PT2020408E - Inibidor de proteína cinase de 2-indolinona substituída com pirrole - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

"INIBIDOR DE PROTEÍNA CINASE DE 2-INDOLINONA SUBSTITUÍDA COM PIRROLE"

INTRODUÇÃO A presente invenção refere-se, em geral, à química orgânica, bioquímica, farmacologia e medicina. De um modo mais particular, refere-se a novos compostos de 2-indolinona substituída com pirrole e os seus sais e profármacos fisiologicamente aceitáveis, os quais modulam a actividade de proteína cinase ("PK") e, deste modo, espera-se que apresentem um efeito salutar contra distúrbios relacionados com actividade de PK anómala.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO 0 seguinte é apresentado apenas como informação antecedente e não se considera que seja técnica anterior à presente invenção.

As PK são enzimas que catalisam a fosforilação de grupos hidroxilo em resíduos de tirosina, serina e treonina de proteínas. As consequências desta actividade aparentemente simples são desconcertantes; crescimento, diferenciação e proliferação celulares, i. e., virtualmente todos os aspectos da vida celular, de um modo ou outro, dependem da actividade de PK. Além disso, a actividade de PK anómala foi relacionada com um 1 distúrbios, grande número de relativamente não mortais, extremamente virulentas, tal cérebro). variando entre doenças tal como psoriase, a doenças como glioblastoma (cancro do

As PK podem ser convenientemente decompostas em duas classes, as proteínas tirosinas cinases (PTK) e as serinas-treoninas cinases (STK).

Um dos principais aspectos da actividade de PTK é o seu envolvimento com receptores do factor de crescimento. Os receptores do factor de crescimento são proteínas de superfície celular. Quando ligados por um ligando do factor de crescimento, os receptores do factor de crescimento são convertidos numa forma activa que interage com proteínas na superfície interna de uma membrana celular. Isto conduz a fosforilação em resíduos de tirosina do receptor e outras proteínas, e à formação, dentro da célula, de complexos com uma variedade de moléculas de sinalização citoplasmática que, por sua vez, efectuam numerosas respostas celulares, tais como divisão celular (proliferação), diferenciação celular, crescimento celular, expressão de efeitos metabólicos no microambiente extracelular, etc. Para uma discussão mais completa, ver Schlessinger e Ullrich, Neuron, 9:303-391 (1992) o qual é incorporado por referência, incluindo quaisquer desenhos, como aqui apresentado na sua totalidade.

Os receptores do factor de crescimento com actividade de PTK são conhecidos como receptores de tirosinas cinases ("RTK"). Compreendem uma grande família de receptores transmembranares com actividade biológica diversa. Presentemente, foram identificadas, pelo menos, dezanove (19) subfamílias distintas de RTK. É um exemplo destas, a subfamília designada como RTK de 2 "HER", a qual inclui EGFR (receptor do factor de crescimento epitelial), HER2, HER3 e HER4. Estes RTK consistem num domínio de ligação de ligando glicosilado extracelular, um domínio transmembranar e um domínio catalítico citoplasmático intracelular que pode fosforilar resíduos de tirosina em proteínas.

Outra subfamília de RTK consiste no receptor de insulina (IR), receptor do factor I de crescimento semelhante a insulina (IGF-1R) e receptor relacionado com o receptor de insulina (IRR) 0 IR e IGF-1R interagem com insulina, IGF-I e IGF-II para formarem um heterotetrâmero de duas subunidades α glicosiladas extracelulares integrais e duas subunidades β que atravessam a membrana celular e que contêm o domínio de tirosina cinase.

Uma terceira subfamília de RTK é referida como o grupo do receptor do factor de crescimento derivado de plaquetas ("PDGFR"), o qual inclui PDGFRa, PDGFRP, CSFIR, c-kit e c-fms. Estes receptores consistem em domínios extracelulares glicosilados compostos por números variáveis de ansas semelhantes à imunoglobina e um domínio intracelular, em que o domínio de tirosina cinase está interrompido por sequências de aminoácidos não relacionados. A subfamília do receptor de cinase de fígado de feto ("flk") é outro grupo que, devido à sua semelhança com a subfamília de PDGFR, está por vezes subsumido no último grupo. Considera-se que este grupo é composto por receptor de cinase 1 de fígado de feto de domínio de inserção de cinase (KDR/FLK-1), flk-lR, flk-4 e tirosina cinase 1 semelhante a fms (flt-1). 3

Um membro adicional da família do receptor do factor de crescimento de tirosina cinase é o subgrupo do receptor do factor de crescimento de fibroblastos ("FGF"). Este grupo consiste em quatro receptores, FGFR1-4 e sete ligandos, FGF1-7. Embora ainda não bem definido, parece que os receptores consistem num domínio extracelular glicosilado contendo um número variável de ansas semelhantes à imunoglobina e um domínio intracelular, no qual a sequência de tirosina cinase está interrompida por regiões de sequências de aminoácidos não relacionados.

Ainda outro membro da família do receptor do factor de crescimento de tirosina cinase é o subgrupo do receptor do factor de crescimento endotelial vascular (VEGF"). 0 VEGF é uma glicoproteína dimérica semelhante a PDGF, mas tem funções biológicas e especificidade de célula alvo in vivo diferentes. Em particular, presentemente, considera-se que o VEGF desempenha um papel essencial na vasculogénese e angiogénese.

Uma listagem mais completa das subfamílias de RTK conhecidas é descrita em Plowman et al., DN&P, 7 (6):334-339 (1994) o qual é incorporado por referência, incluindo quaisquer desenhos, como aqui apresentado na sua totalidade.

Além das RTK, também existe uma família de PTK integralmente intracelulares denominadas "tirosinas cinases não receptoras" ou "tirosinas cinases celulares". Esta última designação, abreviada "CTK", será aqui utilizada. As CTK não contêm domínios extracelulares e transmembranares. Presentemente, foram identificadas mais de 24 CTK em 11 subfamílias (Src, Frk, Btk, Csk, Abl, Zap70, Fes, Fps, Fak, Jak e Ack) . A subfamília de Src parece ser, até agora, o maior 4 grupo de CTK e inclui Src, Yes, Fyn, Lyn, Lck, Blk, Hck, Fgr e Yrk. Para uma discussão mais detalhada das CTK, ver Bolen, Oncogene, 8:2025-2031 (1993), que é incorporado por referência, incluindo quaisquer desenhos, como aqui apresentado na sua totalidade.

As serinas/treoninas cinases, STK, à semelhança das CTK, são predominantemente intracelulares, embora existam algumas cinases receptoras do tipo STK. As STK são as mais comuns das cinases citosólicas; i. e., cinases que desempenham a sua função na parte do citoplasma diferente dos organelos citoplasmáticos e citoesqueleto. O citosol é a região na célula onde ocorre muita da actividade metabólica e biossintética intermediária da célula; e. g. , é no citosol que as proteínas são sintetizadas nos ribossomas.

As RTK, CTK e STK foram todas implicadas num grande número de estados patogénicos incluindo, significativamente, cancro. Outros estados patogénicos que foram associados às PTK incluem, sem limitação, psoríase, cirrose hepática, diabetes, angiogénese, restenose, doenças oculares, artrite reumatóide e outros distúrbios inflamatórios, distúrbios imunológicos, tal como doença auto-imune, doença cardiovascular, tal como aterosclerose e uma variedade de distúrbios renais.

Em relação ao cancro, duas das principais hipóteses avançadas para explicar a excessiva proliferação celular que dirige o desenvolvimento tumoral referem-se a funções conhecidas por serem reguladas por PK. Ou seja, foi sugerido que o crescimento celular maligno resulta de uma desagregação nos mecanismos que controlam a divisão e/ou diferenciação celulares. Demonstrou-se que os produtos proteicos de um número de 5 proto-oncogenes estão envolvidos nas vias de transdução de sinal que regulam o crescimento e diferenciação celulares. Estes produtos proteicos de proto-oncogenes incluem os factores de crescimento extracelulares, receptores de PTK de factor de crescimento transmembranar (RTK), PTK citoplasmáticas (CTK) e STK citosólicas, discutidos acima.

Dada a aparente ligação entre as actividades celulares relacionadas com PK e a ampla variedade de distúrbios humanos, não é surpresa que esteja a ser despendido um esforço considerável, numa tentativa de identificar as vias que modulam a actividade de PK. Algumas destas têm envolvido abordagens biomiméticas, utilizando moléculas grandes modeladas a partir das envolvidas nos processos celulares efectivos (e. g., ligandos mutantes (Pedido U.S. N° 4966849); receptores solúveis e anticorpos (Pedido N° WO 94/10202, Kendall e Thomas, Proc, Nat'1 Acad, Sei., 90:10705-09 (1994), Kim, et al., Nature, 362:841-844 (1993)); ligandos de ARN (Jelinek, et al., Biochemistry, 33:10450-56); Takano, et al., Mol. Bio. Cell 4:358A (1993); Kinsella, et al., Exp. Cell Res. 199:56-62 (1992); Wright, et al. , J. Cellular Phys., 152:448-57) e inibidores de tirosina cinase (documentos WO 94/03427; WO 92/21660; WO 91/15495; WO 94/14808; Pat. U.S. N° 5330992; Mariani, et al., Proc. Am. Assoe. Câncer Res., 35:2268 (1994)).

Além do acima, foram realizadas tentativas para identificar moléculas pequenas que actuam como inibidores de PK. Por exemplo, os compostos bis-monocíclicos, bicíclicos e heterociclicos de arilo (documento PCT WO 92/20642), derivados de vinileno-azaindole (documento PCT WO 94/14808) e l-ciclopropil-4-piridilquinolonas (Pat. U.S. N° 5330992) foram descritos como inibidores de tirosina cinase. Os compostos de 6 estirilo (Pat. U.S. N° 5217999), compostos de piridilo substituídos por estirilo (Pat. U.S. N° 5302606), derivados de quinazolina (Pedido EP N° 0566266A1), selenoindoles e selenidos (documento PCT WO 94/03427), compostos poli-hidroxílicos tricíclicos (documento PCT WO 92/21660) e compostos de ácido benzilfosfónico (documento PCT WO 91/15495), assim como compostos de indolinona (documentos PCT WO 96/40116 e PCT WO 98/50356), foram todos descritos como inibidores de PTK úteis no tratamento do cancro.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Os esforços da requerente para identificar moléculas orgânicas pequenas que modulam a actividade de PK e que, por conseguinte, se espera que sejam úteis no tratamento e prevenção de distúrbios envolvendo actividade de PK anómala, conduziram à identificação de uma família de novos compostos de 2-indolinona substituída com pirrole que apresentam capacidade de modulação de PK e, desse modo, espera-se que tenham um efeito salutar contra distúrbios relacionados com actividade de PK anómala.

Deste modo, a presente invenção refere-se, em geral, à utilização de uma composição farmacêutica compreendendo uma 2-indolinona substituída com pirrole que modula a actividade de receptores de tirosinas cinases (RTK), proteínas tirosinas cinases não receptoras (CTK) e serinas/treoninas proteínas cinases (STK), como definido na reivindicação 1, no tratamento de distúrbios relacionados com PK.

Uma "composição farmacêutica" refere-se a uma mistura de um ou mais dos compostos aqui descritos ou os seus sais ou 7 profármacos fisiologicamente aceitáveis, com outros componentes químicos, tais como veículos e excipientes fisiologicamente aceitáveis. A finalidade de uma composição farmacêutica é facilitar a administração de um composto a um organismo.

Como aqui utilizado, um "veículo fisiologicamente aceitável" refere-se a um veículo ou diluente que não causa irritação significativa a um organismo e não ab-roga a actividade biológica e propriedades do composto administrado.

Um "excipiente" refere-se a uma substância inerte adicionada a uma composição farmacêutica para facilitar ainda a administração de um composto. Os exemplos, sem limitação, de excipientes incluem carbonato de cálcio, fosfato de cálcio, diversos açúcares e tipos de amido, derivados de celulose, gelatina, óleos vegetais e polietilenoglicóis.

1. QUÍMICA A. Características Estruturais Gerais.

Num aspecto, a presente divulgação refere-se a uma 2- indolinona substituída com pirrole, nomeadamente ácido 3- [2,4-Dimetil-5-(2-oxo-l,2-di-hidromidol-3-ilidenometil)-1H-pirrol-3-il]-propiónico. Os sais fisiologicamente aceitáveis do composto reivindicado também estão no âmbito desta invenção.

2. BIOQUIMICA/FARMACOTERAPIA

Outro aspecto desta divulgação refere-se a um método para a modulação da actividade catalítica de uma PK, pela colocação de uma PK em contacto com um composto desta divulgação ou um seu sal fisiologicamente aceitável.

Como aqui utilizado, "PK" refere-se a receptores de proteína tirosina cinase (RTK), tirosina cinase não receptora ou "celular" (CTK) e serinas-treoninas cinases (STK). 0 termo "método" refere-se a modos, meios, técnicas e processos para a realização de uma dada tarefa, incluindo mas não limitados a esses modos, meios, técnicas e processos, conhecidos ou facilmente desenvolvidos a partir de modos, meios, técnicas e processos conhecidos, dos praticantes das técnicas químicas, farmacêuticas, biológicas, bioquímicas e médicas.

Como aqui utilizado, o termo "modulação" ou "modulando" refere-se à alteração da actividade catalítica das RTK, CTK e STK. Em particular, modulando refere-se à activação da actividade catalítica das RTK, CTK e STK, de um modo preferido a activação ou inibição da actividade catalítica das RTK, CTK e STK, dependendo da concentração do composto ou sal a que a RTK, CTK ou STK é exposta ou, de um modo mais preferido, a inibição da actividade catalítica das RTK, CTK e STK. A expressão "actividade catalítica", como aqui utilizada, refere-se à taxa de fosforilação de tirosina sob a influência, directa ou indirecta, das RTK e/ou CTK ou a fosforilação de serina e treonina sob a influência, directa ou indirecta, das STK. 9 A expressão "colocação em contacto", como aqui utilizada, refere-se à reunião de um composto, como aqui divulgado, e uma PK alvo, de modo que o composto possa afectar a actividade catalítica da PK, directamente, i. e., pela interacção com a própria cinase, ou indirectamente, i. e., pela interacção com outra molécula sobre a qual a actividade catalítica da cinase esteja dependente. Essa "colocação em contacto" pode ser realizada "in vitro", i. e., num tubo de ensaio, uma placa de petri ou semelhantes. Num tubo de ensaio, a colocação em contacto pode envolver apenas um composto e uma PK de interesse ou pode envolver células intactas. As células também podem ser mantidas ou cultivadas em placas de cultura celular e colocadas em contacto com um composto nesse ambiente. Neste contexto, a capacidade de um composto particular afectar um distúrbio relacionado com PK, i. e., a IC50 do composto, definido abaixo, pode ser determinada antes da utilização dos compostos in vivo com organismos vivos mais complexos ser tentada. Para células no exterior do organismo, existem múltiplos métodos, e são bem conhecidos dos especialistas na técnica, para se obter as PK em contacto com os compostos, incluindo mas não limitados a micro-injecção celular directa e numerosas técnicas de veículo transmembranar.

Um aspecto adicional desta divulgação é que a modulação da actividade catalítica das PK utilizando um composto desta invenção pode ser efectuada in vitro ou in vivo. "In vitro" refere-se a processos realizados num ambiente artificial, tais como, e. g., sem limitação, num tubo de ensaio ou meio de cultura. 10

Como aqui utilizado, "in vivo" refere-se a processos realizados dentro de um organismo vivo, tais como, sem limitação, um murganho, rato ou coelho.

Ainda um aspecto adicional desta divulgação é que a proteína cinase cuja actividade catalítica está sendo modulada por um composto como aqui divulgado é seleccionada do grupo consistindo em receptores de proteínas tirosinas cinases, tirosinas cinases celulares e serinas-treoninas cinases. E um aspecto desta divulgação que a proteína cinase receptora cuja actividade catalítica é modulada por um composto desta invenção seja seleccionada do grupo consistindo em EGF, HER2, HER3, HER4, IR, IGF-1R, IRR, PDGFRa, PDGFRβ, CSFIR, C-Kit, c-fms, Flk-IR, Flk4, KDR/Flk-1, Flt-1, FGFR-1R, FGFR-2R, FGFR-3R e FGFR-4R.

Além disso, é um aspecto desta divulgação que a tirosina cinase celular, cuja actividade catalítica é modulada por um composto desta invenção, seja seleccionada do grupo consistindo em Src, Frk, Btk, Csk, Abl, ZAP70, Fes/Fps, Fak, Jak, Ack, Yes, Fyn, Lyn, Lck, Blk, Hck, Fgr e Yrk.

Outro aspecto desta divulgação é que a serina-treonina proteína cinase, cuja actividade catalítica seja modulada por um composto desta invenção, seja seleccionada do grupo consistindo em CDK2 e Raf.

Uma composição farmacêutica de um composto desta divulgação com um veículo farmaceuticamente aceitável é ainda outro aspecto desta invenção. Essa composição farmacêutica também pode conter excipientes. 11

Um método para o tratamento ou prevenção de um distúrbio relacionado com proteína cinase num organismo, compreendendo administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto, sal que é uma 3-pirrolidenil-2-indolinona da presente divulgação ao organismo, é outro aspecto aqui descrito.

Como aqui utilizado, "distúrbio relacionado com PK", "distúrbio direccionado por PK" e "actividade de PK anómala" referem-se todos a um estado caracterizado por actividade catalítica de PK inapropriada, i. e., subactividade catalítica ou, mais geralmente, sobreactividade catalítica, onde a PK particular pode ser uma RTK, uma CTK ou uma STK. A actividade catalítica inapropriada pode surgir como o resultado de: (1) expressão de PK em células que normalmente não expressam PK, (2) expressão de PK aumentada, conduzindo a proliferação, diferenciação e/ou crescimento celulares não desejados ou (3) expressão de PK diminuída, conduzindo a reduções não desejadas na proliferação, diferenciação e/ou crescimento celulares. A sobreactividade de uma PK refere-se à amplificação do gene codificando uma particular PK ou à produção de um nível de actividade de PK que pode correlacionar-se com um distúrbio de proliferação, diferenciação e/ou crescimento celulares (ou seja, à medida que o nível da PK aumenta, a gravidade de um ou mais dos sintomas do distúrbio celular aumenta). A subactividade é, evidentemente, o inverso, em que a gravidade de um ou mais sintomas de um distúrbio celular aumenta à medida que o nível da actividade de PK diminui.

Como aqui utilizado, os termos "prevenir", "previne" e "prevenção" referem-se, em primeiro lugar, a um método para impedir um organismo de adquirir um distúrbio relacionado com PK. 12

Como aqui utilizado, os termos "tratar", "tratando" e "tratamento" referem-se a um método de alivio ou ab-rogação de um distúrbio celular mediado por PK e/ou os seus sintomas concomitantes. Em relação particularmente ao cancro, estes termos simplesmente significam que a esperança de vida de um indivíduo afectado com um cancro será aumentada ou que um ou mais dos sintomas da doença serão reduzidos. 0 termo "organismo" refere-se a qualquer entidade viva compreendida por, pelo menos, uma célula. Um organismo vivo pode ser tão simples como, por exemplo, uma única célula eucariótica ou tão complexo como um mamífero, incluindo um ser humano. A expressão "quantidade terapeuticamente eficaz", como aqui utilizada, refere-se à quantidade do composto a ser administrado que irá aliviar, de certo modo, um ou mais dos sintomas do distúrbio a ser tratado. Em referência ao tratamento do cancro, uma quantidade terapeuticamente eficaz refere-se à quantidade que tem efeito de (1) redução do tamanho do tumor, (2) inibição (ou seja, abrandando de certo modo, de um modo preferido, parando) a metástase tumoral, (3) inibição de certo modo (ou seja, abrandando, de certo modo, de um modo preferido, parando) o crescimento tumoral e/ou (4) aliviando de certo modo (ou, de um modo preferido, eliminando) um ou mais sintomas associados ao cancro. É um aspecto desta divulgação que o distúrbio relacionado com proteína cinase acima referenciado seja seleccionado do grupo consistindo num distúrbio relacionado com receptores de proteína tirosina cinase, um distúrbio de tirosina cinase celular e um distúrbio relacionado com serina-treonina cinase. 13 o distúrbio

Ainda noutro aspecto desta divulgação, relacionado com proteína cinase acima referenciado é seleccionado do grupo consistindo num distúrbio relacionado com EGFR, um distúrbio relacionado com PDGFR, um distúrbio relacionado com IGFR e um distúrbio relacionado com flk.

Num aspecto adicional desta divulgação, o distúrbio relacionado com proteína cinase acima referenciado é um cancro seleccionado do grupo consistindo em carcinoma espinocelular, sarcomas, tais como sarcoma de Kaposi, astrocitoma, glioblastoma, cancro do pulmão, cancro da bexiga, cancro colorrectal, cancro gastrointestinal, cancro da cabeça e pescoço, melanoma, cancro dos ovários, cancro da próstata, cancro da mama, cancro das células pequenas do pulmão e glioma.

Ainda noutro aspecto desta divulgação, o distúrbio relacionado com a proteína cinase acima referenciado é seleccionado do grupo consistindo em diabetes, um distúrbio de hiperproliferação, doença de von Hippel-Lindau, restenose, fibrose, psoríase, osteoartrite, artrite reumatóide, um distúrbio inflamatório e angiogénese.

Os distúrbios adicionais que podem ser tratados ou prevenidos utilizando os compostos desta divulgação são distúrbios imunológicos, tal como doença auto-imune (SIDA) e distúrbios cardiovasculares, tal como aterosclerose. É como aspecto desta divulgação que um composto químico que modula a actividade catalítica de uma proteína cinase, pode ser identificado pela colocação de células expressando a referida proteína cinase em contacto com um composto ou sal que é uma 14 3-pirrolidenil-2-indolinona da presente divulgação e, depois, a monitorização das referidas células para um efeito.

Por "monitorização" pretende-se significar observação ou detecção do efeito de colocação de um composto em contacto com uma célula expressando uma PK particular. 0 efeito observado ou detectado pode ser uma alteração no fenótipo celular, na actividade catalítica de uma PK ou uma alteração na interacção de uma PK com um parceiro de ligação natural. As técnicas para observação ou detecção desses efeitos são bem conhecidas no campo técnico.

Num aspecto final desta divulgação, o efeito acima referenciado é seleccionado de uma alteração ou uma ausência de alteração no fenótipo de uma célula, uma alteração ou ausência de alteração na actividade catalítica da referida proteína cinase ou uma alteração ou ausência de alteração na interacção da referida proteína cinase com um parceiro de ligação natural. "Fenótipo celular" refere-se ao surgimento externo de uma célula ou tecido ou à função biológica da célula ou tecido. Os exemplos, sem limitação, de um fenótipo celular são tamanho celular, crescimento celular, proliferação celular, diferenciação celular, sobrevivência celular, apoptose e absorção e utilização de nutriente. Essas características fenotípicas são mensuráveis por técnicas bem conhecidas no campo técnico.

Um "parceiro de ligação natural" refere-se a um polipéptido gue se liga a uma PK particular numa célula. Os parceiros de ligação naturais podem desempenhar um papel na propagação de um sinal num processo de transdução de sinal mediado por PK. Uma 15 alteração na interacção do parceiro de ligação natural com a PK pode, por si só, manifestar-se como uma concentração aumentada ou diminuída do complexo PK/parceiro de ligação natural e, como resultado, numa alteração observável na capacidade de a PK mediar a transdução de sinal. É também um aspecto desta divulgação que um composto aqui descrito ou o seu sal, pode ser combinado com outros agentes quimioterapêuticos para o tratamento das doenças e distúrbios discutidos acima. Por exemplo, um composto ou sal desta divulgação poderá ser combinado com agentes alquilantes, tais como fluorouracilo (5-FU) isoladamente ou em combinação adicional com leucovorina; ou outros agentes alquilantes, tal como, sem limitação, outros análogos de pirimidina, tais como UFT, capecitabina, gemcitabina e citarabina, os sulfonatos de alquilo, e. g., bussulfano (utilizado no tratamento de leucemia granulocítica crónica), improssulfano e pipossulfano; aziridinas, e. g., benzodepa, carboquona, meturedepa e uredepa; etilenoiminas e metilmelaminas, e. g., altretamina, trietilenomelamina, trietilenofosforamida, trietilenotiofosforamida e trimetilolmelamina; e as mostardas de azoto, e. g., clorambucilo (utilizado no tratamento de leucemia linfocítica crónica, macroglobulinemia primária e linfoma não Hodgkin), ciclofosfamida (utilizada no tratamento da doença de Hodgkin, mieloma múltiplo, neuroblastoma, cancro da mama, cancro dos ovários, cancro do pulmão, tumor de Wilm e rabdomiossarcoma), estramustina, ifosfamida, novembricina, prednimustina e mostarda de uracilo (utilizadas no tratamento de trombocitose primária, linfoma não Hodgkin, doença de Hodgkin e cancro dos ovários); e triazinas, e. g., dacarbazina (utilizada no tratamento de sarcoma de tecido mole). 16

Do mesmo modo, poderá esperar-se que um composto ou sal desta divulgação tenha um efeito benéfico em combinação com outros agentes quimioterapêuticos antimetabolito, tais como, sem limitação, análogos de ácido fólico, e. g. metotrexato (utilizado no tratamento de leucemia linfocitica aguda, coriocarcinoma, mycosis fungiodes, cancro da mama, cancro da cabeça e pescoço e sarcoma osteogénico) e pteropterina; e os análogos purínicos, tais como mercaptopurina e tioguanina que encontram utilização no tratamento das leucemias granulocitica aguda, linfocitica aguda e crónica.

