CN117715936A - 用于治疗癌症的方法和组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于通过向受试者施用靶向程序性细胞死亡蛋白1(PD‑1)和淋巴细胞活化基因‑3(LAG3)的双特异性抗体来治疗所述受试者的癌症的方法和组合物。

Description

用于治疗癌症的方法和组合物
序列表
本申请含有序列表，该序列表已经以XML格式以电子方式提交并且以全文引用的方式并入本文中。所述XML副本创建于2022年7月27日，命名为50474-304WO2_Sequence_Listing_7_27_22，并且大小为68,756个字节。
技术领域
本发明涉及用于通过向受试者施用靶向程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)和淋巴细胞活化基因-3(LAG3)的双特异性抗体(PD1-LAG3)与任选地抗TIGIT拮抗剂抗体(例如，替瑞利尤单抗)或VEGF拮抗剂(例如，贝伐单抗)来治疗受试者的癌症的方法和组合物。
背景技术
癌症的特征是细胞亚群不受控制的生长。癌症是发达国家的主要死因，也是发展中国家的第二大死因，每年新诊断的癌症病例超过1400万，癌症死亡人数超过800万。因此，癌症护理代表了一项重大且不断增加的社会负担。
尤其迫切需要治疗常见且难以治疗的癌症的治疗方法。
黑素瘤是黑素细胞的恶性肿瘤。这种潜在致命的皮肤癌症形式是增长最快的恶性肿瘤之一。目前，全球每年有超过300,000人被诊断患有黑素瘤，并且57,000人死于该疾病。大多数患有晚期黑素瘤的人的预后较差。具有***转移(III期)的患者术后局部和远端复发的风险高，并且该患者组的5年存活率为32％-93％。极少数患者在就诊时患有转移性疾病(IV期)，但有些患者在其最初的确定性治疗后出现转移。免疫疗法和靶向疗法已改善了那些患者的结果，并且5年存活率为约50％。黑素瘤仍然是严重的健康问题，医疗需求高，并且过去30年来发病率稳步上升。因此，在该群体中仍然迫切需要新的治疗方法。
肝癌为全球第五大常见癌症，也是癌症相关死亡的第二大常见原因，每年有854,000例新病例和810,000例死亡。肝细胞癌(HCC)为最常见的原发性肝癌形式，占所有原发性肝恶性肿瘤的大约90％。不太常见的原发性肝癌包括肝内胆管癌(iCCA)、血管肉瘤和肝母细胞瘤。诊断后，大多数患有原发性肝癌的患者呈现晚期疾病，这是不推荐使用治愈性疗法治疗的阶段。WHO估计，2030年将有超过100万人死于肝癌，这凸显了一个重大的全球公共卫生问题。
因此，在该领域中对于开发有效的免疫疗法和给药该免疫疗法以用于治疗包括黑素瘤和肝癌在内的癌症的方法存在未满足的需求。
发明内容
在一个方面，本公开提供了一种用于治疗患有癌症的受试者的方法，该方法包括向该受试者施用一个或多个给药周期的靶向PD-1和LAG3的双特异性抗体，该双特异性抗体包含与PD-1特异性结合的第一抗原结合结构域和与LAG3特异性结合的第二抗原结合结构域，其中该方法包括每三周以600mg的固定剂量向该受试者施用该双特异性抗体。
在一些方面，癌症为实体瘤。
在一些方面，癌症是局部晚期或转移性的。
在一些方面，癌症为皮肤癌、肝癌、肺癌、肾癌、膀胱癌、乳腺癌或食管癌。在一些方面，皮肤癌为黑素瘤。在一些方面，皮肤癌为先前未经治疗的不可切除或转移性的黑素瘤。在一些方面，黑素瘤为(a)具有可测量的***转移的III期黑素瘤；(b)不可切除的III期黑素瘤；或(c)IV期黑素瘤，任选地其中黑素瘤并非粘膜黑素瘤或葡萄膜黑素瘤。在一些方面，肝癌为肝细胞癌(HCC)。在一些方面，肺癌为非小细胞肺癌(NSCLC)。在一些方面，肾癌为肾细胞癌(RCC)。在一些方面，膀胱癌为转移性尿路上皮癌(mUC)。在一些方面，乳腺癌为三阴性乳腺癌(TNBC)。在一些方面，食管癌为食管鳞状细胞癌(ESCC)。
在另一方面，本公开提供了一种用于治疗患有黑素瘤的受试者的方法，该方法包括向该受试者施用一个或多个给药周期的靶向PD-1和LAG3的双特异性抗体，该双特异性抗体包含与PD-1特异性结合的第一抗原结合结构域和与LAG3特异性结合的第二抗原结合结构域，其中该方法包括每三周以600mg的固定剂量向该受试者施用该双特异性抗体，并且其中该黑素瘤为(a)不可切除的III期黑素瘤；或(b)IV期黑素瘤。在一些方面，受试者未患有眼部黑素瘤。
在另一方面，本公开提供了一种用于治疗患有肝癌的受试者的方法，该方法包括向该受试者施用一个或多个给药周期的靶向PD-1和LAG3的双特异性抗体，该双特异性抗体包含与PD-1特异性结合的第一抗原结合结构域和与LAG3特异性结合的第二抗原结合结构域，其中该方法包括每三周以600mg的固定剂量向该受试者施用该双特异性抗体。
在一些方面，肝癌为肝细胞癌(HCC)。在一些方面，HCC是局部晚期、转移性和/或不可切除的。
在一些方面，受试者先前未接受过全身性抗癌疗法。
在一些方面，一个或多个给药周期中的每一个的长度为21天。在一些方面，该方法包括在一个或多个给药周期中的每一个的第1天向受试者施用双特异性抗体。
在一些方面，该方法包括向受试者静脉内施用双特异性抗体。
在一些方面，该方法进一步包括向受试者每三周以约15mg/kg的剂量施用贝伐单抗。在一些方面，一个或多个给药周期中的每一个的长度为21天并且该方法包括在一个或多个给药周期中的每一个的第1天向受试者施用贝伐单抗。在一些方面，静脉内施用贝伐单抗。
在一些方面，受试者先前未针对转移性或不可切除的疾病进行治疗。
在一些方面，受试者先前未用包括免疫调节剂的抗癌疗法治疗。
在一些方面，受试者先前未用抗LAG3疗法治疗。
在一些方面，靶向PD-1和LAG3的双特异性抗体包含与PD-1特异性结合的第一抗原结合结构域，该第一抗原结合结构域包含：VH结构域，其包含(i)HVR-H1序列，其包含SEQ IDNO:25的氨基酸序列；(ii)HVR-H2序列，其包含氨基酸序列GGR；和(iii)HVR-H3序列，其包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列；以及VL结构域，其包含(i)HVR-L1序列，其包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列；(ii)HVR-L2序列，其包含氨基酸序列RSS；和(iii)HVR-L3序列，其包含SEQID NO:28的氨基酸序列。
在一些方面，靶向PD-1和LAG3的双特异性抗体包含与LAG3特异性结合的第二抗原结合结构域，该第一抗原结合结构域包含：VH结构域，其包含(i)HVR-H1序列，其包含SEQ IDNO:31的氨基酸序列；(ii)HVR-H2序列，其包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列；和(iii)HVR-H3序列，其包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列；以及VL结构域，其包含(i)HVR-L1序列，其包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列；(ii)HVR-L2序列，其包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列；和(iii)HVR-L3序列，其包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列。
在一些方面，第一抗原结合结构域包含：VH结构域，其包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列；以及VL结构域，其包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列，并且第二抗原结合结构域包含：VH结构域，其包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列；以及VL结构域，其包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列。
在一些方面，双特异性抗体为全长抗体。
在一些方面，靶向PD-1和LAG3的双特异性抗体包含作为IgG的Fc结构域，任选地其中IgG Fc结构域为IgG1 Fc结构域或IgG4 Fc结构域。在一些方面，Fc结构域包含减少与Fc受体的结合的一个或多个氨基酸取代，任选地其中Fc受体为Fcγ受体。
在一些方面，靶向PD-1和LAG3的双特异性抗体包含(a)具有氨基酸突变L234A、L235A和P329G(根据Kabat EU索引编号)的人IgG1亚类的Fc结构域；和/或(b)包含促进Fc结构域的第一亚基和第二亚基的缔合的修饰的Fc结构域。
在一些方面，Fc结构域的第一亚基包含氨基酸取代S354C和T366W(根据Kabat EU索引编号)，并且Fc结构域的第二亚基包含氨基酸取代Y349C、T366S和Y407V(根据Kabat EU索引编号)。
在一些方面，靶向PD-1和LAG3的双特异性抗体包含Fc结构域、包含第一抗原结合结构域的第一Fab片段和包含第二抗原结合结构域的第二Fab片段。在一些方面，在靶向PD-1和LAG3的双特异性抗体的Fab片段中的一个片段中，可变结构域VL和VH被彼此替换，使得VH结构域是轻链的一部分并且VL结构域是重链的一部分，任选地其中在第一Fab片段中可变结构域VL和VH被彼此替换。在一些方面，在Fab片段中的一个片段的恒定结构域CL中，位置124处的氨基酸独立地被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)取代(根据Kabat EU索引编号)，并且在恒定结构域CH1中，位置147和213处的氨基酸独立地被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)取代(根据Kabat EU索引编号)，任选地其中在第二Fab片段的恒定结构域CL中，位置124处的氨基酸独立地被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)取代(根据Kabat EU索引编号)，并且在恒定结构域CH1中，位置147和213处的氨基酸独立地被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)取代(根据Kabat EU索引编号)。
在一些方面，双特异性抗体包含第一重链，其包含与SEQ ID NO:39的序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；第一轻链，其包含与SEQ ID NO:40的序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；第二重链，其包含与SEQ ID NO:41的序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；和第二轻链，其包含与SEQ ID NO:42的序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一些方面，双特异性抗体包含第一重链，其包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列；第一轻链，其包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列；第二重链，其包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列；和第二轻链，其包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列。
在一些方面，双特异性抗体在肿瘤中实现至少90％的LAG3受体占有率(RO)。
在一些方面，受试者为人。
在另一方面，本公开提供了一种用于在治疗患有癌症的受试者的方法中使用的靶向PD-1和LAG3的双特异性抗体，其中该双特异性抗体包含与PD-1特异性结合的第一抗原结合结构域和与LAG3特异性结合的第二抗原结合结构域，并且其中该方法包括每三周以600mg的固定剂量向该受试者施用该双特异性抗体。
在一些方面，癌症为实体瘤。
在一些方面，癌症是局部晚期或转移性的。
在一些方面，癌症为皮肤癌、肝癌、肺癌、肾癌、膀胱癌、乳腺癌或食管癌。在一些方面，皮肤癌为黑素瘤。在一些方面，皮肤癌为先前未经治疗的不可切除或转移性的黑素瘤。在一些方面，黑素瘤为(a)具有可测量的***转移的III期黑素瘤；(b)不可切除的III期黑素瘤；或(c)IV期黑素瘤，任选地其中黑素瘤并非粘膜黑素瘤或葡萄膜黑素瘤。在一些方面，肝癌为肝细胞癌(HCC)。在一些方面，肺癌为非小细胞肺癌(NSCLC)。在一些方面，肾癌为肾细胞癌(RCC)。在一些方面，膀胱癌为转移性尿路上皮癌(mUC)。在一些方面，乳腺癌为三阴性乳腺癌(TNBC)。在一些方面，食管癌为食管鳞状细胞癌(ESCC)。
在另一方面，本公开提供了一种用于在治疗患有黑素瘤的受试者的方法中使用的靶向PD-1和LAG3的双特异性抗体，其中该双特异性抗体包含与PD-1特异性结合的第一抗原结合结构域和与LAG3特异性结合的第二抗原结合结构域，其中该方法包括每三周以600mg的固定剂量向该受试者施用该双特异性抗体，并且其中该黑素瘤为(a)不可切除的III期黑素瘤；或(b)IV期黑素瘤。在一些方面，患者未患有眼部黑素瘤。
在另一方面，本公开提供了一种用于在用于治疗患有肝癌的受试者的方法中使用的靶向PD-1和LAG3的双特异性抗体，其中该双特异性抗体包含与PD-1特异性结合的第一抗原结合结构域和与LAG3特异性结合的第二抗原结合结构域，并且其中该方法包括每三周以600mg的固定剂量向该受试者施用该双特异性抗体。在一些方面，肝癌为HCC。在一些方面，HCC是局部晚期、转移性和/或不可切除的。
在一些方面，受试者先前未接受过全身性抗癌疗法。
在一些方面，一个或多个给药周期中的每一个的长度为21天。在一些方面，该方法包括在一个或多个给药周期中的每一个的第1天向受试者施用双特异性抗体。
在一些方面，该方法包括向受试者静脉内施用双特异性抗体。
在一些方面，该方法进一步包括向受试者每三周以约15mg/kg的剂量施用贝伐单抗。在一些方面，一个或多个给药周期中的每一个的长度为21天并且该方法包括在一个或多个给药周期中的每一个的第1天向受试者施用贝伐单抗。在一些方面，静脉内施用贝伐单抗。
在一些方面，受试者先前未针对转移性或不可切除的疾病进行治疗。
在一些方面，受试者先前未用包括免疫调节剂的抗癌疗法治疗。
在一些方面，受试者先前未用抗LAG3疗法治疗。
在一些方面，靶向PD-1和LAG3的双特异性抗体包含与PD-1特异性结合的第一抗原结合结构域，该第一抗原结合结构域包含：VH结构域，其包含(i)HVR-H1序列，其包含SEQ IDNO:25的氨基酸序列；(ii)HVR-H2序列，其包含氨基酸序列GGR；和(iii)HVR-H3序列，其包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列；以及VL结构域，其包含(i)HVR-L1序列，其包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列；(ii)HVR-L2序列，其包含氨基酸序列RSS；和(iii)HVR-L3序列，其包含SEQID NO:28的氨基酸序列。
在一些方面，靶向PD-1和LAG3的双特异性抗体包含与LAG3特异性结合的第二抗原结合结构域，该第一抗原结合结构域包含：VH结构域，其包含(i)HVR-H1序列，其包含SEQ IDNO:31的氨基酸序列；(ii)HVR-H2序列，其包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列；和(iii)HVR-H3序列，其包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列；以及VL结构域，其包含(i)HVR-L1序列，其包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列；(ii)HVR-L2序列，其包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列；和(iii)HVR-L3序列，其包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列。
在一些方面，第一抗原结合结构域包含：VH结构域，其包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列；以及VL结构域，其包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列，并且第二抗原结合结构域包含：VH结构域，其包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列；以及VL结构域，其包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列。
在一些方面，双特异性抗体为全长抗体。
在一些方面，靶向PD-1和LAG3的双特异性抗体包含作为IgG的Fc结构域，任选地其中IgG Fc结构域为IgG1 Fc结构域或IgG4 Fc结构域。在一些方面，Fc结构域包含减少与Fc受体的结合的一个或多个氨基酸取代，任选地其中Fc受体为Fcγ受体。
在一些方面，靶向PD-1和LAG3的双特异性抗体包含(a)具有氨基酸突变L234A、L235A和P329G(根据Kabat EU索引编号)的人IgG1亚类的Fc结构域；和/或(b)包含促进Fc结构域的第一亚基和第二亚基的缔合的修饰的Fc结构域。
在一些方面，Fc结构域的第一亚基包含氨基酸取代S354C和T366W(根据Kabat EU索引编号)，并且Fc结构域的第二亚基包含氨基酸取代Y349C、T366S和Y407V(根据Kabat EU索引编号)。
在一些方面，靶向PD-1和LAG3的双特异性抗体包含Fc结构域、包含第一抗原结合结构域的第一Fab片段和包含第二抗原结合结构域的第二Fab片段。在一些方面，在靶向PD-1和LAG3的双特异性抗体的Fab片段中的一个片段中，可变结构域VL和VH被彼此替换，使得VH结构域是轻链的一部分并且VL结构域是重链的一部分，任选地其中在第一Fab片段中可变结构域VL和VH被彼此替换。在一些方面，在Fab片段中的一个片段的恒定结构域CL中，位置124处的氨基酸独立地被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)取代(根据Kabat EU索引编号)，并且在恒定结构域CH1中，位置147和213处的氨基酸独立地被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)取代(根据Kabat EU索引编号)，任选地其中在第二Fab片段的恒定结构域CL中，位置124处的氨基酸独立地被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)取代(根据Kabat EU索引编号)，并且在恒定结构域CH1中，位置147和213处的氨基酸独立地被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)取代(根据Kabat EU索引编号)。
在一些方面，双特异性抗体包含第一重链，其包含与SEQ ID NO:39的序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；第一轻链，其包含与SEQ ID NO:40的序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；第二重链，其包含与SEQ ID NO:41的序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；和第二轻链，其包含与SEQ ID NO:42的序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一些方面，双特异性抗体包含第一重链，其包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列；第一轻链，其包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列；第二重链，其包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列；和第二轻链，其包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列。
在一些方面，双特异性抗体在肿瘤中实现至少90％的LAG3受体占有率(RO)。
在一些方面，受试者为人。
