CN104740610A - Pd-1拮抗剂及其使用方法 - Google Patents

Abstract

提供了用于增强和/或延长T细胞活化(即提高T细胞的抗原特异性增殖、增强T细胞的细胞因子生成、刺激T细胞的分化和效应器功能和/或促进T细胞存活)或克服T细胞衰竭和/或无反应性的组合物和方法。合适的组合物包括结合及阻断内源PD-1受体且不触发来自PD-1的抑制信号，或者结合及阻断PD-1受体配体及阻止它们与PD-1受体相互作用的PD-1受体拮抗剂。提供了使用PD-1受体拮抗剂来增强有所需要的受试者中的免疫应答的方法。

Description

PD-1拮抗剂及其使用方法

本申请是中国申请200980142349.6的分案申请，该母案的国际申请日为2009年8月25日，本分案采用了与该母案一致的发明名称。

对相关申请的交叉引用

本申请要求均在2008年8月25日提交的美国临时申请No.61/091,502、61/091,694、61/091,709和61/091,705，在2009年1月5日提交的美国临时申请No.61/142,548，及在2009年4月1日提交的美国临时申请No.61/165,652的优先权和利益，而且在允许的情况中通过述及而完整收录。

发明领域

本发明涉及用于调控T细胞活化的组合物和方法，特别是用于增强T细胞活化的组合物和方法。

发明背景

抗原特异性T细胞应答是由两种信号介导的：1)T细胞受体(TCR)与在MHC背景中呈递的抗原性肽的衔接(信号1)，及2)通过不同受体/配体对之间的接触递送的第二抗原独立信号(信号2)。这种“第二信号”在决定T细胞应答的类型(活化对抑制)以及该应答的强度和持续时间方面是至关重要的，而且受来自共刺激分子，诸如B7蛋白质家族的正和负两种信号调节。最广泛表征的T细胞共刺激途径是B7-CD28，其中B7-1(CD80)和B7-2(CD86)各自能参与活化CD28受体和抑制性CTLA-4(CD152)受体。与经由T细胞受体的信号传导联合，CD28连接提高T细胞的抗原特异性增殖，增强细胞因子的生成，激活分化和效应器功能，及促进T细胞的存活(Lenshow等,Annu.Rev.Immunol.,14:233-258(1996)；Chambers和Allison,Curr.Opin.Immunol.,9:396-404(1997)；及Rathmell和Thompson,Annu.Rev.Immunol.,17:781-828(1999))。相反，认为经由CTLA-4的信号传导递送抑制T细胞增殖、IL-2生成和细胞周期行进的负信号(Krummel和Allison,J.Exp.Med.,183:2533-2540(1996)；及Walunas等,J.Exp.Med.,183:2541-2550(1996))。B7家族的其它成员包括PD-L1(Dong等,Nature Med.,5:1365-1369(1999)；及Freeman等,J.Exp.Med.,192:1-9(2000))、PD-L2(Tseng等,J.Exp.Med.,193:839-846(2001)；及Latchman等,Nature Immunol.,2:261-268(2001))、B7-H2(Wang等,Blood,96:2808-2813(2000)；Swallow等,Immunity,11:423-432(1999)；及Yoshinaga等,Nature,402:827-832(l999))、B7-H3(Chapoval等,Nature Immunol.,2:269-274(2001))和B7-H4(Choi等,J.Immunol.,171:4650-4654(2003)；Sica等,Immunity,18:849-861(2003)；Prasad等,Immunity,18:863-873(2003)；及Zang等,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,100:10388-10392(2003))。B7-H5是B7家族的一个相对较新发现的成员。B7-H5记载于PCT公开号为WO 2006/012232的文件中。功能研究指示B7-H5是T细胞活性的正调节物，发挥活化T细胞的功能。

PD-L1和PD-L2是PD-1(程序性细胞死亡-1)的配体，B7-H2是ICOS的配体，而B7-H3、B7-H4和B7-H5此时仍然是孤儿配体(Dong等,Immunol.Res.,28:39-48(2003))。

大多数B7家族分子在细胞表面上表达，具有近膜恒定IgC结构域和远膜IgV结构域。这些配体的受体共享共同的细胞外IgV样结构域。受体-配体对的相互作用主要经由配体和受体的IgV结构域中的残基来介导(Schwartz等,Nature Immunol.,3:427434(2002))。通常，IgV结构域被描述为具有两个片层，每个含有一层β链(Williams和Barclay,Annu.Rev.Immunol.,6:381-405(1988))。CTLA-4的前和后片层分别含有链A’GFC’C和ABEDC”(Ostrov等,Science,290:816-819(2000))，而B7IgV结构域的前和后片层分别包含链AGFCC’C”和BED(Schwartz等,Nature,410:604-608(2001)；Stamper等,Nature,410:608-611(2001)；及Ikemizu等,Immunity,12:51-60(2000))。结晶学分析揭示了CTLA-4/B7结合界面受来自CTLA-4包含MYPPPY基序的CDR3类似环与B7上主要由G、F、C、C’和C”链形成的表面的相互作用支配(Schwartz等,Nature,410:604-608(2001)；及Stamper等,Nature,410:608-611(2001))。来自氨基酸同源性、突变和计算机建模的数据给这种基序也是CD28的主要B7结合位点的观念提供了支持(Bajorath等,J.Mol.Graph.Model.,15:135-139(1997))。虽然MYPPPY基序在ICOS中不保守，但是研究指示具有序列FDPPPF且位于类似位置的一种相关基序是ICOS结合B7-H2的主要决定子(Wand等,J.Exp.Med.,195:1033-1041(2002))。

PD-L2(也称作B7-DC)是B7家族的一个相对较新的成员，而且具有与PD-L1(也称作B7-H1)约34％相同的氨基酸序列。人和小鼠PD-L2直向同源物共享约70％氨基酸同一性。虽然在多种组织中找到了PD-L1和PD-L2转录物(Dong等,Nature Med.,5:1365-1369(1999)；Latchman等,Nature Immunol.,2:261-268(2001)；及Tamura,Blood,97:1809-1816(2001))，但是这两种蛋白质的表达谱是相当不同的。虽然在巨噬细胞样细胞以外的正常组织中基本上没找到PD-L1蛋白的表达，但是可以在多种组织和细胞类型中诱导PD-L1蛋白的表达(Dong等,Nature Med.,5:1365-1369(1999)；和Ishida等,Immunol.Lett.,84:57-62(2000))。相反，PD-L2只在树突细胞和单核细胞中表达。

已经显示了PD-L1和PD-L2都结合PD-1(Freeman等,J.Exp.Med.,192:1027–1034(2000))，CD28家族的一个远亲成员，在它的细胞质结构域中有免疫受体基于酪氨酸的抑制性基序(ITIM)(Ishida等,EMBO J.,11:3887–3895(1992))。PD-1在淋巴细胞的一个亚类上表达，而且在活化后的T、B和髓样细胞上上调(Agata等,Int.Immunol.,8:765–772(1996))。PD-1在其结合由主要组织相容性复合物(MHC)呈递的肽抗原后起拮抗TCR下游信号转导的作用。认为PD-1信号传导需要其结合极近于TCR:MHC复合物的配体，这在T细胞与抗原呈递细胞之间的免疫学联会时发生(Freeman,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A,105:10275-10276(2008))。PD-1被其配体连接的主要结果是抑制TCR下游的信号传导。因此，经由PD-1的信号转导通常给T细胞提供遏制或抑制信号，导致降低的T细胞增殖或T细胞活性的其它降低。

PD-1^-/-小鼠的表型提供了PD-1在体内是免疫应答的负调节物的直接证据。在PD-1缺失下，C57BL/6背景的小鼠缓慢形成狼疮样肾小球肾炎和渐进性关节炎(Nishimura等,Immunity,11:141–151(1999))。BALB/c背景的PD-1^-/-小鼠迅速形成致命的自身免疫性扩张型心肌病(Nishimura等,Science.291:319–322(2001))。然而，有力的证据表明PD-L2能发挥活化T细胞应答的功能。在次优TCR信号存在下，PD-L2在体外刺激升高的增殖和细胞因子生成(Tseng等,J.Exp.Med.193:839–846(2001))。另一方面，体外研究表明了PD-L2在T细胞应答中的负调节作用。这些表面上矛盾的数据通过T细胞上PD-L2而非PD-1的别的受体的表达得到最好的解释。

PD-L1是引起T细胞中抑制性信号转导的主要PD-1配体。由于认为PD-1信号传导需要其结合极近于TCR:MHC复合物的PD-1配体(通常是PD-L1)，因此阻断PD-1受体与其内源配体相互作用(或是通过阻断受体或是通过抑制其配体，并因此阻止T细胞膜上PD-1和TCR共连接)的蛋白质、抗体或小分子是所涵盖的有用PD-1拮抗剂。

因此，本发明的一个目的是提供用于抑制经由T细胞上PD-1的信号转导的组合物和方法。

本发明的另一个目的是提供结合PD-1但不活化PD-1信号转导的PD-1拮抗剂。

本发明的另一个目的是提供结合PD-1配体及抑制或降低该配体与PD-1相互作用的PD-1拮抗剂。

本发明的另一个目的是提供结合PD-1受体且不参与经由PD-1受体的信号转导，结合PD-1配体及抑制或降低该配体与PD-1受体相互作用，及任选地经由另一受体途径活化T细胞的PD-1拮抗剂。

本发明的另一个目的是提供含有载体的细胞，其表达编码PD-1的拮抗剂多肽的核酸分子。

本发明的还有一个目的是提供用于增强和/或延长T细胞活化或克服T细胞衰竭和/或T细胞无反应性的方法，其通过使它们接触结合PD-1且不活化PD-1，或结合PD-1的配体且抑制或降低该配体与PD-1受体相互作用的多肽来进行。

本发明的还有一个目的是提供给有所需要的哺乳动物施用PD-1的拮抗剂多肽、编码PD-1的拮抗剂多肽的核酸或经编码PD-1的拮抗剂多肽的核酸转染或转导的细胞的方法。

本发明的还有一个目的是提供加强针对抗原或疫苗的免疫应答的方法，其通过与该抗原或疫苗组合地施用PD-1的拮抗剂多肽来进行。

发明概述

提供了用于增强和/或延长T细胞活化(即提高T细胞的抗原特异性增殖，增强T细胞的细胞因子生成，刺激T细胞的分化和效应器功能和/或促进T细胞存活)或克服T细胞衰竭和/或无反应性的组合物和方法。代表性的组合物包括结合及阻断免疫细胞上的内源PD-1且不触发来自PD-1的抑制信号的PD-1拮抗剂。在其它实施方案中，组合物包括结合及阻断PD-1配体并由此阻止它们与PD-1相互作用的PD-1拮抗剂。提供了使用PD-1拮抗剂来增强有所需要的受试者中免疫应答的方法。

结合及阻断免疫细胞(优选T细胞)上的内源PD-1的PD-1拮抗剂包括PD-L1和PD-L2多肽、其PD-1结合片段、PD-1抗体、融合蛋白、及其变体。这些PD-1拮抗剂在生理条件下结合PD-1及阻断T细胞抑制。

结合天然PD-1配体的PD-1拮抗剂包括PD-1和B7.1多肽、其片段、抗体和融合蛋白。这些PD-1拮抗剂结合B7-H1和B7-DC及阻止它们触发经由免疫细胞上PD-1的抑制性信号转导。

在一个优选的实施方案中，B7-DC和B7-H1多肽或其变体偶联其它多肽以形成融合蛋白，其通过结合PD-1受体且不引起经由PD-1的信号转导来拮抗PD-1受体。通常，融合多肽具有第一融合配偶，其具有整个或部分B7-DC或B7-H1或其变体，其(i)直接融合第二多肽，或(ii)任选地，融合接头肽序列，该接头肽序列融合第二多肽。融合配偶的存在能改变多肽的溶解度、亲和力和/或效价。在某些实施方案中，B7-DC、B7-H1或其变体融合一个或多个Ig重链恒定区结构域，优选具有与人免疫球蛋白Cγ1链的铰链、C_H2和C_H3区对应的氨基酸序列。提供了使用B7.1和PD-1的类似融合蛋白。

还提供了编码PD-1受体拮抗剂多肽和融合蛋白的核酸和在载体中包含此类核酸的宿主细胞。

还提供了含有所公开的PD-1受体拮抗剂的免疫原性组合物。免疫原性组合物包括抗原、PD-1受体拮抗剂的来源和任选的佐剂。合适的抗原包括病毒、细菌、寄生物、环境和肿瘤抗原。

提供了使用PD-1受体拮抗剂来降低T细胞抑制和/或延长T细胞活化或克服T细胞衰竭和/或无反应性的方法。提供了PD-1受体拮抗剂和编码它们的核酸的治疗用途。PD-1受体拮抗剂组合物可用于增强针对癌症的免疫应答。PD-1受体拮抗剂组合物还可用于刺激免疫受遏制受试者的免疫应答。在某些实施方案中，PD-1受体拮抗剂组合物与疫苗联合施用。

更具体地，本发明涉及：

1.一种调控免疫应答的方法，其包括施用有效量的PD-1拮抗剂来诱导、提升或增强针对肿瘤的免疫应答，其中分子的剂量、分子的施用时机和/或分子的亲和力容许配体间歇到达PD-1受体。

2.项1的方法，其中所述PD-1拮抗剂抑制或降低内源PD-L1结合PD-1。

3.项1的方法，其中所述PD-1拮抗剂抑制或降低内源PD-L2结合PD-1。

4.项1的方法，其中所述PD-1拮抗剂结合PD-1。

5.项1的方法，其中所述PD-1拮抗剂选自PD-1、PD-L1、PD-L2、B7.1及其片段。

6.项1的方法，其中体内施用后所述分子结合PD-1或其配体三个月或更短。

7.项1的方法，其中施用多于一种PD-1拮抗剂。

8.项1的方法，其中所述肿瘤是自选自下组的癌症形成的：膀胱、脑、***、子宫颈、结直肠、食管、肾、肝、肺、鼻咽、胰、***、皮肤、胃、子宫、卵巢、睾丸和血液。

9.项1的方法，其进一步包括与所述PD-1拮抗剂组合地施用肿瘤抗原以增强针对肿瘤的免疫应答。

10.项1的方法，其中所述PD-1拮抗剂是PD-1配体的融合蛋白。

11.项10的方法，其中所述融合蛋白包含能够结合PD-1的PD-L2细胞外结构域或其片段。

12.项11的方法，其中所述融合蛋白具有SEQ ID NO:57的氨基酸序列。

13.项1的方法，其进一步包括与所述PD-1拮抗剂一起施用选自下组的别的活性剂：免疫调控剂，消减Tregs或抑制Tregs功能的药剂和共刺激分子。

14.项17的方法，其中所述别的活性剂是消减CD4+CD25+Tregs或抑制CD4+CD25+Tregs功能的药剂。

15.项17的方法，其中所述消减CD4+CD25+Tregs或抑制CD4+CD25+Tregs功能的药剂是环磷酰胺。

16.项1的方法，其用于增强抗原呈递细胞功能，其包括使APC接触PD-1拮抗剂，其量有效抑制、降低或阻断APC中的PD-1信号转导或增强的患病APC的清除。

17.一种组合物，其包含有效量的PD-1受体拮抗剂，以在体内结合PD-1受体的配体及降低或抑制PD-1受体信号转导。

18.项17的组合物，其中所述PD-1拮抗剂包含结合B7-H1多肽及抑制或降低B7-H1多肽结合PD-1受体的B7-DC多肽或其片段。

19.项18的组合物，其中所述片段包含结合B7-H1或B7-H1细胞外结构域或其片段的B7-DC细胞外结构域或其片段，所述B7-H1或B7-H1细胞外结构域或其片段结合B7-DC。

20.项17的组合物，其中所述PD-1拮抗剂包含融合蛋白。

21.项20的组合物，其中所述融合蛋白结合PD-1受体且不触发经由PD-1受体的信号转导。

22.项17的组合物，其中所述PD-1受体拮抗剂包含结合B7-DC多肽及抑制或降低B7-DC多肽结合PD-1受体的B7-H1多肽。

23.项22的组合物，其中所述PD-1受体拮抗剂包含融合蛋白。

24.一种组合物，其包含有效量的在体内结合PD-1且不触发经由PD-1的信号转导的多肽。

25.项24的组合物，其中所述多肽包含经过修饰使得其结合PD-1且不触发信号转导的B7-DC或B7-H1多肽。

26.项24的组合物，其中所述多肽包含经过修饰使得多肽结合PD-1且不触发经由PD-1的信号转导的B7-DC或B7-H1变体细胞外结构域。

27.一种融合多肽，其包含：

a)第一融合配偶，和

b)第二融合配偶，

其中所述第一融合配偶包含经过修饰以结合PD-1且不触发经由PD-1的信号转导的PD-1配体变体细胞外结构域或其片段且其中所述第一融合配偶直接融合至所述第二融合配偶，或任选地，融合至接头序列，该接头序列融合至所述第二融合配偶。

28.项27的融合多肽，其中所述第二融合配偶包含一个或多个Ig重链恒定区结构域。

29.项28的融合多肽，其中所述第二多肽包含与人免疫球蛋白Cγ1链的铰链、C_H2和C_H3区对应的氨基酸序列。

30.项27的融合多肽，其中所述第一多肽包含经过修饰以结合PD-1且不触发经由PD-1的信号转导的B7-DC或B7-H1细胞外结构域。

附图简述

图1A-B是显示如实施例1中描述的PD-1结合ELISA中B7-DC-Ig对PD-1的结合1的图。

图2是显示B7-DC-Ig结合表达PD-1的CHO细胞的图。

图3是显示B7-DC-Ig与PD-L1竞争结合PD-1的图。

图4是用于P815肿瘤模型的一种例示性剂量给药方案的图。

图5A-C是肿瘤体积作为时间和处理：A)赋形剂对照，B)小鼠IgG对照，和C)鼠B7-DC-Ig的函数来绘图的线图。

图6A-C是显示环磷酰胺(CTX)和B7-DC-Ig的组合导致小鼠中已建立的CT26肿瘤(结肠癌瘤)根除的线图。

图7显示CTX和B7-DC-Ig的组合根除小鼠中已建立的CT26肿瘤(结肠癌瘤)及针对CT26再攻击提供保护。

图8显示CTX和B7-DC-Ig处理导致肿瘤特异性记忆CTL的产生。

发明详述

I.定义

如本文中使用的，术语“分离的”意图描述处于如下环境中的感兴趣化合物(例如多核苷酸或多肽)，所述环境与该化合物天然存在的环境不同，例如与其天然环境分开，诸如通过将肽浓缩至如下的浓度，在自然界中找不到处于该浓度的该肽。“分离的”意图包括感兴趣化合物得到实质性富集和/或感兴趣化合物得到部分或实质性纯化的样品内的化合物。

