TWI229073B

TWI229073B - Pyrrole substituted 2-indolinone protein kinase inhibitors

Info

Publication number: TWI229073B
Application number: TW088108925A
Authority: TW
Inventors: Cho Tang Peng; Son Le; Gerald Mcmahon
Original assignee: Sugen Inc
Priority date: 1998-05-29
Filing date: 1999-05-29
Publication date: 2005-03-11
Also published as: NZ508815A; PT2020408E; EA005032B1; TR200003514T2; IL139934A0; JP2002516310A; ES2429573T3; KR20010083039A; EP1082305A4; HK1126770A1; SK18062000A3; NO20005916D0; EP1082305A1; CA2314156A1; CN1311775A; DK2020408T3; IL139934A; BR9910792A; CA2314156C; HUP0103617A2

Description

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五、發明說明（、相關申請案 ----^——叫-----裝 (請先閱讀背面之注意事寫本頁) 本申β术/,、美國歷時專利巾請案序號術⑽，川（州8年5 月29日巾tf)及美國臨時專”請案序號_6，啊1999年 \月1 5曰/巧）有關且優先於此等臨時專利申請案申請專利權’此等臨時專利申$杳安卞』甲叫木已完全以提及之方式併入本文中。緒言本般而言係有關有機化學、生化學、藥學及醫學。更特疋。之，其係有關新穎之經吡咯取代2 _啕哚啉酮化合物’及其生理上可接受之鹽與前藥，其可調控蛋白質激酶 (PKs )活性，因此應對與p κ活性異常有關之病變具有有利效果。 · 發明背景下文僅供説明背景，不應視爲本發明之先前技藝。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 PKs爲催化蛋白質之酪胺酸、絲胺酸、與蘇胺酸殘基上羥基I嶙酸化之酵素。此看似簡單活性之結果其實錯综複雜；細胞生長、分化及增殖，亦即細胞生命之實質上各方面均以某種方式依賴PK活性。此外，PK活性異常與病變之估主亦有關’此等病變範圍由相當不威脅生命之疾病如：牛皮癖至極端惡性之疾病（如··神經膠質母細胞瘤）（腦癌） PKs很谷易分解成二種，蛋白質路胺酸激酶（pTKs)及絲胺酸-蘇胺酸激酶（STKs)。 PTK活性之一項主要作用爲其涉及生長因子受體。生長因 -4- 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1229073 at Β7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明説明（2 ) 子受體為細胞表面蛋白質。生長因子受體當與生長因子配位體結合時，會轉化成活性型，與細胞膜之内表面上蛋白質交互作用。其結果造成受體及其他蛋白質之酪胺酸殘基上進行磷酸化，而在細胞内與許多種細胞質訊號分子形成複合物，進而影響許多不同細胞反應如：細胞***（增殖）、細胞分化、細胞生長、表現在細胞外微環境之代謝效果，等等。為了更完整討論，可參見史雷辛格（Schles singer) 與烏力奇 OJllrich)之 Neuron· 9:303-391 (1992)，該文獻包括其中任何圖示宛如完全示於本文中，係以提及之方式併入本文。已知具PTK活性之生長因子受體為受體酪胺酸激酶 (”RTKsn)。其包含具有不同生物活性之穿膜受體大族群。目前至少鑑定出19種不同之RTKs副族群。其中一項實例為稱為"HER” RTKs之副族群，其包括EGFR(表皮生長因子受骨f ) 、HER2、HER3及HER4。這些RTKs由細月包夕卜糖4匕酉己位體結合區、穿膜區及細胞内細胞質催化區組成，可使蛋白質上酷胺酸殘基鱗酸化。另一種RTK副族群由胰島素受體（IR)、似胰島素生長因子I 受體（IGF-1R)及與胰島素受體相關之受體（IRR)組成。IR及 IGF-1R會與胰島素、IGF-I及IGF-II交互作用，形成含二個完全細胞外之糖化α -副單位及二個· /3副單位之雜四聚體，其穿透細胞膜且包含酪胺酸激酶區。第三種RTK副族群稱為血小板衍生之生長因子受體 (7 00?11’’）族群，其包括？00?11^、？00?11/5、0 5?111，（：- (請先閱讀背面之注意事項再Β本頁) •裝· 訂線本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ 297公釐） 1229073

五、發明說明（3 ) 經濟部智慧財產局員工消費合作：^ kit與c-fms。此等受體由包含不同數量似免疫球蛋白之環形之糖化細胞外區與細胞内區組成，其中酪胺酸激酶區中穿插不相關之胺基酸序列。另一種由於其類似PDGFR副族群，因此有時候涵括在 PDGFR副族群中，其係胎肝激酶（”flk，，）受體副族群。咸信此族群由激酶嵌插區.受體胎肝激酶· 1(KDR/FLK-1)、flb1R、 flk-4及似fms酪胺酸激酶](fit-1)組成。酪胺酞激酶生長因子爻體族群之另一個成員爲纖維母細胞生長因子（"FGF”）受體副族群。此族群由四種受體fgfri_4 及七種配位體FGF1-7組成。雖然尚未完全定義，但似乎受體係由含不同數量似免疫球蛋白之環形之糖化細胞外區與細胞内區組成，其中酪胺酸激酶序列中穿插不相關之胺基酸序列區。酪胺酸激酶生長因子受體族群另一個成員爲血管内皮生長因子（"VEGF”）受體副族群。VEGF爲類似pDGF之二聚合糖蛋白，但其生物功能及活體内目標細胞專一性則與pD(}F；^ 同。特定言之，目前認爲VEGF之基本角色爲脈管生成性及血管分佈形成性。已知RTK副族群之更完整列表説明於普羅曼（Plowman)等人，2^，7(6) ·· 334-339 (1994)，該案包括任何圖示宛如其完全示於本文中，係以提及之方式併入本文。除了 RTKs外，尚有一種完全細胞内之pTKs族群，稱爲，，非受體酪胺酸激酶”或，，細胞酪胺酸激酶”。後者簡稱，，ctk，，，且以此簡稱用於本文中。CTKs不含細胞外區及穿膜區。 (請先閱讀背面之注意事項寫本頁： •气· 裝訂、 •線- ________ _ 6 _ ，.張尺度適用中國國家標準各⑽χ 297公髮） 1229073 . A7 B7 五、發明說明（4 ) -----·---★------裝·-- (請先閱讀背面之注意事寫本頁) 前 1 1 個畐1J 族群（Src、Frk、Btk、Csk、Abl、Zap70、Fes、 Fps、Fak、Jak及Ack)中，已鑑定出超過24種CTKs°Src副族群爲目前最大CTKs族群，且包括Src、Yes、Fyn、Lyn、 Lck、Blk、Hck、Fgr及Yrk。有關CTKs之更詳細討論可參見波儉（Bolen)，Oncogene, 8:2025-2031 (1993)’ 該案包括任何圖示，宛如完全示於本文中，係以提及之方式併入本文。絲胺酸/蘇胺酸激酶STKs，如同CTKs，爲細胞内主要族群，但其中仍有少數幾種STK型受體激酶。STKs爲最常見之胞液激酶，亦即該激酶在細胞質部份而不在細胞質小器官及細胞骨架部份發揮其功能。胞液爲細胞内許多細胞中間代謝及生合成活性發生之區域，例如··蛋白質於核糖體上合成之過程即在胞液中進行。 ί線- RTKs、CTKs及STKs均涉及具病原性病症之宿主，該病症明確而言，包括癌症。其他與PTKs有關之病原性病症包括 (但不限於）：牛皮癖、肝硬化、糖尿病、血管分佈形成、血管再狹窄、眼部疾病、類風濕關節炎及其他炎症，免疫性疾病如：自體免疫疾病、心血管疾病如：動脈硬化，及各種腎臟病變。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 ik 在癌症方面，有二個主要假説可進一步解釋衍生成腫瘤發展之過度細胞增殖與已知之ρ κ調節之功能之相關性。亦即該假説認爲在控制細胞***及/或分化之機轉中，分解作用造成惡性細胞生長。已知許多種原始致癌基因之蛋白質產物涉及調節細胞生長與分化之訊號轉導途徑。這些原始致癌基因之蛋白質產物包括如上文討論之細胞外生長因子、本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1229073 A7 B7 五、發明說明（5 ) 穿膜生長因子PTK受體（RTKs)、細胞質PTKs (CTKs)及胞液 STKs 0 -----.---%------裝—— (請先閱讀背面之注意事寫本頁) i線· 就P K相關之細胞活性與許多種人類病變之間表觀相聯性而言，不難發現許多努力都耗在試圖鑑定調節ρ κ活性之途徑上。其中有些涉及生物擬態法，其係使用以確實之細胞過程所涉及之分子爲樣板產生之大分子（例如：突變株配位體（美國專利申請案No· 4,966,849);可溶性受體與抗體（專利申請案No· WO 94/10202)，甘達爾與湯馬斯（Kendall and Thomas), Proc· Nat’l Acad· Sci·，90:10705-09 (1994)，金 (Kim)等人，Nature, 362:841-844 (1993)) ; RNA配位體（傑林克（Jelinek)等人，Biochemistry，33:10450-56);塔卡語 (Takano)等人，Mol. Bio. Cell 4:358A (1993);金赛拉 (Kinsella)等人，Exp. Cell Res· 199:56-62 (1992);莱特 (Wright)等人，J. Cellular Phvs·，152:448-57)及酪胺酸激酶抑制劑（WO 94/03427 ; WO 92/21660 ; WO 91/15495 ; WO 94/14808 ;美國專利案NO· 5,330,992 ;馬里安尼（Mariani)等人，Proc. Am. Assoc. Cancer Res., 35:2268 (1994)) 0 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製除了上埤研究外，亦曾試圖鑑別具有PK抑制劑作用之小分子。例如：已有文獻説明雙-單環系、雙環系及雜環系芳基化合物（PCT WO 92/20642)、伸乙晞基-氮雜吲哚衍生物 (PCT WO 94/14808)及1 -環丙基-4-吡啶基喳啉酮（美國專利案No. 5,330,992)爲酪胺酸激酶抑制劑。苯乙烯基化合物（美國專利案No. 5,217,999)、苯乙晞基取代之吡啶基化合物（美國專利案No. 5,302,606)、+唑啉衍生物（歐洲申請案No. 0 -8- 本紙張尺度適用中S國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） i 1229073 Α7 Β7 五、發明說明（6) 566 266 A1)、硒吲哚及硒化物（pcT W0 94/03427)、三環系多元羥基化合物（PCT WO 92/21660)及苄基膦酸化合物（？匸丁 WO 91/15495)均被指稱爲適用於治療癌症之PTK抑制劑。發明概要吾等本身在鑑定調控PK活性且因此應適用於治療及預防涉及P K活性異常之病變之小型有機分子之努力已帶領吾等發現一種新穎之經吡咯取代之2 _ 丨哚啉酮化合物，其具有 PK調控能力，因此對與PK活性異常有關之病變應有有益的效果’此寺化合物即爲本發明之主題。因此，本發明一般而言係有關新穎之經吡咯取代之2•啕哚啉酮，其可調控受體酪胺酸激酶（RTKs)、非受體蛋白質酪胺酸激酶（CTKs)及絲胺酸/蘇胺酸蛋白質激酶（STKs)之活性。此外，本發明尚有關含本發明化合物與其生理上可接受之鹽與前藥之醫藥組合物之製法及於治療或預防ρκ相關病變上 < 用途，該等病變如，例如（但不限於）：癌症、糖，尿病、肝硬化、心血管疾病如：動脈硬化、血管分佈形成、免疫性疾病如：自體免疫疾病及腎臟疾病。在本又中X換使用之，U丨哚啉酮，，、，，丨哚啉酮，，及” 2 · 羥啕哚”係指如下化學結構式之分子： f請先閱讀背面之注音？事裝--- 寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製

{ 1229073 Α7 Β7 五、發明說明（峨咯”指如下化學結構式之分子

R

R 1-3 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製本文中交換使用之"經吡咯取代之2 -峭哚啉酮”及"3 _ ?比洛淀基-2^1哚啉酮”係指如式I通式之化合物。醫藥組合物’，指本文所述一種或多種化合物，或其生理上了接觉之鹽或如藥’與其他化合物（如生理上可接受之載體與賦形劑）之混合物。醫藥組合物之目的爲協助投與化合物於生物體。 ^ π前藥’’指可於活體内轉化成母化合物之製劑。通常以前藥較適用，因爲其有時候比母藥更容易投藥。例如，前藥口服時，生物可以利用，而母藥則不然。前藥在醫藥組合物中亦比母藥更具有改良之溶解性。前藥實例（但不限於）爲王酯（’’前藥’’）投藥之本發明化合物，以助於穿透細胞膜傳送，此時水溶性會影響移動性，但隨後即代謝水解成羧酸，即活性部份，一旦此部份位於細胞内部時，水溶解度則有助益。前藥另一項實例可爲短多肽，例如（但不限於）：2至1〇個胺基酸多肽，經由末端胺基與本發明化合物之羧基鍵結，其中多肽於活體内水解或代謝釋出活性分子。 ’’峨咯醛，，指如下化學結構之分子：

-----·---W------裝--- (請先閱讀背面之注意事寫本頁) 訂·- 線· 1229073 A7

I t ! S I 背面之ί 注] 意事丁

頁

線 1229073 A7 ----------- B7__ 五、發明說明（9 ) 限於）··羥基、烷氧基、羧基、硝基、氰基、胺基、銨、醯胺基、脲基、磺醯胺基、亞磺醯基、磺醯基、亞磷羧基、嗎啉基、六氫吡畊基及四唑幷基。雖然未受到任何特定理論限制，但申請者認爲極性基團可進行電子交互作用，例如（但不限於）：透過氫鍵、凡德瓦力及/或離子鍵（但非共價鍵結），以胺基酸位於ρτκ活性位置。此等交互作用可協助本發明化合物與活性位置結合，其具有充份韌性足以干擾或預防天然受質進入該位置。極性基團亦可能影響化合物之選擇性，亦即一個極性基團可能對ΡΤΚ結合區之親和力大於其他極性基團，以致含第一個特定極性基團之化合物比含另一個極性基團之化合物更強效。 . 因此本發明一方面係有關具有下列化學結構式之化合物： ---裝--- (請先閱讀背面之注意事寫本頁) .- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製其中： R9

• 12 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1229073 A7 B7 五、發明說明（1〇) R1係選自：氫、烷基、烯基、炔基、環烷基、芳基、羥基、燒氧基、C-羧基、〇-羧基、乙醯基、C-醯胺基、1硫臨胺基、續酿基及三卣甲續酿基。 R2係選自：氫、鹵素、烷基、環烷基、芳基、雜芳基及雜脂環基。 R3、R4、R5與R6分別選自：氫、烷基、三鹵烷基、環烷基、烯基、炔基、芳基、雜芳基、雜脂環基、羥基、烷氧基、芳氧基、氫硫基、烷硫·基、芳硫基、亞磺醯基、磺醯基、S -磺醯胺基、N -磺醯胺基、三鹵曱磺醯胺基、羰基、 C-羧基、0-羧基、C-醯胺基、N-醯胺基、氰基、硝基、鹵素、0 -胺甲醯基、N -胺甲醯基、〇 -硫胺甲醯基、n -硫胺甲醯基、胺基及-NRUR12。 · R11及R12分別選自：氫、烷基、環烷基、芳基、羰基、乙醯基、磺醯基、三氟甲磺醯基、及組合形成5或6員雜脂環。 R3與R4、R4與R5或R4與R5可組合形成6員芳基環，亞甲二氧基或伸乙二氧基。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -----1---^------裝--- (請先閱讀背面之注意事寫本頁) R7選自：氫、烷基、環烷基、晞基、炔基、芳基、雜芳基、雜脂環基、羥基、烷氧基、芳氧基、羰基、乙醯基、 C-醯胺基、C-硫醯胺基、脒基、C-羧基、〇_瘦基、磺醯基及三自甲磺醯基。 “ R8、R9與R10分別選自：氫、烷基、三鹵烷基、環烷基、晞基、炔基、芳基、雜芳基、雜脂環基、經基、燒氧基、芳氧基、氫硫基、烷硫基、芳硫基、亞磺醯基、績醯基、s _ -13-

111229073 A7 B7 五、發明説明（經濟部智慈財產局員工消費合作社印製相胺基、N-續醯胺基、羰基、C-幾基、0-幾基、氰基、硝基、㈣、〇-胺甲醯基、N-胺甲醯基、〇_硫胺甲醯基、 Ν’胺甲醯基、C_醯胺基、N_醯胺基、胺基及_nr11r12, 然而，R8、R%tRl0中至少—個為如式-(alkl)Z基團。 A%為選自：烷基、烯基或炔基。 Z為極性基團。本文中採用之”烷基” 一詞指包括直鏈與分支鏈基團之飽和脂系烴。較佳者，烷基具有1至2〇個碳原子（本文中指出之數字範圍（例如”1至20”）係指該基團若為烷基時，可包含 1個碳原子、2個碳原子、3個碳原子、等等，直到個碳原子）。更佳者，為含1至1〇個碳原子之中等大小烷基。最佳者，為含丨至4個碳原子之低碳數烷基。烷基可經取代或未取代。當經取代時，取代基為分別選自下列之一個或多個基團：環烷基、芳基、雜芳基、雜脂環基、羥基、烷氧基、芳氧基、氫硫基、烷硫基、芳硫基、氰基、鹵素、羰基、硫羰基、0-胺甲醯基、N_胺甲醯基、〇_硫胺甲醯基、N _硫胺甲醯基、C _醯胺基、n -醯胺基、c _羧基、〇 _羧基、硝基、矽烷基、胺基及如上^定義。义 ’’環烷基”指全碳單環或稠合環（亦即共同相鄰碳原子對之環）基團，其中一個或多個環不具有完全共軛π -電子系。環境基實例為（不限於）：環丙烷.·、環丁烷、環戊烷、環戊缔、環己烷、金剛烷、環己二烯、環庚烷及環庚三烯。環燒基可經取代或未取代。當經取代時，取代基為分別選自 F列之一個或多個基團··烷基、芳基、雜芳基、雜脂環請先閱讀背之注 3 旁裝訂 -14 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） ----- 1229073 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明說明（12) 基、經基、烷氧基、芳氧基、氫硫基、烷硫基、芳硫基、氰基、卣素、羰基、硫羰基、c -羧基、0 -羧基、0 -胺甲酿基、N -胺甲醯基、C -醯胺基、N -醯胺基、硝基、胺基及 -NRnR12 ’ Rii與Ri2如上述定義。 π晞基π指如本文中定義之烷基包含至少2個碳原子與至少一個碳-碳雙鍵。 π块基"指如本文中定義之烷基包含至少2個碳原子與至少一個碳-碳春鍵。 η芳基”指具有完全共軛冗-電子系之全碳單環或稠合環多環（亦即共用相鄰碳原子對之環）。芳基實例爲（但不限於）；苯基、莕基及蒽基。芳基可經取代或未取代。當經取代時，取代基最好爲選自下列之一個或多個基團：鹵素、三鹵甲基、烷基、羥基、烷氧基、芳氧基、氫硫基、烷硫基、芳硫基、氰基、硝基、羰基、硫羰基、C-羧基、0-羧基、0 -胺甲醯基、Ν -胺甲醯基、0 -硫胺甲醯基、Ν -硫胺甲醯基、C-醯胺基、Ν -醯胺基、亞磺醯基、續醯基、胺基、及-NRUR12，R11與R12如本文中定義。本文中採用之"雜芳基”指環中含有一個或多個選自氮、氧與硫中原子且另具有完全共軛7Γ -電子系之單環或稠合環 (亦即共用相鄰電子對之環）基團。雜芳基實例爲（但不限於）：P比洛、吱喃、P塞吩、咪峻、5吐、P塞哇、ρ比峻、外匕啶、嘧啶、喹啉、異P查啉、嘌呤與咔唑。雜芳基可經取代或未取代。當經取代時，取代基最好爲選自下列一個或多個取代基：燒基、環说基、函素、三_甲基、經基、炫氧 (請先閱讀背面之注意事寫本頁) 裝訂·- -線I! -15- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格(210 X 297公釐） 1229073

五、發明說明（13 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製基、芳氧基、氫硫基、烷硫基、芳硫基、氰基、硝基、幾土 a談基〶酿胺基、C -叛基、0 -幾基、亞橫酿基、續酿基、〇-胺甲醯基、N-胺甲醯基、0-硫胺甲醯基、^硫胺甲醯基、C·醯胺基、N·醯胺基、胺基及-NRUR12，wRu 與R12如上述定義。 π雜脂環基”指環中含有一個或多個選自：氮、氧與硫中原子之單環或稠合環。環中可具有一個或多個雙鍵。然而環中不具有完全共軛π _電子系。雜脂環基環可經取代或未取代。當經取代時，取代基最好選自下列一個或多個取代基··烷基、環烷基、_素、三自甲基、羥基、烷氧基、芳氧基、氫氧基、烷硫基、芳硫基、氰基、硝基、羰基、硫羰基、C-羧基、〇_羧基、〇 -胺甲醯基、Ν•胺甲醯基、〇-硫胺曱醯基、Ν-硫胺曱醯基、亞磺醯基、磺醯基、c_醯胺基、N-醯胺基、胺基及-NRiiRi2，以Rll與Rl2如上述定義。 n羥基”指-OH基團。 "烷氧基"指如本文定義之_〇_烷基與環烷基。 n芳氧基”指如本文定義之-〇-芳基與雜芳基。 ”氫硫基”指-SH基團。 ”烷硫基"指如本文定義之S -烷基與s -環烷基。 π芳硫基”指如本文定義之S -芳基與S -雜芳基。 ”羰基”指-C(=0)-R”基團，其中R”基團選自如本文定義之氳、烷基、環烷基、芳基、雜芳基（經由環碳鍵結）及雜脂玉衣（經由環碳鍵結）。 ”醛”基指羰基，其中R"爲氫。 (請先閱讀背面之注咅？事寫本頁) -裝-! -丨線' -16- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1229073 A7 五、發明說明（Μ) 氫團硫羰基，，指4(=幻-11"基團，R"如本文定義。 X-叛基"指-C(=0)0-R"基固，R”如本文定 ’〇-羧基"指-0C(=0)R"基團，R"如本文定 1酯基"指-C(=0)0-R”基團，R"如。 +又疋義，但R π不可爲乙酿基指-C(=0)CH3基團。羧酸”指C-羧基，其中R”爲氫。鹵素”基團指氟、氣、溴或碘。二鹵甲基"指-ex?基團，其中父良〒x為如本又定義之自素基 .I I--ί !1! — ·裝 i I (請先閱讀背面之注意事寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製，，三鹵甲磺醯基"指x3cs(=〇)”其圇 v L 3 v hI團，χ如上述定義。 π氰基π指-C Ξ N基團。，，亞磺醯基”指-S(=0)-R”基團，其中升除了如上述定羞外，亦可爲經基。義 •’磺醯基，，指-S(=0)2R”基團，其中R，片丫K除了如上述定義亦可爲羥基。 A W ’丨亞甲二氧基”指-OCH2〇-基團，其中一伽备広原子鍵結。纟中-個乳原予與相鄰碳 ”伸乙二氧基”指-0CH2CH20-基團，其中-伽卜 W“ 圓具中一個氧原子與相鄰碳原子鍵結。 ” S-磺醯胺基”指4(=0)2败，12基團，其 — 與R12如本文疋我0 、二績醢胺基”指-NRhS(=0)2R12基團，其中R"與R12如本文疋義。 -17- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公爱)— 線· 1229073 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明說明（15 ) ”0-胺甲醯基，，指-0C(=0)NRHR12基團，其中RU與R12如本文定義。、口 ” N-胺甲醯基”指R120C(=0)NR11-基團，其中RU與R12如文定義。 α ”0-硫胺甲臨基"指-0C(=S)NR"R12基團，其中R1%R12如本文定義。、 σ 丨，Ν-硫胺甲醯基丨1指RUOCes^RU-某圓，甘山" 、 v ) 丞图，其中與R12如本文定義。 ’’胺基’，指-NRnR12基團，其中ri%r12均爲氫。 "C-醯胺基"指-C(=0)NRnRl2基固，其中如本文定義。 "N-酿胺基"指Κ^(=0)ΝΙΙη:基團，其中以與…2如本文定義。 ”銨"基團指-—NHRUR12基團，其中R11命ϋ12γ ^丹甲R與Ri2分別選自：烷基、環烷基、芳基、及雜芳基。 "脲基，，指观|咖〇輝121113基固，義，且R13之定義與RII及RI2相同。 & ，，胍基"指-R"NC(=N)NR12r13 基團，其中 rU、ri2^i3 文定義。 "脒基，，指RH(哪基團，其中R11與r|2如本 ’’硝基Μ§-νο2基團。 ’’膦醯基”指-OP(=〇)2〇R”，其中R”如本文定義。 ’’嗎P林基’’指如下化學結構式之基團：， (請先閱讀背面之注音？事 ^寫本頁) 裝一-°J· |線· 本紙張尺度適种關家標準(CNS)A4 (210^^7^57 1229073 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製

經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1229073 A7 __ B7 五、發明說明（17) 個或多個卣素-基團取代之低碳數烷氧基、經選自未取代之芳基或經取代之芳基取代之低碳數烷氧基，該經取代之芳基係經一個或多個選自下列之基團取代：未取代之低碳數烷基、羥基、未取代之低碳數烷基烷氧基、卣素、胺基、未取代之低碳數烷基S-磺醯胺基或-NR"R12 ;未取代之芳基或經一個或多個分別選自下列之基團取代之芳基：未取代之低碳數燒基、未取代之低碳數燒基燒氧基、經一個或多個鹵素基團取代之低碳數炫氧基、經選自未取代芳基或經取代芳基之基團取代之低碳數烷氧基，該經取代芳基係經一個或多個分別選自下列之基團取代：未取代之低碳數烷基、經基、未取代之低碳數烷基烷氧基、卣素、胺基、未取代低碳數S-磺醯胺基或-NRnR12 ;羥基、胺基、未取代之低碳數烷磺醯胺基、經選自氫或未取代低碳數烷基之基團取代之C-羧基、嗎啉基、-NRnR12、三鹵甲基、芳基、經一個或多個分別選自下列之基團取代之芳基：羥基、自素、三鹵甲基、胺基、-NRnR12、磺醯胺基、經選自氫或未取代之低碳數烷基取代之C-羧基、未取代之低碳數燒基或經選自下列之基團取代之低碳數烷基：羥基、卣素、經選自氫或低碳數烷基取代之C-羧基；胺基或-NRnR12 ;未取代之雜脂環基、經一個或多個分別選自下列之基團取代之雜脂環基：_素、羥基、未取代之低碳數烷基、未取代之低碳數羰基、羥基、未取代之低碳數烷基烷氧基、或經一個或多個鹵素基團取代之烷氧基、未取代之芳氧基、經一個或多個分別選自下列之基團取代之芳氧基：未取代之低碳數技基、 -20- 本紙張尺度適用中0國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -----------I I I 1 --- Γ清先閱讀背面之>i意事寫本頁) =0· 4. 1229073 A7 B7 五、發明說明（18) 三鹵甲基、鹵素、羥基、胺基*_NRnR12 ;氫硫基、未取代之低碳數烷基烷硫基、未取代之芳硫基、經一個或多個選自下列之基團取代之芳硫基：鹵素、羥基、胺基或-NRnR12 ; 經選自氫及未取代之低碳數烷基中之基團取代之C-羧基、未取代之低碳數纪基0-叛基、未取代之低碳數燒基S-績醯胺基、硝基、未取代之低碳數烷基C -醯胺基、未取代之低碳數烷基N-醯胺基、胺基及-RnR12。本發明另一項目前較佳具體實施例中，R3、R4、R5及R6分別選自：氫、i素、未取代之低碳數烷基、經一個或多個選自下列之基團取代之低碳數烷基：羥基、鹵素、C-羧基（其係經選自氫及未取代之低碳數烷基取代）、胺基或-NRUR12 ; 未取代之低碳數烷基烷氧基，經一個或多個卣素基團取代之低碳數烷氧基、未取代之芳氧基、經一個或多個選自下列之基團取代之芳氧基：未取代之低碳數烷基、經一個或多個函素基團取代之低碳數燒基、經基、未取代之低碳數烷基烷氧基、鹵素、胺基或-NRUR12 ; S-磺醯胺基，其中R11 與R12分別選自：氫及未取代之低碳數烷基；未取代之芳基、經一個或多個分別選自下列之基團取代之芳基：画素、未取代之低碳數烷基、經一個或多個卣素基團取代之低碳數烷基、未取代之低碳數烷基烷氧基、胺基或-NRUR!2 ; 未取代之雜芳基、經一個或多個分別選自下列之基團取代之雜芳基··未取代之低碳數烷基、經一個或多個_素基團取代之低碳數烷基、未取代之低碳數烷基烷氧基、羥基、鹵素、胺基或-NRUR12，未取代之雜脂環基、經一個或多個 -21 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ϋ ϋ n mmj ί ϋ i_^ n n ϋ ϋ ·1 I · n ϋ (請先閱讀背面之注意事寫本頁) 訂. 丨線· 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1229073 A7 B7 五、發明說明（19) 分別選自下列之基團取代之雜脂環基：_素、羥基、未取代之低碳數烷基、經一個或多個_素取代之低碳數烷基、未取代之低碳數烷基烷氧基、胺基或-nrur12，未取代之低碳數烷基0-羧基、C-醯胺基、其中R11與R12爲分別選自下列之基團：氫、未取代之低碳數烷基及未取代之芳基，及 N-醯胺基，其中R11與R12爲分別選自下列之基團：氫、未取代之低碳數烷基及未取代之芳基。本發明目前較佳特色爲R8、R9與R10中之一爲-(alkDZ，而另二者分別選自：氫、羥基、未取代之低碳數烷基、未取代之低碳數晞基、未取代之低碳數炔基、未取代之低碳數烷基烷氧基、經一個或多個卣素基團取代之低碳數烷氧基、未取代之芳基烷氧基、胺基、-NRnR12、鹵素、經選自氫或未取代之低碳數烷基取代之C -羧基、未取代之低碳數烷基0 -羧基、未取代之低碳數烷基C -醯胺基、未取代之低碳數烷基N -醯胺基、乙醯基、未取代之低碳數烷基S -磺醯胺基、未取代之芳基或經選自下列之基團取代之芳基：鹵素、羥基、未取代之低碳數烷基烷氧基、經一個或多個鹵素基團取代之烷氧基、經選自氫或未取代之低碳數烷基取代之C-羧基、未取代之低碳數烷基0-羧基、胺基、未取代之低碳數烷基S-磺醯胺基及-NRnR12。本發明目前較佳特色爲R8與R1G選自氫及未取代低碳數烷基。亦爲本發明目前較佳特色爲alh爲未取代低碳數烷基。本發明另一項目前較佳特色爲Z選自：羥基、胺基、 -22- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1229073 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明說明（20) _NRnR12、四級銨、經選自氫或未取代低碳數烷基之基團取代之C -羧基、經選自氫或未取代低碳數烷基之基團取代之C -酿胺基、嗎琳基、六氫吡啶基、四唑幷基及膦醯基。本發明另一項目前較佳特色爲alki爲2至4個碳原子之未取代低碳數烷基且Z爲羧酸。本發明目前較佳特色爲1^9爲311^2。同樣爲本發明目前較佳特色爲Rii與Ri2分別選自··氫、未取代低碳數烷基、羥基、未取代低碳數烷基烷氧基、未取代低碳數烷基羰基、未取代低碳數烷基〇_羧基及乙醯基。本發明另一項目前較佳具體實施例中，Rl、R2、R3、R4、 R5、R6及R7爲氫，R8與R10爲甲基且尺9爲_CH2CH2C( = 〇)〇H。亦爲本發明目前較佳具體實施例.爲R1、R2、R3、R4、R5、 R6、R7 及 R8爲氫，Ri〇爲甲基且 R9 爲-CH2CH2C(=〇)〇h。本發明另一項目前較佳具體實施例爲R7係選自··氫、未取代之低碳數烷基、經選自下列之基團取代之低碳數烷基：未取代之環燒基、未取代之芳基、及經選自：經基、未取代之低碳數烷基烷氧基及_素取代之芳基。亦爲本發明目前較佳具體實施例中，Z係選自： -C( = 〇)NR13R14，其中R13與rm分別選自：氫、未取代之低碳數烷基、經選自胺基及-NR11R12之基團取代之低碳數烷基、未取代之芳基、經一個或多個選自下列之基團取代之芳基、_素、經基、未取代之低碳數垸基燒氧基及三鹵甲基；未取代之雜芳基、未取代之雜環基。及組合形成之5員或6員未取代雜脂環基，及-NRnR12，其中Rn與rh分別選 -23- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事 I --- 寫本頁) 言. Γ A7 1229073 B7___ 五、發明說明（21 ) 自：未取代之低碳數烷基及組合形成之5或6員未取代雜脂環。 ----*---------裝，--- (請先閱讀背面之注意事寫本頁) 另一項本發明目前較佳具體實施例爲R7選自：未取代低碳數烷基、經一個或多個選自下列之基團取代之低碳數烷基··未取代之環统基、未取代之芳基、經一個或多個分別選自下列之基團取代之芳基：_素及未取代低碳數烷基烷氧基；及未取代之低碳數统基叛垸基，且Z係選自：未取代之C-羧基及未取代之低碳數烷基c-羧基。最後，本發明目前較佳具體實施例中，R3、R4、R5與R6分別選自：氫、鹵素、未取代之低碳數烷基、經一個或多個羥基取代之低碳數烷基、未取代之低碳數烷氧基、未取代之芳基、經一個或多個低碳數烷氧基取代之芳基、及 -S(0)2NRuR12 ’ R5 爲氫，R6 爲-NRnR12，且 R11 與 Ri2 分別選自·風、未取代之低碳數基及組合形成之5或6員未取代雜脂環。線. 經濟部智慧財產局員工消費合作社印^^ 本文所述之化學式可具有互變異構性及結構異構化現象。例如：本文説明之化合物可依連接2_吲哚啉酮部份與各部份之雙鍵呈E或Z組態，或可爲E與Z之混合物。本發明涵括任何互麦異構型或結構異構型，及其混合物，其具有調控RTK、CTK及/或STK活性之能力，且不限於任一種互變異構型或結構異構型。又 2 ·合成/組合庫本發明另一方面爲可由結構式2羥啕哚與結構式3醛反應形成之至少10種3-吡咯啶基-24丨哚啉酮化合物之組合庫 •24- 1229073

五、發明說明（22)

經濟部智慧財產局員工消費合作社印製其中R^R1。如上述定義。、'中採用之組合庫"係指在多次元排列化合物中，由 :’人兀（各化合物與另-種次元之各化合物反應形成之所有化合物。本發明内容中，該排列爲二種次元，其；: 個/人7L代表本發明所有L果，第二個次^代表本發明所有醛。各羥哨哚可與各個及每一個醛反應，以形成3_吡咯走基2 5丨木琳酮化合物。依此方式形成之所有3 _吡咯啶基_ 2斗果琳_化合物均在本發明範圍内。本發明範圍内亦包括由某些羥吲哚與所有醛反應、所有羥吲哚與某些醛反應，或某些幾⑼嗓與某些醛反應等形成之較小組合庫。上述組合庫中之羥峭哚最好選自：羥峭哚本身及經取代之技吲咪如（但不限於）：6 -溴幾啕哚、5 -經基經啕哚、5 -甲氧基技P?l哚、6 -甲氧基羥吲哚、5 -苯胺磺醯基羥吲哚、4-[2-(2-異丙基苯氧基）乙基]羥吲哚、4_[2兴3異丙基苯氧基）乙基]經啕哚、4_[2-(4-異丙基苯氧基）乙基]羥啕哚、5_氟羥啕哚、6 -氟幾啕哚、7 -氟羥啕哚、6 -三氟甲基經吲哚、5 -氧技Μ卜木、6-氣經丨嗓、丨嗓-4-瘦酸、5-溴經p?卜朵、6-(N-乙醯胺基）幾吲哚、4 -甲基羥啕哚、5 _甲基經啕哚、4 -甲基 -25- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（2】〇 X 297公釐） I 1 I ϋ·Ι— i-i §§%ι ϋ ϋ I» I Β — I (請先閱讀背面之注意事寫本頁) 訂.- 線- 1229073 A7 B7 五、發明說明（23) -5-氣羥吲哚、5-乙基羥啕哚、6•羥基羥吲哚、5-乙醯基羥啕哚、羥吲哚-5-羧酸、5 -甲氧基羥吲哚、6 _甲氧基羥，弓丨哚、5-胺基羥4丨哚、6-胺基羥吲哚、4-(2·Ν·嗎啉乙基）經钊哚、7-氮雜羥W哚、羥啕哚-4-胺甲酸第三丁酯、羥丨哚-6-胺甲酸第二丁醋、4-(2-#莖乙基）經吲嗓、4 _正丁基輕峭嗓、 4,5-二甲氧基羥巧嗓、6-(甲磺醯胺基）羥吲哚、6_(苯醯胺基）經4丨哚、5 -乙氧基羥4丨哚、6-苯基羥 <哚、6-(2-甲氧苯 -1-基）羥峭哚、6-(3-甲氧苯-1-基）羥吲哚、6_(4甲氧苯“_基）羥啕哚、5 -胺磺酿基羥啕哚、5 -異丙胺磺醯基羥啕哚、二甲胺橫醯基經峭哚、5-(N-嗎琳續醯基）幾4丨嗓及‘(2-經乙基）上述組合庫中之酸最好選自（但不限於）：3_(5-甲醯基-2,4-二甲基-1H-吡咯-3-基）丙酸、3-(5-甲醯基-4-甲基-1H-吡咯-3-基）丙酸、3-(1-苄基-5-甲酿基-2,4-二甲基-1H-P比洛-3-基）丙酸、3-(5-甲醯基-1-甲氧羰基·2,4-二甲基-1H-吡咯-3-基）丙酸、3-(5-甲臨基-1，2,4-三甲基-1H-P比p各-3-基）丙酸、3-[5-甲醯基-1-(3 -甲氧芊基）-2,4-二甲基-1H-吡咯-3-基）丙酸甲酉旨、3-(1-環己基曱基-5 -曱醯基-2，4-二甲基-lH-p比哈-3-基）丙酸甲酉旨、3-[1-(2,2-二甲基丙基）-5 -甲酿基-2,4-二甲基-lH-吡咯·3-基）丙酸甲酯、l，3,5-三甲基-4-(3-嗎啉-4-基-3-氧丙基）-1Η -p比洛-2 -甲膝、3-(5 -甲酿基-1，2,4-三甲基-1Η-ρ比洛-3-基）-N-(2-嗎淋-4-基-乙基）丙醯胺、3-(5-甲醯基-1，2,4-三甲基- lH-p比咯-3-基）-N-苯基丙酿胺、l，3,5-三甲基-4-(3 -氧-3-六氫0比咬-1-基丙基）-111-0比洛-2-甲酸、1，3,5-三甲基-4-(3-氧 -26- 本纸張尺度適用中S國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公釐） -----·---*------裝'--- (請先閱讀背面之注意事寫本頁) 一-*^— - 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1229073 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明說明（24 ) -3-外1：洛淀-1-基丙基）-1Η-ρ比嘻-2 -甲酸、3 -(5 -甲酿基-1，2,4-三甲基-1H-吡咯-3-基）-N-(4-甲氧苯基）丙醯胺、N-(4-氟苯基）-3-(5 -甲醯基-1，2,4-三甲基-1H-吡哈-3·基）丙醯胺、3-(5-甲醯基-1，2,4-三甲基-1H-吡咯-3-基）·Ν-(4-三氟甲苯基）丙醯胺、3-[5·甲醯基-1-(3-甲氧苄基）_2,4-二甲基-1Η-吡咯-3-基] 丙酸、3-(1-環己基甲基-5-甲醯基-2,4-二甲基-lH-p比咯-3-基）丙酸、3-[1-(3_氟芊基）_5_甲醯基·2,4_二甲基比哈基] 丙酸甲酯、3-(1-芊基-5-甲醯基-2,4-二甲基-1H-吡咯-3-基] 丙酸、3-[1-(4-氟苄基）-5-甲醯基-2,4-二甲基-1H-吡咯-3-基] 丙酸甲酯、3-[1-(4-(氟苄基）-5-甲醯基-2,4-二曱基-1H-吡咯-3-基]丙酸、3-[1-(3-氟芊基）-5-甲醯基-2,4-二甲基-1H-吡洛-3基]丙故、3,5-<一甲基-4-(3-嗎淋-4-基丙基）-ΐΗ -ϊ7比洛-2-甲酸、4-(3- 一甲胺丙基）-3,5-二甲基-甲路、5 -甲醯基_2,4-二甲基- -3-羧酸、3,5-二甲基-4-(4-甲基六氫叶匕畊-1-羰基）-1Η-吡咯·2-甲醛、5 -甲醯基-2,4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸（2-二甲胺乙基）醯胺。本發明另一方面提供一種合成式1 3 -吡咯啶基-2-p5丨哚啦酮之方法’其包括由式2經啕哚與式3酸於溶劑中，最好於鹼之存在下反應。可與式3醛反應產生式1 3 _吡咯啶基-2- 哚啉酮之式2經 4丨嗓貫例爲羥啕哚本身及經取代之羥喇哚如（但不限於）： 6 -漠經啕哚、5 -羥基羥丨哚、5 -甲氧基羥啕哚、6 -甲氧基每p5l %、5 -苯胺橫酿基幾吲嗓、4-[2-(2-異丙基苯氧基）乙基] #坐41嗓、4-[2-(3-異丙基苯氧基）乙基]羥吲哚、4-[2-(4-異丙 -27- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（2〗〇 χ 297公釐) (請先閱讀背面之注意事寫本頁) --裝，· 訂- 丨線丨Γ - 1229073 A7 B7 五、發明說明（25) ----.----------裝—— (請先閱讀背面之注意事寫本頁) 基笨氧基）乙基]羧丨嗓、5 -氟經朵、6 -氟經4卜朵、7 -氟羥哨哚、6-三氟甲基羥啕哚、5-氯羥峭哚、6-氣羥巧哚、啕哚-4-羧酸、5-溴羥啕哚、6-(N-乙醯胺基）羥峭哚、4 -甲基羥啕哚、5 -甲基羥啕哚、4 -甲基-5-氣羥㈤哚、5 -乙基羥啕哚、6 -羥基羥啕哚、5 -乙醯基羥嘀哚、羥4丨哚-5-羧酸、 5 -甲氧基經Η丨嗓、6 -甲氧基經丨味、5 -胺基經丨嗓、6 -胺基羥啕哚、4-(2-N-嗎啉乙基）羥吲哚、7-氮雜羥4丨哚、羥啕嗓-4-胺甲酸第三丁酯、羥巧哚-6-胺甲酸第三丁酯、4-(2-羥乙基）羥吲哚、4-正丁基羥啕哚、4,5-二甲氧基羥啕哚、6-(甲磺醯胺基）羥吲哚、6-(苯醯胺基）羥啕哚、5 -乙氧基羥吲哚、6-苯基羥啕哚、6-(2-甲氧基-1-基）羥啕哚、6-(3-甲氧基-1-基）羥啕哚、6-(4_甲氧基-1·基）羥 <哚、5-胺磺醯基羥吲哚、5 -異丙胺磺醯基羥啕哚、二甲胺磺醯基羥吲哚、5-(N-嗎啉磺醯基）羥啕哚及4-(2_羥乙基）羥峭哚。丨線. 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製可與結構式2羥峭哚反應之結構式3醛之實例爲（但不限於）：3-(5-甲醯基-2,4-二甲基-1H-吡咯-3-基）丙酸、3-(5-甲醯基-4-甲基-1H-吡咯-3-基）丙酸、3-(1-芊基-5-甲醯基-2,4-二甲基-1H-吡咯-3-基）丙酸、3-(5-甲醯基-1-甲氧羰曱基-2,4·二甲基-1H-吡咯-3-基）丙酸、3-(5-甲醯基-1，2,4-三甲基_ 1H-吡咯-3-基）丙酸、3-[5-甲醯基-1-(3-甲氧芊基）-2,4-二曱基-1H-吡咯-3-基）丙酸甲酯、3-(1.-環己基甲基-5-甲醯基_ 2,4-二甲基-1H-吡咯-3-基）丙酸曱酯、3-[1-(2,2-二甲基丙基）-5-甲醯基-2,4-二甲基-1H-吡咯-3-基）丙酸甲酯、1，3,5-三甲基-4-(3-嗎啉-4-基-3-氧丙基）-1Η-吡咯-2-甲醛、3-(5-甲醯 -28- 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1229073 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明說明（26) 基-1，2,4-三甲基-1H-吡咯-3_基）-N-(2-嗎啉-4-基-乙基）丙醯胺、3-(5-甲醯基-1，2,4-三甲基-1H-吡咯-3-基）-N-苯基丙醯胺、1，3,5-三甲基-4-(3-氧-3-六氫吡啶-1-基丙基）-1Η-吡咯-2-甲·、1，3,5-二甲基- 4- (3 -氧- 洛淀-1-基丙基）-1Η - p比洛-2 _ 甲齡、3-(5-甲醯基-ΐ，2,4·三甲基-1H-吡咯-3-基）-N-(4-甲氧苯基）丙醯胺、N-(4-氟苯基）-3-(5-甲醯基-1，2,4-三甲基-lH-吡咯-3-基）丙醯胺、3·(5-甲醯基-l，2,4-三甲基-lH-吡咯-3-基）-N-(4·三氟甲苯基）丙醯胺、3-[5-甲醯基-1-(3-甲氧芊基）- 2.4- 二甲基-1H-吡咯-3-基]丙酸、3-(1-環己基甲基-5-甲醯基 -2,4-二甲基-1H-吡咯-3-基）丙酸、3-[1-(3-氟苄基）-5-甲醯基- 2.4- 二甲基-1H-吡咯-3-基]丙酸甲酯、3-(1-芊基-5-甲醯基· 2.4- 二甲基-1H-吡咯-3-基]丙酸、3-[1-(4-氟芊基）-5-甲醯基- 2.4- 二甲基-1H-吡咯-3-基]丙酸甲酯、3-[1-(4-(氟苄基）-5-甲醯基-2,4-二甲基-1H-吡咯-3-基]丙酸、3-[1-(3-氟苄基）-5-甲醯基-2,4-二甲基-1H-吡咯-3-基]丙酸、3,5-二曱基-4-(3-嗎啉 -4-基丙基）-1Η-吡咯-2-甲醛、4-(3-二甲胺丙基）-3,5-二甲基-1Η-ρ比咯-2·甲酸、5 -甲醯基-2,4-二甲基-1H-吡咯-3·羧酸、 3，5-二甲基-4-(4-甲基六氫吡畊·卜羰基）β1 η-吡咯-2·甲醛、5-甲醯基-2,4-二甲基-ΐΗ-吡咯羧酸（2_二甲胺乙基）醯胺。該反應可於驗之存在下進行。鹼可爲有機或無機鹼。若使用有機驗時，最好爲含氮鹼。有機啥氮鹼實例包括（但不限於）：二異丙胺、三甲胺、三乙胺、苯胺、吡啶、丨，8•重氮雙環[5·4·1]十一碳-7-晞、吡咯啶及六氫吡啶。無機鹼實例爲（但不限於）：氨、鹼金屬或鹼土金屬氫氧化 -29- 本纸張尺度適用中0國豕裇準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事寫本頁) 裝：訂·· •線· A7 B7 1229〇73 i、發明說明（27) 物、磷酸鹽、碳酸鹽、碳酸氫鹽、硫酸氫鹽及胺化物。驗金屬包括姓、鈉及卸，而驗土金屬包括辦、鎮及鋇。本發明目前較佳具體實施例中，當溶劑爲質子性溶劑如：水或醇時，該鹼爲鹼金屬或鹼土金屬無機鹼，以鹼金屬或驗土金屬氫氧化物較佳。相關技藝專家咸了解，根據有機合成法之已知一般原則及本文所揭示内容，即可知道何種鹼最適合該特定反應。進行該反應之溶劑可爲質子性或非質子性溶劑，以質子性溶劑較佳。’’質子性溶劑"爲具有與氧或氮原子共價鍵結之氫原子之溶劑，使得該氫原子呈相當酸性，因而可透過氣鍵與溶質”共用”該氫原子。質子性溶劑實例包括（但不限於）：水及醇。 ’ 非负子性A劑”可爲極性或非極性，但此二種情形均不含敗性虱，因此播法與溶質形成氫鍵。非極性非質子性溶劑實例爲（但不限於）：戊烷、己烷、苯、甲苯、二氣甲燒及四氣化碳。極性非質子性溶劑實例爲氣仿、四氫呋喃、二甲亞颯及二甲基甲醯胺。本發明目前較佳具體實施例中，該溶劑爲質子性溶劑，以水或醇（如··乙醇）較佳。该反應係在咼於室溫之溫度下進行。該反應通常約30。〇至約150 C ’以約80 C至約100°C較佳，以約75°C至約85°C最佳，此溫度約爲乙醇之沸點。”約”係指該溫度範圍最好在所指示溫度之l〇°C範圍内，以所指示溫度之5〇c内較佳，在所才曰示溫度之2 C範圍内最佳。因此，例如：”約乃。c，,指7 5 °c •30- 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（2〗0 X 297公爱) (請先閱讀背面之注意事寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1229073 Α7 Β7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明說明（28) ±10°C，以 75°C 土5°C較佳，且以75°C±2°C最佳。 3 .生化學/醫藥療法本發明另一方面係有關調控PK催化活性之方法，其係由 PK與本發明化合物或其生理上可接受之鹽或前藥接觸。本文中採用之"PK”指受體蛋白質酪胺酸激酶（RTKs)、非受體或”細胞”酪胺酸激酶（CTKs)及絲胺酸-蘇胺酸激g每 (STKs) 〇 ’·方法’’ 一詞係指完成指定作業之方式、方法、技術及過程，包括（但不限於）：化學、醫藥學、生物學、生化學及醫學領域之操作者已知之方式、方法、技術及過程或容易由此等已知方式，方法、技術及過程衍生之方式、方法、技術及過程。 ^ 本文採用之”調控’’係指改變RTKs、CTKs及STKs之催化活性。特定言之”調控”係指活化RTKs、CTKs及STKs之催化活性。以活化或抑制RTKs、CTKs及STKs之催化活性較佳，端賴接觸到RTK、CTK或STK或更佳者，抑制RTKs、CTKs與 STKs之催化活性之化合物或鹽之濃度而定。本文所採用”催化活性”係指直接或間接受到RTKs與/或 CTKs影響下之赂胺酸之璘酸化速率或直接或間接受到STKs 影響下之絲胺酸與蘇胺酸之磷酸化速率。本文所採用π•接觸”一詞指使本發嗍化合物及目標PK在一起之方式可令化合物影響ΡΚ之催化活性，其係直接影響，亦即與激酶本身交互作用，或間接影響，亦即與激酶之催化活性所依賴之另一個分子交互作用。這種”接觸”可於試 -31 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事寫本頁) 裝_ 線丨f 1229073 A7 五·、發明說明（29) 二^ :成5F即’於試管中’培養皿，等等中進行。在試吕中時，接觸作用可僅涉及化合物及所 " 乃士奴4 nA 曰欠< P K ’或可涉 ----·-------I----I (請先閱讀背面之注意事寫本頁) 及疋正，.·田胞。細胞亦可於細胞培養皿中維此環境中與化合物接觸。本文中’該特定化合 ^變之能力，亦即化合物之IC5。(如下文定義)可於曰採用較複雜I活生物體於活體内使用化合物之前決定。對於 $外之細胞，有多種相關技藝專家習知之方法使PL血化 “匆接觸，包括(但不限於）：直接細胞微注射法及多種穿膜式載體技術。本發明另-方面爲可於試管内或活體内，使用本發明物碉控PKs之催化活性。口 "試管内"指於人玉環境進行之過程，如，例如（但不限於）：於試管中或培養基中。本文中採用之，，活體内，，指於活生物體中進行之過程，如 (但不限於）··小白鼠、老鼠或兔子。 .線丨本發明另一方面爲受本發明化合物調控其催化活性之蛋白質激酶係選自：受體蛋白質酪胺酸激酶、細胞酪胺酸激酶及絲胺酸-蘇胺酸激酶。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製本發明一方面爲受本發明化合物調控其催化活性之受體蛋白質激酶係選自：EGF、HER2、HER3、HER4、ir、igf· 1R、IRR、PDGFR a、PDGFR/?、CSFIR、C Kit、匕㈤、 Flk-IR、Flk4、KDR/Flk-1、Flt-1、FGFR-1R、FGFR-2R、 FGFR-3R及FGFR-4R 〇此外，本發明另一方面爲受本發明化合物調控其催化活性 -32- 本紙張尺度適用中S國家標準（CNS)A4規格（2]0 X 297公髮） 1229073 A7 B7 五、發明説明（） 30 7 之細胞酵胺酸激酶係選自：Src、Frk、Btk、Csk、Abl、 (請先閱讀背面之注意事項再本頁) 〇 Fes/Fps、Fak、Jak、Ack、Yes、Fyn、Lyn、Lck、 Blk、Hck、Fgr及 Yrk。本發明另一方面為受本發明化合物調控其催化活性之絲胺 I-蘇胺敗蛋白質激酶係選自：CDK2與Raf。本發明化合物與醫藥上可接受之載體形成之醫藥組合物為本發明另一方面。此等醫藥組合物亦可包含賦形劑。本發明另一方面為治療或預防生物體之蛋白質激酶相關病變 < 方法’其包括投與醫療有效量之化合物、鹽或前藥，其係本發明之3 ·吡咯啶基-2-4丨哚啉酮。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製本文採用之” P K相關病變，，、”受ρ κ驅動之病變，，及，，異常 P K活性”均指出現ρ κ催化活性不適當（亦即過低或更常見之過南）特性之病症，其中該特定PK可為RTK、CTK或STK。不適當之催化活性可因下列因素引起：（1)通常不表現PKS之細胞中卻表現Ρ κ，（2) PK表現增加，導致不要之細胞增殖、分化及/或生長，或（3) ρκ表現減少，導致細胞增殖、分化及/或生長不當地減少。Ρ K活性過高係指編碼特定ρ K 之基因擴增作用或Ρ K活性產生程度與細胞增殖、分化及/或生長病:主相關性（亦即當ρ K含量增加時’ 一種或多種細胞病變之症狀嚴重性會增加）。活性過低當然情形相反，當Ρ K 活性下降時，細胞病變之一種或多種症狀之嚴重性會隨之本文採用之”預防防止•’及”保護”等名詞係指阻隔生物體居先得到與PK相關之病變。 -- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 1229073