在另一方面，本公开提供了靶向PD-1和LAG3的双特异性抗体在制造用于治疗患有癌症的受试者的药物中的用途，其中该双特异性抗体包含与PD-1特异性结合的第一抗原结合结构域和与LAG3特异性结合的第二抗原结合结构域，并且其中该双特异性抗体待每三周以600mg的固定剂量向该受试者施用。
在一些方面，癌症为实体瘤。
在一些方面，癌症是局部晚期或转移性的。
在一些方面，癌症为皮肤癌、肝癌、肺癌、肾癌、膀胱癌、乳腺癌或食管癌。在一些方面，皮肤癌为黑素瘤。在一些方面，皮肤癌为先前未经治疗的不可切除或转移性的黑素瘤。在一些方面，黑素瘤为(a)具有可测量的***转移的III期黑素瘤；(b)不可切除的III期黑素瘤；或(c)IV期黑素瘤，任选地其中黑素瘤并非粘膜黑素瘤或葡萄膜黑素瘤。在一些方面，肝癌为肝细胞癌(HCC)。在一些方面，肺癌为非小细胞肺癌(NSCLC)。在一些方面，肾癌为肾细胞癌(RCC)。在一些方面，膀胱癌为转移性尿路上皮癌(mUC)。在一些方面，乳腺癌为三阴性乳腺癌(TNBC)。在一些方面，食管癌为食管鳞状细胞癌(ESCC)。
在另一方面，本公开提供了靶向PD-1和LAG3的双特异性抗体在制造用于治疗患有黑素瘤的受试者的药物中的用途，其中该双特异性抗体包含与PD-1特异性结合的第一抗原结合结构域和与LAG3特异性结合的第二抗原结合结构域，其中该双特异性抗体待每三周以600mg的固定剂量向该受试者施用，并且其中该黑素瘤为(a)不可切除的III期黑素瘤；或(b)IV期黑素瘤。在一些方面，受试者未患有眼部黑素瘤。
在另一方面，本公开提供了靶向PD-1和LAG3的双特异性抗体在制造用于治疗患有肝癌的受试者的药物中的用途，其中该双特异性抗体包含与PD-1特异性结合的第一抗原结合结构域和与LAG3特异性结合的第二抗原结合结构域，其中该双特异性抗体待每三周以600mg的固定剂量向该受试者施用。在一些方面，肝癌为HCC。在一些方面，HCC是局部晚期、转移性和/或不可切除的。
在一些方面，受试者先前未接受过全身性抗癌疗法。
在一些方面，一个或多个给药周期中的每一个的长度为21天。在一些方面，双特异性抗体待在一个或多个给药周期中的每一个的第1天向受试者施用。
在一些方面，双特异性抗体待静脉内向受试者施用。
在一些方面，贝伐单抗待每三周以约15mg/kg的剂量向受试者施用。在一些方面，一个或多个给药周期中的每一个的长度为21天并且贝伐单抗待在一个或多个给药周期中的每一个的第1天向受试者施用。在一些方面，静脉内施用贝伐单抗。
在一些方面，受试者先前未针对转移性或不可切除的疾病进行治疗。
在一些方面，受试者先前未用包括免疫调节剂的抗癌疗法治疗。
在一些方面，受试者先前未用抗LAG3疗法治疗。
在一些方面，靶向PD-1和LAG3的双特异性抗体包含与PD-1特异性结合的第一抗原结合结构域，该第一抗原结合结构域包含：VH结构域，其包含(i)HVR-H1序列，其包含SEQ IDNO:25的氨基酸序列；(ii)HVR-H2序列，其包含氨基酸序列GGR；和(iii)HVR-H3序列，其包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列；以及VL结构域，其包含(i)HVR-L1序列，其包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列；(ii)HVR-L2序列，其包含氨基酸序列RSS；和(iii)HVR-L3序列，其包含SEQID NO:28的氨基酸序列。
在一些方面，靶向PD-1和LAG3的双特异性抗体包含与LAG3特异性结合的第二抗原结合结构域，该第一抗原结合结构域包含：VH结构域，其包含(i)HVR-H1序列，其包含SEQ IDNO:31的氨基酸序列；(ii)HVR-H2序列，其包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列；和(iii)HVR-H3序列，其包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列；以及VL结构域，其包含(i)HVR-L1序列，其包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列；(ii)HVR-L2序列，其包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列；和(iii)HVR-L3序列，其包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列。
在一些方面，第一抗原结合结构域包含：VH结构域，其包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列，以及VL结构域，其包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列，并且第二抗原结合结构域包含：VH结构域，其包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列；以及VL结构域，其包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列。
在一些方面，双特异性抗体为全长抗体。
在一些方面，靶向PD-1和LAG3的双特异性抗体包含作为IgG的Fc结构域，任选地其中IgG Fc结构域为IgG1 Fc结构域或IgG4 Fc结构域。在一些方面，Fc结构域包含减少与Fc受体的结合的一个或多个氨基酸取代，任选地其中Fc受体为Fcγ受体。
在一些方面，靶向PD-1和LAG3的双特异性抗体包含(a)具有氨基酸突变L234A、L235A和P329G(根据Kabat EU索引编号)的人IgG1亚类的Fc结构域；和/或(b)包含促进Fc结构域的第一亚基和第二亚基的缔合的修饰的Fc结构域。
在一些方面，Fc结构域的第一亚基包含氨基酸取代S354C和T366W(根据Kabat EU索引编号)，并且Fc结构域的第二亚基包含氨基酸取代Y349C、T366S和Y407V(根据Kabat EU索引编号)。
在一些方面，靶向PD-1和LAG3的双特异性抗体包含Fc结构域、包含第一抗原结合结构域的第一Fab片段和包含第二抗原结合结构域的第二Fab片段。在一些方面，在靶向PD-1和LAG3的双特异性抗体的Fab片段中的一个片段中，可变结构域VL和VH被彼此替换，使得VH结构域是轻链的一部分并且VL结构域是重链的一部分，任选地其中在第一Fab片段中可变结构域VL和VH被彼此替换。在一些方面，在Fab片段中的一个片段的恒定结构域CL中，位置124处的氨基酸独立地被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)取代(根据Kabat EU索引编号)，并且在恒定结构域CH1中，位置147和213处的氨基酸独立地被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)取代(根据Kabat EU索引编号)，任选地其中在第二Fab片段的恒定结构域CL中，位置124处的氨基酸独立地被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)取代(根据Kabat EU索引编号)，并且在恒定结构域CH1中，位置147和213处的氨基酸独立地被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)取代(根据Kabat EU索引编号)。
在一些方面，双特异性抗体包含第一重链，其包含与SEQ ID NO:39的序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；第一轻链，其包含与SEQ ID NO:40的序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；第二重链，其包含与SEQ ID NO:41的序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；和第二轻链，其包含与SEQ ID NO:42的序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一些方面，双特异性抗体包含第一重链，其包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列；第一轻链，其包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列；第二重链，其包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列；和第二轻链，其包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列。
在一些方面，双特异性抗体在肿瘤中实现至少90％的LAG3受体占有率(RO)。
在一些方面，受试者为人。
附图说明
图1是示出在患有黑素瘤的患者中Ib/II期临床试验的研究设计的流程图。Atezo＝阿特珠单抗；CIT＝癌症免疫疗法；CLND＝完全***清扫术；Ipi＝伊匹单抗；Nivo＝纳武单抗；R＝随机化；Tira＝替瑞利尤单抗。
图2是研究方案的示意图，其示出了患有黑素瘤的患者的Ib/II期临床试验的队列1中的研究日程和活动的概述。CLND＝完全***清扫术；Comp.＝完成；CT＝计算机断层扫描；Discon.＝中止；M＝月；R＝随机化；Q3M＝每3个月；SFU＝存活随访；Tx＝治疗；W＝周。
图3是示出帕博利珠单抗的最小基于生理学的药代动力学(mPBPK)模型的示意图。Jt＝进入肿瘤区室的帕博利珠单抗流量；kint＝帕博利珠单抗-PD-1复合物内化速率常数；koff＝解离速率常数；kon＝结合速率常数；kdeg＝PD-1的降解速率；Ksyn＝PD-1的合成速率；Lt＝来自肿瘤区室的淋巴流量；L1＝来自紧密组织区室的淋巴流量；L2＝来自渗漏组织区室的淋巴流量；mAb＝帕博利珠单抗浓度；Qt＝肿瘤血浆流速；RC＝帕博利珠单抗-PD-1复合物浓度；Rmax＝总PD-1浓度；V泄露＝具有渗漏血管结构的组织区室的体积；V淋巴＝淋巴区室的体积；Vp＝血浆区室的体积；V紧密＝具有紧密血管结构的组织区室的体积；V肿瘤＝肿瘤区室的体积；σ紧密＝紧密组织的血管反射系数；σ渗漏＝渗漏组织的血管反射系数；σLy＝淋巴反射系数。
图4是示出添加到PD1-LAG3的mPBPK模型中的额外LAG3受体的示意图。
图5是示出NP41300研究的剂量递增(A1部分，Q2W)部分中安全性可评估患者的不良事件概述的表格。
图6是示出NP41300研究的剂量递增(A1部分，Q2W)部分中安全性可评估患者的不良事件概述的表格。
图7是一组箱线图，其示出在Q2W(每2周)或Q3W(每3周)给药方案中以600mg或1200mg剂量第一次和第三次施用PD1-LAG3后的预测C谷。下铰链和上铰链对应于第一和第三四分位数(第25个和第75个百分位数)。上须从铰链延伸到距铰链不超过1.5*IQR的最大值(其中IQR是四分位距，或第一与第三四分位数之间的距离)。下须从铰链延伸到铰链的至多1.5*IQR的最小值。超出须末端的数据称为“***”点，并单独绘制。使用群体药代动力学模型(非线性混合效应建模方法)进行模拟。对于每种给药方案，使用从原始分析数据集引导(带替换)的协变量集对500名个体进行模拟。
图8是示出在3个周期后Q3W施用的RO7247669剂量范围内的模拟PD1和LAG3接合的图。
图9是示出在患有黑素瘤的患者中BP43963试验的研究设计的流程图。
图10是示出GO42216临床试验的研究设计的流程图。CIT＝癌症免疫疗法；HCC＝肝细胞癌；R＝随机化。
图11是示出GO42216临床试验的详细研究设计的流程图。Bev＝贝伐单抗；HCC＝肝细胞癌；Q2W＝每2周；Q3W＝每3周；R＝随机化。
具体实施方式
本发明提供用于治疗癌症的治疗方法和组合物。本文还提供涉及此类联合和/或给药方案的组合物、用途和试剂盒。
I.定义
本文使用以下缩写：
如本文所用，术语“约”是指为此技术领域中的技术人员容易知晓的相应值的常见误差范围。在本文中提及“约”值或参数包括(且描述)涉及该值或参数本身的方面。例如，提及“约X”的描述包括“X”的描述。
除非另外指明，否则如本文所用的术语“TIGIT”或“带有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体”是指来自任何脊椎动物来源的任何天然TIGIT，该脊椎动物来源包括哺乳动物诸如灵长类动物(例如，人)和啮齿动物(例如，小鼠和大鼠)。TIGIT在本领域中也称为DKFZp667A205、FLJ39873、V-set和含有免疫球蛋白结构域的蛋白质9、含有V-set和跨膜结构域的蛋白质3、VSIG9、VSTM3和WUCAM。该术语涵盖“全长”、未加工的TIGIT(例如，全长人TIGIT，其具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列)，以及由在细胞中加工产生的任何形式的TIGIT(例如，没有信号序列的加工的人TIGIT，其具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列)。该术语还涵盖TIGIT的天然存在的变体，例如剪接变体或等位基因变体。示例性人TIGIT的氨基酸序列可以以UniProt登录号Q495A1找到。
如本文所用，“替瑞利尤单抗”为在开放单克隆技术(OMT)大鼠中由完全人IgG1/κMAb衍生的，其结合TIGIT并包含SEQ ID NO:23的重链序列和SEQ ID NO:24的轻链序列。替瑞利尤单抗在Fc结构域中包含两个N连接的糖基化位点(N306)。替瑞利尤单抗也在以下文献中描述：WHO药物信息(国际药用物质非专利名称)，提议的INN：清单117，第31卷，第2期，在2017年7月7日发表(见第343页)。
术语“抗TIGIT拮抗剂抗体”是指能够以足够的亲和力结合TIGIT从而基本上或完全抑制TIGIT的生物活性的抗体或其抗原结合片段或变体。例如，抗TIGIT拮抗剂抗体可以阻断通过PVR、PVRL2和/或PVRL3的信号传导，从而将由T细胞进行的功能性应答(例如，增殖、细胞因子产生、靶细胞杀伤)从功能障碍状态恢复到抗原刺激。例如，抗TIGIT拮抗剂抗体可以阻断通过PVR的信号传导，而不影响PVR-CD226相互作用。本领域普通技术人员将理解，在一些情况下，抗TIGIT拮抗剂抗体可以拮抗一种TIGIT活性而不影响另一种TIGIT活性。例如，用于本文所述的某些方法或用途中的抗TIGIT拮抗剂抗体是响应PVR相互作用、PVRL3相互作用或PVRL2相互作用之一而拮抗TIGIT活性的抗TIGIT拮抗剂抗体，例如，不影响或最小程度地影响任何其他TIGIT相互作用。在一个方面，例如如通过放射免疫测定(RIA)所测得的，抗TIGIT拮抗剂抗体与不相关的非TIGIT蛋白的结合程度小于所述抗体与TIGIT结合程度的约10％。在某些方面，与TIGIT结合的抗TIGIT拮抗剂抗体的解离常数(KD)为≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM或≤0.001nM(例如，10-8M或更小，例如10-8M至10-13M，例如10-9M至10-13M)。在某些方面，抗TIGIT拮抗剂抗体结合在来自不同物种的TIGIT之间保守的TIGIT表位或允许跨物种反应性的TIGIT上的表位。在一些方面，抗TIGIT结合抗体具有完整的Fc介导的效应子功能(例如，替瑞利尤单抗、维博利单抗(vibostolimab)、etigilimab、EOS084448或TJ-T6)。在一些方面，抗TIGIT结合抗体具有增强的Fc介导的效应子功能(例如，SGN-TGT)。在其他方面，抗TIGIT结合抗体缺乏Fc介导的效应子功能(例如，domvanalimab、BMS-986207、ASP8374或COM902)。在一些方面，抗TIGIT结合抗体为IgG1类抗体(例如，替瑞利尤单抗、维博利单抗、domvanalimab、BMS-986207、etigilimab、BGB-A1217、SGN-TGT、EOS084448(EOS-448)、TJ-T6或AB308)。在其他方面，抗TIGIT结合抗体为IgG4类抗体(例如，ASP8374或COM902)。在一方面，抗TIGIT拮抗剂抗体为替瑞利尤单抗。
术语“PD-1轴结合拮抗剂”是指一种分子，该分子抑制PD-1轴结合配偶体与其结合配偶体中的一者或多者的相互作用以消除由PD-1信号传导轴上的信号传导引起的T细胞功能障碍，其结果是恢复或增强T细胞功能(例如，增殖、细胞因子产生和/或靶细胞杀伤)。如本文所用，PD-1轴结合拮抗剂包括PD-L1结合拮抗剂、PD-1结合拮抗剂和PD-L2结合拮抗剂。在一些情况下，PD-1轴结合拮抗剂包括PD-L1结合拮抗剂或PD-1结合拮抗剂。在一优选的方面，PD-1轴结合拮抗剂为PD-L1结合拮抗剂。
术语“PD-L1结合拮抗剂”是指降低、阻断、抑制、消除或干扰由PD-L1与其结合配偶体中的一者或多者(诸如PD-1和/或B7-1)相互作用产生的信号传导的分子。在一些情况下，PD-L1结合拮抗剂为抑制PD-L1与其结合配偶体的结合的分子。在一具体方面，PD-L1结合拮抗剂抑制PD-L1与PD-1和/或B7-1的结合。在一些情况下，PD-L1结合拮抗剂包括抗PD-L1抗体、其抗原结合片段、免疫粘附素、融合蛋白、寡肽和其他降低、阻断、抑制、消除或干扰由PD-L1与其结合配偶体中的一者或多者(诸如PD-1和/或B7-1)相互作用产生的信号转导的分子。在一种情况下，PD-L1结合拮抗剂减少由或通过T淋巴细胞上表达的细胞表面蛋白介导的通过PD-L1的信号传导所介导的负共刺激信号，从而使功能障碍的T细胞功能障碍较少(例如，提高效应子对抗原识别的响应)。在一些情况下，PD-L1结合拮抗剂与PD-L1结合。在一些情况下，PD-L1结合拮抗剂为抗PD-L1抗体(例如，抗PD-L1拮抗剂抗体)。示例性抗PD-L1拮抗剂抗体包括阿特珠单抗、MDX-1105、MEDI4736(德瓦鲁单抗(durvalumab))、MSB0010718C(阿维单抗(avelumab))、SHR-1316、CS1001、恩沃利单抗(envafolimab)、TQB2450、ZKAB001、LP-002、CX-072、IMC-001、KL-A167、APL-502、柯希利单抗(cosibelimab)、洛达利单抗(lodapolimab)、FAZ053、TG-1501、BGB-A333、BCD-135、AK-106、LDP、GR1405、HLX20、MSB2311、RC98、PDL-GEX、KD036、KY1003、YBL-007和HS-636。在一些方面，抗PD-L1抗体为阿特珠单抗、MDX-1105、MEDI4736(德瓦鲁单抗)或MSB0010718C(阿维单抗)。在一个具体方面，PD-L1结合拮抗剂为MDX-1105。在另一具体方面，PD-L1结合拮抗剂为MEDI4736(德瓦鲁单抗)。在另一具体方面，PD-L1结合拮抗剂为MSB0010718C(阿维单抗)。在其他方面，PD-L1结合拮抗剂可以是小分子，例如，GS-4224、INCB086550、MAX-10181、INCB090244、CA-170或ABSK041，其在一些情况下可以口服施用。其他示例性PD-L1结合拮抗剂包括AVA-004、MT-6035、VXM10、LYN192、GB7003和JS-003。在一优选的方面，PD-L1结合拮抗剂为阿特珠单抗。
术语“PD-1结合拮抗剂”是指减少、阻断、抑制、消除或干扰由PD-1与其结合配偶体中的一者或多者(诸如PD-L1和/或PD-L2)相互作用产生的信号传导的分子。PD-1(程序性死亡1)在本领域中也称为“程序性细胞死亡1”、“PDCD1”、“CD279”和“SLEB2”。示例性人PD-1在UniProtKB/Swiss-Prot登录号Q15116中示出。在一些情况下，PD-1结合拮抗剂为抑制PD-1与其结合配偶体中的一者或多者结合的分子。在具体方面，PD-1结合拮抗剂抑制PD-1与PD-L1和/或PD-L2的结合。例如，PD-1结合拮抗剂包括抗PD-1抗体及其抗原结合片段、免疫粘附素、融合蛋白、寡肽以及其他减少、阻断、抑制、消除或干扰由PD-1与PD-L1和/或PD-L2相互作用产生的信号传导的分子。在一种情况下，PD-1结合拮抗剂减少由或通过T淋巴细胞上表达的细胞表面蛋白介导的通过PD-1的信号传导所介导的负共刺激信号，从而使功能障碍的T细胞功能障碍较少(例如，提高效应子对抗原识别的应答)。在一些情况下，PD-1结合拮抗剂与PD-1结合。在一些情况下，PD-1结合拮抗剂为抗PD-1抗体(例如，抗PD-1拮抗剂抗体)。示例性的抗PD-1拮抗剂抗体包括纳武单抗、帕博利珠单抗、MEDI-0680、PDR001(斯巴达珠单抗)、REGN2810(西米普利单抗)、BGB-108、帕洛利单抗、卡瑞利珠单抗、信迪利单抗、替雷利珠单抗、特瑞普利单抗、多塔利单抗、瑞弗利单抗、萨善利单抗、派安普利单抗、CS1003、HLX10、SCT-I10A、赛帕利单抗、巴替利单抗、杰诺单抗、BI 754091、西利单抗、YBL-006、BAT1306、HX008、布格利单抗、AMG 404、CX-188、JTX-4014、609A、Sym021、LZM009、F520、SG001、AM0001、ENUM 244C8、ENUM 388D4、STI-1110、AK-103和hAb21。在一个具体方面，PD-1结合拮抗剂为MDX-1106(纳武单抗)。在另一具体方面，PD-1结合拮抗剂为MK-3475(派姆单抗)。在另一具体方面，PD-1结合拮抗剂为PD-L2融合蛋白，例如，AMP-224。在另一具体方面，PD-1结合拮抗剂为MED1-0680。在另一具体方面，PD-1结合拮抗剂为PDR001(斯巴达珠单抗)。在另一具体方面，PD-1结合拮抗剂为REGN2810(西米普利单抗)。在另一具体方面，PD-1结合拮抗剂为BGB-108。在另一具体方面，PD-1结合拮抗剂为帕洛利单抗。在另一具体方面，PD-1结合拮抗剂为卡瑞利珠单抗。在另一具体方面，PD-1结合拮抗剂为信迪利单抗。在另一具体方面，PD-1结合拮抗剂为替雷利珠单抗。在另一具体方面，PD-1结合拮抗剂为特瑞普利单抗。其他额外的示例性PD-1结合拮抗剂包括BION-004、CB201、AUNP-012、ADG104和LBL-006。
