EA005032B1 - Пирролзамещенные 2-индолиноны (варианты), фармацевтическая композиция (варианты), способ модулирования каталитической активности протеинкиназы, способ лечения или профилактики нарушения в организме, связанного с протеинкиназой - Google Patents

Abstract

Настоящее изобретение относится к новым пирролзамещенным 2-индолинонам и их физиологически приемлемым солям и пролекарствам, которые модулируют активность протеинкиназы и, следовательно, их можно использовать для профилактики и лечения клеточных нарушений, связанных с протеинкиназой, таких как онкологические заболевания.

Description

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение в основном относится к органической химии, биохимии, фармакологии и медицине. Более конкретно, изобретение относится к новым соединениям пирролзамещенного 2-индолинона, их физиологически приемлемым солям и пролекарствам, которые модулируют активность протеинкиназ (ПК) и, следовательно, как ожидается, проявляют лечебное действие по отношению к отклонениям в организме, связанным с аномальной активностью ПК.

Приоритет настоящей заявки испрашивается на основании предварительной заявки на выдачу патента США Νο 60/087310, поданной 29 мая 1998 г., и предварительной заявки на выдачу патента США Νο 60/116106, поданной 15 января 1999 г., обе заявки включены в описание в качестве ссылок.

Уровень техники

В данном разделе представлена информация только о предпосылках создания изобретения, причем данную информацию не следует рассматривать как предшествующий уровень техники настоящего изобретения.

ПК являются ферментами, катализирующими фосфорилирование гидроксильных групп остатков тирозина, серина и треонина в белках. Такая простая на первый взгляд активность имеет глубокие последствия: рост, дифференциация и пролиферация клеток, то есть практически все аспекты функционирования клеток так или иначе зависят от активности ПК. Более того, аномальная активность ПК связана с широким спектром нарушений в организме от совместимых с жизнью заболеваний, таких как псориаз, до чрезвычайно опасных заболеваний, таких как глиобластома (рак мозга).

Обычно ПК разделяют на два класса: тирозинкиназы (ТК) и серин-треонинкиназы (СТК).

Одним из основных аспектов активности ТК является ее взаимосвязь с рецепторами ростовых факторов - белками, расположенными на поверхности клеток. При связывании с лигандом рецепторы ростового фактора превращаются в активную форму, которая взаимодействует с белками, расположенными с внутренней стороны клеточной мембраны. В результате происходит фосфорилирование остатков тирозина рецептора и других белков, а также образование внутри клеток комплексов с рядом цитоплазматических сигнальных молекул, которые в свою очередь воздействуют на множественный клеточный ответ, такой как деление клеток (пролиферация), дифференциация клеток, рост клеток, влияние результата метаболизма на внеклеточное микроокружение и т.п. Более подробная информация приведена в статье ЗсШеззтдег и ИИпсЬ, №игоп. 9:303-391 (1992), которая включена в данное описание в качестве ссылки, включая любые фигуры, как полностью изложено в данном описании.

Рецепторы факторов роста, обладающие активностью ТК, известны как рецепторные ТК (РТК). К таким рецепторам относится многочисленное семейство трансмембранных рецепторов с разнообразной биологической активностью. В настоящее время идентифицировано по крайней мере девятнадцать (19) различных подсемейств РТК. Примером таких подсемейств является подсемейство, названное РТК НЕК, включающее рецептор эпителиального фактора роста (ЕСЕК), НЕК2, НЕК3 и НЕК4. Указанные РТК состоят из внеклеточного гликозилированного лиганд-связывающего домена, трансмембранного домена и внутриклеточного цитоплазматического каталитического домена, который может фосфорилировать остатки тирозина в белках.

Другое подсемейство РТК включает рецептор инсулина (1К), рецептор инсулиноподобного фактора роста I (1СЕ-1К) и рецептор 1КК - родственный рецептору инсулина. 1К и 1СЕ-1К взаимодействуют с инсулином, 1СЕ-1 и 1СЕ-11 с образованием гетеротетрамера, состоящего из двух полностью внеклеточных гликозилированных субъединиц а и двух субъединиц β, которые пересекают клеточную мембрану и содержат домен ТК.

К третьему подсемейству РТК относится группа рецепторов фактора роста тромбоцитов (РЭСЕК). которая включает РЭСЕКа. РЭСЕКв. С8Е1К, с-кй и с-1тз. Эти рецепторы состоят из гликозилированных внеклеточных доменов, содержащих вариабельное число иммуноглобулинподобных петель, и из внутриклеточного домена, в котором последовательность тирозинкиназного домена включает другие (неродственные) аминокислотные фрагменты.

Другой группой, которую иногда из-за схожести с подклассом РЭСЕК относят к вышеупомянутому подклассу, является подсемейство рецепторных киназ из эмбриональной печени (рецепторные киназы Е1к). Предполагают, что упомянутая группа рецепторов состоитиз киназ, включающих киназный домен рецептора Е1к-1 (КОК/ЕЬК-1), Йк-1К, Пк-4 и Етз-подобную тирозинкиназу-1 (111-1).

К другим членам семейства рецепторных ТК, являющихся рецепторами факторов роста, относится подгруппа рецепторов фактора роста фибробластов (ЕСЕ). Эта группа включает четыре рецептора, ЕСЕК1-4, и семь лигандов, ЕСЕ1-7. Согласно предварительным данным рецепторы состоят из гликозилированных внеклеточных доменов, содержащих вариабельное число иммуноглобулинподобных петель, и из внутриклеточного домена, в котором последовательность тирозинкиназы прерывается фрагментами других неродственных аминокислот.

Еще одним членом семейства рецепторных ТК, являющихся рецепторами факторов роста, является подгруппа рецепторов фактора роста эндотелия сосудов (УЕСК). По строению УЕСЕ аналогичен димерному гликопротеину РОСЕ, но характеризуется другими биологическими функциями и специфичностью в отношении клеток-мишеней ίη νίνο. В частности, в настоящее время считают, что УЕСЕ играет существенную роль при васкулогенезе, а также при ангиогенезе.

Более полная номенклатура известных подсемейств РТК представлена Ρ1ο\νιη;·ιη с соавт. в статье ΌΝ&Ρ, 7(6):334-339 (1994), которая включена в данное описание в качестве ссылки, включая любые фигуры.

Кроме семейства РТК существует также семейство целиком и полностью внутриклеточных РТК, названных нерецепторные ТК или клеточные ТК.

Последнее название, сокращенно КТК, будет использовано в данном тексте описания. КТК не содержат внеклеточного и трансмембранного доменов. В настоящее время идентифицировано более 24 КТК, включающих 11 подсемейств (8гс, Егк, В1к, Сак, ЛЫ, Ζαρ70, Ееа, Ера, Еак, 1ак и Аск). До настоящего времени подсемейство 8гс является самым многочисленным семейством КТК и включает 8гс, Уеа, Еуп, Ьуп, Ьск, В1к, Нск, Едг и Угк. Более подробное описание КТК можно найти в статье Во1еп, Опсодепе, 8:2025-2031 (1993), которая включена в данное описание в качестве ссылки, включая любые фигуры.

Серин-треонинкиназы, СТК, аналогично КТК являются преимущественно внутриклеточными, хотя известно несколько рецепторных киназ типа СТК. СТК является наиболее распространенной цитозольной киназой, то есть киназой, выполняющей функцию в данной части цитоплазмы, а не в цитоплазматических органеллах и цитоскелете. Цитозолем называется область внутри клетки, в которой происходит большая часть промежуточной метаболитической и биосинтетической активности, опосредованной клеткой, например, именно в цитозоле происходит синтез белков на рибосомах.

Все РТК, КТК и СТК принимают участие в развитии многочисленных патологических процессов, включая, главным образом, рак. К другим патологическим состояниям, связанным с ТК, относятся, без ограничения перечисленным, псориаз, цирроз печени, диабет, ангиогенез, рестеноз, глазные заболевания, ревматоидный артрит и другие воспалительные процессы, иммунологические заболевания, такие как аутоиммунное заболевание, сердечно-сосудистые заболевания, такие как атеросклероз и ряд почечных нарушений.

Что касается онкологических заболеваний, в настоящее время существуют две основные гипотезы, объясняющие взаимосвязь избыточ ной пролиферации клеток, которая приводит к развитию опухоли, с функциями, известными как регулируемые протеинкиназами. Так, например, предполагают, что рост злокачественных клеток является результатом нарушения механизмов, контролирующих процессы деления клеток и/или дифференциации. Показано, что белковые продукты ряда прото-онкогенов вовлечены в пути передачи сигналов, регулирующих рост и дифференциацию клеток. Указанные белковые продукты прото-онкогенов включают внеклеточные факторы роста, трансмембранные рецепторы факторов роста ТК (РТК), цитоплазматические ТК (КТК) и цитозольные СТК, описанные выше.

С точки зрения очевидной взаимосвязи между регулируемой ПК клеточной активностью и широким спектром разнообразных нарушений у человека, нет ничего удивительного в том, что были предприняты многочисленные попытки найти способ модулирования активности ПК. К некоторым из них относятся подходы с использованием биомиметиков, то есть больших молекул, созданных по образцу молекул, вовлеченных в реальные клеточные процессы (например, мутантные лиганды (заявка на выдачу патента США Νο 4966849); растворимые рецепторы и антитела (заявка Νο АО 94/10202, статья Кепба11 и Т1ютаа, Ргос. Ναΐ'1 Асаб. 8ск, 90:10705-09 (1994), статья К1т с соавт. №1иге, 362:841-844 (1993)); лиганды РНК (статьи 1ейпек с соавт., Вгос11епиа1гу. 33:10450-56; Такаю с соавт., Μο1. Вю. Се11., 4:358А (1993); Кш8е11а с соавт., Ехр. Се11 Кеа., 199:56-62 (1992); Ап§111 с соавт., 1. Се11и1аг Р1уа., 152:448-57) и ингибиторы ТК (АО 94/03427; АО 92/21660; АО 91/15495; АО 94/14808; патент США Νο 5330992; статья Малаш с соавт., Ргос. Ат. Аа8ο^ Сапсег Кеа.. 35:2268 (1994)).

Кроме вышеперечисленных исследований были предприняты попытки идентифицировать небольшие молекулы, действующие как ингибиторы ПК. Например, в качестве ингибиторов ТК описаны соединения бис-моноциклических, бициклических и гетероциклических арильных производных (заявка РСТ АО 92/20642), производные виниленазаиндола (заявка РСТ АО 94/14808) и соединения 1-циклопропил-4пиридилхинолонов (патент США Νο 5330992). В качестве ингибиторов ТК, используемых при лечении опухолевых заболеваний, описаны соединения стирола (патент США Νο 5217999), стирилзамещенные пиридильные соединения (патент США Νο 5302606), производные хиназолина (заявка на выдачу европейского патента Νο 0566266 А1), селениндолы и селениды (заявка РСТ АО 94/03427), трициклические полигидроксильные соединения (заявка РСТ АО 92/21660) и производные бензилфосфоновой кислоты (заявка РСТ АО 91/15495).

Сущность изобретения

Предпринятые авторами настоящего изобретения попытки идентифицировать небольшие органические молекулы, модулирующие активность ПК, и которые, следовательно, можно использовать для лечения и профилактики нарушений, включающих аномальную активность ПК, привели к открытию семейства новых соединений пирролзамещенных 2-индолинонов, обладающих способностью модулировать активность ПК и, следовательно, можно предположить, что такие соединения обладают лечебным действием в отношении нарушений, связанных с аномальной активностью ПК. Указанные соединения являются предметом настоящего изобретения.

Таким образом, настоящее изобретение в основном относится к новым пирролзамещенным 2-индолинонам, которые модулируют активность РТК, КТК и СТК. Кроме того, настоящее изобретение относится к получению и использованию фармацевтических композиций описанных соединений, их физиологически приемлемых солей и пролекарств для лечения или профилактики вызванных ПК нарушений, таких как (представленных в качестве примера и без ограничения перечисленным) опухолевые заболевания, диабет, цирроз печени, сердечнососудистые заболевания, такие как атеросклероз, ангиогенез, иммунологические заболевания, такие как аутоиммунные заболевания, и заболевания почек.

Использованные в данном описании взаимозаменяемые термины 2-индолинон, индолин-2-он и 2-оксиндол означают молекулу

Термин пиррол означает молекулу формулы

н

Взаимозаменяемые термины пирролзамещенный 2-индолинон и 3-пирролиденил-2индолинон, использованные в данном описании, означают химическое соединение общей формулы 1.

Термин фармацевтическая композиция означает смесь одного или более описанных в данном описании соединений, или его физиологически приемлемых солей, или его пролекарств с другими химическими компонентами, такими как физиологически приемлемые носители и наполнители. Назначение фармацевтической композиции заключается в облегчении введения соединения в организм.

Термин пролекарство означает агент, который превращается в исходное лекарство ΐπ νΐνο. Пролекарства часто используются, так как в некоторых случаях введение в виде пролекарства является более простым способом по сравнению с введением в виде исходного лекарства. Например, пролекарства могут быть биодоступными при оральном введении в отличии от исходного лекарства. Пролекарство в составе фармацевтической композиции может обладать более высокой растворимостью по сравнению с исходным лекарством. Примером пролекарства, без ограничения перечисленным, может быть соединение по настоящему изобретению, которое вводят в виде сложного эфира (пролекарства) с целью облегчения прохождения соединения через клеточную мембрану, где растворимость в воде оказывает отрицательное воздействие на подвижность, однако затем при прохождении внутрь клетки, где растворимость в воде является положительным свойством, соединение подвергается метаболитическому гидролизу с образованием карбоновой кислоты, то есть активного соединения.

Другим примером пролекарства может быть короткий полипептид, например, без ограничения перечисленным, полипептид, состоящий из 2-10 аминокислотных остатков, присоединенный посредством концевой аминогруппы к соединению по настоящему изобретению, причем полипептид гидролизуется или происходит его метаболитическое превращение ΐπ νΐνο с высвобождением активной молекулы.

Термин пирролальдегид означает моле-

Использованный в данном тексте термин физиологически приемлемый носитель означает носитель или разбавитель, который не вызывает значительного раздражения организма и не воздействует отрицательно на биологическую активность и свойства введенного соединения.

Термин наполнитель означает инертное вещество, которое добавляют в фармацевтическую композицию для дальнейшего облегчения введения соединения. Примеры наполнителей, без ограничения перечисленным, включают карбонат кальция, фосфат кальция, различные типы сахаров и крахмалов, производные целлюлозы, желатин, растительные масла и полиэтиленгликоли.

1. ХИМИЯ

А. Общие структурные признаки

Одним объектом настоящего изобретения являются пирролзамещенные 2-индолиноны, которые, кроме того, что могут по выбору содержать заместители в обоих пиррольном и индолинольном остатках, должны содержать в качестве заместителей пиррольного остатка один или более углеводородных цепей, которые в свою очередь замещены по крайней мере одной полярной группой. Физиологически приемлемые соли и пролекарства заявленных соединений также включены в область настоящего изобретения.

Термин углеводородная цепь означает алкильную, алкенильную или алкинильную группы, как определено в данном описании.

Термин полярная группа означает группу, в которой ядра атомов ковалентно связаны друг с другом с образованием группы, в которой электронная плотность в области ковалентной связи (связей) распределена неравномерно, в результате электронная плотность вокруг одного атома более плотная по сравнению с другим атомом и таким образом атом с одной стороны данной ковалентной связи имеет относительный отрицательный заряд, а атом с другой стороны ковалентной связи имеет относительно положительный заряд; т.е. в молекуле образуются отрицательный и положительный полюса. Примеры полярных групп включают, без ограничения перечисленным, гидрокси, алкокси, карбокси, нитро, циано, амино, аммоний, амидо, уреидо, сульфонамидо, сульфинил, сульфонил, фосфоно, морфолино, пиперазинил и тетразоло.

Не будучи связанными какой-либо определенной теорией, заявители в настоящее время полагают, что полярные группы могут взаимодействовать с аминокислотными остатками в активном центре ПТК посредством электронных взаимодействий, например (без ограничения перечисленным), с помощью водородных связей, Ван-дер-Ваальсовых сил и/или ионных связей (но не ковалентного связывания). Такие взаимодействия способствуют связыванию молекул по настоящему изобретению с активным центром достаточно прочно, чтобы препятствовать проникновению или предотвратить проникновение природного субстата в активный центр. Полярные группы могут также определять селективность действия данных соединений, т. е. одна полярная группа может иметь большее сродство к связывающему домену ПТК, чем другие полярные группы, и таким образом соединение, содержащее первую определенную полярную группу, будет более эффективным, чем соединения, содержащие другие полярные группы.

Таким образом, одним объектом настоящего изобретения являются соединения со следующей химической структурой:

где В¹ выбирают из группы, включающей водород, алкил, алкенил, алкинил, циклоалкил, арил, гидрокси, алкокси, С-карбокси, О-карбокси, ацетил, С-амидо, С-тиоамидо, сульфонил и тригалогенметансульфонил,

В² выбирают из группы, включающей водород, галоген, алкил, циклоалкил, арил, гетероарил или гетероалициклическую группу,

В³, В⁴, В⁵ и В⁶ независимо выбирают из группы, включающей водород, алкил, тригалогеналкил, циклоалкил, алкенил, алкинил, арил, гетероарил, гетероалициклическую группу, гидрокси, алкокси, арилокси, меркапто, алкилтио, арилтио, сульфинил, сульфонил, 8-сульфонамидо, Ν-сульфонамидо, тригалогенметансульфонамидо, карбонил, С-карбокси, О-карбокси, С-амидо, Ν-амидо, циано, нитро, галоген, Окарбамил, Ν-карбамил, О-тиокарбамил, Νтиокарбамил, амино и -NВ¹¹В¹²,

В¹¹ и В¹² независимо выбирают из группы, включающей водород, алкил, циклоалкил, арил, карбонил, ацетил, сульфонил, трифторметансульфонил и конденсированные пяти- или шестичленные гетероалициклические кольца,

В³ и В⁴, В⁴ и В⁵ или В⁵ и В⁶ могут быть объединены с образованием шестичленного арильного кольца, метилендиокси группы или этилендиокси группы,

В⁷ выбирают из группы, включающей водород, алкил, циклоалкил, алкенил, алкинил, арил, гетероарил, гетероалициклическую группу, гидрокси, алкокси, арилокси, карбонил, ацетил, С-амидо, С-тиоамидо, амидино, Скарбокси, О-карбокси, сульфонил и тригалогенметансульфонил,

В⁸, В⁹ и В¹⁰ независимо выбирают из группы, включающей водород, алкил, тригалогеналкил, циклоалкил, алкенил, алкинил, арил, гетероарил, гетероалициклическую группу, гидрокси, алкокси, арилокси, меркапто, алкилтио, арилтио, сульфинил, сульфонил, 8-сульфонамидо, Ν-сульфонамидо, карбонил, С-карбокси, О-карбокси, циано, нитро, галоген, Окарбамил, Ν-карбамил, О-тиокарбамил, Νтиокарбамил, С-амидо, Ν-амидо, амино и -НВ^ПВ¹², при условии, что по крайней мере один из заместителей В⁸, В⁹ или В¹⁰ означают группу, представленную формулой -(а1к₁7.

А1к₁, выбирают из группы, включающей алкил, алкенил или алкинил.

Ζ означает полярную группу.

Термин алкил, использованный в данном описании, означает насыщенный алифатический углеводород, включающий неразветвленные и разветвленные цепи. Предпочтительная алкильная группа содержит от 1 до 20 атомов углерода (где численный интервал, например, 1-20, использованный в данном контексте, означает, что группа, в данном случае алкильная группа, может содержать 1 атом углерода, 2 атома углерода, 3 атома углерода и т.д. до 20 атомов углерода включительно). Более предпочтительная алкильная группа имеет среднюю длину и содержит от 1 до 10 атомов углерода. Наиболее предпочтительная алкильная группа означает низший алкил, содержащий от 1 до 4 атомов углерода. Алкильная группа может быть замещенной или незамещенной. Если алкильная группа содержит заместители, то один или более заместителей предпочтительно выбирают индивидуально из группы, включающей циклоалкил, арил, гетероарил, гетероалициклическую группу, гидрокси, алкокси, арилокси, меркапто, алкилтио, арилтио, циано, галоген, карбонил, тиокарбонил, О-карбамил, Ν-карбамил, О-тиокарбамил, Ν-тиокарбамил, С-амидо, Ν-амидо, Скарбокси, О-карбокси, нитро, силил, амино и -ΝΚ¹¹Κ¹², где К.¹¹ и К¹² определены выше.

Термин циклоалкил означает моноциклические или сопряженные кольца, состоящие только из атомов углерода (т. е. кольца, которые содержат общую пару соседних атомов углерода), где одно или более колец не содержат полностью сопряженную π-электронную систему. Примеры циклоалкильных групп, без ограничения перечисленным, включают циклопропан, циклобутан, циклопентан, циклопентен, циклогексан, адамантан, циклогексадиен, циклогептан и циклогептатриен. Циклоалкильная группа может быть замещенной или незамещенной. Если циклоалкильная группа содержит заместители, то один или более заместителей предпочтительно выбирают индивидуально из группы, включающей алкил, арил, гетероарил, гетероалициклическую группу, гидрокси, алкокси, арилокси, меркапто, алкилтио, арилтио, циано, галоген, карбонил, тиокарбонил, С-карбокси, Окарбокси, О-карбамил, Ν-карбамил, С-амидо, Νамидо, нитро, амино и -ΝΚ К , где К и К определены выше.

Термин алкенил означает алкильную группу, как определено в данном описании, содержащую по крайней мере 2 атома углерода и по крайней мере одну углерод-углеродную двойную связь.

Термин алкинил означает алкильную группу, как определено в данном описании, содержащую по крайней мере 2 атома углерода и по крайней мере одну углерод-углеродную тройную связь.

Термин арил означает моноциклические или сопряженные полициклические кольца, состоящие только из атомов углерода (т. е. кольца, которые содержат общую пару соседних атомов углерода), содержащие полностью сопряженную π-электронную систему. Примеры арильных групп, без ограничения перечисленным, включают фенил, нафталинил и антраценил. Арильная группа может быть замещенной или незамещенной. Если арильная группа содержит заместители, то в качестве заместителей предпочтительно выбирают один или более заместителей из группы, включающей галоген, тригалогенметил, алкил, гидрокси, алкокси, арилокси, меркапто, алкилтио, арилтио, циано, нитро, карбонил, тиокарбонил, С-карбокси, О-карбокси, О-карбамил, Ν-карбамил, О-тиокарбамил, Νтиокарбамил, С-амидо, Ν-амидо, сульфинил, сульфонил, амино и -НК¹¹К¹², где К¹¹ и К¹² определены выше.

Термин гетероарил означает моноциклические или сопряженные кольца, (например, кольца, которые содержат общую пару соседних атомов углерода), содержащие в кольце(ах) один или более атомов, которые выбирают из группы, включающей азот, кислород и серу и, кроме того, содержащие полностью сопряженную π-электронную систему. Примеры гетероарильных групп, без ограничения перечисленным, включают пиррол, фуран, тиофен, имидазол, оксазол, тиазол, пиразол, пиридин, пиримидин, хинолин, изохинолин, пурин и карбазол. Гетероарильная группа может быть замещенной или незамещенной. Если гетероарильная группа содержит заместители, то в качестве заместителей предпочтительно выбирают один или более заместителей из группы, включающей алкил, циклоалкил, галоген, тригалогенметил, гидрокси, алкокси, арилокси, меркапто, алкилтио, арилтио, циано, нитро, карбонил, тиокарбонил, сульфонамидо, С-карбокси, О-карбокси, сульфинил, сульфонил, О-карбамил, Ν-карбамил, Отиокарбамил, Ν-тиокарбамил, С-амидо, Νамидо, амино и -ΝΕ К , где К и К определены выше.

Термин гетероалициклическая группа означает моноциклические или сопряженные кольца, содержащие в кольце(ах) один или более атомов, которые выбирают из группы, включающей азот, кислород и серу. Данные кольца могут также содержать одну или более двойных связей. Однако данные кольца не содержат полностью сопряженную π-электронную систему. Гетероалициклическая группа может быть замещенной или незамещенной. Если гетероалициклическая группа содержит заместители, то в качестве заместителей предпочтительно выбирают один или более заместителей из группы, включающей алкил, циклоалкил, галоген, тригалогенметил, гидрокси, алкокси, арилокси, меркапто, алкилтио, арилтио, циано, нитро, карбонил, тиокарбонил, С-карбокси, Окарбокси, О-карбамил, Ν-карбамил, О-тиокарбамил, Ν-тиокарбамил, сульфинил, сульфо нил, С-амидо, Ν-амидо, амино и -ΝΚ¹¹Κ¹², где К¹¹ и К¹² определены выше.

Термин гидрокси означает -ОН группу.

Термин алкокси означает -О-алкил и -Оциклоалкил, как определено в данном описании.

Термин арилокси означает -О-арил и -Огетероарил, как определено в данном описании.

Термин меркапто означает -8Н группу.

Термин алкилтио означает -8-алкил и -8циклоалкил, как определено в данном описании.

Термин арилтио означает -δ-арил и -8гетероарил, как определено в данном описании.

Термин карбонил означает -С(=О)-К группу, где К выбирают из группы, включающей водород, алкил, циклоалкил, арил, гетероарил (соединенный через циклический атом углерода) и гетероалициклическую группу (соединенную через циклический атом углерода), как определено в данном описании.

Термин альдегид означает карбонильную группу, в которой К означает водород.

Термин тиокарбонил означает -С(=8)-К группу, в которой К определен в данном описании.

Термин С-карбокси означает -С(=О)О-К группу, в которой К определен в данном описании.

Термин О-карбокси означает -ОС(=О)К группу, в которой К определен в данном описании.

Термин сложный эфир означает -С(=О)О-К группу, в которой К определен в данном описании, при условии, что К не означает водород.

Термин ацетил означает -С(=О)СН₃ группу.

Термин карбоновая кислота означает Скарбокси группу, в которой К означает водород.

Термин галоген означает фтор, хлор, бром или иод.

Термин тригалогенметил означает -СХ₃ группу, в которой X означает галоген, как определено в данном описании.

Термин тригалогенметансульфонил означает Х₃С8(=О)₂- группу, где Х определен выше.

Термин циано означает -С N группу.

Термин сульфинил означает -8(=О)-К группу, где К, определенный выше, может также означать гидроксигруппу.

Термин сульфонил означает -8(=О)₂К группу, где К, определенный выше, может также означать гидроксигруппу.

Термин метилендиокси означает

-ОСН2О- группу, где два атома кислорода присоединены к соседним атомам углерода.

Термин этилендиокси означает

-ОСН2СН2О- группу, где два атома кислорода присоединены к соседним атомам углерода.

Термин 8-сульфонамидо означает -8(=О)₂NК¹¹К¹² группу, в которой К¹¹ и К¹² определены выше.

Термин Ν-сульфонамидо означает -^В^^ОХК.¹² группу, в которой К¹¹ и К¹² определены выше.

Термин О-карбамил означает

-ОС.’(=О^К^||К¹² группу, в которой К¹¹ и К¹² определены выше.

Термин Ν-карбамил означает

К¹²ОС(=О^К^П- группу, в которой К¹¹ и К¹² определены выше.

Термин О-тиокарбамил означает

-ОС(=8)МК^ПК¹² группу, в которой К¹¹ и К¹² определены выше.

Термин Ν-тиокарбамил означает К¹²ОС(=8^К^П- группу, в которой К¹¹ и К¹² определены выше.

Термин амино означает -ХК^ПК¹² группу, в которой оба К¹¹ и К¹² означают водород.

Термин С-амидо означает -С(=О):ХК^ПК¹² группу, в которой К¹¹ и К¹² определены выше.

Термин Ν-амидо означает К¹²С(=О):ХК^Пгруппу, в которой К¹¹ и К¹² определены выше.

Термин аммоний означает -'ΝΗΓΓ¹² группу, где К¹¹ и К¹² независимо выбирают из группы, включающей алкил, циклоалкил, арил и гетероарил.

Термин уреидо означает

-Νβ ¹С(=ОЖ^1:К ³ группу, где К¹¹ и К¹² опеределены в данном описании, и К¹³ имеет одинаковое значение с К¹¹ и К¹².

Термин гуанидино означает

-^Ν^ΝίΝΕ¹²^³ группу, где К¹¹, К¹² и К¹³ определены выше.

Термин амидино означает группу, где К¹¹ и К¹² определены выше.

Термин нитро означает %О₂ группу.

Термин фосфонил означает

-ОР(=О)₂ОК, где К определено выше.

Термин морфолиноозначает группу, имеющую следующую химическую структуру:

Термин пиперазинил означает группу, имеющую следующую химическую структуру: ✓νν*

О

N I

Термин тетразоло означает группу, имеющую следующую химическую структуру:

Б. Предпочтительные структурные признаки

Предпочтительным признаком настоящего изобретения является соединение, в котором К¹ означает водород.

Предпочтительным признаком настоящего изобретения также является соединение, в котором К² означает водород.

Предпочтительным признаком настоящего изобретения также является соединение, в котором К⁷ означает водород.

Предпочтительным признаком настоящего изобретения также является соединение, в котором все три приведенные выше ограничения действительны в одной молекуле, т.е. в соединении по настоящему изобретению К¹, К² и К⁷ означают водород.

Предпочтительным признаком настоящего изобретения также является соединение, в котором К³, К⁴, К⁵ и К⁶ выбирают из группы, включающей водород, незамещенный низший алкил, низший алкил, имеющий заместители, которые выбирают из группы, включающей гидрокси, галоген, С-карбокси, имеющий заместители, которые выбирают из группы, включающей водород и незамещенный низший алкил, амино или -ПК¹¹К¹²; незамещенный низший алкилалкокси, низший алкокси, замещенный одним или более галогенами, низший алкокси, имеющий заместители, включающие незамещенный арил или арил, имеющий один или более заместителей, которые независимо выбирают из группы, включающей незамещенный низший алкил, гидрокси, незамещенный низший алкилалкокси, галоген, амино, незамещенный низший алкил 8сульфонамидо или ПК¹¹К¹², незамещенный арил или арил, имеющий один или более заместителей, которые независимо выбирают из группы, включающей незамещенный низший алкил, незамещенный низший алкилалкокси, низший алкокси, замещенный одним или более галогенами, низший алкокси, имеющий заместитель, который выбирают из группы, включающей незамещенный арил или арил, имеющий один или более заместителей, которые независимо выбирают из группы, включающей незамещенный низший алкил, гидрокси, незамещенный низший алкилалкокси, галоген, амино, незамещенный низший алкил 8-сульфонамидо или ЫК¹¹К¹², гидрокси, амино, незамещенный низший алкилсульфонамидо, С-карбокси, имеющий заместители, которые выбирают из группы, включающей водород или незамещенный низший алкил, морфолино, -ΝΕΕ², тригалогенметил, арил, арил, имеющий один или более заместителей, которые независимо выбирают из группы, включающей гидрокси, галоген, тригалогенметил, амино, -ΝΕΑ, сульфонамидо, Скарбокси, имеющий заместитель, который выбирают из группы, включающей водород или незамещенный низший алкил, незамещенный низший алкил или низший алкил, имеющий за меститель, который выбирают из группы, включающей гидрокси, галоген, С-карбокси, имеющий заместитель, который выбирают из группы, включающей водород или незамещенный низший алкил, амино или -ПК¹¹К¹², незамещенную гетероалициклическую группу, гетероалициклическую группу, имеющую один или более заместителей, которые независимо выбирают из группы, включающей галоген, гидрокси, незамещенный низший алкил, незамещенный низший алкилкарбонил, гидрокси, незамещенный низший алкилалкокси или алкокси, замещенный одним или более галогенами, незамещенный арилокси, арилокси, имеющий один или более заместителей, которые независимо выбирают из группы, включающей незамещенный низший алкил, тригалогенметил, галоген, гидрокси, амино или -ПК¹¹К¹², меркапто, незамещенный низший алкилалкилтио, незамещенный арилтио, арилтио, имеющий один или более заместителей, которые выбирают из группы, включающей галоген, гидрокси, амино или -ПК¹¹К¹², Скарбокси, имеющий заместитель, который выбирают из группы, включающей водород и незамещенный низший алкил, незамещенный низший алкил О-карбокси, незамещенный низший алкил 8-сульфонамидо, нитро, незамещенный низший алкил С-амидо, незамещенный низший алкил Ν-амидо, амино и -ПК¹¹К¹².

В других предпочтительных вариантах воплощения настоящего изобретения К³, К⁴, К⁵ и К⁶ независимо выбирают из группы, включающей водород, галоген, незамещенный низший алкил, низший алкил, имеющий один или более заместителей, которые выбирают из группы, включающей гидрокси, галоген, С-карбокси, имеющий заместитель, который выбирают из группы, включающей водород или незамещенный низший алкил, амино или -ΝΕΑ, незамещенный низший алкилалкокси, низший алкилалкокси, замещенный одним или более галогенами, незамещенный арилокси, арилокси, имеющий один или более заместителей, которые независимо выбирают из группы, включающей незамещенный низший алкил, низший алкил, замещенный одним или более галогеном, гидрокси, незамещенный низший алкилалкокси, галоген, амино или -ПК¹¹К¹², 8-сульфонамидо, где К¹¹ и К¹² независимо выбирают из группы, включающей водород и незамещенный низший алкил, незамещенный арил, арил, имеющий один или более заместителей, которые независимо выбирают из группы, включающей галоген, незамещенный низший алкил, низший алкил, замещенный одним или более галогеном, незамещенный низший алкилалкокси, амино или -ПК¹¹К¹², незамещенный гетероарил, гетероарил, имеющий один или более заместителей, которые независимо выбирают из группы, включающей незамещенный низший алкил, низший алкил, замещенный одним или более галогеном, незамещенный низший алкилалкок15 си, гидрокси, галоген, амино или -ΝΚ.Κ.^ι:. незамещенную гетероалициклическую группу, гетероалициклическую группу, имеющую один или более заместителей, которые независимо выбирают из группы, включающей галоген, гидрокси, незамещенный низший алкил, низший алкил, замещенный одним или более галогеном, незамещенный низший алкилалкокси, амино или -ΝΚ^ΠΚ?², незамещенный низший алкил Окарбокси, С-амидо, где Я¹¹ и Я¹² независимо выбирают из группы, включающей водород, незамещенный низший алкил и незамещенный арил, и Ν-амидо, где Я¹¹ и Я¹² независимо выбирают из группы, включающей водород, незамещенный низший алкил и незамещенный арил.

Предпочтительными признаками настоящего изобретения также являются соединения, в которых один из заместителей Я⁸, Я⁹ и Я¹⁰ означает -(а1к₁)2, в то время, как два оставшихся заместителя независимо выбирают из группы, включающей водород, гидрокси, незамещенный низший алкил, незамещенный низший алкенил, незамещенный низший алкинил, незамещенный низший алкилалкокси, низший алкокси, замещенный одним или более галогенами, незамещенный арилалкокси, амино, -ПЯ^пЯ¹², галоген, С-карбокси, имеющий заместители, которые выбирают из группы, включающей водород или незамещенный низший алкил, незамещенный низший алкил О-карбокси, незамещенный низший алкил С-амидо, незамещенный низший алкил Ν-амидо, ацетил, незамещенный низший алкил 8-сульфонамидо, незамещенный арил или арил, имеющий заместитель, который выбирают из группы, включающей галоген, гидрокси, незамещенный низший алкилалкокси, алкокси, замещенный одним или более галогеном, Скарбокси, имеющий заместитель, который выбирают из группы, включающей водород или незамещенный низший алкил, незамещенный низший алкил О-карбокси, амино, незамещенный низший алкил 8-сульфонамидо и ^Я^ПЯ¹²

Предпочтительными признаками настоящего изобретения также являются соединения, в которых Я⁸ и Я¹⁰ выбирают из группы, включающей водород и незамещенный низший алкил.

Предпочтительным признаком настоящего изобретения также является соединение, в котором а1к₁ означает незамещенный низший алкил.

Другим предпочтительным признаком настоящего изобретения также являются соединения, в которых Ζ выбирают из группы, включающей гидрокси, амино, -ПЯ^пЯ¹², четвертичный аммоний, С-карбокси, имеющий заместитель, который выбирают из группы, включающей водород или незамещенный низший алкил, С-амидо, имеющий заместители, которые выбирают из группы, включающей водород и незамещенный низший алкил, морфолино, пиперидинил, тетразоло и фосфонил.

Другим предпочтительным признаком настоящего изобретения также являются соединения, в которых а1к₁ означает незамещенный низший (С₂-С₄)алкил и Ζ означает карбоновую кислоту.

Предпочтительным признаком настоящего изобретения также является соединение, в котором Я⁹ означает ηΐρΖ.

Предпочтительным признаком настоящего изобретения также является соединение, в котором Я¹¹ и Я¹² независимо выбирают из группы, включающей водород, незамещенный низший алкил, гидрокси, незамещенный низший алкилалкокси, незамещенный низший алкилкарбонил, незамещенный низший алкил О-карбокси и ацетил.

В другом предпочтительном варианте настоящего изобретения Я¹, Я², Я³, Я⁴, Я⁵, Я⁶ и Я⁷ означают водород, Я⁸ и Я¹⁰ означают метил и Я⁹ означает -СН₂Сн₂С(=О)ОН.

В другом предпочтительном варианте настоящего изобретения Я¹, Я², Я³, Я⁴, Я⁵, Я⁶, Я⁷ и Я⁸ означают водород, Я¹⁰ означает метил и Я⁹ означает -СН₂СН₂С(=О)ОН.

В еще одном предпочтительном варианте настоящего изобретения Я⁷ выбирают из группы, включающей водород, незамещенный низший алкил и низший алкил, имеющий заместитель, который выбирают из группы, включающей незамещенный циклоалкил, незамещенный арил и арил, имеющий заместитель, который выбирают из группы, включающей гидрокси, незамещенный низший алкилалкокси и галоген.

В предпочтительном варианте настоящего изобретения Ζ выбирают из группы, включающей -С(=О)ПЯ¹³Я¹⁴, где Я¹³ и Я¹⁴ независимо выбирают из группы, включающей водород, незамещенный низший алкил, низший алкил, имеющий заместитель, который выбирают из группы, включающей амино и -ПЯ^пЯ¹², незамещенный арил, арил, имеющий один или более заместителей, которые выбирают из группы, включающей галоген, гидрокси, незамещенный низший алкилалкокси и тригалогенметил, незамещенный гетероарил, незамещенную гетероалициклическую группу и конденсированную пяти- или шестичленную незамещенную гетероалициклическую группу и -ПЯ^пЯ¹², где Я¹¹ и Я¹² независимо выбирают из группы, включающей незамещенный низший алкил и конденсированный пяти- или шестичленный незамещенный гетероалициклический цикл.

В еще одном предпочтительном варианте воплощения настоящего изобретения Я⁷ выбирают из группы, включающей незамещенный низший алкил, низший алкил, имеющий один или более заместителей, которые выбирают из группы, включающей незамещенный циклоалкил, незамещенный арил, арил, имеющий один или более заместителей, которые независимо выбирают из группы, включающей галоген и незамещенный низший алкилалкокси и незаме щенный низший алкилкарбоксиалкил, и Ζ выбирают из группы, включающей незамещенный С-карбокси и незамещенный низший алкил Скарбокси.

Наконец, в предпочтительном варианте настоящего изобретения К³, К⁴, К⁵ и К⁶ независимо выбирают из группы, включающей водород, галоген, незамещенный низший алкил, низший алкил, замещенный одной или более гидрокси группами, незамещенный низший алкокси, незамещенный арил, арил, замещенный одной или более незамещенными низшими алкокси группами и -8(Ο)₂ΝΚ¹¹Κ¹², К⁵ означает водород, К⁶ означает -ΝΡ К , а К и К независимо выбирают из группы, включающей водород, незамещенный низший алкил и конденсированный пяти- или шестичленный незамещенный гетероалициклический цикл.

Описанные в данном описании соединения могут существовать в виде таутомеров или изомеров. Например, описанные соединения могут существовать в Е или Ζ конфигурациях относительно двойной связи между остатком 2индолинона и остатком пиррола, или они могут быть получены в виде смеси изомеров Е и Ζ. В объем притязаний настоящего изобретения включены любые таутомерные или структурные изомерные формы и их смеси, которые моделируют активность РТК, КТК и/или СТК, причем объем притязаний изобретения не ограничен до какой-либо одной таутомерной или структурной изомерной формы.

2. СИНТЕЗ/КОМБИНАТОРНЫЕ БИБЛИОТЕКИ

Дополнительным аспектом настоящего изобретения является комбинаторная библиотека, включающая по крайней мере десять производных 3-пирролидинил-2-индолинона, которые могут быть получены по реакции оксиндолов формулы 2 с альдегидами формулы 3.

где К¹-К¹⁰ определены выше.

Термин комбинаторная библиотека, использованный в данном описании, означает все соединения, полученные при взаимодействии каждого соединения из множества одного измерения с соединением из каждого множества другого измерения, которые находятся в многомерной совокупности множеств соединений. В контексте настоящего изобретения множество является двумерным и одно измерение означает все оксиндолы по настоящему изобретению, а второе измерение означает все альдегиды по настоящему изобретению. Каждый оксиндол может взаимодействовать с каждым и любым альдегидом с образованием производного 3пирролидинил-2-индолинона. Все производные 3-пирролидинил-2-индолинона, которые получают указанным способом, включены в объем притязаний настоящего изобретения. В объем притязаний настоящего изобретения включены также меньшие комбинаторные библиотеки соединений, которые получены по реакции некоторых оксиндолов со всеми альдегидами, всех оксиндолов с некоторыми альдегидами, или некоторых оксиндолов с некоторыми альдегидами.

Оксиндол из упомянутой выше комбинаторной библиотеки предпочтительно выбирают из группы, включающей оксиндол и замещенные оксиндолы, такие как, без ограничения перечисленным, 6-бромоксиндол, 5-гидроксиоксиндол, 5-метоксиоксиндол, 6-метоксиоксиндол,

5- фениламиносульфонилоксиндол, 4-[2-(2-изопр опилфенокси)этил ] оксиндол, 4 - [2- (3 -изопропилфенокси)этил]оксиндол, 4- [2-(4-изопропилфенокси)этил]оксиндол, 5-фтороксиндол, 6фтороксиндол, 7-фтороксиндол, 6-трифторметилоксиндол, 5-хлороксиндол, 6-хлороксиндол, индол-4-карбоновая кислота, 5-бромоксиндол,

6- (№ацетамидо)оксиндол, 4-метилоксиндол, 5- метилоксиндол, 4-метил-5-хлороксиндол, 5этилоксиндол, 6-гидроксиоксиндол, 5-ацетилоксиндол, оксиндол-5-карбоновая кислота, 5-метоксиоксиндол, 6-метоксиоксиндол, 5-аминооксиндол, 6-аминооксиндол, 4-(2-№морфолиноэтил)оксиндол, 7-азаоксиндол, трет-бутиловый эфир оксиндол-4-карбаминовой кислоты, третбутиловый эфир оксиндол-6-карбаминовой кислоты, 4-(2-карбоксиэтил)оксиндол, 4-н-бутилоксиндол, 4,5-диметоксиоксиндол, 6-(метансульфонамидо)оксиндол, 6-(бензамидо)оксиндол, 5-этоксиоксиндол, 6-фенилоксиндол, 6-(2метоксифен-1-ил)оксиндол, 6-(3-метоксифен-1ил)оксиндол, 6-(4-метоксифен-1-ил)оксиндол, 5аминосульфонилоксиндол, 5-изопропиламиносульфонилоксиндол, диметиламиносульфонилоксиндол, 5-(№морфолиносульфонил)оксиндол и 4-(2-гидроксиэтил)оксиндол.

Альдегид из вышеупомянутой комбинаторной библиотеки предпочтительно выбирают из группы, включающей, без ограничения перечисленным, 3-(5-формил-2,4-диметил-1Н-пиррол-3-ил)пропионовую кислоту, 3-(5-формил-4метил-1Н-пиррол-3-ил)пропионовую кислоту, 3(1- бензил-5 - формил-2,4- диметил-1 Н-пирр ол-3ил)пропионовую кислоту, 3-(5-формил-1-метоксикарбонилметил-2,4-диметил-1Н-пиррол-3-ил) пропионовую кислоту, 3-(5-формил-1,2,4-триметил-1Н-пиррол-3-ил)пропионовую кислоту, метиловый эфир 3-[5-формил-1-(3-метоксибензил)-2,4-диметил-1Н-пиррол-3-ил]пропионовой кислоты, метиловый эфир 3-(1-циклогексилметил-5-формил-2,4-диметил-1Н-пиррол3-ил)пропионовой кислоты, метиловый эфир 3[1 -(2,2-диметилпропил)-5-формил-2,4-диметил1Н-пиррол-3-ил]пропионовой кислоты, 1,3,519 триметил-4-(3-морфолин-4-ил-3-оксопропил)1Н-пиррол-2-карбальдегид, 3-(5-формил-1,2,4триметил-1Н-пиррол-3-ил)-Ы-(2-морфолин-4илэтил)пропионамид, 3 -(5-формил-1,2,4-триметил-1 Н-пиррол-3-ил)-Ы-фенилпропионамид, 1,3,5-триметил-4-(3 -оксо-3 -пиперидин-1-илпропил)-1Н-пиррол-2-карбальдегид, 1,3,5-триметил-4-(3 -оксо-3-пирролидин-1-ил-пропил)-1Нпиррол-2-карбальдегид, 3 -(5-формил- 1,2,4-триметил-1Н-пиррол-3 -ил)-Ы-(4-метоксифенил) пропионамид, Ы-(4-фторфенил)-3-(5-формил-

1.2.4- триметил-1Н-пиррол-3-ил)пропионамид,

3-(5-формил-1,2,4-триметил-1Н-пиррол-3-ил)-Ы(4-трифторметилфенил)пропионамид, 3 - [5 -формил-1 -(3-метоксибензил)-2,4-диметил-1Н-пиррол-3-ил] пропионовую кислоту, 3-(1-циклогексилметил-5-формил-2,4-диметил-1Н-пиррол3-ил)пропионовую кислоту, метиловый эфир 3[1-(3-фторбензил)-5-формил-2,4-диметил-1Нпиррол-3-ил] пропионовой кислоты, 3-(1-бензил5-формил-2,4-диметил-1Н-пиррол-3-ил)пропионовую кислоту, метиловый эфир 3-[1-(4-фторбензил)-5-формил-2,4-диметил-1Н-пиррол-3-ил] пропионовой кислоты, 3-[1-(4-фторбензил)-5формил-2,4-диметил-1Н-пиррол-3-ил]пропионовую кислоту, 3-[1-(3-фторбензил)-5-формил-

2.4- диметил-1Н-пиррол-3-ил]пропионовую кислоту, 3,5-диметил-4-(3-морфолин-4-илпро- пил)-1Н-пиррол-2-карбальдегид, 4-(3-диметиламинопропил)-3,5-диметил-1Н-пиррол-2-карбальдегид, 5-формил-2,4-диметил-1Н-пиррол-3карбоновую кислоту, 3,5-диметил-4-(4-метилпиперазин-1-карбонил)-1Н-пиррол-2-карбальдегид и (2-диметиламиноэтил)амид 5-формил-2,4диметил-1Н-пиррол-3 -карбоновой кислоты.

Другим аспектом воплощения настоящего изобретения является способ синтеза 3-пирролидинил-2-индолинона формулы 1, включающий реакцию оксиндола формулы 2 с альдегидом формулы 3 в растворителе, предпочтительно в присутствии основания.

Примерами оксиндолов формулы 2, которые могут взаимодействовать с альдегидом формулы 3 с образованием 3-пирролидинил-2индолинонов формулы 1, являются оксиндол и замещенные оксиндолы, такие как, без ограничения перечисленным, 6-бромоксиндол, 5-гидроксиоксиндол, 5-метоксиоксиндол, 6-метоксиоксиндол, 5-фениламиносульфонилоксиндол, 4[2-(2-изопропилфенокси)этил]оксиндол, 4-[2-(3изопропилфенокси)этил]оксиндол,4-[2-(4-изопропилфенокси)этил]оксиндол, 5-фтороксиндол, 6-фтороксиндол, 7-фтороксиндол, 6-трифторметилоксиндол, 5-хлороксиндол, 6-хлороксиндол, индол-4-карбоновая кислота, 5-бромоксиндол, 6-(Ы-ацетамидо)оксиндол, 4-метилоксиндол, 5-метилоксиндол, 4-метил-5-хлороксиндол, 5-этилоксиндол, 6-гидроксиоксиндол, 5ацетилоксиндол, оксиндол-5-карбоновая кислота, 5-метоксиоксиндол, 6-метоксиоксиндол, 5аминооксиндол, 6-аминооксиндол, 4-(2-Ы-морфолиноэтил)оксиндол, 7-азаоксиндол, третбутиловый эфир оксиндол-4-карбаминовой кислоты, трет-бутиловый эфир оксиндол-6-карбаминовой кислоты, 4-(2-карбоксиэтил)оксиндол, 4-н-бутилоксиндол, 4,5-диметоксиоксиндол, 6-(метансульфонамидо)оксиндол, 6-(бензамидо)оксиндол, 5-этоксиоксиндол, 6-фенилоксиндол, 6-(2-метоксифен-1-ил)оксиндол, 6-(3метоксифен-1-ил)оксиндол,6-(4-метоксифен-1ил)оксиндол, 5-аминосульфонилоксиндол, 5изопропиламиносульфонилоксиндол, диметиламиносульфонилоксиндол, 5 -(Ν-морфолиносульфонил)оксиндол и 4-(2-гидроксиэтил) оксиндол.

Примерами альдегидов структуры 3, которые могут взаимодействовать с оксиндолами структуры 2, являются, без ограничения перечисленным, 3 -(5-формил-2,4-диметил-1Н-пиррол-3-ил)пропионовая кислота, 3-(5-формил-4метил-1Н-пиррол-3-ил)пропионовая кислота, 3(1-бензил-5-формил-2,4-диметил-1Н-пиррол-3ил)пропионовая кислота, 3-(5-формил-1-метоксикарбонилметил-2,4-диметил-1Н-пиррол-3ил)пропионовая кислота, 3-(5-формил-1,2,4триметил-1Н-пиррол-3-ил)пропионовая кислота, метиловый эфир 3-[5-формил-1-(3метоксибензил)-2,4-диметил-1Н-пиррол-3-ил] пропионовой кислоты, метиловый эфир 3-(1циклогексилметил-5-формил-2,4-диметил-1Нпиррол-3-ил)пропионовой кислоты, метиловый эфир 3 -[ 1 -(2,2-диметилпропил)-5-формил-2,4диметил-1Н-пиррол-3-ил]пропионовой кислоты,

1.3.5- триметил-4-(3 -морфолин-4-ил-3-оксопро- пил)-1Н-пиррол-2-карбальдегид, 3 -(5-формил-

1.2.4- триметил-1Н-пиррол-3-ил)-№(2-морфо- лин-4-илэтил)пропионамид, 3-(5-формил-1,2,4триметил-1Н-пиррол-3 -ил)-№фенилпропионамид, 1,3,5-триметил-4-(3 -оксо-3-пиперидин-1илпропил)-1 Н-пиррол-2 -карбальдегид, 1,3,5триметил-4-(3-оксо-3 -пирролидин-1-илпропил)1Н-пиррол-2-карбальдегид, 3-(5-формил-1,2,4триметил-1Н-пиррол-3 -ил)-№(4-метоксифенил) пропионамид, №(4-фторфенил)-3-(5-формил-

1.2.4- триметил-1Н-пиррол-3-ил)пропионамид,

3-(5-формил-1,2,4-триметил-1Н-пиррол-3-ил)-№ (4-трифторметилфенил)пропионамид, 3-[5-формил-1-(3 -метоксибензил)-2,4-диметил-1Н-пиррол-3-ил] пропионовая кислота, 3-(1-циклогексилметил-5-формил-2,4-диметил-1Н-пиррол3-ил)пропионовая кислота, метиловый эфир 3[1 -(3-фторбензил)-5-формил-2,4-диметил-1Нпиррол-3-ил] пропионовой кислоты, 3-(1-бензил5-формил-2,4-диметил-1Н-пиррол-3-ил)пропионовая кислота, метиловый эфир 3-[1-(4-фторбензил)-5-формил-2,4-диметил-1Н-пиррол-3-ил] пропионовой кислоты, 3-[1-(4-фторбензил)-5формил-2,4-диметил-1Н-пиррол-3-ил]пропионовая кислота, 3-[1-(3-фторбензил)-5-формил-2,4диметил-1Н-пиррол-3-ил]пропионовая кислота,

3.5- диметил-4-(3-морфолин-4-илпропил)-1Нпиррол-2-карбальдегид, 4-(3 -диметиламинопропил)-3,5-диметил-1Н-пиррол-2-карбальдегид, 5формил-2,4-диметил-1Н-пиррол-3-карбоновая кислота, 3,5-диметил-4-(4-метилпиперазин-1-карбонил)-1Н-пиррол-2-карбальдегид и (2-диметиламиоэтил)амид 5-формил-2,4-диметил-1Н-пиррол-3-карбоновой кислоты.

Реакцию можно проводить в присутствии основания. Основание может быть органическим или неорганическим. Предпочтительными органическими основаниями являются азотистые основания. Примеры органических азотистых оснований включают, без ограничения перечисленным, диизопропиламин, триметиламин, триэтиламин, анилин, пиридин, 1,8диазабицикло[5.4.1]ундек-7-ен, пирролидин и пиперидин.

Примерами неорганических оснований являются, без ограничения перечисленным, гидроксиды, фосфаты, карбонаты, бикарбонаты, бисульфаты и амиды аммония, щелочных и щелочно-земельных металлов. Щелочные металлы включают литий, натрий и калий, а щелочноземельные металлы включают кальций, магний и барий.

Если растворителем является протонный растворитель, такой как вода или спирт, в предпочтительном варианте воплощения настоящего изобретения основанием является неорганическое основание щелочного или щелочноземельного металла, предпочтительно гидроксид щелочного или щелочно-земельного металла.

На основании общеизвестных принципов органического синтеза и приведенных в данном контексте описаний специалистам в данной области техники будет представляться очевидным выбор наиболее подходящего основания для данной реакции.

Растворитель, в котором проводят реакцию, может быть протонным или апротонным растворителем, предпочтительно протонным растворителем. Термин протонный растворитель означает растворитель, содержащий атом(ы) водорода, ковалентно связанные с атомами кислорода или азота, при этом атомы водорода являются достаточно кислотными и способными, таким образом, образовывать водородные связи с растворенным веществом.

Примеры апротонных растворителей включают, без ограничения перечисленным, воду и спирты.

Апротонный растворитель может быть полярным или неполярным, но в любом случае не содержит кислотных атомов водорода и, следовательно, не способен образовывать водородные связи с растворенными веществами. Примерами неполярных апротонных растворителей, без ограничения перечисленным, являются пентан, гексан, бензол, толуол, хлористый метилен и четыреххлористый углерод. Примерами полярных апротонных растворителей являются хлороформ, тетрагидрофуран, диметилсульфоксид и диметилформамид.

В предпочтительном варианте воплощения изобретения используют протонный растворитель, предпочтительно воду или спирт, такой как этанол.

Реакцию проводят при температуре выше комнатной температуры. В основном, температурный дипазон составляет от приблизительно 30 до приблизительно 150°С, предпочтительно от приблизительно 80 до приблизительно 100°С, наиболее предпочтительно от приблизительно 75 до приблизительно 85°С, что приблизительно равно температуре кипения этанола. Термин приблизительно означает, что температурный диапазон предпочтительно составляет ±10 градусов Цельсия от указанной величины, более предпочтительно ±5 градусов Цельсия, наиболее предпочтительно ± 2 градуса Цельсия. Таким образом, например, приблизительно 75°С означает 75±10°С, предпочтительно 75±5°С и наиболее предпочтительно 75±2°С.

3. БИОХИМИЯ/ФАРМАКОТЕРАПИЯ

Другим объектом настоящего изобретения является способ модуляции каталитической активности ПК путем контактирования ПК с соединением по настоящему изобретению или его физиологически приемлемой солью или пролекарством.

Используемый в данном тексте термин ПК означает рецепторную тирозиновую протеинкиназу (РТК), нерецепторную или клеточную тирозинкиназу (КТК) и серинтреонинкиназу (СТК).

Термин способ означает способ, средство, методы и методики, используемые для достижения поставленной цели, включающие, без ограничения перечисленным, такие способы, средства, методы и методики, которые либо известны специалистами в области химии, фармацевтики, биологии, биохимии и медицины, либо легко могут быть созданы на основе известных способов, средств, методов и методик.

Используемый в данном тексте термин модуляция или модулирование означает изменение каталитической активности РТК, КТК и СТК. Прежде всего модулирование означает активирование каталитической активности РТК, КТК и СТК, предпочтительно активирование или ингибирование каталитической активности РТК, КТК и СТК, в зависимости от концентрации соединения или соли, воздействию которой подвергаются РТК, КТК и СТК, более предпочтительно ингибирование каталитической активности РТК, КТК и СТК.

Используемый в данном тексте термин каталитическая активность означает скорость фосфорилирования тирозина при прямом или опосредованном действии РТК и/или КТК или фосфорилирования серина и треонина при прямом или опосредованном действии СТК.

Используемый в данном тексте термин контактирование означает осуществление взаимодействия соединения по изобретению с

ПК таким образом, чтобы соединение могло воздействовать на каталитическую активность ПК непосредственно, т.е. взаимодействуя с самой киназой, или опосредованно, т.е. взаимодействуя с другой молекулой, от которой зависит каталитическая активность киназы. Такое контактирование можно проводить ίη νίίτο, т.е. в пробирке, в чашке Петри и т.п. Контактирование в пробирке может включать только соединение и исследуемую ПК или целые клетки. Клетки можно культивировать или выращивать в чашках для культивирования клеток (планшетах) и вводить в контакт с соединением, присутствующем в среде. В связи с этим способность конкретного соединения воздействовать на патологическое состояние, связанное с ПК (т.е. величину его 1С₅₀, которая будет определена ниже), можно определить до проведения исследований ίη νΐνο на более сложных живых организмах. Для испытания на клетках вне организма известно множество способов осуществления контактирования ПК с соединениями, хорошо известных специалистам в данной области техники, включая, без ограничения перечисленным, микроинъекцию непосредственно в клетку и множество способов с использованием трансмембранных переносчиков.

Кроме того, другой аспект настоящего изобретения заключается в том, что модуляцию каталитической активности ПК соединениями по настоящему изобретению можно проводить ίη νίίτο и ίη νΐνο.

Термин ίη νίίτο означает методики, проводимые в искусственной среде, такие как, без ограничения перечисленным, эксперименты в пробирке или в культуральной среде.

Используемый в данном тексте термин ίη νΐνο означает методики, выполняемые на живом организме, таком как, без ограничения перечисленным, мышь, крыса или кролик.

Другой аспект настоящего изобретения состоит в том, что ПК, каталитическая активность которой модулируется соединением по изобретению, выбирают из группы, включающей РТК, КТК и СТК.

Другой аспект данного изобретения заключается в том, что рецептор ПК, каталитическая активность которой модулируется соединением по изобретению, выбирают из группы, включающей ЕСЕ, НЕЮ. НЕР3, НЕЮ. !Я. 1СЕ1К, 1ЯЯ, РПСЕЯа, РПСЕКД С8ЕПЕ С-Κίί, СЕпх Е1к-1К, Е1к4, ΚϋΚ/ΓΚ-1, ЕН-1, ЕСЕК-1К, ЕСЕК-2К, ЕСЕК-3К. и ЕСЕР-4Р.

В дополнение к этому, следующий аспект настоящего изобретения заключается в том, что клеточную тирозинкиназу, каталитическая активность которой модулируется соединением по изобретению, выбирают из группы, включающей 8гс, Егк, ΒίΕ С§к, ЛЫ, Ζαρ70, Ее§, Ер§, Еак, 1ак, Аск, Уе§, Еущ кущ Ьск, В1к, Нск, Едг и Угк.

Другой аспект настоящего изобретения состоит в том, что серин-треонинпротеинкиназу, каталитическая активность которой модулируется соединением по изобретению, выбирают из группы, включающей ί.ΌΚ2 и РаГ.

Следующим объектом настоящего изобретения является фармацевтическая композиция, содержащая соединение по настоящему изобретению и фармацевтически приемлемый носитель. Такая фармацевтическая композиция может также содержать наполнители.

Еще одним объектом настоящего изобретения является способ лечения или профилактики заболеваний, связанных с ПК, включающий введение в организм терапевтически эффективного количества соединения, соли или пролекарства, которое представляет собой 3пирролиденил-2-индолинон по настоящему изобретению.

Используемые в данном тексте термины нарушение, связанное с ПК, нарушение, вызванное ПК и аномальная активность ПК означают состояние организма, для которого характерна необычная, т.е. низкая или в основном, более высокая, каталитическая активность ПК, причем конкретная ПК может быть РТК, КТК или СТК. Необычная каталитическая активность может быть обусловлена следующими причинами: (1) экспрессией ПК клеткой, которая в норме не экспрессирует ПК, (2) повышенной экспрессией ПК, ведущей к нежелательной клеточной пролиферации, дифференциации и/или росту, (3) снижением экспрессии ПК, ведущей к нежелательному снижению клеточной пролиферации, дифференциации и/или росту. Гиперактивность ПК означает или амплификацию гена, кодирующего конкретную ПК, или продуцирование ПК с уровнем активности, который коррелирует с клеточной пролиферацией, дифференциацией и/или нарушением роста (т. е. с увеличением уровня ПК возрастает степень проявления (серьезность) одного или нескольких симптомов нарушения функционирования клетки). Гипоактивность дает обратный эффект, когда проявление одного или нескольких симптомов нарушения функционирования клетки возрастает по мере понижения активности ПК.

