ES2429573T3 - Derivado de 2-indolinona sustituido por un pirrol como inhibidor de proteína kinasa - Google Patents

Abstract

Una composición farmacéutica que comprende: 3-[2,4-Dimetil-5-(2-oxo-1 ,2-dihidroindol-3-ilidenemetil)-1 H -pirrol-3-il]-ácido propiónico o una sal del mismo; y al menos un portador farmacéuticamente aceptable. para su uso en un método para el tratamiento de un desorden relacionado conuna proteína kinasa en un organismo, en que dicho desorden relacionado con la proteínakinasa se selecciona entre el grupo que consiste en cáncer, diabetes, un desorden dehiperproliferación, angiogénesis, un desorden inflamatorio, un desorden inmunológico yun desorden cardiovascular, en que dicho método comprende administrar oralmente dicha composiciónfarmacéutica a dicho organismo.

Description

INTRODUCCIÓN

La presente invención se refiere en general a química orgánica, bioquímica, farmacología y medicina. Más en particular, se refiere a nuevos compuestos de

5 2.indolina sustituidos con pirrol, y sus sales y profármacos fisiológicamente aceptables, que modulan la actividad de proteínas kinasas ("PK") y de esta manera se espera que muestren un efecto beneficioso contra los desórdenes relacionados con la actividad anormal de PK.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

10 La información siguiente se ofrece únicamente como antecedentes, y no se considera como estado de la técnica anterior a la presente invención.

Las PK son enzimas que catalizan la fosforilación de grupos de hidróxido s en residuos de tirosina, y treonina de proteínas. Las consecuencias de esta actividad aparentemente sencilla son sorprendentes: crecimiento, diferenciación y proliferación de

15 células, es decir, prácticamente todos los aspectos de la vida celular dependen de una u otra manera de la actividad de los PK. Asimismo, la actividad anormal de PK se ha relacionado con un gran número de desórdenes, desde enfermedades relativamente no peligrosas para la vida como la soriasis, hasta enfermedades terriblemente virulentas como el glioblastoma (cáncer cerebral).

20 Los PK pueden ser convenientemente separados en dos clases, las proteínas tirosina kinasas (PTK) y las serina-treonina kinasas (STK).

Uno de los aspectos principales de la actividad de PTK es su implicación con receptores de factores de crecimiento. Los receptores de factores de crecimiento son proteínas de superficie celular. Cuando enlazan con un ligando de factor de crecimiento,

los receptores de factor de crecimiento se convierten a una forma activa que interactúa

con proteínas en la superficie interior de la membrana de una célula. Ello provoca la fosforilación de los residuos de tirosina del receptor y otras proteínas y a la formación en el interior de la célula de complejos con una variedad de moléculas de señalización citoplásmica que, a su vez, efectúan numerosas respuestas celulares como la división de células (proliferación), diferenciación de células, crecimiento de células, expresión de efectos metabólicas en el microentomo extracelular, etc. Para una explicación más complete, ver Schlessinger and Ullrich, Neuron, 9:303-391 (1992) que se incorpora como referencia, incluyendo cualquier dibujo, como si se indicara en su totalidad en este documento.

Los receptores de factores de crecimiento con actividad PTK se conocen como tirosina kinasas receptoras ("RTK"). Comprenden una gran familia de receptores de transmembranas con diferente actividad biológica. Actualmente, se han identificado al menos diecinueve (19) familias distintas de RTK. Un ejemplo sería la familia designada como R TK "HER", que incluye EGFR (receptor de factor de crecimiento epitélico), HER2, HER3 y HER4. Estos RTK constan de un dominio de enlace de ligando glicosilatado extracelular, un dominio de transmembrana y un dominio catalítico citoplásmico intracelular que puede fosforilzar residuos de tirosina en proteínas.

Otra subfamilia de RTK consiste en receptor de insulina (IR), receptor de factor de crecimiento 1 parecido a la insulina (lGF-1R) y receptor relativo al receptor de insulina (IRR). IR y IGF-1R interactúan con insulina, IGF-I y IGF-I1 para formar un heterotetrámero de dos subunidades glicosilatadas completamente extracelulares a y dos subunidades ~ que atraviesan la membrana celular y que contienen el dominio de kinasa tirosina.

Una tercera subfamilia de RTK se conoce como el grupo de receptor de factor de

crecimiento derivado de plaqueta ("PDGFR"), que incluye PDGFRa, PDGFR~, CSFIR, c-kit y c-fms. Estos receptores constan de dominios extracelulares glicosilatados compuestos de números variables de bucles parecidos a la inmunoglobina y un dominio

5 intracelular donde el dominio de kinasa-1 tirosina es interrumpido por secuencias de aminoácidos no relacionadas.

Otro grupo que, debido a su similaridad con la subfamilia PDGFR, a veces es subsumido en el grupo anterior es la subfamilia de receptores kinasa de hígado de feto ("flk"). Se cree que este grupo consta de kinasa-1 de hígado fetal de receptor de

10 dominio de inserto de kinasa (KDRlFLK-1), y terosina kinasa 1 similar a flk-1R, flk-4 y fms (flt-1).

Otro miembro de la familia de receptores de factor de crecimiento de tirosina kinasa es el subgrupo de receptores de factor de crecimiento de fibroblasto ("FGF"). Este grupo consta de cuatro receptores, FGFRl-4, y siete ligandos, FGFl-7. Aunque no

15 está muy bien definido, parece ser que los receptores constan de un dominio extracelular glicosilatado que contiene un número variable de bucles similares a la inmunoglobina, y un dominio intracelular en el cual la secuencia de tirosina kinasa es interrumpida por regiones de las secuencias de aminoácidos no relacionadas.

Otro miembro de la familia de receptores de factor de crecimiento de tirosina

20 kinasa es el sub grupo de factor de crecimiento endotélico vascular (VEGF"). VEGF es una glicoproteína dimérica similar a PDGF pero tiene unas funciones biológicas distintas y especificidad de células objetivo in vitro. En particular, actualmente se cree que VEGF juega un papel esencial en vasculogénesis y angiogénesis.

Una lista más completa de las subfamilias de RTK conocidas se describe en

Plowman et al., DN&P, 7(6):334-339 (1994), que se incorpora como referencia, incluyendo cualquier dibujo, como si se especificara en el presente documento.

Además de los RTK, también existe una familia de PTK completamente

5 intracelulares llamada "tirosina kinasas no receptoras" o "tirosina kinasas celulares". Esta última denominación, abreviada como "CTK," se utilizará en el presente documento. Las CTKs no contienen dominios extracelulares y de transmembrana. Actualmente se han identificado más de 24 CTK en 11 subfamilias (Src, Frk, Btk, Csk, Abl, Zap70, Fes, Fps, Fak, Jak y Ack). La subfamilia Src parece ser por ahora el mayor

10 grupo de CTK, e incluye Src, Ves, Fyn, Lyn, Lck, BIk, Hck, Fgr e Yrk. Para una explicación más detallada sobre CTK, ver Bolen, Oncogene, 8:2025-2031 (1993), que se incorpora como referencia, incluyendo cualquier dibujo, como si se especificara en el presente documento.

Las serina/treonina kinasas, STK, igual que las CTK, son predominantemente

15 intracelulares, aunque existen unas cuantas kinasas receptoras del tipo STK. Las STK son las kinasas citosólicas más comunes; es decir, las kinasas que realizan su función en aquella parte del citoplasma distinta de los orgánulos citoplásmicos y el citoesqueleto. El citosol es la región de la célula en la que se produce gran parte de la actividad intermedia biosintética y metabólica de la célula, por ejemplo, es en el cito sol donde las

20 proteínas se sintetizan en ribosomas.

Las RTK, las CTK y las STK han estado implicadas en un gran número de condiciones patógenas, incluyendo, de manera significativa, el cáncer. Otras condiciones patógenas que han sido asociadas con PTK incluyen, sin limitación, soriasis, cirrosis hepática, diabetes, angiogénesis, restenosis, enfermedades oculares,

artritis reumatoide y otros desórdenes inflamatorios, desórdenes inmunológicos como

las enfermedades auto inmunes, enfermedades cardiovasculares como la arteriosclerosis y una variedad de desórdenes renales.

Por lo que se refiere al cáncer, dos de las principales hipótesis avanzadas para

5 explicar la excesiva proliferación celular que provoca el desarrollo de tumores se refiere a funciones que se sabe que están reguladas por PK. Es decir, se ha sugerido que el crecimiento de las células malignas es el resultado de un fallo en los mecanismos que controlan la división y/o la diferenciación celular. Se ha demostrado que los productos de proteínas de una serie de protooncogenes están implicados en las vías de

10 transducción de señales que regulan el crecimiento y la diferenciación celular. Estos productos de proteína de protooncogenes incluyen los factores de crecimiento extracelulares, los receptores de PTK de factor de crecimiento transmembrana (RTK), los PTK citoplásmicos (CTKs) y los STK citosólicos, anteriormente indicados.

A la vista del vínculo aparente entre actividades celulares relacionadas con las

15 PK y una gran variedad de desórdenes humanos, no resulta sorprendente que se haga un gran esfuerzo en un intento de identificar maneras de modular la actividad de las PK. Alguno de ellos ha implicado planteamientos biomiméticos que utilizan grandes moléculas estructuradas en áquellas implicadas en los procesos celulares reales (por ejemplo, ligando s mutantes (Solicitud no. U.S. 4,966,849); receptores y anticuerpos

20 solubles (Sol. No. WO 94/10202, Kendall and Thomas, Proc, Nat'l Acad, Sci., 90:10705-09 (1994), Kim, et al., Nature, 362:841-844 (1993)); ligando s de ARN (Jelinek, et al., Biochemistry, 33: 10450-56); Takano, et al., Mol. Bio. Cell 4:358A (1993); Kinsella, et al., Exp. Cell Res. 199:56-62 (1992); Wright, et al., J. Cellular Phys., 152:448-57) e inhibidores de tirosina kinasa (WO 94/03427 ; WO 92/21660 ;

WO 91/15495 ; WO 94/14808 ; U.S. Pat. No. 5,330,992; Mariani, et al., Proc. Am.

Assoc. Cancer Res., 35:2268 (1994)).

Además de lo anteriormente mencionado, se han realizado intentos de identificación de moléculas pequefias, que actúan como inhibidores de PK. Por ejemplo, 5 se han descrito compuestos de aril monocíclicos, bicíclicos y heterocíclicos (PCT WO 92/20642), derivados de vinileno-azaindol (PCT WO 94/14808) y 1-ciclopropil-4piridilquinolones (Pat. No. US. 5,330,992) como inhibidores de tirosina kinasa. Compuestos de Estiril (Pat. No. U.S. 5,217,999), compuestos de piridil sustituidos con estiril (Pat. No. U.S. 5,302,606), derivados de quinazolina (Solicitud EP. No. O 566266

10 Al), selenaindolas y selenidas (PCT WO 94/03427), compuestos polihidroxilicos tricíclicos (PCT WO 92/21660) y compuestos de ácido benzilfosfónico (PCT WO 91/15495), así como compuestos de indolinona (PCT WO 96/40116 y PCT WO 98/50356) han sido descritos como inhibidores de PTK útiles para el tratamiento del cáncer.

15 RESUMEN DE LA INVENCIÓN

Nuestros propios esfuerzos para identificar pequefias moléculas orgánicas que modulan la actividad de PK y que, por lo tanto, se espera que resulten útiles en el tratamiento y prevención de desórdenes que impliquen una actividad de PK anormal, nos ha llevado al descubrimiento de una familia de nuevos compuestos de 2-indolinona

20 sustituidos con pirrol que muestran una capacidad de modulación de PK, y que, por lo tanto, se espera que tengan un efecto beneficioso contra los desórdenes relacionados con una actividad de PK anormal.

De esta manera, la presente invención se refiere en general a la utilización de una composición farmacéutica que comprende una 2-indolinona sustituida con un nuevo pirrol que modula la actividad de las tirosina kinasas de receptor (RTK), proteínas tirosina kinasas no receptoras (CTK) y proteínas kinasas de serina/treonina (STK), tal como se define en la reivindicación 1, en el tratamiento de desórdenes relacionados con elPK.

5 Una "composición farmacéutica" se refiere a una mezcla de uno o más de los compuestos descritos en el presente documento, o sales o profármacos de los mismos que sean aceptables, con otros componentes químicos, como portadores y excipientes fisiológicamente aceptables. La finalidad de una composición farmacéutica es facilitar la administración de un compuesto a un organismo.

10 Tal como se utiliza en el presente documento, un "portador fisiológicamente aceptable" se refiere a un portador o disolvente que no provoca una irritación significativa en un organismo, y no anula la actividad biológica y las propiedades del compuesto administrado.

Un "excipiente" se refiere a una sustancia inerte añadida a una composición

15 farmacéutica para facilitar todavía más la administración de un compuesto. Los ejemplos de excipientes incluyen, sin limitación, el carbonato de calcio, el fosfato de calcio, diferentes azúcares y tipos de almidón, derivados de celulosa, gelatina, aceites vegetales y glicoles de polietileno.

1. QUÍMICA 20 A. Características de Estructura General.

En un aspecto, la presente divulgación se refiere a una 2-indolinona sustituida con pirrol, es decir, 3-[2,4-Dimetil-5-(2-oxo-1,2-dihidromidol-3-ilidenometil)-1H

pirrol-3-il]-ácido propiónico. Las sales y profármacos fisiológicamente aceptables de los

compuestos reivindicados también entran dentro del ámbito de esta invención.

2. BIOQUÍMICA/F ARMACOTERAPIA

Otro aspecto de esta divulgación se refiere a un método para la modulación de 5 la actividad catalítica de una PK poniendo en contacto una PK con un compuesto de esta divulgación o una sal del mismo fisiológicamente aceptable.

Tal como se utiliza en el presente documento, "PK" se refiere a una proteína tirosina kinasa de receptor (RTK), tirosina kinasa no de receptor o "celular" (CTK), y kinasas de serina-treonina (STK).

10 El término "metodo" se refiere a maneras, medios, técnicas y procedimientos para conseguir una tarea determinada incluyendo, sin limitación, aquellas maneras, medios, técnicas y procedimientos conocidos, o desarrollados con facilidad a partir de maneras, medios, técnicas y procedimientos por parte de practicantes de las técnicas químicas, farmacéuticas, biológicas, bioquímicas y médicas.

15 Tal como se utiliza en el presente documento, el término "modulación" o "modular" se refiere a la alteración de la actividad catalítica de RTK, CTK y STK. En particular, la modulación se refiere a la actividad catalítica de RTK, CTK y STK, preferiblemente la activación o inhibición de la actividad catalítica de RTK, CTK y STK, dependiendo de la concentración del compuesto o la sal a la que se expone la

20 RTK, CTK o STK o, más preferiblemente, la inhibición de la actividad catalítica de RTK, CTK y STK.

El término "actividad catalítica", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere al índice de fosforilación de tirosina bajo la influencia, ya sea

directa o indirecta, de RTK y/o CTK o la fosforilación de serina y treonina bajo la

influencia, directa o indirecta, de STK.

El término "contactar", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a juntar un compuesto tal como se divulga en el presente documento y una PK, 5 de manera que el compuesto pueda afectar a la actividad catalítica de la PK, ya sea directamente, es decir, interactuando con la propia kinasa, o indirectamente, es decir, interactuando con otra molécula de la cual depende la actividad catalítica de la kinasa. Dicho "contacto" puede realizarse "in vitro", es decir, en un tubo de ensayo, en una placa de petri o similares. En un tubo de ensayo, el contacto puede implicar solamente 10 un compuesto y una PK de interés, o puede implicar células completas. Las células también pueden mantenerse o crecer en placas de cultivo de células y ser contactadas con un compuesto en dicho entorno. En este contexto, la capacidad de un compuesto particular para afectar un desorden relativo a PK, es decir, el ICso del compuesto, definido más abajo, puede determinarse antes de intentar utilizar los compuestos in vitro

15 con otros organismos vivos más complejos. Para las células de fuera del organismo existe un gran número de métodos, que son bien conocidos por los expertos en la técnica, para poner en contacto las PK con los compuestos que incluyen, sin limitación, microinyección directa a la célula y numerosas técnicas de portador transmembrana.

Otro aspecto de esta divulgación es que la modulación de la actividad 20 catalítica de las PK utilizando un compuesto de esta invención puede realizarse in vitro

o in vitro.

"In vitro" se refiere a procedimientos realizados en un entorno individual como, por ejemplo, sin limitación, en un tubo de ensayo o un medio de cultivo.

Tal como se utiliza en el presente documento, "in vitro" se refiere a procedimientos

realizados con un organismo vivo, como por ejemplo, sin limitación, un ratón, una rata

o un coneJo.

Otro aspecto de esta divulgación es que la proteína kinasa cuya actividad

5 catalítica está siendo modulada por un compuesto, tal como se divulga en este documento, se selecciona dentro del grupo que consiste en las tirosina kinasa de proteína de receptor, las tirosina kinasas celulares y las kinasas serina-treonina.

Uno de los aspectos de esta divulgación es que la kinasa de proteína de receptor cuya actividad catalítica está modulada por un compuesto de esta invención se

10 selecciona entre el grupo compuesto por EGF, HER2, HER3, HER4, IR, IGF-1R, IRR, PDGFRa, PDGFR~, CSFIR, C-Kit, C-fms, Flk-1R, Flk4, KDRlFlk-1, Flt-1, FGFR-1R, FGFR-2R, FGFR-3R Y FGFR-4R.

Además, uno de los aspectos de esta divulgación es que la tirosina kinasa celular cuya actividad catalítica es modulada por un compuesto de la presente invención 15 se selecciona entre el grupo compuesto por Src, Frk, Btk, Csk, Abl, ZAP70, Fes/Fps,

Fak, Jak, Ack, Yes, Fyn, Lyn, Lck, Blk, Hck, Fgr e Yrk.

Otro aspecto de esta divulgación es que la proteína kinasa de serina-treonina cuya actividad catalítica es modulada por un compuesto de esta invención se selecciona a partir de un grupo que consiste en CDK2 y Raf.

20 Una composición farmacéutica de un compuesto de esta divulgación con un portador farmacéuticamente aceptable es otro de los aspectos de esta invención. Dicha composición farmacéutica puede contener también excipientes.

Un método para tratar o prevenir un desoden relacionado con la proteína

kinasa en un organismo que comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto, sal que es una 3-pirrolidenil-2-indolinona de la presente divulgación para el organismo, es otro aspecto que se describe en el presente

5 documento.

Tal como se utiliza en el presente documento "desorden relativo a las PK", desorden provocado por las PK" y "actividad anormal de las PK" se refieren a condiciones caracterizadas por una insuficiente, o más a menudo excesiva, actividad catalítica de las PK, en que la PK particular puede ser una RTK, una CTK o una STK.

10 La actividad catalítica inapropiada puede surgir como resultado de: (1) una expresión de PK aumentada que normalmente no expresa PK; (2) una expresión de PK aumentada que provoca una proliferación, diferenciación o crecimiento de células no deseados, o

(3) una expresión de PK reducida que provoca una reducción no deseada en la proliferación, diferenciación o crecimiento de células no deseados. La sobreactividad de 15 una PK se refiere a una amplificación del gen que codifica una PK determinada o la producción de un nivel de actividad de la PK que puede corresponderse con una proliferación, diferenciación o desorden de crecimiento de células no deseados (es decir, a medida que aumenta el nivel de la PK, aumenta la gravedad de uno o más de los síntomas del desorden celular). Naturalmente, la infraactividad es lo inverso, en que la

20 gravedad de uno o más síntomas de un desorden celular aumenta a medida que disminuye la actividad de la PK.

Tal como se utilizan en el presente documento, los términos "prevención" y "prevenir" se refieren a un método para impedir que un organismo adquiera un desorden relacionado con PK en primer lugar.

Tal como se utilizan en el presente documento, los términos "tratar" y "tratamiento" se refieren a un método para aliviar o abrogar un desorden celular donde intervienen PK y/o sus síntomas manifiestos. En particular, en relación con el cáncer, estos términos significan sencillamente que la expectativa de vida de una persona

5 afectada de cáncer puede aumentar o que uno o más de los síntomas de la enfermedad se reducirán.

El término "organismo" se refiere a cualquier entidad viva que comprenda por lo menos una célula. Un organismo vivo puede ser tan simple como, por ejemplo, una célula eucariótica sencilla, o tan complejo como un mamífero, incluyendo un ser

10 humano.

El término "cantidad terapéuticamente efectiva" tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a la cantidad del compuesto que se administra que aliviará en alguna medida los síntomas del desorden que se está tratando. En referencia al tratamiento del cáncer, una cantidad terapéuticamente efectiva se refiere a la cantidad

15 que tiene el efecto de (1) reducir el tamaño del tumor, (2) inhibir (es decir, frenar en alguna medida, y si es posible, detener) el crecimiento de tumores y/o (3) inhibir (es decir, frenar en alguna medida, y si es posible, detener) la metástasis de tumores y/o (4) aliviar en alguna medida (o preferiblemente, eliminar) uno o más síntomas asociados con el cáncer.

20 Uno de los aspectos de esta divulgación es que los desórdenes relacionados con la proteína kinasa anteriormente referidos se selecciona a partir de un grupo que consta de un desorden de proteínas tirosina kinasas receptoras, un desorden de tirosina kinasas celulares y un desorden relacionado con la serina-treonina kinasa.

En otro aspecto de esta divulgación, el anteriormente mencionado desorden relacionado con la proteína kinasa se selecciona a partir del grupo que consta de un desorden relacionado con EGFR, un desorden relacionado con PDGFR, un desorden relacionado con IGFR y un desorden relacionado con flk.

5 El anteriormente mencionado desorden relacionado con la proteína kinasa es un cáncer seleccionado a partir del grupo que consta del carcinoma de células escamosas, sarcomas com el sarcoma de Kaposi, astrocitoma, glioblastoma, cáncer de pulmón, cáncer de vesícula, cáncer colorrectal, cáncer gastrointestinal, cáncer de cabeza y cuello, melanoma, cáncer de ovarios, cáncer de próstata, cáncer de mama, cáncer de

10 pulmón de pequeñas células y glioma en otro aspecto de esta divulgación.

El desorden de· proteína kinasa anteriormente mencionado se selecciona dentro del grupo que consta de diabetes, un desorden de hiperproliferación, la enfermedad de von Hippel-Lindau, restenosis, fibrosis, soriasis, osteoartritis, artritis reumatoide, un desorden inflamatorio y angiogénesis en otro aspecto de la presente

15 divulgación.

Otros desórdenes que pueden ser tratados o prevenidos utilizando los compuestos de esta invención son desórdenes inmunológicos como enfermedades autoninmunes (SIDA) y desórdenes cardiovasculares como la arteriosclerosis.

Uno de los aspectos de esta divulgación es que un compuesto químico que

20 modula la actividad catalítica de una proteína kinasa puede ser identificado poniendo en contacto células que expresan dicha proteína kinasa con un compuesto o sal que es un 3pirrolidenil-2-indolinona de la presente divulgación y que monitoriza las células mencionadas para conseguir un efecto.

El término "monitorizar" significa observar o detectar el efecto de poner en

contacto un compuesto con una célula que expresa una PK determinada. El efecto observado o detectado puede ser un cambio en el fenotipo de la célula, en la actividad catalítica de una PK o un cambio en la interacción de una PK con un ligando natural.

5 Las técnicas para observar o detectar dichos efectos son bien conocidas en el estado de la técnica.

El efecto anteriormente referido se selecciona a partir de un cambio o una ausencia de cambio en un fenotipo de célula, un cambio o una ausencia de cambio en la actividad catalítica de dicha proteína kinasa, o un cambio o una ausencia de cambio en

10 la interacción de dicha proteína kinasa con un ligando natural en un aspecto final de esta divulgación.

"Fenotipo de célula" se refiere a la apariencia externa de una célula o tejido o la función biológica de la célula o tejido. Algunos ejemplos, sin limitación, de fenotipo de célula son el tamaño de la célula, el crecimiento de la célula, la proliferación de la

15 célula, la diferenciación de la célula, la supervivencia de la célula, la apoptosis y la captación y el uso de nutrientes. Dichas características fenotípicas pueden ser medidas a través de técnicas bien conocidas en el sector.

Un "ligando natural" se refiere a un polipéptido que enlaza con una PK determinada en una célula. Los ligandos naturales pueden jugar un papel a la hora de

20 propagar una señal en un proceso de transducción de señal mediante PK. Un cambio en la interacción del ligando natural con la PK puede manifestarse como una concentración aumentada o reducida del complejo PKlligando natural y, como resultado, en un cambio observable en la capacidad de la PK para mediar en la transducción de señal.

Otro aspecto de esta divulgación es que un compuesto aquí descrito, o su sal,

pueden combinarse con otros agentes quimioterapéuticos para el tratamiento de las enfermedades y desórdenes anteriormente mencionados. Por ejemplo, un compuesto, o sal, de esta divulgación puede combinarse con agentes alquilatantes como el fluorouracil (5-FU) solo o en combinación con leucovorina; u otros agentes alquilatantes como por ejemplo, sin limitación, otros análogos de pirimidina como UFT, capecitabina, gemcitabina y citarabina, los alquil sulfonatos, por ejemplo, busulfan (utilizado en el tratamiento de la leucemia granulocítica crónica), improsulfan y piposulfan; aziridinas, por ejemplo, benzodepa, carbocuona, meturedepa y uredepa; etileneiminas y metilmelaminas, por ejemplo, altretamina, trietilonemelamina, trietilenofosforamida, trietilenotiofosforamida y trimetilolmelamina; y las mostazas nitrogenadas, por ejemplo clorambucil (utilizado en el tratamiento de la leucemia linfocítica crónica, la macroglobulinemia primaria y los linfomas no de Hodgkin), ciclofosfamida (utilizada en el tratamiento de la enfermedad de Hodgkin, el mieloma múltiple, neuroblastoma, cáncer de mama, cáncer de ovarios, cáncer de pulmón, tumor de Wilm y rabdomiosarcoma), estramustina, ifosfamida, novembriquina, prednimustina y mostaza uracil (utilizada en el tratamiento de la trombocitosis primaria, linfomas no de Hodgkin, enfermedad de Hodgkin y cáncer de ovarios); y triazinas, por ejemplo, dacarbazina (utilizada en el tratamiento de sarcoma en tejidos blandos).

De manera similar, un compuesto, o sal de esta divulgación puede esperarse que tenga un efecto beneficioso en combinación con otros agentes antimetabolíticos quimioterapéuticos, como por ejemplo, sin limitación, análogos de ácido fólico, por ejemplo metotrexato (utilizado en el tratamiento de leucemia lincocítica aguda, coriocarcinoma, cáncer de mama de fungiodas micosis, cáncer de cabeza y cuello y sarcoma osteogénico) y pteropterina; y los análogos de purina como la mercaptopurina

y tioguanina que encuentran su uso en el tratamiento de leucemias granulocíticas

agudas, linfocíticas agudas y granulocíticas crónicas.

Un compuesto o sal de esta divulgación también puede esperarse que se muestre eficaz en combinación con agentes quimioterapéuticos antimetabolíticos 5 basados en productos naturales, como por ejemplo, sin limitación, alcaloides vinca, por ejemplo vinblastina (utilizada en el tratamiento de cáncer de mama y de testículo), vincristina y vindesina; las epipodofilotoxinas, por ejemplo, etoposida y teniposida, ambas útiles en el tratamiento de cáncer de testículo y de sarcoma de Kaposi, los agentes quimioterapéuticos antibióticos, por ejemplo daunorubicina, doxorubicina,

10 epirubicina, mitomicina (utilizada para cáncer de estómago, cuello de útero, cólon, mama, vesícula y páncreas), dactinomicina, temozolomida, plicamicina, bleomicina (utilizada en el tratamiento de cáncer de piel, esófago y tracto genitourinario); y los agentes quimioterapéuticos enzimáticos como L-asparaginasa.