术语“PD-L2结合拮抗剂”是指减少、阻断、抑制、消除或干扰由PD-L2与其一种或多种结合配偶体(诸如PD-1)的相互作用产生的信号传导的分子。PD-L2(程序性死亡配体2)在本领域中也称为“程序性细胞死亡1配体2”、“PDCD1LG2”、“CD273”、“B7-DC”、“Btdc”和“PDL2”。示例性人PD-L2示出在UniProtKB/Swiss-Prot登录号Q9BQ51中。在一些情况下，PD-L2结合拮抗剂为抑制PD-L2与其结合配偶体中的一者或多者的结合的分子。在具体方面，PD-L2结合拮抗剂抑制PD-L2与PD-1的结合。示例性PD-L2拮抗剂包括抗PD-L2抗体、其抗原结合片段、免疫粘附素、融合蛋白、寡肽和其他降低、阻断、抑制、消除或干扰由PD-L2与其结合配偶体(诸如PD-1)中的一者或多者相互作用产生的信号传导的分子。在一方面，PD-L2结合拮抗剂减少由T淋巴细胞上表达的细胞表面蛋白介导的或通过其表达的负共刺激信号，该表面蛋白通过PD-L2介导的信号传导使功能障碍的T细胞功能障碍较少(例如，提高效应子对抗原识别的反应)。在一些方面，PD-L2结合拮抗剂与PD-L2结合。在一些方面，PD-L2结合拮抗剂为免疫粘附素。在其他方面，PD-L2结合拮抗剂为抗PD-L2拮抗剂抗体。
术语“程序性死亡配体1”和“PD-L1”在本文中是指天然序列人PD-L1多肽。天然序列PD-L1多肽在Uniprot登录号Q9NZQ7下提供。例如，天然序列PD-L1可以具有如Uniprot登录号Q9NZQ7-1(异构体1)中所述的氨基酸序列(SEQ ID NO:22)。在另一示例中，天然序列PD-L1可以具有如Uniprot登录号Q9NZQ7-2(异构体2)中所述的氨基酸序列。在又一示例中，天然序列PD-L1可以具有如Uniprot登录号Q9NZQ7-3(异构体3)中所述的氨基酸序列。PD-L1在本领域中也称为“程序性细胞死亡1配体1”、“PDCD1LG1”、“CD274”、“B7-H”和“PDL1”。
当提及可变结构域中的残基(大约为轻链的残基1-107和重链的残基1-113)时，通常使用Kabat编号***(例如，Kabat等人,Sequences of Immunological Interest.第5版Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991))。当提及免疫球蛋白重链恒定区中的残基时，通常使用“EU编号***”或“EU索引”(例如，上述Kabat等人所报道的EU索引)。“Kabat所述的EU索引”是指人类IgG1 EU抗体的残基编号。
出于本文的目的，“阿特珠单抗”为Fc工程化的、人源化的、非糖基化的IgG1κ免疫球蛋白，其结合PD-L1并且包含SEQ ID NO:62的重链序列和SEQ ID NO:63的轻链序列。阿特珠单抗在重链上的位置297处包含单个氨基酸取代(天冬酰胺到丙氨酸)(N297A)，使用Fc区氨基酸残基的EU编号，这导致与Fc受体结合最小的非糖基化抗体。阿特珠单抗也在以下文献中描述：WHO药物信息(国际药用物质非专利名称)，提议的INN：清单112，第28卷，第4期，在2015年1月16日发表(见第485页)。
术语“癌症”是指由部分身体中异常细胞不受控制的***引起的疾病。在一种情况下，癌症是皮肤癌(例如，黑素瘤、基底细胞癌(BCC)、鳞状细胞癌、皮肤T细胞淋巴瘤、隆突性皮肤纤维肉瘤(DFSP)、默克尔细胞癌或皮脂腺癌)。在另一种情况下，癌症是肝癌(例如，肝细胞癌(HCC)，例如，局部晚期或转移性HCC和/或不可切除的HCC)。癌症包括实体瘤癌症和非实体瘤癌症以及局部晚期或转移性癌症(例如，局部晚期或转移性肿瘤)。癌症的实例包括但不限于癌、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤和白血病或淋巴样恶性肿瘤。此类癌症的更具体示例包括但不限于，尿路上皮癌(UC)，包括局部晚期和转移性UC(mUC)、膀胱癌(例如，肌层浸润性膀胱癌(MIBC)和非肌层浸润性膀胱癌(NMIBC)，例如，BCG难治性NMIBC)、MIBC尿路上皮膀胱癌(UBC)；肾脏或肾癌(例如，肾细胞癌(RCC))；泌尿道癌；肺癌，诸如小细胞肺癌(SCLC)(其包括广泛期SCLC(ES-SCLC))、非小细胞肺癌(NSCLC)(其包括鳞状NSCLC或非鳞状NSCLC，包括局部晚期不可切除的NSCLC(例如IIIB期NSCLC)或复发性或转移性NSCLC(例如IV期NSCLC))、肺腺癌或鳞状细胞癌(例如，上皮鳞状细胞癌(例如，肺鳞状细胞癌))；胰腺癌(例如，胰腺导管腺癌(PDAC)，例如，转移性PDAC)；头颈部癌(例如，SCCHN，例如，复发性/转移性PD-L1阳性SCCHN和头颈鳞状细胞癌(HNSCC)；卵巢癌(OC)；食管癌；腹膜癌；肝细胞癌；胃癌(GC)(例如，胃食管连接部(GEJ)癌症或胃部癌症，包括胃肠道癌和胃肠道间质癌；胶质母细胞瘤；泌尿道癌；肝癌；乳腺癌,例如，HER2+乳腺癌和三阴性乳腺癌(TNBC(例如，早期TNBC(eTNBC)，其为***受体阴性(ER-)、孕激素受体阴性(PgR-)和HER2阴性(HER2-))；***癌，诸如去势抵抗性***癌(CRPC)；腹膜癌；肝细胞癌；胃癌或胃部癌症，包括胃肠道癌和胃肠道间质癌；胰腺癌(例如，胰腺导管腺癌(PDAC))；胶质母细胞瘤；***(例如，IVB期、转移性、复发性或持续性***，例如转移性和/或复发性PD-L1阳性***)；卵巢癌；肝癌；结肠癌；直肠癌；结直肠癌(CRC；例如，具有微卫星稳定(MSS)和微卫星不稳定性(MSI)低(MSI-Low)的CRC)；子宫内膜癌或子宫癌；唾液腺癌；***癌；外阴癌；甲状腺癌；肝癌；***癌；***癌；黑素瘤，包括浅表扩散黑素瘤、恶性雀斑黑素瘤、肢端黑素瘤和结节性黑素瘤；多发性骨髓瘤和B细胞淋巴瘤(包括低级别/滤泡性非霍奇金淋巴瘤(NHL)；小淋巴细胞(SL)NHL；中级别/滤泡性NHL；中级别弥漫性NHL；高级别免疫母细胞NHL；高级别成淋巴细胞NHL；高级别小无裂细胞NHL；大体积疾病NHL；套细胞淋巴瘤；AIDS相关淋巴瘤；和华氏巨球蛋白血症)；慢性淋巴细胞白血病(CLL)；急性淋巴细胞白血病(ALL)；急性骨髓性白血病(AML)；毛细胞白血病；慢性粒细胞白血病(CML)；移植后淋巴组织增生性疾患(PTLD)；和骨髓增生异常综合征(MDS)，以及与母斑病(phakomatoses)、水肿(诸如与脑肿瘤相关的水肿)、Meigs综合征、脑癌、头颈部癌和相关转移相关的异常血管增生。
在一些情况下，癌症(例如，皮肤癌(例如，黑素瘤)或肝癌(例如，HCC))是具有包含表达LAG3的CD8+T细胞的肿瘤微环境的肿瘤。
在一些情况下，癌症可能是不可切除的(例如，不可切除的局部晚期或转移性癌症)。
癌症的其他示例包括但不限于癌、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤和白血病或淋巴样恶性肿瘤。癌症的更特定示例包括但不限于食管癌(例如，鳞状细胞癌(例如，食管鳞状细胞癌(ESCC))、腺癌(例如，食管腺癌(EAC))或具有神经内分泌组织病理学的食管癌(例如，食管神经内分泌癌(ENEC))。其他示例包括转移性食管癌(例如，转移性ESCC、转移性EAC或转移性ENEC)。在一个情况下，癌症为结直肠癌(CRC)。如本文所用，术语“结直肠癌”、“CRC”、“结肠癌”或“肠癌”是指从大肠，例如结肠或直肠发展而来的癌症(例如，结直肠腺癌)。癌症的其他示例包括但不限于血液癌症，诸如成熟B细胞癌，不包括霍奇金淋巴瘤，但包括非霍奇金淋巴瘤(NHL)，诸如弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)，其可以是复发性或难治性DLBCL或Richter转化。癌症的其他具体示例还包括生发中心B细胞样(GCB)弥漫大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、活化B细胞样(ABC)DLBCL、滤泡性淋巴瘤(FL)、转化FL、套细胞淋巴瘤(MCL)、急性髓系白血病(AML)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、边缘区淋巴瘤(MZL)、转化型MZL、高级别B细胞淋巴瘤、原发性纵隔腔(胸腺)大B细胞淋巴瘤(PMLBCL)、小淋巴细胞白血病(SLL)、淋巴浆细胞性淋巴瘤(LL)、转化LL、瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症(WM)、中枢神经***淋巴瘤(CNSL)、伯基特淋巴瘤(BL)、前体B细胞淋巴细胞白血病、脾边缘区淋巴瘤、毛细胞白血病、脾淋巴瘤/白血病(不能分类)、脾弥漫性红髓小B细胞淋巴瘤、变异型毛细胞白血病、重链病(α重链病、γ重链病、μ重链病)、浆细胞骨髓瘤、骨孤立性浆细胞瘤、骨外浆细胞瘤、黏膜相关淋巴组织结外边缘区淋巴瘤(MALT淋巴瘤)、***边缘区淋巴瘤、小儿***边缘区淋巴瘤、小儿滤泡性淋巴瘤、原发性皮肤滤泡中心淋巴瘤、富含T细胞/组织细胞的大B细胞淋巴瘤、CNS的原发性DLBCL、原发性皮肤DLBCL(腿型)、老年人EBV阳性DLBCL、与慢性炎症相关的DLBCL、淋巴瘤样肉芽肿、血管内大B细胞淋巴瘤、ALK阳性大B细胞淋巴瘤、浆母细胞性淋巴瘤、HHV8相关多中心卡斯尔曼病引起的大B细胞淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤：B细胞淋巴瘤(不能分类，具有介于DLBCL与伯基特淋巴瘤之间的特征)，以及B细胞淋巴瘤(不能分类，具有介于DLBCL与经典型霍奇金淋巴瘤之间的特征)。癌症的其他示例包括但不限于癌、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤和白血病或淋巴样恶性肿瘤，包括B细胞淋巴瘤。此类癌症的更特别示例包括但不限于多发性骨髓瘤(MM)；低度恶性/滤泡性NHL；小淋巴细胞(SL)NHL；中度恶性/滤泡性NHL；中度恶性弥漫NHL；高级别免疫母细胞性NHL；高级别淋巴母细胞NHL；高级别小型非裂解细胞NHL；巨大肿块NHL；AIDS相关淋巴瘤；和急性淋巴细胞白血病(ALL)；慢性粒细胞白血病；以及移植后淋巴增殖性病症(PTLD)。
术语“B细胞增殖性疾患”或“B细胞恶性肿瘤”是指与某种程度的异常B细胞增殖相关的疾患，并且包括例如淋巴瘤、白血病、骨髓瘤和骨髓增生异常综合征。在一些情况下，B细胞增殖性疾患为淋巴瘤，诸如非霍奇金淋巴瘤(NHL)，包括例如滤泡性淋巴瘤(FL)(例如，复发性和/或难治性FL或转化FL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)(例如，复发性或难治性DLBCL或Richter转化)、MCL、高级别B细胞淋巴瘤或PMLBCL)。在另一个实施例中，B细胞增殖性疾患为白血病，诸如慢性淋巴细胞白血病(CLL)。在一个实施例中，B细胞增殖性疾患为复发性和/或难治性FL。
术语“肿瘤”是指所有赘生性细胞生长和增殖，无论是恶性还是良性，以及所有前癌性和癌性细胞和组织。术语“癌症”、“癌性”、“细胞增生性疾患”、“增生性疾患”和“肿瘤”在本文中并不互相排斥。
如本文所用，“肿瘤细胞”是指存在于肿瘤或其样品中的任何肿瘤细胞。使用本领域已知的和/或本文所述的方法，可以将肿瘤细胞与可能存在于肿瘤样品中的其他细胞，例如基质细胞和肿瘤浸润免疫细胞区分开来。
“肿瘤免疫”是指肿瘤逃避免疫识别和清除的过程。因此，作为治疗概念，当这种逃避被减弱，并且肿瘤被免疫***识别和攻击时，肿瘤免疫被“治疗”。肿瘤识别的实例包括肿瘤结合、肿瘤缩小和肿瘤清除。
如本文所用，“转移”是指癌症从其原发部位扩散到身体的其他部位。癌细胞可以脱离原发肿瘤，渗入***和血管，在血流中循环，并在身体其他部位的正常组织的远处病灶中生长(转移)。转移可以是局部的或远处的。转移是一个连续的过程，取决于肿瘤细胞从原发肿瘤脱落，穿过血流，并在远处停止。在新部位，细胞建立血液供应，并可以生长形成危及生命的肿块。肿瘤细胞内的刺激性和抑制性分子通路调节这种行为，并且肿瘤细胞与远处宿主细胞之间的相互作用也很重要。
如本文所用，“治疗”包括用有效量的治疗剂(例如，靶向PD-1和LAG3的双特异性抗体))进行有效的癌症治疗。本文中的治疗尤其包括辅助疗法、新辅助疗法、非转移性癌症疗法(例如，局部晚期癌症疗法)和转移性癌症疗法。治疗可以是一线治疗(例如，患者可能之前未治疗或不曾接受过先前全身性疗法)，或者二线或后续治疗。
在本文中，“有效量”是指实现治疗结果的治疗剂(例如，靶向PD-1和LAG3的双特异性抗体或治疗剂的组合(例如，靶向PD-1和LAG3的双特异性抗体以及抗TIGIT拮抗剂、替瑞利尤单抗或VEGF拮抗剂，例如，抗VEGF抗体(例如，贝伐单抗))的量。在一些示例中，治疗剂或治疗剂组合的有效量是达到改善的病理学缓解率(PRR)、改善的总缓解率(ORR)、改善的疾病控制率(DCR)、完全缓解(CR)、病理学完全缓解(pCR)、部分缓解(PR)、改善的存活(例如，无疾病存活期(DFS)和/或无进展存活期(PFS)和/或总存活期(OS))和/或改善的缓解持续时间(DOR)的临床终点的该药剂或药剂组合的量。
如本文所用，“完全缓解”和“CR”是指所有靶病灶的消失。
如本文所用，“部分缓解”和“PR”是指以治疗之前的基线最长直径之和(SLD)为参考，靶病灶的SLD减少至少30％。
如这里所用，“疾病进展”和“PD”是指以研究的最小总和(最低点)(包括基线)作为参考，靶病灶的SLD增加至少20％。出现一个或多个新病灶也可被视为PD。
如本文所用，“疾病稳定”或“SD”是指以最小总和作为参考，既没有充分缩小以符合PR，也没有充分增加以符合PD。
如本文所用，“疾病控制率”和“DCR”是指已实现CR、PR和疾病稳定(SD)的患有晚期或转移性癌症的患者的百分比。例如，DCR可以定义为具有SD达≥12周或CR或PR的患者的比例，如由研究人员根据RECIST v1.1所确定。
如本文所用，“总缓解率”、“客观缓解率”和“ORR”可互换，是指完全CR率与PR率之和。例如，客观缓解可以定义为根据实体瘤疗效评估标准(RECIST)v.1.1的CR或PR，如由研究人员评定所确定并通过初始记录后≥4周的重复评定所确认。在另一个示例中，ORR可以定义为相隔≥4周连续两次具有CR或PR的患者比例，如由研究人员根据RECIST v1.1所确定。
如本文所用，“病理学缓解率”和“pRR”可互换地指具有病理学完全缓解(pCR，例如，所治疗的肿瘤床中完全不存在活肿瘤)、病理学接近完全缓解(pnCR，例如，<10％的所治疗的肿瘤床被活肿瘤细胞占有)以及病理学部分缓解(pPR，例如，<50％的所治疗的肿瘤床被活肿瘤细胞占有)(例如，在手术时)的患者比例。
如本文所用，“无进展存活期”和“PFS”是指在治疗期间和治疗后，癌症在其期间不恶化的时间长度。PFS可包括患者已经历CR或PR的时间量，以及患者已经历疾病稳定的时间量。例如，PFS可以定义为从第一次研究治疗到第一次出现进展或因任何原因死亡(以先发生者为准)的时间，如由研究人员根据RECIST v.1.1所确定。在另一个示例中，PFS可以定义为从研究入组到第一次出现进展或因任何原因死亡(以先发生者为准)的时间，如由研究人员根据RECIST v.1.1所确定。
如本文所用，“总存活期”和“OS”是指从诊断日期或开始对疾病(例如，癌症)的治疗起，患者仍然活着的时间长度。例如，OS可定义为从第一次研究治疗到因任何原因死亡的时间。
如本文所用，术语“应答持续时间”和“DOR”是指从记录到肿瘤应答直至疾病进展或死亡(以先发生者为准)的时间长度。例如，DOR可以定义为从首次出现经记录的客观缓解到首次记录到疾病进展或因任何原因死亡时(以先发生者为准)的时间，如由研究人员根据RECIST v1.1所确定。
如本文所用，术语“化疗剂”是指可用于治疗癌症的化合物。化疗剂的示例包括EGFR抑制剂(包括小分子抑制剂(例如，厄洛替尼(Genentech/OSIPharm.)；PD 183805(CI 1033，2-丙烯酰胺、N-[4-[(3-氯-4-氟苯基)氨基]-7-[3-(4-吗啉基)丙氧基]-6-喹唑啉基]-二盐酸盐，Pfizer Inc.)；ZD1839，吉非替尼/>4-(3'-氯-4'-氟苯胺基)-7-甲氧基-6-(3-吗啉代丙氧基)喹唑啉，AstraZeneca)；ZM 105180((6-氨基-4-(3-甲基苯基-氨基)-喹唑啉，Zeneca)；BIBX-1382(N8-(3-氯-4-氟-苯基)-N2-(1-甲基-哌啶-4-基)-嘧啶并[5,4-d]嘧啶-2,8-二胺，Boehringer Ingelheim)；PKI-166((R)-4-[4-[(1-苯乙基)氨基]-1H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基]-苯酚)；(R)-6-(4-羟苯基)-4-[(1-苯乙基)氨基]-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶)；CL-387785(N-[4-[(3-溴苯基)氨基]-6-喹唑啉基]-2-丁炔酰胺)；EKB-569(N-[4-[(3-氯-4-氟苯基)氨基]-3-氰基-7-乙氧基-6-喹啉基]-4-(二甲基氨基)-2-丁烯酰胺)(Wyeth)；AG1478(Pfizer)；AG1571(SU 5271；Pfizer)；以及双重EGFR/HER2酪氨酸激酶抑制剂，诸如拉帕替尼(/>GSK572016或N-[3-氯-4-[(3氟苯基)甲氧基]苯基]-6[5[[[2甲基磺酰基)乙基]氨基]甲基]-2-呋喃基]-4-喹唑啉胺))；酪氨酸激酶抑制剂(例如，EGFR抑制剂；小分子HER2酪氨酸激酶抑制剂，诸如TAK165(Takeda)；CP-724,714，ErbB2受体酪氨酸激酶的口服选择性抑制剂(Pfizer和OSI)；优先结合EGFR但同时抑制过表达HER2和EGFR细胞的双重HER抑制剂，诸如EKB-569(可获自Wyeth)；PKI-166(Novartis)；泛HER抑制剂，诸如卡奈替尼(CI-1033；Pharmacia)；Raf-1抑制剂，诸如抑制Raf-1信号传导的反义剂ISIS-5132(ISIS Pharmaceuticals)；非HER靶向的酪氨酸激酶抑制剂，诸如甲磺酸伊马替尼(/>Glaxo SmithKline)；多重靶向酪氨酸激酶抑制剂，诸如舒尼替尼(/>Pfizer)；VEGF受体酪氨酸激酶抑制剂，诸如瓦他拉尼(PTK787/ZK222584,Novartis/Schering AG)；MAPK细胞外调节的激酶I抑制剂CI-1040(Pharmacia)；喹唑啉类，诸如PD 153035，4-(3-氯苯胺基)喹唑啉；吡啶并嘧啶类；嘧啶并嘧啶类；吡咯并嘧啶类，诸如CGP 59326、CGP 60261和CGP 62706；吡咯并嘧啶类、4-(苯氨基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶；姜黄素(二氟甲酰甲烷，4,5-双(4-氟苯胺基)邻苯二甲酰亚胺)；含有硝基噻吩部分的酪氨酸；PD-0183805(Warner-Lamber)；反义分子(例如，与HER编码核酸结合的分子)；喹噁啉类(美国专利号5,804,396)；酪氨酸磷酸化抑制剂(美国专利号5,804,396)；ZD6474(Astra Zeneca)；PTK-787(Novartis/Schering AG)；泛HER抑制剂，诸如CI-1033(Pfizer)；Affinitac(ISIS 3521；Isis/Lilly)；PKI 166(Novartis)；GW2016(GlaxoSmithKline)；CI-1033(Pfizer)；EKB-569(Wyeth)；塞马替尼(Pfizer)；ZD6474(AstraZeneca)；PTK-787(Novartis/Schering AG)；INC-1C11(Imclone)；和雷帕霉素(sirolimus,/>))；蛋白酶体抑制剂，诸如硼替佐米(/>Millennium Pharm.)