如本文中使用的，术语“多肽”指任何长度的氨基酸链，不管是否修饰(例如磷酸化或糖基化)。

如本文中使用的，“变异”多肽与相应野生型多肽的氨基酸序列相比含有至少一处氨基酸序列改变。

如本文中使用的，“氨基酸序列改变”可以是例如一个或多个氨基酸的替代、缺失或***。

如本文中使用的，“载体”为复制子，诸如质粒、噬菌体或粘粒，其中可以***另一DNA区段，从而致使***的区段复制。本文中描述的载体可以是表达载体。

如本文中使用的，“表达载体”为包括一种或多种表达调控序列的载体。

如本文中使用的，“表达调控序列”为控制及调节另一DNA序列的转录和/或翻译的DNA序列。

如本文中使用的，“可操作连接的”意味着掺入遗传构建物，使得表达控制序列有效调控感兴趣编码序列的表达。

如本文中使用的，多肽的“片段”指多肽的任何子集，其是比全长蛋白质要短的多肽。通常，片段的长度会是五个或更多个氨基酸。

如本文中使用的，“效价”指每个分子可得的结合位点数目。

如本文中使用的，“保守性”氨基酸替代为如下的替代，其中替代的氨基酸具有相似的结构或化学特性。

如本文中使用的，“非保守性”氨基酸替代为如下的替代，其中替代的氨基酸的电荷、疏水性或体积有显著改变。

如本文中使用的，“分离的核酸”指如下的核酸，其与哺乳动物基因组中存在的其它核酸分子(包括正常情况下在哺乳动物基因组中位于该核酸一侧或两侧侧翼的核酸)分开。

如本文中使用的，关于核酸，术语“分离的”包括任何非天然存在的核酸序列，因为此类非天然存在序列在自然界中找不到，而且在天然存在基因组中没有紧邻的序列。

如本文中使用的，术语“宿主细胞”指如下的原核和真核细胞，其中可引入重组表达载体。

如本文中使用的，“转化的”和“转染的”涵盖通过本领域已知的多种技术将核酸(例如载体)引入细胞。

如本文中使用的，术语“抗体”意图包括完整分子以及包括抗原结合位点的其片段。这些包括Fab和F(ab’)₂片段，它们缺少完整抗体的Fc片段。

术语“个体”、“宿主”、“受试者”和“患者”在本文中可互换使用，而且指哺乳动物，包括但不限于人、啮齿类动物诸如小鼠和大鼠及其它实验室动物。

如本文中使用的，术语“有效量”或“治疗有效量”意指足以治疗、抑制或减轻所治疗疾病状态的一种或多种症状或以其它方式提供想要的药理学和/或生理学效果的剂量。精确的剂量会随多种因素而变化，诸如依赖受试者的变量(例如年龄、免疫***健康等)、疾病和所施用的治疗。

II.PD-1拮抗剂

用于干扰PD-1和PD-L1之间相互作用的一种优选PD-1拮抗剂化合物是PD-L2(也称作B7-DC)、PD-L2的细胞外结构域、PD-L2的融合蛋白及其变体，它们结合及阻断PD-1且不触发经由PD-1的抑制性信号转导，及阻止PD-L1结合PD-1。别的PD-1拮抗剂包括结合PD-1且不触发经由PD-1的抑制性信号转导的PD-L1片段，结合PD-1配体及阻止结合T细胞上内源PD-1受体的PD-1或其可溶性片段，及能结合PD-L1及阻止PD-L1结合PD-1的B7.1或其可溶性片段。在某些实施方案中，PD-1拮抗剂提高受试者中的T细胞细胞毒性。多重功能性PD-1拮抗剂有助于在受试者诱导有力的免疫应答及克服T细胞衰竭和T细胞无反应性。

PD-1拮抗剂结合PD-1配体及干扰或抑制配体结合PD-1受体，或直接结合PD-1受体且不参与经由PD-1受体的信号转导。在优选的实施方案中，PD-1拮抗剂直接结合PD-1及阻断PD-1抑制性信号转导。在其它实施方案中，PD-1拮抗剂结合PD-1配体及降低或抑制配体触发经由PD-1的抑制性信号转导。在还有一个实施方案中，PD-1拮抗剂能通过结合PD-1受体以外的受体来活化T细胞。

PD-1拮抗剂可以是小分子拮抗剂。术语“小分子”指如下的有机小分子，其分子量大于100且小于约2,500道尔顿，优选介于100和2000之间，更优选介于约100和约1250之间，更优选介于约100和约1000之间，更优选介于约100和约750之间，更优选介于约200和约500道尔顿之间。小分子常常包括环形碳或杂环结构和/或芳香族或多芳香族结构，其被一种或多种官能团取代。小分子拮抗剂通过结合PD-1配体诸如PD-L1和PD-L2及阻止配体与PD-1相互作用或通过直接结合PD-1受体且不触发经由PD-1受体的信号转导来降低或干扰PD-1受体信号转导。

例示性的PD-1拮抗剂包括但不限于PD-L2、PD-L1、PD-1或B7-1多肽，及其变体、片段或融合蛋白。别的实施方案包括结合任何这些蛋白质的抗体。

A.基于PD-L2的PD-1拮抗剂

1.结合PD-1的基于PD-L2的PD-1拮抗剂

PD-1拮抗剂结合免疫细胞上的PD-1并阻断抑制性PD-1信号传导。认为PD-1信号转导要求与免疫联会内的TCR:MHC复合物极近的PD-1配体(PD-L2或PD-L1；通常是PD-L1)结合PD-1。因此，阻断经由PD-1的抑制性信号转导及任选阻止T细胞膜上的PD-1和TCR共连接的蛋白质、抗体或小分子是有用的PD-1拮抗剂。

代表性的多肽拮抗剂包括但不限于PD-L2多肽、其片段、其融合蛋白及其变体。结合PD-1及阻断经由PD-1的抑制性信号转导的PD-L2多肽是优选的实施方案之一。其它实施方案包括阻止PD-1的天然配体结合及触发信号转导的PD-1拮抗剂。在某些实施方案中，认为所公开的PD-L2多肽具有降低的或没有触发经由PD-1受体的信号转导的能力，因为没有免疫联会背景中肽-MHC复合物对TCR的共连接。因为经由PD-1受体的信号转导传输削弱T细胞活化和T细胞增殖的负信号，所以抑制PD-1信号转导途径容许细胞活化，这在其它情况中会被削弱。

2.例示性的PD-L2多肽PD-1拮抗剂

鼠PD-L2多肽可以与下述序列具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％序列同一性：

(SEQ ID NO:1)或

(SEQ ID NO:2)。

人PD-L2多肽可以与下述序列具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％序列同一性：

(SEQ ID NO:3)或

(SEQ ID NO:4)。

非人灵长类动物(猕猴)PD-L2多肽可以与下述序列具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％序列同一性：

(SEQ ID NO:5)或

(SEQ ID NO:6)。

SEQ ID NO:1、3和5均含有信号肽。

B.基于PD-L1的PD-1拮抗剂

1.结合PD-1受体的基于PD-L1的PD-1拮抗剂

结合PD-1受体的其它PD-1拮抗剂包括但不限于PD-L1多肽、其片段、其融合蛋白及其变体。这些PD-1多肽拮抗剂结合及阻断PD-1受体且具有降低的或没有触发经由PD-1受体的抑制性信号转导的能力。在一个实施方案中，认为PD-L1多肽具有降低的或没有触发经由PD-1受体的信号转导的能力，因为没有免疫联会背景中肽-MHC复合物对TCR的共连接。因为经由PD-1受体的信号转导传输削弱T细胞活化和T细胞增殖的负信号，所以使用PD-L1多肽抑制PD-1信号转导容许细胞活化，这在其它情况中会被削弱。

2.例示性的PD-L1多肽PD-1拮抗剂

鼠PD-L1多肽可以与下述序列具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％序列同一性：

(SEQ ID NO:7)或

(SEQ ID NO:8)。

人PD-L1多肽可以与下述序列具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％序列同一性：

(SEQ ID NO:9)或

(SEQ ID NO:10)。

SEQ ID NO:7和9均含有信号肽。

C.基于B7.1和PD-1的PD-1拮抗剂

1.结合PD-L1和PD-L2的基于B7.1和PD-1的PD-1拮抗剂

其它有用多肽包括PD-1受体蛋白或其可溶性片段，其能结合PD-1配体，诸如PD-L1或PD-L2，及阻止结合内源PD-1受体，由此阻止抑制性信号转导。此类片段还包括PD-1蛋白的可溶性ECD部分，其任选包括突变，诸如A99L突变，该突变增强对天然配体的结合。PD-L1还显示出结合蛋白B7.1(Butte等,Immunity,27(1):111–122(2007))。因此，能结合PD-L1配体及阻止结合内源PD-1受体，由此阻止抑制性信号转导的B7.1或其可溶性片段也是有用的。

2.例示性的B7.1多肽PD-1拮抗剂

鼠B7.1多肽可以与下述序列具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％序列同一性：

(SEQ ID NO:11)或

(SEQ ID NO:12)。

人B7.1多肽可以与下述序列具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％序列同一性：

(SEQ ID NO:13)或

(SEQ ID NO:14)。

SEQ ID NO:11和13均含有信号肽。

3.例示性的PD-1多肽PD-1拮抗剂

人PD-1多肽可以与下述序列具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％序列同一性：

(SEQ ID NO:15)

非人灵长类动物(猕猴)PD-1多肽可以与下述序列具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％序列同一性：

(SEQ ID NO:16)。

SEQ ID NO:15和16均含有信号肽。

D.PD-1拮抗剂多肽的片段

PD-1拮抗剂多肽可以是全长多肽，或者可以是全长多肽的片段。如本文中使用的，PD-1拮抗剂多肽的片段指多肽的任何子集，其是比全长蛋白质要短的多肽。

有用的片段是那些保留结合其天然配体的能力的。作为全长PD-1拮抗剂多肽之片段的PD-1拮抗剂多肽通常具有与全长PD-1拮抗剂多肽相比至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％、100％、或甚至多于100％的结合其天然配体的能力。

例如，有用的PD-L2和PD-L1片段是那些保留结合PD-1的能力的。PD-L2和PD-L1片段通常具有与全长PD-L2和PD-L1相比至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％、100％、或甚至多于100％的结合PD-1的能力。

PD-1拮抗剂多肽的片段包括可溶性片段。可溶性PD-1拮抗剂多肽片段指可以自生成细胞脱落、分泌或以其它方式提取的PD-1拮抗剂多肽片段。可溶性PD-1拮抗剂多肽片段包括多肽的部分或整个胞外结构域，而且缺少部分或整个胞内和/或跨膜结构域。在一个实施方案中，PD-1拮抗剂多肽片段包括PD-1拮抗剂多肽的整个胞外结构域。会领会，胞外结构域可以包括1、2、3、4或5个来自跨膜结构域的氨基酸。或者，胞外结构域可以自C端、N端或二端去除1、2、3、4或5个氨基酸。

通常，PD-1拮抗剂多肽或其片段表达自核酸，该核酸包括编码信号序列的序列。通常自未成熟多肽切除信号序列以生成缺少信号序列的成熟多肽。PD-1拮抗剂多肽的信号序列可以利用标准分子生物学技术由另一种多肽的信号序列替换，以改变多肽的表达水平、分泌、溶解度或其它特性。用于替换PD-1拮抗剂多肽信号序列的信号序列可以是任何本领域已知的。

1.PD-L2细胞外结构域

a.人PD-L2细胞外结构域

在一个实施方案中，PD-1拮抗剂多肽包括人PD-L2的细胞外结构域或其片段。PD-1拮抗剂多肽可以由与下述序列具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％序列同一性的核苷酸序列编码：

(SEQ ID NO:17)。

在另一个实施方案中，PD-1拮抗剂多肽可以与下述人氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％序列同一性：

(SEQ ID NO:18)。

会领会，会在成熟蛋白质中去除信号序列。另外，会领会，来自其它生物体的信号肽可用于增强制造期间来自宿主的蛋白质分泌。SEQ ID NO:19提供没有信号序列的SEQ ID NO:18的人氨基酸序列：

(SEQ ID NO:19)。

在另一个实施方案中，PD-1拮抗剂多肽包括人PD-L2的IgV域。第一融合配偶可以由与下述序列具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％序列同一性的核苷酸序列编码：

(SEQ ID NO:20)。

PD-1拮抗剂多肽可以与下述人氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％序列同一性：

FTVTVPKELY IIEHGSNVTL ECNFDTGSHV NLGAITASLQ KVENDTSPHR ERATLLEEQL 60

PLGKASFHIP QVQVRDEGQY QCIIIYGVAW DYKYLTLK                         98

(SEQ ID NO:21)，也称作PD-L2V。

b.非人灵长类动物PD-L2细胞外结构域

在一个实施方案中，PD-1拮抗剂多肽包括非人灵长类动物(猕猴)PD-L2的细胞外结构域或其片段。PD-1拮抗剂多肽可以由与下述序列具有至少80％、85％、90％、95％、99％、或100％序列同一性的核苷酸序列编码：

(SEQ ID NO:22)。

在另一个实施方案中，PD-1拮抗剂多肽可以与下述非人灵长类动物氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％与序列同一性：

(SEQ ID NO:23)。

会在成熟蛋白质中去除信号序列。另外，来自其它生物体的信号肽可用于增强制造期间来自宿主的融合蛋白分泌。SEQ ID NO:24提供没有信号序列的SEQ ID NO:23的非人灵长类动物氨基酸序列：

(SEQ ID NO:24)。

在另一个实施方案中，PD-1拮抗剂多肽包括非人灵长类动物PD-L2的IgV域。第一融合配偶可以由与下述序列具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％序列同一性的核苷酸序列编码：

(SEQ ID NO:25)。

PD-1拮抗剂多肽可以与下述非人灵长类动物氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％序列同一性：

FTVTVPKELY IIEHGSNVTL ECNFDTGSHV NLGAITASLQ KVENDTSPHR ERATLLEEQL 60

PLGKASFHIP QVQVRDEGQY QCIIIYGVAW DYKYLTLK                         98

(SEQ ID NO:26)，也称作PD-L2V。

c.鼠PD-L2细胞外结构域

在一个实施方案中，PD-1拮抗剂多肽包括鼠PD-L2的细胞外结构域或其片段。PD-1拮抗剂多肽可以由与下述序列具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％序列同一性的核苷酸序列编码：

(SEQ ID NO:27)。

在另一个实施方案中，PD-1拮抗剂多肽可以与下述鼠氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％序列同一性：

(SEQ ID NO:28)。

会在成熟蛋白质中去除信号序列。另外，来自其它生物体的信号肽可用于增强制造期间来自宿主的蛋白质分泌。SEQ ID NO:29提供没有信号序列的SEQ ID NO:28的鼠氨基酸序列：

(SEQ ID NO:29)。

在另一个实施方案中，PD-1拮抗剂多肽包括鼠PD-L2的IgV域。第一融合配偶可以由与下述序列具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％序列同一性的核苷酸序列编码：

(SEQ ID NO:30)。

PD-1拮抗剂多肽可以与下述鼠氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％序列同一性：

FTVTAPKEVY TVDVGSSVSL ECDFDRRECT ELEGIRASLQ KVENDTSLQS ERATLLEEQL 60

PLGKALFHIP SVQVRDSGQY RCLVICGAAW DYKYLTVK                         98

(SEQ ID NO:31)，也称作PD-L2V。

d.PD-L2细胞外结构域片段

PD-L2细胞外结构域可以含有一个或多个来自PD-L2之信号肽或推定跨膜结构域的氨基酸。分泌期间，被切除的信号肽氨基酸的数目可以随表达***和宿主而变化。另外，可使用自C端或N端缺失一个或多个氨基酸但保留结合PD-1能力的PD-L2细胞外结构域片段。

可用作第一融合配偶的例示性的合适的鼠PD-L2片段包括但不限于下述，SEQ ID NO:53的：

24-221,24-220,24-219,24-218,24-217,24-216,24-215,

23-221,23-220,23-219,23-218,23-217,23-216,23-215,

22-221,22-220,22-219,22-218,22-217,22-216,22-215,

21-221,21-220,21-219,21-218,21-217,21-216,21-215,

20-221,20-220,20-219,20-218,20-217,20-216,20-215,

19-221,19-220,19-219,19-218,19-217,19-216,19-215,

18-221,18-220,18-219,18-218,18-217,18-216,18-215,

17-221,17-220,17-219,17-218,17-217,17-216,17-215,

16-221,16-220,16-219,16-218,16-217,16-216,16-215。

别的合适的鼠PD-L2片段包括但不限于下述，SEQ ID NO:1的：

20-221,33-222,33-223,33-224,33-225,33-226,33-227,

21-221,21-222,21-223,21-224,21-225,21-226,21-227,

22-221,22-222,22-223,22-224,22-225,22-226,22-227,

23-221,23-222,23-223,23-224,23-225,23-226,23-227,

24-221,24-222,24-223,24-224,24-225,24-226,24-227,

任选有信号肽的一个至五个氨基酸附着至N端末端。信号肽可以是任何本文中公开的，包括SEQ ID NO:1内包含的信号肽，或者可以是本领域已知的任何信号肽。

可用作第一融合配偶的例示性的合适的人PD-L2片段包括但不限于下述，SEQ ID NO:56的：

24-221,24-220,24-219,24-218,24-217,24-216,24-215,

23-221,23-220,23-219,23-218,23-217,23-216,23-215,

22-221,22-220,22-219,22-218,22-217,22-216,22-215,

21-221,21-220,21-219,21-218,21-217,21-216,21-215,

20-221,20-220,20-219,20-218,20-217,20-216,20-215,

19-221,19-220,19-219,19-218,19-217,19-216,19-215,

18-221,18-220,18-219,18-218,18-217,18-216,18-215,

17-221,17-220,17-219,17-218,17-217,17-216,17-215,

16-221,16-220,16-219,16-218,16-217,16-216,16-215。

别的合适的人PD-L2片段包括但不限于下述，SEQ ID NO:3的：

20-221,33-222,33-223,33-224,33-225,33-226,33-227,

21-221,21-222,21-223,21-224,21-225,21-226,21-227,

22-221,22-222,22-223,22-224,22-225,22-226,22-227,

23-221,23-222,23-223,23-224,23-225,23-226,23-227,

24-221,24-222,24-223,24-224,24-225,24-226,24-227,

任选有信号肽的一个至五个氨基酸附着至N端末端。信号肽可以是任何本文中公开的，包括SEQ ID NO:3内包含的信号肽，或者可以是本领域已知的任何信号肽

可用作第一融合配偶的例示性的合适的非人灵长类动物PD-L2片段包括但不限于下述，SEQ ID NO:5的：

24-221,24-220,24-219,24-218,24-217,24-216,24-215,

23-221,23-220,23-219,23-218,23-217,23-216,23-215,

22-221,22-220,22-219,22-218,22-217,22-216,22-215,

21-221,21-220,21-219,21-218,21-217,21-216,21-215,

20-221,20-220,20-219,20-218,20-217,20-216,20-215,

19-221,19-220,19-219,19-218,19-217,19-216,19-215,

18-221,18-220,18-219,18-218,18-217,18-216,18-215,

17-221,17-220,17-219,17-218,17-217,17-216,17-215,

16-221,16-220,16-219,16-218,16-217,16-216,16-215。

别的合适的非人灵长类动物PD-L2片段包括但不限于下述，SEQ IDNO:5的：

20-221,33-222,33-223,33-224,33-225,33-226,33-227,

21-221,21-222,21-223,21-224,21-225,21-226,21-227,

22-221,22-222,22-223,22-224,22-225,22-226,22-227,

23-221,23-222,23-223,23-224,23-225,23-226,23-227,

24-221,24-222,24-223,24-224,24-225,24-226,24-227,

任选有信号肽的一个至五个氨基酸附着至N端末端。信号肽可以是任何本文中公开的，包括SEQ ID NO:5内包含的信号肽，或者可以是本领域已知的任何信号肽。

PD-L2蛋白还包括SEQ ID NO:3(人全长)的氨基酸20-121或SEQ IDNO:23(细胞外结构域或ECD)的氨基酸1-102的PD-1结合片段。在其具体实施方案中，PD-L2多肽或PD-1结合片段还掺有SEQ ID NO:3的残基110-114处的氨基酸WDYKY或SEQ ID NO:23的残基91-95处的WDYKY。作为非限制性例子，此类PD-1结合片段包含SEQ ID NO:3氨基酸20-121的序列的至少10、至少20、至少30、至少40、至少50、至少60、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少95或至少100个连续氨基酸，其中每种此类PD-1结合片段的一个优选实施方案会包含SEQ ID NO:3的残基110-114处找到的氨基酸WDYKY或SEQ ID NO:23的残基91-95处的WDYKY作为子片段。