-二"治療” 一詞係指減輕或消除p κ所1周節細胞病 = 出現之病狀。針對癌症而言，此等名詞僅指 U症〈個體〈壽命延長或減少該病症之—種或多種症狀。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製

生物把词指含至少一個細胞之任何活個體。活生物把可簡單至例如：單一真核細胞或複雜至哺乳動物，包括人類。、本4、中採用之醫療有效量’’ 一詞係指化合物可使待治療病又I上個或多個症狀減輕至某種程度之投藥量。就癌症治療而言，醫療有效量係指該用量具有下列效果：⑴縮小腫瘤，（2)抑制（亦即減緩至某種程度，最好為遏止）腫瘤轉移，⑺抑制腫瘤生長至某種程度（亦即減缓至某種程度，最好為遏止），及/或，（4)減輕（或較佳者為消除）與癌症有關之一種或多種症狀至某種程度。本發明方面為上述蛋白質激酶相同病變係選自··受體蛋白貝酪胺S艾激酶相關病變、細胞酪胺酸激酶病變及絲胺酸_ 蘇胺酸相關病變。本發明另一方面為上述蛋白質激酶相關病變係選自·· EGFR相關病變、PDGFR相關病變、I(}FR相關病變及仙相關病變。本發明另一方面，上述蛋白質激.酶相關病變為選自下列之癌症：鱗狀細胞癌瘤、肉瘤如··卡波西氏肉瘤、星細胞瘤、神經膠質母細胞瘤、肺癌、膀胱癌、結腸直腸癌、冒腸癌、頭與頸癌、黑色素瘤、卵巢癌、攝護腺癌、乳癌、 -- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公餐）

1229073 小細胞肺癌及神經膠質瘤。本發明另—方面，上述蛋白質激酶相關病變係選自：糖尿病、過度増殖病冑 '凡希波-林島疾病（V〇nHlppel_Lindau d1Sease)、再狹窜現象、纖維變性' 牛皮癖、骨關節炎、類風濕關節炎、炎症及血管分佈形成。其他可使用本發明化合物治療或預防之病變為免疫性病變如：自體免疫疾病(AIDS)及心血管病變如：動脈硬化症。本發明-方面為調控蛋白質激酶催化活性之化合物之鑑定法可由表現該蛋白質激酶之細胞與本發明3 “比咯咬基K 哚酮化合物、其鹽或前藥接觸，然後追踪該細胞之效應。 ’:追踪旨觀察或偵測化合物與表現特定ρκ之細胞接觸I效應。所觀察或偵測到之效應可為細胞表型變化、 Κ催化活性變化或Ρκ與天然結合對象之交互作用變化。觀祭或偵測此等效應之技術係相關技藝習知者。本發月取》纟面中，上述效應係選自：細胞表型有或沒有變化、該蛋白質激酶催化活性有或沒有變化、或該蛋白質激酶與天然結合對象之交互作用有或沒有變化。 ”細胞表型，，指細胞或組織之外觀或細胞或組織之生物功能。細胞表型實例為（但不限於）：細胞大小、細胞生長、 ’ 殖、細胞分化、細胞存活、細胞调亡、及營養素攝取與利用。此等細胞表型特性可利用相術測定。天然結合對象"指於細胞中與特定Ρκ結合之多肽。天然結合對象可在ΡΚ調節之訊號轉導過程中扮演繁殖訊號之角 297公釐） -----»---^---參！ (請先閱讀背面之注意事項本頁) 订經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1229073 A7 B7 五、發明說明（33) --------------裝--- (請先閱讀背面之注意事^^|$寫本頁) 色。當PK/天然結合對象複合物之濃度上升或下降時，天然結合對象與PK交互作用本身會有明顯變化，結果在ρκ調節訊號轉導之能力上會有顯著變化。本發明另一方面爲本文説明之化合物或其鹽或前藥，可與其他用於治療上述疾病與病變之化療劑組合。例如：本發明化合物、其鹽或前藥可組合使用烷化劑如：單獨組合氣尿喊啶（5-FU)或再組合使用洛可林（leukov〇rin);或組合使用其他烷化劑如（但不限於）：其他嘧啶類似物如：UFT、卡皮塔本（capecitabine)、金希塔本（gemcitabine)及希塔拉本 (cytarabine)，炊*基績酸g旨，例如：布速芬（busuifan)(用於治療性粒性細胞白血病）、英普速芬（impr〇sulfan)及皮普速芬（piposulfan);氮丙啶類，例如：苯達波（benz〇depa)、卡波昆（carboquone)、米達波（meturedepa)及優達波（uredepa);

線L 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製乙二胺類及甲基蜜胺類，例如；亞特胺（altretaniine)、三伸乙基蜜胺、三伸乙基磷醯胺、三伸乙基硫代磷醯胺及三羥甲基蜜胺；及氮芥類，例如：苯丁酸氮芥（用於治療慢性淋巴性白血病、原發性巨球蛋白血症及非赫金氏（n〇n_ Hodgkin’s)淋巴瘤）、環磷醯胺（用於治療赫金氏症、多發性骨髓瘤、神經母細胞瘤、乳癌、卵巢癌、肺癌、威倫氏 (Wilm’s)腫瘤及故紋肌肉瘤）、伊母斯丁（estramustine)、伊弗醯胺（ifosfamide)、諾凡比金（novembrichin)、普尼母斯丁 (prednimustine)及尿嘧啶芥類（用於治療原發性血小板增多症、非赫金氏淋巴瘤、赫金氏症及卵巢癌）；及三畊類，例如：達卡畊（dacarbazine)(用於治療軟組織肉瘤）〇 -36-本纸張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公釐）

1229073 五、發明說明（34 ) 同樣地，本發明化合物、其鹽或前藥與其他抗代謝化療劑、且口使用時’亦應具有有利效果，此等化療劑爲如（但不限於）：、葉酸類似物，例如：胺甲碟吟（用於治療急性淋巴球白血病絨毛膜癌、蕈樣肉芽腫乳癌、頭與頸癌、及成骨性母瘤）及普特林（pteropterin);及嗓呤類似物如：氫硫基嘌吟與硫胍（可用於治療急性粒性細胞白血病、急性淋巴細^ 白血病及慢性粒性細胞白血病。本發明化合物、其鹽或前藥.與天然產物爲主之化療劑之組合亦經證貫具有療效，此等化療劑如（但不限於）：長春花生物鹼，例如：長春花鹼（用於治療乳癌與睪丸癌）、長春新鹼及長春素（vinblastin) ; epipodophylotoxins，例如：伊普赛（etoposide)及丹普赛（teniposide)，此二者均適用於治療睪丸癌及卡波西肉瘤；抗生素化療劑，例如：道諾紅微素、杜索紅黴素（d〇x〇rubicin)、表紅黴素（epirubicin)、絲裂黴素 (用於治療胃癌、頸癌、結腸癌、乳癌、膀胱癌、及胰癌）、放線菌素D、狄莫索邁（temozolomide)、摺毅菌黴素 (plicamycin)、博菜黴素（用於治療皮膚癌、食道癌及生殖泌尿道癌）；及酵素性化療劑如：L_天冬胺酸酶。除了上述各點外，本發明化合物、鹽、或前藥與下列藥劑之組合應具有有利效果：鉑配位複合物（例如：希普拉定 (cisplatin));經取代脲類如：幾基.脲；甲基肼衍生物，例如；普卡畊（procarbazine);腎上腺皮質抑制劑例如：明妥丹（mit〇tane)、胺基谷狄醯胺（aminoglutethimide);及激素與激素拮抗劑：腎上腺皮質類固醇（例如：脱氫可體松）、孕 -37- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公釐） ----.--------- (請先閱讀背面之注意事寫本頁) Ίφν. ·. •線. 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1229073

五、發明說明（35) 固_ (例如：經基普触 a 接骱、頁組酮己鉍酯）；***（例如··二乙基己烯雌齡）·，抗***如 · 。莫希分（tamoxifen);雄激素，例如•睪固酮丙酸酯· 4 ’及方構化酶抑制劑（如：安索唾 (anastrozole) 〇經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 ^ 本發月化合物與米赛松（mitoxantrone)或帕立塔赛 P itaxel)之組合對治療固體腫瘤癌症或白血病特別有效，如（但不限於）：急性«性（非淋巴料）白血病。 1上述#或多種化療劑組合時應具有有利效果之本發明目則較佳化合物爲3-[2,4·二甲基-5-(2-氧-1，2-二氫（亞㈣· 3-基甲基）-1Η-吡咯基]丙酸。本發明詳細説明 1 ·圖表之簡要説明表1出示本發明某些化合物實例之化學結構式與生物活性。化合物編號對應於實例部份中之實例編號。亦即表1中化合物1之合成法即説明於實例丨。所採用之生物分析法詳細说明於下文中。其結果以ICm表示，亦即使目標ρκτ之活性相對於未添加試驗化合物之對照組中之ρτκ活性變化50〇/〇時之試驗化合物微莫耳（//Μ)濃度。明確言之，其結果顯示使目標ΡΤΚ活性下降50%時所需之試驗化合物濃度。表1所示化合物僅供範例，並未以任何方式限制本發明範圍。 -38- -----*---Γ-----裝--- (請先閱讀背面之注意事寫本頁) --線· 本纸張尺度適用中0國家標準（CNS)A4規格（2】〇 X 297 ) 1229073 A7B7 五、發明說明（36 ) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製表1 實例# 結構式 bio-FLK-1 1C» (raM) bio-PDGFr ic« (raM) bio-FGFR IQ* (mM) IIUVEC- VEGF HUVEC-aFGF ICM (mM) BrdU- PDGFr ΚΓμ(πιΜ) BrdU- FGFr ICs« (mM) BrdU- EGFr IC5. (mM) 1 1.3 <0.78 20.2 0.38 21.4 8.4 8.8 12 2 89.1 0.14 12.1 1.6 31.6 1.2 >50 >50 3 c,xxp" 1.2 0.042 .0.86 0.05 2.8 2.5 30 >50 4 ο M.cw^^OM 〇r 1.2 13 9 0.11 7.1 8.2 >50 >50 5 O .〇^ 0.13 <1.2 8.81 0.42 9.3 10.7 46.8 95.9 6 6.8 0.26 0.63 18.4 8.6 >50 >50 7 19.2 2.2 1.34 12.3 11.4 >50 >50 8 o 0.77 0.37 0.68 0.74 4.52 8.2 >50 >50 9 o ^cxxy 1.06 0.13 0.33 13.4 6.3 >50 >50 10 ^°xxy 11 <0.78 1.63 10.62 >50 5.1 >50 >50 11 0.7 0.13 7.73 1.4 9.6 11.1 >50 >50 12 52.3 13.6 3.3 11 24.6 1 >50 >50 -39- -----.---I-------- (請先閱讀背面之注意事寫本頁) 一-口. 線- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1229073 A7B7 五、發明說明（37 ) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製實例# 結構式 bio-FLK-l K^(mM) bio-PDGFr IQ. (mM) bio-FGFR IC„(raM) HUVEC- VEGF IC,. (mM) HUVEC-aFGF ICM (mM) BrdU- PDGFr BrdU- FGFr BrdU- EGFr IC5，(mM) 13 31 4.2 14 17 6 15 6.6 <0.78 16 >100 8.7 17 10 10.3 1.2 20 6.3 44.3 >50 18 ^°xxy 2.9 2 2.4 18.4 14.3 46 >50 19 0.006 0.063 0.07 3.6 3.7 39.6 >50 20 0 0.027 0.7 0.29 5 7.4 >50 >50 21 o Η»Υ^^ΟΜ 0.02 0.68 4 4 5.6 24.4 >50 >50 22 7 口 0.61 0.73 0.13 15.8 5 18 >50 23 jCc0^ 5.2 0.8 0.68 3 1.1 10.8 >50 >50 24 o H,CW〜^OM <0.78 0.55 17.9 0.67 25.1 2.4 21 >50 -40- (請先閱讀背面之注意事裝—— 寫本頁) 訂-· l· . 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1229073

A B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明說明（38) 實例# 結構式 bio-FLK-l IC,. (mM) bio-PDGFr 1C» (mM) bio-FGFR ICj, (mM) HUVEC- VEGF ICs» (mM) IIUVEC- aFGF IC»(niM> BrdU- PDGFr ICM (mM) BrdU- FGFr 1C» (mM) BrdU- EGFr 25 0.8 1.2 ί 26 91.8 >100 I 27 16.9 <0.78 0.99 1.5 28 Ο <0.78 0.16 0.04 0.15 1.9 3.4 37 >50 29 〆 5.9 1.18 6.89 0.18 0.13 0.29 13.2 30.6 30 2.6 0.52 3.5 0.25 0.64 0.4 22 24.7 31 c 3.1 1.53 0.09 0.18 2.1 35.9 37.2 32 5.1 <0.009 10 10 0.076 12 32.7 33 4.6 0.16 0.81 1 0.1 21 30.5 34 24.7 3.1 3.8 34.7 36.8 35 14.4 1.2 1.59 35.8 >50 36 89.7 1.4 -41 - -----·----------裝--- (請先閱讀背面之注意事寫本頁) -線- 本紙張尺度適用中0國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1229073

7 7 A B 五、發明說明（39 ) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製實例# 結構式 bio-FLK-l lC»(mM) bio-PDGFr 1C» (mM) bio-FGFR 1C» (mM) HUVEC- VEGF 1C» (mM) IIUVEC-aFGF IC,, (mM) BrdU- PDGFr lC5.(mM) BrdU- FGFr IC—M) BrdU-EGFr 1C» (mM) 37 85.6 1.5 38 ’Cr^ .：' 39 40 o 41 〇a^ 0.01 0.09 3.2 表2 實例# 結構式 1 bio-FLK-l IQ. (mM) bio-EGFr ICM (mM) bio-PDGFr ICM (mM) IIUVFX- VEGF IC,· (mM) HUVEC-aFGF IC« (mM) BrdU-PDGFr ICM (mM) BrdU- FGFr IC5, (mM) BrdU-EGFr 1C» (mM) 42 〇^° <0.78 >100 2.3 1 0.38 34.93 >50 43 <0.78 >100 1.59 0.37 45.48 44.63 44 0^° 42.82 >100 0.27 0.44 >50 >50 45 ofT >100 >100 7.53 1.02 4.96 3.9 46 >100 >100 >100 0.52 15.42 41.9 -42- -----*---Λ--------- (請先閱讀背面之注意事寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（2〗0 χ 297公釐） 1229073

7 7 A R 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明說明（40) 實例# 結構式 bio-FLK-l IC»(mM) bio-EGFr ICj,(raM) bio-PDGFr ICM (mM) HUVEC- VEGF HUVEC- aFGF !Cs« (mM) BrdU- PDGFr ICj, (mM) BrdU-FGFr ICM (mM) BrdU- EGFr 1C,. (mM) 47 >100 >100 0.75 >50 >50 >50 48 <0.78 >100 0.053 0.079 9.93 12.6 49 <0.78 >100 <0.046 <0.069 1.26 4.1 50 5.16 >100 0.1 0.103 3.42 4 51 42.36 22.83 1.02 1.54 3.9 9.56 52 z〇 9.77 28.06 0.11 0.7 10.9 9.57 53 99.55 >100 4.35 0.48 3.1 3.86 54 <0.78 >100 <0.0078 <0.069 3.01 7.49 55 <0.78 86.56 <0.0078 <0.069 13.85 25.37 56 Vt^N' <0.78 >100 0.16 0.55 4.86 11.01 57 <0.78 >100 0.05 0.29 15.7 27.47 -43- -----.----------裝--- (請先閱讀背面之注意事寫本頁) 訂·. •fk 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1229073 A7 B7 五、發明說明（41 ) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製實例# 結構式 bio-FLK-l IC«(mM) bio-PDGFr ΙΟμ(πιΜ) bio-FGFR ICM (mM) HUVEC-VEGF IC5· (mM) HUVEC-aFGF IQ. (mM) BfdU-PDGFr 1C» (mM) BrdU- FGFr iC„(mM) BrdU-EGFr 1C,, (mM) 58 <0.78 >100 <0.0078 <0.069 9.18 25.35 59 <0.78 >100 0.067 0.32 9.95 20.2 60 cicT <0.78 >100 0.43 0.56 3 25.34 61 0.91 >100 0/44 1.04 11.31 6.59 62 1ΐ〇τ^Ν， 1.97 >100 2.35 0.57 2.14 8.38 63 Η 12.08 >100 2.41 10.32 29.09 29.77 64 15.07 >100 2.86 1.45 4.58 11.24 44- ---IΓ--Γ I I I I I · - I (請先閱讀背面之注意事寫本頁) 訂· 線· 本紙張尺度適用中S國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公釐） 1229073 A7 B7 五、發明說明（42) 表2出示本發明某些其他化合物之化學結構式。如表i，化合物編號對應於實例編號。上述生物分析法之一般説明同樣適用於表2之生物分析法。 2.適應症/目標疾病受本發明化合物調控催化活性之PKs包括蛋白質酶酪胺酸激酶，其分兩種：受體酪胺酸激酶（RTKs)及細胞酪胺酸激酶（CTKs)及絲胺酸-蘇胺酸激酶（STKs)。RTK調節之訊號轉導係由在細胞外與專一性生長因子（配位體）之交互作用所引發，隨後進行受體二聚合作用，暫時刺激内因性蛋白質酪胺酸激酶活性及磷酸化。藉以爲細胞内訊號轉導分子建立結合位置，而與可促進適當細胞效應（例如：細胞***、細胞外微環境之代謝效應）之許多種細胞質訊號轉導形成複合物。參見史雷辛格（Schlessinger)與烏力奇（Ullrich)，1992, Neuron 9:303-3 91 0 已有文獻顯示生長因子受體上之酪胺酸磷酸化位置之功能爲訊號分子之SH2 (src同質性）分子之高親和性結合位置。泛塔（Fantl)等人，1992, CeU, 69:413-423，宋楊（Songyang)等人，1994, Mol. Cell· Biol· 14:2777-2785 ;宋揚等人，1993, Cell, 72:767-778，及柯赫（Koch)，1991，Science· 252:668-678。已鑑定出與RTK相關之數種細胞内受質蛋白質。其主要分成二類：（1)具有催化區之受質.，及（2)缺乏此催化區但作爲適應物並與催化活性分子結合之受質。宋楊等人，1993, Cell 72:767-778 〇受體與其受質之SH2區之交互作用專一性係由緊臨磷酸化酪胺酸殘基之胺基酸殘基決|定。SH2區與特 -45- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210x 297公釐） (請先閱讀背面之注意事裝---- 寫本頁} 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1229073 A7 B7 五、發明說明（43 ) 定受體上緊磷酸酪胺酸殘基之胺基酸殘基序列之間結合親和力差異性與其受質嶙酸化形態所觀察到之差異性一致。宋揚等人，1993，CelJ_, 72:767-778。這些現象表示各RTK之功能不僅由其表現形態及配位體可利用性決定，亦由一系列下游訊號轉導途徑（其係受特定受體活性）決定。因此磷酸化作用提供一個重要的調節步驟，可決定由專一性生長因子受體及分化因子受體補充之訊號途徑之選擇性。 STKs(主要在胞液中）會影響細胞之内部生化學，通常爲 k成PTK效應之下游反應。STK涉及引發DNA合成之訊號過程，及隨後之有絲***，造成細胞增殖。因此，在其他效應中，PK訊號轉導造成細胞增殖、分化、生長及代謝。異常細胞增殖可能造成許多種病變與疾病’包括細胞增生發展如：癌瘤、肉瘤、神經膠質母細胞瘤及血管瘤’病變如：白血病、牛皮癖、動脈硬化、關節炎及糖尿病性腎病變及其他與未控制之血管分佈形成及/或脈管生成有關之病變。要操作本發明時，並不需要完全了解本發明化合物抑制 PKs之機轉。然而，雖然不因此受到任何特別機制或理論限制，但咸信該化合物與PKs之催化區中之胺基酸交互作用。 PKs典型地具有二裂片式結構，其中ATp似乎與保留卩^^胺基酸區域中兩葉片之間之裂縫結合·。PKs之抑制劑咸信利用非共價交互作用（如：氫鍵、凡德瓦力及離子***互作用）’在上述ATP與PKs結合之相同一般區中結合。更明確士之，咸認爲本發明化合物之2 -吲哚啉酮成份結合在通常由 -46 - 張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格(210 X元7公釐） (請先閱讀背面之注意事寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1229073 — A/ B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印制农五、發明說明（44) ATP之腺茹環佔據之一般空間中。由於2-啕哚啉酮核心上各種取代基與針對特定PKs之專一胺基酸區之間額外之交互作用，使得特定分子對特定P K具有專一性。因此，不同吲哚啉酮取代基可能造成對特定PKs之優先結合性。在不同ATP (或其他核甞酸）結合位置上選擇化合物活性之能力使得本發明化合物適用於針對具有此等位置之任何蛋白質。因此本文揭示之化合物可用於試管内分析此等蛋白質，並透過與此等蛋白質之交互作用而具有活體内療效。另一方面，與本發明化合物接觸而調控其催化活性之蛋白質激酶爲蛋白質酪胺酸激酶，更特定言之，受體蛋白質酪胺酸激酶。可受本發明化合物或其鹽調控催化活性之受體蛋白質酪胺酸激酶爲（但不限於）：EGF、HER2、HER3、 HER4、IR、IGF-1R、IRR、PDGFRa、PDGFR/?、CSFIR、 C-Kit、C-fms、Flk-lR、Flk4、KDR/Flk-l、Flt-l、FGFR-1R、FGFR-2R、FGFR-3R及FGFR-4R。藉由與本發明化合物或其鹽或前藥接觸而調控其催化活性之蛋白質酪胺酸激酶亦可爲一種非受體或細胞蛋白質酪胺酸ί敦酉每（CTK)。因此，CTKs如（但不限於）：Src、Frk、Btk、 Csk、Abl、ZAP70、Fes、Fps、Fak、Jak、Ack、Yes、Fyn、 Lyn、Lck、Blk、Hck、Fgr及Yrk之催化活性可經由與本發明化合物或鹽接觸來調節。另一組可經由與本發明化合物接觸而調控其催化活性之 PKs爲絲胺酸-蘇胺酸蛋白質激酶如(但不限於）：CDK2及Raf。本發明另一方面係有關治療或預防P K相關病變之方法， -47- 本紙張尺度適罔中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公爱） (請先閱讀背面之注意事寫本頁) 裝訂· •f』 1229073 A7 B7 五、發明說明（45 ) 其係投與醫療有效量之本發明化合物或其鹽或前藥給生物體。本發明另一方面爲含本發明化合物或其鹽或前藥之醫藥組合物，其係投與生物體，供預防或治療PK相關病變。因此本發明係有關調控PK訊號轉導之化合物，其係影響 RTKs、CTKS及/或STKs之酵素活性，藉以干擾此等蛋白質轉導之訊號。更特定T之’本發明係有關調控rtk、CTK及 /或STK調節之訊號轉導途徑之化合物，作爲一種治療許多種固體腫瘤之療法，包括（但不限於）：癌瘤、肉瘤（包括卡波西肉瘤）、成紅細胞瘤、神經膠質母細胞瘤、腦膜瘤、星細胞瘤、黑色素瘤及肌胚細胞瘤。本發明亦涵括治療或預防非固體腫瘤癌症如：白血病、適應症包括（但不限於）·· 腦癌、膀胱癌、卵巢癌、胃癌、胰癌、結腸癌、血癌、肺癌及骨癌。其他可使用本文説明之化合物預防、治療及研究與p K活性不當有關之病變型態實例爲（但不限於）：細胞增殖病變、纖維變性病變及代謝病變。可利用本發明預防、治療或進一步研究之細胞增殖病變包括癌症、血管增殖性病變及腎小球細胞增殖性病變。血管增殖性病變指與脈管生成異常及血管分佈形成異常。雖然脈管生成與血管分佈形成對許.多正常生理過程（如：肢胎形成、黃體形成、傷口癒合及器官再生）扮演重要角色，但在癌症發展中亦扮演中樞角色，造成維持腫瘤存活之新毛細血管形成。其他血管增殖病變實例包括關節炎，此時 -----』---.------裝--- (請先閱讀背面之注意事寫本頁) 訂.·· ••f 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 48- 1229073 A7 B7 五、發明説明（Μ ) 46 新毛細血管侵入關節並破壞軟骨，及眼部疾病，如：糖尿糖性視網膜病’其中視網膜中之新毛細血管侵入玻璃體，出血，以致失明。現已鐘定出一種對VEGF具高度結合親和力之結構性相關之RTKs ·以fus酶胺1 (fit-1)受體（希卜亞（shibuya)等人， 1990, Oncogene, 5:5 19-524 ;狄弗瑞斯（De Vries)等人，1992, Sci-gnce? 255:989-991)及KDR/FLK-1受體，亦稱為 VEGF-R2。有報告指出血管内皮生長因子（VEGF)為具有試管内内皮細胞生長促進活性之内皮細胞專一性有絲***原。費拉 (Ferrara)與亨赛（Henzel)，1989，Biochein. Biophvs Rpc Comm., 161:851-858 ;華斯曼（Vaism an)等人，1990, J, Biol 265:19461-19566。美國申請案序號 08/193 829， 08/038,596及07/975,750之報告強烈認為VEGF不僅負貴内皮細胞增殖，而且為正常及病理性血管分佈形成作用之主要調節劑。一般參見克拉斯本（Klagsburn)與索克（Soker)，1993, Current_ B,i,〇l〇gy, 3 (10) 699-702，胡克（Houck)等人，1992, L Biol. Chem.· 267:2603 1-26037 ° 正常之脈管生成及血管分佈形成作用對許多種生理過程扮演重要角色，如：胚胎發展、傷口癒合、器官再生及女性生殖過程如·***期間黃體中〉慮泡發展及懷孕後之胎盤生長。弗克富（Folkman)與新英（Shing)，1992，J. Biological Chem., 276 (16):1093 1-34。不受控制之脈管生成及/或血管分佈形成與如糖尿病等疾病有關，並與依賴脈管生長作用生長之惡性固體腫瘤有關。克拉斯本與索克，1993, Current 4a-— 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） I-------^--- (請先閱讀背面之注意事項再本頁) 灯 -線經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1229073 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明説明（p) 47 Biology, 3(10):699-702 ;福克漢（Folkham), 1991，J. NatL Cancer Inst., 82:4-6 ;威德（Weidner)等人，1991，New Engl. JL Med.· 324:1-5。據推斷VEGF在血管分佈形成及脈管生成期間之内皮細胞增殖與移動過程扮演之角色顯示，其在此等過程中，對 KDR/FLK-1受體佔有重要影響。如：糖尿病（福克曼，198，检塞與止血之弟十一屆會議fXIth Congress of Thrombosis and Haemostasis)(弗史塔（Verstraeta)等人編輯），卩？.583-5 96 ’ 李 >文大學出版社（Leuven University Press, Leuven)及關節炎，及惡性腫瘤生長等疾病可能由不受控制之血管分佈形成作用引起。參見例如：福克曼（Folkman)，1971，N. Engl. LMed·，285:1 182-1 186。與VEGF專一性結合之受體為調節及調控脈管生成及/或血管分佈形成作用及涉及此等過程所引起異常細胞生長之多種嚴重疾病之重要且強力之醫療目標。普洛曼（Plowman)等人，1994, DN&P. 7(6):334-339。更特定言之，KDR/FLK-. 1受體在新脈管生成作用中之高度專一性角色使其成為治療癌症及其他涉及不受控制之血管形成之疾病之選擇目標。因此’本發明一方面係有關可以調節及/或調控酪胺酸激酶訊號轉導（包括KDR/FLK-1受體訊號轉導）以抑制或促進血管分佈形成及/或脈管生成之化合物，亦即可抑制、預防或干擾KDR/FLK-1受配位體（如：veGF)活化時所轉導之訊號。雖然咸信本發明化合物沿著酪胺酸激酶訊號轉導途禋作用在§:體或其他成份上，但其亦可直接作用在因不受控 (请先閱讀背面之注意事項再本貢) •裝· 線 __- fin - 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公董） 1229073 A7 B7 五、發明説明（π ) 48 制之血管分佈形成所造成之腫瘤細胞上。 (請先閱讀背面之注意事項本頁) 雖然通稱’’ flk-r受體在人類及鼠科相對部份之命名上不同，但在許多方面仍可交換使用。鼠科受體（Flk-Ι)及其人類相對部份（KDR)在細胞内區域序列同質性為93.4%。同樣地，鼠科FLK-Ι與人類VEGF結合之親和力與小白鼠VEGF之結合親和力相同，因此可被來自這二種品種之配位體活化。米勒爾（Millauer)等人，1993，Cell· 72:835-846 ;昆恩 (Quinn)等人，1993，Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 90:7533-7537。當FLK-1與隨後之酪胺酸磷酸化人類RTK受質（例如：PLC- T或p85)共同表現在293細胞（人類胚胎腎纖維母細胞瘤）時，Flk-1與該受質結合。因此依賴FLK-Ι受體之模式可直接應用於探討KDR受體。例如：使用鼠科FLK-1受體來鑑定調節鼠科訊號轉導途徑之化合物之方法可直接用於鑑定調節人類訊號轉導途徑之化合物，亦即調節與KDR受體相關活性之化合物。因此，於試管内鑑定為KDR/FLK-1之抑制劑之化合物可於合適之活性内模式中確認。活體内小白鼠及老鼠兩種動物模式均經過證實對檢測作用在KDR/FLK-1誘發之訊號轉導途徑上之製劑之臨休潛力具有極佳價值。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製因此本發明一方面係有關調節、調控與/或抑制脈管生成及/或血管分佈形成之化合物，其.係影響KDR/FLK-1受體之酵素活性及干擾KDR/FLK-1轉導之訊號。本發明另一方面係有關調節、調控及/或抑制KDR/FLK-1調節之訊號轉導途徑之化合物，作為治療許多種固體腫瘤之療法，包括（但不 _- 51 - 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 1229073 A7 B7 五、發明説明（49) (請先閱讀背面之注意事項^^^本頁) 限於）：神經膠質母細胞瘤、黑瘤及卡波西肉瘤，及卵巢、肺、***、攝護腺、騰、結腸及表皮等癌瘤。此外，數據顯示，投與抑制KDR/Flk-1調節之訊號轉導途徑之化合物亦可用於治療血管瘤、再狹窄及糖尿病視網膜病。本發明另一方面係有關利用其他受體調節之途徑（包括含 fit-1受體之途徑）抑制脈管生成及血管分佈形成。受體酪胺酸激酶調節之訊號轉導係由細胞外與專一性生長因子（配位體）交互作用引發，隨後進行受體二聚合，内因性蛋白質酪胺酸激酶活性之暫時刺激，及自體磷酸化。藉以為細胞内訊號轉導分子建立結合位置，而與許多促進適當細胞效應（例如：細胞***及對細胞外微環境之代謝效果）之細胞質訊號分子形成複合物。參見史雷辛格與烏力奇， 1992，Neuron· 9:1-20 〇 KDR/FLK-1之細胞内區域與PDGF- /3受體（50.3%同質性）及/或相關fit-1受體之細胞内區域之相近同質性顯示誘發了重疊之訊號轉導途徑。例如：已顯示PDGF-/5受體、sr*c族群之成員（湯利（Twamley)等人，1993，Proc. Natl. Acad. Sci USA. 90:7696-7700)、鱗 S螽基月几 g享-3’- S每（胡（Hu)等人，經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1992，Mol. Cell. Biol.· 12:98 1-990)、磷脂酶 c r (卡希西安 (Kashishian) & 古柏（Cooper)，1993，Mol. Cell. Biol.. 4:49-5 1)、ras-GTPase-活化蛋白質（卡希‘西安等人，1992，EM BO T 1 1.1373-1382)，PTP-ID/syp(卡拉斯卡斯（Kazlauskas)等人， 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 10 90:6939-6943)、Grb2(艾弗森（Arvidsson)等人，1994，Mol. Cell. Biol.. 14:6715. __二52_ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 1229073 A7 B7 五、發明說明（50 ) 6726) ’及適應分子She與Nek(尼希木拉（Nishimura)等人， 1993, MoL CeJJ^Bi〇I.? ^:6889-6896)等可與涉及不同自體磷酸化位置之區域結合。一般參見克拉森（(：1^^〇η)_威爾希 (Welsh)，1994, Prog. Growth Factor Res^ 5:37-54。因此，受 KDR/FLK-1活化之訊號轉導途徑似乎包括ras途徑（洛查克斯 (Rozakis)等人，1992, Nature, 360:689-692)、PI-3，-激酶、src 調節途徑及Plc r -調節途徑。此等途徑分別在内皮細胞中 KDR/FLK-1之血管分佈形成及/或脈管生成效應中扮演重要角色。因此本發明另一方面係有關以本文説明之有機化合物於調控血管分佈形成及脈管生成作用上之用途，因爲此等作用過程係受此等途徑控制。反之，與血管萎縮、收縮或封閉有關之病變（如：血管再狹窄）亦涉及其中，因此可使用本發明方法治療或預防。纖維變性病變指細胞外基質形成異常。纖維變性病變實例包括肝硬化及腎小球細胞增殖性病變。肝硬化特徵爲細胞外基質組成份增加，而形成肝疤。病毒感染（如：肝炎）亦可能引起細胞外基質增加而形成肝疤。脂細胞似乎在肝硬化中扮演主要角色。其他涉及之纖維變性病變包括動脈硬化症。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 ---------i------裝____ (請先閱讀背面之注意事*寫本頁) 腎小球細胞增殖性病變指因腎小球細胞增殖異常所致之病變。腎小球增殖性病變包括：各種.人類腎病如：血管球性腎炎'糖尿病性腎病及惡性腎硬化，及如：检塞性微血管病症狀、移植排斥及血管球病等疾#。rtkpdgfr已涉及腎小球細胞增殖作用之維持。弗洛奇（Fl〇ege)等人1993, ____ -53- 本紙張&度_中關家鮮（CNS)A4規$⑽χ 297公髮了 1229073 Α7 Β7 五、發明説明（51)

Kidney International 43:47S-54S 〇許多種癌症為細胞增殖性病變，且如前述，PKS與細胞增殖性病變有關。因此’不難發現PKs(如，例如：rtk族群之成員）與癌症之發展有關。其中有些受體，如：EGFR(土奇 (Tuzi)等人，1991，Br· J· Cancer 63.977-9。，特普（Torp)等人， 1992, APMIS, 1〇〇:713-719)、HER2/neu(斯拉門（Slamon)等人， 1989，Science. 244:707-7 12)及 PDGF-R(庫馬巴（Kumabe)等人， 1992, Oncogene, 7:627_63 3)於許多腫瘤中過度表現，並/或由自體分泌環（autocrine loops)持績活化。事實上，在最常見及嚴重之癌症中，此等受體均過度表現（阿赛卡（Akbasak) 與宋能-阿赛卡（Suner-Akbasak)等人，1992, J. Neurol. Sci 111.119-133 ’ 狄克林（Dickson)等人，1992, Cancer Treatment R^_.，61:249-273，柯克（Korc)等人，1992，J. Clin. Tnvest 90:1352-1360)且已經證實有自體分泌環（李（Lee)與登尼哥 (Donoghue)，1 992，L_Cell. Biol_·，1 1 8:1 057-1070，柯克（Korc) 等人，如上述，阿赛卡及宋能阿赛卡，等人，如上述）。例如：EGFR與鱗狀細胞癌瘤、星細胞瘤、神經膠質母細胞瘤、頭與頸癌、肺癌及膀胱癌有關。HER2與乳癌、卵巢癌、胃癌、肺癌、胰癌及膀胱癌有關。PDGFR與神經膠質母細胞瘤及黑色素瘤，與肺癌、卵巢癌及攝護腺癌有關。 RTK omet與惡性腫瘤形成有關。例如：c-met與癌症中之結腸直腸癌、甲狀腺癌、胰癌、胃癌、及肝細胞癌瘤及淋巴瘤有關。此外c-met與白血病有關。罹患赫金氏症及布克茲症（Burkitts disease)之患者有c-met基因過度表現之現象。本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210χ 297公釐） ----r---1衣一-I (請先閱讀背面之注意事項再mb本頁)

、1T 線 4--J— - 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1229073 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明說明（52) IGF-IR除了涉及營養性支持及Π型糖尿病外，亦與數種癌症有關。例如·· IGF-I涉及數種腫瘤型態之自體分泌生長刺激劑，例如：人類乳癌癌瘤細胞（阿狄加（Arteaga)等人， 1989，jL'—Clin· Invest· 84:1418-1423)及小肺腫瘤細胞（馬考利 (Macauley)等人，1990，Cancer Res·，50:25 1 1-25 17)。此外， IGF-I雖然完全涉及神經系統之正常生長與分化，但亦似乎爲人類神經膠質之自體分泌刺激劑。山柏格（Sandberg)-諾奎斯特（Nordqvist)等人，1993，Cancer Res· 53:2475-2478。IGF-IR及其配位體於細胞增殖作用中之重要性進一步由培養物中多種細胞型態（纖維母細胞、表皮細胞、平滑肌細胞、τ_ 淋巴細胞、骨髓細胞、軟骨細胞及成骨細胞（骨髓之幹細胞））受IGF-I刺激生長之事實來k持。哥林（Goldring)與哥林 (Goldring)，1991，Eukaryotic Gene Expression, 1:301-326 0 在一系列最近文獻中，巴斯加（Baserga)認爲IGF-IR在轉形機轉中扮演中心角色，因此爲治療多種人類惡性疾病之較佳目標。巴斯加，1995，Cancer Res·, 55:249-252，巴斯加， 1994，Cell 79:927-930，克普拉（Coppola)等人，1994，Mol· Cell· Biol·· 14:4588-4595 〇STKs涉及許多種癌症，主要包括乳癌（康斯（Cance)等人， Int· J· Cancer·· 54:571-77 (1993)) ° P K活性異常與疾病之間關係並不.限於癌症。例如·· RTKs 與下列疾病有關，如：牛皮癖、糖尿病、子宮内膜異位、血管分佈形成、粥瘤斑發展、阿茲海默氏症、凡希波-林道症（von Hippel-Lindau disease)、表皮過度增生、神經變性疾 -55- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意 -事項^寫本頁) 裝 ή^τ.. 1229073 A7 B7 五、發明説明（„)