；双硫仑；表没食子；盐孢子酰胺A；卡非佐米；17-AAG(格尔德霉素)；根赤壳菌素；乳酸脱氢酶A(LDH-A)；氟维司群(/>AstraZeneca)；来曲唑(Novartis)、非那沙酯(/>Novartis)；奥沙利铂(Sanofi)；5-FU(5-氟尿嘧啶)；甲酰四氢叶酸；洛那法尼(SCH 66336)；索拉非尼(/>Bayer Labs)；AG1478，烷基化剂诸如噻替哌和/>环磷酰胺；烷基磺酸酯，诸如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡；氮杂环丙烷类，诸如苯佐替派、卡波醌、美妥替哌和乌瑞替哌；乙亚胺类和甲基蜜胺类，包括六甲蜜胺、三亚乙基蜜胺、三亚乙基磷酰胺、三亚乙基硫代磷酰胺和三羟甲基蜜胺；番荔枝内酯类(尤其是布拉他辛和布拉他辛酮)；喜树碱(包括拓扑替康和伊立替康)；苔藓抑素；卡利他汀；CC-1065(包括其阿多来新、卡折来新和比折来新合成类似物)；念珠藻素(特别是念珠藻素1和念珠藻素8)；肾上腺皮质类固醇(包括***和***龙)；醋酸环丙孕酮；5α-还原酶(包括非那雄胺和度他雄胺)；伏立诺他、罗米地辛、泛比司他、丙戊酸、莫西司他；阿地介白素、滑石、杜卡霉素(包括合成类似物KW-2189和CB1-TM1)；五加苷素；水鬼蕉碱；匍枝珊瑚醇；海绵抑素；氮芥类，诸如苯丁酸氮芥、氯苯哌嗪、氯磷酰胺、雌莫司汀、异环磷酰胺、甲氮芥、盐酸甲氧氮芥、美法仑、新氮芥、苯芥胆甾醇、泼尼氮芥、曲洛磷胺、乌拉莫司汀；亚硝基脲，诸如卡莫司汀、氯脲霉素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀和拉尼莫斯汀；抗生素，诸如烯二炔抗生素(例如，卡奇霉素，尤其是卡奇霉素γ1和卡奇霉素ω1)；达内霉素，包括达内霉素A；双磷酸盐，诸如氯膦酸盐；艾司米星；以及新抑癌菌素发色团和相关的发色蛋白烯二炔类抗生素发色团)、阿克拉霉素、放线菌素、氨茴霉素、偶氮丝氨酸、放线菌素、卡柔比星、洋红霉素、嗜癌素、色霉素、放线菌素D、地托比星、6-叠氮-5-氧代-L-正亮氨酸、吗啉代-阿霉素、氰基吗啉代-阿霉素、2-吡咯啉合-阿霉素和脱氧阿霉素)、表柔比星、伊索比星、伊达比星、马塞罗霉素、丝裂霉素诸如丝裂霉素C、霉酚酸、诺加霉素、橄榄霉素、培洛霉素、甲基丝裂霉素、嘌呤霉素、三铁阿霉素、罗多比星、链黑菌素、链脲佐菌素、杀结核菌素、乌苯美司、净司他汀、佐柔比星；抗代谢物，诸如甲氨喋呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，诸如二甲叶酸、甲氨喋呤、蝶罗呤、三甲蝶呤；嘌呤类似物，诸如氟达拉滨、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，诸如安西他滨、阿扎胞苷、6-氮尿苷、卡莫氟、阿糖孢苷、双脱氧尿苷、脱氧氟尿苷、依诺他滨、氟尿苷；雄激素，诸如卡普睾酮、丙酸屈他雄酮、环硫雄醇、美雄烷、睾内酯；抗肾上腺素类药物，诸如氨鲁米特、米托坦、曲洛斯坦；叶酸补充剂，诸如亚叶酸；醋葡醛内酯；醛磷酰胺糖苷；氨基乙酰丙酸；恩尿嘧啶；安吖啶；倍曲布西；比生群；依达曲沙；地磷酰胺；秋水仙胺；亚胺醌；依洛尼塞；依利醋铵；埃博霉素；乙环氧啶；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；氯尼达明；美登木素生物碱，诸如美登素和安丝菌素；米托胍腙；米托蒽醌；莫哌达醇；二胺硝吖啶；喷司他丁；蛋氨氮芥；吡柔比星；洛索蒽醌；鬼臼酸；2-乙基肼；甲基苄肼；/>多糖铁复合物(JHS NaturalProducts)；雷佐生；根霉素；裂裥菌素；锗螺胺；细交链孢菌酮酸；三亚胺醌；2,2',2”-三氯三乙胺；单端孢霉烯族毒素素(尤其是T-2霉素、维拉库林A、漆斑菌素A和蛇形菌素)；尿烷；长春地碱；达卡巴嗪；甘露醇氮芥；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；加西托星；***糖苷(“Ara-C”)；环磷酰胺；噻替派；苯丁酸氮芥；/>(吉西他滨)；6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；甲氨喋呤；依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺；米托蒽醌；诺万隆；替尼泊苷；依达曲塞；柔红霉素；氨基蝶呤；卡培他滨/>伊班膦酸盐；CPT-11；拓扑异构酶抑制剂RFS2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；维甲酸类，诸如视黄酸；以及上述任何一者的药用盐、酸、前药和衍生物。
化疗剂还包括：(i)起到调节或抑制激素对肿瘤的作用的抗激素剂，诸如抗***和选择性***受体调节剂(SERM)，包括例如他莫昔芬(包括枸橼酸他莫昔芬)、雷洛昔芬、屈洛昔芬(droloxifene)、iodoxyfene、4-羟基他莫昔芬、曲奥昔芬(trioxifene)、雷洛昔芬盐酸盐(keoxifene)、LY117018、奥那司酮(onapristone)和/>(枸橼酸托米芬(toremifine citrate))；(ii)抑制芳香化酶的芳香化酶抑制剂，该酶调节肾上腺的***产生，诸如，例如4(5)-咪唑、氨鲁米特、/>(醋酸甲地孕酮)、/>(依西美坦；辉瑞公司)、福美司坦(formestanie)、法屈唑(fadrozole)、/>(伏洛唑(vorozole))、/>(来曲唑；诺华公司)和(阿那曲唑；阿斯利康公司)；(iii)抗雄激素，诸如氟他胺(flutamide)、尼鲁米特(nilutamide)、比卡鲁胺(bicalutamide)、亮丙瑞林(leuprolide)和戈舍瑞林(goserelin)；布舍瑞林(buserelin)、曲普瑞林(tripterelin)、醋酸甲羟孕酮、己烯雌酚、倍美力、氟***、所有反式视黄酸、维甲酰酚胺(fenretinide)以及曲沙他滨(1,3-二氧戊环核苷胞嘧啶类似物)；(iv)蛋白激酶抑制剂；(v)脂质激酶抑制剂；(vi)反义寡核苷酸，特别是那些抑制与异常细胞增殖有关的信号传导途径中的基因表达的寡核苷酸，诸如，例如PKC-α、Ralf和H-Ras；(vii)核酶，诸如VEGF表达抑制剂(例如，/>)和HER2表达抑制剂；(viii)疫苗，诸如基因疗法疫苗，例如/>和(ix)生长抑制剂，包括长春类(例如，长春新碱和长春碱)、/>(长春瑞滨)、紫杉烷类(例如，紫杉醇、白蛋白结合型紫杉醇和多西他赛(docetaxel))、拓扑异构酶II抑制剂(例如，多柔比星、表柔比星、道诺霉素、依托泊苷和博来霉素)和DNA烷化剂(例如，它莫西芬(tamoxigen)、强的松、达卡巴嗪、二氯甲基二乙胺、顺铂、甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶和ara-C)；以及(x)上述任一项的药用盐、酸、前药和衍生物。
如本文所用，术语“细胞毒性剂”是指对细胞有害(例如，造成细胞死亡、抑制增殖或以其他方式阻碍细胞功能)的任何试剂。细胞毒性剂包括但不限于放射性同位素(例如，At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212和Lu的放射性同位素)；化疗剂；酶及其片段，诸如溶核酶；以及毒素，诸如细菌、真菌、植物或动物来源的小分子毒素或酶活性毒素，包括其片段和/或变体。示例性细胞毒性剂可以选自抗微管剂、铂配位络合物、烷化剂、抗生素剂、拓扑异构酶II抑制剂、抗代谢物、拓扑异构酶I抑制剂、激素和激素类似物、信号转导途径抑制剂、非受体酪氨酸激酶血管生成抑制剂、免疫治疗剂、促凋亡剂、LDH-A抑制剂、脂肪酸生物合成抑制剂、细胞周期信号传导抑制剂、HDAC抑制剂、蛋白酶体抑制剂和癌症代谢抑制剂。在一种情况下，细胞毒性剂为铂类化疗剂(例如，卡铂或顺铂)。在一种情况下，细胞毒性剂为EGFR的拮抗剂，例如，N-(3-乙炔基苯基)-6,7-双(2-甲氧基乙氧基)喹唑啉-4-胺(例如，厄洛替尼)。在一种情况下，细胞毒性剂为RAF抑制剂，例如，BRAF和/或CRAF抑制剂。在一种情况下，RAF抑制剂为维罗非尼(vemurafenib)。在一种情况下，细胞毒性剂为PI3K抑制剂。
术语“患者”或“受试者”是指人类患者或受试者。例如，患者或受试者可以是成年人。
本文的术语“抗体”具体地覆盖单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗体片段，只要它们表现出所需的生物学活性即可。在一种情况下，抗体为全长单克隆抗体。
如本文所用，术语IgG“同种型”或“亚类”是指由免疫球蛋白恒定区的化学和抗原特征定义的免疫球蛋白的任何亚类。
根据其重链恒定结构域的氨基酸序列，可以将抗体(免疫球蛋白)分为不同的类别。免疫球蛋白主要分为五类：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且它们中的一些可以进一步分为亚类(同种型)，例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同类别的免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称为α、γ、ε、γ和μ。不同种类的免疫球蛋白的亚基结构和三维构型是众所周知的，并在例如以下文献中有一般描述：Abbas等人Cellular and Mol.Immunology,第4版(W.B.Saunders,Co.,2000)。抗体可以是较大融合分子的一部分，该融合分子是通过抗体与一个或多个其它蛋白质或肽的共价或非共价结合形成的。
术语“全长抗体”、“完整抗体”和“全抗体”在本文中可互换使用，是指其基本上完整形式的抗体而不是如下文定义的抗体片段。该术语是指包含Fc区的抗体。
本文的术语“Fc区”用于定义免疫球蛋白重链的C末端区，该C末端区包含恒定区的至少一部分。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。在一个方面，人IgG重链Fc区从Cys226或从Pro230延伸至重链的羧基末端。然而，由宿主细胞产生的抗体可以经历对来自重链C末端的一个或多个(特别是一个或两个)氨基酸的翻译后裂解。因此，由宿主细胞通过表达编码全长重链的特定核酸分子产生的抗体可以包括全长重链，或者所述抗体可以包括全长重链的切割变体。这可能是重链的最后两个C末端氨基酸为甘氨酸(G446)和赖氨酸(K447)的情况。因此，Fc区的C末端赖氨酸(Lys447)或C末端甘氨酸(Gly446)和赖氨酸(Lys447)可以存在或可以不存在。如果没有另做指示，则包括Fc区的重链的氨基酸序列在本文中表示为没有C末端赖氨酸(Lys447)。在一方面，包括如本文所指定的Fc区的重链包含在根据本文公开的抗体中，该重链包含额外的C末端甘氨酸-赖氨酸二肽(G446和K447)。在一方面，包括如本文所指定的Fc区的重链包含在根据本文公开的抗体中，该重链包含额外的C末端甘氨酸残基(G446)。在一方面，包括如本文所指定的Fc区的重链包含在根据本文公开的抗体中，该重链包含额外的C末端赖氨酸残基(K447)。在一实施例中，Fc区含有重链的单个氨基酸取代N297A。除非本文另有说明，否则Fc区或恒定区中氨基酸残基的编号是根据EU编号***，也称为EU索引，如Kabat等人所述(Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版。美国卫生与公众服务部，国立卫生研究院，马里兰州贝塞斯达，1991)。
“裸抗体”是指不缀合至异源部分(例如，细胞毒性部分)或放射性标记的抗体。裸抗体可存在于药物组合物中。
如本文所用的术语“单克隆抗体”是指从基本上同质的抗体群体获得的抗体，即，除了可能的变体抗体(例如，含有天然存在的突变或在单克隆抗体制剂的生产过程中生产，此类变体通常以少量形式存在)之外，包括该群体的个别抗体具有同一性和/或结合相同表位。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，单克隆抗体制剂中的每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。因此，修饰语“单克隆”表示抗体的特征是从基本上同质的抗体群体获得的，并且不应解释为需要通过任何特定方法生产抗体。例如，根据本发明的单克隆抗体可以通过多种技术制备，包括但不限于杂交瘤方法、重组DNA方法、噬菌体展示方法，以及利用包含全部或部分人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法。
如本文所用的术语“高变区”或“HVR”是指抗体可变结构域中在序列上高变并确定抗原结合特异性的各个区域，例如“互补决定区”(“CDR”)。
通常，抗体包含六个CDR；三个在VH中(CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3)，并且三个在VL中的(CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3)。本文中的示例性CDR包括：
(a)存在于氨基酸残基26-32(L1)、50-52(L2)、91-96(L3)、26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)处的高变环(Chothia和Lesk,J.Mol.Biol.196:901-917(1987))；
(b)存在于氨基酸残基24-34(L1)、50-56(L2)、89-97(L3)、31-35b(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)处的CDR(Kabat等人,Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,第5版Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991))；以及
(c)存在于氨基酸残基27c-36(L1)、46-55(L2)、89-96(L3)、30-35b(H1)、47-58(H2)和93-101(H3)处的抗原接触点(MacCallum等人J.Mol.Biol.262:732-745(1996))。
除非另外指明，否则CDR根据出处同上的Kabat等人所述的方法确定。本领域的技术人员将理解，CDR名称也可以根据出处同上的Chothia所述的方法、出处同上的McCallum所述的方法或者任何其他在科学上接受的命名***来确定。
“框架”或“FR”是指除互补决定区(CDR)之外的可变结构域残基。可变结构域的FR通常由以下四个FR结构域组成：FR1、FR2、FR3和FR4。因此，CDR和FR序列通常在VH(或VL)中以如下序列出现：FR1-CDR-H1(CDR-L1)-FR2-CDR-H2(CDR-L2)-FR3-CDR-H3(CDR-L3)-FR4。
术语“Kabat所述的可变结构域残基编号”或“Kabat所述的氨基酸位置编号”及其变型是指在上述Kabat等人的文献中提出的用于重链可变结构域或轻链可变结构域的编号***。使用该编号***，实际线性氨基酸序列可能包含较少或附加的氨基酸，其对应于可变结构域的FR或HVR的缩短或***。例如，重链可变结构域可在H2的残基52之后包括单个氨基酸***片段(根据Kabat编号的残基52a)以及重链FR残基82之后的***残基(例如，根据Kabat编号的残基82a、82b和82c等)。可通过将抗体序列与“标准”Kabat编号序列的同源性区域进行比对来确定给定抗体的残基的Kabat编号。
如本文所用，术语“单特异性”抗体表示具有一个或多个结合位点的抗体，每个结合位点与相同抗原的相同表位结合。如本文所用，术语“双特异性”抗体意指抗体能够特异性结合至少两种不同的抗原决定簇，例如各自由一对抗体重链可变结构域(VH)和抗体轻链可变结构域(VL)形成的两个结合位点与不同抗原或同一抗原上的不同表位结合。此类双特异性抗体为1+1形式。其他双特异性抗体形式是2+1形式(包含第一抗原或表位的两个结合位点和第二抗原或表位的一个结合位点)或2+2形式(包含第一抗原或表位的两个结合位点和第二抗原或表位的两个结合位点)。典型地，双特异性抗体包含两个抗原结合位点，这两个抗原结合位点中的每一个对不同的抗原具有特异性。
如本文所用，“PD-L1阳性肿瘤细胞分数”为，在免疫组化(IHC)测定法例如使用抗体SP142、SP263、22C3或28-8对PD-L1染色的IHC测定法的背景下，在染色后，相对于样品中存在的所有活肿瘤细胞，以任何强度显示部分或完全膜染色(不包括细胞质染色)的活肿瘤细胞的百分比。因此，可以使用PD-L1 IHC SP142(Ventana)测定法，例如，通过公式PD-L1阳性肿瘤细胞分数＝(PD-L1阳性肿瘤数细胞)/(PD-L1阳性和PD-L1阴性肿瘤细胞的总数)来计算PD-L1阳性肿瘤细胞分数，其中PD-L1对肿瘤细胞和所有非肿瘤细胞(例如，肿瘤浸润性免疫细胞、正常细胞、坏死细胞和碎片)的细胞质染色被排除在评估和评分之外。应当理解，任何给定的诊断性PD-L1抗体可以对应于可用于得出PD-L1阳性肿瘤细胞分数的特定IHC测定方案和/或评分术语。例如，PD-L1阳性肿瘤细胞分数可以分别使用Benchmark ULTRA上的检测、AutostainerLink 48上的EnVision Flex、Benchmark ULTRA上的/>检测和放大或AutostainerLink 48上的EnVision Flex从用SP263、22C3、SP142或28-8染色的肿瘤细胞样品得出。
如本文所用，“Ventana SP142 IHC测定法”是根据Ventana PD-L1(SP142)测定法包装插页(Tucson，AZ：Ventana Medical Systems,Inc.)执行的，其通过引用整体并入本文。
如本文所用，“Ventana SP263 IHC测定法”是根据Ventana PD-L1(SP263)测定法包装插页(Tucson，AZ：Ventana Medical Systems,Inc.)执行的，其通过引用整体并入本文。
如本文所用，“pharmDx 22C3 IHC测定法”是根据PD-L1 IHC 22C3 pharmDx包装插页(Carpinteria，CA：Dako,Agilent Pathology Solutions)执行的，其通过引用整体并入本文。
如本文所用，“pharmDx 28-8 IHC测定法”是根据PD-L1 IHC 28- 8pharmDx包装插页(Carpinteria，CA：Dako,Agilent Pathology Solutions)执行的，其通过引用整体并入本文。
术语“包装插页”用于指治疗产品的商业包装中通常包括的说明书，其含有涉及此类治疗产品的使用的有关适应症、用法、剂量、施用、组合疗法、禁忌和/或警告的信息。
如本文所用，“与……组合”是指除了一种治疗方式之外还施用另一种治疗方式，例如包括施用靶向程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)和淋巴细胞活化基因-3(LAG3)的双特异性抗体以及抗TIGIT拮抗剂抗体(例如，替瑞利尤单抗)或VEGF拮抗剂(例如，抗VEGF抗体(例如，贝伐单抗))的治疗方案。这样，“与……组合”是指在向患者施用一种治疗方式之前、期间或之后施用另一种治疗方式。
与一种或多种其他药物“同时”施用的药物是在同一治疗周期内，在与一种或多种其他药物的治疗的同一天，以及任选地与一种或多种其他药物同时施用。例如，对于每3周给予的癌症治疗，同时施用的药物各自在3周周期的第1天施用。
如本文所用，术语“不良事件”或“AE”是指任何与使用医疗或程序暂时相关的不利和意外的迹象(包括异常的实验室发现)、症状或疾病，这些治疗或程序可能会或可能不会被认为与医疗或程序有关。不良事件可按“级别”分类，如美国国家癌症研究所不良事件通用术语标准v4.0或v5.0(NIH CTCAE)所定义。在一些方面，AE是低级别AE，例如1级或2级AE。1级包括无症状或有轻微症状的AE。2级包括中等和限制适合年龄的日常生活的辅助活动(例如，准备饭菜、购买杂货或衣物)并且表明局部或非侵入性干预的AE。在其他情况下，AE是高级别AE，例如3级、4级或5级AE。在一些情况下，AE是3级或4级AE。3级包括严重的或具有医学意义的但不会立即危及生命并且表明住院治疗或住院治疗延长的AE。4级包括具有危及生命的后果并且表明需要紧急干预的AE。5级包括导致死亡或与死亡相关的AE。
如本文所用，术语“治疗相关AE”是指由研究人员判断由于治疗(例如，PD-1轴结合拮抗剂疗法(例如，阿特珠单抗疗法)和/或抗TIGIT拮抗剂抗体疗法(例如，替瑞利尤单抗疗法))的结果而发生的AE。
