CN1747950A - 用于治疗眼病的作为蛋白激酶抑制剂的2－(1h－吲唑－6－基氨基)－苯甲酰胺化合物 - Google Patents

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Abstract

本发明描述了调节和/或抑制眼病和某些蛋白激酶活性的吲唑化合物。这些化合物和含有它们的药物组合物能够介导酪氨酸激酶信号转导且由此调节和/或抑制不需要的细胞增殖。本发明还涉及含有这类化合物的药物组合物的治疗或预防用途并涉及通过给药有效量的这类化合物治疗眼病和癌症和其它与不需要的血管发生和/或细胞增殖相关的疾病状态的方法，所述的其它与不需要的血管发生和/或细胞增殖相关的疾病状态诸如糖尿病性视网膜病、新生血管性青光眼、类风湿性关节炎和银屑病。

Description

用于治疗眼病的作为蛋白激酶抑制剂的 2-(1H-吲唑-6-基氨基)-苯甲酰胺化合物
相关申请的交叉参考
本申请要求2002年12月19日提交的美国临时专利申请US60/434,902的利益，为所有目的而将该文献的全部内容引入本文作为参考。
发明领域
本发明涉及介导和/或抑制眼病和某些蛋白激酶活性的吲唑化合物和含有这类化合物的药物组合物。本发明还涉及这类化合物和组合物的治疗或预防用途并涉及通过给药有效量的这类化合物治疗眼病和癌症以及其它与不需要的血管发生和/或细胞增殖相关的疾病状态的方法。
发明背景
眼后段的几种疾病和疾患威胁视力。与年龄相关的黄斑变性(ARMD或AMD)、脉络膜新血管形成(CNV)、视网膜病(例如糖尿病性视网膜病、玻璃体视网膜病变、早产儿视网膜病)、视网膜炎(例如巨细胞病毒(CMV)视网膜炎)、葡萄膜炎、黄斑水肿和青光眼是几个实例。
与年龄相关的黄斑变性(ARMD或AMD)是中老年人失明的主要原因。ARMD攻击视觉中心并使其模糊，使得阅读、驾驶和其它具体工作变得困难或不可能。仅在美国每年就有约200,000个ARMD新病例发生。目前的估计显示在年龄超过75岁的人群中大约有40％且在年龄超过60岁的人群中大约有20％患有一定程度的黄斑变性。″湿性″ARMD是最常见致盲的ARMD类型。在湿性ARMD中，新近形成的脉络膜血管(脉络膜新血管形成(CNV))渗漏流体并导致视网膜逐步损害。在ARMD中的特定CNV病例中，目前研发了两种主要治疗方法：(a)光凝固术；和(b)应用血管发生抑制剂。
然而，光凝固术可能对视网膜有害且在CNV位于凹附近时不实用。此外，光凝固术通常在一段时间内导致复发性CNV。还在试验口服给药抗血管形成化合物作为ARMD的***性治疗方法。不过，由于药物特异性代谢限制，所以全身给药通常对眼提供了不足的治疗药物水平。因此，为了达到有效的眼内药物浓度，需要不可接受的高剂量或反复的常规剂量。还研发了各种植入物将抗血管形成化合物局部递送至眼。这类植入物的实例公开在Wong的美国专利US 5,824,072、Gwon等的美国专利US 5,476,511和Ashton等的美国专利US 5,773,019中，为所有目的而将每篇文献的全部内容引入本文作为参考。
眼部新生血管疾病
如上所述，本发明还提供了治疗眼新生血管疾病的方法，所述的眼新生血管疾病包括：例如角膜新血管形成、新生血管性青光眼、增殖型糖尿病性视网膜病、晶状体后纤维增生症(retrolental fbiroblasia)和黄斑变性。
简单的说，作为前段损伤结果的角膜新血管形成是视力下降和失明的重要原因和角膜同种异体移植物排斥的主要危险因素。正如Burger等在Lab，Invest.48：169-180，1983中所述的，角膜血管生成包括三个阶段：血管前潜伏期、新血管形成活跃期以及血管成熟和退化期，为所有目的而将该文献的全部内容引入本文作为参考。还必须揭示出各种血管形成因素的本性和机制，包括炎症反应因子，诸如白细胞、血小板、细胞因子和类二十烷酸类或未鉴定的血浆成分。
目前，临床上没有抑制角膜新血管形成或存在的角膜新血管退化的令人满意的疗法。局部用皮质类固醇看起来具有一定的临床应用性，据推定它通过限制间质炎症而起作用。
因此，本发明在一个方面中提供了治疗诸如角膜新血管形成(包括角膜移植物新血管形成)的眼新生血管疾病的方法，包括对患者角膜给药治疗有效量的抗血管形成组合物(如上所述)的步骤，使得血管形成得到抑制。简单的说，角膜是通常缺乏血管的组织。然而，在某些病理情况中，毛细血管可以从边缘的外周血管丛延伸入角膜。当角膜血管化时，它也变模糊，导致患者视力下降。如果角膜完全不透明，那么视力就会完全丧失。
血管可以以不同模式和深度进入角膜，这取决于刺激新血管形成的过程。这些模式在传统上由眼科学家限定为如下类型：沙眼血管翳、麻风性血管翳、泡性血管翳(pannus phylctenulosus)、变性血管翳和青光眼角膜翳。角膜基质中还可以侵入睫状前动脉分支(称作间质性血管化作用)，导致几种不同的临床损害：″刷样″模式、伞形、格栅形末端环、间质弓(来自巩膜外层血管)和异常不规则血管。
许多种病症可以导致角膜新血管形成，包括：例如角膜感染(例如沙眼、单纯疱疹性角膜炎、利什曼病和盘尾丝虫病)、免疫过程(例如移植物排斥和史-约综合征)、碱烧伤、创伤、炎症(任何原因的炎症)、中毒和营养缺乏状态以及佩戴隐形眼镜的并发症。
尽管角膜新血管形成的原因可以改变，但是角膜对损伤的反应和随后的血管向内生长物相似而与所述的原因无关。简单的说，损伤的位置看起来是重要的，因为仅那些位于边缘临界距离内的损害会刺激血管形成反应。这可能是如下事实所致：导致引起血管侵害的血管形成因子在损害部位生成且必须扩散至最近血管部位(边缘)以发挥其作用。在从边缘经过一定距离后，这种情况不再可能发生且不会诱发缘内皮生长入角膜。几种血管形成因子可能涉及该过程，它们中的许多为炎症反应的产物。实际上，角膜新血管形成仅因炎性细胞浸润而发生且血管发生程度与炎性反应程度成正比。角膜水肿通过使角膜间质结构松弛并提供毛细血管可以生长的″最小阻力″途经而有利于血管向内生长。
在最初的炎性反应后，毛细血管生长入角膜因在其它组织中出现而以相同方式继续进行。边缘毛细血管和小静脉的正常休眠内皮细胞受到刺激而***并迁移。内皮细胞延伸至远离其血管起点、消化周围基底膜和它们所经过的组织并迁移至血管形成刺激物源。盲端芽获得腔且然后彼此吻合成毛细血管袢。最终结果为在角膜基质内建立血管丛。
本发明的抗血管形成因子和组合物通过阻断血管发生促进剂的刺激作用、减少内皮细胞***、减少内皮细胞迁移并减弱内皮分泌的蛋白水解酶活性而起作用。
发明概述
在本发明特别优选的实施方案中，可以制备用于在盐水中(与常用于眼用制剂的任意防腐剂和抗菌剂合并)局部给药的抗血管形成因子并以滴眼剂形式给药。可以制备纯形式的抗血管形成因子溶液或混悬液且每天给药几次。另一方面，还可以将如上所述制备的抗血管形成组合物直接对角膜给药。
在优选的实施方案中，使用与角膜粘合的粘膜粘着剂聚合物制备抗血管形成组合物。在其它实施方案中，可以将抗血管形成因子或抗血管形成组合物用作常规类固醇疗法的辅助物。
局部疗法还可以预防性地用于已知具有诱发血管形成反应(诸如化学灼伤)高度可能性的角膜损害。在这些情况中，可以直接建立可能与类固醇联用的疗法用于帮助预防随后的并发症。
在其它实施方案中，眼科医师可以在显微镜指导下将上述抗血管形成组合物直接注入角膜基质。优选的注射部位可以根据各个损害的形态而改变，但给药目的是将组合物置于脉管***前部(即散布在血管与正常角膜之间)。在大部分情况中，这一过程可以包括角膜缘周注射以″防止″角膜增加血管。这种方法还可以在角膜损伤后不久使用以预防性地防止角膜新血管形成。在这种情况中，可以将所述物质注射在散布在角膜损害与其不需要的潜在边缘供血之间的角膜缘周中。这类方法还可以以类似方式使用以预防植入角膜的毛细血管侵害。对于缓释剂型，每年仅需要注射2-3次。还可以将Asteroid加入到注射溶液中以减轻因注射本身导致的炎症。
本发明在另一个方面中提供了治疗新生血管性青光眼的方法，包括对患者眼部给药治疗有效量的抗血管形成组合物的步骤，使得血管形成得到抑制。
简单的说，新生血管性青光眼是一种病理情况，其中新毛细血管在眼虹膜中发生。血管发生通常来源于位于瞳孔缘的血管且通过虹膜根发展并进入小梁网。成纤维细胞和其它***成分与毛细血管生长有关且纤维血管膜伸展过虹膜前表面发展。最终该组织达到前房角，它在那里形成虹膜粘连。这些粘连依次融合、形成瘢痕并收缩而最终关闭前房角。瘢痕形成阻止了房水通过前房角的充分引流和进入小梁网，使得可以导致失明的眼内压增加。
新生血管性青光眼一般作为视网膜缺血显著的疾病的并发症发生。特别地，约三分之一患有这种病症的患者患有糖尿病性视网膜病且28％存在视网膜中央静脉闭塞。其它原因包括慢性视网膜剥离、末期青光眼、颈动脉阻塞性疾病、晶状体后纤维增生症、镰状细胞性贫血、眼内瘤和颈动脉海绵窦瘘。新生血管性青光眼在其早期阶段可以通过高倍放大裂隙灯活组织显微镜检查来诊断，其中它显示出虹膜表面上小的扩张的结构破坏的毛细血管(其渗漏荧光素)。随后的前房角镜检查表明纤维血管带对前房角的递增的闭塞。尽管前房角仍然开放，但是保守疗法可能具有辅助作用。然而，一旦前房角闭合，则需要外科手术以降低压力。
因此，在本发明的一个实施方案中，可以对眼局部给药抗血管形成因子(单独的或如上所述的抗血管形成组合物)以便治疗早期形式的新生血管性青光眼。
在本发明的其它实施方案中，可以通过将所述组合物注入前房角区植入抗血管形成组合物。这使得抗血管形成因子在局部持续增加并防止血管生长入该区。置于虹膜前置的毛细血管与前房角之间的植入或注入的抗血管形成组合物可以″防护″开放的前房角以避免新血管形成。当毛细血管不在抗血管形成组合物有效半径内生长时，前房角的开放可以得到维持。在其它实施方案中，还可以将抗血管形成组合物置于任意位置，使得抗血管形成因子持续释放入房水中。这可以增加房水内抗血管形成因子的浓度，依次浸没虹膜表面及其异常毛细血管，由此提供递送药物的另一种机制。这些治疗模式还可能在预防上有用并且可以与现有治疗方法联用。
本发明在另一个方面中提供了治疗增殖型糖尿病性视网膜病的方法，包括对患者眼部给药治疗有效量的抗血管形成组合物的步骤，使得血管形成得到抑制。
简单的说，认为糖尿病性视网膜病的病理学与上述对新生血管性青光眼所述类似。特别地，认为背景型糖尿病视网膜病在视网膜低氧影响下转化成增殖型糖尿病性视网膜病。一般来说，新生血管组织从视神经(通常在边缘的10mm内)并从组织灌注缺乏的区中视网膜表面发芽。最初毛细血管在视网膜内界膜与玻璃体后面之间生长。最终血管生长入玻璃体并通过内界膜。当玻璃体收缩时，牵引被施加到血管上，通常因出血而导致血管剪断和玻璃体模糊。视网膜中瘢痕形成的纤维牵引力还可以产生视网膜剥离。
选择的常规疗法为全视网膜光凝固术以减少视网膜组织且由此减少视网膜的氧需求。尽管最初有效，但是因在视网膜的其它部位形成新损害而存在高复发率。这种疗法的并发症包括至多50％患者的周边视觉下降、角膜机械性磨损、激光诱发的白内障形成、急性青光眼和刺激视网膜下新生血管生长(可能导致视力丧失)。因此，这种方法仅在存在几种危害因素且危险-有益比显然有利于手术时进行。
因此，在本发明特别优选的实施方案中，可以通过将抗血管形成因子(或抗血管形成组合物)注入房水或玻璃体以增加视网膜内抗血管形成因子的局部浓度来治疗增殖型糖尿病性视网膜病。优选这种治疗方法应在患需要光凝固术的严重疾病前开始。在本发明的其它实施方案中，可以使新生血管损害的动脉发生栓塞(使用如上所述的抗血管形成组合物)。
本发明在另一个方面中提供了治疗晶状体后纤维增生症(retrolentalfibroblasia)的方法，包括对患者眼部给药治疗有效量的抗血管形成因子(或抗血管形成组合物)的步骤，使得血管形成得到抑制。
简单的说，晶状体后纤维增生症是一种发生在接受氧气疗法的早产儿中的疾病。特别是在颞侧上的周围视网膜脉管***直到胎儿生命结束也不会完全形成。认为过量的氧(甚至到期可以为生理水平)和形成氧自由基因导致未成熟视网膜的血管破坏而是重要的。这些血管收缩且然后在接触氧时结构闭塞。结果，周边视网膜无法血管化且视网膜缺血随之发生。在对缺血的反应中，在正常与缺血性视网膜的接合处诱发新血管形成。
在75％的病例中，这些血管自发退化。然而，在剩余的25％中存在持续的毛细血管生长、纤维血管组成部分收缩以及血管与视网膜上牵引。这导致玻璃体出血和/或视网膜剥离，它们可以导致失明。新生血管性闭角型青光眼也是这种情况的并发症。
因为通常不可能确定这些病例可以自发消退和变得严重，所以一般在患有确定疾病和病状充分发展的患者中开始进行常规治疗(即手术)。这种″等待和观察″手段排除了早期干预且使伴随复杂过程的25％的患者中出现疾病发展。因此，在本发明的一个实施方案中，在处于发生这种疾病的高危婴儿中局部给药抗血管形成因子(或如上所述的抗血管形成组合物)以尝试减少晶状体后纤维增生症发展的发生率。在其它实施方案中，可以使用玻璃体内注射和/或抗血管形成组合物眼内植入物。在具有确定疾病的病例中特别优选这类方法以减少对手术的需求。
蛋白激酶
蛋白激酶是一族催化蛋白质中的特定酪氨酸、丝氨酸或苏氨酸残基的羟基磷酸化的酶。一般来说，这类磷酸化显著破坏蛋白质的功能且由此蛋白激酶在调节各种细胞过程中具有重要作用，包括代谢、细胞增殖、细胞分化和细胞存活。在已知需要蛋白激酶活性的许多不同细胞功能中，某些过程代表了用于某些疾病状态的治疗干预的有吸引力的靶物。两个实例为血管发生和细胞周期控制，其中蛋白激酶起关键作用；这些过程对实体瘤生长以及其它疾病而言必不可少。
血管发生是新毛细血管由现有血管形成的机制。当需要时，血管***具有产生新毛细血管网的能力以便维持组织和器官适当的功能。然而，在成年人中，血管发生相当受限，仅在伤口愈合过程和月经期中子宫内膜新血管形成中发生。参见Merenmies等，Cell Growth & Differentiation，8，3-10(1997)，为所有目的而将该文献引入本文作为参考。另一方面，不需要的血管发生是几种疾病的标志，诸如视网膜病、银屑病、类风湿性关节炎、与年龄相关的黄斑变性(AMD)和癌症(实体瘤)。Folkman，Nature Med.，1，27-31(1995)，为所有目的而将该文献引入本文作为参考。已经证实参与血管形成过程的蛋白激酶包括生长因子受体酪氨酸激酶家族的三个成员：VEGF-R2(血管内皮生长因子受体2，也称作KDR(激酶***结构域受体)和称作FLK-1)；FGF-R(成纤维细胞生长因子受体)；和TEK(也称作Tie-2)。
仅在内皮细胞上表达的VEGF-R2结合有效的血管形成生长因子VEGF并通过激活其胞内激酶活性介导随后的信号转导。因此，预计直接抑制VEGF-R2的激酶活性甚至在有外源性VEGF存在下也会使血管发生减少(参见Strawn等Cancer Research，56，3540-3545(1996))，因为已经证实使用VEGF-R2突变体不能介导信号转导。Millauer等，Cancer Research，56，1615-1620(1996)。此外，看起来VEGF-R2在成年人中的作用不会超过它在介导VEGF血管形成活性中的作用。因此，可以预计VEGF-R2激酶活性的选择性抑制剂几乎不会表现出毒性。
类似地，FGF-R结合血管形成生长因子aFGF和bFGF并介导随后的胞内信号转导。近来，已经提出诸如bFGF的生长因子可能在诱发已经达到一定大小的实体瘤中的血管发生方面起关键作用。Yoshiji等，Cancer Research，57，3924-3928(1997)。然而，不同于VEGF-R2，FGF-R在整个身体内的许多不同细胞类型中表达且可能在成年人中的其它生理过程中起重要作用，也可能在这些过程中不起重要作用。虽然如此，但是已经报导全身给药FGF-R激酶活性的小分子抑制剂可以阻断小鼠中bFGF-诱发的血管形成而没有明显的毒性。Mohammad等，EMBO Journal，17，5996-5904(1998)。
TEK(也称作Tie-2)是另一种仅在内皮细胞上表达的受体酪氨酸激酶，已经证实它在血管发生方面起作用。结合血管形成素-1导致TEK激酶结构域自磷酸化并产生看起来介导内皮细胞与周围内皮支持细胞相互作用的信号转导过程，由此有利于新形成的血管成熟。另一方面，因子血管生成素-2看起来拮抗血管形成素-1对TEK的作用并破坏血管发生。Maisonpierre等，Science，277，55-60(1997)。
作为上述研发结果，已经提出通过使用抑制VEGF-R2、FGF-R和/或TEK的激酶活性的化合物治疗血管发生。例如，WIPO国际公开号WO97/34876中公开了属于VEGF-R2抑制剂的某些噌啉衍生物，它们可以用于治疗与异常血管发生和/或血管渗透性增加相关的疾病状态，诸如癌症、糖尿病、银屑病、类风湿性关节炎、卡波西肉瘤、血管瘤、急性和慢性肾病、粥样斑、动脉再狭窄、自身免疫病、急性炎症和与视网膜血管增生相关的眼病。
磷酸化酶激酶激活糖原磷酸化酶，由此增加糖原分解和肝葡萄糖释放。肝葡萄糖生成在2型糖尿病中失调且是不变高血糖的主要原因，它可以在患有这些病症的患者中产生许多继发性并发症。因此，减少葡萄糖从肝中释放可以降低高的血浆葡萄糖水平。磷酸化酶激酶抑制剂由此应降低磷酸化酶活性和糖原分解，从而降低患者中的高血糖。
另一种对VEGF的生理反应在于血管通透性过高，已经提出它在血管发生的早期阶段起作用。在诸如那些在中风受害者大脑中出现的缺血组织中，低氧引发VEGF表达，导致血管通透性增加和最终周围组织中的水肿。在中风大鼠模型中，van Bruggen等已经在J.Clinical Invest，104，1613-20(1999)中证实给药VEGF的单克隆抗体可以减少梗死体积。因此，预计VEGFR抑制剂用于治疗中风。
除血管发生中的作用外，蛋白激酶还在细胞周期控制中起决定性作用。无法控制的细胞增殖是癌症的标志。对各种刺激反应的细胞增殖由细胞繁殖和***过程的细胞***周期失调来表示。肿瘤细胞一般对通过细胞***周期直接或间接调节发展的基因具有损害作用。
依赖细胞周期蛋白的激酶(CDKs)是丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶，它们在调节细胞周期的不同阶段之间的过渡中起关键作用。例如，参见Science，274，1643-1677(1996)中汇编的论文。CDK复合物通过连接调节细胞周期蛋白亚单位(例如细胞周期蛋白A、B1、B2、D1、D2、D3和E)与催化激酶亚单位(例如cdc2(CDK1)、CDK2、CDK4、CDK5和CDK6)而形成。该名称的意思是，CDKs表现出对细胞周期蛋白亚单位的绝对依赖性以便使其靶底物磷酸化且不同激酶/细胞周期蛋白对通过细胞周期的特定阶段起调节发展的作用。
正是与D细胞周期蛋白复合的CDK4在启动从静止或休眠阶段到细胞发生细胞***的阶段的细胞***周期方面起部分关键作用。这种进展经历了不同的生长调节机制，既包括正调节机制又包括负调节机制。在这种控制***、特别是那些影响CDK4功能的***中的异常涉及细胞发展到高度增殖状态，其特征在于恶性肿瘤，特别是家族性黑素瘤、食道癌和胰腺癌。例如，参见Kamb，Trends in Genetics，11，136-140(1995)；Kamb等，Science，264，436-440(1994)。
众多公开文献中描述了用于不同治疗靶的各种化学化合物。例如，WIPO国际公开号WO 99/23077和WO 99/23076中描述了含有吲唑的化合物，它具有吲唑-儿茶酚生物等构置换产生的IV型磷酸二酯酶抑制活性。美国专利US 5,760,028中公开了用作αγβ3整联蛋白拮抗剂的杂环和相关的细胞表面粘连蛋白受体，所述的杂环包括3-[1-[3-(咪唑啉-2-基氨基)丙基]吲唑-5-基羰基氨基]-2-(苄氧羰基氨基)丙酸。WIPO国际公开号WO 98/09961中公开了某些吲唑衍生物及其作为IV型磷酸二酯酶抑制剂的应用或作为在哺乳动物中产生肿瘤坏死因子(TNF)的抑制剂的应用。近来对已知化合物的实际库中的添加包括那些作为抑制CDKs的抗增殖治疗剂描述的化合物。例如，Xiong等在美国专利US 5,621,082中公开了编码CDK6抑制剂的核酸，且欧洲专利公开号EP0 666 270 A2中描述了起CDK1和CDK2抑制剂作用的肽类和肽模拟物。WIPO国际公开号WO 97/16447中公开了某些属于依赖细胞周期蛋白的激酶、特别是CDK/细胞周期蛋白复合物、诸如CDK4/细胞周期蛋白D1的色酮类似物，它们可以用于抑制过度或异常的细胞增殖，且由此用于治疗癌症。WIPO国际公开号WO 99/21845中描述了用作CDK抑制剂的4-氨基噻唑衍生物。为所有目的而将上面所列的每篇专利和/或申请的全部内容引入本文作为参考。
然而，仍然存在对易于合成且可有效抑制一种或多种CDKs或CDK/细胞周期蛋白复合物的小分子化合物的需求。因为CDK4可以用作大部分细胞中细胞***的一般激活剂且CDK4与D-型细胞周期蛋白的复合物控制细胞周期的早期G1阶段，所以存在对用于治疗一种或多种类型肿瘤的CDK4及其D-型细胞周期蛋白复合物的有效抑制剂的需求。此外，G2/S阶段和G2/M过渡中细胞周期蛋白E/CDK2和细胞周期蛋白B/CDK1激酶的关键作用分别为抑制癌症中失调的细胞周期发展提供了治疗干预的其它靶物。
另一种蛋白激酶CHK1在细胞周期发展中作为关卡起重要作用。关卡是通过影响依赖细胞周期蛋白的激酶形成、活化和随后的失活协调细胞周期发展的控制***。当关卡的要求未得到满足时，关卡防止了在不适宜时间的细胞周期发展、在阻止细胞的同时维持了细胞的代谢平衡且在某些情况中可以诱导编程性细胞死亡(程序性细胞死亡)。例如，参见：O′Connor，Cancer Surveys，29，151-182(1997)；Nurse，Cell，91，865-867(1997)；Hartwell等，Science，266，1821-1828(1994)；Hartwell等，Science，246,629-634(1989)。
一系列关卡监测基因组的完整性且在测知DNA受损时，这些″DNA受损关卡″阻断G1和G2期中细胞周期发展并减缓通过S期的发展。O′Connor，Cancer Surveys，29，151-182(1997)；Hartwell等，Science，266，1821-1828(1994)。这种作用能够使DNA修复过程完成其任务，此后复制基因组且随后发生这种遗传物质分离成新的子细胞。重要的是，在DNA受损后，人癌中最常见的突变基因p53肿瘤抑制基因产生阻断G1期中细胞周期发展的DNA受损关卡蛋白和/或诱导编程性细胞死亡(程序性细胞死亡)。Hartwell等，Science，266，1821-1828(1994)。还说明p53肿瘤抑制基因强化细胞周期的G2期中DNA受损关卡的作用。例如，参见：Bunz等，Science，28，1497-1501(1998)；Winters等，Oncogene，17，673-684(1998)；Thompson，Oncogene，15，3025-3035(1997)。
由于得知人癌中p53肿瘤抑制基因途经的关键性质，所以积极地寻找利用p53-缺陷型癌症中易损性的治疗干预。一种新出现的易损性在于在p53-缺陷型癌细胞中G2关卡的操作。癌细胞因缺乏G1关卡控制而因消除了防止它们受到损害DNA活性剂G2关卡的癌症杀伤作用的最后剩余屏障特别易于受到损害。G2关卡受到从酵母保存到人的控制***调节。在这种保存***中重要的是激酶CHK1，它转导来自DNA-受损感觉复合物中的信号以抑制促进有丝***进入的细胞周期蛋白B/Cdc2激酶的活化。例如，参见：Peng等，Science，277，1501-1505(1997)；Sanche等，Science，277，1497-1501(1997)。已经证明CHK1失活既可以消除抗癌剂引起的DNA损害或内源性DNA损害诱导的G2阻滞、又可以导致优先杀伤所得关卡缺陷细胞。例如，参见：Nurse，Cell，91，865-867(1997)；Weinert，Science，277，1450-1451(1997)；Walworth等，Nature，363，368-371(1993)；和Al-Khodairy等，Molec.Biol.Cell，5，147-160(1994)。
选择性控制癌细胞中的关卡控制可以在癌症化疗和放疗方案中提供广泛应用且还可以提供作为破坏癌细胞的选择基础利用的人癌″基因组不稳定性″的通常标志。因许多因素而将CHK1作为DNA-损害关卡控制中的关键靶。对这种和功能相关激酶，诸如Cds1/CHK2、即近期发现与CHK1在调节S期发展中起协同作用的激酶的抑制剂的说明(参见Zeng等，Nature，395，507-510(1998)；Matsuoka，Science，282，1893-1897(1998))可以为治疗癌症提供有价值的新治疗实体。
与ECM结合的整联蛋白受体启动了FAK(粘着斑激酶)介导的胞内信号，这些信号涉及细胞运动、细胞增殖和存活。在人癌中，FAK超表达涉及肿瘤发生和通过其在整联蛋白介导的信号传导途经中的作用的转移潜能。
酪氨酸激酶可以是受体型(含有胞外跨膜和胞内结构域)或非受体型(完全胞内的)。认为至少一种非受体蛋白酪氨酸激酶，即LCK介导来自细胞表面蛋白(Cd4)与交联抗-Cd4抗体相互作用的信号的T-细胞中的转导。Bolen在Oncogene，8，2025-2031(1993)中提供了非受体酪氨酸激酶的更为详细的讨论，为所有目的而将该文献的全部内容引入本文作为参考。
除上面确定的蛋白激酶外，认为许多其它蛋白激酶为治疗靶且大量公开文献中公开了激酶活性抑制剂，正如在下列文献中综述的：2003年3月18日授权的美国专利US6,534,524；2003年3月11日授权的美国专利US6,531,491；PCT国际专利申请公开号WO 00/38665(2001年7月6日公开)；PCT国际专利申请公开号WO 97/49688(1997年12月31日公开)；PCT国际专利申请公开号WO 98/23613(1998年6月4日公开)；2000年6月6日授权的美国专利US 6,071,935；PCT国际专利申请公开号WO 96/30347(1996年10月3日公开)；PCT国际专利申请公开号WO 96/40142(1996年12月19日公开)；PCT国际专利申请公开号WO 97/13771(1997年4月17日公开)；PCT国际专利申请公开号WO 95/23141(1995年8月31日公开)；PCT国际专利申请公开号WO 03/006059(2003年1月23日公开)；PCT国际专利申请公开号WO 03/035047(2003年5月1日公开)；PCT国际专利申请公开号WO 02/064170(2002年8月22日公开)；PCT国际专利申请公开号WO02/41882(2002年5月30日公开)；PCT国际专利申请公开号WO02/30453(2002年4月18日)；PCT国际专利申请公开号WO 01/85796(2001年11月15日公开)；PCT国际专利申请公开号WO01/74360(2001年10月11日公开)；PCT国际专利申请公开号WO 01/74296(2001年10月11日公开)；PCT国际专利申请公开号WO 01/70268(2001年9月27日公开)；欧洲专利申请公开号EP 1086705(2001年3月28日公开)；和PCT国际专利申请公开号WO 98/51344(1998年11月19日公开)。为所有目的而将上述专利和申请各自的全部内容引入本文作为参考。