Oo (請先閱讀背面之注意事項再本頁) 病、與年齡有關之斑變性、及血管瘤、例如：EGFR涉及角膜與皮膚傷口癒合。胰島素R及IGF-IR缺陷涉及II型糖尿病。有關專一性RTKs與其醫療適應症之間更完整之相關性示於普浴曼（Plowman)等人，1994, DN&P 7:334-339。如上述，不僅RTKs，而且CTKs(包括，但不限於：src、 abl、fps、yes、fyn、lyn、lck、blk、hck、fgr、及yrk)(概略說明於波倫（Bolen)等人，1992, FASEB J.. 6:3403-3409)均涉及增生及代謝訊號轉導途徑，因此應該涉及（而且已經證實涉及）許多種與本發明有關之PTK調節之病變。例如：已顯示突變之src(v-six)為小難之致癌蛋白質（ρρ60ν·^)。然而，其細胞同質物，即原生致癌基因ρρ60ε·^傳遞許多種受體之致癌訊號。EGFR或HER2/neu於腫瘤中過度表現會造成pp60csrc 之構成性活化作用，其係惡性細胞之特性，但不存在於正常細胞中。另一方面，缺乏c-src表現之小白鼠出現骨質石化性表型，表示c-src在成骨功能中之重要參與性，及可能涉及相關病變。同樣地，Zap70涉及T 細胞訊號，此點可能與自體免疫疾病相關。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 STKs與發炎、自體免疫疾病、免疫反應、及過度增生病變如：血管再狹窄、纖維變性、牛皮癬、骨關節炎及類風濕關節炎等有關。 · PKs亦涉及胚胎植入。因此本發明化合物可提供預防此等胚胎植入之有效方法，因而適用為生育控制劑。最後，RTKs與CTKs目前均懷疑涉及過度免疫病變。 -fiR - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 1229073 A7 B7 五、發明說明（54 經濟部智慧財產局員工消費合社印製本發明另一方面爲鑑定調節上述一種或多種蛋白質激酶之催化活性之化合物。該方法涉及使表現所需蛋白質激酶之細胞與本發明化合物（或其鹽或前藥）接觸，並追踪化合物對細胞之任何效應。該效應可爲任何可透過肉眼觀察:利用儀器觀察到之細胞表型變化或沒有變化。所追踪之細胞表型有或沒有變化可爲例如（但不限於）··細胞中蛋白質激酶之催化活性有或沒有變化，或蛋白質激酶與天然結合對象之交互作用有或沒有變化。 θ 本發明例舉之許多化合物對數種RTKs之效應實例示於表i 與2 ’及下文生物實例部份。本文出示之化合物及數據未以任何方式構成本發明範圍之限制。 5 ·醫藥組合物及用途、、本發明化合物、纟前藥或化合物或其前藥之生理上可接受之鹽可呈其本身投與人類患者或可呈醫藥组合物投藥，該組合物係由上述材料與合適載體或賦形劑混合。調配及投 «物之技術可參見：雷氏醫藥學"’馬克出版社，賓州伊斯頓市（nemington's Pharmac〇1〇gical Sciences, ,Mack Publishing Co” Easton, PA)，最新版。投藥途徑本文中採用之"投與，'或”投藥"係指傳送本發明化合物，其鹽、或前藥或含本發明化合物、.其鹽或前藥之醫藥组合物給生物體，供預防或治療Ρκ相關病變。合適投藥途徑包括(但不限於）：口服、經直腸、經黏膜或經腸邵投藥’或肌内、皮下、髓内、椎管内、直接心室 (請先閱讀背面之注意事項1 裝---- 寫本頁) 訂·· •f 57- 五、發明說明（55) 内二靜脈内、玻璃體内、腹膜内、鼻内或眼内注射。較佳投藥途徑爲經口及非經腸式。、或者，可採局部投與化合物替代全身性投藥，例如：直接注射化合物至固體腫瘤内，通常呈貯積式或持續釋放式配物。」匕外’可利用例如：經腫瘤專—性抗體包覆之微脂粒投與樂物至目標之藥物傳送系統中。微脂粒可針對腫瘤或被腫瘤選擇性吸收。組合物/調配物本發明醫藥組合物可利用相關技藝習知之方法製造，例如：利用傳統混合法、溶解法、製粒法、包糖衣法、磨粉法、乳化法、包埋法、截留法或冷凍乾燥法。根據本發明使用之醫藥組合物可依傳統方式使用一種或多種生理上可接受之載體調配，該載體包括促進活性化合物加工成醫藥用製劑之賦形劑與輔劑。適當調配物依選^之才又藥途徑而定。、用於注射之本發明化合物可調配成水溶液，最好含有生理上可相奋《緩衝液中’如：漢克氏（Hanks，）溶液，林格氏溶液、或生理食鹽緩衝液。用於經黏膜投藥時，在調配物中 =用適合通透障壁之穿透劑。料穿透劑係相關技藝習知用/、口服u時’化合物之碉g己法可由活性化合物與相關技藝上習知之醫藥上可接受之載體組合。此發明化合物調配成錠劑、丸劑、騎鍵、糖衣锭If 1229073 A7 B7 五、發明說明（56) -----*---j------裝--- (請先閱讀背面之注意事^^|^寫本頁) 液體、凝膠、糖漿、漿物、懸浮液、等等，供患者口服。口服用之醫藥製劑可使用固體賦形劑，視需要研磨所得之混合物，加工混合物成粒劑，若必要時可先添加其他合適輔劑再加工，得到錠劑或糖衣錠核心。適用賦形劑特定士之爲填料如：糖類，包括乳糖、蔗糖、甘露糖醇或山梨S 醇，纖維素製劑如，例如：玉米澱粉、小麥澱粉、稻米澱粉、及馬鈐薯澱粉、及其他材料如：明膠、黃蓍膠、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉、及/或聚乙晞基吡咯烷酮（PVP)。若需要時，可添加崩解劑，如：交鏈聚乙烯吡咯烷酮、洋菜、或藻酸。亦可添加鹽如：藻酸糖衣錠核心可包覆合適包衣。‘因此可使用濃縮洋菜溶液，其可視需要包含***膠、滑石、聚乙㈣錢_、幾乙缔聚合物膠、聚乙二醇、及/或二氧化鈇、清漆溶液、及合適之有機溶劑或溶劑混合物0可添加染料或色素至錠劑或 •th 糖衣錠包衣中，供鑑定或判別不同活性化合物劑量1組合0 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製可口服之醫藥組合物包括由明膠製備之推合式膠囊，及由明膠與增塑劑如：甘油或山梨糖醇製備之軟式密合膠囊。推合式膠囊可包含活性成份與填料（如：乳糖）、往合劑 (如：戰粉）及/或潤滑劑（如：滑石或硬脂酸鎂）及視需要選用増塑劑之混合物。軟式膠囊中，活性化合浮於合適液體中如：脂肪油類、液態石壞、或液態聚二醇。此等調配物中亦可添加安定劑。 _ -59- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1229073 A7 --------~--- 五、發明說明（57 ) 供吸入投藥時，根據本發明使用之化合物宜呈氣溶膠噴液形式，使用加壓罐或霧化器及合適推進劑傳送，例如（但不㈣）：二氣二氟甲⑨、三氣氟甲垸、二氣四氟乙燒、或二氧化碳。若使用加壓氣溶膠時，可利用傳送定量之開關柝制，量單位。吸入器或吹藥器使用之例如：明膠膠二‘; 式&可由含化合物及合適粉末基質（如：乳糖或澱粉粉末混合物調配。化合物亦可調配成非經腸式投藥，例如：大九劑注射或連射用調配物可呈單位劑型，例如：安瓶或多劑里容器，其中添加添加物。組合物可呈含於水性或油性載州中之磕浮液、洛液或乳液形式，且可包含調配材料如：懸浮劑、安定劑及/或勻散劑。· 用於非經腸式投藥之醫藥组合物包括活性化合物之水溶型，如（但不限於）：鹽之水溶液。此外，活性化合物之賤洋液可於親脂性載劑中製備。合適之親脂性載劑包括脂肪 /由頒如.芝麻油、合成脂肪酸脂如：油酸乙酯及甘油三酸酉旨，或如··微脂粒之材料。水性注射懸浮液可包含提高懸净夜^性之物質，如：羧甲基纖維素鈉、山梨糖醇或葡聚 =。趫序液可視需要亦包含合適安定劑及/或提高化合物溶解度之製備，供製備高濃度溶液。或者，活性成份可呈粉末形式，‘使用前與合適載劑（例如：無菌、無熱原水）重新組成。 6物亦可凋配成直細用組合物如：塞劑或保留灌腸劑，其係使用例如：一般塞劑基質如：可可奶油或其他甘油酯 ______ -60- 本紙張中軸家標準（CNS)A4規格（21G X 297公餐） (請先閱讀背面之注意事項 1 裝— jc寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1229073 A7 B7 五、發明說明（58) 調配。 « n I 11 1 ϋ I Γ— iai ϋ an ϋ I · 1 ϋ (請先閱讀背面之注意事寫本頁) 除了別述凋配物外，化合物亦可調配成貯積式製劑。此等長效性調配物可利用植入式（例如：皮下或肌内）或肌内注射投藥。本發明化合物可使用合適聚合性或疏水性材料（例如：使用醫藥上可接受之油形成乳液），使用離子交換樹脂，或呈難溶性衍生物如（但不限於）：難溶性鹽調配成適合此投藥途徑。線丨』經濟部智慧財產局員工消費合作社印製用於本發明疏水性化合物之醫藥載體之不設限實例爲含芊醇、非極性界面活性劑、與水互溶之有機聚合物及水相之共溶劑系統（如：VPD共溶劑系統）。VPD爲含3 % w/v苄醇、8% w/v非極性界面活性劑聚山梨酸酯80tm，及65% w/v 聚乙二醇300 ’以無水乙醇補充體積形成之溶液。VPD共溶劑系統（¥?0:05\¥)包括乂？0使用5%右旋糖之水溶液稀釋 1 : 1。此共溶劑系統可完全溶解疏水性化合物，當全身投藥時，其本身產生之毒性低。此等共溶劑系統之比例當然可以有相當大變化，但不應破壞其溶解度及毒性特性。此外，共溶劑成份可以改變：例如：可改用其他低毒性非極性界面活性劑替代聚山梨酸酯80TM，聚乙二醇之比例可以改變，可改用其他生物相容性聚合物替代聚乙二醇，例如：聚乙烯吡咯烷酮，且可改用其他糖類或多醣類替代右旋糖。或者，可使用用於傳送疏水性醫藥化合物之傳送系統。微脂粒及乳液爲用於疏水性藥物之習知傳送載劑或載體實例。此外，亦可使用某些有機溶劑如：二甲亞砜，但通常要冒毒性較高之風險。 •61 - 本紙張&度適用中國國家標準（CNS)A4規格（2】0 x 297公釐） 1229073 A7 五、發明說明（59 此外，化合物可使用持續釋放系統傳送，如：含醫療劑之固體疏水性聚合物之半通透性基質。已知各種不同持續釋放之材料，且係相關技藝專家們習知者。持續釋放膠囊可依其化學性質而定，釋放化合物長達數週至1〇〇天以上。根據醫療劑之化學十生質及生物安定性而$，亦可使用其他安定蛋白質之方法。本文之醫藥組合物亦可包含合適固體相或凝膠相載體或賦形劑。此等載體或賦形劑實例包括（但不限於）：碳酸鈣、鱗酸舞、各種糖類、澱粉、纖維素衍生物、明膠及聚合物如··聚乙二醇。本發明4多種p K I周控化合物可呈生理上可接受之鹽型，其中申π專利權之化合物可形▲正電價或負電價物質。化合物形成正電價部份之鹽實例包括（但不限於）：四級銨（如本文中定義）、鹽類如：鹽酸鹽、硫酸鹽、碳酸鹽、乳酸鹽、酒石酸鹽、馬來酸鹽、琥珀酸鹽，其中四級銨基之氮原子爲與通當酸反應之本發明選定之化合物之氮。本發明化合物形成負電價物質之鹽包括（但不限於）：由化合物之羧酸根與適當鹼（例如：氫氧化鈉（Na〇H)、氫氧化鉀 (KOH)、氫氧化鈣（Ca(0H2)，等等反應形成之鈉鉀、鈣及鎂鹽。劑量適用於本發明之醫藥组合物包括其中活性成份含量足以達到預定目的（亦即調控PK活性或治療或預防ρκ相關病變）之組合物。 -62· 參紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（2]〇χ297公爱） (請先閱讀背面之注意事項寫本頁) 裝 J^T· 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1229073 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明說明（60 ) 更明確言之’醫療有效量指化合物之用量可有效防止、減輕或改吾疾病症狀或延長受治療患者之生命。醫療有效量之決定方式係在相關技藝專家之能力範圍内，尤其可根據本文提供之詳細説明決定。本發明方法採用之任何化合物之醫療有效量或劑量可先由細胞培養物分析法估計。然後，調配該劑量用於動物模式’使之達到循環之濃度範圍，其包括於細胞培養物中測定ICW亦即達到P K活性最大抑制率之一半時之試驗化合物濃度）。此等資料可用於更精確測定適用於人類之劑量。本文説明之化合物之毒性與療效可依標準醫藥方法，於細胞培養物中或實驗動物中決定，例如：測定特定化合物之 IC；5。及LD5〇(均討論於本文中）。得自此等細胞培養物分析法及動實驗之數據可用於調配人類用之劑量範圍。該劑量可依採用之劑量形式及投藥途徑而定。各個醫師可根據患者之條件選擇正確調配物、投藥途徑及劑量（參見例如芬格 (Fingl)等人，1975 ，”醫療學之藥理基礎”（The Pharmacological Basis of Therapeutics"，第 1 章，p 1)。劑量及投藥間隔可個別調整，使活性物質之血敢濃度足以維持激酶調控效果。此等血漿濃度係指最小有效濃度 (MECs)。MEC隨各化合物變化，且可由試管内數據估計，例如：可採用本文説明之分析法確認達到抑制激酶5 〇至 90%時之濃度。達到MEC之必要劑量將依個別特性及投藥途徑而定。可採用HPLC分析法或生物分析法來測定血聚濃度。亦可採用MEC値來測定投藥間隔。投與化合物採用之療 -63- 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事 1 - 寫本頁) 裝 •f 1229073 A7 B7 五、發明說明（61 ) 孝王應使當時之血漿濃度維持高於MEc 1〇至90%，以30至 90%較佳，50至90%最佳。若局部投藥或選擇性吸收時，藥物之有效局部濃度不一定與血漿濃度有關，且可採用其他相關技藝已知之方法來測定正確測量及間隔。組合物之投藥量當然依待治療之對象、罹病之嚴重性，投藥方式、參與之醫師之判斷，等等決定。 —包裝该組合物若需要時，可呈包裝或配送器裝置（如：17〇八核准 < 套組），其可包含一種或多種含有活性成份之單位劑型。該包裝可例如：包含金屬箔或塑膠墊，如：發泡包。包裝或配送器裝置可附加投藥&旨示説明。包裝或配送器裝置亦可在容器上附上由管理醫藥製造'用法或販賣之政府機構署名之告示，該告示表示該組合物之形式或人類或獸醫學投藥形式已取得政府機構核准。此等告示可爲例如：由管理藥品之美國食品藥物管理局核准的標讖或合格產品之夾單。含有於可相容之醫藥載體中調配之本發明化合物之組合物亦較佳，置入適當容器中，並標明治療適應症之方法示上说明之適應症可包括治療腫瘤、抑制血管分佈形成、治療纖維變性、糖尿病，等等。 6 ·合成法本發明化合物及2-羥啕哚前體與醛很容易使用化學技藝上習知之技術合成。相關技藝專家們咸了解，形成本發明化合物之其他合成途徑亦可取得，且下文僅供實例，^未 64- 木紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公爱） -----^---K-----.裳---- (請先閱讀背面之注意事項寫本頁) J^T· 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1229073 A7 B7 五、發明說明（62 ) 設限。 A. —般合成法 -----„----------裝—— (請先閱讀背面之注意事寫本頁) 採用下列一般方法製備本發明化合物：由適當取代之2-羥吲哚（1當量）、適當取代之醛（1.2當量) 及7T氫吡啶（0· 1當量）與乙醇（丨至2毫升/毫莫耳2 _羥啕哚）混合，混合物於90°C下加熱3至5小時。冷卻後，反應混合物 ;辰縮，Sk化至pH 3。過遽形成之沈殿物，以水洗至7，然後以冷乙醇、乙酸乙酯及/或己烷洗滌，眞空乾燥，產生目標化合物。產物可視需要經層析法進一步純化。 B . 2-M ^1 ^ 下列實例爲本發明化合物之2 -羥啕哚前體之代表性合成法。此等2-羥吲哚採用上述一般合成法或下文c節例舉之方法，與適當取代之吡咯醛反應，形成本申請專利權之化合物。咸了解，下列合成法並未在合成法上或例舉之羥啕哚合成上構成限制。 5 -胺基-2-經4丨嗓取5-硝基-2-羥峭哚（6.3克）於甲醇中，經1〇% pd/c氫化，產生3.0克（收率60%)標題化合物之白色固體。 5 -溴-2-經吲嗓經濟部智慧財產局員工消費合作社印製取含2-羥啕哚（1.3克）之20毫升乙腈冷卻至“ 〇。〇，緩緩攪拌添加2·0克N-溴琥珀醯亞胺。於·1(Γ(：下攪拌反應1小時，於〇°C下2小時。收集沈澱，以水洗滌，乾燥，產生19克 (收率90%)標題化合物。 4 -甲基-2-羥吲哚 -65- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210^ 297公釐） 1229073 A7 B7 五、發明說明（63 ) 揽拌添加含草酸二乙酯（3〇毫升）之2〇毫升無水醚至含19 克乙醇鉀懸浮之5 〇毫升無水醚中。混合物於冰浴中冷卻，緩緩添加含20毫升3-硝基.鄰二甲苯之2〇毫升無水醚。濃稠之深紅色混合物回流加熱〇·5小時，濃縮成深紅色固體，以 10%氫氧化鈉處理，直到幾乎所有固體均溶解爲止。深紅色混合物經30%過氧化氫處理，直到紅色變成黃色。混合物以 10%氫氧化鈉及30%過氧化氫交替處理，直到深紅色不再出現爲止。濾除固體，以6Ν鹽酸酸化濾液。所得沈澱物經眞空過濾收集，以水洗滌，眞空乾燥，產生9.8克（收率45%) 2 -甲基-6-硝基苯乙酸之灰白色固體。固體於曱醇中經1〇% Pd/C氫化，產生9.04克標題化合物之白色固體。 7 -溴-5-氯-2-經丨嗓取5 -氣-2-¾啕哚（16.8克）及19.6克N -溴琥珀醯亞胺懸浮於 140毫升乙腈中，回流3小時。回流2小時時，薄層層析法 (矽石，乙酸乙酯）顯示有5-氣-2-羥吲哚或^溴琥珀醯亞胺 (Rf〇.8)，再回流i小時後，產物（Rf〇.85)及第二產物（Rf〇9) 之比例沒有改變。混合物冷卻至1(rc，眞空過滤收集沈澱，以25毫升乙醇洗滌，於漏斗中抽乾2〇分鐘，產生141 克濕產物（收率56%)。固體懸浮於200毫升變性乙醇中，揽拌洗滌漿狀物，回流1 0分鐘。混合物於冰浴中冷卻至1 。眞空過濾收集固體產物，以25毫升乙醇洗滌，於4〇〇c眞空乾燥，產生I2·7克（收率51%) 7-溴-5-氣_2_幾巧味。 5-氟-2-羥啕哚取5-乳< 嗓滿二酮（8.2克）溶於50毫升胼水合物中，回流 -66- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（2.10 x 297公釐） (請先閱讀背面之注意事寫本頁) 裝 •fp 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1229073 Δ7 Α7 Β7 五、發明説明（以） 64 (請先閱讀背面之注意事項再mb本頁) 1 ·〇小時。反應混合物倒至冰水中。沈澱物過濾，以水洗滌，於真空烘箱中乾燥，產生標題化合物。 5 -硝基- 2-¾ 4丨嗓取2-羥啕哚（6.5克）溶於25毫升濃硫酸中，混合物保持_1〇至-15 C，同時滴加2.1耄升發烟硝酸。添加硝酸後，反應混合物於〇°C下攪拌0.5小時，倒至冰水中。過濾收集沈澱，以水洗;條’自50%乙中結晶。結晶產物過濾，以水洗滌，真空乾燥，產生6.3克（70%) 5-硝基-2-¾巧嗓。 5 -破-2-經巧嗓取2 -每吲嗓（82.9克）懸浮於630毫升乙酸中，並機械揽掉’混合物於冰水浴中冷卻至1 〇。〇，以1 〇分鐘時間分批添加N-碘琥珀醯亞胺固體（175克）。添加完畢後，混合物於1(rc 下攪拌1.0小時。總是存在之懸浮固體在此時轉呈非常黏稠。真空過濾收集固體，以1 00毫升50%乙酸之水溶液洗滌，然後以200毫升水洗滌，於漏斗中抽乾2 0分鐘。產物真芝乾燥’產生93.5克（3 6%) 5 -破-2-輕4卜朵，由質子NMR測得含約5 % 2 -羥巧哚。 5 -甲基-2-經4卜朵經濟部智慧財產局員工消費合作社印製取5 -甲基4丨嗓滿二g同（1 5 · 0克）及6 0毫升耕水合物於14 0至 1 60Ό下加熱4小時。薄層層析法（乙酸乙酯：己烷1 : 2，石夕膠）顯示不殘留起始物。反應混合物冷卻至室溫，倒至3〇〇毫升冰水中，以6 N鹽酸酸化至pH 2。於室溫下攪掉2天後，真空過濾收集沈澱，以水洗滌及真空乾燥，產生6.5克（收率 47%) 5-甲基-2-羥㈣哚。 -R7 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） A7 1229073 B7___ 五、發明說明（65 ) 5-溴-4-甲基羥啕哚及5,7-二溴-4-甲基羥啕哚取4-甲基-2-¾啕嗓（5克）於40毫升乙腈中，經7.26克N-溴 ί虎ίό酿亞胺處理’於室溫下撥掉4小時。薄層層析法（乙酸乙酉旨：己坑1 : 2，石夕膠）顯示含5-溴（Rf〇.3)及5,7-二漠（Rf 0.5)產物之混合物。再添加7.26克N-溴琥珀醯亞胺，混合物再揽拌4小時。眞空過濾收集固體，以2 〇毫升乙腈洗滌，乾燥，產生單溴與二溴化合物之1 : 1混合物。濾液濃縮，經矽膠層析（乙酸乙酯：己烷（1 : 2))，產生1.67克5-溴-4-甲基 -2-羥峭哚之米色固體。殘留之1 : 1混合物固體自冰醋酸中再結晶2次，產生3.2克5,7-二溴-4-曱基-2-經吲哚之淺燈色固體。此物質之濾液依上述方法層析，產生〇.6克5 •溴·4•甲基-2-羥啕哚及〇·5克5,7-二溴-4-甲基-2-羥吲哚。 6 -氟-2-經啕嗓取氫化鈉（2.6克）及14.5克丙二酸二甲酯於160毫升二甲亞石風中攪拌加熱至l〇〇°C 1.0小時。混合物冷卻至室溫，添加 7.95克2,5-二氟硝基苯，混合物攪拌3〇分鐘。混合物再加熱至l〇〇°C 1.0小時，冷卻至室溫，倒至4〇〇毫升飽和氯化銨溶液中。以200毫升乙酸乙酯萃取混合物，有機層以鹽水洗滌，以無水硫酸鈉脱水，眞空濃縮。殘質自甲醇中再結曰《產生24.4克（收率80%) 4 -氟-2-硝苯基丙二酸二甲g旨之白色固體，薄層層析法Rf 〇·2(乙酸乙酯；己烷1 : 6，矽膠）°濾液濃縮’經矽膠管柱層析（乙酸乙酯：己烷，1 : 8)，再產生5.03克4-氣-2-硝苯基丙二酸二甲g旨，共計29.5 克（收率96%)。 ________- 68 - 本紙張尺㈣巧關家鮮（CNS)A4規格⑵^ χ 297公爱） (請先閱讀背面之注意事項裝，--- 寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1229073 Α7 Β7 五、發明說明（66 ) 取4-氟-2-硝苯基丙二酸二甲酯（5·〇克）於20毫升6N鹽酸中回流2 4小時。反應冷卻，眞空過濾收集白色固體，以水洗滌，乾燥，產生3.3克（收率87%) 4·氟-2-硝苯基乙酸，薄層層析法Rf 0·6(乙酸乙酯：邑烷1 : 2，矽膠）。取4-氟-2-硝苯基乙酸（3.3克）溶於15毫升乙酸中，經〇45 克10% Pd/C，於60 psi Η2下氫化2小時。過濾排除觸媒，以 1 5毫升甲醇洗務。合併之濾液濃縮，加水稀釋。眞空過淚收集沈澱，以水洗滌，乾燥，產生1.6克（收率70%) 6_氟一2· 羥啕哚，薄層層析法Rf 0.24。濾液濃縮，產生紫色固體，其NMR光譜與第一份產物相似。此紫色固體層析（乙酸乙酯：己烷，1 : 2，矽膠），產生第二份6_氟_2-羥吲哚白色固體。、 5-胺磺醯基-2-羥吲哚 100毫升燒瓶中添加27毫升氣磺酸，緩緩添加13.3克2_經峭哚。添加期間，反應溫度保持在3〇。(：以下。添加後，反應混合物於室溫下攪拌1 ·5小時，加熱至68 1小時，冷卻，倒至水中。以水洗滌沈澱，於眞空烘箱中乾燥，產生 11.0克5-氯磺醯基-2-羥吲哚（收率50%)，未再純化即使用。添加5-氯磺醯基-2-羥巧哚（2」克）至含1〇毫升氫氧化銨之 10毫升乙醇中，於室溫下攪拌一夜。混合物濃縮，過濾收集固體，產生0.4克（收率20%)標題化合物之灰白色固體。 5-甲胺磺醯基-2-羥啕哚取含3.38克5-氣磺醯基-2-羥吲哚之10毫升2Μ甲胺之四氫呋喃溶液之懸浮液於室溫下攪拌4小時，此期間有白色固體 •69- 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（2】〇 X 297公爱） •I--I*---^--I I I I · I I (請先閱讀背面之注意事項寫本頁) 訂：經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1229073 A7 B7 五、發明說明（67 ) ----*---：------裝--- (請先閱讀背面之注意事項寫本頁) 形成。眞空過濾收集沈澱，以5毫升水洗滌2次，於40°C下眞空乾燥一夜，產生3.0克（收率88%) 5-甲胺磺醯基-2-羥< 哚〇 5-(4-三氟甲苯胺磺醯基）-2-羥啕哚取含2.1克5-氯磺醯基-2-羥吲哚、1.6克4-三氟甲基苯胺及 1 ·4克吡啶之2 0毫升二氣甲烷懸浮液於室溫下攪拌4小時。眞空過濾收集所形成之沈澱，以5毫升水洗滌2次，於40°C 下眞空乾燥一夜，產生2.4克粗產物，經薄層層析法判斷仍含有一些雜質。粗產物經矽膠層析，以乙酸乙酯：己烷 (1 ·· 2)溶離，產生1.2克（收率37%) 5-(4-三氟甲苯胺磺醯基）-2-¾ p朵。 5-(嗎啉磺醯基）-2-羥吲哚 * 取含2·3克5 -氯磺醯基-2-羥吲哚及2·2克嗎啉之5 0毫升二氣甲烷懸浮液於室溫下攪拌3小時。眞空過濾收集白色沈澱，以乙酸乙酯及己烷洗滌，於40 °C下眞空乾燥一夜，產生2.1克（收率74%) 5-(嗎啉磺醯基）-2-羥啕哚。 6·三氟甲基-2-羥峭哚經濟部智慧財產局員工消費合作社印製添加二甲亞颯（330毫升）至7.9克氫化鈉中，然後滴加436 克早故^一乙S旨。混合物加熱至1 〇〇 C 1 · 0小時，冷卻至室溫。添加2 -硝基-4-三氟甲基甲苯（3 1 ·3克），於室溫下攪拌反應3 0分鐘，然後於1 〇〇°C下加熱1小時。反應冷卻，倒至飽和氣化銨水溶液、乙酸乙酯及己烷之混合物中。以飽和氣化銨，水及鹽水洗滌有機層，脱水，濃縮，產生2_(2_確基-4-三氟甲苯基）丙二酸二甲酯。 -70- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（2】〇χ 297公爱） 1229073 Α7 ______Β7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明説明（） 68 取二酯溶於含6.4克氯化銼及2.7毫升水之1〇〇毫升二甲亞石風混合物中’於100 C下加熱3小時。反應冷卻’倒至乙酸乙酯與鹽水之混合物中。有機相以鹽水洗滌，以硫酸鈉脫 .水，濃縮及矽膠層析（10〇/〇乙酸乙酯之己烷溶液）。取含產物之溶離份蒸發，產生25.7克2-硝基-4-三氟甲苯基乙酸甲酯。取2-硝基-4-三氟甲苯基乙酸甲酯（26毫克）經l〇〇/0 Pd/C氫化，然後於100 °C下加熱3小時。過濾排除觸媒，蒸發溶劑，產生標題化合物。 5-(2-氯乙基）羥峭哚取含5 -氯乙酿基-2-羥啕哚（4· 18克）之3 0毫升三氟乙酸於冰浴中經4.6 5克二乙砂坑處理，於室溫下欖拌3小時。混合物倒至150毫升水中，真空過濾收集沈澱，以5〇毫升水洗滌，乾燥，產生2.53克（收率65%) 5-(2_氯乙基兴2-羥吲哚之紅褐色固體。 5 -甲氧羰基-2-經吲嗓取5-破-2-輕巧嗓（17克）與2克二乙酸鈀、18.2克三乙胺、 150愛升甲醇、1 5毫升二甲亞颯及2 6克dppp於飽和二氧化碳大氣下回流。2 4小時後，反應過濾排除觸媒，濾液濃縮。濃縮液經矽膠層析（3〇〇/0乙酸乙酯之己烷溶液）。濃縮含產物之溶離份’靜置。真空過濾收集沈澱產物，產生〇 8克 (7 % )標題化合物之灰白色固體。 4 -複基-2-經4丨11朵滴加三甲矽烷基重氮甲烷之己烷溶液（2 Μ )至室溫下含 2.01克2-氯-3-叛基硝基苯之2〇毫升甲醇溶液中，直到不再本纸張尺度適财關家標準（CNS ) 2Η)ϋ釐） (請先閱讀背面之注 -裝· 頁) 、1Τ 線 1229073 A7 B7 五、發明說明（69 ) 有氣體冒出爲止。以乙酸中止過量三甲矽烷基重氮甲烷之反應。反應混合物經旋轉蒸發幫浦乾燥，殘質再眞空乾燥一夜。產物（2·氣-3-甲氧羰基_硝基苯）之純度足以進行下一個反應。添加丙酸二甲酯（6·0毫升）至含2·1克氫化鈉之15毫升 DMSO冰***液中。反應混合物於1〇〇。(：下攪拌丨〇小時後，冷部至1：溫。一次添加全量2-氣甲氧羰基硝基苯（215克）至上述混合物中，混合物加熱至1〇〇r 15小時。反應混合物冷卻至至，皿’倒至冰水中，酸化至pH $，以乙酸乙酯萃取。有機層以鹽水洗滌，以無水硫酸鈉脱水，濃縮，產生 3.0克2-甲氧羰基硝基苯基丙二酸二甲醋。取2 -甲氧羰基-6-硝基苯基丙二酸二甲酯（3〇克）於5〇毫升 6Ν鹽鉍中回流一夜。混合物濃縮至乾，與含丨丨克氣化亞錫 (Π)足20耄升乙醇回流2小時。混合物經寅式鹽過濾，濃縮，經矽膠層析（乙酸乙醋：己烷：乙酸），產生〇.65克（收率37%) 4-羧基-2-羥吲哚之白色固體。 5-羧基-2-輕啕嗓 ’小、加2 -备W嗓（6·7克）至冰浴中含2 3克氣化鋁之3 0毫升二 ^垸攪拌懸浮液中。緩緩添加氣乙酼氣（11·3克），有氯化氮氣缸釋出。揽拌1 0分鐘後，反應於4 0至50°C下回溫1.5小時薄層層析法（乙酸乙酯，矽膠）顯示沒有殘留起始物。 w 口物冷卻至室溫，倒至冰水中。眞空過濾收集沈澱，以水洗釭，眞2乾燥，產生10.3克（98%) 5-氣乙醯基-2-羥⑷哚之灰白色固體。 L______ -72- 本纸張尺度適標準（CNSi規格⑵297公餐） I ΓΙΙΓΙ — — — — - I I (請先閱讀背面之注意事項寫本頁) 訂- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1229073 A7 ------ B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印則衣五、發明說明（7〇 ) 取9·3克5-氣乙醯基羥吲哚懸浮於9〇毫升吡啶中，於8〇至90 C下攪拌3小時後，冷卻至室溫。眞空過濾收集沈澱，以20愛升乙醇洗滌。固體溶於9〇毫升2·5ν氫氧化鈉中，於 70至80°C下攪拌3小時。混合物冷卻至室溫，以〇·5 ν鹽酸酸化至pH 2。眞空過濾收集沈澱，以水徹底洗滌，產生5 _ 叛基-2-經,嗓粗產物之深褐色固體。濾液靜置一夜後，產生2克5-羧基-2-羥啕哚黃色固體。取深褐色粗產物溶於熱甲醇中，過/慮排除不溶物，遽液濃縮，產生5 ·6克5 _羧基-幾吲哚之褐色固體。合併收率爲97〇/〇。 5 -叛乙基-2 -經口朵取5-氰乙基-2-羥吲哚（4.02克）之含25毫升濃鹽酸之1 〇毫升水溶液回流4小時。混合物冷卻，加水，眞空過濾收集所產生之固體’以水洗滌，乾燥，產生1.9克（收率44%)標題化合物之黃色固體。 5·碘-4-甲基-2-羥吲哚添加3.67克N-碘琥珀醯亞胺至冰浴中含2克4 -甲基羥啕嗓之40毫升冰醋酸中。混合物攪拌1小時，以1〇〇毫升5〇% 乙S父之水溶液稀釋，過濾。所得白色固體於高度眞空中乾燥’產生3.27克（收率88%)標題化合物之灰白色固體。5-氣_ 4-甲基-2-¾ Μ丨嗓。取含3.0克4-甲基-2-羥吲哚於室溫下，在5〇毫升乙腈中攪拌懸浮，同時分批添加3·3克N-氣琥珀醯亞胺。然後添加三氟乙酸（1毫升）。懸浮液於室溫下攪拌3天，此期間仍含有固體。眞空過濾收集白色固體，以少量冷丙酮洗滌，於4〇t -73- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 χ 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項寫本頁) '寫本言 Γ 1229073 A7 B7 五、發明說明（η ) 眞空烘相中乾燥一夜，產生2.5克（68%) 5-氯-4-甲基-2-羥巧哚。工 5 - 丁基-2-羥啕哚添加二乙梦燒（2.3克）至室溫下含2克4 - 丁醯基-2-羥巧嗓之20¾升三氟乙酸中，溶液攪拌3小時。反應倒至冰水中，產生之紅色油靜置後固化。眞空過濾收集固體，以水及己烷洗滌，乾燥，產生17克（收率91%)標題化合物之灰白色固 5 -乙基-2-經嗓緩緩添加1 · 8克三乙矽烷至冰浴中含5 _乙醯基· 2 _羥啕哚（2 克）< 1 5毫升三氟乙酸中，反應於室溫下攪拌反應5小時。添加1耄升三乙矽烷，續攪拌一夜。反應混合物倒至冰水中，眞S過濾收集所得之沈澱，以水充份洗滌，眞空乾燥，產生1.3克（收率71%)標題化合物之黃色固體。 5-(嗎琳-4_乙基）-2 -幾Η丨味取5-氣乙基-2-羥吲哚（2.3克）、1.2毫升嗎啉及丨.2毫升二異丙基乙胺於l〇〇°C下，在1 〇毫升二甲亞砜中加熱一夜。混合物冷卻，倒至水中，以乙酸乙酯萃取。有機層以鹽水洗滌，脱水及蒸發。殘質經矽膠層析（5 %甲醇之氣仿溶液），產生0.9克（3 1%)標題化合物之白色固體。 5-(4 -甲氧羰基苯醯胺基）_2_羥吲哚- 取82.0毫克5-胺基-2-羥啕哚及131·〇毫克4-甲氧羰基苯甲醒氣含於p比淀中之混合物於室溫下攪拌3小時，倒至冰水中。過濾沈澱，以水洗滌，於眞空烘箱中乾燥，產生138 〇 -74- 本紙張尺度適用中國國家標準（CN’S)A4規格（210 X 297公釐） -i---^------裝--- (請先閱讀背面之注咅？事項H寫本頁) 訂· 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1229073 A7 B7 五、發明説明（） 72 毫克5-(4甲氧羰基苯醯胺基）-2-羥吲哚（收率81%)。 5 - (4 -羧苯醯胺基）_2_羥峭哚取含5-(4 -甲氧羰基苯醯胺基）-2-羥哨哚（0.9克）及〇.4克氫氧化鈉之2 5毫升甲醇回流3小時。混合物濃縮，加水，混合物經6N鹽酸酸化。真空過濾收集沈澱，產生〇 75克（87%)標題化合物之白色固體。 5 -甲氧基-2-經4丨嗓取三氯乙醛水合物（9.6克）溶於200毫升含83克硫酸鈉之水中。溶液加溫至60°C，添加含11.4克羥胺鹽酸鹽之5 〇毫升水溶液，混合物保持60°C。在另一個燒瓶中，加溫含6.4克 4 -胺基苯甲酸與4.3毫升濃鹽酸之8 0毫升水至8〇。(：。添加第一份溶液至第二份溶液中，混合物回流2分鐘後，緩緩冷卻至室溫，然後於冰浴中冷卻。真空過滤收集黃褐色沈澱，以水洗滌，真空乾燥，產生8.6克（收率85%) N-( 2-羥亞胺基 -乙醯基）胺基苯甲醚。取含5毫升水之濃硫酸（4 5毫升）加溫至6 0 °C，一次添加全量8.6克N-(2-輕亞胺乙醯基）胺基苯甲醚。攪;拌之混合物加熱至93 °C 1 0分鐘後，使之冷卻至室溫。混合物倒至5〇〇克冰中，以乙酸乙酯萃取3次。合併之萃液經無水硫酸納脫水，濃縮，產生5.1克（收率65%) 5 -甲氧Mh朵滿二g同之深紅色固體。取5 -曱氧基i丨嗓滿二明（.5 · 0克）及3 0毫升肼水合物加熱至回流1 5分鐘。反應混合物冷卻至室溫，添加5 〇毫升水。以各2 5毫升乙酸乙酯萃取混合物3次，合併有機層，經無水硫酸鈉脫水，濃縮，產生黃色固體。固體於乙酸乙§旨本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2丨〇><297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再本頁) •裝. 線經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1229073 A7 B7 五、發明說明（73) 中攪拌，眞空過濾排除1 · 1克不溶物，保留此物質。此物質經證明爲2 -胼基羰甲基-4-胺基苯甲醚。濾液濃縮，經矽膠層析，以乙酸乙酯··己烷（1 ··丨）溶離，產生〇.7克5 -甲氧基-2-羥啕哚之黃色固體。取丨丨克厂肼基—羰甲基胺基苯甲醚於2 0毫升1 N氫氧化鈉中回流1小時。混合物冷卻，以濃鹽酸酸化至pH 2,以各25毫升乙酸乙酯萃取3次。合併有機萃液，以鹽水洗滌，以無水硫酸鈉脱水，濃縮，產生〇·8克5 _ 甲氧基-2-羥吲哚之黃色固體。合併收量爲15克或33%。， 7 -氮雜經丨哚取3,3-二溴-7-氮雜羥啕哚（2.9克）溶於含20毫升乙酸與3〇耄升乙腈之混合物中。在溶液中添加6·5克鋅粉。混合物於 1：溫下攪拌2小時。自混合物中·過濾固體，蒸發溶劑。殘質與乙酸乙酯和成漿物。取含不溶性固體之乙酸乙酯溶液通過矽膠短管柱。收集之乙酸乙酯溶液蒸發，殘質眞空乾燥’產生1 · 8克（收率9 1 %) 7 -氮雜經丨嗓乙酸鹽。 5 ·二甲胺磺醯基-2-羥吲哚取含2.3克5 -氣磺醯基-2-羥吲哚之1 〇毫升2Μ二甲胺之甲醇懸浮液於室溫下攪拌4小時，此時有固體形成。眞空過濾收集沈澱，以5毫升1Ν氫氧化鈉及5毫升11^鹽酸洗滌，於經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 40 C下眞2乾燥一夜，產生19克（收率79%) 5_二甲胺基磺醯基- 2-¾ Η丨味。 6 -苯基-2-經丨嗓滴加丙二酸二甲醋（10毫升）之25毫升二甲亞颯溶液至縣浮於25毫升二甲亞颯之3.5克氫化鈉中，混合物於ι〇(Γ(：τ -76- A7 1229073 ___B7 五、發明說明（74 ) -----一---j--------- (請先閱讀背面之注意事項lit、寫本頁) 加熱1 0分鐘。混合物冷卻至室溫，添加含4 · 7克4 -氟-3 -硝基聯苯之25毫升二甲亞砜。混合物於i〇〇°C下加熱2小時，冷卻，以300毫升飽和氣化銨溶液中止反應。以乙酸乙醋萃取混合物3次，合併之有機層以水及鹽水洗滌，蒸發，產生3 _ 硝基聯苯基4-丙二酸二甲酯粗產物之黃色油。取3-硝基聯冬基-4-丙二酸二甲g旨粗產物於3〇毫升6N鹽酸中回流2 4小時。過濾收集沈澱，以水洗滌，乾燥，產生45 克3 -硝基聯苯基-4-乙酸乙酯之乳色固體。一次添加全量鐵粉（2.6克）至含4.5克3 -硝基聯苯基-4-乙酸之40毫升乙酸中。混合物回流2小時，濃縮至乾，溶於乙酸乙酷中。過濾排除固體，以1N鹽酸及鹽水洗滌濾液2次，以典水硫故鈉脱水。滤液濃縮，產生3 ·4克（收率93 %) 6 -苯基_2_羥啕哚淺褐色固體。 6-(2-甲氧苯基）-2-經4丨嗓經濟部智慧財產局員工消費合作社印製添加肆（三苯基膦）鈀（1克）至含5克2_甲氧苯基二羥爛酸，6.6克5-溴-2-氟硝基苯與30毫升2M碳酸鈉溶液之50毫升甲苯與5 0毫升乙醇混合物中。混合物回流2小時，濃縮，以乙酸乙酯萃取殘質2次。以水及鹽水洗滌乙酸乙酯層，脱水’ ί辰縮’產生之深綠色油，靜置時固化，爲4 _氟-2匕甲氧基-3-硝基聯苯粗產物。滴加丙二酸二甲酯（14毫升）至含2·9克氫化鈉懸浮之5〇毫升二甲亞砜中。混合物於1 〇〇°C下加熱丨5分鐘，冷卻至室派’添加4 -氟_2’_甲氧基-3-硝基聯苯粗產物之6〇毫升二甲亞现落液，混合物於丨00。〇下加熱2小時。反應混合物冷 ______ -77- 本氏張尺度適用中0國^票準（C]S：S)A4規格⑵〇 X 297公釐） 1229073 B7 五、發明說明（75 ) 卻，以300毫升飽和氣化鈉溶液中止反應，以乙酸乙酯萃取 2次。合併萃液’以飽和氣化铵，水及鹽水洗滌，以無水硫酸鈉脱水，濃縮，產生粗產物2，-甲氧基-3-硝基聯苯-4-丙二酸二甲g旨之黃色油。取2甲氧基-3-硝基聯苯-4-丙二酸二甲酯粗產物於100°C 下。於5 0毫升6 N鹽酸中加熱2 4小時，冷卻。過濾收集沈澱，以水及己烷洗滌，乾燥，產生9.8克2，-甲氧基-2-硝基聯苯基-4-乙酸之淺黃褐色固體。一次添加全量鐵粉（5克）至含9.8克2’-甲氧基-3-硝基聯苯基-4-乙酸之5 0毫升冰醋酸溶液加熱至1 〇〇。〇 3小時。反應混合物濃縮至乾，於乙酸乙酯中經音波處理，過濾排除不溶物。濾液以1 N鹽酸、水洗滌2次，然後以鹽水洗滌，經無水硫酸鈉脱水，及濃縮。殘質經矽膠，以乙酸乙酯：己烷 (1 : 2)層析，產生5.4克6-(2-甲氧苯基）-2-羥峭哚之玫瑰色固體。 6-(3-甲氧苯基）-2-羥峭哚添加肆（三苯基膦）鈀（〇·8克）至含5克3 _甲氧苯基二羥硼酉义’ 5克5 -溴-2-氟-硝基；^及11愛升2Μ碳酸納溶液之100毫升甲苯混合物中。混合物回流2小時，以水稀釋，以乙酸乙醋萃取。以飽和碳酸氫鈉及鹽水洗滌乙酸乙酯層，脱水及濃縮’產生油性固體。固體經矽膠層析（乙酸乙酯：己燒 (1 : 6))，產生4·3克（收率77%) 4·氟_3’·甲氧基-3·硝基聯苯。滴加丙二酸二甲酯（9.7毫升）至含2.0克氫化鈉懸浮之5 〇毫升二甲亞颯中。混合物加熱至1 〇〇 °C 3 5分鐘，冷卻至室 -78- 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公爱 I---- (請先閱讀背面之注意事項寫本頁) 一·°J· 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1229073 A7 _ B7 五、發明說明（76 ) 溫。添加4 -氟-2、甲氧基-3-硝基聯苯（4.2克）之50毫升二甲亞颯溶液，混合物於1 〇〇°C下加熱1小時。反應混合物冷卻，以300毫升飽和氣化銨溶液中止反應，以乙酸乙酯萃取 2次。合併萃液，以鹽水洗滌，經無水硫酸鈉脱水，濃縮，產生3 -甲氧基-3 -硝基聯苯基-4-丙二酸二甲g旨之淺黃色固體。取3、甲乳基-3-硝基聯苯基-4-丙二酸二甲g旨粗產物於4 5毫升6 N鹽酸中’於π 〇。〇下加熱4天，然後冷卻。過濾收集沈澱物，以水及己烷洗滌，乾燥，產生5 3克3、甲氧基硝基聯苯基-4·乙酸之淺黃褐色固體。取3’ -甲氧基-3-硝基聯苯基-4-乙酸（5.2克）溶於甲醇中，經0.8克10% Pd/C，於室溫下氫化3小時。過濾排除觸媒，以甲醇洗條，合併滤液，濃縮，產生褐色固體。固體經碎膠使用乙i父乙g旨：己紀：乙酸（33 :66: 1)層析，產生3·〇克 6-(3-甲氧苯基）-2-經啕嗓之粉紅色固體。 6-(4-甲氧苯基）-2-經p朵經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -----*---i------裝—— (請先閱讀背面之注意事項寫本頁) 添加肆（三苯基膦）鈀（1克）至含5克4 _甲氧苯基二羥硼故，6·6克5 -溴-2-氟硝基苯與3 0毫升2 Μ碳酸鈉溶液之5 〇毫升甲苯與5 0毫升乙醇混合物中。混合物回流2小時，濃縮，以乙酸乙酯萃取殘質2次。以水及鹽水洗滌乙酸乙酯層，脱水’及;辰縮，產生褐色油性固體。此固體經矽膠層析（5 % 乙酞乙酯之己坑溶液），產生粗產物4 •氟·4，·甲氧基硝基聯苯淺黃色固體。滴加丙二酸二甲酯（10毫升）至含2〇克氲化鈉懸浮之6〇毫升二甲亞砜中。混合物於i 〇〇。〇下加熱i 〇分鐘，冷卻至室 -79- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公釐） 1229073 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 Α7 Β7 五、發明說明（77 ) 溫。添加4 -氟-2’-甲氧基-3-硝基聯苯粗產物（5 .2克）之5 0毫升二甲亞颯溶液，混合物於l〇〇°C下加熱2小時。反應混合物冷卻，以300毫升飽和氣化銨溶液中止反應，以乙酸乙酯萃取2次。合併萃液，以飽和氣化按，水及鹽水洗務，以無水硫酸鈉脱水，濃縮，產生粗產物4，-甲氧基-3-硝基聯苯基-4-丙二酸二甲g旨之黃色油。取4’-甲氧基-3-硝基聯苯基-4-丙二酸二甲酯粗產物於100°C 下，於6 0毫升6N鹽酸中加熱1 5小時，冷卻。過濾收集沈澱，以水及己烷洗滌，乾燥，產生7.2克4，-甲氧基-3-硝基聯苯基-4 -乙酸之淺黃褐色固體。一次添加全量鐵粉（3.6克）至含7.2克4，-甲氧基-3-硝基聯苯基-4-乙酸之5 0毫升冰醋酸溶液中，於1 〇〇°C加熱一夜。反應混合物濃縮至乾’於乙酸乙g旨中經音波處理，過濾、排除不溶物。濾液以1 N鹽酸及鹽水洗滌2次，經無水硫酸鈉脱水，及濃縮。產生2.7克6-(4-甲氧苯基）-2-羥吲哚之玫瑰色固體。 6-(3 -乙氧苯基）-2-羥啕哚添加肆（三苯基膦）鈀（0.8克）至含4.2克3 -乙氧苯基二羥硼酉义’ 5 ·0克5 -溴-2-氟-硝基木及2 2愛升2 Μ碳酸鈉溶液之5 0毫升甲苯與5 0毫升乙醇之混合物中。混合物回流2小時，濃縮，加水，以乙酸乙酯萃取混合物‘2次。以水及鹽水洗滌乙酸乙酯層，脱水及濃縮。殘質經矽膠層析（5 %乙酸乙酯之己烷溶液），產生5·3克（收率90%) 4-氟-3，-乙氧基-3-硝基聯苯粗產物之黃色油。 -80 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -----“--------裝-------訂· ί請先閱讀背面之注意事項、寫本頁)

1229073 A7 B7 五、發明說明（78 ) 滴加丙二酸二甲酯（11.4毫升）至含4.0克氫化鈉懸浮之20 毫升二甲亞砜中。混合物加熱至丨〇〇°C 1 〇分鐘，冷卻至室溫。添加4-氟-3，-乙氧基-3-硝基聯苯（5.3克）之25毫升二甲亞礙溶液，混合物於l〇〇°C下加熱2小時。反應混合物冷卻，以300毫升飽和氯化銨溶液中止反應，以乙酸乙酯萃取 3次。合併萃液，以水及鹽水洗滌，經無水硫酸鈉脱水，濃縮’產生3、乙氧基_3-硝基聯苯基_4_丙二酸二甲g旨之黃色油0 取3* -乙氧基硝基聯苯基—4-丙二酸二甲酯粗產物於60毫升6 N鹽酸中，於100°C下加熱4天，然後冷卻。過濾收集沈殿物’以水及己烷洗滌，乾燥，產生4.7克3，_乙氧基硝基聯苯基-4-乙酸之淺黃褐色固體粗產物。一次添加全量鐵粉（2.4克）至含4.6克3、乙氧基-3-硝基聯苯基-4-乙酸之4 〇毫升冰醋酸溶液中，回流2小時。反應混合物渡縮至乾，以乙酸乙酯中重覆處理，過濾排除不溶物。濾、液以1 N鹽酸及鹽水洗滌2次，然後經無水硫酸鈉脱水’及濃縮。產生3.5克（收率91%) 6-(3-乙氧苯基）-2·羥吲哚之淺褐色固體。 6 -漠-2-#i Μ卜朵滴加丙二酸二甲酯（1 3毫升）至含2.7克氫化鈉懸浮之2 0毫升一甲亞颯中。混合物加熱至100°C 10分鐘後，冷卻至室溫。添加5-溴-2-氟硝基苯（5.0克）之25毫升二甲亞砜溶液，混合物於1〇〇。(：下加熱2小時。反應混合物冷卻，以3〇〇毫升飽和氣化銨溶液中止反應，以乙酸乙酯萃取3次。合併萃 -81 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） I---ΓΙΙΓΙΙ — — — - I I (請先閱讀背面之注意事項寫本頁) 訂· 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1229073 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明說明（79 ) 液，以飽和氣化銨、水及鹽水洗滌，以無水硫酸鈉脱水，濃縮’產生4 -漠-2-硝苯基丙二酸二甲@旨粗產物之淺黃色油。取4 -溪-2-硝苯基丙二酸二甲g旨粗產物於η 〇°c下，於4 0毫升6 N鹽酸中加熱2 4小時，冷卻。過濾收集沈澱，以水洗滌，脱水，產生5.3克（收率89%) 4-溴-2-硝基-苯乙酸灰白色固體。取4 -溴-2-硝苯基乙酸（0.26克）、0·26克鋅粉及3毫升50% 硫酸於5毫升乙醇中，於l〇〇°C下加熱一夜。反應混合物過遽，以少量乙酸稀釋，濃縮排除乙醇，以水稀釋，以乙酸乙酯萃取2次。合併之萃液以鹽水洗滌，以無水硫酸鈉脱水辰縮’產生0 · 19克（收率9 0 %) 6 - >臭-2 _經4丨嗓之黃色固體。 · 5 -乙醯基-2-羥吲哚取2-羥啕哚（3克）懸浮於l，2-二氣乙烷中，緩緩添加3.2毫升乙酿氣。所得懸浮液加熱至50。(： 5小時，冷卻，倒至水中。所得沈澱經眞空過濾收集，以水充份洗滌，眞空乾燥’產生2.9克（收率73%)標題化合物之褐色固體。 5-丁醯基-2-羥啕哚。依序添加7.5克2-羥啕哚及12克丁醯氣至冰浴中含15克氣化鋁懸浮之30毫升i，2-二氣乙烷中。所得懸浮液加^至5〇。〇一夜。混合物倒至冰水中，以乙酸乙酯萃取3次。合併之乙 S'丈乙酯層以鹽水洗滌，以硫酸鈉脱水，濃縮至乾，產生褐色固體。固體經矽膠層析（50%乙酸乙酯之己烷溶液），產生 3克（25%)標題化合物之黃色固體。彳 (請先¾讀背面之注意· 事項P寫本巧裝，· -丨線 82- 1229073 A7 B7

五、發明說明（8〇 ) 5 -散乙基- 2-#呈4丨嗓 — — — — — Γ — lri!裝·-- (請先閱讀背面之注意事寫本頁) 添加氰化鉀（2.0克）至15毫升二甲亞砜中，加熱至9〇。〇。取5-氣乙基-2-羥啕哚（3·〇克）溶於5毫升二甲亞颯中，緩緩攪拌添加，反應加熱至150°C 2小時。混合物冷卻，倒至冰水中’具文過滤收集沈殿’以水洗條’乾燥，經碎膠層析 (5%甲醇之氣仿溶液），產生h2克（收率42%)標題化合物。 6 -(嗎淋-4-基）-2 -經㈤嗓取6-胺基-2-羥吲哚（2.2克），4.0克2,2，-二溴乙基醚及7·9克碳酸鈉於2 0毫升乙醇中回流一夜，濃縮，以5 〇毫升水稀釋。混合物以5 0毫升乙酸乙酯萃取3次，合併有機萃液，以 2 0耄升鹽水洗條，以無水硫酸鈉脱水，濃縮至乾。固體經石夕膠管柱層析（乙酸乙酯：己烷（1 :丨），含〇·7%乙酸），產生1.2克（收率37%)標題化合物之米色固體。 6-(3-二氣乙酿苯基）-2-¾ 4丨嗓經濟部智慧財產局員工消費合作社印製取3-胺苯基二羥硼酸（3·9克）、5克5_溴氟硝基苯，〇8 克肆（三苯基膦）鈀與23毫升2Μ碳酸氫鈉溶液之50毫升甲苯溶液於氮氣下回流2.5小時。反應混合物倒至200毫升冰水中，以5 0毫升乙酸乙酯萃取混合物3次。合併之有機層以 5 0毫升水及2 0毫升鹽水洗滌，經無水硫酸鈉脱水，及濃縮，產生9.7克（收率92%) 2-氣-5-(3-胺苯基）硝基苯之深褐色油。緩緩添加三氟乙酸酐（5.4毫升）至0°C下，含9.7克2-氟-5-(3-胺苯基）硝基苯及5.3毫升三乙胺之50毫升二氣甲烷攪拌溶液中，混合物再攪拌2 0分鐘。混合物濃縮，殘質經矽膠 -83- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公爱） 1229073 A7 B7 五、發明說明（81 官枉層析（10%乙酸乙酯之己烷溶液），產生8 6克（收率65%) 請先閱讀背面之注意事 Μ 本頁 2-氟-5-(3-二氟乙醯胺苯基）硝基苯之淺橙色油，靜置時固化。滴加丙一酸二甲酯（9·6毫升）至氮氣下，含3.2克6〇%氫化鈉（含於礦物油中）之4 〇毫升無水二甲亞颯中。混合物攪拌 10分鐘，添加含2-氟-5-(3-三氟乙醯胺苯基）硝基苯之2〇毫升二甲亞礙。所得深紅色混合物加熱至2小時。反應倒至100毫升飽和氣化銨溶液中止反應，以各5 〇毫升乙酸乙酯萃取2次。有機相以各5〇毫升飽和氯化銨溶液、水及鹽水洗滌’經無水硫酸鈉脱水，濃縮，形成黃色油。此油經矽膠官柱層析（乙酸乙酯：己烷（丨：4))，產生4.4克（收率50%) 2-[2-硝基-4-(3-三氟乙醯胺苯基）苯基]丙二酸二甲酯之淺黃色固體。取2-[2-硝基-4·(3-三氟乙醯胺苯基）苯基]丙二酸二甲酯 (4.4克）於5 0毫升6 Ν鹽酸中回流一夜。反應混合物冷卻至室溫，眞空過濾收集固體，以水洗滌，眞空乾燥，產生2.7克 (收率73%) 2-[2-硝基-4-(3-三氟乙醯胺苯基）苯基]乙酸。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製取2-[2-硝基-4-(3-三氟乙醯胺苯基）苯基]乙酸（1〇〇毫克）與 5 〇毫克鐵粉於3毫升乙酸中，於1 〇〇°C中加熱2小時。反應混合物濃縮，殘質於5毫升乙酸乙酯中經音波處理。眞空過濾排除不溶性固體，以丨N鹽酸、水及鹽水洗滌濾液，經無水硫酸鈉脱水，濃縮，產生1 〇毫克（收率14%)標題化合物之玫塊色固體。 B .醛類 -84- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1229073 A7 B7 五、發明說明（82 ) ^ --- (請先閱讀背面之注意事項寫本頁) 5 -甲醒基-2,4-二甲基-iH-p比洛-3-幾酸取3-氧丁酸第三丁酯（158克，1莫耳）溶於含在附裝溫度計、滴加漏斗及機械攪拌之三項圓底燒瓶之2〇0毫升乙酸中。混合物於冰浴中冷卻至約1〇χ：。以75分鐘添加亞硝酸納（69克，1莫耳），並保持在15。(：以下之溫度，離開冷水浴’混合物攪拌3 0分鐘，靜置3.5小時，產生2-經亞胺基-3 _ 氧丁酸第三丁酯。取3 -氧丁故乙酯（13 0克，1莫耳）溶於含於附裝溫度計、滴加漏斗、機械攪拌器且置於油浴中之2升3頸圓底燒瓶中之400毫升乙酸中。添加鋅粉（5〇克，〇76莫耳），混合物攪拌加熱至60°C。緩緩添加上述製備之2 -經亞胺基_3-氧丁酸第三丁酯溶液，反應混合物溫灰維約6 5 T。添加更多鋅粉 (4 X 50克，3.06莫耳），最後一份鋅粉保留在所有第三丁酯添加完畢後才添加。添加結束時之溫度爲。溫度提高至70-75 C ’揽摔1小時後，倒至5升水中。經濟部智慧財產局員工消費合作社印制π 眞空過濾收集灰色之浮動沈澱物，以2升水洗務，產生 3 54克濕粗產物。粗產物溶於1升熱甲醇中，趁熱過滤排除鋅。/慮液冷卻’使沈&形成。興2過濾、收集沈殿，乾燥，產生118克產物。濾液置入冷藏庫一夜，此時另有一份產物沈澱。共得到173.2克3,5-二甲基-1H-吡咯-2,4_二複酸2-第三丁酯4 -乙酯。取3,5-二甲基-1H-说哈-2,4-二幾酸2-第三丁酯扣乙酯（8(U 克，〇·3莫耳）及400毫升三氟乙酸於附裝機械攪掉器並於油浴中加溫至40°C之2升3頸圓底燒瓶中攪拌5分鐘。混合物冷 -85- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 χ 297公釐） 1229073 A7 B7 五、發明說明（83 ) ^1 ϋ I ϋ ^.1 ϋ ί h ϋ n 1 I n (請先閱讀背面之注音？事寫本頁) 卻至-5 f，一次添加全量正甲酸三乙酯（67 〇克，〇·45莫耳）。脈度升回至15 C。混合物攪拌約丨分鐘，離開冷水浴，再攪掉1小時。經旋轉洛發排除三氟乙酸，殘質置人冷藏庫中，使之固化固姐加溫溶解，倒至5〇〇克冰中。以8〇〇毫升二氣甲燒萃取混合物。產生紅色溶液及褐色沈澱，此二份物質均保留。分離沈澱物，以15〇毫升飽和碳酸氫鈉溶液洗滌。二氣甲烷相亦以15〇毫升飽和碳酸氫鈉溶液洗滌。再以 100毫升水洗滌二氣甲烷溶液3次。二氯甲烷溶液蒸發至乾。殘留之深色殘質自含達可碳黑（Darco carbon Mack)之乙奴乙酯中再結晶2次，產生金黃色針狀物。褐色沈澱物自 3 50¾升同樣含達可碳黑之乙酸乙酯中再結晶，產生黃紅色固體。合併所有再結晶之固體·，自5〇〇毫升乙醇中再結晶，產生37.4克（63.9%) 5 -甲醯基-2,4-二甲基-1H·吡咯-3-羧酸乙酯之黃色針狀物(mp 165.6-166.3Ό，文獻上記錄163-164°C )。乙酸乙醋蒸發後得到之殘質與乙醇母液合併，自5〇〇毫升乙醇中再結晶，產生第二份產物（⑺^克）之污黃色針狀物。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製添加5 -甲醯基-2,4-二甲基-1H-吡咯-3·羧酸乙酯（2克，1 〇毫莫耳）至含氫氧化鉀（3克，53毫莫耳）之甲醇（3毫升）與水 (1 〇毫升）溶液中。混合物回流3小時，冷卻至室溫，以6 N 鹽§父δ父化至p Η 3。過遽收集形成之固體，以水洗)條，於眞空烘箱中乾燥一夜，產生1.6克（93%) 5 -甲醯基-2,4-二甲基-1Η-吡哈-3-幾酸。 NMR (300 MHz, DMSO-d6H : 12.09(s，br，2Η，ΝΗ & C〇〇H)，9.59(s，1H，CHO)，2.44(s，3H，CH3)，2.40(s，3H，CH3)。 -86- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公釐） 1229073 Α7 Β7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明說明（84 ) 5 -甲醯基-2,4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸（2-二甲胺乙基）醯胺依序添加苯幷***-1-基氧叁（二甲胺基）鳞六氟嶙酸鹽 (BOP試劑，6克，13·5毫莫耳）及3毫升二異丙基乙胺至含卜甲醯基·2,4-二甲基-1Η-吡咯-3-羧酸（1.67克，1〇毫莫耳）之 '一甲基甲酿胺（1 〇毫升）混合物中。揽摔5分鐘後，添加1毫升Ν，Ν-二甲基乙二胺，混合物於室溫下攪拌24小時。在反應混合物中添加2 5毫升1 Ν氫氧化鈉及2 5毫升鹽水。攪摔 3 0分鐘後’反應混合物倒至水（1 〇〇毫升）中，以1 〇 %甲醇之一氣甲坑溶液萃取（3 X 200毫升）。合併有機層，經無水硫酸鈉脱水，使用旋轉蒸發器蒸發。殘留之殘質經層析純化（石夕膠管柱，5%至10〇/〇甲醇之二氣甲烷溶液），產生1克（42%) 5 -甲醒基-2，4-二甲基- lH-p比洛-3-致酸（2 -二甲胺乙基）醯胺。 W NMR (360 MHz，DMSO-d6)d : 11.77(s，1Η，NH)，9.53(s， 1H，CHO)，7.34(t，J=5.6 Hz，1H，CONH)，3.27(m，2H, CONCH9CH2)? 2.37(t，J=6.8 Hz，2H，CONCHzCi^)，2.35(s，3H，CH3)，2.3(s， 3H，CH3)，2.17(s，6H，2 x CH3)。 MS m/z 238.3 [M+l]+。 3，5-二甲基-4-(4-甲基-六氫吡畊-i-羰基）_ih-吡咯-2-羧基醛依序添加苯幷***-1-基氧畚（二甲胺基）鳞六氟蹲酸鹽 (BOP試劑，6克，13.5毫莫耳）及3毫升二異丙基乙胺至含5-甲酿基-2,4-二曱基·1Η-吡咯-3-羧酸（1.67克，10毫莫耳）之二甲基甲醯胺（10毫升）混合物中。攪拌5分鐘後，添加2毫升1 -甲基六氫吡畊，混合物於室溫下揽拌2 4小時。然後添加25毫升1Ν氫氧化鋼及25亳升鹽水至反應中。揽掉3〇分 ί -裝 i I (請先閱讀背面之注意事寫本頁)

-1 I I 訂.

