IGF-I a IGF-II za vzniku heterotetraméru dvoch úplne glykozylovaných extracelulárnych podjednotiek a a dvoch podjednotiek β, ktoré pretínajú bunkovú membránu, a ktoré obsahujú tyrozínkinázovú doménu.

Tretia podskupina RTK je označovaná ako skupina receptora rastového faktoru doštičkového charakteru (PDGFR), ktorá zahrnuje PDGFRa, PDGFRp, CSFIR, c-kit a c-fms. Tieto receptory sa skladajú z glykozylovaných extracelulárnych oblastí zložených z rôzneho množstvo slučiek podobných imuglobulínu a intracelulárnych domén, kde tyrozínkinázová doména je prerušená nepríbuznými sekvenciami aminokyselín.

Iná skupina, ktorá, vďaka svojej podobnosti na podskupinu PDGFR, je niekedy zaraďovaná do novšej skupiny, podskupina receptoru plodovej pečeňovej kinázy (flk). Bola vyslovená domnienka, že táto skupina je vytvorená ·· ·· ·· • · · · ···· · · ·· • ··· ···· • · · · · · · · · · • · · · · · · · ········ ·· ···· ·· ··· z receptoru fetálnej pečeňovej kinázy 1, (KDR/FLK-1), flk-lR, flk-4 a fms- ako tyrozínkináza 1 (flt-1), vloženého do oblasti kinázy.

v

Ďalší člen skupiny receptoru rastového faktoru tyrozinkinázy je podskupina fibroblastického rastového faktoru (FGF). Táto skupina je zložená zo štyroch receptorov, FGFR1-4, a siedmich ligandov, FGF1-7. Zatiaľ ešte nie je dostatočne opísaný, zdá sa, že sa receptory skladajú z glykozylovaných extracelulárnych oblastí obsahujúcich rôzne množstvo slučiek podobných imuglobulínu a intracelulárnych oblastí, kde tyrozínkinázová oblasť je prerušená nepríbuznými sekvenciami aminokyselín.

Ďalší člen skupiny receptoru rastového faktoru tyrozinkinázy je podskupina vaskulárneho endoteliálneho receptoru rastového faktoru (VEGF). VEGF je dimérny glykoproteín podobný PDGF, ale má odlišné biologické funkcie a in vivo špecifické cieľové bunky. Najmä o VEGF sa teraz uvažuje v súvislosti s jeho hlavnou úlohou pri vaskulárnej genéze a angiogenéze. Ucelenejší prehľad známych podskupín RTK je možné nájsť v Plowman et al., DN&P, 7(6): 334-339 (1994), tuje pripojený ako odkaz.

Okrem RTK existuje tiež skupina úplne intracelulárnych PTK nazývaná „nereceptorové tyrozinkinázy“ alebo „bunkové tyrozinkinázy“. Toto posledné označenie bude ďalej skrátené na CTK. CTK neobsahujú extracelulárne a transmembránové oblasti. Do súčasnej doby bolo indentifikovaných cez 24 CTK v 11 podskupinách (Src, Frk, Btk, Csk, Abl, Zap70, Fes, Fps, Fak, Jak a Ack). Podskupina Src vypadá na to, že bude najväčšou skupinou CTK a zahrnuje Src, Yes, Fyn, Lyn, Lck, Blk, Hck, Fgr a Yrk. Podrobnejší prehľad tykajúci sa CTK viď Bolen, Oncogene, 8:2025-2031 (1993), tu je pripojený ako odkaz.

Serín/treonínkinázy, ďalej len STK, podobné CTK, sú prevažne intracelulárne, aj keď je tu niekoľko receptorových kináz typu STK. Z cytozólových kináz sú najbežnejšie STK; t.j. kinázy, ktoré vykonávajú svoju funkciu v tejto časti cytoplazmy mimo cytoplazmatických organel a cytoskeletu. Cytozól je oblasť v bunke, kde prebieha mnoho intermediálnych metabolických a biosyn• · • · · · • · · · · · ···· · · · · • · · · · ·· ·· ···· ·· · tetických aktivít bunky; napr. v cytozóle sa na ribozómoch syntetizujú proteíny.

Dokázala sa účasť RTK, CTK a STK na patogénnych ochoreniach hostiteľa, vrátane, a to významne, rakoviny. Iné patogénne ochorenia, ktoré boli spojené s PTK zahrnujú, ale nie je to nijak obmedzené, psoriázu, cirhózu pečene, diabetes, angiogenézu, restenózu, očné ochorenie, reumatoidnú artritídu, a iné zápalové ochorenia, imunologické poruchy napr. autoimunitná choroba, kardiovaskulárne ochorenie, napr. aterosklerózu a rôzne renálne poruchy.

Čo sa týka rakoviny, tak dve hlavné hypotézy objasňujú nadmernú bunkovú proliferáciu, ktorá je motorom rakovinového bujnenia spojeného s funkciami, o ktorých je známe, že sú regulované (riadené) PK. T.j., bol vyslovený predpoklad, že malígny bunkový rast vzniká nabúraním mechanizmov, ktoré regulujú (riadia) bunkové delenie a/alebo bunkovú diferenciáciu. Bolo uvedené, že tvorba proteínov mnohých proto-onkogénov je zahrnutá v signálnych cestách transdukcie, ktoré regulujú (riadia) bunkový rast a diferenciáciu. Tieto proteínové produkty proto-onkogénov zahrnujú extracelulárne rastové faktory, transmembránové receptory PTK rastového faktoru (RTK), cytoplazmatické PTK (CTK) a cytozólové STK, ako je uvedené vyššie.

Vzhľadom na zdanlivú spojitosť medzi bunkovými aktivitami súvisiacimi s PK a širokou paletou ľudských porúch, nie je prekvapením, že bolo vynaložené veľké úsilie pri pokusoch identifikovať spôsoby modulovania aktivity PK. Niektoré z týchto pokusov sa týkali biomimetických metód realizovaných pomocou veľkých molekúl modelovaných pre účinné bunkové spracovanie (napr. mutantné ligandy (U.S. App. No. 4,966,849); rozpustné receptory a protilátky (App. No. WO 94/10202, Kendall and Tomas, Proc. Naťl Acad. Sci., 90: 10705-09 (1994), Kim, et al., Náture, 362: 841-844 (1993)); ligandy RNA (Jelinek, et al., Biochemistry, 33: 10450-56); Takano, et al., Mol, Bio, Celí 4: 358A (1993); Kinsella, et al., Exp. Celí Res. 199: 56-62 (1992); Wright, et al., J. Cellular Phys., 152: 448-57) a inhibítory tyrozínkinázy (WO 94/03427; WO 92/21660; WO 91/15495; WO 94/14808; U.S. Pat. No. 5,330,992; Mariani, et al., Proc. Am. Assoc. Cancer Res., 35: 2268 (1994)).

·· • · • · · · · · · • ···· · · · · • · · · · · ···· ···· ·· ···· ·· ·

Okrem vyššie uvedeného, boli uskutočňované pokusy na identifikovanie malých molekúl, ktoré reagujú ako inhibítory PK. Ako inhibítory tyrozínkinázy boli opísané napr. bis-monocyklické, bicyklické a heterocyklické arylové zlúčeniny (PCT WO 92/20642), deriváty vinylén-azaindolu (PCT WO 94/14808) a l-cyklopropyl-4-pyridylchinolóny (U.S. Pat. No. 5,330,992). Ako inhibítory PTK účinné pri ošetrení rakoviny boli opísané styrylové zlúčeniny (U.S. Pat. No. 5,217,999), pyridylové zlúčeniny substituované styrylom (U.S. Pat. No. 5,302,606), deriváty chinazolínu (EP App. No. 0 566 266 Al), selénindoly a selenidy (PCT WO 94/03427), tricyklické polyhydroxylové zlúčeniny (PCT WO 92/21660) a zlúčeniny benzylfosfónovej kyseliny (PCT WO 91/15495).

Podstata vynálezu

Naše úsilie identifikovať malé organické molekuly, ktoré modulujú aktivitu proteínkináz a pri ktorých sa teda dá očakávať, že budú užitočné pri liečbe a prevencii porúch súvisiacich s abnormálnou aktivitou proteínkináz, nás viedlo k objavu rodiny nových zlúčenín, pyrolom substituovaných 2indolinónov, ktoré vykazujú schopnosť modulovať aktivitu proteínkináz, a teda je možné očakávať, že majú priaznivý účinok na poruchy odvodené od abnormálnych aktivít proteínkináz. Sú to tieto zlúčeniny, ktoré sú predmetom tohto vynálezu.

Tak sa tento vynález všeobecne týka nových pyrolom substituovaných 2indolinónov, ktoré modulujú aktivity receptorových tyrozínkináz (RTK), nereceptorových proteíntyrozínkináz (CTK) a serín/treonínproteínkináz (STK). Ďalej sa tento vynález týka prípravy a použitia farmaceutického zloženia tu predkladaných zlúčenín a ich fyziologicky prijateľných solí a prekurzorov liečiv na liečbu a prevenciu porúch súvisiacich s proteínkinázami, ako je napríklad, ale nie len, rakovina, diabetes, cirhóza pečene, kardiovaskulárne ochorenie ako ateroskleróza, angiogenéza, imunologické ochorenia ako autoimunitné ochorenie a obličkové ochorenie.

Termíny 2-indolinón,indolin-2-ón a 2-oxindol sú tu zameniteľné a vzťahujú sa na molekulu, ktorá má chemickú štruktúru:

Termín pyrol sa vzťahuje na molekulu, ktorá má chemickú štruktúru:

R

Termíny pyrolom substituovaný 2-indolinón a 3-pyrolidenyl-2-indolinón sú tu zameniteľné a vzťahujú sa na chemickú zlúčeninu s všeobecnou štruktúrou danou vzorcom 1.

Termín farmaceutická kompozícia sa vzťahuje na zmesi jednej alebo viacerých zložiek, fyziologicky prijateľných solí alebo ich prekurzorov liečiv, s ďalšími chemickými zložkami ako sú napr. fyziologicky prijateľné nosiče a vehikulum. Zámerom použitia farmaceutickej kompozície je uľahčiť aplikáciu zlúčeniny do organizmu.

Termín prekurzor liečivo (proliečivo) sa týka chemického prostriedku, ktorý je premenený v materské liečivo in vivo. Proliečivo sú často užitočné, pretože môžu byť, v niektorých prípadoch, ľahšie aplikované než materské liečivo. Môžu byť napríklad biologicky dostupné na perorálne podávanie, zatiaľ čo materské liečivo nie. Proliečivo môže byť tiež lepšie rozpustné v farmaceutických kompozíciách než materské liečivo. Príkladom proliečivo by okrem iného, mohla byť zlúčenina podľa vynálezu, ktorá je podávaná ako ester (proliečivo), aby sa uľahčil prestup cez membránu bunky, kde je rozpustnosť vo vode škodlivá z dôvodov pohyblivosti, ale potom je metabolický hydrolyzovaná na karboxylovú kyselinu, aktívnu látku, ktorá je už vo vnútri bunky, kde je rozpustnosť vo vode prospešná.

• · • ·

9 • · ··· · · · ···· 9999 99 9999 99 999

Ďalším príkladom by mohol byť krátky polypeptid, napríklad, okrem iného, 2-10 polypeptidová aminokyselina, naviazaná cez koncovú amino skupinu na karboxylovú skupinu tejto zlúčeniny podľa vynálezu, v ktorej je polypeptid hydrolyzovaný alebo metabolizovaný in vivo, aby uvoľnil aktívnu molekulu.

Termín pyrolaldehyd sa vzťahuje na molekulu majúcu chemickú štruktúru:

R

Ako tu bolo použité, fyziologicky prijateľný nosič sa týka nosiča alebo riedidla, ktoré nespôsobí významné podráždenie organizmu a nezruší biologickú aktivitu a vlastnosti podávanej zlúčeniny.

Termín vehikulum sa vzťahuje na inertnú látku, ktorá sa pridáva do farmaceutickej kompozície na ďalšie uľahčenie podávania zlúčeniny. Príklady pomocných látok, okrem iných, zahrnujú uhličitan vápenatý, fosforečnan vápenatý, rôzne cukry a typy škrobov, celulózové deriváty, želatínu, rastlinné oleje a polyetylénové glykoly.

1. Chémia

A. Všeobecné štrukturálne charakteristiky

V jednom smere sa predkladaný vynález vzťahuje na pyrolom substituované 2-indolinóny, ktoré sú navyše okrem toho voliteľne nahradzované ako pyrolovými tak 2-indolinovými časťami zlúčeniny, a ktoré sú nevyhnutne nahradzované v pyrolovej časti jedným alebo viacerými uhľovodíkovými reťazcami, ktoré sú sami nahradzované najmenej raz polárnou skupinou. Fyziologicky prijateľné soli alebo proliečivo požadovanej zlúčeniny sú tiež predmetom skúmania tohto vynálezu.

·· ·· ·· *· ·· • · · · · · · · ··· • · · · · · · • · · · · · · ···· ···· ·· ···· ·· ·

Termín uhľovodíkový reťazec sa, ako tu bolo definované, vzťahuje na alkyl, alkenyl alebo alkinyl.

Termín polárna skupina sa vzťahuje na skupinu, v ktorej sú jadrá atómov navzájom kovalentne viazané jeden k druhému tak, že tvoria skupinu, ktorá nezdieľa elektróny kovalentnej väzby, je spojujúca, rovnakou mierou teda elektrónový oblak je hustejší okolo jedného atómu než okolo druhého. Výsledkom je, že jeden koniec kovalentnej väzby je relatívne záporný a druhý relatívne kladný, t.j. existuje záporný a kladný čiastkový náboj. Príklady polárnych skupín, okrem iného, zahrnujú hydroxy skupinu, alkoxy skupinu, karboxy skupinu, nitro skupinu, kyano skupinu, amino skupinu, amónium, amido skupinu, ureido, sulfónamidy, sulfinyly, sulfonily, fosfonyly, morfolino, piperazinyl a tetrazol.

Tým, že prihlasovatelia nie sú viazaní žiadnou teóriou, v tento okamih veria, že polárne skupiny môžu navzájom pôsobiť elektrónovo, napríklad, okrem iného, cez vodíkové väzby, Van der Wallsove väzby alebo iónové väzby (nie kovalentné), s amino kyselinami v aktívnom mieste PTK. Tieto interakcie môžu pomáhať molekule podľa vynálezu, aby sa naviazala na aktívne miesto s dostatočnou pevnosťou tak, že sťažuje alebo zabraňuje prírodnému substrátu zaujať toto miesto. Polárne skupiny môžu taktiež prispieť k selektivite zlúčeniny, t.j., jedna polárna skupina môže mať väčšiu afinitu k PTK väzbovej oblasti než iná polárna skupina, takže zlúčenina obsahujúca prvú určitú polárnu skupinu je pravdepodobnejšie viazaná než zlúčeniny obsahujúce iné polárne skupiny.

Teda, jeden aspekt predkladaného vynálezu sa týka zlúčeniny majúcej nasledujúcu chemickú štruktúru:

• ·

R¹ je vybraný zo skupiny pozostávajúcej z atómu vodíka, alkylu, alkenylu, cykloalkylu, arylu, hydroxy skupiny, alkoxy skupiny, C-karboxy skupiny, acetylu, C-amidu, C-tioamidu, sulfonylu a trihalogenmetánsulfonylu.

R² je vybraný zo skupiny pozostávajúcej z atómu vodíka, halogénu, alkylu, cykloalkylu, arylu, heteroarylu a heteroalicyklu.

R³ ,R⁴, R⁵ a R⁶ sú nezávisle vybrané zo skupiny pozostávajúcej z atómu vodíka, alkylu, trihalogenalkylu, cykloalkylu, alkenylu, arylu, heteroarylu, heteroalicyklu, hydroxy skupiny, alkoxy skupiny, aryloxy skupiny, merkapto skupiny, alkyltio skupiny, aryltiol skupiny, sulfinylu, sulfonylu, S-sulfónamidu, N-sulfónamidu, trihalogenmetánsulfónamidu, karbonylu, C-karboxy skupiny, O-karboxy skupiny, C-amidu, N-amidu, kyano skupiny, nitro skupiny, halogénu, O-karbamylu, N-karbamylu, O-tiokarbamylu, N-tiokarbamylu, amino skupiny a -NR^]1R¹²,

R¹¹ a R¹² sú nezávisle vybrané zo skupiny pozostávajúcej z atómu vodíka, alkylu, cykloalkylu, arylu, karbonylu, acetylu, sulfonylu, trifluórmetánsulfonylu a kombinovaných päť- alebo šesť-členných heteroalicyklov.

R³ a R⁴, R⁴ a R⁵, alebo R⁴ a R⁵ sa môžu spojiť a vytvoriť šesť-členný arylový kruh, metyléndioxy skupinu alebo etyléndioxy skupinu.

R je vybraný zo skupiny pozostávajúcej z atómu vodíka, alkylu, cykloalkylu, alkenylu, alkinylu, arylu, heteroarylu, heteroalicyklu, hydroxy skupiny, alkoxy skupiny, aryloxy skupiny, karbonylu, acetylu,C-amidu, C-tioamidu, amidínu, C-karboxy skupiny, O-karboxy skupiny, sulfonylu a trihalogenmetánsulfonylu.

R⁸, R⁹ a R¹⁰ sú nezávisle vybrané zo skupiny pozostávajúcej z atómu vodíka, alkylu, trihalogenalkylu, cykloalkylu, alkenylu, alkinylu, arylu, heteroarylu, heteroalicyklu, hydroxy skupiny, alkoxy skupiny, aryloxy skupiny, merkapto skupiny, alkyltio skupiny, aryltio skupiny, sulfinylu, sulfonylu, Ssulfónamidu, N-sulfónamidu, karbonylu, C-karboxy skupiny, O-karboxy skupiny, kyano skupiny, nitro skupiny, halogénu, O-karbamylu, N-karbamylu, 0tiokarbamylu, N-tiokarbamylu, C-amidu, N-amidu, amino skupiny a -NR^UR¹², za predpokladu, že najmenej jeden z R⁸, R⁹ alebo R¹⁰ je skupina majúca vzorec -(alki)Z.

Alkj je vybraný zo skupiny pozostávajúcej z alkylu, alkenylu alebo alkinylu.

Z je polárna skupina.

Ako bude ďalej používané, termín alkyl sa vzťahuje na saturovaný alifatický uhľovodík, vrátane priameho reťazca a postranných reťazcov. Vo väčšine prípadov, alkyl má 1 až 20 uhlíkových atómov (kdekoľvek sa ďalej v texte uvedie numerické rozpätie; napr. 1 - 20, znamená to, že skupina, v tomto prí pade alkyl, môže obsahovať 1 uhlíkový atóm, 2 uhlíkové atómy, 3 uhlíkové atómy, atď. až do 20 uhlíkových atómov vrátane). Často je to alkyl strednej veľ kosti majúci 1 až 10 uhlíkových atómov. Najčastejšie je to nižší alkyl majúci 1 až 4 uhlíkové atómy. Alkyl môže a nemusí byť substituovaný. Ak je substituo vaný, substituent je najčastejšie jedna alebo viac skupín vybraných nezávisle z cykloalkylu. arylu, heteroarylu, heteroalicyklu, hydroxy skupiny, alkoxy skupiny, aryloxy skupiny, merkapto skupiny, alkyltio skupiny, aryltio skupiny, kyano skupiny, halogénu, karbonylu, tiokarbonylu, O- karbamylu, N-karbamylu,

O-tiokarbamylu, N-tiokarbamylu, C-amidu, N-amidu, C-karboxy skupiny, O-

··

1110 11 10 karboxy skupiny, nitro skupiny, silylu, amino skupiny a -NR R , s R a R ako bolo definované vyššie.

Termín cykloalkyl sa vzťahuje na uhlíkový monocyklus alebo spojený kruh (tzn. kruhy, ktoré zdieľajú susedný pár uhlíkových atómov), skupinu, kde jeden alebo viac kruhov nemá kompletne konjugovaný Π-elektrónový systém. Príklady cykloalkylov, okrem iného, sú cyklopropán, cyklobután, cyklopentán, cyklopentén, cyklohexán, adamantan, cyklohexadién, cykloheptán a cykloheptatrién. Cykloalkyl môže alebo nemusí byť substituovaný. Ak je substituovaný, substituent je najčastejšie jedna alebo viac skupín vybraných nezávisle z alkylu, arylu, heteroarylu, heteroalicyklu, hydroxy skupiny, alkoxy skupiny, aryloxy skupiny, merkapto skupiny, alkyltio skupiny, aryltio skupiny, kyano skupiny, halogénu, karbonylu, tiokarbonylu, C-karboxy skupiny, O-karboxy skupiny, O-karbamylu, N-karbamylu, C-amidu, N-amidu, nitro skupiny, amino skupiny a -NR^UR¹², s R¹¹ a R¹² ako bolo definované vyššie.

Termín alkenyl sa vzťahuje na alkyl, ako bolo definované, obsahujúci najmenej dva uhlíkové atómy a najmenej jednu uhlík-uhlík dvojnásobnú väzbu.

Termín alkinyl sa vzťahuje na alkyl, ako bolo definované, obsahujúci najmenej dva uhlíkové atómy a najmenej jednu uhlík-uhlík trojnásobnú väzbu.

Termín aryl sa vzťahuje na uhlíkový monocyklické alebo polycyklické kruhy (tzn.. kruhy, ktoré zdieľajú susedné páry uhlíkových atómov), skupinu majúcu kompletne konjugovaný Π-elektrónový systém. Príklad arylu, okrem iného, je fenyl, naftalenyl a antracenyl. Aryl môže a nemusí byť substituovaný. Ak je substituovaný, substituent je najčastejšie jedna alebo viac skupín vybraných z halogénu, trihalogénmetylu, alkylu, hydroxy skupiny, alkoxy skupiny, aryloxy skupiny, merkapto skupiny, alkyltio skupiny, aryltio skupiny, kyano skupiny, nitro skupiny, karbonylu, tiokarbonylu, C-karboxy skupiny, 0karboxy skupiny, O-karbamylu, N-karbamylu, O-tiokarbamylu, Ntiokarbamylu, C-amidu, N-amidu, sulfinylu, sulfonylu, amino skupiny a NR^hR¹², s R¹’ a R¹² ako bolo definované.

• ·

·· ·· ·· •· · •· • ·· •· ·· ·

Ako bude ďalej používané, termín heteroaryl sa vzťahuje na monocyklické alebo spojené kruhy (tzn., kruhy, ktoré zdieľajú susedné páry atómov), skupinu majúcu v kruhu (hoch) jeden alebo viac atómov vybraných zo skupiny pozostávajúcej z dusíka, kyslíka a síry, a ďalej, ktorá má kompletne konjugovaný pí-elektrónový systém. Príklad heteroarylu, okrem iného, je pyrol, furán, tiofén, imidazol, oxazol, tiazol, pyrazol, pyridín, pyrimidín, chinolín, izochinolín, purín a karbazol. Heteroaryl môže a nemusí byť substituovaný. Ak je substituovaný, substituent je najčastejšie jedna alebo viac skupín vybraných z alkylu, cykloalkylu, halogénu, trihalogénmetylu, hydroxy skupiny, alkoxy skupiny, aryloxy skupiny, merkapto skupiny, alkyltio skupiny, aryltio skupiny, kyano skupiny, nitro skupiny, karbonylu, tiokarbonylu, sulfónamidu, C-karboxy skupiny, O-karboxy skupiny, sulfinylu, sulfonylu, O-karbamylu, N-karbamylu O-tiokarbamylu, N-tiokarbamyl, C-amidu, N-amidu, amino skupiny a -NR R , s R¹¹ a R¹² ako bolo definované.

Termín heteroalicyklická skupinasa vzťahuje na monocyklický alebo kondenzovaný kruh majúci v kruhu (hoch) jeden alebo viac atómov vybraných zo skupiny pozostávajúcej z dusíka, kyslíka a síry. Kruh môže mať jednu alebo viac dvojnásobných väzieb. Kruh však nemá kompletne konjugovaný píelektrónový systém. Heteroalicyklus môže a nemusí byť substituovaný. Ak je substituovaný, substituent je najčastejšie jedna alebo viac skupín vybraných z alkylu, cykloaklylu, halogénu, trihalogénmetylu, hydroxy skupiny, alkoxy skupiny, aryloxy skupiny, merkapto skupiny, alkyltio skupiny, aryltio skupiny, kyano skupiny, nitro skupiny, karbonylu, tiokarbonylu, C-karboxy skupiny, 0karboxy skupiny, O-karbamylu, N-karbamylu, O-tiokarbamylu, Ntiokarbamylu, sulfinylu, sulfonylu, C-amidu, N-amidu, amino skupiny a NRⁿR¹², s R¹¹ a R¹² ako bolo definované.

Termín hydroxy skupina sa týka -OH skupiny.

Termín alkoxy skupina sa týka ako -O-alkylu, tak -O-cykloalkylu, ako bolo definované.

Termín aryloxy skupina sa týka ako -O-arylu, tak -O-heteroarylu, ako bolo definované.

• · · · · ··· ···· ···· ·· ···· ·· ···

Termín merkapto skupina sa týka -SH skupiny.

Termín alkyltio skupina sa týka ako S-alkylu, tak -S-cykloalkylu, ako bolo definované.

Termín aryltio skupina sa týka ako -S-arylu, tak -S-heteroarylu, ako bolo definované.

Termín karbonyľ'sa týka -C(=O)-R skupiny, kde R je vybraný zo skupiny pozostávajúcej z atómu vodíka, alkylu, cykloalkylu, arylu, heteroarylu (viazaného cez uhlíkový kruh) a heteroalicyklu (viazaného cez uhlíkový kruh), ako bolo definované.

Termín aldehyd sa týka karbonylovej skupiny, kde R je atóm vodíka.

Termín tiokarbonyl sa týka -C(=S)-R skupiny, s R ako bolo definované.

Termín C-karboxy skupina sa týka -C(=O)O-R skupiny, s R ako bolo definované.

Termín O-karboxy skupina sa týka -OC(=O)R skupiny, s R ako bolo definované.

Termín ester sa týka -C(=O)O-R skupiny, s R ako bolo definované, avšak R nesmie byť atóm vodíka.

Termín acetyl sa týka -C(=0)CH3 skupiny.

Termín karboxylová kyselina sa vzťahuje na C-karboxy skupinu, v ktorej R je atóm vodíka.

Termín halogén sa týka fluóru, chlóru, brómu alebo jódu.

Termín trihalogénmetyl sa vzťahuje na -CX3 skupinu, kde X je halogén, ako bolo definované.

Termín trihalogénmetánsulfonyľ'sa vzťahuje na X3CS(=O)2- skupinu, s X ako bolo definované.

·· ·· ·· ·· ·· ···· · · · · · ·· • · · · · ·· • ···· · · · · • · · · · ·· ········ ·· ···· ·· ·

Termín kyano skupina sa týka -C=N skupiny.

Termín sulfinyl sa týka -S(=O)-R skupiny, kde okrem definovaného,

R môže byť tiež hydroxy skupina.

Termín sulfonyl sa týka -S(=O)2R skupiny, kde okrem definovaného,

R môže byť tiež hydroxy skupina.

Termín metyléndioxy skupina sa týka -OCH2O- skupiny, kde dva kyslíkové atómy sú viazané so susednými uhlíkovými atómami.

Termín etyléndioxy skupina sa týka -OCH2CH2O-, kde dva kyslíkové atómy sú viazané k susedným uhlíkovým atómom.

Termín S-sulfónamid sa vzťahuje na -S(=O)2NR^HR¹² skupinu, s R¹¹ a

R¹² ako bolo definované.

Termín N-sulfónamid sa vzťahuje na -NR¹¹S(=O)₂R¹² skupinu, s R¹¹ a

R¹² ako bolo definované.

Termín O-karbamyl sa vzťahuje na -OC(=O)NR¹¹R¹² skupinu, s R¹¹ a

R¹² ako bolo definované.

Termín N-karbamylsa vzťahuje na R¹²OC (=O)NR¹¹- skupinu, s R¹¹ a

R¹² ako bolo definované.

Termín O-tiokarbamyl sa vzťahuje na -OC(=S)NR*’R¹² skupinu, s R¹¹ a

R¹² ako bolo definované.

Termín N-tiokarbamyl sa vzťahuje na R^l2OC(=S)NR¹ *- skupinu, s R¹¹ a

R¹² ako bolo definované.

Termín amino skupina sa týka -NR^UR¹² skupiny, kde R¹¹ a R¹² sú obidva atómy vodíka.

Termín C-amid sa vzťahuje na -C(=O) NR^UR¹² skupinu, s R¹¹ a R¹² ako bolo definované.

·· • ·

Termín N-amid sa vzťahuje na R^I2C(=O)NR¹’- skupinu, s R¹¹ a R¹² ako bolo definované.

Termín amónium sa vzťahuje na -+NHRⁿR¹² skupinu, kde R¹¹ a R¹² sú nezávisle vybrané zo skupiny pozostávajúcej z alkylu, cykloalkylu, arylu, a heteroaryiu.

Termín ureido sa týka -NRⁿC(=O)NR¹²R¹³ skupiny, s R¹¹ a R¹² ako bolo definované, a takisto je definovaný aj R¹³.

Termín guanidino sa vzťahuje na -R¹¹NC(=N)NR¹²R¹³ skupinu, s R¹¹, R¹² a R¹³ ako bolo definované.

Termín amidín sa vzťahuje na R¹¹R^,2NC(=N)- skupinu, s R¹¹ a R¹² ako bolo definované.

Termín nitro skupina sa týka -ΝΟ₂ skupiny.

Termín fosfonyl sa vzťahuje na -OP(=O)2OR, s R ako bolo definované.

Termín morfolino sa vzťahuje na skupinu majúcu chemickú štruktúru:

Termín piperazinyl sa vzťahuje na skupinu majúcu chemickú štruktúru:

%/X/X/*

Termín tetrazol sa vzťahuje na skupinu majúcu chemickú štruktúru:

·· ·· ·· ·· ·· · ··· ···· · · ·· • ··· · · · · • ·«·· · · · · · • · ··· · · · ······· ·· ···· ·· ···

B. Výhodné štrukturálne vlastnosti.

Výhodným uskutočnením tohto vynálezu je, že R¹ je atóm vodíka. Takisto výhodným uskutočnením tohto vynálezu je, že R² je atóm vodíka. Rovnako je výhodným uskutočnením tohto vynálezu, že R⁷ je atóm vodíka. Výhodným uskutočnením tohto vynálezu je, že všetky tri vyššie uvedené výhody existujú v rovnakej molekule; tzn., že v zlúčenine tohto vynálezu, R¹, R² a R⁷ sú atómy vodíka.

Ďalšou výhodou tohto vynálezu je, že R³, R⁴, R⁵ a R⁶ sú vybrané zo sku piny pozostávajúcej z atómu vodíka, nesubstituovaného nižšieho alkylu, nižšie ho alkylu substituovaného skupinou vybranou zo skupiny pozostávajúcej z hyd roxy skupiny, halogénu, C-karboxy skupiny substituovanej skupinou vybranou zo skupiny pozostávajúcej z atómu vodíka a nesubstituovaného nižšieho alkylu, amino skupiny alebo -NR^UR¹²; nesubstituovanej nižšej alkylalkoxy skupiny, nižšej alkoxy skupiny substituovanej jedným alebo viacerými halogénmi, nižšej alkoxy skupiny substituovanej nesubstituovaným arylom alebo arylom substitu ovaným raz alebo viacerými skupinami nezávisle vybranými zo skupiny pozostávajúcej z nesubstituovaného nižšieho alkylu, hydroxy skupiny, nesubstituovanej nižšej alkylalkoxy skupiny, halogénu, amino skupiny, nesubstituovaného nižšieho alkyl S-sulfónamidu alebo -NRⁿR¹², nesubstituovaného arylu alebo arylu substituovaného raz alebo viacerými skupinami nezávisle vybranými zo skupiny pozostávajúcej z nesubstituovaného nižšieho alkylu, nesubstituovanej nižšej alkylalkoxy skupiny, nižšej alkoxy skupiny substituovanej jedným alebo viacerými halogénmi, nižšej alkoxy skupiny substituovanej skupinou vybranou zo skupiny pozostávajúcej z nesubstituovaného arylu alebo arylu substituovaného raz alebo viacerými skupinami nezávisle vybranými zo skupiny pozostávajúcej z nesubstituovaného nižšieho alkylu, hydroxy skupiny, nesubstituovanej nižšej alkylalkoxy skupiny, halogénu, amino skupiny, nesubstituovaného ·· ·· • ♦ · · • · • · • · ·· ·· ·· •· · •· • ·· •· ·· · nižšieho alkyl S-sulfónamidu alebo -NR R , hydroxy skupiny, amino skupiny, nesubstituovaného nižšieho alkyl sulfónamidu, C-karboxy skupiny substituovanej skupinou vybranou zo skupiny pozostávajúcej z atómu vodíka alebo nesubstituovaného nižšieho alkylu, morfolínu, -NRⁿR¹², trihalogénmetylu, arylu, arylu substituovaného raz alebo viacerými skupinami nezávisle vybranými zo skupiny pozostávajúcej z hydroxy skupiny, halogénu, trihalogénmetylu, amino skupiny, -NR R , sulfónamidu, C-karboxy skupiny substituovanej skupinou vybranou zo skupiny pozostávajúcej z atómu vodíka alebo nesubstituovaného nižšieho alkylu, nesubstituovaného nižšieho alkylu alebo nižšieho alkylu substituovaného skupinou vybranou zo skupiny pozostávajúcej z hydroxy skupiny, halogénu, C-karboxy skupiny substituovanej skupinou vybranou zo skupiny pozostávajúcej z atómu vodíka alebo nesubstituovaného nižšieho alkylu, amino skupiny alebo -NR R , nesubstituovaného heteroalicyklu, heteroalicyklu substituovaného raz alebo viacerými skupinami nezávisle vybranými zo skupiny pozostávajúcej z halogénu, hydroxy skupiny, nesubstituovaného nižšieho alkylu, nesubstituovaného nižšieho alkylkarbonylu, hydroxy skupiny, nesubstituovanej nižšej alkylalkoxy skupiny alebo alkoxy skupiny substituovanej jedným alebo viacerými halogénmi, nesubstituovanej aryloxy skupiny, aryloxy skupiny substituovanej raz alebo viacerými skupinami nezávisle vybranými zo skupiny pozostávajúcej z nesubstituovaného nižšieho alkylu, trihalogénmetylu, halogénu, hydroxy skupiny, amino skupiny alebo -NRⁿR¹², merkapto skupiny, nesubstituovanej alkyltio skupiny, nesubstituovanej aryltio skupiny, aryltio skupiny substituovanej raz alebo viacerými skupinami vybranými zo skupiny pozostávajúcej z halogénu, hydroxy skupiny, amino skupiny alebo -NRⁿR¹², Ckarboxy skupiny substituovanej skupinou vybranou zo skupiny pozostávajúcej z atómu vodíka a nesubstituovaného nižšieho alkylu, nesubstituovanej nižšej alkyl O-karboxy skupiny, nesubstituovaného nižšieho alkyl S-sulfónamidu, nitro skupiny, nesubstituovaného nižšieho alkyl C-amidu, nesubstituovaného nižšieho alkyl N-amidu, amino skupiny a -RⁿR¹².

V ďalších výhodných uskutočneniach tohto vynálezu, R³, R⁴, R⁵ a R⁶ sú nezávisle vybrané zo skupiny pozostávajúcej z atómu vodíka, halogénu, nesubstituovaného nižšieho alkylu, nižšieho alkylu substituovaného raz alebo viacerými skupinami vybranými zo skupiny pozostávajúcej z hydroxy skupiny, halo-

·· ·· ·· ·· • · · • · •· · •· •· •· ·* · génu, C-karboxy skupiny substituovanej skupinou vybranou zo skupiny pozostávajúcej z atómu vodíka alebo nesubstituovaného nižšieho alkylu, amino skupiny alebo -NRⁿR¹², nesubstituovanej nižšej alkylalkoxy skupiny, nižšej alkylalkoxy skupiny substituovanej jedným alebo viacerými halogénmi, nesubstituované aryloxy skupiny, aryloxy skupiny substituované raz alebo viacerými skupinami nezávisle vybranými zo skupiny pozostávajúcej z nesubstituovaného nižšieho alkylu, nižšieho alkylu substituovaného jedným alebo viacerými halogénmi, hydroxy skupiny, nesubstituovanej nižšej alkylalkoxy skupiny, halogénu, amino skupiny alebo -NR R , S- sulfónamidu, kde R a R sú nezávisle vybrané zo skupiny pozostávajúcej z atómu vodíka a nesubstituovaného nižšieho alkylu, nesubstituovaného arylu, arylu substituovaného raz alebo viacerými skupinami nezávisle vybranými zo skupiny pozostávajúcej z halogénu, nesubstituovaného nižšieho alkylu, nižšieho alkylu substituovaného jedným alebo viacerými halogénmi, nesubstituovanej nižšej alkylalkoxy skupiny, amino skupiny alebo -NRⁿR¹², nesubstituovaného heteroarylu, heteroarylu substituovaného raz alebo viacerými skupinami nezávisle vybranými zo skupiny pozostávajúcej z nesubstituovaného nižšieho alkylu, nižšieho alkylu substituovaného jedným alebo viacerými halogénmi, nesubstituovanej nižšej alkylalkoxy skupiny, hydroxy skupiny, halogénu, amino skupiny alebo -NRⁿR¹², nesubstituovaného heteroalicyklu, heteroalicyklu substituovaného raz alebo viacerými skupinami nezávisle vybranými zo skupiny pozostávajúcej z halogénu, hydroxy skupiny, nesubstituovaného nižšieho alkylu, nižšieho alkylu substituovaného jedným alebo viacerými halogénmi, nesubstituovanej nižšej alkylalkoxy skupiny, amino skupiny alebo -NRⁿR¹², nesubstituovanej nižšej alkyl O-karboxy skúpiny, C-amidu, kde R a R sú nezávisle vybrané zo skupiny pozostávajúcej z atómu vodíka, nesubstituovaného nižšieho alkylu a nesubstituovaného arylu, a N-amidu, kde R¹¹ a R¹² sú nezávisle vybrané zo skupiny pozostávajúcej z atómu vodíka, nesubstituovaného nižšieho alkylu a nesubstituovaného arylu.

Výhodným uskutočnením tohto vynálezu je, že jeden z R⁸, R⁹ a R¹⁰ je (alk])Z, zatiaľ čo ostatné dva sú nezávisle vybrané zo skupiny pozostávajúcej z atómu vodíka, hydroxy skupiny, nesubstituovaného nižšieho alkylu, nesubstituovaného nižšieho alkenylu, nesubstituovaného nižšieho alkinylu, nesubstituovanej nižšej alkylalkoxy skupiny, nižšej alkoxy skupiny substituovanej jedným ·· ·· ·· ·· ·· · • ·· · · ·· · · ··· • ··· ···· • ···· ···· e • · ··· t · · ···· 99·· ·· ···· ·· ··· alebo viacerými halogénmi, nesubstituovanej arylalkoxy skupiny, amino skupiny, -NRⁿR¹², halogénu, C-karboxy skupiny substituovanej skupinami vybranými zo skupiny pozostávajúcej z atómu vodíka alebo nesubstituovaného nižšieho alkylu, nesubstituovanej nižšej alkyl O-karboxy skupiny, nesubstituovaného nižšieho alkylu, C-amidu, nesubstituovaného nižšieho alkyl N-amidu, acetylu, nesubstituovaného nižšieho alkyl S-sulfónamidu, nesubstituovaného arylu alebo arylu substituovaného skupinou vybranou zo skupiny pozostávajúcej z halogénu, hydroxy skupiny, nesubstituovanej nižšej alkylalkoxy skupiny, alkoxy skupiny substituovanej jedným alebo viacerými halogénmi, C-karboxy skupiny substituované skupinou vybranou zo skupiny pozostávajúcej z atómu vodíka alebo nesubstituovaného nižšieho alkylu, nesubstituovanej nižšej alkyl O-karboxy skupiny, amino skupiny, nesubstituovaného nižšieho alkyl Ssulfónamidu a -NRⁿR¹².

Výhodným uskutočnením tohto vynálezu je, že R⁸ a R¹⁰ sú vybrané zo skupiny pozostávajúcej z atómu vodíka a nesubstituovaného nižšieho alkylu.

Je tiež výhodným uskutočnením tohto vynálezu, že alki je nesubstituovaný nižší alkyl.

Ďalšou výhodu tohto vynálezu je, že Z je vybrané zo skupiny pozostávajúcej z hydroxy skupiny, amino skupiny, -NRⁿR¹², kvartérneho amónia, Ckarboxy skupiny substituovanej skupinou vybranou zo skupiny pozostávajúcej z atómu vodíka alebo nesubstituovaného nižšieho alkyl, C-amidu substituovaného skupinami vybranými zo skupiny pozostávajúcej z atómu vodíka a nesubstituovaného nižšieho alkylu, morfolínu, piperadinylu, tetrazolu a fosfonylu.

Ďalšou výhodou tohto vynálezu je, že alki je dvoj až štvoro uhlíkatý nesubstituovaný nižší alkyl a Z je karboxylová kyselina.

Výhodou tohto vynálezu je, že R⁹ je alkiZ.

Podobne je výhodou tohto vynálezu, že R¹¹ a R¹² sú nezávisle vybrané zo skupiny pozostávajúcej z atómu vodíka, nesubstituovaného nižšieho alkylu, hydroxy skupiny, nesubstituovanej nižšej alkylalkoxy skupiny, nesubstituova20 ného nižšieho alkylkarbonylu, nesubstituovanej nižšej alkyl O-karboxy skupiny a acetylu.

Ďalším výhodným uskutočnením tohto vynálezu je, že R¹, R², R³, R⁴, R⁵, R⁶ a R⁷ sú atóm vodíka, R⁸ a R¹⁰ sú metyl a R⁹ je -CH₂CH₂C(=O)OH.

Tiež výhodným uskutočnením tohto vynálezu je, že R¹, R², R³, R⁴, R⁵, R⁶, R⁷ a R⁸ sú atóm vodíka, R¹⁰ je metyl a R⁹ je -CH₂CH₂C(=O)OH.

Takisto je výhodným uskutočnením tohto vynálezu, že R⁷ je vybraný zo skupiny pozostávajúcej z : atómu vodíka, nesubstituovaného nižšieho alkylu a nižšieho alkylu substituovaného skupinou vybranou zo skupiny pozostávajúcej z nesubstituovaného cykloalkylu, nesubstituovaného arylu a arylu substituovaného skupinou vybranou z hydroxy skupiny, nesubstituovanej nižšej alkylalkoxy skupiny a halogénu.

Ďalej je tiež výhodným uskutočnením tohto vynálezu, že Z je vybrané zo skupiny pozostávajúcej z -C(=O)NR¹³R¹⁴, kde R¹³ a R¹⁴ sú nezávisle vybrané zo skupiny pozostávajúcej z atómu vodíka, nesubstituovaného nižšieho alkylu, nižšieho alkylu substituovaného skupinou vybranou zo skupiny pozostávajúcej z amino skupiny a -R^UR¹², nesubstituovaného arylu, arylu substituovaného raz alebo viacerými skupinami vybranými zo skupiny pozostávajúcej z halogénu, hydroxy skupiny, nesubstituovanej nižšej alkylalkoxy skupiny a trihalogénmetylu, nesubstituovaného heteroarylu, nesubstituovaného heteroalicyklu, a kombinovaných päť-členných alebo šesť-členných nesubstituovaných heteroalicyklov, -NRⁿR¹², kde R¹¹ a R¹² sú nezávisle vybrané zo skupiny pozostávajúcej z nesubstituovaného nižšieho alkylu a kombinovaných päť-členných alebo šesťčlenných nesubstituovaných heteroalicyklov.

Preferovaným a výhodným uskutočnením tohto vynálezu je, že R je vybraný zo skupiny pozostávajúcej z nesubstituovaného nižšieho alkylu, nižšieho alkylu substituovaného raz alebo viacerými skupinami vybranými zo skupiny pozostávajúcej z nesubstituovaného cykloalkylu, nesubstituovaného arylu, arylu substituovaného raz alebo viacerými skupinami nezávisle vybranými zo skupiny pozostávajúcej z halogénu a nesubstituovanej nižšej alkylalkoxy skupiny a nesubstituovaného nižšieho alkylkarboxyalkylu, a Z je vybrané zo sku21 ·· ·· ·· ·· ·· ···· ···· ··· • · · · · · · • · · · · · · ··· ···· ·· ···· ·· · piny pozostávajúcej z nesubstituovanej C-karboxy skupiny a nesubstituovanej nižšej alkyl C-karboxy skupiny.

A konečne, výhodným uskutočnením tohto vynálezu je tiež, že R³, R⁴, R⁵, a R⁶ sú nezávisle vybrané zo skupiny pozostávajúcej z atómu vodíka, halogénu, nesubstituovaného nižšieho alkylu, nižšieho alkylu substituovaného raz alebo viacerými hydroxy skupinami, nesubstituovanej nižšej alkoxy skupiny, nesubstituovaného arylu, arylu substituovaného raz alebo viacerými nesubstituovanými nižšími alkoxy skupinami a -S(O)2NR^HR¹², R⁵ je atóm vodíka, R⁶ je NRⁿR¹², R¹¹ a R¹² sú nezávisle vybrané zo skupiny pozostávajúcej z atómu vodíka, nesubstituovaného nižšieho alkylu a kombinovaných päť-členných alebo šesť-členných nesubstituovaných heteroalicyklov.

Chemický vzorec tu opísaný môže vykazovať jav tautomérie a štrukturálnej izomérie. Napríklad, zlúčeniny tu opísané môžu mať E alebo Z konfiguráciu, spojenú s dvojnásobnou väzbou spojujúcou 2-indolinónovú časť s pyrolovou časťou alebo to môže byť zmes E a Z. Tento vynález zahrnuje všetky tautomérne alebo štrukturálne izoméry a ich zmesi, ktoré majú schopnosť modulovať aktivitu RTK, CTK a/alebo STK, a neobmedzuje sa na žiadny jeden z tautomérnych a štrukturálnych izomérov.

2. Syntézne/Kombinatorické knižnice

Ďalším aspektom tohto vynálezu je kombinatorická knižnica najmenej desiatich zlúčenín 3-pyrolidinyl-2-indolinónov, ktoré môžu vzniknúť reakciou oxindolov štruktúry 2 s aldehydmi štruktúry 3.

kde R¹- R¹⁰ majú vyššie uvedený význam.

···· ···· ··· • · · · · · · • · · · · · · ··· ···· ·· ···· ·· ·

Ako bolo použité, termín kombinatorická knižnica sa vzťahuje na všetky zlúčeniny vzniknuté reakciou každej zlúčeniny jednej dimenzie so zlúčeninou z každej z ďalších dimenzií v multi-dimenzionálnej skupine zlúčenín. V kontextu tohto vynálezu je skupina dvoj dimenzionálna a jednu dimenziu reprezentujú všetky oxindoly vynálezu a druhú dimenziu reprezentujú všetky aldehydy vynálezu. Každý oxindol môže reagovať s každým a všetkými aldehydmi, a vytvoriť tak zlúčeninu 3-pyrolidinyl-2-indolinón. Všetky zlúčeniny 3pyrolidinyl-2-indolinónu vzniknuté touto cestou sú predmetom tohto vynálezu. Predmetom tohto vynálezu sú tiež menšie kombinatorické knižnice vzniknuté reakciou niektorých oxindolov so všetkými aldehydmi, všetkých oxindolov s niektorými aldehydmi, alebo niektorých oxindolov s niektorými aldehydmi.

Oxindol z vyššie uvedenej kombinatorickej knižnice je vybraný zo skupiny pozostávajúcej z oxindolu a substituovaných oxindolov ako sú, okrem iných,

6-brómxindol, 5-hydroxyoxindol, 5-metoxyoxindol, 6-metoxyoxindol, 5-fenylaminosulfonyloxindol, 4-[2-(2-izopropylfenoxy)-etyl]oxindol, 4-[2-(3-izopropylfenoxy)etyl]oxindol, 4-[2-(4-izopropylfenoxy)etyl]oxindol, 5-fluóro- xindol, 6-fluóroxindol, 7-fluóroxindol, 6-trifluórmetyloxindol, 5-chlóroxindol, 6chlóroxindol, indol-4-karboxylová kyselina, 5-brómxindol, ó-(N-acetamido)oxindol, 4-metyloxindol, 5-metyloxindol, 4-metyl-5-chlóroxindol, 5-etyloxindol, 6-hydroxyoxindol, 5-acetyloxindol, oxindol-5-karboxylová kyselina, 5metoxyoxindol, 6-metoxyoxindol, 5-aminooxindol, 6-aminooxindol, 4-(2-Nmorfolinetyl)oxindol, 7-azaoxindol, t-butylester oxindol-4-karbámovej kyseliny, t-butylester oxindol-6-karbámovej kyseliny, 4-(2-karboxyetyl)oxindol, 4-nbutyloxindol, 4,5-dimetoxyoxindol, 6-(metánsulfónamido)oxindol, 6-(benzamido)oxindol, 5-etoxyoxindol, 6-fenyloxindol, 6-(2-metoxyfen-l-yl)oxindol, 6-(3-metoxy fen-1-y l)oxindol, 6-(4-metoxyfen-l-yl)oxindol, 5-aminosulfonyloxindol, 5-izopropylaminosulfo- nyloxindol, dimetylaminosulfonyloxindol, 5(N-morfolínsulfonyl)oxindol a 4-(2-hydroxyetyl)oxindol.

Aldehyd z vyššie uvedenej kombinatorickej knižnice je vybraný zo skupiny pozostávajúcej z, okrem iného, 3-(5-formyl-2,4-dimetyl-lH-pyrol-3yl)propiónovej kyseliny, 3-(5-formyl-4-metyl-lH-pyrol-3-yl) propiónovej kyseliny, 3-(l-benzyl-5-formyl-2,4-dimetyl-lH-pyrol-3-yl)propiónovej kyse- liny, ···· ···· ·· · • · · · ···· ···· • · · · · ···· · • · · · · ··· ···· ···· ·· ···· ·· ···

3-(5-formyl-l-metoxy-karbonylmetyl-2,4-dimetyl-lH-pyrol-3-yl)pro- piónovej kyseliny, 3-(5-formyl-l,2,4-trimetyl-lH-pyrol-3-yl)propiónovej kyseliny, metyl esteru 3-[5-formyl-l-(3-metoxy-benzyl)-2,4-dimetyl-lH-pyrol-3-yl]propiónovej kyseliny, metyl esteru 3-(l-cyklohexylmetyl-5-formyl-2,4-dimetyl-lH-pyrol-3yl)propiónovej kyseliny, metyl esteru 3-[l-(2,2-dimetyl-propyl)-5-formyl-2,4dimetyl-lH-pyrol-3-yl]propiónovej kyseliny, l,3,5-trimetyl-4-(3-morfolin-4-yl-

3-oxo-propyl)-lH-pyrol-2-karbaldehydu, 3-(5-formyl-l,2,4-trimetyl-lH-pyrol-

3-yl)-N-(2-morfolin-4-yl-etyl)propiónamidu, 3-(5-formyl-l,2,4-trimetyl-lH-pyrol-3-yl)-N-fenylpropiónamidu, l,3,5-trimetyl-4-(3-oxo-3-piperidin-l-yl-propyl)-lH-pyrol-2-karbaldehydu, l,3,5-trimetyl-4-(3-oxo-3-pyrolidin-l-yl-propyl)-lH-pyrol-2-karbaldehydu, 3-(5-formy 1-1,2,4- trimetyl-lH-pyrol-3-yl)-N(4-metoxy-fenyl)propiónamidu, 3-(5-formyl-l,2,4-trimetyl-lH-pyrol-3-yl)-N(4-metoxyfenyl)propiónamidu, N-(4-fluór-fenyl)-3-(5-formyl-l,2,4-trimetyllH-pyrol-3-yl)propiónamidu, 3-(5-formyl-l,2,4-trimetyl-lH-pyrol-3-yl)-N-(4trifluórmetyl-fenyl)propiónamidu, 3-[5-formyl-l-(3-metoxy-benzyl)-2,4-dimetyl-lH-pyrol-3-yl]propiónovej kyseliny, 3-(1-cyklohexyl metyl-5-formy 1-2,4dimetyl-lH-pyrol-3-yl)propiónovej kyseliny, metyl esteru 3-[l-(3-fluórbenzyl)-5-formyl-2,4-dimetyl-lH-pyrol-3-yl]propiónovej kyseliny, 3-(lbenzyl-5-formyl-2,4-dimetyl-lH-pyrol-3-yl)propiónovej kyseliny, metyl esteru

3-[l-(4-fluórbenzyl)-5-formyl-2,4-dimetyl-lH-pyrol-3-yl]propiónovej kyseliny,

3-[l-(4-fluór-benzyl)-5-formyl-2,4-dimetyl-lH-pyrol-3-yl]propiónovej kyseliny, 3-[l-(3-fluórbenzyl)-5-formyl-2,4-dimetyl-lH-pyrol-3-yl]propiónovej kyseliny, 3,5-dimetyl-4-(3-morfolin-4-yl-propyl)-lH-pyroI-2-karbaldehydu, 4-(3dimetylamino-propyl)-3,5-dimetyl-lH-pyrol-2-karbaldehydu, 5-formyl-2,4-dimetyl-lH-pyrol-3-karboxylovej kyseliny, 3,5-dimetyl-4-(4-metyl-piperazin-lkarbonyl)-1 H-pyrol-2-karbaldehydu, (2-dimetylaminoetyl)amidu 5-formyl-2,4dimetyl-lH-pyrol-3-karboxylovej kyseliny.

Ďalším aspektom tohto vynálezu je, že poskytuje metódu syntézy 3pyrolidiny 1-2-indolinónu vzorca 1 zahrnujúcu reakciu oxindolu vzorca 2 s aldehydom vzorca 3 v rozpúšťadle, najlepšie za prítomnosti bázy.

Príklady oxindolov vzorca 2, ktoré môžu reagovať s aldehydmi vzorca 3 za vzniku 3-pyrolidinyl-2-indolinónov vzorca 1, sú oxindoly a substituované o24 xindoly ako sú, okrem iných, 6-brómxindol, 5-hydroxyoxindol, 5metoxyoxindol, 6-metoxyoxindol, 5-fenylaminosulfonyloxindol, 4-(2-(2izopropylfenoxy)-etyl]oxindol, 4-[2-(3-izopropylfenoxy)etyl]oxindol, 4-(2-(4izopropylfenoxy)etyl]oxindol, 5-fluóroxindol, 6-fluóroxindol, 7-fluóroxindol, 6-trifluórmetyloxindol, 5-chlóroxindol, 6-chlóroxindol, indol-4-karboxylová kyselina, 5-brómxindol, 6-(N-acetamido)-oxindol, 4-metyloxindol, 5metyloxindol, 4-metyl-5-chlóroxindol, 5-etyloxindol, 6-hydroxyoxindol, 5acetyloxindol, oxindol-5-karboxylová kyselina, 5-metoxyoxindol, 6metoxyoxindol, 5-aminooxindol, 6-aminooxindol, 4-(2-N-morfolinoetyl)oxindol, 7-azaoxindol, t-butylester oxindol-4-karbamovej kyseliny, tbutylester oxindol-6-karbámovej kyseliny, 4-(2-karboxyetyl)oxindol, 4-nbutyloxindol, 4,5-dimetoxyoxindol, 6-(metán- sulfónamido)oxindol, 6-(benzamido)oxindol, 5-etoxyoxindol, 6-fenyloxindol, 6-(2-metoxyfen-l-yl)oxindol, 6-(3-metoxyfen-l-yl)oxindol, 6-(4-metoxyfen-l-yl)oxindol, 5-aminosulfonyloxindol, 5-izopropylaminosulfonyloxindol, dimetylaminosulfonyloxindol, 5-(Nmorfolinosulfonyl)oxindol a 4-(2-hydroxyetyl)oxindol.

Príklady aldehydov štruktúry 3, ktoré môžu reagovať s oxindolmi štruktúry 2 sú, okrem iných, 3-(5-formyl-2,4-dimetyl-lH-pyrol-3-yl)propiónová kyselina, 3-(5-formyl-4-metyl-lH-pyrol-3-yl)propiónová kyselina, 3-(l-benzyl-5formyl-2,4-dimetyl-lH-pyrol-3-yl)propiónová kyselina, 3-(5-formyl-lmetoxykarbonylmetyl-2,4-dimetyl-lH-pyrol-3-yl)propiónová kyselina, 3-(5formyl-l,2,4-trimetyi-lH-pyrol-3-yl)propiónová kyselina, metyl ester 3-[5formy l-l-(3-metoxy-benzyl)-2,4-di metyl-lH-pyrol-3-yl]propiónovej kyseliny, metyl ester 3-( 1-cyklohexylmetyl-5-formyl-2,4-di metyl-lH-pyrol-3-yl)propiónovej kyseliny, metyl ester 3-(1-(2,2-dimetyl-propyl)-5-formyl-2,4-dimetyl lH-pyrol-3-yl]propiónovej kyseliny, l,3,5-trimetyl-4-(3-morfolin-4-yl-3-oxopropyl)-lH-pyrol-2-karbaldehyd, 3-(5-formyl-l,2,4-trimetyl-lH-pyrol-3-yl)-N(2-morfolin-4-yl-etyl)propiónamid, 3-(5-formyl-l,2,4-trimetyl-lH-pyrol-3-yl)N-fenylpropiónamid, 1,3,5-tri mety 1-4-(3-oxo-3-piperidin-1-y l-propyl)-lH-py rol-2-karbaldehyd, 1,3,5-tri metyl-4-(3-oxo-3-pyrolidin-l-ylpropyl)-lH-pyrol-2karbaldehyd, nyl)propiónamid, nyl)propiónamid,

3-(5-formyl-l,2,4-trimetyl-lH-pyrol-3-yl)-N-(4-metoxy-fe-

3-(5-formyl- 1,2,4-trimetyl- lH-pyrol-3-yl)-N-(4-metoxy-fe-

N-(4-fluór-feny 1)-3-(5-formy 1-1,2,4-tri mety 1-1 H-pyrol-325 yl)propiónamid, 3-(5-formyl-l,2,4-trimetyl- lH-pyrol-3-yl)-N-(4-trifluórmetylfenyl)propiónamid, 3-[5-formy 1-1-(3-metoxy-benzyl)-2,4-di mety 1-1 H-pyrol-3 yljpropiónová kyselina, 3-(l-cyklohexylmetyl-5-formyl-2,4-dimetyl-lH-pyrol-

3-yl)propiónová kyselina, metyl ester 3-[l-(3-fluór-benzyl)-5-formyl-2,4dimetyl-lH-pyrol-3-yl]propiónovej kyseliny, 3-(l-benzyl-5-formyl-2,4-dimetyl-lH-pyrol-3-yl)propiónová kyselina, metyl ester 3-(1-(4- fluórbenzyl)-5formyl-2,4-dimetyl-lH-pyrol-3-yl]propiónovej kyseliny, 3-[l-(4-fluór-benzyl)-

5-formyl-2,4-dimetyl-lH-pyrol-3-yl]propiónová kyselina, 3-[l-(3-fluórbenzyl)-

5-formyl-2,4-dimetyl-lH-pyrol-3-yl]propiónová kyselina, 3,5-di mety 1-4-(3morfolin-4-yl-propyl)-lH-pyrol-2-karbaldehyd, 4-(3-dimetylma- mino-propyl)3,5-dimetyl-lH-pyrol-2-karbaldehyd, 5-formy 1-2,4-dimetyl-l H-pyrol-3-karboxylová kyselina, 3,5-di metyl-4-(4-metyl-piperazin-l-karbonyl)-lH-pyrol-2karbaldehyd, (2-dimetylaminoetyl)amid 5-formy 1-2,4-dimetyl-l H-pyrol-3karboxylovej kyseliny.

Reakcia môže prebiehať za prítomnosti bázy. Báza môže byť organická alebo anorganická. Ak sa použije organická báza, preferuje sa báza dusíkatá. Príklady organických dusíkatých báz sú, okrem iných, diizopropylamín, trimetylamín, trietylamín, anilín, pyridín, l,8-diazabicyklo-[5,4,l]-undeka-7-én, pyrolidín a piperidín.

Príklady anorganických báz sú, okrem iného, amónium, hydroxidy alkalických kovov alebo kovov alkalických zemín, fosfáty, uhličitany, hydrogenuhličitany, hydrogensírany a amidy. Alkalické kovy sú, lítium, sodík a draslík, zatiaľ čo kovy alkalických zemín sú vápnik, horčík a bárium.

Výhodným uskutočnením tohto vynálezu je, keď rozpúšťadlo je protické rozpúšťadlo, ako je voda alebo alkohol, báza je alkalického kovu alebo kovov alkalických zemín, preferovaný je hydroxid alkalických kovov alebo kovov alkalických zemín.

Pracovníkom v odbore bude zrejmé, na základe všeobecne známych princípov organickej syntézy a na základe informácií tu uvedených, ktorú bázu je treba použiť na priebeh reakcie.

·· ·· ·· ·· ··9 • ·· · · · · · · ··· • ······· • · · · · ···· · • · · · ···· ········ ·· ···· ·· ···

Rozpúšťadlo, v ktorom sa reakcia uskutoční, môže byť protické alebo aprotické rozpúšťadlo, preferuje sa rozpúšťadlo protické.

Termín protické rozpúšťadlo je rozpúšťadlo, ktoré má atómy vodíka kovalentne viazané ku kyslíku alebo atómom dusíka, ktoré činia atóm vodíka kyslým a tým pádom môže byť zdieľaný s rozpúšťanou látkou vo vodíkovej väzbe. Príkladom protických rozpúšťadiel sú, okrem iných, voda a alkohol.

Termín aprotické rozpúšťadlo môže byť polárne alebo nepoláme, ale v každom prípade neobsahuje kyslý vodík, a tak nie je schopné tvoriť s rozpúšťanou látkou vodíkovú väzbu. Príklady, okrem iných, nepolárnych aprotických rozpúšťadiel, sú pentán, hexán, benzén, toluén, metylénchlorid a tetrachlórmetán.

Príklady polárnych aprotických rozpúšťadiel sú chloroform, tetrahydrofurán, dimetylsulfoxid a dimetylformamid.

Výhodným uskutočnením tohto vynálezu je, že rozpúšťadlo je protické rozpúšťadlo, preferuje sa voda alebo alkohol, ako je etanol.

Reakcia prebieha pri teplote väčšej než je izbová teplota. Teplota sa všeobecne pohybuje okolo 30 °C až okolo 150 °C, presnejšie okolo 80 °C až okolo 100 °C, ešte presnejšie okolo 75 °C až okolo 85 °C, čo je asi teplota varu etanolu. Termínom okolo sa rozumie, že teplotný rozsah je prednostne v rozmedzí 10 stupňov Celzia uvedenej teploty, výhodne v rozmedzí 5 stupňov Celzia uvedenej teploty a najvýhodnejšie je to v rozmedzí 2 stupňov Celzia uvedenej teploty. Takže, napríklad, termínom okolo 75 °C sa rozumie 75 °C ± 10 °C, výhodne 75 °C ± 5 °C a najvýhodnejšie 75 °C ± 2 °C.

3. Biochémia/Farmakoterapia v

Ďalší aspekt tohto vynálezu sa vzťahuje na metódu modulácie PK katalitickej aktivity kontaktovaním PK so zlúčeninou tohto vynálezu alebo fyziologicky akceptovateľnou soľou alebo proliečivom.

·· ·· • · · · • · • · • · ·· ·· ··

Ako tu bolo použité, termín PK sa týka receptorových proteíntyrozínkináz (RTK), nereceptorových alebo bunkových tyrozínkináz (CTK) a seríntreonínkináz (STK).

Termín metóda sa vzťahuje na spôsoby, prostriedky, techniky a postupy na splnenie daného problému, ale neobmedzuje sa len na tieto spôsoby, prostriedky, techniky a postupy, buď známe alebo ľahko odvoditeľné spôsoby, prostriedky, techniky a postupy známe odborníkom vied chemických, farmaceutických, biologických, biochemických a medicínskych.

Ako tu bolo použité, termín modulácia alebo modulovanie sa týka zmeny katalytickej aktivity RTK, CTK a STK. Presnejšie, modulácia sa vzťahuje na aktiváciu, katalytickej aktivity RTK, CTK a STK, výhodne aktivácie alebo inhibicie katalytickej aktivity RTK, CTK a STK, závisiacej na koncentrácii zlúčeniny alebo soli, ktorým sú RTK, STK, CTK vystavené, ešte výhodnejšie inhibicie katalytickej aktivity RTK, CTK, STK.

Termín katalytická aktivita, ako tu bolo použité, sa týka pomeru fosforylácie tyrozínu pod vplyvom, priamo alebo nepriamo, RTK a/alebo CTK alebo fosforylácia serínu a treonínu pod vplyvom, priamo alebo nepriamo, STK.

Termín kontaktujúci, ako tu bolo použité, sa týka privedenia zlúčeniny tohto vynálezu do kontaktu s danou PK takým spôsobom, že zlúčenina môže ovplyvniť katalytickú aktivitu PK, buď priamo, tzn. interakciou s kinázou samotnou, alebo nepriamo, tzn. interakciou s inou molekulou, na ktorej katalytická aktivita závisí. Takýto kontakt môže byť dosiahnutý in vitro, tzn. v skúmavke, Petriho miske alebo podobne. V skúmavke sa kontaktu môže účastniť zlúčenina a daná PK alebo sa ho účastnia celé bunky. Bunky môžu byť udržiavané alebo pestované v miskách bunkových kultúr a kontaktované so zlúčeninou v tomto prostredí. V tomto kontexte je snahou overiť schopnosť určitej zlúčeniny ovplyvniť poruchy spojené s PK, t.j. IC50 zlúčenín, definované niž-

nizmoch. Pre bunky mimo organizmus existujú mnohé metódy, dobre známe odborníkom v odbore, vrátane toho ako dostať PK do kontaktu so zlúčeninami a ·· ·· ·· ·· ·· ···· ···· · · · • · · · · · · • ···· · · · · • · · · · · · ···· ···· ·· ···· ·· · neobmedzujúce sa len na priame mikroinjekcie do buniek a mnohé techniky transmembránových prenášačov.