然而，仍然存在对有效蛋白激酶抑制剂的需求。此外，正如本领域技术人员可以理解的，需要对靶激酶具有高度亲合性和与其它蛋白激酶相比具有高选择性的激酶抑制剂。
因此，本发明的一个目的在于发现了用于治疗下列眼病的有效活性剂：诸如与年龄相关的黄斑变性(ARMD)、脉络膜新血管形成(CNV)、视网膜病(例如糖尿病性视网膜病、玻璃体视网膜病变、早产儿视网膜病)、视网膜炎(例如巨细胞病毒(CMV)视网膜炎)、葡萄膜炎、黄斑水肿和青光眼。
本发明的另一个目的在于发现蛋白激酶的有效抑制剂。
本发明的另一个目的在于发现对一种或多种特定激酶具有强和选择性亲合性的有效激酶抑制剂。
本发明的这些和其它目的从说明书中显而易见，通过发现下述调节和/或抑制蛋白激酶活性的吲唑化合物、其药物上可接受的前体药物、药物活性代谢物及其药物上可接受的盐(这类化合物、前体药物、代谢物和盐共同称作″活性剂″)而实现。含有这类活性剂的药物组合物用于治疗激酶活性介导的疾病、诸如癌症以及其它与下列疾病相关的疾病状态：不需要的血管发生和/或细胞增殖，诸如糖尿病性视网膜病、新生血管性青光眼、类风湿性关节炎和银屑病。此外，这些活性剂具有涉及调节和/或抑制与VEGF-R、FGF-R、CDK复合物、CHK1、LCK、TEK、FAK和/或磷酸化酶激酶相关的激酶活性的有利特性。
本发明一般涉及具有如下结构的化合物：
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本发明还涉及调节和/或抑制VEGF-R、FGF-R、CDK复合物、CHK1、LCK、TEK、FAK和/或磷酸化酶激酶的方法，通过给药通式I、II、III或IV化合物或其药物上可接受的前体药物、药物活性代谢物或其药物上可接受的盐来进行。本发明优选的化合物具有选择性激酶活性，即它们对一种或多种特定激酶具有显著活性，同时对一种或多种不同激酶具有较低或最低活性。在本发明的一个优选实施方案中，本发明的化合物是那些对VEGF受体酪氨酸激酶具有基本上高于对FGF-R1受体酪氨酸激酶的功效的通式I化合物。本发明还涉及调节VEGF受体酪氨酸激酶活性而不会显著调节FGF受体酪氨酸激酶活性的方法。
本发明的化合物可以有利地与其它公知治疗剂联用。例如，可以将具有抗血管形成活性的通式I、II、III或IV的化合物与诸如泰素、泰索帝、长春碱、顺铂、多柔比星、阿霉素等的细胞毒性化疗剂共同给药以产生增强的抗肿瘤作用。还可以通过共同给药具有抗血管形成活性的通式I、II、III或IV的化合物与其它抗血管形成剂获得附加的或协同的强化治疗作用，所述的其它抗血管形成剂诸如考布他汀A-4、内皮他丁、普啉司他、塞来考昔、rofocoxib、EMD121974、IM862、抗-VEGF单克隆抗体和抗-KDR单克隆抗体。其它组合以WO 0038716、WO 00387171、WO 0038715、WO0038730、WO 0038718、WO 0038665、WO 0037107、WO 0038786、WO0038719中的组合作为例子，它们均在1999年12月22日同时提交，为所有目的而将这些文献的全部内容引入本文作为参考。
本发明还涉及药物组合物，包括有效量的选自通式I的化合物及其药物上可接受的盐、药物活性代谢物和药物上可接受的前体药物的活性剂和用于这类活性剂的药物上可接受的载体或赋形剂。本发明进一步提供了治疗眼疾病/疾患和癌症以及其它与不需要的血管发生和/或细胞增殖相关的疾病状态的方法，包括对需要这类治疗的患者给药有效量的这类活性剂。
本发明通式I、II、III或IV的化合物用于治疗眼病和介导蛋白激酶活性。更具体地说，所述的化合物用作抗血管形成剂和用作调节和/或抑制蛋白激酶活性的活性剂，由此提供了治疗眼病和癌症或其它与蛋白激酶介导的细胞增殖相关的疾病的方法。
本文所用的术语″烷基″指的是带有1-12个碳原子的直链和支链烷基。典型烷基包括甲基(Me)、乙基(Et)、正丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基(t-Bu)、戊基、异戊基、叔戊基、己基、异己基等。术语″低级烷基″表示带有1-8碳原子的烷基(C1-C8烷基)。合适的取代烷基包括氟甲基、二氟甲基、三氟甲基、2-氟乙基、3-氟丙基、羟甲基、2-羟乙基、3-羟丙基等。
术语″亚烷基″指的是带有1-12个碳原子的二价基团。解释性的亚烷基包括CH2、CHCH3、(CH3)2等。
术语″链烯基″指的是带有2-12个碳原子的直链和支链链烯基。解释性链烯基包括丙-2-烯基、丁-2-烯基、丁-3-烯基、2-甲基丙-2-烯基、己-2-烯基等。
术语″炔基″指的是带有2-12个碳原子的直链和支链炔基。
术语″环烷基″指的是带有3-12个碳原子的饱和或部分不饱和碳环，包括双环和三环环烷基结构。合适的环烷基包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基等。
″杂环烷基″用以指含有碳原子，优选4或5个环碳原子和至少一个选自氮、氧和硫的杂原子的饱和或部分不饱和单环基团。
术语″芳基″和″杂芳基″指的是单环和多环不饱和或芳族环结构，其中″芳基″指的是碳环的那些基团，而″杂芳基″指的是杂环的那些基团。芳族环结构的实例包括苯基、萘基、1，2，3，4-四氢化萘基、呋喃基、噻吩基、吡咯基、吡啶基、吡唑基、咪唑基、吡嗪基、哒嗪基、1，2，3-三嗪基、1，2，4-噁二唑基、1，3，4-噁二唑基、1-H-四唑-5-基、吲哚、喹啉基、苯并呋喃基、苯并苯硫基(硫茚基)等。这类基团可以任选被稠合环结构或桥，例如OCH2-O取代。
术语″烷氧基″用以指基团-O-烷基。解释性实例包括甲氧基、乙氧基、丙氧基等。
术语″芳氧基″表示-O-芳基，其中芳基如上面所定义。
术语″环烷氧基″表示-O-环烷基，其中环烷基如上面所定义。
术语″卤素″表示氯、氟、溴或碘。术语″卤代″表示氯代、氟代、溴代或碘代。
一般来说，通式中的可变的各种部分或官能基可以任选被一个或多个合适的取代基取代。典型的取代基包括卤素(F、Cl、Br或I)、低级烷基、-OH、-NO2、-CN、-CO2H、-O-低级烷基、芳基、-芳基-低级烷基、-CO2CH3、-CONH2、-OCH2CONH2、-NH2、-SO2NH2、卤代烷基(例如-CF3、-CH2CF3)、-O-卤代烷基(例如-OCF3、-OCHF2)等。
术语″包括(comprising)″和″包含(including)″以开放式非限制性含义使用。
可以理解尽管通式I的化合物可以显示互变异构现象，但是本说明书中的通式结构仅清楚地描述可能的互变形式之一。由此可以理解本发明中的通式用以表示所示化合物的任意互变形式且并非仅限于通式结构所描述的具体互变形式。
本发明的某些化合物可以以单一立体异构体(即基本上不含其它立体异构体)、外消旋体和/或对映体和/或非对映体混合物的形式存在。所有这类单一立体异构体、外消旋体及其混合物均属于本发明的范围。优选旋光的本发明化合物以光学纯形式使用。
正如本领域技术人员一般所理解的，含有一个手性中心的光学纯化合物是一种基本上由两种可能的对映体之一组成(即为对映体纯)，且含有一个以上手性中心的光学纯化合物是一种既为非对映体纯又为对映体纯的化合物。优选本发明的化合物以至少90％光学纯的形式使用，即含有至少90％的单一异构体(80％对映体过量(″e.e.″)或非对映体过量(″d.e.″))、更优选至少95％(90％e.e.或d.e.)、甚至更优选至少97.5％(95％e.e.或d.e.)，且最优选至少99％(98％e.e.或d.e.)的形式。
另外，所述通式用以包括所鉴定结构的溶剂化物和非溶剂化物。例如，通式I包括水合和非水合形式的所示结构的化合物。溶剂化物的其它实例包括结合异丙醇、乙醇、甲醇、DMSO、乙酸乙酯、乙酸或乙醇胺的结构。
除通式I、II、III和IV的化合物外，本发明还包括这类化合物的药物上可接受的前体药物、药物活性代谢物和药物上可接受的盐。
″药物上可接受的前体药物″是可以在生理条件下或通过溶剂分解转化成具体化合物或这类化合物的药物上可接受的盐的化合物。
″药物活性代谢物″用以指具体化合物或其盐通过在体内代谢而产生的药理活性产物。可以使用本领域中公知的常规技术鉴定化合物的代谢物且可以使用诸如本文所述的那些试验测定其活性。
可以使用本领域中公知的常规技术鉴定化合物的前体药物和活性代谢物。例如，参见Bertolini，G.等，J.Med.Chem.，40，2011-2016(1997)；Shan，D.等，J.Pharm.Sci.，86(7)，765-767；Bagshawe K.，Drug Dev.Res.，34，220-230(1995)；Bodor，N.，Advances in Drug Res.，13，224-331(1984)；Bundgaard，H.，Design of Prodrugs(Elsevier Press 1985)；和Larsen，I.K.，Design and Application of Prodrugs，Drug Design andDevelopment(Krogsgaard-Larsen等编辑，Harwood Academic Publishers，1991)。
″药物上可接受的盐″用以指保持具体化合物的游离酸和碱的生物有效性的盐或者不是生物学上不需要的盐。本发明的化合物可以带有足够的酸性、足够的碱性或两种官能基，且因此可以与任意数量的无机碱或有机碱以及无机酸和有机酸反应而形成药物上可接受的盐。典型的药物上可接受的盐包括那些通过使本发明化合物与无机酸或有机酸或无机碱反应制备的盐，诸如如下盐：包括硫酸盐、焦硫酸盐、硫酸氢盐、亚硫酸盐、亚硫酸氢盐、磷酸盐、磷酸一氢盐、磷酸二氢盐、偏磷酸盐、焦磷酸盐、氯化物、溴化物、碘化物、乙酸盐、丙酸盐、癸酸盐、辛酸盐、丙烯酸盐、甲酸盐、异丁酸盐、己酸盐、庚酸盐、丙炔酸盐、草酸盐、丙二酸盐、琥珀酸盐、辛二酸盐、癸二酸盐、富马酸盐、马来酸盐、丁炔-1，4-二酸盐、己炔-1，6-二酸盐、苯甲酸盐、氯苯甲酸盐、甲基苯甲酸盐、二硝基苯甲酸盐、羟基苯甲酸盐、甲氧基苯甲酸盐、邻苯二甲酸盐、磺酸盐、二甲苯磺酸盐、苯基乙酸盐、苯基丙酸盐、苯基丁酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐、γ-羟基丁酸盐、乙醇酸盐、酒石酸盐、甲磺酸盐、丙磺酸盐、萘-1-磺酸盐、萘-2-磺酸盐和扁桃酸盐。
如果本发明的化合物为碱，那么可以通过本领域中任意合适的方法，例如通过用无机酸或用有机酸处理游离碱制备所需的药物上可接受的盐，所述的无机酸诸如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等，所述的有机酸诸如乙酸、马来酸、琥珀酸、扁桃酸、富马酸、丙二酸、丙酮酸、草酸、乙醇酸、水杨酸；吡喃糖酸，诸如葡糖醛酸或半乳糖醛酸；α-羟基酸，诸如柠檬酸或酒石酸；氨基酸，诸如天冬氨酸或谷氨酸；芳香酸，诸如苯甲酸或肉桂酸；磺酸，诸如对甲苯磺酸或乙磺酸等。
如果本发明的化合物为酸，那么可以通过任意合适的方法制备所需的药物上可接受的盐，例如通过用无机碱或用有机碱、诸如胺(伯胺、仲胺或叔胺)、碱金属氢氧化物或碱土金属氢氧化物等处理游离酸制备。合适的盐的解释性实例包括来源于诸如甘氨酸和精氨酸的氨基酸、氨、伯胺类、仲胺类和叔胺类和诸如哌啶、吗啉和哌嗪的环胺的有机盐，和来源于钠、钙、钾、镁、锰、铁、铜、锌、铝和锂的无机盐。
就固体的活性剂而言，本领域技术人员可以理解本发明的化合物和盐可以以不同晶形或多晶形物形式存在，它们均属于本发明和具体通式的范围。
治疗有效量的本发明活性剂可以用于治疗由调制或调节蛋白激酶介导的疾病。″有效量″用以指当对需要这类治疗的哺乳动物给药时足以对一种或多种蛋白激酶、诸如酪氨酸激酶活性介导的疾病进行有效治疗的活性剂用量。因此，例如，通式I化合物、其盐、活性代谢物或前体药物的治疗有效量为足以调制、调节或抑制一种或多种蛋白激酶活性的用量，使得由这种活性介导的疾病情况得到缓解或减轻。
相当于该用量的指定活性剂的用量随诸如特定化合物、疾病情况及其严重程度、需要治疗的哺乳动物情况(例如体重)的不同而改变，尽管如此，通常可以由本领域技术人员决定。″治疗″用以指至少部分受到一种或多种蛋白激酶、诸如酪氨酸激酶活性影响的哺乳动物、诸如人的疾病得到减轻，且包括：预防哺乳动物中发生疾病情况，特别是当发现哺乳动物易患该病、但尚未诊断其患有该病时；调节和/或抑制这种疾病情况；和/或减轻这种疾病情况。
可以使用如下所述的反应途经和合成图解，使用易于得到的原料，使用本领域中可利用的技术制备本发明的活性剂。
在一种一般合成方法中，按照下列反应图解制备通式I的化合物：
在优选含有二噁烷的含水/有机混合物中用碘和碱、例如NaOH处理6-硝基吲唑(化合物V)。酸化该混合物并通过过滤分离产物。向在0℃下在二氯甲烷-50％KOH水溶液中的所得3-碘-6-硝基吲唑中加入保护基(″Pg″)试剂(其中X＝卤素)，优选三甲基甲硅烷基乙氧基甲基氯(SEM-CI)和相转移催化剂、例如溴化四丁基铵(TBABr)。1-4小时后，稀释两相，分离有机相、用硫酸钠干燥、过滤并浓缩。通过硅胶色谱法纯化粗产物而得到通式VI的化合物。在有碱，例如碳酸钠水溶液和合适的催化剂，优选Pd(PPh3)4存在的适宜有机溶剂中用合适的R1-有机金属试剂，优选R1-硼酸处理通式VI的化合物，在萃取操作和硅胶色谱后得到通式VII的化合物。可以交换通式VII化合物上的R1取代基或对整个该方案中此后的中间体进行氧化裂解(例如臭氧分解)，随后使用Wittig或缩合转化对所得醛官能基进行加成(以实施例42(a-e)为典型)。用还原剂，优选SnCl2处理通式VII的化合物，在完成常规水处理和纯化后得到通式VIII的化合物。就一系列衍生物而言，其中Y＝NH或N-低级烷基，可以在有碱、优选Cs2CO3和催化剂、优选Pd-BINAP存在下用芳基或杂芳基氯化物、溴化物、碘化物或三氟甲磺酸盐处理通式VIII的化合物(且其中Y＝N-低级烷基，随后进行烷基化步骤)而得到通式X的化合物。为了产生其它Y键，在冷却的标准含水酸性条件下将亚硝酸钠加入到通式VIII的化合物，随后添加碘化钾并适度加热。进行标准处理和纯化而得到通式IX的化合物。
用有机金属试剂，例如丁基锂处理通式IX的化合物可促进锂卤交换。然后使该中间体通过其它金属和催化剂，优选氯化锌和Pd(PPh3)4的可能介导与R2亲电子试剂，例如羰基或三氟甲磺酸根反应而得到通式X的化合物。另一方面，在一氧化碳气氛和有催化剂，优选Pd(PPh3)4存在下用合适的有机金属试剂、诸如有机硼酸处理通式IX的化合物而得到通式X的化合物。另一方面，就Y＝NH或S的衍生物而言，可以在有碱，优选Cs2CO3和K3PO4和催化剂，优选Pd-BINAP或Pd-(双-环己基)二苯基膦存在下与合适的胺类或硫醇类处理通式IX的化合物而得到通式X的化合物。然后可以将常规的官能基交换、诸如氧化、还原、烷基化、酰化、缩合和脱保护进一步衍生该系列而得到最终的通式I的化合物。
还可以按照下列图解中所示的一般方法制备本发明通式I的化合物：
在优选与二噁烷的含水/有机混合物中用碘和碱、例如NaOH处理6-碘吲唑(化合物XI)。酸化该混合物并通过过滤分离产物XII。向在0℃下在二氯甲烷-50％KOH水溶液中的所得3，6-二碘-吲唑中加入保护基试剂，优选SEM-CI，和相转移催化剂、例如TBABr。稀释两相，分离有机相、用硫酸钠干燥，过滤并浓缩。通过硅胶色谱法纯化粗产物而得到通式XIII的化合物。在适宜的有机溶剂中用合适的R2-有机金属试剂、优选R2-ZnCl或硼R2-硼试剂和合适的催化剂，优选Pd(PPh3)4处理通式XIII的化合物，在萃取完成和硅胶色谱后得到通式XIV的化合物。在有碱如碳酸钠水溶液和合适的催化剂，优选Pd(PPh3)4存在下的适宜有机溶剂中用合适的R1-有机金属试剂(例如硼R2-硼试剂或R2-ZnCl)处理通式XIV的化合物，在萃取完成和硅胶色谱后得到通式XV的化合物。然后可以将常规的官能基交换，诸如氧化、还原、烷基化、酰化、缩合和脱保护用于进一步衍生该种类化合物而得到最终的通式I化合物。
另一方面，可以按照下列一般图解制备通式I的化合物，其中R2为取代或未被取代的Y-Ar，其中Y为O或S：
将搅拌的3-氯-环己-2-烯酮(XV)、H-R2和无水碳酸钾的丙酮溶液回流15-24小时，冷却并过滤。浓缩并将滤液进行硅胶色谱而得到3-R2-环己-2-烯酮(XVI)。
可以使通式XVI的酮类与合适的碱(M-B)，优选双(三甲基甲硅烷基)酰胺锂反应并与R1-CO-X(其中X＝卤素)反应，在进行标准酸处理和纯化后得到通式XVII的化合物。将在HOAc/EtOH中的与肼一水合物混合的该产物在合适的温度下加热适宜的时间，优选在60)-80℃下加热2-4小时。冷却后，将该混合物倾入饱和碳酸氢钠溶液，用有机溶剂萃取、浓缩并进行硅胶纯化而得到通式XVIII的化合物。可以使用各种已知方法氧化通式XVIII的化合物而得到通式I的化合物。
Figure A20038010969700321
用于合成本发明化合物的其他方法如下：
其中步骤a)-i)的条件如下：
a)NaNO2、Br2、HBr、0℃-5℃；收率48％；
b)Pd(OAc)2、Pd(邻-甲苯基)3、二-异丙基乙胺(DIEA)、DMF、H2O、脱气、微波、110℃、1小时；收率68％；
c)铁粉、饱和NH4OH水溶液、EtOH、45℃；收率72％；
d)2-溴苯甲酸甲基酯、R-BINAP、Pd2(dba)3、Cs2CO3、甲苯、110℃下脱气过夜；收率74％；
e)KOH、MeOH∶THF∶H2O(3∶1∶1)70℃，2-3小时；定量；
f)被保护的胺、HATU、NEt3、DMF、室温下2小时；收率80％；
g)TsOH(12％在HOAc中的TsOH)、EtOH(10％水溶液)；收率44％yield；
h)三丁基乙烯基锡、Pd(PPh3)4、2，6二-叔丁基-4-甲基苯酚、甲苯、105℃下脱气；收率31％；
i)Pd(OAc)2、Pd(邻-甲苯基)3、DIEA、DMF、100℃下脱气；收率约70％。
可以按照与上述一般方法类似的方法或本文实施例中所述的具体方法制备通式I的其它化合物。可以通过提供极为相近形式的配体的多个拷贝，优选使用载体部分提供的平台增强本发明化合物对受体的亲和性。已经证实提供在所述部分之间具有最佳间距的这类多价化合物可以显著改善与受体的结合。例如，参见Lee等，Biochem，23，4255(1984)。可以提供选择合适的载体部分或连接基单元控制多价和间距。这类部分包括含有多个可以与本发明化合物连接的官能基反应的官能基的分子载体。当然，可以使用各种载体，包括：蛋白质，诸如BSA或HAS；多种肽类，包括：例如五肽类、十肽类、十五肽类等。所述的肽类或蛋白质可以含有所需数量的在其侧链上带有游离氨基的氨基酸残基；然而，也可以使用其它官能基、诸如硫氢基或羟基以获得稳定的键。
有效调节、调制或抑制与受体VEGF、FGF、CDK复合物、TEK、CHK1、LCK、FAK和磷酸化酶激酶等相关的蛋白激酶活性并抑制血管发生和/或细胞增殖的化合物是理想的且为本发明的一个优选实施方案。本发明进一步涉及通过给药本发明活性剂调节或抑制例如哺乳动物组织中的蛋白激酶活性的方法。可以通过本领域技术人员可利用的任意方法、包括体内和/或体外试验测定本发明化合物作为蛋白激酶活性，诸如激酶活性调节剂的活性。用于活性测定的合适的试验的实例包括那些描述在下列文献中的试验：Parast C.等BioChemistry，37，16788-16801(1998)；Jeffrey等Nature，376，313-320(1995)；WIPO国际公开号WO 97/34876；和WIPO国际公开号WO 96/14843。例如，可以通过使用下文实施例中所列的一种或多种生物测试方法评价这些特性。
可以按照如下所述将本发明的活性剂配制成药物组合物。本发明的药物组合物包括有效调制、调节或抑制用量的通式I、II、III或IV的化合物和药物上可接受的惰性载体或稀释剂。在药物组合物的一个实施方案中，提供本发明活性剂至可产生包括调节蛋白激酶的治疗有益性的有效水平。所谓″有效水平″指的是以最低限度调节蛋白激酶作用的水平。将这些组合物制备成适合于给药方式，例如非肠道或口服给药的单位剂型。
可以以通过将治疗有效量的作为活性组分的活性剂(例如通式I的化合物)与合适的药物载体或稀释剂按照常规方法混合制备的常用剂型形式给药本发明活性剂。这些方法可以包括根据需要进行混合、制粒和压制或溶解所述组分而制成所需制剂。
所用的药物载体可以为固体或液体。典型的固体载体为乳糖、蔗糖、滑石粉、明胶、琼脂、果胶、***胶、硬脂酸镁、硬脂酸等。典型的液体载体为糖浆、花生油、橄榄油、水等。类似地，所述的载体或稀释剂可以包括本领域中公知的延时或定时释放的物质，诸如单独的甘油单硬脂酸酯或甘油二硬脂酸酯或与蜡、乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、甲基丙烯酸甲酯等的混合物。
可以使用各种药物剂型。因此，如果使用固体载体，那么可以将制剂压片、将粉末或丸粒形式装入硬胶囊或制成药片或锭剂形式。固体载体的量可以改变，但一般约为25mg-约1g。如果使用液体载体，那么制剂为糖浆剂、乳剂、滴剂、软胶囊、在安瓿或小瓶中的无菌注射溶液或混悬液或非水液体混悬液。
为了获得稳定的水溶性剂型，将本发明的活性剂的药物上可接受的盐溶于有机或无机酸的水溶液，诸如0.3M琥珀酸或柠檬酸溶液。如果无法得到可溶性盐形式，那么可以将活性剂溶于合适的共溶剂或共溶剂的混合物。合适的共溶剂的实例包括、但不限于醇、丙二醇、聚乙二醇300、聚山梨醇酯80、甘油等，其浓度占总体积的0-60％。在典型实施方案中，将通式I的化合物溶于DMSO并用水稀释。该组合物还可以为活性组分的盐形式在合适的含水载体、诸如水或等渗盐水或葡萄糖溶液中的溶液形式。
可以理解本发明组合物中所用的活性剂的实际剂量根据所用特定复合物、配制的具体组合物、给药方式和特定部位、所治疗的宿主和疾病的不同而改变。本领域技术人员可以根据活性剂的实验数据使用常规剂量测定试验给定一组指定条件下的最佳剂量。就口服给药而言，一般使用的典型每日剂量约为0.001-约1000mg/kg体重、更优选约0.001-约50mg/kg体重，其中在合适的间隔重复治疗过程。一般给药重量水平在化学上与完整活性剂形式的重量水平等效的前体药物。
可以按照一般用于制备药物组合物公知的方法制备本发明的组合物，例如使用常规技术，诸如混合、溶解、制粒、制锭、磨细、乳化、包囊、包埋或冻干。可以使用一种或多种生理上可接受的载体、按照常规方法配制药物组合物，所述的载体可以选自有利于将活性化合物加工成可以在药物上使用的制剂的赋形剂和助剂。
合适的制剂取决于选择的给药途径。对于注射，可以将本发明的活性剂配制成水溶液，优选在生理上相容的缓冲液，诸如汉克斯液、林格液或生理盐水缓冲液中。对于跨粘膜给药，可以在制剂中使用适合于透过屏障的渗透剂。这类渗透剂是本领域中一般公知的。
对于口服给药，易于通过将活性化合物与本领域中公知的药物上可接受的载体混合来配制所述的化合物。这类载体能够将本发明的化合物配制成所治疗患者口服摄入的片剂、丸剂、锭剂、胶囊、液体、凝胶、糖浆剂、浆液、混悬液等。可以通过下列步骤获得口服应用的药物制剂：使用固体赋形剂与活性组分(活性剂)的混合物；任选研磨所得混合物，且如果需要，在加入合适的助剂后将颗粒混合物加工成片芯或锭芯。合适的赋形剂包括：填充剂，诸如糖类，包括乳糖、蔗糖、甘露糖醇或山梨醇；和纤维素制品，例如玉米淀粉、小麦淀粉、米淀粉、马铃薯淀粉、明胶、树胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。如果需要，可以加入崩解剂，诸如交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂或藻酸或其盐，诸如藻酸钠。
可以给锭芯包合适的包衣层。为了这一目的，可以使用浓糖溶液，它可以任选含有***树胶、聚乙烯吡咯烷酮、卡波姆凝胶、聚乙二醇和/或二氧化钛、漆溶液和合适的有机溶剂或溶剂混合物。可以向片剂或锭剂包衣层中加入染料或颜料以便于鉴别或使活性组分的不同组合特征化。
可以口服使用的药物制剂包括由明胶制成的推入配合式胶囊以及由明胶和增塑剂、诸如甘油或山梨醇制成的密封的软胶囊。推入配合式胶囊可以含有活性组分与填充剂、诸如乳糖、粘合剂、诸如淀粉和/或润滑剂、诸如滑石粉或硬脂酸镁和任选稳定剂。在软胶囊中，可以将活性剂溶于或悬浮于合适的液体中，诸如脂肪油、液体石蜡或液体聚乙二醇类。此外，可以加入稳定剂。所有用于口服给药的制剂均应在剂量上适合于这类给药。为了***给药，组合物可以采用用常规方式配制成的片剂或锭剂形式。
为了通过鼻内或通过吸入给药，便利的是以来自加压药包的气溶胶喷雾装置或喷雾器的形式递送本发明使用的化合物，在所述的气溶胶喷雾装置或喷雾器中使用合适的抛射剂，例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它合适的气体。就加压气溶胶而言，可以通过安装递送经计量的量的阀门测定剂量单位。可以配制含有化合物与合适的粉末基质、诸如乳糖或淀粉的粉末混合物的用于吸入器或吹入器等的胶囊和明胶药筒。
可以将化合物配制成用于通过注射、例如通过快速浓注或连续输注进行非肠道给药的形式。可以将注射用制剂制成单位剂型，例如添加防腐剂的安瓿或多剂量容器形式。这些组合物可以采用诸如在油或含水载体中的混悬液、溶液或乳剂形式且可以含有配制试剂，诸如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。