1229073 A7 B7 五經濟部智慧財產局員工消費合作社印製、發明說明（85 ) 备後’反應混合物倒至水（100毫升）中，以1 〇%甲醇之二氯甲烷落液萃取（3 X 200毫升）。合併有機層，經無水硫酸鈉脱水，經旋轉蒸發器蒸發。殘留之殘質經層析純化（矽膠管柱，5%至10%甲醇之二氯甲烷溶液），產生1克（4〇%) 3,5· 二甲基-4-(4-甲基六氳吡畊-1-羰基）·1Η_吡咯-2_羧基醛。 !H NMR (360 MHz, DMSO-d6)^ ： 11.82(s, 1H, NH), 9.50(s, 1H，CHO)，3.14(br m，4H，2xCH2)，2.29(br m，4H，2xCH2)， 2.19(s，3H，CH3)，2.17(s，3H, CH3)，2.14(s，3H，CH3)。 MS El 249 [M]+ 〇 C ·實例-經吡咯取代之2 _啕哚啉酮之合成法本發明代表性化合物之下列合成法僅供範例且未構成本發明合成法或包括本發明化合物^内之化合物之限制。實例1 3-[5-(5-氣-2-氧-1，2-二氫亞啕哚-3-基甲基）-4-甲基-1H-吡洛-3 -基]-丙酸取4-(2-羧乙基）-2-甲醯基-3-甲基吡咯（4.5克）、4.2克5-氣-2-羥峭哚及2.9毫升六氫吡啶於50毫升乙醇中加熱至95°C 5 小時。反應混合物冷卻，及濃縮。殘質懇浮於丙酮中，過濾黃色沈澱，以冷乙醇、2 N鹽酸水溶液及水洗滌至pH 6 後，於眞空烘箱中乾燥一夜，產生7.2克標題化合物（88%)黃色固體。 WNMR (360 MHz，DMSO-d6)d : 13.31(s，br，1H，ΝΗ-Γ)， 12.06(s，br，1H，COOH)，10.88(s，br，1H，NH-1)，7.93(d， J=1.88 Hz，1H，H-4)，7.75(s，1H，H·乙烯基），7.19(d，J=3.1 Hz， -88- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 χ 297公釐） (請先閱讀背面之注意事裳—— 寫本頁) 1229073 A7 B7 五、發明說明（86 ) 1H，Η·2，），7.1(dd，b，J=1.88，8.40 Hz，1H，H-6)，6.84(d， J=8.40 Hz，1H，H-7)，2.65(t，J=7.44 Hz，2H，CH2CH2COOH)， 2.46(t，J=7.44 Hz，2H，CH2CH2COOH)，2.28(s，3H，CH3)。實例2 3-[5-(6-甲氧基-2-氧-1，2-二氫亞吲哚·3·基甲基）-4-甲基-1H-吡咯-3-基]-丙酸取4-(2-羧乙基）-2-甲醯基-3-甲基吡咯（190毫克）、163毫克 6 -甲氧基-2-羥吲哚及2滴六氫吡啶於2毫升乙醇中加熱至90 C 3小時。反應混合物冷卻及濃縮。殘質懸浮於6 N鹽酸水溶液中。過遽沈殿，以水洗條至pH 6，於眞空烘箱中乾燥，產生140毫克標題化合物（43%)褐色固體。 WNMR (360 MHz，DMSO-d6)d : 13.1(S，br，1H，NH-1，）， 12.04(s，br，1H，COOH)，10.76(s，br，1H，NH-1)，7.63(d， J=8.29 Hz，1H，H-4)，7.46(s，1H，H-乙晞基），7.07(d，J=3.03 Hz，1H，H-2’)，6.55(dd，J=2.32，8·29 Hz，1H，H-5)，6.43(d， J=2.32 Hz，1H，H-7)，3.74(s，3H，OCH3)，2.63(t，J=7.31 Hz， 2H，CH2CH2COOH)，2.45(t，J=7.31 Hz，2H，CH2CH2COOH)， 2.23(s，3H，CH3); MS m/z (相對強度，％) 327 ([M+l]+，100)。實例3 3-[5-(5-氣-2-氧-1，2-二氫亞吲嗓-3-基甲基）-2,4-二甲基-1H- p比p各-3 -基]-丙fee 取3-(2-叛乙基）-2,4-二甲基-5-甲醯基吡咯（220毫克）、147 毫克5-氣-2名啕哚及2滴六氫吡啶於2毫升乙醇中加熱至90°C 3小時。反應混合物冷卻及濃縮。殘質懸浮於6 n鹽酸水溶液 •89- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公爱） (請先閱讀背面之注意事項 1 裝，—— jc寫本頁) 丨線經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1229073 A7 B7 發明說明（87 中。過濾沈澱，以水洗滌至pH 6，於眞空烘箱中乾燥，產生 172毫克標題化合物（50%)褐色固體。 !HNMR (360 MHz, DMSO-d6) (ί ： 13.42(s, br3 1H, ΝΗ-Γ) 12.03(s，br，1H，COOH)，10.80(s，br，1H，NH-1)，7 87(d J=2.06 Hz，1H，H-4)，7.67(s，1H，H-乙晞基），7.06(dd，J=2.06, 8.3 Hz，1H，H-6)，6.83(d，J=8.3 Hz，1H，H-7)，2.64(t，J=7 6

Hz, 2H, CH2CH2COOH), 2.34(t, J=7.6 Hz, 2H, CH2CH2COOH) 2.29(s, 3H，CH3)，2.27(s，3H，CH3); MS m/z (相對強度，〇/〇) 345 ([M+l]+，64)。實例4 3-[4-甲基-5-(2-氧-1，2-二氫亞吲哚-3-基甲基）-1H-吡咯-3 _ 基]-丙酸取金屬鈉（1 · 5克）置入附裝溫度計、回流冷凝器及機械攪拌器並置入油浴中之3升3項圓底燒瓶中。攪拌添加無水乙醇（1升）。當鋼溶解時，一次添加全量350克戊-2,4-二酮，然後以30分鐘添加310克丙烯酸乙酯。混合物回流2 5小時後，冷卻至室溫一夜。添加冰醋酸（3毫升），旋轉蒸發排除落劑。殘質經矽藻土過濾，於塗膜之蒸餾器中，〇·丨毫米壓力下蒸餾。餾出物使用1 〇吋眞空外套菲格勒管柱（vigreux column)再蒸|留’產生518克5·乙酿基-4-氧己酸乙g旨，BP 84-92C(0.2 至〇·7 毫米）。在附裝溫度計及機械攪拌器且於蒸汽浴上加熱之5升三頸燒瓶中添加350克5 -乙醯基-4-氧己酸乙酯、329克胺基丙二酸乙酯鹽酸鹽、133克乙酸鈉及1.2升乙酸。混合物於37分 -90- 本纸張尺度適用中國國豕標準（CNS)A4規格（210 X 297公爱） ---裝--- (請先閱讀背面之注意事寫本頁) ·. •f 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1229073

五、發明說明（88 ) 4里内加熱至99 C。於62°C時，二氧化碳已快速釋出。於99t n ! I n Γ I I t I- ϋ I ϋ I · I I (請先閱讀背面之注意事項寫本頁) 下共3 5分叙後，c〇2之釋出已大幅減緩。再過i小時後，混合物冷卻，眞空過濾排除氣化鈉，蒸發溶劑。殘質與丨升冷水混合。眞空過濾收集沈澱，以4〇〇毫升水洗滌，溶於1升熱95%乙醇中。以20克達可心6〇處理溶液，趁熱過濾，並冷卻至室溫。眞空過濾收集結晶固體，於濾器上，使用2〇〇毫升50%乙醇洗滌2次，於7(rc下眞空乾燥，產生285克（收率64%) 2 -乙氧羰基-4-(2-乙氧羰乙基）_3,5-二甲基吡咯。濾液於冷藏庫中一夜，再產生531克（收率η·9%)產物，總收率 75.9% 〇經濟部智慧財產局員工消費合作社印製取2-乙氧羰基-4-(2-乙氧羰乙基）_3,5_二甲基吡咯（285克）及3500笔升***置入附裝機械攪拌器、回流冷凝器及滴加漏斗且於冰浴中冷卻之5升三頸燒瓶中。以i 45分鐘時間滴加亞硫醯氣（435克）。當滴加時，混合物轉呈混濁及綠色，然後澄清。添加完畢時，混合物澄清且呈微黃色。混合物再攪拌1小時，然後回流加熱1小時。混合物冷卻，旋轉蒸發，以1500毫升醚稀釋，再旋轉蒸發一次。再重覆稀釋與蒸發。添加殘質至含802克乙酸及535克氫氧化鈉之8升水中。混合物短暫加熱至85°C，然後攪拌冷卻一夜。分離含有固體之水層’以800毫升醚萃取。添加固體及醚層至含 300克碳酸鈉之2.5升水中，攪拌1小時，過濾排除少量（約7 克）固體。添加亞硫酸（137克）至混合物中，所得沈殿以25〇笔升洗條2次’眞2乾燥’產生56.4克產物。添加亞硫酸 (9 2克）至遽液中’所仔沈知以〇. 5升水洗)條2次，眞空乾 -91 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 χ 297公釐） 1229073 A7 ____B7 ____ 五、發明說明（89 ) 燥，產生220克產物，共計276.4克（收率86.8%) 2-羧基·5-乙氧談基- 3-(2·乙氧羰乙基）-4 -甲基ρ比p各。取2-羧基-5-乙氧羰基-3-(2-乙氧羰乙基）-4-甲基吡咯（50.5 克）及400毫升1 〇◦/◦氫氧化鈉溶液於帕爾高壓爸中加熱至18〇 °C 90分鐘。再重覆此過程4次，直到共處理252.5克2-羧基-5-乙氧羰基-3-(2-乙氧羰乙基）-4-甲基吡咯爲止。合併五份溶液，旋轉蒸發成約1.8升體積之濃稠黑色殘質。混合物於水浴中冷卻至l〇°C，緩緩添加50%硫酸，以保持溫度在2 〇 °C 以下，直到pH爲2止。添加***（1400毫升），混合物過濾，保留沈殿物。於索克斯萃取器（Soxhlet extract〇r)中，以5〇〇毫升醚萃取沈澱。合併之醚層依序以250毫升水及150毫升水洗滌。合併之水層再以150毫升醚回萃取。所有醚層均經旋轉蒸發’殘質乾燥’產生123.5克3-(2-幾乙基）-4-甲基ρ比洛0 取3-(2-複乙基）-4-甲基π比p各（123克）與1500毫升***及250 毫升甲醇於機械揽摔之接收瓶中混合。取另一個3升三頸圓底燒瓶加裝磁鐵攪拌器’蒸麵頭，及通往接收燒瓶入口之冷）是器，於水浴中加熱。在此三升燒瓶中置入240克溶於 1800毫升乙§^中之0丨&2&1(1及含73克氫氧化|甲之36〇毫升95% 乙醇與112耄升水之溶液。揽拌3升燒瓶，於水浴中加熱至 6 5至7 5 °C，蒸餾重氮甲烷-醚混合物至攪拌中之接收燒瓶中約2·5小時以上。添加***（200毫升）至3升燒瓶中，繼續蒸飽至完全爲止。再攪拌接收燒瓶30分鐘，然後添加毫升乙酸。以500毫升水萃取混合物2次，再以飽和碳酸氫鈉萃 -92- 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項^ --- '7\寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1229073 A7 ___ B7 五、發明說明（9〇 ) 取2次。醚層經無水硫酸鈉脱水，蒸餾成深色液體殘質。殘質經4吋維格洛管蒸餾2次，經1 0吋眞空外套維格洛管柱蒸餾1次，產生108克（收率80.6%) 3-(2-乙氧羰乙基）-4-甲基吡咯。BP l〇8-113°C(〇.5毫米）。添加二甲基甲醯胺至加裝機械攪拌器、溫度計、滴加漏斗及保持在氮大氣下之5〇〇毫升三頸圓底燒瓶中。燒瓶冷卻至〇 c ’以8 〇分鐘滴加58.4毫升磷縫氯。添加二氣乙燒（280毫升），使混合物回升至室溫，然後冷卻至-10。〇。取3-(2-甲氧羰乙基）-4-甲基吡咯（55.7克）溶於80毫升二氣乙烷中，以1小時時間滴加，混合物再攪拌3 5分鐘。混合物於3〇°C以下旋轉蒸發。液體殘質倒至2700毫升冰冷之2N氫氧化鈉溶液中。所得溶液以2 0分鐘時間加“至8 8 t，再保持此溫度3 0 分鐘。溶液冷卻至周溫，以2〇〇毫升***萃取。水溶液冷卻至〇°C，緩緩添加約1350毫升5N鹽酸酸化至pH 3.5。眞空過滤收集黃色沈澱，以1 〇〇毫升水洗滌4次，於周溫下之眞空烘箱中乾燥，產生54.4克（收率90.2%) 4-(2-羧乙基）-2-甲醯基-3·甲基p比洛粗產物。粗物質置於425毫升乙醇及700毫升***之回流混合物中，趁熱過濾，排除不溶性殘質，保留此殘質。濾液置入冷凍庫中，眞空過濾收集沈澱，以5 〇毫升醚洗滌。再萃取一次濾、液中之不溶性殘質，趁熱過濾，.置入冷凍庫中。合併所得沈殿及第一份沈澱，產生261克4气2_羧乙基甲醯基甲基说嘻之褐色粉末，mp 149.0-150.3。(：。濾液與前一次製備之滤液合併，濃縮，產生4 3克褐色固體。固體置入含5〇〇 -93- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公爱） - — — — — hill· — — — — — · I I (請先閱讀背面之注意事項寫本頁) 訂· 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1229073 A7 B7 五、發明說明（91) -----；—^----»!裝— (請先閱讀背面之注意事項寫本頁)

毫升醚與100毫升乙醇之回流混合物中，過濾。濾液於回流下經諾力得（Norit)處理，再次趁熱過濾。濾液置入冷;東庫f，再產生3份4-(2-複乙基）-2-甲醯基-3-乙基p比p各，77克，MP 148-151。(：，3.2克MP 128-134°C 及以克 ΜΡ 148·2_15〇 ye。取4-(2-羧乙基）-2-甲醯基-3-甲基吡咯（9 〇克）與6〇克2_羥啕哚於50毫升乙醇中，在250毫升加裝溫度計、回流冷凝^ 及磁鐵攪拌器之三頸圓底燒瓶中加熱至7 〇 °C。當大多數固體溶解時，緩緩添加4.5克六氫吡啶，混合物回流4小時。緩緩添加乙酸（1 2毫升），產生很多沈澱。混合物回流5分鐘，冷卻至室溫，眞空過濾收集沈澱，以3 0毫升乙醇洗條。沈澱物於回流下，呈漿物狀經3 0毫升乙醇洗條，冷卻至室溫，眞空過濾收集，以2 0毫升’乙醇洗滌，眞空乾燥，產生 11·9克（收率80%) 3-[4-(2-複乙基）-3 -甲基p比p各-2 -亞曱基] 叫丨哚啉酮，SU6663，爲橙色固體。 WNMR (360 MHz，DMS0-d6)d : 13.29(S，br，1H，NH-1 丨)， 12.05(s，br， 1H，C〇0H)， 10.78(s，br， 1H，NH-1)，7.73(d， J=7.34 Hz，1H，H-4)，7.61(s，1H，H-乙晞基），7.13(d，J=2.75 Hz，1H，H-2’)，7.10(t，J=7.43 Hz，1H，H-6)，6.97(t，J=7.43 Hz， 1H，H-5)，6.85(d，J=7.43 Hz，1H，H-7)，2.64(t，J=7.38 Hz，2H，經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 CH2CH2COOH)，2.46(t，J=7.38 Hz, 2H，CH2CH2COOH)， 2.25(s，3H，CH3); MS m/z(相對強度，％) 297 ([M+l]+，100)。實例5 3-[2,4-二甲基- 5- (2 -氧-1，2-二氫亞丨嗓-3-基甲基比洛 -3-基]-丙酸 -94- 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（2】0 X 297公釐） 1229073 A7 B7 五、發明說明（92 ) -----Γ I I ^--I I · I I (請先閱讀背面之注意事項寫本頁) 取2,4 - 一甲基-5-乙氧談基-3-(2·乙氧幾乙基）p比p各（1〇7公斤）與3.2升5Ν氫氧化鈉於附裝回流冷凝器及滴加漏斗，且於油浴中加熱之1 2升三頸圓底燒瓶中機械攪拌。混合物回流3小時後，内溫爲96°C，所有固體均溶解，薄層層析法顯示已完全水解。離開加熱槽，混合物於水浴中冷卻至5〇乇。緩緩添加1 2 N鹽酸（約1.3升）。添加約50%酸後，氣體開始釋出，溫度達到6 0 °C。添加更多酸，氣體釋出增加，有黃色沈澱形成。以鹽酸調整最終pH至3.5。混合物於冰浴中冷卻至8 C。興2過濾、收集固體，以〇 · 5升蒸館水洗務2次，於 5 5至60°C之眞空烘箱中乾燥4 8小時，產生677克（收率101%) 3-(2-羧乙基）_2,4-二甲基吡咯。 iHNMR (d6-DMS〇）J 11.9(s，iH，COOH)，9.9(s，1H，NH)， 6.2(s，1H，芳香系），2.5(t，2H，CH2)，2.2(t，2H，CH2)，2.0(s，3H， CH3)，1.9(s，3H，CH3); MP 134-136。。。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製取含二甲基甲醯胺（28.5克）之250毫升二氣甲烷溶液於附裝磁鐵攪拌器、溫度計、及滴加漏斗之1升三頸圓底燒瓶中，於冰-鹽浴中冷卻至-1°C。取磷醯氣（59.3克）置入滴加漏斗中，緩緩加至反應混合物中。以2 5毫升二氣甲垸沖刷漏斗，確定所有磷醯氣均耗盡。混合物達到之最高溫爲。混合物攪拌15分鐘，此時溫度爲-3 °C。以15分鐘時間，分批添加3-(2-羧乙基）-2,4-二甲基吡咯（32.6克）固體。混合物達到之取鬲溫度爲7 C。紅黑色混合物再攪拌3 〇分鐘，然後加熱至回流1小時。混合物冷卻至1 5 °C，添加300毫升水，導致反應激烈’此時溫度上升。混合物授掉並冷卻至2 2 °c， -95- 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（2]〇 X 297公釐） 1229073 A7 B7 五、發明說明（93 ) 分層’保留。有機層以100毫升水萃取，合併水層，以5〇毫升二氣甲烷洗滌。有機層棄置。水層經約丨8 〇亳升i N氫氧化鈉調至pH 11。溫度上升至6(TC。混合物攪拌3 〇分鐘，此時溫度爲2 7 °C。混合物經約120毫升1 〇 n鹽酸酸化至pH 2，溫度上升至30°C。添加乙酸乙酯（15〇毫升），攪拌混合物萃取產物。攪拌期間有大量黑色固體出現在水層表面。分離乙酸乙酯層，以1〇〇毫升乙酸乙酯萃取水層及固體。眞空過濾收集仍殘存之固體，以水徹底洗滌，於4 〇。〇下眞空乾燥產生1 2克（收率3 1%) 3-(2-羧乙基）-2,4-二甲基-5-甲醯基吡咯之褐黑色固體。薄層層析法（二氣甲烷：乙酸，95 : 5，石夕膠）顯示在Rf 〇·7有一個點，在起點有一個有色點。合併乙酸乙酯層，經無水硫酸鈉脱水，蒸發成褐黑色固體，於〇C下眞仝乾燥，產生21克（收率55%，總收率％%) 3·(2_ 姜久乙基）-2,4-二甲基-5-甲醯基吡咯，其經薄層層析法分析之外觀與前一份固體相同。或者，取含二甲基甲醯胺（124毫升）之75〇毫升二氣甲烷於附裝機械攪拌器、溫度計及滴加漏斗之5升三頸圓底燒瓶 =，於冰-鹽浴中冷卻至_9。(：。利用滴加漏斗迅速添加磷醯 ^(^14毫升），使用5〇毫升二氣甲烷沖刷至反應混合物中。此ϋ物之最高溫達到_ 4 °C。以2 0分鐘時間，分批添加固體 (姜久乙基）-2,4-二甲基吡咯（133.6克）。混合物之最高溫達。暗紅色混合物加熱至回流1分鐘後，冷卻至-1 °c。混 :分'々卻至-1 C，迅速添加800毫升冰水。最高溫達到1 5 °C。分離有機層，棄置，以約8〇〇毫升1〇 N氫氧化鈉緩緩調整水 ---- -96- 本紙張M^i?iiiTcNS)A4規格⑽X 297公€----—— 裝、-- (請先閱讀背面之注意事項一^寫本頁) 訂.： .•f 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 Lk 1229073 A7 A7 B7 五、發明說明（94 ) 層至pH 12-13，加冰控制溫度。溫度上升至37°C。混合物於周溫下攪摔90分鐘，此時薄層層析法顯示起點只有微量淡色物質，產物之Rf爲0.3。混合物冷卻至〇。(：。混合物經約6〇〇毫升10 N鹽酸酸化至pH 3，加冰控制溫度。最高達到丨。混合物於冷卻下攪拌1小時。眞空過濾收集固體，以1 〇〇毫升洗滌4次’於50至60°C下眞空乾燥，產生14〇·6克（收率 90%) 3-(2-複乙基）-2,4-二甲基-5-甲酿基ρ比洛之褐色固體。 ^NMR (d6-DMSO) ： δ 12.0(s, 1H, COOH), 11.3(s, 1H, NH)，9.4(s，1H，CHO)，2.6(t，2H，CH2)，2.3(t，2H，CH2)，2.2(s， 3H，CH3)，2.1(s，3H，CH3) ο MP 145-147〇C。取3-(2-幾乙基）-2,4-二甲基-5 -甲醯基吡洛（丨8 2克）與i ^ 7 克2 -羥啕哚溶於100毫升乙醇中，於附裝磁鐵攪拌器及回流冷凝器且於油浴中之250毫升圓底燒瓶中加熱。添加吡哈淀 (7.0克）’反應混合物回流2小時，此時出現大量褐黑色固體。薄層層析法（乙酸乙酯··乙醇：乙酸96 ·· 2 ·· 2，石夕膠）顯示沒有羥峭哚起始物。添加8毫升乙酸，混合物回流丨5分鐘。濃稠混合物經5 0毫升乙醇稀釋，冷卻至丨〇。眞空過 ’慮收集固fa ’以5 0毫升乙醇洗)條。固體於12 5毫升乙醇中，在回流下攪拌1 0分鐘，冷卻至1 (TC，眞空過濾收集，以5 〇毫升乙醇洗滌。產物於45°C下眞空乾燥一夜，產生25 5克 (收率88%) 3-[2,4-二甲基- 3-(2·幾乙.基）p比p各-5-亞甲基]2 p弓| 哚啉酮之橙色固體。或者’取含3-(5 -甲醯基-2，4-二甲基- lH-p比哈-3-基）丙酸 (1 0克，5 1毫莫耳）、2-羥吲哚（6.5克，49毫莫耳）與氣氧化 -97- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項寫本頁) 裝 .. 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1229073 A7 B7 五、發明說明（95 ) 納（40克，58毫莫耳）溶於5〇毫升水之混合物於5〇°C下攪拌 4小時。反應混合物冷卻至室溫，過濾，遽液經丨2 N鹽酸酸化至pH 3。眞空過濾收集沈澱固體，以1 〇毫升水洗滌，眞 2乾燥一夜。粗固體與熱乙醇和成漿物2次。眞空過濾收集固體，以10毫升乙醇洗滌，眞空乾燥，產生13.8克（91%) 3-[2,4 - 一甲基-5-(2·乳- I，2·二氫亞g卜朵-3-基甲基比哈- 3-基l·丙酸。 iHNMR (360 MHz，DMSO-d6) : cM3.38(s，br，1H，NH-1，)， 12.05(s，br，1H，COOH)，l〇.70(s，br，1H，NH-1)，7.69(d， J=7.39 Hz，1H，H-4)，7.53(s，1H，H-乙晞基），7.06(t，J=7.39 Hz, 1H，H-6)，6.95(t，J=7.39 Hz，1H，H-5)，6.85(d，J=7.39 Hz，1H， H-7)，2.63(t，J=7.45 Hz，2H，CH2CH2COOH)，2.34(t，J=7.45 Hz，2H，CH2CH2COOH)，2.28(s，3H，CH3)，2.24(s，3H，CH3); MS m/z (相對強度，％) 311 ([M+l]+，100)。實例6 3-[5-(5->臭-2 -氧-1，2 -二氫亞噪-3·基甲基）_4_甲基- iH-ρ比咯-3-基]-丙酸取2-羥啕哚（53·3克）懸浮於640毫升乙腈中，混合物於冰浴中，以機械攪拌冷卻至7 °C。以2 0分鐘時間分批添加ν -溴琥珀醯亞胺固體（74.8克）。添加約三分之一之N _漠琥拍醯亞胺（5分鐘時間）後，溫度上升至12°C。暫停添加，直到混合物溫度降至1 0 C爲止。再開始添加，並保持1 2 °c以下之溫度。添加％畢後’混合物於1 0 C下揽拌1小時，然後再揽拌1小時，使混合物回升至周溫。眞空過濾收集沈澱，以8 0 -98- 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ϋ ϋ n I an ϋ ^i_i I n n I I · n n (請先閱讀背面之注意事寫本頁) 訂- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1229073 A7 五、發明說明（96 ) 毫升乙醇絲，於過_斗中抽乾2G分鐘，產 HPLC判斷其中含有6.4% 2-时朵。取此固體溶於144〇毫升二 k性乙_中’㈣和成漿物洗務，回流5分鐘，此時大多數固體已溶解。混合物於冰浴中冷卻至13。〇。眞空過濾收集固體產物，以80毫升乙醇洗滌，眞空乾燥，'產生二.7克 (68.0%) 5-溴-2-羥吲哚，經HPLC判斷含丨13% 2_羥吲哚。以30%以下之乙醇和成漿物洗滌，產生之收率更高（88%)，但含更多2-羥啕哚（1.76%)。 HNMR (360 MHz，DMSO-d6) : β 10.44(s, br，1H，NH-1) 7.32-7.36(m，2H)，6.76(d，J=8.50 Hz，1H，H-7)，3.5(s，2H， CH2)，MS m/z 212.1/214.1 (M+ / [M+2].)。取4-(2-叛乙基）·2 -甲醯基-3 - #基p比洛（90毫克）、i〇6毫克 5 ·溴-2-羥啕哚、及7 5微升六氫吡啶於2毫升乙醇中加熱至 95°C 5小時。反應混合物冷卻，濃縮。殘質懸浮在2 N鹽酸水溶液中。過濾沈殿，以水洗至pH 6，於眞空烘箱中乾燥，產生120毫克（64%)標題化合物之褐色固體。 ^NMR (360 MHz, DMSO-d6) ： S 13.31 (s, br, 1H? ΝΗ-Γ), 12.06(s，br，1H，COOH)，10.90(s，br，1H，NH-1)，8.06(s，br， 1H，H-4)，7.75(s，1H，H-乙烯基），7.23(d，br，J=8.50 Hz，1H， H-6), 7.19(d, J=2.84 Hz, 1H, H-2f), 6.80(d, br? J=8.50 Hz5 1H, H-7)，2.65(t，J=7.65 Hz，2H，CH2CH2COOH)，2.46(t，J=7.65 Hz, 2H, CH2CH2CO〇H)5 2.28(s5 3H, CH3); MS m/z 375.1/ 377.2 (M+ / [M+2]+) ° 實例7 99- 本紙張尺度適財關家標準（CNS)A4規格(210 X 297公釐） --------I ^------__ (請先閲讀背面之注意事項寫本頁) 一-°J. -I線· 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1229073 A7 B7 五、發明說明（97 ) 3-[5-(5·破-2-氧-1，2-二氫亞吲嗓-3 -基甲基）-4-甲基-1H-叶匕鸣^ - 3 -基]-丙故取2 -經ΘΙ嗓（82.9克）懸浮於630毫升乙酸中，混合物經機械攪拌，於冰水浴中冷卻至1 〇 °C。以1 〇分鐘分批添加Ν -碘琥珀醯亞胺固體（17 5克）。添加完畢後，混合物於1 〇 ι下攪拌1小時。仍然懸浮之固體在此時轉呈極爲濃稠。眞空過滤收集固體，以100毫升50%乙酸之水溶液洗滌，然後以200毫升水洗游，於過滤漏斗中抽乾2 0分鐘。產物眞空乾燥，產生93.5克（36%) 5·蛾-2-¾ 4丨嗓，經質子NMR判斷仍含約5 % 2 -經4丨嗓。 WNMR (360 MHz, DMSO-d6) : d l〇.45(s，1H，NH-1)，7.49 (s，1H，H-4)，7.48(d，J=8.10 Hz, 1H，H-6)，6.64(d，J=8.10 Hz， 1H，H-7)，及 3.46(s，2H，CH2-3); MS m/z 258 [M-l]+。取4-(2-叛乙基）-2-甲醯基-3 -甲基吡咯（90毫克）、130毫克 5-碘-2-羥W哚及75微升六氫吡啶於2毫升乙醇中，在95T：下加熱5小時。反應混合物冷卻及濃縮。殘質懸浮於2 N鹽酸水溶液中。過滤沈澱物，以水洗至pH 6，於眞空烘箱中乾燥，產生162毫克（77%)標題化合物之褐色固體。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 WNMR (360 MHz，DMSO-d6) : 〇M3.30(s，br，1H，NH-1·)， 12.06(s，br，1H，COOH)，10.88(s，br，1H，NH-1)，8.18(s，br， 1H，H-4)，7.73(s，1H，H-乙晞基），7'40(d，br，J=8.03 Hz，1H， H-6)，7.19(d，J=2.94 Hz，1H，H-2丨)，6.69(d，br，J=8.03 Hz，1H， H-7)，2.65(t，J=7.40 Hz，2H，CH2CH2COOH)，2.46(t，J=7.40 Hz，2H，CH2CH2OOH)，2.28(s，3H，CH3); MS m/z 423 [M+l]+。 -100- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1229073 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明說明（98 ) 實例8 3-[4-甲基- 5-(4-甲基-2-氧_1，2-二氫亞η丨嗓_3·基甲基）_1H_ p比咯-3-基]丙酸攪拌添加含草酸二乙酯（30毫升）之2〇毫升無水醚至懸浮於50毫升無水醚中之19克乙醇鉀中。混合物於冰浴中冷卻’緩緩添加2 0毫升3 -硝基鄰二甲苯之2 〇毫升無水醚。渡祠之深紅色混合物加熱至回流〇·5小時，濃縮成深紅色固體，以10%氫氧化鈉處理，直到幾乎所有固體均溶解爲止。深紅色混合物經30%過氧化氫處理，直到紅色轉呈黃色爲止。混合物經10%氫氧化鈉及30%過氧化氫交替處理，直到不再出現紅色爲止。固體過濾，以6 N鹽酸酸化濾液。眞空過濾收集所產生之沈澱，以水&滌，眞空乾燥，產生9.8克 (收率45%) 2-甲基-6-硝苯基乙酸之灰白色固體。固體於甲醇中經10% Pd/C虱化’產生9.04克4 -甲基-2-經4丨嗓之白色固體。 !HNMR (360 MHz, DMSO-d6) ： δ 10.27(s5 br, 1H, NH-1), 7.〇6(t，J=7.71 Hz，1H，H-6)，6.74(d，J=7.73 Hz，H-5)，6.63(d， >7.73 Hz，1H，H-7)，3.36(s，2H，CH2)，2.18(s，3H，CH3)。取4-(2-羧乙基）-2-甲醯基-3-甲基吡咯（90毫克），74毫克 4-甲基-2-羥吲哚，及75微升六氫吡啶於2毫升乙醇中，於 95°C下加熱5小時。反應混合物冷卻及濃縮。殘質懸浮於6 N 鹽酸水溶液中。過濾沈澱，以水洗至pH 6，於眞空烘箱中乾燥，產生80毫克（52%)標題化合物之褐色固體。 WNMR (360 MHz，DMSO-d6) : cM3.33(s，br，1H，NH-1,)， -101 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） C請先閱讀背面之注音？事項一裝*--- jc寫本頁) 訂· •f 1229073 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（99 ) l〇.84(s, br，1H，NH-1)，7.54(s，1H，H-乙晞基），7」2(d，J=2.0 Hz，1H，H-2，)，7.01(t，J=7.75 Hz，1H，H-6)，6.79(d，J=7.75 Hz， H-5)，6.74(d，J=7.75 Hz，1H，H-7)，2.64(t，J=7/65 Hz，2H， CH2CH2COOH), 2.57(s, 3H, CH3), 2.42(t, 1=7.65 Hz, 2H, CH2CH2COOH)，2.19(s，3H，CH3); MS m/z (相對強度，％)，311 ([M+l]+，100) 〇實例9 3-[4-甲基-5-(5-甲基-2-氧-1，2-二氫亞峭哚-3 -基甲基）-1 Η-吡咯-3-基]丙酸取5 _甲基啕哚滿二酮（丨5·〇克）及6 〇毫升肼水合物於14〇至 160°C下加熱4小時。薄層層析法（乙酸乙酯：己烷，1 : 2，矽膠）顯示沒有殘留起始物。反應混合物冷卻至室溫，倒至 300毫升冰水中，以6 N鹽酸酸化至pH 2。於室溫下靜置2天後，眞空過濾收集沈澱，以水洗滌，眞空乾燥，產生6·5克 (收率47%) 5-甲基-2-羥啕哚。 !HNMR (360 MHz, DMSO-d6) ： δ 10.20(s5 br, 1H, NH-1), 6.99(s，1H，H-4)，6.94(d，J=8.11 Hz, 1H，H-6)，6.68(d, J=8.11 Hz, 1H，H-7)，3.39(s，2H，CH2-3)，及2.22(s，3H，CH3-5)。取4-(2-羧乙基）-2-甲醯基-3-甲基吡咯（90毫克），74毫克 5 -甲基-2-羥啕哚，及7 5微升六氫吡啶於2毫升乙醇中，於 95°C下加熱5小時。反應混合物冷卻及濃縮。殘質懸浮於6 N 鹽酸水溶液中。過濾沈澱，以水洗至pH 6，於眞空烘箱中乾燥，產生65毫克（4 2%)標題化合物之褐色固體。 WNMR (360 MHz，DMSO-d6) : (M3.30(s，br，1H，NH-1·)， -102- 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ----·ί---一------裝------11 訂· (請先閱讀背面之注意事寫本頁)

1229073 A7 B7 五、發明說明（1〇〇) 12.〇5(s，br，1H，COOH)，10.67(s，br，1H，NH-1)，7 57(s 2H H-乙晞基，H-4)，7.12(d，J=2.65 Hz，1H，H-2，），6.9l(d，J=7.82 Hz，1H，H-6)，6.74(d，J-7.82 Hz，1H，H-7)，2.65(t，J=6.94 Hz 2H, CH2CH2COOH), 2.46(t, J=6.94 Hz, 2H, CH2CH2COOH), 2.30(s，3H，CH3)’ 2.25(s, 3H, CH3); MS m/z (相對強度，％)， 311 ([M+l]+，100) 0 實例1 0 3-[5-(5,6-二甲基-2-氧-1，2-二氫亞4丨嗓_3-基甲基）-4_甲基- 1H-吡咯-3-基]-丙酸取4-(2-叛乙基）-2·甲醯基-3-甲基p比洛（9 〇毫克），9 7毫克 5,6- 一甲氣基-2 -木’及75微升六氯p比淀於2毫升乙醇中，於95°C下加熱5小時。反應混合物冷卻及濃縮。殘質懸浮於6 N鹽酸水溶液中。過濾沈澱，以水洗至pH 6，於眞空烘箱中乾燥，產生104毫克（5 8 %)標題化合物之褐色固體。 !HNMR (360 MHz, DMSO-d6) ： ά 13.19(s, br, 1H, NH-1'), 12.05(s，br，1H，COOH)，10.53(s，br，1H，NH-1)，7.46(s，1H)， 7.41(s，1H)，7.02(s，1H，Η·2丨)，6.45(s，1H)，3.74(s，3H，OCH3)， 3.70(s，3H，OCH3)，2.59(t，J=7.43 Hz，2H，CH2CH2COOH)， 2.44(t, J=7.43 Hz, 2H, CH2CH2COOH), 2.22(s, 3H, CH3); MS m/z 357 [M+l]+ 〇實例1 1 3-[5-(6-氣-2-氧-1，2-二氫亞啕哚-3-基甲基）-4-甲基-1H-吡咯-3-基]-丙酸取4-(2-羧乙基）-2-甲醯基-3-甲基吡咯（200毫克），167.6毫 -103- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注音？事項寫本頁) ·. 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1229073

五、發明説明（ 101 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 6 ·氣-2ϋ卜木，及166微升六氫i?比咬於2毫升乙醇中，於 95 C下加熱5小時。反應混合物冷卻及濃縮。殘質懸浮於6 Ν 鹽酸水溶液中。過濾沈澱，以水洗至ρΗ 6，於真空烘箱中乾燥，產生246毫克（74%)標題化合物之褐色固體。 lHNMR (360 MHz, DMSO-d6) ： δ 13.22(s, br, 1H? ΝΗ-Γ), 12.09(s，br，1 H，COOH)，l〇.95(s，br，1H，NH-1)，7.78(d， J-7.95 Hz，1H，H-4)，7.66(s，1H，H-乙婦基)，7.18(d，J=2.64 Hz， 1H，H-2’），7.01(dd，J=1.90, 7.95 Hz，1H，H-5)，6.86(d，J=1.90 Hz，1H，H_7)，2.65(t，J=7.14 Hz，2H，CH2CH2COOH)，2.45(t， J=7.14 Hz，2H，CH2CH2COOH)，2.26(s, 3H，CH3)。實例1 2 羧乙基）-3_甲基-1H-吡咯-2-基亞甲基]-2-氧_2,3-二氫-1H-吲哚-5-羧酸甲酯取5 -碘-2-羥啕哚（1 7克）與2克二乙酸鈀、18.2毫升三乙胺、150毫升甲醇、1 5毫升二甲亞颯及2.6克DPPP於飽和含一氧化碳之大氣中回流。2 4小時後，反應混合物過濾排除觸媒，濾液濃縮。濃縮物經矽膠使用30%乙酸乙酯之己烷溶液層析。含產物之溶離份濃縮後，靜置。有產物沈/知’真空過濾收集，產生0.8克（7%) 5-甲氧羰基-2-羥4哚之灰白色固體。 !HNMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 10.70(s, br, lH, NH-1)5 7.83(dd，J=1.77，8.29 Hz，1H，H-6)，7.77(s，br, 1H, H-4)， 6.89(d，J = 8.29 (Hz，1H，H-7)，3.80(s，3H，COOCH3-5)，3.51(s， 2H? CH2-3) 〇 ------ -UX)A-=— 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再!H本頁) •裝. 訂線彳· 1229073 A7

-------JL 五、發明說明（1〇2) 1 ϋ I Lr i i>— b— 11 mmmaf I emmt I · i— 1 (請先閱讀背面之注意事項寫本頁) 取4-(2-羧乙基）·2-甲醯基-3-甲基吡咯（90.6毫克），88.6毫克5 -甲氧羰基-2-羥吲哚，及75微升六氫吡啶於2毫升乙醇中’於95°C下加熱5小時。反應混合物冷卻及濃縮。殘質懸浮於6 N鹽酸水溶液中。過濾沈澱，以水洗至pH 6，於眞空洪箱中乾燥，產生123毫克（6 9%)標題化合物之黃色固體。 !HNMR (360 MHz, DMSO-d6) ： 3 13.27(s, br, 1H5 ΝΗ-Γ), i2.〇(s，vbr，1H，COOH)，11.16(s，br，1H，NH-1)，8.36(s，br， 1H，H-4)，7.80(s，1H，H-乙晞基），7.40(dd，J=1.80, 8·14 Hz， 1H，H-6)，7.20(d，J=2.91 Hz，1H，H-5，），6.96(d，J=8.14 Hz， 1H，H-7)，3.84(s，3H，COOCH3)，2.66(t，J=7.55 Hz，2H， CH2CH2CO〇H)，2.46(t，J=7.55 Hz，2H，CH2CH2COOH)，2.30 (s，3H，CH3); MS m/z (相對強度，· ％)，355 ([M+l]+，100)。實例1 3 3-[4-(2-羧乙基）-3_甲基_1H-吡咯-2-基亞甲基]-2-氧-2,3-二氫-1H-吲哚-5-羧酸經濟部智慧財產局員工消費合作社印製添加2 -羥吲哚（6.7克）至冰浴中含2 3克氣化鋁之3 0毫升二氣乙烷攪拌懸浮液中。緩緩添加氣乙醯氣（Π.3克），有氣化氫氣體釋出。攪拌1 〇分鐘後，反應加溫至40-50°C 1.5小時。薄層層析法（乙酸乙酯，矽膠）顯示沒有起始物殘留。混合物冷卻至室溫，倒至冰水中。眞空過濾收集沈澱，以水洗滌，眞空乾燥，產生10.3克（98%) 5-氣乙醯基-2-羥巧哚之灰白色固體。取9·3克5 -氣乙醯基-2-經Η丨嗓於9 0毫升p比淀中，於8 〇至 9 0°C下攪拌3小時後，冷卻至室溫。眞空過濾收集沈澱，以 -105- 中國國家標準(CNS)A4規格（21G X 297公釐） 1229073

五、發明說明（1〇3) --- 丨 1.1-11.1-1111- · I I (請先閱讀背面之注意事項寫本頁) 20耄升乙醇洗滌。固體溶於9〇毫升2·5 N氫氧化鈉中，於 70-8(TC下攪拌3小時。混合物冷卻至室溫，以〇·5 N鹽酸酸化至pH 2。眞2過濾收集沈澱，以水充份洗滌，產生粗產物 5-羧基-2-羥啕哚之深褐色固體。靜置一夜後，濾液產生2克 5 -羧基-2-羥吲哚之黃色固體。此深褐色粗產物溶於熱甲醇中，過濾排除不溶物，濾液濃縮，產生5.6克5-羧基-2•羥吲 p朵之褐色固體。合併收率爲97%。 1 H>iMR(360 MHZ，DMSO-d6):cM2.56(S，bi*，lH，COOH-5)，10.70(s，1H，NH-1)，7.82(dd，J=15.7, 7.79 Hz，1H，Η·6)， 7.74(s，br，1H，H-4)，6.87(d，J=7.79 Hz，1H，H-7)，及 3.53(s， 2H，CH2-3)。MS m/z (相對強度，〇/。）178 ([m+1]+，100)。取4-(2-致乙基）-2-甲醯基-3-甲基吡咯（9〇 6毫克），88.6毫克5-羧基-2·羥吲哚，及75微升六氳吡啶於2毫升乙醇中，於95°C下加熱5小時。反應混合物冷卻及濃縮。殘質懸浮於6 N鹽S父水；谷液中。過〉慮沈殿，以水洗至ρ η 6，於眞空烘箱中乾燥。粗產物經矽膠管柱層析，使用乙酸乙酯-己烷-乙酸爲溶離液純化，產生5 1毫克（30%)標題化合物之黃色固體。 lHNMR (360 MHz, DMSO-d6) ： δ 13.27(s, br, 1H, NH-1), 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 12.28(s，vbr，2H，2xCOOH)，ll.ll(s，br，1H，NH-1)，8.34(d， J=1.36 Hz，1H，H-4)，7.78(s，1H，H-乙晞基），7.40(dd，J=1.36, 8.20 Hz，1H，H-6)，7.19(d，J=3.07 Hz，1H，H-5，），6.93(d， J=8.20 Hz，1H，H-7)，2.65(t，J=7.56 Hz，2H，CH2CH2COOH)， 2.46(1, J=7.56 Hz, 2H, CH2CH2COOH)5 2.29(s, 3H, CH3); MS m/z 341.0 [M+l]+。 -106- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 χ 297公釐） 1229073 A7 B7 五、發日月說明（104) 實例14 ----»!裝，--- (請先閱讀背面之注意事項Imc寫本頁) 3-[4-甲基-5-(2-氧-5-胺磺醯基·丨，2•二氫亞吲哚·3_基甲基）_ 1Η-吡咯-3-基]-丙酸在含2 7耄升乳％故之100耄升燒瓶中緩緩添加13 3克2 _經吲咪。添加期間之反應溫度保持在3 〇以下。添加後，反應混合物於室溫下攪拌1.5小時，加熱s68°C丨小時，冷卻，倒至水中。以水洗滌沈澱，於眞空烘箱中乾燥，產生 Η·〇克5-氣績醯基-2-經啕哚（收率5〇%)，未再純化即使用。添加5 -氣橫醯基-2-#i吲嗓（2·ι克）至含1 〇毫升氫氧化銨之 1 〇毫升乙醇中，於室溫下攪拌一夜。混合物濃縮，眞空過濾收集固體，產生0.4克（收率20%) 5-胺磺醯基-2-羥吲哚之灰白色固體。 · ^NMR (360 MHz, DMSO-d6) ： ά 10.67(s, 1Η, NH-1), 7.63- 7.66(m，2H，H-4, 6)，7.13(s，2H，5-S02NH2)，6.91(d，J=8.04 •fh

Hz，1H，H-7)，及3.56(s，2H，CH2-3); MS m/z (相對強度，％) 211 ([M-l]+，100) 〇經濟部智慧財產局員工消費合作社印制农取4-(2-羧乙基）-2-曱醯基-3-甲基吡咯（90.6毫克），i〇6毫克5 -胺磺醯基-2-羥啕哚，及7 5微升六氫吡啶於2毫升乙醇中，於95°C下加熱5小時。反應混合物冷卻及濃縮。殘質懸浮於6 N鹽酸水溶液中。過濾沈澱，以水洗至pH 6，於眞空烘箱中乾燥，產生132毫克（70%)標題化合物之黃色固體。 WNMR (360 MHz，DMSO-d6) : cM3.28(s，br，1H，NH-1 丨)， 12.0(s，vbr，1H，COOH)，11.15(s，br，1H，NH-1)，8.20(d， J=1.60 Hz，1H，Η·4)，7.73(s，1H，H-乙稀基），7.59(dd，J=1.60, -107- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公釐） A7 1229073 ___B7____ 五、發明說明（1〇5) 8.17 Hz，1H，H-6)，7.22(d，J=2.85 Hz，1H，Η·2，)，7.10(s，2H， NH2)，6.98(d，J=8.17 Hz，1H，H-7)，2.67(t，J=7.41 Hz，2H， CH2CH2COOH)，2.46(t，J=7.41 Hz，2H，CH2CH2COOH)，及 2.29 (s，3H，CH3) 〇實例1 5 3-[4-甲基-5-(5-甲基胺磺醯基-2-氧-1，2-二氫亞吲哚-3-基甲基）-1Η-吡咯-3-基]-丙酸取含3.38克5-氣磺醯基-2-羥啕哚之10毫升2 Μ甲胺之四氫呋喃溶液之懸浮液於室溫下攪拌4小時，此時出現白色固體。眞空過濾收集沈澱，以5毫升水洗滌2次，於40°C下眞空乾燥一夜，產生3.0克（收率88%) 5-甲胺磺醯基-2-羥峭嗓0 ^NMR (300 MHz, DMSO-d6) ： δ 10.87(s, br, 1H, NH-1), 7.86(s，br，1H，5-S02NHCH3)，7.61(d，J=7.80 Hz，1H，H-6)， 7.32(d，J=4.67 Hz，1H，H-4)，6.97(d，J=7.80 Hz，1H，H-7)， 2.53(s，2H，CH2-3)，及2.36(s，3H，5-S02NHCH3); MS m/z (相對強度，°/〇) 226 (M+，100)。取4-(2-羧乙基）-2-甲醯基-3-甲基吡咯（90.6毫克），113毫克5 -甲胺磺醯基-2-羥峭哚，及7 5微升六氫吡啶於2毫升乙醇中，於95°C下加熱5小時。反應混合物冷卻及濃縮。殘質懸浮於6 N鹽酸水溶液中。過濾沈澱，以水洗至pH 6，於眞空烘箱中乾燥，產生163毫克（83%)標題化合物之黃色固體。 ^NMR (360 MHz, DMSO-d6) ： δ 13.30(s, br5 1H3 ΝΗ-Γ), -108- 木纸張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公爱 -a— H ϋ n l 1 ki n BmM I I I » I ^ (請先閱讀背面之注意事項寫本頁) 訂·· ••f 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1229073

五、發明說明（1〇6) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 12.0(S，Vbr，1H，COOH)，11.19(s，br，1H，NH-1)，8.18((1, J==164 Hz，1H，H-4)，7.80(s，1H，H-乙晞基），7.53(dd，J=1.64, 8·Π Hz，1H，H-6)，7.23(d，J=2.80 Hz，1H，H-2，），7.13(q， J==5.15 Hz，1H，NHCH3)，7.02(d，J=8.17 Hz，1H，H-7)，3.84(s， 3H，C〇〇H3)，2.66(t，J=7.54 Hz，2H，CH2CH2COOH)，2.47(t， J==7.54 Hz5 2H, CH2CH2COOH)5 2.41(d, 1=5.15 Hz, 3H, NCH3), 2.3〇(s，3H, CH3); MS m/z 390 [M+l]+。實例1 6 3-{3-[4-(2-羧乙基）-3-甲基-11^比咯-2-基亞甲基]-2-氧-2,3-—氫-1H-吲嗓-5-基}-丙酸以4.65克二乙石夕纪處理冰浴中含5 ·氣乙醯基_2 -經4丨嗓 (4· 18克）之30毫升三氟乙酸，於室溫下攪拌3小時。混合物倒至1 50毫升水中，眞空過濾收集沈澱，以5 〇毫升水洗滌，乾燥，產生2.53克（收率65%) 5-(2-氣乙基）-2-羥啕哚之紅褐色固體。添加氰化鉀（2.0克）至15毫升二甲亞砜中，加熱至90。(：。取5-氣乙基-2-羥吲哚（3.0克）溶於5毫升二曱亞颯中，緩緩攪拌添加，反應加熱至15〇。(： 2小時。混合物冷卻，倒至冰水中’具丄過/慮收集沈殿，以水洗條，乾燥，產生粗產物。粗產物經矽膠使用5%甲醇之氣仿溶液層析，產生丨.2 克（收率42%)標題化合物。 · 取5 -氰乙基-2-羥吲哚（4.02克）於含25毫升濃鹽酸之1 〇亳升水中回泥4小時。混合物冷卻，加水，眞空過濾、收集所得固體，以水洗絡，乾燥，產生1·9克（收率44%) 5 _經乙基 ----^---^----裝，--- (請先間讀背面之注意事項1¾寫本頁) •f」 -109- 1229073 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（107 ) 幾吲哚之黃色固體。 'HNMR (360 MHz, DMSO-d6) ： dl2.00(s，br，lH，5-CH2CH2COOH)，l〇.21(s，1H，NH-1)，7_05(s，1H，H-4)，6.99(d， J=8.68 Hz，1H，H-6)，6.69(d，J=8.68 Hz，1H，H-7)，3.40(s，2H， CH3-3)，2.74(t，J=7.44 Hz，2H，5-CH2CH2COOH)，及 2.46(t, J=7.44 Hz，2H，-CH2CH2COOH)。取4-(2-羧乙基）-2-甲醯基-3-甲基吡咯（90·6毫克），102.6毫克5-羧乙基·2·羥吲哚，及75微升六氫吡啶於2毫升乙醇中，於95°C下加熱5小時。反應混合物冷卻及濃縮。殘質懸浮於6 N鹽酸水溶液中。過濾沈澱，以水洗至pH 6，於眞空烘箱中乾燥一夜。粗固體經矽膠管柱層析，以乙酸乙酯-己烷-乙酸溶離，產生121毫克（66%)標題化合物之黃色固體。 'HNMR (360 MHz, DMSO-d6) ： ί 13.30(d, J=2.38 Hz, 1H, NH-11)，12.0 3(s，vbr，2H，2xCOOH)，10.68(s，br，1H，NH-1)， 7.63(s，1H，H-4)，7.59(s，1H，H-乙烯基），7.12(d，J=2.64 Hz， 1H，H-2’），6.96(dd，J=1.22, 7.93 Hz，1H，H-6)，6.75(d，J=7.93 Hz，Hl，H-7)，2.81(t，J=7.75 Hz，2H，CH2CH2COOH)，2.65(t， J=7.75 Hz，2H，CH2CH2COOH)，2.55(t，J=7.75 Hz，2H， CH2CH2COOH)，2.46(t，J=7.42 Hz, CH2CH2COOH)，及2.26(s， 3H，CH3) 〇實例1 7 ‘ 3-[5-(5-乙基-2-氧-1，2-二氫亞吲哚-3-基曱基）-4-甲基-1H- 吡咯-3-基]-丙酸取2-#呈吲哚（3克）懸浮於1，2-二氣乙烷中，緩緩使用3.2毫 -no- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ----^---^------裝------1|訂_ (請先閱讀背面之注意事寫本頁)