如在当前应用中所用的术语“价”表示抗原结合分子存在指定数目的结合结构域。因此，术语“二价”、“四价”和“六价”分别表示抗原结合分子中存在两个结合结构域、四个结合结构域和六个结合结构域。根据本发明的双特异性抗体是至少“二价的”，并且可以是“三价的”或“多价的”(例如，“四价的”或“六价的”)。在一个特定方面，本发明的抗体具有两个或更多个结合位点并且是双特异性的。也就是说，即使在存在多于两个结合位点(即抗体是三价的或多价的)的情况下，抗体也可以是双特异性的。
“抗体片段”是指除了完整抗体以外的分子，该分子包含完整抗体的一部分，该部分结合完整抗体所结合的抗原。抗体片段的示例包括但不限于Fv、Fab、Fab'、Fab’-SH、F(ab')2；双体抗体、三体抗体、四体抗体、交叉Fab片段；线性抗体；单链抗体分子(例如scFv)；由抗体片段和单结构域抗体形成的多特异性抗体。关于某些抗体片段的综述，参见Hudson等人，Nat Med 9,129-134(2003)。关于scFv片段的综述，参见例如Plückthun在Theharmacology of Monoclonal Antibodies,第113卷,Rosenburg和Moore编.,Springer-Verlag,New York,第269-315页(1994)中所述；还可参见WO 93/16185；以及美国专利5,571,894号和5,587,458号。关于对包含补救受体结合表位残基并具有增加的体内半衰期的Fab片段和F(ab')2片段的讨论，参见美国专利号5,869,046。双体抗体是具有两个抗原结合位点的抗体片段，该双体抗体可以是二价的或双特异性的，参见例如EP 404,097；WO 1993/01161；Hudson等人，Nat Med 9,129-134(2003)；以及Hollinger等人，Proc Natl Acad SciUSA 90,6444-6448(1993)。在Hudson等人，Nat Med 9,129-134(2003)中也描述了三体抗体和四体抗体。单结构域抗体为包含抗体的全部或部分重链可变结构域或全部或部分轻链可变结构域的抗体片段。在某些实施例中，单结构域抗体是人单结构域抗体(Domantis,Inc.，Waltham，MA；参见例如美国专利号6,248,516B1)。另外，抗体片段包含单链多肽，该单链多肽的特征在于具有VH结构域，即能够与VL结构域一起装配到功能性抗原结合位点；或具有VL结构域的特征，即能够与VH结构域一起装配到功能性抗原结合位点，从而提供全长抗体的抗原结合特性。抗体片段可以通过各种技术制备，如本文所述，包括但不限于完整抗体的蛋白水解消化以及由重组宿主细胞(例如大肠杆菌或噬菌体)产生。
木瓜蛋白酶消化完整抗体产生两个称为“Fab”片段的相同的抗原结合片段，每个“Fab”片段含有重链可变结构域和轻链可变结构域以及轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域(CH1)。因此，如本文所用，术语“Fab片段”是指这样的抗体片段，其包含含有VL结构域和轻链恒定结构域(CL)的轻链片段，以及重链的VH结构域和第一恒定结构域(CH1)。Fab’片段与Fab片段的不同之处在于Fab’片段在重链CH1结构域的羧基末端添加了一些残基，这些残基包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab’-SH是Fab’片段，其中恒定结构域的半胱氨酸残基具有游离的硫醇基。胃蛋白酶处理产生F(ab')2片段，其具有两个抗原结合位点(两个Fab片段)和Fc区的一部分。
术语“cross-Fab片段”或“xFab片段”或“交叉Fab片段”是指其中重链和轻链的可变区或恒定区发生交换的Fab片段。交换型Fab分子的两种不同链组成是可能的，并且包含在本发明的双特异性抗体中：在一方面，Fab重链和轻链的可变区被交换，即交换型Fab分子包含由轻链可变区(VL)和重链恒定区(CH1)组成的肽链，以及由重链可变区(VH)和轻链恒定区(CL)组成的肽链。该交换型Fab分子也称为CrossFab(VLVH)。在另一方面，当Fab重链和轻链的恒定区被交换时，交换型Fab分子包含由重链可变区(VH)和轻链恒定区(CL)组成的肽链，以及由轻链可变区(VL)和重链恒定区(CH1)组成的肽链。该交换型Fab分子也称为CrossFab(CLCH1)。
“单链Fab片段”或“scFab”是由抗体重链可变结构域(VH)、抗体恒定结构域1(CH1)、抗体轻链可变结构域(VL)、抗体轻链恒定结构域(CL)和接头组成的多肽，其中所述抗体结构域和所述接头在N末端至C末端方向上具有以下顺序中的一种：a)VH-CH1-接头-VL-CL，b)VL-CL-接头-VH-CH1，c)VH-CL-接头-VL-CH1，或d)VL-CH1-接头-VH-CL；并且其中所述接头是至少30个氨基酸，优选在32个与50个氨基酸之间的多肽。所述单链Fab片段经由CL结构域与CH1结构域之间的天然二硫键而稳定化。此外，这些单链Fab分子可以通过经由***半胱氨酸残基(例如根据Kabat编号的可变重链中的44位和可变轻链中的100位)产生链间二硫键，而进一步稳定化。
“交换型单链Fab片段”或“x-scFab”是由抗体重链可变结构域(VH)、抗体恒定结构域1(CH1)、抗体轻链可变结构域(VL)、抗体轻链恒定结构域(CL)和接头组成的多肽，其中所述抗体结构域和所述接头在N末端至C末端方向上具有以下顺序中的一种：a)VH-CL-接头-VL-CH1和b)VL-CH1-接头-VH-CL；其中VH和VL一起形成与抗原特异性结合的抗原结合结构域，并且其中所述接头是至少30个氨基酸的多肽。此外，这些x-scFab分子可以通过经由***半胱氨酸残基(例如，根据Kabat编号的可变重链中的44位和可变轻链中的100位)生成链间二硫键，而进一步稳定化。
“单链可变片段(scFv)”是抗体的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的融合蛋白，通过十至约25个氨基酸的短接头肽连接。接头通常富含甘氨酸以获得柔性，以及富含丝氨酸或苏氨酸以获得溶解度，并且可以将VH的N末端与VL的C末端连接，或反之亦然。尽管去除了恒定区并引入了接头，但该蛋白保留了原始抗体的特异性。scFv抗体例如描述于Houston,J.S.,Methods in Enzymol.203(1991)46-96)。另外，抗体片段包含单链多肽，该单链多肽的特征在于具有VH结构域，即能够与VL结构域一起装配到功能性抗原结合位点；或具有VL结构域的特征，即能够与VH结构域一起装配到功能性抗原结合位点，从而提供全长抗体的抗原结合特性。
单结构域抗体是由单一单体可变抗体结构域组成的抗体片段。第一单结构域来源于骆驼科动物的抗体重链的可变结构域(纳米抗体或VHH片段)。此外，术语单结构域抗体包含自体人重链可变结构域(aVH)或来源于鲨鱼的VNAR片段。纤连蛋白可以经工程化改造以结合抗原的支架。Adnectin由III型人纤连蛋白(FN3)的15个重复单元的第10结构域的天然氨基酸序列的主链组成。β-夹层的一个端部处的三个环可以经工程化改造，以使Adnectin能够特异性识别目标治疗靶标。关于进一步细节，参见Protein Eng.Des.Sel.18,435-444(2005)、US20080139791、WO2005056764和US6818418B1。肽适体是组合的识别分子，该组合的识别分子由恒定的支架蛋白，通常是硫氧还蛋白(TrxA)组成，该恒定的支架蛋白含有在活性位点处***的受约束的可变肽环。关于进一步细节，参见Expert Opin.Biol.Ther.5,783-797(2005)。微型体来源于含有3-4个半胱氨酸桥、长度为25-50个氨基酸的天然存在的微蛋白，该微蛋白的示例包括KalataBI和芋螺毒素以及knottin。微蛋白具有环，其可以经工程化改造为包括多达25个氨基酸而不影响微蛋白的整体折叠。关于工程化改造的knottin结构域的进一步细节，参见WO2008098796。
术语“包含与PD-1特异性结合的第一抗原结合结构域和与LAG3特异性结合的第二抗原结合结构域的双特异性抗体”“特异性结合PD-1和LAG3的双特异性抗体”“特异于PD-1和LAG3的双特异性抗原结合分子”或“抗PD-1/抗LAG3抗体”在本文中可互换使用，并且是指能够以足够的亲和力结合PD-1和LAG3，使得该抗体可用作靶向PD-1和LAG3的诊断和/或治疗剂的双特异性抗体。
术语“PD-1”，也称为程序性细胞死亡蛋白1，是一种由288个氨基酸组成的I型膜蛋白，最初在1992年描述(Ishida等人，EMBO J.,11(1992),3887-3895)。PD-1是T细胞调节因子的扩展CD28/CTLA-4家族的成员，并具有两个配体PD-L1(B7-H1、CD274)和PD-L2(B7-DC、CD273)。蛋白质结构包括细胞外IgV结构域，之后是跨膜区和细胞内尾部。细胞内尾部含有位于免疫受体酪氨酸基抑制基序和免疫受体酪氨酸基转换基序中的两个磷酸化位点，这表明PD-1负调节TCR信号。这与配体结合后SHP-1磷酸酶和SHP-2磷酸酶与PD-1的细胞质尾部的结合一致。虽然PD-1不在原初T细胞上表达，但其在T细胞受体(TCR)介导的活化后上调，并且在活化的和耗竭的T细胞上都被观察到(Agata等人，Int.Immunology 8(1996),765-772)。这些耗竭的T细胞具有功能障碍的表型并且不能适当地作出反应。尽管PD-1具有相对宽的表达模式，但其最重要的作用可能是作为T细胞上的共抑制受体(Chinai等人，Trendsin Pharmacological Sciences 36(2015),587-595)。因此，目前的治疗方法聚焦于阻断PD-1与其配体的相互作用以增强T细胞应答。术语“程序性死亡1”“程序性细胞死亡1”“蛋白质PD-1”“PD-1”“PD1”“PDCD1”“hPD-1”和“hPD-1”可互换使用，并且包括人PD-1的变体、同种型、物种同源物，以及与PD-1具有至少一个共同表位的类似物。人PD-1的氨基酸序列示出于UniProt(www.uniprot.org)登录号Q15116(SEQ ID NO:55)。
除非另有说明，否则如本文所用的术语“LAG3”或“Lag-3”或“淋巴细胞活化基因-3”或“CD223”是指来自任何脊椎动物来源的任何天然LAG3，所述脊椎动物来源包括诸如灵长类动物(例如人类)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)等哺乳动物。该术语涵盖“全长”、未加工的LAG3，以及由细胞内加工而产生的任何形式的LAG3。该术语还涵盖LAG3的天然存在变体，例如剪接变体或等位基因变体。在一个优选实施例中，术语“LAG3”是指人LAG3。示例性经加工(无信号序列)的LAG3的氨基酸序列如SEQ ID NO:56所示。示例性细胞外结构域(ECD)LAG3的氨基酸序列如SEQ ID NO:57所示。
术语“抗LAG3抗体”和“结合LAG3的抗体”是指这样的抗体，其能够以足够的亲和力结合LAG3，使得所述抗体可用作靶向LAG3的诊断和/或治疗剂。在一方面，例如如通过放射免疫测定(RIA)所测得的，抗LAG3抗体与不相关的非LAG3蛋白的结合程度小于所述抗体与LAG3结合程度的约10％。在某些实施例中，结合LAG3的抗体的解离常数(KD)为≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM或≤0.001nM(例如，10-8M或更低，例如10-8M至10-13M，例如10-9M至10-13M)。在某些方面，抗LAG3抗体与LAG3的表位结合，所述表位在来自不同物种的LAG3中是保守的。在一个优选实施例中，“抗LAG3抗体”、“特异性结合人LAG3的抗体”和“结合人LAG3的抗体”是指特异性结合人LAG3抗原或其细胞外结构域(ECD)的抗体，其具有KD值为1.0×10-8mol/l或更低，在一个实施例中KD值为1.0x10-9mol/l或更低，在一个实施例中KD值为1.0x10-9mol/l至1.0×10-13mol/l的结合亲和力。在该情境中，例如使用LAG3细胞外结构域，使用标准结合测定(诸如表面等离子体共振技术(GE-HealthcareUppsala，瑞典))来确定结合亲和力。术语“抗LAG3抗体”还涵盖能够结合LAG3和第二抗原的双特异性抗体。
“杵臼结构”技术描述于例如US 5,731,168；US 7,695,936；Ridgway等人，ProtEng 9，617-621(1996)和Carter，J Immunol Meth 248，7-15(2001)中。通常，该方法涉及在第一多肽的界面处引入突起(“杵”)并在第二多肽的界面中引入相应的空腔(“臼”)，使得该突起可以定位在该空腔中，以便促进异二聚体的形成并阻碍同二聚体的形成。突起是通过用较大侧链(例如酪氨酸或色氨酸)取代来自第一多肽的界面的小氨基酸侧链而构建的。具有与突起相同或相似大小的补偿空腔是通过用较小的氨基酸侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)取代大氨基酸侧链而在第二多肽的界面中创建的。凸起和空腔可以通过改变编码多肽的核酸(例如通过位点特异性诱变或通过肽合成)来制备。在具体实施例中，杵修饰包含Fc结构域的两个亚基中的一个中的氨基酸取代T366W，而臼修饰包含Fc结构域的两个亚基中的另一个中的氨基酸取代T366S、L368A和Y407V。在另一个具体实施例中，包含杵修饰的Fc结构域的亚基另外包含氨基酸取代S354C，而包含臼修饰的Fc结构域的亚基另外包含氨基酸取代Y349C。引入这两个半胱氨酸残基导致在Fc区的两个亚基之间形成二硫键，从而进一步稳定化二聚体(Carter,J Immunol Methods 248,7-15(2001))。
术语“效应子功能”是指可归因于抗体的Fc区、随着抗体同种型的变化而变化的那些生物活性。抗体效应子功能的实例包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)、Fc受体结合、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)、细胞因子分泌、免疫复合物介导的抗原呈递细胞的抗原摄取、下调细胞表面受体(例如B细胞受体)，以及B细胞激活。
“活化性Fc受体”是如下Fc受体，其在抗体的Fc区接合后，引起刺激携带受体的细胞执行效应功能的信号传导事件。活化性Fc受体包括FcγRIIIa(CD16a)、FcγRI(CD64)、FcγRIIa(CD32)和FcαRI(CD89)。特定的活化性Fc受体是人FcγRIIIa(参见UniProt登录号P08637，版本141)。
术语“肽接头”是指包含一个或多个氨基酸，通常约2至20个氨基酸的肽。肽接头是本领域中已知的或在本文中描述的。合适的非免疫原性接头肽为例如(G4S)n、(SG4)n或G4(SG4)n肽接头，其中“n”通常为介于1与10之间的数字，通常介于2与4之间，特别是2，即选自由以下项组成的组的肽：GGGGS(SEQ ID NO:46)、GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:47)、SGGGGSGGGG(SEQ ID NO:48)和GGGGSGGGGSGGGG(SEQ ID NO:49)，但还包括序列GSPGSSSSGS(SEQ IDNO：50)、(G4S)3(SEQ ID NO:51)、(G4S)4(SEQ ID NO:52)、GSGSGSGS(SEQ ID NO:53)、GSGSGNGS(SEQ ID NO:54)、GGSGSGSG(SEQ ID NO:55)、GGSGSG(SEQ ID NO:56)、GGSG(SEQID NO:57)、GGSGNGSG(SEQ ID NO:58)、GGNGSGSG(SEQ ID NO:59)和GGNGSG(SEQ ID NO:60)。特别感兴趣的肽接头是(G4S)(SEQ ID NO:46)、(G4S)2或GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:47)、(G4S)3(SEQ ID NO:51)和(G4S)4(SEQ ID NO:53)，更特别地是(G4S)2(SEQ ID NO:47)或GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:47)。
“融合至”或“连接至”是指部件(例如，抗原结合结构域和Fc结构域)直接地或经由一个或多个肽接头而通过肽键连接。
“VEGF拮抗剂”或“VEGF特异性拮抗剂”是指能够与VEGF结合、降低VEGF表达水平或者中和、阻断、抑制、消除、降低或干扰VEGF生物活性的分子，包括但不限于VEGF与一种或多种VEGF受体的结合、VEGF信号传导以及VEGF介导的血管生成和内皮细胞存活或增殖。例如，能够中和、阻断、抑制、消除、降低或干扰VEGF生物活性的分子可通过与一种或多种VEGF受体(VEGFR)(例如，VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3、膜结合VEGF受体(mbVEGFR)或可溶性VEGF受体(sVEGFR))来发挥其作用。此类拮抗剂在本文中也称为“VEGFR抑制剂”。作为可用于本发明的方法中的VEGF特异性拮抗剂，包括与VEGF特异性结合的多肽、抗VEGF抗体及其抗原结合片段、与VEGF特异性结合从而隔绝其与一种或多种受体的受体分子和衍生物、融合蛋白(例如，VEGF-Trap(Regeneron))以及VEGF121-多花白树毒蛋白(Peregrine))。VEGF特异性拮抗剂还包括VEGF多肽的拮抗剂变体、与编码VEGF多肽的核酸分子的至少一个片段互补的反义核碱基寡聚体；与编码VEGF多肽的核酸分子的至少一个片段互补的小RNA；靶向VEGF的核酶；针对VEGF的肽体；以及VEGF适体。VEGF拮抗剂还包括与VEGFR结合的多肽、抗VEGFR抗体(例如，贝伐单抗)及其抗原结合片段，以及与VEGFR结合从而阻断、抑制、消除、降低或干扰VEGF生物活性(例如，VEGF信号传导)的衍生物，或融合蛋白。VEGF特异性拮抗剂还包括与VEGF或VEGFR结合并且能够阻断、抑制、消除、降低或干扰VEGF生物活性的非肽小分子。因此，术语“VEGF生物活性”具体包括VEGF介导的VEGF生物活性。在某些实施例中，VEGF拮抗剂降低或抑制至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多的VEGF的表达水平或生物活性。在一些实施例中，受VEGF特异性拮抗剂抑制的VEGF为VEGF(8-109)、VEGF(1-109)或VEGF165。
如本文所用，VEGF拮抗剂可包括但不限于：抗VEGFR2抗体及相关分子(例如，雷莫芦单抗(ramucirumab)、他尼比鲁单抗(tanibirumab)、阿柏西普(阿柏西普))；抗VEGFR1抗体及相关分子(例如，伊克鲁单抗(icrucumab)、阿柏西普(VEGF Trap-Eye；)和ziv-阿柏西普(VEGF Trap；/>))；双特异性VEGF抗体(例如MP-0250、伐努赛珠单抗(vanucizumab)(VEGF-ANG2)和US2001/0236388中公开的双特异性抗体)；包括抗VEGF、抗VEGFR1和抗VEGFR2臂中的两者的组合的双特异性抗体；抗VEGFA抗体(例如，贝伐单抗(bevacizumab)、赛伐珠单抗(sevacizumab))；抗VEGFB抗体、抗VEGFC抗体(例如，VGX-100)、抗VEGFD抗体以及非肽小分子VEGF拮抗剂(例如，帕唑帕尼(pazopanib)、阿西替尼(axitinib)、凡德他尼(vandetanib)、Stivarga、卡博替尼(cabozantinib)、乐伐替尼(lenvatinib)、尼达尼布(nintedanib)、奥兰替尼(orantinib)、替拉替尼(telatinib)、多韦替尼(dovitinig)、西地尼布(cediranib)、莫特塞尼(motesanib)、索凡替尼(sulfatinib)、阿帕替尼(apatinib)、氟瑞替尼(foretinib)、法米替尼(famitinib)和替肟扎尼(tivozanib))。在一些示例中，VEGF拮抗剂可以是酪氨酸激酶抑制剂，包括受体酪氨酸激酶抑制剂(例如，多重靶向受体酪氨酸激酶抑制剂，诸如舒尼替尼或阿西替尼)。
“抗VEGF抗体”是以足够的亲和力和特异性与VEGF结合的抗体。在某些实施例中，抗体将对VEGF具有足够高的结合亲和力，例如，抗体可以以介于100nM至1pM之间的KD值结合hVEGF。抗体亲和力可例如通过基于表面等离子共振的测定法(诸如PCT申请公开号WO2005/012359中所述的测定法)、酶联免疫吸附试验(ELISA)和竞争测定法(例如放射免疫测定(RIA))来确定。