Además de lo anteriormente mencionado, puede esperarse que un compuesto

15 o sal de esta divulgación tenga un efecto beneficioso utilizado en combinación con los complejos de coordinación de platino (cisplatino, etc.); ureas sustituidas como hidro xi urea; derivados de metilhidrazina, por ejemplo, procarbazina; supresores adrenocorticales, por ejemplo, mitotana, aminoglutetimida; y hormonas y antagonistas de hormonas como los adrenocorticosteriodes (por ejemplo, prednisona), progestinas

20 (por ejemplo, hidroxiprogesterona caproato); estrógeno s (por ejemplo, dietilstilbesterol); antie stró geno s como tamoxifeno; andrógenos, por ejemplo, testosterona propionato; e inhibidores de aromatasa (como el anastrozol).

Finalmente, la combinación de un compuesto de esta divulgación puede esperarse que resulte particularmente eficaz en combinación con mitoxantrona o pac1itaxel para el tratamiento de cánceres de tumor sólido o leucemias como por ejemplo, sin limitación, la leucemia aguda mielogenosa (no linfocítica).

El compuesto de esta invención que puede esperarse que tenga un efecto beneficioso en combinación con uno o más de los agentes quimioterapéuticos 5 anteriormente mencionados es 3-[2,4-Dimetil-5-(2-oxo-1,2-dihidroindol-3

ilidenemetil)-l H-pirrol-3-il]ácido propiónico.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

1. BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS TABLAS

La TABLA 1 muestra las estructuras químicas y la actividad biológica del

10 compuesto de esta invención. Los bioensayos utilizados se describen en detalle más adelante. Los resultados están indicados en términos de leso, la concentración micromolar (¡..Lm) del compuesto que se está probando que provoca un cambio del 50% en la actividad de la PKT objetivo en comparación con la actividad de la PKT en un control al cual no se ha añadido ningún compuesto de prueba. Específicamente, los

15 resultados que se muestran indican la concentración de un compuesto de prueba necesario para provocar una reducción del 50% en la actividad de la PTK objetivo. Los compuestos presentados en la Tabla 1 son únicamente a modo de ejemplo, y no debe considerarse que limiten el ámbito de esta invención de ninguna forma.

2. INDICACIONES/ENFERMEDADES OBJETIVO

La PK cuya actividad catalítica está modulada por los compuestos de esta divulgación incluyen proteínas tirosina kinasas de las cuales existen dos tipos, tirosina kinasas de receptor (RTK) y tirosina kinasas celulares (CTK), y serina-treonina kinasas (STK). La transducción de señal por medio de RTK es iniciada mediante interacción extracelular con un factor de crecimiento específico (ligando) seguido de una dimerización de receptor, estimulación transitoria de la actividad intrínseca de proteína tirosina kinasa y fosforilación. De esta manera se crean los puntos de enlace para las moléculas de transducción de señal intracelulares y se lleva a la formación de complejos con un espectro de moléculas de señalación citoplásmica que facilitan la respuesta celular apropiada (por ejemplo, divisón celular, efectos metabólicos en el microentomo extracelular, etc.). Ver, Schlessinger and Ullrich, 1992, Neuron 9:303-391.

Se ha demostrado que los puntos de fosforilación de tirosina en receptores de factor de crecimiento funcionan como puntos de enlace de alta afinidad para dominios SH2 (homología de src) de moléculas de señalización. Fantl et al., 1992, Cell 69:413423, Songyang et al., 1994, Mol. Cell. Biol. 14:2777-2785), Songyang et al., 1993, Cell 72:767-778, y Koch et al., 1991, Science 252:668-678. Se han identificado varias proteínas de sustrato intracelular que se asocian con R TK. Pueden dividirse en dos grupos principales: (1) sustratos que tienen un dominio catalítico, y (2) sustratos que carecen de dicho dominio pero que sirven como adaptadores y se asocian con moléculas catalíticamente activas. Songyang et al., 1993, Cell 72:767-778. La especificidad de las interacciones entre receptores y dominios SH2 de sus sustratos viene determinada por los residuos de amioácidos que rodean inmediatamente el residuo de tirosina fosforilada. Las diferencias en las afinidades de enlace entre dominios SH2 y las secuencias de aminoácidos que rodean los residuos de fosfotirosina en receptores particulares es consistente con las diferencias observadas en sus perfiles de forforilación de sustrato. Songyang et al., 1993, Cell 72:767-778. Estas observaciones sugieren que la función de cada R TK está determinada no solamente por su estructura de expresión y

5 disponibilidad de ligando, sino también por la selección de vías de transducción de señal aguas abajo que son activadas por un receptor particular. De esta manera, la fosforilación proporciona una fase reguladora importante que determina la selectividad de señalar vías, recopilada por los receptores de factor de crecimiento específicos, así como los receptores de factor de diferenciación.

10 Las STK, que son primariamente citosólicas, afectan a la bioquímica interna de la célula, a menudo como una respuesta más adelante en la línea a un caso de PTK. Las STK han estado implicadas en el proceso de señalización que inicia la síntesis de ADN y la mitosis subsiguiente que lleva a la proliferación de células.

De esta manera, la transducción de señal de PK tiene como resultado, entre

15 otras respuestas, la proliferación diferenciación, crecimiento y metabolismo de células. La proliferación anormal de células puede tener como resultado una gran variedad de desórdenes y enfermedades, incluyendo el desarrollo de neoplasias como el carcinoma, sarcoma, glioblastoma y hemangioma, desórdenes como la leucemia, soriasis, arteriosclerosis, artritis y retinopatía diabética y otros desórdenes relacionados con

20 angiogénesis o vasculogénesis descontroladas.

No es necesaria una comprensión precisa del mecanismo por el cual los compuestos de esta divulgción inhiben las PK para practicar la presente invención. Sin embargo, aunque no existe ningún vínculo con ningún mecanismo o teoría específicos, se cree que los compuestos interactúan con los aminoácidos en la región catalítica de las

PK. Habitualmente, las PK poseen una estructura de bi-lobato en que ATP parece

enlazar en la hendidura entre dos lóbulos en una región en la cual los aminoácidos se conservan entre PK. Se cree que los inhibidores de PK enlazan mediante interacciones no covalentes como la cadena de hidrógeno, las fuerzas de van der Waals e interacciones iónicas en la misma región general en que la ATP anteriormente mencionada enlaza con las PK. Más específicamente, se cree que el componente de 2indolinona de los compuestos de esta invención se enlaza en el espacio general normalmente ocupado por el anillo de adenina de A TP. La especificidad de una molécula determinada para un PK determinado puede surgir como resultado de interacciones adicionales entre los diferentes sustitutivos en el núcleo de 2-indolinona y los dominios de aminoácidos específicos para PK determinados. De esta manera, diferentes sustitutivos de la indolinona pueden contribuir a un enlace preferencial con PK determinados. La capacidad de seleccionar compuestos activos en distintos puntos de enlace de ATP (u otros nucleótidos) convierte a los compuestos de esta invención en útiles para buscar cualquier proteína en dicho lugar. Así, los compuestos divulgados en el presente documento pueden tener una utilidad como pruebas in vitro para dichas proteínas, así como mostrar efectos terapéuticos in vivo a través de la interacción con dichas proteínas.

En otro aspecto, la proteína kinasa, cuya actividad catalítica está modulada por el contacto con un compuesto de esta invención, es una proteína tirosina kinasa, más en particular, una proteína tirosina kinasa receptora. Entre las proteínas tirosina kinasas cuya actividad catalítica puede ser modulada con un compuesto de esta invención, o una sal del mismo, se encuentran, sin limitación, EGF, HER2, HER3, HER4, IR, IGF-IR, IRR, PDGFRa, PDGFR~, CSFIR, C-Kit, C-fms, Flk-lR, Flk4, KDRlFlk-l, Flt-l, FGFR-IR, FGFR-2R, FGFR-3R y FGFR-4R.

La proteína tirosina kinasa cuya actividad catalítica está modulada por un

contacto con un compuesto tal como se divulga en el presente documento, o una sal del mismo, puede ser también una proteína tirosina kinasa no-receptora o celular (CTK). De esta manera, la actividad catalítica de las CTK como por ejemplo, sin limitación, Src,

5 Frk, Btk, Csk, Abl, ZAP70, Fes, Fps, Fak, Jak, Ack, Yes, Fyn, Lyn, Lck, Blk, Hck, Fgr e Yrk, puede ser modulada por contacto con un compuesto o sal de esta invención.

Otro grupo de PK que puede tener su actividad catalítica modulada por contacto con un compuesto de esta divulgación son las proteínas kinasas serinatreonina, como por ejemplo, sin limitación, CDK2 y Raf.

10 En otro aspecto, esta divulgación se refiere a un método para tratar o prevenir un desorden relacionado con PK administrando una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de esta divulgación, o una sal de la misma, a un organismo.

Otro aspecto de esta divulgación es que una composición farmacéutica que contenga un compuesto de esta divulgación o una sal de la misma se administre a un 15 organismo con el fin de prevenir o tratar un desorden relacionado con PK.

Por lo tanto, esta solicitud está dirigida a compuestos que modulan la transducción de señal de PK afectando la actividad enzimática de las RTK, CTK y/o STK, interfiriendo de esta forma con las señales transducidas por dichas proteínas. Más en particular, la presente solicitud está dirigida a compuestos que modulan las vías de

20 transducción de señal por medio de RTK, CTK y/o STK como planteamiento terapéutico para curar muchos tipos de tumores sólidos, incluyendo, sin limitación, carcinomas, sarcomas incluyendo el sarcoma de Kaposi, eritroblastoma, glioblastoma, meningioma, astrocitoma, melanoma y mioblastoma. El tratamiento o la prevención de cánceres de tumores no sólidos como la leucemia también están contemplados por esta

divulgación. Las indicaciones pueden incluir, SIn limitación, cánceres cerebrales,

cánceres de vesícula, cánceres de ovarios, cánceres gástricos, cánceres de páncreas, cánceres de colon, cánceres sanguíneos, cánceres de pulmón y cánceres óseos.

Otros ejemplos, sin limitación, de los tipos de desórdenes relacionados con la

5 actividad inapropiada de las PK para los que los compuestos aquí descritos pueden resultar útiles en su prevención, tratamiento y estudio, son los desórdenes proliferativos de células, los desórdenes fibróticos y los desórdenes metabólicos.

Los desórdenes de proliferación de células, que pueden ser prevenidos, tratados o estudiados en mayor profundidad por la presente divulgación incluyen el 10 cáncer, desórdenes proliferativos de los vasos sanguíneos y desórdenes proliferativos de

células mesangiales.

Los desórdenes proliferativos de los vasos sanguíneos se refieren a desórdenes relacionados con una vasculogénesis (formación de vasos sanguíneos) y angiogénesis (dispersión de vasos sanguíneos) anormales. Mientras que la

15 vasculogénesis y la angiogénesis juegan un papel importante en una variedad de procesos fisiológicos normales, como el desarrollo embrionario, la formación del corpus luteum, la curación de heridas y la regeneración de órganos también juegan un papel determinante en el desarrollo del cáncer, ya que tienen como resultado la formación de nuevos capilares necesarios para mantener vivo un tumor. Otros ejemplos de desórdenes

20 de proliferación de vasos sanguíneos incluyen la artritis, en que nuevos vasos sanguíneos capilares invaden la articulación y destruyen el cartílago, y enfermedades oculares, como la retinopatía diabética, en que nuevos capilares en la retina invaden el vítreo, provocan sangrados y provocan ceguera.

Se han identificado dos RTK estructuralmente relacionados por enlazar

VEGF con alta afinidad: el receptor de tirosina 1 similar a fms (fit-1) (Shibuya et al., 1990, Oncogene, 5:519-524; De Vries et al., 1992, Science, 255:989-991) y el receptor KDRlFLK-1, también conocido como VEGF-R2. Se ha informado que el factor de crecimiento endotélico vascular (VEGF) es un mitógeno específico de célula endotélica con una actividad de activación de crecimiento celular endotélico in vitro. Ferrara & Henzel, 1989, Biochein. Biophys. Res. Comm., 161:851-858; Vaisman et al., 1990, J. Biol. Chem., 265:19461-19566. La información indicada en la solicitud U.S. con números de serie. 08/193,829, 08/038,596 Y 07/975,750, sugieren de forma consistente que el VEGF no sólo es responsable de la proliferación de células endoteliales, sinó también el regulador de cebadores de la angiogénesis normal y patológica. Ver en general, Klagsburn & Soker, 1993, Current Biology, 3(10)699-702; Houck, et al., 1992,

J. Biol. Chem., 267:26031-26037.

Las vasculogénesis y angiogénesis normales juegan un papel importante en una variedad de procesos fisiológicos como el desarrollo embrionario, la curación de heridas, la regeneración de órganos y los procesos reproductivos femeninos como el desarrollo de folículos en el corpus luteum durante la ovulación y el crecimiento placental después del embarazo Folkman & Shing, 1992, J. Biological Chem., 267(16): 10931-34 . La vasculogénesis y/o la angiogénesis no controladas han sido asociadas con enfermedades como la diabetes, así como tumores malignos sólidos que confían en la vascularización para su crecimiento. Klagsbum & Soker, 1993, Current Biology, 3(10):699-702 ; Folkham, 1991, J. Natl. Cancer Inst., 82:4-6 ; Weidner, et al., 1991, New Engl. J. Med., 324:1-5 .

El supuesto papel de VEGF en la proliferación y migración de células endoteliales durante la angiogénesis y la vasculogénesis indica un papel importante para el receptor KDRlFLK-1 en dichos procesos. Enfermedades como la diabetes mellitus (Folkman, 198, in XIth Congress of Thrombosis and Haemostasis (Verstraeta, et al., eds.), pp. 583-596, Leuven University Press, Leuven) y la artritis, así como el crecimiento de tumores malignos, pueden ser el resultado de una angiogénesis no controlada. Ver por ejemplo, Folkman, 1971, N. Engl. J. Med., 285:1182-1186. Los receptores a los cuales VEGF se enlaza específicamente son un objetivo terapéutico poderoso e importante para la regulación y modulación de la vasculogénesis y/o la angiogénesis y una variedad de enfermedades graves que implican un crecimiento celular anormal provocado por dichos procesos. Plowman, et al., 1994, DN&P, 7(6):334-339. Más específicamente, la función altamente específica del receptor KDRlFLK-1 en la neovascularización lo convierte en una opción objetivo para los planteamientos terapéuticos para el tratamiento del cáncer y otras enfermedades que implican la formación no controlada de vasos sanguíneos.

De esta manera, un aspecto de la presente divulgación se refiere a compuestos capaces de regular y/o modular la transducción de señal de tirosina kinasa, incluyendo transducción de señal del receptor KDRlFLK-1 con el fin de inhibir o fomentar la angiogénesis y/o la vasculogénesis, es decir, compuestos que inhiben, previenen o interfieren con la señal transducida KDRlFLK-1 cuando es activada por ligando s como VEGF. Aunque se cree que los compuestos de la presente divulgación actúan sobre un receptor u otro componente a lo largo de la vía de transducción de la señal de tirosina kinasina, pueden también actuar directamente sobre las células del tumor que resultan de la angiogénesis no controlada.

Aunque la nomenclatura de los homólogos humanos y murinos del receptor "flk-I" genérico difieren, son, en muchos aspectos, intercambiables. El receptor, Flk-1, y su homólogo humano, KDR, comparten una homología de secuencia del 93.4% en el

dominio intracelular. De forma parecida, el FLK-I murino enlaza el VEGF humano con

la misma afinidad que el VEGF de ratón y, por consiguiente, es activado por el ligando derivado de cualquiera de dichas especies. Millauer et al., 1993, Cell, 72:835-846; Quinn et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:7533-7537. FLK-1 también se asocia, y posteriormente la tirosina-fosforiliza los substratos de RTK (por ejemplo, PLC-y o p85) cuando se co-expresa en 293 células (fibroblastos de riñón embrionario humano).

Por lo tanto, los modelos que confian en el receptor FLK-1 son directamente de aplicación para comprender el receptor KDR. Por ejemplo, la utilización del receptor FLK-1 murino en métodos que identifican compuestos que regulan la vía de transducción de señal murina son directamente aplicables a la identificación de compuestos que pueden ser utilizados para regular la vía de transducción de señal humana, es decir, que regulan la actividad relativa al receptor KDR. Así, los compuestos químicos identificados como inhibidores de KDRlFLK-1 in vitro, pueden ser confirmados en modelos in vitro adecuados. Tanto ratones in vitro como ratas han demostrado ser de gran valor para el examen del potencial químico de agentes que actúan en la vía de transducción de señal inducida por KDRlFLK-l.

Así, en un aspecto, esta divulgación se dirige a compuestos que regulan, modulan y/o inhiben vasculogénesis y/o angiogénesis afectando a la actividad enzimática del receptor KDRlFLK-1 e interfiriendo con la señal transducida por KDRlFLK-1. En otro aspecto, la presente invención se dirige a compuestos que regulan, modulan y/o inhiben la vía de transducción de señal mediante KDRlFLK-1 como planteamiento terapéutico para el tratamiento de muchos tipos de tumores sólidos, incluyendo, sin limitación, glioblastoma, melanoma y sarcoma de Kaposi, y carcinoma de ovarios, pulmón, mama, próstata, colon y epidermis. Además, los datos sugieren que la administración de compuestos que inhiben la vía de transducción de señal mediante KDRlFlk-1 puede utilizarse también en el tratamiento de hemangioma, restenosis y retinopatía diabética.

Otro aspecto de esta divulgación se refiere a la inhibición de vasculogénesis y 5 angiogénesis por otras vías mediante receptor, incluyendo la vía que comprende el receptor flt-l.

La transducción de señal mediante tirosina kinasa de receptor es iniciada mediante una interacción extracelular con un factor de crecimiento específico (ligando), seguido de la dimerización de receptor, estimulación transitoria de la actividad

10 intrínseca de la proteína tirosina kinasa y autofosforilación. Los puntos de enlace se crean de esta manera para las moléculas de transducción de señal intracelular, lo que provoca la formación de complejos con un espectro de moléculas de señalización citoplásmica que facilitan la respuesta celular apropiada, por ejemplo, la división de células y los efectos metabólicos para el microentomo extracelular. Ver Schlessinger

15 and Ullrich, 1992, Neuron, 9:1-20.

La estrecha homología de las regiones intracelulares de KDRlFLK-1 con las del receptor PDGF-p (50.3% homología) y/o el receptor flt-1 relativo, indica la inducción de solapar las vías de transducción de señal. Por ejemplo, para el receptor PDGF-p, los miembros de la familia de src (Twamley et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci.

20 USA, 90:7696-7700), fosfatidilinositol-3'-kinasa (Hu et al., 1992, Mol. Cell. Biol., 12:981-990), fosfolipasa cy (Kashishian & Cooper, 1993, Mol. Cell. Biol., 4:49-51), proteína activadora de ras-GTPasa, (Kashishian et al., 1992, EMBO J., 11:1373-1382), PTP-ID/syp (Kazlauskas et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 10 90:6939-6943), Grb2 (Arvidsson et al., 1994, Mol. Cell. Biol., 14:6715-6726), y las moléculas

adaptadoras Shc y Nck (Nishimura et al., 1993, Mol. Cell. Biol., 13 :6889-6896), han mostrado que enlazan con regiones que implican diferentes puntos de autofosforilación. Ver en general Claesson-Welsh, 1994, Prog. Growth Factor Res., 5:37-54. De esta manera, es probable que las vías de transducción de señal activadas por KDR/FLK-1 5 incluyan la vía ras (Rozakis et al., 1992, Nature, 360:689-692), y las vías mediante kinasa PI-3', mediante src y mediante plcy. Cada una de estas vías puede jugar un papel decisivo en el efecto angiogénico y/o vasculogénico de KDRlFLK-1 en células endoteliales. En consecuencia, otro aspecto de esta divulgación se refiere al uso de los compuestos orgánicos aquí descritos para modular la angiogénesis y la vasculogénesis,

10 ya que dichos procesos son controlados por dichas vías.

Por el contrario, los desórdenes relacionados con el encogimiento, contracción o cierre de vasos sanguíneos, como la restenosis, también están implicados y pueden ser tratados o impedidos mediante los métodos aquí descritos.

Los desórdenes fibróticos se refieren a la formación anormal de matrices

15 extracelulares. Los ejemplos de desórdenes fibróticos incluyen la cirrosis hepática y los desórdenes proliferativos de células mesangiales. La cirrosis hepática se caracteriza por el incremento de constituyentes de matriz extracelular que provoca la formación de una cicatriz hepática. Una matriz extracelular incrementada que provoca una cicatriz hepática también puede estar causada por una infección vírica como la hepatitis. Parece

20 ser que los lipocitos juegan un papel determinante en la cirrosis hepática. Otros desórdenes fibróticos implicados incluyen la arteriosclerosis.

Los desórdenes por proliferación de células mesangiales se refieren a desórdenes provocados por una proliferación anormal de células mesangiales. Los desórdenes proliferativos mesangiales incluyen varias enfermedades renales humanas,

como la glomerulonefritis, la nefropatía diabética y la nefrosclerosis maligna, así como desórdenes como síndromes de microangiopatía trombótica, rechazo de transplantes y glomerulopatías. La RTK PDGFR ha estado implicada en el mantenimiento de la proliferación de células mesangiales. Floege et al., 1993, Kidney Intemational 43:47S54S.

Muchos cánceres son desórdenes proliferativos celulares, y, tal como se ha mencionado anteriormente, las PK han sido asociadas con desórdenes proliferativos de células. Así, no sorprende que algunas PK como, por ejemplo, miembros de la familia RTK hayan sido asociadas con el desarrollo del cáncer. Algunos de estos receptores, como EGFR (Tuzi et al., 1991, Br. J. Cancer 63:227-233, Torp et al., 1992, APMIS 100:713-719) HER2/neu (Slamon et al., 1989, Science 244:707-712) y PDGF-R (Kumabe et al., 1992, Oncogene, 7:627-633) están sobreexpresados en muchos tumores y/o persistentemente activados por bucles autocrinos. De hecho, en los cánceres más comunes y graves, se han demostrado estas sobreexpresiones de receptores (Akbasak and Suner-Akbasak et al., 1992, J. Neurol. Sci., 111:119-133 , Dickson et al., 1992, Cancer Treatment Res. 61:249-273 ,Korc et al., 1992, J. Clin. Invest. 90:1352-1360) y bucles autocrinos (Lee and Donoghue, 1992, J. Cell. Biol., 118: 1057-1070, Korc et al., supra, Akbasak and Suner-Akbasak et al., supra). Por ejemplo, EGFR ha sido asociado con el carcinoma de células escamosas, astrocitoma, glioblastoma, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de pulmón y cáncer de vesícula. HER2 ha sido asociado con cáncer de mama, ovarios, de estómago, de pulmón, de páncreas y de vesícula. PDGFR ha sido asociado con glioblastoma y melanoma, así como cáncer de pulmón, ovarios y próstata. RTK c-met ha sido asociado también con la formación de tumores malignos. Por ejemplo, c-met ha sido asociado con, entre otros cánceres, el colorrectal, el cáncer de tiroides, de páncreas, de estómago, y carcinomas y linfomas hepatocelulares. Además,

se ha asociado c-met con la leucemia. La sobreexpresión del gen c-met también ha sido

detectada en pacientes con la enfermedad de Hodgkin y la enfermedad de Burkitt.

IGF-IR, además de estar implicada en el soporte nutricional y en la diabetes de tipo n, también ha sido asociado con diversos tipos de cáncer. Por ejemplo, IGF-I ha 5 estado implicado como estimulador de crecimiento de autocrina en varios tipos de tumor, por ejemplo las células de carcinoma de cáncer de mama humano (Arteaga et al., 1989, J. Clin. Invest. 84:1418-1423) y células de pequeños tumores de pulmón (Macauley et al., 1990, Cancer Res., 50:2511-2517). Además, IGF-I, aunque está integralmente implicado en el crecimiento y diferenciación normales del sistema 10 nervioso, también parece ser un estimulador autocrino de los gliomas humanos. Sandberg-Nordqvist et al., 1993, Cancer Res. 53:2475-2478. La importancia de IGF-IR y sus ligando s en la proliferación de células también está soportada por el hecho de que muchos tipos de célula en cultivo (fibroblastos, células epiteliales, células musculares lisas, T -linfocitos, células mieloides, condrocitos y osteoblastos (las células raíz de la 15 médula ósea) son estimuladas para el crecimiento por IGF-I. Goldring and Goldring, 1991, Eukaryotic Gene Expression, 1:301-326. En una serie de publicaciones recientes, Baselga sugiere que IGF-IRjuega un papel central en el mecanismo de transformación, y como tal, podría ser un objetivo preferido para las intervenciones terapéuticas para un gran espectro de enfermedades malignas humanas. Baselga, 1995, Cancer Res., 55:249

20 252, Baselga, 1994, Cell 79:927-930, Coppola et al., 1994, Mol. Cell. Biol., 14:45884595.

Las STK han sido implicadas en muchos tipos de cáncer, incluyendo, notablemente, el cáncer de mama (Cance, et al., Int. J. Cancer, 54:571-77 (1993)).

La asociación entre actividad anormal de PK y enfermedad no se limita al

cáncer. Por ejemplo, se han asociado las RTK con enfermedades como la soriasis, diabetes mellitus, endometriosis, angiogénesis, desarrollo de placa ateromatosa, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de von Hippel-Lindau, hiperproliferación

5 epidérmica, enfermedades neurodegenerativas, degeneración macular relacionada con la edad y hemangiomas. Por ejemplo, se ha implicado el EGFR en la curación de heridas córneas y dérmicas. Los defectos en la Insulina-R e IGF-IR están indicados en la diabetes mellitus de tipo II. Una correlación más completa entre RTK específicas y sus indicaciones terapéuticas aparece en Plowman et al., 1994, DN&P 7:334-339.

10 Tal como se ha citado anteriormente, no sólo las R TK, sino también las CTK que incluyen, sin limitación, src, abl, fps, yes, fyn, lyn, lck, blk, hck, fgr e yrk (revisado por Bolen et al., 1992, F ASEB J., 6:3403-3409) están implicadas en la vía de transducción de señal proliferativa y metabólica, y así puede esperarse, y se ha demostrado, que están implicadas en muchos desórdenes donde interviene PTK a los

15 cuales se dirige la presente divulgación. Por ejemplo, el src mutado (v-src) se ha demostrado que es una oncoproteína (pp60v-arc) en los pollos. Además, su homólogo celular, el protooncogen pp60c-arc transmite señales oncogénicas de muchos receptores. La sobreexpresión de EGFR o HER2/neu en tumores lleva a la activación constitutiva de pp6c arc, que es característica de las células malignas pero está ausente en las células

20 normales. Por otro lado, los ratones deficientes en la expresión de c-src muestran un fenotipo osteopetrótico, que indica una participación clave de c-src en la función osteoclástica y una posible implicación en desórdenes relativos.

De forma parecida, Zap70 ha estado implicada en la señalización de células T, lo cual puede relacionarse con desórdenes autoinmunes.

Las STK han sido asociadas con inflamación, enfermedades autoinmunes,

inmunorespuestas y desórdenes de hiperproliferación como la restenosis, fibrosis, soriasis, osteoartritis y artritis reumatoide.