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本纸張又度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 χ 297公釐） 1229073 A7 B7 五、發明說明（1〇9) CH3); MS m/z 325 [M+l]+。實例1 8 -------ί I I I--i I (請先閱讀背面之注意事寫本頁) 3-[5-(5-甲氧基-2-氧-1，2-二氫亞吲哚-3-基甲基）-4-甲基-1H-吡咯-3-基]-丙酸取三氣乙醛水合物（9.6克）溶於200毫升含83克硫酸鈉之水中。溶液加溫至60°C，添加含11.4克羥胺鹽酸鹽之50毫升水溶液，混合物保持60°C。在另一個燒瓶中，加溫含6·4克 4-胺基苯甲醚與4.3毫升濃鹽酸之80毫升水至80°C。添加第一份溶液至第二份溶液中，混合物回流2分鐘後，緩緩冷卻至室溫，然後於冰浴中冷卻。眞空過濾收集黃褐色沈澱，以水洗滌，眞空乾燥，產生8.6克（收率85%) N-(2-羥亞胺基 •乙酿基）胺基苯甲醚。 .•f 取含5毫升水之濃硫酸（45毫升）加溫至60°C，一次添加全量8.6克N-(2-羥亞胺乙醯基）胺基苯甲醚。攪拌之混合物加熱至93°C 10分鐘後，使之冷卻至室溫。混合物倒至5〇0克冰中’以乙酸乙酯萃取3次。合併之萃液經無水硫酸鈉脱水’濃縮，產生5· 1克（收率65%) 5 -甲氧吲哚滿二g同之深紅色固體。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製取％甲氧基吲哚滿二酮（5.0克）及30毫升肼水合物加熱至回流1 5分鐘。反應混合物冷卻至室溫，添加5 〇毫升水。以各2 5亳升乙酸乙酯萃取混合物3次，合併有機層，經無水硫酸鈉脱水，濃縮，產生黃色固體。固體於乙酸乙醋中攪拌，眞空過濾排除1 · 1克不溶物，保留此物質。此物質經證明爲2-胼基羰甲基-4-胺基苯甲醚。濾液濃縮，經矽膠層 -112- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公釐） 1229073 A7 B7 五、發明說明（11〇) 析，以乙酸乙酯：己烷（1 : 1)溶離，產生0.7克5 -甲氧基-2-羥吲哚之污黃色固體。取1.1克2-肼基-羰甲基-4-胺基苯甲醚於2 0毫升1 N氫氧化鈉中回流1小時。混合物冷卻，以濃鹽酸酸化至pH 2,以各25毫升乙酸乙酯萃取3次。合併有機萃液，以鹽水洗滌，以無水硫酸鈉脱水，濃縮，產生0.8克 5 -甲氧基-2 -經4卜朵之黃色固體。合併收量爲1.5克或33 %。 ^NMR (360 MHz, DMSO-d6) ： δ 10.13(s, 1Η, NH-1), 6.84(s, 1H, H-4), 6.72(d, J=8.68 Hz, 1H, H-6), 6.69(d, J=8.68 Hz, 1H，H-7)，3.68(s，3H，OCHr5)，3.41(s，2H，CH2-3) 〇 MS m/z (相對強度，％) 163 ([M+l]+，100)。取4-(2-叛乙基）-2-甲醯基-3 -甲基说洛（90毫克），82毫克5_ 甲氧基-2-羥吲哚及2滴六氫吡啶於2毫升乙醇中加熱至95Ό 一夜。反應混合物冷卻，濃縮。殘質懸浮於6 N鹽酸水溶液中。沈澱物過濾，以水洗至pH 6，眞空乾燥一夜，產生11 〇毫克（6 7 %)標題化合物之褐色固體。 !HNMR (360 MHz, DMSO-d6) ： δ 13.38(s, br, 1H, ΝΗ-Γ), 12.03(s, vbr, 1H, COOH), 10.57(s, 1H, NH-1), 7.63(s, 1H, H-乙晞基），7.42(d, J=2.46 Hz，1H，H-4)，7.12(d，J=3.08 Hz，1H， H-2’)，6.74(d，J=8.26 Hz，1H，H-6)，6.75(dd，J=2.46，8.26 Hz， 1H，H-7)，3.77(s，3H，〇CH3)，2.65(t, J=7.40 Hz, 2H, CH2CH2COOH)，2.46(t，J=7.40 Hz，CH2CH2COOH)，2.27(s， 3H，CH3); MS m/z (相對強度，。/〇) 327 ([M+l]+，100)。實例1 9 3-[5-(5-溴-2 -氧-1，2-二氫亞嗓-3-基甲基）_2,4_二甲基- -113 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格(210x^7公爱） 1^. — ^----I!裝，— (請先閱讀背面之注意事項寫本頁) 0. -線- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印制衣 1229073 A7 B7 五、發明說明（111) 1H-吡洛-3-基]-丙酸取3-(2-羧乙基）-2,4-二甲基-5-甲醯基吡咯（97.5毫克），1〇6 毫克5 -溴-2-羥啕哚，及7 5微升六氫吡啶於3毫升乙醇中，於9 5 C下加熱5小時。反應混合物冷卻及濃縮。殘質懸浮於6 N鹽酸水溶液中。過滤沈殿，以水洗至pH 6，於眞空烘箱中乾燥一夜，產生171毫克（88%)標題化合物之澄色固體。 WNMR (360 MHz，DMS0-d6) : cM2.04(s，vbr，1H，COOH)， l〇.80(s，br，1H，NH-1)，8.0(d，J=2.06 Hz，1H，H-4)，7.67(s， 1H，H-乙晞基），7.i9(dd，J=2.06, 8.40 Hz，1H，Η·6)，6.79(d， J=8.40 Hz，1H，H-7)，2.65(t，J=7.63 Hz，2H，CH2CH2COOH)， 2.35(t，J=7.63 Hz, 2H，CH2CH2CO〇H)，2.29(s，3H，CH3)， 2.27(s，3H，CH3); MS m/z (相對強度，％) 389 ([M+l]+，loo)。 3-[5-(5-碘-2-氧-1，2-二氫亞啕哚-3-基甲基）-2,4-二甲基-1H-吡咯-3-基]-丙酸取3-(2-羧乙基）-2,4-二甲基-5-甲醯基吡咯（97.5毫克），130 毫克5 -碘-2-羥啕哚，及7 5微升六氫吡啶於3毫升乙醇中，於9 5 °C下加熱5小時。反應混合物冷卻及濃縮。殘質懸浮於 6 N鹽酸水溶液中。過濾沈澱，以水洗至pH 6，於眞空烘箱中乾燥一夜，產生155毫克（71%)標題化合物之橙色固體。 !HNMR (360 MHz, DMSO-d6) · ^ 13.41(s, br, 1H? NH-1'), 12.03(s，br，1H，COOH)，10.79(s，br，1H，NH-1)，8.12(d， J=1.7〇 Hz，1H，H-4)，7.65(s，1H，H-乙烯基），7.36(dd，J=1.70, 7·93 Hz，1H，H-6)，6.79(d，J=7.93 Hz，1H，H-7)，2.64(t， J=7.76 Hz，2H，CH2CH2COOH)，2.34(t，J=7.76 Hz，2H， -114- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公釐） -·1 «I n ai_— —^i ϋ n hB n t— I I I I (請先閱讀背面之注意事項HI寫本頁) 訂- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1229073 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明說明（112) CH2CH2COOH), 2.29(s, 3H, CH3), 2.27(s, 3H5 CH3); MS m/z (相對強度，％) 437 ([M+l]+，100)。實例2 0 3-[5-(5 -破-2 -氧-1，2 -二氫亞嗓-3_基甲基）_2,4_二甲基_ 1H«吡咯-3-基]-丙酸取3-(2-複乙基）-2,4-二甲基-5-甲醯基p比p各（97.5毫克），130 耄克5 -破-2-幾啕嗓，及7 5微升六氫p比淀於3毫升乙醇中，於9 5 °C下加熱5小時。反應混合物冷卻及濃縮。殘質懸浮於 6 N鹽酸水溶液中。過濾沈澱，以水洗至pH 6，於眞空烘箱中乾燥一夜，產生155毫克（71%)標題化合物之橙色固體。 !HNMR (360 MHz, DMSO-d6) ci 13.41(s, br,lH, ΝΗ-Γ), 12.03(8, br, 1H, COOH), 10.79(s, br, 1H, NH-1), 8.12(d, J=1.70 Hz, 1H，H-4)，7.65(s，1H，H-乙烯基），7.36(dd，Jy.M， 7.93 Hz，1H，H-6)，6.79(d，J=7.93 Hz，1H，H-7)，2.64(t， J=7.76 Hz, 2H， CH2CH2CO〇H)， 2.34(t， 1=7.76 Hz, 2H， CH2CH2COOH)，2.29(s，3H，CH3)，2.27(s，3H，CH3)。 MS m/z (相對強度，437 ([m+1]+，100)。實例2 1 3-[2,4-二甲基-5-(4-甲基-2-氧-1，2-二氫亞峭哚-3-基甲基）· 1H-吡洛-3-基卜丙酸取3-(2-羧乙基）-2,4-二甲基-5-甲醯基吡咯（97.5毫克），74 毫克4 -甲基-2-羥吲哚，及7 5微升六氫吡啶於3毫升乙醇中，於9 5 °C下加熱5小時。反應混合物冷卻及濃縮。殘質懸浮於6 N鹽酸水溶液中。過濾沈澱，以水洗至pH 6，於眞空 -115- 本紙張尺度適用中國國豕標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） • n ϋ ϋ ϋ L··· I— i Lr n ϋ I n I I (請先閱讀背面之注意事項HI寫本頁) ^=0 · •線. 1229073 A7 B7 五、發明說明（113) 烘箱中乾燥一夜，產生60毫克（3 7%)標題化合物之綠色固體。 iHNMR (360 MHz，DMSO-d6) : Θ 13.41(s，br，1H，NH-1，)， 12.03(s，br，1H，COOH)，10.72(s，br，1H，NH-1)，7.50(s，1H， H·乙烯基），7.〇i(t，j=7.82 Hz，1H，H-6)，6.79(d，J=7.82 Hz，H· 5)，6.74(d，J=7.82 Hz，1H，H-7)，2.64(t，J=7.76 Hz，2H， CH2CH2COOH)，2.56(s，3H，CH3)，2.34(t，J=7.76 Hz，2H， CH2CH2COOH)，2.29(s，3H，CH3)，2.18(s，3H，CH3); MS m/z (相對強度，％) 325 ([M+l]+，1000)。實例2 2 3-[2,4-二甲基-5-(5-甲基-2-氧-1，2-二氫亞吲哚-3-基甲基）-1H-吡咯-3-基]-丙酸 ’ 取3-(2-羧乙基）-2,4-二甲基-5-甲醯基吡咯（97·5毫克），74 毫克5 -甲基-2-羥啕哚，及75微升六氫吡啶於3毫升乙醇中’於9 5 C下加熱5小時。反應混合物冷卻及濃縮。殘質懸浮於6 Ν鹽酸水溶液中。過濾沈澱，以水洗至ρΗ 6，於眞空烘箱中乾燥一夜，產生104毫克（64%)標題化合物之黃色固體。 iHNMR (360 MHz，DMSO-d6) : (M3.38(s，br，1H，NH-1') 12.〇2(s，br，1H，COOH)，10.57(s, br，1H，NH-1)，7.52(s，br， 1H，H-4)，7.50(S，1H，H-乙烯基），6.87(d，J=7.86 Hz，1H，H-6) 6.73(d，J=7.86 Hz，1H，H-7)，2.63(t，】=7·49 Hz，2H，CH2CH2COOH)’， 2.34(t，J=7.49 Hz，2H，CH2CH2COOH)，2.29(s，3H，Ch3)，2 28(s’ 3H，CH3)，及 2.24(s，3H，Ch3); MS m/z (相對強度3，’％) 325’ ([M+l]+，66)。又，〇 -116- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項寫本頁) 裝，- •fh 經濟部智慧財產局員工消費合作社印制衣 1229073 A7 B7 五、發明說明（114) 實例2 3 3·[5·(6·羥基-2-氧-1，2-二氫亞啕哚-3-基甲基）·2,4-二甲A 1H-吡咯-3-基]-丙酸取含3 ·26克6 -甲氧基-2-羥嘀哚之6 0毫升二氣甲故冷卻至 •2°C，滴加40毫升1Μ三溴化硼之二氣甲烷溶液。反應混人物於冰浴中攪拌1小時後，於室溫下1小時。倒至冰水中，以乙酸乙酯萃取。以水及鹽水洗滌有機層，經無水硫酸鋼脱水，濃縮，過濾所形成之沈澱，於眞空烘箱中乾燥_ 夜，產生2.56克6-羥基-2-羥啕哚（收率86%)。 'HNMR (360 MHz，DMSO-d6) ·· cM0.13(s，1H，NH-1)，9 22 (s，1H，OH-6)，6.93(d，J=7.76 Hz，1H，H-4)，6.27-6.31(m，2H， H-5,7)，及 3.29(s，2H，CH2-3); MS m/z 150 [M+l]+。取3-(2-羧乙基）-2,4-二甲基-5-甲醯基吡咯（82毫克），63毫克6-羥基-2-羥峭哚及48微升六氫吡啶於2毫升乙醇中，於 9 0 °C加熱二天。反應混合物冷卻，濃縮，經碎膠管柱層析法使用乙酸乙酯·己烷-乙酸溶離純化，產生5 5毫克（4 〇 %)標題化合物之深褐色固體。 WNMR (360 MHz, DMSO-d6) : cM3.10(s，br，1H，NH-1，)， 12.0(s，vbr，1H，COOH)，10.51(s，br，1H，NH-1)，9.41(s，1H， OH)，7.44(d，J=7.83, 1H，H-4)，7.29(s，1H，H-乙烯基），6.37 (dd，J=2.16, 7.83 Hz，1H，H-5)，6.33(d，J=2.16 Hz，1H，H-7)， 2.62(t，J=7.75 Hz，2H，CH2CH2COOH)，2.32(t，J=7.75 Hz, 2H， CH2CH2COOH), 2.25(s, 3H, CH3), 2.20(s, 3H, CH3)； MS m/z 325 [M+l]+。 -117- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -----*l·--^----裝，--- (請先閱讀背面之注意事項HI寫本頁) I 訂· 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製

1229073 五、發明說明（115) 實例24 3-[5-(6-甲氧基-2-氧_1，2-二氫亞嘀哚-3-基甲基）_2,4-二甲基-1H_吡咯-3-基]-丙酸取3-(2-羧乙基）-2,4·二甲基-5-甲基吡咯（97.5毫克），82毫克甲氧基-2-經啕味及2滴六氫吡淀於2毫升乙醇中於95。匸加熱一夜。反應混合物冷卻，濃縮。殘質懸浮於2 N鹽酸水液中。沈澱物過漉’以水洗至pH 6，於眞空烘箱中乾燥 —夜，產生130毫克（76 %)標題化合物之黃色固體。 WNMR (360 MHz，DMSO-d6) : (M3.15(s，br，1H，NH-1 丨） n.75(s，vbr，1H，COOH)，10.65(s，br，1H，NH-1)，7.58(d J=8.27 Hz，1H，H-4)，7.29(s，1H，H-乙晞基），6.37(dd，J=2.26, 8.27 Hz，1H，H-5)，6.33(d，J=2..26 Hz，1H，H-7)，3.74(s，3H 〇CH3)，2.62(t，J=7.67 Hz，2H，CH2CH2COOH)，2.33(t，J=7.67 Hz，2H，CH2CH2COOH)，2.26(s，3H，CH3)，及 2.22(s，3H， CH3); MS m/z (相對強度，％) 341 ([M+l]+，100)。實例2 5 3·[5·(6-羥基-2-氧-1，2-二氫亞啕哚-3-基甲基）-4-甲基-iH-口比咯-3-基]-丙酸取4-(2-羧乙基）-2-甲醯基-3-甲基吡咯（543毫克），450毫克 6-羥基-2-羥啕哚及450微升六氫吡啶於10毫升乙醇中於9〇°C 力口熱一夜。反應混合物冷卻，濃縮‘。殘質懸浮於2 N鹽酸水溶液中。沈澱物過濾，以水洗至pH 6，於眞空烘箱中乾燥一夜，產生褐色固體。 WNMR (360 MHz，DMSO-d6) : cM3.05(s，br，1H，NH-1 丨)， -118- 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ------1-----------裝--- (請先閱讀背面之注意事項寫本頁} 二^1· -·線· 經濟部智慧財產局員工消費合作社印制π 1229073 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明說明（116) 10.60(s，br，1H，NH-1)，9.4(s，1H，OH)，7.49(d，J=8.08，1H H-4)，7.35(s，1H，H-乙烯基），7.02(d，J=3.22 Hz，1H，Η·2，） 6.38(dd，J=2.28，8.08 Hz，1H，H-5)，6.32(d，J=2.28 Hz，ih H-7)，2.62(t，J=7.67 Hz, 2H，CH2CH2COOH)，2.44(t，J=7.67 Hz，2H，CH2CH2COOH)，及 2.21(s，3H，CH3); MS m/z (相對強度，％) 313 ([M+l]+，60) 〇實例2 6 3-[5-(6-羥基-2-氧-1，2-二氫亞啕哚-3-基甲基）-4-甲基-1H-吡咯-3-基]-丙酸3,5-二甲氧苄酯取3-[5-(6-羥基-2-氧-1，2-二氫亞吲哚-3-基甲基）-4-甲基-1H-吡咯-3-基]-丙酸（100毫克）、56毫克3,5-二甲氧芊基氣及 207毫克碳酸鉀於2毫升無水二¥基甲醯胺中，於90°C下加熱一夜。反應混合物冷卻，倒至水中，以乙酸乙酉旨萃取。有機層以水及鹽水洗滌，經無水硫酸鈉脱水，濃縮。粗產物經矽膠管柱層析法，使用乙酸乙酯-己烷-乙酸溶離純化，產生3 9毫克標題化合物之褐色固體。 WNMR (360 MHz，DMSO-d6) : C? 13.06(s，br，1H，NH_1’)， 10.60(s, br, 1H, NH-1), 9.4(s, br, 1H, OH), 7.49(d, J=8.03, 1H，H-4), 7.35(s, 1H，H-乙烯基），7.01(d，J=3.08 Hz, 1H，H-2’）， 6.47(d，J=2.29 Hz，2H，芳香系），6.42(t，J=2.29 Hz，1H，芳香系），6.38(dd，J=2」5, 8.03 Hz，1H，H-5)，6.33(d，J=2.15 Hz， lH，H-7)，5.01(s，2H，CH2-Ph)，3.70(s，6H，2x〇CH3)，2.59- 2.72(m，4H，CH2CH2COOH)，及 2.20(s，3H，CH3) 0 實例2 7 -119- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項寫本頁) »!裝，· 訂：

1229073 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（117) 3-{5-[6-(3-甲氧苯基氧」，2·二氫亞旧哚_3'基甲基]· 2,4-二甲基-1Η-吡咯-3-基}-丙酸添加肆（三苯基膦）鈀（〇7克）至含5克3-甲氧苯基二羥硼酸’ 3.8克5-邊-2-氟-硝基苯及η毫升2Μ碳酸鈉溶液之1〇〇愛升甲私混合物中。混合物回流2小時，以水稀釋，以乙酸乙g旨萃取。依序以飽和碳酸氫鈉及鹽水洗滌乙酸乙酯層，脱水及濃縮’產生油性固體。固體經矽膠層析（乙酸乙酯：己坑（1 : 6))，產生4·3克（收率77〇/〇) 4-氟-3，_甲氧基冬硝基聯苯。滴加丙二酸二甲酯（9.7毫升）至含2.0克氫化鈉懸浮之50毫升二甲亞砜中。混合物加熱至l〇〇°c 3 5分鐘，冷卻至室溫。添加4_氟_2’-甲氧基_3_硝墓聯苯（4·2克）之5〇毫升二甲亞颯溶液’混合物加熱至i 00°C下加熱1小時。反應混合物冷卻’以300毫升飽和氣化銨溶液中止反應，以乙酸乙酯萃取2次。合併萃液，以鹽水洗滌，經無水硫酸鈉脱水，濃縮’產生3*-甲氧基-3-硝基聯苯基-4-丙二酸二甲酯之淺黃色固體。取3-甲氧基-3-硝基聯苯基-4-丙二酸S旨粗產物於45毫升6 N 鹽酸中’於110 °C下加熱4天，然後冷卻。過濾收集沈殿物，以水及己烷洗滌，乾燥，產生5.3克3，_甲氧基硝基聯苯基-4-乙酸之淺黃褐色固體。取3* -甲氧基-3-硝基聯苯基-4-乙酸（5.2克）溶於甲醇中，經0.8克10% Pd/C，於室溫下氫化3小時。過濾排除觸媒，以甲醇洗滌，合併濾液，濃縮，產生褐色固體。固體經石夕 -120- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ----------裝—— (請先閱讀背面之注意事寫本頁〕訂· --線. 1229073 A7 B7 五、發明說明（118) 膠使用乙酸乙酯：己烷：乙酸（33 ·· 66 ·· 1)層析，產生3 〇克 (收率75%，以4-氣-3^甲氧基-3-硝基聯苯爲基準計）6-(3_甲氧苯基）-2-羥啕哚之粉紅色固體。 !HNMR (360 MHz，DMS0-d6) : β 10.39(s，br，1H，NH) 7.35(t, J=7.85 Hz, 1H), 7.26(d, J=7.78 Hz, 1H)5 7.19(dd J=1.22, 7.8 Hz，1H)，7.13-7.16(m，1H)，7·09-7·1(τη，1H)，7·〇ι (d，J=1.48 Hz, 1H)，6.90-6.93(m，1H)，3.8(s，3H，OCH3)，3.49 (s，2H，CH2); MS m/z(相對強度，％) 240.0 ([M+l]+，100)。取3-(2-羧乙基）-2,4-二甲基-5-甲基吡咯（117毫克），i2〇毫克6-(3 -甲氧苯基）-2-羥吲哚及3滴六氫吡啶於3毫升乙醇中於90°C加熱一夜。反應混合物冷卻，濃縮。殘質懸浮於6 N 鹽酸水溶液中。沈澱物過遽，以水洗至pH 6，於眞空烘箱中乾燥一夜，產生190毫克（91%)標題化合物之褐色固體。 WNMR (360 MHz，DMSO-d6) : cM3.38(s，br，1H，NH-1，)， 12.04(s，br，1H，COOH)，10.79(s，br，1H，NH-1)，7.77(d， J=8.05，1H，H-4)，7.58(s，1H，H-乙烯基），7.27(dd，J=1.49, 8.05 Hz, 1H, H-5), 7.09(d, J=1.49 Hz, 1H, H-7), 6.89-7.59(m, 4H)，3.81(s，3H，OCH3)，2.65(t，J=7.62 Hz，2H，CH2CH2COOH)， 2.35(t，J=7.62 Hz，2H，CH2CH2COOH)，2.30(s，3H，CH3)，及 2.27(s，3H，CH3); MS m/z (相對強度，％)，417 ([M+l]+，75)。實例2 8 3·[5-(6-溴-2-氧-1，2-二氫亞啕哚-3-基甲基）-4-甲基-1H-吡咯-3-基丙酸滴加丙二酸二甲酯（1 3毫升）至含2.7克氫化鈉懸浮之20毫 -121 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1 ϋ n Mmmf 4— n i_i ^1· n ϋ I 1 I · in ϋ (請先閱讀背面之注意事寫本頁) ιτ I · · •線- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1229073 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明說明（119) 升二甲亞砜中。混合物加熱至100X： 10分鐘後，冷卻至室溫。添加5-溴-2-氟硝基苯（5.0克）之25毫升二甲亞颯溶液，混合物於100°C下加熱2小時。反應混合物冷卻，以300毫升飽和氣化銨溶液中止反應，以乙酸乙酯萃取3次。合併萃液，以飽和氣化銨、水及鹽水洗滌，以無水硫酸鈉脱水，濃縮，產生4 -溴-2-硝苯基丙二酸二甲酯粗產物之淺黃色油。取4-溴-2-硝苯基丙二酸二甲酯粗產物於u〇°C下，於40毫升6N鹽酸中加熱24小時，冷卻。過濾收集沈澱，以水洗滌，脱水，產生5.3克（收率89%) 4 -溴-2-硝基-苯乙酸灰白色固體。取4 -溴-2-硝苯基乙酸（〇·26克）、0.26克鋅粉及3毫升50% 硫酸於5毫升乙醇中，於1 〇〇°C >加熱一夜。反應混合物過濾，以少量乙酸稀釋，濃縮排除乙醇，以水稀釋，以乙酸乙酯萃取2次。合併之萃液以鹽水洗條，以無水硫酸鈉脱水，濃縮，產生0.19克（收率90%) 6-溴-2-羥吲哚之黃色固體。 !HNMR (360 MHz, DMSO-d6) ： ά 10.45(s, br, 1H, NH-1), 7.14(d，J=7.89 Hz，1H，H-4)，7.09(dd，J=1.53，7·89 Hz，1H， H-5)，6.93(d，J=1.53 Hz，1H，H-7)，及 3.43(s，2H，CH2-3); MS m/z (相對強度，％) 210 ([M-2]+，100)及 212 (M+，100)。取4-(2-羧乙基）-2-甲醯基-3-甲基吡咯（90亳克），106毫克 6 -溴_2_羥啕哚及3滴六氫吡啶於3毫升乙醇中於9〇。〇加熱4 小時。反應混合物冷卻，濃縮。殘質懸浮於6 N鹽酸水溶液中。沈澱物過濾，以水洗至pH 6，於眞空烘箱中乾燥一 •122· 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事寫本- 裝頁) 訂· •線丨ί. 1229073 Α7 Β7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明說明（12〇) 夜’產生172毫克（92%)標題化合物之黃色固體。 WNMR (360 MHz，DMS0-d6) : cM3.22(s，br，1H，NH-1，)， ^.04(8, br, 1H, COOH), 10.92(s, br, 1H, NH-1), 7.73(d, >8.37, 1H，H-4)，7.67(s，1H，H-乙晞基），7_18(d，J=3.22 Hz，汨，H-2丨)，7.14(dd，J=1.33, 8·37 Hz，1H，H-5)，6.99(d，J=1.33 Hz，1H，H-7)，2.64(t，J=7.39 Hz，2H，CH2CH2COOH)，2.46(t， J=7.39 Hz, 2H, CH2CH2COOH), 2.25(s, 3H, CH3); MS (APCI) m/z 375.0 [M+l]+。實例2 9 3-{5-[6-(3 -甲氧苯基）-2-氧-1，2-二氫亞啕哚-3-基甲基]-4-甲基-1H-吡哈-3-基卜丙酸取4-(2-羧乙基）-2-甲醯基-3-申基吡咯（90.5毫克），120毫克6 - (3 -甲氧苯基）-2-羥啕哚及3滴六氫吡啶於3毫升乙醇中於90°C加熱一夜。反應混合物冷卻，濃縮。殘質懸浮於6 N 鹽酸水溶液中。沈澱物過濾，以水洗至pH 6，於眞空烘箱中乾燥一夜，產生195毫克（97%)標題化合物之褐色固體。 !HNMR (360 MHz, DMSO-d6) : ^ 13.29(s, br5 1H, ΝΗ-Γ), 12.07(s，br，1H，COOH)，l〇.88(s，br，1H，NH-1)，7.82(d， J=7.77，1H，H-4)，7.65(s，1H，H-乙烯基），7.27(dd，J=1.41， 7.77 Hz，1H，H-5)，7.09(d，J=1.41 Hz，1H，H-7)，6·89-7·36(ιη， 5H)，3.82(s，3H，OCH3)，2.65(t，J=7.55 Hz，2H，CH2CH2COOH)， 2.47(t，J=7.55 Hz，2H，CH2CH2COOH)，2.27(s，3H，CH3); MS (APCI) m/z 401 [M-l]+。實例3 0 (請先閱讀背面之注意事項 1 裝，i I I寫本頁) r丨訂· -線· -123- 1本纸張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 公爱） 1229073 A7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 B7 五、發明說明（121) 3-{5-[6-(3-乙氧苯基）-2-氧-1，2-二氫亞峭哚-3-基甲基]-4-甲基-1Η-吡咯-3-基}•丙酸添加肆（三苯基膦）鈀（0.8克）至含4.2克3 -乙氧苯基二羥硼酸，5.0克5-溴_2-氟-硝基苯及22毫升2Μ碳酸鈉溶液之50毫升甲苯與50毫升乙醇混合物中。混合物回流2小時後濃縮，加水，以乙酸乙酯萃取混合物2次。以水及鹽水洗滌合併之乙酸乙酯層，脱水及濃縮，殘質經矽膠使用5 %乙酸乙酯之己坑溶液層析，產生5 ·3克（收率9〇%) 4-氟-3，-乙氧基-3-硝基聯苯之黃色油。滴加丙二酸二甲酯（丨丨·4毫升）至含4 ·〇克氫化鈉懸浮之2 〇愛升一甲亞職中。混合物加熱至1 〇〇°C 1 〇分鐘，冷卻至室溫。添加4-氟-3，-乙氧基-3-硝盖聯苯（5.3克）之25毫升二甲亞戚溶液，混合物加熱至丨00°C下加熱2小時。反應混合物冷卻’以300毫升飽和氣化銨溶液中止反應，以乙酸乙酯萃取3次。合併萃液，以水及鹽水洗滌，經無水硫酸鈉脱水，濃縮，產生3’-乙氧基-3-硝基聯苯基-4-丙二酸二甲酯之黃色油0 取弘乙氧基-3-硝基聯苯基-4-丙二酸二甲酯粗產物於6〇毫升6 N鹽酸中，於1 〇〇。〇下加熱4天，然後冷卻。過濾收集沈澱物，以水及己烷洗滌，乾燥，產生4 ·7克（收率77%，以5 _ 溴-2-氟硝基苯爲基準計）3，_乙氧基硝基聯苯基_心乙酸之淺黃褐色固體。一次添加全量鐵屑（2.4克）至含4·6克3，_乙氧基-3-硝基聯苯基-4-乙酸之40毫升冰醋酸溶液中，混合物回流2小時。 (請先閱讀背面之注意事項寫本頁) 裝'· 訂· ’•f -124- 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公爱） 1229073 A7 B7 五、發明說明（122) 反應混合物濃縮至乾，以乙酸乙酯重覆處理，過濾排除不 ;谷物。/慮液以1 N鹽酸洗條2次，然後以鹽水洗條，經無水硫酸鈉脱水’及濃縮。產生3.5克（收率91%) 6-(3 -乙氧苯基）-2-經啕嗓之淺褐色固體。 lHNMR (360 MHz, DMSO-d6) · S 10.4(s, br, 1H, NH), 7.33 (t，J=8.4 Hz，1H，H-3f)，7.35(d，J=7.77 Hz，1H)，7.19(dd， J=1.3, 7.66 Hz，1H)，7.13(d，J=7.69 Hz，1H)，7.07-7.08(m， 1H)，7.0(s，br，1H)，6.9(dd，J=2.82, 8.08 Hz，1H)，4.08(q，J=7 Hz，2H，OEt)，3.49(s，2H，CH2)，1.34(t，J=7 Hz，3H，OEt); MS m/z (相對強度，。/〇) 254.2 ([M+l]+，100)。取3-(2-羧乙基）-2,4-二甲基-5-甲醯基吡咯（97.6毫克），127 毫克6-(3 -乙氧苯基）-2-羥峭哚、及2滴六氫吡啶於2毫升乙醇中，於90°C下加熱一夜。反應混合物冷卻及濃縮。殘質懸浮於6 N鹽酸水溶液中。過濾沈澱，以水洗至pH 6，於眞空烘箱中乾燥一夜，產生227毫克（約100%)標題化合物之褐色固體。 WNMR (360 MHz，DMS0-d6) : “3.38(s，br，1H，NH-1 丨)， 12.06(s，br，1H，COOH)，10.81(s，br，1H，NH-1)，7.77(d， J=7.97，1H，H-4)，7.58(s，1H，H-乙烯基），7.26(dd，J=1.35, 7.97 Hz，1H，H-5)，7.08(d，J=1.35 Hz，1H，H-7)，6.87-7.36(m， 4H)，4.09(q，J=7.0 Hz，2H，CH3CH2)，2.65(t，J=7.54 Hz，2H， CH2CH2COOH), 2.47(t, J=7.54 Hz, 2H, CH2CH2COOH), 2.30 (s, 3H，CH3)，2.26(s，3H，CH3)，1.34(t，J=7.0 Hz，3H， CH3CH2); MS m/z (相對強度，％) 431 ([M+l]+，21) 〇 -125- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ----------------裝·--- (請先閱讀背面之注意事項寫本頁) )aj.· -丨線丨1 · 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1229073 Α7 Β7 五、發明說明（123) 實例3 1 • ΜΜ ΜΗ· ΙΜ» Μ·· I I I 讎 · n 1 (請先閱讀背面之注意事項寫本頁) 3-{5-[6-(3-乙氧苯基）-2-氧-1,2-二氫亞吲哚-3-基甲基]-4一甲基-1H-吡咯-3-基卜丙酸取4-(2-羧乙基）-2-甲醯基-3-甲基吡咯（90·5毫克），127毫克6-(3 -乙氧苯基）-2-羥⑷哚及2滴六氫吡啶於2毫升乙醇中於90°C加熱一夜。反應混合物冷卻，濃縮。殘質懸浮於6 N 鹽酸水溶液中。沈澱物過滤，以水洗至pH 6，於眞空烘箱中乾燥一夜，產生200毫克（96%)標題化合物之褐色固體。 iHNMR (360 MHz，DMSO-d6) ·· cM3.29(s，br，1H，NH-1 丨)， 12.07(s，vbr，1H，COOH)，10.88(s，br，1H，NH-1)，7.82(d， J=7.97，1H，H-4)，7.65(s，1H，H-乙烯基），7.28(dd，J=1.20, 7.97 Hz, 1H, H-5), 7.08(d, 1=1.20 Hz, 1H, H-7), 6.87-7.36(m, 5H)，4.09(q，JN6.98 Hz，2H，CH3CH2)，2.65(t，J=7.47 Hz，2H， CH2CH2COOH)，2.47(t，J=7.47 Hz，2H，CH2CH2COOH)，2.27 (s，3H，CH3)，1.34(t，J=6.98 Hz，3H，CH3CH2)。 .線. 實例3 2 3-[2,4-二甲基-5-(2-氧-6-苯基-1，2-二氫亞吲哚-3-基甲基）-1Η - p比鳴^ - 3 -基]-丙紅經濟部智慧財產局員工消費合作社印製添加肆（三苯基膦）飽（〇·8克）至含3· 1克苯二經侧酸，5克 5 -溴-2-氟-硝基苯及22毫升2Μ碳酸鈉溶液之50毫升甲苯與 5 0毫升乙醇混合物中。混合物回流2小時，濃縮，以乙酸乙酯萃取2次。以水及鹽水洗滌乙酸乙酯層，脱水及濃縮，產生黃色油。此油經矽膠使用5 %乙酸乙酯之己烷溶液層析，產生4.75克（收率9 6%) 4-氟-3-硝基聯苯之黃色油。 -126- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1229073 A7 B7 五、發明說明（124) 滴加含丙二酸二甲酯（10毫升）之25毫升二甲基甲醯胺至含 3.5克氫化鈉懸浮之25毫升二甲亞砜中。混合物於1〇〇。(：加熱1 0分鐘。冷卻至室溫。添加4-氟-3-硝基聯苯（4.7克）之 2 5毫升二甲亞观溶液。混合物於1 〇〇 °C下加熱2小時，冷卻，以300毫升飽和氣化銨溶液中止反應，以乙酸乙酯萃取混合物3次。合併有機萃液，以水及鹽水洗滌，蒸發，產生黃色油，3 -硝基聯苯基-4-丙二酸二甲酯粗產物。取3 -硝基聯苯基-4-丙二酸二甲酯粗產物於3 〇毫升6 N鹽酸中回流2 4小時。過濾收集沈澱，以水洗務，乾燥，產生 4.5克（佔4 -氟-3-硝基聯苯之80%) 3 -硝基聯苯-4-乙酸之乳色固體。一次添加全量鐵屑（2.6克）至备4 .5克3 -硝基聯苯基-4-乙酸之4 0毫升乙酸中。混合物回流2小時，濃縮至乾，溶於乙酸乙酯中。過濾排除固體，以1 N鹽酸及鹽水洗滌液2次，經無水硫酸鈉脱水。濾液濃縮，產生3.4克（收率93%) 6-苯基-2-羥峭哚之淺褐色固體。 ^NMR (360 MHz, DMSO-d6) ： δ 10.4(s, br, 1H, NH-1), 7.57-7.6(m，2H)，7.42-7.46(m，2H)，7.32-7.37(m，1H)，7.27(d， J=7.7，1H，H-4)，7.19(dd，J=1.6, 7·7 Hz，1H，H-5)，7.01(d， J=1.6 Hz，1H，H-7)，3.49(s，2H，CH2); MS m/z (相對強度，〇/〇) 210 ([M+l]+，100)。取3-(2-羧乙基）-2,4-二甲基-5-甲醯基吡咯（97.6毫克），l〇5 毫克6-苯基-2-羥啕哚及2滴六氫吡啶於2毫升乙醇中於9〇°C 加熱一夜。反應混合物冷卻，濃縮。殘質懸浮於6 N鹽酸水 -127- 本紙張尺度適用中國國家標準（C1SS)A4規格（210 x 297公釐） ill — ^ΓΙΙί--— II · 11 (請先閱讀背面之注意事項 11^寫本頁) 訂. 線丨，經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1229073 A7 B7 五、發明說明（125) 溶液中。沈澱物過濾，以水洗至pH 6，於眞空烘箱中乾燥一夜，產生138毫克（71%)標題化合物之褐色固體。 I ϋ ϋ ϋ mmr n n #1 n ϋ ϋ I · 1 n (請先閱讀背面之注意事項寫本頁) WNMR (360 MHz，DMS0-d6) : d I3.38(s，br，1H，NH-1 丨)， 12.05(s，br，1H，COOH)，10.81(s，br，1H，NH-1)，7.78(d， J=7.84，1H，H-4)，7.58(s，1H，H-乙烯基），7·25-7·63(ηι，6H)， 7.09(s，br，1H，H-7)，2.64(t，J=7.71 Hz，2H，CH2CH2CO〇H)， 2.35(t，J=7.71 Hz, 2H，CH2CH2COOH)，2.30(s，3H，CH3)，及 2.26(s，3H，CH3); MS m/z (相對強度，％) 387 ([M+l]+，100)。實例3 3 3-[4-甲基- 5- (2-¾ -6 -冬基-1，2-二氯亞 -3-基甲基）-ΐΗ· p比呜^ - 3 _基]-丙酉父線丨ί 取4-(2-羧乙基）-2-甲醯基-3-申基吡咯（90.5毫克），1〇5毫克6 -苯基-2-經Η丨味及2滴六氫ρ比淀於2毫升乙醇中於9〇°C加熱一夜。反應混合物冷卻，濃縮。殘質懸浮於6 N鹽酸水溶液中。沈澱物過濾，以水洗至pH 6，於眞空烘箱中乾燥一夜，產生146毫克（78%)標題化合物之褐色固體。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 WNMR (360 MHz，DMSO-d6) ·· cM3.29(s, br，1H，NH-1 丨)， 12.01(s，vbr，1H，COOH)，10.89(s，br，1H，NH-1)，7.83(d， J=7.92, 1H，H-4)，7.65(s，1H，H-乙晞基），7.30-7.65(m，5H)， 7.16(d，J=2.83 Hz，1H，Η·2’)，7.28(dd，J=1.58，7·92 Hz，1H， H-5)，7.09(d，J=1.58 Hz，1H，H-7)，. 2.66(t，J=7.76 Hz，2H， CH2CH2COOH)，2.45(t，J=7.76 Hz，2H，CH2CH2C〇〇H),及 2.27(s, 3H，CH3); MS m/z (相對強度，％) 373 ([m+1]+，loo)。實例3 4 -128- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1229073 A7 _ B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印制农五、發明說明（126) 3 {5 [6 (4-甲氧基本基）-2-氧-1，2·二氫亞啕嗓基甲基]· 4 -甲基- lH-p比洛-3-基卜丙酸添加肆（三苯基膦）鈀（丨克）至含5克[甲氧苯基二羥蝴酸，6.6克5-溴-2-氟硝基苯與30毫升2M碳酸鈉溶液之5〇毫升甲苯與50毫升乙醇混合物中。混合物回流2小時，濃縮，以乙酸乙酯萃取殘質2次。以水及鹽水洗滌乙酸乙酯層，脱水，濃縮，產生褐色油性固體。此固體經矽膠使用5 %乙酸乙酯之己烷溶液層析，產生粗產物：4-氟-4、甲氧基硝基聯苯之淺黃色固體。滴加丙二酸二甲酯（丨〇毫升）至含2 · 〇克氫化鈉懸浮之6〇毫升二甲亞砜中。混合物於1 OfC下加熱1 〇分鐘。冷卻至室溫。添加4 -氟-4’-甲氧基-3-硝;^聯苯粗產物（5 .2克）之5 0毫升二甲亞砜溶液，混合物於丨00°C下加熱2小時。反應混合物冷卻’以300耄升飽和氣化鈉溶液中止反應，以乙酸乙酯萃取3次。合併萃液，以飽和氣化銨，水及鹽水洗務，以無水硫酸鈉脱水，濃縮，產生粗產物4，_甲氧基_3_硝基聯苯_‘ 丙二酸二甲酯之黃色油。取4、甲氧基-3-硝基聯苯-4-丙二酸二甲酯粗產物於l〇〇°C 下’於6 0爱升6 N鹽酸中加熱1 5小時，冷卻。過;慮收集沈澱，以水及己烷洗滌，乾燥，產生72克4，-甲氧基-3-硝基聯苯基-4-乙酸之淺黃褐色固體。一次添加全量鐵屑（3.6克）至含7.2克4’ -甲氧基-3-硝基聯苯基-4-乙酸之5 〇毫升冰醋酸溶液，於1〇〇°C下加熱一夜。反應混合物濃縮至乾，於乙酸乙酯中經音波處理，過濾排 -129- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項一! 裝ί丨 π寫本頁) 訂·

1229073 A/ B7 五、發明說明（127) 除不溶物。濾液以1 N鹽酸洗滌2次，然後以鹽水洗滌，經無水硫酸鈉脱水，及濃縮。產生2.7克（收率5 4%) 6-(4-甲氧苯基）-2-羥巧哚之玫瑰色固體。 ^NMR (360 MHz, DMSO-d6) ： ά 10.38(s, br, 1H, NH-1), 7.52(d，J=9 Hz，2H)，7.23(d，J=7.3 Hz，1H，H-4)，7.14(d，d， J=1.38, 7·3 Hz，1H，H-5)，7.0(d，J=9 Hz，2H)，6.96(d，J=1.38 Hz，1H，H-7)，3.78(s，3H，OCH3)，3.47(s，2H，CH2); MS m/z (相對強度，％) 214.0 ([M+l]+，100)。取4-(2-羧乙基）-2-甲醯基-3-甲基吡咯（90.5毫克），120毫克6-(4-甲氧苯基）-2·羥峋哚及3滴六氫吡啶於2毫升乙醇中於9 0 °C加熱一夜。反應混合物冷卻，濃縮。殘質懸浮於6 N 鹽酸水溶液中。沈澱物過滤，以水洗至pH 6，於眞空烘箱中乾燥一夜，產生118毫克（5 9%)標題化合物之褐色固體。 WNMR (360 MHz，DMSO-d6) : cM3.26(s，br，1H，NH-1，)， 10.83(s，br，1H，NH-1)，7.78(d，J=8.07 Hz，1H，H-4)，7.61(s， 1H，H-乙烯基），7.56(d，J=8.97 Hz，2H)，7.22(dd，J=1.44, 8.07 Hz, 1H, H-5), 7.13(d, J=3.09 Hz, 1H, H-2f), 7.04(d5 J=1.44 Hz, 1H，H-7)，7.0(d，J=8.97 Hz，2H)，3.79(s，3H，OCH3)， 2.65(t，J=7.54 Hz，2H，CH2CH2COOH)，2.44(t，J=7.54 Hz，2H， CH2CH2COOH)，及 2.27(s，3H，CH3); MS m/z (相對強度，％) 404 ([M+l]+，100)。實例b 3-{5_[6-(4-甲氧基苯基）-2-氧-1，2-二氫亞峭哚-3-基甲基]-2,4-二甲基-1H-吡咯-3-基}-丙酸 -130· 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公釐） (請先閱讀背面之注意. 事項寫本頁) .線· 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1229073 λ； B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明說明（128) 取3-(2-羧乙基）-2,4-二甲基-5-甲醯基吡咯（98毫克），120 毫克6-(4-甲氧苯基）-2-羥峭哚及3滴六氫吡啶於2毫升乙醇中於9 (TC加熱一夜。反應混合物冷卻，濃縮。殘質懸浮於6 N 鹽酸水溶液中。沈澱物過濾，以水洗至PH 6，於眞空烘箱中乾燥一夜，產生118毫克（57 %)標題化合物之褐色固體。 !HNMR (360 MHz, DMSO-d6) · ί 13.35(s, br, 1H, ΝΗ-Γ), 12.02(s，br，1H，COOH)，10.75(s，br，1H，NH-1)，7.73(d， J=6.75 Hz，1H，H-4)，7.56(d，J=9.01 Hz，2H)，7.54(s，1H，H- 乙晞基），7.21(dd，J=1.59, 6·75 Hz，1H，H-5)，7.04(d，J=1.59 Hz，1H，H-7)，7.01(d，J=9.01 Hz，2H)，3.79(s，3H，OCH3)， 2.65(t，J=7.54 Hz, 2H，CH2CH2COOH)，2.35(t，J=7.54 Hz，2H， CH2CH2COOH)，2.29(s，3H，CH3)，及 2.26(s，3H，CH3); MS m/z (相對強度，％) 417 ([M+l]+，100)。實例3 6 3-{5-[6-(2-甲氧苯基）-2-氧-1，2-二氫亞啕哚-3-基甲基卜4_ 甲基-1H-吡咯-3-基}-丙酸添加肆（三苯基膦）鈀（1克）至含5克2 -甲氧苯基二羥硼故’ 6.6克5-溴-2-氟硝基苯與30毫升2M碳酸鈉溶液之5 0毫升甲苯與5 0毫升乙醇混合物中。混合物回流2小時，濃縮，以乙酸乙酯萃取殘質2次。以水及鹽水洗滌乙酸乙酯層，脱水’濃縮’產生之深綠色油靜置時固化，爲4 _氟_2匕甲氧基-3 -硝基聯苯粗產物。滴加丙二酸二甲酯（14毫升）至含2.9克氫化鈉懸浮之5〇毫升一甲亞職中。混合物於100°C下加熱1 5分鐘，冷卻至室溫。

(請先閱讀背面之注意事項θ寫本頁) " 裝- 訂- .線丨t 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1229073 A7 五、發明說明（129) 添加4-氟-2’-甲氧基-3-硝基聯苯粗產物之60毫升二甲亞减落液，混合物於1 〇〇°C下加熱2小時。反應混合物冷卻，以 300毫升飽和氣化鈉溶液中止反應，以乙酸乙酯萃取2次。合併萃液，以飽和氣化銨，水及鹽水洗滌，以無水硫酸鈉脱水，濃縮，產生粗產物2，-甲氧基-3-硝基聯苯-4-丙二酸二甲酯之黃色油。取2、甲氧基-3-硝基聯苯-4-丙二酸二甲酯粗產物於100°C 下。於5 0毫升6 N鹽酸中加熱2 4小時，冷卻。過濾收集沈搬，以水及己烷洗滌，乾燥，產生9.8克2，-甲氧基-2-硝基聯苯基-4-乙酸之淺黃褐色固體。一次添加全量鐵粉（5克）至含9.8克2，-甲氧基-3-硝基聯苯基-4-乙酸之5 0毫升冰醋酸溶液+，混合物加熱至ιοοχ： 3小時。反應混合物濃縮至乾，於乙酸乙酯中經音波處理，過濾排除不溶物。濾液以1 N鹽酸、水洗滌2次，然後以鹽水洗滌，經無水硫酸鈉脱水，及濃縮。殘質經矽膠，以乙酸乙酯：己烷（1 : 2)層析，產生5.4克（收率69%，以5-溴-2-氟硝基苯爲基準計）6-(2-甲氧苯基）-2-經啕嗓之玫瑰色固體。 !HNMR (360 MHz, DMSO-d6) ： ά 10.32(s5 br3 1H, NH) 7.29-7.34(m，lH)，7.19-7.25(m，2H)，7.08(d，J=8Hz，lH，H-4)，6.97-7.02(m，2H)，6.91(d，J=l.〇5 Hz，1H5 H-7)，3.8(s，3H， OCH3)，3.47(s，2H，CH2); MS m/z (相對強度，〇/〇) 239.8 (loo * [M+l]+)〇取4-(2-致乙基）-2-甲酿基-3 -甲基p比洛（217毫克），239毫克 6-(2-甲氧苯基）-2-羥啕哚及3滴六氫吡啶於2毫升乙醇中於 -132- 本纸張又度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公爱） ------^------裝，--- (請先閱讀背面之注意事項寫本頁) 訂· -線. 1229073 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明說明（13〇) 9 0 C加熱一夜。反應混合物冷卻，濃縮。殘質懸浮於6 n鹽酸水溶液中。沈澱物過濾，以水洗至pH 6，於眞空烘箱中乾燥一夜，產生348毫克（86%)標題化合物之褐色固體。 !HNMR (360 MHz, DMSO-d6) ： ά 13.29(s, br5 1H5 NH-l1), 11.59(s，br， 1H，COOH)，10.78(s，br，1H，NH-1)，7.75(d， J=8.13 Hz，1H，H-4)，7.62(s，1H，H-乙烯基），7.0-7.34(m，7H)， 3.76(s, 3H, OCH3), 2.66(t, J=7.46 Hz, 2H, CH2CH2COOH), 2.46(t，J=7.46 Hz，2H，CH2CH2COOH)，及 2.27(s，3H，CH3); MS m/z (相對強度，％) 401 ([M+l]+，100)。實例3 7 3-{5-[6-(2-甲氧苯基）-2-氧-1，2-二氫亞啕哚-3-基甲基]-2,4-二甲基-1H-吡咯-3-基}-丙‘ 取3-(2-羧乙基）-2,4-二甲基·5-甲醯基吡咯（234毫克），239 毫克6-(2 -甲氧苯基）-2-羥啕哚及3滴六氫吡啶於2毫升乙醇中於90°C加熱一夜。反應混合物冷卻，濃縮。殘質懸浮於6 N 鹽酸水溶液中。沈澱物過濾，以水洗至pH 6，於眞空烘箱中乾燥一夜。粗固體經矽膠管柱層析，使用含0.1 %乙酸之乙酸乙酯：己烷1 : 1溶離，產生182毫克（44%)標題化合物之褐色固體。 !HNMR (360 MHz, DMSO-d6) ： ά 13.38(s, br, 1H, ΝΗ-Γ), 12.0(s，br，1H，COOH)，10.7(s，br，1Ή，NH-1)，7.71(d，J=7.74 Hz，1H，H-4)，7.55(s，1H，H-乙晞基），7.0-7.33(m，6H)，3.76(s， 3H，OCH3)，2.65(t，J=7.6 Hz，2H，CH2CH2COOH), 2.35(t， J=7.6 Hz, 2H，CH2CH2COOH)，2.3(s，3H，CH3)，及 2.26(s，3H， -133- 本紙張又度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐）請先閱讀背面S意事項H寫本頁)