2.PD-L1细胞外结构域

在一个实施方案中，变体PD-L1多肽包括整个或部分细胞外结构域。PD-L1的代表性细胞外结构域的氨基酸序列可以与下述序列具有80％、85％、90％、95％或99％序列同一性：

(SEQ ID NO:32)。

PD-L1的跨膜结构域开始于SEQ ID NO:9的氨基酸位置239。会领会，合适的PD-L1片段可以包括信号肽序列的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸(例如SEQ ID NO:9或其变体)，跨膜结构域的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸，或其组合。

鼠PD-L1的细胞外结构域具有下述氨基酸序列：

(SEQ ID NO:33)。

鼠PD-L1的跨膜结构域开始于SEQ ID NO:7的氨基酸位置240。在某些实施方案中，PD-L1多肽包括鼠PD-L1的细胞外结构域及信号肽的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸，跨膜结构域的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸，或其组合。

3.B7.1细胞外结构域

a.鼠B7.1细胞外结构域

在一个实施方案中，PD-1拮抗剂多肽包括鼠B7.1的细胞外结构域或其片段。PD-1拮抗剂多肽可以由与下述序列具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％序列同一性的核苷酸序列编码：

(SEQ ID NO:34)。

在另一个实施方案中，PD-1拮抗剂多肽可以与下述鼠氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％序列同一性：

(SEQ ID NO:35)。

会在成熟蛋白质中去除信号序列。另外，来自其它生物体的信号肽可用于增强制造期间来自宿主的蛋白质分泌。SEQ ID NO:36提供没有信号序列的SEQ ID NO:35的鼠氨基酸序列：

(SEQ ID NO:36)。

在另一个实施方案中，PD-1拮抗剂多肽包括鼠B7.1的IgV域。第一融合配偶可以由与下述序列具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％序列同一性的核苷酸序列编码：

(SEQ ID NO:37)。

PD-1拮抗剂多肽可以与下述鼠氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％序列同一性：

VDEQLSKSVK DKVLLPCRYN SPHEDESEDR IYWQKHDKVV LSVIAGKLKV WPEYKNRTLY 60

DNTTYSLIIL GLVLSDRGTY SCVVQKKERG TYEVKHL                          97

(SEQ ID NO:38)，也称作B7.1V。

b.人B7.1细胞外结构域

在一个实施方案中，PD-1拮抗剂多肽包括人B7.1的细胞外结构域或其片段。PD-1拮抗剂多肽可以由与下述序列具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％序列同一性的核苷酸序列编码：

(SEQ ID NO:39)。

在另一个实施方案中，PD-1拮抗剂多肽可以与下述人氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％序列同一性：

(SEQ ID NO:40)。

会在成熟蛋白质中去除信号序列。另外，来自其它生物体的信号肽可用于增强制造期间来自宿主的蛋白质分泌。SEQ ID NO:41提供没有信号序列的SEQ ID NO:40的人氨基酸序列：

(SEQ ID NO:41)。

在另一个实施方案中，PD-1拮抗剂多肽包括人B7.1的IgV域。第一融合配偶可以由与下述序列具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％序列同一性的核苷酸序列编码：

(SEQ ID NO:42)。

PD-1拮抗剂多肽可以与下述人氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％序列同一性：

VIHVTKEVKE VATLSCGHNV SVEELAQTRI YWQKEKKMVL TMMSGDMNIW PEYKNRTIFD 60

ITNNLSIVIL ALRPSDEGTY ECVVLKYEKD AFKREHLAEV T                    101

(SEQ ID NO:43)，也称作B7.1V。

3.B7.1细胞外结构域片段

可用作共刺激性多肽结构域的例示性的合适的鼠B7.1片段包括但不限于下述，SEQ ID NO:11的：

42-246,42-245,42-244,42-243,42-242,42-241,42-240,

41-246,41-245,41-244,41-243,41-242,41-241,41-240,

40-246,40-245,40-244,40-243,40-242,40-241,40-240,

39-246,39-245,39-244,39-243,39-242,39-241,39-240,

38-246,38-245,38-244,38-243,38-242,38-241,38-240,

37-246,37-245,37-244,37-243,37-242,37-241,37-240,

36-246,36-245,36-244,36-243,36-242,36-241,36-240,

35-246,35-245,35-244,35-243,35-242,35-241,35-240,

34-246,34-245,34-244,34-243,34-242,34-241,34-240。

别的合适的鼠B7.1片段包括但不限于下述，SEQ ID NO:11的：

38-246,38-247,38-248,38-249,38-250,38-251,38-252,

39-246,39-247,39-248,39-249,39-250,39-251,39-252,

40-246,40-247,40-248,40-249,40-250,40-251,40-252,

41-246,41-247,41-248,41-249,41-250,41-251,41-252,

42-246,42-247,42-248,42-249,42-250,42-251,42-252,

任选有信号肽的一个至五个氨基酸附着至N端末端。信号肽可以是任何本文中公开的，包括SEQ ID NO:11内包含的信号肽，或者可以是本领域已知的任何信号肽。

可用作共刺激性多肽结构域的例示性的合适的人B7.1片段包括但不限于下述，SEQ ID NO:13的：

39-243,39-242,39-241,39-240,39-239,39-238,39-237,

38-243,38-242,38-241,38-240,38-239,38-238,38-237,

37-243,37-242,37-241,37-240,37-239,37-238,37-237,

36-243,36-242,36-241,36-240,36-239,36-238,36-237,

35-243,35-242,35-241,35-190,35-239,35-238,35-237,

34-243,34-242,34-241,34-240,34-239,34-238,34-237,

33-243,33-242,33-241,33-240,33-239,33-238,33-237,

32-243,32-242,32-241,32-240,32-239,32-238,32-237,

31-243,31-242,31-241,31-240,31-239,31-238,31-237。

别的合适的人B7.1片段包括但不限于下述，SEQ ID NO:13的：

35-243,35-244,35-245,35-246,35-247,35-248,35-249,

36-243,36-244,36-245,36-246,36-247,36-248,36-249,

37-243,37-244,37-245,37-246,37-247,37-248,37-249,

38-243,38-244,38-245,38-246,38-247,38-248,38-249,

39-243,39-244,39-245,39-246,39-247,39-248,39-249,

任选有信号肽的一个至五个氨基酸附着至N端末端。信号肽可以是任何本文中公开的，包括SEQ ID NO:13内包含的信号肽，或者可以是本领域已知的任何信号肽。

E.变体

1.变体PD-L2和PD-L1PD-1拮抗剂

别的PD-1拮抗剂包括如下的PD-L2和PD-L1多肽及其片段，它们经过突变，使得与未突变的PD-1相比，它们保留在生理条件下结合PD-1的能力，具有升高的对PD-1的结合，或具有降低的对PD-1的结合，但是没有能力促进经由PD-1受体的信号转导。一个实施方案提供分离的PD-L2和PD-L1多肽，它们含有一处或多处氨基酸替代、缺失或***，与非未突变的PD-L2或PD-L1相比，其抑制或降低多肽活化PD-1和将抑制信号传输至T细胞的能力。PD-L2和PD-L1多肽可以是任何物种起源的。在一个实施方案中，PD-L2或PD-L1多肽来自哺乳动物物种。在一个优选的实施方案中，PD-L2或PD-L1多肽是人或非人灵长类动物起源的。

在另一个实施方案中，变体PD-L2或PD-L1多肽具有与野生型或非变体PD-L2或PD-L1相同的对PD-1的结合活性，但是相对于未突变的PD-L2或PD-L1多肽，不具有或具有少于10％的刺激经由PD-1受体的信号转导的能力。在其它实施方案中，变体PD-L2或PD-L1多肽具有相对于野生型PD-L2或PD-L110％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或更多的对PD-1的结合活性，而且具有相对于未突变的PD-L2或PD-L1多肽少于50％、40％、30％、20％或10％的刺激经由PD-1受体的信号转导的能力。

变体PD-L2或PD-L1多肽可以具有氨基酸替代、缺失或***的任何组合。在一个实施方案中，分离的PD-L2或PD-L1变体多肽具有整数数目的氨基酸改变，使得它们的氨基酸序列具有与野生型PD-L2或PD-L1多肽的氨基酸序列至少60、70、80、85、90、95、97、98、99、99.5或100％同一性。在一个优选的实施方案中，B7-H1变体多肽具有与野生型鼠、非人灵长类动物或人PD-L2或PD-L1多肽的氨基酸序列至少60、70、80、85、90、95、97、98、99、99.5或100％同一性的氨基酸序列。

百分比序列同一性可以使用计算机程序或直接序列比较来计算。优选的用于确定两种序列之间同一性的计算机程序方法包括但不限于GCG程序包、FASTA、BLASTP和TBLASTN(参见例如D.W.Mount,2001,Bioinformatics:Sequence and Genome Analysis,Cold Spring Harbor Laboratory Press,ColdSpring Harbor,N.Y.)。BLASTP和TBLASTN程序是公众自NCBI和其它来源可得的。公知的Smith Waterman算法也可用于确定同一性。

例示性的氨基酸序列比较参数包括下述：1)来自Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.,48:443-453(1970))的算法；2)来自Hentikoff和Hentikoff(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,89:10915-10919(1992))的BLOSSUM62比较矩阵；3)缺口罚分＝12；和4)缺口长度罚分＝4。一种与这些参数一起有用的程序是作为“gap”程序(Genetics Computer Group,Madison,Wis.)公众可得的。上述参数是多肽比较的缺省参数(末端缺口没有罚分)。

或者，多肽序列同一性可以使用下述方程式来计算：％同一性＝(相同残基的数目)/(氨基酸残基比对长度)*100。对于这项计算，比对长度包括内部缺口，但是不包括末端缺口。

PD-L2或PD-L1多肽中的氨基酸替代可以是“保守性的”或“非保守性的”。如本文中使用的，“保守性”氨基酸替代为如下的替代，其中替代的氨基酸具有相似的结构或化学特性，而“保守性”氨基酸替代为如下的替代，其中替代的氨基酸的电荷、疏水性或体积有显著改变。非保守性替代在它们维持下述各项的效果方面会更加显著不同：(a)替代区域中肽骨架的结构，例如作为片层或螺旋构象；(b)分子在靶位点处的电荷或疏水性；或(c)侧链的体积。

例示性的保守性氨基酸替代包括那些其中替代在下述五组之一内的：1)小的、脂肪族的、非极性的或微极性的残基(Ala,Ser,Thr,Pro,Gly)；2)极性的、带负电荷的残基及其酰胺(Asp,Asn,Glu,Gln)；极性的、带正电荷的残基(His,Arg,Lys)；大的、脂肪族的、非极性的残基(Met,Leu,Ile,Val,Cys)；和大的、芳香族的残基(Phe,Tyr,Trp)。非保守性氨基酸替代的例子是那些其中1)亲水性残基(例如丝氨酰或苏氨酰)替代(或被替代)疏水性残基(例如亮氨酰、异亮氨酰、苯丙氨酰、缬氨酰或丙氨酰)；2)半胱氨酸或脯氨酸替代(或被替代)任何其它残基；3)具有正电性侧链的残基(例如赖氨酰、精氨酰或组氨酰)替代(或被替代)负电性残基(例如谷氨酰或天冬氨酰)；或4)具有大侧链的残基(例如苯丙氨酸)替代(或被替代)没有侧链的残基(例如甘氨酸)。

然而，可理解的是所述氨基酸位置处的替代可以使用任何氨基酸或氨基酸类似物来进行。例如，所述位置处的替代可以用任何天然存在氨基酸(例如丙氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、精氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、组氨酸、亮氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苏氨酸、丝氨酸、苯丙氨酸、色氨酸或酪氨酸)来进行。

虽然本文中描述的替代是关于小鼠、非人灵长类动物和人PD-L2或PD-L1的，注意，本领域普通技术人员能容易地在来自其它物种(例如大鼠、仓鼠、豚鼠、沙鼠、家兔、犬、猫、马、猪、绵羊或牛)的相应多肽中进行等同改变。然而，由于结合具有一种物种特异性成分，因此当将PD-1拮抗剂施用于人时优选使用人的。

在一个实施方案中，所公开的分离的变体PD-L2或PD-L1多肽是PD-1的拮抗剂，而且结合及阻断PD-1且不触发经由PD-1的信号转导。通过阻止PD-1信号转导对T细胞的削弱，更多T细胞可被活化。相对于未接触PD-1拮抗剂的T细胞，阻止T细胞抑制增强T细胞应答，增强T细胞的增殖，增强T细胞的细胞因子生成和/或分泌，刺激T细胞的分化和效应器功能或促进T细胞的存活。源自相互作用的T细胞应答通常比PD-1拮抗剂多肽缺失下的应答要强。PD-1拮抗剂多肽缺失下的T细胞应答可以是没有应答，或者可以是比PD-1拮抗剂多肽存在下显著要低的应答。T细胞应答可以是效应器(例如CTL或抗体生成B细胞)应答、为一种或多种效应器(例如CTL或抗体生成B细胞)应答提供帮助的辅助应答或阻遏应答。

用于测量两个分子之间的结合的方法是本领域公知的。用于测量变体PD-L2或PD-L1多肽对PD-1的结合亲和力的方法包括但不限于荧光激活细胞分选(FACS)、表面等离振子共振、荧光各向异性、亲和层析和亲和选择-质谱术。

本文中公开的变体多肽可以是全长多肽，或者可以是全长多肽的片段。优选的片段包括有效结合PD-1的整个或部分细胞外结构域。如本文中使用的，片段指多肽的任何子集，其是比全长蛋白质要短的多肽。

2.变体B7.1和PD-1拮抗剂

别的PD-1拮抗剂包括B7.1和PD-1多肽及其片段，它们经过突变，使得它们保留在生理条件下结合PD-L2和/或PD-L1的能力，具有升高的结合，或具有降低的对PD-L2和/或PD-L1的结合。B7.1和PD-1多肽可以是任何物种起源的。在一个实施方案中，B7.1或PD-1多肽来自哺乳动物物种。在一个优选的实施方案中，B7.1或PD-1多肽是人或非人灵长类动物起源的。

变体B7.1或PD-1多肽可以具有氨基酸替代、缺失或***的任何组合。在一个实施方案中，分离的B7.1或PD-1变体多肽具有整数数目的氨基酸改变，使得它们的氨基酸序列与野生型B7.1或PD-1多肽的氨基酸序列具有至少60、70、80、85、90、95、97、98、99、99.5或100％同一性。在一个优选的实施方案中，B7.1或PD-1变体多肽具有与野生型鼠、非人灵长类动物或人B7.1或PD-1多肽的氨基酸序列至少60、70、80、85、90、95、97、98、99、99.5或100％同一性的氨基酸序列。

B7.1或PD-1多肽中的氨基酸替代可以是“保守性的”或“非保守性的”。保守性和非保守性替代描述于上文。

在一个实施方案中，所公开的分离的变体B7.1或PD-1多肽是PD-1的拮抗剂，而且结合PD-L2和/或PD-L1，由此阻断它们结合内源PD-1。通过阻止PD-1信号转导对T细胞的削弱，更多T细胞可被活化。相对于未接触PD-1拮抗剂的T细胞，阻止T细胞抑制增强T细胞应答，增强T细胞的增殖，增强T细胞的细胞因子生成和/或分泌，刺激T细胞的分化和效应器功能或促进T细胞的存活。源自相互作用的T细胞应答通常比PD-1拮抗剂多肽缺失下的应答要强。PD-1拮抗剂多肽缺失下的T细胞应答可以是没有应答，或者可以是比PD-1拮抗剂多肽存在下显著要低的应答。T细胞应答可以是效应器(例如CTL或抗体生成B细胞)应答、为一种或多种效应器(例如CTL或抗体生成B细胞)应答提供帮助的辅助应答或阻遏应答。

变体多肽可以是全长多肽，或者可以是全长多肽的片段。优选的片段包括有效结合PD-L2和/或PD-L1的整个或部分细胞外结构域。如本文中使用的，片段指多肽的任何子集，其是比全长蛋白质要短的多肽。

F.融合蛋白

在一些实施方案中，PD-1拮抗剂是含有第一多肽域和第二靶向域的融合蛋白，其中所述第二靶向域是将融合蛋白靶向肿瘤细胞或肿瘤细胞相关新血管***的抗原结合域。或是融合蛋白能结合T细胞受体及增强T细胞应答，或是优选融合蛋白能结合及阻断抑制性信号转导入T细胞，例如通过竞争性结合PD-1来实现。通过干扰天然抑制性配体结合PD-1，所公开的组合物有效阻断经由PD-1的信号转导。合适的共刺激多肽包括对抑制性T细胞信号转导受体诸如PD-1具有提高的或降低的结合亲和力的变体多肽和/或其片段。

融合蛋白还任选含有肽或多肽接头域，它将第一多肽域与抗原结合域分开。

本文中公开的融合蛋白为式I：

N-R₁-R₂-R₃-C

其中“N”代表融合蛋白的N端，“C”代表融合蛋白的C端，“R₁”为PD-L2、PD-L1、B7.1、PD-1多肽或抗原结合靶向域，“R₂”为肽/多肽接头，而“R₃”为靶向域或抗原结合靶向域，其中当“R₁”为抗原结合域时“R₃”为多肽域，而当“R₁”为PD-L2、PD-L1、B7.1或PD-1多肽域时“R₃”为抗原结合靶向域。在一个优选的实施方案中，“R₁”为PD-L2、PD-L1、B7.1或PD-1多肽域，而“R₃”为抗原结合靶向域。

任选地，融合蛋白另外含有发挥使两个或更多个融合蛋白二聚化或多聚化的功能的域。发挥使融合蛋白二聚化或多聚化的功能的域或是单独的域，或是可以包含在融合蛋白的其它域(PD-L2、PD-L1、B7.1或PD-1多肽域，抗原结合靶向域或肽/多肽接头域)之一内。

融合蛋白可以二聚化或多聚化。二聚化或多聚化可以经由二聚化或多聚化域在两个或更多个融合蛋白之间发生。或者，融合蛋白的二聚化或多聚化可以通过化学交联产生。所形成的二聚物或多聚物可以是同二聚物/同多聚物或异二聚物/异多聚物。

融合蛋白及其以不同组合二聚化或多聚化的能力的模块性质为靶向发挥下述功能的分子提供了大量选项，所述功能为增强针对肿瘤细胞微环境的免疫应答。

1.抗原结合靶向域

融合蛋白还含有抗原结合靶向域。在一些实施方案中，靶向域结合肿瘤细胞或肿瘤相关新血管***特异性的，或与正常组织相比在肿瘤细胞或肿瘤相关新血管***中上调的抗原、配体或受体。在一些实施方案中，靶向域结合免疫组织特异性的，涉及T细胞活化应答传染病致病因子而上调的抗原、配体或受体。

肿瘤/肿瘤相关血管***靶向域

要靶向的抗原、配体和受体

肿瘤特异性和肿瘤相关抗原

在一个实施方案中，融合蛋白含有特异性结合由肿瘤细胞表达的抗原的域。由肿瘤表达的抗原可以是肿瘤特异性的，或者可以是与非肿瘤细胞相比在肿瘤细胞上以更高水平表达的。涵盖或是唯独由癌细胞表达或是相对于适宜的对照在具有恶性状况的受试者中以显著更高水平(例如以统计学显著的方式升高的)存在的抗原标志物，诸如已知为肿瘤相关抗原的血清学定义的标志物，供某些实施方案中使用。