Las PK también se han visto implicadas en la implantación de embriones. De

5 esta manera, los compuestos de esta invención pueden proporcionar un método efectivo para prevenir dicha implantación de embriones, y de esta manera resultar útiles como agentes de control de natalidad.

Finalmente, actualmente se sospecha que tanto las RTK como las CTK están implicadas en desórdenes hiperinmunes.

10 Los compuestos y los datos presentados en las tablas y ejemplos no deben considerarse de ninguna manera como limitadores del ámbito de esta invención.

3. COMPOSICIONES FARMACÉUTICAS Y USO

Un compuesto de la presente invención, o una sal fisiológicamente aceptable del compuesto puede administrarse como tal en un paciente humano o puede

15 administrarse en composiciones farmacéuticas en las que los materiales precedentes se mezclan con portadores o excipientes adecuados. Las técnicas para la formulación y administración de fármacos pueden encontrarse en "Remington's Pharmacological Sciences", Mack Publishing Co., Easton, PA, última edición.

Vías de Administración.

20 Tal como se utiliza en el presente documento, "administrar" o "administración" se refiere a la distribución de un compuesto o una sal de la presente divulgación o de una composición farmacéutica que contenga un compuesto, o una sal

de esta divulgación a un organismo con finalidades de tratamiento de un desorden

relacionado con PK.

Las vías adecuadas de administración pueden incluir, sm limitación, administración oral, rectal, transmucosal o intestinal, o inyección intramuscular,

5 subcutánea, intramedular, intratecal, intraventricular directa, intravenosa, intravitral, intraperitoneal, intranasal, o intraocular. La vía de administración reivindicada es la oral.

Además, puede administrarse el fármaco en un sistema de administración de fármacos objetivo, por ejemplo en un liposoma revestido con un anticuerpo revestido de 10 tumor. Los liposomas serán convertidos en objetivos y absorbidos de forma selectiva

por el tumor.

ComposiciónlFormulación.

Las composiciones farmacéuticas de la presente divulgación pueden ser fabricadas mediante procesos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, por medio de 15 procesos convencionales de mezcla, disolución, granulación, fabricación de grageas,

pulverización, emulsificación, encapsulación, atrapamiento o liofilización.

Las composiciones farmacéuticas para su uso de acuerdo con la presente invención pueden ser formuladas de forma convencional utilizando uno o más portadores fisiológicamente aceptables que comprendan excipientes y auxiliares, que

20 faciliten el proceso de los compuestos activos en preparados que puedan ser utilizados farmacéuticamente. La formulación adecuada depende de la vía de administración seleccionada.

Para la administración oral, los compuestos pueden formulados combinando

los compuestos activos con portadores farmacéuticamente aceptables bien conocidos en el estado de la técnica. Dichos portadores permiten que los compuestos de la invención sean formulados como tabletas, píldoras, comprimidos para chupar, grageas, cápsulas, líquidos, geles, siropes, mezclas, suspensiones y similares, para la ingestión oral por parte de un paciente. Las preparaciones farmacéuticas para uso oral pueden hacerse utilizando un excipiente sólido, opcionalmente granulando el resultado de la mezcla, y procesando la mezcla de gránulos, después de añadir otros auxiliares, si se desea, para obtener tabletas o núcleos de grageas. Los excipientes útiles son, en particular, ingredientes de relleno como azúcares, incluyendo la lactosa, sucrosa, manitol, o sorbitol, preparados de celulosa como, por ejemplo, almidón de maíz, almidón de trigo, almidón de arroz y almidón de patata y otros materiales como gelatina, tragacanto de goma, metil celulosa, hidroxipropilmetil-celulosa, carboximetilcelulosa de sodio, y/o polivinil-pirrolidona (PVP). Si se desea, pueden añadirse agentes desintegradores, como pirrolidona de polivinilo de enlace cruzado, agar o ácido algínico. También puede utilizarse una sal como alginato de sodio.

Los núcleos de gragea se proporcionan con revestimientos adecuados. Con esta finalidad, pueden utilizarse soluciones de azúcar concentradas que opcionalmente pueden contener goma arábiga, talco, pirrolidona de polivinilo, gel carbopol, glicol de polietileno y/o dióxido de titánio, soluciones lacadas y disolventes orgánicos adecuados,

o mezclas de solventes. Pueden añadirse tintes o pigmentos a los revestimientos de las tabletas o las grageas para su identificación o para caracterizar diferentes combinaciones de dosis de compuestos activos.

Las composiciones farmacéuticas que pueden utilizarse oralmente incluyen cápsulas de ajuste a presión hechas con gelatinas, así como cápsulas blandas selladas hechas con gelatina y un plastificante, como glicerol o sorbitol. Las cápsulas de ajuste a presión pueden contener los ingredientes activos en mezcla con un relleno como la lactosa, un enlace como almidón y/o un lubricante como el talco o estearato de magnesio, y, opcionalmente, estabilizadores. En cápsulas blandas, los compuestos activos pueden estar disueltos o suspendidos en líquidos adecuados, como aceites grasos, parafina líquida o glicoles de polietileno líquidos. También pueden añadirse estabilizadores en estas formulaciones.

Un ejemplo no limitador de portador farmacéutico para los compuestos hidrofóbicos de la invención es un sistema cosolvente que comprende alcohol de bencilo, un surfactante no polar, un polímero orgánico mezclable en agua y una fase acuosa como el sistema co-solvente VPD. VPD es una solución de 3% p/v de alcohol de bencilo, 8% p/v del surfactante no polar Polisorbato 80™, y 65% p/v de glicol de polietileno 300, fabricado para adaptarse al volumen preparado en etanol absoluto. El sistema co-solvente VPD (VPD:D5W) consta de VPD diluido a 1: 1 con un 5% de dextrosa en solución acuosa. Este sistema co-solvente disuelve bien los compuestos hidrofóbicos, y produce baja toxicidad en administración sistémica. Naturalmente, las proporciones de dicho sistema co-solvente pueden variar considerablemente sin destruir sus características de solubilidad y toxicidad. Además, la identidad de los componentes co-solventes puede variar: por ejemplo, pueden utilizarse otros surfactantes no polares de baja toxicidad en lugar del Polisorbato 80TM, el tamaño de la fracción del glicol de polietileno puede variar, otros polímeros biocompatibles pueden sustituir al glicol de polietileno, por ejemplo pirrolidona de polivinilo, y otros azúcares o polisacáridos pueden sustituir a la dextrosa.

Como alternativa, pueden utilizarse otros sistemas de dispensación para los compuestos farmacéuticos hidrofóbicos. Los liposomas y las emulsiones son ejemplos

bien conocidos de vehículos de dispensación o portadores de fármacos hidrofóbicos.

Además, también pueden utilizarse ciertos disolventes orgánicos como dimetilsulfóxido, aunque a menudo con el coste de una mayor toxicidad.

Adicionalmente, los compuestos pueden dispensarse utilizando un sistema de

5 liberación sostenida, como las matrices semipermeables de polímeros hidrofóbicos sólidos que contienen el agente terapéutico. Se han establecido diferentes materiales de liberación sostenida y son conocidos por los expertos en la materia. Dependiendo de su naturaleza química, las cápsulas de liberación sostenida pueden liberar los compuestos durante unas semanas, hasta más de 100 días. Dependiendo de la naturaleza química y

10 la estabilidad biológica del reactivo terapéutico, pueden utilizarse estrategias adicionales para la estabilización de proteínas.

Las composiciones farmacéuticas aquí citadas pueden comprender también portadores o excipientes sólidos o de fase de gel adecuados. Entre los ejemplos de dichos portadores o excipientes se incluyen, sin limitación, el carbonato cálcico, fosfato

15 cálcico, diferentes azúcares, almidones, derivados de celulosa, gelatina y polímeros como glicoles de polietileno.

Muchos de los compuestos moduladores de PK aquí divulgados pueden proporcionarse como sales fisiológicamente aceptables en las que el compuesto reivindicado puede formar las especies cargadas negativamente o positivamente. Los

20 ejemplos de sales en las cuales el compuesto forma la mitad cargada positivamente incluyen, sin limitación, amonio cuaternario (defininido en otra parte del presente documento), sales como hidroclorato, sulfato, carbonato, lactato, tartrato, maleato, succinato en que el átomo de nitrógeno del grupo de amonio cuaternario es un nitrógeno del compuesto seleccionado de esta divulgación que ha reaccionado con el ácido

apropiado. Las sales en las que un compuesto de esta invención forma la especie

cargada negativamente incluyen, sin limitación, sales de sodio, potasio, calcio y magnesio formadas por la reacción de un grupo de ácidos carboxílicos en el compuesto con una base apropiada (por ejemplo, hidróxido de sodio (NaOH), hidróxido de potasio

5 (KOH), hidróxido de calcio, (Ca(OHh), etc.).

Dosificación.

Las composiciones farmacéuticas adecuadas para su uso en la presente invención incluyen composiciones en las que los ingredientes activos están contenidos en una cantidad suficiente para conseguir la finalidad pretendida, es decir, la

10 modulación de la actividad de PK o el tratamiento o prevención de un desorden relacionado con PK.

Más específicamente, una cantidad terapéuticamente adecuada significa una cantidad de un compuesto efectiva para prevenir, aliviar o mejorar los síntomas de la enfermedad o prolongar la supervivencia del individuo que está siendo tratado.

15 La determinación de una cantidad terapéuticamente efectiva se encuentra en gran medida dentro de las capacidades de las personas con conocimientos en el tema, especialmente a la luz de la divulgación detallada que proporciona el presente documento.

Para cualquier compuesto utilizado de acuerdo con la invención, la cantidad

20 terapéuticamente efectiva o la dosis pueden estimarse inicialmente a partir de ensayos de cultivo de células. A continuación, puede formularse la dosis para su uso en modelos animales, con el fin de conseguir un rango de concentración de circulación que incluya el lCso tal como se determina en el cultivo de células (es decir, la concentración del compuesto de prueba que consigue una inhibición semi-máxima de la actividad de PK).

Dicha información puede utilizarse para determinar con mayor precisión las dósis útiles

en humanos.

La toxicidad y la eficacia terapéutica de los compuestos aquí descritos puede determinarse mediante procedimientos farmacéuticos estándar en cultivos de células o 5 animales de experimentación, por ejemplo, determinando el lCso y el LDso (los cuales están descritos en otros puntos del presente documento) para un compuesto sujeto. Los datos obtenidos a partir de estos ensayos de cultivo de células y estudios con animales pueden utilizarse para formular un rango de dosificación para uso en seres humanos. La dosificación puede variar dependiendo de la forma de dosificación empleada y de la vía

10 de administración utilizada. La formulación, la vía de administración y la dosis exactas pueden ser seleccionadas por cada médico a la vista de las condiciones del paciente. (Ver por ejemplo, Fingl, et al., 1975, in "The Pharmacological Basis of Therapeutics", Ch. 1 p.1).

La cantidad y el intervalo de la dosis pueden ser ajustados de forma

15 individual para proporcionar niveles de plasma de las especies activas que sean suficientes para mantener los efectos moduladores de la kinasa. Estos niveles de plasma son referidos como concentraciones mínimas eficientes (MEC). Las MEC varían para cada compuesto, pero pueden estimarse a partir de datos in vitro, por ejemplo, la concentración necesaria para conseguir una inhibición del 50-90% de una kinasa puede

20 determinarse utilizando los ensayos aquí descritos. Las dosificaciones necesarias para conseguir la MEC dependerán de las características individuales y de la vía de administración. Pueden utilizarse ensayos HPLC o bioensayos para determinar las concentraciones de plasma.

Los intervalos de dosificación también pueden determinarse utilizando el

valor de la MEC. Los compuestos deben administrarse utilizando un régimen que mantenga los niveles de plasma por encima de la MEC durante un 10-90% del tiempo, preferiblemente entre un 30-90% y todavía más preferiblemente entre 50-90%.

5 En casos de administración local o toma selectiva, la concentración local efectiva del fármaco puede no estar relacionada con la concentración de plasma, y pueden emplearse otros procedimientos conocidos en la técnica para determinar la cantidad y el intervalo de la dosificación correcta.

Lógicamente, la cantidad administrada de una composición dependerá del 10 individuo que se esté tratando, de la gravedad de la afección, de la forma de administración, de la opinión del médico que la prescribe, etc.

Empaquetado.

Si se desea, las composiciones pueden estar presentadas en un pack o un dispositivo de dispensación, como por ejemplo el kit aprobado por la FDA, que puede

15 contener una o más formas de dosificación de unidad que contienen el ingrediente activo. Por ejemplo, el pack puede comprender papel de aluminio, como un pack de blisters. El pack o dispositivo dispensador puede ir acompañado de instrucciones de administración.

El pack o dispensador puede ir también acompañado de una nota relacionada

20 con el contenedor en una forma prescrita por una agencia gubernamental que regule la fabricación, uso o venta de productos farmacéuticos, cuya nota muestre la aprobación por parte de la agencia de las composiciones o de la administración humana o veterinaria. Dicha nota, por ejemplo, puede ser de la etiqueta aprobada por la U.S. Food and Drug Administration (Administración de Comida y Fármacos de los EE.UU.) para

los medicamentos con prescripción o de una inserción de producto aprobado. Las

composiciones que comprenden un compuesto tal como se describe en el presente documento, formuladas en un portador farmacéutico compatible, también pueden ser preparadas, colocadas en un contenedor adecuado y etiquetadas para el tratamiento de

5 una condición indicada. Las condiciones adecuadas indicadas en la etiqueta pueden incluir el tratamiento de un tumor, inhibición o angiogénesis, tratamiento de fibrosis, diabetes, y similares.

4. SÍNTESIS

El compuesto de esta invención, así como el precursor 2-oxindolos y

10 aldehidos, puede ser fácilmente sintetizado utilizando técnicas bien conocidas en química. Los expertos en la materia apreciarán que otras vías sintéticas para formar el compuesto de la invención están disponibles, y que lo siguiente se ofrece a modo de ejemplo, y sin limitación.

A. Procedimiento sintético general

15 La metodología general siguiente puede emplearse para preparar el compuesto de esta invención:

El 2-oxindol adecuadamente sustituido (1 equiv.), el aldehído adecuadamente sustituido (1.2 equiv.) y la piperidina (0.1 equiv.) se mezclan con etanol (1-2 ml/rnmol 2-oxindol) y a continuación se calienta la mezcla a 90°C durante entre 3 y 5 horas.

20 Después de enfriarse, la mezcla de la reacción se concentra y se acidifica a un pH de 3. El precipitado que forma se filtra, se limpia con agua de pH 7, Y a continuación con etanol frío, etil acetato y/o hexano y se seca al vacío para producir el compuesto objetivo. Opcionalmente, el producto puede ser purificado mediante cromatografia.

B. Ejemplos -Síntesis de 2-indolinonas sustituidas con pirrol.

Las siguientes síntesis del compuesto de esta divulgación se muestran únicamente a modo de ejemplo, y no debe considerarse que limiten el ámbito de esta invención por lo que se refiere al planteamiento sintético.

5 Ejemplo 1

3-[2,4-Dimetil-5-(2-oxo-l,2-dihidroindol-3-ilidenemetil)-1H-pirrol-3-il]-ácido

propiónico

2,4-Dimetil-5-etoxicarbonil-3-(2-etoxicarboniletil)-pirrol (1.07 kg) Y 3.2 L 5 N de hidróxido de sodio fueron removidos mecánicamente en un matraz de 12 L de tres 10 cuellos y fondo redondo equipado con un condensador de reflujo y un embudo de adición y calentado en un baño de aceite. La mezcla fue reflujada durante 3 horas, después de las cuales la temperatura interna era de 96°C, todos los sólidos fueron disueltos y una capa fina de cromatografia mostró que la hidrólisis era completa. El baño de calor fue eliminado y la mezcla fue enfriada a 50°C en un baño de agua. Se 15 añadió lentamente 12N de ácido hidroclórico (~1.3 L). Después de añadir aproximadamente un 50% del ácido, se inició la evolución del gas, y la temperatura alcanzó los 60°C. A medida que se añadió más ácido, la evolución del gas se incrementó y se formó un precipitado amarillo. El pH final se ajustó a 3.5 con ácido hidroclórico. La mezcla se enfrió en un baño de hielo a 8°C. Los sólidos fueron recogidos por

20 filtración de vacío, lavados dos veces con 0.5 L de agua destilada y secados durante 48 horas en un horno de vacío a 55-60°C para proporcionar 677 g (10 1 % de producción) de 3 -(2-carboxietil)-2,4-dimetilpirro1.

1 HNMR (d6-DMSO) Ó 11.9(s, lH, COOH), 9.9(s, lH, NH), 6.2(s, lH,

aromático), 2.5 (t, 2H, CH2), 2.2 (t, 2H, CH2), 2.0(s, 3H, CH3), 1.9(s, 3H, CH3); MP 134-136 oc.

Se enfrió dimetilformamida (28.5 g) en 250 mL de diclorometano en un matraz de 1 L de tres cuellos con fondo redondo equipado con removido magnético, un termómetro y un embudo en un baño de sal de hielo a -1°C. Se colocó oxiclorato de fósforo (59.3 g) en el embudo y se añadió lentamente a la mezcla de la reacción. El embudo fue limpiado con 25 mL de diclorometano para asegurar todo el oxicloruro de fósforo. La temperatura máxima alcanzada por la mezcla fue de 5°C. La mezcla fue removida durante 15 minutos, tiempo durante el cual la temperatura fue de -3°C. Se añadió 3-(2-Carboxietil)-2,4-dimetilpirrol (32.6 g) sólido en porciones durante 15 minutos. La temperatura máxima alcanzada por la mezcla fue de 7°C. La mezcla de color negro rojizo fue removida durante 30 minutos más y a continuación fue calentada para reflujo durante 1 hora. La mezcla fue enfriada a 15°C y se añadieron 300 mL de agua lo cual provocó una reacción vigorosa durante la cual la temperatura aumentó. La mezcla fue removida y enfriada a 22°C y se separaron y guardaron las capas. La capa orgánica fue extraída con 100 mL de agua y las capas acuosas fueron combinadas y lavadas con 50 mI de diclorometano. Las capas orgánicas fueron descartadas. La capa acuosa fue ajustada a un pH de 11 con -180 mL de ION de hidróxido de sodio. La temperatura aumentó a 40°C. La mezcla fue removida durante 30 minutos, tiempo durante el cual la temperatura fue de 27°C. La mezcla fue acidificada a un pH de 2 con -120 mL de 10 N de ácido hidroclórico, que aumentó la temperatura a 30°C. Se añadió etil acetato (150 mL) y la mezcla fue removida para extraer el producto. Durante el removido, una cantidad considerable de sólido negro apareció en la parte superior de la capa de agua. La capa de etil acetato fue separada y la capa acuosa y el sólido fueron

extraídos dos veces con 100 mL de etil acetato. El sólido todavía presente fue recogido

mediante filtración de vacío, lavado en profundidad con agua y secado al vacío a 40°C para proporcIOnar 12 g (31 % de producción) de 3-(2-carboxietil)-2,4-dimetil-5formilpirrol como un sólido negro marronoso. La cromatografía de capa fina (ácido 5 acético de diclorometano, 95:5, gel de silica) mostró un punto en Rf 0.7 Y un punto de color en el origen. Las capas de etil acetato fueron combinadas, secadas sobre sulfato de sodio anhídrico, y evaporadas a un sólido negro marronoso que fue secado al vacío a 40°C para proporcionar 21 g (55 % de producción, producción total 86 %) de 3-(2carboxietil)-2,4-dimetil-5-formilpirrol, idéntico en apariencia al sólido previo mediante

10 cromatografía de capas.

Como alternativa, se enfrió dimetilformamida (124 mL) en 750 mL de diclorometano en un matraz de 5 L de tres cuellos con fondo redondo equipado con removido mecánico, un termómetro y un embudo en un baño de sal de hielo a -9°C. Se añadió rápidamente oxilclorato de fósforo (114 mL) a través del embudo, que fue

15 inyectado en la mezcla de la reacción con 50 mL de diclorometano. La temperatura máxima alcanzada por la mezcla fue de -4°C. Se añadió 3-(2-carboxietil)-2,4dimetilpirrol (133.6 g) sólido en porciones durante 20 minutos. La temperatura máxima alcanzada por la mezcla fue de 3°C. La mezcla de color rojizo oscuro fue calentada para reflujo durante 1 minuto, y a continuación se enfrió a -1°C. La mezcla fue enfriada a

201°C y rápidamente se añadieron 800 mL de agua helada. La temperatura máxima alcanzada fue de 15°C. La capa orgánica fue separada y descartada. La capa acuosa fue separada y descartada. La capa acuosa fue lentamente ajustada a un pH de 12 -13 con 800 mL de ION de hidróxido de potasio, añadiendo hielo para controlar la temperatura. La temperatura aumentó a 37°C. La mezcla fue removida durante 90 minutos a

25 temperatura ambiente, período durante el cual la cromatografía de capa fina mostró

solamente un indicio de material de color luminoso en el origen con el producto a Rf

0.3. La mezcla fue enfriada a O°C. La mezcla fue acidificada a pH 3 con ~600 mL 10 N de ácido hidroclórico, añadiendo hielo para controlar la temperatura. La temperatura máxima alcanzada fue de 10°C. La mezcla fue removida durante 1 hora en frío. El

5 sólido fue recogido por filtración de vacío, lavada 4 veces con 100 mL de agua y secada al vacío a 50 -60 oC para proporcionar 140.6 g (90 % de producción) de 3-(2carboxietil)-2,4-dimetil-5-formilpirrol como sólido marrón.

1 HNMR (d6-DMSO): o12.0(s, 1H, COOH), 11.3(s, 1H, NH), 9.4 (s, 1H, CHO), 2.6 (t, 2H, CH2), 2.3 (t, 2H, CH2), 2.2(s, 3H, CH3), 2.1(s, 3H, CH3). MP 14510 147°C.

Se disolvió 3-(2-Carboxietil)-2,4-dimetil-5-formilpirrol (18.2 g) Y 11.7 g 2oxindol en 100 mL de etanol calentando en un matraz de 250 mL de fondo redondo equipado con un removedor magnético y un condensador de reflujo en un baño de aceite. Se añadió pirrolidina (7.0 g) a la mezcla de reacción reflujada durante 2 horas,

15 durante las cuales se encontraba presente una gran cantidad de sólido de color marrónnegro. La cromatografía de capa fina (etil acetato: etanol: ácido acético 96:2:2, gel de silica) mostró la ausencia de material de inicio de oxindol. Se añadieron ocho mL de ácido acético y la mezcla fue reflujada durante 15 minutos. La mezcla gruesa fue diluida con 50 mL de etanol y enfriada a 10°C. El sólido fue recogido por filtración de vacío y

20 lavado con 50 mL de etanol. El sólido fue removido en 125 mI de etanol a reflujo durante 10 minutos, enfriado a 10°C, recogido por filtración de vacío y lavado con 50 mL de etanol. El producto fue secado durante toda una noche a 45°C para proporcionar

25.5 g (88 % de produción) de 3-[2,4-dimetil-3-(2-carboxietil) pirrol-5-metilidenil]-2indolinona como un sólido de color naranja.

Como alternativa, se removió una mezcla de 3-(5-formil-2,4-dimetil-1H

pirrol-3-il)-ácido propiónico (lO g, 51 mmol), 2-oxindol (6.5 g, 49 mmol) e hidróxido de sodio (40 g, 58 mmol) disuelto en 50 mI de agua a 50°C durante 4 horas. La mezcla de reacción fue enfriada a temperatura ambiente y filtrada, y el filtrado fue acidificado a

5 un pH de 3 con 12 N de ácido hidroclórico. El sólido que precipitó fue recogido por filtración de vacío, lavado con 10 mI de etanol y secado al vacío para proporcionar 13.8 g (91 %) de 3-[2,4-dimetil-5-(2-oxo-1 ,2-dihidro-indol-3-ilidenemetil)-lH-pirrol-3-il]ácido propiónico.

1 HNMR (360 MHz, DMSO-d6): Ó 13.38 (s, br, 1H, NH-1'), 12.05 (s, br, 1H, 10 COOH), 10.70 (s, br, 1H, NH-1), 7.69 (d, J = 7.39Hz, 1H, H-4), 7.53 (s, 1H, H-vinilo),

7.06 (t, J = 7.39 Hz, 1H, H-6), 6.95 (t, J= 7.39 Hz, 1H, H-5), 6.85 (d, J= 7.39 Hz, 1H, H-7), 2.63 (t, J = 7.45 Hz, 2H, CH2CH2COOH), 2.34 (t, J = 7.45 Hz, 2H, CH2 CH2COOH), 2.28 (s, 3H, CH3), 2.24 (s, 3H, CH3); MS miz (intensidad relativa, %) 311 ([M+1t, 100).

15 5. EVALUACIÓN BIOLÓGICA

Se valorará que, en cualquier serie de compuestos, se proporcione un espectro de actividad biológica. En las realizaciones actualmente preferentes, esta divulgación se refiere a un nuevo derivado de 2-indolinona sustituido por un pirrol demostrando la capacidad de modular la actividad de RTK, CTL y STK. Los ensayos siguientes se

20 utilizan generalmente para seleccionar aquellos compuestos que demuestran el grado óptimo de la actividad deseada.

A. Procedimientos de Ensayo.

Los siguientes ensayos in vitro pueden utilizarse para determinar el nivel de actividad y de efecto de los compuestos de la presente invención en una o más de las

PK. Pueden diseñarse ensayos similares en la misma línea para cualquier PK utilizando

técnicas bien conocidas en el estado de la técnica.

Los ensayos celulares/catalíticos descritos en el presente documento están realizados en un formato ELISA. El procedimiento general es como sigue: se introduce

5 un compuesto en células que expresan la kinasa de prueba, ya sea de forma natural o recombinada, durante un período de tiempo seleccionado, después del cual, si la kinasa de prueba es un receptor, se añade un ligando conocido para activar el receptor.

Las células son lisadas y el lisato es transferido a los pocillos de una placa ELISA previamente revestida con un anticuerpo específico que reconoce el sustrato de 10 la reacción de fosforilación específica. Los componentes no del sustrato del lisado de célula son eliminados y la cantidad de fosforilación en el sustrato es detectada con un anticuerpo que reconoce específicamente la fosfotirosina comparada con las células de control que no entraron en contacto con un compuesto de prueba. Los ensayos celulares/biológicos descritos en el presente documento miden la cantidad de ADN 15 fabricado en respuesta a la activación de una kinasa de prueba, que es una medición general de una respuesta proliferativa. El procedimiento general para este ensayo es tal como sigue: se introduce un compuesto en células expresando la kinasa de prueba, ya sea de forma natural o recombinada, durante un período de tiempo seleccionado, después del cual, si la kinasa de prueba es un receptor, se añade un ligando conocido

20 para activar el receptor. Después de la incubación durante por lo menos una noche, se añade un reactivo de etiqueta de ADN como la Bromodeoxiuridina (BrdU) o 3Htimidina. La cantidad de ADN etiquetado es detectada ya sea por un anticuerpo antiBrdU o midiendo la radioactividad, y se compara para controlar las células que no han entrado en contacto con un compuesto de prueba.

Ensayos Celulares/Catalíticos

Los ensayos inmunoabsorbentes enlazados con enzimas (ELISA) pueden utilizarse para detectar y medir la presencia de actividad de PK. Los ELISA pueden ser realizados de acuerdo con protocolos conocidos, que se describen en, por ejemplo,

5 Voller, et al., 1980, "Enzyme-Linked Immunosorbent Assay", en: Manual of Clinical Immunology, 2d ed., editado por Rose and Friedman, pp 359-371 Am. Soco Of Microbiology, Washington, D.C.

