JP2002533360A - 蛋白質キナーゼ活性を調節するためおよび癌の化学療法において用いるための３−ヘテロアリーリデニル−２−インドリノン化合物 - Google Patents

蛋白質キナーゼ活性を調節するためおよび癌の化学療法において用いるための３−ヘテロアリーリデニル−２−インドリノン化合物

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JP2002533360A JP2000590484A JP2000590484A JP2002533360A JP 2002533360 A JP2002533360 A JP 2002533360A JP 2000590484 A JP2000590484 A JP 2000590484A JP 2000590484 A JP2000590484 A JP 2000590484A JP 2002533360 A JP2002533360 A JP 2002533360A
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ランゲッカー，ピーター・ジェイ
ショーヴァー，ローラ・ケイ
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    • A61P35/00—Antineoplastic agents

Abstract

(57)【要約】 本発明は，蛋白質キナーゼの酵素活性を調節し，したがって，蛋白質キナーゼ関連細胞性疾患，例えば癌の予防および治療において有用であると予測される３−ヘテロアリーリデニル−２−インドリノン化合物に関する。さらに，これらの化合物は，癌の治療において他の化学療法剤，特にフッ化ピリミジンの有効性を増強すると予測される。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 序 本発明は，一般に，化学，生化学，薬理学，医薬および癌治療に関する。より
詳細には，本発明は，蛋白質キナーゼ（ＰＫ）の活性を調節する３−ヘテロアリ
ーリデニル−２−インドリノン化合物，および異常な蛋白質キナーゼ活性に関連
する疾患，例えば癌の治療において，この化合物と他の化学療法剤を組み合わせ
て用いる方法に関する。
【０００２】 発明の背景 以下は，背景情報としてのみ提供されるものであり，本発明に対する先行技術
であると認めるものではない。
【０００３】 ＰＫは，蛋白質のチロシン，セリンおよびトレオニン残基上のヒドロキシ基の
リン酸化を触媒する酵素である。この外観上は単純な活性の結果は圧倒的である
。細胞成長，分化および増殖，すなわち，細胞生命のほぼすべての観点が種々の
仕方でＰＫ活性に依存する。さらに，異常なＰＫ活性は，比較的生命を脅かさな
い疾患（例えば乾癬）から，非常に悪性の疾患（例えば神経膠細胞腫（脳癌））
までの範囲の疾患の宿主と関連づけられてきた。
【０００４】 ＰＫは，慣用的に２種類に分類することができる：蛋白質チロシンキナーゼ（
ＰＴＫ）およびセリン−トレオニンキナーゼ（ＳＴＫ）。
【０００５】 ＰＫ活性の主な観点は，成長因子レセプターへのその関与である。成長因子レ
セプターは，細胞表面蛋白質である。成長因子リガンドが結合すると，成長因子
レセプターは活性型に変換され，これが細胞膜の内表面上の蛋白質と相互作用す
る。これは，レセプターおよび他の蛋白質上のチロシン残基のリン酸化を引き起
こし，細胞内部で種々の細胞質シグナリング分子との複合体を形成する。次にこ
れらの複合体は，多くの細胞性応答，例えば，細胞***（増殖），細胞分化，細
胞成長，細胞外微細環境に対する代謝的効果の発現等を行う。さらに詳しい議論
については，Ｓｃｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒ ａｎｄ Ｕｌｌｒｉｃｈ，Ｎｅｕｒｏ
ｎ，９：３０３−３９１（１９９２）（本明細書において完全に記載されている
ように，図面を含め本明細書の一部としてここに引用する）を参照されたい。
【０００６】 ＰＫ活性を有する成長因子レセプターは，レセプターチロシンキナーゼ（"Ｒ
ＴＫ"）として知られている。これらは，多様な生物学的活性を有する膜貫通レ
セプターの大きなファミリーを含む。現在のところ，ＲＴＫの少なくとも１９個
の異なるサブファミリーが同定されている。これらのサブファミリーの例は，"
ＨＥＲ"ＲＴＫと称されるサブファミリーであり，これにはＥＧＦＲ（上皮成長
因子レセプター），ＨＥＲ２，ＨＥＲ３およびＨＥＲ４が含まれる。これらのＲ
ＴＫは，細胞外グリコシル化リガンド結合ドメイン，膜貫通ドメイン，および蛋
白質上のチロシン残基をリン酸化しうる細胞内細胞質触媒ドメインから構成され
る。
【０００７】 別のＲＴＫサブファミリーは，インスリンレセプター（ＩＲ），インスリン様
成長因子Ｉレセプター（ＩＧＦ−１Ｒ）およびインスリンレセプター関連レセプ
ター（ＩＲＲ）を含む。ＩＲおよびＩＧＦ−１Ｒはインスリン，ＩＧＦ−Ｉおよ
びＩＧＦ−ＩＩと相互作用して，２つの完全に細胞外グリコシル化されたαサブ
ユニットと２つのβサブユニットのヘテロ４量体を形成し，これは細胞膜を横切
り，チロシンキナーゼドメインを含有する。
【０００８】 第３のＲＴＫサブファミリーは，血小板由来成長因子レセプター（"ＰＤＧＦ
Ｒ"）群と称され，これにはＰＤＧＦＲα，ＰＤＧＦＲβ，ＣＳＦＩＲ，ｃ−ｋ
ｉｔおよびｃ−ｆｍｓが含まれる。これらのレセプターは，可変数のイムノグロ
ビン様ループおよび細胞内ドメインからなるグリコシル化された細胞外ドメイン
から構成され，ここでチロシンキナーゼドメインは関連のないアミノ酸配列によ
り分断されている。
【０００９】 別の群は，そのＰＤＧＦＲサブファミリーとの類似性のため，しばしばＰＤＧ
ＦＲサブファミリーに包摂される，胎児肝キナーゼ（"ｆｌｋ"）レセプターサブ
ファミリーである。この群は，キナーゼ挿入ドメイン−レセプター胎児肝キナー
ゼ−１（ＫＤＲ／ＦＬＫ−１），ｆｌｋ−１Ｒ，ｆｌｋ−４およびｆｍｓ様チロ
シンキナーゼ１（ｆｌｔ−１）からなると考えられている。
【００１０】 チロシンキナーゼ成長因子レセプターファミリーの別の１つのメンバーは，繊
維芽細胞成長因子（"ＦＧＦ"）レセプター群である。この群は，４つのレセプタ
ー，ＦＧＦＲ１−ＦＧＦＲ４，および７つのリガンド，ＦＧＦ１−ＦＧＦ７から
構成される。まだあまり明確にされていないが，レセプターは，可変数のイムノ
グロビン様ループおよび細胞内ドメインを含有するグリコシル化された細胞外ド
メインから構成されるようであり，ここでＰＴＫ配列は関係のないアミノ酸配列
の領域により分断されている。
【００１１】 既知のＲＴＫサブファミリーのより完全なリストは，Ｐｌｏｗｍａｎ ｅｔ
ａｌ．，ＤＮ＆Ｐ，７（６）：３３４−３３９（１９９４）（本明細書において
完全に記載されているように，図面を含め本明細書の一部としてここに引用する
）に記載されている。
【００１２】 ＲＴＫに加え，"非レセプターチロシンキナーゼ"または"細胞性チロシンキナ
ーゼ"と称される，完全に細胞内のＰＴＫのファミリーが存在する。本明細書に
おいては，"ＣＴＫ"と略されるこの後者の呼称を使用する。ＣＴＫは細胞外およ
び膜貫通ドメインを含有しない。現在のところ，１１個のサブファミリー（Ｓｒ
ｃ，Ｆｒｋ，Ｂｔｋ，Ｃｓｋ，Ａｂｌ，Ｚａｐ７０，Ｆｅｓ，Ｆｐｓ，Ｆａｋ，
ＪａｋおよびＡｃｋ）の２４個を越えるＣＴＫが同定されている。Ｓｒｃサブフ
ァミリーは，これまでのところ，ＣＴＫのもっとも大きい群であるようであり，
Ｓｒｃ，Ｙｅｓ，Ｆｙｎ，Ｌｙｎ，Ｌｃｋ，Ｂｌｋ，Ｈｃｋ，ＦｇｒおよびＹｒ
ｋを含む。ＣＴＫのより詳細な議論については，Ｂｏｌｅｎ，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ
，８：２０２３−２０３１（１９９３）（本明細書において完全に記載されてい
るように，図面を含め本明細書の一部としてここに引用する）を参照されたい。
【００１３】 セリン／トレオニンキナーゼもしくはＳＴＫは，ＣＴＫと同様に主として細胞
内にあるが，ＳＴＫレセプターキナーゼは少ない。ＳＴＫはもっとも一般的なサ
イトゾルキナーゼである。すなわち，細胞質オルガネラおよび細胞骨格以外の，
細胞質のその部分でその機能を行うキナーゼである。サイトゾルは，細胞の中間
代謝および生合成活性のほとんどが生ずる細胞中の領域である。例えば，蛋白質
がリボソーム上で合成されるのはサイトゾル内である。
【００１４】 ＲＴＫ，ＣＴＫおよびＳＴＫはすべて，病原性状態，特に癌を含む状態のホス
トであることが示唆されてきた。ＰＴＫと関連づけられてきた他の病原性状態に
は，限定されるものではないが，乾癬，肝硬変，糖尿病，アテローム性動脈硬化
，脈管形成，再狭窄，眼性疾患，慢性関節リウマチおよび他の炎症性疾患，自己
免疫疾患，および種々の腎臓疾患が含まれる。
【００１５】 癌に関しては，腫瘍の発達を推進する過剰な細胞増殖を説明する主要な仮説の
２つは，ＰＫにより制御されることが知られている機能に関連する。すなわち，
悪性細胞成長は細胞***および／または分化を調節するメカニズムの故障に起因
することが示唆されている。多数のプロトオンコジンの蛋白質産物は，細胞成長
および分化を制御するシグナル伝達経路に関与することが示されている。これら
のプロトオンコジンの蛋白質産物には，上で議論した，細胞外成長因子，膜貫通
成長因子ＰＴＫレセプター（ＲＴＫ），細胞質ＰＴＫ（ＣＴＫ）およびサイトゾ
ルＳＴＫが含まれる。
【００１６】 癌は，依然として，ヒトの死亡の主な原因の１つである。癌の大部分は，固体
腫瘍癌，例えば，限定されないが，卵巣癌，直腸結腸癌，脳癌，肝臓癌，腎臓癌
，胃癌，前立腺癌，肺癌，甲状腺癌，カポジ肉腫および皮膚癌である。固体腫瘍
癌のうち，直腸結腸癌は特に一般的な悪性腫瘍である。米国およびほとんどの西
洋化国ではおよそ２０人に１人が大腸の腺癌に罹患している。米国では，直腸結
腸癌は新たに診断された癌の約１５％を占める。直腸結腸癌は癌関連死亡の３番
目に多い原因であるが，予後および結果は診断時における疾病の段階に非常に依
存する。直腸結腸癌は早期段階で診断された場合，多分野治療計画を用いてきわ
めて治癒可能である。いずれにしても，この疾病であると診断された患者の２０
−２５％に転移が生じるか，局所再発性または転移性疾病を発生し，これらの患
者の大部分は最終的にこの疾病のために死亡する。
【００１７】 結腸直腸癌を含む固体腫瘍癌の治療の基本的なモードは，外科手術，放射線治
療および化学療法を，別々に，または組み合わせて行う。
【００１８】 腫瘍の最初の形成および成長は新たな血管の形成を必要としないが，さらに成
長するためには新生血管形成が必要である。すなわち，腫瘍が体積３−４ｍｍ3
を越えて成長するためには，新たな血管の成長，すなわち，現存する血管から新
たな毛細血管の芽を出す新脈管形成が生じなければならない。実際，成長してい
る腫瘍の縁からの腫瘍切片の免疫組織化学的分析は，腫瘍のタイプにかかわらず
，多数の血管を示す。この新生血管形成を達成するために，脈管形成因子が低酸
素症腫瘍細胞から放出され，近くの血管内皮細胞に移動し，これらの細胞を活性
化して形態学的に変化させ，移動させ，***させる。適切な脈管構造を有しない
腫瘍は，壊死性（Ｂｒｅｍ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，１
９７６，３６，２８０７−１２）および／またはアポトーシス性（Ｈｏｌｍｇｒ
ｅｎ，Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．，１９９５，１：１４９−
５３；Ｐａｒａｎｇｉ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，１９９
５，５５：６０７１−６）となり，一方，新生血管形成を行った腫瘍は，急速な
成長の相に入りうるのみならず，増加した転移性能力を示す。ヒト腫瘍における
新脈管形成の重要性を支持するものとして，脈管形成の表現型および患者の生存
に関連した最近の研究は，原発性腫瘍中の微小血管の数が，乳癌腫（Ｇａｓｐａ
ｒｉｎｉ，Ｇ．，ａｎｄ Ｈａｒｒｉｓ，Ａ．Ｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ
．，１９９５，１３：７６５−８２；Ｔｏｉ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊａｐａｎ
．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，１９９４，８５：１０４５−９），膀胱癌腫（
Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ａ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｕｒｏｌ．，１９９
４，７４：７６２−６），結腸癌腫（Ｅｌｌｉｓ，Ｌ．Ｍ．／ ｅｔ ａｌ．，
Ｓｕｒｇｅｒｙ，１９９６，１２０（５）：８７１−８），口腔腫瘍（Ｗｉｌｌ
ｉａｍｓ，Ｊ．Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｓｕｒｇ．，１９９４，１６８
：３７３−８０）の予後において重要であることを示している。新脈管形成はま
た，造血新生物および多発性骨髄腫の成長において役割を果たしているかもしれ
ない（Ｂｅｌｌａｍｙ，Ｗ．Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ａｍｅｒ．Ａｓｓ
ｏｃ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，１９９８，Ａｂｓｔｒａｃｔ＃２５６６）。
【００１９】 現在，悪性腫瘍の新脈管形成の中心的な媒介物は，内皮の有糸***促進物質で
ある血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）であると考えられている。ＶＥＧＦは，多く
のタイプの小および大血管の内皮細胞有糸***促進物質である。これは，組織因
子，コラゲナーゼおよびプラスミノーゲンアクチベータおよび阻害剤の産生を誘
導する。ＶＥＧＦは，その透過性促進効果のため，しばしば"血管透過性因子"と
称される（Ｌａｎｄｒｉｓｃｉｎａ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｃａ
ｎｃｅｒ，１９９８，７８（６）：７６５−７７０）。実際，ＶＥＧＦの血管透
過性係数は，よく知られる血管透過性分子であるヒスタミンより約５０，０００
倍高い（Ｄｖｏｒａｋ，Ｈ．Ｆ．，ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈ．，１９
９５，１４６：１０２９−３９）。この高い透過性のため，循環からのフィブロ
ゲンなどの高分子の溢出が生じ，これは内皮細胞ならびに腫瘍細胞の移動および
組織化のためのフィブリンゲル網または基底を提供する（Ｋｕｍａｒ，Ｈ．，ｅ
ｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，１９９８，４：１２７９−８
５）。ＶＥＧＦ発現は，インビトロで多くのヒト癌細胞株において，および胃腸
管，卵巣，脳，乳および腎臓の外科的に切除された腫瘍中で示されている（Ｔｈ
ｏｍａｓ，Ｋ．Ａ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９６，２７１：６０３−
６）。
【００２０】 ＶＥＧＦはまた，直腸結腸癌の発達と密接に関連づけられてきた。すなわち，
直腸結腸癌を有する患者からの腫瘍組織において，ＶＥＧＦのレベルの増加が認
められている。実際，ＶＥＧＦの増加と，疾病段階および腸管壁侵入の深度との
間に強い相関関係が認められている（Ｃ．Ｂａｒｏｎｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｒｉ
ｔ．Ｊ．Ｃａｃｅｒ，１９９８，７８（６）：７６５−７０）。この結果と一致
して，ＶＥＧＦの血清レベルがデュークス分類および癌胎児性抗原レベルと有意
に相関していること，および肝臓および／またはリンパ節転移を有する患者はそ
のような転移を有しない患者より高い血清ＶＥＧＦレベルを有する傾向にあるこ
とが見いだされている（Ｆｕｊｉｓａｋｉ，Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｇ
ａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，１９９８，９３（２）：２４９−５２）。
【００２１】 固体腫瘍の成長に新生血管形成が必要であり，ＶＥＧＦが特に直腸結腸癌にお
いて新脈管形成の最も重要な媒介物としての役割を果たすのであれば，ＶＥＧＦ
の脈管形成効果を阻害しうる化合物は，フルオロウラシルに基づく直腸結腸癌治
療において観察される反跳効果を遅らせ，このことによりフルオロウラシル単独
またはロイコボリンとの組み合わせの化学療法の有効性を増加させるであろう。
そのような方法の追加の利点は，腫瘍が新たな血管を発達させる能力を減少させ
，したがって細胞毒性ではなくむしろ静細胞性である脈管形成阻害剤の使用は，
標準的な細胞毒性化学療法を補完することであろう。すなわち，異なる作用メカ
ニズムを用いて，追加の毒性を与えることなく，細胞毒性薬剤の有効性を増加さ
せることができる。
【００２２】 発明の概要 蛋白質キナーゼ媒介性シグナル伝達を調節する小有機分子についての本発明者
らの探索により，蛋白質キナーゼ（ＰＫ），例えばレセプターチロシンキナーゼ
（ＲＴＫ），細胞性チロシンキナーゼ（ＣＴＫ）およびセリン−トレオニンチロ
シンキナーゼ（ＳＴＫ）の活性を調節する３−ヘテロアリーリデニル−２−イン
ドリノンが見いだされた。ＲＴＫには，例えば，Ｆｌｋ−１，Ｆｌｔ−１，Ｔｉ
ｅ−１およびＴｉｅ−２が含まれ，これらの発現はすべて内皮細胞に限定される
ことが見いだされている。本発明に関連して特に重要なことは，Ｆｌｋ−１が新
脈管形成において重要な役割を果たすと考えられており，この役割はＶＥＧＦに
より媒介されていることである。このことは，３−ヘテロアリーリデニル−２−
インドリノンが，化学療法剤（例えば，限定されないが，フッ化ピリミジン）が
患者に投与されていない期間に腫瘍のＶＥＧＦ媒介性血管新生を阻害し，このこ
とにより腫瘍の成長を阻害することができ，したがって，化学療法剤の有効性を
増加させるはずであることを示す。
【００２３】 すなわち，１つの観点においては，本発明は，細胞において新脈管形成または
血管形成を阻害する３−ヘテロアリーリデニル−２−インドリノン化合物，すな
わち，次の化学構造：
【化２】 ［式中， Ｒ1はＨまたはアルキルであり； Ｒ2はＯまたはＳであり； Ｒ3は水素であり； Ｒ4，Ｒ5，Ｒ6，およびＲ7は，それぞれ独立して，水素，アルキル，アルコキシ
，アリール，アリールオキシ，アルカリール，アルカリールオキシ，ハロゲン，
トリハロメチル，Ｓ（Ｏ）Ｒ，ＳＯ2ＮＲＲ’，ＳＯ3Ｒ，ＳＲ，ＮＯ2，ＮＲＲ
’，ＯＨ，ＣＮ，Ｃ（Ｏ）Ｒ，ＯＣ（Ｏ）Ｒ，（ＣＨ2）nＣＯ2Ｒ，およびＣＯ
ＮＲＲ’からなる群より選択され； Ａは，チオフェン，ピロール，ピラゾール，イミダゾール，１，２，３−トリア
ゾール，１，２，４−トリアゾール，オキサゾール，イソオキサゾール，チアゾ
ール，イソチアゾール，２−スルホニルフラン，４−アルキルフラン，１，２，
３−オキサジアゾール，１，２，４−オキサジアゾール，１，２，５−オキサジ
アゾール，１，３，４−オキサジアゾール，１，２，３，４−オキサトリアゾー
ル，１，２，３，５−オキサトリアゾール，１，２，３−チアジアゾール，１，
２，４−チアジアゾール，１，２，５−チアジアゾール，１，３，４−チアジア
ゾール，１，２，３，４−チアトリアゾール，１，２，３，５−チアトリアゾー
ル，およびテトラゾールからなる群より選択される五員のヘテロアリール環であ
り，１またはそれ以上の位置において，アルキル，アルコキシ，アリール，アリ
ールオキシ，アルカリール，アルカリールオキシ，ハロゲン，トリハロメチル，
Ｓ（Ｏ）Ｒ，ＳＯ2ＮＲＲ’，ＳＯ3Ｒ，ＳＲ，ＮＯ2，ＮＲＲ’，ＯＨ，ＣＮ，
Ｃ（Ｏ）Ｒ，ＯＣ（Ｏ）Ｒ，（ＣＨ2）nＣＯ2Ｒ，またはＣＯＮＲＲ’で任意に
置換されていてもよく； ｎは０−３であり；そして， ＲおよびＲ’は，独立して，アルキルまたはアリールからなる群より選択される
］ を有する化合物またはその薬学的に許容しうる塩またはプロドラッグに関する。
【００２４】 "アルキル"とは，直鎖，分枝鎖または環状の飽和脂肪族炭化水素を表す。好ま
しくは，アルキル基は，１−１２個の炭素を有する。より好ましくは，これは１
−７個の炭素を有し，より好ましくは，これは１−４個の炭素を有する低級アル
キルである。典型的なアルキル基には，メチル，エチル，プロピル，イソプロピ
ル，ブチル，イソブチル，３級ブチル，ペンチル，ヘキシル等が含まれる。アル
キル基は，ヒドロキシル，−Ｃ（Ｏ）ＯＲ，シアノ，未置換アルコキシ，＝Ｏ，
＝Ｓ，ＮＯ2，ハロゲン，ＮＲＲ’およびＳＲからなる群より選択される１また
はそれ以上の置換基で任意に置換されていてもよい。
【００２５】 "アルケニル"とは，少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を含むアルキル基を
表す。
【００２６】 "アルキニル"とは，少なくとも１つの炭素−炭素三重結合を含むアルキル基を
表す。
【００２７】 "アルコキシ"とは，"−Ｏ−アルキル"基を表し，ここで，アルキル基は１また
はそれ以上のハロ基で任意に置換されていてもよい。
【００２８】 "アリール"とは，少なくとも１つの芳香族環，すなわち，共役パイ電子系を有
する１つの環構造を有する基を表し，炭素環式アリール，ヘテロ環式アリールお
よびビアリール基を含む。アリール基は，ハロゲン，トリハロメチル，ヒドロキ
シル，ＳＲ，ニトロ，シアノ，アルコキシ，アルキルおよびＮＲＲ’からなる群
より選択される１またはそれ以上の置換基で任意に置換されていてもよい。
【００２９】 "アルカリール"とは，アリール基に共有結合しているアルキルを表す。好まし
くは，アルキルは未置換低級アルキルである。
【００３０】 "炭素環式アリール"とは，環原子が炭素であるアリール基を表す。
【００３１】 "ヘテロ環式アリール"とは，１−３個のヘテロ原子を環原子として有し，残り
の環原子が炭素であるアリール基を表す。ヘテロ原子には，酸素，イオウ，およ
び窒素が含まれる。環は５員環でも６員環でもよい。ヘテロ環式アリール基の例
としては，フラニル，チエニル，ピリジル，ピロリル，Ｎ−アルキルピロリル，
ピリミジニル，ピラジニル，イミダゾリルなどが挙げられる。
【００３２】 "アミド"とは，−Ｃ（Ｏ）ＯＮＨＲaを表し，ここで，Ｒaは，アルキル，アリ
ール，アルキルアリールまたは水素である。
【００３３】 "チオアミド"とは，−Ｃ（Ｓ）ＮＨＲaを表す。
【００３４】 "アミノ"とは，ＲおよびＲ’の両方が水素であるＮＲＲ’基を表す。
【００３５】 "チオエーテル"とは，−ＳＲb基を表し，ここで，Ｒbは，アルキル，アリール
またはアルキルアリールである。
【００３６】 "ハロゲン"とは，フッ素，塩素，臭素またはヨウ素を表す。
【００３７】 "スルホニル"とは，−Ｓ（Ｏ）2Ｒcを表し，ここで，Ｒcはアリール，−Ｃ（
ＣＮ）＝Ｃ−アリール，−ＣＨ2ＣＮ，アルキルアリール，−ＳＯ2ＮＲＲ’，−
ＮＨ（アルキル），−ＮＨ（アルキルアリール），または−ＮＨ（アリール）で
ある。
【００３８】 ３−ヘテロアリーリデニル−２−インドリノンの生理学的に許容しうる塩およ
びプロドラッグもまた，本発明の範囲内である。
【００３９】 "生理学的に許容しうる塩"とは，これを投与する患者の物理学的安寧に有害で
ない塩を表す。本発明の化合物が形成することができる生理学的に許容しうる塩
には，負または正に荷電した種が含まれる。化合物が正に荷電した成分を形成し
ている塩の例には，限定されないが，４級アンモニウム基の窒素原子が適当な酸
と反応した本発明の選択された化合物の窒素である，４級アンモニウム（本明細
書において定義される），塩酸，硫酸，炭酸，乳酸，酒石酸，マレイン酸，コハ
ク酸等の塩が含まれる。本発明の化合物が負に荷電した種を形成している塩には
，限定されないが，化合物中のカルボン酸基を適当な塩基（例えば水酸化ナトリ
ウム（ＮａＯＨ），水酸化カリウム（ＫＯＨ），水酸化カルシウム（Ｃａ（ＯＨ
）2）等）と反応させることにより形成されるナトリウム，カリウム，カルシウ
ムおよびマグネシウム塩が含まれる。
【００４０】 "プロドラッグ"とは，インビボで親薬剤に転換される薬剤を表す。プロドラッ
グは，場合により，親薬剤より投与が容易であるかもしれないため，しばしば有
用である。例えば，プロドラッグは経口投与により生物学的に利用可能であるが
，親薬剤はそうではない。プロドラッグはまた，親薬剤よりも医薬組成物中で改
良された溶解性を有するかもしれない。プロドラッグの例は，限定されるもので
はないが，エステル（"プロドラッグ"）として投与されて，水溶性であることが
移動に不利である細胞膜の通過を容易にし，次に，水溶性であることが有利であ
る細胞内に入った後，代謝的に加水分解されて活性種のカルボン酸となるような
，本発明の化合物であろう。プロドラッグのさらに別の例は，カルボキシ基に結
合している短いポリペプチドであり，ポリペプチド基の代謝的除去により活性化
合物が放出される。
【００４１】 本発明の３−ヘテロアリーリデニル−２−インドリノン化合物は，ＥまたはＺ
異性体，またはそれらの組み合わせとして存在することができる。これらのすべ
てのコンフィギュレーションは本発明の範囲内である。本発明の好ましい態様に
おいては，３−ヘテロアリーリデニル−２−インドリノンは，主として（９０％
より多い）Ｚ異性体である。
【００４２】 "阻害する"とは，排除する，減少させる，含有する，じゃまする，妨害する，
遅くする，遅延させるおよび／または制限することを意味する。本発明の現在好
ましい態様においては，阻害するとは，新脈管形成または血管形成を阻害するこ
とを意味する。
【００４３】 "新脈管形成"活性とは，組織において新たな血管を形成することを意味する。
【００４４】 "血管形成"とは，新たな血管が組織に広がり，脈管系を形成することを意味す
る。
【００４５】 別の観点においては，本発明の３−ヘテロアリーリデニル−２−インドリノン
化合物は，３−［４−（２−カルボキシエチル−３，５−ジメチルピロール−２
−イル）メチリデニル］−２−インドリノン（構造１）である。
【００４６】 本発明のさらに別の観点においては，３−ヘテロアリーリデニル−２−インド
リノンは３−［（２，４−ジメチルピロール−５−イル）メチリデニル］−２−
インドリノン（構造２）である。
【化３】
【００４７】 本発明のさらに別の観点においては，そのような治療を必要とする患者に治療
上有効量の他の化学療法剤および治療上有効量の３−ヘテロアリーリデニル−２
−インドリノンを投与することを含む，癌を治療する方法が提供され，ここで，
３−ヘテロアリーリデニル−２−インドリノンは次の化学構造を有する：
【化４】 ［式中，Ｒ1，Ｒ2，Ｒ3，Ｒ4，Ｒ5，Ｒ6，Ｒ7，およびＡは，上で定義したもの
と同じである］。
【００４８】 現在好ましい態様においては，化学療法剤はフッ化ピリミジンである。
【００４９】 ここでもまた，３−ヘテロアリーリデニル−２−インドリンの生理学的に許容
しうる塩またはプロドラッグも，本発明のこの組み合わせ化学療法の観点の範囲
内である。
【００５０】 "方法"との用語は，所与の作業を遂行するための様式，手段，技術，および手
順を表し，化学，薬理学，生物学，生化学，および医学的技術の従業者には周知
の，あるいは既に該従業者によって既知の様式，手段，技術，および手順から開
発された様式，手段，技術，および手順を含むがこれに限定されない。
【００５１】 癌に関しては，"治療する"との用語は，単に，癌に罹患した個体の予想生存が
増加するであろうこと，疾病の１またはそれ以上の症状が減少するであろうこと
，および／または生活の質が向上するであろうことを意味する。
【００５２】 本明細書において用いる場合，"投与する"，"投与すること"または"投与"とは
，本発明の化合物，塩またはプロドラッグ，または本発明の化合物，塩またはプ
ロドラッグを含む医薬組成物を，癌の治療またはＰＫ−関連疾患の予防または治
療の目的のために患者に輸送することを表す。
【００５３】 本明細書において用いる場合，"投与"に関連して"含む"とは，本発明に従って
投与される薬剤が，単に３−ヘテロアリーリデニル−２−インドリノン化合物と
化学療法剤のみとの組み合わせとして投与されてもよく，または追加の薬剤，例
えば，化学療法剤がフッ化ピリミジンである場合，組み合わせに追加の有利な特
徴を与えることが知られているかまたは予測されるロイコボリンを含むように拡
張されてもよいことを意味することが意図される。
【００５４】 一般に，"治療上有効量"とは，疾病の症状を予防，軽減，減少，または改善す
るか，または治療中の患者の生存を延長するのに有効な薬剤またはその代謝産物
の量を表す。特に，癌の治療に関しては，治療上有効量は，（１）腫瘍の大きさ
を減じる（好ましくは排除する），（２）腫瘍の転移を阻害する（すなわち速度
をある程度まで減じる，好ましくは停止する），（３）腫瘍の成長をある程度阻
害する（すなわち速度をある程度まで減じる，好ましくは停止する），および／
または（４）癌に関連した１またはそれ以上の症状をある程度までやわらげる（
または，好ましくは除去する）という効果を有する量を表す。
【００５５】 上述の一般的定義に加えて，"治療上有効量の"化学療法剤とは，医学の技術分
野において現在認識されているか，またはこれらの薬剤の使用に関する将来の開
発の結果として生ずる任意の方法および任意の治療計画で投与される任意の量を
意味する。本発明の現在好ましい態様においては，化学療法剤は，フッ化ピリミ
ジン，特に，フルオロウラシルであり，治療計画は，フルオロウラシルの投与に
ついて化学療法の技術分野において知られているものである。
【００５６】 "治療計画"とは，確立された期間にわたり規定時間に規定方法で投与される，
選択された化学療法剤（および任意に他の薬剤，例えば本発明の３−ヘテロアリ
ーリデニル−２−インドリノン化合物）の特定の量を表す。例えば，限定されな
いが，直腸結腸癌をフルオロウラシル／ロイコボリンで治療する一般的な治療計
画は，４２５ｍｇ／ｍ2（ミリグラム／体表面積１平方メートル，当業者によく
知られている化学療法剤の用量を測定する方法）のフルオロウラシルと２０ｍｇ
／ｍ2のロイコボリン（特定の量の選択された薬剤）を５日間毎日（規定時間）
静脈内押出（規定方法）により投与し，これを４−５週間の間隔（確立された期
間）で行うことを含む。
【００５７】 治療計画において投与の"規定時間"に関連する場合，"連続日"とは，連続する
カレンダー日，例えば月曜日，火曜日，水曜日などを意味する。"交互交替的な"
日とは，間にカレンダー日が挟まれたカレンダー日，例えば，限定されないが，
月曜日，水曜日，土曜日などを意味する。
【００５８】 さらに，"治療上有効量の３−ヘテロアリーリデニル−２−インドリノン"との
語句は，"回復"期すなわち，治療計画中の他の化学療法剤が患者に投与されない
期間の間に，腫瘍の成長，サイズおよび血管新生，すなわち，新脈管形成および
／または血管形成を阻害するのに十分な化合物の量を表す。
【００５９】 "患者"とは，ＰＫ関連疾患，例えば特定の癌に罹患している高等生物を意味す
る。好ましくは，"患者"は哺乳動物，特にヒトを表す。
【００６０】 "フッ化ピリミジン化学療法剤"は，化学療法の分野の当業者にはよく知られて
いる。本発明の化合物とともに用いることができるフッ化ピリミジンの例として
は，限定されないが，カルモフール，ドキシフルリジン，フルオロウラシル，フ
ロキシウリジン，テガフール，カペシタビンおよびウラシル−フトラフール（Ｕ
ＦＴ）が含まれる。
【００６１】 本発明の現在好ましい態様においては，フッ化ピリミジン化学療法剤はフルオ
ロウラシルである。
【００６２】 フッ化ピリミジン化学療法剤がフルオロウラシルである場合，上述の癌の治療
方法はまたロイコボリンを含むことも，本発明の現在好ましい態様である。
【００６３】 本発明のさらに別の観点においては，癌を治療するために他の化学療法剤と組
み合わせて用いられる３−ヘテロアリーリデニル−２−インドリノンは，５−ヒ
ドロキシ−３−［（２，４−ジメチルピロール−５−イル）メチリデニル］−２
−インドリノン（構造３），４−メチル−５−（２−オキソ−１，２−ジヒドロ
インドール−３−イリデンメチル）−１Ｈ−ピロール−２−カルボン酸（構造４
），４−メチル−５−（２−オキソ−１，２−ジヒドロインドール−３−イリデ
ンメチル）−１Ｈ−ピロール−２−カルボン酸メチルエステル（構造５），３−
（５−ヒドロキシメチル−３−メチル−１Ｈ−ピロール−２−イルメチレン）−
１，３−ジヒドロインドール−２−オン（構造６）および４−メチル−５−（２
−オキソ−１，２−ジヒドロインドール−３−イリデンメチル）−１Ｈ−ピロー
ル−２−カルボアルデヒド（構造７）からなる群より選択される：
【化５】
【００６４】 本発明のさらに別の観点においては，他の化学療法剤と組み合わせて癌の治療
に用いられる３−ヘテロアリーリデニル−２−インドリノン化合物は，３−［４
−（２−カルボキシエチル−３，５−ジメチルピロール−２−イル）メチリデニ
ル］−２−インドリノン（構造１）である。
【００６５】 本発明のさらに別の観点においては，他の化学療法剤と組み合わせて癌の治療
に用いられる３−ヘテロアリーリデニル−２−インドリノン化合物は，３−［（
２，４−ジメチルピロール−５−イル）メチリデニル］−２−インドリノン（構
造２）である。
【００６６】 上述の方法を用いて治療することができる癌は，乳癌，胃癌，卵巣癌，腎臓癌
，肝臓癌，膵臓癌，膀胱癌，甲状腺癌，前立腺癌および直腸結腸癌からなる群よ
り選択することができる。
【００６７】 本発明のさらに別の観点は，そのような治療を必要とする患者に，治療上有効
量のフルオロウラシル，および３−［４−（２−カルボキシエチル−３，５−ジ
メチルピロール−２−イル）メチリデニル］−２−インドリノンおよび３−［（
２，４−ジメチルピロール−５−イル）メチリデニル］−２−インドリノンから
なる群より選択される治療上有効量の化合物を投与することを含む，癌を治療す
る方法である。
【００６８】 好ましい態様においては，癌は直腸結腸癌である。
【００６９】 本発明の別の観点においては，癌の治療のための上述の方法はロイコボリンの
使用を含む。
【００７０】 治療上有効量のフルオロウラシルは，約３００−約８００ｍｇ／ｍ2，好まし
くは約４００−約５００ｍｇ／ｍ2の化合物を含む。
【００７１】 本発明のさらに別の観点においては，治療上有効量のフルオロウラシルは静脈
内ボーラス注射としてまたは連続静脈内注入として投与される。
【００７２】 治療上有効量の３−［（２，４−ジメチルピロール−５−イル）−メチリデニ
ル］−２−インドリノンは，約４−約１９０ｍｇ／ｍ2，好ましくは約７２−１
４５ｍｇ／ｍ2の化合物を含む。
【００７３】 治療上有効量のロイコボリンは，約２０−約５００ｍｇ／ｍ2，好ましくは約
２０−約２００ｍｇ／ｍ2の化合物を含む。