用于非肠道给药的药物制剂包括水溶性形式的活性化合物水溶液。另外，可以将活性剂的混悬液制成合适的注射油混悬液。合适的亲脂性溶剂或载体包括：脂肪油，诸如芝麻油；或合成脂肪酸酯类，诸如油酸乙酯或甘油三酯类，或脂质体。含水的注射混悬液可以含有增加该混悬液粘度的物质，诸如羧甲基纤维素钠、山梨醇或葡聚糖。该混悬液还可以任选含有合适的稳定剂或增加化合物溶解度的试剂以便能够制备高浓溶液。
为了对眼部进行给药，可以用药物上可接受的眼用载体递送通式I、II、III或IV的化合物以便维持化合物与眼表接触足够的时间，从而使该化合物透入眼的角膜和/或巩膜和内部区域，包括：例如前房、后房、玻璃体、房水、玻璃体液、角膜、虹膜/睫状体、晶状体、脉络膜/视网膜和巩膜。药物上可接受的眼用载体可以为软膏、植物油或包囊材料。可以将本发明的化合物直接注入玻璃体液或房水。
此外，还可以通过众所周知的可接受方法，诸如特农囊下(subtebnon)和/或结膜下注射给药化合物。正如眼科领域众所周知的，斑点主要由视网膜锥组成且为视网膜中最大的视力区。特农囊或特农膜排列在巩膜上。结膜36覆盖了缘后眼球的少部分区域(球结膜)且折向上(上结膜)或折向下(下结膜)以分别覆盖上眼睑和下眼睑的内部区域。结膜排列在特农囊的上部。
巩膜和特农囊限定了眼球的外表面。为了治疗ARMD、CNV、视网膜病、视网膜炎、葡萄膜炎、囊样黄斑水肿(CME)、青光眼和其它眼后段疾病或疾患，优选将特定量的眼科可接受的药物活性剂的长效制剂直接布置在巩膜外表面上和特农囊下。此外，就ARMD和CME而言，最优选将所述的长效制剂直接布置在巩膜外表面上、特农囊下且一般在斑点上。在使用新西兰白色家兔进行的研究中，将购自Steraloids，Inc.of Wilton，NewHampshire的使血管稳定的类固醇4，9(11)-孕二烯-17.α.，21-二醇-3，20-二酮-21-乙酸酯的长效药物制剂直接布置在家兔眼的巩膜外表面上、特农囊下和中纬线稍后部。这类药物长效制剂产生一定浓度的使血管稳定的类固醇，平均分布在整个视网膜内并在注射后当天测定高于由位于家兔眼结膜下而在特农囊上的长效制剂递送的相似浓度约10倍。由于新西兰白色家兔的特农囊极薄这一事实，所以这些有益效果是非常令人意外的。重要的是注意到人眼的特农囊也极薄。4，9(11)-孕二烯-17.α.，21-二醇-3，20-二酮-21-乙酸酯和相关化合物4，9(11)-孕二烯-17.α.，21-二醇-3，20-二酮更具体地描述在美国专利US 5,770,592和US 5,679,666中，将这两篇文献的全部内容引入作为参考。
另一方面，活性组分可以为使用合适的载体、例如无菌和无致热原的水在使用前溶解的粉末形式。还可以将化合物配制成直肠用组合物，诸如栓剂或保留灌肠剂，例如含有常用栓剂基质、诸如可可脂或其它甘油酯类。
除上述制剂外，还可以将化合物配制成长效制剂。可以通过植入(例如经皮下或肌内)、肌内注射或通过上述特农囊下或玻璃体内注射给药这类长效制剂。
在本发明特别优选的实施方案中，可以制备在盐水中局部给药形式的化合物(与常用于眼用制剂的任意防腐剂和抗菌剂联用)并以滴眼剂形式给药。可以制备纯形式的抗血管生成因子溶液或混悬液且每天给药几次。另一方面，还可以将如上所述制备的抗血管生成组合物直接给药于角膜。
在优选实施方案中，使用与角膜粘合的粘膜粘着剂聚合物制备组合物。因此，例如可以使用合适的聚合物或疏水材料(例如，在可接受的油中的乳剂)或离子交换树脂或作为微溶性衍生物，例如作为微溶性盐配制化合物。在其它实施方案中，可以将抗血管生成因子或抗血管生成组合物用作常用胆固醇疗法的助剂。
用于疏水化合物的药物载体为包括苄醇、非极性表面活性剂、水混溶性有机聚合物和水相的共溶剂***。该共溶剂***可以为VPD共溶剂***。VPD为3％w/v苄醇、8％w/v非极性表面活性剂聚山梨醇酯80和65％w/v聚乙二醇300在无水乙醇中配制的溶液。VPD共溶剂***(VPD∶5W)含有使用5％葡萄糖水溶液按1∶1稀释的VPD。这种共溶剂***充分溶解疏水化合物且其自身在全身给药时产生的毒性低。当然，共溶剂***的比例可以显著改变，但是不会破坏其溶解性和毒性特征。此外，共溶剂成分的组成可以改变：例如可以使用其它低毒性非极性表面活性剂取代聚山梨醇酯80；聚乙二醇的级分大小可以改变；其它生物相容性聚合物可以取代聚乙二醇，例如聚乙烯吡咯烷酮；且其它糖类或多糖类可以替代葡萄糖。
另一方面，可以使用用于疏水药物化合物的其它递送***。脂质体和乳剂是已知递送疏水药物的媒介物或载体的实例。还可以使用某些有机溶剂，诸如二甲亚砜，不过通常以其毒性较高为代价。另外，可以使用缓释***递送化合物，诸如含有治疗剂的固体疏水聚合物的半透性基质。已经确立了各种缓释物质且是本领域技术人员公知的。缓释胶囊随其化学性质的不同可以将化合物释放几周至多达100天。根据治疗试剂化学性质和生物稳定性的不同，可以使用其它蛋白质稳定策略。
所述的药物组合物还可以包括合适的固体或凝胶相载体或赋形剂。这类载体或赋形剂的实例包括碳酸钙、磷酸钙、糖类、淀粉、纤维素衍生物、明胶和聚合物，诸如聚乙二醇类。
可以将本发明的某些化合物以与药物上相容的抗衡离子形成的盐提供。可以与许多酸形成药物上可接受的相容盐，所述酸包括盐酸、硫酸、乙酸、乳酸、酒石酸、苹果酸、琥珀酸等。盐比相应的游离碱形式更倾向于溶于水或其它质子溶剂。
下列实施例中详细描述了本发明优选化合物的制备，但本领域技术人员认为所述化学反应易于适合制备许多其它的本发明蛋白激酶抑制剂。例如，可以通过对本领域技术人员显而易见的修饰成功地合成本发明的非典型的化合物，例如使用合适的保护干扰基、通过改变使用本领域中公知的其它合适的试剂或通过对反应条件的常规改变。另一方面，认为本文公开或本领域公知的其它反应具有制备本发明其它化合物的适用性。
发明详述和优选实施方案
实施例
在下述实施例中，除非另有说明，所有温度均按照摄氏度表示且所有份数和百分比均按重量计。试剂购自商品供应商，诸如Aldrich ChemicalCompany或Lancaster Synthesis Ltd.且除非另有说明，所有试剂均不经进一步纯化就使用。四氢呋喃(THF)、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、二氯甲烷、甲苯和二噁烷以确切密封瓶的形式购自Aldrich且以公认的方式使用。除非另有说明，使用本领域技术人员易于公知的标准方法纯化所有溶剂。
一般在氩气或氮气的正压力下或使用干燥管在环境温度下(除非另有说明)和无水溶剂中进行下列反应，且给反应烧瓶安装用于通过注射器导入底物和试剂的橡胶隔板。烘干和/或加热干燥玻璃器皿。用硅胶60F 254的玻璃衬板Analtech(0.25mm)进行分析薄层色谱(TLC)并使用合适的溶剂比例(v/v)洗脱，且如果合适进行标示。通过TLC检测反应且通过原料耗尽判断反应终止。
使用对茴香醛喷雾试剂或磷钼酸试剂(Aldrich Chemical 20wt％在乙醇中)使TLC显色并使用加热活化。除非另有说明，一般通过使用反应溶剂或萃取溶剂使反应体积加倍且然后使用应用25％体积的萃取体积的所示水溶液洗涤进行处理。用无水Na2SO4干燥产物溶液，此后过滤并在减压条件下用旋转蒸发器蒸发溶剂且注意在真空中除去溶剂。除非另有说明，使用Baker等级快速硅胶(47-61m)和约20∶1-50∶1的硅胶∶粗物质进行快速柱色谱纯化(Still等，J.Org.Chem.，43，2923(1978))。在实施例中指定的压力或环境温度下进行氢解。
用在300MHz下操作的Bruker仪记录1H-NMR波谱并在75MHz下操作记录13C-NMR波谱。作为CDCl3溶液得到NMR波谱(以ppm报导)，将氯仿作为参比标准(7.25ppm和77.00ppm)或CD3OD(3.4和4.8ppm和49.3ppm)，或如果合适，内标为四甲基硅烷(0.00ppm)。如果需要，使用其它NMR溶剂。当报导了峰多样性时，使用下列缩写：s(单峰)，d(双峰)，t(三重峰)，m(多重峰)，br(宽峰)，dd(双二重)，dt(双三重峰)。如果给出偶合常熟，以Hertz(Hz)报导。
用Perkin-Elmer FT-IR分光计以纯油，以KBr片或以CDCl3溶液形式记录红外(IR)光谱，且如果给出，则以波数(cm-1)报导。使用LSIMS或电喷雾获得质谱。所有的熔点(mp)均未校准。
实施例1(a)2-(4-氯-2-硝基-苯基)-丙二酸二甲酯
Figure A20038010969700391
向NaH(36.0g，1500mmo1)在NMP(1.0L)中的搅拌淤浆中滴加丙二酸二甲酯(137.4mL，1200mmol)。根据需要冷却该反应混合物以保持内部温度低于30摄氏度。在气体停止放出后，向该反应混合物中加入2，4-二氯硝基苯(192g，1000mmol)。将该反应混合物谨慎加热至65摄氏度，直到通过HPLC测定反应完成。将该反应混合物冷却至室温且然后倾倒在混合了150mL浓HCl的500mL冰上。使用1N NaOH将水层的pH调节至中性。通过经粗多孔滤器过滤除去固体并用水(3L)冲洗。将黄色固体干燥过夜。收率261.5g，91％。
实施例1(b)(4-氯-2-硝基-苯基)-乙酸甲酯
Figure A20038010969700401
将2-(4-氯-2-硝基-苯基)-丙二酸二甲酯(195g，679.4mmol)在水(100mL)和NMP(1000mL)中的溶液加热至回流3.5小时。通过旋转蒸发除去溶剂得到油状物。将该油状物溶于EtOAc且然后用水(5×300mL)洗涤。然后用EtOAc(4×300mL)萃取水层。用水许洗涤有机层。合并有机层并用MgSO4干燥。通过过滤除去固体后，蒸发溶剂，得到所需产物，为橙色/棕色固体(160.0g，95％)。
实施例1(c)(2-乙酰氨基-4-氯-苯基)-乙酸甲酯
Figure A20038010969700402
向充氩气的烧瓶中加入(4-氯-2-硝基-苯基)-乙酸甲酯(40g，175mmol)、10％Pd/C(2.5g)、乙酐(64mL，677mmol)、水(9mL)和乙酸(150mL)。用30PSI的氢气真空充满烧瓶并剧烈振摇。2小时后，再加入10％Pd/C(2g)，且反应在总计4小时反应时间后完成。通过过滤除去10％Pd/C，并通过旋转蒸发除去溶剂。
实施例1(d)6-氯-1H-吲唑-3-甲酸甲酯
Figure A20038010969700403
在1小时内向在90摄氏度下搅拌的(2-乙酰氨基-4-氯-苯基)-乙酸甲酯(32.0g，133mmol)在乙酸(200mL)中的溶液中加入亚硝酸叔丁酯(20.5mL.172.3mmol)。将该反应混合物倾入水(1.4L)并通过过滤回收固体。将黄色沉淀溶于EtOAc，然后用饱和NaCl洗涤。用MgSO4干燥有机层、过滤并浓缩至得到固体。将该固体用己烷研磨并过滤而得到所需物质(21.63g，77％)。
实施例1(e)6-氯-1-(四氢-吡喃-2-基)-1H-吲唑-3-甲酸甲酯
Figure A20038010969700411
向6-氯-1H-吲唑-3-甲酸甲酯(8.3g，39.5mmol)在MeCN(200mL)中的淤浆中加入3，4-二氢-2H-吡喃(5.4mL，59.3mmol)和对-甲苯磺酸(237mg，1.25mmol)。在将该反应混合物搅拌10分钟后，加入饱和NaHCO3(1mL)并通过旋转蒸发除去溶剂至体积为100mL。用EtOAc稀释该混合物并用水(50mL)且然后用饱和NaCl(50mL)洗涤。然后用Na2SO4干燥有机层。通过过滤除去固体后，通过旋转蒸发将有机层浓缩至得到油状物。用己烷使产物从油状物中沉淀而得到所需产物(7.667g，收率66％)。
实施例1(f)6-(2-甲氧羰基-苯基氨基)-1-(四氢-吡喃-2-基)-1H-吲唑-3-甲酸甲酯
Figure A20038010969700412
向6-氯-1H-吲唑-3-甲酸甲酯(2.94g，10.0mmol)在1，2-二甲氧基乙烷(30mL)中的溶液中加入K3PO4(5.32g，25.0mmol)、三(二亚苄基丙酮)合二钯(459mg，0.05mmol)、2-(二环己基膦基)联苯(701mg，2.0mmol)和邻氨基苯甲酸甲酯(2.59mL，20.0mmol)。用氩气将该溶液真空冲洗3次，此后加热至18摄氏度18小时。将该反应混合物冷却至室温并通过过滤滤出固体。在用乙酸乙酯将固体洗涤后，通过旋转蒸发除去溶剂。对残余油状物进行色谱纯化(150g硅胶，10-30％EtOAc/己烷)而得到1.23g(51％)所需产物。
实施例1(g)6-(2-甲氧羰基-苯基氨基)-1-(四氢-吡喃-2-基)-1H-吲唑-3-甲酸
Figure A20038010969700421
向6-(2-甲氧羰基-苯基氨基)-1-(四氢-吡喃-2-基)-1H-吲唑-3-甲酸甲酯(2.05g，5mmol)在甲醇(18mL)和四氢呋喃(8mL)中的溶液中加入氢氧化钠(0.30g，7.5mmol)在水(2.7mL)中的溶液。将该反应混合物在室温下搅拌3小时且然后用1N HCl中和至pH为1。用EtOAc(25mL)和水(25mL)稀释该混合物。在分离各层后，用CH2Cl2(3×25mL)洗涤水层。用饱和NaCl(100mL)洗涤合并的有机萃取物且然后用Na2SO4干燥。过滤固体并将液体浓缩至得到油状物。使产物从EtOAc和己烷中结晶而得到所需产物(1.616g，82％)。
实施例1(h)2-[3-甲基氨基甲酰基-1-(四氢-吡喃-2-基)-1H-吲唑-6-基氨基]-苯甲酸甲酯
向6-(2-甲氧羰基-苯基氨基)-1-(四氢-吡喃-2-基)-1H-吲唑-3-甲酸(0.50g，1.27mmol)在DMF中的溶液中加入三乙胺(0.42mL，3.04mmol)、甲胺(1.9mL，3.81mmol)和HATU(0.578g，1.52mmol)。将该反应混合物搅拌3小时且然后通过旋转蒸发浓缩。对粗油状物进行色谱纯化(50g硅胶，25-50％EtOAc/己烷)而得到所需产物(214mg，42％)。
实施例1(i)2-[3-甲基氨基甲酰基-1-(四氢-吡喃-2-基)-1H-吲唑-6-基氨基]-苯甲酸
向2-[3-甲基氨基甲酰基-1-(四氢-吡喃-2-基)-1H-吲唑-6-基氨基]-苯甲酸甲酯(0.20g，0.49mmol)在甲醇(1.4mL)和四氢呋喃(0.6mL)中的溶液中加入氢氧化钠(59mg，1.47mmol)在水(0.3mL)中的溶液。将该反应混合物加热至60摄氏度下1小时且然后冷却至室温。用2N HCl将pH调节至pH为2。加入EtOAc(30mL)和水(30mL)并分离各层。用EtOAc(3×20mL)萃取水层且合并有机层。在用水(15mL)洗涤后，用Na2SO4干燥有机层。过滤出固体并蒸发有机层至得到黄色固体(193mg，100％)。
实施例1(j)6-(2-丙-2-炔基氨基甲酰基-苯基氨基)-1-(四氢-吡喃-2-基)-1H-吲唑-3-甲酸甲基酰胺
Figure A20038010969700431
向2-[3-甲基氨基甲酰基-1-(四氢-吡喃-2-基)-1H-吲唑-6-基氨基]-苯甲酸(150mg，0.381mmol)在DMF(3.6mL)中的溶液中加入炔丙基胺(0.052mL，0.761mmol)、TEA(0.264mL，1.90mmol)和HATU(217mg，0.571mmol)。将该反应混合物搅拌4小时且然后用EtOAc(30mL)和水(30mL)稀释。分离各层并用EtOAc(2×20mL)萃取水层。用饱和NaCl(15mL)洗涤合并的有机层且然后用Na2SO4干燥。通过过滤除去固体并通过旋转蒸发浓缩液体而得到黄色油状物(164mg，100％)。
实施例1(k)6-(2-丙-2-炔基氨基甲酰基-苯基氨基)-1H-吲唑-3-甲酸甲基酰胺
在1.5mL的90∶10∶1CH2Cl2∶TFA∶三乙基硅烷的混合物中溶解6-(2-丙-2-炔基氨基甲酰基-苯基氨基)-1-(四氢-吡喃-2-基)-1H-吲唑-3-甲酸甲基酰胺(30mg)并加热至回流12小时。用甲苯(40mL)稀释该溶液并通过旋转蒸发浓缩而得到油状物。将该油状物溶于DMF(1mL)并使用0.2-微米针筒式滤器过滤。使用制备型-HPLC分离所需化合物(12mg，50％)。1H NMR(CDCl3-d)δ 9.96(1H，s)，□□□□s).？？？8.28(1H，d，J＝8.85Hz)，7.47(1H，m)，7.34(1H，m)，7.22(1H，m)，7.15(1H，dd，J1＝8.76Hz，J2＝1.79Hz)，6.99(1H，m)，6.86(1H，t，J＝6.97Hz)，6.31(1H，m)，4.23(2H，dd，J1＝5.18Hz，J2＝2.54Hz)，3.49(3H，s)，2.29(s，1H)。
对C19H17N5O2·1.0MeOH.0.1TFA的分析，计算值：C，62.08；H，5.44；N，17.92。测定值：C，61.78；H，5.45；N，18.04。
实施例2(a)[6-氯-1-(四氢-吡喃-2-基)-1H-吲唑-3-基]-甲醇
向冷却至-78摄氏度的6-氯-1H-吲唑-3-甲酸甲酯(2.94g，10.0mmol)在干CH2Cl2(50mL)中的溶液中缓慢加入DIBAL-H(3.56mL，20.0mmol)。在添加完成后，将该反应混合物温热至室温，其中HPLC显示仍存在10％剩余原料。然后再加入DIBAL-H(0.35mL)并搅拌10分钟。用EtOAc(1000mL)稀释该反应混合物并用1N HCl(2×100mL)洗涤。将该体系进一步用1NNaHCO3(100mL)洗涤且然后用饱和NaCl(100mL)洗涤。用MgSO4干燥有机层、过滤且然后浓缩至得到白色固体(2.65g，99.5％)。
实施例2(b)6-氯-1-(四氢-吡喃-2-基)-1H-吲唑-3-醛
Figure A20038010969700442
将[6-氯-1-(四氢-吡喃-2-基)-1H-吲唑-3-基]-甲醇(1.75g，6.58mmol)、IBX(2.76g，9.87mmol)和DMSO(27mL)的溶液搅拌过夜。将该反应混合物用EtOAc和水稀释。分离各层并用EtOAc(3×100mL)萃取水层。合并有机层并用饱和NaCl(100mL)洗涤。用MgSO4干燥有机层、过滤且然后浓缩至得到固体。将该固体溶于CH2Cl2并过滤。蒸发有机层至得到所需产物(1.707g，92％)。
实施例2(c)1-(6-氯-1H-吲唑-3-基)-2-(5-乙基-吡啶-2-基)-乙醇
Figure A20038010969700451
向在-50摄氏度下的4-乙基-2-甲基吡啶(0.458g，3.79mmol)在THF(4mL)中的搅拌溶液中缓慢加入丁基锂(1.5mL，2.5M，3.79mmol)并搅拌10分钟。向该反应混合物中缓慢加入6-氯-1H-吲唑-3-醛(0.5g，1.89mmol)在THF(4mL)中的溶液。在搅拌10分钟后，用1N柠檬酸(10mL)使反应猝灭。用EtOAc(50mL)、水(20mL)和饱和NaCl(10mL)稀释该混合物。分离各层并用EtOAc(3×15mL)萃取水层。合并有机层并用饱和NaCl(20mL)洗涤。用Na2SO4干燥有机层后，通过过滤除去固体并通过旋转蒸发将液体浓缩至得到油状物。进行色谱纯化(40g硅胶，60-100％EtOAc/己烷)而得到所需产物(142mg，32％)并回收6-氯-1H-吲唑-3-醛(348mg)。
实施例2(d)6-氯-3-[2-(5-乙基-吡啶-2-基)-乙烯基]-1H-吲唑
Figure A20038010969700452
向1-(6-氯-1H-吲唑-3-基)-2-(5-乙基-吡啶-2-基)-乙醇(232mg，0.60mmol)在CH2Cl2中的搅拌溶液中加入TEA(0.25mL，1.81mmol)和甲磺酰氯(0.070mL，0.90mmol)。将该反应混合物搅拌30分钟且然后加入DBU(2mL)。将该反应混合物回流18小时且然后用40mL 1N柠檬酸使反应猝灭。分离各层并用20mL CH2Cl2萃取水层。用Na2SO4干燥合并的有机层、过滤并通过旋转蒸发浓缩(12g硅胶，50-70％EtOAc/己烷)而得到所需化合物(135mg，71％)。
实施例2(e)2-{3-[2-(5-乙基-吡啶-2-基)-乙烯基]-1H-吲唑-6-基氨基}-苯甲酸甲酯
将1，2-二甲氧基甲烷(2mL)加入到6-氯-3-[2-(5-乙基-吡啶-2-基)-乙烯基]-1H-吲唑(130mg，0.354mmol)、三(二亚苄基丙酮)合二钯(16mg，0.018mmol)、-(二环己基膦基)联苯(25mg，0.071mmol)、K3PO4(0.188g，0.885mmol)和邻氨基苯甲酸甲酯(0.092mL，0.71mmol)中。用氩气(4x)真空冲洗该反应混合物且然后加热至80摄氏度19小时。用EtOAc(20mL)稀释该反应混合物并通过硅胶垫过滤。在用EtOAc(50mL)洗涤后，通过旋转蒸发除去溶剂。通过色谱法纯化粗油状物(40g硅胶，30-40％EtOAc/己烷)而得到所需产物(54mg，32％)。
实施例2(f)2-(3-[2-(5-乙基-吡啶-2-基)-乙烯基]-1H-吲唑-6-基氨基)-苯甲酸
Figure A20038010969700462
向2-{3-[2-(5-乙基-吡啶-2-基)-乙烯基]-1H-吲唑-6-基氨基}-苯甲酸甲酯(50mg，0.104mmol)在甲醇(0.42mL)和THF(0.10mL)中的溶液中加入氢氧化钠(12mg，0.311mmol)在水(0.05mL)中的溶液。将该溶液加热至60摄氏度3.5小时且然后用饱和NH4Cl中和。用水(20mL)稀释该反应混合物且然后用EtOAc(2×20mL)萃取。首先用Na2SO4干燥合并的萃取物且然后通过过滤除去固体。在旋转蒸发除去溶剂后回收所需产物(48.7mg，100％)。
实施例2(g)2-{3-[2-(5-乙基-吡啶-2-基)-乙烯基]-1H-吲唑-6-基氨基}-N-丙-2-炔基-苯甲酰胺
向2-{3-[2-(5-乙基-吡啶-2-基)-乙烯基]-1H-吲唑-6-基氨基}-苯甲酸(49mg，0.105mmol)中加入2mL的90∶10∶1CH2Cl2∶TFA∶TES的混合物。将该反应混合物在回流状态下搅拌1小时且然后用甲苯(20mL)稀释。通过旋转蒸发除去溶剂而得到粘稠油状物。将该油状物溶于DMF(1mL)并向该溶液中加入TEA(0.072mL，0.52mmol)、炔丙基胺(0.014mL，0.208mmol)和HATU(59mg，0.156mmol)。将该反应混合物搅拌3小时且然后通过制备型HPLC纯化而得到所需产物(29mg，66％)。1H NMR(CDCl3-d)：δ9.83(1H，s)，8.63(2H，s)，8.04(2H，m)，7.68(2H，s)，7.47(1H，m)，7.32(1H，d，J＝1.51Hz)，7.10(1H，dd，J1＝8.67Hz，J2＝1.88Hz)，6.93(1H，m)，6.07(2H，dd，J1＝5.09Hz，J2＝2.26Hz)，3.15(1H，t，J＝2.35Hz)，2.97(2H，s)，2.74(1H，s)，2.29(1H，s)，1.27(3H，t，J＝7.44Hz)。对C26H23N5O·0.3H2O·1.2TFA的分析计算值：C，60.51；H，4.43；N，12.42.测定值：C，60.38；H，4.73；N，12.44。
实施例2(h)N-环丙基-2-{3-[(E)-2-(4-甲基-吡啶-2-基)-乙烯基]-1H-吲唑-6-基氨基}-苯甲酰胺
Figure A20038010969700472
按照与上述2-{3-[2-(5-乙基-吡啶-2-基)-乙烯基]-1H-吲唑-6-基氨基}-N-丙-2-炔基-苯甲酰胺类似的方法制备标题化合物，在制备1-(6-氯-1H-吲唑-3-基)-2-(5-乙基-吡啶-2-基)-乙醇的步骤中用2，4-二甲基-吡啶替代4-乙基-2-甲基-吡啶且在顺序的最终步骤中用环丙基胺取代炔丙基胺。1HNMR(DMSO-d6)：δ9.85(1H，s)，8.56(2H，m)，8.20(3H，m)，7.53(5H，m)，7.35(1H，s)，7.2(1H，d，J＝6.5Hz)，7.0(1H，s)，2.83(1H，m)，0.70(2H，m)，0.56(2H，m)。ESIMS(M+H+)：410.3。
实施例3(a)N-甲氧基-2-[3-((E)-2-吡啶-2-基-乙烯基)-1H-吲唑-6-基氨基]-苯甲酰胺
Figure A20038010969700481
用HATU(48mg，0.13mmol)处理2-[3-(2-吡啶-2-基-乙烯基)-1H-吲唑-6-基氨基]-苯甲酸(50.0mg，0.084mmol)、O-甲基-羟基胺盐酸盐(15mg，0.17mmol)、三乙胺(58μl，0.42mmol)溶于DMF(0.8mL)的溶液。将该混合物搅拌过夜、然后通过反相HPLC纯化而得到21.6mg(67％)的标题化合物，为黄色固体。1H NMR(DMSO-d6)：δ9.23(1H，s)，8.71(1H，d，J＝2.2)，8.05(4H，m)，7.51(5H，m)，7.25(1H，s)，7.10(1H，d，J＝7.7Hz)，6.91(1H，m)，5.98(1H，m)，4.31(1H，d，J＝14.3)，7.20(1H，d，J＝7.3)，4.42(2H，d，J＝3.2)。ESIMS(M+H+)：412.1。
实施例3(b)N-烯丙氧基-2-[3-((E)-2-吡啶-2-基-乙烯基)-1H-吲唑-6-基氨基]-苯甲酰胺
用HATU(48mg，0.13mmol)处理2-[3-(2-吡啶-2-基-乙烯基)-1H-吲唑-6-基氨基]-苯甲酸(50.0mg，0.084mmol)、O-烯丙基-羟基胺盐酸盐(18.3mg，0.17mmol)、三乙胺(58μl，0.42mmol)溶于DMF(0.8mL)的溶液。将该混合物搅拌过夜，然后通过反相HPLC纯化而得到25.5mg(74％)的标题化合物，为黄色固体。1H NMR(DMSO-d6)：δ9.28(1H，s)，8.67(2H，d，J＝3.4)，8.05(4H，m)，7.48(5H，m)，7.23(1H，s)，7.04(1H，d，J＝7.6Hz)，6.91(1H，m)，3.69(3H，s)。ESIMS(M+H+)：386.1。
实施例3(c)N-异丙氧基-2-[3-((E)-2-吡啶-2-基-乙烯基)-1H-吲唑-6-基氨基]-苯甲酰胺