El protocolo divulgado puede ser adaptado para determinar la actividad con respecto a una PK específica. Esto es, los protocolos preferidos para llevar a cabo los

10 experimentos ELISA para PK específicas se proporcionan más abajo. Sin embargo, la adaptación de estos protocolos para determinar la actividad de un compuesto para otros miembros de la familia RTK, así como para CTK y STK, entra dentro del ámbito de los conocimientos de las personas expertas en la materia.

Ensayo FLK-l

15 Se realiza un ensayo ELISA para medir la actividad de kinasa del receptor FLK-1 y más específicamente, la inhibición o activación de la actividad de TK en el receptor FLK-1. Específicamente, la prueba siguiente puede realizarse para medir la actividad de kinasa del receptor FLK-1 en células manipuladas genéticamente para expresar Flk-l.

20 Materiales y Reactivos.

a.

Placas ELISA Coming de 96-pocillos (Catálogo de Coming No. 2580596),

b.

IgG de cabra anti-conejo Cappel (catálogo no. 55641),

c.

PBS (Catálogo Gibco No. 450-1300EB),

d.

Solución amortiguadora de TBSW (50 mM de Tris (pH 7.2), 150 mM de NaCI y 0.1 % de Tween-20),

e. Concentrado de etanolamina (10% etanolamina (pH 7.0), almacenado a

f.

Solución amortiguadora de HNTG (20 mM de solución amortiguadora de HEPES (pH 7.5), 150mM de NaCI, 0.2% de Triton X-lOO, y 10% de glicerol),

g. EDTA (0.5 M (pH 7.0) como concentración 100X),

h. Ortovanadato de sodio (0.5 M como concentración 100X), 10 i. Pirofosfato de sodio (0.2 M como concentración 100X),

j. Placas de polipropileno NUNC de 96 pocillos con fondo en V (Applied Scientific, Catálogo No. AS-72092),

k. Células NIH3T3 C7#3 (células que expresan FLK-l),

1. DMEM con ix de L-Glutamina de alta glucosa (catálogo No. 11965-050), 15 m. FBS, Gibco (catálogo no. 16000-028),

n. L-glutamina, Gibco (catálogo no. 25030-016),

o.

VEGF, PeproTech, Inc. (catálogo no. 100-20)(guardado como concentración de 1 ¡..tg/l00 ¡..tI en Milli-Q dH20 Y almacenado a -20°C,

p. Antisuero anti-FLK-l purificado de afinidad,

q.

Anticuerpo monoclonal UB40 específico para fosfotirosina (ver, Fendley, et al., 1990, Cancer Research 50:1550-1558),

r.

IgG POD de Cabra anti-ratón de grado EIA (BioRad, catálogo no. 1721011),

5 s. 2,2-azino-bis(solución de 3-etilbenz-tiazolin-6-ácido sulfónico (ABTS) (100 mM de ácido cítrico (anhídrico), 250 mM de Na2HP04 (pH 4.0), 0.5 mg/ml de ABTS (Catálogo Sigma no. A-1888)), la solución debería ser almacenada protegida de la luz a 4°C hasta que esté lista para ser utilizada,

t. H20 2 (solución al 30%) (Catálogo Fisher no. H325),

10 u. ABTS/ H20 2 (solución ABTS 15ml, 2 ~l de H20 2) preparada 5 minutos antes de su utilización a temperatura ambiente,

v.

0.2 M de concentración de HCl en H20,

w.

dimetilsulfóxido (100% )(Catálogo Sigma No. D-8418), y

y.

Tripsina-EDTA (Catálogo Gibco BRL No. 25200-049). Protocolo.

15 1. Revestir placas ELISA Coming de 96 pocillos con 1.0 ~g por pocillo de anticuerpo IgG Anti-conejo Cappel en O.1M de Na2C03, pH 9.6. Llevar el volumen final a 150 ~l por pocillo. Revestir las placas durante una noche a 4°C. Las placas pueden mantenerse hasta dos semanas si se almacenan a 4°C.

2. Cultivar células en Medio de Crecimiento (DMEM, suplementado con 2.0 20 mM de L-Glutamina, 10% FBS) en placas de cultivo adecuadas hasta que confluyen a

37°C, 5% C02.

3. Recolectar células por tripsinización y sembrar en placas de célula de

fondo redondo de 96 pocillos de poliestireno Coming 25850, 25,000 células/pocillo en 200 f.tl de medio de crecimiento.

4. Cultivar las células, al menos una al día, a 37°C, 5% de CO2.

5 5. Lavar células con D-PBS IX.

6. Añadir 200 f.tl/pocillo de medio de inanición (DMEM, 2.0 mM 1Glutamina, 0.1 % FBS). Incubar durante una noche a 37°C, 5% de CO2.

7. Diluir los Compuestos 1 :20 en placas de polipropileno de 96 pocillos

utilizando medio de inanición. Diluir dimetilsulfóxido 1 :20 para su uso en pocillos de 10 control.

8.

Eliminar el medio de inanición de las placas de cultivo de 96 pocillos y añadir 162 f.tl de medio de inanición fresco a cada pocillo.

9.

Añadir 18 f.tl de dilución de compuesto diluido al 1 :20 (de la fase 7) a cada pocillo más la dilución de dimetilsulfóxido al 1 :20 a los pocillos de control (+/-VEGF),

15 para una dilución final de 1 :200 después de la estimulación celular. El dimetilsulfóxido final es al 0.5%. Incubar la placa a 37°C, 5% de C02 durante dos horas.

10. Eliminar los anticuerpos no enlazados de las placas ELISA invirtiendo la placa para eliminar líquido. Lavar 3 veces con TBSW + 0.5% etanolamina, pH 7.0. Golpear suavemente la placa sobre una toalla de papel para eliminar el exceso de

20 líquido y las burbujas.

11. Bloquear las placas con TBSW + 0.5% etanolamina, pH 7.0, 150 !J.I por pocillo. Incubar la placa durante treinta minutos mientras se agita en un sacudidor de placas de microtitulación.

12. Lavar la placa 3 veces tal como se describe en la fase 10.

5 13. Añadir 0.5 !J.g/pocillo de antisuero de conejo policlonal anti-FLU-l purificado de afinidad. Llevar el volumen final a 150 !J.l/pocillo con TBSW + 0.5% de etanolamina pH 7.0. Incubar la placa durante treinta minutos mientras se agita.

14. Añadir 180 !J.I de medio de inanición a las células y estimular las células con 20 !J.l/pocillo de 10.0 mM de ortovanadato de sodio y 500 nglml de VEGF (que dé 10 como resultado una concentración final de 1.0 mM de ortovanadato de sodio y 50 nglml

de VEGF por pocillo) durante ocho minutos a 37°C, 5% de C02. Los pocillos de control negativo solamente reciben un medio de inanición.

15. Al cabo de ocho minutos, los medios deberían ser retirados de las células y limpiados una vez con 200 !J.I/pocillo de PBS.

15 16. Lisar células en 150 !J.I/pocillo de HNTG mientras se agita a temperatura ambiente durante cinco minutos. La formulación de HNTG incluye ortovanadato de sodio, pirofosfato de sodio y EDT A.

17.

Limpiar la placa ELISA tres veces tal como se describe en la fase 10.

18.

Transferir los lisados de célula de la placa de células a la placa ELISA e

20 incubar mientras se agita durante dos horas. Para transferir los lisados de células, subir y bajar con la pipeta mientras se raspan los pocillos.

19. Limpiar la placa tres veces tal como se describe en la fase 10.

20. Incubar la placa ELISA con 0.02 ¡..tg/pocillo de UB40 en TBSW + 05% de etanolamina. Llevar el volumen final a 150 ¡..tl/pocillo. Incubar mientras se agita durante 30 minutos.

21. Lavar la placa tres veces tal como se describe en la fase 10.

5 22. Incubar la placa ELISA con peroxidasa de rábano picante conjugada con IgG de cabra anti-ratón de categoría EIA diluida al 1:10,000 en TBSW más 0.5% de etanolamina, pH 7.0. Llevar el volumen final a 150 ¡..tI/pocillo. Incubar mientras se agita durante treinta minutos.

23. Lavar la placa tal como se describe en la fase 10.

10 24. Añadir 100 ¡..tI de solución de ABTS/ H20 2 al pocillo. Incubar durante diez minutos mientras se agita.

25. Añadir 100 ¡..tI de 0.2 M HCI para una concentración final de 0.1 M HCI para detener la reacción de desarrollo de color. Agitar durante 1 minuto a temperatura ambiente. Eliminar las burbujas con una corriente lenta de aire y leer la placa ELISA en

15 un lector de placas ELISA a 410 nID.

Ensayo de Receptor EGF -Receptor Quimérico HER2 en Células Completas. La actividad de la kinasa HER2 en células completas EGFR-NIH3T3 se mide tal como se describe más abajo:

Materiales y Reactivos. 20 a. EGF: concentración: 16.5 ILM, EGF 201, TOYOBO, Co., Ltd. Japan.

b.

05-101 (UBI) (un anticuerpo monoclonal que reconoce un dominio extracelular EGFR).

c.

Anticuerpo de anti-fosfotirosina (anti-Ptir) (policlonal)(ver, Fendley, et al., supra).

5 d. Anticuerpo de detección: conjugado de peroxidasa IgG de Cabra anticonejo, TAGO, Inc., Burlingame, CA.

e. Solución amortiguadora de TBST: Tris-HCI, pH 7.2 50 mM NaCI l50mM

10 Triton X-lOO 0.1

f. Concentración de HNTG 5X: HEPES 0.1 M NaCI 0.75 M Glicerol 50%

15 Triton X-lOO 1.0%

g. Concentración de ABTS: Ácido Cítrico 100 mM 250 mM

HCI, conc. 0.5 mM 20 ABTS* 0.5mg/ml

* (2,2'-azinobis(3-ácid etilbenztiazolinasulfónico)). Mantener la solución

alejada de la luz a 4°C hasta su uso. Concentrar reactivos de:

EDTA 100 mMpH 7.0

0.5M

5 0.2 M

Procedimiento.

Placa ELISA pre-revestimiento

1. Revestir placas ELISA (Coming, 96 pocillos, Cat. #25805-96) con anticuerpo 05-101 a 0.5 !J.g por pocillo en PBS, 100 !J.l de volumen final/pocillo, y

10 almacenar durante una noche a 4°C. Las placas revestidas sirven para hasta 10 días cuando se almacenan a 4°C.

2. En el día de uso, eliminar la solución amortiguadora de revestimiento y sustituir con 100 !J.I de solución amortiguadora de bloqueo (5% de Leche en polvo sin Grasa Instantánea Camation en PBS). Incubar la placa, agitando, a temperatura

15 ambiente (unos 23°C a 25°C) durante 30 minutos. Justo antes de su utilización, eliminar la solución amortiguadora de bloqueo y lavar la placa 4 veces con solución amortiguadora de TBST.

Cultivar las Células

1. Puede utilizarse una línea de células NIH3T3 sobreexpresando un receptor

20 quimérico que contega el dominio extracelular EGFR y el dominio de kinasa intracelular HER2 para este ensayo.

2. Seleccionar placas con un 80-90% de confluencia para el experimento.

Tripsinizar las células y detener la reacción añadiendo un 10% de suero bovino fetal. Suspender las células en un medio DMEM (medio CS DMEM al 10%) y centrifugar una vez a 1500 rpm, a temperatura ambiente durante 5 minutos.

5 3. Volver a suspender las células en un medio de cultivo (DMEM, 0.5% de suero bovino), y contar las células utilizando trypan azul. Resulta aceptable una viabilidad por encima del 90%. Cultivar las células en medio DMEM (0.5 de suero bovino) a una densidad de 10,000 células por pocillo, 100 111 por pocillo, en una placa de microtitulación de 96 pocillos. Incubar las células cultivadas en 5% de C02 a 37°C

10 durante unas 40 horas.

Procedimientos de Ensayo

1. Comprobar la contaminación de las células cultivadas utilizando un microscopio invertido. Diluir la concentración de fármaco (10 mglml en DMSO) al 1: 10 en medio DMEM, a continuación transferir 5 111 a un pocillo TBST para una dilución

15 final del fármaco al 1 :200 y una concentración final de DMSO del 1 %. Los pozos de control reciben únicamente DMSO. Incubar en 5% de C02 a 37°C durante dos horas.

2. Preparar el ligando EGF: diluir EGF concentrado en DMEM para que, cuando se transfieran 10 111 de EGF diluido (dilución al 1: 12), se consiga una concentración final de 100 nM.

20 3. Preparar HNTG* fresco suficiente para 100 111 por pocillo, y colocar en hielo. HNTG* (10 mI):

Concentrado de HNTG 2.0 mI

8. Eliminar el anticuerpo anti-Ptir y lavar 4 veces con TBST. Transferir el

anticuerpo IgG anti-conejo TAGO recién diluido a la placa ELISA a 100 , . .tI por pocillo. Incubar agitando a temperatura ambiente durante 30 minutos (dilución de anticuerpo IgG anti-conejo al 1 :3000 en TBST).

5 9. Eliminar el anticuerpo de detección TAGO y lavar cuatro veces con TBST. Transferir la solución ABTS/H20 2 recién preparada a la placa ELISA, 100 /-tI por pocillo. Incubar agitando a temperatura ambiente durante 20 minutos (solución ABTS/ H202: 1.0 /-tI al 30% de H202 en 10 mI de concentrado de ABTS).

10. Detener la reacción añadiendo 50 /-tI de 5N H2S04 (opcional), y 10 determinar O.D. a 410 nm.

11. La señal máxima de fosfotirosina se determina restando el valor de los controles negativos de los controles positivos. A continuación, se calcula el porcentaje de inhibición del contenido en fosfotirosina de los pocillos que contienen el extracto, después de la resta de los controles negativos.

15 Ensayo PDGF-R

Todos los medios de cultivo de células, glutamina y suero bovino fetal pueden comprarse en Gibco Life Technologies (Grand Island, NY) a menos que se especifique lo contrario. Todas las células se cultivan en una atmósfera húmeda de un 90-95% de aire y un 5-10% de C02 a 37°C. Todas las líneas de células se subcultivan de

20 forma rutinaria dos veces a la semana y son negativas en micoplasma, tal como determina el método Mycotect (Gibco).

Para los ensayos ELISA se cultivan células (U1242, obtenidas de Joseph Schlessinger, NYU) hasta un 80-90% de confluencia en medio de cultivo (MEM con

10% de FBS, NEAA, 1 mM de NaPir y 2 mM de GLN) y se dejan en una placa de cultivo de tejido de 96 pocillos en un 0.5% de suero a entre 25,000 y 30,000 células por pocillo. Después de la incubación durante toda una noche en un medio que contiene un 0.5% de suero, las células se cambian a un medio libre de suero y se tratan con 5 compuesto de prueba durante 2 horas en un incubador de 5% de C02, a 37°C. A continuación, las células son estimuladas con ligando durante 5-10 minutos, seguido de una lisis con HNTG (20 mM de Hepes, 150 mM de NaCI, 10% de glicerol, 5 mM de EDTA, 5 mM de Na3V04, 0.2% de Triton X-lOO, y 2 mM de NaPir). Los lisatos de célula (0.5 mg/pocillo en PBS) son transferidos a placas ELISA previamente revestidas 10 con anticuerpo específico de receptor y que han sido bloqueadas con un 5% de leche en TBST (50 mM de Tris-HCI pH 7.2, 150 mM de NaCI y 0.1% de Triton X-lOO) a temperatura ambiente durante 30 mino Los lisatos son incubados mientras se agitan durante 1 hora a temperatura ambiente. Las placas son lavadas con TBST cuatro veces y a continuación son incubadas con anticuerpo anti-fosfotirosina policlonal a temperatura 15 ambiente durante 30 minutos. El exceso de anticuerpo anti-fosfotirosina es eliminado aclarando la placa con TBST cuatro veces. Se añade anticuerpo IgG de cabra anticonejo a la placa ELISA durante 30 minutos a temperatura ambiente, seguido del aclarado con TBST cuatro veces más. Se añade ABTS (100 mM de ácido cítrico, 250 mM de Na2HP04 y 0.5 mg/mL de 2,2'-azino-bis(3-etilbenztiazolina-6-ácido sulfónico))

20 más H20 2 (1.2 mL al 30% de H202 a 10 mI de ABTS) a las placas ELISA para iniciar el desarrollo del color. La absorción a 410 nm con una longitud de onda de referencia de 630 nm se registra entre unos 15 y 30 min después de la adición de ABTS.

Ensayo de RECEPTORIGF-l

Puede utilizarse el protocolo siguiente para medir el nivel de fosfotirosina en el receptor IGF-1, que indica una actividad de tirosina kinasa del receptor IGF-l.

Materiales y Reactivos.

5 a. La línea de célula utilizada en este ensayo es 3T3/IGF-1R, una línea de célula manipulada genéticamente para sobreexpresar el receptor IGF-l.

b. NIH3T3/IGF-1R es cultivado en un incubador con un 5% de C02 a 37°C. El medio de crecimiento es DMEM + 10% de FBS (desactivado por calor)+ 2mM de Lglutamina.

10 c. Anticuerpo anti-IGF-1R purificado por afinidad 17-69.

d. D-PBS:

KH2P04 KH2P04 KCl

15 NaCl 0.20 gil

2.16 gil

0.20 gil

8.00 gil (pH 7.2)

e. Solución amortiguadora de Bloqueo: TBST más 5% de Leche (Leche en polvo Sin Grasa Instantánea Camation).

f. Solución amortiguadora de TBST:

Tris-HCl 50 mM 20 NaCl 150mM (pH 7.2IHCI10N)

TritonX-lOO 0.1%

Se prepara solución concentrada de TBS (lOX), y se añade Triton X-lOO a la solución amortiguadora durante la dilución.

g. Solución amortiguadora de HNTG:

5 HEPES 20 mM

NaCI 150 mM (pH 7.2/HCIIN)

Glicerol 10%

Triton X-lOO 0.2%

Se prepara solución concentrada (5X) y se mantiene a 4°C.

10 h. EDTAlHCI: 0.5 M pH 7.0 (NaOH) como concentración 109X.

i. Na3V04: 0.5 M como concentración 100X y se mantienen las partes alícuotas a 80°C.

j.

Na4P207: 0.2 M como concentración 100X.

k.

Factor de crecimiento -1 similar a la insulina de Promega (Cat# G5111).

15 1. Antisuero anti-fosfotirosina polic1onal de conejo.

m. Cabra anti-conejo IgG, conjugado POD (anticuerpo de detección), Tago (Cat. No. 4520, Lote No. 1802): Tago, Inc., Burlingame, CA.

n. Solución de ABTS (2,2'-azinobis(3-ácido etilbenztiazolinasulfónico )):

Ácido cítrico 100 mM 20 Na2HP04 250 mM (pH 4.0/1 N HCI)

ABTS 0.5 mg/ml

La solución de ABTS debe mantenerse alejada de la luz ya 4°C. La solución debe ser descartada cuando se vuelve verde.

o. Peróxido de Hidrógeno: se mantiene la solución al 30% alejado de la luz y

Procedimiento.

Todos los pasos siguientes se realizan a temperatura ambiente a menos que se indique específicamente lo contrario. Todas las limpiezas de placas ELISA se realizan aclarando la placa con agua del grifo tres veces, seguido de un aclarado con TBST.

10 Secar la placa con toallas de papel.

Cultivo de Células:

1. Las células, que crecen en una placa de cultivo de tejido (Coming 25020100) hasta una confluencia de 80-90%, son recolectadas con Trypsin-EDTA (0.25%, 0.5 ml/D-100, GIBCO).

15 2. Volver a suspender las células en DMEM fresco + 10% de FBS + 2mM de L-glutamina, y transferir a una placa de cultivo de tejido de 96 pocillos (Coming, 25806-96) a 20,000 células/pocillo (lOO f.ll/pocillo). Incubar durante 1 día, y a

continuación, sustituir el medio con un medio sin suero (90/f.ll) e incubar en 5% de C02 a 37°C durante una noche.

20 Revestimiento y Bloqueo de Placas ELISA:

1. Revestir la placa ELISA (Corning 25805-96) con Anticuerpo Anti-IGF-1R a 0.5 f.lg/pocillo en 100 f.ll de PBS durante al menos 2 horas.

2. Eliminar la solución de revestimiento, y sustituir con 100 ¡..tI de Solución

amortiguadora de Bloqueo, y agitar durante 30 minutos. Eliminar la solución amortiguadora de bloqueo y lavar la placa justo antes de añadir lisato.

Procedimientos de Ensayo

5 1. Los fármacos se prueban bajo condiciones libres de suero.

2. Diluir el concentrado de fármaco (en 100% de DMSO) al 1:10 con DMEM en una placa de polipropileno de 96 pocillos, y transferir 10 ¡..tI/pocillo de esta solución a las células para conseguir una dilución final del fármaco al 1: 100, Y una concentración final de DMSO del 1.0%. Incubar las células en un 5% de CO2 a 37°C durante 2 horas.

10 3. Preparar solución amortiguadora de lisis de células frescas (HNTG*) HNTG 2ml EDTA 0.1 mI

0.1 mI

15 7.3 mI

4. Después de la incubación del fármaco durante dos horas, transferir 10 ¡..tI/pocillo de 200nM de Ligando IGF-l en PBS a las células (La Conc. Final es de 20 nM), e incubar al 5% de C02 a 37°C durante 10 minutos.

5.

Eliminar el medio y añadir 100 ¡..tl/pocillo de HNTG* y agitar durante 10 20 minutos. Observar las células al microscopio para ver si están adecuadamente lisadas.

6. Utilizar una pipeta de 12 canales para raspar las células de la placa, y homogeneizar ellisato mediante aspiración y dispensación repetidas. Transferir todo el lisato a la placa ELISA revestida de anticuerpo, y agitar durante 1 hora.

7.

Eliminar ellisato, lavar la placa, transferir 100 fll/pocillo de anti-pTir (al 5 1 :3,000 con TBST), y agitar durante 30 minutos.

8. Eliminar el anti-pTir, lavar la placa, transferir 100 fll/pocillo de TAGO (al 1 :3,000 con TBST), y agitar durante 30 minutos.

9. Eliminar el anticuerpo de detección, lavar la placa y transferir ABTS/ H202 fresca (1.2 fll de H20 2 a 10 mI ABTS) 100 fll/pocillo a la placa para iniciar el desarrollo 10 del color. Medición de OD a 410 nm con una longitud de onda de referencia de 630 nm en Dynatech MR5000. Ensayo de EGFR La actividad de kinasa de Receptor EGF en células genéticamente 15 manipuladas para expresar EGF-R humano puede medirse tal como se describe más

abajo: Materiales y Reactivos.

a. Ligando de EGF: concentración = 16.5 flM, EGF 201, TOYOBO, Co., Ltd. Japón.

20 b. 05-101 (UBI) (un anticuerpo monoclonal que reconoce un dominio EGFR

extracelular).

c. Anticuerpo anti-fosfotirosina (anti-Ptir) (policlonal).

d. Anticuerpo de detección: conjugado de peroxidasa de rábano picante IgG de Cabra anti-conejo, TAGO, Inc., Burlingame, CA.

e. Solución amortiguadora de TBST:

5 Tris-HCl, pH 7 50 mM NaCl 150 mM Triton X-lOO 0.1

f. Concentración de HNTG 5X: HEPES 0.1 M

10 NaCI 0.75 M Glicerol 50 Triton X-lOO 1.0%

g. Concentración de ABTS: Ácido Cítrico 100 mM

15 Na3V04 250 mM HCI, conc. 4.0pH ABTS* 0.5 mglml Mantener la solución alejada de la luz, a 4°C hasta su uso.

h. Reactivos concentrados de:

EDTA 100 mMpH 7.0

Na3V04 0.5M

Na4(P207) 0.2 M

Procedimiento.

5 Placa ELISA Pre-recubierta

1. Revestir placas ELISA (Coming, 96 pocillos, Cat. #25805-96) con anticuerpo 05-101 a 0.5 /-lg por pocillo en PBS, 150 /-ll de volumen final/pocillo, y almacenar durante la noche a 4°C. Las placas revestidas sirven para hasta 10 días si se almacenan a 4°C.

10 2. En el día de utilización, retirar la solución amortiguadora de revestimiento y sustituir con solución amortiguadora de bloqueo (5% de Leche en polvo sin Grasa Instantánea Camation en PBS). Incubar la placa, agitando, a temperatura ambiente (alrededor de 23 a 25°C) durante 30 minutos. Justo antes de usar, retirar la solución amortiguadora de bloqueo y lavar la placa 4 veces con solución amortiguadora de

15 TBST.

Cultivar Células

1. Puede utilizarse línea de células NIH 3T3/C7 (Honegger, et al., Cell 51:199-209, 1987) para este ensayo.

2. Seleccionar placas que tengan un 80-90% de confluencia para este

20 experimento. Tripsinizar las células y detener la reacción añadiendo un medio CS DMEM al 10%. Suspender las células en el medio DMEM (medio CS DMEM al 10%) y centrifugar una vez a 1000 rpm a temperatura ambiente durante 5 minutos.

3. Volver a suspender las células en el medio de cultivo (DMEM, 0.5% de

suero bovino), y contar las células utilizando trypan azul. La visibilidad resulta aceptable por encima del 90%. Cultivar las células en medio DMEM (0.5% de suero bovino) a una densidad de 10,000 células por pocillo, 100 ¡..tI por pocillo, en una placa

5 de microtitulación de 96 pocillos. Incubar las células cultivadas en un 5% de C02 a 37°C durante unas 40 horas.

Procedimientos de Ensayo.

1. Comprobar la contaminación de las células cultivadas utilizando un microscopio invertido. Diluir la concentración de compuestos de prueba (lO mglml en

10 DMSO) 1:10 en medio DMEM, a continuación transferir 5 ¡..tI a un pocillo de prueba para una dilución de fármacos de compuestos de prueba al 1 :200 y una concentración final de DMSO del 1 %. Los pocillos de control reciben solamente DMSO. Incubar en 5% de CO2a 37°C durante una hora.

2. Preparar ligando EGF: diluir EGF concentrado en DMEM de manera que

15 con la transferencia de 10 ¡..tI de EGF diluido (dilución al 1:12), se consiga una concentración final de 25 nM.

3. Preparar 10 mI de HNTG* fresco suficiente para 100 ¡..tI por pocillo, en que HNTG* comprende: concentrado de HNTG (2.0 mI), milli-Q H20 (7.3 mI), EDTA, 100 mM, pH 7.0 (0.5 mI), Na3V04 0.5 M (0.1 mI) y N~(P207), 0.2 M (0.1 mI).

20 4. Colocar en hielo.

5. Después de dos horas de incubación con fármaco, añadir ligando EGF preparado a las células, 10 ¡..tI por pocillo, para producir una concentración final de 25

nM. Los pocillos de control reciben únicamente DMEM. Incubar y agitar a temperatura

ambiente durante 5 minutos.

6. Retirar el compuesto de prueba, EGF y DMEM. Lavar las células dos veces con PBS. Transferir HNTG* a las células, 100 ~l por pocillo. Colocar en hielo

5 durante 5 minutos. Mientras, retirar la solución amortiguadora de bloqueo de otra placa ELISA y lavar con TBST tal como se describe más arriba.

7. Con una punta de pipeta encajada firmemente a un micropipetador, raspar las células de la placa y homogeneizar el material de las células aspirando y dispensando repetidamente la solución amortiguadora de lisis de HNTG*. Transferir el

10 lisato a una placa ELISA revestida, bloqueada y lavada. Incubar agitando a temperatura ambiente durante una hora.