Ďalším aspektom tohto vynálezu je, že modulácia katalytickej aktivity PK použitím zlúčeniny tohto vynálezu môže prebiehať in vitro alebo in vivo.

Termín in vitro sa vzťahuje na postupy uskutočnené v umelom prostredí ako sú napr., okrem iného, v skúmavke alebo živnej pôde.

Ako tu bolo použité, termín in vivo sa vzťahuje na postupy uskutočnené vo vnútri žijúcich organizmov ako sú, okrem iného, myš, krysa alebo králik.

Ďalším aspektom tohto vynálezu je, že proteínkináza, ktorej katalytická aktivita je modulovaná zlúčeninou tohto vynálezu, je vybraná zo skupiny pozostávajúcej z receptorovej proteíntyrozínkinázy, bunkovej tyrozínkinázy a serín-treonínkinázy.

Aspektom tohto vynálezu je, že receptorová proteínkináza, ktorej katalytická aktivita je modulovaná zlúčeninou tohto vynálezu je vybraná zo skupiny pozostávajúcej z EGF, HER2, HER3, HER4, IR, IGF-1R, IR, PDGFRa, PDGFRp, CSFIR, C-Kit, C-fms, Flk-IR, Flk4, KDR/Flk-1, Flt-1, FGFR-1R, FGFR-2R, FGFR-3R a FGFR-4R.

A ďalej aspektom tohto vynálezu je, že bunková tyrozínkináza, ktorej katalytická aktivita je modulovaná zlúčeninou tohto vynálezu, je vybraná zo skupiny pozostávajúcej z Src, Frk, Btk, Csk, Abl, ZAP70, Fes/Fps, Fak, Jak, Ack, Yes, Fyn, Lyn, Lck, Blk, Hck, Fgr a Yrk.

Ďalším aspektom tohto vynálezu je, že serín-treonínproteínkináza, ktorej katalytická aktivita je modulovaná zlúčeninou tohto vynálezu, je vybraná zo skupiny pozostávajúcej z CDK2 a Raf.

Farmaceutická kompozícia zlúčeniny tohto vynálezu a farmaceutický prijateľný nosič sú ďalším aspektom tohto vynálezu. Takéto farmaceutické kompozície môžu obsahovať tiež vehikulum.

Metóda pôsobenia alebo prevencia porúch spojených s proteínkinázou v organizme zahrnujúca aplikáciu terapeuticky efektívneho množstvo zlúčeniny, soli alebo proliečivo 3-pyrolidenyl-2-indolinónu tohto vynálezu na organizmus je ďalším aspektom tohto vynálezu.

Ako tu bolo použité, termíny poruchy spojené s PK, poruchy riadené PK a abnormálna PK aktivita hovoria o podmienkach charakterizujúcich nevhodnú, t.j nedostačujúcu, alebo častejšie nadmernú PK katalytickú aktivitu, kde jednotlivé PK môžu byť RTK, CTK alebo STK. Nevhodná katalytická aktivita môže nastať ako výsledok: (1) PK expresia v bunkách, ktoré normálne PK neexprimujú, (2) zvýšenie PK expresie vedúcej ku nechcenej bunkovej proliferácii, diferenciácii a/alebo rastu, alebo (3) zníženiu PK expresie vedúcej k nechcenej redukcii bunkovej proliferácie, diferenciácie a/alebo rastu. Nadmerná aktivita vypovedá buď o zosilnení génu kódujúceho určitú PK alebo o produkcii takejto úrovne PK aktivity, ktorá koreluje s poruchami bunkovej proliferácie, diferenciácie a/alebo rastu (t.j. tak ako sa zvyšuje hladina PK, tak sa zvyšuje závažnosť jedného alebo viacerých symptómov bunkových porúch). Nedostačujúca aktivita je, samozrejme naopak, tam kde sa závažnosť jedného alebo viacerých symptómov zvyšuje so znižujúcou sa hladinou PK aktivity.

Ako tu bolo použité, termíny zabrániť, zabraňujúci a prevencia sa v prvom rade vzťahujú na metódu zabraňujúcu organizmu získať poruchy spojené s PK.

Ako tu bolo použité, termíny ošetrenie, liečenie a liečba sa týkajú metódy zmiernenia alebo ukončenia porúch spojených s PK a/alebo ich prítomných symptómov. S ohľadom zvlášť na rakovinu, tieto termíny jednoducho znamenajú, že dĺžka života jedinca majúceho rakovinu sa predĺži alebo sa redukuje jeden alebo viac symptómov tejto choroby.

Termín organizmus sa týka akéhokoľvek živého celku pozostávajúceho najmenej z jednej bunky. Živý organizmus môže byť tak jednoduchý ako napríklad jediná eukaryotická bunka, alebo tak zložitý ako cicavec vrátane človeka.

• ·

·· ·· • · · •· ·

9· •· ·· ·

Termín terapeuticky efektívne množstvo tak, ako je tu používaný, sa týka množstvo podávanej zlúčeniny, ktoré vedie do určitej miery ku zmierneniu jedného alebo viacerých symptómov liečenej poruchy. S ohľadom na liečbu rakoviny, terapeuticky efektívne množstvo sa týka množstva, ktoré spôsobí (1) redukciu veľkosti nádoru, (2) ihibíciu (t.j., spomalenie do určitej miery alebo zastavenie) metastázy nádoru, (3) ihibíciu, do určitej miery (t.j., spomalenie do určitej miery alebo zastavenie) rastu nádora a/alebo (4) do určitej miery zmiernenie (alebo lepšie elimináciu) jedného alebo viacerých symptómov spojených s rakovinou.

Aspektom tohto vynálezu je, že vyššie spomínané poruchy spojené s proteínkinázou sú vybrané zo skupiny pozostávajúcej porúch spojených s receptorovou proteíntyrozínkinázou, bunkovou tyrozínkinázou a serín/treonínkinázou.

A následne aspektom tohto vynálezu je, že vyššie zmienené poruchy spojené s proteínkinázou sú vybrané zo skupiny pozostávajúcej z porúch spojených s EGFR, PDGFR, IGFR a flk.

Vyššie zmienená porucha spojená s proteínkinázou je rakovina vybraná zo skupiny pozostávajúcej z karcinómu buniek epitelu, astrocytómu, sarkómu ako je Kaposiho sarkóm, glioblastómu, rakoviny pľúc, rakoviny močového mechúra, rakoviny hrubého čreva, gastrointestinálnej rakoviny, rakoviny hlavy a krku, melanómu, rakoviny vaječníku, rakoviny prostaty, rakoviny prsníka, rakoviny malých pľúcnych buniek a gliómu v ďalšom aspekte tohto vynálezu.

Vyššie spomínaná poruchy spojená s proteínkinázou je vybraná zo skupiny pozostávajúcej z diabetu, hyperproliferačnej poruchy, von HippelLindauovej choroby, restenózy, fibrózy, psoriázy, osteo-artritídy, reumatickej artritídy, zápalových porúch a angiogenézy v ďalšom aspekte tohto vynálezu.

Ďalšími poruchami, ktoré môžu byť liečené alebo, ktorým môže byť zabránené použitím zlúčeniny tohto vynálezu sú imunologické poruchy, ako je autoimunitná choroba (AIDS) a kardiovaskulárne poruchy ako je ateroskleróza.

• ·

Aspektom tohto vynálezu je, že chemické zloženie, ktoré moduluje katalytickú aktivitu proteínkinázy môže byť identifikované kontaktovaním buniek exprimujúcich danú proteínkinázu so zlúčeninou, soľou alebo preliečivom, čo je 3-pyrolidenyl-2-indolinón z tohto vynálezu a potom sledovaním účinku na dané bunky.

Termínom sledovanie sa mieni pozorovanie alebo detekcia účinku kontaktu zlúčeniny s bunkou exprimujúcou určitú PK. Pozorovaný alebo detekovaný účinok sa môže meniť v bunkovom fenotype, v katalytickej aktivite PK alebo zmenami v interakcii PK s prirodzeným väzbovým partnerom. Techniky pozorovania alebo detekcie týchto účinkov sú odborníkom dobre známe.

Vyššie spomínaný účinok je vybraný zo zmeny alebo neprítomnosti zmeny bunkového fenotypu, zmeny alebo neprítomnosti zmeny katalytickej aktivity uvedenej proteínkinázy alebo zmeny alebo neprítomnosti zmeny v interakcii uvedenej proteínkinázy s prirodzeným väzbovým partnerom v konečnom aspekte tohto vynálezu.

Termín bunkový fenotyp sa týka vonkajšieho vzhľadu buniek alebo tkanív alebo biologických funkcií buniek alebo tkanív. Príklady, okrem iných, sú bunková veľkosť, rast buniek, proliferácie buniek, diferenciácie buniek, prežívanie buniek, apoptóza a príjem a využitie živín.

Termín prirodzený väzbový partner sa týka polypeptidu, ktorý sa viaže na určitú PK v bunke. Prirodzený väzbový partner môže hrať úlohu v transdukčných procesoch, kde sú signály sprostredkovávané PK. Zmena v interakcii prirodzeného väzbového partnera s PK sa môže prejaviť ako zníženie alebo zvýšenie koncentrácie komlexu PK/prirodzený väzbový partner, čo má za následok pozorovateľnú zmenu v schopnosti PK sprostredkovávať transdukčný signál.

Ďalším aspektom tohto vynálezu je, že zlúčenina tu opísaná, alebo jej soľ či proliečivo, môžu byť kombinované s ďalšími chemoterapeutikami na liečbu ochorení a porúch diskutovaných vyššie. Napríklad, zlúčenina, soľ alebo proliečivo tohto vynálezu môžu byť kombinované s alkylačnými činidlami ako sú • · • · • ·

• · · ·· ···· ·· fluóruracil (5-FU) samotný alebo v ďalšej kombinácii s leukovorínom; alebo

ko sú UFT, capecitabín, gemcitabín a cytarabín, alkyl sulfonáty, napr. busulfán (používaný na liečbu chronickej granulocytárnej lukémie), improsulfán a piposulfán; aziridíny, napr. benzodpa, karboquón, meturedpa a uredpa; etylénimíny a metylmelamíny, napr. altretamín, trietylénmelamín, trietylénfosforamid, trietyléntiofosforamid a trimetylolmelamín; a dusíkaté prípravky, napr. chlórambucil (používaný na liečbu chronickej lymfocytickej lukémie, primárnej makroglobulinémie a non-Hodgkinsovho lymfómu), cyklofosfamid (používaný na liečbu Hodgkinsonovej choroby, početného myelómu, nuroblastómu, rakoviny prsníku, rakoviny vaječníku, rakoviny pľúc, Wilmsovho tumoru a rabdomyosarkómu), estramustín, ifosfamid, novembrichín, prednimustín a uracil prípravky (používané na liečbu primárnej trombocytózy, non-Hodgkinsovho lymfómu, Hodgkinsovej choroby a rakoviny vaječníku); a triazíny, napr. dakarbazín (používaný na liečbu ľahkého tkanivového sarkómu).

Takisto sa očakáva, že zlúčenina, soľ alebo proliečivo tohto vynálezu, majú prospešný účinok v kombinácii s ďalšími antimetabolickými chemoterapeutickými činidlami ako sú, okrem iných, analóg kyseliny listovej, napr. metotrexát (používaný na liečbu akútnej lymfocytickej leukémie, choriokarcinómu, mykosis fungiodes rakoviny prsníku, rakoviny hlavy a krku a osteogénneho sarkómu) a pteropterín; a analógy purínu ako sú merkaptopurín a tioguanín, ktorý našiel uplatnenie pri liečbe akútnej granulocytárnej, akútnej lymfocytárnej a chronickej granulocytárnej leukémie.

Tiež sa môže očakávať, že sa zvýši účinnosť zlúčeniny, soli alebo proliečivo v kombinácii s chemoterapeutikmi na prírodnej báze ako sú, okrem iných, napr. vinblastín (používaný na liečbu rakoviny prsníku a rakoviny semenníkov), vincristín a vindezín; epipodofylotoxíny, napr. etopozid a tenipozid, obidva používané na liečbu rakoviny semenníkov a Kaposiho sarkómu; antibiotické chemoterapeutiká, napr. daunorubicín, doxorubicín, epirubicín, mitomycín (používané na liečbu rakoviny žalúdku, hrdla maternice, hrubého čreva, prsníka, močového mechúra a pankreasu), dactinomycín, temozolomid, plicamycín,

• · ·· ·· • · · · ·

• · ·

···· ···· blomycín (používaných na liečbu rakoviny kože, pažeráka a močovopohlavného traktu); a enzymatické chemoterapeutiká ako L-asparagináza.

A ďalej sa očakáva, že užitočný účinok bude mať zlúčenina, soľ alebo proliečivo tohto vynálezu v kombinácii s platinovými koordinačnými komplexami (cisplatína, atď.); substituovanými močovinami ako hydroxymočovina; deriváty metylhydrazínu, napr. procarbazín; adrenokortikálnymi supresívmi, napr. mitotan, aminoglutetimid; a hormónmi a hormonálnymi antagonistami ako adrenokortikosteriody (napr. prednizón), progestínmi (napr. hydroxyprogesterón kaproát); estrogénmi (napr. dietylstilbesterol); antiestrogénmi ako je tamoxifén; androgénmi, napr. testosterón propionát; a aromatáza inhibítormi (ako je anastrozol).

A konečne ako čiastočne efektívne sa očakáva kombinácia zlúčeniny tohto vynálezu s mitoxantrolom alebo paclitaxelom, ktoré sa používajú na liečbu pevných rakovinných nádorov a leukémií ako sú, okrem iných, akútna myelogénna (non-lymfocitická) leukémia.

Súčasne preferovanou zlúčeninou, pri ktorej sa očakáva užitočný účinok v kombinácii s jedným alebo viacerými vyššie uvedenými chemoterapeutikami je 3-[2,4-dimetyl-5-(2-oxo-l,2-dihydroindol-3-ylidenmetyl)-lH-pyrol-3-yl]propiónová kyselina.

Podrobný opis vynálezu

1. Stručný opis tabuliek

Tabuľka 1 znázorňuje chemickú štruktúru a biologickú aktivitu niektorých zlúčenín tohto vynálezu. Číslovanie zlúčenín zodpovedá číslam príkladov v príkladovej časti. To znamená, že syntéza zlúčeniny 1 v tabuľke 1 je opísaná v Príklade 1. Použité biotesty sú podrobne opísané nižšie. Výsledky sú vykazované v termínoch ICso, mikromolárnej (μΜ) koncentrácii testovaných zlúčenín, ktoré spôsobia 50 % zmenu v aktivite určitej PKT v porovnaní s aktivitou PTK v kontrolnom teste, kde nebola pridaná testovaná zlúčenina. Špecificky, ukáza34 ficky, ukázaný výsledok indikuje koncentráciu testovanej zlúčeniny potrebnej na spôsobenie 50 % redukcie aktivity danej PTK. Zlúčeniny uvedené v Tabuľke 1 sú len na príklad a nie sú konštruované s úmyslom akýmkoľvek spôsobom obmedziť rozsah tohto vynálezu.

Tabulka 1

Prík.	Štruktúra	bio-FLK-1 10« (aM)	1 i bio-PDGFr bio-FGFR	HUVECVEGF 14. (-M)	HUVECFGF 14.(·*Π	BrdUPDCFr ICU.M)	BrdUFGFr 14.(. M)	BrdUEGFr 14,(. M)
ICmI.M)	IC»(bM>
1		1.3	<0.78	20.2	0.38	r 21.4	8.4	8.8	12
2		89.1	0.14	12.1	1.6	31.6	12	>50	>50
3		12	0.042	0.86	0.05	2.8	2.5	30	>50
4	X	12	13	9	0.11	7.1	8.2	>50	>50
5		0.13	<12	8.81	0.42	9.3	10.7	46.8	95.8
6		6.8	026		0.63	18.4	8.6	>50	>50
7		192	22		1.34	12.3	11.4	>50	>50
8	<5^	0.π	0.37	0.68	0.74	4.52	82	>50	>50
9		1.06	0.13		0.33	13.4	6.3	>50	>50
10	* M	11	<0.78	1.63 1	10.62	>50	5.1	>50	>50
11		0.7	0.13	7.73	1.4	9.6	11.1	>50	>50
12		52.3	13.6	i I 13	11	24.6	1	>50	1 >50

·· ·· ·· ·· ·· • · · · · · · · ··· • · · · · · · • · · · · · · ···· ···· ·· ···· ·· ·

Prík	štruktúra	bto-FLK-1 IC»(aM)	bio-PDGFr 10»(·Μ)	š bio-FGFR i iCUaM) 1	HUVECVEGF IC.M0	HUVECFGF IC.fa.xn	BrdUPDGFr ICalaM)	i Brdlii FGFr tC.fa.Xq	BrdUEGFr ICafaM)
13		31	4.2					i s i
14		17	6				-	i t
15	«-A— -ťccp^	6.6-	<0.78						f
16		»100	8.7					i f
17	·*-Λ*	10	10.3		12	20	1 6.3	44.3	>50
18	Λ'Α'·· --ηβ’	2.9	2		2.4	18.4	14.3	46	>50
15		0.006	0.063		0.07	3.8	3.7	39.6	>50
20	’Λ-ύ— -C^	0.027 I	1 . 0.7 i l 1	029	5	7.4	>50	>50
21	Wz->*	0.02	0.68	4	4	5.6	24.4	>50	>50
22	‘W'	0.61 .	0.73		0.13	15.8	5	18	>50
23		5.2	t 0.B : 0.6B 1 «	3	1.1 1	10.8	>50	I ·. >50 I
24	51	<0.78	e 0.55	17.9	0.67	25.1	2.4	21	• i ; >5o 1

Prík	Štruktúra	blo-FLK-lÍ bio-PDGFr ΙΟ.(·Μ) I ICh(bM)	1 í bio-FGFR ICel-M)	HUVEC- í HUVECucŕr .r/»ť·	BrdUPDGFr tq.faAQ	BrdU- j BrdUFGFr f EGFr icnIbM); κ»(·μ)
ICvCaM}	ICn(ibM)
25		0.8	1.2			t
26		91.8	>100
27	x	16.9	<0.78 .		0.99	1.5
28		<0.78	0.16	0.04	0.15	1.9	l 3.4	37 1	>50
29		5.9	1.18	6.B9	0.18	0.13	029	132	30.6
30	Y	2.6	0.52	3.5	0.25	0.64	0.4	22	24.7
31	Y	3.1	1.63		0.09	0.18	2.1	35.9	372
32		5.1	<0.009		10	10	0.076	12	32.7
33		4.6	0.16		0.81	1	0.1	21	30.5
34		24.7	3.1				3.8	34.7	36.6
35	.,Y~	14.4	1.2	1			1.59	35.8	>50
36	X u.	89.7	I 1.4					1

·· ·· ·· ·· ·· ···· ···· ··· • · · · · ···· · • · ··· · 9 · ··· ···· ·· ···· ·· ···

Prik	Štruktúra	1 bw-FLK-li bio>PDGFr	No-FGFR	HUVECVSGF	HWECaFGF	BrdUPDGFr	BrdU-: BrdUFGFr I EGFr ICntaM) i
iCwfaM}
37	y	85.6	t 1 1.5			f
38	y-						-
39				*
40	-ä?
41		i 0.01	0.09	32		1

Tabulka 2

Pri k.	Štruktúra		He-POCFr KmMM>	HUVECVJECT	HUVIC· dKf Κλ.*Μ)	MU» HMSfr	MU· Κ·<-Μ)	BrdU» K.*M)
MĽK4	bíoSCTr «•M®
42		«0.78	>100	2.31			0.38	34.93	>50
43		<0.78·	>100	1.59			0.37	I 45.48	44.63
44	y	42.82	>100	027			0.44	>50	>50
45		>100	>100	7.53			1.02	4.96	3.9
46	y d»	>100	>100	>100			0.52	15.42	41.9

• ·

0 Prík	Štruktúra	i bio-FLK-1; bio-EGFr ICuCaM] i ICwfaMI 1	i bio-PDGFr i tCv<aM) 1	HUVECVEGF	I HUVEC: iFGF ί 1Ο.(·Μ)	BrdUPDGFr ICnImM)	Bŕd U- t BrdUFGFr J EGFr 1
47	X	>100	i j >100	0.75			>50	>50	1 1 >50
48	Cr<*	<0.78	>100	0.053			0.079	9.93	1X6
49		<0.78	>100	<0.046			<0.069	1.26	4.1
50	·	5.16	>100	0.1			0.103	3.42 1	4
51		4X36	2X83	1.02			1.54	3.9	9.56
52		9.77	2B.06	0.11			‘ 0.7	10.9	9.57
53		99.55	>100	4.35			0.48	3.1	3.86
54	y-^n ’-OÍ^ M	<0.78 I	>100	<0.0078			<0.069	3.01	7.49
55	XX	<0.78	86.56	<0.0078			<0.069	13.85	25.37
56	*0$^ M	<0.78	>100	0.16			0.55	4.86	11.01
57	y^^	<0.78	>100	0.05			0X9	15.7	27.47

t • 9

1 Prík	Štruktúra	bio-FLK-1 «•(M)	bio-PDGFr	bio-FGFR	HUVECVEGF 10. (MQ	HUVEC•FGF	BrdUPDGFr	I BrdU- I BrdU- I FGFr EGFr | ICmIbM)
58		<0.78	>100	<0.0078			<0.069	1 1 9.18 ! 25.35 i
59		<0.78 •	>100	0.067			.0.32	f 9.95 j 202 1
60		<0.78	>100	0.43			0.56	! 1 ! 3 j 25.34
61	M......	0.91	>100_._	0,44 _	—		1.04	i • 1 11.31 Í 6.59 1
62		1.97	>100 1	2.35			0.57	1 t 1 2.14 8.3B 1 •
63	H	12.08	>100	2.41			10.32	29.09 i 29.77 i 1
64	H	15.07	1 >100	2.86			1.45	1 1 4.58 | 1124 I

Tabuľka 2 ukazuje chemické štruktúry niektorých prídavných zlúčenín tohto vynálezu. Takisto ako v Tabuľke 1, čísla zlúčenín zodpovedajú číslam príkladov. Základný opis vyššie použitých biotestov sa zhoduje s biotestami v Tabuľke 2.

2. Indikácia/určenie ochorenia

PK, ktorých katalytická aktivita je modulovaná zlúčeninami tohto vynálezu, zahrnujú proteíntyrozínkinázy, ktoré sú dvojakého typu, receptorové tyrozínkinázy (RTK) a bunkové tyrozínkinázy (CTK), a serín/treonínkinázy (STK). Signálna transdukcia sprostredkovávaná RTK je iniciovaná extracelulárnou in·· ·· • ·

9999 9999 •· ·

9 99

99

999999 •· · •· • ·· •· dimerizácia receptoru, dočasná stimulácia aktivity vnútorného proteínu tyrozínkinázy a fosforylácie. Vytvárajú sa teda väzbové miesta pre intracelulárne signálne transdukčné molekuly a vedú k formácii komplexu s celým radom cytoplazmatických signálnych molekúl, ktoré sprostredkovávajú príslušnú bunkovú odpoveď (napr. delenie buniek, metabolické účinky na mimobunkový mikrosvet atď.). Viď Schlessinger a Ulrych, 19992, Neurón 9:303-391.

Bolo ukázané, že tyrozínové fosforylačné miesta na receptoroch rastového faktoru fungujú ako väzbové miesta s vysokou afinitou pre SH2 doménu (homológ src) signálnych molekúl. Fantl et al., 19992, Celí 69:413-423, Songyang et al. 1994, Mol. Celí. Biol. 14:2777-2785), Songyang et al., 1993, Celí 72:767-778, a Koch at al., 1991, Science 252:668-678. Bolo identifikovaných niekoľko intracelulárnych substrátových proteínov, ktoré sa asociujú s RTK. Je možné ich rozdeliť do dvoch základných skupín: (1) substráty, ktoré majú katalytickú doménu, a (2) substráty, ktoré takúto doménu nemajú, ale ktoré slúžia ako adaptéry a asociujú s katalytický aktívnymi molekulami. Songyng et al., 1993, Celí 72:767-778. Špecifita interakcií medzi receptormi a doménami SH2 ich substrátov je určená podľa zvyšku aminokyselín bezprostredne obklopujúcich fosforylovaný tyrozínový zvyšok. Rozdiely vo väzbovej afinite medzi SH2 doménami a aminokyselinovou sekvenciou obklopujúcou fosfotyrozínové zvyšky na určitom receptore súhlasia s pozorovanými rozdielmi v profiloch ich fosforylovaných substrátov. Songyang et al., 1993, Celí 72:767-778. Tieto pozorovania vedú k názoru, že funkcia každej RTK je určená nie len jej vzorcom expresie a dostupnosťou ligandu, ale tiež radom downstream signálov transdukčných ciest, ktoré sú aktivované určitým receptorom. Tak fosforylácia poskytuje dôležitý regulačný krok, ktorý určuje výberovosť signálnych ciest používaných Špecifickými receptormi rastových faktorov rovnako ako receptory diferenciačných faktorov.

STK, ktoré sú primárne cytoplazmatické, ovplyvňujú biochémiu vo vnútri bunky, často ako down-line odpoveď na pôsobenie PTK. STK boli dokázané v signálnych procesoch, ktoré iniciujú syntézu DNA a následnú mitózu vedúcu k bunkovej proliferácii.

·· ·· ·· • · · • · · ·· ···· •· · •· • ·· •· ·· ·

Tak PK signálna transdukcia vedie, okrem iných odpovedí, k bunkovej proliferácii, diferenciácii, rastu a metabolizmu. Abnormálna bunková proliferácia môže viesť k celému radu ochorení a chorôb, vrátane k rozvinutiu neoplazmov ako sú karcinómy, sarkómy, glioblastómy a hemangiómy, k ochoreniam ako leukémia, psoriáza, artérioskleróze, artritíde a diabetickej retinopatii a k ďalším ochoreniam súvisiacim s nekontrolovanou angiogenézou a/alebo vaskulogenézou.

Používanie tohto vynálezu nevyžaduje precízne pochopenie mechanizmov, akými zlúčeniny tohto vynálezu inhibujú proteínkinázy. Viac-menej, zatiaľ čo zlúčeniny tu nie sú viazané k žiadnej určitej teórii mechanizmu pôsobenia, má sa za to, že tieto zlúčeniny interagujú s aminokyselinami v katalytických oblastiach proteínkináz. Proteínkinázy majú typicky dvojslučkovú štruktúru, v ktorej sa ATP zrejme viaže v štrbine medzi týmito dvoma slučkami v oblasti, kde sa vyskytujú aminokyseliny v proteínkinázach konzervované. Predpokladá sa, že inhibítory proteínkináz sa viažu nekovalentnými väzbami ako vodíkovými mostíkmi, van der Waalsovými silami a iónovými interakciami v tej istej oblasti, kde sa už spomínané ATP viaže na proteínkinázy. Presnejšie sa ma za to, že 2-indolínové zložky zlúčenín tohto vynálezu sa viažu na všeobecné miesto obvykle obsadeného adenínovým kruhom ATP. Špecifita určitej molekuly k určitej proteínkináze môže vzniknúť ako výsledok dodatočnej interakcie medzi rôznymi substituentami na 2-indolínovom jadre a aminokyselinovou doménou špecifickou pre určitú proteínkinázu. Tak rôzne idolínové substituenty môžu prispievať k prednostnej väzbe na určitú proteínkinázu. Schopnosťou vybrať zlúčeniny aktívne na rôznych väzbových miestach ATP (alebo iného nukleotidu) sú zlúčeniny tohto vynálezu užitočné na zacielenie akéhokoľvek proteínu s takým miestom. Zlúčeniny tu opísané tak môžu mať úžitok v in vitro testoch pre proteíny a tiež pre in vivo predvedenie terapeutických účinkov prostredníctvom interakcie s takými proteínmi.

V ďalšom aspekte je proteínkináza, ktorej katalytická aktivita je modulovaná kontaktom s niektorou zlúčeninou tohto vynálezu, je proteíntyrozínkináza, presnejšie receptorová proteíntyrozínkináza. Medzi receptorové proteíntyrozínkinázy, ktorých katalytická aktivita môže byť modulovaná niektorou zlúčení·· ·· • · · · • · • · • · • · ···· ···· ·· ·· • · · · • · · • · · • · · ·· ···· •· · •· • ·· •· ·· · nou tohto vynálezu alebo jej soľou, patrí okrem iných EGF, HER2, HER3, HER4, IR, IGF-1R, IR, PDGFRoc, PDGFR3, CSFIR, C-Kit, C-fms, Flk-IR, Flk4, KDR/Flk-1, Fit-1, FGFR-2R, FGFR-3R a FGFR-4R.

Proteíntyrozínkináza, ktorej katalytická aktivita je modulovaná kontaktom so zlúčeninou tohto vynálezu alebo jej soľou či jej proliečivom, môže byť buď nereceptorová, alebo bunková proteíntyrozínkináza (CTK). Tak katalytická aktivita CTK ako takej, ktorou môže byť okrem iných Src, Frk, Brk, Csk, Abl, ZAP70, Fes, Fps, Fak, Jak, Ack, Yes, Fyn, Lyn, Lck, Blk, Hck, Fgr a Yrk, je modulovaná kontaktom so zlúčeninou tohto vynálezu alebo jej soľou.

Ďalšou skupinou proteínkináz, ktoré môžu mať svoje katalytické aktivity modulované kontaktom s niektorou zlúčeninou tohto vynálezu, sú serín/treonínproteínkinázy ako také, medzi inými CDK2 a Raf.

V ďalšom aspekte sa tento vynález vzťahuje na metódu liečby alebo prevencie porúch v súvislosti s PK podaním terapeuticky efektívneho množstva niektorej zlúčeniny tohto vynálezu, jej soli alebo proliečiva, do organizmu.

Je takisto aspektom, tohto vynálezu, že farmaceutická kompozícia obsahujúca niektorú zlúčeninu tohto vynálezu alebo jej soľ či proliečivo, je podané organizmu za účelom prevencie alebo liečby porúch súvisiacich s PK.

Tento vynález je teda zameraný na zlúčeniny, ktoré modulujú proteínkinázovú signálnu transdukciu ovplyvnením enzymatickej aktivity RTK, CTK a/alebo STK, čím interferujú so signálmi transdukovanými týmito proteínmi. Presnejšie je tento vynález zameraný na zlúčeniny, ktoré modulujú RTK, CTK a/alebo STK sprostredkovávané signálne transdukčné dráhy ako terapeutický prístup k liečbe mnohých druhov pevných nádorov, zahrnujúcich okrem iného karcinómy, sarkómy vrátane Kaposiho sarkómu, erytroblastómy, glioblastómy, meningiómy, astrocytómy, melanómy a myoblastómy. Liečba alebo prevencia nepevných rakovinových nádorov, ako je leukémia, sú do tohto vynálezu takisto zahrnuté. Indikácie môžu zahrnovať okrem iného rakoviny mozgu, rakoviny močového mechúra, rakoviny vaječníkov, rakoviny pankreasu, rakoviny hrubého čreva, rakoviny krvi, rakoviny pľúc a rakoviny kostí.

·· ·· ·· ·· • · · · ···· • · · · φ • · · · · · • · φ φ φ ···· ···· ·· ····

Ďalšími príkladmi typov porúch súvisiacich s nevhodnou proteínkinázovou aktivitou, na ktoré môžu byť zlúčeniny tu opísané vhodnou prevenciou, liečbou a štúdiom, sú okrem iného poruchy proliferácie, fibrotické poruchy a metabolické poruchy.

Poruchy bunkovej proliferácie, ktorým tento vynález môže byť prevenciou, liečbou alebo ďalším štúdiom, zahrnujú rakovinu, poruchy proliferácie buniek krvných ciev a poruchy proliferácie mezangiálnych buniek.

Poruchy proliferácie krvných ciev sa týkajú porúch súvisiacich s abnormálnou vaskulogénezou (tvorbou krvných ciev) a angiogenézou (šírenie krvných ciev). Zatiaľ čo vaskulogenéza a angiogenéza hrajú dôležitú úlohu v mnohých normálnych fyziologických procesoch, ako je embryonálny vývoj, vznik žltého telieska, hojenie rán a regenerácia orgánov, hrajú tiež zásadnú úlohu vo vývoji rakoviny, kde vedú k tvorbe nových kapilár potrebných na udržanie nádoru pri živote. Ďalšími príkladmi porúch proliferácie krvných ciev je artritída, kde nové kapiláry krvných ciev poškodzujú kĺb a ničia chrupavku, ďalej očné ochorenie ako diabetická retinopatia, kde nové kapiláry v sietnici napadajú sklovec, krvácajú a spôsobujú slepotu.

Bolo zistené, že dve štrukturálne príbuzné RTK sa viažu k VEGF s vysokou afinitou: fms-podobný tyrozín 1 (fit-1) receptor (Shibuya et al., 1990, Oncogene, 5:519-524, De Vrieš et al., 1992, Science, 255:989-991) a receptor KDR/FLK-1 tiež známy ako VEGF-R2. Bolo publikované, že vakulárny endoteliálny rastový faktor (VEGF) je špecifickým mitogénom endotelových buniek s podpornou aktivitou na rast endotelových buniek in vitro. Ferara & Henzel, 1989, Biochein. Biophys. Res. Comm., 161:851-858, Vaisman et al., 1990, J. Biol. Chem.. 265:19461-19566. Informácie uvedené v U.S. prihláške č. 08/193, 829, 08/038, 596 a 07/975, 750 trvajú na tom, že VEGF je zodpovedný nielen za proliferáciu endotelových buniek, ale tiež je primárnym regulátorom normálnej a patologickej angiogenézy. Všeobecne viď Klagsburn & Soker, 1993, Curent Biology, 3(10)699-702; Houck, et al. 1992, J. Biol. Chem., 267:2603126037.

·· ·· • · · · • · ·· ·· • · · · • · · •· · •· • ·· •· ·· ·

Normálna vaskulogenéza a angiogenéza hrajú dôležitú úlohu v rade fyziologických procesov ako je embryonálny vývoj, hojenie rán, regenerácia orgánov, v ženskom reprodukčnom procese ako je vývoj folikuia v žltom teliesku počas ovulácie a rast placenty v tehotenstve. Folkman & Shing, 1992, J. Biological Chem., 267(16):10931-34. Nekontrolovaná vaskulogenéza a/alebo angiogenéza je spojovaná s takými ochoreniami, ako je diabetes a s malignými pevnými nádormi, ktoré sú svojim rastom závislé na vaskularizácii. Klagsburn & Soker, 1993, Curent Biology, 3(10):699-702; Flokham, 1991, J. Natl. Cancer Inst., 82:4-6; Weidner, et al., 1991, New Engl. J. Med., 324:1-5.

Predpokladaná úloha VEGF v proliferácii endotelových buniek a migrácia počas angiogenézy a vaskulogenéza ukazuje na dôležitú úlohu receptoru KDR/FLK-1 v týchto procesoch. Ochorenia ako diabetes mellitus (Folkman, 198, na XI. Kongrese o trombóze a hemostáze (Vestraeta, et al., eds.), str. 583596, Leuven University Press, Leuven) a artritída, takisto ako rast malígnych nádorov môžu mať príčinu v nekontrolovanej angiogéneze. Viď napr. Fokman, 1971, N. Engl. J. Med., 285:1182-1186. Receptory, na ktoré sa VEGF špecificky viaže, sú dôležitým a silným terapeutickým cieľom pre reguláciu a moduláciu vaskulogenézy a/alebo angiogenézy v rade vážnych ochorení, ktorá zahrnujú abnormálny bunkový rast spôsobený takýmito procesmi. Plowman, et al., 1994, DN&P, 7(6):334-339. Presnejšie, vysoko špecifická úloha receptora KDR/FLK-1 v neovaskularizácii z ktoré činí možný cieľ pre terapeutické prístupy v liečbe rakoviny alebo iných ochorení, ktoré zahrnujú nekontrolovaný vznik krvných ciev.

Tak sa jedným svojim aspektom tento vynález vzťahuje na zlúčeniny schopné regulovať a/alebo modulovať tyrozínkinázovú signálnu transdukciu vrátane transdukčného signálu KDR/FLK-1 receptora za účelom inhibovať alebo podporiť angiogenézu a/alebo vaskulogenézu, t.j. zlúčeniny, ktoré inhibujú, zabraňujú alebo interferujú so signálom transdukovaným KDR/FLK-1, ak sú aktivované ligandom ako je VEGF. Aj napriek tomu bola vyslovená domnienka, že zlúčeniny tohto vynálezu pôsobia na receptor alebo inú zlúčeninu pozdĺž transdukčnej dráhy tyrozínkinázového signálu, môžu tiež pôsobiť priamo na nádorové bunky, ktoré sú výsledkom nekontrolovanej angiogenézy.

·· ·· • · · · • · ·· ·· • · · · • · · • · · • · · ·· ···· • · ··

Aj keď sa nomenklatúra pre ľudský a myší proťajšok druhového receptoru „flk-I“ líši, sú tieto receptory v mnohých ohľadoch zameniteľné. Myší receptor, Flk-1, a jeho ľudský proťajšok, KDR, zdieľajú sekvenčnú homológiu

93,4 % na svojej intracelulárnej doméne. Takisto myší FLK-I viaže ľudský VEGF s rovnakou afinitou ako myší VEGF, a teda je aktivovaný ligandom odvodeným z jedného alebo druhého druhu. Millauer et al., 1993, Celí, 72:835846; Quinn et al., 1993, Proc. Natl. Acd. Sci. USA, 90:7533-7537. FLK-1 tiež asociuje a následne fosforyluje tyrozín substrátov ľudských RTK napr. PLC-γ alebo p85), ak je koexprimovaný v bunkách 293 (línie fibroblastoidných buniek ľudských embryonálnych obličiek).

Na pochopenie KDR receptora sú teda priamo použiteľné modely, ktoré sú založené na FLK-1 receptore. Napríklad využitie myšieho receptoru FLK-1 v metódach určujúcich zlúčeniny, ktoré regulujú myšie signálne transdukčné drá-

reguláciu ľudských signálnych transdukčných dráh, t.j. ktoré regulujú aktivity spojené s KDR receptorom. Tak chemické zlúčeniny identifikované ako inhi bítory KDR/FLK-1 in vitro môžu byť potvrdené ako vhodné modely in vivo. Ako myšie tak krysie in vivo živočíšne modely vykazujú výbornú vlastnosť pre vyšetrovanie klinického potenciálu látok pôsobiacich na KDR/FLK-1 indukovanú signálnu transdukčnú dráhu.

Tak v jednom z aspektov je tento vynález zameraný na zlúčeniny, ktoré regulujú, modulujú a/alebo inhibujú vaskulogenézu a/alebo angiogenézu ovplyvňovaním enzymatickej aktivity receptora KDR/FLK-1 a interferenciu so signálom transdukovaným KDR/FLK-1. V inom svojom aspekte je tento vynález zameraný na zlúčeniny, ktoré regulujú, modelujú a/alebo inhibujú signálnu transdukčnú dráhu sprostredkovanú KDR/FLK-1 ako terapeutický prístup k liečbe mnohých druhov pevných nádorov vrátane, mimo iných, glioblastómov, melanómov a Kaposiho sarkómu, karcinómov vaječníkov, pľúc, mliečnych žliaz, prostaty, pankreasu, hrubého čreva a epidermu. Navyše údaje zakladajú predpoklad, že podávanie zlúčenín, ktoré inhibujú signálnu transdukčnú dráhu sprostredkovanú KDR/FLK-1, môže byť použitý ako liečba hemangiómu, restenois a diabetickej retinopatie.

·· ·· ·· ·· • ·· · · · · · · ··· • ··· · · · · • ···· ···· · • · ··· ··· ···· ···· ·· ···· ·· ···

Ďalší aspekt tohto vynálezu sa vzťahuje na inhibíciu vaskulogenézy a angiogenézy dráhami sprostredkovanými ďalšími receptormi, vrátane dráhy zahrnujúcej receptor flt-1.

Signálna transdukcia sprostredkovaná receptorovou tyrozínkinázou je iniciovaná extracelulárnou interakciou so špecifickým rastovým faktorom (ligandom), po ktorej nasleduje dimerizácia receptoru, dočasná stimulácia aktivity vnútorného proteínu tyrozínkinázy a autofosforylácie. Tým sa vytvoria väzbové miesta pre intracelulárne signálne transdukčné molekuly, čo vedie ku tvorbe komplexov s celým radom cytoplazmatických signálnych molekúl, ktoré sprostredkovávajú vhodnú bunkovú odpoveď, napr. delenie buniek a metabolické účinky na extracelulálne mikroprostredie. Viď Schlessinger a Ullrich, 1992, Neurón, 9:1-20.

Blízka homológia intracelulárnych oblastí KDR/FLK-1 s týmito oblasťami na receptore PDGF-β (50,3 % homológia) a/alebo príbuznom receptore flt-1 ukazuje na indukciu presahujúcich signálnych transdukčných dráh. Napríklad bolo dokázané, že pre receptor PDGF-β, člen src rodiny, (Twamley, et al.,

1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:7696-7700), sa fosfatidylinozitol-3'kináza (Hu et al„ 1992, Mol, Celí, Biol,, 12: 981-990), fosfolipáza cy (Kashishian & Kooper, 1993, Mol, Celí, Biol,, 4: 49-51), ras-GTPázu aktivujúci proteín, (Kashishian et al„ 1992, EMBO J„ II: 1373-1382), PTP-ID/syp (Kazlauskas et al,, 1993, Proc, Natl, Acad, Sci, USA, 10 90: 6939-6943), Grb2 (Arvidsson et al,, 1994, Mol, Celí, Biol,, 14: 6715-6726), a molekuly adaptéra Shc a Nck (Nishimura et al,, 1993, Mol, Celí, Biol,, 13: 6889-6896) viažu na oblasti obsahujúce rôzne autofosforylačné miesta. Všeobecne viď Claesson-Welsh,

1994, Prog, Growt Factor Res., 5: 37-54. Je teda pravdepodobné, že signálne transdukčné dráhy aktivované KDR/FLK-1 zahrnujú dráhu ras (Rozakis et al,, 1992, Náture, 360: 689-692), PI-3'-kinázy, dráhy sprostredkovávané src a plcy. Každá z týchto dráh môže hrať kritickú úlohu v angiogenéznom a/alebo vaskulogenéznom účinku KDR/FLK-1 v endoteliálnych bunkách. V dôsledku toho sa ďalší aspekt tohto vynálezu vzťahuje na využitie týchto organických zlúčenín tu opísaných na moduláciu angiogenézy a vaskulogenézy ako procesov, kontrolovaných týmito dráhami.

·· ·· • · · ·

·· ·· ·· ···· • · ·· ·

A naopak ochorenia súvisiace so zmršťovaním, zakracovaním či uzavieraním krvných ciev, ako je restenóza, sú tu tiež zahrnuté a môžu liečené alebo im môže byť predchádzané metódami tohto vynálezu.

Fibrotické poruchy majú súvislosť s abnormálnou tvorbou extracelulárnej matrix. Príklady fibrotických porúch zahrnujú cirhózu pečene a poruchy proliferácie mezangiálnych buniek. Cirhóza pečene je charakterizovaná zvýšením zložiek extracelulárnej matrix vedúcej k tvorbe pečeňových jaziev. Zvýšená extracelulárna matrix vedúca ku zjazveniu pečene môže byť tiež spôsobená vírusovou infekciou ako je žltačka. Vypadá to, že hlavnú úlohu v cirhóze pečene hrajú tukové bunky. Ďalšie implikované fibrotické poruchy zahrnujú aterosklerózu.

Poruchy proliferácie mezangiálnych buniek súvisia s poruchami zapríčinenými abnormálnou proliferáciou mezangiálnych buniek. Mezangiálne proliferačné poruchy zahrnujú rôzne ľudské obličkové ochorenia, ako je glomerulonefritída, diabetická nefropatia a malígna nefroskleróza spolu s takými ochoreniami ako sú syndrómy trombotického ochorenia mikrociev, odmietanie transplantátov a glomerulopatia. Na procese proliferácie mazangiálnych buniek sa podieľa RTK PDGFR. Floege et al., 1993, Kidney International 43:47S-54S.

Mnoho rakovín je poruchami proliferácie buniek a ako už bolo skôr uvedené, proteínkinázy sú spojené s poruchami proliferácie buniek. Preto nie je prekvapivé, že takéto proteínkinázy ako sú napríklad kinázy z rodiny RTK, sú spojované so vznikom rakoviny. Niektoré z týchto receptorov, ako je EGFR (Tuzi et al., 1991, Br. J. Cancer 63:227-233, Torp et al., 1992, APMIS 100:713-719) HER2/neu (Slamon et al., 1989, Science 244:707-712) a PDGF-R (Kumabe et al., 1992, Oncogene, 7:627-633) sú vo zvýšenej miere exprimované v mnohých nádoroch a/alebo perzistentne aktivované autokrinnými slučkami. V skutočnosti bola v najčastejších a najťažších rakovinách dokázaná nadmerná expresia týchto receptorov (Akbasak a Suner-Akbasak et al., 1992, J. Neurol. Sci., 111:119-133, Dickson et al., 1992, Cancer Treatment Res. 61:249-273, Korc et al., 1992, J. Clin. Invest. 90:1352-1360) a autokrinnej slučky (Lee a Donoghue, 1992, J. Celí. Biol., 1 18:1057-1070, Korc. et al., supra, Akbasak a Suner-Akbasak et al., supra). Napríklad EGFR je spojený s karcinómom plo48 ·· ·· ·· · • · · · · ·· · • · · · ·· « · · · · · · • · · · ·· ·· · · ·· ·· · · · chých buniek, astrocytómom, glioblastómom, rakovinou hlavy a krku, rakovinou pľúc a žlčníka. HER2 je spojený s rakovinou prsníka, vaječníkov, žalúdku, pľúc, slinivky a žlčníka. PDGFR je spojovaný s glioblastómom a melanómom spolu s rakovinou pľúc, vaječníkov a prostaty. RTK c-met je tiež spojovaný s tvorbou malígnych nádorov. Napríklad je c-met spojovaný, okrem iného s typmi rakovín, s kolorektálnym, tyroidným, pankreatickým, gastrickým a pečeňovým karcinómom a lymfómom. Navyše c-met je spojený s leukémiou. Nadmerná expresia génu c-met je tiež zisťovaná u pacientov s Hodgkinsovou chorobou a Burkittovou chorobou.

IGF-IR, okrem toho, že má súvislosť s nutričnou podporou a diabetes typu II, je tiež spojovaná s niekoľkými typmi rakovín. Napríklad bol IGF-I implikovaný ako autokrinný rastový stimulátor pre niekoľko typov nádorov, napr. bunky ľudského karcinómu prsníka (Artaega et al., 1989, J. Clin. Invest. 84:1418-1423) a nádorovej bunky pľúc (Macauley at al., 1990, Cancer Res., 50:2511-2517). Ďalej IGF-I, zatiaľ čo je integrálnou súčasťou normálneho rastu a diferenciácie nervového systému, je zrejme tiež autokrinný stimulátor ľudských gliómov. Sandgerg-Nordqvist et al., 1993, Cancer Res. 53:2475-2478. Dôležitosť IGF-IR a jeho ligandov pre proliferáciu buniek je ďalej podporovaná skutočnosťou, že mnoho typov buniek v kultúre (fibroblasty, epiteliálne bunky, bunky hladkého svalstva, T-lymfocyty, myeloidne bunky, chondrocyty a osteoblasty (kmeňové bunky kostnej drene) sú stimulované k rastu prostredníctvom IGF-I. Goldring a Goldring, 1991, Eukaryotic Gene Expression, 1:301326. V skupine posledných publikácii Baserba navrhuje, že IGF-IR hrá ústrednú úlohu v mechanizme transformácie a ako taký môže byť prednostným cieľom pre terapeutické zásahy do širokého spektra ľudských zhubných bujnení. Baserga, 1995, Cancer Res., 55:249-252, Baserga, 1994, Celí 79:927-930, Coppola et al., 1994, Mol. Celí. Biol., 14:4588-4595.

STK boli implikované v mnohých typoch rakovín vrátane, a predovšetkým, v rakovine prsníka (Cance, et al., Int. J. Cancer, 54:571-77 (1993)).

Spojenie medzi abnormálnou aktivitou PK a ochorením nie je obmedzené len na rakovinu. Napríklad RTK sú tiež spojené s chorobou ako lupienka, diabetes mellitus, endometrióza, angiogenéza, vývoj ateromatických plakov, Al• · • · zheimerovou chorobou, von Hippel-Lindauovou chorobou, epidermálna hyperproliferácia, neurodegeneratívnymi ochoreniami, makulárna degenerácia súvisiaca s vekom a hemangióm. Napríklad EGFR bol indikovaný v hojení poranení pokožky a rohovky. V diabetes mellitus typu II sú indikované defekty IGF-1R a inzulín-R. Zložitejšie korelácie medzi špecifickými RTK a ich terapeutické indikácie sú viacerými opísané v Plowman et al , 1994, DN&P 7:334-339.

Ako už bolo uvedené, nie len RTK, ale okrem iných tiež CTK src, abl, fps, yes, fyn, lyn, lck, blk, hck, fgr a yrk (preskúmané Bolenom et al., 1992, FASEB J., 6:3403-3409) sa podieľa na proliferačných a metabolických signálnych transdukČných dráhach ,a teda je možné očakávať, a bolo to predvedené, že sa podieľajú na mnohých poruchách sprostredkovávaných proteíntyrozínkinázami, na ktoré je smerovaný tento vynález. Napríklad bolo dokázané, že mutovaný src (v-src) je u kurčiat onkoproteínom (pp60^v'^src). Navyše jeho bunkový homológ, protoonkogén pp60^c'^src prenáša onkogénny signál na mnoho receptorov. Nadmerná expresia EGFR alebo HER2/bez v nádoroch vedie ku konštitutívnej aktivácii pp60^c'^src’ čo je charakteristické pre malígne bunky, ale nevyskytuje sa v normálnych bunkách. Na druhej strane myši, ktoré postrádajú expresiu c-src, vykazujú osteopetrotický fenotyp, značiaci kľúčovú účasť c-src vo funkcii osteoklastov a možného zapojenia do súvisiacich porúch.

Podobne bol implikovaný Zap70 v signalizácii T-buniek, čo môže mať súvislosť autoimunitnými poruchami.

STK sú zapojené do zápalu, autoimunitných ochorení, imunoodpovedí a hyperproliferačných porúch, ako je restenóza, fibróza, lupienka, osteoartritída a reumatická artritída.

PK hrajú tiež úlohu v implantácii embrya. Tak zlúčeniny tohto vynálezu môžu poskytovať účinnú metódu na prevenciu takéto implantácie embrya, a tým byť užitočnou látkou na kontrolu pôrodnosti.

A konečne ako RTK, tak CTK sú v súčasnosti podozrievané z účasti na hyperimunitných poruchách.

• ·

Metóda na identifikáciu chemickej zlúčeniny, ktorá moduluje katalitickú aktivitu jednej alebo viacerými vyššie diskutovaných proteínkináz je ďalším aspektom tohto vynálezu. Táto metóda zahrnuje kontaktovanie buniek exprimujúcich požadovanú proteínkinázu s niektorou zlúčeninou tohto vynálezu (alebo jej soľou či proliečivom) a sledovanie týchto buniek, aký účinok na ne daná zlúčenina mala. Tento účinok môže byť pozorovateľný buď prostým okom alebo pomocou nástrojov, ďalej zmenou alebo neprítomnosťou zmeny fenotypu buniek. Takáto zmene alebo absencia zmeny vo fenotypu sledovaných buniek môže byť napríklad, okrem iného, zmena alebo absencia zmeny katalytickej aktivity proteínkinázy v bunkách alebo zmena či absencia zmeny v interakcii proteínkinázy s prirodzeným väzbovým partnerom.

Príklady účinku radu exemplárnych zlúčenín tohto vynálezu na niekoľko PTK sú uvedené v Tabuľke 1 a 2 v oddieli Biologické príklady nižšie. Uvedené zlúčeniny a údaje nie sú v žiadnom prípade konštruované ako obmedzenie rozsahu tohto vynálezu.

5. Farmaceutické prípravky a ich použitie

Zlúčeniny podľa predloženého vynálezu, ich proliečiv alebo fyziologicky prijateľné soli buď zlúčenín podľa predloženého vynálezu alebo ich proliečiv, môžu byť aplikované ako také ľudským subjektom alebo môžu byť aplikované formou farmaceutických prípravkov, v ktorých sú vyššie uvedené látky zmiešané s vhodnými nosičmi alebo vehikulom. Techniky prípravy preparátov a aplikácie liečiv môžu byť nájdené v „Remington's Pharmacological Sciences,“ Mack Publishing Co., Easton, PA, najnovšie vydanie.

Spôsoby aplikácie

Termín „aplikácia“ alebo „aplikovanie“, ako je používaný tu, sa vzťahuje na podanie zlúčeniny, soli alebo proliečivo podľa predloženého vynálezu alebo farmaceutického prípravku obsahujúceho zlúčeninu, soľ alebo proliečivo tohto vynálezu do organizmu za účelom prevencie alebo ošetrenia porúch súvisiacich s PK.

• ·

Vhodné spôsoby aplikácie môžu zahrnovať, ale nie je to nijak limitované, perorální, rektálnu, transmukóznu alebo intestinálnu aplikáciu alebo intramuskulárnu, subkutánnu, intramedulárnu, intratekálnu, priamo intraventrikulárnu, intravenóznu, intravitreálnu, intraperitoneálnu, intranazálnu alebo intraokulárnu injekciu. Výhodné spôsoby aplikácie sú perorálne a parenterálne spôsoby.

Alebo je možné aplikovať zlúčeniny miestne skôr ako sústavne, napr. injekciou zlúčeniny priamo do pevného nádoru, často v preparáte s depotným alebo trvalým uvoľňovaním.

Ďalej je možné aplikovať liečivo v systéme s cieľovým dodaním liečiva, napr. liečivo pokryté lipozómami so špecifickou protilátkou proti určitému nádoru. Lipozómy budú určené a vytvárané selektívne podľa charakteru nádora.

Farmaceutické prípravky

Farmaceutické prípravky podľa predloženého vynálezu môžu byť pripravované spôsobmi, ktoré sú známe z doterajšieho stavu techniky, napr. pomocou štandardného miešania, rozpúšťania, granulovania, prípravy dražé, roztierania, emulgácie, zapúzdrenie, uzavretia (do tuhej látky) alebo lyofilizáciou.

Farmaceutické prípravky na použitie podľa predloženého vynálezu môžu byť pripravované štandardným spôsobom použitím jedného alebo viacerých fyziologicky prijateľných nosičov obsahujúcich vehikulum a pomocné prostriedky, ktoré uľahčujú spracovanie aktívnych látok do preparátov, ktoré môžu byť farmaceutický používané. Vlastná príprava záleží na vybranom spôsobe aplikácie.

Pre dávky vo forme injekcie môžu byť zlúčeniny podľa vynálezu pripravované vo vodných roztokoch, výhodne vo fyziologicky kompatibilných pufroch, napr. Hankov roztok, fyziologický roztok. Pre transmukóznu aplikáciu sú v preparátoch používané tiež vhodné penetrátory, známe z doterajšieho stavu techniky, ktoré sú schopné prestúpiť bariérou.

Pre dávky vo forme perorálnej aplikácie môžu byť zlúčeniny pripravené spojením aktívnych zlúčenín s farmaceutický prijateľnými nosičmi, ktoré sú ·· známe z doterajšieho stavu techniky. Takéto nosiče umožňujú zlúčeninám podľa predloženého vynálezu, aby boli pripravované vo forme tabliet, piluliek, pastiliek, dražé, puzdier, tekutých roztokov, gélov, sirupov, zahustených suspenziou, suspenziou, apod. pre perorálny príjem pacientom. Farmaceutické preparáty na perorálne použitie môžu byť vyrobené použitím pevných excipientov, prípadne trením výslednej zmesi, a spracovaním zmesi granúl, po pridaní ďalších vhodných pomocných látok, pokiaľ je požadované, na získanie tabliet alebo dražé. Použiteľné excipienty sú najmä plnivá, napr. cukry, vrátane laktózy, sacharózy, manitolu alebo sorbitolu, celulózových preparátov, napr. kukuričný škrob, pšeničný škrob, ryžový škrob a zemiakový škrob a iné látky, napr. želatína, traganth, metylcelulóza, hydroxypropylmetylcelulóza, karboxymetylcelulóza sodná, a/alebo polyvinylpyrolidón (PVP). Pokiaľ je treba, môže byť pridaná tiež látka zaisťujúca rozpad tablety po požití, napr. sieťový polyvinylpyrolidón, agar alebo kyselina algínová. Môže byť používaná tiež soľ, napr. alginát sodný.

Dražé majú vhodnú povrchovú vrstvu. Na tento účel môžu byť používané koncentrované roztoky cukru, ktoré prípadne obsahujú arabskú gumu, mastenec, polyvinylpyrolidón, karbopolgel, polyetylénglykol, a/alebo oxid titaničitý, lekárske roztoky a vhodné organické rozpúšťadla alebo zmes rozpúšťadiel. Do povrchových vrstiev tabliet alebo dražé môžu byť pridané farbivá alebo pigmenty kvôli rozpoznaniu alebo charakterizovaniu rôznych kombinácií dávok aktívnej zlúčeniny.

Farmaceutické prípravky, ktoré môžu byť používané perorálne, zahrnujú zasunovacie puzdra vyrobená z želatíny, ako aj mäkké, uzavreté puzdra vyrobené zo želatíny a zmäkčovadla, napr. glycerol alebo sorbitol. Zasunovacie puzdra môžu obsahovať aktívne zložky v prímesi s plnivom, napr. laktózou, spojivom, napr. škrob, a/alebo lubrikant, napr. mastenec alebo stearát horečnatý, prípadne stabilizátory. V mäkkých puzdrách môžu byť aktívne zlúčeniny rozpustené alebo rozptýlené vo vhodných tekutinách, napr. oleje mastných kyselín, minerálny olej alebo tekuté polyetylénglykoly. Tiež môžu byť v týchto prípravkoch pridané stabilizátory.

·· ·· ·· ·· ·· ··· · · · · ··· • 9 9 9 9 9 9 • · 9 9 9 · · ··· ···· ·· ···· ·· ·

Pre aplikáciu vo forme inhalácie sú zlúčeniny na použitie podľa predloženého vynálezu vhodne uvoľňované vo forme aerosólového spreja pomocou tlakovacieho zariadenia alebo rozprašovača a vhodnej hnacej látky, napríklad, bez akéhokoľvek obmedzenia, dichlórdifluórmetán, trichlórfluórmetán, dichlórtetrafluóretán alebo oxid uhličitý. V prípade natlakovaného aerosólu môže byť dávka regulovaná špec. ventilom na zaistenie dávkovaného množstva. Púzdra a náplne, napr. zo želatíny, na použitie v inhalovači alebo insuflatoru môžu byť pripravené s obsahom práškovej zmesi zlúčeniny a vhodnej práškovej bázy, napr. laktóza alebo škrob.

Zlúčeniny môžu byť tiež pripravené pre parenterálnu aplikáciu, napr. injekciou bolusu alebo kontinuálnou infúziou. Preparáty pre injekciu môžu byť vo forme jednotnej dávky, napr. v ampulách, alebo v obaloch na viaceré dávky s pridanou konzervačnou látkou. Prípravky môžu byť tiež vo forme suspenzií, roztokov alebo emulzií v olejovitom alebo vodnom nosiči a môžu tiež obsahovať pomocné látky, napr. suspendačné prostriedky, stabilizačné prostriedky a/alebo dispergujúce prostriedky.

Farmaceutické prípravky na parenterálnu aplikáciu zahrnujú vodné roztoky vo vode rozpustných foriem, napr., ale nie to nijak limitované, soli aktívnej zlúčeniny. Ďalej suspenzie aktívnej zlúčeniny môžu byť pripravené v lipofilnom nosiči. Vhodné lipofilné nosiče zahrnujú oleje mastných kyselín, napr. sezámový olej, syntetické estery mastných kyselín, napr. etyl oleát a triglyceridy alebo látky, napr. lipozómy. Vodné injekčné suspenzie môžu obsahovať látky, ktoré zvyšujú viskozitu suspenzie, napr. karboxymetylcelulóza sodná, sorbitol alebo dextrán. Prípadne môžu tiež suspenzie obsahovať vhodné stabilizačné prostriedky a/alebo agens, ktoré zvyšujú rozpustnosť zlúčenín, čím umožnia prípravu vysoko koncentrovaných roztokov.

Alebo pred použitím môže byť aktívna zložka v práškovej forme primiešaná s vhodným nosičom, napr. sterilná voda neobsahujúca pyrogén.

Zlúčeniny môžu tiež byť pripravované vo forme rektálnych prípravkov, napr. čipky alebo retenčné črevné nálevy, použitím, napr., štandardných čipkových základov, napr. kakaový olej alebo iné glyceridy.

• · ·· ·· ·· ·· ··· · · · · ··· • · · · · · · • · · · · · · ··· ·· ···· ·· ···

Okrem vyššie opísaných preparátov môžu byť zlúčenina tiež pripravovaná vo forme depotných prípravkov. Takéto preparáty s dlhou dobou pôsobenia môžu byť aplikované implantáciou (napr. subkutánne alebo intramuskulárne) alebo intramuskulárnou injekciou. Zlúčeniny tohto vynálezu môžu byť pripravované pre tento spôsob aplikácie s vhodnými polymérnymi alebo hydrofóbnymi látkami (napr. v emulzii s farmakologicky prijateľným olejom), s iónovými meničmi alebo ako ťažko rozpustné soli.

Príklad farmaceutický prijateľného nosiča pre hydrofóbne zlúčeniny podľa vynálezu, ale nie to nijak limitované, je latentné rozpúšťadlo obsahujúce benzylalkohol, nepolárny surfaktant, organický polymér miešateľný s vodou a vodná fáza, napr. latentné rozpúšťadlo VPD. VPD je roztok 3% w/v benzylalkoholu, 8% w/v nepolárneho surfaktantu Polysorbátu 80™ a 65% w/v polyetylénglykolu 300, pripraveného do objemu v absolútnom etanole. Latentné rozpúšťadlo VPD (VPD:D5W) sa skladá z VPD zriedeneného 1:1 s 5% dextrózou vo vodnom roztoku. Toto latentné rozpúšťadlo dobre rozpúšťa hydrofóbnu zlúčeninu a má nízku toxicitu pri sústavnom podávaní. Samozrejme, že pomerné diely tohto latentného rozpúšťadla sa môžu podstatne líšiť, viac-menej by mali byť také, aby sa neporušili jeho rozpustné a toxické vlastnosti. Ďalej charakter komponent tohto latentného rozpúšťadla môže byť odlišný: napríklad môžu byť miesto Polysorbátu 80™ používané iné málo toxické nepoláme surfaktanty, rozmery častí polyetylénglykolu sa môžu líšiť, polyetylénglykol môže byť nahradený inými biokompatibilnými polymérmi, napr. polyvinylpyrolidónom a inými cukrami alebo polysacharidmi môžu nahradiť dextrózu.

Alebo môžu byť pre hydrofóbne farmaceutické zlúčeniny používané iné spôsoby podania. Lipozómy a emulzie sú veľmi dobre známe príklady spojív alebo nosičov používaných pri podávaní hydrofóbnych liečiv. Okrem toho môžu byť používané určité organické rozpúšťadla, napr. dimetylsulfoxid, aj keď často za cenu väčšej toxicity.

Ďalej môžu byť zlúčeniny podávané použitím systému s postupným uvoľňovaním, napr. semipermeabilná matrica pevných hydrofóbnych polymérov obsahujúcich terapeutické agens. Boli zavedené rôzne materiály s postupným uvoľňovaním a sú dobre známe odbornej verejnosti. Púzdra s postupným uvoľ55 ·« ·· ·· ···· ···· · · · · · ·· • · · · · ·· • · · ·· ··· ···· ·· ······ · ňovaním môžu, v závislosti na ich chemickom charaktere, uvoľňovať zlúčeniny počas niekoľkých týždňoch až stoviek dní. V závislosti na chemickom pôvode (charaktere) a biologickej stabilite môžu byť na stabilizáciu proteínov používané doplnkové koncepcie.

Farmaceutické prípravky môžu tiež obsahovať vhodné pevné alebo gólové nosiče alebo excipienty. Príklady takýchto nosičov alebo excipientov zahrnujú, ale nie je to nijak obmedzené, uhličitan vápenatý, fosforečnan vápenatý, rôzne cukry, škroby, deriváty celulózy, želatínu a polyméry, napr. polyetylénglykoly.

Hodne PK modulujúcich zlúčenín podľa vynálezu môže byť vo forme fyziologicky prijateľných solí, kde patentované zlúčeniny môžu tvoriť negatívne alebo pozitívne nabité častice. Príklad solí, v ktorých zlúčenina tvorí pozitívne nabitú časť, zahrnujú, ale nie to nijak limitované, kvartérne amónne soli (podľa tu uvedenej definície), napr. hydrochlorid, sulfát, uhličitan, laktát, tartarát, maleát, sukcinát, kde dusíkový atóm kvartérnej amónnej skupiny je dusík vybranej zlúčeniny tohto vynálezu, ktorá reagovala s príslušnou soľou. Soli, v ktorých zlúčeniny tohto vynálezu tvoria negatívne nabité častice zahrnujú, ale nie to nijak limitované, sodné, draselné, vápenaté a horečnaté soli tvorené reakciou skupiny karboxylovej kyseliny v zlúčenine s príslušnou bázou (napr. hydroxid sodný (NaOH), hydroxid draselný (KOH), hydroxid vápenatý (Ca(OH)₂), atď.

Dávky

Farmaceutické prípravky vhodné na použitie v predloženom vynáleze zahrnujú prípravky, kde aktívne zložky sú obsiahnuté v takom množstve, ktoré je potrebné na dosiahnutie určeného zámeru, tzn. modulácie aktivity PK alebo prevencie alebo ošetrenia porúch súvisiacich s PK.

Presnejšie povedané, terapeuticky účinné množstvo znamená množstvo zlúčeniny účinné na prevenciu, zmiernenie alebo zlepšenie príznakov ochorenia alebo prolongovanie prežitia subjektu, ktorý je ošetrovaný.