【００７４】 本発明のさらに別の観点は，約４００−約５００ｍｇ／ｍ2のフルオロウラシ
ルを１またはそれ以上の日にち投与し（連続的でも交互交替的でもよい），その
後に，約７２−約１４５ｍｇ／ｍ2の３−［（２，４−ジメチルピロール−５−
イル）メチリデニル］−２−インドリノンを１またはそれ以上の日にち投与する
（同様に，連続的でも交互交替的でもよい）ことを含む治療計画である。
【００７５】 別の観点においては，フルオロウラシルを投与する日に２０ｍｇ／ｍ2のロイ
コボリンをも投与してもよい。
【００７６】 本発明の現在好ましい態様においては，上述の治療計画は，治療計画の第１週
の第１，２，３，４および５日にフルオロウラシル（および任意にロイコボリン
）を静脈内ボーラス注射し，治療計画の第２，３および４週の間に週２回，３−
［（２，４−ジメチルピロール−５−イル）メチリデニル］−２−インドリノン
を静脈内ボーラス注射することからなる，４週間の治療計画である。
【００７７】 本発明の別の観点は，そのような治療を必要とする患者に，治療上有効量の３
−［（２，４−ジメチルピロール−５−イル）メチリデニル］−２−インドリノ
ンおよび治療上有効量のゲムシタビン（別のフルオロピリミジン化合物）を投与
することを含む，癌を治療する方法である。ゲムシタビンは，進行膵臓癌の治療
において特に有効であることが示されている。さらに，他の化学療法剤，例えば
パクリタキセル，カルボプラチン，ドキソルビシン（特に，リポソーム性ドキソ
ルビシン）およびトポテカンとの組み合わせにおいて，ゲムシタビンは他の不応
性固体腫瘍癌，例えば進行卵巣癌，小細胞肺癌および腎臓癌に対して実質的な活
性を示す。ゲムシタビンと３−［（２，４−ジメチルピロール−５−イル）メチ
リデニル］−２−インドリノン単独との組み合わせ，またはさらに別の化学療法
剤，例えば上述したものとの組み合わせは，フルオロピリミジンに関して一般的
に議論した理由により，さらに毒性を与えることなく固体腫瘍阻害能力を与える
はずである。
【００７８】 ３−［（２，４−ジメチルピロール−５−イル）メチリデニル］−２−インド
リノンとゲムシタビン以外のヌクレオシド類似体との組み合わせもまた本発明に
より企図される。
【００７９】 ３−［（２，４−ジメチルピロール−５−イル）メチリデニル］−２−インド
リノンとの組み合わせが有益であるはずの別のピリミジン類似体は，転移性乳癌
に対して有効であることが示されているカペシタビンであり，このような組み合
わせは本発明の別の観点である。
【００８０】 さらに，３−［（２，４−ジメチルピロール−５−イル）メチリデニル］−２
−インドリノンと，ピリミジン化学療法剤である５−ＦＵまたはＵＦＴまたはそ
れに関連する誘導体，類似体または薬剤のいずれかとの化学療法的組み合わせは
，本発明の１つの観点である。
【００８１】 本発明のさらに別の観点は，３−［（２，４−ジメチルピロール−５−イル）
メチリデニル］−２−インドリノンと，カルボプラチン，オキサリプラチン，シ
スプラチンまたは関連する化学療法剤との組み合わせである。カルボプラチンお
よびシスプラチンは，現在のところ進行卵巣癌の治療の抜群の薬剤であり，オキ
サリプラチンは転移性直腸結腸癌の最も優れた化学療法剤である。３−［（２，
４−ジメチルピロール−５−イル）メチリデニル］−２−インドリノンをカルボ
プラチンまたはシスプラチンと組み合わせて使用することは，これらの２つの非
常に毒性の高い化学療法剤の癌の治療に必要な量を減少させることを可能とする
であろう。さらに，カルボプラチンまたはシスプラチンとパクリタキセルとの組
み合わせは，卵巣癌の治療に有望であることが示されている。これらの化学療法
剤の組み合わせに３−［（２，４−ジメチルピロール−５−イル）メチリデニル
］−２−インドリノンを加えることにより，上述の組み合わせに関して述べてき
た利点と同じ利点が得られるかもしれない。現在好ましい化学療法剤の組み合わ
せは，３−［（２，４−ジメチルピロール−５−イル）メチリデニル］−２−イ
ンドリノン，シスプラチンおよびゲムシタビンからなる。
【００８２】 本発明のさらに別の観点は，３−［（２，４−ジメチルピロール−５−イル）
メチリデニル］−２−インドリノンと，パクリタキセル（タキソール），その合
成類似体であるドセタキセルまたはポリグルタミン酸化タキサン類との組み合わ
せである。パクリタキセルは，卵巣，乳，肺およびＡＩＤＳ関連癌の治療に関し
てＦＤＡにより認可されている。パクリタキセル／ドセタキセルは，本発明の化
合物とは異なるメカニズムにより作用する。すなわち，これらは細胞が有糸***
の間に有糸***スピンドルを分解する能力をブロックする。したがって，そのよ
うな特定の作用モードを有するこれらの薬剤を，３−［（２，４−ジメチルピロ
ール−５−イル）メチリデニル］−２−インドリノンの抗血管形成活性と組み合
わせることにより，強力な抗腫瘍剤／静腫瘍剤の組み合わせを得ることができる
であろう。
【００８３】 本発明のさらに別の観点は，３−［（２，４−ジメチルピロール−５−イル）
メチリデニル］−２−インドリノンと，トポイソメラーゼＩ阻害剤であるカンポ
テシンの誘導体であって直腸結腸癌に有効であることが証明されているＣＰＴ１
１（イリノテカン）との組み合わせである。ＣＰＴ１１に関連する化学療法剤と
の組み合わせ治療もまた本発明により意図される。ここでもまた，作用モードの
組み合わせが，この型の癌の治療に実質的に有益であるかもしれない。
【００８４】 本発明のさらに別の観点は，３−［（２，４−ジメチルピロール−５−イル）
メチリデニル］−２−インドリノンと，特に，不応性骨髄腫および多型性神経膠
芽細胞腫（非常に悪性の脳癌）に対しても実質的な化学療法的有用性を示すサリ
ドマイドとの組み合わせである。この組み合わせに応答するであろう他の癌には
，前立腺癌，乳癌および皮膚癌（カポジ肉腫）が含まれる。
【００８５】 本発明の１つの観点は，３−［（２，４−ジメチルピロール−５−イル）メチ
リデニル］−２−インドリノンとＣＯＸ−２阻害剤との化学療法的組み合わせで
ある。シクロオキシゲナーゼ−２の阻害は，新脈管形成を刺激する因子の産生を
妨害する。この組み合わせは，癌細胞の活力に必須の血管新生を２つの方法で攻
撃する。
【００８６】 ３−［（２，４−ジメチルピロール−５−イル）メチリデニル］−２−インド
リノンとタモキシフェンまたはその誘導体とからなる組み合わせ治療は，本発明
の１つの観点である。タモキシフェンは，乳癌細胞の成長を促進することが示さ
れているエストロゲンの活性を阻害する。抗新脈管形成化合物である３−［（２
，４−ジメチルピロール−５−イル）メチリデニル］−２−インドリノンとこの
"抗エストロゲン"化合物との組み合わせは，強力な追加の乳癌治療を提供するこ
とができるであろう。
【００８７】 本発明の別の観点は，３−［（２，４−ジメチルピロール−５−イル）メチリ
デニル］−２−インドリノンと，天然に生ずるゴナドトロピン放出ホルモンの合
成ノナペプチド類似体であって，特に精巣癌ならびに卵巣癌および乳癌にも有効
であることが示されているロイプロリドとの組み合わせである。ロイプロリドに
関連する薬剤を用いる組み合わせ治療もまた，本発明により企図される。この場
合にも，２つの異なる作用モードの化合物を組み合わせることにより，実質的な
有益性を得ることができるであろう。
【００８８】 ３−［（２，４−ジメチルピロール−５−イル）メチリデニル］−２−インド
リノンと，アポトーシスにより新脈管形成を阻害するアンジオスタチン，エンド
スタチンまたは類似の化学療法剤との化学療法的組み合わせも同様に，本発明の
１つの観点である。アポトーシスはプログラムされた細胞死である。細胞殺傷性
抗新脈管形成と細胞静止性抗新脈管形成との組み合わせは，強力な化学療法的組
み合わせでありうる。
【００８９】 さらに，３−［（２，４−ジメチルピロール−５−イル）メチリデニル］−２
−インドリノンとマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）阻害剤との化学療
法的組み合わせは，癌を含む多くの疾病状態に関与していることが示されている
。ＭＭＰ阻害剤，例えば，限定されないが，ＡＧ３３４０は，非小細胞肺癌およ
びホルモン不応性前立腺癌等の固体腫瘍癌に対して静腫瘍的効力を示す。新脈管
形成阻害剤の追加は，相乗的組み合わせを提供することができる。
【００９０】 ３−［（２，４−ジメチルピロール−５−イル）メチリデニル］−２−インド
リノンとインターフェロンとの組み合わせは本発明の別の観点である。インター
フェロンアルファ，およびその種々のサブタイプ（例えば，限定されないが，イ
ンターフェロンアルファＡ／２ａ，アルファ／２ｂ，アルファＢ２／アルファ８
）は，ヘアリーセル白血病，慢性骨髄性白血病，腎臓癌，黒色腫，低分化型リン
パ腫，多発性骨髄腫およびカポジ肉腫等の癌に対してよく確立された化学療法剤
である。
【００９１】 本発明のさらに別の観点は，３−［（２，４−ジメチルピロール−５−イル）
メチリデニル］−２−インドリノンと，ドキソルビシン，ダウノルビシンおよび
他のアントラサイクリン抗新生物抗生物質およびそれらの誘導体および処方，例
えば，限定されないが，リポソーム性ドキソルビシンとの化学療法的組み合わせ
である。ドキソルビシンは，悪性リンパ腫，白血病，頭頸部の扁平上皮細胞癌，
乳癌および甲状腺癌の治療に広く用いられている。リポソーム性ドキソルビシン
は，カポジ肉腫の治療用に認可されている。３−［（２，４−ジメチルピロール
−５−イル）メチリデニル］−２−インドリノンの抗新脈管形成活性により弱め
られた腫瘍細胞は，ドキソルビシンに対してはるかに感受性でありうる。３−［
（２，４−ジメチルピロール−５−イル）メチリデニル］−２−インドリノンお
よびメトキサントロン（関連する化学療法剤）を用いる組み合わせ治療は，本発
明により特に企図されている。
【００９２】 本発明の１つの観点である別の化学療法的組み合わせは，３−［（２，４−ジ
メチルピロール−５−イル）メチリデニル］−２−インドリノンと，不応性前立
腺癌の治療において特に有用であることが示されているエストラムスチンおよび
これに関連する化学療法剤との組み合わせである。エストラムスチンは，ＤＮＡ
合成を妨害することにより細胞死を引き起こす。ここでも，異なる作用モード，
すなわち，ＤＮＡ合成の破壊と抗新脈管形成の組み合わせは，有用な化学療法的
組み合わせを提供することができる。
【００９３】 ３−［（２，４−ジメチルピロール−５−イル）メチリデニル］−２−インド
リノンおよびビンカアルカロイド，例えば，限定されるものではないが，ビンク
リスチンおよびビンブラスチンを用いる組み合わせ治療もまた本発明により企図
される。
【００９４】 本発明のさらに別の観点は，５−ヒドロキシ−３−［（２，４−ジメチルピロ
ール−５−イル）メチリデニル］−２−インドリノン（構造３），４−メチル−
５−（２−オキソ−１，２−ジヒドロインドール−３−イリデンメチル）−１Ｈ
−ピロール−２−カルボン酸（構造４），４−メチル−５−（２−オキソ−１，
２−ジヒドロインドール−３−イリデンメチル）−１Ｈ−ピロール−２−カルボ
ン酸メチルエステル（構造５），３−（５−ヒドロキシメチル−３−メチル−１
Ｈ−ピロール−２−イルメチレン）−１，３−ジヒドロインドール−２−オン（
構造６）および４−メチル−５−（２−オキソ−１，２−ジヒドロインドール−
３−イリデンメチル）−１Ｈ−ピロール−２−カルボアルデヒド（構造７）から
なる群より選択される３−ヘテロアリーリデニル−２−インドリノンである。
【００９５】 上述の化合物の生理学的に許容しうる塩およびプロドラッグもまた，本発明の
範囲内に含まれる。
【００９６】 さらに別の観点においては，本発明は，ＰＫを上に示されるいずれかの構造を
有する化合物と接触させることを含む，ＰＫの触媒活性を調節する方法に関する
。
【００９７】 本明細書において用いられる場合，"調節"または"調節すること"との用語は，
ＲＴＫ，ＣＴＫ，およびＳＴＫの触媒活性の変更を表す。特に，調節することは
，ＲＴＫ，ＣＴＫ，およびＳＴＫの触媒活性の活性化を表し，好ましくは，ＲＴ
Ｋ，ＣＴＫ，およびＳＴＫに暴露される化合物または塩の濃度に依存したＲＴＫ
，ＣＴＫ，およびＳＴＫの触媒活性の活性化または阻害を表し，さらに好ましく
は，ＲＴＫ，ＣＴＫ，およびＳＴＫの触媒活性の阻害を表す。
【００９８】 本明細書において用いられる場合，"触媒活性"との用語は，ＲＴＫおよび／ま
たはＣＴＫの直接または間接的な影響下でのチロシンのリン酸化，またはＳＴＫ
の直接または間接的な影響下でのセリンおよびトレオニンのリン酸化の速度を表
す。
【００９９】 本明細書において用いられる場合，"接触させる"との用語は，本発明の化合物
と標的ＰＫとを，当該化合物がＰＫの触媒活性を直接に，すなわちキナーゼ自体
と相互作用することによるか，または間接に，すなわち当該キナーゼの触媒活性
が依存している別の分子と相互作用することにより，影響することが可能な様式
で一緒に合わせることを表す。このような"接触させる"ことは，インビトロで，
すなわち試験管，ペトリ皿等において行うことができる。試験管内では，接触さ
せることは，化合物と目的とするＰＫのみが関与してもよく，あるいは全細胞が
関与してもよい。細胞は培養皿中で維持または成長させ，その環境において化合
物と接触させることができる。この文脈においては，特定の化合物がＰＫ関連疾
患に影響を及ぼす能力，すなわち当該化合物のＩＣ50（以下に定義される）を，
より複雑な生体を用いてのインビボでの使用を試みる前に測定することが可能で
ある。生体の外の細胞については，ＰＫを当該化合物と接触させるための多様な
方法が存在し，かつ当業者には周知であり，例えば直接の細胞マイクロインジェ
クションおよび多数の膜貫通担体技術を含むがこれに限定されない。
【０１００】 本発明の別の観点においては，上述のＰＫは，ＲＴＫ，ＣＴＫまたはＳＴＫか
らなる群より選択される。
【０１０１】 さらに，その触媒活性が本発明の化合物により調節されるレセプター蛋白質キ
ナーゼが，ＥＧＦ，ＨＥＲ２，ＨＥＲ３，ＨＥＲ４，ＩＲ，ＩＧＦ−１Ｒ，ＩＲ
Ｒ，ＰＤＧＦＲα，ＰＤＧＦＲβ，ＣＳＦＩＲ，Ｃ−Ｋｉｔ，Ｃ−ｆｍｓ，Ｆｌ
ｋ−１Ｒ，Ｆｌｋ４，ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１，Ｆｌｔ−１，ＦＧＦＲ−１Ｒ，ＦＧ
ＦＲ−２Ｒ，ＦＧＦＲ−３ＲおよびＦＧＦＲ−４Ｒからなる群より選択されるこ
とも，本発明の１つの観点である。
【０１０２】 さらに，その触媒活性が本発明の化合物により調節される細胞性チロシンキナ
ーゼが，Ｓｒｃ，Ｆｒｋ，Ｂｔｋ，Ｃｓｋ，Ａｂｌ，ＺＡＰ７０，Ｆｅｓ，Ｆｐ
ｓ，Ｆａｋ，Ｊａｋ，Ａｃｋ，Ｙｅｓ，Ｆｙｎ，Ｌｙｎ，Ｌｃｋ，Ｂｌｋ，Ｈｃ
ｋ，ＦｇｒおよびＹｒｋからなる群より選択されることも，本発明の１つの観点
である。
【０１０３】 その触媒活性が本発明の化合物により調節されるセリン−トレオニン蛋白質キ
ナーゼがＣＤＫ２およびＲａｆからなる群より選択されることは，本発明の別の
観点である。
【０１０４】 別の観点においては，本発明は，そのような治療を必要とする患者においてＰ
Ｋ−関連疾患を治療または予防する方法に関し，該方法は，患者に治療上有効量
の１またはそれ以上の上述の化合物を投与することを含む。
【０１０５】 本明細書において用いられる場合，"ＰＫ関連疾患"，"ＰＫ推進性疾患"，およ
び"異常なＰＫ活性"とは，すべて不適切な，すなわち不完全な，あるいはより一
般的には過剰な，ＰＫ触媒活性によって特徴づけられる状態を表し，ここで特定
のＰＫはＲＴＫ，ＣＴＫ，またはＳＴＫであることが可能である。不適切な触媒
活性は；（１）正常にはＰＫを発現しない細胞におけるＰＫの発現，（２）望ま
しくない細胞増殖，分化および／または成長に導くＰＫ発現の増加，または（３
）細胞増殖，分化および／または成長の望ましくない減少に導くＰＫ発現の減少
，のいずれかの結果として生じることが可能である。ＰＫの過剰な活性は，特定
のＰＫをコードしている遺伝子の増幅か，または細胞増殖，分化および／または
成長と相互に関係することが可能なあるレベルのＰＫ活性の産生を表す（すなわ
ち，ＰＫのレベルが増加すると，細胞性障害による一つまたはそれより多い症状
の激しさが増す）。低い活性は，もちろんその逆であり，ＰＫのレベルが低下す
ると，一つまたはそれより多い細胞性障害による症状の激しさが増加する。
【０１０６】 ＰＫ−関連疾患に関して，"治療する，""治療すること"または"治療"とは，Ｐ
Ｋ−関連疾患の原因および／または効果の軽減または排除を表す。
【０１０７】 本明細書において用いられる場合，"予防する"，"予防すること"，および"予
防"との用語は，生物がＰＫ関連疾患を最初の場所で獲得することを妨げるため
の方法を表す。
【０１０８】 本発明のさらに別の観点においては，ＰＫ関連疾患は，ＲＴＫ，ＣＴＫおよび
ＳＴＫ関連疾患からなる群より選択することができる。
【０１０９】 本発明のさらに別の観点においては，上述のＰＫ関連疾患は，ＥＧＦＲ関連疾
患，ＰＤＧＦＲ関連疾患，ＩＧＦＲ関連疾患およびｆｌｋ関連疾患からなる群よ
り選択されることができる。
【０１１０】 本発明のさらに別の観点においては，上述の蛋白質キナーゼ関連疾患は，扁平
上皮癌，星状細胞腫，神経膠芽細胞腫，肺癌，膀胱癌，頭頸部癌，黒色腫，卵巣
癌，前立腺癌，乳癌，小細胞肺癌，直腸結腸癌，胃腸癌および神経膠腫からなる
群より選択される癌である。
【０１１１】 本発明のさらに別の観点においては，上述の蛋白質キナーゼ関連疾患は，糖尿
病，自己免疫疾患，過増殖疾患，再狭窄，線維症，乾癬，変形性関節症，慢性関
節リウマチ，炎症性疾患および新脈管形成からなる群より選択される。
【０１１２】 本発明の化合物により治療することができるかもしれない他の疾患には，限定
されないが，免疫学的および心血管疾患，例えば動脈硬化症がある。
【０１１３】 上述の化合物の医薬組成物は，本発明のさらに別の観点である。
【０１１４】 "医薬組成物"とは，１またはそれ以上の本明細書に記載される化合物または薬
剤，またはそれらの生理学的に許容される塩またはプロドラッグと，他の化学成
分，例えば生理学的に許容しうる担体および賦形剤との混合物を表す。医薬組成
物の目的は，化合物の生物への投与を容易にすることである。
【０１１５】 本明細書において用いる場合，"生理学的に許容しうる担体"とは，投与される
化合物の生物学的活性および特性を排除せず，例えば化合物を安定化または可溶
化することにより投与を容易にする担体または希釈剤を表す。好ましくは，担体
は，生物に顕著な刺激を引き起こさない。
【０１１６】 "賦形剤"とは，医薬組成物に加えて化合物の投与をさらに容易にする物質を表
す。賦形剤の例としては，限定されるものではないが，炭酸カルシウム，リン酸
カルシウム，種々の糖および各種の澱粉，セルロース誘導体，ゼラチン，植物油
，界面活性剤およびポリエチレングリコールが挙げられる。
【０１１７】 本発明のさらに別の観点は，細胞を本発明の３−ヘテロアリーリデニル−２−
インドリノンと接触させることを含む，細胞において腫瘍形成活性を阻害する方
法である。
【０１１８】 本明細書において用い，かつ細胞に関連する場合，"腫瘍形成"活性とは，新生
物の形成に寄与する細胞内および細胞外の生化学活性の両方を表す。
【０１１９】 "新生物"とは，細胞増殖により正常な細胞より早く成長し，新規成長を開始さ
せる刺激が停止した後であっても成長し続ける，異常な組織である。新生物は，
構造的秩序および正常組織との機能的協調を部分的にまたは完全に欠失しており
，通常は明確な組織の塊体を形成する。そのような塊体は，良性（良性腫瘍）ま
たは悪性腫瘍（固体腫瘍癌）でありうる。悪性新生物は，局所的に侵襲性であり
，破壊的であり，多くの場合転移性（影響を受けた生物の元の部位と離れた領域
において組織に広がり，侵入し，破壊する）である。新生物形成のプロセスは，
一般に，"新形成"と称される。すなわち，新形成とは，新生物が形成し，成長す
る生化学プロセスである。
【０１２０】 "悪性新生物"，"癌"，"腫瘍"および"固体腫瘍癌"との用語は，本明細書におい
て相互交換的に用いられ，単に"癌"として一般に称される生命を脅かす疾病とし
て当業者によく知られる状態を表す。
【０１２１】 腫瘍形成活性に関して，"阻害する"または"阻害"とは，新生物を排除する，減
少させる，含有する，じゃまする，妨害する，遅らせる，遅延させるおよび／ま
たは制限することを表す。
【０１２２】 "化学療法剤"とは，疾病を治療するために用いられる化学物質または薬剤を表
す。この用語は，しばしば主として癌の治療に用いられるそのような物質または
薬剤に適用される。
【０１２３】 発明の詳細な説明 １．摘要／標的疾病 一般 その触媒活性が本発明の化合物により調節されるＰＫには，蛋白質チロシンキ
ナーゼが含まれ，これには２つのタイプがある。レセプターチロシンキナーゼ（
ＲＴＫ）および細胞性チロシンキナーゼ（ＣＴＫ），およびセリン−トレオニン
キナーゼ（ＳＴＫ）である。ＲＴＫ媒介性シグナル伝達は，特定の成長因子（リ
ガンド）との細胞外相互作用により開始され，次にレセプター二量体化，内在性
蛋白質チロシンキナーゼ活性の過渡的刺激およびリン酸化が続く。このことによ
り細胞内シグナル伝達分子の結合部位が形成され，適切な細胞性応答（例えば細
胞***，細胞外微小環境に対する代謝効果等）を容易にする，ある範囲の細胞質
シグナリング分子との複合体の形成につながる。Ｓｃｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒ ａ
ｎｄ Ｕｌｌｒｉｃｈ，１９９２，Ｎｅｕｒｏｎ ９：３０３−３９１を参照。
【０１２４】 成長因子レセプター上のチロシンリン酸化部位は，シグナリング分子のＳＨ２
（Ｓｒｃホモロジー）ドメインのための高親和性結合部位として機能することが
示されている。Ｆａｎｔｌ ｅｔ ａｌ．１９９２，Ｃｅｌｌ ６９：４１３−
４２３，Ｓｏｎｇｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．１９９４，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏ
ｌ．１４：２７７７−２７８５），Ｓｏｎｇｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．１９９３，
Ｃｅｌｌ７２：７６７−７７８），およびＫｏｃｈ ｅｔ ａｌ．１９９１，Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ ２５２：６６８−６７８。ＲＴＫと会合するいくつかの細胞内基
質蛋白質が同定されている。それらは二つの主要なグループに分けられる：（１
）触媒ドメインを有する基質，および（２）そのようなドメインを欠くが，アダ
プターとして役立ち，触媒活性のある分子と会合する。Ｓｏｎｇｙａｎｇ ｅｔ
ａｌ．１９９３，Ｃｅｌｌ ７２：７６７−７７８。レセプターとその基質の
ＳＨ２ドメインとの間の相互作用の特異性は，リン酸化されたチロシン残基を直
接取囲んでいるアミノ酸残基によって決められる。ＳＨ２ドメインと，特定のレ
セプターのホスホチロシン残基を取囲んでいるアミノ酸配列との間の結合親和性
の差異は，それらの基質リン酸化のプロファイルに見られる差異と一致している
。Ｓｏｎｇｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．１９９３，Ｃｅｌｌ ７２：７６７−７７８
。これらの観察は，各々のＲＴＫの機能が，その発現パターンならびにリガンド
利用可能性によるだけでなく，特定のレセプターによって活性化される下流のシ
グナル伝達経路によっても決定されることを示唆している。したがって，リン酸
化は特異的な成長因子レセプター，ならびに分化因子レセプターによってリクル
ートされる，シグナリング経路の選択性を決定する重要な段階を提供する。
【０１２５】 ＳＴＫは，本来細胞質ゾル性であり，しばしばＰＴＫ事象についてのダウン方
向の応答として，細胞内部の生化学に影響を及ぼす。ＳＴＫは，細胞増殖に導く
ＤＮＡ合成とそれに続く細胞***とを開始する，シグナリング過程に関係してい
る。
【０１２６】 したがって，ＰＫシグナル伝達は，応答の中で特に，細胞増殖，分化，成長，
および代謝をもたらす。異常な細胞増殖は，癌腫，肉腫，神経膠芽細胞腫，およ
び血管腫等の新生物，白血病，乾癬，動脈硬化症，関節炎，および糖尿病性網膜
炎，および制御されない新脈管形成および／または血管形成に関連する他の疾患
を含む，広い範囲の疾患および疾病という結果をもたらしうる。
【０１２７】 本発明の化合物がＰＫを阻害する機構についての正確な理解は，本発明の実施
のためには必要ではない。しかしながら，本発明においてはいかなる特定のメカ
ニズムまたは理論にも束縛されるものではないが，化合物はＰＫの触媒領域のア
ミノ酸と相互作用すると考えられている。ＰＫは典型的には２葉構造を有してお
り，ＡＴＰは，ＰＫの中でアミノ酸が保存されている領域内の，２つの葉の間の
裂け目に結合するように見える。ＰＫの阻害剤は，前記のＡＴＰがＰＫに結合す
るのと同じ普遍領域において，水素結合，ファン−デル−ワールス力，およびイ
オン相互作用等の非共有結合によって結合すると考えられる。さらに具体的には
，本発明の化合物の２−インドリノン成分が，正常にはＡＴＰのアデニン環によ
って占められる普遍区域に結合すると考えられている。このように，ある特定の
分子の特定のＰＫに対する特異性は，２−インドリノンコア上の種々の置換基と
，特定のＰＫに特異的なアミノ酸ドメインとの間の，付加的な相互作用の結果と
して生じるかもしれない。すなわち，異なるインドリノン置換基は，特定のＰＫ
に対する優先的な結合に貢献するかもしれない。異なるＡＴＰ（または他のヌク
レオチド）結合部位において活性のある化合物を選択する能力は，本発明の化合
物を，そのような部位を有する任意の蛋白質を標的とするのに有用なものにする
。したがって本明細書において開示される化合物は，かかる蛋白質についてのイ
ンビトロでのアッセイ用としての有用性を有すると同時に，かかる蛋白質との相
互作用を通じてインビボでの治療効果を示すものでありうる。
【０１２８】 別の観点においては，その触媒活性が本発明の化合物との接触によって調節さ
れる蛋白質キナーゼは，蛋白質チロシンキナーゼであり，さらに詳しくはレセプ
ター蛋白質チロシンキナーゼである。本発明の化合物またはその塩によりその触
媒活性が調節されるレセプター蛋白質チロシンキナーゼは，これに限定されない
が，ＥＧＦ，ＨＥＲ２，ＨＥＲ３，ＨＥＲ４，ＩＲ，ＩＧＦ−１Ｒ，ＩＲＲ，Ｐ
ＤＧＦＲα，ＰＤＧＦＲβ，ＣＤＦＩＲ，Ｃ−Ｋｉｔ，Ｃ−ｆｍｓ，Ｆｌｋ−１
Ｒ，Ｆｌｋ４，ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１，Ｆｌｔ−１，ＦＧＦＲ−１Ｒ，ＦＧＦＲ−
２Ｒ，ＦＧＦＲ−３Ｒ，およびＦＧＦＲ−４Ｒである。
【０１２９】 本発明の化合物，またはその塩あるいはプロドラッグとの接触により，その触
媒活性が調節される蛋白質チロシンキナーゼは，非レセプターまたは細胞性蛋白
質チロシンキナーゼ（ＣＴＫ）であってもよい。したがって，例えば，限定され
ないが，Ｓｒｃ，Ｆｒｋ，Ｂｔｋ，Ｃｓｋ，Ａｂｌ，ＺＡＰ７０，Ｆｅｓ，Ｆｐ
ｓ，Ｆａｋ，Ｊａｋ，Ａｃｋ，Ｙｅｓ，Ｆｙｎ，Ｌｙｎ，Ｌｃｋ，Ｂｌｋ，Ｈｃ
ｋ，Ｆｇｒ，およびＹｒｋ等のＣＴＫの触媒活性は，本発明の化合物または塩と
の接触により調節することができる。
【０１３０】 本発明の化合物との接触によってその触媒活性が調節されることができるまた
別のＰＫ群は，ＣＤＫ２およびＲａｆ等の（これに限定されない）セリン−トレ
オニン蛋白質キナーゼである。
【０１３１】 別の観点においては，本発明は治療上有効量の本発明の化合物か，またはその
塩またはプロドラッグを投与することにより，ＰＫ関連疾患を治療または予防す
るための方法に関する。
【０１３２】 ＰＫ関連疾患を予防または治療する目的で，本発明の化合物またはその塩また
はプロドラッグを含む医薬組成物を生物に投与することも，本発明の１つの観点
である。
【０１３３】 したがって本発明は，ＲＴＫ，ＣＴＫ，および／またはＳＴＫの酵素活性に影
響を及ぼし，このことによりそのような蛋白質によって伝達されるシグナルを妨
害することにより，ＰＫのシグナル伝達を調節する化合物に関する。さらに詳細
には，本発明は癌腫，カポジ肉腫を含む肉腫，赤芽細胞腫，神経膠芽細胞腫，髄
膜腫，星状細胞腫，黒色腫，および筋芽細胞腫を含むがこれに限定されない多く
の種類の固体腫瘍の治癒に向けられた治療用アプローチとしての，ＲＴＫ，ＣＴ
Ｋ，および／またはＳＴＫを介するシグナル伝達経路を調節する化合物に関する
。白血病等の非固体腫瘍癌の治療または予防もまた本発明により企図される。適
用には，脳癌，膀胱癌，卵巣癌，胃癌，膵臓癌，結腸癌，血液癌，肺癌，および
骨癌が含まれるが，これに限定されない。
【０１３４】 本明細書に記載される化合物がその予防，治療，および研究に有用であるかも
しれない，不適切なＰＫ活性に関連した疾患のタイプの，さらなる例は，限定さ
れないが，細胞増殖性疾患，線維性疾患，および代謝性疾患である。
【０１３５】 本発明により予防，治療，またはさらに研究されることができる細胞増殖性疾
患には，癌，血管増殖性疾患，およびメサンギウム細胞増殖性疾患が含まれる。
【０１３６】 血管増殖性疾患とは，異常な血管形成（血管の形成）および新脈管形成（血管
の拡散）に関連する疾患を表す。血管形成および新脈管形成は胚発生，黄体形成
，損傷治癒，および臓器再生等の種々の正常な生理学的過程において重要な役割
を果たすが，それらはまた腫瘍を生かしておくために必要な新しい毛細血管をそ
れらが形成させる癌の発生においても中枢的な役割を演じる。血管増殖疾患の他
の例は，新しい毛細血管が関節に侵入して軟骨を破壊する関節炎，および糖尿病
性網膜炎のように，網膜内の新しい毛細血管が硝子体に侵入し，出血させ，さら
に失明を引起す眼性疾患を含む。
【０１３７】 逆に，再狭窄などの，血管の収縮，狭窄，または閉鎖に関連した疾患もまた，
本発明の方法により治療または予防することができる。
【０１３８】 線維性疾患は細胞外マトリックスの異常な形成を表す。線維性疾患の例は，肝
硬変およびメサンギウム細胞増殖疾患を含む。肝硬変は，肝性瘢痕の形成を生じ
る結果となる細胞外マトリックス成分の増加によって特徴づけられる。肝性瘢痕
を生じる結果となる増加した細胞外マトリックスは，肝炎等のウイルス感染によ
っても引き起こされることが可能である。脂肪細胞は，肝硬変において重要な役
割を果たすようである。他の線維性疾患はアテローム性動脈硬化症である。
【０１３９】 メサンギウム細胞増殖性疾患は，メサンギウム細胞の異常増殖によってもたら
される疾患を表す。メサンギウム増殖性疾患は，糸球体腎炎，糖尿病性腎症，お
よび悪性腎硬化症等のヒトの腎疾患，ならびに血栓性細小血管症症候群，移植拒
絶反応，および糸球体症等の疾患を含む。ＲＴＫ ＰＤＧＦＲはメサンギウム細
胞の増殖の維持に関与することが示唆されている。Ｆｌｏｅｇｅ ｅｔ ａｌ．
１９９３，Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ４３：４７ｓ−５４ｓ
。
【０１４０】 多くの癌は細胞増殖性疾患であり，先に記載したように，ＰＫは細胞増殖性疾
患と関連づけられている。したがって，例えばＲＴＫファミリーのメンバーが癌
の発生と関連づけられてきたことも意外なことではない。ＥＧＦＲ（Ｔｕｚｉ
ｅｔ ａｌ．１９９１，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ６３：２２７−２３３，Ｔｏ
ｒｐ ｅｔ ａｌ．１９９２，ＡＰＭＩＳ １００：７１３−７１９），ＨＥＲ
２／ｎｅｕ（Ｓｌａｍｏｎ ｅｔ ａｌ．１９８９，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：
７０７−７１２），およびＰＤＧＦ−Ｒ（Ｋｕｍａｂｅ ｅｔ ａｌ．１９９２
，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，７：６２７−６３３）等のこれらのレセプターのいくつか
は多くの腫瘍において過剰発現され，および／またはオートクリンループにより
持続的に活性化される。事実，ほとんどの一般的かつ重い癌においては，これら
のレセプターの過剰発現（Ａｋｂａｓａｋ＆Ｓｕｎｅｒ−Ａｋｂａｓａｋ ｅｔ
ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌ．Ｓｃｉ．１９９２，１１１：１１９−１３３，Ｄ
ｉｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ Ｒｅｓ．１
９９２，６１：２４９−２７３，Ｋｏｒｃ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎ
ｖｅｓｔ．１９９２，９０：１３５２−１３６０），およびオートクリーンルー
プ（Ｌｅｅ ａｎｄ Ｄｏｎｏｇｈｕｅ，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９２
，１１８：１０５７−１０７０，Ｋｏｒｃ ｅｔ ａｌ．前掲，Ａｋｂａｓａｋ
ａｎｄ Ｓｕｎｅｒ−Ａｋｂａｓａｋ ｅｔ ａｌ．前掲）が示されている。
例えば，ＥＧＦＲは扁平上皮癌，星状細胞腫，神経膠芽細胞腫，頭頚部癌，肺癌
，および膀胱癌と関連づけられている。ＨＥＲ２は***，卵巣，胃，肺，膵臓，
および膀胱の癌と結びつけられている。ＰＤＧＦＲは神経膠芽細胞腫および黒色
腫，ならびに肺，卵巣，および前立腺の癌と関連づけられている。ＲＴＫ ｃ−
ｍｅｔもまた悪性の腫瘍形成と関連づけられている。例えば，ｃ−ｍｅｔは他の
癌の中でも，結腸直腸，甲状腺，膵臓，胃，および肝細胞の癌腫およびリンパ腫
と関連づけられている。加えてｃ−ｍｅｔは白血病に結びつけられている。ｃ−
ｍｅｔ遺伝子の過剰発現はまたホジキン病およびバーキット病の患者に検出され
ている。
【０１４１】 Ｆｌｋも同様に，広いスペクトルの腫瘍と関連づけられてきており，これらに
は，限定されないが，乳癌，卵巣癌，肺腫瘍，ならびに神経膠芽種等の神経膠腫
が含まれる。
【０１４２】 ＩＧＦ−ＩＲは，栄養上の支持およびＩＩ型糖尿病に関係づけられていること
に加えて，いくつかの型の癌に関係づけられている。例えば，ＩＧＦ−Ｉはいく
つかの型の腫瘍，例えばヒト乳癌の癌細胞（Ａｒｔｅａｇａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ
．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１９８９，８４：１４１８−１４２３），および肺
腫瘍小細胞（Ｍａｃａｕｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１９９
０，５０：２５１１−２５１７）に対するオートクリン成長刺激因子として関係
づけられている。さらに，ＩＧＦ−Ｉは神経系の正常な成長および分化に完全に
深くかかわっていると共に，ヒトの神経膠腫のオートクリン刺激因子でもあるよ
うに見える。Ｓａｎｄｂｅｒｇ−Ｎｏｒｄｑｖｉｓｔ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃ
ｅｒ Ｒｅｓ．１９９３，５３：２４７５−２４７８。細胞増殖におけるＩＧＦ
−ＩＲとそのリガンドの重要性は，培養されている多くの細胞型（線維芽細胞，
上皮細胞，平滑筋細胞，Ｔリンパ球，骨髄性細胞，軟骨細胞，および骨芽細胞（
骨髄の幹細胞））がＩＧＦ−Ｉによって成長するべく刺激されるという事実によ
ってさらに支持される。Ｇｏｌｄｒｉｎｇ ａｎｄ Ｇｏｌｄｒｉｎｇ，Ｅｕｋ
ａｒｙｏｔｉｃ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，１９９１，１：３０１−３
２６。最近の一連の発表においてＢａｓｅｒｇａは，ＩＧＦ−ＩＲが形質転換の
機構において中心的な役割を果たしていること，またそれ自体がヒトの広範囲の
悪性腫瘍に対する治療的介入のための好ましい標的となり得ることを示唆してい
る。Ｂａｓｅｅｒｇａ，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１９９５，５５：２４９−２５
２，Ｂａｓｅｒｇａ，Ｃｅｌｌ，１９９４，７９：９２７−９３９，Ｃｏｐｐｏ
ｌａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１９９４，１４：４５８８
−４５９５。
【０１４３】 ＳＴＫは，特に乳癌を含む多くの型の癌に関係づけられている（Ｃａｎｃｅ
ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，１９９３，５４：５７１−７７）。
【０１４４】 異常なＰＫ活性と疾患との間の結びつきは癌に限らない。例えば，ＲＴＫは乾
癬，真性糖尿病，子宮内膜症，新脈管形成，アテローム斑の発生，アルツハイマ
ー病，表皮の過剰増殖，神経変性疾患，年齢に関連した黄斑部変性，および血管
腫といった疾患と関連づけられている。例えば，ＥＧＦＲは角膜および皮膚の損
傷治癒と関連づけられている。インスリン−ＲおよびＩＧＦ−Ｒの欠陥はＩＩ型
の真性糖尿病において示される。特異的なＲＴＫとそれらの治療上の指標との間
のさらに完全な相関関係は，Ｐｌｏｗｍａｎ ｅｔ ａｌ．，ＤＮ＆Ｐ，１９９
４，７：３３４−３３９に記載されている。
【０１４５】 先に記したように，ＲＴＫのみならず，ｓｒｃ，ａｂｌ，ｆｐｓ，ｙｅｓ，ｆ
ｙｎ，ｌｙｎ，ｌｃｋ，ｂｌｋ，ｈｃｋ，ｆｇｒ，およびｙｒｋを含むがこれに
限定されないＣＴＫ（Ｂｏｌｅｎらによる総説，１９９２，ＦＡＳＥＢＪ．，６
：３４０３−３４０９）も，増殖および代謝のシグナル伝達経路に関与しており
，したがって本発明が向けられている多くのＰＴＫ媒介性疾患に関与しているこ
とが予想でき，かつ示されてきた。例えば突然変異したｓｒｃ（ｖ−ｓｒｃ）は
，腫瘍性蛋白質（ｐｐ６０v-src）であることがニワトリにおいて示されている
。さらに，その細胞性同等物であるプロトオンコジンｐｐ６０c-srcは，多くの
レセプターの発癌シグナルを伝達する。腫瘍におけるＥＧＦＲまたはＨＥＲ２／
ｎｅｕの過剰発現は，悪性細胞に特徴的であるが正常細胞にはない，ｐｐ６０c- src の構成的活性化に導く。一方，ｃ−ｓｒｃの発現を欠如しているマウスは大
理石骨病の表現形を示し，破骨細胞機能におけるｃ−ｓｒｃの重要な関与と，関
連疾患における可能な関与とを暗示している。
【０１４６】 同様に，Ｚａｐ７０は自己免疫疾患に関与することが示唆されているＴ細胞シ
グナリングに関係づけられている。
【０１４７】 ＳＴＫは，炎症，自己免疫疾患，免疫応答，および，再狭窄，線維症，乾癬，
変形性関節症，および慢性関節リウマチ等の過剰増殖疾患と関連づけられている
。
【０１４８】 ＰＫはまた胚着床にも関連づけられている。したがって本発明の化合物は，か
かる胚着床を防ぐ有効な方法を提供し，それにより受胎調節用薬剤として有用で
ありうる。
【０１４９】 最後に，現在，ＲＴＫおよびＣＴＫの双方は過免疫疾患にかかわっていると疑
われている。
【０１５０】 上で議論した１またはそれ以上の蛋白質キナーゼの触媒活性を調節する化学的
化合物を同定する方法は，本発明の別の観点である。該方法は，所望の蛋白質キ
ナーゼを発現する細胞を本発明の化合物（またはその塩またはプロドラッグ）と
接触させ，化合物が細胞に対して有する任意の影響について細胞をモニターする
ことを含む。影響は，裸眼でまたは機械を使用して観察することができる細胞表
現型の任意の観察可能な変化または無変化でありうる。モニターされる細胞表現
型の変化または無変化は，限定されないが，細胞における蛋白質キナーゼの触媒
活性の変化または無変化，または蛋白質キナーゼと天然の結合パートナーとの相
互作用の変化または無変化でありうる。
【０１５１】新脈管形成および直腸結腸癌におけるＶＥＧＦおよびＦｌｋ−１／ＫＤＲ 腫瘍細胞は，休止内皮細胞を刺激して分化させ，成長因子を放出することによ
り新たな血管を形成させ，これは内皮細胞の近くに結合する（パラクライン作用
モード）。血管内皮成長因子（"ＶＥＧＦ"）がそのレセプターの１つに結合する
と，新たな血管形成に関与する細胞の事象を制御するシグナリングカスケードが
開始される。
【０１５２】 多数のレセプターチロシンキナーゼが，直接的にまたは間接的に新脈管形成に
関与すると考えられている。レセプターを選択的に阻害することにより腫瘍の成
長を支持する新たな血管成長を阻害するようなレセプターの探索が，過去１０年
間の基礎研究の焦点であった。その発現が内皮細胞に限定される多数のレセプタ
ーが存在するが（Ｆｌｋ−１，Ｆｌｔ−１，Ｔｉｅ−１およびＴｉｅ−２を含む
），Ｆｌｋ−１レセプターが新脈管形成において重要な役割を果たしていると考
えられている。
【０１５３】 ＶＥＧＦおよびそのレセプターの発現の時間的および空間的パターンは，これ
らが胚発生の間に正常な新脈管形成に役割を果たしていることを支持する。ＶＥ
ＧＦ，Ｆｌｔ−１およびＦｌｋ−１はまた，多くの固体腫瘍，例えば神経膠腫，
乳癌，膀胱癌，結腸癌腫および他の胃腸管癌の成長を支持する病理学的新脈管形
成に関与することが示唆されている。乳腫瘍，腎臓細胞癌腫および結腸癌におい
て，ＶＥＧＦ発現と血管密度との間に相関関係が認められている。高度に血管化
した神経膠芽細胞腫においては，ＶＥＧＦおよびそのレセプターの転写産物がイ
ンシトゥーハイブリダイゼーションにより同定された。より低い程度に血管化し
た，低い悪性度分類の神経膠腫または正常脳組織においては，転写産物は検出さ
れなかった。この状態（パラクライン作用モードを支持する）においては，Ｆｌ
ｋ−１レセプターは血管の内皮細胞において検出されるが，ＶＥＧＦは腫瘍細胞
に局在化している。ＶＥＧＦおよびそのレセプターの発現は，多発性骨髄腫を含
む造血腫瘍細胞株において示されている。
【０１５４】 ＶＥＧＦは，インビトロで内皮細胞の有糸***促進物質である。そのような系
においては，Ｆｌｋ−１に対する中和抗体は有糸***を阻害する。同様に，ｆｌ
ｋ−１またはｆｌｔ−１ ｍＲＮＡを切断するリボザイムは，ヒト微小血管内皮
細胞の成長を低下させ，これはおそらくは細胞上のレセプターの数を減少させる
ためである。
【０１５５】 種々のインビボ技術を用いて，腫瘍新脈管形成におけるＶＥＧＦシグナリング
の役割の研究が行われてきた。細胞内キナーゼドメインを欠失しているＦｌｋ−
１レセプターは，培養細胞において内因性Ｆｌｋ−１レセプター活性の活性化を
ブロックし，ヌードマウスの皮下に移植された腫瘍の成長を阻害する。この動物
モデルにおいて形成されたすべての腫瘍は，有意に減少した血管密度を有してい
た。また，アンチセンス構築物を用いてＶＥＧＦ発現を低下させると，ヌードマ
ウスにおけるＣ６ラット神経膠腫細胞の成長が阻害され，同時にこれらの腫瘍に
おける血管密度が減少し，ヌード／ＳＣＩＤマウスにおいてヒト黒色腫細胞の成
長が阻害される。同様に，中和抗体によるＶＥＧＦレベルの減少は，ヌードマウ
スにおけるヒト横紋筋肉腫，多型性神経膠芽細胞腫および平滑筋肉腫の成長，お
よびＢＡＬＢｃ／ヌードマウスにおける線維肉腫の成長を阻害する。
【０１５６】 これらの結果を総合すると，固体腫瘍成長における新脈管形成における，Ｆｌ
ｋ−１を介するＶＥＧＦシグナリングの重要な役割の強力な証拠が得られる。Ｆ
ｌｋ−１の阻害剤は，癌患者において治療上の有用性を有するであろう。
【０１５７】 ２．薬理学３−［（２，４−ジメチルピロール−５−イル）メチリデニル］−２−インドリ ノンを用いる前臨床試験 細胞に基づくアッセイにおいては，３−［（２，４−ジメチルピロール−５−
イル）メチリデニル］−２−インドリノンは，典型的にはＶＥＧＦとそのレセプ
ターとの相互作用後のレセプターのリン酸化を阻害することが見いだされている
。３−［（２，４−ジメチルピロール−５−イル）メチリデニル］−２−インド
リノンのインビトロ研究は，これがＦｌｋ−１自己リン酸化を約１μＭのＩＣ50 値で阻害する能力を示した。さらに，３−［（２，４−ジメチルピロール−５−
イル）メチリデニル］−２−インドリノンは，ＶＥＧＦにより誘導される内皮細
胞のインビトロ増殖を約０．０７μＭのＩＣ50値で阻害する。このアッセイにお
いては，３−［（２，４−ジメチルピロール−５−イル）メチリデニル］−２−
インドリノンは，時間依存的な効力の増加を示し，検出可能な活性は薬剤に５分
間暴露した後に最初に認められた。３−［（２，４−ジメチルピロール−５−イ
ル）メチリデニル］−２−インドリノンに１時間暴露すると，３−４日後にイン
ビトロ抗増殖活性が生じる。３−［（２，４−ジメチルピロール−５−イル）メ
チリデニル］−２−インドリノンは，５０μＭまでの濃度では種々の腫瘍細胞株
に対して直接の阻害的効果を有しない。
【０１５８】 種々の腫瘍細胞株を免疫無防備状態マウスの皮下に移植した３−［（２，４−
ジメチルピロール−５−イル）メチリデニル］−２−インドリノンのインビボ研
究においては，３−［（２，４−ジメチルピロール−５−イル）メチリデニル］
−２−インドリノンは，その成長が種々の成長因子，例えば，ＰＤＧＦ，ＥＧＦ
およびＨｅｒ２により推進される広範なスペクトルの腫瘍タイプに対して，腫瘍
成長の有意な抑制を示す。１日の腹膜内用量（１２．５−２５ｍｇ／ｋｇ／日を
２８日間）により，腫瘍成長が３０−８０％阻害された。初期の研究においては
，３−［（２，４−ジメチルピロール−５−イル）メチリデニル］−２−インド
リノンの投与は，腫瘍移植後の第１日に開始した。腫瘍が約５０ｍｍ3の体積に
成長するまで３−［（２，４−ジメチルピロール−５−イル）メチリデニル］−
２−インドリノンの投与を遅らせたその後の研究は，腫瘍成長の抑制について同
等に有効であることを示した。
【０１５９】 ３−［（２，４−ジメチルピロール−５−イル）メチリデニル］−２−インド
リノン（６．２５−２５ｍｇ／ｋｇ／日の用量）を用いる用量応答研究は，無胸
腺マウスの皮下に移植したヒト黒色腫細胞を用いて行った。３−［（２，４−ジ
メチルピロール−５−イル）メチリデニル］−２−インドリノンを１ｍｇ／ｋｇ
／日程度の低い用量で毎日投与したところ，これらの細胞は用量依存的に阻害さ
れた。３−［（２，４−ジメチルピロール−５−イル）メチリデニル］−２−イ
ンドリノンをより低い頻度（１週間に２回を４週間）で無胸腺マウスに腹膜内投
与した追加の研究によってもまた，毎日腹膜内投与と比較して同等の腫瘍成長阻
害が得られた（１週間に２回の投与で７７％に対し，毎日投与で６８％）。
【０１６０】 ３−［（２，４−ジメチルピロール−５−イル）メチリデニル］−２−インド
リノン（２５ｍｇ／ｋｇ／日）の毎日投与はまた，結腸漿膜下に外科的に移植し
た腫瘍細胞の成長を有意に阻害することが示された。３−［（２，４−ジメチル
ピロール−５−イル）メチリデニル］−２−インドリノンによる治療は，腫瘍サ
イズの減少，および３−［（２，４−ジメチルピロール−５−イル）メチリデニ
ル］２−インドリノン処置動物における腫瘍の青白い外観により証明されるよう
に，血管新生の減少を導いた。
【０１６１】３−［（２，４−ジメチルピロール−５−イル）メチリデニル］−２−インドリ ノンの薬物動力学 インビトロの洗浄実験は９６時間の標的半減期を示し，このことは，３−［（
２，４−ジメチルピロール−５−イル）メチリデニル］−２−インドリノンがレ
セプターチロシンキナーゼのＡＴＰ結合部位に非常に強く競合結合することを示
唆する。３−［（２，４−ジメチルピロール−５−イル）メチリデニル］−２−
インドリノンのインビボ静脈内薬物動力学は，親化合物がマウス，ラットおよび
イヌの循環系から急速に排出されることにより特徴づけられた。ラットにおいて
は，マウスおよびイヌと比較して，わずかに長い排出半減期が測定された（デー
タ示さず）。
【０１６２】 ３−［（２，４−ジメチルピロール−５−イル）メチリデニル］−２−インド
リノンのラットにおける薬物動力学は，高い静脈内用量においては用量依存性で
ある。２９．５−９７．９ｍｇ／ｍ2の範囲の用量においては，３−［（２，４
−ジメチルピロール−５−イル）メチリデニル］−２−インドリノンの排出半減
期は用量が増加するのにしたがって直線的に増加し，用量が３倍しか増加しない
とき，ＡＵＣは１０倍増加する。
【０１６３】 ラットおよびイヌにおける準慢性毒性動力学研究（２８日間毒性研究）は，薬
剤が反復投与後に血漿中に蓄積しなかったことを示した。
【０１６４】 ［14Ｃ］−３−［（２，４−ジメチルピロール−５−イル）メチリデニル］−
２−インドリノンを用いる全身オートラジオグラフィーは，３−［（２，４−ジ
メチルピロール−５−イル）メチリデニル］−２−インドリノンが組織に広く分
布し，静脈内注射の後急速に排出されることを示した。最高のレベルは小腸内容
物および尿に存在した（さらに３−［（２，４−ジメチルピロール−５−イル）
メチリデニル］−２−インドリノンは肝臓，腎臓，皮膚，精巣，褐色脂肪，ハル
ダー腺および鼻甲介において認められた）。２４時間内に回収された総用量は投
与した用量の９２％であり，７２％は大便中に排出され１６％は尿中に排出され
た。胆管排出が排出の主要経路であると考えられる。
【０１６５】 非標識および［14Ｃ］−標識３−［（２，４−ジメチルピロール−５−イル）
メチリデニル］−２−インドリノンを用いる研究は，化合物がラットにおいて静
脈内投与後急速に代謝されることを示す。放射性代謝産物プロファイルは，［14 Ｃ］−３−［（２，４−ジメチルピロール−５−イル）メチリデニル］−２−イ
ンドリノンの９０％以上が静脈内投与後３時間以内に代謝されることを示した。
代謝産物同定のデータは，１つの代謝産物はピロール環のメチル基の１つにカル
ボキシル基が付加されており，第２の代謝産物はカルボキシル基にメチルが付加
されていることを示唆する。
【０１６６】 進行した悪性腫瘍を有する患者における，４．４−１９０ｍｇ／ｍ2の用量で
患者を治療した第１相試験からの予備的な薬物動力学データは，この薬剤はヒト
において約６０分間の半減期を有することを示す。アルファ半減期は急速であり
，平均で５．８±１．９分間である。ベータ半減期すなわち排出相は，１０−１
１１分間の範囲で平均値４３．４±２１．９分間である。３−［（２，４−ジメ
チルピロール−５−イル）メチリデニル］−２−インドリノンの全身循環からの
クリアランスは急速であり，平均値は１日あたり１８５７±１０１６リットルの
血漿から３−［（２，４−ジメチルピロール−５−イル）メチリデニル］−２−
インドリノンがクリアされる。クリアランスはこれらのレベルでは用量に依存し
なかった。ＢＳＡに基づいて計算した個々のクリアランスは，４１．８±２２．
１Ｌ／時／ｍ2であった。３−［（２，４−ジメチルピロール−５−イル）メチ
リデニル］−２−インドリノンを８回注入した後，すべての患者においてクリア
ランスの速度は５０−３００％増加した。１コンパートメントモデルにより計算
した３−［（２，４−ジメチルピロール−５−イル）メチリデニル］−２−イン
ドリノンの合計分布容量は５３．６±１１．３リットルであり，このことは，こ
の薬剤が体液全体に分布されたことを示す。これまでにヒトで試験した用量にお
いては，ＡＵＣおよびＣMAXは用量とともに直線的に増加する。
【０１６７】 ３−［（２，４−ジメチルピロール−５−イル）メチリデニル］−２−インド
リノンの代謝の主要経路は，ピロール環上の５−メチル基の逐次酸化反応を経由
するものである。血清中で４種類の代謝産物を測定することができ，これらはす
べてピロール環上のこのメチル基の逐次酸化を含む。インビトロ代謝研究からの
データは，３−［（２，４−ジメチルピロール−５−イル）メチリデニル］−２
−インドリノンが，Ｐ−４５０肝酵素，おそらくは誘導可能酵素であるＣＹＰ１
Ａ２およびＣＹＰ３Ａ４により代謝されることを示す。特に，ＣＹＰ３Ａ４は，
すべての３−［（２，４−ジメチルピロール−５−イル）メチリデニル］−２−
インドリノン注射の前にプレメディケイションとして投与されるデキサメタゾン
等の多くの生体異物により誘導される。
【０１６８】フルオロウラシルおよびフルオロウラシル／ロイコボリン−一般 フルオロウラシルの化学構造は５−フルオロ−２，４（１Ｈ，３Ｈ）−ピリミ
ジンジオンである。フルオロウラシルの正確な作用モードは明らかではないが，
この薬剤は，少なくとも３つの方法で抗代謝剤として機能すると考えられている
。１つの観点においては，この薬剤は，そのデオキシリボヌクレオチド誘導体で
ある５−フルオロ−２’−デオキシウリジン−５’−ホスフェート（Ｆ−ｄＵＭ
Ｐ）としてチミジレートシンセターゼを阻害し，その結果デオキシウリジン酸か
らチミジル酸へのメチル化が阻害される。これは次に，ＤＮＡの合成を妨害する
。第２の観点においては，フルオロウラシルは，少ない量ではあるがＲＮＡのプ
ロセシングおよび機能の両方に重要な影響を与えるのに十分な程度，ＲＮＡ中に
取り込まれることが見いだされている。最後に第３の観点においては，フルオロ
ウラシルはウラシルホスファターゼをブロックし，したがって，あらかじめ形成
されたウラシルがＲＮＡ合成において用いられることを阻害する（Ｇｏｏｄｍａ
ｎ ａｎｄ Ｏｉｌｍａｎ，"Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａ
ｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ"，１９８５，ｐａｇｅｓ １２６８
−１２７１）。
【０１６９】 フルオロウラシルは，単独で，または他の薬剤と組み合わせて投与することが
できる。最も一般的な組み合わせは，ロイコボリン（フォリン酸）の使用を含む
。ロイコボリンはフルオロウラシルの細胞毒性効果を増強する。これは，減少し
た葉酸の細胞外濃度を増加させ，次に（Ｆ−ｄＵＭＰ），５，１０−メチレンテ
トラヒドロフォレートおよびチミジンシンセターゼにより形成される共有三次複
合体を安定化させることによると考えられている。この複合体の安定化は，シン
セターゼの阻害を促進し，このことによりフルオロウラシルの有効性が増加する
。
【０１７０】 これまでに進行段階の直腸結腸癌の治療に用いられてきたフルオロウラシルと
の他の化学療法的組み合わせには，限定されないが，フルオロウラシルと，メト
トレキセート単独（Ｂｌｉｊｈａｍ，Ｇ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ Ｏｎ
ｃｏｌ．，１９９６，１４（８）：２２６６−７３）およびロイコボリンとの組
み合わせ（Ｒｏｍｅｒｏ，Ａ．Ｏ．，ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎ
ｏｃｏｌ．，１９９８，２１（１）：９４−８）；インターフェロンアルファ−
２ａ（Ｇｒｅｃｏ，Ｆ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，１
９９６，１４（１０）：２６７４−８１）；インターフェロンアルファ２ｂ＋ロ
イコボリン（Ｋｏｈｎｅ，Ｃ．Ｈ．，Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，１９９７，５４（２）
：９６−１０１）：白金化合物，例えばシスプラチンおよびオキサリプラチンと
ロイコボリンとの組み合わせ（Ｓｃｈｅｉｔｈａｕｅｒ，Ｗ．，ｅｔ ａｌ．，
Ｃａｎｃｅｒ，１９９４，７３（６）：１５６２−６８）；カルボプラチン＋メ
トトレキセート（フルオロウラシル投与の前）（Ｐｒｏｎｚａｔｏ，Ｐ．，Ｊ．
Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．，１９９８，１０（３）：２５４−５７）；およびＢｌｅ
ｉｂｅｒｇ，Ｈ．ａｎｄＧｒａｍｏｎｔ，Ａ．，Ｓｅｍｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，１
９９８，２５（２ Ｓｕｐｐｉ．５）：３２−３９）：ラバミゾール（Ｂａｎｄ
ｅａｌｙ，Ｍ．Ｔ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，１９９８，４（４）
：９３５−３８）；メチルロムスチンおよびロイコボリン（Ｊｏｎｅｓ，Ｊｒ．
，Ｄ．Ｖ．，Ｃａｎｃｅｒ，１９９５，７６（１０）：１７０９−１４）；およ
び，イリノテカン（トポイソメラーゼ−Ｉ阻害剤，フルオロウラシル／ロイコボ
リンでの前治療の後）（Ｒｏｕｇｉｅｒ，Ｐ． ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．
Ｏｎｃｏｌ．，１９９７，１５（１）：２５１−２６０）との組み合わせが含ま
れる。
【０１７１】 上述の組み合わせの使用は増加しているが，現在フルオロウラシル単独または
フルオロウラシルとロイコボリンとの組み合わせを越える利点を与えているもの
はなさそうである。この後者は，転移性直腸結腸癌を有する患者の標準的な初期
治療である。単独の薬剤として，これは約１５％の応答比率および６か月間の生
存中央値を与える。ロイコボリンとの組み合わせにおいては，フルオロウラシル
の活性は増加し，応答比率は約２０％であり，進行（ステージＤ）直腸結腸癌の
生存期間の中央値は１１−１３か月であることが認められている（Ｗｏｌｍａｒ
ｋ，Ｎ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，１９９３，１１：１８
７９−１８８７）。
【０１７２】 フルオロウラシルは，静脈内ボーラス注射または連続注入のいずれかにより投
与することができる。分布体積は細胞外空間よりわずかに大きい。３７０−７２
０ｍｇ／ｍ2の静脈内ボーラス用量は，８−１４分間の排出半減期を与え，血漿
レベルは２時間の間に細胞毒性効果のほぼ閾値である１μＭ以下になる。薬剤の
１０％未満が尿中に***され，残りは代謝経路を通じてクリアされる。
【０１７３】 しばしば用いられる投与スケジュールは，３−４週間ごとに３−５日間の短い
ボーラス注射，４週間ごとに９６−１２０時間持続の連続静脈内注入，および８
週間ごとに６週間の毎週の注入である。深刻な臨床的毒性の発生は，全身暴露が
高くなるにつれて（例えば，連続注入の間のより高い定常状態血漿濃度およびボ
ーラス投与によるより高いＡＵＣ）増加する傾向にある。
【０１７４】 特に，上述の治療のスケジュールのそれぞれは，フルオロウラシルを投与しな
い実質的な間隔を含む。これは主としてフルオロウラシルの本来の毒性のためで
あり，これはロイコボリンを加えることにより悪化する。残念ながら，この時間
的間隔は，フルオロウラシルの有効性を実質的に減少させる。すなわち，フルオ
ロウラシルまたはフルオロウラシル／ロイコボリンによる患者の最初の治療によ
り，腫瘍の数およびサイズが約３対数単位（３桁，すなわち１０００倍）減少す
る。しかし，治療しない"回復"期間の間，腫瘍の数およびサイズは約２対数単位
（１００倍）程度に反跳する。すなわち，フルオロウラシルによる１クールの治
療の総合的な効果は，フルオロウラシルの１回投与につき，約１対数単位（腫瘍
の数およびサイズの約１０倍の減少）のみである。フルオロウラシルによる長い
治療は治療の費用および患者の生活の質等に関する問題を引き起こすのみならず
，その結果薬剤に対する二次的耐性が生ずる可能性がある。本発明の方法は，回
復期間の間にフルオロウラシルのそれぞれの投与の効果のより実質的な部分を維
持することに向けられている。したがって，治療の全クールにおいて続いて投与
することにより，腫瘍のサイズおよび数の減少が見られ，したがって，フルオロ
ウラシルの総合的な有効性を改良するであろう。
【０１７５】進行直腸結腸癌におけるフルオロウラシルおよびフルオロウラシル／ロイコボリ ンを用いる臨床試験 しばしば用いられる連続注入スケジュールは，３−４週間ごとに３−５日間の
短いボーラス注射，４週間ごとに９６−１２０時間持続の連続静脈内注入，およ
び８週間ごとに６週間の毎週の注入である。深刻な臨床的毒性の発生は，全身暴
露が高くなるにつれて（例えば，連続注入の間のより高い定常状態血漿濃度およ
びボーラス投与によるより高いＡＵＣ）増加する傾向にある。
【０１７６】 メイヨークリニックおよびノースセントラル癌治療群（Ｍａｙｏ／ＮＣＣＴＧ
）により行った進行転移性直腸結腸癌を有する患者におけるランダム化臨床試験
において，３種類の治療計画を比較した。ロイコボリン２００ｍｇ／ｍ2および
フルオロウラシル３７０ｍｇ／ｍ2対ロイコボリン２０ｍｇ／ｍ2およびフルオロ
ウラシル４２５ｍｇ／ｍ2対フルオロウラシル５００ｍｇ／ｍ2。すべての薬剤は
５日間毎日低速静脈内注入により投与し，これを２８−３５日ごとに繰り返した
。応答比率は，高用量ロイコボリン，低用量ロイコボリンおよびフルオロウラシ
ル単独群について，それぞれ２６％（ｐ＝０．０４，対フルオロウラシル単独）
，４３％（ｐ＝０．００１，対フルオロウラシル単独）および１０％であった。
それぞれの生存期間中央値は，１２．２か月（ｐ＝０．０３７），１２か月（ｐ
＝０．０５０），および７．７か月であった。低用量ロイコボリン治療計画は，
５％より多い体重増加，症状の軽減，および行動状態の改良において統計的に有
意の改良を与えた。高用量ロイコボリン治療計画は，行動状態において統計学的
に有意の改良を与え，体重増加および症状の軽減を改良する傾向を示したがこれ
は統計学的には有意ではなかった。
【０１７７】 第２のＭａｙｏ／ＮＣＣＴＧランダム化臨床試験においては，フルオロウラシ
ル単独アームを，メトトレキセート（ＭＴＸ），フルオロウラシル，およびロイ
コボリンを逐次投与する治療計画により置き換えた。ロイコボリン２００ｍｇ／
ｍ2およびフルオロウラシル３７０ｍｇ／ｍ2対ロイコボリン２０ｍｇ／ｍ2およ
びフルオロウラシル４２５ｍｇ／ｍ2対逐次的ＭＴＸおよびフルオロウラシルお
よびロイコボリンを用いたときの応答比率は，それぞれ３１％（ｐ＝＜．０１）
，４２％（ｐ＝＜．０１），および１４％であった。それぞれの生存期間の中央
値は，１２．７か月（ｐ＝＜．０４），１２．７か月（ｐ＝＜．０１），および
８．４か月であった。各治療アームの間には，５％より多い体重増加または動作
状態の改良について統計学的に有意な相違は認められなかった。
【０１７８】 低用量（２０ｍｇ／ｍ2）および高用量（２００ｍｇ／ｍ2）のロイコボリンの
結果および毒性を比較する第３の研究においては，４週間ごとにロイコボリンに
加えて患者に４００ｍｇ／ｍ2／日のフルオロウラシルの１時間注入を行った。
２つの群は，性別比，原発性腫瘍の部位，行動状態，および腫瘍の程度において
統計学的に有意な差がないようにそろえた。２つの治療計画における毒性は低く
，２つの群の間で有意に相違しなかった。全体的な生存の中央値は，２つの群の
間で有意に相違しなかった：低用量ロイコボリンを投与した患者について３４６
日，高用量ロイコボリンを投与した患者について３２３日。１年の時点において
，同等性評価は有意であり（ｐ＜０．０１），このことは高用量治療計画に関し
ては，１年生存において２０％を越える有益性がないことを示す。５日間治療計
画においてフルオロウラシルと組み合わせて高用量ロイコボリンを使用すること
は，転移性直腸結腸癌を有する患者の全体的生存率を有意に改良しない。
【０１７９】 最後に，第４の大きなランダム化研究において，進行した直腸結腸癌の治療に
おけるフルオロウラシル／ロイコボリンの最も一般的な２つのスケジュールを比
較した。先に行った制御された試験において，これらの用量投与スケジュールは
それぞれ単一薬剤ボーラスでのフルオロウラシルより優れていることが示された
ためである。転移性直腸結腸癌を有する３７２人の患者を，行動状態および測定
可能な指標病巣の存在および位置にしたがって分類し，ランダム化して次の２つ
の治療計画のいずれかで化学療法を行った：（１）集中クール−フルオロウラシ
ル＋低用量ロイコボリン（５日間毎日，フルオロウラシル４２５ｍｇ／ｍ2＋ロ
イコボリン２０ｍｇ／ｍ2を静脈内［ＩＶ］プッシュ，このクールを４−５週間
隔で繰り返す）；または（２）毎週−フルオロウラシル＋高用量ロイコボリン（
フルオロウラシル６００ｍｇ／ｍ2をＩＶプッシュ＋ロイコボリン５００ｍｇ／
ｍ2を２時間注入として，６週間毎週，このクールを８週間ごとに繰り返す）。
以下のパラメータに関して，試験した２つのフルオロウラシル／ロイコボリン治
療計画の間には治療の有効性において有意な差はなかった。他覚的腫瘍応答（３
５％ｖ３１％），生存率（中央値，９．３ｖ１０．７か月），および緩和効果（
症状の軽減，改良された行動状態，および体重増加により評価）。毒性について
有意な差異（Ｐ＜．０５）があり，集中クール治療計画（１−５日）ではより多
くの白血球減少症および口内炎が認められ，毎週治療計画ではより多くの下痢が
認められ，毒性を管理するために入院の必要性が増加した。治療上有効性は同様
であるが，化学療法の毒性を管理するために入院の必要が少ないことから，集中
クール−フルオロウラシル＋低用量ロイコボリンは，この研究で適用した用量投
与スケジュールを用いる毎週フルオロウラシル＋高用量ロイコボリンと比較して
優れた治療指数を有するようであった。
【０１８０】 ３．医薬組成物および用途 本発明の化合物，そのプロドラッグ，または該化合物またはそのプロドラッグ
のいずれかの生理学的に許容される塩は，そのままヒトの患者に投与するか，ま
たは前述の材料が適当な担体または賦形剤と混合された医薬組成物中で投与する
ことが可能である。薬物の製剤および投与の技術は，"Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ
Ｐｈａｒｍｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ"（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉ
ｓｈｉｎｇ Ｃｏ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ）の最新版に見られるだろう。
【０１８１】投与経路 一般 適当な投与経路は，限定されないが，経口，直腸，経粘膜，または腸管投与か
，あるいは筋肉内，皮下，骨髄内，髄内，直接心室内，静脈内，硝子体内，腹腔
内，鼻腔内，または眼内の注射を含む。好ましい投与経路は経口および非経口で
ある。
【０１８２】 あるいは，化合物は，全身的方法ではなく局所に，例えば化合物を固体腫瘍内
へ直接に，しばしばデポ剤または持効性の製剤中で，注射することにより投与し
てもよい。
【０１８３】 さらに，薬物はターゲティングされたドラッグデリバリーシステムにおいて，
例えば腫瘍特異的抗体により被覆されたリポソーム中で投与されてもよい。リポ
ソームは当該腫瘍にターゲティングされ，取り込まれるであろう。
【０１８４】組成物／製剤 一般 本発明の医薬組成物は，当該技術分野において周知の工程，例えば通常の混合
，溶解，顆粒化，糖衣作成，研和，乳化，カプセル封入，捕捉，または凍結乾燥
の工程により製造されてよい。
【０１８５】 本発明にしたがって使用するための医薬組成物は，活性成分の薬剤学的に使用
可能な製品への加工を容易にする賦形剤および補助剤を含む，一つまたはそれよ
り多い生理学的に許容される担体を用いる通常の方法で製剤されてよい。適切な
製剤は，選ばれた投与経路に依存する。
【０１８６】 注射用には，本発明の化合物は水溶性溶液，好ましくはハンクス溶液，リンガ
ー溶液，または生理的塩類緩衝液等の生理学的に適した緩衝液において製剤され
てよい。経粘膜投与用には，浸透すべき障壁に適した浸透剤が製剤に用いられる
。そのような浸透剤は当該技術分野において一般に周知である。
【０１８７】 経口投与用には，活性化合物を，当該技術分野において周知の薬剤学的に許容
される担体と組合せることにより処方することができる。かかる担体は，本発明
の化合物を，患者による経口摂取のための錠剤，丸剤，トローチ，糖衣剤，カプ
セル，液体，ゲル，シロップ，スラリー，懸濁液，その他として製剤することを
可能とする。経口使用のための薬剤学的製品は，固形の賦形剤を用い，得られた
混合物を任意に破砕し，所望であればさらに他の適当な補助剤を添加した後に，
顆粒混合物を加工して錠剤または糖衣剤のコアを得る。有用な賦形剤は，特に，
ラクトース，ショ糖，マンニトール，またはソルビトールを含む糖類，トウモロ
コシデンプン，小麦デンプン，米デンプン，およびジャガイモデンプン等のセル
ロース製品，およびゼラチン，トラガカントゴム，メチルセルロース，ヒドロキ
シプロピルメチルセルロース，カルボキシメチルセルロースナトリウム，および
／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）等の他の材料等の増量剤である。所望
であれば，架橋されたポリビニルピロリドン，寒天，またはアルギニン酸等の崩
壊剤が添加されてもよい。またアルギン酸ナトリウム等の塩も使用されてよい。
【０１８８】 糖衣剤のコアは，適当なコーティングとともに供給される。この目的のために
は，濃縮された糖溶液を用いることができるが，アラビアゴム，タルク，ポリビ
ニルピロリドン，カルボポールゲル，ポリエチレングリコール，および／または
二酸化チタン，ラッカー溶液，および適当な有機溶媒または溶媒混合物を任意に
含んでよい。識別のため，あるいは活性成分の用量の異なる組合せを特徴づける
ため，染料または色素が錠剤または糖衣剤コーティングに添加されてよい。
【０１８９】 経口的に用いられることが可能な医薬組成物は，ゼラチンでできたプッシュフ
ィットカプセル，ならびにゼラチンおよびグリセロールやソルビトールといった
可塑剤から成る密封軟カプセルを含む。プッシュフィットカプセルは，活性成分
を，ラクトース等の増量剤，デンプン等の結合剤，および／またはタルクやステ
アリン酸マグネシウムといった潤滑剤，さらに任意に安定剤と混合して含むこと
ができる。軟カプセルにおいては，活性成分は脂肪油，流動パラフィン，または
液体ポリエチレングリコール等の適当な液体中に溶解または懸濁されてよい。安
定剤もこれらの製剤に添加されてよい。
【０１９０】 吸入による投与用には，本発明に従って用いられる化合物は，加圧されたパッ
クまたはネブライザーと，噴射剤，例えばこれに限定されないが，ジクロロジフ
ルオロメタン，トリクロロフルオロメタン，ジクロロテトラフルオロエタン，ま
たは二酸化炭素とを用いたエアーゾルスプレイの形状にて便利に送達される。加
圧されたエアーゾルの場合，用量単位は計量された量を送達するべく備えられた
バルブにより調節されてよい。例えば吸入器または注入器において使用するため
のゼラチン製のカプセルおよびカートリッジは，当該化合物の粉末混合物と，ラ
クトースやデンプンといった適当な粉末基剤とを含んで製剤されてよい。