Используемые в данном тексте термины предупреждать и профилактика означают, прежде всего, способ защиты организма от возникновения нарушения, связанного с ПК, в начальной стадии этого нарушения.

Используемые в данном тексте термины лечить и лечение означают, прежде всего, способ облегчения симптомов или устранение вызванных ПК нарушений функционирования клеток и/или сопутствующих симптомов. В отношении опухолевых заболеваний этот термин означает, что способ позволяет продлить предполагаемую продолжительность жизни человека, пораженного раком, или несколько смягчить один или несколько симптомов болезни.

Термин организм означает любое живое существо, включая по крайней мере одну клет ку. Живой организм может быть простым, например, таким как одна эукариотическая клетка, или сложным, таким как организм млекопитающего, включая человека.

Используемый в данном тексте термин терапевтически эффективное количество означает количество введенного в организм соединения, которое в некоторой степени ослабляет один или несколько симптомов заболевания, подлежащего лечению. В отношении лечения опухолей, терапевтически эффективное количество означает количество соединения, которое приводит к следующим результатам: (1) уменьшает размер опухоли, (2) подавляет (т.е. в некоторой степени замедляет, предпочтительно останавливает) метастазирование, (3) подавляет (т.е. в некторой степени замедляет, предпочтительно останавливает) рост опухоли, (4) в некоторой степени ослабляет (или предпочтительно устраняет) один или несколько симптомов, связанных с опухолью.

Аспект настоящего изобретения заключается в том, что вышеупомянутое нарушение, связанное с ПК, выбирают из группы, включающей нарушение, связанное с рецептором протеинтирозинкиназы, нарушение, связанное с клеточной тирозинкиназой, и нарушение, связанное с серин-треонинкиназой.

Еще один аспект настоящего изобретения заключается в том, что вышеупомянутое нарушение, связанное с ПК, выбирают из группы, включающей нарушение, связанное с ЕСЕВ, нарушение, связанное РИСЕВ, и нарушение, связанное с 1СЕВ и £1к.

Другой аспект настоящего изобретения заключается в том, что вышеупомянутое нарушение, связанное с протеинкиназой, является онкологическим заболеванием, которое выбирают из группы, включающей плоскоклеточную карциному, саркомы, такие как саркома Капоши, астроцитому, глиобластому, рак легкого, рак мочевого пузыря, рак прямой кишки, рак желудочно-кишечного тракта, рак головы и шеи, меланому, рак яичника, рак предстательной железы, рак молочной железы, мелкоклеточный рак легких и глиому.

Еще один аспект настоящего изобретения заключается в том, что вышеупомянутое нарушение, связанное с протеинкиназой, выбирают из группы, включающей сахарный диабет, гиперпролиферацию, болезнь Гиппеля-Линдау (цереброретинальный ангиоматоз), рестеноз, фиброз, псориаз, остеоартрит, ревматоидный артрит, воспалительные процессы и ангиогенез.

Другими нарушениями, которые могут подлежать лечению или профилактике с помощью соединений по настоящему изобретению, являются иммунологические заболевания, такие как аутоиммунные (СПИД) и сердечнососудистые заболевания, такие как атеросклероз.

Аспект настоящего изобретения заключается в том, что химическое соединение, модулирующее каталитическую активность ПК, можно идентифицировать путем контактирования клеток, экспрессирующих упомянутую ПК, с соединением, солью или пролекарством, которое представляет собой 3-пирролиденил-2-индолинон, и путем последующего мониторинга его воздействия на упомянутые клетки.

Термин мониторинг означает наблюдение или обнаружение результата контактирования соединения с клеткой, экспрессирующей конкретную ПК. Наблюдаемый или обнаруженный эффект может представлять собой изменение клеточного фенотипа, каталитической активности ПК или изменение взаимодействия ПК с природным связывающимся партнером (лигандом). Способы наблюдения или обнаружения таких явлений хорошо известны специалистам.

Последний аспект настоящего изобретения заключается в том, что вышепомянутый эффект выбирают из следующих результатов: изменение или отсутствие изменений клеточного фенотипа, изменение или отсуствие изменений каталитической активности упомянутой ПК или изменение или отсутствие изменений во взаимодействии вышеупомянутой ПК с природным связывающимся партнером.

Клеточный фенотип означает внешние признаки клетки или ткани или биологические функции клетки или ткани. Примеры клеточного фенотипа включают, без ограничения перечисленным, размер клетки, клеточный рост, клеточную пролиферацию, дифференциацию клеток, выживание клеток, апоптоз, поглощение и использование питательных веществ. Такие характеристики фенотипа могут быть определены по методикам, известным в данной области техники.

Природный связывающийся партнер (лиганд) означает полипептид, который связывается с конкретной ПК в клетке. Природные лиганды могут выполнять (определенную) функцию в процессе передачи сигнала, опосредованном ПК. Изменение взаимодействия природного лиганда с ПК может проявляться непосредственно, как увеличение или уменьшение концентрации комплекса ПК/природный лиганд и как наблюдаемое изменение способности ПК опосредовать передачу сигнала.

Кроме того, аспект настоящего изобретения заключается в том, что описанное соединение или его соль или пролекарство может быть использовано совместно с другими химиотерапевтическими агентами для лечения вышеупомянутых заболеваний и нарушений. Например, соединение, соль или пролекарство по настоящему изобретению могут быть использованы в сочетании с алкилирующими агентами, таким как фторурацил (5-ФУ), одним или в сочетании с лейковорином; или с другими алкилирующими агентами, такими как, без ограничения пере численным, другие пиримидиновые аналоги, например УФТ, капецитабин, гемцитабин и цитарабин; алкилсульфонатами, например бусульфаном (применяющимся при лечении хронического гранулоцитарного лейкоза), импросульфаном и пипосульфаном; азиридинами, такими как бензодепа, карбоквон, метуредепа и уредепа; этилениминами и метилмеламинами, такими как алтретамин, триэтиленмеламин, триэтиленфосфорамид, триэтилентиофосфорамид и триметилолмеламин; (азотистыми) горчичными маслами, такими как, хлорамбуцил (применяющийся при лечении хронического лимфолейкоза, первичной макроглобулинемии и неХоджкинской лимфомы), циклофосфамид (применяющийся при лечении болезни Ходжкина, множественной миеломы, нейробластомы, рака молочной железы, рака яичника, рака легких, аденосаркомы почки (опухоли Вильмса) и рабдомиосаркомы), эстрамустин, ифосфамид, новембрихин, преднимустин и урациловое горчичное масло (применяющееся при лечении первичного тромбоцитоза, не-Ходжкинской лимфомы, болезни Ходжкина и рака яичника); триазинами, такими как, дакарбазин (приме няющийся при лечении саркомы мягких тканей).

Аналогичным образом, можно ожидать, что соединение, соль или пролекарство по изобретению будет проявлять лечебное действие в сочетании с другими химиотерапевтическими агентами, являющимися антиметаболитами, такими как, без ограничения перечисленным, аналоги фолиевой кислоты, например метотрексат (применяющийся при лечении острого лимфолейкоза, хориокарциномы, микозногрибкового рака молочной железы, рака головы и шеи и остеогенной саркомы) и птероптерин; аналоги пурина, такие как меркаптопурин и тиогуанин, которые находят применение при лечении острого гранулоцитарного лейкоза, острого лимфолейкоза и хронического гранулоцитарного лейкоза.

Можно также ожидать, что соединение, соль или пролекарство по изобретению будет эффективным в сочетании с химиотерапевтическими агентами на основе природных продуктов, таких как, без ограничения перечисленным, алкалоиды барвинка розового, например, винбластин (применяющийся при лечении рака молочной железы и рака яичка), винкристин и виндезин; эпиподофилотоксины, например этопозид и тенипозид, каждый из которых применяется при лечении рака яичка и саркомы Капоши; химиотерапевтические антибиотики, например даунорубицин, доксорубицин, эпирубицин, митомицин (применяющийся при лечении рака желудка, шейки матки, толстой кишки, молочной железы, мочевого пузыря и поджелудочной железы), дактиномицин, темозоломид, пликамицин, блеомицин (применяющийся при лечении рака кожи, пищевода и мочеполового тракта), и ферментативные химиотерапевтические агенты, такие как Ь-аспарагиназа.

Кроме того, можно ожидать, что соединение, соль или пролекарство по изобретению будут проявлять лечебное действие в сочетании с координационными комплексами платины (цисплатин и др.); замещенными производными мочевины, такими как гидроксимочевина; производными метилгидразина, например прокарбазином; адренокортикоидными супрессантами, например митотаном, аминоглютетимидом; гормонами и антагонистами гормонов, такими как адренокортикостероиды (например, преднизолон), прогестины (например, гидроксипрогестерон/капроат); эстрогенами (например, диэтилстилбестеролом); антиэстрогенами, таким как, тамоксифен; андрогенами, например тестостерон пропионатом; и ингибиторами ароматазы, такими как, анастрозол.

Наконец, можно ожидать, что соединение по изобретению окажется особенно эффективным в сочетании с митоксантроном или паклитакселом при лечении солидных злокачественных опухолей или лейкозов, таких как, без ограничения перечисленным, острый миелоидный лейкоз (нелимфоцитарный).

Предпочтительным соединением по настоящему изобретению, которое, как ожидается, будет проявлять лечебное действие в сочетании с одним или несколькими вышеуказанными химиотерапевтическими агентами, является 3-[2,4диметил-5-(2-оксо-1,2-дигидроиндол-3-илиденметил)-1Н-пиррол-3 -ил]пропионовая кислота.

Перечень фигур чертежей

На фиг. 1 представлен результат исследования ингибирующей активности соединений по изобретению ίη νίνο.

На фиг. 2 продемонстрирована биологическая эффективность соединений по изобретению ίη νίνο при введении оральным способом.

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения

1. Краткое описание таблиц

В табл. 1 приведена структура и биологическая активность некоторых типичных соединений по настоящему изобретению. Номера соединений соответствуют номерам примеров, представленных в разделе Примеры, т.е. синтез соединения 1 в табл. 1 описан в примере 1. Биоиспытания подробно описаны ниже. Результаты представлены в виде 1С₅₀, концентрации исследуемого соединения в микромолях (мкМ), которая вызывает 50%-ное изменение активности соответствующей ТК по сравнению с активностью ТК в контроле, не содержащем анализируемого соединения. Более конкретно, полученные результаты представлены в виде концентрации исследуемого соединения, необходимой для 50%-ного подавления активности соответствующей ТК. Соединения, приведенные в табл. 1, даны только в качестве примеров и не могут рассматриваться, как ограничивающие объем притязаний настоящего изобретения.

Таблица 1

1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
1		1.3	<0.78	202	0.38	21.4	6.4	8.8	12
2		69.1	0.14	12.1	1.8	31.6	1.2	>50	>50
3		12	0.042	0.86	0.05	2.8	2.5	30	>50
4		12	13	9	0.11	7.1	8.2	>50	>50
$		0.13	<12	8.81	0.42	9.3	10.7	46.8	95.9
«		6.8	026		0.63	18.4	8.8	>60	>50
7		192	2.2		1.34	12.3	11.4	>50	>50
8		0.П	0.37	0.68	0.74	4.52	8.2	>50	>50
9	X	1.06	0.13		0.33	13.4	6.3	>50	>50
10		11	<0.78	163	10.62	>50	5.1	>60	>50
и		0.7	0.13	7.73	1.4	9.6	11.1	>50	>50
12	-о/·	613	13.6	I =.,	11	24.6	1	>50	I | >50

1	2	3	4	5	6	7	8	9 10
13		31	4.2
14		17	6
15		6.6	<0.78
16		>100	8.7					!
17		10	10.3		1.2	20	6.3	44.3 >50
18		19	2		2.4	18.4	14.3	46 | >50
19		0.006	0.063		0.07	3.6	3.7	39.6 >50
20		0.027	0.7		0.29	в	7.4	>50 ' >50
21		0.02	0.68	4		5.6	24.4	>50 ; >50
22		0.61	0.73		0.13	15.8		1 18 · >50
23		5.2	0.8	0.68	3		10.6	>50 ' >50
24		<0.78	0.55	ί 17.9	0.67	| 25.1	2.4	21 · >50

Примечание к табл. 1:

1. Пример №

2. Структура

3. Биологическая активность в отношении ЕЬК-1, 1С₅₀ (мМ)

4. Биологическая активность в отношении РЭСЕг, 1С₅₀ (мМ)

5. Биологическая активность в отношении ЕСЕК, 1С₅₀ (мМ)

6. Биологическая активность в отношении НИУЕС-УЕСЕ, 1С₅₀ (мМ)

7. Биологическая активность в отношении НИУЕС-аЕСЕ, 1С₅₀ (мМ)

8. Биологическая активность в отношении ВгдИ-РПСЕг, 1С₅₀ (мМ)

9. Биологическая активность в отношении ВгдИ-ЕСЕг, 1С₅₀ (мМ)

10. Биологическая активность в отношении ВгдИ-ЕСЕг, 1С₅₀ (мМ)

Таблица 2

1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
42		<0.7·	>100	23 1			0.38	34.93	>50
43		0.7·'	>100	1.59			0.37	45.48	44.63
44		42.82	>100	0.27			0.44	>50	>50
45		>100	>100	7.53			1.02	4.96	3.9
46		>100	>100	>100			0.52	15.42	41.9

1	2	3	’ 4 I	I 5	6	I I 7	8	9	; 10
41	..сХ	>100	ί | >100	0.75			>50	>50	>50
48		<0.78	I >100 I	0.053			0.079	9.93	12.6
49	-Сг^	<0.78	>100	<0.046			<0.069	126	4.1
50		5.18	>100	0.1			0.103	3.42	4
51		42.36	22.83	1.02			1.54	3.9	9.56
52		9.77	28.06	0.11			0.7	10.9	9.57
53	X	99.55	>100	4.35			048	3.1	3.86
54		<0.78	>100	<0.0078			<0.069	3.01	7.49
55		<0.78	86.58	<0.0078			<0.069	13.Θ5	25.37
56	X	<0.78	>100	0.16			0.55	4.86	11.01
57		<0.7·	>100 ί	0.05			029	15.7	27.47

1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
58	X	<0.78	>100	<0.0078			<0.069	9.18	25.35
59	X	<0.78	>100	0.067			0.32	9.95	202
60	X	<Ο.7β	>100	0.43			0.56	3	25.34
61	•40^5^	0.91	>100	0.44			1.04	11.31	6.59
<2		1.97	>100	235			0.57	2.14	8.38
63		1208	>100 ί	241			10.32	29.09 ί	29.77
64		15.07	»100 : I	286			1.45	I 4.58 | I	1124

Примечание к табл. 2:

1. Пример №

2. Структура

3. Биологическая активность в отношении БЬК-1, Ю₅₀ (мМ)

4. Биологическая активность в отношении ЕСБг, 1С₅₀ (мМ)

5. Биологическая активность в отношении РИСБг, 1С₅₀ (мМ)

6. Биологическая активность в отношении НИУЕС-УЕСБ, 1С₅₀ (мМ)

7. Биологическая активность в отношении НИУЕС-аБСБ, 1С₅₀ (мМ)

8. Биологическая активность в отношении вгаи-рпсБг, 1С₅₀ (мМ)

9. Биологическая активность в отношении Вгаи-БСБг, 1С₅₀ (мМ)

10. Биологическая активность в отношении Вгаи-ЕСБг, 1С₅₀ (мМ)

В табл. 2 приведены структуры ряда других соединений по настоящему изобретению. Как и в табл. 1, номера соединений соответствуют номерам соответствующих примеров. Представленное выше общее описание биологических исследований относится также к результатам биологических испытаний, представленных в табл. 2.

2. Показания/заболевания-мишени

ПК, каталитическая активность которых модулируется соединениями по настоящему изобретению, включают протеиновые тирозинкиназы (ТК) двух типов, а именно рецепторные тирозинкиназы (РТК) и клеточные тирозинкиназы (КТК) и серин-треонинкиназы (СТК). Перенос сигнала, опосредованный РТК, инициируется путем внеклеточного взаимодействия клетки со специфическим ростовым фактором (лигандом) с последующей димеризацией рецептора, временной стимуляцией активного центра ТК на внутренней стороне мембраны и фосфорилированием. Благодаря этому участки связывания становятся доступными для соединений, локализованных в цитоплазме и принимающих участие во внутриклеточной передаче сигнала, что способствует образованию комплексов с целым спектром цитоплазматических сигнальных молекул, которые содействуют формированию соответствующего клеточного ответа (например, деления клетки, метаболическим изменениям во внеклеточной микросреде и т.п.). См. статью БсЫеккшдег и ИПпсй, №игоп, 9: 303-391 (1992).

Установлено, что участки фосфорилирования тирозина у рецепторов ростовых факторов обладают высокой специфичностью связывания 8Н2 домена (гомологичного кгс) сигнальных молекул. См. статьи Бап11 с соавт., Се11, 69: 413423 (1992), Бопдуаид с соавт., Мо1. Се11. Вю1., 14: 2777-2785 (1994), Бопдуапд с соавт., Се11, 72: 767-778 (1993), Косй с соавт., 8с1епсе, 252: 668678 (1991).

Идентифицировано несколько внутриклеточных белков, являющихся субстратами РТК. Эти белки подразделяются на две основные группы: (1) субстраты, содержащие каталитический домен, (2) субстраты, лишенные каталитического домена, но выполняющие функции посредника и ассоциированные с каталитически активными молекулами (субъединицами). См. статью Бопдуаид с соавт., Се11, 72: 767-778 (1993). Специфичность взаимодействия между рецепторами и 8Н2 доменами, содержащимися в соответствующих субстратах, определяется аминокислотными остатками, соседними с остатком тирозина, подлежащего фосфорилированию. Различие в сродстве связывания 8Н2 доменов и аминокислотными последовательностями в конкретных рецепторах, включающими остаток фосфотирозина, коррелирует с наблюдаемыми различиями в профилях фосфорилирования. См. статью 8оидуаид с соавт., Се11, 72: 767-778 (1993). Эти данные свидетельствуют о том, что функция каждой РТК зависит не только от характера экспрессии и доступности лиганда, но также от схемы путей последовательной передачи сигнала, которая активируется данным рецептором. Таким образом, фосфорилирование представляет собой ключевую регуляторную стадию, которая определяет селективность сигнального пути, выбранного рецепторами конкретного ростового фактора, а также рецепторами фактора дифференциации.

СТК, содержащиеся преимущественно в цитозоле, воздействуют на внутреннюю биохимию клетки часто в виде периферического ответа на события с участием РТК. Предполагают, что СТК участвует в сигнальном процессе, который инициирует синтез ДНК и последующий митоз, ведущий к клеточной пролиферации.

Таким образом, перенос сигнала с участием ПК, наряду с прочими событиями, приводит к клеточной пролиферации, дифференциации, росту и изменению метаболизма. Аномальная пролиферация клеток может повлечь за собой множество нарушений и заболеваний, включая развитие неоплазии, такой как карцинома, саркома, гиобластома и гемангиома, нарушений, таких как лейкоз, псориаз, атеросклероз, артрит, диабетическая ретинопатия, и прочие нарушения, связанные с неконтролируемым ангиогенезом и/или васкулогенезом.

Для воплощения настоящего изобретения на практике не обязательно знать подробный механизм ингибирования ПКсоединениями по настоящему изобретению. Однако, не вдаваясь в детали какого-либо механизма или теории, авторы полагают, что соединения взаимодействуют с аминокислотными остатками в каталитическом домене ПК. ПК обычно имеют двудольную структуру, причем установлено, что АТФ связывается в щели между двумя долями, где локализованы наиболее консервативные аминокислотные остатки ПК. Считается, что ингибиторы ПК связываются за счет нековалентных взаимодействий, таких как водородные связи, силы Ван-дер-Ваальса и ионные взаимодействия, именно в этом ключевом участке, где с ПК связывается вышеупомянутый АТФ. Более конкретно, следует полагать, что 2-индолиноновый фрагмент соединений по настоящему изобретению связывается в участке, обычно занятом адениновым циклом АТФ. В таком случае специфичность конкретной молекулы для данной

ПК может быть обусловлена дополнительным взаимодействием между различными заместителями, содержащимися в 2-индолиноновом фрагменте, и аминокислотными доменами, специфичными для данной ПК. Таким образом, различные индолиноновые заместители могут способствовать предпочтительному связыванию с данной ПК. Возможность выбирать соединения, активные к различным участкам связывания АТФ (или другого нуклеотида), позволяет использовать соединения по настоящему изобретению для воздействия на любой белок, содержащий такие участки связывания. Таким образом, описанные в тексте соединения пригодны как для анализа таких белков ίη νίίτο, так и для проявления ίη νίνο терапевтического действия за счет взаимодействия с такими белками.

С другой стороны, ПК, активность которой модулируется при контакте с соединением по настоящему изобретению, является тирозинкиназой (ТК), прежде всего рецепторной ПК (РПК). РПК, каталитическая активность которых модулируется соединением по настоящему изобретению или его солью, включают, без ограничения перечисленным, ЕСБ, НЕР2, НЕР3, НЕР4, !Н. ЮБ-1К, ΙΗΗ. ΡΌΟΕΒα, ΡΌΟΡΒβ, С8Р1Р. С-Κίΐ, С-Гшк, Б1к-1В, Б1к4, КВВ/Ик-1, БИ-1, БСБК-1К, БСБК-2К, БСБК-3К. и БСБК-4К..

Протеиновые тирозинкиназы, каталитическая активность которых модулируется при контакте с соединением по изобретению, или его солью, или пролекарством, могут быть также нерецепторными или клеточными тирозинкиназами (КТК). Таким образом, КТК, каталитическая активность которых модулируется при контакте с соединением или его солью по настоящему изобретению, включают, без ограничения перечисленным, 8гс, Бгк, В1к, Скк, АЫ, ΖΑΡ70, Бек, Брк, Рак, 1ак, Аск, Уек, Руп, Буи, Ьск, В1к, Нск, Бдг и Угк. Еще одной группой ПК, каталитическая активность которых модулируется при контакте с соединением по настоящему изобретению, являются серинтреонинкиназы (СТК), такие как, без ограничения перечисленным, СЭК2 и РаГ.

С другой стороны, настоящее изобретение относится к способу лечения или профилактике нарушений, связанных с ПК, заключающемуся во введении в организм терапевтически эффективного количества соединения по настоящему изобретению или его соли или пролекарства.

Кроме того, аспект настоящего изобретения заключается в том, что фармацевтическая композиция, содержащая соединение по настоящему изобретению или его соль, или пролекарство, вводится в организм с целью профилактики или лечения нарушений, связанных с ПК.

Следовательно, настоящее изобретение направлено на соединения, которые модулируют передачу сигнала, опосредованную ПК, посредством воздействия на ферментативную ак тивность РТК, КТК и/или СТК, тем самым препятствуя сигналу, передаваемому такими белками. Прежде всего, настоящее изобретение направлено на соединения, которые модулируют пути передачи сигнала, опосредованные РТК, КТК и/или СТК, используемые в качестве терапевтического подхода для лечения многих видов солидных опухолей, включая, без ограничения перечисленным, карциномы; саркомы, включая саркому Капоши, эритробластому, глиобластому, менингиому, астроцитому, меланому и миобластому. Кроме того, настоящее изобретение относится к лечению или профилактике несолидных опухолей, таких как лейкоз. Показания могут включать, без ограничения перечисленным, рак мозга, рак мочевого пузыря, рак яичника, рак желудка, рак поджелудочной железы, рак прямой кишки, рак крови, рак легких, рак костной ткани.

Другие примеры нарушений, связанных с аномальной активностью ПК, в случае которых описанные в тексте соединения могут быть использованы для профилактики, лечения и обследования, включают, без ограничения перечисленным, нарушения, связанные с клеточной пролиферацией, фиброзные нарушения и метаболические нарушения.

Клеточные пролиферативные нарушения, для профилактики, лечения и обследования которых могут быть использованы соединения по настоящему изобретению, включают онкологические заболевания, пролиферативные нарушения кровеносных сосудов и мезангиальные клеточные пролиферативные нарушения.

Пролиферативные нарушения кровеносных сосудов означают расстройства, связанные с аномальным васкулогенезом (образование кровеносных сосудов) и ангиогенезом (распространение кровеносных сосудов). Васкулогенез и ангиогенез играют центральную роль во многих нормальных физиологических процессах, таких как эмбриональное развитие, образование желтого тела, заживление ран и регенерация органов, кроме того, они играют центральную роль в развитии онкологического заболевания, в процессе которого они приводят к образованию новых капилляров, необходимых для выживания опухоли. Другие примеры пролиферативных нарушений кровеносных сосудов включают артрит, при котором растущие капиллярные кровеносные сосуды внедряются в сустав и разрушают хрящевую ткань, и глазные болезни, подобные диабетической ретинопатии, при которых растущие капилляры внедряются в сетчатую оболочку стекловидного тела, кровоточат и вызывают слепоту.

Установлено, что две близкие в структурном отношении РТК связывают УЕСР с высоким сродством: Гтк-подобный тирозиновый рецептор-1 (П1-1) (см. статьи 8ЫЬиуа с соавт., Опсодеп, 5: 519-524 (1990); Эе Упек с соавт., 8с1епсе, 255:989-991 (1992)) и рецептор КЭК/РЬК

1, известный также как УЕСР-К2. В литературе описано, что фактор роста эндотелия сосудов (УЕСР) является специфическим митогеном эндотелиальных клеток, обладающим свойством стимулировать рост клеток эндотелия ίη νίΐτο. См. статьи Реггага и Непхей ВюсЬет. ВюрЬук. Кек. Сотт.. 161:851-858 (1989); УаЕтап с соавт., 1. Вю1. СЬет., 265:19461-19566 (1990). Информация, приведенная в заявках на выдачу патента США № 08/193829, 08/038596 и 07/975750, определенно свидетельствует о том, что УЕСР не только отвечает за пролиферацию эндотелиальных клеток, но, кроме того, является основным регулятором ангиогенеза в норме и при патологии. См. статьи К1адкЬит и 8окет, Сштеп! Вю1оду. 3(10):699-702 (1993): Ноиск с соавт. 1. Вю1. СЬет., 267:26031-26037 (1992).

Нормальный васкулогенез и ангиогенез играют центральную роль во многих физиологических процессах, таких как, эмбриональное развитие, заживление ран, регенерация органов и репродуктивные процессы, например образование фолликула в желтом теле во время овуляции и рост плаценты после беременности. См. статью Ро1ктап и 8Ыпд, 1. Вю1. СЬет., 267(16): 10931-10934 (1992). Неконтролируемый васкулогенез и/или ангиогенез связаны с заболеваниями, такими как диабет, а также злокачественными солидными опухолями, которые для своего роста нуждаются в васкуляризации. См. статьи К1адкЬит и 8окег, Сштеп! Вю1оду, 3(10):699-702 (1993); Ро1ктап, 1. ЫаЙ. Сапсег 1пк!., 82:4-6 (1991); ХУеЕпег с соавт., Νονν Епд1, .1. Мей., 324:1-5(1991).

Предполагаемая роль УЕСР в пролиферации эндотелиальных клеток и миграции в процессе ангиогенеза и васкулогенеза свидетельствует о центральной роли рецептора КЛК/РЬК-1 в этих процессах. Неконтролируемый ангиогенез может быть причиной таких заболеваний, как сахарный диабет (см. доклад Ро1ктап с соавт. 1п Х1!Ь Сопдгекк оГ ТИготЬокик апй Наето81а818 (11-ый Конгресс по тромбозу и гемостазу), под ред. Уегк!гае!а с соавт., Ье^еп ипкегкйу Ргекк, Ье^еп, стр. 583-596 (198)), артрит и рост злокачественных опухолей. См., например, статью Ро1ктап, Ν. Епд1. 1. Мей., 285:1182-1186 (1971). Рецепторы, с которыми специфически связывается УЕСР, представляют собой важную и эффективную терапевтическую мишень для регуляции и модулирования васкулогенеза и/или ангиогенеза и множества серьезных заболеваний, которые обусловлены аномальным ростом клеток, вызванным такими процессами. См. статью Р1о\утап с соавт., ΩΝ & Р, 7(6):334339 (1994). Прежде всего, высокоспецифичная роль рецепторов КОК/РЬК-1 в неоваскуляризации позволяет считать их предпочтительной мишенью для терапевтических подходов к лечению онкологических заболеваний и других болезней, связанных с неконтролируемым образованием кровеносных сосудов.

Таким образом, один аспект настоящего изобретения относится к соединениям, способным регулировать и/или модулировать передачу сигнала, опосредованнуюТК, включая передачу сигнала рецептором КОК/ЕЬК-1, с целью ингибирования или индуцирования ангиогенеза и/или васкулогенеза, т. е. к соединениям, которые ингибируют, предотвращают процесс передачи сигнала (или препятствуют передаче сигнала), опосредованный рецептором КОК/ЕЬК-1 при активации лигандами, такими как УЕСЕ. Хотя считается, что соединения по настоящему изобретению взаимодействуют с рецептором или другим компонентом, включенным в цепь передачи сигнала, опосредованную ТК, возможно также, что эти соединения непосредственно воздействуют на опухолевые клетки, образующиеся при неконтролируемом ангиогенезе.

Хотя соответственные рецепторы, относящиеся к общей группе йк-1, человека и мыши имеют различные названия, сами рецепторы во многих отношениях взаимозаменяемы. У рецептора мыши, Е1к-1, и его соответствующего аналога в организме человека, КОК, гомология аминокислотной последовательности внутриклеточного домена составляет 93,4%. Аналогичным образом, рецептор мыши, Е1к-1, связывает УЕСЕ человека с таким же сродством, что и УЕСЕ мыши, и соответственно активируется лигандом любого вида. См. статьи МШаиег с соавт., Се11. 72:835-846 (1993); Ошпп с соавт., Ргос. №б. Асаб. 8οΐ. И8А. 90:7533-7537 (1993). Кроме того, Е1к-1 связывается и следовательно фосфорилирует остатки тирозина в субстратах РТК человека (например, РЬС-γ или р85) при совместной экспрессии в клетках линии 293 (фибробласты печени эмбриона человека).

Следовательно, модели, разработанные с использованием рецептора ЕЬК-1, можно непосредственно использовать для изучения КОК рецептора. Например, данные, полученные при использовании мышиного рецептора ЕЬК-1 в методиках, с помощью которых идентифицированы соединения, регулирующие путь передачи сигнала в организме мыши, могут быть непосредственно использованы для идентификации соединений, способных осуществлять регуляцию пути передачи сигнала в организме человека, т.е. соединений, регулирующих активность, связанную с КОК рецептором. Таким образом, химические соединения, идентифицированные как ингибиторы КОК/ЕЬК-1 ш νίΐτο, могут быть исследованы на соответствующих моделях ш νίνο. Установлено, что обе модели животных для испытаний ш νίνο, мыши и крысы, вполне пригодны для изучения клинических возможностей агентов, воздействующих на путь передачи сигнала, индуцированный КОК/РЬК-1.

Таким образом, с одной стороны, настоящее изобретение направлено на соединения, которые регулируют, модулируют и/или ингибируют васкулогенез и/или ангиогенез путем воздействия на ферментативную активность рецептора КОК/РЬК-1 и препятствуя передаче сигнала, передаваемого КОК/ЕЬК-1. С другой стороны, настоящее изобретение направлено на соединения, которые регулируют, модулируют и/или ингибируют путь передачи сигнала, опосредованный КОК/ЕЬК-1, в качестве терапевтического подхода к лечению многих видов солидных опухолей, включая, без ограничения перечисленным, глиобластому, меланому и саркому Капоши, а также карциномы яичника, легких, молочной железы, предстательной железы, поджелудочной железы, толстой кишки и эпидермои-да (кисты кожи). Кроме того, имеющиеся данные свитедельствуют о том, что введение соединений, которые ингибируют путь передачи сигнала, опосредованный КОК/РЬК-1, также может быть использовано при лечении гемангиомы, рестеноза и диабетической ретинопатии.

Еще один аспект настоящего изобретения относится к ингибированию васкулогенеза и ангиогенеза по другим путям, опосредованным рецепторами, включая путь с участием рецептора 111-1.

Рецепторная тирозинкиназа (РТК), принимающая участие в передаче сигнала, инициируется посредством внеклеточного взаимодействия со специфическим ростовым фактором (лигандом) с последующей димеризацией рецептора, временной стимуляцией собственной тирозинкиназной активности и автофосфорилирования. При этом образуются участки связывания для молекул, обеспечивающих внутриклеточную передачу сигнала, которые приводят к образованию комплексов с рядом цитоплазмаческих сигнальных молекул, что приводит к соответствующему клеточному ответу, например клеточному делению и метаболическим изменениям во внеклеточной микросреде. См. статью 8сЬ1еаатдег и Ь11пс11, Ьсигоп, 9:1-20 (1992).

Близкая гомология внутриклеточных участков КОК/ЕЬК-1 и рецептора РОСЕ-β (гомология 50,3%) и/или близкого по строению рецептора 111-1 указывает на индукцию перекрывающихся путей передачи сигнала. Например, в случае рецептора РОСЕ-β показано, что члены семейства агс (см. статью Т\уат1еу с соавт., Ргос. №11. Асаб. 8οΐ. И8А, 90:7696-7700 (1993)), фосфатидилинозит-3'-киназа (см. статью Ни с соавт., Μο1. Се11. Вю1., 12:981-990 (1992)), фосфолипаза сγ (см. статью КааЫаЫап и Сοοре^, Μο1. Се11. Вю1 4:49-51 (1993)), гаа-ГРФазаактивирующий белок (см. статью КааЫаЫап с соавт., ЕМВО 1., 11:1373-1382 (1992)), РТРГО/аур (см. статью Кахк-шакаа с соавт., Ргос. №б. Асаб. 8сЬ И8А, 90:6939-6943 (1993)), СгЬ2 (см. статью А^ν^бааοη с соавт., Μο1. Се11. Вю1., 14:6715-6726 (1994)), и регуляторные субъединицы 81с и Чск (см. статью МаЫтига с соавт., Μο1. Се11. Вю1., 13:6889-6896 (1993)) связываются в областях, включающих различные участ ки автофосфорилирования. Общие сведения см. в статье С1аеааоп-Уе1аН, Ргод. СгоМЬ ЕасЮг Кеа., 5:37-54 (1994). Таким образом, можно предположить, что пути передачи сигнала, активируемые ΚΌΡ/ΡΤΚ-1, включают путь, опосредованный га а (см. статью ΡοζαΚίδ с соавт. №11иге. 360:689-692 (1992) и пути, опосредованные киназами Р1-3', зге и р1су. Каждый из этих путей может играть центральную роль в ангиогенном и/или васкулогенном воздействии КЭК/ЕЬК-1 на клетки эндотелия. Следовательно, еще один аспект настоящего изобретения относится к применению описанных в данном тексте органических соединений для модулирования ангиогенеза и васкулогенеза, поскольку такие процессы контролируются указанными путями.

Способы по настоящему изобретению могут быть использованы для лечения и профилактики нарушений противоположной этиологии, связанных с сжатием, сокращением или смыканием стенок кровеносных сосудов, таких как рестеноз.

Фиброзные нарушения означают аномальное формирование внеклеточного матрикса. Примеры фиброзных нарушений включают цирроз печени и пролиферативные нарушения мезангиальных клеток. Цирроз печени характеризуется ростом компонентов внеклеточного матрикса, приводящим к образованию рубца. Гипертрофированный внеклеточный матрикс, приводящий к образованию печеночного рубца, может быть также вызван вирусной инфекцией, такой как вирус гепатита. В развитии цирроза печени центральная роль, по-видимому, принадлежит жировым клеткам. Другим примером фиброзных нарушений является атеросклероз.

Пролиферативные нарушения мезангиальных клеток означают нарушения, вызванные аномальной пролиферацией мезангиальных клеток. Такие заболевания включают различные почечные болезни человека, такие как гломерулонефрит, диабетическая нефропатия и злокачественный нефросклероз, а также такие нарушения, как тромботические микроангиопатические синдромы, отторжение трансплантата и гломерулопатии. В поддержании пролиферации мезангиальных клеток принимает участие РТК РЭСЕК См. статью Е1оеде с соавт., К1йпеу 1п!егпа!юпа1. 43:478-548 (1993).

Многие онкологические заболевания являются нарушениями, вызванными пролиферацией клеток, и, как отмечалось выше, ПК непосредственно связаны с нарушениями пролиферации клеток. Таким образом, вполне естественно, что ПК, такие например, как члены семейства РТК имеют непосредственную связь с развитием онкологических заболеваний. Некоторые из этих рецепторов, например, ЕСЕК (см. статьи Τυζί с соавт., Вг. 1. Сапсег. 63:227-233 (1991); Тогр с соавт., АРМ18, 100:713-719 (1992)), НЕК2/пеи (см. статью 81атоп с соавт.

8с1епсе. 244:707-712 (1989)) и РОСЕ-К (см. статью КитаЬе с соавт., Опсодеп. 7:627-633 (1992)) характеризуются повышенной экспрессией во многих опухолях и/или устойчиво активированы в аутокринных петлях. Действительно, показано, что эти рецепторы характеризуются повышенной экспрессией при большинстве обычных и острых онкологических заболеваний (см. статьи АкЬааак и 8ипег-АкЬааак с соавт., 1. №иго1. 8с1., 111:119-133 (1992); Оюкаоп с соавт., Сапсег Тгеа1теп1 Кез., 61:249-273 (1992); Когс с соавт., 1. СИп. !пуеа!., 90:1352-1360 (1992) и аутокринных петлях (см. статьи Ьее и Оопод1ше, 1. Се11. Вю1., 118:1057-1070 (1992); Когс с соавт., см. выше; АкЬааак и 8ипег-АкЬааак с соавт., см. выше). Например, ЕСЕК связан с карциномой сквамозных клеток, астроцитомой, глиобластомой, раком головы и шеи, раком легких и раком мочевого пузыря. НЕК2 ассоциирован с раком молочной железы, яичника, желудка, легких, поджелудочной железы и мочевого пузыря. РЭСЕК ассоциирован с глиобластомой и меланомой, а также с раком легких, яичника и предстательной железы. РТК с-те! ассоциирован с образованием злокачественных опухолей. Например, с-те! ассоциируется наряду с другими онкологическими заболеваниями, с колоректальной, тиреодной, панкреатической, желудочной и гепатоцеллюлярной карциномами и лимфомами. Кроме того, с-те! связан с лейкозом. Гиперэкспрессия гена с-те! обнаружена также у пациентов с болезнью Ходжкина и болезнью Буркитта.

1СЕ-1К, кроме включения в процессы парентерального питания и диабета второго типа, также ассоциирован с некоторыми типами онкологических заболеваний. Например, для некоторых типов опухолей 1СЕ-1 выступает в роли аутокринного стимулятора роста, например для клеток карциномы молочной железы (см. статью Айеада с соавт., 1. С1т. !пуеа!., 84:14181423 (1989)) и мелкоклеточного рака легких (см. статью Масаи1еу с соавт., Сапсег Кеа., 50:25112517 (1990)). Кроме того, 1СЕ-1, в полной мере участвующий в процессе нормального роста и дифференциации (клеток) нервной системы, повидимому, является также аутокринным стимулятором глиомы человека. См. статью 8апйЬегд№гйду1а! с соавт., Сапсег Кеа., 53:2475-2478 (1993)). Важное значение 1СЕ-1К и его лигандов для клеточной пролиферации подтверждается тем, что рост многих типов клеток в культуре (фибробласты, эпителиальные клетки, клетки гладких мышц, Т-лимфоциты, миелоидные клетки, хондроциты и остеобласты (стволовые клетки костного мозга)) стимулируются к росту посредством 1СЕ-1. См. статью Со1йппд и Со1йппд, ЕикапоОс Сепе Ехргеааюп. 1:301326(1991). В серии последних публикаций Вааегда сообщает, что 1СЕ-1К играет центральную роль в механизме трансформации и поэтому может быть предпочтительной мишенью для терапевтического воздействия на широкий спектр злокачественных опухолей. См. статьи Вакегда, Сапсег Кеа., 55:249-252 (1995); Вакегда, Се11, 79:927-930 (1994); Сорро1а с соавт., Мо1. Се11. Βΐοΐ.. 14:4588-4595 (1994).

СТК связывают со многими типами онкологических заболеваний, особенно рака молочной железы (см. статью Сапсе с соавт., Ιηΐ. 1. Сапсег 54:571-577(1993).

Взаимосвязь аномальной активности ПК со многими заболеваниям не ограничивается онкологическими заболеваниями. Например, РТК связана с такими болезнями, как псориаз, сахарный диабет, эндометриоз, ангиогенез, развитие атеросклеротических бляшек, болезнь Альцгеймера, болезнь Гиппеля-Линдау, эпидермальная гиперпролиферация, нейродегенеративные болезни, возрастная дегенерация желтого пятна и гемангиомы. Например, ЕСРК участвует в корнеальном и дермальном ранозаживлении. Дефекты в рецепторе инсулина и ЮР-1К связывают с сахарным диабетом типа-ΙΙ. Более сложная корреляция между специфическими РТК и их терапевтическими показаниями описана в статье Р1отешап с соавт. ΌΝ & Р 7:334339 (1994).

Как отмечалось ранее, в передаче пролиферативного и метаболического сигнала наряду с РТК принимают участие и СТК, включающие, без ограничения перечисленным, кгс, аЫ, Рра, уек, Гуп, 1уп, 1ск, Ык, йск, Гдг и угк (см. обзор Во1еп с соавт., РА8ЕВ .1. 6:3403-3409 (1992). Таким образом, можно ожидать, и это уже установлено, что они связаны со многими нарушениями, опосредованными ПК, и к которым относится настоящее изобретение. Например, установлено, что мутированный кгс (у-кгс) является онкобелком (рр60^¥-8гс) в организме цыпленка. Более того, его внутриклеточный гомолог, прото-онкоген рр60^с-8гс переносит онкогенные сигналы многих рецепторов. Гиперэкспрессия ЕСРК или НЕК2/пеи в опухолях приводит к конститутивной активации рр60 , наличие которого характерно для злокачественных клеток, но который отсутствует в нормальных клетках. С другой стороны, мыши с недостаточной экспресией с-кгс имеют фенотип с мраморной болезнью (врожденный системный остеопороз), что свидетельствует о ключевой роли скгс в функционировании остеокластов и возможной его роли в связанных с ним нарушениях.

Аналогичным образом, 2ар70 принимает участие в передаче сигналов в Т-клетках, которые имеют отношение к аутоиммунным заболеваниям.

СТК ассоциированы с воспалительными процессами, аутоиммунным заболеванием, иммунными реакциями и гиперпролиферативными нарушениями, такими как рестеноз, фиброз, псориаз, остеоартрит и ревматоидный артрит.

ПК также принимают участие в имплантации эмбриона. Таким образом, соединения по настоящему изобретению могут быть эффективно использованы для предотвращения имплантации эмбриона и благодаря этому могут применяться в качестве средств контроля за рождаемостью.

Наконец, в настоящее время предполагают, что РТК и СТК принимают участие в процессах гипериммунных нарушений.

Другим аспектом настоящего изобретения является способ идентификации химическогосоединения, которое модулирует каталитическую активность одной или нескольких вышеуказанных ПК. Способ включает контактирование клеток, экспрессирующих необходимую ПК, с соединением по настоящему изобретению {или его солью или пролекарством) и анализ клеток на наличие какого-либо воздействия со стороны исследуемого соединения. Результатом может быть любое изменение или отсутствие изменения клеточного фенотипа, наблюдаемое невооруженным глазом или с помощью соответствующего оборудования. Регистрируемое изменение или отсутствие изменения клеточного фенотипа может быть, например, без ограничения перечисленным, изменением или отсутствием изменения каталитической активности ПК в клетках или изменением или отсутствием изменений при взаимодействии ПК с природным партнером (лигандом).

Примеры действия ряда типичных соединений по настоящему изобретению на ряд РТК приведены в табл. 1 и 2 и в разделе Биологические исследования, см. ниже. Любые описанные соединения и результаты не могут рассматриваться, как ограничивающие объем притязаний настоящего изобретения.

3. Фармацевтические композиции и их применение

Соединение по настоящему изобретению, его пролекарство или физиологически приемлемую соль соединения или пролекарства можно вводить пациенту отдельно или в составе фармацевтических композиций, в которых вышеупомянутые материалы смешаны с подходящими носителями или наполнителями. Методики получения и введения лекарственных средств можно найти в последнем издании книги ВетшдЮп'к Рйагтасо1од1са1 8с1епсе§ (Фармакологические науки Ремингтона), Маск РиЫИкЫпд Со., Еайоп, РА.

Способы введения лекарственных средств

Используемые в данном тексте термины вводить или введение означают доставку соединения, соли или пролекарства по настоящему изобретению или фармацетической композиции, содержащей соединение, соль или пролекарство по настоящему изобретению, в организм с целью профилактики или лечения нарушения, связанного с ПК.

Подходящие способы введения включают, без ограничения перечисленным, пероральное, ректальное, чрезслизистое или кишечное введение или внутримышечные, подкожные, интрамедуллярные, интратекальные (подоболочечные, внутриоболочечные), прямые интравентрикулярные (внутрижелудочковые), внутривенные, интравитреальные, внутрибрюшинные, интраназальные или внутриглазные инъекции. Предпочтительными являются пероральный и парентеральный способы введения.

В альтернативном варианте предпочтительным способом введения соединения является не системный, а местный способ, например инъекция соединения непосредственно в солидную опухоль, часто в виде композиции пролонгированного или длительного действия.

Кроме того, лекарственное средство можно вводить в лекарственной форме целевого назначения, например в виде липосомы, покрытой антителами, специфичными к опухоли. Липосомы будут доставлены к мишени и поглощены опухолью.

Композиции и их состав

Фармацевтические композиции по настоящему изобретению могут быть получены способами, известными в данной области техники, например, путем обычного смешивания, растворения, гранулирования, дражирования, растирания в порошок, эмульгирования, капсулирования, включения или лиофилизации.

Фармацевтические композиции для применения по настоящему изобретению можно получить с помощью общепринятых способов с использованием одного или более физиологически приемлемых носителей, включая наполнители и вспомогательные средства, которые облегчают переработку активных соединений в лекарственные препараты, используемые в фармацевтике. Состав композиции зависит от требуемого способа введения.

Для инъекций соединения по изобретению получают в виде водных растворов, предпочтительно в физиологически совместимых буферных растворах, таких как раствор Хенкса, раствор Рингера или физиологический раствор. Для чрезслизистого введения в композицию вводят смачивающие реагенты, способствующие преодолению биологического барьера. Такие смачивающие реагенты обычно известны в данной области техники.

Для перорального введения в композицию активные соединения смешиваютсфармацевтически приемлемыми носителями, хорошо известными специалистам. Такие носители позволяют получить соединения по изобретению в виде следующих лекарственных форм, предназначенных для приема внутрь: таблетки, пилюли, лепешки, драже, капсулы, растворы, гели, сиропы, вязкие суспензии, суспензии и т.п.. Фармацевтические композиции для перорального применения могут быть получены с исполь зованием твердого наполнителя, по выбору с измельчением полученной смеси и обработкой смеси гранул после добавления при необходимости других вспомогательных материалов для получения таблеток или ядер драже. Подходящими наполнителями являются, прежде всего, носители, такие как сахара, включая лактозу, сахарозу, маннит или сорбит, производные целлюлозы (крахмалы), такие как кукурузный крахмал, пшеничный крахмал, рисовый крахмал, картофельный крахмал, и прочие материалы, такие как желатин, камедь трагаканта, метилцеллюлоза, гидроксипропилметилцеллюлоза, натриевая соль карбоксиметилцеллюлозы, и/или поливинилпирролидон (ПВП). При необходимости могут быть добавлены дезинтегрирующие агенты, такие как сшитый поливинилпирролидон, агар или альгиновая кислота. Кроме того, можно использовать соль, такую как альгинат натрия.

Ядра драже покрывают подходящей глазурью. Для этой цели используют концентрированные растворы сахаров, которые по выбору содержат гуммиарабик, тальк, поливинилпирролидон, карбополовый гель, полиэтиленгликоль, и/или диоксид титана, растворы лака и пригодные органические растворители или смеси растворителей. С целью идентификации или маркировки различных комбинаций доз активного компонента в глазурь таблеток или драже могут быть добавлены красители или пигменты.

Фармацевтические композиции для перорального применения включают прессованные капсулы из желатина, а также мягкие заплавленные капсулы из желатина и пластификатора, такого как глицерин или сорбит. Прессованные капсулы могут содержать активные компоненты в смеси с наполнителем, таким как лактоза, связующим компонентом, таким как крахмал, и/или замасливателем, таким как тальк или стеарат магния и, по выбору, стабилизаторами. В мягких капсулах активные компоненты могут быть растворены или суспендированы в подходящих жидкостях, таких как нелетучие масла, жидкий парафин или жидкие полиэтиленгликоли. Кроме того, в эти композиции могут быть добавлены стабилизаторы.

Для введения путем ингаляции соединения по настоящему изобретению можно вводить в форме аэрозоля с использованием герметичной упаковки или с использованием распылительной насадки и подходящего газа-вытеснителя, например, без ограничения перечисленным, дихлордифторметана, трихлорфторметана, дихлортетрафторэтана или диоксида углерода. В случае герметичного аэрозоля дозировку можно регулировать с помощью клапана для доставки отмеренного количества лекарственного средства. Капсулы и картриджи, например, из желатина для использования в ингаляторе или в инсуффляторе могут содержать порошок активного соединения в смеси с подходящим порошко образным наполнителем, таким как лактоза или крахмал.

Кроме того, активные соединения могут быть получены в виде композиций для парентерального введения, например, путем струйной инъекции или непрерывного вливания. Композиции для инъекции могут быть представлены в форме стандартной дозировки, например, в ампулах или в упаковке на несколько доз, с добавлением консервантов. Композиции могут быть в виде суспензий, растворов и эмульсий в масляных или водных носителях, могут содержать композиционные материалы, такие как суспендирующие, стабилизирующие и/или диспергирующие агенты.

Фармацевтические композиции для парентерального введения включают водные растворы водорастворимой формы активного соединения, такой как, без ограничения перечисленным, его соль.

Кроме того, суспензии активных соединений могут быть получены в липофильном носителе. Подходящие липофильные носители включают нелетучие масла, такие как кунжутное масло, синтетические эфиры жирных кислот, такие как этиловый эфир олеиновой кислоты, и триглицериды или материалы, такие как липосомы. Водные суспензии для инъекций могут содержать вещества, которые увеличивают вязкость суспензии, такие как натриевая соль карбоксиметилцеллюлозы, сорбит или декстран. По выбору суспензия может также содержать подходящие стабилизаторы и/или агенты, которые увеличивают растворимость соединений, что позволяет получать высококонцентрированные растворы.

В альтернативном варианте активный комопонент может быть получен в порошкообразной форме для смешивания с подходящим носителем, например стерильной апирогенной водой.

Соединения могут быть также получены в виде ректальных композициий, таких как суппозитории или удерживающие клизмы, с использованием общепринятых суппозиторных материалов, таких как кокосовое масло или другие глицериды.

Кроме вышеописанных композиций соединения могут быть получены в виде препаратов пролонгированного действия. Такие долгодействующие композиции имплантируют (например, подкожно или внутримышечно) или вводят внутримышечной инъекцией. Для такого способа введения соединение по изобретению может быть получено в составе смеси с подходящими полимерными или гидрофобными материалами (например, в виде эмульсии в фармакологически приемлемом масле), с ионообменными смолами или в виде труднорастворимого производного, такого как, без ограничения перечисленным, труднорастворимая соль.

Примером фармацевтического носителя для гидрофобных соединений по изобретению является система сорастворителей, включающая бензиловый спирт, неполярное поверхностноактивное вещество (ПАВ), водорастворимый органический полимер и водную фазу, такая как система на основе νΡΌ. Система νΡΌ включает раствор следующего состава: 3 мас/об.% бензилового спирта, 8 мас/об.% неполярного ПАВ полисорбат 80™, 65 мас/об.% полиэтиленгликоля 300 и абсолютный этанол (до 100 об.%). Система на основе νΡΌ (νΡΌ:Ό5^) включает раствор νΡΌ, разбавленный в соотношении 1:1 5%-ным раствором декстрозы в воде. Эта система сорастворителей хорошо растворяет гидрофобные соединения и при системном введении обладает низкой токсичностью. Естественно соотношения компонентов в такой системе сорастворителей могут заметно варьировать без изменения растворяющей способности и токсичности. Кроме того, может быть изменена природа отдельных компонентов: например, вместо полисорбата 80™ можно использовать другие малотоксичные неполярные ПАВ, можно варьировать фракционный состав полиэтиленгликоля, использовать вместо полиэтиленгликоля другие биосовместимые полимеры, например поливинилпирролидон, вместо декстрозы использовать другие сахара или полисахариды.

В альтернативном варианте можно использовать другие системы доставки гидрофобных фармацевтически приемлемых соединений. Общеизвестными примерами систем доставки гидрофобных соединений являются такие носители, как липосомы и эмульсии. Кроме того, могут быть также использованы некоторые органические растворители, такие как диметилсульфоксид, хотя в большинстве случаев обладают более высокой токсичностью.

Кроме того, для доставки соединения могут быть использованы системы пролонгированного действия, такие как полупроницаемые матриксы из твердых гидрофобных полимеров, содержащие терапевтический агент. Множество материалов пролонгированного действия хорошо известны специалистам в данной области техники. В зависимости от своей химической природы капсулы пролонгированного действия могут высвобождать активные соединения в течение периода от нескольких недель до более 100 дней. В зависимости от химической природы и биологической активности терапевтического агента могут быть использованы дополнительные методы стабилизации белков.

Описанные в тексте фармацевтические композиции могут также включать подходящие жидкие или гелевые носители или наполнители. Примеры таких носителей или наполнителей включают, без ограничения перечисленным, карбонат кальция, фосфат кальция, различные сахара, крахмалы, производные целлюлозы, же латин и полимеры, такие как полиэтиленгликоли.

Многие из соединений по изобретению, модулирующие ПК, могут быть получены в виде физиологически приемлемых солей, причем заявленное соединение может иметь положительный или отрицательный заряд. Примеры солей, где соединение имеет положительный заряд (образует катион), включают, без ограничения преречисленным, соли четвертичного аммония (определенного в данном описании), такие как гидрохлорид, сульфат, карбонат, лактат, тартрат, малеат, сукцинат, причем атом азота в группе четвертичного аммония, взаимодействующей с соответствующей кислотой, является атомом азота в соединении по изобретению. Соли, в которых соединение по изобретению имеет отрицательный заряд (образует анион), включают, без ограничения преречисленным, соли натрия, калия, кальция и магния, образованные при взаимодействии карбоксильной группы соединения по изобретению ссоответствующим основанием (например, гидроксидом натрия (ΝαΟΗ), гидроксидом калия (КОН), гидроксидом кальция (Са(ОН)₂) и т.п.).

Дозировка

Фармацевтические композиции, подходящие для применения по настоящему изобретению, включают композиции, в которых активные компоненты присутствуют в количестве, достаточном для достижения поставленной цели, т. е. модулирования активности ПК или лечения или профилактики нарушения, связанного с ПК.

Более подробно, терапевтически эффективное количество означает количество соединения, которое обеспечивает эффективную профилактику и смягчение или снижение интенсивности симптомов болезни или продлевает жизнь пациента, подлежащего лечению.

Определение терапевтически эффективного количества полностью соответствует квалификации специалиста в данной области техники, особенно в свете информации, детально изложенной в данном тексте.

Прежде всего, для любого соединения, используемого в способах по изобретению, терапевтически эффективное количество или доза могут быть определены путем испытания на клеточной культуре. Затем может быть определена дозировка для испытаний на модельных животных, обеспечивающая создание циркулирующей концентрации, включающей величину 1С₅₀, найденную при испытании на клеточной культуре (т.е. концентрации исследуемого соединения, при которой наблюдается ингибирование активности ПК на 50%). Затем полученные данные можно использовать для более точного определения дозы для введения человеку.

Токсичность и терапевтическую эффективность соединений, описанных в данном тексте, определяют с использованием обычных фармацевтических методов в экспериментах на клеточных культурах или на подопытных животных, т.е. путем определения 1С₅₀ и ЬП₅₀ (оба параметра определены в данном тексте) для исследуемых соединений. Данные, полученные при испытаниях на клеточной культуре и на подопытных животных, используются для определения диапазона доз для введения человеку. Дозы могут варьироваться в зависимости от применяемой формы лекарственного средства и способа введения. Точный состав композиции, способ введения и доза определяются лечащим врачом в соответствии с состоянием больного. (См. книгу Ρίη§1 с соавт., Т11С Рйагтасо1од1са1 Ва818 о£ Тйегареийсз (Фармакологические основы применения терапевтических средств), гл. 1, стр.1 (1975)).

Количество доз и интервал между введениями подбирается индивидуально с целью создания в плазме крови такого уровня активных соединений, который является достаточным для поддержания эффектов модулирования киназы. Эти уровни в плазме носят название минимально эффективные концентрации (МЭК). МЭК будут варьировать для каждого соединения, но их можно определить по результатам испытаний ίη νίίτο, т.е. по результатам испытаний, описанных в данном тексте. МЭК означает концентрацию, необходимую для ингибирования киназной активности на 50-90%. Дозировки, необходимые для достижения МЭК, зависят от индивидуальных характеристик и способа введения. Концентрация в плазме может быть определена методом ВЭЖХ (высокоэффективной жидкостной хроматографии) или с помощью биоиспытаний.

Интервалы между дозами (время введения) также определяют, исходя из величины МЭК. Соединения следует вводить по такой схеме, которая обеспечивает поддержание уровня в плазме, превышающего МЭК на 10-90%, предпочтительно на 30-90%, наиболее предпочтительно на 50-90%.

В случае местного введения или избирательного поглощения эффективная местная концентрация лекарственного средства может быть не связана с концентрацией в плазме и для определения точной дозы и интервалов введения следует использовать другие методики, известные специалистам в данной области техники.

Количество введенной композиции естественно зависит от пациента, подлежащего лечению, от степени тяжести заболевания, способа введения, заключения лечащего врача и т.п.

Упаковка

При необходимости композиции могут представлять собой упаковку или дозирующее устройство, такое как набор, утвержденный Управлением по контролю за продуктами и лекарствами (ΡΌΆ), которые могут содержать одну или более лекарственных форм-доз, содер жащих активный компонент. Для упаковки могут быть использованы, например, металлическая фольга или полимерная пленка, например, для упаковки в виде блистера. К упаковке или дозирующему устройству может прилагаться инструкция по применению лекарственного средства. К упаковке или дозирующему устройству может также прилагаться информация, нанесенная на упаковку и составленная в форме, установленной правительственной организацией по контролю за производством, использованием и продажей фармацевтических средств, причем эта информация должна соответствовать нормам, установленным для форм композиций для введения человеку или для ветеринарного назначения, утвержденным соответствующей организацией. При составлении такой информации можно, например, использовать маркировку, утвержденную Управлением по контролю за продуктами и лекарствами для назначения лекарств, или лист-вкладыш, также утвержденный указанной организацией. Могут быть получены также композиции, содержащие соединение по настоящему изобретению и совместимый фармацевтический носитель и помещенные в соответствующую упаковку с этикеткой, содержащей инструкции по применению для лечения определенных заболеваний. Подходящие заболевания, обозначенные на этикетке, могут включать онкологические заболевания, ингибирование ангиогенеза, фиброз, диабет и т.п.

4. СИНТЕЗ

Соединения по настоящему изобретению, а также предшественники 2-оксиндолы и альдегиды могут быть легко получены с помощью способов, хорошо известных в данной области химии. Компетентным специалистам в данной области техники представляется очевидным, что другие пути синтеза для получения данных соединений по настоящему изобретению также являются пригодными, и что следующие примеры представлены для иллюстрации способа, но не для его ограничения.

А. Общие методы синтеза.

Для получения соединений по настоящему изобретению можно использовать следующую общую методологию.

Соответственно замещенный 2-оксиндол (1 экв.), соответственно замещенный альдегид (1,2 экв.) и пиперидин (0,1 эквив.) смешивают в этаноле (1-2 мл/ммоль 2-оксиндола) и затем смесь нагревают при 90°С в течение от 3 до 5 ч. После охлаждения реакционную смесь концентрируют и подкисляют до рН 3. Образующийся осадок отфильтровывают, промывают водой до рН 7 и затем холодным этанолом, этилацетатом и/или гексаном и сушат в вакууме, при этом получают требуемое соединение. Данный продукт может быть по выбору дополнительно очищен с помощью хроматографии.

Б. 2-Оксиндолы.

В данном разделе представлены примеры синтеза с использованием промежуточных производных 2-оксиндола для получения соединений по настоящему изобретению. Указанные 2оксиндолы образуют заявленные соединения по настоящему изобретению по реакции с соответственно замещенным пирролальдегидом с использованием вышеописанных общих методов синтеза или методов, описанных в разделе В ниже. Следует понимать, что представленные ниже методы синтеза необходимо рассматривать как примеры подходов к синтезу и как примеры синтеза оксиндолов, представленных для иллюстрации.

5-Амино-2-оксиндол

5-Нитро-2-оксиндол (6,3 г) гидрируют в метаноле над 10% палладием на угле, при этом получают 3,0 г (выход 60%) требуемого соединения в виде твердого вещества белого цвета.

5-Бром-2-оксиндол

2-Оксиндол (1,3 г) в 20 мл ацетонитрила охлаждают до -10 °С и медленно добавляют 2,0 г Ν-бромсукцинимида при перемешивании. Реакционную смесь перемешивают в течение 1 ч при -10°С и 2 ч при 0°С. Осадок собирают, промывают водой и сушат, при этом получают 1,9 г (выход 90%) требуемого соединения.

4- Метил-2-оксиндол

Диэтилоксалат (30 мл) в 20 мл сухого простого эфира при перемешивании добавляют к 19 г этоксида калия, суспендированного в 50 мл сухого простого эфира. Полученную смесь охлаждают на ледяной бане и медленно добавляют 20 мл 3-нитро-о-ксилола в 20 мл сухого простого эфира. Полученную вязкую смесь темнокрасного цвета нагревают с обратным холодильником в течение 0,5 ч, концентрируют в виде твердого вещества темно-красного цвета и обрабатывают 10% раствором гидроксида натрия до тех пор, пока почти все твердое вещество не растворится. Смесь темно-красного цвета обрабатывают 30% пероксидом водорода до изменения цвета с красного на желтый. В другом варианте полученную смесь обрабатывают 10% гидроксидом натрия и 30% пероксидом водорода до исчезновения темно-красного окрашивания. Полученное твердое вещество отфильтровывают и фильтрат подкисляют 6н. соляной кислотой. Полученный осадок собирают фильтрованием в вакууме, промывают водой и сушат в вакууме, при этом получают 9,8 г (выход 45%) 2-метил-6-нитрофенилуксусной кислоты в виде твердого вещества грязно-белого цвета. Твердое вещество гидрируют в метаноле над 10% палладием на угле, при этом получают 9,04 г требуемого соединения в виде твердого вещества белого цвета.

7-Бром-5-хлор-2-оксиндол

5- Хлор-2-оксиндол (16,8 г) и 19,6 г Νбромсукцинимида суспендируют в 140 мл ацетонитрила и нагревают с обратным холодильни ком в течение 3 ч. По данным тонкослойной хроматографии (силикагель, этилацетат) после 2 ч нагревания с обратным холодильником в смеси присутствуют 5-хлор-2-оксиндол или Νбромсукцинимид (ВГ=0,8), продукт (ЯГ=0,85) и второй продукт (КГ=0,9), соотношение которых не изменяется после дополнительного нагревания с обратным холодильником в течение 1 ч. Полученную смесь охлаждают до 10°С, осадок собирают фильтрованием в вакууме, промывают 25 мл этанола и сушат в вакууме на воронке в течение 20 мин, при этом получают 14,1 г влажного продукта (выход 56%). Полученное твердое вещество суспендируют в 200 мл денатурата и полученную суспензию промывают путем перемешивания и нагревания с обратным холодильником в течение 10 мин. Полученную смесь охлаждают на ледяной бане до 10°С. Твердый продукт собирают фильтрованием в вакууме, промывают 25 мл этанола и сушат в вакууме при 40°С, при этом получают 12,7 г (выход 51%) 7-бром-5-хлор-2-оксиндола.

5-Фтор-2-оксиндол

5-Фторизатин (8,2 г) растворяют в 50 мл гидрата гидразина и нагревают с обратным холодильником в течение 1 ч. Затем реакционную смесь выливают в ледяную воду. Отфильтрованный затем осадок промывают водой и сушат в вакуум-сушильном шкафу, при этом получают требуемое соединение.

5-Нитро-2-оксиндол

2-Оксиндол (6,5 г) растворяют в 25 мл концентрированной серной кислоты и смесь выдерживают при (-10)-(-15)°С в течение периода, необходимого для добавления по каплям 2,1 мл дымящей азотной кислоты. После добавления азотной кислоты реакционную смесь перемешивают при 0°С в течение 0,5 ч и выливают в ледяную воду. Полученный осадок собирают фильтрованием, промывают водой и кристаллизуют из 50% уксусной кислоты. Затем полученный кристаллический продукт отфильтровывают, промывают водой и сушат в вакууме, при этом получают 6,3 г (70%) 5-нитро-2оксиндола.

5-Иод-2-оксиндол

2-Оксиндол (82,9 г) суспендируют в 630 мл уксусной кислоты при механическом перемешивании и полученную смесь охлаждают до 10°С на ледяной бане. Твердый Νиодсукцинимид (175 г) добавляют порциями в течение 10 мин. После завершения добавления полученную смесь перемешивают в течение 1 ч при 10°С. При этом суспензия твердого вещества, которое находится в реакционной смеси, загустевает. Полученное твердое вещество собирают фильтрованием в вакууме, промывают 100 мл 50% раствора уксусной кислоты в воде и затем 200 мл воды и сушат в вакууме на воронке в течение 20 мин. Полученный продукт сушат в вакууме, при этом получают 93,5 г (36%) 5-иод2-оксиндола, содержащего около 5% 2оксиндола согласно данным протонного ЯМР.

5-Метил-2-оксинол

5-Метилизатин (15,0 г) и 60 мл гидрата гидразина нагревают при 140-160 °С в течение 4 ч. Данные тонкослойной хроматографии (этилацетат/гексан 1:2, силикагель) указывают на отсутствие исходного вещества. Полученную реакционную смесь охлаждают до комнатной температуры, выливают в 300 мл ледяной воды и подкисляют 6н. соляной кислотой до рН 2. После выдерживания при комнатной температуре в течение 2 дней осадок собирают фильтрованием в вакууме, промывают водой и сушат в вакууме, при этом получают 6,5 г (выход 47%) 5-метил-2-оксиндола.

5- Бром-4-метилоксиндол и 5,7-дибром-4метилоксиндол

4-Метил-2-оксиндол (5 г) в 40 мл ацетонитрила обрабатывают 7,26 г Ν-бромсукцинимида и перемешивают при комнатной температуре в течение 4 ч. Данные тонкослойной хроматографии (этилацетат/гексан 1:2, силикагель) указывают на присутствие смеси 5-бром(Ш=0,3) и 5,7-дибром- (КГ=0,5) производных. К полученной смеси добавляют дополнительные 7,26 г Ν-бромсукцинимида при перемешивании в течение дополнительных 4 ч. Твердое вещество собирают фильтрованием в вакууме, промывают 20 мл ацетонитрила и сушат, при этом получают смесь 1:1 моно- и дибромпроизводных. Фильтрат концентрируют и очищают хроматографией на силикагеле (этилацетат/гексан 1:2), при этом получают 1,67 г 5-бром-4-метил-2оксиндола в виде твердого вещества бежевого цвета. Оставшуюся смесь 1:1 твердых соединений перекристаллизовывают дважды из ледяной уксусной кислоты, при этом получают 3,2 г 5,7дибром-4-метил-2-оксиндола в виде твердого вещества светло-оранжевого цвета. Полученные фильтраты очищают хроматографией, как описано выше, при этом получают 0,6 г 5-бром-4метил-2-оксиндола и 0,5 г 5,7-дибром-4-метил2-оксиндола.

6- Фтор-2-оксиндол

Гидрид натрия (2,6 г) и 14,5 г диметилмалоната перемешивают при нагревании при 100°С в 160 мл ДМСО в течение 1 ч. Реакционную смесь охлаждают до комнатной температуры, добавляют 7,95 г 2,5-дифторнитробензола и полученную смесь перемешивают в течение 30 мин. Затем смесь нагревают при 100°С в течение 1 ч, охлаждают до комнатной температуры и выливают в 400 мл насыщенного раствора хлорида аммония. Полученную смесь экстрагируют 200 мл этилацетата и органический слой промывают солевым раствором, сушат над безводным сульфатом натрия и концентрируют в вакууме. Остаток кристаллизуют из метанола, при этом получают 24,4 г (выход 80%) диметил-

4-фтор-2-нитрофенилмалоната в виде твердого вещества белого цвета, ЯГ=0.2 по данным тон кослойной хроматографии (этилацетат/гексан 1:6, силикагель). Фильтрат концентрируют и очищают хроматографией на колонке с силикагелем (этилацетат/гексан 1:8), при этом получают дополнительные 5,03 г диметил-4-фтор-2нитрофенилмалоната, суммарный выход составляет 29,5 г (96%).

Диметил-4-фтор-2 -нитро фенилмалонат (5,0 г) кипятят с обратным холодильником в 20 мл 6 н. соляной кислоты в течение 24 ч. Реакционную смесь охлаждают и твердое вещество белого цвета собирают фильтрованием в вакууме, промывают водой и сушат, при этом получают 3,3 г (выход 87%) 4-фтор-2-нитрофенилуксусной кислоты, К£=0,6 по данным тонкослойной хроматографии (этилацетат/гексан 1:2, силикагель).

4- Фтор-2-нитрофенилуксусную кислоту (3,3 г), растворенную в 15 мл уксусной кислоты, гидрируют над 0,45 г 10% палладия на угле в атмосфере Н² при давлениии 41,37 кПа (60 ρκί) в течение 2 ч. Катализатор удаляют фильтрованием и промывают 15 мл метанола. Объединенные фильтраты концентрируют и растворяют в воде. Осадок собирают фильтрованием в вакууме, промывают водой и сушат, при этом получают 1,6 г (выход 70%) 6-фтор-2-оксиндола, К£=0,24 по данным тонкослойной хроматографии. Фильтрат концентрируют, при этом получают твердое вещество пурпурного цвета, ЯМР спектр которого совпадает со спектром первой порции. После хроматографирования твердого вещества пурпурного цвета (этилацетат/гексан 1:2, силикагель) получают вторую порцию 6фтор-2-оксиндола в виде твердого вещества белого цвета.

5- Аминосульфонил-2-оксиндол

В колбу объемом 100 мл, содержащую 27 мл хлорсульфоновой кислоты, медленно добавляют 13,3 г 2-оксиндола. Во время добавления температуру реакционной смеси поддерживают ниже 30°С. После завершения добавления реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 1,5 ч, нагревают при 68°С в течение 1 ч, охлаждают и выливают в воду. Осадок промывают водой и сушат в вакуум-сушильном шкафу, при этом получают 11,0 г

5-хлорсульфонил-2-оксиндола (выход 50%), который используют без дополнительной очистки.

5-Хлорсульфонил-2-оксиндол (2,1 г) добавляют к 10 мл гидроксида аммония в 10 мл этанола и перемешивают при комнатной температуре в течение ночи. Смесь концентрируют и твердое вещество собирают фильтрованием в вакууме, при этом получают 0,4 г (выход 20%) требуемого соединения в виде твердого вещества грязно-белого цвета.

5-Метиламиносульфонил-2-оксиндол

Суспензию 3,38 г 5-хлорсульфонил-2оксиндола в 10 мл 2М метиламина в тетрагидрофуране перемешивают при комнатной темпе ратуре в течение 4 ч, после чего образуется твердое вещество белого цвета. Осадок собирают фильтрованием в вакууме, дважды промывают 5 мл воды и сушат в вакууме при 40°С в течение ночи, при этом получают 3,0 г (выход 88%) 5-метиламиносульфонил-2-оксиндола.

5-(4-Трифторметилфениламиносульфонил)-2-оксиндол

Суспензию 2,1 г 5-хлорсульфонил-2-оксиндола, 1,6 г 4-трифторметиланилина и 1,4 г пиридина в 20 мл дихлорметана перемешивают при комнатной температуре в течение 4 ч. Полученный осадок собирают фильтрованием в вакууме, промывают дважды 5 мл воды и сушат в вакууме при 40°С в течение ночи, при этом получают 2,4 г неочищенного продукта, содержащего некоторые примеси поданным тонкослойной хроматографии. Неочищенный продукт очищают хроматографией на силикагеле, в качестве элюента используют смесь этилацетат/гексан (1:2), при этом получают 1,2 г (выход 37%) 5-(4-трифторметилфениламиносульфонил)-2-оксиндола.

5- (Морфолиносульфонил)-2-оксиндол

Суспензию 2,3 г 5-хлорсульфонил-2оксиндола и 2,2 г морфолина в 50 мл дихлорметана перемешивают при комнатной температуре в течение 3 ч. Белый осадок собирают фильтрованием в вакууме, промывают этилацетатом и гексаном и сушат в вакууме при 40°С в течение ночи, при этом получают 2,1 г (выход 74%) 5(морфолиносульфонил)-2-оксиндола.

6- Трифторметил-2-оксиндол

ДМСО (330 мл) добавляют к 7,9 г гидрида натрия, затем по каплям добавляют 43,6 г диэтилоксалата. Смесь нагревают при 100°С в течение 1,0 ч и охлаждают до комнатной температуры. Добавляют 2-нитро-4-трифторметилтолуол (31,3 г), реакционную смесь перемешивают в течение 30 мин при комнатной температуре и затем нагревают при 100°С в течение 1 ч. Реакционную смесь охлаждают и выливают в смесь насыщенного водного раствора хлорида аммония, этилацетата и гексана. Органический слой промывают насыщенным раствором хлорида аммония, водой и солевым раствором, сушат и концентрируют, при этом получают диметиловый эфир 2-(2-нитро-4-трифторметилфенил)малоновой кислоты.

Сложный диэфир растворяют в смеси 6,4 г хлорида лития и 2,7 мл воды в 100 мл ДМСО и нагревают при 100°С в течение 3 ч. Реакционную смесь охлаждают и выливают в смесь этилацетата и солевого раствора. Органический слой промывают солевым раствором, сушат над сульфатом натрия, концентрируют и очищают хроматографией на силикагеле (10% этилацетата в гексане). Фракции, содержащие продукт, упаривают, при этом получают 25,7 г метилового эфира 2-нитро-4-трифторметилфенилуксусной кислоты.

Метиловый эфир 2-нитро-4-трифторметилфенилуксусной кислоты (26 мг) гидрируют над 10% палладием на угле и затем нагревают при 100°С в течение 3 ч. Катализатор удаляют фильтрованием и растворитель упаривают, при этом получают требуемое соединение.

5-(2-Хлорэтил)оксиндол

5-Хлорацетил-2-оксиндол (4,18 г) в 30 мл трифторуксусной кислоты на ледяной бане обрабатывают 4,65 г триэтилсилана и перемешивают при комнатной температуре в течение 3 ч. Смесь выливают в 150 мл воды и осадок собирают фильтрованием в вакууме, промывают 50 мл воды и сушат, при этом получают 2,53 г (выход 65%) 5-(2-хлорэтил)-2-оксиндола в виде твердого вещества красно-коричневого цвета.

5-Метоксикарбонил-2-оксиндол

5-Иод-2-оксиндол (17 г) кипятят с обратным холодильником с 2 г диацетата палладия, 18,2 г триэтиламина, 150 мл метанола, 15 мл ДМСО и 2,6 г 1,3-бис(дифенилфосфино)пропан (ΌΡΡΡ) в атмосфере, насыщенной монооксидом углерода. Через 24 ч реакционную смесь фильтруют для удаления катализатора и фильтрат концентрируют. Концентрат хроматографируют на силикагеле (30% этилацетата в гексане). Фракции, содержащие продукт, концентрируют и выдерживают в течение определенного периода. Полученный осадок собирают фильтрованием в вакууме, при этом получают 0,8 г (7%) требуемого соединения в виде твердого вещества грязно-белого цвета.

4-Карбокси-2-оксиндол

Раствор триметилсилилдиазометана в гексане (2М) добавляют по каплям к раствору 2,01 г 2-хлор-3-карбоксинитробензола в 20 мл метанола при комнатной температуре до прекращения выделения газа. Избыток триметилсилилдиазометана гасят уксусной кислотой. Реакционную смесь сушат на роторном испарителе и остаток сушат в вакуум-сушильном шкафу в течение ночи. Полученный 2-хлор-3-метоксикарбонилнитробензол в дальнейшем используют без дополнительной очистки.

Диметилмалонат (6,0 мл) добавляют к ледяной суспензии 2,1 г гидрида натрия в 15 мл ДМСО. Затем реакционную смесь перемешивают при 100°С в течение 1 ч и затем охлаждают до комнатной температуры. 2-Хлор-3метоксикарбонилнитробензол (2,15 г) добавляют к вышеуказанной смеси одной порцией и смесь нагревают при 100°С в течение 1,5 ч. Затем реакционную смесь охлаждают до комнатной температуры, выливают в ледяную воду, подкисляют до рН 5 и экстрагируют этилацетатом. Органический слой промывают солевым раствором, сушат над безводным сульфатом натрия и концентрируют, при этом получают 3,0 г диметилового эфира 2-метоксикарбонил-6нитрофенилмалоновой кислоты.

Диметиловый эфир 2-метоксикарбонил-6нитрофенилмалоновой кислоты (3,0 г) кипятят с обратным холодильником в 50 мл 6 н. соляной кислоты в течение ночи. Смесь концентрируют досуха и кипятят с обратным холодильником в течение 2 ч с 1,1 г хлорида олова (II) в 20 мл этанола. Смесь фильтруют через целит, концентрируют и хроматографируют на силикагеле (этилацетат/гексан/уксусная кислота), при этом получают 0,65 г (выход 37%) 4-карбокси-2-оксиндола в виде твердого вещества белого цвета.

5-Карбокси-2-оксиндол

2-Оксиндол (6,7 г) добавляют при перемешивании к суспензии 23 г хлорида алюминия в 30 мл дихлорэтана на ледяной бане. Медленно добавляют хлорацетилхлорид (11,3 г) и при этом наблюдают выделение хлористого водорода. Через 10 мин перемешивания реакционную смесь нагревают при 40-50°С в течение 1,5 ч. Данные тонкослойной хроматографии (этилацетат, силикагель) указывают на отсутствие исходного вещества. Смесь охлаждают до комнатной температуры и выливают в ледяную воду. Осадок собирают фильтрованием в вакууме, промывают водой и сушат в вакууме, при этом получают 10,3 г (98%) 5-хлорацетил-2-оксиндола в виде твердого вещества грязно-белого цвета.

Суспензию 9,3 г 5-хлорацетил-2-оксиндола перемешивают в 90 мл пиридина при 80-90°С в течение 3 ч, затем охлаждают до комнатной температуры. Осадок собирают фильтрованием в вакууме и промывают 20 мл этанола. Твердое вещество растворяют в 90 мл 2,5 н. гидроксида натрия и перемешивают при 70-80°С в течение 3 ч. Смесь охлаждают до комнатной температуры и подкисляют 0,5 н. соляной кислотой до рН 2. Осадок собирают фильтрованием в вакууме и тщательно промывают водой, при этом получают неочищенный продукт 5-карбокси-2оксиндол в виде твердого вещества темнокоричневого цвета. В течение ночи в фильтрате образуется 2 г 5-карбокси-2-оксиндола в виде твердого вещества желтого цвета. Неочищенный темно-коричневый продукт растворяют в горячем метаноле, нерастворимую фракцию удаляют фильтрованием и фильтрат концентрируют, при этом получают 5,6 г 5-карбокси-2оксиндола в виде твердого вещества коричневого цвета. Суммарный выход составляет 97%. 5Карбоксиэтил-2-оксиндол

5-Цианоэтил-2-оксиндол (4,02 г) в 10 мл воды, содержащей 25 мл концентрированной соляной кислоты, кипятят с обратным холодильником в течение 4 ч. Смесь охлаждают, добавляют воду и полученное твердое вещество собирают фильтрованием в вакууме, промывают водой и сушат, при этом получают 1,9 г (44%) требуемого вещества в виде твердого вещества желтого цвета.

5-Иод-4-метил-2-оксиндол

К 2 г 4-метил-2-оксиндола в 40 мл ледяной уксусной кислоты на ледяной бане добавляют 3,67 г Ν-иодсукцинимида. Смесь перемешивают в течение 1 ч, разбавляют 100 мл 50% водного раствора уксусной кислоты и фильтруют. Полученное твердое вещество белого цвета сушат в высоком вакууме, при этом получают 3,27 г (выход 88%) требуемого соединения в виде твердого вещества грязно-белого цвета.

5-Хлор-4-метил-2-оксиндол

Суспензию 3,0 г 4-метил-2-оксиндола перемешивают в 50 мл ацетонитрила при комнатной температуре, при этом добавляют порциями

3.3 г Ν-хлорсукцинимида. Затем добавляют трифторуксусную кислоту (1 мл). Суспензию перемешивают при комнатной температуре в течение 3 дней, при этом твердое вещество постоянно присутствует в смеси. Твердое вещество белого цвета собирают фильтрованием в вакууме, промывают небольшим количеством холодного ацетона и сушат в течение ночи в вакуум-сушильном шкафу при 40°С, при этом получают 2,5 г (68%) 5-хлор-4-метил-2-оксиндола.

5-Бутил-2-оксиндол

Триэтилсилан (2,3 г) добавляют к 2 г 4бутаноил-2-оксиндола в 20 м трифторуксусной кислоты при комнатной температуре и раствор перемешивают в течение 3 ч. Реакционную смесь выливают в ледяную воду, при этом получают масло красного цвета, которое затвердевает при хранении. Твердое вещество собирают фильтрованием в вакууме, промывают водой и гексаном и сушат, при этом получают 1,7 г (выход 91%) требуемого соединения в виде твердого вещества грязно-белого цвета.

5-Этил-2-оксиндол

К 5-ацетил-2-оксиндолу (2 г) в 15 мл трифторуксусной кислоты на ледяной бане медленно добавляют 1,8 г триэтилсилана; затем реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 5 ч. Добавляют 1 мл триэтилсилана и перемешивание продолжают в течение ночи. Реакционную смесь выливают в ледяную воду и полученный осадок собирают фильтрованием в вакууме, промывают избытком воды и сушат в вакууме, при этом получают

1.3 г (выход 71%) требуемого соединения в виде твердого вещества желтого цвета.

5-(Морфолин-4-илэтил)-2-оксиндол

5-Хлорэтил-2-оксиндол (2,3 г), 1,2 мл морфолина и 1,2 мл диизопропилэтиламина нагревают в течение ночи при 100°С в 10 мл ДМСО. Смесь охлаждают, выливают в воду и экстрагируют этилацетатом. Органический слой промывают солевым раствором, сушат и упаривают. Остаток хроматографируют на силикагеле (5% метанола в хлороформе), при этом получают 0,9 г (31%) требуемого соединения в виде твердого вещества белого цвета.

5-(4-Метоксикарбонилбензамидо)-2-оксиндол

Смесь 82,0 мг 5-амино-2-оксиндола и 131,0 мг 4-метоксикарбонилбензоилхлорида в пиридине перемешивают при комнатной температуре в течение 3 ч и выливают в ледяную воду.

Осадок фильтруют, промывают водой и сушат в вакуум-сушильном шкафу, при этом получают 138,0 мг 5-(4-метоксикарбонилбензамидо)-2-оксиндола (выход 81%).

5-(4-Карбоксибензамидо)-2-оксиндол 5-(4-Метоксикарбонилбензамидо)-2-оксиндол (0,9 г) и 0,4 г гидроксида натрия в 25 мл метанола кипятят с обратным холодильником в течение 3 ч. Смесь концентрируют, добавляют воду и смесь подкисляют 6 н. соляной кислотой. Осадок собирают фильтрованием в вакууме, при этом получают 0,75 г (87%) требуемого соединения в виде твердого вещества белого цвета.

5-Метокси-2-оксиндол

Хлораль гидрат (9,6 г) растворяют в 200 мл воды, содержащей 83 г сульфата натрия. Раствор нагревают до 60°С, добавляют раствор 11,4 г гидрохлорида гидроксиламина в 50 мл воды и смесь выдерживают при 60°С. В отдельной колбе 6,4 г 4-анизидина и 4,3 мл концентрированной соляной кислоты в 80 мл воды нагревают до 80°С. Первый раствор добавляют ко второму и смесь кипятят с обратным холодильником в течение 2 мин, после чего раствор медленно охлаждают до комнатной температуры и затем охлаждают на ледяной бане. Осадок желтокоричневого цвета собирают фильтрованием в вакууме, промывают водой и сушат в вакууме, при этом получают 8,6 г (выход 85%) N-(2гидроксиминоацетил)анизидина.

Концентрированную серную кислоту (45 мл), содержащую 5 мл воды, нагревают до 60°С и в смесь одной порцией добавляют 8,6 г Ν-(2гидроксиминоацетил)анизидина. Перемешиваемую смесь нагревают до 93°С в течение 10 мин и затем охлаждают до комнатной температуры. Смесь выливают в 500 г льда и трижды экстрагируют этилацетатом. Объединенные экстракты сушат над безводным сульфатом натрия и концентрируют, при этом получают 5,1 г (выход 65%) 5-метоксиизатина в виде твердого вещества темно-красного цвета. 5-Метоксиизатин (5,0 г) и 30 мл гидрата гидразина нагревают с обратным холодильником в течение 15 мин. Реакционную смесь охлаждают до комнатной температуры и добавляют 50 мл воды. Смесь трижды экстрагируют 25 мл этилацетата, органические слои объединяют, сушат над безводным сульфатом натрия и концентрируют, при этом получают твердое вещество желтого цвета. Твердое вещество перемешивают в этилацетате и 1,1 г нерастворимого вещества удаляют фильтрованием в вакууме и сохраняют. Показано, что полученное вещество является 2-гидразинокарбонилметил-4-анизидином. Фильтрат концентрируют и хроматографируют на силикагеле, в качестве элюента используют смесь этилацетат/гексан (1:1), при этом получают 0,7 г 5метокси-2-оксиндола в виде твердого вещества желтого цвета. 1,1 г 2-гидразинокарбонилметил4-анизидина кипятят с обратным холодильником в течение 1 ч в 20 мл 1 н. гидроксида на трия. Смесь охлаждают, подкисляют до рН 2 концентрированной соляной кислотой и трижды экстрагируют 25 мл этилацетата. Органические экстракты объединяют, промывают солевым раствором, сушат над безводным сульфатом натрия и концентрируют, при этом получают 0,8 г 5-метокси-2-оксиндола в виде твердого вещества желтого цвета. Суммарный выход составляет 1,5 г или 33%.

¹Н ЯМР (360 МГц, ДМСО-б₆): δ 10,13 (8, 1Н, ΝΗ-1), 6,84 (8, 1Н, Н-4), 6,72 (б, 1=8,68 Гц, 1Н, Н-6), 6,69 (б, 1=8,68 Гц, 1Н, Н-7), 3,68 (8, 3Н, ОСН₃-5), 3,41 (8, 2Н, СН₂-3); МС т/ζ (относительная интенсивность, %) 163 ([М+1]⁺, 100).

7-Азаоксиндол

3,3-Дибром-7-азаоксиндол (2,9 г) растворяют в смеси 20 мл уксусной кислоты и 30 мл ацетонитрила. К раствору добавляют 6,5 г цинковой пыли. Смесь перемешивают в течение 2 ч при комнатной температуре. Твердое вещество отфильтровывают от смеси и растворитель упаривают. Остаток суспендируют этилацетатом. Раствор этилацетата, содержащий нерастворимое твердое вещество, пропускают через короткую колонку с силикагелем. Полученный раствор этилацетата упаривают и остаток сушат в вакууме, при этом получают 1,8 г (выход 91%) ацетата 7-азаоксиндола.

5- Диметиламиносульфонил-2-оксиндол

Суспензию 2,3 г 5-хлорсульфонил-2оксиндола в 10 мл 2М диметиламина в метаноле перемешивают при комнатной температуре в течение 4 ч, при этом наблюдается образование твердого вещества белого цвета. Осадок собирают фильтрованием в вакууме, промывают 5 мл 1 н. гидроксида натрия и 5 мл 1 н. соляной кислоты и сушат в вакууме при 40°С в течение ночи, при этом получают 1,9 г (выход 79%) 5диметиламиносульфонил-2-оксиндола.

6- Фенил-2-оксиндол

Диметилмалонат (10 мл) в 25 мл ДМСО по каплям добавляют к 3,5 г гидрида натрия, суспендированного в 25 мл ДМСО и смесь нагревают при 100°С в течение 10 мин. Смесь охлаждают до комнатной температуры и добавляют

4,7 г 4-фтор-3-нитробифенила в 25 мл ДМСО. Смесь нагревают при 100°С в течение 2 ч, охлаждают и гасят 300 мл насыщенного раствора хлорида аммония. Смесь экстрагируют трижды этилацетатом и объединенные органические слои промывают водой и солевым раствором и упаривают, при этом получают неочищенный диметиловый эфир 3-нитробифенил-4-малоновой кислоты в виде масла желтого цвета.

Неочищенный диметиловый эфир 3-нитробифенил-4-малоновой кислоты кипятят с обратным холодильником в 30 мл 6 н. соляной кислоты в течение 24 ч. Осадок собирают фильтрованием, промывают водой и сушат, при этом получают 4,5 г 3-нитробифенил-4-уксусной кислоты в виде твердого вещества кремового цвета.

Порошок железа (2,6 г) добавляют одной порцией к 4,5 г 3-нитробифенил-4-уксусной кислоты в 40 мл уксусной кислоты. Смесь кипятят с обратным холодильником в течение 2 ч, концентрируют досуха и обрабатывают этилацетатом. Твердые вещества удаляют фильтрованием и фильтрат промывают дважды 1 н. соляной кислотой и солевым раствором, сушат над безводным сульфатом натрия. Фильтрат концентрируют и при этом получают 3,4 г (выход 93%) 6-фенил-2-оксиндола в виде твердого вещества светло-коричневого цвета.

6-(2-Метоксифенил)-2-оксиндол

Тетракис(трифенилфосфин)палладий (1 г) добавляют к смеси 5 г 2-метоксифенилборной кислоты, 6,6 г 5-бром-2-фторнитробензола и 30 мл 2М раствора карбоната натрия в 50 мл толуола и в 50 мл этанола. Смесь кипятят с обратным холодильником в течение 2 ч, концентрируют и остаток дважды экстрагируют этилацетатом. Слой этилацетата промывают водой и солевым раствором, затем сушат и концентрируют, при этом получают масло темно-зеленого цвета, которое затвердевает при хранении в неочищенный 4-фтор-2'-метокси-3-нитробифенил.

Диметилмалонат (14 мл) по каплям добавляют к 2,9 г гидрида натрия, суспендированного в 50 мл ДМСО. Смесь нагревают при 100°С в течение 15 мин. Смесь охлаждают до комнатной температуры. Затем добавляют неочищенный 4фтор-2'-метокси-3-нитробифенил в 60 мл ДМСО и смесь нагревают при 100°С в течение 2 ч. Реакционную смесь охлаждают и гасят 300 мл насыщенного раствора хлорида аммония, смесь экстрагируют дважды этилацетатом. Экстракты объединяют, промывают насыщенным раствором хлорида аммония, водой и солевым раствором, сушат над безводным сульфатом натрия и концентрируют, при этом получают неочищенный диметиловый эфир 2'-метокси-3-нитробифенил-4-малоновой кислоты в виде масла желтого цвета.

Неочищенный диметиловый эфир 2'-метокси-3-нитробифенил-4-малоновой кислоты нагревают при 100°С в 50 мл 6 н. соляной кислоты в течение 24 ч и охлаждают. Осадок собирают фильтрованием, промывают водой и гексаном, сушат, при этом получают 9,8 г 2'метокси-3-нитробифенил-4-уксусной кислоты в виде твердого вещества желто-коричневого цвета.

Порошок железа (5 г) добавляют одной порцией к 9,8 г 2'-метокси-3-нитробифенил-4уксусной кислоты в 50 мл ледяной уксусной кислоты и нагревают до 100°С в течение 3 ч. Реакционную смесь концентрируют досуха, обрабатывают ультразвуком в этилацетате и фильтруют для удаления нерастворимых веществ. Фильтрат дважды промывают 1 н. соляной кислотой, водой и солевым раствором, сушат над безводным сульфатом натрия и концен трируют. Остаток хроматографируют на силикагеле в смеси этилацетат/гексан (1:2), при этом получают 5,4 г 6-(2-метоксифенил)-2-оксиндола в виде твердого вещества розового цвета.

6-(3-Метоксифенил)-2-оксиндол

Тетракис(трифенилфосфин)палладий (0,8 г) добавляют к смеси 5 г 3-метоксифенилборной кислоты, 5 г 5-бром-2-фторнитробензола и 11 мл 2М раствора карбоната натрия в 100 мл толуола. Смесь кипятят с обратным холодильником в течение 2 ч, разбавляют водой и экстрагируют этилацетатом. Этилацетат промывают насыщенным раствором бикарбоната натрия и солевым раствором, затем сушат и концентрируют, при этом получают маслообразное твердое вещество. Твердое вещество хроматографируют на силикагеле смесью этилацетат/гексан (1:6), при этом получают 4,3 г (выход 77%) 4фтор-3'-метокси-3-нитробифенила.

Диметилмалонат (9,7 мл) по каплям добавляют к 2,0 г гидрида натрия, суспендированного в 50 мл ДМСО. Смесь нагревают при 100°С в течение 35 мин и охлаждают до комнатной температуры. Затем добавляют 4-фтор-2'-метокси-

3-нитробифенил (4,2 г) в 50 мл ДМСО и смесь нагревают при 100°С в течение 1 ч. Реакционную смесь охлаждают и гасят 300 мл насыщенного раствора хлорида аммония и дважды экстрагируют этилацетатом. Экстракты объединяют, промывают солевым раствором, сушат над безводным сульфатом натрия, концентрируют, при этом получают неочищенный диметиловый эфир 3'-метокси-3-нитробифенил-4-малоновой кислоты в виде твердого вещества светложелтого цвета.

Неочищенный диметиловый эфир 3'метокси-3 -нитробифенил-4-малоновой кислоты нагревают при 110°С в 45 мл 6 н. соляной кислоты в течение 4 дней и охлаждают. Осадок собирают фильтрованием, промывают водой и гексаном, сушат, при этом получают 5,3 г 3'метокси-3-нитробифенил-4-уксусной кислоты в виде твердого вещества светло-коричневого цвета.

3'-Метокси-3 -нитробифенил-4-уксусную кислоту (5,2 г) растворяют в метаноле и гидрируют над 0,8 г 10% палладия на угле в течение 3 ч при комнатной температуре. Катализатор удаляют фильтрованием, промывают метанолом, фильтраты объединяют и концентрируют, при этом получают твердое вещество коричневого цвета. Остаток хроматографируют на силикагеле в смеси этилацетат/гексан/уксусная кислота (33:66:1), при этом получают 3,0 г 6-(3метоксифенил)-2-оксиндола в виде твердого вещества розового цвета.

6-(4-Метоксифенил)-2-оксиндол

Тетракис(трифенилфосфин)палладий (1 г) добавляют к смеси 5 г 4-метоксифенилборной кислоты, 6,6 г 5-бром-2-фторнитробензола и 30 мл 2М раствора карбоната натрия в 50 мл толуола и 50 мл этанола. Смесь кипятят с обрат ным холодильником в течение 2 ч, концентрируют и остаток дважды экстрагируют этилацетатом. Слой этилацетата промывают водой и солевым раствором, сушат и концентрируют, при этом получают маслообразное твердое вещество коричневого цвета. Твердое вещество хроматографируют на силикагеле (5% этилацетат в гексане), при этом получают неочищенный

4-фтор-4'-метокси-3-нитробифенил в виде твердого вещества светло-желтого цвета.

Диметилмалонат (10 мл) по каплям добавляют к 2,0 г гидрида натрия, суспендированного в 60 мл ДМСО. Смесь нагревают при 100°С в течение 10 мин и охлаждают до комнатной температуры. Затем добавляют неочищенный 4фтор-4'-метокси-3-нитробифенил (5,2 г) в 50 мл ДМСО и смесь нагревают при 100°С в течение 2 ч. Реакционную смесь охлаждают и гасят 300 мл насыщенного раствора хлорида натрия и трижды экстрагируют этилацетатом. Экстракты объединяют, промывают насыщенным раствором хлорида аммония, водой и солевым раствором, сушат над безводным сульфатом натрия и концентрируют, при этом получают неочищенный диметиловый эфир 4'-метокси-3-нитробифенил4-малоновой кислоты в виде твердого вещества светло-желтого цвета.

Неочищенный диметиловый эфир 4'метокси-3-нитробифенил-4-малоновой кислоты нагревают при 100°С в 60 мл 6 н. соляной кислоты в течение 15 ч и охлаждают. Осадок собирают фильтрованием, промывают водой и гексаном, сушат, при этом получают 7,2 г неочищенной 4'-метокси-3-нитробифенил-4-уксусной кислоты в виде твердого вещества светлого желто-коричневого цвета.

Порошок железа (3,6 г) добавляют одной порцией к 7,2 г 4'-метокси-3-нитробифенил-4уксусной кислоты в 50 мл ледяной уксусной кислоты и нагревают при 100°С в течение ночи. Реакционную смесь концентрируют досуха, обрабатывают ультразвуком в этилацетате и фильтруют для удаления нерастворимых веществ. Фильтрат дважды промывают 1 н. соляной кислотой и солевым раствором, сушат над безводным сульфатом натрия и концентрируют, при этом получают 2,7 г 6-(4-метоксифенил)-2оксиндола в виде твердого вещества розового цвета.

6-(3-Этоксифенил)-2-оксиндол

Тетракис(трифенилфосфин)палладий (0,8 г) добавляют к смеси 4,2 г 3-этоксифенилборной кислоты, 5,0 г 5-бром-2-фторнитробензола и 22 мл 2М раствора карбоната натрия в 50 мл толуола и 50 мл этанола. Смесь кипятят с обратным холодильником в течение 2 ч, концентрируют, добавляют воду и смесь дважды экстрагируют этилацетатом. Слой этилацетата промывают водой и солевым раствором, затем сушат и концентрируют. Остаток хроматографируют на силикагеле (5% этилацетат в гексане), при этом получают 5,3 г (выход 90%) неочищенного 4 фтор-3'-этокси-3-нитробифенила в виде масла желтого цвета.

Диметилмалонат (11,4 мл) по каплям добавляют к 4,0 г гидрида натрия, суспендированного в 20 мл ДМСО. Смесь нагревают при 100°С в течение 10 мин и затем охлаждают до комнатной температуры. Затем добавляют неочищенный 4-фтор-3'-этокси-3-нитробифенил (5,3 г) в 25 мл ДМСО и смесь нагревают при 100°С в течение 2 ч. Реакционную смесь охлаждают и гасят 300 мл насыщенного раствора хлорида аммония и трижды экстрагируют этилацетатом. Экстракты объединяют, промывают водой и солевым раствором, затем сушат над безводным сульфатом натрия и концентрируют, при этом получают неочищенный диметиловый эфир 3'-этокси-3-нитробифенил-4-малоновой кислоты в виде масла желтого цвета.

Неочищенный диметиловый эфир 3'этокси-3-нитробифенил-4-малоновой кислоты нагревают при 100°С в 60 мл 6 н. соляной кислоты в течение 4 дней и охлаждают. Осадок собирают фильтрованием, промывают водой и гексаном, сушат, при этом получают 4,7 г неочищенной 3'-этокси-3-нитробифенил-4уксусной кислоты в виде твердого вещества светлого желто-коричневого цвета.

Порошок железа (2,4 г) добавляют одной порцией к 4,6 г 3'-этокси-3-нитробифенил-4уксусной кислоты в 40 мл ледяной уксусной кислоты и кипятят с обратным холодильником в течение 2 ч. Реакционную смесь концентрируют досуха, несколько раз обрабатывают этилацетатом и фильтруют для удаления нерастворимых веществ. Фильтрат дважды промывают 1 н. соляной кислотой и солевым раствором, затем сушат над безводным сульфатом натрия, концентрируют, при этом получают 3,5 г (выход 91%) 6-(3-этоксифенил)-2-оксиндола в виде твердого вещества светло-коричневого цвета.

6-Бром-2-оксиндол

Диметилмалонат (13 мл) по каплям добавляют к 2,7 г гидрида натрия, суспендированного в 20 мл ДМСО. Смесь нагревают при 100°С в течение 10 мин и затем охлаждают до комнатной температуры. Добавляют 5-бром-2фторнитробензол (5,0 г) в 25 мл ДМСО и смесь нагревают при 100°С в течение 2 ч. Реакционную смесь охлаждают и гасят 300 мл насыщенного раствора хлорида аммония и трижды экстрагируют этилацетатом. Экстракты объединяют, промывают насыщенным раствором хлорида аммония, водой и солевым раствором, сушат над безводным сульфатом натрия и концентрируют, при этом получают неочищенный диметиловый эфир 4-бром-2-нитрофенилмалоновой кислоты в виде масла светло-желтого цвета.

Неочищенный диметиловый эфир 4-бром-

2-нитрофенилмалоновой кислоты нагревают при 110°С в 40 мл 6 н. соляной кислоты в течение 24 ч и охлаждают. Осадок собирают фильтрованием, промывают водой и сушат, при этом получают 5,3 г (выход 89%) 4-бром-2нитрофенилуксусной кислоты в виде твердого вещества грязно-белого цвета.

4- Бром-2-нитрофенилуксусную кислоту (0,26 г), 0,26 г порошка цинка и 3 мл 50% серной кислоты в 5 мл этанола нагревают при 100°С в течение ночи. Реакционную смесь фильтруют, разбавляют небольшим количеством уксусной кислоты, концентрируют для удаления этанола, разбавляют водой и экстрагируют дважды этилацетатом. Объединенные экстракты промывают солевым раствором, сушат над безводным сульфатом натрия и концентрируют, при этом получают 0,19 г (выход 90%) 6бром-2-оксиндола в виде твердого вещества желтого цвета.

5- Ацетил-2-оксиндол

2-Оксиндол (3 г) суспендируют в 1,2дихлорэтане и медленно добавляют 3,2 мл ацетилхлорида. Полученную суспензию нагревают при 50°С в течение 5 ч, охлаждают и выливают в воду. Полученный осадок собирают фильтрованием в вакууме, промывают избытком воды и сушат в вакууме, при этом получают 2,9 г (выход 73%) требуемого соединения в виде твердого вещества коричневого цвета.

5-Бутаноил-2-оксиндол

К 15 г хлорида алюминия, суспендированного в 30 мл 1,2-дихлорэтана на ледяной бане, добавляют 7,5 г 2-оксиндола и затем 12 г бутаноилхлорида. Полученную суспензию нагревают при 50°С в течение ночи. Смесь выливают в ледяную воду и экстрагируют трижды этилацетатом. Объединенные слои этилацетата промывают солевым раствором, сушат над сульфатом натрия и концентрируют досуха, при этом получают твердое вещество коричневого цвета. Твердое вещество хроматографируют на силикагеле (50% этилацетат в гексане), при этом получают 3 г (25%) требуемого соединения в виде твердого вещества желтого цвета.

5- Цианоэтил-2-оксиндол

Цианид калия (2,0 г) добавляют к 15 мл диметилсульфоксида, нагревают до 90°С. 5хлорэтил-2-оксиндол (3,0 г), растворенный в 5 мл ДМСО, медленно добавляют при перемешивании и реакционную смесь нагревают при 150°С в течение 2 ч. Полученную смесь охлаждают, выливают в ледяную воду и осадок собирают фильтрованием в вакууме, промывают водой, сушат и затем хроматографируют на силикагеле (5% метанол в хлороформе), при этом получают 1,2 г (выход 42 %) требуемого соединения.

6- (Морфолин-4-ил)-2-оксиндол

6-Амино-2-оксиндол (2,2 г), 4,0 г 2,2'дибромэтилового эфира и 7,9 г карбоната натрия кипятят с обратным холодильником в 20 мл этанола в течение ночи, концентрируют и разбавляют 50 мл воды. Полученную смесь экстрагируют трижды 50 мл этилацетата и органические экстракты объединяют, промывают 20 мл солевого раствора, сушат над безводным сульфатом натрия и концентрируют досуха. Твердое вещество хроматографируют на колонке с силикагелем (этилацетат/гексан (1:1), содержащей 0,7% уксусной кислоты), при этом получают 1,2 г (выход 37%) требуемого соединения в виде твердого вещества бежевого цвета.

6-(3-Трифторацетамидофенил)-2-оксиндол

3-Аминофенилборную кислоту (3,9 г), 5 г 5-бром-2-фторнитробензола, 0,8 г тетракис(трифенилфосфин)палладия и 23 мл 2М раствора бикарбоната натрия в 50 мл толуола кипятят с обратным холодильником в атмосфере азота в течение 2,5 ч. Реакционную смесь выливают в 200 мл ледяной воды, полученную смесь экстрагируют трижды 50 мл этилацетата. Объединенные органические слои промывают 50 мл воды и 20 мл солевого раствора, сушат над безводным сульфатом натрия и концентрируют, при этом получают 9,7 г (выход 92%) 2-фтор-5-(3аминофенил)нитробензола в виде масла темнокоричневого цвета.

Трифторуксусный ангидрид (5,4 мл) медленно добавляют при перемешивании к раствору 9,7 г 2-фтор-5-(3-аминофенил)-нитробензола и 5,3 мл триэтиламина в 50 мл дихлорметана при 0°С и полученную смесь перемешивают в течение дополнительных 20 мин. Смесь концентрируют и остаток хроматографируют на колонке с силикагелем (10% этилацетат в гексане), при этом получают 8,6 г (выход 65%) 2-фтор-5(3-трифторацетамидофенил)нитробензола в виде масла светло-оранжевого цвета, которое затвердевает при хранении.

Диметилмалонат (9,6 мл) добавляют по каплям при перемешивании к суспензии 3,2 г 60% гидрида натрия в минеральном масле в 40 мл безводного ДМСО в атмосфере азота. Полученную смесь перемешивают в течение 10 мин и добавляют 2-фтор-5-(3-трифторацетамидофенил)нитробензол в 20 мл ДМСО. Полученную смесь темно-красного цвета нагревают при 100°С в течение 2 ч. Реакционную смесь гасят 100 мл насыщенного раствора хлорида аммония и дважды экстрагируют 50 мл этилацетата. Органическую фазу промывают по 50 мл насыщенного раствора хлорида аммония, воды и солевого раствора, сушат над безводным сульфатом натрия и концентрируют, при этом получают желтое масло. Полученное масло хроматографируют на колонке с силикагелем (этилацетат/гексан 1:4), при этом получают 4,4 г (выход 50%) диметилового эфира 2-[2-нитро-4-(3трифторацетамидофенил)фенил]малоновой кислоты в виде твердого вещества бледно-желтого цвета.

Диметиловый эфир 2-[2-нитро-4-(3-трифторацетамидофенил)фенил]малоновой кислоты (4,4 г) кипятят с обратным холодильником в течение ночи в 50 мл 6 н. соляной кислоты. Реакционную смесь охлаждают до комнатной температуры и твердые вещества собирают фильтрованием в вакууме, промывают водой и сушат в вакууме, при этом получают 2,7 г (выход 73%) 2-[2-нитро-4-(3-трифторацетамидофенил)фенил]уксусной кислоты.

2-[2-Нитро-4-(3-трифторацетамидофенил) фенил]уксусную кислоту (100 мг) и 50 мг порошка железа в 3 мл уксусной кислоты нагревают при 100°С в течение 2 ч. Реакционную смесь концентрируют и остаток обрабатывают ультразвуком в 5 мл этилацетата. Нерастворимые твердые вещества удаляют фильтрованием в вакууме и фильтрат промывают 1 н. соляной кислотой, водой и солевым раствором, сушат над безводным сульфатом натрия и концентрируют, при этом получают 10 мг (выход 14%) требуемого соединения в виде твердого вещества розового цвета.

В. Альдегиды.

5-Формил-2,4-диметил-1Н-пиррол-3-карбоновая кислота

Трет-бутил-3-оксобутират (158 г, 1 моль) растворяют в 200 мл уксусной кислоты в трехгорлой круглодонной колбе объемом 500 мл, снабженной термометром, капельной воронкой и механической мешалкой. Полученную смесь охлаждают на ледяной бане до приблизительно 10°С. Добавляют нитрит натрия (69 г, 1 моль) в течение 75 мин при температуре ниже 15°С. Ледяную баню убирают и смесь перемешивают в течение 30 мин, и затем выдерживают в течение 3,5 ч, при этом получают трет-бутил-2гидроксимино-3-оксобутират.

Этил-3-оксобутират (130 г, 1 моль) растворяют в 400 мл уксусной кислоты в трехгорлой круглодонной колбе объемом 2 л, снабженной термометром, капельной воронкой и механической мешалкой, и помещают на масляную баню. К полученной смеси добавляют цинковую пыль (50 г, 0,76 моль) и нагревают при перемешивании до 60°С. Раствор трет-бутил-2-гидроксимино-3-оксобутирата, приготовленный выше, медленно добавляют, поддерживая температуру реакционной смеси около 65°С. Затем добавляют дополнительное количество цинковой пыли (4 х 50 г, 3,06 моль), причем последнюю порцию добавляют после того, как добавлено все количество трет-бутилового эфира. По окончании добавления температура составляет 64°С. Температуру увеличивают до 70-75°С, смесь перемешивают в течение 1 ч, затем выливают в 5 л воды.

Всплывающий осадок серого цвета собирают фильтрованием в вакууме и промывают 2 л воды, при этом получают 354 г влажного неочищенного продукта, который растворяют в 1 л горячего метанола и фильтруют в горячем состоянии для удаления цинка. Фильтрат охлаждают, при этом образуется осадок. Осадок собирают фильтрованием в вакууме и сушат, при этом получают 118 г продукта. Фильтрат помещают в холодильник на ночь, при этом образуется дополнительное количество осадка продук та. Таким образом, в сумме получают 173,2 г 2трет-бутиловый эфир 4-этиловый эфир 3,5диметил-1 Н-пиррол-2,4-дикарбоновой кислоты.

2-Трет-бутиловый эфир 4-этиловый эфир 3,5-диметил-1Н-пиррол-2,4-дикарбоновой кислоты (80,1 г, 0,3 моль) и 400 мл трифторуксусной кислоты перемешивают в течение 5 мин в трехгорлой круглодонной колбе объемом 2 л, снабженной механической мешалкой, и нагревают до 40°С на масляной бане. Затем полученную смесь охлаждают до -5°С и одной порцией добавляют триэтилортоформиат (67,0 г, 0,45 моль). Температуру увеличивают до 15°С. Смесь перемешивают в течение приблизительно 1 мин, удаляют из ледяной бани и затем перемешивают в течение 1 ч. Трифторуксусную кислоту удаляют на роторном испарителе и остаток помещают в холодильник, где он затвердевает. Осадок растворяют при нагревании и выливают в 500 г льда. Полученную смесь экстрагируют 800 мл дихлорметана, при этом получают раствор красного цвета и осадок коричневого цвета, которые сохраняют. Осадок отделяют и промывают 150 мл насыщенного раствора бикарбоната натрия. Слой дихлорметана также промывают 150 мл бикарбоната натрия. Затем раствор дихлорметана промывают еще 3 раза 100 мл воды. Раствор дихлорметана упаривают досуха. Оставшийся остаток темного цвета перекристаллизовывают из этилацетата, содержащего активированный уголь Оагео, при этом получают иглы золотисто-желтого цвета. Осадок коричневого цвета перекристаллизовывают из 350 мл этилацетата, также содержащего уголь Оагео, при этом получают твердое вещество желто-красного цвета. Все перекристаллизованные твердые вещества объединяют и перекристаллизовывают из 500 мл этанола, при этом получают 37,4 г (63,9 %) этилового эфира 5формил-2,4-диметил-1Н-пиррол-3-карбоновой кислоты в виде игл желтого цвета (Т_пл 165,6166,3°С, лит. 163-164°С). Остатки, полученные после упаривания маточных растворов в этилацетате и этаноле, объединяют и перекристаллизовывают из 500 мл этанола, при этом получают вторую порцию (10,1 г) продукта в виде игл грязно-желтого цвета.

Этиловый эфир 5-формил-2,4-диметил-1Нпиррол-3-карбоновой кислоты (2 г, 10 ммоль) добавляют к раствору гидроксида калия (3 г, 53 ммоль), растворенного в метаноле (3 мл) и воде (10 мл). Полученную смесь кипятят с обратным холодильником в течение 3 ч, охлаждают до комнатной температуры и подкисляют 6 н. соляной кислотой до рН 3. Полученное твердое вещество собирают фильтрованием, промывают водой и сушат в вакуум-сушильном шкафу в течение ночи, при этом получают 1,6 г (93%) 5формил-2,4-диметил-1Н-пиррол-3-карбоновой кислоты.

'Н ЯМР (300 МГц, ДМСО-дб): δ 12,09 (₈, Ьг, 2Н, ΝΗ и СООН), 9,59 (₈, 1Н, СНО), 2,44 (₈, 3Н, СН₃), 2,40 (8, 3Н, СН₃).

(2-Диметиламиноэтил)амид 5-формил-2,4диметил-1 Н-пиррол-3 -карбоновой кислоты

К смеси 5-формил-2,4-диметил-1Н-пиррол-3-карбоновой кислоты (1,67 г, 10 ммоль) в диметилформамиде (10 мл) добавляют гексафторфосфат бензотриазол-1-илокситрис(диметиламино)фосфония (реагент ВОР, 6 г, 13,5 ммоль), затем добавляют 3 мл диизопропилэтиламина. После перемешивания в течение 5 мин добавляют 1 мл Ν,Ν-диметилэтилендиамина и полученную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 24 ч. К реакционной смеси добавляют 25 мл 1н. раствора гидроксида натрия и 25 мл солевого раствора. После перемешивания в течение 30 мин реакционную смесь выливают в воду (100 мл) и экстрагируют (3 х 200 мл) 10% раствором метанола в дихлорметане. Органические слои объединяют, сушат над безводным сульфатом натрия и упаривают на роторном испарителе. Полученный остаток очищают хроматографией (колонка с силикагелем, 5-10% метанол в дихлорметане), при этом получают 1 г (42%) (2-диметиламиноэтил)амид 5-формил-2,4-диметил-1Н-пиррол-3-карбоновой кислоты.

'Н ЯМР (360 МГц, ДМСО-άβ): δ 11,77 (8, 1Н, ΝΗ), 9,53 (8, 1Н, СНО), 7,34 (ΐ, 1=5,6 Гц, 1Н, СОЯН), 3,27 (т, 2Н, СО^Н₂СН₂), 2,37 (ΐ, 1=6,8 Гц, 2Н, ^Ν^^^), 2,35 (8, 3Н, СН₃), 2,3 (8, 3Н, СН₃), 2,17 (8, 6Н, 2хСН₃).

МС т/ζ 238,3 [М+1]⁺.

3,5-Диметил-4-(4-метилпиперазин-1-карбонил)-1Н-пиррол -2-карбоксальдегид

К смеси 5-формил-2,4-диметил-1Н-пиррол3-карбоновой кислоты (1,67 г, 10 ммоль) в диметилформамиде (10 мл) добавляют гексафторфосфат бензотриазол-1-илокситрис(диметиламино)фосфония (реагент ВОР, 6 г, 13,5 ммоль), затем добавляют 3 мл диизопропилэтиламина. После перемешивания в течение 5 мин добавляют 2 мл 1-метилпиперазина и полученную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 24 ч. К реакционной смеси добавляют 25 мл 1 н. раствора гидроксида натрия и 25 мл солевого раствора. После перемешивания в течение 30 мин реакционную смесь выливают в воду (100 мл) и экстрагируют (3 х 200 мл) 10% раствором метанола в дихлорметане. Органические слои объединяют, сушат над безводным сульфатом натрия и упаривают на роторном испарителе. Полученный остаток очищают хроматографией (колонка с силикагелем, 5-10% метанол в дихлорметане), при этом получают 1 г (40%) 3,5-диметил-4-(4-метилпиперазин-1карбонил)-1Н-пиррол-2-карбоксальдегид.

'Н ЯМР (360 МГц, ДМСО-де): δ 11,82 (8, 1Н, ПН), 9,50 (8, 1Н, СНО), 3,14 (Ьг т, 4Н,

2хСН₂), 2,29 (Ьг т, 4Н, 2хСН₂), 2,19 (к, 3Н, СН₃),

2,17 (к, 3Н, СН₃), 2,14 (к, 3Н, СН₃).

МС Е1 249 [М]⁺.

Г. Примеры синтеза пирролзамещенных 2индолинонов

Представленные ниже примеры синтеза соединения по настоящему изобретению следует рассматривать как иллюстрацию подходов к синтезу или соединений, включенных в объем настоящего изобретения без ограничения объема притязаний изобретения.

Пример 1. 3-[5-(5-Хлор-2-оксо-1,2-дигидроиндол-3 -илиденметил)-4-метил-1Н-пиррол-3ил]-пропионовая кислота.

4-(2-Карбоксиэтил)-2-формил-3-метилпиррол (4,5 г), 4,2 г 5-хлор-2-оксиндола и 2,9 мл пиперидина в 50 мл этанола нагревают при 95°С в течение 5 ч. Реакционную смесь охлаждают и концентрируют. Остаток суспендируют в ацетоне и отфильтровывают осадок желтого цвета, промывают холодным этанолом, 2 н. водным раствором соляной кислоты и водой до рН 6, затем сушат в вакуум-сушильном шкафу в течение ночи, при этом получают 7,2 г требуемого соединения (88%) в виде твердого вещества желтого цвета.

'11 ЯМР (360 МГц, ДМСО-И₆): δ 13,31 (к, Ьг, 1Н, ΝΉ-1’), 12,06 (к, Ьг, 1Н, СООН), 10,88 (к, Ьг, 1Н, ΝΉ-1), 7,93 (И, 1=1,88 Гц, 1Н, Н-4), 7,75 (к, 1Н, Н-винил), 7,19 (И, 1=3,1 Гц, 1Н, Н-2'), 7,1 (ИИ, Ьг, 1=1,88, 8,40 Гц, 1Н, Н-6), 6,84 (И, 1=8,40 Гц, 1Н, Н-7), 2,65 (1, 1=7,44 Гц, 2Н, СН₂СН₂СООН), 2,46 (I- 1=7,44 Гц, 2Н, СН2СН2СООН), 2,28 (к, 3Н, СН3).

Пример 2. 3-[5-(6-Метокси-2-оксо-1,2-дигидроиндол-3-илиденметил)-4-метил-1Н-пиррол-3-ил]пропионовая кислота.

4-(2-Карбоксиэтил)-2-формил-3-метилпиррол (190 мг), 163 мг 6-метокси-2-оксиндола и 2 капли пиперидина в 2 мл этанола нагревают при 90°С в течение 3 ч. Реакционную смесь охлаждают и концентрируют. Остаток суспендируют в 6 н. водном растворе соляной кислоты. Осадок отфильтровывают, промывают водой до рН 6, затем сушат в вакуум-сушильном шкафу, при этом получают 140 мг требуемого соединения (43%) в виде твердого вещества коричневого цвета.

'11 ЯМР (360 МГц, ДМСО-И₆): δ 13,1 (к, Ьг, 1Н, ΝΉ-1’), 12,04 (к, Ьг, 1Н, СООН), 10,76 (к, Ьг, 1Н, ΝΉ-1), 7,63 (И, 1=8,29 Гц, 1Н, Н-4), 7,46 (к, 1Н, Н-винил), 7,07 (И, 1=3,03 Гц, 1Н, Н-2’), 6,55 (ИИ, 1=2,32, 8,29 Гц, 1Н, Н-5), 6,43 (И, 1=2,32 Гц, 1Н, Н-7), 3,74 (к, 3Н, ОСН₃), 2,63 (1, 1=7,31 Гц, 2Н, СН₂СН₂СООН), 2,45 (1, 1=7,31 Гц, 2Н, СН2СН2СООН), 2,23 (к, 3Н, СН₃);

МС т/ζ (относительная интенсивность, %) 327 ([М+1]⁺, 100).

Пример 3. 3-[5-(5-Хлор-2-оксо-1,2-дигидроиндол-3 -илиденметил)-2,4-диметил-1Н-пиррол-3-ил] пропионовая кислота.

3-(2-Карбоксиэтил)-2,4-диметил-5-формилпиррол (220 мг), 147 мг 5-хлор-2-оксиндола и 2 капли пиперидина в 2 мл этанола нагревают при 90°С в течение 3 ч. Реакционную смесь охлаждают и концентрируют. Остаток суспендируют в 6 н. растворе соляной кислоты. Осадок отфильтровывают, промывают водой до рН 6, затем сушат в вакуум-сушильном шкафу, при этом получают 172 мг требуемого соединения (50%) в виде твердого вещества коричневого цвета.

¹Н ЯМР (360 МГц, ДМСО-И6): δ 13,42 (к, Ьг, 1Н, ΝΉ-1’), 12,03 (к, Ьг, 1Н, СООН), 10,80 (к, Ьг, 1Н, ΝΉ-1), 7,87 (И, 1=2,06 Гц, 1Н, Н-4), 7,67 (к, 1Н, Н-винил), 7,06 (ИИ, 1=2,06, 8,3 Гц, 1Н, Н-

6), 6,83 (И, 1=8,3 Гц, 1Н, Н-7), 2,64 (1, 1=7,6 Гц, 2Н, СН₂СН₂СООН), 2,34 (1, 1=7,6 Гц, 2Н, СН2СН2СООН), 2,29 (к, 3Н, СН3), 2,27 (к, 3Н, СН3);

МС т/ζ (относительная интенсивность, %) 345 ([М+1]⁺, 64).