•· ·· ·· ·· · · ···· · · · · ··· • · · · · · · • ···· · · · · • · · · · · · ···· ···· ·· ···· ·· ·

Stanovenie terapeuticky účinného množstva je v rámci spôsobilosti odbornej verejnosti, najmä v súvzťažnosti na tu podrobne uvedenú opisnú časť.

Pre akúkoľvek tu používanú zlúčeninu v spôsoboch podľa vynálezu môže byť na počiatku terapeuticky účinné množstvo tejto zlúčeniny navrhnuté podľa uskutočnených stanovení na bunkovej kultúre. Potom môže byť dávka pripravená na použitie na zvieracích modeloch tak, aby sa dosiahlo periodického rozpätia koncentrácie, ktoré zahrnuje hodnotu IC50 podľa uskutočneného stanovenia na bunkovej kultúre (tzn. koncentrácia testovanej zlúčeniny, ktorá dosiahne polovičnú maximálnu inhibíciu aktivity PK). Tento údaj potom môže byť používaný ako presnejšie stanovená účinná dávka u ľudských subjektov.

Toxicita a terapeutická účinnosť tu opisovaných zlúčenín môže byť stanovená štandardnými farmaceutickými postupmi na bunkových kultúrach alebo na experimentálnych zvieratách, napr. stanovením hodnoty IC50 a LD50 (obidve sú uvedené v tejto opisnej časti) pre danú zlúčeninu. Údaje získané z týchto stanovení uskutočňovaných na bunkovej kultúre a zvieracích subjektoch môžu byť používané pri formulovaní rozsahu dávky na použitie u ľudských subjektov. Dávka sa môže líšiť v závislosti na používanej forme dávky a na používanom spôsobe aplikácie dávky. Presné spôsoby prípravy, aplikácie a dávky môžu byť vybrané jednotlivými lekármi v závislosti na stave pacienta. Viď napr. Fingl, et al., 1975, v „Te Pharmacological Basis of Terapeutics“, kapitola 1, str. 1).

Množstvo dávky a interval môže byť prispôsobený jednotlivým subjektom na poskytnutie plazmatickej hladiny aktívnej látky, ktorá je dostačujúca na udržanie kinázových modulačných účinkov na kinázu. Tieto plazmatické hladiny sa nazývajú minimálne účinné koncentrácie (MEC). MEC sa budú podľa zlúčeniny líšiť, ale môžu byť odhadnuté na základe in vitro údajov, napr. koncentrácie, ktorá je nevyhnutná na dosiahnutie 50 - 90% inhibicie kinázy môže byť určená pomocou stanovení, ktoré sú tu opísané. Miery dávky, ktoré sú nevyhnutné na dosiahnutie MEC, budú závislé na jednotlivých charakteristikách a spôsoboch aplikácie.

·· ·« ·· ·· ·· • ·· · · ·· · · · · · • ··· · · · · • · · · · · · · · · • · · · · ··· • t·· ···· ·· ···· ·· ···

Rozpätie dávky môže byť tiež stanovené pomocou hodnoty MEC. Zlúčeniny by mali byť aplikované v takom režime, ktorý zaistí z 10 - 90% času plazmatickej hladiny nad MEC.

V prípadoch miestnej aplikácie alebo voliteľnej absorpcie nesúvisí koncentrácia liečiva s koncentráciou v plazme a na stanovenie správneho množstva a rozpätia dávky môžu byť používané iné postupy známe z doterajšieho stavu techniky.

Množstvo aplikovaného prípravku bude samozrejme závisieť na subjekte, ktorý je ošetrovaný, závažnosti poruchy, spôsobu aplikácie, posúdenia predpisujúceho lekára, atď.

Baliaca technika

Prípravky môžu, pokiaľ je to požadované, byť v balení alebo v dávkovacom zariadení, napr. schválený kit FDA, ktorý môže obsahovať jeden alebo viacero dávkovacích jednotiek aktívnej zložky. Balenie môže napr. obsahovať kovovú alebo umelohmotnú fóliu, napr. pevný plastický obal s lepenkovou podperou. Balenie alebo dávkovacie zariadenie môže byť vybavené návodom na použitie. Balenie alebo dávkovacie zariadenie môže byť tiež vybavené sprevádzajúcimi upozorneniami o forme predpísanej orgánom štátnej správy regulujúcim výrobu, použitie alebo predaj farmaceutických prípravkov, ktorý povoľuje formy prípravku alebo ľudskej alebo veterinárnej aplikácie. Takéto upozornenia, napr. môžu byť schválené americkým Úradom na kontrolu potravín a liekov, pre liečivý prípravok (len na lekársky predpis) alebo schválený pridaný produkt. Môžu byť tiež pripravené prípravky obsahujúce zlúčeninu podľa vynálezu pripravenú v kompatibilnom farmaceutickom nosiči, umiestnenej v príslušnom zásobníku a označené na ošetrenie indikovaného stavu. Vhodné stavy ochorení, ktoré sú indikované na štítku, môžu zahrnovať ošetrenie nádoru, inhibíciu angiogenézy, ošetrenie fibrózy, diabetes, apod.

6. Syntéza

Zlúčeniny tohto vynálezu, takisto ako aj prekurzory 2-oxindolov a aldehydov, môžu byť ľahko syntetizované použitím odborníkom dobre známych ·· ·· techník. Bude ocenené odborníkmi v odbore, že cesty vedúce k syntéze zlúčenín tohto vynálezu s dosiahnuteľné, a že nasledujúce ponúkané spôsoby sú len ako príklad a nie ako jediná možnosť syntézy týchto zlúčenín.

A. Základný syntetický postup

Nasledujú základné metódy, ktoré môžu byť použité na prípravu zlúčenín tohto vynálezu:

Vhodne substituovaný 2-oxindol (1 ekvivalent), vhodne substituovaný aldehyd (1,2 ekv.) a piperidín (0,1 ekv.) sú zmiešané s etanolom (1-2 ml/mmol

2-oxindolu) a zmes sa potom zahrieva pri 90 °C po dobu 3 až 5 hodín. Po ochladení sa reakčná zmes koncentruje a okyslí sa na pH 3. Vytvorený precipitát sa prefiltruje, premyje vodou na pH 7 a potom studeným etanolom, etylacetátom a/alebo hexánom a suší sa vo vákuu, čím sa získa požadovaná zlúčenina. Produkt sa môže prípadne prečistiť chromatografiou.

B. 2-oxindoly.

Nasledujúce príklady reprezentujú syntézy zlúčenín tohto vynálezu z prekurzorov 2-oxindolu. Tieto 2-oxindoly budú vytvárať požadovanej zlúčeniny reakciou s vhodne substituovaným pyrol aldehydom použitím základného syntetického postupu alebo postupov uvedených v časti C, nižšie. Rozumie sa, že nasledujúce syntézy nie sú konštruované ako obmedzenie buď už syntetického prístupu, alebo oxindolov, ktorých syntéza sa uskutočňuje.

5-amino-2-oxindol

5-nitro-2-oxindol (6,3 g) sa hydrogenuje v metanole cez 10 % paladium na aktívnom uhlí, čím sa získajú 3,0 g (60 % výťažok) požadovanej zlúčeniny ako bielej pevnej látky.

5-bromo-2-oxindol

2-oxindol (1,3 g) v 20 ml acetonitrilu sa ochladí na 10 °C a pomaly sa pridajú 2,0 g N-brómsukcínimidu za stáleho miešania. Reakcia sa mieša po do59 ·· ·· ·· ·· ·· · • ·· · · ·· · · ··· • ··· · · · · • · · · · · · · · · • · · · · · · · • e······ ·· ···· ·· ··· bu 1 hodiny pri -10 °C a 2 hodiny pri 0 °C. Precipitát sa zhromaždí, premyje sa vodou a usuší sa. Získa sa 1,9 g (90 % výťažok) požadovanej zlúčeniny.

4-metyl-2-oxindol

Dietyloxalát (30 ml) v 20 ml suchého éteru sa pridá za stáleho miešania do 19 g etoxidu draselného rozpusteného v 50 ml suchého éteru. Zmes sa ochladí v ľadovom kúpeli a pomaly sa pridá 20 ml 3-nitro-o-xylénu v 20 ml suchého éteru. Hustá tmavá zmes sa zahrieva pod refluxom po dobu 30 minút, koncentruje sa do vzniku tmavo červenej pevnej látky a nechá sa pôsobiť s 10 % hydroxidom sodným pokiaľ sa takmer všetka pevná látka nerozpustí. Tmavo červená zmes sa nechá pôsobiť s 30% peroxidom vodíka pokiaľ sa červená farba nezmení na žltú alebo sa zmes nechá pôsobiť s 10% hydroxidom sodným a 30% peroxidom vodíka pokiaľ nezmizne tmavo červená farba. Pevná látka sa prefiltruje a filtrát sa okyslí 6N chlorovodíkovou kyselinou. Výsledný precipitát sa zhromaždí vákuovou filtráciou, premyje vodou a suší pod vákuom. Získa sa 9,8 g (45% výťažok) 2-metyl-6-nitrofenyloctovej kyseliny ako šedastej pevnej látky. Pevná látka sa hydrogenuje v metanole cez 10 % paládium na aktívnom uhlí. Získa sa 9,04 g požadovanej zlúčeniny ako bielej pevnej látky.

7-bromo-5-chlór-2-oxindol

5-chlór-2-oxindol (16,8 g) a 19,6 g N-brómsukcínimid sa rozpustí v 140 ml acetonitrilu a refluxuje po dobu 3 hodiny. Tenkovrstvová chromatografia (silikagél, etylacetát) po 2 hodinách refluxu potvrdí 5-chlór-2-oxindol alebo Nbrómsukcínimid (Rf 0,8), produkt (Rf 0,85) a druhý produkt (Rf 0,9) ktorých pomer sa za ďalšiu hodinu refluxu nezmení. Zmes sa ochladí na 10 °C, precipitát sa zhromaždí vákuovou filtráciou, premyje 25 ml etanolu a odsáva sa odsácacim lievikom po dobu 20 minút. Získa sa 14,1 g vlhkého produktu (56 % výťažok). Pevná látka sa rozpustí v 200 ml denaturovaného etanolu, rozotrie sa miešaním a refluxuje po dobu 10 minút. Zmes sa ochladí v ľadovom kúpeli na 10 °C. Pevný produkt sa zhromaždí vákuovou filtráciou, premyje 25 ml etanolu a suší sa pod vákuom pri 40 °C, čím sa získa 12,7 g (51% výťažok) 7-bromo-5chlór-2-oxindol.

·· ·· ·· ···· • · •· · •· • ·· •· • · ·

5-fluór-2-oxindol

5-fluórisatín (8,2 g) sa rozpustí v 50 ml hydrátu hydrazínu a refluxuje po dobu 1 hodiny. Potom sa reakčná zmes preleje do ľadovej vody. Precipitát sa prefiltruje, premyje vodou a usuší vo vákouvej peci, čím sa získa požadovaná zlúčenina.

5-nitro-2-oxindol

2-oxindol (6,5 g) sa rozpusti v 25 ml koncentrovanej kyseliny sírovej a zmes sa udržuje pri teplote -10 až -15 °C. V tomto čase sa po kvapkách pridá

2,1 ml kyseliny dusičnej. Po pridaní kyseliny dusičnej sa reakčná zmes mieša pri 0 °C po dobu 30 minút a preleje do vody. Precipitát sa zhromaždí vákuovou filtráciou, premyje vodou a kryštalizuje z 50 % kyseliny octovej. Kryštalický produkt sa prefiltruje, premyje vodou a suší pod vákuom, čím sa získa 6,3 g (70%) 5-nitro-2-oxindolu.

5-jodo-2-oxindol

2-oxindol (82,9 g) sa rozpustí v 630 ml kyseliny octovej mechanickým miešaním a zmes sa ochladí na 10 °C v ľadovom vodnom kúpeli. Pevný Njódsukcínimid (175 g) sa pridá po častiach počas 10 minút. Potom sa zmes mieša po dobu 1 hodiny pri 10 °C. Stále prítomná rozpustená pevná látka počas tejto doby zhustne. Pevná látka sa zhromaždí vákuovou filtráciou, premyje 100 ml 50 % kyseliny octovej vo vode, 200 ml vody a odsáva sa na lieviku po dobu 20 minút. Produkt sa suší pod vákuom, čím sa získa 93,5 g (36 %) 5-jód-2oxindolu obsahujúceho podľa protónovej NMR približne 5% 2-oxindolu.

5-metyl-2-oxindol

5-melylisatín (15,0 g) a 60 ml hydrátu hydrazínu sa zahrievajú na teplotu 140 až 160 °C po dobu 4 hodín. Tenkovrstvová chromatografia (etylacetát: hexán 1: 2, silikagél) neukáže žiadny zvyšujúci východiskový materiál. Reakčná zmes sa ochladí na izbovú teplotu, preleje do 300 ml ľadovej vody a okyslí sa na pH 2 pomocou 6N kyseliny chlorovodíkovej. Po státí pri izbovej teplote po ·· ·· ·· ·· ·· ··· · · · · · · • · · · · · · • · · · · ···· • · · · · · · dobu 2 dní sa precipitát zhromaždí vákuovou filtráciou, premyje vodou a suší pod vákuom, čím sa získa 6,5 g (47 % výťažok) 5-metyl-2-oxindolu.

5- bromo-4-metyloxindol a 5,7-dibróm-4-metyloxindol

4-metyl-2-oxindol (5 g) v 40 ml acetonitrilu sa nechá pôsobiť s 7,26 g Nbrómsukcínimidu a mieša sa pri izbovej teplote 4 hodiny. Tenkovrstvová chromatografia (etylacetát: hexán 1: 2, silikagél) potvrdí zmes 5-bromo (Rf 0,3) a

5,7-dibróm (Rf 0,5) produktov. Pridá sa ďalších 7,26 g N-brómsukcínimidu a zmes sa mieša ďalšie 4 hodiny. Pevná látka sa zhromaždí vákuovou filtráciou, premyje 20 ml acetonitrilu a suší, čím sa získa zmes mono a dibromo zlúčenín v pomere 1 1. Filtrát sa koncentruje a chromatografuje na silikagély (etylacetát: hexán (1: 2)) . Získa sa 1,67 g 5-bróm-4-metyl-2-oxindolu ako béžová pevná látka. Zvyšujúca zmes pevných látok s pomerom 1 : 1 sa dvakrát rekryštalizuje z ľadovej kyseliny octovej, čím sa získa 3,2 g 5,7-dibróm-4-metyl-2oxindolu ako svetlo oranžová pevná látka. Filtráty tohto materiálu sa chromatografujú podľa viď. vyššie, čím sa získa 0,6 g 5-bróm-4-metyl-2-oxindolu a 0,5 g 5,7-dibróm-4-metyl-2-oxindolu.

6- fluór-2-oxindol

Hydrid sodný (2,6 g) a 14,5 g dimetylmalonátu sa mieša a zahrieva pri 100 °C v 160 ml dimetylsulfoxidu 1 hodinu. Zmes sa ochladí na izbovú teplotu, pridá sa 7,95 g 2,5-difluórnitrobenzénu a zmes sa mieša po dobu 30 minút. Potom sa zmes zahrieva pri 100 °C po dobu 1 hodiny, ochladí sa na izbovú teplotu a preleje do 400 ml roztoku saturovaného chloridu sodného. Zmes sa extrahuje 200 ml etylacetátu a organická vrstva sa premyje soľankou, suší nad bezvodým síranom sodným a koncentruje pod vákuom. Zvyšok sa kryštalizuje z metanolu, čím sa získa 24,4 g (80 % výťažok) dimetyl 4-fluór-2-nitrofenylmalonátu ako bielej pevnej látky, Rf 0,2 na tenkovrstvovej chromatografii (etylacetát: hexán 1: 6, silikagél). Filtrát sa koncentruje a chromatografuje na stĺpci silikagélu (etylaceOtát: hexán 1: 8), čím sa získa ďalších 5,03 g dimetyl 4-fluór-2-nitrofenylmalonátu. Čo dohromady činí 29,5 g (96 % výťažok).

Dimetyl 4-fluór-2-nitrofenylmalonát (5,0 g) sa refluxuje v 20 ml 6N kyseliny chlorovodíkovej po dobu 24 hodín. Reakcia sa ochladí a biela pevná lát·· ··

·· ·· • · · ·· ···· ka sa zhromaždí vákuovou filtráciou, premyje vodou a usuší. Získa sa 3,3 g (87 % výťažok) 4-fluór-2-nitrofenyloctvej kyseliny, Rf 0,6 na tenkovrstvovej chromatografii (etylacetát: hexán 1: 2, silikagél).

4- fluór-2-nitrofenyloctová kyselina (3,3 g) zriedená v 15 ml kyseliny octovej sa hydrogenuje cez 0,45 g 10 % paládia na aktívnom uhlí pri 60 psi H₂ po dobu 2 hodín. Katalyzátor sa odstráni filtráciou a premyje sa 15 ml metanolu. Spojené filtráty sa spoja a zriedia vodou. Precipitát sa zhromaždí vákuovou filtráciou, premyje vodou a usuší, čím sa získa 1,6 g (70 % výťažok) 6fluór-2-oxindolu, Rf 0,24 na tenkovrstvovej chromatografie. Filtrát sa koncentruje do vzniku nachovej pevnej látky s podobným NMR spektrom ako prvé množstvo. Chromatografiou nachovej pevnej látky (etylacetát: hexán 1: 2, silikagél) sa získa druhé množstvo 6-fluór-2-oxindolu ako bielej pevnej látky.

5-aminosulfonyl-2-oxindol

Do 100 ml banky naplnenej 27 ml chlórsírovej kyseliny sa pomaly pridá

13,3 g 2-oxindolu. Počas pridávania sa reakčná teplota udržuje pod 30 °C. Po prídavku sa reakčná zmes mieša pri izbovej teplote po dobu 1,5 hodiny, zahrieva sa na 68 °C po dobu 1 hodiny, ochladí sa a preleje do vody. Precipitát sa premyje vodou a usuší vo vákuovej peci, čím sa získa 11,0 g 5-chlórsulfonyl-2oxindolu (50% výťažok), ktorý sa použije bez ďalšieho čistenia.

5- chlórsulfonyl-2-oxindol (2,1 g) sa pridá do 10 ml hydroxidu amónneho v 10 ml etanolu a mieša sa pri izbovej teplote cez noc. Zmes sa koncentruje a pevná látka sa zhromaždí vákuovou filtráciou. Získa sa 0,4 g (20% výťažok) požadovanej zlúčeniny ako šedej pevnej látky.

5-metylaminosulfonyl-2-oxindol

Suspenzia 3,38 g 5-chlórsulfonyl-2-oxindolu v 10 ml 2M metylamínu v tetrahydrofuráne sa mieša pri izbovej teplote po dobu 4 hodín, počas ktorej sa utvorí biela pevná látka. Precipitát sa zhromaždí vákuovou filtráciou, premyje dvakrát 5 ml vody a suší pod vákuom pri 40 °C cez noc. Získa sa 3,0 g (88 % výťažok) 5-metylaminosulfonyl-2-oxindolu.

·· ·· ·· ·· ·· · ···· ···· · · ·· • ··· · · · · • ···· · · · · · • 9 9 9 9 9 9 9

9999 9999 99 9999 99 999

5-(4-trifluórmetylfenylaminosulfonyl)-2-oxindol

Suspenzia 2,1 g 5-chlórsulfonyl-2-oxindolu, 1,6 g 4-trifluórmetylanilínu a 1,4 g pyridínu v 20 ml dichlórmetánu sa mieša pri izbovej teplote po dobu 4 hodín. Precipitát, ktorý sa utvoril sa zhromaždí vákuovou filtráciou, premyje dvakrát 5 ml vody a suší pod vákuom pri 40 °C cez noc. Získa sa 2,4 g surového produktu, ktorý podľa tenkovrstvovej chromatografie obsahuje nejaké nečistoty. Surový produkt sa chromatografuje na silikagély mobilnou fázou etylacetát: hexán (1: 2), čím sa získa 1,2 g (37 % výťažok) 5-(4-trifluórmetylfenylaminosulfonyl)-2-oxindolu.

5- (morfolinosulfonyl)-2-oxindol

Suspenzia 2,3 g 5-chlórsulfonyl-2-oxindolu a 2,2 g morfolínu v 50 ml dichlórmetánu sa mieša pri izbovej teplote po dobu 3 hodín. Biely precipitát sa zhromaždí vákuovou filtráciou, premyje sa etylacetátom a hexánom a suší sa pod vákuom pri 40 °C cez noc. Získa sa 2,1 g (74 % výťažok) 5(morfolinosulfonyl)-2-oxindolu.

6- trifluórmetyl-2-oxindol

Dimetylsulfoxid (330 ml) sa pridá do 7,9 g hydridu sodného, potom sa po kvapkách pridá 43,6 g dietyloxalátu. Zmes sa zahrieva pri 100 °C po dobu 1 hodiny a ochladí sa na izbovú teplotu. Pridá sa 2-nitro-4-trifluórmetyltoluén (31,3 g). Reakcia sa mieša po dobu 30 minút pri izbovej teplote a potom sa zahrieva pri 100 °C po dobu 1 hodiny. Reakcia sa ochladí a preleje do zmesi saturovaného vodného chloridu amónneho, etylacetátu a hexánu. Organická vrstva sa premyje saturovaným chloridom amónnym, vodou a soľankou. Suší sa a koncentruje, čím sa získa dimetyl 2-(2-nitro-4-trifluórmetylfenyl)malonát.

Diester sa rozpustí v zmesi 6,4 g chloridu íítneho a 2,7 ml vody v 100 ml dimetylsulfoxidu a zahrieva sa pri 100 °C po dobu 3 hodín. Reakcia sa ochladí a preleje do zmesi etylacetátu a soľanky. Organická fáza sa premyje soľankou, suší sa so síranom sodným, koncentruje a chromatografuje na silikagély (10 % etylacetát v hexáne). Frakcia obsahujúca produkt sa odparí, čím sa získa 25,7 g metyl 2-nitro-4-trifluórmetylfenylacetátu.

·· ··

·· ·· ·· • ·· •· •· ·· ····

Metyl 2-nitro-4-trifluórmetylfenylacetát (26 mg) sa hydrogenuje cez 10 % paládium na aktívnom uhlí a potom sa zahrieva pri 100 °C po dobu 3 hodín. Katalyzátor sa odstráni filtráciou a rozpúšťadlo sa odparí, čím sa získa požadovaná zlúčenina.

5-(2-chlóretyl)oxindol

5-chlóracetyl-2-oxindol (4,18 g) v 30 ml trifluoroctovej kyseliny v ľadovom kúpeli sa nechá pôsobiť s 4,65 g trietylsilánu a mieša sa pri izbovej teplote po dobu 3 hodín. Zmes sa naleje do 150 ml vody a precipitát sa zhromaždí vákuovou filtráciou, premyje 50 ml vody a usuší, čím sa získa 2,53 g (65% výťažok) 5-(2-chlóretyl)-2-oxindolu ako červenohnedej pevnej látky.

5-metoxykarbonyl-2-oxindol

5-jód-2-oxindol (17 g) sa refluxuje s 2 g diacetátu paládia, 18,2 g trietylamínu, 150 ml metanolu, 15 ml dimetylsulfoxidu a 2,6 g DPPP v atmosfére saturovanej oxidom uhoľnatým. Po 24 hodinách sa z reakčnej zmesi odstráni katalyzátor filtráciou a filtrát sa koncentruje. Koncentrát sa chromatografuje na silikagély (30 % etylacetát v hexáne). Frakcie obsahujúce produkt sa koncentrujú a nechajú sa stáť. Precipitát produktu sa zhromaždí vákuovou filtráciou, čím sa získa 0,8 g (7%) požadovanej zlúčeniny ako šedej pevnej látky.

4-karboxy-2-oxindol

Roztok trimetylsilyldiazometánu v hexáne (2M) sa pridáva po kvapkách do roztoku 2,01 g 2-chlór-3-karboxy-nitrobenzénu v 20 ml metanolu pri izbovej teplote pokiaľ sa nezačne uvoľňovať plyn. Prebytok trimetylsilyldiazo-metánu sa odstráni octovou kyselinou. Reakčná zmes sa suší na rotačnej pumpe a zvyšok sa ďalej suší vo vákuovej peci cez noc. Získa sa produkt (2 chlór-3metoxykarbonyl-nitrobenzén) dostatočne čistý pre ďalšiu reakciu.

Dimetyl malonát (6,0 ml) sa pridá do ľadovo studenej suspenzie 2,1 g hydridu sodného v 15 ml DMSO. Reakčná zmes sa potom mieša pri 100 °C po dobu 1 hodiny a potom sa ochladí na izbovú teplotu. Do tejto zmesi sa v jednej dávke pridá 2-chlór-3-metoxykarbonylnitrobenzén (2,15 g) a zmes sa zahrieva • · pri 100 °C po dobu 1,5 hodiny. Reakčná zmes sa ochladí na izbovú teplotu a preleje sa do ľadovej vody. Okyslí sa na pH 5 a extrahuje etylacetátom. Organická vrstva sa premyje soľankou, suší sa nad bezvodým síranom sodným a koncentruje, čím sa získajú 3,0 g dimetyl 2-metoxykarbonyl-6nitrofenylmalonátu.

Dimetyl 2-metoxykarbonyl-6-nitrofenylmalonát (3,0 g) sa refluxuje v 50 ml 6 N chlorovodíkovej kyseliny cez noc. Zmes sa koncentruje do sucha a refluxuje po dobu 2 hodín s 1,1 g chloridu cínatého v 20 ml etanolu. Zmes sa prefiltruje cez Celit, koncentruje a chromatografuje na silikagély (etylacetát: hexán: octová kyselina), čím sa získa 0,65 g (37% výťažok) 4-karboxy-2-oxindolu ako bielej pevnej látky.

5-karboxy-2-oxindol

2-oxindol (6,7 g) sa pridá do miešanej suspenzie 23 g chloridu hlinitého v 30 ml dichlóretánu v ľadovom kúpeli. Pomaly sa pridá chlóracetyl chlorid (11,3 g) a začne sa vyvíjať plynný chlorovodík. Po desiatich minútach miešania sa reakcia zahrieva na teplotu 40 až 50 °C po dobu 1,5 hodiny. Tenkovrstvová chromatografia (etylacetát, silikagél) nepotvrdila žiadny zvyšný východiskový materiál. Zmes sa ochladí na izbovú teplotu a preleje do ľadovej vody. Precipitát sa zhromaždí vákuovou filtráciou, premyje vodou a usuší po vákuom, čím sa získa 10,3 g (98%) 5-chlóracetyl-2-oxindolu ako šedej pevnej látky.

Suspenzia 9,3 g 5-chlóracetyl-2-oxindolu sa mieša v 90 ml pyridínu pri 80 až 90 °C po dobu 3 hodiny a potom sa ochladí na izbovú teplotu. Precipitát sa zhromaždí vákuovou filtráciou a premyje 20 ml etanolu. Pevná látka sa rozpustí v 90 ml 2,5N hydroxidu sodného a mieša sa pri 70 až 80 °C po dobu 3 hodín. Zmes sa ochladí na izbovú teplotu a okyslí sa 0,5 N kyselinou chlorovodíkovou na pH 2. Precipitát sa zhromaždí vákuovou filtráciou a dôkladne premyje vodou, čím sa získa surový 5-karboxy-2-oxindol ako tmavo hnedá pevná látka. Filtrát sa ponechá stáť cez noc, čím sa získajú 2 g 5-karboxy-2-oxindolu vo forme žltej pevnej látky. Surový tmavo hnedý produkt sa rozpustí v horúcom metanole, nerozpustný materiál sa odstráni filtráciou a filtrát sa koncentruje, ·· · · ·· ·· ·· ···· «··· · • · · · · · · • · · · · · · ···· ···· ·· ···· ·· · 66 čím sa získa 5,6 g 5-karboxy-2-oxindolu ako hnedej pevnej látky. Spojené výťažky činia 97%.

5-karboxyetyl-2-oxindol

5-kyanoetyl-2-oxindol (4,02 g) v 10 ml vody obsahujúci 25 ml koncentrovanej kyseliny chlorovodíkovej sa refluxuje po dobu 4 hodín. Zmes sa ochladí, pridá sa voda a výsledná pevná látka sa zhromaždí vákuovou filtráciou. Premyje sa vodou a usuší, čím sa získa 1,9 g (44% výťažok) požadovanej zlúčeniny ako pevnej žltej látky.

5-jód-4-metyl-2-oxindol

Do 2 g 4-metyl-2-oxindolu v 40 ml ľadovej kyseliny octovej v ľadovom kúpeli sa pridá 3,67 g N-jódsukcínimidu. Zmes sa mieša po dobu 1 hodiny, zriedi sa 100 ml 50 % octovej kyseliny vo vode a prefiltruje sa. Výsledná biela pevná látka sa suší pod vysokým vákuom, čím sa získa 3,27 g (88% výťažok) požadovanej zlúčeniny ako šedej pevnej látky.

5-chlór-4-metyl-2-oxindol

Suspenzia 3,0 g 4-metyl-2-oxindolu sa mieša v 50 ml acetonitrilu pri izbovej teplote a medzi tým sa po dávkach pridá 3,3 g N-chlórsukcínimidu. Potom sa pridá trifluóroctová kyselina (1 ml). Suspenzia sa mieša pri izbovej teplote 3 dni, počas ktorých je pevná látka stále prítomná. Biela pevná látka sa zhromaždí vákuovou filtráciou, premyje malým množstvom studeného acetónu a suší cez noc vo vákuovej peci pri teplote 40 °C. Získa sa 2,5 g (68 %) 5chlór-4-metyl-2-oxindolu.

5-butyl-2-oxindol

Trietylsilán (2,3 g) sa pridá do 2 g 4-butanoyl-2-oxindolu v 20 ml trifluóroctovej kyseliny pri izbovej teplote a roztok sa mieša po dobu 3 hodín. Zmes sa naleje do ľadovej vody, čím vznikne červený olej, ktorý postupne stuhne. Pevná látka sa zhromaždí vákuovou filtráciou, premyje sa vodou, hexánom a usuší sa. Získa sa 1,7 g (91% výťažok) požadovanej zlúčeniny ako šedej pevnej látky.

·· ·· ·· ·· ·· · • ·· · · ·· · · ··· • · · · ···· • ···· «··· 4 • · ··· ··· ···· ···· ·· ···· ·· ···

5-etyl-2-oxindol

Do 5-acetyl-2-oxindolu (2 g) v 15 ml trifluóroctovej kyseliny v ľadovom kúpeli sa pomaly pridá 1,8 g trietylsilánu, reakcia sa mieša pri izbovej teplote po dobu 5 hodín. Pridá sa jeden ml trietylsilánu a miešanie pokračuje cez noc. Reakčná zmes sa naleje do ľadovej vody a výsledný precipitát sa zhromaždí vákuovou filtráciou. Poriadne sa premyje vodou a suší sa pod vákuom, čím sa získa 1,3 g (71% výťažok) požadovanej zlúčeniny ako žltej pevnej látky.

5-(morfolin-4-etyl)-2-oxindol

5-Chlóretyl-2-oxindol (2,3 g), 1,2 ml morfolínu a 1,2 ml diizopropyletylamínu sa zahrieval cez noc pri 100 °C v 10 ml dimetylsulfoxidu. Zmes sa ochladí, preleje do vody a extrahuje etylacetátom. Organická vrstva sa premyje soľankou, usuší a odparí. Zvyšok sa chromatografuje na silikagély (5 % metanol v chlorforme), čím sa získa 0,9 g (31%) požadovanej zlúčeniny ako bielej pevnej látky.

5-(4-metoxykarbonylbenzamido)-2-oxindol

Zmes 82,0 mg 5-amino-2-oxindol a 131,0 mg 4-metoxykarbonylbenzoylchloridu v pyridíne sa mieša pri izbovej teplote po dobu 3 hodín a preleje do ľadovej vody. Precipitát sa prefiltruje, premyje vodou a usuší vo vákuovej peci. Získa sa 138,0 mg 5-(4-metoxykarbonylbenzamido)-2-oxindolu (81 % výťažok).

5-(4-karboxybenzamido)-2-oxindol

5-(4-metoxykarbonyIbenzamido)-2-oxindol (0,9 g) a 0,4 g hydroxidu sodného v 25 ml metanolu sa refluxujú po dobu 3 hodín. Zmes sa koncentruje, pridá sa voda a zmes sa okyslí 6N chlorovodíkovou kyselinou. Precipitát sa zhromaždí vákuovou filtráciou, čím sa získa 0,75 g (87%) požadovanej zlúčeniny ako bielej pevnej látky.

• · • · · · · · · • 9 · · · ···· • · · · · · · ········ ·· ···· ·· 68

5-metoxy-2-oxindol

Chloral hydrát (9,6 g) sa rozpustí v 200 ml vody obsahujúcej 83 g síranu sodného. Roztok sa zahreje na teplotu 60 °C a pridá sa roztok 11,4 g hydroxylamín hydrochloridu v 50 ml vody a zmes sa udržuje pri teplote 60 °C. V oddelenej banke sa na teplotu 80 °C zahreje 6,4 g 4-anizidínu a 4,3 ml koncentrovanej kyseliny chlorovodíkovej v 80 ml vody. Prvý roztok sa pridá do druhého a zmes sa refluxuje 2 minúty. Potom sa pomaly ochladí na izbovú teplotu a následne sa vloží do ľadového kúpeľa. Precipitát sa zhromaždí vákuovou filtráciou, premyje vodou a usuší pod vákuom, čím sa získa 8,6 g ( 86 % výťažok) N-(hydroxyiminoacetyl)anizidínu.

Koncentrovaná kyselina sírová (45 ml) obsahujúca 5 ml vody sa zahreje na teplotu 60 °C a pridá sa 8,6 g N-(hydroxyiminoacetyl)anizidínu v jednej dávke. Miešaná zmes sa zahrieva pri teplote 93 °C po dobu 10 minút a potom sa ochladí na izbovú teplotu. Zmes sa naleje do 500 g ľadu a extrahuje 3 krát etylacetátom. Spojené extrakty sa sušia nad bezvodým síranom sodným a koncentrujú sa, čím sa získa 5,1 g (65 % výťažok) 5-metoxyizatínu ako tmavočervenej pevnej látky. 5-Metoxyizatín (5,0 g) a 30 ml hydrátu hydrazínu sa zahrieva pri refiuxe po dobu 15 minút. Reakčná zmes sa ochladí na izbovú teplotu a pridá sa 50 ml vody. Zmes sa 3 krát extrahuje zakaždým 25 ml etylacetátu, organické vrstvy sa spoja, sušia sa nad bezvodým síranom sodným a koncentrujú sa do vzniku žltej pevnej látky. Pevná látka sa mieša v etylacetáte a 1,1 g nerozpustného materiálu sa odstráni vákuovou filtráciou a uschová. Tento materiál je 2-hydrazinokarbonylmetyl-4-anizidín. Filtrát sa koncentruje a chromatografuje na silikagély mobilnou fázou etylacetát : hexán (1: 1), čím sa získa 0,7 g 5-metoxy-2-oxindolu ako žltej pevnej látky. 1,1 g 2-hydrazinokarbonylmetyl-4-anizidínu sa refluxuje po dobu 1 hodiny v 20 ml IN hydroxidu sodného. Zmes sa ochladí, okyslí sa na pH 2 koncentrovanou kyselinou chlorovodíkovou a extrahuje sa 3 krát zakaždým 25 ml etylacetátu. Organické extrakty sa spoja, premyjú soľankou, sušia sa nad bezvodým síranom sodným a koncentrujú, čim sa získa 0,8 g 5-metoxy-2-oxindolu ako žltej pevnej látky. Spojený výťažok činí 1,5 g 33%.

·· ·· ·· ·· • · · • · · · · · · • · · · · · · ···· ···· ·· ···· ·· · 69

7-azaoxindol

3,3-dibróm-7-azaoxindol (2,9 g) sa rozpustí v zmesi 20 ml octovej kyseliny a 30 ml acetonitrilu. Do roztoku sa pridá 6,5 g zinkového prachu. Zmes sa mieša 2 hodiny pri izbovej teplote. Pevná látka sa odfiltruje zo zmesi a rozpúšťadlo sa odparí. Zvyšok sa rozotrie s etylacetátom. Etylacetátový roztok obsahujúci nerozpustnú pevnú látku sa nechá prejsť krátkou kolónou silikagélu. Spojené etylacetátové roztoky sa odparia a zvyšok sa usuší pod vákuom, čím sa získa 1,8 g (výťažok 91%) soli 7-azaoxindol octovej kyseliny.

5- dimetylaminosulfonyl-2-oxindol

Suspenzia 2,3 g 5-chlórsulfonyl-2-oxindolu v 10 ml 2M dimetylamínu v metanole sa mieša pri izbovej teplote 4 hodiny. Počas tohto času sa utvorí biela pevná látka. Precipitát sa zhromaždí vákuovou filtráciou, premyje 5 ml IN hydroxidu sodného a 5 ml IN chlorovodíkovej kyseliny. Suší sa cez noc pod vákuom pri 40 ^c'C, čím sa získa 1,9 g (79 % výťažok) 5-dimetylamino-sulfonyl-2oxindolu.

6- fenyl-2-oxindol

Dimetyl malonát (10 ml) v 25 ml dimetylsulfoxidu sa pridá po kvapkách do 3,5 g hydridu sodného suspendovaného v 25 ml dimetylsulfoxidu a zmes sa zahrieva pri 100 °C po dobu 10 minút. Zmes sa ochladí na izbovú teplotu a pridá sa 4,7 g 4-fluór-3-nitrobifenylu v 25 ml dimetylsulfoxidu. Zmes sa zahrieva pri 100 °C 2 hodiny, ochladí sa a reakcia sa podporí roztokom 300 ml saturovaného chloridu amónneho. Zmes sa trikrát extrahuje etylacetátom a spojené organické vrstvy sa premyjú vodou a soľankou. Odparia sa, čím sa získa surový dimetyl-3-nitrobifenyI-4-malonát ako žltý olej.

Surový dimetyl-3-nitrobifenyl-4-malonát sa refluxuje v 30 ml 6 N chlorovodíkovej kyseliny 24 hodiny. Precipitát sa zhromaždí vákuovou filtráciou, premyje vodou a usuší, čím sa získa 4,5 g 3-nitrobifenyl-4-octovej kyseliny ako krémovo sfarbenej pevnej látky.

• · • · · · · · · «······· ·· ···· ·· · 70

Železný prášok (2,6 g) sa pridá všetok naraz do 4,5 g 3-nitrobifenyl-4octovej kyseliny v 40 ml octovej kyseliny. Zmes sa refluxuje 2 hodiny, koncentruje do sucha a vloží do etylacetátu. Pevná látka sa odstráni filtráciou a filtrát sa dvakrát premyje IN chlorovodíkovou kyselinou a soľankou a suší sa nad bezvodým síranom sodným. Filtrát sa koncentruje, čím sa získa 3,4 g (93 % výťažok) 6-fenyl-2-oxindolu ako svetlohnedej pevnej látky.

6-(2-metoxyfenyl)-2-oxindol

Tetrakis(trifenylfosfín)paládium (1 g) sa pridá do zmesi 5 g 2-metoxyfenylboritej kyseliny, 6,6 g 5-bróm-2-fluórnitrobenzénu a 30 ml 2 M roztoku uhličitanu sodného v 50 ml toluéne a 50 ml etanole. Zmes sa refluxuje 2 hodiny, koncentruje a zvyšok sa dvakrát extrahuje etylacetátom. Etylacetátová vrstva sa premyje vodou a soľankou. Potom sa suší a koncentruje, čím sa získa tmavo zelený olej, ktorý stránim tuhne, surový 4-fluór-2'-metoxy-3nitrobifenyl.

Dimetyl malonát (14 ml) sa pridá po kvapkách do 2,9 g hydridu sodného suspendovaného v 50 ml dimetylsulfoxidu. Zmes sa zahrieva pri 100 °C po dobu 15 minút a ochladí sa na izbovú teplotu. Pridá sa surový 4-fluór-2'-metoxy-

3-nitrobifenyl v 60 ml dimetylsulfoxide a zmes sa zahrieva pri 100 °C po dobu 2 hodiny. Reakčná zmes sa ochladí, ustáli sa 300 ml roztoku saturovaného chloridu sodného a dvakrát sa extrahuje etylacetátom. Spojené extrakty sa premyjú saturovaným chloridom amónnym, vodou a soľankou. Sušia sa nad bezvodým síranom sodným a koncentrujú, čím vznikne surový dimetyl 2'-metoxy-3nitrobifenyl-4-malonát ako žltý olej.

Surový dimetyl 2'-metoxy-3-nitrobifenyl-4-malonát sa zahrieva pri 100 °C v 50 ml 6 N chlorovodíkovej kyseliny po dobu 24 hodín a ochladí sa. Precipitát sa zhromaždí vákuovou filtráciou, premyje vodou a hexánom a usuší. Získa sa 9,8 g 2¹- metoxy-2-nitrobifenyl-4-octovej kyseliny ako svetlo sfarbenej pevnej látky.

Železný prášok (5 g) sa pridá v jednej dávke do 9,8 g 2'-metoxy-3nitrobifenyl-4-octovej kyseliny v 50 ml ľadovej kyseliny octovej a zahrieva sa pri 100 °C po dobu 3 hodín. Reakčná zmes sa koncentruje do sucha, sonikuje v ·· ·· ·· ·· ·· • · · · ···· ··· • · · · · · · • · ··· ··· ··· ···· ·Β ···· ·· ··· etylacetáte a prefiltruje sa nerozpustiteľný podiel. Filtrát sa dvakrát premyje IN chlorovodíkovou kyselinou, vodou a potom soľankou. Suší sa nad bezvodým síranom sodným a koncentruje. Zvyšok sa chromatografuje na silikagély etylacetát : hexánom (1: 2), čím sa získa 5,4 g 6-(2-metoxyfenyl)-2-oxindolu vo forme ružovo sfarbenej pevnej látky.

6-(3-metoxy fenyl)-2-oxindol

Tetrakis(trifenylfosfín)paládium (0,8 g) sa pridá do zmesi 5 g 3-metoxyfenylboritej kyseliny, 5 g 5-bróm-2-fluór-nitrobenzénu a 11 ml 2 M roztoku uhličitanu sodného v 100 ml toluénu. Zmes sa refluxuje po dobu 2 hodín, zriedi sa vodou a extrahuje etylacetátom. Etylacetát sa premyje saturovaným hydrogenuhličitanom sodným a soľankou a potom sa suší a koncentruje, čím sa získa olejovitá pevná látka. Pevná látka sa chromatografuje na silikagély (etylacetát: hexán (1: 6)), čím sa získa 4,3 g (77% výťažok) 4-fluór-3'-metoxy-3nitrobifenylu.

Dimetyl malonát (9,7 ml) sa pridá po kvapkách do 2,0 g hydridu sodného suspendovaného v 50 ml dimetylsulfoxidu. Zmes sa zahrieva pri 100 °C po dobu 35 minút a ochladí sa na izbovú teplotu. Pridá sa 4-fluór-2'-metoxy-3-nitrobifenyl (4,2 g) v 50 ml dimetylsulfoxidu a zmes sa zahrieva pri teplote 100 °C po dobu 1 hodiny. Reakčná zmes sa ochladí a ustáli 300 ml roztoku saturovaného chloridu amónneho a dvakrát sa extrahuje etylacetátom. Spojené extrakty sa premyjú soľankou, sušia sa nad bezvodým síranom sodným a koncentrujú, čím sa získa surový dimetyl 3'-metoxy-3-nitrobifenyl-4-malonát ako svetložltá pevná látka.

Surový dimetyl 3'-metoxy-3-nitrobifenyl-4-malonát sa zahrieva pri 110 °C v 45 ml 6N chlorovodíkovej kyseliny 4 dni a potom sa ochladí. Precipitát sa zhromaždí vákuovou filtráciou, premyje vodou a hexánom a usuší. Získa sa 5,3 g 3'-metoxy-2-nitrobifenyl-4-octovej kyseliny ako svetlo sfarbenej pevnej látky.

3'-metoxy-3-nitrobifenyl-4-octová kyselina (5,2 g) sa rozpustí v metanole a hydrogenuje sa cez 0,8 g 10% paládia na aktívnom uhlí 3 hodiny pri izbovej teplote. Katalyzátor sa odstráni filtráciou, premyje sa metanolom a spojené fil-

• · ·· • · · • · • · ·· ···· tráty sa koncentrujú, čím sa získa hnedá pevná látka. Pevná látka sa chromatografuje na silikagély etylacetát: hexán: octovou kyselinou (33: 66: 1). Získajú sa 3,0 g 6-(3-metoxyfeny)-2-oxindolu ako ružovej pevnej látky.

6-(4-metoxyfenyl)-2-oxindol

Tetrakis(trifenylfosfín)paládium (I g) sa pridá do zmesi 5 g 4-metoxyfenylboritej kyseliny, 6,6 g 5-bróm-2-fluórnitrobenzénu a 30 ml 2 M roztoku uhličitanu sodného v 50 ml toluénu a 50 ml etanolu. Zmes sa refluxuje 2 hodiny, koncentruje a zvyšok sa extrahuje dvakrát etylacetátom. Etylacetátová vrstva sa premyje vodou a soľankou, usuší sa a koncentruje. Získa sa hnedá olejovitá látka. Látka sa chromatografuje na silikagély (5 % etylacetát v hexáne), získa sa surový 4-fluór-4'-metoxy-3-nitrobifenyl ako svetložltá pevná látka.

Dimetylmalonát (10 ml) sa pridá po kvapkách do 2,0 g hydridu sodného suspendovaného v 60 ml dimetylsulfoxidu. Zmes sa zahrieva pri 100 °C po dobu 10 minút a ochladí sa na izbovú teplotu. Pridá sa surový 4-fluór-2'-metoxy-

3-nitrobifenyl (5,2 g) v 50 ml dimetylsulfoxidu a zmes sa zahrieva pri 100 °C 2 hodiny. Reakčná zmes sa ochladí a ustáli prídavkom 300 ml roztoku saturovaného chloridu sodného a extrahuje sa trikrát etylacetátom. Spojené extrakty sa premyjú saturovaným chloridom amónnym, vodou a soľankou. Suší sa nad bezvodým síranom sodným a koncentrujú sa. Získa sa surový dimetyl-4'-metoxy-3nitrobifenyl-4-malonát ako žltý olej.

Surový dimetyl-4'-metoxy-3-nitro-bifenyI-4-malonát sa zahrieva pri 100 °C v 60 ml 6N kyseliny chlorovodíkovej 15 hodín a ochladí sa. Precipitát sa zhromaždí vákuovou filtráciou, premyje vodou a hexánom a usuší. Získa sa 7,2 g surového 4'-metoxy-3-nitrobifenyl-4-octovej kyseliny ako svetlo sfarbenej pevnej látky.

Železný prášok (3,6 g) sa pridá v jednej dávke do 7,2 g 4'-metoxy-3nitrobifenyl-4-octovej kyseliny v 50 ml ľadovej kyseliny octovej a zahrieva sa cez noc pri 100 °C. Reakčná zmes sa koncentruje do sucha, sonikuje v etylacetáte a nerozpustné látky sa odstránia filtráciou. Filtrát sa premyje dvakrát IN kyselinou chlorovodíkovou a soľankou, suší sa nad bezvodým síranom sodným ·· · · ·· ·· ·· ··· · · · · ·· • · · · · 4 · • ···· ···· • · · · t · · a koncentruje. Získa sa 2,7 g 6-(4-metoxyfenyl)-2-oxindolu ako ružovo sfarbenej pevnej látky.

6-(3-etoxyfenyl)-2-oxindol

Tetrakis(trifenylfosfín)paládium (0,8 g) sa pridá do zmesi 4,2 g 3-etoxyfenylboritej kyseliny, 5,0 g 5-bróm-2-fluórnitrobenzénu a 22 ml 2 M roztoku uhličitanu sodného v 50 ml toluénu a 50 ml etanolu. Zmes sa refluxuje 2 hodiny, koncentruje, pridá sa voda a zmes sa extrahuje dvakrát etylacetátom. Etylacetátová vrstva sa premyje vodou a soľankou. Potom sa usuší a koncentruje. Zvyšok sa chromatografuje na silikagély (5 % etylacetát v hexáne). Získa sa

5,3 g (90 % výťažok) surového 4-fluór-3'-etoxy-3-nitrobifenylu vo forme žltého oleja.

Dimetylmalonát (11,4 ml) sa pridá po kvapkách do 4,0 g hydridu sodného suspendovaného v 20 ml dimetylsulfoxidu. Zmes sa zahrieva pri 100 °C po dobu 10 minút a potom sa ochladí na izbovú teplotu. Pridá sa surový 4-fluór-3'etoxy-3-nitrobifenyl (5,3 g) v 25 ml dimetylsulfoxidu a zmes sa zahrieva pri 100 °C 2 hodiny. Reakčná zmes sa ochladí a ustáli prídavkom 300 ml roztoku saturovaného chloridu amónneho a extrahuje sa trikrát etylacetátom. Spojené extrakty sa premyjú vodou a soľankou a potom sa sušia nad bezvodým síranom sodným. Po zakoncentrovaní sa získa surový dimetyl-3'-etoxy-3-nitrobifenyl-

4-malonát ako žltý olej.

Surový dimetyl-3'-etoxy-3-nitrobifenyI-4-malonát sa zahrieva pri 100 °C v 60 ml 6N kyseliny chlorovodíkovej 4 dni a potom sa ochladí. Precipitát sa zhromaždí vákuovou filtráciou, premyje vodou a hexánom a usuší. Získajú sa

4,7 g surovej 3'-etoxy-3-nitrobifenyl-4-octovej kyseliny vo forme svetlo sfarbenej pevnej látky.

Železný prášok (2,4 g) sa pridá v jednej dávke do 4,6 g 3'-etoxy-3nitrobifenyl-4-octovej kyseliny v 40 ml ľadovej kyseliny octovej a refluxuje sa 2 hodiny. Reakčná zmes sa koncentruje do sucha, znovu sa nechá pôsobiť s etylacetátom a nerozpustné látky sa odstránia filtráciou. Filtrát sa dvakrát premyje IN kyselinou chlorovodíkovou a soľankou a potom sa suší nad bezvodým

• · · · · ··· ··· ···· ·· ···· ·· ··· síranom sodným. Po zakoncentrovaní sa získa 3,5 g (91 % výťažok) 6-(3etoxyfenyl)-2-oxindolu ako svetlohnedej pevnej látky.

6-bróm-2-oxindol

Dimetylmalonát (13 ml) sa pridá po kvapkách do 2,7 g hydridu sodného suspendovaného v 20 ml dimetylsulfoxidu. Zmes sa zahrieva pri 100 °C po 10 minút a potom sa ochladí na izbovú teplotu. Pridá sa 5-bróm-2-fluórnitrobenzén (5,0 g) v 25 ml dimetylsulfoxidu a zmes sa zahrieva pri 100 °C 2 hodiny. Reakčná zmes sa ochladí a ustáli prídavkom 300 ml roztoku saturovaného chloridu amónneho a trikrát sa extrahuje etylacetátom. Spojené extrakty sa premyjú saturovaným chloridom sodným, vodou a soľankou. Sušia sa nad bezvodým síranom sodným a koncentrujú sa. Získa sa surový dimetyl-4-bróm-2nitrofenylmalonát vo forme svetlo žltého oleja.

Surový dimetyl-4-bróm-2-nitrofenylmalonát sa zahrieva pri 110 °C v 40 ml 6N kyseliny chlorovodíkovej po dobu 24 hodín a potom sa ochladí. Precipitát sa zhromaždí vákuovou filtráciou, premyje vodou a usuší. Získa sa 5,3 g (89 % výťažok) 4-bróm-2-nitro-fenyloctovej kyseliny ako šedej pevnej látky.

4-bromo-2-nitrofenyloctová kyselina (0,26 g), 0,26 g zinkového prachu a 3 ml 50 % kyseliny sírovej v 5 ml etanolu sa zahrieva cez noc pri teplote 100 °C. Reakčná zmes sa prefiltruje, zriedi sa malým množstvom kyseliny octovej, odstráni sa etanol, zriedi sa vodou a dvakrát sa extrahuje etylacetátom. Spojené extrakty sa premyjú soľankou, sušia sa nad bezvodým síranom sodným a koncetrujú sa. Získa sa 0,19 g (90 % výťažok) 6-bromo-2-oxindolu ako žltej pevnej látky.

5-acetyl-2-oxindol

2-oxindol (3 g) sa suspenduje v 1,2-dichlóretáne a pomaly sa pridá 3,2 ml acetylchloridu. Výsledná suspenzia sa zahrieva pri 50 °C po dobu 5 hodín, ochladí sa a preleje do vody. Výsledný precipitát sa zhromaždí vákuovou filtráciou, poriadne sa premyje vodou a usuší sa pod vákuom. Získa sa 2,9 g (73 % výťažok) požadovanej zlúčeniny ako hnedej pevnej látky.

• · · · ·· ·· ·· ···· ···· ··· • · · · · · · • · · · · · · ···· ···· ·· ···· ·· 9

5-butanoyl-2-oxindol

Do 15 g chloridu hlinitého suspendovaného v 30 ml 1,2-dichlóretánu v ľadovom kúpeli sa pridá 7,5 g 2-oxindolu a potom 12 g butanoylchloridu. Výsledná suspenzia sa zahrieva cez noc pri 50 °C. Zmes sa naleje do ľadovej vody a trikrát sa extrahuje etylacetátom. Spojené etylacetátové vrstvy sa premyjú soľankou, sušia sa nad síranom sodným a koncentrujú do sucha. Získa sa hnedá pevná látka, ktorá sa chromatografuje na silikagély (50 % etylacetát v hexáne). Získajú sa 3 g (25%) požadovanej zlúčeniny ako žltej pevnej látky.

5- kyanoetyl-2-oxindol

Kyanid draselný (2,0 g) sa pridá do 15 ml dimetylsulfoxidu a zahreje sa na 90 °C. Za stáleho miešania sa pomaly pridá 5-chlóretyl-2-oxindol (3,0 g) rozpustený v 5 ml dimetylsulfoxidu a reakcia sa zahrieva pri 150 °C 2 hodiny. Zmes sa ochladí, preleje do ľadovej vody a precipitát sa zhromaždí vákuovou filtráciou. Premyje sa vodou, usuší a potom sa chromatografuje na silikagély (5 % metanol v chlorforme). Získa sa 1,2 g (42 % výťažok) požadovanej zlúčeniny.

6- morfolino-4-yl-2-oxindol

6-amino-2-oxindol (2,2 g), 4,0 g 2,2'-dibrómetyléteru a 7,9 g uhličitanu sodného sa cez noc refluxuje v 20 ml etanolu, koncentruje sa a zriedi 50 ml vody. Zmes sa trikrát extrahuje 50 ml etylacetátu a spojené organické extrakty sa premyjú 20 ml soľanky, sušia sa nad bezvodým síranom sodným a koncentrujú sa do sucha. Pevná látka sa chromatografuje na stĺpci silikagélu (etylacetát: hexán (1:1) obsahujúci 0,7 % kyseliny octovej). Získa sa 1,2 g (37 % výťažok) požadovanej zlúčeniny ako béžovej pevnej látky.

6-(3-trifluóracetylfenyl)-2-oxindol

3-aminofenylboritá kyselina (3,9 g), 5 g 5-bróm-2-fluórnitrobenzénu, 0,8 g tetrakis(trifenylfosfín)paládia a 23 ml 2 M roztoku hydrogenuhličitanu sodného v 50 ml toluénu sa refluxuje pod dusíkom 2,5 hodiny. Reakčná zmes sa naleje do 200 ml ľadovej vody a zmes sa trikrát extrahuje 50 ml etylacetátu.

·· ·· ·· ·· ·· ··· ···· ·· • · · · · · · • · · · · ···· • · · · · · ·

Spojené organické vrstvy sa premyjú 50 ml vody a 20 ml soľanky, sušia sa nad bezvodým síranom sodným a koncentrujú sa. Získa sa 9,7 g (92 % výťažok) 2fluór-5-(3-aminofenyl)nitrobenzénu ako tmavohnedého oleja.

Anhydrid trifluóroctovej kyseliny (5,4 ml) sa pomaly pridá do miešaného roztoku 9,7 g 2-fluór-5-(3-aminofenyl)-nitrobenzénu a 5,3 ml trietylamínu v 50 ml dichlórmetánu za teploty 0 °C a zmes sa mieša ďalších 20 minút. Zmes sa koncentruje a zvyšok sa chromatografuje na stĺpci silikagélu (10 % etylacetát v hexáne). Získa sa 8,6 g (65 % výťažok) 2-fluór-5-(3trifluóracetamidofenyl)nitrobenzénu ako svetlo oranžového oleja, ktorý státím tuhne.

Dimetylmalonát (9,6 ml) sa pridá po kvapkách do miešanej suspenzie 3,2 g 60 % hydridu sodného v minerálnom oleji v 40 ml bezvodého dimetylsulfoxidu pod dusíkom. Zmes sa mieša 10 minút a pridá sa 2-fluór-5-(3-trifluóracetamido-ŕenyl)nitrobenzén v 20 ml dimetylsulfoxidu. Výsledná tmavočervená zmes sa zahrieva pri 100 °C 2 hodiny. Reakcia sa zhasne preliatím do roztoku 100 ml saturovaného chloridu amónneho a dvakrát sa extrahuje 50 ml etylacetátu. Organická fáza sa premyje roztokom saturovaného chloridu amónneho, vodou a soľankou, vždy 50 ml. Suší sa nad bezvodým síranom sodným a koncentruje. Získaný žltý olej sa chromatografuje na stĺpci silikagélu (etylacetát: hexán (1: 4)). Získa sa 4,4 g (50 % výťažok) dimetyl-2-[2-nitro-4-(3trifluoracetamidofenyl)fenyl]-malonátu ako svetložltej látky.

Dimetyl-2-[2-nitro-4-(3-trifluoracetamidofenyl)-fenyl]malonát (4,4 g) sa refluxuje cez noc v 50 ml 6N kyseliny chlorovodíkové. Reakčná zmes sa ochladí na izbovú teplotu a pevná látka sa zhromaždí vákuovou filtráciou, premyje vodou a suší pod vákuom. Získa sa 2,7 g (73 % výťažok) 2-[2-nitro-4-(3trifluóracetamidofenyl)fenyl]octovej kyseliny.

2-[2-nitro-4-(3-trifluóracetamidofenyl)fenyl]octová kyselina (100 mg) a mg železného prášku v 3 ml kyseliny octovej sa zahrieva pri 100 °C 2 hodiny. Reakčná zmes sa koncentruje a zvyšok sa sonikuje v 5 ml etylacetátu. Nerozpustné látky sa odstránia vákuovou filtráciou a filtrát sa premyje IN kyselinou chlorovodíkovou, vodou a soľankou. Sušia sa nad bezvodým síranom sod77 ·· ·· • · · · ·· ·· ·· ···· ·· •· · •· • ·· •· ·· · ným a koncentrujú. Získa sa 10 mg (14 % výťažok) požadovanej zlúčeniny vo forme ružovo sfarbenej pevnej látky.

B. Aldehydy

5-formyl-2,4-dimetyl-lH-pyrol-3-karboxylová kyselina t-butyl-3-oxobutyrát (158 g, 1 mol) sa rozpustí v 200 ml kyseliny octovej v 500 ml trojhrdlovej banke s okrúhlym dnom vybavenej teplomerom, prídavným lievikom a mechanickým miešadlom. Zmes sa ochladí v ľadovom kúpeli na teplotu okolo 10 °C. Dusitan sodný (69 g, 1 mol) sa pridáva 75 minút za teploty udržiavanej pod 15 °C. Ľadový kúpeľ sa odstráni a zmes sa mieša 30 minút a nechá sa stáť 3,5 hodiny. Získa sa t-butyl-2-hydroximino-3-oxobutyrát.

Etyl-3-oxobutyrát (130 g, 1 mol) sa rozpustí v 400 ml kyseliny octovej v 2 1 trojhrdlovej banke s guľatým dnom vybavenej teplomerom, prídavným lievikom, mechanickým miešadlom a umiestni sa do olejového kúpeľa. Pridá sa zinkový prach (50 g, 0,76 mol) a zmes sa za stáleho miešania zahrieva pri 60 °C. Pomaly sa pridá skôr pripravený roztok t-butyl-2-hydroximino-3-oxobutyrátu, teplota reakčnej zmesi sa udržiava okolo 65 °C. Potom sa pridá ďalší zinkový prach (4 x 50 g, 3,06 mol), pričom posledná dávka sa pridá potom, čo bol pridaný všetok t-butylester. Na konci pridávania je teplota 64 °C. Teplota sa zvýši na 70 až 75 °C, mieša sa jednu hodiny a potom sa preleje do 5 1 vody.

Šedý vznášajúci sa precipitát sa zhromaždí vákuovou filtráciou a premyje 2 1 vody. Získa sa 354 g mokrého surového produktu. Surový produkt sa rozpustí v 1 1 horúceho metanolu a zinok sa odstráni filtráciou za horúca. Filtrát sa ochladí, čím sa vytvorí precipitát. Precipitát sa zhromaždí vákuovou filtráciou a usuší sa. Získa sa 118 g produktu. Filtrát sa ponechá cez noc v ľadničke, vytvorí sa ďalšia časť precipitátu. Dohromady sa získa 173,2 g 2-tercbutylesteru 4-etylesteru 3,5-dimetyl-lH-pyrol-2,4-dikarboxylovej kyseliny.

2-/erc-butylester 4-etylester 3,5-dimetyl-lH-pyrol-2,4-dikarboxylovej kyseliny (80,1 g, 0,3 mol) a 400 ml kyseliny trifluóroctovej sa mieša 5 minút v

1 trojhrdlovej banke s okrúhlym dnom vybavenej mechanickým miešadlom a zahriatej na 40 °C v olejovom kúpeli. Zmes sa potom ochladí na -5 °C a naraz ·· ·· ·· ·· ·· ··· ···· ·· • · · · · · · • ···· ···· • · · · · · · sa pridá a trietylortoformiát (67,0 g, 0,45 mol). Teplota sa zvýši na 15 °C. Zmes sa mieša 1 minútu, odstráni sa z ľadového kúpeľa a mieša sa 1 hodinu. Trifluóroctová kyselina sa odstráni na rotačnej odparke a zvyšok sa vloží do ľadničky, kde stuhne. Pevná látka sa zahriatím rozpustí a preleje do 500 g ľadu. Zmes sa extrahuje 800 ml dichlórmetánu . Získa sa červený roztok a hnedý precipitát, oboje sa uschová. Precipitát sa izoluje a premyje 150 ml roztoku saturovaného hydrogenuhličitanu sodného. Dichlórometánová fáza sa tiež premyje 150 ml hydrogenuhličitanu sodného. Dichlórmetánový roztok sa potom premyje najmenej trikrát 100 ml vody. Dichlórmetánový roztok sa odparí do sucha. Tmavý zvyšok sa dvakrát rekryštalizuje z etylacetátu obsahujúceho Darko čierny uhlík. Získajú sa zlato žlté ihličky. Hnedý precipitát sa rekryštalizuje z 350 ml etylacetátu tiež obsahujúci Darko. Získa sa červenožltá pevná látka. Všetky rekryštalizované látky sa spoja a rekryštalizujú z 500 ml etanolu. Získa sa 37,4 g (63,9 %) etylesteru 5-formyl-2,4-dimetyl-lH-pyrol-3-karboxylovej kyseliny vo forme žltých ihličiek (teplota topenia 165,6-166,3 °C, lit. 163 164 °C). Zvyšky získané odparením etylacetátového a etanolového matečného roztoku sa spoja a rekryštalizujú z 500 ml etanolu. Získa sa druhá časť produktu (10,1 g) vo forme špinavo žltých ihličiek.

Etylester 5-formyl-2,4-dimetyl-lH-pyrol-3-karboxylovej kyseliny (2 g, 10 mmol) sa pridá do roztoku hydroxidu sodného (3 g, 53 mmol) rozpusteného v metanole (3 ml) a vode (10 ml). Zmes sa refluxuje 3 hodiny, ochladí sa na izbovú teplotu a okyslí sa 6 N kyselinou chlorovodíkovou na pH 3. Utvorí sa pevná látka, ktorá sa zhromaždí filtráciou, premyje vodou a suší sa cez noc vo vákuovej peci. Získa sa 1,6 g (93 %) 5-formyl-2,4-dimetyl-lH-pyrol-3karboxylovej kyseliny.

’HNMR (300 MHz, DMSO-de) δ: 12,09 (s, br, 2H, NH & COOH), 9,59 (s, 1H, CHO), 2,44 (s, 3H, CH₃), 2,40 (s, 3H, CH₃).

(2-dimetylaminoetyl)amid 5-formy 1-2,4-dimetyl-lH-pyrol-3-karboxylovej kyseliny

Do zmesi 5-formyl-2,4-dimetyl-lH-pyrol-3-karboxylovej kyseliny (1,67 g, 10 mmol) v dimetylforamide (10 ml) sa pridá benzotriazol-l-yloxy79 ···· ···· ··· • · · · · · · • · ··· ··· ····«·· ·· ···· ·· ··· tris(dimetylamino)fosfóniumhexafluórfosfát (BOP činidlo, 6 g, 13,5 mmol), potom 3 ml diizopropyletylamínu. Po 5 minútach miešania sa pridá 1 ml N,Ndimetyletyléndiamínu a zmes sa mieša pri izbovej teplote 24 hodín. Do reakčnej zmesi sa pridá 25 ml IN hydroxidu sodného a 25 ml soľanky. Po 30 minútach miešania sa reakčná zmes naleje do vody (100 ml) a extrahuje (3 x 200 ml) 10 % metanolom v dichlórmetáne. Spojené organické vrstvy sa sušia nad bezvodým síranom sodným a odparia na rotačnej odparke. Zvyšok sa prečistí kolónovou chromatografiou (silikagél, 5 % - 10 % metanol v dichlórmetáne). Získa sa 1 g (42 %) 5-formyl-2,4-dimetyl-lH-pyrol-3-karboxylovej kyseliny (2-dimetylamino-etyl)-amidu.