Também poderá esperar-se que um composto ou sal desta divulgação prove ser eficaz em combinação com agentes quimioterapêuticos à base de produtos naturais, tais como, sem limitação, os alcaloides da vinca, e. g., vinblastina (utilizada no tratamento de cancro da mama e dos testículos), vincristina e vindesina; as epipodofilotoxinas, e. g., etopósido e tenipósido, os quais são ambos úteis no tratamento do cancro dos testículos e sarcoma de Kaposi; os agentes quimioterapêuticos antibióticos, e. g., daunorrubicina, doxorrubicina, epirubicina, mitomicina (utilizados para tratar os cancros do estômago, colo uterino, cólon, mama, bexiga e pancreas), dactinomicina, temozolomida, plicamicina, bleomicina (utilizadas no tratamento dos cancros da pele, esófago e aparelho genitourinário); e os agentes quimioterapêuticos enzimáticos, tal como L-asparaginase.

Além do acima, poderá esperar-se que um composto ou sal desta divulgação tenha um efeito benéfico utilizado em combinação com os complexos de coordenação de platina (cisplatina, etc.); ureias substituídas, tal como hidroxiureia; derivados de metil-hidrazina, e. g., procarbazina; supressores adrenocortiçais, e. g., mitotano, aminoglutetimida; e hormonas e 17 antagonistas de hormonas, tais como os adrenocorticosteróides (e. g., prednisona), progestina (e. g., caproato de hidroxiprogesterona); estrogénios (e. g., dietilestilbesterol); antiestrogénios, tal como tamoxifeno; androgénios, e. g., propionato de testosterona; e inibidores de aromatase (tal como anastrozole).

Finalmente, poderá esperar-se que a combinação de um composto desta divulgação seja particularmente eficaz em combinação com mitoxantrona ou paclitaxel para o tratamento de cancros de tumores sólidos ou leucemias, tal como, sem limitação, leucemia mielógena aguda (não linfocítica). 0 composto desta invenção que poderá esperar-se que tenha um efeito benéfico em combinação com um ou mais dos agentes quimioterapêuticos acima é o ácido 3-[2,4-Dimetil-5-(2-oxo-l,2-di-hidroindol-3-ilidenometil)-lH-pirrol-3-il]propiónico.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO 1. BREVE DESCRIÇÃO DAS TABELAS A TABELA 1 mostra a estrutura química e actividade biológica do composto desta invenção. Os bioensaios utilizados são descritos em detalhe abaixo. Os resultados são referidos em termos de IC5o, a concentração micromolar (μΜ) do composto a ser testado o qual causa uma alteração de 50% na actividade da PKT alvo, comparativamente com a actividade da PTK num controlo a que não foi adicionado composto de teste. Especificamente, os resultados mostrados indicam a concentração de um composto de teste necessária para causar uma redução de 50% da actividade da 18 PTK alvo. Os compostos apresentados na Tabela 1 são apenas exemplificativos e não podem ser considerados como limitando o âmbito desta invenção de qualquer modo.

Exemplo Estrutura bio-FLK-1 IC30(mM) bio-PDGFr IC (mM) bio- FGFR IC (mM) HUVEC— VEGF IC (mM) HUVEC— aFGF IC (mM) BrdU- PDGFr IC (mM) BrdU- FGFr IC (mM) BrdU- EGFr IC (mM) 1 0,13 <1,2 8,81 0,42 9,3 10, 7 46, 8 95, 9

2. INDICAÇÕES/DOENÇAS ALVO

As PK cuja actividade catalítica é modulada pelos compostos desta divulgação incluem proteínas tirosinas cinases, das quais há dois tipos, receptores de tirosinas cinases (RTK) e tirosinas cinases celulares (CTK) e serinas-treoninas cinases (STK). A transdução de sinal mediada por RTK é iniciada por interacção extracelular com um factor de crescimento específico (ligando), seguida de dimerização do receptor, estimulação transiente da actividade intrínseca de proteína tirosina cinase e fosforilação. Os sítios de ligação são, por esse meio, criados para moléculas de transdução de sinal intracelulares e conduzem à formação de complexos com um espectro de moléculas sinalizadoras citoplasmáticas que facilitam a resposta celular apropriada (e. g., divisão celular, efeitos metabólicos no microambiente extracelular, etc.). Ver Schlessinger e Ullrich, 1992, Neuron 9:303-391. 19

Mostrou-se que os sítios de fosforilação de tirosina nos receptores do factor de crescimento funcionam como sítios de ligação de elevada afinidade para domínios de SH2 (homologia de src) de moléculas de sinalização. Fantl et al., 1992, Cell 69:413-423, Songyang et al., 1994, Mol. Cell. Biol. 14:2777-2785), Songyang et al., 1993, Cell 72 : 767-778 e Koch et al., 1991, Science 252:668-678. Foram identificadas várias proteínas de substrato intracelular que se associam com as RTK.

Podem ser divididas em dois grupos principais: (1) substratos que têm um domínio catalítico e (2) substratos que são desprovidos desse domínio mas que servem como adaptadores e se associam com moléculas cataliticamente activas. Songyang et al., 1993, Cell 72:767-778. A especificidade das interacções entre receptores e domínios de SH2 dos seus substratos é determinada pelos resíduos de aminoácido circundando imediatamente o resíduo de tirosina fosforilada. As diferenças nas afinidades de ligação entre domínios de SH2 e as sequências de aminoácidos circundando os resíduos de fosfotirosina em receptores particulares são consistentes com as diferenças observadas nos seus perfis de fosforilação de substrato. Songyang et al., 1993, Cell 72:767-778. Estas observações sugerem que a função de cada RTK é determinada, não apenas pelo seu padrão de expressão e disponibilidade de ligando, mas também pela matriz das vias de transdução de sinal a jusante que são activadas por um receptor particular. Deste modo, a fosforilação proporciona uma importante etapa reguladora que determina a selectividade das vias de sinalização recrutadas por receptores específicos do factor de crescimento, assim como receptores do factor de diferenciação.

As STK, sendo principalmente citosólicas, afectam a bioquímica interna da célula, frequentemente como uma resposta 20 de linha descendente para um evento de PTK. As STK foram implicadas no processo de sinalização que inicia a síntese de ADN e subsequente mitose, conduzindo a proliferação celular.

Deste modo, a transdução de sinal de PK resulta, entre outras respostas, em proliferação, diferenciação, crescimento e metabolismo celulares. A proliferação celular anormal pode resultar num vasto leque de distúrbios e doenças, incluindo o desenvolvimento de neoplasia, tais como carcinoma, sarcoma, glioblastoma e hemangioma, distúrbios, tais como leucemia, psoríase, arteriosclerose, artrite e retinopatia diabética e outros distúrbios relacionados com angiogénese e/ou vasculogénese descontroladas.

De modo a realizar a presente invenção, não é requerida uma compreensão precisa do mecanismo pelo qual os compostos desta divulgação inibem as PK. Contudo, embora não se deseje por este meio a ligação a qualquer mecanismo ou teoria particular, considera-se que os compostos interagem com os aminoácidos na região catalítica das PK. As PK possuem, tipicamente, uma estrutura bilobada, em que o ATP parece ligar-se na cavidade entre os dois lobos numa região onde os aminoácidos, de entre as PK, são conservados. Considera-se que os inibidores das PK se ligam por interacções não covalentes, tais como ligações de hidrogénio, forças de van der Waals e interacções iónicas, na mesma região geral onde o ATP supracitado se liga às PK. Mais especificamente, considera-se que o componente de 2-indolinona dos compostos desta invenção se liga no espaço geral normalmente ocupado pelo anel de adenina do ATP. A especificidade de uma molécula particular para uma PK particular pode, depois, surgir como o resultado de interacções adicionais entre os diversos substituintes no núcleo de 2-indolinona e os domínios de 21 aminoácido específicos das PK particulares. Deste modo, diferentes substituintes de indolinona podem contribuir para a ligação preferida a PK particulares. A capacidade para seleccionar compostos activos em diferentes sítios de ligação de ATP (ou outro nucleótido), faz dos compostos desta invenção úteis para visarem qualquer proteína com esse sítio. Os compostos aqui divulgados podem, deste modo, ter utilidade como ensaios in vitro para essas proteínas, assim como exibirem efeitos terapêuticos in vivo através de interacção com essas proteínas.

Noutro aspecto, a proteína cinase, cuja actividade catalítica é modulada por contacto com um composto desta divulgação, é uma proteína tirosina cinase, de um modo mais particular, um receptor de proteína tirosina cinase. De entre as receptores de proteínas tirosinas cinases cuja actividade catalítica pode ser modulada com um composto desta invenção, ou seu sal, estão, sem limitação, EGF, HER2, HER3, HER4, IR, IGF-1R, IRR, PDGFRa, PDGFRp, CSFIR, C-Kit, C-fms, Flk-IR, Flk4, KDR/Flk-1, Flt-1, FGFR-1R, FGFR-2R, FGFR-3R e FGFR-4R. A proteína tirosina cinase, cuja actividade catalítica é modulada por contacto com um composto como aqui divulgado ou um seu sal, também pode ser uma proteína tirosina cinase (CTK) não receptora ou celular Deste modo, a actividade catalítica de CTK, tais como, sem limitaçao, Src, Frk, Btk, Csk, Abl, ZAP70, Fes, Fps, Fak, Jak, Ack, Yes, Fyn, Lyn, Lck, Blk, Hck, Fgr e

Yrk, pode ser modulada por contacto com um composto ou sal desta invenção.

Ainda outro grupo de PK que pode ter a sua actividade catalítica modulada por contacto com um composto desta 22 divulgação são as serinas-treoninas proteínas cinases, tais como, sem limitação, CDK2 e Raf.

Noutro aspecto, esta divulgação refere-se a um método para o tratamento ou prevenção de um distúrbio relacionado com PK, pela administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto desta divulgação ou um seu sal, a um organismo.

Também é um aspecto desta divulgação que uma composição farmacêutica contendo um composto desta divulgação ou um seu sal, seja administrada a um organismo para os efeitos de prevenção ou tratamento de um distúrbio relacionado com PK.

Este pedido é, por conseguinte, direccionado a compostos que modulam a transdução de sinal de PK, pela afectação a actividade enzimática das RTK, CTK e/ou STK interferindo, desse modo, com os sinais transduzidos por essas proteínas. De um modo mais particular, o presente pedido é direccionado a compostos que modulam as vias de transdução de sinal mediadas por RTK, CTK e/ou STK, como uma abordagem terapêutica para curar muitos tipos de tumores sólidos, incluindo mas não limitados a carcinomas, sarcomas, incluindo sarcoma de Kaposi, eritroblastoma, glioblastoma, meningioma, astrocitoma, melanoma e mioblastoma. 0 tratamento ou prevenção de cancros de tumores não sólidos, tal como leucemia, também estão contemplados por esta divulgação. As indicações podem incluir, mas não estão limitadas a cancros do cérebro, cancros da bexiga, cancros dos ovários, cancros gástricos, cancros do pâncreas, cancros do cólon, cancros do sangue, cancros do pulmão e cancros ósseos.

Exemplos adicionais, sem limitação, dos tipos de distúrbios relacionados com actividade de PK inapropriada que os compostos 23 aqui descritos podem ser úteis na prevenção, tratamento e estudo, são distúrbios proliferativos celulares, distúrbios fibróticos e distúrbios metabólicos.

Os distúrbios proliferativos celulares que podem ser prevenidos, tratados ou ainda estudados pela presente divulgação incluem cancro, distúrbios proliferativos dos vasos sanguíneos e distúrbios proliferativos celulares mesangiais.

Os distúrbios proliferativos dos vasos sanguíneos referem-se a distúrbios relacionados com vasculogénese (formação de vaso sanguíneo) e angiogénese (propagação de vasos sanguíneos) anormais. Embora a vasculogénese e a angiogénese desempenhem papéis importantes numa variedade de processos fisiológicos normais, tais como desenvolvimento embrionário, formação de corpo lúteo, cicatrização e regeneração de órgãos, também desempenham um papel central no desenvolvimento do cancro onde resultam na formação de novos capilares necessários para manter um tumor vivo. Outros exemplos de distúrbios de proliferação de vasos sanguíneos incluem artrite, onde novos vasos sanguíneos capilares invadem a articulação e destroem cartilagem, e doenças oculares, como a retinopatia diabética, onde novos capilares na retina invadem o vítreo, sangram e causam cegueira.

Foram identificadas duas RTK estruturalmente relacionadas que se ligam a VEGF com elevada afinidade: a tirosina 1 receptora semelhante a fms (fit-1) (Shibuya et ai., 1990, Oncogene, 5:519-524; De Vries et al., 1992, Science, 255:989-991) e o receptor de KDR/FLK-1, também conhecido como VEGF-R2. O factor de crescimento endotelial vascular (VEGF) foi referido como sendo um mitogénio específico de célula endotelial, com actividade de promoção de crescimento de célula endotelial in vitro. Ferrara & Henzel, 1989, Biochein. Biophys. Res. Comm., 161:851-858; Vaisman et al., 1990, J. Biol. Chem., 265:19461-19566. A informação apresentada nos pedidos U.S. com os N° de Série 08/193829, 08/038596 e 07/975750 sugere fortemente que o VEGF é, não apenas responsável pela proliferação de célula endotelial, mas também é o principal regulador da angiogénese normal e patológica. Ver, de uma maneira geral, Klagsburn & Soker, 1993, Current Biology, 3(10)699-702; Houck, et al., 1992, J. Biol. Chem., 267:26031-26037. A vasculogénese e angiogénese normais desempenham importantes papéis numa variedade de processos fisiológicos, tais como desenvolvimento embrionário, cicatrização, regeneração de órgãos e processos reprodutivos femininos, tais como desenvolvimento folicular no corpo lúteo durante a ovulação e crescimento placentário após a gravidez. Folkman & Shing, 1992, J. Biological Chem., 267(16):10931-34. A vasculogénese e/ou angiogénese descontroladas foram associadas a doenças, tais como diabetes, assim como com tumores sólidos malignos que dependem da vascularização para crescimento. Klagsburn & Soker, 1993, Current Biology, 3 (10):699-702; Folkham, 1991, J. Natl. Câncer Inst., 82:4-6; Weidner, et al., 1991, New Engl. J. Med., 324:1-5. O suposto papel do VEGF na proliferação e migração de célula endotelial durante a angiogénese e vasculogénese indica um papel importante para o receptor de KDR/FLK-1 nestes processos. Doenças, tais como diabetes mellitus (Folkman, 198, em Xlth Congress of Thrombosis and Haemostasis (Verstraeta, et al. , ed.), p. 583-596, Leuven University Press, Leuven) e 25

artrite, assim como crescimento tumoral maligno, podem resultar da angiogénese descontrolada. Ver, e. g. , Folkman, 1971, N. Engl. J. Med., 285:1182-1186. Os receptores aos quais o VEGF se liga especificamente são um importante e poderoso alvo terapêutico para a regulação e modulação da vasculogénese e/ou angiogénese e uma variedade de doenças graves que envolvem crescimento celular anormal causado por esses processos. Plowman, et al., 1994, DN&P, 7(6):334-339. De um modo mais particular, o papel altamente específico dos receptores de KDR/FLK-1 na neovascularização faz deles um alvo de escolha para abordagens terapêuticas no tratamento do cancro e outras doenças que envolvem a formação descontrolada de vasos sanguíneos.

Deste modo, um aspecto da presente divulgação refere-se a compostos capazes de regularem e/ou modularem a transdução de sinal de tirosina cinase, incluindo a transdução de sinal do receptor de KDR/FLK-1, de modo a inibirem ou promoverem a angiogénese e/ou vasculogénese, ou seja, compostos que inibem, previnem ou interferem com o sinal transduzido por KDR/FLK-1 quando activado por ligandos, tal como VEGF. Embora se considere que os compostos da presente divulgação actuem num receptor ou outro componente ao longo da via de transdução de sinal de tirosina cinase, também podem actuar directamente nas células tumorais que resultam da angiogénese descontrolada.

Embora a nomenclatura dos equivalentes humanos e murinos do receptor genérico de "flk-I" difira, são, em muitos aspectos, intermutáveis. 0 receptor murino, Flk-1 e o seu equivalente humano, KDR, partilham uma homologia de sequência de 93,4% no domínio intracelular. Do mesmo modo, o FLK-I murino liga-se a VEGF humano com a mesma afinidade que o VEGF de murganho e, consequentemente, é activado pelo ligando derivado de qualquer 26 das espécies. Millauer et al., 1993, Cell, 72:835-846; Quinn et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 90:7533-7537. O FLK-1 também se associa a tirosina e, subsequentemente, fosforila substratos de RTK humano (e. g., PLC-γ ou p85) quando co-expresso em células 293 (fibroblastos de rim embrionário humano).

Os modelos que dependem do receptor de FLK-1 são, por conseguinte, directamente aplicáveis à compreensão do receptor de KDR. Por exemplo, a utilização do receptor de FLK-1 murino em métodos que identificam compostos que regulam a via de transdução de sinal murina é directamente aplicável à identificação de compostos que podem ser utilizados para regular a via de transdução de sinal humana, ou seja, que regulam a actividade relacionada com o receptor de KDR. Deste modo, os compostos quimicos identificados como inibidores de KDR/FLK-1 in vitro, podem ser confirmados em modelos in vivo adequados. Demonstrou-se que os modelos animais de murganho e rato in vivo são de excelente valor para a examinação do potencial clínico de agentes actuando na via de transdução de sinal induzida por KDR/FLK-1.

Deste modo, num aspecto, esta divulgação é dirigida a compostos que regulam, modulam e/ou inibem a vasculogénese e/ou angiogénese, pela afectação da actividade enzimática do receptor de KDR/FLK-1 e interferência com o sinal transduzido por KDR/FLK-1. Noutro aspecto, o presente pedido é direccionado a compostos que regulam, modulam e/ou inibem a via de transdução de sinal mediada por KDR/FLK-1 como uma abordagem terapêutica ao tratamento de muitos tipos de tumores sólidos, incluindo mas não limitados a glioblastoma, melanoma e sarcoma de Kaposi, e carcinoma dos ovários, pulmonar, mamário, prostético, 27 pancreático, colónico e epidermóide. Além disso, os dados sugerem que a administração de compostos que inibem a via de transdução de sinal mediada por KDR/Flk-1 também pode ser utilizada no tratamento de hemangioma, restenose e retinopatia diabética.

Um aspecto adicional desta divulgação refere-se à inibição da vasculogénese e angiogénese por outras vias mediadas por receptor, incluindo a via compreendendo o receptor de flt-1. A transdução de sinal mediada por tirosina cinase receptora é iniciada por interacção extracelular com um factor de crescimento específico (ligando) , seguida de dimerização do receptor, estimulação transiente da actividade intrínseca de proteína tirosina cinase e autofosforilação. Os sítios de ligação são, por esse meio, criados para moléculas de transdução de sinal intracelulares que conduzem à formação de complexos com um espectro de moléculas de sinalização citoplasmática que facilitam a resposta celular apropriada, e. g., divisão celular e efeitos metabólicos para o microambiente extracelular. Ver Schlessinger e Ullrich, 1992, Neuron, 9:1-20. A homologia próxima das regiões intracelulares de KDR/FLK-1 com a do receptor de PDGF-β (homologia de 50,3%) e/ou o receptor de flt-1 relacionado, indica a indução de vias de transdução de sinal de sobreposição. Por exemplo, para o receptor de PDGF-β, demonstrou-se que os membros da família de src (Twamley et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 90:7696-7700), fosfatidilinositol-3'-cinase (Hu et al., 1992, Mol. Cell. Biol., 12 : 981-990), fosfolipase cy (Kashishian & Cooper, 1993, Mol. Cell. Biol., 4:49-51), proteína de activação de ras-GTPase, (Kashishian et al., 1992, EMBO J., 11:1373-1382), PTP-ID/syp 28 (Kazlauskas et al.r 1993, 10 90:6939-6943), Grb2 (Arvidsson et al., 1994, Mol. Cell. Biol., 14:6715-6726) e as moléculas Shc e Nck adaptadoras (Nishimura et al., 1993, Mol. Cell. Biol., 13:6889-6896), se ligam a regiões envolvendo diferentes sítios de autofosforilação. Ver, de um modo geral, Claesson-Welsh, 1994, Prog. Growth Factor Res., 5:37-54. Deste modo, é provável que as vias de transdução de sinal activadas por KDR/FLK-1 incluam a via de ras (Rozakis et al., 1992, Nature, 360:689-692), a PI-3'-cinase, as vias mediadas por src e as mediadas por ρΐογ. Cada destas vias pode desempenhar um papel crítico no efeito angiogénico e/ou vasculogénico de KDR/FLK-1 nas células endoteliais. Consequentemente, ainda um aspecto adicional desta divulgação refere-se à utilização dos compostos orgânicos aqui descritos para modular a angiogénese e vasculogénese, visto que esses processos são controlados por estas vias. Inversamente, os distúrbios relacionados com o estreitamento, contracção ou oclusão de vasos sanguíneos, tal como restenose, também estão implicados e podem ser tratados ou prevenidos pelos métodos aqui divulgados. Os distúrbios fibróticos referem-se à formação anómala de matrizes extracelulares. Os exemplos de distúrbios fibróticos incluem cirrose hepática e distúrbios proliferativos celulares mesangiais. A cirrose hepática é caracterizada pelo aumento nos constituintes de matriz extracelular, resultando na formação de uma cicatriz hepática. Uma matriz extracelular aumentada resultando numa cicatriz hepática também pode ser causada por uma infecção virai, tal como hepatite. Os lipócitos parecem desempenhar um papel principal na cirrose hepática. Outros distúrbios fibróticos implicados incluem aterosclerose.

Proc .

Nat 1.

Acad.

Sei. USA, 29

Os distúrbios proliferativos celulares mesangiais referem-se a distúrbios provocados por proliferação anómala de células mesangiais. Os distúrbios proliferativos mesangiais incluem diversas doenças renais humanas, tais como glomerulonefrite, nefropatia diabética e nefroesclerose maligna, assim como distúrbios, tais como sindromes de microangiopatia trombótica, rejeição de transplante e glomerulopatias. 0 PDGFR de RTK foi implicado na manutenção da proliferação celular mesangial. Floege et al., 1993, Kidney International 43:47S-54S.

Muitos cancros são distúrbios proliferativos celulares e, como notado anteriormente, as PK foram associadas a distúrbios proliferativos celulares. Deste modo, não é surpreendente gue as PK tal como, por exemplo, membros da família de RTK, tivessem sido associadas ao desenvolvimento do cancro. Alguns destes receptores, como EGFR (Tuzi et al., 1991, Br. J. Câncer 63:227-233, Torp et al., 1992, APMIS 100:713-719) HER2/neu (Slamon et al., 1989, Science 244:707-712) e PDGF-R (Kumabe et al., 1992, Oncogene, 7:627-633) são sobreexpressos em muitos tumores e/ou persistentemente activados por ciclos autócrinos. De facto, nos cancros mais comuns e graves, estas sobreexpressões de receptor (Akbasak e Suner-Akbasak et al., 1992, J. Neurol. Sei., 111:119-133, Dickson et al., 1992, Câncer Treatment Res. 61:249-273, Korc et al., 1992, J. Clin. Invest. 90:1352-1360) e ciclos autócrinos (Lee e Donoghue, 1992, J. Cell. Biol., 118 : 1057-1070, Korc et al., supra, Akbasak e Suner-Akbasak et al., supra) foram demonstrados. Por exemplo, o EGFR foi associado a carcinoma espinocelular, astrocitoma, glioblastoma, cancro da cabeça e pescoço, cancro do pulmão e cancro da bexiga. O HER2 foi associado a cancro da mama, dos ovários, gástrico, pulmonar, pancreático e da bexiga. O PDGFR foi associado a glioblastoma e melanoma, assim como cancro 30 pulmonar, ovariano e prostático. 0 c-met de RTK também foi associado à formação de tumor maligno. Por exemplo, o c-met foi associado a, entre outros cancros, colorrectal, tiróide, pancreático, gástrico e carcinomas hepatocelulares e linfornas. Além disso, o c-met foi ligado a leucemia. A sobreexpressão do gene de c-met também foi detectada em doentes com doença de Hodgkin e doença de Burkitt. 0 IGF-IR, além de estar implicado no suporte nutricional e na diabetes tipo II, também foi associado a vários tipos de cancros. Por exemplo, o IGF-I foi implicado como um estimulador de crescimento autócrino para vários tipos de tumores, e. g., células de carcinoma de cancro da mama humano (Arteaga et al., 1989, J. Clin, Invest. 84:1418-1423) e células pequenas de tumor do pulmão (Macauley et al., 1990, Câncer Res., 50:2511-2517). Além disso, o IGF-I, embora integralmente envolvido no crescimento e diferenciação normais do sistema nervoso, também parece ser um estimulador autócrino de gliomas humanos. Sandberg-Nordqvist et al., 1993, Câncer Res. 53:2475-2478. A importância do IGF-IR e os seus ligandos na proliferação celular é ainda suportada pelo facto de que muitos tipos de células em cultura (fibroblastos, células epiteliais, células de músculo liso, linfócitos T, células mielóides, condrócitos e osteoblastos (as células estaminais da medula óssea)) são estimulados a crescerem por IGF-I. Goldring e Goldring, 1991, Eukaryotic Gene Exprespion, 1:301-326. Numa série de publicações recentes, Baserga sugere que o IGF-IR desempenha um papel central no mecanismo de transformação e, como tal, poderia ser um alvo preferido para intervenções terapêuticas para um largo espectro de malignidades humanas. Baserga, 1995, Câncer Res., 55:249-252, Baserga, 1994, Cell 79:927-930, Coppola et al., 1994, Mol. Cell. Biol., 14:4588-4595. 31

As STK foram implicadas em muitos tipos de cancro, incluindo, de um modo notável, cancro da mama (Cance, et ai., Int. J. Câncer, 54:571-77 (1993)). A associação entre actividade de PK anómala e doença não está restrita ao cancro. Por exemplo, as RTK foram associadas a doenças, tais como psoriase, diabetes mellitus, endometriose, angiogénese, desenvolvimento de placa ateromatosa, doença de Alzheimer, doença de von Hippel-Lindau, hiperproliferação epidérmica, doenças neurodegenerativas, degenerescência macular e hemangiomas relacionados com a idade. Por exemplo, o EGFR foi indicado na cicatrização corneana e dérmica. Os defeitos em insulina-R e IGF-1R são indicados na diabetes mellitus tipo II. Uma correlação mais completa entre RTK especificas e as suas indicações terapêuticas é apresentada em Plowman et al., 1994, DN&P 7:334-339.