Figure A20038010969700483
用HATU(48mg，0.13mmol)处理2-[3-(2-吡啶-2-基-乙烯基)-1H-吲唑-6-基氨基]-苯甲酸(50.0mg，0.084mmol)、O-烯丙基-羟基胺盐酸盐(18.7mg，0.17mmol)、三乙胺(58μl，0.42mmol)溶于DMF(0.8mL)的溶液。将该混合物搅拌过夜、然后通过反相HPLC纯化而得到17.4mg(50％)的标题化合物，为黄色固体。1H NMR(DMSO-d6)：δ9.23(1H，s)，8.69(H，d，J＝2.1)，8.03(4H，m)，7.50(5H，m)，7.23(1H，s)，7.04(1H，d，J＝6.7Hz)，6.92(1H，m)，5.98(1H，m)，4.13(1H，m)，1.29(6H，d，J＝8.1)。ESIMS(M+H+)：414.1。
实施例3(d)N-环丙基-2-[3-((E)-2-吡啶-2-基-乙烯基)-1H-吲唑-6-基氨基]-苯甲酰胺
Figure A20038010969700491
用HATU(48mg，0.13mmol)处理2-[3-(2-吡啶-2-基-乙烯基)-1H-吲唑-6-基氨基]-苯甲酸(50.0mg，0.084mmol)、环丙基胺(11.6uL，0.17mmol)、三乙胺(58μl，0.25mmol)溶于DMF(0.8mL)的溶液。将该混合物搅拌过夜、然后通过反相HPLC纯化而得到11.7mg(35％)的标题化合物，为黄色固体。1HNMR(DMSO-d6)：δ9.81(1H，s)，8.68(1H，d，J＝1.7)，8.51(1H，s)，8.01(4H，m)，7.50(5H，m)，7.24(1H，s)，7.03(1H，d，J＝5.3)，6.89(1H，t，J＝4.2)，2.84(1H，m)，0.72(2H，m)，0.56(2H，m)。ESIMS(M+H+)：396.1。
实施例3(f)1-甲基-1H-吡咯-2-甲酸N′-(1-{2-[3-((E)-2-吡啶-2-基-乙烯基)-1H-吲唑-6-基氨基]-苯基}-甲酰基)-酰肼
Figure A20038010969700492
用HATU(48mg，0.13mmol)处理2-[3-(2-吡啶-2-基-乙烯基)-1H-吲唑-6-基氨基]-苯甲酸(50.0mg，0.084mmol)、1-甲基-1H-吡咯-2-甲酸酰肼(23.3mg，0.17mmol)、三乙胺(58μl，0.42mmol)溶于DMF(0.8mL)的溶液。将该混合物搅拌过夜、然后通过反相HPLC纯化而得到16.1mg(35％)的标题化合物，为黄色固体。1H NMR(DMSO-d6)：δ10.39(1H，s)，10.00(1H，s)，9.52(1H，s)，8.67(1H，d，J＝2.4)，8.07(4H，m)，7.77(1H，d，J＝5.2)，7.51(4H，m)，7.32(1H，s)，7.09(1H，d，J＝6.3)，6.98(3H，m)，6.13(1H，m)，3.87(3H，s)。ESIMS(M+H+)：478.1。
实施例3(g)N-苄基-2-[3-((E)-2-吡啶-2-基-乙烯基)-1H-吲唑-6-基氨基]-苯甲酰胺
Figure A20038010969700501
用HATU(48mg，0.13mmol)处理2-[3-(2-吡啶-2-基-乙烯基)-1H-吲唑-6-基氨基]-苯甲酸(50.0mg，0.084mmol)、苄胺(18.2μl，0.17mmol)、三乙胺(58μl，0.42mmol)溶于DMF(0.8mL)的溶液。将该混合物搅拌过夜、然后通过反相HPLC纯化而得到45.2mg(76％)的标题化合物，为TFA盐(1.5H2O，2.1TFA，有效MW＝711.98)。1H NMR(DMSO-d6)：δ9.86(1H，s)，9.14(1H，t，J＝5.4)，8.73(1H，d，J＝4.8)，8.29(4H，m)，7.56(1H，d，J＝7.0)，7.74(2H，m)，7.89(2H，m)，7.31(5H，m)，7.16(1H，d，J＝7.8)，6.93(1H，t，J＝7.3)，4.46(2H，d，J＝6.1)。ESIMS(M+H+)：446.5。
实施例3(h)N-(2-M乙氧基-苄基)-2-[3-((E)-2-吡啶-2-基-乙烯基)-1H-吲唑-6-基氨基]-苯甲酰胺
用HATU(48mg，0.13mmol)处理2-[3-(2-吡啶-2-基-乙烯基)-1H-吲唑-6-基氨基]-苯甲酸(50.0mg，0.084mmol)、o-甲氧基苄胺(21.8uL，0.17mmol)、三乙胺(58μl，0.42mmol)溶于DMF(0.8mL)的溶液。将该混合物搅拌过夜、然后通过反相HPLC纯化而得到46mg(81％)的标题化合物，为TFA盐(1.5H2O，1.5TFA，有效MW＝673.59)。1H NMR(DMSO-d6)：δ9.83(1H，s)，9.03(1H，t，J＝3.4)，8.70(1H，d，J＝3.7)，8.08(4H，m)，7.82(1H，d，J＝7.4)，7.49(4H，m)，7.21(3H，m)，6.96(4H，m)，4.48(2H，d，J＝6.3)。ESIMS(M+H+)：476.1。
实施例3(i)N-呋喃-2-基甲基-2-[3-((E)-2-吡啶-2-基-乙烯基)-1H-吲唑-6-基氨基]-苯甲酰胺
Figure A20038010969700503
用HATU(48mg，0.13mmol)处理2-[3-(2-吡啶-2-基-乙烯基)-1H-吲唑-6-基氨基]-苯甲酸(50.0mg，0.084mmol)、C-呋喃-2-基-甲胺(19μL，0.17mmol)、三乙胺(58μl，0.42mmol)溶于DMF(0.8mL)的溶液。将该混合物搅拌过夜、然后通过反相HPLC纯化而得到45mg(85％)的标题化合物，为TFA盐(1.5H2O，1.5TFA，有效MW＝633.52)。1H NMR(DMSO-d6)：δ9.82(1H，s)，9.05(1H，t，J＝2.6)，8.73(1H，d，J＝3.7)，8.13(4H，m)，7.73(1H，d，J＝6.8)，7.57(2H，m)，7.26(1H，s)，7.03(1H，d，J＝7.5)，6.40(1H，m)，6.28(1H，m)，4.48(2H，d，J＝6.5)。ESIMS(M+H+)：436.1。
实施例3(j)N-环丁基-2-[3-((E)-2-吡啶-2-基-乙烯基)-1H-吲唑-6-基氨基]-苯甲酰胺
Figure A20038010969700511
用HATU(48mg，0.13mmol)处理2-[3-(2-吡啶-2-基-乙烯基)-1H-吲唑-6-基氨基]-苯甲酸(50.0mg，0.084mmol)、环丁胺(18.2uL，0.17mmol)、三乙胺(58μl，0.42mmol)溶于DMF(0.8mL)的溶液。将该混合物搅拌过夜、然后通过反相HPLC纯化而得到43.2mg(92％)的标题化合物，为TFA盐(1.5H2O，1.1TFA，有效MW＝561.92)。1H NMR(DMSO-d6)：δ9.78(1H，s)，8.72(2H，m)，8.13(4H，m)，7.70(1H，d，J＝7.1)，7.58(2H，m)，7.41(2H，m)，7.27(1H，s)，6.89(1H，t，J＝4.2)，2.84(1H，m)，0.72(2H，m)，0.56(2H，m)。ESIMS(M+H+)：396.1。
实施例3(k)N-(2-甲基-烯丙基)-2-[3-((E)-2-吡啶-2-基-乙烯基)-1H-吲唑-6-基氨基]-苯甲酰胺
Figure A20038010969700512
用HATU(48mg，0.13mmol)处理2-[3-(2-吡啶-2-基-乙烯基)-1H-吲唑-6-基氨基]-苯甲酸(50.0mg，0.084mmol)、2-甲基-烯丙基胺(16.4uL，0.17mmol)、三乙胺(58μl，0.42mmol)溶于DMF(0.8mL)的溶液。将该混合物搅拌过夜、然后通过反相HPLC纯化而得到45mg(91％)的标题化合物，为TFA盐(1.6H2O，1.3TFA，有效MW＝586.53)。1H NMR(DMSO-d6)：δ9.78(1H，s)，8.72(2H，m)，8.13(4H，m)，7.70(1H，d，J＝7.1)，7.58(2H，m)，7.41(2H，m)，7.27(1H，s)，7.06(1H，d，J＝7.1)，6.91(1H，t，J＝7.5)，4.42(1H，m)，2.22(2H，m)，2.08(2H，m)，1.68(2H，m)。ESIMS(M+H+)：410.1。
实施例3(l)6-硝基-3-吡啶-2-基乙炔基-1-(2-三甲基硅烷基-乙氧基甲基)-1H-吲唑
Figure A20038010969700521
将3-碘-6-硝基-1-(2-三甲基硅烷基-乙氧基乙基)-1H-吲唑(838mg，2.0mmol)、2-乙炔基-吡啶(242μL，2.4mmol)和三乙胺(6.0mL)的混合物脱气并用氩气冲洗，然后用CuI(8mg，0.042mmol)和Pd(PPh3)2Cl2(16mg，0.023mmol)处理。将所得混合物在室温下搅拌过夜，此时HPLC显示所有原料均已消耗。通过在高度真空中反萃取挥发性物质、然后通过用乙酸乙酯洗脱的硅胶垫来纯化该混合物。不经进一步纯化将所得产物用于下一步。ESIMS(M+H+)：395.1。
实施例3(m)3-吡啶-2-基乙炔基-1-(2-三甲基硅烷基-乙氧基甲基)-1H-吲唑-6-基胺
Figure A20038010969700522
将6-硝基-3-吡啶-2-基乙炔基-1-(2-三甲基硅烷基-乙氧基甲基)-1H-吲唑(2mmol)、SnCl2(1.37uL，6.0mmol)、水(0.5mL)和二MeOH(10ml)的混合物在60℃的油浴上搅拌30分钟，此时HPLC显示完全还原。用甲醇反萃取所得混合物、悬浮于EtOAc(50mL)中并用1M NaOH(18mL)稀释。用EtOAc(10×25ml)缓慢萃取所得乳浊液。用1M Na2SO4、盐水萃取合并的有机层、用MgSO4干燥、浓缩并通过用EtOAc洗脱的硅胶垫过滤。两步的粗产物产量为701mg，质量收率96％。ESIMS(M+H+)：365.1。
实施例3(n)2-[3-吡啶-2-基乙炔基-1-(2-三甲基硅烷基-乙氧基甲基)-1H-吲唑-6-基氨基]-苯甲酸甲酯
Figure A20038010969700531
用氮气真空冲洗3-吡啶-2-基乙炔基-1-(2-三甲基硅烷基-乙氧基甲基)-1H-吲唑-6-胺(560mg，1.54mmol)、2-溴甲基苯甲酸酯(647.5uL，4.61mmol)、联苯-2-基-二环己基-磷烷(107.8mg，0.308mmol)、Pd2(dba)3(70.5mg，0.0768mmol)、K3PO4(816mg，3.844mmol和二甲氧基乙烷(1.7ml)的混合物、然后在70℃的油浴上加热24小时。用二氯甲烷稀释该黑色混合物并过滤、浓缩且进行色谱纯化(20％-40％乙酸乙酯/己烷)。得到260mg黄色/橙色油状物，三步收率为35％。
实施例3(o)2-[3-吡啶-2-基乙炔基-1-(2-三甲基硅烷基-乙氧基甲基)-1H-吲唑-6-基氨基]-苯甲酸
Figure A20038010969700532
将2-[3-吡啶-2-基乙炔基-1-(2-三甲基硅烷基-乙氧基甲基)-1H-吲唑-6-基氨基]-苯甲酸甲酯(253mg，0.517mmol)加入到NaOH(62mg，1.55mmol)溶于THF(1.0mL)、MeOH(2.25mL)和水(0.5mL)的溶液中。将该反应混合物在室温下搅拌1小时，此时HPLC显示所有原料已完全消耗。用1N HCl中和该反应混合物、用乙酸乙酯萃取、然后用盐水洗涤并用MgSO4干燥。在真空中浓缩后，得到249mg黄色固体(质量收率99％)。不经进一步纯化就使用该物质。ESIMS(M-H-)：483.0。
实施例3(p)2-[3-吡啶-2-基乙炔基-1H-吲唑-6-基氨基]-苯甲酸
Figure A20038010969700533
将2-[3-吡啶-2-基乙炔基-1-(2-三甲基硅烷基-乙氧基甲基)-1H-吲唑-6-基氨基]-苯甲酸(231mg，0.477)、1M氟化四丁基铵在THF(3.8mL，3.816mmol)中的溶液，和乙二胺(127uL，1.908mmol)的溶液在80℃下的油浴中搅拌6小时。用乙酸(218uL，3.816mmol)使该反应猝灭、用水稀释并用EtOAc(10×50mL)萃取。用盐水洗涤合并的有机层并用MgSO4干燥。在浓缩后，将形成的固体用CH2Cl2研磨而得到产物，为黄色粉末(124mg，73％)。ESIMS(M-H-)：353.0。
实施例3(q)N-丙-2-炔基-2-[3-((E)-2-吡啶-2-基-乙烯基)-1H-吲唑-6-基氨基]-苯甲酰胺
用HATU(89mg，0.233mmol)处理2-(3-吡啶-2-基乙炔基-1H-吲唑-6-基氨基)-苯甲酸(41mg，0.117mmol)、炔丙基胺(24μL，0.35mmol)、三乙胺(81μl，0.58mmol)溶于DMF(0.5mL)的溶液。将该混合物搅拌过夜、然后通过反相HPLC纯化而得到27mg(59％)的标题化合物，黄色固体。1HNMR(DMSO-d6)：δ9.78(1H，s)，8.99(1H，m)，8.61(1H，d，J＝2.1)，7.88(1H，s)，7.72(3H，m)，7.43(4H，m)，7.29(1H，s)，7.04(1H，d，J＝7.3)，6.91(1H，t，J＝5.2)，4.04(2H，s)，3.04(1H，s)。ESIMS(M+H+)：392.1。
实施例4(a)：2-溴-4，6-二甲基-吡啶
Figure A20038010969700542
将48％HBr溶液(水溶液)(Aldrich，65mL，1.2mol，10eq)冷却至-5℃并用4，6-二甲基-吡啶-2-基胺(Aldrich，15.0g，0.12mol.1.0eq)处理。使用机械搅拌器搅拌粘稠的白色盐混合物，同时滴加溴(Aldrich，19.7mL，0.38mol，3.1eq)。在1小时内用NaNO2的水溶液(32mL H2O)(Aldrich，22.1g，0.32mol，2.6eq)处理所得红色混合物。在加入亚硝酸盐中温度维持在低于5℃，且然后在2小时内逐步加热至20℃。用NaOH(水溶液)将该反应混合物调节至pH14并用MTBE萃取。用水、盐水洗涤有机萃取物、用硫酸镁干燥、过滤并在减压条件下浓缩。通过快速色谱法(硅胶，350g)纯化粗产物(29g红色油状物)并用2-7％乙酸乙酯-环己烷洗脱而得到橙色油状物(11.0g，48％)。1HNMR(DMSO-d6，300MHz)δ7.30(1H，s)，7.13(1H，s)，2.39(3H，s)，2.26(3H，s)。13C NMR(DMSO-d6，75MHz)δ159.4，151.3，140.9，125.7，124.0，23.7，20.3。ESI m/z 186/188(M+H)+。
实施例4(b)：3-[2-(4，6-二甲基-吡啶-2-基)-乙烯基]-6-硝基-1-(四氢-吡喃-2-基)-1H-吲唑
通过氩气鼓泡将2-溴-4，6-二甲基吡啶(2.42g，13mmol)、3-乙烯基-6-硝基-1-(四氢-吡喃-2-基)-1H-吲唑(2.37g，8.67mmol)、乙酸钯(0.145g，0.65mmol)、三-邻-甲苯基膦(0.791g，2.6mmol)和二异丙基乙胺(2.4mL，13.8mmol)在DMF水溶液(85％，34.5mL)中的混悬液脱气5分钟，随后超声处理5分钟，此后在110℃下用微波仪(300瓦，10％能量)加热40分钟。冷却后，将该混合物滴入冷水。通过过滤收集所得黄色沉淀物。将固体溶于乙酸乙酯、干燥(硫酸钠)并在减压条件下浓缩。用硅胶纯化残余物，使用0-20％乙酸乙酯在氯仿与己烷(1∶1)混合物中的溶液梯度作为洗脱液。将色谱纯化的产物用MTBE/己烷研磨而得到澄清产物，为黄色固体。按照类似方式用硅胶再纯化母液，随后研磨而得到更为澄清的产物，收率68％。1H NMR(CDCl3)：δ8.54(1H，s)，8.15(1H，d，J＝9.4Hz)，8.08(1H，dd，J＝9.04，1.9Hz)，7.87(1H，d，J＝9.0，3.0Hz)，4.08-4.01(1H，m)，3.84-3.76(1H，m)，2.56(3H，s)，2.62-2.54(1H，m)，2.34(3H，s)，2.24-2.10(2H，m)，1.88-1.68(3H，m)。
实施例5)：3-[2-(4，6-二甲基-吡啶-2-基)-乙烯基]-1-(四氢-吡喃-2-基)-1H-吲唑-6-基胺
Figure A20038010969700552
将3-[2-(4，6-二甲基-吡啶-2-基)-乙烯基]-6-硝基-1-(四氢-吡喃-2-基)-1H-吲唑(4.22g，11.16mmol)、铁粉(2.71g，48.51mmol)和饱和NH4Cl(25ml)在25ml乙醇中的混悬液在45℃下加热18小时。将该反应混合物冷却并通过滤纸过滤，用甲醇洗涤。在减压条件下除去溶剂并用EtOAc(2x)萃取水层。用盐水洗涤合并的有机层、干燥(MgSO4)并在减压条件下浓缩而得到4.02g(定量)的铁锈色固体且不经进一步纯化就使用。
1H NMR(DMSO-d6)δ7.79(1H，s)，7.74(1H，d，J＝16.4Hz)，7.35(1H，d，J＝16.4Hz)，7.29(1H，s)，6.96(1H，s)，6.63(2H，m)，5.57(1H，dd，J＝2.4，9.5Hz)，5.44(2H，broad s)，3.88(1H，m)，3.67(1H，m)，2.45(3H，s)，2.37(1H，m)，2.29(3H，s)，1.99(2H，m)，1.73(1H，m)，1.57(2H，m)。
实施例6：2-[3-[2-(4，6-二甲基-吡啶-2-基)-乙烯基]-1-(四氢-吡喃-2-基)-1H-吲唑-6-基氨基]-苯甲酸甲酯
将搅拌的3-[2-(4，6-二甲基-吡啶-2-基)-乙烯基]-1-(四氢-吡喃-2-基)-1H-吲唑-6-基胺(870mg，2.5mmol)、2-溴-苯甲酸甲酯(0.44ml，3.12mmol)、R-BINAP(78mg，0.125mmol)、Pd2(dba)3(29mg，0.03mmol)和碳酸铯(1.22g，3.75mmol)在甲苯(6ml)中的混悬液脱气并在100℃下加热18小时。将该反应混合物冷却、倾入饱和NaHCO3中并用EtOAc(2x)萃取。用盐水洗涤合并的有机层、干燥(MgSO4)并在减压条件下浓缩。残余物进行快速硅胶色谱纯化，用5-10％EtOA在CH2Cl2中的梯度溶液洗脱而得到964mg(80％)黄色泡沫。
1H NMR(DMSO-d6)δ9.49(1H，s)，8.13(1H，d，J＝8.7Hz)，7.94(1H，dd，J＝1.5，8.0Hz)，7.85(1H，d，J＝16.4Hz)，7.58(1H，d，J＝1.5Hz)，7.48(1H，d，J＝16.4Hz)，7.47(1H，m)，7.37(1H，d，J＝7.7Hz)，7.34(1H，s)，7.19(1H，dd，J＝1.7，8.7Hz)，6.99(1H，s)，6.89(1H，t，J＝8.1Hz)，5.83(1H，d，J＝7.2Hz)，3.88(3H，s)，3.75(1H，m)，2.48(3H，s)，2.41(2H，m)，2.31(3H，s)，2.02(2H，m)，1.75(1H，m)，1.59(2H，m)。对C29H30N4O30.15EtOAc的分析，计算值：C，71.71；H，6.34；N，11.30。测定值：C，71.60；H，6.14；N，11.37。
实施例7：2-[3-[2-(4，6-二甲基-吡啶-2-基)-乙烯基]-1-(四氢-吡喃-2-基)-1H-吲唑-6-基氨基]-苯甲酸
向搅拌的2-[3-[2-(4，6-二甲基-吡啶-2-基)-乙烯基]-1-(四氢-吡喃-2-基)-1H-吲唑-6-基氨基]-苯甲酸甲酯(1.98g，4.11mmol)在THF∶MeOH(12ml，3∶1)中的溶液中加入溶于H2O(3ml)的氢氧化钾(1.15g，20.5mmol)。将该反应混合物在70℃下加热2小时、冷却、在减压条件下浓缩至约5ml且再用水稀释。用2N HCl中和该溶液并通过过滤收集沉淀且用水洗涤而得到2.00g(定量)的淡黄色固体。1H NMR(DSMO-d6)δ13.12(1H，宽s)，9.82(1H，s)，8.13(1H，d，J＝8.7Hz)，7.95(1H，dd，J＝1.5，8.0Hz)，7.89(1H，d，J＝16.4Hz)，7.60(1H，s)，7.50(1H，d，J＝16.4Hz)，7.46(1H，d，J＝6.9Hz)，7.37(1H，d，J＝7.7Hz)，7.20(1H，d，J＝8.7Hz)，7.06(1H，s)，6.86(1H，t，J＝6.9Hz)，5.85(1H，d，J＝7.3Hz)，3.82(2H，m)，2.50(3H，s，与dmso重叠)，2.48(2H，m)，2.34(3H，s)，2.03(2H，m)，1.76(1H，m)，1.59(2H，m)。对C28H28N4O30.5KOH的分析，计算值：C，67.72；H，5.79；N，11.28。测定值：C，67.65；H，5.88；N，11.07。
实施例8：2-{3-[2-(4，6-二甲基-吡啶-2-基)-乙烯基]-1H-吲唑-6-基氨基}-苯甲酸对-甲苯磺酸盐
将2-[3-[2-(4，6-二甲基-吡啶-2-基)-乙烯基]-1-(四氢-吡喃-2-基)-1H-吲唑-6-基氨基]-苯甲酸(2mmol)和对-甲苯磺酸(10mmol)在甲醇水溶液(90％，20mL)中的混合物在70℃下搅拌18小时。冷却后，过滤所得粘稠黄色淤浆并用甲醇洗涤固体而得到2-{3-[2-(4，6-二甲基-吡啶-2-基)-乙烯基]-1H-吲唑-6-基氨基}-苯甲酸，为甲苯磺酸盐，收率85％，为淡黄色固体。1HNMR(DSMO-d6)δ13.43(1H，s)，9.78(1H，s)，8.24-8.19(2H，m)，8.09(1H，d，J＝9.04Hz)，7.95(1H，dd，J＝7.9，1.1Hz)，7.62-7.55(2H，m)，7.49-7.38(5H，m)，7.20(1H，dd，J＝9.0，1.9Hz)，7.09(2H，d，J＝8.3Hz)，6.86(1H，dt，J＝7.9，1.1Hz)，2.67(3H，s)，2.54(3H，s)，2.27(3H，s)。
实施例9：N-[4-(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-丁-2-炔基]-2-[3-[2-(4，6-二甲基-吡啶-2-基)-乙烯基]-1-(四氢-吡喃-2-基)-1H-吲唑-6-基氨基]-苯甲酰胺
Figure A20038010969700581
按照与2000年6月30日提交的美国专利申请顺序号US 09/609,335实施例33(a)步骤(v)中所述类似的方法制备，只是使用4-(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-丁-2-炔基胺和2-[3-(2-(4，6-二甲基-吡啶-2-基)-乙烯基]-1-(四氢-吡喃-2-基)-1H-吲唑-6-基氨基]-苯甲酸，为所有目的而将所述文献的全部内容引入作为参考。1H NMR(DSMO-d6)δ9.56(1H，s)，9.01(1H，t，J＝5.7Hz)，8.06(1H，d，J＝8.7Hz)，7.81(1H，d，J＝16.4Hz)，7.66(1H，d，J＝7.5Hz)，7.41(4H，m)，7.32(1H，s)，7.09(1H，dd，J＝1.8，8.7Hz)，6.98(1H，s)，6.89(1H，t，J＝8.0Hz)，5.79(1H，dd，J＝2.4，9.2Hz)，4.28(2H，s)，4.09(2H，m)，3.86(1H，m)，3.72(1H，m)，2.46(3H，s)，2.42(1H，m)，2.30(3H，s)，2.08(2H，m)，1.74(1H，m)，1.57(2H，m)，0.80(9H，s)，0.03(6H，s)。对C38H47N5O3Si 0.7H2O的分析，计算值：C，68.89；H，7.36；N，10.57.测定值：C，68.99；H，7.36；N，10.21。
实施例10：2-{3-[(E)-2-(4，6-二甲基-吡啶-2-基)-乙烯基]-1H-吲唑-6-基氨基}-N-(4-羟基-丁-2-炔基)-苯甲酰胺
Figure A20038010969700582
将搅拌的N-[4-(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-丁-2-炔基]-2-[3-[2-(4，6-二甲基-吡啶-2-基)-乙烯基]-1-(四氢-吡喃-2-基)-1H-吲唑-6-基氨基]-苯甲酰胺(737mg，1.13mmol)和对-甲苯-磺酸(8.2ml，12％在HOAc中的溶液)的溶液在70℃下加热2小时。将该反应混合物冷却并谨慎倾入饱和NaHCO3且用EtOAc(2x)萃取。用盐水(2x)洗涤合并的有机层、干燥(MgSO4)并在减压条件下浓缩。对残余物进行快速硅胶色谱纯化，用CH2Cl2∶EtOAc∶MeOH(1∶1∶0.1)洗脱而得到225mg(44％)白色固体。1H NMR(DSMO-d6)δ12.91(1H，s)，9.84(s，1H)，9.01(1H，t，J＝5.3Hz)，8.07(1H，d，J＝8.7Hz)，7.84(1H，d，J＝16.4Hz)，7.70(1H，d，J＝7.2Hz)，7.43(3H，m)，7.31(1H，s)，7.26(1H，s)，7.02(1H，dd，J＝1.6，8.7Hz)，6.97(1H，s)，6.89(1H，t，J＝6.7Hz)，5.12(1H，t，J＝5.8Hz)，4.10(2H，d，J＝5.3Hz)，4.07(2H，d，J＝5.8Hz)，2.47(3H，s)，2.31(3H，s)。对C27H25N5O21.1H2O的分析，计算值：C，68.80；H，5.82；N，14.86.测定值：C，68.72；H，5.81；N，14.65。
实施例11：4-(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-丁-2-炔基胺
Figure A20038010969700591