*H NMR (360 MHz, DMSO-d₆)Ô: 11,77 (s, 1H, NH), 9,53 (s, 1H, CHO), 7,34 (t, J = 5,6 Hz, 1H, CONH), 3,27 (m, 2H, CONCH₂CH₂), 2,37 (t, J = 6,8 Hz, 2H, CONCH₂CH₂), 2,35 (s, 3H, CH₃), 2,3 (s, 3H, CH₃), 2,17 (s, 6H, 2 x CH₃), MS m/z 238,3 [M+l] ⁺

3,5-dimetyl-4-(4-metyl-piperazín-l-karbonyl)-lH-pyrol-2-karboxaldehyd

Do zmesi 5-formyl-2,4-dimetyl-lH-pyrol-3-karboxylovej kyseliny (1,67 g, 10 mmol) v dimetylformamide (10 ml) sa pridá benzotriazol-l-yloxytris (dimetylamino)-fosfónium hexafluórfosfát (BOP činidlo, 6 g, 13,5 mmol), potom 3 ml diizopropyletylamínu. Po 5 minútach miešania sa pridajú 2 ml 1metylpiperazínu a zmes sa mieša pri izbovej teplote 24 hodín. Do zmesi sa potom pridá 25 ml IN hydroxidu sodného a 25 ml soľanky. Po 30 minútach miešania sa reakčná zmes naleje do vody (100 ml) a extrahuje (3x 200 ml) 10 % metanolom v dichlórmetáne. Spojené organické vrstvy sa sušia nad bezvodým síranom sodným a odparia sa na rotačnej odparke. Zvyšok sa prečistí kolónovou chromatografiou (silikagél, 5 % - 10 % metanol v dichlórmetáne). Získa sa 1 g (40 %) 3,5-dimetyl-4-(4-metyl-piperazin-l-karbonyl)-lH-pyrol-2-karboxaldehydu.

^JH NMR (360 MHz, DMSO-d_fi) δ: 11,82 (s, 1H, NH), 9,50 (s, 1H, CHO),

3,14 (br m, 4H, 2xCH₂), 2,29 (br m, 4H, 2xCH₂), 2,19 (s, 3H, CH₃), 2,17 (s,

3H, CH₃), 2,14 (s, 3H, CH₃), ·· ·· ·· ·· ·· ···· ···· ··· • · · · · · · • · · · · · ·

MS El 249 [M] ⁺.

C. Príklady syntézy pyrolom substituovaných 2-indolinónov

Nasledujúce syntézy reprezentatívnych zlúčenín tohto vynálezu ukazujú len príklady prípravy a nie sú konštruované tak, aby obmedzovali rozsah tohto vynálezu ako je syntetický prístup alebo zlúčeniny obsiahnuté v tomto vynálezu.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

3- [5-(5-chlór-2-oxo-l,2-dihydroindol-3-ylidénmetyl)-4-metyl-lH-pyrol-3yl]-propiónová kyselina

4- (2-karboxyetyl)-2-formyl-3-metylpyrol (4,5 g), 4,2 g 5-chlór-2-oxindolu, a 2,9 ml piperidínu v 50 ml etanolu sa zahrievajú pri 95 °C 5 hodín. Reakčná zmes sa ochladí a koncentruje. Zvyšok sa suspenduje v acetóne a žltý precipitát sa prefiltruje, premyje studeným etanolom, 2 N vodnou kyselinou chlorovodíkovou a vodou na pH 6. Potom sa suší cez noc vo vákuovej peci. Získa sa 7,2 g požadovanej zlúčeniny (88 %) vo forme žltej pevnej látky *HNMR (360 MHz, DMSO-d₆): δ 13,31 (s, br, 1H, ΝΗ-Γ), 12,06 (s, br, 1H, COOH), 10,88 (s, br, 1H, NH-1), 7,93 (d, J = 1,88 Hz, 1H, H-4), 7,75 (s, 1H, H-vinyl), 7,19 (d, J = 3,1 Hz, 1H, H-2’), 7,1 (dd, b, J = 1,88, 8,40 Hz, 1H, H-6), 6,84 (d, J = 8,40 Hz, 1H, H-7), 2,65 (t, J = 7,44 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH),

2,46 (t, J = 7,44 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,28 (s, 3H, CH₃);

·· ·· ·· ·· ·· · ···· · · · · ···· • · · · · · · · • ··>· ···· · • · · · · ···· ···· ·· ···· ·· ···

Príklad 2

3- [5-(6-metoxy-2-oxo-l,2-dihydroindol-3-ylidénmetyl)-4-metyI-lHpyrol-3-yl]-propiónová kyselina

4- (2-karboxyetyl)-2-formyl-3-metylpyrol (190 mg), 163 mg 6-metoxy-2indolu a 2 kvapky piperidínu sa zahrievajú v 2 ml etanolu pri 90 °C 3 hodiny. Reakčná zmes sa ochladí a koncentruje. Zvyšok sa suspenduje v 6 N vodnej kyseline chlorovodíkovej. Precipitát sa prefiltruje, premyje vodou na pH 6 a suší vo vákuovej peci. Získa sa 140 mg požadovanej zlúčeniny (43%) ako hnedej pevnej látky.

‘HNMR (360 MHz, DMSO-d₆): δ 13,1 (s, br, 1H, NH-ľ), 12,04 (s, br, 1H, COOH), 10,76 (s, br, 1H, NH-1), 7,63 (d, J = 8,29 Hz, 1H, H-4), 7,46 (s, 1H, H-vinyl), 7,07 (d, J = 3,03 Hz, 1H, H-2'), 6,55 (dd, J = 2,32, 8,29 Hz, 1H, H-5), 6,43 (d, J = 2,32 Hz, 1H, H-7), 3,74 (s, 3H, OCH₃), 2,63 (t, J = 7,31 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,45 (t, J = 7,31 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,23 (s, 3H, CH₃); MS m/z (relatívna intenzita, %) 327 ([M+l] ⁺, 100).

Príklad 3

3-[5-(5-chlór-2-oxo-l,2-dihydroindol-3-ylidénmetyl)-2,4-dimetyl-lHpyrol-3-yl]-propiónová kyselina

3-(2-karboxyetyl)-2,4-dimetyl-5-formylpyrol (220 mg), 147 mg 5-chlór-

2-oxindolu a 2 kvapky piperidínu sa zahrievajú v 2 ml etanolu pri 90 °C 3 hodiny. Reakčná zmes sa ochladí a koncentruje. Zvyšok sa suspenduje v 6 N vodnej kyseline chlorovodíkovej. Precipitát sa prefiltruje, premyje vodou na pH 6 a suší sa vo vákuovej peci. Získa sa 172 mg požadovanej zlúčeniny (50 %) ako hnedej pevnej látky.

’HNMR (360 MHz, DMSO-d₆): δ 13,42 (s, br, 1H, NH-ľ), 12,03 (s, br, 1H, COOH), 10,80 (s, br, 1H, NH-1), 7,87 (d, J = 2,06 Hz, 1H, H-4), 7,67 (s, 1H, H-vinyl), 7,06 (dd, J = 2,06, 8,3 Hz, 1H, H-6), 6,83 (d, J = 8,3 Hz, 1H, H7), 2,64 (t, J = 7,6 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,34 (t, J = 7,6 Hz, 2H, ·· ·· ·· ·· ·· ···· ···· ··· • · · · · e · • · · ♦ · · · · ··· ···· ·· ···· ·· ···

CH₂CH₂COOH), 2,29 (s, 3H, CH₃), 2,27 (s, 3H, CH₃); MS m/z (relatívna intenzita, %) 345 ( [M+l]⁺, 64).

Príklad 4

3-[4-metyl-5-(2-oxo-l,2-dihydroindol-3-ylidenmetyl)-lH-pyrol-3-ylJpropiónová kyselina

Kovový sodík (1,5 g) sa vloží do 3 1 trojhrdlovej banky s okrúhlym dnom vybavenej teplomerom, refluxným kondenzátorom a mechanickým miešadlom umiestnenej v olejovom kúpeli. Za stáleho miešania sa pridá absolútny etanol (1 1). Keď sa sodík rozpustí, pridá sa naraz 350 g pentán-2,4-diónu a potom sa v priebehu 30 minút pridá 310 g etylakrylátu. Zmes sa refluxuje 2,5 hodiny a potom sa cez noc ochladí na izbovú teplotu. Pridá sa ľadová kyselina octová (3 ml) a rozpúšťadlo sa odstráni na rotačnej odparke. Zvyšok sa prefiltruje cez vrstvu kremelíny a destiluje v kolóne s tenkým filmom pri 0,1 mm. Destilát sa redestiluje použitím 10 palcovej vákuovej opláštenej Vigreux kolóny, čím sa získa 518 g etyl-5-acetyl-4-oxohexanoátu, teplota topenia 84 - 92 °C pri 0,2 0,7 mm.

Do 5 1 trojhrdlovej banky vybavenej teplomerom a mechanickým miešadlom zahrievanej na parnom kúpeli sa pridá 350 g etyl-5-acetyl-4oxohexanoátu, 329 g etylaminomalonátu hydrochloridu, 133 g octanu sodného a

1,2 1 kyseliny octovej. Zmes sa zahrieva pri 99 °C počas 37 minút. Pri teplote 62 °C už dochádza k rýchlemu vyvíjaniu oxidu uhličitého. Po 35 minútach pri 99 °C sa vývin oxidu uhličitého rapídne spomalí. Po hodine sa zmes ochladí, chlorid sodný sa odstráni vákuovou filtráciou a rozpúšťadlo sa odparí. Zvyšok sa zmieša s 1 1 studenej vody. Precipitát sa zhromaždí vákuovou filtráciou, premyje 400 ml vody a rozpustí v 1 1 horúceho 95 % etanolu. Roztok sa nechá pôsobiť s 20 g Darko G-60, za horúca prefiltruje a ochladí sa na izbovú teplotu. Kryštalická pevná látka sa zhromaždí vákuovou filtráciou, dvakrát premyje na filtri 200 ml 50 % etanolu a suší sa pod vákuom pri 70 °C. Získa sa 285 g (64 % výťažok) 2-etoxykarbonyl-4-(2-etoxykarbonyletyl)-3,5-dimetylpyrolu. Filtrát ·· sa ponechá cez noc v ľadničke, čím sa získa ďalších 53,1 g (11,9 % výťažok) produktu. Spojený výťažok činí 75,9 %.

2-etoxykarbonyl-4-(2-etoxykarbonyletyl)-3,5-dimetylpyrol (285 g) a 3500 ml etyléteru sa vloží do 5 1, trojhrdlovej banky vybavenej mechanickým miešadlom, refluxným kondenzátorom a prídavným lievikom. Banka je umiestnená v ľadovom kúpeli. V priebehu 145 minút sa po kvapkách pridáva sulfurylchlorid (435 g). Pridávaním sa zmes zakalí a zozelená a potom vyjasní. Na konci prídavku sa zmes prečistí a sfarbí do slabo žltej farby. Zmes sa mieša ďalšiu 1 hodinu a potom sa zahrieva pod refluxom 1 hodinu. Zmes sa ochladí a odparí na rotačnej odparke, zriedi sa 1500 ml éteru a znovu odparí na rotačnej odparke. Zriedenie a odparenie sa uskutoční ešte raz. Zvyšok sa pridá do 8 1 vody obsahujúcej 802 g kyseliny octovej a 53 5 g hydroxidu sodného. Zmes sa krátko zahreje na 85 °C a potom sa za stáleho miešania nechá cez noc chladnúť. Vodná vrstva obsahujúca soli sa separuje a extrahuje 800 ml éteru. Pevný podiel a éterová vrstva sa pridajú do 2,5 1 vody obsahujúcej 300 g uhličitanu sodného. Mieša sa 1 hodinu a filtráciou sa odstráni malé množstvo (~7 g) pevnej látky. Do zmesi sa pridá kyselina siričitá (137 g) a výsledný precipitát sa dvakrát premyje 250 ml vody a suší sa pod vákuom, čím sa získa 56,4 g produktu. Do filtrátu sa pridá kyselina siričitá (92 g) a výsledný precipitát sa dvakrát premyje 0,5 1 vody a suší sa pod vákuom. Získa sa 220 g produktu, čo dohromady činí 276,4 g (86,8 % výťažok) 2-karboxy-5-etoxykarbonyl-3-(2- etoxykarbonyletyl)-4-metylpyrolu.

2-karboxy-5-etoxykarbonyl-3-(2-etoxykarbonyletyl)-4-metylpyrol (50,5 g) a 400 ml 10 % hydroxidu sodného sa zahrieva pri 180 °C v Parrovom autokláve 90 minút. Tento proces sa ešte štyrikrát opakuje, pokiaľ sa nespracuje všetkých 252,5 g 2-karboxy-5-etoxykarbonyl-3-(2-etoxykarbonyletyl)-4-metylpyrolu. Päť roztokov sa spojí a odparí sa na rotačnej odparke na množstvo 1,8 1 hustého čierneho zvyšku. Zmes sa ochladí na 10 °C vo vodnom kúpeli a pomaly sa pridáva 50 % kyselina siričitá tak, aby teplota nepresiahla 20 °C a pokiaľ pH nie je 2. Pridá sa etyléter (1 400 ml), zmes sa prefiltruje a precipitát sa uschová. Precipitát sa extrahuje v Soxhletovom extraktore 500 ml éteru. Spojené éterové vrstvy sa premyjú 250 ml vody a potom 150 ml vody. Spojené vodné vrst·· · · · · · · ·· ···· · e · · ··· • · · · · · · < · ··« · · · ······· ·· ··» ·· ··· vy sa naspäť extrahujú 150 ml éteru. Všetky éterové vrstvy sa odparia na rotačnej odparke a zvyšok sa usuší. Získa sa 123,5 g 3-(2-karboxyetyl)-4-metylpyrolu.

3-(2-karboxyetyl)-4-metylpyrol (123 g) sa zmieša s 1500 ml etyléteru a 250 ml metanolu v magneticky miešanej banke. Do 3 1, trojhrdlovej banky s guľatým dnom vybavenej magnetickým miešadlom, destilačným nástavcom a kondenzátorom vedúcim do vstupu do banky a zahrievanej na vodnom kúpeli sa umiestni 240 g Diazaldu rozpusteného v 1 800 ml etyléteru, roztok 73 g hydroxidu sodného rozpusteného v 360 ml 95 % etanolu a 112 ml vody. 3 1 banka sa mieša a zahrieva pri 65 - 75 °C na vodnom kúpeli a diazometán-éterová zmes sa destiluje do miešanej zachytávacej banky počas 2,5 hodiny. Pridá sa etyléter (200 ml) a destilácia pokračuje pokiaľ nie je kompletná. Zachytávacia banka sa mieša ďalších 30 minút a potom sa pridá 10 ml kyseliny octovej. Zmes sa dvakrát extrahuje 500 ml vody, potom dvakrát 200 ml saturovaného hydrogenuhličitanu sodného. Éterová vrstva sa suší nad bezvodým síranom sodným a destiluje, čím vznikne tmavý tekutý zvyšok. Zvyšok sa dvakrát destiluje cez 4 palcovú Vigreux kolónu a raz cez 10 palcovú vákuovú-opláštenú Vigreux kolónu. Získa sa 108 g (80,6 % výťažok) 3-(2-etoxykarbonyletyi)-4-metylpyrolu. Teplota topenia 108 - 113 °C pri 0,5 mm.

Dimetylformamid v 500 ml trojhrdlovej banke s okrúhlym dnom vybavenej mechanickým miešadlom, teplomerom a prikvapkávacim lievikom sa udržuje pod atmosférou dusíka. Banka sa ochladí na 0 °C a po kvapkách v priebehu 80 minút sa pridáva 58,4 ml oxychloridu fosforečného. Pridá sa dichlóretán (280 ml) a zmes sa ohreje na izbovú teplotu a potom sa ochladí na -10 °C. Po kvapkách sa počas hodiny pridáva 3-(2-metoxykarbonyl-etyl)-4-metylpyrol (55,7 g) rozpustený v 80 ml dichlóretánu a zmes sa mieša ďalších 35 minút. Zmes sa odparí na rotačnej odparke pri teplote < 30 °C. Tekutý zvyšok sa naleje do 2700 ml ľadovo studeného 2 N roztoku hydroxidu sodného. Výsledný roztok sa zahrieva na 88 °C cez 20 minút a potom sa na tejto teplote udržuje ďalších 30 minút. Roztok sa ochladí na teplotu okolia a extrahuje sa 200 ml etyléteru. Vodný roztok sa ochladí na 0 °C a okyslí sa na pH 3,5 pomalým pridávaním približne 1350 ml 5 N kyseliny chlorovodíkovej. Žltý precipitát sa ·· · · ·· ·· • · · · · · · · · • · · · · · · zhromaždí vákuovou filtráciou, štyrikrát premyje 100 ml vody a suší sa vo vákuovej peci pri okolitej teplote. Získa sa 54,4 g (90,2 % výťažok) surového 4(2-karboxyetyl)-2-formyl-3-metylpyrolu.

Surový materiál sa umiestni do refluxujúcej sa zmesi 425 ml etanolu a 700 ml etyléteru a za horúca sa prefiltruje nerozpustný zvyšok. Filtrát sa vloží do mrazničky a výsledný precipitát sa zhromaždí vákuovou filtráciou a premyje 50 ml éteru. Filtrát sa znovu použije na extrakciu nerozpustiteľného zvyšku, za horúca prefiltruje a vloží do mrazničky. Výsledný precipitát a prvý precipitát sa spojí, čím sa získa 26,1 g 4-(2-karboxyetyl)-2-formyl-3-metylpyrolu ako hnedého prášku. Teplota topenia 149,0 - 150,3 °C. Filtrát sa spojí s filtrátom z predchádzajúcej prípravy a koncentruje sa, čím sa získa 43 g hnedej pevnej látky. Pevná látka sa vloží do refluxujúcej zmesi 500 ml éteru a 100 ml etanolu a prefiltruje. Filtrát sa nechá pôsobiť s Noritom pri refluxe a znovu sa za horúca prefiltruje. Filtrát sa vloží do mrazničky, čím sa získajú 3 dávky 4-(2karboxyetyl)-2-formyl-3-etylpyrolu, 7,7 g, teplota topenia 148 - 151 °C, 3,2 g, teplota topenia 128 - 134 °C a 4,1 g, teplota topenia 148,2 - 150,0 °C.

4-(2-karboxyetyl)-2-formyl-3-metylpyrol (9,0 g) a 6,0 g 2-oxindolu v 50 ml etanolu sa zahrieva na 70 °C v 250 ml, trojhrdlovej banke s okrúhlym dnom vybavenej teplomerom, refluxným kondenzátorom a mechanickým miešadlom. Keď sa väčšina pevnej látky rozpustí pomaly sa pridá 4,5 g piperidínu a zmes sa refluxuje 4 hodiny. Pomaly sa pridá kyselina octová (12 ml), čím vznikne výdatný precipitát. Zmes sa refluxuje 5 minút, ochladí sa na izbovú teplotu a precipitát sa zhromaždí vákuovou filtráciou a premyje 30 ml etanolu. Precipitát sa rozotrie pod refluxom v 30 ml etanolu, ochladí sa na izbovú teplotu, zhromaždí vákuovou filtráciou, premyje 20 ml etanolu a suší sa pod vákuom. Získa sa 11,9 g (80 % výťažok) 3-[4-(2-karboxyetyl)-3-metylpyrol-2-metylidenyl]-2indolinónu, SU6663, ako oranžovej pevnej látky.

'HNMR (360 MHz, DMSO-d₆)· δ 13,29 (s, br, 1H, NH-ľ), 12,05 (s, br,

1H, COOH), 10,78 (s, br, 1H, NH-1), 7,73 (d, J = 7,43 Hz, 1H, H-4), 7,61 (s,

1H, H-vinyl), 7,13 (d, J = 2,75 Hz, 1H, H-2'), 7,10 (t, J = 7,43 Hz, 1H, H-6), 6,97 (t, J = 7,43 Hz, 1H, H-5), 6,85 (d, J = 7,43 Hz, 1H, H-7), 2,64 (t, J = 7,38 ·· ·· ·· ·· ·· ···· ···· · · · • · · · · · · • · · · · · · ···· ···· ·· ···· ·· ·

Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,46 (t, J = 7,38 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,25 (s, 3H, CH3); MS m/z (relatívna intenzita, %) 297 ( [M+l]⁺, 100).

Príklad 5

3-[2,4-dimetyl-5-(2-oxo-l,2-dihydroindol-3-ylidenmetyl)-lH-pyrol-3-yl]propiónová kyselina

2,4-dimetyl-5-etoxykarbonyl-3-(2-etoxykarbonyletyl)pyrol (1,07 kg) a

3,2 1 5 N hydroxidu sodného sa mechanicky mieša v 12 1 trojhrdlovej banke s okrúhlym dnom vybavenej refluxným kondenzátorom, prídavným lievikom a zahrieva sa v olejovom kúpeli. Zmes sa refluxuje po dobu 3 hodiny a po tejto dobe je vnútorná teplota 96 °C, všetka pevná látka je rozpustená a tenkovrstvová chromatografia ukáže hydrolýzu ako kompletnú. Odstránia sa parný kúpeľ a zmes sa ochladí na 50 °C vo vodnom kúpeli. Pomaly sa pridá 12 N kyselina chlorovodíková (~1,3 L). Potom čo sa pridá asi 50 % kyseliny sa začne vyvíjať plyn a teplota sa zvýši na 60 °C. Ako sa pridáva ďalšia kyselina, vyvíjanie zosiluje a začne sa tvoriť žltý precipitát. Kyselinou chlorovodíkovou sa pH upraví na konečnú hodnotu 3,5. Zmes sa ochladí v ľadovom kúpeli na 8 °C. Pevné látky sa zhromaždia vákuovu filtráciou, dvakrát sa premyjú 0,5 1 destilovanej vody a sušia sa 48 hodín vo vákuovej peci pri 55 - 60 °C. Získa sa 677 g (101% výťažok) 3-(2-karboxyetyl)-2,4-dimetylpyrolu.

’HNMR (de-DMSO) δ 11,9 (s, 1H, COOH), 9,9 (s, 1H, NH), 6,2 (s, 1H, aromatika), 2,5 (t, 2H, CH₂), 2,2 (t, 2H, CH₂), 2,0 (s, 3H, CH₃), 1,9 (s, 3H, CH₃); Teplota topenia 134 - 136 °C.

Dimetylformamid (28,5 g) v 250 ml dichlórmetánu v 1 1 trojhrdlovej banke s okrúhlym dnom vybavenej magnetickým miešadlom, teplomerom a prikvapkávacím lievikom sa ochladí v ľadovom soľnom kúpeli na teplotu -1 °C. Oxychlorid fosforečný (59,3 g) sa z prikvapkávacieho lieviku pomaly prikvapká do reakčnej zmesi. Oxychlorid fosforečný sa z nálevky vypláchne 25 ml dichlórmetánu. Zmes dosiahne teplotu maximálne 5 °C. Zmes sa mieša počas 15 minút, počas ktorých je teplota -3 °C. Pevný 3-(2-karboxyetyl)-2,4-dimetylpyrol (32,6 g) sa pridáva po dávkach v priebehu 15 minút. Zmes dosiahne tep87 ·· ·· ·· ·· ·· ··· · B B B B · ·

B B B B B B B

B B B · B B · B ·

B B f · · · B lotu maximálne 7 °C. Červenohnedá zmes sa mieša cez 30 minút a potom sa refluxuje 1 hodinu. Zmes sa ochladí na 15 °C a pridá sa 300 ml vody, čo má za následok prudkú reakciu a zvýšenie teploty. Zmes sa mieša a ochladí sa na 22 °C, vrstvy sa separujú a uschovávajú. Organická vrstva sa extrahuje 100 ml vody a vodné vrstvy sa spoja a premyjú 50 ml dichlórmetánu. Organické vrstvy sa vylejú. Vodná vrstva sa upraví na pH 11 ~180 ml 10 N hydroxidu sodného. Teplota sa zvýši na 40 °C. Zmes sa mieša po dobu 30 minút za teploty 27 °C. Zmes sa okyslí na pH 2 ~120 ml 10 N kyseliny chlorovodíkovej. Teplota sa zvýši na 30 °C. Pridá sa etylacetát (150 ml) a zmes sa mieša, čím sa získa produkt. Počas miešania sa navrchu vodnej vrstvy objaví značné množstvo čiernej pevnej látky. Etylacetátová vrstva sa oddelí a vodná vrstva a pevná látka sa dvakrát extrahujú 100 ml etylacetátu. Stále prítomná pevná látka sa zhromaždí vákuovou filtráciou, dôkladne sa premyje vodou a suší sa pod vákuom pri 40 °C. Získa sa 12 g (31 % výťažok) 3-(2-karboxyetyl)-2,4-dimetyl-5-formylpyrolu ako hnedočiernej pevnej látky. Tenkovrstvová chromatografia (dichlórmetán : octová kyselina, 95: 5, silikagél) ukáže škvrnu na Rf 0,7 a zafarbenú škvrnu na počiatku. Etylacetátové vrstvy sa spoja, sušia sa nad bezvodým síranom sodným, odparia sa do vzniku hnedo-čiernej pevnej látky, ktorá sa suší pod vákuom pri 40 °C. Získa sa 21 g (55 % výťažok, celkový výťažok 86 %) 3(2-karboxyetyl)-2,4-dimetyl-5-formylpyrolu, na tenkovrstvovej chromatografii identického vzhľadu ako predchádzajúca pevná látka.

Alternatívny postup: dimetylformamid (124 ml) v 750 ml dichlórmetánu v 5 I trojhrdlovej banke s okrúhlym dnom vybavenej mechanickým miešadlom teplomerom a prekvapkávajúcim lievikom sa ochladí v ľadovom-soľnom kúpeli na -9 °C. Oxychlorid fosforečný (114 ml) sa rýchlo pridáva z prikvapkávacieho lievika a spláchne sa do reakčnej zmesi 50 ml dichlórmetánu. Maximálna dosiahnutá teplota zmesi je -4 °C. Pevný 3-(2-karboxyetyl)-2,4-dimetylpyrol (133,6 g) sa pridáva po dávkach 20 minút. Maximálna dosiahnutá teplota zmesi je 3 °C. Tmavo červená zmes sa zahrieva pod refluxom 1 minútu a potom sa ochladí na -1 °C. Zmes sa ochladí na 1 °C a rýchlo sa pridá 800 ml ľadovej vody. Maximálna dosiahnutá teplota je 15 °C. Organická vrstva sa separuje a odstráni. Vodná vrstva sa upraví na pH 12 - 13 pomocou 800 ml 10 N hydroxidu sodného, na upravovanie teploty sa pridáva ľad. Teplota stúpne na 37 °C. Zmes ·· e· ·· ·· ··· ·· · · ·· · · · · · • ··· · · ·· • ···· ····· « · ··* · ·· ··· ···· ·· ···· ·· ··· sa mieša 90 minút pri teplote okolia a počas tejto doby tenkovrstvová chromatografia ukáže len stopy svetlo sfarbenej látky na počiatku a produkt na Rf 0,3. Zmes sa ochladí na 0 °C. Zmes sa okyslí na pH 3 pomocou 600 ml 10 N kyseliny chlorovodíkovej, na upravovanie teploty sa pridáva ľad. Maximálna dosiahnutá teplota je 10 °C. Zmes sa mieša v chlade 1 hodinu. Pevná látka sa zhromaždí vákuovou filtráciou, štyrikrát premyje 100 ml vody a suší sa pod vákuom pri 50 - 60 °C, čím sa získa 140,6 g (90 % výťažok) 3-(2-karboxyetyl)-2,4dimetyl-5-formylpyroIu ako hnedej pevnej látky.

’HNMR (dô-DMSO): δ 12,0 (s, 1H, COOH), 11,3 (s, 1H, NH), 9,4 (s, 1H, CHO), 2,6 (t, 2H, CH₂), 2,3 (t, 2H, CH₂), 2,2 (s, 3H, CH₃), 2,1 (s, 3H, CH₃), Teplota topenia 145-147°C.

3-(2-karboxyetyl)-2,4-dimetyl-5-formylpyrol (18,2 g) a 11,7 g 2-oxindolu sa rozpustí v 100 ml etanolu zahrievaním v 250 ml banke s okrúhlym dnom vybavenej magnetickým miešadlom a refluxným kondenzátorom v olejovom kúpeli. Pridá sa pyrolidín (7,0 g) a reakčná zmes sa refluxuje 2 hodiny. Počas tohto času je prítomné veľké množstvo hnedočiernej pevnej látky. Tenkovrstvová chromatografia (etylacetát: etanol: octová kyselina 96: 2: 2, silikagél) neukáže žiadny východiskový oxindol. Pridá sa 8 ml kyseliny octovej a zmes sa refluxuje 15 minút. Hustá zmes sa zriedi 50 ml etanolu a ochladí sa na 10 °C. Pevná látka sa zhromaždí vákuovou filtráciou a premyje 50 ml etanolu. Ďalej sa mieša v 125 ml etanolu pod refluxom po dobu 10 minút, ochladí sa na 10 °C, zhromaždí sa vákuovou filtráciou a premyje sa 50 ml etanolu. Produkt sa suší cez noc pri 45 °C pod vákuom, čím sa získa 25,5 g (88 % výťažok) 3-[2,4dimetyl-3-(2-karboxyetyl)pyrol-5-metylidenyl]-2-indolinónu ako oranžovej pevnej látky.

Alternatívny postup: zmes 3-(5-formyl-2,4-dimetyl-lH-pyrol-3-yl)propiónovej kyseliny (10 g, 51 mmol), 2-oxindolu (6,5 g, 49 mmol) a hydroxidu sodného (40 g, 58 mmol) sa rozpustí v 50 ml vody a mieša sa pri 50 °C počas 4 hodín. Reakčná zmes sa ochladí na izbovú teplotu, prefiltruje a filtrát sa okyslí 12 N kyselinou chlorovodíkovou na pH 3. Precipitovaná pevná látka sa zhromaždí vákuovou filtráciou, premyje 10 ml vody a suší sa pod vákuom cez noc. Surová pevná látka sa dvakrát rozotrie s horúcim etanolom, potom sa

Λ · · · · · · · · · · · · · 9 · · zhromaždí vákuovou filtráciou, premyje sa 10 ml etanolu a suší sa pod vákuom. Získa sa 13,8 g (91%) 3-[2,4-dimetyl-5-(2-oxo-l,2-dihydro-indol-3ylidénmetyl)-lH-pyrol-3-yl]-propiónovej kyseliny.

’HNMR (360 MHz, DMSO-d₆): δ 13,38 (s, br, 1H, ΝΗ-Γ), 12,05 (s, br, 1H, COOH), 10,70 (s, br, 1H, NH-1), 7,69 (d, J = 7, 39 Hz, 1H, H-4), 7,53 (s, 1H, H-vinyl), 7,06 (t, J = 7,39 Hz, 1H, H-6), 6,95 (t, J = 7,39 Hz, 1H, H-5),

6,85 (d, J = 7,39 Hz, 1H, H-7), 2,63 (t, J = 7,45 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,34 (t, J = 7,45 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,28 (s, 3H, CH₃), 2,24 (s, 3H, CH₃); MS m/z (relatívna intenzita, %) 311 ([M+l]⁺, 100).

Príklad 6

3-[5-(5-bróm-2-oxo-l,2-dihydroindol-3-ylidénmetyl)-4-metyl-lH-pyrol-3ylj-propiónová kyselina

2-oxindol (53,3 g) sa suspenduje v 640 ml acetonitrilu a zmes sa ochladí na 7 °C v ľadovom kúpeli za stáleho miešania. Počas 20 minút sa v dávkach pridá pevný N-brómsukcínimid (74,8 g). Potom čo sa pridá asi jedna tretina Nbrómsukcínimidu teplota stúpne na 12 °C. Pridávanie sa pozastaví pokiaľ teplota zmesi neopadne na 10 °C. V pridávaní sa pokračuje za teploty pod 12 °C. Potom, čo sa dokončí pridávanie, sa zmes mieša po dobu 1 hodiny pri 10 °C. Počas ďalšej hodiny miešania sa zmes nechá ohriať na teplotu okolia. Precipitát sa zhromaždí vákuovou filtráciou, premyje 80 ml etanolu a 20 minút sa odsáva do sucha na filtračnom lieviku. Získa sa produkt podľa HPLC obsahujúci 6,4 %

2-oxindolu. Pevná látka sa suspenduje v 1440 ml denaturovaného etanolu a rozotrie sa miešaním a refluxovaním po dobu 5 minút. Počas tejto doby sa väčšina pevnej látky rozpustí. Zmes sa ochladí v ľadovom kúpeli na 13 °C. Pevný produkt sa zhromaždí vákuovou filtráciou, premyje sa 80 ml etanolu a suší sa pod vákuom, čím sa získa 57,7 g (68,0 %) 5-bróm-2-oxindolu podľa HPLC obsahujúceho 1,13 % 2-oxindolu. Rozomletím s menším množstvom 30 % etanolu sa získa lepší výťažok (88 %), ale obsahujúci viacero 2-oxindolu (1,76 %).

·· ·· ·· ·· ·· · • · · · · · · · · · · • ··· ··« • · · · · ···· · • · · · · · · · ······· ·· ···· ·· ··· ’HNMR (360 MHz, DMSO-de): Ô 10,44 (s, br, 1H, NH-1), 7,32- 7,36 (m, 2H), 6,76 (d, J = 8,50 Hz, 1H, H-7), 3,5 (s, 2H, CH₂); MS m/z 212,1/214,1 (M⁺/ [M+2]⁺).

4-(2-karboxyetyl)-2-formyl-3-metylpyrol (90 mg), 106 mg 5-bromo-2oxindolu a 75 μΐ piperidínu v 2 ml etanolu sa zahrieva pri 95 °C po dobu 5 hodín. Reakčná zmes sa ochladí a koncentruje. Zvyšok sa suspenduje v 2 N vodnej kyseline chlorovodíkovej. Precipitát sa prefiltruje, premyje vodou na pH 6 a suší sa vo vákuovej peci. Získa sa 120 mg (64 %) požadovanej zlúčeniny ako hnedej pevnej látky.

*HNMR (360 MHz, DMSO-de); δ 13,31 (s, br, 1H, NH-ľ), 12,06 (s, br, 1H, COOH), 10,90 (s, br, 1H, NH-1), 8,06 (s, br, 1H, H-4), 7,75 (s, 1H, Hvinyl), 7,23 (d, br, J = 8,50 Hz, 1H, H-6), 7,19 (d, J = 2,84 Hz, 1H, H-2'), 6,80 (d, br, J = 8,50 Hz, 1H, H-7), 2,65 (t, J = 7,65 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,46 (t, J = 7,65 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,28 (s, 3H, CH₃) ; MS m/z 375,1/ 377,2 (M⁺/ [M+2]⁺).

Príklad 7

3-[5-(5-jodo-2-oxo-l,2-dihydroindol-3-ylidénmetyl)-4-metyl-lH-pyrol-3yl]-propiónová kyselina

2-oxindol (82,9 g) sa suspenduje v 630 ml kyseliny octovej, zmes sa mechanicky mieša a ochladí sa na 10 °C v ľadovom vodnom kúpeli. Počas 10 minút sa po dávkach pridá N-jódsukcínimid (175 g). Potom sa zmes mieša po dobu 1 hodiny pri 10 °C. Prítomná suspendovaná látka počas tejto doby zhustne. Pevná látka sa zhromaždí vákuovou filtráciou, premyje sa 100 ml 50 % kyseliny octovej vo vode, potom 200 ml vody a 20 minút sa odsáva do sucha na filtračnom lieviku. Produkt sa suší pod vákuom, čím sa získa 93,5 g (36 %) 5jodo-2-oxindolu podľa protónovej NMR obsahujúceho 5 % 2-oxindolu.

·· ·· ·· ·· ·· ··· ···· ··· • · · · · · · • ···· · · · · • · · · · · · ··· ···· ·· ···· ·· · ‘HNMR (360 MHz, DMSO-d₆)>: δ 10,45 (s, 1H, NH-1), 7,49 (s, 1H, H-4),

7,48 (d, J = 8,10 Hz, 1H, H-6), 6,64 (d, J = 8,10 Hz, 1H, H-7) a 3,46 (s, 2H, CH₂-3); MS m/z 258 [M-l]⁺.

4-(2-karboxyetyl)-2-formyl-3-metylpyrol (90 mg), 130 mg 5-jodo-2-oxindolu a 75 μΐ piperidínu v 2 ml etanolu sa zahrievajú pri teplote 95 °C po dobu 5 hodín. Reakčná zmes sa ochladí a koncentruje. Zvyšok sa suspenduje v 2 N vodnej kyseline chlorovodíkovej. Precipitát sa prefiltruje, premyje vodou na pH 6 a suší sa vo vákuovej peci, čím sa získa 162 mg (77 %) požadovanej zlúčeniny ako hnedej pevnej látky.

*HNMR (360 MHz, DMSO-d₆): δ 13,30 (s, br, 1H, ΝΗ-Γ), 12,06 (s, br, 1H, COOH), 10,88 (s, br, 1H, NH-1), 8,18 (s, br, 1H, H-4), 7,73 (s, 1H, Hvinyl), 7,40 (d, br, J = 8,03 Hz, 1H, H-6), 7,19 (d, J = 2,94 Hz, 1H, H-2'), 6,69 (d, br, J = 8,03 Hz, 1H, H-7), 2,65 (t, J = 7,40 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,46 (t, J = 7,40 Hz, 2H, CH2CH2COOH), 2,28 (s, 3H, CH₃); MS m/z 423 [M+l]⁺.

Príklad 8

3-[4-metyl-5-(4-metyl-2-oxo-l,2-dihydroindol-3-ylidénmetyl)-lH-pyrol-

3-yl]-propiónová kyselina

Dietyloxalát (30 ml) v 20 ml suchého éteru sa za stáleho miešania pridá do 19 g etoxidu draselného suspendovaného v 50 ml suchého éteru. Zmes sa ochladí v ľadovom kúpeli a pomaly sa pridá 20 ml 3-nitro-o-xylénu v 20 ml suchého éteru. Hustá tmavo červená zmes sa zahrieva pod refluxom po dobu 0,5 hodiny, zakoncentruje sa do tmavo červenej pevnej látky a nechá sa pôsobiť s 10 % hydroxidom sodným, pokiaľ sa takmer všetka pevná látka nerozpustí. Tmavo červená zmes sa nechá pôsobiť s 30 % peroxidom vodíka, pokiaľ sa červená farba nezmení na žltú alebo sa zmes nechá reagovať s 10% hydroxidom sodným a 30% peroxidom vodíka, pokiaľ nevymizne červené sfarbenie. Pevná látka sa prefiltruje a filtrát sa okyslí 6 N kyselinou chlorovodíkovou. Výsledný precipitát sa zhromaždí vákuovou filtráciou, premyje sa vodou a suší sa pod vákuom. Získa sa 9,8 g ( 45 % výťažok) 2-metyl-6-nitrofenyloctovej kyseliny ·· ·· ·· ·· ·· ···· · · · · · ·· • · · · · ·· • · · · · ···· · · · · ·· ···· ···· ·· ···· ·· · ako šedej pevnej látky. Pevná látka sa hydrogenuje v metanole cez 10 % paládium na aktívnom uhlí, čím sa získa 9,04 g 4-metyl-2-oxindolu ako bielej pevnej látky.

’HNMR (360 MHz, DMSO-d₆): Ô 10,27 (s, br, 1H, NH-1), 7,06 (t, J =

7,71 Hz, 1H, H-6), 6,74 (d, J = 7,73 Hz, H-5), 6,63 (d, J = 7,73 Hz, 1H, H-7),

3,36 (s, 2H, CH₂), 2,18 (s, 3H, CH₃).

4- (2-karboxyetyl)-2-formyl-3-metylpyrol (90 mg), 74 mg 4-metyl-2oxindol a 75 μΐ piperidínu v 2 ml etanolu sa zahrieva pri 95 °C po dobu 5 hodín. Reakčná zmes sa ochladí a koncentruje. Zvyšok sa suspenduje v 6 N vodnej kyseline chlorovodíkovej. Precipitát sa prefiltruje, premyje vodou na pH 6 a suší sa vo vákuovej peci. Získa sa 80 mg (52 %) požadovanej zlúčeniny ako hnedej pevnej látky.

’HNMR (360 MHz, DMSO- d6): δ 13,33 (s, br, 1H, NH-1'), 10,84 (s, br, 1H, NH-1), 7,54 (s, 1H, H-vinyl), 7,12 (d, J = 2,0 Hz, 1H, H-2'), 7,01 (t, J = 7,75 Hz, 1H, H-6), 6,79 (d, J = 7,75 Hz, H-5), 6,74 (d, J = 7,75 Hz, 1H, H-7),

2,64 (t, J = 7,65 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,57 (s, 3H, CH₃), 2,42 (t, J = 7,65 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,19 (s, 3H, CH₃); MS m/z (relatívna intenzita, %) 311 ( [M+l]⁺, 100).

Príklad 9

3-[4-metyl-5-(5-metyl-2-oxo-l,2-dihydroindol-3-ylidénmetyl)-lH-pyrol-

3-yl]-propiónová kyselina

5- metylizatín (15,0 g) a 60 ml hydrátu hydrazínu sa zahrieva pri 140-160 °C 4 hodiny. Tenkovrstvová chromatografia (etylacetát: hexán 1: 2, silikagél) neukáže žiadny zvyšujúci východiskový materiál. Reakčná zmes sa ochladí na izbovú teplotu, preleje do 300 ml ľadovej vody a okyslí sa na pH 2 kyselinou chlorovodíkovou. Dva dni sa nechá stáť pri izbovej teplote, precipitát sa zhromaždí vákuovou filtráciou, premyje vodou a suší sa pod vákuom, čím sa získa

6,5 g (47 % výťažok) 5-metyl-2-oxindolu.

·· ·· ·· ·· ·· ··· ···· ··· • · · · · · · ‘HNMR (360 MHz, DMSO-d₆): δ 10,20 (s, br, 1H, NH-1), 6,99 (s, 1H, H-

4), 6,94 (d, J = 8,11 Hz, 1H, H-6), 6,68 (d, J = 8,11 Hz, 1H, H-7), 3,39 (s, 2H, CH₂-3), a 2,22 (s, 3H, CH₃-5).

4-(2-karboxyetyl)-2-formyl-3-metylpyrol (90 mg), 74 mg 5-metyl-2oxindolu a 75 μΐ piperidínu v 2 ml etanolu sa zahrievajú pri 95 °C po dobu 5 hodín. Reakčná zmes sa ochladí a koncentruje. Zvyšok sa suspenduje v 6 N vodnej kyseline chlorovodíkovej. Precipitát sa prefiltruje, premyje vodou na pH 6 a suší sa vo vákuovej peci, čím sa získa 65 mg (42%) požadovanej zlúčeniny ako hnedej pevnej látky.

*HNMR (360 MHz, DMSO-d₆): δ 13,30 (s, br, 1H, ΝΗ-Γ), 12,05 (s, br, 1 H, COOH), 10,67 (s, br, 1H, NH-1), 7,57 (s, 2H, H-vinyl, H-4), 7,12 (d, J =

2,65 Hz, 1H, H-2'), 6,91 (d, J = 7,82 Hz, 1H, H-6), 6,74 (d, J = 7,82 Hz, 1H, H7), 2,65 (t, J = 6,94 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,46 (t, J = 6,94 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,30 (s, 3H, CH₃), 2,25 (s, 3H, CH₃); MS m/z (relatívna intenzita, %) 311 ( [M+l]⁺, 100).

Príklad 10

3- [5-(5,6-dimetoxy-2-oxo-l,2-dihydroindol-3-ylidénmetyl)-4-metyl-lHpyrol-3-yl]-propiónová kyselina

4- (2-karboxyetyl)-2-formyl-3-metylpyrol (90 mg), 97 mg 5,6-dimetoxy-

2-oxindolu a 75 μΐ piperidínu v 2 ml etanolu sa zahrievajú pri 95 °C po dobu 5 hodín. Reakčná zmes sa ochladí a koncentruje. Zvyšok sa suspenduje v 6 N vodnej kyseline chlorovodíkovej. Precipitát sa prefiltruje, premyje vodou na pH 6 a suší sa vo vákuovej peci, čím sa získa 104 mg (58%) požadovanej zlúčeniny ako hnedej pevnej látky.

’HNMR (360 MHz, DMSO-d₆): Ô 13,19 (s, br, 1H, NH-ľ), 12,05 (s, br, 1

H, COOH), 10,53 (s, br, 1H, NH-1), 7,46 (s, 1H), 7,41 (s, 1H), 7,02 (s, 1H, H2'), 6,45 (s, 1H), 3,74 (s, 3H, OCH₃), 3,70 (s, 3H, OCH₃), 2,59 (t, J = 7,43 Hz, ·· · ·· ···· ···· · ·· · · ·· • · · · · ·· • · · · · ·· «··· ···· ·· ······ ·

2Η, CH₂CH₂COOH), 2,44 (t, J = 7,43 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,22 (s, 3H, CH₃); MS m/z 357 [M+l]⁺.

Príklad 11

3- [5-(6-chloro-2-oxo-l,2-dihydroindol-3-ylidénmetyl)-4-metyl-lH-pyrol3-yl]-propiónová kyselina

4- (2-karboxyetyl)-2-formyl-3-metylpyrol (200 mg), 167,6 mg 6-chloro-2oxindolu a 166 μΐ piperidinu v 2 ml etanolu sa zahrievajú pri 95 °C po dobu 5 hodín. Reakčná zmes sa ochladí a koncentruje. Zvyšok sa suspenduje v 6 N vodnej kyseline chlorovodíkovej. Precipitát sa prefiltruje, premyje vodou na pH 6 a suší sa vo vákuovej peci, čím sa získa 246 mg (74%) požadovanej zlúčeniny ako hnedej pevnej látky.

‘HNMR (360 MHz, DMSO-d₆): δ 13,22 (s, br, 1H, NH-ľ), 12,09 (s, br, 1 H, COOH), 10,95 (s, br, 1H, NH-1), 7,78 (d, J = 7,95 Hz, 1H, H-4), 7,66 (s, 1H, H-vinyl), 7,18 (d, J = 2,64 Hz, 1H, H-2')> 7,01 (dd, J = 1,90, 7,95 Hz, 1H, H-5), 6,86 (d, J = 1,90 Hz, 1H, H-7), 2,65 (t, J= 7,14 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,45 (t, J = 7,14 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,26 (s, 3H, CH₃).

Príklad 12

Metyl ester 3-[4-(2-karboxyetyl)-3-metyl-lH-pyrol-2-ylmetylén]-2-oxo-

2,3-dihydro-lH-indol-5-karboxylovej kyseliny

5- jodo-2-oxindol (17 g) sa refluxuje s 2 g paládium diacetátom, 18,2 trietylamínu, 150 ml metanolu, 15 ml dimetylsulfoxidu a 2,6 g DPPP v atmosfére oxidu uhoľnatého. Po 24 hodinách sa z reakčnej zmesi prefiltruje katalyzátor a filtrát sa koncentruje. Koncentrát sa chromatografuje na silikagély použitím 30% etylacetátu v hexáne. Frakcie obsahujúce produkt sa koncentrujú a ponechajú sa stáť. Precipitovaný produkt sa zhromaždí vákuovou ·· ·« ·· ·· ·· • · · · · · · • · · · · · · • ···· ···· • · · · · · · ········ ·· ···· ·· filtráciou, čím sa získa 0,8 g (7 %) 5-metoxykarbonyl-2-oxindolu ako šedej pevnej látky.

^lHNMR (360 MHz, DMSO-d₆) δ 10,70 (s, br, 1H, NH-1), 7,83 (dd, J = 1,77, 8,29 Hz, 1H, H-6), 7,77 (s, br, 1H, H-4), 6,89 (d, J = 8,29 (Hz, 1H, H-7), 3,80 (s, 3H, COOCH₃-5), 3,51 (s, 2H, CH₂-3).

4-(2-karboxyetyl)-2-formyl-3-metylpyrol (90,6 mg), 88,6 mg 5metoxykarbonyl-2-oxindolu a 75 μΐ piperidínu v 2 ml etanolu sa zahrievajú pri 95 °C po dobu 5 hodín. Reakčná zmes sa ochladí a koncentruje. Zvyšok sa suspenduje v 6 N vodnej kyseline chlorovodíkovej. Precipitát sa prefiltruje, premyje vodou na pH 6 a suší sa vo vákuovej peci, čím sa získa 123 mg (69%) požadovanej zlúčeniny ako žltej pevnej látky.

’HNMR (360 MHz, DMSO-d₆): δ 13,27 (s, br, 1H, NH-ľ), 12,0 (s, vbr, 1H, COOH), 11,16 (s, br, 1H, NH-1), 8,36 (s, br, 1H, H-4), 7,80 (s, 1H, Hvinyl), 7,40 (dd, J = 1,80, 8,14 Hz, 1H, H-6), 7,20 (d, J = 2,91 Hz, 1H, H-5'),

6,96 (d, J = 8,14 Hz, 1H, H-7), 3,84 (s, 3H, COOCH₃), 2,66 (t, J = 7,55 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,46 (t, J = 7,55 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,30 (s, 3H, CH₃); MS m/z (relatívna intenzita, %) 355 ( [M+l]⁺, 100).

Príklad 13

3-[4-(2-karboxy-etyl)-3-metyl-lH-pyrol-2-ylmetylén]-2-oxo-2,3-dihydrolH-indol-5-karboxylová kyselina

2-oxindol (6,7 g) sa pridá do miešanej suspenzie 23 g chloridu hlinitého v 30 ml dichlóretánu v ľadovom kúpeli. Pomaly sa pridá chlóracetylchlorid (11,3 g) a začne sa vyvíjať plynný chlorovodík. Po desiatich minútach miešania sa reakčná zmes zahrieva pri 40 - 50 °C po dobu 1,5 hodiny. Tenkovrstvová chromatografia (etylacetát, silikagél) neukáže žiadnu východiskovú látku. Zmes sa ochladí na izbovú teplotu a preleje sa do ľadovej vody. Precipitát sa zhromaždí vákuovou filtráciou, premyje vodou a suší sa pod vákuom. Získa sa

10,3 g (98 %) 5-chlóracetyl-2-oxindolu ako šedej pevnej látky.

• · · · · · · · ··· • · · · · · · • · ··· ··· ··· ···· ·· ···· ·· ···

Suspenzia 9,3 g 5-chlóracetyl-2-oxindolu sa mieša v 90 ml pyridínu pri 80 - 90 °C 3 hodiny a potom sa ochladí na izbovú teplotu. Precipitát sa zhromaždí vákuovou filtráciou a premyje 20 ml etanolu. Pevná látka sa rozpustí v 90 ml 2,5 N hyroxidu sodného a mieša sa pri 70 - 80 °C po dobu 3 hodín. Zmes sa ochladí na izbovú teplotu a okyslí sa na pH 2 pomocou 0,5 N kyseliny chlorovodíkovej. Precipitát sa zhromaždí vákuovou filtráciou a riadne sa premyje vodou. Získa sa surový 5-karboxy-2-oxindol ako tmavo hnedá pevná látka. Nechá sa stáť cez noc, čím vzniknú 2 g 5-karboxy-2-oxindolu ako žltej pevnej látky. Surová tmavo hnedá látka sa rozpustí v horúcom metanole, nerozpustný podiel sa odstráni filtráciou a filtrát sa koncentruje. Získa sa 5,6 g 5-karboxy-2oxindolu ako hnedej pevnej látky. Spojený výťažok činí 97 %.

’HNMR (360 MHz, DMSO-d₆) δ 12,56 (s, br, 1H, COOH-5), 10,70 (s, 1H, NH-1), 7,82 (dd, J = 1,57, 7,79 Hz, 1H, H-6), 7,74 (s, br, 1H, H-4), 6,87 (d, J = 7,79 Hz, 1H, H-7), a 3,53 (s, 2H, CH₂-3). MS m/z (relatívna intenzita, %) 178 ([M+l]⁺, 100).

4-(2-karboxyetyl)-2-formyl-3-metylpyrol (90,6 mg), 88,6 mg 5-karboxy-

2-oxindolu a 75 μΐ piperidínu v 2 ml etanolu sa zahrievajú pri 95 °C po dobu 5 hodín. Reakčná zmes sa ochladí a koncentruje. Zvyšok sa suspenduje v 6 N vodnej kyseline chlorovodíkovej. Precipitát sa prefiltruje, premyje vodou na pH 6 a suší sa vo vákuovej peci. Surový produkt sa prečistí kolónovou chromatografiou na silikagély použitím etylacetát-hexán-octovej kyseliny ako eluentu. Získa sa 51 mg (30%) požadovanej zlúčeniny ako žltej pevnej látky.

’HNMR (360 MHz, DMSO-d₆): δ 13,27 (s, br, 1H, NH-1), 12,28 (s, vbr, 2H, 2xCOOH), 11,11 (s, br, 1H, NH-1), 8,34 (d, J = 1,36 Hz, 1H, H-4), 7,78 (s, 1H, H-vinyl), 7,40 (dd, J = 1,36, 8,20 Hz, 1H, H-6), 7,19 (d, J = 3,07 Hz, 1H, H-5'), 6,93 (d, J = 8,20 Hz, 1H, H-7), 2,65 (t, J = 7,56 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH),

2,46 (t, J = 7,56 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,29 (s, 3H, CH₃); MS m/z 341,0 [M+l]⁺.

·· ·· ·· ·· ·· · ···· ···· ···· • · · · ···· ···· 9 9 9 9 · * · ··· ··· ········ ·· ···· ·· ·«·

Príklad 14

3- [4-metyl-5-(2-oxo-5-sulfamoyl-l,2-dihydroindol-3-ylidénmetyl)-lH- pyrol-3-yI]-propiónová kyselina

Do 100 ml banky naplnenej 27 ml kyseliny chlórsírovej sa pomaly pridá

13,3 g 2-oxindolu. Počas pridávania sa teplota reakcie udržuje pod 30 °C. Po- tom sa reakčná zmes mieša pri izbovej teplote po dobu 1,5 hodiny, zahrieva sa pri 68 °C po dobu 1 hodiny, ochladí sa a preleje do vody. Precipitát sa premyje vodou a suší sa vo vákuovej peci, čím sa získa 11,0 g 5-chíórsulfonyl-2oxindolu (50 % výťažok), ktorý sa použije bez ďalšieho čistenia.

5-chlórsulfonyl-2-oxindol (2,1 g) sa pridá do 10 ml hydroxidu amónneho v 10 ml etanolu a mieša sa pri izbovej teplote cez noc. Zmes sa koncentruje a pevná látka sa zhromaždí vákuovou filtráciou. Získa sa 0,4 g (20 % výťažok) 5aminosulfonyl-2-oxindolu ako šedej pevnej látky.

’HNMR (360 MHz, DMSO-d₆); δ 10,67 (s, 1H, NH-1), 7,63-7,66 (m, 2H,

H-4,6), 7,13 (s, 2H, 5-SO₂NH₂), 6,91 (d, J = 8,04 Hz, 1H, H-7), a 3,56 (s, 2H,

CH₂-3); MS m/z (relatívna intenzita, %) 211 ( [M-l]⁺, 100).

4- (2-karboxyetyl)-2-formyl-3-metylpyrol (90,6 mg), 106 mg 5- aminosulfonyl-2-oxindolu a 75 μΐ piperidínu v 2 ml etanolu sa zahrievajú pri °C po dobu 5 hodín. Reakčná zmes sa ochladí a koncentruje. Zvyšok sa suspenduje v 6 N vodnej kyseline chlorovodíkovej. Precipitát sa prefiltruje, premyje vodou na pH 6 a suší sa vo vákuovej peci. Získa sa 132 mg (70%) požadovanej zlúčeniny ako žltej pevnej látky.

’HNMR (360 MHz, DMSO-d₆); δ 13,28 (s, br, 1H, NH-ľ), 12,0 (s, vbr,

1H, COOH), 11,15 (s, br, 1H, NH-1), 8,20 (d, J = 1,60 Hz, 1H, H-4), 7,73 (s,

1H, H-vinyl), 7,59 (dd, J = 1,60, 8,17 Hz, 1H, H-6), 7,22 (d, J = 2,85 Hz, 1H,

H-2¹), 7,10 (s, 2H, NH₂), 6,98 (d, J = 8,17 Hz, 1H, H-7), 2,67 (t, J = 7,41 Hz,

2H, CH₂CH₂COOH), 2,46 (t, J = 7,41 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH) a 2,29 (s, 3H,

CH₃).

• · · · ···· ··· • · · · · e · • · ··· ··· ··· ···· Β· ···· ·· ··«

Príklad 15

3- [4-rnetyl-5-(5-metylsulfamoyI-2-oxo-l,2-dihydroindol-3-ylidénmetyl)lH-pyrol-3-yl]-propiónová kyselina

Suspenzia 3,38 g 5-chlórsulfonyl-2-oxindolu v 10 ml 2 M metylaminu v tetrahydrofuráne sa mieša pri izbovej teplote 4 hodiny. Počas tejto doby je biela pevná látka stále prítomná. Precipitát sa zhromaždí vákuovou filtráciou, premyje dvakrát 5 ml vody a suší sa pod vákuom pri 40 °C cez noc. Získajú sa 3,0 g (88 % výťažok) 5-metylaminosulfonyl-2-oxindolu.

‘HNMR (300 MHz, DMSO-de): δ 10,87 (s, br, 1H, NH-1), 7,86 (s, br, 1H,

5-SO2NHCH3), 7,61 (d, J = 7,80 Hz 1H, H-6), 7,32 (d, J = 4,67 Hz, 1H, H-4),

6,97 (d, J== 7,80 Hz, 1H, H-7), 2,53 (s, 2H, CH₂-3), a 2,36 (s, 3H, 5SO2NHCH3); MS m/z (relatívna intenzita, %) 226 (M⁺, 100).

4- (2-karboxyetyl)-2-formyl-3-metylpyrol (90,6 mg), 113 mg 5metylaminosulfonyl-2-oxindolu a 75 μΐ piperidínu v 2 ml etanolu sa zahrievajú pri 95 °C 5 hodín. Reakčná zmes sa ochladí a koncentruje sa. Zvyšok sa suspenduje v 6 N vodnej kyseline chlorovodíkovej. Precipitát sa prefiltruje, premyje sa vodou na pH 6 a suší sa vo vákuovej peci. Získa sa 163 mg (83%) požadovanej zlúčeniny ako žltej pevnej látky.

*HNMR (360 MHz, DMSO-d₆): δ 13,30 (s, br, 1H, NH-ľ), 12,0 (s, vbr, 1H, COOH), 11,19 (s, br, 1H, NH-1), 8,18 (d, J = 1,64 Hz, 1H, H-4), 7,80 (s, 1H, H-vinyl), 7,53 (dd, J = 1,64, 8,17 Hz, 1H, H-6), 7,23 (d, J = 2,80 Hz, 1H, H-2'), 7,13 (q, J = 5,15 Hz, 1H, NHCH3), 7,02 (d, J = 8,17 Hz, 1H, H-7), 3,84 (s, 3H, COOCH3), 2,66 (t, J = 7,54 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,47 (t, J = 7,54 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,41 (d, J = 5,15 Hz, 3H, NCH₃), 2,30 (s, 3H, CH₃); MS m/z 390 [M+l]⁺.

Príklad 16

3-{3-[4-(2-karboxy-etyl)-3-metyl-lH-pyroí-2-ylmetylén]-2-oxo-2,3dihydro-lH-indol-5-yl}-propiónová kyselina • · ··· ··· ···· ···· ·· ···· ·· ···

5-chlóracetyl-2-oxindol (4,18 g) v 30 ml trifluóroctovej kyseliny v ľadovom kúpeli sa nechá reagovať s 4,65 g trietylsilanu a mieša sa pri izbovej teplote 3 hodiny. Zmes sa naleje do 150 ml vody a precipitát sa zhromaždí vákuovou filtráciou, premyje sa 50 ml vody a suší sa. Získa sa 2,53 g (65 % výťažok)

5-(2-chlóretyl)-2-oxindolu ako červenohnedej pevnej látky.

Kyanid draselný (2,0 g) sa pridá do 15 ml dimetylsulfoxidu a zahreje sa na 90 °C. 5-chlóretyl-2-oxindol (3,0 g) rozpustený v 5 ml dimetylsulfoxidu sa pomaly pridáva za stáleho miešania a reakcia sa zahrieva pri 150 °C 2 hodiny. Zmes sa ochladí, preleje sa do ľadovej vody a precipitát sa zhromaždí vákuovou filtráciou, premyje sa vodou a suší sa. Získaná surová látka sa chromatografuje na silikagély 5% metanolom v chloroforme. Získa sa 1,2 g (42% výťažok) požadovanej zlúčeniny.

5-kyanoetyl-2-oxindol (4,02 g) v 10 ml vody obsahujúci 25 ml koncentrovanej kyseliny octovej sa refluxuje 4 hodiny. Zmes sa ochladí, pridá sa voda a výsledná pevná látka sa zhromaždí vákuovou filtráciou, premyje vodou a suší sa. Získa sa 1,9 g (44 % výťažok) 5-karboxyetyl-2-oxindolu ako žltej pevnej látky.

'HNMR (360 MHz, DMSO-d₆): δ 12,00 (s, br, 1H, 5-CH₂CH₂COOH),

10,21 (s, 1H, NH-1), 7,05 (s, 1H, H-4), 6,99 (d, J = 8,68 Hz, 1H, H-6), 6,69 (d, J = 8,68 Hz, 1H, H-7), 3,40 (s, 2H, CH₂-3), 2,74 (t, J = 7,44 Hz, 2H, 5CH₂CH₂COOH) a 2,46 (t, J = 7,44 Hz, 2H,-CH₂CH₂COOH).

4-(2-karboxyetyl)-2-formyl-3-metylpyrol (90,6 mg), 102,6 mg 5-karboxyetyl-2-oxindolu a 75 μΐ piperidínu v 2 ml etanolu sa zahrievajú pri 95 °C po dobu 5 hodín. Reakčná zmes sa ochladí a koncentruje sa. Zvyšok sa suspenduje v 6 N vodnej kyseline chlorovodíkovej. Precipitát sa prefiltruje, premyje vodou na pH 6 a suší sa vo vákuovej peci cez noc. Surová pevná látka sa prečistí kolónovou chromatografiou na silikagély mobilnou fázou etylacetát-hexán-octová kyselina. Získa sa 121 mg (66%) požadovanej zlúčeniny ako žltej pevnej látky.

’HNMR (360 MHz, DMSO-d₆): δ 13,30 (d, J = 2,38 Hz, 1H, ΝΗ-Γ), 12,03 (s, vbr, 2H, 2xC00H), 10,68 (s, br, 1H, NH-1), 7,63 (s, 1H, H-4), 7,59 ·· ·· ·· ·· · • · ·· · · ··· • · · · · · · • · ··· · · « ···· ···· ·· ···· ·· ··«

100 (s, 1Η, H-vinyl), 7,12 (d, J = 2,64 Hz, 1H, H-2'), 6,96 (dd, J = 1, 22, 7,93 Hz, 1H, H-6), 6, 75 (d, J = 7,93 Hz, 1H, H-7), 2,81 (t, J = 7,75Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,65 (t, J = 7,75Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,55 (t, J = 7,75 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,46 (t, J = 7,42 Hz, CH₂CH₂COOH) a 2,26 (s, 3H, CH₃).

Príklad 17

3- [5-(5-etyl-2-oxo-l,2-dihydro-indol-3-ylidénmetyl)-4-metyl-lH-pyrol-3yl]-propiónová kyselina

2-oxindol (3 g) sa suspenduje v 1,2-dichlóretáne a pomaly sa nechá pôsobiť s 3,2 ml acetylchloridu. Výsledná suspenzia sa zahrieva pri 50 °C po dobu 5 hodín, ochladí sa a preleje sa do vody. Získaný precipitát sa zhromaždí vákuovou filtráciou, riadne sa premyje vodou a suší sa pod vákuom. Získa sa

2,9 g (73 % výťažok) 5-acetyl-2-oxindolu ako hnedej pevnej látky.

5-acetyl-2-oxindol (2 g) v 15 ml trifluóroctovej kyseliny v ľadovom kúpeli sa nechá pomaly pôsobiť s 1,8 g trietylsilanu a potom sa mieša pri izbovej teplote po dobu 5 hodín. Pridá sa jeden ml trietylsilanu a miešanie pokračuje cez noc. Reakčná zmes sa naleje do ľadovej vody a výsledný precipitát sa zhromaždí vákuovou filtráciou, riadne sa premyje vodou a suší sa pod vákuom. Získa sa 1,3 g (71 % výťažok) požadovanej zlúčeniny ako žltej pevnej látky.

’HNMR (360 MHz, DMSO-d₆): δ 10,25 (s, br, NH-1), 7,03 (s, 1H, H-4),

6,97 (d, J = 8,05 Hz, 1H, H-6), 6,69 (d, J = 8,05 Hz, 1H, H-7), 3,40 (s, 2H, CH₂-3), 2,51 (q, J = 7,69 Hz, 2H, CH₂CH₃-5) a 1,12 (t, J = 7,42 Hz, 3H, CH₂CH₃-5).

4- (2-karboxyetyl)-2-formyl-3-metylpyrol (90,6 mg), 80,5 mg 5-etyl-2oxindolu a 75 μΐ piperidínu v 2 ml etanolu sa zahrievajú pri 95 °C po dobu 5 hodín. Reakčná zmes sa ochladí a koncentruje sa. Zvyšok sa suspenduje v 6 N vodnej kyseline chlorovodíkovej. Precipitát sa prefiltruje, premyje sa vodou na pH 6 a suší sa vo vákuovej peci cez noc. Surová pevná látka sa prečistí chro101 ···· • · · · • t •· ·· ·· •· · · •· · ·· • ·· •· • · · ·· ···· • · · ·· ··· matografiou na silikagély mobilnou fázou etylacetát-hexán-octová kyselina. Získa sa 52 mg (32%) požadovanej zlúčeniny.

‘HNMR (360 MHz, DMSO-d₆): δ 13,31 (s, br, IH, ΝΗ-Γ), 12,04 (s, vbr, IH, COOH), 10,66 (s, IH, NH-1), 7,59 (s, 2H, H-4 a H-vinyl), 7,11 (d, J = 3,29 Hz, IH, H-2'), 6,94 (d, J = 7, 85 Hz, IH, H-6), 6,75 (d, J = 7,85 Hz, IH, H-7),

2,65 (t, J = 7,66 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,57 (q, J = 7,83 Hz, 2H, CH₃CH₂),

2,46 (t, J = 7,66 Hz, CH₂CH₂COOH), 1,20 (t, J = 7,83, 3H, CH₃CH₂), 2,26 (s, 3H, CH₃); MS m/z 325 [M+l]⁺.