m mMm I — 111訂·！！丨！線- 1229073 A7 B7 五、發明說明（131 ) CH3); MS(APCI neg) m/z (相對強度，415 ([M-1]，100)。實例3 8 3-[2,4-二甲基-5-(6-嗎啉-4-基-2-氧-1，2-二氫亞吲哚-3-基甲基）-1Η-吡咯-3-基]-丙酸添加氣化錫二水合物（225克）至含2,4-二硝基苯乙酸（226 克）之乙醇（450毫升）溶液中。混合物於9(rc下加熱1〇小時。反應混合物冷卻，以12 M氫氧化鈉鹼化至1)11 n。過濾排除固體，濾液濃縮。殘質經乙醇（3〇〇毫升）處理。過濾不溶物，以乙醇洗滌（5 X 60毫升）。合併之乙醇洗液蒸發，眞全乾燥’產生15克6-胺基-2-幾吲嗓之褐色粉末。 ^NMR (360 MHz, DMSO-d6) ： ^ l〇.〇3(s5 br, NH), 6.78(d, J=8.55 Hz，1H，H-4)，6.09-6.11(m，2H)，4.95(s，br，2H，NH2)， 3.22(s，2H，H-3); MS (+ APCI) m/z (相對強度，〇/〇) Μ? (_]]+， 100)。取6-胺基-2-羥啕哚（2·2克）、4.0克2,2，-二溴***及7·9克碳酸鈉於20毫升乙醇中回流一夜，濃縮，以5〇毫升水稀釋。此合物經5 0毫升乙自父乙g旨萃取3次，合併有機萃液，以2 〇愛升鹽水洗務’經典水硫酸納脱水，丨農縮至乾。固體經石夕膠管柱，以乙酸乙酯：己烷1 :丨（含〇.7%乙酸）溶離，產生 1.2克（收率37%) 6-(嗎琳-4-基）-2-經Η丨嗓之米色固體。 !HNMR (360 MHz, DMSO-d6) ： ά 10.2(S) br, 1H5 NH-1), 7.02(d，J-7.87 Hz，1H，H-4)，6.47(dd，J=2.11 7 87 Hz 1H H-5)，6.37(d，J=2.11 Hz，1H，H-7)，3.69-3.72(m，4H)，3.32(s， 2H, CH:)’ 3.01-3.04(m, 4H); MS m/z (相對強度％) 219 -134- 本紙張尺中國國家標準（CNS)A4規格（210 χ 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項寫本頁) 裝，· •線 — Γ, 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1229073 A7 B7 五、發明說明（132) ([M+l]+，100) 〇 (請先閱讀背面之注咅？事項Λ寫本頁) 取3-(2-羧乙基）-2,4-二甲基-5-甲醯基吡咯（3 ·3克），4克6-(嗎琳-4-基）-2-輕4丨嗓及1 ·8毫升六氫p比淀於6 0毫升乙醇中，於9 0°C下加熱7小時。反應混合物冷卻及濃縮。殘質懸浮於 6 N鹽酸水溶液中。過滤沈澱，以水洗至pH 6，於眞空烘箱中乾燥一夜。所得固體經矽膠管柱層析，使用乙酸乙酯-己烷_乙酸溶離，產生2.78克（收率38%)標題化合物之褐色固體。 !HNMR (360 MHz，DMSO-d6) : cM3.13(s，br，1H，NH-1，)， 12.02(s，br，1H，COOH)，10.57(s，br，1H，NH-1)，7.52(d， J=8.46 Hz，1H，H-4)，7.32(s，1H，H-乙烯基），6.58(dd，J=1.99, 8.46 Hz，1H，H-5)，6.41(d，J=1.99 Hz，1H，H-7)，3.71-3.74(m， 4H)，3.06-3.09(m，4H)，2.62(t，J=7.57 Hz，2H，CH2CH2COOH)， 2.33(t，J=7.57 Hz，2H，CH2CH2COOH)，2.26(s，3H，CH3)，及 2.21(s，3H，CH3); MS m/z (相對強度，％) 396 ([M+l]+，100)。實例3 9 -線· 3-[5-(5-氣-4-甲基-2-氧-1，2-二氫亞啕哚-3·基甲基]·2,4-二甲基-1Η-吡咯-3-基]-丙酸經濟部智慧財產局員工消費合作社印制衣取含3.0克4-曱基-2-羥啕哚於室溫下，於5〇毫升乙腈中攪拌懸浮’同時分批添加3.3克Ν -氣琥珀醯亞胺。添加三氟乙酸（1毫升）。懸浮液於室溫下攪拌3天，此期間仍有固體出現。眞空過濾收集白色固體，以少量冷丙酮洗滌，於4 〇 °C 之眞空烘箱中乾燥一夜，產生2.5克（68%) 5-氣-4-甲基-2-羥十朵0 -135- 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1229073 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明說明（133) !HNMR (360 MHz, DMSO-d6) ： ί 10.38(s, br, 1H3 NH), 7.19(d，J=8 Hz，1H，芳香系），6.64(d，J=8 Hz，1H，芳香系）， 3.46(s，2H，H-3)，2.19(s，3, CH3) 0 取3-(2-幾乙基）-2，4-二甲基-5-甲酿基p比p各（98毫克），91毫克5 -氣-4-甲基-2-經Θ丨哚及2滴六氫吡啶於2毫升乙醇中於9 〇 °C加熱4小時。反應混合物冷卻，濃縮。殘質懸浮於6 n鹽酸水溶液中。沈澱物過濾，以水洗至pH 6，於眞空烘箱中乾燥一夜，產生100毫克標題化合物。 WNMR (360 MHz，DMSO-d6) : cM3.47(s，br，1H，NH-11)， 12.03(s，br，1H，COOH)，10.83(s，br，1H，NH-1)，7.61(s，1H， H-乙晞基)，7.14(d，J=8.17 Hz，1H，芳香系），6.74(d，J=8.17 Hz， 1H，方香系），2.64(s，3H，CH3)，2.64(t，J=7.62 Hz，2H CH2CH2COOH)，2.34(t，J=7.62 Hz，2H，CH2CH2CO〇H)，2.3 (S， 3H，CH3)，及 2.20(s，3H，CH3)。實例4 0 3-[5-(5-氯-4 -甲基-2-氧-1，2-二風亞4卜朵-3-基甲基]-心甲基 -1H-吡咯-3-基]-丙酸取4-(2-叛乙基）-2 -甲驢基-3 -甲基p比洛（91毫克），91毫克 5 -氣-4-甲基-2-經Θ丨哚及2滴六氫吡啶於2毫升乙醇中於9 〇加熱4小時。反應混合物冷卻，濃縮。殘質懸浮於6 N鹽酸水溶液中。沈澱物過滤，以水洗至pH ‘6，於眞空烘箱中乾燥一夜，產生95毫克標題化合物。 iHNMR (360 MHz，DMSO-d6) : cM3.36(s，br，1H，NH-lf) 11.98(s，br，1H，COOH)，10.92(s，br，1H，NH-1)，7.68(s，1H)， -136- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項寫本頁) 裝，· Ίδι:- •線丨· 1229073 A7 B7 五、發明說明（彳34) 7.l9(d，J=7.14 Hz，1H，芳香系），7.17(s，1H)，6.75(d，J=7.14 Hz，1H，芳香系），2.66(s，3H，CH3-4)，2.66(t，J=7.51 Hz，2H， CH2CH2COOH)，2.45(t，J=7.51 Hz，2H，CH2CH2COOH)，2.21 (s，3H，CH3); MS m/z (相對強度，％) 345 ([M+l]+，100)。實例4 1 3_[2,4-二甲基-5-(2-氧-1，2-二氫亞吲哚-3-基甲基）-1Η-吡哈 -3 -基]-丙酸鋼鹽〜、加含8克3-[2,4-二甲基-5-(2-氧-1，2-二氫亞4|嗓-3-基甲基）-1Η-吡咯-3-基]丙酸之60毫升水懸浮液至含〇·98克氫氧化鈉之1 0毫升水中。混合物於室溫下攪拌3 〇分鐘後，過濾、。濾液冷凍及冷凍乾燥，產生8克標題化合物。或者，添加含117克318-005‘470毫升水懸浮液至含1647 克氫氧化鈉之7 4毫升水中。混合物於室溫下攪掉i 5分鐘，過遽。濾液加至210毫升乙醇中，抽吸過濾收集所形成之沈澱。乾燥後，共得到106克標題化合物。 !HNMR (360 MHz, DMSO-d6) ： ά 13.34(s, br5 1H, NH-1') l〇.82(s，br，1H，NH-1)，7.65(d，J=7.52 Hz，1H，H-4)，7.5(s 1H，H-乙烯基），7.04(t，J=7.52 Hz，1H，H-6)，6.93(t，J = 7.52 Hz， 1H，H-5)，6.85(d，J=7.52 Hz，1H，H-7)，2.55(t，J=6.95 Hz，2H， CH2CH2COOH)，2.28(s，3H，CH3)，2.24(s，3H，CH3)，及 i.99(t， J=6.95 Hz，2H，CH2CH2COOH) 〇實例4 2 3 - [3,5 --一甲基-4-(3-嗎琳-4 -基丙基-基亞甲美] 1，3-二氫啕哚-2-酮 -137- 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） I »1 1 amem tmm mmf mmmm mm§ mmmm mMM I ammm I · I I (請先閱讀背面之注音？事項me寫本頁) 訂- -·線丨1 - 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1229073 A7 B7 五、發明說明（135) 步恭1 ·依序添加1，1’_羰基二咪唑（i丨6克，8毫莫耳）及嗎啉（5.5毫升，60.8毫莫耳）與N，N-二異丙基乙胺（亨尼氏鹼，10毫升，60.8毫莫耳）至含3_(2,4.二甲基-1H4洛小基）丙酸（1 0克，60.8毫莫耳）之60毫升二氣甲烷懸浮液中。深紅色反應混合物於室溫下攪拌一夜，倒至冰水中。以鹽水洗滌有機層，直到洗液之pH約6止，經無水硫酸鈉脱水，及濃縮。粗產物經矽膠管柱使用二氣甲烷-甲醇（98 : 2)溶離純化，產生13·84克（96%) 3-(2,4-二甲基-出-咐嘻_3-基）-1-嗎 p林-4 -基丙-1-酉同。步驟2 :滴加3-(2,4-二甲基-1H-吡咯-3-基卜丨-嗎啉基丙 1-酮（13.84克，59毫莫耳）之四氫呋喃（5〇亳升）溶液至含氫化經銘（2.67克，70¾莫耳）之四氫吱喃（iqq毫升）懸浮液中。反應混合物於8 0°C攪拌1小時，於冰浴中冷卻。緩緩加冰至反應混合物中，直到氣體停止釋出止。添加幾滴2 1^氫氧化鈉，反應混合物於室溫下攪拌3 〇分鐘。反應混合物經乙酸乙醋萃取’經無水硫酸鋼脱水，濃縮，產生1 〇 3 7克 (79%) 4-[3-(2，4-二甲基-1H-吡哈-3-基）丙基]嗎琳之淺褐色油，未再純化即使用。步驟3 :滴加磷醯氣（6·5毫升，70毫莫耳）至含N，N-二甲基甲醯胺（5.5毫升，70毫莫耳）之二氣甲烷（3〇毫升）冰***液中。當添加完畢時，反應混合物於。室溫下攪拌i 5分鐘，之後於0°C下滴加3,5-二甲基-4-(3-嗎啉-4-基丙基哈_2-羧基醛（10.37克，46.6毫莫耳）之二氣甲烷（2〇毫升）溶液。最終反應混合物於6 0 °C下回流4小時後，於冰浴中冷卻。緩 -138- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公爱） (請先閱讀背面之注意事項寫本頁) Ί — 訂·· _ --線- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1229073 A7 B7 五、發明說明（136) 緩加冰至反應混合物中，然後添加2 N氫氧化鋼，直到達 pH 12止。反應混合物於室溫下攪拌3 0分鐘，以乙酸乙酉旨萃取。有機層以鹽水洗滌，經無水硫酸鈉脱水，濃縮，產生之粗產物經矽膠管柱使用二氣甲烷-甲醇-氫氧化銨（9.5 : 〇 5) 純化，產生4.57克（39%) 3,5-二甲基-4-(3-嗎啉-4-基丙基 1Η-ρ比洛-3-獲基路之深紅色油： WNMR (360 MHz，DMSO，d6)d 11.34(s，br，1H，NH-1)，9.40(s 1H5 CHO-2), 3.55(t, J=4.68 Hz, 4H, 〇(CH2CH2)2NCH2CH2CH2-4), 2.28-2.34(m, 6H, 2.21(t, 2H5 J=7.10 Hz, 2H, 0(CH2CH2)2NCH2CH2CH2.4) CH3-3), 2.19(s5 3H，CH3-5)，2.14(s，3H，CH3-3)，1.51(quint·，J=7.10 Hz，2H，〇(CH2CH2)2NCH2CH2CH2-4), * MS m/z (相對強度，％) 251 ([M+l]+·，100)。步驟4 :取含1，3-二氫啕哚-2-酮（133毫克，1·〇毫莫耳）、 3,5 - 一甲基-4-(3-嗎淋-4-基丙基各-2 -叛基酸（250毫克，1.0毫莫耳）及3滴吡洛啶於2毫升乙醇中，於90 °C下回流4小時後，冷卻至室溫。過濾沈澱，以冷乙醇及己烷洗滌，於眞空烘箱中乾燥一夜，產生308.9克（85%) 3-[3，5-二甲基-4-(3-嗎啉-4-基丙基）-1Η-吡咯-2-基亞甲基]-1，3-二氫峭哚-2-酮之黃色固體： ]HNMR (300 MHz, DMSO-d6) ^ 13.*37(s, 1Η, ΝΗ-Γ)? 10.71(s, 1H，NH-1)，7.68(d，J=7.47 Hz，1H，H-4)，7.53(s，1H，H-乙烯基）， 7.06(dt，J=7.47 Hz，1H，H-6)，6.94(dt，J=7.74 Hz，1H，H-5)，6.84(d，J=7.47 Hz, 1H3 H-7), 3.55(t, J=4.37 Hz, 4H, 0(CH2CH2)2NCH2CH2CH2-4?), -139- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -------------裝，--- (請先閱讀背面之注意事項ϋ!寫本頁) • 1 . •線· 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1229073 A7 B7 五、發明說明（137) 2.40(t, J=7.31 Hz, 2H, 〇(CH2CH2)2NCH2CH2CH2-4,), 2.31(t, J=4.37 Hz, 4H, 〇(CH2CH2)2NCH2CH2CH2-4f)9 2.28(s, 3H, CH3-3f)5 2.23(s, 3H, CH3-5f), 2.23(t, J=7.31 Hz, 2H, 0(CH2CH2)2NCH2CH2CH2-4丨)，1.56(quint., J=7.31 Hz, 2H， 0(CH2CH2)2NCH2CH2CH2-4,), MS m/z (相對強度，％) 365 (M+·，100)。實例4 3 5-溴-3-[3,5-二甲基-4-(3-嗎啉-4-基丙基）-1 Η-吡咯-2-基亞曱基]-1，3-二氫吲哚-2-酮取含5-溴-1，3-二氫啕哚-2-酮（212毫克，1.0毫莫耳）、3,5-二甲基-4-(3-嗎啉-4-基丙基）-1Η-吡咯-2-羧基醛（250毫克， 1 ·〇毫莫耳）及3滴吡咯啶於2毫斗乙醇中，於9 0 °C下回流4小時後，冷卻至室溫。過濾沈澱，以冷乙醇及己烷洗滌，於眞空烘箱中乾燥一夜，產生399.8毫克（90%) 5-溴-3-[3,5-二甲基-4-(3-嗎啉-4-基丙基）-1Η-吡咯-2-基亞甲基]-1,3-二氫啕哚-2-酮之紅色固體： !HNMR (300 MHz, DMSO-d6)cy 13.43(s, 1H, ΝΗ-Γ), 10.81 (s，1H，NH-1)，7.99(d，J=2.07 Hz，1H，Η·4)，7.66(s，1H，H-乙晞基)，7.18(dd，J=2.07, 7.58 Hz，1H，H-6)，6.79(d，J=7.58 Hz， 1H, H-7), 3.55(t, J=4.39 Hz, 4H, 0(CH2CH2)2NCH2CH2CH2-4f), 2.40(t, J=7.32 Hz, 2H5 0(CH2CH2)2NCH2CH2CH2-4,)5 2.31(t? J=4.39 Hz? 4H, 0(CH2CH2)2NCH2CH2CH2-4t)5 2.29(s, 3H, CH3-3’），2.26(s，3H，CH3-5，），2.23(t，J=7.32 Hz，2H， 0(CH2CH2)2NCH2CH2CH2-4t)? 1.56(quint.? 1=7.32 Hz, 2H, -140- 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -Hi ϋ emmmmm ·ϋ n n« ·_ Hi i_i I m MmmKm 11 (請先閱讀背面之注意事項寫本頁) 訂.· · ί線' 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1229073 A7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 B7_ 五、發明說明（138) 0(CH2CH2)2NCH2CH2CH2-4,), MS m/z (相對強度，％) 443 (M+·，100)，445 ([M+2]+.，100)。實例4 4 3-[3,5-二甲基-4-(3-嗎啉-4-基-丙基）-1Η-吡咯-2-基亞曱基]-6 -私基-1，3 - —風丨嗓-2 -嗣採用實例2之方法，得到收率88%標題化合物之黃色固體： WNMR (300 MHz，DMSO-d6)(M3.37(s，1H，NH-11)，10.81 (s，1H，NH-1)，7.77(d，J=8.20 Hz，1H，H-4)，7.62(d，J=7.39 Hz，2H，H-2’’，6·’），7.58(s，1H，H-乙烯基），7.44(t，J=7.39 Hz， 2H，H-3"，5’丨)，7.32(t，br，J=7.39 Hz，1H，H-4，，)，7.26(dd， J=l.49, 8.29 Hz，1H，H-5)，7.09(d，J=1.49 Hz，1H，H-7)，3.56 (t，J=4.48 Hz，4H，0(CH2CH2)2NCH2CH2CH2.4')5 2.4 l(t， J=7.18 Hz, 2H, 〇(CH2CH2)2NCH2CH2CH2-4,), 2.31(t, J=4.48 Hz, 4H, 〇(CH2CH2)2NCH2CH2CH2.4,), 2.29(s, 3H, CH3.3,), 2.26 (s5 3H, CH3-5,), 2.24(t? J=7.18 Hz, 2H, 0(CH2CH2)2NCH2CH2CH2-4f), 1.56(quint., J=7.18 Hz, 2H, 0(CH2CH2)2NCH2CH2CH2-4,), MS m/z (相對強度，％) 441 (M+.，100)。實例4 5 3-[3,5 - —甲基-4-(3-嗎淋-4-基-丙基-2-基亞甲基]-6-(2-甲氧苯基）-1，3-二氫啕哚-2-酮採用實例2之方法，得到收率86%標題化合物之黃色固體： WNMR (300 MHz，DMSO-d6) d 13.37(s，1H，NH-1，)， 10.72(s，1H，NH-1)，7.71(d，J=7.79 Hz，1H，H_4)，7.55(s，1H， H-乙烯基），7.27-7.34(m，2H)，6.98-7.10(m，4H)，3.76(s，3H， (請先閱讀背面之注意事項1 裝，· — I π寫本頁) 訂. -，線- -141 - 了木紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公爱） 1229073 Α7 Β7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明說明（139) OCH3-2,f), 3.56(t, J=4.50 Hz, 4H, 〇(CH2CH2)2NCH2CH2CH2-4，)，2.41(t, 1=7.12 Hz, 2H，0(CH2CH2)2NCH2CH2CH2-4,)5 2.21-2.31(m, 6H, 0(CH2CH2)2NCH2CH2CH2-4,)5 2.29(s, 3H, CH3-3,), 2.25(s, 3H, CH3-5f), 1.57(quint.5 J=7.12 Hz, 2H, 0(CH2CH2)2NCH2CH2CH2-4f), MS m/z (相對強度，％) 471 (M+_，100)。實例4 6 3-[3,5-二甲基-4-(3-嗎啉-4-基-丙基）-1^1-吡咯-2-基亞曱基]-6-(3-甲氧苯基）-1，3-二氫巧哚_2-酮採用實例2之方法，得到收率87%標題化合物之黃色固體·· !HNMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 13.38(s, 1Η，ΝΗ-1 丨)， 10.80(s，1Η，NH-1)，7.76(d，J=7.93 Ηζ，1Η，H-4)，7.57(s，1Η， H-乙烯基），7.35(t，J=8.08 Hz，1H，H-5，’），7.26(dd，J=1.73 7·93 Hz，1H，H-5)，7.18(d，br，J=8.08 Hz，1H，H-4，，），7.13(t br，J=1.94 Hz，1H，H-2n)，7.08(d，J=1.73 Hz，1H，H-7)，6.90 (dd，J=1.94, 8.08 Hz，1H，H-6")，3.81(s，3H，OCH3-3n)，3.56(t， J=4.38 Hz，4H，〇(CH2CH2)2NCH2CH2CH2-4,)) 2.41(t, J=7.19 Hz, 2H5 0(CH2CH2)2NCH2CH2CH2.4t), 2.31(t, J=4.38 Hz, 4H, 2.29(s，3H，CH3-3，），2.26(s，3H， CH3-5丨)，2.24(t，J=7.19 Hz, 2H，0(CH2CH2)2NCH2CH2CH2-4丨)， 1.56(quint., J=7.19 Hz, 2H, 〇(CH2CH2)2NCH2CH2CH2-4,)5 MS m/z (相對強度，％) 471 (M+·，100)。實例4 7 3-[3,5-二甲基-4-(3-嗎啉-4-基-丙基）-1 Η-吡咯-2-基亞甲 -142- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項β寫本頁) »Ί 裝，· 訂： •線· 1229073 a7 B7 五、發明說明（14C)) 基]-6-(4-甲氧苯基）-l，3-二氫峭哚-2-酮採用實例2之方法，得到收率52%標題化合物之黃色固體： WNMR (300 MHz，DMSO-d6H 13.35(s，1H，NH-1，)，10.77 (s, 1H, NH-1), 7.72(d, J=7.97 Hz, 1H, H-4), 7.55(d, J=8.57

Hz，2H，H-2，，，6，·），7.54(s，1H，H-乙烯基），7.20(dd，J=1.35, 7.97 Hz，1H，H-5)，7.04(d，J=1.35 Hz，1H，H-7)，6.99(d， J=8.57 Hz，1H，H-3，，，5，’），3.78(s，3H，OCH3-4’，），3.55(t， J=4.57 Hz, 4H, 0(CH2CH2)2NCH2CH2CH2-4,), 2.40(t, J=6.97 Hz, 2H? 0(CH2CH2)2NCH2CH2CH2.4i), 2.30(t, J=4.57 Hz, 4H, 0(CH2CH2)2NCH2CH2CH2-4f)J 2.28(s, 3H, CH3-3,), 2.24(s, 3H, CH3-51), 2.23(t, J=6.97 Hz, 2H, 〇(CH2CH2)2NCH2CH2CH2-4,), 1.55(quint., J=6.97 Hz, 2H, 〇(CH2CH2)2NCH2CH2CH2-4,), MS m/z (相對強度，％) 471 (M+·，100)。實例4 8 3-[4-(3-二甲胺丙基）-3,5-二甲基-1H-吡咯-2-基亞甲基]-1,3-二氫吲哚-2-酮採用實例1步驟1、2與3之方法，得到收率63%之4-(3-二甲胺丙基）-3,5-二甲基-1H-吡咯-2-羧基醛之深紅色油： . !HNMR(300 MHz, DMSO-d6)(y 11.33(s, br, 1H, NH-1), 9.40(s, 1H, CHO-2)，2.30(t，J=7.42 Hz，2H，（CHANCi^CH^Ci^d)，2.18(s， 3H，CHr3)，2.15(t，J=7.42 Hz，2H，（CHANCi^CH'iVM， 2.14(s，3H，CHr5)，2.10(s，6H，（Cii3)2NCH2CH2CH2-4)，1·47 (quint., J=7.42 Hz, 2H, (CH3)2NCH2CH2CH2-4), MS m/z (相對強度，％) 208 ([M+l]+·，100)。 -143- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項！1^寫本頁) 訂- •線經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1229073 A/ B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明說明（141) 採用實例1步驟4之方法，得到收率52%標題化合物之黃色固體： WNMR (360 MHz，DMSO-d6)cM3.38(s，1H，NH-1 丨)，10.70 (s，1H，NH-1)，7.68(d，J=7.54 Hz，1H，H-4), 7.53(s，1H，Η-乙烯基)， 7.06(t，J=7.54 Hz，1H，H-6)，6.94(t，J=7.54 Hz，1H，H-5)，6.85(d， J=7.54 Hz, 1H, H-7), 2.38(t5 J=7.25 Hz, 2H, (CH3)2NCH2CH2CH2-4,), 2.27(s，3H，CHr3’)，2.23(s，3H，CH3-5’)，2.17(t，J=7.25 Hz，2H， 2.1 l(s, 6H, (CH3)2NCH2CH2CH2.4i), 1.52(quing., J=7.25 Hz, 2H, (CH3)2NCH2CH2CH2-4,)? MS m/z (相對強度，％) 323 (M+·，100)。實例4 9 5-溴-3-[4-(3-二甲胺丙基）-3,5-二甲基-1H-吡咯-2-基亞甲基]-1，3-二氫⑼哚-2-酮採用實例2之方法，得到收率71%標題化合物之紅色固體： !HNMR (360 MHz，DMSO-d6H 13.42(s，1H，NH-1 丨)，10.81 (s，1H，NH-1)，7.98(d，J=1.89 Hz，1H，H-4)，7.66(s，1H，H-乙烯基），7.17(dd，J=1.89, 8·23 Hz，1H，H-6)，6.79(d，J=8.23 Hz， 1H, H-7), 2.38(t, J=7.23 Hz, 2H, (CH3)2NCH2CH2CH2-4,), 2.27(s, 3H, CH3-3,), 2.25(s, 3H, CH3-5f), 2.16(t? J=7.23 Hz, 2H5 (CH3)2NCH2CH2CH2-4,), 2.10(s, 6H, (CH3)2NCH2CH2CH2-4’），1.51(quint·，J=7.23 Hz，2H，（CUNCHzC^CHrf)， MS m/z (相對強度，％) 4〇i ([M-l]+.，100 及 403 ([M+l] +， 100)。實例5 0 -144- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 χ 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項y 裝--- π寫本頁) 訂· •線i A7 B7 1229073 i、發明說明（142 ) 3-[4-(3-二甲胺丙基）-3,5-二甲基_ih-吡咯-2-基亞甲基]·6· 苯基-1，3-二氫啕哚-2-酮採用實例2之方法，得到收率83%標題化合物之橙色固體： WNMR (360 MHz，DMSO-d6)(M3.38(s，1Η，ΝΗ-1，)，10·81 (s，1Η，ΝΗ-1)，7.77(d，J=7.82 Ηζ，1Η，Η-4)，7.62(d，J=7.59 Hz，2H，H-2，6 )，7.58(s，1H，H-乙締基），7.44(t，J=7.59 Hz， 2H，H-3”，5”)，7.32(t，J=7.59 Hz，1H，H-4”)，7.27(dd，JM.u， 7·82 Hz, 1H，H-5)，7.09(d，J=l.li Hz，1H，H-7)，2.39(t， J=7.18 Hz, 2H, (CH3)2NCH2CH2CH2.4,), 2.29(s, 3H, CH3-3*), 2.25(s，3H，CH3-5 )，2.17(t，J=7.18 Hz，2H，（CH3)2NCJ£2C|£2CH2-4，） 2.11(s，6H，（CD2NCH2CH2CH2-4’)，1.53(quint·，J=7」8 Hz， 2H, (CH3)2NCH2CH2CH2.4,), · MS m/z (相對強度，％) 399 (M+，100)。實例5 1 3-[4-(3-二甲胺丙基）-3,5-二甲基-1H-吡洛-2-基亞甲基卜6· (2-甲氧苯基）-1，3-二氫啕哚-2-酮採用實例2之方法，得到收率83%標題化合物之黃色固體： iHNMR (360 MHz，DMSO-d6)cM3.38(s，1Η，ΝΗ-1，)，1〇·72 (s, 1Η, ΝΗ-1), 7.70(d, J=8.06 Ηζ，1Η，Η-4)，7.55(s，1Η，Η-乙烯基)，7.28-7.36(111，211，11-4”，5’，)，7.14((1，>8.32 1^，1111-6’’），7.04(dd，J=1.21，8.06 Hz，1H，H-5)，6.99(d，】=7·42 Hz 1H，H-3 )，6.99(d，J-1·21 Hz，1H，H-7)，3.76(s，3H，〇CH3-2n)， 2.39(t, 1=7.24 Hz, 2H, (CH3)2NCH2CH2CH2-4f)5 2.28(s5 3H,

CH3-3 )，2.25(s，3H，CH3-5’)，2.18(t，J=7.24 Hz，2H -145- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） n ϋ ϋ J— I ϋ Mia ϋ ϋ n I · n ϋ (請先閱讀背面之注意事寫本頁) · 丨線丨Ί 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1229073 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明說明（143)(CH3)2NCH2CH2CH2-4f)? 2.1 l(s, 6H, (CH3)2NCH2CH2CH2-4»), 1.53(quint., J=7.24 Hz, 2H, (CH3)2NCH2CH2CH2-4f)5 MS m/z (相對強度，％) 429 (M+, 100)。實例5 2 3-[4-(3-二甲胺丙基）-3,5-二甲基-1H-吡咯-2-基亞甲基]·6_ (3-甲氧苯基）-1,3-二氫峭哚-2-酮採用實例2之方法，得到收率83%標題化合物之紅色固體： iHNMR (360 MHz，DMSO-d6H 13.38(s，1H，NH-1)，10.80 (s，1H，NH-1)，7.60(d，J=8.06 Hz，1H，H-4)，7.57(s，1H，H-乙晞基)， 7.35(t，J=8.15 Hz，1H，H-5”)，7.26(dd，J=1.39, 8·06 Hz，1H，H編5)， 7.19(d，br，J=8.15 Hz，H-6’’)，7.13(m，1H，H-2n)，7.09(d，J=1.39 Hz， 1H，H-7)，6.90(dd，J=2.57, 8.15 Hz，1H，H-4n)，3.81(s，3H，OCH3-3")， 2.39(t, J=7.17 Hz, 2H, (CH3)2NCH2CH2CH2-4,), 2.29(s5 3H, CH3-3f), 2.25(s5 3H, CH3-5'), 2.17(t, J=7.17 Hz, 2H3 2.11(8, 6H, (CH3)2NCH2GH2CH2-4f), 1.53(quint.5 1=7.17 Hz, 2H5 (CH3)2NCH2CH2CH2-4f), MS m/z (相對強度，％) 429 (M+，100)。實例5 33-[4-(3-二甲胺丙基）-3,5-二甲基-1H-吡咯-2-基亞甲基]-δα-甲氧苯基）-l，3-二氫啕哚-2-酮採用實例2之方法，得到收率83%標題化合物之褐色固體： iHNMR (360 MHz，DMSO-d6)cM3.35(s，1H，ΝΗ-1’)，1〇·77 (s，1H，NH-1)，7.73(d，J=7.82 Hz，1H，Η·4)，7.56(d，J=8.83 Hz，2H，H-2n，6’’），7.54(s，1H，H-乙烯基），7.20(dd，J=1.64, -146- 本纸張又度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項寫本頁) 裝，· 訂.· -線· 1229073 A7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 B7 -_ 五、發明說明（144) 7.82 Hz, 1H, H-5), 7.04(d, J-1.64 Hz, H-7), 7.00(d, J=8 83 Hz，2H，H-3’’，5)，3.78(s，3H，〇CH3-4，，），2.39(t，J=7.24 Hz 2H, (CH3)2NCH2CH2CH2-4,), 2.28(s, 3H, CH3-3f), 2.25(s, 3H CH3-5f), 2.17(t, J=7.24 Hz, 2H, (CH3)2NCH2CH2CH2«4,), 2.11 (s，6H，（C^3)2NCH2CH2CH2-4’)，1.52(quint·，J=7.24 Hz，2H (CH3)2NCH2CH2CH2-4,), ’ MS m/z (相對強度，％) 429 (M+，100)。實例5 4 5- 氯- 3-[4-(3-二甲胺丙基）-3,5-二甲基- iH-p比洛-2-基亞甲基]-1，3-二氫啕哚-2-酮採用實例2之方法，得到收率53%標題化合物之褐色固體： ΉΝΜΪΙ (360 MHz，DMSO-d6)cM3.43(s，1H，NH-1 丨)，1〇 84 (s，1H，NH-1)，7.87(dd，J=1.85 Hz，1H，H-4)，7.66(s，1H，Η-乙晞基)，7.05(dd，J=1.85, 8.15 Hz，1H，H-6)，6.83(d，J=8.15 Hz，1H， H-7), 2.36-2.45(m, 4H, (CH3)2NCH2CH2CH2-4f)5 2.30(s, 6H3 (CH3)2NCH2CH2CH2-4')5 2.28(s，3H，CH3-3丨)，2.26 (s，3H， CH3-5f)5 1.58(quint., J=7.52 Hz, 2H? (CH3)2NCH2CH2CH2-4f), MS m/z (相對強度，％) 357 ([Μ-1Γ·，I00)。實例5 5 6- 氣-3-[4-(3-二甲胺丙基）-3,5-二甲基吡咯-2-基亞甲基]-1，3-二氫⑷哚-2-酮採用實例2之方法，得到收率77%之標題化合物： MS EI 357 [M-l]+ ° 實例5 6 -147- 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公爱） (請先閱讀背面之注咅？事項1|^寫本頁) 丨·裝訂： •線· 1229073 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明說明（145) 3-(4-(3-二甲胺丙基）-3 5 -田並丄a 1 ; 一甲基-1H-吡咯-2-基亞甲基]-5- 甲氧基-1，3-二氫4丨嗓-2-酮採用實例2之方法，得到收率77%之標題化合物·· MS EI 353 [M]、實例5 7 3-[4-(3-二甲胺丙基）-3,5·二甲n-吡咯_2_基亞甲基]冬甲氧基-1，3-二氫啕哚-2-酮採用貫例2之方法，得到收率7 4 %之標題化合物。實例5 8 3-[4-(3-二甲胺丙基）-3,5-二甲基-1H-吡咯基亞甲基]-5_ 甲基-1,3-二氫吲哚-2-酮採用實例2之方法，得到收率“ ％之標題化合物： MS EI 337 [M]+ 〇實例5 9 3-[4-(3-二甲胺丙基）-3,5-二甲基-1H-吡咯-2-基亞甲基]-4- 甲基-1，3-二氫啕哚-2-酮採用實例2之方法，得到收率99%之標題化合物·· iHNMR (300 MHz，DMSO-d6)cM3.45(s, br，1H，NH)，10.78 (s，br，1H，NH)，7.50(s，1H，Η-乙晞基），6.98(t，J=8.1 Hz，1H， H-6)，6.76(t，J=8.1 Hz，2H，H-5 & H-7)，2.88(m，2H，CH2)， 2.64(s，6H，2xCH3)，2.56(s，3H，CH3)，2.43(t，J=7.4 Hz，2H， CH3)，2.29(s，3H，CH3)，2.19(s，3H，CH3)，1.65-1.75(m，2H， ch2)， MS El 337 [M]+。 148 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項β寫本頁) •裝，· 訂. --線· 1229073 A7 B7 五、發明說明（146) 實例6 0 (請先閱讀背面之注意事項HI寫本頁) 3-[4-(3-二甲胺丙基）-3,5-二甲基-1H-吡咯-2·基亞甲基]-4-(2-羥乙基）-1，3-二氫啕哚-2-酮採用實例2之方法，得到收率9 8 %之標題化合物。實例6 1 3-[4-(3-二甲胺丙基）-3,5-二甲基-1H-吡咯-2-基亞甲基]-2-氧-2,3-二氫-1H-啕哚-5-磺酸醯胺採用實例2之方法，得到收率5 9 %之標題化合物： WNMR (300 MHz，DMSO-d6)cM3.41(s，1H，NH-1·)，11.12 (s，1H，NH-1)，8.l6(d，J=l·78 Hz，1H，H-4)，7.66(S，1H，Η-乙晞基)， 7.55(dd，J=1.78, 8.18 Hz，1H，H-6)，7.11(s，br，2H，ii2NS02-5)，6.98(d， J=8.18 Hz, 1H, H-7), 2.47-2.2H, (CH3)2NCH2CH2CH2-4,), 2.41(t, 1=7.37 Hz5 2H5 (CH3)2NCH2CH2CH2.4f), 2.36(s, 6H, (CH3)2NCH2CH2CH2-4f), 2.30(s, 3H, CH3-3,), 2.28(s, 3H, CH3-5'), 1.61(quint., J=7.37 Hz, 2H, (CH3)2NCH2CH2CH2-4,), 實例6 2 3·[4-(3-二甲胺丙基）-3,5-二甲基-1H-吡咯-2-基亞甲基]-2- 乳- 2,3 -一鼠- 績酸異丙酿胺採用實例2之方法，得到收率6 4 %之標題化合物·· 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 MS EI 444 [M]+ 〇實例6 3 · . 3-[4-(3-二甲胺丙基）-3,5-二甲基-lH-p比洛-2-基亞甲基]-5-(嗎琳-4·-績酿基）-1，3-二氫啕噪-2-酮採用實例2之方法，得到收率9 〇 %之標題化合物： -149- 本紙張&度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1229073

五、發明說明（147) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 MS El 472 [M]+ 〇實例64 广[心(3_二甲胺丙基^3,5。甲基·比咯基亞甲基]冬氧_2,3-二氫卜朵-5-續酸二甲酿胺採用實例2之方法，得到收率92%之標題化合物： WNMR (300 MHz，DMSO-d6H 13.5(s，br，1H，NH)，12.21(:，br，1H，NH)，8.18(d，J=l.8 Hz，1H，H-4)，7.84(s，1H，H-乙晞基），7.44(dd，J=1.8, 8.4 Hz，1H，H-6)，7.05(d，J=8.4 Hz，1H， H-7)，2.59(s，6H，2xCH3)，2.59-2.64(m，2H，CH2)，2 44“ 6H 2xCH3), 2,S-2,4(m, 2H, CH2), ,31(s, 6H, 2xCH3), ；,9： 1.69(m，2H，CH2)， MS El 430 [M]+ 〇 · 7 .生物評估法咸了解，任何指定之一系列化合物均有生物活性範圍。本發明目如較佳具體貫施例中，係有關新穎之經咐哈取代之 2-⑼嗓琳酮證實具有調控尺丁尺、CTK及STK活性之能力。採用下列分析法選拔展現最佳所需活性程度之化合物。 A.分析法可採用下列試管内分析法測定本發明不同化合物對一種或多種PKs之活性程度及影響。亦可採用相關技藝習知之技術，爲相同系列之化合物針對任何ρ κ設計類似之分析法。本文説明之細胞/催化分析法係以ELISA形式進行。其一般程序如下：添加化合物至表現試驗激酶之細胞中（天然細胞或重組細胞）一段指定時間期，之後若試驗激酶爲受體 -150- ^紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公髮） (請先閱讀背面之注意事項寫本頁) 裝、 · 線- 1229073 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（148) 時，添加已知可活化受體之配位體。溶解細胞，取溶胞液移至預先塗佈可辨識酵素磷酸化反應之受質之專一抗體之 ELIS A板之孔中。洗除細胞溶胞液之非受質成份，使用辨識嶙酸路胺酸之專一抗體檢測受質上鱗酸化量，與未接觸試驗化合物之對照組細胞比較。本文説明之細胞/生物分析法測定因應試驗激酶之活化作用製法之DNA量，其係增殖反應之一般測定法。此分析法之一般過程如下··添加化合物至表現試驗激酶之細胞中（天然細胞或重組細胞）一段指定時間期，之後若試驗激酶爲受體時，添加已知可活化受體之配位體。至少培養一夜後，添加DNA標識試劑如：溴去氧尿嘧啶核甞（BrdU)或3H-胸甞。採用抗-BrdU抗體檢測標識之DNA量或測定放射活性並與未接觸試驗化合物之對照組細胞比較。細胞/催化分析可採用酵素連結免疫吸收分析法（ELIS A)檢測及測定P K活性之存在。可根據述於例如：弗勒（Voller)等人，1980，π酵素連結免疫吸收分析法”，述於”臨床免疫學手册”，第2 版，洛斯與弗德曼編輯，ρ 359-371，華盛頓特區美國微生物學會（’’Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，’’ In: Manual of Clinccal Immunology, 2d ed., edited by Rose and Friedman, pp 359-371 Am. Soc. Of Microbiology，Washington，D.C.)之已知方法進行ELIS A。所揭示之方法可用於測定對專一性P K之活性。亦即，專一性Ρ Κ之ELIS Α實驗較佳進行方式如下。然而，擷用此等 -151 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公釐） -----ΊΙΙ1!! - i I (請先閱讀背面之注意事寫本頁) 訂· -線· 1229073 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明説明（149) 測定化合物對RTK族群中其他成員及對CTKs與STKs之活性之方法係相關技藝專家之知識範圍内。 FLK-1分析法進行ELISA分析法測定FLK-1受體之激酶活性，更明確言之，測定T K對FLK-1受體之抑制或活化活性。明確言之，進行下列分析法測定經基因工程處理可表現Flk-1之細胞中 FLK-1受體之激酶活性。材料與試驗 a. 康寧96孔ELIS A板（康寧產品目錄No. 25805-96)， b. 卡波公司山羊抗兔子IgG(目錄No. 55641)， c. PBS(奇布可（Gibco)產品目錄 No. 450-1300EB)， d. TBSW緩衝液（50 mM Tris (pH 7·2)，150 mM NaCl 與 0.1% Tween-20)， e. 乙醇胺母液（10%乙醇胺（pH 7.0)，存放在4 °C)， f. HNTG 緩衝液（20 mM HEPES 緩衝液（pH 7.5)，150 mM NaCl，0.2% Triton X-100，及 10%甘油）， g. EDTA(0.5 M(pH 7.0)，100倍母液）， h. 正釩酸鈉（0·5 M，100倍母液）， i. 焦磷酸鈉（0.2 M，100倍母液）， j. NUNC 96孔V型底聚丙烯板（應用科學公司 (Applied Scientific)目錄No. AS-72092)， k. NIH3T3 C7#3 細胞（FLK-1 表現細胞）， l. DMEM含IX高葡萄糖L-麩醯胺（目錄No. 1 1965-050)， (請先閱讀背面之注意事項再I®本頁) •裝· 訂線 _- 1F19 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 1229073 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明說明（15〇) m. FBS(奇布可公司目錄No· 16000-028)， η· L-麩醯胺（奇布可公司，目錄No· 25030-016)， 0. VEGF，必普科技公司（PeproTech，Inc·)(目錄No· 100-20)(以含在Milli-Q dH20中1微克/ 100微升之母液保存在-20°C 下）， p. 親和性純化抗-FLK-1抗血清， q. 針對磷酸酪胺酸之UB40單株抗體（參見芬德利 (Fendley)等人，1990，Cancer Research 50:1550-1558)， r. EIA級山羊抗小白鼠IgG-POD(拜瑞公司（BioRad)目錄 No· 172-1011)， s. 2,2-連氮基-雙（3-乙基苯幷噻唑啉）-6-磺酸（ABTS)溶液（100 mM 擰檬酸（無水），250 mM Na2HP04(pH 4.0)，0·5 毫克/毫升ABTS(希格馬（Sigma)目錄No. Α-1888)，溶液應保存在4 °C暗處中，直到使用前爲止， t. H202 (30%溶液）（費雪公司（Fisher)目錄No· H325)， u. ABTS/H202 (15毫升ABTS溶液，2微升H202)，使用前 5分鐘製備，置於室溫下， v. 0.2 M HC1水溶液母液， w. 二甲亞颯（100%)(希格馬公司目錄No. D-8418)，及 y. 胰蛋白酶-EDTA (奇布可公司RRL目錄No. 25200-049) 。 ^ 方法 1. 在康寧96孔ELISA板上，每孔塗佈含1.0微克卡波抗兔子IgG抗體之0.1 M Na2C03 pH 9.6。補充每孔終體積至150 -153- 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事裝*--- 寫本頁) -線· 1229073 A7 五、發明說明（151) 微升。塗佈ELISA板於4°C下_夜。當板子存放在4。〇下時，可保存至長2週。 2.使細胞於生長培養基（DMEM，補充2·0 mM L_麩醯胺，10% FBS)中，於合適培養皿中，在m，5% c〇2下生長至融合止。 3 ·利用騰蛋白酶處理收集細胞，接種至康寧2 5 8 5 0聚苯乙晞96孔圓底細胞板中，25,0〇〇個細胞/孔含於2〇〇微升生長培養基中。 4· 使細胞於37°C，5% C02下生長至少一天。 5· 以D-PBS IX洗滌細胞。 6.添加200微升/孔斷食培養基（DMEM，2·〇 mM丨省醯胺，0.1% FBS)。於37°C，5% C02下培養一夜。 7·於聚丙烯96孔板中，使用斷食培養基稀釋化合物1 : 20。稀釋二甲亞砜1 ·· 20用於對照組孔中。 8 ·自96孔細胞培養板中排除斷食培養基，在各孔中添加162微升新鮮斷食培養基。 9 ·在各孔中添加1 8微升1 : 20稀釋化合物溶液（來自步驟7 )，於對照組孔中添加1 : 2 0二甲亞砜稀釋液（+/_ VEGF)，細胞刺激作用後之最終稀釋度爲丨·· 2〇〇。最終二甲亞砜爲0.5%。板子於37°C，5% C02下培養2小時。 1 0 ·板子反轉排除液體，以排除ELISA板中未結合之抗體。以TBSW+0.5%乙醇胺pH 7.0洗滌3次。以紙巾拍打板子，排除過多液體與氣泡。 11·以每孔150微升TBSW+0.5%乙醇胺，pH 7.0組斷板子 (請先閱讀背面之注意事寫本頁) -裝_ 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -154- 1229073 A7 五、發明說明（152) 反應。板子於微滴定板振盪器上振盪培養30分鐘。 1 2 ·依步驟1 〇所述洗滌板子3次。 13. 添加0.5微克/孔親和性純化之抗-FLU-1多株兔子抗血清。以TBSW+0.5%乙醇胺pH 7.0補充至終體積150微升/ 孔。板子振盪培養30分鐘。 14. 添加180微升斷食培養基至細胞中，以2〇微升/孔loo mM正釩酸鈉及500毫微克/毫升VEGF刺激細胞（每孔終濃度爲1.0 mM正釩酸鈉及50毫微克/毫升VEGF)，於37°C，5% C02下8分鐘。陰性對照組僅接受斷食培養基。 1 5 · 8分鐘後，應自細胞中排除培養基，以2〇〇微升/孔 P B S洗務一次。 1 6 ·於150微升/孔HNTG中溶解細胞，同時於室溫下振i 5分鐘。HNTG調配物包括正飢酸鋼、焦鱗酸鈉及edta。 17·依步驟10所述洗滌ELISA板三次。 1 8 ·自細胞培養板中轉移細胞溶胞液至elis A板中，振盈培養2小時。爲了轉移溶胞液，使吸管上下移動，同時刮除孔壁。 1 9 ·依步驟1 〇洗滌板子3次。 20· ELISA板與〇·〇2微克/孔UB40於TBSW + 〇·5%乙醇胺中培養。使終體積達150微升/孔。振盪培養3〇分鐘。 21·依步驟10洗滌板子3次。 22· ELISA板與稀釋1 : 1〇, 〇〇〇之ΕΙΑ級山羊抗小白鼠igG 共軛辣根過氧化酶，於TBSW加0.5%乙醇胺，pH 7 〇中培養。使終體積達150微升/孔。振盪培養3 0分鐘。 (請先閱讀背面之注意事寫本頁) 裝一-口：經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -155 1229073 A7 B7 五、發明說明（153) 23.依步驟10洗務板子。 2 4.添加100微升ABTS/H202溶液至孔中。振盪培養10分鐘〇 25 ·添加100微升0.2 M HC1，終濃度爲0.1 M HC1，以中止呈色反應。於室溫下振盪1分鐘。以緩慢流動之空氣排除汽泡，於410 nm ELISΑ板讀數器上讀取ELISΑ板。完整細胞之EGF受體-HER2嵌合受體分析法依下文説明測定完整EGFR-NIH3T3細胞之HER2激酶活性：材料與試劑：

a. EGF :母液濃度：16.5 ILM，EGF 201，日本TOYOBO 公司。 b. 05-101 (UBI)(辨識EGFR細胞外區之單株抗體）。 c · 抗磷酸酪胺酸抗體（抗-Ptyr)(多株）（參見上述芬德利等人文獻）。 d. 檢測抗體：山羊抗兔子IgQ辣根過氧化酶共軛物，加州塔哥公司（TAGO，Inc. Burlingame，CA)。 e. TBST緩衝液：

Tris-HCM，pH 7.2 50 mM

NaCl 150 mM

Triton X-100 0.1 f. HNTG 5X母液：

HEPES 0.1 M

NaCl 0.75 M 156 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐）請先閱讀背面之注意事 S· 寫本頁經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1229073 A7 B7 — 五、發明說明（154) 甘油 Triton X-100 g. ABTS 母液·· 擰檬酸 Na2HP04 濃HC1 ABTS* 50% 1.0%

100 mM 250 mM 0.5 mM 0.5毫克/毫升 *(2,2f-連氮雙（3-乙基苯幷噹唑啉磺酸））。溶液保存在4°C黑暗中，直到使用前爲止。 h · 母液試劑： EDTA 100 mM pH 7.0 Na3V04 0.5 Μ ’

Na4(P207) 0.2 Μ 方法預塗佈ELISA板 1 · 以05-101抗體塗佈ELISA板（康寧，96孔，目錄 #25805-96)，每孔0.5微克含於PBS中，100微升終體積/孔，於4 °C下保存一夜。已塗佈之板子於4 °C下保存時，可存放達10天。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 2 · 使用當天，排除塗佈緩衝液，改換100微升阻斷緩衝液（5 %康乃馨即溶脱指奶粉，含於PBS中）。板子於室溫下 (約23°C至25°C)振盪培養30分鐘。臨用前，排除阻斷緩衝液，以TBST緩衝液洗滌板子4次。接種細胞 -157- 本纸張瓦度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公爱） 1229073 Α7 Β7 五、發明說明（155) 1 · 此分析法採用過度表現嵌合受體且包含EGFR細胞外區及細胞内HER2激酶區之NIH3T3細胞株。 2.選出融合度80-90%之培養皿進行實驗。以胰蛋白酶處理細胞’添加10%胎牛血清中止反應。細胞懸浮在DMEM 培養基中（10% CS DMEM培養基），於1500 rpm，室溫下離心一次0 3·細胞懸浮在接種培養基中（DMEM，0.5%牛血清），採用錐蟲藍計算細胞數。生存率超過90%才可接受。細胞接種在96孔微滴定板之DMEM培養基（〇·5%牛血清）中，每孔密度10,000個細胞’每孔100微升。接種之細胞於5%匚〇2及37。〇下培養約4 0小時。分析過程 ’ 1 · 採用反轉式顯微鏡檢查接種細胞之污染情形。以 DMEM培養基稀釋藥物母液（1〇毫克/毫升dmSO) 1 : 10，然後取5微升移至TBST孔中，最終藥物稀釋度1 : 200，最終 DMSO濃度1%。對照組孔僅接受DMSO。於5% C02及3 7°C培養2小時。 2.製備EGF配位體：於DMEM中稀釋EGF母液，因此當取10微升稀EGF(稀釋1 : 12)移至孔内時，終濃度達1〇〇 mM。 3·製備新鮮HNTG*，使之足夠供應每孔100微升，並置於冰上。 . HNTG* (10毫升）： HNTG母液 2·〇毫升 milli-Q Η20 7·3 毫升 -158- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公爱） Q?先閱讀背面之注意事填寫本頁) 裝訂- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1229073 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明說明（156) EDTA，100 mM pH 7.0 0.5 毫升

Na3V04 (0.5 Μ) 0·1 毫升

Na4 (Ρ207) (0.2 Μ) 0.1 毫升 4. 與藥物培養120分鐘後，添加製備之SGF配位體至細胞中，每孔1 0微升，至終濃度100 nM。對照組孔僅接受 DMEM。於室溫下振盪培養5分鐘。 5. 排除藥物、EGF及DMEM。以PBS洗滌細胞2次。取 HNTG*移至細胞中，每孔100微升。置於冰上5分鐘。同時排除其他ELISA板上之阻斷緩衝液，依上述使用TBST洗條。 6 · 在微滴定管上小心加裝吸管尖頭，到除板上細胞，重覆吸出及添加HNTG*溶胞緩*液，使細胞材料均質化。轉移溶胞液至經塗佈、阻斷及洗滌之ELIS A板中。於室溫下振盪培養1小時。 7 · 排出溶胞液，以TBST洗滌4次。取新鮮稀釋之抗-Ptyr抗體移至ELISA板中，每孔100微升。於室溫下，於抗-Ptyr抗血清之存在下（於TBST中稀釋1 : 3000)，振盪培養30 分鐘。 8. 排除抗-Ptyr抗體，以TBST洗滌4次。取新鮮稀釋之 TAGO抗兔子IgG抗體移至ELISA板中，每孔100微升。於室溫下振盪培養30分鐘（抗兔子IgG抗體··於TBST中稀釋1 : 3000) 〇 9. 排除TAGO檢測抗體，以TBST洗滌4次。取新鮮製備之ABTS/H202溶液移至ELISA板中，每孔100微升。於室溫 -159- 本紙張又度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公釐） ----.---·----I!裝，------丨訂 (請先閱讀背面之注意事¥^^寫本頁)

1229073 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明說明（157) 下振盪培養20分鐘（ABTS/H202溶液：1.0微升30% H202含於 10毫升ABTS母液中）。 10.添加50微升51^1^23〇4(視需要添加）中止反應，於410 nm下測定光密度。 1 1 ·由陽性對照組減去陰性對照組數値，即測得磷酸酪胺酸最大訊號。扣除陰性對照組後，計算含萃液之孔中磷酸酪胺酸内容物之抑制百分比。 PDGF-R分析法除非另有説明，否則所有細胞培養基、麩醯胺及胎牛血清均可講自奇布可生命技術公司（Gibco Life Technologies， Grand Island，NY)。所有細胞均於 90-85% 空氣與 5-10% C02 之潮濕大氣中，於37°C下生長。所有細胞株均例行每週次培養二次，並由Mycotect法（奇布可公司）判定沒有黴漿菌生長。進行ELISA分析法時，細胞（U1242，得自約瑟夫史雷辛格公司（Joseph Schlessinger，NYU))於生長培養基中（含10% FBS、NEAA、1 mM NaPyr及2 mM GLW之MEM)生長至融合度80-90%，並接種至含0.5%血清之96孔組織培養板中，每孔25,000至30,000個細胞含於0.5%血清中。於含0.5%血清之培養基中培養一夜後，細胞換成無血清培養基，於5 % C02，37%培養箱中，以試驗化合物.處理2小時。再以配位體刺激細胞5至1 0分鐘，然後以HNTG溶解細胞（20 mM Hepes，150 mM NaCl，10% 甘油，5 mM EDTA，5 mM Na3V04，0.2% Triton X-100 及2 mM NaPyr)。取溶胞液（0.5 -160- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格(210 x 297公釐） --------------»!裝'— (請先閱讀背面之注意事寫本頁) 訂- •線- 1229073 A7 B7 五、發明說明（158) 毫克/孔，含於PBS中）_移至預先塗佈受體專一性抗體且經含 5% 牛奶之TBST(50 mM Tris-HCl pH 7.2，150 mM NaCl 及 0.1% Triton X-l00)於室溫下阻斷30分鐘之ELISA板中。溶胞液於室溫下振盪培養1小時。以TBST洗滌板子4次，然後於室溫下與多株抗磷酸酪胺酸抗體培養3 0分鐘。以TBST潤洗板子4次，以排除過量之抗磷酸酪胺酸抗體。添加山羊抗兔子IgG抗體至ELISA板中，於室溫下30分鐘後，再以TBST 潤洗4次。添加ABTS (100 mM擰檬酸，250 mM Na2HP04及 0.5毫克/毫升2,2^連氮基-雙-(3 -乙基苯幷噻唑啉-6-磺酸））加Η202(1·2毫升30% H202加至1 0毫升ABTS中）至ELISA板中，開始呈色。添加ABTS後約15至30分鐘，記錄410 nm下之吸光度，參考波長630 nm。 IGF-1受體分析法採用下列方法測定IGF-1受體上磷酸酪胺酸含量，此表示 IGF-1受體酪胺酸激酶活性。材料與試劑 a. 本方法採用之細胞株爲3T3/IGF-1R，係經基因工程處理可過度表現IGF-1受體之細胞株。 b. 由NIH3T3/IGF-1R於5% (：02及37°(：之培養箱中生長。生長培養基爲DMEM + 10% FBS(加熱去活性）+ 2 mM L-麩驢胺。 · c. 親和性純化之抗-IGF-1R抗體17-69。 d. D-PBS : KH2P〇4 0.20 克/升 -161 - 本纸張尺度通円中國國家標準（CNS)A4規格（2】〇χ 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項_填寫本頁) I 訂·· 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1229073 A7 B7 五、發明說明（159) e. f. KH2P〇4 2.16 克/升 KC1 0.20 克/升 NaCl 8.00 克/升（pH 7.2) 阻斷緩衝液：TBST加5%牛奶（康乃馨即溶脱脂奶粉）。 TBST緩衝液： 50 mM 150 mM (pH 7.2/HC1 10 N) 0.1% 稀釋過程中添加Triton X-100至 g·