在某些实施例中，抗VEGF抗体可用作靶向和干扰VEGF活性参与其中的疾病或病症的治疗剂。而且，可以对抗体进行其他生物活性测定，例如，以评价其作为治疗剂的有效性。此类测定是本领域已知的，并且取决于靶抗原和抗体的预期用途。实例包括HUVEC抑制测定；肿瘤细胞生长抑制测定(例如，如WO 89/06692中所述)；抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和补体介导的细胞毒性(CDC)测定(美国专利号5,500,362)；以及激动活性或造血作用测定(参见WO 95/27062)。抗VEGF抗体通常不会与其他VEGF同源物(诸如VEGF-B或VEGF-C)结合，也不会与其他生长因子(诸如PlGF、PDGF或bFGF)结合。在一个实施例中，抗VEGF抗体是与由杂交瘤ATCC HB 10709产生的单克隆抗VEGF抗体A4.6.1结合至相同表位的单克隆抗体。在另一实施例中，抗VEGF抗体为根据Presta等人(Cancer Res.57:4593-4599,1997)生成的重组人源化抗VEGF单克隆抗体，包括但不限于称为贝伐单抗(BV；)的抗体。
抗VEGF抗体“贝伐单抗(BV)”也称为“rhuMAb VEGF”或为根据Presta等人(Cancer Res.57:4593-4599,1997)生成的重组人源化抗VEGF单克隆抗体。它包含突变的人IgG1框架区和来自鼠抗hVEGF单克隆抗体A.4.6.1的阻断人VEGF与其受体结合的抗原结合互补决定区。贝伐珠单抗的约93％的氨基酸序列，包括大部分框架区，来源于人IgG1，并且约7％的序列来源于鼠抗体A4.6.1。贝伐单抗具有约149,000道尔顿的分子量并且经糖基化。贝伐单抗和其他人源化抗VEGF抗体进一步描述于2005年2月26日授权的美国专利号6,884,879，其全部公开内容通过引用明确并入本文。
II.用于癌症的治疗方法和组合物
A.包括靶向PD-1和LAG3的双特异性抗体的方法
在一个方面，本公开提供了一种用于治疗患有癌症的受试者的方法，该方法包括向该受试者施用一个或多个给药周期的靶向程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)和淋巴细胞活化基因3(LAG3)的双特异性抗体，该双特异性抗体包含与PD-1特异性结合的第一抗原结合结构域和与LAG3特异性结合的第二抗原结合结构域，其中该方法包括向该受试者每三周以约600mg的固定剂量(例如，600mg的固定剂量)施用该双特异性抗体。
下文第VIII节提供了靶向PD-1和LAG3的示例性双特异性抗体。靶向PD-1和LAG3的双特异性抗体的具体示例是如本文定义的PD1-LAG3。
最近，瑞拉利单抗和纳武单抗的组合在患有先前未经治疗的转移性或不可切除的黑素瘤的患者中提供了PD-1和LAG3双重抑制的临床概念验证(Tawbi等人,N Engl J Med,386(1):24-34,2022)。通过靶向功能障碍的肿瘤特异性T淋巴细胞上的PD-1和LAG-3二者，靶向PD-1和LAG3的双特异性抗体旨在恢复有效的抗肿瘤免疫应答，并相比于目前可用的检查点抑制剂为癌症患者提供甚至更多的存活益处。通过优先靶向PD-1/LAG-3共表达功能障碍的T细胞并可能减少对肿瘤微环境中表达LAG-3的Treg的靶向，靶向PD-1和LAG3的双特异性抗体可能避免重新激活Treg介导的免疫抑制作用，同时恢复抗肿瘤免疫应答。
在一些方面，一个或多个给药周期中的每一个的长度为21天。在一些方面，该方法包括在一个或多个给药周期中的每一个的第1天向受试者施用(例如，静脉内施用)双特异性抗体。
癌症可以为实体瘤(例如，具有包含表达LAG3的CD8+T细胞的肿瘤微环境的实体瘤)。例如，在一些方面，癌症可以为皮肤癌(例如，黑素瘤)、肝癌(例如，肝细胞癌(HCC))、肺癌(例如，非小细胞肺癌(NSCLC))、肾脏癌、肾癌(例如，肾细胞癌(RCC))、膀胱癌(例如，转移性尿路上皮癌(mUC))、乳腺癌(例如，三阴性乳腺癌(TNBC))、食管癌(例如，食管鳞状细胞癌(ESCC))、胰腺癌、***、头颈部癌、胃癌、结直肠癌或卵巢癌。在一些方面，癌症为皮肤癌(例如，黑素瘤)、肝癌(例如，HCC)、肺癌(例如，NSCLC)、肾脏癌、肾癌(例如，RCC)、膀胱癌(例如，mUC)、乳腺癌(例如，TNBC)或食管癌(例如，ESCC)。癌症可能是局部晚期的或转移性的。
在皮肤癌是黑素瘤的方面，黑素瘤可以是例如先前未经治疗的不可切除或转移性黑素瘤(例如，根据美国癌症联合委员会(AJCC)分期***经组织学证实的不可切除或转移性黑素瘤(不可切除的III期或IV期))。在一些方面，黑素瘤为(a)具有可测量的***转移的III期黑素瘤；(b)不可切除的III期黑素瘤；或(c)IV期黑素瘤。在一些方面，黑素瘤不是粘膜黑素瘤或葡萄膜黑素瘤。
在一些方面，受试者先前未接受过全身性抗癌疗法。
在一些方面，受试者先前未用包括免疫调节剂的抗癌疗法治疗，例如，未用包含检查点抑制剂(CPI)的抗癌剂治疗，例如，未用抗程序性死亡配体1(PD-L1)/PD-1药剂或未用抗细胞毒性T淋巴细胞相关抗原(CTLA-4)药剂治疗。在其他方面，受试者先前已经用免疫调节剂(例如，CPI)作为辅助或新辅助疗法进行治疗。
在一些方面，受试者先前未针对转移性或不可切除的疾病进行治疗。
在一些方面，受试者先前未用抗LAG3疗法治疗。
在一些方面，双特异性抗体在肿瘤中实现至少90％LAG3受体占有率(RO)，例如，在肿瘤中实现至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％RO。
在一些方面，受试者为人。
B.包括靶向PD-1和LAG3的双特异性抗体和贝伐单抗的方法
在一些方面，该方法进一步包括向受试者施用(例如，静脉内施用)VEGF拮抗剂，例如，抗VEGF抗体(例如，贝伐单抗)。示例性VEGF拮抗剂在下文第IX节中提供。
在一些方面，VEGF拮抗剂在靶向PD-1和LAG3的双特异性抗体之前施用。在其他方面，VEGF拮抗剂在靶向PD-1和LAG3的双特异性抗体之后施用。在又进一步的方面，同时施用VEGF拮抗剂和靶向PD-1和LAG3的双特异性抗体。
在一些方面，该方法包括向受试者每三周以约15mg/kg的剂量(例如，15mg/kg的剂量)施用VEGF拮抗剂(例如，贝伐单抗)。
在一些方面，一个或多个给药周期中的每一个的长度为21天并且该方法包括在一个或多个给药周期中的每一个的第1天向受试者施用VEGF拮抗剂(例如，贝伐单抗)。
因此，在一个方面，本公开提供了一种用于治疗患有癌症的受试者的方法，该方法包括向该受试者施用一个或多个给药周期的(1)靶向PD-1和LAG3的双特异性抗体，其包含与PD-1特异性结合的第一抗原结合结构域和与LAG3特异性结合的第二抗原结合结构域(例如，下文第VIII节中提供的靶向PD-1和LAG3的双特异性抗体)和(2)VEGF拮抗剂(例如，贝伐单抗)，其中该方法包括每三周以600mg的固定剂量向该受试者施用双特异性抗体和每三周以15mg/kg的剂量施用VEGF拮抗剂。
在其他方面，该方法进一步包括每两周以约10mg/kg的剂量(例如，10mg/kg的剂量)向受试者施用VEGF拮抗剂(例如，贝伐单抗)。在一些方面，一个或多个给药周期中的每一个的长度为28天并且该方法包括在一个或多个给药周期中的每一个的第1天和第15天向受试者施用VEGF拮抗剂(例如，贝伐单抗)。
在另一方面，本公开提供了一种用于在治疗患有癌症的受试者的方法中使用的靶向PD-1和LAG3的双特异性抗体(例如，用于上述方法中任一种的靶向PD-1和LAG3的双特异性抗体)，其中该双特异性抗体包含与PD-1特异性结合的第一抗原结合结构域和与LAG3特异性结合的第二抗原结合结构域，并且其中该方法包括每三周以600mg的固定剂量向该受试者施用该双特异性抗体。靶向PD-1和LAG3的双特异性抗体的具体示例是如本文定义的PD1-LAG3。
在另一方面，本公开提供了靶向PD-1和LAG3的双特异性抗体在制造用于治疗患有癌症的受试者的药物中的用途，其中该双特异性抗体包含与PD-1特异性结合的第一抗原结合结构域和与LAG3特异性结合的第二抗原结合结构域，并且其中该双特异性抗体待每三周以600mg的固定剂量向该受试者施用。
C.包括靶向PD-1和LAG3的双特异性抗体和抗TIGIT拮抗剂抗体的方法
在一些方面，该方法进一步包括向受试者施用(例如，静脉内施用)抗TIGIT拮抗剂抗体(例如，替瑞利尤单抗)。
示例性抗TIGIT拮抗剂抗体在下文第VII节中提供。
在一些方面，抗TIGIT拮抗剂抗体在靶向PD-1和LAG3的双特异性抗体之前施用。在其他方面，抗TIGIT拮抗剂抗体在靶向PD-1和LAG3的双特异性抗体之后施用。在又进一步的方面，同时施用抗TIGIT拮抗剂抗体以及靶向PD-1和LAG3的双特异性抗体。
在一些方面，该方法包括向受试者每三周以约600mg的固定剂量(例如，600mg的固定剂量)施用抗TIGIT拮抗剂抗体(例如，替瑞利尤单抗)。
在一些方面，一个或多个给药周期中的每一个的长度为21天并且该方法包括在一个或多个给药周期中的每一个的大约第1天(例如，第1天)向受试者施用抗TIGIT拮抗剂抗体。
因此，在一个方面，本公开提供了一种用于治疗患有癌症的受试者的方法，该方法包括向该受试者施用一个或多个给药周期的(1)靶向PD-1和LAG3的双特异性抗体，其包含与PD-1特异性结合的第一抗原结合结构域和与LAG3特异性结合的第二抗原结合结构域(例如，下文第VIII节中提供的靶向PD-1和LAG3的双特异性抗体，特别是本文定义的PD1-LAG3)和(2)抗TIGIT拮抗剂抗体(例如，替瑞利尤单抗)，其中该方法包括每三周以600mg的固定剂量向该受试者施用双特异性抗体和每三周以600mg的固定剂量施用抗TIGIT拮抗剂抗体。
III.用于肝癌的治疗方法和组合物
A.包括靶向PD-1和LAG3的双特异性抗体的方法
在一个方面，本公开提供了一种用于治疗患有肝癌的受试者的方法，该方法包括向该受试者施用一个或多个给药周期的靶向程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)和淋巴细胞活化基因3(LAG3)的双特异性抗体，该双特异性抗体包含与PD-1特异性结合的第一抗原结合结构域和与LAG3特异性结合的第二抗原结合结构域，其中该方法包括每三周以约600mg的固定剂量(例如，600mg的固定剂量)向该受试者施用该双特异性抗体。
下文第VIII节提供了靶向PD-1和LAG3的示例性双特异性抗体。靶向PD-1和LAG3的双特异性抗体的具体示例是如本文定义的PD1-LAG3。
在另一方面，本公开提供了一种用于治疗患有肝癌的受试者的方法，该方法包括向该受试者施用一个或多个给药周期的靶向PD-1和LAG3的双特异性抗体，该双特异性抗体包含与PD-1特异性结合的第一抗原结合结构域和与LAG3特异性结合的第二抗原结合结构域，其中该方法包括每三周以1200mg的固定剂量向该受试者施用该双特异性抗体。
在一些方面，一个或多个给药周期中的每一个的长度为21天。在一些方面，该方法包括在一个或多个给药周期中的每一个的第1天向受试者施用(例如，静脉内施用)双特异性抗体。
在又一方面，本公开提供了一种用于治疗患有肝癌的受试者的方法，该方法包括向该受试者施用一个或多个给药周期的靶向PD-1和LAG3的双特异性抗体，该双特异性抗体包含与PD-1特异性结合的第一抗原结合结构域和与LAG3特异性结合的第二抗原结合结构域，其中该方法包括每两周以2100mg的固定剂量向该受试者施用该双特异性抗体。
在一些方面，一个或多个给药周期中的每一个的长度为28天。在一些方面，该方法包括在一个或多个给药周期中的每一个的第1天和第15天向受试者施用(例如，静脉内施用)双特异性抗体。
在一些方面，肝癌为肝细胞癌(HCC)。在一些方面，肝癌(例如，HCC)具有包括表达LAG3的CD8+T细胞的肿瘤微环境。HCC可以是例如局部晚期、转移性和/或不可切除的。
在一些方面，受试者先前未接受过全身性抗癌疗法。
在一些方面，受试者先前未用包括免疫调节剂的抗癌疗法治疗，例如，未用包含检查点抑制剂(CPI)的抗癌剂治疗，例如，未用抗程序性死亡配体1(PD-L1)/PD-1药剂或未用抗细胞毒性T淋巴细胞相关抗原(CTLA-4)药剂治疗。在其他方面，受试者先前已经用免疫调节剂(例如，CPI)作为辅助或新辅助疗法进行治疗。
在一些方面，受试者先前未针对转移性或不可切除的疾病进行治疗。
在一些方面，受试者先前未用抗LAG3疗法治疗。
在一些方面，双特异性抗体在肿瘤中实现至少90％LAG3受体占有率(RO)，例如，在肿瘤中实现至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％RO。
在一些方面，受试者为人。
B.包括靶向PD-1和LAG3的双特异性抗体和贝伐单抗的方法
在一些方面，该方法进一步包括向受试者施用(例如，静脉内施用)VEGF拮抗剂，例如，抗VEGF抗体(例如，贝伐单抗)。示例性VEGF拮抗剂在下文第IX节中提供。
在一些方面，抗TIGIT拮抗剂抗体在靶向PD-1和LAG3的双特异性抗体之前施用。在其他方面，抗TIGIT拮抗剂抗体在靶向PD-1和LAG3的双特异性抗体之后施用。在又进一步的方面，同时施用抗TIGIT拮抗剂抗体以及靶向PD-1和LAG3的双特异性抗体。
在一些方面，该方法包括向受试者每三周以约15mg/kg的剂量(例如，15mg/kg的剂量)施用VEGF拮抗剂(例如，贝伐单抗)。
在一些方面，一个或多个给药周期中的每一个的长度为21天并且该方法包括在一个或多个给药周期中的每一个的第1天向受试者施用VEGF拮抗剂(例如，贝伐单抗)。
因此，在一个方面，本公开提供了一种用于治疗患有肝癌的受试者的方法，该方法包括向该受试者施用一个或多个给药周期的(1)靶向PD-1和LAG3的双特异性抗体，其包含与PD-1特异性结合的第一抗原结合结构域和与LAG3特异性结合的第二抗原结合结构域(例如，下文第VIII节中提供的靶向PD-1和LAG3的双特异性抗体，并且特别是PD1-LAG3)和(2)VEGF拮抗剂，其中该方法包括每三周以600mg的固定剂量向该受试者施用双特异性抗体和每三周以15mg/kg的剂量施用VEGF拮抗剂。
在另一个方面，本公开提供了一种用于治疗患有肝癌的受试者的方法，该方法包括向该受试者施用一个或多个给药周期的(1)靶向PD-1和LAG3的双特异性抗体，其包含与PD-1特异性结合的第一抗原结合结构域和与LAG3特异性结合的第二抗原结合结构域(例如，下文第VIII节中提供的靶向PD-1和LAG3的双特异性抗体)和(2)VEGF拮抗剂，其中该方法包括每三周以1200mg的固定剂量向该受试者施用双特异性抗体和每三周以15mg/kg的剂量向该受试者施用VEGF拮抗剂。
在其他方面，该方法进一步包括每两周以约10mg/kg的剂量(例如，10mg/kg的剂量)向受试者施用VEGF拮抗剂(例如，贝伐单抗)。在一些方面，一个或多个给药周期中的每一个的长度为28天并且该方法包括在一个或多个给药周期中的每一个的第1天和第15天向受试者施用VEGF拮抗剂(例如，贝伐单抗)。
因此，在另一个方面，本公开提供了一种用于治疗患有肝癌的受试者的方法，该方法包括向该受试者施用一个或多个给药周期的(1)靶向PD-1和LAG3的双特异性抗体，其包含与PD-1特异性结合的第一抗原结合结构域和与LAG3特异性结合的第二抗原结合结构域(例如，下文第VIII节中提供的靶向PD-1和LAG3的双特异性抗体)和(2)VEGF拮抗剂(例如，贝伐单抗)，其中该方法包括每两周以2100mg的固定剂量向该受试者施用双特异性抗体和每两周以10mg/kg的剂量向该受试者施用VEGF拮抗剂。
IV.用于黑素瘤的治疗方法和组合物
A.包括抗TIGIT拮抗剂抗体和靶向PD-1和LAG3的双特异性抗体的方法
在一个方面，本公开提供了一种用于治疗患有黑素瘤的受试者的方法，该方法包括向该受试者施用抗TIGIT拮抗剂抗体和靶向PD-1和LAG3的双特异性抗体，该双特异性抗体包含与靶向程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)特异性结合的第一抗原结合结构域和与淋巴细胞活化基因3(LAG3)特异性结合的第二抗原结合结构域。在一些实施例中，以包括一个或多个给药周期的给药方案向受试者施用抗TIGIT拮抗剂抗体和双特异性抗体。
在一些方面，该方法包括向受试者(a)每三周以约600mg的固定剂量(例如，600mg的固定剂量)施用抗TIGIT拮抗剂抗体；和(b)每三周以约2100mg的固定剂量(例如，2100mg的固定剂量)施用双特异性抗体。
在特定方面，该方法包括向受试者(a)每三周以约600mg的固定剂量(例如，600mg的固定剂量)施用抗TIGIT拮抗剂抗体；和(b)每三周以约600mg的固定剂量(例如，600mg的固定剂量)施用双特异性抗体。
在另一个方面，本公开提供了一种用于治疗患有黑素瘤的受试者的方法，该方法包括向该受试者施用一个或多个给药周期的靶向PD-1和LAG3的双特异性抗体，该双特异性抗体包含与PD-1特异性结合的第一抗原结合结构域和与LAG3特异性结合的第二抗原结合结构域(例如，下文第VIII节中提供的靶向PD-1和LAG3的双特异性抗体，并且特别是PD1-LAG3)，其中该方法包括每三周以600mg的固定剂量向该受试者施用双特异性抗体，并且其中黑素瘤为：(a)不可切除的III期黑素瘤；或(b)IV期黑素瘤(例如，根据美国癌症联合委员会(AJCC)分期***经组织学证实的不可切除或转移性黑素瘤(不可切除的III期或IV期))。
在一些方面，一个或多个给药周期中的每一个的长度为21天。在一些方面，该方法包括在一个或多个给药周期中的每一个的约第1天(例如，第1天)向受试者施用抗TIGIT拮抗剂抗体和双特异性抗体。
在一些方面，该方法包括在抗TIGIT拮抗剂抗体之前向受试者施用双特异性抗体。在其他方面，该方法包括在双特异性抗体之前向受试者施用抗TIGIT拮抗剂抗体。
在一些方面，该方法包括向受试者静脉内施用双特异性抗体和抗TIGIT拮抗剂抗体。
i.新辅助疗法
在一些方面，一个或多个给药周期作为新辅助疗法施用。
在一些方面，抗TIGIT拮抗剂抗体以及靶向PD-1和LAG3的双特异性抗体作为新辅助疗法施用。
在一些方面，黑素瘤是具有可测量的***转移的III期黑素瘤。
在一些方面，受试者在开始治疗之前的六个月内没有发生移行转移。
在一些方面，受试者先前未用癌症免疫疗法治疗。
在一些方面，黑素瘤不是粘膜黑素瘤或葡萄膜黑素瘤。
在一些方面，第一给药周期在手术前启动。
在一些方面，至少一个给药周期(例如，一个、两个、三个、四个或多于四个给药周期)或至少两个给药周期(例如，两个、三个、四个或多于四个给药周期)均在手术前完成。在一些方面，两个给药周期在手术前完成。
在一些方面，手术在最后一个给药周期后约一周内进行。
在一些方面，手术是完全***清扫术(CLND)。
在一些方面，治疗引起病理学缓解率(pRR)与参考pRR相比增加。在一些方面，参考pRR是已接受对照疗法的受试者群体的pRR。在一些方面，对照疗法是包括抗TIGIT拮抗剂抗体且不包括靶向PD-1和LAG3的双特异性抗体的疗法；包括靶向PD-1和LAG3的双特异性抗体且不包括抗TIGIT拮抗剂抗体的疗法；或包括伊匹单抗和纳武单抗的疗法。
在一些方面，治疗引起无事件存活期(EFS)与参考EFS相比增加；无复发存活期(RFS)与参考RFS相比增加；总存活期(OS)与参考OS相比增加；和/或总缓解率(ORR)与参考ORR相比增加。在一些方面，参考EFS、RFS、OS或ORR是已接受对照疗法的受试者群体的EFS、RFS、OS或ORR。在一些方面，对照疗法是包括抗TIGIT拮抗剂抗体且不包括靶向PD-1和LAG3的双特异性抗体的疗法；包括靶向PD-1和LAG3的双特异性抗体且不包括抗TIGIT拮抗剂抗体的疗法；或包括伊匹单抗和纳武单抗的疗法。
ii.IV期黑素瘤的治疗
在一些方面，黑素瘤为IV期黑素瘤。
在一些方面，(a)受试者已接受不超过两种前线全身性治疗；或(b)黑素瘤是BRAF突变型黑素瘤，并且受试者已接受不超过三种前线全身性治疗。
在一些方面，该治疗导致总缓解率(ORR)与参考ORR相比增加。在一些方面，参考ORR是已接受(a)包括靶向PD-1和LAG3的双特异性抗体且不包括抗TIGIT拮抗剂抗体的治疗；和/或(b)包括抗TIGIT拮抗剂抗体且不包括靶向PD-1和LAG3的双特异性抗体的治疗的受试者群体的ORR。
在一些方面，与参考PFS相比，治疗导致无进展存活期(PFS)增加；与参考DOR相比，缓解持续时间(DOR)增加；与参考OS相比，OS增加；与参考DCR相比，疾病控制率(DCR，例如，疾病稳定12周或更长时间、完全缓解(CR)或部分缓解(PR))增加。在一些方面，参考PFS、OS、DOR或DCR是已接受对照疗法的受试者群体的PFS、OS、DOR或DCR。在一些方面，对照疗法是包括抗TIGIT拮抗剂抗体且不包括靶向PD-1和LAG3的双特异性抗体的疗法；包括靶向PD-1和LAG3的双特异性抗体且不包括抗TIGIT拮抗剂抗体的疗法；或包括伊匹单抗和纳武单抗的疗法。
在一些方面，受试者为人。
B.包括靶向PD-1和LAG3的双特异性抗体的方法
在另一个方面，本公开的特征在于一种用于治疗患有黑素瘤的受试者的方法，该方法包括向该受试者施用靶向PD-1和LAG3的双特异性抗体，该双特异性抗体包含与PD-1特异性结合的第一抗原结合结构域和与LAG3特异性结合的第二抗原结合结构域。在一些实施例中，以包括一个或多个给药周期的给药方案向受试者施用双特异性抗体。在一些实施例中，一个或多个给药周期作为新辅助疗法施用。