向冰冷的搅拌的已知的4-(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-丁-2-炔-1-醇(3.14g，15.7mmol)在THF(50ml)中的溶液中加入DBU(2.6ml，17.4mmol)和DPPA(3.8mol，17.6mmol)。将该溶液加热至室温并在惰性气体环境中搅拌过夜。将该反应混合物倾入饱和NaHCO3并分离各层。再用EtOAc(2x)萃取水层并干燥合并的有机层(Na2SO4)且在真空中浓缩。向溶于THF(50ml)的这种粗叠氮化物中加入三苯基膦(4.61g，17.6mmol)，随后添加H2O(0.44ml)。将所得溶液在室温下搅拌过夜、在减压条件下浓缩并将残余物在1∶1Et2O/石油醚混合物中搅拌成淤浆。除去固体并浓缩滤液且通过快速硅胶色谱法纯化，用CH2Cl2/MeOH(19∶1)洗脱而得到琥珀色油状物。1H NMR(CDCl3)δ4.19(2H，t，J＝1.9Hz)，3.33(2H，t，J＝1.9Hz)，0.79(9H，s)，0.00(6H，s)。
实施例12：2-[3-[2-(4，6-二甲基-吡啶-2-基)-乙烯基]-1-(四氢-吡喃-2-基)-1H-吲唑-6-基氨基]-N-丙-2-炔基-苯甲酰胺
按照与上述实施例6所述类似的方法制备，只是使用2-[3-[2-(4，6-二甲基-吡啶-2-基)-乙烯基]-1-(四氢-吡喃-2-基)-1H-吲唑-6-基氨基]-苯甲酸和炔丙基胺。1H NMR(DSMO-d6)δ9.87(1H，s)，9.04(1H，t，J＝5.8Hz)，8.08(1H，d，J＝8.7Hz)，7.83(1H，d，J＝16.4Hz)，7.69(1H，d，J＝7.5Hz)，7.44(4H，m)，7.34(1H，s)，7.12(1H，dd，J＝1.7，8.7Hz)，6.99(1H，s)，6.91(1H，t，J＝5.8Hz)，5.81(1H，dd，J＝2.4，9.2Hz)，4.07(2H，dd，J＝2.5，5.7Hz)，3.88(1H，m)，3.74(1H，m)，3.12(1H，t，J＝2.5Hz)，2.48(3H，s)，2.43(1H，m)，2.31(3H，s)，2.01(2H，m)，1.74(1H，m)，1.58(2H，m)。对C31H31N5O2·1.1H2O·0.3TBME的分析，计算值：C，70.73；H，6.72；N，12.69。测定值：C，70.56；H，6.45；N，12.49。
实施例13：N-(丙-2-炔基)-2-{3-[(E)-2-(2，4-二甲基-吡啶-2-基)-乙烯基]-1H-吲唑-6-基氨基}-苯甲酰胺
Figure A20038010969700602
按照与实施例7所述类似的方法制备，只是使用N-(3-环丙基-丙-2-炔基)-2-[3-[2-(4，6-二甲基-吡啶-2-基)-乙烯基]-1-(四氢-吡喃-2-基)-1H-吲唑-6-基氨基]-苯甲酰胺替代N-[4-(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-丁-2-炔基]-2-[3-[2-(4，6-二甲基-吡啶-2-基)-乙烯基]-1-(四氢-吡喃-2-基)-1H-吲唑-6-基氨基]-苯甲酰胺。1H NMR(DSMO-d6)δ12.90(1H，s)，9.78(1H，s)，9.01(1H，t，J＝5.3Hz)，8.06(1H，d，J＝8.3Hz)，7.84(1H，d，J＝16.2Hz)，7.68(1H，dd，J＝7.9，1.1Hz)，7.45-7.36(3H，m)，7.30(1H，s)，7.25(1H，d，J＝1.5Hz)，7.01(1H，dd，J＝8.7，1.9Hz)，6.96(1H，s)，6.88(1H，dt，J＝6.8，1.9Hz)，4.04(2H，dd，J＝5.6，2.6Hz)，3.11(1H，t，J＝2.6Hz)，2.46(3H，s)，2.29(3H，s)。
实施例14：2-[3-[2-(4，6-二甲基-吡啶-2-基)-乙烯基]-1-(四氢-吡喃-2-基)-1H-吲唑-6-基氨基]-N-(2-甲基-烯丙基)-苯甲酰胺
Figure A20038010969700611
按照与上述实施例6所述类似的方法制备，只是使用2-[3-[2-(4，6-二甲基-吡啶-2-基)-乙烯基]-1-(四氢-吡喃-2-基)-1H-吲唑-6-基氨基]-苯甲酸和2-甲基-烯丙基胺。1H NMR(DSMO-d6)δ9.87(1H，s)，8.82(1H，t，J＝5.8Hz)，8.07(1H，d，J＝8.7Hz)，7.82(1H，d，J＝16.4Hz)，7.74(1H，d，J＝7.3Hz)，7.43(4H，m)，7.33(1H，s)，7.10(1H，d，J＝8.7Hz)，6.99(1H，s)，6.92(1H，t，J＝7.8Hz)，5.80(1H，dd，J＝2.2，9.2Hz)，4.83(2H，d，J＝11.8Hz)，3.83(4H，m)，2.47(3H，s)，2.44(1H，m)，2.31(3H，s)，2.00(2H，m)，1.75(1H，m)，1.73(3H，s)，1.58(2H，m)。对C32H35N5O2·1.09H2O的分析，计算值：C，71.00；H，6.92；N，12.94。测定值：C，71.40；H，6.89；N，12.54。
实施例15：2-{3-[2-(4，6-二甲基-吡啶-2-基)-乙烯基]-1H-吲唑-6-基氨基}-N-(2-甲基-烯丙基)-苯甲酰胺
按照与实施例7所述类似的方法制备，只是使用N-(2-甲基-烯丙基)-2-[3-[2-(4，6-二甲基-吡啶-2-基)-乙烯基]-1-(四氢-吡喃-2-基)-1H-吲唑-6-基氨基]-苯甲酰胺代替N-[4-(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-丁-2-炔基]-2-[3-[2-(4，6-二甲基-吡啶-2-基)-乙烯基]-1-(四氢-吡喃-2-基)-1H-吲唑-6-基氨基]-苯甲酰胺。1H NMR(DSMO-d6)δ12.89(1H，s)，9.75(1H，s)，8.79(1H，t，J＝5.6Hz)，8.05(1H，d，J＝8.7Hz)，7.85(1H，d，J＝16.2Hz)，7.74(1H，d，J＝7.9Hz)，7.45-7.33(4H，m)，7.23(1H，d，J＝1.5Hz)，7.00-6.97(2H，m)，6.90(1H，dt，J＝7.9，1.1Hz)，4.81(2H，d，J＝11.3Hz)，3.81(2H，d，J＝5.6Hz)，2.47(3H，s)，2.30(3H，s)，1.71(3H，s)。
可选择的合成方案
Figure A20038010969700621
实施例16(a)：环丙基-丙-2-炔-1-醇
Figure A20038010969700622
向含有在-10℃冰浴中冷却的70mL无水THF的圆底烧瓶中加入65.6mL的1.6M BuLi己烷(105mmol)溶液。缓慢导入5-氯-戊-1-炔(5.13g，50mmol)，同时将温度维持在-10-0℃。将该混合物在0℃下和氩气环境中搅拌2小时。加入固体低聚甲醛(3g，100mmol)。将该混合物缓慢温热至室温并在氩气环境中搅拌过夜。第2天加入水并加入约50mL的1N HCl水溶液。用乙酸乙酯萃取该混合物并用盐水洗涤合并的有机层、用Na2SO4干燥、过滤并浓缩。用柱纯化粗产物，用20％Et2O的己烷溶液洗脱而得到3g 3-环丙基-丙-2-炔-1-醇，为油状物(收率62％)。1H NMR(CDCl3)δ4.22(dd，2H，J＝6.04，2.01Hz)，1.46(t，1H，J＝6.04Hz)，1.26(m，1H)，0.77(m，2H)，0.70(m，2H)。
实施例16(b)：3-环丙基-丙-2-炔基叠氮化物
Figure A20038010969700623
将3-环丙基-丙-2-炔-1-醇(3.28g，34.1mmol)溶于40mL甲苯，加入DPPA(11.26g，40.9mmol)，随后加入DBU(6.24g，40.9mmol)，同时用水浴维持温度。将该混合物在室温下搅拌1小时并用100mL己烷和15mL CH2Cl2稀释。用水将该混合物洗涤4次并用盐水洗涤1次、用Na2SO4干燥、过滤并使用冷水浴通过旋转蒸发浓缩以除去大部分有机溶剂，保留一些甲苯(挥发性产物)。将残余油状物用于下一步。1H NMR(CDCl3)δ3.85(s，2H)，1.26(m，1H)，0.80(m，2H)，0.72(m，2H)。
实施例16(c)：3-环丙基-丙-2-炔基胺
将3-环丙基-丙-2-炔基叠氮化物(约34mmol)溶于100mL THF，加入1mL水，随后加入固体PPh3(13.37g，51mmol)，同时用水浴维持温度。将该混合物在室温下搅拌1小时。将150mL 1N HCl水溶液加入到该混合物中。用二氯甲烷将该混合物洗涤3次。用5N NaOH将水层碱化至pH10-12。用乙酸乙酯萃取该混合物。用TLC染色检查水层以监测胺萃取入有机相的进程。用Na2SO4干燥合并的有机层、过滤并浓缩至得到1.62g所需产物(挥发性产物，含有残余的EtOAc溶剂)(两步收率50％)。1H NMR(CDCl3)δ3.37(d，2H，J＝2Hz)，1.22(m，1H)，0.74(m，2H)，0.65(m，2H)。
实施例17：N-(3-环丙基-丙-2-炔基)-2-[3-[2-(4，6-二甲基-吡啶-2-基)-乙烯基]-1-(四氢-吡喃-2-基)-1H-吲唑-6-基氨基]-苯甲酰胺
Figure A20038010969700631
按照与上述实施例6所述类似的方法制备，只是使用2-[3-[2-(4，6-二甲基-吡啶-2-基)-乙烯基]-1-(四氢-吡喃-2-基)-1H-吲唑-6-基氨基]-苯甲酸E和3-环丙基-丙-2-炔基胺。1H NMR(CDCl3)：δ9.51(1H，s)，7.97(1H，d，J＝8.7Hz)，7.81(1H，d，J＝16.6Hz)，7.51-7.42(3H，m)，7.34-7.29(2H，m)，7.16(1H，s)，7.11(1H，dd，J＝9.0，1.9Hz)，6.85(1H，s)，6.81(1H，dt，J＝7.2，1.1Hz)，6.23(1H，t，J＝7.2Hz)，5.61(1H，dd，J＝9.0，2.6Hz)，4.17(2H，dd，J＝5.3，2.3Hz)，4.07-4.00(1H，m)，3.75-3.66(1H，m)，2.63-2.50(1H，m)，2.54(3H，s)，2.32(3H，s)，2.20-2.02(2H，m)，1.79-1.62(3H，m)，1.29-1.19(1H，m)，0.77-0.67(4H，m)。
实施例18：N-(3-环丙-2-炔基)-2-{3-[(E)-2-(4，6-二甲基-吡啶-2-基)-乙烯基]-1H-吲唑-6-基氨基}-苯甲酰胺
Figure A20038010969700641
按照与上述实施例7所述类似的方法制备，只是使用2-[3-[2-(4，6-二甲基-吡啶-2-基)-乙烯基]-1-(四氢-吡喃-2-基)-1H-吲唑-6-基氨基]-N-丙-2-炔基-苯甲酰胺代替N-[4-(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-丁-2-炔基]-2-[3-[2-(4，6-二甲基-吡啶-2-基)-乙烯基]-1-(四氢-吡喃-2-基)-1H-吲唑-6-基氨基]-苯甲酰胺。1HNMR(DSMO-d6)：δ12.90(1H，s)，9.79(1H，s)，8.91(1H，t，J＝5.6Hz)，8.06(1H，d，J＝8.7Hz)，7.83(1H，d，J＝16.2Hz)，7.68(1H，dd，J＝7.9，1.1Hz)，7.49-7.38(3H，m)，7.29(1H，s)，7.25(1H，d，J＝1.9Hz)，6.99(1H，dd，J＝9.0，2.3Hz)，6.96(1H，s)，6.88(1H，dt，J＝7.9，1.5Hz)，4.00(2H，dd，J＝5.6，1.9Hz)，2.46(3H，s)，2.29(3H，s)，1.31-1.23(1H，m)，0.75-0.70(2H，m)，0.57-0.52(2H，m)。
实施例19(a)：2-丁炔-1，4-二醇一乙酸盐
向在室温下丁炔-1，4-二醇(5g，58mmol)在干THF中的溶液中滴加氢化钠(60％在油中的分散液，2.32g，58mmol)。4.3小时后，加入乙酰氯(4.12mL，58mmol)。在室温下搅拌22小时后，在减压条件下浓缩该混合物。从甲苯中浓缩两次残余物，此后用硅胶纯化，使用乙酸乙酯/二氯甲烷(1∶3)作为洗脱剂，而得到2-丁炔-1，4-二醇一乙酸盐，为油状物，收率为49％。1HNMR(DSMO-d6)δ5.23(1H，bs)，4.70(2H，t，J＝1.8Hz)，4.09(2H，s)，2.03(3H，s)。
实施例19(b)：乙酸4-氨基-丁-2-炔基酯
Figure A20038010969700643
按照如实施例8所述类似的方法制备，只是使用2-丁炔-1，4-二醇一乙酸盐代替4-(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-丁-2-炔-1-醇。1H NMR(DSMO-d6)δ4.77(2H，s)，4.20(2H，s)，2.04(3H，s)。
实施例20：乙酸4-(2-{3-[(E)-2-(4，6-二甲基-吡啶-2-基)-乙烯基]-1H-吲唑-6-基氨基}苯甲酰氨基)-丁-2-炔基酯
按照与上述实施例6所述类似的方法制备，只是使用2-[3-2-(4，6-二甲基-吡啶-2-基)-乙烯基]-1H-吲唑-6-基氨基]-苯甲酸对-甲苯磺酸酯和乙酸4-氨基-丁-2-炔基酯。1H NMR(CD3CN)：δ11.00(1H，bs)，9.59(1H，s)，7.99(1H，d，J＝8.6Hz)，7.86(1H，d，J＝16.4Hz)，7.58(1H，d，J＝7.8Hz)，7.49-7.37(4H，m)，7.32(1H，s)，7.21(1H，s)，7.06(1H，dd，J＝8.8，1.8Hz)，6.96(1H，s)，6.90(1H，t，J＝7.8Hz)，4.63(2H，s)，4.16(2H，d，J＝5.6Hz)，2.49(3H，s)，2.32(3H，s)，2.01(3H，s)。
实施例21：2-[3-[(E)-2-(4，6-二甲基-吡啶-2-基)-乙烯基]-1-(四氢-吡喃-2-基)-1H-吲唑-6-基氨基]-烟酸甲酯
Figure A20038010969700652
按照与上述实施例3所述类似的方法制备，只是使用2-溴-烟酸甲酯代替2-溴-苯甲酸甲酯。1H NMR(DSMO-d6)：δ10.36(1H，s)，8.50(1H，dd，J＝4.7，1.9Hz)，8.36(1H，d，J＝1.4Hz)，8.30(1H，dd，J＝7.8，2.0Hz)，8.08(1H，d，J＝8.8Hz)，7.83(1H，d，J＝16.4Hz)，7.48(1H，d，J＝7.5Hz)，7.44(1H，s)，7.33(1H，s)，6.98-6.93(2H，m)，5.80(1H，d，J＝7.0Hz)，2.93(3H，s)，3.93-3.90(1H，m)，3.80-3.75(1H，m)，2.46(3H，s)，2.30(3H，s)，2.10-1.97(2H，m)，1.89-1.60(3H，m)。
实施例22：2-[3-[(E)-2-(4，6-二甲基-吡啶-2-基)-乙烯基]-1-(四氢-吡喃-2-基)-1H-吲唑-6-基氨基]-烟酸
Figure A20038010969700661
按照与实施例4所述类似的方法制备，只是使用2-[3-[(E)-2-(4，6-二甲基-吡啶-2-基)-乙烯基]-1-(四氢-吡喃-2-基)-1H-吲唑-6-基氨基]-烟酸甲酯代替2-[3-[2-(4，6-二甲基-吡啶-2-基)-乙烯基]-1-(四氢-吡喃-2-基)-1H-吲唑-6-基氨基]-苯甲酸甲酯。1H NMR(DSMO-d6)：δ10.73(1H，s)，8.49(1H，d，J＝1.9Hz)，8.45(1H，s)，8.31(1H，dd，J＝7.7，1.8Hz)，8.16-7.97(3H，m)，7.70(1H，d，J＝16.4Hz)，7.50(1H，d，J＝8.6Hz)，7.37(1H，s)，6.96(1H，dd，J＝7.7，4.8Hz)，5.87(1H，d，J＝8.4Hz)，3.95-3.90(1H，m)，3.79-3.70(1H，m)，2.63(3H，s)，2.47(3H，s)，2.07-1.99(2H，m)，1.81-1.62(3H，m)。
实施例23：2-{3-[(E)-2-(4，6-二甲基-吡啶-2-基)-乙烯基]-1H-吲唑-6-基氨基}-N-(4-羟基-丁-2-炔基)-烟酰胺
Figure A20038010969700662
按照与上述对实施例6所述类似的方法由2-[3-[(E)-2-(4，6-二甲基-吡啶-2-基)-乙烯基]-1-(四氢-吡喃-2-基)-1H-吲唑-6-基氨基]-烟酸和4-(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-丁-2-炔基胺制备N-(4-羟基-丁-2-炔基)-2-[3-[2-(4，6-二甲基-吡啶-2-基)-乙烯基]-1-H-吲唑-6-基氨基]-烟酰胺和N-[4-(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-丁-2-炔基]-2-3-[2-(4，6-二甲基-吡啶-2-基)-乙烯基]-1-(四氢-吡喃-2-基)-1H-吲唑-6-基氨基]-烟酰胺粗混合物，且随后按照与对实施例7所述类似的方法将其转化成2-{3-[(E)-2-(4，6-二甲基-吡啶-2-基)-乙烯基]-1H-吲唑-6-基氨基}-N-(4-羟基-丁-2-炔基)-烟酰胺，只是使用N-(4-羟基-丁-2-炔基)-2-[3-[2-(4，6-二甲基-吡啶-2-基)-乙烯基]-1-(四氢-吡喃-2-基)-1H-吲唑-6-基氨基1-烟酰胺和N-[4-(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-丁-2-炔基]-2-[3-[2-(4，6-二甲基-吡啶-2-基)-乙烯基]-1-(四氢-吡喃-2-基)-1H-吲唑-6-基氨基]-烟酰胺的混合物代替N-[4-(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-丁-2-炔基]-2-[3-[2-(4，6-二甲基-吡啶-2-基)-乙烯基]-1-(四氢-吡喃-2-基)-1H-吲唑-6-基氨基]-苯甲酰胺。1HNMR(DSMO-d6)：δ12.99(1H，s)，11.21(1H，s)，9.26(1H，t，J＝5.3Hz)，8.50(1H，d，J＝1.9Hz)，8.41(1H，dd，J＝4.9，1.9Hz)，8.16(1H，dd，J＝8.3，1.9Hz)，8.04(1H，d，J＝9.0Hz)，7.85(1H，d，J＝16.6Hz)，7.42(1H，d，J＝16.6Hz)，7.31(1H，s)，7.06(1H，dd，J＝8.7，1.5Hz)，6.96(1H，s)，6.93(1H，dd，J＝7.5，4.9Hz)，5.14(1H，t，J＝5.6Hz)，4.16(2H，d，J＝5.6Hz)，4.08(2H，d，J＝7.2Hz)，2.46(3H，s)，2.30(3H，s)。
实施例24：2-{3-[2-(4，6-二甲基-吡啶-2-基)-乙烯基]-1H-吲唑-6-基氨基}-烟酸对-甲苯磺酸盐
Figure A20038010969700671
按照与实施例5所述类似的方法制备，只是使用2-[3-[(E)-2-(4，6-二甲基-吡啶-2-基)-乙烯基]-1-(四氢-吡喃-2-基0-1H-吲唑-6-基氨基)-烟酸代替2-[3-[2-(4，6-二甲基-吡啶-2-基)-乙烯基]-1-(四氢-吡喃-2-基)-1H-吲唑-6-基氨基]-苯甲酸。
1H NMR(DSMO-d6)：δ13.49(1H，s)，10.80(1H，s)，8.63(1H，d，J＝1.5Hz)，8.49(1H，dd，J＝4.8，1.9Hz)，8.31(1H，dd，J＝7.7，1.9Hz)，8.24-8.19(2H，m)，8.06(1H，d，J＝8.8Hz)，7.60-7.55(2H，m)，7.46(2H，d，J＝8.1Hz)，7.22(1H，dd，J＝8.8，1.7Hz)，7.09(2H，d，J＝7.9Hz)，6.95(1H，dd，J＝7.7，4.7Hz)，2.66(3H，s)，2.54(3H，s)，2.27(3H，s)。
实施例25：N-(3-环丙基-丙-2-炔基)-2-{3-[(E)-2-(4，6-二甲基-吡啶-2-基)-乙烯基]-1H-吲唑-6-基氨基}-烟酰胺
Figure A20038010969700681
按照与上述实施例6所述类似的方法制备，只是使用2-{3-[2-(4，6-二甲基-吡啶-2-基)-乙烯基]-1H吲唑-6-基氨基}-烟酸对-甲苯磺酸酯和3-环丙基-丙-2-炔基胺。1H NMR(DSMO-d6)：δ13.01(1H，s)，11.20(1H，s)，9.19(1H，bt)，8.51(1H，s)，8.40(1H，d，J＝4.9Hz)，8.15(1H，d，J＝7.5Hz)，8.05(1H，d，J＝8.7Hz)，7.83(1H，d，J＝16.4Hz)，7.42(1H，d，J＝16.4Hz)，7.31(1H，s)，7.05(1H，d，J＝8.3Hz)，6.96(1H，s)，6.92(1H，dd，J＝7.5，4.9Hz)，4.06(2H，d，J＝4.14Hz)，2.46(3H，s)，2.29(3H，s)，1.33-1.28(1H，m)，0.77-0.72(2H，m)，0.60-0.55(2H，m)。
实施例26：4-甲基-2-乙烯基-吡啶
将2-溴-4-甲基-吡啶(Aldrich，5.2g，30.5mmol，1.0eq)、2，6-二-叔丁基-4-甲基-苯酚(Aldrich，67mg，0.3mmol，1mol％)、三丁基-乙烯基-锡烷(Aldrich，26.8mL，91.5mmol，3.0eq)和四(三苯基膦)合钯(0)(Strem，1.8g，1.5mmol，5mol％)在甲苯(100mL)中的黄色混合物脱气并用氩气冲洗。在将该混合物加热至100℃后得到琥珀色溶液。18小时后通过添加1.0M HCl使该反应混合物猝灭。用***洗涤酸性萃取物、用碳酸氢钠调节至pH9并用乙酸乙酯萃取。用盐水洗涤有机萃取物、用硫酸镁干燥、过滤并在减压条件下浓缩。通过快速(硅胶)色谱法纯化粗产物(3.7g棕色油状物)并用0-5％乙酸乙酯-二氯甲烷洗脱而得到澄清油状物(1.9g，53％)。1H NMR(DSMO-d6，300MHz)δ8.39(1H，d，J＝4.9Hz)，7.33(1H，s)，7.10(1H，dd，J＝5.0，0.8Hz)，6.77(1H，dd，17.5，10.8Hz)，6.20(1H，dd，J＝17.5，1.7Hz)，5.44(1H，dd，J＝10.8，1.8Hz)，2.31(3H，s)。ESIMS m/z 120(M+H)+。
实施例27：3-[2-(4-甲基-吡啶-2-基)-乙烯基]-6-硝基-1-(四氢-吡喃-2-基)-1H-吲唑
Figure A20038010969700691
将4-甲基-2-乙烯基-吡啶(实施例23)(1.9g，15.97mmol)、6-硝基-1-(四氢-吡喃-2-基)-3-乙烯基-1H-吲唑(4.96g，13.3mmol)、Pd(OAc)2(149mg，0.66mol)、P(邻-甲苯基)3和DIEA(3.5mol，19.96mmol)在脱气的DMF(50ml)中的混悬液在100℃下和氩气环境中加热18小时。冷却该反应混合物并通过过滤除去固体，使用EtOAc洗涤。用EtOAc稀释滤液并用盐水(2x)洗涤、干燥(MgSO4)且在减压条件下浓缩。对残余物进行硅胶色谱纯化，用己烷∶EtOAc(3∶1)洗脱而得到3.40g(70％)的亮黄色固体。
1H NMR(CDCl3)：δ8.56(1H，s)，8.50(1H，d，J＝5.0Hz)，8.11(2H，m)，7.89(1H，d，J＝16.3Hz)，7.61(1H，s)，7.03(1H，d，J＝4.3Hz)，5.83(1H，dd，J＝2.6，9.0Hz)，4.06(1H，m)，3.82(1H，m)，2.58(1H，m)，2.39(3H，s)，2.18(2H，m)，1.78(3H，m)。对C20H20N4O3的分析，计算值：C，65.92；H，5.53；N，15.38。测定值：C，65.80；H，5.52；N，15.15。
实施例28：3-[2-(4-甲基-吡啶-2-基)-乙烯基]-1-(四氢-吡喃-2-基)-1H-吲唑-6-基胺
Figure A20038010969700692
按照与实施例2所述类似的方法制备，只是使用[2-(4-甲基-吡啶-2-基)-乙烯基]-6-硝基-1-(四氢-吡喃-2-基)-1H-吲唑(实施例24)代替3-[2-(4，6-二甲基-吡啶-2-基)-乙烯基]-6-硝基-1-(四氢-吡喃-2-基)-1H-吲唑。1HNMR(DSMO-d6)：δ8.43(1H，d，J＝4.8Hz)，7.79-7.73(2H，m)，7.50(1H，s)，7.39(1H，d，J＝16.4Hz)，7.09(1H，d，J＝4.8Hz)，6.64-6.62(2H，m)，5.57(1H，dd，J＝9.8，2.5Hz)，5.48(2H，bs)，3.92-3.85(1H，m)，3.72-3.64(1H，m)，2.43-2.34(1H，m)，2.33(3H，s)，2.07-2.00(1H，m)，1.96-1.90(1H，m)，1.79-1.66(1H，m)，1.60-1.53(2H，m)。
实施例29：2-[3-[2-(4-甲基-吡啶-2-基)-乙烯基]-1-(四氢-吡喃-2-基)-1H-吲唑-6-基氨基]-苯甲酸甲酯
按照与实施例3所述类似的方法制备，只是使用3-[2-(4-甲基-吡啶-2-基)-乙烯基]-1-(四氢-吡喃-2-基)-1H-吲唑-6-基胺代替3-[2-(4，6-二甲基-吡啶-2-基)-乙烯基]-1-(四氢-吡喃-2-基)-1H-吲唑-6-基胺。1H NMR(DSMO-d6)：δ9.48(1H，s)，8.45(1H，d，J＝4.9Hz)，8.13(1H，d，J＝8.7Hz)，7.93(1H，dd，J＝8.3，1.9Hz)，7.86(1H，d，J＝16.2Hz)，7.58(1H，d，J＝1.9Hz)，7.54-7.44(3H，m)，7.36(1H，d，J＝7.5Hz)，7.18(1H，dd，J＝8.7，1.9Hz)，7.11(1H，d，J＝4.9Hz)，6.87(1H，t，J＝8.3Hz)，5.83(1H，dd，J＝9.4，2.3Hz)，3.87(3H，1H)，3.93-3.84(1H，m)，3.77-3.69(1H，m)，2.46-2.37(1H，m)，2.34(3H，s)，2.10-1.94(2H，m)，1.81-1.53(3H，m)。