Como notado anteriormente, não apenas as RTK mas as CTK, incluindo mas não limitadas a, src, abl, fps, yes, fyn, lyn, lck, blk, hck, fgr e yrk (revisto por Bolen et al. , 1992, FASEB J. , 6:3403-3409) estão envolvidas na via de transdução de sinal proliferativa e metabólica e, deste modo, poderia ser esperado, e foi mostrado, as quais estão envolvidas em muitos distúrbios mediados por PTK a que a presente divulgação é dirigida. Por exemplo, mostrou-se que o src mutado (v-src) era uma oncoproteina (pp60v_arc) em galinhas. Além disso, o seu homólogo celular, o proto-oncogene pp60c_arc transmite sinais oncogénicos de muitos receptores. A sobreexpressão de EGFR ou HER2/neu em tumores conduz à activação constitutiva de pp60c arc, que é caracteristica de células malignas, mas ausente em células normais. Por outro lado, os murganhos deficientes na expressão de c-src apresentam um fenótipo osteopetrótico, indicando uma 32 participação chave de c-src na função de osteoclasto e um possível envolvimento em distúrbios relacionados.

De modo semelhante, o Zap70 foi implicado na sinalização de célula T que pode relacionar-se com distúrbios auto-imunes.

As STK foram associadas a inflamação, doença auto-imune, imunorrespostas e distúrbios de hiperproliferação, tais como restenose, fibrose, psoríase, osteoartrite e artrite reumatóide.

As PK também foram implicadas na implantação de embrião. Deste modo, os compostos desta invenção podem proporcionar um método eficaz de prevenir essa implantação de embrião e, desse modo, serem úteis como agentes de controlo da natalidade.

Finalmente, suspeita-se actualmente que as RTK e CTK estejam envolvidas em distúrbios hiperimunes.

Os compostos e dados apresentados nas Tabelas e Exemplos não podem ser considerados como limitando absolutamente de qualquer modo desta invenção.

3. COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS E UTILIZAÇÃO

Um composto da presente invenção ou um sal fisiologicamente aceitável do composto, pode ser administrado como tal a um doente humano ou pode ser administrado em composições farmacêuticas, nas quais os materiais anteriores são misturados com veículos ou excipiente(s) adequados. As técnicas para formulação e administração de fármacos podem ser consultadas em 33 "Remington's Pharmacological Sciences", Mack Publishing Co. Easton, PA, última edição.

Vias de administração.

Como aqui utilizado, "administrar" ou "administração" referem-se à distribuição de um composto ou sal da presente divulgação ou de uma composição farmacêutica contendo um composto ou sal desta divulgação, a um organismo para os efeitos de tratamento de um distúrbio relacionado com PK.

As vias de administração adequadas podem incluir, sem limitação, administração oral, rectal, transmucosal ou intestinal ou injecções intramuscular, subcutânea, intramedular, intratecal, intraventricular directa, intravenosa, intravitrea, intraperitoneal, intranasal ou intra-ocular. A via de administração reivindicada é oral.

Além disso, pode-se administrar o fármaco num sistema de distribuição direccionada de fármacos, num lipossoma revestido com anticorpo específico de tumor. Os lipossomas serão direccionados e capturados selectivamente pelo tumor.

Composição/Formulação.

As composições farmacêuticas da presente divulgação podem ser preparadas por processos bem conhecidos na técnica, e. g., por meio de processos convencionais de mistura, dissolução, granulação, preparação de drageias, levigação, emulsificação, encapsulação, aprisionamento ou liofilização. 34

As composições farmacêuticas para utilizar de acordo com a presente invenção podem ser formuladas de modo convencional, utilizando um ou mais veículos fisiologicamente aceitáveis compreendendo excipientes e auxiliares que facilitam o processamento dos compostos activos em preparações que podem ser utilizadas farmaceuticamente. A formulação apropriada está dependente da via de administração escolhida.

Para administração oral, os compostos podem ser formulados pela combinação dos compostos activos com veículos farmaceuticamente aceitáveis, bem conhecidos na técnica. Esses veículos possibilitam que os compostos da invenção sejam formulados como comprimidos, pílulas, pastilhas, drageias, cápsulas, líquidos, géis, xaropes, pastas, suspensões e semelhantes, para ingestão oral por um doente. As preparações farmacêuticas para utilização oral podem ser preparadas utilizando um excipiente sólido, opcionalmente triturando a mistura resultante e processando a mistura de grânulos, após adição de outros auxiliares adequados, se desejado, para se obterem núcleos de comprimidos ou drageias. Os excipientes úteis são, em particular, espessantes, tal como açúcar, incluindo lactose, sacarose, manitol ou sorbitol, preparações de celulose, tais como, por exemplo, amido de milho, amido de trigo, amido de arroz e amido de batata e outros materiais, tais como gelatina, goma-tragacanto, metilcelulose, hidroxipropilmetilcelulose, carboximetilcelulose de sódio e/ou polivinilpirrolidona (PVP). Se desejado, podem ser adicionados agentes desagregantes, tais como polivinilpirrolidona reticulada, ágar ou ácido algínico. Um sal, tal como alginato de sódio, também pode ser utilizado. 35

Os núcleos de drageia são proporcionados com revestimentos adequados. Para este efeito, podem ser utilizadas soluções concentradas de açúcar que podem, opcionalmente, conter goma-arábica, talco, polivinilpirrolidona, gel de carbopol, polietilenoglicol e/ou dióxido de titânio, soluções de lacas e solventes orgânicos ou misturas de solventes adequados. Podem ser adicionados agentes corantes ou pigmentos aos revestimentos de comprimidos ou drageias, para identificação ou para caracterizar diferentes combinações de doses de composto activo.

As composições farmacêuticas que podem ser utilizadas oralmente incluem cápsulas de ajustamento deslizante, compostas por gelatina, assim como cápsulas moles, seladas, compostas por gelatina e um plastificante, tais como glicerol ou sorbitol. As cápsulas de ajustamento deslizante podem conter os ingredientes activos em mistura com um espessante, tal como lactose, um aglutinante, tal como amido e/ou um lubrificante, tais como talco ou estearato de magnésio e, opcionalmente, estabilizantes. Em cápsulas moles, os compostos activos podem ser dissolvidos ou suspensos em líquidos adequados, tais como óleos gordos, parafina líquida ou polietilenoglicóis líquidos. Os estabilizantes também podem ser adicionados nestas formulações.

Um exemplo não limitativo de um veículo farmacêutico para os compostos hidrófobos da invenção é um sistema co-solvente compreendendo álcool benzílico, um surfactante não polar, um polímero orgânico miscível em água e uma fase aquosa, tal como o sistema de co-solvente de VPD. 0 VPD é uma solução de álcool benzílico a 3%, p/v, do surfactante não polar Polissorbato 80™ e polietilenoglicol 300 a 65%, p/v, perfeita para volume em álcool absoluto. O sistema de co-solvente de VPD (VPD:D5W) consiste em VPD diluído 1:1 com uma solução de dextrose a 5% em água. Este 36 sistema de co-solvente dissolve bem compostos hidrófobos e produz, por si só, baixa toxicidade após administração sistémica. Naturalmente, as proporções desse sistema co-solvente podem ser consideravelmente variadas, sem destruir as suas caracteristicas de solubilidade e toxicidade. Além disso, a identidade dos componentes do co-solvente podem ser variadas: por exemplo, outros surfactantes não polares de baixa toxicidade podem ser utilizados em vez do Polissorbato 80™, o tamanho de fracção do polietilenoglicol pode ser variado, outros polímeros biocompatíveis podem substituir o polietilenoglicol, e. g., polivinilpirrolidona e outros açúcares ou polissacáridos podem substituir para dextrose.

Alternativamente, podem ser empregues outros sistemas de distribuição para compostos farmacêuticos hidrófobos. Os lipossomas e emulsões são exemplos bem conhecidos de transportadores de distribuição ou veículos para grupos hidrófobos. Além disso, determinados solventes orgânicos, tal como dimetilssulfóxido, também podem ser empregues, embora frequentemente à custa de maior toxicidade.

Além disso, os compostos podem ser distribuídos utilizando um sistema de libertação prolongada, tal como matrizes semipermeáveis de polímeros hidrófobos sólidos contendo o agente terapêutico. Vários materiais de libertação prolongada foram estabelecidos e são bem conhecidos dos especialistas na técnica. As cápsulas de libertação prolongada podem, dependendo da sua natureza química, libertar os compostos durante algumas semanas até mais de 100 dias. Dependendo da natureza química e da estabilidade biológica do reagente terapêutico, podem ser empregues estratégias adicionais para estabilização de proteína. 37

As presentes composições farmacêuticas também podem compreender veículos ou excipientes de fase sólida ou gel adequados. Os exemplos desses veículos ou excipientes incluem mas não estão limitados a carbonato de cálcio, fosfato de cálcio, diversos açúcares, amidos, derivados de celulose, gelatina e polímeros, tal como polietilenoglicóis.

Muitos dos compostos de modulação de PK aqui divulgados podem ser proporcionados como sais fisiologicamente aceitáveis, em que o composto reivindicado pode formar a espécie carregada negativamente ou positivamente. Os exemplos de sais nos quais o composto forma a fracção carregada positivamente incluem, sem limitação, amónio quaternário (aqui definido em qualquer outra parte), sais, tais como o cloridrato, sulfato, carbonato, lactato, tartarato, maleato, succinato, em que o átomo de azoto do grupo de amónio quaternário é um azoto do composto seleccionado desta divulgação que reagiu com o ácido apropriado. Os sais nos quais um composto desta invenção forma a espécie carregada negativamente incluem, sem limitação, os sais de sódio, potássio, cálcio e magnésio, formados pela reacção de um grupo de ácido carboxílico no composto com uma base apropriada (e. g., hidróxido de sódio (NaOH), hidróxido de potássio (KOH), hidróxido de cálcio (Ca(OH)2), etc.).

Dosagem.

As composições farmacêuticas adequadas para utilização na presente invenção incluem composições em que os ingredientes activos estão contidos numa quantidade eficaz para alcançar a finalidade pretendida, i. e., a modulação da actividade de PK ou o tratamento ou prevenção de um distúrbio relacionado com PK. 38

Mais especificamente, uma quantidade terapeuticamente eficaz significa uma quantidade de composto eficaz para prevenir, aliviar ou melhorar os sintomas da doença ou prolongar a sobrevivência do indivíduo a ser tratado. A determinação de uma quantidade terapeuticamente eficaz está bem dentro da capacidade dos especialistas na técnica, especialmente à luz da divulgação detalhada aqui proporcionada.

Para qualquer composto utilizado de acordo com a invenção, a quantidade ou dose terapeuticamente eficaz pode ser inicialmente estimada a partir de ensaios de cultura celular. Depois, a dosagem pode ser formulada para utilização em modelos animais, de modo a alcançar-se uma gama de concentrações em circulação que inclui a IC50/· como determinado em cultura celular (i. e., a concentração do composto de teste que alcança uma inibição semi-máxima da actividade de PK) . Essa informação pode ser, depois, utilizada para determinar com mais rigor as doses úteis em humanos. A toxicidade e eficácia terapêutica dos compostos aqui descritos podem ser determinadas por processos farmacêuticos padrão em culturas celulares ou animais experimentais, e. g., pela determinação da IC5o e da LD50 (sendo ambas aqui discutidas em qualquer outra parte) num composto submetido. Os dados obtidos destes ensaios de cultura celular e estudos animais podem ser utilizados na formulação de uma gama de dosagens para utilização em humanos. A dosagem pode variar, dependendo da forma de dosagem empregue e da via de administração utilizada. A formulação, via de administração e dosagem exactas podem ser escolhidas pelo próprio médico, em vista do estado do doente. 39 (Ver, e. g., Fingi, et al., 1975, em "The Pharmacological Basis of Therapeutics", Cap. 1 p. 1). A quantidade e intervalo de dosagem podem ser ajustados individualmente, para proporcionar niveis plasmáticos da espécie activa que sejam suficientes para manter os efeitos de modulação de cinase. Estes niveis plasmáticos são referidos como concentrações mínimas eficazes (MEC). A MEC variará para cada composto, mas pode ser estimada a partir de dados in vitro; e. g., a concentração necessária para alcançar 50-90% de inibição de uma cinase pode ser verificada utilizando os ensaios aqui descritos. As dosagens necessárias para alcançar a MEC dependerão de características individuais e via de administração. Os ensaios de HPLC ou bioensaios podem ser utilizados para determinar concentrações plasmáticas.

Os intervalos de dosagem também podem ser determinados utilizando o valor de MEC. Os compostos devem ser administrados utilizando um regime que mantenha níveis plasmáticos acima da MEC durante 10-90% do tempo, de um modo preferido entre 30-90% e, de um modo muito preferido, entre 50-90%.

Nos casos de administração local ou toma selectiva, a concentração local eficaz do fármaco pode não estar relacionada com a concentração plasmática e podem ser empregues outros processos conhecidos na técnica para determinar a quantidade e intervalo de dosagem correctos. A quantidade de uma composição administrada irá, certamente, estar dependente do indivíduo a ser tratado, da gravidade da daença, do modo de administração, do parecer do médico que prescreve, etc. 40

Embalagem.

As composições podem, se desejado, ser apresentadas numa embalagem ou mecanismo doseador, tal como um kit aprovado pela FDA, o qual pode conter uma ou mais formas de dosagem unitárias contendo o ingrediente activo. A embalagem pode, por exemplo, compreender folha de plástico ou metal, tal como uma embalagem blister. A embalagem ou dispositivo doseador podem estar acompanhados por instruções para administração. A embalagem ou doseador também podem estar acompanhados por uma comunicação associada ao recipiente, numa forma prescrita por uma agência governamental regulando a preparação, utilização ou venda de medicamentos, cuja comunicação é susceptível de ser aprovada pela agência da forma das composições ou da administração humana ou veterinária. Essa comunicação, por exemplo, pode ser a comunicação aprovada pela U.S. Food and Drug Administration para prescrição de fármacos ou um folheto informativo de produto aprovado. As composições compreendendo um composto como aqui descrito, formulado num veículo farmacêutico compatível, também podem ser preparadas, colocadas num recipiente apropriado e rotuladas para tratamento de um estado indicado. Os estados adequados indicados no rótulo podem incluir tratamento de um tumor, inibição de angiogénese, tratamento de fibrose, diabetes e semelhantes.

4. SÍNTESE 0 composto desta invenção, assim como o precursor 2-oxindoles e aldeídos, podem ser facilmente sintetizados utilizando técnicas bem conhecidas nas técnicas químicas. Será 41 entendido pelos especialistas na técnica que estão disponíveis outras vias sintéticas para formação do composto da invenção e que o seguinte é oferecido a título exemplificativo e não de limitação. A. Processo sintético geral. A seguinte metodologia geral pode ser empregue para preparar o composto desta invenção: 0 2-oxindole apropriadamente substituído (1 equiv.), o aldeído apropriadamente substituído (1,2 equiv.) e piperidina (0,1 equiv.) são misturados com etanol (2-oxindole a 1-2 mL/mmol) e a mistura é, depois, aquecida a 90 °C, durante 3a 5 horas. Após arrefecimento, a mistura reaccional é concentrada e acidificada a pH 3. 0 precipitado que se forma é filtrado, lavado com água para pH 7 e, depois, etanol frio, acetato de etilo e/ou hexano e seco a vácuo, para produzir o composto alvo. O produto pode, opcionalmente, ser ainda purificado por cromatografia. B. Exemplos - Síntese de 2-indolinona substituída com pirrole.

As seguintes sínteses do composto desta divulgação são mostradas apenas a título exemplificativo e não podem ser consideradas como limitando o âmbito desta invenção quanto à abordagem sintética. 42

Exemplo 1 Ácido 3—[2,4—Dimetil—5—(2—oxo—1,2—di—hidroindol—3— ilidenometil)-lH-pirrol-3-il]-propiónico 2,4-Dimetil-5-etoxicarbonil-3-(2-etoxicarboniletil)-pirrole (1,07 kg) e 3,2 L de hidróxido de sódio a 5 N foram agitados mecanicamente, num frasco de fundo redondo de três tubuladuras de 12 L, equipado com um condensador de refluxo e um funil de adição e aquecido num banho de óleo. A mistura foi submetida a refluxo, durante 3 horas, tempo após o qual a temperatura interna foi 96 °C, todos os sólidos foram dissolvidos e a cromatografia de camada fina mostrou que a hidrólise foi completa. O banho de aquecimento foi removido e a mistura arrefecida a 50 °C em banho-maria. Ácido clorídrico a 12 N (~1,3 L) foi lentamente adicionado. Depois de cerca de 50% do ácido ter sido adicionado, começou a evolução de gás e a temperatura atingiu 60 °C. À medida que mais ácido foi adicionado, a evolução de gás aumentou e formou-se um precipitado amarelo. O pH final foi ajustado para 3,5 com ácido clorídrico. A mistura foi arrefecida num banho de gelo a 8 °C. Os sólidos foram recolhidos por filtração a vácuo, lavados duas vezes com 0,5 L de água destilada e secos, durante 48 horas, numa estufa a vácuo, a 55-60 °C, para proporcionar 677 g (rendimento de 101%) de 3-(2-carboxietil)-2,4-dimetilpirrole. RMN de XH (d6-DMSO) δ 11, 9 (s, 1H, COOH) , 9,9(s, 1H, NH) , 6,2 (s, 1H, aromático), 2,5 (t, 2H, CH2) , 2,2 (t, 2H, CH2) , 2,0 (s, 3H, CH3), 1,9 (s, 3H, CH3) ; P.F. 134-136 °C.

Dimetilformamida (28,5 g) , em 250 mL de diclorometano, num frasco de fundo redondo de três tubuladuras de 1 L, equipado com 43 agitação magnética, um termómetro e um funil de gotejamento, foi arrefecida num banho de sal-gelo a -1 °C. Oxicloreto de fósforo (59,3 g) foi colocado no funil de gotejamento e lentamente adicionado à mistura reaccional. 0 funil foi lavado com 25 mL de diclorometano para garantir todo o oxicloreto de fósforo. A temperatura máxima atingida pela mistura foi 5 °C. A mistura foi agitada durante 15 minutos, momento em que a temperatura foi -3 °C. Foi adicionado em porções 3-(2-carboxietil)-2,4-dimetilpirrole (32,6 g) sólido, ao longo de 15 minutos. A temperatura máxima atingida pela mistura foi 7 °C. A mistura negra avermelhada foi agitada, durante mais 30 minutos e, depois, aquecida a refluxo, durante 1 hora. A mistura foi arrefecida a 15 °C e foram adicionados 300 mL de água, conduzindo a uma vigorosa reacção, durante a qual a temperatura aumentou. A mistura foi agitada e arrefecida a 22 °C e as camadas foram separadas e guardadas. A camada orgânica foi extraída com 100 mL de água e as camadas aquosas combinadas e lavadas com 50 mL de diclorometano. As camadas orgânicas foram descartadas. A camada aquosa foi ajustada a pH 11 com -180 mL de hidróxido de sódio a 10 N. A temperatura aumentou a 40 °C. A mistura foi agitada durante 30 minutos, momento em que a temperatura foi 27 °C. A mistura foi acidificada para pH 2 com -120 mL de ácido clorídrico a 10 N que aumentou a temperatura para 30 °C. Foi adicionado acetato de etilo (150 mL) e a mistura foi agitada para extrair o produto. Durante a agitação, uma quantidade considerável de sólido negro surgiu por cima da camada de água. A camada de acetato de etilo foi separada e a camada aquosa e sólido foram extraídos duas vezes com 100 mL de acetato de etilo. O sólido ainda presente foi recolhido por filtração a vácuo, lavado exaustivamente com água e seco sob vácuo, a 40 °C, para proporcionar 12 g (rendimento de 31%) de 3-(2-carboxietil)-2,4-dimetil-5-formilpirrole, como um sólido 44 negro acastanhado. A cromatografia de camada fina (diclorometano:ácido acético, 95:5, sílica gel) mostrou um ponto de Rf a 0,7 e um ponto colorido na origem. As camadas de acetato de etilo foram combinadas, secas sobre sulfato de sódio anidro e evaporadas até um sólido negro acastanhado que foi seco sob vácuo, a 40 °C, para proporcionar 21 g (rendimento de 55%, rendimento total de 86%) de 3-(2-carboxietil)-2,4-dimetil-5-formilpirrole, idêntico em aparência ao sólido anterior por cromatografia de camada fina.

Alternativamente, dimetilformamida (124 mL) , em 750 mL de diclorometano, num frasco de fundo redondo de três tubuladuras de 5 L, equipado com agitação mecânica, um termómetro e um funil de gotejamento, foi arrefecida num banho de gelo-sal a -9 °C. Foi adicionado oxicloreto de fósforo (114 mL) , rapidamente, por meio do funil de gotejamento que foi lavado na mistura reaccional com 50 mL de diclorometano. A temperatura máxima atingida pela mistura foi -4 °C. 3-(2-carboxietil)-2, 4- dimetilpirrole (133,6 g) sólido foi adicionado em porções, ao longo de 20 minutos. A temperatura máxima atingida pela mistura foi 3 °C. A mistura avermelhada escura foi aquecida a refluxo, durante 1 minuto e, depois, arrefecida a -1 °C. A mistura foi arrefecida a 1 °C e 800 mL de água gelada foram rapidamente adicionados. A temperatura máxima atingida foi 15 °C. A camada orgânica foi separada e descartada. A camada aquosa foi lentamente ajustada a pH 12 - 13, com 800 mL de hidróxido de potássio a 10 N, adicionando gelo a controlar a temperatura. A temperatura aumentou a 37 °C. A mistura foi agitada, durante 90 minutos, à temperatura ambiente, momento em que a cromatografia de camada fina mostrou apenas um vestígio de material de cor clara na origem, com o produto com Rf a 0,3. A mistura foi arrefecida a 0 °C. A mistura foi acidificada para 45 ρΗ 3 com -600 mL de ácido clorídrico a 10 N, o gelo sendo adicionado para controlar a temperatura. A temperatura máxima atingida foi 10 °C. A mistura foi agitada, durante 1 hora, no frio. O sólido foi recolhido por filtração a vácuo, lavado 4 vezes com 100 mL de água e seco sob vácuo, a 50 - 60 °C, para proporcionar 140,6 g (rendimento de 90%) de 3-(2-carboxietil)-2,4-dimetil-5-formilpirrole, como um sólido castanho. RMN de ΤΗ (de-DMSO) : δ 12,0(s, 1H, COOH) , 11,3 (s, 1H, NH) , 9,4 (s, 1H, CHO), 2,6 (t, 2H, CH2) , 2,3 (t, 2H, CH2), 2,2 (s, 3H, CH3), 2, 1 (s, 3H, CH3) . P.F. 145-147 °C. 3-(2-Carboxietil)-2,4-dimetil-5-formilpirrole (18,2 g) e 11,7 g de 2-oxindole foram dissolvidos em 100 mL de etanol, pelo aquecimento num frasco de fundo redondo de 250 mL, equipado com um agitador magnético e um condensador de refluxo, num banho de óleo. A pirrolidina (7,0 g) foi adicionada e a mistura reaccional foi submetida a refluxo, durante 2 horas, momento em que uma grande quantidade de sólido castanho-negro estava presente. A cromatografia de camada fina (acetato de etilo:etanol:ácido acético 96:2:2, sílica-gel) mostrou a ausência do material de partida oxindole. Oito mL de ácido acético foram adicionados e a mistura submetida a refluxo, durante 15 minutos. A mistura espessa foi diluída com 50 mL de etanol e arrefecida a 10 °C. O sólido foi recolhido por filtração a vácuo e lavado com 50 mL de etanol. O sólido foi agitado em 125 mL de etanol a refluxo, durante 10 minutos, arrefecido a 10 °C, recolhido por filtração a vácuo e lavado com 50 mL de etanol. 0 produto foi seco, de um dia para o outro, a 45 °C, sob vácuo, para proporcionar 25,5 g (rendimento de 88%) de 3-[ 2,4-dimetil-3-(2-carboxietil) pirrol-5-metilidenil]-2- indolinona, como um sólido cor de laranja. 46

Alternativamente, uma mistura de ácido 3-(5-formil-2,4-dimetil-lH-pirrol-3-il)-propiónico (10 g, 51 mmol), 2-oxindole (6,5 g, 49 mmol) e hidróxido de sódio (40 g, 58 mmol) dissolvida em 50 mL de água foi agitada, a 50 °C, durante 4 horas. A mistura reaccional foi arrefecida à temperatura ambiente, filtrada e o filtrado acidificado a pH 3 com ácido clorídrico a 12 N. O sólido que precipitou foi recolhido por filtração a vácuo, lavado com 10 mL de água e seco sob vácuo, de um dia para o outro. A pasta sólida em bruto foi lavada com etanol quente, duas vezes. O sólido foi, depois, recolhido por filtração a vácuo, lavado com 10 mL de etanol e seco, sob vácuo, para proporcionar 13,8 g (91%) de ácido 3-[2,4-dimetil-5-(2-oxo-l, 2-di-hidro-indol-3-ilidenometil)-lH-pirrol-3-il]-propiónico. RMN de ΧΗ (360 MHz, DMSO-d6): δ 13,38 (s, br, 1H, NH-1'), 12,05 (s, br, 1H, COOH), 10, 70 (s, br, 1H, NH-1), 7,69 (d, J = 7,39 Hz, 1H, H-4) , 7,53 (s, 1H, H-vinilo), 7,06 (t, J = 7,39 Hz, 1H, H-6), 6, 95 (t, j = 7,39 Hz, 1H, H-5), 6, 85 (d, J= 7,39 Hz, 1H, H-7), 2,63 (t, J= 7,45 Hz, 2H, CH2CH2COOH) , 2,34 (t, J= 7,45 Hz, 2H, CH2CH2COOH) , 2,28 (s, 3H, CH3), 2,24 (s, 3H, CH3) ; MS m/z (intensidade relativa, %) 311 ([M+l]+, 100).