8. Eliminar ellisato y lavar 4 veces con TBST. Transferir el anticuerpo antiPtir recién diluido a la placa ELISA a 1 00 ~l por pocillo. Incubar agitando a temperatura ambiente durante 30 minutos en presencia del antisuero anti-Ptyr (dilución

15 al1 :3000 en TBST).

9. Eliminar el anticuerpo anti-Ptir y lavar cuatro veces con TBST. Transferir el anticuerpo IgG anti-conejo TAGO 30 recién diluido a la placa ELISA a 100 ~l por pocillo. Incubar agitando a temperatura ambiente durante 30 minutos (anticuerpo IgG anti-conejo: dilución al 1 :3000 en TBST).

20 10. Eliminar el anticuerpo de detección y lavar 4 veces con TBST. Transferir la solución de ABTS/ H202 recién preparada a la placa ELISA, 1 00 ~l por pocillo. Incubar a temperatura ambiente durante 20 minutos. Solución de ABTS/ H202: 1.2 ~l al 30% de H202 en 10 mI de ABTS concentrado.

11.

Detener la reacción añadiendo 50 /-tI de 5N H2S04 (opcional), y determinar el O.D. a 410 nm.

12.

La señal máxima de fosfotirosina se determina restando el valor de los controles negativos de los controles positivos. A continuación se calcula el porcentaje

5 de inhibición del contenido de fosfotirosina para los pocillos que contienen extracto, después de restar los controles negativos.

Ensayo de Autofosforilación de Met

Este ensayo determina la actividad de Met tirosina kinasa analizando los niveles de Met proteína tirosina kinasa en el receptor Met.

10 Reactivos

a. HNTG (solución concentrada 5X): Disolver 23.83 g de HEPES y 43.83 g de NaCI en unos 350 mI de dH20. Ajustar el pH a 7.2 con HCI o NaOH, añadir 500 mI de glicerol y 10 mI de Triton X-lOO, mezclar, añadir dH20 a 1 L de volumen total. Para preparar 1 L de solución de trabajo IX añadir 200 mI de 5X solución concentrada a 800

15 mI de dH20, comprobar y ajustar el pH según necesidad, almacenar a 4°C.

b. PBS (Salino, en Solución Amortiguadora de Fosfato de Dulbecco), Gibco Cat. # 4501300EB (solución IX).

c. Solución amortiguadora de bloqueo: en 500 mI de dH20 colocar 100 g de

BSA, 12.1 g de Tris-pH7.5, 58.44 g de NaCI y 10 mI de Tween-20, diluir a 1 L de 20 volumen total.

d. Solución amortiguadora de Kinasa: A 500 mI de dH20 añadir 12.1 g de TRIS (pH 7.2), 58.4 g de NaCI, 40.7 g de MgCh y 1.9 g de EGTA, llevar a 1 L de volumen total con dH20.

e. PMSF (Fluoruro de fenilmetilsulfonil), Sigma Cat. # P-7626, a 435.5 mg,

añadir 100% de etanol hasta un volumen total de 25 mI, remover.

f. ATP (Fuente Bacteriana), Sigma Cat. # A-7699, almacenar polvo a -20°C, para crear la solución para uso, disolver 3.31 mg en 1 mI de dH20.

5 g. RC-20H HRPO Anti-Fosfotirosina conjugada, Transduction Laboratories, Catálogo. # E120H.

h. Pierce I_StepTM Turbo TMB-ELISA (3,3',5,5'-tetrametilbenzidina, Pierce, Catálogo. # 34022.

i. H2S04, añadir 1 mI de conc. (18 N) a 35 mI de dH20.

10 j. TRIS HCL, Fischer Cat. # BPI52-5, a 121.14 g de material, añadir 600 mI de MilliQ H20, ajustar el pH a 7.5 (o 7.2) con HCI, llevar volumen a 1 L con MilliQ

H20.

k. NaCI, Fischer Cat. # S271-10, preparar 5M de solución.

1. Tween-20, Fischer Cat. # S337-500.

15 m. Na3V04, Fischer Cat. # S454-50, a 1.8 g de material añadir 80 mI de MilliQ H20, ajustar el pH a 10.0 con HCI o NaOH, hervir en microondas, enfriar, comprobar el pH, repetir el proceso hasta que el pH se estabilice a 10.0, añadir MilliQ H20 a 100 mI de volumen total, hacer partes alícuotas de 1 mI y almacenar a -80°C.

n. MgCh, Fischer Cat. # M33-500, preparar 1M de solución.

20 o. HEPES, Fischer Cat. # BP31 0-500, a 200 mI de MilliQ H20, añadir 59.6 g de material, ajustar el pH a 7.5, llevar el volumen a un total de 250 mI, fitrar con fltro estéril.

p.

Albumina, Bovina (BSA), Sigma Cat. # A-4503, a 30 gramos de material añadir agua destilada estéril para alcanzar un volumen total de 300 mI, almacenar a 4°C.

q.

Solución amortiguadora de TBST: a aprox. 900 mI de dH20 en un cilindro graduado de 1 L añadir 6.057 g de TRIS y 8.766 g de NaCl, cuando se disuelva, ajustar

5 el pH a 7.2 con HCI, añadir 1.0 mI de Triton X-lOO y llevar al L de volumen total con dH20.

r. IgG de Conejo Anticuerpo Purificado con Afinidad de Cabra (molécula completa), Cappel Cat. # 55641.

s. Anti h-Met (C-28), anticuerpo IgG policlonal de coneJo, Santa Cruz 10 Chemical Cat. # SC-161.

t.

EGFR Transitoriamente Transfectado EGFRlCélulas quiméricas Met (EMR) (Komada, et al., Oncogene, 8:2381-2390 (1993).

u.

Solución amortiguadora de Carbonato de Sodio, (Na2C04, Fischer Cat. # S495): a 10.6 g de material añadir 800 mI de MilliQ H20, cuando se disuelva, ajustar el

15 pH a 9.6 con NaOH, llevar a 1 L de volumen total con MilliQ H20, filtrar, almacenar a 4°C.

Procedimiento

Todos los pasos siguientes se realizan a temperatura ambiente a menos que se indique específicamente lo contrario. Todos los lavados de placas ELISA son aclarando 20 4X con TBST.

Lisis de EMR

Este procedimiento puede realizarse la noche anterior o inmediatamente antes de iniciar la captura del receptor.

1. Descongelar rápidamente los lisatos en un baño de agua a 37°C con un 5 movimiento de remolino hasta que desaparezcan los últimos cristales.

2. Lisar las bolitas de células con IX HNTG que contenga 1 mM de PMSF. Utilizar 3 mI de HNTG por cada placa de células de 15 cm. Añadir 1/2 del volumen de HNTG calculado, remover el tubo durante 1 min., añadir la cantidad restante de HNTG, remover durante otro mino

10 3. Equilibrar los tubos, centrifugar a 10,000 x g durante 10 min a 4°C.

4. Agrupar los sobrenadantes, retirar una parte alícuota para la determinación de proteína.

5. Congelar rápidamente la muestra recogida en un baño de hielo seco/etanol.

Esta fase se realiza sin tener en cuenta si el lisado será almacenado durante toda una 15 noche o si se utilizará inmediatamente después de la determinación de la proteína.

6. Realizar la determinación de la proteína utilizando el método del ácido bicinconínico (BCA) estándar (Kit de Reactivos de Ensayo BCA de Pierce Chemical Cat. # 23225).

Procedimiento ELISA

20 1. Revestir placas ELISA de 96 pocillos de Coming con 5 Jlg por pocillo anticuerpo anti-conejo de cabra en una solución amortiguadora de Carbonato para un volumen total de pocillo de 50 Jll. Almacenar durante toda una noche a 4°C.

2. Eliminar el anticuerpo anti-conejo de cabra no enlazado invirtiendo la

placa para eliminar líquido.

3. Añadir 150 J.ll de Solución Amortiguadora de Bloqueo a cada pocillo. Incubar durante 30 mino Agitar.

5 4. Lavar 4X con TBST. Golpear ligeramente la placa sobre una toalla de papel para eliminar el exceso de líquido y las burbujas.

5. Añadir 1 J.lg por pocillo de anticuerpo anti-Met de conejo en TBST para un volumen total de 100 J.ll.

6. Diluir ellisato en HNTG (90 J.lg de lisatoll 00 J.ll)

10 7. Añadir 100 J.ll de lisato diluido a cada pocillo. Agitar durante 60 mino

8. Lavar 4X con TBST. Golpear ligeramente la placa sobre una toalla de papel para eliminar el exceso de líquido y las burbujas.

9. Añadir 50 J.ll de IX solución amortiguadora de lisato por pocillo.

10. Diluir los compuestos/extractos al 1:10 en IX Solución Amortiguadora de 15 Kinasa en una placa de polipropileno de 96 pocillos.

11.

Transferir 5.5 J.ll de compuesto diluido a pocillos de placas ELISA. Incubar a temperatura ambiente agitando durante 20 mino

12.

Añadir 5.5 J.ll de solución de ATP de 60 J.lM por pocillo. Los controles negativos no reciben ATP. Incubar durante 90 min., agitando.

20 13. Lavar 4X con TBST. Golpear ligeramente la placa sobre una toalla de papel para eliminar el exceso de líquido y las burbujas.

14.

Añadir 100 ,....1 por pocillo de RC20 (dilución al 1 :3000 en Solución Amortiguadora de Bloqueo). Incubar 30 mino Agitar.

15.

Lavar 4X con TBST. Golpear ligeramente la placa sobre una toalla de papel para eliminar el exceso de líquido y las burbujas.

5 16. Añadir 100 ,....1 por pocillo de Turbo-TMB. Incubar agitando durante 30-60 mm.

17. Añadir 100,....1 por pocillo de 1M H2S04 para detener la reacción.

18. Leer el ensayo en el lector de ELISA Dynatech MR7000. Filtro de Prueba = 450 nm, filtro de referencia = 410 nm. 10 Ensayo de src bioquímico Este ensayo se utiliza para determinar la actividad de proteína kinasa de src

midiendo la fosforilación de un péptido biotinilado como lectura de salida. Materiales y Reactivos:

a. Levadura transformada con src (Sugen, Inc., Redwood City, California).

15 b. Lisatos de célula: las células de levadura que expresan src son convertidas en bolitas, lavadas una vez con agua, vueltas a convertir en bolitas y almacenadas a 80°C hasta su uso.

c. Se prepara EEEYEEYEEEYEEEYEEEY biotinilado N-terminus mediante

procedimientos estándar, bien conocidos por aquellas personas con conocimientos sobre 20 el tema.

d.

DMSO: Sigma, St. Louis, MO.

e.

Placa ELISA de 96 Pocillos: Placas de Fondo Plano Modificadas de Fácil

Lavado de 96 Pocillos Corning, Corning Cato #25805-96.

f. Placas de polipropileno de fondo en V de 96 pocillos NUNC para la dilución de compuestos: Applied Scientific Cato # A-72092.

5 g. Reactivo Vecastain ELITE ABC: Vector, Burlingame, CA.

h. Mab Anti-src (327): se utiliza Schizosaccharomyces Pombe para expresar el Src recombinante (Superti-Furga, et al., EMBO J., 12:2625-2634, Superti-Furga, et al., Nature Biochem., 14:600-605). Se cultiva una cepa de S. Pombe SP200 (h-s leu1.32 ura4 ade210) tal como se describe, y las transformaciones de plásmidos de expresión

10 pRSP se realizan mediante el método de acetato de litio (Superti-Furga, supra). Las células se cultivan en presencia de 1 /-lM de tiamina para reprimir la expresión del promotor nmtl o en ausencia de tiamina para inducir la expresión.

i. Anti-fosfotirosina monoclonal, UBI 05-321 (puede utilizarse UB40 como alternativa).

15 j. Substrato de peroxidasaTurbo TMB-ELISA: Pierce Chemical.

Soluciones Amortiguadoras

a. PBS (Salina con Solución Amortiguadora de Fosfato de Dulbecco): GIBCO PBS, GIBCO Cato # 450-1300EB.

b. Solución Amortiguadora de Bloqueo: 5% Leche sin grasa (Camation) en 20 PBS.

c. Solución Amortiguadora de Carbonato: Na2C04 de Fischer, Cato # S495, preparar 100 mM de solución concentrada.

d. Solución Amortiguadora de Kinasa: 1.0 mI (a partir de 1M de solución

concentrada) de MgCh, 0.2 mI (a partir de 1M de solución concentrada) de MnCh, 0.2 mI (a partir de 1M de solución concentrada) de DTT, 5.0 mI de HEPES (a partir de 1M de solución concentrada), 0.1 mI de TX-100, llevar a 10 mI de volumen total con MilliQ

5 H20.

e. Solución Amortiguadora de Lisis: 5.0 de HEPES (a partir de 1M de solución concentrada.), 2.74 mI de NaCI (a partir de 5M de solución concentrada), 10 mI de glicerol, 1.0 mI de TX-100, 0.4 mI de EDTA (a partir de 100 mM de solución concentrada), 1.0 mI de PMSF (a partir de 100 mM de solución concentrada), 0.1 mI de

10 Na3V04 (a partir de 0.1 M de solución concentrada), llevar a 100 mI de volumen total con MilliQ H20.

f. ATP: Sigma Cato # A-7699, preparar 10 mM de solución concentrada (5.51 mg/ml).

g. TRIS-HCI: Fischer Cato # BP 152-5, a 600 mI MilliQ H20 añadir 121.14 g

15 de material, ajustar el pH a 7.5 con HCI, llevar a 1 L de volumen total con MilliQ H20 H20.

h. NaCl: Fischer Cato # S271-1O, Preparar 5M de solución concentrada con MilliQ H20.

i. Na3V04: Fischer Cato # S454-50, a 80 mI de MilliQ H20, añadir 1.8 g de

20 material, ajustar el pH a 10.0 con HCI o NaOH, hervir en un microondas, enfriar, comprobar el pH, repetir el ajuste de pH hasta que el pH permanezca estable después del ciclo de calentar/enfriar, llevar a 100 mI de volumen total con MilliQ H20, hacer partes alícuotas de 1 mI y almacenar a -80°C.

j. MgCI2: Fischer Cat. # M33-500, preparar 1M de solución concentrada con

Milli(2 1I2().

k. lIEPES: Fischer Cat. # BP 310-500, a 200 mI Milli(2 1I2(), añadir 59.6 g de

material, ajustar el plI a 7.5, llevar a 250 mI de volumen total con Milli(2 1I2(), filtro 5 estéril (1 M de solución concentrada).

1. Solución Amortiguadora de TBST: Solución Amortiguadora de TBST: A 900 mI d1I2() añadir 6.057 g de TRIS 8.766 g de NaCI, ajustar el plI a 7.2 con lICI, añadir 1.0 mI de Triton-XI00, llevar a 1 L de volumen total con d1I2().

m. MnCh: Fischer Cat. # M87-100, preparar 1M de solución concentrada con Milli(2 10 1I2().

n. DTT: Fischer Cat. # BPI72-5.

o. TBS (Salina de Solución Amortiguadora de TRIS): a 900 mI de Milli(2 1I2() añadir 6.057 g de TRIS y 8.777 g de NaCI, llevar a lL de volumen total con Milli(2 1I2().

15 p. Mezcla de Reacción de Kinasa: Cantidad por placa de ensayo (100 pocillos): 1.0 mI de Solución Amortiguadora de Kinasa, 200 Ilg de GST-~, llevar a un volumen final de 8.0 mI con Milli(2 1I2().

q. EEEYEEYEEEYEEEYEEEY Etiquetado con Biotina: Preparar una solución péptida concentrada (lmM, 2.98 mg/ml) en agua potable justo antes de usar.

20 r. Reactivo Vectastain ELITE ABC: Para preparar 14 mI de reactivo de trabajo, añadir 1 gota de reactivo A a 15 mI de TBST e invertir varias veces para que se mezcle. A continuación, añadir una gota del reactivo B. Poner el tubo en el agitador orbital a temperatura ambiente y mezclar durante 30 minutos.

Procedimientos:

Preparación de placa ELISA revestida con src.

1. Revestir la placa ELISA con 0.5 J.lg/pocillo de mab anti-src en 100 J.ll de

pH 9.6 de solución amortiguadiora de carbonato de sodio, mantener a 4°C durante toda 5 una noche.

2. Lavar los pocillos una vez con PBS.

3. Bloquear la placa con 0.15 mI de leche al 5% en PBS durante 30 mino a temperatura ambiente.

4. Lavar la placa 5X con PBS.

10 5. Añadir 10 J.lg/pocillo de lisatos de levadura transformados con src diluidos en Solución Amortiguadora de Lisis (0.1 mI de volumen total por pocillo). (La cantidad de lisato puede variar entre los diferentes lotes.) Agitar la placa durante 20 minutos a temperatura ambiente.

Preparación de placa ELISA revestida con anticuerpo de fosfotirosina.

15 1. placa 4G 10: revestir 0.5 J.lg/pocillo de 4G lOen 100 J.lI de PBS durante una noche a 4°C y bloquear con 150 J.lI de leche al 5% en PBS durante 30 minutos a temperatura ambiente.

Procedimiento de ensayo de Kinasa.

1. Eliminar las proteínas no enlazadas de las placas y lavar las placas 5X con 20 PBS.

2. Añadir 0.08 mI de Mezcla de Reacción de Kinasa por pocillo (que

contengan 10 ¡..tI de 10X Solución Amortiguadora de Kinasa y 10 ¡..tM de biotinaEEEYREYEEEYEEEYEEEY por pocillo diluida en agua (concentración final).

3. Añadir 10 ¡..tI de compuesto diluido en agua que contenga un 10% de 5 DMSO y pre-incubar durante 15 minutos a temperatura ambiente.

4. Iniciar la reacción de kinasa añadiendo 10 ¡..tl/pocillo de 0.05 mM de ATP en agua (5 ¡..tM de ATP final).

5.

Agitar la placa ELISA durante 15 mino a temperatura ambiente.

6.

Detener la reacción de kinasa añadiendo 10 ¡..tI 0.5 M de EDTA por pocillo.

10 7. Transferir 90 ¡..tI de sobrenadante a una placa ELISA revestida con 4G 10 bloqueado.

8.

Incubar durante 30 mino mientras se agita a temperatura ambiente.

9.

Lavar la placa 5X con TBST.

10. Incubar con Vectastain ELITE ABe Reactivo (100 ¡..tI/pocillo) durante 30 15 mino a temperatura ambiente.

11.

Lavar los pocillos 5X con TBST.

12.

Desarrollar con Turbo TMB.

Ensayo Bioquímico de lck

Este ensayo se utiliza para determinar las actividades de la proteína kinasa lck 20 midiendo la fosforilación de GST -1; como lectura de salida.

Materiales y Reactivos:

a. Levadura transformada con lck. Se utiliza schizosaccharomyces Pombe para expresar el Lck recombinante (Superti-Furga, et al., EMBO J, 12:2625-2634, Superti-Furga, et al., Nature Biotech., 14:600-605). Se cultiva una cepa de S. Pombe

5 SP200 (h-s leul.32 ura4 ade210) tal como se describe, y se realizan transformaciones con plásmidos de expresión de pRSP mediante el método de acetato de litio (SupertiFurga, supra). Las células se cultivan en presencia de 1 flM de tiamina para inducir la expresión.

b. Lisatos de células: Las células de levadura que expresan lck se transforman

lOen bolitas, se lavan una vez en agua, se vuelven a convertir en bolitas y se almacenan congeladas a -80°C hasta su uso.

c. GST-~: codificación de ADN para proteína de fusión GST -~ para su expresión en bacteria obtenida de Arthur Weiss del Howard Hughes Medical Institute en la University of California, San Francisco. Las bacterias transformadas se cultivan

15 durante una noche mientras se agitan a 25°C. El GST-~ es purificado mediante cromatografia de afinidad de glutationa, Pharmacia, Alameda, CA.

d. DMSO: Sigma, St. Louis, MO.

e. Placa ELISA de 96 pocillos: Placa de Fondo Plano Modificado de Fácil Limpieza de 96 Pocillos Corning, Cat. #25805-96 de Corning.

20 f. Placas de polipropileno de fondo en V de 96 pocillos NUNC para la dilución de compuestos. Applied Scientific Cat. # AS-72092.

g. Antisuero anti-GST de Conejo Purificado: Amrad Corporation (Australia) Cat. #90001605.

h.

IgG-HRP anti-conejo de Cabra: Amersham Cato # V010301.

i.

IgG anti-ratón de oveja (H+L): Jackson Labs Cato # 5215-005-003.

j.

Mab Anti-Lck (3A5): Santa Cruz Biotechnology Cat # sc-433.

k. UBI 05-321 Anti-fosfotirosina monoclonal (puede utilizarse UB40 como 5 alternativa).

Soluciones Amortiguadoras:

a. Solución PBS (Salina con Solución Amortiguadora de Dulbecco) IX: GIBCO PBS, GIBCO Cato # 450-1300EB.

b. Solución Amortiguadora de Bloqueo: 100 g. de BSA, 12.1 g. de TRIS 10 (pH7.5), 58.44 g de NaCI, 10 mI de Tween-20, llevar a 1 L de volumen total con MilliQ

H20.

c. Solución Amortiguadora de Carbonato: Na2C04 de Fischer, Cato # S495, preparar 100 mM de solución con MilliQ H20.

d. Solución amortiguadora de kinasa: 1.0 mI (a partir de 1M de solución

15 concentrada) de MgCh, 0.2 mI (a partir de 1M de solución concentrada) de MnCh, 0.2 mI (a partir de 1M de solución concentrada) de DTT, 5.0 mI (a partir de 1M de solución concentrada) HEPES, 0.1 mI TX-100, llevar a 10 mI de solución total con MilliQ H20.

e. Solución amortiguadora de lisis: 5.0 HEPES (a partir de 1M de solución concentrada.), 2.74 mI de NaCI (a partir de 5M de solución concentrada), 10 mI de

20 glicerol, 1.0 mI de TX-100, 0.4 mI de EDTA (a partir de 100 mM de solución concentrada), 1.0 mI de PMSF (a partir de 100 mM de solución concentrada), 0.1 mI de

Na3V04 (a partir de 0.1 M de solución concentrada), llevar a un volumen total de 100

mI con MilliQ H20.

f. ATP: Sigma Cat. # A-7699, preparar 10 mM de solución concentrada (5.51 mg/ml).

5 g TRIS-HCl: Fischer Cato # BP 152-5, a 600 mI de MilliQ H20 añadir 121.14 g de material, ajustar el pH a 7.5 con HCI, llevar a 1 L de volumen total con MilliQ H20.

h. NaCI: Fischer Cat. # S271-1O, Preparar 5M de solución concentrada con MilliQ H20.

10 i Na3V04: Fischer Cat. # S454-50, a 80 mI MilliQ H20, añadir 1.8 g de material, ajustar el pH a 10.0 con HCI o NaOH, hervir en microondas, enfriar, comprobar el pH, repetir el ajuste de pH hasta que el pH permanezca estable después del ciclo de calentar/enfriar, llevar a un volumen total de 100 mI con MilliQ H20, hacer partes alícuotas de 1 mI y almacenar a -80°C.

15 j. MgCI2: Fischer Cat. # M33-500, preparar 1M de solución concentrada con MilliQ H20.

k. HEPES: Fischer Cat. # BP 310-500, a 200 mI de MilliQ H20, añadir 59.6 g de material, ajustar el pH a 7.5, llevar a un volumen total de 250 mI con MilliQ H20, filtro estéril (1M de solución concentrada).

20 1. Albumina, Bovina (BSA), Sigma Cat. # A4503, a 150 mI de MilliQ H20 añadir 30 g de material, llevar a 300 mI de volumen total con MilliQ H20 filtrar a través de un filtro de 0.22 ¡..tm, almacenar a 4°C.

m. Solución Amortiguadora de TBST: A 900 mI de dH20 añadir 6.057 g de

TRIS y 8.766 g de NaCI, ajustar el pH a 7.2 con HCI, añadir 1.0 mI de Triton-XlOO, llevar a un volumen total de 1 L con dH20.

n. MnCI2: Fischer Cat. # M87-100, preparar 1M de solución concentrada con 5 MilliQ H20.

o. DTT: Fischer Cat. # BP172-5.

p. TBS (Salina de Solución Amortiguadora de TRIS): a 900 mI de MilliQ H20 añadir 6.057 g de TRIS y 8.777 g de NaCl, llevar a 1 L de volumen total con MilliQ H20.

10 q. Mezcla de Reacción de Kinasa: Cantidad por placa de ensayo (lOO pocillos): 1.0 mI Solución amortiguadora de kinasa, 200 J.lg de GST-~, llevar a un volumen final de 8.0 mI con MilliQ H20.

Procedimientos: Preparación de placa ELISA revestida con Lck.

15 1. Revestir 2.0 J.lg/pocillo IgC anti-ratón de oveja en 100 J.lI de pH 9.6 de solución amortiguadora de carbonato de sodio a 4°C durante toda una noche.

2. Lavar en profundidad una vez con PBS.

3. Bloquear la placa con 0.15 mI de solución amortiguadora de bloqueo durante 30 mino a temperatura ambiente.

20 4. Lavar la placa 5X con PBS.

5. Añadir 0.5 f.lg/pocillo de anti-1ck (mab 3A5) en 0.1 mI de PBS a temperatura ambiente durante 1-2 horas.

6.

Lavar la placa 5X con PBS.

7.

Añadir 20 f.lg/pocillo de lisatos de levadura transformados con lck diluidos

5 en Solución amortiguadora de lisis (0.1 mI de volumen total por pocillo). Agitar la placa a 4°C durante una noche para impedir la pérdida de actividad.

Preparación de placa ELISA revestida con anticuerpo de fosfotirosina.

1. Placa de UB40: 1.0 f.lg/pocillo de UB40 en 100 f.ll de PBS durante una

noche a 4°C y bloquear con 150 f.ll de Solución Amortiguadora de bloqueo durante al 10 menos 1 hora.

Procedimiento de ensayo de Kinasa.

1. Eliminar las proteínas no enlazadas de las placas y lavar las placas 5X con PBS.

2. Añadir 0.08 mI de Mezcla de Reacción de Kinasa por pocillo (que

15 contenga 10 f.ll de 10X Solución amortiguadora de kinasa y 2 f.lg de GST -~ por pocillo diluido con agua).

3. Añadir 10 f.ll de compuesto diluido en agua que contenga un 10% de DMSO y preincubar durante 15 minutos a temperatura ambiente.

4. Iniciar la reacción de kinasa añadiendo 10f.lI/pocillo de 0.1 mM de ATP en 20 agua (lO f.lM A TP final).

5.

Agitar la placa ELISA durante 60 mino a temperatura ambiente.

6.

Detener la reacción de kinasa añadiendo 10 ¡..tI de 0.5 M EDTA por pocillo.

7. Transferir 90 ¡..tI de sobrenadante a una placa ELISA revestida con 4G 10 bloqueado de la sección B, más arriba.

8. Incubar mientras se agita durante 30 mino a temperatura ambiente.

5 9. Lavar la placa 5X con TBST.

10. Incubar con anticuerpo anti-GST de conejo en una dilución al 1 :5000 en 100 ¡..tI de TBST durante 30 mino a temperatura ambiente.

11. Lavar los pocillos 5X con TBST.

12. Incubar con IgG-HRP anti-conejo de cabra en una dilución al1 :20,000 en 10 100 ¡..tI de TBST for 30 mino a temperatura ambiente.

13.

Lavar los pocillos 5X con TBST.