实施例30：2-[3-[2-(4-甲基-吡啶-2-基)-乙烯基]-1-(四氢-吡喃-2-基)-1H-吲唑-6-基氨基]-苯甲酸
Figure A20038010969700702
按照与上述实施例4所述类似的方法制备，只是使用2-[3-[2-(4-甲基-吡啶-2-基)-乙烯基]-1-(四氢-吡喃-2-基)-1H-吲唑-6-基氨基]-苯甲酸甲酯代替2-[3-[2-(4，6-二甲基-吡啶-2-基)-乙烯基]-1-(四氢-吡喃-2-基)-1H-吲唑-6-基氨基]-苯甲酸甲酯(实施例3)。1H NMR(DSMO-d6)：δ13.17(1H，broad s)，9.83(1H，s)，8.51(1H，d，J＝5.2Hz)，8.14(1H，d，J＝8.7Hz)，7.95(1H，d，J＝16.4Hz)，7.94(dd，(1H，J＝1.5，8.0Hz)，7.73(1H，s)，7.60(1H，d，J＝1.5Hz)，7.59(1H，s)，7.54(1H，s)，7.46(1H，m)，7.37(1H，d，J＝7.6Hz)，7.23(2H，m)，6.86(1H，t，J＝6.9Hz)，5.87(1H，d，J＝7.6Hz)，3.90(1H，m)，3.76(1H，m)，2.45(1H，m)，2.41(3H，s)，2.03(2H，m)，1.77(1H，m)，1.59(2H，m)。
实施例31：2-[3-[2-(4-甲基-吡啶-2-基)-乙烯基]-1-(四氢-吡喃-2-基)-1H-吲唑-6-基氨基]-N-丙-2-炔基-苯甲酰胺
Figure A20038010969700711
按照与上述实施例6所述类似的方法制备，只是使用炔丙基胺和2-[3-[2-(4-甲基-吡啶-2-基)-乙烯基]-1-(四氢-吡喃-2-基)-1H-吲唑-6-基氨基]-苯甲酸。1H NMR(DSMO-d6)δ9.87(1H，s)，9.03(1H，t，J＝5.5Hz)，8.46(1H，d，J＝4.9Hz)，8.08(1H，d，J＝8.7Hz)，7.86(1H，d，J＝16.4Hz)，7.69(1H，d，J＝7.3Hz)，7.53(1H，s)，7.44(4H，m)，7.13(2H，m)，6.91(1H，t，J＝7.9Hz)，5.81(1H，dd，J＝2.2，9.6Hz)，4.07(2H，dd，J＝2.5，5.5Hz)，3.89(1H，m)，3.75(1H，m)，3.12(1H，t，J＝2.5Hz)，2.42(1H，m)，2.36(3H，s)，2.00(2H，m)，1.75(1H，m)，1.58(2H，m)。
对C30H29N5O2·0.25TBME的分析，计算值：C，73.07；H，6.28；N，13.64。测定值：C，72.95；H，6.30；N，13.64。
实施例32：2-{3-[(E)-2-(4-甲基-吡啶-2-基)-乙烯基]-1H-吲唑-6-基氨基}-N-丙-2-炔基-苯甲酰胺
按照与实施例7所述类似的方法制备，只是使用2-[3-[2-(4-甲基-吡啶-2-基)-乙烯基]-1-(四氢-吡喃-2-基)-1H-吲唑-6-基氨基]-N-丙-2-炔基-苯甲酰胺代替N-[4-(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-丁-2-炔基]-2-[3-[2-(4，6-二甲基-吡啶-2-基)-乙烯基]-1-(四氢-吡喃-2-基)-1H-吲唑-6-基氨基]-苯甲酰胺。1HNMR(DSMO-d6)δ12.93s).9.79(1H，s)，9.02(1H，t，J＝5.4Hz，8.45(1H，d，J＝4.9Hz)，8.08(1H，d，J＝8.7Hz)，7.88(1H，d，J＝16.4Hz)，7.69(1H，d，J＝7.7Hz)，7.45(4H，m)，7.27(1H，s)，)，7.10(1H，d，J＝4.9Hz)，7.03(1H，d，J＝8.8Hz)，6.90(1H，t，J＝7.9Hz)，4.06(2H，dd，J＝2.4，5.4Hz)，3.12(1H，t，J＝2.4Hz)，2.35(3H，s)。
对C25H21N5O·0.35CH2Cl2的分析，计算值：C，69.64；H，5.00；N，16.02。测定值：C，69.65；H，5.15；N，15.80。
实施例33：N-(2-甲基-烯丙基)-2-[3-[2-(4-甲基-吡啶-2-基)-乙烯基]-1-(四氢-吡喃-2-基)-1H-吲唑-6-基氨基]-苯甲酰胺
Figure A20038010969700721
按照与上述实施例6所述类似的方法制备，只是使用2-甲基-烯丙基胺和2-[3-[2-(4-甲基-吡啶-2-基)-乙烯基]-1-(四氢-吡喃-2-基)-1H-吲唑-6-基氨基]-苯甲酸。1H NMR(DSMO-d6)δ9.86(1H，s)，8.81(1H，t，J＝5.5Hz)，8.46(1H，d，J＝4.9Hz)，8.07(1H，d，J＝8.9Hz)，7.86(1H，d，J＝16.4Hz)，7.75(1H，d，J＝7.7Hz)，7.54(1H，s)，7.50(1H，d，J＝16.4Hz)，7.43(3H，m)，7.11(2H，m)，6.92(1H，t，J＝8.1Hz)，5.81(1H，dd，J＝2.5，9.8Hz)，4.83(2H，d，J＝11.5Hz)，3.81(4H，m)，2.41(1H，m)，2.35(3H，s)，2.00(2H，m)，1.76(1H，m)，1.73(3H，s)，1.58(2H，m)。对C31H33N5O2·0.80TBME的分析，计算值：C，72.71；H，7.43；N，12.11。测定值：C，72.43；H，7.57；N，12.02。
实施例34：N-(2-甲基-烯丙基)-2-{[(E)-2-(4-甲基-吡啶-2-基)-乙烯基]-1H-吲唑-6-基氨基}-苯甲酰胺
Figure A20038010969700722
按照与上述实施例7所述类似的方法制备，只是使用N-(2-甲基-烯丙基)-2-[3-[2-(4-甲基-吡啶-2-基)-乙烯基]-1-(四氢-吡喃-2-基)-1H-吲唑-6-基氨基]-苯甲酰胺代替N-[4-(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-丁-2-炔基]-2-[3-[2-(4，6-二甲基-吡啶-2-基)-乙烯基]-1-(四氢-吡喃-2-基)-1H-吲唑-6-基氨基]-苯甲酰胺。1H NMR(DSMO-d6)δ12.90(1H，s)，9.76(1H，s)，8.80(1H，t，J＝5.5Hz)，8.45(1H，d，J＝5.1Hz)，8.07(1H，d，J＝8.9Hz)，7.88(1H，d，J＝16.4Hz)，7.75(1H，d，J＝7.9Hz)，7.51(1H，s)，7.48(1H，d，J＝16.4Hz)，7.43(2H，m)，7.24(1H，s)，7.10(1H，d，J＝4.9Hz)，7.00(1H，dd，J＝1.9，8.9Hz)，6.91(1H，t，J＝8.1Hz)，4.82(2H，d，J＝11.3Hz)，3.83(2H，d，J＝5.8Hz)，2.35(3H，s)，1.73(3H，s)。
对C26H25N5O·0.20H2O的分析，计算值：C，73.11；H，5.99；N，16.40。测定值：C，73.13；H，6.03；N，16.13。
实施例35：N-(3-环丙基-丙-2-炔基)-2-[3-[2-(4-甲基-吡啶-2-基)-乙烯基]-1-(四氢-吡喃-2-基)-1H-吲唑-6-基氨基]-苯甲酰胺
按照与上述实施例6所述类似的方法制备，只是使用2-[3-[2-(4-甲基-吡啶-2-基)-乙烯基]-1-(四氢-吡喃-2-基)-1H-吲唑-6-基氨基]-苯甲酸和3-环丙基-丙-2-炔基胺。1H NMR(DSMO-d6)：δ9.88(1H，bs)，8.93(1H，bt)，8.46(1H，d，J＝4.9Hz)，8.08(1H，d，J＝8.7Hz)，7.85(1H，d，J＝16.4Hz)，7.69(1H，d，J＝7.6Hz)，7.54-7.40(5H，m)，7.14-7.11(2H，m)，6.90(1H，t，J＝6.1Hz)，5.81(1H，d，J＝7.5Hz)，4.02(2H，d，J＝3.6Hz)，3.95-3.85(1H，m)，3.79-3.72(1H，m)，2.49-2.35(1H，m)，2.35(3H，s)，2.15-2.01(2H，m)，1.87-1.55(3H，m)，1.30-1.25(1H，m)，0.77-0.70(2H，m)，0.59-0.54(2H，m)。
实施例36：N-(3-环丙-2-炔基)-2-{3-[(E)-2-(4-甲基-吡啶-2-基)-乙烯基]-1H-吲唑-6-基氨基}-苯甲酰胺
按照与上述实施例7所述类似的方法制备，只是使用N-(3-环丙-2-炔基)-2-[3-[2-(4-甲基-吡啶-2-基)-乙烯基]-1-(四氢-吡喃-2-基)-1H-吲唑-6-基氨基]-苯甲酰胺代替N-[4-(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-丁-2-炔基]-2-[3-[2-(4，6-二甲基-吡啶-2-基)-乙烯基]-1-(四氢-吡喃-2-基)-1H-吲唑-6-基氨基]-苯甲酰胺。1H NMR(DSMO-d6)：δ12.91(1H，s)，9.79(1H，s)，8.91(1H，t，J＝5.6Hz)，8.44(1H，d，J＝4.9Hz)，8.06(1H，d，J＝8.7Hz)，7.87(1H，d，J＝16.6Hz)，7.67(1H，dd，J＝7.9，1.5Hz)，7.50-7.35(4H，m)，7.24(1H，d，J＝1.9Hz)，7.09(1H，d，J＝4.9Hz)，7.00(1H，dd，J＝8.7，1.5Hz)，6.88(1H，dt，J＝4.1，1.5Hz)，4.00(2H，dd，J＝5.3，1.9Hz)，2.34(3H，s)，1.31-1.23(1H，m)，0.75-0.69(2H，m)，0.56-0.52(2H，m)。
实施例37：2-{3-[2-(4-甲基-吡啶-2-基]-乙烯基}-1H-吲唑-6-基氨基)-N-吡啶-2-基甲基-苯甲酰胺
按照与上述实施例6和实施例7所述类似的方法制备，只是使用2-[3-[2-(4-甲基-吡啶-2-基)-乙烯基]-1-(四氢-吡喃-2-基)-1H-吲唑-6-基氨基]-苯甲酸和C-吡啶-2-基-甲胺。1H NMR(DSMO-d6，300MHz)δ12.91(1H，s)，9.77(1H，s)，9.19(1H，t，J＝5.8Hz)，8.50(1H，d，J＝4.1Hz)，8.45(1H，d，J＝5.0Hz)，8.06(1H，d，J＝8.8Hz)，7.88(1H，d，J＝16.4Hz)，7.82-7.70(2H，m)，7.51-7.25(7H，m)，7.10(1H，d，J＝4.6Hz)，6.98(1H，dd，J＝8.8，1.8Hz)，6.96-6.91(1H，m)，4.58(2H，d，J＝5.9Hz)，2.35(3H，s)。ESIMS m/z 461(M+H)+。对C28H24N6O·0.3MTBE的分析，计算值：C，72.71；H，5.77；N，17.25。测定值：C，72.38；H，5.80；N，16.88。
实施例38：2-{3-[2-(4-甲基-吡啶-2-基)-乙烯基]-1H-吲唑-6-基氨基}-N-吡啶-4-基甲基-苯甲酰胺
Figure A20038010969700742
按照与上述实施例6和实施例7所述类似的方法制备，只是使用2-[3-[2-(4-甲基-吡啶-2-基)-乙烯基]-1-(四氢-吡喃-2-基)-1H-吲唑-6-基氨基]-苯甲酸和C-吡啶-4-基-甲胺。1H NMR(DSMO-d6，300MHz)δ12.90(1H，s)，9.73(1H，s)，9.21(1H，t，J＝5.9Hz)，8.49-8.44(3H，m)，8.06(1H，d，J＝8.7Hz)，7.88(1H，d，J＝16.4Hz)，7.81(1H，d，J＝7.5Hz)，7.51-7.40(4H，m)，7.31(2H，d，J＝5.9Hz)，7.24(1H，s)，7.11(1H，d，J＝4.4Hz)，7.00(1H，dd，J＝8.7，1.7Hz)，6.97-6.92(1H，m)，4.50(2H，d，J＝5.9Hz)，2.35(3H，s)。ESIMS m/z 461(M+H)+。对C28H24N6O×0.4H2O×0.7MTBE的分析，计算值：C，71.36；H，6.45；N，15.85。测定值：C，71.27；H，6.29；N，15.53。
实施例39：N-(6-甲基-吡啶-2-基甲基)-2-{3-[2-(4-甲基-吡啶-2-基)-乙烯基]-1H-吲唑-6-基氨基}-苯甲酰胺
按照与上述实施例6和实施例7所述类似的方法制备，只是使用2-[3-[2-(4-甲基-吡啶-2-基)-乙烯基]-1-(四氢-吡喃-2-基)-1H-吲唑-6-基氨基]-苯甲酸和C-(6-甲基-吡啶-2-基)-甲胺。1H NMR(DSMO-d6，300MHz)δ12.92(1H，s)，9.76(1H，s)，9.20(1H，t，J＝5.8Hz)，8.44(1H，d，J＝4.9Hz)，8.05(1H，d，J＝8.6Hz)，7.86(1H，d，J＝16.4Hz)，7.81(1H，d，J＝7.7Hz)，7.59(1H，t，J＝7.7Hz)，7.49-7.37(4H，m)，7.23(1H，s)，7.11-7.08(3H，m)，6.99(1H，dd，J＝8.7，1.6Hz)，6.95-6.90(1H，m)，4.51(2H，d，J＝5.9Hz)，2.42(3H，s)，2.33(3H，s)。ESIMS m/z 475(M+H)+。对C29H26N6Ox0.4DCM的分析，计算值：C，68.98；H，5.29；N，16.39。测定值：C，68.84；H，5.42；N，16.20。
实施例40：N-(2，5-二甲基-2H-吡唑-3-基甲基)-2-[(E)-3-[2-(4-甲基-吡啶-2-基)-乙烯基]-1-(四氢-吡喃-2-基)-1H-吲唑-6-基氨基]-苯甲酰胺
按照与上述实施例6所述类似的方法制备，只是使用2-{3-[2-(4-甲基-吡啶-2-基-乙烯基)-1-(四氢-吡喃-2-基)-1H-吲唑-6-基氨基]-苯甲酸和C-(2，5-二甲基-2H-吡唑-3-基)-甲胺。1H NMR(DSMO-d6)δ9.81(1H，s)，9.05(1H，bt)，8.468.7Hz}，7.85(1H，d，J＝16.4Hz)，7.71(1H，d，J＝7.5Hz)，7.54-7.40(5H，m)，7.11-7.09(2H，m)，6.91(1H，t，J＝6.9Hz)，5.94(1H，s)，5.80(1H，d，J＝7.3Hz)，4.45(2H，d，J＝5.5Hz)，3.93-3.85(1H，m)，3.78-3.69(1H，m)，3.73(3H，s)，2.45-2.35(1H，m)，2.35(3H，s)，2.07(3H，s)，2.06-1.95(2H，m)，1.85-1.53(m，3H)。
实施例41：N-(2，5-二甲基-2H-吡唑-3-基甲基)-2-{3-[(E)-2-(4-甲基-吡啶-2-基)-乙烯基]-1H-吲唑-6-基氨基}-苯甲酰胺
Figure A20038010969700762
按照与上述实施例7所述类似的方法制备，只是使用N-(2，5-二甲基-2H-吡唑-3-基甲基)-2-[(E)-3-[2-(4-甲基-吡啶-2-基)-乙烯基]-1-(四氢-吡喃-2-基)-1H-吲唑-6-基氨基]-苯甲酰胺代替N-[4-(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-丁-2-炔基]-2-[3-[2-(4，6-二甲基-吡啶-2-基)-乙烯基]-1-(四氢-吡喃-2-基)-1H-吲唑-6-基氨基]-苯甲酰胺。1H NMR(DSMO-d6)δ12.90(1H，s)，9.70(1H，s)，9.03(1H，t，J＝6.0Hz)，8.44(1H，d，J＝4.9Hz)，8.06(1H，d，J＝9.0Hz)，7.87(1H，d，J＝16.2Hz)，7.70(1H，d，J＝7.5Hz)，7.50-7.38(4H，m)，7.22(1H，s)，7.1(1H，d，J＝5.6Hz)，6.99(1H，dd，J＝8.7，1.5Hz)，6.90(1H，dt，J＝7.9，1.9Hz)，5.91(1H，s)，4.43(2H，d，J＝5.6Hz)，3.72(3H，s)，2.34(3H，s)，2.05(3H，s)。
实施例42：1-甲基-1H-苯并咪唑-2-醛肟
向搅拌的1-甲基-1H-苯并咪唑-2-醛(980mg，6.61mmol)在H2O(10ml)中的混悬液中加入乙酸钠(3.25g，39.68mmol)和羟基胺盐酸盐(1.38g，19.84mmol)在10ml H2O中的溶液。将该反应混合物在室温下搅拌2小时并通过过滤收集粘稠沉淀、用水洗涤并在真空中干燥而得到1.02g(94％)白色固体。1H NMR(DSMO-d6)δ12.06(1H，s)，8.28(1H，s)，7.65(1H，d，J＝7.5Hz)，7.60(1H，d，J＝6.8Hz)，7.32(1H，t，J＝7.2Hz)，7.23(1H，t，J＝6.8Hz)，4.00(3H，s)。对C9H9N3O的分析，计算值：C，61.70；H，5.18；N，23.99。测定值：C，61.80；H，5.23；N，23.98。
实施例43：C-(1-甲基-1H-苯并咪唑-2-基)-甲胺二盐酸盐
Figure A20038010969700772
向帕尔压力瓶内加入1-甲基-1H-苯并咪唑-2-醛肟M(267mg，1.6mmol)、10％钯/碳(75mg)、浓HCl(2滴)和EtOH(25mol)。将该反应混合物在45psi H2环境中振摇2小时，此后通过过滤除去催化剂。在减压条件下浓缩滤液并将残余物用Et2O研磨而得到340mg(90％)白色固体，为二盐酸盐，且不经进一步纯化使用。1H NMR(DSMO-d6)：δ8.87(2H，broad s)，7.72(2H，m)，7.38(2H，m)，4.50(2H，s)，3.89(3H，s)。
实施例44：N-(1-甲基-1H-苯并咪唑-2-基甲基)-2-[3-[2-(4-甲基-吡啶-2-基)-乙烯基]-1-(四氢-吡喃-2-基)-1H-吲唑-6-基氨基]-苯甲酰胺
按照与上述实施例6所述类似的方法制备，只是使用C-(1-甲基-1H-苯并咪唑-2-基)-甲胺盐酸盐N和2-[3-[2-(4-甲基-吡啶-2-基)-乙烯基]-1-(四氢-吡喃-2-基)-1H-吲唑-6-基氨基]-苯甲酸。1H NMR(DSMO-d6)δ9.82(1H，s)，9.20(1H，t，J＝5.3Hz)，8.46(1H，d，J＝4.9Hz)，8.07(1H，d，J＝8.9Hz)，7.85(1H，d，J＝16.4Hz)，7.74(1H，d，J＝7.3Hz)，7.58(1H，d，J＝7.2Hz)，7.50(6H，m)，7.19(4H，m)，6.92(1H，t，J＝8.1Hz)，5.78(1H，dd，J＝2.5，9.5Hz)，4.79(2H，d，J＝5.5Hz)，3.89(1H，m)，3.83(3H，s)，3.71(1H，m)，2.41(1H，m)，2.35(3H，s)，2.00(2H，m)，1.74(1H，m)，1.57(2H，m)。
对C36H35N7O2·0.65己烷的分析，计算值：C，73.31；H，6.80；N，15.00。测定值：C，72.92；H，6.90；N，14.71。
实施例45：N-(1-甲基-1H-苯并咪唑-2-基甲基)-2-{3-[(E)2-(4-甲基-吡啶-2-基)-乙烯基]-1H-吲唑-6-基氨基}-苯甲酰胺
Figure A20038010969700781
按照与实施例7所述类似的方法制备，只是使用N-(1-甲基-1H-苯并咪唑-2-基甲基)-2-[3-[2-(4-甲基-吡啶-2-基)-乙烯基]-1-(四氢-吡喃-2-基)-1H-吲唑-6-基氨基]-苯甲酰胺代替N-[4-(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-丁-2-炔基]-2-[3-[2-(4，6-二甲基-吡啶-2-基)-乙烯基]-1-(四氢-吡喃-2-基)-1H-吲唑-6-基氨基]-苯甲酰胺。1H NMR(DSMO-d6)δ12.93(1H，s)，9.73(1H，s)，9.19(1H，t，J＝5.3Hz)，8.45(1H，d，J＝4.9Hz)，8.06(1H，d，J＝8.5Hz)，7.88(1H，d，J＝16.4Hz)，7.74(1H，d，J＝7.9Hz)，7.60-7.36(6H，m)，7.29-7.14(3H，m)，7.10(1H，d，J＝4.7Hz)，7.04(1H，dd，J＝1.8，8.9Hz)，6.91(1H，t，J＝7.3Hz)，4.79(2H，d，J＝5.3Hz)，3.83(3H，s)，2.35(3H，s)。
对C31H27N7O·1.80H2O·0.40CH2Cl2的分析，计算值：C，65.02；H，5.46；N，16.91。测定值：C，64.97；H，5.82；N，17.09。
实施例46：1-甲基-1H-咪唑-2-醛肟
按照与实施例39所述类似的方法制备，只是使用1-甲基-1H-咪唑-2-醛。1H NMR(DSMO-d6)δ11.50(1H，s)，8.05(1H，s)，7.28(1H，s)。
对C5H7N3O的分析，计算值：C，47.99；H，5.64；N，33.58。测定值：C，48.22；H，5.58；N，33.45。
实施例47：C-(1-甲基-1H-咪唑-2-基)-甲胺二盐酸盐
按照与实施例40所述类似的方法制备，只是使用1-甲基-1H-咪唑-2-醛肟代替1-甲基-1H-苯并咪唑-2-醛肟。1H NMR(DSMO-d6)δ7.45(1H，s)，7.29(1H，s)，4.25(21H，s)，3.79(3H，s)。
实施例48：N-(1-甲基-1H-咪唑-2-基甲基)-2-[3-[2-(4-甲基-吡啶-2-基)-乙烯基]-1-(四氢-吡喃-2-基)-1H-吲唑-6-基氨基]-苯甲酰胺
按照与上述实施例6所述类似的方法制备，只是使用C-(1-甲基-1H-咪唑-2-基)-甲胺盐酸盐和2-[3-[2-(4-甲基-吡啶-2-基)-乙烯基]-1-(四氢-吡喃-2-基)-1H-吲唑-6-基氨基]-苯甲酸。1H NMR(DSMO-d6)δ9.83(1H，s 9.03(1H，t，J＝5.5Hz)，8.45(1H，d，J＝4.7Hz)，8.09(1H，d，J＝8.5Hz)，7.85(1H，d，J＝16.5Hz)，8.67(1H，d，J＝7.3Hz)，7.53-7.39(4H，m)，7.11(3H，m)，6.90(1H，d，J＝6.9Hz)，6.86(1H，s)，5.79(1H，d，J＝8.9Hz)，5.75(1H，s)，4.54(1H，d，J＝5.5Hz)，3.85-3.70(2H，m)，3.66(3H，s)，2.10(2H，m)，1.70(2H，m)，1.60(3H，m)。对C32H33N7O2·0.8CH2Cl2的分析，计算值：C，63.99；H，5.672；N，15.93。测定值：C，63.95；H，5.72；N，16.01。
实施例49：N-(1-甲基-1H-咪唑-2-基甲基)-2-{3-[2-(4-甲基-吡啶-2-基)-乙烯基]-1H-吲唑-6-基氨基}-苯甲酰胺
按照与实施例7所述类似的方法制备，只是使用N-(1-甲基-1H-咪唑-2-基甲基)-2-[3-[2-(4-甲基-吡啶-2-基)-乙烯基]-1-(四氢-吡喃-2-基)-1H-吲唑-6-基氨基]-苯甲酰胺代替N-[4-叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-丁-2-炔基]-2-[3-[2-(4，6-二甲基-吡啶-2-基)-乙烯基]-1-(四氢-吡喃-2-基)-1H-吲唑-6-基氨基]-苯甲酸。1H NMR(DSMO-d6)δ12.89(1H，s 9.72(1H，s，8.99(1H，t，J＝5.6Hz)，8.44(1H，d，J＝4.9Hz)，8.05(1H，d，J＝8.7Hz)，7.86(1H，d，J＝16.4Hz)，7.66(1H，d，J＝6.7Hz)，7.49-7.36(4H，m)，7.24(1H，m)，6.86(1H，s)，7.09(2H，d，J＝8.1Hz)，7.02(1H，d，J＝8.8Hz)，6.88(1H，s)，4.52(2H，d，J＝5.5Hz)，3.29(3H，s)，2.34(3H，s)。对C27H25N7O·0.35CH2Cl2的分析，计算值：C，66.59；H，5.252；N，19.88。测定值：C，66.485；H，5.65；N，19.56。
实施例50：N-(4-羟基-丁-2-炔基)-2-[3-[2-(4-甲基-吡啶-2-基)-乙烯基]-1-(四氢-吡喃-2-基)-1H-吲唑-6-基氨基]-苯甲酰胺
按照与实施例6所述类似的方法制备，只是使用2-[3-[2-(4-甲基-吡啶-2-基)-乙烯基]-1-(四氢-吡喃-2-基)-1H-吲唑-6-基氨基]-苯甲酸和4-(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-丁-2-炔基胺。1H NMR(CDCl3)δ9.48(H，s)，8.46(1H，d，J＝5.3Hz)，7.92(1H，d，J＝9.0Hz)，7.83(1H，d，J＝16.2Hz)，7.52(1H，d，J＝16.6Hz)，7.46-7.41(2H，m)，7.34-7.31(3H，m)，7.12(1H，dd，J＝8.7，1.9Hz)，6.99(1H，d，J＝4.9Hz)，6.81(1H，t，J＝6.8Hz)，6.40(1H，t，J＝4.9Hz)，5.62(1H，dd，J＝9.4，3.0Hz)，4.28-4.23(4H，m)，4.08-4.01(1H，m)，3.76-3.67(1H，m)，2.63-2.49(1H，m)，2.38(3H，s)，2.22-2.06(2H，m)，1.80-1.60(3H，m).