Tris-HCl NaCl Triton X-10 製備TBS (10X)母液緩衝液中。 HNTG緩衝液： HEPES NaCl 甘油 Triton X-100 (請先閱讀背面之注意事裝---- 寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 20 mM 150 mM (pH 7.2/HC1 IN) 10% 0.2% 製備母液（5X)，保存在4°C下。 h. EDTA/HC1 : 0·5 M pH 7.0 (NaOH)，爲 100X母液。 i. Na3V04 : 0.5 Μ，100X母液，分成數等份保存在80°C。 j. Na4P207 : 0.2 Μ，100X母液。 k. 似胰島素生長因子-1，來自普美加公司（Promega)，目錄# G5111 。 1 · 兔子多株抗磷酸酪胺酸抗血清。 m. 山羊抗兔子IgG，POD共軛物（檢測抗體），Tago(目錄 No· 4520，批號 1802):塔哥公司（Tago，Inc.，Burlingame， 162- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1229073 A7 B7 五、發明說明（160) CA)。

n. ABTS(2,2、連氮基雙（3 -乙基苯幷噻唑啉磺酸））溶液：擰檬酸 100 mM

Na2HP04 250 mM (pH 4.0/1 N HC1) ABTS 0.5毫克/毫升 ABTS溶液應保存在4 °C暗處。當轉呈綠色時，應拋棄此溶液。〇 · 過氧化氫：3 0 %溶液，保存在4 °C暗處。方法下列所有步驟均於室溫下進行，除非另有説明。所有 ELISA板之洗滌法均以自來水潤洗板子3次，然後以TBST潤洗一次。以紙巾拍乾板子。細胞接種法： 1 · 細胞於組織培養皿（康寧25020-100)中生長至80至 90%融合度後，以胰蛋白酶-EDTA(0.25%，0.5毫升/D-100，奇布可公司）收穫細胞。 2. 細胞再度懸浮於新鮮DMEM + 10% FBS +2 mM L-麩醯胺中，移至96孔組織培養板（康寧25806-96)，20,000個細胞/孔（100微升/孔）。培養1天後，改換成無血清培養基（9 0/ 微升），於5% C02及37°C下培養一夜。 ELIS A板塗佈及阻斷法： … 1 . 以抗-IGF-1R抗體塗佈ELISA板（康寧25805-96)至少2 小時，0.5微克/孔100微升PBS中。 2. 排除塗佈塗液，改換100微升阻斷緩衝液，振盪3 0分 -163- 本纸張反度遠3中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事填寫本頁) -裝*· 訂· · 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 1229073 ____B7___ 五、發明說明（161 ) 鐘。即將添加溶胞液之前方排除阻斷緩衝液及洗條板子。分析法 1 . 於無血清條件下試驗藥物。 2 . 於9 6孔聚丙晞板中，以DMEM稀釋藥物母液（含於 100% DMSO中）1 : 10，取10微升/孔此溶液移至細胞中，最終藥物稀釋度1 : 100，最終DMSO濃度10%。細胞於5〇/〇 C02，37t下培養2小時。製備新鮮細胞溶胞緩衝液（HNTG*) HNTG 2毫升 EDTA 0.1毫升 Na3V04 0.1毫升 Na4(P207) 0.1毫升 H20 7.3毫升藥物培養2小時後，取10微升/孔200 nM IGF-1配位體之PBS溶液移至細胞中（終濃度20 nM)，於5% C02及37。〇下培養1 0分鐘。 5 · 排除培養基，添加100微升/孔HNTG*，振盪1 0分鐘。於顯微鏡下檢視細胞，觀察是否適當溶解。 6 ·採用1 2個通道之吸管自板上刮除細胞，以重覆吸出及添加之方式使溶胞液均質化。轉移所有溶胞液至塗佈抗體之ELISA板中，振盪1小時。 . 7· 排除溶胞液，洗滌板子，添加抗-pTyr(以TBST稀釋 1 ·· 3,000) 100微升/孔，振盪3〇分鐘。 8· 排除抗-PTyr，洗滌板子，添加TAGO(以TBST稀釋 •164- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（2】〇χ 297公爱） (請先閱讀背面之注意事項_填寫本頁) 裝：訂：經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1229073 A7 B7 五、發明說明（162) 1 ·· 3,000) 100微升/孔，振盪30分鐘。 9. 排除檢測抗體，洗滌板子，添加新鮮ABTS/H202 (1.2 微升H202至10毫升ABTS中）100微升/孔至板子中，開始呈色。於Dynatec MR5000檢測410 nm之吸光度，參考波長510 nm 0 EGFR分析法依下列方法測定經基因工程處理可表現人類EGF-R之細胞中EGF受體激酶活性：材料與試劑·· a. EGF配位體：母液濃度=16.5 " Μ，EGF 201，日本 TOYOBO公司。 b. 05-101 (UBI)(辨識EGFR細胞外區之單株抗體）。 c· 抗磷酸酪胺酸抗體（抗-Ptyr)(多株）。 d. 檢測抗體：山羊抗兔子IgG辣根過氧化酶共軛物，加州塔哥公司（TAGO，Inc. Burlingame, CA)。 (請先閱讀背面之注意事項填寫本頁) FI· 裝〜 0 . 經濟部智慧財產局員工消費合作社印制衣 TBST緩衝液·· Tris-HCl，pH 7 50 mM NaCl 150 mM Triton X-100 0.1 HNTG 5X母液： - HEPES 0.1 M NaCl 0.75 M 甘油 50 -165- 本纸張&度:¾ 3中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 163 ^1229073 A7 B7 五、發明説明（

Triton X-100 g. ABTS母液= 檸檬酸 Na3V04 濃HC1 ABTS* 1.0%

100 mM 250 mM 4.0 pH 0.5毫克/亳升 *溶液保存在4 °C黑暗中，直到使用前為止。 h . 母液試劑： EDTA 100 mM pH 7.0 Na3V〇4 0 5 Μ Na4(P207) 0.2 Μ 方法預塗佈ELISA板目錄 1. 以05-101抗體塗佈ELISA板（康寧，96孔 #25805-96)，每孔0.5微克含於PBS中，150微升終體積/孔，於4 °C下保存一夜。已塗佈之板子於4 °C下保存時，可存放達1 0天。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 2 . 使用當天，排除塗佈緩衝液，改換阻斷緩衝液（5 % 康乃馨即溶脫脂奶粉，含於PBS中）。板子於室溫下（約23 °c 至25 °C )振盪培養3 0分鐘。臨用前，排除阻斷緩衝液，以 TBST緩衝液洗滌板子4次。。接種細胞 1 . 此分析法採用NIH 3T3/C7細胞株（亨尼格（Honegger) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 1229073 A7

五、發明說明（164 ) 等人，Cell 51:199-209，1987)。 ,---,----裝--- (請先閱讀背面之注意事、寫本頁) 2 ·選出融合度80-90°/。之培養皿進行實驗。以騰蛋白酶處理細胞’添加10% CS DMEM培養基中止反應。細胞懸浮在DMEM培養基中（10% CS DMEM培養基），於1000 rpm，室溫下離心5分鐘一次。 3 ·細胞懸浮在接種培養基中（DMEM，0.5%牛血清），採用錐蟲藍計算細胞數。生存率超過9〇%才可接受。細胞接種在96孔微滴定板之DMEM培養基（〇·5%牛血清）中，每孔密度ιο,οοο個細胞，每孔1〇〇微升。接種之細胞於5% 下培養約4 0小時。分析過程 1 ·採用反轉式顯微鏡檢i接種細胞之污染情形。以 DMEM培養基稀釋藥物母液（1〇毫克/毫升dmSO) 1 ·· 10，然後取5微升移至試驗孔中，最終試驗化合物藥物稀釋度1 : 200 ’最終DMSO濃度1 %。對照組孔僅接受dmSO。於5% C02及37°C培養1小時。 2·製備EGF配位體：於DMEM中稀釋EGF母液，因此當取10微升稀EGF(稀釋1 : 12)移至孔内時，終濃度達25 mM。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 3·製備新鮮1〇毫升HNTG*，使之足夠供應每孔1〇〇微升，其中HNTG*包含：HNTG母液（2.0毫升），milli-Q H20 (7.3¾ 升），EDTA，100 mM pH 7·0 (0·5毫升），Na3V04 (0·5 Μ) (0.1 毫升），Na4 (P2〇7) (〇·2 Μ) (0.1 毫升）。 4 . 置於冰上。 5 .與藥物培養120分鐘後，添加製備之EGF配位體至細 -167- 本纸張纹度適闬中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公爱）" 1229073 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明說明（165) 胞中，每孔1 0微升，至終濃度2 5 nM。對照組孔僅接受 DMEM。於室溫下振盪培養5分鐘。 6. 排除試驗化合物、EGF及DMEM。以PBS洗滌細胞2 次。取HNTG*移至細胞中，每孔100微升。置於冰上5分鐘。同時排除其他ELISA板上之阻斷緩衝液，依上述使用 TBST洗滌。 7 · 在微滴定管上小心加裝吸管尖頭，刮除板上細胞，重覆吸出及添加HNTG*溶胞緩衝液，使細胞材料均質化。轉移溶胞液至經塗佈、阻斷及洗滌之ELIS A板中。於室溫下振盪培養1小時。 8. 排出溶胞液，以TBST洗滌4次。取新鮮稀釋之抗-Ptyr抗體移至ELISA板中，每孔、00微升。於室溫下，於抗-Ptyr抗血清之存在下（於TBST中稀釋1 : 3000)，振盪培養30 分鐘。 9. 排除抗-Ptyr抗體，以TBST洗滌4次。取新鮮稀釋之 TAGO 30抗兔子IgG抗體移至ELISA板中，每孔100微升。於室溫下振盪培養30分鐘（抗兔子IgG抗體：於TBST中稀釋 1 : 3000)。 1 0 ·排除檢測抗體，以TBST洗滌4次。取新鮮製備之 ABTS/H202溶液移至ELISA板中，每孔100微升。於室溫下振盪培養20分鐘（ABTS/H202溶液：1.2微升30% H202含於 10毫升ABTS母液中）。 1 1 ·添加5 0微升5N H2S04 (視需要添加）中止反應，於410 nm下測定光密度。 -168- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項填寫本頁)

-mmmm B 裝，_ 訂· 1229073 A7 B7 五、發明說明（166) 1 2 ·由陽性對照組減去陰性對照組數値，即測得磷酸路胺酸最大訊號。扣除陰性對照組後，計算含萃液之孔中鱗酸酪胺酸内容物之抑制百分比。

Met自體磷酸化分折法此分析法測定Met酪胺酸激酶活性，其係分析Met受體上之Met蛋白質酪胺酸激酶含量。試劑 a. HNTG (5X母液）：取 23.83 克 HEPES及 43·83 克NaCl溶於約350毫升dH20中。以HC1或NaOH調至pH 7.2，添加500毫升甘油及1 0毫升Triton X-100，混合，添加dH20至總體積1 升。製備1升1 X操作溶液時，添加2〇〇毫升5 X母液至800毫升dH2〇中，必要時檢查及調整pH，保存在4°c下。 b. PBS(杜氏（Dulbecco’s)磷酸鹽緩衝食鹽水），奇布可公司目錄# 450-1300ΕΒ(1Χ溶液）。 c·阻斷緩衝液：在500毫升dH2〇中添加1〇〇克BSA，12.1 克 Tris-pH 7.5，58.44 克 NaCl 及 10 亳升 Tween_2〇，稀釋至總體積1升。 d.激酶緩衝液：在500毫升dH2〇中添加12.1克TRIS (pH 7·2) ’ 58.4 克 NaCl，40·7 克 MgCl2 及 1·9 克 EGTA，以 dH20 調至經濟部智慧財產局員工消費合作社印製總體積1升。 e* PMSF (苯甲續醯氟）’希格馬目錄# P-7626，435.5毫克，添加100%乙醇至總體積25毫升，滿轉混合。 f. ATP(來自細菌），希格馬目綠#A-7699，以粉末保存在-20°C下，使用特製成溶液，取331毫克溶於1毫升dH2〇 -169- 义度述3中國國家標準（cns)a4規格（210 X 297公釐 1229073 A7 ___B7___ 五、發明說明（167 ) 中。 g. RC-2〇H HRPO共軛抗磷酸酪胺酸，轉導實驗室 (Transduction Laboratories)目錄# E120H。 h. Pierce l-StepTM Turbo TMB-ELISA (3,3’，5,5’-四甲基聯苯胺，皮爾斯（Pierce)目錄# 34022。 i. H2S04，添加1毫升濃H2S04 (18 N)至35毫升dH2〇中。 j. TRIS HCL，費雪目綠# BP 152-5，121.14克，添加 600 毫升 MilliQ H20，以 HC1 調至 pH 7.5 (或 7.2)，以 MilliQ H20補充至1升體積。 k. NaCl，費雪目錄# S271-10，補充至5M溶液。 l. Tween-20，費雪目錄# S337-500。 m. Na3V04，費雪目錄# S454-50，1.8克，添加80毫升 MelliQ H20，以HC1或NaOH調至pH 10.0，於微波爐中煮沸，冷卻，檢查p Η，查重覆此步驟直到p Η穩定達到1 〇·〇爲止，添加MilliQ Η20至總體積100毫升，取1毫升分裝，保存在-80〇C 〇 η· MgCl2，費雪目錄# Μ33-500，配成1Μ溶液。〇· HEPES，費雪目錄# BP310-500，取59.6克加至2〇〇毫升MilliQ仏0中，調至pH 7.5，補充至總體積250毫升，無菌過遽。 ρ· 牛白蛋白（BSA)，希格馬目錄# A-4503，30克，添加無菌蒸餾水至總體積300毫升，保存在4°C。

q· TBST緩衝液；在含約900毫升dH20之1升定量筒中添加6.057克TRIS及8.766克NaCl，溶解時以HC1調整至pH -170- 本紙張尺度適用中國國家標準（Cns)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項寫本頁) 訂* 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1229073 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明說明（168 ) 7.2 ’添加1 ·〇毫升Trit〇n X-1〇〇，以dH20補充至總體積1升。 r. 親和性純化之山羊抗體兔子IgG(完整分子），卡波目綠# 55641。 s· 抗h-Met (C-28)兔子多株IgG抗體，山塔克魯茲化學 (Santa Cruz Chemical)目錄# SC-161。 t· 暫時轉感染EGFR/Met嵌合細胞（EMR)(柯馬達 (Komada)等人，〇nc〇gene，8:2381-2390 (1993))。 u. 碳酸鈉緩衝液（—28〇4，費雪目綠#8495):10.6克，添加800毫升MilliQ H20，溶解時，以NaOH調至pH 9.6，以 MilliQ HA補充至1升總體積，過濾，保存在4。〇下。方法：下列所有步驟均在室溫下進行，除非另有説明。所有 ELISA板均以TBST洗滌4次。 EMR溶胞法在開始捕捉受體前一晚或之前可進行此方法。 1·於37°C水浴中，以旋轉運動迅速解凍溶胞液，直到最後一個晶胞消失爲止。 2·以含1 mM PMSF之IX HNTG溶解細胞塊。每個15公刀、.田胞培養皿使用3毫升HNTG。添加HNTG計I骨告穑夕 …滿轉試μ分鐘，添加其餘娜，再^ 積（ 3·試管平衡稱重，於4°C及1〇,〇〇〇>^下離心1〇分鐘。 4 ·收集上澄液，取部份進行蛋白質測定。 5·收集之樣本於乾冰/乙醇浴中迅速冷;東。不論溶胞液是否保存-夜在或在測定蛋白質後立即使用均應進行此步 171 - ‘纸張尸、度適…中國國家標準（CNS)A4規格⑵公髮） (請先閱讀背面之注意事項寫本頁) i· :裝： •f 1229073 Α7 Β7 五、發明說明（169 ) 驟。 6.採用二辛可寧酸（BCA)法（BCA分析試劑套組，皮爾斯化學公司目錄# 23225)測定蛋白質。 ELISA 法 1 ·以母孔含5彳政克山羊抗兔子抗體之碳酸鹽緩衝液塗佈康寧96孔ELISA板，孔總體積50微升。於4。(：下保存一夜。 2 ·反轉板子排除液體，以排除未結合之山羊抗兔子抗體。 3 ·在各孔中添加150微升阻斷緩衝液。振盪培養3 〇分鐘。 4 ·以TBST洗滌4次。於紙巾上拍打，以排除過量液體與汽泡。 5 ·每孔添加1微升兔子抗Met抗體，於TBST中稀釋，孔總體積100微升。 6. 於HNTG中稀釋溶胞液（90微克溶胞液/1〇〇微升）。 7. 各孔中添加1〇〇微升稀釋之溶胞液。振盪6〇分鐘。 8 ·以ST洗滌4次。於紙巾上拍打去除過量液體與汽泡0 9 · 每孔添加5 0微升1 X溶胞液緩衝液。 1 0 ·於聚丙烯9 6孔板中，以1 X激酶緩衝液稀釋化合物/ 萃液1 : 1 0。 1 1 ·取5.5微升稀釋之化合物加至ELISA板之孔中。於室溫下振盪培養20分鐘。 1 2 ·每孔添加5.5微升60 " Μ ATP溶液。陰性對照組未接受任何ΑΤΡ。振盪培養9 0分鐘。 -172- 本纸張尺度適用中國國豕標準（CI\S)A4規格（210 X 297公爱） (請先閱讀背面之注意事項寫本頁) 裝·· .. 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1229073 A7 B7 五、發明說明（170) 1 3 ·以TBST洗滌4次。於紙巾上拍打，以排除過量液體與汽泡。 14. 每孔添加100微升RC 20(於阻斷緩衝液中稀釋1 : 3000)。振盪培養3 0分鐘。 15. 以TBST洗滌4次，於紙巾上拍打，以去除過量液體與汽泡。 16. 每孔添加100微升Turbo-TMB。振盪培養30至60分鐘0 17. 每孔添加100微升1MH2S04，以中止反應。 1 8 · 於Dynatech MR 7000 ELIS A讀數器上讀取分析數據。試驗遽塾=4 5 0 nm，參考滤蟄= 410 nm。生4匕s r c分析採用此分析法測定src蛋白質激酶活性，測定生物素化肽之磷酸化數値。材料與試劑： a . 以 src(蘇根公司（Sugen，Inc·，Redwood City，CA))轉化酵母。 b . 細胞溶胞液：取表現src之酵母細胞離心集結成塊，以水洗滌一次，再離心集結成塊，保存在-80°C下至使用前止。 c . N -末端生物素基4匕EEEYEEYEEEYEEEYEEEY係依相關技藝專家習知之標準方法製備。 d . DMSO :希格馬公司（Sigma，St· Louis，MO)。 e. 96孔ELISA板··康寧96孔易洗滌改良式平底板，康 -173 本纸K度適3中國國家標準（CNS)A4規格（2]0 X 297公釐）請先閱讀背面之注意事

I 寫本頁經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1229073 B7 五、發明說明（171 ) 寧目錄# 25805-96。 f. NUNC 96孔V型底聚丙晞板，用於稀釋化合物··應用科學公司目綠# A-72092。 g. Vecastain ELITE ABC 試劑：特公司（Vector， Burlingame，CA) 0 h. 抗-src (327) mab :採用粟酒裂殖酵母（Schizo-saccharomyces Pombe)來表現重組之src(斯柏地-富加 (Superti-Furga)等人，EMBO J.? 12:2625-2634，斯柏地-富加等人，Nature Biochem·，14:60〇-605)。粟酒裂殖酵母菌株SP 200(h-s leul. 32 ura4 ade210)依上述方法生長，且利用乙酸鋰法（上述斯柏地-富加文獻）轉化成pRSP表現質體。細胞於 1 A 胺存在下生長’以抑制nmtl發動子表現，或於1"M 硫胺素不存在下生長，以誘發表現。 u 單株抗磷酸酪胺酸，UBI 〇5-321(可改用UB 40替代）。 j· Turbo TMB-ELISA過氧化酶受質：皮爾斯化學公司。緩衝溶液 a· PBS(杜氏磷酸鹽緩衝食鹽水）：gibCO PBS，奇布可目綠# 450-1300EB。經濟部智慧財產局員工消費合社印製 b*阻斷緩衝液：5%脱脂奶粉（康乃馨牌）含於PBS中。 c·碳酸鹽緩衝液：Na2C〇4來自費雪公司，目綠# S495，配成100 mM母液。 “ d·激酶緩衝液：1·〇毫升（來自1M母液）MgCl2，0.2毫升 (來自1M母液）MnCl2，0.2毫升（來自iM母液）DTT，5.0毫升 (來自1M母液）HEPES，〇.1毫升丁^⑼，以MiUiQ h20調至本紙張又度適用 ~ 174 -

國國家標準（CNS)A4規格（210 X A7 1229073 _______B7 五、發明說明（172) 1 0毫升總體積。 e. 溶胞緩衝液：5·0 HEPES(來自1M母液），2·74毫升 NaCl(來自5Μ母液），1〇毫升甘油，1,〇毫升ΤΧ-100，0.4毫升EDTA(來自1〇〇 mM母液），1.0毫升PMSF(來自100 mM母液），0.1毫升Na3N04(來自0·1 Μ母液），以MilliQ H20配至總體積100毫升。 f· ATP :希格馬目錄# A-7699，配成10 mM母液（5.51毫克/毫升）。 g· 丁1113-^1(：1:費雪目綠#8?152-5，添加12.14克至600 毫升MilliQ H2〇中，以HC1調至pH 7.5，以MilliQ H20配至總體積1升。 h. NaCl :費雪目錄# S271-10，以 MilliQ H20 配成 5M 母液0 i. Na3N04 :費雪目錄# S454-50，添加1.8克至80毫升 MilliQ H20中，以HC1或NaOH調至pH 10.0，於微波爐中煮沸，冷卻，檢查pH，經過加熱/冷卻循環後，重覆調整pH 直到pH保持穩定爲止，以MilliQ H20配成100毫升總體積，取1毫升保存在-80°C下。 j · MgCl2 ··費雪目錄 # M33-500，以 MilliQ H20 配成 1 Μ 母液。 k· HEPES :費雪目錄# BP 310-500，添加59.6克至200毫升MilliQ H20中，調至PH 7.5，以MilliQ H20配成250毫升總體積，無菌過濾（1 Μ母液）。 1. TBST 緩衝液：添加 6.057 克 TRIS 及 8.766 克 NaCl 至 900 -175- 本紙張义度適$中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） --------丨丨丨裝*--- (請先閲讀背面之注意事項寫本頁) 訂· 經濟部智慧財產局員工消費合作社印一私 1229073 A7 B7 五、發明說明（173) 毫升dH20中，以HC1調至pH 7.2，添加1.0毫升Triton X-100，以dH20配成1升總體積。

m. MnCl2 :費雪目錄# M87-100，以 MilliQ H20 酉己成 1M 母液。 n. DTT :費雪目錄# ΒΡ172-5。〇· TBS(TRIS緩衝食鹽水）：添加6.057克TRIS及8.777克 NaCl至900毫升MilliQH20中，以MilliQH20配成1升總體積。 ρ· 激酶反應混合物：每個分析板之用量（100孔）：1.0毫升激酶緩衝液，200微克GSK，以MilliQ H20配成終體積 8.0毫升。 q. 標識生物素之EEEYEEYEEEYEEEYEEEY :臨用前於水中新鮮製備肽母液（1 mM，2.98毫克/毫升）。 r. Vectastain ELITE ABC試劑：製備14毫升操作試劑時，取1滴試劑A加至1 5毫升TBST中，反轉試管數次混合。然後添加1滴試劑B。試管置於室溫下環繞式振盪器上’混合3 0分鐘。方法：塗佈src之ELISA板製法 1 · 以含0.5微克/孔抗-src mab之100微升pH 9.6碳酸鈉緩衝液塗佈ELISA板，保持4°C下一夜^ 2. 以PBS洗滌孔一次。 3 · 以〇 · 15毫升5%牛奶之PBS之溶液於室溫下阻斷培養板一夜0 -176- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項；^寫本頁) rl裝： *1=口，·. 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1229073 A7 B7 五、發明說明（174) 4. 以PBS洗滌板子5次。 5 . 添加1 0微克/孔src轉化之酵母溶胞液，於溶胞緩衝液中稀釋（每孔總體積0.1毫升）（每批次之間之溶胞液量可能會有變化）。板子於室溫下振盪2 0分鐘。塗佈磷酸酪胺酸抗體之ELIS A板之製法 1. 4G10板：於4°C下，以含0.5微克/孔4G10之100微升 PBS塗佈一夜，於室溫下，以150微升含5%牛奶之PBS阻斷 3 0分鐘。激酶分析法 1 . 排除板子上未結合之蛋白質，以PBS洗滌板子5次。 2. 每孔添加0.08毫升激酶反應混合物（含1 0微升10X激酶緩衝液及於水中稀釋成每孔10 A Μ(終濃度）生物素-ΕΕΕΥΕΕΥΕΕΕΥΕΕΕΥΕΕΕΥ 0 3. 添加10微升於含10% DMSO之水中稀釋之化合物，於室溫下預培養1 5分鐘。 4. 添加1 0微升/孔0·05 mM ΑΤΡ之水溶液（最終5 // Μ ATP)開始反應。 5 · ELISA板於室溫下振盪15分鐘。 6. 每孔添加10微升0.5 M EDTA中止反應。 7. 取90微升上澄液加至經阻斷之塗佈4G10之ELISΑ板中 0 .. 8. 於室溫下振盪培養3 0分鐘。 9. 以TBST洗滌板子5次。 10. 於室溫下與Vectastain ELITE ABC試劑（100微升/孔） -177- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（2】0 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項寫本頁) ：裝：訂. 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1229073 A7 B7 五、發明說叼（175) 培養30分鐘。 1 1 ·以TBST洗滌孔5次。 12.以 Turbo TMB展開。生化lck分析法採用此分析法測定lck蛋白質激酶活性，以GST- C之磷酸化數値爲測定値。材料與試劑： a· 經lek轉化之酵母：，採用粟酒裂殖酵母（Schizo_ saccharomyces Pombe)來表現重組之lck (斯柏地-富加 (Superti-Furga)等人，EMb〇 j^ 12:2625-2634，斯柏地-富加等人’ Nature Biochem., 14:600-605)。粟酒裂殖酵母 SP 200 (h-s leul· 32 ura4 ade21〇)依上▲方法生長，且利用乙酸鋰法 (上述斯柏地-富加文獻）轉化成pRSP表現質體。細胞於1 # μ 硫胺素存在下生長，以誘發表現。 b · 細胞溶胞液：使表現lck之酵母細胞離心集結成塊，以水洗滌一次，再離心集結成塊，於_8〇。〇下冷凍保存至使用時止。 c · GST- C :自舊金山加州大學霍華胡斯醫學研究所 (Howard Hughes Medical Institute)之亞瑟懷斯（Arthur Weiss) 得到用於在細菌中表現之編碼GST- C融合蛋白質之DNA。轉化之細菌於2 5 °C下振盪生長一夜。利用穀胱甘肽親和性層析法（法馬藥废，Pharmacia, Alameda，CA)純化GST-亡。 d· DMSO ··希格馬公司（Sigma，St. Louis，M〇）。 e. 96孔ELISA板：康寧96孔易洗改良式平底板，康寧 -178- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項寫本頁) 裝' · 訂·· 經濟部智慧財產局員工消費合作社印制衣 1229073 Α7 Β7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明說明（176) 目錄#25805-96 〇 f· NUNC 96孔V型底聚丙晞板，用於稀釋化合物：應用科學公司目錄#AS-72092。 g·純化之兔子抗_GST抗血清：安瑞（Amrad)公司（澳洲）目錄# 90001605。 h·山羊抗兔子JgG-HRP :艾莫珊（Amersham)公司目錄# V010301。， i.綿羊抗小白鼠kG (H+L):傑克森實驗室目錄# 5215_ 005-003 〇 j · 抗_Lck (3 A5) mab :山塔克魯茲生物科技公司目錄# sc-433 〇 k · 早株抗鱗酸路胺自父UBI 05-321(可改用UB40)。緩衝溶液 a· PBS(杜氏磷酸鹽緩衝食鹽水” GIBc〇 pbs，奇布可目錄# 450-1300EB 〇 b·阻斷緩衝液：1〇〇克 BSA，12.1 克 TRIS (pH 7.5)， 5 8.44克—(：卜10毫升丁\¥6611-20，以]^11丨(5 112〇補充至1升總體積。 c. 碳酸鹽緩衝液：Na2C04來自費雪公司，目綠# S495，以MilliQ H20配成100 mM母液。 d. 激酶緩衝液：1·〇毫升（來自1 Μ母液）MgCl2，0·2毫升 (來自1Μ母液）MnCl2，0.2毫升（來自1Μ母液）DTT，5·〇亳升 (來自 1 Μ母液）HEPES，0.1 毫升 τχ-ΐ〇〇，以 MilliQ Η2〇調至 1 0毫升總體積。 -179- 本纸張&度H々國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公爱） (請先閱讀背面之注意事項寫本頁)

-I I 裝1 訂’ 1229073 A7 B7 五、發明說明（177) e. 溶胞緩衝液：5.0 HEPES(來自1M母液），2.74毫升 NaCl(來自5Μ母液），10毫升甘油，1·〇毫升ΤΧ-100，0.4毫升EDTA(來自100 mM母液），1·〇毫升PMSF(來自100 mM母液），0.1毫升Na3N04(來自〇·1 Μ母液），以MilliQ H20配至總體積100毫升。 f. ATP :希格馬目錄# A-7699，配成10 mM母液（5.51克 /毫升）。 g. 丁犯-11(：1:費雪目錄#6?152-5，添加121.14克至 600 毫升 MilliQ H20 中，以 HC1 調至 pH 7.5，以 MilliQ H20 配至總體積1升。 h· NaCl :費雪目錄# S271-10，以 MilliQ H20配成 5M 母液。 i· Na3N04 :費雪目錄# S454-50，添加1.8克至80毫升 MilliQ H20中，以HC1或NaOH調至pH 10.0，於微波爐中煮沸’冷卻，檢查p Η，經過加熱/冷卻循環後，重覆調整p Η 直到pH保持穩定爲止，以MilliQ Η20配成100毫升總體積，取1毫升保存在-80°C下。 j · MgCl2 :費雪目錄# M33-500，以 MilliQ H20配成 1 Μ 母液。 k· HEPES :費雪目錄# BP 310-500，添加59.6克至200毫升MilliQ H20中，調至pH 7.5，以MilliQ H20配成250毫升總體積，無菌過濾（1 Μ母液）。 1· 牛白蛋白（BSA)，希格馬目錄# Α4503，取30克加至 150毫升MilliQ η20中，以MilliQ Η20配成300毫升總體積， -180 - 本紙扠尺度!®用中®國家標準（CNS)A4規格⑵0 X 297公爱） (請先閱讀背面之注意事項^?^寫本頁) 裝*· 經濟部智慧財產局員工消費合作社印制π 1229073 A7 B7 五、發明說明（178) 經0.22微米濾紙過濾，保存在4°C下。 m TBST緩衝液：添加6.057克TRIS及8.766克NaCl至900 毫升dH20中，以HC1調至pH 7.2，添加1 ·0毫升Triton X-100，以dH20配成1升總體積。 n. MnCl2 :費雪目錄# Μ87-100，以MilliQ Η20配成 1 Μ 母液。〇· DTT :費雪目錄# ΒΡ172-5。 ρ· TBS(TRIS緩衝食鹽水）：添加6.057克丁1113及8.777克

NaCl至900毫升MilliQ H20中，以MilliQ H20配成1升總體積。 q. 激酶反應混合物：每個分析板之用量（100孔）：1.0毫升激酶緩衝液，200微克GST-G，以MilliQ H20配成終體積 8.0毫升。方法：塗佈Lck之ELIS A板之製法 1· 以含於100微升pH 9.6碳酸鈉緩衝液中之2.0微克/孔綿羊抗-小白鼠IgG塗佈，於4 °C下一夜。 2. 以PBS洗滌孔一次。 3 . 以〇· 15毫升阻斷緩衝液於室溫下阻斷板子反應3 0分鐘0 4. 以PBS洗滌板子5次。秦 5 · 於室溫下添加含於0.1毫升PBS中之〇·5微克/孔抗_lck (mab 3A5) 1 至2小時。 6. 以PBS洗滌板子5次。 -181 - 本紙張K/艾適:;丨中國國家標準（CNS)A4規格（2〗〇 X 297公爱） -I I I I,— I I Ί I 1^ - 11 (請先閱讀背面之注意事項寫本頁) 訂_ 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1229073 A7 B7 五、發明說明（I79) 7 · 添加於溶胞緩衝液中稀釋（每孔總體積〇· 1毫升）之2 0 微克/孔經lck轉化之酵母溶胞液。板子於4 °C下振盪一夜，以防喪失活性。塗佈磷酸酪胺酸抗體之ELISA板之製法 1 · UB40板：含於100微升PBS中之1.0微克/孔UB40於4°C 下一夜，以150微升阻斷緩衝液阻斷至少1小時。激酶分析法 1 · 排除板子上未結合之蛋白質，以PBS洗滌板子5次。 2 · 每孔添加〇·〇8毫升激酶反應混合物（含1 〇微升1 〇χ激酶緩衝液及加水稀釋之每孔2微克GST4 )。 3 · 添加1 〇微升於含10% DMSO之水中稀釋之化合物，於室溫下預培養15分鐘。 · 4 · 添加1 〇微升/孔0· 1 mM ATP之水溶液（最終10 " Μ ATP)開始反應。 5 . ELISA板於室溫下振盪15分鐘。 6. 每孔添加1 〇微升0·5 M EDTA中止激酶反應。 7· 取90微升上澄液加至經阻斷之塗佈4G10之ELISΑ板中〇 8. 於室溫下振盪培養3 0分鐘。 9 · 以T B S T洗務板子5次。 1 0 ·於室溫下與於1〇〇微升TBST中稀釋1 : 5000之兔子抗-GST 抗體培養3 0分鐘。 1 1·以TBST洗滌孔5次。 12.於室溫下與於1〇〇微升TBST中稀釋1 : 20,000之山羊 -182 - 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項寫本頁) 裝：經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1229073 A7 B7 I五、發明說明（18G) 抗兔子-IgG-HRP培養3 0分鐘。 13. 以TBST洗滌孔5次。 14. 以 Turbo ΤΜΒ展開。測定RAF之磷酸化功能之分析法下列分析法説明其目標蛋白質MEK及MEK之目標MAPK之 RAF-催化磷酸量。RAF基因序列説明於波尼（Bonner)等人， 1985, Molec. Cell· Biol·, 5:1400-1407，且很容易且多重基因序列數據銀行取得，本發明此部份採用之核酸媒體之構築法及細胞株已詳細説明於莫里森（Morrison)等人之1988, Proc. Natl. Acad. Sci· USA, 85:8855-8859 ° 材料與試劑 1. Sf9(草地黏蟲（Spodoptera frugiperda)細胞，奇布可公司（GIBCO-BRL，Gaithersburg，MD) 〇 2· RIPA 緩衝液：20 mM Tris/HCl pH 7.4，137 mM NaCl，10%甘油，1 mM PMSF，5毫克/升抗蛋白酶肽、0.5% Triton X-100。 3· 硫氧化還原蛋白-MEK融合蛋白質（T-MEK):根據製造商之方法進行親和性層析法表現及純化T-MEK。目錄# K350-01 及 R 350-40，因維金公司（Invitrogen Corp·，San Diego, CA) 0 4. 於經編碼His-MAPK之pUC18媒體轉化之XL1 Blue細胞中表現His-MAPK (ERK-2)，附His之MAPK。採用Ni-親和性層析法純化His-MAPK。目錄# 27-4949-01，法馬藥廠 (Pharmacia, Alameda，CA) 〇 -183- 本纸張尺度这引中國國家標準（CNS)AO見格⑵0 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項^^寫本頁) FI裝：經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1229073 A 7 B7 五、發明説明（181) 5 . 轉羊抗小白鼠IgG :傑克森實驗室（Jackson laboratories，West Grove，PA)，目錄 # 5 15-006-008，批號 28563 ° 6. RAF-1蛋白質激酶專一性抗體··來自UBI之URP2653。 7. 塗佈緩衝液：PBS，磷酸鹽緩衝食鹽水，奇布可公司 (GIBCO-BRL，Gaithersburg，MD)。 8. 洗滌緩衝液：TBST(50 mM Tris/HCL pH 7.2，150 mM NaCl，0.1% Triton X-100)。 9. 阻斷緩衝液：TBST，0.1%乙醇胺，pH 7.4。 1 0 . DMSO，希格馬公司（Sigma，St. Louis，MO)。 1 1 .激酶緩衝液（KB) : 20 mM HEPES/HC1 pH 7.2，150 mM NaCl，0.1% Triton X-100，1 mM PMSF，5毫升/升抗蛋白酶肤、75 mM正訊酸鋼，0.5 mM DTT及10 mM MgCh。 1 2. ATP混合物·· 100 mM MgCl2，300 mM ATP，10 mCi r33P ATP(杜邦-NEN)/毫升。 13.中止反應溶液：1 %磷酸，費雪公司（Fisher， Pittsburgh，PA) 0 1 4 .華克纖維素磷酸酯濾墊，芬蘭華克公司（Wallac， Turku, Finnland) 0 15.濾墊洗滌溶液：1%磷酸，費雪公司（Fisher， Pittsburgh，CA)。 - 1 6 ·湯狄克板收集器（Tomtec plate harvester)，華克公司 (Wallac，Turku，Finnland) 〇 17.華克冷-板讀數機# 1205，華克公司（Wallac, Turku， •____—_- 1R4,— 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再111^本頁) -棄· 口經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1229073 A7

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Finnland) ° 18. NUNC 96孔V型底聚丙晞板，供化合物用公司目錄# AS-72092。心用科學方法下列所有步驟均在室溫下進行，除非另有説明。 1·塗佈ELISA板：以100毫升綿羊抗小白鼠經化之抗血清（1毫克/100毫升塗佈緩衝液）塗佈/於純 C下一伙。ELISA板當於4 °C下存放時，可使用2週。 2 ·反轉板子並排除液體。添加1 〇〇毫升阻斷溶液， 30分鐘。 4 吾養 3·排除阻斷溶液，以洗滌緩衝液洗滌4次。板子於紙巾上拍打以排除過量液體。 · 、 4·添加1毫克針對RAF-1之抗體至各孔中，培養i小時。依步驟3所述洗滌。 5 .取RAS/RAF感染之Sf9細胞之落胞液解;東，以tbST稀釋至1 0毫克/1 〇〇毫升。添加1 〇毫克稀釋之溶胞液至孔中，培養1小時，板子振盪培養。陰性對照組不接受溶胞液。細胞經重組桿病毒感染（各病毒之MOI爲5)後，由RAS/RAF感染之Sf9昆蟲細胞製備溶胞液。以PBS洗滌細胞一次，於 RIPA緩衝液中溶解細胞。離心排除不溶物（5分鐘，ι〇,〇〇〇 χ g)。取部份溶胞液於乾冰/乙醇中冷凍，保存在-80°C下直到使用時爲止。 6 . 排除未結合之物質，依上述步驟3所述洗滌。 7 · 每孔添加2毫克T-MEK及2毫克His-MAEPK，並以激 (請先閱讀背面之注咅？事項寫本頁) -1 - 裝：訂.· -185- 本纸張尺度適用々國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1229073 A7 B7 五、發明說明（183) 酶緩衝液調至4 0毫升體積。本文例舉自細胞萃液中純化τ_ ΜΕΚ及ΜΑΡΚ之方法。 -----.---^----裝'--- (請先閱讀背面之注意事項寫本頁) 8. 於含1% DMSO之TBST中預先稀釋化合物（母液1〇毫克/毫升DMSO)或萃液20倍。添加5毫升預先稀釋之化合物/ 萃液至步驟6説明之孔中。培養2 0分鐘。對照組不接受藥物0 9· 添加5毫升ΑΤΡ混合物開始激酶反應，板子於ELISA 板振盪器上振盪培養。 1 0 · 6 0分鐘後，添加3 0毫升中止反應溶液至各孔中，中止激酶反應。 1 1 ·取鱗酸纖維素墊及ELIS Α板置於湯狄克（T〇mtec)板收集器上。根據製造適之建議’以濾、塾洗液收集及洗滌減墊。濾墊乾燥，濾墊密封，置入固定器中。將固定器嵌入放射活性檢測器内，定量濾墊上之放射活性崎。 •f· 或者’自分析板上各孔取40毫升移至磷酸纖維素滤塾上相應位置。濾墊風乾後，置於平盤上。溫和搖動平盤，每 1 5分鐘換一次洗滌溶液，歷1小時。濾墊風乾。濾塾密封並置入適合測定樣本中放射活性磷之固定器中。將固定器嵌入檢測器中，定量濾墊上放射活性嶙。經濟部智慧財產局員工消費合作社印？农 CDK2/環素（Cyclin) A-抑制作用分析法本分析法分析外用性受質中CDK2之蛋白質激酶活性。試劑： A·緩衝液 A : (80 mM Tris (ρΗ 7·2)，4〇碰 MgCl2)， 4.84 克 Tris (FK2U 克 / 莫耳），4·〇7 克 MgCl2 (F w = -186- 本紙張尺度適用中國國家標準（CMS)A4規格（2】0 x 297公爱） 1229073 Α7 Β7 五、發明說明（184) 203.31克/莫耳）溶於500毫升H20中。以HC1調至pH 7.2。 B. 組織蛋白H1溶液（0.45毫克/毫升組織蛋白H1及20 mM HEPES pH 7·2) : 5毫克組織蛋白H1(百靈藥廠 (Boehinger Mannheim)含於 11· 111 毫升 20 mM HEPES pH 7.2 (477 毫克 HEPES (F.W.=238.3 克 / 莫耳）溶於 100 毫升 ddH2〇中），分裝成1毫升保存在-80°C下。 C· ATP 溶液（60 // Μ ATP，300微克 / 毫升 BSA，3 mM DTT) : 120微升10 mM ATP，600微升10毫克/毫升BSA，加至2 0毫升，分成1毫升保存在-80°C下。 D· CDK2溶液：cdk2/環素 A 含於 10 mM HEPES pH 7.2， 25 mM NaC卜0.5 mM DTT，10%甘油中，分裝成9微升保存在-80°C 下。 ’ 方法 1.於ddH20/15% DMSO(體積比）中製備抑制劑溶液，濃度爲所需最終分析濃度之3倍。 2 ·取2 0微升抑制劑加至聚丙烯9 6孔板之各孔中（或陽性與陰性對照組使用20微升15% DMSO)。 3 ·解凍組織蛋白Η 1溶液（1毫升/板）、ATP溶液（1毫升/ 板加1 1份陰性對照組）及CDK2溶液（9微升/板）。CD2保持在冰上至使用時爲止。適當分裝CDK2溶液，以避免重覆冷康 -解凍循環。 .. 4. 取9微升CDK2溶液稀釋至2·1毫升緩衝液a中（每板）。混合，取2 0微升加至各孔中。 5 ·混合1毫升組織蛋白Η 1溶液及1毫升ATP溶液（每板） (請先閱讀背面之注意事項一裝，--- ^寫本頁) 一U°J.· _ 經濟部智慧財產局員Η消費合作社印製 •187-

1229073 A7 B7 五、發明說明（185) 加至1 0毫升附旋轉盍之試管中。添加^ 33p ATP至濃度〇· 15 "Ci/20微升（〇·15 "Ci/分析板孔）。小心混合以避免BSA起泡。取2 0微升加至適當孔中。板子於板振盪器上混合。陰性對照組係由ATP溶液與等量2〇 mM HEPES pH 7.2混合，添加r 33P ATP至濃度爲0·15 e Ci/20微升溶液。取20微升加至適當孔中。 6. 使反應進行6 0分鐘。 7·取35微升10% TCA加至各孔中。板子於板振盪器上混合。 8 ·取4 0微升各樣本加在P30濾墊上。使濾墊乾燥（約1 〇至2 0分鐘）。 9 ·以250毫升1 %磷酸（每升ddH20含1 〇毫升磷酸）洗滌濾墊4 X 10分鐘。 1 0 ·以Θ -板讀數器爲滤塾計數。細胞/生物分析法 PDGF-誘發之BrdU吸收分析法材料與試劑 (1) PDGF :人類 PDGF B/B，1276-956，德國百靈藥嚴。 (2) BrdU標識試劑；10 mM含於PBS(pH 7.4)中，目綠No. 1 647 229，德國百靈藥廠。 (3) FixDenat :固定溶液（現成可用），目錄No. 1 647 229，德國百靈藥廠。 (4) 抗-BrdU-POD :小白鼠單株抗體與過氧化酶之共輛物，目綠No. 1 647 229，德國百靈藥廠。 -188- 本纸張尺度遠用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項巧填寫本頁) 一 Ί - 裝經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1229073 A7 _ B7 五、發明說明（186 ) (5) TMB受質溶液：四甲基聯苯胺（Tmb)，現成可用，目錄No. 1 647 229，德國百靈藥廠。 (6) PBS洗滌液：IX PBS，pH 7.4(蘇根公司，Sugen，Inc.， Redwood City，California) 〇 ⑺牛白蛋白（BSA):第V部份粉末，A-855l，希格馬公司（Sigma Chemical Co.，USA)。 (8)經基因工程處理可表現人類pdgF-R之3T3細胞株。方法 ⑴細胞接種在96孔板中含10% CS，2 mM Gin之DMEM 中’每孔8000孔細胞。細胞於37°C及5% C02下培養一夜。 (2) 24小時後，以PBS洗條細胞，於不含血清之培養基 (0% CS DMEM，含0.1% PSA)中·停止供應血清24小時。 (3) 第3天時，同時添加配位體（pdgF，3·8 nM，於含 0.1% BSA之DMEM中製備）及試驗化合物至細胞中。陰性對照組孔僅接受不含血清但含〇· 1 % BSA之DMEM，陽性對辟組孔則接受配位體（PDGF)，但不接受試驗化合物。試驗化合物係於9 6孔板中，不含血清但含配位體之DMEM中製備，連續稀釋7種試驗濃度。 (4) 配位體活化20小時後，添加稀釋之BrkU標記試劑 (1 : 100 DMEM，0.1% BSA)，細胞與BrdU(終濃度=ι〇"Μ) 培養1 · 5小時。， (5) 與標记試劑培養後，傾析排除培養基，板子反轉，於紙巾上拍打。添加FixDenat溶液（5 0微升/孔），板子於室溫下之板振盧器上培養4 5分鐘。 _ -189- 本纸張&度:¾丐中國國家標準（CNS)A4規格（2】0 x 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項 !裝*--- 寫本頁) 訂· 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1229073 A7 B7 五、發明說明（187) (6) 傾析徹底排除FixDenat溶液，反轉板子，於紙巾上拍打。添加牛奶（5%脱水奶粉含於PBS中，200微升/孔）作爲阻斷溶液，板子於室溫下之板振盪器上培養30分鐘。 (7) 傾析排除阻斷溶液，以PBS洗滌孔一次。添加抗-BrdU-POD溶液（於PBS 中稀釋 1 : 100，10% BSA)(100微升 / 孔），板子於室溫下之板振盪器上培養90分鐘。 (8) 傾析徹底排除抗體共軛物，以PBS洗滌孔5次，板子反轉，以紙巾拍打乾燥。 (9) 添加TMB受質溶液（100微升/孔），於室溫之板振盪器上培養20分鐘，直到顏色發展至足以進行光度測定爲止。 (10) 於Dynatech ELISA板讀數器上，於410 nm測定樣本吸光度（採’’雙波長π法，以490 nm爲參考波長讀取滤塾讀數）。 EGF誘發之BrdU吸收分析法材料與試劑 (1) EGF :小白鼠EGF，210，日本Toyobo公司。 (2) BrdU標識試劑；10 mM，含於PBS(pH 7.4)中，目錄 No. 1 647 229，德國百靈藥廠。 (3) FixDenat :固定溶液（現成可用），目錄No· 1 647 229，德國百靈藥廠。 (4) 抗-BrdU-POD ··小白鼠單株▲抗體與過氧化酶之共軛物，目綠No. 1 647 229，德國百靈藥廠。 (5) TMB受質溶液：四甲基聯苯胺（TMB)，現成可用，目錄No. 1 647 229，德國百靈藥廠。 -190- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -I !Ί I I Ί I I 裝」— I (請先閱讀背面之注意事項寫本頁) 訂· 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1229073 A7 B7 五、發明說明（188) (6) PBS洗滌液·· IX PBS，pH 7·4(蘇根公司，Sugen，lnc.， Redwood City，California) 〇 (7) 牛白蛋白（BSA):第V部份粉末，A-855l，希格馬公司（Sigma Chemical Co·，USA) 〇 (8) 經基因工程處理可表現人類EGF-R之3T3細胞株。方法 (1) 細胞接種在96孔板中含10% CS，2 mM Gin之DMEM 中，每孔8000孔細胞。細胞於37°C及5% C02下培養一夜。 (2) 24小時後，以PBS洗滌細胞，於不含血清之培養基 (0% CS DMEM，含0.1% BSA)中停止供應血清24小時。 (3) 弟3天時’同時添加配位體（EGF，2 nM，於含〇 1 % BSA之DMEM中製備）及試驗化‘物至細胞中。陰性對照組孔僅接受不含血清但含0.1 % BSA之DMEM，陽性對照組則接受配位體（EFG)，但不接受試驗化合物。試驗化合物係於 96孔板中，不含血清但含配位體之DMEM中製備，連續稀釋7種試驗濃度。 (4) 配位體活化2 0小時後’添加稀釋之BrdU標記試劑 (1 : 100 DMEM，0.1% BSA)，細胞與BrdU(終濃度=10"M) 培養1 · 5小時。 (5) 與標記試劑培養後，傾析排除培養基，板子反轉，於紙巾上拍打。添加FixDenat溶液（5 0微升/孔），板子於室溫下之板振盪器上培養4 5分鐘。 (6) 傾析徹底排除FixDenat溶液，反轉板子，於紙巾上拍打。添加牛奶（5%脱水奶粉含於PBS中，200微升/孔）作爲 -191 - 本紙張&度適引中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項寫本頁) rl裝： Ί I 訂··' 經濟部智慧財產局員工消費合作社印制衣 1229073 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明說明（189) 阻斷溶液，板子於室溫下之板振盪器上培養30分鐘。 (7) 傾析排除阻斷溶液，以PBS洗滌孔一次。添加抗-BrdU-POD 溶液（於 PBS 中稀釋 1 ·· 100，1% BSA)(100微升 / 孔），板子於室溫下之板振盪器上培養9 0分鐘。 (8) 傾析徹底排除抗體共軛物，以PBS洗滌孔5次，板子反轉，以紙巾拍打乾燥。 (9) 添加TMB受質溶液（100微升/孔），於室溫之板振盪器上培養2 0分鐘，直到顏色發展至足以進行光度測定爲止。 (10) 於Dynatech ELISA板讀數器上，於410 nm測定樣本吸光度（採π雙波長”法，以490 nm爲參考波長讀取濾墊讀數）。 EGF謗發Her2-驅動之BrdU吸收^析法材料與試劑 (1) EGF :小白鼠EGF，210，日本Toyobo公司。 (2) 6^11標識試劑；1〇111]\4，含於？83(0117.4)中，目錄 No. 1 647 229，德國百靈藥廠。 (3) FixDenat :固定溶液（現成可用），目錄No· 1 647 229，德國百靈藥廠。 (4) 抗-BrdU-POD :小白鼠單株抗體與過氧化酶之共軛物，目錄No. 1 647 229，德國百靈藥廠。 (5) TMB受質溶液：四甲基聯苯胺（TMB)，現成可用，目錄No. 1 647 229，德國百靈藥廠。 (6) PBS洗滌液：IX PBS，pH 7.4，室内製備。 (7) 牛白蛋白（BSA) ··第V部份粉末，A-855 1，希格馬公 -192- 本紙張&度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -----·---11--裝，--- (請先閱讀背面之注意事項寫本頁) 訂· 1229073

五、發明說明（190) 司（Sigma Chemical Co·，USA) 0 (8) 經基因工程處理可表現具有EGF-R之細胞外區與Her2 之細胞内區之嵌合受體之3T3細胞株。方法 (1) 細胞接種在96孔板中含10% CS，2 mM Gin之DMEM 中，每孔8000個細胞。細胞於37°C及5% C02下培養一夜。 (2) 24小時後，以PBS洗滌細胞，於不含血清之培養基 (0% CS DMEM，含0.1% BSA)中停止供應血清24小時。 (3) 第3天時，同時添加配位體（EGF，2 nM，於含0.1% BSA之DMEM中製備）及試驗化合物至細胞中。陰性對照組孔僅接受不含血清但含0.1 % BSA之DMEM，陽性對照組則接受配位體（EGF)，但不接受試驗化合物。試驗化合物係於 96孔板中，不含血清但含配位體之DMEM中製備，連續稀釋7種試驗濃度。 (4) 配位體活化2 0小時後，添加稀釋之BrdU標記試劑 (1 : 100 DMEM，0.1% BSA)，細胞與 BrdU(終濃度=10yM) 培養1.5小時。 (5) 與標記試劑培養後，傾析排除培養基，板子反轉，於紙巾上拍打。添加FixDenat溶液（50微升/孔），板子於室溫下之板振盪器上培養45分鐘。 (6) 傾析徹底排除FixDenat溶液，反轉板子，於紙巾上拍打。添加牛奶（5%脱水奶粉於PBS中，200微升/孔）作爲阻斷溶液，板子於室溫下之板振盪器上培養3 0分鐘。 (7) 傾析排除阻斷溶液，以PBS洗滌孔一次。添加抗- -193- 本纸張尺度適S中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐) (請先閱讀背面之注意事項寫本頁) ri裝：經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1229073 A7 B7 五、發明說明（191)