14.

Desarrollar con Turbo TMB.

Ensayo que mide la función de fosforilación de RAF.

El ensayo siguiente informa sobre la cantidad de fosforilación catalizada por

15 RAF de su proteína objetivo MEK, así como del objetivo MAPK de MEK. La secuencia genética de RAF se describe en Bonner et al., 1985, Molec. Cell. Biol., 5:1400-1407, y es fácilmente accesible en múltiples bancos de datos de secuencia genética. La construcción del vector de ácido nuc1eico y de las líneas de células utilizadas para esta parte de la invención están descritas plenamente en Morrison et al., 1988, Proc. Natl.

20 Acad. Sci. USA, 85:8855-8859.

Materiales y Reactivos

1. Células Sf9 (Spodoptera frugiperda), GIBCO-BRL, Gaithersburg, MD.

2. Solución amortiguadora de RIPA: 20 mM de Tris/HCI pH 7.4, 137 mM de NaCl, 10% de glicerol, 1 mM de PMSF, 5 mg/L de Aprotenina, 0.5 % de Triton X-lOO,

5 3. Proteína de fusión tioredoxina-MEK (T-MEK): la expresión y purificación de T-MEK mediante cromatografía de afinidad se realizan de acuerdo con los procedimientos del fabricante. Catalogos# K 350-01 Y R 350-40, Invitrogen Corp., San Diego, CA

4. His-MAPK (ERK 2), El MAPK etiquetado con His se expresa en las

10 células XLI Blue transformadas con His-MAPK de codificación de vector pUC18. El His-MAPK es purificado mediante cromatografía de afinidad Ni. Cat# 27-4949-01, Pharmacia, Alameda, CA, tal como se describe en el presente documento.

5. IgG anti-ratón de oveja: Jackson laboratories, West Grove, PA. Catálogo, # 515-006008, Lote# 28563

15 6. Anticuerpo específico de proteína kinasa RAF-1: URP2653 de UBI.

7.

Solución amortiguadora de revestimiento: salina, con solución amortiguadora con PBS y fosfato, GIBCO-BRL, Gaithersburg, MD.

8.

Solución amortiguadora de lavado: TBST (50 mM de TrislHCL pH 7.2, 150 mM de NaCl, 0.1 % de Triton X-lOO).

20 9. Solución amortiguadora de bloqueo: TBST, 0.1 % de etanolamina pH 7.4

10.

DMSO, Sigma, St. Louis, MO

11.

Solución amortiguadora de kinasa (KB): 20 mM de HEPESIHCl pH 7.2,

150 mM de NaCl, 0.1 % de Triton X-lOO, 1 mM de PMSF, 5 mg/L de Aprotenina, 75 mM de ortovanadato de sodio, 0.5 MM de DTT y 10 mM de MgCh.

12.

Mezcla de ATP: 100 mM de MgCh, 300 mM de ATP, 10 mCi X33p ATP 5 (Dupont-NEN)/mL.

13.

Solución de detención: 1 % de ácido fosfórico, Fisher, Pittsburgh, P A.

14.

Mats de Filtro de Fosfato Celulosa Wallac, Wallac, Turku, Finlandia.

15.

Solución Filtro Lavado: 1 % de ácido fosfórico, Fisher, Pittsburgh, P A.

16.

Recolector de placa Tomtec, Wallac, Turku, Finlandia. 10 17. Lector de placa beta Wallac # 1205, Wallac, Turku, Finlandia.

18. Placas de polipropileno para compuestos de fondo en V, de 96 pocillos NUNC Applied Scientific, Catálogo # AS-72092.

Procedimiento

Todos los pasos siguientes se realizan a temperatura ambiente a menos que se 15 indique específicamente lo contrario.

1. Revestimiento placa ELISA: los pocillos ELISA están revestidos con 100 mI de antisuero purificado de afinidad anti-ratón de oveja (1 mg/100 mL de solución amortiguadora de revestimiento) durante una noche a 4°C. Las placas ELISA pueden utilizarse durante dos semanas cuando se almacenan a 4°C.

20 2. Invertir la placa y eliminar el líquido. Añadir 100 mL de solución de bloqueo e incubar durante 30 mino

3. Eliminar la solución de bloqueo y lavar cuatro veces con solución

amortiguadora de lavado. Golpear ligeramente la placa sobre una toalla de papel para eliminar el exceso de líquido.

4. Añadir 1 mg de anticuerpo específico para RAF-l a cada pocillo e incubar 5 durante 1 hora. Lavar tal como se describe en la fase 3.

5. Fundir los lisatos de las células Sf9 infectadas con RASIRAF y diluir con TBST hasta 10 mgll00 mL. Añadir 10 mg de lisato diluido a los pocillos e incubar durante 1 hora. Agitar la placa durante la incubación. Los controles negativos no reciben lisato. Los lisatos de las células de insecto Sf9 infectadas con RASIRAF se

10 preparan después que las células sean infectadas con baculovirus recombinantes a un MOl de 5 para cada virus, y son recolectados 48 horas más tarde. Las células se lavan una vez con PBS y son lisados en solución amortiguadora de RIP A. El material no soluble se elimina por centrifugación (5 min a 10,000 x g). Se congelan partes alícuotas de lisatos en hielo seco/etano y se almacenan a -80°C hasta su uso.

15 6. Eliminar el material no enlazado y lavar tal como se ha indicado más arriba (fase 3).

7. Añadir 2 mg de T-MEK y 2 mg de His-MAEPK por pocillo y ajustar el volumen a 40 mI con solución amortiguadora de kinasa. Los métodos para purificar TMEK Y MAPK de los extractos de célula se proporcionan en el presente documento en

20 forma de ejemplo.

8.

Pre-diluir los compuestos (solución concentrada 10 mg/ml de DMSO) o extractos 20 veces en TBST más 1% de DMSO. Añadir 5 mI de los compuestos/extractos pred-diluidos a los pocillos descritos en la fase 6. Incubar durante 20 mino Los controles no reciben ningún fármaco.

9.

Iniciar la reacción de kinasa añadiendo 5 mI de mezcla de ATP, Agitar las placas en una placa ELISA durante la incubación.

10.

Detener la reacción de kinasa al cabo de 60 minutos añadiendo 30 mL de solución de detención a cada pocillo.

5 11. Colocar el mat de fosfocelulosa y la placa ELISA en el recolector de placa Tomtec. Recoger y lavar el filtro con la solución de lavado de filtro, de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Secar los mats de filtro. Sellar los mats de filtro y colocarlos en el soporte. Insertar el soporte en el aparato de detección de radioactividad y cuantificar el fósforo radio activo en los mats de filtro.

10 Como alternativa, pueden transferirse partes alícuotas de 40 mL de pocillos individuales de la placa de ensayo a las posiciones correspondientes en el mat de filtro de fosfocelulosa. Después de secar con aire los filtros, poner los filtros en una bandeja. Balancear suavemente la bandeja, cambiando la solución de lavado en intervalos de 15 minutos durante 1 hora. Secar con aire los mats de filtro. Sellar los mats de filtro y

15 colocarlos en un soporte adecuado para medir el fósforo radioactivo en las muestras. Insertar el soporte en un dispositivo de detección y cuantificar el fósforo radioactivo en los mats de filtro.

CDK2/Ciclina A -Ensayo de Inhibición

Este ensayo analiza la actividad de la proteína kinasa de CDK2 en substrato 20 exógeno.

Reactivos:

A. Solución Amortiguadora A: (80 mM de Tris (pH 7.2), 40 mM de MgCh),

4.84 g. de Tris (F.W. =121.1 g/mol), 4.07 g. de MgCh (F.W.=203.31 g/mol) disueltos en 500 mI de H20. Ajustar el pH a 7.2 con HCl.

5 B. Solución de Histone H1 (0.45 mg/ml de Histone H1 y 20 mM de HEPES, pH 7.2: 5 mg de Histone H1 (Boehinger Mannheim) en 11.111 mI 20 mM de HEPES, pH 7.2 (477 mg de HEPES (F.W.= 238.3 g/mol) disueltos en 100 mI de dH20, almacenados en partes alícuotas de 1 mI a -80°C.

C. Solución de ATP (60 JlM de ATP, 300 Jlg/ml de BSA, 3 mM de DTT):

10 120 JlI 10 mM de ATP, 600 JlI 10 mg/ml de BSA a 20 mI, almacenados en partes alícuotas de 1 mI a -80°C.

D. Solución de CDK2: cdk2/ciclina A en 10 mM de HEPES, pH 7.2, 25 mM de NaCI, 0.5 mM de DTT, 10% de glicerol, almacenado en partes alícuotas de 9 JlI a 80°C.

15 Protocolo

1.

Preparar soluciones de inhibidores a tres veces la concentración final deseada del ensayo en dH20/15% de DMSO por volumen.

2.

Dispensar 20 JlI de inhibidores a los pocillos de las placas de polipropileno de 96 pocillos (o 20 JlI al 15% de DMSO para controles positivos y negativos).

20 3. Fundir la solución Histone HI (1 mI/placa), la solución ATP (1 ml/placa más 1 parte alícuota para el control negativo), y la solución CDK2 (9 JlI/placa).

Mantener el CDK2 en hielo hasta su uso. Repartir adecuadamente en partes alícuotas la

solución de CDK2 para evitar ciclos repetidos de congelación/fusión.

4. Diluir 9 /-tI de solución de CDK2 en 2.1 mI de Solución Amortiguadora A (por placa). Mezclar. Dispensar 20 /-tI en cada pocillo.

5 5. Mezclar 1 mI de solución de Histona H1 con 1 mI de solución de ATP (por placa) en un tubo con tapón de rosca de 10 ml. Añadir i 3p ATP a una concentración de

0.15 /-tCi/20 /-tI (0.15 /-tCi/pocillo en ensayo). Mezclar cuidadosamente para evitar la espumación del BSA. Añadir 20 /-tI a los pocillos adecuados. Mezclar las placas en el agitador de placas. Para el control negativo, mezclar la solución de ATP con una

10 cantidad igual de 20 mM HEPES, pH 7.2 y añadir y33p ATP a una concentración de una solución de 0.15 /-tCi/20 /-tl. Añadir 20 /-tI a los pocillos adecuados.

6. Dejar que se produzcan las reaciones durante 60 minutos.

7. Añadir 35 /-tI al 10% de TCA a cada pocillo. Mezclar las placas en el agitador de placas.

15 8. Colocar 40 /-tI de cada muestra en cuadrados de mat de filtro P30. Dejar que los mats se sequen (aprox. 10-20 minutos).

9. Lavar los mats de filtro 4 X 10 minutos con 250 mI al 1 % de ácido fosfórico (10 mI de ácido fosfórico por litro de dH20).

10. Contar los mats de filtro con el lector de placas beta. 20

Ensayos CelulareslBiológicos

Ensayo de Incorporación de BrdU Inducido por PDGF Materiales y reactivos:

(1) PDGF: PDGF B/B humano, 1276-956, Boehringer Mannheim, Alemania.

5 (2) Reactivo de Etiquetado BrdU: 10 mM, en PBS (pH7.4), Cat. No. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Alemania.

(3) FixDenat: solución de fijación (lista para usar), Cat. No. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Alemania.

(4) Anti-BrdU-POD: Anticuerpo monoclonal de ratón conjugado con 10 peroxidasa, Cat. No. 1 647229, Boehringer Mannheim, Alemania.

(5)

Solución de Substrato TMB: tetrametilbenzidina (TMB), lista para usar, Cat. No. 1 647229, Boehringer Mannheim, Alemania.

(6)

Solución de Lavado PBS: IX PBS, pH 7.4 (Sugen, rnc., Redwood City, California).

15 (7) Albumina, Bovina (BSA): polvo de la fracción V, A-8551, Sigma Chemical Co., USA.

(8) Línea de células 3T3 manipuladas genéticamente para expresar PDGF-R humano.

Protocolo

(1) Las células se cultivan a 8000 células/pocillo en DMEM, al 10% de CS, 2mM de Gln en una placa de 96 pocillos. Las células se incuban durante toda una noche a 37°C en un 5% de C02.

5 (2) Al cabo de 24 horas, las células fueron lavadas con PBS, y fueron privadas de suero en un medio libre de suero (O%CS de DMEM con 0.1 % de BSA) durante 24 horas.

(3) En el día 3, los compuestos de ligando (PDGF, 3.8 nM, preparado en DMEM con un 0.1 % de BSA) y de prueba se afiaden a las células de forma simultánea.

10 Los pocillos de control negativo reciben DMEM libre de suero con ligando en una placa de 96 pocillos, y se diluyen en serie para 7 concentraciones de prueba.

(4) Al cabo de 20 horas de la activación del ligando, se añade reactivo de etiquetado BrdU diluido (1:100 en DMEM, 0.1% de BSA) y las células son incubadas con BrdU (concentración final=lO J.1M) durante 1.5 horas.

15 (5) Después de la incubación con reactivo de etiquetado, el medio es eliminado por decantación, golpeando ligeramente la placa invertida sobre una toalla de papel. Se añade solución FixDenat (50 J.1l1pocillo) y las placas se incuban a temperatura ambiente durante 45 minutos en un agitador de placas.

(6) La solución FixDenat es eliminada en profundidad por decantación y

20 golpeando ligeramente la placa invertida sobre una toalla de papel. Se añade leche (leche deshidratada al 5% en PBS, 200 J.1l1pocillo) como solución de bloqueo y la placa es incubada durante 30 minutos a temperatura ambiente sobre un agitador de placas.

(7) La solución de bloqueo es eliminada por decantación y los pocillos se

lavan una vez con PBS. Se añade solución Anti-BrdU-POD (dilución al 1:100 en PBS, 1% de BSA) (100 /-ll/pocillo) y la placa es incubada durante 90 minutos a temperatura ambiente sobre un agitador de placas.

5 (8) El conjugado de anticuerpo es eliminado en profundidad por decantación y aclarando los pocillos 5 veces con PBS, y la placa se seca invirtiéndola y golpeando suavemente con una toalla de papel.

(9) Se añade solución de substrato de TMB (100 /-ll/pocillo) y se incuba

durante 20 minutos a temperatura ambiente sobre un agitador de placas hasta que el 10 desarrollo del color es suficiente para la detección fotométrica.

(10) La absorción de las muestras se mide a 410 nm (en modo "longitud de onda dual" con una lectura de filtro a 490 nm, como longitud de onda de referencia) en un lector de placas ELISA Dynatech.

Ensayo de Incorporación de BrdU Inducido por EGF

15 Materiales y reactivos

(1) EGF: EGF de ratón, 201, Toyobo, Co., Ltd. Japan.

(2) Reactivo de Etiquetado BrdU: 10 mM, en PBS (pH7.4), Cat. No. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Alemania.

(3) FixDenat: solución de fijación (lista para usar), Cat. No. 1 647 229, 20 Boehringer Mannheim, Alemania.

(4) U-POD Anti-Brd: anticuerpo monoclonal de ratón conjugado con peroxidasa, Cat. No. 1 647229, Boehringer Mannheim, Alemania.

(5) Solución de Substrato de TMB: tetrametilbenzidina (TMB), lista para

usar, Cat. No. 1 647229, Boehringer Mannheim, Alemania.

(6) Solución de Lavado PBS: IX PBS, pH 7.4 (Sugen, lnc., Redwood City, California).

5 (7) Albumina, Bovina (BSA): polvo de fracción V, A-8551, Sigma Chemical Co., USA.

(8) Línea de células 3T3 manipuladas genéticamente para expresar EGF-R humano.

Protocolo

10 (1) Las células son cultivadas a 8000 células/pocillo en 10% de CS, 2mM de Gln en DMEM, en una placa de 96 pocillos. Las células son incubadas durante toda la noche a 37°C en 5% de C02.

(2) Al cabo de 24 horas, las células se lavan con PBS, y a continuación son

privadas de suero en un medio libre de suero (0% de CS DMEM con un 0.1% de BSA) 15 durante 24 horas.

(3) En el día 3, el ligando (EGF, 2 nM, preparado en DMEM con 0.1% de BSA) y los compuestos de prueba son añadidos a las células de forma simultánea. Los pocillos de control negativo reciben únicamente DMEM libre de suero, con un 0.1 % de BSA, las células de control positivo reciben el ligando (EGF) pero ningún compuesto de

20 prueba. Los compuestos de prueba son preparados en DMEM libre de suero con ligando en una placa de 96 pocillos, y diluidos en serie para 7 concentraciones de prueba.

(4) Al cabo de 20 horas de la activación del ligando, se añade el reactivo de

etiquetado de BrdU diluido (1:100 en DMEM, 0.1% de BSA) y las células son incubadas con BrdU (concentración final = 10 ¡..tM) durante 1.5 horas.

(5) Después de la incubación con reactivo de etiquetado, el medio es

5 eliminado por decantación y golpeando la placa invertida sobre una toalla de papel. Se añade solución FixDenat (50 ¡..tl/pocillo) y las placas se incuban a temperatura ambiente durante 45 minutos sobre un agitador de placas.

(6) La solución FixDenat es eliminada en profundidad por decantación y golpeando suavemente la placa invertida en una toalla de papel. Se añade leche (leche

10 deshidratada al 5% en PBS, 200 ¡..tl/pocillo) como solución de bloqueo y la placa es incubada durante 30 minutos a temperatura ambiente sobre un agitador de placas.

(7) La solución de bloqueo es eliminada por decantación y los pocillos son lavados una vez con PBS. Se añade la solución anti-BrdU-POD (dilución al 1:100 en PBS, 1 % de BSA) (100 ¡..tl/pocillo) y la placa es incubada durante 90 minutos a

15 temperatura ambiente sobre un agitador de placas.

(8) El conjugado de anticuerpo es eliminado en profundidad por decantación y aclarando los pocillos 5 veces con PBS, y la placa se seca invirtiéndola y golpeando suavemente con una toalla de papel.

(9) Se añade solución de substrato de TMB (100 ¡..tl/pocillo) y es incubada

20 durante 20 minutos a temperatura ambiente sobre un agitador de placas hasta que el desarrollo del color es suficiente para la detección fotométrica.

(10) La absorción de las muestras se mide a 410 nm (en modo "longitud de

onda dual" con una lectura de filtro a 490 nm, como longitud de onda de referencia) en un lector de placas ELISA Dynatech.

Incorporación de BrdU Movido por Her2, Inducido por EGF 5 Materiales y reactivos

(1) EGF: EGF de ratón, 201, Toyobo, Co., Ltd. Japan

(2) Reactivo de Etiquetado de BrdU: 10 mM, en PBS (pH7.4), Cat. No. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Alemania.

(3) FixDenat: solución de fijación (lista para usar), Cat. No. 1 647 229, 10 Boehringer Mannheim, Alemania.

(4)

Anti-BrdU-POD: anticuerpo monoclonal de ratón conjugado con peroxidasa, Cat. No. 1 647229, Boehringer Mannheim, Alemania.

(5)

Solución de Substrato de TMB: tetrametilbenzidina (TMB), lista para usar, Cat. No. 1 647229, Boehringer Mannheim, Alemania.

15 (6) Solución de Lavado PBS: IX PBS, pH 7.4, de fabricación casera.

(7)

Albumina, Bovina (BSA): polvo de fracción V, A-8551, Sigma Chemical Co., USA.

(8)

Línea de células 3T3 manipulada para expresar un receptor quimérico con el dominio extracelular de EGF-R y el dominio intracelular de Her2.

Protocolo

(1) Las células son cultivadas a 8000 células/pocillo en DMEM, al 10% de es, 2mM de Gln en una placa de 96 pocillos. Las células son incubadas durante toda la noche a 37°C en un 5% de C02.

5 (2) Al cabo de 24 horas, las células se lavan con PBS, y a continuación son privadas de suero en un medio libre de suero (0% de es DMEM con un 0.1 % de BSA) durante 24 horas.

(3) En el día 3, el ligando (EGF = 2 nM, preparado en DMEM con 0.1 % de BSA) y los compuestos de prueba son añadidos a las células de forma simultánea. Los

10 pocillos de control negativo reciben únicamente DMEM libre de suero, con un 0.1 % de BSA, las células de control positivo reciben el ligando (EGF) pero ningún compuesto de prueba. Los compuestos de prueba son preparados en DMEM libre de suero con ligando en una placa de 96 pocillos, y diluidos en serie para 7 concentraciones de prueba.

(4) Al cabo de 20 horas de la activación del ligando, se añade el reactivo de

15 etiquetado de BrdU diluido (al 1:100 en DMEM, 0.1% de BSA) y las células son incubadas con BrdU (concentración final = 10 )lM) durante 1.5 horas.

(5) Después de la incubación con reactivo de etiquetado, el medio es eliminado por decantación y golpeando la placa invertida sobre una toalla de papel. Se añade solución FixDenat (50 )ll/pocillo) y las placas se incuban a temperatura ambiente

20 durante 45 minutos sobre un agitador de placas.

(6) La solución FixDenat es eliminada en profundidad por decantación y golpeando suavemente la placa invertida en una toalla de papel. Se añade leche (5%

leche deshidratada en PBS, 200 Jlllpocillo) como solución de bloqueo, y la placa es incubada durante 30 minutos a temperatura ambiente sobre un agitador de placas.

(7) La solución de bloqueo es eliminada por decantación y los pocillos son lavados una vez con PBS. Se añade la solución Anti-BrdU-POD (dilución a 1:100 en

5 PBS, 1% de BSA) (100 Jlllpocillo) y la placa es incubada durante 90 minutos a temperatura ambiente sobre un agitador de placas.

(8) El conjugado de anticuerpo es eliminado en profundidad por decantación y aclarando los pocillos 5 veces con PBS, y la placa se seca invirtiéndola y golpeando suavemente con una toalla de papel.

10 (9) Se añade solución de substrato de TMB (100 Jlllpocillo) e incubada durante 20 minutos a temperatura ambiente sobre un agitador de placas hasta que el desarrollo del color es suficiente para la detección fotométrica.

(10) La absorción de las muestras se mide a 410 nm (en modo "longitud de

onda dual" con una lectura de filtro a 490 nm, como longitud de onda de referencia) en 15 un lector de placas ELISA Dynatech.

Ensayo:le Incorporación de BrdU Inducido por IGFl

Materiales y reactivos

(1) Ligando IGF1: humano, recombinante, G511, Promega Corp, USA.

(2) Reactivo de Etiquetado de BrdU: 10 mM, en PBS (pH7.4), Cat. No. 1 647 20 229, Boehringer Mannheim, Alemania.

(3) FixDenat: solución de fijación (lista para usar), Cat. No. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Alemania.

ligando en una placa de 96 pocillos, y diluidos en serie para 7 concentraciones de

prueba.

(4) Al cabo de 16 horas de la activación del ligando, se añade el reactivo de

etiquetado de BrdU diluido (1: 100 en DMEM, 0.1 % BSA) y las células son incubadas 5 con BrdU (concentración final=lO /-tM) durante 1.5 horas.

(5) Después de la incubación con reactivo de etiquetado, el medio es

eliminado por decantación y golpeando la placa invertida sobre una toalla de papel. Se añade solución FixDenat (50 /-tI/pocillo) y las placas se incuban a temperatura ambiente durante 45 minutos sobre un agitador de placas.

10 (6) La solución FixDenat es eliminada en profundidad por decantación y golpeando suavemente la placa invertida en una toalla de papel. Se añade leche (leche deshidratada al 5% en PBS, 200 /-tI/pocillo) como solución de bloqueo y la placa es incubada durante 30 minutos a temperatura ambiente sobre un agitador de placas.

(7) La solución de bloqueo es eliminada por decantación y los pocillos son

15 lavados una vez con PBS. Se añade la solución Anti-BrdU-POD (dilución a 1:100 en PBS, 1% de BSA) (100 /-tl/pocillo) y la placa es incubada durante 90 minutos a temperatura ambiente sobre un agitador de placas.

(8) El conjugado de anticuerpo es eliminado en profundidad por decantación

y aclarando los pocillos 5 veces con PBS, y la placa se seca invirtiéndola y golpeando 20 suavemente con una toalla de papel.

(9) Se añade solución de substrato de TMB (100 /-tl/pocillo) y es incubada durante 20 minutos a temperatura ambiente sobre un agitador de placas hasta que el desarrollo del color es suficiente para la detección fotométrica.

(10) La absorción de las muestras se mide a 410 nm (en modo "longitud de

onda dual" con una lectura de filtro a 490 nm, como longitud de onda de referencia) en un lector de placas ELISA Dynatech.

Ensayo de Incorporación de BrdU inducido por FGF

5 Este ensayo mide la síntesis de ADN inducida por FGF en células 3Tc7/EGFr que expresan receptores FGF endógenos.

Materiales y reactivos:

1. FGF: FGF2/bFGF humano (Gibco BRL, No. 13256-029).

2. Reactivo de Etiquetado de BrdU, (10 mM de PBS (pH 7.4), Boehringer 10 Mannheim Cat No. 1 647 229).

3. Solución de fijación FixDenat (Boehringer Mannheim Cat No. 1 647229).

4. Anti-BrdU-POD (anticuerpo monoclonal de ratón conjugado con peroxidasa, Boehringer Mannheim Cat. No. 1 647 229).

5. TMB (tetrametilbenzidina, Boehringer Mannheim Cat. No. 1 647 229).

15 6. Solución de Lavado de PBS, pH 7.4 (Sugen, Inc.).

7. Albumina, Bovina (BSA), polvo de fracción V (Sigma Chemical Co., Cat. No. A-8551)

Procedimiento

1. Línea de células manipuladas 3T3: 3T3c7/EGFr.

20 2. Las células son cultivadas a 8,000 células/pocillo en DMEM, al 10% de CS y 2 mM de Gln en una placa de 96 pocillos. Incubar 24 horas a 37°C en 5% de C02.

3. Al cabo de 24 horas, lavar las células con PBS y a continuación privar de

suero en un medio libre de suero (0% DMEM, 0.1 % de BSA) durante 24 horas.

4. Añadir ligando (FGF2 (1.5 nM en DMEM con 0.1 % de BSA) y el compuesto de prueba de forma simultánea. Los pocillos de control negativo reciben

5 DMEM libre de suero con un 0.1 % de BSA solamente, los pocillos de control positivo reciben ligando FGF2, pero ningún compuesto de prueba. Los compuestos de prueba se preparan en DMEM libre de suero con ligando en una placa de 96 pocillos y se diluyen en serie para realizar siete (7) concentraciones de prueba.

5. Al cabo de 20 horas, añadir el reactivo de etiquetado de BrdU diluido

10 (1:100 BrdU:DMEM, 0.1% de BSA, la concentración final es de 10 ~M) a las células e incubar durante 1.5 horas.

6. Decantar el medio. Eliminar los restos de material con una toalla de papel. Añadir FixDenat (50 ~l/pocillo) e incubar a temperatura ambiente durante 45 minutos sobre un agitador de placas.

15 7. Eliminar la solución Fixdenat. Añadir la solución de bloqueo (leche deshidratada al 5% en PBS (200 ~l/pocillo)) e incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente sobre un agitador de placas.

8. Decantar la solución de bloqueo, lavar los pocillos una vez con PBS.

Añadir solución anti-BrdU-POD (dilución al 1:100 en PBS, 0.1% de BSA), incubar 20 durante 90 minutos a temperatura ambiente sobre un agitador de placas.

9. Decantar el conjugado de anticuerpo, aclarar los pocillos 5 veces con PBS. Secar la placa invirtiéndola sobre una toalla de papel y golpeando suavemente.

10. Añadir solución de TMB (100 J..ll/pocillo), incubar 20 minutos a

temperatura ambiente sobre un agitador de placas hasta que el desarrollo del color sea suficiente para la detección fotométrica.