实施例51：2-{3-[(E)-2-(4-甲基-吡啶-2-基)-乙烯基]-1H-吲唑-6-基氨基}-N-(4-羟基-丁-2-炔基)-苯甲酰胺
Figure A20038010969700802
按照与实施例7所述类似的方法制备，只是使用N-(4-羟基-丁-2-炔基)-2-[3-[2-(4-甲基-吡啶-2-基)-乙烯基]-1-(四氢-吡喃-2-基)-1H-吲唑-6-基氨基]-苯甲酰胺和N-[4-(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-丁-2-炔基)-2-[3-(2-(4-甲基-吡啶-2-基)-乙烯基]-1-(四氢-吡喃-2-基)-1H-吲唑-6-基氨基]-苯甲酰胺的混合物代替N-[4-(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-丁-2-炔基)-2-[3-[2-(4，6-二甲基-吡啶-2-基)-乙烯基]-1-(四氢-吡喃-2-基)-1H-吲唑-6-基氨基]-苯甲酰胺。
1H NMR(DSMO-d6)δ12.92(1H，s)，9.83(1H，s)，9.00(1H，t，J＝5.3Hz)，8.44(1H，d，J＝4.9Hz)，8.06(1H，d，J＝9.0Hz)，7.87(1H，d，J＝16.6Hz)，7.68(1H，d，J＝7.9Hz)，7.50-7.38(4H，m)，7.26(1H，s)，7.09(1H，d，J＝5.3Hz)，7.01(1H，dd，J＝8.7，1.5Hz)，6.88(1H，dt，J＝6.8，1.5Hz)，5.11(1H，t，J＝3.0Hz)，4.10-4.04(4H，m)，2.34(3H，s)。
实施例52：2-[3-(吡咯-1-基亚氨基甲基)-1-(2-三甲基硅烷基-乙氧基甲基)-1H-吲唑-6-基氨基]-苯甲酸甲酯
按照与上述实施例2和3所述类似的方法制备，只是使用6-硝基-3-苯乙烯基-1-H-吲唑取代6-碘-3-苯乙烯基-1-(2-三甲基硅烷基-乙氧基甲基)-1H-吲唑。
取作为产物与2-氨基-苯甲酸甲酯的粗混合物的该物质用于下一步。
实施例53：2-[3-(吡咯-1-基亚氨基甲基)-1-(2-三甲基硅烷基-乙氧基甲基)-1H-吲唑-6-基氨基]-苯甲酸
Figure A20038010969700812
使用与2000年6月30日提交的美国专利申请顺序号09/609,335中实施例11所述类似的方法从N-[4-(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-丁-2-炔基]-2-[3-(吡咯-1-基亚氨基甲基)-1-(2-三甲基硅烷基-乙氧基甲基)-1H-吲唑-6-基氨基]-苯甲酰胺和TBAF的反应混合物中分离上述化合物作为副产物，为所有目的将所述文献的全部内容引入本文作为参考。1H NMR(DSMO-d6)δ13.19(1H，broad s 10.00(1H，s，9.13(1H，s)，8.37(1H，d，J＝8.7Hz)，8.06(1H，d，J＝7.5Hz)，7.75(1H，s)，7.64(2H，t，J＝2.3Hz)，7.54(2H，m)，7.35(1H，dd，J＝1.9，8.7Hz)，6.99(1H，m)，6.33(2H，t，J＝2.3Hz)，5.89(2H，s)，3.68(2H，t，J＝8.1Hz)，0.94(2H，t，J＝8.1Hz)，0.00(9H，s)。
实施例54：N-(3-环丙基-丙-2-炔基)-2-[3-(吡咯-1-基亚氨基甲基)-1-(2-三甲基硅烷基-乙氧基甲基)-1H-吲唑-6-基氨基]-苯甲酰胺
Figure A20038010969700821
按照与上述实施例6所述类似的方法制备，只是使用2-[3-(吡咯-1-基亚氨基甲基)-1-(2-三甲基硅烷基-乙氧基甲基)-1H-吲唑-6-基氨基]-苯甲酸和3-环丙基-丙-2-炔基胺。1H NMR(DSMO-d6)δ9.93(1H，s 8.99(1H，s)，8.95(1H，d，J＝5.6Hz)，8.20(1H，d，J＝8.9Hz)，7.68(1H，d，J＝8.1Hz)，7.51(4H，m)，7.37(1H，t，J＝6.8Hz)，7.14(1H，d，J＝9.OHz)，6.91(1H，t，J＝7.5Hz)，6.21(2H，t，J＝2.3Hz)，5.74(2H，s)，4.00(2H，dd，J0.73(2H，m)，0.55(2H，m)。对C25H22N6O·0.05己烷·0.30H2O的分析，计算值：C，70.31；H，5.43；N，19.45.测定值：C，70.63；H，5.38；N，19.18。
实施例55：N-(3-环丙基-丙-2-炔基)-2-[3-(吡咯-1-基亚氨基甲基)-1H-吲唑-6-基氨基]-苯甲酰胺
Figure A20038010969700822
使用与2000年6月30日提交的美国专利申请顺序号US 09/609,335中实施例11所述类似的方法制备，只是使用N-(3-环丙基-丙-2-炔基)-2-[3-(吡咯-1-基亚氨基甲基)-1-(2-三甲基硅烷基-乙氧基甲基)-1H-吲唑-6-基氨基]-苯甲酰胺代替N-甲基-N-{3-苯乙烯基-1-[2-三甲基-硅烷基)-乙氧基甲基]-1H-吲唑-6-基}-苯-1，3-二胺，为所有目的将所述文献的全部内容引入本文作为参考。1H NMR(DSMO-d6)δ13.29(1H，s)，9.83(1H，s)，8.98(1H，s)，8.95(1H，t，J＝5.5Hz)，8.19(1H，d，J＝8.9Hz)，7.68(1H，d，J＝7.5Hz)，7.52(2H，t，J＝2.3Hz)，7.43(2H，m)，7.29(1H，s)，7.07(1H，dd，J＝1.9，8.7Hz)，6.91(1H，t，J＝7.4Hz)，6.21(2H，t，J＝2.3Hz)，4.01(2H，dd，J＝1.7，5.5Hz)，1.27(1H，m)，0.73(2H，m)，0.55(2H，m)。对C25H22N6O·0.05己烷·0.30H2O的分析，计算值：C，70.31；H，5.43；N，19.45。测定值：C，70.63；H，5.38；N，19.18。
实施例56：N-[4-(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-丁-2-炔基]-2-[3-(吡咯-1-基亚氨基甲基)-1-(2-三甲基硅烷基-乙氧基甲基)-1H-吲唑-6-基氨基]-苯甲酰胺
Figure A20038010969700831
按照与上述实施例6所述类似的方法制备，只是使用2-[3-(吡咯-1-基亚氨基甲基)-1-(2-三甲基硅烷基-乙氧基甲基)-1H-吲唑-6-基氨基]苯甲酸和4-(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-丁-2-炔基胺。1H NMR(DSMO-d6)δ10.04(1H，s9.16(1H，t，J＝5.3Hz)，9.10(1H，s)，8.31(1H，d，J＝8.7Hz)，7.78(1H，d，J＝7.9Hz)，7.67(4H，m)，7.49(1H，t，J＝8.5Hz)，7.24(1H，dd，J＝1.7，8.7Hz)，7.03(1H，t，J＝7.4Hz)，6.33(2H，t，J＝2.3Hz)，5.85(2H，s)，4.83(2H，s)，4.19(2H，d，J＝5.5Hz)，3.66(2H，t，J＝7.9Hz)，0.94(2H，m)，0.89(9H，s)，0.13(6H，s)，0.00(9H，s)。
实施例57：N-(4-羟基-丁-2-炔基)-2-[3-(吡咯-1-基亚氨基甲基)-1H-吲唑-6-基氨基]-苯甲酰胺
Figure A20038010969700832
使用与2000年6月30日提交的美国专利申请顺序号US 09/609,335中实施例11所述类似的方法制备，只是使用N-[4-(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-丁-2-炔基]-2-[3-(吡咯-1-基亚氨基甲基)-1-(2-甲基硅烷基-乙氧基甲基)-1H-吲唑-6-基氨基]-苯甲酰胺代替N-甲基-N-{3-苯乙烯基-1-[2-三甲基-硅烷基)-乙氧基甲基]-1H-吲唑-6-基}-苯-1，3-二胺，为所有目的将所述文献的全部内容引入本文作为参考。1H NMR(DSMO-d6)δ13.30(1H，s)，9.87(1H，s 9.04(1H，t，J＝5.3Hz)，8.99(1H，s)，8.19(1H，d，J＝8.5Hz)，7.70(1H，d，J＝7.3Hz)，7.46(4H，m)，7.31(1H，s)，7.08(1H，dd，J＝1.7，8.7Hz)，6.91(1H，t，J＝7.3Hz)，6.21(2H，t，J＝2.1Hz)，5.14(1H，t，J＝5.8Hz)，4.10(2H，d，J＝5.5Hz)，4.06(2H，d，J＝5.8Hz)。对C23H20N6O2·0.35己烷·0.20H2O的分析，计算值：C，67.45；H，5.86；N，18.81。测定值：C，67.70；H，5.73；N，18.56。
实施例58：2，5-二甲基-2H-吡唑-3-腈
Figure A20038010969700841
按照Castellanos，Maria和Montserrat，Llinas在JCS Perkins TransI(1985)1209-1215中对1-甲基-吡唑-5-腈公开的方法由1，3-二甲基吡唑-5-甲酸乙酯制备2，5-二甲基-2H-吡唑-3-腈。1H NMR(CDCl3)δ6.52(1H，s)，3.96(3H，s)，2.27(3H，s)。
实施例59：C-(2，5-二甲基-2H-吡唑-3-基)-甲胺
将2，5-二甲基-2H-吡唑-3-腈(654mg，5.4mmol)和10％钯/碳(200mg)在乙醇(15mL)中的混悬液在45psi H2下的帕尔氢化仪中振摇17小时。将该混合物通过塞力特硅藻土过滤并在减压条件下浓缩滤液而得到608mg油状物，将其不经任何进一步纯化就使用。1H NMR(CDCl3)δ5.91(1H，s)，3.81，3.73(2H，2s)，3.75(3H，s)，2.21(3H，s)。
实施例60：N-(2，5-二甲基-2H-吡唑-3-基甲基)-2-[3-(吡咯-1-基亚氨基甲基rl-(2-三甲基硅烷基-乙氧基甲基)-1H-吲唑-6-基氨基]-苯甲酰胺
按照与上述实施例6所述类似的方法制备，只是使用2-[3-(吡咯-1-基亚氨基甲基)-1-(2-三甲基硅烷基-乙氧基甲基)-1H-吲唑-6-基氨基]-苯甲酸和C-(2，5-二甲基-2H-吡唑-3-基)-甲胺。1H NMR(CDCl3)δ9.56(1H，s)，8.68(1H，s)，8.30(1H，d，J＝8.7Hz)，7.49(1H，d，J＝8.3Hz)，7.43(1H，dd，J＝7.9，1.5Hz)，7.36-7.31(2H，m)，7.23(2H，t，J＝2.6Hz)，7.17(1H，dd，J＝8.7，1.9Hz)，6.83(1H，t，J＝7.2Hz)，6.32(1H，bt)，6.29(2H，t，J＝2.3Hz)，6.01(1H，s)，5.67(2H，s)，4.61(2H，d，J＝5.6Hz)，3.60(3H，s)，3.58(2H，t，J＝8.3Hz)，2.22(3H，s)，0.90(2H，t，J＝8.7Hz)，0.06(9H，s)。
实施例61：N-(2，5-二甲基-2H-吡唑-3-基甲基)-2-[3-(吡咯-1-基亚氨基甲基)-1H-吲唑-6-基氨基]-苯甲酰胺
使用与2000年6月30日提交的美国专利申请顺序号US 09/609,335中实施例11所述类似的方法制备，只是使用N-(2，5-二甲基-2H-吡唑-3-基甲基)-2-[3-(吡咯-1-基亚氨基甲基)-1-(2-三甲基硅烷基-乙氧基甲基)-1H-吲唑-6-基氨基]-苯甲酰胺代替N-甲基-N-{3-苯乙烯基-1-[2-三甲基-硅烷基)-乙氧基甲基]-1H-吲唑-6-基}-苯-1，3-二胺，为所有目的将所述文献的全部内容引入本文作为参考。1H NMR(CDCl3)δ13.27(1H，s)，9.72(1H，s)，9.05(1H，t，J＝5.3Hz)，8.97(1H，s)，8.16(1H，d，J＝8.7Hz)，7.68(1H，dd，J＝8.3，1.9Hz)，7.50(2H，t，J＝2.6Hz)，7.46-7.38(2H，m)，7.25(1H，s)，7.05(1H，dd，J＝8.7，1.9Hz)，6.91(1H，t，J＝6.80Hz)，6.20(2H，t，J＝2.3Hz)，5.91(1H，s)，4.43(2H，d，J＝5.6Hz)，3.71(3H，s)，2.04(3H，s)。
实施例62：2-[3-(吡咯-1-基亚氨基甲基)-1H-吲唑-6-基氨基]-苯甲酸
Figure A20038010969700861
使用与2000年6月30日提交的美国专利申请顺序号US 09/609,335中实施例11所述类似的方法制备，只是使用2-[3-(吡咯-1-基亚氨基甲基)-1-(2-三甲基硅烷基-乙氧基甲基)-1H-吲唑-6-基氨基]-苯甲酸代替N-甲基-N-{3-苯乙烯基-1-[2-三甲基-硅烷基)-乙氧基甲基]-1H-吲唑-6-基}-苯-1，3-二胺，为所有目的将所述文献的全部内容引入本文作为参考。1H NMR(DSMO-d6)δ13.12(1H，s)，12.70(1H，s)，8.94(1H，s)，8.10(1H，d，J＝8.7Hz)，7.91(1H，dd，J＝1.7，7.7Hz)，7.50(2H，t，J＝2.3Hz)，7.36(1H，d，J＝7.9Hz)，7.27(1H，d，J＝1.5Hz)，7.16(1H，t，J＝7.5Hz)，6.94(1H，dd，J＝1.7，8.7Hz)，6.68(1H，t，J＝7.5Hz)，6.19(2H，t，J＝2.3Hz)。
实施例63：2-[3-(吡咯-1-基亚氨基甲基)-1H-吲唑-6-基氨基]-苯甲酸
按照与上述实施例6所述类似的方法制备，只是使用2-[3-(吡咯-1-基亚氨基甲基)-1H-吲唑-6-基氨基]-苯甲酸和炔丙基胺。1H NMR(DMSO-d6)δ13.30(1H，s)，9.82(1H，s)，9.04(1H，t，J＝5.6Hz)，8.98(1H，s)，8.19(1H，d，J＝8.6Hz)，7.69(1H，d，J＝7.9Hz)，7.45(4H，m)，7.31(1H，s)，7.08(1H，d，J＝8.6Hz)，6.91(1H，t，J＝7.6Hz)，6.21(2H，s)，4.05(2H，s)，3.13(1H，s)。对C22H18N6O·0.40H2O·0.05己烷的分析，计算值：C，67.97；H，5.01；N，21.33。测定值：C，67.91；H，4.78；N，21.00。
实施例64：N-(4-羟基-丁-2-炔基)-2-[3-(2-吡啶-2-基-乙烯基)-1H-吲唑-6-基氨基]-苯甲酰胺
Figure A20038010969700871
按照与上述实施例6所述类似的方法制备，只是使用2-[3-(2-吡啶-2-基-乙烯基)-1H-吲唑-6-基氨基]-苯甲酸四丁基铵和4-氨基-丁-2-炔-1-醇。1HNMR(DMSO-d6)：δ12.95(1H，s)，9.84(1H，s)，9.02(1H，t，J＝5.6Hz)，8.59(1H，d，J＝4.9Hz)，8.08(1H，d，J＝8.7Hz)，7.90(1H，d，J＝16.2Hz)，7.80(1H，t，J＝7.2Hz)，7.70-7.64(2H，m)，7.51(1H，d，J＝16.2Hz)，7.45-7.36(2H，m)，7.27-7.24(2H，m)，7.02(1H，d，J＝9.0Hz)，6.88(1H，t，J＝7.2Hz)，5.13(1H，t，J＝5.6Hz)，4.10-4.04(4H，m)。
实施例65：N-(2，5-二甲基-2H-吡唑-3-基甲基)-2-[3-(2-吡啶-2-基-乙烯基)-1H-吲唑-6-基氨基]-苯甲酰胺
Figure A20038010969700872
按照与上述实施例6所述类似的方法制备，只是使用2-[3-(2-吡啶-2-基-乙烯基)-1H-吲唑-6-基氨基]-苯甲酸四丁基铵和C-(2，5-二甲基-2H-吡唑-3-基)-甲胺。1H NMR(DMSO-d6)δ12.93(1H，s)，9.70(1H，s)，9.04(1H，bt)，8.58(1H，d，J＝4.0Hz)，8.07(1H，d，J＝8.8Hz)，7.88(1H，d，J＝16.4Hz)，7.79(1H，t，J＝8.6Hz)，7.71-7.64(2H，m)，7.50(1H，d，J＝16.4Hz)，7.44-7.39(2H，m)，7.28-7.23(2H，m)，7.00(1H，d，J＝8.8Hz)，6.90(1H，t，J＝8.0Hz)，5.91(1H，s)，4.43(2H，d，J＝5.5Hz)，3.71(3H，s)，2.04(3H，s)。
可以使用下述试验测试上述典型化合物的活性。
生物试验：酶试验
诸如VEFG、FGF及其它的生长因子对细胞增殖的刺激取决于它们诱导其相应的受体酪氨酸激酶各自的自磷酸化。因此，可以通过抑制肽底物测定蛋白激酶抑制剂阻断自磷酸化的能力。为了测定所述化合物对蛋白激酶的抑制活性，设计如下构建物。
试验用VEGF-R2构建物：该构建物测定测试化合物抑制酪氨酸激酶活性的能力。在杆状病毒/昆虫细胞***中表达缺乏激酶***结构域68个残基中的50个中心残基的人血管内皮生长因子受体2(VEGF-R2)的胞质结构域的构建物(VEGF-R2A50)。在全长VEGF-R2的1356个残基中，VEGF-R2A50含有806-939和990-1171位残基且还含有一个与野生型VEGF-R2相比激酶***结构域内的点突变(E990V)。通过在4℃下和有3mM ATP和40mMMgCl2存在下的含有5％甘油和5mM DTT的pH7.5的100mM HEPES中以4uM的浓度将所述酶保温2小时使纯化的构建物进行自磷酸化。自磷酸化后，已经证实该构建物具有基本上与野生型自磷酸化激酶结构域构建物基本上等效的催化活性。参见Parast等，Biochemistry，37，16788-16801(1998)。
试验用FGF-R1构建物：使用按照Mohammadi等在Mol.Cell.BioL，16，977-989(1996)中所述的残基编号***从456位内源性甲硫氨酸残基开始到766位谷氨酸残基的杆状病毒载体表达体系表达人FGF-R1的胞内激酶结构域。此外，该构建物还含有如下3种氨基酸取代：L457V、C488A和C584S。
试验用LCK构建物：在昆虫细胞中表达作为从223位氨基酸残基开始到509位残基上的蛋白质终止的N-末端缺失的LCK酪氨酸激酶，其中在N-末端上存在如下两种氨基酸取代：P233M和C224D。
试验用CHK1构建物：使用杆状病毒/昆虫细胞***表达C-末端His-标记的全长人CHK1(FL-CHK1)。它在476个氨基酸的人CHK1的C-末端上含有6个组氨酸残基(6x His-标记)。通过常规色谱技术纯化该蛋白质。
试验用CDK2/细胞周期调节蛋白A构建物：使用公开的方法(Rosenblatt等J.MoL Biol.，230，1317-1319(1993))从已经感染了杆状病毒表达载体的昆虫细胞中纯化CDK2。从表达全长重组细胞周期调节蛋白A的大肠杆菌细胞中纯化细胞周期调节蛋白A且通过限制性蛋白水解产生截短的细胞周期调节蛋白A构建物并如上所述纯化(Jeffrey等Nature，376，313-320(1995))。
试验用CDK4/细胞周期调节蛋白A构建物：使用传统的生化色谱技术从已经共同感染了相应杆状病毒表达载体的昆虫细胞中纯化人CDK4和细胞周期调节蛋白D3的复合物或细胞周期调节蛋白D1与人CDK4和谷胱甘肽-S-转移酶(GST-CDK4)的融合蛋白的复合物。
试验用FAK构建物使用杆状病毒载体表达***表达人FAK(FAKcd409)的催化结构域。表达的280个氨基酸结构域包括409位甲硫氨酸到689位谷氨酸残基。与Whithey，G.S.等在DNA Cell Biol，9，823-30(1993)中公开的序列登记号L13616相比存在一种氨基酸取代(P410T)。使用传统色谱技术纯化该蛋白质。
试验用TIE-2(TEK)构建物
在昆虫细胞中表达作为从774位氨基酸残基开始到1124位残基上的蛋白质终止的N-末端缺失的TIE-2酪氨酸激酶结构域。该构建物还携带用作翻译中的启动甲硫氨酸残基的R774M突变。
VEGF-R2试验
联用的分光光度(FLVK-P)测定
由伴随磷酰基转移的ATP产生ADP关联使用磷酸烯醇丙酮酸(PEP)和含有丙酮酸激酶(PK)和乳酸脱氢酶(LDH)的***的NADH氧化。使用Beckman DU 650分光光度计通过如下在340nm处的吸收度下降监测NADH的氧化(ε340＝6.22cm-1mM-1)。磷酸化VEGF-R2A50(下表中表示为FLVK-P)的测定条件如下：1mM PEP；250μM NADH；50个单位的LDH/mL；20个单位的PK/mL；5mM DTT；5.1mM聚(E4Y1)；1mM ATP；和25mMMgCl2，在200mM HEPES中，pH7.5。未磷酸化VEGF-R2A50(下表中表示为FLVK)的测定条件如下：1mM PEP；250uM NADH；50个单位的LDH/mL；20个单位的PK/mL；5mM DTT；20mM聚(E4Y1)；3mM ATP；和60mMMgCl2和2mM MnCl2，在200mM HEPES中，pH7.5。使用5-40nM的酶启动试验。通过在有不同测试化合物浓度下测定酶活性确定KI值。使用Enzyme Kinetic和Kaleidagraph软件分析数据。
ELISA试验
使用生物素化胃泌素肽(1-17)作为底物监测磷酸胃泌素形成。使用链霉抗生物素蛋白包被的96-孔微量滴定板固定生物素化的磷酸胃泌素，随后使用与辣根过氧化物酶缀合的抗-磷酸酪氨酸-抗体进行检测。使用2，2′-连氮基-二-[3-乙基苯并噻唑啉磺酸(6)]二铵盐(ABTS)监测辣根过氧化物酶活性。典型测定溶液含有：2μM生物素化胃泌素肽；5mM DTT；20uM ATP；26mMMgCl2；和2mM MnCl2，在200mM HEPES中，pH7.5。使用0.8nM磷酸化VEGF-R2A50启动试验。使用10mM ABTS检测辣根过氧化物酶活性。通过添加酸(H2SO4)使辣根过氧化物酶反应停止，随后在405nm处读取吸收度。通过在有不同浓度测试化合物存在下测定酶活性确定KI值。使用Enzyme Kinetic和Kaleidagraph软件分析数据。
FGF-R试验
如上面对VEGF-R2所述进行分光光度测定，只是浓度有如下改变：FGF-R＝50nM，ATP＝2mM，且聚(E4Y1)＝15mM。
LCK试验
如上面对VEGF-R2所述进行分光光度测定，只是浓度有如下改变：LCK＝60nM，MgCl2＝0mM，聚(E4Y1)＝20mM。
CHK1试验
由伴随磷酰基转移至合成底物肽Syntide-2(PLARTLSVAGLPGKK)的ATP产生ADP关联使用磷酸烯醇丙酮酸(PEP)通过丙酮酸激酶(PK)和乳酸脱氢酶(LDH)作用氧化NADH。使用HP8452分光光度计通过如下在340nm处的吸收度下降监测NADH的氧化(ε40＝6.22cm-1mM-1)。典型反应溶液含有：4mN PEP；0.15mM NADH；28个单位的LDH/mL；16个单位的PK/mL；3mM DTT；0.125mM Syntide-2；0.15mM ATP；25mM MgCl2，在50mM TRIS中，pH7.5；和400mM NaCl。使用10nM FL-CHK1启动试验。通过在有不同测试化合物浓度下测定酶活性确定KI值。使用Enzyme Kinetic和Kaleidagraph软件分析数据。
CDK2/细胞周期调节蛋白A和CDK4/细胞周期调节蛋白D试验
通过对来自[32P]ATP的放射性磷酸的酶催化的时间依从性进入视网膜母细胞瘤蛋白的重组片段进行定量来确定依赖细胞周期蛋白的激酶活性。除非另有说明，测定在有10mM HEPES(N-[2-羟乙基]哌嗪-N′-[2-乙磺酸])(pH7.4)、10mM MgCl2，25μM腺苷三磷酸(ATP)、1mg/mL卵清蛋白、5μg/mL亮异蛋白酶肽、1mM二硫苏糖醇、10mM β-磷酸甘油、0.1mM钒酸钠、1mM氟化钠、2.5mM乙二醇-双(对-氨基***)-N，N，N′N′-四乙酸(EGTA)、2％(v/v)二甲亚砜和0.03-0.2μCi[32P]ATP存在下的总体积为50μL的96-孔平板中进行。底物(0.3-0.5μg)为纯化的重组视网膜母细胞瘤蛋白片段(Rb)(天然视网膜母细胞瘤蛋白的386-928位残基；62.3kDa，含有在天然106-kDa蛋白中发现的大部分磷酸化位点以及易于纯化的6个组氨酸残基尾端)。使用CDK2(150nM CDK2/细胞周期调节蛋白A复合物)或CDK4(50nMCDK4/细胞周期调节蛋白D3复合物)启动反应、在30℃下保温并在20分钟(min.)后通过添加乙二胺四乙酸(EDTA)至250mM终止反应。然后使用96-孔过滤多支管将磷酸化底物捕获在硝化纤维膜上并通过反复用0.85％磷酸洗涤除去为结合的放射性。通过使干燥的硝化纤维膜接触磷成像仪对放射性进行定量。通过在有不同化合物浓度下检测酶活性并扣除在没有酶存在下测定的背景放射性来确定表观KI值。在通常的检测条件下，通过测定起始速率对ATP浓度的依赖性对每种酶测定动力学参数(ATP的kcat、Km)。使用Kaleidagraph(Synergy Software)使数据适合于竞争性抑制的公式或使用软件KineTic(BioKin，Ltd.)使数据适合于竞争性紧密结合抑制的公式。测定的已知抑制剂对CDK4和CDK2的KI值与公布的IC50值一致。CDK4的特异活性与是否复合全长细胞周期调节蛋白D3或截短的细胞周期调节蛋白D3的构建物相同；两种复合物还产生了对选择的抑制剂而言极为相似的KI值。