BrdU-POD溶液（於PBS 中稀釋 1 : 100，1% BSA)(100微升 / 孔），板子於室溫下之板振盪器上培養90分鐘。 (8) 傾析徹底排除抗體共軛物，以PBS洗滌孔5次，板子反轉，以紙巾拍打乾燥。 (9) 添加TMB受質溶液（100微升/孔），於室溫之板振盪器上培養2 0分鐘，直到顏色發展至足以進行光度測定爲止。 (10) 於0;/1^6。11丑]^13八板讀數器上，於41〇11111測定樣本吸光度（採”雙波長”法，以490 nm爲參考波長讀取濾墊讀數）。 IGF1誘發之BrdU吸收分析法材料與試劑 (1) IGF1配位體··人類，重組體，G511，美國普美加公司 (Promega Corp· USA) 〇 (2) BrdU標識試劑；10 mM，含於PBS(pH 7·4)中，目錄 No. 1 647 229，德國百靈藥廠。 (3) FixDenat :固定溶液（現成可用），目錄No. 1 647 229，德國百靈藥廠。 (4) 抗-BrdU-POD :小白鼠單株抗體與過氧化酶之共軛物，目錄No. 1 647 229，德國百靈藥廠。 (5) TMB受質溶液：四甲基聯苯胺（TMB)，現成可用，目錄No. 1 647 229,德國百靈_藥廠。- (6) PBS洗滌液：IX PBS，pH 7·4(蘇根公司，Sugen，Inc·， Redwood City，California) 0 (7) 牛白蛋白（BSA):第V部份粉末，A-855 l，希格馬公 -194- 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項一! 裝*--- ^寫本頁) 訂、經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1229073 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明說明（192) 司（Sigma Chemical Co·，USA) 0 (8) 經基因工程處理可表現人類IGF-1受體之3T3細胞株。方法 (1) 細胞接種在96孔板中含10% CS，2 mM Gin之DMEM 中，每孔8000個細胞。細胞於37°C及5% C02下培養一夜。 (2) 24小時後，以PBS洗滌細胞，於不含血清之培養基 (0% CS DMEM，含0.1% BSA)中停止供應血清24小時。 (3) 第3天時，同時添加配位體（IGF1 =3·3 nM，於含〇· 1 % A之DMEM中製備）及試驗化合物至細胞中。陰性對照組孔僅接受不含血清但含〇· 1 % BSA之DMEM，陽性對照組細胞則接受配位體（IGF1)，但不接受試驗化合物。試驗化合物係於9 6孔板中，不含血清但含配位體之DMEM中製備，連續稀釋7種試驗濃度。 (4) 配位體活化1 6小時後，添加稀釋之BrdU標記試劑 (1 ·· 100 DMEM，0.1% BSA)，細胞與Brdu(終濃度=10jUM) 立合養1 · 5小時。 (5) 與標記試劑培養後，傾析排除培養基，板子反轉，於紙巾上拍打。添加FixDenat溶液（5〇微升/孔），板子於室溫下之板振盪器上培養4 5分鐘。 (6) 傾析徹底排除FixDenat溶液，反轉板子，於紙巾上拍打。添加牛奶（5%脱水奶粉於PBS中，2〇〇微升/孔）作爲阻斷溶液，板子於室溫下之板振盪器上培養3〇分鐘。 (7) 傾析排除阻斷溶液，以PBS洗滌孔一次。添加抗卜紙張叉度中國國家標準（CNS)A4規格 -195- (210x297 公釐） (請先閱讀背面之注意事項寫本頁) rl裝' 訂·： 1229073 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（μ) BrdU-POD 溶液（於 PBS 中稀釋 1 : 100，1% BSA)(100微升 / 孔），板子於室溫下之板振盪器上培養9 0分鐘。 (8) 傾析徹底排除抗體共軛物，以PBS洗滌孔5次，板子反轉，以紙巾拍打乾燥。 (9) 添加TMB受質溶液（100微升/孔），於室溫之板振盪器上培養2 0分鐘，直到顏色發展至足以進行光度測定為止。 (10) 於Dynatech ELISA板讀數器上，於410 nm測定樣本吸光度（採’’雙波長”法，以490 nm為參考波長讀取濾墊讀數）。 FGF謗發之BrdU吸收分析法材料與試劑 1. FGF :人類FGF2/bFGF (4布可公司 No. 13 25 6-029)。 2. 8^11標識試劑；1〇1111^含於？83化^17.4)中，目錄>^〇. 1 647 229，德國百靈藥廠。 3. FixDenat :固定溶液，目錄No. 1 647 229，德國百靈藥廠。 4. 抗-Br*dU-POD :小白鼠單株抗體與過氧化酶之共軛物，目錄No. 1 647 229，德國百靈藥廠。 5. TMB :四甲基聯苯胺，目錄No. 1 647 229，德國百靈藥廢。 6. PBS 洗滌液：IX PBS，pH 7.4(蘇根公司，Sugen, Inc.) 〇 7. 牛白蛋白（BSA):第V部份粉末，目錄No. A-855 1，希格馬公司（Sigma Chemical Co.，USA)。 (請先閱讀背面之注意事項再n本頁) -裝- 訂線 _- - 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X：297公釐） 1229073 A7 B7 五、發明說明（194) 方法 1· 3T3基因工程處理細胞株：3T3c7/EGFr。 2· 細胞接種在96孔板中含10% CS，2 mM Gin之DMEM 中，每孔8000個細胞。細胞於37°C及5% C02下培養一夜。 3· 24小時後’以PBS洗條細胞，於不含血清之培養基 (0% CS DMEM，含0.1% BSA)中停止供應血清24小時。 4. 同時添加配位體（FGF2，1·5 nM，於含BSA之 DMEM中製備）及試驗化合物。陰性對照組孔僅接受不含血清但含0.1% BSA之DMEM，陽性對照組孔則接受fGF2配位體，但不接受試驗化合物。試驗化合物係於9 6孔板中，不含血清但含配位體之DMEM中製備，連續稀釋7種試驗濃度。 5· 20小時後’添加稀釋之BrkU標記試劑（1 : j〇〇

BrdU : DMEM，0.1% BSA，終濃度= 10//M)至細胞中，培養 1.5小時。 6· 傾析培養基，以紙巾排除微量物質。添加FixDenat溶液（5 0微升/孔），板子於室溫下之板振盪器上培養4 5分鐘。 7. 排除FixDenat溶液。添加阻斷溶液（5 %脱水奶粉含於 PBS中，200微升/孔），於室溫下之板振盪器上培養3 〇分鐘。 8· 傾析阻斷溶液，以PBS洗條孔一次。添加抗_BrdU-POD溶液（於PBS中稀釋1 : 1〇〇，1%. BSA)，於室溫下之板振盪器上培養9 0分鐘。 9. 傾析除抗體共軛物，以PBS洗滌孔5次，板子反轉，以紙巾拍打乾燥。 -197- 本紙張尺度適用中國國家標準CCNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項d 裝---- 7寫本頁)

訂V 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1229073 A7 A7 B7 五、發明説明（） 195 10. 添加TMB受質溶液（100微升/孔），於室溫之板振盪器上培養2 0分鐘，直到顏色發展至足以進行光度測定為止。 11. 於Dynatech ELIS A板讀數器上，於4 10 nm測定樣本吸 .光度(採’’雙波長’’法，以490 nm為參考波長讀取濾墊讀數）。生化EGFR分析法此分析法使用ELIS A於試管内測定EGFR之激酶活性。材料與試劑 1. 康寧96孔ELISA板（康寧目錄No. 25805-96)。 2. 3 .SUM01單株抗-EGFR抗體（蘇根公司生化實驗室）。 PBS(杜氏磷酸鹽緩衝食鹽水，奇布可目錄No. 450- 1300 EB)。 4. TBST緩衝液試劑分子量操作濃度每升含量 Tris 121.14 50 mM 6.057 克 NaCl 58.44 150 mM 8.766克 Triton X-100 NA 0.1% 1.0毫升 5. 阻斷緩衝液：試劑分子量操作濃度每100毫升用量康乃馨牌 5% 5.0克即溶脫脂奶粉 PBS NA -NA 100毫升 6. A43 1細胞溶胞液（蘇根公司篩選實驗室（Screening Lab·，SUGEN，Inc.))。 7. TBS緩衝液：本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（) I--------^-- «·I» (請先閲讀背面之注再本貢) 訂線經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 1229073 B7 五、發明說明（196) 試劑分子量操作濃度每升用量 Tris 121.14 50 mM 6.057 克 NaCl 58.44 150 mM 8.766 克 8. TBS+10 % DMSO 試劑分子量操作濃度每升用量 Tris 121.14 50 mM 1.514 克 NaCl 58.44 150 mM 2.192克 DMSO ΝΑ ' 10% 25毫升 9. 腺苷-5’-三磷酸（ATP，來自馬肌肉，希格馬目錄N 〇. A-5394) 〇於dH20中製成1.0 mM溶液。此試驗應於臨用前方製備，並保持在冰上。 10. MnCl2 〇於dH20中製備1.0 M母液 0 1 1 . ATP/MnCl2磷酸化混合物試劑母液每10毫升用量操作濃度 ATP 1.0 mM 300微升 30 μΜ MnCl2 1.0 Μ 500微升 50 mM dH20 9.2毫升 (請先閱讀背面之注意事項\^寫本頁) 裝- 訂， •f. 經濟部智慧財產局員工消費合作社印制衣此試劑應於臨用前方製備，並保持在冰上。 12. NUNC 96孔V型底聚丙晞板（應用科學目錄No. AS-72092” 13. 乙二胺四乙酸（EDTA) 於dH20中製備200 mM操作溶液。以10 N NaOH調至 -199- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1229073 A7 B7 五、發明說明（彳97 ) pH 8.0 0 14·兔子多株抗磷酸酪胺酸血清（蘇根公司生化實驗·室） 15.山羊抗兔子IgG過氧化酶共輕物（生物資源公司 (Biosource)目錄No· ALI0404)。 16· ABTS(2,2’-連氮基-雙（3-乙基苯幷嘍唑啉_6•磺酸），希格馬目錄No. A-1888)。. 試劑_分子量操作濃度每升用量

檸檬酸 Na2HP04 ABTS 192.12 141.96 ΝΑ 100 mM 250 mM 〇·5毫克/毫升 19.21 克 35·49 克 500毫克 (請先閱讀背面之注意事項寫本頁) »!裝：於約900耄升dH2〇中混合前2種成份，以嶙酸調至ρΗ 4.0。添加ABTS，加蓋，靜置約〇·5小時，過濾。溶液應保存在4°C暗處直到使用前爲止。 17·過氧化氫30%溶液（費雪目錄N〇. H325)。 18. ABTS/H202 混合15毫升ABTS溶液與2·0微升H20。臨用前5分鐘才製備。 1 9. 0.2 M HC1。方法 1 ·以含於1⑼微升PBS之每孔0.5微克SUM01塗佈康寧 9 6孔ELIS Α板，於4 °C下保存一夜… 2 ·反轉板子排除液體，以排除孔中未結合之SUMO 1。於紙巾上拍打板子，以排除過量液體。 3·在各孔中添加150微升阻斷緩衝液。於室溫下振盪培 -200- (2】〇χ^97公釐）— •f· 經濟部智慧財產局消費合社印製 1229073 A7 B7 五、發明說明（198) 養3 0分鐘。 4 · 以去離子水洗務板子3次，然後以TBST洗條一次。板子於紙巾上拍打，以排除過量液體與汽泡。 5.於PBS中稀釋溶胞液（7微克溶胞液/1〇〇微升PBS)。 6· 在各孔中添加100微升稀釋之溶胞液。於室溫下振盪 6 0分鐘。 7· 依上述（4)之步驟洗滌板子。 8· 添加120微升TBS至含有捕捉之EGFR之ELISA板子中。 9. 於96孔聚丙烯板中，以TBS稀釋試驗化合物1 : 1〇(亦即1 0微升化合物+ 9 0微升TBS)。 10. 添加13·5微升稀釋之試驗化合物至ELISA板中。對照組孔（即不接受任何試驗化合物之孔）中則添加13.5微孔TB S + 10% DMSO。 1 1 ·於室溫下振盪培養3 0分鐘。 1 2 ·直接添加1 5微升磷酸化混合物至各孔中，但陰性對照組除外，該孔中不接受ATP/MnCl2(孔中終體積應約15〇微升，各孔終濃度3 // Μ ATP/5 mM MnCl2)。振盪培養5分鐘。 13. 5分鐘後，添加16.5微升200 mM EDTA(pH 8·〇)至各孔中，以中止反應，並持續振盪。添加EDTA後，振還i分鐘。 14. 以去離子水洗滌4次，以TBST洗滌2次。 15. 每孔中添加100微升抗磷酸酪胺酸（於TBST中稀釋！： 3000)。於室溫下振盪培養30至45分鐘。 1 6 ·依上述第（4)步驟所述條)條。 -201 - 本紙張尺度適用中國國家標準（Ci\S)A4規格（210 公爱〉 I I I I Ί I ·1 J_i I- I I I I · I I (請先閱讀背面之注意事項寫本頁) 訂- .線！經濟部智慧財產局員工消費合作社印制取 1229073 A7 B7 五、發明說明（199) 17.在各孔中添加100微升生物資源公司之山羊抗兔子 IgG過氧化酶共軛物（於TBST中稀釋1 : 2000)。於室溫下振盪培養3 0分鐘。 18·依上述第（4)步驟洗滌。 19.在各孔中添加100微升ABTS/H202溶液。 2 0 .振盪培養5至1 0分鐘。排除任何汽泡。 2 1 ·若必要時，每孔添加100微升0.2 M HC1中止反應。 2 2 · 於Dynatech MR 7000 ELIS Α讀數器上讀取分析數値。試驗遽塾·· 410 nm，參考滤塾：630 nm。生化PDGFR分析法此分析法採用ELISA於試管内測定PDGFR之激酶活性。材料與試劑除非另有説明，否則下列試劑之操作溶液製法與上述生化 EGFR分析法相同。 1 . 康寧96孔ELISA板（康寧目錄No. 25805-96)。 2. 28D4C10單株抗-PDGFR抗體（蘇根公司生化實驗室” 3. PBS(杜氏磷酸鹽緩衝食鹽水，奇布可目綠No. 450-1300EB)。 4. TBST緩衝液。 5. 阻斷緩衝液。 6. 表現PDGFR-/?之NIH 3T3細胞溶胞液（蘇根公司篩選實驗室）。 7. TBS緩衝液。 -202- 本纸張尸V度適S中國國家標準（CNS)A4規格(21〇x 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項v 裝---- I jc寫本頁) 訂. 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1229073 A7 _B7_ 五、發明說明（200 ) 8. TBS + 10% DMSO。 9. 腺茹-5’-三磷酸（ATP，來自馬肌肉，希格馬目綠No. A-5394)。 10. MnCl2 〇 11. 激酶緩衝液磷酸化混合物。試劑母液每10毫升含量操作濃度

Tris 1 Μ 250微升 25 mM NaCl 5 Μ 200微升 100 mM MnCl2 1 Μ 100微升 10 mM TX-100 100 mM 50微升 0.5 mM 12. NUNC 96孔V型底聚丙晞板（應用科學目錄No· AS-72092) 〇 13. 乙二胺四乙酸（EDTA)。 14. 兔子多株抗磷酸酪胺酸血清（蘇根公司生化實驗室）。 1 5 .山羊抗兔子IgG過氧化酶共軛物（生物資源目錄No. ALI 0404” 16. 2,2’-連氮基-雙（3、乙基苯幷噻唑啉-6-磺酸）（ABTS，希格馬目綠No. A-1888)。 17·過氧化氫30%溶液（費雪目錄No. H325)。 18. ABTS/H202 1 9· 0·2 M HC1 0 方法 1 . 以含於100微升PBS之每孔0.5微克28D4C 10塗佈康寧 -203- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（2】〇χ 297公釐） -----·--I ^--- --裝 (#?先^^讀背面之注意事項寫本頁) 訂· _線！經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1229073 A7 B7 五、發明說明（201 ) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 96孔ELISA板，於4 °C下保存一夜。 2. 反轉板子排除液體，以排除孔中未結合之勘_。以dH2〇洗蘇！次。於紙巾上拍打板子，以排除過量液體。 3. 在各孔中添加15〇微升阻斷緩衝液。於室溫下振鱼培養3 0分鐘。 4 ·以去離子水洗條板子3 :欠，然後以tbst洗條一次。板子於紙巾上拍打，以排除過量液體與汽泡。 5·於HNTG中稀釋溶胞液（1〇微克溶胞液/1〇〇微升 HNTG) 〇 6·在各孔中添加100微升稀釋之溶胞液。於室溫下振盪 6 0分鐘。 7· 依上述（4)之步驟洗滌板·子。 8 ·添加8 〇微升操作激酶緩衝液至含有捕捉之pDGFRi ELISA板子中。 9·於96孔聚丙晞板中，以丁別稀釋試驗化合物(亦即10微升化合物+ 90微升TBS)。 10·添加10微升稀釋之試驗化合物至ELIS A板中。對照組孔（即不接受任何試驗化合物之孔）中則添加丨〇微升TBS + 10% DMSO 〇 11·於室溫下振盪培養30分鐘。 12·直接添加1 〇微升ATP至各孔中，但陰性對照組除外，（各孔中終體積應約1〇〇微升，20 "Μ ATP)。振盪培養 3 0分鐘。 13· 30分鐘後，添加1〇微升2〇〇 mM EDTA(pH 8.0)至各孔 i——»!裝· (請先閱讀背面之注意事項寫本頁) -Ί 訂. •f· -204- 本纸張义度適…中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1229073 B7 五、發明說明（ 202 ) 中，以中止反應。 14.以去離子水洗滌4次，以tBST洗滌2次。 15·每孔中添加1〇〇微升抗磷酸酪胺酸（於TBST中稀釋1 · 3000)。於室溫下振盪培養3〇至45分鐘。 16. 依上述第（4)步驟所述洗滌。 17. 在各孔中添加100微升生物資源公司之山羊抗兔子 IgG過氧化酶共軛物（於TBST中稀釋1 : 2〇〇〇)。於室溫下振盪培養3 0分鐘。 18·依上述第（4)步驟洗滌。 19·在各孔中添加1〇〇微升ABTS/H202溶液。 2 0 ·振盪培養1 0至3 〇分鐘。排除任何汽泡。 2 1 ·若必要時，每孔添加ι〇〇微升〇 2 μ HC1中止反應。 2 2 ·於Dynatech MR 7000 ELIS Α讀數器上讀取分析數値。試驗濾墊：410 nm，參考濾螯：630 nm。生化FGFR分析法此分析法採用ELISA於試管内測定Myc-GyΓB-FGFR融合蛋白質之激酶活性。

材料與試劑 1 . HNTG ί請先閱讀背面之注意事項寫本頁) 裝· 訂· · •線！ Φ 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製試劑分子量 5x母液濃度每升用量 lx操作濃度 HEPES 238.3 100 mM 23.83 克 20 mM NaCl 58.44 750 mM 43.83 克 150 mM 甘油 NA 5 0% 500毫升 10% Triton X-100 NA 5% 10毫升 1.0% -205- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210^297公爱7 1229073 A7 _B7 五、發明說明（2〇3) 製備1升5x母液時，取HEPES及NaCl溶於約350毫升 dH20，以HC1或NaOH調至pH 7.2(依採用之HEPES而定），添加甘油，Triton X-100，然後添加dH20補充體積。 2. PBS(杜氏磷酸鹽緩衝食鹽水，奇布可目錄# 450-1300 EB)。 3 . 阻斷緩衝液。 4. 激酶緩衝液。試劑分子量 10x母液濃度 lx操作濃度

HEPES (pH 12) 238.3 500 mM 50 mM MnCl2 20 mM 2 mM MgCl2 203.32 200 mM 10 mM Triton-X-100 1% 0.1% DTT 380.35 5 mM 0.5 mM 5. 苯甲磺醯氟（PMSF，希格馬目錄# P-7626) 操作溶液·· 100 mM乙醇溶液 6. ATP(來自細菌，希格馬目錄No. A-7699) 每升使用3.31毫克MilliQ H2〇，配成母液濃度6 mM。 7. 生物素共軛抗磷酸酪胺酸mab(純系4G10，奧普生物科技公司（Upstate Biotechnology)目錄 No· 16-103，序號 14495)。 8. Vectastain Elite ABC試劑（抗生物素蛋白過氧化酶共輒物，菲特實驗室（Vector Laboratories)目錄No· PK-6 100)。 9. ABTS 溶液。 10·過氧化氫30%溶液（費雪目錄#H325)。 -206- 本紙張纥度遠3中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項寫本頁) --Μ 訂_ · 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1229073 A7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印刺衣 B7__ 五、發明說明（ 204 ) 11. ABTS/H202 〇 12. 0.2 M HC卜 13· TRIS HC1(費雪目錄ν〇· BP 152-5)。於MilliQ H2〇中製備！〇溶液，以HC1調至pH 7.2。 14· NaCl(費雪目綠ν〇· S271-10)。於MilliQ H2〇中製備5 μ溶液。 1 5 · MgCl2(費雪目綠ν〇· Μ33-500)。於MilliQH2〇中製備1 μ溶液。 1 6 · HEPES(費雪目綠ν〇· ΒΡ310-500)。於MilliQ H2〇中製備！ M溶液，調至ρΗ 7·5，無菌過滤。 17. TBST緩衝液。 · 18·碳酸鈉緩衝液（費雪目綠n〇S495)。於MilliQ H2〇中製備〇」M溶液，以Na〇H調至 9.6，過濾、。 19·二硫異赤蘚糖醇（DTT，費雪目錄]^〇· Bpi72_25)。。臨用刖方於MilliQ Ηβ中製備〇·5 乂操作溶液。存放在-20°C下直到使用時爲止，剩餘部份均丟棄。 20. MnCl2。 2 1 · Triton X-100 〇 22.山羊江-兔子IgG(卡波公司）。。 23·親和性純化之兔子α（蘇根公司生化實驗室）。方法 (請先閱讀背面之注意事項t 裝，i I I寫本頁) 訂： •f, -207- 1229073 A7 B7 五、發明說明（2〇5) 經濟部智慧財產局消費合作社印製下列所有步驟均在室溫下進行，除非另有説明。 1 ·以含在碳酸鹽緩衝液中之每孔2微克山羊α _兔子抗體塗佈康寧96孔ELISA板，使孔中總體積爲1〇〇微升。於下存放一夜。 2 ·板子反轉排除液體’以排除未結合之山羊江-兔子抗體。板子於紙巾上拍打，以排除過量液體與汽泡。 3 ·添加150微升阻斷緩衝液（5 %低脂奶粉溶於ρβs中）至各孔中。於微滴定板振盪器上振盪培養3 〇分鐘。 4 ·以TBST洗滌4次。板子於紙巾上拍打，以排除過量液體與汽泡。 5· 母孔中添加0.5微克兔子a -GyrB抗體，於DPBS中稀釋柷體’至每孔終體積1 〇〇微升。於室溫下之微滴定板振盛器上振盪培養1小時。 6· 依步驟4所述，以TBST洗滌4次。 7 · 各孔中添加含於HNTG中之2微克COS/FGFR細胞溶胞液（Myc-GyrB-FGFR來源），每孔終體積100微升。於微滴定板振盪器上振盪培養1小時。 8. 依步驟4所述，以TBST洗滌4次。 9 · 每孔添加8 0微升1 X激酶緩衝液。 1 〇 ·於聚丙烯9 6孔板中，以1 X激酶緩衝液+ 1 % D M S Ο 稀釋試驗化合物1 : 1 〇。 - 1 1 ·自聚丙烯板之孔中取1 〇微升稀釋之試驗化合物溶液及對照組溶液移至相應之ELISA板之孔中，於微滴定板振盪态上振盘培養2 〇分鐘。 -208- (請先閱讀背面之注意事項寫本頁) 裝，- •1^·· •f· 本紙… 中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1229073 A7 B7 五、發明說明（2〇6 ) 1 2 ·添加1 〇微升於激酶緩衝液中稀釋之70 # Μ ATP至陽性對照組及試驗組孔中（ATp終濃度爲7 ju Μ/孔）。添加1 0微升 1 X激酶緩衝液至陰性對照組孔中。於微滴定板振盪器上振盈培養1 5分鐘。 13·所有孔均添加5微升0.5 M EDTA中止激酶反應。 14·依步驟4所述，以TBST洗滌4次。 Ϊ5·各孔中添加於TBST中稀釋之100微升生物素共軛沈-磷酸酪胺酸mab(b4G10)。於微滴定板振盪器上振盪培養1〇分鐘。 1 6 ·製備Vectastain ABC試劑。滴加1滴試劑A至1 5毫升 TBST中。反轉試管混合數次。滴加1滴試劑b，再混合一次。 * 17·依步驟4所述，以TBST洗滌4次。 18. 各孔中添加1〇〇微升ABC HRP試劑。於微滴定板振盪為上振盟培養3 〇分鐘。 19. 依步驟4所述，以TBST洗滌4次。 20·各孔中添加1〇〇微升ABST/H202溶液。 22·振盪培養5至15分鐘。排除任何汽泡。 23. 若必要時，添加1〇〇微升0.2 M HC1/孔，中止反應。 24. 於Dynatech MR7000 ELISA板讀數器上讀取分析數値’試驗滤髮· ： 410 nm ’參考滤塾·： 6 3 0 nm。生化FLK-1分拚法此分析法採用FLISA於試管内分析flk-1自體磷酸化活性。材料與試劑 -209- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -----一--Ί-Ϊ------裝--- (請先閱讀背面之注意事項寫本頁) 訂-. •f 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1229073 A7 B7 五、發明說明（207) 1 . 1 5公分組織培養皿。 (請先閱讀背面之注意事項d 2. Flk-1/NIH細胞：過度表現人類flk-Ι純系3之NIH纖維母細胞株（蘇根公司，得自德國MPI公司（MPI，Martinsried， Germany)) ° 3. 生長培養基：DMEM加10%熱去活性FBS及2 mM麩醯胺（奇布可公司）。 4. 斷食培養基：DMEM加0.5%熱去活性TBS，2 mM麩醯胺（奇希可公司）。 5· 康寧96孔ELISA板（康寧目錄No. 25805-96)。 6. 針對flk-1之L4或E38單株專一性抗體，經蛋白質A瓊脂糖親和性層析法純化（蘇根公司）。訂- 7. PBS(杜氏磷酸鹽緩衝食鹽水），奇布可目綠No. 450-1300EB)。 8. HNTG(其製法參見 BIOCHEMICAL FGFR)。 9. 皮爾斯BCA蛋白質測定套組。線！ 1 0 ·阻斷緩衝液。 11. TBST (pH 7.0) 〇 12. 激酶緩衝液。 1 3 ·激酶中止溶液：200 mM EDTA。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 14.生物素基化4G10，針對磷酸酪胺酸（UBI，目錄No· 16-103)。 · 15· AB套組（菲特實驗室目綠No· PK 4000)。

16. DMSO 17· NUNC 96孔V型底聚丙晞板（應用科學公司目錄No· -210- 本紙張汶度iS 4中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公爱） 1229073 A7 B7 五、發明說明（ 208 ) AS-72092) 〇 18· Turbo-TMB(皮爾斯公司）。 19· Turbo-TMB 中止溶液：imH2〇S4。 20· ATP(希格馬目綠N〇. A-7699)。 21· 20% DMSO含於tbs 中（pH 7.0)。方法細胞生長及溶胞液製法 1 ·接種細胞至生長培養基中，於37°C及5% C02下生長至90至100%融合度。不要轉移2〇次以上。 2 · 排除培養基’以PBS洗滌細胞2次。以HNTG溶胞緩衝液溶解細胞。收集所有溶胞液，渦轉混合2〇至3〇秒。 3 ·離心排除不溶物（於約1〇,〇〇〇 X g下5至1 〇分鐘）。 4 · 採用BCA套組測定蛋白質濃度。 5·溶胞液以1毫克分裝，存放在-8〇°C下。分析法 1 .以含於100微升PBS之每孔2微克純化之L4(或E3 8)塗佈康寧96孔ELISA板，於4°C下保存一夜。 2 .反轉板子排除液體，以排除孔中未結合之蛋白質。以 dH2〇洗滌1次。於紙巾上拍打板子，以排除過量液體。 3 ·在各孔中添加150微升阻斷緩衝液。於4 下振盪培養4 5至6 0分鐘。 4 ·排除阻斷緩衝液，以去離子水洗滌板子3次，然後以 TBST洗條一次。板子於紙巾上拍打，以排除過量液體。 5.於PBS中稀釋溶胞液，終濃度爲50微克/1〇〇微升。各 -211 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（2〗0 X 297公爱"7 (請先閱讀背面之注意事項API寫本頁) 裝- 線！經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1229073 A7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 _____B7__ 五、發明說明（2〇9) 孔中加100微升稀釋之溶胞液。於4 °c下振湯择養_夜 6 ·反轉板子，以排除孔中未結合之蛋白質。依步驟4所述洗if条。 7·添加80微升激酶緩衝液至孔中（陰性對照組中添加9〇微升）。 8·在含20% DMS0之PBS溶液之聚丙烯板之孔中稀釋試驗化合物（通常1 0倍）。 9 ·添加1 〇微升稀釋化合物至含固定化flk-丨之elisA孔中，並振盪。對照組孔中則不接受化合物。 10·由1 πιΜ ATP母液，使用dH20製備〇·3 mM ATP溶液 (或可使用激酶緩衝液製備）。 1 1 ·除了陰性對照組外，各孔中均添加丨0微升0.3 mM A T P。於室溫下振盛培養6 〇分鐘。 1 2. 1小時後’添加1 1微升2〇〇 mjy[ EDTA中止激酶反應。振盪1至2分鐘。 13.以dH20洗滌ELISA板4次，以TBST洗條2次。 1 4 ·在所有孔中均添加1〇〇微升1 : 5〇〇〇生物素基化 4〇10:丁68丁。於室溫下振盪培養4 5分鐘。 1 5 ·上述培養過程期間，添加5 〇微升來自abc套組之A 與B溶液至1 〇毫升TBST中。此等溶液必須在使用前約3 〇分鐘方可組合。 .. 16·依步驟4所述洗滌板子。 1 7 .所有孔中均添加1 〇〇微升預先形成之a & b錯合物。於室溫下振盧培養3 〇分鐘。 -212- 本纸fc尺/艾:i ’.：令國國家標準（CNS)A4規格（2】〇 X 297公釐） C請先閱讀背面之注意事項1^、寫本頁) ϋ II»、裝· 訂.· •線· 1229073 A7 _B7 五、發明說明（210 ) 18. 依步驟4洗滌板子。 19. 添加100微升turbo-TMB。於室溫下振盪培養10至15 (請先閱讀背面之注意事項寫本頁) 分鐘。 2 0 .當陽性對照組孔中顏色達吸光度約0.35至0.4時，以 100微升turbo-TMB中止反應溶液中止反應。 2 1 .於Dynatech MR7000 ELISA讀數器上讀取分析數値。試驗濾墊：450 nM，參考濾墊：4 10 nM。 HUV-EC-C分析法亦採用下列方法來測定化合物對抗PDGF-R、FGF-R、 VEGF、aFGF或Flk-1/KDR之活性，其均於HUV-EC細胞中天然表現。第0天經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1 . 洗滌HUV-EC-C細胞（人類臍靜脈内皮細胞，美國菌種培養物收集處，目錄No. 1730 CRL)，以胰蛋白酶處理。以杜氏磷酸鹽緩衝食鹽水（D-PBS，得自奇布可公司，目綠 No. 14190-029)洗滌2次，約1毫升/10公分2組織培養瓶。以含於非酵素性細胞解離溶液之0.05%胰蛋白酶-EDTA(希格馬化學公司，目錄No. C-1544)處理。由0.25%胰蛋白酶/1 mM EDTA(奇布可公司，目錄No. 25200-049)於細胞解離溶液中稀釋，製成0.05%胰蛋白酶。以約1毫升/25至30公分2組織培養瓶，於3 7 °C下進行胰蛋白酶處>理約5分鐘。細胞自燒瓶上剝離後，添加等體積之分析培養基，移至5 0毫升無菌離心管（費雪科技，目錄No· 05-539-6)。 2. 於5 0毫升無菌離心管中，以約3 5毫升分析培養基洗 -213- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格(2】〇χ 297公釐） 1229073 A7 B7 2ir 五、發明説明（ (請先閲讀背面之注意事項再HP本頁) 條細胞，其係添加分析培養基，於約2〇〇 x g離心i 〇分鐘，吸出上澄油，使用3 5毫升D-PBS再懸浮。再以D-PBS重覆洗條2次，細胞再懸浮於約1毫升分析培養基/丨5公分2組織培養瓶中。分析培養基包括F12K培養基（奇布可公司，目錄No. 21 127-0 14)及0.5%熱去活性之胎牛血清。使用考特計數器 (Coulter Counter )(考特電子公司（c〇ulter Electronics，Inc.) 计算細胞數’並添加分析培養基至細胞中，得到濃度〇. 8· 1.0 χ ΙΟ5個細胞/毫升。 3. 添加細胞至96孔平底板中，1〇〇微升/孔或〇 8至1〇 χ 1 04個細胞/孔，於3 7它及5% c〇2下培養约2 4小時。第1天 1 ·在另一個9 6孔板上，製備2倍試驗化合物滴定濃度，通常為50 //M下降至〇。採用上述第〇天第2步驟之相同分析培養基。滴定過程係添加9〇微升/孔2〇〇 “Μ試驗化合物（孔中終濃度之4倍）至特殊多層培養板之上層孔中。由於試驗化合物母液通常於含於Dmso中之2〇溶液，因此 200 //M藥物濃度含有2% DMSO。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製採用以分析培養基（F12K+〇 5%胎牛血清）稀釋至2% DMS〇之稀釋液作為滴定試驗化合物之稀釋液，以稀釋試驗化合物，但保持DMSO濃度恆定。添加此稀釋液至其餘各層孔中，60微升/孔。自多層孔之上層孔中12〇微升2〇〇驗化合物稀釋液取6 〇微升，與多層孔之第二層孔中6 〇微升混合。自此孔取6 0微升，與多層孔之第三層孔中6 〇微升混合，依此類推，直到完成兩倍稀釋為止。當混合倒數第: w ( cns ) 1229073 A7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 —— —_B7__ 五、發明說明（212 ) 層孔時，自此孔中120微升取出60微升並丟棄。留下最後一個孔含有6 0微升DMSO/培養基稀釋液作爲不含試驗化合物之對照物。製成九層經滴定之試驗化合物，足以供三重覆分析：（1) VEGF(得自必普技術公司（Pepro Tech Inc.)，目錄 No· 100-200，（2)内皮細胞生長因子（ECGF)(亦稱爲酸性纖維母細胞生長因子，或aFGF)(來自百靈藥廠（Boehdnger Mannheim Biochemica)，目錄 No· 1439 600)，或（3)人類 PDGF B/B( 1276-956，德國百靈藥廠），及分析培養基對照組。ECGF爲使用肝素鈉之製劑。 2 · 第〇天時，取5 0微升/孔試驗化合物稀釋液移至含os 至1·〇Χ 104個第0天之HUV-EC-C細胞/100微升/孔之96孔分析板中，於3 7°C及5% C02下培^約2小時。 3 ·在三重覆中，對各試驗化合物條件添加5 0微升/孔之 8 0微克/毫升VEGF，20毫微克/毫升ECGF或培養基對照組。試驗化合物組中’生長因子濃度爲所需終濃度之4倍。採用第0天第2步驟之分析培養基製備生長因子濃度。於37。^， 5% C〇2下培養約24小時。各孔將含有5〇微升試驗化合物稀釋液’ 5 0微升生長因子或培養基，及1 〇〇微升細胞，經計算共200微升/孔。因此當所有材料均加至孔中後，試驗化合物濃度爲4倍’生長因子爲1倍。第2天 ‘ 1 ·添加胸嘗（父莫珊（Amersham)，目綠η 〇，TRK_ 686)，1 "Ci/孔（於RPMI培養基+ 1〇%熱去活性胎牛血清中配成loo "ci/毫升溶液，取10微升/孔），於37Ό，5% c〇2 (請先閱讀背面之注意事 n ϋ I 項 --- 寫本頁) 線！ 215

1229073 五、發明說明（213) 下培養约24小時。PRMI來自奇布可公司，目錄Ν〇· η· 051 〇 -第3天 1 · 培養板於-20°C下冷凍一夜。板子解束，以96孔板收集器（湯狄克收集器（T〇mtec Harvester 96®)收集在濾墊（華克公司，目綠Ν〇 ΐ2〇54〇ι) 上，於華克貝他板™液相閃爍計數器上計數。适體内動物模式外來移植物動物楛式人類腫瘤於無胸腺小白藏（例如：Balb/c，nu/nu)中呈外來移植物形式生長之能力可作爲活體内研究治療人類腫瘤之生物反應之適用模式。自從人類腫瘤外來移植物第一次成功移植至無胸腺小白鼠體内後（李加德（Rygaard)與波森 (Povlsen)，1969，Acta Pathol· Microbial. Scand· 77:758-760) ’已移殖過許多不同人類腫瘤細胞株（例如：***、肺、生殖泌尿器、胃腸、頭與頸、神經膠質母細胞瘤、骨骼、及惡性黑色素瘤），且於無毛小白鼠體内成功生長。可採用下列分析法來測定本發明不同化合物之活性程度、專一性及影響。有三種一般分析法適用於評估化合物：細胞/ 催化性、細胞/生物性及活體内。細胞/催化性分析法之目的爲測定化合物對T K使細胞中已知受質上酶胺酸進行嶙酸化之能力之影響。細胞/生物分析法之目的爲測定化合物對細胞中受T K刺激之生物效應之影響。活體内分析法之目的爲 -216- 本紙張&度適S古國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -----；—裝，— (請先閱讀背面之注意事項寫本頁) 訂- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1229073 A7 B7 五、發明說明（214) 測定化合物在特定病變（如：癌症）之動物模式中之影響。適合皮下外來移植物實驗之細胞株包括C 6細胞（神經膠質，ATCC # CCL 107)，A375細胞）黑色素瘤，ATCC # CRL 1619)，A431 細胞（表皮樣癌瘤，ATCC # CRL 1555)，Calu 6 細胞（肺，ATCC # HTB 56)，PC3細胞（攝護腺，ATCC # CRL 143 5)，SKOV3TP5細胞及經基因工程處理可過度表現 EGFR、PDGFR、IGF-1R或其他試驗激酶之NIH 3T3纖維母細胞。採用下列方法進行外來移植物實驗：自西蒙森實驗室（Simonsen Laboratories，Gilroy，CA)取得雌性無胸腺細胞（B ALB/c，nu/nu)。所有動物均保持在乾淨室内條件下之鋪設a -dri底層之微隔離籠中。接受無菌老鼠飼料及自由飲水。細胞株於適當培養基中生長（例如：MEM，DMEM，Ham，s F10，或Ham’s F12 + 5%至10%胎牛血清（FBS)及2 mM麩醯胺 (GLN))。所有培養基、麩醯胺、及胎牛血清均購自奇布可生命科技（Gibco Life Technologies，Grand Island，NY)，除非另有説明。所有細胞均於9 0至9 5 %空氣與5至10% <：02之潮濕大氣下，於3 7 °C下生長。所有細胞照例每週次培養二次，並由Mycotect法（奇布可公司）判定沒有黴漿菌存在。

於融合時或接近融合時，以0.05%胰蛋白酶-EDTA收集細胞，於450 X g下離心1 〇分鐘集結成塊。離心塊再懸浮於無菌PBS或培養基（不含FBS)中，至達特定濃度，細胞移植至小白鼠後腹部（每組8至1 〇隻小白鼠，2至10 X 106個細胞/ 隻）。採用測徑器測量腫瘤體積3至6週。以腫瘤長度X寬X -217- 本紙張尺度適闬中國國家標準（CNS)A4規格（21〇 X 297公g ) (請先閱讀背面之注意事項寫本頁) ·

經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1229073 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明說明（215) 高計算腫瘤體積，除非另有説明。採用史都登t _試驗計算p 値。含於50至100微升賦形劑（DMSO，或VPD : D5W)中之試驗化合物通常係於移植後第1天開始，依不同濃度進行1{>注射。腫瘤侵害模式已發展出下列腫瘤侵害模式，用於評估所鑑定化合物在選擇性抑制KDR/FLK-1受體上之醫療價値及效力。方法採用8週大無毛小白鼠（雌性）（西蒙森公司）作爲實驗動物。腫瘤細胞之植入法可於通風櫥中進行。麻醉時，經腹膜内投與赛畊（Xylazine/克它胺（Ketamine)混合液（1〇〇毫克/ 公斤克它胺與5毫克/公斤赛畊）。切開中線，曝露出腹腔 (約1.5公分長），注射含在1〇〇微升培養基中之1〇7個腫瘤細胞）。細胞係注入胰臟之十二腸葉或注入結腸之漿膜。以6 _ 0號連績絲縫線縫合腹膜及肌肉，使用傷口夾夾住皮膚。每天觀察動物。分析 2至6週後（依動物之大體觀察而定），殺死小白氣，取下轉移至各種不同器官（肺、肝、腦、胃、胰、心、肌肉）之局部腫瘤’並分析（測量腫瘤大小、侵害程度、免疫化學、原位雜交測定、等等）。 . 細胞毒性測定法醫療性化合物於抑制受體酪胺酸激酶活性上應比產生細胞毒性政應更強效。化合物之有效性及細胞毒性之測定法係 -218- 本紙張叉度这W中國國豕標準（CNS)A4規格（21〇 X 297公餐） (請先閱讀背面之注咅？事項^^|寫本頁) 裝- 訂- .線- 1229073

五、發明說明（216) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製由醫療指數（亦即ICm/LDm · ICd決定，達到50%抑制率時所需之劑量可採用如本文説明之標準技術測定。ld5〇係產生 50%毒性時之劑量，亦可由標準技術測定（莫斯曼（M〇ssman， 1983’ I^mmuno丄 Methods，65:55-63)，其係測定 LDH釋出量 (柯森尼斯基（Korzeniewski)與卡勒華特（Callewaert，1983, ^ Irnm^ol. Methods, 64:3 13，狄克（Decker)與洛曼·馬狄斯 (Lohmann-Matthes)，1988, L_ImmunoL Methods, 115:61)，或於動物模式中測定致死劑量。醫療指數高之化合物較佳。醫療指數應大於2，至少1〇較佳，至少5〇更佳。 B·實例-生物活性本發明化合物之試管内效力實例示於表1與2。數據顯示化合物於試管内對抗多種PTKs·時，通常相當強效。該化合物於活體内試驗時亦保持優越活性。例如本發明數種化合物當經口投藥時，使皮下植入小白鼠體内之c 6神經膠質腫瘤之平均大小顯著縮小。然而化合物5顯然優於本發明其他化合物。在一項實驗中，於第〇天，在雌性BA]LB/c nU/mH、白鼠之後腹邵皮下植入C 6人類神經膠質細胞（3 X 1 〇6個細胞，η = 1 0至2 0隻動物/組）。植入後第一天開始經口投與含於拉布索水溶液（aqueous labrasol)中之化合物3、5、1 9及 20，200毫克/公斤/天。採用測徑器測量腫瘤生長，並由長 X寬X高計算腫瘤體積。 . 219- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（2】0 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項Θ寫本頁) 裝- --線· !229〇73 A7 B7 五、替明說明（217 )

由下圖可見，所有試驗化合物均展現比僅使用載劑之對照組更顯著之抑制作用。然而，由試驗化合物之結構相近性而言，化合物5顯然優於其化化合物。亦即，當化合物3、 1 9及2 1均使植入後第1 8天腫瘤生長之抑制作用集中在約 4 0 - 4 5 %時，化合物5於此時抑制腫瘤生長達8 〇至8 5 %。訂經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 220- 本紙張汶tiS引中國國家標準（CNS)A4規格（210 公釐） 1229073 A7 B7 五、發明說明（218) -β- SU65970化錄 y SU6668e 化合杨 5| SU952〇e化合物 19 一f- SU9518〇i匕合彳勿 20 載削對照組 (^^^T)無？@

(請先閱讀背面之注意事項3寫本頁) 裝· _ 一-°J· 植入後天數化合物5於活體内之驚人效力（尤其當經口投藥時），進一步由與化合物6 5比較來證實： h〇2c

化合物65於試管内之效；6幾乎比化合物5高一倍（未出示 -221 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公釐） -I線' 經濟部智慧財產局員工消費合作社印^^ 1229073 Α7 Β7 _五、發明説明） 219 數據）。然而，當於小白鼠腹膜内對抗兩種不同腫瘤細胞株 (SF763T及SF767T)時，化合物5、之效力稍高於（於第1 2天時之抑制作用高出5%)至顯著高於（於第21天時之抑制作用高出14%)化合物05。當化合物5及化合物6 5經口投藥時，此二種化合物之間之活性差異更大。化合物6 5及其數種類似物（化合物6 6至6 9 ) 之口服效力圖示如下：請先閱讀背之注意事項再頁 00 5 2 15 00 10 〇 SU9902 @化合物66 STJ9903 @ 化合物 67 SU9905 @·化合物68 SU9908 @化合物69 SU9904 ® 化雜 69 拉布索水溶液未處理經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 50

I I Γ 1 I ' 1 | : 1 [ "* 1 ； j > 2 4 6 8 10 12 14 16 18 植入後夭數 .-,22,?·-- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210 X 297公釐） 1229073 A7 B7 五、發明說明（220 ho2c

66 〇

67 〇

68 CH,

I !裝* i I (請先閱讀背面之注意事項HI寫本頁) -4.- 訂.·- 69 由圖可見，化合物6 5經口投與200毫克/公斤/天時，於小白氣皮下植入C 6腫瘤1 8天後，展現約65%抑制作用，此點 _著優於其類似物，後者平均抑制腫瘤生長約丨4至丨6 %。然而，化合物6 5之口服效力仍驚人地顯著低於化合物5 ,此化合物5如上已述，在同時間及相同腫瘤模式中展現8〇-85〇/〇抑制作用。 δ與化合物70比較時，化合物5•對抗fgf-R1及PDGFR之 Kl s(抑制木數）顯著較小（亦即效力較高），對抗fgF-R1之 1爲化a物5之1.2 ’而化合物7〇則爲19·49，對抗pdGFr之

Ki貝1J未出示。 ' •線· 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1229073 A7 B7 五、發明說明（221 )

CK

CH3 Η 化合物5之驚人優異性尚Τ由其口服效力肖其相近類似物 (化合物7 1 )之口服效力之比較來證實：

-----ΤΙΙΤ-----裝--- (請先閱讀背面之注意事項|||寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印制衣 zi 儘管其具有結構相似性，但當於200毫克/公斤/天下進行口服試驗，在B ALB/c nu/nu小白鼠體内對抗皮下C 6人類黑色素瘤時，於植入後第1 8天時之化合物7 1僅抑制57%腫瘤生長（未示出數據），而化合物5則再度展現8 0至8 5 %抑制作用0 根據上述化合物5 口服時之驚人效力，化合物5爲本發明目前較佳具體實施例。結論。因此，咸了解本發明化合物、方法及醫藥組合物可有效碉節PK活性，因此應爲對抗RTK、CTK-及STK-相關病變之有效醫療劑。 _ -224- 本纸張尺度適用中國國^票準（CNS)A4規格⑵〇 x 297公^7 · •線· 1229073 五、發明說明（222 ) 相關技藝專家咸了解，本發明完全配合進行達到到本文説明及固有之結果與優點。本文說入: ，方法、過程、處理、分子、明確化合物爲目前代表，爲範例，並無意限制本發明之範園。相:: 技藝專家們可能進行之變化及其他用法均涵括在申: 範圍所定義之本發明内涵範圍内。 η 2關技藝專家們咸了解，本文揭示之發明内容本發明之範圍及内涵内進行各種替代及修改。不偏離頁本説明書中述及之所有專利案及文獻説明與彼等相關技範本入文本r宛如各文獻已明確，使此明本文説明之本發明可在缺少本文未明確揭示之任㈤、限制(群)下操作。因此例如:本文中出現之任本，"基本上包括"及"包括"可被其他任二個名詞替代。已。用之名詞及表示法係、用爲説明名詞，且不受限制， ‘線寺名詞與表示法之用法中無意排除其所出示特色及其説明或郅…何同等物，但咸了解可在申請專利範園内進行各種修改。因此咸了解，雖然本發明已利用較佳具體實施例及視需要選用〈特色進行明確説明，但相關技仍I能修飾及改變本文揭示之觀念，而此等修_改= 在申請專利範圍所定義之本發明範圍内。又仍此外，若本發明之特色或女 g—)之名稱説明時，相關族：— 剛抆轟專豕咸了％，本發明亦藉 -225 本紙狀！:¾ Μ 関家標準(CNS)A4 (2J〇T^7i^7 1229073 A7 B7 五、發明說明（ 223 ) 由馬庫希族群之任何個別成員或成員之次族群説明。例如：若X説明爲選自包含溴、氣及碘之族群中時，則完全説明X爲溴之申請專利範圍及X爲溴與氣之申請專利範圍。其他具體實施例均在下列申請專利範圍中。 (請先閱讀背面之注意事項寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -226- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A.4規格（210 X 297公釐）

Claims

1229(^為8108925號專利申請案3·“·ΰί益中文申請專利範圍替換本⑼车Π气彳〇8 y^V j：k 13' -^φη

本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(210 X 297公釐) 1229073

R8為未取代之0:^4烷基； R9為-(CH2)(CH2)C(=0)0H ;及 R1 G為未取代之C ! _ 4燒基。 2.根據申請專利範圍第1項之化合物，其具有下气

稱為3 [2,4-一甲基- 5-(2-氧-1，2-二氫亞吲嗓基甲基吡咯-3-基]-丙酸。 3 ·種用於治療或預防生物體之蛋白質激酶相關病變之醫藥組合物，包含治療有效量之根據申請專利範圍第丨項之化合物。 4 ·根據申請專利範圍第3項之醫藥組合物，包含治療有效量之根據申請專利範圍第2項之化合物。 5·根據申請專利範圍第3項之醫藥組合物，其中該蛋白質激酶相關病變係選自··受體酪胺酸激酶相關病變、非受體酶胺酸激酶相關病變及絲胺酸-蘇胺酸激酶相關病變。 6 ·根據申請專利範圍第4項之醫藥組合物，其中該蛋白質激酶相關病變係選自：受體酪胺酸激酶相關病變、非受體 -2 - 1229073 B8 C8 _____ D8 六、申請專利範圍酵胺酸激酶相關病變及絲胺酸-蘇胺酸激酶相關病變。 7·根據申請專利範圍第3項之醫藥組合物，其中該蛋白質激酶相關病變係選自：EGFR相關病變、PDGFR相關病變、 IGFR相關病變及flk相關病變。 8·根據申請專利範圍第4項之醫藥組合物，其中該蛋白質激酶相關病變係選自：EGFR相關病變、PDGFR相關病變、 IGFR相關病變及flk相關病變。 9·根據申請專利範圍第3項之醫藥組合物，其中該蛋白質激酶相關病變為選自下列之癌症：鱗狀細胞癌瘤、星細胞瘤、卡波西氏肉瘤、神經膠質母細胞瘤、肺癌、膀胱癌、頭與頸癌、黑色素瘤、卵巢癌、攝護腺癌、乳癌、小細胞肺癌、神經膠質瘤、.結腸直腸癌、生殖泌尿器官癌及肠胃癌。 10·根據申請專利範圍第4項之醫藥組合物，其中該蛋白質激酶相關病變為選自下列之癌症：鱗狀細胞癌瘤、星細胞瘤、卡波西氏肉瘤、神經膠質母細胞瘤、肺癌、膀胱癌、頭與頸癌、黑色素瘤、卵巢癌、攝護腺癌、乳癌、小細胞肺癌、神經膠質瘤、結腸直腸癌、生殖泌尿器官癌及腸胃癌。 11·根據申睛專利範圍第3項之醫藥組合物，其中該蛋白質激酶相關病變係選自：糖尿病、過度增殖病變、血管分佈形成、炎症、免疫病變及心血管病變。 12·根據申睛專利範圍第4項之醫藥組合物，其中該蛋白質激酶相關病變係選自··糖尿病、過度增殖病變、血管分佈 -3 - ^紙張尺度適财® ®轉準(CNS) A4規格(2ι〇χ297公釐〉 1229073 A8 B8 C8 ------------ D8 六、申請專利範圍形成、炎症、免疫病變及心血管病變。 13·根據申請專利範圍第9項之醫藥組合物，其中該生物體為哺乳動物。 14·根據申請專利範圍第丨〇項之醫藥組合物，其中該生物體為哺乳動物。 15·根據申請專利範圍第1項之化合物，其係選自下列： 3-[5-(5-氯-2_氧-1，2-二氫亞啕哚-3-基甲基）-2,4-二甲基- 1H-吡咯-3-基]-丙酸， 3-[2,4·二甲基-5-(2-氧-1，2-二氫亞吲哚_3_基甲基）-1Η- 吡咯·3-基]-丙酸， 3_[5-(5-溴-2-氧-1,2-二氫亞吲哚-3-基甲基）-2,4-二甲基-lH-ρ比洛_3_基]-丙酸， 3-[5-(5-琪-2-氧-1，2-二氫亞吲哚-3-基甲基）-2,4-二甲基· 1H-吡嘻-3-基]-丙酸， / 3_[2,4-二甲基-5-(4-甲基-2-氧-1，2-二氫亞吲哚-3-基甲基MH-吡咯-3_基]-丙酸， 3-[2,4- 一甲基- 5-(5 -甲基-2 -氧-1,2-二氣亞 < 嗓-3 -基甲基）-1Η-吡嘻-3-基]-丙酸， 3-[5-(6-幾基-2-氧-1，2-二氫亞啕嗓-3-基甲基）-2,4 -二甲基* 1Η -外匕- 3 -基]-丙酸， 3-[5-(6-甲氧基-2-氧-1，2-二氫亞吲哚-3-基甲基）-2,4-二甲基-1Η-吡咯-3-基]·丙酸， 3-{5-[6-(3 -甲氧苯基）-2 -氧-1,2 -二氯亞ρ引嗓_3-基甲基]_ 2,4-二甲基-111-外!：嘻-3-基}-丙酸， -4 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1229073 A8 B8 C8 申請專利範圍 3-{5-[6-(3-乙氧苯基）-2·氧-丨，2·二氳亞啩哚·％基甲基]· 2,4_二甲基_1H•吡咯基卜丙酸， >[2,4β二甲基巧_(2-氧-6-苯基-1，2-二氫亞丨哚-3-基甲基）_1H-峨咯_3-基]-丙酸， 3-{5_[6-(4•甲氧苯基二氫亞峭哚基甲基]· 2.4- 一甲基_1H•吡咯-3-基}_丙酸， 3 {5 [6_(2_甲氧苯基）-；2-氧-丨，2·二氫亞钊哚基甲基卜 2.4- 二甲基吡咯-3-基丨·丙酸， 3 [2’4 一甲基-5-(6-嗎淋-4-基-2-氧-1，2_二氫亞Θ丨嗓-3-基甲基）-1Η-吡咯-3-基]-丙酸， 3-[5-氯-4-甲基_2-氧-1，2-二氫亞吲嗓_3-基甲基卜2,4-二甲基-1H-吡咯-3-基]-丙酸。 16·根據申請專利範圍第丨丨項之醫藥組合物，其中該過度增殖病變係選自血管再狹窄、纖維變性及牛皮癖。 Π·根據申請專利範圍第丨丨項之醫藥組合物，其中該炎症係選自骨關節炎及類風濕關節炎。 18·根據申請專利範圍第丨2項之醫藥組合物，其中該過度增殖病變係選自血管再狹窄、纖維變性及牛皮癬。 19·根據申請專利範圍第12項之醫藥組合物，其中該炎症係選自骨關節炎及類風濕關節炎。 2〇·根據申請專利範圍第丨丨項之醫藥組合物，其中該免疫病變為自體免疫病變。 21·根據申請專利範圍第12項之醫藥組合物，其中該免疫病變為自體免疫病變。