【０１９１】 また当該化合物は，例えばボーラス注射または連続注入による非経口投与用に
製剤されてもよい。注射用の製剤は，単位用量にて，例えばアンプルにて，ある
いは添加された保存料と共に多用量容器中で提供されてよい。組成物は油性また
は水性のベヒクルにおいて，懸濁液，溶液，または乳濁液といった形状をとって
よく，また懸濁，安定および／または分散剤といった製剤物質を含んでもよい。
【０１９２】 非経口投与用の薬剤組成物は，これに限定されないが，活性成分の塩等の，水
に可溶性の形状の水溶液を含む。さらに，活性成分の懸濁物は，親油性のベヒク
ル中で調製されてよい。適切な親油性ベヒクルはゴマ油等の脂肪油，オレイン酸
エチル等の合成脂肪酸エステル，およびトリグリセリド，またはリポソーム等の
物質を含む。水溶性の注射用懸濁液は，カルボキシメチルセルロースナトリウム
，ソルビトール，またはデキストラン等の当該懸濁液の粘度を増す物質を含んで
よい。任意に，当該懸濁液はまた，高度に濃縮された溶液の調製を可能にするべ
く，当該化合物の可溶性を亢進する適当な安定剤および／または薬剤を含んでも
よい。
【０１９３】 あるいは，活性成分は，使用前に適当な媒体，例えば無菌の，発熱物質なしの
水を用いて構成するための，粉末の形状であってもよい。
【０１９４】 当該化合物は，例えばカカオバターまたは他のグリセリドといった通常の坐剤
基剤を用いて，坐剤または停留浣腸等の直腸用組成物に製剤されてもよい。
【０１９５】 先に述べた製剤に加えて，当該化合物はまたデポ製剤として製剤されてよい。
かかる長時間作用性の製剤は，埋込み（例えば皮下または筋肉内への）によるか
，または筋肉内注射により投与されてよい。この投与経路のためには，本発明の
組成物は適当な高分子性または疎水性物質と共に（例えば薬理学的に許容される
油剤による乳濁液にて），イオン交換樹脂と共に，あるいはこれに限定されない
がやや溶けにくい塩等のやや溶けにくい誘導体として，製剤されてよい。
【０１９６】 本発明の疎水性化合物のための薬学的担体の非限定的例は，ベンジルアルコー
ル，非極性界面活性剤，水混和性有機ポリマーおよび水性相を含む共溶媒系，例
えばＶＰＤ共溶媒系である。ＶＰＤは，３％ｗ／ｖベンジルアルコール，８％ｗ
／ｖ非極性界面活性剤ポリソルベート８０（商標），および６５％ｗ／ｖポリエ
チレングリコール３００を純粋エタノール中に作成した溶液である。ＶＰＤ共溶
媒系（ＶＰＤ：Ｄ５Ｗ）は，ＶＰＤを５％デキストロースの水溶液中に１：１で
希釈したものである。この共溶媒系は疎水性化合物をよく溶解し，それ自体，全
身投与に際して低い毒性を示す。そのような共溶媒系の比率は，その溶解性およ
び毒性特性を破壊することなく相当変化させることができる。さらに，共溶媒成
分の同一性も変化させることができる。例えば，他の低毒性非極性界面活性剤を
ポリソルベート８０（商標）の代わりに用いることができ，ポリエチレングリコ
ールの分画サイズは様々でありうる。他の生体適合性ポリマー，例えばポリビニ
ルピローリドンをポリエチレングリコールの代わりに用いることができ，他の糖
または多糖類をデキストロースの代わりに用いることができる。
【０１９７】 あるいは，疎水的医薬化合物のための他の輸送系を用いてもよい。リポソーム
および乳剤は，疎水的薬剤のための輸送用ベヒクルまたは担体の例としてよく知
られている。さらに，ある種の有機溶媒，例えばジメチルスルホキシドもまた用
いることができるが，しばしば毒性がより高くなる。
【０１９８】 さらに，化合物は，持続放出系，例えば治療薬剤を含む固体疎水性ポリマーの
準透過性マトリクスを用いて輸送することができる。種々の持続放出材料が確立
されており，当業者にはよく知られている。持続放出カプセルはその化学的性質
に応じて，数週間から１００日を越える期間，化合物を放出する。治療薬剤の化
学的性質および生物学的安定性に応じて，さらに別の蛋白質安定化戦略を用いて
もよい。
【０１９９】 本発明の医薬組成物はまた，適当な固体またはゲル相担体または賦形剤を含ん
でいてもよい。そのような担体または賦形剤の例には，限定されるものではない
が，炭酸カルシウム，リン酸カルシウム，種々の糖およびでんぷん，セルロース
誘導体，ゼラチン，およびポリエチレングリコール等のポリマーが含まれる。
【０２００】３−［（２，４−ジメチルピロール−５−イル）メチリデニル］−２−インドリ ノン組成物 この化合物は，上述の任意の組成物または製剤として処方することができる。
しかし現在好ましい処方は，４．５ｍｇ／ｍｌの最終濃度を与えるのに十分な無
菌非経口投与溶液中の３−［（２，４−ジメチルピロール−５−イル）メチリデ
ニル］−２−インドリノンからなる。処方の追加の成分には，ポリエチレングリ
コール４００；ポリオキシル３５ひまし油（Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ（登録商標））
；ベンジルアルコールおよび脱水アルコールが含まれる。この処方は，Ｃｒｅｍ
ｏｐｈｏｒ（登録商標）を含有するため，標準的なＰＶＣ裏打シリンジ，静脈内
バッグおよび投与セットとは適合性ではないことに注意すべきである。
【０２０１】フルオロウラシル／ロイコボリン組成物 フルオロウラシルは，化学療法の分野の当業者に知られている組成物および処
方中で市販されており，本発明の方法においては，これらの組成物／処方として
投与することができる。そのような組成物／処方の例は，市販のフルオロウラシ
ルの包装挿入物中に見いだされ，これを本明細書中に完全に記載されているよう
に本明細書の一部としてここに引用する。将来開発されるかまたは利用可能とな
る任意の他のまたは異なる組成物／処方の使用も，本発明の範囲内である。
【０２０２】 同様に，ロイコボリンもまた化学療法の技術分野の当業者に知られる組成物／
処方中で市販されており，本発明の方法においてはそのような組成物／処方とし
て投与することができる。そのような組成物／処方の例は，市販のロイコボリン
に付属の包装挿入物中に示されており，これを本明細書において完全に記載され
ているように本明細書の一部としてここに引用する。上述したように，将来開発
され入手可能になるであろう任意の他のまたは異なる組成物／処方それ自体もま
た，本発明の範囲内である。
【０２０３】用量 一般 本発明における使用に適した医薬組成物は，意図された目的，すなわちＰＫ活
性の調節，またはＰＫ関連疾患の治療または予防を遂行するのに充分な量の活性
物質が含まれている組成物を含む。
【０２０４】 さらに具体的には，治療上有効な量とは，疾患の症状を予防，緩和，または改
善するため，あるいは治療されている患者の生存を延長させるために有効な化合
物の量を意味する。
【０２０５】 治療上有効な量の決定は，特に本明細書において提供された詳細な開示に照ら
し合われせば，当業者の能力で充分可能である。
【０２０６】 本発明の方法において用いられる化合物については，治療上有効な量または用
量は，最初は細胞培養検定から見積もることができる。次に，動物モデルにおけ
る使用のために，培養細胞において測定されたＩＣ50（すなわちＰＫ活性の最大
阻害の半分を成し遂げる試験化合物の濃度）を含む循環濃度範囲を達成するよう
な用量を処方することができる。かかる情報は次いで，ヒトにおける有用な用量
のさらに正確な決定のために用いられることが可能である。
【０２０７】 本明細書に述べた化合物の毒性ならびに治療上の有効性は，細胞培養物または
実験動物において標準的な薬剤学的方法により，例えば披検化合物についてＩＣ 50 およびＬＤ50（双方とも本明細書の他の場所において議論されている）を測定
することにより，測定することが可能である。このような細胞培養物の検定およ
び動物研究から得られたデータは，ヒトにおいて使用するための用量範囲の処方
に利用することができる。用量は，用いられる剤形と，利用される投与経路とに
依存して変えられてよい。正確な製剤，投与経路，および用量は，個々の医師に
より，患者の状態を考慮して選択されることが可能である。（例えば，Ｆｉｎｇ
ｌ ｅｔ ａｌ．１９７５，"Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａ
ｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ"，Ｃｈ．１，ｐ．１を参照のこと）
。
【０２０８】 投薬用量および間隔は，活性種の，キナーゼ調節効果を維持するために充分な
血漿濃度を提供するべく，個々に調節されてよい。このような血漿濃度は，最小
有効濃度（ＭＥＣ）と呼ばれる。ＭＥＣは各々の化合物ごとに異なるであろうが
，インビトロのデータから算定されることは可能であり，例えばキナーゼの５０
〜９０％阻害を達成するために必要な濃度は，本明細書に述べた検定法を用いて
確認されてよい。ＭＥＣに達するために必要な用量は個体の特性および投与経路
に依存することとなる。ＨＰＬＣ検定法または生物学的検定法は，血漿濃度を測
定するべく使用されることが可能である。
【０２０９】 投薬間隔もまたＭＥＣ値を用いて測定することができる。化合物は，ＭＥＣよ
り高い血漿濃度が１０〜９０％の時間，好ましくは３０〜９０％の間，最も好ま
しくは５０〜９０％の間にわたって維持される投与計画を用いて投与すべきであ
る。
【０２１０】 局所投与または選択的摂取の場合には，薬剤の有効な局所濃度は血漿濃度に関
係なく，当該技術分野において周知の他の方法を用いて，正しい用量および間隔
を決定することができる。
【０２１１】 投与される組成物の量は，もちろん治療される患者，苦しみの激しさ，投与法
，処方している医師の判断，その他に依存する。
【０２１２】３−［（２，４−ジメチルピロール−５−イル）メチリデニル］−２−インドリ ノンの用量 ３−［（２，４−ジメチルピロール−５−イル）メチリデニル］−２−インド
リノン（上述を参照）に関して得られた薬理学的データに基づけば，化合物は，
約４ｍｇ／ｍ2から約１９５ｍｇ／ｍ2の範囲の用量で投与することができる。現
在好ましい態様においては，用量は約７２．５ｍｇ／ｍ2−約１４５ｍｇ／ｍ2で
ある。
【０２１３】 上述の組成物の節で記載した希釈物は，患者に，約５０−約３５０ｃｃ／時の
速度で投与することができる。好ましくは，速度は約１５０−約２５０ｃｃ／時
である。最も好ましくは，速度は約１７５−約２２５ｃｃ／時である。
【０２１４】 "約"との用語は，本明細書において用いられる場合，±１０％を意味する。す
なわち，約１７５ｃｃ／時とは，１５７．５ｃｃ／時−１９２．５ｃｃ／時を意
味する。
【０２１５】 現在好ましい態様においては，３−［（２，４−ジメチルピロール−５−イル
）メチリデニル］−２−インドリノンの用量を，フルオロウラシルまたはフルオ
ロウラシル／ロイコボリンを患者に投与しない期間の間に投与する。上述の薬理
学の節における例から明らかにされたように，フルオロウラシルまたはフルオロ
ウラシル／ロイコボリンは，多くの治療計画において投与することができ，治療
計画の選択は担当の臨床医の知識および専門的能力の範囲内である。
【０２１６】フルオロウラシルおよびフルオロウラシル／ロイコボリンの用量 上述のフルオロウラシルおよびフルオロウラシル／ロイコボリンを用いる臨床
試験において見られるように，現在，フルオロウラシルまたはフルオロウラシル
／ロイコボリンを進行直腸結腸癌に投与するのに用いられる種々のスケジュール
が存在する。しかし，フルオロウラシルおよびフルオロウラシル／ロイコボリン
の種々の投与用量およびスケジュールを用いた結果には顕著な相違はなく，ほと
んどの治療計画は，白血球減少症，下痢および粘膜炎を様々な程度で生ずる。す
なわち，フルオロウラシルは，約３００ｍｇ／ｍ2−約８００ｍｇ／ｍ2の範囲の
用量で投与することができるが，約４００−５００ｍｇ／ｍ2／週の用量強度を
与えるフルオロウラシルのスケジュールが現在最適な治療であると考えられてい
る。ロイコボリンを治療に含める場合，低および高用量ロイコボリンについての
臨床結果の相違は小さく，高用量治療計画には追加の毒性があるため，現在低用
量治療計画が最も適当であるようである。
【０２１７】 すなわち，フルオロウラシルまたはフルオロウラシル／ロイコボリンは，本発
明の範囲内で，現在認可されている任意の方法で，または将来有効であると見い
だされる任意の方法で投与することができるが，上述のデータによれば，本発明
の現在好ましい態様においては，フルオロウラシルは４週間サイクルの第１−５
日に約４００−５００ｍｇ／ｍ2の用量でボーラス静脈内注射として投与する。
４週間のサイクルは，必要に応じて，または治療を実施している臨床医に認識さ
れる有害な副作用が生ずるまで，繰り返すことができる。
【０２１８】 ロイコボリンは，フルオロウラシルとともに投与することができる。ロイコボ
リンは，約２０−約５００ｍｇ／ｍ2，好ましくは約２０−約２００ｍｇ／ｍ2の
用量で投与することができ，本発明の現在好ましい態様においては，フルオロウ
ラシルの各投与について，約２０ｍｇ／ｍ2の低用量投与として，ボーラス注射
として投与する。
【０２１９】フルオロウラシルまたはフルオロウラシル／ロイコボリンと３−［（２，４−ジ メチルピロール−５−イル）メチリデニル］−２−インドリノンとの組み合わせ ３−［（２，４−ジメチルピロール−５−イル）メチリデニル］−２−インド
リノンをフルオロウラシルまたはフルオロウラシル／ロイコボリンとの組み合わ
せで投与する場合，化合物は，各成分の特徴の最大の利点を得るように計算され
た治療計画にしたがって，同時に，逐次的に，連続的に，間欠的に等で投与する
ことができることが，本発明の１つの観点である。現在好ましい態様においては
，３−［（２，４−ジメチルピロール−５−イル）メチリデニル］−２−インド
リノンは，フルオロウラシルまたはフルオロウラシル／ロイコボリンを投与しな
い日に投与する。すなわち，本発明の１つの態様においては，上述の３−［（２
，４−ジメチルピロール−５−イル）メチリデニル］−２−インドリノンの用量
を，所望の任意のパターンで投与することができる。例えば，限定されるもので
はないが，フルオロウラシルまたはフルオロウラシル／ロイコボリンについて選
択された治療計画において，フルオロウラシルまたはフルオロウラシル／ロイコ
ボリンを投与しない，各日，１日おき，２日おき等で投与することができる。３
−［（２，４−ジメチルピロール−５−イル）メチリデニル］−２−インドリノ
ンは，ボーラス静脈内注射として，または連続静脈内注入として投与することが
できる。しかし，インビトロデータに基づけば，３−［（２，４−ジメチルピロ
ール−５−イル）メチリデニル］−２−インドリノンは，比較的短い時間（５−
３０分間）かけて投与することができ，その３−４日後に内皮細胞に対して抗増
殖活性を示す。同様に，インビボデータは，３−［（２，４−ジメチルピロール
−５−イル）メチリデニル］−２−インドリノンを３−４日間隔で投与すること
は，毒性を示すことなく腫瘍成長を阻害するのに十分であることを示している。
さらに，５２週間までの治療を受けた患者における第１相用量増加試験において
累積的毒性は認められなかった。すなわち，本発明の現在好ましい態様において
は，３−［（２，４−ジメチルピロール−５−イル）メチリデニル］−２−イン
ドリノンの示された用量を，４週間の治療計画のそれぞれの２−４週において週
２回投与する。
【０２２０】 本明細書の開示に基づけば，３−［（２，４−ジメチルピロール−５−イル）
メチレン］−２−インドリノンは，他の化学療法剤との組み合わせにおいても作
用すると予測される。例えば，３−［（２，４−ジメチルピロール−５−イル）
メチレン］−２−インドリノンと他のアルキル化剤との組み合わせは，毒性を増
加させることなく相乗的活性を与えるであろう。そのようなアルキル化剤には，
限定されないが，アルキルスルホネート，例えばブルスファン（慢性顆粒球性白
血病の治療に用いられる），イムプロスルファンおよびピポスルファン；アジリ
ジン類，例えばベンゾデパ，カルボコン，メツレデパおよびウレデパ；エチレン
イミン類およびメチルメラミン類，例えばアルトレタミン，トリエチレンメラミ
ン，トリエチレンホスホルアミド，トリエチレンチオホスホルアミドおよびトリ
メチロールメラミン，およびナイトロジェンマスタード類，例えばクロラムブシ
ル（慢性リンパ性白血病，原発性マクログロブリン血症および非ホジキンリンパ
腫の治療において用いられる），シクロホスファミド（ホジキン病，多発性骨髄
腫，神経芽細胞腫，乳癌，卵巣癌，肺癌，ウイルムス腫瘍および横紋筋肉腫の治
療において用いられる），エストラムスチン，イフォスファミド，ノベムブリチ
ン，プレドニムスチンおよびウラシルマスタード（原発性血小板増加症，非ホジ
キンリンパ腫，ホジキン病および卵巣癌用）；およびトリアジン類，例えばダカ
ルバジン（軟組織肉腫用）が含まれる。
【０２２１】 同様に，３−［（２，４−ジメチルピロール−５−イル）メチレン］−２−イ
ンドリノンは，他の抗代謝化学療法剤，例えば，限定されないが，葉酸類似体（
例えば，メトトレキセート（急性リンパ性白血病，絨毛癌腫，菌状息肉腫，乳癌
，頭頸部癌および肺癌，骨形成性肉腫の治療に用いられる）およびプテロプテリ
ン），プリン類似体，例えばメルカプトプリンおよびチオグアニン（急性顆粒球
性白血病，急性リンパ性白血病および慢性顆粒球性白血病の治療に用いられる）
との組み合わせにおいて，有益な効果を有するかもしれない。
【０２２２】 ３−［（２，４−ジメチルピロール−５−イル）メチレン］−２−インドリノ
ンはまた，天然産物化学療法剤，例えば，限定されないが，ビンカアルカロイド
（ビンブラスチン（乳癌および精巣癌に用いられる），ビンクリスチン，ビンデ
シン），エピポドフィロトキシン類（エトポシド，テニポシド（両方とも精巣癌
およびカポジ肉腫の治療に用いられる）），抗生物質化学療法剤（ダウノルビシ
ン，ドキソルビシン，ブレオマイシン，マイトマイシン（胃癌，子宮頸癌，結腸
癌，乳癌，膀胱癌および膵臓癌に用いられる），ダクチノマイシン，プリカマイ
シン，ブレオマイシン（皮膚癌，食道癌および尿生殖器管癌に用いられる）およ
び酵素的化学療法剤，例えばＬ−アスパラギナーゼとの組み合わせにおいて有効
性を示すかもしれない。
【０２２３】 本発明の開示に基づけば，３−［（２，４−ジメチルピロール−５−イル）メ
チレン］−２−インドリノンは，化学療法剤，例えば白金配位錯体（シスプラチ
ン等），置換尿素（ヒドロウレア），メチルヒドラジン誘導体（プロカルバジン
），副腎皮質抑制剤（ミトーテン，アミノグルテチミド），ならびにホルモンお
よびアンタゴニスト，例えばアドレノコルチコステロイド（プレドニゾン），プ
ロゲスチン（ヒドロキシプロゲステロンカプロネート），エストロゲン（ジエチ
ルスチルベストロール），抗エストロゲン（タモキシフェン）およびアンドロゲ
ン（テストステロンプロピオネート）等の活性にも有益であるかもしれない。
【０２２４】 最後に，３−［（２，４−ジメチルピロール−５−イル）メチレン］−２−イ
ンドリノンとミトザントロンまたはパクリタキセルの組み合わせは，固体腫瘍ま
たは白血病，例えば，限定されないが，急性骨髄性（非リンパ球）白血病の治療
において特に有益な効果を示すと予測される。
【０２２５】 上述の説明はフルオロウラシルまたはフルオロウラシル／ロイコボリンとの組
み合わせにおける３−［（２，４−ジメチルピロール−５−イル）メチレン］−
２−インドリノンの使用に関するものであるが，本発明の他の化合物，特にフル
オロウラシルまたはフルオロウラシル／ロイコボリンとの組み合わせにおける３
−［４−（２−カルボキシエチル−３，５−ジメチルピロール−２−イル）メチ
リデニル］−２−インドリノンもまた，本発明の範囲および精神の範囲内である
ことが理解されるべきである。
【０２２６】包装 組成物は，所望であれば， ＦＤＡ承認のキット等の，活性成分を含んでいる
一つまたはそれより多い単位剤形を含むパックまたは調剤装置にて提供されてよ
い。パックは例えばＰＴＰ包装等の金属またはプラスチックの箔を含む。パック
または調剤装置には，投与のための使用説明書が添付されてよい。またパックま
たは調剤装置は，薬剤の製造，用途，または販売を取締まる政府機関によって規
定された形式の，容器に関連した注意書が添付されてよく，その注意書は当該組
成物の形状について，あるいはヒトまたは獣医学的投与についての当該機関によ
る承認を反映するものである。かかる注意書は，例えば米国食品医薬品局により
処方箋調剤薬として承認されたラベルによるものか，または承認された製品に差
込まれたものでもよい。適合した製剤学的担体中で製剤された，本発明の化合物
を含んでいる組成物もまた調製され，適当な容器内に設置され，さらに指示され
た条件による処置のためにラベルされてよい。ラベル上に示される適切な状態と
しては，腫瘍の治療，新脈管形成の阻害，線維症，糖尿病等の治療が挙げられる
。
【０２２７】 ４．合成 本発明の化合物，ならびに前駆体である２−オキシインドール類およびアルデ
ヒド類は，化学の技術分野においてよく知られる技術を用いて容易に合成するこ
とができる。当業者は，本発明の化合物を形成するために他の合成経路が利用可
能であり，以下の記載は例示のために提供されるものであり，限定ではないこと
を理解するであろう。
【０２２８】 １． ４−メチル−５−（２−オキソ−１，２−ジヒドロインドール−３−イリ
デンメチル）−１Ｈ−ピロール−２−カルボン酸メチルエステル オキシ塩化リン（０．１８６ｍＬ，１．４４ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（４
ｍＬ）中のジメチルホルムアミド（０．１５ｍＬ，１．４４ｍｍｏｌ）の溶液に
０℃で滴加した。混合物を室温に暖め，３０分間撹拌し，次に０℃に冷却した。
４−メチル−２−ピロールカルボキシレートメチルエステル（１００ｍｇ，０．
７２ｍｍｏｌ）を少しずつ加え，次に混合物を４０−５０℃で４時間撹拌した。
水酸化ナトリウム（１０％水性溶液，２ｍｌ）を加え，反応混合物を３０分間撹
拌した。次に塩基性溶液を酢酸エチル（３Ｘ）で抽出し，有機層をブラインで洗
浄し，ｐＨ６−７とし，無水硫酸ナトリウムで乾燥し，真空下で濃縮して，１１
５．９ｍｇ（９６％）の４−メチル−５−ホルミル−２−ピロールカルボキシレ
ートメチルエステルを黄色油状物として得た。
【０２２９】 オキシインドール（１０５ｍｇ，０．７９ｍｍｏｌ），４−メチル−５−ホル
ミル−２−ピロールカルボキシレートメチルエステル（１１０ｍｇ，０．６７ｍ
ｍｏｌ）およびピペリジン（２滴）のエタノール（２ｍＬ）中の混合物を，９０
℃で３時間撹拌した。沈殿物を真空濾過により回収し，エタノールで洗浄し，真
空下で乾燥して，１５３．２ｍｇ（８１％）の４−メチル−５−（２−オキソ−
１，２−ジヒドロインドール−３−イリデンメチル）−１Ｈ−ピロール−２−カ
ルボン酸メチルエステルを得た。
【化６】
【０２３０】 ２． ４−メチル−５−（２−オキソ−１，２−ジヒドロインドール−３−イリ
デンメチル）−１Ｈ−ピロール−２−カルボン酸 オキシ塩化リン（０．６６ｍＬ，７．２ｍｍｏｌ）を，ジメチルホルムアミド
（０．６ｍＬ，７．２ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（３０ｍＬ）中の氷***液に
滴加した。混合物を室温で３０分間撹拌し，次に氷浴中で冷却した。４−メチル
−２−ピロールカルボキシレートエチルエステル（９１９ｍｇ，６ｍｍｏｌ）を
反応混合物にゆっくり加えた。次に，得られた反応混合物を室温で２．４時間撹
拌した。次に，混合物を氷浴中で冷却し，２Ｎ水酸化ナトリウムを加え，混合物
を３０分間撹拌した。水性混合物を酢酸エチル（２Ｘ）で抽出し，有機層を合わ
せ，ブラインで洗浄し，次に無水硫酸ナトリウムで乾燥し，真空下で濃縮した。
得られたピンク色の固体を真空下で室温で３日間乾燥して，１．０５ｇ（９６％
）の４−メチル−５−ホルミル−２−ピロールカルボキシレートエチルエステル
を得た。生成物はさらに精製することなく用いた。ＭＳ（ＡＰＣＩ）［Ｍ−ｌ］ + １８０（８０％），［Ｍ−３４］+１４６（１００％）。
【０２３１】 ４−メチル−５−ホルミル−２−ピロールカルボキシレートエチルエステル（
５４３．５７ｍｇ，３ｍｍｏｌ）の２Ｎ水酸化ナトリウム（１５ｍＬ水中１．２
ｇ）中の混合物を１／２時間還流した。反応混合物を室温に冷却し，氷水に注加
した。次にこれを２Ｎ塩酸で酸性にしてｐＨ約３．５とし，酢酸エチル（２Ｘ）
で抽出した。有機層をブラインで洗浄し，無水硫酸ナトリウムで乾燥し，真空下
で濃縮した。得られた固体を真空下で４０℃で２時間乾燥して，４１０ｍｇ（８
９％）の４−メチル−５−ホルミル−２−ピロールカルボン酸を白色固体として
得た。
【０２３２】 オキシインドール（１３３．１５ｍｇ，１ｍｍｏｌ），４−メチル−５−ホル
ミル−２−ピロールカルボン酸（１５３．１４ｍｇ，１ｍｍｏｌ），ピペリジン
（２滴）のエタノール（２ｍＬ）中の混合物を３時間還流した。沈殿物を真空濾
過により回収し，エタノールで洗浄し，２Ｎ塩酸で中和し，水で洗浄し，乾燥し
て，２６８．５ｍｇ（１００％）の４−メチル−５−（２−オキソ−１，２−ジ
ヒドロインドール−３−イリデンメチル）−１Ｈ−ピロール−２−カルボン酸を
橙色／赤色固体として得た。
【化７】
【０２３３】 ３． ３−（５−ヒドロキシメチル−３−メチル−１Ｈ−ピロール−２−イルメ
チレン）−１，３−ジヒドロインドール−２−オンおよび ４．４−メチル−５−（２−オキソ−１，２−ジヒドロ−インドール−３−イリ
デンメチル）−１Ｈ−ピロール−２−カルボキシアルデヒド ４−メチル−５−（２−オキソ−１，２−ジヒドロインドール−３−イリデン
メチル）−１Ｈ−ピロール−２−カルボン酸（４．０２ｇ，１５ｍｍｏｌ）のテ
トラヒドロフラン（５０ｍＬ）中の懸濁液に，塩化オキサリル（３．８０ｇ，３
０ｍｍｏｌ）を０℃でゆっくり加えた。添加が完了した後，得られた懸濁液を室
温で２時間撹拌した。次にホウ水素化ナトリウム（１．１４ｇ，３０ｍｍｏｌ）
を混合物に少しずつ加え，懸濁液を室温でさらに１日間撹拌した。この時点で，
１．１４ｇのホウ水素化ナトリウムをさらに加え，次に１０ｍＬのジメチルホル
ムアミドを加えて固体を溶解し，反応混合物を室温でさらに１日間撹拌した。氷
冷した反応混合物に，ガスが発生しなくなるまで氷水を加えた。水性層を酢酸エ
チルで抽出した。有機層と水性層との間に形成された沈殿物を濾過し，水および
酢酸エチルで洗浄し，乾燥して，２．５ｇ（６０％）の赤色固体を得た。有機層
をブラインで洗浄し，無水硫酸ナトリウムで乾燥し，濃縮し，シリカゲルカラム
で酢酸エチル−ヘキサンで溶出して精製して，３４０ｍｇ（９％）の３−（５−
ヒドロキシメチル−３−メチル−１Ｈ−ピロール−２−イルメチレン）−１，３
−ジヒドロインドール−２−オンを黄色固体として，および５４０ｍｇ（１４％
）の４−メチル−５−（２−オキソ−１，２−ジヒドロインドール−３−イリデ
ンメチル）−１Ｈ−ピロール−２−カルボアルデヒドを橙色固体として得た。
【０２３４】 ３−（５−ヒドロキシメチル−３−メチル−１Ｈ−ピロール−２−イルメチレン
）−１，３−ジヒドロインドール−２−オン：
【化８】 ４−メチル−５−（２−オキソ−１，２−ジヒドロインドール−３−イリデンメ
チル）−１Ｈ−ピロール−２−カルボアルデヒド：
【化９】
【０２３５】 ５．生物学的評価 任意の与えられた一群の化合物において，生物学的活性のスペクトルが得られ
るであろうことが理解されるであろう。好ましい態様においては，本発明は，Ｒ
ＴＫ，ＣＴＫ，およびＳＴＫ活性を調節する能力を示す，新規な３−ヘテロアリ
ーリデニル−２−インドリノンに関する。以下のアッセイを用いて，最適な程度
の所望の活性を示す化合物が選択される。
【０２３６】アッセイ方法 以下のインビトロアッセイを用いて，本発明の種々の化合物の１つまたはそれ
以上のＰＫに対する活性および効果のレベルを決定することができる。同様にし
て，当該技術分野においてよく知られる技術を用いて，任意のＰＫについて類似
のアッセイを設計することができる。
【０２３７】 本明細書に記載される細胞／触媒アッセイは，ＥＬＩＳＡフォーマットで実施
する。一般的方法は以下のとおりである：天然にまたは組換え的に試験キナーゼ
を発現する細胞に化合物を導入する。選択された時間が経過した後，試験キナー
ゼがレセプターである場合には，レセプターを活性化することが知られているリ
ガンドを加える。細胞を溶解し，あらかじめ酵素的リン酸化反応の基質を認識す
る特異的抗体でコーティングしたＥＬＩＳＡプレートのウエルに溶解物を移す。
細胞溶解物の非基質成分を洗い流し，ホスホチロシンを特異的に認識する抗体で
基質のリン酸化の量を検出し，試験化合物と接触させていない対照細胞と比較す
る。
【０２３８】 本明細書に記載される細胞／生物学的アッセイは，試験キナーゼの活性化に応
答して生成したＤＮＡの量を測定し，これは一般的な増殖性応答の尺度である。
このアッセイの一般的方法は次のとおりである：天然にまたは組換え的に試験キ
ナーゼを発現する細胞に化合物を導入し，選択された時間が経過した後，試験キ
ナーゼがレセプターである場合にはレセプターを活性化することが知られている
リガンドを加える。少なくとも一夜インキュベーションした後，ＤＮＡ標識試薬
，例えばブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）または３Ｈ−チミジンを加える。
抗ＢｒｄＵ抗体でまたは放射活性を測定することにより標識されたＤＮＡの量を
検出し，試験化合物と接触させていない対照細胞と比較する。
【０２３９】細胞／触媒アッセイ 酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）を用いて，ＰＫ活性の存在
を検出し測定することができる。ＥＬＩＳＡは，例えば，Ｖｏｌｌｅｒ，ｅｔ
ａｌ．，１９８０（"Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎ
ｔ Ａｓｓａｙ，" Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ
ｏｇｙ，２ｄ．ｅｄ，Ｒｏｓｅ ａｎｄ Ｆｒｉｅｄｍａｎ，ｐｐ３５９−３７
１ Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，
Ｄ．Ｃ．）に記載の既知のプロトコルに従って実施することができる。
【０２４０】 開示されるプロトコルを，特定のＰＫに関する活性を検出するように適合させ
ることができる。例えば，特定のＰＫに関するＥＬＩＳＡ実験を実施するための
好ましいプロトコルは以下に記載される。しかし，ＲＴＫファミリーの他のメン
バー，ならびにＣＴＫおよびＳＴＫに対する化合物の活性を検出するためにこれ
らのプロトコルを適合させることは，当業者の知識の範囲内である。
【０２４１】ＦＬＫ−１アッセイ ＥＬＩＳＡアッセイを実施して，ＦＬＫ−１レセプターのキナーゼ活性，より
詳細にはＦＬＫ−１レセプター上のＴＫ活性の阻害または活性化を測定する。詳
細には，以下のアッセイを実施して，Ｆｌｋ−１を発現するように遺伝子工学処
理された細胞において，ＦＬＫ−１レセプターのキナーゼ活性を測定することが
できる。
【０２４２】材料および方法 ａ． Ｃｏｒｎｉｎｇ９６ウエルＥＬＩＳＡプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇカタログ
Ｎｏ．２５８０５−９６）； ｂ． Ｃａｐｐｅｌヤギ抗ウサギＩｇＧ（カタログＮｏ．５５６４１）； ｃ． ＰＢＳ（ＧｉｂｃｏカタログＮｏ．４５０−１３００ＥＢ）； ｄ． ＴＢＳＷ緩衝液（５０ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ７．２），１５０ｍＭＮａＣｌ
および０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０）； ｅ． エタノールアミン保存液（１０％エタノールアミン（ｐＨ７．０），４℃
で保存）； ｆ． ＨＮＴＧ緩衝液（２０ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５），１５０ｍＭ
ＮａＣｌ，０．２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００，および１０％グリセロール）； ｇ． ＥＤＴＡ（０．５Ｍ（ｐＨ７．０）１００Ｘ保存液として）； ｈ． オルトバナジウム酸ナトリウム（０．５Ｍ，１００Ｘ保存液として）； ｉ． ピロリン酸ナトリウム（０．２Ｍ，１００Ｘ保存液として）； ｊ． ＮＵＮＣ９６ウエルＶ底ポリプロピレンプレート（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃ
ｉｅｎｔｉｆｉｃカタログＮｏ．ＡＳ−７２０９２）； ｋ． ＮＩＨ３Ｔ３ Ｃ７＃３細胞（ＦＬＫ−１発現細胞）； ｌ． ＤＭＥＭ，１Ｘ高グルコースＬ−グルタミン含有（カタログＮｏ．１１９
６５−０５０）； ｍ． ＦＢＳ，Ｇｉｂｃｏ（カタログＮｏ．１６０００−０２８）； ｎ． Ｌ−グルタミン，Ｇｉｂｃｏ（カタログＮｏ．２５０３０−０１６）； ｏ． ＶＥＧＦ，ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ，Ｉｎｃ．（カタログＮｏ．１００−２０
）Ｍｉｌｌｉ−ＱｄＨ2Ｏ中１μｇ／１００μｌ保存液として保持し，−２０℃
で保存； ｐ． アフィニティー精製抗ＦＬＫ−１抗血清； ｑ． ホスホチロシン特異的ＵＢ４０モノクローナル抗体（Ｆｅｎｄｌｅｙ，ｅ
ｔ ａｌ．，１９９０，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５０：１５５０−１
５５８を参照）； ｒ． ＥＩＡ等級ヤギ抗マウスＩｇＧ−ＰＯＤ（ＢｉｏＲａｄカタログＮｏ．１
７２−１０１１）； ｓ． ２，２−アジノ−ビス（３−エチルベンズチアゾリン−６−硫酸（ＡＢＴ
Ｓ）溶液（１００ｍＭクエン酸（無水），２５０ｍＭＮａ2ＨＰＯ4（ｐＨ４．０
），０．５ｍｇ／ｍｌＡＢＴＳ（ＳｉｇｍａカタログＮｏ．Ａ−１８８８）），
溶液は，使用まで暗所で４℃で保存しなければならない； ｔ． Ｈ2Ｏ2（３０％溶液）（ＦｉｓｈｅｒカタログＮｏ．Ｈ３２５）； ｕ． ＡＢＴＳ／Ｈ2Ｏ2（１５ｍｌＡＢＴＳ溶液，２μｌＨ2Ｏ2）使用の５分間
に調製，室温に保持； ｖ． ０．２ＭＨＣｌ保存液，Ｈ2Ｏ中； ｗ． ジメチルスルホキシド（１００％）（ＳｉｇｍａカタログＮｏ．Ｄ−８４
１８）；および ｙ． トリプシン−ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬカタログＮｏ．２５２００−
０４９）
【０２４３】プロトコル １． Ｃｏｒｎｉｎｇ９６ウエルＥＬＩＳＡプレートを，ウエルあたり１．０μ
ｇの，０．１ＭＮａ2ＣＯ3（ｐＨ９．６）中Ｃａｐｐｅｌ抗ウサギＩｇＧ抗体，
でコーティングする。最終容量をウエルあたり１５０μｌとする。プレートを４
℃で一夜コーティングする。プレートは，４℃で保存したとき，２週間まで保存
することができる。 ２． 細胞を適当な培養皿中で成長培地（ＤＭＥＭ，２．０ｍＭＬ−グルタミン
，１０％ＦＢＳを補充）中で，コンフルエントとなるまで３７℃，５％ＣＯ2で
成長させる。 ３． トリプシン処理により細胞を回収し，Ｃｏｒｎｉｎｇ２５８５０ポリスチ
レン９６ウエル丸底細胞プレートに，２００μｌの成長培地中２５，０００細胞