5. AVALIAÇÃO BIOLÓGICA

Será entendido que, em qualquer determinada série de compostos, será proporcionado um espectro de actividade biológica. Nas suas formas de realização presentemente preferidas, esta divulgação refere-se a uma 2-indolinona substituída com pirrole, demonstrando a capacidade de modular a actividade de RTK, CTK e STK. Os seguintes ensaios são, em 47 geral, empregues para seleccionar os compostos demonstrando o grau óptimo da actividade desejada. A. Processos de Ensaio.

Os seguintes ensaios in vitro podem ser utilizados para determinar o nivel de actividade e efeito dos compostos da presente invenção em uma ou mais das PK. Ensaios semelhantes podem ser concebidos em conjunto com as mesmas linhas para qualquer PK utilizando técnicas bem conhecidas no campo técnico.

Os ensaios celulares/catalíticos aqui descritos são realizados num formato de ELISA. 0 processo geral é como se segue: um composto é introduzido em células expressando a cinase de teste, naturalmente ou recombinantemente, durante um período de tempo seleccionado, após o qual, se a cinase de teste for um receptor, é adicionado um ligando conhecido por activar o receptor.

As células são lisadas e o lisado é transferido para os poços de uma placa de ELISA, previamente revestida com um anticorpo específico reconhecendo o substrato da reacção de fosforilação enzimática. Os componentes de não substrato do lisado celular são removidos por lavagem e a quantidade de fosforilação no substrato é detectada com um anticorpo reconhecendo especificamente a fosfotirosina, em comparação com células controlo que não foram colocadas em contacto com um composto de teste. Os ensaios celulares/biológicos aqui descritos medem a quantidade de ADN produzida em resposta à activação de uma cinase de teste, a qual é uma medida geral de uma resposta proliferativa. 0 processo geral para este ensaio é 48 como se segue: um composto é introduzido em células expressando a cinase de teste, naturalmente ou recombinantemente, durante um período de tempo seleccionado, após o qual, se a cinase de teste for um receptor, é adicionado um ligando conhecido por activar o receptor. Após incubação, pelo menos, de um dia para o outro, é adicionado um reagente de marcação de ADN, tal como Bromodesoxiuridina (BrdU) ou 3H-timidina. A quantidade de ADN marcado é detectada com um anticorpo anti-BrdU ou pela medição da radioactividade e é comparada a células controlo que não contactaram com um composto de teste.

Ensaios Celulares/Catalíticos

Os ensaios de imunoabsorção enzimática (ELISA) podem ser utilizados para detectar e medir a presença de actividade de PK. 0 ELISA pode ser conduzido de acordo com protocolos conhecidos que são descritos, por exemplo, em Voller, et al., 1980, "Enzyme-Linked Immunosorbent Assay", Em: Manual of Clinicai Immunology, 2a ed., editado por Rose and Friedman, p. 359-371 Am. Soc. Of Microbiology, Washington, D.C. O protocolo divulgado pode ser adaptado para determinar a actividade em relação a uma PK específica. Ou seja, os protocolos preferidos para conduzir as experiências de ELISA para PK específicas, são proporcionados abaixo. Contudo, a adaptação destes protocolos para determinar a actividade de um composto para outros membros da família de RTK, assim como para CTK e STK, está bem dentro do âmbito do conhecimento dos especialistas na técnica. 49

Ensaio de FLK-1 É conduzido um ensaio de ELISA para medir a actividade de cinase do receptor de FLK-1 e, mais especificamente, a inibição ou activação da actividade de TK no receptor de FLK-1. Especificamente, o seguinte ensaio pode ser conduzido para medir a actividade de cinase do receptor de FLK-1 em células geneticamente manipuladas para expressar Flk-1.

Materiais e Reagentes. a. Placas de ELISA de 96 poços Corning (Catálogo Corning N° 25805-96), b. IgG de cabra anti-coelho Cappel (Catálogo N° 55641), c. PBS (Catálogo Gibco N° 450-1300EB), d. Tampão de TBSW (Tris a 50 mM (pH 7,2), NaCl a 150 mM e Tween-20 a 0,1%), e. Stock de etanolamina (etanolamina a 10% (pH 7,0), armazenado a 4 °C) , f. Tampão de HNTG (tampão de HEPES a 20 mM (pH 7,5), NaCl a 150 mM, Triton X-100 a 0,2% e glicerol a 10%), g. EDTA (0,5 M (pH 7,0), como um stock a 100X), h. Ortovanadato de sódio (0,5 M, como um stock a 100X), 50 i. Pirofosfato de sódio (0,2 M, como um stock a 100X), ii. j. Placas de polipropileno de fundo em V de 96 poços NUNC (Catálogo Applied Scientific N° AS-72092), k. Células NIH3T3 C7N° 3 (células expressando FLK-1), l. DMEM com L-Glutamina de elevado teor de glucose a lx (catálogo N° 11965-050), m. FBS, Gibco (catálogo N° 16000-028), n. L-glutamina, Gibco (catálogo N° 25030-016), o. VEGF, PeproTech, Inc. (catálogo N° 100-20) (mantido como stock a 1 pg/100 yL em dfbO Milli-Q e armazenado a -20 °C, p. Anti-soro anti-FLK-1 purificado por afinidade, q. Anticorpo monoclonal UB40 específico para fosfotirosina (ver Fendley, et al., 1990, Câncer Research 50:1550-1558), r. IgG-POD de Cabra anti-murganho de grau EIA (catálogo BioRad N° 172-1011), s. Solução de ácido 2,2-azino-bis(3-etilbenz-tiazolino-6-sulfónico (ABTS) (ácido cítrico a 100 mM (anidro), Na2HPC>4 a 250 mM (pH 4,0), ABTS a 0,5 mg/mL (catálogo Sigma N° A-1888)), a solução deve ser armazenada no escuro, a 4 °C, até estar pronta para utilização, t. H2O2 (solução a 30%) (catálogo Fisher N° H325), 51 u. ABTS/H202 (15 mL de solução de ABTS, 2 pL de H202), preparada 5 minutos antes de utilização e deixada à temperatura ambiente, v. Stock de HC1 a 0,2 M em H20, w. dimetilsulfóxido (100%) (Catálogo Sigma N° D-8418) e y. Tripsina-EDTA (Catálogo Gibco BRL N° 25200-049).

Protocolo. 1. Revestir placas de ELISA de 96 poços Corning com 1,0 pg por poço de anticorpo IgG Anti-coelho Cappel em Na2C03 a 0,1 M, pH 9,6. Perfazer o volume final para 150 pL por poço. Revestir as placas, de um dia para o outro, a 4 °C. Quando armazenadas a 4 °C, as placas podem ser mantidas até duas semanas. 2. Cultivar as células em Meios de Crescimento (DMEM, suplementado com L-Glutamina a 2,0 mM, FBS a 10%), em placas de cultura adequadas até à confluência, a 37 °C, C02 a 5%. 3. Recolher as células por tripsinização e semear em placas de células de fundo redondo de 96 poços Corning 25850, 25000 células/poço em 200 pL de meios de crescimento. 4. Cultivar as células, pelo menos, um dia a 37 °C, C02 a 5%. 5. Lavar as células com D-PBS a IX. 52 6. Adicionar 200 pL/poço de meios de inanição (DMEM, 1-Glutamina a 2,0 mM, FBS a 0,1%). Incubar, de um dia para o outro, a 37 °C, CO2 a 5%. 7. Diluir os Compostos 1:20 em placas de 96 poços de polipropileno, utilizando meios de inanição. Diluir o dimetilsulfóxido 1:20, para utilização em poços de controlo. 8. Remover os meios de inanição das placas de cultura celular de 96 poços e adicionar 162 pL de meios de inanição frescos a cada poço. 9. Adicionar 18 pL de diluição de composto diluído 1:20 (da etapa 7) a cada poço, mais a diluição de dimetilsulfóxido a 1:20 aos poços de controlo (+/- VEGF), para uma diluição final de 1:200, após estimulação celular. O dimetilsulfóxido final é 0,5%. Incubar a placa a 37 °C, CO2 a 5%, durante duas horas. 10. Remover anticorpo não ligado das placas de ELISA, pela inversão da placa para remover o líquido. Lavar 3 vezes com TBSW + etanolamina a 0,5%, pH 7,0. Bater a placa num toalhete de papel para remover o liquido e bolhas em excesso. 11. Bloquear as placas com TBSW + etanolamina 3. 0,5%, PH 7,0, 150 pL por poço. Incubar a placa trinta minutos, agitando simultaneamente num agitador de placas de microtitulação. 12. Lavar a placa 3 vezes, como descrito na etapa 10. 13. Adicionar 0,5 pg/poço de anti-soro de coelho policlonal anti-FLU-1 purificado por afinidade. Perfazer o volume final 53 para 150 pL/poço com TBSW + etanolamina a 0,5%, pH 7,0. Incubar a placa durante trinta minutos, agitando simultaneamente. 14. Adicionar 180 pL de meio de inanição às células e estimular as células com 20 pL/poço de ortovanadato de sódio a 10,0 mM e VEGF a 500 ng/mL (resultando numa concentração final de ortovanadato de sódio a 1,0 mM e VEGF a 50 ng/mL por poço), durante oito minutos, a 37 °C, CO2 a 5%. Os poços de controlo negativo recebem apenas meio de inanição. 15. Após oito minutos, os meios devem ser removidos das células e lavados, uma vez, com PBS a 200 pL/poço. 16. Lisar as células em HNTG a 150 pL/poço agitando, simultaneamente, à temperatura ambiente, durante cinco minutos. A formulação de HNTG inclui ortovanadato de sódio, pirofosfato de sódio e EDTA. 17. Lavar a placa de ELISA, três vezes, como descrito na etapa 10. 18. Transferir os lisados celulares da placa de células para placa de ELISA e incubar agitando, simultaneamente, durante duas horas. Para transferir o lisado celular, pipetar para cima e para baixo raspando, simultaneamente, os poços. 19. Lavar a placa, três vezes, como descrito na etapa 10. 20. Incubar a placa de ELISA com 0,02 pg/poço de UB40 em TBSW + etanolamina a 0,5%. Perfazer o volume final para 150 pL/poço. Incubar agitando, simultaneamente, durante 30 minutos. 54 21. Lavar a placa, três vezes, como descrito na etapa 10. 22. Incubar a placa de ELISA com IgG de cabra anti-murganho de grau EIA, diluído 1:10000, conjugado a peroxidase de rábano, em TBSW mais etanolamina a 0,5%, pH 7,0. Perfazer o volume final para 150 pL/poço. Incubar agitando, simultaneamente, durante trinta minutos. 23. Lavar a placa como descrito na etapa 10. 24. Adicionar 100 pL de solução de ABTS/H2O2 ao poço. Incubar dez minutos, agitando simultaneamente. 25. Adicionar 100 pL de HC1 a 0,2 M, para concentração final de HC1 a 0,1 M, para parar a reacção de desenvolvimento de cor. Agitar 1 minuto, à temperatura ambiente. Remover bolhas com corrente lenta de ar e ler a placa de ELISA num leitor de placas de ELISA a 410 nm.

Ensaio do Receptor Quimérico Receptor de EGF-HER2 Em Células Intactas. A actividade de cinase de HER2 em células EGFR-NIH3T3 intactas é medida como descrito abaixo:

Materiais e Reagentes. a. EGF: concentração de stock: 16,5 pM, EGF 201, TOYOBO, Co., Ltd. Japão. 55 b. 05-101 (UBI) (um anticorpo monoclonal reconhecendo um domínio extracelular de EGFR). c. Anticorpo anti-fosfotirosina (anti-Ptyr) (policlonal) (ver Fendley, et ai., supra). d. Anticorpo de detecção: IgG de cabra anti-coelho conjugado a peroxidase de rábano, TAGO, Inc., Burlingame, CA. e. Tampão de TBST:

Tris-HCl, pH 7,2 50 mM NaCl 150 mM Triton X-100 0,1 Stock de HNTG a 5X: HEPES i—1 O NaCl 0, 75 M Glicerol 50% Triton X-100 1,0% Stock de ABTS: Ácido Cítrico 100 mM Na2HP04 250 mM HC1, conc. 0,5 mM ABTS1 0,5 mg/mL 56 1 (ácido 2,2'-azinobis(3-etilbenztiazolinossulfónico)).

Manter a solução no escuro, a 4 °C, até à sua utilização. h. Reagentes de stock de:

EDTA 100 mM, pH 7, 0

0,5 M

0,2 M

Na3V04

Na4(P2O7)

Processo.

Pré-revestir a Placa de ELISA 1. Revestir as placas de ELISA (Corning, 96 poços, Cat. N° 25805-96) com anticorpo 05-101, a 0,5 pg por poço em PBS, 100 pL de volume final/poço e armazenar, de um dia para o outro, a 4 °C. Quando armazenadas a 4 °C, as placas revestidas são boas até 10 dias. 2. No dia da utilização, remover o tampão de revestimento e substituir com 100 pL de tampão de bloqueio (Leite Magro Seco Instantâneo a 5%, Carnation, em PBS). Incubar a placa agitando, à temperatura ambiente (cerca de 23 °C a 25 °C) , durante 30 minutos. Imediatamente antes da utilização, remover o tampão de bloqueio e lavar a placa, 4 vezes, com tampão de TBST.

Sementeira de Células 1. Uma linha celular NIH3T3, sobreexpressando um receptor quimérico contendo o domínio extracelular de EGFR e domínio de cinase de HER2 intracelular, pode ser utilizada para este ensaio. 57 2. Escolher placas tendo 80-90% de confluência para a experiência. Tripsinizar as células e parar a reacção pela adição de soro bovino fetal a 10%. Suspender as células em meio de DMEM (meio de DMEM, CS a 10%) e centrifugar, uma vez, a 1500 rpm, à temperatura ambiente, durante 5 minutos. 3. Ressuspender as células em meio de sementeira (DMEM, soro bovino a 0,5%) e contar as células utilizando azul de tripano. A viabilidade acima de 90% é aceitável. Semear as células em meio de DMEM (soro bovino a 0,5%), a uma densidade de 10000 células por poço, 100 pL por poço, numa placa de microtitulação de 96 poços. Incubar as células semeadas em CO2 a 5%, a 37 °C, durante cerca de 40 horas.

Processos de Ensaio 1. Verificar as células semeadas para contaminação, utilizando um microscópio invertido. Diluir o stock de fármaco (10 mg/mL em DMSO) 1:10 em meio de DMEM, depois, transferir 5 pL para um poço de TBST, para uma diluição de fármaco final de 1:200 e uma concentração de DMSO final de 1%. Os poços de controlo recebem apenas DMSO. Incubar em C02 a 5%, a 3 7 °C, durante duas horas. 2. Preparar o ligando de EGF: diluir o EGF de stock em DMEM, de modo que, após transferência de 10 pL de EGF diluído (diluição 1:12), seja alcançada uma concentração final de 100 nM. 3. Preparar HNTG* fresco, suficiente para 100 pL por poço e colocar sobre gelo. 58 HNTG* (10 mL):

2,0 mL

7,3 mL

0,5 mL

0,1 mL

0,1 mL

Stock de HNTG

H20 milli-Q EDTA, 100 mM, pH 7,0

Na3V04 (0,5 M)

Na4 (P207) (0,2 M) 4. Após 120 minutos de incubação com fármaco, adicionar o ligando de SGF preparado às células, 10 pL por poço, para uma concentração final de 100 nM. Os poços de controlo recebem apenas DMEM. Incubar com agitação, à temperatura ambiente, durante 5 minutos. 5. Remover o fármaco, EGF e DMEM. Lavar as células, duas vezes, com PBS. Transferir o HNTG* para as células, 100 pL por poço. Colocar sobre gelo, durante 5 minutos. Entretanto, remover o tampão de bloqueio de outra placa de ELISA e lavar com TBST, como descrito acima. 6. Com uma ponta de pipeta firmemente colocada num micropipetador, raspar as células da placa e homogeneizar o material celular por aspiração repetida e dispensar o tampão de lise de HNTG*. Transferir o lisado para uma placa de ELISA revestida, bloqueada e lavada. Incubar, com agitação, à temperatura ambiente, durante uma hora. 7. Remover o lisado e lavar, 4 vezes, com TBST. Transferir anticorpo anti-Ptyr diluído de fresco para placa de ELISA, a 100 pL por poço. Incubar, com agitação, à temperatura ambiente, durante 30 minutos, na presença do anti-soro anti-Ptyr (diluição 1:3000 em TBST). 59 8. Remover o anticorpo anti-Ptyr e lavar, 4 vezes, com TBST. Transferir o anticorpo igG TAGO anti-coelho diluído de fresco para a placa de ELISA, a 100 pL por poço. Incubar, com agitação, à temperatura ambiente, durante 30 minutos (anticorpo IgG anti-coelho: diluição 1:3000 em TBST). 9. Remover o anticorpo de detecção TAGO e lavar, 4 vezes, com TBST. Transferir a solução de ABTS/H2O2 preparada de fresco para uma placa de ELISA, 100 pL por poço. Incubar com agitação, à temperatura ambiente, durante 20 minutos, (solução de ABTS/H2O2: 1,0 pL de H2O2 a 30% em 10 mL de stock de ABTS). 10. Parar a reacção pela adição de 50 pL de H2S04 a 5 N (opcional) e determinar a D.O. a 410 nm. 11. O sinal máximo de fosfotirosina é determinado pela subtracção do valor dos controlos negativos dos controlos positivos. A percentagem de inibição do teor de fosfotirosina para poços contendo extracto é, depois, calculada, após subtracção dos controlos negativos.

Ensaio de PDGF-R

Todos os meios de cultura celular, glutamina e soro bovino fetal podem ser adquiridos a Gibco Life Technologies (Grand Island, N.I.), salvo indicado em contrário. Todas as células são cultivadas numa atmosfera húmida de ar a 9 0- -95% e C02 a 5-10%, a 37 °C. Todas as linhas celulares são rotineiramente subcultivadas, duas vezes por semana e são negativas para micoplasma, como determinado pelo método de Mycotect (Gibco). 60

Para os ensaios de ELISA, as células (U1242, obtidas de Joseph Schlessinger, NYU) são cultivadas a 80-90% de confluência em meio de crescimento (MEM com FBS a 10%, NEAA, NaPyr a 1 mM e GLN a 2 mM) e inoculadas em placas de cultura de tecidos de 96 poços, em soro a 0,5%, a 25000 a 30000 células por poço. Após incubação de um dia para o outro em meio contendo soro a 0,5%, as células são mudadas para meio isento de soro e tratadas com composto de teste, durante 2 h, numa incubadora de CO2 a 5%, 37 °C. As células são, depois, estimuladas com ligando, durante 5-10 minutos, seguido de lise com HNTG (Hepes a 20 mM, NaCl a 150 mM, glicerol a 10%, EDTA a 5 mM, Na3V04 a 5 mM, Triton X-100 a 0,2% e NaPyr a 2 mM) . Os lisados celulares (0,5 mg/poço em PBS) são transferidos para placas de ELISA, anteriormente revestidas com anticorpo especifico de receptor e que tinham sido bloqueadas com leite a 5% em TBST (Tris-HCl a 50 mM, pH 7,2, NaCl a 150 mM e Triton X-100 a 0,1%), à temperatura ambiente, durante 30 min. Os lisados são incubados com agitação, durante 1 hora, à temperatura ambiente. As placas são lavadas com TBST, quatro vezes e, depois, incubadas com anticorpo policlonal anti-fosfotirosina, à temperatura ambiente, durante 30 minutos. O anticorpo anti-fosfotirosina em excesso é removido pela lavagem da placa com TBST, quatro vezes. O anticorpo IgG de cabra anti-coelho é adicionado à placa de ELISA, durante 30 min, à temperatura ambiente, seguido de # com TBST, quatro vezes mais. ABTS (ácido cítrico a 100 mM, Na2HPO a 250 mM e 0,5 mg/mL de ácido 2,2'-azino-bis(3-etilbenztiazolino-6-sulfónico) mais H202 (1,2 mL de H202 a 30% para 10 mL de ABTS) são adicionados às placas de ELISA para se iniciar o desenvolvimento da cor. A absorvência a 410 nm, com um comprimento de onda de referência de 630 nm, é registada cerca de 15 a 30 min após a adição de ABTS . 61

Ensaio do RECEPTOR de IGF-1 0 seguinte protocolo pode ser utilizado para medir o nível de fosfotirosina no receptor de IGF-1, que indica actividade de tirosina cinase de receptor de IGF-1.

Materiais e Reagentes. a. A linha celular utilizada neste ensaio é 3T3/IGF-1R, uma linha celular geneticamente manipulada para sobreexpressar o receptor de IGF-1. b. A NIH3T3/IGF-1R é cultivada numa incubadora com CO2 a 5%, a 37 °C. Os meios de crescimento são DMEM + FBS a 10% (inactivado por calor) + L-glutamina a 2 mM. c. Anticorpo 17-69 anti-IGF-lR purificado por afinidade. D-PBS: KH2PO4 0, 20 g/L KH2PO4 2, 16 g/L KC1 0, 20 g/L NaCl 8, 00 g/L (pH 7,2) Tampão de Bloqueio: TBST mais Leite a 5% (Leite Magro Seco

Instantâneo, Carnation). 62 f. Tampao de TBST:

Tris-HCl 5 0 mM NaCl 150 mM (pH 7,2/HCl a 10 N) Triton X-100 0, 1% ;olução stock de TBS (10X) é preparada e Triton X-100 é adicionado ao tampao durante a diluição, g. Tampão de HNTG: HEPES NaCl Glicerol Triton X-100

2 0 mM 150 mM (pH 7,2/HCl a 1 N) 10% 0,2% A solução stock (5X) é preparada e mantida a 4 °C. h. EDTA/HC1: 0,5 M, pH 7,0 (NaOH), como stock a 100X. i. NasVCG: 0,5 M, como stock a 100X e as aliquotas são mantidas a 80 °C. j. Na4P207: 0,2 M, como stock a 100X. k. Factor de crescimento semelhante a insulina da Promega (Cat N° G5111) . 1. Anti-soro anti-fosfotirosina policlonal de coelho. 63 m. IgG de cabra detecção), Tago Burlingame, CA. anti-coelho, conjugado a POD (anticorpo de (Cat. N° 4520, Lote N° 1802): Tago, Inc., n. Solução de ABTS etilbenztiazolinossulfónico)): n. (ácido 2,2'-azinobis(3-

100 mM Ácido cítrico

Na2HP04

ABTS

250 mM (pH 4,0/HCl a 1 N) 0,5 mg/mL

A solução de ABTS deve ser mantida no escuro e 4 °C. A solução deve ser descartada quando ficar verde. 0. Peróxido de Hidrogénio: a solução a 30% é mantida no escuro e a 4 °C.

Processo.

Todas as etapas seguintes são conduzidas à temperatura ambiente, salvo especificamente indicado em contrário. Todas as lavagens de placas de ELISA são realizadas pelo lavagem da placa com água da torneira, três vezes, seguida de uma enxaguadela de TBST. Secar a placa batendo-a contra toalhetes de papel.

Sementeira de Células: 1. As células, cultivadas em placa de cultura de tecidos (Corning 25020-100) para 80-90% de confluência, são recolhidas com Tripsina-EDTA (0,25%, 0,5 mL/D-100, GIBCO). 2. Ressuspender as células em DMEM + FBS a 10% + L-Glutamina a 2 mM fresco e transferir para placa de cultura de tecidos de 96 poços (Corning, 25806-96), a 20000 células/poço (100 pL/poço). Incubar, durante 1 dia, depois, trocar o meio para meio isento de soro (90/pL) e incubar em C02 a 5% e a 37 °C, de um dia para o outro.

Revestimento e Bloqueio de Placa de ELISA: 1. Revestir a placa de ELISA (Corning 25805-96) com Anticorpo Anti-IGF-IR, a 0,5 pg/poço, em 100 pL de PBS, pelo menos, 2 horas. 2. Remover a solução de revestimento e substituir com 100 pL de Tampão de Bloqueio e agitar durante 30 minutos. Remover o tampão de bloqueio e lavar a placa imediatamente antes da adição de lisado.

Processos de Ensaio: 1. Os fármacos são testados sob condição isenta de soro.