肿瘤相关抗原可以包括例如细胞癌基因编码的产物或异常表达的原癌基因编码的产物(例如由neu、ras、trk和kit基因编码的产物)，或突变形式的生长因子受体或受体样细胞表面分子(例如由c-erb B基因编码的表面受体)。其它肿瘤相关抗原包括可能直接参与转化事件的分子，或可能不直接参与致癌转化事件但由肿瘤细胞表达的分子(例如癌胚抗原、CA-125、黑素瘤相关抗原等)(参见例如美国专利No.6,699,475；Jager等,Int.J.Cancer,106:817-20(2003)；Kennedy等,Int.Rev.Immunol.,22:141-72(2003)；Scanlan等,CancerImmun.,4:1(2004))。

编码细胞肿瘤相关抗原的基因包括细胞癌基因和异常表达的原癌基因。一般地，细胞癌基因编码直接参与细胞转化的产物，而且因此，这些抗原是免疫疗法特别优选的靶。一个例子是致瘤neu基因，其编码一种参与致癌转化的细胞表面分子。其它例子包括ras、kit、和trk基因。原癌基因(经过突变形成癌基因的正常基因)的产物可能异常表达(例如过表达)，而且此异常表达可能参与细胞转化。如此，可以靶向由原癌基因编码的产物。一些癌基因编码在肿瘤细胞表面上表达的生长因子受体分子或生长因子受体样分子。一个例子是由c-erbB基因编码的细胞表面受体。其它肿瘤相关抗原可以直接参与恶性转化或可以不这样。然而，这些抗原由某些肿瘤细胞表达，而且因此可提供有效靶。一些例子是癌胚抗原(CEA)、CA 125(与卵巢癌有关)和黑素瘤特异性抗原。

例如，在卵巢和其它癌瘤中，肿瘤相关抗原是易于获得的生物学流体诸如血清或粘膜分泌的样品中可检测的。一种此类标志物是CA125，即一种癌瘤相关抗原，它也脱落入血流，在那里在血清中能检测到它(例如Bast等,N.Eng.J.Med.,309:883(1983)；Lloyd等,Int.J.Canc.,71:842(1997))。已经测量了血清和其它生物学液体中的CA125水平，以及其它标志物的水平，例如癌胚抗原(CEA)、鳞状细胞癌抗原(SCC)、组织多肽特异性抗原(TPS)、唾液酰TN粘蛋白(STN)和胎盘碱性磷酸酶(PLAP)，试图提供卵巢和其它癌瘤的诊断和/或预后概况(例如Sarandakou等,Acta Oncol.,36:755(1997)；Sarandakou等,Eur.J.Gynaecol.Oncol.,19:73(1998)；Meier等,Anticancer Res.,17(4B):2945(1997)；Kudoh等,Gynecol.Obstet.Invest.,47:52(1999))。升高的血清CA125也可伴随成神经细胞瘤(例如Hirokawa等,Surg.Today,28:349(1998))，而升高的CEA和SCC可伴随结肠直肠癌等(Gebauer等,Anticancer Res.,17(4B):2939(1997))。

通过与单克隆抗体K-1的反应性来定义的肿瘤相关抗原间皮素(mesothelin)存在于大多数鳞状细胞癌(包括上皮卵巢、宫颈和食管肿瘤)上，及间皮瘤上(Chang等,Cancer Res.,52:181(1992)；Chang等,Int.J.Cancer,50:373(1992)；Chang等,Int.J.Cancer,51:548(1992)；Chang等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,93:136(1996)；Chowdhury等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,95:669(1998))。使用单抗K-1，间皮素仅作为细胞相关肿瘤标志物能被检测到，而且在来自卵巢癌患者的血清中或在由OVCAR-3细胞条件化的培养基中没有找到可溶形式(Chang等,Int.J.Cancer,50:373(1992))。然而，结构相关的人间皮素多肽也包括肿瘤相关抗原多肽，诸如独特的间皮素相关抗原(MRA)多肽，它在来自具有恶性的患者的生物学液体中作为天然存在可溶性抗原能检测到(参见WO 00/50900)。

肿瘤抗原可包括细胞表面分子。结构已知且具有已知或已述功能的肿瘤抗原包括下述细胞表面受体：HER1(GenBank编号U48722)，HER2(Yoshino等,J.Immunol.,152:2393(1994)；Disis等,Canc.Res.,54:16(1994)；GenBank编号X03363和M17730)，HER3(GenBank编号U29339和M34309)，HER4(Plowman等,Nature,366:473(1993)；GenBank编号L07868和T64105)，表皮生长因子受体(EGFR)(GenBank编号U48722,和KO3193)，血管内皮细胞生长因子(GenBank编号M32977)，血管内皮细胞生长因子受体(GenBank编号AF022375,1680143,U48801和X62568)，***-I(GenBank编号X00173,X56774,X56773,X06043,欧洲专利GB 2241703)，***-II(GenBank编号X03562,X00910,M17863和M17862)，运铁蛋白受体(Trowbridge和Omary,Proc.Nat.Acad.USA,78:3039(1981)；GenBank编号X01060和M11507)，***受体(GenBank编号M38651,X03635,X99101,U47678和M12674)，孕酮受体(GenBank编号X51730,X69068和M15716)，促卵泡激素受体(FSH-R)(GenBank编号Z34260和M65085)，视黄酸受体(GenBank编号L12060,M60909,X77664,X57280,X07282和X06538)，MUC-1(Barnes等,Proc.Nat.Acad.Sci.USA,86:7159(1989)；GenBank编号M65132和M64928)，NY-ESO-1(GenBank编号AJ003149和U87459)，NA 17-A(PCT公开号WO 96/40039)，Melan-A/MART-1(Kawakami等,Proc.Nat.Acad.Sci.USA,91:3515(1994)；GenBank编号U06654和U06452)，酪氨酸酶(Topalian等,Proc.Nat.Acad.Sci.USA,91:9461(1994)；GenBank编号M26729；Weber等,J.Clin.Invest,102:1258(1998))，Gp-100(Kawakami等,Proc.Nat.Acad.Sci.USA,91:3515(1994)；GenBank编号S73003,Adema等,J.Biol.Chem.,269:20126(1994))，MAGE(van den Bruggen等,Science,254:1643(1991)；GenBank编号U93163,AF064589,U66083,D32077,D32076,D32075,U10694,U10693,U10691,U10690,U10689,U10688,U10687,U10686,U10685,L18877,U10340,U10339,L18920,U03735和M77481)，BAGE(GenBank编号U19180；美国专利No.5,683,886和5,571,711)，GAGE(GenBank编号AF055475,AF055474,AF055473,U19147,U19146,U19145,U19144,U19143和U19142)，任何CTA类受体(特别包括由SSX2基因编码的HOM-MEL-40抗原)(GenBank编号X86175,U90842,U90841和X86174)，癌胚抗原(CEA,Gold和Freedman,J.Exp.Med.,121:439(1985)；GenBank编号M59710,M59255和M29540)，和PyLT(GenBank编号J02289和J02038)；p97(黑素运铁蛋白)(Brown等,J.Immunol.,127:539-46(1981)；Rose等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,83:1261-61(1986))。

别的肿瘤相关抗原包括***表面抗原(PSA)(美国专利No.6,677,157；6,673,545)；β-人绒毛膜***(β-HCG)(McManus等,Cancer Res.,36:3476-81(1976)；Yoshimura等,Cancer,73:2745-52(1994)；Yamaguchi等,Br.J.Cancer,60:382-84(1989)；Alfthan等,Cancer Res.,52:4628-33(1992))；糖基转移酶β-1,4-N-乙酰半乳糖氨基转移酶(GalNAc)(Hoon等,Int.J.Cancer,43:857-62(1989)；Ando等,Int.J.Cancer,40:12-17(1987)；Tsuchida等,J.Natl.Cancer,78:45-54(1987)；Tsuchida等,J.Natl.Cancer,78:55-60(1987))；NUC18(Lehmann等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86:9891-95(1989)；Lehmann等,Cancer Res.,47:841-45(1987))；黑素瘤抗原gp75(Vijayasardahi等,J.Exp.Med.,171:1375-80(1990)；GenBank编号X51455)；人细胞角蛋白8；高分子量黑素瘤抗原(Natali等,Cancer,59:55-63(1987))；角蛋白19(Datta等,J.Clin.Oncol.,12:475-82(1994))。

感兴趣的肿瘤抗原包括本领域视作“癌症/睾丸”(CT)抗原的抗原，它们在具有恶性状况的受试者中是免疫原性的(Scanlan等,Cancer Immun.,4:1(2004))。CT抗原包括至少19种不同的抗原家族，它们含有一个或多个成员，而且能够诱导免疫应答，包括但不限于MAGEA(CT1)；BAGE(CT2)；MAGEB(CT3)；GAGE(CT4)；SSX(CT5)；NY-ESO-1(CT6)；MAGEC(CT7)；SYCP1(C8)；SPANXB1(CT11.2)；NA88(CT18)；CTAGE(CT21)；SPA17(CT22)；OY-TES-1(CT23)；CAGE(CT26)；HOM-TES-85(CT28)；HCA661(CT30)；NY-SAR-35(CT38)；FATE(CT43)和TPTE(CT44)。

可以靶向的别的肿瘤抗原(包括肿瘤相关或肿瘤特异性抗原)包括但不限于α-辅肌动蛋白-4，Bcr-Abl融合蛋白，Casp-8，β-联蛋白，cdc27，cdk4，cdkn2a，coa-1，dek-can融合蛋白，EF2，ETV6-AML1融合蛋白，LDLR-岩藻糖转移酶AS融合蛋白，HLA-A2，HLA-A11，hsp70-2，KIAAO205，Mart2，Mum-1，2,和3，neo-PAP，I类肌球蛋白，OS-9，pml-RARα融合蛋白，PTPRK，K-ras，N-ras，磷酸丙糖异构酶，Bage-1，Gage 3,4,5,6,7，GnTV，Herv-K-mel，Lage-1，Mage-A1,2,3,4,6,10,12，Mage-C2，NA-88，NY-Eso-1/Lage-2，SP17，SSX-2，和TRP2-Int2，MelanA(MART-I)，gp100(Pmel 17)，酪氨酸酶，TRP-1，TRP-2，MAGE-1，MAGE-3，BAGE，GAGE-1，GAGE-2，p15(58)，CEA，RAGE，NY-ESO(LAGE)，SCP-1，Hom/Mel-40，PRAME，p53，H-Ras，HER-2/neu，BCR-ABL，E2A-PRL，H4-RET，IGH-IGK，MYL-RAR，EpsteinBarr病毒抗原，EBNA，人***瘤病毒(HPV)抗原E6和E7，TSP-180，MAGE-4，MAGE-5，MAGE-6，p185erbB2，p180erbB-3，c-met，nm-23H1，PSA，TAG-72-4，CA 19-9，CA 72-4，CAM 17.1，NuMa，K-ras，β-联蛋白，CDK4，Mum-1，p16，TAGE，PSMA，PSCA，CT7，端粒末端转移酶，43-9F，5T4，791Tgp72，α-胎蛋白，13HCG，BCA225，BTAA，CA 125，CA 15-3(CA27.29\BCAA)，CA 195，CA 242，CA-50，CAM43，CD68\KP1，CO-029，FGF-5，G250，Ga733(EpCAM)，HTgp-175，M344，MA-50，MG7-Ag，MOV18，NB\70K，NY-CO-1，RCAS1，SDCCAG16，TA-90(Mac-2结合蛋白\亲环蛋白C相关蛋白)，TAAL6，TAG72，TLP，和TPS。其它肿瘤相关和肿瘤特异性抗原是本领域技术人员已知的，而且适合于通过所公开的融合蛋白来靶向。

与肿瘤新血管***有关的抗原

蛋白质治疗剂在***中可能是低效/无效的，因为它们在肿瘤穿透方面是低效/无效的。肿瘤相关新血管***提供了容易可及的路径，蛋白质治疗剂经由它能到达肿瘤。在另一个实施方案中，融合蛋白含有特异性结合如下抗原的域，该抗原由与肿瘤有关的新血管***表达。

抗原可以是肿瘤新血管***特异性的，或者可以是与正常血管***相比在肿瘤新血管***中以更高水平表达的。与正常血管***相比由肿瘤相关新血管***过表达的例示性抗原包括但不限于VEGF/KDR、Tie2、血管细胞粘附分子(VCAM)、内皮糖蛋白和α₅β₃整联蛋白/玻连蛋白。与正常血管***相比由肿瘤相关新血管***过表达的其它抗原是本领域技术人员已知的，而且适合于通过所公开的融合蛋白来靶向。

趋化因子/趋化因子受体

在另一个实施方案中，融合蛋白含有特异性结合趋化因子或趋化因子受体的域。趋化因子为可溶的小分子量(8-14kDa)蛋白质，它们结合其关联G-蛋白偶联受体(GPCR)以引发细胞应答，通常是定向迁移或趋化。肿瘤细胞分泌且响应趋化因子，这促进生长，通过升高的内皮细胞募集和血管发生、对免疫学监督的破坏及机动肿瘤白细胞概况使其偏向使得肿瘤生长和转移至远端部位能够实现的趋化因子释放来实现。如此，趋化因子对于肿瘤发展是至关重要的。

基于趋化因子的保守的两个N端半胱氨酸残基的定位，将它们归类入四个组，即CXC、CC、CX3C和C趋化因子。基于CXC序列之前基序“glu-leu-arg(ELR基序)”的存在或缺失，CXC趋化因子可进一步归类入ELR+和ELR-趋化因子。CXC趋化因子结合及活化嗜中性细胞、淋巴细胞、内皮和上皮细胞上的其关联趋化因子受体。CC趋化因子作用于树突细胞、淋巴细胞、巨噬细胞、嗜曙红细胞、天然杀伤细胞的数个亚类，但是不刺激嗜中性细胞，因为它们缺少CC趋化因子受体，鼠嗜中性细胞除外。有大约50种趋化因子和仅20种趋化因子受体，如此，配体/受体相互作用的这种***中有客观的冗余。

自肿瘤和基质细胞产生的趋化因子结合肿瘤和基质细胞上存在的趋化因子受体。肿瘤细胞的自分泌环及肿瘤和基质细胞之间的旁分泌刺激环促进肿瘤的发展。值得注意地，CXCR2、CXCR4、CCR2和CCR7在肿瘤发生和转移中发挥重要作用。CXCR2在血管发生中发挥至关重要的作用，而CCR2在巨噬细胞募集入肿瘤微环境中发挥作用。CCR7参与肿瘤细胞转移入哨兵***，因为该***具有CCR7的配体，即CCL21。CXCR4主要参与极其多种肿瘤的转移扩散。

靶向域的分子类别

配体和受体

在一个实施方案中，肿瘤或肿瘤相关新血管***靶向域为结合如下细胞表面抗原或受体的配体，该细胞表面抗原或受体在肿瘤细胞或肿瘤相关新血管***上特异性表达或者与正常组织相比在肿瘤细胞或肿瘤相关新血管***上过表达。肿瘤还将多种配体分泌入肿瘤微环境，其影响肿瘤生长和发展。结合由肿瘤分泌的配体(包括但不限于生长因子、细胞因子和趋化因子，包括上文提供的趋化因子)的受体适合于在所公开的融合蛋白中使用。由肿瘤分泌的配体可使用结合所分泌配体的受体的可溶性片段来靶向。可溶性受体片段为可以自生成细胞脱落、分泌或以其它方式提取的多肽的片段，而且包括完整细胞外结构域或其片段。

单一多肽抗体

在另一个实施方案中，肿瘤或肿瘤相关新血管***靶向域为结合如下细胞表面抗原或受体的单一多肽抗体，该细胞表面抗原或受体在肿瘤细胞或肿瘤相关新血管***上特异性表达或者与正常组织相比在肿瘤细胞或肿瘤相关新血管***上过表达。上文关于共抑制性受体拮抗剂域描述了单一域抗体。

Fc域

在另一个实施方案中，肿瘤或肿瘤相关新血管***靶向域为结合在肿瘤细胞上或在肿瘤相关新血管***上表达的Fc受体的免疫球蛋白重链Fc域。如本文中使用的，Fc区包括含有抗体恒定区(排除第一恒定区免疫球蛋白域)的多肽。如此，Fc指IgA、IgD和IgG的最后两个恒定区免疫球蛋白域，及IgE和IgM的最后三个恒定区免疫球蛋白域。在一个优选的实施方案中，Fc域衍生自人或鼠免疫球蛋白。在一个更优选的实施方案中，Fc域衍生自人IgG1或鼠IgG2a，包括C_H2和C_H3区。

在一个实施方案中，人免疫球蛋白Cγ1链的铰链、C_H2和C_H3区由与下述序列具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％序列同一性的核酸编码：

(SEQ ID NO:44)。

由SEQ ID NO:44编码的人免疫球蛋白Cγ1链铰链、C_H2和C_H3区具有下述氨基酸序列：

(SEQ ID NO:45)。

在另一个实施方案中，鼠免疫球蛋白Cγ2a链的铰链、C_H2和C_H3区由与下述序列具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％序列同一性的核酸编码：

(SEQ ID NO:46)。

由SEQ ID NO:46编码的鼠免疫球蛋白Cγ2a链铰链、C_H2和C_H3区具有下述氨基酸序列：

(SEQ ID NO:47)。

在一个实施方案中，Fc域可含有一处或多处氨基酸***、缺失或替代，其增强与如下特定Fc受体的结合，该特定Fc受体在肿瘤或肿瘤相关新血管***上特异性表达或者相对于正常组织在肿瘤或肿瘤相关新血管***上过表达。合适的氨基酸替代包括保守性和非保守性替代，如上所述。

为非何杰金氏淋巴瘤或瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症而用利妥昔单抗(rituximab)(一种针对CD20的嵌合小鼠/人IgG1单克隆抗体)处理的患者中的治疗结果与个体的Fcγ受体的等位基因变体的表达有关，该Fcγ受体等位基因变体对人IgG1的Fc域具有独特的内在亲和力。特别地，具有低亲和力活化性Fc受体CD16A(FcγRIIIA)的高亲和力等位基因的患者显示出更高的响应率及，在非何杰金氏淋巴瘤情况中的改善的无进展存活。在另一个实施方案中，Fc域可含有一处或多处氨基酸***、缺失或替代，它们降低对低亲和力抑制性Fc受体CD32B(FcγRIIB)的结合及保持野生型水平的对低亲和力活化性Fc受体CD16A(FcγRIIIA)的结合或增强对低亲和力活化性Fc受体CD16A(FcγRIIIA)的结合。在一个优选的实施方案中，Fc域含有增强对CD16A的结合的氨基酸***、缺失或替代。人IgG1的Fc域中提高对CD16A的结合及降低对CD32B的结合的多种替代是本领域已知的，而且记载于Stavenhagen等,Cancer Res.,57(18):8882-90(2007)。具有降低的对CD32B的结合和/或升高的对CD16A的结合的例示性人IgG1Fc域变体含有F243L、R929P、Y300L、V305I或P296L替代。这些氨基酸替代可以以任何组合存在于人IgG1Fc域中。在一个实施方案中，人IgG1Fc域变体含有F243L、R929P和Y300L替代。在另一个实施方案中，人IgG1Fc域变体含有F243L、R929P、Y300L、V305I和P296L替代。

糖磷脂酰肌醇锚域

在另一个实施方案中，肿瘤或肿瘤相关新血管***靶向域为为翻译后添加糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚提供信号的多肽。GPI锚为翻译后添加至多种真核蛋白质C端的糖脂结构。此修饰锚定细胞膜外叶中的被锚定蛋白质。GPI锚可用于将T细胞受体结合域附着至细胞表面以呈递给T细胞。在这个实施方案中，GPI锚域为T细胞受体结合域的C端。