Príklad 18

3-[5-(5-metoxy-2-oxo-l,2-dihydroindol-3-ylidénmetyl)-4-metyl-lHpyrol-3-yl]-propiónová kyselina

Chlóralhydrát (9,6 g) sa rozpustí v 200 ml vody obsahujúcej 83 g síranu sodného. Roztok sa ohreje na 60 °C a pridá sa roztok 11,4 g hydroxylaménhydrochloridu v 50 ml vody a zmes sa udržuje pri 60 °C. V oddelenej banke sa na 80 °C ohreje 6,4 g 4-anizidínu a 4,3 ml koncentrovanej kyseliny chlorovodíkovej v 80 ml vody . Prvý roztok sa pridá do druhého a výsledná zmes sa refluxuje 2 minúty, pomaly sa ochladí na izbovú teplotu a potom sa ochladí v ľadovom kúpeli. Zafarbený precipitát sa zhromaždí vákuovou filtráciou, premyje sa vodou a suší sa pod vákuom. Získa sa 8,6 g (85% výťažok) N-(2hydroximinoacetyl)anizidínu.

Koncentrovaná kyselina sírová (45 ml) obsahujúca 5 ml vody sa ohreje na 60 °C a v jednej dávke sa pridá 8,6 g N-(2-hydroximinoacetyl)anizidínu. Miešaná zmes sa zahrieva pri 93 °C po dobu 10 minút a potom sa ochladí na izbovú teplotu. Zmes sa naleje do 500 g ľadu a extrahuje sa trikrát etylacetátom. Spojené extrakty sa sušia nad bezvodým síranom sodným a koncentrujú sa. Získa sa 5,1 g (65 % výťažok) 5-metoxyizatínu ako tmavočervenej pevnej látky.

5-metoxyizatín (5,0 g) a 30 ml hydrátu hydrazínu sa zahrieva pod refluxom po dobu 15 minút. Reakčná zmes sa ochladí na izbovú teplotu a pridá sa ···· ···· ··· • · · · · · · » ···· · · · • · · · · · · ···· ···· ·· ···· ·· ·

102

0 ml vody. Zmes sa trikrát extrahuje 25 ml etylacetátu, organické vrstvy sa spoja a sušia sa nad bezvodým síranom sodným. Potom sa koncentrujú, čím vznikne žltá pevná látka. Pevná látka sa mieša v etylacetáte a 1,1 g nerozpustného materiálu sa odstráni vákuovou filtráciou a uschová sa. Táto látka je 2hydrazino-karbonylmetyl-4-anizidín. Filtrát sa koncentruje a chromatografuje na silikagély mobilnou fázou etylacetát: hexán 1: 1, čím sa získa 0,7 g 5metoxy-2-oxindolu ako špinavo žltej pevnej látky. 1,1 g 2-hydrazinokarbonylmetyl-4-anizidínu sa refluxuje 1 hodinu v 20 ml 1 N hydroxidu sodného Zmes sa ochladí, okyslí sa na pH 2 koncentrovanou kyselinou chlorovodíkovou a trikrát sa extrahuje 25 ml etylacetátu. Organické extrakty sa spoja, premyjú soľankou, sušia sa nad bezvodým síranom sodným a koncentrujú sa. Získa sa 0,8 g 5-metoxy-2-oxindolu ako špinavo žltej pevnej látky. Spojený výťažok činí 1,5 g, čo je 33 %.

’HNMR (360 MHz, DMSO-d₆): δ 10,13 (s, 1H, NH-1), 6,84 (s, 1H, H-4),

6,72 (d, J = 8,68 Hz, 1H, H-6), 6,69 (d, J = 8,68 Hz, 1H, H-7), 3,68 (s, 3H, OCH3-5), 3,41 (s, 2H, CH₂-3), MS m/z (relatívna intenzita, %) 163 ( [M+l]⁺, 100).

4-(2-karboxyetyl)-2-formyl-3-metylpyrol (90 mg), 82 mg 5-metoxy-2oxindolu a 2 kvapky piperidínu v 2 ml etanol sa zahrievajú pri 95 °C cez noc. Reakčná zmes sa ochladí a koncentruje sa. Zvyšok sa suspenduje v 6 N vodnej kyseline chlorovodíkovej. Precipitát sa prefiltruje, premyje vodou na pH 6 a suší sa vo vákuovej peci cez noc. Získa sa 110 mg (67%) požadovanej zlúčeniny ako hnedej pevnej látky.

’HNMR (360 MHz, DMSO-d₆): δ 13,38 (s, br, 1H, NH-ľ), 12,03 (s, vbr, 1H, COOH), 10,57 (s, 1H, NH-1), 7,63 (s, 1H, H-vinyl), 7,42 (d, J = 2,46 Hz, 1H, H-4), 7,12 (d, J = 3,08 Hz, 1H, H-2'), 6,74 (d, J = 8,26 Hz, 1H, H-6), 6,75 (dd, J = 2,46, 8,26 Hz, 1H, H-7), 3,77 (s, 3H, OCH₃), 2,65 (t, J = 7,40Hz, 2H, CH2CH2COOH), 2,46 (t, J = 7,40 Hz, CH₂CH₂COOH), 2,27 (s, 3H, CH₃) ; MS m/z (relatívna intenzita, %) 327 ( [M+l]⁺, 100).

103

Príklad 19

3-[5-(5-bromo-2-oxo-l,2-dihydroindol-3-ylidénmetyl)-2,4-dimetyl-lHpyrol-3-yl]-propiónová kyselina

3-2-karboxyetyl)-2,4-dimetyl-5-formylpyrol (97,5 mg), 106 mg 5-bromo2-oxindolu a 75 μΐ piperidínu v 3 ml etanolu sa zahrievajú pri 95 °C po dobu 5 hodín. Reakčná zmes sa ochladí a koncentruje sa. Zvyšok sa suspenduje v 6 N vodnej kyseline chlorovodíkovej. Precipitát sa prefiltruje, premyje sa vodou na pH 6 a suší sa vo vákuovej peci cez noc. Získa sa 171 mg (88%) požadovanej zlúčeniny ako oranžovej pevnej látky.

*HNMR (360 MHz, DMSO-de): δ 12,04 (s, vbr, 1H, COOH), 10,80 (s, br, 1H, NH-1), 8,0 (d, J = 2,06 Hz, 1H, H-4), 7,67 (s, 1H, H-vinyl), 7,19 (dd, J = 2,06, 8,40 Hz, 1H, H-6), 6,79 (d, J = 8,40 Hz, 1H, H-7), 2,65 (t, J = 7,63 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,35 (t, J = 7,63 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,29 (s, 3H, CH₃), 2,27 (s, 3H, CH₃); MS m/z (relatívna intenzita, %) 389 ( [M+l]⁺ 100).

3-[5-(5-jodo-2-oxo-l,2-dihydroindol-3-ylidénmetyl)-2,4-dimetyl-lHpyrol-3-yl]-propiónová kyselina

3-(2-karboxyetyl)-2,4-dimetyl-5-formylpyrol (97,5 mg), 130 mg 5-jodo2-oxindolu a 75 μΐ piperidínu v 3 ml etanolu sa zahrievajú pri 95 °C po dobu 5 hodín. Reakčná zmes sa ochladí a koncentruje sa. Zvyšok sa suspenduje v 6 N vodnej kyseline chlorovodíkovej. Precipitát sa prefiltruje, premyje vodou na pH 6 a suší sa vo vákuovej peci cez noc. Získa sa 155 mg (71%) požadovanej zlúčeniny ako oranžovej pevnej látky.

’HNMR (360 MHz, DMSO-d₆): δ 13,41 (s, br, 1H, ΝΗ-Γ), 12,03 (s, br, 1H, COOH), 10,79 (s, br, 1H, NH-1), 8,12 (d, J = 1,70 Hz, 1H, H-4), 7,65 (s, 1H, H-vinyl), 7,36 (dd, J = 1,70, 7,93 Hz, 1H, H-6), 6,79 (d, J = 7,93 Hz, 1H, H-7), 2,64 (t, J = 7,76 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,34 (t, J = 7,76 Hz, 2H, CH2CH2COOH), 2,29 (s, 3H, CH₃), 2, 27 (s, 3H, CH₃); MS m/z (relatívna intenzita, %) 437 ([M+l]⁺, 100).

·· ·· ·· ·· ···· ···· · · · • · t · · · · • · · · · · · ···· ···· ·· ···· ·· ·

104

Príklad 20

3-[5-(5-jodo-2-oxo-l,2-dihydroindol-3-ylidénmetyl)-2,4-dimetyl-lHpyrol-3-yl]-propiónová kyselina

3-(2-karboxyetyl)-2,4-dimetyl-5-formylpyrol (97,5 mg), 130 mg 5-jodo2-oxindolu a 75 μΐ piperidínu v 3 ml etanolu sa miešajú pri 95 °C po dobu 5 hodín. Reakčná zmes sa ochladí a koncentruje sa. Zvyšok sa suspenduje v 6 N vodnej kyseline chlorovodíkovej. Precipitát sa prefiltruje, premyje sa vodou na pH 6 a suší sa vo vákuovej peci cez noc. Získa sa 155 mg požadovanej zlúčeniny (71 %) ako oranžovej pevnej látky.

*HNMR (360 MHz, DMSO-d₆): δ 13,41 (s, br, 1H, NH-ľ), 12,03 (s, br, 1H, COOH), 10,79 (s, br, 1H, NH-1), 8,12 (d, J = 1,70 Hz, 1H, H-4), 7,65 (s, 1H, H-vinyl), 7,36 (dd, J = 1,70, 7,93 Hz, 1H, H-6), 6,79 (d, J = 7,93 Hz, 1H, H-7), 2,64 (t, J = 7,76 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,34 (t, J = 7,76 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,29 (s, 3H, CH₃), 2, 27 (s, 3H, CH₃), MS m/z (relatívna intenzita, %) 437 ( [M+l]⁺, 100).

Príklad 21

3-[2,4-dimetyl-5-(4-metyl-2-oxo-l,2-dihydroindol-3-ylidénmetyl)-IHpyrol-3-yl]-propiónová kyselina

3-(2-karboxyetyl)-2,4-dimetyl-5-formylpyrol (97,5 mg), 74 mg 4-metyl2-oxindolu a 75 μΐ piperidínu v 3 ml etanolu sa zahrievajú pri 95 °C po dobu 5 hodín. Reakčná zmes sa ochladí a koncentruje sa. Zvyšok sa suspenduje v 6 N vodnej kyseline chlorovodíkovej. Precipitát sa prefiltruje, premyje sa vodou na pH 6 a suší sa vo vákuovej peci cez noc. Získa sa 60 mg (37 %) požadovanej zlúčeniny ako zelenej pevnej látky.

’HNMR (360 MHz, DMSO-d₆): δ 13,41 (s, br, 1H, NH-ľ), 12,03 (s, br, 1H, COOH), 10,72 (s, br, 1H, NH-1), 7,50 (s, 1H, H-vinyl), 7,01 (t, J = 7, 82 Hz, 1H, H-6), 6, 79 (d, J = 7,82 Hz, H-5), 6,74 (d, J = 7,82 Hz, 1H, H-7), 2,64 (t, J = 7,76 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,56 (s, 3H, CH₃), 2,34 (t, J = 7,76 Hz,

105 ···· · · · · ··· • · · · · · · • · ··· · · · ··· ···· ·· ···· ·· ···

2Η, CH₂CH₂COOH), 2,29 (s, 3H, CH₃), 2,18 (s, 3H, CH₃); MS m/z (relatívna intenzita, %) 325 ( [M+l]⁺, 100).

Príklad 22

3-[2,4-dimetyl-5-(5-metyl-2-oxo-l,2-dihydroindol-3-ylidénmetyl)-lHpyrol-3-yl]-propiónová kyselina

3-(2-karboxyetyl)-2,4-dimetyl-5-formylpyrol (97,5 mg), 74 mg 5-metyI2-oxindolu a 75 μΐ piperidínu v 3 ml etanolu sa zahrievajú pri 95 °C po dobu 5 hodín. Reakčná zmes sa ochladí a koncentruje sa. Zvyšok sa suspenduje v 6 N vodnej kyseline chlorovodíkovej. Precipitát sa prefiltruje, premyje sa vodou na pH 6 a suší sa vo vákuovej peci cez noc. Získa sa 104 mg (64 %) požadovanej zlúčeniny ako žltej pevnej látky.

’HNMR (360 MHz, DMSO-d₆): δ 13,38 (s, br, 1H, NH-ľ), 12,02 (s, br, 1H, COOH), 10,57 (s, br, 1H, NH-1), 7,52 (s, br, 1H, H-4), 7,50 (s, 1H, Hvinyl), 6,87 (d, J = 7,86 Hz, 1H, H6), 6,73 (d, J = 7,86 Hz, 1H, H-7), 2,63 (t, J = 7,49 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,34 (t, J = 7,49 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,29 (s, 3H, CH₃), 2,28 (s, 3H, CH₃), a 2,24 (s, 3H, CH₃); MS m/z (relatívna intenzita, %) 325 ([M+l]⁺, 66).

Príklad 23

3-[5-(6-hydroxy-2-oxo-l,2-dihydroindol-3-ylidénmetyl)-2,4-dimetyl-lHpyrol-3-yl]-propiónová kyselina

3,26 g 6-metoxy-2-oxindol v 60 ml dichlórmetánu sa ochladí na -2 °C a po kvapkách sa pridá roztok 40 ml 1 M boridu bromitého. Reakčná zmes sa mieša v ľadovom kúpeli po dobu 1 hodiny a potom pri izbovej teplote po dobu 1 hodiny. Potom sa preleje do ľadovej vody a extrahuje etylacetátom. Organická vrstva sa premyje vodou a soľankou, suší sa nad bezvodým síranom sodným, « ·

106 koncentruje sa a precipitát, ktorý sa utvorí sa prefiltruje a potom sa suší vo vákuovej peci cez noc. Získa sa 2,56 g 6-hydroxy-2-oxindolu (86% výťažok).

’HNMR (360 MHz, DMSO-d₆): δ 10,13 (s, 1H, NH-1), 9,22 (s, 1H, OH-

6), 6,93 (d, J = 7,76 Hz, 1H, H-4), 6,27-6,31 (m, 2H, H-5,7) a 3,29 (s, 2H, CH₂-3); MS m/z 150 [M+lf.

3-(2-karboxyetyl)-2,4-dimetyl-5-formylpyrol (82 mg), 63 mg 6-hydroxy2-oxindolu a 48 μΐ piperidínu v 2 ml etanolu sa zahrievajú pri 90 °C po dobu dvoch dní. Reakčná zmes sa ochladí, koncentruje sa a prečistí sa na silikagély kolónovou chromatografiou mobilnou fázou etylacetát-hexán-octová kyselina. Získa sa 55 mg (40%) požadovanej zlúčeniny ako tmavo hnedej pevnej látky.

’HNMR (360 MHz, DMSO-d₆): Ô 13,10 (s, br, 1H, ΝΗ-Γ), 12,0 (s, vbr, 1H, COOH), 10,51 (s, br, 1H, NH-1), 9,41 (s, 1H, OH), 7,44 (d, J = 7,83,1H, H-4), 7,29 (s, 1H, H-vinyl), 6,37 (dd, J = 2,16, 7,83 Hz, 1H, H-5), 6,33 (d, J =

2,16 Hz, 1H, H-7), 2,62 (t, J = 7,75 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,32 (t, J = 7,75 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,25 (s, 3H, CH₃), 2, 20 (s, 3H, CH₃); MS m/z 325 [M+l]⁺.

Príklad 24

3-[5-(6-metoxy-2-oxo-l,2-dihydroindol-3-ylidénmetyl)-2,4-dimetyl-lHpyrol-3-yl]-propiónová kyselina

3-(2-karboxyetyl)-2,4-dimetyl-5-formylpyrol (97,5 mg), 82 mg 6-metoxy2-oxindolu a 2 kvapky piperidínu v 2 ml etanolu sa zahrievajú pri 95 °C cez noc. Reakčná zmes sa ochladí a koncentruje sa. Zvyšok sa suspenduje v 2 N vodnej kyseline chlorovodíkovej. Precipitát sa prefiltruje, premyje sa vodou na pH 6 a suší sa vo vákuovej peci cez noc. Získa sa 130 mg (76%) požadovanej zlúčeniny ako žltej pevnej látky.

’HNMR (360 MHz, DMSO-d₆): δ 13,15 (s, br, 1H, ΝΗ-Γ), 11,75 (s, vbr, 1H, COOH), 10,65 (s, br, 1H, NH-1), 7,58 (d, J = 8,27,1H, H-4), 7,29 (s, 1H, H-vinyl), 6,37 (dd, J = 2,26, 8,27 Hz, 1H, H-5), 6,33 (d, J = 2,26 Hz, 1H, H-7),

107 ···· · · · · ··· • 9 9 9 · 9 9

3,74 (s, 3H, OCH₃), 2,62 (t, J = 7,67 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,33 (t, J = 7,67 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,26 (s, 3H, CH₃), a 2,22 (s, 3H, CH₃); MS m/z (relatívna intenzita, %) 341 ( [M+l]⁺, 100)

Príklad 25

3- [5-(6-hydroxy-2-oxo-l,2-dihydroindol-3-ylidénmetyl)-4-metyl-lHpyrol-3-yl]-propiónová kyselina

4- (2-karboxyetyl)-2-formyl-3-metylpyrol (543 mg), 450 mg 6-hydroxy-2oxindolu a 450 μΐ piperidínu v 10 ml etanolu sa zahrievajú pri 90 °C cez noc. Reakčná zmes sa ochladí a koncentruje sa. Zvyšok sa suspenduje v 2 N vodnej kyseline chlorovodíkovej. Precipitát sa prefiltruje, premyje sa vodou na pH 6 a suší sa vo vákuovej peci cez noc. Získa sa hnedá pevná látka.

'HNMR (360 MHz, DMSO-d₆): δ 13,05 (s, br, 1H, NH-ľ), 10,60 (s, br, 1H, NH-1), 9,4 (s, 1H, OH), 7,49 (d, J = 8,08, 1H, H-4), 7,35 (s, 1H, H-vinyl), 7,02 (d, J = 3,22 Hz, 1H, H2'), 6,38 (dd, J = 2,28, 8,08 Hz, 1H, H-5), 6,32 (d, J = 2,28 Hz, 1H, H-7), 2,62 (t, J = 7,67 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,44 (t, J = 7,67 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH) a 2,21 (s, 3H, CH₃); MS m/z (relatívna intenzita, %) 313 ( [M+l]⁺, 60).

Príklad 26

3,5-dimetoxy-benzyl ester 3-[5-(6-hydroxy-2-oxo-l,2-dihydroindol-3ylidénmetyl)-4-metyl-lH-pyrol-3-yl]-propiónovej kyseliny

3-[5-(6-hydroxy-2-oxo-l,2-dihydroindol-3-ylidénmetyl)-4-metyl-lHpyrol-3-yl]-propiónová kyselina (100 mg), 56 mg 3,5-dimetoxy-benzylchloridu a 207 mg uhličitanu draselného v 2 ml bezvodého dimetylformamidu sa zahrievajú pri 90 °C cez noc.

Reakčná zmes sa ochladí, preleje sa do vody a extrahuje sa etylacetátom. Organická vrstva sa premyje vodou a soľankou, suší sa nad bezvodým síranom ··

108 sodným a koncentruje sa. Surový produkt sa prečistí kolónovou chromatografiou na silikagély mobilnou fázou etylacetát-hexán-octová kyselina. Získa sa 39 mg požadovanej zlúčeniny ako hnedej pevnej látky.

1HNMR (360 MHz, DMSO-de): δ 13,06 (s, br, 1H, ΝΗ-Γ), 10,60 (s, br, 1H, NH-1), 9,4 (s, br, 1H, OH), 7,49 (d, J = 8,03, 1H, H-4), 7,35 (s, 1H, Hvinyl), 7,01 (d, J = 3,08 Hz, 1H, H-2'), 6,47 (d, J = 2,29 Hz, 2H, aromatika), 6,42 (t, J = 2,29Hz, 1H, aromatika), 6,38 (dd, J = 2,15, 8,03 Hz, 1H, H-5), 6,33 (d, J = 2,15 Hz, 1H, H-7), 5,01 (s, 2H, CH₂-F), 3,70 (s, 6H, 2xOCH₃), 2,59-

2,72 (m, 4H, CH₂CH₂COOH) a 2,20 (s, 3H, CH₃).

Príklad 27

3-{5-[6-(3-metoxy-fenyl)-2-oxo-l,2-dihydroindol-3-ylidénmetyl]-2,4dimetyl-lH-pyrol-3-yl}-propiónová kyselina

Tetrakis(trifenylfosfín)paládium (0,7 g) sa pridá do zmesi 5 g 3metoxyfenylboritej kyseliny, 3,8 g 5-bromo-2-fluórnitrobenzénu a 11 ml 2 M roztoku uhličitanu sodného v 100 ml toluénu. Zmes sa refluxuje 2 hodiny, zriedi sa vodou a extrahuje sa etylacetátom. Etylacetát sa premyje saturovaným hydrogenuhiičitanom sodným a potom soľankou, suší sa a koncentruje sa. Vznikne olejovitá pevná látka. Pevná látka sa chromatografuje na silikagély etylacetát: hexánom (1: 6). Získa sa 4,3 g (77 % výťažok) 4-fluoro-3'-metoxy-3nitrobifenylu.

Dimetylmalonát (9,7 ml) sa pridá po kvapkách do 2,0 g hydridu sodného suspendovaného v 50 ml dimetylsulfoxidu. Zmes sa zahrieva pri 100 °C po dobu 35 minút a potom sa ochladí na izbovú teplotu. Pridá sa 4-fluoro-2'-metoxy3-nitrobifenyl (4,2 g) v 50 ml dimetylsulfoxidu a zmes sa zahrieva pri 100 °C 1 hodinu. Reakčná zmes sa ochladí, ustáli sa roztokom 300 ml saturovaného chloridu amónneho a extrahuje sa dvakrát etylacetátom. Extrakty sa spoja, premyjú sa soľankou, sušia sa nad bezvodým síranom sodným a koncentrujú sa. Získa sa surový dimetyl-3'-metoxy-3-nitrobifenyl-4-malonát ako bledožltá pevná látka.

109 ·· ·· ·· ·· ·· ··· · · · · ·· • 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9

Surový 3'-metoxy-3-nitro-bifenyl-4-malonát sa zahrieva pri 110 ’C v 45 ml 6 N kyseliny chlorovodíkovej 4 dni a ochladí sa. Precipitát sa zhromaždí filtráciou, premyje sa vodou a hexánom a suší sa. Získa sa 5,3 g 3'-metoxy-2nitrobifenyl-4-octovej kyseliny ako svetlohnedej pevnej látky.

3'-metoxy-3-nitrobifenyl-4-octová kyselina (5,2 g) sa rozpustí v metanole a hydrogenuje sa cez 0,8 g 10 % paládia na aktívnom uhlí 3 hodiny pri izbovej teplote. Katalyzátor sa odstráni filtráciou, premyje sa metanolom, filtráty sa spoja a koncentrujú sa do vzniku hnedej pevnej látky. Pevná látka sa chromatografuje na silikagély etylacetát: hexán: octovou kyselinou 33: 66: 1. Získa sa 3,0 g (75 % výťažok založený na 4-fluoro-3'-metoxy-3-nitrobifenylu) 6-(3metoxyfenyl)-2-oxindolu ako ružovej pevnej látky.

’HNMR (360 MHz, DMSO-d₆): δ 10,39 (s, br, 1H, NH), 7,35 (t, J = 7,85 Hz, 1H), 7,26 (d, J = 7,78 Hz, 1H), 7,19 (dd, J = 1,22, 7,8 HZ, 1H), 7,13-7,16 (m, 1H), 7,09-7,1 (m, 1H), 7,01 (d, J = 1,48 Hz, 1H), 6,90-6,93 (m, 1H), 3,8 (s, 3H, OCH₃), 3,49 (s, 2H, CH₂); MS m/z (relatívna intenzita, %) 240,0 ( [M+l]⁺, 100).

3-(2-karboxyetyl)-2,4-dimetyl-5-formylpyro! (117 mg), 120 mg 6-(3metoxyfenyl)-2-oxindolu a 3 kvapky piperidínu v 3 ml etanolu sa zahrievajú pri 90 °C cez noc. Reakčná zmes sa ochladí a koncentruje sa. Zvyšok sa suspenduje v 6 N vodnej kyseline chlorovodíkovej. Precipitát sa prefiltruje, premyje sa vodou na pH 6 a suší sa vo vákuovej peci cez noc. Získa sa 190 mg (91 %) požadovanej zlúčeniny ako hnedej pevnej látky.

’HNMR (360 MHz, DMSO-d₆): δ 13,38 (s, br, 1H, NH-ľ), 12,04 (s, br, 1H, COOH), 10,79 (s, br, 1H, NH-1), 7,77 (d, J = 8,05,1H, H-4), 7,58 (s, 1H, H-vinyl), 7,27 (dd, J = 1,49, 8,05 Hz, 1H, H-5), 7,09 (d, J = 1,49 Hz, 1H, H-7), 6,89-7,59 (m, 4H), 3,81 (s, 3H, OCH₃), 2,65 (t, J = 7,62 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,35 (t, J = 7,62 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,30 (s, 3H, CH₃) a

2,27 (s, 3H, CH₃); MS m/z (relatívna intenzita, %) 417 ( [M+l]⁺,75).

99 ···· ···· · · · · · ·· • · · · · ·· φ* · · · · ·· ···· ···· ·· ···· ··9

110

Príklad 28

3- [5-(6-bromo-2-oxo-l,2-dihydroindol-3-ylidénmetyl)-4-metyl-lH-pyrol3-yl]-propiónová kyselina

Dimetylmalonát (13 ml) sa pridá po kvapkách do 2,7 g hydridu sodného suspendovaného v 20 ml dimetylsulfoxidu. Zmes sa zahrieva pri 100 °C po dobu 10 minút a ochladí sa na izbovú teplotu. Pridá sa 5-bromo-2fluórnitrobenzén (5,0 g) v 25 ml dimetylsulfoxidu a zmes sa zahrieva pri 100 °C 2 hodiny. Reakčná zmes sa ochladí a ustáli sa roztokom 300 ml saturovaného chloridu amónneho a extrahuje trikrát etylacetátom. Extrakty sa spoja, premyjú sa saturovaným chloridom amónnym, vodou a soľankou, sušia sa nad bezvodým síranom sodným a koncentrujú sa. Získa sa surový dimetyl-4-bromo-2nitrofenylmalonát ako bledožltý olej.

Surový dimetyl-4-bromo-2-nitrofenylmalonát sa zahrieva pri 110 °C v 40 ml 6 N kyseliny chlorovodíkovej 24 hodín a ochladí sa. Precipitát sa zhromaždí filtráciou, premyje sa vodou a suší sa. Získa sa 5,3 g (89 % výťažok) 4-bromo2-nitrofenyloctovej kyseliny ako šedej pevnej látky.

4- bromo-2-nitrofenyloctová kyselina (0,26 g), 0,26 g zinkového prášku a 3 ml 50 % kyseliny sírovej v 5 ml etanolu sa zahrievajú pri 100 °C cez noc. Reakčná zmes sa prefiltruje, zriedi sa malým množstvom kyseliny octovej, koncentruje sa, čím sa odstráni etanol, zriedi sa vodou a extrahuje sa dvakrát etylacetátom. Spojené extrakty sa premyjú soľankou, sušia sa nad bezvodým síranom sodným a koncentrujú sa. Získa sa 0,19 g (90 % výťažok) 6-bromo-2oxindolu ako žltej pevnej látky.

’HNMR (360 MHz, DMSO-d₆): δ 10,45 (s, br, 1H, NH-1), 7,14 (d, J =

7,89 Hz, 1H, H-4), 7,09 (dd, J = 1,53, 7,89 Hz, 1H, H-5), 6,93 (d, J = 1,53 Hz, 1H, H-7) a 3,43 (s, 2H, CH₂-3); MS m/z (relatívna intenzita, %) 210 ( [M-2]⁺, 100) a 212 (M⁺, 100).

4-(2-karboxyetyl)-2-formyl-3-metylpyrol (90 mg), 106 mg 6-bromo-2oxindol a 3 kvapky piperidínu v 3 ml etanolu sa zahrievajú pri 90 °C 4 hodiny. Reakčná zmes sa ochladí a koncentruje sa. Zvyšok sa suspenduje v 6 N vodnej

111 ·· ·· ·· ·· ·· · • ·· · · ·· · ···· • ··· · ·t · • ···· · · ·· · • · · · · ··· ···· ···· ·· ···· ·· ··· kyseline chlorovodíkovej. Precipitát sa prefiltruje, premyje sa vodou na pH 6 a suší sa vo vákuovej peci cez noc. Získa sa 172 mg (92%) požadovanej zlúčeniny ako žltej pevnej látky.

'HNMR (360 MHz, DMSO-d₆): δ 13,22 (s, br, 1H, ΝΗ-Γ), 12,04 (s, br, 1H, COOH), 10,92 (s, br, 1H, NH-1), 7,73 (d, J = 8,37,1H, H-4), 7,67 (s, 1H, H-vinyl), 7,18 (d, J = 3,22 Hz, 1H, H-2¹), 7,14 (dd, J = 1,33, 8,37 Hz, 1H, H-5),

6,99 (d, J = 1,33 Hz, 1H, H-7), 2,64 (t, J = 7,39 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,46 (t, J = 7,39 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,25 (s, 3H, CH₃); MS (APCI) m/z 375,0 [M+l]⁺.

Príklad 29

3- {5-[6-(3-metoxy-fenyl)-2-oxo-l,2-dihydroindol-3-ylidénmetyl]-4metyl-lH-pyrol-3-yl}-propiónová kyselina

4- (2-karboxyetyl)-2-formyl-3-metylpyrol (90,5 mg), 120 mg 6-(3metoxyfenyl)-2-oxindolu a 3 kvapky piperidínu v 3 ml etanolu sa zahrievajú pri 90 °C cez noc. Reakčná zmes sa ochladí a koncentruje sa. Zvyšok sa suspenduje v 6 N vodnej kyseline chlorovodíkovej. Precipitát sa prefiltruje, premyje sa vodou na pH 6 a suší sa vo vákuovej peci cez noc. Získa sa 195 mg (97%) požadovanej zlúčeniny ako hnedej pevnej látky.

’HNMR (360 MHz, DMSO-d₆): δ 13,29 (s, br, 1H, NH-ľ), 12,07 (s, br, 1H, COOH), 10,88 (s, br, 1H, NH-1), 7,82 (d, J = 7,77 Hz, 1H, H-4), 7,65 (s, 1H, H-vinyl), 7,27 (dd, J = 1,41, 7,77 Hz, 1H, H-5), 7,09 (d, J = 1,41 Hz, 1H, H-7), 6,89-7,36 (m, 5H), 3,82 (s, 3H, OCH₃), 2,65 (t, J = 7,55 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,47 (t, J = 7,55 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,27 (s, 3H, CH₃); MS (APCI) m/z 401 [M-l]⁺.

·· ·· ·· ·· ·· ···· ···· · · ·· • ··· · · · · • ···· · · · · · • · ··· · · · ···· ···· ·· ···· ·· ···

112

Príklad 30

3-5-[6-(3-etoxy-fenyl)-2-oxo-l,2-dihydroindol-3-ylidénmetyl]-2,4dimetyl-lH-pyrol-3-yl}-propiónová kyselina

Tetrakis(trifenylfosfín)paládium (0,8 g) sa pridá do zmesi 4,2 g 3etoxyfenylboritej kyseliny, 5,0 g 5-bromo-2-fluórnitrobenzénu a 22 ml 2 M roztoku uhličitanu sodného v 50 ml toluénu a 50 ml etanolu. Zmes sa refluxuje 2 hodiny a potom sa koncentruje. Pridá sa voda a zmes sa extrahuje dvakrát etylacetátom. Spojené etylacetátové vrstvy sa premyjú vodou a soľankou, potom sa sušia a koncentrujú. Zvyšok sa chromatografuje na silikagély 5 % etylacetátom v hexáne. Získa sa 5,3 g (90 % výťažok) surového 4-fluoro-3'-etoxy-3nitrobifenylu ako žltého oleja.

Dimetylmalonát (11,4 ml) sa pridá po kvapkách do 4,0 g hydridu sodného suspendovaného v 20 ml dimetylsulfoxidu. Zmes sa zahrieva pri 100 °C po dobu 10 minút a ochladí sa na izbovú teplotu. Pridá sa surový 4-fluoro-3'-etoxy3-nitrobifenyl (5,3 g) v 25 ml dimetylsulfoxidu a zmes sa zahrieva pri 100 °C 2 hodiny. Reakčná zmes sa ochladí, ustáli sa roztokom 300 ml saturovaného chloridu amónneho a extrahuje trikrát etylacetátom. Spojené extrakty sa premyjú vodou a soľankou, sušia sa nad bezvodým síranom sodným a koncentrujú sa. Získa sa surový dimetyl-3'-etoxy-3-nitrobifenyl-4-malonát ako žltý olej.

Surový dimetyl-3'-etoxy-3-nitrobifenyl-4-malonát sa zahrieva pri 100 °C v 60 ml 6 N kyseliny chlorovodíkovej celkom 4 dni a ochladí sa. Precipitát sa zhromaždí filtráciou, premyje sa vodou a hexánom a suší sa. Získa sa 4,7 g (77 % výťažok založený na 5-bromo-2-fluórnitrobenzénu) surovej 3'-etoxy-3nitrobifenyl-4-octovej kyseliny ako svetlohnedej pevnej látky.

Železné úlomky (2,4 g) sa pridajú v jednej dávke do 4,6 g 3'-etoxy-3nitrobifenyl-4-octovej kyseliny v 40 ml ľadovej kyseline octovej a zmes sa refluxuje 2 hodiny. Reakčná zmes sa koncentruje do sucha, znovu sa nechá pôsobiť s etylacetátom a prefiltruje sa nerozpustný materiál. Filtrát sa premyje dvakrát 1 N kyselinou chlorovodíkovou a potom soľankou, suší sa nad bezvodým síranom sodným a koncentruje sa. Získa sa 3,5 g (91 % výťažok) 6-(3etoxyfenyl)-2-oxindolu ako hnedej pevnej látky.

113 ‘HNMR (360 MHz, DMSO-d₆): δ 10,4 (s, br, 1H, NH), 7,33 (t, J = 8,4 Hz, 1H, H-3'), 7,35 (d, J = 7,77 Hz, 1H), 7,19 (dd, J = 1,3, 7,66 HZ, 1H), 7,13 (d, J = 7,69 Hz, 1H), 7,07-7,08 (m, 1H), 7,0 (s, br, 1H), 6,9 (dd, J = 2,82, 8,08 Hz, 1H), 4,08 (q, J = 7 Hz, 2H, OEt), 3,49 (s, 2H, CH₂), 1,34 (t, J = 7Hz, 3H, OEt); MS m/z (relatívna intenzita, %) 254,2 ([M+l]⁺, 100).

3-(2-karboxyetyl)-2,4-dimetyl-5-formylpyrol (97,6 mg), 127 mg 6-(3etoxyfenyl)-2-oxindoi a 2 kvapky piperidínu v 2 ml etanolu sa zahrievajú pri 90 °C cez noc. Reakčná zmes sa ochladí a koncentruje sa. Zvyšok sa suspenduje v 6 N vodnej kyseline chlorovodíkovej. Precipitát sa prefiltruje, premyje sa vodou na pH 6 a suší sa vo vákuovej peci cez noc. Získa sa 227 mg požadovanej zlúčeniny (-100%) ako hnedej pevnej látky.

'HNMR (360 MHz, DMSO-de): δ 13,38 (s, br, 1H, ΝΗ-Γ), 12,06 (s, br, 1H, COOH), 10,81 (s, br, 1H, NH-1), 7,77 (d, J = 7,97,1H, H-4), 7,58 (s, 1H, H-vinyl), 7,26 (dd, J = 1,35, 7,97 Hz, 1H, H-5), 7,08 (d, J = 1,35 Hz, 1H, H-7), 6,87-7,36 (m, 4H), 4,09 (q, J = 7,0 Hz, 2H, CH₃CH₂), 2,65 (t, J = 7,54 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,47 (t, J = 7,54 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,30 (s, 3H, CH₃),

2,26 (s, 3H, CH₃), 1, 34 (t, J = 7,0 Hz, 3H, CH₃CH₃); MS m/z (relatívna intenzita, %) 431 ( [M+l]⁺, 21).

Príklad 31

3- {5-[6-(3-etoxy-fenyl)-2-oxo-l,2-dihydroindol-3-ylidénmetyl]-4-metyllH-pyrol-3-yl}-propiónová kyselina

4- (2-karboxyetyl)-2-formyl-3-metylpyrol (90,5 mg), 127 mg 6-(3-etoxyfenyl)-2-oxindol a 2 kvapky piperidínu v 2 ml etanolu sa zahrievajú pri 90 °C cez noc. Reakčná zmes sa ochladí a koncentruje sa. Zvyšok sa suspenduje v 6 N vodnej kyseline chlorovodíkovej. Precipitát sa prefiltruje, premyje sa vodou na pH 6 a suší sa vo vákuovej peci cez noc. Získa sa 200 mg (96 %) požadovanej zlúčeniny ako hnedej pevnej látky.

114 ·· ·· ·· ·· ·· · • · · · ···· · · ·· • ··· · · · · • ···· ···· · • · · · · · · · ···· ··· ·· ···· ·· ··· ^lHNMR (360 MHz, DMSO-d₆): δ 13,29 (s, br, 1H, NH-ľ), 12,07 (s, vbr, 1H, COOH), 10,88 (s, br, 1H, NH-1), 7,82 (d, J = 7,97,1H, H-4), 7,65 (s, 1H, H-vinyl), 7,28 (dd, J = 1,20, 7,97 Hz, 1H, H-5), 7,08 (d, J = 1,20 Hz, 1H, H-7), 6,87 - 7,36 (m, 5H), 4,09 (q, J = 6,98 Hz, 2H, CH₃CH₂), 2, 65 (t, J = 7,47 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,47 (t, J = 7,47 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,27 (s, 3H, CH₃), 1,34 (t, J = 6,98Hz, 3H, CH₃CH₂).

Príklad 32

3-[2,4-dimetyl-5-(2-oxo-6-fenyl-l,2-dihydroindol-3-ylidénmetyl)-lHpyrol-3-yl]-propiónová kyselina

Tetrakis(trifenylfosfín)paládium (0,8 g) sa pridá do zmesi 3,1 g benzénboritej kyseliny, 5 g 5-bromo-2-fluórnitrobenzénu a 22 ml 2 M roztoku uhličitanu sodného v 50 ml toluénu a 50 ml etanolu. Zmes sa refluxuje 2 hodiny, koncentruje sa a zvyšok sa extrahuje dvakrát etylacetátom. Etylacetátová vrstva sa premyje vodou a soľankou, suší sa a koncentruje sa. Vznikne žltý olej. Olej sa chromatografuje na silikagély 5 % etylacetátom v hexáne. Získa sa 4,75 g (96 % výťažok) 4-fluoro-3-nitrobifenylu ako žltého oleja.

Dimetylmalonát (10 ml) v 25 ml dimetylsulfoxidu sa pridá po kvapkách do 3,5 g hydridu sodného suspendovaného v 25 ml dimetylsulfoxidu a zmes sa zahrieva pri 100 °C po dobu 10 minút. Zmes sa ochladí na izbovú teplotu a pridá sa 4,7 g 4-fluoro-3-nitrobifenylu v 25 ml dimetylsulfoxidu. Zmes sa zahrieva pri 100 °C 2 hodiny, ochladí sa a ustáli sa roztokom 300 ml saturovaného chloridu amónneho. Zmes sa trikrát extrahuje etylacetátom a spojené organické vrstvy sa premyjú vodou a soľankou a odparia sa. Vznikne žltý olej, surový dimetyl-3-nitrobifenyl-4-malonát.

Surový dimetyl-3-nitrobifenyl-4-malonát sa refluxuje v 30 ml 6 N kyseliny chlorovodíkovej po dobu 24 hodín. Precipitát sa zhromaždí filtráciou, premyje vodou a suší sa. Získa sa 4,5 g (80 % založený na 4-fluoro-3nitrobifenylu) 3-nitrobifenyl-4-octová kyseliny ako krémovo sfarbená pevná látka • ·

115 ·· • · · · • · • · ·· ·· • · ·· • ·· • · · •· · ·· ····

V jednej dávke sa pridajú železné úlomky (2,6 g) do 4,5 g 3-nitrobifenyl-

4-octovej kyseliny v 40 ml kyseliny octovej. Zmes sa refluxuje po dobu 2 hodín, koncentruje sa do sucha a vloží do etylacetátu. Pevné látky sa odstránia filtráciou a filtrát sa dvakrát premyje 1 N kyselinou chlorovodíkovou a soľankou a sušia nad bezvodým síranom sodným. Filtrát sa koncentruje, čím vznikne

3,4 g (93 % výťažok) 6-fenyl-2-oxindolu ako svetlohnedej pevnej látky.

‘HNMR (360 MHz, DMSO-d₆): δ 10,4 (s, br, 1H, NH-1), 7,57-7,6 (m, 2H), 7,42 - 7,46 (m, 2H), 7,32 - 7,37 (m, 1H), 7,27 (d, J = 7,7, 1H, H-4), 7,19 (dd, J = 1,6,7,7Hz, 1H, H-5), 7,01 (d, J = 1,6Hz, 1H, H-7), 3,49 (s, 2H, CH2); MS m/z (relatívna intenzita, %) 210 ([M+l]⁺, 100).

3-(2-karboxyetyl)-2,4-dimetyl-5-formyIpyrol (97,6 mg), 105 mg 6-fenyl-

2- oxindolu a 2 kvapky piperidínu v 2 ml etanolu sa zahrievajú pri 90 °C cez noc. Reakčná zmes sa ochladí a koncentruje sa. Zvyšok sa suspenduje v 6 N vodnej kyseline chlorovodíkovej. Precipitát sa prefiltruje, premyje sa vodou na pH 6 a suší sa vo vákuovej peci cez noc. Získa sa 138 mg (71 %) požadovanej zlúčeniny ako hnedej pevnej látky.

’HNMR (360 MHz, DMSO-d₆): δ 13,38 (s, br, 1H, NH-ľ), 12,05 (s, br, 1H, COOH), 10,81 (s, br, 1H, NH-1), 7,78 (d, J = 7,84,1H, H-4), 7,58 (s, 1H, H-vinyl), 7,25 - 7,63 (m, 6H), 7,09 (s, br, 1H, H-7), 2,64 (t, J = 7,71 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,35 (t, J = 7,71 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,30 (s, 3H, CH₃) a

2,26 (s, 3H, CH₃); MS m/z (relatívna intenzita, %) 387 ([M+1 ]⁺, 100).

Príklad 33

3- [4-metyl-5-(2-oxo-6-fenyl-l,2-dihydroindol-3-ylidénmetyl)-lH-pyrol-

3- yl]-propiónová kyselina

4- (2-karboxyetyl)-2-formyl-3-metylpyrol (90,5 mg), 105 mg 6-fenyl-2oxindolu a 2 kvapky piperidínu v 2 ml etanolu sa zahrievajú pri 90 °C cez noc. Reakčná zmes sa ochladí a koncentruje sa. Zvyšok sa suspenduje v 6 N vodnej kyseline chlorovodíkovej. Precipitát sa prefiltruje, premyje sa vodou na pH 6 a

116 ·· ·· ·· ·· ·· ···· ···· ··· • · · · · · · • ···· · · · · • · · · · · · ···· ···· ·· ···· ·· · suší sa vo vákuovej peci cez noc. Získa sa 146 mg (78 %) požadovanej zlúčeniny ako hnedej pevnej látky.

*HNMR (360 MHz, DMSO-d₆): δ 13,29 (s, br, 1H, NH-ľ), 12,01 (s, vbr, 1H, COOH), 10,89 (s, br, 1H, NH-1), 7,83 (d, J = 7,92,1H, H-4), 7,65 (s, 1H, H-vinyl), 7,30 - 7,65 (m, 5H), 7,16 (d, J = 2,83 Hz, 1H, H-2'), 7,28 (dd, J = 1,58, 7,92 Hz, 1H, H-5), 7,09 (d, J = 1,58 Hz, 1H, H-7), 2,66 (t, J = 7,76 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,45 (t, J = 7,76 Hz, 2H, CH2CH2COOH), a 2,27 (s, 3H, CH3); MS m/z (relatívna intenzita, %) 373 ( [M+l]⁺, 100).

Príklad 34

3-5-[6-(4-metoxy-fenyl)-2-oxo-l,2-dihydroindol-3-ylidénmetyl]-4-metyl1 H-pyrol-3-yl}-propiónová kyselina

Tetrakis(trifenylfosfín)paládium (1 g) sa pridá do zmesi 5 g 4metoxyfenylboritej kyseliny, 6,6 g 5-bromo-2-fluórnitrobenzénu a 30 ml 2 M roztoku uhličitanu sodného v 50 ml toluénu a 50 ml etanolu. Zmes sa refluxuje po dobu 2 hodín, koncentruje sa a zvyšok sa extrahuje dvakrát etylacetátom. Etylacetátová vrstva sa premyje vodou a soľankou, suší sa a koncentruje sa. Získa sa hnedá olejovitá látka. Táto látka sa chromatografuje na silikagély 5 % etylacetátom v hexáne. Získa sa surový 4-fluoro-4'-metoxy-3-nitrobifenyl ako bledožltá pevná látka.

Dimetylmalonát (10 ml) sa pridá po kvapkách do 2,0 g hydridu sodného suspendovaného v 60 ml dimetylsulfoxidu. Zmes sa zahrieva pri 100 °C po dobu 10 minút a ochladí sa na izbovú teplotu. Pridá sa surový 4-fluór-2'-metoxy3-nitrobifenyl (5,2 g) v 50 ml dimetylsulfoxidu a zmes sa zahrieva pri 100 °C po dobu 2 hodín. Reakčná zmes sa ochladí, ustáli sa roztokom 300 ml saturovaného chloridu amónneho a extrahuje sa trikrát etylacetátom. Spojené extrakty sa premyjú saturovaným chloridom amónnym, vodou a soľankou, sušia nad bezvodým síranom sodným a koncentrujú sa. Získa sa surový dimetyl-4¹metoxy-3-nitrobifenyl-4-malonát ako žltý olej.

• · • · • · • · ···· · · · · ··· • · · · · · · • e··· ···· • · · · · · · ···· ···· ·· ···· ·· ·

117

Surový 4'-metoxy-3-nitrobifenyl-4-malonát sa zahrieva pri 100 ⁰ C v 60 ml 6 N kyseliny chlorovodíkovej po dobu 15 hodín a ochladí sa. Utvorený precipitát sa zhromaždí filtráciou, premyje sa vodou a hexánom a suší sa. Získa sa

7,2 g surovej 4'-metoxy-3-nitrobifenyl-4-octovej kyseliny ako svetlohnedastej pevnej látky.

Železné úlomky (3,6 g) sa pridajú v jednej dávke do 7,2 g 4'-metoxy-3nitrobifenyl-4-octovej kyseliny v 50 ml ľadovej kyseliny octovej a zahrieva sa pri 100 °C cez noc. Reakčná zmes sa koncentruje do sucha, sonikuje sa v etylacetáte a filtráciou sa odstráni nerozpustný materiál. Filtrát sa premyje dvakrát 1 N kyselinou chlorovodíkovou, potom soľankou, suší nad bezvodým síranom sodným a koncentruje sa. Získa sa 2,7 g (54 % výťažok založený na 5-bromo-2fluórnitrobenzéne) 6-(4-metoxyfenyl)-2-oxindolu ako ružovo sfarbenej pevnej látky.

’HNMR (360 MHz, DMSO-d₆): δ 10,38 (s, br, 1H, NH-1), 7,52 (d, J = 9 Hz, 2H,), 7,23 (d, J = 7,3 Hz, 1H, H-4), 7,14 (d, d, J = 1,38, 7,3Hz, 1H, H-5), 7,0 (d, J = 9 Hz, 2H), 6,96 (d, J = 1,38 Hz, 1H, H-7), 3,78 (s, 3H, OCH₃), 3,47 (s, 2H, CH₂); MS m/z (relatívna intenzita, %) 214,0 ( [M+l]⁺, 100).

4-(2-karboxyetyl)-2-formyl-3-metylpyrol (90,5 mg), 120 mg 6-(4-metoxyfenyl)-2-oxindolu a 3 kvapky piperidínu v 2 ml etanolu sa zahrievajú pri 90 °C cez noc. Reakčná zmes sa ochladí a koncentruje sa. Zvyšok sa suspenduje v 6 N vodnej kyseline chlorovodíkovej. Precipitát sa prefiltruje, premyje sa vodou na pH 6 a suší sa vo vákuovej peci cez noc. Získa sa 118 mg (59 %) požadovanej zlúčeniny ako hnedej pevnej látky.

’HNMR (360 MHz, DMSO-d₆) : δ 13,26 (s, br, 1H, ΝΗ-Γ), 10,83 (s, br, 1H, NH-1), 7,78 (d, J = 8,07 Hz, 1H, H-4), 7,61 (s, 1H, H-vinyl), 7,56 (d, J =

8,97 Hz, 2H), 7, 22 (dd, J = 1,44, 8,07 Hz, 1H, H-5), 7,13 (d, J = 3,09 Hz, 1H, H-2'), 7,04 (d, J = 1,44 Hz, 1H, H-7), 7,0 (d, J = 8,97 Hz, 2H), 3,79 (s, 3H, OCH₃), 2,65 (t, J = 7,54 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,44 (t, J = 7,54 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), a 2,27 (s, 3H, CH₃); MS m/z, (relatívna intenzita, %) 404 ( [M+l]⁺, 100).

44 44·· • · · · 4· • 4 4 4 4 44

4··· 4444 ·· ···· ···

118

Príklad 35

3-{5-[6-(4-metoxy-fenyl)-2-oxo-l,2-dihydroindol-3-ylidénmetyl]-2,4dimetyl-lH-pyrol-3-yl}-propiónová kyselina

3-(2-karboxyetyl)-2,4-dimetyl-5-formylpyrol (98 mg), 120 mg 6-(4metoxyfenyl)-2-oxindolu a 3 kvapky piperidínu v 2 ml etanolu sa zahrievajú pri 90 °C cez noc. Reakčná zmes sa ochladí a koncentruje sa. Zvyšok sa suspenduje v 6 N vodnej kyseline chlorovodíkovej. Precipitát sa prefiltruje, premyje vodou na pH 6 a suší sa vo vákuovej peci cez noc. Získa sa 118 mg (57 %) požadovanej zlúčeniny ako hnedej pevnej látky.

*HNMR (360 MHz, DMSO-de): δ 13,35 (s, br, 1H, NH-ľ), 12,02 (s, br, 1H, COOH), 10,75 (s, br, 1H, NH-1), 7,73 (d, J = 6,75 Hz, 1H, H-4), 7,56 (d, J = 9, 01 Hz, 2H), 7,54 (s, 1H, H-vinyl), 7,21 (dd, J = 1,59, 6,75 Hz, 1H, H-5), 7,04 (d, J = 1,59 Hz, 1H, H-7), 7,01 (d, J = 9,01 Hz, 2H), 3,79 (s, 3H, OCH₃ ),

2,65 (t, J = 7,54 Hz, 2H, CH₂CH2COOH), 2,35 (t, J = 7,54 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,29 (s, 3H, CH₃), a 2,26 (s, 3H, CH₃); MS m/z (relatívna intenzita, %) 417 ([M+l]⁺, 100).

Príklad 36

3-5-[6-(2-metoxy-fenyl)-2-oxo-l,2-dihydroindol-3-ylidénmetyl]-4-metyllH-pyrol-3-yl}-propiónová kyselina

Tetrakis(trifenylfbsfín)paládium (1 g) sa pridá do zmesi 5 g 2metoxyfenylboritej kyseliny, 6,6 g 5-bromo-2-fluórnitrobenzénu a 30 ml 2 M roztoku uhličitanu sodného v 50 ml toluénu a 50 ml etanolu. Zmes sa refluxuje po dobu 2 hodín, koncentruje sa a zvyšok sa extrahuje dvakrát etylacetátom. Spojené etylacetátová vrstvy sa premyjú vodou a soľankou, sušia sa a koncentrujú sa. Získa sa tmavo zelený olej, ktorý státím tuhne na surový 4-fluoro-2'metoxy-3-nitrobi fenyl.

• · • ·

119

Dimetylmalonát (14 ml) sa pridá po kvapkách do 2,9 g hydridu sodného suspendovaného v 50 ml dimetylsulfoxidu. Zmes sa zahrieva pri 100 °C po dobu 15 minút a ochladí sa na izbovú teplotu.

Pridá sa surový 4-fluór-2'-metoxy-3-nitrobifenyl v 60 ml dimetylsulfoxidu a zmes sa zahrieva pri 100 °C po dobu 2 hodín. Reakčná zmes sa ochladí, ustáli sa roztokom 300 ml saturovaného chloridu amónneho a extrahuje dvakrát etylacetátom. Spojené extrakty sa premyjú saturovaným chloridom sodným, vodou, soľankou a sušia nad bezvodým síranom sodným. Koncentrujú sa, čím sa získa surový dimetyl-2'-metoxy-3-nitrobifenyl-4-malonát ako žltý olej.

Surový 2'-metoxy-3-nitrobifenyl-4-malonát sa zahrieva pri 100 °C v 50 ml 6 N kyseliny chlorovodíkovej po dobu 24 hodín a ochladí sa. Precipitát sa zhromaždí filtráciou, premyje sa vodou, hexánom a suší sa. Získa sa 9,8 g 2'metoxy-2-nitrobifenyl-4-octovej kyseliny ako svetlohnedej pevnej látky.

v

Železné úlomky (5 g) sa pridajú v jednej dávke do 9,8 g 2'-metoxy-3nitrobifenyl-4-octovej kyseliny v 50 ml ľadovej kyseliny octovej a zmes sa zahrieva pri 100 °C po dobu 3 hodín. Reakčná zmes sa koncentruje do sucha, sonikuje sa v etylacetáte a filtráciou sa odstráni nerozpustný materiál. Filtrát sa premyje dvakrát 1 N kyselinou chlorovodíkovou, vodou, soľankou a suší sa nad bezvodým síranom sodným a koncentruje sa. Zvyšok sa chromatografuje na silikagély etylacetát : hexánom 1: 2. Získa sa 5,4 g (69 % výťažok založený na 5bróm-2-fluórnitrobenzéne) 6-(2-metoxyfenyl)-2-oxindolu ako ružovo sfarbenej pevnej látky.

’HNMR (360 MHz, DMSO-de): δ 10,32 (s, br, 1H, NH), 7,29- 7,34 (m, 1H), 7,19 -7,25 (m, 2H), 7,08 (d, J = 8Hz, 1H, H-4), 6,97 - 7,02 (m, 2H), 6,91 (d, J = 1,05 Hz, 1H, H-7), 3,8 (s, 3H, OCH₃), 3,47 (s, 2H, CH₂); MS m/z (relatívna intenzita, %) 239,8 (100, [M+l]⁺).

4-(2-karboxyetyl)-2-formyl-3-metylpyrol (217 mg), 239 mg 6-(2-metoxyfenyl)-2-oxindolu a 3 kvapky piperidínu v 2 ml etanolu sa zahrievajú pri 90 °C cez noc. Reakčná zmes sa ochladí a koncentruje sa. Zvyšok sa suspenduje v

N vodnej kyseline chlorovodíkovej. Precipitát sa prefiltruje, premyje sa vo120 • 9 9 · · · · · · · • · · · · · · ·· ···· ·· ···· ·· ··· dou na pH 6 a suší sa vo vákuovej peci cez noc. Získa sa 348 mg (86 %) požadovanej zlúčeniny ako hnedej pevnej látky.

’HNMR (360 MHz, DMSO-d₆): δ 13,29 (s, br, IH, NH-ľ), 11,59 (s, br, IH, COOH), 10,78 (s, br, IH, NH-1), 7,75 (d, J = 8,13 Hz, IH, H-4), 7,62 (s, IH, H-vinyl), 7,0-7,34 (m, 7H), 3,76 (s, 3H, OCH₃), 2,66 (t, J = 7,46 Hz, 2H, CH2CH2COOH), 2,46 (t, J = 7,46 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH) a 2,27 (s, 3H, CH₃); MS m/z (relatívna intenzita, %) 401 ( [M+l]⁺, 100).

Príklad 37

3-5-[6-(2-metoxy-fenyl)-2-oxo-l,2-dihydroindol-3-ylidénmetyl]-2,4dimetyl-lH-pyrol-3-yl}-propiónová kyselina

3-(2-karboxyetyl)-2,4-dimetyl-5-formylpyrol (234 mg), 239 mg 6-(2metoxyfenyl)-2-oxindolu a 3 kvapky piperidínu v 2 ml etanolu sa zahrievajú pri 90 °C cez noc. Reakčná zmes sa ochladí a koncentruje sa. Zvyšok sa suspenduje v 6 N vodnej kyseline chlorovodíkovej. Precipitát sa prefiltruje, premyje sa vodou na pH 6 a suší sa vo vákuovej peci cez noc.

Surová pevná látka sa prečistí kolónovou chromatografiou na silikagély mobilnou fázou etylacetát : hexán 1: 1 obsahujúcou 0,1 % kyseliny octovej. Získa sa 182 mg (44 %) požadovanej zlúčeniny ako hnedej pevnej látky.

’HNMR (360 MHz, DMSO-d₆): δ 13,38 (s, br, IH, NH-ľ), 12,0 (s, br, IH, COOH), 10,7 (s, br, IH, NH-1), 7,71 (d, J = 7,74 Hz, IH, H-4), 7,55 (s, IH, H-vinyl), 7,0-7,33 (m, 6H), 3,76 (s, 3H, 0CH₃), 2,65 (t, J = 7,6 Hz, 2H, CH2CH2COOH), 2,35 (t, J = 7,6 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,3 (s, 3H, CH₃), a

2,26 (s, 3H, CH₃); MS (APCI neg) m/z (relatívna intenzita, %) 415 ([M-l], 100).

·· • · · · · · · ···· ··*· ·· ···· ·· · 121

Príklad 38

3-[2,4-dimetyl-5-(6-morfolin-4-yl-2-oxo-l,2-dihydroindol-3-ylidénmetyl)-lH-pyrol-3-yl]-propiónová kyselina

Dihydrát chloridu cínu (225 g) sa pridá do roztoku 2,4-dinitrofenyloctovej kyseliny (22,6 g) v etanole (450ml). Zmes sa zahrieva pri 90 °C po dobu 10 hodín. Reakčná zmes sa ochladí a 12 M hydroxidom sodným sa upraví pH na 11. Pevná látka sa odstráni filtráciou a filtrát sa koncentruje. Zvyšok sa nechá reagovať s etanolom (300 ml). Nerozpustné látky sa sfiltrujú a premyjú etanolom (5x 60ml). Spojené etanolové podiely sa odparia a sušia sa pod vákuom. Získa sa 15g 6-amino-2-oxindolu ako hnedého prášku.

‘HNMR (360 MHz, DMSO-de): Ô 10,03 (s, br, NH), 6,78 (d, J = 8,55 Hz, 1H, H-4), 6,09-6,11 (m, 2H), 4,95 (s, br, 2H, NH₂), 3,22 (s, 2H, H-3); MS (+ APCI) m/z (relatívna intenzita, %) 147 ([M-l]⁺, 100).

6-amino-2-oxindol (2,2 g), 4,0 g 2,2'-dibrómetyléteru a 7,9 g uhličitanu sodného sa refluxujú cez noc v 20 ml etanolu, koncentrujú sa a zriedia sa 50 ml vody. Zmes sa extrahuje trikrát 50 ml etylacetátu, organické extrakty sa spoja, premyjú sa 20 ml soľanky, sušia nad bezvodým síranom sodným a koncentrujú sa do sucha. Pevná látka sa chromatografuje na stĺpci silikagélu mobilnou fázou etylacetát : hexán 1: 1 obsahujúcou 0,7 % kyseliny octovej. Získa sa 1,2 g (37 % výťažok) 6-(morfolin-4-yl)-2-oxindolu ako béžovej pevnej látky.

HNMR (360 MHz, DMSO-d6): δ 10,2 (s, br, 1H, NH-1), 7,02 (d, J = 7,87 Hz, 1H, H-4), 6,47 (dd, J = 2,11, 7,87 Hz, 1H, H5), 6,37 (d, J = 2,11 Hz, 1H, H-7), 3,69-3,72 (m, 4H), 3,32 (s, 2H, CH₂), 3,01-3,04 (m, 4H); MS m/z (relatívna intenzita, %) 219 ([M+l]⁺, 100).

3-(2-karboxyetyl)-2,4-dimetyl-5-formylpyrol (3,3 g), 4 g 6-(morfolin-4yl)-2-oxindolu a 1,8 ml piperidínu v 60 ml etanolu sa zahrievajú pri 90 °C po dobu 7 hodín. Reakčná zmes sa ochladí a koncentruje sa. Zvyšok sa suspenduje v 6 N vodnej kyseline chlorovodíkovej. Precipitát sa prefiltruje, premyje sa vodou na pH 6 a suší sa vo vákuovej peci cez noc. Výsledná pevná látka sa prečistí kolónovou chromatografiou na silikagély mobilnou fázou etylacetát 122 • 9 · · · · · ··· ···· ·· ···· ·· · hexán - octová kyselina. Získa sa 2,78 g (38 % výťažok) požadovanej zlúčeniny ako hnedej pevnej látky.

’HNMR (360 MHz, DMSO-d6): δ 13,13 (s, br, 1H, NH-ľ), 12,02 (s, br, 1H, COOH), 10,57 (s, br, 1H, NH-1), 7,52 (d, J = 8,46 Hz, 1H, H-4), 7,32 (s, 1H, H-vinyl), 6,58 (dd, J = 1,99, 8,46 Hz, 1H, H-5), 6,41 (d, J = 1,99 Hz, 1H, H-7), 3,71-3,74 (m, 4H), 3,06-3,09 (m, 4H), 2,62 (t, J = 7, 57 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,33 (t, J = 7,57 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,26 (s, 3H, CH₃), a

2,21 (s, 3H, CH₃); MS m/z (relatívna intenzita, %) 396 ([M+l]⁺, 100).

Príklad 39

3-[5-(5-chlór-4-metyl-2-oxo-l,2-dihydroindol-3-ylidénmetyl)-2,4dimetyl-lH-pyrol-3-yl]-propiónová kyselina

Suspenzia 3,0 g 4-metyl-2-oxindolu sa mieša v 50 ml acetonitrilu pri izbovej teplote a po dávkach sa pridá 3,3 g N-chlór-sukcínimidu. Potom sa pridá trifluóroctová kyselina (1 ml). Suspenzia sa mieša pri izbovej teplote 3 dni, počas ktorých je pevná látka stále prítomná. Biela pevná látka sa zhromaždí vákuovou filtráciou, premyje sa malým množstvom studeného acetónu a suší sa cez noc vo vákuovej peci pri 40 °C. Získa sa 2,5 g (68 %) 5-chlór-4-metyl-2oxindolu.

’HNMR (360 MHz, DMSO-d₆): δ 10,38 (s, br, 1H, NH), 7,19 (d, J = 8Hz, 1H, aromatika), 6,64 (d, J = 8 Hz, 1H, aromatika), 3,46 (s, 2H, H-3), 2,19 (s, 3H, CH₃).

3-(2-karboxyetyl)-2,4-dimetyl-5-formylpyrol (98 mg), 91 mg 5-chlór-4metyl-2-oxindolu a 2 kvapky piperidínu v 2 ml etanolu sa zahrievajú pri 90 °C po dobu 4 hodín. Reakčná zmes sa ochladí a koncentruje sa. Zvyšok sa suspenduje v 6 N vodnej kyseline chlorovodíkovej. Precipitát sa prefiltruje, premyje sa vodou na pH 6 a suší sa vo vákuovej peci cez noc. Získa sa 100 mg požadovanej zlúčeniny.

• · • · · · · · · ···« ···· ·· ···· ·· ·

123 ’HNMR (360 MHz, DMSO-d₆): δ 13,47 (s, br, 1H, NH-ľ), 12,03 (s, br, 1H, COOH), 10,83 (s, br, 1H, NH-1), 7,61 (s, 1H, H-vinyl), 7,14 (d, J = 8,17 Hz, 1H, aromatika), 6,74 (d, J = 8,17 Hz, 1H, aromatika), 2,64 (s, 3H, CH₃), 2,64 (t, J = 7,62 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,34 (t, J = 7,62 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,3 (s, 3H, CH₃) a 2,20 (s, 3H, CH₃).

Príklad 40

3- [5-(5-chloro-4-metyl-2-oxo-l,2-dihydroindol-3-ylidénmetyl)-4-metyllH-pyrol-3-yl]-propiónová kyselina

4- (2-karboxyetyl)-2-formyl-3-metylpyrol (91 mg), 91 mg 5-chloro-4metyl-2-oxindolu a 2 kvapky piperidínu v 2 ml etanolu sa zahrievajú pri 90 °C po dobu 4 hodín. Reakčná zmes sa ochladí a koncentruje sa. Zvyšok sa suspenduje v 6 N vodnej kyseline chlorovodíkovej. Precipitát sa prefiltruje, premyje sa vodou na pH 6 a suší sa vo vákuovej peci cez noc. Získa sa 95 mg požadovanej zlúčeniny.

’HNMR (360 MHz, DMSO-d₆): δ 13,36 (s, br, 1H, NH-ľ), 11,98 (s, br, 1H, COOH), br, 1H, NH-1), 7,68 (s, 1H), 7,19 (d, J = 7,14Hz, 1H, aromatika),

7,17 (s, 1H), 6,75 (d, J = 7,14 Hz, 1H, aromatika), 2,66 (s, 3H, CH₃-4), 2,66 (t, J = 7,51 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,45 (t, J = 7,51 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH),

2,21 (s, 3H, CH₃); MS m/z (relatívna intenzita, %) 345 ([M+l]⁺, 100).