2. Diluir o stock de fármaco (em DMSO a 100%) 1:10 com DMEM em placa de polipropileno de 96 poços e transferir 10 pL/poço desta solução para as células, para se alcançar a diluição de fármaco final de 1:100 e concentração de DMSO final de 1,0%. Incubar as células em C02 a 5%, a 37 °C, durante 2 horas. 65 3. Preparar tampão de lise celular fresco (HNTG*)

HNTG 2 mL EDTA 1—1 O mL Na3V04 i—1 0 mL Na4(P207) i—1 0 mL h2o 7,3 mL 4. Após incubação de fármaco, durante duas horas, transferir 10 pL/poço de Ligando de IGF-1 a 200 nM em PBS para as células (a Cone. Final é 20 nM) e incubar a CO2 a 5%, a 37 °C, durante 10 minutos. 5. Remover os meios e adicionar 100 pL/poço de HNTG* e agitar durante 10 minutos. Observar as células sob microscópio, para ver se estão adequadamente lisadas. 6. Utilizar uma pipeta de 12 canais para raspar as células da placa e homogeneizar o lisado por aspiração e dispensação repetida. Transferir todo o lisado para a placa de ELISA revestida com anticorpo e agitar durante 1 hora. 7. Remover o lisado, lavar a placa, transferir anti-pTyr (1:3000 com TBST) a 100 pL/poço e agitar durante 30 minutos. 8. Remover o anti-pTyr, lavar a placa, transferir o TAGO (1:3000 com TBST) a 100 pL/poço e agitar durante 30 minutos. 9. Remover o anticorpo de detecção, lavar a placa e transferir ABTS/H202 fresco (1,2 pL de H202 para 10 mL de ABTS) a 100 pL/poço para a placa, para se iniciar o desenvolvimento da cor. 66

Medir a D. 0., a 410 nm, com um comprimento de onda de referência de 630 nm em Dynatec MR5000.

Ensaio de EGFR A actividade de cinase do receptor de EGF em células geneticamente manipuladas para expressarem EGF-R humano pode ser medida como descrito abaixo:

Materiais e Reagentes. a. Ligando de EGF: concentração de stock: 16,5 μΜ, EGF 201, TOYOBO, Co., Ltd. Japão. b. 05-101 (UBI) (um anticorpo monoclonal reconhecendo um domínio extracelular de EGFR). c. Anticorpo anti-fosfotirosina (anti-Ptyr) (policlonal). d. Anticorpo de detecção: IgG de cabra anti-coelho conjugado a peroxidase de rábano, TAGO, Inc., Burlingame, CA. e. Tampão de TBST:

Tris-HCl, pH 7 50 mM

NaCl 150 mM

Triton X-100 0,1 67 f. Stock de HNTG a 5X: HEPES 0, 1 M NaCl 0,75 M Glicerol 50 Triton X-100 1, 0% g. Stock de ABTS: Ácido Cítrico 100 mM Na3V04 250 mM HC1, conc. pH 4, 0 ABTS* 0,5 mg/mL Manter a solução utilizada. no escuro, a 4 °C, até ser h. Reagentes de stock de:

EDTA 100 mM, pH 7,0 Na3V04 0,5 M Na4(P2O7) 0,2 M

Processo.

Pré-revestir a Placa de ELISA 1. Revestir as placas de ELISA (Corning, 96 poços, Cat. N° 25805-96) com anticorpo 05-101, a 0,5 pg por poço em PBS, 150 pL de volume final/poço e armazenar, de um dia para o outro, a 4 °C. Quando armazenadas a 4 °C, as placas revestidas são boas até 10 dias. 68 2. No dia da utilização, remover o tampão de revestimento e substituir com tampão de bloqueio (Leite Magro Seco Instantâneo a 5%, Carnation, em PBS) . Incubar a placa agitando, à temperatura ambiente (cerca de 23 °C a 25 °C), durante 30 minutos. Imediatamente antes da utilização, remover o tampão de bloqueio e lavar a placa, 4 vezes, com tampão de TBST.

Sementeira de Células 1. A linha celular NIH 3T3/C7 (Honegger, et al., Cell 51:199-209, 1987) pode ser utilizada para este ensaio. 2. Escolher placas tendo 80-90% de confluência para a experiência. Tripsinizar as células e parar a reacção, pela adição de meio de DMEM, CS a 10%. Suspender as células em meio de DMEM (meio de DMEM, CS a 10%) e centrifugar, uma vez, a 1000 rpm, à temperatura ambiente, durante 5 minutos. 3. Ressuspender as células em meio de sementeira (DMEM, soro bovino a 0,5%) e contar as células utilizando azul de tripano. A viabilidade acima de 90% é aceitável. Semear as células em meio de DMEM (soro bovino a 0,5%), a uma densidade de 10000 células por poço, 100 pL por poço, numa placa de microtitulação de 96 poços. Incubar as células semeadas em C02 a 5%, a 37 °C, durante cerca de 40 horas. 69

Processos de Ensaio. 1. Verificar as células semeadas para contaminação, utilizando um microscópio invertido. Diluir o stock de compostos de teste (10 mg/mL em DMSO) 1:10 em meio de DMEM, depois, transferir 5 pL para um poço de teste, para uma diluição de fármaco de compostos de teste de 1:200 e uma concentração de DMSO final de 1%. Os poços de controlo recebem apenas DMSO. Incubar em CO2 a 5%, a 37 °C, durante uma hora. 2. Preparar o ligando de EGF: diluir o EGF de stock em DMEM, de modo que, após transferência de 10 pL de EGF diluído (diluição 1:12), seja alcançada uma concentração final de 25 nM.

3. Preparar 10 mL de HNTG* fresco, suficiente para 100 pL por poço, em que o HNTG* compreende: stock de HNTG (2,0 mL) , H2O milli-Q (7,3 mL) , EDTA, 100 mM, pH 7,0 (0,5 mL) , Na3V04 a 0,5 M (0,1 mL) e Na4(p207), 0,2 M (0,1 mL) . 4. Colocar sobre gelo. 5. Após incubaçao de duas horas com fármaco, , adicionar ligando de EGF preparado às células, 10 pL por poço, para produzir uma concentração final de 25 nM. Os poços de controlo recebem apenas DMEM. Incubar, com agitaçao, à temperatura ambiente , durante 5 minutos. 6. Remover 0 composto de teste, EGF e DMEM . Lavar as células, duas vezes, com PBS. Transferir 0 HNTG* para as células, 100 pL por poço. Colocar sobre gelo, durante 5 minutos. Entretanto, remover o tampão de bloqueio de outra placa de ELISA e lavar com TBST, como descrito acima. 70 7. Com uma ponta de pipeta firmemente colocada num micropipetador, raspar as células da placa e homogeneizar o material celular por aspiração repetida e dispensar o tampão de lise de HNTG*. Transferir o lisado para uma placa de ELISA revestida, bloqueada e lavada. Incubar, com agitação, à temperatura ambiente, durante uma hora. 8. Remover o lisado e lavar, 4 vezes, com TBST. Transferir anticorpo anti-Ptyr diluído de fresco para placa de ELISA, a 100 pL por poço. Incubar, com agitação, à temperatura ambiente, durante 30 minutos, na presença do anti-soro anti-Ptyr (diluição 1:3000 em TBST) . 9. Remover o anticorpo anti-Ptyr e lavar, 4 vezes, com TBST. Transferir o anticorpo IgG anti-coelho TAGO 30 diluído de fresco para a placa de ELISA, a 100 pL por poço. Incubar, com agitação, à temperatura ambiente, durante 30 minutos (anticorpo IgG anti-coelho: diluição 1:3000 em TBST). 10. Remover o anticorpo de detecção e lavar, 4 vezes, com TBST. Transferir a solução de ABTS/H202 preparada de fresco para uma placa de ELISA, 100 pL por poço. Incubar, à temperatura ambiente, durante 20 minutos. Solução de ABTS/H202: 1,2 pL de H202 a 30% em 10 mL de stock de ABTS. 11. Parar a reacção pela adição de 50 pL de H2S04 a 5 N (opcional) e determinar a D.O. a 410 nm. 12. O sinal máximo de fosfotirosina é determinado pela subtracção do valor dos controlos negativos dos controlos positivos. A percentagem de inibição do teor de fosfotirosina 71 para poços contendo extracto é, depois, calculada, após subtracção dos controlos negativos.

Ensaio de Autofosforilação de Met

Este ensaio determina a actividade de tirosina cinase de Met, pela análise dos níveis de proteína tirosina cinase de Met no receptor de Met.

Reagentes a. HNTG (solução stock a 5X) : Dissolver 23, 83 g de HEPES e 43,83 g de NaCl em cerca de 350 mL de dH20. Ajustar o pH para 7,2 com HC1 ou NaOH, adicionar 500 mL de glicerol e 10 mL de Triton X-100, misturar, adicionar dH20 para 1 L de volume total. Para preparar 1 L de solução de trabalho a IX, adicionar 200 mL de solução stock a 5X a 800 mL de dH20, verificar e ajustar o pH conforme necessário, armazenar a 4 °C. b. PBS (Solução Salina Tamponada com Fosfatos de Dulbecco), Gibco Cat. N° 450-1300EB (solução a IX). c. Tampão de Bloqueio: em 500 mL de dH20 colocar 100 g de BSA, 12,1 g de Tris, pH 7,5, 58,44 g de NaCl e 10 mL de Tween- 20, diluir para 1 L de volume total. d. Tampão de Cinase: A 500 mL de dH20 adicionar 12,1 g de TRIS (pH 7,2), 58,4 g de NaCl, 40,7 g de MgCl2 e 1,9 g de EGTA, perfazer para 1 L de volume total com dH20. 72 e. PMSF (Fluoreto de fenilmetilsulfonilo), Sigma Cat. N° P-7626, a 435,5 mg adicionar etanol a 100% para 25 mL de volume total, agitar em vórtice. f. ATP (Fonte Bacteriana), Sigma Cat. N° A-7699, armazenar o pó a -20 °C, para preparar solução para utilização, dissolver 3,31 mg em 1 mL de dH20. g. Anti-Fosfotirosina Conjugada a HRPO de RC-20H,

Transduction Laboratories Cat. N° E120H. h. Pierce 1-Step™ Turbo TMB-ELISA (3,3',5,5'-tetrametilbenzidina, Pierce Cat. N° 34022. i. H2S04, adicionar 1 mL de conc. (18 N) a 35 mL de dH20. j. TRIS HCL, Fischer Cat. N° BP152-5, a 121,14 g de material adicionar 600 mL de H2O MilliQ, ajustar o pH para 7,5 (ou 7,2) com HC1, perfazer para 1 L de volume com H2O MilliQ. k. NaCl, Fischer Cat. N° S271-10, preparar solução a 5 M. l. Tween-20, Fischer Cat. N° S337-500. m. Na3V04, Fischer Cat. N° S454-50, a 1,8 g de material adicionar 80 mL de H20 MilliQ, ajustar o pH para 10,0 com HC1 ou NaOH, ferver em microondas, arrefecer, verificar o pH, repetir o processo até pH estável a 10,0, adicionar H20 MilliQ para 100 mL de volume total, preparar alíquotas de 1 mL e armazenar a -80 °C. n. MgCl2, Fischer Cat. N° M33-500, preparar solução a 1 M. 73 o. HEPES, Fischer Cat. N° BP310-500, a 200 mL de H20 MilliQ, adicionar 59,6 g de material, ajustar o pH para 7,5, perfazer um volume total de 250 mL, esterilizar por filtração. p. Albumina, Bovina (BSA), Sigma Cat. N° A-4503, a 30 gramas de material adicionar água destilada estéril para preparar volume total de 300 mL, armazenar a 4 °C. q. Tampão de TBST: a aprox. 90 0 mL de dH20 num cilindro graduado de 1 L adicionar 6,057 g de TRIS e 8, 766 g de NaCl, quando dissolvido, ajustar o pH para 7,2 com HC1, adicionar 1,0 mL de Triton X-100 e perfazer um volume total de 1 L com dH20. r. IgG de Coelho de anticorpo de cabra purificado por Afinidade (molécula intacta), Cappel Cat. N° 55641. s. Anticorpo IgG policlonal de coelho anti-h-Met (C-28), Santa Cruz Chemical Cat. N° SC-161. t. Células quiméricas de EGFR/Met transfectadas de um modo transiente (EMR) (Komada, et ai., Oncogene, 8:2381-2390 (1993). u. Tampão de Carbonato de Sódio, (Na2C04, Fischer Cat. N° S495) : a 10,6 g de material adicionar 800 mL de H20 MilliQ, quando dissolvido ajustar o pH para 9,6 com NaOH, perfazer 1 L de volume total com H20 MilliQ, filtrar, armazenar a 4 °C. 74

Processo

Todas as etapas seguintes são conduzidas à temperatura ambiente, salvo especificamente indicado em contrário. A lavagem de todas as placas de ELISA é por lavagem 4X com TBST.

Lise de EMR

Este processo pode ser realizado na noite antes ou imediatamente antes do inicio da captura de receptor. 1. Descongelar rapidamente os lisados em banho-maria, a 3 7 °C, com um movimento de agitação em torvelinho até que os últimos cristais desapareçam. 2. Lisar o sedimento celular com HNTG a IX, contendo PMSF a 1 mM. Utilizar 3 mL de HNTG por placa de 15 cm de células. Adicionar 1/2 do volume de HNTG calculado, agitar em vórtice o tubo durante 1 min., adicionar a quantidade restante de HNTG, agitar em vórtice durante outro min. 3. Equilibrar os tubos, centrifugar a 10000 x g, durante 10 min, a 4 °C. 4. Agregar os sobrenadantes, remover uma aliquota para determinação de proteína. 5. Descongelar rapidamente a amostra agregada em banho de gelo seco/etanol. Esta etapa é realizada independentemente de o lisado ser armazenado, de um dia para o outro, ou utilizado imediatamente após determinação de proteína. 75 6. Realizar a determinação de proteína, utilizando o método padrão de ácido bicinconínico (BCA) (Kit BCA Assay Reagent, da Pierce Chemical Cat. N° 23225).

Processo de ELISA 1. Revestir placas de ELISA de 96 poços Corning com 5 pg por poço de anticorpo de Cabra anti-Coelho em Tampão de Carbonato, para um volume de poço total de 50 pL. Armazenar, de um dia para o outro, a 4 °C. 2. Remover anticorpo de Cabra anti-coelho não ligado, pela inversão da placa para remover o líquido. 3. Adicionar 150 pL de Tampão de Bloqueio a cada poço. Incubar durante 30 min., com agitação. 4. Lavar 4X com TBST. Bater a placa num toalhete de papel para remover o líquido e bolhas em excesso. 5. diluído 6 . 7 . durante

Adicionar 1 pg por poço de anticorpo de Coelho anti-Met, em TBST, para um volume de poço total de 100 pL

Diluir o lisado em HNTG (90 pg de lisado/100 pL)

Adicionar 100 pL de lisado diluído a cada poço. Agitar 60 min. 8. Lavar 4X com TBST. Bater num toalhete de papel para remover o líquido e bolhas em excesso. 76 9. Adicionar 50 pL de tampão de lisado a IX por poço. 10. Diluir os compostos/extractos 1:10 em Tampao de Cinase a IX numa placa de polipropileno de 96 poços. 11. Transferir 5,5 pL do composto diluído para poços de placa de ELISA. Incubar, à temperatura ambiente, com agitação, durante 20 min. 12. Adicionar 5,5 pL de solução de ATP a 60 pM por poço. Os controlos negativos não recebem gualguer ATP. Incubar durante 90 min., com agitação. 13. Lavar 4X com TBST. Bater a placa para toalhete de papel para remover o líquido e bolhas em excesso. 14. Adicionar 100 pL por poço de RC20 (diluição 1:3000 em Tampão de Bloqueio). Incubar 30 min., com agitação. 15. Lavar 4X com TBST. Bater a placa para toalhete de papel para remover o líquido e bolhas em excesso. 16. Adicionar 100 pL por poço de Turbo-TMB. Incubar, com agitação, durante 30-60 min. 17. Adicionar 100 pL por poço de H2SO4 a 1 M para parar a reacção. 18. Ler o ensaio no leitor de ELISA Dynatech MR7000 Filtro de Teste = 450 nm, filtro de referência = 410 nm. 77

Ensaio bioquímico de src

Este ensaio é utilizado para determinar a actividade de proteína cinase de src medindo, como leitura, a fosforilação de um péptido biotinilado.

Materiais e Reagentes: a. Levedura transformada com src (Sugen, Inc., Redwood City, Califórnia). b. Lisados celulares: As células de levedura expressando src são sedimentadas, lavadas, uma vez, com água, ressedimentadas e armazenadas, a -80 °C, até à sua utilização. c. A terminação N biotinilada EEEYEEYEEEYEEEYEEEY é preparada por processos padrão, bem conhecidos dos especialistas na técnica. d. DMSO: Sigma, St. Louis, MO. e. Placa de ELISA de 96 Poços; Corning 96 Well Easy Wash, Placa de Fundo raso Modificada, Corning Cat. N° 25805-96. f. Placas de polipropileno de fundo em V de 96 poços NUNC para diluição de compostos: Applied Scientific Cat. N° A-72092. g. Reagente Vectastain ELITE ABC: Vector, Burlingame, CA. h. mab anti-src (327) : A Schizosaccharomyces Pombe é utilizada para expressar Src recombinante (Superti-Furga, 78 et al., EMBO J., 12:2625-2634, Superti-Furga, et al., Nature

Biochem., 14:600-605). A estirpe SP200 de S. Pombe (h-s leul.32 ura4 ade210) é cultivada como descrito e as transformações com plasmideos de expressão pRSP são feitas pelo método de acetato de litio (Superti-Furga, supra). As células são cultivadas na presença de tiamina a 1 μΜ, para reprimir a expressão do promotor de nmtl, ou na ausência de tiamina, para induzir a expressão. i. Anti-fosfotirosina monoclonal, UBI 05-321 (como alternativa, pode ser utilizado o UB40). j. Substrato de peroxidase de Turbo TMB-ELISA: Pierce Chemical.

Soluções Tampão a. PBS (Solução Salina Tamponada com Fosfatos de Dulbecco): GIBCO PBS, GIBCO Cat. N° 450-1300EB. b. Tampão de Bloqueio: Leite magro a 5% (Carnation) em PBS. c. Tampão de Carbonato: Na2C04 da Fischer, Cat. N° S495, preparar solução stock a 100 mM. d. Tampão de Cinase: 1,0 mL (de solução stock a 1 M) MgCl2, 0,2 mL (de uma solução stock a 1 M) MnCl2, 0,2 mL (de uma solução stock a 1 M) DTT, 5,0 mL (de uma solução stock a 1 M) HEPES, 0,1 mL de TX-100, perfazer para 10 mL de volume total com H20 MilliQ. 79 e. Tampão de Lise: 5,0 HEPES (de solução stock a 1 M) , 2,74 mL de NaCl (de solução stock a 5 M) , 10 mL de glicerol, 1,0 mL de TX-100, 0,4 mL de EDTA (de uma solução stock a 100 mM), 1,0 mL de PMSF (de uma solução stock a 100 mM) , 0,1 mL de Na3V04 (de uma solução stock a 0,1 M), perfazer para 100 mL de volume total com H2O MilliQ. f. ATP: Sigma Cat. N° A-7699, preparar solução stock a 10 mM (5,51 mg/mL). g. TRIS-HC1: Fischer Cat. N° BP 152-5, a 600 mL de H20 MilliQ adicionar 121,14 g de material, ajustar o pH para 7,5 com HC1, perfazer para 1 L de volume total com H20 MilliQ. h. NaCl: Fischer Cat. N° S271-10, Preparar solução stock a 5 M com H20 MilliQ. i. Na3V04: Fischer Cat. N° S454-50, a 80 mL de H20 MilliQ, adicionar 1,8 g de material, ajustar o pH para 10,0 com HC1 ou NaOH, ferver num microondas, arrefecer, verificar o pH, repetir 0 ajustamento de pH até que o pH permaneça estável após o ciclo de aquecimento/arrefecimento, perfazer 100 mL de volume total com H20 MilliQ, preparar aliquotas de 1 mL e armazenar a -80 °C. j. MgCl2: Fischer Cat. N° M33-500, preparar solução stock a 1 M com H20 MilliQ. k. HEPES: Fischer Cat. N° BP 310-500, a 200 mL de H20 MilliQ, adicionar 59,6 g de material, ajustar o pH para 7,5, perfazer 250 mL de volume total com H20 MilliQ, esterilizar por filtração (solução stock a 1 M). 80 l. Tampão de TBST: Tampão de TBST: A 900 mL de dH20 adicionar 6,057 g de TRIS e 8, 766 g de NaCl, ajustar o pH para 7,2 com HC1, adicionar 1,0 mL de Triton-X100, perfazer 1 L de volume total com dH20. m. MnCl2: Fischer Cat. N° M87-100, preparar solução stock a 1 M com H20 MilliQ. n. DTT: Fischer Cat. N° BP172-5. o. TBS (Solução Salina Tamponada com TRIS) : a 900 mL de H20 MilliQ adicionar 6,057 g de TRIS e 8,777 g de NaCl, perfazer 1 L de volume total com H20 MilliQ. p. Mistura Reaccional de Cinase: Quantidade por placa de ensaio (100 poços): 1,0 mL de Tampão de Cinase, 200 yg de GST-ζ, perfazer volume final de 8,0 mL com H20 MilliQ. q. EEEYEEYEEEYEEEYEEEY marcado com biotina: Preparar solução stock de péptido (1 mM, 2,98 mg/mL) em água fresca, imediatamente antes de utilização. r. Reagente Vectastain ELITE ABC: Para preparar 14 mL de reagente de trabalho, adicionar 1 gota do reagente A a 15 mL de TBST e inverter o tubo várias vezes para misturar. Depois, adicionar 1 gota de reagente B. Colocar o tubo em agitador orbital, à temperatura ambiente e misturar durante 30 minutos. 81

Processos:

Preparação de placa de ELISA revestida com src. 1. Revestir a placa de ELISA com 0,5 pg/poço de mab anti-src em 100 pL de tampão de carbonato de sódio, pH 9,6, manter a 4 °C, de um dia para o outro. 2. Lavar os poços, uma vez, com PBS. 3. Bloquear a placa com 0,15 mL de leite a 5% em PBS, durante 30 min., à temperatura ambiente. 4. Lavar a placa 5X com PBS. 5. Adicionar 10 pg/poço de lisados de levedura transformados com src, diluídos em Tampão de Lise (0,1 mL de volume total por poço). (A quantidade de lisado pode variar entre lotes de cultura). Agitar a placa durante 20 minutos, à temperatura ambiente.

Preparação de placa de ELISA revestida com anticorpo de fosfotirosina. 1. Placa 4G10: revestir 0,5 pg/poço de 4G10 em 100 pL de PBS, de um dia para o outro, a 4 °C e bloquear com 150 pL de leite a 5% em PBS, durante 30 minutos, à temperatura ambiente. 82

Processo de Ensaio de Cinase. 1. Remover proteínas nao ligadas das placas e lavar as placas 5X com PBS. 2. Adicionar 0,08 mL de Mistura Reaccional de Cinase por poço (contendo 10 pL de Tampão de Cinase a 10X e 10 μΜ (concentração final) de biotina-EEEYREYEEEYEEEYEEEY por poço, diluído em água. 3. Adicionar 10 pL de composto diluído em água contendo DMSO a 10% e pré-incubar, durante 15 minutos, à temperatura ambiente. 4. Iniciar a reacção de cinase, pela adição de 10 pL/poço de ATP a 0,05 mM em água (ATP a 5 pM final). 5. Agitar a placa de ELISA durante 15 min., à temperatura ambiente. 6. Parar a reacção de cinase, pela adição de 10 pL de EDTA a 0,5 M por poço. 7. Transferir 90 pL de sobrenadante para uma placa de ELISA revestida com 4G10 bloqueada. 8. Incubar durante 30 min., agitando simultaneamente à temperatura ambiente. 9. Lavar a placa 5X com TBST. 10. Incubar com o reagente Vectastain ELITE ABC (100 pL/poço), durante 30 min., à temperatura ambiente. 83 11. Lavar os poços 5X com TBST. 12. Revelar com Turbo TMB.

Ensaio Bioquímico de lck

Este ensaio é utilizado para determinar as actividades de proteína cinase de lck medindo, como leitura, a fosforilação de GST-ζ.