在一些方面，该方法包括向受试者每三周以约2100mg的固定剂量(例如，2100mg的固定剂量)施用双特异性抗体。
在特定方面，该方法包括向受试者每三周以约600mg的固定剂量(例如，600mg的固定剂量)施用双特异性抗体。
在一些方面，一个或多个给药周期中的每一个的长度为21天。在一些方面，该方法包括在一个或多个给药周期中的每一个的约第1天(例如，第1天)向受试者施用双特异性抗体。
在一些方面，该方法包括向受试者静脉内施用双特异性抗体。
在一些方面，黑素瘤是具有可测量的***转移的III期黑素瘤。
在一些方面，受试者在开始治疗之前的六个月内没有发生移行转移。
在一些方面，受试者先前未用癌症免疫疗法治疗。
在一些方面，黑素瘤不是粘膜黑素瘤或葡萄膜黑素瘤。
在一些方面，第一给药周期在手术前启动。
在一些方面，至少一个给药周期(例如，一个、两个、三个、四个或多于四个给药周期)或至少两个给药周期(例如，两个、三个、四个或多于四个给药周期)均在手术前完成。在一些方面，两个给药周期在手术前完成。
在一些方面，手术在最后一个给药周期后约一周内进行。
在一些方面，手术是完全***清扫术(CLND)。
在一些方面，治疗引起病理学缓解率(pRR)与参考pRR相比增加。在一些方面，参考pRR是已接受对照疗法的受试者群体的pRR。在一些方面，对照疗法是包括伊匹单抗和纳武单抗的疗法。
在一些方面，治疗引起无事件存活期(EFS)与参考EFS相比增加；无复发存活期(RFS)与参考RFS相比增加；总存活期(OS)与参考OS相比增加；和/或总缓解率(ORR)与参考ORR相比增加。在一些方面，参考EFS、RFS、OS或ORR是已接受对照疗法的受试者群体的EFS、RFS、OS或ORR。在一些方面，对照疗法是包括伊匹单抗和纳武单抗的疗法。
在一些方面，受试者为人。
C.包括抗TIGIT拮抗剂抗体和PD-1轴结合拮抗剂的方法
在另一个方面，本公开的特征在于一种用于治疗患有黑素瘤的受试者的方法，该方法包括向该受试者施用一个或多个给药周期的抗TIGIT拮抗剂抗体和PD-1轴结合拮抗剂，其中一个或多个给药周期作为新辅助疗法施用。在另一个方面，本公开的特征在于一种用于治疗患有黑素瘤的受试者的方法，该方法包括向该受试者施用抗TIGIT拮抗剂抗体和PD-1轴结合拮抗剂，其中该抗TIGIT拮抗剂抗体和PD-1轴结合拮抗剂作为新辅助疗法施用。
在一些方面，该方法包括向受试者(a)每三周以约600mg的固定剂量(例如，600mg的固定剂量)施用抗TIGIT拮抗剂抗体；和(b)每三周以约600mg的固定剂量(例如，600mg的固定剂量)施用PD-1轴结合拮抗剂。
在一些方面，一个或多个给药周期中的每一个的长度为21天。
在一些方面，该方法包括在一个或多个给药周期中的每一个的约第1天(例如，第1天)向受试者施用抗TIGIT拮抗剂抗体和PD-1轴结合拮抗剂。
在一些方面，该方法包括在抗TIGIT拮抗剂抗体之前向受试者施用PD-1轴结合拮抗剂。在一些方面，该方法包括在PD-1轴结合拮抗剂之前向受试者施用抗TIGIT拮抗剂抗体。
在一些方面，该方法包括向受试者静脉内施用PD-1轴结合拮抗剂和抗TIGIT拮抗剂抗体。
在一些方面，黑素瘤是具有可测量的***转移的III期黑素瘤。
在一些方面，受试者在开始治疗之前的六个月内没有发生移行转移。
在一些方面，受试者先前未用癌症免疫疗法治疗。
在一些方面，黑素瘤不是粘膜黑素瘤或葡萄膜黑素瘤。
在一些方面，第一给药周期在手术前启动。
在一些方面，至少一个给药周期(例如，一个、两个、三个、四个或多于四个给药周期)或至少两个给药周期(例如，两个、三个、四个或多于四个给药周期)均在手术前完成。在一些方面，两个给药周期在手术前完成。
在一些方面，手术在最后一个给药周期后约一周内进行。
在一些方面，手术是完全***清扫术(CLND)。
在一些方面，治疗引起病理学缓解率(pRR)与参考pRR相比增加。在一些方面，参考pRR是已接受对照疗法的受试者群体的pRR。在一些方面，对照疗法是包括抗TIGIT拮抗剂且不包括PD-1轴结合拮抗剂的疗法；包括PD-1轴结合拮抗剂且不包括抗TIGIT拮抗剂抗体的疗法；或包括伊匹单抗和纳武单抗的疗法。
在一些方面，治疗引起无事件存活期(EFS)与参考EFS相比增加；无复发存活期(RFS)与参考RFS相比增加；总存活期(OS)与参考OS相比增加；和/或总缓解率(ORR)与参考ORR相比增加。在一些方面，参考EFS、RFS、OS或ORR是已接受对照疗法的受试者群体的EFS、RFS、OS或ORR。在一些方面，对照疗法是包括抗TIGIT拮抗剂且不包括PD-1轴结合拮抗剂的疗法；包括PD-1轴结合拮抗剂且不包括抗TIGIT拮抗剂抗体的疗法；或包括伊匹单抗和纳武单抗的疗法。
在一些方面，受试者为人。
D.用于在治疗黑素瘤的方法中使用的药剂
i.靶向PD-1和LAG3的双特异性抗体
靶向PD-1和LAG3的双特异性抗体及其给药方案的更多示例在下文第VIII节中提供。靶向PD-1和LAG3的双特异性抗体的具体示例是如本文定义的PD1-LAG3。
ii.抗TIGIT拮抗剂抗体
示例性抗TIGIT拮抗剂抗体及其给药方案在下文第VII节中提供。
iii.PD-1轴结合拮抗剂
示例性的PD-1轴结合拮抗剂及其给药方案在下文第X节中提供。
V.PD-L1表达的评定
可以评定根据本文所述的供使用的任何方法和组合物治疗的受试者中的PD-L1的表达。该方法和供使用的组合物可以包括确定从患有癌症(例如，食管癌(例如，转移性食管癌))的受试者获得的生物样品(例如，肿瘤样品)中PD-L1的表达水平。在其他实例中，从受试者获得的生物样品(例如，肿瘤样品)中的PD-L1表达水平已经在治疗启动之前或治疗启动之后确定。PD-L1表达可以使用任何合适的方法来确定。例如，PD-L1表达可以如美国专利申请号15/787,988和15/790,680中所述来确定。可使用任何合适的肿瘤样品，例如，***固定且石蜡包埋的(FFPE)肿瘤样品、存档肿瘤样品、新鲜肿瘤样品或冷冻肿瘤样品。
例如，PD-L1表达可以根据表达可检测的PD-L1表达水平的肿瘤浸润性免疫细胞所占据的肿瘤样品的百分比来确定，作为肿瘤样品中表达可检测的PD-L1表达水平的肿瘤浸润性免疫细胞的百分比，和/或作为肿瘤样品中表达可检测PD-L1表达水平的肿瘤细胞的百分比。应当理解，在任何前述实例中，肿瘤浸润性免疫细胞所占据的肿瘤样品的百分比可以是肿瘤浸润性免疫细胞在从受试者获得的肿瘤样品的切片中覆盖的肿瘤面积的百分比，例如，如通过IHC使用抗PD-L1抗体(例如SP142抗体)所评定。可以使用任何合适的抗PD-L1抗体，包括例如SP142(Ventana)、SP263(Ventana)、22C3(Dako)、28-8(Dako)、E1L3N(CellSignaling Technology)、4059(ProSci,Inc.)、h5H1(Advanced Cell Diagnostics)和9A11。在一些示例中，抗PD-L1抗体为SP142。在其他示例中，抗PD-L1抗体为SP263。
在一些实例中，从受试者获得的肿瘤样品在肿瘤样品中小于1％的肿瘤细胞中、在肿瘤样品中1％或更多的肿瘤细胞中、在肿瘤样品中1％至小于5％的肿瘤细胞中、在肿瘤样品中5％或更多的肿瘤细胞中、在肿瘤样品中5％至小于50％的肿瘤细胞中或在肿瘤样品中50％或更多的肿瘤细胞中具有可检测的PD-L1表达水平。
在一些实例中，从受试者获得的肿瘤样品在肿瘤浸润免疫细胞中具有可检测的PD-L1表达水平，该肿瘤浸润免疫细胞占据小于1％的肿瘤样品、超过1％的肿瘤样品、1％到小于5％的肿瘤样品、大于5％的肿瘤样品、5％到小于10％的肿瘤样品或大于10％的肿瘤样品。
在一些方面，根据本文提供的方法中的任一种治疗的受试者的食管癌具有<5％的PD-L1阳性肿瘤细胞(TC)分数或肿瘤浸润免疫细胞(IC)分数。在一些方面，食管癌具有<1％的PD-L1阳性TC分数。在其他方面，根据本文提供的方法中的任一种治疗的受试者的食管癌具有≥5％的PD-L1阳性TC分数或IC分数。在一些方面，使用Ventana SP142 IHC测定、Ventana SP263 IHC测定、pharmDx 22C3 IHC测定或pharmDx 28-8 IHC测定来检测PD-L1。
在一些实施例中，可以分别根据表2和/或表3中所示的诊断评定标准针对在肿瘤浸润性免疫细胞和/或肿瘤细胞中的PD-L1阳性对肿瘤样品进行评分。
表2.肿瘤浸润免疫细胞(IC)IHC诊断标准
表3.肿瘤细胞(TC)IHC诊断标准
VI.TIGIT表达的评定
可以在患有癌症(例如，食管癌(例如，转移性食管癌))的受试者中评定TIGIT的表达水平，该受试者已经根据本文所述的方法、用途和供使用的组合物中的任一种进行治疗。该方法、用途和供使用的组合物可以包括确定从受试者获得的生物样品(例如，肿瘤样品)中TIGIT的表达水平。在其他实例中，从受试者获得的生物样品(例如，肿瘤样品)中的TIGIT表达水平已经在治疗启动之前或治疗启动之后确定。TIGIT表达可以使用任何合适的方法来确定。可使用任何合适的肿瘤样品，例如，***固定且石蜡包埋的(FFPE)肿瘤样品、存档肿瘤样品、新鲜肿瘤样品或冷冻肿瘤样品。
例如，TIGIT表达可以根据表达可检测的TIGIT表达水平的肿瘤浸润性免疫细胞所占据的肿瘤样品的百分比来确定，作为肿瘤样品中表达可检测的TIGIT表达水平的肿瘤浸润性免疫细胞的百分比，和/或作为肿瘤样品中表达可检测TIGIT表达水平的肿瘤细胞的百分比。应当理解，在任何前述实例中，肿瘤浸润性免疫细胞所占据的肿瘤样品的百分比可以是肿瘤浸润性免疫细胞在从受试者获得的肿瘤样品的切片中覆盖的肿瘤面积的百分比，例如，如通过IHC使用抗TIGIT拮抗剂抗体所评定。可以使用任何合适的抗TIGIT拮抗剂抗体。在一些实例中，抗TIGIT拮抗剂抗体为10A7(WO 2009/126688A3；美国专利号：9499596)。
VII.抗TIGIT拮抗剂抗体
本发明提供可用于治疗患有癌症的受试者(例如，人)的癌症的抗TIGIT拮抗剂抗体。
在一些情况下，抗TIGIT拮抗剂抗体为替瑞利尤单抗(CAS登记号：1918185-84-8)。替瑞利尤单抗(基因泰克公司)也称为MTIG7192A。
在某些情况下，抗TIGIT拮抗剂抗体包括至少一个、两个、三个、四个、五个或六个选自以下项的HVR：(a)HVR-H1，其包含SNSAAWN(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列；(b)HVR-H2，其包含KTYYRFKWYSDYAVSVKG(SEQ ID NO:2)的氨基酸序列；(c)HVR-H3，其包含ESTTYDLLAGPFDY(SEQ ID NO:3)的氨基酸序列；(d)HVR-L1，其包含KSSQTVLYSSNNKKYLA(SEQID NO:4)的氨基酸序列，(e)HVR-L2，其包含WASTRES(SEQ ID NO:5)的氨基酸序列；和/或(f)HVR-L3，其包含QQYYSTPFT(SEQ ID NO:6)的氨基酸序列，或上述HVR中的一个或多个与其一个或多个变体的组合，该变体与SEQ ID NO:1-6中的任一者具有至少约90％序列同一性(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性)。
在一些情况下，抗TIGIT拮抗剂抗体可以包括(a)HVR-H1，其包含SNSAAWN(SEQ IDNO:1)的氨基酸序列；(b)HVR-H2，其包含KTYYRFKWYSDYAVSVKG(SEQ ID NO:2)的氨基酸序列；(c)HVR-H3，其包含ESTTYDLLAGPFDY(SEQ ID NO:3)的氨基酸序列；(d)HVR-L1，其包含KSSQTVLYSSNNKKYLA(SEQ ID NO:4)的氨基酸序列；(e)HVR-L2，其包含WASTRES(SEQ ID NO:5)的氨基酸序列；和(f)HVR-L3，其包含QQYYSTPFT(SEQ ID NO:6)的氨基酸序列。在一些情况下，抗TIGIT拮抗剂抗体具有VH结构域，其包含与EVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNSAAWNWIRQSPSRGLEWLGKTYYRFKWYSDYAVSVKGRITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVFYCTRESTTYDLLAGPFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:17)的序列具有至少90％序列同一性(例如，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列，或EVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNSAAWNWIRQSPSRGLEWLGKTYYRFKWYSDYAVSVKGRITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVFYCTRESTTYDLLAGPFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:17)的序列，或者与QVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNSAAWNWIRQSPSRGLEWLGKTYYRFKWYSDYAVSVKGRITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVFYCTRESTTYDLLAGPFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:18)的序列具有至少90％序列同一性(例如，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列，或QVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNSAAWNWIRQSPSRGLEWLGKTYYRFKWYSDYAVSVKGRITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVFYCTRESTTYDLLAGPFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:18)的序列；和/或VL结构域，其包含与DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQTVLYSSNNKKYLAWYQQKPGQPPNLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYSTPFTFGPGTKVEIK(SEQ ID NO:19)的序列具有至少90％序列同一性(例如，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列，或DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQTVLYSSNNKKYLAWYQQKPGQPPNLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYSTPFTFGPGTKVEIK(SEQID NO:19)的序列。在一些情况下，抗TIGIT拮抗剂抗体具有VH结构域，其包含与SEQ ID NO:17的序列具有至少90％序列同一性(例如，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列，或SEQ ID NO:17的序列；和/或VL结构域，其包含与SEQ ID NO:19的序列具有至少90％序列同一性(例如，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列，或SEQ ID NO:19的序列。在一些情况下，抗TIGIT拮抗剂抗体具有VH结构域，其包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列；以及VL结构域，其包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列。在一些情况下，抗TIGIT拮抗剂抗体具有VH结构域，其包含与SEQ ID NO:18的序列具有至少90％序列同一性(例如，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列，或SEQ ID NO:18的序列；和/或VL结构域，其包含与SEQ ID NO:19的序列具有至少90％序列同一性(例如，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列，或SEQ ID NO:19的序列。在一些情况下，抗TIGIT拮抗剂抗体具有VH结构域，其包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列；以及VL结构域，其包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列。
在一些情况下，抗TIGIT拮抗剂抗体包括重链和轻链序列，其中：(a)重链包含以下氨基酸序列：EVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNSAAWNWIRQSPSRGLEWLGKTYYRFKWYSDYAVSVKGRITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVFYCTRESTTYDLLAGPFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:23)；并且(b)轻链包含以下氨基酸序列：
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQTVLYSSNNKKYLAWYQQKPGQPPNLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYSTPFTFGPGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:24)。
在一些情况下，抗TIGIT拮抗剂抗体还包含以下轻链可变区框架区(FR)中的至少一个、两个、三个或四个：FR-L1，其包含DIVMTQSPDSLAVSLGERATINC(SEQ ID NO:7)的氨基酸序列；FR-L2，其包含WYQQKPGQPPNLLIY(SEQ ID NO:8)的氨基酸序列；FR-L3，其包含GVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYC(SEQ ID NO:9)的氨基酸序列；和/或FR-L4，其包含FGPGTKVEIK(SEQ ID NO:10)的氨基酸序列，或上述FR中的一个或多个与其一个或多个变体的组合，该变体与SEQ ID NO:7-20中的任一者具有至少约90％序列同一性(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性)。在一些情况下，例如，该抗体还包含FR-L1，其包含DIVMTQSPDSLAVSLGERATINC(SEQ ID NO:7)的氨基酸序列；FR-L2，其包含WYQQKPGQPPNLLIY(SEQ ID NO:8)的氨基酸序列；FR-L3，其包含GVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYC(SEQ ID NO:9)的氨基酸序列；和FR-L4，其包含FGPGTKVEIK(SEQ ID NO:10)的氨基酸序列。