Príklad 41

Sodná soľ 3-[2,4-dimetyl-5-(2-oxo-l,2-dihydroindol-3-ylidénmetyl)-lHpyrol-3-yl]-propiónovej kyseliny

Suspenzia 8 g 3-[2,4-dimetyi-5-(2-oxo-l,2-dihydroindol-3-ylidénmetyl)lH-pyrol-3-yl]-propiónovej kyseliny v 60 ml vody sa pridá do 0,98 g hydroxidu sodného v 10 ml vody. Zmes sa mieša pri izbovej teplote po dobu 30 minút a • · prefiltruje sa. Filtrát sa zmrazí a lyofilizuje sa. Získa sa 8 g požadovanej zlúčeniny.

Alebo iným spôsobom: suspenzia 117g 318 - 005 v 470 ml vody sa pridá 16,47 g hydroxidu sodného v 74 ml vody. Zmes sa mieša pri izbovej teplote po dobu 15 minút a prefiltruje sa. Filtrát sa pridá do 210 ml etanolu a výsledný precipitát, ktorý sa utvorí sa zhromaždí podtlakovou filtráciou. Po usušení sa získa konečných 106 g požadovanej zlúčeniny.

'HNMR (360 MHz, DMSO-d₆): δ 13,34 (s, br, 1H, NH-ľ), 10,82 (s, br, 1H, NH-1), 7,65 (d, J = 7,52 Hz, 1H, H-4), 7,5 (s, 1H, H-vinyl), 7,04 (t, J = 7,52 Hz, 1H, H-6), 6,93 (t, J = 7,52 Hz, 1H, H-5), 6,85 (d, J = 7,52 Hz, 1H, H-

7), 2,55 (t, J = 6,95 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,28 (s, 3H, CH₃), 2,24 (s, 3H, CH₃) a 1,99 (t, J = 6,95 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH).

Príklad 42

3-[3,5-dimetyl-4-(3-morfolin-4-ylpropyl)-lH-pyrol-2ylmetylén]-l,3dihydroindol-2-ón

Krok 1: Do suspenzie 3-(2,4-dimetyl-lH-pyrol-3-yl)-propiónovej kyseliny (10 g, 60,8 mmol) v 60 ml dichlórmetánu sa pridá l,ľ-karbonyldiimidazol (11,6 g, 71,8 mmol) a následne morfolín (5,5 ml, 60,8 mmol) a N,Ndiizopropyletylamín (Hunigova báza, 10 ml, 60,8 mmol). Tmavočervená reakčná zmes sa mieša pri izbovej teplote cez noc a preleje sa do ľadovej vody. Organická vrstva sa premýva soľankou až do pH 6, suší sa nad bezvodým síranom sodným a koncentruje sa. Surový produkt sa prečisti na kolóne silikagélu mobilnou fázou dichlórmetán-metanol (98: 2). Získa sa 13,84 g (96 %) 3-(2,4dimetyl-lH-pyrol-3-yl)-l-morfolin-4-yl-propan-l-ónu.

Krok 2: Do suspenzie L1AIH4 (2,67 g, 70 mmol) v tetrahydrofuráne (100 ml) sa pridá po kvapkách roztok 3-(2,4-dimetyl-lH-pyrol-3-yl)-l-morfolin-4yl-propan-l-ónu (13,84 g, 59 mmol) v tetrahydrofuráne (50 ml). Reakčná zmes sa mieša pri 80 °C po dobu 1 hodiny a ochladí sa v ľadovom kúpeli. Do reakč125 • · · · · · · ··· ···· ·· ···· ·· · nej zmesi sa pomaly pridáva ľad pokiaľ nezačne unikať plyn. Pridá sa pár kvapiek 2N hydroxidu sodného a reakčná zmes sa mieša pri izbovej teplote po dobu 30 minút. Potom sa reakčná zmes extrahuje etylacetátom, suší sa nad bezvodým síranom sodným a koncentruje sa. Získa sa 10,37 g (79 %) 4-[3-(2,4dimetyl-lH-pyrol-3-yl)-propyl]-morfolínu ako svetlohnedého oleja, ktorý sa použije bez ďalšieho čistenia.

Krok 3: Do ľadového studeného roztoku N,N-dimetylformamidu (5,5 ml, 70 mmol) v dichlórmetáne (30 ml) sa po kvapkách pridá oxychlorid fosforečný (6,5 ml, 70 mmol). Potom sa reakčná zmes mieša pri izbovej teplote po dobu 15 minút. Následne sa po kvapkách pri teplote 0 °C pridá roztok 3,5-dimetyl-4-(3morfolin-4-yl-propyl)-lH pyrol-2-karboxaldehydu (10,37 g, 46,6 mmol) v dichlórmetáne (20 ml). Finálna reakčná zmes sa refluxuje pri 60 °C po dobu 4 hodín a ochladí sa v ľadovom kúpeli. Do reakčnej zmesi sa pomaly pridáva ľad a následne 2 N hydroxid sodný pokiaľ pH nedosiahne hodnotu 12. Reakčná zmes sa mieša pri izbovej teplote po dobu 30 minút a potom sa extrahuje etylacetátom. Organická vrstva sa premyje soľankou, suší sa nad bezvodým síranom sodným a koncentruje sa. Surový produkt sa prečistí na kolóne silikagélu mobilnou fázou dichlórmetán - metanol - hydroxid amónny (9,5: 0,5). Získa sa 4,57 g (39 %) 3,5-dimetyl-4-(3-morfolin-4-yl-propyl)-lH pyrol-2-karbaldehydu ako tmavočerveného oleja.

’HNMR (360 MHz, DMSO-de) δ 11,34 (s, br, 1H, NH-1), 9,40 (s, 1H, CHO-2), 3,55 (t, J = 4,68 Hz, 4H, O(CH₂CH₂)₂NCH₂CH₂CH₂-4), 2,28-2,34 (m, 6H, O(CH₂CH₂)₂NCH₂CH₂CH₂-4), 2,21 (t, 2H, J = 7,10 Hz, 2H,

O(CH₂CH₂)₂NCH₂CH₂CH₂-4) CH₃-3), 2,19 (s, 3H, CH₃-5), 2,14 (s, 3H, CH₃-3),

1,51 (kvintet, J = 7,10 Hz, 2H, O(CH₂CH₂)₂NCH₂CH₂CH₂-4), MS m/z (relatívna intenzita, %) 251 ([M+l]⁺, 100).

Krok 4: Zmes 1,3-dihydroindol-2-ónu (133 mg, 1,0 mmol), 3,5-dimetyl-

4-H-pyrol-2-karboxaldehyd (250 mg, 1, 0 mmol) a 3 tri kvapky pyrolidínu v 2,0 ml etanolu sa refluxuje pri 90 °C po dobu 4 hodín a potom sa ochladí na izbovú teplotu. Precipitát sa prefiltruje, premyje studeným etanolom a hexánom a suší sa vo vákuovej peci cez noc. Získa sa 308,9 mg (85 %) 3-[3,5-dimetyl-4-(3• · • · · · · · · ···« ···· ·· ···· ·· ·

126 morfolin-4-yl-propyl)-lH-pyrol-2-ylmetylén]-l,3-dihydroindol-2-ónu ako žltej pevnej látky.

'HNMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ 13,37 (s, 1H, NH-ľ), 10,71 (s, 1H, NH1), 7,68 (d, J = 7,47 Hz, 1H, H-4), 7,53 (s, 1H, H-vinyl), 7,06 (dt, J = 7,47 Hz, 1H, H-6), 6,94 (dt, J = 7,74 Hz, 1H, H-5), 6,84 (d, J = 7,47 Hz, 1H, H-7), 3,55 (t, J = 4,37 Hz, 4H, O(CH₂CH2)2NCH₂CH₂CH₂-4^I), 2,40 (t, J = 7,31 Hz, 2H, O(CH₂CH₂)₂NCH₂CH₂CH₂-4'), 2,31 (t, J = 4,37 Hz, 4H,

O(CH₂CH₂)₂NCH₂CH₂CH₂-4'), 2,28 (s, 3H, CH₃-3'), 2,23 (s, 3H, CH₃-5'), 2,23 (t, J = 7,31 Hz, 2H, O(CH₂CH₂)₂NCH₂CH₂CH₂-4'), 1,56 (kvintet, J = 7,31 Hz, 2H, O(CH₂CH₂)₂NCH₂CH₂CH₂-4'), MS m/e (relatívna intenzita, %) 365 (M⁺,100).

Príklad 43

5-bróm-3-[3,5-dimetyl-4-(3-morfolin-4-yl-propyl)-lH-pyrol-2-ylmetylén]-l ,3-dihydroindoI-2-ón

Zmes 5-bróm-l,3-dihydroindol-2-ónu (212 mg, 1,0 mmol), 3,5-dimetyl-4(3-morfolin-4-yl-propyl)-lH-pyrol-2-karbaldehydu (250 mg, 1,0 mmol) a 3 kvapiek pyrolidínu v 2,0 ml etanolu sa refluxuje pri 90 °C po dobu 4 hodín a potom sa ochladí na izbovú teplotu. Precipitát sa prefiltruje, premyje sa studeným etanolom a hexánom a suší sa vo vákuovej peci cez noc. Získa sa 399,8 mg (90 %) 5-bróm-3-[3,5-di mety 1-4-(3-morfolin-4-y l-propyl)-l H-pyrol-2ylmetylén]-l,3-dihydroindol-2-ónu ako červenej pevnej látky.

1HNMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 13,43 (s, 1H, NH-ľ), 10,81 (s, 1H, NH1), 7,99 (d, J = 2,07 Hz, 1H, H-4), 7,66 (s, 1H, Hvinyl), 7,18 (dd, J = 2,07, 7,58 Hz, 1H, H-6), 6,79 (d, J = 7,58 Hz, 1H, H-7), 3,55 (t, J = 4,39 Hz, 4H, O(CH2CH2)2NCH2CH2CH2-4'), 2,40 (t, J = 7,32 Hz, 2H,

O(CH2CH2)2NCH2CH2CH2-4'), 2,31 (t, J = 4,39 Hz, 4H,

O(CH2CH2)2NCH2CH2CH2-4'), 2,29 (s, 3H, CH3-3'), 2,26 (s, 3H, CH3-5'),

2,23 (t, J = 7,32 Hz, 2H, O(CH2CH2)2NCH2CH2CH2-4'), 1,56 (kvintet, J = 7,32 Hz, 2H, O(CH2CH2)2NCH2CH2CH2-4'), ·· • ·

127

MS m/e (relatívna intenzita, %) 443 (M+, 100), 445 ([M+2]⁺, 100).

Príklad 44

3-[3,5-dimetyl-4-(3-morfolin-4-yl-propyl)-lH-pyrol-2-ylmetylén]-6fenyl-1,3-dihy droindol-2-ón

Postupom z Príkladu 2 sa získa 88 % výťažok požadovanej zlúčeniny ako žltej pevnej látky.

’HNMR (300 MHz, DMSO-de) δ 13, 37 (s, 1H, NH-ľ), 10,81 (s, 1H, NH1), 7,77 (d, J = 8,20 Hz, 1H, H-4), 7,62 (d, J = 7,39 Hz, 2H, H-2, 6), 7,58 (s, 1H, H-vinyl), 7,44 (t, J = 7,39 Hz, 2H, H-3, 5), 7,32 (t, br, J = 7,39 Hz, 1H, H-4), 7,26 (dd, J = 1,49, 8,29 Ηζ,ΙΗ, H-5), 7,09 (d, J = 1,49 Hz, 1H, H-7),

3,56 (t, J = 4,48 Hz, 4H, O(CH₂CH₂)₂NCH₂CH₂CH₂-4'), 2,41 (t, J = 7,18 Hz, 2H, O(CH₂CH₂)₂NCH₂CH₂CH₂-4'), 2,31 (t, J = 4,48 Hz, 4H,

O(CH₂CH₂)₂NCH₂CH₂CH₂-4'), 2,29 (s, 3H, CH₃-3'), 2,26 (s, 3H, CH₃-5'), 2,24 (t, J = 7,18 Hz, 2H, O(CH₂CH₂)₂NCH₂CH₂CH₂-4'), 1,56 (kvintet, J = 7,18 Hz, 2H, O(CH₂CH₂)₂NCH₂CH₂CH₂-4'),

MS m/e (relatívna intenzita, %) 441 (M⁺, 100).

Príklad 44

3-[3,5-dimetyl-4-(3-morfolin-4-yl-propyl)-lH-pyrol-2-ylmetylén]-6fenyl-l,3-dihydroindol-2-ón

Postupom z Príkladu 2 sa získa 88 % výťažok požadovanej zlúčeniny ako žltej pevnej látky.

*HNMR (300 MHz, DMSO-de) δ 13, 37 (s, 1H, NH-ľ), 10,81 (s, 1H, NH1), 7,77 (d, J = 8,20 Hz, 1H, H-4), 7,62 (d, J = 7,39 Hz, 2H, H-2, 6), 7,58 (s,

1H, H-vinyl), 7,44 (t, J = 7,39 Hz, 2H, H-3, 5), 7,32 (t, br, J = 7,39 Hz, 1H,

H-4), 7,26 (dd, J = 1,49, 8,29 Ηζ,ΙΗ, H-5), 7,09 (d, J = 1,49 Hz, 1H, H-7), • · • ·

128

3,56 (t, J = 4,48 Hz, 4H, OÍCHaCHahNCHiCHjCH^'), 2,41 (t, J = 7,18 Hz, 2H, O(CH₂CH₂)₂NCH₂CH₂CH₂-4'), 2,31 (t, J = 4,48 Hz, 4H,

O(CH₂CH₂)₂NCH₂CH₂CH₂-4'), 2,29 (s, 3H, CH₃-3'), 2,26 (s, 3H, CH₃-5·), 2,24 (t, J = 7,18 Hz, 2H, O(CH₂CH₂)₂NCH₂CH₂CH₂-4'), 1,56 (kvintet, J = 7,18 Hz, 2H, O(CH₂CH₂)₂NCH₂CH₂CH₂-4'),

MS m/e (relatívna intenzita, %) 441 (M⁺, 100).

Príklad 45

3-[3,5-dimetyl-4-(3-morfolin-4-yl-propyl)-lH-pyrol-2-ylmetylén]-6-(2metoxy fény 1)-1,3-dihydroindol-2-ón

Postupom z Príkladu 2 sa získa 86 % výťažok požadovanej zlúčeniny ako žltej pevnej látky.

‘HNMR (300 MHz, DMSO-dfi) δ 13,37 (s, 1H, NH-ľ), 10,72 (s, 1H, NH1), 7,71 (d, J = 7,79 Hz, 1H, H-4), 7,55 (s, 1H, H-vinyl), 7,27-7,34 (m, 2H), 6,98-7,10 (m, 4H), 3,76(s, 3H, OCH₃-2), 3,56 (t, J = 4,50 Hz, 4H, O(CH₂CH₂)₂NCH₂CH₂CH₂-4'), 2,41 (t, J = 7,12 Hz, 2H, O(CH₂CH₂)₂NCH₂CH₂CH₂-4'), 2,21-2,31 (m, 6H, O(CH₂CH₂)₂NCH₂CH₂CH₂4'), 2,29 (s, 3H, CH₃-3'), 2,25 (s, 3H, CH₃-5'), 1,57 (kvintet, J = 7,12 Hz, 2H, O(CH₂CH₂)₂NCH₂CH₂CH₂-4'),

MS m/e (relatívna intenzita, %) 471 (M⁺, 100).

Príklad 46

3-[3,5-dimetyl-4-(3-morfolin-4-yl-propyl)-lH-pyrol-2-ylmetyIén]-6-(3metoxy fény 1)-1,3-dihydroindol-2-ón

Postupom z Príkladu 2 sa získa 87% výťažok požadovanej zlúčeniny ako žltej pevnej látky.

129 • · · · ···· ··· • · · · · · · • · ··· ··· ··· ···· ·· ···· ·· ··· ’HNMR (300 MHz, DMSO-de) δ 13, 38 (s, 1H, NH-ľ), 10,80 (s, 1H, NH1), 7,76 (d, J = 7,93 Hz, 1H, H-4), 7,57 (s, 1H, H-vinyl), 7,35 (t, J = 8,08 Hz, 1H, H-5), 7,26 (dd, J = 1,73, 7,93 Ηζ,ΙΗ, H-5), 7,18 ( d, br, J = 8,08 Hz, 1H, H-4), 7,13 ( d, br, J = 1,94 Hz, 1H, H-2), 7,08 (d, J = 1,73 Hz, 1H, H-7), 6,90 (dd, J = 1,94, 8,08 Hz, 1H, H-6), 3,81 (s, 3H, OCH₃-3), 3,56 (t, J = 4,38 Hz, 4H, OCCJ^CH^NCHjCHaC^^'), 2,41 (t, J = 7,19 Hz, 2H, O(CH₂CH₂)2NCH2CH₂CH2-4'), 2,31 (t, J = 4,38 Hz, 4H,

O(CH₂CH₂)₂NCH₂CH₂CH₂-4'), 2,29 (s, 3H, CH₃-3'), 2,26 (s, 3H, CH₃-5'), 2,24 (t, J = 7,19 Hz, 2H, O(CH₂CH₂)₂NCH₂CH₂CH₂-4^I), 1,56 (kvintet, J = 7,19 Hz, 2H, O(CH₂CH₂)2NCH2CH2CH2-4'),

MS m/e (relatívna intenzita, %) 471 (M⁺, 100).

Príklad 47

3-[3,5-dimetyl-4-(3-morfolin-4-yl-propyl)-lH-pyrol-2-ylmetylén]-6-(4metoxy fenyl)-1,3-dihy droindol-2-ón

Postupom z Príkladu 2 sa získa 52 % výťažok požadovanej zlúčeniny ako žltej pevnej látky.

‘HNMR (300 MHz, DMSO-de) δ 13,35 (s, 1H, NH-ľ), 10,77 (s, 1H, NH1), 7,72 (d, J = 7,97 Hz, 1H, H-4), 7,55 (d, J = 8,57 Hz, 2H, H-2, 6), 7,54 (s, 1H, H-vinyl), 7,20 (dd, J = 1,35, 7,97 Hz, 1H, H-5), 7,04 (d, J = 1,35 Hz, 1H, H-7), 6,99 (d, J = 8,57 Hz, 1H, H-3, 5), 3,78 (s, 3H, OCH₃-4), 3,55 (t, J =

4,57 Hz, 4H, O(CH2CH₂)₂NCH2CH₂CH₂-4'), 2,40 (t, J = 6,97 Hz, 2H, O(CH₂CH₂)₂NCH₂CH2CH₂-4·), 2,30 (t, J = 4,57 Hz, 4H,

O(CH2CH2)2NCH2CH2CH2-4'), 2,28 (s, 3H, CH₃-3'), 2,24 (s, 3H, CH₃-5'), 2,23 (t, J = 6,97 Hz, 2H, O(CH₂CH₂)₂NCH₂CH₂CH₂-4'), 1,55 (kvintet, J = 6,97 Hz, 2H, O(CH2CH2)2NCH2CH₂CH2-4'),

MS m/e (relatívna intenzita, %) 471 (M⁺, 100).

130 ·· ·· ·· ·· ·· ···· ···· ·· • · · · · · · • ···· ···· • · · · · · · ···· ···· ·· ···· ··

Príklad 48

3-(4-(3-dimetyl aminopropy 1)-3,5-dimetyl-lH-pyrol-2yImetylén]-1,3dihydroindol-2-ón

Podľa krokov 1, 2 a 3 z Príkladu 1 sa získa 63 % výťažok 4-(3dimetylaminopropyl)-3,5-dimetyl-lH-pyrol-2-karboxaldehydu vo forme tmavo červeného oleja.

’HNMR (360 MHz, DMSO-d₆) δ 11,33 (s, br, 1H, NH-1), 9,40 (s, 1H, CHO-2), 2,30 (t, J = 7,42 Hz, 2H, (CH₃)₂NCH₂CH₂CH₂-4), 2,18 (s, 3H, CH₃-3),

2,15 (t, J = 7,42 Hz, 2H, (CH₃)₂NCH₂CH₂CH₂-4), 2,14 (s, 3H, CH₃-5), 2,10 (s, 6H, (CH₃)₂NCH₂CH₂CH₂-4), 1,47 (kvintet, J = 7,42 Hz, 2H, (CH₃)₂NCH₂CH₂CH₂-4),

MS m/z (relatívna intenzita, %) 208 ([M+l]⁺, 100).

Podľa kroku 4 z Príkladu 1 sa získa 52 % výťažok požadovanej zlúčeniny ako žltej pevnej látky.

’HNMR (360 MHz, DMSO-d₆) δ 13,38 (s, 1H, NH-ľ), 10,70 (s, 1H, NH1), 7,68 (d, J = 7,54 Hz, 1H, H-4), 7,53 (s, 1H, H- vinyl), 7,06 (t, J = 7,54 Hz, 1H, H-6), 6,94 (t, J = 7,54 Hz, 1H, H-5), 6,85 (d, J = 7,54 Hz, 1H, H-7), 2,38 (t, J = 7,25 Hz, 2H, (CH₃)₂NCH₂CH₂CH₂-4'), 2,27 (s, 3H, CH₃-3'), 2,23 (s, 3H, CH₃-5'), 2,17 (t, J = 7,25 Hz, 2H, (CH₃)₂NCH₂CH₂CH₂-4'), 2,11 (s, 6H, (CH₃)2NCH₂CH₂CH₂-4'), 1,52 (chint,, J = 7,25 Hz, 2H, (CH₃)₂NCH₂CH₂CH₂4'),

MS m/z (relatívna intenzita, %) 323 (M⁺, 100),

Príklad 49

5-bróm-3-[4-(3-dimetylaminopropyl)-3,5-dimetyI-lH-pyrol-2-ylmetylén]-

1,3-dihy droindol-2-ón

131 ·· ·· ·· ·· ·· • · · ···· · · • · · · e · · • · · · · ···· • · · · · · ·

Postupom z Príkladu 2 sa získa 71% výťažok požadovanej zlúčeniny ako červenej pevnej látky.

’HNMR (360 MHz, DMSO-de) δ 13,42 (s, 1H, NH-ľ), 10,81 (s, 1H, NH1), 7,98 (d, J = 1,89 Hz, 1H, H-4), 7,66 (s, 1H, Hvinyl), 7,17 (dd, J = 1,89,

8,23 Hz, 1H, H-6), 6,79 (d, J = 8,23 Hz, 1H, H-7), 2,38 (t, J = 7,23 Hz, 2H, (CH₃)₂NCH₂CH₂CH₂- 4'), 2,27 (s, 3H, CH₃-3'), 2,25 (s, 3H, CH₃-5'), 2,16 (t, J = 7,23 Hz, 2H, (CH₃)₂NCH₂CH₂CH₂-4'), 2,10 (s, 6H, (CH3)₂NCH₂CH₂CH₂- 4'),

1,51 (kvintet, J = 7,23 Hz, 2H, (CH^NCHaCHjCH^'),

MS m/z (relatívna intenzita, %) 401 ([M-l]⁺, 100) a 403 ([M+l]⁺, 100). Príklad 50

3-[4-(3-dimetylaminopropy 1)-3,5-dimety 1-1 H-pyrol-2-y lmety lén]-6-fenyl- l,3-dihydroindol-2-ón

Postupom z Príkladu 2 sa získa 83 % výťažok požadovanej zlúčeniny ako oranžovej pevnej látky:

’HNMR (360 MHz, DMSO-de) δ 13,38 (s, 1H, NH-ľ), 10,81 (s, 1H, NH1), 7,77 (d, J = 7,82 Hz, 1H, H-4), 7,62 (d, J = 7,59 Hz, 2H, H-2, 6), 7,58 (s, 1H, H-vinyl), 7,44 (t, J = 7,59 Hz, 2H, H-3, 5), 7,32 (t, J = 7,59 Hz, 1H, H4), 7,27 (dd, J = 1,11, 7,82 Hz, 1H, H-5), 7,09 (d, J = 1,11 Hz, 1H, H-7), 2,39 (t, J = 7,18 Hz, 2H, (CH₂)₂NCH₂CH₂CH2-4'), 2,29 (s, 3H, CH₃-3'), 2,25 (s, 3H, CH₃-5'), 2,17 (t, J = 7,18 Hz, 2H, (CH₃)₂NCH₂CH₂CH₂- 4'), 2,11 (s, 6H, (CH₃)₂NCH₂CH₂CH₂-4'), 1,53 (kvintet, J = 7,18 Hz, 2H, (CH₃)₂NCH₂CH₂CH₂-

4),

MS m/z (relatívna intenzita, %) 399 (M⁺, 100).

132 ·· ·· ·· ·· ·· • · · · · · · · · · · • · · · β · · • · · e · · ·

Príklad 51

3-[4-(3-dimetyIaminopropyl)-3,5-dimetyl-lH-pyrol-2-ylmetylén]-6-(2metoxyfeny 1)-1,3-dihydroindol-2-ón

Postupom z Príkladu 2 sa získa 83 % výťažok požadovanej zlúčeniny ako žltej pevnej látky.

‘HNMR (360 MHz, DMSO-d₆) δ 13,38 (s, 1H, NH-ľ), 10,72 (s, 1H, NH1), 7,70 (d, J = 8,06 Hz, 1H, H-4), 7,55 (s, 1H, Hvinyl), 7,28-7,36 (m, 2H, H4, 5), 7,14 (d, J = 8,32 Hz, 1H, H-6), 7,04 (dd, J = 1,21, 8,06 Hz, 1H, H-5),

6,99 (d, J = 7,42 Hz, 1H, H-3), 6,99 (d, J = 1,21 Hz, 1H, H-7) 3,76 (s, 3H, OCH₃-2), 2,39 (t, J = 7,24 Hz, 2H, (CH₃)₂NCH₂CH₂CH₂-4'), 2,28 (s, 3H, CH₃3'), 2,25 (s, 3H, CH₃-5'), 2,18 (t, J = 7,24 Hz, 2H, (CH₃)₂NCH₂CH₂CH₂-4^I), 2,11 (s, 6H, (CH₃)₂NCH₂CH₂CH₂-4')_J 1,53 (kvintet, J = 7,24 Hz, 2H, (CH₃)₂NCH₂CH₂CH₂-4'),

MS m/z (relatívna intenzita, %) 429 (M⁺, 100).

Príklad 52

3-[4-(3-dimetylaminopropyl)-3,5-dimetyl-lH-pyrol-2-ylmetylén]-6-(3metoxyfenyl)-l,3-dihydroindol-2-ón

Postupom z Príkladu 2 sa získa 83 % výťažok požadovanej zlúčeniny ako červenej pevnej látky.

*HNMR (360 MHz, DMSO-d₆) δ 13,38 (s, 1H, NH-ľ), 10,80 (s, 1H, NH1), 7,60 (d, J = 8,06 Hz, 1H, H-4), 7,57 (s, 1H, H- vinyl), 7,35 (t, J = 8, 15 Hz, 1H, H-5), 7,26 (dd, J = 1,39, 8,06 Hz, 1H, H-5), 7,19 (d, br, J = 8,15 Hz, H6), 7,13 (m, 1H, H-2), 7,09 (d, J = 1,39 Hz, 1H, H-7), 6,90 (dd, J = 2,57, 8,15 Hz, 1H, H-4), 3,81 (s, 3H, OCH₃-3), 2,39 (t, J = 7,17 Hz, 2H, (CH₃)₂NCH₂CH₂CH₂-4'), 2,29 (s, 3H, CH₃-3'), 2,25 (s, 3H, CH₃-5'), 2,17 (t, J =

7,17 Hz, 2H, (CH₃)₂NCH₂CH₂CH₂-4'), 2,11 (s, 6H, (CH₃)₂NCH₂CH₂CH₂-4'), 1,53 (kvintet, J = 7,17 Hz, 2H, (CH₃)₂NCH₂CH₂CH₂-4^,)_J

133 φ φ Φ φ ···· φφφ • φφφ φ · · φ φ φφφ φφφ φφφ ···· φφ φφφφ φφ φφφ

MS m/z (relatívna intenzita, %) 429 (Μ⁺, 100).

Príklad 53

3-[4-(3-dimetylaminopropyl)-3,5-dimetyl-lH-pyrol-2-ylmetylén]-6-(4metoxy fény 1)-1,3-dihydroindol-2-ón

Postupom z Príkladu 2 sa získa 83 % výťažok požadovanej zlúčeniny ako hnedej pevnej látky.

*HNMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 13,35 (s, 1H, NH-ľ), 10,77 (s, 1H, NH1), 7,73 (d, J = 7,82 Hz, 1H, H-4), 7,56 (d, J = 8,83 Hz, 2H, H-2, 6), 7,54 (s, 1H, H-vinyl), 7,20 (dd, J = 1,64, 7,82 Hz, 1H, H-5), 7,04 (d, J = 1,64 Hz, H-7), 7,00 (d, J = 8,83 Hz, 2H, H-3, 5), 3,78 (s, 3H, OCH3-4), 2,39 (t, J = 7,24 Hz, 2H, (CHjjaNCHjCHjCHí^'), 2, 28 (s, 3H, CH₃-3'), 2,25 (s, 3H, CH₃-5'), 2,17 (t, J = 7,24 Hz, 2H, (CH₃)2NCH2CH2CH2-4'), 2,11 (s, 6H, (CH₃)₂NCH₂CH2CH2-

4) 1,52 (kvintet, J = 7,24 Hz, 2H, (CH₃)2NCH2CH₂CH2-4')

MS m/z (relatívna intenzita, %) 429 (M+, 100)

Príklad 54

5-chlór-3-[4-(3-dimetylaminopropyl)-3,5-dimetyl-lH-pyrol-2-ylmetylén]-

1,3-dihy droindol-2-ón

Postupom z Príkladu 2 sa získa 53 % výťažok požadovanej zlúčeniny ako hnedej pevnej látky.

’HNMR (360 MHz, DMSO-d₆) δ 13,43 (s, 1H, NH-ľ), 10,84 (s, 1H, NH1), 7,87 (d, J = 1,85 Hz, 1H, H-4), 7,66 (s, 1H, H-vinyl), 7,05 (dd, J = 1,85,

8,15 Hz, 1H, H-6), 6,83 (d, J = 8,15 Hz, 1H, H-7), 2,36-2,45 (m, 4H, (CH₃)₂NCH2CH2CH2-4·), 2,30 (s, 6H, (CH₃)₂NCH2CH₂CH2-4'), 2,28 (s, 3H, CH₃-3'), 2,26 (s, 3H,CH₃-5'), 1,58 (kvintet, J = 7,52 Hz, 2H, (CH₃)2NCH2CH2CH2-4^,)_> ·· ·· • · · · • · • · · • ·

134 ·· ···

MS m/z (relatívna intenzita, %) 357 ( [M-l]⁺, 100).

Príklad 55

6-chlór-3-[4-(3-dimetylaminopropyl)-3,5-dimetyI-lH-pyrol-2-ylmetylén]- l,3-dihydroindol-2-ón

Postupom z Príkladu 2 sa získa 77 % výťažok požadovanej zlúčeniny

MS EI 357 [M-l]⁺.

Príklad 56

3-[4-(3-dimetylaminopropyl)-3,5-dimetyl-lH-pyrol-2-ylmetylén]-5metoxy-l,3-dihydroindol-2-ón

Postupom z Príkladu 2 sa získa 77 % výťažok požadovanej zlúčeniny.

MS EI 353 [M]⁺.

Príklad 57

3-[4-(3-dimetylaminopropyl)-3,5-dimetyl-lH-pyrol-2-ylmetylén]-6metoxy-l,3-dihydroindol-2-ón

Postupom z Príkladu 2 sa získa 74 % výťažok požadovanej zlúčeniny.

Príklad 58

3-[4-(3-dimetylaminopropyl)-3,5-dimetyl-lH-pyrol-2-yImetylén]-5-metyl- l,3-dihydroindol-2-ón

Postupom z Príkladu 2 sa získa 45 % výťažok požadovanej zlúčeniny.

·· ·· • · · · • · • ·

135 • · · ·· ···· ·· • · · • · • · · • e ···

MS El 337 [M]⁺.

Príklad 59

3-[4-(3-dimetylaminopropyl)-3,5-dimetyl-IH-pyrol-2-ylmety lén]-4-metyl- l,3-dihydroindol-2-ón

Postupom z Príkladu 2 sa získa 99 % výťažok požadovanej zlúčeniny.

’HNMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ 13,45 (s, br, 1H, NH), 10,78 (s, br, 1H, NH), 7,50 (s, 1H, H-vinyl), 6,98 (t, J = 8,1 Hz, 1H, H-6), 6,76 (t, J = 8,1 Hz, 2H, H-5 & H-7), 2,88 (m, 2H, CH₂), 2,64 (s, 6H, 2xCH₃), 2,56 (s, 3H, CH₃), 2, 43 (t, J = 7,4 Hz, 2H, CH₂), 2,29 (s, 3H, CH₃), 2, 19 (s, 3H, CH₃), 1,65-1,75 (m, 2H, CH₂),

MS El 337 [M]⁺.

Príklad 60

3-[4-(3-dimetylaminopropyl)-3,5-dimetyI-lH-pyrol-2-ylmetylén]-4-(2hydroxy-etyl)-l,3-dihydroindol-2-ón

Postupom z Príkladu 2 sa získa 98 % výťažok požadovanej zlúčeniny. Príklad 61

Amid 3-[4-(3-dimetylaminopropyl)-3,5-dimetyl-lH-pyrol-2-ylmetylén]2-oxo-2,3-dihydro-lH-indol-5-sulfónovej kyseliny

Postupom z Príkladu 2 sa získa 59 % výťažok požadovanej zlúčeniny.

’HNMR (300 MHz, DMSO-de) δ 13,41 (s, 1H, NH-ľ), 11,12 (s, 1H, NH1), 8,16 (d, J = 1,78 Hz, 1H, H-4), 7,66 (s, 1H, H-vinyl), 7,55 (dd, J = 1,78,

8,18 Hz, 1H, H-6), 7,11 (s, br, 2H, H₂NSO₂-5), 6,98 (d, J = 8,18 Hz, 1H, H-7),

136 ·· ·· ·· ·· ·· · • · · · ···· ···· • · · · ···· • ···· ···· · • · ··· ··· ···· ···· ·· ···· ·· ···

2,47-2,50 (m, 2H, (CH₃)₂NCH₂CH₂CH₂-4'), 2,41 (t, J = 7,37 Hz, 2H, (CH₃)₂NCH₂CH₂CH₂-4'), 2,36 (s, 6H, (CH₃)₂NCH₂CH₂CH₂-4^I), 2,30 (s, 3H, CH₃-3'), 2,28 (s, 3H, CH₃-5'), 1,61 (kvintet, J = 7, 37 Hz, 2H, (CH₃)₂NCH₂CH₂CH₂-4').

Príklad 62

Izopropylamid 3-[4-(3-dimetylaminopropyl)-3,5-dimetyl-lH-pyrol-2-ylmetylén]-2-oxo-2,3-dihydro-lH-indol-5-sulfónovej kyseliny

Postupom z Príkladu 2 sa získa 64 % výťažok požadovanej zlúčeniny.

MS EI 444 [M]⁺·

Príklad 63

3-[4-(3-dimetylaminopropyl)-3,5-dimetyl-lH-pyrol-2-ylmetylén]-5(morfolin-4-sulfonyl)-l,3-dihydroindol-2-ón

Postupom z Príkladu 2 sa získa 90 % výťažok požadovanej zlúčeniny.

MS EI 472 [M]⁺.

Príklad 64

Dietylamid 3-[4-(3-di mety lamino propyl)-3,5-di metyl-lH-pyrol-2-ylmetylén]-2-oxo-2,3-dihydro-lH-indol-5-sulfónovej kyseliny

Postupom z Príkladu 2 sa získa 92 % výťažok požadovanej zlúčeniny:

’HNMR (300 MHz, DMSO-d_fi) δ 13,5 (s, br, 1H, NH), 12,21 (s, br, 1H, NH), 8,18 (d, J = 1,8 Hz, 1H, H-4), 7,84 (s, 1H, H-vinyl), 7,44 (dd, J = 1,8,8,4 Hz, 1H, H-6), 7,05 (d, J = 8,4 Hz, 1H, H-7), 2,59 (s, 6H, 2xCH₃), 2,59-2,64 (m, • ·

137

2Η, CH₂), 2,44 (s, 6H, 2xCH₃), 2,38-2,44 (m, 2H, CH₂), 2,31 (s, 6H, 2xCH₃),

1,59-1,69 (m, 2H, CH₂),

MS El 430 [M]⁺.

7. Biologické hodnotenie

Prínosom tohto vynálezu je dosiahnutie spektra biologickej aktivity ktorejkoľvek danej série zlúčenín. Vo svojich súčasných výhodných uskutočneniach sa tento vynález vzťahuje na nové pyrol substituujúce 2-indolinóny vykazujúce schopnosť modulovať aktivitu RTK, CTK a STK. Nasledujúce testy sú použité na výber tých zlúčenín, ktoré vykazujú optimálny stupeň požadovanej aktivity.

A. Postupy testov

Nasledujúce in vitro testy je možné použiť na stanovenie úrovne aktivity a účinku rôznych zlúčenín tohto vynálezu na jednu alebo viaceré proteínkinázy. Podobné testy môžu byť podobným spôsobom použité pre akékoľvek proteinkinázy s použitím techník, ktoré sú pracovníkom v odbore dobre známe.

Tu opísaný bunkový/katalytický test je realizovaný na formáte ELISA testu. Všeobecný postup je nasledujúci: zlúčenina sa transportuje do bunky exprimujúcou testovanou kinázu, buď prirodzene, alebo v dôsledku rekombinácie, po určitú zvolenú dobu, po ktorej, ak je testovanou kinázou receptor, sa pridá ligand známy na aktiváciu tohto receptoru. Bunky sa lyžujú a lyzát je prenesený do jamiek ELISA platne, ktorá bola najskôr spracovaná špecifickou protilátkou rozpoznávajúcou substrát tejto enzymatickej fosforylačnej reakcie. Bezsubstrátové zložky bunkového lyzátu sú odmyté a množstvo fosforylácie substrátu je určené pomocou protilátky špecificky rozpoznávajúcej fosfotyrozín v porovnaní s kontrolnými bunkami, ktoré neprišli do styku s testovanou zlúčeninou. Tu opísaný bunkový/biologický test merá množstvo DNA vytvorenej ako odpoveď na aktiváciu testovanej kinázy, ktorá je všeobecne mierou proliferačnej odpovedi. Všeobecný postup tohto testu je nasledujúci: zlúčenina je trans138 ·· ·· ·· ·· ··· ·· · · ·· · · ··· • ······· • ···· ···· · • · · · ·· · · ··· ···· ·· ···· ·· ··· portovaná do buniek exprimujúcich testovanú kinázu, buď prirodzene, alebo v dôsledku rekombinácie, na vybrané časové obdobie, po ktorom, ak je testovaná kináza receptorom, je pridaný ligand známy na aktiváciu tohto receptoru. Po inkubácii najmenej cez noc je pridané činidlo na značenie DNA, ako brómdeoxyuridín (BrdU) alebo 3H-tymidín. Množstvo značenej DNA sa určí buď protilátkou proti BrdU alebo meraním rádioaktivity v porovnaní s kontrolnými bunkami, ktoré neprišli do kontaktu s testovanou zlúčeninou.

Bunkové/katalytické testy

Na detekciu a meranie prítomnosti aktivity PK je možné použiť ELISA test (Enzýme linked immunosorbent assay). ELISA sa vykoná podľa známych protokolov, ktoré sú opísané napr. v Voliér, et. al., 1980, Enzýme- Linked Immunosorbent Assay, v: Manual of Clinical Immunology, 2.vyd., editované Rose a Friedmanom, str. 359-371 Am. Soc. of Microbiology, Washington, D.C.

Uvedený protokol môže byť upravený na určenie aktivity s ohľadom na špecifickú PK. To znamená, výhodný protokol na vykonanie ELISA experimentov pre špecifické proteín kinázy je uvedený nižšie. Viac-menej úpravy týchto protokolov na určenie aktivity zlúčeniny ostatných členov rodiny RTK, takisto tak ako pre CTK a STK, sú pracovníkom v odbore dobre známe.

Test FLK-1

Vykoná sa ELISA test na meranie kinázovej aktivity receptoru FLK-1 a špecifickejšej inhibície alebo aktivácie tyrozínkinázovej aktivity receptoru FLK-1. Špecificky môže byť nasledujúci test vykonaný na zmeranie kinázovej aktivity receptora FLK-1 v bunkách geneticky upravených na expresiu Flk-1. Látky a činidlá.

a. 96-jamkové ELISA platne Corning (Corning Katalóg č. 25805-96),

b. Cappelovo kozie protikráličie IgG (katalóg, č. 55641),

c. PBS (Gibco katalóg, č. 450-1300EB),

d. TBSW pufer (50 mM Tris (pH 7,2), 150 mM NaCl a 0,1 % Tween-20).

··

139

e. Zásobný etanolamín (10 = etanolamín (pH 7,0), skladovaný pri 4 °C,

f. HNTG pufer (20 mM HEPES pufer (pH 7,5), 150 mM NaCl, 0,2 % Triton X-100 a 10 % glycerol),

g. EDTA (0,5 M (pH 7,0) ako zásobný 100X),

h. Ortovanadičnan sodný (0,5 M ako zásobný 100X),

i. Pyrofosfát sodný (0,2 M ako zásobný 100X),

j. Polypropylénové 96-jamkové platne NUNC s dnom v tvare V (Applied Scientific katalóg, č. AS-72092),

k. Bunky NIH3T3 C7#3 (bunky exprimujúce FLK-1),

l. DMEM s IX vysokým glukózo L-glutamínom (katalóg, č. 11965-050),

m. FBS, Gibco (katalóg č. 16000-028),

n. L-glutamín, Gibco (katalóg, č. 25030-016),

o. VEGF, PeproTech, Inc. (katalóg, č. 100-20) (uchovávaný ako 1 μg/100 μΐ zásobný roztok v Milli-Q dH₂O a skladovaný pri -20°C),

p. Afinitne purifikované anti-FLK-1 antisérum,

q. UB40 monoklonálna protilátka proti fosfotyrozínu (viď Fendley, et. al., 1990, Cancer Research 50:1550-1558),

r. EIA stupeň kozej protikráličej IgG-POD (BioRad katalóg, č. 172-1011),

s. Roztok 2,2-azino-bis(3-etylbenz-tiazolín-6-kyseliny sulfónovej (ABTS) (100 mM kyselina citrónová (bezvodá), 250 mM Na₂HPO₄ (pH 4,0), 0,5 mg/ml ABTS (Sigma katalóg, č. A-1888), roztok sa až do použitia uchováva v tme pri 4 °C,

t. H₂O₂ (30 % roztok) (Fischer katalóg, č. H325), • ·

140

u. ABTS/ H2O2 (15 ml roztoku ABTS, 2 μΐ H₂O₂) pripravené 5 minút pred použitím a ponechané pri izbovej teplote,

v. 0,2 M zásoba HC1 v H₂O,

w. dimetylsulfoxid (100 %) (Sigma katalóg, č. D-8418) a

x. Trypsín-EDTA (Gibco BRL katalóg, č. 25200-049).

Protokol

1. Corning 96-jamkovej ELISA platne s 1,0 μβ Cappelovo protikráličieho IgG antiséra v 0,1 M Na₂CO₃ pH 9,6 v každej jamke. Platne sa spracovávajú cez noc pri 4 °C. Ak sú platne skladované pri teplote 4 °C, môžu byť uchovávané až dva týždne.

2. Bunky sa pestujú v rastovom médiu (DMEM, doplnený 2,0 mM Lglutamínom, 10 % FBS) vo vhodných kultivačných miskách až do súvislého pokrytia pri 37 °C, v 5 % CO₂.

3. Bunky sa zozbierajú trypsinizáciou a vysejú do 96-jamkových Corning 25850 polystyrénových platní s okrúhlym dnom v množstve 25 000 buniek/jamka v 200 μΐ rastového média.

4. Bunky sa pestujú aspoň jeden deň pri teplote 37 °C, 5 % CO₂.

5. Bunky sa omyjú IX D-PBS.

6. Do každej jamky sa pridá 200 μΐ hladového média (DMEM, 2,0 mM Lglutamín, 0,1 % FBS). Inkubuje sa cez noc pri 37°C v5% CO₂.

7. Zlúčeniny sa nariedia 1 : 20 na 96-jamkovej polypropylénovej platni s použitím hladového média. Na použitie pre kontrolné bunky sa nariedi dimetylsulfoxid 1:20

8. Z kultivačných 96-jamkovýh platní s bunkami sa odstráni hladové médium a do každej jamky sa pridá 162 μΐ čerstvého hladového média.

• · ·· ··

141

9. Do každej jamky sa pridá 18 μΐ riedenia zlúčeniny riedenej 1 : 20 (z kroku 7) a riedenie 1 : 20 dimetylsulfoxidu ku kontrolným bunkám (+/- VEGF), na konečné riedenie 1 : 2000 po stimulácii buniek. Konečná koncentrácia dimetylsulfoxidu je 0,5 %. Platňa sa inkubuje pri 37 °C v 5 % CO₂ po dobu dvoch hodín.

10. Nenaviazaná protilátka sa s ELISA platničiek odstráni ich prevrátením, aby tekutina vytiekla. Platne sa trikrát omyjú TBSW + 0,5 % etanolamín, pH 7,0. Prebytočná tekutina a bubliny sa odstránia vytrepaním platne na papierový uterák.

11. Platne sa blokujú TBSW + 0,5 % etanolamín, pH 7,0 v množstve 150 μΐ na každú jamku. Platňa sa inkubuje tridsať minút za stáleho trepania na trepačke pre mikrotitračné platne.

12. Platne sa trikrát omyjú postupom opísaným v kroku 10.

13. Do každej jamky sa pridá 0,5 μΙ afinitne purifikovaného anti-FLU-1 polyklonálneho králičieho antiséra. Každá jamka sa doplní do konečného objemu 150 μΐ TBSW + 0,5 % etanolamín pH 7,0. Platňa sa inkubuje tridsať minút za stáleho trepania.

14. K bunkám sa pridá 180 μΙ hladového média a bunky sa stimulujú 20 μΙ/jamka 10,0 mM ortovanadičnanom sodným a 500 ng/ml VEGF (čím sa dosiahne konečná koncentrácia 1,0 mM ortovanadičnanu sodného a 50 ng/ml VEGF v každej jamke) po dobu 8 minút pri 37 °C, 5 % CO₂. Jamky s negatívnou kontrolou sú naplnené len hladovým médiom.

15. Po ôsmich minútach sa médium z buniek odstráni a platňa sa raz omyje 200 μΙ/jamka PBS.

16. Bunky sa lyžujú v 150 μΙ/jamka HNTG za stáleho trepania pri izbovej teplote po dobu piatich minút. HNTG formulácia zahrnuje ortovanadičnan sodný, pyrofosfát sodný a EDTA.

17. ELISA platňa sa trikrát omyje spôsobom opísaným v kroku 10.

·· ·· ·· ·· ·· · ···· ···· ·· ·· • ······· • 9 9 9 9 ····· • · · ·· ··· ···· ···· ·· ···· ·· ···

142

18. Bunkový lyzát sa s kultivačnej platne prenesie na ELISA platňu a inkubuje sa za stáleho trepania dve hodiny. Na prenesenie bunkového lyzátu sa pri zoškrabovaní jamiek vypúšťa a nasáva obsah pipety.

19. Platňa sa trikrát omyje spôsobom opísaným v kroku 10

20. ELISA platňa sa inkubuje s 0,02 μg/jamka UB40 v TBSW + 0,5 % etanolamín. Jamky sa doplnia do konečného objemu 150 μΐ/jamka. Inkubuje sa za stáleho trepania 30 minút.

21. Platňa sa trikrát omyje spôsobom opísaným v kroku 10.

22. ELISA platňa sa inkubuje s 1 : 10 000 riedeným EIA kozím anti-myším IgG konjugovaným chrenovou peroxidázou v TBSW + 0,5 % etanolamín, pH 7,0. Doplní sa do konečného objemu 150 μΐ/jamka. Inkubuje sa za stáleho trepania tridsať minút.

23. Platňa sa trikrát omyje spôsobom opísaným v kroku 10.

24. Do každej jamky sa pridá 100 μΐ ABTS/H2O2. Inkubuje sa desať minút za stáleho trepania.

25. Pridá sa 100 μΐ 0,2 M HC1 do konečnej koncentrácie 0,1 M HC1, aby sa zastavil vývoj farebnej reakcia. Trepe sa 1 minútu pri izbovej teplote. Bubliny sa odstránia slabým prúdom vzduchu a ELISA platňa sa odpočíta na mikrofotometry pre ELISA mikrotitracné platne pri 410 nm.

Test na EGF receptor - HER2 chimérický receptor v celých bunkách

Kinázová aktivita HER2 v celých bunkách EGFR-NIH3T3 sa meria nasledujúcim spôsobom:

Látky a činidlá

a. EGF: zásobná koncentrácia: 16,5 ILM, EGF 201, TOYBO, Co. Ltd. Japan.

b. 05-101 (UBI) (monoklonálna protilátka rozpoznávajúca extracelulárnu doménu EGFR).

143

·· • · · ·	• · •	·· • ·	• · ·
4	•	« ·
• · ·	•	•	• ·	•
• ·	•	•	•	•
	··	····	··		• ·

c. Protilátka proti fosfotyrozínu (anti-Ptyr) (polyklonálna) (viď Fendley, et al., supra).

d. Detekčná protilátka: kozia protikráličia IgG konjugovaná chrenovou peroxidázou, TÁGO, Inc., Burlingame, CA.

e. TBST pufer:

Tris-HCl, pH 7,2 50 mM

NaCI	150 mM
Triton X-	100 0,1
HNTG 5X zásobný
HEPES	0,1 M
NaCI	0,75 M
Glycerol	50 %
Triton X-100	1,0 %

g. ABTS zásobný:

Kyselina citrónová	100 mM
Na2HPO4	250 mM
HC1, koncentr.	0,5 mM
ABTS*	0,5 mg/ml

* (2,2'-azinobis(3-etylbenztiazolínsulfónová kyselina) ··

144

h. Zásobné roztoky:

EDTA 100 mM pH 7,0

Na₃VO₄ 0,5 M

Na₄(P₂O₇) 0,2 M

Postup

Spracovanie ELISA platne

1. ELISA platne (Corning, 96-jamkové, katalóg. #25805-96) sa spracovávajú s protilátkou 05 - 101 v množstve 0,5 gg na jamku v PBS, konečný objem 100 μΙ/jamka a uskladnia sa cez noc pri teplote 4 °C. Spracované platne sú použiteľné až 10 dní, ak sú skladované pri teplote 4 °C.

2. V deň použitia sa odstráni pufer a nahradí sa 100 μΐ blokovacieho pufru (5 % Carnation instantné odtučnené sušené mlieko v PBS). Platňa sa inkubuje a trepe pri izbovej teplote (okolo 23 °C až 25 °C) po dobu 30 minút. Tesne pred použitím sa odstráni blokovaci pufer a platnička sa štyrikrát omyje TBST pufrom.

Vysievanie buniek

1. Na tento test môže byť použitá bunková línia NIH3T3 so zvýšenou expresiou chimérického receptoru obsahujúceho EGFR extracelulárnu doménu a intracelulárnu kinázovú doménu HER2.

2. Na experiment sa vyberú misky s 80 - 90 % súvislým pokryvom. Bunky sa trypsinizujú a reakcia sa zastaví pridaním 10 % fetálneho hovädzieho séra. Bunky sa suspendujú v DMEM médiu (10 % CS DMEM médium) a centrifugujú sa raz pri 1500 rpm pri izbovej teplote po dobu 5 minút.

3. Bunky sa resuspendujú vo vysievacom médiu (DMEM, 0,5 % hovädzie sérum) a spočítajú použitím trypánovej modrej. Prijateľná je životnosť cez 90 %. Bunky sa vysievajú v DMEM médiu (0,5 % hovädzie sérum) v hustote 10

145 ·· ·· ·· ·· ·· • · · · · · · · ·· • · · · · · · • · · · · ···· • · · · · · · ···· ···· ·· ···· ··

000 buniek na jamku, 100 μΐ na jamku na 96-jamkovej mikrotitračnej platni. Vysiate bunky sa inkubujú v 5 % CO₂ pri 37 °C po dobu približne 40 hodín.

Postupy testu

1. Vysiate bunky sa skontrolujú, či nie sú kontaminované, pod invertovaným mikroskopom. Zásobné liečivo (10 mg/ml v DMSO) sa nariedi DMEM médiom 1 : 10, potom sa prenesie 5 μΐ do jamky TBST do konečného riedenia liečiva 1 : 200 a konečnej koncentrácie DMSO 1 %. Kontrolné jamky majú len DMSO. Inkubuje sa dve hodiny v 5 % CO₂ pri 37 °C.

2. Pripraví sa EGF ligand: zásobný EGF v DMEM sa nariedi tak, aby sa pri prenose 10 μΐ riedeného EGF (riedenie 1 : 12) dosiahlo konečnej koncentrácie 100 nM.

3. Pripraví sa čerstvé HNTG* v množstve dostatočnom na 100 μΐ do každej jamky a umiestni sa na ľad.

HNTG* (10 ml):

zásobný HNTG	2,0 ml
Milli-Q H2O	7,3 ml
EDTA, 100 mM, pH 7,0	0,5 ml
Na3VO4 (0,5 M)	0,1 ml
Na4(P2O7) (0,2 M)	0,1 ml
Po 120 minútach inkubácie s liečivom sa k bunkám pridá pripravený ligand SGF v množstve 10 μΐ na jamku do konečnej koncentrácie 100 nM. Kontrolné jamky majú len DMEM. Inkubuje sa za stáleho trepania pri izbovej tep-

lote po dobu 5 minút.

5. Liečivo, EGF a DMEM sa odstráni. Bunky sa dvakrát omyjú PBS. K bunkám sa v množstve 100 μΐ na jamku prenesie HNTG*. Umiestni sa na ľad na 5

146 ·· ·· ·· ·· ·· · ···· ···· ···· • · · · ···· • · · · · ···· · • · ··· · · · ··«· ···· ·· ···· ·· ··· minút. Medzi tým sa z inej ELISA platne odstráni blokovací pufer a omyje sa TBST vyššie opísaným spôsobom.

Pipetovacou špičkou pevne nasadenou na mikropipetu sa bunky zoškrabujú s platne a homogenizujú sa opakovaným nasávaním a vypúšťaním HNTG* lyzovacieho pufru pipetou. Lyzát sa prenesie na spracovanú, blokovanú a omytú ELISA platňu. Inkubuje sa pri izbovej teplote jednu hodinu.

7. Lyzát sa odstráni a platňa sa štyrikrát omyje TBST. Na platňu sa prenesie čerstvo nariedená protilátka proti fosfotyrozínu v množstve 100 μΐ na jamku. Inkubuje sa za stáleho trepania pri izbovej teplote po dobu 30 minút za prítomnosti protilátky proti fosfotyrozínu (riedenie 1:3000 v TBST).

8. Protilátka proti fosfotyrozínu sa odstráni a platňa sa štyrikrát omyje TBST. Na platňu sa prenesie čerstvo nariedená TÁGO protikráličia IgG protilátka v množstve 100 μΐ na jamku. Inkubuje sa za stáleho trepania pri izbovej teplote 30 minút (riedenie protikráličej IgG protilátky 1 : 3000 v TBST).

9. Odstráni sa detekčná TÁGO protilátka a platňa sa omyje štyrikrát TBST. Na platňu sa prenesie čerstvo nariedený roztok ABTS/H2O2 v množstve 100 μΐ na jamku. Inkubuje sa za stáleho trepania pri izbovej teplote po dobu 20 minút. (roztok ABTS/H2O2: 1,0 μΐ 30 % H₂O₂ v 10 ml zásobného ABTS).

10. Reakcia sa zastaví pridaním 50 μΐ 5 N H2SO4 (voliteľné), a určí sa optická hustota pri 410.

11. Maximálny fosfotyrozínový signál je určený odpočítaním hodnôt negatívnych kontrol od pozitívnych kontrol. Percento inhibície fosfotyrozínového obsahu pre extrakt obsahujúci bunky sa potom vypočíta po odpočítaní negatívnych kontrol.

Test PDGF-R

Všetky bunkové kultivačné média, glutamín a fetálne hovädzie sérum je nakúpené od Gibco Life Technologies (Grand Island, NY), pokiaľ nie je určené inak. Všetky bunky sú pestované vo vlhkej atmosfére 90 - 95 % vzduchu a 5 -

147 • · · ·· ···· % CO₂ pri 37 °C. Všetky bunkové línie sa rutinne presadzujú dvakrát týždenne a určuje sa neprítomnosť mykoplazmat metódou mykotestu (Gibco).

Na ELISA testy sa pestujú bunky (U1242, získané od Josepha Schlessingera, NYU) do súvislého pokrytia 80 - 90 % v rastovom médiu (MEM s 10 % FBS, NEAA, 1 mM NaPyr a 2 mM GLN) a vysievajú sa na 96-jamkové platne pre tkanivové kultúry v 0,5 % sére v množstve 25 000 až 30 000 buniek na jamku. Po inkubácii cez noc v médiu obsahujúcom 0,5 % sérum je bunkám médium zamenené za bezsérové médium a bunky sú ošetrené testovanou zlúčeninou po dobu 2 hodín v 5 % CO₂ pri 37 °C v inkubátore. Bunky sa potom stimulujú ligandom 5-10 minút, po čom nasleduje lýza pomocou HNTG (20 mM HEPES, 150 mM NaCl, 10 % glycerol, 5 mM EDTA, 5 mM Na₃VO₄, 0,2 % Triton X-100 a 2 mM NaPyr). Bunkový lyzát (0,5 mg/jamka v PBS) sa prenesie na ELISA platne, ktoré boli vopred spracované protilátkou špecifickou na receptor a ktorá bola blokovaná 5 % mliekom v TBST (50 mM Tris-HCl pH 7,2, 150 mM NaCl a 0,1 % Triton X-100) pri izbovej teplote 30 minút. Lyzáty sa inkubujú za stáleho trepania pri izbovej teplote jednu hodinu. Platne sa štyrikrát omyjú TBST a potom sa inkubujú s polyklonálnou protilátkou proti fosfotyrozínu pri izbovej teplote 30 minút. Prebytočná protilátka proti fosfotyrozínu sa odstráni štvornásobným opláchnutím platne TBST. Na ELISA platňu sa pridá kozia protikráličia IgG protilátka na dobu 30 minút pri izbovej teplote, po čom nasleduje opäť štvornásobné omytie TBST. Na spustenie farebnej reakcie sa na ELISA platne pridá ABTS (100 mM kyselina citrónová, 250 mM Na₂HPO₄ a 0,5 mg/mL 2,2'-azino-bis(3-etylbenztiazolíne-6-sulfónová kyselina)) plus H₂O₂ (1,2 ml 30 % H₂O₂ do 10 ml ABTS). Pätnásť až tridsať minút po pridaní ABTS sa zaznamená absorbancia pri 410 nm s referenčnou vlnovou dĺžkou 630 nm.

Test receptoru IGF-1

Nasledujúci protokol môže byť použitý na meranie hladiny fosfotyrozínu na receptore IGF-1, ktorá indikuje tyrozínkinázovú aktivitu IGF-1 receptoru.

Látky a činidlá.

a. Bunkovou líniou použitou v tomto teste je 3T3/IGF-1R, bunková línia geneticky upravená na zvýšenú expresiu IGF-1 receptora.

148 ·· ·· ·· ·· ·· • · · · ···· ··· • · · · · · · • · · · · · · ··· ···· ·· ···· ·· ·

b. NIH3T3/IGF-1R sa pestuje v inkubátore s 5 % CO₂ pri 37 °C. Rastovým médiom je DMEM + 10 % FBS (tepelne inaktivované) + 2 mM L-glutamin.

c. Afinitne purifikovaná anti-IGF-lR protilátka 17-69.

d. D-PBS:

KH2PO4	0,20 g/l
kh2po4	2,16 g/l
KC1	0,20 g/l
NaCl	8,00 g/l (pH 7,2)
e. Blokovací pufer:	TBST plus 5 % mlieko (Carnation instantné odtučnené

sušené mlieko).

f. TBST pufer:

Tris- HC1	50 mM
NaCl	150 mM (pH 7,2/HCl 1 N)
glycerol	10 %
Triton X-100	0,2 %

g. HNTG pufer:

HEPES	20 mM
NaCl	150 mM (Ph 7,2/HCl 1 N)
glycerol	10 %
Triton X-100	0,2 %

Pripraví sa zásobný roztok (5X) a uchováva sa pri 4 °C.

h. EDTA/HC1: 0,5 M pH 7,0 (NaOH) ako 100X zásobný roztok.

·· ·· ·· ·· ·Φ • · · ···· ··· • · · · · · ·

149 • · ··· ··· ··· ···· ·· ···· ·· ···

i. Na3VO₄. 0,5 M ako 100X zásobný. Alikvotné množstvo sa uchováva pri 80 °C.

j. Na₄P₂O₇: 0,2 M ako 100X zásobný.

k. Inzulínu podobný rastový faktor 1 od Promegy (kat. # G5111).

l. Králičie polyklonálne antisérum proti fosfotyrozínu.

m. Kozí protikráličí IgG, POD konjugát (detekčná protilátka), TÁGO, Inc., Burlingame, CA.

n. ABTS roztok (2,2'-azinobis(3-etylbenztiazolínsulfónovej kyseliny):

Kyselina citrónová 100 mM

Na₂HPO₄ 250 mM (pH 4,0/1 N HCI)

ABTS 0,5 mg/ml roztok ABTS je nutné uchovávať v temne pri 4 °C. Akonáhle roztok zozelená, mal by sa vyradiť.

o. Peroxid vodíka: 30 % roztok sa uchováva v temne pri 4 °C.

Postup

Pokiaľ nie je uvedené inak, vykonávajú sa všetky nasledujúce kroky pri izbovej teplote. Všetky oplachy ELISA platní sú vykonané tak, že platne sú trikrát opláchnuté vodou z vodovodu a potom raz opláchnuté TBST. Platne sa sušia vytrepaním na papierový uterák.

Vysiatie buniek:

1. Bunky sa pestujú v miskách na tkanivové kultúry (Corning 25020-100) do súvislého pokryvu 80 - 90 %, zozbiera sa Trypsín-EDTA (0,25 %, 0,5 ml/D100, GIBCO).

2. Bunky sa resuspendujú v čerstvom DMEM + 10 % FBS + 2 mM L-Glutamín a prenesú na 96-jamkovú platňu na tkanivové kultúry (Corning, 25806-96) v

ΒΒ

B B B B B B B B B BB • · · · B B·

B B 8 B B BB #··· BBBB ·· ···· B· B

150 množstve 20 000 buniek/jamka (100 μΙ/jamka). Inkubuje sa 1 deň, a potom sa médium nahradí bezsérovým médiom (90 μΐ) a inkubuje cez noc v 5 % CO₂ pri 37 °C.

Spracovanie a blokovanie ELISA platní:

1. ELISA platňa (Corning 25805-96) sa spracuje protilátkou anti-IGF-lR v množstve 0,5 μβ/jamka v 100 μΐ PBS najmenej 2 hodiny.

2. Zásobné liečivo (v 100 % DMEM) sa nariedi DMEM 1 : 10 na 96-jamkovej polypropylénovej platni a do každej jamky sa k bunkám prenesie 10 μΐ tohto roztoku, aby sa dosiahlo konečné riedenie liečiva 1 : 100 a konečná koncentrácia DMSO 1, %. Bunky sa inkubujú v 5 % CO₂ pri 37 °C dve hodiny.

3. Pripraví sa čerstvý lyzovací pufer na bunky (HNTG*):

HNTG	2 ml
EDTA	0,1 ml
Na3VO4	0,1 ml
Na4 (P2O7)	0,1 ml
H2O	7,3 ml

4. Po inkubácii liečiva dve hodiny sa k bunkám prenesie v množstve 10 μΙ/jamka 200 nM ligand IGF-1 v PBS (konečná koncentrácia je 20 nM) a inkubuje sa v 5 % CO₂ pri 37 °C 10 minút.

5. Médium sa odstráni a pridá sa do každej jamky 100 μΐ HNTG* a trepe sa 10 minút. Bunky sa prezrú pod mikroskopom, či sú adekvátne lyzované.

6. Na zoškrabanie buniek s platne sa použije 12-nástavcová pipeta. Lyzát sa homogenizuje opakovaným nasávaním a vypúšťaním. Všetok lyzát sa prenesie na ELISA platňu spracovanú protilátkou a trepe sa 1 hodinu.

7. Lyzát sa odstráni, platňa sa omyje a prenesie sa protilátka proti fosfotyrozínu (1:3000 v TBST) v množstve 100 μΙ/jamka a trepe sa 30 minút.

·· • · • ·

151

8. Detekčná protilátka sa odstráni, platňa sa omyje a prenesie sa čerstvý roztok ABTS/H₂O₂ (1,2 μΙ H₂O₂ do 10 ml ABTS) v množstve 100 μΙ/jamka, aby sa naštartovala farebná reakcia.

Zmeria sa O.D. pri 410 nm s referenčnou vlnovou dĺžkou 630 nm na Dynatec MR5000.

Test EGFR

Kinázová aktivita receptora EGF v bunkách geneticky upravených na expresiu ľudského EGF-R sa môže merať nasledujúcim spôsobom:

Látky a činidlá.

a. Ligand EGF: zásobná koncentrácia = 16,5 μΜ, EGF 201, TOYOBO, Co. Ltd. Japan.

b. 05-101 (UBI) (monoklonálna protilátka rozpoznávajúca extracelulárnu doménu EGFR).

c. Protilátka proti fosfotyrozínu (anti-Ptyr) (polyklonálna).

d. Detekčná protilátka: kozia protikráličia IgG konjugovaná chrenovou peroxidázou, TÁGO, Inc., Burlingame, CA.

e. TBST pufer:

Tris-HCl, pH 7	50 mM
NaCl	150 mM
Triton X-100	0,1
HNTG 5X zásobný:
HEPES	0,1 M
NaCl	0,

glycerol • 4 44 44 44 44

444 4444 44

4 4 · 4 4 4

152

4 4 4 4 4 4

Triton X-100

1,0 %

g. ABTS zásobný:

kyselina citrónová

100 mM

Na₃VO₄

250 mM

HCI, koncentr.