Materiais e Reagentes: a. Levedura transformada com lck. A Schizosaccharomyces Pombe é utilizada para expressar Lck recombinante (Superti-Furga, et al., EMBO J, 12:2625-2634, Superti-Purga, et al. , Nature Biotech., 14:600-605). A estirpe SP200 de S. Pombe (h-s leul.32 ura4 ade210) é cultivada como descrito e as transformações com plasmídeos de expressão pRSP são feitas pelo método de acetato de lítio (Superti-Furga, supra). As células são cultivadas na presença de tiamina a 1 μΜ, para induzir a expressão. b. Lisados celulares: As células de levedura expressando lck são sedimentadas, lavadas uma vez em água, ressedimentadas e armazenadas congeladas, a -80 °C, até à sua utilização. c. GST-ζ: ADN codificando para a proteína de fusão GST-ζ para expressão em bactérias obtido de Arthur Weiss do Howard Hughes Medicai Institute na Universidade da Califórnia, São Francisco. As bactérias transformadas são cultivadas, de um dia 84 para o outro, agitando, simultaneamente a 25 °C. 0 GST-ζ é purificado por cromatografia de afinidade de glutationo, Pharmacia, Alameda, CA. d. DMSO: Sigma, St. Louis, MO. e. Placa de ELISA de 96 poços: Corning 96 Well Easy Wash, Placa de Fundo Raso Modificada, Corning Cat. N° 25805-96. f. Placas de polipropileno de fundo em V de 96 poços NUNC para diluição de compostos: Applied Scientific Cat. N° AS-72092. g. Anti-soro de Coelho anti-GST purificado: Amrad

Corporation (Austrália) Cat. N° 90001605. h. IgG-HRP de Cabra anti-Coelho: Amersham Cat. N° V010301. i. IgG de ovelha anti-murganho (H+L) : Jackson Labs Cat. N° 5215-005-003. j. mab anti-Lck (3A5): Santa Cruz Biotechnology Cat N° sc-433. k. Anti-fosfotirosina monoclonal, UBI 05-321 (como alternativa, pode ser utilizado o UB40). 85

Soluções tampão; a. Solução de PBS a IX (Solução Salina Tamponada com Fosfatos de Dulbecco): GIBCO PBS, GIBCO Cat. N° 450-1300EB.

b. Tampão de Bloqueio: 100 g de BSA, 12,1 g de TRIS (pH 7,5), 58,44 g de NaCl, 10 mL de Tween-20, perfazer 1 L de volume total com H2O MilliQ. c. Tampão de Carbonato: Na2C04 da Fischer, Cat. N° S495, preparar solução stock a 100 mM com H20 MilliQ. d. Tampão de Cinase: 1,0 mL (de solução stock a 1 M) MgCl2, 0,2 mL (de uma solução stock a 1 M) MnCl2, 0,2 mL (de uma solução stock a 1 M) DTT, 5,0 mL (de uma solução stock a 1 M) HEPES, 0,1 mL de TX-100, perfazer para 10 mL de volume total com H20 MilliQ. e. Tampão de Lise: 5,0 HEPES (de solução stock a 1 M) , 2, 74 mL de NaCl (de solução stock a 5 M) , 10 mL de glicerol, 1,0 mL de TX-100, 0,4 mL de EDTA (de uma solução stock a 100 mM) , 1,0 mL de PMSF (de uma solução stock a 100 mM) , 0,1 mL de Na3V04 (de uma solução stock a 0,1 M), perfazer para 100 mL de volume total com H20 MilliQ. f. ATP: Sigma Cat. N° A-7699, preparar solução stock a 10 mM (5,51 mg/mL). g. TRIS-HC1: Fischer Cat. N° BP 152-5, a 600 mL de H20 MilliQ adicionar 121,14 g de material, ajustar o pH para 7,5 com HC1, perfazer para 1 L de volume total com H20 MilliQ. 86 h. NaCl: Fischer Cat. N° S271-10, Preparar solução stock a 5 M com H20 MilliQ. i. Na3V04: Fischer Cat. N° S454-50, a 80 mL de H20 MilliQ, adicionar 1,8 g de material, ajustar o pH para 10,0 com HC1 ou NaOH, ferver num microondas, arrefecer, verificar o pH, repetir 0 ajustamento de pH até que o pH permaneça estável após o ciclo de aquecimento/arrefecimento, perfazer 100 mL de volume total com H20 MilliQ, preparar aliquotas de 1 mL e armazenar a -80 °C. j. MgCl2: Fischer Cat. N° M33-500, preparar solução stock a 1 M com H20 MilliQ. k. HEPES: Fischer Cat. N° BP 310-500, a 200 mL de H20 MilliQ, adicionar 59,6 g de material, ajustar o pH para 7,5, perfazer 250 mL de volume total com H20 MilliQ, esterilizar por filtração (solução stock a 1 M). l. Albumina, Bovina (BSA), Sigma Cat. N° A4503, a 150 mL de H20 MilliQ adicionar 30 g de material, perfazer 300 mL de volume total com H20 MilliQ, filtrar através de filtro de 0,22 pm, armazenar a 4 °C. m. Tampão de TBST: A 900 mL de dH20 adicionar 6, 057 g de TRIS e 8,766 g de NaCl, ajustar o pH para 7,2 com HC1, adicionar 1,0 mL de Triton-X100, perfazer 1 L de volume total com dH20. n. MnCl2: Fischer Cat. N° M87-100, preparar solução stock a 1 M com H20 MilliQ. o. DTT: Fischer Cat. N° BP172-5. 87 p. TBS (Solução Salina Tamponada com TRIS): a 900 mL de H2O MilliQ adicionar 6,057 g de TRIS e 8,777 g de NaCl, perfazer 1 L de volume total com H2O MilliQ. q. Mistura Reaccional de Cinase: Quantidade por placa de ensaio (100 poços): 1,0 mL de Tampão de Cinase, 200 pg de GST-ζ, perfazer volume final de 8,0 mL com H2O MilliQ.

Processos:

Preparação de placa de ELISA revestida com Lck. 1. Revestir 2,0 pg/poço de IgG de Ovelha anti-murganho em 100 pL de tampão de carbonato de sódio a pH 9,6, a 4 °C, de um dia para o outro. 2. Lavar o poço, uma vez, com PBS. 3. Bloquear a placa com 0,15 mL de Tampão de bloqueio, durante 30 min., à temp. ambiente. 4. Lavar a placa 5X com PBS. 5. Adicionar 0,5 pg/poço de anti-lck (mab 3A5) em 0,1 mL de PBS, à temperatura ambiente, durante 1-2 horas. 6. Lavar a placa 5X com PBS. 7. Adicionar 20 pg/poço de lisados de levedura transformados com lck, diluídos em Tampão de Lise (0,1 mL de volume total por poço) . Agitar a placa, a 4 °C, de um dia para o outro, para prevenir a perda de actividade.

Preparação de placa de ELISA revestida com anticorpo de fosfotirosina. 1. Placa UB40: UB40 a 1,0 pg/poço em 100 pL de PBS, de um dia para o outro, a 4 °C e bloquear com 150 pL de Tampão de Bloqueio durante, pelo menos, 1 hora.

Processo de Ensaio de Cinase. 1. Remover proteínas não ligadas das placas e lavar as placas 5X com PBS. 2. Adicionar 0,08 mL de Mistura Reaccional de Cinase por poço (contendo 10 pL de Tampão de Cinase a 10X e 2 pg de GST-ζ por poço, diluído em água). 3. Adicionar 10 pL de composto diluído em água contendo DMSO a 10% e pré-incubar, durante 15 minutos, à temperatura ambiente. 4. Iniciar a reacção de cinase, pela adição de 10 pL/poço de ATP a 0,1 mM em água (ATP a 10 pM final). 5. Agitar a placa de ELISA durante 60 min., à temperatura ambiente. 6. Parar a reacção de cinase, pela adição de 10 pL de EDTA a 0,5 M por poço. 89 7. Transferir 90 pL de sobrenadante para uma placa de ELISA revestida com 4G10 bloqueada da secção B, acima. 8. Incubar agitando, simultaneamente, durante 30 min., à temperatura ambiente. 9. Lavar a placa 5X com TBST. 10. Incubar com anticorpo de Coelho anti-GST à diluição de 1:5000 em 100 pL de TBST, durante 30 min., à temperatura ambiente. 11. Lavar os poços 5X com TBST. 12. Incubar com IgG-HRP de Cabra anti-Coelho à diluição de 1:20000 em 100 pL de TBST, durante 30 min., à temperatura ambiente. 13. Lavar os poços 5X com TBST. 14. Revelar com Turbo TMB.

Ensaio medindo a função de fosforilação de RAF. 0 seguinte ensaio refere a quantidade de fosforilação catalisada por RAF da sua proteína alvo MEK, assim como o alvo MAPK de MEK. A sequência génica de RAF é descrita em Bonner et al., 1985, Molec. Cell. Biol., 5:1400-1407 e é facilmente acessível em múltiplos bancos de dados de sequências génicas. A construção do vector de ácido nucleico e linhas celulares utilizadas para esta porção da invenção são totalmente descritas 90 em Morrison et al.r 1988, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 85:8855-8859.

Materiais e Reagentes 1. Células Sf9 (Spodoptera frugiperda) , GIBCO-BRL,

Gaithersburg, MD. 2. Tampão de RIPA: Tris/HCl a 20 mM, pH 7,4, NaCl a 137 mM, glicerol a 10%, PMSF a 1 mM, Aprotenina a 5 mg/L, Triton X-100 a 0,5%,

3. Proteína de fusão tioredoxina-MEK (T-MEK): A expressão e purificação de T-MEK por cromatografia de afinidade são realizadas de acordo com os processos do fabricante. Catálogo N° K 350-01 e R 350-40, Invitrogen Corp., San Diego, CA 4. His-MAPK (ERK 2), MAPK com cauda de His é expresso em células XL1 Blue transformadas com o vector pUC18 codificando His-MAPK. O His-MAPK é purificado por cromatografia de afinidade de Ni. Cat N° 27-4949-01, Pharmacia, Alameda, CA, como aqui descrito. 5. IgG de ovelha anti-murganho: Jackson laboratories, West Grove, PA. Catálogo, N° 515-006-008, Lote N° 28563 6. Anticorpo específico de proteína cinase RAF-1: URP2653 da UBI. 7. Tampão de revestimento: PBS, solução salina tamponada com fosfatos, GIBCO-BRL, Gaithersburg, MD. 91 8. Tampao de lavagem: TBST (Tris/HCL a 50 mM, pH 7,2, NaCl a 150 mM, Triton X-100 a 0,1%). 9. Tampão de bloqueio: TBST, etanolamina a 0,1%, pH 7,4

10. DMSO, Sigma, St. Louis, MO 11. Tampão de cinase (KB): HEPES/HC1 a 20 mM, pH 7,2, NaCl a 150 mM, Triton X-100 a 0,1%, PMSF a 1 mM, Aprotenina a 5 mg/L, ortovanadato de sódio a 75 mM, DTT a 0,5 MM e MgCl2 a 10 mM. 12. Mistura de ATP: MgCl2 a 100 mM, ATP a 300 mM, γ33Ρ ATP a 10 mCi (Dupont-NEN)/mL. 13. Solução de paragem: ácido fosfórico a 1%, Fisher, Pittsburgh, PA. 14. Mantas filtrantes de Fosfato de Celulose Wallac, Wallac, Turku, Finlândia. 15. Solução de lavagem de filtro: ácido fosfórico a 1%, Fisher, Pittsburgh, PA. 16. Recolhedor de placas Tomtec, Wallac, Turku, Finlândia. 17. Leitor de placas Wallac beta N° 1205, Wallac, Turku, Finlândia. 18. Placas de polipropileno de fundo em V de 96 poços NUNC para compostos, Applied Scientific, Catálogo N° AS-72092. 92

Processo

Todas as etapas seguintes sao conduzidas à temperatura ambiente, salvo especificamente indicado em contrário. 1. Revestimento de placa de ELISA: Os poços de ELISA são revestidos com 100 mL de anti-soro de Ovelha anti-murganho purificado por afinidade (1 mg/100 mL de tampão de revestimento), de um dia para o outro, a 4 °C. Quando armazenadas a 4 °C, as placas de ELISA podem ser utilizadas durante duas semanas. 2. Inverter a placa e remover o liquido. Adicionar 100 mL de solução de bloqueio e incubar durante 30 min. 3. Remover a solução de bloqueio e lavar, quatro vezes, com tampão de lavagem. Bater a placa num toalhete de papel para remover o liquido em excesso. 4. Adicionar 1 mg de anticorpo especifico para RAF-1 a cada poço e incubar durante 1 hora. Lavar como descrito na etapa 3. 5. Descongelar os lisados das células Sf9 infectadas com RAS/RAF e diluir com TBST para 10 mg/100 mL. Adicionar 10 mg de lisado diluido aos poços e incubar durante 1 hora. Agitar a placa durante a incubação. Os controlos negativos não recebem lisado. Os lisados das células de insecto Sf9 infectadas com RAS/RAF são preparados depois de as células serem infectadas com baculovirus recombinantes, a uma MOI de 5 para cada vírus e recolhidas 48 horas mais tarde. As células são lavadas, uma vez, com PBS e lisadas em tampão de RIPA. O material insolúvel é removido por centrifugação (5 min, a 10000 x g). As alíquotas 93 dos lisados sao congeladas em gelo seco/etanol e armazenadas, a -80 °C, até à sua utilização. 6. Remover material não ligado e lavar como delineado acima (etapa 3). 7. Adicionar 2 mg de T-MEK e 2 mg de His-MAEPK por poço e ajustar o volume para 40 mL com tampão de cinase. Os métodos para purificação de T-MEK e MAPK a partir dos extractos celulares são aqui proporcionados para exemplo. 8. Pré-diluir os compostos (solução stock de DMSO a 10 mg/mL) ou os extractos 20 vezes em TBST mais DMSO a 1%. Adicionar 5 mL dos compostos/extractos pré-diluídos aos poços descritos na etapa 6. Incubar durante 20 min. Os controlos não recebem fármaco. 9. Iniciar a reacção de cinase pela adição de 5 mL de mistura de ATP, agitar as placas num agitador de placas de ELISA durante a incubação. 10. Parar a reacção de cinase após 60 min por adição de 30 mL de solução de paragem a cada poço. 11. Colocar a manta filtrante de fosfocelulose e a placa de ELISA num recolhedor de placas Tomtec. Recolher e lavar o filtro com a solução de lavagem de filtro de acordo com a recomendação do fabricante. Secar as mantas filtrantes. Selar as mantas filtrantes e colocá-las no suporte. Inserir o suporte no aparelho de detecção radioactivo e quantificar o fósforo radioactivo nas mantas filtrantes. 94

Alternativamente, alíquotas de 40 mL de poços individuais da placa de ensaio podem ser transferidas para as correspondentes posições na manta filtrante de fosfocelulose. Após secagem dos filtros ao ar, colocar os filtros num tabuleiro. Oscilar suavemente o tabuleiro, mudando a solução de lavagem em intervalos de 15 min, durante 1 hora. Secar as mantas filtrantes ao ar. Selar as mantas filtrantes e colocá-las num suporte adequado para medição do fósforo radioactivo nas amostras. Inserir o suporte num dispositivo de detecção e quantificar o fósforo radioactivo nas mantas filtrantes.

Ensaio de Inibição de CDK2/Ciclina A

Este ensaio analisa a actividade de proteína cinase de CDK2 em substrato exógeno.

Reagentes: A. Tampão A: (Tris a 80 mM (pH 7,2), MgCl2 a 40 mM) , 4,84 g de Tris (F.W. = 121,1 g/mol), 4,07 g de MgCl2 (F.W.=203,31 g/mol) dissolvido em 500 mL de H20. Ajustar o pH para 7,2 com HC1. B. Solução de Histona Hl (Histona Hl a 0,45 mg/mL e HEPES a 20 mM pH 7,2: 5 mg de Histona Hl (Boehinger Mannheim) em 11,111 mL de HEPES a 2 0 mM, pH 7, 2 (477 mg de HEPES (F.W.= 238,3 g/mol) dissolvida em 100 mL de ddH20, armazenada em alíquotas de 1 mL, a -80 °C. 95 C. Solução de ATP (ATP a 60 μΜ, BSA a 300 pg/mL, DTT a 3 mM) : 120 pL de ATP a 10 mM, 600 pL de BSA a 10 mg/mL para 20 mL, armazenada em alíquotas de 1 mL, a -80 °C. D. Solução de CDK2: cdk2/ciclina A em HEPES a 10 mM, pH 7,2, NaCl a 25 mM, DTT a 0,5 mM, glicerol a 10%, armazenada em alíquotas de 9 pL, a -80 °C.

Protocolo 1. Preparar as soluções dos inibidores a três vezes a concentração de ensaio final desejada em ddH20/DMS0 a 15%, em volume. 2. Dispensar 20 pL dos inibidores nos poços de placas de polipropileno de 96 poços (ou 20 pL de DMSO a 15% para controlos positivos e negativos). 3. Descongelar a solução de Histona Hl (1 mL/placa), solução de ATP (1 mL/placa mais 1 alíquota para controlo negativo) e solução de CDK2 (9 pL/placa) . Manter CDK2 sobre gelo até à sua utilização. Aliquotar a solução de CDK2 apropriadamente, para evitar ciclos repetidos de congelação-descongelação. 4. Diluir 9 pL de solução de CDK2 em 2,1 mL de Tampão A (por placa). Mistura. Dispensar 20 pL em cada poço. 5. Misturar 1 mL de solução de Histona Hl com 1 mL de solução de ATP (por placa) num tubo com tampa de rosca de 10 mL. Adicionar γ33Ρ ATP para uma concentração de 0,15 pCi/20 pL (0,15 pCi/poço no ensaio). Misturar cuidadosamente para evitar 96 que o BSA espume. Adicionar 20 pL a poços apropriados. Misturar as placas num agitador de placas. Para controlo negativo, misturar solução de ATP com uma quantidade igual de HEPES a 20 mM, pH 7,2 e adicionar γ33Ρ ATP para uma concentração de 0,15 pCi/20 pL de solução. Adicionar 20 pL a poços apropriados. 6. Deixar as reacções continuar durante 60 minutos. 7. Adicionar 35 pL de TCA a 10% a cada poço. Misturar as placas num agitador de placas. 8. Aplicar em ponto 40 pL de cada amostra sobre quadrados de mantas filtrantes P30. Deixar as mantas secar (aprox. 10-20 minutos). 9. Lavar as mantas filtrantes 4 X 10 minutos com 250 mL de ácido fosfórico a 1% (10 mL de ácido fosfórico por litro de ddH20). 10. Contar as mantas filtrantes com leitor beta de placas.

Ensaios Celulares/Biológicos

Ensaio de Incorporação de BrdU Induzido por PDGF Materiais e Reagentes: (1) PDGF: PDGF B/B humano, 1276-956, Boehringer Mannheim, Alemanha. 97 (2) Reagente de Marcaçao de BrdU: 10 mM, em PBS (pH 7,4),

Cat. N° 1647229, Boehringer Mannheim, Alemanha. (3) FixDenat: solução de fixação (pronta a utilizar), Cat. N° 1647229, Boehringer Mannheim, Alemanha. (4) Anti-BrdU-POD: anticorpo monoclonal de murganho conjugado com peroxidase, Cat. N° 1647229, Boehringer Mannheim, Alemanha. (5) Solução de Substrato de TMB: tetrametilbenzidina (TMB), pronta a utilizar, Cat. N° 1647229, Boehringer Mannheim, Alemanha. (6) Solução de Lavagem de PBS: IX PBS, pH 7,4 (Sugen, Inc., Redwood City, Califórnia). (7) Albumina, Bovina (BSA) : fracção V em pó, A-8551, Sigma Chemical Co., EUA. (8) linha celular 3T3 geneticamente manipulada para expressar PDGF-R humano.

Protocolo (1) As células são semeadas a 8000 células/poço em DMEM, CS a 10%, Gin a 2 mM, numa placa de 96 poços. As células são incubadas, de um dia para o outro, a 37 °C, em CO2 a 5%. 98 (2) Após 24 horas, as células são lavadas com PBS e, depois,

são submetidas a inanição de soro em meio isento de soro (DMEM de CS a 0% com BSA a 0,1%), durante 24 horas. (3) No dia 3, ligando (PDGF, 3,8 nM, preparado em DMEM com BSA a 0,1%) e compostos de teste são adicionados às células simultaneamente. Os poços de controlo negativo recebem DMEM isento de soro com BSA a 0,1% apenas, as células de controlo positivo recebem o ligando (PDGF) mas não composto de teste. Os compostos de teste são preparados em DMEM isento de soro com ligando, numa placa de 96 poços e serialmente diluídos para 7 concentrações de teste. (4) Após 20 horas de activação de ligando, o reagente de marcação de BrdU diluído (1:100 em DMEM, BSA a 0,1%) é adicionado e as células são incubadas com BrdU (concentração final = 10 μΜ), durante 1,5 horas. (5) Após incubação com reagente de marcação, o meio é removido por decantação e batimento da placa invertida num toalhete de papel. A solução FixDenat é adicionada (50 pL/poço) e as placas são incubadas, à temperatura ambiente, durante 45 minutos, num agitador de placas. (6) A solução de FixDenat é exaustivamente removida por decantação e batimento da placa invertida num toalhete de papel. É adicionado leite (leite desidratado a 5% em PBS, 200 pL/poço) como uma solução de bloqueio e a placa é incubada, durante 30 minutos, à temperatura ambiente, num agitador de placas. (7) A solução de bloqueio é removida por decantação e

os poços são lavados, uma vez, com PBS. Solução de Anti-BrdU-POD 99 (diluição 1:100 em PBS, BSA a 1%) é adicionada (100 yL/poço) e a placa é incubada, durante 90 minutos, à temperatura ambiente, num agitador de placas. (8) O conjugado de anticorpo é exaustivamente removido por decantação e lavagem dos poços, 5 vezes, com PBS e a placa é seca por inversão e batimento num toalhete de papel. (9) A solução de substrato de TMB é adicionada (100 pL/poço) e incubada, durante 20 minutos, à temperatura ambiente, num agitador de placas, até que o desenvolvimento de cor seja suficiente para detecção fotométrica. (10) A absorvência das amostras é medida a 410 nm (em modo de "comprimento de onda duplo", com um filtro lendo a 490 nm, como um comprimento de onda de referência) num leitor de placas de ELISA Dynatech.

Ensaio de Incorporação de BrdU Induzido por EGF Materiais e Reagentes (1) EGF: EGF de murganho, 201, Toyobo, Co., Ltd. Japão. (2) Reagente de Marcação de BrdU: 10 mM, em PBS (pH 7,4), Cat. N° 1647229, Boehringer Mannheim, Alemanha. (3) FixDenat: solução de fixação (pronta a utilizar), Cat. N° 1647229, Boehringer Mannheim, Alemanha. 100 (4) Anti-BrdU-POD: anticorpo monoclonal de murganho conjugado com peroxidase, Cat. N° 1647229, Boehringer Mannheim, Alemanha. (5) Solução de Substrato de TMB: tetrametilbenzidina (TMB), pronta a utilizar, Cat. N° 1647229, Boehringer Mannheim, Alemanha. (6) Solução de Lavagem de PBS: IX PBS, pH 7,4 (Sugen, Inc., Redwood City, Califórnia). (7) Albumina, Bovina (BSA) : fracção V em pó, A-8551, Sigma Chemical Co., EUA. (8) linha celular 3T3 geneticamente manipulada para expressar EGF-R humano.

Protocolo (1) As células são semeadas a 8000 células/poço em CS a 10%, Gin a 2 mM em DMEM, numa placa de 96 poços. As células são incubadas, de um dia para o outro, a 37 °C, em C02 a 5%. (2) Após 24 horas, as células são lavadas com PBS e, depois, são submetidas a inanição de soro em meio isento de soro (DMEM de CS a 0% com BSA a 0,1%), durante 24 horas. (3) No dia 3, ligando (EGF, 2 nM, preparado em DMEM com BSA a 0,1%) e compostos de teste são adicionados às células simultaneamente. Os poços de controlo negativo recebem DMEM isento de soro com BSA a 0,1% apenas, as células de controlo 101 positivo recebem o ligando (EGF) mas não composto de teste. Os compostos de teste são preparados em DMEM isento de soro com ligando, numa placa de 96 poços e serialmente diluídos para 7 concentrações de teste. (4) Após 20 horas de activação de ligando, o reagente de marcação de BrdU diluído (1:100 em DMEM, BSA a 0,1%) é adicionado e as células são incubadas com BrdU (concentração final = 10 μΜ), durante 1,5 horas. (5) Após incubação com reagente de marcação, o meio é removido por decantação e batimento da placa invertida num toalhete de papel. A solução FixDenat é adicionada (50 pL/poço) e as placas são incubadas, à temperatura ambiente, durante 45 minutos, num agitador de placas. (6) A solução de FixDenat é exaustivamente removida por decantação e batimento da placa invertida num toalhete de papel. É adicionado leite (leite desidratado a 5% em PBS, 200 pL/poço) como uma solução de bloqueio e a placa é incubada, durante 30 minutos, à temperatura ambiente, num agitador de placas. (7) A solução de bloqueio é removida por decantação e os poços são lavados, uma vez, com PBS. Solução de Anti-BrdU-POD (diluição 1:100 em PBS, BSA a 1%) é adicionada (100 pL/poço) e a placa é incubada, durante 90 minutos, à temperatura ambiente, num agitador de placas. (8) 0 conjugado de anticorpo é exaustivamente removido por decantação e lavagem dos poços, 5 vezes, com PBS e a placa é seca por inversão e batimento num toalhete de papel. 102 (9) A solução de substrato de TMB é adicionada (100 yL/poço) e incubada, durante 20 minutos, à temperatura ambiente, num agitador de placas, até que o desenvolvimento de cor seja suficiente para detecção fotométrica. (10) A absorvência das amostras é medida a 410 nm (em modo de "comprimento de onda duplo", com um filtro lendo a 490 nm, como um comprimento de onda de referência) num leitor de placas de ELISA Dynatech.

Incorporação de BrdU Dirigida por Her2 Induzida por EGF

Materiais e Reagentes (1) EGF: EGF de murganho, 201, Toyobo, Co., Ltd. Japão (2) Reagente de Marcação de BrdU: 10 mM, em PBS (pH 7,4), Cat. N° 1647229, Boehringer Mannheim, Alemanha. (3) FixDenat: solução de fixação (pronta a utilizar), Cat. N° 1647229, Boehringer Mannheim, Alemanha. (4) Anti-BrdU-POD: anticorpo monoclonal de murganho conjugado com peroxidase, Cat. N° 1647229, Boehringer Mannheim, Alemanha. (5) Solução de Substrato de TMB: tetrametilbenzidina (TMB), pronta a utilizar, Cat. N° 1647229, Boehringer Mannheim, Alemanha. 103 (6) Solução de Lavagem de PBS: IX PBS, pH 7,4, preparada domesticamente. (7) Albumina, Bovina (BSA) : fracção V em pó, A-8551, Sigma Chemical Co., EUA. (8) Linha celular 3T3 manipulada para expressar um receptor quimérico tendo o domínio extracelular de EGF-R e o domínio intracelular de Her2.

Protocolo

(1) As células são semeadas a 8000 células/poço em DMEM, CS a 10%, Gin a 2 mM, numa placa de 96 poços. As células são incubadas, de um dia para o outro, a 37 °C, em CO2 a 5%. (2) Após 24 horas, as células são lavadas com PBS e, depois, são submetidas a inanição de soro em meio isento de soro (DMEM de CS a 0% com BSA a 0,1%), durante 24 horas.