Пример 4. 3-[4-Метил-5-(2-оксо-1,2-дигидроиндол-3 -илиденметил)-1Н-пиррол-3-ил]пропионовая кислота.

Металлический натрий (1,5 г) помещают в трехгорлую круглодонную колбу объемом 3 л, снабженную термометром, обратным холодильником и механической мешалкой, и помещают на масляную баню. При перемешивании добавляют абсолютный этанол (1 л). После растворения натрия добавляют 350 г пентан-2,4-диона одной порцией и затем 310 г этилакрилата в течение 30 мин. Полученную смесь кипятят с обратным холодильником в течение 2,5 ч и затем охлаждают до комнатной температуры в течение ночи. Добавляют ледяную уксусную кислоту (3 мл) и растворитель удаляют на роторном испарителе. Осадок фильтруют через слой кизельгура и перегоняют в пленочном испарителе при 0,1 мм. Дистиллят повторно перегоняют на 10-дюймовой колонке Ургеих с вакуумной рубашкой, при этом получают 518 г этилового эфира 4-ацетил-5-оксогексановой кислоты, Т_кип 84-92°С при 26,66-93,33 Н/м² (0,20,7 мм).

В трехгорлую колбу объемом 5 л, снабженную термометром, механической мешалкой, при нагревании на паровой бане добавляют 350 г этилового эфира 4-ацетил-5-оксогексановой кислоты, 329 г гидрохлорида этил аминомалоната, 133 г ацетата натрия и 1,2 л уксусной кислоты. Полученную смесь нагревают при 99°С в течение 37 мин. При 62 °С начинается быстрое выделение диоксида углерода. Через 35 мин при 99°С выделение СО2 заметно замедляется. Еще через час смесь охлаждают, хлорид натрия удаляют фильтрованием в вакууме и растворитель упаривают. Остаток смешивают с 1 л холодной воды. Осадок собирают фильтрованием в вакууме, промывают 400 мл воды и растворяют в 1 л горячего 95%-ного этанола. Полученный раствор обрабатывают 20 г угля Эагсо 6-60, фильтруют на воронке для горячего фильтрования и охлаждают до комнатной температуры. Кристаллическое твердое вещество собирают фильтрованием в вакууме, дважды промывают на фильтре 200 мл 50% этанола и сушат в вакууме при 70°С, при этом получают 285 г (выход 64%) 2-этоксикарбонил-4-(2-этоксикарбонилэтил)-3,5-диметилпиррола. Фильтрат оставляют в холодильнике на ночь, при этом получают дополнительное количество 53,1 г (выход 11,9%) продукта, суммарный выход составляет 75,9%.

2-Этоксикарбонил-4-(2-этоксикарбонилэтил)-3,5-диметилпиррол (285 г) и 3500 мл этилового эфира помещают в трехгорлую колбу объемом 5 л, снабженную механической мешалкой, обратным холодильником и капельной воронкой, и охлаждают на водяной бане. Затем по каплям добавляют сульфурилхлорид (435 г) в течение 145 мин. Во время добавления реактива раствор мутнеет и зеленеет, затем становится прозрачным. После завершения добавления смесь становится прозрачной и бледно-желтой. Смесь перемешивают в течение еще одного часа и затем нагревают с обратным холодильником в течение 1 ч. Смесь охлаждают и упаривают на роторном испарителе, разбавляют 1500 мл эфира и снова упаривают на роторном испарителе. Разбавление и упаривание на роторном испарителе повторяют еще раз. Остаток добавляют к 8 л воды, содержащей 802 г уксусной кислоты и 535 г гидроксида натрия. Смесь быстро нагревают до 85°С и затем охлаждают в течение ночи при перемешивании. Водный слой, содержащий твердые вещества, отделяют и экстрагируют 800 мл эфира. Твердые вещества и слой эфира добавляют к 2,5 л воды, содержащей 300 г карбоната натрия, перемешивают в течение 1 ч и фильтруют для удаления небольшого количества (приблизительно 7 г) твердого вещества. К смеси добавляют сернистую кислоту (137 г) и полученный осадок промывают дважды 250 мл воды, сушат в вакууме, при этом получают 56,4 г продукта. К фильтрату добавляют сернистую кислоту (92 г) и полученный осадок промывают дважды 0,5 л воды, сушат в вакууме, при этом получают 220 г продукта, суммарный выход 276,4 г (выход 86,8%) 2-карбокси-5-этоксикарбонил-3-(2-этоксикарбонилэтил)-4-метилпиррола.

2-Карбокси-5-этоксикарбонил-3-(2-этоксикарбонилэтил)-4-метилпиррол (50,5 г) и 400 мл 10% раствора гидроксида натрия нагревают в автоклаве Рагг при 180°С в течение 90 мин. Данный процесс повторяют еще 4 раза, до тех пор, пока не будет обработано все 252,5 г 2карбокси-5-этоксикарбонил-3-(2-этоксикарбонилэтил)-4-метилпиррола. Пять полученных растворов объединяют и упаривают на роторном испарителе до объема приблизительно 1,8 л вязкого остатка черного цвета. Смесь охлаждают до 10°С на водяной бане и медленно добав ляют 50% серную кислоту, при этом температуру поддерживают менее 20°С до тех пор, пока значение рН не станет равным 2. Добавляют этиловый эфир (1400 мл), смесь фильтруют и осадок сохраняют. Осадок экстрагируют 500 мл эфира в аппарте Сокслета. Объединенные эфирные слои промывают 250 мл воды, затем 150 мл воды. Объединенные водные слои снова экстрагируют 150 мл эфира. Все эфирные слои упаривают на роторном испарителе и остаток сушат, при этом получают 123,5 г 3-(2-карбоксиэтил)-

4-метилпиррола.

3-(2-Карбоксиэтил)-4-метилпиррол (123 г) смешивают с 1500 мл этилового эфира и 250 мл метанола в колбе-приемнике с магнитной мешалкой. Отдельную трехгорлую круглодонную колбу объемом 3 л, снабженную магнитной мешалкой, обратным холодильником, дистилляционной насадкой, соединенной с колбойприемником, нагревают на водяной бане. В колбу объемом 3 л помещают 240 г диазометаналя, растворенного в 1800 мл этилового эфира, раствор 73 г гидроксида калия в 360 мл 95% этанола и 112 мл воды. Полученную смесь перемешивают и нагревают до 65-75°С на водяной бане, смесь диазометан-эфир перегоняют в приемную колбу при перемешивании в течение приблизительно 2,5 ч. В колбу объемом 3 л добавляют этиловый эфир (200 мл) и перегонку продолжают до завершения. Раствор в приемной колбе перемешивают в течение дополнительных 30 мин и затем добавляют 10 мл уксусной кислоты. Полученную смесь экстрагируют дважды 500 мл воды, затем дважды 200 мл насыщенного раствора бикарбоната натрия. Эфирный слой сушат над безводным сульфатом натрия и отгоняют, при этом получают жидкий остаток черного цвета. Остаток дважды очищают на 4-х дюймовой колонке ХУщгеих и 1 раз на 10-ти дюймовой колонке ХУщгеих с вакуумной рубашкой, при этом получают 108 г (выход 80,6%) 3(2-метоксикарбонилэтил)-4-метилпиррола. Т_кип 108-113°С при 66,66 Н/м² (0,5 мм).

Диметилформамид помещают в трехгорлую плоскодонную колбу объемом 500 мл, снабженную механической мешалкой, термометром и капельной воронкой, и выдерживают в атмосфере азота. Колбу охлаждают до 0°С и добавляют по каплям 58,4 мл оксихлорида фосфора в течение 80 мин. В полученный раствор добавляют дихлорэтан (280 мл) и нагревают до комнатной температуры, затем охлаждают до -10°С. 3-(2-Метоксикарбонилэтил)-4-метилпиррол (55,7 г) растворяют в 80 мл дихлорэтана и добавляют по каплям к полученной смеси в течение 1 ч, полученную смесь перемешивают в течение дополнительных 35 мин. Смесь упаривают на роторном испарителе при <30°С. Жидкий остаток растворяют в 2700 мл ледяного раствора 2 н. гидроксида натрия. Полученный раствор нагревают при 88°С в течение 20 мин и затем выдерживают при данной температуре в течение дополнительных 30 мин. Раствор охлаждают до температуры окружающей среды и экстрагируют 200 мл этилового эфира. Водный раствор охлаждают до 0°С и подкисляют до рН 3,5, медленно добавляя приблизительно 1350 мл 5 н. соляной кислоты. Осадок желтого цвета собирают фильтрованием в вакууме, промывают 4 раза 100 мл воды и сушат в вакуумсушильном шкафу при температуре окружающей среды, при этом получают 54,4 г (выход 90,2%) неочищенного 4-(2-карбоксиэтил)-2формил-3-метилпиррола.

Неочищенный материал помещают в смесь 425 мл этанола и 700 мл этилового эфира, которую кипятят с обратным холодильником и фильтруют на воронке для горячего фильтрования для удаления нерастворимого остатка, который сохраняют. Фильтрат помещают в холодильник, полученный осадок собирают фильтрованием в вакууме и промывают 50 мл эфира. Полученный фильтрат используют для повторной экстракции нерастворимого осадка, горячего фильтрования и помещают в холодильник. Полученные осадки объединяют, при этом получают 26,1 г 4-(2-карбоксиэтил)-2-формил-3метилпиррола в виде порошка коричневого цвета, Т_пл 149,0-150,3°С. Фильтрат объединяют с ранее полученным фильтратом и концентрируют, при этом получают 43 г твердого вещества коричневого цвета. Твердое вещество помещают в смесь 500 мл эфира, 100 мл этанола, которую кипятят с обратным холодильником, и фильтруют. Фильтрат обрабатывают углем Νοη1 при нагревании с обратным холодильником и снова фильтруют при нагревании. Фильтрат помещают в холодильник, при этом получают 3 дополнительных порции 4-(2-карбоксиэтил)-2формил-3-метилпиррола, 7,7 г, Т_пл 148-151°С,

3,2 г, Т_пл 128-134°С и 4,1 г, Т_пл 148,2-150,0°С.

4-(2-Карбоксиэтил)-2-формил-3-метилпиррол (9,0 г) и 6,0 г 2-оксиндола в 50 мл этанола нагревают до 70°С в трехгорлой круглодонной колбе объемом 250 мл, снабженной термометром, обратным холодильником и магнитной мешалкой. После растворения основного количества твердых веществ добавляют 4,5 г пиперидина и смесь кипятят с обратным холодильником в течение 4 ч. Медленно добавляют уксусную кислоту (12 мл), что приводит к увеличению количества осадка. Полученную смесь кипятят с обратным холодильником в течение 5 мин, охлаждают до комнатной температуры и осадок собирают фильтрованием в вакууме и промывают 30 мл этанола. Осадок промывают при кипячении с обратным холодильником в 30 мл этанола, охлаждают до комнатной температуры, собирают фильтрованием в вакууме, промывают 20 мл этанола и сушат в вакууме, при этом получают 11,9 г (выход 80%) 3-[4-(2карбоксиэтил)-3-1метилпиррол-2-метилиденил]2-индолинона, 8И6663, в виде твердого вещества оранжевого цвета.

'Н ЯМР (360 МГц, ДМСО-й₆): δ 13,29 (к, Ьг, 1Н, ΝΗ-1’), 12,05 (к, Ьг, 1Н, СООН), 10,78 (к, Ьг, 1Н, ΝΗ-1), 7,73 (й, 1=7,43 Гц, 1Н, Н-4), 7,61 (к, 1Н, Н-винил), 7,13 (й, 1=2,75 Гц, 1Н, Н-2’), 7,10 (1, 1=7,43 Гц, 1Н, Н-6), 6,97 (1, 1=7,43 Гц, 1Н, Н-5), 6,85 (й, 1=7,43 Гц, 1Н, Н-7), 2,64 (1, 1=7,38 Гц, 2Н, СН₂СН₂СООН), 2,46 (1, 1=7,38 Гц, 2Н, СН₂СН₂СООН), 2,25 (к, 3Н, СН₃);

МС т/ζ (относительная интенсивность, %) 297 ([М+1]⁺, 100).

Пример 5. 3-[2,4-Диметил-5-(2-оксо-1,2дигидроиндол-3 -илиденметил)-1Н-пиррол-3-ил] пропионовая кислота.

2,4-Диметил-5 -этоксикарбонил-3-(2-этоксикарбонилэтил)пиррол (1,07 кг) и 3,2 л 5н. гидроксида натрия механически перемешивают в трехгорлой круглодонной колбе объемом 12 л, снабженной обратным холодильником и капельной воронкой, и нагревают на масляной бане. Смесь кипятят с обратным холодильником в течение 3 ч, после чего температура смеси составляет 96°С, все твердые вещества растворены и по данным тонкослойной хроматографии гидролиз завершен. Масляную баню удаляют и смесь охлаждают до 50°С на водяной бане. Медленно добавляют 12н. соляную кислоту (приблизительно 1,3 л). После добавления приблизительно 50% кислоты начинается выделение газа, температура составляет 60°С. После добавления большего количества кислоты газ выделяется более интенсивно и образуется осадок желтого цвета. Конечную величину рН доводят до 3,5 соляной кислотой. Смесь охлаждают на ледяной бане до 8°С. Твердое вещество собирают фильтрованием в вакууме, промывают дважды 0,5 л дистиллированной воды и сушат в течение 48 ч в вакуум-сушильном шкафу при 55-60°С, при этом получают 677 г (выход приблизительно 100%) 3-(2-карбоксиэтил)-2,4-диметилпиррола.

'11 ЯМР (ДМСО-й₆): δ 11,9 (к, 1Н, СООН),

9,9 (к, 1Н, N4), 6,2 (к, 1Н, ароматический), 2,5 (1, 2Н, СН₂), 2,2 (1, 2Н, СН₂), 2,0 (к, 3Н, СН₃), 1,9 (к, 3Н, СН₃); Т_пл 134-136°С.

Диметилформамид (28,5 г) в 250 мл дихлорметана в трехгорлой круглодонной колбе объемом 1 л, снабженной магнитной мешалкой, термометром и капельной воронкой, охлаждают на бане со смесью льда с солью до -1 °С. Оксихлорид фосфора (59,3 г) помещают в капельную воронку и медленно добавляют к реакционной смеси. Воронку промывают 25 мл дихлорметана, чтобы добавить все остатки оксихлорида фосфора. Максимальная температура смеси составляет 5°С. Смесь перемешивают в течение 15 мин при температуре -3°С. Твердый 3-(2карбоксиэтил)-2,4-диметилпиррол (32,6 г) порциями добавляют через 15 мин. Максимальная температура смеси составляет 7°С. Смесь красновато-черного цвета перемешивают в течение 30 мин и затем нагревают с обратным холо дильником в течение 1 ч. Смесь охлаждают до 15°С и добавляют 300 мл воды, что приводит к интенсивной реакции, во время которой наблюдается увеличение температуры. Смесь перемешивают и охлаждают до 22°С, слои разделяют и сохраняют. Органический слой экстрагируют 100 мл воды и водные слои объединяют, промывают 50 мл дихлорметана. Органические слои отбрасывают. рН водного слоя доводят до 11 с помощью приблизительно 180 мл 10н. гидроксида натрия. Температура увеличивается до 40°С. Смесь перемешивают в течение 30 мин при температуре 27°С. Смесь подкисляют до рН 2 с помощью приблизительно 120 мл 10н. соляной кислоты, что приводит к увеличению температуры до 30°С. Добавляют этилацетат (150 мл) и смесь перемешивают для экстракции продукта. Во время перемешивания в верхней части водного слоя образуется значительное количество твердого вещества черного цвета. Слой этилацетата отделяют и водный слой и твердое вещество экстрагируют дважды 100 мл этилацетата.

Оставшееся твердое вещество собирают фильтрованием в вакууме, тщательно промывают водой и сушат в вакууме при 40°С, при этом получают 12 г (выход 31%) 3-(2-карбоксиэтил)2,4-диметил-5-формилпиррола в виде твердого вещества коричневато-черного цвета. На тонкослойной хроматограмме (дихлорметан/уксусная кислота 95:5, силикагель) наблюдается пятно при КГ=0,7 и цветное пятно на старте. Слои этилацетата объединяют, сушат над безводным сульфатом натрия и упаривают до получения твердого вещества коричневаточерного цвета, которое сушат в вакууме при 40°С, при этом получают 21 г (выход 55%, суммарный выход 86%) 3-(2-карбоксиэтил)-2,4диметил-5-формилпиррола, данные тонкослойной хроматографии идентичны данным, полученным для предыдущего твердого вещества.

По другому способу диметилформамид (124 мл) в 750 мл дихлорметана в трехгорлой круглодонной колбе объемом 5 л, снабженной механической мешалкой, термометром и капельной воронкой, охлаждают на бане со смесью льда с солью до -9 °С. Оксихлорид фосфора (114 мл) быстро добавляют с помощью капельной воронки, которую промывают 25 мл дихлорметана в реакционную смесь. Максимальная температура смеси составляет -4°С. Твердый 3-(2-карбоксиэтил)-2,4-диметилпиррол (133,6 г) порциями добавляют в смесь через 20 мин. Максимальная температура смеси составляет 3°С. Смесь темно-красноватого цвета нагревают с обратным холодильником в течение 1 мин и затем охлаждают до -1°С. После достижения температуры смеси 1°С быстро добавляют 800 мл ледяной воды. Максимальная температура составляет 15°С. Органический слой отделяют и удаляют. рН водного слоя медленно доводят до 12-13 с помощью приблизительно

800 мл 10 н. гидроксида калия, добавляя лед для регулирования температуры. Температура увеличивается до 37°С. Смесь перемешивают в течение 90 мин при температуре окружающей среды, после чего на тонкослойной хроматограмме наблюдаются только следовые количества светлоокрашенного материала на старте и продукт с КГ 0,3. Смесь охлаждают до 0°С. Смесь подкисляют до рН 3 с помощью приблизительно 600 мл 10 н. соляной кислоты, добавляя лед для регулирования температуры. Максимальная температура составляет 10 °С. Смесь перемешивают в течение 1 ч на холоду. Твердое вещество собирают фильтрованием в вакууме, промывают 4 раза 100 мл воды и сушат в вакууме при 50-60°С, при этом получают 140,6 г (выход 90%) 3-(2-карбоксиэтил)-2,4-диметил-5формилпиррола в виде твердого вещества коричневого цвета.

'11 ЯМР (ДМСО-й₆): δ 12,0 (к, 1Н, СООН),

11,3 (к, 1Н, ΝΗ), 9,4 (к, 1Н, СНО), 2,6 (!, 2Н, СН₂), 2,3 (!, 2Н, СН₂), 2,2 (к, 3Н, СН₃), 2,1 (к, 3Н, СН₃). Т 145-147°С.

3-(2-Карбоксиэтил)-2,4-диметил-5-формилпиррол (18,2 г) и 11,7 г 2-оксиндола растворяют в 100 мл этанола нагреванием в круглодонной колбе объемом 250 мл, снабженной магнитной мешалкой и обратным холодильником, на масляной бане. Добавляют пирролидин (7,0 г) и реакционную смесь кипятят с обратным холодильником в течение 2 ч, после чего образуется большое количество осадка коричневочерного цвета. Данные тонкослойной хроматографии (этилацетат/этанол/уксусная кислота, 96:2:2, силикагель) указывают на отсутствие исходного оксиндола. Добавляют 8 мл уксусной кислоты и смесь кипятят с обратным холодильником в течение 15 мин. Вязкую смесь разбавляют 50 мл этанола и охлаждают до 10°С. Твердое вещество собирают фильтрованием в вакууме и промывают 50 мл этанола. Твердое вещество перемешивают в 125 мл этанола при кипячении с обратным холодильником в течение 10 мин, охлаждают до 10°С, собирают фильтрованием в вакууме и промывают 50 мл этанола. Продукт сушат в течение ночи при 45°С в вакууме, при этом получают 25,5 г (выход 88%) 3-[2,4-диметил-3-(2-карбоксиэтил)пиррол-5-метилиденил]-2-индолинона в виде твердого вещества оранжевого цвета.

По другому способу смесь 3-(5-формил2,4-диметил-1Н-пиррол-3-ил)пропионовой кислоты (10 г, 51 ммоль), 2-оксиндола (6,5 г, 49 ммоль) и гидроксида натрия (40 г, 58 ммоль) растворяют в 50 мл воды и перемешивают при 50°С в течение 4 ч. Реакционную смесь охлаждают до комнатной температуры, фильтруют и фильтрат подкисляют 12 н. соляной кислотой до рН 3. Полученное твердое вещество собирают фильтрованием в вакууме, промывают 10 мл воды и сушат в вакууме в течение ночи. Неочищенное твердое вещество промывают горячим этанолом дважды. Затем твердое вещество собирают фильтрованием в вакууме, промывают 10 мл этанола и сушат в вакууме, при этом получают 13,8 г (91%) 3-[2,4-диметил-5-(2-оксо1,2-дигидроиндол-3 -илиденметил)-1Н-пиррол-3ил]пропионовой кислоты.

¹Н ЯМР (360 МГц, ДМСО-б₆): δ 13,38 (8, Ьг, 1Н, ΝΗ-1’), 12,05 (8, Ьг, 1Н, СООН), 10,70 (8, Ьг, 1Н, ΝΗ-1), 7,69 (б, 1=7,39 Гц, 1Н, Н-4), 7,53 (8, 1Н, Н-винил), 7,06 (1, 1=7,39 Гц, 1Н, Н-6),

6,95 (1, 1=7,39 Гц, 1Н, Н-5), 6,85 (б, 1=7,39 Гц, 1Н, Н-7), 2,63 (1, 1=7,45 Гц, 2Н, СН₂СН₂СООН),

2,34 (1, 1=7,45 Гц, 2Н, СН₂СН₂СООН), 2,28 (8, 3Н, СН3), 2,24 (8, 3Н, СН3);

МС т/ζ (относительная интенсивность, %) 311 ([М+1]⁺, 100).

Пример 6. 3-[5-(5-Бром-2-оксо-1,2-дигидроиндол-3 -илиденметил)-4-метил-1Н-пиррол-3ил]пропионовая кислота.

2-Оксиндол (53,3 г) суспендируют в 640 мл ацетонитрила и смесь охлаждают до 7°С на ледяной бане при механическом перемешивании. Порциями добавляют твердый Ν-бромсукцинимид (74,8 г) в течение 20 мин. После того, как добавлена приблизительно 1/3 часть Νбромсукцинимида (через 5 мин) температура увеличивается до 12°С. Добавление прекращают до тех пор, пока температура смеси не снизится до 10°С. Добавление возобновляют, поддерживая температуру ниже 12°С. После завершения добавления смесь перемешивают в течение 1 ч при 10°С и затем дополнительно в течение 1 ч, при котором смесь нагревается до температуры окружающей среды. Осадок собирают фильтрованием в вакууме, промывают 80 мл этанола, сушат в вакууме досуха в течение 20 мин на воронке для фильтрования, при этом получают продукт, содержащий 6,4% 2-оксиндола по данным ВЭЖХ. Твердое вещество суспендируют в 1440 мл денатурированного спирта и промывают при перемешивании и кипячении с обратным холодильником в течение 5 мин, после чего большинство твердых веществ растворяется. Смесь охлаждают на ледяной бане до 13°С. Твердый продукт собирают фильтрованием в вакууме, промывают 80 мл этанола и сушат в вакууме, при этом получают 57,7 г (68,0%) 5бром-2-оксиндола, содержащего 1,13% 2оксиндола по данным ВЭЖХ. Промывка более разбавленным этанолом (с концентрацией на 30 % меньше) позволяет увеличить выход (88%), но при этом увеличивается содержание 2оксиндола (1,76 %).

¹Н ЯМР (360 МГц, ДМСО-б6): δ 10,44 (8, Ьг, 1Н, ΝΗ-1), 7,32-7,36 (т, 2Н), 6,76 (б, 1=8,50 Гц, 1Н, Н-7), 3,5 (8, 2Н, СН₂).

МС т/ζ 212,1/214,1 (М⁺/[М+2]⁺).

4-(2-Карбоксиэтил)-2-формил-3-метилпиррол (90 мг), 106 мг 5-бром-2-оксиндола и 75 мкл пиперидина в 2 мл этанола нагревают при 95°С в течение 5 ч. Реакционную смесь охлаждают и концентрируют. Остаток суспендируют в 2н. водной соляной кислоте. Остаток фильтруют, промывают водой до рН 6 и сушат в вакуумсушильном шкафу, при этом получают 120 мг (64%) требуемого соединения в виде твердого вещества коричневого цвета.

¹Н ЯМР (360 МГц, ДМСО-б6): δ 13,31 (8, Ьг, 1Н, ЦН-1’), 12,06 (8, Ьг, 1Н, СООН), 10,90 (8, Ьг, 1Н, ЦН-1), 8,06 (8, Ьг, 1Н, Н-4), 7,75 (8, 1Н, Нвинил), 7,23 (б, Ьг, 1=8,50 Гц, 1Н, Н-6), 7,19 (б, 1=2,84 Гц, 1Н, Н-2’), 6,80 (б, Ьг, 1=8,50 Гц, 1Н, Н-7), 2,65 (1, 1=7,65 Гц, 2Н, СН₂СН₂СООН), 2,46 (1, 1=7,65 Гц, 2Н, СН₂СН₂СООН), 2,28 (8, 3Н, СН₃);

МС т/ζ 375,1/377,2 (М⁺/[М+2]⁺).

Пример 7. 3-[5-(5-Иод-2-оксо-1,2-дигидроиндол-3 -илиденметил)-4-метил-1Н-пиррол-3-ил] пропионовая кислота.

2-Оксиндол (82,9 г) суспендируют в 630 мл уксусной кислоты при механическом перемешивании и смесь охлаждают до 10°С на ледяной бане. Порциями добавляют твердый Ν-иодсукцинимид (175 г) в течение 10 мин. После завершения добавления смесь перемешивают в течение 1 ч при 10°С. Суспендированное твердое вещество становится очень вязким. Твердое вещество собирают фильтрованием в вакууме, промывают 100 мл 50% водной уксусной кислоты и затем 200 мл воды, сушат в вакууме досуха в течение 20 мин на воронке для фильтрования. Продукт сушат в вакууме, при этом получают 93,5 г (36,0%) 5-иод-2-оксиндола, содержащего приблизительно 5% 2-оксиндола по данным протонного ЯМР.

'Н ЯМР (360 МГц, ДМСО-б₆): δ 0,45 (8, 1Н, ЦН-1), 7,49 (8, 1Н, Н-4), 7,48 (б, 1=8,10 Гц, 1Н, Н-6), 6,64 (б, 1=8,10 Гц, 1Н, Н-7) и 3,46 (8, 2Н, СН2-3);

МС т/ζ 258 [М-1]⁺.

4-(2-Карбоксиэтил)-2-формил-3-метилпиррол (90 мг), 130 мг 5-иод-2-оксиндола и 75 мкл пиперидина в 2 мл этанола нагревают при 95°С в течение 5 ч. Реакционную смесь охлаждают и концентрируют. Остаток суспендируют в 2н. водной соляной кислоте. Остаток фильтруют, промывают водой до рН 6 и сушат в вакуумсушильном шкафу, при этом получают 162 мг (77%) требуемого соединения в виде твердого вещества коричневого цвета.

¹Н ЯМР (360 МГц, ДМСО-б6): δ 13,30 (8, Ьг, 1Н, ЦН-1’), 12,06 (8, Ьг, 1Н, СООН), 10,88 (8, Ьг, 1Н, ЦН-1), 8,18 (8, Ьг, 1Н, Н-4), 7,73 (8, 1Н, Нвинил), 7,40 (б, Ьг, 1=8,03 Гц, 1Н, Н-6), 7,19 (б, 1=2,94 Гц, 1Н, Н-2’), 6,69 (б, Ьг, 1=8,03 Гц, 1Н, Н-7), 2,65 (1, 1=7,40 Гц, 2Н, СН₂СН₂СООН), 2,46 (1, 1=7,40 Гц, 2Н, СН₂СН₂СООН), 2,28 (8, 3Н, СН3);

МС т/ζ 423 [М+1]⁺.

Пример 8. 3-[4-Метил-5-(4-метил-2-оксо1,2-дигидроиндол-3 -илиденметил)-1Н-пиррол-3ил] пропионовая кислота.

Диэтилоксалат (30 мл) в 20 мл сухого эфира добавляют при перемешивании к 19 г этоксида калия, суспендированного в 50 мл сухого эфира. Смесь охлаждают на ледяной бане и медленно добавляют 20 мл тринитро-о-ксилола в 20 мл сухого эфира. Вязкую смесь темнокрасного цвета нагревают с обратным холодильником в течение 0,5 ч, концентрируют, при этом получают твердое вещество темнокрасного цвета, которое обрабатывают 10% гидроксидом натрия до почти полного растворения твердого вещества. Смесь темно-красного цвета обрабатывают 30% пероксидом водорода до изменения красного цвета на желтый. По другому способу, смесь обрабатывают 10% гидроксидом натрия и 30% пероксидом водорода до исчезновения темно-красной окраски. Твердое вещество фильтруют и фильтрат подкисляют 6н. соляной кислотой. Полученный осадок собирают фильтрованием в вакууме, промывают водой и сушат в вакууме, при этом получают 9,8 г (выход 45%) 2-метил-6-нитрофенилуксусной кислоты в виде твердого вещества грязнобелого цвета. Твердое вещество гидрируют в метаноле в присутствии 10% палладия на угле, при этом получают 9,04 г 4-метил-2-оксиндола в виде твердого вещества белого цвета.

^!Н ЯМР (360 МГц, ДМСО-б₆): δ 10,27 (а, Ьг, 1Н, ΝΗ-1), 7,06 (1, 1=7,71 Гц, 1Н, Н-6), 6,74 (б, 1=7,73 Гц, Н-5), 6,63 (б, 1=7,73 Гц, 1Н, Н-7), 3,36 (а, 2Н, СН₂), 2,18 (а, 3Н, СН₃).

4- (2-Карбоксиэтил)-2-формил-3-метилпиррол (90 мг), 74 мг 4-метил-2-оксиндола и 75 мкл пиперидина в 2 мл этанола нагревают при 95°С в течение 5 ч. Реакционную смесь охлаждают и концентрируют. Остаток суспендируют в 6н. водной соляной кислоте. Осадок фильтруют, промывают водой до рН 6 и сушат в вакуумсушильном шкафу, при этом получают 80 мг (52%) требуемого соединения в виде твердого вещества коричневого цвета.

¹Н ЯМР (360 МГц, ДМСО-б6): δ 13,33 (а, Ьг, 1Н, ΝΗ-1’), 10,84 (а, Ьг, 1Н, ΝΗ-1),7,54 (а, 1Н, Н-винил), 7,12 (б, 1=2,0 Гц, 1Н, Н-2'), 7,01 (1, 1=7,75 Гц, 1Н, Н-6), 6,79 (б, 1=7,75 Гц, Н-5), 6,74 (б, 1=7,75 Гц, 1Н, Н-7), 2,64 (1, 1=7,65 Гц, 2Н, СН₂СН₂СООН), 2,57 (а, 3Н, СН₃), 2,42 (1, 1=7,65 Гц, 2Н, СН₂СН₂СООН), 2,19 (а, 3Н, СН₃);

МС т/ζ (относительная интенсивность, %) 311 ([М+1]⁺, 100).

Пример 9. 3-[4-Метил-5-(5-метил-2-оксо1,2-дигидроиндол-3-илиденметил)-1Н-пиррол-3ил]пропионовая кислота.

5- Метилизатин (15,0 г), 60 мл гидразингидрата нагревают при 140-160°С в течение 4 ч. Данные тонкослойной хроматографии (этилацетат/гексан 1:2, силикагель) показывают отсутствие исходного вещества. Реакционную смесь охлаждают до комнатной температуры, выливают в 300 мл ледяной воды и подкисляют 6н. соляной кислотой до рН 2. После выдерживания смеси при комнатной температуре в течение 2 дней осадок собирают фильтрованием в вакууме, промывают водой и сушат в вакууме, при этом получают 6,5 г (выход 47%) 5-метил-2оксиндола.

^!Н ЯМР (360 МГц, ,ΠΜ^^): δ 10,20 (а, Ьг, 1Н, ЦН-1), 6,99 (а, 1Н, Н-4), 6,94 (б, 1=8,11 Гц, 1Н, Н-6), 6,68 (б, 1=8,11 Гц, 1Н, Н-7), 3,39 (а, 2Н, СН₂-3) и 2,22 (а, 3Н, СН₃-5).

4-(2-Карбоксиэтил)-2-формил-3-метилпиррол (90 мг), 74 мг 5-метил-2-оксиндола и 75 мкл пиперидина в 2 мл этанола нагревают при 95°С в течение 5 ч. Реакционную смесь охлаждают и концентрируют. Остаток суспендируют в 6н. водной соляной кислоте. Осадок фильтруют, промывают водой до рН 6 и сушат в вакуумсушильном шкафу, при этом получают 65 мг (42%) требуемого соединения в виде твердого вещества коричневого цвета.

¹Н ЯМР (360 МГц, ДМСО-б6): δ 13,30 (а, Ьг, 1Н, ЦН-1’), 12,05 (а, Ьг, 1Н, СООН), 10,67 (а, Ьг, 1Н, ЦН-1), 7,57 (а, 2Н, Н-винил, Н-4), 7,12 (б, 1=2,65 Гц, 1Н, Н-2'), 6,91 (б, 1=7,82 Гц, 1Н, Н-6),

6,74 (б, 1=7,82 Гц, 1Н, Н-7), 2,65 (1, 1=6,94 Гц, 2Н, СН₂СН₂СООН), 2,46 (1, 1=6,94 Гц, 2Н, СН2СН2СООН), 2,30 (а, 3Н, СН3), 2,25 (а, 3Н, СН3);

МС т/ζ (относительная интенсивность, %) 311 ([М+1]⁺, 100).

Пример 10. 3-[5-(5,6-диметокси-2-оксо-1,2дигидроиндол-3 -илиденметил)-4-метил-1Н-пиррол-3-ил] пропионовая кислота.

4-(2-Карбоксиэтил)-2-формил-3-метилпиррол (90 мг), 97 мг 5,6-диметокси-2-оксиндола и 75 мкл пиперидина в 2 мл этанола нагревают при 95°С в течение 5 ч. Реакционную смесь охлаждают и концентрируют. Остаток суспендируют в 6н. водной соляной кислоте. Осадок фильтруют, промывают водой до рН 6 и сушат в вакуум-сушильном шкафу, при этом получают 104 мг (58%) требуемого соединения в виде твердого вещества коричневого цвета.

^!Н ЯМР (360 МГц, ,ΠΜ^^): δ 13,19 (а, Ьг, 1Н, ЦН-1’), 12,05 (а, Ьг, 1Н, СООН), 10,53 (а, Ьг, 1Н, ЦН-1), 7,46 (а, 1Н), 7,41 (а, 1Н), 7,02 (а, 1Н, Н-2’), 6,45 (а, 1Н), 3,74 (а, 3Н, ОСН₃), 3,70 (а, 3Н, ОСН₃), 2,59 (1, 1=7,43 Гц, 2Н,

СН₂СН₂СООН), 2,44 (1, 1=7,43 Гц, 2Н,

СН2СН2СООН), 2,22 (а, 3Н, СН3);

ΜС т/ζ 357 [Μ+1]⁺.

Пример 11. 3-[5-(6-хлор-2-оксо-1,2-дигидроиндол-3-илиденметил)-4-метил-1Н-пиррол-3ил]пропионовая кислота.

4-(2-Карбоксиэтил)-2-формил-3-метилпиррол (200 мг), 167,6 мг 6-хлор-2-оксиндола и 166 мкл пиперидина в 2 мл этанола нагревают при 95°С в течение 5 ч. Реакционную смесь охлаждают и концентрируют. Остаток суспендируют в 6н. водной соляной кислоте. Осадок фильтруют, промывают водой до рН 6 и сушат в вакуум-сушильном шкафу, при этом получают

246 мг (74%) требуемого соединения в виде твердого вещества коричневого цвета.

Ή ЯМР (360 МГц, ДМСО-а₆): δ 13,22 (8, Ьг, 1Н, ΝΗ-1’), 12,09 (8, Ьг, 1Н, СООН), 10,95 (8, Ьг, 1Н, ΝΗ-1), 7,78 (ά, 1=7,95 Гц, 1Н, Н-4), 7,66 (8, 1Н, Н-винил), 7,18 (ά, 1=2,64 Гц, 1Н, Н-2'), 7,01 (άά, 1=1,90, 7,95 Гц, 1Н, Н-5), 6,86 (ά, 1=1,90 Гц, 1Н, Н-7), 2,65 (!, 1=7,14 Гц, 2Н,

СН₂СН₂СООН), 2,45 (!, 1=7,14 Гц, 2Н,

СН2СН2СООН), 2,26 (8, 3Н, СН3).

Пример 12. Метиловый эфир 3-[4-(2-карбоксиэтил)-3-метил-1Н-пиррол-2-илметилен]-2оксо-2,3-дигидро-1Н-индол-5-карбоновой кислоты.

5-Иод-2-оксиндол (17 г) кипятят с обратным холодильником с 2 г диацетата палладия, 18,2 г триэтиламина, 150 мл метанола, 15 мл ДМСО и 2,6 г ΌΡΡΡ в атмосфере, насыщенной монооксидом углерода. Через 24 ч реакционную смесь фильтруют для удаления катализатора и фильтрат концентрируют. Концентрат хроматографируют на силикагеле с использованием 30% этилацетата в гексане. Фракции, содержащие продукт, концентрируют и выдерживают. Полученный продукт осаждают и собирают фильтрованием в вакууме, при этом получают 0,8 г (7%) 5-метоксикарбонил-2-оксиндола в виде твердого вещества грязно-белого цвета.

Ή ЯМР (360 МГц, ДМСОО: δ 10,70 (8, Ьг, 1Н, N^1), 7,83 (άά, 1=1,77, 8,29 Гц, 1Н, Н-6),

7,77 (8, Ьг, 1Н, Н-4), 6,89 (ά, 1=8,29 Гц, 1Н, Н-7),

3,80 (8, 3Н, СООСН3-5), 3,51 (8, 2Н, СН2-3).

4-(2-Карбоксиэтил)-2-формил-3-метилпиррол (90,6 мг), 88,6 мг 5-метоксикарбонил-2оксиндола и 75 мкл пиперидина в 2 мл этанола нагревают при 95°С в течение 5 ч. Реакционную смесь охлаждают и концентрируют. Остаток суспендируют в 6н. водной соляной кислоте. Осадок фильтруют, промывают водой до рН 6 и сушат в вакуум-сушильном шкафу, при этом получают 123 мг (69%) требуемого соединения в виде твердого вещества желтого цвета.

Ή ЯМР (360 МГц, ДМСОО: δ 13,27 (8, Ьг, 1Н, N^1’), 12,0 (8, уЬг, 1Н, СООН), 11,16 (8, Ьг, 1Н, N^1), 8,36 (8, Ьг, 1Н, Н-4), 7,80 (8, 1Н, Нвинил), 7,40 (άά, 1=1,80, 8,14 Гц, 1Н, Н-6), 7,20 (ά, 1=2,91 Гц, 1Н, Н-5'), 6,96 (ά, 1=8,14 Гц, 1Н, Н-

7), 3,84 (8, 3Н, СООСНз), 2,66 (!, 1=7,55 Гц, 2Н, СН₂СН₂СООН), 2,46 (!, 1=7,55 Гц, 2Н,

СН2СН2СООН), 2,30 (8, 3Н, СН3).

МС т/ζ (относительная интенсивность, %) 355 ([М+1]⁺, 100).

Пример 13. 3-[4-(2-Карбоксиэтил)-3-метил1Н-пиррол-2-илметилен]-2-оксо-2,3-дигидро1Н-индол-5-карбоновая кислота.

2-Оксиндол (6,7 г) при перемешивании добавляют к суспензии 23 г хлорида алюминия в 30 мл дихлорэтана на ледяной бане. Медленно добавляют хлорацетилхлорид (11,3 г), при этом выделяется газообразный хлористый водород. Через 10 мин перемешивания реакционную смесь нагревают при 40-50°С в течение 1,5 ч. Данные тонкослойной хроматографии (этилацетат, силикагель) показывают отсутствие исходного вещества. Смесь охлаждают до комнатной температуры и выливают в ледяную воду. Осадок собирают фильтрованием в вакууме, промывают водой и сушат в вакууме, при этом получают 10,3 г (98%) 5-хлорацетил-2-оксиндола в виде твердого вещества грязно-белого цвета.

Суспензию 9,3 г 5-хлорацетил-2-оксиндола перемешивают в 90 мл пиридина при 80-90°С в течение 3 ч, затем охлаждают до комнатной температуры. Осадок собирают фильтрованием в вакууме и промывают 20 мл этанола. Твердое вещество растворяют в 90 мл 2,5н. гидроксида натрия и перемешивают при 70-80°С в течение 3 ч. Полученную смесь охлаждают до комнатной температуры и подкисляют 0,5н. соляной кислотой до рН 2. Осадок собирают фильтрованием в вакууме и тщательно промывают водой, при этом получают неочищенный 5-карбокси-2оксиндол в виде твердого вещества темнокоричневого цвета. После выдерживания в течение ночи из фильтрата получают 2 г 5карбокси-2-оксиндола в виде твердого вещества желтого цвета. Неочищенный продукт темнокоричневого цвета растворяют в горячем метаноле, нерастворимое вещество удаляют фильтрованием и фильтрат концентрируют, при этом получают 5,6 г 5-карбокси-2-оксиндола в виде твердого вещества коричневого цвета. Суммарный выход составляет 97%.

'Н ЯМР (360 МГц, ДМСО-ф): δ 12,56 (8, Ьг, 1Н, СООН-5), 10,70 (8, 1Н, N^1), 7,82 (άά, 1=1,57, 7,79 Гц, 1Н, Н-6), 7,74 (8, Ьг, 1Н, Н-4),

6,87 (ά, 1=7,79 Гц, 1Н, Н-7), 3,53 (8, 2Н, СН₂-3);

МС т/ζ (относительная интенсивность, %) 178 ([М+1]⁺, 100).

4-(2-Карбоксиэтил)-2-формил-3-метилпиррол (90,6 мг), 88,6 мг 5-карбокси-2-оксиндола и 75 мкл пиперидина в 2 мл этанола нагревают при 95°С в течение 5 ч. Реакционную смесь охлаждают и концентрируют. Остаток суспендируют в 6н. водной соляной кислоте. Осадок фильтруют, промывают водой до рН 6 и сушат в вакуум-сушильном шкафу. Неочищенный продукт очищают хроматографией на колонке с силикагелем с использованием в качестве элюента смеси этилацетат/гексан/уксусная кислота, при этом получают 51 мг (30%) требуемого соединения в виде твердого вещества желтого цвета.

'Н ЯМР (360 МГц, ДМСО-άρ: δ 13,27 (8, Ьг, 1Н, N^1), 12,28 (8, уЬг, 2Н, 2хСООН), 11,11 (8, Ьг, 1Н, N^1), 8,34 (ά, 1=1,36 Гц, 1Н, Н-4),

7,78 (8, 1Н, Н-винил), 7,40 (άά, 1=1,36, 8,20 Гц, 1Н, Н-6), 7,19 (ά, 1=3,07 Гц, 1Н, Н-5’), 6,93 (ά, 1=8,20 Гц, 1Н, Н-7), 2,65 (!, 1=7,56 Гц, 2Н, СН₂СН₂СООН), 2,46 (!, 1=7,56 Гц, 2Н,

СН2СН2СООН), 2,29 (8, 3Н, СН3);

МС т/ζ 341,0 [М+1]⁺.

Пример 14. 3-[4-Метил-5-(2-оксо-5-сульфамоил-1,2-дигидроиндол-3-илиденметил)-1 Нпиррол-3-ил] пропионовая кислота.

В колбу объемом 100 мл помещают 27 мл хлорсульфоновой кислоты и медленно добавляют 13,3 г 2-оксиндола. При добавлении реагента температуру реакционной смеси поддерживают ниже 30°С. После добавления реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 1,5 ч, нагревают при 68°С в течение 1 ч, охлаждают и выливают в воду. Осадок промывают водой, сушат в вакуум-сушильном шкафу, при этом получают 11,0 г 5-хлорсульфонил-2-оксиндола (выход 50%), который используют без дальнейшей очистки.

5-Хлорсульфонил-2-оксиндол (2,1 г) добавляют к 10 мл гидроксида аммония в 10 мл этанола и перемешивают при комнатной температуре в течение ночи. Полученную смесь концентрируют и твердое вещество собирают фильтрованием в вакууме, при этом получают 0,4 г (выход 20%) 5-аминосульфонил-2-оксиндола в виде твердого вещества грязно-белого цвета.

¹Н ЯМР (360 МГц, ДМСО-б₆): δ 10,67 (8, 1Н, ΝΗ-1), 7,63-7,66 (т, 2Н, Н-4,6), 7,13 (8, 2Н, 5-8Ο₂ΝΗ₂), 6,91 (б, 1=8,04 Гц, 1Н, Н-7) и 3,56 (8, 2Н, СН₂-3);

МС т/ζ (относительная интенсивность, %) 211 ([М-1]⁺, 100).

4-(2-Карбоксиэтил)-2-формил-3-метилпиррол (90,6 мг), 106 мг 5-аминосульфонил-2оксиндола и 75 мкл пиперидина в 2 мл этанола нагревают при 95°С в течение 5 ч. Реакционную смесь охлаждают и концентрируют. Остаток суспендируют в 6н. водной соляной кислоте. Осадок фильтруют, промывают водой до рН 6 и сушат в вакуум-сушильном шкафу, при этом получают 132 мг (70%) требуемого соединения в виде твердого вещества желтого цвета.

¹Н ЯМР (360 МГц, ДМСО-б₆): δ 13,28 (8, Ьг, 1Н. ΝΗ-1'), 12,0 (8, уЬг, 1Н, СООН), 11,15 (8, Ьг, 1Н, ХН-1), 8,20 (б, 1=1,6 Гц, 1Н, Н-4), 7,73 (8, 1Н, Н-винил), 7,59 (бб, 1=1,60, 8,17 Гц, 1Н, Н-6), 7,22 (б, 1=2,85 Гц, 1Н, Н-2'), 7,10 (8, 2Н, Ν^),

6,98 (б, 1=8,17 Гц, 1Н, Н-7), 2,67 (1, 1=7,41 Гц, 2Н, СН₂СН₂СООН), 2,46 (1, 1=7,41 Гц, 2Н, СН₂СН₂СООН) и 2,29 (8, 3Н, СН₃).

Пример 15. 3-[4-Метил-5-(5-метилсульфамоил-2-оксо-1,2-дигидроиндол-3-илиденметил)1Н-пиррол-3-ил]пропионовая кислота.

Суспензию 3,38 г 5-хлорсульфонил-2-оксиндола в 10 мл 2М метиламина в тетрагидрофуране перемешивают при комнатной температуре в течение 4 ч, в течение которых присутствует твердое вещество белого цвета. Осадок собирают фильтрованием в вакууме, дважды промывают 5 мл воды и сушат в вакууме при 40°С в течение ночи, при этом получают 3,0 г (выход 88%) 5-метиламиносульфонил-2-оксиндола.

^!Н ЯМР (300 МГц, ДМСО-б₆): δ 10,87 (8, Ьг, 1Н, ХН-1), 7,86 (8, Ьг, 1Н, 5-8О2ЖСН₃), 7,61 (б, 1=7,80 Гц, 1Н, Н-6), 7,32 (б, 1=4,67 Гц, 1Н, Н-

4), 6,97 (б, 1=7,80 Гц, 1Н, Н-7), 2,53 (8, 2Н, СН₂-

3) и 2,36 (8, 3Н, 5-8О₂ЫНСН₃);

МС т/ζ (относительная интенсивность, %) 226 (М, 100).

4- (2-Карбоксиэтил)-2-формил-3-метилпиррол (90,6 мг), 113 мг 5-метиламиносульфонил-2оксиндола и 75 мкл пиперидина в 2 мл этанола нагревают при 95°С в течение 5 ч. Реакционную смесь охлаждают и концентрируют. Остаток суспендируют в 6н. водной соляной кислоте. Осадок фильтруют, промывают водой до рН 6 и сушат в вакуум-сушильном шкафу, при этом получают 163 мг (83%) требуемого соединения в виде твердого вещества желтого цвета.

^!Н ЯМР (360 МГц, ДМСО-бб): δ 13,30 (8, Ьг, 1Н, ЯН-Г), 12,0 (8, уЬг, 1Н, СООН), 11,19 (8, Ьг, 1Н, ХН-1), 8,18 (б, 1=1,64 Гц, 1Н, Н-4), 7,80 (8, 1Н, Н-винил), 7,53 (бб, 1=1,64, 8,17 Гц, 1Н, Н6), 7,23 (б, 1=2,80 Гц, 1Н, Н-2'), 7,13 (ф 1=5,15 Гц, 1Н, ЯНСН,), 7,02 (б, 1=8,17 Гц, 1Н, Н-7),

3,84 (8, 3Н, СООСН₃), 2,66 (1, 1=7,54 Гц, 2Н, СН₂СН₂СООН), 2,47 (1, 1=7,54 Гц, 2Н,

СН₂СН₂СООН), 2,41 (б, 1=5,15 Гц, 3Н, ЖЯ₃),

2,30 (8, 3Н, СН₃); МС т/ζ 390 [М+1]⁺.

Пример 16. 3-{3-[4-(2-Карбоксиэтил)-3-метил-1Н-пиррол-2-илметилен]-2-оксо-2,3-дигидро-1 Н-индол-5-ил}пропионовая кислота.

5- Хлорацетил-2-оксиндол (4,18 г) в 30 мл трифторуксусной кислоты на ледяной бане обрабатывают 4,65 г триэтилсилана и перемешивают при комнатной температуре в течение 3 ч. Смесь выливают в 150 мл воды и осадок собирают фильтрованием в вакууме, промывают 50 мл воды и сушат, при этом получают 2,53 г (выход 65%) 5-(2-хлорэтил)-2-оксиндола в виде твердого вещества красно-коричневого цвета.

Цианид калия (2,0 г) добавляют к 15 мл ДМСО и нагревают при 90°С. При перемешивании добавляют 5-хлорэтил-2-оксиндол (3,0 г), растворенный в 5 мл ДМСО и реакционную смесь нагревают при 150°С в течение 2 ч. Смесь охлаждают, выливают в ледяную воду и осадок собирают фильтрованием в вакууме, промывают водой, сушат, при этом получают неочищенный продукт. Неочищенное вещество подвергают хроматографии на силикагеле с использованием 5% метанола в хлороформе, при этом получают 1,2 г (выход 42%) требуемого соединения.

5-Цианоэтил-2-оксиндол (4,02 г) в 10 мл воды, содержащей 25 мл концентрированной соляной кислоты, кипятят с обратным холодильником в течение 4 ч. Смесь охлаждают, добавляют воду и полученное твердое вещество собирают фильтрованием в вакууме, промывают водой и сушат, при этом получают 1,9 г (выход 44%) 5-карбоксиэтил-2-оксиндола в виде твердого вещества желтого цвета.

¹Н ЯМР (360 МГц, ДМСО-а₆): δ 12,00 (8, Ьг, 1Н, 5-СН₂СН₂СООН), 10,21 (8, 1Н, ΝΗ-1), 7,05 (8, 1Н, Н-4), 6,99 (ά, 1=8,68 Гц, 1Н, Н-6),

6,69 (ά, 1=8,68 Гц, 1Н, Н-7), 3,40 (8, 2Н, СН₂-3),

2,74 (ΐ, 1=7,44 Гц, 2Н, 5-СН₂СН₂СООН), 2,46 (ΐ, 1=7,44 Гц, 2Н, СН₂СН₂СООН).

4- (2-Карбоксиэтил)-2-формил-3-метилпиррол (90,6 мг), 102,6 мг 5-карбоксиэтил-2оксиндола и 75 мкл пиперидина в 2 мл этанола нагревают при 95°С в течение 5 ч. Реакционную смесь охлаждают и концентрируют. Остаток суспендируют в 6н. водной соляной кислоте. Осадок фильтруют, промывают водой до рН 6 и сушат в вакуум-сушильном шкафу в течение ночи. Неочищенный продукт очищают хроматографией на колонке с силикагелем с использованием в качестве элюента смеси этилацетат/гексан/уксусная кислота, при этом получают 121 мг (66%) требуемого соединения в виде твердого вещества желтого цвета.

¹Н ЯМР (360 МГц, ДМСО-а₆): δ 13,30 (ά, 1=2,38 Гц, 1Н, ΝΉ-1’), 12,03 (8, уЬг, 2Н, 2хСООН), 10,68 (8, Ьг, 1Н, ΝΗ-1), 7,63 (8, 1Н, Н-

4), 7,59 (8, 1Н, Н-винил), 7,12 (ά, 1=2,64 Гц, 1Н, Н-2’), 6,96 (άά, 1=1,22, 7,93 Гц, 1Н, Н-6), 6,75 (ά, 1=7,93 Гц, 1Н, Н-7), 2,81 (ΐ, 1=7,75 Гц, 2Н, СН₂СН₂СООН), 2,65 (ΐ, 1=7,75 Гц, 2Н,

СН₂СН₂СООН), 2,55 (ΐ, 1=7,75 Гц, 2Н,

СН₂СН₂СООН), 2,46 (ΐ, 1=7,42 Гц, СН2СН2СООН) и 2,26 (8, 3Н, СН3).

Пример 17. 3-[5-(5-Этил-2-оксо-1,2-дигидроиндол-3-илиденметил)-4-метил-1Н-пиррол-3ил]пропионовая кислота.

2-Оксиндол (3 г) суспендируют в 1,2-дихлорэтане и медленно обрабатывают 3,2 мл ацетилхлорида. Полученную суспензию нагревают при 50°С в течение 5 ч, охлаждают и выливают в воду. Полученный осадок собирают фильтрованием в вакууме, многократно промывают водой и сушат в вакууме, при этом получают 2,9 г (выход 73%) 5-ацетил-2-оксиндола в виде твердого вещества коричневого цвета.

5- Ацетил-2-оксиндол (2 г) в 15 мл трифторуксусной кислоты на ледяной бане медленно обрабатывают 1,8 г триэтилсилана и затем перемешивают при комнатной температуре в течение 5 ч. Добавляют 1 мл триэтилсилана и перемешивание продолжают в течение ночи. Реакционную смесь выливают в ледяную воду и полученный осадок собирают фильтрованием в вакууме, многократно промывают водой и сушат в вакууме, при этом получают 1,3 г (выход 71 %) требуемого соединения в виде твердого вещества желтого цвета.

¹Н ЯМР (360 МГц, ДМСОО: δ 10,25 (8, Ьг, ΝΉ-1), 7,03 (8, 1Н, Н-4), 6,97 (ά, 1=8,05 Гц, 1Н, Н-6), 6,69 (ά, 1=8,05 Гц, 1Н, Н-7), 3,40 (8, 2Н, СН₂-3), 2,51 (ф 1=7,69 Гц, 2Н, СН₂СН₃-5), и 1,12 (ΐ, 1=7,42 Гц, 3Н, СН₂СН₃-5).

4-(2-Карбоксиэтил)-2-формил-3-метилпиррол (90,6 мг), 80,5 мг 5-этил-2-оксиндола и 75 мкл пиперидина в 2 мл этанола нагревают при 95°С в течение 5 ч. Реакционную смесь охлаждают и концентрируют. Остаток суспендируют в 6н. водной соляной кислоте. Осадок фильтруют, промывают водой до рН 6 и сушат в вакуумсушильном шкафу в течение ночи. Неочищенный продукт очищают хроматографией на колонке с силикагелем с использованием в качестве элюента смеси этилацетат/гексан/уксусная кислота, при этом получают 52 мг (32%) требуемого соединения.

¹Н ЯМР (360 МГц, ДМСО-άί,): δ 13,31 (8, Ьг, 1Н, ΝΉ-1’), 12,04 (8, уЬг, 1Н, СООН), 10,66 (8, 1Н, ΝΉ-1), 7,59 (8, 2Н, Н-4, Н-винил), 7,11 (ά, 1=3,29 Гц, 1Н, Н-2'), 6,94 (ά, 1=7,85 Гц, 1Н, Н-6),

6,75 (ά, 1=7,85 Гц, 1Н, Н-7), 2,65 (ΐ, 1=7,66 Гц, 2Н, СН₂СН₂СООН), 2,57 (ф 1=7,83 Гц, 2Н, СН₃СН₂), 2,46 (ΐ, 1=7,66 Гц, СН₂СН₂СООН), 1,20 (ΐ, 1=7,83 Гц, 3Н, СН₃СН₂) и 2,26 (8, 3Н, СН₃);

МС т/ζ 325 [М+1]⁺ .

Пример 18. 3-[5-(5-Метокси-2-оксо-1,2-дигидроиндол-3-илиденметил)-4-метил-1Н-пиррол-3-ил]пропионовая кислота.

4-(2-Карбоксиэтил)-2-формил-3-метилпиррол (90 мг), 82 мг 5-метокси-2-оксиндола и 2 капли пиперидина в 2 мл этанола нагревают при 95°С в течение ночи. Реакционную смесь охлаждают и концентрируют. Остаток суспендируют в 6н. водной соляной кислоте. Осадок фильтруют, промывают водой до рН 6 и сушат в вакуум-сушильном шкафу в течение ночи, при этом получают 110 мг (67%) требуемого соединения в виде твердого вещества коричневого цвета.

¹Н ЯМР (360 МГц, ДМСО-άί,): δ 13,38 (8, Ьг, 1Н, ΝΉ-1’), 12,03 (8, уЬг, 1Н, СООН), 10,57 (8, 1Н, ΝΉ-1), 7,63 (8, 1Н, Н-винил), 7,42 (ά, 1=2,46 Гц, 1Н, Н-4), 7,12 (ά, 1=3,08 Гц, 1Н, Н-2’),

6,74 (ά, 1=8,26 Гц, 1Н, Н-6), 6,75 (άά, 1=2,46, 8,26 Гц, 1Н, Н-7), 3,77 (8, 3Н, ОСН₃), 2,65 (ΐ, 1=7,40 Гц, СН₂СН₂СООН), 2,46 (ΐ, 1=7,40 Гц, 2Н, СН₂СН₂СООН), 2,27 (8, 3Н, СН₃);

МС т/ζ (относительная интенсивность, %) 327 ([М+1]⁺, 100).

Пример 19. 3-[5-(5-Бром-2-оксо-1,2-дигидроиндол-3-илиденметил)-2,4-диметил-1Нпиррол-3-ил]пропионовая кислота.

3-(2-Карбоксиэтил)-2,4-диметил-5-формилпиррол (97,5 мг), 106 мг 5-бром-2-оксиндола и 75 мкл пиперидина в 3 мл этанола нагревают при 95°С в течение 5 ч. Реакционную смесь охлаждают и концентрируют. Остаток суспендируют в 6н. водной соляной кислоте. Осадок фильтруют, промывают водой до рН 6 и сушат в вакуум-сушильном шкафу в течение ночи, при этом получают 171 мг (88%) требуемого соединения в виде твердого вещества оранжевого цвета.

¹Н ЯМР (360 МГц, ДМСО-де): δ 12,04 (8, уЬг, 1Н, СООН), 10,80 (8, Ьг, 1Н, ΝΉ-1), 8,0 (ά, 1=2,06 Гц, 1Н, Н-4), 7,67 (8, 1Н, Н-винил), 7,19 (йй, 1= 2,06, 8,40 Гц, 1Н, Н-6), 6,79 (й, 1=8,40 Гц, 1Н, Н-7), 2,65 (!, 1=7,63 Гц, 2Н, СН₂СН₂СООН),

2,35 (!, 1=7,63 Гц, 2Н, СН₂СН₂СООН), 2,29 (а, 3Н, СН3), 2,27 (а, 3Н, СН3);

МС т/ζ (относительная интенсивность, %) 389 ([М+1]⁺, 100).

Пример 20. 3-[5-(5-Иод-2-оксо-1,2-дигидроиндол-3 -илиденметил)-2,4-диметил-1Н-пиррол-3-ил] пропионовая кислота.

3-(2-Карбоксиэтил)-2,4-диметил-5-формилпиррол (97,5 мг), 130 мг 5-иод-2-оксиндола и 75 мкл пиперидина в 3 мл этанола нагревают при 95°С в течение 5 ч. Реакционную смесь охлаждают и концентрируют. Остаток суспендируют в 6н. водной соляной кислоте. Осадок фильтруют, промывают водой до рН 6 и сушат в вакуум-сушильном шкафу в течение ночи, при этом получают 155 мг (71%) требуемого соединения в виде твердого вещества оранжевого цвета.

'Н ЯМР (360 МГц, ДМСО-й₆): δ 13,41 (а, Ьг, 1Н, ΝΗ-1’), 12,03 (а, Ьг, 1Н, СООН), 10,79 (а, Ьг, 1Н, ΝΗ-1), 8,12 (й, 1=1,70 Гц, 1Н, Н-4), 7,65 (а, 1Н, Н-винил), 7,36 (йй, 1= 1,70, 7,93 Гц, 1Н, Н-6), 6,79 (й, 1=7,93 Гц, 1Н, Н-7), 2,64 (!, 1=7,76 Гц, 2Н, СН₂СН₂СООН), 2,34 (!, 1=7,76 Гц, 2Н, СН2СН2СООН), 2,29 (а, 3Н, СН3), 2,27 (а, 3Н, СН3);

МС т/ζ (относительная интенсивность, %) 437 ([М+1]⁺, 100).

Пример 21. 3-[2,4-Диметил-5-(4-метил-2оксо-1,2-дигидроиндол-3-илиденметил)-1Н-пиррол-3-ил] пропионовая кислота.

3-(2-карбоксиэтил)-2,4-диметил-5-формилпиррол (97,5 мг), 74 мг 4-метил-2-оксиндола и 75 мкл пиперидина в 3 мл этанола нагревают при 95°С в течение 5 ч. Реакционную смесь охлаждают и концентрируют. Остаток суспендируют в 6н. водной соляной кислоте. Осадок фильтруют, промывают водой до рН 6 и сушат в вакуум-сушильном шкафу в течение ночи, при этом получают 60 мг (37%) требуемого соединения в виде твердого вещества зеленого цвета.

¹Н ЯМР (360 МГц, ДМСО-й6): δ 13,41 (а, Ьг, 1Н, ЫН-1’), 12,03 (а, Ьг, 1Н, СООН), 10,72 (а, Ьг, 1Н, ΝΉ-1), 7,50 (а, 1Н, Н-винил), 7,01 (!, 1=

7,82 Гц, 1Н, Н-6), 6,79 (й, 1=7,82 Гц, Н-5), 6,74 (й, 1=7,82 Гц, 1Н, Н-7), 2,64 (!, 1=7,76 Гц, 2Н, СН₂СН₂СООН), 2,56 (а, 3Н, СН₃), 2,34 (!, 1=7,76 Гц, 2Н, СН₂СН₂СООН), 2,29 (а, 3Н, СН₃), 2,18 (а, 3Н, СН3);

МС т/ζ (относительная интенсивность, %) 325 ([М+1]⁺, 100).

Пример 22. 3-[2,4-Диметил-5-(5-метил-2оксо-1,2-дигидроиндол-3-илиденметил)-1Н-пиррол-3-ил] пропионовая кислота.

3-(2-Карбоксиэтил)-2,4-диметил-5-формилпиррол (97,5 мг), 74 мг 5-метил-2-оксиндола и 75 мкл пиперидина в 3 мл этанола нагревают при 95°С в течение 5 ч. Реакционную смесь охлаждают и концентрируют. Остаток суспенди руют в 6н. водной соляной кислоте. Осадок фильтруют, промывают водой до рН 6 и сушат в вакуум-сушильном шкафу в течение ночи, при этом получают 104 мг (64%) требуемого соединения в виде твердого вещества желтого цвета.

¹Н ЯМР (360 МГц, ДМСО-й6): δ 13,38 (а, Ьг, 1Н, ЫН-1’), 12,02 (а, Ьг, 1Н, СООН), 10,57 (а, Ьг, 1Н, ЫН-1),7,52 (а, Ьг, 1Н, Н-4), 7,50 (а, 1Н, Нвинил), 6,87 (й, 1=7,86 Гц, 1Н, Н-6), 6,73 (й, 1=7,86 Гц, 1Н, Н-7), 2,63 (!, 1=7,49 Гц, 2Н, СН₂СН₂СООН), 2,34 (!, 1=7,49 Гц, 2Н, СН2СН2СООН), 2,29 (а, 3Н, СН3), 2,28 (а, 3Н, СН3), 2,24 (а, 3Н, СН3);

МС т/ζ (относительная интенсивность, %) 325 ([М+1]⁺, 66).

Пример 23. 3-[5-(6-Гидрокси-2-оксо-1,2дигидроиндол-3 -илиденметил)-2,4-диметил-1Нпиррол-3-ил]пропионовая кислота.

3,26 г 6-Метокси-2-оксиндола в 60 мл дихлорметана охлаждают до -2°С и по каплям добавляют 40 мл 1М раствора трибромида бора в дихлорметане. Реакционную смесь перемешивают на ледяной бане в течение 1 ч и затем при комнатной температуре в течение 1 ч. Смесь выливают в ледяную воду и экстрагируют этилацетатом. Органический слой промывают водой и солевым раствором, сушат над безводным сульфатом натрия, концентрируют и полученный осадок фильтруют, затем сушат в вакуумсушильном шкафу в течение ночи, при этом получают 2,56 г 6-гидрокси-2-оксиндола (выход 86%).

¹Н ЯМР (360 МГц, ДМСО-й6): δ 10,13 (а, 1Н, ЯН-1), 9,22 (а, 1Н, ОН-6), 6,93 (й, 1=7,76 Гц, 1Н, Н-4), 6,27-6,31 (т, 2Н, Н-5,7) и 3,29 (а, 2Н, СН2-3);

МС т/ζ 150 [М+1]⁺.

3-(2-Карбоксиэтил)-2,4-диметил-5-формилпиррол (82 мг), 63 мг 6-гидрокси-2оксиндола и 48 мкл пиперидина в 2 мл этанола нагревают при 90°С в течение 2 дней. Реакционную смесь охлаждают и концентрируют, и очищают хроматографией на колонке с силикагелем, с использованием в качестве элюента смеси этилацетат/гексан/уксусная кислота, при этом получают 55 мг (40%) требуемого соединения в виде твердого вещества темнокоричневого цвета.

¹Н ЯМР (360 МГц, ДМСО-й6): δ 13,10 (а, Ьг, 1Н, ЫН-1’), 12,0 (а, уЬг, 1Н, СООН), 10,51 (а, Ьг, 1Н, ЯН-1), 9,41 (а, 1Н, ОН), 7,44 (й, 1=7,83 Гц, 1Н, Н-4), 7,29 (а, 1Н, Н-винил), 6,37 (йй, 1=2,16, 7,83 Гц, 1Н, Н-5), 6,33 (й, 1=2,16 Гц, 1Н, Н-7), 2,62 (!, 1=7,75 Гц, 2Н, СН₂СН₂СООН), 2,32 (!, 1=7,75 Гц, 2Н, СН₂СН₂СООН), 2,25 (а, 3Н, СН3), 2,20 (а, 3Н, СН3);

МС т/ζ 325 ([М+1]⁺, 100).

Пример 24. 3-[5-(6-Метокси-2-оксо-1,2-дигидроиндол-3-илиденметил)-2,4-диметил-1Нпиррол-3-ил]пропионовая кислота.

3- (2-Карбоксиэтил)-2,4-диметил-5-фор- милпиррол (97,5 мг), 82 мг 6-метокси-2оксиндола и 2 капли пиперидина в 2 мл этанола нагревают при 95°С в течение ночи. Реакционную смесь охлаждают и концентрируют. Остаток суспендируют в 2н. водной соляной кислоте. Осадок фильтруют, промывают водой до рН 6 и сушат в вакуум-сушильном шкафу в течение ночи, при этом получают 130 мг (76%) требуемого соединения в виде твердого вещества желтого цвета.

Ή ЯМР(360 МГц, ДМСО-б₆): δ 13,15 (8, Ьг, 1Н, ΝΗ-1’), 11,75 (8, уЬг, 1Н, СООН), 10,65 (8, Ьг, 1Н, N^1), 7,58 (б, 1=8,27 Гц, 1Н, Н-4), 7,29 (8, 1Н, Н-винил), 6,37 (бб, 1=2,26, 8,27 Гц, 1Н, Н-

5), 6,33 (б, 1=2,26 Гц, 1Н, Н-7), 3,74 (8, 3Н, ОСН₃), 2,62 (ί, 1=7,67 Гц, 2Н, СН₂СН₂СООН), 2,33 (ί, 1=7,67 Гц, 2Н, СН₂СН₂СООН), 2,26 (8, 3Н, СН3), 2,22 (8, 3Н, СН3);

МС т/ζ (относительная интенсивность, %) 341 ([М+1]⁺, 100).

Пример 25. 3-[5-(6-Гидрокси-2-оксо-1,2дигидроиндол-3 -илиденметил)-4-метил-1Н-пиррол-3-ил] пропионовая кислота.

4- (2-Карбоксиэтил)-2-формил-3-метилпиррол (543 мг), 450 мг 6-гидрокси-2-оксиндола и 450 мкл пиперидина в 10 мл этанола нагревают при 90°С в течение ночи. Реакционную смесь охлаждают и концентрируют. Остаток суспендируют в 2н. водной соляной кислоте. Осадок фильтруют, промывают водой до рН 6 и сушат в вакуум-сушильном шкафу в течение ночи, при этом получают твердое вещество коричневого цвета.

¹Н ЯМР (360 МГц, ДМСО-б6): δ 13,05 (8, Ьг, 1Н, N^1’), 10,60 (8, Ьг, 1Н, N^1), 9,4 (8, 1Н, ОН), 7,49 (б, 1=8,08 Гц, 1Н, Н-4), 7,35 (8, 1Н, Нвинил), 7,02 (б, 1=3,22 Гц, 1Н, Н-2’), 6,38 (бб, 1=2,28, 8,08 Гц, 1Н, Н-5), 6,32 (б, 1=2,28 Гц, 1Н, Н-7), 2,62 (ί, 1=7,67 Гц, 2Н, СН₂СН₂СООН), 2,44 (ί, 1=7,67 Гц, 2Н, СН₂СН₂СООН) и 2,21 (8, 3Н, СН3);

МС т/ζ (относительная интенсивность, %) 313 ([М+1]⁺, 60).

Пример 26. 3,5-Диметоксибензиловый эфир 3-[5-(6-гидрокси-2-оксо-1,2-дигидроиндол3-илиденметил)-4-метил-1Н-пиррол-3-ил]пропионовой кислоты.

3-[5-(6-Гидрокси-2-оксо-1,2-дигидроин дол-3 -илиденметил)-4-метил-1Н-пиррол-3-ил] пропионовую кислоту (100 мг), 56 мг 3,5-диметоксибензилхлорида и 207 мг карбоната калия в 2 мл безводного диметилформамида нагревают при 90°С в течение ночи. Реакционную смесь охлаждают, выливают в воду и экстрагируют этилацетатом. Органический слой промывают водой и солевым раствором, сушат над безводным сульфатом натрия и концентрируют. Неочищенный продукт очищают хроматографией на колонке с силикагелем с использованием в качестве элюента смеси этилацетат/гексан/ук сусная кислота, при этом получают 39 мг требуемого соединения в виде твердого вещества коричневого цвета.

¹Н ЯМР (360 МГц, ДМСО-б6): δ 13,06 (8, Ьг, 1Н, N^1’), 10,60 (8, Ьг, 1Н, 1МН-1), 9,4 (8, Ьг, 1Н, ОН), 7,49 (б, 1=8,03 Гц, 1Н, Н-4), 7,35 (8, 1Н, Н-винил), 7,01 (б, 1=3,08 Гц, 1Н, Н-2’), 6,47 (б, 1=2,29 Гц, 2Н, ароматический), 6,42 (ί, 1=2,29 Гц, 1Н, ароматический), 6,38 (бб, 1=2,15, 8,03 Гц, 1Н, Н-5), 6,33 (б, 1=2,15 Гц, 1Н, Н-7), 5,01 (8, 2Н, СН₂-РЬ), 3,70 (8, 6Н, 2хОСН₃), 2,59-2,72 (т, 4Н, СН₂СН₂СООН), и 2,20 (8, 3Н, СН₃).

Пример 27. 3-{5-[6-(3-Метоксифенил)-2оксо-1,2-дигидроиндол-3-илиденметил]-2,4-диметил-1Н-пиррол-3-ил}пропионовая кислота.

Тетракис(трифенилфосфин)палладий (0,7 г) добавляют к смеси 5 г 3-метоксифенилборной кислоты, 3,8 г 5-бром-2-фторнитробензола и 11 мл 2М раствора карбоната натрия в 100 мл толуола. Смесь кипятят с обратным холодильником в течение 2 ч, разбавляют водой и экстрагируют этилацетатом. Этилацетат промывают насыщенным раствором бикарбоната натрия и солевым раствором, затем сушат и концентрируют, при этом получают маслообразное твердое вещество. Твердое вещество хроматограф и руют на силикагеле с использованием смеси этилацетат/гексан 1:6, при этом получают 4,3 г (выход 77%) 4-фтор-3'-метокси-3-нитробифенила.

Диметилмалонат (9,7 мл) по каплям добавляют к 2,0 г гидрида натрия, суспендированного в 50 мл ДМСО. Смесь нагревают при 100°С в течение 35 мин и охлаждают до комнатной температуры. Затем добавляют 4-фтор-2'-метокси-

3-нитробифенил (4,2 г) в 50 мл ДМСО и смесь нагревают при 100°С в течение 1 ч. Реакционную смесь охлаждают и гасят 300 мл насыщенного раствора хлорида аммония и дважды экстрагируют этилацетатом. Экстракты объединяют, промывают солевым раствором, сушат над безводным сульфатом натрия, концентрируют, при этом получают неочищенный диметиловый эфир 3'-метокси-3-нитробифенил-4-малоновой кислоты в виде твердого вещества светложелтого цвета.

Неочищенный диметил 3'-метокси-3нитробифенил-4-малонат нагревают при 110°С в 45 мл 6н. соляной кислоты в течение 4 дней и охлаждают. Осадок собирают фильтрованием, промывают водой и гексаном, сушат, при этом получают 5,3 г 3'-метокси-32-нитробифенил-4уксусной кислоты в виде твердого вещества желто-коричневого цвета.

3'-Метокси-3-нитробифенил-4-уксусную кислоту (5,2 г) растворяют в метаноле и гидрируют в присутствии 0,8 г 10% палладия на угле в течение 3 ч при комнатной температуре. Катализатор удаляют фильтрованием, промывают метанолом, фильтраты объединяют и концентрируют, при этом получают твердое вещество коричневого цвета. Твердое вещество хромато графируют на силикагеле в смеси этилацетат/гексан/уксусная кислота (33:66:1), при этом получают 3,0 г (выход 75% от 4-фтор-3'метокси-3-нитробифенила) 6-(3-метоксифенил)2-оксиндола в виде твердого вещества розового цвета.

'Н ЯМР (360 МГц, ДМСО-й₆): δ 10,39 (8, Ьг, 1Н, ΝΗ), 7,35 (1, 1=7,85 Гц, 1Н), 7,26 (ά, 1=7,78 Гц, 1Н), 7,19 (άά, 1=1,22, 7,8 Гц, 1Н),

7,13-7,16 (т, 1Н), 7,09-7,1 (т, 1Н), 7,01 (ά, 1=1,48 Гц, 1Н), 6,90-6,93 (т, 1Н), 3,8 (8, 3Н, ОСН₃), 3,49 (8, 2Н, СН2);

МС т/ζ (относительная интенсивность, %) 240,0 ([М+1]⁺, 100).

3-(2-Карбоксиэтил)-2,4-диметил-5-формилпиррол (117 мг), 120 мг 6-(3-метоксифенил)2-оксиндола и 3 капли пиперидина в 3 мл этанола нагревают при 90°С в течение ночи. Реакционную смесь охлаждают и концентрируют. Остаток суспендируют в 6н. водной соляной кислоте. Осадок фильтруют, промывают водой до рН 6 и сушат в вакуум-сушильном шкафу в течение ночи, при этом получают 190 мг (91%) требуемого соединения в виде твердого вещества коричневого цвета.

'Н ЯМР (360 МГц, ДМСО-ά^): δ 13,38 (8, Ьг, 1Н, ΝΗ-1'), 12,04 (8, Ьг, 1Н, СООН), 10,79 (8, Ьг, 1Н, ЫН-1), 7,77 (ά, 1=8,05 Гц, 1Н, Н-4), 7,58 (8, 1Н, Н-винил), 7,27 (άά, 1=1,49, 8,05 Гц, 1Н, Н-

5), 7,09 (ά, 1=1,49 Гц, 1Н, Н-7), 6,89-7,59 (пл, 4Н), 3,81 (8, 3Н, ОСН₃), 2,65 (1, 1=7,62 Гц, 2Н, СН₂СН₂СООН), 2,35 (1, 1=7,62 Гц, 2Н,

СН2СН2СООН), 2,30 (8, 3Н, СН3) и 2,27 (8, 3Н, СН3);

МС т/ζ (относительная интенсивность, %) 417 ([М+1]⁺, 75).

Пример 28. 3-[5-(6-Бром-2-оксо-1,2-дигидроиндол-3 -илиденметил)-4-метил-1Н-пиррол-3ил]пропионовая кислота.

Диметилмалонат (13 мл) по каплям добавляют к 2,7 г гидрида натрия, суспендированного в 20 мл ДМСО. Смесь нагревают при 100°С в течение 10 мин и затем охлаждают до комнатной температуры. Добавляют 5-бром-2-фторнитробензол (5,0 г) в 25 мл ДМСО и смесь нагревают при 100°С в течение 2 ч. Реакционную смесь охлаждают и гасят 300 мл насыщенного раствора хлорида аммония и трижды экстрагируют этилацетатом. Экстракты объединяют, промывают насыщенным раствором хлорида аммония, водой и солевым раствором, сушат над безводным сульфатом натрия и концентрируют, при этом получают неочищенный диметиловый эфир 4-бром-2-нитрофенилмалоновой кислоты в виде масла светло-желтого цвета.

Неочищенный диметиловый эфир 4-бром2-нитрофенилмалоновой кислоты нагревают при 110°С в 40 мл 6н. соляной кислоты в течение 24 ч и охлаждают. Осадок собирают фильтрованием, промывают водой и сушат, при этом получают 5,3 г (выход 89%) 4-бром-2-нитро фенилуксусной кислоты в виде твердого вещества грязно-белого цвета.

4-Бром-2-нитрофенилуксусную кислоту (0,26 г), 0,26 г порошкообразного цинка и 3 мл 50% серной кислоты в 5 мл этанола нагревают при 100°С в течение ночи. Реакционную смесь фильтруют, разбавляют небольшим количеством уксусной кислоты, концентрируют для удаления этанола, разбавляют водой и экстрагируют дважды этилацетатом. Объединенные экстракты промывают солевым раствором, сушат над безводным сульфатом натрия и концентрируют, при этом получают 0,19 г (выход 90%) 6бром-2-оксиндола в виде твердого вещества желтого цвета.

' Н ЯМР (360 МГц, ДМСО^₆): δ 10,45(8, Ьг, 1Н, ЫН-1), 7,14 (ά, 1=7,89 Гц, 1Н, Н-4), 7,09 (άά, 1=1,53, 7,89 Гц, 1Н, Н-5), 6,93 (ά, 1=1,53 Гц, 1Н, Н-7) и 3,43 (8, 2Н, СН₂-3);

МС т/ζ (относительная интенсивность, %) 210 ([М-2]⁺, 100) и 212 (М⁺, 100).

4-(2-Карбоксиэтил)-2-формил-3-метилпиррол (90 мг), 106 мг 6-бром-2-оксиндола и 3 капли пиперидина в 3 мл этанола нагревают при 90°С в течение 4 ч. Реакционную смесь охлаждают и концентрируют. Остаток суспендируют в 6н. водной соляной кислоте. Осадок фильтруют, промывают водой до рН 6 и сушат в вакуумсушильном шкафу в течение ночи, при этом получают 172 мг (92%) требуемого соединения в виде твердого вещества желтого цвета.

'Н ЯМР (360 МГц, ДМСО^₆): δ 13,22 (8, Ьг, 1Н, ЫН-Г), 12,04 (8, Ьг, 1Н, СООН), 10,92 (8, Ьг, 1Н, ЫН-1), 7,73 (ά, 1=8,37 Гц, 1Н, Н-4), 7,67 (8, 1Н, Н-винил), 7,18 (ά, 1=3,22 Гц, 1Н, Н-2’),

7,14 (άά, 1=1,33, 8,37 Гц, 1Н, Н-5), 6,99 (ά, 1=1,33 Гц, 1Н, Н-7), 2,64 (1, 1=7,39 Гц, 2Н,

СН₂СН₂СООН), 2,46 (1, 1=7,39 Гц, 2Н,

СН2СН2СООН), 2,25 (8, 3Н, СН3);

МС (АРС1) т/ζ 375,0 [М+1]⁺.

Пример 29. 3-{5-[6-(3-Метоксифенил)-2оксо-1,2-дигидроиндол-3-илиденметил]-4-метил-1Н-пиррол-3 -ил}пропионовая кислота.

4-(2-Карбоксиэтил)-2-формил-3-метилпиррол (90,5 мг), 120 мг 6-(3-метоксифенил)-2оксиндола и 3 капли пиперидина в 3 мл этанола нагревают при 90°С в течение ночи. Реакционную смесь охлаждают и концентрируют. Остаток суспендируют в 6 н. водной соляной кислоте. Осадок фильтруют, промывают водой до рН 6 и сушат в вакуум-сушильном шкафу, при этом получают 195 мг (97%) требуемого соединения в виде твердого вещества коричневого цвета.

'Н ЯМР (360 МГц, ДМСО-де): δ 13,29 (8, Ьг, 1Н, ЫН-1'), 12,07 (8, Ьг, 1Н, СООН), 10,88 (8, Ьг, 1Н, ЫН-1), 7,82 (ά, 1=7,77 Гц, 1Н, Н-4), 7,65 (8, 1Н, Н-винил), 7,27 (άά, 1=1,41, 7,77 Гц, 1Н, Н5), 7,09 (ά, 1=1,41, 1Н, Н-7), 6,89-7,36 (т, 5Н),

3,82 (8, 3Н, ОСН₃), 2,65 (1, 1=7,55 Гц, 2Н, СН₂СН₂СООН), 2,47 (1, 1=7,55 Гц, 2Н,

СН2СН2СООН), 2,27 (8, 3Н, СН3);

МС (АРС1) т/ζ 401 [М-1]⁺.

Пример 30. 3-{5-[6-(3-Этоксифенил)-2-оксо-1,2-дигидроиндол-3-илиденметил]-2,4-диметил-1Н-пиррол-3-ил}пропионовая кислота.

Тетракис(трифенилфосфин)палладий (0,8 г) добавляют к смеси 4,2 г 3-этоксифенилборной кислоты, 5,0 г 5-бром-2-фторнитробензола и 22 мл 2М раствора карбоната натрия в 50 мл толуола и 50 мл этанола. Смесь кипятят с обратным холодильником в течение 2 ч, концентрируют, добавляют воду и смесь дважды экстрагируют этилацетатом. Слой этилацетата промывают водой и солевым раствором, затем сушат и концентрируют. Остаток хроматографируют на силикагеле (5% этилацетата в гексане), при этом получают 5,3 г (выход 90%) неочищенного 4фтор-3'-этокси-3-нитробифенила в виде масла желтого цвета.

Диметилмалонат (11,4 мл) по каплям добавляют к 4,0 г гидрида натрия, суспендированного в 20 мл ДМСО. Смесь нагревают при 100°С в течение 10 мин и затем охлаждают до комнатной температуры. Затем добавляют неочищенный 4-фтор-3'-этокси-3-нитробифенил (5,3 г) в 25 мл ДМСО и смесь нагревают при 100°С в течение 2 ч. Реакционную смесь охлаждают и гасят 300 мл насыщенного раствора хлорида аммония и трижды экстрагируют этилацетатом. Экстракты объединяют, промывают водой и солевым раствором и затем сушат над безводным сульфатом натрия и концентрируют, при этом получают неочищенный диметиловый эфир 3'-этокси-3-нитробифенил-4-малоновой кислоты в виде масла желтого цвета.

Неочищенный диметиловый эфир 3’этокси-3-нитробифенил-4-малоновой кислоты нагревают при 100°С в 60 мл 6н. соляной кислоты в течение 4 дней и охлаждают. Осадок собирают фильтрованием, промывают водой и гексаном, сушат, при этом получают 4,7 г (выход 77% от 5-бром-2-фторнитробензола) неочищенной 3'-этокси-3-нитробифенил-4-уксусной кислоты в виде твердого вещества светлого желтокоричневого цвета.

Стружку железа (2,4 г) добавляют одной порцией к 4,6 г 3'-этокси-3-нитробифенил-4уксусной кислоты в 40 мл ледяной уксусной кислоты и кипятят с обратным холодильником в течение 2 ч. Реакционную смесь концентрируют досуха, несколько раз обрабатывают этилацетатом и фильтруют для удаления нерастворимых веществ. Фильтрат дважды промывают 1н. соляной кислотой и солевым раствором и затем сушат над безводным сульфатом натрия, концентрируют, при этом получают 3,5 г (выход 91%) 6-(3-этоксифенил)-2-оксиндола в виде твердого вещества светло-коричневого цвета.

Ή ЯМР (360 МГц, ДМСО-а₆): δ 10,4 (к, Ьг, 1Н, ΝΗ), 7,33 (1, 1=8,4 Гц, 1Н, Н-3'), 7,35 (а, 1=7,77 Гц, 1Н), 7,19 (аа, 1=1,3, 7,66 Гц, 1Н), 7,13 (а, 1=7,69 Гц, 1Н), 7,07-7,08 (ш, 1Н), 7,0 (к, Ьг, 1Н), 6,9 (аа, 1=2,82, 8,08 Гц, 1Н), 4,08 (д, 1=7 Гц,

2Н, ОЕ1), 3,49 (к, 2Н, СН₂), 1,34 (1, 1=7 Гц, 3Н, ОЕ1);

МС т/ζ (относительная интенсивность, %)

254,2 ([М+1]⁺, 100).

3- (2-Карбоксиэтил)-2,4-диметил-5-формилпиррол (97,6 мг), 127 мг 6-(3-этоксифенил)2-оксиндола и 2 капли пиперидина в 2 мл этанола нагревают при 90°С в течение ночи. Реакционную смесь охлаждают и концентрируют. Остаток суспендируют в 6н. водной соляной кислоте. Осадок фильтруют, промывают водой до рН 6 и сушат в вакуум-сушильном шкафу в течение ночи, при этом получают 227 мг (выход приблизительно 100%) требуемого соединения в виде твердого вещества коричневого цвета.

¹Н ЯМР (360 МГц, ДМСО-а6): δ 13,38 (к, Ьг, 1Н, N4-1’), 12,06 (к, Ьг, 1Н, СООН), 10,81 (к, Ьг, 1Н, ΝΉ-1), 7,77 (а, 1=7,97 Гц, 1Н, Н-4), 7,58 (к, 1Н, Н-винил), 7,26 (аа, 1=1,35, 7,97 Гц, 1Н, Н5), 7,08 (а, 1=1,35 Гц, 1Н, Н-7), 6,87-7,36 (т, 4Н), 4,09 (ф 1=7,0 Гц, 2Н, СН₃СН₂), 2,65 (1, 1=7,54 Гц, 2Н, СН₂СН₂СООН), 2,47 (1, 1=7,54 Гц, 2Н, СН2СН2СООН), 2,30 (к, 3Н, СН3), 2,26 (к, 3Н, СН₃), 1,34 (1, 1=7,0 Гц, 3Н, СН₃СН₂);

МС т/ζ (относительная интенсивность, %) 431 ([М+1]⁺, 21).

Пример 31. 3-{5-[6-(3-Этоксифенил)-2-оксо-1,2-дигидроиндол-3-илиденметил]-4-метил1Н-пиррол-3-ил}пропионовая кислота.

4- (2-Карбоксиэтил)-2-формил-3-метилпиррол (90,5 мг), 127 мг 6-(3-этоксифенил)-2оксиндола и 2 капли пиперидина в 2 мл этанола нагревают при 90°С в течение ночи. Реакционную смесь охлаждают и концентрируют. Остаток суспендируют в 6н. водной соляной кислоте. Осадок фильтруют, промывают водой до рН 6 и сушат в вакуум-сушильном шкафу, при этом получают 200 мг (96%) требуемого соединения в виде твердого вещества коричневого цвета.

¹Н ЯМР (360 МГц, ДМСО-а6): δ 13,29 (к, Ьг, 1Н, ΝΉ-1'), 12,07 (к, уЬг, 1Н, СООН), 10,88 (к, Ьг, 1Н, ΝΉ-1), 7,82 (а, 1=7,97 Гц, 1Н, Н-4), 7,65 (к, 1Н, Н-винил), 7,28 (аа, 1=1,20, 7,97 Гц, 1Н, Н5), 7,08 (а, 1=1,20 Гц, 1Н, Н-7), 6,87-7,36 (т, 5Н), 4,09 (ф 1=6,98 Гц, 2Н, СН₃СН₂), 2,65 (1, 1=7,47 Гц, 2Н, СН₂СН₂СООН), 2,47 (1, 1=7,47 Гц, 2Н, СН₂СН₂СООН), 2,27 (к, 3Н, СН₃), 1,34 (1, 1=6,98 Гц, 3Н, СН3СН2).

Пример 32. 3-[2,4-Диметил-5-(2-оксо-6фенил-1,2-дигидроиндол-3 -илиденметил)-1Нпиррол-3-ил] пропионовая кислота.

Тетракис(трифенилфосфин)палладий (0,8 г) добавляют к смеси 3,1 г бензолборной кислоты, 5 г 5-бром-2-фторнитробензола и 22 мл 2М раствора карбоната натрия в 50 мл толуола и 50 мл этанола. Смесь кипятят с обратным холодильником в течение 2 ч, концентрируют, остаток экстрагируют дважды этилацетатом. Слой этилацетата промывают водой и солевым раствором, затем сушат и концентрируют, при этом получают масло желтого цвета. Масло хромато графируют на силикагеле с использованием 5% этилацетата в гексане, при этом получают 4,75 г (выход 96%) 4-фтор-3-нитробифенила в виде масла желтого цвета.

Диметилмалонат (10 мл) в 25 мл ДМСО по каплям добавляют к 3,5 г гидрида натрия, суспендированного в 25 мл ДМСО, и смесь нагревают при 100°С в течение 10 мин. Смесь охлаждают до комнатной температуры и добавляют

4,7 г 4-фтор-3-нитробифенила в 25 мл ДМСО. Смесь нагревают при 100°С в течение 2 ч, охлаждают и гасят 300 мл насыщенного раствора хлорида аммония. Смесь экстрагируют трижды этилацетатом и объединенные органические слои промывают водой и солевым раствором, упаривают, при этом получают неочищенный диметиловый эфир 3-нитробифенил-4малоновой кислоты в виде масла желтого цвета.

Неочищенный диметиловый эфир 3-нитробифенил-4-малоновой кислоты кипятят с обратным холодильником в 30 мл 6н. соляной кислоты в течение 24 ч. Осадок собирают фильтрованием, промывают водой и сушат, при этом получают 4,5 г (выход 80% от 4-фтор-3нитробифенила) 3-нитробифенил-4-уксусной кислоты в виде твердого вещества кремового цвета.

Железную стружку (2,6 г) добавляют одной порцией к 4,5 г 3-нитробифенил-4-уксусной кислоты в 40 мл уксусной кислоты. Смесь кипятят с обратным холодильником в течение 2 ч, упаривают досуха и обрабатывают этилацетатом. Твердое вещество удаляют фильтрованием и фильтрат дважды промывают 1н. раствором соляной кислоты и солевым раствором, а затем сушат над безводным сульфатом натрия. Фильтрат концентрируют, при этом получают 3,4 г (выход 93%) 6-фенил-2-оксиндола в виде твердого вещества светло-коричневого цвета.

'Н ЯМР (360 МГц, ΌΜ8Θ-ά₆): δ 10,4 (к, Ыг, 1Н, ΝΗ-1), 7,57-7,6 (т, 2Н), 7,42-7,46 (т, 2Н),

7,32-7,37 (т, 1Н), 7,27 (б, 1=7,7 Гц, 1Н, Н-4),

7,19 (бб, 1=1,6, 7,7 Гц, 1Н, Н-5), 7,01 (б, 1=1,6 Гц, 1Н, Н-7), 3,49 (к, 2Н, СН₂);

МС т/ζ (относительная интенсивность, %) 210 ([М+1]⁺, 100).

3-(2-Карбоксиэтил)-2,4-диметил-5-формилпиррол (97,6 мг), 105 мг 6-фенил-2оксиндола и 2 капли пиперидина в 2 мл этанола нагревают при 90°С в течение ночи. Затем реакционную смесь охлаждают и концентрируют. Остаток суспендируют в 6н. водном растворе соляной кислоты. Осадок отфильтровывают, промывают водой до рН 6 и сушат в вакуумсушильном шкафу в течение ночи, при этом получают 138 мг (71%) требуемого соединения в виде твердого вещества коричневого цвета.

'Н ЯМР (360 МГц, ΌΜ8Θ-6₆): δ 13,38 (к, Ыг, 1Н, ΝΉ-1’), 12,05 (к, Ыг, 1Н, СООН), 10,81 (к, Ыг, 1Н, ΝΉ-1), 7,78 (б, 1=7,84 Гц, 1Н, Н-4), 7,58 (к, 1Н, Н-винил), 7,25-7,63 (т, 6Н), 7,09 (к, Ыг,

1Н, Н-7), 2,64 (!, 1=7,71 Гц, 2Н, СН₂СН₂СООН),

2,35 (!, 1=7,71 Гц, 2Н, СН₂СН₂СООН), 2,30 (к, 3Н, СН₃), и 2,26 (к, 3Н, СН₃);

МС т/ζ (относительная интенсивность, %) 387 ([М+1]⁺, 100).

Пример 33. 3-[4-Метил-5-(2-оксо-6-фенил1,2-дигидроиндол-3 -илиденметил)-1Н-пиррол-3ил] пропионовая кислота.

4-(2-Карбоксиэтил)-2-формил-3-метилпиррол (90,5 мг), 105 мг 6-фенил-2-оксиндола и 2 капли пиперидина в 2 мл этанола нагревают при 90°С в течение ночи. Затем реакционную смесь охлаждают и концентрируют. Остаток суспендируют в 6 н. водном растворе соляной кислоты. Осадок отфильтровывают, промывают водой до рН 6 и сушат в вакуум-сушильном шкафу в течение ночи, при этом получают 146 мг (78%) требуемого соединения в виде твердого вещества коричневого цвета.

'Н ЯМР (360 МГц, ОМ8О-б₆): δ 13,29 (к, Ыг, 1Н, ΝΉ-1’), 12,01 (к, уЫг, 1Н, СООН), 10,89 (к, Ыг, 1Н, ΝΉ-1), 7,83 (б, 1=7,92 Гц, 1Н, Н-4),

7,65 (к, 1Н, Н-винил), 7,30-7,65 (т, 5Н), 7,16 (б, 1=2,83 Гц, 1Н, Н-2’), 7,28 (бб, 1=1,58, 7,92 Гц, 1Н, Н-5), 7,09 (б, 1=1,58 Гц, 1Н, Н-7), 2,66 (!, 1=7,76 Гц, 2Н, СН₂СН₂СООН), 2,45 (!, 1=7,76 Гц, 2Н, СН₂СН₂СООН) и 2,27 (к, 3Н, СН₃);

МС т/ζ (относительная интенсивность, %) 373 ([М+1]⁺, 100).

Пример 34. 3-{5-[6-(4-Метоксифенил)-2оксо-1,2-дигидроиндол-3-илиденметил]-4-метил-1Н-пиррол-3 -ил}пропионовая кислота.

Тетракис(трифенилфосфин)палладий (1 г) добавляют к смеси 5 г 4-метоксифенилборной кислоты, 6,6 г 5-бром-2-фторнитробензола и 30 мл 2М раствора карбоната натрия в 50 мл толуола и 50 мл этанола. Смесь кипятят с обратным холодильником в течение 2 ч, концентрируют и остаток дважды экстрагируют этилацетатом. Слой этилацетата промывают водой и солевым раствором, сушат и концентрируют, получают маслообразное твердое вещество коричневого цвета. Это вещество очищают хроматографией на силикагеле с использованием 5% этилацетата в гексане, при этом получают неочищенный 4-фтор-4'-метокси-3-нитробифенил в виде твердого вещества светло-желтого цвета.

Диметилмалонат (10 мл) добавляют по каплям к 2,0 г гидрида натрия, суспендированного в 60 мл диметилсульфоксида. Смесь нагревают при 100°С в течение 10 мин и затем охлаждают до комнатной температуры. Добавляют неочищенный 4-фтор-2'-метокси-3-нитробифенил (5,2 г) в 50 мл диметилсульфоксида и смесь нагревают при 100°С в течение 2 ч. Затем реакционную смесь охлаждают, гасят 300 мл насыщенного раствора хлористого аммония и три раза экстрагируют этилацетатом. Экстракты объединяют, промывают насыщенным раствором хлористого аммония, водой и солевым раствором, сушат над безводным сульфатом натрия и концентрируют, при этом получают неочищенный диметиловый эфир 4'-метокси-3-нитробифенил4-малоновой кислоты в виде масла желтого цвета.

Неочищенный диметиловый эфир 4'метокси-3-нитробифенил-4-малоновой кислоты нагревают при 100°С в 60 мл 6н. соляной кислоты в течение 15 ч и охлаждают. Полученный осадок собирают фильтрованием, промывают водой и гексаном, сушат, при этом получают 7,2 г неочищенной 4'-метокси-3-нитробифенил-4уксусной кислоты в виде твердого вещества светлого желто-коричневого цвета.

Железную стружку (3,6 г) добавляют одной порцией к 7,2 г 4'-метокси-3-нитробифенил4-уксусной кислоты в 40 мл ледяной уксусной кислоты и нагревают при 100°С в течение ночи. Реакционную смесь упаривают досуха, обрабатывают ультразвуком в этилацетате и удаляют нерастворимые вещества. Фильтрат дважды промывают 1н. раствором соляной кислоты, солевым раствором, а затем сушат над безводным сульфатом натрия и концентрируют, при этом получают 2,7 г (выход 54% от 5-бром-2фторнитробензола) 6-(4-метоксифенил)-2оксиндола в виде твердого вещества розового цвета.

Ή ЯМР (360 МГц, ΌΜ8Θ-ά₆): δ 10,38 (₈, Ьг, 1Н, ΝΉ-1), 7,52 (д, 1=9 Гц, 2Н), 7,23 (д, 1=7,3 Гц, 1Н, Н-4), 7,14 (дд, 1=1,38, 7,3 Гц, 1Н, Н-5), 7,0 (д, 1=9 Гц, 2Н), 6,96 (д, 1=1,38 Гц, 1Н, Н-7),

3,78 (8, 3Н, ОСН₃), 3,47 (з, 2Н, СН₂);

МС т/ζ (относительная интенсивность, %) 214 ([М+1]⁺, 100).

4-(2-Карбоксиэтил)-2-формил-3-метилпиррол (90,5 мг), 120 мг 6-(4-метоксифенил)-2оксиндола и 3 капли пиперидина в 2 мл этанола нагревают при 90°С в течение ночи. Затем реакционную смесь охлаждают и концентрируют. Остаток суспендируют в 6н. водном растворе соляной кислоты. Осадок отфильтровывают, промывают водой до рН 6 и сушат в вакуумсушильном шкафу в течение ночи, при этом получают 118 мг (59%) требуемого соединения в виде твердого вещества коричневого цвета.

'Н ЯМР (360 МГц, ОМ8О-д₆): δ 13,26 (з, Ьг, 1Н, ΝΉ-1’), 10,83 (з, Ьг, 1Н, ΝΉ-1), 7,78 (д, 1=8,07 Гц, 1Н, Н-4), 7,61 (з, 1Н, Н-винил), 7,56 (д, 1=8,97 Гц, 2Н), 7,22 (дд, 1=1,44, 8,07 Гц, 1Н, Н-5), 7,13 (д, 1=3,09 Гц, 1Н, Н-2'), 7,04 (д, 1=1,44 Гц, 1Н, Н-7), 7,0 (д, 1=8,97 Гц, 2Н), 3,79 (з, 3Н, ОСН₃), 2,65 (1, 1=7,54 Гц, 2Н, СН₂СН₂СООН), 2,44 (1, 1=7,54 Гц, 2Н, СН₂СН₂СООН) и 2,27 (з, 3Н, СН3);

МС т/ζ (относительная интенсивность, %) 404 ([М+1]⁺, 100).

Пример 35. 3-{5-[6-(4-Метоксифенил)-2оксо-1,2-дигидроиндол-3-илиденметил]-2,4-диметил-1Н-пиррол-3-ил}пропионовая кислота.

3-(2-Карбоксиэтил)-2,4-диметил-5-формилпиррол (98 мг), 120 мг 6-(4-метоксифенил)2-оксиндола и 3 капли пиперидина в 2 мл этано ла нагревают при 90°С в течение ночи. Затем реакционную смесь охлаждают и концентрируют. Остаток суспендируют в 6н. водном растворе соляной кислоты. Осадок отфильтровывают, промывают водой до рН 6 и сушат в вакуумсушильном шкафу в течение ночи, при этом получают 118 мг (57%) требуемого соединения в виде твердого вещества коричневого цвета.

'Н ЯМР (360 МГц, ОМ8О-д₆): δ 13,35 (з, Ьг, 1Н, ΝΉ-1’), 12,02 (з, Ьг, 1Н, СООН), 10,75 (з, Ьг, 1Н, ΝΠ-1),7,73(ά, 1=6,75 Гц, 1Н, Н-4), 7,56 (д, 1=9,01 Гц, 2Н), 7,54 (з, 1Н, Н-винил), 7,21 (дд, 1=1,59, 6,75 Гц, 1Н, Н-5), 7,04 (д, 1=1,59 Гц, 1Н, Н-7), 7,01 (д, 1=9,01 Гц, 2Н), 3,79 (з, 3Н, ОСН₃),

2,65 (1, 1=7,54 Гц, 2Н, СН₂СН₂СООН), 2,35 (1, 1=7,54 Гц, 2Н, СН₂СН₂СООН), 2,29 (з, 3Н, СН₃) и 2,26 (з, 3Н, СН₃);

МС т/ζ (относительная интенсивность, %) 417 ([М+1]⁺, 100).

Пример 36. 3-{5-[6-(2-Метоксифенил)-2оксо-1,2-дигидроиндол-3-илиденметил]-4-метил-1Н-пиррол-3 -ил}пропионовая кислота.

Тетракис(трифенилфосфин)палладий (1 г) добавляют к смеси 5 г 2-метоксифенилборной кислоты, 6,6 г 5-бром-2-фторнитробензола, 30 мл 2М раствора карбоната натрия в 50 мл толуола и 50 мл этанола. Смесь кипятят с обратным холодильником в течение 2 ч, концентрируют и остаток дважды экстрагируют этилацетатом. Объединенные слои этилацетата промывают водой и солевым раствором, сушат и концентрируют, при этом получают темно-зеленое масло, которое затвердевает в процессе хранения, представляющее собой неочищенный 4фтор-2'-метокси-3 -нитробифенил.

Диметилмалонат (14 мл) добавляют по каплям к 2,9 г гидрида натрия, суспендированного в 50 мл диметилсульфоксида. Смесь нагревают при 100°С в течение 15 мин и затем охлаждают до комнатной температуры.

Добавляют неочищенный 4-фтор-2'-метокси-3-нитробифенил в 60 мл диметилсульфоксида, и смесь нагревают при 100°С в течение 2 ч. Затем реакционную смесь охлаждают и гасят 300 мл насыщенного раствора хлористого аммония, дважды экстрагируют этилацетатом. Экстракты объединяют, промывают насыщенным хлористым аммонием, водой и солевым раствором, сушат над безводным сульфатом натрия и концентрируют, при этом получают неочищенный диметиловый эфир 2'-метокси-3нитробифенил-4-малоновой кислоты в виде масла желтого цвета.

Неочищенный диметиловый эфир 2'метокси-3-нитробифенил-4-малоновой кислоты нагревают при 100°С в 50 мл 6н. соляной кислоты в течение 24 ч и охлаждают. Полученный осадок собирают фильтрованием, промывают водой и гексаном, сушат, при этом получают 9,8 г 2'-метокси-3-нитробифенил-4-уксусной кислоты в виде твердого вещества светлого желтокоричневого цвета.

100

Железную стружку (5 г) добавляют одной порцией к 9,8 г 2'-метокси-3-нитробифенил-4уксусной кислоты в 50 мл ледяной уксусной кислоты и нагревают при 100°С в течение 3 ч.

Реакционную смесь упаривают досуха, обрабатывают ультразвуком в этилацетате и нерастворимые вещества удаляют фильтрованием. Фильтрат дважды промывают 1н. раствором соляной кислоты, водой и солевым раствором, а затем сушат над безводным сульфатом натрия и концентрируют. Остаток очищают хроматографией на силикагеле при помощи смеси этилацетат/гексан 1:2, при этом получают 5,4 г (выход 69% от 5-бром-2-фторнитробензола) 6-(2-метоксифенил)-2-оксиндола в виде твердого вещества розового цвета.

'Н ЯМР (360 МГц, ^М§О-й₆): δ 10,32 (к, Ьг, 1Н, ПН), 7,29-7,34 (т, 1Н), 7,19-7,25 (т, 2Н), 7,08 (й, 1=8 Гц, 1Н, Н-4), 6,97-7,02 (т, 2Н), 6,91 (й, 1=1,05 Гц, 1Н, Н-7), 3,8 (к, 3Н, ОСН₃), 3,47 (к, 2Н, СН2) ;

МС т/ζ (относительная интенсивность, %)

239,8 ([М+1]⁺, 100).

4-(2-Карбоксиэтил)-2-формил-3-метилпиррол (217 мг), 239 мг 6-(2-метоксифенил)-2оксиндола и 3 капли пиперидина в 2 мл этанола нагревают при 90°С в течение ночи. Затем реакционную смесь охлаждают и концентрируют. Остаток суспендируют в 6н. водном растворе соляной кислоты. Осадок отфильтровывают, промывают водой до рН 6 и сушат в вакуумсушильном шкафу в течение ночи, при этом получают 348 мг (86%) требуемого соединения в виде твердого вещества коричневого цвета.

'Н ЯМР (360 МГц, ОМНО-с1₆): δ 13,29 (к, Ьг, 1Н, ΝΉ-Γ), 11,59 (к, Ьг, 1Н, СООН), 10,78 (к, Ьг, 1Н, ΝΉ-1), 7,75 (й, 1=8,13 Гц, 1Н, Н-4), 7,62 (к, 1Н, Н-винил), 7,0-7,34 (т, 7Н), 3,76 (к, 3Н, ОСН₃), 2,66 (!, 1=7,46 Гц, 2Н, СН₂СН₂СООН),

2,46 (!, 1=7,46 Гц, 2Н, СН₂СН₂СООН) и 2,27 (к, 3Н, СН3);

МС т/ζ (относительная интенсивность, %) 401 ([М+1]⁺, 100).

Пример 37. 3-{5-[6-(2-Метоксифенил)-2оксо-1,2-дигидроиндол-3-илиденметил]-2,4-диметил-1Н-пиррол-3-ил}пропионовая кислота.

3-(2-Карбоксиэтил)-2,4-диметил-5-формилпиррол (234 мг), 239 мг 6-(2-метоксифенил)2-оксиндола и 3 капли пиперидина в 2 мл этанола нагревают при 90°С в течение ночи. Затем реакционную смесь охлаждают и концентрируют. Остаток суспендируют в 6н. водном растворе соляной кислоты. Осадок отфильтровывают, промывают водой до рН 6 и сушат в вакуумсушильном шкафу в течение ночи. Неочищенное твердое вещество очищают хроматографией на колонке с силикагелем, элюируют смесью этилацетат/гексан 1:1, содержащим 0,1% уксусной кислоты, при этом получают 182 мг (44%) требуемого соединения в виде твердого вещества коричневого цвета.

'Н ЯМР (360 МГц, 1)\18О-с1₆): δ 13,38 (к, Ьг, 1Н, ΝΉ-1’), 12,0 (к, Ьг, 1Н, СООН), 10,7 (к, Ьг, 1Н, ΝΉ-1), 7,71 (й, 1=7,74 Гц, 1Н, Н-4), 7,55 (к, 1Н, Н-винил), 7,0-7,33 (т, 6Н), 3,76 (к, 3Н, ОСН₃), 2,65 (!, 1=7,6 Гц, 2Н, СН₂СН₂СООН),

2,35 (!, 1=7,6 Гц, 2Н, СН₂СН₂СООН), 2,3 (к, 3Н, СН₃) и 2,26 (к, 3Н, СН₃);

МС (АРС1 отрицат.) т/ζ (относительная интенсивность, %) 415 ([М-1], 100).

Пример 38. 3-[2,4-Диметил-5-(6-морфолин4-ил-2-оксо-1,2-дигидроиндол-3-илиденметил)1Н-пиррол-3-ил]пропионовая кислота.

Дигидрат хлористого олова (225 г) добавляют к раствору 2,4-динитрофенилуксусной кислоты (22,6 г) в этаноле (450 мл). Смесь нагревают при температуре 90°С в течение 10 ч. Затем реакционную смесь охлаждают и подщелачивают 12М раствором гидроксида натрия до рН 11. Твердые вещества удаляют фильтрованием и фильтрат концентрируют. Остаток обрабатывают этанолом (300 мл). Нерастворимые вещества отфильтровывают и промывают этанолом (5x60 мл). Этанол, использованный для промывки, объединяют, упаривают и сушат в вакууме, при этом получают 15 г 6-амино-2оксиндола в виде порошка коричневого цвета.

'Н ЯМР (360 МГц, 1)\18О-с1₆): δ 10,03 (к, Ьг, ΝΉ), 6,78 (й, 1=8,55 Гц, 1Н, Н-4), 6,09-6,11 (т, 2Н), 4,95 (к, Ьг, 2Н, ΝΉ₂), 3,22 (к, 2Н, Н-3);

МС (+АРС1) т/ζ (относительная интенсивность, %) 147 ([М-1]⁺, 100).

6-Амино-2-оксиндол (2,2 г), 4,0 г 2,2'-дибромэтилового эфира и 7,9 г карбоната натрия кипятят с обратным холодильником в 20 мл этанола в течение ночи, концентрируют и разбавляют 50 мл воды. Смесь трижды экстрагируют 50 мл этилацетата, органические экстракты объединяют, промывают 20 мл солевого раствора, высушивают над безводным сульфатом натрия и упаривают досуха. Твердое вещество очищают хроматографией на колонке с силикагелем, элюируют смесью этилацетат/гексан 1:1, содержащей 0,7% уксусной кислоты, при этом получают 1,2 г (37%) 6-(морфолин-4-ил)-2оксиндола в виде твердого вещества бежевого цвета.

' Н ЯМР (360 МГц, 1)\18О-с1₆): δ 10,2 (к, Ьг, 1Н, ΝΉ-1), 7,02 (й, 1=7,87 Гц, 1Н, Н-4), 6,47 (йй, 1=2,11,7,87 Гц, 1Н, Н-5), 6,37 (й, 1=2,11 Гц, 1Н, Н-7), 3,69-3,72 (т, 4Н), 3,32 (к, 2Н, СН2), 3,013,04 (т, 4Н);

МС т/ζ (относительная интенсивность, %) 219 ([М+1]⁺, 100).

3-(2-Карбоксиэтил)-2,4-диметил-5-формилпиррол (3,3 г), 4 г 6-(морфолин-4-ил)-2оксиндола и 1,8 мл пиперидина в 60 мл этанола нагревают при 90°С в течение 7 ч. Затем реакционную смесь охлаждают и концентрируют. Остаток суспендируют в 6н. водном растворе соляной кислоты. Осадок отфильтровывают, промывают водой до рН 6 и сушат в вакуум

101

102 сушильном шкафу в течение ночи. Полученное твердое вещество очищают хроматографией на колонке с силикагелем, элюируют смесью этилацетат/гексан/уксусная кислота, при этом получают 2,78 г (выход 38%) требуемого соединения в виде твердого вещества коричневого цвета.

Ή ЯМР (360 МГц, ΌΜ8Ο-ά₆): δ 13,13 (8, Ьг, 1Н, ЦН-1’), 12,02 (8, Ьг, 1Н, СООН), 10,57 (8, Ьг, 1Н, ЦН-1), 7,52 (й, 1=8,46 Гц, 1Н, Н-4), 7,32 (8, 1Н, Н-винил), 6,58 (άά, 1=1,99, 8,46 Гц, 1Н, Н5), 6,41 (ά, 1=1,99 Гц, 1Н, Н-7), 3,71-3,74 (т, 4Н), 3,06-3,09 (т, 4Н), 2,62 (ΐ, 1=7,57 Гц, 2Н, СН₂СН₂СООН), 2,33 (ΐ, 1=7,57 Гц, 2Н,

СН2СН2СООН), 2,26 (8, 3Н, СН3) и 2,21 (8, 3Н, СН3);

МС т/ζ (относительная интенсивность, %) 396 ([М+1]⁺, 100).

Пример 39. 3-[5-(5-Хлор-4-метил-2-оксо1,2-дигидроиндол-3 -илиденметил)-2,4-диметил1Н-пиррол-3-ил]пропионовая кислота.

3,3 г Ν-хлорсукцинимида порциями добавляют к суспензии 3,0 г 4-метил-2-оксиндола в 50 мл ацетонитрила при перемешивании при комнатной температуре. Затем добавляют трифторуксусную кислоту (1 мл). Суспензию перемешивают при комнатной температуре в течение 3 дней, в течение указанного периода времени в суспензии присутствуют твердые вещества. Белое твердое вещество собирают вакуумной фильтрацией, промывают небольшим количеством холодного ацетона и сушат в течение ночи в вакуум-сушильном шкафу при 40°С, при этом получают 2,5 г (68%) 5-хлор-4-метил-2-оксиндола.

Ή ЯМР (360 МГц, ПМ8О-й₆): δ 10,38 (8, Ьг, 1Н, ΝΕ), 7,19 (ά, 1=8 Гц, 1Н, ароматический), 6,64 (ά, 1=8 Гц, 1Н, ароматический), 3,46 (8, 2Н, Н-3), 2,19 (8, 3Н, СН₃).

3- (2-Карбоксиэтил)-2,4-диметил-5-формилпиррол (98 мг), 91 мг 5-хлор-4-метил-2оксиндола и 2 капли пиперидина в 2 мл этанола нагревают при 90°С в течение 4 ч. Затем реакционную смесь охлаждают и концентрируют. Остаток суспендируют в 6н. водном растворе соляной кислоты. Осадок отфильтровывают, промывают водой до рН 6 и сушат в вакуумсушильном шкафу в течение ночи, при этом получают 100 мг требуемого соединения.

Ή ЯМР (360 МГц, ПМ8О-й₆): δ 13,47 (8, Ьг, 1Н, ЦН-1’), 12,03 (8, Ьг, 1Н, СООН), 10,83 (8, Ьг, 1Н, ЦН-1), 7,61 (8, 1Н, Н-винил), 7,14 (ά, 1=8,17 Гц, 1Н, ароматический), 6,74 (ά, и=8,17 Гц, 1Н, ароматический), 2,64 (8, 3Н, СН₃), 2,64 (ΐ, 1=7,62 Гц, 2Н, СН₂СН₂СООН), 2,34 (ΐ, 1=7,62 Гц, 2Н, СН2СН2СООН), 2,3 (8, 3Н, СН3) и 2,20 (8, 3Н, СН3).

Пример 40. 3-[5-(5-Хлор-4-метил-2-оксо1,2-дигидроиндол-3 -илиденметил)-4-метил-1Нпиррол-3-ил] пропионовая кислота.

4- (2-Карбоксиэтил)-2-формил-3-метилпиррол (91 мг), 91 мг 5-хлор-4-метил-2-оксиндола и капли пиперидина в 2 мл этанола нагревают при 90°С в течение 4 ч. Затем реакционную смесь охлаждают и концентрируют. Остаток суспендируют в 6н. водном растворе соляной кислоты. Осадок отфильтровывают, промывают водой до рН 6 и сушат в вакуум-сушильном шкафу в течение ночи, при этом получают 95 мг требуемого соединения.

'Н ЯМР (360 МГц, ПМ8О-й₆): δ 13,36 (8, Ьг, 1Н, ЦН-1’), 11,98 (8, Ьг, 1Н, СООН), 10,92 (8, Ьг, 1Н, ЦН-1), 7,68 (8, 1Н), 7,19 (ά, 1=7,14 Гц, 1Н, ароматический), 7,17 (8, 1Н), 6,75 (ά, 1=7,14 Гц, 1Н, ароматический), 2,66 (8, 3Н, СН3-4), 2,66 (ΐ, 1=7,51 Гц, 2Н, СН₂СН₂СООН), 2,45 (ΐ, 1=7,51 Гц, 2Н, СН2СН2СООН), 2,21 (8, 3Н, СН3);

МС т/ζ (относительная интенсивность, %) 345 ([М+1]⁺, 100).

Пример 41. Натриевая соль 3-[2,4-диметил5-(2-оксо-1,2-дигидроиндол-3-илиденметил)1Н-пиррол-3-ил]пропионовой кислоты.

К 0,98 гидроксида натрия в 10 мл воды добавляют суспензию 8 г 3-[2,4-диметил-5-(2оксо-1,2-дигидроиндол-3 -илиденметил)-1Н-пиррол-3-ил] пропионовой кислоты в 60 мл воды. Смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 30 мин и фильтруют. Фильтрат замораживают и высушивают лиофильно, при этом получают 8 г требуемого соединения.

В другом варианте, суспензию 117 г 318005 в 470 мл воды добавляют к 16,47 г гидроксида натрия в 74 мл воды. Смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 15 мин и фильтруют. Фильтрат добавляют к 210 мл этанола и полученный осадок собирают фильтрацией в вакууме. После высушивания получают 106 г требуемого соединения.

'Н ЯМР (360 МГц, ПМ8О-й₆): δ 13,34 (8, Ьг, 1Н, ΝΗ-1’), 10,82 (8, Ьг, 1Н, ЦН-1), 7,65 (ά, 1=7,52 Гц, 1Н, Н-4), 7,5 (8, 1Н, Н-винил), 7,04 (ΐ, 1=7,52 Гц, 1Н, Н-6), 6,93 (ΐ, 1=7,52 Гц, 1Н, Н-5),

6,85 (ά, 1=7,52 Гц, 1Н, Н-7), 2,55 (ΐ, 1=6,95 Гц, 2Н, СН2СН2СООН), 2,28 (8, 3Н, СН3), 2,24 (8, 3Н, СН₃) и 1,99 (ΐ, 1=6,95 Гц, 2Н,

СН2СН2СООН).

Пример 42. 3-[3,5-Диметил-4-(3-морфолин4-ил-пропил)-1Н-пиррол-2-илметилен]-1,3-дигидроиндол-2-он.

Стадия 1. К суспензии 3-(2,4-диметил-1Нпиррол-3-ил)-пропионовой кислоты (10 г, 60,8 ммоль) в 60 мл дихлорметана добавляют 1,1'карбонилдиимидазол (11,6 г, 71,8 ммоль), затем морфолин (5,5 мл, 60,8 ммоль) и Ν,Ν-диизопропилэтиламин (основание Хюнига, 10 мл, 60,8 ммоль). Реакционную смесь темно-красного цвета перемешивают при комнатной температуре в течение ночи и выливают в смесь воды со льдом. Органический слой промывают солевым раствором примерно до рН 6, сушат над безводным сульфатом натрия и концентрируют. Неочищенный продукт очищают на колонке с силикагелем и элюируют смесью дихлорме103

104 тан/метанол (98:2), при этом получают 13,84 г (96%) 3 -(2,4-диметил-1Н-пиррол-3-ил)-1 морфолин-4-ил-пропан-1-он.

Стадия 2. К суспензии алюмогидрида лития (2,67 г, 70 ммоль) в тетрагидрофуране (100 мл) добавляют по каплям раствор 3-(2,4-диметил-1Н-пиррол-3 -ил)-1 -морфолин-4-илпропан-1-он (13,84 г, 59 ммоль) в тетрагидрофуране (50 мл). Реакционную смесь перемешивают при 80°С в течение 1 ч и охлаждают на ледяной бане. Лед медленно добавляют к реакционной смеси, пока не прекратится выделение газа. Затем добавляют несколько капель 2н. гидроксида натрия и реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 30 мин. Затем реакционную смесь экстрагируют этилацетатом, сушат над безводным сульфатом натрия и концентрируют, при этом получают 10,37 г (79%) 4[3-(2,4-диметил-1Н-пиррол-3-ил)пропил]морфолина в виде масла светлокоричневого цвета, которое используют без дальнейшей очистки.

Стадия 3. К охлажденному льдом раствору Ν,Ν-диметилформамида (5,5 мл, 70 ммоль) в дихлорметане (30 мл) добавляют по каплям оксихлорид фосфора (6,5 мл, 70 ммоль). После завершения добавления реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 15 мин, после чего добавляют по каплям раствор 3,5-диметил-4-(3-морфолин-4-илпропил)-1Н-пиррол-2-карбоксальдегида (10,37 г, 46,6 ммоль) в дихлорметане (20 мл) при 0°С. Полученную реакционную смесь кипятят с обратным холодильником при 60°С в течение 4 ч и затем охлаждают на ледяной бане. К реакционной смеси медленно добавляют лед, а затем 2н. гидроксид натрия до рН 12. Реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 30 мин и затем экстрагируют этилацетатом. Органический слой промывают солевым раствором, сушат над безводным сульфатом натрия, концентрируют, при этом получают неочищенный продукт, который очищают на колонке с силикагелем и элюируют смесью дихлорметан/метанол/гидроксид аммония (9,5:0,5), при этом получают 4,57 г (39%) 3,5диметил-4-(3-морфолин-4-илпропил)-1Н-пиррол-2-карбальдегида в виде масла темнокрасного цвета.

'Н ЯМР (360 МГц, ОМ8О-й₆): δ 11,34 (к, Ьг, 1Н, Ν4-1), 9,40 (к, 1Н, СНО-2), 3,55 (1, 1=4,68 Гц, 4Н, О(СН₂СН₂)^СН₂СН₂СН₂-4), 2,28-2,34 (т, 6Н, О(СН₂СН₂)₂ЫСН₂СН₂СН₂-4), 2,21 (1,2Н, 1=7,10 Гц, 2Н,О(СН₂СН₂)₂ЫСН₂СН₂СН₂-4) СН₃3), 2,19 (к, 3Н, СН₃-5), 2,14 (к, 3Н, СН₃-3), 1,51 (квинтет, 1=7,10 Гц, 2Н, О(СН₂СН₂)^СН₂ СН2СН2-4),

МС т/ζ (относительная интенсивность, %) 251 ([М+1]⁺, 100).

Стадия 4. Смесь 1,3-дигидроиндол-2-она (133 мг, 1,0 ммоль), 3,5-диметил-4-(3-морфолин4-ил-пропил)-1Н-пиррол-2-карбоксальдегида (250 мг, 1,0 ммоль) и 3 капель пирролидина в 2,0 мл этанола кипятят с обратным холодильником при 90°С в течение 4 ч и затем охлаждают до комнатной температуры. Осадок отфильтровывают, промывают холодным этанолом и гексаном, сушат в вакуум-сушильном шкафу в течение ночи, при этом получают 308,9 мг (85%)

3- [3,5-диметил-4-(3-морфолин-4-илпропил)-1Нпиррол-2-илметилен]-1,3-дигидроиндол-2-она в виде твердого вещества желтого цвета.

'Н ЯМР (300 МГц, ОМ8О-й₆): δ 13,37 (к, 1Н, Ν^Ρ), 10,71 (к, 1Н, Ν4-1), 7,68 (й, 1=7,47 Гц, 1Н, Н-4), 7,53 (к, 1Н, Н-винил), 7,06 (й1, 1=7,47 Гц, 1Н, Н-6), 6,94 (й1, 1=7,74 Гц, 1Н, Н-5),

6,84 (й, 1=7,47 Гц, 1Н, Н-7), 3,55 (1, 1=4,37 Гц, 4Н, О(СН₂СН₂)₂ЫСН₂СН₂СН₂-4'), 2,40 (1, 1=7,31 Гц, 2Н, О^НУНД^СНАНАН^’), 2,31 (1, 1 =

4,37 Гц 4Н, О(СН2СН₂)^СН₂СН₂СН₂-4'), 2,28 (к, 3Н, СН₃-3'), 2,23 (к, 3Н, СН₃-5'), 2,23 (1, 1=7,31 Гц, 2Н, О(СН₂СН₂)₂ЫСН₂СН₂СН₂-4'), 1,56 (квинтет, 1=7,31 Гц, 2Н, О(СН₂СН₂)^СН₂ СН2СН2-4'),

МС т/е (относительная интенсивность, %) 365 (М⁺, 100).

Пример 43. 5-Бром-3-[3,5-диметил-4-(3морфолин-4-илпропил)-1Н-пиррол-2-илметилен]-1,3-дигидроиндол-2-он.

Смесь 5-бром-1,3-дигидроиндол-2-она (212 мг, 1,0 ммоль), 3,5-диметил-4-(3-морфолин-4илпропил)-1Н-пиррол-2-карбальдегида (250 мг, 1,0 ммоль) и 3 капель пирролидина в 2,0 мл этанола кипятят с обратным холодильником при 90°С в течение 4 ч и затем охлаждают до комнатной температуры. Осадок отфильтровывают, промывают холодным этанолом и гексаном, сушат в вакуум-сушильном шкафу в течение ночи, при этом получают 399,8 мг (90%) 5бром-3-[3,5-диметил-4-(3-морфолин-4-илпропил)-1Н-пиррол-2-илметилен]-1,3-дигидроиндол-2-она в виде твердого вещества красного цвета.

'Н ЯМР (300 МГц, ОМ8О-й₆): δ 13,43 (к, 1Н, Ν^Ρ), 10,81 (к, 1Н, Ν4-1), 7,99 (й, 1=2,07 Гц, 1Н, Н-4), 7,66 (к, 1Н, Н-винил), 7,18 (йй, 1=2,07, 7,58 Гц, 1Н, Н-6), 6,79 (й, 1=7,58 Гц, 1Н, Н-7), 3,55 (1, 1=4,39 Гц, 4Н, О(СН₂СН₂)₂ КСН₂СН₂СН₂-4’), 2,40 (1, 1=7,32 Гц, 2Н,

О(СН₂СН₂)₂КСН₂СН₂СН₂-4’), 2,31 (1, 1=4,39 Гц, 4Н, О(СН₂СН₂)₂ЫСН₂СН₂СН₂-4'), 2,29 (к, 3Н, СН₃-3'), 2,26 (к, 3Н, СН₃-5'), 2,23 (1, 1=7,32 Гц, 2Н, О(СН₂СН₂)₂ЫСН₂СН₂СН₂-4'), 1,56 (квинтет, 1=7,32 Гц, 2Н, О(СН₂СН₂)₂ЫСН₂СН₂СН₂-4>),

МС т/е (относительная интенсивность, %) 443 (М⁺, 100), 445 ([М+2]⁺, 100).

Пример 44. 3-[3,5-Диметил-4-(3-морфолин-

4- илпропил)-1Н-пиррол-2-илметилен]-6-фенил1,3-дигидроиндол-2-он.

Требуемое соединение получают, как описано в примере 2, в виде твердого вещества желтого цвета, выход составляет 88%.

105

106

Ί1 ЯМР (300 МГц, ЭМ8О-И₆): 6 13,37 (к, 1Н, ΝΉ-1’), 10,81 (к, 1Н, ΝΉ-1), 7,77 (И, 1=8,20 Гц, 1Н, Н-4), 7,62 (И, 1=7,39 Гц, 2Н, Н-2,6), 7,58 (к, 1Н, Н-винил), 7,44 (1, 1=7,39 Гц, 2Н, Н3, 5), 7,32 (1, Ьг, 1=7,39 Гц, 1Н, Н-4), 7,26 (ИИ, 1=1,49, 8,29 Гц, 1Н, Н-5), 7,09 (И, 1=1,49 Гц, 1Н, Н-7), 3,56 (1, 1=4,48 Гц, 4Н, О(СН₂СН₂)₂ ЫСН₂СН₂СН₂-4'), 2,41 (1, 1 = 7,18 Гц, 2Н, О(СН2СН2)2МСН2СН2СН2-4'), 2,31 (1, 1=4,48 Гц, 4Н, О(СН₂СН₂)₂ЫСН₂СН₂СН₂-4’), 2,29 (к, 3Н, СНз-3'), 2,26 (к, 3Н, СН₃-5'), 2,24 (1, 1=7,18 Гц, 2Н, О(СН₂СН₂)₂ЫСН₂СН₂СН₂-4'), 1,56 (квинтет, 1=7,18 Гц, 2Н, О(СН₂СН₂)₂ЫСН₂СН2СН₂-4’),

МС т/е (относительная интенсивность, %) 441 (М⁺, 100).

Пример 45. 3-[3,5-Диметил-4-(3-морфолин4-илпропил)-1Н-пиррол-2-илметилен]-6-(2-метоксифенил)-1,3-дигидроиндол-2-он.

Требуемое соединение получают, как описано в примере 2, в виде твердого вещества желтого цвета, выход составляет 86%.

Ί1 ЯМР (300 МГц, ЭМ8О-И₆): δ 13,37 (к, 1Н, ΝΉ-1’), 10,72 (к, 1Н, ΝΉ-1), 7,71 (И, 1=7,79 Гц, 1Н, Н-4), 7,55 (к, 1Н, Н-винил), 7,27-7,34 (т, 2Н), 6,98-7,10 (т, 4Н), 3,76 (к, 3Н, ОСН₃-2),

3,56 (1, 1=4,50 Гц, 4Н, О(СН₂СН₂)₂ЫСН₂СН₂СН₂4'), 2,41 (1, 1=7,12 Гц, 2Н, О(СН₂СН₂)₂

ЫСН₂СН₂СН2-4'), 2,21-2,31 (т, 6Н, О(СН₂СН₂)₂ ЫСН₂СН₂СН₂-4'), 2,29 (к, 3Н, СН₃-3'), 2,25 (к, 3Н, СН₃-5'), 1,57 (квинтет, 1=7,12 Гц, 2Н, ОЩЩСЩЦМСЩСЩСЩЧ’),

МС т/е (относительная интенсивность, %) 471 (М⁺, 100).

Пример 46. 3-[3,5-Диметил-4-(3-морфолин4-ил-пропил)-1Н-пиррол-2-илметилен]-6-(3-метоксифенил)-1,3-дигидроиндол-2-он.

Требуемое соединение получают, как описано в примере 2, в виде твердого вещества желтого цвета, выход составляет 87%.

Ί1 ЯМР (300 МГц, ЭМ8О-И₆): δ 13,38 (к, 1Н, ΝΉ-1’), 10,80 (к, 1Н, ΝΉ-1), 7,76 (И, 1=7,93 Гц, 1Н, Н-4), 7,57 (к, 1Н, Н-винил), 7,35 (1, 1=8,08 Гц, 1Н, Н-5), 7,26 (ИИ, 1=1,73, 7,93 Гц, 1Н, Н-5), 7,18 (И, Ьг, 1=8,08 Гц, 1Н, Н-4), 7,13 (1, Ьг, 1=1,94 Гц, 1Н, Н-2), 7,08 (И, 1=1,73 Гц, 1Н, Н-7), 6,90 (ИИ, 1=1,94, 8,08 Гц, 1Н, Н-6), 3,81 (к, 3Н, ОСН₃-3), 3,56 (1, 1=4,38 Гц, 4Н,

О(С\ШС1 ΚΑΝΟ ЬС1ЬС1 Ь-4')_ 2,41 (1, 1=7,19 Гц, 2Н, О(СН₂СН₂)₂ЫСН₂СН₂СН₂-4'), 2,31 (1, 1=4,38 Гц, 4Н, О(СН₂СН₂)₂ЫСН₂СН₂СН₂-4'), 2,29 (к, 3Н, СН₃-3'), 2,26 (к, 3Н, СН₃-5’), 2,24 (1, 1=7,19 Гц, 2Н, О(СН₂СН₂)₂ЫСН₂СН₂СН₂-4’), 1,56 (квинтет, 1=7,19 Гц, 2Н, О(СН₂СН₂)₂ЫСН₂СН₂СН₂-4'),

МС т/е (относительная интенсивность, %) 471 (М⁺, 100).

Пример 47. 3-[3,5-Диметил-4-(3-морфолин4-ил-пропил)-1Н-пиррол-2-илметилен]-6-(4-метоксифенил)-1,3-дигидроиндол-2-он.

Требуемое соединение получают, как описано в примере 2, в виде твердого вещества желтого цвета, выход составляет 52%.

Ί1 ЯМР (300 МГц, ЭМ8О-И₆): δ 13,35 (к, 1Н, ΝΉ-1’), 10,77 (к, 1Н, ΝΉ-1), 7,72 (И, 1=7,97 Гц, 1Н, Н-4), 7,55 (И, 1=8,57 Гц, 2Н, Н-2, 6),

7.54 (к, 1Н, Н-винил), 7,20 (ИИ, 1=1,35, 7,97 Гц, 1Н, Н-5), 7,04 (И, 1=1,35 Гц, 1Н, Н-7), 6,99 (И, 1=8,57 Гц, 1Н, Н-3, 5), 3,78 (к, 3Н, ОСН₃-4),

3.55 (1, 1=4,57 Гц, 4Н, О(СНгСН₂)₂МСН₂СН₂СН₂4’), 2,40 (1, 1 = 6,97 Гц, 2Н, О(СН₂СН₂)₂ ЫСН₂СН₂СН₂-4’), 2,30 (1, 1 = 4,57 Гц, 4Н, О(СН2СН2)2МСН2СН2СН2-4’), 2,28 (к, 3Н, СН33'), 2,24 (к, 3Н, СН₃-5'), 2,23 (1, 1=6,97 Гц, 2Н, О(СН₂СН₂)₂ЫСН2СН₂СН₂-4'), 1,55 (квинтет, 1=6,97 Гц, 2Н, О(СН₂СН₂)₂ЫСН₂СН₂СН₂-4’),

МС т/ζ (относительная интенсивность, %) 471 (М⁺, 100).

Пример 48. 3-[4-(3-Диметиламинопропил)3,5-диметил-1Н-пиррол-2-илметилен]-1,3-дигидроиндол-2-он.

4-(3-Диметиламинопропил)-3,5-диметил1 Н-пиррол-2-карбоксальдегид получают, как описано в примере 1, на стадиях 1, 2 и 3, в виде масла темно-красного цвета, выход составляет 63%.

Ί1 ЯМР (360 МГц, ЭМ8О-И₆): δ 11,33 (к, Ьг, 1Н, ЯН-1), 9,40 (к, 1Н, СНО-2), 2,30 (1, 1=7,42 Гц, 2Н, (СН₃)₂ЫСН₂СН₂СН₂-4), 2,18 (к, 3Н, СН₃3), 2,15 (1, 1=7,42 Гц, 2Н, (СН₃)₂ЫСН₂СН₂СН₂-4),

2,14 (к, 3Н, СН₃-5), 2,10 (к, 6Н, (СН₃)₂ЫСН₂ СН₂СНг-4), 1,47 (квинтет, 1=7,42 Гц, 2Н, (СН₃)₂ЫСН₂СН2СН₂-4),

МС т/ζ (относительная интенсивность, %) 208 ([М+1]⁺, 100).

Требуемое соединение получают, как описано в примере 1, на стадии 4, в виде твердого вещества желтого цвета, выход составляет 52%.

Ί1 ЯМР (360 МГц, ЭМ8О-И₆): δ 13,38 (к, 1Н, ЫН-Г), 10,70 (к, 1Н, ЯН-1), 7,68 (И, 1=7,54 Гц, 1Н, Н-4), 7,53 (к, 1Н, Н-винил), 7,06 (1, 1=7,54 Гц, 1Н, Н-6), 6,94 (1, 1=7,54 Гц, 1Н, Н-5),

6,85 (И, 1=7,54 Гц, 1Н, Н-7), 2,38 (1, 1=7,25 Гц, 2Н, (СН₃)₂МСН₂СН₂СН2-4'), 2,27 (к, 3Н, СН₃-3'), 2,23 (к, 3Н, СН₃-5'), 2,17 (1, 1=7,25 Гц, 2Н, (СН₃)₂МСН₂СН₂СН₂-4’), 2,11 (к, 6Н, (СН₃)₂МСН₂СН₂СН₂-4'), 1,52 (квинтет, 1=7,25 Гц, 2Н, (СН₃)₂МСН₂СН2СН₂-4’), МС т/ζ (относительная интенсивность, %) 323 (М⁺, 100).

Пример 49. 5-Бром-3-[4-(3-диметиламинопропил)-3,5-диметил-1Н-пиррол-2-илметилен]1,3-дигидроиндол-2-он.

Требуемое соединение получают, как описано в примере 2, в виде твердого вещества красного цвета, выход составляет 71%.

Ί1 ЯМР (360 МГц, ЭМ8О-И₆): δ 13,42 (к, 1Н, ЦН-Г), 10,81 (к, 1Н, ЯН-1), 7,98 (И, 1=1,89 Гц, 1Н, Н-4), 7,66 (к, 1Н, Н-винил), 7,17 (ИИ, 1=1,89, 8,23 Гц, 1Н, Н-6), 6,79 (И, 1=8,23 Гц, 1Н, Н-7), 2,38 (1, 1=7,23 Гц, 2Н, (СН₃)₂МСН₂СН₂СНг4’), 2,27 (к, 3Н, СН₃-3'), 2,25 (к, 3Н, СН₃-5'), 2,16 (1, 1=7,23 Гц, 2Н, (СН₃)₂МСН₂СН₂СН₂-4’), 2,10 (к, 6Н, (СН₃)₂МСН₂СН₂СН₂-4’), 1,51 (квинтет, 1=7,23 Гц, 2Н, (СН₃)₂МСН₂СН₂СН₂-4'),

107

108

ΜС т/ζ (относительная интенсивность, %) 401 ([М-1]⁺, 100) и 403 ([М+1]⁺, 100).

Пример 50. 3-[4-(3-Диметиламинопропил)-

3.5- диметил-1Н-пиррол-2-илметилен]-6-фенил1,3-дигидроиндол-2-он.

Требуемое соединение получают, как описано в примере 2, в виде твердого вещества оранжевого цвета, выход составляет 83%.

^!Н ЯМР (360 МГц, 1)\18О-с1₆): δ 13,38 (а, 1Н, ΝΉ-1'), 10,81 (а, 1Н, ЦН-1), 7,77 (б, 1=7,82 Гц, 1Н, Н-4), 7,62 (б, 1=7,59 Гц, 2Н, Н-2, 6), 7,58 (а, 1Н, Н-винил), 7,44 (1, 1=7,59 Гц, 2Н, Н3, 5''), 7,32 (1, 1=7,59 Гц, 1Н, Н-4''), 7,27 (бб, 1=1,11, 7,82 Гц, 1Н, Н-5), 7,09 (б, 1=1,11 Гц, 1Н, Н-7), 2,39 (1, 1=7,18 Гц, 2Н, (СН₃)₂ЫСН₂СН₂СН₂4'), 2,29 (а, 3Н, СН3-3'), 2,25 (а, 3Н, СН3-5'), 2,17 (1, 1=7,18 Гц, 2Н, (СН₃)₂НСН₂СН₂СН₂-4'), 2,11 (а, 6Н, (СН₃)2НСН₂СН₂СН₂-4'), 1,53 (квинтет, 1=7,18 Гц, 2Н, (СН₃)₂ЫСН₂СН₂СН₂-4'),

МС т/ζ (относительная интенсивность, %) 399 (М⁺, 100).

Пример 51. 3-[4-(3-Диметиламинопропил)-

3.5- диметил-1Н-пиррол-2-илметилен]-6-(2-метоксифенил)-1,3-дигидроиндол-2-он.

Требуемое соединение получают, как описано в примере 2, в виде твердого вещества желтого цвета, выход составляет 83%.

^!Н ЯМР (360 МГц, 1)\18О-с1₆): δ 13,38 (а, 1Н, ΝΉ-1'), 10,72 (а, 1Н, ΝΉ-1), 7,70 (б, 1=8,06 Гц, 1Н, Н-4), 7,55 (а, 1Н, Н-винил), 7,28-7,36 (т, 2Н, Н-4, 5), 7,14 (б, 1=8,32 Гц, 1Н, Н-6), 7,04 (бб, 1=1,21, 8,06 Гц, 1Н, Н-5), 6,99 (б, 1=7,42 Гц, 1Н, Н-3), 6,99 (б, 1=1,21 Гц, 1Н, Н-7), 3,76 (а, 3Н, ОСН₃-2), 2,39 (1, 1=7,24 Гц, 2Н, (СН₃)₂ЫСН₂СН₂СН₂-4'), 2,28 (а, 3Н, СН₃-3'), 2,25 (а, 3Н, СН₃-5’), 2,18 (1, 1=7,24 Гц, 2Н, (СН3)2НСН2СН2СН2-4’), 2,11 (а, 6Н, (СНЩЫСЩСЩСЩЧ'), 1,53 (квинтет, 1=7,24 Гц, 2Н, (СН₃)₂ЫСН₂СН₂СН₂-4'),

ΜС т/ζ (относительная интенсивность, %) 429 (Μ*·-, 100).

Пример 52. 3-[4-(3-Диметиламинопропил)-

3.5- диметил-1Н-пиррол-2-илметилен] -6-(3-метоксифенил)-1,3-дигидроиндол-2-он.

Требуемое соединение получают, как описано в примере 2, в виде твердого вещества красного цвета, выход составляет 83%.

^!Н ЯМР (360 МГц, 1)\18О-с1₆): δ 13,38 (а, 1Н, ΝΉ-1’), 10,80 (а, 1Н, ΝΉ-1), 7,60 (б, 1=8,06 Гц, 1Н, Н-4), 7,57 (а, 1Н, Н-винил), 7,35 (1, 1=8,15 Гц, 1Н, Н-5), 7,26 (бб, 1=1,39, 8,06 Гц, 1Н, Н-5), 7,19 (б, Ьг, 1=8,15 Гц, Н-6), 7,13 (т, 1Н, Н-2), 7,09 (б, 1=1,39 Гц, 1Н, Н-7), 6,90 (бб, 1=2,57, 8,15 Гц, 1Н, Н-4), 3,81 (а, 3Н, ОСН₃-3),

2,39 (1, 1=7,17 Гц, 2Н, (СН₃)₂ЫСН₂СН₂СН₂-4'),

2,29 (а, 3Н, СН₃-3'), 2,25 (а, 3Н, СН₃-5'), 2,17 (1, 1=7,17 Гц, 2Н, (СН₃)₂ЫСН₂СН₂СН₂-4’), 2,11 (а, 6Н, (СН₃)₂ЫСН₂СН₂СН₂-4’), 1,53 (квинтет, 1=7,17 Гц, 2Н, (СН₃)₂ЫСН₂СН₂СН₂-4’),

ΜС т/ζ (относительная интенсивность, %) 429 (М⁺, 100).

Пример 53. 3-[4-(3-Диметиламинопропил)-

3.5- диметил-1Н-пиррол-2-илметилен]-6-(4-метоксифенил)-1,3-дигидроиндол-2-он.

Требуемое соединение получают, как описано в примере 2, в виде твердого вещества коричневого цвета, выход составляет 83%.

^!Н ЯМР (360 МГц, 1)\18О-с1₆): δ 13,35 (а, 1Н, ЫН-Г), 10,77 (а, 1Н, ΝΉ-1), 7,73 (б, 1=7,82 Гц, 1Н, Н-4), 7,56 (б, 1=8,83 Гц, 2Н, Н-2, 6), 7,54 (а, 1Н, Н-винил), 7,20 (бб, 1=1,64, 7,82 Гц, 1Н, Н-5), 7,04 (б, 1=1,64 Гц, Н-7), 7,00 (б, 1=8,83 Гц, 2Н, Н-3, 5), 3,78 (а, 3Н, ОСН3-4), 2,39 (1, 1=7,24 Гц, 2Н, (СН₃)₂ЫСН₂СН₂СН₂-4'), 2,28 (а, 3Н, СН₃-3'), 2,25 (а, 3Н, СН₃-5'), 2,17 (1, 1=7,24 Гц, 2Н, (СН₃)₂ЫСН₂СН₂СН₂-4'), 2,11 (а, 6Н, (СН₃)₂ЫСН₂СН₂СН₂-4'), 1,52 (квинтет, 1=7,24 Гц, 2Н, (СН₃)₂ЫСН₂СН2СН₂-4'),

ΜС т/ζ (относительная интенсивность, %) 429 (М⁺, 100).

Пример 54. 5-Хлор-3-[4-(3-Диметиламинопропил)-3,5-диметил-1Н-пиррол-2-илметилен]1,3-дигидроиндол-2-он.

Требуемое соединение получают, как описано в примере 2, в виде твердого вещества коричневого цвета, выход составляет 53%.

^!Н ЯМР (360 МГц, 1)\18О-с1₆): δ 13,43 (а, 1Н, ΝΉ-1'), 10,84 (а, 1Н, ΝΉ-1), 7,87 (б, 1=1,85 Гц, 1Н, Н-4), 7,66 (а, 1Н, Н-винил), 7,05 (бб, 1=1,85, 8,15 Гц, 1Н, Н-6), 6,83 (б, 1=8,15 Гц, 1Н, Н-7), 2,36-2,45 (т, 4Н, (СН ₃)₂ЫСН₂СН₂СН₂-4'),

2,30 (а, 6Н, (СН₃)₂НСН₂СН₂СН₂-4'), 2,28 (а, 3Н, СН₃-3'), 2,26 (а, 3Н, СН₃-5'), 1,58 (квинтет, 1=7,52 Гц, 2Н, (СН₃)₂ЫСН₂СН2СН₂-4'),

ΜС т/ζ (относительная интенсивность, %) 357 ([М-1]⁺, 100).

Пример 55. 6-Хлор-3-[4-(3-Диметиламинопропил)-3,5-диметил-1Н-пиррол-2-илметилен]1,3-дигидроиндол-2-он.

Требуемое соединение получают, как описано в примере 2, выход составляет 77%.

ΜС Е1 357 [М-1]⁺.

Пример 56. 3-[4-(3-Диметиламинопропил)-

3.5- диметил-1Н-пиррол-2-илметилен]-5-метокси-1,3-дигидроиндол-2-он.

Требуемое соединение получают, как описано в примере 2, выход составляет 77%.

МС Е1 353 [М]⁺.

Пример 57. 3-[4-(3-Диметиламинопропил)-

3.5- диметил-1Н-пиррол-2-илметилен]-6-метокси-1,3-дигидроиндол-2-он.

Требуемое соединение получают, как описано в примере 2, выход составляет 74%.

Пример 58. 3-[4-(3-Диметиламинопропил)-

3.5- диметил-1Н-пиррол-2-илметилен]-5-метил1,3-дигидроиндол-2-он.

Требуемое соединение получают, как описано в примере 2, выход составляет 45%.

МС Е1 337 [М]⁺.

Пример 59. 3-[4-(3-Диметиламинопропил)-

3.5- диметил-1 Н-пиррол-2 -илметилен]-4 -метил1,3-дигидроиндол-2-он.

109

110

Требуемое соединение получают, как описано в примере 2, выход составляет 99%.

Ή ЯМР (300 МГц, ОМ8О-б₆): δ 13,45 (8, Ьг, 1Н, ЫН), 10,78 (8, Ьг, 1Н, ЦН), 7,50 (8, 1Н, Нвинил), 6,98 (1, 1=8,1 Гц, 1Н, Н-6), 6,76 (1, 1=8,1 Гц, 2Н, Н-5 & Н-7), 2,88 (т, 2Н, СН₂), 2,64 (8, 6Н, 2хСН₃), 2,56 (8, 3Н, СН₃), 2,43 (1, 1=7,4 Гц, 2Н, СН₂), 2,29 (8, 3Н, СН₃), 2,19 (8, 3Н, СН₃),

1,65-1,75 (т, 2Н, СН₂),

МС Е1 337 [М]⁺.

Пример 60. 3-[4-(3-Диметиламинопропил)-

3.5- диметил-1Н-пиррол-2-илметилен]-4-(2-гидроксиэтил)-1,3-дигидроиндол-2-он.

Требуемое соединение получают, как описано в примере 2, выход составляет 98%.

Пример 61. Амид 3-[4-(3-диметиламинопропил)-3,5-диметил-1Н-пиррол-2-илметилен]2-оксо-2,3-дигидро-1Н-индол-5-сульфоновой кислоты.

Требуемое соединение получают, как описано в примере 2, выход составляет 59%.

Ή ЯМР (300 МГц, ОМ8О-б₆): δ 13,41 (8, 1Н, ЦН-1’), 11,12 (8, 1Н, ЦН-1), 8,16 (б, 1=1,78 Гц, 1Н, Н-4), 7,66 (8, 1Н, Н-винил), 7,55 (бб, 1=1,78, 8,18 Гц, 1Н, Н-6),7,11 (8, Ьг, 2Н, Нз№О₂5), 6,98(6, 1=8,18 Гц, 1Н, Н-7), 2,47-2,50 (т, 2Н, (СНД^СН^Н^Нг^'), 2,41 (1, 1=7,37 Гц, 2Н, (СН^СНгСН^НН'), 2,36 (8, 6Н, (СНз^СН^Н^НН'), 2,30 (8, 3Н, СН₃-3’), 2,28 (8, 3Н, СН₃-5'), 1,61 (квинтет, 1=7,37 Гц, 2Н, (СНД^СН^Н^Н^’).

Пример 62. Изопропиламид 3-[4-(3-диметиламинопропил)-3,5-диметил-1Н-пиррол-2-илметилен]-2-оксо-2,3-дигидро-1Н-индол-5-сульфоновой кислоты.

Требуемое соединение получают, как описано в примере 2, выход составляет 64%.

МС Е1 444 [М]⁺.

Пример 63. 3-[4-(3-Диметиламинопропил)-

3.5- диметил-1Н-пиррол-2-илметилен]-5-(морфолин-4-сульфонил)-1,3 -дигидроиндол-2-он.

Требуемое соединение получают, как описано в примере 2, выход составляет 90%.

МС Е1 472 [М]⁺.

Пример 64. Диметиламид 3-[4-(3-диметиламинопропил)-3,5-диметил-1Н-пиррол-2-илметилен]-2-оксо-2,3-дигидро-1Н-индол-5-сульфоновой кислоты.

Требуемое соединение получают, как описано в примере 2, выход составляет 92%.

Ή ЯМР (300 МГц, ЭМ8О-б₆): δ 13,5 (8, Ьг, 1Н, ЦН), 12,21 (8, Ьг, 1Н, ЦН), 8,18 (б, 1=1,8 Гц, 1Н, Н-4), 7,84 (8, 1Н, Н-винил), 7,44 (бб, 1=1,8,

8,4 Гц, 1Н, Н-6), 7,05 (б, 1=8,4 Гц, 1Н, Н-7), 2,59 (8, 6Н, 2хСН₃), 2,59-2,64 (т, 2Н, СН₂), 2,44 (8, 6Н, 2хСН3), 2,38-2,44 (т, 2Н, СН2), 2,31 (8, 6Н, 2хСН₃), 1,59-1,69 (т, 2Н, СН₂).

МС Е1 430 [М]⁺.

7. БИОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Следует иметь в виду, что любая из предложенных групп соединений обладает спектром биологической активности. Предпочтительные варианты воплощения настоящего изобретения относятся к новым пирролзамещенным 2-индолинонам, проявляющим способность модулировать активность РТК, КТК и СТК. Описанные ниже исследования были использованы для отбора соединений, проявляющих оптимальный уровень требуемой активности.

А. Методы анализа.

Описанные ниже исследования ίη νίίΓΟ могут быть использованы для определения уровня активности и воздействия различных соединений по настоящему изобретению на одну или более ПК. Аналогичные методы анализа могут проводиться по одним и тем же схемам для любых ПК с применением методик, хорошо известных в данной области.

Исследование каталитической активности на клеточных линиях, описанные в данном изобретении, проводят методом ИФА (иммуноферментного анализа). В основном, методика анализа заключается в следующем: соединение добавляют к клеткам, природным или рекомбинантным, экспрессирующим исследуемую киназу, инкубируют в течение определенного периода времени, а затем, если исследуемая киназа является рецептором, добавляют лиганд, известный как активатор рецептора. Клетки лизируют, и лизат переносят в лунки планшета для ИФА, предварительно покрытые антителами, специфичными к субстрату реакции ферментативного фосфорилирования. Компоненты клеточного лизата, не являющиеся субстратом, отмывают и степень фосфорилирования определяют количественно с использованием антител, специфичных к фосфотирозину по сравнению с контрольными клетками, не обработанными исследуемым соединением. Описанные в данном тексте биологические исследования на клетках позволяют определить количество ДНК, синтезированной в ответ на активацию исследуемой киназы, что является общепринятым методом определения пролиферативного ответа. В основном, методика данного анализа заключается в следующем: соединение добавляют к клеткам, природным или рекомбинантным, экспрессирующим исследуемую киназу, инкубируют в течение определенного периода времени, а затем, если исследуемая киназа является рецептором, добавляют лиганд, который известен как активатор рецептора. После инкубирования в течение, по крайней мере, ночи добавляют реагент для введения метки в ДНК, такой, как бромдезоксиуридин (ВгбИ) или 3Н-тимидин. Количество меченой ДНК определяют либо при помощи антител анти-ВгбИ, либо путем измерения радиоактивности, по сравнению с контрольными клетками, не обработанными исследуемым соединением.

111

112

Исследование каталитической активности на клетках

Для обнаружения и измерения активности ПК используют иммуноферментный анализ (ИФА). ИФА проводят согласно известным методикам, описанным, например, νο1Ετ с соавт., Егыуте-Ынкеб Ιιηιηι.ιηο8οΓ^ηί А88ау (Иммуноферментный анализ), в книге Μαηηυαΐ οΓ С11шса1 Ιιηιηιιηο1οβν (Руководство по клинической иммунологии), изд. 2-е, под ред. Иο8е анб Епебтап, (1980), стр. 359-371, Ат. 8ο^ οΓ М1сгоЬюкду, ΧνίΜιίηβίοη, Ь.С.

Описанная методика для определения активности может быть модифицирована с учетом специфичности ПК. Таким образом, ниже приведены наиболее предпочтительные методики определения активности специфичных ПК методом ИФА. Однако возможные модификации указанных методик для определения активности соединений по отношению к другим членам семейства РТК, а также к КТК и СТК, очевидные для компетентных специалистов в данной области техники, находятся в пределах объема притязаний настоящего изобретения.

Определение активности рецептора ЕЬК-1

Данное исследование используют для определения киназной активности рецептора ЕЬК1 и, более подробно, ингибирования или активации ТК-активности рецептора ЕЬК-1. Следующий анализ проводят для определения киназной активности рецептора ЕЬК-1 в клетках, полученных методами генной инженерии и экспрессирующих Е1к-1.

Материалы и реагенты

а. 96-луночные планшеты для ИФА производства фирмы Соттд (номер по каталогу 25805-96);

б. Козьи антитела к 1дС кролика производства фирмы Сарре1 (номер по каталогу 55641);

в. Буферный раствор РВ8 (производства фирмы С1Ьсс, номер по каталогу 450-1300ЕВ);

г. Буферный раствор ТВ 8XV (50 мМ трис (рН 7,2), 150 мМ №1С1 и 0,1% твин-20);

д. Исходный раствор этаноламина (10% этаноламин (рН 7,0), хранят при 4°С);

е. Буферный раствор НЭТС (20 мМ НЕРЕ8 (рН 7,5), 150 мМ №С1, 0,2% тритон Х-100 и 10% глицерин)

ж. ЕЬТА (0,5 М (рН 7,0), исходный раствор 100Х);

з. Ортованадат натрия (0,5 М, исходный раствор 100Х);

и. Пирофосфат натрия (0,2 М, исходный раствор 100Х);

к. 96-луночные полипропиленовые планшеты с ν-образным дном производства фирмы NυNС, АррНеб 8с1еийГ1с (номер по каталогу А8-72092);

л. Клетки МН3Т3 С7#3 (клетки, экспрессирующие ЕЬК-1);

м. Клеточная среда ЬМЕМ 1Х, с повышенным содержанием глюкозы и Ь-глутамина (номер по каталогу 11965-050);

н. Эмбриональная сыворотка теленка (ЕВ8), производства фирмы СЛот (номер по каталогу 16000-028);

о. Ь- глутамин, производства фирмы СЛто (номер по каталогу 25030-016);

п. Ростовой фактор VЕСЕ производства фирмы РергоТесН 1ис. (номер по каталогу 10020) (хранят при температуре -20°С в виде исходного раствора с концентрацией 1 мкг/100 мкл бН₂О Μί11ί-ρ, т.е. воды, деионизированной на установке МПП-Р);

р. Антитела против ЕЬК-1, очищенные аффинной хроматографией;

с. Моноклональные антитела ИВ40, специфичные к фосфотирозину (см. статья ЕеЮку с соавт., Саг1сег Ре8еагсН (1990) т. 50, стр. 15501558);

т. Коньюгат козьих антител против 1дС мыши с пероксидазой, 1дС-РОЬ марки Е1А (производства фирмы Βΐο-Каб, номер по каталогу 172-1011);

у. Раствор 2,2'-азино-бис(3-этилбензтиазолин-6-сульфоновой кислоты)(АВТ8) (100 мМ лимонная кислота (безводная), 250 мМ №₂НРО₄ (рН 4,0), 0,5 мг/мл АВТ8 (фирмы 81дта, номер по каталогу А-1888)), раствор хранят в темном месте при 4°С до использования;

ф. Н₂О₂ (30%-ный раствор) (производство фирмы Е18Йег, номер по каталогу Н325);

х. Смесь АВТ8/Н₂О₂ (15 мл раствора АВТ8, 2 мкл Н₂О₂), готовят за 5 мин до использования и выдерживают при комнатной температуре;

ц. Исходный раствор 0,2 М НС1 в Н₂О;

ч. Диметилсульфоксид (100%) (производство фирмы 81дта, номер по каталогу Ό-8418) и

ш. Трипсин-ЕОТА (фирмы СЛто ВЯЬ, номер по каталогу 25200-049).

Методика

1. 96-луночные планшеты для ИФА обрабатывают раствором антител к 1дС кролика (производства фирмы Саре1) в 0,1М №ьСО₃ рН 9,6. В каждую лунку добавляют по 1 мкг антител, конечный объем в лунке составляет 150 мкл. Планшеты инкубируют в течение ночи при 4°С. Планшеты можно использовать в течение двух недель, если хранить их при 4°С.

2. Клетки культивируют до конфлюэнтности в ростовой среде (ЭМЕМ с добавлением 2,0 мМ Ь-глутамина, 10% ЕВ 8) в чашках Петри, подходящих для выращивания клеток, при 37°С, 5% СО2.

3. Клетки собирают путем обработки трипсином и высевают в 96-луночные круглодонные полистирольные планшеты производства фирмы Τ’οΓηίηβ 25850, по 25000 клеток на лунку в 200 мкл ростовой среды.

4. Клетки культивируют по крайней мере в течение одних суток при 37°С, 5% СО₂.

113

114

5. Клетки промывают буфером Ό-ΡΒδ 1Х.

6. В каждую лунку добавляют по 200 мкл минимальной среды (ЭМЕМ, 2,0 мМ Ьглутамина, 0,1% ΕΒ8). Инкубируют в течение ночи при 37°С, 5% СО₂.

7. Соединения разводят минимальной средой в соотношении 1:20 в 96-луночном полипропиленовом планшете. В контрольные лунки добавляют диметилсульфоксид, разбавленный в соотношении 1:20.

8. Из лунок 96-луночных планшетов с культурами клеток удаляют минимальную среду и в каждую лунку добавляют по 162 мкл свежей минимальной среды.

9. В каждую лунку добавляют по 18 мкл разбавленного в соотношении 1:20 раствора соединения (см. п.7), в контрольные лунки добавляют диметилсульфоксид, разбавленный в соотношении 1:20, (+/- фактор роста УЕСЕ), причем после стимуляции клеток конечное разбавление составляет 1:200. Конечная концентрация диметилсульфоксида составляет 0,5%. Планшеты инкубируют при 37°С, 5% СО2 в течение 2 ч.

10. Несвязанные антитела удаляют из лунок планшетов для ИФА, опрокидывая планшеты и выливая раствор. Трижды промывают буфером ΤΒδν+0,5% этаноламин, рН 7,0. Для удаления избытка жидкости и пузырьков воздуха планшетом постукивают по бумажной салфетке.

11. Планшеты блокируют буфером ΤΒ8\ν+ 0,5% этаноламин, рН 7,0, добавляя в каждую лунку по 150 мкл указанного раствора. Планшет инкубируют в течение 30 мин при встряхивании на качалке для микропланшетов.

12. Планшет трижды промывают, как описано в п. 10.

13. В каждую лунку планшета добавляют по 0,5 мкг поликлональных кроличьих антител к ЕЬК-1. Конечный объем раствора в каждой лунке доводят до 150 мкл буфером ΤΒδν + 0,5% этаноламин, рН 7,0. Планшет инкубируют при встряхивании в течение 30 мин.

14. К клеткам добавляют по 180 мкл минимальной среды и стимулируют их добавлением в каждую лунку по 20 мкл 10,0 мМ ортованадата натрия и 500 нг/мл ростового фактора УЕСЕ (при этом конечная концентрация реактивов в каждой лунке составляет 1,0 мМ ортованадата натрия и 50 нг/мл ростового фактора УЕСЕ), инкубируют при 37°С, 5% СО₂ в течение 8 мин. В лунки с отрицательным контролем добавляют только минимальную среду.

15. Через 8 мин среду удаляют и клетки промывают один раз, добавляя в каждую лунку по 200 мкл буфера ΡΒ8.

16. Клетки лизируют, добавляя по 150 мкл буфера НОТС в каждую лунку, при встряхивании при комнатной температуре в течение 5 мин. В состав буфера НОТС входят ортованадат натрия, пирофосфат натрия и ЕОТА.

17. Планшет для ИФА трижды промывают, как описано в п.10.

18. Клеточные лизаты переносят из лунок планшета для культивирования клеток в лунки планшета для ИФА и инкубируют при встряхивании в течение 2 ч. При переносе лизата лунку несколько раз промывают с помощью автоматической пипетки (набирая суспензию из лунки и выпуская ее в ту же лунку и повторяя эту операцию несколько раз).

19. Планшет трижды промывают, как описано в п. 10.

20. Планшет для ИФА инкубируют, добавляя в каждую лунку по 0,02 мкг моноклональных антител ИВ40 в буфере ΤΒδν + 0,5% этаноламин. Конечный объем в каждой лунке доводят до 150 мкл. Инкубируют при встряхивании в течение 30 мин.

21. Планшет трижды промывают, как описано в п. 10.

22. Планшет для ИФА инкубируют с конъюгатом козьих антител к 1дС мыши с пероксидазой хрена, марки Е1А, разбавленным 1:10000 буфером ΤΒδν + 0,5% этаноламин, рН 7,0. Конечный объем в каждой лунке доводят до 150 мкл. Планшет инкубируют при встряхивании в течение 30 мин.

23. Планшет трижды промывают, как описано в п.10.

24. Добавляют по 100 мкл раствора ΑΒΤδ/ЩО^ Инкубируют при встряхивании в течение 10 мин.

25. Развитие окрашивания останавливают, добавляя по 100 мкл 0,2 М НС1 до конечной концентрации 0,1 М НС1. Встряхивают при комнатной температуре в течение 1 мин. Пузырьки воздуха удаляют в слабом токе воздуха и считывают результаты ИФА на ридере для планшетов ИФА при длине волны 410 нм.

Определение активности гибридной рецепторной киназы ЕСЕ-НЕК2 на целых клетках.

Активность киназы НЕК2 на целых клетках ЕСЕЯ-NIΗ3Τ3 определяют согласно методике, описанной ниже.

Материалы и реагенты

а. Фактор роста ЕСЕ, исходная концентрация: 16,5 1ЬМ, ЕСЕ 201, производства фирмы ΤОΥОΒО Со. Μά., Япония.

б. 05-101 (^^моноклональные антитела, специфичные к внеклеточному домену рецептора ЕСЕК).

в. Антитела к фосфотирозину (анти-Г^г), поликлональные (см. выше, ЕсЮ1су с соавт.).

г. Антитела для проявления: коньюгат козьих антител к 1дС кролика с пероксидазой хрена, производство фирмы ΤΑСО, 1пс., ΒιιιΊίπβαιηο. СА.

д. Буфер ΤΒ8Τ:

Трис-НС1, рН 7,2 50 мМ №1С1 150 мМ

Тритон Х-100 0,1%

е. Исходный буфер НОТС 5Х:

115

116

№ΡΕ8	0,1 М
№1С1	0,75М
Глицерин	50%
Тритон Х-100	1,0%
ж. Исходный раствор АВТ8:
Лимонная кислота	100 мМ
Ха.-НЮТ	250 мМ
НС1, конц.	0,5 мМ
АВТ8*	0,5 мг/мл
* 2,2'-азино-бис(3-этилбензтиазолин-6-
сульфоновая кислота).
Раствор хранят в темном месте при темпе-
ратуре 4°С до использования.
з. Исходные растворы:
КОТА 100 мМ рН	7,0
№3УО4	0,5 М
№4(Я2О7)	0,2 М

Основные стадии метода

Предварительная обработка планшетов для ИФА

1. 96-луночные планшеты для ИФА (производства фирмы Сотшпд, номер по каталогу #25805-96) покрывают антителами 05-101, добавляя в каждую лунку по 0,5 мкг в виде раствора в ΡΒ8 (конечный объем в каждой лунке 100 мкл) и выдерживая при 4°С в течение ночи. При хранении при температуре 4°С обработанные планшеты можно использовать в течение 10 дней.

2. В день использования обрабатывающий буфер удаляют и заменяют на 100 мкл блокирующего буфера (5%-ное быстрорастворимое обезжиренное молоко Сатпайоп в ΡΒ8). Планшеты инкубируют, встряхивая при комнатной температуре (приблизительно 23-25°С) в течение 30 мин. Непосредственно перед использованием блокирующий буфер удаляют и планшеты промывают четыре раза буфером ТВ8Т.

Пересев клеток

1. В данном эксперименте могут быть использованы клетки линии NIΗ3Τ3 с повышенной экспрессией гибридного рецептора, содержащего внеклеточный домен БОРЯ и внутриклеточный домен киназы НЕЯ2.

2. Для анализа отбирают чашки Петри с 80-90%-ной конфлюэнтностью клеток. Клетки обрабатывают трипсином, реакцию останавливают добавлением 10%-ной РВ8. Клетки суспендируют в среде ΌΜΕΜ (10% среда С8 ΌΜΕΜ) и центрифугируют один раз при 1500 об./мин при комнатной температуре в течение 5 мин.

3. Клетки ресуспендируют в среде для посева (ΌΜΕΜ, 0,5 % РВ8) и число клеток определяют с использованием красителя трипана голубого. Для анализа отбирают клетки с жизнеспособностью более 90%. Клетки помещают в 96луночный микропланшет в среде ΌΜΕΜ (0,5% РВ8), добавляя в каждую лунку по 10000 клеток в 100 мкл. Клетки инкубируют при 37°С, 5% СО₂ в течение 40 ч.

Определение активности

1. Пересеянные клетки проверяют на наличие загрязнений при помощи инвертированного микроскопа. Исходный раствор лекарственного средства (10 мг/мл в ДМСО) разбавляют 1:10 в среде ΌΜΕΜ, затем добавляют в каждую лунку по 5 мкл указанного раствора и буфер ΤΒ8Τ, при этом конечное разбавление лекарственного средства составляет 1:200, а конечная концентрация ДМСО - 1%. В контрольные лунки добавляют только ДМСО. Инкубируют при 37°С, 5% СО2 в течение 2 ч.

2. Готовят раствор лиганда ΕΟΡ: разбавляют исходный раствор ΕΟΡ в ΌΜΕΜ с таким расчетом, чтобы при добавлении 10 мкл разбавленного раствора ΕΟΡ (разведение 1:12) конечная концентрация составляла 100 нМ.

3. Готовят свежий раствор НЯТС* в количестве, достаточном для добавления по 100 мкл в каждую лунку, и помещают его в лед. НОТО* (10 мл):

Исходный раствор НОТС 2,0 мл

Н₂О, деионизированная ιηί11ί-Ρ 7,3 мл

ΕΌΤΆ, 100 мМ, рН 7,0 0,5 мл №₃УО₄(0,5 Μ) 0,1 мл ^(₽₂О₇) (0,2 М) 0,1 мл

4. Через 120 мин инкубирования клеток с лекарственным средством в каждую лунку добавляют по 10 мкл полученного ранее раствора лиганда ΕΟΡ, конечная концентрация в каждой лунке составляет 100 нМ. В контрольные лунки добавляют только ΌΜΕΜ. Инкубируют, встряхивая при комнатной температуре в течении 5 мин.

5. Удаляют лекарственное средство, ΕΟΡ и ^ΜЕМ. Клетки дважды промывают ΡΒ8. К клеткам добавляют буфер НОТС* по 100 мкл в каждую лунку. Планшет помещают на лед на 5 мин. Тем временем удаляют блокирующий буфер из лунок планшетов для ИФА и промывают буфером ΤΒ8Τ, как было описано ранее.

6. Клетки тщательно вымывают из лунок планшета с помощью автоматической микропипетки с плотно надетым наконечником (набирая суспензию из лунки и выпуская ее в ту же лунку и повторяя ту же операцию несколько раз) буфером НОТС для лизиса. Лизат переносят в лунки планшета для ИФА, предварительно обработанного антителами, блокирующим буфером и отмытого соответствующим буфером. Планшет инкубируют при встряхивании при комнатной температуре в течение 1 ч.

7. Лизат удаляют и промывают четыре раза буфером ТВ8Т. В каждую лунку планшета для ИФА добавляют по 100 мкл свежеприготовленного раствора антител к Ρίντ. Инкубируют при встряхивании при комнатной температуре в течение 30 мин в присутствии сыворотки к Ρΐντ (разбавленной в буфере ТВ8Т в соотношении 1:3000).

8. Антитела к Ρΐντ удаляют и лунки промывают четыре раза буфером ТВ8Т. В каждую

117

118 лунку планшета для ИФА добавляют по 100 мкл свежеразбавленных антител к 1дС кролика фирмы ТАСО. Инкубируют при встряхивании при комнатной температуре в течение 30 мин (разбавление антител к 1дС кролика в буфере ТВ8Т составляет 1:3000).

9. Использованные для проявления антитела фирмы ТАСО удаляют и лунки промывают четыре раза буфером ТВ8Т. В каждую лунку планшета для ИФА добавляют по 100 мкл свежеприготовленного раствора АВТ8/Н2О2. Инкубируют при встряхивании при комнатной температуре в течение 20 мин. (Раствор АВТ8/Н₂О₂:1,0 мкл 30%-ной Н₂О₂ в 10 мл исходного раствора АВТ8).

10. Реакцию останавливают добавлением 50 мкл раствора 5н. Н28О4(по выбору) и определяют оптическую плотность при длине волны 410 нм.

11. Максимальную величину сигнала фосфотирозина определяют путем вычитания значений отрицательных контролей из значений положительных контролей. Затем после вычитания значений отрицательных контролей рассчитывают процент ингибирования фосфорилирования по уменьшению количества фосфотирозина для лунок, содержащих экстракт.

Определение активности РОСЕ-К

Все среды для культивирования клеток, глутамин и эмбриональная ЕВ8, если особо не оговорено, могут быть приобретены на фирме С1Ьсо Ь1£е ТесНпо1од1еа (Сгапй Напй, ΝΥ). Все клетки выращивают во влажной атмосфере, содержащей 90-95% воздуха и 5-10% СО₂, при температуре 37°С. Все клеточные линии пересевают дважды в неделю, проверяют на отсутствие микоплазмы с использованием метода Мусо!ес! (С1Ьсо).

Для исследования методом ИФА клетки (И1242, полученные от Йозефа Шлессингера, ΝΥυ) культивируют до 80-90%-ной конфлюэнтности в ростовой среде (МЕМ, 10% ЕВ8, ΝΈΑΛ, 1 мМ пирувата натрия, 2 мМ глутамина) и пересевают в 96-луночные планшеты для культивирования клеток в 0,5% сыворотке, добавляя в каждую лунку в количестве от 25000 до 30000 клеток. Клетки инкубируют в среде, содержащей 0,5% сыворотки в течение ночи, затем среду заменяют на бессывороточную среду и обрабатывают исследуемым соединением в инкубаторе при 37°С, 5% СО₂ в течение 2 ч. Затем клетки стимулируют лигандом в течение 5-10 мин, лизируют буфером НЫТС (20 мМ НЕРЕ8, 150 мМ №1С1, 10% глицерин, 5 мМ БЭТА, 5 мМ Ыа₃УО₄, 0,2% тритон Х-100 и 2 мМ пируват натрия). В каждую лунку планшета для ИФА, предварительно обработанного специфичными к рецептору антителами и заблокированного 5%-ным молоком в буфере ТВ8Т (50 мМ Трис НС1, рН 7,2, 150 мМ ЫаС1 и 0,1% тритон Х-100) при комнатной температуре в течение 30 мин, добавляют по 0,5 мг клеточного лизата в РВ8. Лизаты инкубируют при встряхивании при комнатной температуре в течение 1 ч. Планшеты промывают четыре раза буфером ТВ8Т, затем инкубируют с поликлональными антителами к фосфотирозину при комнатной температуре в течение 30 мин. Избыток антител к фосфотирозину удаляют путем четырехкратной промывки планшета буфером ТВ8Т. В каждую лунку планшета для ИФА добавляют козьи антитела к 1дС кролика и инкубируют при комнатной температуре в течение 30 мин, затем промывают четыре раза буфером ТВ8Т. Для развития окрашивания в каждую лунку планшета для ИФА добавляют буфер АВТ8 (100 мМ лимонная кислота, 250 мМ Ыа₂НРО₄ и 0,5 мг/мл 2,2'-азино-бис(3-этилбензтиазолин-6-сульфоновой кислоты)) и Н₂О₂ (1,2 мкл 30%-ной Н₂О₂ в 10 мл АВТ8). Через 15-30 мин после добавления АВТ8 определяют поглощение при 410 нм, длина волны для сравнения 630 нм.

Определение активности рецептора фактора роста 1СЕ-1

Приведенная ниже методика может быть использована для определения уровня фосфотирозина в рецепторе 1СЕ-1, что позволяет определить тирозинкиназную активность рецептора 1СЕ-1.

Материалы и реагенты

а. В данном исследовании используют клеточную линию 3Т3/1СЕ-1К, полученную генноинженерными методами, с повышенной экспрессией рецептора 1СЕ-1.

б. Клетки Ы1Н3Т3/1СЕ-1К культивируют в инкубаторе при температуре 37°С, 0,5% СО2. В качестве ростовой среды используют ЭМЕМ с добавлением 10% ЕВ8 (термически инактивированной) и 2 мМ Ь-глутамина.

в. Антитела к 1СЕ-1К 17-69, очищенные методом аффинной хроматографии.

г. Э-РВ8:

КН2РО4 0,20 г/л

К₂НРО₄ 2,16 г/л

КС1 0,20 г/л

ЫаС1 8,00 г/л (рН 7,2)

д. Блокирующий буфер: буфер ТВ8Т с добавлением 5% молока (быстрорастворимое обезжиренное сухое молоко Сагпайоп)

е. Буфер ТВ8Т: Трис-НС1

ЫаС1

Тритон Х-100 мМ

150 мМ(рН 7,2/1н. НС1)

0,1%

Готовят исходный раствор ТВ 8 (10Х), а тритон Х-100 добавляют при разбавлении рас твора.

ж. Буфер НЫТС:

НЕРЕ8 №С1 мМ

150 мМ (рН 7,2/1 н.

НС1)

10%

0,2%

Глицерин

Тритон Х-100

Готовят исходный раствор (5Х) и хранят его при 4°С

119

120

з. Е0ТА/НС1: 0,5 М рН 7,0 (№ОН), исходный раствор 100Х.

и. №1₃УО₃: 0,5М, исходный раствор 100Х, аликвоты хранят при -80°С.

к. №1.-|Р_;О- 0,2 М, исходный раствор 100Х.

л. Инсулино-подобный фактор роста-1, производства фирмы Рготеда (номер по каталогу # 65111).

м. Кроличья поликлональная сыворотка к фосфотирозину.

н. Коньюгат пероксидазы с козьими антителами к 1д6 кролика (антитела для проявления), производства фирмы Тадо (номер по каталогу 4520, Ьо1 № 1802): Тадо, 1пс., Виг1шдаше, СА.

о. Раствор АВТ8 (2,2'-азино-бис(3этилбензтиазолин-6-сульфоновая кислота)):

Лимонная кислота 100 мМ №1₂НРО₄ 250 мМ (рН 4,0/ 1н. НС1)

АВТ8 0,5 мг/мл

Раствор АВТ8 следует хранить в темноте при температуре 4°С. Если раствор становится зеленым, его следует выбросить.

п. Перекись водорода: 30%-ный раствор хранят в темноте при температуре 4°С.

Основные стадии метода

Все описанные ниже операции проводят при комнатной температуре, если не оговорено особо. Все планшеты для ИФА промывают три раза водопроводной водой, затем один раз буфером ТВ8Т. Планшеты сушат, постукивая планшетом по бумажной салфетке.

Пересев клеток

1. Клетки, выращенные в чашке Петри (производство фирмы Согшпд, номер по каталогу 25020-100) до конфлюэнтности 80-90%, собирают с использованием раствора трипсинЕЭТА (0,25%, 0,5 мл/О-100, производство фирмы 61ВСО).

2. Клетки ресуспендируют в свежеприготовленной смеси (ЭМЕМ + 10% БВ8 + 2 мМ Ьглутамин) и переносят в лунки 96-луночного планшета для культивирования тканей (фирмы Согшпд, номер по каталогу 25806-96) по 20000 клеток в каждой лунке (по 100 мкл). Инкубируют в течение 1 сут, затем среду заменяют на бессывоторочную среду (90 мкл) и инкубируют при 37°С, 5% СО₂ в течение ночи.

Обработка и блокирование планшетов для ИФА

1. Планшеты для ИФА (фирмы Согшпд, номер по каталогу 25805-96) обрабатывают антителами к 16Б-1К, добавляя в каждую лунку по 0,5 мкг антител в 100 мкл РВ8, в течение по крайней мере 2 ч.

2. Раствор удаляют, заменяют его на 100 мкл блокирующего буфера и планшет встряхивают в течение 30 мин. Блокирующий буфер удаляют и планшет промывают непосредственно перед добавлением лизата.

Анализ

1. Лекарственные препараты тестируют в условиях отсутствия сыворотки.

2. Исходный раствор лекарственного средства (в 100% ДМСО) разбавляют 1:10 средой ЭМЕМ в 96-луночном полипропиленовом планшете и в каждую лунку планшета для культивирования тканей добавляют по 10 мкл указанного раствора, при этом конечное разбавление лекарственного средства составляет 1:100, а конечная концентрация ДМСО - 1%. Клетки и инкубируют при температуре 37°С, 5% СО2 в течение 2 ч.

3. Готовят свежий буфер для лизиса клеток (Н№Г6*)

Н№Г6	2 мл
Е(ОТА	0,1 мл
№13УО4	0,1 мл
№12(Р2О-)	0,1 мл
Н2О	7,3 мл
4. Через 2	ч инкубирования с лекарствен-

ными препаратами к клеткам добавляют лиганд 16Б-1, с концентрацией 200 нМ в РВ8, по 10 мкл в каждую лунку (конечная концентрация составляет 20 нМ) и инкубируют при температуре 37°С, 5% СО₂ в течение 10 мин.

5. Среду удаляют, добавляют буфер Н№Г6* по 100 мкл в каждую лунку и планшет встряхивают в течение 10 мин. Процесс лизиса контролируют под микроскопом.

6. При помощи 12-канальной автоматической пипетки клетки вымывают из лунок планшета и гомогенизируют лизат, набирая суспензию из лунки и выпуская ее в ту же лунку и повторяя эту операцию несколько раз. Весь лизат переносят в лунки обработанного антителами планшета для ИФА и встряхивают его в течение 1 ч.

7. Лизат удаляют, планшет промывают, в каждую лунку добавляют по 100 мкл антител к рТуг (разбавленных 1:3000 буфером ТВ8Т) и планшет встряхивают в течение 30 мин.

8. Антитела к рТуг удаляют, промывают планшет, добавляют антитела фирмы ТА6О (разбавленные 1:3000 буфером ТВ8Т) по 100 мкл на каждую лунку и встряхивают в течение 30 мин.

9. Для развития окрашивания проявляющие антитела удаляют, планшет промывают и в лунки добавляют по 100 мкл свежеприготовленного раствора АВТ8/Н₂О₂ (1,2 мкл Н₂О₂ в 10 мл раствора АВТ8).

Оптическую плотность измеряют на приборе Оупа1ес МК5000 при длине волны 410 нм, длина волны для сравнения 630 нм.

Определение активности Е6БК

Активность рецепторной киназы Е6Б в клетках, полученных методами генной инженерии и экспрессирующих Е6Б-К человека, определяют согласно методике, описанной ниже.

Материалы и реагенты

а. Лиганд Е6Б, исходная концентрация: 16,5 мкМ, Е6Б 201 фирмы ТОУОВО, Со., Ыа, Япония.

121

122

б. 05-101 (иВ1)(моноклональные антитела, специфичные к внеклеточному домену рецептора ЕСЕК).

в. Антитела к фосфотирозину (анти-Р(уг) (поликлоналыные).

г. Антитела для проявления: коньюгат с пероксидазой хрена козьих антител к 1дС кролика, фирмы ТАСО 1пс., ВшЕпдате, СА.

д. Буфер ТВ8Т:

Трис-НС1, рН 7 50 мМ №10’1 150 мМ

Тритон Х-100 0,1%

е. Исходный буфер НОТС 5Х:

НЕРЕ8 0,1 М №10’1 0,75 М

Глицерин 50%

Тритон Х-100 1,0%

ж. Исходный раствор АВТ8:

Лимонная кислота 100 мМ

ХаА'ОГ 250 мМ

НС1, конц. рН 4,0

АВТ8* 0,5 мг/мл

Раствор хранят в темном месте при 4°С до использования.

з. Исходные растворы:

БЭТА 100 мМ, рН 7,0

ХаА'ОГ 0,5 М \а₄(РС ) 0,2 М

Основные стадии метода

Предварительная обработка планшетов для ИФА

1. Планшеты для ИФА (фирмы Согшпд, 96-луночные, номер по каталогу #25805-96) покрывают антителами 05-101, добавляя по 0,5 мкг в каждую лунку в виде раствора в РВ8, конечный объем в лунке 150 мкл, и выдерживая при 4°С в течение ночи. При хранении при 4°С обработанные планшеты могут быть использованы в течение 10 дней.

2. В день использования обрабатывающий буфер удаляют и заменяют на блокирующий буфер (5%-ное быстрорастворимое обезжиренное молоко СагпаЕоп в РВ8). Планшеты инкубируют, встряхивая при комнатной температуре (приблизительно 23-25°С) в течение 30 мин. Непосредственно перед использованием блокирующий буфер удаляют и планшеты промывают четыре раза буфером ТВ8Т.

Пересев клеток

1. В данном эксперименте могут быть использованы клетки линии МН 3Т3/С7 (Нопеддег с соавт., Се11, 1987, 51:199-209).

2. Для анализа отбирают чашки Петри с 80-90%-ной конфлюэнтностью клеток. Клетки обрабатывают трипсином, реакцию останавливают добавлением 10%-ной С8 ΌΜΕΜ. Клетки суспендируют в среде ΌΜΕΜ (10% С8 ΌΜΕΜ) и однократно центрифугируют при 1000 об/мин при комнатной температуре в течение 5 мин.

3. Клетки ресуспендируют в среде для пересева (ΌΜΕΜ, 0,5% сыворотки быка) и число клеток подсчитывают с использованием краси теля трипана голубого. Для анализа отбирают клетки с жизнеспособностью более 90%. Клетки помещают в 96-луночный микропланшет в среде ΌΜΕΜ (0,5% ЕВ8), добавляя в каждую лунку по 10000 клеток в 100 мкл. Клетки инкубируют при 37°С, 5% СО₂ в течение 40 ч.

Определение активности

1. Пересеянные клетки проверяют на наличие загрязнений при помощи инвертированного микроскопа. Исходный раствор лекарственного средства (10 мг/мл в ДМСО) разбавляют 1:10 в среде ΌΜΕΜ, затем добавляют в каждую лунку по 5 мкл указанного раствора и буфер ТВ8Т, при этом конечное разбавление лекарственного средства составляет 1:200, а конечная концентрация ДМСО - 1%. В контрольные лунки добавляют только ДМСО. Инкубируют при 37°С, 5% СО2 в течение 1 ч.

2. Готовят раствор лиганда ΕСЕ: разбавляют исходный раствор ΕСЕ в ΌΜΕΜ с таким расчетом, чтобы при добавлении 10 мкл разбавленного раствора ΕСЕ (разведение 1:12) конечная концентрация составляла 25 нМ.

3. Готовят свежий раствор НОТС* в количестве, достаточном для добавления по 100 мкл в каждую лунку, в состав НОТС* входят: исходный раствор НОТС (2,0 мл), Н₂О ιηί11ί-0 (7,3 мл), 1:1)%% 100 мМ, рН 7,0 (0,5 мл), ХаА'СС. 0,5 М (0,1 мл) и №1₄(Р₂О-). 0,2 М (0,1 мл).

4. Раствор помещают на лед.

5. Через 2 ч инкубирования клеток с лекарственным средством в каждую лунку добавляют по 10 мкл полученного ранее раствора лиганда ΕСЕ, конечная концентрация в каждой лунке составляет 25 нМ. В контрольные лунки добавляют только ΌΜΕΜ. Инкубируют, встряхивая при комнатной температуре в течение 5 мин.

6. Удаляют лекарственное средство, ΕСЕ и ΌΜΕΜ. Клетки дважды промывают РВ8. К клеткам добавляют буфер НОТС*, по 100 мкл в каждую лунку. Планшет помещают на лед на 5 мин. Тем временем удаляют блокирующий буфер из лунок другого планшета для ИФА и промывают буфером ТВ8Т, как было описано ранее.

7. Клетки тщательно вымывают из лунок планшета с помощью автоматической микропипетки с плотно надетым наконечником (набирая суспензию из лунки и выпуская ее в ту же лунку и повторяя эту операцию несколько раз) буфером НОТС* для лизиса. Лизат переносят в лунки планшета для ИФА, предварительно обработанного антителами, блокирующим буфером и отмытого соответствующим буфером. Планшет инкубируют при встряхивании при комнатной температуре в течение 1 ч.

8. Лизат удаляют и промывают четыре раза буфером ТВ8Т. В каждую лунку планшета для ИФА добавляют по 100 мкл свежеприготовленного раствора антител к Р(уг. Инкубируют при встряхивании при комнатной температуре в течение 30 мин в присутствии сыворотки против

123

124

Р1у г (разбавленной в буфере ТВ8Т в соотношении 1:3000).

9. Антитела против Р1у г удаляют и лунки четыре раза промывают буфером ТВ8Т. В каждую лунку планшета для ИФА добавляют по 100 мкл свежеразбавленного раствора антител ТАС0 30 к 1дС кролика фирмы ТАС0. Инкубируют при встряхивании при комнатной температуре в течение 30 мин (разбавление антител против 1дС кролика в буфере ТВ8Т составляет 1:3000).

10. Использованные для проявления антитела удаляют и лунки промывают четыре раза буфером ТВ8Т. В каждую лунку планшета для ИФА добавляют по 100 мкл свежеприготовленного раствора АВТ8/Н₂0₂. Инкубируют при встряхивании при комнатной температуре в течение 20 мин. (Раствор АВТ8/Н₂0₂: 1,2 мкл 30%-ной Н₂О₂ в 10 мл исходного раствора АВТ8).

11. Реакцию останавливают добавлением 50 мкл раствора 5 н. Н₂80₄ (по выбору) и определяют оптическую плотность при длине волны 410 нм.

12. Максимальную величину сигнала фосфотирозина определяют путем вычитания значений отрицательных контролей из значений положительных контролей. Затем после вычитания значений отрицательных контролей рассчитывают процент ингибирования фосфорилирования по уменьшению количества фосфотирозина для лунок, содержащих экстракт.

Определение автофосфорилирования киназы Ме1

Данный анализ используют для определения активности тирозинкиназы Ме1 путем определения уровня активности протеинтирозинкиназы Ме1 с использованием рецептора Ме1.

Реагенты

а. ΗNТ6 (исходный раствор 5Х). Растворяют 23,83 г НЕРЕ8 и 43,83 г №101 приблизительно в 350 мл дН₂0, рН доводят до 7,2 при помощи НС1 или №10Н. добавляют 500 мл глицерина и 10 мл тритона Х-100, перемешивают, добавляют ά^0 до конечного объема 1 л. Для получения 1 л рабочего раствора к 800 мл ά^0 добавляют 200 мл исходного раствора 5Х, измеряют рН, если необходимо, доводят до требуемой величины рН, хранят при 4°С.

б. РВ8 (буферный раствор, содержащий фосфаты и №101) (Эи1Ьессо), фирмы С1Ьсо, номер по каталогу # 450-1300ЕВ (раствор 1Х).

в. Блокирующий буфер: в 500 мл ά^0 растворяют 100 г В8А, 12,1 г Трис (рН 7,5), 58,44 г №С1 и 10 мл твин-20, разбавляют до конечного объема 1 л.

г. Буфер для растворения киназы: к 500 мл ά^0 добавляют 12,1 г трис (рН 7,2), 58,4 г №01, 40,7 г МдС1₂ и 1,9 г ЕСТА, доводят ά^0 до конечного объема 1 л.

д. РМ8Е (фенилметилсульфонилфторид), фирмы 81дта, номер по каталогу # Р-7626, к

435,5 мг РМ8Е добавляют 100%-ный этанол до конечного объема 25 мл, перемешивают на мешалке типа Уойех.

е. АТФ (бактериального происхождения), фирмы 81дта, номер по каталогу # А-7699, хранят при температуре -20°С в виде порошка; чтобы приготовить рабочий раствор, растворяют 3,31 мг в 1 мл ά^0.

ж. Коньюгатантител к фосфотирозину ЕС20Н НЕР0, фирмы Тгаг^ископ ЬаЬога1ог1е8, номер по каталогу # Е120Н.

з. Реактив 1-81ер ™ ТигЬо ТМВ-ЕЫ8А (3,3',5,5'-тетраметилбензидин), фирмы Р1егсе, номер по каталогу # 34022.

и. Н₂80₄, добавляют 1 мл концентрированной (18 н.) кислоты к 35 мл ά^0.

к. Трис НС1, фирмы Е18Йег, номер по каталогу # ВР152-5; к 121,14 г трис добавляют 600 мл Н₂О МИИр, рН доводят раствором НС1 до 7,5 (или 7,2), объем доводят до 1 л Н₂О М1Шр.

л. №0, фирмы Е18Йег, номер по каталогу # 8271-10, готовят 5 М раствор.

м. Твин-20, фирмы Е18Йег, номер по каталогу # 8337-500.

н. NазVΟ₄ фирмы Е18Йег, номер по каталогу # 8454-50; к 1,8 г соли добавляют 80 мл Н₂О МШ1р, рН доводят до 10,0 раствором НС1 или №0Н, кипятят в микроволновой печи, охлаждают, измеряют рН, повторяют доведение рН тех пор, пока рН раствора (равное 10) не изменяется при повторении цикла нагревание/охлаждение, общий объем раствора доводят до 100 мл Н₂О МИИр, разделяют на аликвоты по 1 мл, хранят при температуре -80°С.

о. МдС1₂, фирмы Е18Йег, номер по каталогу # М33-500, готовят 1 М раствор.

п. НЕРЕ8, фирмы Е18Йег, номер по каталогу # ВР310-500: к 200 мл Н₂О МИПО добавляют 59,6 г НЕРЕ8, рН доводят до 7,5, доводят конечный объем до 250 мл, стерилизуют фильтрованием.

р. Альбумин, бычий (В 8 А), фирмы 81дта, номер по каталогу # А-4503; к 30 г В8А добавляют стерильную дистиллированную воду до конечного объема 300 мл, хранят при температуре 4°С.

с. Буфер ТВ8Т: в мерный цилиндр объемом 1 л наливают примерно 900 мл ά^0, добавляют 6,057 г трис и 8,766 г №0, твердые вещества растворяют, рН доводят до 7,2 раствором НС1, добавляют 1,0 мл тритона Х-100 и общий объем раствора доводят до 1 л ά^0.

т. Козьи антитела к 1§С кролика, очищенные аффинной хроматографией (нативные молекулы), фирмы Сарре1, номер по каталогу # 55641.

у. Поликлональные антитела 1дС кролика к 11-Ме1 (С-28), фирмы 8ап1а Сп.^ Сйеппсак номер по каталогу # 8С-161.

ф. Нестабильные гибридные клетки, трансфектные Е6ЕЕ/Ме1 (ЕМЕ) (Кοтаάа с соавт., 0псодепе, 8:2381-2390, (1993).

125

126

х. Натрий-карбонатный буфер, (№ьСО₃), фирмы Р1кйег, номер по каталогу # 8495): к 10,6 г соли добавляют 800 мл Н₂О М|Шр, после растворения рН раствора доводят до 9,6 при помощи №1ОН, общий объем раствора доводят до 1 л Н₂О М|Шр, фильтруют, хранят при 4°С.

Основные стадии метода

Все описанные ниже операции проводят при комнатной температуре, если особо не оговорено. Все планшеты для ИФА промывают 4 раза буфером ТВ8Т.

Лизис клеток ЕМК

Эту операцию проводят накануне вечером или непосредственно перед началом связывания с рецептором.

1. Лизаты быстро размораживают на водяной бане при температуре 37°С, перемешивая вращательными движениями до исчезновения последних кристаллов.

2. Осадок клеток лизируют с использованием буфера НОТС 1Х, содержащего 1 мМ РМ8Р. Для обработки одной чашки Петри диаметром 15 см необходимо 3 мл буфера НNТС. В пробирку с осадком добавляют половину рассчитанного количества буфера НКГС, пробирку встряхивают на мешалке типа Уойех в течение 1 мин, добавляют оставшееся количество буфера НКГС, встряхивают еще 1 мин.

3. Пробирки уравновешивают и центрифугируют при 10000 х д в течение 10 мин при 4°С.

4. Супернатанты объединяют, отбирают аликвоту для определения концентрации белка.

5. Объединенные образцы быстро замораживают в смеси этанола и сухого льда. Эту операцию выполняют в любом случае независимо от того, будет ли лизат храниться в течение ночи или будет использоваться сразу после определения концентрации белка.

6. Содержание белка определяют стандартным методом с использованием бицинхониновой кислоты (ВСА) (набор реагентов для анализа ВСА производства фирмы Р1егсе Сйетка1, номер по каталогу 23225).

Иммуноферментный анализ (ИФА)

1. 96-луночные планшеты для ИФА обрабатывают раствором козьих антител против антител кролика в карбонатном буфере (добавляют по 5 мкг антител в 50 мкл буфера в каждую лунку). Хранят в течение ночи при 4°С.

2. Несвязанные кроличьи антитела против антител кролика удаляют, опрокидывая планшеты и выливая раствор.

3. В каждую лунку добавляют по 150 мкл блокирующего буфера, инкубируют в течение 30 мин при встряхивании.

4. Планшет промывают 4 раза раствором ТВ8Т. Чтобы удалить избыток раствора и пузырьки воздуха, планшетом постукивают по бумажной салфетке.

5. В каждую лунку добавляют кроличьи антитела апй-Ме!, разбавленные в растворе ТВ8Т (по 1 мкг в 100 мкл).

6. Лизат разбавляют раствором НОТС (90 мкг лизата/100 мкл).

7. В каждую лунку добавляют по 100 мкл разбавленного лизата, встряхивают в течение 60 мин.

8. Планшет промывают 4 раза раствором ТВ8Т. Чтобы удалить избыток раствора и пузырьки воздуха, планшетом постукивают по бумажной салфетке.

9. В каждую лунку добавляют по 50 мкл буфера для лизиса 1Х.

10. Соединения/экстракты разбавляют 1:10 в буфере 1Х для расворения киназы в полипропиленовом 96-луночном планшете.

11. Переносят по 5,5 мкл разбавленного соединения в лунки планшета для ИФА. Инкубируют при комнатной температуре при встряхивании в течение 20 мин.

12. В каждую лунку добавляют по 5,5 мкл 60 мкМ раствора АТФ. В лунки с отрицательным контролем раствор АТФ не добавляют. Инкубируют в течение 90 мин при встряхивании.

13. Планшет промывают 4 раза раствором ТВ8Т. Чтобы удалить избыток раствора и пузырьки воздуха, планшетом постукивают по бумажной салфетке.

14. В каждую лунку добавляют по 100 мкл конъюгата КС20 (разбавление 1:3000 в блокирующем буфере). Инкубируют в течение 30 мин при встряхивании.

15. Планшет промывают 4 раза раствором ТВ8Т. Чтобы удалить избыток раствора и пузырьки воздуха, планшетом постукивают по бумажной салфетке.

16. В каждую лунку добавляют по 100 мкл ТигЫо-ТМВ. Инкубируют в течение 30-60 мин при встряхивании.

17. Чтобы остановить реакцию, в каждую лунку добавляют по 100 мкл 1М раствора серной кислоты.

18. Данные анализа считывают на ридере Эупа1ес11 МК7000 ЕЫ8А. Фильтр для тестирования при 450 нм, фильтр для сравнения при 410 нм.

Биохимическое исследование активности киназы кгс

Данное исследование используют для определения активности протеинкиназы кгс путем измерения степени фосфорилирования биотинилированного пептида, используемого в качестве индикатора.

Материалы и реагенты

а. Дрожжевые клетки, трансформированные киназой кгс (производства фирмы 8идеп 1пс., Кебтеооб Сйу, Калифорния).

б. Клеточные лизаты: дрожжевые клетки, экспрессирующие киназу кгс, осаждают центрифугированием, промывают один раз водой, снова осаждают центрифугированием и хранят при -80°С до использования.

в. Биотинилированный по Ν-концевому остатку пептид ЕЕЕУЕЕУЕЕЕУЕЕЕУЕЕЕУ

127

128 получают по стандартной методике, хорошо известной специалистам в данной области техники.

г. ДМСО производства фирмы 8щта, 81.Ьошз, МО.

д. 96-луночный планшет для ИФА (Согшпд 96 ^е11 Еазу \УазВ) с модифицированным плоским дном производства фирмы Согшпд, номер по каталогу 25805-96.

е. 96-луночные полипропиленовые планшеты с У-образным дном фирмы Шпс, Аррйед 8с1еп1Шс, номер по каталогу А-72092, используют для разбавления соединений.

ж. Реагент Уесаз!аш ЕЫТЕ АВС, Уес1ог, ВшЕпдате, СА.

з. Моноклональные антитела (таЬ) антизгс (327): для экспрессии рекомбинантного 8гс используют 8с1^озасс11аготусез РотЬе (см. статью 8ирегй-Еигда с соавт., ЕМВО I., 12:26252634, 8ирегй-Еигда с соавт., №1иге ВюсБет., 14:600-605). Штамм 8. РотЬе 8Р200 (1-з 1еи1.32 ига4 аде210) выращивают как описано, а трансформацию проводят с использованием плазмид с экспрессией рК8Р и литийацетатного метода (см. статьи 8ирегй-Еигда выше). Клетки выращивают в присутствии 1 мкМ тиамина для подавления экспрессии промотера пт11 или в отсутствии тиамина для индукции экспрессии.

и. Моноклональные антитела к фосфотирозину, ИВ1 05-321 (могут быть также использованы антитела ИВ40).

к. Субстрат пероксидазы ТигЬо ТМВЕЫ8А производства фирмы Р1егсе СБет1са1.

Буферные растворы

а. Буфер РВ8 (фосфатный буфер, содержащий хлористый натрий, ОЫЬессо), С1Ьсо РВ8 производства фирмы С1Ьсо, номер по каталогу 450-1300ЕВ.

б. Блокирующий буфер: 5% обезжиренное молоко (Сагпайоп) в буфере РВ8.

в. Карбонатный буфер: №ьСО₃ производства фирмы ПзсБег, номер по каталогу 8495, готовят исходный 100 мМ буферный раствор.

г. Буфер для растворения киназы: смешивают 1,0 мл исходного 1М раствора МдС1₂, 0,2 мл исходного 1М раствора МпС12, 0,2 мл исходного 1М раствора ΌΤΤ, 5,0 мл исходного 1М раствора НЕРЕ8, 0,1 мл ТХ-100 и добавляют воду МПНО до общего объема 10 мл.

д. Буфер для лизиса: смешивают 5,0 мл исходного 1М раствора НЕРЕ8, 2,74 мл исходного 5М раствора №С1, 10 мл глицерина, 1,0 мл ТХ100, 0,4 мл исходного 100 мМ раствора ЕЭТА, 1,0 мл исходного 100 мМ раствора РМ8Е, 0,1 мл исходного 0,1 М раствора №₃УО₄ и добавляют воду МПНО до общего объема 100 мл.

е. АТФ, производства фирмы 8щта, номер по каталогу А-7699: готовят 10 мМ исходный раствор (5,51 мг/мл).

ж. Трис-НС1, производства фирмы Изсйег, номер по каталогу ВР 152-5: 121,14 г Трис-НС1 добавляют в 600 мл воды МИНО, раствор тит руют НС1 до рН 7,5 и добавляют воду МПНО до общего объема 1 л.

з. №С1, производства фирмы ПзсБег, номер по каталогу 8271-10: готовят исходный 5М раствор в воде МПНр.

и. №1₃УО,| производства фирмы ПзсБег, номер по каталогу 8454-50, 1,8 г соли добавляют к 80 мл воды МПНО, рН раствора доводят НС1 или №ОН до рН 10,0, кипятят в микроволновой печи, охлаждают, измеряют рН, повторяют доведение рН до тех пор, пока рН раствора (равное 10) не изменяется при повторении цикла нагревание/охлаждение, общий объем раствора доводят до 100 мл водой МИНО, отбирают аликвоты по 1 мл и хранят их при -80°С.

к. МдС1₂, производства фирмы Изсйег, номер по каталогу М33-500: готовят исходный 1М раствор в воде МПНр.

л. НЕРЕ8, производства фирмы ПзсБег, номер по каталогу ВР 310-500: 59,6 г соли добавляют в 200 мл воды МИНО, рН доводят до 7,5, общий объем раствора доводят до 250 мл водой МИНО и фильтруют через стерильный фильтр (исходный 1М раствор).

м. Буфер ТВ8Т: в 900 мл дН2О добавляют 6,057 г Трис и 8,766 г №С1, рН раствора доводят НС1 до 7,2, добавляют 1,0 мл тритона Х100, общий объем раствора доводят до 1 л дН2О.

н. МпС1₂, производства фирмы ПзсБег, номер по каталогу М87-100: готовят исходный 1М раствор в воде МПНр.

о. ОТТ, производства фирмы ПзсБег, номер по каталогу ВР172-5.

п. Буферный раствор ТВ8 (раствор трис, содержащий хлористый натрий): в 900 мл воды МПНО добавляют 6,057 г трис и 8,777 г №С1, общий объем доводят до 1 л водой МИНО.

р. Реакционная смесь для определения киназной активности (количество, необходимое для добавления в 100 лунок одного планшета): 1,0 мл буфера для растворения киназы, 200 мкг С8Т-/, общий объем доводят до 8,0 мл водой М1Шр.

с. Меченый биотином ЕЕЕУЕЕУЕЕЕУ ЕЕЕУЕЕЕУ: каждый раз перед использованием готовят свежий исходный 1 мМ раствор пептида (2,98 мг/мл) в воде.

т. Реагент Уес1аз1ат ЕЫТЕ АВС: Для приготовления 14 мл рабочего раствора добавляют 1 каплю реагента А в 15 мл раствора ТВ8Т и полученный раствор перемешивают, переворачивая пробирку несколько раз. Затем добавляют 1 каплю реагента В, пробирку помещают в круговую качалку и перемешивают при комнатной температуре в течение 30 мин.

Основные стадии метода

Обработка планшета для ИФА киназой згс

1. В каждую лунку планшета для ИФА добавляют раствор таЬ анти-згс (по 0,5 мкг в 100 мкл натрий карбонатного буфера, рН 9,6) и выдерживают при 4°С в течение ночи.

129

130

2. Лунки промывают один раз буфером РВ8.

3. Планшет блокируют, добавляя в лунки по 0,15 мл 5% молока в РВ8 и выдерживая планшет при комнатной температуре в течение 30 мин.

4. Планшет промывают 5 раз РВ8.

5. В каждую лунку добавляют по 10 мкг лизата 8гс-трансформированных дрожжевых клеток, разбавленного буфером для лизиса (конечный объем в одной лунке - 0,1 мл). Количество лизата может изменяться от партии к партии. Планшет встряхивают при комнатной температуре в течение 20 мин.

Обработка планшета для ИФА антителами к фосфотирозину

1. Планшет 4010: в каждую лунку добавляют по 0,5 мкг антител 4010 в 100 мкл РВ8 и выдерживают при 4°С в течение ночи, затем блокируют планшет, добавляя по 150 мкл 5% молока в РВ8 и инкубируя планшет при комнатной температуре в течение 30 мин.

Определение киназной активности

1. Несвязанные белки удаляют и планшет промывают 5 раз раствором РВ8.

2. В каждую лунку добавляют по 0,08 мл реакционной смеси для определения киназной активности, содержащей 10 мкл исходного буфера 10Х для растворения киназы и 10 мкМ (конечная концентрация) биотинилированного пептида ΕΕΕΥΕΕΥΕΕΕΥΕΕΕΥΕΕΕΥ, разбавленного в воде.

3. В каждую лунку добавляют по 10 мкл раствора соединения в воде, содержащей 10% ДМСО, и предварительно инкубируют в течение 15 мин при комнатной температуре.

4. Инициируют киназную реакцию путем добавления в каждую лунку по 10 мкл 0,05 мМ раствора АТФ в воде (конечная концентрация АТФ - 5 мкМ).

5. Планшет для ИФА встряхивают в течение 15 мин при комнатной температуре.

6. Киназную реакцию останавливают путем добавления в каждую лунку по 10 мкл 0,5 М раствора ΕΌΤΑ.

7. Переносят по 90 мкл супернатанта в лунки блокированного планшета для ИФА, обработанного антителами 4010.

8. Инкубируют при встряхивании при комнатной температуре в течение 30 мин.

9. Планшет промывают 5 раз раствором ΊΒ8Τ.

10. Инкубируют после добавления реагента Уес1а81аю ΕΜΤΕ АВС (по 100 мкл в каждую лунку) в течение 30 мин при комнатной температуре.

11. Лунки промывают 5 раз раствором ΊΒ8Τ.

12. Реакцию проявляют реактивом ΤϋΛο 'ГМВ.

Биохимическое исследование активности киназы 1ск

Данное исследование используют для определения активности протеинкиназы 1ск путем измерения степени фосфорилирования 08Τ-ζ, используемого в качестве индикатора.

Материалы и реагенты

а. Дрожжевые клетки, трансформированные киназой 1ск. Для экспрессии рекомбинантного 1ск используют 8с1^о8асс11аготусе8 РотЬе (см. статью 8ирег11-Еигда с соавт., ΕΜВΟ 1., 12:2625-2634, 8ирегй-Ецгда с соавт., ΝαΙιιΐΐ Вюскет., 14:600-605). Штамм 8. РотЬе 8Р200 (1-8 1еи1.32 ига4 аάе210) выращивают, как описано, а трансформацию проводят с использованием плазмид с экспрессией рВ8Р и литийацетатного метода (см. статьи 8ирег11-Еигда выше). Клетки выращивают в присутствии 1 мкМ тиамина для индукции экспрессии.

б. Клеточные лизаты: дрожжевые клетки, экспрессирующие киназу 1ск, осаждают центрифугированием, промывают один раз водой, снова осаждают центрифугированием и до использования хранят при -80°С.

в. 08Τ-ζ: гибридный белок, содержащий кодирующую 08Τ-ζ ДНК, для экспрессии в бактериях, предоставлен Аг11иг \Уе188 из медицинского института Но\уогй Нцд1е8 при Калифорнийском университете, Сан-Франциско. Трансформированные бактерии выращивают в течение ночи при встряхивании при 25°С. 08Τζ очищают методом аффинной хроматографии на иммобилизованном глутатионе производства фирмы Фармация, Α1атеάа, СА.

г. ДМСО производства фирмы 81дта, 8ΐ. Ьош8, МО.

д. 96-луночный планшет для ИФА (Согшпд 96 ^е11 Εа8у \Уа811) с модифицированным плоским дном производства фирмы Согшпд, номер по каталогу 25805-96.

е. 96-луночные полипропиленовые планшеты с У-образным дном фирмы Νιιικ, Ацц^й 8с1еп(1Пс, номер по каталогу А8-72092.

ж. Очищенная кроличья антисыворотка анти-08Τ производства фирмы Анной Согр. (Австралия), номер по каталогу 90001605.

з. Козьи антитела против 1д0-НЯР кролика производства фирмы АтегаЬат, номер по каталогу У010301.

и. Овечьи антитела против 1д0 мыши (Н+Ь) производства фирмы 1аск8оп ЬаЬ8, номер по каталогу 5215-005-003.

к. МаЬ к киназе Ьск апН-Ьск (3А5) производства фирмы 8аШа ί’πιζ В|о1есНпо1оду, номер по каталогу 8с-433.

л. МаЬ к фосфотирозину, ИВ1 05-321 (могут быть также использованы анитела ИВ40).

Буферные растворы

а. Буфер РВ8 (фосфатный буфер, содержащий хлористый натрий, ЭиНессо), 01Ьсо РВ8

131

132 производства фирмы С1Ьсо, номер по каталогу 450-1300ЕВ.

б. Блокирующий буфер: 100 г БСА, 12,1 г Трис (рН 7,5), 58,44 г ЫаС1, 10 мл Твин-20, общий объем раствора доводят до 1 л водой М1111Ω.

в. Карбонатный буфер: №ьСО₃ производства фирмы Р1ксЬег, номер по каталогу 8495, готовят исходный 100 мМ раствор в воде М1Шр.

г. Буфер для растворения киназы: смешивают 1,0 мл исходного 1М раствора МдС1₂, 0,2 мл исходного 1М раствора МпС12, 0,2 мл исходного 1М раствора ЭТТ, 5,0 мл исходного 1М раствора НЕРЕ8, 0,1 мл ТХ-100 и добавляют воду МПНО до общего объема 10 мл.

д. Буфер для лизиса: смешивают 5,0 мл исходного 1М раствора НЕРЕ8, 2,74 мл исходного 5М раствора №1С1, 10 мл глицерина, 1,0 мл ТХ100, 0,4 мл исходного 100 мМ раствора ЕЭТА, 1,0 мл исходного 100 мМ раствора РМ8Р, 0,1 мл исходного 0,1 М раствора Ыа₃УО₄ и добавляют воду МПНО до общего объема 100 мл.

е. АТФ, производства фирмы 81дта, номер по каталогу А-7699: готовят 10 мМ исходный раствор (5,51 мг/мл).

ж. Трис-НС1, производства фирмы РксЬег, номер по каталогу ВР 152-5: 121,14 г Трис-НС1 добавляют в 600 мл воды Мййр, раствор титруют НС1 до рН 7,5 и добавляют воду Мййр до общего объема 1 л.

з. №1С1, производства фирмы Р1ксЬег, номер по каталогу 8271-10: готовят исходный 5М раствор в воде Мййр.

и. Ыа₃УО₄ производства фирмы Р1ксЬег, номер по каталогу 8454-50, 1,8 г соли добавляют к 80 мл воды Мййр, рН раствора доводят НС1 или №1ОН до рН 10,0, кипятят в микроволновой печи, охлаждают, измеряют рН, повторяют доведение рН до тех пор, пока рН раствора (равное 10) не изменяется при повторении цикла нагревание/охлаждение, общий объем раствора доводят до 100 мл водой Мййр, отбирают аликвоты по 1 мл и хранят их при -80°С.

к. МдС1₂, производства фирмы Р1ксЬег, номер по каталогу М33-500: готовят исходный 1М раствор в воде Мййр.

л. НЕРЕ8, производства фирмы РксЬег, номер по каталогу ВР 310-500: 59,6 г соли добавляют в 200 мл воды Мййр, рН доводят до 7,5, общий объем раствора доводят до 250 мл водой Мййр и фильтруют через стерильный фильтр (исходный 1М раствор).

м. Альбумин бычий сывороточный (БСА) производства фирмы 81дта, номер по каталогу А4503: 30 г белка добавляют в 150 мл воды М111ίΩ, общий объем доводят до 300 мл водой М11йр, фильтруют через фильтр с диаметром пор 0,22 мкм, хранят при 4°С.

н. Буфер ТВ8Т: в 900 мл йН2О добавляют 6,057 г Трис и 8,766 г №1С1, рН раствора доводят НС1 до 7,2, добавляют 1,0 мл тритона Х100, общий объем раствора доводят до 1 л йН2О.

o. МпС1₂, производства фирмы РксЬег, номер по каталогу М87-100: готовят исходный 1М раствор в воде Мййр.

п. ЭТТ, производства фирмы Р1ксЬег, номер по каталогу ВР172-5.

p. Буферный раствор ТВ8 (раствор трис, содержащий хлористый натрий): в 900 мл воды Мййр добавляют 6,057 г трис и 8,777 г ЫаС1, общий объем доводят до 1 л водой Мййр.

с. Реакционная смесь для определения киназной активности (количество, необходимое для добавления в 100 лунок одного планшета): 1,0 мл буфера для растворения киназы, 200 мкг С8Т-Е общий объем доводят до 8,0 мл водой М1Шр.

Основные стадии метода

Обработка планшета для ИФА киназой Ьск

1. В каждую лунку планшета для ИФА добавляют раствор овечьих антител против 1дС мыши (по 2,0 мкг в 100 мкл натрий карбонатного буфера, рН 9,6) и выдерживают при 4°С в течение ночи.

2. Лунки промывают один раз буфером РВ8.

3. Планшет блокируют, добавляя в лунки по 0,15 мл блокирующего буфера и выдерживая планшет при комнатной температуре в течение 30 мин.

4. Планшет промывают 5 раз РВ8.

5. В каждую лунку добавляют по 0,5 мкг антител против Ьск (таЬ 3А5) в 0,1 мл РВ8 и выдерживают при комнатной температуре в течение 1-2 ч.

6. Планшет промывают 5 раз раствором РВ8.

7. В каждую лунку добавляют по 20 мкг лизата 1ск-трансфомированных дрожжевых клеток, разбавленного буфером для лизиса (конечный объем в одной лунке - 0,1 мл). Планшет встряхивают при 4°С в течение ночи для предотвращения потери активности.

Обработка планшета для ИФА антителами к фосфотирозину

1. Планшет ИВ40: в каждую лунку добавляют по 1,0 мкг антител ИВ40 в 100 мкл РВ8 и выдерживают при 4°С в течение ночи, затем блокируют планшет, добавляя по 150 мкл блокирующего буфера и инкубируя планшет в течение по крайней мере 1 ч.

Определение киназной активности

1. Несвязанные белки удаляют и планшет промывают 5 раз раствором РВ8.

2. В каждую лунку добавляют по 0,08 мл реакционной смеси для определения киназной активности, содержащей 10 мкл исходного буфера 10Х для растворения киназы и 2 мкг С8Тζ, разбавленного водой.

3. В каждую лунку добавляют по 10 мкл раствора соединения в воде, содержащей 10% ДМСО, и предварительно инкубируют в течение 15 мин при комнатной температуре.

133

134

4. Инициируют киназную реакцию путем добавления в каждую лунку по 10 мкл 0,1 мМ раствора АТФ в воде (конечная концентрация АТФ - 10 мкМ).

5. Планшет для ИФА встряхивают в течение 60 мин при комнатной температуре.

6. Киназную реакцию останавливают путем добавления в каждую лунку по 10 мкл 0,5 М раствора ΞΌΤΑ.

7. Переносят по 90 мкл супернатанта в лунки блокированного планшета для ИФА, обработанного антителами 4С10, как указано в разделе Б выше.

8. Инкубируют при встряхивании при комнатной температуре в течение 30 мин.

9. Планшет промывают 5 раз раствором ΤΒ3Τ.

10. Инкубируют после добавления в каждую лунку по 100 мкл кроличьих антител против 63Τ, разбавленных раствором ΤΒ3Τ в соотношении 1:5000, в течение 30 мин при комнатной температуре.

11. Лунки промывают 5 раз раствором ΤΒ3Τ.

12. Инкубируют после добавления в каждую лунку по 100 мкл козьих антител против 1дС кролика, аηί^-^аЬЬ^ΐ-IдС-ΗКΡ, разбавленных раствором ΤΒ3Τ в соотношении 1:20000, в течение 30 мин при комнатной температуре.

13. Планшет промывают 5 раз раствором ΤΒ3Τ.

14. Реакцию проявляют реактивом ΤιιγΕο Έ^Β.

Определение Фосфорилирующей функции белка КАР

Следующий метод исследования предназначен для определения степени КАЕкатализируемого фосфорилирования белкамишени МЕК, а также белка МАРК - мишени белка МЕК. Последовательность гена КАЕ описана в статье ΒοππβΓ с соавт., 1985, Мо1ес. Се11. Βίο1., 5:1400-1407, указанную последовательность можно легко найти в банке данных по последовательностям многочисленных генов. Конструкция вектора РНК и клеточных линий, использованных в настоящем изобретении, полностью описаны в статье Мот8оп с соавт., 1988, Ρι-ос. N811. Αсаά. 8с1. ИЗА, 85:8855-8859.

Материалы и реагенты

1. Клетки ЗГ9 (δροάορίΌΐΉ ЕгидреМа), производства фирмы ΟΙΒίΌ-ΒΚΕ, Саййег8Ьигд, МО.

2. Буферный раствор К1ЯА: 20 мМ Трис/НС1, рН 7,4, 137 мМ №С1, 10% глицерин, 1 мМ ЯМБЕ, 5 мг/л апротенина, 0,5% тритон Х100.

3. Гибридный белок тиоредоксин-МЕК(ТМЕК), экспрессию белка Т-МЕК и его очистку аффинной хроматографией проводят согласно рекомендациям фирмы-производителя. Номер по каталогу К 350-01 и К 350-40, фирма ΙηνίΐΓΟдеп Согр., Зап О1едо, СА.

4. Н18-МАЕК (ЕКК 2), белок МАРК с включенным гистидиновым фрагментом экспрессируют в клетках ХЬ1 Β1ικ, трансформированных вектором рИС18, кодирующим Н18МΑΡК. Белок Н|8-МАЕК очищают N1аффинной хроматографией. Номер по каталогу 27-4949-01, производства фирмы Фармация, Α1атеάа, СА, как описано в данном описании.

5. Овечьи антитела против 1дС мыши производства фирмы 1аск8оп 1аЬога1опе8, Ае81 Стюе, ΡΑ. Номер по каталогу 515-006-008, номер партии 28563.

6. Антитела, специфичные к протеинкиназе КАЕ-1, υКΡ2653 фирмы ϋΒΙ.

7. Буферный раствор для нанесения на планшеты: фосфатный буфер, содержащий хлористый натрий, производства фирмы СШСОΒΡΕ, Саййег8Ьигд, МО.

8. Буферный раствор для промывки, ΤΒ3Τ (50 мМ трис/НС1, рН 7,2, 150 мМ №С1, 0,1% тритон Х-100).

9. Блокирующий буфер: ΤΒ3Τ, 0,1% этаноламин, рН 7,4.

10. ДМСО, производства фирмы З1дта, 3ΐ. Ьош8, МО.

11. Буфер для растворения киназы (КБ): 20 мМ НЕКЕЗ/На, рН 7,2, 150 мМ №С1, 0,1% тритон Х-100, 1 мМ ΡМЗЕ, 5 мг/л апротенина, 75 мМ ортованадат натрия, 0,5 мМ ΌΤΤ и 10 мМ МдС12.

12. Смесь АТФ: 100 мМ МдС1₂, 300 мМ АТФ, 10 мКи у³³Р АТФ (фирмы Эироп1^Ц)/мл.

13. Буфер для остановки реакции: 1% раствор фосфорной кислоты производства фирмы Е18Йег, ΡίΙΐ8Ειιι^1ι, ΡΑ.

14. Полоски фильтровальной бумаги из фосфата целлюлозы производства фирмы Vа11ас, Лигки, Финляндия.

15. Раствор для промывки фильтров: 1% раствор фосфорной кислоты производства фирмы Е18Йег, ΡίΙ^Ειιι^Ιι, ΡΑ.

16. Прибор для сбора клеток 1от!ес р1а!е 11аг\'е81ег, производства фирмы Vа11ас, ΤνίΓίαι, Финляндия.

17. Ридер для планшетов Ье!а р1а!е ^еаάе^. номер по каталогу 1205, производства фирмы Vа11ас, Τικίαι, Финляндия.

18. 96-луночные полипропиленовые планшеты NυNС с У-образным дном для соединений, производства фирмы Αρρ1^еά ЗаепШю, номер по каталогу АЗ-72092.

Методика

Все следующие стадии проводят при комнатной температуре, если особо на оговорено.

1. Нанесение антител на планшет для ИФА: в каждую лунку добавляют по 100 мкл овечьей антисыворотки против 1дС мыши, очищенной аффинной хроматографией (1 мг/100 мл буфера для нанесения) и планшет инкубируют в течение ночи при 4°С. Полученные планшеты

135

136 можно использовать в течение двух недель при хранении при 4°С.

2. Планшет переворачивают и удаляют жидкость. Добавляют по 100 мкл блокирующего раствора и инкубируют в течение 30 мин.

3. Блокирующий раствор удаляют и планшет промывают буфером для промывки 4 раза. Избыток жидкости удаляют, постукивая планшетом по бумажной салфетке.

4. В каждую лунку добавляют по 1 мкг антител, специфичных к ВАЕ и инкубируют в течение 1 ч. Промывают, как указано на стадии 3.

5. Лизаты клеток 8Г9. инфицированных ВА8/ВАЕ, размораживают и разбавляют раствором ТВ8Т до концентрации 10 мг/100 мл. В каждую лунку добавляют по 10 мкг разбавленного лизата и инкубируют в течение 1 ч при встряхивании. В лунки с отрицательным контролем лизат не добавляют. Лизаты клеток насекомых 8Г9, инфицированных ВА8/ВАЕ, получают после инфицирования клеток рекомбинантными бакуловирусами, причем множественность заражения (МО1) составляет 5 для каждого вируса, и после сбора клеток через 48 ч. Клетки промывают 1 раз раствором РВ8 и лизируют в буфере В1РА. Нерастворимый материал удаляют центрифугированием (5 мин при 10000 хд). Аликвоты лизатов замораживают в смеси сухой лед/этанол и хранят при -80°С до использования.

6. Несвязанный материал удаляют и планшет промывают, как указано выше (стадия 3).

7. В каждую лунку добавляют по 2 мкг ТМЕК и по 2 мкг Н18-МАРК и общий объем доводят до 40 мкл буфером для растворения киназы. Методы очистки белков Т-МЕК и МАРК из клеточных экстрактов описаны в примерах.

8. Соединения (исходный раствор 10 мг/мл ДМСО) или экстракты предварительно разбавляют в 20 раз раствором ТВ8Т, содержащим 1% ДМСО. В лунки, описанные на стадии 6, добавляют по 5 мкл предварительного разбавленного раствора соединения/эктракта. Инкубируют в течение 20 мин. В контрольные лунки лекарственное средство не добавляют.

9. Инициируют киназную активность путем добавления по 5 мкл смеси АТФ, планшеты инкубируют при встряхивании на качалке для планшет ИФА.

10. Киназную реакцию останавливают через 60 мин путем добавления в каждую лунку по 30 мкл раствора для остановки реакции.

11. Полоску фильтровальной бумаги из фосфоцеллюлозы и планшет помещают в прибор для сбора клеток Тот1ес р1а1е Наг\'С81сг. Клетки собирают и полоски бумаги промывают буфером для промывки фильтров согласно рекомендациям фирмы-изготовителя. Полоски высушивают, запаковывают и помещают в держатель, который устанавливают в прибор для определения радиоактивности, определяют количество радиоактивного фосфора в полосках.

В альтернативном варианте, аликвоты по 40 мкл из каждой лунки аналитического планшета переносят на соответствующие зоны фосфоцеллюлозной фильтровальной полоски. После высушивания полосок на воздухе их помещают в поддон и промывают их в буфере для промывки фильтров, меняя буфер через каждые 15 мин в течение 1 ч и мягко покачивая поддон. Полоски высушивают, запаковывают и помещают в держатель, который устанавливают в прибор для определения радиоактивности, определяют количество радиоактивного фосфора в полосках.

Определение ингибирующей активности СРК2/циклин А

Данный метод предназначен для определения активности протеинкиназы в СЭК2 из экзогенного субстрата.

Реагенты

A. Буфер А: (80 мМ трис (рН 7,2), 40 мМ МдС1₂), 4,84 г трис (мол.масса 121,1 г/моль), 4,07 г МдС1₂ (мол.масса 203,31 г/моль) растворяют в 500 мл воды, рН доводят НС1 до 7,2.

Б. Раствор гистона Н1 (0,45 мг/мл гистона Н1 и 20 мМ НЕРЕ8 рН 7,2): 5 мг гистона Н1 (производства фирмы ВоеЫпдег МаппНенп) в 11,111 мл 20 мМ раствора НЕРЕ8 рН 7,2 (477 мг НЕРЕ8 (мол.масса 238,3 г/моль)) растворяют в 100 мл ббН₂О, отбирают аликвоты по 1 мл и хранят при -80°С.

B. Раствор АТФ (60 мкМ АТФ, 300 мкг/мл БСА, 3 мМ ОТТ): 120 мкл 10 мМ АТФ, 600 мкл раствора БСА (10 мг/мл) разбавляют до 20 мл, отбирают аликвоты по 1 мл и хранят при -80°С.

Г. Раствор СОК2: смесь бк2/циклин А в 10 мМ НЕРЕ8 рН 7,2, 25 мМ №С1, 0,5 мМ ОТТ, 10% глицерин, отбирают аликвоты по 9 мкл и хранят при -80°С.

Методика

1. Готовят растворы ингибиторов в трехкратном разведении по объему от необходимой концентрации для исследования в смеси ббН2О/15 об.% ДМСО.

2. В каждую лунку 96-луночного полипропиленового планшета добавляют по 20 мкл раствора ингибитора (или по 20 мкл 15% ДМСО для лунок с положительным и отрицательным контролем).

3. Размораживают раствор гистона Н1 (1 мл на 1 планшет), раствор АТФ (1 мл на 1 планшет + 1 аликвот на отрицательный контроль) и раствор СЭК2 (9 мкл на 1 планшет). Раствор ί'.ΌΚ2 помещают в ледяную баню. Следует отбирать аликвоты СЭК2 с достаточной точностью, чтобы избежать повторных циклов замораживания-размораживания.

4. 9 мкл раствора СЭК2 разбавляют в 2,1 мл буфера А (на 1 планшет), смешивают и добавляют в каждую лунку по 20 мкл.

5. 1 мл раствора гистона Н1 смешивают с 1 мл раствора АТФ (на 1 планшет) в пробирке объемом 10 мл с завинчивающейся крышкой.

137

138

Добавляют раствор у³³Р АТФ до концентрации 0,15 мкКи в 20 мкл (в каждую лунку по 0,15 мкКи). Осторожно смешивают, чтобы исключить вспенивание БСА. В соответствующие лунки добавляют по 20 мкл. Планшеты встряхивают на качалке. Готовят раствор для отрицательного контроля путем смешивания раствора АТФ с равным количеством 20 мМ НЕРЕ8 рН 7,2 и добавления раствора у³³Р АТФ до концентрации 0,15 мкКи в 20 мкл раствора. В соответствующие лунки добавляют по 20 мкл.

6. Проводят реакцию в течение 60 мин.

7. В каждую лунку добавляют по 35 мкл 10% раствора ТХУ и планшет встряхивают на качалке для планшет.

8. Наносят по 40 мкл каждого образца на полоски фильтровальной бумаги Р30. Полоски высушивают (приблизительно в течение 10-20 мин).

9. Полоски промывают 4 раза по 10 мин 250 мл 1% раствора фосфорной кислоты (10 мл фосфорной кислоты в 1 л ййН2О).

10. В полосках определяют количество радиоактивности с использованием прибора для определения бета-радиоактивности.

Биологические исследования на клеточном уровне

Определение включения метки Вгйи, индуцированного фактором ΡΌΟΕ Материалы и реагенты (1) Фактор ΡΌΟΕ человека, ΡΌΟΕ В/В, 1276-956, производства фирмы Воейппдег, МаппНеип. Германия.

(2) Реагент для введения метки Вгйи: 10 мМ раствор в буфере РВ8 (рН 7,4), номер по каталогу 1647229, производства фирмы ВоеЕппдег, МаппНе1т, Германия.

(3) Е1хЭепа1: раствор для фиксации (готовый для использования), номер по каталогу 1647229, производства фирмы ВоеЕппдег, МаппЕет, Германия.

(4) Лп11-Вгйи-РОЭ: конъюгат мышиных моноклональных антител с пероксидазой, номер по каталогу 1647229, производства фирмы ВоеЕппдег, МаппНе1т, Германия.

(5) Раствор субстрата ТМВ: тетраметилбензидин (ТМВ), готовый для использования, номер по каталогу 1647229, производства фирмы ВоеЕппдег, МаппНе1т, Германия.

(6) Раствор для промывки, РВ8: РВ8 1Х, рН 7,4 производства фирмы 8идеп 1пс., Кей^оой Сйу, Калифорния.

(7) Бычий сывороточный альбумин (БСА): фракция V, порошкообразный, А-8551, производства фирмы 81дта СНет1са1 Со., США.

(8) Линия клеток 3Т3, модифицированная генно-инженерным методом для экспрессии РОСЕ-К человека.

Методика (1) Клетки культивируют в 96-луночном планшете в количестве 8000 клеток в лунке в присутствии среды ОМЕМ, 10% С8, 2 мМ С1п. Клетки инкубируют при 37°С в 5% СО₂ в течение ночи.

(2) Через 24 ч клетки промывают раствором РВ8, затем среду истощают, заменяя среду на бессывороточную среду (0% С8 в ОМЕМ, 0,1% БСА) и инкубируя клетки в течение 24 ч.

(3) На третий день к клеткам одновременно добавляют лигагд(РОСЕ, 3,8 нМ раствор в среде ЭМЕМ, содержащей 0,1% БСА) и тестируемые соединения. В лунки с отрицательным контролем добавляют только бессывороточную среду ЭМЕМ, содержащую 0,1% БСА, в лунки с положительным контролем - лиганд (РОСЕ), но без тестируемого соединения. Растворы тестируемых соединений готовят в 96-луночном планшете в бессывороточной среде ЭМЕМ в смеси с лигандом и последовательно разбавляют, получая семь концентраций тестируемого соединения.

(4) Активацию лиганда проводят в течение 20 ч, затем добавляют разбавленный реагент Вгйи для введения метки (1:100 в среде ЭМЕМ, содержащей 0,1% БСА) и клетки инкубируют с реагентом Вгйи (конечная концентрация 10 мкМ) в течение 1,5 ч.

(5) После инкубации с реагентом для введения метки среду удаляют декантацией и постукиванием перевернутого планшета по бумажной салфетке. Добавляют раствор Е1хЭепа1 (по 50 мкл в лунку) и планшет инкубируют при комнатной температуре в течение 45 мин на качалке для планшет.

(6) Раствор для фиксации тщательно удаляют декантацией и постукиванием перевернутого планшета по бумажной салфетке. Добавляют молоко (5% раствор обезвоженного молока в РВ8, по 200 мкл в лунку) и планшет инкубируют при комнатной температуре в течение 30 мин на качалке для планшет.

(7) Блокирующий раствор удаляют декантацией и лунки промывают один раз раствором РВ8. Добавляют раствор конъюгата антител АпЦ-ВгйЕ-РОО (разбавленный 1:100 в РВ8, содержащем 1% БСА, по 100 мкл в лунку) и планшет инкубируют при комнатной температуре в течение 90 мин на качалке для планшет.

(8) Конъюгат антител тщательно удаляют декантацией и промыванием лунок 5 раз раствором РВ8, затем планшет сушат путем переворачивания и постукивания планшетом по бумажной салфетке.

(9) Добавляют раствор субстрата ТМВ (по 100 мкл в лунку) и инкубируют в течение 20 мин при комнатной температуре на качалке для планшет до образования окрашивания, достаточного для фотометрического измерения.

(10) Поглощение образцов измеряют при 410 нм (в режиме двойной длины волны с использованием фильтра при 490 нм для сравнения) на ридере Эупа1есН ЕЫ8Л.

139

140

Определение включения метки Вгйи, индуцированного фактором ЕСЕ Материалы и реагенты:

(1) Фактор ЕСЕ мыши, 201, производства фирмы ТоуоЬо, Со., Ь!й., Япония.

(2) Реагент для введения метки Вгйи: 10 мМ раствор в буфере РВ8 (рН 7,4), номер по каталогу 1647229, производства фирмы ВоеНппдег, МаппНепп, Германия.

(3) Е1хЭепа!: раствор для фиксации (готовый для использования), номер по каталогу 1647229, производства фирмы ВоеНппдег, Маппйет, Германия.

(4) ΛπΙί-Вгйи-РОО: конъюгат мышиных моноклональных антител с пероксидазой, номер по каталогу 1647229, производства фирмы ВоеНппдег, МаппНе1т, Германия.

(5) Раствор субстрата ТМВ: тетраметилбензидин (ТМВ), готовый для использования, номер по каталогу 1647229, производства фирмы ВоеНппдег, МаппНе1т, Германия.

(6) Раствор для промывки, РВ8: РВ8 1Х, рН 7,4 производства фирмы 8идеп 1пс., Кейуоой Сйу, Калифорния.

(7) Бычий сывороточный альбумин (БСА): фракция V, порошкообразный, А-8551, производства фирмы 81дта СНеиНса1 Со., США.

(8) Линия клеток 3Т3, модифицированная генно-инженерным методом для экспрессии ЕСЕ-К человека.

Методика (1) Клетки культивируют в 96-луночном планшете в количестве 8000 клеток в лунке в присутствии среды ЭМ ЕМ, 10% С8, 2 мМ С1п. Клетки инкубируют при 37°С в 5% СО₂ в течение ночи.

(2) Через 24 ч клетки промывают раствором РВ8, затем среду истощают, заменяя среду на бессывороточную среду (0% С8 в ЭМЕМ, 0,1% БСА) и инкубируя клетки в течение 24 ч.

(3) На третий день к клеткам одновременно добавляют лиганд (ЕСЕ, 2 нМ раствор в среде ЭМЕМ, содержащей 0,1% БСА) и тестируемые соединения. В лунки с отрицательным контролем добавляют только бессывороточную среду ЭМЕМ, содержащую 0,1% БСА, в лунки с положительным контролем - лиганд (ЕСЕ), но без тестируемого соединения. Растворы тестируемых соединений готовят в 96-луночном планшете в бессывороточной среде ЭМЕМ в смеси с лигандом и последовательно разбавляют, получая семь концентраций тестируемого соединения.

(4) Активацию лиганда проводят в течение 20 ч, затем добавляют разбавленный реагент Вгйи для введения метки (1:100 в среде ЭМЕМ, содержащей 0,1% БСА) и клетки инкубируют с реагентом Вгйи (конечная концентрация 10 мкМ) в течение 1,5 ч.

(5) После инкубации с реагентом для введения метки, среду удаляют декантацией и постукиванием перевернутого планшета по бу мажной салфетке. Добавляют раствор Е1хЭепа! (по 50 мкл в лунку) и планшет инкубируют при комнатной температуре в течение 45 мин на качалке для планшет.

(6) Раствор Е1хЭепа! тщательно удаляют декантацией и постукиванием перевернутого планшета по бумажной салфетке. В качестве блокирующего раствора добавляют молоко (5% раствор обезвоженного молока в РВ8, по 200 мкл в лунку) и планшет инкубируют при комнатной температуре в течение 30 мин на качалке для планшет.

(7) Блокирующий раствор удаляют декантацией и лунки промывают один раз раствором РВ8. Добавляют раствор конъюгата антител Ап!1-Вгйи-РОП (разбавленный 1:100 в РВ8, содержащем 1% БСА, по 100 мкл в лунку) и планшет инкубируют при комнатной температуре в течение 90 мин на качалке для планшет.

(8) Конъюгат антител тщательно удаляют декантацией и промыванием лунок 5 раз раствором РВ8, затем планшет сушат путем переворачивания и постукивания планшетом по бумажной салфетке.

(9) Добавляют раствор субстрата ТМВ (по 100 мкл в лунку) и инкубируют в течение 20 мин при комнатной температуре на качалке для планшет до образования окрашивания, достаточного для фотометрического измерения.

(10) Поглощение образцов измеряют при 410 нм (в режиме двойной длины волны с использованием фильтра при 490 нм для сравнения) на ридере Эуш-ИесН ЕЫ8А.

Определение включения метки Вгйи, индуцированного фактором ЕСЕ, содержащим домен Нег2

Материалы и реагенты:

(1) Фактор ЕСЕ мыши, 201, производства фирмы ТоуоЬо, Со., Ь!й., Япония.

(2) Реагент для введения метки Вгйи: 10 мМ раствор в буфере РВ8 (рН 7,4), номер по каталогу 1647229, производства фирмы ВоеНппдег, МаппЕет, Германия.

(3) Е1хЭепа!: раствор для фиксации (готовый для использования), номер по каталогу 1647229, производства фирмы ВоеНппдег, МаппНе1т, Германия.

(4) А пи-Вгйи-РОЭ: конъюгат мышиных моноклональных антител с пероксидазой, номер по каталогу 1647229, производства фирмы ВоеНппдег, МаппНе1т, Германия.

(5) Раствор субстрата ТМВ: тетраметилбензидин (ТМВ), готовый для использования, номер по каталогу 1647229, производства фирмы ВоеНппдег, МаппНе1т, Германия.

(6) Раствор для промывки, РВ8: РВ8 1Х, рН 7,4, полученный в лаборатории.

(7) Бычий сывороточный альбумин (БСА): фракция V, порошкообразный, А-8551, производства фирмы 81дта СНет1са1 Со., США.

(8) Линия клеток 3Т3, модифицированная генно-инженерным методом для экспрессии

141

142 гибридного рецептора, содержащего внеклеточный домен ΕΟΡ-Я и внутриклеточный домен Нег2.

Методика (1) Клетки культивируют в 96-луночном планшете в количестве 8000 клеток в лунке в присутствии среды ΌΜΕΜ, 10% С8, 2 мМ С1п. Клетки инкубируют при 37°С в 5% СО2 в течение ночи.

(2) Через 24 ч клетки промывают раствором ΡΒ8, затем среду истощают, заменяя среду на бессывороточную среду (0% С8 в ΌΜΕΜ, 0,1% БСА) и инкубируя клетки в течение 24 ч.

(3) На третий день к клеткам одновременно добавляют лиганд (ΕΟΡ, 2 нМ раствор в среде ΌΜΕΜ, содержащей 0,1% БСА) и тестируемые соединения. В лунки с отрицательным контролем добавляют только бессывороточную среду ΌΜΕΜ, содержащую 0,1% БСА, в лунки с положительным контролем - лиганд (ΕΟΡ), но без тестируемого соединения. Растворы тестируемых соединений готовят в 96-луночном планшете в бессывороточной среде ΌΜΕΜ в смеси с лигандом и последовательно разбавляют, получая семь концентраций тестируемого соединения.

(4) Активацию лиганда проводят в течение 20 ч, затем добавляют разбавленный реагент Вгби для введения метки (1:100 в среде ΌΜΕΜ, содержащей 0,1% БСА) и клетки инкубируют с реагентом Вгби (конечная концентрация 10 мкМ) в течение 1,5 ч.

(5) После инкубации с реагентом для введения метки, среду удаляют декантацией и постукиванием перевернутого планшета по бумажной салфетке. Добавляют раствор ΕίχΌοπαΙ (по 50 мкл в лунку) и планшет инкубируют при комнатной температуре в течение 45 мин на качалке для планшет.

(6) Раствор для фиксации тщательно удаляют декантацией и постукиванием перевернутого планшета по бумажной салфетке. В качестве блокирующего буфера добавляют молоко (5% раствор обезвоженного молока в ΡΒ8, по 200 мкл в лунку) и планшет инкубируют при комнатной температуре в течение 30 мин на качалке для планшет.

(7) Блокирующий раствор удаляют декантацией и лунки промывают один раз раствором ΡΒ8. Добавляют раствор конъюгата антител /^111-111-61)-14)1) (разбавленный 1:100 в ΡΒ8, содержащем 1% БСА, по 100 мкл в лунку) и планшет инкубируют при комнатной температуре в течение 90 мин на качалке для планшет.

(8) Конъюгат антител тщательно удаляют декантацией и промыванием лунок 5 раз раствором ΡΒ8, затем планшет сушат путем переворачивания и постукивания планшетом по бумажной салфетке.

(9) Добавляют раствор субстрата ТМВ (по 100 мкл в лунку) и инкубируют в течение 20 мин при комнатной температуре на качалке для планшет до образования окрашивания, достаточного для фотометрического измерения.

(10) Поглощение образцов измеряют при 410 нм (в режиме двойной длины волны с использованием фильтра при 490 нм для сравнения) на ридере Όνπαίοοίι ΕΌΙ8Α.

Определение включения метки Вгби, индуцированного фактором 1СР1 Материалы и реагенты (1) Фактор 1СР1 человека, рекомбинантный, С511, производства фирмы ΡΐΌΐηοβα Согр., США.

(2) Реагент для введения метки ВгбИ: 10 мМ раствор в буфере ΡΒ8 (рН 7,4), номер по каталогу 1647229, производства фирмы Воейппдег, Μ;ιιιιι1κ1ιι·ι, Германия.

(3) Р1хОепа1: раствор для фиксации (готовый для использования), номер по каталогу 1647229, производства фирмы Воейппдег, 1^1111111^1111, Германия.

(4) Ап1 ί-ВгбИ-БОЭ: конъюгат мышиных моноклональных антител с пероксидазой, номер по каталогу 1647229, производства фирмы Воейппдег, ΜιππΙκΙπι, Германия.

(5) Раствор субстрата ТМВ: тетраметилбензидин (ТМВ), готовый для использования, номер по каталогу 1647229, производства фирмы Воейппдег, ΜιππΙκΙπι, Германия.

(6) Раствор для промывки, ΡΒ8: ΡΒ8 1Х, рН 7,4 производства фирмы 8идеп 1пс., Яеб^ооб С11у, Калифорния.

(7) Бычий сывороточный альбумин (БСА): фракция ν, порошкообразный, А-8551, производства фирмы 8щта СНет1са1 Со., США.

(8) Линия клеток 3Т3, модифицированная генно-инженерным методом для экспрессии рецептора 1СР-1 человека.

Методика (1) Клетки культивируют в 96-луночном планшете в количестве 8000 клеток в лунке в присутствии среды ΌΜΕΜ, 10% С8, 2 мМ С1п. Клетки инкубируют при 37°С в 5% СО2 в течение ночи.

(2) Через 24 ч клетки промывают раствором ΡΒ8, затем среду истощают, заменяя среду на бессывороточную среду (0% С8 в ΌΜΕΜ, 0,1% БСА) и инкубируя клетки в течение 24 ч.