4,0 pH

ABTS*

0,5 mg/ml

Uchovávajte roztok až do použitia v temne pri 4 °C.

h. Zásobné činidlá

EDTA 100 mM pH 7,0

Na₃VO₄ 0,5 M

Na₄ (P₂O₇) 0,2 M

Postup

Spracovanie ELISA platne

1. ELISA platne (Corning, 96-jamkové, katalóg, č. 25805-96) sa spracujú s protilátkou 05-101 v množstve 0,5 μg na jamku v PBS, konečný objem jamky 150 μΐ. Uskladnia sa cez noc pri 4 °C Sterilizované platne sú vhodné na spotrebovanie až do 10 dní, ak sú uchovávané v 4 °C.

2. V deň použitia sa spracovávací pufer odstráni a nahradí sa blokovacím pufrom (5 % Carnation instantné odtučnené sušené mlieko v PBS). Platňa sa inkubuje a trepe pri izbovej teplote (okolo 23 °C až 25 °C) tridsať minút. Tesne pred použitím sa odstráni blokovací pufer a platňa sa štyrikrát omyje TBST pufrom.

153 • ·

Vysievanie buniek

1. Na tento test môže byť použitá bunková línia NIH3T3/C7 (Honegger, et al., Celí 51:199-209, 1987).

2. Na experiment sa vyberú platne, ktoré majú súvislý pokryv 80 - 90 %. Bunky sa trypsinizujú a reakcia sa zastaví pridaním 10 % CS DMEM média. Bunky sa resuspendujú v DMEM médiu (10 % CS DMEM médium) a centrifugujú sa raz pri 1000 rpm pri izbovej teplote po dobu 5 minút.

3. Bunky sa resuspendujú vo vysievacom médiu (DMEM, 0,5 % hovädzie sérum) a bunky sa spočítajú s použitím trypánovej modrej. Je prijateľná životnosť nad 90 %. Bunky sa vysievajú v médiu DMEM (0,5 % hovädzie sérum) v hustote 10 000 buniek na jamku, 100 μΐ na jamku, na 96-jamkovú platňu. Bunky sa inkubujú v 5 % CO2 pri 3 7 °C po dobu 40 hodín.

Postupy testu

1. Vysiate bunky sa skontrolujú na kontamináciu s použitím invertovaného mikroskopu. Zásoba testovaných zlúčenín sa nariedi (10 mg/ml v DMSO) 1:10 v DMEM médiu, potom sa prenesie 5 μΐ do testovacích jamiek na riedenie testovaných zlúčenín liečiv 1 : 200 a konečné koncentrácie DMSO 1 %. Kontrolné jamky majú len DMSO. Inkubuje sa v 5 % CO2 pri 37 °C po dobu jednej hodiny.

2. Pripraví sa ligand EGF: zásobný EGF sa nariedi DMEM, aby sa pri prenose dosiahlo 10 μΐ riedeného EGF (1 : 12 riedenie), finálna koncentrácia 25 nM.

3. Pripraví sa 10 ml HNTG* dostatočné pre 100 μΐ na jamku, pričom HNTG* obsahuje: zásobný HNTG (2,0 ml), Milli-Q H2O (7,3 ml), EDTA, 100 mM, pH 7,0 (0,5 ml), Na₃VO₄ 0,5 M (0,1 ml) a Na₄(P₂O₇), 0,2 M (0,1 ml).

4. Umiestni sa na ľad.

5. Po dvoch hodinách inkubácie s liečivom sa k bunkám pridá pripravený ligand EGF v množstve 10 μΐ na jamku, aby sa dosiahla konečná koncentrácia 25

154 ·· ·· ·· ···· •· · •· • ·· •· ·· · nM. Kontrolné jamky majú len DMEM. Inkubuje sa za stáleho trepania pri izbovej teplote 5 minút.

Odstráni sa testovaná zlúčenina, EGF, a DMEM. Bunky sa dvakrát omyjú PBS. K bunkám sa prenesie HNTG* v množstve 100 μΐ/jamka. Umiestni sa na 5 minút na ľad. Medzi tým sa s inej ELISA platne odstráni blokovací pufer a platňa sa omyje TBST vyššie opísaným spôsobom.

7. Bunky sa zoškriabu s platne špičkou pipety pevne nasadenou na mikropipete a bunkový materiál sa homogenizuje opakovaným nasávaním a vypúšťaním lyzovacieho HNTG pufru. Lyzát sa prenesie na spracovanú, blokovanú a omytú ELISA platňu. Inkubuje sa za stáleho trepania pri izbovej teplote jednu hodinu.

8. Lyzát sa odstráni a platňa sa štyrikrát omyje TBST. Na platňu sa prenesie čerstvo nariedená protilátka proti fosfotyrozínu v množstve 100 μΐ/jamka. Inkubuje sa za stáleho trepania pri izbovej teplote 30 minút za prítomnosti protilátky proti fosfotyrozínu (riedenie 1:3000 v TBST).

9. Odstráni sa protilátka proti fosfotyrozínu a platňa sa štyrikrát omyje TBST. Prenesie sa čerstvo nariedená TÁGO 30 protikráličia IgG protilátka na ELISA platňu v množstve 100 μΐ. Inkubuje sa za stáleho trepania pri izbovej teplote 30 minút (protikráličia IgG protilátka: riedenie 1 : 3000 v TBST).

10. Odstráni sa detekčná protilátka a platňa sa štyrikrát omyje TBST. Prenesie sa čerstvo pripravený roztok ABTS/H2O2 na ELISA platňu v množstve 100 μΐ/jamka. Inkubuje sa pri izbovej teplote 20 minút. Roztok ABTS/H₂O₂: 1,2 μΐ 30 % H₂O₂ v 10 ml zásobného ABTS.

11. Reakcia sa zastaví pridaním 50 μΐ 5 N H2SO4 (voliteľné) a určí sa O.D. pri 410 nm.

12. Maximálny fosfotyrozínový signál je určený odpočítaním hodnoty negatívnych kontrol od pozitívnych kontrol. Percento inhibície obsahu fosfotyrozínu v extrakte obsahujúcom bunky sa potom spočíta po odpočítaní negatívnych kontrol.

155 • · · · ···· ··· • · · · · · · • · · · · · · ··· ···· ·· ···· ·· ·

Test autofosforylácie Met

Tento test určuje aktivitu Met tyrozínkinázy analýzou hladiny Met proteíntyrozínkinázy na Met receptore.

Činidla

a. HNTG (5X zásobný roztok): rozpustí sa 23,83 g HEPES a 43,83 g NaCl v približne 350 ml dH₂O. Upraví sa pH HC1 alebo NaOH na 7,2, pridá sa 500 ml glycerolu a 10 ml Triton X-100, zmieša sa a do celkového objemu 1 L sa doplní dH₂O. Na prípravu 1 L IX pracovného roztoku sa pridá 200 ml 5X zásobného roztoku do 800 ml dH₂O, v prípade potreby sa skontroluje a upraví pH, uskladní sa v 4 °C.

b. PBS (Dulbeccov fosfátom pufrovaný fyziologický roztok), Gibco katalóg, č. 450-1300EB (IX roztok).

c. Blokovací pufer: do 500 ml dH₂O sa dá 100 g BSA, 12,1 g Tris-pH 7,5; 58,44 g NaCl a 10 ml Tween-20, nariedi sa do konečného objemu 1 1.

d. Kinázový pufer: do 500 ml dH₂O sa pridá 12,1 g TRIS (pH 7,2), 58,4 g NaCl, 40,7 g MgCl₂ a 1,9 g EGTA, do konečného objemu 1 1 sa doplní dH₂O.

e. PMSF (fenylmetylsulfonylfluorid), Sigma kat. č. P-7626, k 435,5 mg sa pridá 100 % etanol do celkového objemu 25 ml, vortexuje sa.

f. ATP (bakteriálny zdroj), Sigma kat. č. A-7699, prášok sa uskladňuje pri -20 °C. Na prípravu roztoku na použitie sa rozpustí 3,31 mg v 1 ml dH₂O.

g. RC-20H HRPO konjugovaná proti fosfotyrozíne, Transduction Laboratories Kat. č. E120H.

h. Pierce 1-Step™ Turbo TMB-ELISA (3,3',5,5'- tetrametylbenzidín, Pierce Kat. č. 34022.

i. H₂SO4, pridá sa 1 ml koncentr. (18 N) do 35 ml dH₂O.

156 ···· · · · · ··· • · · · · · · • · · · · ··· ··· ···· ·· ···· ·· ···

j. TRIS HCL, Fischer kat. č. BP152-5, do 121,14 g látky sa pridá 600 ml MilliQ H₂O, upraví sa pH na 7,5 (alebo 7,2) HC1, do celkového objemu 1 1 sa doplní MilliQ H₂O.

k. NaCl, Fischer kat. č. S271-10, pripraví sa 5 M roztok.

l. Tween-20, Fischer kat. č. S337-5OO.

m. Na3VO4, Fischer kat. č. S454-50, k 1,8 g látky sa pridá 80 ml MilliQ H₂O, pH sa upraví HC1 alebo NaOH na 10,0, povarí sa v mikrovlnej rúre, ochladí, skontroluje sa pH. Postup sa opakuje, pokiaľ nie je pH stabilne na 10,0. Do celkového objemu 100 ml sa doplní MilliQ H₂O, pripravia sa alikvóty 1 ml, ktoré sa uskladnia v -80 °C.

n. MgCl₂, Fischer kat. č. M33-5OO, pripraví sa 1 M roztok.

o. HEPES, Fischer kat. č. BP310-500, do 200 ml MilliQ H₂O sa pridá 59,5 g látky, upraví sa pH na 7,5, doplní sa do celkového objemu 250 ml, sterilné sa sfiltruje.

p. Albumín, hovädzí (BSA), Sigma kat. č. A-4503, ku 30 g látky sa pridá sterilná destilovaná voda do celkového objemu 300 ml, uskladní sa pri 4 °C.

q. TBST pufer: k približne 900 ml dH₂O v jednolitrovom kalibrovanom valci sa pridá 6,057 g TRIS a 8,766 g NaCl. Akonáhle sa rozpustí, upraví sa pH na

7,2 HC1, pridá sa 1,0 ml Triton X-100 a do konečného objemu 1 1 sa doplní dH₂O.

r. Kozia afinitne purifikovaná protikráličia IgG (celé molekuly), Cappel kat. č 55641.

s. Anti h-Met (C-28) králičia polyklonálna IgG protilátka, Šanta Cruz Chemical kat. č. SC-161.

t. Dočasne transfekované chimérické bunky EGFR/Met (EMR) (Komada, et al., Oncogene, 8:2381-2390 (1993).

·· ·· ·· ·· • · · ···· ·· • · · · · · · • · · · · ···· • · · · · · ·

157

u. Pufer uhličitanu sodného (NajCO/;, Fischer kat. č. S495): k 10,6 g látky sa pridá 800 ml MilliQ H2O. Akonáhle sa rozpustí, upraví sa pH na 9,6 pomocou NaOH, do celkového objemu sa doplní MilliQ H2O, sfiltruje a uskladní pri 4 °C.

Postup

Pokiaľ nie je uvedené inak, vykonávajú sa všetky nasledujúce kroky pri izbovej teplote. Všetky ELISA platne sa omývajú 4X opláchnutím TBST.

Lýza EMR

Tento postup je možné použiť noc pred alebo bezprostredne pred započatím záchytu receptora.

1. Lyzát sa rýchlo roztaví vo vodnom kúpeli, ktorý má teplotu 37 °C pri súčasnom premiešavaní kúpeľa až do roztopenia posledného kryštálu.

2. Bunková peleta sa lyžuje IX HNTG obsahujúcim 1 mM PMSF. Na každú 15 cm misku bunkovej kultúry sa použije 3 ml HNTG. Pridá sa 1/2 vypočítaného objemu HNTG, skúmavka sa vortexuje 1 minútu, pridá sa zvyšný objem HNTG a vortexuje sa ďalšiu minútu.

3. Skúmavky sa vyrovnajú, centrifugujú pri 10 000 x g po dobu 10 minút pri 4 °C.

4. Supernatanty sa spoja, odstránia sa alikvóty na určenie proteínu.

5. Vzorka sa rýchle zmrazí v kúpeli suchý ľad/etanol. Tento krok sa vykonáva bez ohľadu na to, či bude lyzát skladovaný cez noc, alebo bude určenie proteínu nasledovať ihneď.

6. Vykoná sa určenie proteínu použitím štandardnej metódy kyseliny bicínchonínovej (BCA) (BCA testovacia súprava od Pierce Chemical kat. č. 23225).

·· ·· ·· ·· ·· ··· ···· ·· • · · · · · · • · · · · ···· • · · · · · ·

158

Postup ELISA testu

1. Každá jamka 96-jamkových ELISA platní sa ošetruje 5 gg kozou protikráličou protilátkou v uhličitanovom pufre v celkovom objeme 50 gl. Platne sa uchovávajú cez noc v teplote 4 °C.

2. Tekutina s nenaviazanými kozími protikráličími protilátkami sa odstráni preklopením platne dnom hore.

3. Do každej jamky sa pridá 150 μΐ blokovacieho pufru. Platňa sa inkubuje 30 minút za stáleho trepania.

4. Platňa sa 4x omyje TBST. Bubliny a prebytočná tekutina sa odstránia vytrepaním platničky na papierový uterák.

5. Do každej jamky sa pridá 1 gg králičej protilátky anti-Met nariedenej v TBST do celkového objemu 100 gl na jamku.

6. Lyzát sa rozriedi HNTG (90 gg lyzátu/100 gl).

7. Do každej jamky sa pridá 100 gl rozriedeného lyzátu. Trepe sa 60 minút.

8. Platňa sa 4x omyje TBST. Bubliny a prebytočná tekutina sa odstránia vytrepaním platne na papierový uterák.

9. Do každej jamky sa pridá 50 gl IX lyzovacieho pufru.

10. Vykoná sa riedenie zlúčeniny/extrakty 1 : 10 v IX kinázovom pufry na 96jamkovej platne.

11. Do jamiek ELISA sa prenesie 5,5 gl rozriedenej zlúčeniny. Za stáleho trepania sa inkubuje pri izbovej teplote 20 min.

12. Do každej jamky sa pridá 5,5 gl 60 gM roztoku ATP. Negatívna kontrola neobsahuje žiadne ATP. Inkubuje sa 90 minút za stáleho trepania.

13. Platňa sa 4x omyje TBST. Bubliny a prebytočná tekutina sa odstránia vytrepaním platne na papierový uterák.

159 ·· ·· • 9 9 9 • · ·· ·· • 9

99

9· •· ·· ···· ·· ·

14. Do každej jamky sa pridá 100 μΐ RC20 (v riedení 1 : 3000 v blokovacom pufre). Za stáleho trepania sa inkubuje 30 minút.

15. Platňa sa 4x omyje TBST. Bubliny a prebytočná tekutina sa odstráni vytrepaním platne na papierový uterák.

16. Do každej jamky sa pridá 100 μΐ Turbo-TMB. Za stáleho trepania sa inkubuje 30 - 60 minút.

17. Do každej jamky sa pridá 100 μΐ IM H2SO4, aby sa zastavila reakcia.

18. Test sa vyhodnotí na ELISA mikrofotometre Dynatech MR7000. Testovací filter = 450 nm, referenčný filter = 410 nm.

Biochemický src test

Tento test sa používa na stanovenie aktivity src proteínkinázy meraním fosforylácie biotinylovaného peptidu ako detekčnej reakcie.

Látky a činidlá:

a. Kvasinky transformované src (Sugen, Inc., Redwood City, California).

b. Bunkové lyzáty: kvasinkové bunky exprimujúce srs sa peletujú, raz omyjú vodou, opäť peletujú a uskladnia až do upotrebenia pri teplote - 80 °C.

c. N-koniec biotinylovaný EEEYEEYEEEYEEEYEEEY sa pripraví štandardným postupom pracovníkom v tejto oblasti dobre známym.

d. DMSO: Sigma, St. Louis, MO.

e. 96-jamková ELISA platňa s plochým dnom: Corning 96 Well Easy Wash, Modified fiat Bottom Plate, Corning kat. #25805-96.

f. 96-jamkové platne NUNC na riedenie zlúčenín s dnom v tvare V: Applied

Scientific kat. #A-72092.

g. Činidlo Vecastain ELITE ABC: Vector, Burlingame, CA.

160 ·· ·· ·· ·· ·· • · · · ···· · · · • · · · · · · • ···· ···· • · · · · · · ···· ···· ·· ···· ·· ·

h. Anti-src (327) monoklonálna protilátka. Na expresiu rekombinantného Src sa používa Schizosaccharomyces Pombe (Superti-Furga, et al., EMBO J., 12:2625-2634). Kmeň S. Pombe SP200 (h-s leul. 32 ura4 ade210) sa pestuje opísaným spôsobom a transformácie pRSP exprimujúcich plazmidov sú vykonané metódou lítium acetátu (Superti-Furga, supra). Bunky sú pestované v prítomnosti 1 μΜ tiamínu na potlačenie expresie z nmtl promótoru alebo v neprítomnosti tiamínu na indukciu expresie.

i. Monoklonálna protilátka proti fosfotyrozínu, UBI 05-321 (miesto toho môže byť použitá UB40).

j. Peroxidázový substrát Turbo TMB-ELISA: Pierce Chemical.

Roztoky pufrov

a. PBS (Dulbeckov fosfátom pufrovaný fyziologický roztok): GIBCO PBS, GIBCO kat. # 450-1300EB.

b. Blokovací pufer: 5 % odtučnené mlieko (Carnation) v PBS.

c. Uhličitanový pufer: Na₂CO4 od Fischera, kat. # S495, pripraví sa 100 mM zásobný roztok.

d. Kinázový pufer: 1,0 ml (z IM zásobného roztoku) MgCh, 0,2 ml (z IM zásobného roztoku) MnC12, 0,2 ml (z IM zásobného roztoku) DTT, 5,0 ml (z IM zásobného roztoku) HEPES, 0,1 ml TX-100 sa do celkového objemu 10 ml doplní MilliQ H₂O.

e. Lyzovací pufer: 5,0 HEPES (z IM zásobného roztoku), 2,74 ml NaCl (z 5M zásobného roztoku), 10 ml glycerolu, 0,1 ml TX-100, 0,4 ml EDTA (z 100 mM zásobného roztoku), 1,0 ml PMSF (z 100 mM zásobného roztoku), 0,1 ml Na₃VO4 (z 0,1 M zásobného roztoku) sa do celkového objemu 100 ml doplní MilliQ H2O.

f. ATP: Sigma kat. # A-7699, pripraví sa 10 mM zásobný roztok (5,51 mg/ml).

161 ·· ·· ·· ·· ·· • · · · · · * · ·· • · · · · · · • · · · · ···· • · · · · · ·

g. TRIS-HC1: Fischer kat. # BP 152-5, do 600 ml MilliQ H₂O sa pridá 121,14 g materiálu, pH sa upraví na 7,5 HC1 a do celkového objemu 1 1 sa doplní MilliQ H₂O.

h. NaCl: Fischer kat. # S271-10, pripraví sa 5M zásobný roztok s použitím MilliQ H₂O.

i. Na₃VO₄: Fischer kat. # S454-50, do 80 ml MilliQ H₂O sa pridá 1,8 g materiálu, pH sa upraví HC1 alebo NaOH na 10,0, varí sa v mikrovlnej rúre, ochladí, skontroluje sa pH, úprava pH sa opakuje, pokiaľ nezostáva po cykle varenia a chladenia stabilný. Do celkového objemu 100 ml sa doplní MilliQ H₂O, pripraví sa alikvotné množstvo 1 ml a skladuje sa pri teplote - 80 °C.

j. MgCl₂: Fischer kat. # M33-5OO, pripraví sa IM zásobný roztok s použitím MilliQ H₂O.

k. HEPES: Fischer kat. # BP 310-500, do 200 ml MilliQ H₂O sa pridá 59,6 g materiálu, upraví sa pH na 7,5, do celkového objemu 250 ml sa doplní MilliQ H₂O, sterilné filtruje (IM zásobný roztok).

l. TBST pufer: TBST pufer: do 900 ml dH₂O sa pridá 6,057 g TRIS a 8,766 g NaCl, pH sa upraví na 7,2 Hcl, pridá sa 1,0 ml Triton-X100. Do celkového objemu 1 1 sa doplní dH₂O.

m. MnCl₂: Fischer kat. # M87-100, pripraví sa IM zásobný roztok s použitím MilliQ H₂O.

n. DTT: Fischer kat. # BP172-5.

o. TBS (TRISom pufrovaný fyziologický roztok): do 900 ml MilliQ H₂O sa pridá 6,057 g TRIS a 8,777 g NaCl, do celkového objemu 1 1 sa doplní MilliQ H₂O.

p. Kinázová reakčná zmes: množstvo na testovaciu platničku (100 jamiek): 1,0 ml kinázového pufru, 200 μg GST-ζ, do celkového objemu 8,0 ml sa doplní MilliQ H₂O.

162 ·· ·· ·· ·· ·· · • · · ···· ···· • · · · ···· • · · · · ···· · • · · · · ··· ··· ···· ·· ···· ·· ···

q. Biotín označený EEEYEEYEEEYEEEYEEEY’ pripraví sa zásobný peptidový roztok (lmM, 2,98 mg/ml) vo vode vždy čerstvý pred upotrebením.

r. Vectastain ELITE ABC činidlo: na prípravu 14 ml pracovného činidla sa pri- dá 1 kvapka činidla A do 15 ml TBST a premieša sa niekoľkokrát prevrátením skúmavky. Potom sa pridá 1 kvapka činidla B. Skúmavka sa vloží do orbitálnej trepačky a pri izbovej teplote sa trepe po dobu 30 minút.

Postupy:

Príprava ELISA platne spracovanej src.

1. ELISA platňa sa spracuje 0,5 μg/jamka monoklonálnou protilátkou anti-src v

100 μΐ uhličitanového pufru s pH 9,6 a ponechá sa cez noc pri teplote 4 °C.

2. Jamky sa raz omyjú PBS.

3. Platňa sa blokuje 0,15 ml 5 % mlieka v PBS po dobu 30 minút pri izbovej teplote.

4. Platňa sa 5x omyje PBS.

5. Do každej jamky sa pridá 10 pg lyzátu kvasiniek transformovaných src rie- deného lyzovacím pufrom (0,1 ml celkové množstvo na jamku). (Množstvo lyzátu sa môže v jednotlivých várkach líšiť.) Platňa sa trepe 20 minút pri izbovej teplote.

Príprava ELISA platne spracovanej fosfotyrozínovou protilátkou.

1. 4G10 platňa: každá komôrka sa pokryje 0,5 μg 4G10 v 100 μΐ PBS cez noc pri teplote 4 °C a blokuje sa 150 μΐ 5 % mlieka v PBS po dobu 30 minút pri izbovej teplote.

Postup kinázového testu.

1. Nenaviazané proteíny sa s platni odstránia a platne sa 5x omyjú PBS.

·· ·· ·· ·· ·· ···· ···· ··· • · · · · é · • · · · · · · ···· ···· ·· ···· ·· ·

163

2. Do každej jamky sa pridá 0,08 ml kinázovej reakčnej zmesi (obsahujúcej 10 μΐ 10X kinázového pufru a 10 μΜ (konečná koncentrácia) biotinuEEEYEEYEEEYEEEYEEEY na jamku, riedenej vodou.

3. Pridá sa 10 μΐ zlúčeniny riedenej vodou obsahujúcou 10 % DMSO a preinkubuje sa 15 minút pri izbovej teplote.

4. Kinázová reakcia sa naštartuje pridaním 10 μΐ 0,05 mM ATP vo vode do každej jamky (konečná koncentrácia 5 μΜ ATP).

5. ELISA platňa sa trepe pri izbovej teplote 15 minút.

6. Kinázová reakcia sa zastaví pridaním 10 μΐ 0,5 M EDTA do každej jamky.

7. 90 μΐ supernatantu sa prenesie na spracovanú ELISA platňu blokovanú 4G10.

8. Inkubuje sa za stáleho trepania 30 minút pri izbovej teplote.

9. Platňa sa 5x omyje TBST.

10. Inkubuje sa s činidlom Vectastain ELITE ABC (100 μΙ/jamka) po dobu 30 minút pri izbovej teplote.

11. Jamky sa 5x omyjú TBST.

12. Vyvinie sa pomocou Turbo TMB.

Biochemický lck test

Tento test sa používa na stanovenie aktivity lck proteínkinázy meraním fosforylácie GST-ζ ako detekčnej reakcie.

Látky a činidlá:

a. Kvasinky transformované lck. Na expresiu rekombinantnej Lck sa použije

Schizosaccaromyces Pombe (Superti-Furga, et al., EMBO J, 12:2625-2634,

Superti-Furga, et al., Náture Biotech., 14:600-605). S. Pombe kmeň SP200 (h-s leul. 32 ura4 ade 210) sa pestuje opísaným spôsobom a transformácia plazmidmi exprimujúcimi pRSP sa vykoná metódou lítium acetátu (Superti·· • · · · ···· ··· • · · · · · · • · · · · · χ* · · • · · · · · · ···· ···· ·· ···· ·· ·

164

Furga, supra). Bunky sa pestujú v prítomnosti 1 μΜ tiamínu na indukciu expresie.

b. Bunkové lyzáty: kvasinkové bunky exprimujúce lck sa peletujú, raz omyjú vodou, opäť peletujú a uskladnia zmrazené až do upotrebenia pri teplote -80 °C.

c. GST-ζ: DNA kódujúca GST-ζ fúzny proteín na expresiu v baktériách získaná od Artura Weisse z Howard Hughes Medical Inštitúte na University of California, San Francisco. Transformované baktérie sa pestujú cez noc za stáleho trepania pri teplote 25 °C. GST-ζ sa purifikuje glutatiónovou afinitnou chromatografiou, Pharmacia, Alameda, CA.

d. DMSO: Sigma, St. Louis, MO.

e. 96-jamkové ELISA platne s plochým dnom: Corning 96 Well Easy Wash, Modified Fiat Bottom Plate, Corning kat. #25805-96.

f. NUNC 96-jamkové polypropylénové platne na riedenie zlúčenín s dnom v tvare V: Applied Scientific kat. # AS-72092.

g. Purifikované králičie anti-GST antisérum: Amrad Corporation (Austrália) kat. #90001605.

h. Kozia protikráličia protilátka (anti-Rabbit-IgG-HRP): Amersham kat. # V010301.

i. Ovčia protimyšia IgG (H+L): Jackson Labs kat. # 5215-005-003.

j. Monoklonálna protilátka proti Lck (3A5): Šanta Cruz Biotechnology kat # sc-433.

k. Monoklonálna protilátka proti fosfotyrozín UBI 05-321 (miesto toho môže byť použitá UB40).

·· · · ·· ·· · · • · · · ···· · · · • · · · · · · • · · · · ···· • · · · · · ···· ···· ·· ···· ·· ·

165

Roztoky pufrov:

a. PBS (Dulbeccov fosfátom pufrovaný fyziologický roztok) IX roztok: GIBCO PBS, GIBCO kat. # 450-1300EB.

b. Blokovací pufer: 100 g BSA, 12,1 g TRIS (pH 7,5), 58,44 g NaCl, 10 ml Tween-20, do celkového objemu 1 I sa doplní MilliQ H₂O.

c. Uhličitanový pufer: Na₂CO₃ od Fischera, kat. # S495, pripraví sa 100 mM roztok s použitím MilliQ H₂O.

d. Kinázový pufer: 1,0 ml MgCl₂ (zo zásobného IM roztoku), 0,2 ml MnCl₂ (zo zásobného IM roztoku), 0,2 ml DTT (zo zásobného IM roztoku), 5,0 ml HEPES (zo zásobného IM roztoku), 0,1 ml TX-100, do celkového objemu 10 ml sa doplní MilliQ H₂O.

e. Lyzovací pufer: 5,0 HEPES (zo zásobného IM roztoku), 2,74 ml NaCl (zo zásobného 5M roztoku), 10 ml glycerolu, 1,0 ml TX-100, 0,4 ml EDTA (zo zásobného 100 mM roztoku), 1,0 ml PMSF (zo zásobného 100 mM roztoku), 0,1 ml Na₃VO4 (zo zásobného 0,1 M roztoku), do celkového objemu 100 ml sa doplní MilliQ H₂O.

f. ATP: Sigma kat. # A-7699, pripraví sa 10 mM zásobný roztok (5,51 mg/ml).

g. TRIS-HC1: Fischer kat. # BP 152-5, do 600 ml MilliQ H₂O sa pridá 121,14 g látky, pH sa upraví HC1 na 7,5, do celkového objemu 1 1 sa doplní MilliQ H₂O.

h. NaCl: Fischer kat. # S271-10, pripraví sa 5M zásobný roztok s použitím MilliQ H₂O.

i. Na₃VO4: Fischer kat. # S454-50, do 80 ml MilliQ H₂O sa pridá 1,8 g látky, pH sa upraví HC1 alebo NaOH na 10,0, varí sa v mikrovlnej rúre, ochladí, skontroluje sa pH a opäť sa upraví, pokiaľ nezostane po cykle varenia a chladenia stabilný, do celkového objemu 100 ml sa doplní MilliQ H₂O, pripraví sa alikvotné množstvo 1 ml a skladuje sa pri teplote -80 °C.

• · • · • · · · · · · ···· ···· · ···· ·· ·

166

j. MgCl₂: Fischer kat. # M33-5OO, pripraví sa IM zásobný roztok s použitím MilliQ H₂O.

k. HEPES: Fischer kat. # BP 310-500, do 150 ml MilliQ H₂O sa pridá 30 g látky, do celkového množstva 300 ml sa doplní MilliQ H₂O, sterilné sa filtruje (IM zásobný roztok).

l. Albumín, hovädzí (BSA), Sigma kat. # A4503, do 150 ml MilliQ H₂O sa pridá 30 g látky, do celkového objemu sa doplní MilliQ H₂O, filtruje cez 0,22 pm filter, skladuje sa pri 4 °C.

m. TBST pufer: do 900 ml dH₂O sa pridá 6,057 g TRIS a 8,766 g NaCl, pH sa upraví HCI na 7,2, pridá sa 1,0 ml Triton-X100, do celkového objemu 1 1 sa doplní dH₂O.

n. MnCl₂: Fischer kat. # M87-100, pripraví sa IM zásobný roztok s použitím MilliQ H₂O.

o. DTT: Fischer kat. # BP172-5.

p. TBS (TRISom puferovaný fyziologický roztok): do 900 ml MilliQ H₂O sa pridá 6,057 g TRIS a 8,777 g NaCl, do celkového objemu 1 I sa doplní MilliQ H₂O.

q. Kinázová reakčná zmes: množstvo na jednu testovaciu platňu (100 jamiek): 1,0 ml Kinázového pufra, 200 pg GST-ζ, do celkového objemu 8,0 ml sa doplní MilliQ H₂O.

Postupy

Príprava ELISA platne spracovanej Lck.

1. Platňa sa spracuje ovčím protimyším IgG v množstve 2,0 pg/jamka v 100 pl uhličitanového pufra s pH 9,6 a ponechá sa cez noc.

2. Platňa sa raz omyje PBS.

·· • ·

167

3. Platňa sa blokuje 0,15 ml blokovacieho pufru po dobu 30 minút pri izbovej teplote.

4. Platňa sa 5x omyje PBS.

5. Do každej jamky sa pridá 0,5 pg anti-lck (monoklonálna protilátka 3A5) v 0,1 ml PBS a ponechá 1-2 hodiny pri izbovej teplote.

6. Platňa sa 5x omyje PBS.

7. Do každej jamky sa pridá 20 pg lyzátu kvasiniek transformovaných lck v lyzovacom pufry (0,1 ml celkový objem na komôrku). Platňa sa trepe pri teplote 4 °C cez noc, aby sa zabránilo strate aktivity.

Príprava ELISA platne spracovanej fosfotyrozínovou protilátkou.

1. UB40 platňa: 1,0 pg/jamka UB40 v 100 pl PBS sa ponechá cez noc pri teplote 4 °C a blokuje sa 150 pl blokovacieho pufru po dobu najmenej 1 hodiny.

Postup kinázového testu:

1. Nenaviazané proteíny sa odstránia z platne a platne sa 5x omyjú PBS.

2. Do každej jamky sa pridá 0,08 ml kinázovej reakčnej zmesi (obsahujúcej 10 pl 10X kinázového pufru a 2 pg GST-ζ na jamku riedené vodou).

3. Pridá sa 10 pl zlúčeniny riedenej vodou obsahujúcej 10 % DMSO a preinkubuje sa 15 minút pri izbovej teplote.

4. Naštartuje sa kinázová reakcia pridaním 10 pl/jamka 0,1 mM ATP vo vode (konečná koncentrácia 10 pM ATP).

5. ELISA platňa sa trepe 60 minút pri izbovej teplote.

6. Kinázová reakcia sa zastaví pridaním 10 pl 0,5 M EDTA do každej jamky.

7. 90 pl supernatantu sa prenesie do ELISA platne spracovanej blokovanou 4G10 podľa vyššie uvedenej časti B.

• · ·· • · · · ···· ··· • · · · · · · • · · · · · · ···· ···· ·· ···· ·· · 168

8. Inkubuje sa za stáleho trepania 30 minút pri izbovej teplote.

9. Platňa sa 5x omyje TBST.

10.Inkubuje sa s králičou ant-GST protilátkou v riedení 1 : 5000 v 100 μΐ TBST po dobu 30 minút pri izbovej teplote.

11. Jamky sa 5x omyjú TBST.

12. Inkubuje sa s kozou protikráličou protilátkou (anti-Rabbit-IgG-HRP) v riedení 1 : 20 000 v 100 μΐ TBST po dobu 30 minút pri izbovej teplote.

13. Jamky sa 5x omyjú TBST.

14. Vyvinie sa pomocou Turbo TMB.

Test meraním fosforylačnej funkcie RAF.

Nasledujúci test opisuje množstvo RAF katalyzované fosforyláciou svojho cieľového proteínu MEK a cieľový MAPK tohto MEK proteínu. Sekvencia génu RAF je opísaná v Bonner et al., 1985, Molec. Celí. Biol., 5:1400-1407, a je ľahko dostupná v mnohých databankách génových sekvencii. Konštrukcia vektoru nukleovej kyseliny a bunkových línii použitých v tejto časti vynálezu sú podrobne opísané v Morison et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci._USA, 85:8855-8859.

Látky a činidlá:

1. Bunky Sf9 (Spodoptera frugiperdá), GIBCO-BRL, Gaintersburg, MD.

2. RIPA pufer: 20 mM TRIS/HC1 pH 7,4, 137 mM NaCl, 10 % glycerol, 1 mM PMSF, 5 mg/L Aprotein, 0,5 % Triton X-100.

3. Tioredoxín - MEK fúzny proteín (T-MEK): expresia T-MEK a purifikácia afinitnou chromatografiou sa vykoná podľa návodu výrobcu. Katalógové # 350-01 a R 350-40, Invitrogen Corp., San Diego, CA.

4. His-ΜΑΡΚ (ERK 2), MAPK s naviazaným histidínom sú exprimované v modrých bunkách XL1 transformovaných vektorom pUC18 kódujúcim His··

169

ΜΑΡΚ. His-ΜΑΡΚ sa purifikuje Ni-afinitnou chromatografiou. Kat # 274949-01, Pharmacia, Alameda, CA, ako je tu opísané.

5. Ovčí protimyší IgG: Jackson laboratiories, West Grove, PA. Katalóg, # 515006-008, Lot # 28563.

6. RAF-1 proteínkinázová špecifická protilátka: URP2653 z UBI.

7. Spracovávací pufer: PBS, fosfátom pufrovaný fyziologický roztok, GIBCOBRL, Gaitersburg, MD.

8. Omývací pufer: TBST (50 mM Tris/HCI ph 7,2, 150 mM NaCI, 0,1 % Triton X-100).

9. Blokovací pufer: TBST, 0,1 % etanolamín pH 7,4

10. DMSO, Sigma, St. Louis, MO

11. Kinázový pufer (KB): 20 mM HEPES/HC1 pH 7,2, 150 mM NaCI, 0,1 % Triton X-100, 1 mM PMSF, 5 g/L A proteín, 75 mM ortovanadičnan sodný, 0,5 MM DTT a 10 mM MgCl₂.

12. Zmes ATP: 100 mM MgCl₂, 300 mM ATP, 10 mCi γ³³Ρ ATP (DupontNEN)/ml.

13.Stopovací roztok: 1 % kyselina fosforečná, Fischer, Pittsburg, P A.

14. Fosfocelulózové filtre Wallac, Wallac, Turku, Finsko.

15.Roztok na oplachovanie filtrov: 1 % kyselina fosforečná, Fischer, Pittsburgh, PA.

ló.Zbierací stroj Tomtec na zber platní, Wallac, Turku, Fínsko.

17.Wallac scintilačný spektrofotometer na platne, kat. # 1205, Wallac, Turku, Fínsko.

18.NUNC 96-jamkové polypropylénové platne na riedenie zlúčenín s dnom v tvare V, Applied Scientific katalóg # AS-72092.

• ·

170 ·· ·· ·· ···· •· • ·· •· ·· ·

Postup

Pokiaľ nie je uvedené inak, vykonávajú sa všetky nasledujúce kroky pri izbovej teplote.

1. Spracovanie ELISA platne: ELISA jamky sa spracovávajú 100 ml purifikovaného ovčieho antiséra s protimyšacou afinitou (1 mg/100 ml spracovací pufer) a ponechajú cez noc pri teplote 4 °C. ELISA platničky sa môžu použiť dva týždne, ak sú skladované pri 4 °C.

2. Platňa sa obráti hore dnom a tekutina sa odstráni. Pridá sa 100 ml blokovacieho roztoku a inkubuje sa 30 minút.

3. Blokovací roztok sa odstráni a platňa sa 4x omyje omývacím pufrom. Prebytočná tekutina sa odstráni poklepaním platne na papierový uterák.

4. Do každej jamky sa pridá 1 mg RAF-1 špecifickej protilátky a inkubuje sa 1 hodinu. Omyje sa ako v kroku 3.

5. Lyzáty Sf9 buniek infikovaných RAS/RAF sa rozmrazia a nariedi TBST na 10 mg/100 ml. Do jamiek sa pridá 10 mg riedeného lyzátu a inkubuje sa 1 hodinu. Počas inkubácie sa platňa trepe. Negatívna kontrola neobsahuje žiadny lyzát. Lyzáty Sf9 buniek infikovaných RAS/RAF sa pripravia potom, čo sa bunky infikujú rekombinantným bakulovírusom pri MOI 5 pre každý vírus a zozbierajú sa po 48 hodinách. Bunky sa raz omyjú PBS a lyžujú v RIPA pufry. Nerozpustné látky sa odstránia centrifugáciou (5 minút pri 10 000 x g). Alikvotné množstvo lyzátu sa zmrazí na suchom ľade/etanolu a skladujú do upotrebenia pri teplote -80 °C.

6. Nenaviazané látky sa odstránia a platňa sa omyje podľa vyššie uvedeného postupu (krok 3).

7. Do každej jamky sa pridá 2 mg T-MEK a 2 mg His-MAEPK a objem sa upraví na 40 ml kinázovým pufrom. Metódy purifikácie T-MEK a MAPK z bunkových extraktov sú tu opísané v príklade.

··

171

8. Predriedia sa zlúčeniny (zásobný roztok 10 mg/ml DMSO) alebo extrakty 20 x v TBST s 1 % DMSO. Do každej jamky sa pridá 5 ml predriedených zlúčenín/extraktov postupom opísaným v kroku 6. Inkubuje sa 20 minút. Kontroly neobsahujú žiadne liečivo.

9. Kinázová reakcia sa odštartuje pridaním 5 ml zmesi ATP. ELISA platne sa počas inkubácie trepú na ELISA trepačke.

10. Kinázová reakcia sa zastaví po 60 minútach pridaním 30 ml stopovacieho roztoku do každej jamky.

11. Na ELISA platňu sa v Tomtec zbieracom zariadení umiestni fosfocelulózový filter. Platňa sa zozbiera a filter sa omyje roztokom na omývanie filtra podľa odporúčania výrobcu. Filtre sa usušia. Filtre sa upevnia do držiaku. Držiak sa vloží do prístroja na detekciu rádioaktivity a kvantifikuje sa rádioaktívny fosfor na filtroch.

Môže sa tiež postupovať tak, že sa 40 ml alikvóty z jednotlivých jamiek testovacej platničke prenesú na zodpovedajúce miesto na fosfocelulózovom filtre. Po vysušení filtrov vzduchom sa filtre položia na podnos. Podnos sa jemne kýva, omývací roztok sa vymieňa každých 15 minút po dobu 1 hodiny. Filtre sa osušia vzduchom, upevnia sa do držiaku vhodného na meranie rádioaktívneho fosforu vo vzorcoch. Držiak sa vloží do detekčného zariadenia a kvantifikuje sa rádioaktívny fosfor na filtroch.

CDK2/Cyklín A - Inhibičný test

Tento test analyzuje proteínkinázovou aktivitu CDK2 v exogénnom substráte.

Činidlá:

A.Pufer A: (80 mMTris (pH 7,2), 40 mM MgCl₂), 4,84 g Tris (F.W. = 121,1 g/mol), 4,07 g MgCl₂ (F.W. = 203,31 g/mol) rozpustenej v 500 ml H₂O.

Hodnota pH sa upraví HC1 na 7,2.

172 ·· ·· ·· ·· ·· • · · ···· ·· • · · · · · · • ···· ···· • · · · · · ·

B. Roztok histónu Hl (0,45 mg/ml histónu Hl a 20 mM HEPES pH 7,2 (477 mg HEPES (F.W. = 23 8,3 g/mol) rozpustenej v 100 ml ddH2O, uskladnený v 1 ml alikvótoch pri teplote -80 °C.

C. Roztok ATP (60 μΜ ATP, 300 úg/ml BSA, 3 mM DTT): 120 μΐ 10 mM ATP, 600 μΐ 10 mg/ml BSA do 20 ml, uskladnený v 1 ml alikvótoch pri teplote -80 ^QC.

D. Roztok CDK2: cdk2/cyklín A v 10 mM HEPES pH 7,2, 25 mM NaCI, 0,5 mM DTT, 10 % glycerol, uskladnený v 9 μΐ alikvótoch pri teplote -80 °C.

Protokol

1. Pripraví sa trojnásobný objem roztokov inhibítorov v požadovanej konečnej koncentrácii v ddH2O/15 % DMSO.

2. Do jamiek 96-jamkových platničiek sa transportuje 20 μΐ inhibítorov (alebo 20 μΐ 15 % DMSO pre pozitívnu a negatívnu kontrolu).

3. Rozmrazí sa roztok histónu Hl (1 ml/platňa), roztok ATP (1 ml/platňa plus 1 alikvót pre negatívnu kontrolu) a roztok CDK2 (9 μΐ/platňa). CDK2 sa uchováva až do použitia na ľade. Správne rozdelenie roztoku CDK2 na alikvotné množstvo zamedzí opakovaniam cyklu zmrazenie - rozmrazenie.

4. 9 μΐ roztoku CDK2 sa rozriedi 2,1 ml pufru A (na každú platňu). Roztok sa mieša a do každej jamky sa vpraví 20 μΐ.

5. 1 ml roztoku histónu Hl sa zmieša s 1 ml roztoku ATP (na jednu platňu) v skúmavke so skrutkovacím uzáverom. Pridá sa γ³³Ρ ATP do koncentrácie 0,15 μ^/20 μΐ. (0,15 μ^ na každú jamku v teste). Speneniu BSA sa zamedzí opatrným miešaniam. Do príslušných jamiek sa pridá 20 μΐ. Platne sa premiešajú na platňovej trepačke. Pre negatívnu kontrolu sa mieša roztok ATP so rovnakým množstvom 20 mM HEPES pH 7,2 a pridá sa γ³³Ρ ATP do koncentrácie 0,15 μ^/20 μΐ roztoku. Do príslušných jamiek sa pridá 20 μΐ.

6. Reakcia sa nechá prebiehať 60 minút.

··

7. Do každej jamky sa pridá 35 μΐ 10 % TCA. Platne sa miešajú na platňovej trepačke.

8. Na štvorcové filtre P30 sa umiestni z každej vzorky 40 μΐ. Filtre sa nechajú uschnúť (približne 10 - 20 minút).

9. Filtre sa omývajú 4x10 minút 250 ml 1 % kyseliny fosforečnej (10 ml kyseliny fosforečnej na liter ddĺhO).

10. Filtre sa odpočítajú pomocou scintilačného spektrofotometra na odpočítanie platničiek.

Bunkové/bioiogické testy

PDGF-Indukovaný BrdU Inkorporačný test

Látky a činidlá:

(1) Ľudský PDGF B/B, 1276-956, Boehringer Mannheim, Germany.

(2) BfrU značiace činidlo: 10 mM, v PBS (pH 7,4), Kat. č. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Germany.

(3) FixDenat: fixačný roztok (pripravený na použitie), Kat. č. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Germany.

(4) Anti-BrdU-POD: myšia monoklonálna protilátka konjugovaná peroxidázou, Kat. č. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Germany.

(5) TMB substrátový roztok: tetrametylbenzidín (TMB), pripravený na použitie, Kat. č. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Germany.

(6) PBS omývací roztok: 1XPBS, pH 7,4 (Sugen, Include, Redwood City, California).

(7) Albumín, hovädzí (BSA): prášková V. frakcia, A-8551, Sigma Chemical Co., USA.

(8) 3T3 bunková línie geneticky upravená na expresiu ľudského PDGF-R.

174 ·· ·· ·· ·· ·· · • ·· · · ·· · · ·· · • · e · · · ·· • · · · · ···· · • · ··· · ·· ···· ··· ·· ···· ·· ···

Protokol (1) Bunky sa vysievajú v množstve 8 000 buniek/jamka v DMEM, 10 % CS, 2 mM Gin na 96-jamkovú platničku. Bunky sa inkubujú cez noc pri teplote 37 °C v 5 % CO₂.

(2) Po 24 hodinách sa bunky omyjú PBS, potom sa nechajú hladovať v bezsérovom médiu 24 hodín (0 % CS DMEM s 0,1 % BSA).

(3) Tretí deň sa k bunkám pridá súčasne ligand (PDGF, 3,8 nM, pripravený v DMEM s 0,1 % BSA) a testované zlúčeniny. Do komôrok s negatívnou kontrolou sa dá len bezsérové DMEM s 0,1 % BSA, do komôrok s pozitívnou kontrolou sa dá ligand (PDGF), ale nedá sa žiadna testovaná zlúčenina. Testované zlúčeniny sú pripravené v bezsérovom DMEM s ligandom na 96jamkovej platni a postupne riedené do 7 testovaných koncentrácií.

(4) Po 20 hodinách aktivácie ligandu sa pridá riedené BrdU značiace činidlo (1 : 100 v DMEM, 0,1 % BSA) a bunky sa inkubujú s BrdU (konečná koncentrácia = 10 mM) po dobu 1,5 hodiny.

(5) Po inkubácií so značiacim činidlom sa médium odstráni dekantáciou a vytrepaním obrátenej platne na papierový uterák. Pridá sa FixDenat roztok (50 μΙ/komôrka) a platne sa inkubujú pri izbovej teplote 45 minút na platňovej trepačke.

(6) FixDenat roztok sa dôkladne odstráni dekantáciou a vytrepaním obrátenej platne na papierový uterák. Pridá sa mlieko (5 % dehydratované mlieko v PBS, 200 μΙ/jamka) ako blokovací pufer a platňa sa inkubuje 30 minút pri izbovej teplote na platňovej trepačke.

(7) Blokovací roztok sa odstráni dekantáciou a bunky sa raz omyjú PBS. Pridá sa roztok anti-BrdU-POD (riedenie 1:100 v PBS, 1 % BSA) a platňa sa inkubuje 90 minút pri izbovej teplote na platňovej trepačke.

(8) Konjugovaná protilátka sa dôkladne odstráni dekantáciou a jamky sa 5 x zmočia PBS, platňa sa vysuší preklopením a vytrepaním na papierový uterák.

175 ·· ·· ·· ·· 9· · ··· · · · · ···· • · · · · « · · • ···· ···· · • · · · · ··· ··· ···· ·· ···· ·· ·»· (9) Pridá sa TMB substrátový roztok (100 μΙ/jamka) a inkubuje sa 20 minút pri izbovej teplote na platňovej trepačke, pokiaľ sa nevyvinie zafarbenie dostatočné na fotometrickú detekciu.

(10) Absorbancia vzorky sa meria pri 410 nm (ako referenčná vlnová dĺžka v móde dvojitej vlnovej dĺžky s sčítacím filtrom 490 nm) na Dynatech čítacom zariadení pre platne ELISA.

EGF-indukovaný BrdU inkorporačný test

Látky a činidlá (1) EGF: myší EGF, 201, Toyobo, Co., Ltd. Japan.

(2) BrdU značiace činidlo: 10 mM, v PBS (pH 7,4), Kat. č. 1 647 229, Boehrin- ger Mannheim, Germany.

(3) FixDenat: fixačný roztok (pripravený na použitie), Kat. č. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Germany.

(4) Anti-BrdU-POD: myšia monoklonálna protilátka konjugovaná peroxidázou,

Kat. č. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Germany.

(5) TMB substrátový roztok: tetrametylbenzidín (TMB), pripravený na použi- tie, Kat. č. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Germany.

(6) PBS omývací roztok: IX PBS, pH 7,4 (Sugen, Inc., Redwood City, California).

(7) Albumín, hovädzí (BSA): prášková V. frakcia, A-8551, Sigma Chemical

Co., USA.

(8) 3T3 bunková línia geneticky upravená na expresiu ľudskej EGF-R.

Protokol (1) Bunky sa vysievajú na 96-jamkovú platňu v množstve 8 000 buniek/jamka v % CS, 2 mM Gin v DMEM. Bunky sa inkubujú cez noc pri teplote 37 °C v % CO₂.

·· ·· • · · · · · · • · · · · • · · · · ·· ···· ·· · 176 (2) Po 24 hodinách sa bunky omyjú PBS a potom sa nechajú hladovať v bezsérovom médiu (0 % CS DMEM s 0,1 % BSA) po dobu 24 hodín.

(3) Tretí deň sa k bunkám súčasne pridá Iigand (EGF, 2 nM, pripravený v DMEM s 0,1 % BSA) a testované zlúčeniny. Do jamiek s negatívnou kontrolou sa dá len Iigand (EGF) bez testovaných zlúčenín. Testované zlúčeniny sú pripravené v bezsérovom DMEM s ligandom na 96-jamkovej platni a postupne riedené na 7 testovaných koncentrácií.

(4) Po 20 hodinách aktivácie ligandom sa pridá riedené BrdU značiace činidlo (1 : 100 v DMEM, 0,1 % BSA) a bunky sa inkubujú s BrdU (konečná koncentrácia = 10 μΜ) po dobu 1,5 hodiny.

(5) Po inkubácii sa značiacim činidlom sa médium odstráni dekantáciou, prevrátením a vytrepaním platne na papierový uterák. Pridá sa roztok FixDenat (50 μΙ/jamka) a platne sa inkubujú pri izbovej teplote 45 minút na platňovej trepačke.

(6) Roztok FixDenat sa dôkladne odstráni dekantáciou a vytrepaním prevrátenej platne na papierový uterák. Ako blokovací pufer sa pridá mlieko (5 % dehydratované mlieko v PBS, 200 μΙ/jamka) a platňa sa inkubuje 30 minút pri izbovej teplote na platňovej trepačke.

(7) Blokovací pufer sa odstráni dekantáciou a jamky sa raz opláchnu PBS. Pridá sa (100 μΙ/jamka) roztok anti-BrdU-POD (riedenie 1:100 v PBS), l % BSA) a platňa sa inkubuje 90 minút pri izbovej teplote na platňovej trepačke.

(8) Konjugovaná protilátka sa dôkladne odstráni dekantáciou a 5 x omytím jamiek PBS. Platňa sa usuší prevrátením a vyklepaním na papierový uterák.

(9) Pridá sa substrátový roztok TMB (100 μΙ/jamka) a inkubuje sa 20 minút pri izbovej teplote na platňovej trepačke, pokiaľ sa nevyvinie zafarbenie dostatočné pre fotometrickú detekciu.

(10) Absorbancia vzoriek sa merá pri 410 nm (v móde dvojitej vlnovej dĺžky s čítacím filtrom pri 490 nm ako referenčnej vlnovej dĺžke) na Dynatech mikrofotometry pre ELISA platne.

·· • · • ·

177

EGF-indukovaná Her2-riadená inkorporácia BrdU

Látky a činidlá (1) EGF: myší EGF, 201, Tyobo, Co. Ltd. Japan.

(2) BrdU značiace činidlo: 10 mM, v PBS (pH 7,4), Kat. č. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Germany.

(3) FixDenat: fixačný roztok (pripravený na použitie), Kat. č. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Germany.

(4) Anti-BrdU-POD: myšia monoklonálna protilátka konjugovaná peroxidázou, Kat. č. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Germany.

(5) TMB substrátový roztok: tetrametylbenzidín (TMB), pripravený na použitie, Kat. č. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Germany.

(6) PBS omývací roztok: IX PBS, pH 7,4, pripravený na mieste.

(7) Albumín, hovädzí (BSA): prášková V. frakcia, A-8551, Sigma Chemical Co., USA.

(8) 3T3 bunková línia geneticky upravená na expresiu chimérického receptora majúceho extracelulárnu doménu EGR-R a intracelulárnu doménu Her2.

Protokol (1) Bunky sa vysievajú na 96-jamkovú platňu v množstve 8000 buniek/jamka, 10 % CS, 2 mM Gin. Bunky sa inkubujú cez noc pri teplote 37 °C v 5 % CO₂.

(2) Po 24 hodinách sa bunky opláchnu PBS a nechajú sa hladovať v bezsérovom médiu (0 % CS DMEM s 0,1 % BSA) 24 hodín.

(3) Tretí deň sa k bunkám súčasne pridá ligand (EGF = 2 nM, pripravený v DMEM s 0,1 % BSA) a testované zlúčeniny. Do jamiek s negatívnou kontrolou sa pridá len bezsérové DMEM s 0,1 % BSA, do jamiek s pozitívnou kontrolou sa pridá ligand (EGF), ale nepridajú sa žiadne testované zlúčeniny.

178 ·· ·· ·· ·· ·· • · · · ···· ··· • · · · · · · • ···· ···· • · · · · · · ···· ···· ·· ···· ·· ·

Testované zlúčeniny sa pripravia v bezsérovom DMEM s ligandom na 96jamkovej platni a postupne sa riedi do 7 testovaných koncentrácií.

(4) Po 20 hodinách aktivácie ligandom sa pridá riedené značiace činidlo BrdU (1:100 v DMEM, 0,1 % BSA) a bunky sa inkubujú s BrdU (konečná koncentrácia = 10 μΜ) po dobu 1,5 hodiny.

(5) Po inkubácii so značiacim činidlom sa médium odstráni dekantáciou, vytrepaním a vyklepaním platne na papierový uterák. Pridá sa roztok FixDenat (50 μΐ/jamka) a platne sa inkubujú pri izbovej teplote 45 minút na platňovej trepačke.

(6) Roztok FixDenat sa dôkladne odstráni dekantáciou a vytrepaním prevrátenej platne na papierový uterák. Pridá sa mlieko ako blokovací pufer (5 % dehydratované mlieko v PBS, 200 μΐ/jamka) a platňa sa inkubuje 30 minút pri izbovej teplote na platňovej trepačke.

(7) Blokovací roztok sa odstráni dekantáciou a jamky sa raz opláchnu PBS. Pridá sa roztok (100 μΐ/jamka) anti-BrdU-POD (riedenie 1:100, 1% BSA) a platňa sa inkubuje pri izbovej teplote 90 minút na platňovej trepačke.

(8) Konjugovaná protilátka sa dôkladne odstráni dekantáciou a 5x opláchnutím komôrok PBS, platňa sa osuší prevrátením a vyklepaním na papierový uterák.

(9) Pridá sa TMB substrátový roztok (100 μΐ/jamka) a inkubuje sa 20 minút pri izbovej teplote na platňovej trepačke, pokiaľ sa nevyvinie zafarbenie dostatočné na fotometrickú detekciu.

(10) Absorbancia vzoriek sa meria pri 410 nm (v móde dvojitej vlnovej dĺžky s čítacím filtrom pri 490 nm ako referenčnej vlnovej dĺžky) na Dynatech mikrofotometry pre ELISA platne.

IGFl-indukovaný BrdU inkorporačný test

Látky a činidlá • ·

179 (1) IGF1 ligand: ľudský rekombinantný G511, Promega Corp. USA.

(2) BrdU značiace činidlo: 10 mM v PBS (pH 7,4), Kat. č. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Germany.

(3) FixDenat: fixačný roztok (pripravený na použitie), Kat. č. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Germany.

(4) Anti-BrdU-POD: myšia monoklonálna protilátka konjugovaná peroxidázou, Kat. č. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Germany.

(5) TMB substrátový roztok: tetrametylbenzidín (TMB), pripravený na použitie, Kat. č. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Germany.

(6) PBS omývací roztok; IX PBS, pH 7,4, (Sugen, Inc. Redwooed City, California).

(7) Albumín hovädzí (BSA): prášková V. frakcia, A-8551, Sigma Chemical Co., USA.

(8) 3T3 bunková línia geneticky upravená na expresiu ľudského IGF-1 receptora.

Protokol (1) Bunky sa vysievajú na 96-jamkovú platňu v množstve 8000 buniek/jamka v DMEM, 10 % CS, 2 mM Gin. Bunky sa inkubujú cez noc pri 37 °C v 5 % CO₂.

(2) Po 24 hodinách sa bunky omyjú PBS a nechajú sa hladovať v bezsérovom médiu (0 % CS DMEM s 0,1 % BSA) 24 hodín.

(3) Tretí deň sa k bunkám pridá spoločne ligand (IGF1 = 3,3 nM pripravený v DMEM s 0,1 % BSA) a testovacie zlúčeniny. Do jamiek s negatívnou kontrolou sa dá len bezsérové DMEM s 0,1 % BSA, do jamiek s pozitívnou kontrolou sa dá ligand (IGF1), ale nedajú sa žiadne testované zlúčeniny. Testované zlúčeniny sa pripravia v bezsérovom DMEM s ligandom na 96-jamkovej platni a postupne sa riedi do 7 testovaných koncentrácií.

180 ·· ·· ·· ·· • · · · ···· • · · · · ·· ···· ·· (4) Po 16 hodinách aktivácie ligandom sa pridá riedené značiace činidlo BrdU (1:100 v DMEM, 0,1 % BSA) a bunky sa inkubujú s BrdU (konečná koncentrácia = 10 mM) po dobu 1,5 hodiny.

(5) Po inkubácii so značiacim činidlom sa médium odstráni dekantáciou a vytrepaním prevrátenej platne na papierový uterák. Pridá sa FixDenat roztok (50 μΐ/jamka) a platňa sa inkubuje pri izbovej teplote 45 minút na platňovej trepačke.

(6) Roztok FixDenat sa dôkladne odstráni dekantáciou a vytrepaním prevrátenej platne na papierový uterák. Pridá sa mlieko (5 % dehydratované mlieko v PBS, 200 μΐ/jamka) ako blokovací pufer a platňa sa inkubuje 30 minút pri izbovej teplote na platňovej trepačke.

(7) Blokovací roztok sa odstráni dekantáciou a jamky sa raz omyjú PBS. Pridá sa roztok anti-BrdU-POD (v riedení 1:100 v PBS, 1 % BSA, a objemu 100 μΐ/jamka) a platňa sa inkubuje 90 minút pri izbovej teplote na platňovej trepačke.

(8) Konjugát protilátky sa dôkladne odstráni dekantáciou a 5x opláchnutím jamiek PBS. Platňa sa osuší preklopením a vytrepaním na papierový uterák.

(9) Pridá sa TMB substrátový roztok (100 μΐ/jamka) a inkubuje sa 20 minút pri izbovej teplote na platňovej trepačke, pokiaľ sa nevyvinie zafarbenie dostatočné na fotometrickú detekciu.

(10) Absorbancia vzorky sa meria pri 410 nm (v móde dvojitej vlnovej dĺžky s čítacím filtrom pri 490 nm ako referenčnej vlnovej dĺžke) na Dynatech mikrofotometry pre ELISA platne.

FGF-indukovaný BrdU inkorporačný test

Tento test meria syntézu FGF-indukovanej DNA v bunkách 3Tc7/EGFr, ktoré exprimujú endogénne FGF receptory.

·· ·· ·· ·· ·· • · · · ···· ··· • · · · · · · • · · · · · · ···· ···· ·· ···· ·· · 181

Látky a činidlá (1) FGF: ľudský FGF2/bFGF (Gibco BRL, č. 13256-029).

(2) BrdU značiace činidlo: (10 mM v PBS (pH 7,4), Kat. č. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Germany).

(3) FixDenat: fixačný roztok (Boehringer Mannheim, kat. č. 1 647 229) (4) Anti-BrdU-POD (myšia monoklonálna protilátka konjugovaná peroxidázou, Boehringer Mannheim, kat. č. 1 647 229,).

(5) TMB (tetrametylbenzidín, Boehringer Mannheim, kat. č. 1 647 229).

(6) PBS omývací roztok, pH 7,4 (Sugen, Inc.).

(7) Albumín hovädzí (BSA): prášková V. frakcia, Sigma Chemical Co., kat. č. A-8551).

Postup

1. 3T3 geneticky upravená bunková línia: 3T3c7/EGFr.

2. Bunky sa vysievajú na 96-jamkovú platničku v množstve 8000 buniek/jamka v DMEM, 10 % CS a 2 mM Gin. Bunky sa inkubujú 24 hodín pri 37 °C v 5 % CO₂.

3. Po 24 hodinách sa bunky omyjú PBS a nechajú sa hladovať v bezsérovom médiu (0 % DMEM, 0,1 % BSA) 24 hodín.

4. K bunkám sa pridá spoločne ligand (FGF2 (1,5 nM v DMEM s 0,1% BSA) a testovacie zlúčeniny. Do jamiek s negatívnou kontrolou sa dá len bezsérové DMEM s 0,1 % BSA, do jamiek s pozitívnou kontrolou sa dá ligand (FGF2), ale nedajú sa žiadne testované zlúčeniny. Testované zlúčeniny sa pripravia v bezsérovom DMEM s ligandom na 96-jamkovej platne a postupne sa riedi do siedmich (7) testovaných koncentrácií.

182 ·· (1) Po 20 hodinách aktivácie ligandom sa k bunkám pridá riedené značiace činidlo BrdU (1:100 v DMEM, 0,1 % BSA, konečná koncentrácia je 10 nM) a bunky sa inkubujú po dobu 1,5 hodiny.

(2) Médium sa dekantuje. Zvyšky látok sa odstránia papierovým uterákom. Pridá sa FixDenat roztok (50 μΙ/jamka) a platňa sa inkubuje pri izbovej teplote 45 minút na platňovej trepačke.

(3) Odstránia sa roztok FixDenat. Pridá sa mlieko (5 % dehydratované mlieko v PBS, 200 μΙ/jamka) ako blokovací pufer a platňa sa inkubuje 30 minút pri izbovej teplote na platňovej trepačke.

(4) Blokovací roztok sa dekantuje a jamky sa raz omyjú PBS. Pridá sa roztok anti-BrdU-POD (v riedení 1:100 v PBS, 1 % BSA) a platňa sa inkubuje 90 minút pri izbovej teplote na platňovej trepačke.

(5) Konjugát protilátky sa dekantuje, jamky sa 5x opláchnu PBS. Platňa sa osuší preklopením a vytrepaním na papierový uterák.

(6) Pridá sa TMB substrátový roztok (100 μΙ/jamka) a inkubuje sa 20 minút pri izbovej teplote na platňovej trepačke, pokiaľ sa nevyvinie zafarbenie dostatočné na fotometrickú detekciu.

(7) Absorbancia vzorky sa merá pri 410 nm na Dynatech mikrofotometry pre ELISA platničky pri použití módu dvojitej vlnovej dĺžky s čítacím filtrom pri 490 nm.

Biochemický EGFR test

Tento test meria in vitro kinázovú aktivitu EGFR pri použití ELISA.

Látky a činidlá

Corning 96-jamkové ELISA platne (Corning kat. č. 25805-96).

··

183

2. SUM01 monoklonálna anti-EGFR protilátka (Biochemistry Lab, SUGEN,

Inc.).

3. PBS (Dulbeccov fosfátom pufrovaný fyziologický roztok, Gibco katalóg č. 450-1300EB).

4. TBST pufer

činidlo	mol. hmotn.	pracovná koncentrácia	množstvo na 1 1
TRIS	121,44	50 mM	6,057 g
NaCl	58,44	50 mM	8,766 g
Triton X-100	NA	0,1 %	1,0 ml

5. Blokovací pufer:

činidlo	mol. hmotn.	pracovná koncentrácia	množstvo na 1 1
Instantné odtučnené		5 %	5,0 g
mlieko Carnation
PBS	NA	NA	100 ml

6. A431 bunkový lyzát (Screening Lab, SUGEN, Inc.)

7. TBS pufer: činidlo	mol. hmotn.	pracovná koncentrácia	množstvo na 1 l
TRIS	121,14	50 mM	6,057 g
NaCl	58,44	150 mM	8,766 g

8. TBS + 10 % DMSO

činidlo	mol. hmotn.	pracovná koncentrácia	množstvo na 1 1
TRIS	121,14	50 mM	1,514 g
NaCl	58,44	150 mM	2,192 g

DMSO NA 10% 25 ml ··

184 ·· ·· ·· ·· • · · · ····· • · · · ·· • ······· • · · · ·· ···· ···· ·· ····

9. Adenozín-5'-trifosfát (ATP, z konského svalu, Sigma kat. č. A-5394).

Pripraví sa 1,0 mM roztok v dHjO. Toto činidlo by malo byť pripravené bezprostredne pred použitím a malo by byť držané na ľade.

10. MnCl₂.

Pripraví sa 1,0 M zásobný roztok v dHzO.

11. ATP/MnCh, fosforylačná zmes

činidlo	zásobný roztok	pracovná koncentrácia	množstvo na 10 ml
ATP	1,0 mM	30 μΜ	300 μΐ
MnCl2	1,0 M	50 mM	500 μΐ
dH2O		9,2 ml

Toto činidlo by malo byť pripravené bezprostredne pred použitím a malo by byť držané na ľade.