(3) No dia 3, ligando (EGF = 2 nM, preparado em DMEM com BSA a 0,1%) e compostos de teste são adicionados às células simultaneamente. Os poços de controlo negativo recebem DMEM isento de soro com BSA a 0,1% apenas, as células de controlo positivo recebem o ligando (EGF) mas não composto de teste. Os compostos de teste são preparados em DMEM isento de soro com ligando, numa placa de 96 poços e serialmente diluídos para 7 concentrações de teste. (4) Após 20 horas de activação de ligando, o reagente de marcação de BrdU diluído (1:100 em DMEM, BSA a 0,1%) é 104 adicionado e as células são incubadas com BrdU (concentração final = 10 pM) , durante 1,5 horas. (5) Após incubação com reagente de marcação, o meio é removido por decantação e batimento da placa invertida num toalhete de papel. A solução FixDenat é adicionada (50 pL/poço) e as placas são incubadas, à temperatura ambiente, durante 45 minutos, num agitador de placas. (6) A solução de FixDenat é exaustivamente removida por decantação e batimento da placa invertida num toalhete de papel. É adicionado leite (leite desidratado a 5% em PBS, 200 pL/poço) como uma solução de bloqueio e a placa é incubada, durante 30 minutos, à temperatura ambiente, num agitador de placas. (7) A solução de bloqueio é removida por decantação e os poços são lavados, uma vez, com PBS. Solução de Anti-BrdU-POD (diluição 1:100 em PBS, BSA a 1%) é adicionada (100 pL/poço) e a placa é incubada, durante 90 minutos, à temperatura ambiente, num agitador de placas. (8) O conjugado de anticorpo é exaustivamente removido por decantação e lavagem dos poços, 5 vezes, com PBS e a placa é seca por inversão e batimento num toalhete de papel. (9) A solução de substrato de TMB é adicionada (100 pL/poço) e incubada, durante 20 minutos, à temperatura ambiente, num agitador de placas, até que o desenvolvimento de cor seja suficiente para detecção fotométrica. (10) A absorvência das amostras é medida a 410 nm (em modo de "comprimento de onda duplo", com um filtro lendo a 490 nm, 105 como um comprimento de onda de referência) num leitor de placas de ELISA Dynatech.

Ensaio de Incorporação de BrdU Induzido por IGFl

Materiais e Reagentes (1) Ligando de IGFl: humano, recombinante, G511, Promega Corp, EUA. (2) Reagente de Marcação de BrdU: 10 mM, em PBS (pH 7,4), Cat. N° 1647229, Boehringer Mannheim, Alemanha. (3) FixDenat: solução de fixação (pronta a utilizar), Cat. N° 1647229, Boehringer Mannheim, Alemanha. (4) Anti-BrdU-POD: anticorpo monoclonal de murganho conjugado com peroxidase, Cat. N° 1647229, Boehringer Mannheim, Alemanha. (5) Solução de Substrato de TMB: tetrametilbenzidina (TMB), pronta a utilizar, Cat. N° 1647229, Boehringer Mannheim, Alemanha. (6) Solução de Lavagem de PBS: IX PBS, pH 7,4 (Sugen, Inc., Redwood City, Califórnia). (7) Albumina, Bovina (BSA): fracção V em pó, A-8551, Sigma Chemical Co., EUA. 106 (8) linha celular 3T3 geneticamente manipulada para expressar receptor de IGF-1 humano.

Protocolo (1) As células são semeadas a 8000 células/poço em DMEM, CS a 10%, Gin a 2 mM, numa placa de 96 poços. As células são incubadas, de um dia para o outro, a 37 °C, em CO2 a 5%. (2) Após 24 horas, as células são lavadas com PBS e, depois,

são submetidas a inanição de soro em meio isento de soro (DMEM de CS a 0% com BSA a 0,1%), durante 24 horas. (3) No dia 3, ligando (IGF1 = 3,3 nM, preparado em DMEM com BSA a 0,1%) e compostos de teste são adicionados às células simultaneamente. Os poços de controlo negativo recebem DMEM isento de soro com BSA a 0,1% apenas, as células de controlo positivo recebem o ligando (IGF1) mas não composto de teste. Os compostos de teste são preparados em DMEM isento de soro com ligando, numa placa de 96 poços e serialmente diluídos para 7 concentrações de teste. (4) Após 16 horas de activação de ligando, o reagente de marcação de BrdU diluído (1:100 em DMEM, BSA a 0,1%) é adicionado e as células são incubadas com BrdU (concentração final = 10 μΜ), durante 1,5 horas. (5) Após incubação com reagente de marcação, o meio é removido por decantação e batimento da placa invertida num toalhete de papel. A solução FixDenat é adicionada (50 pL/poço) 107 e as placas são incubadas, à temperatura ambiente, durante 45 minutos, num agitador de placas. (6) A solução de FixDenat é exaustivamente removida por decantação e batimento da placa invertida num toalhete de papel. É adicionado leite (leite desidratado a 5% em PBS, 200 pL/poço) como uma solução de bloqueio e a placa é incubada, durante 30 minutos, à temperatura ambiente, num agitador de placas. (7) A solução de bloqueio é removida por decantação e os poços são lavados, uma vez, com PBS. Solução de Anti-BrdU-POD (diluição 1:100 em PBS, BSA a 1%) é adicionada (100 pL/poço) e a placa é incubada, durante 90 minutos, à temperatura ambiente, num agitador de placas. (8) O conjugado de anticorpo é exaustivamente removido por decantação e lavagem dos poços, 5 vezes, com PBS e a placa é seca por inversão e batimento num toalhete de papel. (9) A solução de substrato de TMB é adicionada (100 pL/poço) e incubada, durante 20 minutos, à temperatura ambiente, num agitador de placas, até que o desenvolvimento de cor seja suficiente para detecção fotométrica. (10) A absorvência das amostras é medida a 410 nm (em modo de "comprimento de onda duplo", com um filtro lendo a 490 nm, como um comprimento de onda de referência) num leitor de placas de ELISA Dynatech. 108

Ensaio de Incorporação de BrdU Induzido por FGF

Este ensaio mede a síntese de ADN induzida por FGF em células 3Tc7/EGFr que expressam receptores de FGF endógenos.

Materiais e Reagentes: 1. FGF: FGF2/bFGF humano (Gibco BRL, N° 13256-029). 2. Reagente de marcação de BrdU (PBS a 10 mM (pH 7,4), Boehringer Mannheim Cat N° 1647229). 3. Solução de fixação Fixdenat (Boehringer Mannheim

Cat N° 1647 229). 4. Anti-BrdU-POD (anticorpo monoclonal de murganho conjugado com peroxidase, Boehringer Mannheim Cat. N° 1647229). 5. TMB (tetrametilbenzidina, Boehringer Mannheim Cat. N° 1647229). 6. Solução de lavagem de PBS, pH 7,4 (Sugen, Inc.). 7. Albumina, bovina (BSA), fracção V em pó (Sigma Chemical Co., Cat. N° A-8551). 109

Processo 1. Linha celular 3T3 manipulada: 3T3c7/EGFr. 2. As células são semeadas a 8000 células/poço em DMEM, CS a 10% e Gin a 2 M, numa placa de 96 poços. Incubar 24 horas, a 37 °C, em C02 a 5%. 3. Após 24 horas, lavar as células com PBS, depois, submeter a inanição de soro em meio isento de soro (0% de DMEM, BSA a 0,1%), durante 24 horas. 4. Adicionar ligando (FGF2 (1,5 nM em DMEM com BSA a 0,1%) e composto de teste simultaneamente. Os poços de controlo negativo recebem DMEM isento de soro com BSA a 0,1% apenas, os poços de controlo positivo recebem ligando FGF2 mas não composto de teste. Os compostos de teste são preparados em DMEM isento de soro com ligando, numa placa de 96 poços e serialmente diluidos para preparar sete (7) concentrações de teste. 5. Após 20 horas, adicionar reagente de marcação de BrdU diluido (1:100 BrdU:DMEM, BSA a 0,1%, a concentração final é 10 μΜ) às células e incubar durante 1,5 horas. 6. Decantar o meio. Remover vestígios de material com toalhete de papel. Adicionar FixDenat (50 pL/poço) e incubar, à temperatura ambiente, durante 45 minutos, num agitador de placas. 7. Remover a solução Fixdenat. Adicionar solução de bloqueio (leite desidratado a 5% em PBS (200 pL/poço)) e incubar, durante 30 minutos, à temperatura ambiente, num agitador de placas. 110 8. Decantar a solução de bloqueio, lavar os poços, uma vez, com PBS. Adicionar solução de anti-BrdU-POD (diluição 1:100 em PBS, BSA a 1%), incubar durante 90 minutos, à temperatura ambiente, num agitador de placas. 9. Decantar o conjugado de anticorpo, enxaguar os poços, 5 vezes, com PBS. Secar a placa pela inversão em toalhete de papel e batimento. 10. Adicionar solução de TMB (100 pL/poço), incubar 20 minutos, à temperatura ambiente, num agitador de placas, até que o desenvolvimento de cor seja suficiente para detecção fotométrica. 11. Medir a absorvência a 410 nM num leitor de placas de ELISA Dynatech utilizando o modo de "Comprimento de onda duplo", com um filtro a 490 nM.

Ensaio Bioquímico de EGFR

Este ensaio mede a actividade de cinase in vitro de EGFR utilizando ELISA.

Materiais e Reagentes 1. Placas de ELISA de 96 poços Corning (Catálogo Corning N° 25805-96). 2. Anticorpo SUMOl anti-EGFR monoclonal (Biochemistry Lab, SUGEN, Inc.). 111 3. PBS (Solução Salina Tamponada com Fosfatos de Dulbecco),

Catálogo Gibco N° 450-1300EB). 4. Tampão de TBST

Reagente P.M. Concentração de Trabalho Quantidade por L Tris 121,14 5 0 mM 6,057 g NaCl 58,44 150 mM 8, 766 g Triton X- 10 0 NA 0,1% 1,0 mL

Tampão de Bloqueio: Reagente P.M. Concentração de Quantidade por Trabalho 10 0 mL Leite Magro Instant Carnation 5% 5,0 g PBS NA NA 10 0 mL Lisado celular A431 (Screening Lab, SUGEN, Inc.) Tampao de TBS : Reagente P.M. Concentração de Quantidade por L Trabalho Tris 121, 14 5 0 mM 6,057 g NaCl 58,44 150 mM 8, 766 g 112 8. TBS + DMSO a 10%

Reagente P.M. Concentração de Quantidade por L

Trabalho

Tris 121,14 50 mM 1,514 g

NaCl 58,44 150 mM 2,192 g

DMSO NA 10% 25 mL 9. Adenosina-5'-trifosfato (ATP, de músculo Equino, Sigma Cat. N° A-5394).

Preparar uma solução a 1,0 mM em dH20. Este reagente deve ser preparado imediatamente antes da utilização e mantido sobre gelo. 10. MnCl2 ·

Preparar uma solução stock a 1,0 mM em dH20. 11. Mistura de fosforilação de ATP/MnCl2

Reagente Solução Quantidade por Concentração de stock 10 mL Trabalho

ATP 1, 0 mM 300 yL 3 0 pM MnCl2 1, 0 M 500 pL 5 0 mM dH20 9,2 mL

Este reagente deve ser preparado imediatamente antes da utilização e mantido sobre gelo. 12. Placas de polipropileno de fundo em V de 96 poços NUNC (Applied Scientific Cat. N° AS-72092). 113 13. Ácido etilenodiaminotetraacético (EDTA)

Preparar uma solução de trabalho a 200 mM em dH20. Ajustar o pH 8,0 com NaOH a 10 N. 14. Soro policlonal de coelho anti-fosfotirosina (Biochemistry Lab, SUGEN, Inc.) 15. IgG de cabra anti-coelho conjugado a peroxidase (Biosource Cat. N° ALI0404) 16. ABTS (ácido 2,2'-azino-bis(3-etilbenztiazolino-6- sulfónico), Sigma Cat. N° A-1888).

Reagente P.M. Concentração de Trabalho por L Quantidade Ácido Cítrico 192,12 100 mM 19,21 g Na2HP04 141,96 250 mM 35,49 g ABTS NA 0,5 mg/mL 500 mg

Misturar os primeiros dois ingredientes em cerca de 900 mL de dH20, ajustar o pH para 4,0 com ácido fosfórico. Adicionar ABTS, tapar, deixar repousar cerca de 0,5 h, filtrar. A solução deve ser mantida no escuro, a 4 °C, até estar pronta a utilizar. 17. Solução de peróxido de hidrogénio a 30% (Fisher Cat. N° H325) 18. ABTS/H202 114

Misturar 15 mL de solução de ABTS e 2,0 pL de H2O2. Preparar 5 minutos antes da utilização. 19. HC1 a 0,2 M.

Processo 1. Revestir placas de ELISA de 96 poços Corning com 0,5 pg de SUMOl em 100 pL de PBS por poço, armazenar, de um dia para o outro, a 4 °C. 2. Remover SUMOl não ligado dos poços, pela inversão da placa para remover o líquido. Lavar lx com dH20. Bater a placa num toalhete de papel para remover o líquido em excesso. 3. Adicionar 150 pL de Tampão de Bloqueio a cada poço. Incubar durante 30 min., à temperatura ambiente, com agitação. 4. Lavar a placa 3x com água desionizada, depois, uma vez, com TBST. Bater a placa num toalhete de papel para remover o líquido e bolhas em excesso. 5. Diluir o lisado em PBS (7 pg de lisado/100 pL de PBS). 6. Adicionar 100 pL de lisado diluído a cada poço. Agitar, à temperatura ambiente, durante 60 min. 7. Lavar as placas como descrito em 4, acima. 8. Adicionar 120 pL de TBS às placas de ELISA contendo EGFR capturado. 115 9. Diluir o composto de teste 1:10 em TBS em placas de polipropileno de 96 poços (i. e., 10 pL de composto + 90 pL de TBS) . 10. Adicionar 13,5 pL de composto de teste diluído à placa de ELISA. A poços de controlo (poços que não recebem qualquer composto de teste), adicionar 13,5 pL de TBS + DMSO a 10%. 11. Incubar durante 30 minutos agitando, simultaneamente, à temperatura ambiente. 12. Adicionar 15 pL de mistura de fosforilação directamente a todos os poços, excepto o poço de controlo negativo que não recebe ATP/MnCl2 (o volume de poço final deve ser, aproximadamente, 150 pL, com concentração final de ATP a 3 pM/MnCl2 a 5 mM em cada poço) . Incubar 5 minutos, agitando simultaneamente. 13. Após 5 minutos, parar a reacção pela adição de 16,5 pL de EDTA a 200 mM (pH 8,0) a cada poço, agitando continuamente. Depois de o EDTA ter sido adicionado, agitar durante 1 min. 14. Lavar 4x com água desionizada, duas vezes, com TBST. 15. Adicionar 100 pL de anti-fosfotirosina (diluição 1:3000 em TBST) por poço. Incubar 30-45 min., à temperatura ambiente, com agitação. 16. Lavar como descrito em 4, acima. 116 17. Adicionar 100 pL de IgG de Cabra anti-coelho conjugado a peroxidase Biosource (diluição 1:2000 em TBST) a cada poço. Incubar 30 min, à temperatura ambiente, com agitação. 18. Lavar como descrito em 4, acima. 19. Adicionar 100 pL de solução de ABTS/H2C>2 a cada poço. 20. Incubar 5 a 10 minutos, com agitação. Remover quaisquer bolhas. 21. Se necessário, parar a reacção com a adição de 100 pL de HC1 a 0,2 M por poço. 22. Ler o ensaio no leitor de ELISA Dynatech MR7000 Filtro de Teste: 410 nM. Filtro de referência: 630 Nm.

Ensaio Bioquímico de PDGFR

Este ensaio mede a actividade de cinase in vitro de PDGFR utilizando ELISA.

Materiais e Reagentes

Salvo indicação em contrário, a preparação da solução de trabalho dos seguintes reagentes é a mesma que para o ensaio Bioquímico de EGFR, acima. 1. Placas de ELISA de 96 poços Corning (Catálogo Corning N° 25805-96). 117 2. Anticorpo 28D4C10 anti-PDGFR monoclonal (Biochemistry Lab, SUGEN, Inc.). 3. PBS (Solução Sal ina Tamponada com Fosfatos de Dulbecco), Catálogo Gibco N° 450-1300EB). 4. Tampão de TBST. 5. Tampão de Bloqueio. 6. Lisado celular de NIH 3T3 expressando PDGFR-β (Screening Lab, SUGEN, Inc.). 7. Tampão de TBS. 8. TBS + DMSO a 10%. 9. Adenosina-5'-trifosfato (ATP, de músculo Equino, Sigma Cat. N° A-5394). 10. MnCl2. 11. Mistura de fosforilação de tampão de cinase.

Reagente Solução Quantidade por Concentração de stock 10 mL Trabalho

Tris 1 M 250 pL 25 mM NaCl 5 M 200 pL 100 mM MnCl2 1 M 100 pL 10 mM TX-100 100 mM 50 pL 0,5 mM 118 12. Placas de polipropileno de fundo em V de 96 poços NUNC (Applied Scientific Cat. N° AS-72092). 13. Ácido etilenodiaminotetraacético (EDTA). 14. Soro policlonal de coelho anti-fosfotirosina (Biochemistry Lab, SUGEN, Inc.). 15. igG de cabra anti-coelho conjugado a peroxidase (Biosource Cat. N° ALI0404). 16. Ácido 2,2'-azino-bis(3-etilbenztiazolino-6-sulfónico) (ABTS, Sigma Cat. N° A-1888). 17. Solução de peróxido de hidrogénio a 30% (Fisher Cat. N° H325) . 18. ABTS/H202 . 19. HC1 a 0,2 M.

Processo 1. Revestir placas de ELISA de 96 poços Corning com 0,5 pg de 28D4C10 em 100 pL de PBS por poço, armazenar, de um dia para o outro, a 4 °C. 2. Remover 28D4C10 não ligado dos poços, pela inversão da placa para remover o liquido. Lavar lx com dH20. Bater a placa num toalhete de papel para remover o liquido em excesso. 119 3. Adicionar 150 pL de Tampão de Bloqueio a cada poço. Incubar durante 30 min., à temperatura ambiente, com agitação. 4. Lavar a placa 3x com água desionizada, depois, uma vez, com TBST. Bater a placa num toalhete de papel para remover o liquido e bolhas em excesso. 5. Diluir o lisado em HNTG (10 pg de lisado/100 pL de HNTG) 6. Adicionar 100 pL de lisado diluído a cada poço. Agitar, à temperatura ambiente, durante 60 min. 7. Lavar as placas como descrito em 4, acima. 8. Adicionar 80 pL de mistura de tampão de cinase de trabalho à placa de ELISA contendo PDGFR capturado. 9. Diluir o composto de teste 1:10 em TBS em placas de polipropileno de 96 poços (i. e., 10 pL de composto + 90 pL de TBS) . 10. Adicionar 10 pL de composto de teste diluído à placa de ELISA. A poços de controlo (poços que não recebem qualquer composto de teste), adicionar 10 pL de TBS + DMSO a 10%. 11. Incubar durante 30 minutos agitando, simultaneamente, à temperatura ambiente. 12. Adicionar 10 pL de ATP directamente a todos os poços, excepto o poço de controlo negativo (o volume de poço final deve ser, aproximadamente, 100 pL, com ATP a 20 pM em cada poço) . Incubar 30 minutos, agitando simultaneamente. 120 13. Após 30 minutos, parar a reacçao pela adição de 10 pL de EDTA a 200 mM (pH 8,0) a cada poço. 14. Lavar 4x com água desionizada, duas vezes, com TBST. 15. Adicionar 100 pL de anti-fosfotirosina (diluição 1:3000 em TBST) por poço. Incubar 30-45 min., à temperatura ambiente, com agitação. 16. Lavar como descrito em 4, acima. 17. Adicionar 100 pL de IgG de Cabra anti-coelho conjugado a peroxidase Biosource (diluição 1:2000 em TBST) a cada poço. Incubar 30 min., à temperatura ambiente, com agitação. 18. Lavar como descrito em 4, acima. 19. Adicionar 100 pL de solução de ABTS/H202 a cada poço. 20. Incubar 10 a 30 minutos, com agitação. Remover quaisquer bolhas. 21. Se necessário, parar a reacção com a adição de 100 pL de HC1 a 0,2 M por poço. 22. Ler o ensaio no leitor de ELISA Dynatech MR7000: filtro de teste: 410 nM, filtro de referência: 630 nM. 121

Ensaio Bioquímico de FGFR

Este ensaio mede a actividade de cinase in vitro da proteína de fusão Myc-GyrB-FGFR utilizando ELISA.

Materiais e Reagentes 1. HNTG Reagente P.M. Concentração de Stock 5x Quantidade por L Concentração de Trabalho lx HEPES 238,3 10 0 mM 23,83 g 2 0 mM NaCl 58,44 75 0 mM 43,83 g 150 mM Glicerol NA 50% 50 0 mL 10% Triton X-100 NA 5% 10 mL 1,0%

Para preparar um litro de solução stock a 5x, dissolver HEPES e NaCl em cerca de 350 mL de dlhO, ajustar o pH para 7,2 com HC1 ou NaOH (dependendo do HEPES que é utilizado) , adicionar glicerol, Triton X-100 e, depois, dH20 para volume. 2. PBS (Solução Salina Tamponada com Fosfatos de Dulbecco, Catálogo Gibco N° 450-1300EB). 3. Tampão de Bloqueio. 122 4. Tampão de Cinase Reagente P.M. Concentração de Stock lOx Concentração de Trabalho lx HEPES (pH 7,2) 238,3 50 0 mM 5 0 mM MnCl2 2 0 mM 2 mM MgCl2 203,32 200 mM 10 mM Triton-X-10 0 1% 0, 1% DTT 380,35 5 mM 0,5 mM 5. Fluoreto de fenilmetilsulfonilo (PMSF, Sigma, Cat. N° P-7626):

Solução de trabalho: 100 mM em etanol. 6. ATP (Fonte bacteriana, Sigma Cat. N° A-7699)

Utilizar 3,31 mg por mL de H20 MilliQ, para uma concentração de stock de 6 mM. 7. Mab anti-fosfotirosina conjugado a biotina (clone 4G10, Upstate Biotechnology Inc. Cat. N° 16-103, Ser. N° 14495). 8. Reagente Vectastain Elite ABC (conjugado de peroxidase de Avidina, Vector Laboratories Cat. N° PK-6 100).

9. Solução de ABTS 10. Solução de peróxido de hidrogénio a 30% (Catálogo Fisher N° H325). 11. ABTS/H202. 123 12. HC1 a 0,2 M. 13. TRIS HC1 (Fischer Cat. N° BP 152-5).

Preparar solução a 1,0 mM em H20 MilliQ, ajustar 7,2 com HC1. 14. NaCl (Fisher Cat. N° S271-10).

Preparar solução a 5 M em H20 MilliQ. 15. MgCl2 (Fisher Cat. N° M33-500).

Prepare solução a 1 M em H20 MilliQ. 16. HEPES (Fisher Cat, N° BP310-500).

Preparar solução a 1 mM em H20 MilliQ, ajustar 7,5, esterilizar por filtração. 17. Tampão de TBST. 18. Tampão de Carbonato de Sódio (Fisher Cat. N° :

Preparar solução a 0,1 M em H20 MilliQ, ajustar 9,6 com NaOH, filtrar. 19. Ditiotreitol (DTT, Fisher Cat. N° BP172-25).

Preparar solução de trabalho a 0,5 mM em H imediatamente antes da utilização. Armazenar a -20 utilizada, descartar quaisquer restos. o pH para o pH para 495) . o pH para 20 MilliQ, °C até ser 124 20. MnCl2. 21. Triton X-100. 22. IgG de Cabra α-Coelho (Cappel). 23. α GST GyrB de Coelho purificado por afinidade (Biochemistry Lab. SUGEN, Inc.).