在一个实施方案中，GPI锚域为当多肽在真核***中表达时发出翻译后添加GPI锚的信号的多肽。锚添加由GPI锚信号序列决定，其包括锚添加位点(ω位点)处的一组小氨基酸，后续亲水性间隔物及以疏水性串结束(Low,FASEB J.,3:1600-1608(1989))。在ER中发生对此信号序列的切割，之后添加具有保守中央成分(Low,FASEB J.,3:1600-1608(1989))但有可变外周模块(Homans等,Nature,333:269-272(1988))的锚。GPI锚定的蛋白质的C端经由磷酸乙醇胺桥连接至高度保守的核心聚糖，甘露糖(α1-2)甘露糖(α1-6)甘露糖(α1-4)葡糖胺(α1-6)肌肉-肌醇。磷脂尾将GPI锚附着至细胞膜。聚糖核心可以用侧链各式各样地修饰，诸如磷酸乙醇胺基团、甘露糖、半乳糖、唾液酸或其它糖。最常见的附着至第一个甘露糖残基的侧链为另一个甘露糖。附着至聚糖核心的第三个甘露糖的复杂侧链，诸如含有N-乙酰基半乳糖胺的多糖见于哺乳动物锚结构。核心葡糖胺很少修饰。取决于蛋白质和物种起源，磷酸肌醇环的脂质锚为二酰甘油、烃基酰基甘油或神经酰胺。脂质种类长度有变化，范围为14至28个碳，而且可以是饱和的或不饱和的。多种GPI锚还在肌醇环的2-羟基上含有别的脂肪酸，诸如棕榈酸。此额外的脂肪酸使得GPI锚对PI-PLC的切割有抗性。

GPI锚附着可通过在能够进行PGI翻译后修饰的真核***中表达含有GPI锚域的融合蛋白来实现。GPI锚域可用作肿瘤或肿瘤血管***靶向域，或者可另外添加至已含有别的肿瘤或肿瘤血管***靶向域的融合蛋白。

在另一个实施方案中，经由体外酶促或化学工艺，GPI锚模块直接添加至分离的T细胞受体结合域。在这个实施方案中，GPI锚可添加至不需要GPI锚域的多肽。如此，GPI锚模块可添加至本文中描述的具有T细胞受体结合域和肿瘤或肿瘤血管***靶向域的融合蛋白。或者，GPI锚可直接添加至不需要编码肿瘤或肿瘤血管***靶向域的融合配偶的T细胞受体结合域多肽。

2.肽或多肽接头域

本文中公开的融合蛋白任选含有肽或多肽接头域，其将共刺激多肽域与抗原结合靶向域分开。

抗体的铰链区

在一个实施方案中，接头域含有免疫球蛋白的铰链区。在一个优选的实施方案中，铰链区衍生自人免疫球蛋白。可衍生铰链的合适的人免疫球蛋白包括IgG、IgD和IgA。在一个优选的实施方案中，铰链区衍生自人IgG。

在另一个实施方案中，接头域含有上文描述的免疫球蛋白的铰链区，而且进一步包括一个或多个别的免疫球蛋白域。在一个实施方案中，别的域包括免疫球蛋白的Fc域。如本文中使用的，Fc区包括含有抗体恒定区(排除第一恒定区免疫球蛋白域)的多肽。如此，Fc指IgA、IgD和IgG的最后两个恒定区免疫球蛋白域，及IgE和IgM的最后三个恒定区免疫球蛋白域。在一个优选的实施方案中，Fc域衍生自人免疫球蛋白。在一个更优选的实施方案中，Fc域衍生自包括C_H2和C_H3区的人IgG。

在另一个实施方案中，接头域含有免疫球蛋白的铰链区，而且或是免疫球蛋白重链的C_H1域或是免疫球蛋白轻链的C_L域。在一个优选的实施方案中，C_H1或C_L域衍生自人免疫球蛋白。C_L域可衍生自κ轻链或λ轻链。在一个更优选的实施方案中，C_H1或C_L域衍生自人IgG。

免疫球蛋白铰链区和其它域的氨基酸序列是本领域公知的。

其它肽/多肽接头域

其它合适的肽/多肽接头域包括天然存在或非天然存在的肽或多肽。肽接头序列长度为至少2个氨基酸。优选地，肽或多肽域为柔性肽或多肽。“柔性接头”在本文中指如下的肽或多肽，其含有通过肽键相连接的两个或更多个氨基酸残基，为由此相连接的两条多肽提供比在没有柔性接头下两条相连接的多肽升高的旋转自由。此类旋转自由容许通过柔性接头相连接的两个或更多个抗原结合位点均更有效地到达靶抗原。例示性的柔性肽/多肽包括但不限于氨基酸序列Gly-Ser、Gly-Ser-Gly-Ser(SEQ ID NO:48)、Ala-Ser、Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO:49)、(Gly₄-Ser)₃(SEQ ID NO:50)和(Gly₄-Ser)₄(SEQ ID NO:51)。别的柔性肽/多肽序列是本领域公知的。

3.二聚化和多聚化域

本文中公开的融合蛋白任选含有二聚化或多聚化域，其发挥使两个或更多个融合蛋白二聚化或多聚化的功能。发挥使融合蛋白二聚化或多聚化功能的域可以是单独的域，或者可以包含在融合蛋白的其它域(T细胞共刺激/共抑制受体结合域、肿瘤/肿瘤新血管***抗原结合域或肽/多肽接头域)之一内。

二聚化域

“二聚化域”通过至少两个氨基酸残基或至少两条肽或多肽(其可具有相同或不同的氨基酸序列)的联合来形成。肽或多肽可以经由共价和/或非共价联合而彼此相互作用。优选的二聚化域含有至少一个半胱氨酸，其能够与配偶融合蛋白上的半胱氨酸形成分子间二硫键。二聚化域可含有一个或多个半胱氨酸残基，使得能在配偶融合蛋白间形成二硫键。在一个实施方案中，二聚化域含有一个、两个或三个至约十个半胱氨酸残基。在一个优选的实施方案中，二聚化域为免疫球蛋白的铰链区。在这个特别的实施方案中，二聚化域包含在融合蛋白的接头肽/多肽内。

别的例示性的二聚化域可以是本领域已知的任何二聚化域，而且包括但不限于卷曲螺旋、酸性斑、锌指、钙手、C_H1-C_L对、如美国专利No.5,821,333中记载的具有工程化改造的“节”和/或“突起”的“界面”、亮氨酸拉链(例如来自jun和/或fos)(美国专利No.5,932,448)、SH2(src同源物2)、SH3(src同源物3)(Vidal等,Biochemistry,43,7336-44((2004))、磷酸酪氨酸结合(PTB)(Zhou等,Nature,378:584-592(1995))、WW(Sudol,Prog.Biochys.Mol.Bio.,65:113-132(1996))、PDZ(Kim等,Nature,378:85-88(1995)；Komau等,Science,269:1737-1740(1995))14-3-3、WD40(Hu等,J Biol Chem.,273,33489-33494(1998))EH、Lim、异亮氨酸拉链、受体二聚物对(例如白介素-8受体(IL-8R)；和整联蛋白异二聚物诸如LFA-1和GPIIIb/IIIa)或其二聚化区、二聚配体多肽(例如神经生长因子(NGF)、神经营养蛋白-3(NT-3)、白介素-8(IL-8)、血管内皮生长因子(VEGF)、VEGF-C、VEGF-D、PDGF成员和脑衍生神经营养因子(BDNF)(Arakawa等,J.Biol.Chem.,269(45):27833-27839(1994)及Radziejewski等,Biochem.,32(48):1350(1993))，而且还可以是这些域的变体，其中亲和力发生改变。多肽对可以通过本领域已知方法来鉴定，包括酵母双杂交筛选。酵母双杂交筛选记载于美国专利No.5,283,173和6,562,576，通过述及将二者完整收入本文。一对相互作用域之间的亲和力可利用本领域已知方法来测定，包括如记载于Katahira等,J.Biol.Chem.,277,9242-9246(2002))。或者，可以对肽序列文库筛选异二聚化，例如使用WO 01/00814中记载的方法。对于蛋白质-蛋白质相互作用有用的方法还记载于美国专利No.6,790,624。

多聚化域

“多聚化域”为引起三条或更多条肽或多肽经由共价和/或非共价联合而彼此相互作用的域。合适的多聚化域包括但不限于卷曲螺旋域。卷曲螺旋为通常在七个氨基酸(七元重复)或十一个氨基酸(十一元重复)的序列中，具有相隔3和4个残基的主要是疏水性残基的连续样式的肽序列，其装配(折叠)以形成多聚螺旋束。还涵盖序列包括3和4个残基间距的一些不规则分布的卷曲螺旋。疏水性残基特别是疏水性氨基酸Val、Ile、Leu、Met、Tyr、Phe和Trp。主要是疏水性的意味着至少50％的残基必须选自所述疏水性氨基酸。

卷曲螺旋域可衍生自层粘连蛋白。在细胞外空间中，异三聚卷曲螺旋蛋白质层粘连蛋白在基底膜的形成中发挥重要作用。显然地，多功能寡聚结构是层粘连蛋白功能所需要的。卷曲螺旋域还可衍生自血小板反应蛋白，其中三条(TSP-1和TSP-2)或五条(TSP-3、TSP-4和TSP-5)链相连接，或来自COMP(COMPcc)(Guo等,EMBO J.,1998,17:5265-5272)，其折叠成平行的五链卷曲螺旋(Malashkevich等,Science,274:761-765(1996))。

别的衍生自其它蛋白质的卷曲螺旋域，和其它介导多肽多聚化的域是本领域已知的，而且适合于在所公开的融合蛋白中使用。

4.例示性的融合蛋白

B7-DC

一种代表性鼠PD-L2融合蛋白由与下述序列具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％序列同一性的核酸编码：

(SEQ ID NO:52)

由SEQ ID NO:52编码的鼠PD-L2融合蛋白具有下述氨基酸序列：

(SEQ ID NO:53)

SEQ ID NO:53的鼠PD-L2融合蛋白没有信号序列的氨基酸序列为：

(SEQ ID NO:54)。

一种代表性人PD-L2融合蛋白由与下述序列具有至少80％、85％、90％、95％、99％或100％序列同一性的核酸编码：

(SEQ ID NO:55)

由SEQ ID NO:55编码的人PD-L2融合蛋白具有下述氨基酸序列：

(SEQ ID NO:56)

SEQ ID NO:56的人PD-L2融合蛋白没有信号序列的氨基酸序列为：

(SEQ ID NO:57)。

G.分离的编码PD-1受体拮抗剂的核酸分子

公开了分离的编码PD-1拮抗剂多肽、其变体及其融合蛋白的核酸序列。如本文中使用的，“分离的核酸”指与哺乳动物基因组中存在的其它核酸分子(包括正常情况下在哺乳动物基因组中位于感兴趣核酸一侧或两侧的核酸)分开的感兴趣核酸。

分离的核酸可以是例如DNA分子，前提是正常情况下在天然存在基因组中发现正好位于该DNA分子侧翼的核酸序列之一被除去或缺失。如此，分离的核酸包括但不限于独立于其它序列作为分开的分子存在的DNA分子(例如化学合成的核酸或通过PCR或限制性内切核酸酶处理生成的cDNA或基因组DNA片段)，以及掺入载体、自主复制质粒、病毒(例如逆转录病毒、慢病毒、腺病毒或疱疹病毒)、或掺入原核生物或真核生物的重组DNA。另外，分离的核酸可包括工程化改造的核酸，诸如作为杂合或融合核酸一部分的重组DNA分子。在例如cDNA文库或基因组文库或含有基因组DNA限制性消化物的凝胶片内数以百计至数以百万计的其它核酸中存在的核酸不被视作分离的核酸。

核酸可以处以有义或反义取向，或者可以与编码B7-DC、PD-L1、PD-1或B7.1多肽或其变体的参照序列互补。参照序列包括例如本领域已知的和上文讨论的人B7-DC、人PD-L1或鼠PD-L2和鼠PD-L1的核苷酸序列。

核酸可以是DNA、RNA或核酸类似物。核酸类似物可以在碱基模块、糖模块或磷酸根模块处修饰。此类修饰可以改进例如核酸的稳定性、杂交或溶解性。碱基模块处的修饰可包括用于脱氧胸苷的脱氧尿苷，及用于脱氧胞苷的5-甲基-2’-脱氧胞苷或5-溴-2’-脱氧胞苷。糖模块处的修饰可包括修饰核糖的2’-羟基以形成2’-O-甲基或2’-O-烯丙基糖。可修饰脱氧核糖磷酸酯主链以生成吗啉代核酸，其中每个碱基模块连接至六元吗啉代环，或肽核酸，其中脱氧磷酸酯主链用假肽主链替换且保留四种碱基。参见例如Summerton和Weller(1997)Antisense Nucleic Acid Drug Dev.7:187-195；及Hyrup等(1996)Bioorgan.Med.Chem.4:5-23。另外，脱氧磷酸酯主链可以用例如硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯主链、氨基磷酸酯或烃基磷酸三酯主链替换。

H.表达PD-1受体拮抗剂的载体和宿主细胞

核酸，诸如上文描述的那些，可***载体，用于在细胞中表达。如本文中使用的，“载体”为其中可***另一DNA区段，从而使得所***的区段复制的复制子，诸如质粒、噬菌体或粘粒。载体可以是表达载体。“表达载体”为包括一种或多种表达控制序列的载体，而“表达调控序列”为控制和调节另一DNA序列的转录和/或翻译的DNA序列。

载体中的核酸可操作连接一种或多种表达调控序列。如本文中使用的，“可操作连接”意味着掺入遗传构建物，使得表达调控序列有效控制感兴趣编码序列的表达。表达调控序列的例子包括启动子、增强子和转录终止区。启动子为由DNA分子的一个区域构成的表达调控序列，通常在转录起始的点上游100个核苷酸内(一般在RNA聚合酶II的起始位点附近)。为了使编码序列在启动子控制下，必须使多肽的翻译读框的翻译起始位点位于启动子下游介于1个和约50个核苷酸之间。增强子提供时间、位置和水平方面的表达特异性。与启动子不同，增强子在位于距转录位点各种距离时能发挥功能。增强子还可位于转录起始位点的下游。当RNA聚合酶能够将编码序列转录成mRNA，然后mRNA能翻译成由该编码序列编码的蛋白质时，在细胞中编码序列与表达控制序列可操作连接及在表达控制序列控制下。

合适的表达载体包括但不限于质粒和病毒载体，其衍生自例如噬菌体、杆状病毒、烟草花叶病毒、疱疹病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒、痘苗病毒、腺病毒和腺伴随病毒。众多载体和表达***可购自诸如Novagen(Madison,WI)、Clontech(Palo Alto,CA)、Stratagene(La Jolla,CA)、和Invitrogen LifeTechnologies(Carlsbad,CA)等公司。

表达载体可包括标签序列。标签序列通常表达为与所编码多肽的融合物。此类标签可***多肽内的任何处，包括羧基或氨基端任一。有用的标签的例子包括但不限于绿色荧光蛋白(GFP)、谷胱甘肽S-转移酶(GST)、多组氨酸、c-myc、血凝素、Flag^TM标签(Kodak,New Haven,CT)、麦芽糖E结合蛋白和蛋白A。在一个实施方案中，变体PD-L2融合蛋白存在于载体中，该载体含有编码Ig重链恒定区的一个或多个域的核酸，优选具有与人免疫球蛋白Cγ1链的铰链、C_H2和C_H3区对应的氨基酸序列。

含有要表达的核酸的载体可转移入宿主细胞。术语“宿主细胞”意图包括其中可导入重组表达载体的原核和真核细胞。如本文中使用的，“转化”和“转染”涵盖通过多种技术之一将核酸分子(例如载体)导入细胞。虽然不限于特定技术，本领域已完善建立多种这些技术。通过例如电穿孔或氯化钙介导的转化，可以用核酸转化原核细胞。通过包括例如磷酸钙共沉淀、DEAE-右旋糖苷介导的转染、脂转染、电穿孔或显微注射的技术，可以将核酸转染入哺乳动物细胞。宿主细胞(例如原核细胞或真核细胞，诸如CHO细胞)可用于例如生成本文中描述的PD-1拮抗剂多肽。

I.抗体PD-1拮抗剂

公开了与PD-1拮抗剂或PD-1的表位反应的单克隆和多克隆抗体。单克隆抗体(单抗)及用于生成和使用它们的方法记载于Kohler和Milstein,Nature256:495-497(1975)；美国专利No.4,376,110；Hartlow,E.等,Antibodies:ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1988)；Monoclonal Antibodies and Hybridomas:A New Dimension inBiological Analyses,Plenum Press,New York,N.Y.(1980)；H.Zola等,inMonoclonal Hybridoma Antibodies:Techniques and Applications,CRC Press,1982))。

对于免疫应答的增强、提示或刺激，优选如下的抗体，其结合PD-1及阻断经由PD-1的信号转导，而且具有比当前使用的那些要低的亲和力，从而容许抗体在施用后不到三个月、两个月、一个月、三周、两周、一周或几天的时段里解离。

免疫测定方法记载于Coligan,J.E.等,eds.,Current Protocols inImmunology,Wiley-Interscience,New York 1991(或最新版本)；Butt,W.R.(ed.)Practical Immunoassay:The State of the Art,Dekker,N.Y.,1984；Bizollon,Ch.A.,ed.,Monoclonal Antibodies and New Trends in Immunoassays,Elsevier,N.Y.,1984；Butler,J.E.,ELISA(第29章),In:van Oss,C.J.等,(eds),Immunochemistry,Marcel Dekker,Inc.,New York,1994,pp.759-803；Butler,J.E.(ed.),Immunochemistry of Solid-Phase Immunoassay,CRC Press,Boca Raton,1991；Weintraub,B.,Principles of Radioimmunoassays,Seventh Training Courseon Radioligand Assay Techniques,The Endocrine Society,March,1986；Work,T.S.等,Laboratory Techniques and Biochemistry in Molecular Biology,NorthHolland Publishing Company,NY,(1978)(Chapter by Chard,T.,"AnIntroduction to Radioimmune Assay and Related Techniques")。

抗独特型抗体记载于例如Idiotypy in Biology and Medicine,AcademicPress,New York,1984；Immunological Reviews Volume 79,1984；Immunological Reviews Volume 90,1986；Curr.Top.Microbiol.,Immunol.Volume 119,1985；Bona,C.等,CRC Crit.Rev.Immunol.,pp.33-81(1981)；Jerme,N K,Ann.Immunol.125C:373-389(1974)；Jerne,N K,In:Idiotypes--Antigens on the Inside,Westen-Schnurr,I.,ed.,Editiones Roche,Basel,1982；Urbain,J.等,Ann.Immunol.133D:179-(1982)；Rajewsky,K.等,Ann.Rev.Immunol.1:569-607(1983)。

抗体可以是异种的(xenogeneic)、同种异型的(allogeneic)、同基因的(syngeneic)或其修饰形式，诸如人源化的或嵌合的抗体。还包括对特定抗体例如抗PD-L2抗体的独特型特异的抗独特型抗体。术语“抗体”意图包括完整分子以及其包括抗原结合位点且能够结合PD-1拮抗剂表位的片段二者。这些包括Fab和F(ab')₂片段，它们缺少完整抗体的Fc片段，更加快速地自循环清除，而且可具有比完整抗体要少的非特异性组织结合(Wahl等,J.Nuc.Med.24:316-325(1983))。还包括Fv片段(Hochman,J.等(1973)Biochemistry12:1130-1135；Sharon,J.等(1976)Biochemistry 15:1591-1594)。这些各种片段是使用常规技术生成的，诸如蛋白酶切割或化学切割(参见例如Rousseaux等,Meth.Enzymol.,121:663-69(1986))。