／ウエルで播種する。 ４． 細胞を３７℃，５％ＣＯ2で少なくとも１日成長させる。 ５． 細胞をＤ−ＰＢＳ １Ｘで洗浄する。 ６． ２００μｌ／ウエルの飢餓培地（ＤＭＥＭ，２．０ｍＭ ｌ−グルタミン
，０．１％ＦＢＳ）を加える。３７℃，５％ＣＯ2で一夜インキュベートする。 ７． 化合物をポリプロピレン９６ウエルプレート中で飢餓培地を用いて１：２
０に希釈する。対照ウエルで使用するために，ジメチルスルホキシドを１：２０
に希釈する。 ８． ９６ウエル細胞培養プレートから飢餓培地を除去し，１６２μｌの新たに
調製した飢餓培地を各ウエルに加える。 ９． １：２０に希釈された化合物希釈物１８μｌ（工程７より）を各ウエルに
加え，１：２０ジメチルスルホキシド希釈物を対照ウエルに加え（＋／−ＶＥＧ
Ｆ），細胞刺激の後，１：２００の最終希釈とする。最終ジメチルスルホキシド
は０．５％である。プレートを３７℃，５％ＣＯ2で２時間インキュベートする
。 １０． プレートを逆さにして液体を除去することにより，未結合抗体をＥＬＩ
ＳＡプレートから除去する。ＴＢＳＷ＋０．５％エタノールアミン，ｐＨ７．０
で３回洗浄する。プレートをペーパータオル上で軽くたたいて，過剰の液体およ
び気泡を除去する。 １１． ウエルあたり１５０μｌのＴＢＳＷ＋０．５％エタノールアミン，ｐＨ
７．０でプレートをブロッキングする。プレートをマイクロタイタープレート振
盪器で振盪しながら，３０分間インキュベートする。 １２． プレートを工程１０で記載したように３回洗浄する。 １３． ０．５μｇ／ウエルのアフィニティー精製抗ＦＬＵ−１ポリクローナル
ウサギ抗血清を加える。ＴＢＳＷ＋０．５％エタノールアミンｐＨ７．０で最終
容量を１５０μｌ／ウエルとする。プレートを振盪しながら３０分間インキュベ
ートする。 １４． 細胞に１８０μｌの飢餓培地を加え，２０μｌ／ウエルの１０．０ｍＭ
オルトバナジウム酸ナトリウムおよび５００ｎｇ／ｍｌＶＥＧＦ（最終濃度；ウ
エルあたり１．０ｍＭオルトバナジウム酸ナトリウムおよび５０ｎｇ／ｍｌＶＥ
ＧＦ）で３７℃，５％ＣＯ2で８分間細胞を刺激する。陰性対照ウエルには飢餓
培地のみを加える。 １５． ８分後，培地を細胞から除去し，２００μｌ／ウエルのＰＢＳで１回洗
浄しなければならない。 １６． １５０μｌ／ウエルのＨＮＴＧ中で室温で５分間振盪しながら細胞を溶
解させる。ＨＮＴＧ配合物はオルトバナジウム酸ナトリウム，ピロリン酸ナトリ
ウムおよびＥＤＴＡを含む。 １７． ＥＬＩＳＡプレートを工程１０に記載したように３回洗浄する。 １８． 細胞溶解物を細胞プレートからＥＬＩＳＡプレートに移し，振盪しなが
ら２時間インキュベートする。細胞溶解物を移すには，ウエルを掻きながらピペ
ットアップおよびダウンを行う。 １９． プレートを工程１０に記載したように３回洗浄する。 ２０． ＥＬＩＳＡプレートを０．０２μｇ／ウエルのＴＢＳＷ＋０５％エタノ
ールアミン中のＵＢ４０とともにインキュベートする。最終容量を１５０μｌ／
ウエルとする。振盪しながら３０分間インキュベートする。 ２１． プレートを工程１０に記載したように３回洗浄する。 ２２． ＥＬＩＳＡプレートを，ＴＢＳＷ＋０．５％エタノールアミン，ｐＨ７
．０中で１：１０，０００に希釈したＥＩＡ等級ヤギ抗マウスＩｇＧコンジュゲ
ート西洋ワサビペルオキシダーゼとともにインキュベートする。最終容量を１５
０μｌ／ウエルとする。振盪しながら３０分間インキュベートする。 ２３． 工程１０で記載したようにプレートを洗浄する。 ２４． １００μｌのＡＢＴＳ／Ｈ2Ｏ2溶液をウエルに加える。振盪しながら１
０分間インキュベートする。 ２５． １００μｌの０．２ＭＨＣｌを０．１ＭＨＣｌ最終濃度となるように加
えて，発色反応を停止する。室温で１分間振盪する。ゆっくりした空気の流れで
気泡を除去し，ＥＬＩＳＡプレートをＥＬＩＳＡプレートリーダーで４１０ｎｍ
で読む。
【０２４４】全細胞におけるＥＧＦレセプター−ＨＥＲ２キメラレセプターアッセイ ＥＧＦＲ−ＮＩＨ３Ｔ３全細胞中のＨＥＲ２キナーゼ活性を以下に記載するよ
うにして測定した。
【０２４５】材料および試薬 ａ． ＥＧＦ：保存液濃度：１６．５ＩＬＭ；ＥＧＦ２０１，ＴＯＹＯＢＯ，Ｃ
ｏ．，Ｌｔｄ．Ｊａｐａｎ ｂ． ０５−１０１（ＵＢＩ）（ＥＧＦＲ細胞外ドメインを認識するモノクロー
ナル抗体） ｃ． 抗ホスホチロシン抗体（抗Ｐｔｙｒ）（ポリクローナル）（Ｆｅｎｄｌｅ
ｙ，ｅｔ ａｌ．，（上掲）を参照） ｄ． 検出抗体：ヤギ抗ウサギｌｇＧ西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲー
ト，ＴＡＧＯ，Ｉｎｃ．，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ ｅ． ＴＢＳＴ緩衝液： Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．２ ５０ｍＭ ＮａＣｌ １５０ｍＭ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００ ０．１ ｆ． ＨＮＴＧ ５Ｘ保存液： ＨＥＰＥＳ ０．１Ｍ ＮａＣｌ ０．７５Ｍ グリセロール ５０％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００ １．０％ ｇ． ＡＢＴＳ保存液： クエン酸 １００ｍＭ Ｎａ2ＨＰＯ4 ２５０ｍＭ ＨＣｌ（濃） ０．５ｍＭ ＡＢＴＳ* ０．５ｍｇ／ｍｌ ＊（２，２'−アジノビス（３−エチルベンズチアゾリンスルホン酸）） 溶液は使用するまで暗所で４℃で保存する。 ｈ． 試薬保存液： ＥＤＴＡ １００ｍＭ ｐＨ７．０ Ｎａ3ＶＯ4 ０．５Ｍ Ｎａ4（Ｐ2Ｏ7） ０．２Ｍ
【０２４６】方法 ＥＬＩＳＡプレートのプレコート １． ＥＬＩＳＡプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，９６ウエル，Ｃａｔ．＃２５８０
５−９６）をウエルあたりＰＢＳ中０．５μｇの０５−１０１抗体で１００μｌ
の最終容量／ウエルでコーティングし，４℃で一夜保存する。コーティングした
プレートは４℃で保存した場合，１０日間まで良好である。 ２． 使用の日，コーティング緩衝液を除去し，１００μｌのブロッキング緩衝
液（ＰＢＳ中５％Ｃａｒｎａｔｉｏｎインスタント脱脂乾燥ミルク）で置き換え
る。プレートを室温で（約２３℃から２５℃）振盪しながら３０分間インキュベ
ートする。使用の直前に，ブロッキング緩衝液を除去し，プレートをＴＢＳＴ緩
衝液で４回洗浄する。
【０２４７】細胞播種 １． このアッセイには，ＥＧＦＲ細胞外ドメインおよび細胞内ＨＥＲ２キナー
ゼドメインを含有するキメラレセプターを過剰発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞株を用
いることができる。 ２． ８０−９０％コンフルエントの培養皿を実験用に選択する。細胞をトリプ
シン処理し，１０％ウシ胎児血清を加えることにより反応を停止させる。細胞を
ＤＭＥＭ培地（１０％ＣＳ ＤＭＥＭ培地）中に懸濁し，１５００ｒｐｍで室温
で５分間１回遠心分離する。 ３． 細胞を播種培地（ＤＭＥＭ，０．５％ウシ血清）に再懸濁し，トリパンブ
ルーを用いて細胞を計数する。９０％より高い生存性が許容される。細胞をＤＭ
ＥＭ培地（０．５％ウシ血清）中で，ウエルあたり１０，０００細胞の密度で，
ウエルあたり１００μｌで，９６ウエルマイクロタイタープレートに播種する。
播種した細胞を５％ＣＯ2中で３７℃で約４０時間インキュベートする。
【０２４８】アッセイ方法 １． 播種した細胞を，倒立顕微鏡を用いてコンタミネーションについて検査す
る。薬剤保存液（ＤＭＳＯ中１０ｍｇ／ｍｌ）をＤＭＥＭ培地で１：１０に希釈
し，次に５μｌを，最終薬剤希釈１：２００および最終ＤＭＳＯ濃度１％となる
ように，ＴＢＳＴウエルに移す。対照ウエルにはＤＭＳＯのみを加える。５％Ｃ
Ｏ2中で３７℃で２時間インキュベートする。 ２． ＥＧＦリガンドの調製：保存液ＥＧＦを，１０μｌ希釈ＥＧＦ（１：１２
希釈）を移したときに１００ｎＭの最終濃度が得られるように，ＤＭＥＭ中で希
釈する。 ３． ウエルあたり１００μｌに十分なように新たにＨＮＴＧ*を調製し，氷上
に置く。 ＨＮＴＧ*（１０ｍｌ）： ＨＮＴＧ保存液 ２．０ｍｌ ｍｉｌｌｉ−ＱＨ2Ｏ ７．３ｍｌ ＥＤＴＡ，１００ｍＭ，ｐＨ７．０ ０．５ｍｌ Ｎａ3ＶＯ4，０．５Ｍ ０．１ｍｌ Ｎａ4（Ｐ2Ｏ7），０．２Ｍ ０．１ｍｌ ４． 薬剤とともに１２０分間インキュベーションした後，調製したＳＧＦリガ
ンドを，ウエルあたり１０μｌ，最終濃度１００ｎＭとなるように細胞に加える
。対照ウエルにはＤＭＥＭのみを加える。室温で５分間振盪しながらインキュベ
ートする。 ５． 薬剤，ＥＧＦ，およびＤＭＥＭを除去する。細胞をＰＢＳで２回洗浄する
。ウエルあたり１００μｌのＨＮＴＧ*を細胞に移す。氷上に５分間放置する。
この間に，ブロッキング緩衝液を他のＥＬＩＳＡプレートから除去し，上述した
ようにＴＢＳＴで洗浄する。 ６． マイクロピペッターにぴったりと固定したピペットチップを用いて，細胞
をプレートからはがし，ＨＮＴＧ*溶解緩衝液を繰り返し吸引および分配するこ
とにより，細胞物質をホモジナイズする。コーティングし，ブロッキングし，洗
浄したＥＬＩＳＡプレートに溶解物を移す。振盪しながら室温で１時間インキュ
ベートする。 ７． 溶解物を除去し，ＴＢＳＴで４回洗浄する。新たに希釈した抗Ｐｔｙｒ抗
体をウエルあたり１００μｌでＥＬＩＳＡプレートに移す。抗Ｐｔｙｒ抗血清（
ＴＢＳＴ中１：３０００希釈）の存在下で，振盪しながら室温で３０分間インキ
ュベートする。 ８． 抗Ｐｔｙｒ抗体を除去し，ＴＢＳＴで４回洗浄する。新たに希釈したＴＡ
ＧＯ抗ウサギＩｇＧ抗体をＥＬＩＳＡプレートにウエルあたり１００μｌで移す
。振盪しながら室温で３０分間インキュベートする（抗ウサギＩｇＧ抗体：ＴＢ
ＳＴ中１：３０００希釈）。 ９． ＴＡＧＯ検出抗体を除去し，ＴＢＳＴで４回洗浄する。新たに調製したＡ
ＢＴＳ／Ｈ2Ｏ2溶液をウエルあたり１００μｌでＥＬＩＳＡプレートに移す。振
盪しながら室温で２０分間インキュベートする（ＡＢＴＳ／Ｈ2Ｏ2溶液：１０ｍ
ｌＡＢＴＳ保存液中１．０μｌの３０％Ｈ2Ｏ2）。 １０． ５０μｌの５Ｎ Ｈ2ＳＯ4を加えることにより反応を停止し（任意），
４１０ｎｍでＯ．Ｄ．を測定する。 １１． 最大ホスホチロシンシグナルは，陰性対照の値を陽性対照の値から差し
引くことにより決定する。次に，抽出物含有ウエルについて，陰性対照を差し引
いた後にホスホチロシン含有量のパーセント阻害を計算する。
【０２４９】ＰＤＧＦ−Ｒアッセイ すべての細胞培養培地，グルタミンおよびウシ胎児血清は，特に記載しないか
ぎり，Ｇｉｂｃｏ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌ
ａｎｄ，ＮＹ）から購入した。すべての細胞は，９０−９５％空気および５−１
０％ＣＯ2の湿潤雰囲気下で３７℃で成長させた。すべての細胞株は，日常的に
１週間に２回サブカルチャーし，Ｍｙｃｏｔｅｃｔ法（Ｇｉｂｃｏ）によりマイ
コプラズマがないことを確認した。
【０２５０】 ＥＬＩＳＡアッセイについては，細胞（Ｕ１２４２，Ｊｏｓｅｐｈ Ｓｃｈｌ
ｅｓｓｉｎｇｅｒ，ＮＹＵから入手）を成長培地（ＭＥＭ，１０％ＦＢＳ，ＮＥ
ＡＡ，１ｍＭ ＮａＰｙｒおよび２ｍＭＧＬＮ含有）で８０−９０％コンフルエ
ントまで成長させ，９６ウエル組織培養プレートに０．５％血清中で，ウエルあ
たり２５，０００−３０，０００細胞を播種する。０．５％血清含有培地で一夜
インキュベーションした後，細胞を無血清培地に移し，５％ＣＯ2，３７℃イン
キュベーター中で試験化合物で２時間処理する。次に細胞をリガンドで５−１０
分間刺激し，ＨＮＴＧ（２０ｍＭＨｅｐｅｓ，１５０ｍＭＮａＣｌ，１０％グリ
セロール，５ｍＭＥＤＴＡ，５ｍＭＮａ3ＶＯ4，０．２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１０
０，および２ｍＭＮａＰｙｒ）で溶解する。細胞溶解物（ＰＢＳ中０．５ｍｇ／
ウエル）をレセプター特異的抗体であらかじめ被覆し，ＴＢＳＴ（５０ｍＭＴｒ
ｉｓ−ＨＣｌｐＨ７．２，１５０ｍＭＮａＣｌおよび０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−
１００）中５％ミルクで室温で３０分間ブロッキングしたＥＬＩＳＡプレートに
移す。溶解物を振盪しながら室温で１時間インキュベートする。プレートをＴＢ
ＳＴで４回洗浄し，次にポリクローナル抗ホスホチロシン抗体とともに室温で３
０分間インキュベートする。プレートをＴＢＳＴで４回すすぐことにより過剰の
抗ホスホチロシン抗体を除去する。ＥＬＩＳＡプレートにヤギ抗ウサギＩｇＧ抗
体を室温で３０分間加え，次にＴＢＳＴでさらに４回すすぐ。ＡＢＴＳ（１００
ｍＭクエン酸，２５０ｍＭＮａ2ＨＰＯ4および０．５ｍｇ／ｍＬ２，２'−アジ
ノ−ビス（３−エチルベンズチアゾリン−６−硫酸）），およびＨ2Ｏ2（１．２
ｍＬ３０％Ｈ2Ｏ2を１０ｍｌＡＢＴＳに加える）をＥＬＩＳＡプレートに加えて
発色を開始させる。ＡＢＴＳ添加の約１５から３０分後，４１０ｎｍおよび６３
０ｎｍの参照波長における吸光度を記録する。
【０２５１】ＩＧＦ−Ｉレセプターアッセイ 以下のプロトコルを用いて，ＩＧＦ−Ｉレセプター上のホスホチロシンレベル
を測定することができ，これはＩＧＦ−Ｉレセプターチロシンキナーゼ活性を示
す。
【０２５２】材料および試薬 ａ． このアッセイにおいて用いる細胞株は，ＩＧＦ−１レセプターを過剰発現
するように遺伝子工学処理された細胞株３Ｔ３／ＩＧＦ−１Ｒである。 ｂ． ＮＩＨ３Ｔ３／ＩＧＦ−１Ｒを，５％ＣＯ2，３７℃のインキュベーター
で成長させる。成長培地はＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ（熱不活性化）＋２ｍＭＬ−
グルタミンである。 ｃ． アフィニティー精製抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体１７−６９ ｄ． Ｄ−ＰＢＳ： ＫＨ2ＰＯ4 ０．２０ｇ／ｌ Ｋ2ＨＰＯ4 ２．１６ｇ／ｌ ＫＣｌ ０．２０ｇ／ｌ ＮａＣｌ ８．００ｇ／ｌ（ｐＨ７．２） ｅ． ブロッキング緩衝液：ＴＢＳＴプラス５％ミルク（Ｃａｒｎａｔｉｏｎイ
ンスタント脱脂乾燥ミルク） ｆ． ＴＢＳＴ緩衝液： Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ５０ｍＭ ＮａＣｌ １５０ｍＭ（ｐＨ７．２／ＨＣｌ １０Ｎ） ＴｒｉｔｏｎＸ−１００ ０．１％ ＴＢＳ（１０Ｘ）の保存溶液を調製し，希釈の間に緩衝液にＴｒｉｔｏｎＸ−１
００を加える。 ｇ． ＨＮＴＧ緩衝液： ＨＥＰＥＳ ２０ｍＭ ＮａＣｌ １５０ｍＭ（ｐＨ７．２／ＨＣｌ １Ｎ） グリセロール １０％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００ ０．２％ 保存溶液（５Ｘ）を調製し，４℃で保存する。 ｈ． ＥＤＴＡ／ＨＣｌ：０．５ＭｐＨ７．０（ＮａＯＨ），１００Ｘ保存液と
して ｉ． Ｎａ3ＶＯ4：１００Ｘ保存液として０．５Ｍ，アリコートは−８０℃で保
存する。 ｊ． Ｎａ4Ｐ2Ｏ7：１００Ｘ保存液として０．２Ｍ ｋ． インスリン様成長因子−１，Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｃａｔ＃Ｇ５１１１） ウサギポリクローナル抗ホスホチロシン抗血清 ｍ． ヤギ抗ウサギＩｇＧ，ＰＯＤコンジュゲート（検出抗体），Ｔａｇｏ（Ｃ
ａｔ．Ｎｏ．４５２０，ＬｏｔＮｏ．１８０２）：Ｔａｇｏ，Ｉｎｃ．，Ｂｕｒ
ｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ ｎ． ＡＢＴＳ（２，２'−アジノビス（３−エチルベンズチアゾリン硫酸）） 溶液： クエン酸 １００ｍＭ Ｎａ2ＨＰＯ4 ２５０ｍＭ（ｐＨ４．０／１ＮＨＣｌ） ＡＢＴＳ ０．５ｍｇ／ｍｌ ＡＢＴＳ溶液は暗所で４℃で保存しなければならない。溶液は緑色に変色したと
きは廃棄しなければならない。 ｏ． 過酸化水素：３０％溶液を暗所で４℃で保存する。
【０２５３】方法 以下のすべての工程は，特に記載しないかぎり，室温で実施する。すべてのＥ
ＬＩＳＡプレート洗浄は，プレートを水道水で３回すすぎ，ＴＢＳＴで１回すす
ぐことにより実施する。プレートを軽くたたいてペーパータオルで乾燥させる。
【０２５４】細胞播種 ： １． 組織培養皿（Ｃｏｒｎｉｎｇ２５０２０−１００）で８０−９０％コンフ
ルエントまで成長させた細胞を，トリプシン−ＥＤＴＡ（０．２５％，０．５ｍ
ｌ／Ｄ−１００，ＧＩＢＣＯ）で回収する。 ２． 細胞を新鮮なＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋２ｍＭＬ−グルタミン中に再懸濁
し，９６ウエル組織培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，２５８０６−９６）に２０
，０００細胞／ウエル（１００μｌ／ウエル）で移す。１日インキュベートし，
次に培地を無血清培地（９０／μｌ）で置き換え，５％ＣＯ2，３７℃で一夜イ
ンキュベートする。
【０２５５】ＥＬＩＳＡプレートコーティングおよびブロッキング ： １． ＥＬＩＳＡプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ２５８０５−９６）を，１００μｌ
ＰＢＳ中の抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体で０．５μｇ／ウエルで少なくとも２時間コーテ
ィングする。 ２． コーティング溶液を除去し，１００μｌのブロッキング緩衝液で置き換え
，３０分間振盪する。ブロッキング緩衝液を除去し，溶解物を加える直前にプレ
ートを洗浄する。
【０２５６】アッセイ方法 ： １． 薬剤は，無血清条件で試験する。 ２． 薬剤保存液（１００％ＤＭＳＯ中）を９６ウエルポリプロピレンプレート
中でＤＭＥＭで１：１０に希釈し，１０μｌ／ウエルのこの溶液を細胞に移して
，最終薬剤希釈１：１００，最終ＤＭＳＯ濃度１．０％とする。細胞を５％ＣＯ 2 中で３７℃で２時間インキュベートする。 ３． 新鮮な細胞溶解緩衝液（ＨＮＴＧ＊）を調製する。 ＨＮＴＧ ２ｍｌ ＥＤＴＡ ０．１ｍｌ Ｎａ3ＶＯ4 ０．１ｍｌ Ｎａ4（Ｐ2Ｏ7） ０．１ｍｌ Ｈ2Ｏ ７．３ｍｌ ４． 薬剤を２時間インキュベートした後，１０μｌ／ウエルのＰＢＳ中２００
ｎＭＩＧＦ−１リガンドを細胞に移し（最終濃度２０ｎＭ），５％ＣＯ2で３７
℃で１０分間インキュベートする。 ５． 培地を除去し，１００μｌ／ウエルのＨＮＴＧ＊を加え，１０分間振盪す
る。細胞を顕微鏡下で観察して，これらが適切に溶解したか否かを見る。 ６． １２チャネルピペットを用いて細胞をプレートから掻き取り，吸引と分配
を繰り返すことにより溶解物をホモジナイズする。すべての溶解物を抗体コーテ
ィングＥＬＩＳＡプレートに移し，１時間振盪する。 ７． 溶解物を除去し，プレートを洗浄し，抗ｐＴｙｒ（ＴＢＳＴ中１：３，０
００）を１００μｌ／ウエルで移し，３０分間振盪する。 ８． 抗ｐＴｙｒを除去し，プレートを洗浄し，ＴＡＧＯ（ＴＢＳＴ中１：３，
０００）を１００μｌ／ウエルで移し，３０分間振盪する。 ９． 検出抗体を除去し，プレートを洗浄し，新鮮なＡＢＴＳ／Ｈ2Ｏ2（１．２
μｌＨ2Ｏ2を１０ｍｌＡＢＴＳに加える）を１００μｌ／ウエルでプレートに移
して，発色を開始させる。 １０． ＤｙｎａｔｅｃＭＲ５０００で参照波長６３０ｎｍで４１０ｎｍのＯＤ
を測定する。
【０２５７】ＥＧＦＲアッセイ ヒトＥＧＦ−Ｒを発現するよう遺伝子工学処理された細胞中のＥＧＦレセプタ
ーキナーゼ活性を以下に記載するように測定することができる。
【０２５８】材料および試薬 ａ． ＥＧＦリガンド：保存液濃度＝１６．５μＭ；ＥＧＦ２０１，ＴＯＹＯＢ
Ｏ，Ｃｏ．，Ｌｔｄ．Ｊａｐａｎ ｂ． ０５−１０１（ＵＢＩ）（ＥＧＦＲ細胞外ドメインを認識するモノクロー
ナル抗体） ｃ． 抗ホスホチロシン抗体（抗Ｐｔｙｒ）（ポリクローナル） ｄ． 検出抗体：ヤギ抗ウサギｌｇＧ西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲー
ト，ＴＡＧＯ，Ｉｎｃ．，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ ｅ． ＴＢＳＴ緩衝液： Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７ ５０ｍＭ ＮａＣｌ １５０ｍＭ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００ ０．１ ｆ． ＨＮＴＧ ５Ｘ保存液： ＨＥＰＥＳ ０．１Ｍ ＮａＣｌ ０．７５Ｍ グリセロール ５０ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００ １．０％ ｇ． ＡＢＴＳ保存液： クエン酸 １００ｍＭ ＮａＶＯ4 ２５０ｍＭ ＨＣｌ（濃） ４．０ｐＨ ＡＢＴＳ* ０．５ｍｇ／ｍｌ 溶液は使用するまで暗所で４℃で保存する。 ｈ． 試薬保存液： ＥＤＴＡ １００ｍＭ ｐＨ７．０ Ｎａ3ＶＯ4 ０．５Ｍ Ｎａ4（Ｐ2０7） ０．２Ｍ
【０２５９】方法 ＥＬＩＳＡプレートのプレコート １． ＥＬＩＳＡプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，９６ウエル，Ｃａｔ．＃２５８０
５−９６）をウエルあたりＰＢＳ中０．５μｇ，１５０μｌ最終容量／ウエルの
０５−１０１抗体でコーティングし，４℃で一夜保存する。コーティングしたプ
レートは４℃で保存した場合１０日間まで良好に使用しうる。 ２． 使用の日，コーティング緩衝液を除去し，ブロッキング緩衝液（ＰＢＳ中
５％Ｃａｒｎａｔｉｏｎインスタント脱脂乾燥ミルク）で置き換える。プレート
を振盪しながら室温（約２３℃−２５℃）で３０分間インキュベートする。使用
の直前に，ブロッキング緩衝液を除去し，プレートをＴＢＳＴ緩衝液で４回洗浄
する。
【０２６０】細胞播種 １． このアッセイにはＮＩＨ３Ｔ３／Ｃ７細胞株（Ｈｏｎｅｇｇｅｒ，ｅｔ
ａｌ．，Ｃｅｌｌ５１：１９９−２０９，１９８７）を用いることができる。 ２． ８０−９０％コンフルエントの皿を実験用に選択する。細胞をトリプシン
処理し，１０％ＣＳ ＤＭＥＭ培地を加えることにより反応を停止させる。細胞
をＤＭＥＭ培地（１０％ＣＳ ＤＭＥＭ培地）中に懸濁し，１０００ｒｐｍで室
温で５分間，１回遠心分離する。 ３． 細胞を播種培地（ＤＭＥＭ，０．５％ウシ血清）に再懸濁し，トリパンブ
ルーを用いて細胞を計数する。９０％を越える生存率が許容範囲である。細胞を
９６ウエルマイクロタイタープレート上で，ＤＭＥＭ培地（０．５％ウシ血清）
中に，ウエルあたり１０，０００細胞の密度でウエルあたり１００μｌで播種す
る。播種した細胞を５％ＣＯ2，３７℃で約４０時間インキュベートする。
【０２６１】アッセイ方法 １． 倒立顕微鏡を用いて，播種した細胞のコンタミネーションを調べる。試験
化合物保存液（ＤＭＳＯ中１０ｍｇ／ｍｌ）をＤＭＥＭ培地中で１：１０に希釈
し，次に５μｌを試験ウエルに移して，１：２００の最終薬剤希釈および１％の
最終ＤＭＳＯ濃度とする。対照ウエルにはＤＭＳＯのみを加える。５％ＣＯ2，
３７℃で１時間インキュベートする。 ２． ＥＧＦリガンドの調製：保存液ＥＧＦを，１０μｌの希釈ＥＧＦ（１：１
２希釈）を移したときに２５ｎＭの最終濃度が得られるように，ＤＭＥＭ中で希
釈する。 ３． ウエルあたり１００μｌに十分なように新鮮なＨＮＴＧ*１０ｍｌを調製
する。ＨＮＴＧ＊は以下のものを含む：ＨＮＴＧ保存液（２．０ｍｌ），ｍｉｌ
ｌｉ−ＱＨ2Ｏ（７．３ｍｌ），ＥＤＴＡ，１００ｍＭ，ｐＨ７．０（０．５ｍ
ｌ），Ｎａ3ＶＯ4０．５Ｍ（０．１ｍｌ）およびＮａ4（Ｐ2Ｏ7），０．２Ｍ（
０．１ｍｌ） ４． 氷上に置く。 ５． 薬剤とともに２時間インキュベーションした後，調製したＥＧＦリガンド
を，ウエルあたり１０μｌで，２５ｎＭの最終濃度となるように細胞に加える。
対照ウエルにはＤＭＥＭのみを加える。振盪しながら室温で５分間インキュベー
トする。 ６． 試験化合物，ＥＧＦおよびＤＭＥＭを除去する。細胞をＰＢＳで２回洗浄
する。ＨＮＴＧ*をウエルあたり１００μｌで細胞に移す。氷上に５分間置く。
その間に，他のＥＬＩＳＡプレートからブロッキング緩衝液を除去し，上述した
ようにＴＢＳＴで洗浄する。 ７. マイクロピペッターにぴったりと固定したピペットチップを用いて，細胞
をプレートからはがし，ＨＮＴＧ*溶解緩衝液を繰り返し吸引および分配するこ
とにより，細胞物質をホモジナイズする。コーティングし，ブロッキングし，洗
浄したＥＬＩＳＡプレートに溶解物を移す。振盪しながら室温で１時間インキュ
ベートする。 ８． 溶解物を除去し，ＴＢＳＴで４回洗浄する。新たに希釈した抗Ｐｔｙｒ抗
体をウエルあたり１００μｌでＥＬＩＳＡプレートに移す。抗Ｐｔｙｒ抗血清（
ＴＢＳＴ中１：３０００希釈）の存在下で，振盪しながら室温で３０分間インキ
ュベートする。 ９． 抗Ｐｔｙｒ抗体を除去し，ＴＢＳＴで４回洗浄する。新たに希釈したＴＡ
ＧＯ３０抗ウサギＩｇＧ抗体をＥＬＩＳＡプレートにウエルあたり１００μｌで
移す。振盪しながら室温で３０分間インキュベートする（抗ウサギＩｇＧ抗体：
ＴＢＳＴ中１：３０００希釈）。 １０． 検出抗体を除去し，ＴＢＳＴで４回洗浄する。新たに調製したＡＢＴＳ
／Ｈ2Ｏ2溶液をウエルあたり１００μｌでＥＬＩＳＡプレートに移す。室温で２
０分間インキュベートする（ＡＢＴＳ／Ｈ2Ｏ2溶液：１０ｍｌＡＢＴＳ保存液中
１．２μｌの３０％Ｈ2Ｏ2）。 １１． ５０μｌの５ＮＨ2ＳＯ4を加えることにより反応を停止し（任意），４
１０ｎｍでＯ．Ｄ．を測定する。 １２． 最大ホスホチロシンシグナルは，陰性対照の値を陽性対照の値から差し
引くことにより決定する。次に，陰性対照を差し引いた後，抽出物含有ウエルに
ついてのホスホチロシン含有量のパーセント阻害を計算する。
【０２６２】Ｍｅｔ自己リン酸化アッセイ このアッセイは，Ｍｅｔレセプター上のＭｅｔ蛋白質チロシンキナーゼレベル
を分析することにより，Ｍｅｔチロシンキナーゼ活性を決定する試薬 ａ． ＨＮＴＧ（５Ｘ保存溶液）：２３．８３ｇＨＥＰＥＳおよび４３．８３ｇ
ＮａＣｌを約３５０ｍｌｄＨ2Ｏに溶解する。ＨＣｌまたはＮａＯＨでｐＨを７
．２に調節し，５００ｍｌグリセロールおよび１０ｍｌＴｒｉｔｏｎＸ−１００
を加え，混合し，ｄＨ2Ｏを加えて総容量を１Ｌとする。１Ｘ作業溶液１Ｌを作
成するためには，２００ｍｌの５Ｘ保存溶液を８００ｍｌｄＨ2Ｏに加え，必要
に応じてｐＨを調べて調節し，４℃で保存する。 ｂ． ＰＢＳ（ダルベッコリン酸緩衝化食塩水），Ｇｉｂｃｏ Ｃａｔ．＃４５
０−１３００ＥＢ（１Ｘ溶液） ｃ． ブロッキング緩衝液：５００ｍｌｄＨ2Ｏ中に，１００ｇＢＳＡ，１２．
１ｇＴｒｉｓ−ｐＨ７．５，５８．４４ｇＮａＣｌおよび１０ｍｌＴｗｅｅｎ−
２０を加え，希釈して総容量１Ｌとする。 ｄ． キナーゼ緩衝液：５００ｍｌｄＨ2Ｏに，１２．１ｇＴＲＩＳ（ｐＨ７．
２），５８．４ｇＮａＣｌ，４０．７ｇＭｇＣｌ2および１．９ｇＥＧＴＡを加
え，ｄＨ2Ｏで総容量１Ｌとする。 ｅ． ＰＭＳＦ（フッ化フェニルメチルスルホニル），Ｓｉｇｍａ Ｃａｔ．＃
Ｐ−７６２６，４３５．５ｍｇに１００％エタノールを総容量２５ｍｌとなるよ
うに加え，ボルテックスする。 ｆ． ＡＴＰ（細菌起源），Ｓｉｇｍａ Ｃａｔ．＃Ａ−７６９９，粉末を−２
０℃で保存する；作業溶液を作成するためには，３．３１ｍｇを１ｍｌｄＨ2Ｏ
中に溶解する。 ｇ． ＲＣ−２０Ｈ ＨＲＰＯコンジュゲート化抗ホスホチロシン，Ｔｒａｎｓ
ｄｕｃｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｃａｔ．＃Ｅ１２０Ｈ ｈ． Ｐｉｅｒｃｅ １−Ｓｔｅｐ（商標）Ｔｕｒｂｏ−ＴＭＢ−ＥＬＩＳＡ（
３，３'，５，５'−テトラメチルベンジジン），Ｐｉｅｒｃｅ Ｃａｔ．＃３４
０２２ ｉ． Ｈ2ＳＯ4，濃硫酸１ｍｌ（１８Ｎ）を３５ｍｌｄＨ2Ｏに加える。 ｊ． ＴＲＩＳ ＨＣＬ，Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｃａｔ．＃ＢＰ１５２−５；材料１
２１．１４ｇに６００ｍｌのＭｉｌｌｉＱ Ｈ2Ｏを加え，ＨＣｌでｐＨを７．
５（または７．２）に調節し，ＭｉｌｌｉＱ Ｈ2Ｏで容量を１Ｌとする。 ｋ． ＮａＣｌ，Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｃａｔ．＃Ｓ２７１−１０，５Ｍ溶液を作成
する。 ｌ． Ｔｗｅｅｎ−２０，Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｃａｔ．＃Ｓ３３７−５００ ｍ． Ｎａ3ＶＯ4，Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｃａｔ．＃Ｓ４５４−５０，材料１．８ｇ
に８０ｍｌのＭｉｌｌｉＱ Ｈ2Ｏを加え，ＨＣｌまたはＮａＯＨでｐＨを１０
．０に調節し，電子レンジで沸騰させ，冷却し，ｐＨを調べ，ｐＨが１０．０で
安定となるまでこの工程を繰り返し，ＭｉｌｌｉＱ Ｈ2Ｏを加えて総容量１０
０ｍｌとし，１ｍｌアリコートを作成し，−８０℃で保存する。 ｎ． ＭｇＣｌ2，Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｃａｔ．＃Ｍ３３−５００，１Ｍ溶液を作
成する。 ｏ． ＨＥＰＥＳ，Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｃａｔ．＃ＢＰ３１０−５００，２００ｍ
ｌＭｉｌｌｉＱ Ｈ2Ｏに，材料５９．６ｇを加え，ｐＨを７．５に調節し，総
容量２５０ｍｌとし，濾過滅菌する。 ｐ． アルブミン，ウシ（ＢＳＡ），Ｓｉｇｍａ Ｃａｔ．＃Ａ−４５０３，材
料３０ｇに滅菌蒸留水を加えて総容量３００ｍｌとし，４℃で保存する。 ｑ． ＴＢＳＴ緩衝液：１Ｌの目盛り付きシリンダー中の約９００ｍｌのｄＨ2
Ｏに６．０５７ｇＴＲＩＳおよび８．７６６ｇＮａＣｌを加え，溶解したとき，
ＨＣｌでｐＨを７．２に調節し，１．０ｍｌＴｒｉｔｏｎＸ−１００を加え，ｄ
Ｈ2Ｏで総容量１Ｌとする。 ｒ． ヤギアフィニティー精製抗体ウサギＩｇＧ（全分子），Ｃａｐｐｅｌ Ｃ
ａｔ．＃５５６４１ ｓ． 抗ｈ−Ｍｅｔ（Ｃ−２８）ウサギポリクローナルＩｇＧ抗体，Ｓａｎｔａ
Ｃｒｕｚ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃａｔ．＃ＳＣ−１６１ ｔ． 過渡的にトランスフェクションされたＥＧＦＲ／Ｍｅｔキメラ細胞（ＥＭ
Ｒ）（Ｋｏｍａｄａ，ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，８：２３８１−２３９
０（１９９３） ｕ． 炭酸ナトリウム緩衝液，（Ｎａ2ＣＯ4，Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｃａｔ．＃Ｓ４
９５）：材料１０．６ｇに８００ｍｌのＭｉｌｌｉＱ Ｈ2Ｏを加え，溶解した
とき，ＮａＯＨでｐＨを９．６に調節し，ＭｉｌｌｉＱ Ｈ2Ｏで総容量１Ｌと
し，濾過し，４℃で保存する。
【０２６３】方法 以下の工程は，特に記載のない限り，全て室温で実施する。ＥＬＩＳＡプレー
ト洗浄は全てＴＢＳＴで４回すすぐことにより行う。
【０２６４】ＥＭＲ溶解 この方法は，レセプター捕捉の開始の前夜または直前に実施することができる
。 １． 溶解物を３７℃の水浴中で渦巻き動作により最後の結晶が消失するまで急
速に溶解する。 ２． 細胞ペレットを１ｍＭＰＭＳＦを含有する１Ｘ ＨＮＴＧ中で溶解する。
１５ｃｍ皿の細胞あたり３ｍｌのＨＮＴＧを用いる。計算したＨＮＴＧ容量の１
／２を加え，管を１分間ボルテックスし，残量のＨＮＴＧを加え，さらに１分間
ボルテックスする。 ３． 管の釣り合いをとり，１０，０００ｘｇ，１０分間，４℃で遠心分離する
。 ４． 上清をプールし，アリコートを除去して蛋白質測定を行う。 ５． プールしたサンプルをドライアイス／エタノール浴中で急速凍結する。こ
の工程は，溶解物を一夜保存するか蛋白質測定後に直ちに使用するかにかかわら
ず実施する。 ６． 標準的ビシンコニン酸（ＢＣＡ）法を用いて蛋白質測定を実施する（ＢＣ
Ａアッセイ試薬キット，Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃａｔ．＃２３２２
５）。
【０２６５】ＥＬＩＳＡ法 １． Ｃｏｒｎｉｎｇ９６ウエルＥＬＩＳＡプレートを，総ウエル容量５０μｌ
，ウエルあたり５μｇの炭酸塩緩衝液中のヤギ抗ウサギ抗体でコーティングする
。４℃で一夜保存する。 ２． プレートを逆さにして液体を除去することにより，未結合ヤギ抗ウサギ抗
体を除去する。 ３． １５０μｌのブロッキング緩衝液を各ウエルに加える。振盪しながら３０
分間インキュベートする。 ４． ＴＢＳＴで４回洗浄する。プレートをペーパータオル上で軽くたたいて過
剰の液体および気泡を除去する。 ５． ウエル総容量１００μｌに対して，ＴＢＳＴ中で希釈したウサギ抗Ｍｅｔ
抗体をウエルあたり１μｇ加える。 ６． 溶解物をＨＮＴＧで希釈する（９０μｇ溶解物／１００μｌ）。 ７． 希釈した溶解物１００μｌを各ウエルに加える。６０分間振盪する。 ８． ＴＢＳＴで４回洗浄する。ペーパータオル上で軽くたたいて過剰の液体お
よび気泡を除去する。 ９． ウエルあたり５０μｌの１Ｘ溶解物緩衝液を加える。 １０． 化合物／抽出物をポリプロピレン９６ウエルプレート中で１Ｘキナーゼ
緩衝液中で１：１０に希釈する。 １１． 希釈した化合物５．５μｌをＥＬＩＳＡプレートウエルに移す。振盪し
ながら室温で２０分間インキュベートする。 １２． ウエルあたり５．５μｌの６０μＭＡＴＰ溶液を加える。陰性対照には
ＡＴＰを加えない。振盪しながら９０分間インキュベートする。 １３． ＴＢＳＴで４回洗浄する。プレートをペーパータオル上で軽くたたいて
過剰の液体および気泡を除去する。 １４． ウエルあたり１００μｌのＲＣ２０（ブロッキング緩衝液中１：３００
０希釈）を加える。振盪しながら３０分間インキュベートする。 １５． ＴＢＳＴで４回洗浄する。プレートをペーパータオル上で軽くたたいて
過剰の液体および気泡を除去する。 １６． ウエルあたり１００μｌのＴｕｒｂｏ−ＴＭＢを加える。振盪しながら
３０−６０分間インキュベートする。 １７． ウエルあたり１００μｌの１ＭＨ2ＳＯ4を加えて反応を停止させる。 １８． Ｄｙｎａｔｅｃｈ ＭＲ７０００ ＥＬＩＳＡリーダーでアッセイを読
む。試験フィルター＝４５０ｎｍ，参照フィルター＝４１０ｎｍ。
【０２６６】生化学的ｓｒｃアッセイ このアッセイを用いて，ビオチニル化ペプチドのリン酸化を読出しとして測定
することにより，ｓｒｃ蛋白質キナーゼ活性を決定する。
【０２６７】材料および試薬： ａ． ｓｒｃでトランスフォームした酵母（Ｓｕｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｒｅｄｗｏ
ｏｄ Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ） ｂ． 細胞溶解物：ｓｒｃを発現する酵母細胞をペレット化し，水で１回洗浄し