11. Medir la absorción a 410 nM en un lector de placas ELISA Dynatech 5 utilizando el modo "longitud de onda dual" con un filtro a 490 nM. Ensayo de EGFR Bioquímico

Este ensayo mide la actividad de kinasa in vitro de EGFR utilizando ELISA. Materiales y reactivos

1. Placas Elisa de 96 pocillos Coming (Coming, Catálogo No. 25805-96).

10 2. Anticuerpo anti-EGFR monoclonal SUM01 (Biochemistry Lab, SUGEN, Inc.).

3. PBS (Salino, con Solución Amortiguadora de Fosfato, de Dulbecco,

Catálogo Gibco No. 450-1300EB).

4. Solución Amortiguadora de TBST

15 Reactivo Tris

NaCI M.W.

121.14

58.44

Triton X-lOO ND

Concentración de trabajo 50 mM 150 mM 0.1%

5. Solución amortiguadora de bloqueo:

Cantidad por

6.057 g

8.766 g

1.0 mI

Reactivo M.W. Concentración de trabajo Cantidad por 100 mI

Carnation lnstant

Leche 5% 5.0 g

SIn grasa

5

PBS ND ND 100 mI

6. Lisato de células A431 (Screening Lab, SUGEN, lnc.)

7. Solución Amortiguadora de TBS:

Reactivo

M.W. Concentración de trabajo Cantidad por L

10

Tris 121.14 50 mM 6.057 g

NaCI

58.44 150mM 8.766 g

8. TBS + 10% de DMSO

Reactivo

M.W. Concentración de trabajo Cantidad por L

Tris

121.14 50 mM 1.514 g

15

NaCl 58.44 150mM 2.192 g

DMSO

ND 10% 25 mI

9. Adenosina-5'-trifosfato (ATP, de músculo equino, Sigma Cat. No.

A

5394).

Preparar

una solución de 1.0 mM en dH20. Este reactivo debería ser

20 preparado inmediatamente antes de usar, y conservarse en hielo.

10. MnCb.

Preparar una 1.0 M solución concentrada en dH20.

11. Mezcla de fosforilación ATPIMnCh

Reactivo Solución concentrada Cantidad por 10 mI Concentración de trabajo ATP 1.0 mM 300 ~l 30~M

5 MnCh 1.0 M 500 ~l 50mM

9.2 mI

Este reactivo debería ser preparado inmediatamente antes de usar, y conservarse en hielo.

12. Placas de polipropileno de fondo en V de 96 pocillos NUNC (Applied 10 Scientific Cat. No. AS-72092).

13. Ácido Etilenodiaminatetraacético (EDTA)

Preparar 200 mM de solución de trabajo en dH20. Ajustar a un pH de 8.0 con 10 N de NaOH.

14. Suero anti-fosfotirosina policlonal de conejo (Biochemistry Lab, SUGEN, 15 rnc.)

15.

Conjugado de peroxidasa de rgG anti-conejo de cabra (Biosource Cat. No. ALI0404)

16.

ABTS (2,2'-azino-bis(3-etilbenztiazolina-6-ácido sulfónico), Sigma Cat. No. A-1888).

Reactivo M.W. Concentración de trabajo Cantidad por L

Ácido Cítrico 192.12 100 mM 19.21 g

141.96 250 mM 35.49 g

ABTS ND 0.5 mglml 500mg

Mezclar los primeros dos ingredientes en unos 900 mI de dH20, ajustar el pH a 4.0 con ácido fosfórico. Añadir ABTS, cubrir, dejar reposar aprox. 0.5 hr., filtrar. La solución debe guardarse protegida de la luz a 4°C hasta que esté lista para usar.

17. Solución al 30% de peróxido de hidrógeno (Fisher Cat. No. H325)

10 Mezclar 15 mI de solución de ABTS y 2.0 JlI de H202. Preparar 5 minutos antes de usar.

19.0.2 M de HCI

Procedimiento

1.

Revestir las placas ELISA de 96 pocillos Coming con 0.5 Jlg de SUM01 15 en 100 JlI de PBS por pocillo, almacenar durante toda la noche a 4°C.

2. Eliminar el SUM01 no enlazado de los pocillos invirtiendo la placa para eliminar el líquido. Lavar Ix con dH20. Golpear ligeramente la placa en una toalla de papel para eliminar el exceso de líquido.

3.

Añadir 150 JlI de Solución Amortiguadora de bloqueo a cada pocillo. 20 Incubar durante 30 mino a temperatura ambiente mientras se agita.

4. Lavar la placa 3x con agua desionizada, y a continuación una vez con

TBST. Golpear ligeramente la placa en una toalla de papel para eliminar el exceso de líquido y las burbujas.

5. Diluir lisato en PBS (7 f-Lg de lisato/100 f-LI de PBS).

5 6. Añadir 100 f-LI de lisato diluido a cada pocillo. Agitar a temperatura ambiente durante 60 mino

7.

Lavar las placas tal como se describe en el punto 4 más arriba.

8.

Añadir 120 f-LI de TBS a la placa ELISA que contiene el EGFR capturado.

9. Diluir el compuesto de prueba 1: lOen TBS en placas de polipropileno de 10 96 pocillos (es decir. 10 f-LI de compuesto + 90 f-LI de TBS).

10. Añadir 13.5 f-LI de compuesto de prueba diluido a la placa ELISA. Para controlar los pocillos (pocillos que no reciben ningún compuesto de prueba), añadir

13.5 f-LI de TBS + 10% de DMSO.

11. Incubar durante 30 minutos mientras se agita a temperatura ambiente.

15 12. Añadir 15 f-LI de mezcla de fosforilación directamente a todos los pocillos, excepto al pocillo de control negativo, que no recibe ATP/MnCh (el volumen final del pocillo debería ser aproximadamente de 150 f-LI con 3 f-LM de ATP/5 mM MnCh de concentración final en cada pocillo). Incubar 5 minutos mientras se agita.

13. Al cabo de 5 minutos, detener la reacción añadiendo 16.5 f-LI de EDTA de

20 200 mM (pH 8.0) a cada pocillo, agitando de forma continuada. Una vez añadido el EDTA, agitar durante 1 mino

14. Lavar 4x con agua desionizada, dos veces con TBST.

15. Añadir 100 /-11 de anti-fosfotirosina (dilución al 1:3000 en TBST) por pocillo. Incubar 30-45 mino a temperatura ambiente, agitando.

16. Lavar tal como se describe en el punto 4 más arriba.

5 17. Añadir 100 /-11 de Conjugado de peroxidasa de IgG anti-conejo de cabra Biosource (dilución al 1:2000 en TBST) a cada pocillo. Incubar 30 mino a temperatura ambiente, agitando.

18. Lavar tal como se describe en el punto 4 más arriba.

19. Añadir 100 /-11 de solución de ABTS/ H202 a cada pocillo. 10 20. Incubar de 5 a 10 minutos agitando. Eliminar las burbujas.

21.

En caso necesario, detener la reacción con la adición de 100 /-11 de 0.2 M HCl por pocillo.

22.

Leer el ensayo en un lector de ELISA Dynatech MR7000. Filtro de Prueba: 410 nM Filtro de Referencia: 630 Nm.

15 Ensayo Bioquímico de PDGFR

Este ensayo mide la actividad de kinasa In vitro de PDGFR utilizando ELISA.

Materiales y reactivos

A menos que se indique lo contrario, la preparación de la solución de trabajo 20 de los reactivos siguientes es la misma que para el ensayo bioquímico de EGFR más arriba.

1. Placas Elisa de 96 pocillos Coming (Coming, Catálogo No. 25805-96).

2. Anticuerpo anti-PDGFR monoclonal 28D4ClO (Biochemistry Lab, SUGEN, Inc.).

3. PBS (Salino, con Solución Amortiguadora de Fosfato de Dulbecco, Gibco, 5 Catálogo No. 450-1300EB)

4.

Solución Amortiguadora de TBST.

5.

Solución Amortiguadora de bloqueo.

6. Lisato de células NIH 3T3 que expresa PDGFR-~ (Screening Lab, SUGEN, Inc.).

10 7. Solución Amortiguadora de TBS.

8. TBS + 10% de DMSO.

9. Adenosina-5'-trifosfato (ATP, de músculo equino, Sigma Cato No. A5394).

10. MnCh. 15 11. Mezcla de fosforilación de solución amortiguadora de kinasa.

Reactivo Solución concentrada Cantidad por 10 mI Concentración de trabajo Tris 1M 250 ¡..tI 25 mM NaCI 5M 200 ¡..tI 100 mM 20 MnCl2 1M 100 ¡..tI 10 mM

TX-I00 100 mM 50 III 0.5 mM

12. Placas de polipropileno de fondo en V de 96 pocillos NUNC (Applied Scientific Cat. No. AS-72092).

13. Ácido etilendiaminotetraacético (EDTA).

5 14. Suero anti-fosfotirosina policlonal de conejo (Biochemistry Lab, SUGEN, Inc.).

15. Conjugado de peroxidasa de IgG anti-conejo de cabra (Biosource Cat. No. ALI0404).

16. 2,2'-azino-bis(3-etilbenztiazolina-6-ácido sulfónico) (ABTS, Sigma Cat. 10 No. A-1888).

17.

Peróxido de hidrógeno en solución al 30% (Fisher Cat. No. H325).

18.

ABTS/ H2Ü2.

19.0.2 M de HCl

Procedimiento

15 1. Revestir placas ELISA de 96 pocillos Coming con 0.5 Ilg de 28D4CI0 en 100 III de PBS por pocillo, almacenar durante toda la noche a 4°C.

2. Eliminar el 28D4C 1 Ono enlazado de los pocillos invirtiendo la placa para extraer el líquido. Lavar Ix con dH2ü. Golpear ligeramente la placa en una toalla de papel para eliminar el exceso de líquido.

20 3. Añadir 150 III de Solución amortiguadora de bloqueo a cada pocillo. Incubar durante 30 mino a temperatura ambiente mientras se agita.

4. Lavar la placa 3x con agua desionizada, y a continuación una vez con TBST. Golpear ligeramente la placa en una toalla de papel para eliminar el exceso de líquido y las burbujas.

5. Diluir ellisato en HNTG (lO J.lg de lisatollOO J.ll HNTG)

5 6. Añadir 100 J.ll de lisato diluido a cada pocillo. Agitar a temperatura ambiente durante 60 mino

7. Lavar las placas tal como se describe en el punto 4 más arriba.

8. Añadir 80 J.ll de mezcla de solución amortiguadora de kinasa de trabajo a la placa ELISA que contiene el PDGFR capturado.

10 9. Diluir el compuesto de prueba al 1:10 en TBS en placas de polipropileno de 96 pocillos (es decir, 10 J.ll compuesto + 90 J.ll TBS).

10. Añadir 10 J.ll de compuesto de prueba diluido a la placa ELISA. Para controlar los pocillos (pocillos que no reciben ningún compuesto de prueba), añadir 10 J.ll de TBS + 10 % de DMSO.

15 11. Incubar durante 30 minutos mientras se agita a temperatura ambiente.

12. Añadir 10 J.ll de ATP directamente a todos los pocillos excepto al pocillo de control negativo (el volumen final del pocillo debería ser aproximadamente de 100 J.ll con 20 J.lM de ATP en cada pocillo.) Incubar 30 minutos mientas se agita.

13. Al cabo de 30 minutos, detener la reacción añadiendo 10 J.ll de 200 mM 20 EDTA (pH 8.0) a cada pocillo.

14. Lavar 4x con agua desionizada, dos veces con TBST.

15. Añadir 100 ¡..tI de anti-fosfotirosina (dilución al 1 :3000 en TBST) por pocillo. Incubar 30-45 mino a temperatura ambiente, agitando

16.

Lavar tal como se describe en el punto 4 más arriba.

17.

Añadir 100 ¡..tI de conjugado de peroxidasa de IgG anti-conejo de cabra

5 Biosource (dilución al 1 :2000 en TBST) en cada pocillo. Incubar 30 mino a temperatura ambiente, agitando.

18.

Lavar tal como se describe en el punto 4 más arriba.

19.

Añadir 100 ¡..tI de solución de ABTS/ H202 a cada pocillo.

20.

Incubar de 10 a 30 minutos, agitando. Eliminar las burbujas.

10 21. En caso necesario, detener la reacción con la adición de 100 ¡..tI 0.2 M de Hel por pocillo.

22. Leer el ensayo en un lector de ELISA Dynatech MR7000: filtro de prueba: 410 nM, filtro de referencia: 630 nM.

Ensayo Bioquímico de FGFR

15 Este ensayo mide la actividad de kinasa in vitro de la proteína de fusión MycGyrB-FGFR utilizando ELISA.

Materiales y reactivos

1. HNTG

Reactivo M.W. Concentración 5x Cantidad por L Concentración de trabajo 1 x

HEPES 238.3 100 mM 23.83 g 20 mM NaCI 58.44 750 mM 43.83 g l50mM

5 Glicerol ND 50% 500 mI 10% Triton X-lOO ND 5% 10 mI 1.0%

Para preparar un litro de solución concentrada 5x, disolver HEPES y NaCI en

unos 350 mI de dH20, ajustar el pH a 7.2 con HCI o NaOH (dependiendo del HEPES

que se utilice), añadir glicerol, Triton X-lOO y a continuación dH20 hasta el volumen.

10 2. PBS (Salino, con Solución Amortiguadora de Fosfato de Dulbecco, Gibco, Catálogo # 450-l300EB).

3. Solución amortiguadora de bloqueo.

4. Solución amortiguadora de kinasa. Reactivo M.W. Concentración lOx Concentración de trabajo Ix 15

HEPES (pH 7.2) 238.3 500 mM 50 mM MnCh 20 mM 2mM MgCh 203.32 200 mM 10mM Triton-X-lOO 1% 0.1%

20 DTT 380.35 5mM 0.5M

5. Fenilmetilsulfonil fluoruro (PMSF, Sigma, Cat. No. P-7626):

Solución de trabajo: 100 mM en etanol.

6. ATP (Fuente bacteriana, Sigma Cat. No. A-7699) Utilizar 3.31 mg por mI de MilliQ H20 para una concentración de 6 mM.

5 7. Mab de antifosfotirosina conjugada con biotina (don 4GI0, Upstate Biotechnology Inc. Cat. No. 16-103, Ser. No. 14495).

8. Reactivo Vectastain Elite ABC (Conjugado de peroxidasa de avidina, Vector Laboratories Cat. No. PK-6 100).

9. Solución de ABTS. 10 10. Solución de peróxido de hidrógeno al 30% (Fisher, Catálogo # H325).

12.0.2

M de HCl.

13.

TRIS HCI (Fischer Cat. No. BP 152-5). Preparar 1.0 mM de solución en MilliQ H20, ajustar el pH a 7.2 con HCl.

15 14. NaCI (Fisher Cat. No. S271-10). Preparar 5 M de solución en MilliQ H20.

15.

MgCh (Fisher Cat. No. M33-500). Preparar 1 M de solución en MilliQ H20.

16.

HEPES (Fisher, Cat. No. BP31 0-500).

Preparar 1 M de solución en MilliQ H20, ajustar el pH a 7.5, filtrar con filtro

estéril.

17. Solución Amortiguadora de TBST.

18. Solución Amortiguadora de Carbonato de Sodio (Fisher, Cato No. S495). 5 Preparar 0.1 M de solución en MilliQ H20, ajustar el pH a 9.6 con NaOH, filtrar.

19. Ditiotreitol (DTT, Fisher, Cato No. BP172-25).

Preparar 0.5 mM de solución de trabajo en MilliQ H20 justo antes de su utilización. Almacenar a -20°C hasta su uso, descartar las sobras.

20. MnClz. 10 21. Triton X-IDO.

22. IgG a-conejo de cabra (Cappel).

23. GyrB GST a de conejo purificado de afinidad (Biochemistry Lab. SUGEN,Inc.).

Procedimiento

15 Todas las fases siguientes se realizan a temperatura ambiente a menos que se indique lo contrario.

1. Revestir Placas Elisa de 96 pocillos Coming con 2 ¡..tg de anticuerpo aconejo de cabra por pocillo en Solución Amortiguadora de Carbonato de manera que el volumen total del pocillo sea de 100 ¡..tI. Almacenar durante toda la noche a 4°C.

2. Eliminar el anticuerpo a-conejo de cabra no enlazado invirtiendo la placa

para eliminar líquido. Golpear ligeramente la placa en una toalla de papel para eliminar el exceso de líquido y las burbujas.

3. Añadir 150 III de Solución Amortiguadora de bloqueo (5% de Leche baja

5 en Grasa en PBS) a cada pocillo. Incubar mientras se agita en un agitador de placas de microtitulación durante 30 mino

4. Lavar 4x con TBST. Golpear ligeramente la placa en una toalla de papel para eliminar el exceso de líquido y las burbujas.

5. Añadir 0.5 Ilg de anticuerpo a-GyrB de conejo por pocillo. Diluir el

10 anticuerpo en DPBS hasta un volumen final de 100 III por pocillo. Incubar agitando en un agitador de placas de microtitulación a temperatura ambiente durante 1 hora.

6.

Lavar 4x con TBST tal como se describe en la fase 4.

7.

Añadir 2 Ilg de lisato de células COSIFGFR (fuente Myc-GyrB-FGFR) en

HNTG a cada pocillo para obtener un volumen final de 100 III por pocillo. Incubar 15 mientras se agita en un agitador de placas de microtitulación durante 1 hora.

8.

Lavar 4X con TBST tal como se describe en la fase 4.

9.

Añadir 80 III de Ix solución amortiguadora de kinasa por pocillo.

10. Diluir el compuesto de prueba a 1:10 en Ix solución amortiguadora de kinasa + 1% DMSO en una placa de polipropileno de 96 pocillos.

20 11. Transferir 10 III de solución de compuesto de prueba diluida y los pocillos de control desde los pocillos de la placa de polipropileno a los pocillos de la placa

ELISA correspondientes, incubar agitando en un agitador de placas de microtitulación

durante 20 minutos.

12. Añadir 10 ¡..tI de 70 ¡..tM de ATP diluida en solución amortiguadora de kinasa para el control positivo y los pocillos de prueba (la concentración final de A TP

5 es de 7 ¡..tM/pocillo). Añadir 10 ¡..tI Ix solución amortiguadora de kinasa a los pocillos de control negativo. Incubar agitando en una placa de microtitulación durante 15 mino

13. Detener la reacción de kinasa añadiendo 5 ¡..tI 0.5 M de EDTA a todos los pocillos.

14. Lavar 4x con TBST tal como se describe en la fase 4.

10 15. Añadir 100 ¡..tI de mab de a-fosfotirosina (b4GlO) conjugado con biotina diluida en TBST a cada pocillo. Incubar agitando en un agitador de placa de microtitulación durante 30 minutos.

16. Preparar Reactivo Vectastain ABC. Añadir 1 gota de Reactivo A a 15 mI

de TBST. Mezclar invirtiendo varias veces. Añadir 1 gota de Reactivo B y volver a 15 mezclar.

17. Lavar 4x con TBST tal como se describe en la fase 4.

18. Añadir 100 ¡..tI de Reactivo ABC HRP a cada pocillo. Incubar agitando en un agitador de placas de microtitulación durante 30 minutos.

19. Lavar 4x con TBST tal como se describe en la fase 4. 20 20. Añadir 100 ¡..tI de solución ABTS/ H20 2 a cada pocillo.

22.

Incubar entre 5 y 15 minutos, mientras se agita. Eliminar las burbujas.

23.

En caso necesario, detener la reacción añadiendo 1 00 111 de 0.2M

HCl/pocillo.

24. Leer en ensayo en un Lector de Placas ELISA Dynatech MR7000 ELISA, filtro de prueba: 410 nM, filtro de referencia: 630 nM.

5 Ensayo Bioquímico FLK-l Este ensayo evalúa la actividad de autofosforilación in vitro de flk-1 utilizando ELISA.

Materiales y reactivos

1. Placas de cultivo de tejido de 15 cm

10 2. Células Flk-1/NlH: línea de fibroblasto NlH que sobre expresa el cIon 3 de flk-1 humano (SUGEN, lnc., obtenido de MPl, Martinsried, Alemania).

3. Medio de crecimiento: DMEM más 10% de FBS activado por calor y 2 mM de Glutamina (Gibco-BRL).

4.

Medio de inanición: DMEM más 0.5% de FBS inactivado por calor, 2 mM 15 de Glutamina (Gibco-BRL).

5. Placas Elisa de 96 pocillos Coming (Coming, Cat. No. 25805-96).

6. Anticuerpo monocIonal L4 o E38 específico para flk-1, purificado mediante cromatografía de afinidad de agarosa -Proteína A (SUGEN, lnc.).

7.

PBS (Salino, con Solución Amortiguadora de Fosfato de Dulbecco) Gibco, 20 Cat. No. 450-1300EB).

8. HNTG (ver BIOCHEMICAL FGFR para más detalles sobre la

preparación).

9.

Kit de determinación de proteína de Pierce BCA.

10.

Solución amortiguadora de bloqueo

5 11. TBST (pH 7.0)

12.

Solución amortiguadora de kinasa

13.

Solución de Detención de Kinasa: 200 mM de EDTA.

14. 4G10 biotinilado, específico para fosfotirosina (UBI, Cato No. No. 16103).

10 15. Kit AB (Vector Laboratories, Cato No. PK 4000).

16. DMSO

17. Placas de polipropileno de fondo en V de 96 pocillos NUNC (Applied Scientific, Cato No. AS-72092).

18. Turbo-TMB (Pierce). 15 19. Solución de detección Turbo-TMB: 1 M H2S04.

20. ATP (Sigma Cat. No. A-7699). 21.20% de DMSO en TBS (pH 7.0).

Procedimiento

Cultivo de Células y Preparación de Lisato.

1. Cultivar las células en el medio de cultivo y dejar crecer durante 2-3 días en una confluencia del 90-100% a 37°C y 5% de C02. No exceder del paso #20.

5 2. Eliminar el medio y lavar las células dos veces con PBS. Lisar con solución amortiguadora de lisis HNTG. Recoger todos los lisatos y remover mezclándolos durante 20-30 segundos.

3. Eliminar el material no soluble por centrifugación (5-10 min a unos 10,000 xg).

10 4. Determinar la concentración de proteínas utilizando el kit BCA.

5. Dividir ellisato en partes alícuotas de 1 mg, almacenar a -80°C. Procedimiento de Ensayo

1. Revestir las Placas Elisa de 96 pocillos Coming con 2 ¡.tg/pocillo de L4 (o E 38) purificado en 100 ¡.tI de PBS. Almacenar durante toda la noche a 4°C.

15 2. Eliminar las proteínas no enlazadas de los pocillos invirtiendo la placa para eliminar el líquido. Lavar una vez con dH20, golpear suavemente la placa sobre una toalla de papel para eliminar el exceso de líquido.

3. Bloquear las placas con 150 ¡.tI de solución amortiguadora de bloqueo por pocillo. Incubar durante 45-60 minutos mientras se agita a 4°C.

4. Eliminar la solución amortiguadora de bloqueo y lavar la placa ELISA tres

veces con dH20 y una vez con TBST. Golpear suavemente la placa sobre una toalla de papel para eliminar el exceso de líquido.

5. Diluir ellisato en PBS para obtener una concentración final de 50 IJ-g/100

5 IJ-l. Añadir 100 IJ-l de lisato diluido a cada pocillo. Incubar mientras se agita a 4°C durante toda una noche.

6. Eliminar las proteínas no enlazadas de los pocillos invirtiendo la placa. Lavar igual que en el paso 4.

7. Añadir 80 IJ-l de solución amortiguadora de kinasa a los pocillos (90 IJ-l a 10 los pocillos de control negativo).

8.

Diluir el compuesto de pruebas (normalmente 10 veces) en los pocillos de una placa de polipropileno que contenga un 20% de DMSO en TBS.

9.

Añadir 10 IJ-l de los compuestos diluidos a los pocillos ELISA que contienen flk-1 inmovilizado y agitar. Los pocillos de control no reciben compuestos.

15 10. A partir de la concentración de 1 mM de ATP, preparar 0.3 mM de solución de ATP en dH20 (como alternativa, puede utilizarse solución amortiguadora de kinasa).

11.

Añadir 10 IJ-l de 0.3 mM A TP a todos los pocillos excepto a los controles negativos. Incubar durante 60 mino a temperatura ambiente, mientras se agita.

13. Lavar la placa ELISA 4 veces con dH20 y dos veces con TBST.

14.

Añadir 100 Jll de 4G 1 O:TBST biotinilado 1 :5000 a todos los pocillos. Incubar 45 min agitando a temperatura ambiente.

20 12. Al cabo de 1 hora, detener la reacción de kinasa añadiendo 11 IJ-1200 mM de EDTA. Agitar durante 1-2 mino

15. Mientras se agita lo anteriormente mencionado, añadir 50 Jll de

soluciones A & B del kit ABC a 10 mI de TBST. Estas soluciones deben ser 5 combinadas aproximadamente 30 mino antes de su utilización.

16. Lavar las placas como en el paso 4.

17. Añadir 100 Jll del complejo A & B preformado a todos los pocillos. Incubar 30 min agitando a temperatura ambiente.

18. Lavar las placas como en el paso 4.

10 19. Añadir 100 Jll de turbo-TMB. Agitar a temperatura ambiente durante 1015 mino

20. Cuando el color en los pocillos de control positivo alcance una absorción de aprox. 0.35 -004, detener la reacción con 100 Jll de solución de detención turboTMB.

15 21. Leer las placas en el lector de ELISA Dynatech MR7000, filtro de prueba: 450 nM, filtro de referencia: 410 nM.

Ensayo HUV-EC-C

El protocolo siguiente puede utilizarse también para medir la actividad de un compuesto en relación a PDGF-R, FGF-R, VEGF, aFGF o Flk-1/KDR, todos los cuales 20 están expresados de forma natural por las células HUV-Ee.

DÍA O

1. Lavar y tripsinizar células HUV-EC-C (células endotélicas de vena umbilical humana, (American Type Culture Collection, catálogo no. 1730 CRL). Lavar con salino con solución amortiguadora de fosfato de Dulbecco (D-PBS, obtenido de

5 Gibco BRL, catálogo no. 14190-029) 2 veces a aprox. 1 mUlO cm2 de matraz de cultivo de tejido. Tripsinizar con un 0.05% de tripsina-EDTA en una solución de disociación de células no enzimática (Sigma Chemical Company, catálogo no. C-1544). La tripsina al 0.05% se produce diluyendo un 0.25% de tripsina/1 mM EDTA (Gibco, catálogo no. 25200-049) en la solución de disociación de células. Tripsinizar con aprox. 1 ml/25-30

10 cm2 de matraz de cultivo de tejido durante unos 5 minutos a 3rC. Una vez que las células se han separado del matraz, añadir un volumen equivalente de medio de ensayo y transferir a un tubo centrífugo estéril de 50 mI (Fisher Scientific, catálogo no. 05-5396).

2. Lavar las células con unos 35 mI de medio de ensayo en el tubo centrífugo

15 estéril de 50 mI añadiendo el medio de ensayo, centrifugar durante 10 minutos a aproximadamente 200x g, aspirar el sobrenadante, y volver a suspender con 35 mI de DPBS. Repetir el lavado dos veces más con D-PBS, volver a suspender las células en aprox. 1 mI de medio de ensayo/15 cm2 de matraz de cultivo de tejido. El medio de ensayo consta de un medio F12K (Gibco BRL, catálogo no. 21127-014) y 0.5% de

20 suero bovino fetal inactivado por calor. Contar las células con un Contador Coulter Counter® (Coulter Electronics, Inc.) y añadir el medio de ensayo a las células para

o btener una concentración de 0.8-1. O x 105 células/mI.