(3) На третий день к клеткам одновременно добавляют лиганд (1СР1, 3,3 нМ раствор в среде ΌΜΕΜ, содержащей 0,1% БСА) и тестируемые соединения. В лунки с отрицательным контролем добавляют только бессывороточную среду ΌΜΕΜ, содержащую 0,1% БСА, в лунки с положительным контролем - лиганд (1СР1), но без тестируемого соединения. Растворы тестируемых соединений готовят в 96-луночном планшете в бессывороточной среде ΌΜΕΜ в смеси с лигандом и последовательно разбавляют, получая семь концентраций тестируемого соединения.

(4) Активацию лиганда проводят в течение 16 ч, затем добавляют разбавленный реагент

143

144

Вгби для введения метки (1:100 в среде ЭМЕМ, содержащей 0,1% БСА) и клетки инкубируют с реагентом Вгби (конечная концентрация 10 мкМ) в течение 1,5 ч.

(5) После инкубации с реагентом для введения метки, среду удаляют декантацией и постукиванием перевернутого планшета по бумажной салфетке. Добавляют раствор Р1хЭеиа! (по 50 мкл в лунку) и планшет инкубируют при комнатной температуре в течение 45 мин на качалке для планшет.

(6) Раствор для фиксации тщательно удаляют декантацией и постукиванием перевернутого планшета по бумажной салфетке. В качестве блокирующего буфера добавляют молоко (5% раствор обезвоженного молока в РВ8, по 200 мкл в лунку) и планшет инкубируют при комнатной температуре в течение 30 мин на качалке для планшет.

(7) Блокирующий раствор удаляют декантацией и лунки промывают один раз раствором РВ8. Добавляют раствор конъюгата антител Αηΐί-Вгби-РОО (разбавленный 1:100 в РВ8, содержащем 1% БСА, по 100 мкл в лунку) и планшет инкубируют при комнатной температуре в течение 90 мин на качалке для планшет.

(8) Конъюгат антител тщательно удаляют декантацией и промыванием лунок 5 раз раствором РВ8, затем планшет сушат путем переворачивания и постукивания планшетом по бумажной салфетке.

(9) Добавляют раствор субстрата ТМВ (по 100 мкл в лунку) и инкубируют в течение 20 мин при комнатной температуре на качалке для планшет до образования окрашивания, достаточного для фотометрического измерения.

(10) Поглощение образцов измеряют при 410 нм (в режиме двойной длины волны с использованием фильтра при 490 нм в качестве сравнения) на ридере Оупа!есй ЕЫ8А.

Определение включения метки Вгби, индуцированного фактором РСР

Данный метод предназначен для определения индуцированного фактором РСР синтеза ДНК в клетках 3Тс7/ЕСРг, экспрессирующих эндогенный рецептор РСР.

Материалы и реагенты

1. Фактор РСР человека, РСР2/ЫРСР, производства фирмы С1Ысо ВКЬ, номер по каталогу 13256-029.

2. Реагент для введения метки ВгбИ: 10 мМ раствор в буфере РВ8 (рН 7,4), номер по каталогу 1647229, производства фирмы ВоеНппдег, МаппНепп, Германия.

3. Р1хЭепа!: раствор для фиксации, номер по каталогу 1647229, производства фирмы Воейппдег, МаппНе1т, Германия.

4. Апб-Вгби-РОЭ: конъюгат мышиных моноклональных антител с пероксидазой, номер по каталогу 1647229, производства фирмы Воейппдег, МаппНе1т, Германия.

5. Раствор субстрата ТМВ: тетраметилбензидин (ТМВ), номер по каталогу 1647229, производства фирмы Воейгшдег, МаппНе1т, Германия.

6. Раствор для промывки, РВ8, рН 7,4 производства фирмы 8идеп 1пс.. (7) Бычий сывороточный альбумин (БСА): фракция V, порошкообразный, А-8551, производства фирмы 81дта С11ет1са1 Со., США.

Методика

1. Линия клеток 3Т3, модифицированная генно-инженерным методом: 3Т3с7/ЕСРг.

2. Клетки культивируют в 96-луночном планшете в количестве 8000 клеток в лунке в присутствии среды ЭМЕМ, 10% С8, 2 мМ С1п. Клетки инкубируют при 37°С в 5% СО₂ в течение 24 ч.

3. Через 24 ч клетки промывают раствором РВ8, затем среду истощают, заменяя среду на бессывороточную среду (0% ЭМЕМ, 0,1% БСА) и инкубируя клетки в течение 24 ч.

4. К клеткам одновременно добавляют лиганд (РСР2, 1,5 нМ раствор в среде ЭМЕМ, содержащей 0,1% БСА) и тестируемые соединения. В лунки с отрицательным контролем добавляют только бессывороточную среду ЭМЕМ, содержащую 0,1% БСА, в лунки с положительным контролем - лиганд (РСР2), но без тестируемого соединения. Растворы тестируемых соединений готовят в 96-луночном планшете в бессывороточной среде в смеси с лигандом и последовательно разбавляют, получая семь концентраций тестируемого соединения.

5. Через 20 ч добавляют разбавленный реагент Вгби для введения метки (1:100 ВгбиПМЕМ, 0,1% БСА) и клетки инкубируют с реагентом Вгби (конечная концентрация 10 мкМ) в течение 1,5 ч.

6. Среду удаляют декантацией и остатки материала удаляют путем постукивания перевернутого планшета по бумажной салфетке. Добавляют раствор Р1хЭепа! (по 50 мкл в лунку) и планшет инкубируют при комнатной температуре в течение 45 мин на качалке для планшет.

7. Раствор для фиксации удаляют. Добавляют блокирующий раствор (5% раствор обезвоженного молока в РВ8, по 200 мкл в лунку) и планшет инкубируют при комнатной температуре в течение 30 мин на качалке для планшет.

8. Блокирующий раствор удаляют декантацией и лунки промывают один раз раствором РВ8. Добавляют раствор конъюгата антител Апб-ВгбИ-РОО (разбавленный 1:100 в РВ8, содержащем 1 % БСА) и планшет инкубируют при комнатной температуре в течение 90 мин на качалке для планшет.

9. Конъюгат антител удаляют декантацией и промыванием лунок 5 раз раствором РВ8, затем планшет сушат путем переворачивания и постукивания планшетом по бумажной салфетке.

145

146

10. Добавляют раствор субстрата ТМВ (по 100 мкл в лунку) и инкубируют в течение 20 мин при комнатной температуре на качалке для планшет до образования окрашивания, достаточного для фотометрического измерения.

(11) Поглощение образцов измеряют при 410 нм (в режиме двойной длины волны с использованием фильтра при 490 нм для сравнения) на ридере Оупа1ес11 ЕЫ8А.

Биохимический метод исследования рецептора Е6БК

Данный метод предназначен для определения киназной активности ίπ У11го рецептора Е6БК с использованием метода ИФА.

Материалы и реагенты

1. 96-луночные планшеты для ИФА фирмы Согшпд (номер по каталогу 25805-96).

2. Моноклональные антитела ап11-Е6БК

8ИМО1 (производства фирмы ВюсйетШгу ЬаЬ., 8идеп, 1пс.).

3. Буферный раствор РВ8 (фосфатный буфер, содержащий хлористый натрий, Пи1Ьессо, производства фирмы 61Ьсо, номер по каталогу 450-1300ЕВ).

4. Буфер ТВ8Т

Реагент	Мол. масса	Рабочая концентрация	Количество на 1 л
Трис	121,14	50 мМ	6,057 г
№С1	58,44	150 мМ	8,766 г
Тритон Х-100	не исп.	0,1%	1,0 мл

5. Блокирующий буфер

Реагент	Мол. масса	Рабочая концентрация	Количество на 100 мл
Обезжиренное молоко, быстрорастворимое, СагпаОоп	не исп.	5%	5,0 г
ΡΒδ	не исп.	не исп.	100 мл

6. Лизат клеток А431 (производства фирмы Зсгеешпд ЬаЬ., 8идеп, 1пс.)

7. Буфер ТВ8

Реагент	Мол. масса	Рабочая концентрация	Количество на 1 л
Трис	121,14	50 мМ	6,057 г
ИаС!	58,44	150 мМ	8,766 г

8. Буфер ТВ8 + 10% ДМСО

Реагент	Мол. масса	Рабочая концентрация	Количество на 1 л
Трис	121,14	50 мМ	1,514 г
№С1	58,44	150 мМ	2,192 г
ДМСО	не исп.	10%	25 мл

9. Аденозин-5'-трифосфат (АТФ из мышц лошади, производства фирмы 81дта, номер по каталогу А-5394).

Готовят 1,0 М раствор в аН₂О. Указанный реагент готовят непосредственно перед использованием и хранят на льду.

10. МпС1₂

Готовят исходный 1,0 М раствор в аН₂О.

Данный реагент готовят непосредственно перед использованием и хранят на льду.

12. 96-луночные полипропиленовые планшеты с У-образным дном NυNС (производства фирмы Аррйеа 8с1еп11йс, номер по каталогу А872092).

13. Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЕБТА).

Готовят рабочий 200 мМ раствор в аН₂О, рН доводят 10 н. №ЮН до рН 8,0.

14. Кроличья поликлональная сыворотка к фосфотирозину (производства фирмы ВюсНет1к1гу ЬаЬ., 8идеп 1пс.).

15. Коньюгат козьих антител против 1д6 кролика с пероксидазой (производства фирмы Вюкоигсе, номер по каталогу АЫ0404).

16. Реагент АВТ8 (2,2'-азино-бис(3этилбензтиазолин-6-сульфоновая кислота)), производства фирмы 81дта, номер по каталогу А-1888).

Реагент	Мол. масса	Рабочая концентрация	Количество на 1 л
Лимонная кислота	192,12	100 мМ	19,21 г
№2НРО4	141,96	250 мМ	35,49 г
АВТ8	не исп.	0,5 мг/мл	500 мг

Два первых компонента смешивают в приблизительно 900 мл аН2О, рН доводят до 4,0 фосфорной кислотой. Добавляют реагент АВТ8, емкость закрывают и выдерживают в течение 0,5 ч, фильтруют. Раствор хранят в темном месте при 4°С до использования.

17. 30% раствор перекиси водорода (производства фирмы ЫкНег, номер по каталогу Н325.

18. Смесь АВТ8/Н₂О₂.

Смешивают 15 мл раствора АВТ8 и 2,0 мкл Н2О2. Раствор готовят за 5 мин до использования.

19. 0,2 М раствор НС1.

Методика

1. 96-луночный планшет для ИФА фирмы Согшпд обрабатывают антителами 8ИМО1, добавляя в каждую лунку по 0,5 мкг 8ИМО1 в 100 мкл РВ8, хранят в течение ночи при 4°С.

147

148

2. Несвязанные антитела 8ϋΜΌ1 удаляют путем переворачивания планшета и удаления раствора. Планшет промывают 1 раз άН₂О. Избыток раствора удаляют, постукивая планшетом по бумажной салфетке.

3. В каждую лунку добавляют по 150 мкл блокирующего буфера и инкубируют в течение 30 мин при комнатной температуре при встряхивании.

4. Планшет промывают 3 раза деионизированной водой, затем один раз раствором ТВ8Т. Планшетом постукивают по бумажной салфетке для удаления избытка жидкости и пузырьков воздуха.

5. Лизат разбавляют раствором РВ8 (7 мкг лизата в 100 мкл РВ8).

6. В каждую лунку добавляют по 100 мкл разбавленного лизата, планшет встряхивают при комнатной температуре в течение 60 мин.

7. Планшет промывают, как указано на стадии 4 выше.

8. В каждую лунку планшета для ИФА, содержащего связанный рецептор ΕСЕК, добавляют по 120 мкл раствора ТВ8.

9. Исследуемое соединение разбавляют в ТВ8 в соотношении 1:10 в лунках 96-луночного полипропиленового планшета (т.е. 10 мкл соединения + 90 мкл ТВ8).

10. В лунки планшета для ИФА добавляют по 13,5 мкл разбавленного исследуемого соединения. В лунки с контролем (т.е. в лунки, в которые исследуемое соединение не добавляют) добавляют 13,5 мкл ТВ8 + 10% ДМСО.

11. Планшет инкубируют в течение 30 мин при комнатной температуре и при встряхивании.

12. Практически во все лунки, кроме лунок с отрицательным контролем, в которые не добавляют смесь АТФ/МпС1₂, добавляют по 15 мкл смеси для фосфорилирования (конечный объем смеси в каждой лунке должен составлять приблизительно 150 мкл, конечная концентрация компонентов в каждой лунке составляет 3 мкМ АТФ/5 мМ ΜηС1₂). Планшет инкубируют в течение 5 мин при встряхивании.

13. Через 5 мин реакцию останавливают путем добавления в каждую лунку по 16,5 мкл 200 мМ раствора БЭТА (рН 8,0) при непрерывном встряхивании, после добавления раствора НЭТА планшет встряхивают в течение 1 мин.

14. Планшет промывают 4 раза деионизированной водой, два раза раствором ТВ8Т.

15. В каждую лунку добавляют по 100 мкл раствора антител к фосфотирозину (разбавление в ТВ8Т 1:3000). Инкубируют в течение 30-45 мин при комнатной температуре при встряхивании.

16. Промывают, как указано на стадии 4 выше.

17. В каждую лунку добавляют по 100 мкл конъюгата козьих антител против 1дС кролика и пероксидазы фирмы Вю8оигсе (разбавленного в

ТВ8Т 1:2000). Инкубируют при комнатной температуре в течение 30 мин при встряхивании.

18. Промывают, как указано на стадии 4 выше.

19. В каждую лунку добавляют по 100 мкл раствора АВТ8/Н2О2.

20. Инкубируют в течение от 5 до 10 мин при встряхивании, удаляют любые пузырьки воздуха.

21. При необходимости реакцию останавливают путем добавления в каждую лунку по 100 мкл 0,2 М раствора НС1.

22. Поглощение в лунках измеряют на ридере Оупа1ес11 ΜΚ7000 ВЕБА (фильтр для образцов - 410 нм, фильтр сравнения - 630 нм).

Биохимический метод исследования рецептора

РОСЕК

Данный метод предназначен для определения 1п νίΙΐΌ киназной активности рецептора РОСЕК с использованием метода ИФА.

Материалы и реагенты

Рабочие растворы следующих реагентов, если особо не оговорено, готовят аналогично описанной выше методике для биохимического исследования рецептора ΕСЕК.

1. 96-луночные планшеты для ИФА фирмы Согшпд (номер по каталогу 25805-96).

2. Моноклональные антитела апй-РОСЕК 28040’10 (производства фирмы Вюс11е1Ш81гу БаЬ., 8идеп, 1пс.).

3. Буферный раствор РВ8 (фосфатный буфер, содержащий хлористый натрий, Ои1Ьессо, производства фирмы С1Ьсо, номер по каталогу 450-1300ЕВ).

4. Буфер ТВ8Т.

5. Блокирующий буфер.

6. Лизат клеток МН 3Т3, экспрессирующих рецептор РОСЕК-β (производства фирмы 8сгеешпд БаЬ., 8идеп, 1пс.).

7. Буфер ТВ8.

8. Буфер ТВ8 + 10% ДМСО.

9. Аденозин-5'-трифосфат (АТФ из мышц лошади, производства фирмы 81дта, номер по каталогу А-5394).

10. ΜηС1₂.

11. Смесь для фосфорилирования киназой.

Реагент	Исходный раствор	Количество на 10 мл	Рабочая концентрация
Трис	1 М	250 мкл	25 мМ
ИаС!	5,0 М	200 мкл	100 мМ
МпС12	1 м	100 мкл	10 мМ
ТХ-100	100 мМ	50 мкл	0,5 мМ

12. 96-луночные полипропиленовые планшеты с У-образным дном NυNС (производства фирмы АррНеП 8с1еп11Пс, номер по каталогу А872092).

13. Этилендиаминтетрауксусная кислота (ΕϋΊΆ).

149

150

14. Кроличья поликлональная антисыворотка к фосфотирозину (производства фирмы ЕИосНстйЦу ЬаЬ., 8идеи 1ис.).

15. Конъюгат козьих антител против 1дС кролика с пероксидазой (производства фирмы Вюкоигсе, номер по каталогу АЫ0404).

16. Реагент АВТ8 (2,2'-азино-бис(3-этилбензтиазолин-6-сульфоновая кислота)), производства фирмы 81дша, номер по каталогу А1888).

17. 30% раствор перекиси водорода (производства фирмы ЕЕйсг. номер по каталогу Н325).

18. Смесь АВТ8/Н2О2.

19. 0,2 М раствор НС1.

Методика

1. 96-луночный планшет для ИФА фирмы Согшид обрабатывают антителами, добавляя в каждую лунку по 0,5 мкг 28О4СЮ в 100 мкл РВ8, хранят в течение ночи при 4°С.

2. Несвязанные антитела 28О4СЮ удаляют путем переворачивания планшета и удаления жидкости. Планшет промывают 1 раз с1Н₂0. Избыток жидкости удаляют, постукивая планшетом по бумажной салфетке.

3. В каждую лунку добавляют по 150 мкл блокирующего буфера и инкубируют в течение 30 мин при комнатной температуре при встряхивании.

4. Планшет промывают 3 раза деионизированной водой, затем один раз раствором ТВ8Т. Планшетом постукивают по бумажной салфетке для удаления избытка жидкости и пузырьков воздуха.

5. Лизат разбавляют раствором ΗΝΤΟ (10 мкг лизата в 100 мкл ΗΝΤΟ).

6. В каждую лунку добавляют по 100 мкл разбавленного лизата, планшет встряхивают при комнатной температуре в течение 60 мин.

7. Планшет промывают, как указано на стадии 4 выше.

8. В каждую лунку планшета для ИФА, содержащего связанный рецептор РОСЕР. добавляют по 80 мкл рабочего раствора для фосфорилирования киназой.

9. Исследуемое соединение разбавляют в ΙΒ8 в соотношении 1:10 в лунках 96-луночного полипропиленового планшета (т.е. 10 мкл соединения + 90 мкл ТВ 8).

10. В лунки планшета для ИФА добавляют по 10 мкл разбавленного исследуемого соединения. В лунки с контролем (т.е. в лунки, в которые исследуемое соединение не добавляют) добавляют 10 мкл ТВ8 + 10% ДМСО.

11. Планшет инкубируют в течение 30 мин при комнатной температуре и при встряхивании.

12. Практически во все лунки, кроме лунок с отрицательным контролем, добавляют по 10 мкл раствора АТФ (конечный объем смеси в каждой лунке должен составлять приблизительно 100 мкл, конечная концентрация АТФ в каж дой лунке составляет 20 мкМ). Планшет инкубируют в течение 30 мин при встряхивании.

13. Через 30 мин реакцию останавливают путем добавления в каждую лунку по 10 мкл 200 мМ раствора ΕϋΤΑ (рН 8,0).

14. Планшет промывают 4 раза деионизированной водой, два раза раствором ТВ8Т.

15. В каждую лунку добавляют по 100 мкл раствора антител к фосфотирозину (разбавление в ТВ8Т 1:3000). Инкубируют в течение 30-45 мин при комнатной температуре при встряхивании.

16. Промывают, как указано на стадии 4 выше.

17. В каждую лунку добавляют по 100 мкл конъюгата козьих антител против 1дС кролика и перокисдазы (разбавленного в ΙΒ8Τ 1:2000). Инкубируют при комнатной температуре в течение 30 мин при встряхивании.

18. Промывают, как указано на стадии 4 выше.

19. В каждую лунку добавляют по 100 мкл раствора АВТ8/Н₂О₂.

20. Инкубируют в течение от 10 до 30 мин при встряхивании, удаляют любые пузырьки воздуха.

21. При необходимости реакцию останавливают путем добавления в каждую лунку по 100 мкл 0,2 М раствора НС1.

22. Поглощение в лунках измеряют на ридере Оуиа1ес11 МК.7000 ЕЫ8А (фильтр для образцов - 410 нм, фильтр сравнения - 630 нм).

Биохимический метод исследования рецептора ЕС ЕВ

Данный метод предназначен для определения ίη νίίτο киназной активности гибридного белка Мус-СугВ-ЕСЕВ с использованием метода ИФА.

Материалы и реагенты

1. Буферный раствор ΗΝΤΟ

Реагент	Мол. масса	Концентрация исходного раствора 5Х	Количество на 1 л	Рабочая концентрация 1Х
НЕРЕЗ	238,3	100 мМ	23,83 г	20 мМ
№С1	58,44	750 мМ	43,83 г	150 мМ
Глицерин	не исп.	50%	500 мл	10%
Тритон Х-100	не исп.	5%	10 мл	1,0%

Готовят 1 л исходного раствора 5Х, растворяя НЕРЕ8 и №С1 в приблизительно 350 мл άΗ₂Ο, доводят рН до 7,2 с помощью НС1 или ΝηΟΗ (в зависимости от типа используемого НЕРЕ8), добавляют глицерин, тритон Х-100 и затем доводят объем άΗ₂Ο до указанного значения.

2. Буферный раствор РВ8 (фосфатный буфер, содержащий хлористый натрий, Ои1Ьессо, производства фирмы С1Ьсо, номер по каталогу 450-1300ЕВ).

151

152

3. Блокирующий буфер.

4. Смесь для растворения киназы.

5. Фенилметилсульфонилфторид (РМ8Р, производства фирмы 81дта, номер по каталогу Р-7626).

Готовят рабочий 100 мМ раствор в этаноле.

6. АТФ (бактериальный, производства фирмы 81дта, номер по каталогу А-7699). Готовят исходный раствор с концентрацией 3,31 мг/мл воды МИкр (6 мМ раствор).

7. Биотинилированный конъюгат моноклональных антител к фосфотирозину (клон 4О10, производства фирмы Ир81а1е Вю1есйпо1оду 1пс., номер по каталогу 16-103, серийный номер 14495).

8. Реагент Уес1а81ат Е111е АВС (конъюгат авидина и пероксидазы, производства фирмы Уес1ог ЬаЬога1опе8, номер по каталогу РК-6 100).

9. Раствор АВТ8.

10. 30% раствор перекиси водорода (производства фирмы Р18Йег, номер по каталогу Н325.

11. Смесь АВТ8/Н₂0₂.

12. 0,2 М раствор НС1.

13. Трис-НС1 (производства фирмы Р18сйег, номер по каталогу ВР 152-5). Готовят 1,0 мМ раствор в воде МИкр, рН доводят НС1 до 7,2.

14. №0 (производства фирмы Р18сйег, номер по каталогу 8271-10). Готовят 5М раствор в воде МИкр.

15. МдС1₂ (производства фирмы Р18сйег, номер по каталогу М33-500). Готовят 1М раствор в воде МПкр.

16. НЕРЕ8 (производства фирмы Р18сйег, номер по каталогу ВР310-500). Готовят 1 М раствор в воде МПкр, рН доводят до 7,5, фильтруют через стерилизующий фильтр.

17. Буферный раствор ТВ8Т.

18. Натрий карбонатный буферный раствор (производства фирмы Р18сйег, номер по каталогу 8495).

Готовят 0,1 М раствор в воде МИкр, рН доводят №0Н до 9,6, фильтруют.

19. Дитиотреитол (ОТТ, производства фирмы Р|8с11ег, номер по каталогу ВР172-25).

Готовят рабочий 0,5 мМ раствор в воде МПкр непосредственно перед использованием, хранят при -20°С, все остатки от использованного раствора отбрасывают.

20. МпС12.

21. Тритон Х-100.

22. Козьи антитела против а-1дО кролика (производства фирмы Сарре1).

23. Очищенные аффинной хроматографией кроличьи антитела α О8Т ОугВ (производства фирмы Вюсйет181гу ЬаЬ., 8идеп 1пс.).

Методика

Все следующие стадии, если особо не оговорено, проводят при комнатной температуре.

1. 96-луночный планшет для ИФА фирмы Согшпд покрывают антителами, добавляя в каждую лунку по 2 мкг козьих антител против α1дС кролика в карбонатном буфере, причем общий объем раствора в лунке составляет 100 мкл, хранят в течение ночи при 4°С.

2. Несвязанные козьи антитела против α1дО кролика удаляют путем переворачивания планшета и удаления жидкости. Избыток жидкости и пузырьки воздуха удаляют, постукивая планшетом по бумажной салфетке.

3. В каждую лунку добавляют по 150 мкл блокирующего буфера (5% раствор молока с низким содержание жира в растворе РВ8) и инкубируют в течение 30 мин при комнатной температуре при встряхивании на качалке для микропланшет.

4. Планшет промывают 4 раза раствором ТВ8Т. Планшетом постукивают по бумажной салфетке для удаления избытка жидкости и пузырьков воздуха.

5. В каждую лунку добавляют по 0,5 мкг кроличьих антител α-ОугВ, антитела разбавляют раствором 0РВ8, при этом конечный объем в лунке составляет 100 мкл, затем планшет встряхивают на качалке для микропланшет при комнатной температуре в течение 1 ч.

6. Планшет промывают 4 раза раствором ТВ8Т, как указано на стадии 4 выше.

7. В каждую лунку добавляют по 2 мкг клеточного лизата С08/РОРЕ (в качестве источника используют Мус-ОугВ-РОРЕ), растворенного в растворе НКТО, при этом конечный объем в каждой лунке составляет 100 мкл. Инкубируют в планшете при встряхивании на качалке для микропланшет в течение 1 ч.

8. Планшет промывают 4 раза раствором ТВ8Т, как указано на стадии 4 выше.

9. В каждую лунку добавляют по 80 мкл буфера 1Х для растворения киназы.

10. Исследуемое соединение разбавляют в соотношении 1:10 в лунках 96-луночного полипропиленового планшета в буфере 1Х для растворения киназы, содержащем 1% ДМСО.

11. В соответствующие лунки планшета для ИФА переносят по 10 мкл разбавленного исследуемого соединения из лунок полипропиленового планшета и из лунок с контролем. Ин

153

154 кубируют при встряхивании на качалке для микропланшет в течение 20 мин.

12. В лунки с положительным контролем и с исследуемым соединением добавляют по 10 мкл 70 мкМ раствора АТФ, разбавленного в буфере для растворения киназы (конечная концентрация АТФ составляет 7 мкМ/в лунке). В лунки с отрицательным контролем добавляют по 10 мкл буфера 1Х для растворения киназы. Инкубируют в планшете при встряхивают на качалке для микропланшет в течение 15 мин.

13. Киназную реакцию останавливают путем добавления в каждую лунку по 5 мкл 0,5 М раствора Ε^ΤΑ.

14. Планшет промывают 4 раза раствором ΤВ8Τ, как описано на стадии 4.

15. В каждую лунку добавляют по 100 мкл раствора конъюгата моноклональных антител к α-фосфотирозину с биотином (Ь4010), разбавленного в ΤВ8Τ. Инкубируют в течение 30 мин при встряхивании на качалке для микропланшет.

16. Готовят раствор реагента Уес1а81аш АВС. Добавляют одну каплю реагента А в 15 мл раствора ΤВ8Τ. Смесь перемешивают, переворачивая пробирку несколько раз. Добавляют 1 каплю реагента В и снова перемешивают.

17. Промывают 4 раза раствором ΤВ8Τ, как указано на стадии 4 выше.

18. В каждую лунку добавляют по 100 мкл реагента АВС НИР. Инкубируют при встряхивании на качалке для микропланшет в течение 30 мин.

19. Промывают 4 раза раствором ΤВ8Τ, как указано на стадии 4 выше.

20. В каждую лунку добавляют по 100 мкл раствора ΑВΤ8/Η₂Ο₂.

21. Инкубируют в течение от 5 до 15 мин при встряхивании, удаляют любые пузырьки воздуха.

22. При необходимости реакцию останавливают путем добавления в каждую лунку по 100 мкл 0,2 М раствора НС1.

23. Поглощение в лунках измеряют на ридере Оупа1ес11 МИ7000 РЫ8А (фильтр для образцов - 410 нм, фильтр сравнения - 630 нм).

Биохимический метод исследования киназы

РЬК-1

Данный метод предназначен для определения 1п νίΙΐΌ автофосфорилирующей активности киназы Г1к-1 с использование метода ИФА.

Материалы и реагенты

1. Чашки Петри для культивирования диаметром 15 см.

2. Клетки Пк-1/МН: фибробластная линия ИН с повышенной экспрессией Г1к-1 человека, клон 3 (производства фирмы 8идеп 1пс., от МР1, Μа^ι^η8^^еά, Германия).

3. Ростовая среда ЭМРМ, содержащая инактивированную нагреванием 10% эмбриональную сыворотку быка (РВ8) и 2 мМ глутамин (фирмы 01Ьсо-ВКР).

4. Минимальная среда ЭМРМ, содержащая инактивированную нагреванием 0,5% РВ8, 2 мМ глутамин (фирмы 01Ьсо-ВЯЬ).

5. 96-луночные планшеты для ИФА Согп1пд (производства фирмы Согшпд, номер по каталогу 25805-96).

6. Моноклональные антитела Ь4 или Е38, специфичные к киназе Г1к-1, очищенные аффинной хроматографией с использованием иммобилизованного на агарозе белка-А (производства фирмы 8идеп 1пс.).

7. Буферный раствор РВ8 (фосфатный буфер, содержащий хлористый натрий, ОЫЬессо, производства фирмы 01Ьсо, номер по каталогу 450-1300ЕВ).

8. Раствор ΗNΤ0 (см. раздел Биохимическое исследование рецептора РОРИ).

9. Набор для определения белка ВСА производства фирмы Р1егсе.

10. Блокирующий буфер.

11. Раствор ΤВ8Τ (рН 7,0).

12. Буфер для растворения киназы.

13. Раствор для остановки киназной реакции: 200 мМ Ε^ΤΑ.

14. Биотинилированный конъюгат антител к фосфотирозину 4010, (ИВ1, номер по каталогу 16-103).

15. Набор АВ (производства фирмы Уес1ог ЬаЬогаЮгу, номер по каталогу РК4000).

16. ДМСО.

17. 96-луночные полипропиленовые планшеты ΝυΝϋ с У-образным дном (производства фирмы АррНеН 8с1еп11Пс, номер по каталогу А872092).

18. Реактив Τи^Ьο-ΤΜВ (фирмы Р1егсе).

19. Раствор для остановки реакции Τμ^ΤΜВ: 1 М Н₂8О₄.

20. АТФ (фирмы 81дта, номер по каталогу А-7699).

21. 20% ДМСО в растворе ΤВ8 (рН 7,0).

Основные стадии метода Культивирование клеток и получение лизата

1. Клетки высевают в ростовую среду и культивируют в течение 2-3 дней при 37°С в присутствии 5% СО2 до тех пор, пока конфлюэнтность не достигнет 90-100%. Количество пассажей не превышает 20.

2. Среду удаляют, клетки промывают два раза раствором РВ8 и проводят лизис буфером для лизиса НКГО, все лизаты собирают и перемешивают на мешалке типа Вортекс Цойех) в течение 20-30 с.

3. Нерастворимый материал удаляют центрифугированием (в течение 5-10 мин при приблизительно 10000 хд).

4. В лизате определяют концентрацию белка с помощью набора ВСА.

5. Лизат разделяют на аликвоты по 1 мг, хранят при -80°С.

Анализ

1. 96-луночный планшет для ИФА фирмы Согшпд обрабатывают антителами, добавляя в

155

156 каждую лунку по 2 мкг очищенных антител Ь4 (или Е 38) в 100 мкл РВ8, хранят в течение ночи при 4°С.

2. Несвязанные антитела удаляют путем переворачивания планшета и удаления жидкости. Промывают один раз йН₂О, избыток жидкости удаляют, постукивая планшетом по бумажной салфетке.

3. Планшет блокируют, добавляя в каждую лунку по 150 мкл блокирующего буфера, инкубируют в течение 45-60 мин при 4°С при встряхивании.

4. Блокирующий буфер удаляют и планшет промывают 3 раза йН2О и один раз раствором ТВ8Т. Планшетом постукивают по бумажной салфетке для удаления избытка жидкости.

5. Лизат разбавляют в РВ8 до конечной концентрации 50 мкг/100 мкл. В каждую лунку добавляют по 100 мкл разбавленного лизата. Инкубируют при встряхивании в течение ночи при 4°С.

6. Несвязанные белки удаляют путем переворачивания планшета. Планшет промывают, как указано на стадии 4 выше.

7. В каждую лунку добавляют по 80 мкл буфера для растворения киназы (по 90 мкл в лунки с отрицательным контролем).

8. Исследуемое соединение разбавляют (обычно в соотношении 1:10) в лунках 96луночного полипропиленового планшета в буфере ТВ8, содержащем 20% ДМСО.

9. В лунки планшета для ИФА, содержащие иммобилизованную киназу Г1к-1, добавляют по 10 мкл разбавленного исследуемого соединения и встряхивают. В лунки с контролем исследуемое соединение не добавляют.

10. Готовят 0,3 мМ раствор АТФ в йН₂О из исходного 1 мМ раствора (в другом варианте используют буфер для растворения киназы).

11. Во все лунки кроме отрицательного контроля добавляют по 10 мкл 0,3 мМ раствора АТФ. Планшет инкубируют при комнатной температуре при встряхивании в течение 60 мин.

12. Через 1 ч киназную реакцию останавливают путем добавления в каждую лунку по 11 мкл 200 мМ раствора ЕЭТА, втряхивают с течение 1-2 мин.

13. Планшет промывают 4 раза йН₂О и 2 раза раствором ТВ8Т.

14. Во все лунки добавляют по 100 мкл раствора конъюгата моноклональных антител к α-фосфотирозину с биотином (4С10), разбавленного раствором ТВ8Т в соотношении 1:5000. Инкубируют в течение 45 мин при встряхивании при комнатной температуре.

15. В процессе инкубирования планшета к 15 мл раствора ТВ8Т добавляют по 50 мкл раствора А и раствора В из набора реагентов АВС. Этот раствор необходимо приготовить за 30 мин до использования.

16. Промывают, как указано на стадии 4 выше.

17. Во все лунки добавляют по 100 мкл предварительно приготовленного комплекса А и В. Инкубируют при встряхивании в течение 30 мин при комнатной температуре.

18. Промывают, как указано на стадии 4 выше.

19. В каждую лунку добавляют по 100 мкл раствора ТиГЬо-ТМВ. Встряхивают при комнатной температуре в течение 10-15 мин.

20. Когда поглощение в лунках с положительным контролем достигает приблизительно 0,35-0,4, реакцию останавливают путем добавления в каждую лунку по 100 мкл раствора для остановки реакции ТиГЬо-ТМВ.

21. Поглощение в лунках измеряют на ридере Эупа1ес11 МК7000 ЕЫ8А (фильтр для образцов - 450 нм, фильтр сравнения - 410 нм).

Исследование с использованием клеток

НИУ-ЕС-С

Следующая методика предназначена также для определения активности исследуемых соединений по отношению к рецепторам РОСЕ-Е, РСР-К, УЕСР, аРСР или Р1к-1/КЭК, причем все перечисленные рецепторы являются природными соединениями, экспрессируемыми клетками НИУ-ЕС.

Нулевой день

1. Клетки НИУ-ЕС-С (эндотелиальные клетки пупочной вены человека из коллекции Атепсап Туре СоПесЕоп, номер по каталогу 1730 СКИ) промывают и обрабатывают трипсином. Клетки промывают раствором Э-РВ8 (фосфатный буфер, содержащий хлористый натрий, ОЫЬессо, производства фирмы С1Ьсо ВКИ, номер по каталогу 14190-029) два раза объемом приблизительно 1 мл на флакон с площадью 10 см². Клетки обрабатывают раствором 0,05% трипсин-ЕЭТА в несодержащем ферментов растворе для диссоциации клеток (производства фирмы 81дта СЬетка1 Сотрапу, номер по каталогу С-1544). 0,05% раствор трипсина готовят путем разбавления раствора 0,25% трипсин/1 мМ ЕЭТА (производства фирмы С1Ьсо, номер по каталогу 25200-049) в растворе для диссоциации клеток. Клетки обрабатывают трипсином объемом приблизительно 1 мл на флакон с площадью 25-30 см² в течение 5 мин при 37°С. Когда клетки сняты с поверхности флакона, добавляют равный объем среды для анализа и переносят в стерильную центрифужную пробирку объемом 50 мл (производства фирмы Р1кЬег 8с1еп(1Пс, номер по каталогу 05539-6).

2. Клетки промывают приблизительно 35 мл среды для анализа в стерильной центрифужной пробирке объемом 50 мл путем добавления среды для анализа, центрифугирования при приблизительно 200хд в течение 10 мин, удаления супернатанта и ресуспендирования в 35 мл раствора Э-РВ8. Клетки промывают еще два

157

158 раза раствором Э-РВЗ, затем клетки ресуспендируют в среде для анализа в объеме приблизительно 1 мл на культуральный флакон площадью 15 см². Среда для анализа содержит среду Е12К (производства фирмы С1Ьсо ВКЬ, номер по каталогу 21127-014) и 0,5% инактивированной нагреванием ЕВ 8. Число клеток подсчитывают на приборе Сои11ег Соип1ег® (производства фирмы Сои11ег Е1ес1гошс8 1пс.) и добавляют среду для анализа до концентрации клеток 0,81,0х10⁵ клеток/мл.

3. В каждую лунку 96-луночного планшета с плоским дном добавляют по 100 мкл клеточной суспензии или по 0,8-1,0х10⁴ клеток, инкубируют при 37°С в присутствии 5% СО₂ в течение приблизительно 24 ч.

Первый день

1. Готовят серию двухкратных разведений исследуемого соединения в отдельном 96луночном планшете, в основном в диапазоне концентрации от 50 до 0 мкМ. Используют вышеупомянутую среду для анализа, как указано на стадии 2 выше в нулевой день. Разведения получают путем добавления в верхнюю лунку определенного столбца лунок в планшете 90 мкл раствора исследуемого соединения концентрации 200 мкМ (раствор 4Х) (то есть исходная концентрация 4Х в 4 раза выше по сравнению с конечной концентрацией в лунке). Так как концентрация исходного раствора исследуемого соединения обычно составляет 20 мМ в ДМСО, то концентрация раствора лекарственного средства составляет 200 мкМ, а концентрация ДМСО - 2%.

В качестве раствора для разбавления исследуемого соединения используют среду для анализа (Е12К+0,5% ЕВ8), содержащую 2% ДМСО, с целью разбавления исследуемого соединения при постоянной концентрации ДМСО. В каждую из остальных лунок в (столбце) добавляют по 60 мкл указанного раствора для разбавления. Из верхней лунки, содержащей 120 мкл 200 мкМ раствора исследуемого соединения, отбирают 60 мкл и смешивают их с 60 мкл раствора во второй лунке столбца. Затем отбирают 60 мкл из этой лунки и смешивают их с 60 мкл третьей лунки столбца и разбавления продолжают до завершения двухкратных разведений. Когда смешивание в предпоследней лунке столбца завершено, из нее отбирают 60 мкл раствора и отбрасывают их. В последней лунке столбца оставляют 60 мкл среды, содержащей ДМСО, и используют эту лунку как контрольную, несодержащую исследуемого соединения. Готовят 9 колонок с разбавлениями исследуемых соединений, которых достаточно для проведения анализа в трех повторных сериях для каждого исследуемого соединения: (1) фактор УЕСЕ (полученный на фирме Рерго ТесН 1пс., номер по каталогу 100-200, (2) эндотелиальный фактор роста (ЕССЕ), известный также под названием кислый фибробластный фактор роста или аЕСЕ (полученный на фирме ВоеНппдег МаппНепп ВюсНетюа, номер по каталогу 1439 600) или (3) фактор РОСЕ В/В человека, полученный на фирме ВоеНппдег МаппНе1т, Германия, номер по каталогу 1276-956) и контроль с сывороткой для анализа. ЕССЕ используют в виде препарата, содержащего натриевую соль гепарина.

2. В 96-луночный планшет для анализа, содержащий в каждой лунке по 0,8-1,0х10⁴ клеток НИУ-ЕС-С в 100 мкл среды, полученных в течение нулевого дня, переносят по 50 мкл разбавленного исследуемого соединения из каждой лунки планшета с разбавлениями и инкубируют в течение приблизительно 2 ч при 37°С в присутствии 5% СО₂.

3. В три повторные серии лунок, содержащих исследуемое соединение, добавляют по 50 мкл раствора фактора УЕСЕ с концентрацией 80 мкг/мл, раствора фактора ЕССЕ с концентрацией 20 нг/мл или контрольной среды. По аналогии с концентрацией исследуемых соединений концентрация факторов роста в четыре раза выше (раствор 4Х) по сравнению с необходимой конечной концентрацией. Для разбавления факторов роста до необходимой концентрации используют среду для анализа, описанную на стадии 2 нулевого дня. Клетки инкубируют приблизительно в течение 24 ч при 37°С в присутствии 5% СО2. В каждой лунке содержится 50 мкл исследуемого соединения, 50 мкл фактора роста или среды и 100 мкл клеток, общий объем в лунке составляет 200 мкл. Таким образом раствор 4Х исследуемого соединения и фактора роста разбавляется в 4 раза (образуется раствор 1 Х) после добавления всех указанных компонентов в лунку.

Второй день

1. В каждую лунку добавляют по 10 мкл (1 мкКи) раствора ³Н-тимидина (производства фирмы АтегаНат, номер по каталогу ТВК-686), указанный раствор с радиоактивностью 100 мкКи/мл получают в среде ВРМ1 + инактивированная нагреванием 10% ЕВ8. Планшет инкубируют в течение приблизительно 24 ч при 37°С в присутствии 5% СО₂. Среду ВРМ1 получают на фирме С1Ьсо ВКЬ, номер по каталогу 11875-051.

Третий день

1. Планшеты замораживают при -20°С и хранят в течение ночи.

Четвертый день

Планшеты размораживают и клетки снимают на полоски фильтровальной бумаги (производства фирмы \Уа11ас, номер по каталогу 1205-401) с использованием прибора для сбора клеток Тот1ес Нагте81ег 96®. Количество радиактивности определяют на жидкостном сцинтиляционном счетчике \Уа11ас Ве1ар1а1е™.

Модели животных т νί\Ό Ксенотрансплантатные модели животных

Способность опухоли человека расти в виде ксенотранстплантата в мышах с отсутствую

159

160 щей вилочковой железой (например, мыши Ва1Ь/с, пи/пи) позволяет использовать таких мышей в качестве модели ΐπ у1уо для исследования биологического ответа при терапии опухолей человека. С момента первой успешной ксенотрансплантации опухолей человека в мышь без вилочковой железы (см. статью Кудаагд и Роу1зеп, 1969, Ас1а Ра11ю1. М1сгоЬю1.8сапд., 77:758-760) множество клеточных линий различных опухолей человека (например, молочной железы, легких, мочеполового тракта, желудочно-кишечного тракта, головы и шеи, глиобластомы, костей и злокачественных меланом) были трансплантированы и успешно развивались в голых мышах. Следующие методы анализа могут быть использованы для определения уровня активности, специфичности и действия различных соединений по настоящему изобретению. Для изучения соединений используют три основных типа анализа: клеточнокаталитический, клеточно-биологический анализы и анализ ш у1уо. Целью клеточнокаталитического анализа является оценка действия соединения на степень фосфорилирования с помощью ТК остатков тирозина в известном субстрате в клетке. Целью клеточнобиологического анализа является оценка действия соединения на стимулированный ТК (тирозинкиназой) клеточный ответ. Целью анализа ш У1уо является оценка действия соединения на модельное животное с определенным заболеванием, таким как онкологическое заболевание.

Подходящие клеточные линии для подкожных ксенотрансплантатных экспериментов включают клетки С6 (глиома, АТСС # ССЬ 107), клетки А375 (меланома, АТСС # СКЬ 1619), клетки А431 (эпидермоидный рак, АТСС # СКЬ 1555), клетки Са1и 6 (легкие, АТСС # НТВ 56), клетки РС3 (предстательная железа, АТСС # СКЬ 1435), клетки 8КОУ3ТР5 и фибробластные клетки N14 3Т3, модифицированные методом генной инженерии для избыточной экспрессии рецепторов ЕСЕК, РЭСЕК, 1СЕ-1К или любой другой исследуемой киназы.

Следующую методику можно использовать для проведения ксенотрансплантатных экспериментов.

Самок мышей с отсутствующей вилочковой железой (ВАЬВ/с, пи/пи) получают на фирме 81топзеп ЬаЬогаЮпез (Сйгоу, СА). Всех животных содержат в чистых условиях в микроклетках с подстилкой типа А1рИа-дг1. Животные получают стерильный корм для грызунов и стерильную воду в неограниченном количестве.

Клеточные линии выращивают в соответствующей среде (например, среды МЕМ, ЭМЕМ, Нат'з Е10 или Нет'з Е12, содержащие 5%-10% ЕВ8 и 2 мМ глутамина). Все среды для культуральных линий, глутамин и ЕВ8, если особо не указано, получены на фирме С1Ьсо Ые ТесБпо1од1ез (Сгапд 1з1апд, ΝΥ). Все клетки выращивают во влажной атмосфере, содержащей

90-95% воздуха и 5%-10% СО₂ при 37°С. Все клеточные линии инокулируют дважды в неделю, причем клеточные линии не содержат микоплазму, отсутствие которой контролируют по методу Мусо1ес1 (производство фирмы С1Ьсо).

Клетки истощают путем добавления смеси 0,05% трипсин-ЕЭТА до конфлюэнтности и осаждают центрифугированием при 450хд в течение 10 мин. Осадок ресуспендируют в стерильном растворе РВ8 или в среде, не содержащей ЕВ8, до соответствующей концентрации и клетки имплантируют в заднюю часть бока мыши (8-10 мышей в группе, 2-10 х 10⁶ клеток на одно животное). Рост опуходи измеряют через 3-6 недель с использованием штангенциркуля. Объем опухоли рассчитывают, если особо не указано, как произведение длина х ширина х высота. Величину Р рассчитывают с использованием ΐ-критерия Стьюдента. Исследуемые соединения в 50-100 мкл наполнителя (ДМСО или УРО:Ь5\У) можно вводить внутрибрюшинно при различных концентрациях в основном через один день после имплантации.

Модель прорастания опухоли

Следующая модель прорастания опухоли была разработана для оценки терапевтического действия и эффективности соединений, селективно ингибирующих рецептор КОК/ЕЬК-1.

Методика

В качестве экспериментальных животных используют 8-ми недельных голых мышей (самок производства фирмы 81топзеп 1пс.). Имплантацию опухолевых клеток проводят в проточном ламинаре. Анестезию проводят путем внутрибрюшинного введения смеси ксилазин/кетамин (100 мг/кг кетамина и 5 мг/кг ксилазина). Делают центральный надрез (длиной приблизительно 1,5 см) для доступа в брюшную полость для введения опухолевых клеток в количестве 10⁷ в 100 мкл среды. Клетки вводят в дуоденальную долю поджелудочной железы или в серозную оболочку ободочной кишки. Брюшину и мышцы сшивают, накладывая непрерывный шелковый шов (6-0) и кожу смыкают с использованием скоб для заживления ран. За животными ведут ежедневное наблюдение.

Анализ

Через 2-6 недель, в зависимости от общих наблюдений за животными, мышей забивают, вырезают местные метастазы в различных органах (легкие, печень, мозг, желудок, селезенка, сердце, мышцы) и анализируют их (измеряют размер опухоли, степень прорастания, иммунохимический анализ, гибридизация ш зйи и т.п.).

Определение цитотоксичности

Соединения, предназначенные для терапии, должны проявлять в большей степени ингибирующую активность по отношению к активности рецепторов ТК и по возможности не обладать цитотоксическим действием. Эффективность действия и цитотоксичность соединения определяют по терапевтическому индексу,

161

162 то есть по соотношению 1С₅₀/ЬО₅₀. 1С₅₀ означает дозу, необходимую для достижения 50% ингибирования, которую определяют по стандартному методу, такому как представленный в данном описании. ЬО₅₀ означает дозу, которая приводит к 50% токсичности и которую также определяют по одному из стандартных методов: (Μοаатаηη, 1983. 1. Iттиηο1. Μе1Ηοба. 65:5563), путем измерения количества высвобождающегося ЬОН (Ι<οι^ι^\\Έ1<ί и Са11е\\'аег1, 1983, 1. Тштиюк Μе1Ηοба. 64:313, Эескег и ^^апп^ай^, 1988, 1. ^тию! Μе1Ηοба. 115:61) или путем измерения летальной дозы на модельных животных. Предпочтительными являются соединения с более высоким терапевтическим индексом. Терапевтический индекс должен быть более 2, предпочтительно по крайней мере 10, более предпочтительно по крайней мере 50.

Примеры определения биологической активности

Результаты определения активности соединений по настоящему изобретению ш νίίτο приведены в табл. 1 и 2. Полученные данные свидетельствуют о том, что соединения в основном достаточно активны по отношению к ряду ПТК ш νί1Γο. Соединения проявляют также чрезвычайно высокую активность ш νίνο. Например, некоторые соединения по настоящему изобретению, введенные оральным способом, приводят к значительному снижению среднего размера опухоли (глиомы С6), имплантированной мышам подкожным способом. Однако соединение 5 обладает значительно более высокой активностью по сравнению с другими соединениями по настоящему изобретению. Согласно одному эксперименту, клетки глиомы человека С6 (3 х 10⁶, п = 10-20 животных в группе) имплантируют подкожным способом в заднюю часть бока самок мышей (ВАЬВ/с пи/пи) в нулевой день. Соединения 3, 5, 19 и 20 в водном лабразоле вводят животным орально в дозе 200 мг/кг/день, начиная со следующего после имплантации дня. Размер опухоли измеряют с помощью кронштангеля, а объем опухоли рассчитывают как произведение длина х ширина х вы-

Как показано на фиг. 1, все исследованные соединения проявляют значительную ингибирующую активность по сравнению с контрольными животными, которым вводят только носитель. Однако соединение 5 проявляет неожиданно высокую активность по сравнению с остальными соединениями, что удивительно, принимая во внимание аналогичную химическую структуру исследованных соединений. В то время, как соединения 3, 19 и 21 ингибируют рост опухоли на 40-45% на 18 день после имплантации, соединение 5 ингибирует рост опухоли на 80-85%.

Неожиданная высокая эффективность соединения 5 ш νίνο, особенно при оральном введении, продемонстрирована также посравнению с соединением 65

Соединение 65 проявляет активность ш νί1го почти на порядок выше по сравнению с соединеним 5 (данные не показаны). Однако, при внутрибрюшинном введении мышам с двумя различными клеточными линиями опухолей 8Е763Т и 8Е767Т соединение 5 проявляет более высокую ингибирующую активность по сравнению с соединением 65: от незначительного различия (ингибирование на 5% выше на 21 день) до заметного различия (ингибирование на 14% выше на 21 день).

Различие в активности соединения 5 и соединения 65 становится еще более значительным, если оба соединения введены оральным способом. Оральная эффективность соединения 65 и нескольких его аналогов, соединений 6669, представлена на фиг. 2.

Как показано на фиг. 2, соединение 65, введенное орально в дозе 200 мг/кг/день, ингибирует рост опухоли С6 через 18 дней после подкожного имплантирования мышам приблизительно на 65%, что значительно выше по сравнению с аналогами соединения 65, которые ингибируют рост опухоли на 14-16%. Однако, неожиданно оказалось, что эффективность соединения 65, введенного оральным способом, все же значительно ниже по сравнению с соединением 5, которое, как показано выше, при оральном введении ингибирует рост опухоли на 80-85% на аналогичной модели через одинаковый период времени.

По сравнению с соединением 70 соединение 5 характеризуется значительно более низкой величиной (т.е. большей эффективностью) К₁ (константой ингибирования) по отношению к рецептору ЕСЕ-К1 (1,2 для соединения 5 по сравнению с 19,49 для соединения 70) и к рецептору РОСЕК (данные не показаны).

163

164

СН_Э

2Δ

Неожиданная значительная эффективность соединения 5 при оральном введении была также продемонстрирована по сравнению с его близким аналогом, соединением 71

Несмотря на структурную аналогию, соединение 71, введенное орально в дозе 200 мг/кг/день мышам (ВАБВ/с пи/пи) с имплантированной подкожно меланомной опухолью, ингибирует рост опухоли лишь на 57% (данные не показаны), что также ниже по сравнению с соединением 5, которое ингибирует рост опухоли на 80-85%.

В связи с неожиданно более высокой эффективностью при оральном введении, показанной выше, соединение 5 является предпочтительным вариантом воплощения настоящего изобретения.

Заключение

Таким образом, следует отметить, что соединения, способы и фармацевтические композиции по настоящему изобретению являются эффективными модуляторами активности ПК и следует ожидать, что указанные соединения и композиции могут быть эффективно использованы в качестве терапевтических средств для лечения нарушений, связанных с активностью РТК, КТК и СТК.

Для специалистов в данной области техники представляется совершенно очевидным, что настоящее изобретение разработано не только для достижения упомянутых целей и преимуществ, но и для достижения других целей, характерных для настоящего изобретения. Молекулярные комплексы и способы, методики, способы лечения, молекулы, специфические соединения представлены в данном описании в качестве предпочтительных примеров воплощения настоящего изобретения и не ограничивают объем притязаний изобретения. Любые изменения и другие способы использования, очевидные для специалистов, компетентных в данной области техники, включены в объем притязаний настоящего изобретения, заявленный в пунктах формулы изобретения.

Для специалистов в данной области техники представляется очевидным, что изменение заместителей и другие модификации объектов, представленных в данном описании, также включены в объем притязаний настоящего изобретения.

Все упомянутые патенты и публикации представлены для определения уровня техники для специалистов, для которых предназначено данное изобретение. Все упомянутые в данном описании патенты и публикации включены в описание в качестве ссылок таким же образом, как публикации, про каждую из которых в тексте заявки указано, что она включена в качестве ссылки в текст описания изобретения.

Настоящее изобретение описано в иллюстративном варианте и может быть использовано в отсутствии любого элемента или элементов, ограничения или ограничений, которые подробно не описаны в данном описании. Таким образом, например, в данном описании в каждом конкретном случае любой из терминов включающий, в значительной степени включающий и состоящий из может быть заменен на один из оставшихся двух терминов. Термины и выражения, использованные в данном описании, предназначены для описания, но не для ограничения объема притязаний изобретения и следовательно, использование таких терминов и выражений не означает исключение любых эквивалентов описанных признаков или их части, но при этом следует понимать, что возможны различные модификации в пределах заявленного объема притязаний изобретения. Таким образом, следует понимать, что несмотря на подробное описание предпочтительных вариантов воплощения изобретения и признаков по выбору, для специалиста в данной области техники представляется возможным модифицировать и изменить концепцию изобретения, и что такие модификации и изменения будут рассматриваться как включенные в объем притязаний настоящего изобретения, заявленный в пунктах прилагаемой формулы изобретения.

Кроме того, если признаки или аспекты изобретения описаны в терминах групп Маркуша, то для специалиста в данной области техники представляется очевидным, что в настоящем изобретении описаны любой индивидуальный представитель или подгруппа представителей группы Маркуша. Например, если Х описан как выбранный из группы, включающей бром, хлор и иод, то пункты формулы изобретения, в которых Х означает бром, и пункты формулы, в которых Х означает бром и хлор, полностью описаны.

Другие варианты воплощения изобретения включены в следующие пункты формулы изобретения.

Claims (14)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Пирролзамещенный 2-индолинон, представленный общей формулой где К¹, К² и К⁷ означают водород;

   К³, К⁴, К⁵ и К⁶ независимо выбраны из группы, включающей водород, гидрокси, галоген, незамещенный С₁-С₄алкил, С₁-С₄алкил, замещенный карбоновой кислотой, незамещенный С1-С4алкокси, группу карбоновой кислоты, незамещенный арил, арил, замещенный по меньшей мере одной группой незамещенного С₁С4алкилалкокси, и морфолино;

   К⁸ означает незамещенный С1-С4алкил,

   К⁹ означает -(СН2)(СН2)С(=О)ОН и К¹⁰ означает незамещенный С1-С4алкил.
2. 2. 3-[2,4-Диметил-5-(2-оксо-1,2-дигидроиндол-3-илиденметил)-1Н-пиррол-3-ил]пропионовая кислота формулы
3. 3. Фармацевтическая композиция, отличающаяся тем, что она содержит соединение по п.1, его соль или пролекарство и физиологически приемлемый носитель или наполнитель.
4. 4. Способ модулирования каталитической активности протеинкиназы, отличающийся тем, что осуществляют контактирование упомянутой протеинкиназы с соединением по п.1, его солью или пролекарством.
5. 5. Способ по п.4, отличающийся тем, что упомянутую протеинкиназу выбирают из группы, включающей рецепторную тирозинкиназу, нерецепторную тирозинкиназу и серинтреонинкиназу.
6. 6. Фармацевтическая композиция, отличающаяся тем, что она содержит соединение по п.2, его соль или пролекарство и физиологически приемлемый носитель или наполнитель.
7. 7. Способ лечения или профилактики нарушения в организме, связанного с протеинкиназой, отличающийся тем, что в организм вводят терапевтически эффективное количество соединения по п.1 или 2, их соли или пролекарства.
8. 8. Способ по п.7, отличающийся тем, что в упомянутый организм вводят терапевтически эффективное количество 3-[2,4-диметил-5-(2оксо-1,2-дигидроиндол-3-илиденметил)-1Нпиррол-3-ил]пропионовой кислоты.
9. 9. Способ по п.7, отличающийся тем, что нарушение, связанное с упомянутой протеинкиназой, выбирают из группы, включающей нарушение, связанное с рецепторной тирозинкиназой, нарушение, связанное с нерецепторной тирозинкиназой, и нарушение, связанное с серинтреонинкиназой.
10. 10. Способ по п.7, отличающийся тем, что нарушение, связанное с упомянутой протеинкиназой, выбирают из группы, включающей нарушение, связанное с ΕСЕК, нарушение, связанное с РОСЕК, нарушение, связанное с 1СЕС, и нарушение, связанное с йк.
11. 11. Способ по п.7, отличающийся тем, что нарушением, связанным с упомянутой протеинкиназой, является онкологическое заболевание, которое выбирают из группы, включающей плоскоклеточный рак, астроцитому, саркому Капоши, глиобластому, рак легких, рак мочевого пузыря, рак головы и шеи, меланому, рак яичников, рак предстательной железы, рак молочной железы, мелкоклеточный рак легких, глиому, колоректальный рак, рак мочеполовой системы и рак желудочно-кишечного тракта.
12. 12. Способ по п.7, отличающийся тем, что нарушение, связанное с упомянутой протеинкиназой, выбирают из группы, включающей диабет, аутоиммунное заболевание, гиперпролиферацию, рестеноз, фиброз, псориаз, остеоартрит, ревматоидный артрит, ангиогенез, воспалительный процесс, иммунологическое нарушение и сердечно-сосудистое нарушение.
13. 13. Способ по п.7, отличающийся тем, что упомянутым организмом является млекопитающее.
14. 14. Соединение, выбранное из группы, состоящей из

    3-[5-(5-хлор-2-оксо-1,2-дигидроиндол-3илиденметил)-2,4-диметил-1Н-пиррол-3-ил]пропионовой кислоты,

    3-[2,4-диметил-5-(2-оксо-1,2-дигидроиндол-3-илиденметил)-1Н-пиррол-3-ил]пропионовой кислоты,

    3-[5-(5-бром-2-оксо-1,2-дигидроиндол-3илиденметил)-2,4-диметил-1Н-пиррол-3-ил]пропионовой кислоты,

    3-[5-(5-иод-2-оксо-1,2-дигидроиндол-3илиденметил)-2,4-диметил-1Н-пиррол-3-ил]пропионовой кислоты,

    3-[2,4-диметил-5-(4-метил-2-оксо-1,2-дигидроиндол-3-илиденметил)-1Н-пиррол-3-ил] пропионовой кислоты,

    3-[2,4-диметил-5-(5-метил-2-оксо-1,2-дигидроиндол-3-илиденметил)-1Н-пиррол-3-ил] пропионовой кислоты,

    167

    168

    3-[5-(6-гидрокси-2-оксо-1,2-дигидроиндол3-илиденметил)-2,4-диметил-1Н-пиррол-3-ил] пропионовой кислоты,

    3-[5-(6-метокси-2-оксо-1,2-дигидроиндол3-илиденметил)-2,4-диметил-1Н-пиррол-3-ил] пропионовой кислоты,

    3-{5-[6-(3-метоксифенил)-2-оксо-1,2-дигидроиндол-3-илиденметил]-2,4-диметил-1Нпиррол-3-ил}пропионовой кислоты,

    3-{5-[6-(3-этоксифенил)-2-оксо-1,2-дигидроиндол-3 -илиденметил] -2,4-диметил-1Н-пиррол-3-ил}пропионовой кислоты,

    3-[2,4-диметил-5-(2-оксо-6-фенил-1,2-дигидроиндол-3-илиденметил)-1Н-пиррол-3-ил] пропионовой кислоты,

    3-{5-[6-(4-метоксифенил)-2-оксо-1,2-дигидроиндол-3-илиденметил]-2,4-диметил-1Нпиррол-3-ил}пропионовой кислоты,

    3-{5-[6-(2-метоксифенил)-2-оксо-1,2-дигидроиндол-3-илиденметил]-2,4-диметил-1Нпиррол-3-ил}пропионовой кислоты,

    3-[2,4-диметил-5-(6-морфолин-4-ил-2-оксо-1,2-дигидроиндол-3-илиденметил)-1Н-пиррол-3-ил] пропионовой кислоты,

    3-[5-хлор-4-метил-2-оксо-1,2-дигидроиндол-3 -илиденметил)-2,4-диметил-1Н-пиррол-3ил] пропионовой кислоты.