，再びペレット化して，使用するまで−８０℃で保存する。 ｃ． Ｎ−末端ビオチニル化ＥＥＥＹＥＥＹＥＥＥＹＥＥＥＹＥＥＥＹは，当業
者に周知の標準的な方法により調製する。 ｄ． ＤＭＳＯ：Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ ｅ． ９６ウエルＥＬＩＳＡプレート：Ｃｏｒｎｉｎｇ９６ウエルＥａｓｙ Ｗ
ａｓｈ，改変平底プレート，Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃａｔ．＃２５８０５−９６ ｆ． ＮＵＮＣ９６ウエルＶ−底ポリプロピレンプレート，化合物の希釈用：Ａ
ｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃａｔ．＃Ａ−７２０９２ ｇ． Ｖｅｃａｓｔａｉｎ ＥＬＩＴＥ ＡＢＣ試薬：Ｖｅｃｔｏｒ，Ｂｕｒｌ
ｉｎｇａｍｅ，ＣＡ ｈ． 抗ｓｒｃ（３２７）ｍａｂ：Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
Ｐｏｍｂｅを用いて組換えＳｒｃを発現させる（Ｓｕｐｅｒｔｉ−Ｆｕｒｇａ，
ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．，１２：２６２５−２６３４；Ｓｕｐｅｒｔｉ−
Ｆｕｒｇａ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１４：６００−
６０５）。Ｓ．Ｐｏｍｂｅ ＳＰ２００株（ｈ−ｓ ｌｅｕｌ．３２ ｕｒａ４
ａｄｅ２１０）を記載されたように増殖させ，酢酸リチウム法（Ｓｕｐｅｒｔ
ｉ−Ｆｕｒｇａ，（上掲））によりｐＲＳＰ発現プラスミドでトランスフォーム
する。細胞は１μＭチアミンの存在下で増殖させてｎｍｔｌプロモーターの発現
を抑制するか，またはチアミンの非存在下で増殖させて発現を誘導する。 ｉ． モノクローナル抗ホスホチロシン，ＵＢＩ０５−３２１（代わりにＵＢ４
０を用いることができる） ｊ． Ｔｕｒｂｏ ＴＭＢ−ＥＬＩＳＡペルオキシダーゼ基質：Ｐｉｅｒｃｅ
Ｃｈｅｍｉｃａｌ
【０２６８】緩衝液溶液： ａ． ＰＢＳ（ダルベッコリン酸緩衝化食塩水）：ＧＩＢＣＯ ＰＢＳ，ＧＩＢ
ＣＯ Ｃａｔ．＃４５０−１３００ＥＢ ｂ． ブロッキング緩衝液：５％無脂乳（Ｃａｒｎａｔｉｏｎ），ＰＢＳ中 ｃ 炭酸塩緩衝液：Ｎａ2ＣＯ4，Ｆｉｓｃｈｅｒ，Ｃａｔ．＃Ｓ４９５，１００
ｍＭ保存溶液を作成する。 ｄ． キナーゼ緩衝液：１．０ｍｌ（１Ｍ保存溶液から）ＭｇＣｌ2；０．２ｍ
ｌ（１Ｍ保存溶液から）ＭｎＣｌ2；０．２ｍｌ（１Ｍ保存溶液から）ＤＴＴ；
５．０ｍｌ（１Ｍ保存溶液から）ＨＥＰＥＳ；０．１ｍｌＴＸ−１００；Ｍｉｌ
ｌｉＱ Ｈ2Ｏで総容量１０ｍｌとする。 ｅ． 溶解緩衝液：５．０ＨＥＰＥＳ（１Ｍ保存溶液から）；２．７４ｍｌＮａ
Ｃｌ（５Ｍ保存溶液から）；１０ｍｌグリセロール；１．０ｍｌＴＸ−１００；
０．４ｍｌＥＤＴＡ（１００ｍＭ保存溶液から）；１．０ｍｌＰＭＳＦ（１００
ｍＭ保存溶液から）；０．１ｍｌＮａ3ＶＯ4（０．１Ｍ保存溶液から）；Ｍｉｌ
ｌｉＱ Ｈ2Ｏで総容量１００ｍｌとする。 ｆ． ＡＴＰ：Ｓｉｇｍａ Ｃａｔ．＃Ａ−７６９９，１０ｍＭ保存溶液（５．
５１ｍｇ／ｍｌ）を作成する。 ｇ ＴＲＩＳ−ＨＣｌ：Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｃａｔ．＃ＢＰ１５２−５，６００ｍ
ｌのＭｉｌｌｉＱ Ｈ2Ｏに１２１．１４ｇの物質を加え，ＨＣｌでｐＨを７．
５に調節し，ＭｉｌｌｉＱ Ｈ2Ｏで総容量１Ｌとする。 ｈ． ＮａＣｌ：Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｃａｔ．＃Ｓ２７１−１０，ＭｉｌｌｉＱ
Ｈ2Ｏで５Ｍ保存溶液を作成する。 ｉ． Ｎａ3ＶＯ4：Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｃａｔ．＃Ｓ４５４−５０；８０ｍｌのＭ
ｉｌｌｉＱ Ｈ2Ｏに，１．８ｇの物質を加える；ＨＣｌまたはＮａＯＨでｐＨ
を１０．０に調節する；電子レンジ中で沸騰させる；冷却する；ｐＨを調べ，加
熱／冷却サイクルの後にｐＨが安定に維持されるまでｐＨ調節を繰り返す；Ｍｉ
ｌｌｉＱ Ｈ2Ｏで総容量１００ｍｌとする；１ｍｌのアリコートを作成し，−
８０℃で保存する。 ｊ． ＭｇＣｌ2：Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｃａｔ．＃Ｍ３３−５００，ＭｉｌｌｉＱ
Ｈ2Ｏで１Ｍ保存溶液を作成する。 ｋ． ＨＥＰＥＳ：Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｃａｔ．＃ＢＰ３１０−５００；２００ｍ
ｌＭｉｌｌｉＱ Ｈ2Ｏに，５９．６ｇの物質を加え，ｐＨを７．５に調節し，
ＭｉｌｌｉＱ Ｈ2Ｏで総容量２５０ｍｌとし，濾過滅菌する（１Ｍ保存溶液）
。 ｌ． ＴＢＳＴ緩衝液：ＴＢＳＴ緩衝液：９００ｍｌのｄＨ2Ｏに，６．０５７
ｇＴＲＩＳおよび８．７６６ｇＮａＣｌを加える；ＨＣｌでｐＨを７．２に調節
し，１．０ｍｌＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１００を加える；ｄＨ2Ｏで総容量１Ｌとする
。 ｍ． ＭｎＣｌ2：Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｃａｔ．＃Ｍ８７−１００，ＭｉｌｌｉＱ
Ｈ2Ｏで１Ｍ保存溶液とする。 ｎ． ＤＴＴ：Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｃａｔ．＃ＢＰ１７２−５ ｏ． ＴＢＳ（ＴＲＩＳ緩衝化食塩水）：９００ｍｌのＭｉｌｌｉＱ Ｈ2Ｏに
，６．０５７ｇＴＲＩＳおよび８．７７７ｇＮａＣｌを加える；ＭｉｌｌｉＱ
Ｈ2Ｏで総容量を１Ｌとする。 ｐ． キナーゼ反応混合物：アッセイプレート（１００ウエル）１枚あたりの量
：１．０ｍｌキナーゼ緩衝液，２００μｇＧＳＴ−ζ，ＭｉｌｌｉＱ Ｈ2Ｏで
最終容量８．０ｍｌとする。 ｑ． ビオチン標識ＥＥＥＹＥＥＹＥＥＥＹＥＥＥＹＥＥＥＹ：水中のペプチド
保存溶液（１ｍＭ，２．９８ｍｇ／ｍｌ）を使用の直前に新たに作成する。 ｒ． Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ ＥＬＩＴＥ ＡＢＣ試薬：１４ｍｌの作業用試薬
を調製するためには，１滴の試薬Ａを１５ｍｌＴＢＳＴに加え，管を数回逆さに
して混合する。次に１滴の試薬Ｂを加える。管を室温で環状振盪器に入れ，３０
分間混合する。
【０２６９】方法： ｓｒｃでコーティングしたＥＬＩＳＡプレートの調製 １． ＥＬＩＳＡプレートを１００μｌの炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．６）
中の０．５μｇ／ウエルの抗ｓｒｃモノクローナル抗体で，４℃で一夜コーティ
ングする。 ２． ウエルをＰＢＳで１回洗浄する。 ３． プレートをＰＢＳ中５％ミルク０．１５ｍｌで，室温で３０分間ブロッキ
ングする。 ４． プレートをＰＢＳで５回洗浄する。 ５． 溶解緩衝液中で希釈した，ｓｒｃでトランスフォームした酵母の溶解物を
１０μｇ／ウエルで加える（ウエルあたり総容量０．１ｍｌ）。（溶解物の量は
，バッチにより異なるであろう）。プレートを室温で２０分間振盪する。
【０２７０】ホスホチロシン抗体でコーティングしたＥＬＩＳＡプレートの調製 １． ４Ｇ１０プレート：１００μｌＰＢＳ中の０．５μｇ／ウエルの４Ｇ１０
で４℃で一夜コーティングし，１５０μｌのＰＢＳ中５％ミルクで室温で３０分
間ブロッキングする。
【０２７１】キナーゼアッセイ法 １． 未結合蛋白質をプレートから除去し，プレートをＰＢＳで５回洗浄する。 ２． ウエルあたり０．０８ｍｌのキナーゼ反応混合物（ウエルあたり１０μｌ
の１０Ｘキナーゼ緩衝液および１０μＭ（最終濃度）のビオチン−ＥＥＥＹＥＥ
ＹＥＥＥＹＥＥＥＹＥＥＥＹ，水中に希釈）を加える。 ３． １０％ＤＭＳＯを含有する水中に希釈した１０μｌの化合物を加え，室温
で１５分間プレインキュベートする。 ４． １０μｌ／ウエルの水中０．０５ｍＭＡＴＰ（最終５μＭＡＴＰ）を加え
ることにより，キナーゼ反応を開始させる。 ５． ＥＬＩＳＡプレートを室温で１５分間振盪する。 ６． ウエルあたり１０μｌの０．５ＭＥＤＴＡを加えることによりキナーゼ反
応を停止させる。 ７． ９０μｌの上清を，ブロッキングした４Ｇ１０コーティングＥＬＩＳＡプ
レートに移す。 ８． 振盪しながら室温で３０分間インキュベートする。 ９． プレートをＴＢＳＴで５回洗浄する。 １０． Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ ＥＬＩＴＥ ＡＢＣ試薬（１００μｌ／ウエル
）とともに室温で３０分間インキュベートする。 １１． ウエルをＴＢＳＴで５回洗浄する。 １２． Ｔｕｒｂｏ ＴＭＢで発色させる。
【０２７２】生化学的ｌｃｋアッセイ このアッセイを用いて，ＧＳＴ−ζのリン酸化を読出しとして測定することに
より，ｌｃｋ蛋白質キナーゼ活性を決定する材料および試薬： ａ． ｌｃｋでトランスフォームした酵母：Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙ
ｃｅｓ Ｐｏｍｂｅを用いて組換えＬｃｋを発現させる（Ｓｕｐｅｒｔｉ−Ｆｕ
ｒｇａ，ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ，１２：２６２５−２６３４；Ｓｕｐｅｒ
ｔｉ−Ｆｕｒｇａ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１４：６
００−６０５）。Ｓ．Ｐｏｍｂｅ ＳＰ２００株（ｈ−ｓ ｌｅｕｌ．３２ ｕ
ｒａ４ ａｄｅ２１０）を記載されたように増殖させ，ｐＲＳＰ発現プラスミド
で酢酸リチウム法によりトランスフォームする（Ｓｕｐｅｒｔｉ−Ｆｕｒｇａ，
（上掲））。細胞を１μＭチアミンの存在下で増殖させ，発現を誘導する。 ｂ． 細胞溶解物：ｌｃｋを発現する酵母細胞をペレット化し，水で１回洗浄し
，再ペレット化し，使用するまで−８０℃で凍結保存する。 ｃ． ＧＳＴ−ζ：細菌中で発現させるためのＧＳＴ−ζ融合蛋白質をコードす
るＤＮＡは，Ｈｏｗａｒｄ Ｈｕｇｈｅｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔ
ｅ，ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｓａｎ Ｆ
ｒａｎｃｉｓｃｏのＡｒｔｈｕｒ Ｗｅｉｓｓから入手する。トランスフォーム
した細菌を振盪しながら２５℃で一夜増殖させる。ＧＳＴ−ζは，グルタチオン
アフィニティークロマトグラフィー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ａｌａｍｅｄａ，Ｃ
Ａ）により精製する。 ｄ． ＤＭＳＯ：Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ ｅ． ９６ウエルＥＬＩＳＡプレート：Ｃｏｒｎｉｎｇ９６ウエルＥａｓｙ Ｗ
ａｓｈ，改変平底プレート，Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃａｔ．＃２５８０５−９６ ｆ． ＮＵＮＣ９６ウエルＶ−底ポリプロピレンプレート，化合物希釈用：Ａｐ
ｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃａｔ．＃ＡＳ−７２０９２ ｇ． 精製ウサギ抗ＧＳＴ抗血清：Ａｍｒａｄ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ａｕ
ｓｔｒａｌｉａ）Ｃａｔ．＃９０００１６０５ ｈ． ヤギ抗ウサギ−ＩｇＧ−ＨＲＰ：Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｃａｔ．＃Ｖ０１０
３０１ ｉ． ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）：Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓ Ｃａｔ．＃
５２１５−００５−００３ ｊ． 抗Ｌｃｋ（３Ａ５）モノクローナル抗体：Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏ
ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＣａｔ＃ｓｃ−４３３ ｋ． 抗ホスホチロシンモノクローナル抗体ＵＢＩ０５−３２１（代わりにＵＢ
４０を用いてもよい）
【０２７３】緩衝液溶液： ａ． ＰＢＳ（ダルベッコリン酸緩衝化食塩水）１Ｘ溶液：ＧＩＢＣＯＰＢＳ，
ＧＩＢＣＯ Ｃａｔ．＃４５０−１３００ＥＢ ｂ． ブロッキング緩衝液：１００ｇＢＳＡ，１２．１ｇＴＲＩＳ−ｐＨ７．５
，５８．４４ｇＮａＣｌ，１０ｍｌＴｗｅｅｎ−２０，ＭｉｌｌｉＱ Ｈ2Ｏで
総容量１Ｌとする。 ｃ． 炭酸緩衝液：Ｎａ2ＣＯ4，Ｆｉｓｃｈｅｒ，Ｃａｔ．＃Ｓ４９５；Ｍｉｌ
ｌｉＱ Ｈ2Ｏで１００ｍＭ溶液とする。 ｄ． キナーゼ緩衝液：１．０ｍｌ（１Ｍ保存溶液より）ＭｇＣｌ2；０．２ｍ
ｌ（１Ｍ保存溶液より）ＭｎＣｌ2；０．２ｍｌ（１Ｍ保存溶液より）ＤＴＴ；
５．０ｍｌ（１Ｍ保存溶液より）ＨＥＰＥＳ；０．１ｍｌＴＸ−１００；Ｍｉｌ
ｌｉＱ Ｈ2Ｏで総容量１０ｍｌとする。 ｅ． 溶解緩衝液：５．０ＨＥＰＥＳ（１Ｍ保存溶液より）；２．７４ｍｌＮａ
Ｃｌ（５Ｍ保存溶液より）；１０ｍｌグリセロール；１．０ｍｌＴＸ−１００；
０．４ｍｌＥＤＴＡ（１００ｍＭ保存溶液より）；１．０ｍｌＰＭＳＦ（１００
ｍＭ保存溶液より）；０．１ｍｌＮａ3ＶＯ4（０．１Ｍ保存溶液より）；Ｍｉｌ
ｌｉＱ Ｈ2Ｏで総容量１００ｍｌとする。 ｆ． ＡＴＰ：Ｓｉｇｍａ Ｃａｔ．＃Ａ−７６９９，１０ｍＭ保存溶液（５．
５１ｍｇ／ｍｌ）を作成する。 ｇ． ＴＲＩＳ−ＨＣｌ：Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｃａｔ．＃ＢＰ１５２−５，６００
ｍｌのＭｉｌｌｉＱ Ｈ2Ｏに，１２１．１４ｇの物質を加え，ＨＣｌでｐＨを
７．５に調節し，ＭｉｌｌｉＱ Ｈ2Ｏで総容量１Ｌとする。 ｈ． ＮａＣｌ：Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｃａｔ．＃Ｓ２７１−１０，ＭｉｌｌｉＱ
Ｈ2Ｏで５Ｍ保存溶液を作成する。 ｉ． Ｎａ3ＶＯ4：Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｃａｔ．＃Ｓ４５４−５０；８０ｍｌのＭ
ｉｌｌｉＱ Ｈ2Ｏに，１．８ｇの物質を加える；ＨＣｌまたはＮａＯＨでｐＨ
を１０．０に調節する；電子レンジ中で沸騰させる；冷却する；ｐＨを調べ，加
熱／冷却サイクルの後にｐＨが安定となるまでｐＨ調節を繰り返す；Ｍｉｌｌｉ
Ｑ Ｈ2Ｏで総容量１００ｍｌとする；１ｍｌのアリコートを作成し，−８０℃
で保存する。 ｊ． ＭｇＣｌ2：Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｃａｔ．＃Ｍ３３−５００，ＭｉｌｌｉＱ
Ｈ2Ｏで１Ｍ保存溶液を作成する。 ｋ． ＨＥＰＥＳ：Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｃａｔ．＃ＢＰ３１０−５００；２００ｍ
ｌのＭｉｌｌｉＱ Ｈ2Ｏに，５９．６ｇの物質を加え，ｐＨを７．５に調節し
，ＭｉｌｌｉＱ Ｈ2Ｏで総容量２５０ｍｌとし，濾過滅菌する（１Ｍ保存溶液
）。 ｌ． アルブミン，ウシ（ＢＳＡ），Ｓｉｇｍａ Ｃａｔ．＃Ａ４５０３；１５
０ｍｌのＭｉｌｌｉＱ Ｈ2Ｏに，３０ｇの物質を加え，ＭｉｌｌｉＱ Ｈ2Ｏで
総容量３００ｍｌとし，０．２２μｍフィルターを通して濾過し，４℃で保存す
る。 ｍ． ＴＢＳＴ緩衝液：９００ｍｌのｄＨ2Ｏに，６．０５７ｇＴＲＩＳおよび
８．７６６ｇＮａＣｌを加える；ＨＣｌでｐＨを７．２に調節する；１．０ｍｌ
Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００を加える；ｄＨ2Ｏで総容量１Ｌとする。 ｎ． ＭｎＣｌ2：Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｃａｔ．＃Ｍ８７−１００，ＭｉｌｌｉＱ
Ｈ2Ｏで１Ｍ保存溶液を作成する。 ｏ． ＤＴＴ；Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｃａｔ．＃ＢＰ１７２−５ ｐ． ＴＢＳ（ＴＲＩＳ緩衝化食塩水）：９００ｍｌのＭｉｌｌｉＱ Ｈ2Ｏに
，６．０５７ｇＴＲＩＳおよび８．７７７ｇＮａＣｌを加える；ＭｉｌｌｉＱ
Ｈ2Ｏで総容量１Ｌとする。 ｑ． キナーゼ反応混合物：アッセイプレート（１００ウエル）１枚あたりの量
：１．０ｍｌキナーゼ緩衝液，２００μｇＧＳＴ−ζ，ＭｉｌｌｉＱ Ｈ2Ｏで
最終容量８．０ｍｌとする。
【０２７４】方法： ＬｃｋでコーティングしたＥＬＩＳＡプレートの調製 １． １００μｌの炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．６）中のヤギ抗マウスＩｇ
Ｇ２．０μｇ／ウエルで，４℃で一夜コーティングする。 ２． ウエルをＰＢＳで１回洗浄する。 ３． プレートを０．１５ｍｌのブロッキング緩衝液で室温で３０分間ブロッキ
ングする。 ４． プレートをＰＢＳで５回洗浄する。 ５． ０．１ｍｌＰＢＳ中の抗ｌｃｋ（モノクローナル抗体３Ａ５）を０．５μ
ｇ／ウエルで室温で１−２時間加える。 ６． プレートをＰＢＳで５回洗浄する。 ７． 溶解緩衝液中に希釈した，ｌｃｋでトランスフォームした酵母の溶解物を
２０μｇ／ウエルで加える（ウエルあたり総容量０．１ｍｌ）。プレートを４℃
で一夜振盪して活性の喪失を防止する。
【０２７５】ホスホチロシン抗体でコーティングしたＥＬＩＳＡプレートの調製 １． ＵＢ４０プレート：１００μｌＰＢＳ中の１．０μｇ／ウエルＵＢ４０を
４℃で一夜加え，１５０μｌのブロッキング緩衝液で少なくとも１時間ブロッキ
ングする。
【０２７６】キナーゼアッセイ法 １． 未結合蛋白質をプレートから除去し，プレートをＰＢＳで５回洗浄する。 ２． ウエルあたり０．０８ｍｌのキナーゼ反応混合物（ウエルあたり，水で希
釈した１０μｌの１０Ｘキナーゼ緩衝液および２μｇＧＳＴ−ζを含む）を加え
る。 ３． １０％ＤＭＳＯを含有する水中で希釈した化合物１０μｌを加え，室温で
１５分間プレインキュベートする。 ４． 水中０．１ｍＭＡＴＰ（最終濃度１０μＭＡＴＰ）を１０μｌ／ウエルで
加えることによりキナーゼ反応を開始させる。 ５． ＥＬＩＳＡプレートを室温で６０分間振盪する。 ６． ウエルあたり１０μｌの０．５ＭＥＤＴＡを加えることによりキナーゼ反
応を停止させる。 ７． ９０μｌの上清を，上述のＢ節からのブロッキングした４Ｇ１０コーティ
ングＥＬＩＳＡプレートに移す。 ８． 振盪しながら室温で３０分間インキュベートする。 ９． プレートをＴＢＳＴで５回洗浄する。 １０． １００μｌＴＢＳＴ中１：５０００に希釈したウサギ抗ＧＳＴ抗体とと
もに室温で３０分間インキュベートする。 １１． ウエルをＴＢＳＴで５回洗浄する。 １２． １００μｌのＴＢＳＴ中１：２０，０００に希釈したヤギ抗ウサギ−Ｉ
ｇＧ−ＨＲＰとともに室温で３０分間インキュベートする。 １３． ウエルをＴＢＳＴで５回洗浄する。 １４． Ｔｕｒｂｏ ＴＭＢで発色させる。
【０２７７】ＲＡＦのリン酸化機能を測定するアッセイ 以下のアッセイは，ＲＡＦにより触媒される，その標的蛋白質ＭＥＫならびに
ＭＥＫの標的であるＭＡＰＫのリン酸化の量を測定する。ＲＡＦ遺伝子配列は，
Ｂｏｎｎｅｒら（１９８５，Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：１４００−
１４０７）に記載されており，多くの遺伝子配列データバンクにおいて容易にア
クセス可能である。核酸ベクターの構築および本発明のこの部分において用いら
れる細胞株は，Ｍｏｒｒｉｓｏｎら（１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ
．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：８８５５−８８５９）にすべて記載されている。
【０２７８】材料および試薬 １． Ｓｆ９（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞；ＧＩＢＣ
Ｏ−ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ ２． ＲＩＰＡ緩衝液：２０ｍＭＴｒｉｓ／ＨＣ１ｐＨ７．４，１３７ｍＭＮａ
Ｃｌ，１０％グリセロール，１ｍＭＰＭＳＦ，５ｍｇ／Ｌアプロテニン，０．５
％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００； ３． チオレドキシン−ＭＥＫ融合蛋白質（Ｔ−ＭＥＫ）：Ｔ−ＭＥＫ 発現およびアフィニティークロマトグラフィーによる精製は，製造元の方法に従
って実施する。カタログ＃Ｋ３５０−０１およびＲ３５０−４０，Ｉｎｖｉｔｒ
ｏｇｅｎＣｏｒｐ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ ４． Ｈｉｓ−ＭＡＰＫ（ＥＲＫ２）；Ｈｉｓ−タグＭＡＰＫは，Ｈｉｓ−ＭＡ
ＰＫをコードするｐＵＣ１８ベクターによりトランスフォームしたＸＬ１ Ｂｌ
ｕｅ細胞中で発現させる。Ｈｉｓ−ＭＡＰＫはＮｉ−アフィニティークロマトグ
ラフィーにより精製する。Ｃａｔ＃２７−４９４９−０１，Ｐｈａｒｍａｃｉａ
，Ａｌａｍｅｄａ，ＣＡ，本明細書に記載されたとおり。 ５． ヤギ抗マウスＩｇＧ：Ｊａｃｋｓｏｎ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｗｅ
ｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ．カタログ，＃５１５−００６−００８，Ｌｏｔ＃２８
５６３ ６． ＲＡＦ−１蛋白質キナーゼ特異的抗体：ＵＲＰ２６５３，ＵＢＩ ７． コーティング緩衝液：ＰＢＳ；リン酸緩衝化食塩水，ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ
，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ ８． 洗浄緩衝液：ＴＢＳＴ−５０ｍＭＴｒｉｓ／ＨＣＬｐＨ７．２，１５０ｍ
ＭＮａＣｌ，０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００ ９． ブロッキング緩衝液：ＴＢＳＴ，０．１％エタノールアミンｐＨ７．４ １０． ＤＭＳＯ，Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ １１． キナーゼ緩衝液（ＫＢ）：２０ｍＭＨＥＰＥＳ／ＨＣｌ（ｐＨ７．２）
，１５０ｍＭＮａＣｌ，０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００，１ｍＭＰＭＳＦ，５
ｍｇ／Ｌアプロテニン，７５ｍＭオルトバナジウム酸ナトリウム，０．５ＭＭＤ
ＴＴおよび１０ｍＭＭｇＣｌ2 １２． ＡＴＰ混合物：ｌ００ｍＭＭｇＣｌ2，３００ｍＭＡＴＰ，１０ｍＣｉ
γ33ＰＡＴＰ（ＤｕＰｏｎｔ−ＮＥＮ）／ｍＬ １３ 停止溶液：１％リン酸；Ｆｉｓｈｅｒ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ １４． Ｗａｌｌａｃリン酸セルロースフィルターマット；Ｗａｌｌａｃ，Ｔｕ
ｒｋｕ，Ｆｉｎｎｌａｎｄ １５． フィルター洗浄溶液：１％リン酸，Ｆｉｓｈｅｒ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇ
ｈ，ＰＡ １６． Ｔｏｍｔｅｃプレート回収機，Ｗａｌｌａｃ，Ｔｕｒｋｕ，Ｆｉｎｎｌ
ａｎｄ １７． Ｗａｌｌａｃベータプレートリーダー＃１２０５，Ｗａｌｌａｃ，Ｔｕ
ｒｋｕ，Ｆｉｎｎｌａｎｄ １８． 化合物用に，ＮＵＮＣ９６ウエルＶ底ポリプロピレンプレート，Ａｐｐ
ｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃカタログ＃ＡＳ−７２０９２
【０２７９】方法 以下のすべての工程は，特に指示しないかぎり，室温で実施する。 １． ＥＬＩＳＡプレートコーティング：ＥＬＩＳＡウエルを１００ｍｌのヤギ
抗マウスアフィニティー精製抗血清（１ｍｇ／ｌ００ｍＬコーティング緩衝液）
で４℃で一夜コーティングする。ＥＬＩＳＡプレートは，４℃で保存したとき，
２週間使用することができる。 ２． プレートを逆さにして液体を除去する。１００ｍＬのブロッキング溶液を
加え，３０分間インキュベートする。 ３． ブロッキング溶液を除去し，洗浄緩衝液で４回洗浄する。プレートをペー
パータオル上で軽くたたいて過剰の液体を除去する。 ４． 各ウエルに１ｍｇのＲＡＦ−１特異的抗体を加え，１時間インキュベート
する。工程３に記載したように洗浄する。 ５． ＲＡＳ／ＲＡＦで感染させたＳｆ９細胞からの溶解物を解凍し，ＴＢＳＴ
で１０ｍｇ／１００ｍＬに希釈する。１０ｍｇの希釈溶解物をウエルに加え，１
時間インキュベートする。インキュベーションの間，プレートを振盪する。陰性
対照には溶解物を加えない。各ウイルスにつきＭＯＩ５で細胞を組換えバキュロ
ウイルスで感染させた後，ＲＡＳ／ＲＡＦで感染させたＳｆ９昆虫細胞からの溶
解物を調製し，４８時間後に回収する。細胞をＰＢＳで１回洗浄し，ＲＩＰＡ緩
衝液中で溶解する。不溶物質を遠心分離（５分間，１００００ｘｇ）により除去
する。溶解物のアリコートをドライアイス／エタノール中で凍結し，使用まで−
８０℃で保存する。 ６． 非結合物質を除去し，上に簡単に述べたように洗浄する（工程３）。 ７． ウエルあたり２ｍｇのＴ−ＭＥＫおよび２ｍｇのＨｉｓ−ＭＡＥＰＫを加
え，キナーゼ緩衝液で容量を４０ｍＬに調節する。細胞抽出物からＴ−ＭＥＫお
よびＭＡＰＫを精製する方法は，本明細書の実施例に記載される。 ８． 化合物（保存溶液１０ｍｇ／ｍＬＤＭＳＯ）または抽出物をＴＢＳＴプラ
ス１％ＤＭＳＯ中であらかじめ２０倍に希釈する。５ｍＬのあらかじめ希釈した
化合物／抽出物を工程６に記載したウエルに加える。２０分間インキュベートす
る。対照には薬剤を加えない。 ９． ５ｍＬＡＴＰミックスを加えることによりキナーゼ反応を開始する。イン
キュベーションの間，ＥＬＩＳＡプレート振盪器でプレートを振盪する。 １０． ６０分後，３０ｍＬの停止溶液を各ウエルに加えることによりキナーゼ
反応を停止する。 １１． ホスホセルロースマットおよびＥＬＩＳＡプレートをＴｏｍｔｅｃプレ
ート回収機中に置く。フィルターを回収し，フィルター洗浄溶液で製造元の推奨
にしたがってこれを洗浄する。フィルターマットを乾燥する。フィルターマット
を密封し，ケース中に置く。ケースを放射活性検出装置に入れ，フィルターマッ
ト上の放射活性リンを定量する。 あるいは，アッセイプレートの個々のウエルからの４０ｍＬのアリコートを，
ホスホセルロースフィルターマットの対応する位置に移すことができる。フィル
ターを風乾した後，フィルターをトレイ中に置く。トレイを穏やかにロックし，
洗浄溶液を１５分間ごとに１時間交換する。フィルターマットを風乾する。フィ
ルターマットを密封し，サンプル中の放射活性リンを測定するのに適当なケース
中に入れる。ケースを検出装置に入れ，フィルターマット上の放射活性リンを定
量する。
【０２８０】ＣＤＫ２／サイクリンＡ−阻害アッセイ このアッセイは，外部基質中のＣＤＫ２の蛋白質キナーゼ活性を測定する。試薬： Ａ． 緩衝液Ａ（８０ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ７．２），４０ｍＭＭｇＣｌ2）：４
．８４ｇＴｒｉｓ（Ｆ．Ｗ．＝１２１．１ｇ／ｍｏｌ），４．０７ｇＭｇＣｌ2
（Ｆ．Ｗ．＝２０３．３１ｇ／ｍｏｌ），５００ｍｌＨ2Ｏ中に溶解。ＨＣｌで
ｐＨを７．２に調節する。 Ｂ． ヒストンＨ１溶液（０．４５ｍｇ／ｍｌヒストンＨ１および２０ｍＭＨＥ
ＰＥＳ（ｐＨ７．２）：１１．１１１ｍｌの２０ｍＭＨＥＰＥＳｐＨ７．２（４
７７ｍｇＨＥＰＥＳ（Ｆ．Ｗ．＝２３８．３ｇ／ｍｏｌ））中の５ｍｇヒストン
Ｈ１（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ），１００ｍｌｄｄＨ2Ｏ中に
溶解する。１ｍｌアリコートとして−８０℃で保存する。 Ｃ． ＡＴＰ溶液（６０μＭＡＴＰ，３００μｇ／ｍｌＢＳＡ，３ｍＭＤＴＴ）
：１２０μｌの１０ｍＭＡＴＰ，６００μｌの１０ｍｇ／ｍｌＢＳＡで２０ｍｌ
とし，１ｍｌアリコートとして−８０℃で保存する。 Ｄ． ＣＤＫ２溶液：ｃｄｋ２／サイクリンＡ，１０ｍＭＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．
２，２５ｍＭＮａＣｌ，０．５ｍＭＤＴＴ，１０％グリセロール中。９μｌアリ
コートとして−８０℃で保存する。
【０２８１】プロトコル １． 阻害剤の溶液を，ｄｄＨ2Ｏ／１５％ＤＭＳＯ（ｖ／ｖ）で所望の最終ア
ッセイ濃度の３倍で調製する。 ２． ２０μｌの阻害剤をポリプロピレンの９６ウエルプレートのウエルに加え
る（または陽性および陰性対照については２０μｌの１５％ＤＭＳＯ）。 ３． ヒストンＨ１溶液（１ｍｌ／プレート），ＡＴＰ溶液（１ｍｌ／プレート
プラス陰性対照について１アリコート），およびＣＤＫ２溶液（９μｌ／プレー
ト）を解凍する。ＣＤＫ２は使用まで氷上に保存する。ＣＤＫ２溶液を適当にア
リコートに分けて，凍結解凍サイクルの繰り返しを避ける。 ４． ９μｌのＣＤＫ２溶液を２．１ｍｌ緩衝液Ａ（プレートあたり）で希釈し
，混合し，２０μｌを各ウエルに加える。 ５． １ｍｌヒストンＨ１溶液を１ｍｌＡＴＰ溶液（プレートあたり）と混合し
て，１０ｍｌねじ蓋管に入れる。γ33Ｐ ＡＴＰを０．１５μＣｉ／２０μｌ（
アッセイ中，０．１５μＣｉ／ウエル）の濃度となるよう加える。ＢＳＡの泡を
避けるよう注意深く混合する。２０μｌを適当なウエルに加える。プレートをプ
レート振盪器上で混合する。陰性対照については，等量の２０ｍＭＨＥＰＥＳ（
ｐＨ７．２）とＡＴＰ溶液とを混合し，γ33Ｐ ＡＴＰを０．１５μＣｉ／２０
μｌ溶液の濃度となるように加える。２０μｌを適当なウエルに加える。 ６． 反応を６０分間進行させる。 ７． ３５μｌの１０％ＴＣＡを各ウエルに加える。プレートをプレート振盪器
上で混合する。 ８． ４０μｌの各サンプルをＰ３０フィルターマットの升目上にスポットする
。マットを乾燥させる（約１０−２０分間）。 ９． フィルターマットを２５０ｍｌの１％リン酸（ｄｄＨ2Ｏ １ｌあたり１
０ｍｌリン酸）で４Ｘ１０分間洗浄する。 １０． フィルターマットをベータプレートリーダーで計数する。
【０２８２】細胞／生物学的アッセイ ＰＤＧＦ−誘導性ＢｒｄＵ取り込みアッセイ 材料および試薬 ： （１） ＰＤＧＦ：ヒトＰＤＧＦ Ｂ／Ｂ；１２７６−９５６，Ｂｏｅｈｒｉｎ
ｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ （２） ＢｒｄＵ標識試薬：１０ｍＭ，ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中，Ｃａｔ．Ｎｏ
．１６４７２２９，Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ （３） ＦｉｘＤｅｎａｔ：固定溶液（即使用可），Ｃａｔ．Ｎｏ．１６４７２
２９，Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ （４） 抗ＢｒｄＵ−ＰＯＤ：ペルオキシダーゼとコンジュゲート化したマウス
モノクローナル抗体，Ｃａｔ．Ｎｏ．１６４７２２９，Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ
Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ （５） ＴＭＢ基質溶液：テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ），即使用可，Ｃａ
ｔ．Ｎｏ．１６４７２２９，Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒ
ｍａｎｙ （６） ＰＢＳ洗浄溶液：１ＸＰＢＳ，ｐＨ７．４（Ｓｕｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｒ
ｅｄｗｏｏｄ Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ） （７） アルブミン，ウシ（ＢＳＡ）：画分Ｖ粉末；Ａ−８５５１，Ｓｉｇｍａ
Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，ＵＳＡ （８） ヒトＰＤＧＦ−Ｒを発現するよう遺伝子工学処理された３Ｔ３細胞株
【０２８３】プロトコル （１） 細胞をＤＭＥＭ，１０％ＣＳ，２ｍＭＧｌｎ中で，９６ウエルプレート
に８０００細胞／ウエルで播種する。細胞を５％ＣＯ2中で３７℃で一夜インキ
ュベートする。 （２） ２４時間後，細胞をＰＢＳで洗浄し，次に無血清培地（０％ＣＳ ＤＭ
ＥＭ，０．１％ＢＳＡ）中で２４時間血清飢餓とする。 （３） 第３日に，リガンド（ＰＤＧＦ，３．８ｎＭ，ＤＭＥＭ，０．１％ＢＳ
Ａ中で調製）および試験化合物を細胞に同時に加える。陰性対照ウエルには，無
血清ＤＭＥＭおよび０．１％ＢＳＡのみを加える；陽性対照細胞には，リガンド
（ＰＤＧＦ）を加えるが試験化合物を加えない。試験化合物は，９６ウエルプレ
ート中で無血清ＤＭＥＭ中でリガンドとともに調製し，連続希釈して７種類の試
験濃度とする。 （４） リガンド活性化の２０時間後，希釈ＢｒｄＵ標識試薬（ＤＭＥＭ，０．
１％ＢＳＡ中１：１００）を加え，細胞をＢｒｄＵ（最終濃度＝１０μＭ）とと
もに１．５時間インキュベートする。 （５） 標識試薬とともにインキュベーションした後，デカントし，逆さにした
プレートをペーパータオル上で軽くたたくことにより，培地を除去する。Ｆｉｘ
Ｄｅｎａｔ溶液を加え（５０μｌ／ウエル），プレートをプレート振盪器上で室
温で４５分間インキュベートする。 （６） デカントし，逆さにしたプレートをペーパータオル上で軽くたたくこと
により，ＦｉｘＤｅｎａｔ溶液をよく除去する。ブロッキング溶液としてミルク
を加え（ＰＢＳ中５％脱水ミルク，２００μｌ／ウエル），プレートをプレート
振盪器上で室温で３０分間インキュベートする。 （７） デカントによりブロッキング溶液を除去し，ウエルをＰＢＳで１回洗浄
する。抗ＢｒｄＵ−ＰＯＤ溶液（ＰＢＳ，１％ＢＳＡ中１：１００希釈）を加え
（１００μｌ／ウエル），プレートをプレート振盪器上で室温で９０分間インキ
ュベートする。 （８） デカントし，ウエルをＰＢＳで５回すすぐことにより抗体コンジュゲー
トをよく除去し，プレートを逆さにしてペーパータオル上で軽くたたくことによ
り乾燥させる。 （９） ＴＭＢ基質溶液を加え（１００μｌ／ウエル），プレート振盪器で室温