3. Añadir células a placas de fondo plano de 96 pocillos a 100 ~l/pocillo o 0.8-1.0 x 104 células/pocillo, incubar -24h a 3rC, 5% de C02.

DÍA 1

1. Preparar titulaciones de compuesto de prueba dobladas en placas separadas de 96 pocillos, generalmente 50 J..lM hasta OJ..lM. Utilizar el mismo medio de ensayo que se menciona en el día O, paso 2 más arriba. Las titulaciones se crean añadiendo 90

5 J..ll/pocillo de compuesto de prueba a 200 J..lM (4X la concentración final del pocillo) al pocillo superior de una columna de placas determinada. Dado que el compuesto de la prueba de concentrado es normalmente de 20 mM en DMSO, la concentración de 200 J..lM de fármaco contiene un 2% de DMSO. Se utiliza un diluyente producido al 2% de DMSO en medio de ensayo (F12K + 0.5% de suero bovino fetal) como diluyente para

10 las titulaciones del compuesto de prueba para diluir el compuesto de prueba, pero manteniendo constante la concentración de DMSO. Añadir este diluyente a los pocillos restantes en la columna a 60 J..ll/pocillo. Tomar 60 J..ll de los 120 J..ll de la dilución de compuesto de prueba de 200 J..l M en el pocillo superior de la columna y mezclar con los 60 J..ll en el segundo pocillo de la columna. Tomar 60 J..ll de este pocillo y mezclar con

15 los 60 J..ll del tercer pocillo de la columna, y así sucesivamente hasta que se completen las titulacioness dobladas. Cuando se mezcle el penúltimo pocillo, tomar 60 J..ll de los 120 J..ll de este pocillo y descartarlos. Dejar el último pocillo con 60 J..ll de DMSO/diluyente de medio como control que no contiene compuesto de prueba.

Realizar 9 columnas de compuesto de prueba titulada, lo suficiente para triplicar cada 20 uno de los pocillos por: (1) VEGF (obtenido de Pepro Tech Inc., catálogo no. 100-200,

(2) factor de crecimiento de célula endotélica (ECGF) (también conocido como factor de crecimiento de fibroblasto ácido, o aFGF) (obtenido de Boehringer Mannheim Biochemica, catálogo no. 1439 600), o, (3) PDGF B/B (1276-956 humano, Boehringer

Mannheim, Alemania) y control de medio de ensayo. El ECGF viene como preparado

con heparina de sodio.

2. Transferir 50 , . .!.l/pocillo de las diluciones del compuesto de prueba a las

placas de ensayo de 96 pocillos que contienen las 0.8-1.0x104 células/lOO ¡..tI/pocillo de 5 las células HUV -EC-C del día O e incubar -2 h a 37°C, 5% de CO2•

3. Por triplicado, añadir 50 ¡..tllpocillo de 80 ¡..tg/ml de VEGF, 20 nglml de ECGF, o control de medio a cada estado del compuesto de prueba. Igual como sucede con los compuestos de prueba, las concentraciones de factor de crecimiento son 4X la concentración final deseada. Utilizar el medio de ensayo desde el día O, fase 2 para

10 producir las concentraciones de factores de crecimiento. Incubar aproximadamente 24 horas a 37°C, 5% de CO2. Cada pocillo tendrá 50 ¡..tI de dilución de compuesto de prueba, 50 ¡..tI de factor de crecimiento o medio, y 100 ¡..tI de células, lo cual suma un total de 200 ¡..tllpocillo. De esta manera, las concentraciones 4X del compuesto de prueba y los factores de crecimiento se convierten en IX una vez que todo ha sido

15 añadido a los pocillos.

DÍA 2

l. Añadir 3H-timidina (Amersham, catálogo no. TRK-686) a 1 ¡..tCi/pocillo (solución de 10 ¡..tI/pocillo de 100 ¡..tCi/ml producida en medio RPMI + 10% suero bovino fetal inactivado por calor) e incubar -24 h a 37°C, 5% de CO2• El RPMI se

20 obtiene en Gibco BRL, catálogo no. 11875-051.

DÍA 3

l. Congelar las placas durante toda una noche a -20°C. Mannheim, Alemania) y control de medio de ensayo. El ECGF viene como preparado

con heparina de sodio.

2. Transferir 50 , . .!.l/pocillo de las diluciones del compuesto de prueba a las

placas de ensayo de 96 pocillos que contienen las 0.8-1.0x104 células/lOO ¡..tI/pocillo de 5 las células HUV -EC-C del día O e incubar -2 h a 37°C, 5% de CO2•

3. Por triplicado, añadir 50 ¡..tllpocillo de 80 ¡..tg/ml de VEGF, 20 nglml de ECGF, o control de medio a cada estado del compuesto de prueba. Igual como sucede con los compuestos de prueba, las concentraciones de factor de crecimiento son 4X la concentración final deseada. Utilizar el medio de ensayo desde el día O, fase 2 para

10 producir las concentraciones de factores de crecimiento. Incubar aproximadamente 24 horas a 37°C, 5% de CO2. Cada pocillo tendrá 50 ¡..tI de dilución de compuesto de prueba, 50 ¡..tI de factor de crecimiento o medio, y 100 ¡..tI de células, lo cual suma un total de 200 ¡..tllpocillo. De esta manera, las concentraciones 4X del compuesto de prueba y los factores de crecimiento se convierten en IX una vez que todo ha sido

15 añadido a los pocillos.

DÍA 2

l. Añadir 3H-timidina (Amersham, catálogo no. TRK-686) a 1 ¡..tCi/pocillo (solución de 10 ¡..tI/pocillo de 100 ¡..tCi/ml producida en medio RPMI + 10% suero bovino fetal inactivado por calor) e incubar -24 h a 37°C, 5% de CO2• El RPMI se

20 obtiene en Gibco BRL, catálogo no. 11875-051.

DÍA 3

l. Congelar las placas durante toda una noche a -20°C.

DÍA 4

Descongelar las placas y recolectarlas con un recolector de placas de 96 pocillos (Tomtec Harvester 96®) en mats de filtro (Wallac, catálogo no. 1205-401), leer el contaje en un contador de centelleo líquido Wallac Betaplate™).

5 Modelos de Animales in vivo

Modelos de Animales de Xenoinjerto

La capacidad de los tumores humanos para crecer como xenoinjertos en ratones atímicos (por ejemplo, Balb/c, nu/nu) proporciona un modelo útil in vivo para estudiar la respuesta biológica a terapias para tumores humanos. Desde el primer

10 xenotransplante satisfactorio de tumores humanos a ratones atímicos (Rygaard and Povlsen, 1969, Acta Pathol. Microbial. Scand. 77:758-760), muchas líneas de células de tumor humano distintas (por ejemplo, mamarias, de pulmón, genitourinario, gastrointestinal, cabeza y cuello, glioblastoma, hueso y melanomas malignos) han sido transplantadas e implantadas satisfactoriamente en ratones desnudos. Los ensayos

15 siguientes pueden utilizarse para determinar el nivel de actividad, especificidad y efecto de los diferentes compuestos aquí descritos. Hay tres tipos de ensayos generales que resultan útiles para evaluar compuestos: celular/catalítico, celular/biológico e in vivo. El objeto de los ensayos celulares/catalíticos es determinar el efecto de un compuesto sobre la capacidad de una TK para fosforilar tirosinas en un substrato conocido de una célula.

20 El objeto de los ensayos celulares/biológicos es determinar el efecto de un compuesto sobre la respuesta biológica estimulada por una TK en una célula. El objeto de los ensayos in vivo es determinar el efecto de un compuesto sobre un modelo animal de un desorden determinado como el cáncer.

Las líneas de células adecuadas para los experimentos de xenoinjertos

subcutáneos incluyen las células C6 (glioma, ATCC # CCL 107), células A375 (melanoma, ATCC # CRL 1619), células A431 (carcinoma epidermoide, ATCC # CRL 1555), células Calu 6 (pulmón, ATCC # HTB 56), células PC3 (próstata, ATCC # CRL

5 1435), células SKOV3TP5 y fibroblastos NIH 3T3 manipulados genéticamente para sobreexpresar EGFR, PDGFR, IGF-IR o cualquier otro tipo de kinasa de prueba. El protocolo siguiente puede ser utilizado para realizar experimentos de xenoinjertos:

Los ratones atímicos hembra (BALB/c, nu/nu) se obtienen en Simonsen Laboratories (Gilroy, CA). Todos los animales se mantienen en condiciones de espacio 10 limpio en cajas Micro-isolator con un lecho Alpha-dri. Reciben comida estéril para

roedores yagua ad libitum.

Las líneas de células se cultivan en un medio apropiado (por ejemplo, MEM, DMEM, FlO de Ham, o F12 de Ham más 5% -10% de suero bovino fetal (FBS) y 2 mM de glutamina (GLN)). Todos los medios de cultivo, glutamina y suero bovino fetal

15 se compran en Gibco Life Technologies (Grand Island, NY) a menos que se especifique lo contrario. Todas las células crecen en una atmósfera húmeda de 90-95% de aire y 510% de C02 a 37°C. Todas las líneas de células se subcultivan de forma rutinaria dos veces por semana y son negativas en micoplasma tal como determina el método Mycotect (Gibco).

20 Las células son cosechadas en o cerca de la confluencia con 0.05% de Tripsina-EDTA y convertidas en bolitas a 450 x g durante 10 mino Las bolitas son suspendidas otra vez en PBS estéril o medio (sin FBS) a una concentración determinada y las células se implantan en el flanco trasero del ratón (8 -10 ratones por grupo, 2 -10 X 106 células/animal). El crecimiento del tumor se mide durante entre 3 y 6 semanas utilizando calibres venier. Los volúmenes del tumor se calculan como el producto de largo x ancho x alto, a menos que se indique lo contrario. Los valores de P se calculan utilizando el test t de Student. Los compuestos de prueba en excipiente de 50 -100 f.tL (DMSO, o VPD:D5W) pueden administrarse por inyección IP a diferentes

5 concentraciones, generalmente empezando en el día uno después de la implantación.

Modelo de Invasión de Tumor

El siguiente modelo de invasión de tumor ha sido desarrollado y puede ser utilizado para la evaluación del valor terapéutico y la eficacia de los compuestos que han sido identificados como capaces de inhibir de forma selectiva el receptor

10 KDRlFLK-1.

Procedimiento

Se utilizan ratones desnudos de 8 semanas de vida (hembra) (Simonsen Inc.) como animales experimentales. La implantación de células de tumor puede realizarse en una campana de flujo laminar. Para la anestesia se administra un cóctel de

15 Xylazina/Ketamina (100 mglkg ketamina y 5 mglkg de Xylazina) en modo intraperitoneal. Se realiza una incisión a media línea para exponer la cavidad abdominal (aproximadamente 1.5 cm de longitud) con el fin de inyectar 107 células de tumor en un volumen de 100 f.tl de medio. Las células son inyectadas en el lóbulo duodenal del páncreas o bajo la serosa del colon. El peritóneo y los músculos se cierran con una

20 sutura continua de seda de 6-0 y la piel se cierra utilizando grapas de sutura. Los animales son observados diariamente.

Análisis

Al cabo de 2-6 semanas, dependiendo de las observaciones evidentes de los animales, los ratones son sacrificados, 'y las metástasis de tumores locales en diferentes órganos (pulmón, hígado, cerebro, estómago, bazo, corazón, músculo) son extirpadas y

5 analizadas (medición del tamaño del tumor, grado de invasión, inmunoquímica, determinación de hibridización in situ, etc.).

Medición de la Toxicidad de las Células

Los compuestos terapéuticos deberían ser más potentes a la hora de inhibir la actividad de la tirosina kinasa del receptor que para ejercer un efecto citotóxico. Puede 10 obtenerse una medición de la efectividad y toxicidad de las células de un compuesto determinando su índice terapéutico, es decir, IC50/LD5o. IC50, la dosis requerida para conseguir un 50% de inhibición, puede medirse utilizando técnicas estándar como las que se describen en el presente documento. LD5o, la dosificación que provoca un 50% de toxicidad, también puede medirse mediante técnicas estándar (Mossman, 1983, J.

15 Immunol. Methods, 65:55-63), midiendo la cantidad de LDH liberada (Korzeniewski and Callewaert, 1983, J. Immunol. Methods, 64:313, Decker and Lohmann-Matthes, 1988, J. Immunol. Methods, 115:61), o midiendo la dosis letal en modelos animales. Se prefieren compuestos con un gran índice terapéutico. El índice terapéutico debería ser superior a 2, preferiblemente por lo menos 10, Y más preferiblemente por lo menos 50.

20 B. Ejemplos -Actividad Biológica.

Los ejemplos de la potencia in vitro del compuesto de esta invención se muestran en la Tabla 1. Los datos muestran que el compuesto es generalmente bastante potente contra una variedad de PTK in vitro. El compuesto también mantiene una excelente actividad cuando se prueba in vivo. Por ejemplo, el compuesto citado en las

Reivindicaciones (compuesto 5), cuando se administra oralmente, muestra un tamaño

medio marcadamente reducido de los tumores glioma C6 subcutáneos implantados en ratones. De hecho, el compuesto 5 se mostró notablemente superior al resto de compuestos probados. En un experimento, las células de glioma humano C6 (3 X 106

5 células, n = 10 -20 animales/grupo) fueron implantadas subcutáneamente en el flanco posterior de ratones BALB/c nu/nu hembra en el día O. La administración oral de los compuestos 3, 5, 19 Y 20 en labrasol acuoso a 200 mg/kg/día empezó en el día uno posterior a la implantación. El crecimiento de los tumores se midió utilizando calibres vernier como el producto de largo x ancho x alto.

,.~: ~.1,

lo

.~

....-.~

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Tal como se muestra en el gráfico siguiente, todos los compuestos probados muestran una marcada inhibición comparados con el control únicamente de vehículo. Sin embargo, el compuesto 5 claramente, y considerando la gran similaridad de los

15 compuestos probados, sorprendentemente, destaca por encima del resto. Es decir, mientras que los compuestos 3, 19 Y 21 se mueven alrededor de un 40 -45% de inhibición de crecimiento de tumor en el día 18 después de la implantación, el compuesto 5 inhibe el crecimiento del tumor en un 80 -85% en ese mismo punto.

,:

"

."

: ~....Compuesto 3

.

• : 00II CompuestoS . ..,¡ Compuesto 19

, ..,¡ Compuesto 20 .. ~ .-C Control de vehículo

Volumen medio del tumor

...

(mm3)

'.

.:.. .. .., . '!_.

. ....:

Días post-implantación

La inesperada eficacia del compuesto 5 in vivo, particulamente en

administración oral, queda todavía mejor demostrada cuando se compara con el

compuesto 65:

S.r

El compuesto 65 manifiesta casi un orden de potencia de mayor magnitud in vitro que el compuesto 5 (no se muestran los datos). Sin embargo, cuando se prueba en

modo interperitoneal en ratones contra dos líneas de células de tumor diferentes,

SF763T y SF767T, el compuesto 5 es entre ligeramente (inhibición 5% superior a 21 días) y notablemente (inhibición 14% superior a 21 días) más eficaz que el compuesto

65.

5 La diferencia en la actividad entre el compuesto 5 y el compuesto 65 es todavía mayor cuando los dos compuestos se administran por vía oral. La eficacia oral del compuesto 65 y algunos de sus análogos, los compuestos 66 -69, se muestra en la gráfica más abajo:

--

Compuesto 66 --Compuesto 67

......

Compuesto 68

Compuesto 69 " Compuesto 65

Volumen

Labarsol Ac.

medio del

No tratado

tumor (mm3)

~~ :

" :

O,~~~~~~~~~~~~~~~~--~~~~~~

O J • , 0,. tli 1.. il Días Post-Implantación

Tal como puede aprecIarse en el gráfico, el compuesto 65, administrado oralmente a 200 mg/kgldía, muestra aproximadamente un 65% de inhibición de los tumores C6 18 días después de la implantación subcutánea en ratones, lo cual es

5 claramente superior a sus propios análogos, que presentan un promedio de

\

aproximadamente un 14 -16% de inhibición del crecimiento del tumor. Sin embargo,

sorprendentemente, la eficacia oral del compuesto 65 es todavía apreciablemente menor que la del compuesto 5, que tal como se ha indicado anteriormente, muestra un 80-85% de inhibición en el mismo tiempo en el mismo modelo de tumor.

Cuando se compara con el compuesto 70, el compuesto 5 muestra unas K¡ (constantes de inhibición) significativamente inferiores (es decir, una mayor potencia) en relación con FGF-Rl (1.2 para el compuesto 5 contra 19.49 para el compuesto 70) y PDGFR (no se muestran los datos).

eH

" .. "~

o"

CffS\'

• .. • #'

La inesperada superioridad del compuesto 5 queda todavía más demostrada cuando se compara su eficacia oral con la de un análogo próximo, el compuesto 71:

t.r·.

H~

.....:

A pesar de su similaridad estructural, cuando se prueba oralmente a 200 mg/kg/día contra tumores de melanoma humano C6 implantados subcutáneamente en ratones BALB/c nu/nu, 18 días después de la implantación, el compuesto 71 muestra

5 solamente un 57% de inhibición de crecimiento de tumor (no se muestran los datos) comparado, otra vez, con la inhibición del 80-85% demostrada por el complejo 5.

Sobre la base de la sorprendente eficacia anteriormente mencionada del compuesto 5 cuando se administra oralmente, el compuesto 5 es actualmente una realización preferente de esta invención.

10 El ámbito de la presente invención está determinado por las reivindicaciones siguientes:

Claims (7)

1. Reivindicaciones

   1. Una composición farmacéutica que comprende:

   3-[2,4-Dimetil-5-(2-oxo-1 ,2-dihidroindol-3-ilidenemetil)-1 H -pirrol-3-il]ácido propiónico o una sal del mismo; y

   5 al menos un portador farmacéuticamente aceptable.

   para su uso en un método para el tratamiento de un desorden relacionado con una proteína kinasa en un organismo, en que dicho desorden relacionado con la proteína kinasa se selecciona entre el grupo que consiste en cáncer, diabetes, un desorden de hiperproliferación, angiogénesis, un desorden inflamatorio, un desorden inmunológico y

   10 un desorden cardiovascular,

   en que dicho método comprende administrar oralmente dicha composición farmacéutica a dicho organismo.
2. 2. La composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en que dicho cáncer se selecciona a partir del grupo que consta de

   15 carcinoma de células escamosas, astrocitoma, sarcomas de Kaposi, glioblastoma, cáncer de pulmón, cáncer de vesícula, cáncer colorrectal, cáncer gastrointestinal, cáncer de cabeza y cuello, melanoma, cáncer de ovarios, cáncer de próstata, cáncer de mama, cáncer de pulmón de células pequeñas, glioma, cáncer colorrectal, cáncer genitourinario y cáncer gastrointestinal.

   20 3. La composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en que la enfermedad es un cáncer de pulmón de células pequeñas.
3. 4. La composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en que el desorden hiperproliferativo se selecciona dentro del grupo que consta de restenosis, fibrosis y soriasis.
4. 5. La composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la

   5 reivindicación 1, en que el desorden inflamatorio se selecciona dentro del grupo que consta de osteoartritis y artritis reumatoide.
5. 6. La composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en que el desorden inmunológico es una enfermedad auto inmune
6. 7. La composición farmacéutica para su uso de acuerdo con cualquiera de 10 las reivindicaciones 1 a 6, en que dicho organismo es un mamífero.

   REFERENCIAS CITADAS EN LA DESCRIPCIÓN

   Esta lista de reforencias citada por el solicitante es únicamente para facilitar

   la lectura. No forma parte del documento de Patente Europea. Aunque se ha tenido un

   cuidado extremado a la hora de recopilar las reforencias, no pueden descartarse

   errores u omisiones, y la EPO declina cualquier responsabilidad a este respecto.

   Documentos de patente citados en la descripción:

   •

   US 4966849 A [0017] US 5217999 A [0018]

   •

   WO 9410202 A [0017] US 5302606 A [0018]

   •

   WO 9403427 A [0017] [0018] • EP 0566266 A 1 [0018]

   •

   WO 9221660 A [0017] [0018] WO 9640116 A [0018]

   •

   WO 9115495 A [0017] [0018] • WO 9850356 A [0018]

   •

   WO 9414808 A [0017] [0018] • US 193829 A [0076]

   •

   US 5330992 A [0017] [0018] US 08038596 B [0076]

   •

   WO 9220642 A [0018] US 07975750 B [0076]

   Documentos no de patente citados en la descripción:

   ULLRICH. Neuron, 1992, vol. 9, 303-391 [0005] PLOWMAN et al. ON&P, 1994, vol. 7 (6), 334-339 [0012] [0078] BOLEN. Oneogene, 1993, vol. 8, 2025-2031 [0013] KENDALL; THOMAS. Proe, Nat'l Aead, Sei., 1994, vol. 90, 10705-09 [0017] KIM at al. Nature, 1993, vol. 362, 841-844 [0017] JELlNEK et al. Bloehemistry, vol. 33, 10450-56 [0017] TAKANO at al. Mol. Bio. Call, 1993, vol. 4, 358A [0017] KINSELLA et al. Exp. Cell Res., 1992, vol. 199, 56-62 [0017] WRIGHT et al. J. Cellular Phys., vol. 152,448-57 [0017] MARIANI et al. Proe. Am. Assoe. Caneer Res, 1994, vol. 35, 2268 [0017] SCHLESSINGER; ULLRICH. Neuron, 1992, vol. 9, 303-391 [0062] FANTL et al. Cell, 1992, vol. 69,413-423 [0063] SONGYANG at al, Mol. Cell. Biol., 1994, vol. 14, 2777-2785 [0063] SONGYANG et al. Cell, 1993, vol. 72, 767-778 [0063] KOCH atal. Seienee, 1991, vol. 252, 668-678 [0063] SHIBUYA at al. Oneogene, 1990, vol. 5, 519-524 (0076) DE VRIES et al. Seienee, 1992, vol. 255, 989-991 [0076] FERRARA; HENZEL. Bioehein. Biophys. Res. Comm., 1989, vol. 161,851-858 [0076] VAISMAN et al, J. Biol. Chem, 1990, vol. 265, 19461-19566 [0076) KLAGSBURN; SOKER. CurrentBi%gy, 1993, vol. 3 (10),699-702 [0076) [0077) HOUCK at al, J. Biol. Chem, 1992, vol. 267, 26031-26037 [0076)

   FOLKMAN; SHING. J. Blologieal Chem, 1992, vol. 267 (16),10931-34 (0077) FOLKHAM. J. Natl. Caneer Inst., 1991, vol. 82, 4-6 [0077] WEIDNER et al. New Engl. J. Med., 1991, vol. 324, 1-5 [0077] FOLKMAN at al. Xlth Congress of Thrombosis and Haemostasis. Leuven University Press, 583-596 [0078] FOLKMAN. N. Engl. J. Med., 1971, vol. 285, 1182-1186 [0078] MILLAUER et al. Call, 1993, vol. 72, 835-846 [0080] QUINN et al. Proe. Natl. Aead. Sei. USA, 1993, vol. 90, 7533-7537 [0080] SCHLESSINGER; ULLRICH. Neuron, 1992, vol. 9, 1-20 [0084] TWAMLEY et al. Proe. Nat!. Aead. Sei. USA, 1993, vol. 90, 7696-7700 [0085] HU et al. Mol. Cell. Biol., 1992, vol. 12, 981-990 [0085] KASHISHIAN ; COOPERo Mol. Cell. Biol., 1993, vol.
7. 4. 49-51 [0085] KASHISHIAN et al. EMBO J, 1992, vol. 11, 1373-1382 [0085] KAZLAUSKAS at al. Proc. Nat!. Aead. Sei. USA, 1993, vol. 10 (90),6939-6943 [0085] ARVIDSSON et al. Mo/. Cell. Biol., 1994, vol. 14, 6715-6726 (0085) NISHIMURA et al. Mol. Cell. Biol., 1993, vol. 13, 6889-6896 [0085) CLAESSON-WELSH. Prog. Growth Factor Res., 1994, vol. 5, 37-54 [0085) ROZAKIS et al. Nature, 1992, vol. 360, 689-692 [0085] FLOEGE et al. Kidney Internatíona/, 1993, vol. 43, 478-545 [0088]

   TUZI at al. Br. J. Caneer, 1991, vol. 63, 227-233 [0089] TORP et al. APMIS, 1992, vol. 100, 713-719 [0089] SLAMON at al. Seienee, 1989, vol. 244, 707-712 [0089) KUMABE at al. Oncogene, 1992, vol. 7, 627-633 [0089] AKBASAK; SUNER·AKBASAK et al. J. NeuroL Sei., 1992, vol. 111, 119-133 [0089] DICKSON et al. Caneer Treatment Res., 1992, vol. 61, 249-273 [0089] KORC et al. J. Clin. Invest., 1992, vol. 90, 1352-1360 [0089] LEE; DONOGHUE. J. Cel/. Biol, 1992, vol. 118, 1057-1070 [0089] ARTEAGA at al. J. Clin, Invest, 1989, vol. 84, 1418-1423 [0090] MACAULEY at al. Caneer Res, 1990, vol. 50, 2511-2517 [0090] SANDBERG·NORDQVISTetal. CancerRes, 1993, vol. 53, 2475-2478 [0090) GOLDRING. EukaryotieGeneExprespion, 1991, vol. 1, 301-326 [0090] BASERGA. Caneer Res, 1995, vol. 55, 249-252 [0090] BASERGA. Gel/, 1994, vol. 79, 927-930 [0090) COPPOLA et al. Mol. Cell. Bio/., 1994, vol. 14, 4588-4595 [0090) CANCE et al. Int. J. Caneer, 1993, vol. 54, 571-77 [0091] PLOWMAN et al. DN&P, 1994, vol. 7, 334-339 [0092]

   BOLEN et al. FASEB J., 1992, vol. 6, 3403-3409 [0093) Remington's Pharmacological Sciences. Mack Publishing Ca, [0099] FINGL et al. The Pharmacological Basis of Therapeutics. 1975, 1 [0117) Enzyme-Linked Immunosorbent Assay. VOLLER et al. Manual of Clinical Immunology. Am. Soco Of Microbiology, 1980, 359-371 [0140] FENDLEY et al. Caneer Research, 1990, vol. 50, 1550-1558 [0143] HONEGGER et al. Cell, 1987, vol. 51, 199-209 [0161] KOMADA et al. Oncogene, 1993, vol. 8, 2381-2390 [0164] SUPERTI·FURGA et al. EMBO J, vol. 12,2625-2634 [0169] [0175] SUPERTI·FURGA at al. Nature Bioehem, vol. 14, 600-605 [0169] SUPERTI·PURGA et al. Nature Biotech., vol. 14, 600-605 [0175) BONNER et al. Mo/ae. Cell, Bio/., 1985, vol. 5, 1400-1407 [0180) MORRISON etal. Proe. Natl. Aead. Sei. USA, 1988, vol. 85, 8855-8859 [0180] RYGAARD; POVLSEN. Acta Patho/, Microbia/, Seand., 1969, vol. 77, 758-760 [0231] MOSSMAN. J. Immuno/, Methods, 1983, vol. 65, 55-63 [0239] KORZENIEWSKI; CALLEWAERT. J. Immuno/. Methods, 1983, vol. 64, 313 [0239] DECKER; LOHMANN·MATTHES. J. Immunol. Methods, 1988, vol. 115,61 [0239]