FAK试验
FAK HTS使用了由LJL Biosystems提供的荧光偏振测定法。激酶溶液含有：100Hepes pH7.5，10mMMgCl2，1mM DTT，1mM ATP，和1mg/ml聚Glu-Tyr(4∶1)。通过添加5nM FAKcd409启动反应。通过添加EDTA终止反应，随后添加均由LJL Biosystems提供的荧光标记的肽和抗磷酸酪氨酸抗体。在Analyst(LJL)检测器上读取抑制结果。
TIE-2公光光度试验
由伴随磷酰基转移至无规共聚物聚(GIu4Tyr)的ATP激酶催化产生ADP关联通过丙酮酸激酶(PK)和乳酸脱氢酶(LDH)的活性氧化NADH。使用Beckman DU650分光光度计通过在340nm处的吸收度下降监测NADH转化成NAD+(ε40＝6.22cm-1mM-1)。典型反应溶液含有：1mM磷酸烯醇丙酮酸，0.24mM NADH，40mM MgCl2，5mM DTT，2.9mg/mL聚(GIu4Tyr)，0.5mM ATP，15个单位/mL PK，15个单位/mL LDH，在100mM HEPES中，pH7.5。通过添加4-12nM磷酸化Tie-2(aa 775-1122)启动试验。在1uM抑制剂浓度下按照一式三份测定抑制百分比。
TIE-2 DELFIA试验
使用生物素化p34cdc2(aa6-20＝KVEKIGEGTYGVVYK)肽作为底物监测磷酸酪氨酸形成。使用NeutrAvidinTM包被的96-孔微量滴定板固定生物素化肽，随后使用与铕N1螯合物缀合的抗-磷酸酪氨酸-抗体(PY20)进行检测。典型测定溶液含有：1μM生物素化p34cdc2肽，150μM ATP，5mM MgCl2，1mM DTT，0.01％BSA，5％甘油，2％DMSO，25mM HEPES pH7.5。在NeutrAvidin平板中使用50nM TIE2细胞内结构域启动试验。使用50mMEDTA终止激酶反应。然后洗涤平板并加入铕抗体。保温后，再次洗涤它们并加入DELFIATM强化溶液。在标准铕时间分辨设置下读取平板(ex 340nm，em 615nm，延缓400μsec，window 400μsec)。以加入了DMSO而非在DMSO中的化合物的平板内孔为基准计算抑制百分比，其中以在添加酶前加入了EDTA的平板内孔为基准从实验组和对照组中扣除背景。
HUVEC增殖试验
本试验测定测试化合物抑制生长因子刺激的人脐静脉内皮细胞(″HUVEC″)增殖的能力。将HUVEC细胞(第3-4代，Clonetics，Corp.)在T75烧瓶内融化入EGM2培养基(Clonetics Corp)。24小时后将新制的EGM2培养基加入到烧瓶中。4或5天后，使细胞再接触培养基(补充了10％胎牛血清(FBS)、60lg/mL内皮细胞生长补充剂(ECGS)和0.1mg/mL肝素的F12K培养基)。将呈指数生长的HUVEC细胞用于此后的实验。将1万-1万2千个HUVEC细胞平板固定在96-孔平皿上的富含100μl的培养基(上述)中。使细胞在该培养基中附着24小时。然后通过抽吸除去培养基并向各孔中加入105μl饥饿培养基(F12K+1％FBS)。24小时后，将溶于1％在饥饿培养基中的DMSO的15μl测试活性剂或这种单独的载体加入到各处理孔中；最终的DMSO浓度为0.1％。1小时后，将30μl在饥饿培养基中的VEGF(30ng/mL)加入到所有孔中，但不包括含有未处理的对照组的孔；最终VEGF浓度为6ng/mL。72小时后根据MTT染料的减少对细胞增殖定量，此时使细胞接触MTT(Promega Corp.)4小时。通过添加终止溶液(Promega Corp.)终止染料减少且在96-孔分光光度计平板读取器上测定595λ处的吸收度。
通过A595对不同浓度测试活性剂的反应的曲线拟合计算IC50值；一般来说，使用以0.5log为间距的7个浓度，其中对每一浓度均使用一式三份的孔。为了筛选化合物库平板，使用一个或两个浓度(每个浓度一个孔)并通过如下公式计算抑制％：
抑制％＝(对照-试验)÷(对照-饥饿)，其中：
当VEGF存在而没有测试活性剂时，对照＝A595；
当VEGF存在而有测试活性剂时，试验＝A595；
当VEGF和测试活性剂均不存在时，饥饿＝A595。
小鼠PK试验
使用下列实验分析药物的药物动力学特性(例如吸收和消除)。将测试化合物配制成在30∶70(PEG 400∶酸化的H2O)载体中的溶液或混悬液或在0.5％CMC中的混悬液。将其以可变剂量对两个不同组(n＝4)的B6雌性小鼠通过口服(p.o.)腹膜内(i.p.)给药。通过在给药后的以下时间点经眼眶放血采集血样：0小时(前剂量)、0.5小时、1.0小时、2.0小时和4.0小时以及7.0小时。通过以2500rpm离心5分钟从各样品中获得血浆。通过有机蛋白沉淀法从血浆中萃取测试化合物。对每次取血而言，将50μL血浆与1.0mL乙腈混合、涡旋2分钟且然后以4000rpm旋转15分钟以沉淀蛋白质并萃取出测试化合物。接下来将乙腈上清液(含有测试化合物的萃取物)倾入新试管并在热平板(25℃)上和N2汽流中蒸发。向含有干燥的测试化合物萃取物的各管中加入125μL流动相(60∶40，0.025M NH4H2PO4+2.5ml/L TEA∶乙腈)。通过涡旋将测试化合物重新悬浮于流动相中并通过以4000rpm离心5分钟除去更多蛋白质。将每份样品倾入HPLC小瓶以便使用带有UV检测的Hewlett Packard 1100系列HPLC进行测试化合物分析。对每份样品而言，将95□L注入Phenomenex-Prodigy反相C-18，150×3.2mm柱并在10分钟内用45-50％乙腈梯度洗脱。通过与使用按照上述方法从血浆样品中萃取的已知测试化合物浓度的标准曲线进行比较测定测试化合物血浆浓度(μg/mL)(峰面积-浓度μg/mL)。除标准品和未知的外，还进行三个组(n＝4)的质量控制(0.25μg/mL、1.5μg/mL和7.5μg/mL)以确保分析的一致性。标准曲线具有R2＞0.99且质量控制均在其预计值的10％内。使用Kalidagraph软件绘制定量测试样品的曲线以便目视观察且使用WIN NONLIN软件测定药物动力学参数。实施例1(a)提供了如下结果：0.69(小鼠pK，AUC，ip，Rg-h/ml)；0.33(小鼠pK，AUC，po，lg-h/ml)。
PAE-KDR细胞试验中KDR(VEGFR2)的磷酸化
本试验测定测试化合物抑制猪大动脉内皮(PAE)-KDR细胞中KDR自磷酸化的能力。在该试验中使用超表达人KDR的PAE细胞。在补充了10％胎牛血清(FBS)和400ug/mL G418的Ham′s F12培养基中培养细胞。将3万个细胞接种入96-孔平板各孔中的75μL生长培养基并使其在37℃下附着6小时。然后使细胞接触饥饿培养基(补充了0.1％FBS的Ham′s F12培养基)16小时。在饥饿期过后，将10μL在5％在饥饿培养基中DMSO中的测试活性剂加入到测试孔中并将10μL载体(5％在饥饿培养基中的DMSO)加入到对照孔中。各孔中最终的DMSO浓度为0.5％。将平板在37μC下保温1小时且然后在有2mM Na3VO4存在下用500ng/ml VEGF(购自R & D System)将细胞刺激8分钟。用1mm在HBSS中的Na3VO4将细胞洗涤1次并通过添加50μL/孔裂解缓冲液裂解。然后将100ul稀释缓冲液加入到各孔中并将稀释的细胞裂解物转入用家兔抗人抗-flk-1C-20抗体(购自Santa Cruz)预包被的96-孔山羊抗-家兔包被的平板(购自Pierce)中。将平板在室温下保温2小时并用1％在PBS中的Tween 20洗涤7次。稀释HRP-PY20(购自Santa Cruz)并加入到平板中进行30分钟保温。然后再次洗涤平板并加入TMB过氧化物酶底物(购自Kirkegaard & Perry)进行10-分钟保温。向96孔平板的各孔中加入100μL的0.09N H2SO4以终止反应。通过在450nm处用分光光度计读取数据评价磷酸化状态。使用四参数分析通过曲线拟合计算IC50值。
PAE-PDGFRβ细胞试验中的PAE-PDGFRβ磷酸化
本试验测定测试化合物抑制猪大动脉内皮(PAE)-PDGFRβ细胞中PDGFRβ自磷酸化的能力。在本试验中使用超表达人PDGFRβ的PAE细胞。在补充了10％胎牛血清(FBS)和400ug/mL G418的Ham′s F12培养基中培养细胞。将2万个细胞接种入96-孔平板各孔中的50μL生长培养基中并使其在37℃下附着6小时。然后使细胞接触饥饿培养基(补充了0.1％FBS的Ham′s F12培养基)16小时。在饥饿期过后，将10μL在5％在饥饿培养基中DMSO中的测试活性剂加入到测试孔中并将10μL载体(5％在饥饿培养基中的DMSO)加入到对照孔中。各孔中最终的DMSO浓度为0.5％。将平板在37μC下保温1小时且然后在有2mM Na3VO4存在下用1ug/mL PDGF-BB(R& D System)将细胞刺激8分钟。用1mm在HBSS中的Na3VO4将细胞洗涤1次并通过添加50μL/孔裂解缓冲液裂解。然后将100ul稀释缓冲液加入到各孔中并将稀释的细胞裂解物转入用家兔抗人PDGFRβ抗体(Santa Cruz)预包被的96-孔山羊抗-家兔包被的平板(Pierce)中。将平板在室温下保温2小时并用1％在PBS中的Tween 20洗涤7次。稀释HRP-PY20(Santa Cruz)并加入到平板中进行30分钟保温。然后再次洗涤平板并加入TMB过氧化物酶底物(Kirkegaard & Perry)进行10-分钟保温。向96孔平板的各孔中加入100μL的0.09N H2SO4以终止反应。通过在450nm处用分光光度计读取数据评价磷酸化状态。使用四参数分析通过曲线拟合计算IC50值。
人肝脏微粒体(HLM)试验
如下通过化LC-MS分析试验方法测定人肝脏微粒体中的化合物代谢。首先融化人肝脏微粒体(HLM)并用冷100mM磷酸钾(KPO4)缓冲液稀释至5mg/mL。在37℃下将适量的KPO4缓冲液、NADPH-再生溶液(含有B-NADP、葡糖-6-磷酸、葡糖-6-磷酸脱氢酶和MgCl2)和HLM在13×100mm玻璃试管内预保温10分钟(每种测试化合物3支试管-一式三份)。将测试化合物(终浓度5□M)加入到各试管中以启动反应并通过缓慢涡旋混合，随后在37℃下保温。在t＝0、2小时时从每支保温试管内取出250-uL样品以分离含有1mL冰冷的乙腈与0.05uM蛇根碱的12×75mm玻璃试管。以4000rpm将样品离心20分钟以沉淀蛋白和盐(Beckman Allegra 6KR，S/NALK98D06#634)。将上清液转入新的12×75mm玻璃试管并通过Speed-Vac真空离心蒸发器蒸发。将样品在200uL 0.1％甲酸/乙腈(90/10)中再溶解并剧烈涡旋以溶解。然后将样品转入分离用聚丙烯微量离心管并以14000xg离心10分钟(FisherMicro 14，S/N M0017580)。对在每一时间点处(0和2小时)的各自重复(#1-3)而言，将各测试化合物的等分样品合并入单一HPLC小瓶(总计6份样品)进行如下所述的LC-MS分析。
将合并的化合物样品注入LC-MS***，该***由Hewlett-PackardHP1100二极管阵列HPLC和在阳极电雾化SIR模式中操作的MicromassQuattroII三重四极质谱仪组成(设计程序以便特别对各测试化合物的分子离子进行扫描。在每一时间点对各测试化合物峰进行积分。对每一化合物而言，求每一时间点处(n＝3)峰面积的平均值并将2小时时的平均峰面积除以0小时时的平均峰面积而得到2小时时剩余的测试化合物的百分比。
将使用不同试验测试所述化合物的结果概括在下表中，其中除非另有说明，″％@″的标志表示在所述浓度下的抑制百分比；″*″值表示在1μM*或50nM**化合物浓度下的Ki(nM)或抑制％。″NT″表示不存在显著性抑制作用或未测试。
表1
 实施例#   FLVK Ki％ 抑制@50 nM   FLVK-P**   LckP*％抑制@1μM   FGF-P％抑制@1μM   HUVECIC50(nM)   HUVEC+清蛋白IC50(nM)   ％剩余(HLM)   PAEPDGFR自磷酸化IC50(nM)   PAEKDRIC50nMAVG  bFGFHuvecIC50(nM)AVG
 3(a)  98   NT   30   99   12.7   NT   NT   NT   NT  NT
 3(b)  98   NT   27   96   57   NT   84@2h   NT   NT  NT
 3(c)  91   NT   9   83   0.43   9.2   [email protected]   NT   NT  NT
 3(d)  89   NT   11   80   0.4   7.5   68@2h   3.5   NT  147
 3(f)3(g)  9595   NTNT   4128   6072   NT1.1   ＞100NT   [email protected]   NTNT   NTNT  NTNT
 3(h)  96   NT   37   85   1.6   NT   [email protected]   0.63   NT  NT
 3(i)  88   NT   22   45   0.2   NT   NT   1.9   NT  1000
 3(j)  80   NT   17   43   1.7   NT   [email protected]   4.7   NT  NT
 3(k)  74   NT   19   36   0.8   NT   [email protected]   5   NT  1000
 3(q)  47   NT   7   31   5   NT   [email protected]   5.2   NT  NT
 2(h)  84   NT   NT   75   1.6   NT   [email protected]   2.8   NT  70
 1(k)  27   NT   NT   12   ＞10   NT   NT   NT   NT  NT
 2(g)  83   NT   NT   79   0.71   NT   [email protected]   10.5   NT  173
 64  94   NT   NT   39   0.15   NT   [email protected]   5.5   NT  1250
 65  3.11nM   NT   NT   NT   3.4   NT   [email protected]   5.8   NT  NT
 61  65   NT   NT   14   6.5   NT   NT   NT   NT  662
 41  45   NT   NT   11   6.4   NT   NT   NT   NT  3775
 51  82   NT   NT   52   NT   NT   NT   NT   NT  NT
 15  64   NT   NT   29   1.5   NT   NT   12.3   NT  1613
 36  95   0.3nM   NT   69   1.67   NT   NT   NT   1.62  935
表1续
 实施例#   FLVK Ki％ 抑制@50 nM   FLVK-P**   LckP*％抑制@1□M   FGF-P％抑制@1□M   HUVECIC50(nM)   HUVEC+清蛋白IC50(nM)   ％剩余(HLM)   PAEPDGFR自磷酸化IC50(nM)   PAEKDRIC50nMAVG   bFGFHuvecIC50(nM)AVG
 13  80   NT   NT   63   NT   NT   NT   6   NT   NT
 18  94   NT   NT   59％   NT   NT   NT   NT   NT   1882
 20  91   NT   NT   35％   0.084   NT   NT   NT   NT   NT
 37  90   NT   NT   45   NT   NT   NT   NT   0.76   NT
 38  75   NT   NT   NT   NT   0.68   NT   2   NT   NT
 39  96   NT   NT   76％   NT   NT   NT   4.7   NT   NT
 32  78   NT   NT   70％   0.61   NT   [email protected]   0.5   NT   NT
 55  97   NT   NT   67％   0.2   NT   NT   3.7   NT   NT
 57  91   NT   NT   52％   ＜1.8   NT   NT   1.3   NT   NT
 63  85   NT   NT   63％   0.1   NT   NT   2.4   NT   NT
 34  72   NT   NT   NT   NT   NT   NT   4.5   NT   NT
10 76 6.07   NT   38,197nM 0.67   NT [email protected] 21   NT   NT
 45  28   NT   NT   24   NT   NT   NT   NT   NT   NT
 49  11   NT   NT   36   NT   NT   NT   NT   NT   NT
 23  23   NT   NT   56   NT   NT   NT   40   NT   NT
 25  64   NT   NT   13   3   NT   NT   NT   NT   NT
新生家兔视网膜血管发育的体内试验
家兔视网膜血管发育在出生后第1天到出生后第14天(P1-P14)发生。该过程取决于VEGF活性(J.Stone等J.Neurosci.，15，4738(1995))。上述情况证实VEGF还在早期血管发育过程中起视网膜血管存活因子的作用(Alon等Nat.Med.，1，1024(1995))。为了评价具体化合物体内抑制VEGF活性的能力，用合适的载体，通常为50％平均分子量为400道尔顿的聚乙二醇和50％的300mM蔗糖的去离子水溶液配制化合物。一般来说，将2微升(2μl)的药物溶液注入出生后第8或第9天的家兔幼仔眼的中部玻璃体。玻璃体内注射后第6天，处死动物并从剩余的眼组织中剥离视网膜。然后对分离的视网膜实施特异性染色上皮细胞的组织化学染色方案(Lutty和McLeod，Arch.Ophthalmol.，110，267(1992))，在组织样品中显示血管化程度。然后将各视网膜平坦固定在载波片上并检查以测定血管化程度。有效化合物抑制视网膜脉管***进一步发育并诱导视网膜内的几乎最大血管退化。将血管退化的量用于评价体内给药后化合物的相对功效。将血管退化分成1-3+的主观等级，其中1+为可检测到经判断约25％或25％以下退化；2+为判断约25-75％退化，而3+使视网膜内脉管***接近全部退化(约75％或75％以上)。
为了更为定量地分析退化，用与解剖显微镜连接的数码照相机俘获ADPase-染色的平坦固定的视网膜影像。然后将视网膜影像输入图像分析软件(Image Pro Plus 4.0，Media Cybernetics，Silver Spring，MD)。该软件用于确定含有染色血管的视网膜区域百分比。将实验眼的该值与来自相同动物的注射载体的对侧眼的测定值进行比较。随后将接受化合物的眼与注射载体的眼中观察到的血管面积相比的减少值表示为该样品的″退化百分比″。对5-8只动物的组求退化百分比平均值。
在通过显微镜观察显示接近全部退化的样品中，通常测定了65-70％的退化百分比值。这是因为视网膜襞内的染色沉积物所致，所述的视网膜襞由用于药物注射的载体诱发。图像分析软件解译了这些作为血管的含有染色剂的襞。对这些襞未进行校准尝试，因为它们因眼的不同而改变。因此，应注意退化百分比值报导的是根据按等级顺序精确排列化合物、而低估了其绝对功效的保收测定值得到的结果。
早产视网膜病新生家兔模型中视网膜血管发育的体内试验
将第二种VEGF依赖性视网膜新血管形成模型用于评价该系列化合物的活性。在该模型(Penn等，Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.，36，2063，(1995))中，将家兔幼仔(n＝16)与其母兔一起放入计算机控制的可调节氧浓度的室内。使动物接触50％浓度的氧24小时，随后接触10％浓度的氧24小时。将这种氧过多、氧过少交替循环重复7次，此后取出动物接触室内空气(P14)。在取出接触室内空气时通过玻璃体内注射给药化合物并在6天后处死动物(P20)。然后分离视网膜、进行染色固定并如上述在发育模型中进行分析。也如对发育模型所述对有效性进行分级。
将上述典型化合物配制成下列一般实施例的药物组合物。
实施例1：非肠道组合物
为了制备适合于通过注射给药的非肠道药物组合物，将100mg通式I化合物的水溶性盐溶于DMSO且然后与10mL的0.9％无菌盐水混合。将该混合物制成适合于通过注射给药的单位剂型。
实施例2：口服组合物
为了制备用于口服递送的药物组合物，将100mg通式I的化合物与750mg乳糖混合。将该混合物制成适合于口服给药的口服剂量单位，诸如硬胶囊。
实施例3：眼内组合物
为了制备用于眼内递送的缓释药物组合物，将通式I的化合物悬浮于透明质酸(浓度1.5％)在磷酸盐缓冲液(pH7.4)中的中性等渗溶液中而形成1％混悬液。
可以理解的是上面描述实际上为典型和解释性的且用于解释本发明及其优选实施方案。本领域技术人员认为显然可以通过常规实验在不脱离本发明实质的情况下对此进行修改和改变。因此，本发明并非由上述描述来限定，而由如下权利要求书和等同物限定。

Claims (15)

1.化合物、药物上可接受的前体药物、药物活性代谢物，或药物上可接受的盐，选自下列化合物组成的组：
Figure A2003801096970002C1
Figure A2003801096970003C1
Figure A2003801096970005C1
2.由下列通式表示的化合物，或其药物上可接受的前体药物、药物活性代谢物，或药物上可接受的盐：
Figure A2003801096970005C2
3.使用治疗有效量的如权利要求1或2中所限定的化合物、药物上可接受的前体药物、药物活性代谢物，或药物上可接受的盐治疗哺乳动物与年龄相关的黄斑变性的方法。
4.使用治疗有效量的如权利要求1或2中所限定的化合物、药物上可接受的前体药物、药物活性代谢物，或药物上可接受的盐治疗哺乳动物脉络膜新血管形成的方法。
5.使用治疗有效量的如权利要求1或2中所限定的化合物、药物上可接受的前体药物、药物活性代谢物，或药物上可接受的盐治疗哺乳动物视网膜病的方法。
6.权利要求5所述的方法，其中所述的视网膜病包括糖尿病性视网膜病、玻璃体视网膜病变或早产儿视网膜病。
7.使用治疗有效量的如权利要求1或2中所限定的化合物、药物上可接受的前体药物、药物活性代谢物，或药物上可接受的盐治疗哺乳动物视网膜炎的方法。
8.权利要求7所述的方法，其中所述的视网膜炎包括巨细胞病毒视网膜炎。
9.使用治疗有效量的如权利要求1或2中所限定的化合物、药物上可接受的前体药物、药物活性代谢物，或药物上可接受的盐治疗哺乳动物黄斑水肿的方法。
10.使用治疗有效量的如权利要求1或2中所限定的化合物、药物上可接受的前体药物、药物活性代谢物，或药物上可接受的盐治疗哺乳动物眼病的方法。
11.药物组合物，包括：
(a)治疗有效量的权利要求1或2的化合物、药物上可接受的前体药物、药物活性代谢物，或药物上可接受的盐；和
(b)药物上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
12.使用治疗有效量的如权利要求1或2中所限定的化合物、药物上可接受的前体药物、药物活性代谢物，或药物上可接受的盐治疗由蛋白激酶活性介导的哺乳动物疾病的方法。
13.权利要求12的方法，其中所述的哺乳动物疾病与肿瘤生长、细胞增殖或血管发生相关。
14.调节蛋白激酶受体活性的方法，包括使所述的激酶受体与有效量的如权利要求1或2中所限定的化合物、药物上可接受的前体药物、药物活性代谢物或药物上可接受的盐接触。
15.权利要求14的方法，其中所述的蛋白激酶受体为VEGF受体。
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