で２０分間，発色が光度計による検出に十分となるまでインキュベートする。 （１０） サンプルの吸光度は，Ｄｙｎａｔｅｃｈ ＥＬＩＳＡプレートリーダ
ーで４１０ｎｍで測定する（参照波長として４９０ｎｍで読みとるフィルターを
用いる"二波長"モード）。
【０２８４】ＥＧＦ−誘導性ＢｒｄＵ取り込みアッセイ 材料および試薬 （１） ＥＧＦ：マウスＥＧＦ，２０１；Ｔｏｙｏｂｏ，Ｃｏ．，Ｌｔｄ．Ｊａ
ｐａｎ （２） ＢｒｄＵ標識試薬：１０ｍＭ，ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中，Ｃａｔ．Ｎｏ
．１６４７２２９，Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ （３） ＦｉｘＤｅｎａｔ：固定溶液（即使用可），Ｃａｔ．Ｎｏ．１６４７２
２９，Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ （４） 抗ＢｒｄＵ−ＰＯＤ：ペルオキシダーゼとコンジュゲート化したマウス
モノクローナル抗体，Ｃａｔ．Ｎｏ．１６４７２２９，Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ
Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ （５） ＴＭＢ基質溶液：テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ），即使用可，Ｃａ
ｔ．Ｎｏ．１６４７２２９，Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒ
ｍａｎｙ （６） ＰＢＳ洗浄溶液：１ＸＰＢＳ，ｐＨ７．４（Ｓｕｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｒ
ｅｄｗｏｏｄＣｉｔｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ） （７） アルブミン，ウシ（ＢＳＡ）：画分Ｖ粉末；Ａ−８５５１，Ｓｉｇｍａ
Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，ＵＳＡ （８） ヒトＥＧＦ−Ｒを発現するよう遺伝子工学処理された３Ｔ３細胞株
【０２８５】プロトコル （１） 細胞をＤＭＥＭ中１０％ＣＳ，２ｍＭＧｌｎで，９６ウエルプレート中
で８０００細胞／ウエルで播種する。細胞を５％ＣＯ2中で３７℃で一夜インキ
ュベートする。 （２） ２４時間後，細胞をＰＢＳで洗浄し，次に無血清培地（０％ＣＳ ＤＭ
ＥＭ，０．１％ＢＳＡ）中で２４時間血清飢餓とする。 （３） 第３日に，リガンド（ＥＧＦ，２ｎＭ，ＤＭＥＭ，０．１％ＢＳＡ中で
調製）および試験化合物を細胞に同時に加える。陰性対照ウエルには０．１％Ｂ
ＳＡを含む無血清ＤＭＥＭのみを加える。陽性対照細胞には，リガンド（ＥＧＦ
）を加えるが試験化合物を加えない。試験化合物は，９６ウエルプレート中で，
無血清ＤＭＥＭ中でリガンドとともに調製し，連続希釈して７種類の試験濃度と
する。 （４） リガンド活性化の２０時間後，希釈したＢｒｄＵ標識試薬（ＤＭＥＭ中
１：１００，０．１％ＢＳＡ）を加え，細胞をＢｒｄＵ（最終濃度＝１０μＭ）
とともに１．５時間インキュベートする。 （５） 標識試薬とともにインキュベートした後，デカントして逆さにしたプレ
ートをペーパータオル上で軽くたたくことにより培地を除去する。ＦｉｘＤｅｎ
ａｔ溶液を加え（５０μｌ／ウエル），プレートをプレート振盪器で室温で４５
分間インキュベートする。 （６） デカントして逆さにしたプレートをペーパータオル上で軽くたたくこと
によりＦｉｘＤｅｎａｔ溶液をよく除去する。ブロッキング溶液としてミルクを
加え（ＰＢＳ中５％脱水ミルク，２００μｌ／ウエル），プレートをプレート振
盪器で室温で３０分間インキュベートする。 （７） デカントによりブロッキング溶液を除去し，ウエルをＰＢＳで１回洗浄
する。抗ＢｒｄＵ−ＰＯＤ溶液（ＰＢＳ中１：１００希釈，１％ＢＳＡ）を加え
（１００μｌ／ウエル），プレートをプレート振盪器で室温で９０分間インキュ
ベートする。 （８） デカントし，ウエルをＰＢＳで５回すすぐことにより抗体コンジュゲー
トをよく除去し，プレートを逆さにしてペーパータオル上で軽くたたくことによ
り乾燥させる。 （９） ＴＭＢ基質溶液を加え（１００μｌ／ウエル），プレート振盪器で室温
で２０分間，発色が高度計検出に十分となるまでインキュベートする。 （１０） サンプルの吸光度は，Ｄｙｎａｔｅｃｈ ＥＬＩＳＡプレートリーダ
ーで，４１０ｎｍ（参照波長として４９０ｎｍを読むフィルターを用いる"二波
長"モード”で）測定する。
【０２８６】ＥＧＦ−誘導性Ｈｅｒ２−推進ＢｒｄＵ取り込み 材料および試薬 ： （１） ＥＧＦ：マウスＥＧＦ，２０１；Ｔｏｙｏｂｏ，Ｃｏ．，Ｌｔｄ．Ｊａ
ｐａｎ （２）ＢｒｄＵ標識試薬：１０ｍＭ，ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中，Ｃａｔ．Ｎｏ．
１６４７２２９，Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ （３） ＦｉｘＤｅｎａｔ：固定溶液（即使用可），Ｃａｔ．Ｎｏ．１６４７２
２９，Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ （４） 抗ＢｒｄＵ−ＰＯＤ：ペルオキシダーゼとコンジュゲート化したマウス
モノクローナル抗体，Ｃａｔ．Ｎｏ．１６４７２２９，Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ
Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ （５） ＴＭＢ基質溶液：テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ），即使用可，Ｃａ
ｔ．Ｎｏ．１６４７２２９，Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒ
ｍａｎｙ （６） ＰＢＳ洗浄溶液：１ＸＰＢＳ，ｐＨ７．４，自社製。 （７） アルブミン，ウシ（ＢＳＡ）：画分Ｖ粉末；Ａ−８５５１，Ｓｉｇｍａ
Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，ＵＳＡ （８） ＥＧＦ−Ｒの細胞外ドメインおよびＨｅｒ２の細胞内ドメインを有する
キメラレセプターを発現するよう遺伝子工学処理された３Ｔ３細胞株
【０２８７】プロトコル ： （１） 細胞をＤＭＥＭ，１０％ＣＳ，２ｍＭＧｌｎ中で９６−ウエルプレート
に８０００細胞／ウエルで播種する。細胞を３７℃で５％ＣＯ2中で一夜インキ
ュベートする。 （２） ２４時間後，細胞をＰＢＳで洗浄し，次に無血清培地（０％ＣＳ ＤＭ
ＥＭ，０．１％ＢＳＡを含む）中で２４時間血清飢餓とする。 （３） 第３日に，リガンド（ＥＧＦ＝２ｎＭ，０．１％ＢＳＡを含むＤＭＥＭ
中で調製）および試験化合物を細胞に同時に加える。陰性対照ウエルには無血清
ＤＭＥＭ，０．１％ＢＳＡのみを加える；陽性対照細胞にはリガンド（ＥＧＦ）
を加えるが試験化合物は加えない。試験化合物は，無血清ＤＭＥＭ中でリガンド
とともに９６ウエルプレート中で調製し，連続希釈して７種類の試験濃度とする
。 （４） リガンド活性化の２０時間後，希釈ＢｒｄＵ標識試薬（ＤＭＥＭ中１：
１００，０．１％ＢＳＡ）を加え，細胞をＢｒｄＵ（最終濃度＝１０μＭ）とと
もに１．５時間インキュベートする。 （５） 標識試薬とともにインキュベートした後，デカントして逆さにしたプレ
ートをペーパータオル上で軽くたたくことにより培地を除去する。ＦｉｘＤｅｎ
ａｔ溶液を加え（５０μｌ／ウエル），プレートを室温でプレート振盪器で４５
分間インキュベートする。 （６） デカントし，逆さにしたプレートをペーパータオル上で軽くたたくこと
により，ＦｉｘＤｅｎａｔ溶液をよく除去する。ブロッキング溶液としてミルク
を加え（ＰＢＳ中５％脱水ミルク，２００μｌ／ウエル），プレートをプレート
振盪器上で室温で３０分間インキュベートする。 （７） デカントによりブロッキング溶液を除去し，ウエルをＰＢＳで１回洗浄
する。抗ＢｒｄＵ−ＰＯＤ溶液（ＰＢＳ，１％ＢＳＡ中１：１００希釈）を加え
（１００μｌ／ウエル），プレートをプレート振盪器上で９０分間室温でインキ
ュベートする。 （８） デカントし，ウエルをＰＢＳで５回すすぐことにより抗体コンジュゲー
トをよく除去し，プレートを逆さにしてペーパータオル上で軽くたたくことによ
り乾燥させる。 （９） ＴＭＢ基質溶液を加え（１００μｌ／ウエル），プレート振盪器で室温
で２０分間，発色が光度計検出に十分となるまでインキュベートする。 （１０） サンプルの吸光度を，Ｄｙｎａｔｅｃｈ ＥＬＩＳＡプレートリーダ
ーで，４１０ｎｍで（参照波長として４９０ｎｍで読むフィルターを用いる"二
波長"モードで）測定する。
【０２８８】ＩＧＦ１−誘導性ＢｒｄＵ取り込みアッセイ 材料および試薬 ： （１） ＩＧＦ１リガンド：ヒト，組換え；Ｇ５１１，Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒ
ｐ，ＵＳＡ （２） ＢｒｄＵ標識試薬：１０ｍＭ，ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中，Ｃａｔ．Ｎｏ
．１６４７２２９，Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ （３） ＦｉｘＤｅｎａｔ：固定溶液（即使用可），Ｃａｔ．Ｎｏ．１６４７２
２９，Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ （４） 抗ＢｒｄＵ−ＰＯＤ：ペルオキシダーゼとコンジュゲート化したマウス
モノクローナル抗体，Ｃａｔ．Ｎｏ．１６４７２２９，Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ
Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ （５） ＴＭＢ基質溶液：テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ），即使用可，Ｃａ
ｔ．Ｎｏ．１６４７２２９，Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒ
ｍａｎｙ （６） ＰＢＳ洗浄溶液：１ＸＰＢＳ，ｐＨ７．４（Ｓｕｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｒ
ｅｄｗｏｏｄ Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ） （７） アルブミン，ウシ（ＢＳＡ）：画分Ｖ粉末；Ａ−８５５１，Ｓｉｇｍａ
Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，ＵＳＡ （８） ヒトＩＧＦ−１レセプターを発現するよう遺伝子工学処理された３Ｔ３
細胞株
【０２８９】プロトコル ： （１） 細胞をＤＭＥＭ，１０％ＣＳ，２ｍＭＧｌｎ中で９６−ウエルプレート
に８０００細胞／ウエルで播種する。細胞を５％ＣＯ2中，３７℃で一夜インキ
ュベートする。 （２） ２４時間後，細胞をＰＢＳで洗浄し，次に無血清培地（０％ＣＳ ＤＭ
ＥＭ，０．１％ＢＳＡ）中で２４時間血清飢餓とする （３） 第３日に，リガンド（ＩＧＦ１＝３．３ｎＭ，０．１％ＢＳＡを含むＤ
ＭＥＭ中で調製）および試験化合物を細胞に同時に加える。陰性対照ウエルには
０．１％ＢＳＡを含む無血清ＤＭＥＭのみを加える。陽性対照細胞にはリガンド
（ＩＧＦ１）を加えるが試験化合物を加えない。試験化合物は，９６ウエルプレ
ートで無血清ＤＭＥＭ中でリガンドとともに調製し，連続希釈して７種類の試験
濃度とする。 （４） リガンド活性化の１６時間後，希釈ＢｒｄＵ標識試薬（ＤＭＥＭ，０．
１％ＢＳＡ中１：１００）を加え，細胞をＢｒｄＵ（最終濃度＝１０μＭ）とと
もに１．５時間インキュベートする。 （５） 標識試薬とともにインキュベーションした後，デカントし，逆さにした
プレートをペーパータオル上で軽くたたくことにより培地を除去する。ＦｉｘＤ
ｅｎａｔ溶液を加え（５０μｌ／ウエル），プレートをプレート振盪器上で室温
で４５分間インキュベートする。 （６） デカントし，逆さにしたプレートをペーパータオル上で軽くたたくこと
によりＦｉｘＤｅｎａｔ溶液をよく除去する。ブロッキング溶液としてミルクを
加え（ＰＢＳ中５％脱水ミルク，２００μｌ／ウエル），プレートをプレート振
盪器上で室温で３０分間インキュベートする。 （７） ブロッキング溶液をデカントにより除去し，ウエルをＰＢＳで１回洗浄
する。抗ＢｒｄＵ−ＰＯＤ溶液（ＰＢＳ，１％ＢＳＡ中１：１００希釈）を加え
（１００μｌ／ウエル），プレートをプレート振盪器上で室温で９０分間インキ
ュベートする。 （８） デカントし，ウエルをＰＢＳで５回すすぐことにより抗体コンジュゲー
トをよく除去し，プレートを逆さにしペーパータオル上で軽くたたくことにより
乾燥する。 （９） ＴＭＢ基質溶液を加え（１００μｌ／ウエル），プレート振盪器上で室
温で２０分間，発色が光度計検出に十分となるまでインキュベートする。 （１０） サンプルの吸光度は，Ｄｙｎａｔｅｃｈ ＥＬＩＳＡプレートリーダ
ーで，４１０ｎｍ（参照波長として４９０ｎｍで読むフィルターを用いる"二波
長"モード）で測定する。
【０２９０】ＦＧＦ−誘導性ＢｒｄＵ取り込みアッセイ このアッセイは，外来性ＦＧＦレセプターを発現する３Ｔｃ７／ＥＧＦｒ細胞
におけるＦＧＦ誘導性ＤＮＡ合成を測定する。
【０２９１】材料および試薬： １．ＦＧＦ：ヒトＦＧＦ２／ｂＦＧＦ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ，Ｎｏ．１３２５６
−０２９） ２．ＢｒｄＵ標識試薬，（１０ｍＭＰＢＳ（ｐＨ７．４），Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅ
ｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ ＣａｔＮｏ．１６４７２２９） ３．Ｆｉｘｄｅｎａｔ固定溶液（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｃ
ａｔ Ｎｏ．１６４７２２９） ４．抗ＢｒｄＵ−ＰＯＤ（ペルオキシダーゼとコンジュゲートしたマウスモノク
ローナル抗体，Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ ＭａｎｎｈｅｉｍＣａｔ：．Ｎｏ．１６
４７２２９） ５．ＴＭＢ（テトラメチルベンジジン，Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉ
ｍＣａｔ．Ｎｏ．１６４７２２９） ６．ＰＢＳ洗浄溶液，ｐＨ７．４（Ｓｕｇｅｎ，Ｉｎｃ．） ７．アルブミン，ウシ（ＢＳＡ），画分Ｖ粉末（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ
Ｃｏ．，Ｃａｔ．Ｎｏ．Ａ−８５５１）
【０２９２】方法 １．３Ｔ３遺伝子工学処理細胞株：３Ｔ３ｃ７／ＥＧＦｒ ２．細胞は，ＤＭＥＭ，１０％ＣＳおよび２ｍＭＧｌｎで，９６ウエルプレート
に８，０００細胞／ウエルで播種する。５％ＣＯ2中で３７℃で２４時間インキ
ュベートする。 ３．２４時間後，細胞をＰＢＳで洗浄し，次に，無血清培地（０％ＤＭＥＭ，０
．１％ＢＳＡ）中で２４時間血清飢餓とする。 ４．リガンド（ＦＧＦ２（ＤＭＥＭ中１．５ｎＭ，０．１％ＢＳＡ）および試験
化合物を同時に加える。陰性対照ウエルには０．１％ＢＳＡを含む無血清ＤＭＥ
Ｍのみを加え，陽性対照ウエルにはＦＧＦ２リガンドを加えるが試験化合物は加
えない。試験化合物は，９６ウエルプレート中で無血清ＤＭＥＭ中でリガンドと
ともに調製し，連続希釈して７種類の試験濃度とする。 ５．２０時間後，希釈ＢｒｄＵ標識試薬を細胞に加え（１：１００ＢｒｄＵ：Ｄ
ＭＥＭ，０．１％ＢＳＡ，最終濃度１０μＭ），１．５時間インキュベートする
。 ６．培地をデカントする。ペーパータオルで痕跡量の物質を除去する。ＦｉｘＤ
ｅｎａｔを加え（５０μｌ／ウエル），プレート振盪器で室温で４５分間インキ
ュベートする。 ７．Ｆｉｘｄｅｎａｔ溶液を除去する。ブロッキング溶液（ＰＢＳ中５％脱水ミ
ルク（２００μｌ／ウエル））を加え，プレート振盪器で室温で３０分間インキ
ュベートする。 ８．ブロッキング溶液をデカントし，ウエルをＰＢＳで１回洗浄する。抗Ｂｒｄ
Ｕ−ＰＯＤ溶液（ＰＢＳ中１：１００希釈，０．１％ＢＳＡ）を加え，プレート
振盪器で室温で９０分間インキュベートする。 ９．抗体コンジュゲートをデカントし，ウエルをＰＢＳで５回すすぐ。ペーパー
タオル上で逆さにして軽くたたくことによりプレートを乾燥する。 １０．ＴＭＢ溶液を加え（１００μｌ／ウエル），プレート振盪器で室温で２０
分間，発色が光度検出に十分となるまでインキュベートする。 １１．Ｄｙｎａｔｅｃｈ ＥＬＩＳＡプレートリーダーで"二波長"モードを用い
，４９０ｎＭのフィルターを用いて，４１０ｎＭで吸光度を測定する。
【０２９３】生化学的ＥＧＦＲアッセイ このアッセイは，ＥＬＩＳＡを用いてＥＧＦＲのインビトロキナーゼ活性を測
定する材料および試薬 １．Ｃｏｒｎｉｎｇ９６ウエルＥｌｉｓａプレート（ＣｏｒｎｉｎｇカタログＮ
ｏ．２５８０５−９６） ２．ＳＵＭ０１モノクローナル抗ＥＧＦＲ抗体（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌ
ａｂ，ＳＵＧＥＮ，Ｉｎｃ．） ３．ＰＢＳ（ダルベッコリン酸緩衝化食塩水，ＧｉｂｃｏカタログＮｏ．４５０
−１３００ＥＢ） ４．ＴＢＳＴ緩衝液
【表１】 ５．ブロッキング緩衝液：
【表２】 ６．Ａ４３１細胞溶解物（Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ Ｌａｂ，ＳＵＧＥＮ，Ｉｎｃ．
）７．ＴＢＳ緩衝液：
【表３】 ８．ＴＢＳ＋１０％ＤＭＳＯ
【表４】 ９．アデノシン−５'−三リン酸（ウマ筋肉からのＡＴＰ，Ｓｉｇｍａ Ｃａｔ
．Ｎｏ．Ａ−５３９４） ｄＨ2Ｏ中１．０ｍＭ溶液を調製する。この試薬は使用の直前に作成し，氷上に
保存する。 １０．ＭｎＣｌ2 ｄＨ2Ｏ中１．０Ｍの保存溶液を調製する。 １１．ＡＴＰ／ＭｎＣｌ2リン酸化混合物
【表５】 この試薬は，使用直前に調製し，氷上に保存しなければならない。 １２．ＮＵＮＣ９６ウエルＶ底ポリプロピレンプレート（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃ
ｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃａｔ．Ｎｏ．ＡＳ−７２０９２） １３．エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ） ｄＨ2Ｏ中２００ｍＭの作業溶液を調製する。１０ＮＮａＯＨでｐＨ８．０に調
製する。 １４．ウサギポリクローナル抗ホスホチロシン血清（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
Ｌａｂ，ＳＵＧＥＮ，Ｉｎｃ．） １５．ヤギ抗ウサギＩｇＧペルオキシダーゼコンジュゲート（Ｂｉｏｓｏｕｒｃ
ｅ Ｃａｔ．Ｎｏ．ＡＬＴ０４０４） １６．ＡＢＴＳ（２，２'−アジノ−ビス（３−エチルベンズチアゾリン−６−
硫酸），Ｓｉｇｍａ Ｃａｔ．Ｎｏ．Ａ−１８８８）
【表６】 最初に，約９００ｍｌのｄＨ2Ｏ中で２つの成分を混合する。リン酸でｐＨを４
．０に調製する。ＡＢＴＳを加え，カバーし，約０．５時間放置し，濾過する。
溶液は使用前まで暗所で４℃で保存すべきである。 １７．過酸化水素３０％溶液（Ｆｉｓｈｅｒ Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｈ３２５） １８．ＡＢＴＳ／Ｈ2Ｏ2 １５ｍｌのＡＢＴＳ溶液と２．０μｌのＨ2Ｏ2を混合する。使用の５分前に調製
する。 １９．０．２ＭＨＣｌ
【０２９４】方法 １．Ｃｏｒｎｉｎｇ９６ウエルＥＬＩＳＡプレートをウエルあたり１００μｌＰ
ＢＳ中０．５μｇのＳＵＭ０１でコーティングし，４℃で一夜保存する。 ２．プレートを逆さにして液体を除去することにより，未結合ＳＵＭ０１をウエ
ルから除去する。ｄＨ2Ｏで１回洗浄する。プレートをペーパータオル上で軽く
たたいて過剰の液体を除去する。 ３．１５０μｌのブロッキング緩衝液を各ウエルに加える。振盪しながら室温で
３０分間インキュベートする。 ４．プレートを脱イオン水で３回，次にＴＢＳＴで１回洗浄する。プレートをペ
ーパータオル上で軽くたたいて，過剰の液体および気泡を除去する。 ５．溶解物をＰＢＳ中で希釈する（７μｇ溶解物／１００μｌＰＢＳ）。 ６．１００μｌの希釈溶解物を各ウエルに加える。室温で６０分間振盪する。 ７．上述の工程４に記載したようにプレートを洗浄する。 ８．１２０μｌのＴＢＳを，捕捉ＥＧＦＲを含有するＥＬＩＳＡプレートに加え
る。 ９．試験化合物を９６ウエルポリプロピレンプレート中でＴＢＳで１：１０に希
釈する（すなわち，１０μｌ化合物＋９０μｌＴＢＳ）。 １０．１３．５μｌの希釈試験化合物をＥＬＩＳＡプレートに加える。対照ウエ
ルには１３．５μｌＴＢＳ＋１０％ＤＭＳＯを加える（ウエルには試験化合物を
加えない）。 １１．振盪しながら室温で３０分間インキュベートする。 １２．１５μｌリン酸化混合物を陰性対照ウエルを除くすべてのウエルに直接加
える。陰性対照ウエルにはＡＴＰ／ＭｎＣｌ2を加えない。（最終ウエル容量は
約１５０μｌ，各ウエル中３μＭＡＴＰ／５ｍＭＭｎＣｌ2の最終濃度となるは
ずである）。振盪しながら５分間インキュベートする。 １３．５分後，１６．５μｌの２００ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）を各ウエルに
加えることにより反応を停止させ，振盪を続ける。ＥＤＴＡを加えた後，１分間
振盪する。 １４．脱イオン水で４回，ＴＢＳＴで２回洗浄する。 １５．ウエルあたり１００μｌの抗ホスホチロシン（ＴＢＳＴ中１：３０００希
釈）を加える。振盪しながら室温で３０−４５分間インキュベートする。 １６．上述の工程４に記載したように洗浄する。 １７．１００μｌのＢｉｏｓｏｕｒｃｅヤギ抗ウサギＩｇＧペルオキシダーゼコ
ンジュゲート（ＴＢＳＴ中１：２０００希釈）を各ウエルに加える。振盪しなが
ら室温で３０分間インキュベートする。 １８．上述の工程４に記載したように洗浄する。 １９．１００μｌのＡＢＴＳ／Ｈ2Ｏ2溶液を各ウエルに加える。 ２０．振盪しながら５−１０分間インキュベートする。気泡を除去する。 ２１．必要ならば，ウエルあたり１００μｌの０．２ＭＨＣｌを加えて，反応を
停止させる。 ２２．アッセイをＤｙｎａｔｅｃｈ ＭＲ７０００ ＥＬＩＳＡリーダーで読む
；試験フィルター：４１０ｎＭ参照フィルター：６３０Ｎｍ。
【０２９５】生化学的ＰＤＧＦＲアッセイ このアッセイは，ＥＬＩＳＡを用いてＰＤＧＦＲのインビトロキナーゼ活性を
測定する。
【０２９６】材料および試薬 特に記載しないかぎり，以下の試薬の作業溶液の調製は，上述の生化学的ＥＧ
ＦＲアッセイと同じである。 １．Ｃｏｒｎｉｎｇ９６ウエルＥｌｉｓａプレート（ＣｏｒｎｉｎｇカタログＮ
ｏ．２５８０５−９６） ２．２８Ｄ４Ｃ１０モノクローナル抗ＰＤＧＦＲ抗体（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ Ｌａｂ，ＳＵＧＥＮ，Ｉｎｃ．） ３．ＰＢＳ（ダルベッコリン酸緩衝化食塩水，ＧｉｂｃｏカタログＮｏ．４５０
−１３００ＥＢ） ４．ＴＢＳＴ緩衝液 ５．ブロッキング緩衝液 ６．ＰＤＧＦＲ−β発現ＮＩＨ３Ｔ３細胞溶解物（Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ Ｌａｂ
，ＳＵＧＥＮ，Ｉｎｃ．） ７．ＴＢＳ緩衝液 ８．ＴＢＳ＋１０％ＤＭＳＯ ９．アデノシン−５'−三リン酸（ＡＴＰ，ウマ筋肉由来，Ｓｉｇｍａ Ｃａｔ
．Ｎｏ．Ａ−５３９４） １０．ＭｎＣｌ2 １１．キナーゼ緩衝液リン酸化混合物
【表７】 １２．ＮＵＮＣ９６ウエルＶ底ポリプロピレンプレート（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃ
ｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃａｔ．Ｎｏ．ＡＳ−７２０９２） １３．エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ） １４．ウサギポリクローナル抗ホスホチロシン血清（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
Ｌａｂ，ＳＵＧＥＮ，Ｉｎｃ．） １５．ヤギ抗ウサギＩｇＧペルオキシダーゼコンジュゲート（Ｂｉｏｓｏｕｒｃ
ｅ Ｃａｔ．Ｎｏ．ＡＬＩ０４０４） １６．２，２'−アジノ−ビス（３−エチルベンズチアゾリン−６−硫酸）（Ａ
ＢＴＳ，Ｓｉｇｍａ Ｃａｔ．Ｎｏ．Ａ−１８８８） １７．過酸化水素３０％溶液（Ｆｉｓｈｅｒ Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｈ３２５） １８．ＡＢＴＳ／Ｈ2Ｏ2 １９．０．２ＭＨＣｌ
【０２９７】方法 １．Ｃｏｒｎｉｎｇ９６ウエルＥＬＩＳＡプレートをウエルあたり１００μｌＰ
ＢＳ中の０．５μｇの２８Ｄ４Ｃ１０でコーティングする。４℃で一夜保存する
。 ２．プレートを逆さにして液体を除去することにより，未結合２８Ｄ４Ｃ１０を
ウエルから除去する。ｄＨ2Ｏで１回洗浄する。プレートをペーパータオル上で
軽くたたいて過剰の液体を除去する。 ３．１５０μｌのブロッキング緩衝液を各ウエルに加える。振盪しながら室温で
３０分間インキュベートする。 ４．プレートを脱イオン水で３回，次にＴＢＳＴで１回洗浄する。プレートをペ
ーパータオル上で軽くたたいて，過剰の液体および気泡を除去する。 ５．溶解物をＨＮＴＧ中で希釈する（１０μｇ溶解物／１００μｌＨＮＴＧ） ６．１００μｌの希釈溶解物を各ウエルに加える。室温で６０分間振盪する。 ７．プレートを上述の工程４に記載したように洗浄する。 ８．８０μｌの作業用キナーゼ緩衝液混合物を捕捉ＰＤＧＦＲを含有するＥＬＩ
ＳＡプレートに加える。 ９．試験化合物を９６ウエルポリプロピレンプレート中でＴＢＳで１：１０に希
釈する（１０μｌ化合物＋９０μｌＴＢＳ）。 １０．１０μｌの希釈試験化合物をＥＬＩＳＡプレートに加える。対照ウエル（
試験化合物を加えないウエル）には１０μｌＴＢＳ＋１０％ＤＭＳＯを加える。 １１．振盪しながら室温で３０分間インキュベートする。 １２．１０μｌのＡＴＰを陰性対照ウエルを除く全てのウエルに直接加える。（
各ウエル中最終ウエル容量は２０μＭＡＴＰを含む約１００μｌとなるはずであ
る）。振盪しながら３０分間インキュベートする。 １３．３０分後，１０μｌの２００ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）を各ウエルに加
えることにより反応を停止する。 １４．脱イオン水で４回，ＴＢＳＴで２回洗浄する。 １５．ウエルあたり１００μｌの抗ホスホチロシン（ＴＢＳＴ中１：３０００希
釈）を加える。振盪しながら室温で３０−４５分間インキュベートする。 １６．上述の工程４に記載したように洗浄する。 １７．１００μｌのＢｉｏｓｏｕｒｃｅヤギ抗ウサギＩｇＧペルオキシダーゼコ
ンジュゲート（ＴＢＳＴ中１：２０００希釈）を各ウエルに加える。振盪しなが
ら室温で３０分間インキュベートする。 １８．上述の工程４に記載したように洗浄する。 １９．１００μｌのＡＢＴＳ／Ｈ2Ｏ2溶液を各ウエルに加える。 ２０．振盪しながら１０−３０分間インキュベートする。気泡を除去する。 ２１．必要ならば，ウエルあたり１００μｌの０．２ＭＨＣｌを加えて反応を停
止する。 ２２．Ｄｙｎａｔｅｃｈ ＭＲ７０００ ＥＬＩＳＡリーダーでアッセイを読む
：試験フィルター：４１０ｎＭ，参照フィルター：６３０ｎＭ。
【０２９８】生化学的ＦＧＦＲアッセイ このアッセイは，ＥＬＩＳＡを用いてＭｙｃ−ＧｙｒＢ−ＦＧＦＲ融合蛋白質
のキナーゼ活性をインビトロで測定する。
【０２９９】材料および試薬 １．ＨＮＴＧ
【表８】 １リットルの５ｘ保存溶液を作成するためには，ＨＥＰＥＳおよびＮａＣｌを約
３５０ｍｌのｄＨ2Ｏに溶解し，ＨＣｌまたはＮａＯＨでｐＨを７．２に調節し
（用いるＨＥＰＥＳによる），グリセロール，ＴｒｉｔｏｎＸ１００を加え，次
にｄＨ2Ｏを加えて最終容量とする。 ２．ＰＢＳ（ダルベッコリン酸緩衝化食塩水，Ｇｉｂｃｏカタログ＃４５０−１
３００ＥＢ） ３．ブロッキング緩衝液 ４．キナーゼ緩衝液
【表９】 ５．フッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ，Ｓｉｇｍａ，Ｃａｔ．Ｎｏ．
Ｐ−７６２６） 作業溶液：エタノール中１００ｍＭ ６．ＡＴＰ（細菌起源，Ｓｉｇｍａ Ｃａｔ．Ｎｏ．Ａ−７６９９） ６ｍＭの濃度の保存液のためには，１ｍｌのＭｉｌｌｉＱ Ｈ2Ｏあたり３．３
１ｍｇを用いる。 ７．ビオチンコンジュゲート化抗ホスホチロシンモノクローナル抗体（クローン
４Ｇ１０，Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．Ｃａｔ．Ｎ
ｏ．１６−１０３，Ｓｅｒ．Ｎｏ．１４４９５） ８．Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ Ｅｌｉｔｅ ＡＢＣ試薬（アビジンペルオキシダー
ゼコンジュゲート，Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｃａｔ．Ｎｏ．
ＰＫ−６１００） ９．ＡＢＴＳ溶液 １０．過酸化水素３０％溶液（Ｆｉｓｈｅｒカタログ＃Ｈ３２５） １１．ＡＢＴＳ／Ｈ2Ｏ2 １２．０．２ＭＨＣｌ １３．ＴＲＩＳ ＨＣｌ（Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｃａｔ．Ｎｏ．ＢＰ１５２−５） ＭｉｌｌｉＱ Ｈ2Ｏ中の１．０ｍＭ溶液を調製し，ＨＣｌでｐＨを７．２に調
節する １４．ＮａＣｌ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｓ２７１−１０） ＭｉｌｌｉＱ Ｈ2Ｏ中の５Ｍ溶液を調製する １５．ＭｇＣｌ2（Ｆｉｓｈｅｒ Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｍ３３−５００） ＭｉｌｌｉＱ Ｈ2Ｏ中の１Ｍ溶液を調製する １６．ＨＥＰＥＳ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｃａｔ．Ｎｏ．ＢＰ３１０−５００） ＭｉｌｌｉＱ Ｈ2Ｏ中の１Ｍ溶液を調製し，ｐＨを７．５に調節し，濾過滅菌
する。 １７．ＴＢＳＴ緩衝液 １８．炭酸ナトリウム緩衝液（Ｆｉｓｈｅｒ Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｓ４９５） ＭｉｌｌｉＱ Ｈ2Ｏ中に０．１Ｍ溶液を調製し，ＮａＯＨでｐＨを９．６に調
製し，濾過する。 １９．ジチオスレイトール（ＤＴＴ，Ｆｉｓｈｅｒ Ｃａｔ．Ｎｏ．ＢＰ１７２
−２５） 使用直前にＭｉｌｌｉＱ Ｈ2Ｏ中に０．５ｍＭの作業溶液を調製する。使用す
るまで−２０℃で保存し，残りは廃棄する。 ２０．ＭｎＣｌ2 ２１．ＴｒｉｔｏｎＸ−１００ ２２．ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｃａｐｐｅｌ） ２３．アフィニティー精製ウサギ抗ＧＳＴ ＧｙｒＢ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ Ｌａｂ．ＳＵＧＥＮ，Ｉｎｃ．）
【０３００】方法 以下の全ての工程は，特に記載しない限り，室温で実施する。 １．Ｃｏｒｎｉｎｇ９６ウエルＥＬＩＳＡプレートを，ウエルの総容量が１００
μｌとなるように，ウエルあたり２μｇの炭酸緩衝液中のヤギ抗ウサギ抗体でコ
ーティングする。４℃で一夜保存する。 ２．プレートを逆さにして液体を除去することにより，未結合ヤギ抗ウサギ抗体
を除去する。プレートをペーパータオル上で軽くたたいて，過剰の液体および気
泡を除去する。 ３．１５０μｌのブロッキング緩衝液（ＰＢＳ中５％低脂肪ミルク）を各ウエル
に加える。マイクロタイタープレート振盪器で振盪しながら３０分間インキュベ
ートする。 ４．ＴＢＳＴで４回洗浄する。プレートをペーパータオル上で軽くたたいて，過
剰の液体および気泡を除去する。 ５．ウエルあたり０．５μｇのウサギ抗ＧｙｒＢ抗体を加える。抗体をＤＰＢＳ
中で希釈して最終容量をウエルあたり１００μｌとする。マイクロタイタープレ
ート振盪器で振盪しながら室温で１時間インキュベートする。 ６．工程４に記載したようにＴＢＳＴで４回洗浄する。 ７．ＨＮＴＧ中の２μｇのＣＯＳ／ＦＧＦＲ細胞溶解物（Ｍｙｃ−ＧｙｒＢ−Ｆ
ＧＦＲ源）を各ウエルに加えて，ウエルあたり１００μｌの最終容量とする。マ
イクロタイタープレート振盪器で振盪しながら１時間インキュベートする。 ８．工程４に記載したようにＴＢＳＴで４回洗浄する。 ９．ウエルあたり８０μｌの１ｘキナーゼ緩衝液を加える。 １０．ポリプロピレン９６ウエルプレート中で試験化合物を１ｘキナーゼ緩衝液
＋１％ＤＭＳＯで１：１０に希釈する。 １１．希釈した試験化合物溶液および対照ウエルの１０μｌをポリプロピレンプ
レートウエルから対応するＥＬＩＳＡプレートウエルに移し，マイクロタイター
プレート振盪器で振盪しながら２０分間インキュベートする。 １２．キナーゼ緩衝液中で希釈した７０μＭＡＴＰの１０μｌを陽性対照および
試験ウエル（最終ＡＴＰ濃度は７μＭ／ウエル）に加える。１０μｌの１ｘキナ
ーゼ緩衝液を陰性対照ウエルに加える。マイクロタイタープレート振盪器で振盪
しながら１５分間インキュベートする。 １３．５μｌの０．５ＭＥＤＴＡをすべてのウエルに加えることによりキナーゼ
反応を停止する。 １４．工程４に記載したようにＴＢＳＴで４回洗浄する。 １５．ＴＢＳＴ中で希釈したビオチンコンジュゲート化抗ホスホチロシンモノク
ローナル抗体（ｂ４Ｇ１０）１００μｌを各ウエルに加える。マイクロタイター
プレート振盪器で振盪しながら３０分間インキュベートする。 １６．Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ ＡＢＣ試薬を調製する。１滴の試薬Ａを１５ｍｌ
のＴＢＳＴに加える。管を数回逆さにすることにより混合する。１滴の試薬Ｂを
加え，再び混合する。 １７．工程４に記載したようにＴＢＳＴで４回洗浄する。 １８．１００μｌのＡＢＣ ＨＲＰ試薬を各ウエルに加える。マイクロタイター
プレート振盪器で振盪しながら３０分間インキュベートする。 １９．工程４に記載したようにＴＢＳＴで４回洗浄する。 ２０．１００μｌのＡＢＴＳ／Ｈ2Ｏ2溶液を各ウエルに加える。 ２２．振盪しながら５−１５分間インキュベートする。気泡を除去する。 ２３．必要ならば，１００μｌの０．２ＭＨＣｌ／ウエルを加えることにより 反応を停止させる。 ２４．アッセイをＤｙｎａｔｅｃｈ ＭＲ７０００ ＥＬＩＳＡプレートリーダ