12. NUNC 96-jamkové polypropylénové platne s dnom v tvare V (Applied Scientific kat. č. AS-72092.

13. Kyselina etyléndiamíntetraoctová (EDTA)

Pripraví sa 200 mM pracovného roztoku v dl^O. Upraví sa pH na 8,0 pomocou 10 N NaOH.

14. Králičie polyklonálne antisérum proti fosfotyrozínu (Biochemistry Lab, SUGEN, Inc.)

15. Kozie protikráličie IgG konjugované peroxidázou (Biosource kat. č. ALI0404).

16. ABTS (2,2'-azino-bis(3-etylbenztiazolín-6-sulfónová kyselina), Sigma kat. č. A-1888).

• · ··

185

činidlo	zásobný roztok	pracovná koncentrácia	množstvo na 11
Kyselina	192,12	100 mM	19,21 g
citrónová
Na2HPO4	141,96	250 mM	35,49 g
ABTS	NA	0,5 mg/ml	500 mg

Prvé dve zložky sa zmiešajú v približne 900 ml dH₂O, upravia sa kyselinou fosforečnou pH na 4,0. Pridá sa ABTS, zakryje, nechá stáť približne 0,5 hodiny, filtruje. Roztok by sa mal až do použitia uchovávať v tme a pri teplote 4 °C.

17. 30 % roztok peroxidu vodíka (Fischer kat. č. H325).

18. ABTS/H₂O₂

Zmieša sa 15 ml roztoku ABTS a 2,0 μΐ H2O2. Pripraví sa 5 minút pred použitím.

19. 0,2 M Hcl.

Postup

1. 96-jamkové ELISA platne sa spracujú 0,5 pg SUMO1 v 100 μΐ PBS na jednu jamku, uskladnia sa cez noc pri 4 °C.

2. Nenaviazaná SUMO1 sa z jamiek odstráni prevrátením platní a odstránením tekutiny. Jamky sa jedenkrát omyjú dH₂O. Prebytočná tekutina sa odstráni vytrepaním platne na papierový uterák.

3. Do každej jamky sa pridá 150 μΐ blokovacieho pufru. Inkubuje sa 30 minút pri izbovej teplote za stáleho trepania.

4. Platňa sa 3x omyje deionizovanou vodou, potom raz TBST. Prebytočná tekutina a bubliny sa odstránia prevrátením a vytrepaním platne na papierový uterák.

5. Lyzát sa zriedi PBS (7pg lyzátu/100 μΐ PBS).

·· ··

186 ·· ·· • · · · • · · •· · •· • ·· •· ·· ·

6. Do každej jamky sa pridá 100 μΐ zriedeného lyzátu. Trepe sa pri izbovej teplote 60 minút.

7. Platne sa omyjú podľa vyššie uvedeného bodu 4.

8. Na ELISA platňu, ktorá obsahuje zachytený EGFR sa pridá 120 μΐ TBS.

9. Testované zlúčeniny sa zriedia TBS 1:10 na 96-jamkových polypropylénových platniach (t.j. 10 μΐ zlúčeniny + 90 μΐ TBS).

10. Na ELISA platňu sa pridá 13,5 μΐ riedených testovaných zlúčenín. Do kontrolných jamiek (jamky neobsahujúce žiadne testované zlúčeniny) sa pridá

13,5 μΐ TBS + 10 % DMSO.

11. Inkubuje sa 30 minút pri izbovej teplote za stáleho trepania.

12. Do všetkých jamiek okrem jamiek pre negatívnu kontrolu, ktoré neobsahujú ATP/MnCb (konečný objem jamiek by mal byť približne 150 μΐ s 3 μΜ ATP/5 mM MnCl₂, konečná koncentrácia v každej jamke) sa priamo pridá 15 μΐ fosforylačnej zmesi. Inkubuje sa 5 minút za stáleho trepania.

13. Po 5 minútach sa reakcia zastaví pridaním 16,5 μΐ 200 mM EDTA (pH 8,0) do každej jamky za stáleho trepania. Po pridaní EDTA sa trepe ďalšiu 1 minútu.

14. Platňa sa 4x omyje deionizovanou vodou, dvakrát TBST.

15. Do každej jamky sa pridá 100 μΙ protilátky proti fosfotyrozínu (1:3000 riedenie v TBST). Inkubuje sa 30-45 minút pri izbovej teplote za stáleho trepania.

16. Omyje sa podľa vyššie opísaného bodu 4.

17. Do každej jamky sa pridá 100 μΐ Biozdroja kozieho anti-králičieho IgG konjugovaného peroxidázou (riedenie 1:2000 v TBST). Inkubuje sa 30 minút pri izbovej teplote za stáleho trepania.

18. Omyje sa podľa vyššie opísaného bodu 4.

• B ·· BB • · · B B B B B • · · B B B • · · BBBB B • · B B B B ·· ···· ΒΒ BBB

ΒΒ ·· • · · B • ·

B B

B B ····BBBB

187

19. Do každej jamky sa pridá 100 μΙ roztoku ABTS/H2O2.

20. Inkubuje sa 5 až 10 minút za stáleho trepania. Odstránia sa všetky bubliny.

21. V prípade nutnosti sa reakcia zastaví pridaním 100 μΐ 0,2 M HC1 do každej jamky.

22. Platňa sa odpočíta na Dynatech MR7000 ELISA mikrofotometry. Testovací filter: 410 nM, referenčný filter: 630 nM.

Biochemický PDGFR test

Tento test meria in vitro kinázovú aktivitu PDGFR pomocou ELISA.

Látky a činidlá

Pokiaľ nie je uvedené inak, pripravia sa pracovné roztoky nasledujúcich činidiel rovnakým spôsobom, ako vo vyššie uvedenom biochemickom EGFR teste.

1. Corning 96t-jamkovej ELISA platne (Corning kat. č. 25805-96).

2. 28D4C10 monoklonálna anti-PDGFR protilátka (Biochemistry Lab., SUGEN, Inc.).

3. PBS (Dulbeccov fosfátom pufrovaný fyziologický roztok, Gibco kat. č. 4501300EB).

4. TBST pufer.

5. Blokovací pufer.

6. PDGFR-β lyzát 3T3 buniek exprimujúcich NIH (Screening Lab, SUGEN, Inc.).

7. TBS pufer.

8. TBS + 10 % DMSO.

9. Adenozín-5'-trifosfát (ATP, z konského svalu, Sigma kat. č. A-5394).

··

188

10. MnCI₂.

11. Kinázová pufrovacia fosforylačná zmes.

činidlo	zásobný roztok	pracovná koncentrácia	množstvo na 10 ml
TRIS	1 M	25 mM	250 μΐ
NaCl	5 M	100 mM	200 μΐ
MnCl2	1 M	10 mM	100 μΐ
TX-100	100 mM	0,5 mM	50 μΐ

12. NUNC 96-jamkovej polypropylénovej platne s dnom v tvare V (Applied Scientific kat. č. AS-72092).

13. Kyselina etyléndiamíntetraoctová (EDTA).

14. Králičie polyklonálne antisérum proti fosfotyrozínu (Biochemistry Lab., SUGEN, Inc.).

15. Kozí anti-králičí IgG konjugovaný peroxidázou (Biosource kat. č. ALI0404).

16. 2,2'-azino-bis(3-etylénbenztiazolín-6-sulfónová kyselina) (ATBS, Sigma kat. č. A-1888).

17. 30 % roztok peroxidu vodíka (Fisher kat. č. H325).

18. ABTS/H₂O₂.

19. 0,2 M HC1.

Postup

1. Corning 96-jamkové ELISA platne sa spracujú s 0,5 μg 28D4C10 v 100 μΐ PBS na jamku a ponechajú cez noc pri teplote 4 °C.

2. Nenaviazaná 28D4C10 sa z jamiek odstráni preklopením platne. Jamky sa lx omyjú dH₂O. Prebytočná tekutina sa odstráni vytrepaním platne na papierový uterák.

189 ·· ·· *· • · · · · · ·· · « · • · · · · · • · · · · ·· ···· ·· ···

3. Do každej jamky sa pridá 150 μΐ blokovacieho pufru. Inkubuje sa 30 minút pri izbovej teplote za stáleho trepania.

4. Platňa sa 3x omyje deionizovanou vodou, potom Ix TBST. Prebytočná tekutina a bubliny sa odstránia vyklepaním platne na papierový uterák.

5. Lyzát sa zriedi HNTG (10 μβ lyzátu/100 μΐ HNTG).

6. Do každej jamky sa pridá 100 μΐ riedeného lyzátu. Pri izbovej teplote sa trepe 60 minút.

7. Platňa sa omyje postupom opísaným v bode 4.

8. Na ELISA platňu obsahujúcu zachytený PDGFR sa pridá 80 μΐ pracovnej kinázovej pufrovacej zmesi.

9. Testované zlúčeniny sa zriedia TBS 1:10 na 96-jamkovej polypropylénovej platni (t.j. 10 μΐ zlúčeniny + 90 μΙ TBS).

10. Na ELISA platňu sa pridá 10 μΐ riedenej testovanej zlúčeniny. Do kontrolných jamiek (t.j. jamky, ktoré neobsahujú žiadnu testovanú zlúčeninu) sa pridá 10 μΐ TBS + 10 % DMSO.

11. Inkubuje sa 30 minút pri izbovej teplote za stáleho trepania.

12. Priamo do každej jamky, okrem negatívnych kontrol, sa pridá 10 μΐ ATP (konečný objem jamiek by mal byť približne 100 μΐ s 20 μΜ ATP v každej jamke). Inkubuje sa 30 minút za stáleho trepania.

13. Po 30 minútach sa reakcia zastaví pridaním 10 μΐ 200 mM EDTA do každej jamky (pH 8,0).

14. Platňa sa 4x omyje deionizovanou vodou, 2x TBST.

15. Do každej jamky sa pridá 100 μΐ protilátky proti fosfotyrozínu (riedenie 1:3000 v TBST). Inkubuje sa pri izbovej teplote za stáleho trepania.

16. Platňa sa omyje spôsobom opísaným v bode 4 vyššie.

190 ·· ·· ·· ·· ·· • · · * ···· ··· • · * · · · e ···· ···· * · · · · · · ···· ···· ·· ···· ·· ·

17. Do každej jamky sa pridá 100 μΐ Biozdroja kozieho protikráličieho IgG konjugovaného peroxidázou (riedenie 1:2000 v TBST). Inkubuje sa pri izbovej teplote za stáleho trepania.

18. Platňa sa omyje podľa vyššie uvedeného bodu 4.

19. Do každej jamky sa pridá 100 μΐ roztoku ABTS/H2O2.

20. Inkubuje sa 10 až 30 minút za stáleho trepania. Odstránia sa bubliny.

21. V prípade nutnosti sa reakcia zastaví pridaním 100 μΐ 0,2 M HCI do každej jamky.

22. Platňa sa odpočíta na Dynatech MR7000 ELISA mikrofotometry : testovací filter: 410 nM, referenčný filter: 630 nM.

Biochemický FGFR test

Tento test meria in vitro kinázovú aktivitu fúzneho proteínu Myc-GyrBFGFR s použitím ELISA.

Látky a činidlá

1.HNTG

činidlo	mol. hmotnosť	5 x zásobná koncentrácia	množstvo na 1 1	lx pracovná koncentrácia
HEPES	238,3	100 mM	23,83 g	20 mM
NaCl	58,44	750 mM	43,83 g	150 mM
Glycerol	NA	50 %	500 ml	10 %
Triton X-	100 NA	5 %	10 ml	1,0 %

Na prípravu 1 1 5x zásobného roztoku sa rozpustí HEPES a NaCl v približne 350 ml dH₂O, pH sa upraví HCI alebo NaOH na 7,2 (podľa toho, ktorý HEPES sa použije), pridá sa glycerol, Triton X-100 a objem sa doplní dH₂O.

191

2. PBS (Dulbeccov fosfátom pufrovaný fyziologický roztok, Gibco katalóg, č. 450-1300EB).

3. Blokovací pufor.

4. Kinázový pufor.

činidlo	mol. hmotnosť	lOx zásobná koncentrácia	lx pracovná koncentrácia
HEPES (pH 7,2)	238,3	500 mM	50 mM
MnCl2		20 mM	2 mM
MgCl2	203,32	200 mM	10 mM
Triton-X-100		1 %	0,1 %
DTT	380,35	5 mM	0,5 mM

5. Fenylmetylsulfonyl fluorid (PMSF, Sigma, Kat. δ. P-7626):

Pracovná koncentrácia: 100 mM v etanole.

6. ATP (bakteriálny zdroj, Sigma kat. č. A-7699).

Pre pracovnú koncentráciu 6 mM sa použije 3,31 mg na 1 ml MilliQ H₂O.

7. Biotinom konjugovaná monoklonálna protilátka proti fosfotyrozínu (kloň 4G10, Upstate Biotechnology Inc. kat. č. 16-103, ser. č. 14495).

8. Vectastain Elite ABC činidlo (Avidín konjugovaný peroxidázou, Vector Laboratories kat. č. PK-6 100).

9. Roztok ABTS.

10.30 % roztok peroxidu vodíka (Fischer katalóg č. H325).

11. ABTS/H₂O₂.

12. 0,2 M HC1.

13. TRIS Hcl (Fischer kat. č. BP 152-5).

Pripraví sa 1,0 mM roztok v MilliQ H2O, pH sa upraví HC1 na 7,2.

192 • ·· · · β · · a··· • ··· · · ·· • · B · · · · · ·φ

B · 8 B B 8 8B ···· 8888 ·· ···· ·· ···

14. NaCI (Fischer kat. č. S271-10).

Pripraví sa 5 M roztok v MilliQ H₂O.

15. MgCI₂ (Fischer kat .č. M33-500).

Pripraví sa IM roztok v MilliQ H₂O.

16. HEPES (Fischer kat. č. BP310-500).

Pripraví sa 1 M roztok v MilliQ H₂O, pH sa upraví 7,5 a sterilné sfiltruje.

17. TBST pufer.

18. Pufer uhličitanu sodného (Fischer kat. č. S495).

Pripraví sa 0,1 M roztok v MilliQ H₂O, pH sa upraví NaOH na 9,6 a sfiltruje.

19. Ditiotreitol (DTT, Fischer kat. č. BP172-25).

Pripraví sa 0,5 mM pracovný roztok v MilliQ H₂O bezprostredne pred upotrebením. Do použitia sa uchováva pri teplote -20 °C. Akékoľvek zvyšky sa vyhodia.

20. MnCI₂.

21. Triton X-100.

22. Kozí α-králičí IgG (Cappel).

23. Afinitne purifikovaný králičí a GST GyrB (Biochemistry Lab. SUGEN,

Inc.).

Postup

Pokiaľ nie je uvedené inak, vykonávajú sa všetky nasledujúce kroky pri izbovej teplote.

193 ·· ·· ·· ·· ·· ···· ···· · · • · · · · e · • · · · · · ·

1. Corning 96-jamkové ELISA platne sa spracujú 2 pg kozej α-králičej protilátky v uhličitanovom pufry do každej jamky tak, aby celkový objem jamky bol 100 pl. Platňa sa uchová cez noc pri teplote 4 °C.

2. Nenaviazaná kozia a-rabbit protilátka sa odstráni prevrátením platne. Prebytočná tekutina a bubliny sa odstránia vytrepaním platne na papierový uterák.

3. Do každej jamky sa pridá 150 μΐ blokovacieho pufru (5 % nízkotučného mlieka v PBS). Za stáleho miešania sa inkubuje na platňovej trepačke.

4. Omyje sa 4x TBST. Platňa sa vyklepe na papierový uterák, aby sa odstránila prebytočná tekutina a bubliny.

5. Do každej jamky sa pridá 0,5 pg králičej a-GyrB. Protilátka sa riedi PDBS do konečného objemu 100 μΐ na každú jamku. Inkubuje sa za stáleho trepania na platňovej trepačke pri izbovej teplote 1 hodinu.

6. Platňa sa 4x omyje TBST postupom opísaným v bode 4 vyššie.

7. Do každej jamky sa pridajú 2 pg COS/FGFR bunkového lyzátu (zdroj MycGyrB-FGFR) v HNTG do konečného objemu 100 μΐ na jamku. Za stáleho trepania sa inkubuje na platňovej trepačke po dobu 1 hodiny.

8. Omyje sa 4x TBST postupom opísaným v kroku 4.

9. Do každej jamky sa pridá 80 μΐ kinázového pufru.

10. Testované zlúčeniny sa nariedia na polypropylénovej 96-jamkovej platni lx kinázovým pufrom v pomere 1:10.

11. 10 μΐ riedeného roztoku testovaných zlúčenín a obsah kontrolných jamiek sa z polypropylénovej platne prenesie do zodpovedajúcich jamiek ELISA platne, inkubuje sa za stáleho trepania na mikrotitračnej platni 20 minút.

194 ·· ·· ·· ·· ·· • · « · · · · · ··· • · · · · · ·

12. Do jamiek s pozitívnou kontrolou a testovaných jamiek sa pridá 10 μΐ 70 μΜ ATP riedeného v kinázovom pufry (konečná koncentrácia ATP je 7 μΜ/jamka). Inkubuje sa za stáleho trepania na platňovej trepačke 15 minút.

13. Kinázová reakcia sa zastaví pridaním 5 μΐ 0,5 M EDTA do každej jamky.

14. Omyje sa 4x TBST podľa postupu opísaného v bode 4.

15. Do každej jamky sa pridá 100 μΐ biotinom konjugovanej a-fosfotyrozin monoklonálnej protilátky (b4G10). Inkubuje sa za stáleho trepania na platňovej trepačke 30 minút.

16. Pripraví sa Vectastain ABC činidlo. Do 15 ml TBST sa pridá 1 kvapka činidla A. Premieša sa prevrátením skúmavky. Do zmesi sa ďalej pridá 1 kvapka činidla B.

17. Omyje sa 4x TBST postupom podľa kroku 4.

18. Do každej jamky sa pridá 100 μΐ ABC HRP činidla. Inkubuje sa za stáleho trepania na platňovej trepačke 30 minút.

19. Omyje sa 4x TBST postupom opísaným v kroku 4.

20. Do každej jamky sa pridá 100 μΐ ABTS/H₂O₂.

21. Inkubuje sa 5 až 15 minút za stáleho trepania. Všetky bubliny sa odstránia.

22. V prípade nutnosti sa reakcia zastaví pridaním 100 μΐ 0,2 M HCl/jamka.

23. Platňa sa odpočíta na Dynetech MR7000 ELISA mikrofotometry, testovací filter: 410 nM, referenčný filter: 630 nM.

Biochemický FLK-1 test

Tento test vyhodnocuje in vitro autofosforylačnú aktivitu flk-1 s použitím ELISA.

• ·

195 ·· ·· • ·

Látky a činidlá

1. 15 cm misky na tkanivové kultúry.

2. Bunky Flk-1: NIH fibroblastoidná línia exprimujúca ľudský flk-1 kloň 3 (SUGEN, Inc., získaný z MPI, Marinsried, Germany).

3. Rastové médium: DMEM s teplotné inaktivovaným 10 % FBS a 2 mM glutamínu (Gibco - BRL).

4. Hladové médium: DMEM a 0,5 % teplotné inaktivovaný 0,5 % FBS, 2 mM glutamín (Gibco-BRL).

5. Corning 96-jamkovej ELISA platne (Corning kat. č. 25805-96).

6. Monoklonálna protilátka L4 alebo E38 špecifická na flk-1, purifikovaná afinitnou chromatografiou na proteín-A agaróze (SUGEN, Inc.).

7. PBS (Dublbeccov fosfátom pufrovaný fyziologický roztok), Gibco kat.č. 450-1300EB).

8. HNTG (viď príprava v Biochemickom FGFR).

9. Pierce BCA detekčná súprava.

10. Blokovací pufer.

11. TBST (pH 7,0).

12. Kinázový pufer.

13. Stopovací kinázový roztok: 200 mM EDTA.

14. Biotinovaná 4G10, špecifická na fosfotyrozín (UBI, kat. č. 16-103).

15. AB súprava (Vector Laboratories kat. č. PK 4000).

16. DMSO.

17. NUNC 96-jamkovej polypropylénovej platne (V-dno) (Applied Scientific kat. č. AS-72092).

196 ·· ·· 99 9999

9 9 9 9 9 9 9 99

9 9 9 9 99

9 9 9 9 99

999 9999 99 999999 9

18. Turbo-TMB (Pierce).

19. Turbo-TMB stopovací roztok: 1 M H2SO4.

20. ATP (Sigma kat. č. A-7699).

21. 20 % DMSO v TBS (pH 7,0).

Postup

Pestovanie buniek a príprava lyzátu.

1. Bunky sa vysejú do rastového média a pestujú 2-3 dni do 90-100 % pokryvu pri 37 °C a 5 % CO₂. Počet pasáží nesmie prekročiť 20.

2. Médium sa odstráni a bunky sa 2x omyjú PBS. Bunky sa lyžujú HNTG lyzovacím pufrom. Všetok lyzát sa zhromaždí a vortexuje 20-30 minút.

3. Nerozpustný materiál sa odstráni centrifugáciou (5-10 minút pri cca 10 000 xg)·

4. Koncentrácia proteínu sa určí pomocou BCA súpravy.

5. Lyzát sa rozdelí do 1 mg alikvótov a uskladní pri -80 °C.

Postup testu

1. Corning 96-jamkovej ELISA platne sa spracuje 2 pg/jamka purifikovanej L4 (alebo E 38) v 100 μΐ PBS. Uskladní sa pri teplote 4 °C cez noc.

2. Nenaviazané proteíny sa z jamiek odstránia prevrátením platne, aby sa odstránila tekutina. Platňa sa raz omyje dH₂O, prebytočná tekutina sa z platne vytrepe na papierový uterák.

3. Platne sa blokujú 150 μΐ blokovacieho pufru do každej jamky. Inkubuje sa 45-60 minút za stáleho trepania pri teplote 4 °C.

4. Blokovací pufer sa odstráni a ELISA platňa sa trikrát omyje dH₂O a raz TBST. Prebytočná tekutina sa odstráni vytrepaním platne na papierový uterák.

• ·

5. Lyzát sa zriedi PBS do konečnej koncentrácie 50 pg/100 μΐ. Do každej jamky sa pridá 100 μΐ riedeného lyzátu. Inkubuje sa cez noc pri teplote 4 °C za stáleho trepania.

6. Nenaviazané proteíny sa z jamiek odstránia preklopením platne. Platňa sa omyje postupom rovnakým ako v kroku 4.

7. Do každej jamky sa pridá 80 μΐ kinázového pufru (90 μΐ do jamiek s negatívnou kontrolou).

8. Testované zlúčeniny sa rozriedia (obvykle lOx) do jamiek na polypropylénovej platne obsahujúcej 20 % DMSO v TBS.

9. Do komôrok ELISA platne obsahujúcich imobilizovaný flk-1 sa pridá 10 μΐ riedených zlúčenín a trepe sa. Kontrolné jamky neobsahujú žiadne zlúčeniny.

10. Zo zásobného 1 mM roztoku ATP sa pripraví 0,3 mM roztok ATP v dH₂O (môže sa tiež použiť kinázový pufer).

11. Do každej jamky, okrem negatívnych kontrol, sa pridá 10 μΐ 0,3 mM ATP. Inkubuje sa 60 minút pri izbovej teplote za stáleho trepania.

12. Po 1 hodine sa reakcia zastaví pridaním 11 μΐ 200 mM EDTA. Trepe sa 1-2 minúty.

13. ELISA platňa sa 4x omyje dH₂O a 2x TBST.

14. Do každej jamky sa pridá 100 μΐ 1:5000 biotinylovanej 4G10:TBST. Inkubuje sa 45 minút pri izbovej teplote za stáleho trepania.

15. Zatiaľ čo sa vyššie uvedená platňa inkubuje, pridajú sa do 10 ml TBST 50 μΐ roztoky A & B z ABC súpravy. Tieto roztoky sa musia miešať približne 30 minút pred použitím.

16. Platne sa omyjú postupom uvedeným v kroku 4.

17. Do každej jamky sa pridá 100 μΐ vopred pripraveného A & B komplexu. Inkubuje sa 30 minút za stáleho trepania pri izbovej teplote.

• 9

198

18. Platne sa omyjú postupom uvedeným v kroku 4.

19. Pridá sa 100 μΐ turbo-TMB. Trepe sa pri izbovej teplote 10-15 minút.

20. Akonáhle zafarbenie jamiek s pozitívnou kontrolou dosiahne absorbanciu okolo 0,35-0,4, reakcia sa zastaví 100 μΐ turbo-TMB stopovacieho roztoku.

21. Platne sa odpočítajú na Dynatech MR7000 ELISA mikrofotometer, testovací filter: 450 nM, referenčný filter: 410 nM.

HUV-EC-C test

Nasledujúci protokol môže byť tiež použitý na meranie aktivity zlúčeniny proti PDGF-R, FGF-R, VEGF, aFGF alebo Flk-1/KDR, ktoré sú všetky prirodzene exprimované bunkami HUV-EC.

Deň 0

1. HUV-EC-C bunky sa omyjú a trypsinizujú, (Američan Type Culture Collection, kat. č. 1730 CRL). Omyjú sa Dulbeccovým fosfátom pufrovaným fyziologickým roztokom (D-PBS, získaný od Gibco BRL, kat. č. 14190-029) 2x v množstve 1 ml/10 cm² nádoby na tkanivové kultúry. Trypsinizujú sa 0,05 % trypsín-EDTA v neenzymatickom bunky disociujúcom roztoku (Sigma Chemical Company, kat. č. C-1544). 0,05 % trypsín sa pripraví riedením 0,25 % trypsín/1 mM EDTA (Gibco, katalógové č. 25200-049) bunky disociujúcom roztokom. Trypsinizuje sa asi 1 ml/25-30 cm² nádoby na tkanivové kultúry po dobu 5 minút pri teplote 37 °C. Akonáhle sa bunky oddelia od nádoby, pridá sa ekvivalentný objem testovacieho média a prenesie sa do sterilnej 50 ml centrifugačnej skúmavky (Fischer Scientific, katalógové č. 05539-6).

2. Bunky sa omyjú asi 35 ml testovacieho média v sterilnej 50 ml centrifugačnej skúmavke pridaním tohto testovacieho média, centrifugujú sa 10 minút pri rýchlosti približne 200xg, supernatant sa odsaje, bunky sa resuspendujú 35 ml D-PBS. Omytie sa opakuje ešte 2x s D-PBS, bunky sa resuspendujú asi v 1 ml testovacieho média/15 cm² nádobe na tkanivové kultúry. Testovacie médium sa skladá z média F12K (Gibco BRL, katalógové č. 21127-014) a 0,5 • ·

99 ···· • · · · · · · ·· • 9 9 9 9 99 • 9 9 9 9 99

9999 9999 99 999999

199 % teplom inaktivovaného fetálneho hovädzieho séra. Bunky sa spočítajú pomocou Coulter Counter® (Coulter Electronics, Inc.) a k bunkám sa pridá testovacie médium, aby sa získala koncentrácia 0,8-1,0 x 10⁵ buniek/ml.

3. Bunky sa pridajú do 96-jamkových platní s plochým dnom v množstve 100 μΙ/jamka alebo 0,8-1,0 x 10⁴ buniek/jamka, inkubujú sa približne 24 hodín pri teplote 37 °C v 5 % CO₂.

Deň 1

1. Pripravia sa dvojnásobné titrácie testovacích zlúčenín v samostatných 96jamkových platniach, obvykle od 50 mM dole k 0 mM. Použije sa rovnaké testovacie médium ako pre deň 0, krok 2 vyššie. Titrácie sa vykonajú pridaním 90 μΙ/jamka testovacej zlúčeniny v 200 μΜ (4x konečná koncentrácia v jamke) do hornej jamky príslušného stĺpca na platne. Pretože zásobná testovaná zlúčenina je obvykle 20 mM v DMSO, obsahuje 200 μΜ koncentrácie látky 2 % DMSO.

Riedidlo s koncentráciou 2 % DMSO v testovacom médiu (F12K + 0,5 % fetálne hovädzie sérum) sa použije ako riedidlo na titrácie testovaných zlúčenín, aby sa testované zlúčeniny nariedili a pritom sa uchovala stála koncentrácia DMSO. Toto riedidlo sa pridá ku zvyšujúcim jamkám v stĺpci v množstve 60 μΙ/jamka. Vezme sa 60 μΐ z 120 μΐ 200 μΜ riedenej testovanej zlúčeniny na počiatku stĺpca jamiek a zmieša sa s 60 μΐ v druhej jamke toho istého stĺpca. Vezme sa 60 μΐ z tejto jamky a zmieša sa s 60 μΐ v tretej jamke toho istého stĺpca a tak ďalej, pokiaľ sa nevykoná dvojitá titrácia. Akonáhle sa zmieša predposledná jamka, vezme sa 60 μΐ z 120 μΐ v tejto jamke a dá sa bokom. Posledná jamka sa ponechá s 60 μΐ DMSO/riediace médium ako kontrola neobsahujúca testovanú zlúčeninu. Pripraví sa 9 stĺpcov titrácií testovaných zlúčenín pre trojice jamiek každá pre: (1) VEGF (získané od Pepro Tech Inc., katalógové č. 100-200, (2) rastový faktor endoteliálnych buniek (ECGF), (tiež známy ako kyslý fibroblastový rastový faktor alebo aFGF) (získaný od Boehringer Mannheim Biochemica, katalógové č. 1439 600) alebo (3) ľudský PDGF B/B (1276-956), Boehringer Mannheim, Germany) a kontrola s testovacím médiom. ECGF sa pripravuje s heparínom sodným.

200 ·· ·· ·· ·· ·· • · · ···· ·· • · · · · · e • · · · · ···· • · · · · · ·

2. Do každej jamky 96-jamkovej testovacej platne, ktorá v každej jamke obsahuje v 100 μΐ 0,8-l,0xl0⁴ HUV-EC-C buniek z dňa 0, sa prenesie 50 μΐ nariedených testovaných zlúčenín a inkubuje sa približne 2 hodiny pri teplote 37 °C a 5 % CO₂.

3. Do trojíc jamiek sa pridá 50 μΐ/jamka 80 100 plg/ml VEGF, 20 ng/ml ECGF alebo kontrolného média ku každej testovanej zlúčenine. S testovanými zlúčeninami majú rastové faktory 4X požadovanú konečnú koncentráciu. Na prípravu koncentrácií rastových faktorov sa použije testovacie médium z dňa 0 kroku 2. Inkubuje sa približne 24 hodín pri 37 °C, 5 % CO₂. Každá jamka bude mať 50 μΐ riedenej testovanej zlúčeniny, 50 μί rastového faktoru alebo média, 100 μί buniek, čo dohromady činí 200 μί v každej jamke. Akonáhle sa všetko pridá do jamiek, dosiahne sa 4X koncentrácia testovaných zlúčenín a rastových faktorov IX.

Deň 2

1. Do každej jamky sa pridá ³H-tymidín (Amersham, katalóg, č. TRK-686) v 1 pCi/jamka (10 μί/jamka roztoku 100 pCi/ml pripraveného v RPMI médiu + 10 % teplotné inaktivované fetálne hovädzie sérum) a inkubuje sa asi 24 hodín pri teplote 37 °C, 5 % CO₂. RPMI sa získa of Gibco BRL, katalóg, č. 11875-051.

Deň 3

1. Platne sa zmrazia cez noc pri teplote -20 °C.

Deň 4

Platne sa rozmrazia a zozbierajú zberacím zariadením pre 96-jamkové platne (Tomtec Harvester 96®) na filtry (Wallac, katalóg, č. 1205-401), rozpady sa odpočítajú v tekutinovom scintilačnom spektrofotometre Wallac Betaplate™.

In vivo živočíšne modely

Modely štepov živočíšnych tkanív

·· ·· ·· • · · · · ·

201

Schopnosť ľudských nádorov rásť na tkanivových štepoch na atymovaných myšiach (napr. Balb/c, nu/nu) poskytuje užitočný in vivo model na štúdium biologickej odpovedi na liečbu ľudských nádorov. Od dôb prvej úspešnej xenotransplantácie ľudského nádoru do atymovaných myší (Rygaard and Povlsen, 1969, Acta Päto. Microbial. Scand,. 77:758-760), bolo holým myšiam transplantovaných a na nich pestovaných mnoho rôznych ľudských nádorových bunkových línií (napr. bunky mliečnych žliaz, pľúc, močopohlavného traktu, gastrointestinálne, hlavy a krku, glioblastómy, kostí a bunky malígnych melanómov). Nasledujúci test je možné použiť na určenie hladiny aktivity, špecifity a účinku rôznych zlúčenín predkladaného vynálezu. Na hodnotenie zlúčenín sú vhodné tri základne typy testov:

bunkový/katalytický, bunkový/biologický a in vivo. Predmetom bunkového/katalytického testu je určenie účinku zlúčeniny na schopnosť TK fosforylovať tyrozíny na známom susbstráte v bunke. Predmetom bunkového/biologického testu je určenie účinku zlúčeniny na biologickú odpoveď stimulovanú TK v bunke. Predmetom in vivo testov je určenie účinku zlúčeniny v živočíšnom modeli určitého ochorenia, ako je rakovina.

Vhodné bunkové línie na experimenty so subkutánnymi cudzorodými štepmi zahrnujú bunky C6 (glióm, ATCC # CCL 107), bunky A375 (melanóm, ATCC # CRL 1555), bunky Calu 6 (pľúca, ATCC # HTB 56), bunky PC3 (prostata, ATCC # CRL 1435), bunky SKOV3TP5 a NIH 3T3 fibroblasty geneticky upravené na zvýšenú expresiu EGFR, PDGFR, IGF-1R alebo ktorejkoľvek testovanej kinázy. Na vykonanie experimentov s cudzorodými štepmi je možné použiť nasledujúci protokol:

Samice atymovaných myší (BALB/c, nu/nu) sa získajú od Simonsen Laboratories (Gilroy, CA). Všetky zvieratá sú udržiavané v sterilných podmienkach v klietkach Micro-isolator na podstielke Alpha-dri. Dostávajú sterilné krmivo pre hlodavce a vodu podľa chuti.

Bunkové línie sú pestované na vhodnom médiu (napríklad MEM, DMEM, Hamovo F10 alebo Hamovo F12 s prídavkom 5 % - 10 % fetálneho hovädzieho séra (FBS) a 2 mM glutamínom (GLN) ). Pokiaľ nie je uvedené inak, sú všetky

202 média pre bunkové kultúry, glutamín a fetálne hovädzie sérum nakupované od Gibco Life Technologies (Grand Island, NY). Všetky bunky sú pestované vo vlhkej atmosfére 90 - 95 % vzduchu a 5 - 10 % CO2 pri 37 °C. Všetky bunkové línie sú rutinne pasážované dvakrát týždenne a negatívne na mykoplazmy, čo sa určí metódou Mycotest (Gibco).

Bunky sa zbierajú pri plnom či takmer plnom pokryve 0,05 % TrypsínEDTA a peletujú pri 450 x g po dobu 10 minút. Pelety sa resuspendujú v sterilnom PBS alebo v médiu (bez PBS) do určitej koncentrácie a bunky sa implantujú do zadnej časti boku myši (8 - 10 myší v skupine, 2-10xl0⁶ buniek/zviera). Rast nádoru sa meria po 3 až 6 týždňoch s použitím plášťových kaliperov. Pokiaľ nie je uvedené inak, sú objemy nádorov vypočítané ako súčin dĺžky x šírky x výšky. P hodnoty sú vypočítavané pomocou Študentského t-testu. Testované zlúčeniny v 50 - 100 μΐ vehikulá (DMSO alebo VPD:D5W) môžu byť prenesené IP injekciou v rôznych koncentráciách aplikovaných prvý deň po implantácii.

Nádorový invazívny model

Nasledujúci nádorový invazívny model bol vyvinutý na vyhodnotenie liečebnej hodnoty a účinku zlúčenín selektívne inhibujúcich receptor KDR/FLK-1.

Postup

Ako pokusné zvieratá sú použité osem týždňové holé myši (samice) (Simonsen Inc.). Implantácia nádorových buniek môže byť vykonaná v laminárnom boxe. Ako anestetikum sa podáva intraperitoneálne Xylazín/Ketamín koktajl (100 mg/kg ketamínu a 5mg/kg Xylazínu). Odkrytia brušnej dutiny sa vykonávajú stredným rezom (približne 1,5 cm dlhým), do dutiny sa injikuje 100 μΐ média s 10⁷ nádorových buniek. Bunky sa vstrekujú buď do duodenálneho laloka, alebo do seróznej blany hrubého čreva. Peritoneum a svaly sa uzavrú hodvábom 6-0 pokračovacím stehom a koža je uzavrená použitím svoriek. Zvieratá sú denne pozorované.

203 ·· ·· ·· ·· ·· • · · · ···· ·· • · · · · · · • ···· ···· • · 9 9 9 9 9 ···· ···· ·· ···· ··

Analýza

Po 2 - 6 týždňoch, podľa výsledkov pozorovania pokusných zvierat, sú myši usmrtené a metastázy lokálnych nádorov do rôznych orgánov (pľúca, pečeň, mozog, žalúdok, slezina, srdce, svaly) sú vybraté a analyzované (meranie veľkosti nádorov, stupeň invázie, imunochémia, hybridizačné testy in situ atď.).

Meranie bunkovej toxicity

Liečebné zlúčeniny by sa mali skôr účastniť inhibície aktivity tyrozínkinázy než vykazovať cytotoxický účinok. Meranie účinnosti a bunkovej toxicity zlúčeniny sa môže získať určením liečebného indexu, t.j. IC50/LD50. IC50, dávka potrebná na dosiahnutie 50 % inhibície, sa môže merať použitím štandardných techník, ktoré sú tu opísané. LD50, dávka vedúca k 50 % toxicite, môže byť tiež meraná štandardnými postupmi (Mossman, 1983, J. Immunol. Metods, 65:55-63), meraním množstva uvoľneného LDH (Korzeniewski a Callewaert, 1983, J. Immunol. Metods, 64:313, Decker a Lohmann-Mattes, 1988, J. Immunol. Metods, 115-61) alebo meraním letálnej dávky v živočíšnych modeloch. Dáva sa prednosť zlúčeninám s veľkým liečebným indexom. Liečebný index by mal byť väčší než 2, najlepšie aspoň 10 a ešte lepšie aspoň 50.

B. Príklady - Biologická aktivita.

Príklady in vitro účinnosti zlúčenín tohto vynálezu sú uvedené v Tabuľke a 2. Údaje ukazujú, že tieto zlúčeniny sú všeobecne účinné voči rôznym PTK in vitro. Napríklad niekoľko zlúčenín tohto vynálezu, ak sú podávané orálne, vykazuje značne redukovanú priemernú veľkosť nádorov typu glióm C6 subkutánne implantovaných do myší. Viac-menej zlúčenina 5 sa v porovnaní s ostatnými zlúčeninami tohto vynálezu prejavuje výrazne najlepšie. V jednom experimente sa samiciam myší BALB/c nu/nu v deň 0 implantujú subkutánne do zadného boku bunky ľudského gliómu C6 (3 x 10⁶ buniek, n = 10 - 20 zvierat/skupina). Deň po implantácii sa myšiam orálne podávajú zlúčeniny 3, 5, 19 a 20 vo vodnom labrasóle v dávke 200 mg/kg/deň. Rast nádoru sa meria pomocou kalipérov a objemy nádorov sa vypočítajú ako súčin dĺžky x šírky x výšky.

204 ·· ·· ·· ·· ·· • · · · ···· ·· • · · · · · · • ···· ···· • · · · · · · ···· ···· ·· ···· ··

Ako je uvedené v nasledujúcom grafe, vykazujú všetky testované zlúčeniny značnú inhibíciu v porovnaní s kontrolou obsahujúcou len vehikulum. Avšak, aj napriek tomu má zlúčenina 5 štruktúru podobnú ostatným testovaným zlúčeninám, sú jej účinky výrazne odlišné. To jest, zatiaľ čo inhibícia nádorového rastu zlúčeninami 3, 19 a 21 je 18.deň po implantácii okolo 40 - 45 %, zlúčenina 5 inhibuje rast nádoru v tejto dobe 80 - 85 %.

·· ·· ·· ·· ·· • · · · ···· ·· • · · · 4 44 • ···· 4 4 44 • · · · · · « • e·· ···· ·· e···44 ···

205

Táto neočakávaná účinnosť zlúčeniny 5 in vivo, zvlášť po orálnom použití, sa ďalej prejavuje v porovnaní so zlúčeninou 65:

Zlúčenina 65 vykazuje takmer radovo vyšší účinok in vitro než zlúčenina 5 (údaje nie sú uvedené). Avšak, ak je testovaná interperitoneálne v myšiach proti rôznym líniám nádorových buniek, SF763T a SF767T, vykazuje zlúčenina 5 mierne vyšší (5 % vyššia inhibícia po 21 dňoch) až značne vyšší (14 % vyššia inhibícia po 21 dňoch) účinok než zlúčenina 65.

206

Rozdiel v aktivite zlúčeniny 5 a 65 je ešte vyšší, keď sú tieto zlúčeniny podávané orálne. Orálny účinok zlúčeniny 65 a niekoľkých jej analógov, zlúčenín 66 - 69, je uvedený v nasledujúcom grafe.

··

·· • · ··

207

Ako je vidieť na grafe, zlúčenina 65 podávaná orálne v množstve 200 mg/kg/deň vykazuje približne 65 % inhibíciu nádorov C6 18 dní po subkutánnej implantácii do myší, čo je jasne viac v porovnaní s analógmi tejto zlúčeniny, ktoré vykazujú v priemere 14 - 16 % inhibíciu nádorového rastu. Viac-menej je prekvapivé, že orálny účinok zlúčeniny 65 je aj tak značne nižší než zlúčeniny 5, ktorá, ako je uvedené vyššie, vykazuje 80 - 85 % inhibíciu v rovnakej dobe a v rovnakom nádorovom modeli.

Na porovnanie so zlúčeninou 70 vykazuje zlúčenina 5 značne menšie Ki's (t.j. väčší účinok) (inhibičnú konštantu) proti FGR-R1 (1,2 pre zlúčeninu 5 oproti 19,49 pre zlúčeninu 70) a PDGFR (údaje nie sú uvedené).

208 ·· ·· ·· ·· ·· • · · · · · · · ··· • · · · * ·9

9 9 9 9 9 9 99

9 9 9 9 99

9999 9999 99 9999 999

Neočakávaná kvalita zlúčeniny 5 je ďalej dokázaná, ak je jej účinok porovnávaný s účinkom jej blízkeho analóga, zlúčeniny 71:

Napriek štrukturálnej podobnosti vykazuje zlúčenina 71, ak je testovaná orálne pri 200 mg/kg/deň proti C6 ľudským melanómom implantovaným subkutánne myšiam BALB/c nu/nu 18 dní po implantácii, len 57 % inhibíciu nádorového rastu (údaje nie sú uvedené) opäť v porovnaní s 80 - 85 % inhibíciou, ktorú vykazuje zlúčenina 5.

Na základe vyššie uvedeného účinku zlúčeniny 5 pri orálnom podávaní je zlúčenina 5 v súčasnej dobe výhodným uskutočnením tohto vynálezu.

Záver

Prínosom tohto vynálezu je teda to, že zlúčeniny, metódy a farmaceutické zloženie tohto vynálezu sú účinné v modulácii aktivity PK a teda sa očakáva ich terapeutický účinok proti ochoreniam v súvislosti s RTK, CTK- a STK.

209 ·· ·· ·· ·· ·· • · · · ···· ··· • · · · · · · • ···· ···· • · · · · · · ···· ···· ·· ···· ·· ·

Odborníci v odbore ocenia, že tento vynález je dobre adaptovaný na realizáciu cieľov a na dosiahnutie uvedených výhod vrátane tých, ktoré sú súčasťou vynálezu. Molekulové komplexy a metódy, postupy, liečby, molekuly, špecifické zlúčeniny tu opísané sú v súčasnosti predstaviteľmi výhodných uskutočnení, sú príkladné a nie sú zamýšľané ako obmedzenie rozsahu tohto vynálezu. Ich zmeny a ďalšie využitie, ku ktorým odborníci v danom odbore dospejú, sú definované rozsahom patentových nárokov.

Odborníkom v odbore bude zrejmé, že variácie substitúcií a modifikácií môžu byť realizované v predkladanom vynáleze bez odklonu od jeho rozsahu.

Všetky patenty a publikácie uvedené v opise sú príznačné pre úroveň odborníkov v odbore, ktorých sa tento vynález tyká. Všetky patenty a publikácie sú tu začlenené pomocou odkazov v rovnakom rozsahu, v akom by bola každá jednotlivá publikácia špecificky a individuálne označená na začlenenie odkazom.

Tento vynález vhodne a názorne opísaný môže byť realizovaný v neprítomnosti akéhokoľvek prvku či prvkov, jedného či viacerých obmedzení, ktoré tu nie sú špecificky určené. Tak, napríklad, v každej situácii môže byť akýkoľvek z termínov obsahujúci, pozostávajúcej najmä z a pozostávajúcej z nahradený ktorýmkoľvek z ostatných dvoch termínov. Termíny a výrazy, ktoré boli použité, sú používané ako termíny opisné a nie obmedzujúce, a neexistuje zámer, aby z použitia takých termínov a výrazov boli vyberané akékoľvek ekvivalenty vlastností ukázaných a tu opísaných alebo ich častí, ale uznáva sa, že v rozsahu nárokovaného vynálezu sú možné rôzne modifikácie. Tým by malo byť zrozumiteľné, že aj keď je tento súčasný vynález špecificky určený výhodnými uskutočneniami a ľubovoľnými vlastnosťami, modifikácie a variácie obsahu tu uvedeného, ku ktorým sa odborníci v odbore môžu uchýliť, sú považované za súčasť rozsahu tohto vynálezu, ako je definované v patentových nárokoch.

v

Dalej tam, kde sú vlastnosti či aspekty tohto vynálezu opisované v termínoch Markushových skupín, budú odborníci v odbore uznávať, že tento vynález je týmto tiež opisovaný v termínoch ktoréhokoľvek individuálneho člena alebo • ·

210 podskupiny členov tejto Markushovej skupiny. Napríklad, ak X je opisované a vyberané zo skupiny skladajúcej sa z brómu, chlóru a jódu, sú nároky na X, ktorý je brómom, a nároky na X, ktorý je brómom a chlórom, plne opísané.

Ďalšie uskutočnenia sú medzi nasledujúcimi nárokmi.

Claims (23)

1. Pyrolom substituovaný 2-indolinón majúci chemickú štruktúru:

R' kde:

R¹ je vybraný zo skupiny pozostávajúcej z atómu vodíka, alkylu, alkenylu, alkinylu, cykloalkylu, arylu, hydroxy skupiny, alkoxy skupiny, Ckarboxy skupiny, O-karboxy skupiny, acetylu, C-amidu, C-tioamidu, sulfonylu a trihalogénmetánsulfonylu;

R je vybraný zo skupiny pozostávajúcej z atómu vodíka, halogénu, alkylu, cykloalkylu, arylu, heteroarylu a heteroalicyklu;

R³, R⁴, R⁵ a R⁶ sú nezávisle vybrané zo skupiny pozostávajúcej z atómu vodíka, alkylu, trihalogénalkylu, cykloalkylu, alkenylu, alkinylu, arylu, heteroarylu, heteroalicyklickej skupiny, hydroxy skupiny, alkoxy skupiny, aryloxy skupiny, merkapto skupiny, alkyltio skupiny, aryltio skupiny, sulfinylu, sulfonylu, S-sulfónamidu, N-sulfónamidu, trihalogénmetánsulfónamidu, karbonylu, C-karboxy skupiny, O-karboxy skupiny, C-amidu, N-amidu, kyano skupiny, nitro skupiny, halogénu, O-karbamylu, N-karbamylu, O-tiokarbamylu, N-tiokarbamylu, aminu a -NRⁿR¹²;

212 • · · · · · · · ··· • · · · · · · • · ♦ · · · · ··· ···· ·· ···· ·· ·

R¹¹ a R¹² sú nezávisle vybrané zo skupiny pozostávajúcej z atómu vodíka, alkylu, cykloalkylu, arylu, karbonylu, acetylu, sulfonylu, trifluórmetánsulfonylu a kombinovaných päť- alebo šesť-členných heteroalicyklov;

R³ a R⁴, R⁴ a R⁵, alebo R⁴ a R⁵ sa môžu spojiť a utvoriť šesť-členný arylový kruh, metyléndioxy skupinu alebo etyléndioxy skupinu;

R⁷ je vybraný zo skupiny pozostávajúcej z atómu vodíka, alkylu, cykloalkylu, alkenylu, alkinylu, arylu, heteroarylu, heteroalicyklu, hydroxy skupiny, alkoxy skupiny, aryloxy skupiny, karbonylu, acetylu, C-amidu, C-tioamidu, amidinu, C-karboxy skupiny, O-karboxy skupiny, sulfonylu a trihalogénmetán-sulfonylu;

R⁸, R⁹ a R¹⁰ sú nezávisle vybrané zo skupiny pozostávajúcej z atómu vodíka, alkylu, trihalogénalkylu, cykloalkylu, alkenylu, alkinylu, arylu, heteroarylu, heteroalicyklu, hydroxy skupiny, alkoxy skupiny, aryloxy skupiny, merkapto skupiny, alkyltio skupiny, aryltio skupiny, sulfinylu, sulfonylu, S-sulfónamidu, N-sulfónamidu, karbonylu, C-karboxy skupiny, O-karboxy skupiny, kyano skupiny, nitro skupiny, halogénu, 0karbamylu, N-karbamylu, O-tiokarbamylu, N-tiokarbamylu, C-amidu, Namidu, amino skupiny a NR^UR¹², za predpokladu, že najmenej jeden z R⁸, R⁹ alebo R¹⁰ je skupina majúca vzorec -(alki)Z kde:

Alki je vybraný zo skupiny pozostávajúcej z alkylu, alkenylu alebo alkinylu;

a Z je polárna skupina.

s predpokladom, že nasledujúca zlúčenina je vylúčená:

·· ·· ·· ·· ··· · · · · e·· • · · · · · ·

213 • · « · · » · ··· ···· ·· ···· ·· ·

6-nitro-3-(lH-pyrol-2-yImetyIén)-l ,3-dihydro-indol-2-ón.

2. Zlúčenina nároku 1, kde R¹, R² a R⁷ sú atómy vodíka.

3. Zlúčenina nároku 2, kde jeden z R⁸, R⁹ alebo R¹⁰ je alkiZ kde:

alk] je vybraný zo skupiny pozostávajúcej z nesubstituovaného nižšieho alkylu, nesubstituovaného nižšieho alkenylu a nesubstituovaného nižšieho alkinylu; a

Z je polárna skupina vybraná zo skupiny pozostávajúcej z hydroxy skupiny, alkoxy skupiny, C-karboxy skupiny, karbonylu, nitro skupiny, kyano skupiny, amino skupiny, amónium skupiny, -NRⁿR¹², C-amidu, Ssulfónamidu, sulfinylu, sulfonylu, fosfonylu, ureido skupiny, amidínu, guanidinylu, morfolínu, piperidinylu a tetrazolu.

4. Zlúčeniny nároku 1 kde R³, R⁴, R⁵ a R⁶ sú nezávisle vybrané zo skupiny pozostávajúcej z:

atómu vodíka;

halogénu;

nesubstituovaného nižšieho alkylu;

nižšieho alkylu substituovaného raz alebo viacerými skupinami vybranými zo skupiny pozostávajúcej z:

hydroxy skupiny;

halogénu;

C-karboxy skupiny substituovanej skupinou vybranou zo skupiny pozostávajúcej z:

214 •· · · •· •· · * 9· ·· ···· atómu vodíka; alebo, nesubstituovaného nižšieho alkylu;

amino skupiny; alebo, nesubstituovanej nižšej alkylalkoxy skupiny;

nižšej alkylalkoxy skupiny substituovanej jedným alebo viacerými halogénmi;

nesubstituovanej aryloxy skupiny;

aryloxy skupiny substituovanej raz alebo viacerými skupinami nezávisle vybranými zo skupiny pozostávajúcej z:

nesubstituovaného nižšieho alkylu;

nižšieho alkyl substituovaného jedným alebo viacerými halogénmi;

hydroxy skupiny;

nesubstituovanej nižšej alkylalkoxy skupiny;

halogénu;

amino skupiny; alebo,

S-sulfónamidu kde R¹¹ a R¹² sú nezávisle vybrané zo skupiny pozostávajúcej z atómu vodíka a nesubstituovaného nižšieho alkylu; nesubstituovaného arylu;

arylu substituovaného raz alebo viacerými skupinami nezávisle vybranými zo skupiny pozostávajúcej z :

halogénu;

215 nesubstituovaného nižšieho alkylu;

nižšieho alkylu substituovaného jedným alebo viacerými halogénmi;

nesubstituovanej nižšej alkylalkoxy skupiny;

amino skupiny; alebo,

-NRⁿR¹²;

nesubstituovaného heteroarylu;

heteroarylu substituovaného raz alebo viacerými skupinami nezávisle vybranými zo skupiny pozostávajúcej z :

nesubstituovaného nižšieho alkylu;

nižšieho alkylu substituovaného jedným alebo viacerými halogénmi;

nesubstituovanej nižšej alkyl alkoxy skupiny;

hydroxy skupiny;

halogénu;

amino skupiny; alebo,

-NR^UR¹²;

nesubstituovaného heteroalicyklu;

heteroalicyklu substituovaného raz alebo viacerými skupinami nezávisle vybranými zo skupiny pozostávajúcej z:

halogénu;

hydroxy skupiny;

nesubstituovaného nižšieho alkylu;

216 • · · · · · · · a ··

8 8 · 8 8 88 • 9 B 8 8 8B

M······ 88 8880 88· nižšieho alkylu substituovaného jedným alebo viacerými halogénmi;

nesubstituovanej nižšej alkylalkoxy skupiny;

amino skupiny; alebo,

R^UR¹²;

nesubstituovanej nižšej alkyl O-karboxy skupiny ;

C-amidu, kde R¹¹ a R¹² sú nezávisle vybrané zo skupiny pozostávajúcej z atómu vodíka nesubstituovaného nižšieho alkylu a nesubstituovaného arylu;

a N-amidu kde R¹¹ a R¹² sú nezávisle vybrané zo skupiny pozostávajúcej z atómu vodíka, nesubstituovaného nižšieho alkylu a nesubstituovaného arylu.

5. Zlúčenina nároku 3, kde R³, R⁴, R⁵ a R⁶ sú vybrané zo skupiny pozostávajúcej z:

atómu vodíka;

halogénu;

nesubstituovaného nižšieho alkylu;

nižšieho alkylu substituovaného raz alebo viacerými skupinami vybranými zo skupiny pozostávajúcej z:

hydroxy skupiny;

halogénu;

C-karboxy skupiny substituovanej skupinou vybranou zo skupiny pozostávajúcej z:

• · · ·· · « • · · · ···· · · · • · · · · · · • · · · · · · _ ········ ·· ···· ·· ·

217 atómu vodíka; alebo, nesubstituovaného nižšieho alkylu;

amino skupiny; alebo,

-NR^UR¹²;

nesubstituovanej nižšej alkylalkoxy skupiny;

nižšej alkylalkoxy skupiny substituovanej jedným alebo viacerými halogénmi;

nesubstituovanej aryloxy skupiny;

aryloxy skupiny substituovanej raz alebo viacerými skupinami nezávisle vybranými zo skupiny pozostávajúcej z:

nesubstituovaného nižšieho alkylu;

nižšieho alkylu substituovaného jedným alebo viacerými halogénmi;

hydroxy skupiny;

nesubstituovanej nižšej alkylalkoxy skupiny;

halogénu;

amino skupiny; alebo,

-NR^HR¹²;

S-sulfónamidu, kde R¹¹ a R¹² sú nezávisle vybrané zo skupiny pozostávajúcej z atómu vodíka a nesubstituovaného nižšieho alkylu;

nesubstituovaného arylu;

arylu substituovaného raz alebo viacerými skupinami nezávisle vybranými zo skupiny pozostávajúcej z:

halogénu;

nesubstituovaného nižšieho alkylu;

nižšieho alkylu substituovaného jedným alebo viacerými halogénmi;

nesubstituovanej nižšej alkylalkoxy skupiny;

amino skupiny; alebo,

-NRⁿR¹²;

nesubstituovaného heteroarylu;

heteroarylu substituovaného raz alebo viacerými skupinami nezávisle vybranými zo skupiny pozostávajúcej z:

nesubstituovaného nižšieho alkylu;

nižšieho alkylu substituovaného jedným alebo viacerými halogénmi;

nesubstituovanej nižšej alkylalkoxy skupiny;

hydroxy skupiny;

halogénu;

amino skupiny; alebo,

-NRⁿR¹²;

nesubstituovaného heteroalicyklu;

heteroalicyklu substituovaného raz alebo viacerými skupinami nezávisle vybranými zo skupiny pozostávajúcej z:

halogénu;

hydroxy skupiny;

219 ···· · · · · ··· • · e · · · · nesubstituovaného nižšieho alkylu;

nižšieho alkylu substituovaného jedným alebo viacerými halogénmi;

nesubstituovanej nižšej alkylalkoxy skupiny;

amino skupiny; alebo,

RⁿR¹²;

nesubstituovanej nižšej alkyl O-karboxy skupiny;

C-amidu, kde R¹¹ a R¹² sú nezávisle vybrané zo skupiny pozostávajúcej z atómu vodíka, nesubstituovaného nižšieho alkylu a nesubstituovaného arylu;

a N-amidu, kde R¹¹ a R¹² sú nezávisle vybrané zo skupiny pozostávajúcej z atómu vodíka, nesubstituovaného nižšieho alkylu a nesubstituovaného arylu.

6. Zlúčenina nároku 1, kde:

R¹, R², R³, R⁴, R⁵, R⁶ a R⁷ sú atómy vodíka;

R⁸ a R¹⁰ sú metyl;

a R⁹ je -(CH₂)(CH₂)C(=O)OH.

7. Farmaceutická kompozícia, vyznačujúca sa tým, že obsahuje uvedenú zlúčeninu podľa nároku 6 a fyziologicky akceptovateľný nosič alebo vehikulum.

220 • « ·♦ ·

8. Zlúčenina podľa nároku 1, kde:

R¹, R² a R⁷ sú atóm vodíka;

R³, R⁴, R⁵ a R⁶ sú nezávisle vybrané zo skupiny pozostávajúcej z:

atómu vodíka;

hydroxy skupiny;

halogénu;

nesubstituovaného nižšieho alkylu;

nižšieho alkylu substituovaného karboxylovou kyselinou;

nesubstituovanej nižšej alkoxy skupiny;

karboxylovej kyseliny;

nesubstituovaného arylu;

arylu substituovaného raz alebo viacerými nesubstituovanými nižšími alkylalkoxy skupinami; alebo, morfblínom;

Λ

R je vybraný zo skupiny pozostávajúcej z atómu vodíka a nesubstituovaného nižšieho alkylu;

R⁹ je -(CH₂)(CH₂)C(=O)OH; a

R¹⁰ je nesubstituovaný nižší alkyl.

9. Zlúčenina podľa nároku 2, kde R⁷ je vybraný zo skupiny pozostávajúcej z:

atómu vodíka, nesubstituovaného nižšieho alkylu,

221 ·· ·· ·· ·· ·· • · · · · é · · ··· • · · · · · · • · · · · · · ···· ···· ·· ···· ·· · a nižšieho alkylu substituovaného skupinou vybranou zo skupiny pozostávajúcej z:

nesubstituovaného cykloalkylu, nesubstituovaného arylu, a arylu substituovaného skupinou vybranou z hydroxy skupiny, nesubstituovanej nižšej alkylalkoxy skupiny a halogénu.

10. Zlúčenina podľa nároku 2, kde Z je vybrané zo skupiny pozostávajúcej z: -C(=O)NR¹³R¹⁴, kde R¹³ a R¹⁴ sú nezávisle vybrané zo skupiny pozostávajúcej z:

atómu vodíka, nesubstituovaného nižšieho alkylu, nižšieho alkylu substituovaného skupinou vybranou zo skupiny pozostávajúcej z:

amino skupiny a -NR^UR¹², nesubstituovaného arylu, arylu substituovaného raz alebo viacerými skupinami vybranými zo skupiny pozostávajúcej z halogénu, hydroxy skupiny, nesubstituovanej nižšej alkylalkoxy skupiny a trihalogénmetylu, nesubstituovaného heteroarylu, nesubstituovaného heteroalicyklu, a kombinovaných, päť-členných alebo šesť-členných nesubstituovaných heteroalicyklov, a

-NRⁿR¹², kde,

222 ·· ·· ·· ·· ·· ··· · · · · · · · • · · · · · · • · · · · ···· • · · · · · · ··· ···· ·· ···· ·· ·

R¹¹ a R¹² sú nezávisle vybrané zo skupiny pozostávajúcej z nesubstituovaného nižšieho alkylu a, kombinovaných päť-členných alebo šesťčlenných nesubstituovaných heteroalicyklov.

11. Zlúčenina podľa nároku 1, kde:

R⁷ je vybraný zo skupiny pozostávajúcej z nesubstituovaného nižšieho alkylu, nižšieho alkylu substituovaného raz alebo viacerými skupinami vybranými zo skupiny pozostávajúcej z:

nesubstituovaného cykloalkylu, nesubstituovaného arylu, arylu substituovaného raz alebo viacerými skupinami nezávisle vybranými zo skupiny pozostávajúcej z halogénu a nesubstituovanej nižšej alkylalkoxy skupiny a nesubstituovaného nižšieho alkyl karboxyalkylu, a

Z je vybraný zo skupiny pozostávajúcej z nesubstituovanej C-karboxy skupiny a nesubstituovanej nižšej alkyl C-karboxy skupiny.

12. Zlúčenina podľa nároku 1, kde:

R³, R⁴, R⁵, a R⁶ sú nezávisle vybrané zo skupiny pozostávajúcej z:

atómu vodíka, nesubstituovaného nižšieho alkylu, halogénu,

223 ·· ·· ·· ·· ·· ···· ···· ·· • · · · · · · • · · · · ···· • · · · · · · ···· ···· ·· ···· ·· nižšieho alkylu substituovaného raz alebo viacerými hydroxy skupinami, nesubstituované nižší alkoxy skupiny, nesubstituovaného arylu, arylu substituovaného raz alebo viacerými nesubstituovanými nižšími alkoxy skupinami, a S(O)₂NR^llR¹²,

R⁵ je atóm vodíka,

R⁶ je NRⁿR¹², a

R¹¹ a R¹² sú nezávisle vybrané zo skupiny pozostávajúcej z atómu vodíka, nesubstituovaného nižšieho alkylu a kombinovaných päť-členných alebo šesť-členných nesubstituovaných heteroalicyklov.

13. Spôsob modulácie katalytickej aktivity proteínkinázy, vyznačujúci sa tým, že zahrnuje kontakt uvedenej proteínkinázy so zlúčeninou, soľou alebo proliečivom podľa nároku 1.

14. Spôsob podľa nároku 13, vyznačujúci sa tým, že uvedená proteínkináza je vybraná zo skupiny pozostávajúcej z receptorovej tyrozínkinázy, nereceptorovej tyrozínkinázy a serín/treonínkinázy.

15. Farmaceutická kompozícia, vyznačujúca sa tým, že obsahuje zlúčeninu, soľ alebo proliečivo podľa nároku 1; a fyziologicky akceptovateľný nosič alebo vehikulum.

· ·· ·· ·· ·· • · · · ···· · • · · · · · · • ···· ···· • · · · · · · ···· ···· ·· ···· ··

224

16. Spôsob ošetrenia alebo prevencie porúch tykajúcich sa proteínkinázy v organizme, vyznačujúci sa tým že zahrnuje aplikáciu terapeuticky účinného množstvo zlúčeniny, soli alebo proliečivo podľa nároku 1 do uvedeného organizmu.

17. Spôsob podľa nároku 16, vyznačujúci sa tým, že zahrnuje aplikáciu terapeuticky účinného množstvo 3-[2,4-dimetyl-5-(2-oxo-l,2-dihydroindol3-ylidenmetyl)-lH-pyrol-3-yl]-propiónovej kyseliny do uvedeného organizmu.

18. Spôsob podľa nároku 16, vyznačujúci sa tým, že uvedená porucha spojená s proteínkinázou je vybraná zo skupiny pozostávajúcej z poruchy tykajúcej sa receptorovej tyrozínkinázy, poruchy tykajúcej sa nereceptorovej tyrozínkinázy a poruchy tykajúcej sa serín/treonínkinázy.

19. Spôsob podľa nároku 16, vyznačujúci sa tým, že uvedená porucha spojená s proteínkinázou je vybraná zo skupiny pozostávajúcej z poruchy spojenej s EGFR, z poruchy spojenej s PDGFR, z poruchy spojenej s IGFR a z poruchy spojenej s flk.

20. Spôsob podľa nároku 16, vyznačujúci sa tým, že uvedená porucha spojená s proteínkinázou je rakovina vybraná zo skupiny pozostávajúcej z karcinómu epitelových buniek, astrocytómu, Kaposiho sarkómu, glioblastómu, rakoviny pľúc, rakoviny močového mechúra, rakoviny hlavy a krku, melanómu, rakoviny vaječníku, rakoviny prostaty, rakoviny prsníka, rakoviny malých pľúcnych buniek, gliómu, rakoviny hrubého čreva, močopohlavnej rakoviny a gastrointestinálnej rakoviny.

·· ·· ·· ·· • · · · ···· • · · · · • · · · · · · • · · · · ···· ···· ·· ····

225 • · •· •· •· •· ··

21. Spôsob podľa nároku 16, vyznačujúci sa tým, že uvedená porucha spojená s proteínkinázou je vybraná zo skupiny pozostávajúcej z diabetu, auto-immunitnej poruchy, hyperproliferačnej poruchy, restenózy, fibrózy, psoriázy, osteo-artritídy, reumatickej artritídy, angiogénzy, zápalových porúch, imunologických porúch a kardio-vasculárnych porúch.

22. Spôsob podľa nároku 16, vyznačujúci sa tým, že uvedený organizmus je ľudský.

23. Zlúčenina zo skupiny pozostávajúcej z: