CZ20004412A3 - Pyrrolem substituované 2-indoIinony jako inhibitory proteinkinázy - Google Patents

Abstract

Řešení se týká nových pyrrolem substituovaných 2-indolinonů a jejich fyziologicky přijatelných solí a proléčiv, které modulují aktivitu proteinkináz, a lze tudíž očekávat, že budou užitečné pro prevenci a léčbu buněčných poruch souvisejících s proteinkinázami, jako je rakovina.

Description

Oblast vynálezu

Předložený vynález se obecně týká organické chemie, biochemie, farmakologie a medicíny. Zejména se vztahuje na nové pyrrolem substituované 2-indolinony a jejich fyziologicky přijatelné soli a proléčiva, jenž modulují aktivitu protein kináz (PK), z čehož lze usuzovat, že vykazují pozitivní účinky u onemocnění, které jsou spojené s abnormální aktivitou PK.

Dosavadní stav techniky

Následující text je zde uveden pouze jako popis dosavadního stavu techniky a nemá být chápán jako známý stav techniky předloženého vynálezu.

PK jsou enzymy, které katalyzují fosforylací hydroxy skupin na tyrosinovém, serinovém a threoninovém zbytku proteinů. Následky této zdánlivě jednoduché aktivity jsou enormní; růst buněk, diferenciace a proliferace, tzn. prakticky všechny aspekty života buňky jsou závislé na aktivitě PK. Kromě toho byla abnormální aktivita PK spojována s nemocemi hostitele, v rozmezí od relativně život neohrožujících onemocnění, např. psoriáza, až po extrémně virulentní onemocnění, např. glioblastom (rakovinu mozku). PK mohou být prakticky rozděleny na dva typy, protein tyrozinkinázu (PTK) a serin/threonin kinázu (STK).

Jeden z hlavních aspektů aktivity PTK je její participace s receptory růstového faktoru. Receptory růstového faktoru jsou povrchové proteiny buňky. Pokud se navážou ligandem růstového faktoru, jsou receptory růstového faktoru konvertovány na aktivní formy, které interagují s proteiny na vnitřním povrchu buněčné membrány, což vede k fosforylací na tyrosinovém zbytku receptoru a

dalších proteinech a k tvoření komplexů uvnitř buňky s různými cytoplazmatickými signálními molekulami, které ovlivňují mnoho buněčných reakcí, např. buněčné dělení (proliferace), buněčnou diferenciaci, růst buňky, expresi metabolických účinků do extracelulárního mikroprostoru, atd. Pro detailnější popis viz Schlessinger a Ullrich, Neuron, 9:303-391 (1992), zde je uvedeno jako odkaz.

Receptory růstového faktoru, které mají PTK aktivitu, jsou známy jako tyrozinkinázové receptory (RTK). Obsahují velkou skupinu transmembránových receptorů s rozdílnou biologickou aktivitou. Do současné doby bylo identifikováno alespoň devatenáct (19) odlišných podskupin RTK, např. podskupina označená „HER“ RTK, která zahrnuje EGFR (epiteliální receptor růstového faktoru), HER2, HER3 a HER4. Tyto RTK se skládají z vazebné oblasti extracelulárního glykosylovaného ligandu, transmembránové oblasti a intracelulární cytoplazmatické katalytické oblasti, která může fosforylovat tyrozinové zbytky na proteinech.

Další podskupiny RTK se skládají z receptoru insulinu (IR), receptoru růstového faktoru I (IGF-1R), který je podobný receptoru insulinu, a receptoru příbuzného receptoru insulinu (IRR). IR a IGF-1R interagují s insulinem, IGF-I a IGF-II za vzniku heterotetrameru dvou zcela glykosylovaných extracelulárních podjednotek a a dvou podjednotek β, které protínají buněčnou membránu, a které obsahují tyrozinkinázovou oblast.

Třetí podskupina RTK je označována jako skupina receptoru růstového faktoru destičkového charakteru (PDGFR), která zahrnuje PDGFRa, ΡϋΰΕΚβ, CSFIR, c-kit a c-fms. Tyto receptory se skládají z glykosylovaných extracelulárních oblastí složených z různého množství ohybů podobných imuglobulinu a intracelulárních oblastí, kde tyrozinkinázová oblast je přerušena nepříbuznými sekvencemi aminokyselin.

Jiná skupina, která, díky své podobnosti k podskupině PDGFR, je někdy zařazována do novější skupiny, podskupina receptoru plodové • ·

jaterní kinázy (flk). Byla vyslovena domněnka, že tato skupina je vytvořena z receptoru fetální jaterní kinázy 1, (KDR/FLK-1), flk-lR, flk-4 a fms-jako tyrozinkináza 1 (flt-1), vloženého do oblasti kinázy.

Další člen skupiny receptoru růstového faktoru tyrozinkinázy je podskupina fibroblastického růstového faktoru (FGF). Tato skupina je složena ze čtyřech receptorů, FGFR1-4, a sedmi ligandů, FGF1-7. Zatímco ještě není dostatečně popsán, zdá se, že se receptory skládají z glykosylovaných extracelulárních oblastí obsahujících různý množství smyček podobných imuglobulinu a intracelulárních oblastí, kde tyrosinkinázová oblast je přerušena nepříbuznými sekvencemi aminokyselin.

Další člen skupiny receptoru růstového faktoru tyrozinkinázy je podskupina vaskulárního endoteliálního receptoru růstového faktoru (VEGF). VEGF je dimérní glykoprotein podoný PDGF, ale má odlišné biologické funkce a in vivo specifické cílové buňky. Zejména o VEGF se nyní uvažuje v souvislosti s jeho hlavní úlohou při vaskulární genezi a angiogenezi. Ucelenější přehled známých podskupin RTK lze nalézt v Plowman et al., DN&P, 7(6): 334-339 (1994), zde je připojeno jako odkaz.

Kromě RTK existuje také skupina zcela intracelulárních PTK nazývaná „nereceptorové tyrozinkinázy“ nebo „buněčné tyrozinkinázy“. Toto poslední označení bude dále zkráceno na CTK. CTK neobsahují extracelulární a transmembránové oblasti. Do současné doby bylo indentifikováno přes 24 CTK v 11 podskupinách (Src, Frk, Btk, Csk, Abl, Zap70, Fes, Fps, Fak, Jak a Ack). Podskupina Src vypadá na to, že bude největší skupinou CTK a zahrnuje Src, Yes, Fyn, Lyn, Lek, Blk, Hek, Fgr a Yrk. Pro podrobnější přehled o CTK viz Bolen, Oncogene, 8:2025-2031 (1993), zde je připojeno jako odkaz.

Serin/threoninkinázy, dále jen STK, podobné CTK, jsou převážně intracelulární, ačkoliv je zde několik receptorových kináz typu STK. Z cytosolových kináz jsou nejběžnější STK; tj. kinázy, které vykonávají svoji funkci v této části cytoplazmy mimo cytoplazmatických organel a cytoskeletu. Cytosol je oblast v buňce, kde probíhá mnoho intermediálních metabolických a biosyntetických aktivit buňky; např.

v cytosolu se na ribozómech syntetizují proteiny.

Byla prokázána účast RTK, CTK a STK na patogenních onemocněních hostitele, včetně, a to významně, rakoviny. Jiné patogenní onemocnění, která byla spojena s PTK zahrnují, ale není to nikterak omezeno, psoriázu, cirhózu jater, diabetes, angiogenezi, restenózu, oční onemocnění, revmatoidní artritidu, a jiná zánětlivá onemocnění, např. autoimunní chorobu, kardiovaskulární onemocnění, např. aterosklerózu a různé renální poruchy.

Co se týká rakoviny, tak dvě hlavní hypotézy objasňují nadměrnou buněčnou proliferaci, která je motorem rakovinného bujení spojeného s funkcemi, o kterých je známo, že jsou regulovány (řízeny) PK. Tj., byl vysloven předpoklad, že maligní buněčný růst vzniká nabouráním mechanismů, které regulují (řídí) buněčné dělení a/nebo buněčnou diferenciaci. Bylo uvedeno, že tvorba proteinů mnoha protoonkogenů je zahrnuta v signálních cestách transdukce, které regulují (řídí) buněčný růst a diferenciaci. Tyto proteinové produkty protoonkogenů zahrnují extracelulární růstové faktory, transmembránové receptory PTK růstového faktoru (RTK), cytoplazmatické PTK (CTK) a cytosolové STK, jak je uvedeno výše.

Vzhledem k zdánlivé spojitosti mezi buněčnými aktivitami souvisejícími s PK a širokou paletou lidských poruch, není překvapením, že bylo vynaloženo hodně úsilí při pokusech identifikovat způsoby modulování aktivity PK. Některé z těchto pokusů se týkaly biomimetických metod prováděných pomocí velkých molekul modelovaných pro účinné buněčné zpracování (např. mutantní ligandy (U.S. App. No. 4,966,849); rozpustné receptory a protilátky (App. No. WO 94/10202, Kendall and Thomas, Proč. Naťl Acad. Sci., 90: 1070509 (1994), Kim, et al., Nátuře, 362: 841-844 (1993)); ligandy RNA (Jelínek, et al., Biochemistry, 33: 10450-56); Takano, et al., Mol, Bio, Cell 4: 358A (1993); Kinsella, et al., Exp. Cell Res. 199: 56-62 (1992); Wright, et al., J. Cellular Phys., 152: 448-57) a inhibitory tyrozinkinázy (WO 94/03427; WO 92/21660; WO 91/15495; WO • · · · · ·

94/14808; U.S. Pat. No. 5,330,992; Mariani, et al., Proč. Am. Assoc. Cancer Res., 35: 2268 (1994)).

Kromě výše uvedeného, byly prováděny pokusy k identifikování malých molekul, které reagují jako inhibitory PK. Jako inhibitory tyrozinkinázy byly popsány např. bis-monocyklické, bicyklické a heterocyklické arylové sloučeniny (PCT WO 92/20642), deriváty vinylen-azaindolu (PCT WO 94/14808) a 1 -cyklopropyl-4pyridylchinolony (U.S. Pat. No. 5,330,992). Jako inhibitory PTK účinné při ošetření rakoviny byly popsány styrylové sloučeniny (U.S. Pat. No. 5,217,999), pyridylové sloučeniny substituované styrylem (U.S. Pat. No. 5,302,606), deriváty chinazolinu (EP App. No. 0 566 266 Al), selenindoly a selenidy (PCT WO 94/03427), tricyklické polyhydroxylové sloučeniny (PCT WO 92/21660) a sloučeniny benzylfosfonové kyseliny (PCT WO 91/15495).

Podstata vynálezu

Naše úsilí identifikovat malé organické molekuly, které modulují aktivitu proteinkináz a u kterých tudíž lze očekávat, že budou užitečné při léčbě a prevenci poruch souvisejících s abnormální aktivitou proteinkináz, nás vedlo k objevu rodiny nových sloučenin, pyrrolem substituovaných 2-indolinonů, které vykazují schopnost modulovat aktivitu proteinkináz, a tudíž lze očekávat, že mají příznivý účinek na poruchy odvozené od abnormálních aktivit proteinkináz. Jsou to tyto sloučeniny, které jsou předmětem tohoto vynálezu.

Tak se tento vynález obecně týká nových pyrrolem substituovaných 2-indolinonů, které modulují aktivity receptorových tyrozinkináz (RTK), nereceptorových proteintyrozinkináz (CTK) a serin/threoninproteinkináz (STK). Dále se tento vynález týká přípravy a použití farmaceutické kompozice zde předkládaných sloučenin a jejich fyziologicky přijatelných solí a proléčiv pro léčbu a prevenci poruch souvisejících s proteinkinázami, jako je například, nikoli však pouze, rakovina, diabetes, cirhóza jater, kardiovaskulární nemoci jako « · · · atheroskleróza, angiogeneze, imunologická onemocnění jako autoimunitní onemocnění a ledvinová onemocnění.

Termíny 2-indolinon,indolin-2-on a 2-oxindol jsou zde zaměnitelné a vztahují se k molekule mající chemickou strukturu:

Termín pyrrol se vztahuje k molekule mající chemickou strukturu:

Termíny pyrrolem substituovaný 2-indolinon a 3-pyrrolidenyl2-indolinon jsou zde zaměnitelné a vztahují se k chemické sloučenině s obecnou strukturou danou vzorcem 1.

Termín farmaceutická kompozice se vztahuje ke směsi jedné nebo více složek, fyziologicky přijatelných solí nebo jejich proléčiv, s dalšími chemickými složkami jako jsou např. fyziologicky přijatelné nosiče a vehikulum. Záměrem použití farmaceutické kompozice je usnadnit aplikaci sloučeniny do organizmu.

Termín proléčivo se týká chemického prostředku, který je přeměněn v mateřské léčivo in vivo. Proléčiva jsou často užitečná, protože mohou být, v některých případech, snadněji aplikována než • · · · mateřské léčivo. Mohou být například biologicky dostupná pro orální podávání, zatímco mateřské léčivo nikoliv. Proléčivo může být také lépe rozpustné ve farmaceutických kompozicích než mateřské léčivo. Příkladem proléčiva by kromě jiného, byla sloučenina podle vynálezu, která je podávána jako ester (proléčivo), aby se usnadnil přestup přes membránu buňky, kde je rozpustnost ve vodě škodlivá z důvodů pohyblivosti, ale poté je metabolicky hydrolyzována na karboxylovou kyselinu, aktivní látku, která je již uvnitř buňky, kde je rozpustnost ve vodě prospěšná.

Dalším příkladem by mohl být krátký polypeptid, například, kromě jiného, 2-10 polypeptidová aminokyselina, navázaná přes konečnou amino skupinu na karboxylovou skupinu této sloučeniny podle vynálezu, v níž je polypeptid hydrolyzován nebo metabolizován in vivo, aby uvolnil aktivní molekulu.

Termín pyrrolaldehyd se vztahuje k molekule mající chemickou strukturu:

Jak zde bylo použito, fyziologicky přijatelný nosič se týká nosiče nebo ředidla, které nezpůsobí významné podráždění organismu a nezruší biologickou aktivitu a vlastnosti podávané sloučeniny.

Termín vehikulum se vztahuje k inertní látce, která se přidává do farmaceutické kompozice pro další usnadnění podávání sloučeniny. Příklady pomocných látek, kromě jiných, zahrnují uhličitan vápenatý, fosforečnan vápenatý, různé cukry a typy škrobů, celulózové deriváty, želatinu, rostlinné oleje a polyethylenové glykoly.

• · · · ·

1. Chemie

A. Obecné strukturální charakteristiky

V jednom směru se předkládaný vynález vztahuje k pyrrolem substituovaným 2-indolinonům, které jsou navíc kromě toho volitelně nahrazovány jak pyrrolovými tak 2-indolinovými částmi sloučeniny, a které jsou nezbytně nahrazovány v pyrrolové části jedním nebo více uhlovodíkovými řetězci, které jsou sami nahrazovány nejméně jednou polární skupinou. Fyziologicky přijatelné soli nebo proléčiva požadované sloučeniny jsou rovněž předmětem zkoumání toho vynálezu.

Termín uhlovodíkový řetězec se, jak zde bylo definováno, vztahuje k alkylu, alkenylu nebo alkynylu.

Termín polární skupina se vztahuje ke skupině v níž jsou jádra atomů navzájem kovalentně vázána jeden k druhému tak, že tvoří skupinu, která nesdílí elektrony kovalentní vazby, je spojující, stejnou měrou; tedy elektronový oblak je hustější okolo jednoho atomu než okolo druhého. Výsledkem je, že jeden konec kovalentní vazby je relativně záporný a druhý relativně kladný, tj. existuje záporný a kladný pól. Příklady polárních skupin, mimo jiné, zahrnují hydroxy skupinu, alkoxy skupinu, karboxy skupinu, nitro skupinu, kyano skupinu, amino skupinu, amonium, amido skupinu, ureido, sulfonamidy, sulfinyly, sulfonily, fosfonyly, morfolino, piperazinyl a tetrazol.

Tím, že přihlašovatelé nejsou vázáni žádnou teorií, v tuto chvíli věří, že polární skupiny mohou navzájem působit elektronově, například, kromě jiného, přes vodíkové vazby, Van der Wallsovy síly anebo iontové vazby (nikoliv kovalentní), s amino kyselinami v aktivním místě PTK. Tyto interakce mohou pomoci molekule tohoto vynálezu, aby se navázala na aktivní místo s dostatečnou pevností tak, že ztěžuje nebo zabraňuje přírodnímu substrátu zaujmout toto místo. Polární skupiny mohou rovněž přispět k selektivitě sloučeniny, tj., jedna polární skupina může mít větší afinitu k PTK vazební oblasti než jiná polární skupina, takže sloučenina obsahující první určitou polární skupinu je pravděpodobněji vázána než sloučeniny obsahující jiné polární skupiny.

Tudíž, jeden aspekt stávajícího vynálezu se týká sloučeniny mající následující chemickou strukturu;

R¹ je vybrán ze skupiny sestávající se z atomu vodíku, alkylu, alkenylu, cykloalkylu, arylu, hydroxy skupiny, alkoxy skupiny, Ckarboxy skupiny, acetylu, C-amidu, C-thioamidu, sulfonylu a tr ihal ogen methan sulfonylu.

R² je vybrán ze skupiny sestávající se z atomu vodíku, halogenu, á’kylu, cykloalkylu, arylu, heteroarylu a heteroalicyklu.

R³ ,R⁴, R⁵ a R⁶ jsou nezávisle vybrané ze skupin sestávající se z atomu yodíku, alkylu, trihalogenalkylu, cykloalkylu, alkenylu, arylu, heteroarylu, heteroalicyklu, hydroxy skupiny, alkoxy skupiny, aryloxy skupiny, merka',uto skupiny, alkylthio skupiny, arylthiol skupiny, sulfinylu, sulfonylu, S-sulfonamidu, N-sulfonamidu, trihalogenmethansulfonamjdu, karbonylu, C-karboxy skupiny, Okarboxy skupiny, C-amidu, N-amidu, kyano skupiny, nitro skupiny, halogenu, O-karbamylu, N-k/?rbamylu, O-thiokarbamylu, Nthiokarbamylu, amino skupiny a -NR”Ř¹², ί

• · · ·

R¹¹ a R¹² jsou nezávisle vybrány ze skupiny sestávající se z atomu vodíku, alkylu, cykloalkylu, arylu, karbonylu, acetylu, sulfonylu, trifluormethansulfonylu a kombinovaných pěti- nebo šesti-ělenných heteroalicyklů.

R³ a R⁴, R⁴ a R⁵, nebo R⁴ a R⁵ se mohou spojit a vytvoří šestičlenný arylový kruh, methylendioxy skupinu nebo ethylendioxy skupinu.

R⁷ je vybrán ze skupiny sestávající se z atomu vodíku, alkylu, cykloalkylu, alkenylu, alkynylu, arylu, heteroarylu, heteroalicyklů, hydroxy skupiny, alkoxy skupiny, aryloxy skupiny, karbonylu, acetylu,C-amidu, C-thioamidu, amidinu, C-karboxy skupiny, O-karboxy skupiny, sulfonylu a trihalogenmethan-sulfonylu.

R⁸, R⁹ a R¹⁰ jsou nezávisle vybrány ze skupiny sestávající se z atomu vodíku, alkylu, trihalogenalkylu, cykloalkylu, alkenylu, alkynylu, arylu, heteroarylu, heteroalicyklů, hydroxy skupiny, alkoxy skupiny, aryloxy skupiny, merkapto skupiny, alkylthio skupiny, arylthio skupiny, sulfinylu, sulfonylu, S-sulfonamidu, N-sulfonamidu, karbonylu, C-karboxy skupiny, O-karboxy skupiny, kyano skupiny, nitro skupiny, halogenu, O-karbamylu, N-karbamylu, O-thiokarbamylu, N-thiokarbamylu, C-amidu, N-amidu, amino skupiny a -NRⁿR¹², za předpokladu, že nejméně jeden z R⁸, R⁹ nebo R¹⁰ je skupina mající vzorec -(alk[)Z.

Alki je vybrán ze skupiny sestávající se z alkylu, alkenylu nebo alkynylu.

Z je a polární skupina.

Jak bude dále používáno, termín alkyl se vztahuje na saturovaný alifatický uhlovodík, včetně přímého řetězce a postranních řetězců. Ve většině případů, alkyl má 1 až 20 uhlíkových atomů (kdykoliv se dále v textu uvede numerické rozpětí; např. 1-20, znamená to, že skupina, v tomto případě alkyl, může obsahovat 1 uhlíkový atom, 2 uhlíkové atomy, 3 uhlíkové atomy, atd, až do 20 uhlíkových atomů včetně). Často je to alkyl střední velikosti mající 1 až 10 uhlíkových atomů. Nejěastěji je to nižší alkyl mající 1 až 4 uhlíkové atomy. Alkyl může a i

• · · · · nemusí být substituován. Je-li substituován, substituent je nejčastěji jedna nebo více skupin vybraných nezávisle z cykloalkylu, arylu, heteroarylu, heteroalicyklu, hydroxy skupiny, alkoxy skupiny, aryloxy skupiny, merkapto skupiny, alkylthio skupiny, arylthio skupiny, kyano skupiny, halogenu, karbonylu, thiokarbonylu, O- karbamylu, Nkarbamylu, O-thiokarbamylu, N-thiokarbamylu, C-amidu, N-amidu, Ckarboxy skupiny, O-karboxy skupiny, nitro skupiny, silylu, amino skupiny a -NR^UR¹², s R¹¹ a R¹² jak bylo definováno výše.

Termín cykloalkyl se vztahuje k uhlíkovému monocyklu nebo spojenému kruhu (tzn. kruhy , které sdílí sousední pár uhlíkových atomů), skupině, kde jeden nebo více kruhů nemá kompletně konjugovaný pí-elektronový systém. Příklady cykloalkylů, kromě jiného, jsou cyklopropan, cyklobutan, cyklopentan, cyklopenten, cyklohexan, adamantan, cyklohexadien, cykloheptan a cykloheptatrien. Cykloalkyl může nebo nemusí být substituován. Je-li substituován, substituent je nejčastěji jedna nebo více skupin vybraných nezávisle z alkylu, arylu, heteroarylu, heteroalicyklu, hydroxy skupiny, alkoxy skupiny, aryloxy skupiny, merkapto skupiny, alkylthio skupiny, arylthio skupiny, kyano skupiny, halogenu, karbonylu, thiokarbonylu, C-karboxy skupiny, O-karboxy skupiny, O-karbamylu, N-karbamylu, C-amidu, Namidu, nitro skupiny, amino skupiny a -NRⁿR¹², s R¹¹ a R¹² jak bylo definováno výše.

Termín alkenyl se vztahuje k alkylu, jak bylo definováno, obsahujícímu nejméně dva uhlíkové atomy a nejméně jednu uhlík-uhlík dvojnou vazbu.

Termín alkynyl se vztahuje k alkylu, jak bylo definováno, obsahujícímu nejméně dva uhlíkové atomy a nejméně jednu uhlík-uhlík trojnou vazbu.

Termín aryl se vztahuje k uhlíkovému monocyklu nebo polycyklu (tzn., kruhy , které sdílí sousední páry uhlíkových atomů), skupině mající kompletně konjugovaný pí-elektronový systém. Příklad arylu, kromě jiného, jsou fenyl, nafthalenyl a anthracenyl. Aryl může a nemusí být substituován. Je-li substituován, substituent je nejčastěji ·» 00 00 • · · · · · · • · 0 0 0 >

• 0 · · • · · · ·· <··· 00 · jedna nebo více skupin vybraných z halogenu, trihalogenmethylu, alkylu, hydroxy skupiny, alkoxy skupiny, aryloxy skupiny, merkapto skupiny, alkylthio skupiny, arylthio skupiny, kyano skupiny, nitro skupiny, karbonylu, thiokarbonylu, C-karboxy skupiny, O-karboxy skupiny, O-karbamylu, N-karbamylu, O- thiokarbamylu, Nthiokarbamylu, C-amidu, N-amidu, sulfinylu, sulfonylu, amino skupiny a -NR^I!R¹², s R¹¹ a R¹² jak bylo definováno.

Jak bude dále používáno, termín heteroaryl se vztahuje k monocyklu nebo spojeným kruhům (tzn., kruhy , které sdílí sousední páry atomů), skupině mající v kruhu(-zích) jeden nebo více atomů vybraných ze skupiny sestávající se z dusíku, kyslíku a síry , a dále, který má kompletně konjugovaný pí-elektronový systém. Příklad heteroarylu, kromě jiného, jsou pyrrol, furan, thiofen, imidazol, oxazol, thiazol, pyrazol, pyridin, pyrimidin, chinolin, izochinolin, purin a karbazol. Heteroaryl může a nemusí být substituován. Je-li substituován, substituent je nejčastěji jedna nebo více skupin vybraných z alkylu, cykloalkylu, halogenu, trihalogenmethylu, hydroxy skupiny, alkoxy skupiny, aryloxy skupiny, merkapto skupiny, alkylthio skupiny, arylthio skupiny, kyano skupiny, nitro skupiny, karbonylu, thiokarbonylu, sulfonamidu, C-karboxy skupiny, O-karboxy skupiny, sulfinylu, sulfonylu, O-karbamylu, N-karbamylu O-thiokarbamylu, Nthiokarbamyl, C-amidu, N-amidu, amino skupiny a -NRⁿR¹², sR¹¹ a R¹² jak bylo definováno.

Termín heteroalicyklse vztahuje k monocyklu nebo spojenému kruhu majícímu v kruhu (zích) jeden nebo více atomů vybraných ze skupiny sestávající se dusíku, kyslíku a síry. Kruh může mít jednu nebo více dvojných vazeb. Kruh však nemá kompletně konjugovaný píelektronový systém. Heteroalicykl může a nemusí být substituován. Jeli substituován, substituent je nejčastěji jedna nebo více skupin vybraných z alkylu, cykloaklylu, halogenu, trihalogenmethylu, hydroxy skupiny, alkoxy skupiny, aryloxy skupiny, merkapto skupiny, alkylthio skupiny, arylthio skupiny, kyano skupiny, nitro skupiny, karbonylu, thiokarbonylu, C-karboxy skupiny, O-karboxy skupiny, O- karbamylu, >

·» »9 99 • · 9 9 9 · · • · » » · • 99 · · • 9 «999 99

N-karbamylu, O-thiokarbamylu, N-thiokarbamylu, sulfinylu, sulfonylu,

1110 11 to

C-amidu, N-amidu, amino skupiny a -NR R , s R a R jak bylo definováno.

Termín hydroxy skupina se týká -OH skupiny.

Termín alkoxy skupina se týká jak -O-alkylu, tak -Ocykloalkylu, jak bylo definováno.

Termín aryloxy skupina se týká jak -O-arylu, tak -Oheteroarylu, jak bylo definováno.

Termín merkapto skupina se týká -SH skupiny.

Termín alkylthio skupina se týká jak S-alkylu, tak -Scykloalkylu, jak bylo definováno.

Termín arylthio skupina se týká jak -S-arylu, tak -Sheteroarylu, jak bylo definováno.

Termín karbonylse týká -C(=O)-R skupiny, kde R je vybrán ze skupiny sestávající se z atomu vodíku, alkylu, cykloalkylu, arylu, heteroarylu (vázaného přes uhlíkový kruh) a heteroalicyklu (vázaného přes uhlíkový kruh), jak bylo definováno.

Termín aldehyd se týká karbonylové skupiny, kde R je atom vodíku.

Termín thiokarbonyl se týká -C(=S)-R skupiny, s R jak bylo definováno.

Termín C-karboxy skupina se týká -C(=O)O-R skupiny, s R jak bylo definováno.

Termín O-karboxy skupina se týká -OC(=O)R skupiny, s R jak bylo definováno.

Termín ester se týká -C(=O)O-R skupiny, s R jak bylo definováno, avšak R nesmí být atom vodíku.

Termín acetyl se týká -C(=0)CH3 skupiny.

Termín karboxylová kyselina se vztahuje k C-karboxy skupině, ve které R je atom vodíku.

Termín halogen se týká fluoru, chloru, bromu nebo jodu.

Termín trihalogenmethyl se vztahuje k -CX3 skupině, kde X je halogen, jak bylo definováno.

• flflfl fl flfl flfl flfl • fl flflflfl flflfl • · « flflfl • flflfl flflflfl fl flflfl flfl • flfl flfl flflflfl flfl ·

Termín trihalogenmethansulfonylse vztahuje k X3CS(=O)2skupině, s X jak bylo definováno.

Termín kyano skupina se týká -C=N skupiny.

Termín sulfinylse týká -S(=O)-R skupiny, kde kromě definovaného, R může být také hydroxy skupina.

Termín sulfonyl se týká -S(=O)2R skupiny, kde kromě definovaného, R může být také hydroxy skupina.

Termín methylendioxy skupina se týká -OCH2O- skupiny, kde dva kyslíkové atomy jsou vázány se sdílenými uhlíkovými atomy.

Termín ethylendioxy skupina se týká -OCH2CH2O-, kde dva kyslíkové atomy jsou vázány k sousedním uhlíkovým atomům.

Termín S-sulfonamid se vztahuje k -S(=O)2 NRⁿR¹² skupině, s Rl 1 a R12 jak bylo definováno.

Termín N-sulfonamid se vztahuje k -NR¹¹ S(=O)2R¹² skupině, s

19

R a R jak bylo definováno.

Termín O-karbamyl se vztahuje k -OC(=O)NR¹ *R¹² skupině, s R¹¹ a R¹² jak bylo definováno.

Termín N-karbamylse vztahuje k R¹²OC (=O)NR^U- skupině, s R¹¹ a R¹² jak bylo definováno.

Termín O-thiokarbamyl se vztahuje k -OC(=S)NR’^]R¹² skupině, s R¹¹ a R¹² jak bylo definováno.

Termín N-thiokarbamyl se vztahuje k R¹²OC(=S)NR’¹ - skupině, s R¹¹ a R¹² jak bylo definováno.

Termín amino skupina se týká -NRⁿR¹² skupiny, kde R¹¹ a R¹² jsou oba atomy vodíku.

Termín C-amid se vztahuje k -(3(=0) NRⁿR¹² skupině, s R¹¹ a R¹² jak bylo definováno.

Termín N-amid se vztahuje k R¹²C(=O)NR¹¹- skupině, s R¹¹ a

R¹² jak bylo definováno.

Termín amonium se vztahuje k -+NHR^1IR¹² skupině, kde R¹¹ a

R¹² jsou nezávisle vybrány ze skupiny sestávající se z alkylu, cykloalkylu, arylu, a heteroarylu.

Termín ureidose týká -NR¹'C(=O)NR¹²R¹³ skupiny, s R¹¹ a R¹² jak bylo definováno, a stejně tak je definován i R¹³.

Termín guanidino se vztahuje k -R¹ 'NC(=N)NR¹²R¹³ skupině, s R¹¹, R¹² a R¹³ jak bylo definováno.

Termín amidin se vztahuje k R¹¹R¹²NC(=N)- skupině, s R¹¹ a R¹² jak bylo definováno.

Termín nitro skupina se týká -NO2 skupiny.

Termín fosfonyl se vztahuje -OP(=O)2OR, s R jak bylo definováno.

Termín morfolino se vztahuje k skupině mající chemickou strukturu:

Termín piperazinyl se vztahuje k skupině mající chemickou strukturu:

I

N

I

Termín tetrazol se vztahuje k skupině mající chemickou strukturu:

• ·

B. Výhodné strukturální vlastnosti.

Výhodným provedením tohoto vynálezu je, že R¹ je atom vodíku.Rovněž výhodným provedením tohoto vynálezu je, že R² je atom vodíku.Stejně tak je výhodným provedením tohoto vynálezu, že R⁷ je atom vodíku.Výhodným provedením tohoto vynálezu je, že všechny tři výše uvedené výhody existují ve stejné molekule; tzn., že ve sloučenině tohoto vynálezu, R¹, R² a R⁷ jsou atomy vodíku.

Další výhodou tohoto vynálezu je, že R³, R⁴, R⁵ a R⁶ jsou vybrány ze skupiny sestávající se z atomu vodíku, nesubstituovaného nižšího alkylu, nižšího alkylu substituovaného skupinou vybranou ze skupiny sestávající se z hydroxy skupiny, halogenu, C-karboxy skupiny substituované skupinou vybranou ze skupiny sestávající se z atomu vodíku a nesubstituovaného nižšího alkylu, amino skupiny nebo NR“R¹² ; nesubstituované nižší alkylalkoxy skupiny, nižší alkoxy skupiny substituované jedním nebo více halogeny, nižší alkoxy skupiny substituované nesubstituovaným arylem nebo arylem substituovaným jednou nebo více skupinami nezávisle vybranými ze skupiny sestávající se z nesubstituovaného nižšího alkylu, hydroxy skupiny, nesubstituované nižší alkylalkoxy skupiny, halogenu, amino skupiny, nesubstituovaného nižšího alkyl S-sulfonamidu nebo -NRⁿR¹², nesubstituovaného arylu nebo arylu substituovaného jednou nebo více skupinami nezávisle vybranými ze skupiny sestávající se z nesubstituovaného nižšího alkylu, nesubstituované nižší alkylalkoxy skupiny, nižší alkoxy skupiny substituované jedním nebo více halogeny, nižší alkoxy skupiny substituované skupinou vybranou ze skupiny sestávající se z nesubstituovaného arylu nebo arylu substituovaného jednou nebo více skupinami nezávisle vybranými ze skupiny sestávající se z nesubstituovaného nižšího alkylu, hydroxy skupiny, nesubstituované nižší alkylalkoxy skupiny, halogenu, amino skupiny, nesubstituovaného nižšího alkyl S-sulfonamidu nebo -NRⁿR¹² , hydroxy skupiny, amino skupiny, nesubstituovaného nižšího alkyl sulfonamidu, C-karboxy skupiny substituované skupinou vybranou ze skupiny sestávající se z atomu vodíku nebo nesubstituovaného nižšího alkylu, morfolinu, -NR R , trihalogenmethylu, arylu, arylu substituovaného jednou nebo více skupinami nezávisle vybranými ze skupiny sestávající se z hydroxy skupiny, halogenu, trihalogenmethylu, amino skupiny, NRⁿR¹², sulfonamidu, C-karboxy skupiny substituované skupinou vybranou ze skupiny sestávající se z atomu vodíku nebo nesubstituovaného nižšího alkylu, nesubstituovaného nižšího alkylu nebo nižšího alkylu substituovaného skupinou vybranou ze skupiny sestávající se z hydroxy skupiny, halogenu, C-karboxy skupiny substituované skupinou vybranou ze skupiny sestávající se z atomu vodíku nebo nesubstituovaného nižšího alkylu, amino skupiny nebo NRⁿR¹², nesubstituovaného heteroalicyklu, heteroalicyklu substituovaného jednou nebo více skupinami nezávisle vybranými ze skupiny sestávající se z halogenu, hydroxy skupiny, nesubstituovaného nižšího alkylu, nesubstituovaného nižšího alkylkarbonylu, hydroxy skupiny, nesubstituované nižší alkylalkoxy skupiny nebo alkoxy skupiny substituované jedním nebo více halogeny, nesubstituované aryloxy skupiny , aryloxy skupiny substituované jednou nebo více skupinami nezávisle vybranými ze skupiny sestávající se z nesubstituovaného nižšího alkylu, trihalogenmethylu, halogenu, hydroxy skupiny, amino skupiny nebo -NRⁿR¹², merkapto skupiny, nesubstituované nižší alkyl alkylthio skupiny, nesubstituované arylthio skupiny, arylthio skupiny substituované jednou nebo více skupinami vybranými ze skupiny sestávající se z halogenu, hydroxy skupiny, amino skupiny nebo -NRⁿR¹², C-karboxy skupiny substituované skupinou vybranou ze skupiny sestávající sé z atomu vodíku a nesubstituovaného nižšího alkylu, nesubstituované nižší alkyl Okarboxy skupiny, nesubstituovaného nižšího alkyl S-sulfonamidu, nitro skupiny, nesubstituovaného nižšího alkyl C-amidu, nesubstituovaného nižšího alkyl N-amidu, amino skupiny a -R R .

V dalších výhodných provedeních tohoto vynálezu, R³, R⁴, R⁵ a R⁶ jsou nezávisle vybranými ze skupiny sestávající se z atomu vodíku, halogenu, nesubstituovaného nižšího alkylu, nižšího alkylu substituovaného jednou nebo více skupinami vybranými ze skupiny sestávající se z hydroxy skupiny, halogenu, C-karboxy skupiny substituované skupinou vybranou ze skupiny sestávající se z atomu vodíku nebo nesubstituovaného nižšího alkylu, amino skupiny nebo NR^flR¹², nesubstituované nižší alkylalkoxy skupiny, nižší alkylalkoxy skupiny substituované jedním nebo více halogeny, nesubstituované aryloxy skupiny, aryloxy skupiny substituované jednou nebo více skupinami nezávisle vybranými ze skupiny sestávající se z nesubstituovaného nižšího alkylu, nižšího alkylu substituovaného jedním nebo více halogeny, hydroxy skupiny, nesubstituované nižší alkylalkoxy skupiny, halogenu, amino skupiny nebo -NR R , Ssulfonamidu, kde R¹¹ a R¹² jsou nezávisle vybrány ze skupiny sestávající se z atomu vodíku a nesubstituovaného nižšího alkylu, nesubstituovaného arylu, arylu substituovaného jednou nebo více skupinami nezávisle vybranými ze skupiny sestávající se z halogenu, nesubstituovaného nižšího alkylu, nižšího alkylu substituovaného jedním nebo více halogeny, nesubstituované nižší alkylalkoxy skupiny, amino skupiny nebo -NR^UR¹², nesubstituovaného heteroarylu, heteroarylu substituovaného jednou nebo více skupinami nezávisle vybranými ze skupiny sestávající se z nesubstituovaného nižšího alkylu, nižšího alkylu substituovaného jedním nebo více halogeny, nesubstituované nižší alkylalkoxy skupiny, hydroxy skupiny, halogenu, amino skupiny nebo -NRⁿR¹², nesubstituovaného heteroalicyklu, heteroalicyklu substituovaného jednou nebo více skupinami nezávisle vybranými ze skupiny sestávající se z halogenu, hydroxy skupiny, nesubstituovaného nižšího alkylu, nižšího alkylu substituovaného jedním nebo více halogeny, nesubstituované nižší alkylalkoxy skupiny, amino skupiny nebo -NR^UR¹², nesubstituované nižší alkyl O-karboxy skupiny, C-amidu, kde R¹¹ a R¹² jsou nezávisle vybrány ze skupiny sestávající se z atomu vodíku, nesubstituovaného nižšího alkylu a nesubstituovaného arylu, a N-amidu, kde R¹¹ a R¹² jsou nezávisle vybrány ze skupiny sestávající se z atomu vodíku, nesubstituovaného nižšího alkylu a nesubstituovaného arylu.

···· ·· ·

Výhodným provedením tohoto vynálezu je, že jeden z R⁸, R⁹ a R¹⁰ je -(alki)Z , zatímco ostatní dva jsou nezávisle vybrány ze skupiny sestávající se z atomu vodíku, hydroxy skupiny, nesubstituovaného nižšího alkylu, nesubstituovaného nižšího alkenylu, nesubstituovaného nižšího alkynylu, nesubstituované nižší alkylalkoxy skupiny, nižší alkoxy skupiny substituované jedním nebo více halogeny, nesubstituované arylalkoxy skupiny, amino skupiny, NR^UR¹², halogenu, C-karboxy skupiny substituované skupinami vybranými ze skupiny sestávající se z atomu vodíku nebo nesubstituovaného nižšího alkylu, nesubstituované nižší alkyl Okarboxy skupiny, nesubstituovaného nižšího alkylu, C-amidu, nesubstituovaného nižšího alkyl N-amidu, acetylu, nesubstituovaného nižšího alkyl S-sulfonamidu, nesubstituovaného arylu nebo arylu substituovaného skupinou vybranou ze skupiny sestávající se z halogenu, hydroxy skupiny, nesubstituované nižší alkylalkoxy skupiny, alkoxy skupiny substituované jedním nebo více halogeny, C-karboxy skupiny substituované skupinou vybranou ze skupiny sestávající se z atomu vodíku nebo nesubstituovaného nižšího alkylu, nesubstituované nižší alkyl O-karboxy skupiny, amino skupiny, nesubstituovaného nižšího alkyl S-sulfonamidu a -NR R .

10

Výhodným provedením tohoto vynálezu je, že R a R jsou vybrány ze skupiny sestávající se z atomu vodíku a nesubstituovaného nižšího alkylu.

Je také výhodným provedením tohoto vynálezu, že alkj je nesubstituovaný nižší alkyl.

Další výhodu tohoto vynálezu je, že Z je vybráno ze skupiny sestávající se z hydroxy skupiny, amino skupiny, -NRⁿR¹², kvartérního amonia, C-karboxy skupiny substituované skupinou vybranou ze skupiny sestávající se z atomu vodíku nebo nesubstituovaného nižšího alkyl, C-amidu substituovaného skupinami vybranými ze skupiny sestávající se z atomu vodíku a nesubstituovaného nižšího alkylu, morfolinu, piperadinylu, tetrazolu a fosfonylu.

Další výhodou tohoto vynálezu je, že alki je dvou až čtyř uhlíkatý nesubstituovaný nižší alkyl a Z je karboxylová kyselina.

Výhodou tohoto vynálezu je, že R⁹ je alk]Z.

19·

Obdobně je výhodou tohoto vynálezu, že R a R jsou nezávisle vybrány ze skupiny sestávající se z atomu vodíku, nesubstituovaného nižšího alkylu, hydroxy skupiny, nesubstituované nižší alkylalkoxy skupiny, nesubstituovaného nižšího alkylkarbonylu, nesubstituované nižší alkyl O-karboxy skupiny a acetylu.

Další výhodným provedením tohoto vynálezu je, že R¹, R², R³, R⁴, R⁵, R⁶ a R⁷ jsou atom vodíku, R⁸ a R¹⁰ jsou methyl a R⁹ je CH₂CH₂C(=O)OH.

Také výhodným provedením tohoto vynálezu je, že R¹, R², R³, R⁴, R⁵, R⁶, R⁷ a R⁸ jsou atom vodíku, R¹⁰ je methyl a R⁹ je CH₂CH₂C(=O)OH.

Stejně tak je výhodným provedením tohoto vynálezu, že R je vybrán ze skupiny sestávající se z ;

atomu vodíku, nesubstituovaného nižšího alkylu a nižšího alkylu substituovaného skupinou vybranou ze skupiny sestávající se z nesubstituovaného cykloalkylu, nesubstituovaného arylu a arylu substituovaného skupinou vybranou z hydroxy skupiny, nesubstituované nižší alkylalkoxy skupiny a halogenu.

Dále je také výhodným provedením tohoto vynálezu, že Z je vybráno ze skupiny sestávající se z -C(=O)NR¹³R¹⁴, kde R¹³ a R¹⁴ jsou nezávisle vybrány ze skupiny sestávající se z atomu vodíku, nesubstituovaného nižšího alkylu, nižšího alkylu substituovaného skupinou vybranou ze skupiny sestávající se z amino skupiny a RⁿR¹², nesubstituovaného arylu, arylu substituovaného jednou nebo více skupinami vybranými ze skupiny sestávající se z halogenu, hydroxy skupiny, nesubstituované nižší alkylalkoxy skupiny a trihalogenmethylu, nesubstituovaného heteroarylu, nesubstituovaného heteroalicyklu, a kombinovaných pěti-členných nebo šesti-členných nesubstituovaných heteroalicyklů, -NR^HR¹², kde R¹¹ a R¹² jsou nezávisle vybrány ze skupiny sestávající se z nesubstituovaného • ·

··· nižšího alkylu a kombinovaných pěti-členných nebo šesti-členných ne substituovaných heteroalicyklů.

Preferovaným a výhodným provedením tohoto vynálezu je, že R⁷ je vybrán ze skupiny sestávající se z nesubstituovaného nižšího alkylu, nižšího alkylu substituovaného jednou nebo více skupinami vybranými ze skupiny sestávající se z nesubstituovaného cykloalkylu, nesubstituovaného arylu, arylu substituovaného jednou nebo více skupinami nezávisle vybranými ze skupiny sestávající se z halogenu a nesubstituované nižší alkylalkoxy skupiny a nesubstituovaného nižšího alkylkarboxyalkylu, a Z je vybráno ze skupiny sestávající se z nesubstituované C-karboxy skupiny a nesubstituované nižší alkyl Ckarboxy skupiny.

A konečně, výhodným provedením tohoto vynálezu je také, že R , R⁴, R⁵, a R⁶ jsou nezávisle vybrány ze skupiny sestávající se z atomu vodíku, halogenu, nesubstituovaného nižšího alkylu, nižšího alkylu substituovaného jednou nebo více hydroxy skupinami, nesubstituované nižší alkoxy skupiny, nesubstituovaného arylu, arylu substituovaného jednou nebo více nesubstituovanými nižšími alkoxy skupinami a S(O)2NR' 'r'², R⁵ je atom vodíku, R⁶ je -NR^UR¹², R¹¹ a R¹² jsou nezávisle vybrány ze skupiny sestávající se z atomu vodíku, nesubstituovaného nižšího alkylu a kombinovaných pěti-členných nebo šesti-členných nesubstituovaných heteroalicyklů.

Chemický vzorec zde popsaný může vykazovat jev tautomerie a strukturální izomerie. Například, sloučeniny zde popsané mohou mít E nebo Z konfiguraci, spojenou s dvojnou vazbou spojující 2indolinonovou část s pyrrolovou částí nebo to může být směs E a Z. Tento vynález zahrnuje všechny tautomerní nebo strukturální izomery a jejich směsi, které mají schopnost modulovat aktivitu RTK, CTK a/nebo STK, a neomezuje se na žádný z tautomerních a strukturálních izomerů.

·♦· ·

2. Syntézní/Kombinatorické knihovny

Dalším aspektem tohoto vynálezu je kombinatorická knihovna nejméně deseti sloučenin 3-pyrrolidinyl-2-indolinonů, které mohou vzniknout reakcí oxindolů struktury 2 s aldehydy struktury 3.

kde R¹- R¹⁰ mají výše uvedený význam.

Jak bylo použito, termín kombinatorická knihovna se vztahuje na všechny sloučeniny vzniklé reakcí každé sloučeniny jedné dimenze se sloučeninou z každé z dalších dimenzí v multi-dimenzionální skupině sloučenin. V kontextu tohoto vynálezu je skupina dvou dimenzionální a jednu dimenzi representují všechny oxindoly podle vynálezu a druhou dimenzi representují všechny aldehydy podle vynálezu. Každý oxindol může reagovat s každým a všemi aldehydy, a vytvořit tak sloučeninu 3pyrrolidinyl-2-indolinon. Všechny sloučeniny 3-pyrrolidinyl-2indolinonu vzniklé touto cestou jsou předmětem tohoto vynálezu. Předmětem tohoto vynálezu jsou také menší kombinatorické knihovny vzniklé reakcí některých oxindolů se všemi aldehydy, všech oxindolů s některými aldehydy, nebo některých oxindolů s některými aldehydy.

Oxindol z výše uvedené kombinatorické knihovny je vybrán ze skupiny sestávající se z oxindolů a substituovaných oxindolů jako jsou, kromě jiných, 6-bromoxindol, 5-hydroxyoxindol, 5-methoxyoxindol, 6methoxyoxindol, 5-fenylaminosulfonyloxindol, 4-[2-(2izopropylfenoxy)-ethyl]oxindol, 4-[2-(3-izopropylfenoxy)ethyl]oxindol, 4-[2-(4-izopropylfenoxy)ethyl]oxindol, 5-fluoroxindol, 6-fluoroxindol, 7-fluoroxindol, 6-trifluormethyloxindol, 5-chloroxindol, 6φ φ φ φ φ φ φ φ φ φ

ΦΦΦΦ φφφ chloroxindol, indol-4-karboxylová kyselina, 5-bromoxindol, 6-(Νacetamido)-oxindol, 4-methyloxindol, 5-methyloxindol, 4-methyl-5chloroxindol, 5-ethyloxindol, 6-hydroxyoxindol, 5-acetyloxindol, oxindol-5-karboxylová kyselina, 5-methoxyoxindol, 6-methoxyoxindol, 5-aminooxindol, 6-aminooxindol, 4-(2-N-morfolinethyl)oxindol, 7azaoxindol, t-butylester oxindol-4-karbamové kyseliny, t-butylester oxindol-6-karbamové kyseliny, 4-(2-karboxyethyl)oxindol, 4-nbutyloxindol, 4,5-dimethoxyoxindol, 6-(methansulfonamido)oxindol, 6(benzamido)oxindol, 5-ethoxyoxindol, 6-fenyloxindol, 6-(2methoxyfen-1 -yl)oxindol, 6-(3-methoxyfen-1 -yl)oxindol, 6-(4methoxyfen-1-yl)oxindol, 5-aminosulfonyloxindol, 5izopropylaminosulfonylox indol, di methy lamino sul fonylox indol, 5-(Nmorfolinsulfonyl)oxindol a 4-(2-hydroxyethyl)oxindol.

Aldehyd z výše uvedené kombinatorické knihovny je vybrán ze skupiny sestávající se z, kromě jiného, 3-(5-formyl-2,4-dimethyl-lHpyrrol-3-yl)propionové kyseliny, 3-(5-formyl-4-methyl -1 H-pyrrol-3-yl) propionové kyseliny, 3-(l -benzyl-5-formyl-2,4-dimethyl -1 H-pyrrol-3yl)propionové kyseliny, 3-(5-formyl -1 -methoxy-karbony lmethy 1-2,4dimethyl-ΊΗ- pyrrol-3-yl)propionové kyseliny, 3-(5-formyl-1,2,4trimethyl-ΙΗ- pyrrol-3-yl)propionové kyseliny, methyl esteru 3-[5formy 1-1-(3-methoxy-benzyl)-2,4-di methyl-1 H-pyrrol-3-yl]propionové kyseliny, methyl esteru 3-( 1 -cyklohexylmethyl-5-formyl-2,4-dimethyl1 H-pyrrol-3-yl)propionové kyseliny, methyl esteru 3-[ 1-(2,2-dimethylpropyl)-5-formy 1-2,4-dimethyl -1 H-pyrrol-3-yl]propionové kyseliny,

1,3,5-trimethyl-4-(3-morfolin-4-yl-3-oxo-propyl)- lH-pyrrol-2karb aldehydu, 3-(5-formyl -1,2,4-trimethyl -1 H-pyrrol-3-yl)-N-(2morfolin-4-yl-ethyl)propionamidu, 3-(5-formyl -1,2,4-trimethyl -1Hpyrrol-3-yl)-N-fenylpropionamidu, 1,3,5-trimethyl-4-(3-oxo-3piperidin-1 -y 1 -propyl) -1H-pyrrol-2- karbaldehydu, 1,3,5-trimethyl-4-(3oxo-3-pyrrolidin-1 - yl-propyl)-1 H-pyrrol-2-karbaldehydu, 3-(5-formy 11,2,4- trimethyl-1 H-pyrrol-3-yl)-N-(4-methoxy-fenyl)propionamidu, 3(5-formyl -1,2,4-trimethyl - lH-pyrrol-3-yl)-N-(4methoxyfenyl)propionamidu, N-(4-fluor-fenyl)-3-(5-formyl -1,2,424 • ·· · tri methyl -1 H-pyrrol-3-yl)propionamidu, 3-(5-formyl -1,2,4-tr im ethyl1 H-pyrrol-3-yl)-N-(4-trifluormethyl-fenyl)propionamidu, 3-[5-formyl1 -(3-methoxy-benzyl)-2,4-dimethyl- ÍH-pyrrol-3-yl]propionové kyseliny, 3-(l -cyklohexylmethy 1-5-formy 1-2,4-dimethyl -1 H-pyrrol-3 yl)propionové kyseliny, methyl esteru 3-[ 1-(3-fluor-benzyl)-5-formyl2,4-dimethyl-1 H-pyrrol-3-yl]propionové kyseliny, 3-(l-benzyl-5formyl-2,4-dimethyl-lH-pyrrol-3-yl)propionové kyseliny, methyl esteru 3-[ 1 - (4- fluorbenzyl)-5-formy 1-2,4-dimethyl-lH-pyrrol-3-yljpropionové kyseliny, 3-[l -(4-fluor-benzyl)-5-formy 1-2,4-dimethy 1-1 H-pyrrol-3 yl]propionové kyseliny, 3-[l -(3-fluorbenzy 1)-5-formy 1-2,4-dimethyl1 H-pyrrol-3-yl]propionové kyseliny, 3,5-dimethyl-4-(3-morfolin-4-ylpropyl) -1H-py r rol-2-karb aldehydu, 4-(3 -dimethyl amino-p ropy 1)-3,5 dimethyl -1H- pyrrol-2-karbaldehydu, 5-formy 1-2,4-dimethyl -1 H-pyrrol3-karboxylové kyseliny, 3,5-dimethyl-4-(4-methyl-piperazin-lkarbonyl) -1 H-pyrrol-2-karbaldehydu, (2-dimethylaminoethyl)amidu 5formyl-2,4-dimethyl-lH-pyrrol-3-karboxylové kyseliny.

Dalším aspektem tohoto vynálezu je, že poskytuje metodu syntézy

3- pyrrolidinyl-2-indolinonu vzorce 1 zahrnující reakci oxindolu vzorce s aldehydem vzorce 3 v rozpouštědle, nejlépe za přítomnosti báze.

Příklady oxindolů vzorce 2, které mohou reagovat s aldehydy vzorce 3 za vzniku 3-pyrrolidinyl-2-indolinonů vzorce 1, jsou oxindoly a substituované oxindoly jako jsou, kromě jiných, 6-bromoxindol, 5hydroxyoxindol, 5-methoxyoxindol, 6-methoxyoxindol, 5fenylaminosulfonyloxindol, 4-[2-(2-izopropylfenoxy)- ethyljoxindol, 4[2-(3-izopropylfenoxy)ethyl]oxindol, 4-[2-(4izopropylfenoxy)ethyl]oxindol, 5-fluoroxindol, 6-fluoroxindol, 7fluoroxindol, 6-trifluormethyloxindol, 5-chloroxindol, 6-chloroxindol, indol-4-karboxylová kyselina, 5-bromoxindol, 6-(N-acetamido)-oxindol,

4- methyloxindol, 5-methyloxindol, 4-methyl-5-chlorox:indol, 5ethyloxindol, 6-hydroxyoxindol, 5-acetyloxindol, oxindol-5karboxylová kyselina, 5-methoxyoxindol, 6-methoxyoxindol, 5aminooxindol, 6-aminooxindol, 4-(2-N-morfolinoethyl)oxindol, Ίazaoxindol, t-butylester oxindol-4-karbamové kyseliny, t-butylester

oxindol-6-karbamové kyseliny, 4-(2-karboxyethyl)oxindol, 4-nbutyloxindol, 4,5-dimethoxyoxindol, 6-(methansulfonamido)oxindol, 6(benzamido)oxindol, 5-ethoxyoxindol, 6-fenyloxindol, 6-(2methoxyfen-1-yl)oxindol, 6-(3-methoxyfen-1 -yl)oxindol, 6-(4methoxyfen-l-yl)oxindol, 5-aminosulfonyloxindol, 5izopropylaminosulfonyloxindol, dimethylaminosulfonylox indol, 5-(Nmorfolinosulfonyl)oxindol a 4-(2-hydroxyethyl)oxindol.

Příklady aldehydů struktury 3, které mohou reagovat s oxindoly struktury 2 jsou, kromě jiných, 3-(5- formyl-2,4-dimethyl-ÍH-pyrrol-3yl)propionová kyselina, 3-(5-formyl-4-methyl-lH-pyrrol-3yl)propionová kyselina, 3-(l-benzyl-5-formyl-2,4-dimethyl -1 H-pyrrol3-yl)propionová kyselina, 3-(5- formyl-l-methoxykarbonylmethyl-2,4dimethyl-1 H-pyrrol-3-yl)propionová kyselina, 3-(5-formyl-1,2,4trimethyl-1 H-pyrrol-3-yl)propionová kyselina, methyl ester 3-[5formyl-l-(3-methoxy-benzyl)-2,4-dimethyl -1 H-pyrrol-3-yl]propionové kyseliny, methyl ester 3-( 1 -cyklohexylmethyl-5-formyl-2,4-dimethyl1 H-pyrrol-3-yl)propionové kyseliny, methyl ester 3-[l-(2, 2-dimethylpropyl)-5- formy 1-2,4-dimethyl-1 H-pyrrol-3-yl]propionové kyseliny, 1,3,5-trimethyl-4-(3-morfolin-4-yl-3-oxo-propyl) -1 H-pyrrol-2karb aldehyd, 3-(5-formy 1-1,2,4-trimethyl-1 H-pyrrol-3-yl)-N-(2morfolin-4-yl-ethyl)propionamid, 3-(5-formyl -1,2,4-trimethyl-1Hpyrrol-3-yl)-N-fenylpropionamid, 1,3,5-trimethyl-4-(3-oxo-3-piperidin1 -yl-propyl) -1 H-pyrrol-2-karbaldehyd, 1,3,5-tri methy 1-4-(3-oxo-3pyrrolidin -1 -ylpropyl)-1 H-pyrrol-2-karbaldehyd, 3-(5-formy 1-1,2,4trimethyl-1 H-pyrrol-3-yl)-N-(4-methoxy-fenyl)propionamid, 3-(5formyl -1,2,4-trimethyl -1 H-pyrrol-3-yl)-N-(4-methoxyfenyl)propionamid, N-(4-fluor-fenyl)-3-(5-formyl-1,2,4-trimethyl-1Hpyrrol-3-yl)propionamid, 3-(5-formy 1-1,2,4-trimethyl-1 H-pyrrol-3-yl)N-(4-trifluormethyl-fenyl)propionamid, 3-[5-formy 1-1 - (3-methoxybenzyl)-2,4-dimethyl-1 H-pyrrol-3-yl]propionová kyselina, 3-(lcyklohexy 1 methy 1-5 -formy 1-2,4-dimethyl - lH-pyrrol-3-yl)propionová kyselina, methyl ester 3-[l-(3-fluor-benzyl)-5-formyl-2,4-dimethyl-lHpyrrol-3-yl]propionové kyseliny, 3-(l -benzy 1-5-formy 1-2,4-di methyl0 · ··

0 • 00 0 · lH-pyrrol-3-yl)propionová kyselina, methyl ester 3-(1-(4- fluorbenzyl)5-formyl-2,4-dimethyl - lH-pyrrol-3-yl]propionové kyseliny, 3-[l-(4fluor-benzyl)-5-formyl-2,4-dimethyl- lH-pyrrol-3-yl]propionová kyselina, 3-[ 1 -(3-fluorbenzyl)-5-formyl-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3yljpropi onová kyselina, 3,5 -dimethy 1-4-(3-morfolin-4-yl-propyl) -1 řípy rr o 1-2-karbaldehyd, 4-(3-dimethy lamino-propy 1)-3,5-dimethy 1- 1Hpyrrol-2-karbaldehyd, 5 -formy 1-2,4-dimethyl -1 H-pyrrol-3-karboxylová kyselina, 3,5-dimethyl-4-(4-methyl-piperazin-1 -karbonyl) -1 H-pyrrol-2karbaldehyd, (2-dimethylaminoethyl)amid 5-formyl-2,4-dimethyl- 1Hpyrrol-3-karboxylové kyseliny.

Reakce může probíhat za přítomnosti báze. Báze může být organická nebo anorganická. Použije-li se organická báze, preferuje se báze dusíkatá. Příklady organických dusíkatých bází jsou, kromě jiných, diizopropylamin, trimethylamin, triethylamin, anilin, pyridin, 1,8-diazabicyklo-[5,4,1 ]-undeka-7-en, pyrrolidin a piperidin.

Příklady anorganických bází jsou, kromě jiného, amonium, hydroxidy alkalických kovů nebo kovů alkalických zemin, fosfáty, uhličitany, hydrogenuhličitany, hydrogensírany a amidy. Alkalické kovy jsou, lithium, sodík a draslík, zatímco kovy alkalických zemin jsou vápník, hořčík a barium.

Výhodným provedením tohoto vynálezu je, když rozpouštědlo je protické rozpouštědlo, jako je voda nebo alkohol, báze je alkalického kovu nebo kovů alkalických zemin, preferován je hydroxid alkalických kovů nebo kovů alkalických zemin.

Pracovníkům v oboru bude zřejmé, na základě obecně známých principů organické syntézy a na základě informací zde uvedených, kterou bázy je třeba použít pro průběh reakce.

Rozpouštědlo, ve kterém se reakce uskuteční, může být protické nebo aprotické rozpouštědlo, preferuje se rozpouštědlo protické.

Termín protické rozpouštědlo je rozpouštědlo, které má atomy vodíku kovalentně vázané ke kyslíku nebo atomům dusíku, které činí atom vodíku kyselým a tím pádem možným býti sdílen s rozpouštěnou

Φ φφ · látkou ve vodíkové vazbě. Příkladem protických rozpouštědel jsou , kromě jiných, voda a alkohol.

Termín aprotické rozpouštědlo může být polární nebo nepolární, ale v každém případě neobsahuje kyselý vodík, a tak není schopno tvořit s rozpouštěnou látkou vodíkovou vazbu. Příklady, kromě jiných, nepolárních aprotických rozpouštědel, jsou pentan, hexan, benzen, toluen, methylenchlorid a tetrachlormethan.

Příklady polárních aprotických rozpouštědel jsou chloroform, tetrahydrofuran, dimethylsulfoxid a dimethylformamid.

Výhodným provedením tohoto vynálezu je, že rozpouštědlo je protické rozpouštědlo, preferuje se voda nebo alkohol, jako je ethanol.

Reakce probíhá při teplotě větší než je pokojová teplota. Teplota se obecně pohybuje okolo 30°C až okolo 150°C, přesněji okolo 80°C až okolo 100°C, ještě přesněji okolo 75°C až okolo 85°C, což je zhruba bod varu ethanolu. Termínem okolo se rozumí, že teplotní rozsah je přednostně v rozmezí 10 stupňů Celsia uvedené teploty, přednostněji v rozmezí 5 stupňů Celsia uvedené teploty a nejpřednostněji je to v rozmezí 2 stupňů Celsia uvedené teploty. Takže, například, termínem okolo 75°C se rozumí 75°C ± 10°C, přednostněji 75°C ± 5°C a nejpřednostněji 75°C ± 2°C.

3. Biochemie/Farmakoterapie

Další aspekt tohoto vynálezu se vztahuje k metodě modulace PK katalytické aktivity kontaktováním PK se sloučeninou tohoto vynálezu nebo fyziologicky akceptovatelnou solí nebo proléčivem.

Jak zde bylo použito, termín PK se týká receptorových proteintyrozinkináz (RTK), nereceptorových nebo buněčných tyrozinkináz (CTK) a serin-threoninkináz (STK).

Termín metoda se vztahuje na způsoby, prostředky, techniky a postupy pro splnění daného problému, ale neomezuje se pouze na tyto způsoby, prostředky, techniky a postupy, buď známé nebo snadno odvoditelné způsoby, prostředky, techniky a postupy známé odborníkům • · • φ · v 4 4 9 4 4 věd chemických, farmaceutických, biologických, biochemických a medicínských.

Jak zde bylo použito, termín modulace nebo modulování se týká změny katalytické aktivity RTK, CTK a STK. Přesněji, modulace se vztahuje na aktivaci, katalytické aktivity RTK, CTK a STK, přednostně aktivace nebo inhibice katalytické aktivity RTK, CTK a STK, závisející na koncentraci sloučeniny nebo soli, kterým jsou RTK, STK, CTK vystaveny, ještě přednostněji inhibice katalytické aktivity RTK, CTK, STK.

Termín katalytická aktivita, jak zde bylo použito, se týká poměru fosforylace tyrosinu pod vlivem, přímo nebo nepřímo, RTK a/nebo CTK nebo fosforylace šeřinu a threoninu pod vlivem, přímo nebo nepřímo, STK.

Termín kontaktující, jak zde bylo použito, se týká přivedení sloučeniny tohoto vynálezu a do kontaktu s danou PK takovým způsobem, že sloučenina může ovlivnit katalytickou aktivitu PK, buď přímo, tzn. interakcí s kinázou samotnou, nebo nepřímo, tzn. interakcí s jinou molekulou, na které katalytická aktivita závisí. Takového kontaktu může být dosaženo in vitro, tzn. ve zkumavce, Petriho misce nebo podobně. Ve zkumavce se kontaktu může účastnit sloučenina a daná PK nebo se ho účastní celé buňky. Buňky mohou být udržovány nebo pěstovány v miskách buňečných kultur a kontaktovány se sloučeninou v tomto prostředí. V tomto kontextu je snahou ověřit schopnost určité sloučeniny ovlivnit poruchy spojené s PK, tj. IC50 sloučenin, definované níže, určit ještě před použitím sloučenin in vivo^ tj. na složitějších žijících organizmech. Pro buňky mimo organizmus existují četné metody, dobře známé odborníkům v oboru, včetně toho jak dostat PK do kontaktu se sloučeninami a neomezující se pouze na přímé mikroinjekce do buněk a četné techniky transmembránových přenašečů.

Dalším aspektem tohoto vynálezu je, že modulace katalytické aktivity PK užitím sloučeniny tohoto vynálezu může probíhat in vitro nebo in vivo.

• · • •«4

Termín in vitro se vztahuje na postupy provedené v umělém prostředí jako jsou např., kromě jiného, ve zkumavce nebo živné půdě.

Jak zde bylo použito, termín in vivo se vztahuje na postupy provedené uvnitř žijících organismů jako jsou, kromě jiného, myš, krysa nebo králík.

Dalším aspektem tohoto vynálezu je, že proteinkináza, jejíž katalytická aktivita je modulována sloučeninou tohoto vynálezu, je vybrána ze skupiny sestávající se z receptorové proteintyrozinkinázy, buněčné tyrozinkinázy a serin-threoninkinázy.

Aspektem tohoto vynálezu je, že receptorová proteinkináza, jejíž katalytické aktivita je modulována sloučeninou tohoto vynálezu je vybrána ze skupiny sestávající se z EGF, HER2, HER3, HER4, IR, IGF1R, IRR, PDGFRa, PDGFRβ, CSFIR, C-Kit, C-fms, Flk-lR, Flk4, KDR/Flk-1, Flt-1, FGFR-1R, FGFR-2R, FGFR-3R a FGFR-4R.

A dále aspektem tohoto vynálezu je, že buněčná tyrozinkináza, jejíž katalytická aktivita je modulována sloučeninou tohoto vynálezu, je vybrána ze skupiny sestávající se z Src, Frk, Btk, Csk, Abl, ZAP70, Fes/Fps, Fak, Jak, Ack, Yes, Fyn, Lyn, Lek, Blk, Hek, Fgr a Yrk.

Dalším aspektem tohoto vynálezu je, že serinthreoninproteinkináza jejíž katalytická aktivita je modulována sloučeninou tohoto vynálezu, je vybrána ze skupiny sestávající se z CDK2 a Raf.

Farmaceutická kompozice sloučeniny podle tohoto vynálezu a farmaceuticky přijatelný nosič jsou dalším aspektem tohoto vynálezu. Taková farmaceutická kompozice může obsahovat také vehikulum.

Metoda působení nebo prevence poruch spojených s proteinkinázou v organizmu zahrnující aplikaci terapeuticky efektivního množství sloučeniny, soli nebo proléčiva 3-pyrrolidenyl-2-indolinonu tohoto vynálezu na organizmus je dalším aspektem tohoto vynálezu.

Jak zde bylo použito, termíny poruchy spojené s PK, poruchy řízené PK a abnormální PK aktivita pojednávají o podmínkách charakterizující nevhodnou, tj. nedostačující, nebo častěji nadměrnou

PK katalytickou aktivitu, kde jednotlivé PK mohou být RTK, CTK nebo STK. Nevhodná katalytická aktivita může nastat jako výsledek: (1) PK exprese v buňkách, které normálně PK neexprimují, (2) zvýšení PK exprese vedoucí k nechtěné buněčné proliferaci, diferenciaci a/nebo růstu, nebo (3) snížení PK exprese vedoucí k nechtěné redukci buněčné proliferace, diferenciace a/nebo růstu. Nadměrná aktivita vypovídá buď o zesílení genu kódujícího určitou PK nebo o produkci takové úrovně PK aktivity, která koreluje s poruchami buněčné proliferace, diferenciace a/nebo růstu ( tj. tak jak se zvyšuje hladina PK, tak se zvyšuje závažnost jednoho nebo více symptomů buněčných poruch). Nedostačující aktivita je, samozřejmě naopak, tam kde se závažnost jednoho nebo více symptomů zvyšuje se snižující se hladinou PK aktivity.

Jak zde bylo použito, termíny zabránit, zabraňující a prevence se v první řadě vztahují k metodě zabraňující organizmu získat poruchy spojené s PK.

Jak zde bylo použito, termíny ošetření , léčení a léčba se týká metody zmírnění nebo ukončení poruch pojených s PK a/nebo jejich přítomných symptomů. S ohledem zvláště na rakovinu, tyto termíny jednoduše znamenají, že délka života jedince majícího rakovinu se prodlouží nebo se redukuje jeden nebo více symptomů této nemoci.

Termín organizmus se týká jakéhokoli živého celku sestávajícího nejméně z jedné buňky. Živý organizmus může být tak jednoduchý jako například jediná eukaryotická buňka, nebo tak složitý jako savec včetně člověka.

Termín terapeuticky efektivní množství tak, jak je zde používán, se týká množství podávané sloučeniny, které vede do určité míry ke zmírnění jednoho nebo více symptomů léčené poruchy. S ohledem na léčbu rakoviny, terapeuticky efektivní množství se týká množství, které způsobí (1) redukci velikosti nádoru , (2) inhibici (tj., zpomalení do určité míry nebo zastavení) metastázy nádoru, (3) inhibici , do určité míry (tj., zpomalení do určité míry nebo zastavení) růstu ·· • · · ·

• · » » · · • · • ** • · «· ···· nádoru a/nebo (4) do určité míry zmírnění ( nebo lépe eliminaci) jednoho nebo více symptomů spojených s rakovinou.

Aspektem tohoto vynálezu je, že výše zmíněné poruchy spojené s proteinkinázou jsou vybrány ze skupiny sestávající s z poruch spojených s receptorovou proteintyrozinkinázou, buněčnou tyrozinkinázou a serin-threoninkinázou.

A následně aspektem tohoto vynálezu je, že výše zmíněné poruchy spojené s proteinkinázou jsou vybrány ze skupiny sestávající se z poruch spojených s EGFR, PDGFR, IGFR a flk.

Výše zmíněná porucha spojená s proteinkinázou je rakovina vybraná ze skupiny sestávající se ze spinocelulárního karcinomu (karcinomu epitelu buňek), astrocytomu, sarkomu jako je Kaposiho sarkomu, glioblastomu, rakoviny plic, rakoviny močového měchýře, rakoviny tlustého střeva, gastrointestinální rakoviny, rakoviny hlavy a krku, melanomu, rakoviny vaječníku, rakoviny prostaty, rakoviny prsu, rakoviny malých plicních buňek a gliomu v dalším aspektu tohoto vynálezu.

Výše zmíněná poruchy spojená s proteinkinázou je vybrána ze skupiny sestávající se z diabetů, hyperproliferační poruchy, von Hippel-Lindauovy nemoci, restenózy, fibrosy, psoriasy, osteo-artritidy, revmatické artritidy, zánětlivých poruch a angiogeneze v nyní dalším aspektu tohoto vynálezu.

Dalšími poruchami, které mohou být léčeny nebo, kterým může být zabráněno užitím sloučeniny tohoto vynálezu jsou imunologické poruchy, jako je autoimunitní nemoc (AIDS) a kardiovaskulární poruchy jako je ateroskleróza.

Aspektem tohoto vynálezu je, že chemické složení, které moduluje katalytickou aktivitu proteinkinázy může být identifikováno kontaktováním buněk exprimujících danou proteinkinázu se sloučeninou, solí nebo proléčivem, což je

3-pyrrolidenyl-2-indolinon z tohoto vynálezu a poté sledováním účinku na dané buňky.

• ·

9 ·*·♦*··*· · · · 9 9 9 9

9999 999 99 9999 99 9

Termínem sledování se míní pozorování nebo detekce účinku kontaktu sloučeniny s buňkou exprimující určitou PK. Pozorovaný nebo detekovaný účinek se může měnit v buněčném fenotypu, v katalytické aktivitě PK nebo změnami v interakci PK s přirozeným vazebným partnerem. Techniky pozorování nebo detekce těchto účinků jsou odborníkům dobře známé.

Výše zmíněný účinek je vybrán ze změny nebo nepřítomnosti změny buněčného fenotypu, změny nebo nepřítomnosti změny katalytické aktivity řečené proteinkinázy nebo změny nebo nepřítomnosti změny v interakci řečené proteinkinázy s přirozeným vazebným partnerem v konečném aspektu tohoto vynálezu.

Termín buněčný fenotyp se týká vnějšího vzhledu buněk nebo tkání nebo biologických funkcí buněk nebo tkání. Příklady, kromě jiných, jsou buněčná velikost, růst buněk, proliferace buněk, diferenciace buněk, přežívání buněk, apoptóza a příjem a využití živin.

Termín přirozený vazebný partner se týká polypeptidu, který se váže na určitou PK v buňce. Přirozený vazebný partner může hrát roly v transdukěních procesech, kde jsou signály zprostředkovávány PK. Změna v interakci přirozeného vazebného partnera s PK se může projevit jako snížení nebo zvýšení koncentrace komplexu PK/přirozený vazebný partner, což má za následek pozorovatelnou změnu ve schopnosti PK zprostředkovávat transdukční signál.

Dalším aspektem tohoto vynálezu je, že sloučenina zde popsaná, nebo její sůl či proléčivo, mohou být kombinovány s dalšími chemoterapeutiky na léčbu nemocí a poruch diskutovaných výše. Například, sloučenina, sůl nebo proléčivo tohoto vynálezu mohou být kombinovány s alkylačními činidly jako jsou fluoruracil (5-FU) samotný nebo v další kombinaci s leukovorinem; nebo dalšími alkylačními činidly jako jsou , kromě jiných, další analoga pyrimidinu jako jsou UFT, capecitabin, gemcitabin a cytarabin, alkyl sulfonáty, např. busulfan ( používaný na léčbu chronické granulocytární lukemie), improsulfan a piposulfan; aziridiny, např. benzodepa, karboquon, meturedepa a uredepa; ethyleniminy a methylmelaminy, např.

φ · φφφφ φφφ φ φ φφφ ίφ φφφφ φ φ φ φ φφ φφφφ φφ φ altretamin, triethylenmelamin, triethylenfosforamid, triethylenthiofosforamid a trimethylolmelamin; a dusíkaté přípravky, např. chlorambucil (používaný na léčbu chronické lymfocytické leukémie, primární makroglobulinémie a non-Hodgkinsova lymfomu), cyklofosfamid (používaný na léčbu Hodgkinsovy choroby, četného myelomu, neuroblastomu, rakoviny prsu, rakoviny vaječníku, rakoviny plic, Wilmsova tumoru a rabdomyosarkomu), estramustin, ifosfamid, novembrichin, prednimustin a uráčil přípravky (používané na léčbu primární trombocytosy, non-Hodgkinsova lymfomu, Hodgkinsovy choroby a rakoviny vaječníku); a triaziny, např. dakarbazin (používaný na léčbu lehkého tkáňového sarkomu).

Stejně tak se očekává, že sloučenina, sůl nebo proléčivo tohoto vynálezu, mají prospěšný účinek v kombinaci s dalšími antimetabolickými chemotherapeutickými činidly jako jsou, kromě jiných, analoga kyseliny listové, např. methotrexát (používaný na léčbu akutní lymfocytické leukémie, choriokarcinomu, mykosis fungiodes rakoviny prsu, rakoviny hlavy a krku a osteogenního sarkomu) a pteropterin; a analoga purinu jako jsou merkaptopurin a thioguanin, který našel uplatnění při léčbě akutní granulocytární, akutní lymfocytární a chronické granulocytární leukémie.

Také se může očekávat, že se zvýší účinnost sloučeniny, soli nebo proléčiva v kombinaci s chemoterapeutiky na přírodní bázy jako jsou, kromě jiných, např. vinblastin ( používaný na léčbu rakoviny prsu a rakoviny varlat), vincristin a vindesin; epipodofylotoxiny, např. etoposid a teniposid, oba používané na léčbu rakoviny varlat a Kaposiho sarkomu; antibiotická chemoterapeutika, např. daunorubicin, doxorubicin, epirubicin, mitomycin (používané na léčbu rakoviny žaludku, děložního hrdla, tlustého střeva, prsu, močového měchýře a pankreatu), dactinomycin, temozolomid, plicamycin, blomycin (používaných na léčbu rakoviny kůže, jícnu a močo-pohlavního traktu); a enzymatická chemoterapeutika jako L-asparaginaza.

A dále se očekává, že užitečný účinek bude mít sloučenina, sůl nebo proléčivo tohoto vynálezu v kombinaci s platinovými koordinačními komplexy (cisplatin, atd.); substituovanými močovinami jako hydroxymočovina; deriváty methylhydrazinu, např. procarbazin; adrenokortikálními supresivy, např.mitotan, aminoglutethimid; a hormony a hormonálními antagonisty jako adrenokortikosteriody (např. prednizon), progestiny (např. hydroxyprogesteron kaproát); estrogeny (např. diethylstilbesterol); antiestrogeny jako je tamoxifen; androgeny, např. testosteron propionát; a aromatáza inhibitory (jako je anastrozol).

A konečně jako částečně efektivní se očekává kombinace sloučeniny tohoto vynálezu s mitoxantrolem nebo paclitaxelem, které se používají na léčbu pevných rakovinných nádorů a leukémií jako jsou, kromě jiných, akutní myelogenní (non-lymfocitická) leukémie.

Současně preferovanou sloučeninou, u které se očekává užitečný účinek v kombinaci s jedním nebo více výše uvedenými chemoterapeutiky je 3-[2,4-dimethyl-5-(2-oxo-l ,2-dihydroindol-3ylidenmethyl)-1 H-pyrrol-3-yl]propionová kyselina.

DETAILNÍ POPIS VYNÁLEZU

1. Stručný popis tabulek

Tabulka 1 ukazuje chemickou strukturu a biologickou aktivitu některých sloučenin tohoto vynálezu. Číslování sloučenin odpovídá číslům příkladů v příkladové části. To znamená, že syntéza sloučeniny 1 v tabulce 1 je popsána v Příkladu 1. Použité biotesty jsou podrobně popsány níže. Výsledky jsou vykazovány v termínech IC50, mikromolární (μΜ) koncentraci testovaných sloučenin, které způsobí 50 % změnu v aktivitě určité PKT ve srovnání s aktivitou PTK v kontrolním testu, kde nebyla přidána testovaná sloučenina. Specificky, ukázaný výsledek indikuje koncentraci testované sloučeniny potřebné pro způsobení 50 % redukce aktivity dané PTK. Sloučeniny uvedené v Tabulce 1 jsou pouze pro příklad a nejsou konstruovány s úmyslem jakýmkoli způsobem omezit rozsah tohoto vynálezu.

• · ♦ 9 9 99 • · · · 9 9 9 9 • · 9 9 9 o c 9 9 9 4 4 4

9999 999 99 9999

Tabulka 1

Příklad*	Struktura	blo-FLK-l ICj,(«M)	bio-PDGFr ICwí-M)	bio-FGFR	HUVEC- VEGF ICm(biM)	HUVEC- aFGF IC.(nM)	BrdU- PDGFr ICw(biM)	BrdU- FGFr ICm(oiM)	BrdU- EGFr IC,(»M)
1		1.3	<0.78	20.2	0.38	21.4	8.4	8.8	12
2	,*νζ-^'ΟΒ	89.1	0.14	12.1	1.6	31.6	1.2	>50	>50
3	Vp'‘	1.2	0.042	0.86	0.05	2.8	2.5	30	>50
4		1.2	13	9	0.11	7.1	8.2	>50	>50
5	αρ“'	0.13	<1.2	8.81	0.42	9.3	10.7	46.8	95.9
6		6.8	0.26		0.63	18.4	8.6	>50	>50
7	v?	19.2	2.2		1.34	12.3	11.4	>50	>50
8		0.77	0.37	0.68	0.74	4.52	8.2	>50	>50
9		1.06	0.13		0.33	13.4	6.3	>50	>50
10	%°£z$	11	<0.78	1.63	10.62	>50	5.1	>50	>50
Π	V^”M o^ti	0.7	0.13	7.73	1.4	9.6	11.1	>50	>50
12	vyP^0	52.3	13.6	3.3	11	24.6	1	>50	>50

Příklad*	Struktura	bio-FLK-1 ICtt(mM)	i bio-PDGFr i bio-FGFR IC„(«M) I !C„(mM) I	HUVEC- VEGF IC„<mM)	HUVEC- aFGF IC»(aM)	BrdU- PDGFr IQ,(mM)	BrdU- FGFr )C»(l»M)	BrdU- EGFr lCa.(nM)
13		' *Vi θ£	r	31	4.2					1 i
14			Λ	17	6
15			Z	6.6	<0.78 .
16	Mo-U·'·	•w Ct£	Λ	>100	8.7					i 1 i
17			o ζ-Λ0	10	10.3		1.2	20	6.3	44.3	>50
18			>»	2.9	2		2.4	18.4	14.3	«	>50
19	Ί			0.006	0.063		0.07	3.6	3.7	39.6	>50
20	Ί		Y^0M Α'ΒΗ,	0.027	0.7		0.29	5	7.4	>50	>50
21		sí	ď	0.02	0.68	4	4	5.6	24.4	>50	>50
22			J- x*\	0.61	0.73		0.13	15.8	5		>50
23	J			5.2	0.8	0.68	3	1.1	10.8	>50	>50
24	V-O-C	£ H	Z 'CH,	<0.78	0.55	17.9	0.67	25.1	2.4	21	>50

«···

Prikhiil·	Struktura	bio-FLK-1 IQ. («Μ)	bio-PDGFr 1C»(»M)	bio-FGFR ICm(-M)	HUVEC- VEGF lC»(mM)	HUVEC- »FGF IC«(mM)	BrdU- PDGFr	BrdU- FGFr	BrdU- EGFr ICeCBM)
25	«Λ»	0.8	1.2
26	Fř	Θ1.8	>100
27	«\··*	16.9	<0.78 .		0.99	1.5
28		<0.78	0.16	0.04	0.15	1.9	3.4	37	>50
29		S.9	1.18	6.89	0.18	0.13	0.29	13.2	30.6
30		2.6	0.52	3.5	0.25	0.64	0.4	22	24.7
31	X	3.1	1.53		0.09	0.18	2.1	35.9	37.2
32		5.1	<0.009		10	10	0.076	12	32.7
33		4.6	0.16		0.81	1	0.1	21	30.5
34		24.7	3.1				3.8	34.7	36.8
35		14.4	1.2				1.59	35.8	>50
36	«_λ~	89.7	1.4

• · 0 · 0 ·

9 9 9 9 9 9 * · 9 9 9 • 99 · a • 0 0 00 0 0 0 0

Příklad»	Struktura	blo-FLK-1! bio-PDGFr	bio-FGFR	HUVEC- VEGF	HUVEC- FGF ICb(»M)	BrdU- PDGFr IC«(aM)	BrdU- FGFr IChÍbM)	BrdU- EGFr ιε»(·Μ)
37		85.6	1.5
38	’9rr^° c^'
39
40
41		0.01	0.09	3.2

Tabulka 2

Příklad.	Struktura	bio-FLK-1 ις»(«Μ)	bio-EGFr	bio-PDGFr 1Cm(»M>	HUVEC- VEGF ICmIoM)	HUVEC- •FGF	BrdU- PDGFr 1Cm(«M)	BrdU- FGFr !C»<mM)	BrdU- EGFr
42	H	<0.78	>100	2.31			0.38	34.93	>50
43		<0.78	>100	1.59			0.37	45.48	44.83
44		42.82	>100	0.27			0.44	>50	>50
45		>100	>100	7.53			1.02	4.96	3.9
46	,0	>100	>100	>100			0.52	15.42	41.9

φ · ♦ φ · · · • « « · • » * φ φ φφφ · «φ φφ·φ

Přikladli	Struktura	1 1 bio-FLK-li bio-EGFr	bio-PDGFr	HUVEC- VEGF ICm(biM)	HUVEC- aFGF IC»(bM)	BrdU- PDGFr ICW(»M)	BrdU- FGFr	BrdU- EGFr
lCe(mM)	ICm <-M>
47		>100	>100	0.75			>50	>50	>50
48		<0.78	>100	0.053			0.079	9.93	12.6
49		<0.78	>100	<0.046			<0.069	1.26	4.1
50		5.16	>100	0.1			0.103	3.42	4
51	1	42.36	22.83	1.02			1.54	3.9	9.56
52	.X	9.77	28.06	0.11			0.7	10.9	9.57
53		99.55	>100	4.35			0.48	3.1	3.66
54	X-S-S'“’ °V<r	<0.78	>100	<0.0078			<0.069	3.01	7.49
55	ífrF	<0.78	86.56	<0.0078			<0.069	13.85	25.37
56	-ο	<0.78	>100	0.16			0.55	4.86	11.01
57		<0.78	>100	0.05			0.29	15.7	27.47

Přiklad·	Struktura	blo-FLK-l ICninM)	bio-FOGFr	bio-FGFR	HUVEC- VEGF !C»(mM)	HUVEC- •FGF	BrdU- PDGFr	BrdU- FGFr	BrdU- EGFr KW**·»
58		<0.78	>100	<0.0078			<0.069	9.18	25.35
59		<0.78	>100	0.067			0.32	9.95	20.2
60		<0.78	>100	0.43			0.56	3	25.34
61	χΧ	0.91	>100	0.44			1.04	11.31	6.59
62		1.97	>100	2.35			0.57	2.14	8.38
63	x^< 9 ftA* H	12.08	>100	2.41			10.32	29.09	29.77
64	XA H	15.07	>100	2.86			1.45	4.58	11.24

Tabulka 2 ukazuje chemické struktury některých přídavných sloučenin tohoto vynálezu. Stejně jako v Tabulce 1, čísla sloučenin odpovídají číslům příkladů. Základní popis výše použitých biotestů se shoduje s biotesty v Tabulce 2.

2. Indikace/urěená onemocnění

PK, jejichž katalytická aktivita je modulována sloučeninami podle tohoto vynálezu, obsahující proteintyrosinkinázy, které jsou dvojího typu, receptorové tyrozinkinázy (RTK) a buněčné tyrozinkinázy (CTK), a serín-threoninkinázy (STK). Signální transdukce zprostředkovávaná RTK je iniciována extracelulární interakcí se specifickým růstovým faktorem (ligandem), po které následuje dimerizace receptoru, dočasná stimulace aktivity vnitřního proteinu tyrozinkinázy a fosforylace. Vytváří se tudíž vazebná místa pro intracelulární signální transdukční molekuly a vedou k formaci komplexu s celou řadou cytoplazmatických signálních molekul, které zprostředkovávají příslušnou buněčnou odpověď (např. dělení buněk, metabolické účinky na mimobuněčný mikrosvět atd.). Viz Schlessinger a Ulrych, 19992, Neuron 9:303-391.

Bylo ukázáno, že tyrozinová fosforylaění místa na receptorech růstového faktoru fungují jako vazebná místa s vysokou afinitou pro SH2 doménu (homolog src) signálních molekul. Fantl et al., 19992, Cell 69:413-423, Songyang et al. 1994, Mol. Cell. Biol. 14:2777-2785), Songyang et al., 1993, Cell 72:767-778, a Koch at al., 1991, Science 252:668-678. Bylo identifikováno několik intracelulárních substrátových proteinů, které se asociují s RTK. Lze je rozdělit do dvou základních skupin: (1) substráty, které mají katalytickou doménu, a (2) substráty, které takovou doménu nemají, ale které slouží jako adaptéry a asociují s katalyticky aktivními molekulami. Songyng et al., 1993, Cell 72:767-778. Specifita interakcí mezi receptory a doménami SH2 jejich substrátů je určena podle zbytků aminokyselin bezprostředně obklopujících fosforylovaný tyrozinový zbytek. Rozdíly ve vazebné afinitě mezi SH2 doménami a aminokyselinovou sekvencí obklopující fosfotyrozinové zbytky na určitém receptoru souhlasí s pozorovanými rozdíly v profilech jejich fosforylovaných substrátů. Songyang et al., 1993, Cell 72:767-778. Tato pozorování vedou k názoru, že funkce každé RTK je určena nikoli pouze jejím vzorcem exprese a dostupnosti ligandu, ale také řadou downstream signálů transdukčních cest, které jsou aktivovány určitým receptorem. Tak fosforylace poskytuje důležitý regulační krok, který určuje výběrovost signálních cest používaných specifickými receptory růstových faktorů stejně tak jako receptory diferenciačních faktorů.

STK, které jsou primárně cytoplazmatické, ovlivňují biochemii uvnitř buňky, často jako down-line odpověď na působení PTK. STK byly prokázány v signálních procesech, které iniciují syntézu DNA a následnou mitózu vedoucí k buněčné proliferaci.

Tak PK signální transdukce vede, kromě jiných odpovědí, k buněčné proliferaci, diferenciaci, růstu a metabolizmu. Abnormální buněčná proliferace může vést k celé řadě onemocnění a nemocí, včetně k rozvinutí neoplasmů jako jsou karcinomy, sarkomy, glioblastomy a hemangiomy, k onemocněním jako leukémie, psoriáza, arterioskleróze, arthritidě a diabetické retinopathii a k dalším onemocněním souvisejícím s nekontrolovanou angiogenezi a/nebo vaskulogenezí.

Používání tohoto vynálezu nevyžaduje precizní pochopení mechanizmů, jakými sloučeniny tohoto vynálezu inhibují proteinkinázy. Nicméně, zatímco sloučeniny zde nejsou vázány k žádné určité teorii mechanizmu působení, má se za to, že tyto sloučeniny interagují s aminokyselinami v katalytických oblastech proteinkináz. Proteinkinázy mají typicky dvoulaločnou strukturu, ve které se ATP zřejmě váže ve štěrbině mezi těmito dvěma laloky v oblasti, kde se vyskytují aminokyseliny v proteinkinázách konzervované. Věří se, že inhibitory proteinkináz se vážou nekovalentními vazbami jako vodíkovými můstky, van der Waalsovými sílami a iontovými interakcemi v té samé oblasti, kde se již zmíněné ATP váže na proteinkinázy. Přesněji, má se za to, že 2-indolinové složky sloučenin tohoto vynálezu se vážou na obecné místo obvykle obsazeného adeninovým kruhem ATP. Specifita určité molekuly k určité proteinkináze může vzniknout jako výsledek dodatečné interakce mezi různými substituenty na 2-indolinovém jádře a aminokyselinovou doménou specifickou pro určitou proteinkinázu. Tak různé idolinové substituenty mohou přispívat k přednostní vazbě na určitou proteinkinázu. Schopností vybrat sloučeniny aktivní na různých vazebných místech ATP (nebo jiného nukleotidu) jsou sloučeniny tohoto vynálezu užitečné pro zacílení jakéhokoli proteinu s takovým místem. Sloučeniny zde popsané tak mohou mít užitek v in vitro testech pro takové proteiny a také pro in vivo předvedení terapeutických účinků prostřednictvím interakce s takovými proteiny.

V dalším aspektu je proteinkináza, jejíž katalytická aktivita je modulována kontaktem s některou sloučeninou tohoto vynálezu, je proteintyrozinkináza, přesněji receptorová proteintyrozinkináza. Mezi »♦ «··· ·

receptorové proteintyrozinkinázy, jejichž katalytická aktivita může být modulovaná některou sloučeninou tohoto vynálezu nebo její solí, patří kromě jiných EGF, HER2, HER3, HER4, IR, IGF-1R, IRR, PDGFRa, PDGFRp, CSFIR, C-Kit, C-fms, Flk-IR, Flk4, KDR/Flk-1, Flt-1, FGFR2R, FGFR-3R a FGFR-4R.

Proteintyrozinkináza, jejíž katalytická aktivita je modulována kontaktem se sloučeninou tohoto vynálezu nebo její solí či jejím proléčivem, může být buď nereceptorová, nebo buněčná proteintyrozinkináza (CTK). Tak katalytická aktivita CTK jako takové, kterou může být kromě jiných Src, Frk, Brk, Csk, Abl, ZAP70, Fes, Fps, Fak, Jak, Ack, Yes, Fyn, Lyn, Lek, Blk, Hek, Fgr a Yrk, je modulována kontaktem se sloučeninou tohoto vynálezu nebo její solí.

Další skupinou proteinkináz, které mohou mít své katalytické aktivity modulovány kontaktem s některou sloučeninou tohoto vynálezu, jsou serin-threoninproteinkinázy jako takové, mezi jinými CDK2 a Raf.

V dalším aspektu se tento vynález vztahuje na metodu léčby nebo prevence poruch v souvislosti s PK podáním terapeuticky efektivního množství některé sloučeniny tohoto vynálezu, její soli nebo proléčiva, do organizmu.

Je rovněž aspektem tohoto vynálezu, že farmaceutická kompozice obsahující některou sloučeninu tohoto vynálezu nebo její sůl či proléčivo, je podáno organizmu za účelem prevence nebo léčby poruch souvisejících s PK.

Tento vynález je tedy zaměřen na sloučeniny, které modulují proteinkinázovou signální transdukci ovlivněním enzymatické aktivity RTK, CTK a/nebo STK, čímž interferují se signály transdukovanými těmito proteiny. Přesněji je tento vynález zaměřen na sloučeniny, které modulují RTK, CTK a/nebo STK zprostředkovávané signální transdukční dráhy jako terapeutický přístup k léčbě mnoha druhů pevných nádorů, zahrnujících kromě jiného karcinomy, sarkomy včetně Kaposiho sarkomu, erytroblastomy, glioblastomy, meningiomy, astrocytomy, melanomy a myoblastomy. Léčba nebo prevence ♦ · 9 · 9 99 9« • 999 999« 9 9 · • · 9 9 9 9 9 44 · 9999 9999

T^T · 9 9 9 9 9 9

9999 999 99 9999 99 9 nepevných rakovinných nádorů, jako je leukemie, jsou do tohoto vynálezu rovněž zahrnuty. Indikace mohou zahrnovat kromě jiného rakoviny mozku, rakoviny močového měchýře, rakoviny vaječníků, rakoviny pankreatu, rakoviny tlustého střeva, rakoviny krve, rakoviny plic a rakoviny kostí.

Dalšími příklady typů poruch souvisejících se nevhodnou proteinkinázovou aktivitou, ke kterým mohou být sloučeniny zde popsané vhodnou prevencí, léčbou a studiem, jsou kromě jiného poruchy proliferace, fibrotické poruchy a metabolické poruchy.

Poruchy buněčné proliferace, kterým tento vynález může být prevencí, léčbou nebo dalším studiem, zahrnují rakovinu, poruchy proliferace buněk krevních cév a poruchy proliferace mesangiálních buněk.

Poruchy proliferace krevních cév se týkají poruchám souvisejícím s abnormální vaskulogenezí (tvorbou krevních cév) a angiogenezí (šíření krevních cév). Zatímco vaskulogeneze a angiogeneze hrají důležitou roli v mnoha normálních fyziologických procesech, jako je embryonální vývoj, formace žlutého tělíska, hojení ran a regenerace orgánů, hrají také zásadní roli ve vývoji rakoviny, kde vedou k tvorbě nových kapilár potřebných pro udržení nádoru při životě. Dalšími příklady poruch proliferace krevních cév je artritida, kde nové kapiláry krevních cév poškozují kloub a ničí chrupavku, dále oční onemocněni jako diabetická retinopatie, kde nové kapiláry v sítnici napadají sklivec, krvácejí a způsobují slepotu.

Bylo zjištěno, že dvě strukturálně příbuzné RTK se vážou k VEGF s vysokou afinitou: fms-podobný tyrosin 1 (fit-1) receptor (Shibuya et al., 1990, Oncogene, 5:519-524, De Vries et al., 1992, Science, 255:989-991) a receptor KDR/FLK-1 také známý jako VEGF-R2. Bylo publikováno, že vaskulární endoteliální růstový faktor (VEGF) je specifickým mitogenem endotelových buněk s podpůrnou aktivitou na růst endotelových buněk in vitro. Ferrara & Henzel, 1989, Biochein. Biophys. Res. Comm., 161:851-858, Vaisman et al., 1990, J. Biol. Chem., 265:19461-19566. Informace podané v US přihlášce č. 08/193,

829, 08/038, 596 a 07/975, 750 trvají na tom, že VEGF je odpovědný nejen za proliferaci endotelových buněk, ale také je primárním regulátorem normální a patologické angiogeneze. Obecně viz Klagsburn & Soker, 1993, Current Biology, 3(10)699-702; Houck, et al.

1992, J. Biol. Chem., 267:26031-26037.

Normální vaskulogeneze a angiogeneze hrají důležitou roli v řadě fyziologických procesů jako je embryonální vývoj, hojení ran, regenerace orgánů, v ženském reprodukčním procesu jako je vývoj folikula ve žlutém tělísku během ovulace a růst placenty v těhotenství. Folkman & Shing, 1992, J. Biological Chem., 267(16):10931-34. Nekontrolovaná vaskulogeneze a/nebo angiogeneze je spojována s takovými nemocemi, jako je diabetes a s maligními pevnými nádory, které jsou svým růstem závislé na vaskularizaci. Klagsburn & Soker,

1993, Current Biology, 3(10):699-702; Flokham, 1991, J. Nati. Cancer Inst., 82:4-6; Weidner, et al., 1991, New Engl. J. Med., 324:1-5.

Předpokládaná role VEGF v proliferaci endotelových buněk a migrace během angiogeneze a vaskulogeneze ukazuje na důležitou úlohu receptoru KDR/FLK-1 v těchto procesech. Nemoci jako diabetes mellitus (Folkman, 198, na XI. Kongresu o thrombóze a hemostázi (Vestraeta, et al., eds.), str. 583-596, Leuven University Press, Leuven) a arthritida, stejně jako růst maligních nádorů mohou mít příčinu v nekontrolované angiogenezi. Viz např. Folkman, 1971, N. Engl. J. Med., 285:1 182-1 186. Receptory, na které se VEGF specificky váže, jsou důležitým a silným terapeutickým cílem pro regulaci a modulaci vaskulogeneze a/nebo angiogeneze v řadě vážných onemocnění, která zahrnují abnormální buněčný růst způsobený takovýmito procesy. Plowman, et al., 1994, DN&P, 7(6):334-339. Přesněji, vysoce specifická role receptoru KDR/FLK-1 v neovaskularizaci z něho činí možný cíl pro terapeutické přístupy v léčbě rakoviny nebo jiných nemocí, které zahrnují nekontrolovaný vznik krevních cév.

Tak se jedním svým aspektem tento vynález vztahuje na sloučeniny schopné regulovat a/nebo modulovat tyrozinkinázovou signální transdukci včetně transdukčního signálu KDR/FLK-1 receptoru ·♦♦· · za účelem inhibovat nebo podpořit angiogenezi a/nebo vaskulogenezi, tj. sloučeniny, které inhibují, zabraňují nebo interferují se signálem transdukovaným KDR/FLK-1, jsou-li aktivovány ligandem jako je VEGF. Přestože byla vyslovena domněnka, že sloučeniny tohoto vynálezu působí na receptor nebo jinou sloučeninu podél transdukční dráhy tyrozinkinázového signálu, mohou rovněž působit přímo na nádorové buňky, které jsou výsledkem nekontrolované angiogeneze.

Ačkoli se nomenklatura pro lidský a myší protějšek druhového receptorů „flk-I“ liší, jsou tyto receptory v mnoha ohledech zaměnitelné. Myší receptor, Flk-1, a jeho lidský protějšek, KDR, sdílejí sekvenční homologii 93,4 % na své intracelulární doméně. Stejně tak myší FLK-I váže lidský VEGF se stejnou afinitou jako myší VEGF, a tudíž je aktivován ligandem odvozeným z jednoho nebo druhého druhu. Millauer et al., 1993, Cell, 72:835-846; Quinn et al., 1993, Proč. Nati. Acd. Sci. USA, 90:7533-7537. FLK-1 rovněž asociuje a následně fosforyluje tyrosin substrátů lidských RTK např. PLC-γ nebo p85), je-li koexprimován v buňkách 293 (linie fibroblastoidních buněk lidských embryonálních ledvin).

Pro pochopení KDR receptorů jsou tedy přímo použitelné modely, které jsou založeny na FLK-1 receptorů. Například využití myšího receptorů FLK-1 v metodách určujících sloučeniny, které regulují myší signální transdukční dráhy, je přímo využitelné na identifikaci sloučenin, které mohou být použity na regulaci lidských signálních transdukčních drah, tj. které regulují aktivity spojené s KDR receptorem. Tak chemické sloučeniny identifikované jako inhibitory KDR/FLK-1 in vitro mohou být potvrzeny jako vhodné modely in vivo. Jak myší tak krysí in vivo živočišné modely vykazují výbornou vlastnosti pro vyšetřování klinického potenciálu látek působících na KDR/FLK-1 indukovanou signální transdukční dráhu.

Tak v jednom z aspektů je tento vynález zaměřen na sloučeniny, které regulují, modulují a/nebo inhibují vaskulogeneze a/nebo angiogeneze ovlivňováním enzymatické aktivity receptorů KDR/FLK-1 a interferencí se signálem transdukovaným KDR/FLK-1. V jiném svém ·♦·· v • 4 *· 44 4 • · 4 4 4 4··

4 4 4 4 4 • 4 4 4 4 4 4 4 • 4 4 4 4 4 • 44 4444 44 444 aspektu je tento vynález zaměřen na sloučeniny, které regulují, modelují a/nebo inhibují signální transdukční dráhu zprostředkovanou KDR/FLK-1 jako terapeutický přístup k léčbě mnoha druhů pevných nádorů včetně, mimo jiných, glioblastomů, melanomů a Kaposiho sarkomu, karcinomů vaječníků, plic, mléčných žláz, prostaty, pankreatu, tlustého střeva a epidermu. Navíc údaje zakládají předpoklad, že podávání sloučenin, které inhibují signální transdukční dráhu zprostředkovanou KDR/FLK-1, může být rovněž použito jako léčba hemangiomu, restenois a diabetické retinopatie.

Další aspekt tohoto vynálezu se vztahuje k inhibici vaskulogeneze a angiogeneze dráhami zprostředkovanými dalšími receptory, včetně dráhy zahrnující receptor flt-1.

Signální transdukce zprostředkovaná receptorovou tyrozinkinázou je iniciována extracelulární interakcí se specifickým růstovým faktorem (ligandem), po které následuje dimerizace receptoru, dočasná stimulace aktivity vnitřního proteinu tyrozinkinázy a autofosforylace. Tím se vytvoří vazebná místa pro intracelulární signální transdukční molekuly, což vede ke tvorbě komplexů s celou řadou cytoplazmatických signálních molekul, které zprostředkovávají vhodnou buněčnou odpověď, např. dělení buněk a metabolické účinky na extracelulální mikroprostředí. Viz Schlessinger a Ullrich, 1992, Neuron, 9:1-20.

Blízká homologie intracelulárních oblastí KDR/FLK-1 s těmito oblastmi na receptoru PDGF-β (50,3 % homologie) a/nebo příbuzném receptoru flt-1 ukazuje na indukci přesahujících signálních transdukčních drah. Například bylo prokázáno, že pro receptor PDGFβ, člen src rodiny, (Twamley, et al., 1993, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 90:7696-7700), se fosfatidylinositol-3'-kináza (Hu et al,, 1992, Mol, Cell, Biol,, 12: 981-990), fosfolipáza cy (Kashishian & Kooper, 1993, Mol, Cell, Biol,, 4: 49-51), ras-GTPázu aktivující protein, (Kashishian et al,, 1992, EMBO J,, 1 1: 1373-1382), PTP-ID/syp (Kazlauskas et al,, 1993, Proč, Nati, Acad, Sci, USA, 10 90: 6939-6943), Grb2 (Arvidsson et al,, 1994, Mol, Cell, Biol,, 14: 6715-6726), a molekuly adaptéru Shc a Nck (Nishimura et al,, 1993, Mol, Cell, Biol,, 13: 6889-6896) vážou φ φ

ΦΦ

na oblasti obsahující různá autofosforylační místa. Obecně viz Claesson-Welsh, 1994, Prog, Growth Factor Res., 5: 37-54. Je tudíž pravděpodobné, že signální transdukční dráhy aktivované KDR/FLK-1 zahrnují dráhu ras (Rozakis et al,, 1992, Nátuře, 360: 689-692), PI-3'kinázy, dráhy zprostředkovávané src a plcy. Každá z těchto drah může hrát kritickou úlohu v angiogenezním a/nebo vaskulogenezním účinku KDR/FLK-1 v endoteliálních buňkách. V důsledku toho se další aspekt tohoto vynálezu vztahuje k využití těchto organických sloučenin zde popsaných pro modulaci angiogeneze a vaskulogeneze jako procesů, kontrolovaných těmito dráhami.

A naopak onemocnění související se smršťováním, zkracováním či uzavíráním krevních cév, jako je restenóza, jsou zde rovněž zahrnuty a mohou být léčeny nebo jim může být předcházeno metodami tohoto vynálezu.

Fibrotické poruchy mají souvislost s abnormální tvorbou extracelulární matrix. Příklady fibrotických poruch zahrnují cirhózu jater a poruchy proliferace mesangialních buněk. Cirhóza jater je charakterizována zvýšením složek extracelulární matrix vedoucím k tvorbě jaterních jizev. Zvýšená extracelulární matrix vedoucí ke zjizvení jater může být rovněž způsobena virovou infekcí jako je žloutenka. Vypadá to, že hlavní roli v cirhóze jater hrají tukové buňky. Další implikované fibrotické poruchy zahrnují atherosklerózu.

Poruchy proliferace mezangiálních buněk souvisí s poruchami zapříčiněnými abnormální proliferaci mezangiálních buněk. Mezangiální proliferační poruchy zahrnují různá lidská ledvinová onemocnění, jako je glomerulonefritida, diabetická nefropatie a maligní nefroskleróza spolu s takovými onemocněními jako jsou syndromy trombotického onemocnění mikrocév, odmítání transplantátů a glomerulopatie. Na procesu proliferace mazangiálních buněk se podílí RTK PDGFR. Floege et al., 1993, Kidney International 43:47S54S.

Mnoho rakovin je poruchami proliferace buněk a jak již bylo dříve uvedeno, proteinkinázy jsou spojeny s poruchami proliferace

ΦΦ φ φφ φφ φ φ ·Φ φ φ φ ♦ • φ φ · * φ φ φ φ · φφφφ φφφ φφ φφφφ buněk. Proto není překvapivé, že takové proteinkinázy jako jsou například kinázy z rodiny RTK, jsou spojovány se vznikem rakoviny. Některé z těchto receptorů, jako je EGFR (Tuzi et al., 1991, Br. J. Cancer 63:227-233, Torp et al., 1992, APMIS 100:713-719) HER2/neu (Slamon et al., 1989, Science 244:707-712) a PDGF-R (Kumabe et al., 1992, Oncogene, 7:627-633) jsou ve zvýšené míře exprimovány v mnoha nádorech a/nebo persistentně aktivovány autokrinními smyčkami. Ve skutečnosti byla v nejčastějších a nejtěžších rakovinách prokázána nadměrná exprese těchto receptorů (Akbasak a SunerAkbasak et al., 1992, J. Neurol. Sci., 111:119-133, Dickson et al., 1992, Cancer Treatment Res. 61:249-273, Korc et al., 1992, J. Clin. Invest. 90:1352-1360) a autokrinní smyčky (Lee a Donoghue, 1992, J. Cell. Biol., 1 18:1057-1070, Korc. et al., supra, Akbasak a SunerAkbasak et al., supra). Například EGFR je spojen s karcinomem plochých buněk, astrocytomem, glioblastomem, rakovinou hlavy a krku, rakovinou plic a žlučníku. HER2 je spojen s rakovinou prsu, vaječníků, žaludku, plic, slinivky a žlučníku. PDGFR je spojován s glioblastomem a melanomem spolu s rakovinou plic, vaječníků a prostaty. RTK c-met je rovněž spojován s tvorbou maligních nádorů. Například je c-met spojován, mimo jiné typy rakovin, s kolorektálním, thyroidním, pankreatickým, gastrickým a jaterním karcinomem a lymfomem. Navíc c-met je spojen s leukémií. Nadměrná exprese genu c-met je rovněž zjišťována u pacientů s Hodgkinsovou nemocí a Burkittovou nemocí.

IGF-IR, kromě toho, že má souvislost s nutriční podporou a diabetes typu II, je rovněž spojován s několika typy rakovin. Například byl IGF-I implikován jako autokrinní růstový stimulátor pro několik typů nádorů, např. buňky lidského karcinomu prsu (Artaega et al., 1989, J. Clin. Invest. 84:1418-1423) a nádorové buňky plic (Macauley at al., 1990, Cancer Res., 50:251 1-2517). Dále IGF-I, zatímco je integrální součástí normálního růstu a diferenciace nervového systému, je zřejmě rovněž autokrinní stimulátor lidských gliomů. Sandgerg-Nordqvist et al., 1993, Cancer Res. 53:2475-2478. Důležitost IGF-IR a jeho ligandů pro proliferaci buněk je dále podporována skutečností, že mnoho typů ·· · ·Φ ·· ·· ♦ · ·· » · · * » · • · · « · · * • · · · * ···· • · · « « · · «··· ··· ·· »··· *· buněk v kultuře (fibroblasty, epiteliální buňky, buňky hladkého svalstva, T-lymfocyty, myeloidní buňky, chondrocyty a osteoblasty (kmenové buňky kostní dřeně) jsou stimulovány k růsty prostřednictvím IGF-I. Goldring a Goldring, 1991, Eukaryotic Gene Expression, 1:301326. V řadě posledních publikací Baserba navrhuje, že IGF-IR hraje ústřední roli v mechanizmu transformace a jako takový může být přednostním cílem pro terapeutické zásahy do širokého spektra lidských zhoubných bujení. Baserga, 1995, Cancer Res., 55:249-252, Baserga, 1994, Cell 79:927-930, Coppola et al., 1994, Mol. Cell. Biol., 14:45884595.

STK byly implikovány v mnoha typech rakovin včetně, a především, v rakovině prsu (Cance, et al., Int. J. Cancer, 54:571-77 (1993)).

Spojení mezi abnormální aktivitou PK a onemocnění není omezeno pouze na rakovinu. Například RTK jsou rovněž spojeny s nemocemi jako lupénka, diabetes mellitus, endometrióza, angiogeneze, vývoj ateromatických plaků, Alzheimerovou nemocí, von HippelLindauovou nemocí, epidermální hyperproliferací, neurodegenerativními onemocněními, makulární degenerace související s věkem a hemangiom. Například EGFR byl indikován v hojení poranění pokožky a rohovky. V diabetes mellitus typu II jsou indikovány defekty IGF-IR a insulin-R. Složitější korelace mezi specifickými RTK a jejich terapeutické indikace jsou více popsány v Plowman et al., 1994, DN&P 7:334-339.

Jak již bylo uvedeno, nejen RTK, ale kromě jiných také CTK src, abl, fps, yes, fyn, lyn, lek, blk, hek, fgr a yrk (přezkoumány Bolenem et al., 1992, FASEB J., 6:3403-3409) se podílí na proliferačních a metabolických signálních transdukčních drahách ,a tudíž lze očekávat, a bylo to předvedeno, že se podílejí na mnoha poruchách zprostředkovávaných proteintyrozinkinázami, na které je směřován tento vynález. Například bylo dokázáno, že mutovaný src (v-src) je u kuřat onkoproteinem (pp60^{v src})· Navíc jeho buněčný homolog, protoonkogen pp60^c'^src přenáší onkogenní signál na mnoho receptorů.

·· ·· · ·<· ·· ·· ···· * · · · *9 • · · · · · · · • ···· · 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9

9999 999 99 9999 99 999

Nadměrná exprese EGFR nebo HER2/bez v nádorech vede ke konstitutivní aktivaci pp60^c'^src , což je charakteristické pro maligní buňky, ale nevyskytuje se v normálních buňkách. Na druhé straně myši, které postrádají expresi c-src, vykazují osteopetrotický fenotyp, značící klíčovou účast c-src ve funkci osteoklastů a možného zapojení do souvisejících poruch.

Podobně byl implikován Zap70 v signalizaci T-buněk, což může mít souvislost autoimunitními poruchami.

STK jsou zapojeny do zánětů, autoimunitních onemocnění, imunoodpovědí a hyperproliferačních poruch, jako je restenóza, fibróza, lupénka, osteoarhtritida a revmatická arthritida.

PK hrají rovněž roli v implantaci embrya. Tak sloučeniny tohoto vynálezu mohou poskytovat účinnou metodu pro prevenci takové implantace embrya, a tím být užitečnou látkou pro kontrolu porodnosti.

A konečně jak RTK, tak CTK jsou v současnosti podezírány z účasti na hyperimunitních poruchách.

Metoda pro identifikaci chemické sloučeniny, která moduluje katalytickou aktivitu jedné nebo více výše diskutovaných proteinkináz je dalším aspektem tohoto vynálezu. Tato metoda zahrnuje kontaktováni buněk exprimujících požadovanou proteinkinázu s některou sloučeninou tohoto vynálezu (nebo její solí či proléčivem) a sledování těchto buněk, jaký účinek na ně daná sloučenina měla. Tento účinek může být pozorovatelný buď prostým okem nebo pomocí nástrojů, dále změnou nebo nepřítomností změny fenotypu buněk. Takovou změnou nebo absencí změny ve fenotypu sledovaných buněk může být například, mimo jiné, změna nebo absence změny katalytické aktivity proteinkinázy v buňkách nebo změna či absence změny v interakci proteinkinázy s přirozeným vazebným partnerem.

Příklady účinku řady exemplárních sloučenin tohoto vynálezu na několik PTK jsou uvedeny v Tabulce 1 a 2 v oddíle Biologické příklady níže. Uvedené sloučeniny a data nejsou v žádném případě konstruovány jako omezení rozsahu tohoto vynálezu.

5. Farmaceutické přípravky a jejich použití

Sloučeniny podle předloženého vynálezu, jejich proléčiv nebo fyziologicky přijatelné soli buď sloučenin podle předloženého vynálezu anebo jejich proléčiv, mohou být aplikovány jako takové lidským subjektům nebo mohou být aplikovány formou farmaceutických přípravků, ve kterých jsou výše uvedené látky smíchány s vhodnými nosiči nebo vehikulem. Techniky přípravy preparátů a aplikace léčiv mohou být nalezeny v „Remington's Pharmacological Sciences,“ Mack Publishing Co., Easton, PA, nejnovější vydání.

Způsoby aplikace

Termín „aplikace“ nebo „aplikování“, jak je používán zde, se vztahuje na podání sloučeniny, soli nebo proléčiva podle předloženého vynálezu nebo farmaceutického přípravku obsahujícího sloučeninu, sůl nebo proléčiva tohoto vynálezu do organizmu za účelem prevence nebo ošetření poruch souvisejících s PK.

Vhodné způsoby aplikace mohou zahrnovat, ale není to nikterak limitováno, perorální, rektální, transmukózní nebo intestinální aplikaci nebo intramuskulámí, subkutánní, intramedulární, intratekální, přímo intraventrikulární, intravenózní, intravitreální, intraperitoneální, intranazální nebo intraokulární injekce. Výhodné způsoby aplikace jsou perorální a parenterální způsoby.

Nebo lze aplikovat sloučeniny místně spíše než soustavně, např. injekcí sloučeniny přímo do pevného nádoru, často v preparátu s depotním nebo trvalým uvolňováním.

Dále lze aplikovat léčivo v systému s cílovým dodáním léčiva, např. léčivo pokryté lipozómy s specifickou protilátkou proti určitému nádoru. Lipozómy budou určeny a vytvářeny selektivně podle charakteru nádoru.

• ·

Farmaceutické přípravky

Farmaceutické přípravky podle předloženého vynálezu mohou být připravovány způsoby, které jsou známy z dosavadního stavu techniky, např. pomocí standardního míchání, rozpouštění, granulování, přípravy dražé, roztírání, emulgace, zapouzdření, uzavření(do tuhé látky) nebo lyofilizací.

Farmaceutické přípravky pro použití podle předloženého vynálezu mohou být připravovány standardním způsobem použitím jednoho nebo více fyziologicky přijatelných nosiěů obsahujících vehikulum a pomocné prostředky, které usnadňují zpracování aktivních látek do preparátů, jenž mohou být farmaceuticky používány. Vlastní příprava záleží na vybraném způsobu aplikace.

Pro dávky ve formě injekce mohou být sloučeniny podle vynálezu připravovány ve vodných roztocích, výhodně ve fyziologicky kompatibilních pufrech, např. Hankův roztok, fyziologický roztok. Pro transmukózní aplikaci jsou v preparátech používány takové vhodné penetrátory, známé z dosavadního stavu techniky, které jsou schopny prostoupit bariérou.

Pro dávky ve formě perorální aplikace mohou být sloučeniny připraveny spojením aktivních sloučenin s farmaceuticky přijatelnými nosiči, které jsou známy z dosavadního stavu techniky. Takové nosiče umožňují sloučeninám podle předloženého vynálezu, aby byly připravovány ve formě tablet, pilulek, pastilek, dražé, pouzder, tekutých roztoků, gelů, sirupů, zahuštěných suspenzí ,suspenzí, apod. pro perorální příjem pacientem. Farmaceutické preparáty pro perorální použití mohou být vyrobeny použitím pevných excipientů, případně třením výsledné směsi, a zpracováním směsi granulí, po přidání dalších vhodných pomocných látek, pokud je požadováno, k obdržení tablet nebo dražé. Použitelné excipienty jsou zejména plniva, např. cukry, včetně laktózy, sacharózy, mannitolu nebo sorbitolu, celulózových preparátů, např. kukuřičný škrob, pšeničný škrob, rýžový škrob a bramborový škrob a jiné látky, např. želatina, tragant, methylcelulóza, ®

hydroxypropylmethylcelulóza, karboxymethylcelulóza sodná, a/nebo pólyvinylpyrrolidon (PVP). Pokud je třeba, může být přidána také látka zajišťující rozpad tablety po požití, např. síťový polyvinylpyrrolidon, agar nebo kyselina alginová. Může být používána také sůl, např. alginát sodný.

Dražé mají vhodnou povrchovou vrstvu. Pro tento účel mohou být používány koncentrované roztoky cukru, které případně obsahuje arabskou gumu, talek, polyvinylpyrrolidon, karbopolgel, polyethylenglykol, a/nebo oxid titaniěitý, lakařské roztoky a vhodná organická rozpouštědla nebo směs rozpouštědel. Do povrchových vrstev tablet nebo dražé mohou být přidána barviva nebo pigmenty kvůli rozpoznání nebo charakterizování různých kombinací dávek aktivní sloučeniny.

Farmaceutické přípravky, které mohou být používány perorálně, zahrnují zasunovací pouzdra vyrobená z želatiny, jakož i měkká, uzavřená pouzdra vyrobená z želatiny a změkčovadla, např. glycerol nebo sorbitol. Zasunovací pouzdra mohou obsahovat aktivní složky v příměsi s plnivem, např. laktózou, pojivém, např. škrob, a/nebo lubrikans, např. talek nebo stearát hořečnatý, případně stabilizátory.

V měkkých pouzdrech mohou být aktivní sloučeniny rozpuštěny nebo rozptýleny ve vhodných tekutinách, např. oleje mastných kyselin, minerální olej nebo tekuté polyethylenglykoly. Také mohou být v těchto přípravcích přidány stabilizátory.

Pro aplikaci ve formě inhalace jsou sloučeniny pro použití podle předloženého vynálezu vhodně uvolňovány ve formě aerosolového spreje pomocí tlakovacího zařízení nebo rozprašovače a vhodné hnací látky, například, bez jakéhokoliv omezení, dichlordifluormethan, trichlorfluormethan, dichlortetrafluorethan nebo oxid uhličitý.

V případě natlakovaného aerosolu může být dávka regulována spec. ventilem k zajištění dávkovaného množství. Pouzdra a náplně, např. z želatiny, pro použití v inhalovači nebo insuflatoru mohou být připravena s obsahem práškové směsi sloučeniny a vhodné práškové báze, např. laktóza nebo škrob.

·· ·· ·· • · · · · · • · · · ·

Sloučeniny mohou být také připraveny pro parenterální aplikaci, např. injekcí bolusu nebo kontinuální infúzi. Preparáty pro injekci mohou být v formě jednotné dávky, např. v ampulích, nebo v obalech na více dávek s přidanou konzervační látkou. Přípravky mohou být také ve formě suspenzí, roztoků nebo emulzí v olejovitém nebo vodném nosiči a mohou také obsahovat pomocné látky, např. suspendační prostředky, stabilizační prostředky a/nebo dispergující prostředky.

Farmaceutické přípravky pro parenterální aplikaci zahrnují vodné roztoky ve vodě rozpustných forem, např., ale není to nikterak limitováno, soli aktivní sloučeniny. Dále suspenze aktivní sloučeniny mohou být připraveny v lipofilním nosiči. Vhodné lipofilní nosiče zahrnují oleje mastných kyselin, např. sezamový olej, syntetické estery mastných kyselin, např. ethyl oleát a triglyceridy nebo látky, např. lipozómy. Vodné injekční suspenze mohou obsahovat látky, které zvyšují viskozitu suspenze, např. karboxymethylcelulóza sodná, sorbitol nebo dextran. Případně mohou také suspenze obsahovat vhodné stabilizační prostředky a/nebo agens, které zvyšují rozpustnost sloučenin, čímž umožní přípravu vysoce koncentrovaných roztoků.

Nebo před použitím může být aktivní složka v práškové formě přimíchána s vhodným nosičem, např. sterilní voda neobsahující pyrogen.

Sloučeniny mohou také být připravovány ve formě rektálních přípravků, např. čípky nebo retenční střevní nálevy, použitím, např., standardních čípkových základů, např. kakaový olej nebo jiné glyceridy.

Vedle výše popsaných preparátů mohou být sloučeniny také připravovány ve formě depotních přípravků. Takové preparáty s dlouhou dobou působení mohou být aplikovány implantací (např. subkutánně nebo intramuskulárně) nebo intramuskulární injekcí. Sloučeniny tohoto vynálezu mohou být připravovány pro tento způsob aplikace s vhodnými polymerními nebo hydrofóbními látkami (např. v emulzi s farmakologicky přijatelným olejem), s iontovými měniči nebo jako těžko rozpustné soli.

• ·

Příklad farmaceuticky přijatelného nosiče pro hydrofobní sloučeniny podle vynálezu, ale není to nikterak limitováno, je latentní rozpouštědlo obsahující benzylalkohol, nepolární surfaktant, organický polymer mísitelný s vodou a vodná fáze, např. latentní rozpouštědlo VPD. VPD je roztok 3% w/v benzylalkoholu, 8% w/v nepolárního surfaktantu Polysorbátu 80™ a 65% w/v polyethylenglykolu 300, připraveného do objemu v absolutním ethanolu. Latentní rozpouštědlo VPD (VPD:D5W) se skládá z VPD zředěného 1:1 s 5% dextrózou ve vodném roztoku. Toto latentní rozpouštědlo dobře rozpouští hydrofobní sloučeniny a má nízkou toxicitu při soustavném podávání. Samozřejmě, že poměrné díly tohoto latentního rozpouštědla se mohou podstatně lišit, nicméně by měly být takové, aby se neporušily jeho rozpustné a toxické vlastnosti. Dále charakter komponent tohoto latentního rozpouštědla se může být odlišný: například mohou být místo Polysorbátu 80™ používány jiné málo toxické nepolární surfaktanty, rozměry částí polyethylenglykolu se mohou lišit, polyethylenglykol může být nahrazen jinými biokompatibilními polymery, např. póly vinylpyrrolidonem a jinými cukry nebo polysacharidy mohou nahradit dextrózu.

Nebo mohou být pro hydrofobní farmaceutické sloučeniny používány jiné způsoby podání. Lipozómy a emulze jsou velmi dobře známé příklady pojiv nebo nosičů používaných při podávání hydrofóbních léčiv. Kromě toho mohou být používána určitá organická rozpouštědla, např. dimethylsulfoxid, ačkoliv často za cenu větší toxicity.

Dále mohou být sloučeniny podávány použitím systému s postupným uvolňováním, např. semipermeabilní matrice pevných hydrofóbních polymerů obsahujících terapeutické agens. Byly zavedeny různé materiály s postupným uvolňováním a jsou dobře známy odborné veřejnosti. Pouzdra s postupným uvolňováním mohou, v závislosti na jejich chemickém charakteru, uvolňovat sloučeniny po několik týdnů až stovky dnů. V závislosti na chemickém původu (charakteru) a • · · · · 99 99 9 • ··· 9 9 9 9 9 999 • · · · · · · · • 9 9 9 9 9 9 9 9 9 • · 9 9 9 9 9 9

9999 999 99 9999 99 999 biologické stabilitě mohou být pro stabilizaci proteinů používány doplňkové koncepce.

Farmaceutické přípravky mohou také obsahovat vhodné pevné nebo gelové nosiče nebo excipienty. Příklady takových nosičů nebo excipientů zahrnují, ale není to nikterak omezeno, uhličitan vápenatý, fosforečnan vápenatý, různé cukry, škroby, deriváty celulózy, želatinu a polymery, např. polyethylenglykoly.

Hodně PK modulujících sloučenin podle vynálezu může být ve formě fyziologicky přijatelných solí, kde patentované sloučeniny mohou tvořit negativně nebo pozitivně nabité částice. Příklad solí, ve kterých sloučenina tvoří pozitivně nabitou část, zahrnují, ale není to nikterak limitováno, kvartérní amonné soli (podle zde uvedené definice), např. hydrochlorid, sulfát, uhličitan, laktát, tartarát, maleát, sukcinát, kde dusíkový atom kvartérní amonné skupiny je dusík vybrané sloučeniny tohoto vynálezu, která se nechala reagovat s příslušnou solí. Soli, ve kterých sloučeniny tohoto vynálezu tvoří negativně nabité částice zahrnují, ale není to nikterak limitováno, sodné, draselné, vápenaté a hořečnaté soli tvořené reakcí skupiny karboxylové kyseliny ve sloučenině s příslušnou bází (např. hydroxid sodný (NaOH), hydroxid draselný (KOH), hydroxid vápenatý (Ca(OH)₂), atd.

Dávky

Farmaceutické přípravky vhodné pro použití v předloženém vynálezu zahrnují přípravky, kde aktivní složky jsou obsaženy v takovém množství, které je potřebné k dosažení určeného záměru, tzn. modulaci aktivity PK nebo prevenci nebo ošetření poruch souvisejících s PK.

Přesněji řečeno, terapeuticky účinné množství znamená množství sloučeniny účinné k prevenci, zmírnění nebo zlepšení příznaků onemocnění nebo prolongování přežití subjektu, který je ošetřován.

• ·

Stanovení terapeuticky účinného množství je v rámci způsobilosti odborné veřejnosti, zejména v souvztažnosti se zde podrobně uvedenou popisnou částí.

Pro jakoukoliv zde používanou sloučeninu ve způsobech podle vynálezu může být na počátku terapeuticky účinné množství této sloučeniny navrženo podle provedených stanovení na buněčné kultuře. Poté může být dávka připravena pro použití na zvířecích modelech tak, aby se dosáhlo periodického rozpětí koncentrace, které zahrnuje hodnotu IC50 podle provedeného stanovení na buněčné kultuře (tzn. koncentrace testované sloučeniny, která dosáhne poloviční maximální inhibice aktivity PK). Tento údaj pak může být používán jako přesněji stanovená účinná dávka u lidských subjektů.

Toxicita a terapeutická účinnost zde popisovaných sloučenin může být stanovena standardními farmaceutickými postupy na buněčných kulturách nebo na experimentálních zvířatech, např. stanovením hodnoty IC50 a LD50 (obé je uvedeno v této popisné části) pro danou sloučeninu. Údaje obdržené z těchto stanovení prováděných na buněčné kultuře a zvířecích subjektech mohou být používána při formulování rozsahu dávky pro použití u lidských subjektů. Dávka se může lišit v závislosti na používané formě dávky a na používaném způsobu aplikace dávky. Přesné způsobu přípravy, aplikace a dávky mohou být vybrány jednotlivými lékaři v závislosti na stavu pacienta. Viz např. Fingl, et al., 1975, v „The Pharmacological Basis of Therapeutics“, kapitola 1, str. 1).

Množství dávky a interval může být přizpůsoben jednotlivým subjektům k poskytnutí plazmatické hladiny aktivní látky, která je dostačující k udržení kinázových modulačních účinků na kinázu. Tyto plazmatické hladiny se nazývají minimální účinné koncentrace (MEC). MEC se budou podle sloučeniny lišit, ale mohou být odhadnuty na základě in vitro údajů, např. koncentrace, která je nezbytná k dosažení 50 - 90% inhibice kinázy může být určena pomocí stanovení, která jsou zde popsána. Míry dávky, které jsou nezbytné k dosažení MEC, budou závislé na jednotlivých charakteristikách a způsobech aplikace.

• · » · · · · · · • ·♦·· · * · « • · · · · · · ···· ··· ·· ···· ··

Rozpětí dávky může být také stanoveno pomocí hodnoty MEC. Sloučeniny by měly být aplikovány v takovém režimu, který zajistí z 10 - 90% času plazmatické hladiny nad MEC.

V případech místní aplikace nebo volitelné absorpce nesouvisí koncentrace léčiva s koncentrací v plazmě a ke stanovení správného množství a rozpětí dávky mohou být používány jiné postupy známé z dosavadního stavu techniky.

Množství aplikovaného přípravku bude samozřejmě záviset na subjektu, který je ošetřován, závažnosti poruchy, způsobu aplikace, posouzení předepisujícího lékaře, atd.

Balicí technika

Přípravky mohou, pokud je to požadováno, být v balení nebo v dávkovacím zařízení, např. schválený kit FDA, který může obsahovat jeden nebo více dávkovačích jednotek aktivní složky. Balení může např. obsahovat kovovou nebo umělohmotnou fólii, např. pevný plastický obal s lepenkovou podpěrou. Balení nebo dávkovači zařízení mohou být opatřena návodem k použití. Balení nebo dávkovači zařízení mohou být také opatřena doprovodným upozorněním o formě předepsané orgánem státní správy regulujícím výrobu, použití nebo prodej farmaceutických přípravků, jenž povoluje formy přípravku nebo lidské nebo veterinární aplikace. Takové upozornění, např. může být označení schválené americkým Úřadem pro kontrolu potravin a léků, pro léčivý přípravek (pouze na lékařský předpis) nebo schválený přidaný produkt. Mohou být také připraveny přípravky obsahující sloučeninu podle vynálezu připravenou v kompatibilním farmaceutickém nosiči, umístněné v příslušném zásobníku a označené pro ošetření indikovaného stavu. Vhodné stavy onemocnění, které jsou indikované na štítku, mohou zahrnovat ošetření nádoru, inhibice angiogeneze, ošetření fibrózy, diabetes, apod.

0 • · · · 0 0 0 • 0 ·00

6. Syntézy

Sloučeniny tohoto vynálezu, stejně tak jako prekurzory 2oxindolů a aldehydů, mohou být snadno syntetizovány použitím odborníkům dobře známých technik. Bude oceněno odborníky v oboru, že cesty vedoucí k syntéze sloučenin tohoto vynálezu jsou dosažitelné, a že následující nabízené způsoby jsou pouze jako příklad a nikoliv jako jediná možnost syntézy těchto sloučenin.

A. Základní syntetický postup

Následují základní metody, které mohou být použity k přípravě sloučenin tohoto vynálezu:

Vhodně substituovaný 2-oxindol (1 ekvivalent), vhodně substituovaný aldehyd (1,2 ekv.) a piperidin (0,1 ekv.) jsou smíchány s ethanolem (1-2 ml/mmol 2-oxindolu) a směs se poté zahřívá při 90°C po dobu 3 až 5 hodin. Po zchlazení se reakční směs koncentruje a okyselí se na pH 3. Vytvořený precipitát se zfiltruje, promyje vodou na pH 7 a poté studeným ethanolem, ethylacetátem a/nebo hexanem a suší se ve vakuu, čímž se získá požadovaná sloučenina. Produkt se může případně přečistit chromatografií.

B. 2-oxindoly.

Následující příklady representují syntézy sloučenin tohoto vynálezu z prekurzorů 2-oxindolu. Tyto 2-oxindoly budou vytvářet požadované sloučeniny reakcí s vhodně substituovaným pyrrol aldehydem použitím základního syntetického postupu nebo postupů uvedených v části C, níže. Rozumí se, že následující syntézy nejsou konstruovány jako omezení ať už syntetického přístupu, nebo oxindolů, jejichž syntéza se provádí.

• ·

Φ φ

5-amino-2-oxindol

5-nitro-2-oxindol (6,3 g) se hydrogenuje v methanolu přes 10 % paladium na aktivním uhlí, čímž se získají 3,0 g (60 % výtěžek) požadované sloučeniny jako bílé pevné látky.

5-brom-2-oxindol

2-oxindol (1,3 g) v 20 ml acetonitrilu se ochladí na 10°C a pomalu se přidají 2,0 g N-bromsukcinimidu za stálého míchání. Reakce se míchá po dobu 1 hodiny při -10°C a 2 hodiny při 0°C. Precipitát se shromáždi, promyje se vodou a usuší se. Získá se 1,9 g (90 % výtěžek) požadované sloučeniny.

4-methyl-2-oxindol

Diethyloxalát (30 ml) v 20 ml suchého etheru se přidá za stálého míchání dol9 g ethoxidu draselného rozpuštěného v 50 ml suchého etheru. Směs se ochladí v ledové lázni a pomalu se přidá 20 ml 3-nitro-o-xylen ve 20 ml suchého etheru. Hustá tmavá směs se zahřívá pod refluxem po dobu 30 minut, koncentruje se do vzniku tmavě červené pevné látky a nechá se působit sl0% hydroxidem sodným dokud se téměř veškerá pevná látka nerozpustí. Tmavě červená směs se nechá působit s 30% peroxidem vodíku dokud se červená barva nezmění na žlutou. Nebo se směs nechá působit s 10% hydroxidem sodným a 30% peroxidem vodíku dokud nezmizí tmavě červená barva. Pevná látka se zfiltruje a filtrát se okyselí 6N chlorovodíkovou kyselinou. Výsledný precipitát se shromáždí vakuovou filtrací, promyje vodou a suší pod vakuem. Získá se 9,8 g (45% výtěžek) 2-methyl-6-nitrofenylocotvé kyseliny jako našedlé pevné látky. Pevná látka se hydrogenuje v methanolu přes 10 % paladium na aktivním uhlí. Získá se 9,04 g požadované sloučeniny jako bílé pevné látky.

• 4 • 4

7-brom-5-chlor-2-oxindol

5-chlor-2-oxindol (16,8 g) a 19,6 g N-bromsukcinimid se rozpustí ve 140 ml acetonitrilu a refluxuje po dobu 3 hodiny. Tenkovrstvá chromatografie (silica, ethylacetát) po 2 hodinách refluxu ukáže 5-chlor-2-oxindol nebo N-bromsukcinimid (Rf 0,8), produkt (Rf 0,85) a druhý produkt (Rf 0,9) jejichž poměr se za další hodinu refluxu nezmění. Směs se zchladí na 10°C, precipitát se shromáždí vakuovou filtrací, promyje 25 ml ethanolu a vysává se v nálevce po dobu 20 minut. Získá se 14,1 g vlhkého produktu (56 % výtěžek). Pevná látka se rozpustí ve 200 ml denaturovaného ethanolu, rozmělní se mícháním a refluxuje po dobu 10 minut. Směs se ochladí v ledové lázni na 10°C. Pevný produkt se shromáždí vakuovou filtrací, promyje 25 ml ethanolu a suší se pod vakuem při 40°C, čímž se získá 12,7 g (51% výtěžek) 7-brom-5chlor-2-oxindol.

5-fluor-2-oxindol

5-fluorisatin (8,2 g) se rozpustí v 50 ml hydrátu hydrazinů a refluxuje po dobu 1 hodiny. Poté se reakční směs přelije do ledové vody. Precipitát se zfiltruje, promyje vodou a usuší ve vakuové peci, čímž se získá požadovaná sloučenina.

5-nitro-2-oxindol

2-oxindol (6,5 g) se rozpustí v 25 ml koncentrované kyseliny sírové a směs se udržuje při teplotě -10 až -15°C. V této době se po kapkách přidá 2,1 ml dýmavé kyseliny dusičné. Po přidání kyseliny dusičné se reakční směs míchá při 0°C po dobu 30 minut a přelije do vody. Precipitát se shromáždí vakuovou filtrací, promyje vodou a krystalizuje z 50 % kyseliny octové. Krystalický produkt se zfiltruje, promyje vodou a suší pod vakuem, čímž se získá 6,3 g (70%) 5-nitro2-oxindolu.

5-jod-2-oxindol

2-oxindol (82,9 g) se rozpustí v 630 ml kyseliny octové mechanickým mícháním a směs se zchladí na 10°C v ledové vodní lázni. Pevný N-jodsukcinimid (175 g) se přidá po částech během 10 minut. Poté se směs míchá po dobu 1 hodiny při 10°C. Stále přítomná rozpuštěná pevná látka během této doby zhoustne. Pevná látka se shromáždí vakuovou filtrací, promyje 100 ml 50 % kyseliny octové ve vodě, 200 ml vody a vysává v nálevce po dobu 20 minut. Produkt se suší pod vakuem, čímž se získá 93,5 g (36 %) 5-jod-2-oxindolu obsahujícího podle protonové NMR přibližně 5% 2-oxindolu.

5-methyl-2-oxindol

5-methylisatin (15,0 g) a 60 ml hydrátu hydrazinu se zahřívají na teplotu 140 až 160°C po dobu 4 hodin. Tenkovrstvá chromatografie(ethylacetát: hexan 1: 2, silikagel) neukáže žádný zbývající výchozí materiál. Reakční směs se ochladí na pokojovou teplotu, přelije do 300 ml ledové vody a okyselí se na pH 2 pomocí 6N kyseliny chlorovodíkové. Po stání při pokojové teplotě po dobu 2 dnů se precipitát shromáždí vakuovou filtrací, promyje vodou a suší pod vakuem, čímž se získá 6,5 g (47 % výtěžek) 5-methyl-2-oxindolu.

5-brom-4-methyloxindol a 5,7-dibrom-4-methyloxindol

4-methyl-2-oxindol (5 g) ve 40 ml acetonitrilu se nechá působit s 7,26 g N-bromsukcinimidu a míchá se při pokojové teplotě po dobu 4 hodiny. Tenkovrstvá chromatografie (ethylacetát: hexan 1: 2, silikagel) ukáže směs 5-brom (Rf 0,3) a 5,7-dibrom (Rf 0,5) produktů. Přidá se dalších 7,26 g N-bromsukcinimidu a směs se míchá po dobu dalších 4 hodiny. Pevná látka se shromáždí vakuovou filtrací, promyje 20 ml acetonitrilu a suší, čímž se získá směs mono a dibrom sloučenin v poměru 1:1. Filtrát se koncentruje a chromatografuje na silikagelu (ethylacetát: hexan (1: 2)) . Získá se 1,67 g 5-brom-4-methyl-264 ♦ · oxindolů jako béžové pevné látky. Zbývající směs pevných látek o poměru 1:1 se dvakrát rekrystaluje z ledové kyseliny octové, čímž se získá 3,2 g 5,7-dibrom-4-methyl-2-oxindolu jako světle oranžová pevná látka. Filtráty tohoto materiálu se chromatografují podle viz. výše, čímž se získá 0,6 g 5-brom-4-methyl-2- oxindolů a 0,5 g 5,7dibrom-4-methyl-2-oxindolu.

6-fluor-2-oxindol

Hydrid sodný (2,6 g) a 14,5 g dimethylmalonátu se míchá a zahřívá při 100°C v 160 ml dimethylsulfoxidu po dobu 1 hodiny. Směs se ochladí na pokojovou teplotu, přidá se 7,95 g 2,5difluornitrobenzenu a směs se míchá po dobu 30 minut. Poté se směs zahřívá při 100°C po dobu 1 hodiny, zchladí se na pokojovou teplotu a přelije do 400 ml roztoku saturovaného chloridu sodného. Směs se extrahuje 200 ml ethylacetátu a organická vrstva se promyje solankou, suší nad bezvodým síranem sodným a koncentruje pod vakuem. Zbytek se krystalizuje z methanolu, čímž se získá 24,4 g (80 % výtěžek) dimethyl 4-fluor-2-nitrofenylmalonátu jako bílé pevné látky, Rf 0,2 na tenkovrstvé chromatografií (ethylacetát: hexan 1: 6, silikagel). Filtrát se koncentruje a chromatografuje na sloupci silikagelu (ethylacetát: hexan 1: 8), čímž se získá dalších 5,03 g dimethyl 4fluor-2-nitro-fenylmalonátu. Což dohromady činí 29,5 g (96 % výtěžek).

Dimethyl 4-fluor-2-nitrofenylmalonát (5,0 g) se refluxuje ve 20 ml 6N kyseliny chlorovodíkové po dobu 24 hodin. Reakce se ochladí a bílá pevná látka se shromáždí vakuovou filtrací, promyje vodou a usuší. Získá se 3,3 g (87 % výtěžek) 4-fluor-2-nitrofenyloctvé kyseliny, Rf 0,6 na tenkovrstvé chromatografií (ethylacetát: hexan 1: 2, silikagel).

4-fluor-2-nitrofenyloctová kyselina (3,3 g) zředěná v 15 ml kyseliny octové se hydrogenuje přes 0,45 g 10 % paladia na aktivním uhlí při 60 psi H₂ po dobu 2 hodiny. Katalyzátor se odstraní filtrací a • · • · • φ φφ φφφ* • φφφφ φφφφ φ • 9 9, 9 9 9 9 9 ··· ΦΦΦ ΦΦ ΦΦΦΦ ΦΦ ΦΦ promyje se 15 ml methanolu. Spojené filtráty se spojí a zředí vodou. Precipitát se shromáždí vakuovou filtrací, promyje vodou a usuší, čímž se získá 1,6 g (70 % výtěžek) 6-fluor-2-oxindolu, Rf 0,24 na tenkovrstvé chromatografií. Filtrát se koncentruje do vzniku nachové pevné látky s podobným NNM spektrem jako první množství. Chromatografií nachové pevné látky (ethylacetát: hexan 1: 2, silikagel) se získá druhé množství 6-fluor-2-oxindolu jako bílé pevné látky.

5-ami nosu lfonyl-2-oxindol

Do 100 ml baňky naplněné 27 ml chlorsírové kyseliny se pomalu přidá 13,3 g 2-oxindolu. Během přidávání se reakční teplota udržuje pod 30°C . Po přídavku se reakční směs míchá při pokojové teplotě po dobu 1,5 hodiny, zahřívá se na 68°C po dobu 1 hodiny, zchladí se a přilije do vody. Precipitát se promyje vodou a usuší ve vakuové peci, čímž se získá 11,0 g 5-chlorsulfonyl-2-oxindolu (50% výtěžek), který se použije bez dalšího čištění.

5-chlorsulfonyl-2-oxindol (2,1 g) se přidá do 10 ml hydroxidu amonného v 10 ml ethanolu a míchá se při pokojové teplotě přes noc. Směs se koncentruje a pevná látka se shromáždí vakuovou filtrací. Získá se 0,4 g (20% výtěžek) požadované sloučeniny jako šedé pevné látky.

5-methylaminosulfonyl-2-oxindol

Suspenze 3,38 g 5-chlorsulfonyl-2-oxindolu v 10 ml 2M methylaminu v tetrahydrofuranu se míchá při pokojové teplotě po dobu 4 hodiny, během které se utvoří bílá pevná látka. Precipitát se shromáždí vakuovou filtrací, promyje dvakrát 5 ml vody a suší pod vakuem při 40°C přes noc. Získá se 3,0 g (88 % výtěžek) 5methy lamin osul fony 1-2-oxindolu.

5-(4-trifluormethylfenylaminosulfonyl)-2-oxindol

Suspenze 2,1 g 5-chlorsulfonyl-2-oxindolu, 1,6 g 4trifluormethylanilinu a 1,4 g pyridinu ve 20 ml dichlormethanu se míchá při pokojové teplotě po dobu 4 hodiny. Precipitát, který se utvořil se shromáždí vakuovou filtrací, promyje dvakrát 5 ml vody a suší pod vakuem při 40°C přes noc. Získá se 2,4 g surového produktu, který podle tenkovrstvé chromatografie obsahuje nějaké nečistoty. Surový produkt se chromatografuje na silikagelu mobilní fází ethylacetát: hexan (1: 2), čímž se získá 1,2 g (37 % výtěžek) 5-(4tr i fluor m e thy 1 feny 1-amin o sul fonyl)-2-ox indolu.

5- (morfolinosulfonyl)-2-oxindol

Suspenze 2,3 g 5-chlorsulfonyl-2-oxindolu a 2,2 g morfolinu v 50 ml dichlormethanu se míchají při pokojové teplotě po dobu 3 hodiny. Bílý precipitát se shromáždí vakuovou filtrací, promyje se ethylacetátem a hexanem a suší se pod vakuem při 40°C přes noc. Získá se 2,1 g (74 % výtěžek) 5-(morfolinosulfonyl)-2-oxindolu.

6- trifluormethyl-2-oxindol

Dimethylsulfoxid (330 ml) se přidá do 7,9 g hydridu sodného, poté se po kapkách přidá 43,6 g diethyloxalátu. Směs se zahřívá při 100°C po dobu 1 hodiny a zchladí se na pokojovou teplotu. Přidá se 2-nitro-4-trifluormethyltoluen (31,3 g). Reakce se míchá po dobu 30 minut při pokojové teplotě a poté se zahřívá při 100°C po dobu 1 hodiny. Reakce se ochladí a přelije do směsi saturovaného vodného chloridu amonného, ethylacetátu a hexanu. Organická vrstva se promyje saturovaným chloridem amonným, vodou a solankou. Suší se a koncentruje, čímž se získá dimethyl 2-(2-nitro-4trifluormethylfenyljmalonát.

Diester se rozpustí ve směsi 6,4 g chloridu litného a 2,7 ml vody ve 100 ml dimethylsulfoxidu a zahřívá se při 100°C po dobu 3 • » • 9

0 • · 00 »000 • · 0 0 0 • 0 0 0 0 0 0 » 0 0 0 • 000 000 00 000« hodiny. Reakce se ochladí a přelije do směsy ethylacetátu a solanky. Organická fáze se promyje solankou, suší se síranem sodným, koncentruje a chromatografuje na silikagelu (10 % ethylacetát v hexanu). Frakce obsahující produkt se odpaří, čímž se získá 25,7 g methyl 2-n i tr o-4-trifluormethyl feny lacetátu.

Methyl 2-nitro-4-trifluormethylfenylacetát (26 mg) se hydrogenuje přes 10 % paladium na aktivním uhlí a poté se zahřívá při 100°C po dobu 3 hodiny. Katalyzátor se odstraní filtrací a rozpouštědlo se odpaří, čímž se získá požadovaná sloučenina.

5-(2-chlorethyl) oxindol

5-chloracetyl-2-oxindol (4,18 g) ve 30 ml trifluoroctvé kyseliny v ledové lázni se nechá působit s 4,65 g triethylsilanu a míchá se při pokojové teplotě po dobu 3 hodiny. Směs se nalije do 150 ml vody a precipitát se shromáždí vakuovou filtrací, promyje 50 ml vody a usuší, čímž se získá 2,53 g (65% výtěžek) 5-(2-chlorethyl)-2-oxindolu jako ěervenohnědé pevné látky.

5-methoxykar bony 1-2-oxindol

5-jod-2-oxindol (17 g) se refluxuje se 2 g diacetátu paladia, 18,2 g triethylaminu, 150 ml methanol, 15 ml dimethylsulfoxidu a 2,6 g DPPP v atmosféře saturované oxidem uhelnatým. Po 24 hodinách se z reakční směsi odstraní katalyzátor filtrací a filtrát se koncentruje. Koncentrát se chromatografuje na silikagelu (30 % ethylacetát v hexanu). Frakce obsahující produkt se koncentrují a nechají se stát. Precipitát produktu se shromáždí vakuovou filtrací, čímž se získá 0,8 g (7%) požadované sloučeniny jako šedá pevná látka.

4-karboxy-2 -oxindol

Roztok trimethylsilyldiazomethanu v hexanu (2M) se přidává po kapkách do roztoku 2,01 g 2-chlor-3-karboxy-nitrobenzenu ve 20 ml • 9 * t 9 99 • 9 • · • · • 999 999

9 9 9 • · 9

9 9 9 ·· 9 •9 9999 « 9

9 • 9

9

-199 methanolu při pokojové teplotě dokud se nepřestane uvolňovat plyn. Přebytek trimethylsilyldiazo-methanu se odstraní octovou kyselinou. Reakční směs se suší na rotační pumpě a zbytek se dále suší ve vakuové peci přes noc. Získá se produkt (2 chlor-3-methoxykarbonylnitrobenzen) dostatečně čistý pro další reakci.

Dimethyl malonát (6,0 ml) se přidá do ledově studené suspenze 2,1 g hydridu sodného v 15 ml DMSO. Reakční směs se poté míchá při 100°C po dobu 1 hodiny a poté se zchladí na pokojovou teplotu. Do této směsi se v jedné dávce přidá 2-chlor-3methoxykarbonylnitrobenzen (2,15 g) a směs se zahřívá při 100°C po dobu 1,5 hodiny. Reakční směs se zchladí na pokojovou teplotu a přelije se do ledové vody.Okyselí se na pH 5 a extrahuje ethylacetátem. Organická vrstva se promyje solankou, suší se nad bezvodým síranem sodným a koncentruje, čímž se získají 3,0 g dimethyl 2-methoxykarbony 1-6-nitrofenylmalonátu.

Dimethyl 2-methoxykarbonyl-6-nitrofenylmalonát (3,0 g) se refluxuje v 50 ml 6 N chlorovodíkové kyseliny přes noc. Směs se koncentruje do sucha a refluxuje po dobu 2 hodiny s 1,1 g chloridu cínatého ve 20 ml ethanolu. Směs se zfiltruje přes Celit, koncentruje a chromatografuje na silikagelu (ethylacetát: hexan: octová kyselina), čímž se získá 0,65 g (37% výtěžek) 4-karboxy-2-oxindolu jako bílé pevné látky.

5-karboxy-2-oxindol

2-oxindol (6,7 g) se přidá do míchané suspenze 23 g chloridu hlinitého ve 30 ml dichlorethanu v ledové lázni. Pomalu se přidá chloracetyl chlorid (11,3 g) a začne se vyvíjet plynný chlorovodík. Po deseti minutách míchání se reakce zahřívá na teplotu 40 až 50°C po dobu 1,5 hodiny. Tenkovrstvá chromatografie (ethylacetát, silikagel) neprokáže žádný zbývající výchozí materiál. Směs se ochladí na pokojovou teplotu a přelije do ledové vody. Precipitát se shromáždí • · zrn · · · · · · · ···· ··· ·· ···· ·· vakuovou filtrací, promyje vodou a usuší po vakuem, čímž se získálO,3 g (98%) 5-chloracetyl-2-oxindolu jako šedé pevné látky.

Suspenze 9,3 g 5-chloracetyl-2-oxindolu se míchá v 90 ml pyridinu při 80 až 90°C po dobu 3 hodiny a poté se zchladí na pokojovou teplotu. Precipitát se shromáždí vakuovou filtrací a promyje 20 ml ethanolu. Pevná látka se rozpustí v 90 ml 2,5N hydroxidu sodného a míchá se při 70 až 80°C po dobu 3 hodiny. Směs se ochladí na pokojovou teplotu a okyselí se 0,5 N kyselinou chlorovodíkovou na pH 2. Precipitát se shromáždí vakuovou filtrací a důkladně promyje vodou, čímž se získá surový 5-karboxy-2-oxindol jako tmavě hnědá pevná látka. Filtrát se ponechá stát přes noc, čímž se získají 2 g 5-karboxy-2-oxindolu jako žluté pevné látky. Surový tmavě hnědý produkt se rozpustí v horkém methanolu, nerozpustný materiál se odstraní filtrací a filtrát se koncentruje,čímž se získá 5,6 g 5karboxy-2-oxindolu jako hnědé pevné látky. Spojené výtěžky činí 97%.

5-karboxyethyl-2-oxindol

5-kyanoethyl-2-oxindol (4,02 g) v 10 ml vody obsahující 25 ml koncentrované kyseliny chlorovodíkové se refluxuje po dobu 4 hodiny. Směs se ochladí, přidá se voda a výsledná pevná látka se shromáždí vakuovou filtrací. Promyje se vodou a usuší, čímž se získá 1,9 g (44% výtěžek) požadované sloučeniny jako pevné žluté látky.

5-jod-4-methyl-2-oxindol

Do 2 g 4-methyl-2-oxindolu ve 40 ml ledové kyseliny octové v ledové lázni se přidá 3,67 g N-jodsukcinimidu. Směs se míchá po dobu 1 hodiny, zředí se 100 ml 50 % octové kyseliny ve vodě a zfiltruje se. Výsledná bílá pevná látka se suší pod vysokým vakuem, čímž se získá 3,27 g (88% výtěžek) požadované sloučeniny jako šedé pevné látky.

• ·

5-chlor-4-methyl-2-oxindol

Suspenze 3,0 g 4-methyl-2-oxindolu se míchá v 50 ml acetonitrilu při pokojové teplotě a mezí tím se po dávkách přidá 3,3 g N-chlorsukcinimidu. Poté se přidá trifluoroctová kyselina (1 ml). Suspenze se míchá při pokojové teplotě po dobu 3 dny, během nichž je pevná látka stále přítomna. Bílá pevná látka se shromáždí vakuovou filtrací, promyje malým množstvím studeného acetonu a suší přes noc ve vakuové peci při teplotě 40°C. Získá se 2,5 g (68 %) 5-chlor-4methy 1-2-oxindolu.

5-butyl-2-oxindol

Triethylsilan (2,3 g) se přidá do 2 g 4-butanoyl-2-oxindolu ve 20 ml trifluoroctové kyseliny při pokojové teplotě a roztok se míchá po dobu 3 hodiny. Směs se nalije do ledové vody, čímž vznikne červený olej, který postupně ztuhne. Pevná látka se shromáždí vakuovou filtrací, promyje se vodou, hexanem a usuší se. Získá se 1,7 g (91% výtěžek) požadované sloučeniny jako šedé pevné látky.

5-ethyl-2-oxindol

Do 5-acetyl-2-oxindolu (2 g) v 15 ml trifluoroctové kyseliny v ledové lázni se pomalu přidá 1,8 g triethylsilanu, reakce se míchá při pokojové teplotě po dobu 5 hodin. Přidá se jeden ml triethylsilanu a míchání pokračuje přes noc. Reakční směs se nalije do ledové vody a výsledný precipitát se shromáždí vakuovou filtrací. Řádně se promyje vodou a suší se pod vakuem, čímž se získá 1,3 g (71% výtěžek) požadované sloučeniny jako žluté pevné látky.

5-(morfolin-4-ethyl)-2-oxindol

5-Chlorethyl-2-oxindol (2,3 g), 1,2 ml morfolinu a 1,2 ml diizopropylethylaminu se zahřívá přes noc při 100°C v 10 ml dimethylsulfoxidu. Směs se zchladí, přelije do vody a extrahuje ethylacetátem. Organická vrstva se promyje solankou, usuší a odpaří. Zbytek se chromatografuje na silikagelu (5 % methanol v chloroformu), čímž se získá 0,9 g (31%) požadované sloučeniny jako bílé pevné látky.

-(4-methoxy karbony lbenzamido)-2-oxindol

Směs 82,0 mg 5-amino-2-oxindol a 131,0 mg 4methoxykarbonylbenzoylchloridu v pyridinu se míchá při pokojové teplotě po dobu 3 hodiny a přelije do ledové vody. Precipitát se zfiltruje, promyje vodou a usuší ve vakuové peci. Získá se 138,0 mg 5(4-methoxykarbonylbenzamido)-2-oxindolu (81 % výtěžek).

5-(4-karboxybenzamido)-2-oxindol

5-(4-methoxykarbonylbenzamido)-2-oxindol (0,9 g) a 0,4 g hydroxidu sodného v 25 ml methanolu se refluxují po dobu 3 hodiny. Směs se koncentruje, přidá se voda a směs se okyselí 6N chlorovodíkovou kyselinou. Precipitát se shromáždí vakuovou filtrací, čímž se získá 0,75 g (87%) požadované sloučeniny jako bílé pevné látky.

5-methoxy-2-oxindol

Chloral hydrát (9,6 g) se rozpustí ve 200 ml vody obsahující 83 g síranu sodného. Roztok se zahřeje na teplotu 60°C a přidá se roztok 11,4 g hydroxylamin hydrochloridu v 50 ml vody a směs se udržuje při teplotě 60°C. V oddělené baňce se na teplotu 80°C zahřeje 6,4 g

4-anisidinu a 4,3 ml koncentrované kyseliny chlorovodíkové v 80 ml vody. První roztok se přidá do druhého a směs se refluxuje po dobu 2 minuty. Poté se pomalu zchladí na pokojovou teplotu a následně se vloží do ledové lázně. Precipitát se shromáždí vakuovou filtrací, • · *70 · · · · · · · / Z, ···· ··· ·· ···· ·· promyje vodou a usuší pod vakuem, čímž se získá 8,6 g ( 86 % výtěžek)N-(hydroxyiminoacetyl)anisidinu.

Koncentrovaná kyselina sírová (45 ml) obsahující 5 ml vody se zahřeje na teplotu 60°C a přidá se 8,6 g N(hydroxyiminoacetyl)anisidinu v jedné dávce. Míchaná směs se zahřívá při teplotě 93°C po dobu 10 minut a poté se zchladí na pokojovou teplotu. Směs se nalije do 500 g ledu a extrahuje 3 krát ethylacetátem. Spojené extrakty se suší nad bezvodým síranem sodným a koncentrují se, čímž se získá 5,1 g (65 % výtěžek) 5-methoxyisatinu jako tmavě červené pevné látky. 5-Methoxyisatin (5,0 g) a 30 ml hydrátu hydrazinu se zahřívá při refluxu po dobu 15 minut. Reakční směs se ochladí na pokojovou teplotu a přidá se 50 ml vody. Směs se 3 krát extrahuje pokaždé 25 ml ethylacetátu, organické vrstvy se spojí, suší se nad bezvodým síranem sodným a koncentrují se do vzniku žluté pevné látky. Pevná látka se míchá v ethylacetátu a 1,1 g nerozpustného materiálu se odstraní vakuovou filtrací a uschová. Tento materiál je 2hydrazinokarbonylmethyl-4-anisidin. Filtrát se koncentruje a chromatografuje na silikágelu mobilní fází ethylacetát : hexan (1: 1), čímž se získá 0,7 g 5-methoxy-2-oxindolu jako žluté pevné látky. 1,1 g 2-hydrazino-karbonylmethyl-4-anisidinu se refluxuje po dobu 1 hodiny ve 20 ml IN hydroxidu sodného. Směs se ochladí, okyselí se na pH 2 koncentrovanou kyselinou chlorovodíkovou a extrahuje se 3 krát pokaždé 25 ml ethylacetát. Organické extrakty se spojí, promyjí solankou, suší se nad bezvodým síranem sodným a koncentrují, čímž se získá 0,8 g 5-methoxy-2-oxindolu jako žluté pevné látky. Spojený výtěžek činí 1,5 g 33%.

7-azaoxindol

3,3-dibrom-7-azaoxindol (2,9 g) se rozpustí ve směsi 20 ml octové kyseliny a 30 ml acetonitrilu. Do roztoku se přidá 6,5 g zinkového prachu. Směs se míchá po dobu 2 hodiny při pokojové teplotě. Pevná látka se odfiltruje ze směsi a rozpouštědlo se odpaří.

··· · ·

Zbytek se rozmělní s ethylacetátem. Ethylacetátový roztok obsahující nerozpustnou pevnou látku se nechá projít krátkou kolonou silikagelu. Spojené ethylacetátové roztoky se odpaří a zbytek se usuší pod vakuem, čímž se získá 1,8 g (výtěžek 91%) soli 7-azaoxindol octové kyseliny.

5- dimethylaminosulfonyl-2-oxindol

Suspenze 2,3 g 5-chlorsulfonyl-2-oxindolu v 10 ml 2M dimethylaminu v methanolu se míchá při pokojové teplotě po dobu 4 hodiny. Během této doby se utvoří bílá pevná látka. Precipitát se shromáždí vakuovou filtrací, promyje 5 ml IN hydroxidu sodného a 5 ml IN chlorovodíkové kyseliny. Suší se přes noc pod vakuem při 40°C, čímž se získá

1,9 g (79 % výtěžek) 5-dimethylamino-sulfonyl-2-oxindolu.

6- fenyl-2-oxindol

Dimethyl malonát (10 ml) ve 25 ml dimethylsulfoxidu se přidá po kápkách do 3,5 g hydridu sodného suspendovaného v 25 ml dimethylsulfoxidu a směs se zahřívá při 100°C po dobu 10 minut. Směs se ochladí na pokojovou teplotu a přidá se 4,7 g 4-fluor-3nitrobifenylu ve 25 ml dimethylsulfoxidu. Směs se zahřívá při 100°C po dobu 2 hodiny, zchladí se a reakce se potlačí roztokem 300 ml saturovaného chloridu amonného. Směs se třikrát extrahuje ethylacetátem a spojené organické vrstvy se promyjí vodou a solankou. Odpaří se, čímž se získá surový dimethyl-3-nitrobifenyl-4malonát jako žlutý olej.

Surový dimethyl-3-nitrobifenyl-4-malonát se refluxuje ve 30 ml 6 N chlorovodíkové kyseliny po dobu 24 hodiny. Precipitát se shromáždí vakuovou filtrací, promyje vodou a usuší, čímž se získá 4,5 g 3-nitrobifenyl-4-octové kyseliny jako krémově zbarvené pevné látky.

Železný prášek (2,6 g) se přidá všechen najednou do 4,5 g 3nitrobifenyl-4-octové kyseliny ve 40 ml octové kyseliny. Směs se refluxuje po dobu 2 hodiny, koncentruje do sucha a vloží do ethylacetátu. Pevné látky se odstraní filtrací a filtrát se dvakrát promyje IN chlorovodíkovou kyselinou a solankou a suší se nad bezvodým síranem sodným. Filtrát se koncentruje, čímž se získá 3,4 g (93 % výtěžek) 6-fenyl-2-oxindolu jako světlehnědé pevné látky.

6-(2-methoxyfenyl)-2-oxindol

Tetrakis(trifenylfosfin)paladium (1 g) se přidá do směsi 5 g

2-methoxyfenylborité kyseliny, 6,6 g 5-brom-2-fluornitrobenzenu a 30 ml 2 M roztoku uhličitanu sodného v 50 ml toluenu a 50 ml ethanolu. Směs se refluxuje po dobu 2 hodiny, koncentruje a zbytek se dvakrát extrahuje ethylacetátem. Ethylacetátová vrstva se promyje vodou a solankou. Poté se suší a koncentruje , čímž se získá tmavě zelený olej, který stáním tuhne, surový 4-fluor-2'-methoxy-3-nitrobifenyl.

Dimethyl malonát (14 ml) se přidá po kapkách do 2,9 g hydridu sodného suspendovaného v 50 ml dimethylsulfoxidu. Směs se zahřívá při 100°C po dobu 15 minut a zchladí se na pokojovou teplotu. Přidá se surový 4-fluor-2'-methoxy-3-nitrobifenyl v 60 ml dimethylsulfoxidu a směs se zahřívá při 100°C po dobu 2 hodiny. Reakční směs se ochladí, ustálí se 300 ml roztoku saturovaného chloridu sodného a dvakrát se extrahuje ethylacetátem. Spojené extrakty se promyjí saturovaným chloridem amonným, vodou a solankou. Suší se nad bezvodým síranem sodným a koncentrují, čímž vznikne surový dimethyl 2'-methoxy-3-nitrobifenyl-4-malonát jako žlutý olej.

Surový dimethyl 2'-methoxy-3-nitrobifenyl-4-malonát se zahřívá při 100°C v 50 ml 6 N chlorovodíkové kyseliny po dobu 24 hodiny a zchladí se. Precipitát se shromáždí vakuovou filtrací, promyje vodou a hexanem a usuší. Získá se 9,8 g 2'- methoxy-2-nitrobifenyl-4-octové kyseliny jako světle zbarvené pevné látky.

···

Železný prášek (5 g) se přidá v jedné dávce do 9,8 g 2'-methoxy3-nitrobifenyl-4-octové kyseliny v 50 ml ledové kyseliny octové a zahřívá se při 100°C po dobu 3 hodiny. Reakční směs se koncentruje do sucha, sonikuje v ethylacetátu a zfiltruje se nerozpustitelný podíl. Filtrát se dvakrát promyje IN chlorovodíkovou kyselinou, vodou a poté solankou. Suší se nad bezvodým síranem sodným a koncentruje. Zbytek se chromatografuje na silikagelu ethylacetát : hexanem (1: 2), čímž se získá 5,4 g 6-(2-methoxyfenyl)-2-oxindolu jako růžově zbarvená pevná látka.

6-(3-methoxyfenyl)-2-oxindol

Tetrakis(trifenylfosfin)paladium (0,8 g) se přidá do směsi 5 g 3methoxyfenylborité kyseliny, 5 g 5-brom-2-fluor-nitrobenzenu a 11 ml 2 M roztoku uhličitanu sodného ve 100 ml toluenu. Směs se refluxuje po dobu 2 hodiny, zředí se vodou a extrahuje ethylacetátem. Ethylacetát se promyje saturovaným hydrogenuhličitanem sodným a solankou a poté se suší a koncentruje, čímž se získá olejovitá pevná látka. Pevná látka se chromatografuje na silikagelu (ethylacetát: hexan (1: 6)), čímž se získá 4,3 g (77% výtěžek) 4-fluor-3'-methoxy-3nitrobifenylu.

Dimethyl malonát (9,7 ml) se přidá po kapkách do 2,0 g hydridu sodného suspendovaného v 50 ml dimethylsulfoxidu. Směs se zahřívá při 100°C po dobu 35 minut a zchladí se na pokojovou teplotu. Přidá se 4-fluor-2'-methoxy-3-nitrobifenyl (4,2 g) v 50 ml dimethylsulfoxidu a směs se zahřívá při teplotě 100°C po dobu 1 hodiny. Reakční směs se ochladí a ustálí 300 ml roztokem saturovaného chloridu amonného a dvakrát se extrahuje ethylacetátem. Spojené extrakty se promyjí solankou, suší se nad bezvodým síranem sodným a koncentrují, čímž se získá surový dimethyl 3'-methoxy-3nitrobifenyl-4-malonát jako světle žlutá pevná látka.

Surový dimethyl 3'-methoxy-3-nitrobifenyl-4-malonát se zahřívá při 110°C ve 45 ml 6N chlorovodíkové kyseliny po dobu 4 dny a poté φφ φφ φφ φφφ φφφ φ φφφ φ φφφφ φ φ φ φ φφ φφφφ φφ · φφφφ se zchladí. Precipitát se shromáždí vakuovou filtrací, promyje vodou a hexanem a usuší. Získá se 5,3 g 3'- methoxy-2-nitrobifenyl-4-octové kyseliny jako světle zbarvené pevné látky.

3'-methoxy-3-nitrobifenyl-4-octová kyseliny (5,2 g) se rozpustí v methanolu a hydrogenuje se přes 0,8 g 10% paladia na aktivním uhlí po dobu 3 hodiny při pokojové teplotě. Katalyzátor se odstraní filtrací, promyje se methanolem a spojené filtráty se koncentrují, čímž se získá hnědá pevná látka. Pevná látka se chromatografuje na silikagelu ethylacetát: hexan: octovou kyselinou (33: 66: 1). Získají se 3,0 g 6-(3-methoxyfeny)-2-oxindolu jako růžové pevné látky.

6-(4-meth oxy fenyl)-2-oxindol

Tetrakis(trifenylfosfin)paladium (I g) se přidá do směsi 5 g 4methoxyfenylborité kyseliny, 6,6 g 5-brom-2-fluornitrobenzenu a 30 ml 2 M roztoku uhličitanu sodného v ml toluenu a 50 ml ethanolu. Směs se refluxuje po dobu 2 hodiny, koncentruje a zbytek se extrahuje dvakrát ethylacetátem. Ethylacetátová vrstva se promyje vodou a solankou, usuší se a koncentruje. Získá se hnědá olejovitá látka. Látka se chromatografuje na silikagelu (5 % ethylacetát v hexanu), získá se surový 4- fluor-4'methoxy-3-nitrobifenyl jako světložlutá pevná látka.

Dimethylmalonát (10 ml) se přidá po kapkách do 2,0 g hydridu sodného suspendovaného v 60 ml dimethylsulfoxidu. Směs se zahřívá při 100°C po dobu 10 minut a zchladí se na pokojovou teplotu. Přidá se surový 4-fluor-2'-methoxy-3-nitrobifenyl (5,2 g) v 50 ml dimethylsulfoxidu a směs se zahřívá při 100°C po dobu 2 hodiny. Reakční směs se ochladí a ustálí přídavkem 300 ml roztoku saturovaného chloridu sodného a extrahuje se třikrát ethylacetátem. Spojené extrakty se promyjí saturovaným chloridem amonným, vodou a solankou. Suší se nad bezvodým síranem sodným a koncentrují se. Získá se surový dimethyl-4'-methoxy-3-nitrobifenyl-4-malonát jako žlutý olej.

49« 9

9 9

9« 9999

Surový dimethyl- 4'-methoxy-3-nitro-bifenyl-4-malonát se zahřívá při 100°C v 60 ml 6N kyseliny chlorovodíkové po dobu 15 hodin a zchladí se. Precipitát se shromáždí vakuovou filtrací, promyje vodou a hexanem a usuší. Získá se 7,2 g surového 4'-methoxy-3nitrobifenyl-4-octové kyseliny jako světle zbarvené pevné látky.

Železný prášek (3,6 g) se přidá v jedné dávce do 7,2 g 4'methoxy-3-nitrobifenyl-4-octové kyseliny v 50 ml ledové kyseliny octové a zahřívá se přes noc při 100°C. Reakční směs se koncentruje do sucha, sonikuje v ethylacetátu a nerozpustné látky se odstraní filtrací. Filtrát se promyje dvakrát IN kyselinou chlorovodíkovou a solankou, suší se nad bezvodým síranem sodným a koncentruje. Získá se 2,7 g 6-(4-methoxyfenyl)-2-oxindolu jako růžově zbarvené pevné látky.

6-(3-ethoxyfenyl)-2-oxindol

Tetrakis(trifenylfosfin)paladium (0,8 g) se přidá do směsi 4,2 g 3-ethoxyfenylborité kyseliny, 5,0 g 5-brom-2-fluornitrobenzenu a 22 ml 2 M roztoku uhličitanu sodného v 50 ml toluenu a 50 ml ethanolu. Směs se refluxuje po dobu 2 hodiny, koncentruje, přidá se voda a směs se extrahuje dvakrát ethylacetátem. Ethylacetátová vrstva se promyje vodou a solankou. Poté se usuší a koncentruje. Zbytek se chromatografuje na silikagelu (5 % ethylacetát v hexanu). Získá se 5,3 g (90 % výtěžek) surového 4-fluor-3'-ethoxy-3-nitrobifenylu jako žlutého oleje.

Dimethylmalonát (11,4 ml) se přidá po kapkách do 4,0 g hydridu sodného suspendovaného ve 20 ml dimethylsulfoxidu. Směs se zahřívá při 100°C po dobu 10 minut a poté se zchladí na pokojovou teplotu. Přidá se surový 4-fluor-3'-ethoxy-3-nitrobifenyl (5,3 g) ve 25 ml dimethylsulfoxidu a směs se zahřívá při 100°C o dobu 2 hodiny. Reakční směs se ochladí a ustálí přídavkem 300 ml roztoku saturovaného chloridu amonného a extrahuje se třikrát ethylacetátem.Spojené extrakty se promyjí vodou a solankou a poté se .5 ♦

• 4

• φ suší nad bezvodým síranem sodným. Po zakoncentrování se získá surový dimethyl-3'-ethoxy-3-nitrobifenyl- 4-malonát jako žlutý olej.

Surový dimethyl-3'-ethoxy-3-nitrobifenyl-4-malonát se zahřívá při 100°C v 60 ml 6N kyseliny chlorovodíkové po dobu 4 dny a poté se zchladí. Precipitát se shromáždí vakuovou filtrací, promyje vodou a hexanem a usuší. Získá se 4,7 g surové 3 '-ethoxy-3-ni tr ob i feny 1-4octové kyseliny jako světle zbarvené pevné látky.

Železný prášek (2,4 g) se přidá v jedné dávce do 4,6 g 3'-ethoxy3-nitrobifenyl-4-octové kyseliny ve 40 ml ledové kyseliny octové a refluxuje se po dobu 2 hodiny. Reakční směs se koncentruje do sucha, znovu se nechá působit s ethylacetátem a nerozpustné látky se odstraní filtrací. Filtrát se dvakrát promyje IN kyselinou chlorovodíkovou a solankou a poté se suší nad bezvodým síranem sodným. Po zakoncentrování se získá 3,5 g (91 % výtěžek) 6-(3-ethoxyfenyl)-2oxindolu jako světlehnědé pevné látky.

6-brom-2-oxindol

Dimethylmalonát (13 ml) se přidá po kapkách do 2,7 g hydridu sodného suspendovaného ve 20 ml dimethylsulfoxidu. Směs se zahřívá při 100°C po dobu 10 minut a poté se zchladí na pokojovou teplotu. Přidá se 5-brom-2-fluornitrobenzen (5,0 g) ve 25 ml dimethylsulfoxidu a směs se zahřívá při 100°C po dobu 2 hodiny. Reakční směs se ochladí a ustálí přídavkem 300 ml roztoku saturovaného chloridu amonného a třikrát se extrahuje ethylacetátem. Spojené extrakty se promyjí saturovaným chloridem sodným, vodou a solankou. Suší se nad bezvodým síranem sodným a koncentrují se. Získá se surový dimethyl-4-brom-2-nitrofenylmalonát jako světle žlutý olej.

Surový dimethyl-4-brom-2-nitrofenylmalonát se zahřívá při 110°C ve 40 ml 6N kyseliny chlorovodíkové po dobu 24 hodin a poté se zchladí. Precipitát se shromáždí vakuovou filtrací, promyje vodou a usuší. Získá se 5,3 g (89 % výtěžek) 4-brom-2-nitro-fenyloctové kyseliny jako šedé pevné látky.

• · ♦ · * · * * · · · I * · ; · nc\ · · · · · * - * /y · Z · · ··· ·· ···· ··

4-brom-2-nitrofenyloctová kyselina (0,26 g), 0,26 g zinkového prachu a 3 ml 50 % kyseliny sírové v 5 ml ethanolu se zahřívá přes noc při teplotě 100°C. Reakční směs se zfiltruje, zředí se malým množstvím kyseliny octové, odstraní se ethanol, zředí se vodou a dvakrát se extrahuje ethylacetátem. Spojené extrakty se promyjí solankou, suší se nad bezvodým síranem sodným a koncentrují se. Získá se 0,19 g (90 % výtěžek) 6-brom-2-oxindolu jako žluté pevné látky.

5-acetyl-2-oxindol

2-oxindol (3 g) se suspenduje v 1,2-dichlorethanu a pomalu se přidá 3,2 ml acetylchloridu. Výsledná suspenze se zahřívá při 50°C po dobu 5 hodin, zchladí se a přelije do vody. Výsledný precipitát se shromáždí vakuovou filtrací, řádně se promyje vodou a usuší se pod vakuem. Získá se 2,9 g (73 % výtěžek) požadované sloučeniny jako hnědé pevné látky.

5-butanoyl-2-oxindol

Do 15 g chloridu hlinitého suspendovaného ve 30 ml 1,2-dichlorethanu v ledové lázni se přidá 7,5 g 2-oxindolu a poté 12 g butanoylchloridu. Výsledná suspenze se zahřívá přes noc při 50°C. Směs se nalije do ledové vody a třikrát se extrahuje ethylacetátem. Spojené ethylacetátové vrstvy se promyjí solankou, suší se nad síranem sodným a koncentrují do sucha. Získá se hnědá pevná látka, která se chromatografuje na silikagelu (50 % ethylacetát v hexanu). Získají se 3 g (25%) požadované sloučeniny jako žluté pevné látky.

5-kyanoethyl-2-oxindol

Kyanid draselný (2,0 g) se přidá do 15 ml dimethylsulfoxidu a zahřeje se na 90°C. Za stálého míchání se pomalu přidá 5-chlorethyl2-oxindol (3,0 g) rozpuštěný v 5 ml dimethylsulfoxidu a reakce se zahřívá při 150°C po dobu 2 hodiny. Směs se ochladí, přelije do ledové vody a precipitát se shromáždí vakuovou filtrací. Promyje se vodou, usuší a poté se chromatografuje na silikagelu (5 % méthanol v chloroformu). Získá se 1,2 g (42 % výtěžek) požadované sloučeniny.

6-morfolino-4-yl-2-oxindol

6-amino-2-oxindol (2,2 g), 4,0 g 2,2'-dibromethyletheru a 7,9 g uhličitanu sodného se přes noc refluxuje ve 20 ml ethanolu, koncentruje se a zředí 50 ml vody. Směs se třikrát extrahuje 50 ml ethylacetátu a spojené organické extrakty se promyjí 20 ml solanky, suší se nad bezvodým síranem sodným a koncentrují se do sucha. Pevná látka se chromatografuje na sloupci silikagelu (ethylacetát: hexan (1: 1) obsahující 0,7 % kyseliny octové). Získá se 1,2 g (37 % výtěžek) požadované sloučeniny jako béžové pevné látky.

6-(3-trifluoracetylfenyl)-2-oxindol

3-aminofenylboritá kyselina (3,9 g), 5 g 5-brom-2fluornitrobenzenu, 0,8 g tetrakis(trifenylfosfin)paladia a 23 ml 2 M roztoku hydrogenuhličitanu sodného v 50 ml toluenu se refluxuje pod dusíkem po dobu 2,5 hodiny. Reakční směs se nalije do 200 ml ledové vody a směs se třikrát extrahuje 50 ml ethylacetátu. Spojené organické vrstvy se promyjí 50 ml vody a 20 ml solanky, suší se nad bezvodým síranem sodným a koncentrují se. Získá se 9,7 g (92 % výtěžek) 2-fluor-5-(3-aminofenyl)nitrobenzenu jako tmavě hnědého o 1 e j e.

Anhydrid trifluoroctové kyseliny (5,4 ml) se pomalu přidá do míchaného roztoku 9,7 g 2-fluor-5-(3-aminofenyl)-nitrobenzenu a 5,3 ml triethylaminu v 50 ml dichlormethanu za teploty 0°C a směs se míchá po dobu dalších 20 minut. Směs se koncentruje a zbytek se chromatografuje na sloupci silikagelu (10 % ethylacetát v hexanu). Získá se 8,6 g (65 % výtěžek) 2-fluor-5-(3« · • · · • · • · • · · · · ♦ · • i · · • 4 · * · • I 1· · ♦ «··· ··· ·· · · trifluoracetamidofenyl)nitrobenzenu jako světle oranžového oleje, který stáním tuhne.

Dimethylmalonát (9,6 ml) se přidá po kapkách do míchané suspenze 3,2 g 60 % hydridu sodného v minerálním oleji ve 40 ml bezvodého dimethylsulfoxidu pod dusíkem. Směs se míchá po dobu 10 minut a přidá se 2-fluor-5-(3-trifluoracetamido-fenyl)nitrobenzen ve 20 ml dimethylsulfoxidu. Výsledná tmavoěervená směs se zahřívá při 100°C po dobu 2 hodiny. Reakce se zhasne přelitím do roztoku 100 ml saturovaného chloridu amonného a dvakrát se extrahuje 50 ml ethylacetátu. Organická fáze se promyje roztokem saturovaného chloridu amonného, vodou a solankou, vždy 50 ml. Suší se nad bezvodým síranem sodným a koncentruje. Získaný žlutý olej se chromatografuje na sloupci silikagelu (ethylacetát: hexan (1: 4)). Získá se 4,4 g (50 % výtěžek) dimethyl-2-[2-nitro-4-(3trifluoracetamidofenyl)fenyl]-malonátu jako světložluté látky.

Dimethyl-2- [2 -nitro-4-(3 -tri fluor ac etami do fenyl)-feny ljmal on át (4,4 g) se refluxuje přes noc v 50 ml 6N kyseliny chlorovodíkové. Reakění směs se ochladí na pokojovou teplotu a pevná látka se shromáždí vakuovou filtrací, promyje vodou a suší pod vakuem. Získá se 2,7 g (73 % výtěžek) 2-[2-nitro-4-(3tr i fl uor ace tam i do fenyl) fenyl] octové kyseliny.

2- [2-nitro-4-(3-trifluoracetamidofenyl)fenyl] octová kyseliny (100 mg) a 50 mg železného prášku ve 3 ml kyseliny octové se zahřívá při 100°C po dobu 2 hodiny. Reakční směs se koncentruje a zbytek se sonikuje v 5 ml ethylacetátu. Nerozpustné látky se odstraní vakuovou filtrací a filtrát se promyje IN kyselinou chlorovodíkovou, vodou a solankou. Suší se nad bezvodým síranem sodným a koncentruje. Získá se 10 mg (14 % výtěžek) požadované sloučeniny jako růžově zbarvené pevné látky.

í * .: í ‘

I « « · a ·· «··» »» · ·*

B. Aldehydy

5-formyl-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-karboxylová kyselina t-butyl-3-oxobutyrát (158 g, 1 mol) se rozpustí ve 200 ml kyseliny octové v 500 ml trojhrdlé baňky s kulatým dnem vybavené teploměrem, přídavnou nálevkou a mechanickým míchadlem. Směs se ochladí v ledové lázni na teplotu okolo 10°C. Dusitan sodný (69 g, 1 mol) se přidává 75 minut za teploty udržované pod 15°C. Ledová lázeň se odstraní a směs se míchá po dobu 30 minut a nechá se stát po dobu 3,5 hodiny. Získá se t-butyl-2-hydroximino-3-oxobutyrát.

Ethyl-3-oxobutyrát (130 g, 1 mol) se rozpustí ve 400 ml kyseliny octové v 2 L trojhrdlé baňce s kulatým dnem vybavené teploměrem, přídavnou nálevkou, mechanickým míchadlem a umístí se do olejové lázně. Přidá se zinkový prach (50 g, 0,76 mol) a směs se za stálého míchání zahřívá při 60°C. Pomalu se přidá dříve připravený roztok tbutyl-2-hydroximino-3-oxobutyrátu, teplota reakční směsi se udržuje okolo 65°C. Poté se přidá další zinkový prach (4 x 50 g, 3,06 mol), přičemž poslední dávka se přidá poté, co byl přidán všechen tbutylester. Na konci přidávání je teplota 64°C. Teplota se zvýší na 70 až 75°C, míchá se po dobu jedné hodiny a poté se přelije do 5 L vody.

Šedý vznášející se precipitát se shromáždí vakuovou filtrací a promyje 2 L vody. Získá se 354 g mokrého surového produktu. Surový produkt se rozpustí v 1 L horkého methanolu a zinek se odstraní filtrací za horka. Filtrát se ochladí, čímž se utvoří precipitát. Precipitát se shromáždí vakuovou filtrací a usuší. Získá se 118 g produktu. Filtrát se ponechá přes noc v chladničce, vytvoří se další část precipitátu. Dohromady se získá 173,2 g 2-tert-butylesteru 4ethylesteru 3,5-dimethyl-lH-pyrrol-2,4-dikarboxylové kyseliny.

2-tert-butylester 4-ethylester 3,5-dimethyl-lH-pyrrol-2,4dikarboxylové kyseliny (80,1 g, 0,3 mol) a 400 ml kyseliny trifluoroctové se míchá po dobu 5 minut v 2 L trojhrdlé baňce s kulatým dnem vybavené mechanickým míchadlem a zahřáté na 40°C t··· ·ΦΦ • ΦΦ φ» ·Φ··

100 ml vody. Tmavý zbytek se v olejové lázni. Směs se poté zchladí na -5°C a najednou se přidá a triethylorthoformiát (67,0 g, 0,45 mol). Teplota se zvýší na 15°C. Směs se míchá 1 minutu, odstraní se z ledové lázně a míchá se po dobu 1 hodiny. Trifluoroctová kyselina se odstraní na rotační odparce a zbytek se vloží do chladničky, kde ztuhne. Pevná látka se zahřátím rozpustí a přelije do 500 g ledu. Směs se extrahuje 800 ml dichlormethanu . Získá se červený roztok a hnědý precipitát, obojí se uschová. Precipitát se izoluje a promyje 150 ml roztoku saturovaného hydrogenuhličitanu sodného . Dichloromethanová fáze se také promyje 150 ml hydrogenuhličitanu sodného. Dichlormethanový roztok se poté promyje nejméně třikrát

Dichlormethanový roztok se odpaří do sucha, dvakrát rekrystalizuje z ethylacetátu obsahujícího Darko černý uhlík. Získají se zlatě žluté jehličky. Hnědý precipitát se rekrystalizuje z 350 ml ethylacetátu také obsahující Darko. Získá se červenožlutá pevná látka. Všechny rekrystalizované látky se spojí a rekrystalizují z 500 ml ethanolu. Získá se 37,4 g (63,9 %) ethylesteru 5-formyl-2,4dimethyl-lH-pyrrol-3-karboxylové kyseliny jako žlutých jehliček (bod tání 165,6-166,3°C, lit. 163-164°C). Zbytky získané odpařením ethylacetátového a ethanolového matečného roztoku se spojí a rekrystalizují z 500 ml ethanol. Získá se druhá část produktu (10,1 g) jako špinavé žluté jehličky.

Ethylester 5-formy 1-2,4-dimethyl-lH-pyrrol-3-karboxylové kyseliny (2 g, 10 mmol) se přidá do roztoku hydroxidu sodného (3 g, 53 mmol) rozpuštěného v methanolu (3 ml) a vodě (10 ml). Směs se refluxuje po dobu 3 hodiny, zchladí se na pokojovou teplotu a okyselí se 6 N kyselinou chlorovodíkovou na pH 3. Utvoří se pevná látka, která se shromáždí filtrací, promyje vodou a suší se přes noc ve vakuové peci. Získá se 1,6 g (93 %) 5-formyl-2,4-dimethyl-lH-pyrrol-3-karboxylové kyseliny.

‘HNMR (300 MHz, DMSO-ds) δ: 12,09 (s, br, 2H, NH & COOH), 9,59 (s, 1H, CHO), 2,44 (s, 3H, CH₃), 2,40 (s, 3H, CH₃).

··· · 4 • » · ·

(2-dimethylaminoethyl)amid 5-formy 1-2,4-dimethy 1-1 H-pyrrol-3karboxylové kyseliny

Do směsi 5-formyl-2,4-dimethyl-lH-pyrrol-3-karboxylové kyseliny (1,67 g, 10 mmol) v dimethylforamidu (10 ml) se přidá benzo triazol -1 -yloxytris(dimethylamino)fosfoniumhexafluorfosfát (BOP činidlo, 6 g, 13,5 mmol) , poté 3 ml diizopropylthylaminu. Po 5 minutách míchání se přidá 1 ml N, N-dimethylthylndiaminu a směs se míchá při pokojové teplotě po dobu 24 hodin. Do reakční směsi se přidá 25 ml IN hydroxidu sodného a 25 ml solanky. Po 30 minutách míchání se reakční směs nalije do vody (100 ml) a extrahuje (3 x 200 ml) 10 % methanolem v dichlormethanu. Spojené organické vrstvy se suší nad bezvodým síranem sodným a odpaří na rotační odparce. Zbytek se přečistí kolonovou chromatografií (silikagel, 5 %-10 % methanol v dichlormethanu). Získá se 1 g (42 %) 5-formyl-2,4dimethyl -1 H-pyrro 1-3-karboxylové kyseliny (2-dimethylamino-ethyl)amidu.

'H NMR (360 MHz, DMSO-d₆)d: 11,77 (s, 1H, NH), 9,53 (s, 1H, CHO), 7,34 (t, J = 5,6 Hz, 1H, CONH), 3,27 (m, 2H, CONCH2CH2), 2,37 (t, J - 6,8 Hz, 2H, CONCH2CH2), 2,35 (s, 3H, CH₃), 2,3 (s, 3H, CH₃), 2,17 (s, 6H, 2 x CH₃), MS m/z 238,3 [M+l] ⁺

3,5-dimethyl-4- (4-methyl-piperazin -1 -karbonyl)-1 H-pyrrol-2karboxaldehyd

Do směsi 5-formyl-2,4-dimethyl-lH-pyrrol-3-karboxylové kyseliny (1,67 g, 10 mmol) v dimethylformamidu (10 ml) se přidá benzotriazol-1-yloxytris (dimethylamino)- fosfonium hexafluorfosfát (BOP činidlo, 6 g, 13,5 mmol) , poté 3 ml diizopropylthylaminu. Po 5 minutách míchání se přidají 2 ml 1-methylpiperazinu a směs se míchá při pokojové teplotě po dobu 24 hodin. Do směsi se poté přidá 25 ml IN hydroxidu sodného a 25 ml solanky. Po 30 minutách mícháni se reakční směs nalije do vody (100 ml) a extrahuje (3x 200 ml) 10 % methanolem v dichlormethanu. Spojené organické vrstvy se suší nad bezvodým síranem sodným a odpaří se na rotační odparce. Zbytek se přečistí kolonovou chromatografií (silikagel, 5 % - 10 % methanol v dichlormethanu). Získá se 1 g (40 %) 3,5-dimethyl-4-(4-methylpiperazin-1 -karbony l)-lH-pyrrol-2-karboxaldehydu.

*H NMR (360 MHz, DMSO-dg) δ: 11,82 (s, 1H, NH), 9,50 (s, 1H, CHO), 3,14 (br m, 4H, 2xCH₂), 2,29 (br m, 4H, 2xCH₂), 2,19 (s, 3H, CH₃), 2,17 (s, 3H, CH₃), 2,14 (s, 3H, CH₃),

MS El 249 [M] ⁺.

C. Příklady- syntézy pyrrolem substituovaných 2-indolinonů

Následující syntézy representativních sloučenin tohoto vynálezu ukazují pouze příklady přípravy a nejsou konstruovány tak, aby omezovali rozsah tohoto vynálezu jako je syntetický přístup nebo sloučeniny obsažené v tomto vynálezu.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

3- [5-(5-chlor-2-oxo-l ,2 -dihydro indol-3-y li denmethy l)-4-methyllH-pyrrol-3-yl]-propionová kyselina

4- (2-karboxyethyl)-2-formyl-3-methylpyrrol (4,5 g), 4,2 g 5chlor-2-oxindolu, a 2,9 ml piperidinu v 50 ml ethanolu se zahřívají při 95°C po dobu 5 hodin. Reakční směs se ochladí a koncentruje. Zbytek se suspenduje v acetonu a žlutý precipitát se zfiltruje, promyje studeným ethanolem, 2 N vodnou kyselinou chlorovodíkovou a vodou na pH 6. Poté se suší přes noc ve vakuové peci. Získá se 7,2 g požadované sloučeniny (88 %) jako žluté pevné látky 'HNMR (360 MHz, DMSO-d₆): δ 13,31 (s, br, 1H, NH-1'), 12,06 (s, br, 1H, COOH), 10,88 (s, br, 1H, NH-1), 7,93 (d, J = 1,88 Hz, 1H, H-4), 7,75 (s, 1H, H-vinyl), 7,19 (d, J = 3,1 Hz, 1H, H-2'), 7,1 (dd, b, J = 1,88, 8,40 Hz, 1H, H-6), 6,84 (d, J - 8,40 Hz, 1H, H-7), 2,65 (t, J = 7,44 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,46 (t, J = 7,44 Hz, 2H,

CH₂CH₂COOH), 2,28 (s, 3H, CH₃);

Příklad 2

3- [5-(6-methoxy-2-oxo-l ,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-4methyl -1 H-pyrrol-3-yl]-propionová kyselina

4- (2-karboxyethyl)-2-formyl-3-methylpyrrol (190 mg), 163 mg 6-methoxy-2-indolu a 2 kapky piperidinu se zahřívají ve 2 ml ethanolu při 90°C po dobu 3 hodiny. Reakční směs se ochladí a koncentruje. Zbytek se suspenduje v 6 N vodné kyselině chlorovodíkové. Precipitát se zfiltruje, promyje vodou na pH 6 a suší ve vakuové peci. Získá se 140 mg požadované sloučeniny (43%) jako hnědé pevné látky.

'HNMR (360 MHz, DMSO-d₆): δ 13,1 (s, br, 1H, NH-1'), 12,04 (s, br, 1H, COOH), 10,76 (s, br, 1H, NH-1), 7,63 (d, J = 8,29 Hz, 1H, H-4), 7,46 (s, 1H, H-vinyl), 7,07 (d, J = 3,03 Hz, 1H, H-2'), 6,55 (dd, J = 2,32, 8,29 Hz, 1H, H-5), 6,43 (d, J = 2,32 Hz, 1H, H-7), 3,74 (s, 3H, OCH₃), 2,63 (t, J = 7,31 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,45 (t, J = 7,31 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,23 (s, 3H, CH₃); MS m/z (relativní intenzita, %) 327 ([M+l] ⁺, 100).

Příklad 3

3-[5-(5-chlor-2-oxo-l ,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-2,4dimethy 1-1H-pyrrol-3-yl]-propionová kyselina

3-(2-karboxyethyl)-2,4-dimethyl-5-formylpyrrol (220 mg), 147 mg 5-chlor-2-oxindolu a 2 kapky piperidinu se zahřívají ve 2 ml ethanolu při 90°C po dobu 3 hodiny. Reakční směs se ochladí a koncentruje. Zbytek se suspenduje 6 N vodné kyselině chlorovodíkové. Precipitát se zfiltruje, promyje vodou na pH 6 a suší se ve vakuové peci . Získá se 172 mg požadované sloučeniny (50 %) jako hnědé pevné látky.

^lHNMR (360 MHz, DMSO-d₆): δ 13,42 (s, br, 1H, NH-1’), 12,03 (s, br, 1H, COOH), 10,80 (s, br, 1H, NH-1), 7,87 (d, J = 2,06 Hz, 1H, H-4), 7,67 (s, 1H, H-vinyl), 7,06 (dd, J = 2,06, 8,3 Hz, 1H, H-6), 6,83 (d, J = 8,3 Hz, 1H, H-7), 2,64 (t, J - 7,6 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,34 (t, J = 7,6 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,29 (s, 3H, CH₃), 2,27 (s, 3H, CH₃); MS m/z (relativní intenzita, %) 345 ( [M+l] ⁺ , 64).

Příklad 4

3-[4-methyl-5-(2-oxo-1,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-lHpyrrol-3-yl]-propionová kyselina

Kovový sodík (1,5 g) se vloží do 3 L trojhrdlé baňky s kulatým dnem vybavené teploměrem, refluxním kondenzátorem a mechanickým míchadlem umístěné v olejové lázni. Za stálého míchání se přidá absolutní ethanol (1 L). Když se sodík rozpustí, přidá se najednou 350 g pentan-2,4-dionu a poté se v průběhu 30 minut přidá 310 g ethylakrylátu. Směs se refluxuje po dobu 2,5 hodiny a poté se přes noc zchladí na pokojovou teplotu. Přidá se ledová kyselina octová (3 ml) a rozpouštědlo se odstraní na rotační odparce. Zbytek se zfiltruje přes vrstvu křemeliny a destiluje v koloně s tenkým filmem při 0,1 mm. Destilát se redestiluje použitím 10 palcové vakuové opláštěné Vigreux kolony, čímž se získá 518 g ethyl-5-acetyl-4-oxohexanoátu, bod tání 84-92°C při 0,2 - 0,7 mm.

Do 5 L trojhrdlé baňky vybavené teploměrem a mechanickým míchadlem zahřívané na parní lázni se přidá 350 g ethyl-5-acetyl-4oxohexanoátu, 329 g ethylaminomalonátu hydrochloridu, 133 g octanu sodného a 1,2 L kyseliny octové. Směs se zahřívá při 99°C přes 37 minut. Při teplotě 62°C už dochází k rychlému vyvíjení oxidu uhličitého. Po 35 minutách při 99°C se vývin oxidu uhličitého rapidně zpomalí. Po hodině se směs ochladí, chlorid sodný se odstraní vakuovou filtrací a rozpouštědlo se odpaří . Zbytek se smísí s 1 L studené vody. Precipitát se shromáždí vakuovou filtrací, promyje 400 ml vody a rozpustí v 1 L horkého 95 % ethanolu. Roztok se nechá ·

<· ♦

* Λ působit s 20 g Darko G-60, za horka zfiltruje a zchladí se na pokojovou teplotu. Krystalická pevná látka se shromáždí vakuovou filtrací, dvakrát promyje na filtru 200 ml 50 % ethanolu a suší se pod vakuem při 70°C. Získá se 285 g (64 % výtěžek) 2-ethoxykarbonyl-4(2-ethoxykarbonylthyl)-3,5-dimethylpyrrolu. Filtrát se ponechá přes noc v chladničce, čímž se získá dalších 53,1 g (11,9 % výtěžek) produktu. Spojený výtěžek činí 75,9 %.

- eth oxy karbony 1-4-(2-ethoxykarbonyl ethyl)-3,5-dimethylpyrr o 1 (285 g) a 3500 ml ethyletheru se vloží do 5 L, trojhrdlé baňky vybavené mechanickým míchadlem, refluxním kondenzátorem a přídavnou nálevkou. Baňka je umístěna v ledové lázni. V průběhu 145 minut se po kapkách přidává sulfurylchlorid (435 g). Přidáváním se směs zakalí a zezelená a poté vyjasní. Na konci přídavku se směs pročistí a zbarví do slabě žluté barvy. Směs se míchá další 1 hodinu a poté se zahřívá pod refluxem po dobu 1 hodiny. Směs se ochladí a odpaří na rotační odparce, zředí se 1500 ml etheru a znovu odpaří na rotační odparce. Zředění a odpaření se provede ještě jednou. Zbytek se přidá do 8 L vody obsahující 802 g kyseliny octové a 535 g hydroxidu sodného. Směs se krátce zahřeje na 85°C a poté se za stálého míchání nechá přes noc chladnout. Vodná vrstva obsahující sole se separuje a extrahuje 800 ml etheru. Pevný podíl a etherová vrstva se přidají do 2,5 L vody obsahující 300 g uhličitanu sodného. Míchá se po dobu 1 hodiny a filtrací se odstraní malé množství (~7 g) pevné látky. Do směsi se přidá kyselina siřičitá (137 g) a výsledný precipitát se dvakrát promyje 250 ml vody a suší se pod vakuem, čímž se získá 56,4 g produktu. Do filtrátu se přidá kyselina siřičitá (92 g) a výsledný precipitát se dvakrát promyje 0,5 L vody a suší se pod vakuem. Získá se 220 g produktu, což dohromady činí 276,4 g (86,8 % výtěžek) 2karboxy-5-ethoxy karbony 1-3-(2 -ethoxy karbony 1 ethyl)-4methylpyrrolu.

2-karboxy-5-ethoxykarbony 1-3-(2-ethoxykarbonyl ethy 1)-4 methylpyrrol (50,5 g) a 400 ml 10 % hydroxidu sodného se zahřívá při 180°C v Parr autoklávu po dobu 90 minut. Tento proces se ještě • · · · « φ • · · * · φ · φ φ · · · • φ φ φ φ φ · φφφ φ φ

-a* ·»·» φ *Φ Φ čtyřikrát opakuje, dokud se nezpracuje všech 252,5 g 2-karboxy-5ethoxykarbonyl-3-(2-ethoxykarbonylethyl)-4-methylpyrrolu. Pět roztoků se spojí a odpaří se na rotační odparce na množství 1,8 L hustého černého zbytku. Směs se ochladí na 10°C ve vodní lázni a pomalu se přidává 50 % kyselina siřičitá tak, aby teplota nepřesáhla 20°C a dokud pH není 2. Přidá se ethylether (1400 ml), směs se zfiltruje a precipitát se uschová. Precipitát se extrahuje v Soxhlet extraktoru 500 ml etheru. Spojené etherové vrstvy se promyjí 250 ml vody a poté 150 ml vody. Spojené vodné vrstvy se zpátky extrahují 150 ml etheru. Všechny etherové vrstvy se odpaří na rotační odparce a zbytek se usuší. Získá se 123,5 g 3-(2-karboxyethyl)-4-methylpyrrolu.

3-(2-karboxyethyl)-4-methylpyrrol (123 g) se smíchá s 1500 ml ethyletheru a 250 ml methanolu v magneticky míchané jímací baňce. Do 3 L, trojhrdlé baňky s kulatým dnem vybavené magnetickým míchadlem, destilačním nástavcem a kondenzátorem vedoucím do vstupu do jímací baňky a zahřívané na vodní lázni se umístí 240 g Diazaldu rozpuštěného v 1800 ml ethyletheru, roztok 73 g hydroxidu sodného rozpuštěného v 360 ml 95 % ethanolu a 112 ml vody. 3 L baňka se míchá a zahřívá při 65-75°C na vodní lázni a diazomethanetherová směs se destiluje do míchané jímací baňky po dobu přes 2,5 hodiny. Přidá se ethylether (200 ml) a destilace pokračuje dokud není kompletní. Jímací baňka se míchá po dobu dalších 30 minut a poté se přidá 10 ml kyseliny octové. Směs se dvakrát extrahuje 500 ml vody, poté dvakrát 200 ml saturovaného hydrogenuhličitanu sodného. Etherová vrstva se suší nad bezvodým síranem sodným a destiluje, čímž vznikne tmavý tekutý zbytek. Zbytek se dvakrát destiluje přes 4 palcovou Vigreux kolonu a jednou přes 10 palcovou vakuovouopláštěnou Vigreux kolonu. Získá se 108 g (80,6 % výtěžek) 3-(2ethoxykarbonylethyl)-4-methylpyrrolu. BP 108-113°C při 0,5 mm.

Dimethylformamid v 500 ml, trojhrdlé baňce s kulatým dnem vybavené mechanickým míchadlem, teploměrem a přikapávací nálevkou se udržuje pod atmosférou dusíku. Baňka se ochladí na 0°C a po kapkách v průběhu 80 minut se přidává 58,4 ml oxychloridu

Φ φφφ • · » φ φ ·

Η ΦΦΦ fosforečného. Přidá se dichlorethan (280 ml) a směs se ohřeje na pokojovou teplotu a poté se zchladí na -10°C. Po kapkách se přes hodinu přidává 3-(2-methoxykarbonyl-ethyl)-4-methylpyrrol (55,7 g) rozpuštěný v 80 ml dichlorethanu a směs se míchá dalších 35 minut. Směs se odpaří na rotační odparce při teplotě < 30°C. Tekutý zbytek se nalije do 2700 ml ledově studeného 2 N roztoku hydroxidu sodného. Výsledný roztok se zahřívá na 88°C přes 20 minut a poté se na této teplotě udržuje po dalších 30 minut. Roztok se ochladí na teplotu okolí a extrahuje se 200 ml ethyletheru. Vodný roztok se ochladí na 0°C a okyselí se na pH 3,5 pomalým přidáváním přibližně 1350 ml 5 N kyseliny chlorovodíkové. Žlutý precipitát se shromáždí vakuovou filtrací, čtyřikrát promyje 100 ml vody a suší se ve vakuové peci při okolní teplotě. Získá se 54,4 g (90,2 % výtěžek) surového 4-(2kar boxy ethyl)-2-formy 1-3-methy lpyrrolu.

Surový materiál se umístí do refluxující se směsi 425 ml ethanolu a 700 ml ethyletheru a za horka se zfiltruje nerozpustný zbytek. Filtrát se vloží do mrazáku a výsledný precipitát se shromáždí vakuovou filtrací a promyje 50 ml etheru. Filtrát se znovu použije pro extrakci nerozpustitelného zbytku, za horka zfiltruje a vloží do mrazáku. Výsledný precipitát a první precipitát se spojí, čímž se získá 26,1 g 4-(2-karboxyethyl)-2-formyl-3-methylpyrrolu jako hnědého prášku. Teplota tání 149,0-150, 3°C. Filtrát se spojí s filtrátem z předchozí přípravy a koncentruje se, čímž se získá 43 g hnědé pevné látky. Pevná látka se vloží do refluxující se směsi 500 ml etheru a 100 ml ethanolu a zfiltruje. Filtrát se nechá působit s Noritem při refluxu a znovu se za horka zfiltruje. Filtrát se vloží do mrazáku, čímž se získají 3 dávky 4-(2-karboxyethyl)-2-formyl-3-ethylpyrrolu, 7,7 g, teplota tání 148-151°C, 3,2 g, teplota tání 128-134°C a 4,1 g, teplota tání 148,2-150,0°C.

4-(2-karboxyethyl)-2-formyl-3-methylpyrrol (9,0 g) a 6,0 g 2oxindolu v 50 ml ethanolu se zahřívá na 70°C v 250 ml, trojhrdlé baňce s kulatým dnem vybavené teploměrem, refluxním kondenzátorem a mechanickým míchadlem. Když se většina pevné ο» ··»· *· látky rozpustí pomalu se přidá 4,5 g piperidinu a směs se refluxuje po dobu 4 hodiny. Pomalu se přidá kyselina octová (12 ml), čímž vznikne vydatný precipitát. Směs se refluxuje po dobu 5 minut, zchladí se na pokojovou teplotu a precipitát se shromáždí vakuovou filtrací a promyje 30 ml ethanolu. Precipitát se rozmělní pod refluxem v 30 ml ethanolu, zchladí se na pokojovou teplotu, shromáždí vakuovou filtrací, promyje 20 ml ethanolu a suší se pod vakuem. Získá se 11,9 g (80 % výtěžek) 3-[4-(2-karboxyethyl)-3-methylpyrrol-2-methylidenyl]2-indolinonu, SU6663, jako oranžové pevné látky.

'HNMR (360 MHz, DMSO-d₆): δ 13,29 (s, br, ΙΗ, NH-1'), 12,05 (s, br, 1H, COOH), 10,78 (s, br, 1H, NH-1), 7,73 (d, J = 7,43 Hz, 1H, H-4), 7,61 (s, 1H, H-vinyl), 7,13 (d, J = 2,75 Hz, 1H, H-2'), 7,10 (t, J = 7,43 Hz, 1H, H-6), 6,97 (t, J = 7,43 Hz, 1H, H-5), 6,85 (d, J = 7,43 Hz, 1H, H-7), 2,64 (t, J = 7,38 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,46 (t, J = 7,38 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,25 (s, 3H, CH₃); MS m/z (relativní intenzita, %) 297 ( [M + l] ⁺ , 100).

Příklad 5

3-[2,4-dimethyl-5-(2-oxo -1,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl) -1Hpyrrol-3-yl]-propionová kyselina

2,4-dimethyl-5-ethoxykarbonyl-3-(2-ethoxykarbonylethyl)pyrrol (1,07 kg) a 3,2 L 5 N hydroxidu sodného se mechanicky míchá ve 12 L trojhrdlé baňce s kulatým dnem vybavené refluxním kondenzátorem, přídavnou nálevkou a zahřívá se v olejové lázni. Směs se refluxuje po dobu 3 hodiny a po této době je vnitřní teplota 96°C, všechna pevná látka je rozpuštěna a tenkovrstvá chromatografie ukáže hydrolýzu jako kompletní. Odstraní se varná lázeň a směs se zchladí na 50°C ve vodní lázni. Pomalu se přidá 12 N kyselina chlorovodíková (~1,3 L). Poté co se přidá asi 50 % kyseliny se začne vyvíjet plyn a teplota se zvýší na 60°C. Jak se přidává další kyselina, vyvíjení zesiluje a začne se tvořit žlutý precipitát. Kyselinou chlorovodíkovou se pH upraví na konečnou hodnotu 3,5. Směs se ochladí v ledové lázni na 8°C. Pevné • ·· * látky se shromáždí vakuovou filtrací, dvakrát se promyjí 0,5 L destilované vody a suší se po dobu 48 hodiny ve vakuové peci při 5560°C. Získá se 677 g (101% výtěžek) 3-(2-karboxyethyl)-2,4dimethylpyrrolu.

'HNMR (de-DMSO) Ó 11,9 (s, ÍH, COOH), 9,9 (s, ÍH, NH), 6,2 (s, ÍH, aromatika), 2,5 (t, 2H, CH₂), 2,2 (t, 2H, CH₂), 2,0 (s, 3H, CH₃), 1,9 (s, 3H, CH₃); Teplota tání 134-136°C.

Dimethylformamid (28,5 g) ve 250 ml dichlormethanu v 1 L trojhrdlé baňce s kulatým dnem vybavené magnetickým míchadlem, teploměrem a přikapávací nálevkou se ochladí v ledové solné lázni na teplotu -1°C. Oxichlorid fosforečný (59,3 g) se z přikapávací nálevky pomalu přikapává do reakční směsi. Oxichlorid fosforečný se z nálevky vypláchne 25 ml dichlormethanu. Směs dosáhne teploty maximálně 5°C. Směs se míchá po dobu 15 minut, během kterých je teplota -3°C. Pevný 3-(2-karboxyethyl)-2,4-dimethylpyrrol (32,6 g) se přidává po dávkách v průběhu 15 minut. Směs dosáhne teploty maximálně 7°C. Červenohnědá směs se míchá přes 30 minut a poté se refluxuje po dobu 1 hodiny. Směs se ochladí na 15°C a přidá se 300 ml vody, což má za následek prudkou reakci a zvýšení teploty. Směs se míchá a zchladí se na 22°C, vrstvy se separují a uschovají. Organická vrstva se extrahuje 100 ml vody a vodné vrstvy se spojí a promyjí 50 ml dichlormethanu. Organické vrstvy se vylijí. Vodná vrstva se upraví na pH 11 ~180 ml 10 N hydroxidu sodného. Teplota se zvýší na 40°C. Směs se míchá po dobu 30 minut za teploty 27°C. Směs se okyselí na pH 2 ~1 20 ml 10 N kyseliny chlorovodíkové. Teplota se zvýší na 30°C. Přidá se ethylacetát (150 ml) a směs se míchá, čímž se získá produkt. Během míchání se navrchu vodné vrstvy objeví značné množství černé pevné látky. Ethylacetátová vrstva se oddělí a vodná vrstva a pevná látka se dvakrát extrahují 100 ml ethylacetátu. Stále přítomná pevná látka se shromáždí vakuovou filtrací, důkladně se promyje vodou a suší se pod vakuem při 40°C. Získá se 12 g (31 % výtěžek) 3-(2karboxyethyl)-2,4-dimethyl-5-formylpyrrolu jako hnědočerné pevné látky. Tenkovrstvá chromatografie (dichlormethan: octová kyselina,

ΦΦ «φ φφ Φ φ φ φ · φ φ ΦΦ φ φ φφφφ φ · φφφφ φ • φ φ « φ · φφ φφφφ φφ φφ φ φ φφφ

ΦΦΦ φ φ

95: 5, silikagel) ukáže skvrnu na Rf 0,7 a zabarvenou skvrnu na počátku. Ethylacetátové vrstvy se spojí, suší se nad bezvodým síranem sodným, odpaří se do vzniku hnědočerné pevné látky, která se suší pod vakuem při 40°C. Získá se 21 g (55 % výtěžek, celkový výtěžek 86 %)

3-(2-karboxyethyl)-2,4-dimethyl-5-formylpyrrolu, na tenkovrstvé chromatografii identického vzhledu jako předchozí pevná látka.

Alternativní postup: dimethylformamid (124 ml) v 750 ml dichlormethanu v 5 L trojhrdlé baňce s kulatým dnem vybavené mechanickým míchadlem, teploměrem a přikapávací nálevkou se ochladí v ledové-solné lázni na -9°C. Oxichlorid fosforečný (114 ml) se rychle přidává z přikapávací nálevky a spláchne se do reakčni směsi 50 ml dichlormethanu. Maximální dosažená teplota směsi je -4°C. Pevný 3-(2-karboxyethyl)-2,4-dimethylpyrrol (133,6 g) se přidává po dávkách 20 minut. Maximální dosažená teplota směsi je 3°C. Tmavě červená směs se zahřívá pod refluxem 1 minutu a poté se zchladí na 1°C. Směs se ochladí na 1°C a rychle se přidá 800 ml ledové vody. Maximální dosažená teplota je 15°C. Organická vrstva se separuje a odstraní. Vodná vrstva se upraví na pH 12-13 pomocí 800 ml 10 N hydroxidu sodného, pro upravování teploty se přidává led. Teplota stoupne na 37°C. Směs se míchá po dobu 90 minut při teplotě okolí a během této doby tenkovrstvá chromatografie ukáže pouze stopy světle zbarvené látky na počátku a produkt na Rf 0,3. Směs se ochladí na 0°C. Směs se okyselí na pH 3 pomocí 600 ml 10 N kyseliny chlorovodíkové, pro upravování teploty se přidává led. Maximální dosažená teplota je 10°C. Směs se míchá v chladnu po dobu 1 hodiny. Pevná látka se shromáždi vakuovou filtrací, čtyřikrát promyje 100 ml vody a suší se pod vakuem při 50-60°C, čímž se získá 140,6 g (90 % výtěžek) 3-(2-karboxyethyl)-2,4-dimethyl-5-formylpyrrolu jako hnědé pevné látky.

'HNMR (dg-DMSO): δ 12,0 (s, 1H, COOH), 11,3 (s, 1H, NH), 9,4 (s, 1H, CHO), 2,6 (t, 2H, CH₂), 2,3 (t, 2H, CH₂), 2,2 (s, 3H, CH₃), 2,1 (s, 3H, CH₃), Teplota tání 145-147°C.

• · ♦ 9 •	• • Φ ♦	* •	··	• · 9 9 9	• ·	9 9 9 9
9 9	9 9
9	9
•	•	•		9	9	9	9	9
·♦··	···		♦ ♦				9 9	9 9 9

3-(2-karboxyethyl)-2,4-dimethyl-5-formylpyrrol (18,2 g) a 11,7 g 2-oxindolu se rozpustí ve 100 ml ethanolu zahříváním v 250 ml baňce s kulatým dnem vybavené magnetickým míchadlem a refluxním kondenzátorem v olejové lázni. Přidá se pyrrolidin (7,0 g) a reakční směs se refluxuje po dobu 2 hodiny. Během této doby je přítomno velké množství hnědočerné pevné látky. Tenkovrstvá chromatografie (ethylacetát: ethanol: octová kyselina 96: 2: 2, silikagel) neukáže žádný výchozí oxindol. Přidá se 8 ml kyseliny octové a směs se refluxuje po dobu 15 minut. Hustá směs se zředí 50 ml ethanolu a zchladí se na 10°C. Pevná látka se shromáždí vakuovou filtrací a promyje 50 ml ethanolu. Dále se míchá ve 125 ml ethanolu pod refluxem po dobu 10 minut, zchladí se na 10°C, shromáždí se vakuovou filtrací a promyje se 50 ml ethanolu. Produkt se suší přes noc při 45°C pod vakuem, čímž se získá 25,5 g (88 % výtěžek) 3[2,4-dimethy 1-3 -(2-karboxy ethyl)pyrrol-5-methy lidenyl] -2-indolinon jako oranžové pevné látky.

Alternativní postup: směs 3-(5-formyl-2,4-dimethyl-1 H-pyrrol-3yl)-propionové kyseliny (10 g, 51 mmol), 2-oxindolu (6,5 g, 49 mmol) a hydroxidu sodného (40 g, 58 mmol) se rozpustí v 50 ml vody a míchá se při 50°C po dobu 4 hodiny. Reakční směs se ochladí na pokojovou teplotu, zfiltruje a filtrát se okyselí 12 N kyselinou chlorovodíkovou na pH 3. Precipitovaná pevná látka se shromáždí vakuovou filtrací, promyje 10 ml vody a suší se pod vakuem přes noc. Surová pevná látka se dvakrát rozmělní s horkým ethanolem, poté se shromáždí vakuovou filtrací, promyje se 10 ml ethanol a suší se pod vakuem. Získá se 13,8 g (91%) 3-[2,4-dimethyl-5-(2-oxo-l ,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-lH-pyrrol-3-yl]-propionové kyseliny.

‘HNMR (360 MHz, DMSO-d₆): δ 13,38 (s, br, 1H, NH-1'), 12,05 (s, br, 1H, COOH), 10,70 (s, br, 1H, NH-1), 7,69 (d, J = 7, 39 Hz, 1H, H-4), 7,53 (s, 1H, H-vinyl), 7,06 (t, J = 7,39 Hz, 1H, H-6), 6,95 (t, J = 7,39 Hz, 1H, H-5), 6,85 (d, J = 7,39 Hz, 1H, H-7), 2,63 (t, J = 7,45 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,34 (t, J = 7,45 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), ·· * ·· ·· ·· ♦ 9 *··· ·

9 9 9 · · · • · · · · »··· · · · · 9 9

9999 999 99 ♦ ··· »·

2,28 (s, 3Η, CH3), 2,24 (s, 3Η, CH3); MS m/z (relativní intenzita, %) 311 ([M+lf, 100).

Příklad 6

3- [5-(5-brom-2-oxo-1,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-4-methyllH-pyrrol-3-yl]-propionová kyselina

2-oxindol (53,3 g) se suspenduje v 640 ml acetonitrilu a směs se zchladí na 7°C v ledové lázni za stálého míchání. Během 20 minut se v dávkách přidá pevný N-bromsukcinimid (74,8 g). Poté co se přidá zhruba jedna třetina N-bromsukcinimidu teplota stoupne na 12°C. Přidávání se pozastaví dokud teplota směsi neopadne na 10°C.

V přidávání se pokračuje za teploty pod 12°C. Poté, co se dokončí přidávání, se směs míchá po dobu 1 hodiny při 10°C. Během další hodiny míchání se směs nechá ohřát na teplotu okolí. Precipitát se shromáždí vakuovou filtrací, promyje 80 ml ethanolu a 20 minut se odsává do sucha na filtrační nálevce. Získá se produkt podle HPLC obsahující 6,4 % 2-oxindolu. Pevná látka se suspenduje v 1440 ml denaturovaného ethanolu a rozmělní se mícháním a refluxováním po dobu 5 minut. Během této doby se většina pevné látky rozpustí. Směs se ochladí v ledové lázni na 13°C. Pevný produkt se shromáždí vakuovou filtrací, promyje se 80 ml ethanolu a suší se pod vakuem , čímž se získá 5 7,7 g (68,0 %) 5-brom-2-oxindolu podle HPLC obsahujícího 1,13 % 2-oxindolu. Rozmělněním s menším množstvím 30 % ethanolu se získá lepší výtěžek (88 %), ale obsahující více 2oxindolu (1,76 %).

'HNMR (360 MHz, DMSO-d₆): δ 10,44 (s, br, 1H, NH-1), 7,327,36 (m, 2H), 6,76 (d, J = 8,50 Hz, 1H, H-7), 3,5 (s, 2H, CH₂); MS m/z 212,1/214,1 (M⁺/ [M+2]⁺)·

4- (2-karboxyethyl)-2-formyl-3-methylpyrrol (90 mg), 106 mg 5brom-2-oxindolu a 75 pL piperidinu ve 2 ml ethanolu se zahřívá při 95°C po dobu 5 hodin. Reakění směs se ochladí a koncentruje. Zbytek se suspenduje v 2 N vodné kyselině chlorovodíkové. Precipitát se • ♦ · · · 0· 000» 00» ·» ·»·· 00 0 zfiltruje, promyje vodou na pH 6 a suší se ve vakuové peci. Získá se 120 mg (64 %) požadované sloučeniny jako hnědé pevné látky.

'HNMR (360 MHz, DMSO-d₆): δ 13,31 (s, br, 1H, NH-1’), 12,06 (s, br, 1H, COOH), 10,90 (s, br, 1H, NH-1), 8,06 (s, br, 1H, H-4), 7,75 (s, 1H, H-vinyl), 7,23 (d, br, J = 8,50 Hz, 1H, H-6), 7,19 (d, J = 2,84 Hz, 1H, H-2'), 6,80 (d, br, J = 8,50 Hz, 1H, H-7), 2,65 (t, J = 7,65 Hz,

2H, CH₂CH₂COOH), 2,46 (t, J = 7,65 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,28 (s,

3H, CH₃) ; MS m/z 375,1/ 377,2 (M⁺/ [M+2]⁺)·

Příklad 7

3- [5-(5-jod-2-oxo-l ,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-4-methyllH-pyrrol-3-yl]-propionová kyselina

2-oxindol (82,9 g) se suspenduje v 630 ml kyseliny octové, směs se mechanicky míchá a zchladí se na 10°C v ledové vodní lázni. Běhen 10 minut se po dávkách přidá N-jodsukcinimid (175 g). Poté se směs míchá po dobu 1 hodiny při 10°C. Přítomná suspendovaná látka během této doby zhoustne. Pevná látka se shromáždí vakuovou filtrací, promyje se 100 ml 50 % kyseliny octové ve vodě, poté 200 ml vody a 20 minut se odsává do sucha na filtrační nálevce. Produkt se suší pod vakuem, čímž se získá 93,5 g (36 %) 5-jod-2-oxindolu podle protonové NMR obsahujícího 5 % 2-oxindolu.

'HNMR (360 MHz, DMSO-d₆),: δ 10,45 (s, 1H, NH-1), 7,49 (s,

1H, H-4), 7,48 (d, J = 8,10 Hz, 1H, H-6), 6,64 (d, J = 8,10 Hz, 1H, H7) a 3,46 (s, 2H, CH₂-3); MS m/z 258 [M-l] ⁺ .

4- (2-karboxyethyl)-2-formyl-3-methylpyrrol (90 mg), 130 mg 5jod-2-oxindolu a 75 pL piperidinu ve 2 ml ethanolu se zahřívají při teplotě 95°C po dobu 5 hodin. Reakční směs se ochladí a koncentruje. Zbytek se suspenduje v 2 N vodné kyselině chlorovodíkové. Precipitát se zfiltruje, promyje vodou na pH 6 a suší se ve vakuové peci, čímž se získá 162 mg (77 %) požadované sloučeniny jako hnědé pevné látky.

'HNMR (360 MHz, DMSO-d₆): δ 13,30 (s, br, 1H, NH-1’), 12,06 (s, br, 1H, COOH), 10,88 (s, br, 1H, NH-1), 8,18 (s, br, 1H, H-4), 7,73

• *	• 9 ·	9 · • 9	9 9 9 9	9	99	9	9 9
9	9	9 9	9	9		9
9 9	9 999	9 9 9 9	9 99*9	9	9 9	9	9 9

(s, 1H, H-vinyl), 7,40 (d, br, J = 8,03 Hz, 1H, H-6), 7,19 (d, J = 2,94 Hz, 1H, H-2'), 6,69 (d, br, J = 8,03 Hz, 1H, H-7), 2,65 (t, J = 7,40 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,46 (t, J = 7,40 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,28 (s, 3H, CH₃); MS m/z 423 [M+lf.

Příklad 8

3- [4-methyl-5-(4-methyl-2-oxo -1,2-dihydroindol-3ylidenmethyl)-lH-pyrrol-3-yl]-propionová kyselina

Diethyloxalát (30 ml) ve 20 ml suchého etheru se za stálého míchání přidá do 19 g ethoxidu draselného suspendovaného v 50 ml suchého etheru. Směs se ochladí v ledové lázni a pomalu se přidá 20 ml 3-nitro-o-xylenu ve 20 ml suchého etheru. Hustá tmavě červená směs se zahřívá pod refluxem po dobu 0,5 hodiny, zakoncentruje se do tmavě červené pevné látky a nechá se působit s 10 % hydroxidem sodným, dokud se téměř všechna pevná látka nerozpustí. Tmavě červená směs se nechá působit s 30 % peroxidem vodíku, dokud se červená barva nezmění na žlutou. Nebo se směs nechá působit s 10% hydroxidem sodným a 30% peroxidem vodíku, dokud nevymizí červené zbarvení. Pevná látka se zfiltruje a filtrát se okyselí 6 N kyselinou chlorovodíkovou. Výsledný precipitát se shromáždí vakuovou filtrací, promyje se vodou a suší se pod vakuem. Získá se 9,8 g ( 45 % výtěžek) 2-methyl-6-nitrofenyloctové kyseliny jako šedé pevné látky. Pevná látka se hydrogenuje v methanolu přes 10 % paladium na aktivním uhlí, čímž se získá 9,04 g 4-methyl-2-oxindolu jako bílé pevné látky.

‘HNMR (360 MHz, DMSO-d₆): δ 10,27 (s, br, 1H, NH-1), 7,06 (t, J = 7,71 Hz, 1H, H-6), 6,74 (d, J = 7,73 Hz, H-5), 6,63 (d, J = 7,73 Hz, 1H, H-7), 3,36 (s, 2H, CH₂), 2,18 (s, 3H, CH₃).

4- (2-karboxyethyl)-2-formyl-3-methylpyrrol (90 mg), 74 mg 4methyl-2-oxindol a 75 pL piperidinu ve 2 ml ethanolu se zahřívá při 95°C po dobu 5 hodin. Reakční směs se zchladí a koncentruje. Zbytek se suspenduje v 6 N vodné kyselině chlorovodíkové. Precipitát se •Φ φ φφ φφ φφ φφφφ φφφφ φφ • φ φ φ φφφ φ φ · φ φ φφφφ φ φ φφφ φ φ φφφφ φφφ φφ φφφφ φφ zfiltruje, promyje vodou na pH 6 a suší se ve vakuové peci. Získá se 80 mg (52 %) požadované sloučeniny jako hnědé pevné látky.

'HNMR (360 MHz, DMSO- d6): δ 13,33 (s, br, IH, NH-1'), 10,84 (s, br, IH, NH-1), 7,54 (s, IH, H-vinyl), 7,12 (d, J = 2,0 Hz, IH, H-2'), 7,01 (t, J - 7,75 Hz, IH, H-6), 6,79 (d, J - 7,75 Hz, H-5), 6,74 (d, J - 7,75 Hz, IH, H-7), 2,64 (t, J - 7,65 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,57 (s, 3H, CH₃), 2,42 (t, J = 7,65 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,19 (s, 3H, CH₃); MS m/z (relativní intenzita, %) 311 ( [M+l] ⁺ , 100).

Příklad 9

3- [4-methyl-5-(5-methy 1-2-oxo -1,2-dihydroindol-3ylidenmethyl)-lH-pyrrol-3-yl]-propionová kyselina

5-methylisatin (15,0 g) a 60 ml hydrátu hydrazinu se zahřívá při 140-160°C po dobu 4 hodiny. Tenkovrstvá chromatografie (ethylacetát: hexan 1: 2, silikagel) neukáže žádný zbývající výchozí materiál. Reakční směs se ochladí na pokojovou teplotu, přelije do 300 ml ledové vody a okyselí se na pH 2 kyselinou chlorovodíkovou. Dva dny se nechá stát při pokojové teplotě, precipitát se shromáždí vakuovou filtrací, promyje vodou a suší se pod vakuem, čímž se získá 6,5 g (47 % výtěžek) 5-methyl-2-oxindolu.

'HNMR (360 MHz, DMSO-d₆): δ 10,20 (s, br, IH, NH-1), 6,99 (s, IH, H-4), 6,94 (d, J = 8,11 Hz, IH, H-6), 6,68 (d, J - 8,11 Hz, IH, H-7), 3,39 (s, 2H, CH₂-3), a 2,22 (s, 3H, CH₃-5).

4- (2-karboxyethyl)-2-formyl-3-methylpyrrol (90 mg), 74 mg 5methyl-2-oxindolu a 75 pL piperidinu ve 2 ml ethanolu se zahřívají při 95°C po dobu 5 hodin. Reakční směs se zchladí a koncentruje. Zbytek se suspenduje v 6 N vodné kyselině chlorovodíkové. Precipitát se zfiltruje, promyje vodou na pH 6 a suší se ve vakuové peci, čímž se získá 65 mg (42%) požadované sloučeniny jako hnědé pevné látky.

'HNMR (360 MHz, DMSO-d₆): δ 13,30 (s, br, IH, NH-1'), 12,05 (s, br, 1 H, COOH), 10,67 (s, br, IH, NH-1), 7,57 (s, 2H, H-vinyl, H4), 7,12 (d, J = 2,65 Hz, IH, H-2’), 6,91 (d, J = 7,82 Hz, IH, H-6),

6,74 (d, J = 7,82 Hz, 1H, H-7), 2,65 (t, J = 6,94 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,46 (t, J = 6,94 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,30 (s, 3H, CH3), 2,25 (s, 3H, CH₃); MS m/z (relativní intenzita, %) 311 ( [M+l] ⁺ , 100).

Příklad 10

3- [5-(5,6-dimethoxy-2-oxo-1,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-4methyl-lH-pyrrol-3-yl]-propionová kyselina

4- (2-karboxyethyl)-2-formyl-3-methylpyrrol (90 mg), 97 mg 5,6dimethoxy-2-oxindolu a 75 pL piperidinu ve 2 ml ethanolu se zahřívají při 95°C po dobu 5 hodin. Reakční směs se ochladí a koncentruje. Zbytek se suspenduje v 6 N vodné kyselině chlorovodíkové. Precipitát se zfiltruje, promyje vodou na pH 6 a suší se ve vakuové peci, čímž se získá 104 mg (58%) požadované sloučeniny jako hnědé pevné látky.

'HNMR (360 MHz, DMSO-d₆): δ 13,19 (s, br, 1H, NH-1’), 12,05 (s, br, 1 H, COOH), 10,53 (s, br, 1H, NH-1), 7,46 (s, 1H), 7,41 (s, 1H), 7,02 (s, 1H, H-2'), 6,45 (s, 1H), 3,74 (s, 3H, OCH₃), 3,70 (s, 3H, OCH₃), 2,59 (t, J = 7,43 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,44 (t, J = 7,43 Hz, 2H, CH2CH2COOH), 2,22 (s, 3H, CH₃); MS m/z 357 [M+lf.

Příklad 11

3- [5-(6-chlor-2-oxo-l,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-4-methyl1H-pyrrol-3-yl]-propionová kyselina

4- (2-karboxyethyl)-2-formyl-3-methylpyrrol (200 mg), 167,6 mg

6-chlor-2-oxindolu a 166 pL piperidinu ve 2 ml ethanol se zahřívají při 95°C po dobu 5 hodin. Reakční směs se ochladí a koncentruje. Zbytek se suspenduje v 6 N vodné kyselině chlorovodíkové. Precipitát se zfiltruje, promyje vodou na pH 6 a suší se ve vakuové peci, čímž se získá 246 mg (74%) požadované sloučeniny jako hnědé pevné látky.

φφ φφ φ« φφ ♦ ΦΦΦ φ φ φ φ · · « φφφ

100 φφφφ φ • φ φ φ φ • φ φ · φφφ φφ 'HNMR (360 MHz, DMSO-d₆): δ 13,22 (s, br, 1H, NH-1'), 12,09 (s, br, 1 H, COOH), 10,95 (s, br, 1H, NH-1), 7,78 (d, J = 7,95 Hz, 1H, H-4), 7,66 (s, 1H, H-vinyl), 7,18 (d, J = 2,64 Hz, 1H, H-2’), 7,01 (dd,

J = 1,90, 7,95 Hz, 1H, H-5), 6,86 (d, J = 1,90 Hz, 1H, H-7), 2,65 (t, J= 7,14 Hz , 2H, CH2CH2COOH), 2,45 (t, J = 7,14 Hz, 2H,

CH2CH2COOH), 2,26 (s, 3H, CH₃).

Příklad 12

Methyl ester 3-[4-(2-karboxyethyl)-3-methyl-lH-pyrrol-2y lmethy len]-2-oxo-2,3-dihydro -1 H-indol-5-karboxylové kyseliny

5-jod-2-oxindol (17 g) se refluxuje s 2 g paladium diacetátem, 18,2 triethylaminu, 150 ml methanolu, 15 ml dimethylsulfoxidu a 2,6 g DPPP v atmosféře oxidu uhelnatého. Po 24 hodinách se z reakční směsi zfiltruje katalyzátor a filtrát se koncentruje. Koncentrát se chromatografuje na silikagelu použitím 30% ethylacetátu v hexanu. Frakce obsahující produkt se koncentrují a ponechají se stát. Precipitovaný produkt se shromáždí vakuovou filtrací , čímž se získá 0,8 g (7 %) 5-methoxykarbonyl-2-oxindolu jako šedé pevné látky.

'HNMR (360 MHz, DMSO-d_ó) δ 10,70 (s, br, 1H, NH-1), 7,83 (dd, J = 1,77, 8,29 Hz, 1H, H-6), 7,77 (s, br, 1H, H-4), 6,89 (d, J = 8,29 (Hz, 1H, H-7), 3,80 (s, 3H, COOCH₃-5), 3,51 (s, 2H, CH₂-3).

4-(2-karboxyethyl)-2-formyl-3-methylpyrrol (90,6 mg), 88,6 mg

5-methoxykarbonyl-2-oxindolu a 75 pL piperidinu ve 2 ml ethanolu se zahřívají při 95°C po dobu 5 hodin. Reakční směs se ochladí a koncentruje. Zbytek se suspenduje v 6 N vodné kyselině chlorovodíkové. Precipitát se zfiltruje, promyje vodou na pH 6 a suší se ve vakuové peci, čímž se získá 123 mg (69%) požadované sloučeniny jako žluté pevné látky.

‘HNMR (360 MHz, DMSO-d₆): δ 13,27 (s, br, 1H, NH-1'), 12,0 (s, vbr, 1H, COOH), 11,16 (s, br, 1H, NH-1), 8,36 (s, br, 1H, H-4), 7,80 (s, 1H, H-vinyl), 7,40 (dd, J = 1,80, 8,14 Hz, 1H, H-6), 7,20 (d, J = 2,91 Hz, 1H, H-5'), 6,96 (d, J = 8,14 Hz, 1H, H-7), 3,84 (s, 3H, ·'·

9 9

9 9

101

9

9999 999

99

9 9 9

9 ·

9 9

9999 • · · • 9 9 99

COOCH₃), 2,66 (t, J = 7,55 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,46 (t, J = 7,55 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,30 (s, 3H, CH₃); MS m/z (relativní intenzita, %) 355 ( [M+l] ⁺ , 100).

Příklad 13

3-[4-(2-karboxy-ethyl)-3-methyl-lH-pyrrol-2-ylmethylen]-2-oxo2,3-dihydro-ΙΗ-indol-5-karboxy lová kyselina

2-oxindol (6,7 g) se přidá do míchané suspenze 23 g chloridu hlinitého ve 30 ml dichlorethanu v ledové lázni. Pomalu se přidá chloracetylchlorid (11,3 g) a začne se vyvíjet plynný chlorovodík. Po deseti minutách míchání se reakční směs zahřívá při 40-50°C po dobu 1,5 hodiny. Tenkovrstvá chromatografie (ethylacetát, silikagel) neukáže žádnou výchozí látku. Směs se ochladí na pokojovou teplotu a přelije se do ledové vody. Precipitát se shromáždí vakuovou filtrací, promyje vodou a suší se pod vakuem. Získá se 10,3 g (98 %) 5chloracetyl-2-oxindolu jako šedé pevné látky.

Suspenze 9,3 g 5-chloracetyl-2-oxindolu se míchá v 90 ml pyridinu při 80-90°C po dobu 3 hodiny a poté se zchladí na pokojovou teplotu. Precipitát se shromáždí vakuovou filtrací a promyje 20 ml ethanolu. Pevná látka se rozpustí v 90 ml 2,5 N hyroxidu sodného a míchá se při 70 -80°C po dobu 3 hodiny. Směs se ochladí na pokojovou teplotu a okyselí se na pH 2 pomocí 0,5 N kyseliny chlorovodíkové. Precipitát se shromáždí vakuovou filtrací a řádně se promyje vodou. Získá se surový 5-karboxy-2-oxindol jako tmavě hnědá pevná látka. Nechá se stát přes noc, čímž vzniknou 2 g 5-karboxy-2oxindol jako žluté pevné látky. Surová tmavě hnědá látka se rozpustí v horkém methanolu, nerozpustný podíl se odstraní filtrací a filtrát se koncentruje. Získá se 5,6 g 5-karboxy-2-oxindolu jako hnědé pevné látky. Spojený výtěžek činí 97 %.

'HNMR (360 MHz, DMSO-d₆) δ 12,56 (s, br, 1H, COOH-5), 10,70 (s, 1H, NH-1), 7,82 (dd, J = 1,57, 7,79 Hz, 1H, H-6), 7,74 (s, br,

ΦΦ • ·

102 • ·· φφ φφ φφ φφφφ φφφ » φ φ φ φφφ φ φφφφ φφφφ φ φ φφφ φ φ φφφ φφφ φφ φφφφ φφ φ

1Η, Η-4), 6,87 (d, J - 7,79 Hz, 1Η, Η-7), a 3,53 (s, 2H, CH₂-3). MS m/z (relativní intenzita, %) 178 ([M+l] ⁺ , 100).

4- (2-karboxyethyl)-2-formyl-3-methylpyrrol (90,6 mg), 88,6 mg

5-karboxy-2-oxindolu a 75 pL piperidinu v 2 ml ethanol se zahřívají při 95°C po dobu 5 hodin. Reakčni směs se ochladí a koncentruje. Zbytek se suspenduje v 6 N vodné kyselině chlorovodíkové. Precipitát se zfiltruje , promyje vodou na pH 6 a suší se ve vakuové peci. Surový produkt se přečistí kolonovou chromatografií na silikagelu použitím ethylacetát-hexan-octové kyseliny jako eluentu. Získá se 51 mg (30%) požadované sloučeniny jako žluté pevné látky.

‘HNMR (360 MHz, DMSO-d₆): δ 13,27 (s, br, 1H, NH-1), 12,28 (s, vbr, 2H, 2xCOOH), 11,11 (s, br, 1H, NH-1), 8,34 (d, J = 1,36 Hz,

1H, H-4), 7,78 (s, 1H, H-vinyl), 7,40 (dd, J = 1,36, 8,20 Hz, 1H, H-6), 7,19 (d, J = 3,07 Hz, 1H, H-5'), 6,93 (d, J = 8,20 Hz, 1H, H-7), 2,65 (t, J = 7,56 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,46 (t, J = 7,56 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,29 (s, 3H, CH₃); MS m/z 341,0 [M+l] ⁺ .

Příklad 14

3-[4-methy 1-5-(2-oxo-5-sulfamoyl -1,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl) -1 H-pyrrol-3-yl]-propionová kyselina

Do 100 ml baňky naplněné 27 ml kyseliny chlorsírové se pomalu přidá 13,3 g 2-oxindolu. Během přidávání se teplota reakce udržuje pod 30°C. Poté se reakčni směs míchá při pokojové teplotě po dobu 1,5 hodiny, zahřívá se při 68°C po dobu 1 hodiny, zchladí se a přelije do vody. Precipitát se promyje vodou a suší se ve vakuové peci, čímž se získá 11,0 g 5-chlorsulfonyl-2-oxindolu (50 % výtěžek), který se použije bez dalšího čištění.

5- chlorsulfonyl-2-oxindol (2,1 g) se přidá do 10 ml hydroxidu amonného v 10 ml ethanolu a míchá se při pokojové teplotě přes noc. Směs se koncentruje a pevná látka se shromáždí vakuovou filtrací. Získá se 0,4 g (20 % výtěžek) 5-aminosulfonyl-2-oxindolu jako šedé pevné látky.

« • » • · • · 'HNMR (360 MHz, DMSO-d₆); δ 10,67 (s, 1H, NH-1), 7,63-7,66 (m, 2H, H-4,6), 7,13 (s, 2H, 5-SO₂NH₂), 6,91 (d, J = 8,04 Hz, 1H, H7), a 3,56 (s, 2H, CH₂-3); MS m/z (relativní intenzita, %) 211 ( [ΜΙ]¹, 100).

4-(2-karboxyethyl)-2-formyl-3-methylpyrrol (90,6 mg), 106 mg

5-aminosulfonyl-2-oxindolu a 75 pL piperidinu ve 2 ml ethanol se zahřívají při 95°C po dobu 5 hodin. Reakční směs se ochladí a koncentruje. Zbytek se suspenduje v 6 N vodné kyselině chlorovodíkové. Precipitát se zfiltruje, promyje vodou na pH 6 a suší se ve vakuové peci. Získá se 132 mg (70%) požadované sloučeniny jako žluté pevné látky.

'HNMR (360 MHz, DMSO-d₆); δ 13,28 (s, br, 1H, NH-1'), 12,0 (s, vbr, 1H, COOH), 11,15 (s, br, 1H, NH-1), 8,20 (d, J = 1,60 Hz, 1H, H-4), 7,73 (s, 1H, H-vinyl), 7,59 (dd, J = 1,60, 8,17 Hz, 1H, H-6), 7,22 (d, J = 2,85 Hz, 1H, H-2'), 7,10 (s, 2H, NH₂), 6,98 (d, J - 8,17 Hz, 1H, H-7), 2,67 (t, J = 7,41 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,46 (t, J = 7,41 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH) a 2,29 (s, 3H, CH₃).

Příklad 15

3-[4-methyl-5-(5-methylsulfamoyl-2-oxo-1,2-dihydroindol-3ylidenmethyl) -1 H-pyrrol-3-yl]-propionová kyselina

Suspenze 3,38 g 5-chlorsulfonyl-2-oxindolu v 10 ml 2 M methylaminu v tetrahydrofuranu se míchá při pokojové teplotě po dobu 4 hodiny. Během této doby je bílá pevná látka stále přítomná. Precipitát se shromáždí vakuovou filtrací, promyje dvakrát 5 ml vody a suší se pod vakuem při 40°C přes noc. Získají se 3,0 g (88 % výtěžek) 5 - methy lam i no sul fonyl-2-oxindolu.

'HNMR (300 MHz, DMSO-d₆): δ 10,87 (s, br, 1H, NH-1), 7,86 (s, br, 1H, 5-SO₂NHCH₃), 7,61 (d, J = 7,80 Hz 1H, H-6), 7,32 (d, J = 4,67 Hz, 1H, H-4), 6,97 (d, J- 7,80 Hz, 1H, H-7), 2,53 (s, 2H, CH₂-3), a 2,36 (s, 3H, 5-SO₂NHCH₃); MS m/z (relativní intenzita, %) 226 (M⁺, 100).

104

4- (2-karboxyethyl)-2-formyl-3-methylpyrrol (90,6 mg), 113 mg

5-methylaminosulfonyl-2-oxindolu a 75 pL piperidinu ve 2 ml ethanolu se zahřívají při 95°C po dobu 5 hodin. Reakční směs se ochladí a koncentruje se. Zbytek se suspenduje v 6 N vodné kyselině chlorovodíkové. Precipitát se zfiltruje, promyje se vodou na pH 6 a suší se ve vakuové peci. Získá se 163 mg (83%) požadované sloučeniny jako žluté pevné látky.

'HNMR (360 MHz, DMSO-d₆): δ 13,30 (s, br, 1H, NH-1'), 12,0 (s, vbr, 1H, COOH), 11,19 (s, br, 1H, NH-1), 8,18 (d, J = 1,64 Hz, 1H, H-4), 7,80 (s, 1H, H-vinyl), 7,53 (dd, J = 1,64, 8,17 Hz, 1H, H-6), 7,23 (d, J = 2,80 Hz, 1H, H-2'), 7,13 (q, J = 5,15 Hz, 1H, NHCH₃), 7,02 (d, J = 8,17 Hz, 1H, H-7), 3,84 (s, 3H, COOCH₃), 2,66 (t, J 7,54 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,47 (t, J = 7,54 Hz, 2H,

CH₂CH₂COOH), 2,41 (d, J = 5,15 Hz, 3H, NCH₃), 2,30 (s, 3H, CH₃); MS m/z 390 [M+1 ] ⁺ .

Příklad 16

3-{3-[4-(2-karboxy-ethyl)-3-methyl-lH-pyrrol-2-ylmethylen]-2oxo-2,3-dihydro-lH-indol-5-yl}-propionová kyselina

5- chloracetyl-2-oxindol (4,18 g) ve 30 ml trifluoroctové kyseliny v ledové lázni se nechá působit s 4,65 g triethylsilanu a míchá se při pokojové teplotě po dobu 3 hodiny. Směs se nalije do 150 ml vody a precipitát se shromáždí vakuovou filtrací, promyje se 50 ml vody a suší se. Získá se 2,53 g (65 % výtěžek) 5-(2-chlorethyl)-2-oxindolu jako červenohnědé pevné látky.

Kyanid draselný (2,0 g) se přidá do 15 ml dimethylsulfoxidu a zahřeje se na 90°C. 5-chlorethyl-2-oxindol (3,0 g) rozpuštěný v 5 ml dimethylsulfoxidu se pomalu přidává za stálého míchání a reakce se zahřívá při 150°C po dobu 2 hodiny. Směs se ochladí, přelije se do ledové vody a precipitát se shromáždí vakuovou filtrací, promyje se vodou a suší se. Získaná surová látka se chromatografuje na silikágelu • · « ·» ·« ·· ··· · * t> · · · · • · ♦ · * · ♦

5% methanolem v chloroformu. Získá se 1,2 g (42% výtěžek) požadované sloučeniny.

5-kyanoethyl-2-oxindol (4,02 g) v 10 ml vody obsahující 25 ml koncentrované kyseliny octové se refluxuje po dobu 4 hodiny. Směs se ochladí, přidá se voda a výsledná pevná látka se shromáždí vakuovou filtrací, promyje vodou a suší se. Získá se 1,9 g (44 % výtěžek) 5-karboxyethyl-2-oxindolu jako žluté pevné látky.

‘HNMR (360 MHz, DMSO-d₆): δ 12,00 (s, br, ÍH, 5CH₂CH₂COOH), 10,21 (s, ÍH, NH-1), 7,05 (s, ÍH, H-4), 6,99 (d, J 8,68 Hz, ÍH, H-6), 6,69 (d, J = 8,68 Hz, ÍH, H-7), 3,40 (s, 2H, CH₂3), 2,74 (t, J = 7,44 Hz, 2H, 5-CH₂CH₂COOH) a 2,46 (t, J = 7,44 Hz, 2H,-CH₂CH₂COOH).

4-(2-karboxyethyl)-2-formyl-3-methylpyrrol (90,6 mg), 102,6 mg

5-karboxyethyl-2-oxindolu a 75 pL piperidinu ve 2 ml ethanolu se zahřívají při 95°C po dobu 5 hodin. Reakční směs se ochladí a koncentruje se. Zbytek se suspenduje v 6 N vodné kyselině chlorovodíkové. Precipitát se zfiltruje, promyje vodou na pH 6 a suší se ve vakuové peci přes noc. Surová pevná látka se přečistí kolonovou chromatografií na silikagelu mobilní fází ethylacetát-hexan-octová kyselina. Získá se 121 mg (66%) požadované sloučeniny jako žluté pevné látky.

'HNMR (360 MHz, DMSO-d₆): δ 13,30 (d, J = 2,38 Hz, ÍH, NH1'), 12,03 (s, vbr, 2H, 2xCOOH), 10,68 (s, br, ÍH, NH-1), 7,63 (s, ÍH, H-4), 7,59 (s, ÍH, H-vinyl), 7,12 (d, J = 2,64 Hz, ÍH, H-2'), 6,96 (dd, J = 1, 22, 7,93 Hz, ÍH, H-6), 6, 75 (d, J = 7,93 Hz, ÍH, H-7), 2,81 (t, J = 7,75Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,65 (t, J = 7,75Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,55 (t, J = 7,75 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,46 (t, J = 7,42 Hz, CH₂CH₂COOH) a 2,26 (s, 3H, CH₃).

Příklad 17

3-[5-(5-ethyl-2-oxo -1,2-dihydro-indol-3-ylidenmethyl)-4-methyllH-pyrrol-3-yl]-propionová kyselina

2-oxindol (3 g) se suspenduje v 1,2-dichlorethanu a pomalu se nechá působit s 3,2 ml acetylchloridu. Výsledná suspenze se zahřívá při 50°C po dobu 5 hodin, zchladí se a přelije se do vody. Získaný precipitát se shromáždí vakuovou filtrací, řádně se promyje vodou a suší se pod vakuem. Získá se 2,9 g (73 % výtěžek) 5-acetyl-2-oxindolu jako hnědé pevné látky.

5-acetyl-2-oxindol (2 g) v 15 ml trifluoroctové kyseliny v ledové lázni se nechá pomalu působit s 1,8 g triethylsilanu a poté se míchá při pokojové teplotě po dobu 5 hodin. Přidá se jeden ml triethylsilanu a míchání pokračuje přes noc. Reakční směs se nalije do ledové vody a výsledný precipitát se shromáždí vakuovou filtrací, řádně se promyje vodou a suší se pod vakuem. Získá se 1,3 g (71 % výtěžek) požadované sloučeniny jako žluté pevné látky.

‘HNMR (360 MHz, DMSO-d₆): δ 10,25 (s, br, NH-1), 7,03 (s, 1H, H-4), 6,97 (d, J = 8,05 Hz, 1H, H-6), 6,69 (d, J = 8,05 Hz, 1H, H7), 3,40 (s, 2H, CH₂-3), 2,51 (q, J = 7,69 Hz, 2H, CH₂CH₃-5) a 1,12 (t, J = 7,42 Hz, 3H, CH₂CH₃-5).

4-(2-karboxyethyl)-2-formyl-3-methylpyrrol (90,6 mg), 80,5 mg

5-ethyl-2-oxindolu a 75 pL piperidinu ve 2 ml ethanolu se zahřívají při 95°C po dobu 5 hodin. Reakční směs se ochladí a koncentruje se. Zbytek se suspenduje v 6 N vodné kyselině chlorovodíkové. Precipitát se zfiltruje, promyje se vodou na pH 6 a suší se ve vakuové peci přes noc. Surová pevná látka se přečistí chromatografií na silikagelu mobilní fází ethylacetát-hexan-octová kyselina. Získá se 52 mg (32%) požadované sloučeniny.

‘HNMR (360 MHz, DMSO-d₆): δ 13,31 (s, br, 1H, NH-1'), 12,04 (s, vbr, 1H, COOH), 10,66 (s, 1H, NH-1), 7,59 (s, 2H, H-4 a H-vinyl), 7,11 (d, J = 3,29 Hz, 1H, H-2’), 6,94 (d, J = 7, 85 Hz, 1H, H-6), 6,75 (d, J = 7,85 Hz, 1H, H-7), 2,65 (t, J = 7,66 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,57 (q, J = 7,83 Hz, 2H, CH₃CH₂), 2,46 (t, J = 7,66 Hz, CH₂CH₂COOH), 1,20 (t, J = 7,83, 3H, CH₃CH₂), 2,26 (s, 3H, CH₃); MS m/z 325 [M+l] ⁺ .

107 • ·

0 « 0 • 0 «

Příklad 18

3-[5-(5-methoxy-2-oxo-1,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-4methyl-ΙΗ-pyrrol-3-yl]-propionová kyselina

Chloralhydrát (9,6 g) se rozpustí ve 200 ml vody obsahující 83 g síranu sodného. Roztok se ohřeje na 60°C a přidá se roztok 11,4 g hydroxylaminhydrochloridu v 50 ml vody a směs se udržuje při 60°C. V oddělené baňce se na 80°C ohřeje 6,4 g 4-anisidinu a 4,3 ml koncentrované kyseliny chlorovodíkové v 80 ml vody . První roztok se přidá do druhého a výsledná směs se refluxuje po dobu 2 minuty, pomalu se zchladí na pokojovou teplotu a poté se zchladí v ledové lázni. Zabarvený precipitát se shromáždí vakuovou filtrací, promyje se vodou a suší se pod vakuem. Získá se 8,6 g (85% výtěžek) N-(2hydroximinoacetyl)anisidinu.

Koncentrovaná kyselina sírová (45 ml) obsahující 5 ml vody se ohřeje na 60°C a v jedné dávce se přidá 8,6 g N-(2hydroximinoacetyl)anisidinu. Míchaná směs se zahřívá při 93°C po dobu 10 minut a poté se zchladí na pokojovou teplotu. Směs se nalije do 500 g ledu a extrahuje se třikrát ethylacetátem. Spojené extrakty se suší nad bezvodým síranem sodným a koncentrují se. Získá se 5,1 g (65 % výtěžek) 5-methoxyisatinu jako tmavě červené pevné látky.

5-methoxyisatin (5,0 g) a 30 ml hydrátu hydrazinu se zahřívá na refluxu po dobu 15 minut. Reakční směs se ochladí na pokojovou teplotu a přidá se 50 ml vody. Směs se třikrát extrahuje 25 ml ethylacetátu, organické vrstvy se spojí a suší se nad bezvodým síranem sodným. Poté se koncentrují, čímž vznikne žlutá pevná látka. Pevná látka se míchá v ethylacetátu a 1,1 g nerozpustného materiálu se odstraní vakuovou filtrací a uschová se. Tato látka je 2-hydrazinokarbonylmethyl-4-anisidin. Filtrát se koncentruje a chromatografuje na silikagelu mobilní fází ethylacetát: hexan 1: 1, čímž se získá 0,7 g 5methoxy-2-oxindol jako špinavě žluté pevné látky. 1,1 g 2hydrazinokarbonylmethyl-4-anisidinu se refluxuje po dobu 1 hodiny ve 20 ml 1 N hydroxidu sodného. Směs se ochladí, okyselí se na pH 2

108 ·

•» 0 0 0 · • 000 0 0 · « 0 · · 0

0 0 0 * · · • · 0 0 0

0000 · 0 koncentrovanou kyselinou chlorovodíkovou a třikrát se extrahuje 25 ml ethylacetátu. Organické extrakty se spojí, promyjí se solankou, suší se nad bezvodým síranem sodným a koncentrují se. Získá se 0,8 g 5methoxy-2-oxindolu jako špinavě žluté pevné látky. Spojený výtěžek činí 1,5 g, což je 33 %.

'HNMR (360 MHz, DMSO-d₆): δ 10,13 (s, ÍH, NH-1), 6,84 (s, ÍH, H-4), 6,72 (d, J - 8,68 Hz, ÍH, H-6), 6,69 (d, J - 8,68 Hz, ÍH, H7), 3,68 (s, 3H, OCH₃-5), 3,41 (s, 2H, CH₂-3), MS m/z (relativní intenzita, %) 163 ( [M+l]⁺, 100).

4-(2-karboxyethyl)-2-formyl-3-methylpyrrol (90 mg), 82 mg 5methoxy-2-oxindolu a 2 kapky piperidinu ve 2 ml ethanol se zahřívají při 95°C přes noc. Reakční směs se ochladí a koncentruje se. Zbytek se suspenduje v 6 N vodné kyselině chlorovodíkové. Precipitát se zfiltruje, promyje vodou na pH 6 a suší se ve vakuové peci přes noc. Získá se 110 mg (67%) požadované sloučeniny jako hnědé pevné látky.

‘HNMR (360 MHz, DMSO-d₆): δ 13,38 (s, br, ÍH, NH-1'), 12,03 (s, vbr, ÍH, COOH), 10,57 (s, ÍH, NH-1), 7,63 (s, ÍH, H-vinyl), 7,42 (d, J = 2,46 Hz, ÍH, H-4), 7,12 (d, J = 3,08 Hz, ÍH, H-2'), 6,74 (d, J = 8,26 Hz, ÍH, H-6), 6,75 (dd, J = 2,46, 8,26 Hz, ÍH, H-7), 3,77 (s, 3H, OCH₃), 2,65 (t, J = 7,40Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,46 (t, J = 7,40 Hz, CH₂CH₂COOH), 2,27 (s, 3H, CH₃) ; MS m/z (relativní intenzita, %) 327 ( [M + l] ⁺ , 100).

Příklad 19

3-[5-(5-brom-2-oxo-l ,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-2,4dimethyl-lH-pyrrol-3-yl]-propionová kyselina

3-2-karboxyethyl)-2,4-dimethyl-5-formylpyrrol (97,5 mg), 106 mg 5-brom-2-oxindolu a 75 pL piperidinu ve 3 ml ethanolu se zahřívají při 95°C po dobu 5 hodin. Reakční směs se ochladí a koncentruje se. Zbytek se suspenduje v 6 N vodné kyselině

109 chlorovodíkové. Precipitát se zfiltruje, promyje se vodou na pH 6 a suší se ve vakuové peci přes noc. Získá se 171 mg (88%) požadované sloučeniny jako oranžové pevné látky.

‘HNMR (360 MHz, DMSO-d₆): δ 12,04 (s, vbr, 1H, COOH), 10,80 (s, br, 1H, NH-1), 8,0 (d, J = 2,06 Hz, 1H, H-4), 7,67 (s, 1H, Hvinyl), 7,19 (dd, J - 2,06, 8,40 Hz, 1H, H-6), 6,79 (d, J = 8,40 Hz, 1H, H-7), 2,65 (t, J = 7,63 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,35 (t, J - 7,63 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,29 (s, 3H, CH₃), 2,27 (s, 3H, CH₃); MS m/z (relativní intenzita, %) 389 ( [M+l]⁺ 100).

3-[5-(5-jod-2-oxo-l ,2-dihydroindol-3-ylidenmethy 1)-2,4dimethyl-lH-pyrrol-3-yl]-propionová kyselina

3-(2-karboxyethyl)-2,4-dimethyl-5-formylpyrrol (97,5 mg), 130 mg 5-jod-2-oxindolu a 75 pL piperidinu ve 3 ml ethanolu se zahřívají při 95°C po dobu 5 hodin. Reakční směs se ochladí a koncentruje se. Zbytek se suspenduje v 6 N vodné kyselině chlorovodíkové. Precipitát se zfiltruje, promyje se vodou na pH 6 a suší se ve vakuové peci přes noc. Získá se 155 mg (71%) požadované sloučeniny jako oranžové pevné látky.

'HNMR (360 MHz, DMSO-d₆): δ 13,41 (s, br, 1H, NH-1'), 12,03 (s, br, 1H, COOH), 10,79 (s, br, 1H, NH-1), 8,12 (d, J = 1,70 Hz, 1H, H-4), 7,65 (s, 1H, H-vinyl), 7,36 (dd, J = 1,70, 7,93 Hz, 1H, H-6), 6,79 (d, J - 7,93 Hz, 1H, H-7), 2,64 (t, J = 7,76 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,34 (t, J = 7,76 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,29 (s, 3H, CH₃), 2, 27 (s, 3H, CH₃); MS m/z (relativní intenzita, %) 437 ([M+l] ⁺ , 100).

Příklad 20

3-[5-(5-jod-2-oxo-l ,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-2,4dimethyl-lH-pyrrol-3-yl]-propionová kyselina

3-(2-karboxyethyl)-2,4-dimethyl-5-formylpyrrol (97,5 mg), 130 mg 5-jod-2-oxindolu a 75 pL piperidinu ve 3 ml ethanolu se míchají při 95°C po dobu 5 hodin. Reakční směs se ochladí a koncentruje se.

110 • · · · φ φ · * φ φ · φ φ φ φ

11 φ • · Φφφ φφφφ φφφ φφ φφφφ

Zbytek se suspenduje v 6 Ν vodné kyselině chlorovodíkové. Precipitát se zfiltruje, promyje se vodou na pH 6 a suší se ve vakuové peci přes noc. Získá se 155 mg požadované sloučeniny (71 %) jako oranžové pevné látky.

‘HNMR (360 MHz, DMSO-d₆): δ 13,41 (s, br, 1H, NH-1'), 12,03 (s, br, 1H, COOH), 10,79 (s, br, 1H, NH-1), 8,12 (d, J = 1,70 Hz, 1H, H-4), 7,65 (s, 1H, H-vinyl), 7,36 (dd, J = 1,70, 7,93 Hz, 1H, H-6), 6,79 (d, J = 7,93 Hz, 1H, H-7), 2,64 (t, J = 7,76 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,34 (t, J = 7,76 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,29 (s, 3H, CH₃), 2, 27 (s, 3H, CH₃), MS m/z (relativní intenzita, %) 437 ( [M+l] ⁺ , 100).

Příklad 21

3-[2,4-dimethyl-5-(4-methyl-2-oxo-1,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-lH-pyrrol-3-yl]-propionová kyselina

3-(2-karboxyethyl)-2,4-dimethyl-5-formylpyrrol (97,5 mg), 74 mg 4-methyl-2-oxindolu a 75 pL piperidinu ve 3 ml ethanolu se zahřívají při 95°C po dobu 5 hodin. Reakční směs se ochladí a koncentruje se. Zbytek se suspenduje v 6 N vodné kyselině chlorovodíkové. Precipitát se zfiltruje, promyje se vodou na pH 6 a suší se ve vakuové peci přes noc. Získá se 60 mg (37 %) požadované sloučeniny jako zelené pevné látky.

'HNMR (360 MHz, DMSO-d_ó): δ 13,41 (s, br, 1H, NH-1'), 12,03 (s, br, 1H, COOH), 10,72 (s, br, 1H, NH-1), 7,50 (s, 1H, H-vinyl), 7,01 (t, J = 7, 82 Hz, 1H, H-6), 6, 79 (d, J = 7,82 Hz, H-5), 6,74 (d, J = 7,82 Hz, 1H, H-7), 2,64 (t, J = 7,76 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,56 (s, 3H, CH₃), 2,34 (t, J = 7,76 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,29 (s, 3H, CH₃), 2,18 (s, 3H, CH₃); MS m/z (relativní intenzita, %) 325 ( [M+l] ⁺ , 100).

111

Příklad 22

3-[2,4-dimethyl-5-(5-methyl-2-oxo- l,2-dihydroindol-3ylidenmethyl)-lH-pyrrol-3-yl]-propionová kyselina

3-(2-karboxyethyl)-2,4-dimethyl-5-formylpyrrol (97,5 mg), 74 mg 5-methyl-2-oxindolu a 75 pL piperidinu ve 3 ml ethanolu se zahřívají při 95°C po dobu 5 hodin. Reakční směs se ochladí a koncentruje se. Zbytek se suspenduje v 6 N vodné kyselině chlorovodíkové. Precipitát se zfiltruje, promyje se vodou na pH 6 a suší se ve vakuové peci přes noc. Získá se 104 mg (64 %) požadované sloučeniny jako žluté pevné látky.

'HNMR (360 MHz, DMSO-d₆): δ 13,38 (s, br, 1H, NH-1'), 12,02 (s, br, 1H, COOH), 10,57 (s, br, 1H, NH-1), 7,52 (s, br, 1H, H-4), 7,50 (s, 1H, H-vinyl), 6,87 (d, J = 7,86 Hz, 1H, H6), 6,73 (d, J = 7,86 Hz, 1H, H-7), 2,63 (t, J = 7,49 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,34 (t, J = 7,49 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,29 (s, 3H, CH₃), 2,28 (s, 3H, CH₃), a 2,24 (s, 3H, CH₃); MS m/z (relativní intenzita, %) 325 ([M+1 ] ⁺ , 66).

Příklad 23

3-[5-(6-hydroxy-2-oxo -1,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-2,4dimethyl-lH-pyrrol-3-yl]-propionová kyselina

3,26 g 6-methoxy-2-oxindol v 60 ml dichlormethanu se ochladí na -2°C a po kapkách se přidá roztok 40 ml 1 M boridu bromitého. Reakční směs se míchá v ledové lázni po dobu 1 hodiny a poté při pokojové teplotě po dobu 1 hodiny. Poté se přelije do ledové vody a extrahuje ethylacetátem. Organická vrstva se promyje vodou a solankou, suší se nad bezvodým síranem sodným, koncentruje se a precipitát, který se utvoří se zfiltruje a poté se suší ve vakuové peci přes noc. Získá se 2,56 g 6-hydroxy-2-oxindolu (86% výtěžek).

'HNMR (360 MHz, DMSO-d₆): δ 10,13 (s, 1H, NH-1), 9,22 (s, 1H, OH-6), 6,93 (d, J - 7,76 Hz, 1H, H-4), 6,27-6,31 (m, 2H, H-5,7) a 3,29 (s, 2H, CH₂-3); MS m/z 150 [M+l] ⁺ .

112 φ · * · · ·«·· ««· φφ · ·· ·

3-(2-karboxyethyl)-2,4-dimethyl-5-formylpyrrol (82 mg), 63 mg 6-hydroxy-2-oxindolu a 48 pL piperidinu ve 2 ml ethanolu se zahřívají při 90°C po dobu dvou dnů. Reakčni směs se ochladí, koncentruje se a přečistí se na silikagelu kolonovou chromatografií mobilní fází ethylacetát-hexan-octová kyselina. Získá se 55 mg (40%) požadované sloučeniny jako tmavě hnědé pevné látky.

'HNMR (360 MHz, DMSO-d₆): δ 13,10 (s, br, 1H, NH-1'), 12,0 (s, vbr, 1H, COOH), 10,51 (s, br, 1H, NH-1), 9,41 (s, 1H, OH), 7,44 (d, J = 7,83,1H, H-4), 7,29 (s, 1H, H-vinyl), 6,37 (dd, J - 2,16, 7,83 Hz, 1H, H-5), 6,33 (d, J = 2,16 Hz, 1H, H-7), 2,62 (t, J = 7,75 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,32 (t, J = 7,75 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,25 (s, 3H, CH₃), 2, 20 (s, 3H, CH₃); MS m/z 325 [M+1 ] ⁺ .

Příklad 24

3-[5-(6-methoxy-2-oxo-l,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-2,4dimethyl-lH-pyrrol-3-yl]-propionová kyselina

3-(2-karboxyethyl)-2,4-dimethyl-5-formylpyrrol (97,5 mg), 82 mg 6-methoxy-2-oxindolu a 2 kapky piperidinu ve 2 ml ethanolu se zahřívají při 95°C přes noc. Reakčni směs se ochladí a koncentruje se. Zbytek se suspenduje v 2 N vodné kyselině chlorovodíkové. Precipitát se zfiltruje, promyje se vodou na pH 6 a suší se ve vakuové peci přes noc. Získá se 130 mg (76%) požadované sloučeniny jako žluté pevné látky.

'HNMR (360 MHz, DMSO-d₆): δ 13,15 (s, br, 1H, NH-1'), 11,75 (s, vbr, 1H, COOH), 10,65 (s, br, 1H, NH-1), 7,58 (d, J = 8,27,1H, H-4), 7,29 (s, 1H, H-vinyl), 6,37 (dd, J = 2,26, 8,27 Hz, 1H, H-5), 6,33 (d, J = 2,26 Hz, 1H, H-7), 3,74 (s, 3H, OCH₃), 2,62 (t, J = 7,67 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,33 (t, J = 7,67 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,26 (s, 3H, CH₃), a 2,22 (s, 3H, CH₃); MS m/z (relativní intenzita, %) 341 ( [M+l] ⁺ , 100) • ·

113

Příklad 25

3- [5-(6-hydroxy-2-oxo-l ,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-4methyl -1 H-pyrrol-3-yl]-propionová kyselina

4- (2-karboxyethyl)-2-formyl-3-methylpyrrol (543 mg), 450 mg 6-hydroxy-2-oxindolu a 450 pL piperidinu v 10 ml ethanol se zahřívají při 90°C přes noc. Reakční směs se ochladí a koncentruje se. Zbytek se suspenduje v 2 N vodné kyselině chlorovodíkové. Precipitát se zfiltruje, promyje se vodou na pH 6 a suší se ve vakuové peci přes noc. Získá se hnědá pevná látka.

‘HNMR (360 MHz, DMSO-d_ó): δ 13,05 (s, br, IH, NH-1'), 10,60 (s, br, IH, NH-1), 9,4 (s, IH, OH), 7,49 (d, J = 8,08, IH, H-4), 7,35 (s, IH, H-vinyl), 7,02 (d, J = 3,22 Hz, IH, H2'), 6,38 (dd, J = 2,28, 8,08 Hz, IH, H-5), 6,32 (d, J = 2,28 Hz, IH, H-7), 2,62 (t, J = 7,67 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,44 (t, J = 7,67 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH) a 2,21 (s, 3H, CH₃); MS m/z (relativní intenzita, %) 313 ( [M+l] ⁺ , 60).

Příklad 26

3,5-dimethoxy-benzyl ester 3-[5-(6-hydroxy-2-oxo-1,2dihydroindol-3-ylidenmethyl)-4-methyl-lH-pyrrol-3-yl]-propionové kyseliny

3-[5-(6-hydroxy-2-oxo-l ,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-4methyl-lH-pyrrol-3-yl]-propionová kyselina (100 mg), 56 mg 3,5dimethoxy-benzylchloridu a 207 mg uhličitanu draselného ve 2 ml bezvodého dimethylformamidu se zahřívají při 90°C přes noc.

Reakční směs se ochladí, přelije se do vody a extrahuje se ethylacetátem. Organická vrstva se promyje vodou a solankou, suší se nad bezvodým síranem sodným a koncentruje se. Surový produkt se přečistí kolonovou chromatografií na silikagelu mobilní fází ethylacetát-hexan-octová kyselina. Získá se 39 mg požadované sloučeniny jako hnědé pevné látky.

114 • · · ·· ·· · · ··«· · · ♦ » · * · « · * · · * · ···· ··« 9· ···· ·· ·

1HNMR (360 MHz, DMSO-d₆): δ 13,06 (s, br, 1H, NH-1’), 10,60 (s, br, 1H, NH-1), 9,4 (s, br, 1H, OH), 7,49 (d, J - 8,03, 1H, H-4), 7,35 (s, 1H, H-vinyl), 7,01 (d, J = 3,08 Hz, 1H, H-2'), 6,47 (d, J = 2,29 Hz, 2H, aromatika), 6,42 (t, J = 2,29Hz, 1H, aromatika), 6,38 (dd, J = 2,15, 8,03 Hz, 1H, H-5), 6,33 (d, J = 2,15 Hz, 1H, H-7), 5,01 (s, 2H, CH₂-F), 3,70 (s, 6H, 2xOCH₃), 2,59-2,72 (m, 4H,

CH₂CH₂COOH) a 2,20 (s, 3H, CH₃).

Příklad 27

- {5-[6-(3-methoxy-fenyl)-2-oxo-1,2-dihydroindol-3ylidenmethyl]-2,4-dimethyl-1 H-pyrrol-3-yl} -pr op i onová kyselina

Tetrakis(trifenylfosfin)paladium (0,7 g) se přidá do směsi 5 g 3methoxyfenylborité kyseliny, 3,8 g 5-brom-2-fluornitrobenzenu a 11 ml 2 M roztoku uhličitanu sodného ve 100 ml toluenu. Směs se refluxuje po dobu 2 hodiny, zředí se vodou a extrahuje se ethylacetátem. Ethylacetát se promyje saturovaným hydrogenuhliěitanem sodným a poté solankou, suší se a koncentruje se. Vznikne olejovitá pevná látka. Pevná látka se chromatografuje na silikagelu ethylacetát: hexanem (1: 6). Získá se 4,3 g (77 % výtěžek) 4-fluor-3'-methoxy-3-nitrobifenylu.

Dimethylmalonát (9,7 ml) se přidá po kapkách do 2,0 g hydridu sodného suspendovaného v 50 ml dimethylsulfoxidu. Směs se zahřívá při 100°C po dobu 35 minut a poté se zchladí na pokojovou teplotu. Přidá se 4-fluor-2'-methoxy-3-nitrobifenyl (4,2 g) v 50 ml dimethylsulfoxidu a směs se zahřívá při 100°C po dobu 1 hodiny. Reakční směs se ochladí, ustálí se roztokem 300 ml saturovaného chloridu amonného a extrahuje se dvakrát ethylacetátem. Extrakty se spojí, promyjí se solankou, suší se nad bezvodým síranem sodným a koncentrují se. Získá se surový dimethyl-3'-methoxy-3-nitrobifenyl-4malonát jako bledě žlutá pevná látka.

Surový 3'-methoxy-3-nitro-bifenyl-4-malonát se zahřívá při 110°C ve 45 ml 6 N kyseliny chlorovodíkové po dobu 4 dny a zchladí • 0 » 0

115

00·· se. Precipitát se shromáždí filtrací, promyje se vodou a hexanem a suší se. Získá se 5,3 g 3'-methoxy-2-nitrobifenyl-4-octové kyseliny jako světlehnědé pevné látky.

3'-methoxy-3-nitrobifenyl-4-octová kyselina (5,2 g) se rozpustí v methanolu a hydrogenuje se přes 0,8 g 10 % paladia na aktivním uhlí po dobu 3 hodiny při pokojové teplotě. Katalyzátor se odstraní filtrací, promyje se methanolem, filtráty se spojí a koncentrují se do vzniku hnědé pevné látky. Pevná látka se chromatografuje na silikagelu ethylacetát: hexan: octovou kyselinou 33: 66: 1. Získá se 3,0 g (75 % výtěžek založený na 4-fluor-3'-methoxy-3-nitrobifenylu) 6-(3-methoxyfenyl)-2-oxindolu jako růžové pevné látky.

'HNMR (360 MHz, DMSO-d₆): δ 10,39 (s, br, 1H, NH), 7,35 (t, J = 7,85 Hz, 1H), 7,26 (d, J = 7,78 Hz, 1H), 7,19 (dd, J = 1,22, 7,8 HZ, 1H), 7,13-7,16 (m, 1H), 7,09-7,1 (m, 1H), 7,01 (d, J = 1,48 Hz, 1H), 6,90-6,93 (m, 1H), 3,8 (s, 3H, OCH₃), 3,49 (s, 2H, CH₂); MS m/z (relativní intenzita, %) 240,0 ( [M+l] ⁺ , 100).

3-(2-karboxyethyl)-2,4-dimethyl-5-formylpyrrol (117 mg), 120 mg 6-(3-methoxyfenyl)-2-oxindolu a 3 kapky piperidinu ve 3 ml ethanolu se zahřívají při 90°C přes noc. Reakční směs se ochladí a koncentruje se. Zbytek se suspenduje v 6 N vodné kyselině chlorovodíkové. Precipitát se zfiltruje, promyje se vodou na pH 6 a suší se ve vakuové peci přes noc. Získá se 190 mg (91 %) požadované sloučeniny jako hnědé pevné látky.

'HNMR (360 MHz, DMSO-d₆): δ 13,38 (s, br, 1H, NH-1'), 12,04 (s, br, 1H, COOH), 10,79 (s, br, 1H, NH-1), 7,77 (d, J = 8,05,1H, H4), 7,58 (s, 1H, H-vinyl), 7,27 (dd, J = 1,49, 8,05 Hz, 1H, H-5), 7,09 (d, J = 1,49 Hz, 1H, H-7), 6,89-7,59 (m, 4H), 3,81 (s, 3H, OCH₃), 2,65 (t, J = 7,62 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,35 (t, J = 7,62 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,30 (s, 3H, CH₃) a 2,27 (s, 3H, CH₃); MS m/z (relativní intenzita, %) 417 ( [M+l] ⁺ ,75).

• ·

116 » 4 44

4

4

4

4444 444

4 4

4444

Příklad 28

3- [5-(6-brom-2-oxo-l ,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-4-methyl1 H-pyrrol -3-yl]-prop i on ová kyselina

Dimethylmalonát (13 ml) se přidá po kapkách do 2,7 g hydridu sodného suspendovaného ve 20 ml dimethylsulfoxidu. Směs se zahřívá při 100°C po dobu 10 minut a zchladí se na pokojovou teplotu. Přidá se 5-brom-2-fluornitrobenzen (5,0 g) ve 25 ml dimethylsulfoxidu a směs se zahřívá při 100°C po dobu 2 hodiny. Reakční směs se ochladí a ustálí se roztokem 300 ml saturovaného chloridu amonného a extrahuje třikrát ethylacetátem. Extrakty se spojí, promyjí se saturovaným chloridem amonným, vodou a solankou, suší se nad bezvodým síranem sodným a koncentrují se. Získá se surový dimethyl4-brom-2-nitrofenylmalonát jako bledě žlutý olej.

Surový dimethyl-4-brom-2-nitrofenylmalonát se zahřívá při 110°C ve 40 ml 6 N kyseliny chlorovodíkové po dobu 24 hodiny a zchladí se. Precipitát se shromáždí filtrací, promyje se vodou a suší se. Získá se 5,3 g (89 % výtěžek) 4-brom-2-nitrofenyloctové kyseliny jako šedé pevné látky.

4- brom-2-nitrofenyloctová kyselina 0,26 g), 0,26 g zinkového prášku a 3 ml 50 % kyseliny sírové v 5 ml ethanolu se zahřívají při 100°C přes noc. Reakční směs se zfiltruje, zředí se malým množstvím kyseliny octové, koncentruje se, čímž se odstraní ethanol, zředí se vodou a extrahuje se dvakrát ethylacetátem. Spojené extrakty se promyjí solankou, suší se nad bezvodým síranem sodným a koncentrují se. Získá se 0,19 g (90 % výtěžek) 6-brom-2-oxindolu jako žluté pevné látky.

‘HNMR (360 MHz, DMSO-d₆): δ 10,45 (s, br, 1H, NH-1), 7,14 (d, J = 7,89 Hz, 1H, H-4), 7,09 (dd, J - 1,53, 7,89 Hz, 1H, H-5), 6,93 (d, J = 1,53 Hz, 1H, H-7) a 3,43 (s, 2H, CH₂-3); MS m/z (relativní intenzita, %) 210 ( [M-2] ⁺ , 100) a 212 (M⁺, 100).

4-(2-karboxyethyl)-2-formyl-3-methylpyrrol (90 mg), 106 mg 6brom-2-oxindol a 3 kapky piperidinu ve 3 ml ethanolu se zahřívají při

117 flfl · flfl flfl flfl flflflfl · · · · flflfl • · flfl flflfl fl · flflfl flfl • flflfl flflfl flfl flflflfl flfl fl

90°C po dobu 4 hodiny. Reakční směs se ochladí a koncentruje se. Zbytek se suspenduje v 6 N vodné kyselině chlorovodíkové. Precipitát se zfiltruje, promyje se vodou na pH 6 a suší se ve vakuové peci přes noc. Získá se 172 mg (92%) požadované sloučeniny jako žluté pevné látky.

'HNMR (360 MHz, DMSO-d₆): δ 13,22 (s, br, 1H, NH-1'), 12,04 (s, br, 1H, COOH), 10,92 (s, br, 1H, NH-1), 7,73 (d, J = 8,37,1H, H4), 7,67 (s, 1H, H-vinyl), 7,18 (d, J = 3,22 Hz, 1H, H-2’), 7,14 (dd, J = 1,33, 8,37 Hz, 1H, H-5), 6,99 (d, J = 1,33 Hz, 1H, H-7), 2,64 (t, J = 7,39 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,46 (t, J = 7,39 Hz, 2H,

CH2CH2COOH), 2,25 (s, 3H, CH₃); MS (APCI) m/z 375,0 [M+l] ⁺ .

Příklad 29

- {5-[6-(3-methoxy-fenyl)-2-oxo -1,2-dihydroindol-3ylidenmethyl]-4-methyl -1 H-pyrrol-3-yl}-propionová kyselina

4-(2-karboxyethyl)-2-formyl-3-methylpyrrol (90,5 mg), 120 mg 6-(3-methoxyfenyl)-2-oxindolu a 3 kapky piperidinu ve 3 ml ethanolu se zahřívají při 90°C přes noc. Reakční směs se ochladí a koncentruje se. Zbytek se suspenduje v 6 N vodné kyselině chlorovodíkové. Precipitát se zfiltruje, promyje se vodou na pH 6 a suší se ve vakuové peci přes noc. Získá se 195 mg (97%) požadované sloučeniny jako hnědé pevné látky.

'HNMR (360 MHz, DMSO-d₆): δ 13,29 (s, br, 1H, NH-1'), 12,07 (s, br, 1H, COOH), 10,88 (s, br, 1H, NH-1), 7,82 (d, J = 7,77 Hz, 1H, H-4), 7,65 (s, 1H, H-vinyl), 7,27 (dd, J = 1,41, 7,77 Hz, 1H, H-5), 7,09 (d, J = 1,41 Hz, 1H, H-7), 6,89-7,36 (m, 5H), 3,82 (s, 3H, OCH₃), 2,65 (t, J = 7,55 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,47 (t, J = 7,55 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,27 (s, 3H, CH₃); MS (APCI) m/z 401 [M-l] ⁺ .

9999 9 99 9 9 99 • 9 9 9 9 9 9

ΙΟ 9 99999999

1 Ο 9 9999 99

9999 999 99 9999 99 9

Příklad 30

3-5-[6-(3-ethoxy-fenyl)-2-oxo -1,2-dihydroindol-3ylidenmethyl]-2,4-dimethyl-1 H-pyrrol-3-yl}-propionová kyselina

Tetrakis(trifenylfosfin)paladium (0,8 g) se přidá do směsi 4,2 g 3-ethoxyfenylborité kyseliny, 5,0 g 5-brom-2-fluornitrobenzenu a 22 ml 2 M roztoku uhličitanu sodného v 50 ml toluenu a 50 ml ethanolu. Směs se refluxuje po dobu 2 hodiny a poté se koncentruje. Přidá se voda a směs se extrahuje dvakrát ethylacetátem. Spojené ethylacetátové vrstvy se promyjí vodou a solankou, poté se suší a koncentrují. Zbytek se chromatografuje na silikagelu 5 % ethylacetátem v hexanu. Získá se 5,3 g (90 % výtěžek) surového 4fluor-3'-ethoxy-3-nitrobifenylu jako žlutého oleje.

Dimethylmalonát (11,4 ml) se přidá po kapkách do 4,0 g hydridu sodného suspendovaného ve 20 ml dimethylsulfoxidu. Směs se zahřívá při 100°C po dobu 10 minut a zchladí se na pokojovou teplotu. Přidá se surový 4-fluor-3'-ethoxy-3-nitrobifenyl (5,3 g) ve 25 ml dimethylsulfoxidu a směs se zahřívá při 100°C po dobu 2 hodiny. Reakční směs se ochladí, ustálí se roztokem 300 ml saturovaného chloridu amonného a extrahuje třikrát ethylacetátem. Spojené extrakty se promyjí vodou a solankou, suší se nad bezvodým síranem sodným a koncentrují se. Získá se surový dimethyl-3'-ethoxy-3-nitrobifenyl-4malonát jako žlutý olej.

Surový dimethyl-3'-ethoxy-3-nitrobifenyl-4-malonát se zahřívá při 100°C v 60 ml 6 N kyseliny chlorovodíkové celkem 4 dny a zchladí se. Precipitát se shromáždí filtrací, promyje se vodou a hexanem a suší se. Získá se 4,7 g (77 % výtěžek založený na 5-brom-2fluornitrobenzenu) surové 3'-ethoxy-3-nitrobifenyl-4-octové kyseliny jako světlehnědé pevné látky.

Železné úlomky (2,4 g) se přidají v jedné dávce do 4,6 g 3'ethoxy-3-nitrobifenyl-4-octové kyseliny ve 40 ml ledové kyselině octové a směs se refluxuje po dobu 2 hodiny. Reakční směs se koncentruje do sucha, znovu se nechá působit s ethylacetátem a

119

ΦΦΦ · φφ φφφφ zfiltruje se nerozpustný materiál. Filtrát se promyje dvakrát 1 N kyselinou chlorovodíkovou a poté solankou, suší se nad bezvodým síranem sodným a koncentruje se. Získá se 3,5 g (91 % výtěžek) 6-(3ethoxyfenyl)-2-oxindolu jako hnědé pevné látky.

'HNMR (360 MHz, DMSO-d₆): δ 10,4 (s, br, 1H, NH), 7,33 (t, J = 8,4 Hz, 1H, H-3'), 7,35 (d, J = 7,77 Hz, 1H), 7,19 (dd, J = 1,3, 7,66 HZ, 1H), 7,13 (d, J = 7,69 Hz, 1H), 7,07-7,08 (m, 1H), 7,0 (s, br, 1H), 6,9 (dd, J = 2,82, 8,08 Hz, 1H), 4,08 (q, J = 7 Hz, 2H, OEt), 3,49 (s, 2H, CH2), 1,34 (t, J = 7Hz, 3H, OEt); MS m/z (relativní intenzita, %) 254,2 ([M+l]⁺, 100).

3-(2-karboxyethyl)-2,4-dimethyl-5-formylpyrrol (97,6 mg), 127 mg 6-(3-ethoxyfenyl)-2-oxindol a 2 kapky piperidinu ve 2 ml ethanolu se zahřívají při 90°C přes noc. Reakční směs se ochladí a koncentruje se. Zbytek se suspenduje v 6 N vodné kyselině chlorovodíkové. Precipitát se zfiltruje, promyje se vodou na pH 6 a suší se ve vakuové peci přes noc. Získá se 227 mg požadované sloučeniny (-100%) jako hnědé pevné látky.

'HNMR (360 MHz, DMSO-d₆): δ 13,38 (s, br, 1H, NH-1'), 12,06 (s, br, 1H, COOH), 10,81 (s, br, 1H, NH-1), 7,77 (d, J = 7,97,1H, H4), 7,58 (s, 1H, H-vinyl), 7,26 (dd, J = 1,35, 7,97 Hz, 1H, H-5), 7,08 (d, J = 1,35 Hz, 1H, H-7), 6,87-7,36 (m, 4H), 4,09 (q, J = 7,0 Hz, 2H, CH₃CH₂), 2,65 (t, J = 7,54 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,47 (t, J = 7,54 Hz, 2H, CH2CH2COOH), 2,30 (s, 3H, CH₃), 2,26 (s, 3H, CH₃), 1, 34 (t, J = 7,0 Hz, 3H, CH3CH3); MS m/z (relativní intenzita, %) 431 ( [M+l] ⁺ , 21).

Příklad 31

- {5-[6-(3-ethoxy-fenyl)-2-oxo -1,2-dihydroindol-3ylidenmethyl]-4-methyl - lH-pyrrol-3-yl}-propionová kyselina

4-(2-karboxyethyl)-2-formyl-3-methylpyrrol (90,5 mg), 127 mg 6-(3-ethoxyfenyl)-2-oxindol a 2 kapky piperidinu ve 2 ml ethanolu se zahřívají při 90°C přes noc. Reakční směs se ochladí a koncentruje se.

120

ΦΦ φ φφ φφ φφφφ φφφ • φ φ » * φφφφ φ φ φ φφφ φφφφ φφφ φφ φφφ φφφ φ φ

Zbytek se suspenduje v 6 Ν vodné kyselině chlorovodíkové. Precipitát se zfiltruje, promyje se vodou na pH 6 a suší se ve vakuové peci přes noc. Získá se 200 mg (96 %) požadované sloučeniny jako hnědé pevné látky.

'HNMR (360 MHz, DMSO-d₆): δ 13,29 (s, br, 1H, NH-1'), 12,07 (s, vbr, 1H, COOH), 10,88 (s, br, 1H, NH-1), 7,82 (d, J = 7,97,1H, H4), 7,65 (s, 1H, H-vinyl), 7,28 (dd, J - 1,20, 7,97 Hz, 1H, H-5), 7,08 (d, J = 1,20 Hz, 1H, H-7), 6,87 - 7,36 (m, 5H), 4,09 (q, J = 6,98 Hz, 2H, CH3CH2), 2, 65 (t, J = 7,47 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,47 (t, J = 7,47 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,27 (s, 3H, CH₃), 1,34 (t, J = 6,98Hz, 3H, CH₃CH₂).

Příklad 32

3-[2,4-di methy 1-5-(2-oxo-6-fenyl -1,2-dihydroindol-3ylidenmethyl)-lH-pyrrol-3-yl]-propionová kyselina

Tetrakis(trifenylfosfin)paladium (0,8 g) se přidá do směsi 3,1 g benzenborité kyseliny, 5 g 5-brom-2-fluornitrobenzenu a 22 ml 2 M roztoku uhličitanu sodného v 50 ml toluenu a 50 ml ethanolu. Směs se refluxuje po dobu 2 hodiny, koncentruje se a zbytek se extrahuje dvakrát ethylacetátem. Ethylacetátová vrstva se promyje vodou a solankou, suší se a koncentruje se. Vznikne žlutý olej. Olej se chromatografuje na silikagelu 5 % ethylacetátem v hexanu. Získá se 4,75 g (96 % výtěžek) 4-fluor-3-nitrobifenylu jako žlutého oleje.

Dimethylmalonát (10 ml) ve 25 ml dimethylsulfoxid se přidá po kapkách do 3,5 g hydridu sodného suspendovaného ve 25 ml dimethylsulfoxidu a směs se zahřívá při 100°C po dobu 10 minut. Směs se ochladí na pokojovou teplotu a přidá se 4,7 g 4-fluor-3nitrobifenylu ve 25 ml dimethylsulfoxidu. Směs se zahřívá při 100°C po dobu 2 hodiny, zchladí se a ustálí se roztokem 300 ml saturovaného chloridu amonného. Směs se třikrát extrahuje ethylacetátem a spojené organické vrstvy se promyjí vodou a solankou a odpaří se. Vznikne žlutý olej, surový dimethyl-3-nitrobifenyl-4-malonát.

121 ·· » ·« ·· • * · · 9 · · · • · · · · • ♦ · · · » • 9 9 9 9

999 9 999 99 999 9

Surový dimethyl-3-nitrobifenyl-4-malonát se refluxuje ve 30 ml 6 N kyseliny chlorovodíkové po dobu 24 hodiny. Precipitát se shromáždí filtrací, promyje vodou a suší se. Získá se 4,5 g (80 % založený na 4-fluor-3-nitrobifenylu) 3-nitrobifenyl-4-octová kyseliny jako krémově zbarvené pevné látky.

V jedné dávce se přidají železné úlomky (2,6 g) do 4,5 g 3nitrobifenyl-4-octové kyseliny ve 40 ml kyseliny octové. Směs se refluxuje po dobu 2 hodiny, koncentruje se do sucha a vloží do ethylacetátu. Pevné látky se odstraní filtrací a filtrát se dvakrát promyje 1 N kyselinou chlorovodíkovou a solankou a suší nad bezvodým síranem sodným. Filtrát se koncentruje, čímž vznikne 3,4 g (93 % výtěžek) 6-fenyl-2-oxindolu jako světlehnědé pevné látky.

‘HNMR (360 MHz, DMSO-d₆): δ 10,4 (s, br, 1H, NH-1), 7,57-7,6 (m, 2H), 7,42 - 7,46 (m, 2H), 7,32 - 7,37 (m, 1H), 7,27 (d, J = 7,7, 1H, H-4), 7,19 (dd, J = 1,6,7,7Hz, 1H, H-5), 7,01 (d, J = 1,6Hz, 1H, H-7), 3,49 (s, 2H, CH2); MS m/z (relativní intenzita, %) 210 ([M+lf, 100).

3-(2-karboxyethyl)-2,4-dimethyl-5-formylpyrrol (97,6 mg), 105 mg 6-fenyl-2-oxindolu a 2 kapky piperidinu ve 2 ml ethanolu se zahřívají při 90°C přes noc. Reakční směs se ochladí a koncentruje se. Zbytek se suspenduje v 6 N vodné kyselině chlorovodíkové. Precipitát se zfiltruje, promyje se vodou na pH 6 a suší se ve vakuové peci přes noc. Získá se 138 mg (71 %) požadované sloučeniny jako hnědé pevné látky.

'HNMR (360 MHz, DMSO-d₆): δ 13,38 (s, br, 1H, NH-1'), 12,05 (s, br, 1H, COOH), 10,81 (s, br, 1H, NH-1), 7,78 (d, J = 7,84,1H, H4), 7,58 (s, 1H, H-vinyl), 7,25 - 7,63 (m, 6H), 7,09 (s, br, 1H, H-7), 2,64 (t, J = 7,71 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,35 (t, J = 7,71 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,30 (s, 3H, CH₃) a 2,26 (s, 3H, CH₃); MS m/z (relativní intenzita, %) 387 ([M+l] ⁺ , 100).

122 ·* · «9 ·· ·· # * » » 9 9 9 9 9 9 9 • 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9

9999 999 99 9999 99 9

Příklad 33

3- [4-methyl-5-(2-oxo-6-fenyl-l ,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)1 H-pyrro 1-3-yl]-propionová kyselina

4- (2-karboxyethyl)-2-formyl-3-methylpyrrol (90,5 mg), 105 mg 6-fenyl-2-oxindolu a 2 kapky piperidinu ve 2 ml ethanol se zahřívají při 90°C přes noc. Reakční směs se ochladí a koncentruje se. Zbytek se suspenduje v 6 N vodné kyselině chlorovodíkové. Precipitát se zfiltruje, promyje se vodou na pH 6 a suší se ve vakuové peci přes noc. Získá se 146 mg (78 %) požadované sloučeniny jako hnědé pevné látky.

'HNMR (360 MHz, DMSO-d₆): δ 13,29 (s, br, 1H, NH-1'), 12,01 (s, vbr, 1H, COOH), 10,89 (s, br, 1H, NH-1), 7,83 (d, J = 7,92,1H, H4), 7,65 (s, 1H, H-vinyl), 7,30 - 7,65 (m, 5H), 7,16 (d, J = 2,83 Hz, 1H, H-2'), 7,28 (dd, J = 1,58, 7,92 Hz, 1H, H-5), 7,09 (d, J = 1,58 Hz, 1H, H-7), 2,66 (t, J = 7,76 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,45 (t, J = 7,76 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), a 2,27 (s, 3H, CH₃); MS m/z (relativní intenzita, %) 373 ( [M+l]⁺, 100).

Příklad 34

3-5-[6-(4-methoxy-fenyl)-2-oxo -1,2-dihydroindol-3ylidenmethyl]-4-methyl -1 H-pyrrol-3-yl}-propionová kyselina

Tetrakis(trifenylfosfin)paladium (1 g) se přidá do směsi 5 g 4methoxyfenylborité kyseliny, 6,6 g 5-brom-2-fluornitrobenzenu a 30 ml 2 M roztoku uhličitanu sodného v 50 ml toluenu a 50 ml ethanolu. Směs se refluxuje po dobu 2 hodiny, koncentruje se a zbytek se extrahuje dvakrát ethylacetátem. Ethylacetátová vrstva se promyje vodou a solankou, suší se a koncentruje se. Získá se hnědá olejovitá látka. Tato látka se chromatografuje na silikagelu 5 % ethylacetátem v hexanu. Získá se surový 4-fluor-4'-methoxy-3- nitrobifenyl jako bledě žlutá pevná látka.

Dimethylmalonát (10 ml) se přidá po kapkách do 2,0 g hydridu sodného suspendovaného v 60 ml dimethylsulfoxidu. Směs zahřívá při

123 ·· · ·* ·9 ·· • · ·· · · · · ··· • · · · · · · • · · · · ···· • · · · · · 9

9··Φ ··· 9· ···· ·· ·

100°C po dobu 10 minut a zchladí se na pokojovou teplotu. Přidá se surový 4-fluor-2'-methoxy-3-nitrobifenyl (5,2 g) v 50 ml dimethylsulfoxidu a směs se zahřívá při 100°C po dobu 2 hodiny. Reakční směs se ochladí, ustálí se roztokem 300 ml saturovaného chloridu amonného a extrahuje se třikrát ethylacetátem. Spojené extrakty se promyjí saturovaným chloridem amonným, vodou a solankou, suší nad bezvodým síranem sodným a koncentrují se. Získá se surový dimethyl-4'-methoxy-3-nitrobifenyl-4-malonát jako žlutý olej.

Surový 4'-methoxy-3-nitrobifenyl-4-malonát se zahřívá při 100° C v 60 ml 6 N kyseliny chlorovodíkové po dobu 15 hodiny a zchladí se. Utvořený precipitát se shromáždí filtrací, promyje se vodou a hexanem a suší se. Získá se 7,2 g surového 4'-methoxy-3-nitrobifenyl4-octové kyseliny jako světle nahnědlé pevné látky.

Železné úlomky (3,6 g) se přidají v jedné dávce do 7,2 g 4'methoxy-3-nitrobifenyl-4-octové kyseliny v 50 ml ledové kyseliny octové a zahřívá se při 100°C přes noc. Reakční směs se koncentruje do sucha, sonikuje se v ethylacetátu a filtrací se odstraní nerozpustný materiál. Filtrát se promyje dvakrát 1 N kyselinou chlorovodíkovou, poté solankou, suší nad bezvodým síranem sodným a koncentruje se. Získá se 2,7 g (54 % výtěžek založený na 5-brom-2-fluornitrobenzenu) 6-(4-methoxyfenyl)-2-oxindolu jako růžově zbarvené pevné látky.

‘HNMR (360 MHz, DMSO-d₆): δ 10,38 (s, br, 1H, NH-1), 7,52 (d, J = 9 Hz, 2H,), 7,23 (d, J = 7,3 Hz, 1H, H-4), 7,14 (d, d, J = 1,38, 7,3Hz, 1H, H-5), 7,0 (d, J = 9 Hz, 2H), 6,96 (d, J = 1,38 Hz, 1H, H-7), 3,78 (s, 3H, OCH3), 3,47 (s, 2H, CH₂); MS m/z (relativní intenzita, %) 214,0 ( [M+l ] ⁺ , 100).

4-(2-karboxyethyl)-2-formyl-3-methylpyrrol (90,5 mg), 120 mg 6-(4-methoxyfenyl)-2-oxindolu a 3 kapky piperidinu ve 2 ml ethanolu se zahřívají při 90°C přes noc. Reakční směs se ochladí a koncentruje se. Zbytek se suspenduje v 6 N vodné kyselině chlorovodíkové. Precipitát se zfiltruje, promyje se vodou na pH 6 a suší se ve vakuové

124 peci přes noc. Získá se 118 mg (59 %) požadované sloučeniny jako hnědé pevné látky.

‘HNMR (360 MHz, DMSO-d₆) : δ 13,26 (s, br, ÍH, NH-1'), 10,83 (s, br, ÍH, NH-1), 7,78 (d, J = 8,07 Hz, ÍH, H-4), 7,61 (s, ÍH, Hvinyl), 7,56 (d, J - 8,97 Hz, 2H), 7, 22 (dd, J = 1,44, 8,07 Hz, ÍH, H5), 7,13 (d, J - 3,09 Hz, ÍH, H-2’), 7,04 (d, J - 1,44 Hz, ÍH, H-7), 7,0 (d, J = 8,97 Hz, 2H), 3,79 (s, 3H, OCH₃), 2,65 (t, J = 7,54 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,44 (t, J = 7,54 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), a 2,27 (s, 3H, CH₃); MS m/z, (relativní intenzita, %) 404 ( [M+l] ⁺ , 100).

Příklad 35

3-{5-[6-(4-methoxy-fenyl)-2-oxo-l ,2-dihydroindol-3ylidenmethyl]-2,4-dimethyl -1 H-pyrrol-3-yl}-propionová kyselina

3-(2-karboxyethyl)-2,4-dimethyl-5-formylpyrrol (98 mg), 120 mg 6-(4-methoxyfenyl)-2-oxindolu a 3 kapky piperidinu ve 2 ml ethanolu se zahřívají při 90°C přes noc. Reakční směs se ochladí a koncentruje se. Zbytek se suspenduje v 6 N vodné kyselině chlorovodíkové. Precipitát se zfiltruje, promyje s vodou na pH 6 a suší se ve vakuové peci přes noc. Získá se 118 mg (57 %) požadované sloučeniny jako hnědé pevné látky.

‘HNMR (360 MHz, DMSO-d₆): δ 13,35 (s, br, ÍH, NH-1’), 12,02 (s, br, ÍH, COOH), 10,75 (s, br, ÍH, NH-1), 7,73 (d, J = 6,75 Hz, ÍH, H-4), 7,56 (d, J = 9, 01 Hz, 2H), 7,54 (s, ÍH, H-vinyl) , 7,21 (dd, J = 1,59, 6,75 Hz, ÍH, H-5), 7,04 (d, J = 1,59 Hz, ÍH, H-7), 7,01 (d, J = 9,01 Hz, 2H), 3,79 (s, 3H, OCH₃ ), 2,65 (t, J = 7,54 Hz, 2H, CH₂CH2COOH), 2,35 (t, J = 7,54 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,29 (s, 3H, CH₃), a 2,26 (s, 3H, CH₃); MS m/z (relativní intenzita, %) 417 ([M+l] ⁺ , 100).

125

Příklad 36

3-5-[6-(2-methoxy-fenyl)-2-oxo-1,2-dihydroindol-3yliden methyl]-4-methyl -1 H-pyrrol-3-yl} -pr opi onová kyselina

Tetrakis(trifenylfosfin)paladium (1 g) se přidá do směsi 5 g 2methoxyfenylborité kyseliny, 6,6 g 5-brom-2-fluornitrobenzenu a 30 ml 2 M roztoku uhličitanu sodného v 50 ml toluenu a 50 ml ethanolu. Směs se refluxuje po dobu 2 hodiny, koncentruje se a zbytek se extrahuje dvakrát ethylacetátem. Spojené ethylacetátové vrstvy se promyjí vodou a solankou, suší se a koncentrují se. Získá se tmavě zelený olej, který stáním tuhne na surový 4-fluor-2'-methoxy-3nitrobifenyl.

Dimethylmalonát (14 ml) se přidá po kapkách do 2,9 g hydridu sodného suspendovaného v 50 ml dimethylsulfoxidu. Směs se zahřívá při 100°C po dobu 15 minut a zchladí se na pokojovou teplotu.

Přidá se surový 4-fluor-2'-methoxy-3-nitrobifenyl v 60 ml dimethylsulfoxidu a směs se zahřívá při 100°C po dobu 2 hodiny. Reakční směs se ochladí, ustálí se roztokem 300 ml saturovaného chloridu amonného a extrahuje dvakrát ethylacetátem. Spojené extrakty se promyjí saturovaným chloridem sodným, vodou, solankou a suší nad bezvodým síranem sodným. Koncentrují se, čímž se získá surový dimethyl-2'-methoxy-3-nitrobifenyl-4-malonát jako žlutý olej.

Surový 2'-methoxy-3-nitrobifenyl-4-malonát se zahřívá při 100°C v 50 ml 6 N kyseliny chlorovodíkové po dobu 24 hodiny a zchladí se. Precipitát se shromáždí filtrací, promyje se vodou, hexanem a suší se. Získá se 9,8 g 2'-methoxy-2-nitrobifenyl-4-octové kyseliny jako světlehnědé pevné látky.

Železné úlomky (5 g) se přidají v jedné dávce do 9,8 g 2'methoxy-3-nitrobifenyl-4-octové kyseliny v 50 ml ledové kyseliny octové a směs se zahřívá při 100°C po dobu 3 hodiny. Reakční směs se koncentruje do sucha, sonikuje se v ethylacetátu a filtrací se odstraní nerozpustný materiál. Filtrát se promyje dvakrát 1 N kyselinou chlorovodíkovou, vodou, solankou a suší se nad bezvodým síranem

126

sodným a koncentruje se. Zbytek se chromatografuje na silikagelu ethylacetát : hexanem 1: 2. Získá se 5,4 g (69 % výtěžek založený na

5- brom-2-fluornitrobenzenu) 6-(2-methoxyfenyl)-2-oxindolu jako růžově zbarvené pevné látky.

‘HNMR (360 MHz, DMSO-d₆): δ 10,32 (s, br, 1H, NH), 7,297,34 (m, 1H), 7,19 -7,25 (m, 2H), 7,08 (d, J = 8Hz, 1H, H-4), 6,97 7,02 (m, 2H), 6,91 (d, J = 1,05 Hz, 1H, H-7), 3,8 (s, 3H, OCH₃), 3,47 (s, 2H, CH₂); MS m/z (relativní intenzita, %) 239,8 (100, [M+l]⁺).

4-(2-karboxyethyl)-2-formyl-3-methylpyrrol (217 mg), 239 mg

6- (2-methoxyfenyl)-2-oxindolu a 3 kapky piperidinu ve 2 ml ethanolu se zahřívají při 90°C přes noc. Reakčni směs se ochladí a koncentruje se. Zbytek se suspenduje v 6 N vodné kyselině chlorovodíkové. Precipitát se zfiltruje, promyje se vodou na pH 6 a suší se ve vakuové peci přes noc. Získá se 348 mg (86 %) požadované sloučeniny jako hnědé pevné látky.

'HNMR (360 MHz, DMSO-d₆): δ 13,29 (s, br, 1H, NH-1'), 11,59 (s, br, 1H, COOH), 10,78 (s, br, 1H, NH-1), 7,75 (d, J = 8,13 Hz, 1H, H-4), 7,62 (s, 1H, H-vinyl), 7,0-7,34 (m, 7H), 3,76 (s, 3H, OCH₃), 2,66 (t, J = 7,46 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,46 (t, J = 7,46 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH) a 2,27 (s, 3H, CH₃); MS m/z (relativní intenzita, %) 401 ( [M + l] ⁺ , 100).

Příklad 37

3-5-[6-(2-methoxy-fenyl)-2-oxo-l ,2-dihydroindol-3ylidenmethyl]-2,4-dimethyl-lH-pyrrol-3-yl}-propionová kyselina

3-(2-karboxyethyl)-2,4-dimethyl-5-formylpyrrol (234 mg), 239 mg 6-(2-methoxyfenyl)-2-oxindolu a 3 kapky piperidinu ve 2 ml ethanolu se zahřívají při 90°C přes noc. Reakčni směs se ochladí a koncentruje se. Zbytek se suspenduje v 6 N vodné kyselině chlorovodíkové. Precipitát se zfiltruje, promyje se vodou na pH 6 a suší se ve vakuové peci přes noc.

127 ··· ·

Surová pevná látka se přečistí kolonovou chromatografií na silikagelu mobilní fází ethylacetát : hexan 1: 1 obsahující 0,1 % kyseliny octové. Získá se 182 mg (44 %) požadované sloučeniny jako hnědé pevné látky.

‘HNMR (360 MHz, DMSO-d₆): δ 13,38 (s, br, 1H, NH-1’), 12,0 (s, br, 1H, COOH), 10,7 (s, br, 1H, NH-1), 7,71 (d, J = 7,74 Hz, 1H, H-4), 7,55 (s, 1H, H-vinyl), 7,0-7,33 (m, 6H), 3,76 (s, 3H, OCH₃), 2,65 (t, J = 7,6 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,35 (t, J = 7,6 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,3 (s, 3H, CH₃), a 2,26 (s, 3H, CH₃); MS (APCI neg) m/z (relativní intenzita, %) 415 ([M-l], 100).

Příklad 38

3-[2,4-dimethyl-5-(6-morfolin-4-yl-2-oxo -1,2-dihydroindol-3ylidenmethyl) -1 H-pyrrol-3-yl]-propionová kyselina

Dihydrát chloridu cínu (225 g) se přidá do roztoku 2,4dinitrofenyloctové kyseliny (22,6 g) v ethanolu (450ml). Směs se zahřívá při 90°C po dobu 10 hodin. Reakční směs se ochladí a 12 M hydroxidem sodným se upraví pH na 11. Pevné látky se odstraní filtrací a filtrát se koncentruje. Zbytek se nechá působit s ethanolem (300 ml). Nerozpustné látky se zfiltrují a promyjí ethanolem (5x 60ml). Spojené ethanolové podíly se odpaří a suší se pod vakuem. Získá se 15g 6-amino-2-oxindolu jako hnědého prášku.

‘HNMR (360 MHz, DMSO-d₆): δ 10,03 (s, br, NH), 6,78 (d, J = 8,55 Hz, 1H, H-4), 6,09-6,11 (m, 2H), 4,95 (s, br, 2H, NH₂), 3,22 (s, 2H, H-3); MS (+ APCI) m/z (relativní intenzita, %) 147 ([ΜΙ ] ⁺ , 100).

6-amino-2-oxindol (2,2 g), 4,0 g 2,2'-dibromethyletheru a 7,9 g uhličitanu sodného se refluxují přes noc ve 20 ml ethanol, koncentrují se a zředí se 50 ml vody. Směs se extrahuje třikrát 50 ml ethylacetátu, organické extrakty se spojí , promyjí se 20 ml solanky, suší nad bezvodým síranem sodným a koncentrují se do sucha. Pevná látka se chromatografuje na sloupci silikagelu mobilní fází ethylacetát

128 : hexan 1: 1 obsahující 0,7 % kyseliny octové. Získá se 1,2 g (37 % výtěžek) 6-(morfolin-4-yl)-2-oxindolu jako béžové pevné látky.

HNMR (360 MHz, DMSO-d6): δ 10,2 (s, br, 1H, NH-1), 7,02 (d, J = 7,87 Hz, 1H, H-4), 6,47 (dd, J = 2,11, 7,87 Hz, 1H, H5), 6,37 (d, J = 2,11 Hz, 1H, H-7), 3,69-3,72 (m, 4H), 3,32 (s, 2H, CH₂), 3,01-3,04 (m, 4H); MS m/z (relativní intenzita, %) 219 ([M+l]⁺, 100).

3-(2-karboxyethyl)-2,4-dimethyl-5-formylpyrrol (3,3 g), 4 g 6(morfolin-4-yl)-2-oxindolu a 1,8 ml piperidinu v 60 ml ethanolu se zahřívají při 90oC po dobu 7 hodin. Reakční směs se ochladí a koncentruje se. Zbytek se suspenduje v 6 N vodné kyselině chlorovodíkové. Precipitát se zfiltruje, promyje se vodou na pH 6 a suší se ve vakuové peci přes noc. Výsledná pevná látka se přečistí kolonovou chromatografií na silikagelu mobilní fází ethylacetát hexan - octová kyselina. Získá se 2,78 g (38 % výtěžek) požadované sloučeniny jako hnědé pevné látky.

'HNMR (360 MHz, DMSO-d6): δ 13,13 (s, br, 1H, NH-1'), 12,02 (s, br, 1H, COOH), 10,57 (s, br, 1H, NH-1), 7,52 (d, J = 8,46 Hz, 1H, H-4), 7,32 (s, 1H, H-vinyl), 6,58 (dd, J = 1,99, 8,46 Hz, 1H, H-5), 6,41 (d, J - 1,99 Hz, 1H, H-7), 3,71-3,74 (m, 4H), 3,06-3,09 (m, 4H), 2,62 (t, J = 7, 57 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,33 (t, J = 7,57 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,26 (s, 3H, CH₃), a 2,21 (s, 3H, CH₃); MS m/z (relativní intenzita, %) 396 ([M+l]⁺, 100).

Příklad 39

3-[5-(5-chlor-4-methyl-2-oxo -1,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)2,4-dimethyl -1 H-pyrrol-3-yl]-propionová kyselina

Suspenze 3,0 g 4-methyl-2-oxindolu se míchá v 50 ml acetonitrilu při pokojové teplotě a po dávkách se přidá 3,3 g Nchlor-sukcinimidu. Poté se přidá trifluoroctová kyselina (1 ml). Suspenze se míchá při pokojové teplotě po dobu 3 dnů, během kterých je pevná látka stále přítomná. Bílá pevná látka se shromáždí vakuovou filtrací, promyje se malým množstvím studeného acetonu a suší se přes

129 noc ve vakuové peci při 40°C. Získá se 2,5 g (68 %) 5-chlor-4-methyl2-oxindolu.

'HNMR (360 MHz, DMSO-d₆): δ 10,38 (s, br, 1H, NH), 7,19 (d,

J = 8Hz, 1H, aromatika), 6,64 (d, J = 8 Hz, 1H, aromatika), 3,46 (s,

2H, H-3), 2,19 (s, 3H, CH₃).

3-(2-karboxyethyl)-2,4-dimethyl-5-formylpyrrol (98 mg), 91 mg

5-chlor-4-methyl-2-oxindolu a 2 kapky piperidinu ve 2 ml ethanolu se zahřívají při 90°C po dobu 4 hodiny. Reakční směs se ochladí a koncentruje se. Zbytek se suspenduje v 6 N vodné kyselině chlorovodíkové. Precipitát se zfiltruje, promyje se vodou na pH 6 a suší se ve vakuové peci přes noc. Získá se 100 mg požadované sloučeniny.

'HNMR (360 MHz, DMSO-d_ó): δ 13,47 (s, br, 1H, NH-1'), 12,03 (s, br, 1H, COOH), 10,83 (s, br, 1H, NH-1), 7,61 (s, 1H, H-vinyl), 7,14 (d, J = 8,17 Hz, 1H, aromatika), 6,74 (d, J = 8,17 Hz, 1H, aromatika), 2,64 (s, 3H, CH₃), 2,64 (t, J = 7,62 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,34 (t, J = 7,62 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,3 (s, 3H, CH₃) a 2,20 (s, 3H, CH₃).

Příklad 40

3- [5-(5-chlor-4-methyl-2-oxo -1,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)4-methyl -lH-pyrrol-3-yl]-propionová kyselina

4- (2-karboxyethyl)-2-formyl-3-methylpyrrol (91 mg), 91 mg 5chlor-4-methyl-2-oxindolu a 2 kapky piperidinu ve 2 ml ethanolu se zahřívají při 90°C po dobu 4 hodiny. Reakční směs se ochladí a koncentruje se. Zbytek se suspenduje v 6 N vodné kyselině chlorovodíkové. Precipitát se zfiltruje, promyje se vodou na pH 6 a suší se ve vakuové peci přes noc. Získá se 95 mg požadované sloučeniny.

'HNMR (360 MHz, DMSO-d₆): δ 13,36 (s, br, 1H, NH-1'), 11,98 (s, br, 1H, COOH), br, 1H, NH-1), 7,68 (s, 1H), 7,19 (d, J = 7,14Hz, 1H, aromatika), 7,17 (s, 1H), 6,75 (d, J = 7,14 Hz, 1H, aromatika),

130

2,66 (s, 3H, CH₃-4), 2,66 (t, J = 7,51 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,45 (t, J = 7,51 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,21 (s, 3H, CH₃); MS m/z (relativní intenzita, %) 345 ([M+lf, 100).

Příklad 41

Sodná sůl 3-[2,4-dimethyl-5-(2-oxo-1,2-dihydroindol-3ylidenmethyl)-lH-pyrrol-3-yl]-propionové kyseliny

Suspenze 8 g 3-[2,4-dimethyl-5-(2-oxo-1,2-dihydroindol-3ylidenmethyl)-1 H-pyrrol-3-yl]-propionové kyseliny v 60 ml vody se přidá do 0,98 g hydroxidu sodného v 10 ml vody. Směs se míchá při pokojové teplotě po dobu 30 minut a zfiltruje se. Filtrát se zmrazí a lyofilizuje se. Získá se 8 g požadované sloučeniny.

Nebo jiným způsobem: suspenze 117g 318-005 ve 470 ml vody se přidá 16,47 g hydroxidu sodného v 74 ml vody. Směs se míchá při pokojové teplotě po dobu 15 minut a zfiltruje se. Filtrát se přidá do 210 ml ethanolu a výsledný precipitát, který se utvoří se shromáždí podtlakovou filtrací. Po usušení se získá konečných 106 g požadované sloučeniny.

'HNMR (360 MHz, DMSO-d₆): δ 13,34 (s, br, 1H, NH-1’), 10,82 (s, br, 1H, NH-1), 7,65 (d, J = 7,52 Hz, 1H, H-4), 7,5 (s, 1H, H-vinyl), 7,04 (t, J = 7,52 Hz, 1H, H-6), 6,93 (t, J = 7,52 Hz, 1H, H-5), 6,85 (d, J = 7,52 Hz, 1H, H-7), 2,55 (t, J = 6,95 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,28 (s, 3H, CH₃), 2,24 (s, 3H, CH₃) a 1,99 (t, J = 6,95 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH).

Příklad 42

-[3,5-dimethy 1-4-(3 -morfolin-4-ylpropyl)-lH-pyrrol2ylmethylen]-l ,3-dihydroindol-2-on

Krok 1: Do suspenze 3-(2,4-dimethyl-lH-pyrrol-3-yl)propionové kyseliny (10 g, 60,8 mmol) v 60 ml dichlormethanu se přidá 1,1'-karbonyldiimidazol (11,6 g, 71,8 mmol) a následně morfolin

9

99 99

9 9 9 9 9 9

9 9 9 9

131 «99 9

9 9 9 9 9

99 9999 99 999 (5,5 ml, 60,8 mmol) a Ν,Ν-diizopropylethylamin (Hunigova báze, 10 ml, 60,8 mmol). Tmavočervená reakční směs se míchá při pokojové teplotě přes noc a přelije se do ledové vody. Organická vrstva se promývá solankou až do pH 6, suší se nad bezvodým síranem sodným a koncentruje se. Surový produkt se přečistí na koloně silikagelu mobilní fází dichlormethan-methanol (98: 2). Získá se 13,84 g (96 %) 3-(2,4-dimethyl -1 H-pyrrol-3-yl) -1 -mor folin-4-yl-propan -1 - on.

Krok 2: Do suspenze L1AIH4 (2,67 g, 70 mmol) v tetrahydrofuranu (100 ml) se přidá po kapkách roztok 3-(2,4-dimethyl1 H-pyrrol-3-yl)-1-morfolin-4-yl-propan-1-onu (13,84 g, 59 mmol) v tetrahydrofuranu (50 ml). Reakční směs se míchá při 80°C po dobu 1 hodiny a zchladí se v ledové lázni. Do reakční směsi se pomalu přidává led dokud nepřestane unikat plyn. Přidá se pár kapek 2N hydroxidu sodného a reakční směs se míchá při pokojové teplotě po dobu 30 minut. Poté se reakční směs extrahuje ethylacetátem, suší se nad bezvodým síranem sodným a koncentruje se. Získá se 10,37 g (79 %) 4-[3-(2,4-dimethyl-lH-pyrrol-3-yl)-propyl]-morfolinu jako světlehnědého oleje, který se použije bez dalšího čištění.

Krok 3: Do ledově studeného roztoku N,N-dimethylformamid (5,5 ml, 70 mmol) v dichlormethanu (30 ml) se po kapkách přidá oxychlorid fosforečný (6,5 ml, 70 mmol).Poté se reakční směs míchá při pokojové teplotě po dobu 15 minut. Následně se po kapkách při teplotě 0°C přidá roztok 3,5-dimethyl-4-(3-morfolin-4-yl-propyl)-lH pyrrol-2-karboxaldehydu (10,37 g, 46,6 mmol) v dichlormethanu (20 ml). Finální reakční směs se refluxuje při 60°C po dobu 4 hodiny a zchladí se v ledové lázni. Do reakční směsi se pomalu přidává led a následně 2 N hydroxid sodný dokud pH nedosáhne hodnoty 12. Reakční směs se míchá při pokojové teplotě po dobu 30 minut a poté se extrahuje ethylacetátem. Organická vrstva se promyje solankou, suší se nad bezvodým síranem sodným a koncentruje se. Surový produkt se přečistí na koloně silikagelu mobilní fází dichlormethan methanol - hydroxid amonný (9,5: 0,5). Získá se 4,57 g (39 %) 3,5132

dimethyl-4-(3-morfolin-4-yl-propyl)-lH pyrrol-2-karbaldehydu jako tmavě červeného oleje:

'HNMR (360 MHz, DMSO-d₆) δ 11,34 (s, br, 1H, NH-1), 9,40 (s, 1H, CHO-2), 3,55 (t, J = 4,68 Hz, 4H, O(CH2CH₂)2NCH2CH₂CH2-4), 2,28-2,34 (m, 6H, O(CH2CH₂)2NCH₂CH₂CH₂-4), 2,21 (t, 2H, J = 7,10 Hz, 2H, O(CH₂CH2)2NCH2CH₂CH2-4) CH₃-3), 2,19 (s, 3H, CH₃-5), 2,14 (s, 3H, CH₃-3), 1,51 (kvintet, J = 7,10 Hz, 2H,

O(CH₂CH2)2NCH₂CH2CH2-4), MS m/z (relativní intenzita, %) 251 ([M+lf, 100).

Krok 4: Směs 1,3-dihydroindol-2-onu (133 mg, 1,0 mmol), 3,5dimethyl-4-H-pyrrol-2-karboxaldehydu (250 mg, 1, 0 mmol) a 3 tří kapek pyrrolidinu ve 2,0 ml ethanol se refluxuje při 90°C po dobu 4 hodiny a poté se zchladí na pokojovou teplotu. Precipitát se zfiltruje, promyje studeným ethanolem a hexanem a suší se ve vakuové peci přes noc. Získá se 308,9 mg (85 %) 3-[3,5-dimethyl-4-(3-morfolin-4-ylpropyl) -1 H-pyrrol-2-ylmethylen]-1,3-dihydroindol-2-onu jako žluté pevné látky:

‘HNMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ 13,37 (s, 1H, NH-1'), 10,71 (s, 1H, NH-1), 7,68 (d, J = 7,47 Hz, 1H, H-4), 7,53 (s, 1H, H-vinyl), 7,06 (dt, J = 7,47 Hz, 1H, H-6), 6,94 (dt, J = 7,74 Hz, 1H, H-5), 6,84 (d, J

= 7,47 Hz, 1H, H-7),	3,55	(t,	J = 4,37 Hz,	4H,
O(CH2CH2)2NCH2CH2CH2-4'),	2,40	(t,	J = 7,31 Hz,	2H,
O(CH2CH2)2NCH2CH2CH2-4'),	2,31	(t,	J = 4,37 Hz,	4H,
O(CH2CH2)2NCH2CH2CH2-4'),	2,28 (s,	3H,	CH3-3'), 2,23 (s, 3H,	ch3-

5'), 2,23 (t, J = 7,31 Hz, 2H, O(CH₂CH2)2NCH2CH2CH₂-4'), 1,56 (kvintet, J = 7,3 1 Hz, 2H, O(CH₂CH2)2NCH₂CH2CH2-4'), MS m/e (relativní intenzita, %) 365 (M⁺,100).

Příklad 43

5-brom-3-[3,5-dimethyl-4-(3-morfolin-4-yl-propyl)-lH-pyrrol-2yl methy len] -1,3-dihydroindol-2-on φ φ

133

Směs 5-brom-1,3-dihydroindol-2-onu (212 mg, 1,0 mmol), 3,5di methy 1-4-(3-morfolin-4-yl-propyl)-lH-pyrrol-2-karbaldehydu (250 mg, 1,0 mmol) a 3 kapek pyrrolidinu ve 2,0 ml ethanolu se refluxuje při 90°C po dobu 4 hodiny a poté se zchladí na pokojovou teplotu. Precipitát se zfiltruje, promyje se studeným ethanolem a hexanem a suší se ve vakuové peci přes noc. Získá se 399,8 mg (90 %) 5-brom-3[3,5-dimethyl-4-(3-morfolin-4-yl-propyl)-lH-pyrrol-2-ylmethylen]1,3-dihydroindol-2-onu jako červené pevné látky:

1HNMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 13,43 (s, IH, NH-1'), 10,81 (s, IH, NH-1), 7,99 (d, J = 2,07 Hz, IH, H-4), 7,66 (s, IH, Hvinyl), 7,18 (dd, J = 2,07, 7,58 Hz, IH, H-6), 6,79 (d, J - 7,58 Hz, IH, H-7), 3,55 (t, J = 4,39 Hz, 4H, O(CH2CH2)2NCH2CH2CH2-4'), 2,40 (t, J = 7,32 Hz, 2H, O(CH2CH2)2NCH2CH2CH2-4'), 2,31 (t, J = 4,39 Hz, 4H, O(CH2CH2)2NCH2CH2CH2-4'), 2,29 (s, 3H, CH3-3'), 2,26 (s, 3H, CH3-5'), 2,23 (t, J = 7,32 Hz, 2H, O(CH2CH2)2NCH2CH2CH2-4'), 1,56 (kvintet, J = 7,32 Hz, 2H, O(CH2CH2)2NCH2CH2CH2-4'),

MS m/e (relativní intenzita, %) 443 (M+, 100), 445 ([M+2] ⁺ ,

100).

Příklad 44

3-[3,5-dimethyl-4-(3-morfolin-4-yl-propyl)-lH-pyrrol-2yl methy len]-6-fenyl-1,3-dihydroindol-2-on

Postupem z Příkladu 2 se získá 88 % výtěžek požadované sloučeniny jako žluté pevné látky:

'HNMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ 13, 37 (s, IH, NH-1'), 10,81 (s, IH, NH-1), 7,77 (d, J = 8,20 Hz, IH, H-4), 7,62 (d, J = 7,39 Hz, 2H, H-2, 6), 7,58 (s, IH, H-vinyl), 7,44 (t, J = 7,39 Hz, 2H, H-3, 5),

7,32 (t, br, J = 7,39 Hz, IH, H-4), 7,26 (dd, J = 1,49, 8,29 Ηζ,ΙΗ, H5), 7,09 (d, J = 1,49 Hz, IH, H-7), 3,56 (t, J = 4,48 Hz, 4H, O(CH2CH2)2NCH2CH₂CH2-4'), 2,41 (t, J = 7,18 Hz, 2H,

O(CH₂CH2)2NCH2CH₂CH2-4'), 2,31 (t, J = 4,48 Hz, 4H,

O(CH₂CH2)2NCH₂CH₂CH2-4'), 2,29 (s, 3H, CH₃-3'), 2,26 (s, 3H, CH₃134

5’), 2,24 (t, J = 7,18 Hz, 2H, CKCHzCH^NCíhCHzCH^'), 1,56 (kvintet, J = 7,18 Hz, 2H, O(CH₂CH₂)₂NCH₂CH2CH₂-4'),

MS m/e (relativní intenzita, %) 441 (M⁺, 100).

Příklad 44

3-[3,5-dimethyl-4-(3-morfolin-4-yl-propyl)-lH-pyrrol-2ylmethylen]-6-fenyl -1,3-dihydro indol-2-on

Postupem z Příkladu 2 se získá 88 % výtěžek požadované sloučeniny jako žluté pevné látky:

'HNMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ 13, 37 (s, 1H, NH-1'), 10,81 (s, 1H, NH-1), 7,77 (d, J = 8,20 Hz, 1H, H-4), 7,62 (d, J = 7,39 Hz, 2H, H-2, 6), 7,58 (s, 1H, H-vinyl), 7,44 (t, J = 7,39 Hz, 2H, H-3, 5),

7,32 (t, br, J = 7,39 Hz, 1H, H-4), 7,26 (dd, J = 1,49, 8,29 Ηζ,ΙΗ, H5), 7,09 (d, J = 1,49 Hz, 1H, H-7), 3,56 (t, J = 4,48 Hz, 4H, O(CH_₂CH₂)₂NCH₂CH₂CH₂-4'), 2,41 (t, J = 7,18 Hz, 2H,

O(CH₂CH₂)₂NCH₂CH₂CH2-4'), 2,31 (t, J = 4,48 Hz, 4H,

O(CH₂CH2)₂NCH₂CH₂CH₂-4'), 2,29 (s, 3H, CH₃-3'), 2,26 (s, 3H, CH₃5'), 2,24 (t, J = 7,18 Hz, 2H, O(CH₂CH₂)₂NCH₂CH₂CH₂-4'), 1,56 (kvintet, J = 7,18 Hz, 2H, O(CH₂CH₂)₂NCH₂CH₂CH₂-4'),

MS m/e (relativní intenzita, %) 441 (M⁺, 100).

Příklad 45

3-[3,5-dimethyl-4-(3-morfolin-4-yl-propyl)-lH-pyrrol-2ylmethylen]-6-(2-metoxyfenyl) -1,3-dihydroindol-2-on

Postupem z Příkladu 2 se získá 86 % výtěžek požadované sloučeniny jako žluté pevné látky:

‘HNMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ 13,37 (s, 1H, NH-1'), 10,72 (s, 1H, NH-1), 7,71 (d, J = 7,79 Hz, 1H, H-4), 7,55 (s, 1H, H-vinyl), 7,27-7,34 (m, 2H), 6,98-7,10 (m, 4H), 3,76(s, 3H, OCH₃-2), 3,56 (t, J = 4,50 Hz, 4H, O(CH2CH₂)₂NCH₂CH₂CH₂-4'), 2,41 (t, J = 7,12 Hz, 2H, O(CH₂CH₂)₂NCH₂CH₂CH₂-4'), 2,21-2,31 (m, 6H,

135

0· ····

O(CH₂CH2)2NCH₂CH2CH2-4'), 2,29 (s, 3H, CH₃-3'), 2,25 (s, 3H, CH₃5'), 1,57 (kvintet, J = 7,12 Hz, 2H, O(CH₂CH₂)₂NCH₂CH2CH2-4'),

MS m/e (relativní intenzita, %) 471 (M⁺, 100).

Příklad 46

3-[3,5-dimethyl-4-(3-morfolin-4-yl-propyl)-lH-pyrrol-2ylmethylen]-6-(3-metoxyfenyl)-1,3-di hydro indol-2-on

Postupem z Příkladu 2 se získá 87% výtěžek požadované sloučeniny jako žluté pevné látky:

'HNMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ 13, 38 (s, ÍH, NH-1'), 10,80 (s, ÍH, NH-1), 7,76 (d, J = 7,93 Hz, ÍH, H-4), 7,57 (s, ÍH, H-vinyl), 7,35 (t, J = 8,08 Hz, ÍH, H-5), 7,26 (dd, J = 1,73, 7,93 Ηζ,ΙΗ, H-5), 7,18 ( d, br, J = 8,08 Hz, ÍH, H-4), 7,13 ( d, br, J = 1,94 Hz, ÍH, H-2), 7,08 (d, J = 1,73 Hz, ÍH, H-7), 6,90 (dd, J = 1,94, 8,08 Hz, ÍH, H-6),

3,81 (s, 3H, OCH3-3),	3,56	(t,	J = 4,38	Hz,	4H,
O(CH2CH2)2NCH2CH2CH2-4'),	2,41	(t,	J = 7,19	Hz,	2H,
O(CH2CH2)2NCH2CH2CH2-4'),	2,31	(t,	J = 4,38	Hz,	4H,
O(CH2CH2)2NCH2CH2CH2-4'),	2,29 (s,	3H,	CH3-3'), 2,26 (s,	3H,	CH3-

5’), 2,24 (t, J = 7,19 Hz, 2H, O(CH₂CH2)2NCH2CH₂CH2-4'), 1,56 (kvintet, J = 7,19 Hz, 2H, CXC^C^hNCHsCjhC^^'),

MS m/e (relativní intenzita, %) 471 (M⁺, 100).

Příklad 47

3-[3,5-dimethyl-4-(3-morfolin-4-yl-propyl)-lH-pyrrol-2ylmethylen]-6-(4-methoxyfenyl)-l,3-dihydroindol-2-on

Postupem z Příkladu 2 se získá 52 % výtěžek požadované sloučeniny jako žluté pevné látky:

'HNMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ 13,35 (s, ÍH, NH-1’), 10,77 (s, ÍH, NH-1), 7,72 (d, J = 7,97 Hz, ÍH, H-4), 7,55 (d, J = 8,57 Hz, 2H, H-2, 6), 7,54 (s, ÍH, H-vinyl), 7,20 (dd, J = 1,35, 7,97 Hz, ÍH, H-5), 7,04 (d, J = 1,35 Hz, ÍH, H-7), 6,99 (d, J = 8,57 Hz, ÍH, H-3, 5), « ·

136		• · Φ « · ·	• • ·	• · •
		··♦· ···	*· ··♦· ··
3,78 (s, 3H, OCH3-4), 3,55	(t,	J = 4,57	Hz,	4H,
O(CH2CH2)2NCH2CH2CH2-4'), 2,40	(t,	J = 6,97	Hz,	2H,
O(CH2CH2)2NCH2CH2CH2-4'), 2,30	(t,	J = 4,57	Hz,	4H,
O(CH2CH2)2NCH2CH2CH2-4’), 2,28 (s,	3H,	CH3-3'), 2,24 (s,	3H,	ch3-
5'), 2,23 (t, J = 6,97 Hz, 2H, O(CH2CH2)2NCH2CH2CH2-4’),	1,55

(kvintet, J = 6,97 Hz, 2H, O(CH₂CH₂)₂NCH₂CH₂CH₂-4’),

MS m/e (relativní intenzita, %) 471 (M⁺, 100).

Příklad 48

3-[4-(3-dimethylaminopropyl)-3,5-dimethyl-lH-pyrrol2ylmethylen]-1,3-dihydroindol-2-on

Podle kroků 1,2, a 3 z Příkladu lse získá 63 % výtěžek 4-(3di methylaminopropy 1)-3,5-dimethyl -1 H-pyrrol-2-karboxaldehydu jako tmavěčerveného oleje:

'HNMR (360 MHz, DMSO-d₆) δ 11,33 (s, br, 1H, NH-1), 9,40 (s, 1H, CHO-2), 2,30 (t, J - 7,42 Hz, 2H, (CH₃)₂NCH₂CH₂CH2-4), 2,18 (s, 3H, CH₃-3), 2,15 (t, J = 7,42 Hz, 2H, (CH₃)₂NCH2CH₂CH₂-4), 2,14 (s, 3H, CH₃-5), 2,10 (s, 6H, (CH₃)₂NCH₂CH₂CH₂-4), 1,47 (kvintet, J = 7,42 Hz, 2H, (CH₃)₂NCH₂CH2CH₂-4),

MS m/z (relativní intenzita, %) 208 ([M+l]⁺, 100).

Podle kroku 4 z Příkladu 1 se získá 52 % výtěžek požadované sloučeniny jako žluté pevné látky:

'HNMR (360 MHz, DMSO-d_ó) δ 13,38 (s, 1H, NH-1'), 10,70 (s, 1H, NH-1), 7,68 (d, J = 7,54 Hz, 1H, H-4), 7,53 (s, 1H, H- vinyl), 7,06 (t, J = 7,54 Hz, 1H, H-6), 6,94 (t, J = 7,54 Hz, 1H, H-5), 6,85 (d, J = 7,54 Hz, 1H, H-7), 2,38 (t, J = 7,25 Hz, 2H, (CH₃)₂NCH₂CH₂CH2-4'), 2,27 (s, 3H, CH₃-3'), 2,23 (s, 3H, CH₃-5'), 2,17 (t, J = 7,25 Hz, 2H, (CH₃)₂NCH₂CH₂CH₂-4'), 2,11 (s, 6H, (CH₃)₂NCH₂CH₂CH2-4'), 1,52 (chint, J = 7,25 Hz, 2H, (CH₃)₂NCH₂CH2CH₂-4’),

MS m/z (relativní intenzita, %) 323 (M⁺, 100),

137 ·· · ·· ·♦ ·« • · · · · · · · · · · • · · 9 9 9 9 • 9 9 9 9 9 9

9999 999 99 9999 99

Příklad 49

5-brom-3-[4-(3-dimethylaminopropyl)-3,5-dimethyl-lH-pyrrol-2yl methy len] -1,3-dihydroindol-2-on

Postupem z Příkladu 2 se získá 71% výtěžek požadované sloučeniny jako červené pevné látky:

‘HNMR (360 MHz, DMSO-d₆) δ 13,42 (s, 1H, NH-1'), 10,81 (s, 1H, NH-1), 7,98 (d, J = 1,89 Hz, 1H, H-4), 7,66 (s, 1H, Hvinyl), 7,17 (dd, J - 1,89, 8,23 Hz, 1H, H-6), 6,79 (d, J = 8,23 Hz, 1H, H-7), 2,38 (t, J = 7,23 Hz, 2H, (CH₃)₂NCH₂CH₂CH2- 4'), 2,27 (s, 3H, CH₃-3'), 2,25 (s, 3H, CH₃-5'), 2,16 (t, J - 7,23 Hz, 2H, (CH₃)₂NCH2CH₂CH₂4'), 2,10 (s, 6H, (CH3)₂NCH₂CH₂CH₂- 4'), 1,51 (kvintet, J = 7,23 Hz, 2H, (CH₃)₂NCH₂CH2CH₂-4’),

MS m/z (relativní intenzita, %) 401 ([M-l] ⁺ , 100) a 403 ([M+l]⁺,

100).

Příklad 50

3-[4-(3-dimethylaminopropyl)-3,5-dimethyl -1 H-pyrrol-2ylmethylen]-6-fenyl -1,3-dihydroindol-2-on

Postupem z Příkladu 2 se získá 83 % výtěžek požadované sloučeniny jako oranžové pevné látky:

'HNMR (360 MHz, DMSO-d₆) δ 13,38 (s, 1H, NH-1'), 10,81 (s, 1H, NH-1), 7,77 (d, J = 7,82 Hz, 1H, H-4), 7,62 (d, J = 7,59 Hz, 2H, H-2, 6), 7,58 (s, 1H, H-vinyl), 7,44 (t, J = 7,59 Hz, 2H, H-3, 5),

7,32 (t, J - 7,59 Hz, 1H, H-4), 7,27 (dd, J = 1,11, 7,82 Hz, 1H, H-5), 7,09 (d, J = 1,11 Hz, 1H, H-7), 2,39 (t, J - 7,18 Hz, 2H, (CH₂)₂NCH₂CH₂CH2-4'), 2,29 (s, 3H, CH₃-3'), 2,25 (s, 3H, CH₃-5’), 2,17 (t, J = 7,18 Hz, 2H, (CH₃)₂NCH2CH₂CH₂- 4’), 2,11 (s, 6H, (CH₃)₂NCH₂CH₂CH₂-4'), 1,53 (kvintet, J = 7,18 Hz, 2H, (CH₃)₂NCH₂CH2CH₂-4),

MS m/z (relativní intenzita, %) 399 (M⁺, 100).

• ·

138

Příklad 51

3-[4-(3-di methy laminopr opy 1)-3,5-dimethyl - 1 H-pyrrol-2yl methylen] -6-(2-methoxy feny 1)-1,3 -dihydroindol-2-on

Postupem z Příkladu 2 se získá 83 % výtěžek požadované sloučeniny jako žluté pevné látky:

‘HNMR (360 MHz, DMSO-d₆) δ 13,38 (s, 1H, NH-1'), 10,72 (s, 1H, NH-1), 7,70 (d, J = 8,06 Hz, 1H, H-4), 7,55 (s, 1H, Hvinyl), 7,287,36 (m, 2H, H-4, 5), 7,14 (d, J = 8,32 Hz, 1H, H-6), 7,04 (dd, J = 1,21, 8,06 Hz, 1H, H-5), 6,99 (d, J = 7,42 Hz, 1H, H-3), 6,99 (d, J = 1,21 Hz, 1H, H-7) 3,76 (s, 3H, OCH₃-2), 2,39 (t, J = 7,24 Hz, 2H, (CH3)₂NCH₂CH₂CH2-4'), 2,28 (s, 3H, CH₃-3'), 2,25 (s, 3H, CH₃-5'), 2,18 (t, J = 7,24 Hz, 2H, (CH3)₂NCH2CH₂CH₂-4'), 2,11 (s, 6H, (CH₃)₂NCH₂CH₂CH₂-4'), 1,53 (kvintet, J = 7,24 Hz, 2H, (CH3)₂NCH₂CH2CH₂-4'),

MS m/z (relativní intenzita, %) 429 (M⁺, 100).

Příklad 52

3-[4-(3-dimethylaminopropyl)-3,5-dimethyl-lH-pyrrol-2y Imethy len]-6-(3-methoxy fenyl) -1,3-dihydroindol-2-on

Postupem z Příkladu 2 se získá 83 % výtěžek požadované sloučeniny jako červené pevné látky:

‘HNMR (360 MHz, DMSO-d_ó) δ 13,38 (s, 1H, NH-1’), 10,80 (s, 1H, NH-1), 7,60 (d, J = 8,06 Hz, 1H, H-4), 7,57 (s, 1H, H- vinyl), 7,35 (t, J - 8, 15 Hz, 1H, H-5), 7,26 (dd, J = 1,39, 8,06 Hz, 1H, H-5), 7,19 (d, br, J = 8,15 Hz, H-6), 7,13 (m, 1H, H-2), 7,09 (d, J = 1,39 Hz, 1H, H-7), 6,90 (dd, J = 2,57, 8,15 Hz, 1H, H-4), 3,81 (s, 3H, OCH₃3), 2,39 (t, J = 7,17 Hz, 2H, (CH3)₂NCH₂CH₂CH2-4'), 2,29 (s, 3H, CH₃-3’), 2,25 (s, 3H, CH₃-5'), 2,17 (t, J = 7,17 Hz, 2H, (CH3)₂NCH2CH₂CH₂-4'), 2,11 (s, 6H, (CH₃)₂NCH₂CH₂CH₂-4'), 1,53 (kvintet, J = 7,17 Hz, 2H, (CH₃)2NCH₂CH2CH₂-4'),

MS m/z (relativní intenzita, %) 429 (M⁺, 100).

4 4

4

4

4 ·

139 ·· ·φ • · ♦ · • ♦ ♦ · · *

4 4

44 4444

Příklad 53

3-[4-(3-dimethylaminopropyl)-3,5-dimethyl-lH-pyrrol-2y lmethy len]-6-(4-methoxy feny 1)-1,3-dihydroindol-2-on

Postupem z Příkladu 2 se získá 83 % výtěžek požadované sloučeniny jako hnědé pevné látky:

‘HNMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 13,35 (s, ÍH, NH-1'), 10,77 (s, ÍH, NH-1), 7,73 (d, J = 7,82 Hz, ÍH, H-4), 7,56 (d, J = 8,83 Hz, 2H, H-2, 6), 7,54 (s, ÍH, H-vinyl), 7,20 (dd, J = 1,64, 7,82 Hz, ÍH, H-5), 7,04 (d, J = 1,64 Hz, H-7), 7,00 (d, J = 8,83 Hz, 2H, H-3, 5), 3,78 (s, 3H, OCH₃-4), 2,39 (t, J = 7,24 Hz, 2H, (CH₃)₂NCH₂CH₂CH2-4'), 2, 28 (s, 3H, CH₃-3'), 2,25 (s, 3H, CH₃-5'), 2,17 (t, J = 7,24 Hz, 2H, (CH₃)₂NCH2CH₂CH₂-4'), 2,11 (s, 6H, (CH₃)₂NCH₂CH₂CH₂-4) 1,52 (kvintet, J = 7,24 Hz, 2H, (CH₃)₂NCH₂CH₂CH2-4')

MS m/z (relativní intenzita, %) 429 (M+, 100),

Příklad 54

5- chlor-3-[4-(3-dimethylaminopropy 1)-3,5-dimethyl -1 Hpyrrol-2y lmethy len] -1,3-dihydroindol-2-on

Postupem z Příkladu 2 se získá 53 % výtěžek požadované sloučeniny jako hnědé pevné látky:

‘HNMR (360 MHz, DMSO-d₆) δ 13,43 (s, ÍH, NH-1'), 10,84 (s, ÍH, NH-1), 7,87 (d, J = 1,85 Hz, ÍH, H-4), 7,66 (s, ÍH, H-vinyl), 7,05 (dd, J = 1,85, 8,15 Hz, ÍH, H-6), 6,83 (d, J = 8,15 Hz, ÍH, H-7), 2,362,45 (m, 4H, (CH₃)₂NCH2CH₂CH2-4'), 2,30 (s, 6H, (CH₃)₂NCH₂CH₂CH₂-4'), 2,28 (s, 3H, CH₃-3’), 2,26 (s, 3H,CH₃-5'), 1,58 (kvintet, J = 7,52 Hz, 2H, (CH₃)₂NCH₂CH2CH₂-4'),

MS m/z (relativní intenzita, %) 357 ( [M-l]⁺, 100).

Příklad 55

6- chlor-3-[4-(3-dimethylaminopropyl)-3,5-dimethyl- lH-pyrrol-2y lmethy len] -1,3-dihydroindol-2-on ·· ·· 9«

9 9 9 · · · • 9 9 · ·

140 • 9 9 9 9

9 · ·« 9 9

Postupem z Příkladu 2 se získá 77 % výtěžek požadované sloučeniny:

MS El 357 [M-l] ⁺ .

Příklad 56

3-[4-(3-dimethy laminopropy 1)-3,5-dimethyl- 1H-pyrro 1-2ylmethylen]-5-methoxy-1,3-dihydroindol-2-on

Postupem z Příkladu 2 se získá 77 % výtěžek požadované sloučeniny:

MS El 353 [M] ⁺ .

Příklad 57

3-[4-(3-dimethylaminopropyl)-3,5-dimethyl-lH-pyrrol-2ylme thyl en]-6-me thoxy-1,3-d i hydro indol-2-on

Postupem z Příkladu 2 se získá 74 % výtěžek požadované sloučeniny.

Příklad 58

- [4-(3-dimethy laminopropy l)-3,5-dimethyl-lH-pyrr o 1-2ylmethylen]-5-methyl-l,3-dihydroindol-2-on

Postupem z Příkladu 2 se získá 45 % výtěžek požadované sloučeniny :

MS El 337 [M] ⁺ .

Příklad 59

3-[4-(3-dimethylaminopropyl)-3,5-dimethyl-lH-pyrrol-2yl methy len] -4-methyl -1,3-d i hydro indol-2-on

Postupem z Příkladu 2 se získá 99 % výtěžek požadované sloučeniny:

·· ·» ·· • · · · · « ♦ · · * ·

141 • · ···· 'HNMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ 13,45 (s, br, 1H, NH), 10,78 (s, br, 1H, NH), 7,50 (s, 1H, H-vinyl), 6,98 (t, J = 8,1 Hz, 1H, H-6), 6,76 (t, J = 8,1 Hz, 2H, H-5 & H-7), 2,88 (m, 2H, CH₂), 2,64 (s, 6H, 2xCH₃), 2,56 (s, 3H, CH₃), 2, 43 (t, J = 7,4 Hz, 2H, CH₂), 2,29 (s, 3H, CH₃), 2, 19 (s, 3H, CH₃), 1,65-1,75 (m, 2H, CH₂),

MS El 337 [M] ⁺ .

Příklad 60

3-[4-(3-dimethylaminopropyl)-3,5-dimethyl-lH-pyrrol-2y lmethy len]-4-(2-hydroxy-ethyl) -1,3-dihydroindol-2-on

Postupem z Příkladu 2 se získá 98 % výtěžek požadované sloučeniny.

Příklad 61

Amid 3-[4-(3-dimethy laminopropy 1)-3,5-dimethyl -1 H-pyrrol-2y lmethy len]-2-oxo-2,3 -dihy dro-1 H-indol-5 -sul fonové kyseliny

Postupem z Příkladu 2 se získá 59 % výtěžek požadované sloučeniny :

'HNMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ 13,41 (s, 1H, NH-1'), 11,12 (s, 1H, NH-1), 8,16 (d, J = 1,78 Hz, 1H, H-4), 7,66 (s, 1H, H-vinyl), 7,55 (dd, J = 1,78, 8,18 Hz, 1H, H-6), 7,11 (s, br, 2H, H^NSO^), 6,98 (d, J = 8,18 Hz, 1H, H-7), 2,47-2,50 (m, 2H, (CH₃)₂NCH₂CH₂CH2-4’), 2,41 (t, J = 7,37 Hz, 2H, (CH₃)₂NCH₂CH₂CH₂-4'), 2,36 (s, 6H, (CH₃)₂NCH₂CH₂CH₂-4'), 2,30 (s, 3H, CH₃-3'), 2,28 (s, 3H, CH₃-5'), 1,61 (kvintet, J = 7, 37 Hz, 2H, (CH₃)₂NCH₂CH2CH₂-4').

Příklad 62

Izopropylamid 3 - [ 4 - (3 - dimethylaminopropyl) -3,5dimethyl- 1H - pyrrol - 2 - ylmethylen]-2-oxo-2,3-dihydro-lH-indol5-sulfonové kyseliny

142 ·· · ·» ·· ·· • · ·· «*·· · · · ♦ · · · · · • · · · · · · ···· ··· ·» ···» ··

Postupem z Příkladu 2 se získá 64 % výtěžek požadované sloučeniny:

MS El 444 [M]⁺·

Příklad 63

3-[4-(3-dimethylaminopropyl)-3,5-dimethyl - lH-pyrrol-2yl methylen]-5-(morfolin-4-sulfonyl)-l ,3-dihydroindol-2-on

Postupem z Příkladu 2 se získá 90 % výtěžek požadované sloučeniny,

MS El 472 [M] ⁺ .

Příklad 64

Diethylamid 3- [4- (3- dimethylaminopropyl)- 3,5- dimethyl- 1Hpyrrol- 2- ylmethylen]-2-oxo-2,3-dihydro-lH-indol-5-sulfonové kyseliny

Postupem z Příkladu 2 se získá 92 % výtěžek požadované sloučeniny:

'HNMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ 13,5 (s, br, 1H, NH), 12,21 (s, br, 1H, NH), 8,18 (d, J = 1,8 Hz, 1H, H-4), 7,84 (s, 1H, H-vinyl), 7,44 (dd, J = 1,8,8,4 Hz, 1H, H-6), 7,05 (d, J = 8,4 Hz, 1H, H-7), 2,59 (s, 6H, 2xCH₃), 2,59-2,64 (m, 2H, CH₂), 2,44 (s, 6H, 2xCH₃), 2,38-2,44 (m, 2H, CH₂), 2,31 (s, 6H, 2xCH₃), 1,59-1,69 (m, 2H, CH₂),

MS El 430 [M] ⁺ .

7. Biologické hodnocení

Přínosem tohoto vynálezu je dosažení spektra biologické aktivity kterékoli dané série sloučenin. Ve svých současných výhodných provedeních se tento vynález vztahuje na nové pyrol substituující 2indolinony vykazující schopnost modulovat aktivitu RTK, CTK a STK. Následující testy jsou použity pro výběr těch sloučenin, které vykazují optimální stupeň požadované aktivity.

φ φ · • · • · • · φφ ·

143 ·· ·« » • · ·· • · • φ • φ φφφφ φφφ »· φφ e « · φ • · φ *φφ φφφ φφ φ·φ·

A. Postupy testů

Následující in vitro testy lze použít ke stanovení úrovně aktivity a účinku různých sloučenin tohoto vynálezu na jednu nebo více proteinkináz. Podobné testy mohou být podobným způsobem použity pro jakékoli proteinkinázy s použitím technik, které jsou pracovníkům v oboru dobře známé.

Zde popsaný buněčný/katalytický test je proveden na formátu ELISA testu. Obecný postup je následující: sloučenina se vpraví do buňky exprimující testovanou kinázu, ať již přirozeně, nebo v důsledku rekombinace, po určitou zvolenou dobu, po které, je-li testovanou kinázou receptor, se přidá ligand známý pro aktivaci tohoto receptorů. Buňky se lyžují a lyzát je přenesen do jamek ELISA destičky, která byla nejdřív povlečena specifickou protilátkou rozpoznávající substrát této enzymatické fosforylační reakce. Bezsubstrátové složky buněčného lyzátu jsou odmyty a množství fosforylace substrátu je určeno pomocí protilátky specificky rozpoznávající fosfotyrosin v porovnání s kontrolními buňkami, které nepřišly do styku s testovanou sloučeninou. Zde popsaný buněčný/biologický test měří množství DNA vytvořené jako odpověď na aktivaci testované kinázy, která je obecně mírou proliferační odpovědi. Obecný postup tohoto testu je následující: sloučenina je vpravena do buněk exprimujících testovanou kinázu, ať již přirozeně, nebo v důsledku rekombinace, na vybrané časové období, po kterém, je-li testovaná kináza receptorem, je přidán ligand známý pro aktivaci tohoto receptorů. Po inkubaci nejméně přes noc je přidáno činidlo pro značení DNA, jako bromdeoxyuridin (BrdU) nebo 3H-thymidin. Množství značené DNA se určí buď protilátkou proti BrdU nebo měřením radioaktivity v porovnáni s kontrolními buňkami, které nepřišly do kontaktu s testovanou sloučeninou.

• ·

144

Buněčné/katalytické testy

K detekci a měření přítomnosti aktivity PK lze použít ELISA test (Enzyme linked immunosorbent assay). ELISA se provede podle známých protokolů, které jsou popsány např. v Voliér, et. al., 1980, Enzyme- Linked Immunosorbent Assay, v: Manual of Clinical Immunology, 2.vyd., editované Rose a Friedmanem, str. 359-371 Am. Soc. of Microbiology, Washington, D.C.

Uvedený protokol může být upraven pro určení aktivity s ohledem na specifickou PK. To jest, výhodný protokol pro provedení ELISA experimentů pro specifické protein kinázy je uveden níže. Nicméně úpravy těchto protokolů pro určení aktivity sloučeniny ostatních členů rodiny RTK, stejně tak jako pro CTK a STK, jsou pracovníkům v oboru dobře známy.

Test FLK-1

Provede se ELISA test pro měření kinázové aktivity receptorů FLK-1 a specifičtěji inhibice nebo aktivace tyrosinkinázové aktivity receptorů FLK-1. Specificky může být následující test proveden pro měření kinázové aktivity receptorů FLK-1 v buňkách geneticky upravených pro expresi Flk-1.

Látky a činidla.

a. 96ti-jamkové ELISA destičky Corning (Corning Katalog ě. 25805-96),

b. Cappelovo kozí proti králičí IgG (katalog, ě. 55641),

c. PBS (Gibco katalog, č. 450-1300EB),

d. TBSW pufr (50 mM Tris (pH 7,2), 150 mM NaCl a 0,1 % Tween-20).

e. Zásobní ethanolamin (10 - ethanolamin (pH 7,0), skladovaný při 4°C, ·

145

99 • · t *

• 9

9 9

9999

9 9

9 9

f. HNTG pufr (20 mM HEPES pufr (pH 7,5), 150 mM NaCl, 0,2 % Triton X-100 a 10 % glycerol),

g. EDTA (0,5 M (pH 7,0) jako zásobní 100X),

h. Ortovanadičnan sodný (0,5 M jako zásobní 100X),

i. Pyrofosfát sodný (0,2 M jako zásobní 100X),

j. Polypropylénové 96ti-jamkové destičky NUNC se dnem ve tvaru V (Applied Scientific Catalog. č. AS-72092),

k. Buňky NIH3T3 C7#3 (buňky exprimující FLK-1),

l. DMEM s IX vysokým glukózo L-glutaminem (katalog, č. 1 1965-050),

m. FBS, Gibco (katalog č. 16000-028),

n. L-glutamin, Gibco (katalog, č. 25030-016),

o. VEGF, PeproTech, lne. (katalog, č. 100-20) (uchovávaný jako 1 pg/100 μΐ zásobní roztok v Milli-Q dH₂O a skladovaný při

-20°C),

p. Afinitně purifikované anti-FLK-1 antisérum,

q. UB40 monoklonální protilátka proti fosfotyrosinu (viz Fendley, et. al., 1990, Cancer Research 50:1550-1558),

r. EIA stupeň kozí proti králičí IgG-POD (BioRad katalog, č. 1721011),

s. Roztok 2,2-azino-bis(3-ethylbenz-thiazolin-6-kyseliny sulfonové (ABTS) (100 mM kyselina citrónová (bezvodá), 250 mM Na₂HPC>4 (pH 4,0), 0,5 mg/ml ABTS (Sigma katalog, č. A1888), roztok se až do použití uchovává v temnu při 4°C,

t. H₂O₂ (30 % roztok) (Fischer katalog, č. H325),

u. ABTS/ H₂O₂ (15 ml roztoku ABTS, 2 μΐ H₂O₂) připravené 5 minut před použitím a ponecháno při pokojové teplotě,

v. 0,2 M zásoba HCI v H₂O,

w. dimetylsulfoxid (100 %) (Sigma katalog, č. D-8418) a

x. Trypsin-EDTA (Gibco BRL katalog, č. 25200-049).

146

Protokol

1. Corningovy 96ti-jamkové ELISA destičky se povlečou s 1,0 pg Cappelova protikráličiho IgG antiséra v 0,1 M Na₂CO₃ pH 9,6 v každé jamce. Povlečené destičky se uchovají přes noc při 4°C. Jsou-li destičky skladovány při teplotě 4°C, mohou být uchovávány až dva týdny.

2. Buňky se pěstují v růstovém médiu (DMEM, doplněný 2,0 mM Lglutaminem, 10 % FBS) ve vhodných kultivačních miskách až do souvislého pokrytí při 37°C, v 5 % CO₂.

3. Buňky se sklidí trypsinizací a vysejou do 96ti-jamkových Corningových 25850 polystyrénových destiček s kulatým dnem v množství 25 000 buněk/jamka ve 200 pL růstového média.

4. Buňky se pěstují alespoň jeden den při teplotě 37°C, 5 % CO₂.

5. Buňky se omyjí IX D-PBS.

6. Do každé jamky se přidá 200 pl hladového média (DMEM, 2,0 mM L-glutamin, 0,1 % FBS). Inkubuje se přes noc při 37°C v 5 % CO₂.

7. Sloučeniny se naředí 1:20 na 96ti-jamkové polypropylenové destičce s použitím hladového média. Pro použití na kontrolní buňky se naředí dimethylsulfoxid 1:20.

8. Z kultivačních 96ti-jamkovýh destiček s buňkami se odstraní hladové médium a do každé jamky se přidá 162 pl čerstvého hladového média.

9. Do každé jamky se přidá 18 pl ředění sloučeniny ředěné 1:20 (z kroku 7) a ředění 1:20 dimethylsulfoxidu ke kontrolním buňkám (+/VEGF), pro konečné ředění 1:2000 po stimulaci buněk. Konečná koncentrace dimethylsulfoxidu je 0,5 %. Destička se inkubuje při 37°C v 5 % CO₂ po dobu dvou hodin.

10. Nenavázaná protilátka se s ELISA destiček odstraní jejich převrácením, aby tekutina vytekla. Destičky se třikrát omyjí TBSW + 0,5 % ethanolamin, pH 7,0. Přebytečná tekutina a bubliny se odstraní vytřepáním destičky na papírový ručník.

• 4 ··· • 4

147

11. Destičky se blokují TBSW + 0,5 % ethanolamin, pH 7,0 v množství 150 μΐ na každou jamku. Destička se inkubuje třicet minut za stálého třepání na třepačce pro mikrotitrační destičky.

12. Destičky se třikrát omyjí postupem popsaným v kroku 10.

13. Do každé jamky se přidá 0,5 μΐ afinitně purifikovaného anti-FLU-1 polyklonálního králičího antiséra. Každá jamka se doplní do konečného objemu 150 μΐ TBSW + 0,5 % ethanolamin pH 7,0. Destička se inkubuje třicet minut za stálého třepání.

14. K buňkám se přidá 180 μΐ hladového média a buňky se stimulují 20 μΐ/jamka 10,0 mM ortovanadičnanem sodným a 500 ng/ml VEGF (čímž se dosáhne konečné koncentrace 1,0 mM orthovanadičnanu sodného a 50 ng/ml VEGF v každé jamce) po dobu 8 minut při 37°C, 5 % CO2. Jamky s negativní kontrolou obdrží pouze hladové médium.

15. Po osmi minutách se médium s buněk odstraní a destička se jednou omyje 200 μΐ/jamka PBS.

16. Buňky se lyžují v 150 μΐ/jamka HNTG za stálého třepání při pokojové teplotě po dobu pěti minut. HNTG formulace zahrnuje orthovanadičnan sodný, pyrofosfát sodný a EDTA.

17. ELISA destička se třikrát omyje způsobem popsaným v kroku 10.

18. Buněčný lyzát se s kultivační destičky přenese na ELISA destičku a inkubuje se za stálého třepání dvě hodiny. Pro přenesení buněčného lyzátu se při seškrabování jamek vypouští a nasává obsah pipety.

19. Destička se třikrát omyje způsobem popsaným v kroku 10.

20. ELISA destička se inkubuje s 0,02 pg/jamka UB40 v TBSW + 0,5 % ethanolamin. Jamky se doplní do končeného objemu 150 μΐ/jamka. Inkubuje se za stálého třepání 30 minut.

21. Destička se třikrát omyje způsobem popsaným v kroku 10.

22. ELISA destička se inkubuje s 1 : 10 000 ředěným EIA kozím antimyším IgG konjugovaným křenovou peroxidázou v TBSW + 0,5 % ethanolamin, pH 7,0. Doplní se do konečného objemu 150 μΐ/jamka. Inkubuje se za stálého třepání třicet minut.

23. Destička se třikrát omyje způsobem popsaným v kroku 10.

148 »··· ··» ·» ···· ** *

24. Do každé jamky se přidá 100 μΐ ABTS/H2O2. Inkubuje se deset minut za stálého třepání.

25. Přidá se 100 μΐ 0,2 M HCI do konečné koncentrace 0,1 M HCI, aby se zastavil vývoj barevné reakce. Třepe se 1 minutu při pokojové teplotě. Bubliny se odstraní slabým proudem vzduchu a ELISA destička se odečte na mikrofotometru pro ELISA mikrotitrační destičky při 410 nm.

Test na EGF receptor - HER2 chimérický receptor v celých buňkách

Kinázová aktivita HER2 v celých buňkách EGFR-NIH3T3 se měří následujícím způsobem:

Látky a činidla

a. EGF: zásobní koncentrace: 16,5 ILM, EGF 201, TOYBO, Co. Ltd. Japan.

b. 05-101 (UBI) (monoklonální protilátka rozpoznávající extracelulární doménu EGFR).

c. Protilátka proti fosfotyrosinu (anti-Ptyr) (polyklonální) (viz Fendley, et al., supra).

d. Detekční protilátka: kozí protikráliěí IgG konjugovaný křenovou peroxidázou, TÁGO, lne., Burlingame, CA.

e. TBST pufr:

Tris-HCl, pH 7,2 50 mM NaCl 150 mM

Triton X-100 0,1

f. HNTG 5X zásobní

HEPES 0,1 M

NaCl 0,75 M

Glycerol 50 %

Triton X-100

1,0 %

149 • »

g. ABTS zásobní:

Kyselina citrónová Na₂HPO₄ HCI, koncentr. ABTS*

100 mM

250 mM 0,5 mM 0,5 mg/ml * (2,2'-azinobis(3-ethylbenzthiazolinsulfonová kyselina)

h. Zásobní roztoky:

EDTA 100 mM pH 7,0 Na₃VO₄ 0,5 M Na₄(P₂O₇) 0,2 M

Postup

Předpovlečení ELISA destičky

1. ELISA destičky (Corning, 96ti-jamkové, katalog. #25805-96) se povlečou protilátkou 05-101 v množství 0,5 pg na jamku v PBS, konečný objem 100 pl/jamka a uskladní se přes noc při teplotě 4°C. Povlečené destičky jsou k použitelné až 10 dnů, jsou-li skladovány při teplotě 4°C.

2. V den použití se odstraní povlékací pufr a nahradí se 100 pl blokovacího pufru (5 % Carnation instantní odtučněné sušené mléko v PBS). Destička se inkubuje a třepe při pokojové teplotě (kolem 23°C až 25°C) po dobu 30 minut. Těsně před použitím se odstraní blokovací pufr a destička se čtyřikrát omyje TBST pufrem.

Vysévání buněk

1. Pro tento test může být použita buněčná linie NIH3T3 se zvýšenou expresí chimérického receptorů obsahujícího EGFR extracelulární doménu a intracelulární kinázovou doménu HER2.

• ·

Φ «

150

2. Pro experiment se vyberou misky s 80-90 % souvislým pokryvem. Buňky se trypsinizují a reakce se zastaví přidáním 10 % fetálního hovězího séra. Buňky se suspendují v DMEM médiu (10 % CS DMEM médium) a centrifugují se jednou při 1500 rpm při pokojové teplotě po dobu 5 minut.

3. Buňky se resuspendují ve vysévacím médiu (DMEM, 0,5 % hovězí sérum) a spočítají použitím trypanové modři. Přijatelná je životnost přes 90 %. Buňky se vysejí v DMEM médiu (0,5 % hovězí sérum) v hustotě 10 000 buněk na jamku, 100 μΐ na jamku na 96ti-jamkové mikrotitrační destičce. Vyseté buňky se inkubují v 5 % CO2 při 37°C po dobu přibližně 40 hodin.

Postupy testu

1. Vyseté buňky se zkontrolují, zdali nejsou kontaminovány, pod invertovaným mikroskopem. Zásobní léčivo (10 mg/ml v DMSO) se naředí DMEM médiem 1 : 10, pak se přenese 5 μΐ do jamky TBST do konečného ředění léčiva 1 : 200 a konečné koncentrace DMSO 1 %. Kontrolní jamky obdrží pouze DMSO. Inkubuje se dvě hodiny v 5 % CO₂ při 37°C.

2. Připraví se EGF ligand: zásobní EGF v DMEM se naředí tak, aby se při přenosu 10 μΐ ředěného EGF (ředění 1:12) dosáhlo konečné koncentrace 100 nM.

3. Připraví se čerstvé HNTG* v množství dostatečném na 100 μΐ do každé jamky a umístí se na led.

HNTG* (10 ml): zásobní HNTG Milli-Q H2O

2,0 ml

7,3 ml

EDTA, 100 mM, pH 7,0 0,5 ml

Na₃VO₄ (0,5 M) 0,1 ml

Na₄(P₂O₇) (0,2 M) 0,1 ml

4. Po 120 minutách inkubace s léčivem se k buňkám přidá připravený ligand SGF v množství 10 μΐ na jamku do konečné koncentrace 100 «<? ·· ·· • flfl * • fl

151 • ·»· X· ·

I fl ♦ fl ♦

I · fl 4 «· flfl X flfl nM. Kontrolní jamky obdrží pouze DMEM. Inkubuje se za stálého třepání při pokojové teplotě po dobu 5 minut.

5. Léčivo, EGF a DMEM se odstraní. Buňky se dvakrát omyjí PBS. K buňkám se v množství 100 μΐ na jamku přenese HNTG*. Umístí se na led na 5 minut. Mezitím se z jiné ELISA destičky odstraní blokovací pufr a omyje se TBST výše popsaným způsobem.

6. Pipetovací špičkou pevně nasazenou na mikropipetu se buňky seškrabují s destičky a homogenizují se opakovaným nasáváním a vypouštěním HNTG* lyzovacího pufru pipetou. Lyzát se přenese na povlečenou, blokovanou a omytou ELISA destičku. Inkubuje se při pokojové teplotě jednu hodinu.

7. Lyzát se odstraní a destička se čtyřikrát omyje TBST. Na destičku se přenese čerstvě naředěná protilátka proti fosfotyrosinu v množství 100 μΐ na jamku. Inkubuje se za stálého třepání při pokojové teplotě po dobu 30 minut za přítomnosti protilátky proti fosfotyrosinu (ředění 1:3000 v TBST).

8. Protilátka proti fosfotyrosinu se odstraní a destička se čtyřikrát omyje TBST. Na destičku se přenese čerstvě naředěná TÁGO protikráličí IgG protilátka v množství 100 μΐ na jamku. Inkubuje se za stálého třepání při pokojové teplotě 30 minut (ředění protikráličí IgG protilátky 1 : 3000 v TBST).

9. Odstraní se detekční TÁGO protilátka a destička se omyje čtyřikrát TBST. Na destičku se přenese čerstvě naředěný roztok ABTS/H2O2 v množství 100 μΐ na jamku. Inkubuje se za stálého třepání při pokojové teplotě po dobu 20 minut, (roztok ABTS/H₂O₂: 1,0 μΐ 30 % H₂O₂ v 10 ml zásobního ABTS).

10. Reakce se zastaví přidáním 50 μΐ 5 N H2SO4 (volitelné), a určí se optická denzita při 410.

11. Maximální fosfotyrosinový signál je určen odečtením hodnot negativních kontrol od pozitivních kontrol. Procento inhibice fosfotyrosinového obsahu pro extrakt obsahující buňky se pak vypočítá po odečtení negativních kontrol.

♦ * ♦

152

•··· ·*· • · · t • · 4 t 4 • 9 · * ·»···>* ·.* *

Test PDGF-R

Všechna buněčná kultivační média, glutamin a fetální hovězí sérum je nakoupeno od Gibco Life Technologies (Grand Island, NY), pokud není určeno jinak. Všechny buňky jsou pěstovány ve vlhké atmosféře 90-95 % vzduchu a 5-10 % CO₂ při 37°C. Všechny buněčné linie se rutinně přesazují dvakrát týdně a určuje se nepřítomnost mykoplazmat metodou mykotestu (Gibco).

Pro ELISA testy se pěstují buňky (U1242, získané od Josepha Schlessingera, NYU) do souvislého pokrytí 80 - 90 % v růstovém médiu (MEM s 10 % FBS, NEAA, 1 mM NaPyr a 2 mM GLN) a vysévají se na 96ti-jamkové destičky pro tkáňové kultury v 0,5 % séru v množství 25 000 až 30 000 buněk na jamku. Po inkubaci přes noc v médiu obsahujícím 0,5 % sérum je buňkám médium zaměněno za bezsérové médium a buňky jsou ošetřeny testovanou sloučeninou po dobu 2 hodin v 5 % CO₂ při 37°C v inkubátoru. Buňky se potom stimulují ligandem 5-10 minut, po čemž následuje lýza pomocí HNTG (20 mM HEPES, 150 mM NaCl, 10 % glycerol, 5 mM EDTA, 5 mM Na₃VO4, 0,2 % Triton X-100 a 2 mM NaPyr). Buněčný lyzát (0,5 mg/jamka v PBS) se přenese na ELISA destičky, které byly předem povlečeny protilátkou specifickou na receptor a která byla blokována 5 % mlékem v TBST (50 mM Tris-HCl pH 7,2, 150 mM NaCl a 0,1 % Triton X-100) při pokojové teplotě 30 minut. Lyzáty se inkubují za stálého třepání při pokojové teplotě jednu hodinu. Destičky se čtyřikrát omyjí TBST a pak se inkubují s polyklonální protilátkou proti fosfotyrosinu při pokojové teplotě 30 minut. Přebytečná protilátka proti fosfotyrosinu se odstraní čtyřnásobným opláchnutím destičky TBST. Na ELISA destičku se přidá kozí protikráličí IgG protilátka na dobu 30 minut při pokojové teplotě, po čemž následuje opět čtyřnásobné omytí TBST. Pro spuštění barevné reakce se na ELISA destičku přidá ABTS (100 mM kyselina citrónová, 250 mM Na₂HPO4 a 0,5 mg/ml 2,2 '-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6sulfonová kyselina)) plus H₂O₂ (1,2 ml 30 % H₂O₂ do 10 ml ABTS).

« t

153 ·· »

* ·

Patnáct až třicet minut po přidání ABTS se zaznamená absorbance při 410 nm s referenční vlnovou délkou 630 nm.

Test receptorů IGF-1

Následující protokol může být použit pro měření hladiny fosfotyrosinu na receptorů IGF-1, která indikuje tyrozinkinázovou aktivitu IGF-1 receptorů.

Látky a činidla.

a. Buněčnou linií použitou v tomto testuje 3T3/IGF-1R, buněčná linie geneticky upravená pro zvýšenou expresi IGF-1 receptorů.

b. NIH3T3/IGF-IR se pěstuje v inkubátoru s 5 % CO₂ při 37°C. Růstovým médiem je DMEM + 10 % FBS (tepelně inaktivované) + 2 mM L-glutamin.

c. Afinitně purifikovaná anti-IGF-lR protilátka 17-69.

d. D-PBS:

0,20 g/1 2,16 g/1

0,20 g/1

8,00 g/1 (pH 7,2)

TBST plus 5 % mléko (Carnation instantní

KH₂PO₄ KH₂PO₄ KC1 NaCl

e. Blokovací pufr:

odtučněné sušené mléko)

f. TBST pufr:

Tris- HCI NaCl glycerol Triton X-100

g. HNTG pufr:

HEPES NaCl glycerol mM

150 mM (pH 7,2/HCl 1 N) %

0,2 % mM

150 mM (pH 7,2/HCl 1 N) %

154

Triton X-100 0,2 %

Připraví se zásobní roztok (5X) a uchovává se při 4°C.

h. EDTA/HC1: 0,5 M pH 7,0 (NaOH) jako 100X zásobní roztok.

i. Na₃VO4: 0,5 M jako 100X zásobní. Alikvótní množství se uchovávají při 80°C.

j. Na4P2O7: 0,2 M jako 100X zásobní.

k. Insulinu podobný růstový faktor 1 od Promegy (kat. # G5111).

l. Králičí polyklonální antisérum proti fosfotyrosinu.

m. Kozí protikráličí IgG, POD konjugát (detekční protilátka), TÁGO, lne., Burlingame, CA.

n. ABTS roztok (2,2 '-azinobis(3-ethylbenzthiazolinsulfonové kyseliny):

Kyselina citrónová 100 mM

Na₂HPO₄ 250 mM (pH 4,0/1 N HC1)

ABTS 0,5 mg/ml roztok ABTS je nutno uchovávat v temnu při 4°C. Jakmile roztok zezelená, měl by se vyřadit.

o. Peroxid vodíku: 30 % roztok se uchovává v temnu při 4°C.

Postup

Pokud není uvedeno jinak, provádějí se všechny následující kroky při pokojové teplotě. Všechny oplachy ELISA destiček jsou provedeny tak, že destičky jsou třikrát opláchnuty vodou z vodovodu a poté jednou opláchnuty TBST. Destičky se suší vytřepáním na papírový ručník.

Vysetí buněk:

1. Buňky se pěstují v miskách na tkáňové kultury (Corning 25020-100) do souvislého pokryvu 80 - 90 %, sklidí se Trypsin-EDTA (0,25 %, 0,5 ml/D-100, GIBCO).

• » φ ·

Φ · Φ

155

• Φ » · «» ♦

ΦΦ

2. Buňky se resuspendují v čerstvém DMEM + 10 % FBS + 2 mM LGlutamin a přenesou na 96ti-jamkovou destičku na tkáňové kultury (Corning, 25806-96) v množství 20 000 buněk/jamka (100 μΐ/jamka). Inkubuje se 1 den, a pak se médium nahradí bezsérovým médiem (90 μΐ) a inkubuje přes noc v 5 % CO₂ při 37°C.

Povlékání a blokování ELISA destiček:

1. ELISA destička (Corning 25805-96) se povléká protilátkou antiIGF-1R v množství 0,5 pg/jamka v 100 μΐ PBS nejméně 2 hodiny.

2. Zásobní léčivo (ve 100 % DMEM) se naředí DMEM 1 : 10 na 96tijamkové polypropylenové destičce a do každé jamky se k buňkám přenese 10 μΐ tohoto roztoku, aby se dosáhlo konečného ředění léčiva 1 : 100 a konečné koncentrace DMSO 1, %. Buňky se inkubují v 5 % CO₂ při 37°C dvě hodiny.

3. Připraví se	čerstvý lyzovací pufr na buňky (HNTG*)
HNTG	2 ml
EDTA	0,1 ml
Na3VO4	0,1 ml
Na4 (P2O7)	0,1 ml
H2O	7,3 ml

4. Po inkubaci léčiva po dvě hodiny se k buňkám přenese v množství 10 μΐ/jamka 200 nM ligand IGF-1 v PBS (konečná koncentrace je 20 nM) a inkubuje se v 5 % CO₂ při 37°C 10 minut.

5. Médium se odstraní a přidá se do každé jamky 100 μΐ HNTG* a třepe se 10 minut. Buňky se prohlédnou pod mikroskopem, zda jsou adekvátně lyžovány.

6. Na seškrábání buněk s destičky se použije 12ti-nástavcová pipeta. Lyzát se homogenizuje opakovaným nasáváním a vypouštěním. Veškerý lyzát se přenese na ELISA destičku povlečenou protilátkou a třepe se 1 hodinu.

4 ·

4

156 ♦ · »·»· 444

7. Lyzát se odstraní, destička se omyje a přenese se protilátka proti fosfotyrosinu (1:3000 v TBST) v množství 100 μΙ/jamka a třepe se 30 minut.

8. Detekční protilátka se odstraní, destička omyje a přenese se čerstvý roztok ABTS/H2O2 (1,2 μΐ H2O2 do 10 ml ABTS) v množství 100 μΙ/jamka, aby se nastartovala barevná reakce.

Změří se O.D. při 410 nm s referenční vlnovou délkou 630 nm na

Dynatec MR5000.

Test EGFR

Kinázová aktivita receptoru EGF v buňkách geneticky upravených pro expresi lidského EGF-R se může měřit následujícím způsobem:

Látky a činidla.

a. Ligand EGF: zásobní koncentrace = 16,5 μΜ, EGF 201, TOYOBO, Co. Ltd. Japan.

b. 05-101 (UBI) (monoklonální protilátka rozpoznávající extracelulární doménu EGFR).

c. Protilátka proti fosfotyrosinu (anti-Ptyr) (polyklonální).

d. Detekční protilátka: kozí protikráličí IgG konjugovaná křenovou peroxidázou, TÁGO, lne., Burlingame, CA.

e. TBST pufr: Tris-HCl, pH 7 NaCl

Triton X-100 mM

150 mM

0,1

f. HNTG 5X zásobní

HEPES

0,1 M

NaCl

0,75 M glycerol Triton X-100

1,0 % ··

157

g. ABTS zásobní: kyselina citrónová Na₃VO₄ HCI, koncentr. ABTS*

100 mM 250 mM 4,0 pH 0,5 mg/ml

Uchovávejte roztok až do použití v temnu při 4°C.

h. Zásobní činidla

EDTA 100 mM pH 7,0 Na₃VO₄ 0,5 M Na₄ (P₂O₇) 0,2 M

Postup

Předpovlékání ELISA destičky

1. ELISA destičky (Corning, 96ti-jamkové, katalog, č. 25805-96) se povlékají protilátkou 05-101 v množství 0,5 pg na jamku v PBS, konečný objem jamky 150 pl. Uskladní se přes noc při 4°C. Povlečené destičky jsou vhodné k upotřebení až 10 dnů, jsou-li uchovávány v 4°C.

2. V den použití se povlékací pufr odstraní a nahradí se blokovacím pufrem (5 % Carnation instantní odtučněné sušené mléko v PBS). Destička se inkubuje a třepe při pokojové teplotě (kolem 23°C až 25°C) třicet minut. Těsně před použitím se odstraní blokovací pufr a destička se čtyřikrát omyje TBST pufrem.

Vysévání buněk

1. Pro tento test může být použita buněčná linie NIH3T3/C7 (Honegger, et al., Cell 51:199-209, 1987).

2. Pro experiment se vyberou destičky, které mají souvislý pokryv 80 90 %. Buňky se trypsinizují a reakce se zastaví přidáním 10 % CS DMEM média. Buňky se resuspendují v DMEM médiu (10 % CS φ · ·· ♦ φφφ ♦ φφφ φ φφφφ φφφ φ φ «φ φφφφ φφ ·

Β ·

158

DMEM médium) a centrifugují se jednou při 1000 rpm při pokojové teplotě po dobu 5 minut.

3. Buňky se resuspendují ve vysévacím médiu (DMEM, 0,5 % hovězí sérum) a buňky se spočítají s použitím trypanové modři. Je přijatelná životnost nad 90 %. Buňky se vysejí v médiu DMEM (0,5 % hovězí sérum) v hustotě 10 000 buněk na jamku, 100 μΐ na jamku, na 96ti-jamkovou destičku. Buňky se inkubují v 5 % CO₂ při 37°C po dobu 40 hodin.

Postupy testu

1. Vyseté buňky se zkontrolují na kontaminaci s použitím invertovaného mikroskopu. Zásoba testovaných sloučenin se naředí (10 mg/ml v DMSO) 1:10 v DMEM médiu, pak se přenese 5 μΐ do testovacích jamek pro ředění testovaných sloučenin léčiv 1 : 200 a konečné koncentrace DMSO 1 %. Kontrolní jamky obdrží pouze DMSO. Inkubuje se v 5 % CO₂ při 37°C po dobu jedné hodiny.

2. Připraví se ligand EGF: zásobní EGF se naředí DMEM, aby se při přenosu dosáhlo 10 μΐ ředěného EGF (1:12 ředění), finální koncentrace 25 nM,

3. Připraví se 10 ml HNTG* dostatečné pro 100 μΐ na jamku, přičemž HNTG* obsahuje: zásobní HNTG (2,0 ml), Milli-Q H2O (7,3 ml), EDTA, 100 mM, pH 7,0 (0,5 ml), Na₃VO₄ 0,5 M (0,1 ml) a Na₄(P₂O₇), 0,2 M (0,1 ml).

4. Umístí se na led.

5. Po dvou hodinách inkubace s léčivem se k buňkám přidá připravený ligand EGF v množství 10 μΐ na jamku, aby se dosáhlo konečné koncentrace 25 nM. Kontrolní jamky obdrží pouze DMEM. Inkubuje se za stálého třepání při pokojové teplotě 5 minut.

6. Odstraní se testovaná sloučenina, EGF, a DMEM. Buňky se dvakrát omyji PBS. K buňkám se přenese HNTG* v množství 100 μΙ/jamka. Umístí se na 5 minut na led. Mezitím se s jiné ELISA destičky • 0 • 0

159 » · 0*9 00 0000 odstraní blokovací pufr a destička se omyje TBST výše popsaným způsobem.

7. Buňky se seškrábou s destičky špičkou pipety pevně nasazenou na mikropipetu a buněčný materiál se homogenizuje opakovaným nasáváním a vypouštěním lyzovacího HNTG pufru. Lyzát se přenese na povlečenou, blokovanou a omytou ELISA destičku. Inkubuje se za stálého třepání při pokojové teplotě jednu hodinu.

8. Lyzát se odstraní a destička se čtyřikrát omyje TBST. Na destičku se přenese čerstvě naředěná protilátka proti fosfotyrosinu v množství 100 μΐ/jamka. Inkubuje se za stálého třepání při pokojové teplotě 30 minut za přítomnosti protilátky proti fosfotyrosinu (ředění 1:3000 v TBST).

9. Odstraní se protilátka proti fosfotyrosinu a destička se čtyřikrát omyje TBST. Přenese se čerstvě naředěná TÁGO 30 protikráličí IgG protilátka na ELISA destičku v množství 100 μΐ. Inkubuje se za stálého třepání při pokojové teplotě 30 minut (protikráličí IgG protilátka: ředění 1:3000 v TBST).

10.Odstraní se detekční protilátka a destička se čtyřikrát omyje TBST. Přenese se čerstvě připravený roztok ABTS/H2O2 na ELISA destičku v množství 100 μΐ/jamka. Inkubuje se při pokojové teplotě 20 minut. Roztok ABTS/H2O2: 1,2 μΐ 30 % H₂O₂ v 10 ml zásobního ABTS.

11. Reakce se zastaví přidáním 50 μΐ 5 N H₂SO₄ (volitelné) a určí se O.D. při 410 nm.

12. Maximální fosfotyrosinový signál je určen odečtením hodnoty negativních kontrol od pozitivních kontrol. Procento inhibice obsahu fosfotyrosinu v extraktu obsahujícím buňky se pak spočítá po odečtení negativních kontrol.

Test autofosforylace Met

Tento test určuje aktivitu Met tyrozinkinázy analýzou hladiny Met proteintyrozinkinázy na Met receptorů.

160 ·· ·· ♦· • · ♦ ♦ · · • · · • * · · · • · · · «· 9 9 9 9 ·9 9

Činidla

a. HNTG (5X zásobní roztok): rozpustí se 23,83 g HEPES a 43,83 g NaCl v přibližně 350 ml dH₂O. Upraví se pH HC1 nebo NaOH na 7,2, přidá se 500 ml glycerolu a 10 ml Triton X-100, smíchá se a do celkové objemu 1 L se doplní dH₂O. Pro přípravu 1 L IX pracovního roztoku se přidá 200 ml 5X zásobního roztoku do 800 ml dH₂O, v případě potřeby se zkontroluje a upraví pH, uskladní se v 4°C.

b. PBS (Dulbeccův fosfátem pufrovaný fyziologický roztok), Gibco katalog, č. 450-1300EB (IX roztok).

c. Blokovací pufr: do 500 ml dH₂O se dá 100 g BSA, 12,1 g Tris-pH 7,5; 58,44 g NaCl a 10 ml Tween-20, naředí se do konečného objemu 1 1.

d. Kinázový pufr: do 500 ml dH2O se přidá 12,1 g TRIS (pH 7,2), 58,4 g NaCl, 40,7 g MgCl₂ a 1,9 g EGTA, do konečného objemu 1 L se doplní dH₂O.

e. PMSF (fenylmethylsulfonylfluorid), Sigma kat. č. P-7626, k 435,5 mg se přidá 100 % ethanol do celkového objemu 25 ml, vortexuje se.

f. ATP (bakteriální zdroj), Sigma kat. č. A-7699, prášek se uskladňuje při -20°C. Pro přípravu roztoku k použití se rozpustí 3,31 mg v 1 ml dH₂O.

g. RC-20H HRPO konjugovaná proti fosfotyrosinu, Transduction Laboratories Cat. č. E120H.

h. Pierce 1-Step™ Turbo TMB-ELISA (3,3',5,5'- tetramethylbenzidin, Pierce Kat. ě. 34022.

i. H₂SO4, přidá se 1 ml koncentr. (18 N) do 35 ml dH₂O.

j. TRIS HCL, Fischer kat. č. BP152-5, do 121,14 g látky se přidá 600 ml MilliQ H₂O, upraví se pH na 7,5 (nebo 7,2) HC1, do celkového objemu 1 1 se doplní MilliQ H₂O.

k. NaCl, Fischer kat. č. S271-10, připraví se 5 M roztok.

l. Tween-20, Fischer kat. č. S337-500.

m. Na3VO4, Fischer kat. č. S454-50, k 1,8 g látky se přidá 80 ml MilliQ H₂O, pH se upraví HC1 nebo NaOH na 10,0, povaří se v ♦ 4 9 • ·

161

9 · 9 •

• 9 9 • 9 9 · 4 mikrovlnné troubě, ochladí, zkontroluje se pH. Postup se opakuje, dokud není pH stabilně na 10,0. Do celkového objemu 100 ml se doplní MilliQ H₂O, připraví se alikvóty 1 ml, které se uskladní v

-80°C.

n. MgC12, Fischer kat. č. M33-500, připraví se 1 M roztok.

o. HEPES, Fischer kat. č. BP310-500, do 200 ml MilliQ H₂O se přidá 59,5 g látky, upraví se pH na 7,5, doplní se do celkového objemu 250 ml, sterilně se sfiltruje.

p. Albumin, hovězí (BSA), Sigma kat. ě. A-4503, ke 30 g látky se přidá sterilní destilovaná voda do celkového objemu 300 ml, uskladní se při 4°C.

q. TBST pufr: k přibližně 900 ml dH₂O v jednolitrovém kalibrovaném válci se přidá 6,057 g TRIS a 8,766 g NaCl. Jakmile se rozpustí, upraví se pH na 7,2 HC1, přidá se 1,0 ml Triton X-100 a do konečného objemu 1 L se doplní dH₂O.

r. Kozí afinitně purifikovaná protikráličí IgG (celé molekuly), Cappel Cat. č 55641.

s. Anti h-Met (C-28) králičí polyklonální IgG protilátka, Santa Cruz Chemical Cat. č. SC-161.

t. Dočasně transfekované chimérické buňky EGFR/Met (EMR) (Komada, et al., Oncogene, 8:2381-2390 (1993).

u. Pufr uhličitanu sodného (Na₂CC>4, Fischer kat. č. S495): k 10,6 g látky se přidá 800 ml MilliQ H₂O. Jakmile se rozpustí, upraví se pH na 9,6 pomocí NaOH, do celkového objemu se doplní MilliQ H₂O, sfiltruje a uskladní při 4°C.

Postup

Pokud není uvedeno jinak, provádějí se všechny následující kroky při pokojové teplotě. Všechny ELISA destičky se omývají 4X opláchnutím TBST.

9 99 9999 999

9 9 9 9 9 9 , ♦ 99·· *9··

162 ,;.. ,:, ·..· .

Lyže EMR

Tento postup lze použít noc před nebo bezprostředně před započetím záchytu receptoru.

1. Lyzát se rychle roztaví ve vodní lázni mající teplotu 37°C při současném promíchávání lázně až do roztátí posledního krystalu.

2. Buněčná peleta se lyžuje IX HNTG obsahujícím 1 mM PMSF. Na každou 15 cm misku na buněčné kultury se použije 3 ml HNTG. Přidá se 1/2 vypočteného objemu HNTG, zkumavka se vortexuje 1 minutu, přidá se zbylý objem HNTG a vortexuje se další minutu.

3. Zkumavky se vyrovnají, centrifugují při 10 000 x g po dobu 10 minut při 4°C.

4. Supernatanty se spojí, odstraní se alikvot pro určení proteinu.

5. Vzorek se rychle zmrazí v lázni suchý led/ethanol. Tento krok se provádí bez ohledu na to, zda bude lyzát skladován přes noc, nebo bude určení proteinu následovat ihned.

6. Provede se určení proteinu použitím standardní metody kyseliny bicinchoninové (BCA) (BCA testovací souprava od Pierce Chemical kat. č. 23225).

Postup ELISA testu

1. Každá jamka 96ti-jamkových ELISA destiček se povlékají 5 pg kozí protikráličí protilátkou v uhličitanovém pufru v celkovém objemu 50 μΐ. Destičky se uchovají přes noc v teplotě 4°C.

2. Tekutina s nenavázanými kozími protikráličími protilátkami se odstraní překlopením destičky dnem vzhůru.

3. Do každé jamky se přidá 150 μΐ blokovacího pufru. Destička se inkubuje 30 minut za stálého třepání.

4. Destička se 4x omyje TBST. Bubliny a přebytečná tekutina se odstraní vytřepáním destičky na papírový ručník.

5. Do každé jamky se přidá 1 pg králičí protilátky anti-Met naředěné v TBST do celkovém objemu 100 μΐ na jamku.

• ·

6. Lyzát se rozředí HNTG (90 pg lyzátu/100 μΐ).

7. Do každé jamky se přidá 100 μΐ rozředěného lyzátu. Třepe se 60 minut.

8. Destička se 4x omyje TBST. Bubliny a přebytečná tekutina se odstraní vytřepáním desky na papírový ručník.

9. Do každé jamky se přidá 50 μΐ IX lyzovacího pufru.

10. Provede se ředění sloučeniny/extrakty 1 : 10 v IX kinázovém pufru na 96ti-jamkové destičce.

11. Do jamek ELISA destičky se přenese 5,5 μΐ rozředěné sloučeniny. Za stálého třepání se inkubuje při pokojové teplotě 20 min.

12. Do každé jamky se přidá 5,5 μΐ 60 μΜ roztoku ATP. Negativní kontrola neobsahuje žádné ATP. Inkubuje se 90 minut za stálého třepání.

13. Destička se 4x omyje TBST. Bubliny a přebytečná tekutina se odstraní vytřepáním destičky na papírový ručník.

14. Do každé jamky se přidá 100 μΐ RC20 (v ředění 1 : 3 000 v blokovacím pufru). Za stálého třepání se inkubuje 30 minut.

15. Destička se 4x omyje TBST. Bubliny a přebytečná tekutina se odstraní vytřepáním destičky na papírový ručník.

16. Do každé jamky se přidá 100 μΐ Turbo-TMB. Za stálého třepání se inkubuje 30 - 60 minut.

17. Do každé jamky se přidá 100 μΐ IM H2SO4, aby se zastavila reakce.

18. Test se vyhodnotí na ELISA mikrofotometru Dynatech MR7000. Testovací filtr - 450 nm, referenční filtr = 410 nm.

Biochemický src test

Tento test se používá pro stanovení aktivity src proteinkinázy měřením fosforylace biotinylovaného peptidu jako detekční reakce.

• ·

164 • · · · • 9 9 · • 9 9 9 ·

9 · ♦··· 99 9

Látky a činidla:

a. Kvasinky transformované src (Sugen, lne., Redwood City, California).

b. Buněčné lyzáty: kvasinkové buňku exprimující srs se peletují, jednou omyji vodou, opět peletují a uskladní až do upotřebení při teplotě - 80°C.

c. N-konec biotinylovaný EEEYEEYEEEYEEEYEEEY se připraví standardním postupem pracovníkům v této oblasti dobře známým.

d. DMSO: Sigma, St. Louis, MO.

e. 96ti-jamková ELISA destička s plochým dnem: Corning 96 Well Easy Wash, Modified fiat Bottom Plate, Corning kat. #25805-96.

f. 96ti-jamkové destičky NUNC na ředění sloučenin se dnem ve tvaru V: Applied Scientific Cat. #A-72092.

g. Činidlo Vecastain ELITE ABC: Vector, Burlingame, CA.

h. Anti-src (327) monoklonální protilátka. Pro expresi rekombinantního Src se používá Schizosaccharomyces Pombe (Superti-Furga, et al., EMBO J., 12:2625-2634). Kmen S. Pombe SP200 (h-s leul. 32 ura4 ade210) se pěstuje popsaným způsobem a transformace pRSP exprimujících plazmidů jsou provedeny metodou lithium acetátu (Superti-Furga, supra). Buňky jsou pěstovány v přítomnosti 1 μΜ thiaminu k potlačení exprese z nmtl promotoru nebo v nepřítomnosti thiaminu pro indukci exprese.

i. Monoklonální protilátka proti fosfotyrosinu, UBI 05-321 (místo toho může být použita UB40).

j. Peroxidázový substrát Turbo TMB-ELISA: Pierce Chemical.

Roztoky pufrů

a. PBS (Dulbeccův fosfátem pufrovaný fyziologický roztok): GIBCO PBS, GIBCO kat. # 450-1300EB.

b. Blokovací pufr: 5 % odtučněné mléko (Carnation) v PBS.

165

999 9 999

9 9 9 9 9

9999 99 999

c. Uhličitanový pufr: Na₂CO₄ od Fischera, kat. # S495, připraví se 100 mM zásobní roztok.

d. Kinázový pufr: 1,0 ml (z IM zásobního roztoku) MgCl₂, 0,2 ml (z IM zásobního roztoku) MnCl₂, 0,2 ml (z IM zásobního roztoku) DTT, 5,0 ml (z IM zásobního roztoku) HEPES, 0,1 ml TX-100 se do celkového objemu 10 ml doplní MilliQ H₂O.

e. Lyzovací pufr: 5,0 HEPES (z IM zásobního roztoku), 2,74 ml NaCl (z 5M zásobního roztoku), 10 ml glycerolu, 0,1 ml TX-100, 0,4 ml EDTA (z 100 mM zásobního roztoku), 1,0 ml PMSF (z 100 mM zásobního roztoku), 0,1 ml Na₃VO₄ (z 0,1 M zásobního roztoku) se do celkového objemu 100 ml doplní MilliQ H₂O.

f. ATP: Sigma kat. # A-7699, připraví se 10 mM zásobní roztok (5,51 mg/ml).

g. TRIS-HCl: Fischer kat. # BP 152-5, do 600 ml MilliQ H₂O se přidá 121,14 g materiálu, pH se upraví na 7,5 HCI a do celkového objemu 1 L se doplní MilliQ H₂O.

h. NaCl: Fischer kat. # S271-10, připraví se 5M zásobní roztok s použitím MilliQ H₂O.

i. Na₃VO₄: Fischer kat. # S454-50, do 80 ml MilliQ H₂O se přidá 1,8 g materiálu, pH se upraví HCI nebo NaOH na 10,0, vaří se v mikrovlnné troubě, ochladí, zkontroluje se pH, úprava pH se opakuje, dokud nezůstává po cyklu vaření a chlazení stabilní. Do celkového objemu 100 ml se doplní MilliQ H₂O, připraví se alikvotní množství 1 ml a skladuje se při teplotě - 80°C.

j. MgCl₂: Fischer kat. # M33-500, připraví se IM zásobní roztok s použitím MilliQ H₂O.

k. HEPES: Fischer kat. # BP 310-500, do 200 ml MilliQ H₂O se přidá 59,6 g materiálu, upraví se pH na 7,5, do celkového objemu 250 ml se doplní MilliQ H₂O, sterilně filtruje (IM zásobní roztok).

l. TBST pufr: TBST pufr: do 900 ml dH₂O se přidá 6,057 g TRIS a 8,766 g NaCl, pH se upraví na 7,2 Hel, přidá se 1,0 ml Triton-X100. Do celkového objemu 1 L se doplní dH₂O.

166 ·<

m. MnCQ: Fischer kat. # M87-100, připraví se 1M zásobní roztok s použitím MilliQ HýO.

n. DTT: Fischer kat. # BP172-5.

o. TBS (TRISem pufrovaný fyziologický roztok): do 900 ml MilliQ H2O se přidá 6,057 g TRIS a 8,777 g NaCl, do celkového objemu 1 L se doplní MilliQ H2O.

p. Kinázová reakční směs: množství na testovací destičku (100 jamek): 1,0 ml kinázového pufru, 200 pg GST-ζ, do celkového objemu 8,0 ml se doplní MilliQ H2O.

q. Biotin značený EEEYEEYEEEYEEEYEEEY: připraví se zásobní peptidový roztok (lmM, 2,98 mg/ml) ve vodě vždy čerstvě před upotřebením.

r. Vectastain ELITE ABC činidlo: k přípravě 14 ml pracovního činidla se přidá 1 kapka činidla A do 15 ml TBST a promíchá se několikerým převrácením zkumavky. Pak se přidá 1 kapka činidla

B. Zkumavka se vloží do orbitální třepačky a při pokojové teplotě se třepe po dobu 30 minut.

Postupy:

Příprava ELISA destičky povlečené src.

1. ELISA destička se povléká 0,5 pg/jamka monoklonální protilátkou anti-src ve 100 μΐ uhličitanového pufru o pH 9,6 a ponechá přes noc při teplotě 4°C.

2. Jamky se jednou omyjí PBS.

3. Destička se blokuje 0,15 ml 5 % mléka v PBS po dobu 30 minut při pokojové teplotě.

4. Destička se 5x omyje PBS.

5. Do každé jamky se přidá 10 pg lyzátu kvasinek transformovaných src ředěného lyzovacím pufrem (0,1 ml celkové množství na jamku). (Množství lyzátu se může v jednotlivých várkách lišit.) Destička se třepe 20 minut při pokojové teplotě.

φφ • φ φφ φφφφ φφφ • · φ φ φφφ i srn · φφφφ φφφφ

10/ φ φφφφ φ « φφφφ φφφ φφ φφφφ φφ φ

Příprava ELISA destičky povlečené fosfotyrosinovou protilátkou.

1.4G10 deska: každá komůrka se pokryje 0,5 pg 4G10 v 100 μΐ PBS přes noc při teplotě 4°C a blokuje se 150 μΐ 5 % mléka v PBS po dobu 30 minut při pokojové teplotě.

Postup kinázového testu.

1. Nenavázané proteiny se s destiček odstraní a destičky se 5x omyjí PBS.

2. Do každé jamky se přidá 0,08 ml kinázové reakční směsi (obsahující 10 μΐ 10X kinázového pufru a 10 μΜ (konečná koncentrace) biotinuEEEYEEYEEEYEEEYEEEY na jamku, ředěné vodou.

3. Přidá se 10 μΐ sloučeniny ředěné vodou obsahující 10 % DMSO a preinkubuje se 15 minut při pokojové teplotě.

4. Kinázová reakce se nastartuje přidáním 10 μΐ 0,05 mM ATP ve vodě do každé jamky (konečná koncentrace 5 μΜ ATP).

5. ELISA destička se třepe při pokojové teplotě 15 minut.

6. Kinázová reakce se zastaví přidáním 10 μΐ 0,5 M EDTA do každé jamky.

7.90 μΐ supernatantu se přenese na povlečenou ELISA destičku blokovanou 4G 1 0.

8. Inkubuje se za stálého třepání 30 minut při pokojové teplotě.

9. Destička se 5x omyje TBST.

10. Inkubuje se s činidlem Vectastain ELITE ABC (100 μΙ/jamka) po dobu 30 minut při pokojové teplotě.

11. Jamky se 5x omyjí TBST.

12. Vyvine se pomocí Turbo TMB.

Biochemický lek test

Tento test se používá ke stanovení aktivity lek protein kinázy měřením fosforylace GST-ζ jako detekční reakce.

·· 00 • · * • 0

168 • · ·

0000

0 0 0 0

0 0 0 0

0

Látky a činidla:

a. Kvasinky transformované lek. K expresi rekombinantní Lek se použije Schizosaccaromyces Pombe (Superti-Furga, et al., EMBO J, 12:2625-2634, Superti-Furga, et al., Nátuře Biotech., 14:600-605). S. Pombe kmen SP200 (h-s leul. 32 ura4 ade 210) se pěstuje popsaným způsobem a transformace plazmidy exprimujícími pRSP se provede metodou lithium acetátu (Superti-Furga, supra). Buňky se pěstují v přítomnosti 1 μΜ thiaminu k indukci exprese.

b. Buněčné lyzáty: kvasinkové buňky exprimující lek se peletují, jednou omyjí vodou, opět peletují a uskladní zmrazené až do upotřebení při teplotě -80°C.

c. GST-ζ: DNA kódující GST-ζ fúzní protein pro expresi v bakteriích získaná od Arthura Weisse z Howard Hughes Medical Institute na University of California, San Francisco. Transformované bakterie se pěstují přes noc za stálého třepání při teplotě 25°C. GST-ζ se purifikuje glutathionovou afinitní chromatografií, Pharmacia, Alameda, CA.

d. DMSO: Sigma, St. Louis, MO.

e. 96ti-jamkové ELISA destičky s plochým dnem: Corning 96 Well Easy Wash, Modified Fiat Bottom Plate, Corning kat. #25805-96.

f. NUNC 96ti-jamkové polypropylenové desky pro ředění sloučenin se dnem ve tvaru V: Applied Scientific Cat. # AS-72092.

g. Purifikované králičí anti-GST antisérum: Amrad Corporation (Australia) kat. #90001605.

h. Kozí protikráliěí protilátka (anti-Rabbit-IgG-HRP): Amersham kat. # V010301.

i. Ovčí protimyší IgG (H+L): Jackson Labs kat. # 5215-005-003.

j. Monoklonální protilátka proti Lek (3A5): Santa Cruz Biotechnology kat # sc-433.

k. Monoklonální protilátka proti fosfotyrosin UBI 05-321 (místo toho může být použita UB40).

• fl fl flfl

169

Roztoky pufrů:

a. PBS (Dulbeccův fosfátem pufrovaný fyziologický roztok) IX roztok: GIBCO PBS, GIBCO kat. # 450-1300EB.

b. Blokovací pufr: 100 g BSA, 12,1 g TRIS (pH 7,5), 58,44 g NaCl, 10 ml Tween-20, do celkového objemu 1 L se doplní MilliQ H2O.

c. Uhličitanový pufr: Na₃CO₃ od Fischera, kat. # S495, připraví se 100 mM roztok s použitím MilliQ H2O.

d. Kinázový pufr: 1,0 ml MgCU (ze zásobního IM roztoku), 0,2 ml MnCU (ze zásobního IM roztoku), 0,2 ml DTT (ze zásobního IM roztoku), 5,0 ml HEPES (ze zásobního IM roztoku), 0,1 ml TX-100, do celkového objemu 10 ml se doplní MilliQ H2O.

e. Lyzovací pufr: 5,0 HEPES (ze zásobního IM roztoku), 2,74 ml NaCl (ze zásobního 5M roztoku), 10 ml glycerolu, 1,0 ml TX-100, 0,4 ml EDTA (ze zásobního 100 mM roztoku), 1,0 ml PMSF (ze zásobního 100 mM roztoku), 0,1 ml Na₃VO4 (ze zásobního 0,1 M roztoku), do celkového objemu 100 ml se doplní MilliQ H2O.

f. ATP: Sigma kat. # A-7699, připraví se 10 mM zásobní roztok (5,51 mg/ml).

g. TRIS-HCl: Fischer kat. # BP 152-5, do 600 ml MilliQ H₂O se přidá 121,14 g látky, pH se upraví HCI na 7,5, do celkového objemu 1 L se doplní MilliQ H2O.

h. NaCl: Fischer kat. # S271-10, připraví se 5M zásobní roztok s použitím MilliQ H2O.

i. Na₃VO4: Fischer kat. # S454-50, do 80 ml MilliQ H2O se přidá 1,8 g látky, pH se upraví HCI nebo NaOH na 10,0, vaří se v mikrovlnné troubě, ochladí, zkontroluje se pH a opět se upraví, dokud nezůstane po cyklu vaření a chlazení stabilní, do celkového objemu 100 ml se doplní MilliQ H2O, připraví se alikvótní množství 1 ml a skladuje se při teplotě -80°C.

j. MgC12: Fischer kat. # M33-5OO, připraví se IM zásobní roztok s použitím MilliQ H2O.

·· · ·· • ··» · ·· · · »·· • · · η · · · ·

170 .· : · : ί .· · » : ι ·♦·· ··· ·· ·*·· ·· ·4

k. HEPES: Fischer kat. # BP 310-500, do 150 ml MilliQ H₂O se přidá 30 g látky, do celkového množství 300 ml se doplní MilliQ H₂O, sterilně se filtruje (IM zásobní roztok).

l. Albumin, hovězí (BSA), Sigma kat. # A4503, do 150 ml MilliQ H₂O se přidá 30 g látky, do celkového objemu se doplní MilliQ H₂O, filtruje přes 0,22 pm filtr, skladuje se při 4°C.

m. TBST pufr: do 900 ml dH₂O se přidá 6,057 g TRIS a 8,766 g NaCl, pH se upraví HCI na 7,2, přidá se 1,0 ml Triton-XlOO, do celkového objemu 1 L se doplní dH₂O.

n. MnCl₂: Fischer kat. # M87-100, připraví se IM zásobní roztok s použitím MilliQ H₂O.

o. DTT: Fischer kat. # BP172-5.

p. TBS (TRISem pufrovaný fyziologický roztok): do 900 ml MilliQ H₂O se přidá 6,057 g TRIS a 8,777 g NaCl, do celkového objemu 1 L se doplní MilliQ H₂O.

q. Kinázová reakční směs: množství na jednu testovací destičku (100 jamek): 1,0 ml Kinázového pufru, 200 pg GST-ζ, do celkového objemu 8,0 ml se doplní MilliQ H₂O.

Postupy:

Příprava ELISA destičky povlečené Lek.

1. Destička se povleče ovčím protimyším IgG v množství 2,0 pg/jamka v 100 pl uhličitanového pufru o pH 9,6 a ponechá se přes noc.

2. Destička se jednou omyje PBS.

3. Destička se blokuje 0,15 ml blokovacího pufru po dobu 30 minut při pokojové teplotě.

4. Destička se 5x omyje PBS.

5. Do každé jamky se přidá 0,5 pg anti-lck (monoklonální protilátka 3A5) v 0,1 ml PBS a ponechá 1-2 hodiny při pokojové teplotě.

6. Destička se 5x omyje PBS.

7. Do každé jamky se přidá 20 pg lyzátu kvasinek transformovaných lek v lyzovacím pufru (0,1 ml celkový objem na komůrku).

» · • · i

171

C* 9 · · «>

Destička se třepe při teplotě 4°C přes noc, aby se zabránilo ztrátě aktivity.

Příprava ELISA destičky povlečené fosfothyrosinovou protilátkou.

1.UB40 destička: 1,0 pg/jamka UB40 ve 100 μΐ PBS se ponechá přes noc při teplotě 4°C a blokuje se 150 μΐ blokovacího pufru po dobu nejméně 1 hodiny.

Postup kinázového testu:

1. Nenavázané proteiny se odstraní z destiček a destičky se 5x omyjí PBS.

2. Do každé jamky se přidá 0,08 ml kinázové reakění směsi (obsahující 10 μΐ 10X kinázového pufru a 2 pg GST-ζ na jamku ředěné vodou).

3. Přidá se 10 μΐ sloučeniny ředěné vodou obsahující 10 % DMSO a preinkubuje se 15 minut při pokojové teplotě.

4. Nastartuje se kinázová reakce přidáním 10 μΐ/jamka 0,1 mM ATP ve vodě (konečná koncentrace 10 μΜ ATP).

5. ELISA destička se třepe 60 minut při pokojové teplotě.

6. Kinázová reakce se zastaví přidáním 10 μΐ 0,5 M EDTA do každé jamky.

7. 90 μΐ supernatantu se přenese do ELISA destičky povlečené blokovanou 4G10 podle výše uvedené části B.

8. Inkubuje se za stálého třepání 30 minut při pokojové teplotě.

9. Destička se 5x omyje TBST.

10.Inkubuje se s králičí anti-GST protilátkou v ředění 1:5000 ve 100 μΐ TBST po dobu 30 minut při pokojové teplotě.

11. Jamky se 5x omyjí TBST.

12. Inkubuje se s kozí protikráličí protilátkou (anti-Rabbit-IgG-HRP) v ředění 1:20 000 ve 100 μΐ TBST po dobu 30 minut při pokojové teplotě.

13. Jamky se 5x omyjí TBST.

172 . i : . : i i

I · · · t I ·· ···«> ·· 99

14.Vyvine se pomocí Turbo TMB.

Test měřením fosforylační funkce RAF.

Následující test popisuje množství RAF katalyzované fosforylace svého cílového proteinu MEK a cílový MAPK tohoto MEK proteinu. Sekvence genu RAF je popsána v Bonner et al., 1985, Molec. Cell. Biol., 5:1400-1407, a je snadno dostupná v četných databankách genových sekvencí. Konstrukce vektoru nukleové kyseliny a buněčných linií použitých v této části vynálezu jsou podrobně popsány v Morrison et al., 1988, Proč. Nati. Acad. Sci._USA, 85:8855-8859.

Látky a činidla:

1. Buňky Sf9 (Spodoptera frugiperda), GIBCO-BRL, Gainthersburg,

MD.

2. RIPA pufr: 20 mM TRIS/HC1 pH 7,4, 137 mM NaCI, 10 % glycerol, mM PMSF, 5 mg/L Aprotein, 0,5 % Triton X-100.

3. Thioredoxin - MEK fúzní protein (T-MEK): exprese T-MEK a purifikace afinitní chromatografií se provedou podle návodu výrobce. Katalogové # 350-01 a R 350-40, Invitrogen Corp., San Diego, CA.

4. His-MAPK (ERK 2), MAPK s navázaným histidinem jsou exprimovány v modrých buňkách XL1 transformovaných vektorem pUC18 kódujícím His-MAPK. His-MAPK se purifikuje Ni-afinitní chromatografií. Kat # 27-4949-01, Pharmacia, Alameda, CA, jak je zde popsáno.

5. Ovčí protimyši IgG: Jackson laboratiories, West Grove, PA. Katalog, # 515-006-008, Lot # 28563.

6. RAF-1 proteinkinázová specifická protilátka: URP2653 z UBI.

7. Povlékací pufr: PBS, fosfátem pufrovaný fyziologický roztok, GIBCO-BRL, Gaithersburg, MD.

·· ··

173

8. Omývací pufr: TBST (50 mM Tris/HCl pH 7,2, 150 mM NaCI, 0,1 % Triton X-100).

9. Blokovací pufr: TBST, 0,1 % ethanolamin pH 7,4

10. DMSO, Sigma, St. Louis, MO

11. Kinázový pufr (KB): 20 mM HEPES/HC1 pH 7,2, 150 mM NaCI, 0,1 % Triton X-100, 1 mM PMSF, 5 g/L A protein, 75 mM orthovanadičnan sodný, 0,5 MM DTT a 10 mM MgCl₂.

12. Směs ATP: 100 mM MgCl₂, 300 mM ATP, 10 mCi γ³³Ρ ATP (Dupont-NEN)/ml.

13.Stopovací roztok: 1 % kyselina fosforečná , Fischer, Pittsburg, PA.

14. Fosfocelulosové filtry Wallac, Wallac, Turku, Finsko.

15. Roztok na oplachování filtrů: 1 % kyselina fosforečná, Fischer, Pittsburgh, PA.

16.Sklízeči stroj Tomtec pro sklízení destiček, Wallac, Turku, Finsko.

17. Wallac scintilační spektrofotometr na destičky, kat. # 1205,

Wallac, Turku, Finsko.

18. NUNC 96ti-jamkové polypropylénové desky na ředění sloučenin se dnem ve tvaru V, Applied Scientific Catalog # AS-72092.

Postup

Pokud není uvedeno jinak, provádějí se všechny následující kroky při pokojové teplotě.

1. Povlékání ELISA destičky: ELISA jamky se povlékají 100 ml purifikovaného ovčího antisera s protimyší afinitou (1 mg/100 ml povlékací pufr) a ponechají přes noc při teplotě 4°C. ELISA destičky se mohou použít dva týdny, jsou-li skladovány při 4°C.

2. Destička se obrátí vzhůru dnem a tekutina se odstraní. Přidá se 100 ml blokovacího roztoku a inkubuje se 30 minut.

3. Blokovací roztok se odstraní a destička se 4x omyje omývacím pufrem. Přebytečná tekutina se odstraní poklepáním destičky na papírový ručník.

• · ·· ί* · * · ·'

174 : ’ ϊ t .* · i : i <4·· ··» ·· ♦·*♦ ·* ·*

4. Do každé jamky se přidá 1 mg RAF-1 specifické protilátky a inkubuje se 1 hodinu. Omyje se jako v kroku 3.

5. Lyzáty Sf9 buněk infikovaných RAS/RAF se rozmrazí a naředí TBST na 10 mg/100 ml. Do jamek se přidá 10 mg ředěného lyzátu a inkubuje se 1 hodinu. Během inkubace se deska třepe. Negativní kontrola neobsahuje žádný lyzát. Lyzáty Sf9 buněk infikovaných RAS/RAF se připraví poté, co se buňky infikují rekombinantním bakulovirem při MOI 5 pro každý virus a sklidí se po 48 hodinách. Buňky se jednou omyjí PBS a lyžují v RIPA pufru. Nerozpustné látky se odstraní centrifugací (5 minut při 10 000 x g). Alikvótní množství lyzátu se zmrazí na suchém ledu/etanolu a skladují do upotřebení při teplotě -80°C.

6. Nenavázané látky se odstraní a destička se omyje podle výše uvedeného postupu (krok 3).

7. Do každé jamky se přidá 2 mg T-MEK a 2 mg His-MAEPK a objem se upraví na 40 ml kinázovým pufrem. Metody purifikace T-MEK a MAPK z buněčných extraktů jsou zde popsány v příkladu.

8. Předředí se sloučeniny (zásobní roztok 10 mg/ml DMSO) nebo extrakty 20 x v TBST s 1 % DMSO. Do každé jamky se přidá 5 ml předředěných sloučenin/extraktů postupem popsaným v kroku 6. Inkubuje se 20 minut. Kontroly neobsahují žádné léčivo.

9. Kinázová reakce se odstartuje přidáním 5 ml směsi ATP. ELISA destičky se během inkubace třepají na ELISA třepačce.

10. Kinázová reakce se zastaví po 60 minutách přidáním 30 ml stopovacího roztoku do každé jamky.

11. Na ELISA destičku se v Tomtec sklízecím zařízení umístí fosfocelulosový filtr. Deska se sklidí a filtr se omyje roztokem na omývání filtru podle doporučení výrobce. Filtry se usuší. Filtry se upevní do držáku. Držák se vloží do přístroje na detekci radioaktivity a kvantifikuje se radioaktivní fosfor na filtrech.

Může se rovněž postupovat tak, že se 40 ml alikvóty z jednotlivých jamek testovací destičky přenesou na odpovídající místo na fosfocelulosovém filtru. Po vysušení filtrů vzduchem se filtry položí • · na tác. Tác se jemně kývá, omývací roztok se vyměňuje každých 15 minut po dobu 1 hodiny. Filtry se osuší vzduchem, upevní se do držáku vhodného pro měření radioaktivního fosforu ve vzorcích. Držák se vloží do detekčního zařízení a kvantifikuje se radioaktivní fosfor na filtrech.

CDK2/Cyklin A - Inhibiční test

Tento test analyzuje proteinkinázovou aktivitu CDK2 v exogenním substrátu.

Činidla:

A. Pufr A: (80 mMTris (pH 7,2), 40 mM MgCl₂), 4,84 g Tris (F.W. = 121,1 g/mol), 4,07 g MgCl₂ (F.W. = 203,31 g/mol) rozpuštěné v 500 ml H₂O. Hodnota pH se upraví HC1 na 7,2.

B. Roztok histonu H1 (0,45 mg/ml histonu H1 a 20 mM HEPES pH 7,2 (477 mg HEPES (F.W. = 238,3 g/mol) rozpuštěné v 100 ml ddH₂O, uskladněný v 1 ml alikvótech při teplotě -80°C.

C. Roztok ATP (60 μΜ ATP, 300 pg/ml BSA, 3 mM DTT): 120 μΐ 10 mM ATP, 600 μΐ 10 mg/ml BSA do 20 ml, uskladněný v 1 ml alikvótech při teplotě -80°C.

D. Roztok CDK2: cdk2/cyklin A v 10 mM HEPES pH 7,2, 25 mM NaCl, 0,5 mM DTT, 10 % glycerol, uskladněný v 9 μΐ alikvótech při teplotě -80°C.

Protokol

1. Připraví se trojnásobný objem roztoků inhibitorů v požadované konečné koncentraci v ddH₂O/15 % DMSO.

2. Do jamek 96ti-jamkových destiček se vpraví 20 μΐ inhibitorů (nebo 20 μΐ 15 % DMSO pro pozitivní a negativní kontrolu).

176 · 9 9

14« 1»

9 9 9-99 4

3. Rozmrazí se roztok histonu HI (1 ml/destička), roztok ATP (1 ml/destička plus 1 alikvót pro negativní kontrolu) a roztok CDK2 (9 μΐ/destička). CDK2 se uchovává až do použití na ledu. Správné rozdělení roztoku CDK2 na alikvótní množství zamezí opakování cyklu zmrazení - rozmražení.

4.9 μΐ roztoku CDK2 se rozředí 2,1 ml pufru A (na každou destičku). Roztok se míchá a do každé jamky se vpraví 20 μΐ.

5. 1 ml roztoku histonu HI se smíchá s 1 ml roztoku ATP (na jednu destičku) ve zkumavce se šroubovacím uzávěrem. Přidá se γ P ATP do koncentrace 0,15 pCi/20 μΐ. (0,15 pCi na každou jamku v testu). Zpěnění BSA se zamezí opatrným mícháním. Do příslušných jamek se přidá 20 μΐ. Desky se promíchají na deskové třepačce. Pro negativní kontrolu se smíchá roztok ATP se stejným množstvím 20 mM HEPES pH 7,2 a přidá se γ³³Ρ ATP do koncentrace 0,15 pCi/20 μΐ roztoku. Do příslušných jamek se přidá 20 μΐ.

6. Reakce se nechá probíhat 60 minut.

7. Do každé jamky se přidá 35 μΐ 10 % TCA. Destičky se míchají na deskové třepačce.

8. Na čtvercové filtry P30 se umístí z každého vzorku 40 μΐ. Filtry se nechají uschnout (přibližně 10-20 minut).

9. Filtry se omývají 4 x 10 minut 250 ml 1 % kyseliny fosforečné (10 ml kyseliny fosforečné na litr ddH₂O).

10. Filtry se odečtou pomocí scintilačního spektrofotometru na odečítání destiček.

Buněčné/biologické testy

PDGF-Indukovaný BrdU Inkorporační test

Látky a činidla:

(1) Lidský PDGF B/B, 1276-956, Boehringer Mannheim, Německo.

(2) BfrU značící činidlo: 10 mM, v PBS (pH 7,4), Kat. č. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Německo.

177 (3) FixDenat: fixační roztok (připravený k použití), Kat. č. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Německo..

(4) Anti-BrdU-POD: myší monoklonální protilátka konjugovaná peroxidázou, Kat. č. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Německo..

(5) TMB substrátový roztok: tetramethylbenzidin (TMB), připravený k použití, Kat. č. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Německo..

(6) PBS omývací roztok: 1XPBS, pH 7,4 (Sugen, Include, Redwood City, California).

(7) Albumin, hovězí (BSA): prášková V, frakce, A-8551, Sigma Chemical Co., USA.

(8) 3T3 buněčná linie geneticky upravená pro expresi lidského PDGFR.

Protokol (1) Buňky se vysejí v množství 8000 buněk/jamka v DMEM, 10 % CS, 2 mM Gin na 96ti-jamkovou destičku. Buňky se inkubují přes noc při teplotě 37°C v 5 % CO₂.

(2) Po 24 hodinách se buňky omyjí PBS, poté se nechají hladovět v bezsérovém mediu 24 hodiny (0 % CS DMEM s 0,1 % BSA).

(3) Třetí den se k buňkám přidá současně ligand (PDGF, 3,8 nM, připravený v DMEM s 0,1 % BSA) a testované sloučeniny. Do komůrek s negativní kontrolou se dá pouze bezsérové DMEM s 0,1 % BSA, do komůrek s pozitivní kontrolou se dá ligand (PDGF), ale nedá se žádná testovaná sloučenina. Testované sloučeniny jsou připraveny v bezsérovém DMEM s ligandem na 96ti-jamkové destičce a postupně ředěny do 7 testovaných koncentrací.

(4) Po 20 hodinách aktivace ligandu se přidá ředěné BrdU značící činidlo (1:100 v DMEM, 0,1 % BSA) a buňky se inkubují s BrdU (konečná koncentrace = 10 mM) po dobu 1,5 hodiny.

(5) Po inkubací se značícím činidlem se medium odstraní dekantací a vytřepáním obrácené destičky na papírový ručník. Přidá se

178 * · · « φ ·· 9» • * « · « · · * Φ · Φ * · · · φφφ • · φ · · · φ · ·

Φ · · Φ « φ φ ·<►*· ··· ·* ««»» «· φ

FixDenat roztok (50 μΙ/komůrka) a destičky se inkubují při pokojové teplotě 45 minut na deskové třepačce.

(6) FixDenat roztok se důkladně odstraní dekantací a vytřepáním obrácené destičky na papírový ručník. Přidá se mléko (5 % dehydratované mléko v PBS, 200 μΙ/jamka) jako blokovací pufr a destička se inkubuje 30 minut při pokojové teplotě na deskové třepačce.

(7) Blokovací roztok se odstraní dekantací a buňky se jednou omyjí PBS. Přidá se roztok anti-BrdU-POD (ředění 1:100 v PBS, 1 % BSA) a destička se inkubuje 90 minut při pokojové teplotě na deskové třepačce.

(8) Konjugovaná protilátka se důkladně odstraní dekantací a jamky se 5 x smočí PBS, destička se vysuší překlopením a vytřepáním na papírový ručník.

(9) Přidá se TMB substrátový roztok (100 μΙ/jamka) a inkubuje se 20 minut při pokojové teplotě na deskové třepačce, dokud se nevyvine zabarvení dostatečné pro fotometrickou detekci.

(10) Absorbance vzorků se měří při 410 nm (jako referenční vlnová délka v modu dvojité vlnové délky se čtecím filtrem 490 nm) na Dynatech čtecím zařízení pro destičky ELISA.

EGF-indukovaný BrdU inkorporační test

Látky a činidla (1) EGF: myší EGF, 201, Toyobo, Co., Ltd. Japonsko.

(2) BrdU značící činidlo: 10 mM, v PBS (pH 7,4), Kat. č. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Německo.

(3) FixDenat: fixační roztok (připravený k použití), Kat. č. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Německo.

(4) Anti-BrdU-POD: myší monoklonální protilátka konjugovaná peroxidázou, Kat. č. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Německo..

(5) TMB substrátový roztok: tetramethylbenzidin (TMB), připravený k použití, Kat. č. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Něšmecko.

179

··*>

(6) PBS omývací roztok: IX PBS, pH 7,4 (Sugen, lne., Redwood City, California).

(7) Albumin, hovězí (BSA): prášková V. frakce, A-855 1, Sigma Chemical Co., USA.

(8) 3T3 buněčná linie geneticky upravená pro expresi lidské EGF-R.

Protokol (1) Buňky se vysejí na 96ti-jamkovou destičku v množství 8 000 buněk/jamka v 10 % CS, 2 mM Gin v DMEM. Buňky se inkubují přes noc při teplotě 37°C v 5 % CO₂.

(2) Po 24 hodinách se buňky omyjí PBS a poté se nechají hladovět v bezsérovém mediu (0 % CS DMEM s 0,1 % BSA) po dobu 24 hodin.

(3) Třetí den se k buňkám současně přidá ligand (EGF, 2 nM, připravený v DMEM s 0,1 % BSA) a testované sloučeniny. Do jamek s negativní kontrolou se dá pouze ligand (EGF) bez testovaných sloučenin. Testované sloučeniny jsou připraveny v bezsérovém DMEM s ligandem na 96ti-jamkové destičce a postupně ředěny na 7 testovaných koncentrací.

(4) Po 20 hodinách aktivace ligandem se přidá ředěné BrdU značící činidlo (1:100 v DMEM, 0,1 % BSA) a buňky se inkubují s BrdU (konečná koncentrace = 10 μΜ) po dobu 1,5 hodiny.

(5) Po inkubaci se značícím činidlem se medium odstraní dekantací, převrácením a vytřepáním destičky na papírový ručník. Přidá se roztok FixDenat (50 μΐ/jamka) a destičky se inkubují při pokojové teplotě 45 minut na deskové třepačce.

(6) Roztok FixDenat se důkladně odstraní dekantací a vytřepáním převrácené destičky na papírový ručník. Jako blokovací pufr se přidá mléko (5 % dehydratované mléko v PBS, 200 μΐ/jamka) a deska se inkubuje 30 minut při pokojové teplotě na deskové třepačce.

(7) Blokovací pufr se odstraní dekantací a jamky se jednou opláchnou PBS. Přidá se (100 μΐ/jamka) roztok anti-BrdU-POD (ředění 1:100

Φ · · « •Φ

Φ Φ

Φ

Φ 4 • Φ

180

Φ* v PBS), 1 % BSA) a destička se inkubuje 90 minut při pokojové teplotě na deskové třepačce.

(8) Konjugovaná protilátka se důkladně odstraní dekantací a 5 x omytím jamek PBS. Destička se usuší převrácením a vyklepáním na papírový ručník.

(9) Přidá se substrátový roztok TMB (100 μΐ/jamka) a inkubuje se 20 minut při pokojové teplotě na deskové třepačce, dokud se nevyvine zabarvení dostatečné pro fotometrickou detekci.

(10) Absorbance vzorků se měří při 410 nm (v modu dvojité vlnové délky se čtecím filtrem při 490 nm jako referenční vlnové délce) na Dynatech mikrofotometru pro ELISA destičky.

EGF-indukovaná Her2-řízená inkorporace BrdU

Látky a činidla (1) EGF: myší EGF, 201, Tyobo, Co. Ltd. Japonsko.

(2) BrdU značící činidlo: 10 mM, v PBS (pH 7,4), Kat. č. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Německo.

(3) FixDenat: fixační roztok (připravený k použití), Kat. č. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Německo.

(4) Anti-BrdU-POD: myší monoklonální protilátka konjugovaná peroxidázou, Kat. č. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Německo.

(5) TMB substrátový roztok: tetramethylbenzidin (TMB), připravený k použití, Kat. č. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Německo.

(6) PBS omývací roztok: IX PBS, pH 7,4, připravený na místě.

(7) Albumin, hovězí (BSA): prášková V. frakce, A-855 1, Sigma Chemical Co., USA.

(8) 3T3 buněčná linie geneticky upravená pro expresi chimérického receptoru majícího extracelulární doménu EGR-R a intracelulámí doménu Her2.

• · φ ♦

181 • »

Protokol (1) Buňky se vysejí na 96ti-jamkovou destičku v množství 8000 buněk/jamka, 10 % CS, 2 mM Gin. Buňky se inkubují přes noc při teplotě 37°C v 5 % CO₂.

(2) Po 24 hodinách se buňky opláchnou PBS a nechají se hladovět v bezsérovém mediu (0 % CS DMEM s 0,1 % BSA) 24 hodin.

(3) Třetí den se k buňkám současně přidá ligand (EGF = 2 nM, připravený v DMEM s 0,1 % BSA) a testované sloučeniny. Do jamek s negativní kontrolou se přidá pouze bezsérové DMEM s 0,1 % BSA, do jamek s pozitivní kontrolou se přidá ligand (EGF), ale nepřidají se žádné testované sloučeniny. Testované sloučeniny se připraví v bezsérovém DMEM s ligandem na 96ti-jamkové destičce a postupně se ředí do 7 testovaných koncentrací.

(4) Po 20 hodinách aktivace ligandem se přidá ředěné značící činidlo BrdU (1:100 v DMEM, 0,1 % BSA) a buňky se inkubují s BrdU (konečná koncentrace = 10 μΜ) po dobu 1,5 hodiny.

(5) Po inkubaci se značícím činidlem se medium odstraní dekantací, vytřepáním a vyklepáním destičky na papírový ručník. Přidá se roztok FixDenat (50 μΐ/jamka) a destičky se inkubují při pokojové teplotě 45 minut na deskové třepačce.

(6) Roztok FixDenat se důkladně odstraní dekantací a vytřepáním převrácené destičky na papírový ručník. Přidá se mléko jako blokovací pufr (5 % dehydratované mléko v PBS, 200 μΐ/jamka) a destička se inkubuje 30 minut při pokojové teplotě na deskové třepačce.

(7) Blokovací roztok se odstraní dekantací a jamky se jednou opláchnou PBS. Přidá se roztok (100 μΐ/jamka) anti-BrdU-POD (ředění 1:100, 1% BSA) a destička se inkubuje při pokojové teplotě 90 minut na deskové třepačce.

(8) Konjugovaná protilátka se důkladně odstraní dekantací a 5x opláchnutím komůrek PBS, destička se osuší převrácením a vyklepáním na papírový ručník.

182

(9) Přidá se TMB substrátový roztok (100 μΐ/jamka) a inkubuje se 20 minut při pokojové teplotě na destičkové třepačce, dokud se nevyvine zabarvení dostatečné pro fotometrickou detekci.

(10) Absorbance vzorků se měří při 410 nm (v modu dvojité vlnové délky se čtecím filtrem při 490 nm jako referenční vlnové délky) na Dynatech mikrofotometru pro ELISA destičky.

IGF 1-indukovaný BrdU inkorporační test

Látky a činidla (1) IGF1 ligand: lidský rekombinantní G51 1, Promega Corp. USA.

(2) BrdU značící činidlo: 10 mM v PBS (pH 7,4), Kat. č. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Německo.

(3) FixDenat: fixační roztok (připravený k použití), Kat. ě. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Německo.

(4) Anti-BrdU-POD: myší monoklonální protilátka konjugovaná peroxidázou, Kat. ě. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Německo.

(5) TMB substrátový roztok: tetramethylbenzidin (TMB), připravený k použití, Kat. č. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Německo.

(6) PBS omývací roztok: IX PBS, pH 7,4, (Sugen, lne. Redwooed City, California).

(7) Albumin hovězí (BSA): prášková V. frakce, A-855 1, Sigma Chemical Co., USA.

(8) 3T3 buněčná linie geneticky upravená pro expresi lidského IGF-1 receptoru.

Protokol (1) Buňky se vysejí na 96ti-jamkovou desku v množství 8000 buněk/jamka v DMEM, 10 % CS, 2 mM Gin. Buňky se inkubují přes noc při 37°C v 5 % CO₂.

(2) Po 24 hodinách se buňky omyjí PBS a nechají se hladovět v bezsérovém mediu (0 % CS DMEM s 0,1 % BSA) 24 hodin.

183 • · · · « ♦ · ··«» «*» *· ·«·· «t (3) Třetí den se k buňkám přidá společně ligand (IGF1 = 3,3 nM připravený v DMEM s 0,1 % BSA) a testovací sloučeniny. Do jamek s negativní kontrolou se dá pouze bezsérové DMEM s 0,1 % BSA, do jamek s pozitivní kontrolou se dá ligand (IGF 1), ale nedají se žádné testované sloučeniny. Testované sloučeniny se připraví v bezsérovém DMEM s ligandem na 96ti-jamkové destičce a postupně se ředí do 7 testovaných koncentrací.

(4) Po 16 hodinách aktivace ligandem se přidá ředěné značící činidlo BrdU (1:100 v DMEM, 0,1 % BSA) a buňky se inkubují s BrdU (konečná koncentrace = 10 mM) po dobu 1,5 hodiny.

(5) Po inkubaci se značícím činidlem se medium odstraní dekantací a vytřepáním převrácené destičky na papírový ručník. Přidá se FixDenat roztok (50 μΐ/jamka) a destička se inkubuje při pokojové teplotě 45 minut na deskové třepačce.

(6) Roztok FixDenat se důkladně odstraní dekantací a vytřepáním převrácené destičky na papírový ručník. Přidá se mléko (5 % dehydratované mléko v PBS, 200 μΐ/jamka) jako blokovací pufr a destička se inkubuje 30 minut při pokojové teplotě na deskové třepačce.

(7) Blokovací roztok se odstraní dekantací a jamky se jednou omyjí PBS. Přidá se roztok anti-BrdU-POD (v ředění 1:100 v PBS, 1 % BSA, a objemu 100 μΐ/jamka) a destička se inkubuje 90 minut při pokojové teplotě na deskové třepačce.

(8) Konjugát protilátky se důkladně odstraní dekantací a 5x opláchnutím jamek PBS. Destička se osuší překlopením a vytřepáním na papírový ručník.

(9) Přidá se TMB substrátový roztok (100 μΐ/jamka) a inkubuje se 20 minut při pokojové teplotě na deskové třepačce, dokud se nevyvine zabarvení dostatečné pro fotometrickou detekci.

(10) Absorbance vzorku se měří pri 410 nm (v modu dvojité vlnové délky se čtecím filtrem při 490 nm jako referenční vlnové délky) na Dynatech mikrofotometru pro ELISA destičky.

111

1

184 *· * 9 1 11

1 11 lili » 1 11 1

9119

FGF-indukovaný BrdU inkorporační test

Tento test měří syntézu FGF-indukované DNA v buňkách 3Tc7/EGFr, které exprimují endogenní FGF receptory.

Látky a činidla (1) FGF: lidský FGF2/bFGF (Gibco BRL, č. 13256-029).

(2) BrdU značící činidlo: (10 mM v PBS (pH 7,4), Kat. č. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Německo).

(3) FixDenat: fixační roztok (Boehringer Mannheim, kat. č. 1 647 229) (4) Anti-BrdU-POD (myší monoklonální protilátka konjugovaná peroxidázou, Boehringer Mannheim, kat. č. 1 647 229,).

(5) TMB (tetramethylbenzidin, Boehringer Mannheim, kat. č. 1 647 229).

(6) PBS omývací roztok, pH 7,4 (Sugen, lne.).

(7) Albumin hovězí (BSA): prášková V. frakce, Sigma Chemical Co., kat. č. A-855 1).

Postup

1. 3T3 geneticky upravená buněčná linie: 3T3c7/EGFr.

2. Buňky se vysejí na 96ti-jamkovou destičku v množství 8000 buněk/jamka v DMEM, 10 % CS a 2 mM Gin. Buňky se inkubují 24 hodin při 37°C v 5 % CO₂.

3. Po 24 hodinách se buňky omyjí PBS a nechají se hladovět v bezsérovém mediu (0 % DMEM, 0,1 % BSA) 24 hodin.

4. K buňkám se přidá společně ligand (FGF2 (1,5 nM v DMEM s 0,1%

BSA) a testovací sloučeniny. Do jamek s negativní kontrolou se dá pouze bezsérové DMEM s 0,1 % BSA, do jamek s pozitivní kontrolou se dá ligand (FGF2), ale nedají se žádné testované sloučeniny. Testované sloučeniny se připraví v bezsérovém DMEM s ligandem na 96ti-jamkové destičce a postupně se ředí do sedmi (7) testovaných koncentrací.

185

(1) Po 20 hodinách aktivace ligandem se k buňkám přidá ředěné značící činidlo BrdU (1:100 v DMEM, 0,1 % BSA, konečná koncentrace je 10 nM) a buňky se inkubují po dobu 1,5 hodiny.

(2) Medium se dekantuje. Zbytky látek se odstraní papírovým ručníkem. Přidá se FixDenat roztok (50 μΙ/jamka) a destička se inkubuje při pokojové teplotě 45 minut na deskové třepačce.

(3) Odstraní se roztok FixDenat. Přidá se mléko (5 % dehydratované mléko v PBS, 200 μΙ/jamka) jako blokovací pufr a destička se inkubuje 30 minut při pokojové teplotě na deskové třepačce.

(4) Blokovací roztok se dekantuje a jamky se jednou omyjí PBS. Přidá se roztok anti-BrdU-POD (v ředění 1:100 v PBS, 1 % BSA) a destička se inkubuje 90 minut při pokojové teplotě na deskové třepačce.

(5) Konjugát protilátky se dekantuje, jamky se 5x opláchnou PBS. Destička se osuší překlopením a vytřepáním na papírový ručník.

(6) Přidá se TMB substrátový roztok (100 μΙ/jamka) a inkubuje se 20 minut při pokojové teplotě na deskové třepačce, dokud se nevyvine zabarvení dostatečné pro fotometrickou detekci.

(7) Absorbance vzorku se měří při 410 nm na Dynatech mikrofotometru pro ELISA destičky při použití modu dvojité vlnové délky se čtecím filtrem při 490 nm.

Biochemický EGFR test

Tento test měří in vitro kinázovou aktivitu EGFR při použití ELISA.

Látky a činidla

1. Corning 96ti-jamkové ELISA destičky (Corning katalog č. 2580596).

2.SUMO1 monoklonální anti-EGFR protilátka (Biochemistry Lab, SUGEN, lne.).

186 * 99 99 99

9 *9 9*99 9 9 9 • · 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 ···· 999 99 999* 99

3. PBS (Dulbeccův fosfátem pufrovaný fyziologický roztok, Gibco katalog č. 450-1300EB).

4. TBST pufr

činidlo	mol. hmotn	pracovní koncentrace na 1	množství l L
TRIS	121,44	50 mM	6,057 g
NaCl	58,44	50 mM	8,766 g
Triton X-	100 NA	0,1 % 1,0 ml
5. Blokovací pufr:
činidlo	mol. hmotn	pracovní	množství
		koncentrace	na 1 1
Instantní	odtučněné	5 %	5,0 g
mléko Carnation
PBS	NA	NA	100 ml
6. A431 buněčný lyzát (Screening Lab, SUGEN, lne.)
7. TBS pufr:
činidlo	mol. hmotn	pracovní	množství
		koncentrace	na 1 1
TRIS	121,14	50 mM	6,057 g
NaCl	58,44	150 mM	8,766 g
8. TBS + 10 %	DMSO
činidlo	mol. hmotn	pracovní	množství
		koncentrace	na 1 1
TRIS	121,14	50 mM	1,514 g
NaCl	58,44	150 mM	2,192 g
DMSO	NA	10 %	25 ml

9. Adenosin-5'-trifosfát (ATP, z koňského svalu, Sigma kat. č. A5394).

Připraví se 1,0 mM roztok v dH₂O. Toto činidlo by mělo být připraveno bezprostředně před použitím a mělo by být drženo na ledu.

10. MnCl₂.

Připraví se 1,0 M zásobní roztok v dH₂O.

11. ATP/MnCl₂, fosforylační směs

9

187 ♦ · činidlo zásobní roztok pracovní množství koncentrace na 10 ml

ATP ,0 mM 0 μΜ 300 μΐ

MnCl₂ 1,0 M 0 mM 500 μΐ dH₂O 9,2 ml

Toto činidlo by mělo být připraveno bezprostředně před použitím a mělo by být drženo na ledu.

12. NUNC 96ti-jamkové polypropylenové destičky se dnem ve tvaru V (Applied Scientific Cat. č. AS-72092.

13. Kyselina ethylendiamintetraoctová (EDTA)

Připraví se 200 mM pracovního roztoku v dH₂O. Upraví se pH na 8,0 pomocí 10 N NaOH.

14. Králičí polyklonální antiserum proti fosfotyrozinu (Biochemistry Lab, SUGEN, lne.)

15. Kozí protikráličí IgG konjugovaný peroxidázou (Biosource kat. č.

ALI0404).

16. ABTS (2,2'- azino-bis(3-ethylbenzthiazolin-6-sulfonová kyselina), Sigma kat. ě. A-1888).

činidlo	mol. hmotn.	pracovní koncentrace	množství na 11
Kyselina	192,12	100 mM	19,21 g
citrónová
Na2HPO4	141,96	250 mM	35,49 g
ABTS	NA	0,5 mg/ml	500 mg

První dvě složky se smíchají v přibližně 900 ml dH2O, upraví se kyselinou fosforečnou pH na 4,0. Přidá se ABTS, zakryje, nechá stát přibližně 0,5 hodiny, filtruje. Roztok by se měl až do použití uchovávat v temnu a při teplotě 4°C.

17. 30 % roztok peroxidu vodíku (Fischer kat. ě. H325).

18. ABTS/H₂O₂

Smíchá se 15 ml roztoku ABTS a 2,0 μΐ H₂O₂. Připraví se 5 minut před použitím.

19. 0,2 M Hel.

188 ♦ ·

• · 0

Postup

1. Corningovy 96ti-jamkové ELISA destičky se povlečou 0,5 pg SUMO1 v 100 μΐ PBS na jednu jamku, uskladní se přes noc při 4°C.

2. Nenavázaná SUMO1 se z jamek odstraní převrácením destičky a odstraněním tekutiny. Jamky se jedenkrát omyjí dH₂O. Přebytečná tekutina se odstraní vytřepáním destičky na papírový ručník.

3. Do každé jamky se přidá 150 μΐ blokovacího pufru. Inkubuje se 30 minut při pokojové teplotě za stálého třepání.

4. Destička se 3x omyje dionizovanou vodou, pak jednou TBST. Přebytečná tekutina a bubliny se odstraní převrácením a vytřepáním destičky na papírový ručník.

5. Lyzát se zředí PBS (7pg lyzátu/100 μΐ PBS).

6. Do každé jamky se přidá 100 μΐ ředěného lyzátu. Třepe se při pokojové teplotě 60 minut.

7. Destičky se omyjí podle výše uvedeného bodu 4.

8. Na ELISA destičku obsahující zachycený EGFR se přidá 120 μΐ TBS.

9. Testované sloučeniny se zředí TBS 1:10 na 96ti-jamkových polypropylenových destičkách (tj. 10 μΐ sloučeniny + 90 μΐ TBS).

10. Na ELISA destičku se přidá 13,5 μΐ ředěných testovaných sloučenin. Do kontrolních jamek (jamky neobsahující žádné testované sloučeniny) se přidá 13,5 μΐ TBS + 10 % DMSO.

11. Inkubuje se 30 minut při pokojové teplotě za stálého třepání.

12. Do všech jamek kromě jamek pro negativní kontrolu, které neobsahují ATP/MnCl₂ (konečný objem jamek by měl být přibližně 150 μΐ se 3 μΜ ATP/5 mM MnC12, konečná koncentrace v každé jamce) se přímo přidá 15 μΐ fosforylační směsi. Inkubuje se 5 minut za stálého třepání.

13. Po 5 minutách se reakce zastaví přidáním 16,5 μΐ 200 mM EDTA (pH 8,0) do každé jamky za stálého třepání. Po přidání EDTA se třepe další 1 minutu.

14. Destička se 4x omyje deionizovanou vodou, dvakrát TBST.

189 · 9999 99

9 99 9 9 9 9 9 9 9 • · 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9

9999 999 99 9999 99 999

15. Do každé jamky se přidá 100 μΐ protilátky proti fosfotyrozinu (1:3000 ředění v TBST). Inkubuje se 30-45 minut při pokojové teplotě za stálého třepání.

16. Omyje se podle výše popsaného bodu 4.

17. Do každé jamky se přidá 100 μΐ Biosource kozího anti-králičího IgG konjugovaného peroxidázou (ředění 1:2000 v TBST). Inkubuje se 30 minut při pokojové teplotě za stálého třepání.

18. Omyje se podle výše popsaného bodu 4.

19. Do každé jamky se přidá 100 μΐ roztoku ABTS/H2O2.

20. Inkubuje se 5 až 10 minut za stálého třepání. Odstraní se veškeré bubliny.

21. V případě nutnosti se reakce zastaví přidáním 100 μΐ 0,2 M HC1 do každé jamky.

22. Destička se odečte na Dynatech MR7000 ELISA mikrofotometru. Testovací filtr: 410 nM, referenční filtr: 630 nM.

Biochemický PDGFR test

Tento test měří in vitro kinázovou aktivitu PDGFR pomocí ELISA.

Látky a činidla

Pokud není uvedeno jinak, připraví se pracovní roztoky následujících činidel stejným způsobem, jako ve výše uvedeném biochemickém EGFR testu.

1. Corning 96ti-jamkové ELISA destičky (Corning kat. č. 25805-96). 2.28D4C10 monoklonální anti-PDGFR protilátka (Biochemistry Lab.,

SUGEN, lne.).

3. PBS (Dulbeccův fosfátem pufrovaný fyziologický roztok, Gibco kat. č. 450-1300EB).

4. TBST puft.

5. Blokovací pufr.

• « φ» φφ • · · φ φ φ φ

190 φφφ • · »»··

6. PDGFR-β lyzát 3Τ3 buněk exprimujících ΝΙΗ (Screening Lab, SUGEN, lne.).

7. TBS pufr.

8. TBS + 10 % DMSO.

9. Adenosin-5'-trifosfát (ATP, z koňského svalu, Sigma kat. č. A5394).

10. MnCl₂.

11. Kinázová pufrovací fosforylaění směs.

činidlo	zásobní roztok	pracovní koncentrace	množství na 10 ml
TRIS	1 M	25 mM	250 μΐ
NaCI	5 M	100 mM	200 μΐ
MnCl2	1 M	10 mM	100 μΐ
TX-100	100 mM	0,5 mM	50 μΐ

12. NUNC 96ti-jamkové polypropylenové destičky se dnem ve tvaru V(Applied Scientific kat. ě. AS-72092).

13. Kyselina ethylendiamintetraoctová (EDTA).

14. Králičí polyklonální antiserum proti fosfotyrozinu (Biochemistry Lab., SUGEN, lne.).

15. Kozí anti-králičí IgG konjugovaný peroxidázou (Biosource kat. č. ALI0404).

16. 2,2'-azino-bis(3-ethylenbenzthiazolin-6-sulfonová kyselina) (ATBS, Sigma kat. č. A-1888).

17. 30 % roztok peroxidu vodíku (Fisher kat. č. H325).

18. ABTS/H₂O₂.

19. 0,2 M HC1.

• · • · ♦ · φφ « · · • ·

V

191 ····

Postup

1. Corningovy 96ti-jamkové ELISA destičky se povlečou 0,5 pg 28D4C10 ve 100 μΐ PBS na jamku a ponechají přes noc při teplotě 4°C.

2. Nenavázaná 28D4C10 se z jamek odstraní překlopením destičky. Jamky se lx omyjí dH2O. Přebytečná tekutina se odstraní vytřepáním destičky na papírový ručník.

3. Do každé jamky se přidá 150 μΐ blokovacího pufru. Inkubuje se 30 minut při pokojové teplotě za stálého třepání.

4. Destička se 3x omyje deionizovanou vodou, pak lx TBST. Přebytečná tekutina a bubliny se odstraní vyklepáním destičky na papírový ručník.

5. Lyzát se zředí HNTG (10 pg lyzátu/100 μΐ HNTG).

6. Do každé jamky se přidá 100 μΐ ředěného lyzátu. Při pokojové teplotě se třepe 60 minut.

7. Destička se omyje postupem popsaným v bodě 4.

8. Na ELISA destičku obsahující zachycený PDGFR se přidá 80 μΐ pracovní kinázové pufrovací směsi.

9. Testované sloučeniny se zředí TBS 1:10 na 96ti-jamkové polypropylenové destičce (tj. 10 μΐ sloučeniny + 90 μΐ TBS).

10. Na ELISA destičku se přidá 10 μΐ ředěné testované sloučeniny. Do kontrolních jamek (tj. jamky, které neobsahují žádnou testovanou sloučeninu) se přidá 10 μΐ TBS + 10 % DMSO.

11. Inkubuje se 30 minut při pokojové teplotě za stálého třepání.

12. Přímo do každé jamky, kromě negativních kontrol, se přidá 10 μΐ ATP (konečný objem jamek by měl být přibližně 100 μΐ s 20 μΜ ATP v každé jamce). Ikubuje se 30 minut za stálého třepání.

13. Po 30 minutách se reakce zastaví přidáním 10 μΐ 200 mM EDTA do každé jamky (pH 8,0).

14. Destička se 4x omyje deionizovanou vodou, 2x TBST.

192 • >

Φ » *···

15. Do každé jamky se přidá 100 μΐ protilátky proti fosfotyrozinu (ředění 1:3000 v TBST). Inkubuje se při pokojové teplotě za stálého třepání.

16. Destička se omyje způsobem popsaným v bodě 4 výše.

17. Do každé jamky se přidá 100 μΐ Biosource kozího protikráličího IgG konjugovaného peroxidázou (ředění 1:2000 v TBST). Inkubuje se při pokojové teplotě za stálého třepání.

18. Destička se omyje podle výše uvedeného bodu 4.

19. Do každé jamky se přidá 100 μΐ roztoku ABTS/H2O2.

20. Inkubuje se 10 až 30 minut za stálého třepání. Odstraní se bubliny.

21. V případě nutnosti se reakce zastaví přidáním 100 μΐ 0,2 M HC1 do každé jamky.

22. Destička se odečte na Dynatech MR7000 ELISA mikrofotometru: testovací filtr: 410 nM, referenční filtr: 630 nM.

Biochemický FGFR test

Tento test měří in vitro kinázovou aktivitu fúzního proteinu MycGyrB-FGFR s použitím ELISA.

Látky a činidla

1. HNTG činidlo mol. hmotnost 5 x zásobní množství lx pracovní koncentrace na 1 1 koncentrace

HEPES	238,3	100 mM	23,83 g	20 mM
NaCl	58,44	750 mM	43,83 g	150 mM
Glycerol	NA	50 %	500 ml	10 %
Triton X-100	NA	5 %	10 ml	1,0 %

Pro přípravu 1 L 5x zásobního roztoku se rozpustí HEPES a NaCl v přibližně 350 ml dH₂O, pH se upraví HC1 nebo NaOH na 7,2 (podle

ΦΦ • · · • ΦΦΦ ·

193 ·· ·· ·· • φ · φ · φ φ • € · Φ · • · · ΦΦΦΦ • · · · ·

ΦΦ Φ··· «Φ φ toho, který HEPES se použije), přidá se glycerol, Triton X-100 a objem se doplní dH₂O.

2. PBS (Dulbeccův fosfátem pufrovaný fyziologický roztok, Gibco katalog, č. 450-1300EB).

3. Blokovací pufr.

4. Kinázový pufr.

činidlo mol. hmotnost lOx zásobní lx pracovní koncentrace koncentrace

HEPES (pH 7,2)	238,3	500 mM	50 mM
MnCl2		20 mM	2 mM
MgCl2	203,32	200 mM	10 mM
Triton-X-100		1 %	0,1 %
DTT	380,35	5 mM	0,5 mM

5. Fenylmethylsulfonyl fluorid (PMSF, Sigma, Kat. č. P-7626):

Pracovní koncentrace: 100 mM v ethanolu.

6. ATP (bakteriální zdroj, Sigma kat. č. A-7699).

Pro pracovní koncentraci 6 mM se použije 3,31 mg na 1 ml MilliQ H₂O.

7. Biotinem konjugovaná monoklonální protilátka proti fosfotyrozinu (klon 4G10, Upstate Biotechnology lne. kat. č. 16-103, ser. č. 14495).

8. Vectastain Elitě ABC činidlo (Avidin konjugovaný peroxidázou, Vector Laboratories kat. č. PK-6 100).

9. Roztok ABTS.

10.30 % roztok peroxidu vodíku (Fischer katalog č. H325).

11. ABTS/H₂O₂.

12. 0,2 M HC1.

13. TRIS Hel (Fischer kat. č. BP 152-5).

Připraví se 1,0 mM roztok v MilliQ H2O, pH se upraví HC1 na 7,2.

14. NaCI (Fischer kat. č. S271-10).

Připraví se 5 M roztok v MilliQ H₂O.

15. MgC12 (Fischer kat .č. M33-500).

Připraví se IM roztok v MilliQ H₂O.

194

16. HEPES (Fischer kat. č. BP310-500).

Připraví se 1 M roztok v MilliQ H₂O, pH se upraví 7,5 a sterilně sfiltruje.

17. TBST pufr.

18. Pufr uhličitanu sodného (Fischer kat. č. S495).

Připraví se 0,1 M roztok v MilliQ H₂O, pH se upraví NaOH na 9,6 a sfiltruje.

19. Dithiothreitol (DTT, Fischer kat. č. BP172-25).

Připraví se 0,5 mM pracovní roztok v MilliQ H₂O bezprostředně před upotřebením. Do použití se uchovává při teplotě -20°C. Veškeré zbytky se vyhodí.

20. MnCl₂.

1. Triton X-100.

22. Kozí α-králičí IgG (Cappel).

23. Afinitně purifikovaný králičí a GST GyrB (Biochemistry Lab. SUGEN, lne.).

Postup

Pokud není uvedeno jinak, provádí se všechny následující kroky při pokojové teplotě.

1. Corningovy 96ti-jamkové ELISA destičky se povlečou 2 pg kozí akráličí protilátkou v uhličitanovém pufru do každé jamky tak, aby celkový objem jamky byl 100 μΐ. Destička se uchová přes noc v teplotě 4°C.

2. Nenavázaná kozí a-králičí protilátka se odstraní převrácením destičky. Přebytečná tekutina a bubliny se odstraní vytřepáním destičky na papírový ručník.

3. Do každé jamky se přidá 150 μΐ blokovacího pufru (5 % nízkotučného mléka v PBS). Za stálého míchání se inkubuje na deskové třepačce.

4. Omyje se 4x TBST. Destička se vyklepe na papírový ručník, aby se odstranila přebytečná tekutina a bubliny.

195 • ·

5. Do každé jamky se přidá 0,5 pg králičí a-GyrB. Protilátka se ředí PDBS do konečného objemu 100 pl na každou jamku. Inkubuje se za stálého třepání na deskové třepačce při pokojové teplotě 1 hodinu.

6. Destička se 4x omyje TBST postupem popsaným v bodě 4 výše.

7. Do každé jamky se přidá 2 pg COS/FGFR buněčného lyzátu (zdroj Myc-GyrB-FGFR) v HNTG do konečného objemu 100 pl na jamku. Za stálého třepání se inkubuje na deskové třepačce po dobu 1 hodiny.

8. Omyje se 4x TBST postupem popsaným v kroku 4.

9. Do každé jamky se přidá 80 pl kinázového pufru.

10. Testované sloučeniny se naředí na polypropylenové 96ti-jamkové destičce lx kinázovým pufrem v poměru 1:10.

11. 10 pl ředěného roztoku testovaných sloučenin a obsah kontrolních jamek se z polypropylénové destičky přenese do odpovídajících jamek ELISA destičky, inkubuje se za stálého třepání na mikrotitrační desce 20 minut.

12. Do jamek s pozitivní kontrolou a testovaných jamek se přidá 10 pl 70 pM ATP ředěného v kinázovém pufru (konečná koncentrace ATP je 7 pM/jamka). Inkubuje se za stálého třepání na deskové třepačce 1 5 minut.

13. Kinázová reakce se zastaví přidáním 5 pl 0,5 M EDTA do každé jamky.

14. Omyje se 4x TBST podle postupu popsaného v bodu 4.

15. Do každé jamky se přidá 100 pl biotinem konjugované afosfotyrozin monoklonální protilátky (b4G10). Inkubuje se za stálého třepání na deskové třepačce 30 minut.

16. Připraví se Vectastain ABC činidlo. Do 15 ml TBST se přidá 1 kapka činidla A. Promíchá se několikerým převrácením zkumavky. Do směsi se dále přidá 1 kapka činidla B.

17. Omyje se 4x TBST postupem podle kroku 4.

196 • · • · ·

18. Do každé jamky se přidá 100 pl ABC HRP činidla. Inkubuje se za stálého třepání na deskové třepačce 30 minut.

19. Omyje se 4x TBST postupem popsaným v kroku 4.

20. Do každé jamky se přidá 100 pl ABTS/H2O2.

21. Inkubuje se 5 až 15 minut za stálého třepání. Veškeré bubliny se odstraní.

22. V případě nutnosti se reakce zastaví přidáním 100 μΐ 0,2 M HCl/jamka.

23. Deska se odečte na Dynetech MR7000 ELISA mikrofotometru, testovací filtr: 410 nM, referenční filtr: 630 nM.

Biochemický FLK-1 test

Tento test vyhodnocuje in vitro autofosforylační aktivitu flk-1 s použitím ELISA.

Látky a činidla

1.15 cm misky na tkáňové kultury.

2. Buňky Flk-1: NIH fibroblastoidní linie exprimující lidský flk-1 klon 3 (SUGEN, lne., získaný z MPI, Marinsried, Německo).

3. Růstové medium: DMEM s teplotně inaktivovaným 10 % FBS a 2 mM glutamin (Gibco - BRL).

4. Hladové medium: DMEM a 0,5 % teplotně inaktivovaný 0,5 % FBS, 2 mM glutamin (Gibco-BRL).

5. Corning 96ti-jamkové ELISA destičky (Corning kat. č. 25805-96).

6. Monoklonální protilátka L4 nebo E38 specifická na flk-1, purifikovaná afinitní chromatografií na protein-A agarose (SUGEN, lne.).

7. PBS (Dublbeccův fosfátem pufrovaný fyziologický roztok), Gibco kat.č. 450-1300EB).

8. HNTG (viz příprava v Biochemickém FGFR).

9. Pierce BCA detekční souprava.

197 • 9 9 · · * · · ·· ···· 4 4 · · ·

10. Blokovací pufr.

11. TBST (pH 7,0).

12. Kinázový pufr.

13. Stopovací kinázový roztok: 200 mM EDTA.

14. Biotinovaná 4G10, specifická na fosfotyrozin (UBI, kat. č. 16103).

15. AB souprava (Vector Laboratories kat. č. PK 4000).

16. DMSO.

17. NUNC 96ti-jamkové polypropylenové destičky (V-dno) (Applied Scientific kat. ě. AS-72092).

18. Turbo-TMB (Pierce).

19. Turbo-TMB stopovací roztok: 1 M H2SO4.

20. ATP (Sigma kat. ě. A-7699).

21. 20 % DMSO v TBS (pH 7,0).

Postup

Pěstování buněk a příprava lyzátu.

1. Buňky se vysejí do růstového media a pěstují 2-3 dny do 90-100 % pokryvu při 37°C a 5 % CO₂. Počet pasáží nesmí překročit 20.

2. Medium se odstraní a buňky se 2x omyjí PBS. Buňky se lyžují HNTG lyzovacím pufrem. Všechen lyzát se shromáždí a vortexuje 20-30 minut.

3. Nerozpustný materiál se odstraní centrifugací (5-10 minut při cca 10 000 xg).

4. Koncentrace proteinu se určí pomocí BCA soupravy.

5. Lyzát se rozdělí do 1 mg alikvótů a uskladní při -80°C.

Postup testu

1. Corning 96ti-jamkové ELISA destičky se koutují 2 pg/jamka purifikované L4 (nebo E 38) v 100 pl PBS. Uskladní se při teplotě 4°C přes noc.

·* ·· ··

2. Nenavážené proteiny se z jamek odstraní převrácením destičky, aby se odstranila tekutina. Destička se jednou omyje dH₂O, přebytečná tekutina se z destičky vytřepe na papírový ručník.

3. Destičky se blokují 150 μΐ blokovacího pufru do každé jamky. Inkubuje se 45-60 minut za stálého třepání při teplotě 4°C.

4. Blokovací pufr se odstraní a ELISA destička se třikrát omyje dH₂O a jednou TBST. Přebytečná tekutina se odstraní vytřepáním destičky na papírový ručník.

5. Lyzát se zředí PBS do konečné koncentrace 50 pg/100 μΐ. Do každé jamky se přidá 100 μΐ ředěného lyzátu. Inkubuje se přes noc při teplotě 4°C za stálého třepání.

6. Nenavázané proteiny se z jamek odstraní překlopením destičky. Destička se omyje postupem stejným jako v kroku 4.

7. Do každé jamky se přidá 80 μΐ kinázového pufru (90 μΐ do jamek s negativní kontrolou).

8. Testované sloučeniny se rozředí (obvykle lOx) do jamek na polypropylenové destičce obsahující 20 % DMSO v TBS.

9. Do komůrek ELISA destičky obsahujících imobilizovaný flk-1 se přidá 10 μΐ ředěných sloučenin a třepe se. Kontrolní jamky neobsahují žádné sloučeniny.

10. Ze zásobního 1 mM roztoku ATP se připraví 0,3 mM roztok ATP v dH₂O (může se rovněž použít kinázový pufr).

11. Do každé jamky, kromě negativních kontrol, se přidá 10 μΐ 0,3 mM ATP. Inkubuje se 60 minut při pokojové teplotě za stálého třepání.

12. Po 1 hodině se reakce zastaví přidáním 11 μΐ 200 mM EDTA. Třepe se 1-2 minuty.

13. ELISA destička se 4x omyje dH₂O a 2x TBST.

14. Do každé jamky se přidá 100 μΐ 1:5000 biotinylované 4G10:TBST. Inkubuje se 45 minut při pokojové teplotě za stálého třepání.

199 • ·

15. Zatímco se výše uvedená destička inkubuje, přidá se do 10 ml TBST 50 μΐ roztoků A & B z ABC soupravy. Tyto roztoky se musí míchat přibližně 30 minut před použitím.

16. Destičky se omyjí postupem uvedeným v kroku 4.

17. Do každé jamky se přidá 100 μΐ předem připraveného A & B komplexu. Inkubuje se 30 minut za stálého třepání při pokojové teplotě.

18. Destičky se omyjí postupem uvedeným v kroku 4.

19. Přidá se 100 μΐ turbo-TMB. Třepe se při pokojové teplotě 10-15 minut.

20. Jakmile zabarvení jamek s pozitivní kontrolou dosáhne absorbance kolem 0,35-0,4, reakce se zastaví 100 μΐ turbo-TMB stopovacího roztoku.

21. Destičky se odečtou na Dynatech MR7000 ELISA mikrofotometru, testovací filtr: 450 nM, referenční filtr: 410 nM.

HUV-EC-C test

Následující protokol může být rovněž použit pro měření aktivity sloučeniny proti PDGF-R, FGF-R, VEGF, aFGF nebo Flk-1/KDR, které jsou všechny přirozeně exprimovány buňkami HUV-EC.

Den 0

1. HUV-EC-C buňky se omyjí a trypsinizují, (American Type Culture Collection, (ATCC) kat. č. 1730 CRL). Omyjí se Dulbeccovým fosfátem pufrovaným fyziologickým roztokem (D-PBS, získaný od Gibco BRL, kat. č. 14190-029) 2x v množství 1 ml/10 cm² láhve na tkáňové kultury. Trypsinizují se 0,05 % trypsin-EDTA v neenzymatickém buňky disociujícím roztoku (Sigma Chemical Company, kat. č. C-1544). 0,05 % trypsin se připraví ředěním 0,25 % trypsin/1 mM EDTA (Gibco, katalogové č. 25200-049) buňky disociujícím roztokem. Trypsinizuje se asi 1 ml/25-30 cm láhve na

200

tkáňové kultury po dobu 5 minut při teplotě 37°C. Jakmile se buňky oddělí od láhve, přidá se ekvivalentní objem testovacího media a přenese se do sterilní 50 ml centrifugační zkumavky (Fischer Scientific, katalogové č. 05-539-6).

2. Buňky se omyjí asi 35 ml testovacího media ve sterilní 50 ml centrifugační zkumavce přidáním tohoto testovacího media, centrifugují se 10 minut při rychlosti přibližně 200xg, supernatant se odsaje, buňky se resuspendují 35 ml D-PBS. Omytí se opakuje ještě 2x s D-PBS, buňky se resuspendují asi v 1 ml testovacího media/15 cm² láhve na tkáňové kultury. Testovací medium se skládá z media F12K (Gibco BRL, katalogové č. 21127-014) a 0,5 % teplem inaktivovaného fetálního hovězího séra. Buňky se spočítají pomocí Coulter Counter® (Coulter Electronics, lne.) a k buňkám se přidá testovací medium, aby se získala koncentrace 0,81,0 x 10⁵ buněk/ml.

3. Buňky se přidají do 96ti-jamkových destiček s plochým dnem v množství 100 μΐ/jamka nebo 0,8-1,0 x 10⁴ buněk/jamka, inkubují se přibližně 24 hodin při teplotě 37°C v 5 % CO₂.

Den 1

1. Připraví se dvojnásobné titrace testovacích sloučenin v samostatných 96ti-jamkových destičkách, obvykle od 50 mM dolů k 0 mM. Použije se stejné testovací medium jako pro den 0, krok 2 výše. Titrace se provedou přidáním 90 μΐ/jamka testovací sloučeniny v 200 μΜ (4x konečná koncentrace v jamce) do horní jamky příslušného sloupce na destičce. Protože zásobní testovaná sloučenina je obvykle 20 mM v DMSO, obsahuje 200 μΜ koncentrace látky 2 % DMSO.

Ředidlo s koncentrací 2 % DMSO v testovacím mediu (F12K + 0,5 % fetální hovězí sérum) se použije jako ředidlo pro titrace testovaných sloučenin, aby se testované sloučeniny naředily a přitom uchovala stálá koncentrace DMSO. Toto ředidlo se přidá ke zbývajícím jamkám

201

99 9 ve sloupci v množství 60 μΙ/jamka. Vezme se 60 μΐ ze 120 μΐ 200 μΜ ředění testované sloučeniny na počátku sloupce jamek a smíchá se s 60 μΐ ve druhé jamce téhož sloupce. Vezme se 60 μΐ z této jamky a smíchá se 60 μΐ ve třetí jamce téhož sloupce a tak dále, dokud se neprovede dvojí titrace. Jakmile se smíchá předposlední jamka, vezme se 60 μΐ ze 120 μΐ v této jamce a dá se stranou. Poslední jamka se ponechá se 60 μΐ DMSO/ředící medium jako kontrola neobsahující testovanou sloučeninu. Připraví se 9 sloupců titrací testovaných sloučenin pro trojice jamek každá pro: (1) VEGF (získané of Pepro Tech lne., katalogové č. 100-200, (2) růstový faktor endoteliálních buněk (ECGF), (rovněž známý jako kyselý fibroblastový růstový faktor nebo aFGF) (získaný od Boehringer Mannheim Biochemica, katalogové č. 1439 600) nebo (3) lidský PDGF B/B (1276-956), Boehringer Mannheim, Německo) a kontrola s testovacím mediem. ECGF se připravuje s heparinem sodným.

2. Do každé jamky 96ti-jamkové testovací destičky, která v každé jamce obsahuje ve 100 μΐ 0,8-l,0xl0⁴ HUV-EC-C buněk ze dne 0, se přenese 50 μΐ naředěných testovaných sloučenin a inkubuje se přibližně 2 hodiny při teplotě 37°C a 5 % CO₂.

3. Do trojic jamek se přidá 50 μΙ/jamka z 80 μg/ml VEGF, 20 ng/ml ECGF nebo kontrolního media ke každé testované sloučenině. S testovanými sloučeninami mají růstové faktory 4X požadovanou konečnou koncentraci. K přípravě koncentrací růstových faktorů se použije testovací medium ze dne 0 kroku 2. Inkubuje se přibližně 24 hodin při 37°C, 5 % CO₂. Každá jamka bude mít 50 μΐ ředěné testované sloučeniny, 50 μΐ růstového faktoru nebo media, 100 μΐ buněk, což dohromady dělá 200 μΐ v každé jamce. Jakmile se vše přidá do jamek, dosáhne se 4X koncentrace testovaných sloučenin a růstových faktorů IX.

zuz

Den 2

l.Do každé jamky se přidá H-thymidin (Amersham, katalog, č. TRK686) v 1 pCi/jamka (10 μΙ/jamka roztoku 100 pCi/ml připraveného v RPMI mediu + 10 % teplotně inaktivované fetální hovězí sérum) a inkubuje se asi 24 hodin při teplotě 37°C, 5 % CO₂. RPMI se získá of Gibco BRL, katalog, č. 1 1875-051.

Den 3

1. Destičky se zmrazí přes noc při teplotě -20°C.

Den 4

Destičky se rozmrazí a sklidí na sklízecím zařízení pro 96ti-jamkové destičky (Tomtec Harvester 96®) na filtry (Wallac, katalog, č. 1205401), rozpady se odečtou v tekutinovém scintilačním spektrofotometru Wallac Betaplate™.

In vivo živočišné modely

Modely štěpů živočišných tkání

Schopnost lidských nádorů růst na tkáňových štěpech na athymovaných myších (např. Balb/c, nu/nu) poskytuje užitečný in vivo model pro studium biologické odpovědi na léčbu lidských nádorů. Od dob první úspěšné xenotransplantace lidského nádoru do athymovaných myší (Rygaard and Povlsen, 1969, Acta Patho. Microbial. Scand. 77:758-760), bylo holým myším transplantováno a na nich pěstováno mnoho různých lidských nádorových buněčných linií (např. buňky mléčných žláz, plic, močopohlavního traktu, gastrointestinální, hlavy a krku, glioblastomy, kostí a buňky maligních melanomů). Následující test lze použít k určení hladiny aktivity, specifity a účinku různých sloučenin předkládaného vynálezu. Pro hodnocení sloučenin jsou vhodné tři základní typy testů:

203

9999 buněčný/katalytický, buněčný/biologický a in vivo. Předmětem buněěného/katalytického testu je určení účinku sloučeniny na schopnost TK fosforylovat tyroziny na známém substrátu v buňce. Předmětem buněčného/biologického testu je určení účinku sloučeniny na biologickou odpověď stimulovanou TK v buňce. Předmětem in vivo testů je určení účinku sloučeniny v živočišném modelu určitého onemocnění, jako je rakovina.

Vhodné buněčné linie pro experimenty se subkutánními cizorodými štěpy zahrnuji buňky C6 (gliom, ATCC # CCL 107), buňky A375 (melanom, ATCC # CRL 1 555), buňky Calu 6 (plíce, ATCC # HTB 56), buňky PC3 (prostata, ATCC # CRL 1435), buňky SKOV3TP5 a NIH 3T3 fibroblasty geneticky upravené pro zvýšenou expresi EGFR, PDGFR, IGF-1R nebo kterékoli testované kinázy. K provedení experimentů s cizorodými štěpy lze použít následující protokol:

Samice athymovaných myší (BALB/c, nu/nu) se získají od Simonsen Laboratories (Gilroy, CA). Všechna zvířata jsou udržována ve sterilních podmínkách v klecích Micro-isolator na podestýlce Alpha-dri. Dostávají sterilní krmivo pro hlodavce a vodu podle libosti.

Buněčné linie jsou pěstovány na vhodném mediu (například MEM, DMEM, Hamovo F10 nebo Hamovo F12 s přídavkem 5 % - 10 % fetálního hovězího séra (FBS) a 2 mM glutaminem (GLN) ). Pokud není uvedeno jinak, jsou všechna media pro buněčné kultury, glutamin a fetální hovězí sérum nakupovány od Gibco Life Technologies (Grand Island, NY). Všechny buňky jsou pěstovány ve vlhké atmosféře 90 95 % vzduchu a 5 - 10 % CO₂ při 37°C. Všechny buněčné linie jsou rutinně pasážovány dvakrát týdně a negativní na mykoplazmy, což se určí metodou Mycotest (Gibco).

Buňky se sklízejí při plném či téměř plném pokryvu 0,05 % Trypsin-EDTA a peletují při 450 x g po dobu 10 minut. Pelety se resuspendují ve sterilním PBS nebo v médiu (bez PBS) do určité koncentrace a buňky se implantují do zadní části boku myši (8-10 myší ve skupině, 2-10xl0⁶ buněk/zvíře). Růst nádoru se měří po 3 až 6

204 týdnech s použitím plášťových kaliperů. Pokud není uvedeno jinak, jsou objemy nádorů vypočítány jako součin délka x šířka x výška. P hodnoty jsou vypočítávány pomocí Studentského t-testu. Testované sloučeniny ve 50 - 100 μΐ vehikula (DMSO nebo VPD:D5W) mohou být vpraveny IP injekcí v různých koncentracích aplikovaných první den po implantaci.

Nádorový invazivní model

Následující nádorový invazivní model byl vyvinut pro vyhodnocení léčebné hodnoty a účinku sloučenin selektivně inhibujících receptor KDR/FLK-1.

Postup

Jako pokusná zvířata jsou použity osmitýdenní holé myši (samice) (Simonsen lne.). Implantace nádorových buněk může být provedena v laminárním boxu. Jako anestetikum se podává intraperitoneálně Xylazin/Ketamin koktejl (100 mg/kg ketaminu a 5mg/kg Xylazinu). Odkrytí břišní dutiny se provádí středním řezem (přibližně 1,5 cm dlouhým), do dutiny se injikuje 100 μΐ media s 10⁷ nádorových buněk. Buňky se vstřikují buď do duodenálního laloku, nebo do serózní blány tlustého střeva. Peritoneum a svaly se uzavřou hedvábím 6-0 pokračovacím stehem a kůže je uzavřena použitím svorek. Zvířata jsou denně pozorována.

Analýza

Po 2 - 6 týdnech, podle výsledků pozorování pokusných zvířat, jsou myši utraceny a metastázy lokálních nádorů do různých orgánů (plíce, játra, mozek, žaludek, slezina, srdce, svaly) jsou vyjmuty a analyzovány (měření velikosti nádory, stupeň invaze, imunochemie, hybridizační testy in šitu atd.).

• 9 ·· • 9 9 9

9 9

205 • 999

Měření buněčné toxicity

Léčebné sloučeniny by se měly spíše účastnit inhibice aktivity tyrozinkinázy než vykazovat cytotoxický účinek. Měření účinnosti a buněčné toxicity sloučeniny se může získat určením léčebného indexu, tj. IC50/LD50. IC50, dávka potřebná k dosažení 50 % inhibice, se může měřit použitím standardních technik, které jsou zde popsány. LD50, dávka vedoucí k 50 % toxicitě, může být rovněž měřena standardními postupy (Mossman, 1983, J. Immunol. Methods, 65:55-63), měřením množství uvolněného LDH (Korzeniewski a Callewaert, 1983, J. Immunol. Methods, 64:313, Decker a Lohmann-Matthes, 1988, J. Immunol. Methods, 115-61) nebo měřením letální dávky v živočišných modelech. Dává se přednost sloučeninám s velkým léčebným indexem. Léčebný index by měl být větší než 2, nejlépe alespoň 10 a ještě lépe alespoň 50.

B. Příklady - Biologická aktivita.

Příklady in vitro účinnosti sloučenin tohoto vynálezu jsou uvedeny v Tabulce 1 a 2. Údaje ukazují, že tyto sloučeny jsou obecně účinné vůči různým PTK in vitro. Například několik sloučenin tohoto vynálezu, jsou-li podávány orálně, vykazuje značně redukovanou průměrnou velikost nádorů typu gliom C6 subkutánně implantovaných do myší. Nicméně sloučenina 5 se v porovnání s ostatními sloučeninami tohoto vynálezu projevuje výrazně nejlépe. V jednom experimentu se samicím myší BALB/c nu/nu v den 0 implantují subkutánně do zadního boku buňky lidského gliomu C6 (3 x 10⁶ buněk, n = 10 - 20 zvířat/skupina). Den po implantaci se myším orálně podávají sloučeniny 3, 5, 19 a 20 ve vodném labrasolu v dávce 200 mg/kg/den. Růst nádoru se měří pomocí kaliperů a objemy nádorů se vypočítají jako součin délka x šířka x výška.

Jak je uvedeno v následujícím grafu, vykazují všechny testované sloučeniny značnou inhibici ve srovnání s kontrolou obsahující pouze vehikulum. Avšak, přestože má sloučenina 5 strukturu podobnou ostatním testovaným sloučeninám, jsou její účinky výrazně odlišné. To jest, zatímco inhibice nádorového růstu sloučeninami 3, 19 a 21 je 18.den po implantaci kolem 40 - 45 %, sloučenina 5 inhibuje růst nádoru v této době 80 - 85 %.

207 • ••4 «

Tato neočekávaná účinnost sloučeniny 5 in vivo, zvláště po orálním použití, se dále projevuje v porovnání se sloučeninou 65:

Sloučenina 65 vykazuje téměř řádově vyšší účinek in vitro než sloučenina 5 (data nejsou uvedena). Nicméně, je-li testována interperitoneálně v myších proti různým liniím nádorových buněk, SF763T a SF767T, vykazuje sloučenina 5 mírně vyšší (5 % vyšší inhibice po 21 dnech) až značně vyšší (14 % vyšší inhibice po 21 dnech) účinek než sloučenina 65.

9» « 9 «

208 • 9*9 ·· ·

9 99 • 9 ** 9 • 9

99·· 999 »· 9 «99 • 9 · • 99 9

9 9

9 9 9

Rozdíl v aktivitě sloučeniny 5 a 65 je ještě vyšší, když jsou tyto sloučeniny podávány orálně. Orální účinek sloučeniny 65 a několika jejích analogů, sloučenin 66 - 69, je uveden v následujícím grafu.

25002000f15001000 —O— • o

Dny po implantaci sloučenina 66 sloučenina 67 sloučenina 68 sloučenina 69 sloučenina 65 vodný labarsol neošetrovaný sub • * * · 4 4 • 4 · 4 4

4 4 4 4 *

4 4 4 4 ·· 4444 44 444 «

ϊ

209 ♦ 444 · · ·

££67 68

Jak je vidět na grafu, sloučenina 65 podávaná orálně v množství 200 mg/kg/den vykazuje přibližně 65 % inhibici nádorů C6 18 dnů po subkutánní implantaci do myší, což je jasně více v porovnání s analogy této sloučeniny, které vykazují v průměru 14 - 16 % inhibici nádorového růstu. Nicméně je překvapivé, že orální účinek sloučeniny 65 je přesto značně nižší než sloučeniny 5, která, jak je uvedeno výše, vykazuje 80 - 85 % inhibici ve stejné době a ve stejném nádorovém modelu.

Ve srovnání se sloučeninou 70 vykazuje sloučenina 5 značně menší K/s (tj. větší účinek) (inhibiční konstantu) proti FGR-R1 (1,2 pro sloučeninu 5 oproti 19,49 pro sloučeninu 70) a PDGFR (data nejsou uvedena).

• ·

210

ZQ.

Neočekávaná kvalita sloučeniny 5 je dále prokázána, je-li její účinek porovnán s účinkem jejího blízkého analogu, sloučeniny 71:

Přes strukturální podobnost vykazuje sloučenina 71, je-li testována orálně při 200 mg/kg/den proti C6 lidským melanomům implantovaným subkutánně myším BALB/c nu/nu 18 dní po implantaci, pouze 57 % inhibici nádorového růstu (data nejsou uvedena) opět ve srovnání s 80 85 % inhibici, kterou vykazuje sloučenina 5.

Na základě výše uvedeného účinku sloučeniny 5 při orálním podávání je sloučenina 5 v současné době výhodným provedením tohoto vynálezu.

ZÁVĚR

Přínosem tohoto vynálezu je tedy to, že sloučeniny, metody a farmaceutická kompozice podle tohoto vynálezu jsou účinné v modulaci aktivity PK a tudíž se očekává jejich terapeutický účinek proti onemocnění v souvislosti s RTK, CTK- a STK.

• ·

211 • 9 · · » · · · ···· ··· ·· ···· ·· ···

Pracovníci v oboru rychle ocení, že tento vynález je dobře adaptován na provedení cílů a k dosažení konců a uvedených výhod včetně těch, které jsou součástí vynálezu. Molekulové komplexy a metody, postupy, léčby, molekuly, specifické sloučeniny zde popsané jsou v současnosti představiteli výhodných provedení, jsou exemplární a nejsou zamýšleny jako omezení rozsahu tohoto vynálezu. Jejich změny a další využití, ke kterým pracovníci v oboru znalí povahy tohoto vynálezu dospějí, jsou definovány rozsahem patentových nároků.

Pracovníkům v oboru bude jasně zřejmé, že variace substitucí a modifikací mohou být provedeny ve zde předkládaném vynálezu bez odklonu od jeho povahy a rozsahu.

Veškeré patenty a publikace uvedené ve specifikaci jsou příznačné pro úroveň pracovníků v oboru, kterých se tento vynález týká. Všechny patenty a publikace jsou zde začleněny pomocí odkazů ve stejném rozsahu, v jakém by byla každá jednotlivá publikace specificky a individuálně označena pro začlenění odkazem.

Tento vynález zde vhodně a názorně popsán může být prováděn v nepřítomnosti jakéhokoli prvku či prvků, jednoho či více omezení, které zde nejsou specificky určeny. Tak, například, v každé situaci může zde být jakýkoli z termínů obsahující, sestávající zejména z a sestávající z nahrazen kterýmkoli z ostatních dvou termínů. Termíny a výrazy, které byly použity, jsou používány jako termíny popisné nikoli omezující, a neexistuje záměr, aby z použití takových termínů a výrazů byly vyjímány jakékoli ekvivalenty vlastností ukázaných a zde popsaných nebo jejich částí, ale uznává se, že v rozsahu nárokovaného vynálezu jsou možné různé modifikace. Tím by mělo být srozuměno, že ačkoli je tento současný vynález specificky určen výhodnými provedeními a libovolnými vlastnostmi, modifikace a variace obsahu zde uvedeného, ke kterým se pracovníci v oboru mohou uchýlit, jsou považovány za součást rozsahu tohoto vynálezu, jak je definováno v patentových nárocích v dodatku.

Dále tam, kde jsou vlastnosti či aspekty tohoto vynálezu popisovány v termínech Markushových skupin, budou pracovníci v

212 oboru uznávat, že tento vynález je tímto také popisován v termínech kteréhokoli individuálního člena nebo podskupiny členů této Markushovy skupiny. Například, jestliže X je popisován a vybírán ze skupiny skládající se z bromu, chloru a jódu, jsou nároky na X, který je bromem, a nároky na X, který je bromem a chlorem, plně popsány.

Další provedení jsou mezi následujícími nároky.

Claims (24)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Pyrrolem substituovaný 2-indolinon mající chemickou strukturu:

   kde:

   R¹ je vybrán ze skupiny sestávající se z atomu vodíku, alkylu, alkenylu, alkynylu, cykloalkylu, arylu, hydroxy skupiny, alkoxy skupiny, Ckarboxy skupiny, O-karboxy skupiny , acetylu, C-amidu, C-thioamidu, sulfonylu a trihalogenmethansulfonylu;

   R² je vybrán ze skupiny sestávající se z atomu vodíku, halogenu, alkylu, cykloalkylu, arylu, heteroarylu a heteroalicyklů;

   R³, R⁴, R⁵ a R⁶ jsou nezávisle vybrány ze skupiny sestávající se z atomu vodíku, alkylu, trihalogenalkylu, cykloalkylu, alkenylu, alkynylu, arylu, heteroarylu, heteroalicyklické skupiny, hydroxy skupiny , alkoxy skupiny, aryloxy skupiny, merkapto skupiny, alkylthio skupiny, arylthio skupiny , sulfinylu, sulfonylu, S-sulfonamidu, Nsulfonamidu, trihalogenmethansulfonamidu, karbonylu, C-karboxy skupiny , O-karboxy skupiny , C-amidu, N-amidu, kyano skupiny , nitro skupiny , halogenu, O-karbamylu, N-karbamylu, O-thiokarbamylu, N-thiokarbamylu, aminu a -NR^HR¹² ;

   'Zfy eil&i cP 214 i

   R¹¹ a R¹² jsou nezávisle vybrány ze skupiny sestávající se z atomu vodíku, alkylu, cykloalkylu, arylu, karbonylu, acetylu, sulfonylu, trifluormethansulfonylu a kombinovaných pěti- nebo šesti-ělenných heteroalicyklů;

   R³ a R⁴, R⁴ a R⁵, nebo R⁴ a R⁵ se mohou spojit a utvořit šesti-členný arylový kruh, methylendioxy skupinu nebo ethylendioxy skupinu;

   R⁷ je vybrán ze skupiny sestávající se z atomu vodíku, alkylu, cykloalkylu, alkenylu, alkynylu, arylu, heteroarylu, heteroalicyklů, hydroxy skupiny , alkoxy skupiny , aryloxy skupiny , karbonylu, acetylu, C-amidu, C-thioamidu, amidinu, C-karboxy skupiny, Okarboxy skupiny, sulfonylu a trihalogenmethan-sulfonylu;

   R⁸, R⁹ a R¹⁰ jsou nezávisle vybrány ze skupiny sestávající se z atom vodíku, alkylu, trihalogenalkylu, cykloalkylu, alkenylu, alkynylu, arylu, heteroarylu, heteroalicyklů, hydroxy skupiny, alkoxy skupiny, aryloxy skupiny, merkapto skupiny, alkylthio skupiny, arylthio skupiny, sulfinylu, sulfonylu, S-sulfonamidu, N-sulfonamidu, karbonylu, Ckarboxy skupiny, O-karboxy skupiny, kyano skupiny, nitro skupiny, halogenu, O-karbamylu, N-karbamylu, O- thiokarbamylu, Nthiokarbamylu, C-amidu, N-amidu, amino skupiny a NR^hR¹², za předpokladu, že nejméně jeden z R⁸, R⁹ nebo R¹⁰ je skupina mající vzorec -(alki)Z kde:

   Alk) je vybrán ze skupiny sestávající se z alkylu, alkenylu nebo alkynylu;

   a Z je a polární skupina, s výhradou, že je vyloučena sloučenina 6-nitro-3-(lH-pyrrol-2ylmetylen)-! ,3-dihydro-indol-2-on vzorce

   N

   H

   215 ·· · ·· ·· ·· • · · · ···» • · · « · ···* · • · · · · · ·« ··«< ··· tt <··· «· ···
2. 2. Sloučeniny podle nároku 1, kde R¹, R² a R⁷ jsou atomy vodíku.
3. 3. Sloučeniny podle nároku 2, kde jeden z R⁸, R⁹ nebo R¹⁰ je alkiZ kde:

   alki je vybrán ze skupiny sestávající se z nesubstituovaného nižšího alkylu, nesubstituovaného nižšího alkenylu a nesubstituovaného nižšího alkynylu;

   a Z je polární skupina vybrána ze skupiny sestávající se z hydroxy skupiny, alkoxy skupiny, C-karboxy skupiny, karbonylu, nitro skupiny, kyano skupiny, amino skupiny, amonium skupiny, -NRⁿR¹², C-amidu, S-sulfonamidu, sulfinylu, sulfonylu, fosfonylu, ureido skupiny, amidinu, guanidinylu, morfolinu, piperidinylu a tetrazolu.
4. 4. Sloučeniny podle nároku 1, kde R³, R⁴, R⁵ a R⁶ jsou nezávisle vybrány ze skupiny sestávající se z :

   atomu vodíku; halogenu;

   nesubstituovaného nižšího alkylu;

   nižšího alkylu substituovaného jednou nebo více skupinami vybranými ze skupiny sestávající se z:

   hydroxy skupiny; halogenu;

   C-karboxy skupiny substituované skupinou vybranou ze skupiny sestávající se z:

   atomu vodíku; nebo, nesubstituovaného nižšího alkylu;

   amino skupiny; nebo,

   -NRR¹²;

   nesubstituované nižší alkylalkoxy skupiny;

   nižší alkylalkoxy skupiny substituované jedním nebo více halogeny; nesubstituované aryloxy skupiny;

   aryloxy skupiny substituované jednou nebo více skupinami nezávisle vybranými ze skupiny sestávající se z:

   ·· • · · φ ♦

   216 φφφ • · ·· · nesubstituovaného nižšího alkylu;

   nižšího alkyl substituovaného jedním nebo více halogeny; hydroxy skupiny;

   nesubstituované nižší alkylalkoxy skupiny; halogenu;

   amino skupiny; nebo,

   -NR¹^¹²;

   11 19

   S-sulfonamidu kde R a R jsou nezávisle vybrány ze skupiny sestávající se z atomu vodíku a nesubstituovaného nižšího alkylu; nesubstituovaného arylu;

   arylu substituovaného jednou nebo více skupinami nezávisle vybraným ze skupiny sestávající se z :

   halogenu;

   nesubstituovaného nižšího alkylu;

   nižšího alkylu substituovaného jedním nebo více halogeny; nesubstituované nižší alkylalkoxy skupiny; amino skupiny; nebo,

   -NR^UR¹²;

   nesubstituovaného heteroarylu;

   heteroarylu substituovaného jednou nebo více skupinami nezávisle vybranými ze skupiny sestávající se z :

   nesubstituovaného nižšího alkyl;

   nižšího alkylu substituovaného jedním nebo vícehalogeny; nesubstituované nižší alkyl alkoxy skupiny; hydroxy skupiny;

   halogenu;

   amino skupiny; nebo,

   -NRR¹²;

   nesubstituovaného heteroalicyklu;

   heteroalicyklu substituovaného jednou nebo více skupinami nezávisle vybranými ze skupiny sestávající se z:

   halogenu; hydroxy skupiny;

   0 « 0 4

   0 0 « >000 00

   217 nesubstituovaného nižšího alkylu;

   nižšího alkylu substituovaného jedním nebo více halogeny; nesubstituované nižší alkylalkoxy skupiny; amino skupiny; nebo,

   RR¹²;

   nesubstituované nižší alkyl O-karboxy skupiny ;

   C-amidu, kde R a R jsou nezávisle vybrány ze skupiny sestávající se z atomu vodíku, nesubstituovaného nižšího alkylu a nesubstituovaného arylu;

   a N-amidu kde R¹¹ a R¹² jsou nezávisle vybrány ze skupiny sestávající se z atomu vodíku, nesubstituovaného nižšího alkylu a nesubstituovaného arylu.
5. 5. Sloučenina podle nároku 3, kde R³, R⁴, R⁵ a R⁶ jsou vybrány ze skupiny sestávající se z : atomu vodíku;

   halogenu;

   nesubstituovaného nižšího alkylu;

   nižšího alkylu substituovaného jednou nebo více skupinami vybranými ze skupiny sestávající se z:

   hydroxy skupiny; halogenu;

   C-karboxy skupiny substituované skupinou vybranou ze skupiny sestávající se z:

   atomu vodíku; nebo, nesubstituovaného nižšího alkylu;

   amino skupiny; nebo,

   -NRR¹²;

   nesubstituované nižší alkylalkoxy skupiny;

   nižší alkylalkoxy skupiny substituované jedním nebo více halogeny; nesubstituované aryloxy skupiny;

   aryloxy skupiny substituované jednou nebo více skupinami nezávisle vybranými ze skupiny sestávající se z:

   • ·

   218 ·«· * · · · · * · · « · · • ·· 1 1»1 11 111 nesubstituovaného nižšího alkylu;

   nižšího alkylu substituovaného jedním nebo více halogeny; hydroxy skupiny;

   nesubstituované nižší alkylalkoxy skupiny; halogenu;

   amino skupiny; nebo,

   -NR¹¹R¹²;

   S-sulfonamidu, kde R¹¹ a R¹² jsou nezávisle vybrány ze skupiny sestávající se z atomu vodíku a nesubstituovaného nižšího alkylu; nesubstituovaného arylu;

   arylu substituovaného jednou nebo více skupinami nezávisle vybranými ze skupiny sestávající se z:

   halogenu;

   nesubstituovaného nižšího alkylu;

   nižšího alkylu substituovaného jedním nebo více halogeny; nesubstituované nižší alkylalkoxy skupiny; amino skupiny; nebo,

   -NR“R¹²;

   nesubstituovaného heteroarylu;

   heteroarylu substituovaného jednou nebo více skupinami nezávisle vybranými ze skupiny sestávající se z:

   nesubstituovaného nižšího alkylu;

   nižšího alkylu substituovaného jedním nebo více halogeny; nesubstituované nižší alkylalkoxy skupiny; hydroxy skupiny;

   halogenu;

   amino skupiny; nebo,

   -NRⁿR¹²;

   nesubstituovaného heteroalicyklu;

   heteroalicyklu substituovaného jednou nebo více skupinami nezávisle vybranými ze skupiny sestávající se z:

   halogenu; hydroxy skupiny;

   219 nesubstituovaného nižšího alkylu;

   nižšího alkylu substituovaného jedním nebo více halogeny; nesubstituované nižší alkylalkoxy skupiny; amino skupiny; nebo,

   R^UR¹²;

   nesubstituované nižší alkyl O-karboxy skupiny;

   C-amidu, kde R¹¹ a R¹² jsou nezávisle vybrány ze skupiny sestávající se z atomu vodíku, nesubstituovaného nižšího alkylu a nesubstituovaného arylu;

   a N-amidu, kde R¹¹ a R¹² jsou nezávisle vybrány ze skupiny sestávající se z atomu vodíku, nesubstituovaného nižšího alkylu a nesubstituovaného arylu.
6. 6. Sloučenina podle nároku 1, kde:

   R¹, R², R³, R⁴, R⁵, R⁶ a R⁷ jsou atom vodíku;

   R⁸ a R¹⁰ jsou methyl;

   a R⁹ je -(CH₂)(CH₂)C(=O)OH.
7. 7. Farmaceutická kompozice, vyznačující se tím, že zahrnuje: uvedenou sloučeninu podle nároku 6;

   a fyziologicky akceptovatelný nosič nebo vehikulum.
8. 8. Sloučenina podle nároku 1, kde:

   R¹, R² a R⁷ jsou atom vodíku;

   R³, R⁴, R⁵ a R⁶ jsou nezávisle vybrány ze skupiny sestávající se z: atomu vodíku; hydroxy skupiny; halogenu;

   nesubstituovaného nižšího alkylu;

   nižšího alkylu substituovaného karboxylovou kyselinou;

   nesubstituované nižší alkoxy skupiny;

   karboxylové kyseliny;

   nesubstituovaného arylu;

   220 ·· * Μ Φ· ΦΦ • Φ Φ · φφφφ ΦΦΦ

   Φ Φ Φ Φ ΦΦΦ

   Φ · ΦΦΦ φφφ • ΦΦΦ ΦΦΦ ΦΦ ΦΦΦΦ ΦΦ ΦΦΦ arylu substituovaného jednou nebo více nesubstituovanými nižšími alkylalkoxy skupinami; nebo, morfolinem;

   R⁸ je vybrán ze skupiny sestávající se z atomu vodíku a nesubstituovaného nižšího alkylu;

   R⁹ je -(CH₂)(CH₂)C(=O)OH;

   a R^{10 *} je nesubstituovaný nižší alkyl.
9. 9. Sloučenina podle nároku 2, kde R⁷ je vybrán ze skupiny sestávající se z:

   atomu vodíku, nesubstituovaného nižšího alkylu, a nižšího alkylu substituovaného skupinou vybranou ze skupiny sestávající se z:

   nesubstituovaného cykloalkylu, nesubstituovaného arylu, a arylu substituovaného skupinou vybranou z hydroxy skupiny, nesubstituované nižší alkylalkoxy skupiny a halogenu.
10. 10. Sloučenina podle nároku 2, kde Z je vybráno ze skupiny sestávající se z:

    -C(=O)NR¹³R¹⁴, kde R¹³ a R¹⁴ jsou nezávisle vybrány ze skupiny sestávající se z:

    atomu vodíku, nesubstituovaného nižšího alkylu, nižšího alkylu substituovaného skupinou vybranou ze skupiny sestávsjící se z:

    amino skupiny a -NR^HR¹², nesubstituovaného arylu, arylu substituovaného jednou nebo více skupinami vybranými ze skupiny sestávající se z halogenu, hydroxy skupiny, nesubstituované nižší alkylalkoxy skupiny a trihalogenmethylu, φ φ

    221 • φ φφ φφφφ φφ φφφ φ φ φφφ φ φ · φ φ • φ φ φ φφ φφφφ φ φ nesubstituovaného heteroarylu, ne substituovaného heteroalicyklu, a kombinovaných, pěti-členných nebo šesti-členných ne substituovaných heteroalicyklů, a -NR“R¹², kde,

    R a R jsou nezávisle vybrány ze skupiny sestávající se z nesubstituovaného nižšího alkylu a, kombinovaných pěti-členných nebo šesti-členných nesubstituovaných heteroalicyklů.
11. 11. Sloučenina podle nároku 1, kde:

    R⁷ je vybrán ze skupiny sestávající se z nesubstituovaného nižšího alkylu, nižšího alkylu substituovaného jednou nebo více skupinami vybranými ze skupiny sestávající se z:

    nesubstituovaného cykloalkylu, nesubstituovaného arylu, arylu substituovaného jednou nebo více skupinami nezávisle vybranými ze skupiny sestávající se z halogenu a nesubstituované nižší alkylalkoxy skupiny a nesubstituovaného nižšího alkyl karboxyalkylu, a Z je vybráno ze skupiny sestávající se z nesubstituované C-karboxy skupiny a nesubstituované nižší alkyl C-karboxy skupiny.
12. 12. Sloučenina podle nároku 1, kde:

    R³, R⁴, R⁵, a R⁶ jsou nezávisle vybrány ze skupiny sestávající se z: atomu vodíku, halogenu, nesubstituovaného nižšího alkylu, nižšího alkylu substituovaného jednou nebo více hydroxy skupinami, nesubstituované nižší alkoxy skupiny, nesubstituovaného arylu,

    222 •9 9 99 99 99 • 9 99 99*9 999 • 9 9 9 9 9 9

    9 9 9*9 999

    9999 999 99 9999 99 999 arylu substituovaného jednou nebo více nesubstituovanými nižšími alkoxy skupinami, a S(O)₂NR¹¹R¹²,

    R⁵ je atom vodíku,

    R⁶ je NRⁿR¹², a R¹¹ a R¹² jsou nezávisle vybrány ze skupiny sestávající se z atomu vodíku, nesubstituovaného nižšího alkylu a kombinovaných pětičlenných nebo šesti-členných nesubstituovaných heteroalicyklů.
13. 13. Způsob modulace katalytické aktivity proteinkinázy, vyznačující se tím, že zahrnuje kontakt řečené proteinkinázy se sloučeninou, solí nebo proléčivem nároku 1.
14. 14. Způsob podle nároku 13, vyznačující se tím, že řečená proteinkináza je vybraná ze skupiny sestávající se z receptorové tyrozinkinázy, nereceptorové tyrozinkinázy a serin-threoninkinázy.
15. 15. Farmaceutická kompozice, vyznačující se tím, že zahrnuje: sloučeninu, sůl nebo proléčivo nároku 1; a fyziologicky akceptovatelný nosič nebo vehikulum.
16. 16. Způsob ošetření nebo prevence poruch týkajících se proteinkinázy v organizmu, vyznačující se tím, že zahrnuje aplikaci terapeuticky efektivního množství sloučeniny, soli nebo proléčiva nároku 1 do uvedeného organizmu.
17. 17. Způsob podle nároku 16, vyznačující se tím, že zahrnuje aplikaci terapeuticky efektivního množství

    3-[2,4-dimethyl-5-(2-oxo-l ,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-lH-pyrrol3-yl]-propionové kyseliny do uvedeného organizmu.
18. 18. Způsob podle nároku 16, vyznačující se tím, že porucha spojená s proteinkinázou je vybraná ze skupiny sestávající se z poruchy • ·

    223

    4 4

    44 44 44

    4 4 4 4 4 4

    44 4444 44 ·♦· týkající se receptorové tyrozinkinázy, z poruchy týkající se nereceptorové tyrozinkinázy a z poruchy týkající se serinthreoninkinázy.
19. 19. Způsob podlenároku 16, vyznačující se tím, že uvedená porucha spojená s proteinkinázou je vybraná ze skupiny sestávající se z poruchy spojené s EGFR, z poruchy spojené s PDGFR, z poruchy spojené s IGFR a z poruchy spojené s flk.
20. 20. Způsob podle nároku 16, vyznačující se tím, že uvedená porucha spojená s proteinkinázou je rakovina vybraná ze skupiny sestávající se z spinocelulárního karcinomu, astrocytomu, Kaposiho sarkomu, glioblastomů, rakoviny plic, rakoviny močového měchýře, rakoviny hlavy a krku, melanomů, rakoviny vaječníků, rakoviny prostaty, rakoviny prsu, rakoviny malých plicních buňek, gliomu, rakoviny tlustého střeva, moěo-pohlavní rakoviny a gastrointestinální rakoviny.
21. 21. Způsob podle nároku 16, vyznačující se tím, že řečená porucha spojená s proteinkinázou je vybranán ze skupiny sestávající se z diabetů, auto-immunitní poruchy, hyperproliferační poruchy, restenózy, fibrosy, psoriasy, osteo-artritidy, revmatické artritidy, angiogenze, zánětlivých poruch, imunologických poruch a kardiovasculárních poruch.
22. 22. Způsob podle nároku 16, vyznačující se tím, že řečený organizmus je lidský.
23. 23. Sloučenina ze skupiny sestávající se z:

    3-[5-(5-chlor-2-oxo-l,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-4-methyl1 H-pyrrol-3-yl]-propionová kyselina

    3-[5-(6-methoxy-2-oxo-l,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-4methyl-1 H-pyrrol-3-yl]-propionová kyselina

    224

    3-[5-(5-chlor-2-oxo-l ,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-2,4dimethyl -1 H-pyrrol-3-yl]-propionová kyselina

    3-[4-methyl-5-(2-oxo-l ,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-1Hpyrrol-3-yl]-propionová kyselina

    3-[2,4-dimethyl-5-(2-oxo-l,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl) - 1Hpyrrol-3-yl]-propionová kyselina

    3-[5-( 5-brom-2-oxo- 1,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-4-methyllH-pyrrol-3-yl]-propionová kyselina

    3-[5-(5-jod-2-oxo-l ,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-4-methyl-1H pyrrol-3-yl]-propionová kyselina

    3-[4-methy 1-5-(4-methyl-2-oxo-1,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl) lH-pyrrol-3-yl]-propionová kyselina

    3-[4-methyl-5-(5-methyl-2-oxo-1,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl) 1 H-pyrrol-3-yl]-propionová kyselina

    3-[5-(5,6-dimethoxy-2-oxo-1,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-4methyl-1 H-pyrrol-3-yl]-propionová kyselina

    3-[5-(6-chlor-2-oxo-l ,2-dihydro indol-3-yl i denmethyl)-4-methyl1 H-pyrrol-3-yl]-propionová kyselina

    Methyl ester 3-[4-(2-karboxyethyl)-3-methyl-lH-pyrrol-2y 1 methy len]-2-oxo-2,3-dihydro- 1H- indol- 5-karboxylové kyseliny

    3-[4-(2-karboxy-ethyl)-3-methyl-lH-pyrrol-2-ylmethylen]-2-oxo2,3-dihydro-1 H-indol-5-karboxylová kyselina

    3 -[4-methy 1-5-(2-oxo-5 -sulfamoy 1-1,2-dihydro indol- 3-yl i denmethyl) -1 H-pyrrol-3-yl]-propionová kyselina

    3 -[4-methyl-5 -(5-methyl sulfamoy 1-2-oxo -1,2-dihydroindol-3ylidenmethyl) -1 H-pyrrol-3-yl]-propionová kyselina

    3-{3-[4-(2-karboxy-ethyl)-3-methyl-lH-pyrrol-2- ylmethylen]-2oxo-2,3-dihydro-1 H-indol-5-yl}-propionová kyselina

    3-[5-(5-ethyl-2-oxo-1,2-dihydro-indol-3-ylidenmethyl)-4-methyl1 H-pyrrol-3-yl]-propionová kyselina

    3-[5-(5-methoxy-2-oxo-l ,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-4methyl-1 H-pyrrol-3-yl]-propionová kyselina

    225 «0 0 «0*0 ·« «000 0 · · · «09

    9 9 0 9 9 9 « • 0 «00 «90 • «0« ·«« 00 0000 00 «00

    3-[5-(5-brom-2-oxo-l ,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-2,4d i methyl -1 H-pyrrol-3-yl]-pr opi onová kyselina

    3-[5-(5-jod-2-oxo-l,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-2,4d i methyl -1 H-pyrrol-3-yl]-propionová kyselina

    3-[2,4-dimethy 1-5-(4-methy 1-2-oxo -1,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl) -1 H-pyrrol-3-yl]-pr opi onová kyselina

    3-[2,4-dimethy 1-5-(5-methy 1-2-oxo -1,2-dihydroindol-3ylidenmethyl) -1 H-pyrrol-3-yl]-propionová kyselina

    3-[5-(6-hydroxy-2-oxo-1,2-dihydro indol-3-y li denmethy 1)-2,4dimethy 1- 1 H-pyrrol-3-yl]-propionová kyselina

    3-[5-(6-methoxy-2-oxo -1,2-dihydroindol-3-ylidenmethy 1)-2,4dimethy 1-1 H-pyrrol-3-yl]-propionová kyselina

    3-[5-(6-hydroxy-2-oxo-1,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-4methyl-1 H-pyrrol-3-yl]-propionová kyselina

    3,5-dimethoxy-benzylester 3-[5-(6-hydroxy-2-oxo -1,2d ihydroindol-3-y li denmethy 1)-4-methy 1-1 H-pyrrol-3-yl]-propionové kyseliny

    3- {5-[6-(3-methoxy-fenyl)-2-oxo -1,2-dihydroindol-3ylindenmenthyl]-2,4-dimethy 1-1 H-pyrrol-3-yl}-propionová kyselina

    3-[5-(6-brom-2-oxo-l ,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-4-methyl1 H-pyrrol-3-yl]-propionová kyselina

    3-{5-[6-(3-methoxy-fenyl)-2-oxo-l,2-dihydroindol-3ylidenmethyl]-4-methy 1-lH-pyrrol-3-yl}-propionová kyselina

    3 - {5-[6-(3-ethoxy-fenyl)-2-oxo -1,2-dihydroindol-3ylidenmethyl]-2,4-dimethyl-lH-pyrrol-3-yl}-propionová kyselina

    3-{5-[6-(3-ethoxy-fenyl)-2-oxo-l,2-dihydroindol-3ylidenmethyl]-4-methyl-lH-pyrrol-3-yl}-propionová kyselina

    3-[2,4-dimethy 1-5-(2-oxo-6-fenyl-1,2-dihydroindol-3ylidenmethyl) -1 H-pyrrol-3-yl]-propionová kyselina

    3 -[4-methyl -5-(2-oxo-6-fenyl -1,2-dihydro-indol-3-ylidenmethyl)1 H-pyrrol-3-yl]-propionová kyselina

    3 - {5-[6-(4-methoxy-fenyl)-2-oxo-1,2-dihydro indol-3ylidenmethyl]-4-methyl-1 H-pyrrol-3-yl}-propionová kyselina

    226

    3- {5-[6-(4-methoxy-fenyl)-2-oxo-1,2-dihydroindol-3ylidenmethyl]-2,4-dimethyl-lH-pyrrol-3-yl}-propionová kyselina

    3 - {5-[6-(2-methoxy-fenyl)-2-oxo-1,2-dihydroindol-3ylidenmethyl]-4-methyl -1 H-pyrrol-3-yl}-propionová kyselina

    3-{5-[6-(2-methoxy-fenyl)-2-oxo-l,2-dihydroindol-3ylidenmethyl]-2,4-dimethyl -1 H-pyrrol-3-yl}-propionová kyselina

    3-[2,4-dimethyl-5-(6-morfolin-4-yl-2-oxo-l,2-dihydroindol-3ylidenmethyl) -1 H-pyrrol-3-yl]-propionová kyselina

    3-[5-(5-chlor-4-methyl-2-oxo-1,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)2,4-dimethyl-lH-pyrrol-3-yl]-propionová kyselina

    3-[5-(5-chlor-4-methyl-2-oxo-l,2-dihydroindol-3- ylidenmethyl)

    4-methyl -1 H-pyrrol-3-yl]-propionová kyselina

    Sodná sůl 3-[2,4-dimethyl-5-(2-oxo-l,2-dihydroindol-3ylidenmethyl) -1 H-pyrrol-3-yl]-propionové kyseliny
24. 24. Sloučenina vybraná ze skupiny sestávající se z: 3-[3,5-dimethyl-4-(3-morfolin-4-ylpropyl)-1 H-pyrrol-2ylmethylen]-l ,3-dihydroindol-2-on

    5-brom-3-[3,5-dimethyl-4-(3-morfolin-4-ylpropyl)-l H-pyrrol-2yl methy len]-1,3-dihydroindol-2-on

    3-[3,5-dimethyl-4-(3-morfolin-4-ylpropyl) - lH-pyrrol-2ylmethylen]-6-fenyl -1,3-dihydroindol-2-on

    3-[3,5-di methy 1-4-(3-mor fol in-4-y lpropy 1) -1 H-pyrrol-2ylmethy len]-6-(2-methoxy fenyl) -1,3-dihydroindol-2-on

    3-[3,5-dimethyl-4-(3-morfolin-4-ylpropyl) - 1 H-pyrrol 2ylmethy len]-6-(3-methoxy fenyl) -1,3-dihydroindol-2-on

    3-[3,5-dimethyl-4-(3-morfolin-4-ylpropyl)-lH-pyrrol-2ylmethy len]-6-(4-methoxyfenyl) -1,3-dihydroindol-2-on

    3-[4-(3-dimethy laminopropy 1)-3,5-dimethyl -1 H-pyrrol-2ylmethy len]-1,3-dihydroindol-2-on

    5-brom-3-[4-(3-dimethylaminopropyl)-3,5-dimethyl-lH pyrro 1-2 ylmethylen]-1,3-dihydroindol-2-on

    227 • · • · ·<

    • · · « · 9

    9 9 9

    99 9999

    3-[4-(3-dimethylaminopropyl)-3,5-dimethyl-lH-pyrrol-2y Imethy len]-6-fenyl -1,3-dihydroindol-2-on

    3-[4-(3-dimethylaminopropyl)-3,5-dimethyl - 1 H-pyrrol-2ylmethylen]-6-(2-methoxy fenyl) -1,3-dihydroindol-2-on

    3-[4-(3-dimethylaminopropyl)-3,5-dimethyl-lH-pyrrol-2y 1 methy len ]-6-(3-methoxy fenyl) -1,3-dihydroindol-2-on

    3-[4-(3-dimethylaminopropy 1)-3,5-dimethyl -1 H-pyrrol-2y Imethy len]-6-(4-methoxy feny 1)-1,3-dihydroindol-2-on

    5- chlor-3 -[4-(3-dimethylaminopropy 1)-3,5 -dimethyl-1 H-pyrrol-2y Imethy len]-1,3-dihydroindol-2-on

    6- chlor-3-[4-(3-dimethylaminopropyl)-3,5-dimethyl -1 H-pyrrol-2y Imethy len]-l ,3-dihydroindol-2-on

    3 -[4-(3-dimethyl aminopropy 1)-3,5 -dimethyl -1 H-pyrrol-2y Imethy len]-5-methoxy-1,3-dihydroindol-2-on

    3-[4-(3-dimethylaminopropyl)-3,5-dimethyl - lH-pyrrol-2y Imethy len]-6-methoxy-1,3-dihydroindol-2-on

    3-[4-(3-dimethylaminopropyl)-3,5-dimethyl -1 H-pyrrol-2ylmethylen]-5-methyl -1,3-dihydroindol-2-on

    3-[4-(3-dimethylaminopropyl)-3,5-dimethyl-lH-pyrrol-2y Imethy len]-4-methyl-1,3-dihydroindol-2-on

    3-[4-(3-dimethylaminopropyl)-3,5-dimethyl - lH-pyrrol-2y Imethy len]-4-(2- hydr oxy ethyl)-1,3-dihydroindol-2-on

    3-[4-(3-dimethylaminopropyl)-3,5-dimethyl-lH-pyrrol-2ylmethylen]-2-oxo-2,3-dihydro -1 H-indol-5-sulfonová kyselina

    Izopropylamid 3-[4-(3-dimethylaminopropyl)-3,5-dimethyl-1Hpyrrol-2-ylmethylen]-2-oxo-2,3-dihydro -ÍH-indol-5-sulfonové kyseliny

    3-[4-(3-dimethylaminopropyl)-3,5-dimethyl-lH-pyrrol-2ylmethylen]-5-(morfolin-4-sulfonyl)-l ,3-dihydroindol-2-on

    Dimethylamid 3-[4-(3-dimethylaminopropy 1)-3,5-dimethyl-1 tipy rro 1-2-y Imethy len]-2-oxo-2,3-dihydro- 1 H-indol-5-sulfonové kyseliny.