ーで読む；試験フィルター：４１０ｎＭ，参照フィルター：６３０ｎＭ。
【０３０１】生化学的ＦＬＫ−１アッセイ このアッセイは，ＥＬＩＳＡを用いて，ｆｌｋ−１自己リン酸化活性をインビ
トロで評価する。
【０３０２】材料および試薬 １．１５ｃｍ組織培養皿 ２．Ｆｌｋ−１／ＮＩＨ細胞：ヒトｆｌｋ−１クローン３（ＳＵＧＥＮ，Ｉｎｃ
．，ＭＰＩ，Ｍａｒｔｉｎｓｒｉｅｄ，Ｇｅｒｍａｎｙより入手）を過剰発現す
るＮＩＨ繊維芽細胞株 ３．成長培地：ＤＭＥＭプラス熱不活性化１０％ＦＢＳおよび２ｍＭグルタミン
（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ） ４．飢餓培地：ＤＭＥＭプラス０．５％熱不活性化ＦＢＳ，２ｍＭグルタミン（
Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ） ５．Ｃｏｒｎｉｎｇ９６ウエルＥＬＩＳＡプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃａｔ．
Ｎｏ．２５８０５−９６） ６．ｆｌｋ−１に特異的なＬ４またはＥ３８モノクローナル抗体；蛋白質−Ａア
ガロースアフィニティークロマトグラフィーにより精製（ＳＵＧＥＮ，Ｉｎｃ．
） ７．ＰＢＳ（ダルベッコリン酸緩衝化食塩水）Ｇｉｂｃｏ Ｃａｔ．Ｎｏ．４５
０−１３００ＥＢ） ８．ＨＮＴＧ（調製については生化学的ＦＧＦＲを参照） ９．ＰｉｅｒｃｅＢＣＡ蛋白質検定キット １０．ブロッキング緩衝液 １１．ＴＢＳＴ（ｐＨ７．０） １２．キナーゼ緩衝液 １３．キナーゼ停止溶液：２００ｍＭＥＤＴＡ １４．ビオチニル化４Ｇ１０，ホスホチロシンに特異的（ＵＢＩ，Ｃａｔ．Ｎｏ
．Ｎｏ．１６−１０３） １５．ＡＢキット（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｃａｔ．Ｎｏ．
ＰＫ４０００） １６．ＤＭＳＯ １７．ＮＵＮＣ９６ウエルＶ底ポリプロピレンプレート（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃ
ｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃａｔ．Ｎｏ．ＡＳ−７２０９２） １８．Ｔｕｒｂｏ−ＴＭＢ（Ｐｉｅｒｃｅ） １９．Ｔｕｒｂｏ−ＴＭＢ停止溶液：１Ｍ Ｈ2ＳＯ4 ２０．ＡＴＰ（Ｓｉｇｍａ Ｃａｔ．Ｎｏ．Ａ−７６９９） ２１．２０％ＤＭＳＯ，ＴＢＳ（ｐＨ７．０）中
【０３０３】方法 細胞成長および溶解物調製 １．細胞を成長培地中に播種し，３７℃，５％ＣＯ2で９０−１００％コンフル
エントとなるまで２−３日間成長させる。２０継代を越えないこと。 ２．培地を除去し，細胞をＰＢＳで２回洗浄する。ＨＮＴＧ溶解緩衝液で溶解す
る。すべての溶解物を回収し，２０−３０秒間ボルテックス混合する。 ３．遠心分離（５−１０分間，約１０，０００ｘｇ）により不溶性物質を除去す
る。 ４．ＢＣＡキットを用いて蛋白質濃度を決定する。 ５．溶解物を１ｍｇのアリコートに分配し，−８０℃で保存する。
【０３０４】アッセイ方法 １．Ｃｏｒｎｉｎｇ９６ウエルＥＬＩＳＡプレートを，１００μｌのＰＢＳ中の
２μｇ／ウエルの精製Ｌ４（またはＥ３８）でコーティングする。４℃で一夜保
存する。 ２．プレートを逆さにして液体を除去することにより，未結合蛋白質をウエルか
ら除去する。ｄＨ2Ｏで１回洗浄し，プレートをペーパータオル上で軽くたたい
て過剰の液体を除去する。 ３．プレートをウエルあたり１５０μｌのブロッキング緩衝液でブロッキングす
る。４℃で振盪しながら４５−６０分間インキュベートする。 ４．ブロッキング緩衝液を除去し，ＥＬＩＳＡプレートをｄＨ2Ｏで３回，ＴＢ
ＳＴで１回洗浄する。プレートをペーパータオル上で軽くたたいて過剰の液体を
除去する。 ５．溶解物をＰＢＳ中で希釈して，最終濃度を５０μｇ／１００μｌとする。１
００μｌの希釈溶解物を各ウエルに加える。振盪しながら４℃で一夜インキュベ
ートする。 ６．プレートを逆さにすることにより未結合蛋白質をウエルから除去する。工程
４と同様に洗浄する。 ７．８０μｌのキナーゼ緩衝液をウエルに加える（陰性対照ウエルには９０μｌ
）。 ８．試験化合物をＴＢＳ中２０％ＤＭＳＯを含むポリプロピレンプレートのウエ
ル中で希釈する（通常は１０倍）。 ９．１０μｌの希釈化合物を固定化ｆｌｋ−１を含むＥＬＩＳＡウエルに加え，
振盪する。対照ウエルには化合物を加えない。 １０．１ｍＭＡＴＰ保存液から，ｄＨ2Ｏ中０．３ｍＭＡＴＰ溶液を調製する（
あるいは，キナーゼ緩衝液を用いてもよい）。 １１．陰性対照を除くすべてのウエルに１０μｌの０．３ｍＭＡＴＰを加える。
振盪しながら室温で６０分間インキュベートする。 １２．１時間後，１１μｌの２００ｍＭＥＤＴＡを加えることにより，キナーゼ
反応を停止させる。１−２分間振盪する。 １３．ＥＬＩＳＡプレートをｄＨ2Ｏで４回，ＴＢＳＴで２回洗浄する。 １４．１００μｌの１：５０００ビオチニル化４Ｇ１Ｏ：ＴＢＳＴをすべてのウ
エルに加える。振盪しながら室温で４５分間インキュベートする。 １５．上述のものをインキュベートしている間，ＡＢＣキットからの５０μｌの
溶液ＡおよびＢを１０ｍｌのＴＢＳＴに加える。これらの溶液は，使用の約３０
分前に混合しなければならない。 １６．工程４と同様にプレートを洗浄する。 １７．あらかじめ形成したＡとＢの複合体１００μｌをすべてのウエルに加える
。振盪しながら室温で３０分間インキュベートする。 １８．工程４と同様にプレートを洗浄する。 １９．１００μｌのＴｕｒｂｏ−ＴＭＢを加える。室温で１０−１５分間振盪す
る。 ２０．陽性対照ウエルの色が吸光度約０．３５−０．４に達したとき，１００μ
ｌのＴｕｒｂｏ−ＴＭＢ停止溶液で反応を停止する。 ２１．Ｄｙｎａｔｅｃｈ ＭＲ７０００ ＥＬＩＳＡリーダーでプレートを読む
。試験フィルター：４５０ｎＭ，参照フィルター：４１０ｎＭ。
【０３０５】ＨＵＶ−ＥＣ−Ｃアッセイ また，以下のプロトコルを用いて，ＰＤＧＦ−Ｒ，ＦＧＦ−Ｒ，ＶＥＧＦ，ａ
ＦＧＦまたはＦｌｋ−１／ＫＤＲ（これらはすべてＨＵＶ−ＥＣ細胞により天然
に発現されている）に対する化合物の活性を測定することができる。
【０３０６】第０日 １． ＨＵＶ−ＥＣ−Ｃ細胞（ヒト臍静脈内皮細胞，（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙ
ｐｅ Ｃｕｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ；カタログＮｏ．１７３０ＣＲＬ）
を洗浄し，トリプシン処理する。ダルベッコリン酸緩衝化食塩水（Ｄ−ＰＢＳ；
Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ；カタログＮｏ．１４１９０−０２９から入手）で２回，約
１ｍｌ／１０ｃｍ2組織培養フラスコで洗浄する。非酵素細胞解離溶液（Ｓｉｇ
ｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ；カタログＮｏ．Ｃ−１５４４）中で
０．０５％トリプシン−ＥＤＴＡでトリプシン処理する。０．０５％トリプシン
は，０．２５％トリプシン／１ｍＭＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ；カタログＮｏ．２５
２００−０４９）を細胞解離溶液中で希釈することにより作成する。約１ｍｌ／
２５−３０ｃｍ2組織培養フラスコで３７℃で約５分間トリプシン処理する。細
胞をフラスコからはがした後，等量のアッセイ培地を加え，５０ｍｌ滅菌遠心分
離管（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；カタログＮｏ．０５−５３９−６
）に移す。
【０３０７】 ２． ５０ｍｌ滅菌遠心分離管中にアッセイ培地を加えることにより，細胞を約
３５ｍｌのアッセイ培地で洗浄し，約２００ｇで１０分間遠心分離し，上清を吸
引し，３５ｍｌのＤ−ＰＢＳに再懸濁する。Ｄ−ＰＢＳでさらに２回洗浄し，細
胞を約１ｍｌ／組織培養フラスコ１５ｃｍ2のアッセイ培地に再懸濁する。アッ
セイ培地は，Ｆ１２Ｋ培地（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ；カタログＮｏ．２１１２７−
０１４）＋０．５％熱不活性化ウシ胎児血清からなる。Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｃｏｕ
ｎｔｅｒ（商標）（Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ，Ｉｎｃ．）で細
胞を計数し，アッセイ培地を細胞に加えて０．８−１．０ｘ１０5細胞／ｍｌの
濃度とする。
【０３０８】 ３． 細胞を９６ウエル平底プレートに１００μｌ／ウエルまたは０．８−１．
０ｘ１０4細胞／ウエルで加える；３７℃，５％ＣＯ2で約２４時間インキュベー
トする。
【０３０９】第１日 １． 試験化合物の２倍滴定を別々の９６ウエルプレート中に作成する。一般に
，５０μＭから０μＭまで。上述の第０日，工程２と同じアッセイ培地を用いる
。滴定は，９０μｌ／ウエルの試験化合物を２００μＭ（４Ｘ最終ウエル濃度）
で特定のプレートカラムの最上のウエルに加えることにより行う。試験化合物保
存液濃度は通常ＤＭＳＯ中２０ｍＭであるため，２００μＭの薬剤濃度は２％Ｄ
ＭＳＯを含む。
【０３１０】 ＤＭＳＯ濃度を一定に保持しながら薬剤を希釈するために，アッセイ培地中（
Ｆ１２Ｋ＋０．５％ウシ胎児血清）２％ＤＭＳＯとした希釈剤を，試験化合物滴
定の希釈剤として用いる。この希釈物をカラム中の残りのウエルに６０μｌ／ウ
エルで加える。カラムの最上ウエル中の１２０μｌの２００μＭ試験化合物希釈
物から６０μｌを採取し，カラムの第２のウエル中の６０μｌと混合する。この
ウエルから６０μｌを採取し，カラム中の第３のウエル中の６０μｌと混合し，
２倍滴定が完了するまでこれを続ける。最後から２番目のウエルが混合されたと
き，このウエル中の１２０μｌの６０μｌを採取し，これを廃棄する。最後のウ
エルには薬剤非含有対照として６０μｌのＤＭＳＯ／培地希釈物を加える。以下
のアッセイの，滴定する試験化合物の三重のウエルに十分な９つのカラムを作成
する：（１）ＶＥＧＦ（Ｐｅｐｒｏ Ｔｅｃｈ Ｉｎｃ．，から入手，カタログ
Ｎｏ．１００−２００，（２）内皮細胞成長因子（ＥＣＧＦ）（酸性繊維芽細胞
成長因子またはａＦＧＦとしても知られる）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎ
ｈｅｉｍ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａから入手，カタログＮｏ．１４３９６００）；
または（３）ヒトＰＤＧＦ Ｂ／Ｂ（１２７６−９５６，Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ
Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）およびアッセイ培地対照。ＥＣＧＦはヘ
パリンナトリウムを有する調製物として得た。
【０３１１】 ２． ５０μｌ／ウエルの試験化合物希釈物を，第０日からのＨＵＶ−ＥＣ−Ｃ
細胞０．８−１．０ｘ１０4細胞／１００μｌ／ウエルを含む９６ウエルアッセ
イプレートに移し，３７oＣ，５％ＣＯ2で約２時間インキュベートする。
【０３１２】 ３． 三重に，８０μｇ／ｍｌＶＥＧＦ，２０ｎｇ／ｍｌＥＣＧＦ，または各試
験化合物の条件に対する培地対照を５０μｌ／ウエルで加える。試験化合物につ
いては，成長因子濃度は所望の最終濃度の４倍である。第０日，工程２からのア
ッセイ培地を用いて，成長因子の濃度を調節する。３７℃，５％ＣＯ2で約２４
時間インキュベートする。各ウエルに５０μｌの試験化合物希釈物，５０μｌの
成長因子または培地，および１００μｌの細胞を加え，総量２００μｌ／ウエル
とする。すなわち，すべてをウエルに加えたとき，４倍濃度の試験化合物および
成長因子は１倍となる。
【０３１３】第２日 １． 3Ｈ−チミジン（Ａｍｅｒｓｈａｍ；カタログＮｏ．ＴＲＫ−６８６）を
１μＣｉ／ウエル（ＲＰＭＩ培地＋１０％熱不活性化ウシ胎児血清中で調製した
１００μＣｉ／ｍｌ溶液を１０μｌ／ウエル）で加え，３７℃，５％ＣＯ2で約
２４時間インキュベートする。ＲＰＭＩはＧｉｂｃｏ ＢＲＬから入手する，カ
タログＮｏ．１１８７５−０５１
【０３１４】第３日 １． プレートを−２０℃で一夜凍結する。
【０３１５】第４日 １． プレートを融解し，９６ウエルプレート回収器（Ｔｏｍｔｅｃ Ｈａｒｖ
ｅｓｔｅｒ９６（登録商標））でフィルターマット（Ｗａｌｌａｃ；カタログＮ
ｏ．１２０５−４０１）上に回収する；Ｗａｌｌａｃ Ｂｅｔａｐｌａｔｅ（商
標）液体シンチレーション計数機で計数する。
【０３１６】インビボ動物モデル 異種移植片動物モデル ヒト腫瘍が無胸腺マウス（例えば，Ｂａｌｂ／ｃ，ｎｕ／ｎｕ）中で異種移植
片として成長する能力は，ヒト腫瘍の治療に対する生物学的応答を研究するのに
有用なインビボモデルを提供する。ヒト腫瘍の無胸腺マウスへの最初の成功的な
異種移植（Ｒｙｇａａｒｄ ａｎｄ Ｐｏｖｌｓｅｎ，１９６９，Ａｃｔａ Ｐ
ａｔｈｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ．Ｓｃａｎｄ．７７：７５８−７６０）以来，
多くの異なるヒト腫瘍細胞株（例えば，***，肺，尿生殖器，胃腸，頭頸部，神
経膠芽細胞腫，骨，および悪性黒色腫）が移植され，ヌードマウス中での成長に
成功してきた。以下のアッセイを用いて，本発明の種々の化合物の活性，特異性
および効果のレベルを決定することができる。３種類の一般的アッセイ，すなわ
ち細胞／触媒，細胞／生物学的およびインビボアッセイが化合物の評価に有用で
ある。細胞／触媒アッセイの目的は，ＴＫが細胞中の既知の基質上のチロシンを
リン酸化する能力に及ぼす化合物の影響を判定することである。細胞／生物学的
アッセイの目的は，細胞中でＴＫにより刺激される生物学的応答に及ぼす化合物
の影響を判定することである。インビボアッセイの目的は，特定の疾患，例えば
癌の動物モデルにおける化合物の影響を判定することである。
【０３１７】 皮下異種移植片実験に適した細胞株としては，Ｃ６細胞（神経膠腫，ＡＴＣＣ
＃ＣＣＬ１０７），Ａ３７５細胞（黒色腫，ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ１６１９），Ａ４
３１細胞（類表皮癌腫，ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ１５５５），Ｃａｌｕ６細胞（肺，Ａ
ＴＣＣ＃ＨＴＢ５６），ＰＣ３細胞（前立腺，ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ１４３５），お
よびＥＧＦＲ，ＰＤＧＦＲ，ＩＧＦ−１Ｒまたは任意の他の試験キナーゼを過剰
発現するように遺伝子工学処理されたＳＫＯＶ３ＴＰ５細胞およびＮＩＨ３Ｔ３
繊維芽細胞が挙げられる。以下のプロトコルを用いて異種移植片実験を行うこと
ができる。
【０３１８】 雌無胸腺マウス（ＢＡＬＢ／ｃ，ｎｕ／ｎｕ）はＳｉｍｏｎｓｅｎ Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｇｉｌｒｏｙ，ＣＡ）から入手する。すべての動物は，クリ
ーンルーム条件下で，マイクロアイソレーターケージでアルファドライ敷きわら
で維持する。動物には，滅菌齧歯類食および水を任意に与える。
【０３１９】 細胞株は，適当な培地（例えば，ＭＥＭ，ＤＭＥＭ，Ｈａｍ'ｓＦ１０，また
はＨａｍ'ｓＦ１２プラス５％−１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）および２ｍＭグ
ルタミン（ＧＬＮ））中で成長させる。すべての細胞培養培地，グルタミン，お
よびウシ胎児血清は，特に断らない限り，Ｇｉｂｃｏ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏ
ｌｏｇｉｅｓ（Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）から購入する。すべての細胞
は，９０−９５％空気および５−１０％ＣＯ2の湿潤環境下で３７℃で成長させ
る。すべての細胞株は，週に２回，定期的に継代し，Ｍｙｃｏｔｅｃｔ法（Ｇｉ
ｂｃｏ）により判定して，マイコプラズマについては陰性である。
【０３２０】 細胞は，コンフルエント，またはそれに近い状態で，０．０５％トリプシン−
ＥＤＴＡで回収し，４５０ｘｇで１０分間ペレット化する。ペレットを滅菌ＰＢ
Ｓまたは培地（ＦＢＳなし）中に懸濁して特定の濃度とし，細胞をマウス（１群
あたり，８−１０匹のマウス，２−１０ｘ１０6細胞／動物）の後側腹部内に移
植する。腫瘍成長は，ベニエカリパスを用いて３−６週間にわたり測定する。腫
瘍体積は，とくに記載のないかぎり，長さｘ幅ｘ高さの積として計算する。Ｐ値
は，スチューデントｔ−テストを用いて計算する。５０−１００μｌの賦形剤（
ＤＭＳＯ，またはＶＰＤ：Ｄ５Ｗ）中の試験化合物は，通常は移植後の第１日か
ら初めて，異なる濃度でＩＰ注入により輸送することができる。
【０３２１】腫瘍侵襲モデル 以下の腫瘍侵襲モデルが開発されており，ＫＤＲ／ＦＬＫ−１レセプターを選
択的に阻害すると同定された化合物の治療的価値および有効性を評価するために
用いることができる。
【０３２２】方法 ８週齢のヌードマウス（雌）（ＳｉｍｏｎｓｅｎＩｎｃ．）を実験動物として
用いる。腫瘍細胞の移植は，層流フード内で行うことができる。麻酔用に，キシ
ラジン／ケタミンカクテル（１００ｍｇ／ｋｇケタミンおよび５ｍｇ／ｋｇキシ
ラジン）を腹膜内に投与する。中線切開を行って，腹腔を露出して（約１．５ｃ
ｍの長さ），容量１００μｌの培地中の１０7個の腫瘍細胞を注入する。細胞は
，膵臓の十二指腸葉または結腸の漿膜下に注入する。腹膜および筋肉を６−０絹
連続縫糸により縫合し，皮膚は創傷クリップを用いて縫合する。動物は毎日観察
する。
【０３２３】分析 動物の全体的所見により２−６週間後，マウスを殺し，局所腫瘍の種々の臓器
（肺，肝臓，脳，胃，脾臓，心臓，筋肉）への転移を調べ，分析する（腫瘍サイ
ズ，侵襲の程度，免疫化学，およびインサイチオハイブリダイゼーション測定）
。
【０３２４】細胞毒性の測定 治療用化合物は，細胞毒性効果を発揮するよりも，蛋白質キナーゼ活性の阻害
においてより強力であるべきである。ある化合物の有効性および細胞毒性の尺度
は，治療指数，すなわちＩＣ50／ＬＤ50を決定することにより得ることができる
。５０％阻害を達成するのに必要な用量ＩＣ50は，標準的な技術，例えば本明細
書に記載される技術を用いて測定することができる。５０％毒性を与える用量Ｌ
Ｄ50もまた，標準的な技術を用いて（Ｍｏｓｓｍａｎ，１９８３，Ｊ．Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，６５：５５−６３），放出されたＬＤＨの量を測定す
ることにより（Ｋｏｒｚｅｎｉｅｗｓｋｉ ａｎｄ Ｃａｌｌｅｗａｅｒｔ，１
９８３，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，６４：３１３；Ｄｅｃｋｅｒ
ａｎｄ Ｌｏｈｍａｎｎ−Ｍａｔｔｈｅｓ，１９８８，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍ
ｅｔｈｏｄｓ，１１５：６１），または動物モデルにおける致死量を測定するこ
とにより，測定することができる。高い治療指数を有する化合物が好ましい。治
療指数は，２より大きくなくてはならず，好ましくは少なくとも１０，より好ま
しくは少なくとも５０である。
【０３２５】結論 以上のように，３−ヘテロアリーリデニル−２−インドリノンは，種々の化学
療法剤，特にフッ化ピリミジン化合物の化学療法的有効性に有益な効果を有する
ことが予測されることが理解されるであろう。さらに，３−［（２，４−ジメチ
ルピロール−５−イル）メチレン］−２−インドリノンとフルオロウラシルまた
はフルオロウラシル／ロイコボリンとの組み合わせは，直腸結腸癌の治療用の有
効な化学療法的組み合わせであると予測される。
【０３２６】 また，本発明の化合物，方法および医薬組成物は，ＲＰＫおよびＣＴＫ活性を
調節すると予測され，したがって，ＲＴＫおよびＣＴＫ関連疾患に対する治療薬
として有効であると予測されることが理解されるであろう。
【０３２７】 当業者は，本発明は，その目的を実施し，記載される結果および利点，ならび
に本明細書に固有のものを得るのによく適合していることを容易に理解するであ
ろう。本明細書に記載される分子複合体および方法，手順，処理，分子，特定の
化合物は，現在のところ好ましい態様の代表的なものであり，例示的なものであ
って，本発明の範囲を限定することを意図するものではない。当業者は，特許請
求の範囲において定義される本発明の精神の中に包含される変更および他の用途
をなすであろう。
【０３２８】 当業者は，本発明の範囲および精神から逸脱することなく，本明細書に開示さ
れる本発明に対して種々の置換および変更をなすことが可能であることを容易に
理解するであろう。
【０３２９】 本明細書において言及されるすべての特許および刊行物は，本発明の属する技
術分野の技術者のレベルを示す。すべての特許および刊行物は，それぞれの刊行
物が特定的に個々に本明細書の一部としてここに引用されることと同じ程度に，
本明細書の一部として引用される。
【０３３０】 本明細書に例示的に記載されている発明は，本明細書に特定的に開示されてい
ない任意の要素または限定なしでも適切に実施することができる。すなわち，例
えば，本明細書における各例において，"・・・を含む"，"・・・から本質的に
なる"および"・・・からなる"との用語は，他の２つのいずれかと置き換えるこ
とができる。本明細書において用いた用語および表現は，説明の用語として用い
るものであり，限定ではない。そのような用語および表現の使用においては，示
されかつ記載されている特徴またはその一部の等価物を排除することを意図する
ものではない。特許請求の範囲に記載される本発明の範囲中で種々の変更が可能
であることが理解される。すなわち，好ましい態様および任意の特徴により本発
明を特定的に開示してきたが，当業者には本明細書に記載される概念の変更およ
び変種が可能であり，そのような変更および変種も特許請求の範囲に定義される
本発明の範囲内であると考えられることが理解されるべきである。
【０３３１】 さらに，発明の特徴および観点がマーカッシュグループの用語で記載されてい
る場合，当業者は，本発明が，マーカッシュグループのメンバーの個々のメンバ
ーまたはサブグループに関してもまた記載されていることを認識するであろう。
例えば，Ｘが，臭素，塩素およびヨウ素からなる群より選択されるとして記載さ
れている場合，Ｘが臭素である特許請求の範囲およびＸが臭素および塩素である
特許請求の範囲も完全に記載されている。
【０３３２】 他の態様も特許請求の範囲の範囲内である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ， ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，Ｃ Ｚ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ， ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，Ｌ Ｒ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ， ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，Ｔ Ｒ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (71)出願人 230 Ｅａｓｔ Ｇｒａｎｄ Ａｖｅｎｕ ｅ，Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓ ｃｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ 94080，Ｕ ｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅ ｒｉｃａ (72)発明者 ショーヴァー，ローラ・ケイ アメリカ合衆国 カリフォルニア州 94112， サンフランシスコ， コッタ ー・ストリート， 216 (72)発明者 タン，ペン・チョー アメリカ合衆国 カリフォルニア州 94556， モラーガ， カミーノ・リカル ド， 827 (72)発明者 スン，リ アメリカ合衆国 カリフォルニア州 94404， フォスター・シティ， ロック ハーバー・レイン， 64 Ｆターム(参考） 4C086 AA01 AA02 BC13 BC42 BC43 GA02 GA07

Claims (29)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 癌を治療する方法であって，そのような治療を必要とする患
    者に，治療上有効量のフッ化ピリミジン化学療法剤および次の化学構造： 【化１】 ［式中，Ｒ1はＨまたはアルキルであり； Ｒ2はＯまたはＳであり； Ｒ3は水素であり； Ｒ4，Ｒ5，Ｒ6，およびＲ7は，それぞれ独立して，水素，アルキル，アルコキシ
    ，アリール，アリールオキシ，アルカリール，アルカリールオキシ，ハロゲン，
    トリハロメチル，Ｓ（Ｏ）Ｒ，ＳＯ2ＮＲＲ’，ＳＯ3Ｒ，ＳＲ，ＮＯ2，ＮＲＲ
    ’，ＯＨ，ＣＮ，Ｃ（Ｏ）Ｒ，ＯＣ（Ｏ）Ｒ，（ＣＨ2）nＣＯ2Ｒ，およびＣＯ
    ＮＲＲ’からなる群より選択され； Ａは，チオフェン，ピロール，ピラゾール，イミダゾール，１，２，３−トリア
    ゾール，１，２，４−トリアゾール，オキサゾール，イソオキサゾール，チアゾ
    ール，イソチアゾール，２−スルホニルフラン，４−アルキルフラン，１，２，
    ３−オキサジアゾール，１，２，４−オキサジアゾール，１，２，５−オキサジ
    アゾール，１，３，４−オキサジアゾール，１，２，３，４−オキサトリアゾー
    ル，１，２，３，５−オキサトリアゾール，１，２，３−チアジアゾール，１，
    ２，４−チアジアゾール，１，２，５−チアジアゾール，１，３，４−チアジア
    ゾール，１，２，３，４−チアトリアゾール，１，２，３，５−チアトリアゾー
    ル，およびテトラゾールからなる群より選択される五員のヘテロアリール環であ
    り，これらは１またはそれ以上の位置において，アルキル，アルコキシ，アリー
    ル，アリールオキシ，アルカリール，アルカリールオキシ，ハロゲン，トリハロ
    メチル，Ｓ（Ｏ）Ｒ，ＳＯ2ＮＲＲ’，ＳＯ3Ｒ，ＳＲ，ＮＯ2，ＮＲＲ’，ＯＨ
    ，ＣＮ，Ｃ（Ｏ）Ｒ，ＯＣ（Ｏ）Ｒ，（ＣＨ2）nＣＯ2Ｒ，またはＣＯＮＲＲ’
    で任意に置換されていてもよく； ｎは０−３であり；および， ＲおよびＲ’は，独立して，Ｈ，アルキルまたはアリールからなる群より選択さ
    れる］ を有する治療上有効量の化合物またはその生理学的に許容しうる塩またはプロド
    ラッグを投与することを含む方法。
  2. 【請求項２】 前記化合物が，５−ヒドロキシ−３−［（２，４−ジメチル
    ピロール−５−イル）メチリデニル］−２−インドリノン，４−メチル−５−（
    ２−オキソ−１，２−ジヒドロインドール−３−イリデンメチル）−１Ｈ−ピロ
    ール−２−カルボン酸，４−メチル−５−（２−オキソ−１，２−ジヒドロイン
    ドール−３−イリデンメチル）−１Ｈ−ピロール−２−カルボン酸メチルエステ
    ル，３−（５−ヒドロキシメチル−３−メチル−１Ｈ−ピロール−２−イルメチ
    レン）−１，３−ジヒドロインドール−２−オンおよび４−メチル−５−（２−
    オキソ−１，２−ジヒドロインドール−３−イリデンメチル）−１Ｈ−ピロール
    −２−カルボアルデヒドまたはそれらの生理学的に許容しうる塩またはプロドラ
    ッグからなる群より選択される，請求項１記載の方法。
  3. 【請求項３】 前記化合物が３−［４−（２−カルボキシエチル−３，５−
    ジメチルピロール−２−イル）メチリデニル］−２−インドリノンである，請求
    項１記載の方法。
  4. 【請求項４】 前記化合物が３−［（２，４−ジメチルピロール−５−イル
    ）メチリデニル］−２−インドリノンである，請求項１記載の方法。
  5. 【請求項５】 前記フッ化ピリミジン化学療法剤が，カルモフール，ドキシ
    フルリジン，フルオロウラシル，フロキシウリジン，テガフール，カペシタビン
    およびウラシル−フトラフールからなる群より選択される，請求項１記載の方法
    。
  6. 【請求項６】 前記フッ化ピリミジン化学療法剤がフルオロウラシルである
    ，請求項１記載の方法。
  7. 【請求項７】 治療上有効量のロイコボリンを前記患者に投与することをさ
    らに含む，請求項６記載の方法。
  8. 【請求項８】 前記癌が，乳癌，胃癌，卵巣癌，腎臓癌，肝臓癌，膵臓癌，
    膀胱癌，前立腺癌および直腸結腸癌からなる群より選択される，請求項１記載の
    方法。
  9. 【請求項９】 直腸結腸癌を治療する方法であって，そのような治療を必要
    とする患者に，治療上有効量のフルオロウラシルおよび治療上有効量の３−［（
    ２，４−ジメチルピロール−５−イル）メチリデニル］−２−インドリノンを投
    与することを含む方法。
  10. 【請求項１０】 治療上有効量のロイコボリンを前記患者に投与することを
    さらに含む，請求項９記載の方法。
  11. 【請求項１１】 前記治療上有効量の前記フルオロウラシルが約４００ｍｇ
    ／ｍ2−約５００ｍｇ／ｍ2で含まれる，請求項９記載の方法。
  12. 【請求項１２】 前記治療上有効量の前記フルオロウラシルが非経口的に投
    与される，請求項９記載の方法。
  13. 【請求項１３】 前記治療上有効量の前記３−［（２，４−ジメチルピロー
    ル−５−イル）メチリデニル］−２−インドリノンが，１回の処置あたり約４ｍ
    ｇ／ｍ2−１９０ｍｇ／ｍ2で含まれる，請求項９記載の方法。
  14. 【請求項１４】 前記治療上有効量の前記３−［（２，４−ジメチルピロー
    ル−５−イル）メチリデニル］−２−インドリノンが１回の処置あたり約７２ｍ
    ｇ／ｍ2−約１４５ｍｇ／ｍ2で含まれる，請求項９記載の方法。
  15. 【請求項１５】 ３−［（２，４−ジメチルピロール−５−イル）メチリデ
    ニル］−２−インドリノンおよび少なくとも１つの他の化学療法剤の組み合わせ
    を含む，癌を治療する方法。
  16. 【請求項１６】 前記他の化学療法剤が，カペシタビン，５−ＦＵ，ＵＦＴ
    ，カルボプラチン，シスプラチン，オキサリプラチン，パクリタキセル，ドセタ
    キセル，ポリグルタミン酸化タキサン，イリノテカン，サリドマイド，ＣＯＸ−
    ２阻害剤，タモキシフェン，ロイプロリド，アンジオスタチン，エンドスタチン
    ，マトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤，インターフェロン，ドキソルビシン
    ，リポソーム性ドキソルビシン，ダウノルビシン，メトキサントロン，エストラ
    ムチンおよびビンカアルカロイド，またはこれらの組み合わせからなる群より選
    択される，請求項１５記載の方法。
  17. 【請求項１７】 ５−ヒドロキシ−３−［（２，４−ジメチルピロール−５
    −イル）メチリデニル］−２−インドリノン，４−メチル−５−（２−オキソ−
    １，２−ジヒドロインドール−３−イリデンメチル）−１Ｈ−ピロール−２−カ
    ルボン酸，４−メチル−５−（２−オキソ−１，２−ジヒドロインドール−３−
    イリデンメチル）−１Ｈ−ピロール−２−カルボン酸メチルエステル，３−（５
    −ヒドロキシメチル−３−メチル−１Ｈ−ピロール−２−イルメチレン）−１，
    ３−ジヒドロインドール−２−オンおよび４−メチル−５−（２−オキソ−１，
    ２−ジヒドロインドール−３−イリデンメチル）−１Ｈ−ピロール−２−カルボ
    アルデヒドからなる群より選択される３−ヘテロアリーリデニル−２−インドリ
    ノン化合物またはその生理学的に許容しうる塩またはプロドラッグ。
  18. 【請求項１８】 蛋白質キナーゼの触媒活性を調節する方法であって，前記
    蛋白質キナーゼを請求項１７記載の化合物，塩またはプロドラッグと接触させる
    ことを含む方法。
  19. 【請求項１９】 前記蛋白質キナーゼが，レセプター蛋白質チロシンキナー
    ゼ，細胞性チロシンキナーゼおよびセリン−トレオニンキナーゼからなる群より
    選択される，請求項１８記載の方法。
  20. 【請求項２０】 請求項１７記載の化合物，塩またはプロドラッグ；および
    ，薬学的に許容しうる担体または賦形剤を含む医薬組成物。
  21. 【請求項２１】 患者において蛋白質キナーゼ関連疾患を治療または予防す
    る方法であって，治療上有効量の請求項１７記載の化合物，塩またはプロドラッ
    グを前記患者に投与することを含む方法。
  22. 【請求項２２】 前記蛋白質キナーゼ関連疾患が，レセプター蛋白質チロシ
    ンキナーゼ関連疾患，細胞性チロシンキナーゼ関連疾患およびセリン−トレオニ
    ンキナーゼ関連疾患からなる群より選択される，請求項２１記載の方法。
  23. 【請求項２３】 前記蛋白質キナーゼ関連疾患が，ＥＧＦＲ関連疾患，ＰＤ
    ＧＦＲ関連疾患，ＩＧＦＲ関連疾患およびｆｌｋ関連疾患からなる群より選択さ
    れる，請求項２１記載の方法。
  24. 【請求項２４】 前記蛋白質キナーゼ関連疾患が，扁平上皮癌，星状細胞腫
    ，神経膠芽細胞腫，肺癌，膀胱癌，頭頸部癌，黒色腫，卵巣癌，前立腺癌，乳癌
    ，小細胞肺癌および神経膠腫からなる群より選択される癌である，請求項２１記
    載の方法。
  25. 【請求項２５】 前記蛋白質キナーゼ関連疾患が，糖尿病，自己免疫疾患，
    過増殖疾患，再狭窄，線維症，乾癬，変形性関節症，慢性関節リウマチ，炎症性
    疾患および新脈管形成からなる群より選択される，請求項２１記載の方法。
  26. 【請求項２６】 癌を治療する方法であって，治療を必要とする患者に，治
    療上有効量のゲムシタビンおよび治療上有効量の３−［（２，４−ジメチルピロ
    ール−５−イル）メチリデニル］−２−インドリノンを投与することを含む方法
    。
  27. 【請求項２７】 前記癌が膵臓癌である，請求項２６記載の方法。
  28. 【請求項２８】 治療上有効量のパクリタキセル，カルボプラチン，リポソ
    ーム性ドキソルビシン，またはトポテカンをさらに含む，請求項２６記載の方法
    。
  29. 【請求項２９】 前記癌が，卵巣癌，小細胞肺癌および腎臓癌からなる群よ
    り選択される，請求項２６記載の方法。
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