多克隆抗体以来自经免疫动物的血清获得，诸如家兔、山羊、啮齿类动物等，而且可以直接使用无需进一步处理或者可以进行常规富集或纯化方法，诸如硫酸铵沉淀、离子交换层析和亲和层析。

免疫原可以包括完整PD-1拮抗剂、PD-1或其片段或衍生物。优选的免疫原包括PD-1拮抗剂或PD-1的完整或部分细胞外结构域(ECD)，其中这些残基含有翻译后修饰，诸如糖基化。包括细胞外结构域的免疫原以本领域已知的多种方式生成，例如使用常规重组方法表达克隆的基因或自细胞来源分离。

单克隆抗体可以使用常规杂交瘤技术来生成，诸如由Kohler和Milstein,Nature,256:495-97(1975)介绍的规程及其改良(参见上文参考文献)。通过用如上所述免疫原免疫接种使动物(优选小鼠)致敏以在致敏的动物中引发期望抗体应答。将来自致敏动物之***、脾或外周血的B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，通常在融合促进剂存在下进行，诸如聚乙二醇(PEG)。多种鼠骨髓瘤细胞系可用于此类用途：P3-NS1/1-Ag4-1，P3-x63-k0Ag8.653，Sp2/0-Ag14或HL1-653骨髓瘤系(可得自ATCC,Rockville,Md.)。后续步骤包括在选择性培养基中生长，使得未融合的亲本骨髓瘤细胞和供体淋巴细胞细胞最终死亡，而只有杂交瘤细胞存活。将这些细胞克隆并培养，并对它们的上清液筛选具有期望特异性的抗体的存在，例如使用PD-L2或PD-L1融合蛋白通过免疫测定技术进行。亚克隆阳性克隆，例如通过有限稀释，并分离单克隆抗体。

使用本领域已知的技术(一般参见Fink等,Prog.Clin.Pathol.,9:121-33(1984))，可以在体外或在体内(在腹水中)扩增依照这些方法生成的杂交瘤。一般地，在培养物中扩增各细胞系，并可以通过倾析、过滤或离心来收获含有高浓度的单一单克隆抗体的培养液。

可以作为单链抗体或scFv而非普通多聚物结构来生成抗体。单链抗体包括来自感兴趣Ig的高变区，并且再创建天然Ig的抗原结合位点，同时大小是完整Ig的分数(Skerra,A.等Science,240:1038-1041(1988)；Pluckthun,A.等Methods Enzymol.178:497-515(1989)；Winter,G.等Nature,349:293-299(1991))。在一个优选的实施方案中，使用常规分子生物学技术来生成抗体。

III.制造方法

A.用于生产PD-1拮抗剂多肽及其变体的方法

分离的PD-1拮抗剂多肽、其变体、及其融合蛋白可通过例如化学合成或通过宿主细胞中的重组生产来获得。为了重组生产PD-1拮抗剂多肽，可以用含有编码多肽的核苷酸序列的核酸转化、转导、或转染细菌或真核宿主细胞(例如昆虫、酵母、或哺乳动物细胞)。一般而言，核酸构建物包括与编码PD-1拮抗剂多肽的核苷酸序列可操作连接的调节序列。调节序列(在本文中也称作表达调控序列)通常不编码基因产物，而是影响与它们可操作连接的核酸序列的表达。

对于表达和生产多肽有用的原核和真核***是本领域公知的，包括例如大肠杆菌菌株诸如BL-21和培养的哺乳动物细胞诸如CHO细胞。

在真核宿主细胞，可利用多种基于病毒的表达***来表达PD-1拮抗剂多肽。基于病毒的表达***是本领域公知的，而且包括但不限于杆状病毒、SV40、逆转录病毒或基于痘苗的病毒载体。

可以使用具有适宜调控元件和选择标志的表达载体来生成稳定表达变体共刺激多肽的哺乳动物细胞系。例如，真核表达载体pCR3.1(Invitrogen LifeTechnologies)和p91023(B)(参见Wong等(1985)Science 228:810-815)对于在例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、COS-1细胞、人胚肾293细胞、NIH3T3细胞、BHK21细胞、MDCK细胞和人血管内皮细胞(HUVEC)中表达变体共刺激多肽是合适的。通过电穿孔、脂转染、磷酸钙或氯化钙共沉淀、DEAE右旋糖苷、或其它合适的转染方法导入表达载体后，可以选择(例如通过对G418、卡那霉素、或潮霉素的抗生素抗性)稳定的细胞系。可以培养经转染的细胞，使得感兴趣多肽表达，并且可以自例如细胞培养物上清液或自裂解的细胞回收多肽。或者，可以如下来生产PD-1拮抗剂多肽，(a)将扩增的序列连接入哺乳动物表达载体，诸如pcDNA3(Invitrogen Life Technologies)，并(b)使用小麦胚提取物或家兔网织红细胞溶胞物在体外转录和翻译。

可以使用例如层析方法来分离PD-1拮抗剂多肽，诸如DEAE离子交换、凝胶过滤和羟基磷灰石层析。例如，可以使用蛋白G柱来分离细胞培养物上清液或细胞质提取物中的共刺激多肽。在一些实施方案中，可以“工程化改造”变体共刺激多肽以含有容许多肽被捕捉到亲和基质上的氨基酸序列。例如，可以使用标签来帮助多肽纯化，诸如c-myc、血凝素、多组氨酸或Flag^TM(Kodak)。此类标签可以***多肽内的任何处，包括羧基或氨基端任一。其它可能有用的融合包括帮助检测多肽的酶，诸如碱性磷酸酶。也可以使用免疫亲和层析来纯化共刺激多肽。

用于引入随机突变以生成变体多肽的方法是本领域已知的。可以使用随机肽展示文库来筛选与PD-1受体或配体相互作用的肽。用于创建和筛选此类随机肽展示文库的技术是本领域已知的(Ladner等,美国专利No.5,223,409；Ladner等,美国专利No.4,946,778；Ladner等,美国专利No.5,403,484和Ladner等,美国专利No.5,571,698)，而且随机肽展示文库和用于筛选此类文库的试剂盒是商品化的。

B.用于生成分离的编码PD-1拮抗剂多肽的核酸分子的方法

可以通过标准技术来生成分离的编码PD-1拮抗剂多肽的核酸分子，包括但不限于常用分子克隆和化学核酸合成技术。例如，聚合酶链式反应(PCR)技术可用于获得分离的编码变体共刺激多肽的核酸。PCR为一种酶促扩增靶核酸的技术。典型地，可采用来自感兴趣区域末端或以外的序列信息来设计在序列方面与要扩增的模板的相反链相同的寡核苷酸引物。PCR可用于自包括来自总基因组DNA或总细胞RNA的序列的DNA以及RNA扩增特定序列。引物通常长度为14至40个核苷酸，但是长度范围可以是10个核苷酸至数以百计的核苷酸。一般的PCR技术记载于例如PCR Primer:A Laboratory Manual,Dieffenbach和Dveksler编,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1995。当使用RNA作为模板来源时，可使用逆转录酶来合成互补DNA(cDNA)链。连接酶链式反应、链置换扩增、自持序列复制或基于核酸序列的扩增也可用于获得分离的核酸。参见例如Lewis(1992)Genetic Engineering News 12:1；Guatelli等(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:1874-1878；及Weiss(1991)Science254:1292-1293。

分离的核酸可以化学合成，或是作为单一核酸分子或是作为一系列寡核苷酸(例如使用亚磷酰胺技术进行3’至5’方向的自动化DNA合成)。例如，可以合成一或多对含有期望序列的长寡核苷酸(例如>100个核苷酸)，其中每对含有一小段互补性(例如约15个核苷酸)，使得寡核苷酸对退火时形成双链体。可使用DNA聚合酶来延伸寡核苷酸，每对寡核苷酸产生单一双链核酸分子，然后可连接入载体。分离的核酸也可通过诱变来获得。可以使用标准技术来突变编码PD-1拮抗剂的核酸，包括经由PCR进行得寡核苷酸指导的诱变和/或定点诱变。参见Short Protocols in Molecular Biology.Chapter 8,Green Publishing Associates and John Wiley&Sons,edited by Ausubel等,1992。可修饰的氨基酸位置的例子包括本文描述的那些。

IV.制剂

A.PD-1拮抗剂制剂

A.PD-1拮抗剂制剂

提供了包括PD-1拮抗剂的药物组合物。含有肽或多肽的药物组合物可以供通过胃肠外(肌肉内、腹膜内、静脉内(IV)或皮下注射)、经皮(被动的或使用离子透入或电穿孔)、或经粘膜(鼻、***、直肠、或舌下)施用路径的施用。组合物也可以使用生物可蚀解***物来施用，或者可以直接投递至适宜的淋巴样组织(例如脾、***、或粘膜相关淋巴样组织)或直接投递至器官或肿瘤。可以以对于每种施用路径适宜的剂量形式配制组合物。可以另外配制含有不是肽或多肽的PD-1受体之拮抗剂的组合物供肠施用。

如本文中使用的，术语“有效量”或“治疗有效量”意指足以治疗、抑制、或减轻所治疗病症的一种或多种症状或以其它方式提供期望药理学和/或生理学效果的剂量。精确剂量会随多种因素而变化，诸如依赖受试者的变量(例如年龄、免疫***健康等)、疾病和所实施的治疗。治疗有效量的PD-1拮抗剂引起免疫应答被激活、增强、提升或持续，和/或克服或减轻T细胞衰竭和/或T细胞无反应性，和/或激活单核细胞、巨噬细胞、树突细胞和其它抗原呈递细胞(“APC”)。

在一个优选的实施方案中，基于来自肿瘤建模和生物利用度的外推，以0.1-20mg/kg的范围施用PD-1拮抗剂。一个最优选的范围是5-20mg PD-1拮抗剂/kg。一般地，对于静脉内注射或输注，剂量可以低于通过其它路径的施用。

1.用于胃肠外施用的制剂

在一个优选的实施方案中，所公开的组合物(包括那些含有肽和多肽的)在水溶液中通过胃肠外注射来施用。制剂也可以处于悬浮液或乳状液的形式。一般地，提供如下的药物组合物，其包括有效量的肽或多肽，而且任选包括药学可接受稀释剂、防腐剂、增溶剂、乳化剂、佐剂和/或载体。此类组合物包括无菌水、缓冲盐水(例如Tris-HCl、乙酸盐、磷酸盐)、pH和离子强度；和任选的添加剂，诸如去污剂和增溶剂(例如20、TWEEN 80、Polysorbate 80)、抗氧化剂(例如抗坏血酸、偏亚硫酸氢钠)以及防腐剂(例如Thimersol、苯甲醇)和填充物质(例如乳糖、甘露醇)。非水溶剂或媒介的例子有丙二醇、聚乙二醇、植物油诸如橄榄油和玉米油、明胶和可注射有机酯诸如油酸乙酯。制剂可以冻干及临使用前重溶解/重悬浮。制剂可以灭菌，例如通过经由细菌截留滤器过滤、通过将灭菌剂掺入组合物、通过照射组合物或通过加热组合物。

2.受控投递聚合物基质

含有一种或多种PD-1拮抗剂或编码PD-1拮抗剂的核酸的组合物可以在控释剂中施用。可以为长期***释放而制备控释聚合物基质，接着植入聚合物装置(杆/棒、筒/柱、膜、盘/片)或注射(微粒)。基质可以处于微粒的形式，诸如微球体，其中肽分散在固体聚合物基质或微胶囊内，其中核心是与聚合物壳不同的材料，而且肽分散或悬浮在核心中，其性质可以是液体或固体。除非本文中有具体限定，微粒、微球体和微胶囊可互换使用。或者，聚合物可以铸造成薄板或膜(范围为几纳米至四厘米)，通过研磨或其它标准技术生成的粉或甚至凝胶诸如水凝胶。基质也可以掺入医学装置之中或之上以调控免疫应答，在免疫受损的患者(诸如插有导管的老年人或早产的儿童)中预防感染，或帮助愈合(如使用基质来帮助压疮(pressure sores)、褥疮(decubitis ulcers)等愈合的情况)。

生物不可降解或生物可降解基质均可用于投递PD-1拮抗剂或编码它们的核酸，尽管生物可降解基质是优选的。这些可以是天然的或合成的聚合物，尽管合成的聚合物是优选的，原因在于更好的降解和释放概况表征。基于期望的释放时段来选择聚合物。在一些情况中，线性释放可能是最有用的，尽管在其它情况中，脉冲释放或“大量释放”(bulk release)可能提供更加有效的结果。聚合物可以处于水凝胶的形式(通常吸收以重量计多至约90％的水)，而且可任选用多价离子或聚合物来交联。

基质可以通过溶剂蒸发、喷雾干燥、溶剂提取和本领域技术人员知道的其它方法来形成。生物可蚀解微球体可以使用为制备用于药物投递的微球体而开发的任何方法来制备，例如如Mathiowitz和Langer,J.Contolled Release,5:13-22(1987)；Mathiowitz等,Reactive Polymers,6:275-283(1987)；及Mathiowitz等,J.Appl.Polymer Sci.,35:755-774(1988)记载的。

可能想要控释口服制剂。PD-1抑制性信号传导的拮抗剂可掺入惰性基质，其容许通过扩散或沥滤机制来释放，例如膜或胶。缓慢分解基质也可以掺入制剂。另一种形式的受控释放如下，其中药物封装在半透膜中，由于渗透效应，半透膜容许水进入及推动药物经单一小开口出去。对于口服制剂，释放的位置可以是胃、小肠(十二指肠、空肠、或回肠)、大肠。优选地，释放会避免胃环境的有害影响，或是通过保护活性剂(或衍生物)或是通过在胃环境之后(诸如在肠中)释放活性剂。为了确保完全胃抗性，肠涂层(即对至少pH 5.0是不能渗透的)是至关重要的。这些涂层可以以混合膜的形式或以胶囊的形式(诸如那些可得自Banner Pharmacaps的)使用。

可以为了局部释放来配制装置以治疗植入或注射区域，而且通常投递比治疗全身的剂量少得多的剂量。也可以为***投递来配制装置。这些可以皮下植入或注射。

3.用于肠施用的制剂

也可以为口服投递而配制PD-1的拮抗剂。口服固体剂量形式是本领域技术人员知道的。固体剂量形式包括片剂、胶囊剂、丸剂、锭剂(troches或lozenges)、扁囊剂、弹丸剂(pellets)、粉剂或颗粒剂或者将材料掺入聚合化合物(诸如聚乳酸、聚乙醇酸等)的特定制备物或掺入脂质体。此类组合物可以改变本发明蛋白质和衍生物的物理状态、稳定性、体内释放速率和体内清除速率。参见例如Remington's Pharmaceutical Sciences,第21版(2005,Lippincott,Williams&Wilins,Baltimore,Md.21201)第889-964页。组合物可以以液体形式来制备，或者可以是干粉(例如冻干的)形式。可使用脂质体或聚合物封装来配制组合物。还可参见Marshall,K.In:Modern PharmaceuticsEdited by G.S.Banker和C.T.Rhodes Chapter 10,1979。一般而言，制剂会包括活性剂和在胃环境中保护PD-1拮抗剂，以及在肠中释放生物学活性材料的惰性组分。

用于口服施用的液体剂量形式，包括药学可接受乳状液、溶液、悬浮液和糖浆剂，可以含有其它成分，包括惰性稀释剂、佐剂诸如润湿剂、乳化和悬浮剂；以及甜味、芳香和香味剂。

B.包括PD-1受体拮抗剂的疫苗

疫苗要求强烈的T细胞应答来消除癌细胞。本文中描述的PD-1拮抗剂可以作为疫苗的成分来施用以防止对T细胞的抑制信号。本文中公开的疫苗包括抗原，PD-1拮抗剂多肽的来源和任选的佐剂和靶向分子。PD-1拮抗剂多肽的来源包括任何公开的B7-DC、PD-L1、PD-1或B7.1多肽，其融合蛋白，其变体，编码这些多肽及其融合蛋白或变体的核酸，或含有表达PD-1拮抗剂多肽的载体的宿主细胞。

1.抗原

抗原可以是肽、蛋白质、多糖、糖、脂、核酸或其组合。抗原可以衍生自转化的细胞，诸如癌或白血病细胞，而且可以是完整细胞或其免疫原性成分。合适的抗原是本领域已知的，而且可得自商业、政府和科学来源。抗原可以是纯化的或部分纯化的衍生自肿瘤的多肽，或者可以是通过在异源表达***中表达编码多肽抗原的DNA而生成的重组多肽。抗原可以是编码完整或部分抗原性蛋白质的DNA。DNA可以是载体DNA的形式，诸如质粒DNA。

抗原可以作为单一抗原来提供，或者可以在组合中提供。抗原也可以作为多肽或核酸的复杂混合物来提供。

抗原可以肿瘤抗原，包括肿瘤相关的或肿瘤特异性的抗原，诸如但不限于α-辅肌动蛋白-4、Bcr-Abl融合蛋白、Casp-8、β-联蛋白、cdc27、cdk4、cdkn2a、coa-1、dek-can融合蛋白、EF2、ETV6-AML1融合蛋白、LDLR-岩藻糖基转移酶AS融合蛋白、HLA-A2、HLA-A11、hsp70-2、KIAAO205、Mart2、Mum-1,2,和3、neo-PAP、I类肌球蛋白、OS-9、pml-RARa融合蛋白、PTPRK、K-ras、N-ras、磷酸丙糖异构酶、Bage-1、Gage 3,4,5,6,7、GnTV、Herv-K-mel、Lage-1、Mage-A1,2,3,4,6,10,12、Mage-C2、NA-88、NY-Eso-1/Lage-2、SP17、SSX-2、和TRP2-Int2、MelanA(MART-I)、gp100(Pmel 17)、酪氨酸酶、TRP-1、TRP-2、MAGE-1、MAGE-3、BAGE、GAGE-1、GAGE-2、p15(58)、CEA、RAGE、NY-ESO(LAGE)、SCP-1、Hom/Mel-40、PRAME、p53、H-Ras、HER-2/neu、BCR-ABL、E2A-PRL、H4-RET、IGH-IGK、MYL-RAR、Epstein Barr病毒抗原、EBNA、人***瘤病毒(HPV)抗原E6和E7、TSP-180、MAGE-4、MAGE-5、MAGE-6、p185erbB2、p180erbB-3、c-met、nm-23H1、PSA、标签-72-4、CA19-9、CA 72-4、CAM 17.1、NuMa、K-ras、b-联蛋白、CDK4、Mum-1、p16、标签E、PSMA、PSCA、CT7、端粒末端转移酶、43-9F、5T4、791Tgp72、α-胎蛋白、13HCG、BCA225、BTAA、CA 125、CA 15-3(CA 27.29\BCAA)、CA 195、CA 242、CA-50、CAM43、CD68\KP1、CO-029、FGF-5、G250、Ga733(EpCAM)、HTgp-175、M344、MA-50、MG7-Ag、MOV18、NB\70K、NY-CO-1、RCAS1、SDCCAG16、TA-90(Mac-2结合蛋白\亲环蛋白C相关蛋白)、TAAL6、标签72、TLP和TPS。

2.佐剂

任选地，本文中描述的疫苗可以包括佐剂。佐剂可以是但不限于下述一种或多种：油乳剂(例如弗氏佐剂)；皂苷配制剂；病毒体(virosome)和病毒样颗粒；细菌和微生物衍生物；免疫刺激性寡核苷酸；ADP-核糖基化毒素和去毒衍生物；明矾；BCG；含矿物组合物(例如矿物盐，诸如铝盐和钙盐、氢氧化物、磷酸盐、硫酸盐、等)；生物粘附剂和/或粘膜粘附剂；微粒；脂质体；聚氧乙烯醚和聚氧乙烯酯配制剂；聚磷腈；胞壁酰基肽；咪唑并喹诺酮化合物；和表面活性物质(例如溶血卵磷脂、Pluronic多元醇、聚阴离子、肽、油乳剂、匙孔虫戚血蓝蛋白和二硝基酚)。

佐剂还可包括免疫调控剂，诸如细胞因子、白介素(例如IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12等)、干扰素(例如干扰素-γ)、巨噬细胞集落刺激因子和肿瘤坏死因子。在PD-1拮抗剂之外，可以施用其它共刺激分子，包括B7家族的其它多肽。此类蛋白质佐剂可以作为全长多肽或其活性片段，或者以DNA诸如质粒DNA的形式来提供。

IV.使用方法

A.T细胞活化

PD-1拮抗剂多肽和小分子、其变体、其融合蛋白、编码PD-1拮抗剂多肽和融合蛋白的核酸、或表达PD-1拮抗剂多肽和融合蛋白的细胞可用于防止T细胞失活和/或延长T细胞活化(即提高T细胞的抗原特异性增殖、增强T细胞的细胞因子生成、刺激T细胞的分化和效应器功能和/或促进T细胞存活)或克服T细胞衰竭和/或无反应性。

优选的PD-1拮抗剂包括如下的多肽，其结合内源PD-L1或PD-L2及降低或抑制PD-L1和PD-L2与PD-1受体诸如PD-1或B7-1多肽相互作用。通过降低这些配体与PD-1的相互作用，阻止或降低由PD-1传输的负信号。在次优TCR信号存在下，内源PD-L2或PD-L1多肽能在体外刺激升高的增殖和细胞因子生成。如此，PD-L2和PD-L1表现出也结合PD-1以外的T细胞受体。结合及阻断PD-1受体且不传输经由PD-1的负信号的PD-1拮抗剂也是优选的。这些拮抗剂的例子包括重组PD-1配体，诸如在它们结合PD-1时不触发信号转导的PD-L2和PD-L1。

使用PD-1拮抗剂多肽的方法包括以有效抑制或降低T细胞中PD-1信号转导的量使T细胞接触PD-1拮抗剂多肽。接触可以是体外的、离体的或体内的(例如在哺乳动物中，诸如小鼠、大鼠、家兔、犬、牛、猪、非人灵长类动物或人)。

接触可以T细胞活化之前、期间或之后发生。典型地，T细胞与PD-1拮抗剂多肽的接触可以与活化基本上同时。活化可以是例如通过将T细胞暴露于结合T细胞受体(TCR)或与TCR物理上有关联的CD3复合物的多肽之一的抗体。或者，可以将T细胞暴露于例如APC[例如交错树突细胞(在本文中称作树突细胞)、巨噬细胞、单核细胞或B细胞]上的同种异型抗原(例如MHC同种异型抗原)或通过由任何上述APC加工蛋白质抗原而生成并由APC表面上的MHC分子呈递给T细胞的抗原性肽。T细胞可以是CD4⁺T细胞或CD8⁺T细胞。

在一些实施方案中，PD-1拮抗剂多肽可以直接施用至T细胞。或者，可以用含有编码PD-1拮抗剂多肽的核苷酸序列的核酸转化、转导或转染APC诸如巨噬细胞、单核细胞、交错树突细胞(在本文中称作树突细胞)或B细胞，并且可用由经转化、转导或转染的APC接触T细胞。经转化、转导或转染的细胞可以是在转化、转导或转染之前可以自施用所针对的受试者或另一受试者(例如同一物种的另一受试者)获得的细胞或其后代。

PD-1拮抗剂多肽可以是本文中描述的任何PD-1拮抗剂多肽，包括任何公开的氨基酸改变、多肽片段、融合蛋白及其组合。

如果活化是体外的，那么可以将PD-1拮抗剂多肽结合至有关培养容器的底部，或珠或其它固体支持物例如塑料微量滴定板的孔。

体外应用PD-1拮抗剂多肽可能是有用的，例如在免疫机制的基础科学研究中或用于生成活化的T细胞供关于T细胞功能的研究或例如被动免疫疗法中使用。此外，PD-1拮抗剂多肽可添加至体外测定法(例如T细胞增殖测定法)，其设计用于测试获取T细胞的受试者中对感兴趣抗原的免疫力。将PD-1拮抗剂多肽添加至此类测定法预期会导致更加有力的，且因此更加易于检测到的体外应答。此外，PD-1拮抗剂多肽或经编码此类多肽的核酸转化、转染或转导的APC可以：(a)在用于测试其它分子的T细胞增强活性的测定法中用作阳性对照；或(b)在针对在抑制T共刺激中有用的化合物(例如对于治疗自身免疫性疾病或器官移植物排斥潜在有用的化合物)的筛选测定法中使用。

B.PD-1拮抗剂的治疗用途

1.癌症治疗

本文中提供的PD-1拮抗剂作为免疫应答刺激性治疗剂在体内和离体一般是有用的。一般而言，所公开的拮抗剂组合物对于治疗具有或倾向于任何如下疾病或病症的受试者是有用的，其中受试者的免疫***针对所述疾病或病症发起免疫应答。PD-1拮抗剂抑制或降低PD-1信号处理的能力使得更加有力的免疫应答成为可能。所公开的组合物对于刺激或增强涉及T细胞的免疫应答是有用的。

通过对受试者施用在受试者中有效共刺激T细胞的量的PD-1拮抗剂，所公开的PD-1拮抗剂对于在宿主中刺激或增强免疫应答以治疗癌症是有用的。可以用所提供的组合物和方法来治疗的癌症类型包括但不限于下述：膀胱、脑、***/乳腺、宫颈、结肠-直肠、食管、肾、肝、肺、鼻咽、胰腺、***、皮肤、胃、子宫、卵巢、睾丸和血液学的。

可以治疗的恶性肿瘤在本文中依据衍生肿瘤的组织的胚胎起源来归类。癌瘤(Carcinoma)为源自内胚层或外胚层组织的肿瘤，诸如皮肤或内脏和腺的上皮层。不太频繁产生的肉瘤(Sarcoma)衍生自中胚层***，诸如骨、脂肪和软骨。白血病(leukemia)和淋巴瘤(lymphoma)为骨髓的造血细胞的恶性肿瘤。白血病作为单细胞来增殖，而淋巴瘤趋于作为肿瘤块来生长。恶性肿瘤可以在身体的多种器官或组织处显露出来以产生癌症。

2.PD-1拮抗剂在疫苗中的用途

所公开的PD-1拮抗剂或编码它们的核酸可以单独地或与任何其它合适治疗组合地施用。在一个实施方案中，PD-1拮抗剂可以与疫苗组合物联合或作为疫苗组合物的成分来施用。上文描述了疫苗组合物的合适成分。所公开的PD-1拮抗剂可以在施用疫苗之前、同时或之后施用。在一个实施方案中，PD-1拮抗剂组合物在施用疫苗的同时施用。

所公开的PD-1拮抗剂组合物可以与预防性疫苗或治疗性疫苗联合施用，其可用于启动或增强受试者对预先存在的抗原(诸如具有癌症的受试者中的肿瘤抗原)的免疫应答。

依照本领域公知的原则，预防、治疗或脱敏免疫应答的期望结果可以随疾病而变化。类似地，针对癌症、变应原或传染剂的免疫应答可以完全治疗疾病，可以减轻症状，或者可以是针对疾病的总体治疗干预中的一个方面。例如，针对癌症的免疫应答刺激可以联合手术、化疗、放射学、激素和其它免疫学办法以进行治疗。

3.辅助疗法

所公开的PD-1拮抗剂或编码它们的核酸可用于克服对抗原的耐受，及由此治疗癌症。适宜靶向共信号传导途径可导致T细胞活化及克服对肿瘤抗原的耐受。一个实施方案提供施用有效量的PD-1拮抗剂或编码它们的核酸来克服抗原耐受。抑制或降低PD-1负信号传导也能放大T细胞应答及总体免疫力(施用第一治疗剂后)或针对免疫原性较差的抗原诸如肿瘤相关抗原的应答。一个实施方案提供在主要治疗、疫苗接种或杀死肿瘤(抗体介导的，用化疗或辐射或其任何组合)之后被动施用PD-1拮抗剂或编码它们的核酸。认为PD-1拮抗剂增强/加强主要应答，导致有力的且持久的针对肿瘤的保护性应答。

在根除肿瘤的第一治疗剂之外施用的治疗称作辅助疗法。给予辅助治疗来提升主要治疗，诸如手术或辐射，降低癌症复发的机会。这种额外的治疗可导致主要应答的放大，如表现为更加有力的和/或持久的应答。

主要由五类辅助疗法(注意，其中一些也用作主要/单一疗法)：1)化疗，其使用药物来杀死癌细胞，或是通过阻止它们繁殖或是通过引起细胞自我破坏；2)激素疗法，其用于降低激素生成和阻止癌生长；3)辐射疗法，其使用高能射线来杀死癌细胞；4)免疫疗法，其试图影响身体自己的免疫***来攻击和根除任何剩余癌细胞。免疫疗法能刺激(癌症疫苗)或补充(被动施用抗体或免疫细胞)身体自己的防御；或5)靶向疗法，其靶向癌细胞内存在的特定分子，只留下正常的、健康的细胞。例如，乳腺癌的许多病例是由生成太多称作HER2的蛋白质的肿瘤引起的。曲妥单抗(Trastuzumab，Herceptin)用作靶向HER2阳性肿瘤的辅助疗法。

典型地，辅助治疗与主要治疗共施用或联合给予以诱导多重机制及增加根除肿瘤的机会。免疫疗法(特别是疫苗)提供独特的优点，即诱导持续的抗肿瘤效果，其具有敏锐的特异性及战胜现有免疫耐受的能力。发现了延迟“辅助疗法”使应答最大化及增加根除肿瘤的机会。

在一个优选的实施方案中，如本文中描述的PD-1拮抗剂或编码它们的核酸在施用第一治疗剂诸如癌症治疗剂之后施用。施用佐剂的时机的范围可以是主要治疗之后第0天至第14天，而且可以包括单次或多次治疗。在某些实施方案中，PD-1拮抗剂在施用主要治疗之后第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14天施用。佐剂优选***性施用于患者(IV、IM或SQ)。

用于增强免疫应答的PD-1拮抗剂的选择可能依赖于最初的主要治疗模式。例如，与化疗联合使用的同一PD-1拮抗剂可能与辐照治疗一起会运转不佳。因此，治疗剂和PD-1拮抗剂分子的特定组合可以是最佳功效所要求的。可以根据癌症的类型(例如实体对液体肿瘤)来优化PD-1拮抗剂，例如使用亲和力成熟。

PD-1拮抗剂和编码它们的核酸在诱导或增强针对肿瘤的免疫应答中可能是有用的。例如可以工程化改造细胞以携带编码PD-1拮抗剂的核酸，如本文中描述的，然后对受试者施用以阻碍受试者中的肿瘤特异性耐受。值得注意地，B7-1在B7阴性鼠肿瘤细胞中的异位表达显示出在小鼠中诱导T细胞介导的特异性免疫，伴有肿瘤排斥和延长的针对肿瘤攻击的保护。利用B7相关因子的细胞基因疗法治疗可以在动物实验(参见K.Dunussi-Joannopoulos等,J.Pediatr.Hematol.Oncol.19:356-340(1997)；K.Hiroishi等,Gene Ther.6:1988-1994(1999)；B.K.Martin等,J.Immunol.162:6663-6670(1999)；M.Kuiper等,Adv.Exp.Med.Biol.465:381-390(2000))或使用B7-1或B7-2进行基因转移疗法的人I期试验实验(H.L.Kaufman等,Hum.Gene Ther.11:1065-1082(2000))上建立模型。

施用不限于治疗现有的肿瘤或传染病，而是还可用于预防或降低个体中形成此类疾病的风险，即用于预防用途。预防性疫苗接种的潜在候选人包括有高风险形成癌症，即有某些类型癌症的个人或家族史的个体。

另一个实施方案提供一种用于增加受试者中浸润肿瘤的白细胞群体的方法，其通过对受试者施用有效量的PD-1拮抗剂或编码它们的核酸来增强受试者的T细胞的活化。

C.组合疗法

所公开的PD-1拮抗剂组合物可以单独地或与一种或多种别的治疗剂或所述PD-1拮抗剂的组合组合地施用于有所需要的受试者。别的治疗剂是基于要治疗的状况、病症或疾病而选择的。例如，PD-1拮抗剂可以与一种或多种别的发挥增强或促进免疫应答功能的药剂共施用。

1.化疗剂

PD-1拮抗剂也可以与一种或多种别的治疗剂组合。代表性的治疗剂包括但不限于化疗剂和促凋亡剂。代表性的化疗剂包括但不限于安吖啶(amsacrine)、博来霉素(bleomycin)、白消安(busulfan)、卡培他滨(capecitabine)、卡铂(carboplatin)、卡莫司汀(carmustine)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、顺铂(cisplatin)、克拉屈滨(cladribine)、氯法齐明(clofarabine)、crisantaspase、环磷酰胺(cyclophosphamide)、阿糖胞苷(cytarabine)、达卡巴嗪(dacarbazine)、放线菌素D(dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、多西他赛(docetaxel)、多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、依托泊苷(etoposide)、氟达拉滨(fludarabine)、氟尿嘧啶(fluorouracil)、吉西他滨(gemcitabine)、羟基脲(hydroxycarbamide)、伊达比星(idarubicin)、异环磷酰胺(ifosfamide)、伊立替康(irinotecan)、亚叶酸(leucovorin)、多柔比星脂质体(liposomal doxorubicin)、柔红霉素脂质体(liposomal daunorubicin)、洛莫司汀(lomustine)、美法仑(melphalan)、巯嘌呤(mercaptopurine)、美司钠(mesna)、甲氨蝶呤(methotrexate)、丝裂霉素(mitomycin)、米托蒽醌(mitoxantrone)、奥沙利铂(oxaliplatin)、帕立他塞(paclitaxel)、培美曲塞(pemetrexed)、喷司他丁(pentostatin)、丙卡巴肼(procarbazine)、雷替曲塞(raltitrexed)、沙铂(satraplatin)、链唑星(streptozocin)、替加氟-尿嘧啶(tegafur-uracil)、替莫唑胺(temozolomide)、替尼泊苷(teniposide)、塞替派(thiotepa)、硫鸟嘌呤(tioguanine)、托泊替康(topotecan)、曲奥舒凡(treosulfan)、长春碱(vinblastine)、长春新碱(vincristine)、长春地辛(vindesine)、长春瑞滨(vinorelbine)或其组合。代表性的促凋亡剂包括但不限于氟达拉滨(fludarabine)、牛黄斯坦(taurosporine)、环己酰亚胺(cycloheximide)、放线菌素D(actinomycin D)、乳糖苷神经酰胺(lactosylceramide)、15d-PGJ(2)及其组合。

在某些实施方案中，可以组合使用超过一种PD-1拮抗剂来提高或增强受试者中的免疫应答。

2.增强免疫应答的融合蛋白

在其它实施方案中，PD-1拮抗剂可以与含有增强免疫应答的其它B7家族共刺激分子的组合物共施用。其它B7共刺激多肽可以是任何物种起源的。在一个实施方案中，共刺激多肽来自哺乳动物物种。在一个优选的实施方案中，共刺激多肽是鼠或人起源的。在一个实施方案中，多肽为B7.1。有用的别的人B7多肽与由具有GenBank登录号U04343的核酸编码的B7-2多肽或由具有GenBank登录号NP_071436的核酸编码的B7-H5多肽具有至少约80、85、90、95或100％序列同一性。B7-H5还披露于PCT公开号WO 2006/012232中。

在一个优选的实施方案中，别的B7家族分子作为如本文中描述的可溶性融合蛋白来提供。形成二聚物或多聚物的B7分子的可溶性融合蛋白具有交联其关联受体的能力，及由此发挥受体激动剂的功能。

在一个实施方案中，第一融合配偶为B7家族分子，包括但不限于B7-1、B7-2或B7-H5的片段。如本文中使用的，B7分子的片段指多肽的任何子集，其是比全长蛋白质要短的多肽。有用的片段是那些保留结合其天然配体的能力的。作为全长B7分子之片段的B7多肽通常具有与全长B7分子相比至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％、100％或甚至超过100％的结合其天然配体的能力。

B7多肽的片段包括可溶性片段。可溶性B7多肽片段为可以自生成细胞脱落、分泌或以其它方式提取的B7多肽片段。可溶性B7多肽片段包括受体多肽的部分或整个胞外结构域，而且缺少部分或整个胞内和/或跨膜结构域。在一个实施方案中，B7多肽片段包括B7多肽的整个胞外结构域。在其它实施方案中，可溶性B7多肽片段包括保留B7生物学活性的胞外结构域片段。会领会，胞外结构域可以包括1、2、3、4或5个来自跨膜结构域的氨基酸。或者，胞外结构域可以自C端、N端或两端去除1、2、3、4或5个氨基酸。

通常，B7多肽或其片段表达自核酸，该核酸包括编码信号序列的序列。通常自未成熟多肽切除信号序列以生成缺少信号序列的成熟多肽。会领会，B7多肽的信号序列可以利用标准分子生物学技术由另一种多肽的信号序列替换，以改变多肽的表达水平、分泌、溶解度或其它特性。用于替换信号序列的信号序列可以是任何本领域已知的。

B7分子融合多肽包括变异多肽，其突变成相对于野生型多肽序列含有一个或多个氨基酸的缺失、替代、***或重排。有用的变异B7融合蛋白为那些保留结合受体多肽的能力的。变异B7融合多肽通常具有与全长B7分子相比至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％、100％或甚至超过100％的结合B7受体多肽的能力。

变体B7-H5融合多肽可以具有氨基酸替代、缺失或***的任何组合。变体多肽可以在第一融合配偶、第二多肽和/或任选的接头肽序列任一或全部内含有一处或多处氨基酸缺失、替代、***或重排。

D.组合疗法

PD-1拮抗剂组合物可以单独地或与一种或多种别的治疗剂组合地施用于有所需要的受试者。别的治疗剂是基于要治疗的状况、病症或疾病而选择的。例如，PD-1拮抗剂可以与一种或多种别的发挥增强或促进免疫应答的功能的药剂共施用。

E.过继转移

过继性T细胞疗法是一种有希望的用于***已建立的患者的策略，但是常常限于特定的癌症，其中能获得浸润肿瘤的淋巴细胞，即用于离体培养的T细胞的来源。一个实施方案提供一种用于治疗癌症的方法，其通过与抗原特异性T细胞的过继性T细胞疗法组合，施用有效量的PD-1拮抗剂来抑制或降低肿瘤细胞中PD-1受体介导的信号转导来进行。过继性T细胞转移可以在施用PD-1的拮抗剂之前或之后施用于受试者，或者离体添加至细胞。

抗原特异性T细胞系可以通过在体外用抗原刺激，接着在CD3/CD28珠上非特异性扩增来生成。扩增抗原特异性T细胞的能力可以使用IFN-γ和粒酶B酶联免疫吸附点来评估。所得T细胞系的表型可以通过流式细胞术来评估，包括表达FOXP3的CD4(+)T细胞的存在。来自外周血单个核细胞(PBMC)的抗原特异性T细胞群的扩增通常经由在体外在IL-2存在下用最佳长度抗原性肽重复刺激来实施。传统上使用低剂量的IL-2(介于10和50U/ml之间)来避免淋巴因子活化的杀伤细胞的活化/扩增，如常用来来监测特定T细胞扩增的铬释放测定法中所揭示的。抗原性肽的浓度可以是0.1-10μM。

1.肿瘤特异性和肿瘤相关抗原

可以自来自要治疗的受试者的肿瘤活检获得对于扩增T细胞有用的抗原。可以自肿瘤活检生化纯化抗原。或者，抗原可以是重组多肽。由肿瘤表达的抗原可以是肿瘤特异性的，或者可以是与非肿瘤细胞相比在肿瘤细胞上以更高水平表达的。涵盖或是唯独由癌细胞表达或是相对于适宜的对照在具有恶性状况的受试者中以显著更高水平(例如以统计学显著的方式升高的)存在的抗原标志物，诸如已知为肿瘤相关抗原的血清学定义的标志物，供某些实施方案中使用。

肿瘤相关抗原可以包括例如细胞癌基因编码的产物或异常表达的原癌基因编码的产物(例如由neu、ras、trk和kit基因编码的产物)，或突变形式的生长因子受体或受体样细胞表面分子(例如由c-erb B基因编码的表面受体)。其它肿瘤相关抗原包括可能直接涉及转化事件的分子，或可能不直接涉及致癌转化事件但由肿瘤细胞表达的分子(例如癌胚抗原、CA-125、黑素瘤相关抗原等)(参见例如美国专利No.6,699,475；Jager等,Int.J.Cancer,106:817-20(2003)；Kennedy等,Int.Rev.Immunol.,22:141-72(2003)；Scanlan等,CancerImmun.,4:1(2004))。

编码细胞肿瘤相关抗原的基因包括细胞癌基因和异常表达的原癌基因。一般地，细胞癌基因编码直接涉及细胞转化的产物，而且因此，这些抗原是免疫疗法特别优选的靶。一个例子是致瘤neu基因，其编码一种涉及致癌转化的细胞表面分子。其它例子包括ras、kit和trk基因。原癌基因(经过突变形成癌基因的正常基因)的产物可能异常表达(例如过表达)，而且此异常表达可能涉及细胞转化。如此，可以靶向由原癌基因编码的产物。一些癌基因编码在肿瘤细胞表面上表达的生长因子受体分子或生长因子受体样分子。一个例子是由c-erbB基因编码的细胞表面受体。其它肿瘤相关抗原可以直接参与恶性转化或可以不这样。然而，这些抗原由某些肿瘤细胞表达，而且因此可提供有效靶。一些例子是癌胚抗原(CEA)、CA 125(与卵巢癌有关)和黑素瘤特异性抗原。

例如，在卵巢和其它癌瘤中，肿瘤相关抗原是易于获得的生物学液体诸如血清或粘膜分泌的样品中可检测的。一种此类标志物是CA125，即一种癌瘤相关抗原，它也脱落入血流，在那里在血清中能检测到它(例如Bast等,N.Eng.J.Med.,309:883(1983)；Lloyd等,Int.J.Canc.,71:842(1997))。已经测量了血清和其它生物学流体中的CA125水平，以及其它标志物的水平，例如癌胚抗原(CEA)、鳞状细胞癌抗原(SCC)、组织多肽特异性抗原(TPS)、唾液酰TN粘蛋白(STN)和胎盘碱性磷酸酶(PLAP)，试图提供卵巢和其它癌瘤的诊断和/或预后概况(例如Sarandakou等,Acta Oncol.,36:755(1997)；Sarandakou等,Eur.J.Gynaecol.Oncol.,19:73(1998)；Meier等,Anticancer Res.,17(4B):2945(1997)；Kudoh等,Gynecol.Obstet.Invest.,47:52(1999))。升高的血清CA125也可伴随成神经细胞瘤(例如Hirokawa等,Surg.Today,28:349(1998))，而升高的CEA和SCC可伴随结肠直肠癌等(Gebauer等,Anticancer Res.,17(4B):2939(1997))。

通过与单克隆抗体K-1的反应性来定义的肿瘤相关抗原间皮素存在于大多数鳞状细胞癌(包括上皮卵巢、宫颈和食管肿瘤)上，及间皮瘤上(Chang等,Cancer Res.,52:181(1992)；Chang等,Int.J.Cancer,50:373(1992)；Chang等,Int.J.Cancer,51:548(1992)；Chang等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,93:136(1996)；Chowdhury等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,95:669(1998))。使用单抗K-1，间皮素仅作为细胞相关肿瘤标志物能被检测到，而且在来自卵巢癌患者的血清中或在由OVCAR-3细胞条件化的培养基中没有找到可溶形式(Chang等,Int.J.Cancer,50:373(1992))。然而，结构相关的人间皮素多肽也包括肿瘤相关抗原多肽，诸如独特的间皮素相关抗原(MRA)多肽，它在来自具有恶性的患者的生物学液体中作为天然存在可溶性抗原能检测到。

肿瘤抗原可包括细胞表面分子。结构已知且具有已知或已述功能的肿瘤抗原(见上文)。

2.与肿瘤新血管***有关的抗原

蛋白质治疗剂在***中可能是低效/无效的，因为它们在肿瘤穿透方面是低效/无效的。肿瘤相关新血管***提供了容易可及的路径，蛋白质治疗剂经由它能到达肿瘤。在另一个实施方案中，融合蛋白含有特异性结合如下抗原的域，该抗原由与肿瘤有关的新血管***表达。

抗原可以是肿瘤新血管***特异性的，或者可以是与正常血管***相比在肿瘤新血管***中以更高水平表达的。与正常血管***相比由肿瘤相关新血管***过表达的例示性抗原包括但不限于VEGF/KDR、Tie2、血管细胞粘附分子(VCAM)、内皮糖蛋白和α₅β₃整联蛋白/玻连蛋白。与正常血管***相比由肿瘤相关新血管***过表达的其它抗原是本领域技术人员已知的，而且适合于通过所公开的融合蛋白来靶向。

实施例

通过参考下面的非限制性实施例，可以进一步理解本发明。

实施例1：B7-DC结合PD-1

通过ELISA评估了人B7-DC-Ig的PD-1结合活性。96孔ELISA板用在BupH碳酸盐/碳酸氢盐pH 9.4缓冲液(Pierce)中稀释的100μL 0.75μg/mL重组人PD-1/Fc(R&D Systems)包被2小时，然后用BSA溶液(JacksonImmunoResearch)封闭90-120分钟。容许连续稀释的人B7-DC-Ig以及人IgG1同种型对照结合90分钟。使用100μL 0.5μg/mL生物素偶联的抗人B7-DC克隆MIH18(eBioscience)，接着用1:1000稀释的HRP-链霉亲合素(BD Bioscience)和TMB底物(BioFX)来检测结合的B7-DC-Ig。使用读板仪(Molecular Devices)来读取450nm处的吸光度，并在SoftMax中使用4参数对数拟合来分析数据。

通过ELISA评估了鼠B7-DC-Ig的PD-1结合活性。96孔ELISA板用在BupH碳酸盐/碳酸氢盐pH 9.4缓冲液(Pierce)中稀释的100μL 0.75μg/mL重组小鼠PD-1/Fc(R&D Systems)包被2小时，然后用BSA溶液(Candor-Bioscience)封闭90分钟。容许连续稀释的鼠B7-DC-Ig(野生型，以及为降低的对PD-1的结合而选择的D111S和K113S突变体)以及鼠IgG2a同种型对照结合90分钟。使用100μL 0.25μg/mL生物素偶联的抗小鼠B7-DC克隆112(eBioscience)，接着用1:2000稀释的HRP-链霉亲合素(BD Bioscience)和TMB底物(BioFX)来检测结合的B7-DC-Ig。使用读板仪(Molecular Devices)来读取450nm处的吸光度，并在SoftMax中使用4参数对数拟合来分析数据。

图1A和1B显示PD-1结合ELISA中OD450对B7-DC-Ig的量(ug/ml)的线图。图4A 1A显示人B7-DC-Ig的四个不同批次的结合。图4B 1B显示野生型鼠B7-DC-Ig(圆圈)、DS突变体(具有D111S替代的B7-DC-Ig，三角形)和KS突变体(具有K113S替代的B7-DC-Ig，方框)、和鼠IgG2a同种型对照(菱形)的结合。

实施例2：B7-DC结合表达PD-1的CHO细胞

首先将B7-DC-Ig与别藻蓝素(APC)偶联，然后以多种浓度与组成性表达PD-1的CHO细胞系或不表达PD-1的亲本CHO细胞一起温育。通过流式细胞术来分析结合。作为探针浓度(x轴)的函数，图2显示B7-DC-Ig-APC的中值荧光强度(MFI)(y轴)。B7-DC-Ig-APC结合CHO.PD-1细胞(实心圆圈)，但是不结合未转染的CHO细胞(灰色三角形)。

实施例3：B7-DC-Ig与B7-H1竞争对PD-1的结合

首先将B7-H1-Ig与别藻蓝素(APC)偶联。首先将未标记的B7-DC-Ig以多种浓度与组成性表达PD-1的CHO细胞系一起温育，之后将B7-H1-Ig-APC添加至探针和细胞混合物。作为所添加的未标记B7-DC-Ig竞争物的浓度(x轴)的函数，图3显示B7-H1-Ig-APC的中值荧光强度(MFI)(y轴)。随着未标记B7-DC-Ig的浓度升高，结合CHO细胞的B7-H1-Ig-APC的量降低，从而证明了B7-DC-Ig与B7-H1竞争对PD-1的结合。

实施例4：P815肥大细胞瘤模型

在P815肥大细胞瘤肿瘤模型中测试鼠B7-DC-Ig的体内活性。P815肥大细胞瘤细胞衍生自甲基胆蒽(MCA)处理后的DBA/2小鼠。SC注射5×10⁴个细胞可在肿瘤接种后大约35天导致死亡。

首先通过体侧SC注射5×10⁴个活的P815细胞来攻击DBA/2小鼠(6-10周龄，雌性)。六周后，经IP注射用鼠B7-DC-Ig处理小鼠。图4中显示的剂量给药方案为每次注射100μg鼠B7-DC-Ig(大约5mg/kg)，每周2次，总共6剂。对照组只用赋形剂或用鼠IgG处理。每2-3天用数字式测径器测量肿瘤大小。依照美国红十字会(ARC；the site of Amplimmune’s vivarium)的科研动物护理和研究委员会(IACUC)批准的方案，当小鼠的肿瘤大小达到或超过1000mm³时，小鼠处以安乐死并定义为死的。第52天用P815肿瘤细胞再攻击存活的无肿瘤的小鼠。

如表1和图4中显示的，所有用赋形剂或对照小鼠IgG处理的小鼠到第38天需要安乐死，因为它们的肿瘤体积达到了IACUC限度。5只用鼠B7-DC-Ig处理的小鼠中有4只对处理有响应：在鼠B7-DC-Ig处理期间，两只小鼠中根除了肿瘤，而另两只小鼠显示延迟的肿瘤生长。

表1：P815肿瘤模型结果。

图5A-C显示使用鼠B7-DC-Ig的小鼠中的肿瘤根除。然后第52天用施用至初次接种部位相对体侧的5×10⁴个P815细胞再攻击无肿瘤的小鼠。初次接种后74天小鼠仍然无肿瘤，而所有用P815细胞攻击的裸(naive)小鼠形成了肿瘤。这提示接种P815细胞并用鼠B7-DC-Ig处理的小鼠形成了针对P815肥大细胞瘤的长期免疫。

CTX+B7-DC-Ig方案的基本原理

单独的鼠B7-DC-Ig在P815模型中是有效的，认为它是相对免疫原性的，但是显示最低限度的针对攻击性较大、免疫原性较小的肿瘤类型的活性。我们预期它在人类癌症患者中也会困以促进有效的抗肿瘤免疫应答。

为了改善B7-DC-Ig及其鼠类似物的活性，基于证明了低剂量CTX能安全且有效地提升癌症免疫疗法的活性的研究，在治疗方案中掺入CTX。通常使用人类中100-300mg/m²或小鼠中20-200mg/kg的剂量。这些剂量是亚治疗性的，而且不具有直接的抗肿瘤活性。

在癌症患者中及在癌症的鼠同基因和遗传模型中，低剂量的CTX导致Treg的选择性消减。Treg在肿瘤微环境中相对丰富，而且在遏制抗肿瘤免疫应答中发挥主要作用。在用抗原性刺激、疫苗、或细胞因子处理之前施用CTX促进功能性更高的抗肿瘤免疫应答，导致增强的肿瘤根除。作为单一药剂或与癌症疫苗或细胞因子组合地施用低剂量CTX的多项临床试验得到了极好的耐受，而且显示了免疫增强以及临床功效的证据。

基于使用低剂量CTX(它被表征为免疫增强剂)的广泛经验和安全性，以及在Amplimmune产生的数据，B7-DC-Ig应当以标准方案来施用，该标准方法包括施用CTX，接着施用B7-DC-Ig。在动物模型中使用100mg/kg的剂量。在启动B7-DC-Ig或鼠B7-DC-Ig处理之前24小时投递CTX。可以使用备用的(alternate)剂量给药方案，诸如周期性的(metronomic)CTX。

实施例6：CT26肿瘤模型

小鼠结肠直肠肿瘤细胞系，CT26，得自ATCC。遵循ATCC指导方针生成了处于第4代的原始细胞库。测试细胞，并确认没有支原体和其它病原体污染。自冷冻保存的原种融化一管肿瘤细胞，并培养两代，之后接种。

用30mL完全培养基(RPMI+10％FBS,2mM L-Glu,和1×P/S)以1:5稀释度(用于2天培养)或者用30ml完全培养基以1:10稀释度(用于3天培养)分拆CT26细胞。

如下收获CT26细胞，吸走培养基，用5mL PBS漂洗烧瓶，添加5mL胰蛋白酶，于37℃温育2分钟，然后用10mL完全培养基中和。以600×g(～1000rpm)离心5分钟后，吸走培养基，并通过用10ml单纯的RPMI反复吸取来重悬浮细胞团粒。此清洗步骤重复三次。

最后一个清洗步骤期间，用适当的稀释度(例如1:5稀释，10μL细胞+40μL锥虫蓝)通过锥虫蓝染料染色来分析接种的细胞的细胞数和存活力，并通过NOVA细胞计数来确认。用于接种的细胞存活力一般大于95％。

用单纯的RPMI将CT26细胞稀释至6.7×10⁵个细胞/mL，供初始接种，并保存于冰上。典型地，给每只小鼠接种150μL(1×10⁵个细胞)。

第9天，首先将所有携带肿瘤的小鼠分组入大鼠笼，并将小鼠随机分至实验组。用1×PBS重建CTX溶液至4mg/mL。给20克的小鼠腹膜内(IP)注射0.5mL CTX溶液，则为2mg，即100mg/kg。

第10天，给20克的小鼠IP注射0.5mL B7-DC-Ig(0.2mg/mL)，则为0.1mg，即5mg/kg。相同剂量每周给予2次，持续4周，总共8剂。通过每周两次经数字式测径器测量肿瘤来监测肿瘤生长，始于给予B7-DC-Ig那天。如下计算肿瘤体积：

肿瘤体积＝π(D短)2×(D长)/6＝～0.52×(D段)2×(D长)

若肿瘤体积达到2000mm3或者若肿瘤接种部位有皮肤溃疡和感染，则小鼠处以安乐死并退出研究。

实施例5：环磷酰胺和B7-DC-Ig的组合能根除已建立的肿瘤

如上所述给9至11周龄的Balb/C小鼠皮下植入1.0×10⁵个CT26结肠直肠肿瘤细胞。植入肿瘤后第10天，小鼠接受100mg/kg环磷酰胺。1天后，即第11天开始B7-DC-Ig处理。小鼠用100ug B7-DC-Ig处理，每周2剂，持续4周，总共8剂。75％的接受CTX+B7-DC-Ig治疗方案的小鼠到第44天根除了已建立的肿瘤，而对照仅CTX组中的所有小鼠因肿瘤生长而死亡或因肿瘤超过IACUC批准的大小而被处以安乐死(图6中显示的结果)。这些结果证明了治疗方案对已建立的肿瘤的有效性，而非仅仅预防。

实施例6：环磷酰胺和B7-DC-Ig的组合能根除已建立的肿瘤及针对肿瘤再攻击提供保护

在第44天和第70天用1×10⁵个CT26细胞再攻击来自上文所述实验的根除了已建立CT26结肠直肠肿瘤的小鼠。没有自再攻击长出肿瘤，从而提示它们自环磷酰胺和B7-DC-Ig组合处理形成了长期抗肿瘤免疫力。媒介对照组中的所有小鼠形成了肿瘤(图7中显示的结果)。这些结果显示治疗方案对已建立的肿瘤的有效性及环磷酰胺和B7-DCIg组合治疗导致针对肿瘤抗原的记忆应答。

实施例7：环磷酰胺和B7-DC-Ig的组合能生成肿瘤特异性的记忆细胞毒性T淋巴细胞

在第44天用2.5×10⁵个CT26细胞再攻击来自上文所述实验的根除了已建立CT26结肠直肠肿瘤的小鼠。7天后，分离小鼠脾。在高尔基体阻断剂(BDBioScience)存在下将小鼠脾细胞用5或50μg/mL卵清蛋白(OVA)或AH1肽脉冲6小时。通过评估CD8⁺/IFNγ⁺T细胞来分析记忆T效应细胞。图8中的结果显示根除了CT26肿瘤的小鼠中有显著量的CT26特异性T效应细胞。

除非另有定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有与所公开的发明所属领域的技术人员的普遍理解相同的含义。

本领域技术人员会认识到，或者仅仅使用例行实验就能够确定本文中描述的发明的具体实施方案的许多等同方案。所附权利要求意图涵盖此类等同方案。

Claims (15)

1.多肽制备药物的用途，其中所述多肽由SEQ ID NO:57的氨基酸序列组成、施用量为5mg/kg至20mg/kg，所述药物诱导、提升或增强受试者的免疫应答。

2.权利要求1的用途，其中所述药物是用于治疗癌症的药物，所述癌症包括肿瘤。

3.权利要求1或2的用途，其中所述免疫应答是抗肿瘤免疫应答。

4.权利要求2或3的用途，其中所述肿瘤的微环境包含衰竭的T细胞、无反应性T细胞、或它们的组合。

5.权利要求4的用途，其中所述衰竭的或无反应性T细胞包含衰竭的或无反应性CD8+T细胞。

6.权利要求5的用途，其中所述衰竭的或无反应性CD8+T细胞表达PD-1。

7.权利要求2-6之一的用途，其中所述肿瘤是来自选自下组的癌症：膀胱、脑、***、子宫颈、结直肠、食管、肾、肝、肺、肥大细胞瘤、鼻咽、胰、***、皮肤、胃、子宫、卵巢、睾丸和血液。

8.权利要求7的用途，其中所述肿瘤是结直肠肿瘤。

9.权利要求7的用途，其中所述肿瘤是肥大细胞瘤。

10.权利要求1-9之一的用途，其中所述药物进一步包括肿瘤抗原。

11.权利要求1-9之一的用途，其中所述药物进一步包括免疫调控剂。

12.权利要求11的用途，其中所述免疫调控剂选自消减Tregs或抑制Tregs功能的药剂和共刺激分子。

13.权利要求11或12的用途，其中所述免疫调控剂是消减CD4+CD25+Tregs或抑制CD4+CD25+Tregs功能的药剂。

14.权利要求13的用途，其中所述消减CD4+CD25+Tregs或抑制CD4+CD25+Tregs功能的药剂是施用量为100-300mg/m²的环磷酰胺。

15.前述任一项权利要求的用途，其中所述药物是每周两次施用的配制剂。