Processo

Todas as etapas seguintes são conduzidas à temperatura ambiente, salvo indicação em contrário. 1. Revestir placas de ELISA de 96 poços Corning com 2 pg de anticorpo de Cabra α-Coelho por poço em Tampão de Carbonato, de modo que o volume de poço total seja 100 pL. Armazenar, de um dia para o outro, a 4 °C. 2. Remover anticorpo de Cabra a-Coelho não ligado, pela inversão da placa para remover o líquido. Bater a placa num toalhete de papel para remover o líquido e bolhas em excesso 3. Adicionar 150 pL de Tampão de Bloqueio (Leite Pobre em Matéria gorda a 5% em PBS) a cada poço. Incubar agitando, simultaneamente, num agitador de placas de microtitulação, durante 30 min. 4. Lavar 4x com TBST. Bater a placa num toalhete de papel para remover o líquido e bolhas em excesso. 125 5. Adicionar 0,5 yg de anticorpo de Coelho a-GyrB por poço. Diluir o anticorpo em DPBS para um volume final de 100 yL por poço. Incubar, com agitação, num agitador de placas de microtitulação, à temperatura ambiente, durante 1 hora. 6. Lavar 4x com TBST, como descrito na etapa 4. 7. Adicionar 2 yg de lisado celular de COS/FGFR (fonte de Myc-GyrB-FGFR) em HNTG a cada poço, para proporcionar um volume final de 100 yL por poço. Incubar, com agitação, num agitador de placas de microtitulação, durante 1 hora. 8. Lavar 4X com TBST, como descrito na etapa 4. 9. Adicionar 80 yL de tampão de cinase a lx por poço. 10. Diluir o composto de teste 1:10 em tampão de cinase a lx + DMSO a 1% numa placa de polipropileno de 96 poços. 11. Transferir 10 yL de solução de composto de teste diluída e poços de controlo dos poços da placa de polipropileno para os correspondentes poços da placa de ELISA, incubar, com agitação, num agitador de placas de microtitulação, durante 20 minutos. 12. Adicionar 10 yL de ATP a 70 yM diluído em tampão de cinase a poços de controlo positivo e teste (a concentração de ATP final é 7 yM/poço). Adicionar 10 yL de tampão de cinase a lx a poços de controlo negativo. Incubar, com agitação, num agitador de placas de microtitulação, durante 15 min. 13. Parar a reacção de cinase, pela adição de 5 yL de EDTA a 0,5 M a todos os poços. 126 14. Lavar 4x com TBST, como descrito na etapa 4. 15. Adicionar 100 pL de mab de α-fosfotirosina conjugado a biotina (b4G10) diluído em TBST a cada poço. Incubar, com agitação, num agitador de placas de microtitulação, durante 30 minutos. 16. Preparar o reagente Vectastain ABC. Adicionar 1 gota de reagente A a 15 mL de TBST. Misturar pela inversão do tubo várias vezes. Adicionar 1 gota de reagente B e misturar novamente. 17. Lavar 4x com TBST, como descrito na etapa 4. 18. Adicionar 100 pL de reagente ABC HRP a cada poço. Incubar, com agitação, num agitador de placas de microtitulação, durante 30 minutos. 19. Lavar 4x com TBST, como descrito na etapa 4. 20. Adicionar 100 pL de solução de ABTS/H2O2 a cada poço. 22. Incubar 5 a 15 minutos, com agitação. Remover quaisquer bolhas. 23. Se necessário, para a reacção pela adição de 1 00 pL de HC1 a 0,2 M/poço. 24. Ler o ensaio no Leitor de Placas de ELISA Dynatech MR7000, filtro de teste: 410 nM, filtro de referência: 630 nM. 127

Ensaio Bioquímico de FLK-1

Este ensaio avalia a actividade de autofosforilaçao de flk-1 in vitro utilizando ELISA.

Materiais E Reagentes 1. Placas de cultura de tecidos de 15 cm

2. Células Flk-l/NIH: Linha de fibroblastos de NIH sobreexpressando o clone 3 de flk-1 humano (SUGEN, Inc., obtido de MPI, Martinsried, Alemanha). 3. Meio de crescimento: DMEM mais FBS a 10% inactivado por calor e Glutamina a 2 mM (Gibco-BRL). 4. Meio de inanição: DMEM mais FBS a 0,5% inactivado por calor, Glutamina a 2 mM (Gibco-BRL). 5. Placas de ELISA de 96 poços Corning (Corning Cat. N° 25805-96). 6. Anticorpo L4 ou E38 monoclonal específico para flk-1, Purificado por cromatografia de afinidade de agarose de Proteína A (SUGEN, Inc.). 7. PBS (Solução Salina Tamponada com Fosfatos de Dulbecco), Gibco Cat. N° 450-1300EB). 8. HNTG (ver FGFR BIOQUÍMICO para preparação). 128 9. Kit de determinação de proteína Pierce BCA. 10. Tampao de bloqueio 11. TBST (pH 7,0) 12. Tampão de Cinase 13. Solução de Paragem de Cinase: EDTA a 200 mM. 14. 4G10 biotinilado, específico para fosfotirosina (UBI, Cat. N° 16-103). 15. Kit AB (Vector Laboratories Cat. N° PK 4000) .

16. DMSO 17. Placas de polipropileno de fundo em V de 96 poços NUNC (Applied Scientific Cat. N° AS-72092). 18. Turbo-TMB (Pierce). 19. Solução de paragem Turbo-TMB: H2S04 a 1 M. 20. ATP (Sigma Cat. N° A-7699). 21. DMSO a 20% em TBS (pH 7,0). 129

Processo

Crescimento Celular e Preparação de Lisado. 1. Semear as células em meio de crescimento e cultivar, durante 2-3 dias, até 90-100% de confluência, a 37 °C e C02 a 5%. Não exceder a passagem N° 20. 2. Remover o meio e lavar as células, duas vezes, com PBS. Lisar com tampão de lise de HNTG. Recolher todos os lisados e misturá-los, por agitação em vórtice, durante 20-30 segundos. 3. Remover material insolúvel por centrifugação (5-10 min, a cerca de 10000 xg). 4. Determinar a concentração de proteína utilizando o kit de BCA. 5. Particionar o lisado em aliquotas de 1 mg, armazenar a -80 °C.

Processo de Ensaio 1. Revestir placas de ELISA de 96 poços Corning com 2 yg/poço de L4 purificado (ou E 38) em 100 μL de PBS. Armazenar, de um dia para o outro, a 4 °C. 2. Remover proteínas não ligadas dos poços, pela inversão da placa, para remover o liquido. Lavar uma vez com dH20, bater a placa num toalhete de papel para remover o líquido em excesso. 130 3. Bloquear as placas com 150 pL de tampao de bloqueio por poço. Incubar durante 45-60 minutos, com agitação, a 4 °C. 4. Remover o tampão de bloqueio e lavar a placa de ELISA, três vezes, com dH20 e uma vez com TBST. Bater a placa para toalhete de papel para remover o líquido em excesso. 5. Diluir o lisado em PBS para proporcionar uma concentração final de 50 pg/100 pL. Adicionar 100 pL de lisado diluído a cada poço. Incubar, com agitação, a 4 °C, de um dia para o outro. 6. Remover proteínas não ligadas dos poços, pela inversão da placa. Lavar como na etapa 4. 7. Adicionar 80 pL de tampão de cinase aos poços (90 pL aos poços de controlo negativo). 8. Diluir os compostos de teste (normalmente, 10 vezes) em poços de uma placa de polipropileno contendo DMSO a 20% em TBS. 9. Adicionar 10 pL dos compostos diluídos aos poços de ELISA contendo flk-1 imobilizado e agitar. Os poços de controlo não recebem compostos. 10. Do stock de ATP a 1 mM, preparar solução de ATP a 0,3 mM em dH20 (alternativamente, pode ser utilizado tampão de cinase). 11. Adicionar 10 pL de ATP a 0,3 mM a todos os poços, excepto os controlos negativos. Incubar durante 60 min., à temperatura ambiente, com agitação. 131 12. Após 1 h, parar a reacçao de cinase, pela adição de 11 pL de EDTA a 200 mM. Agitar durante 1-2 min. 13. Lavar a placa de ELISA, 4 vezes, com dH20 e, duas vezes, com TBST. 14. Adicionar 100 pL de 4G10:TBST biotinilado 1:5000 a todos os poços. Incubar 45 min, com agitação, à temperatura ambiente. 15. Enquanto o acima está a incubar, adicionar 50 pL das soluções A & B do kit ABC a 10 mL de TBST. Estas soluções devem ser combinadas, aproximadamente, 30 min, antes da utilização. 16. Lavar as placas como na etapa 4. 17. Adicionar 100 pL do complexo A & B pré-formado a todos os poços. Incubar 30 min, com agitação, à temperatura ambiente. 18. Lavar as placas como na etapa 4. 19. Adicionar 100 pL de turbo-TMB. Agitar, à temperatura ambiente, durante 10-15 min. 20. Quando a cor nos poços de controlo positivo atinge uma absorvência de cerca de 0,35 - 0,4, parar a reacção com 100 pL de solução de paragem turbo-TMB. 21. Ler as placas no leitor de ELISA Dynatech MR7000, filtro de teste: 450 nM, filtro de referência: 410 nM. 132

Ensaio de HUV-EC-C 0 seguinte protocolo também pode ser utilizado para medir a actividade de um composto contra PDGF-R, FGF-R, VEGF, aFGF ou Flk-l/KDR, sendo todos eles naturalmente expressos por células HUV-EC. DIA 0 1. Lavar e tripsinizar as células HUV-EC-C (células endoteliais de veia umbilical humana, (American Type Culture Collection, catálogo N° 1730 CRL). Lavar com solução salina tamponada com fosfatos de Dulbecco (D-PBS, obtida de Gibco BRL, catálogo N° 14190-029), 2 vezes, a cerca de 1 mL/10 cm1 de frasco de cultura de tecidos. Tripsinizar com tripsina-EDTA a 0,05% em solução de dissociação celular não enzimática (Sigma Chemical Company, catálogo N° C-1544) . A tripsina a 0,05% é preparada pela diluição de tripsina a 0,25%/EDTA a 1 mM (Gibco, catálogo N° 25200-049) na solução de dissociação celular. Tripsinizar com cerca de 1 mL/25-30 cm1 de frasco de cultura de tecidos, durante cerca de 5 minutos, a 37 °C. Depois de as células se terem desprendido do frasco, adicionar um volume igual de meio de ensaio e transferir para um tubo de centrífuga estéril de 50 mL (Fisher Scientific, catálogo N° 05-539-6). 133 1

Lavar as células com cerca de 35 mL de meio de ensaio no tubo de centrífuga estéril de 50 mL, pela adição do meio de ensaio, centrifugar durante 10 minutos a, aproximadamente, 200x g, aspirar o sobrenadante e ressuspender com 35 mL de D-PBS. Repetir a lavagem mais duas vezes com D-PBS, ressuspender as células em cerca de 1 mL de meio de ensaio/15 cm1 do frasco de cultura de tecidos. 0 meio de ensaio consiste no meio F12K (Gibco BRL, catálogo N° 21127-014) e soro bovino fetal a 0,5%, inactivado por calor. Contar as células com um Coulter Counter® (Coulter Electronics, Inc.) e adicionar meio de ensaio às células para se obter uma concentração de 0,8-1,0 x 105 células/mL. 3. Adicionar as células a placas de fundo raso de 96 poços, a 100 pL/poço ou 0,8-1,0 x 104 células/poço, incubar ~24 h, a 37 °C, C02 a 5%. DIA 1 1. Preparar titulações de composto de teste duplas em placas de 96 poços separadas, em geral 50 μΜ até 0 μΜ. Utilizar o mesmo meio de ensaio como mencionado no dia 0, etapa 2, acima. As titulações são realizadas pela adição de 90 pL/poço de composto de teste, a 200 μΜ (4X a concentração de poço final), ao poço de topo de uma coluna de placa particular. Visto que o stock de composto de teste é, habitualmente, 20 mM em DMSO, a concentração de fármaco de 200 μΜ contém DMSO a 2%.

Um diluente preparado a DMSO a 2% em meio de ensaio (F12K + soro bovino fetal a 0,5%) é utilizado como diluente para as titulações de composto de teste, de modo a diluir o composto de teste mas manter a concentração de DMSO constante. Adicionar este diluente aos poços restantes na coluna, a 60 pL/poço. Retirar 60 pL dos 120 pL da diluição de composto de teste a 200 pM no poço de topo da coluna e misturar com os 60 pL no 134 segundo poço da coluna. Retirar 60 pL desde poço e misturar com os 60 pL no terceiro poço da coluna e etc., até que as titulações duplas sejam completadas. Quando o penúltimo poço é misturado, retirar 60 pL dos 120 pL neste poço e descartá-los. Deixar o último poço com 60 pL de diluente de DMSO/meios como o controlo não contendo composto de teste. Preparar 9 colunas de composto de teste titulado, suficientes para poços em triplicado, cada para: (1) VEGF (obtido de Pepro Tech Inc., catálogo N° 100-200, (2) factor de crescimento de célula endotelial (ECGF) (também conhecido como factor de crescimento de fibroblastos acídico, ou aFGF) (obtido de Boehringer Mannheim Biochemica, catálogo N° 1439600) ou (3) PDGF B/B humano (1276-956, Boehringer Mannheim, Alemanha) e controlo de meios de ensaio. O ECGF vem como uma preparação com heparina sódica. 2. Transferir 50 pL/poço das diluições de composto de teste para as placas de ensaio de 96 poços contendo as 0,8-l,0xl04 células/100 pL/poço das células HUV-EC-C do dia 0 e incubar, ~2 h, a 37 °C, CO2 a 5%. 3. Em triplicado, adicionar 50 pL/poço de VEGF a 80 pg/mL, ECGF a 20 ng/mL ou controlo de meios a cada condição de composto de teste.

Como com os compostos de teste, as concentrações de factor de crescimento são 4X a concentração final desejada. Utilizar os meios de ensaio da etapa 2 do dia 0 para preparar as concentrações dos factores de crescimento. Incubar aproximadamente 24 horas, a 37 °C, CO2 a 5%. Cada poço terá 50 pL de diluição de composto de teste, 50 pL de factor de crescimento ou meios e 100 pL de células, o que dá um total calculado de 200 pL/poço. Deste modo, assim que tudo tenha sido adicionado 135 aos poços, as concentrações de 4X de composto de teste e factores de crescimento ficam IX. DIA 2 1. Adicionar 3H-timidina (Amersham, catálogo N° TRK-686) a 1 pCi/poço (10 pL/poço de solução a 100 pCi/mL, preparada em meios RPMI + soro bovino fetal a 10% inactivado por calor) e incubar ~24 h, a 37 °C, CO2 a 5%. O RPMI é obtido de Gibco BRL, catálogo N° 11875-051. DIA 3 1. Congelar as placas, de um dia para o outro, a -20 °C. DIA 4

Descongelar as placas e recolher com um recolhedor de placas de 96 poços (Tomtec Harvester 96®) em mantas filtrantes (Wallac, catálogo N° 1205-401), ler as contagens num contador de cintilação liquida Wallac Betaplate™.

Modelos Animais In Vivo

Modelos Animais de Xenoenxerto A capacidade de os tumores humanos crescerem como xenoenxertos em murganhos atímicos (e. g., Balb/c, nu/nu), 136 proporciona um modelo útil in vivo para o estudo da resposta biológica a terapias para tumores humanos. Desde a primeira xenotransplantação bem sucedida de tumores humanos em murganhos atimicos, (Rygaard e Povlsen, 1969, Acta Pathol. Microbial. Scand. 77:758-760), muitas linhas celulares tumorais humanas diferentes (e. g., mamária, pulmonar, genitourinária, gastrointestinal, cabeça e pescoço, glioblastoma, óssea e melanomas malignos) foram transplantadas e cresceram com êxito em murganhos atimicos. Os seguintes ensaios podem ser utilizados para determinar o nível de especificidade de actividade e efeito dos diferentes compostos aqui descritos. Três tipos gerais de ensaios são úteis para avaliação de compostos: celular/catalítico, celular/biológico e in vivo. 0 objectivo dos ensaios celulares/catalíticos é determinar o efeito de um composto na capacidade de uma TK fosforilar tirosinas num substrato conhecido numa célula. 0 objectivo dos ensaios celulares/biológicos é determinar o efeito de um composto na resposta biológica estimulada por uma TK numa célula. O objectivo dos ensaios in vivo é determinar o efeito de um composto num modelo animal de um distúrbio particular, tal como cancro.

As linhas celulares adequadas para experiências de xenoenxerto subcutâneo incluem células C6 (glioma, ATCC N° CCL 107), células A375 (melanoma, ATCC N° CRL 1619), células A431 (carcinoma epidermóide, ATCC N° CRL 1555), células Caiu 6 (pulmão, ATCC N° HTB 56), células PC3 (próstata, ATCC N° CRL 1435) , células SKOV3TP5 e fibroblastos NIH 3T3 geneticamente manipulados para sobreexpressarem EGFR, PDGFR, IGF-1R ou qualquer outra cinase de teste. O seguinte protocolo pode ser utilizado para realizar experiências de xenoenxertos: 137

Murganhos fêmea atímicos (BALB/c, nu/nu) são obtidos de Simonsen Laboratories (Gilroy, CA) . Todos os animais são mantidos sob condições de sala limpa em gaiolas Micro-isolator com cama Alpha-dri. Recebem ração para roedor estéril e água ad libitum.

As linhas celulares são cultivadas em meio apropriado (por exemplo, MEM, DMEM, FIO de Ham ou F12 de Ham, mais 5% - 10% de soro bovino fetal (PBS) e glutamina a 2 mM (GLN) ) . Todos os meios de cultura celular, glutamina e soro bovino fetal são adquiridos a Gibco Life Technologies (Grand Island, N.I.), salvo especificado em contrário. Todas as células são cultivadas numa atmosfera húmida de ar a 90-95% e CO2 a 5-10%, a 37 °C. Todas as linhas celulares são rotineiramente subcultivadas, duas vezes por semana e são negativas para micoplasma, como determinado pelo método de Mycotect (Gibco).

As células são recolhidas a confluência, ou próximo de confluência, com Tripsina-EDTA a 0,05% e sedimentadas a 450 x g, durante 10 min. Os sedimentos são ressuspensos em PBS estéril ou meios (sem FBS) para uma concentração particular e as células são implantadas no flanco posterior dos murganhos (8-10 murganhos por grupo, 2 - 10 x 106 células/animal). O crescimento tumoral é medido ao longo de 3 a 6 semanas, utilizando compassos de Vernier. Os volumes tumorais são calculados como um produto do comprimento x largura x altura, salvo indicado em contrário. Os valores de P são calculados utilizando o teste t de Student. Os compostos de teste in 50 - 100 pL de excipiente (DMSO ou VPD:D5W) podem ser distribuídos por injecção IP a diferentes concentrações começando, em geral, no dia um após a implantação. 138

Modelo de Invasão de Tumor 0 seguinte modelo de invasão de tumor foi desenvolvido e pode ser utilizado para a avaliação do valor e eficácia terapêuticos dos compostos identificados como inibindo selectivamente o receptor de KDR/FLK-1.

Processo

Os murganhos nus, de 8 semanas de idade (fêmea) (Simonsen Inc.), são utilizados como animais experimentais. A implantação de células tumorais pode ser realizada numa câmara de fluxo laminar. Para anestesia, o Cocktail de Xilazina/Cetamina (cetamina a 100 mg/kg e Xilazina a 5 mg/kg) é administrado intraperitonealmente. Uma incisão de linha média é feita para expor a cavidade abdominal (aproximadamente, 1,5 cm em comprimento), para injectar 107 células tumorais, num volume de 100 pL de meio. As células são injectadas no lobo duodenal do pâncreas ou sob a serosa do cólon. O peritoneu e músculos são fechados com uma sutura continua de seda 6-0 e a pele é fechada pela utilização de agrafos. Os animais são observados diariamente.

Análise

Após 2-6 semanas, dependendo de observações grosseiras dos animais, os murganhos são sacrificados e as metástases tumorais locais de diversos órgãos (pulmão, fígado, cérebro, estômago, baço, coração, músculo) são excisadas e analisadas (medição de 139 tamanho de tumor, grau de invasao, imunoquímica, determinação de hibridação in situ, etc.)·

Medição De Toxicidade Celular

Os compostos terapêuticos devem ser mais potentes a inibirem a actividade de tirosina cinase receptora do que a exercerem um efeito citotóxico. Uma medida da eficácia e toxicidade celular de um composto pode ser obtida pela determinação do índice terapêutico, i. e., IC50/LD50. A IC50, a dose requerida para alcançar 50% de inibição, pode ser medida utilizando técnicas padrão, tal como as aqui descritas. LD50, a dosagem que resulta em 50% de toxicidade, também pode ser igualmente medida por técnicas padrão (Mossman, 1983, J. Immunol, Methods, 65:55-63), pela medição da quantidade de LDH libertada (Korzeniewski e Callewaert, 1983, J. Immunol. Methods, 64:313, Decker e Lohmann-Matthes, 1988, J. Immunol. Methods, 115:61) ou pela medição da dose letal em modelos animais. Os compostos com um grande índice terapêutico são preferidos. O índice terapêutico deve ser superior a 2, de um modo preferido, pelo menos, 10, de um modo mais preferido, pelo menos, 50. B. Exemplos - Actividade Biológica.

Os exemplos da potência in vitro do composto desta invenção são mostrados na Tabela 1. Os dados mostram que o composto é, em geral, bastante potente contra uma variedade de PTK in vitro. O composto também mantém excelente actividade, quando testado in vivo. Por exemplo, o composto enumerado nas reivindicações (composto 5) , quando administrado oralmente, exibe um marcado 140 tamanho médio reduzido de tumores de glioma C6, subcutaneamente implantados em murganhos. De facto, o Composto 5 foi notavelmente superior aos outros compostos testados. Numa experiência, as células de glioma humano C6 (3 X 106 células, n = 10 - 20 animais/grupo) foram implantadas subcutaneamente no flanco posterior de murganhos nu/nu BALB/c fêmea, no dia 0. A administração oral dos compostos 3, 5, 19 e 20 em labrasol aquoso, a 200 mg/kg/dia, começou um dia pós-implantação. O crescimento tumoral foi medido utilizando compassos de Vernier e os volumes tumorais foram calculados como o produto do comprimento x largura x altura.

Como mostrado no gráfico seguinte, todos os compostos testados mostraram uma marcada inibição, comparativamente com apenas controlo de transportador. Contudo, o composto 5 claramente e, considerando a semelhança estrutural próxima dos compostos testados, surpreendentemente, destaca-se dos restantes. Ou seja, enquanto os compostos 3, 19 e 21 agrupam-se 141 em cerca de 40 - 45% de inibição de crescimento tumoral no dia 18 pós-implantação, o composto 5 inibe o crescimento tumoral em 80 - 85% nesse ponto.

composto 5 oral, é ainda in vivo, demonstrada A eficácia inesperada do particularmente após administração quando é comparada ao composto 65:

142 0 composto 65 manifesta uma potência quase uma ordem de grandeza maior in vitro do que o composto 5 (dados não mostrados). Contudo, quando testado intraperitonealmente em murganhos contra duas linhas tumorais celulares diferentes, SF763T e SF767T, o composto 5 é desde ligeiramente (inibição 5% maior aos 21 dias) a notavelmente (inibição 14% maior aos 21 dias) mais eficaz do que o composto 65. A diferença em actividade entre o composto 5 e composto 65 é ainda maior quando os dois compostos são administrados oralmente. A eficácia oral do composto 65 e vários dos seus análogos, compostos 66 - 69, é mostrada graficamente abaixo:

143

δ& êl &R

Como pode ser verificado a partir do gráfico, o composto 65, administrado oralmente, a 200 mg/kg/dia, mostra aproximadamente 65% de inibição dos tumores C6 aos 18 dias pós-implantação subcutânea em murganhos, a qual é claramente superior aos seus próprios análogos, os quais perfazem uma média de cerca de 14 - 16% de inibição do crescimento tumoral.

Surpreendentemente, contudo, a eficácia oral do composto 65 é ainda notavelmente inferior à do composto 5 que, como notado acima, demonstra 80-85% de inibição no mesmo tempo, no mesmo modelo de tumor. 144

Quando comparado com o composto 70, o composto 5 mostra Ki (constantes de inibição) significativamente mais pequena (i. e., maior potência) contra FGF-R1 (1,2 para o composto 5 versus 19,49 para o composto 70) e PDGFR (dados não mostrados). CHj

A superioridade inesperada do composto 5 é, ainda, demonstrada, quando a sua eficácia oral é comparada com a do análogo próximo, o composto 71:

21 Não obstante a semelhança estrutural, quando testado oralmente, a 200 mg/kg/dia, contra tumores de melanoma humano C6 subcutaneamente implantados em murganhos BALB/c nu/nu, aos 18 dias pós-implantação, o composto 71 mostra apenas uma inibição de 57% do crescimento tumoral (dados não mostrados) comparada, de novo, com a inibição de 80-85%, demonstrada pelo composto 5. 145

Com base na eficácia surpreendente, acima, do composto 5, quando administrado oralmente, o composto 5 é, presentemente, uma forma de realização preferida desta invenção. 0 âmbito da presente invenção é determinado pelas seguintes reivindicações.

Lisboa, 6 de Setembro de 2013 146

Claims (7)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Composição farmacêutica compreendendo: ácido 3-[2,4-dimetil-5-(2-oxo-l,2-di-hidroindol-3- ilidenometil)-lH-pirrol-3-il]-propiónico ou um seu sal; e pelo menos, um veículo farmaceuticamente aceitável, para utilização num método para o tratamento de um distúrbio relacionado com proteína cinase num organismo, em que o referido distúrbio relacionado com proteína cinase é seleccionado do grupo consistindo em cancro, diabetes, um distúrbio de hiperproliferação, angiogénese, um distúrbio inflamatório, um distúrbio imunológico e um distúrbio cardiovascular, em que o referido método compreende administrar oralmente a referida composição farmacêutica ao referido organismo.
2. 2. Composição farmacêutica para utilização de acordo com a reivindicação 1, em que o referido cancro é seleccionado do grupo consistindo em carcinoma espinocelular, astrocitoma, sarcoma de Kaposi, glioblastoma, cancro do pulmão, cancro da bexiga, cancro da cabeça e pescoço, melanoma, cancro dos ovários, cancro da próstata, cancro da mama, cancro das células pequenas do pulmão, glioma, cancro colorrectal, cancro genitourinário e cancro gastrointestinal.
3. 3. Composição farmacêutica para utilização de acordo com a reivindicação 1, em que a doença é cancro das células pequenas do pulmão.
4. 4. Composição farmacêutica para utilização de acordo com a reivindicação 1, em que o distúrbio hiperproliferativo é seleccionado do grupo consistindo em restenose, fibrose e psoriase.
5. 5. Composição farmacêutica para utilização de acordo com a reivindicação 1, em que o distúrbio inflamatório é seleccionado do grupo consistindo em osteoartrite e artrite reumatóide.
6. 6. Composição farmacêutica para utilização de acordo com a reivindicação 1, em que o distúrbio imunológico é uma doença auto-imune.
7. 7. Composição farmacêutica para utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, em que o referido organismo é um mamífero. Lisboa, 6 de Setembro de 2013 2