在一些情况下，抗TIGIT拮抗剂抗体还包含以下重链可变区FR中的至少一个、两个、三个或四个：FR-H1，其包含X1VQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVS(SEQ ID NO:11)的氨基酸序列，其中X1是E或Q；FR-H2，其包含WIRQSPSRGLEWLG(SEQ ID NO:12)的氨基酸序列；FR-H3，其包含RITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVFYCTR(SEQ ID NO:13)的氨基酸序列；和/或FR-H4，其包含WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:14)的氨基酸序列，或上述FR中的一个或多个与其一个或多个变体的组合，该变体与SEQ ID NO:11-14中的任一者具有至少约90％序列同一性(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性)。抗TIGIT拮抗剂抗体可进一步包括例如以下重链可变区FR中的至少一个、两个、三个或四个：FR-H1，其包含EVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVS(SEQ ID NO:15)的氨基酸序列；FR-H2，其包含WIRQSPSRGLEWLG(SEQ ID NO:12)的氨基酸序列；FR-H3，其包含RITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVFYCTR(SEQ ID NO:13)的氨基酸序列；和/或FR-H4，其包含WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:14)的氨基酸序列，或上述FR中的一个或多个与其一个或多个变体的组合，该变体与SEQ IDNO:12-15中的任一者具有至少约90％序列同一性(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性)。在一些情况下，抗TIGIT拮抗剂抗体包括FR-H1，其包含EVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVS(SEQ ID NO:15)的氨基酸序列；FR-H2，其包含WIRQSPSRGLEWLG(SEQ ID NO:12)的氨基酸序列；FR-H3，其包含RITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVFYCTR(SEQ ID NO:13)的氨基酸序列；FR-H4，其包含WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:14)的氨基酸序列。在另一情况下，例如，抗TIGIT拮抗剂抗体可以进一步包括以下重链可变区FR中的至少一个、两个、三个或四个：FR-H1，其包含QVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVS(SEQ IDNO:16)的氨基酸序列；FR-H2，其包含WIRQSPSRGLEWLG(SEQ ID NO:12)的氨基酸序列；FR-H3，其包含RITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVFYCTR(SEQ ID NO:13)的氨基酸序列；和/或FR-H4，其包含WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:14)的氨基酸序列，或上述FR中的一个或多个与其一个或多个变体的组合，该变体与SEQ ID NO:12-14和16中的任一个具有至少约90％序列同一性(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性)。在一些情况下，抗TIGIT拮抗剂抗体包括FR-H1，其包含QVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVS(SEQ ID NO:16)的氨基酸序列；FR-H2，其包含WIRQSPSRGLEWLG(SEQ ID NO:12)的氨基酸序列；FR-H3，其包含RITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVFYCTR(SEQ ID NO:13)的氨基酸序列；FR-H4，其包含WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:14)的氨基酸序列。
在另一方面，提供一种抗TIGIT拮抗剂抗体，其中该抗体包含如以上提供的任何情况下的VH和如以上提供的任何情况下的VL，其中一个或两个可变结构域序列包括翻译后修饰。
在一些情况下，上述任何一个抗TIGIT拮抗剂抗体除了能够与人TIGIT结合之外，也能够与兔TIGIT结合。在一些情况下，上述任何一个抗TIGIT拮抗剂抗体能够与人TIGIT和食蟹猴(cyno)TIGIT结合。在一些情况下，上述任何一个抗TIGIT拮抗剂抗体能够与人TIGIT、cyno TIGIT和兔TIGIT结合。在一些情况下，上述任何一个抗TIGIT拮抗剂抗体能够与人TIGIT、cyno TIGIT和兔TIGIT结合，但不能与鼠TIGIT结合。
在一些情况下，抗TIGIT拮抗剂抗体以约10nM或更低的KD与人TIGIT结合和以约10nM或更低的KD与cyno TIGIT结合(例如以约0.1nM至约1nM的KD与人TIGIT结合，以约0.5nM至约1nM的KD与cyno TIGIT结合，例如以约0.1nM或更低的KD与人TIGIT结合，以约0.5nM或更低的KD与cyno TIGIT结合)。
在一些情况下，抗TIGIT拮抗剂抗体与TIGIT特异性结合并抑制或阻断TIGIT与脊髓灰质炎病毒受体(PVR)的相互作用(例如，拮抗剂抗体抑制由TIGIT与PVR结合介导的细胞内信号传导)。在一些情况下，拮抗剂抗体以10nM或更低(例如，1nM至约10nM)的IC50值抑制或阻断人TIGIT与人PVR的结合。在一些情况下，抗TIGIT拮抗剂抗体与TIGIT特异性结合并抑制或阻断TIGIT与PVR的相互作用，而不影响PVR-CD226相互作用。在一些情况下，拮抗剂抗体以50nM或更低(例如，1nM至约50nM，例如1nM至约5nM)的IC50值抑制或阻断cyno TIGIT与cyno PVR的结合。在一些情况下，抗TIGIT拮抗剂抗体抑制和/或阻断CD226与TIGIT的相互作用。在一些情况下，抗TIGIT拮抗剂抗体抑制和/或阻断TIGIT破坏CD226同源二聚化的能力。
在一些情况下，本文所述的方法或用途可包括使用或施用分离的抗TIGIT拮抗剂抗体，该抗体与上述任何抗TIGIT拮抗剂抗体竞争结合TIGIT。例如，该方法可以包括施用分离的抗TIGIT拮抗剂抗体，该抗体与具有以下六个HVR的抗TIGIT拮抗剂抗体竞争结合TIGIT：(a)HVR-H1，其包含SNSAAWN(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列；(b)HVR-H2，其包含KTYYRFKWYSDYAVSVKG(SEQ ID NO:2)的氨基酸序列；(c)HVR-H3，其包含ESTTYDLLAGPFDY(SEQ ID NO:3)的氨基酸序列；(d)HVR-L1，其包含KSSQTVLYSSNNKKYLA(SEQ ID NO:4)的氨基酸序列，(e)HVR-L2，其包含WASTRES(SEQ ID NO:5)的氨基酸序列；和(f)HVR-L3，其包含QQYYSTPFT(SEQ ID NO:6)的氨基酸序列。本文所述的方法还可包括施用与上述抗TIGIT拮抗剂抗体结合相同表位的分离的抗TIGIT拮抗剂抗体。
在一些方面，抗TIGIT拮抗剂抗体表现出Fc介导的效应子功能，例如，参与抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。在一些方面，抗TIGIT拮抗剂抗体为具有完整的Fc介导的效应子功能(例如，替瑞利尤单抗、维博利单抗、etigilimab、EOS084448或TJ-T6)或增强的效应子功能(例如，SGN-TGT)的抗体。
在其他方面，抗TIGIT拮抗剂抗体为缺乏Fc介导的效应子功能的抗体(例如，domvanalimab、BMS-986207、ASP8374或COM902)。
在一些方面，抗TIGIT拮抗剂抗体是IgG类抗体。在一些方面，抗TIGIT拮抗剂抗体为IgG1类抗体，例如，替瑞利尤单抗、维博利单抗、domvanalimab、BMS-986207、etigilimab、BGB-A1217、SGN-TGT、EOS084448(EOS-448)、TJ-T6或AB308。在一些方面，抗体是包含Fc区的人单克隆全长IgG1类抗体。
在一些方面，抗TIGIT拮抗剂抗体是人单克隆全长IgG1亚类抗体，其包含人IgG1Fc区、包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的重链可变区(VH)和包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的轻链可变区(VL)。
在其他方面，抗TIGIT拮抗剂抗体为IgG4类抗体，例如，ASP8374或COM902。
可用于本发明的抗TIGIT拮抗剂抗体(例如，替瑞利尤单抗)，包括含有此类抗体的组合物，可以与PD-1轴结合拮抗剂(例如，PD-L1结合拮抗剂(例如，抗PD-L1拮抗剂抗体，例如，阿特珠单抗)、PD-1结合拮抗剂(例如，抗PD-1拮抗剂抗体，例如，帕博利珠单抗)和PD-L2结合拮抗剂(例如，抗PD-L2拮抗剂抗体))。
在一些实施例中，抗TIGIT拮抗剂抗体起到抑制TIGIT信号传导的作用。在一些实施例中，抗TIGIT拮抗剂抗体抑制TIGIT与其结合配偶体的结合。示例性TIGIT结合配偶体包括CD155(PVR)、CD112(PVRL2或Nectin-2)和CD113(PVRL3或Nectin-3)。在一些实施例中，抗TIGIT拮抗剂抗体能够抑制TIGIT与CD155之间的结合。在一些实施例中，抗TIGIT拮抗剂抗体可以抑制TIGIT与CD112之间的结合。在一些实施例中，抗TIGIT拮抗剂抗体抑制TIGIT与CD113之间的结合。在一些实施例中，抗TIGIT拮抗剂抗体抑制免疫细胞中TIGIT介导的细胞信号传导。在一些实施例中，抗TIGIT拮抗剂抗体通过消耗调节性T细胞来抑制TIGIT(例如，当接合FcγR时)。
在一些实施例中，抗TIGIT抗体为单克隆抗体。在一些实施例中，抗TIGIT抗体为选自由Fab、Fab'-SH、Fv、scFv和(Fab')2片段组成的组的抗体片段。在一些实施例中，抗TIGIT抗体为人源化抗体。在一些实施例中，抗TIGIT抗体为人抗体。在一些实施例中，本文所述的抗TIGIT抗体与人TIGIT结合。在一些实施例中，抗TIGIT抗体为Fc融合蛋白。
在一些实施例中，抗TIGIT抗体选自由以下项组成的组：替瑞利尤单抗(MTIG7192A、RG6058或RO7092284)、维博利单抗(MK-7684)、ASP8374(PTZ-201)、EOS884448(EOS-448)、SEA-TGT(SGN-TGT))、BGB-A1217、BMS-986207(ONO-4686)、COM902(CGEN-15137)、IBI939、domvanalimab(AB154)、M6223、AB308、AB154、TJ-T6、MG1131、NB6253、HLX301、HLX53、SL-9258(TIGIT-Fc-LIGHT)、STW264和YBL-012。在一些实施例中，抗TIGIT抗体选自由以下项组成的组：替瑞利尤单抗(MTIG7192A、RG6058或RO7092284)、维博利单抗(MK-7684)、ASP8374(PTZ-201)、EOS-448和SEA-TGT(SGN-TGT)。抗TIGIT抗体可以是替瑞利尤单抗(MTIG7192A、RG6058或RO7092284)。
在一些实施例中，抗TIGIT抗体包含本文公开的任何抗TIGIT抗体的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个互补决定区(CDR)。在一些实施例中，抗TIGIT抗体包含本文公开的任何抗TIGIT抗体的六个CDR。在一些实施例中，抗TIGIT抗体包含选自由替瑞利尤单抗、ASP8374(PTZ-201)、BGB-A1217、BMS-986207(ONO-4686)、COM902(CGEN-15137)、M6223、IBI939、EOS884448(EOS-448)、domvanalimab(AB154)、维博利单抗(MK-7684)和SEA-TGT(SGN-TGT)组成的组的抗体中任一抗体的六个CDR。
在一些实施例中，抗TIGIT抗体包含重链和轻链，其中重链包含本文公开的任何一种抗TIGIT抗体的重链可变区(VH)序列，并且轻链包含同一抗体的轻链可变区(VL)。在一些实施例中，抗TIGIT抗体包含选自由替瑞利尤单抗、ASP8374(PTZ-201)、BGB-A1217、BMS-986207(ONO-4686)、COM902(CGEN-15137)、M6223、IBI939、EOS884448(EOS-448)、domvanalimab(AB154)、维博利单抗(MK-7684)和SEA-TGT(SGN-TGT)组成的组的抗TIGIT抗体的VH和VL。
在一些实施例中，抗TIGIT抗体包含本文公开的任何抗TIGIT抗体的重链和轻链。在一些实施例中，抗TIGIT抗体包含选自由替瑞利尤单抗、ASP8374(PTZ-201)、BGB-A1217、BMS-986207(ONO-4686)、COM902(CGEN-15137)、M6223、IBI939、EOS884448(EOS-448)、domvanalimab(AB154)、维博利单抗(MK-7684)和SEA-TGT(SGN-TGT)组成的组的抗TIGIT抗体的重链和轻链。
VIII.靶向PD-1和LAG3的双特异性抗体
A.结合PD-1和LAG3的示例性双特异性抗体
在一个方面，本发明提供了一种双特异性抗体，其包含与PD-1特异性结合的第一抗原结合结构域和与LAG3特异性结合的第二抗原结合结构域，其中所述与PD-1特异性结合的所述第一抗原结合结构域包含：VH结构域，其包含：
(i)HVR-H1，其包含GFSFSSY(SEQ ID NO:25)的氨基酸序列，
(ii)HVR-H2，其包含氨基酸序列GGR，和
(iii)HVR-H3，其包含TGRVYFALD(SEQ ID NO:26)的氨基酸序列；以及VL结构域，其包含
(i)HVR-L1，其包含SESVDTSDNSF(SEQ ID NO:27)的氨基酸序列；
(ii)HVR-L2，其包含氨基酸序列RSS，和
(iii)HVR-L3，其包含NYDVPW(SEQ ID NO:28)的氨基酸序列。
在一个方面，双特异性抗体包含Fc结构域，所述Fc结构域是IgG，具体地是IgG1 Fc结构域或IgG4 Fc结构域，并且其中Fc结构域具有降低或甚至消除的效应子功能。具体地，Fc结构域包含一个或多个氨基酸取代，所述一个或多个氨基酸取代减少与Fc受体的结合，具体地是与Fcγ受体的结合。
在另一个方面，提供了一种双特异性抗体，其包含与PD-1特异性结合的第一抗原结合结构域和与LAG3特异性结合的第二抗原结合结构域，其中双特异性抗体包含Fc结构域，所述Fc结构域是IgG，具体地是IgG1Fc结构域或IgG4 Fc结构域，并且其中Fc结构域包含一个或多个氨基酸取代，所述一个或多个氨基酸取代减少与Fc受体的结合，具体地是与Fcγ受体的结合。
在另一个方面，提供了一种双特异性抗体，其包含与PD-1特异性结合的第一抗原结合结构域和与LAG3特异性结合的第二抗原结合结构域，其中与LAG3特异性结合的第二抗原结合结构域包含：VH结构域，其包含
(i)HVR-H1，其包含DYTMN(SEQ ID NO:31)的氨基酸序列，
(ii)HVR-H2，其包含VISWDGGGTYYTDSVKG(SEQ ID NO:32)的氨基酸序列，和
(iii)HVR-H3，其包含GLTDTTLYGSDY(SEQ ID NO:33)的氨基酸序列；以及
VL结构域，其包含
(i)HVR-L1，其包含RASQSISSYLN(SEQ ID NO:34)的氨基酸序列，
(ii)HVR-L2，其包含AASTLQS(SEQ ID NO:35)的氨基酸序列，和
(iii)HVR-L3，其包含QQTYSSPLT(SEQ ID NO:36)的氨基酸序列。
在另一个方面，提供了一种双特异性抗体，其包含与PD-1特异性结合的第一抗原结合结构域和与LAG3特异性结合的第二抗原结合结构域，其中与PD-1特异性结合的第一抗原结合结构域包含：
VH结构域，其包含
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSFSSYTMSWVRQAPGKGLEWVATISGGGRDIYYPDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVLLTGRVYFALDSWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:29)的氨基酸序列；和VL结构域，其包含
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKASESVDTSDNSFIHWYQQKPGQSPKLLIYRSSTLESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQNYDVPWTFGQGTKVEIK(SEQ ID NO:30)的氨基酸序列。
在另一个方面，提供了一种双特异性抗体，其包含与PD-1特异性结合的第一抗原结合结构域和与LAG3特异性结合的第二抗原结合结构域，其中与LAG3特异性结合的第二抗原结合结构域包含：
VH结构域，其包含EVQLLESGGGLVQPGGSLRL
SCAASGFIFDDYTMNWVRQAPGKGLEWVAVISWDGGGTYYTDSVKGRFTISRDDFKNTLY
LQMNSLRAEDTAVYYCAKGLTDTTLYGSDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:37)的氨基酸序列，和VL结构域，其包含
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTYSSPLTFGGGTKVEIK(SEQ ID NO:38)的氨基酸序列。
在一个方面，靶向PD-1和LAG3的双特异性抗体包含与PD-1特异性结合的第一抗原结合结构域和与LAG3特异性结合的第二抗原结合结构域，其中与PD-1特异性结合的第一抗原结合结构域包含：VH结构域，其与SEQ ID NO:29的氨基酸序列具有至少90％的同一性(例如，具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或超过99％的同一性)；以及VL结构域，其与SEQ ID NO:30的氨基酸序列具有至少90％的同一性(例如，具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或超过99％的同一性)。在一个方面，与PD-1特异性结合的第一抗原结合结构域包含：VH结构域，其包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列；以及VL结构域，其包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列。
在一个方面，靶向PD-1和LAG3的双特异性抗体包含与PD-1特异性结合的第一抗原结合结构域和与LAG3特异性结合的第二抗原结合结构域，其中与LAG3特异性结合的第二抗原结合结构域包含：VH结构域，其与SEQ ID NO:37的氨基酸序列具有至少90％的同一性(例如，具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或超过99％的同一性)；以及VL结构域，其与SEQ ID NO:38的氨基酸序列具有至少90％的同一性(例如，具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或超过99％的同一性)。在一个方面，与LAG3特异性结合的第二抗原结合结构域包含：VH结构域，其包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列；以及VL结构域，其包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列。
在一个方面，靶向PD-1和LAG3的双特异性抗体包含与PD-1特异性结合的第一抗原结合结构域和与LAG3特异性结合的第二抗原结合结构域，其中与PD-1特异性结合的第一抗原结合结构域包含：VH结构域，其与SEQ ID NO:29的氨基酸序列具有至少90％的同一性(例如，具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或超过99％的同一性)；以及VL结构域，其与SEQ ID NO:30的氨基酸序列具有至少90％的同一性(例如，具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或超过99％的同一性)，并且与LAG3特异性结合的第二抗原结合结构域包含：VH结构域，其与SEQ ID NO:37的氨基酸序列具有至少90％的同一性(例如，具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或超过99％的同一性)；以及VL结构域，其与SEQ ID NO:38的氨基酸序列具有至少90％的同一性(例如，具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或超过99％的同一性)。
在另一个方面，提供了一种双特异性抗体，其包含与PD-1特异性结合的第一抗原结合结构域和与LAG3特异性结合的第二抗原结合结构域，其中
与PD-1特异性结合的第一抗原结合结构域包含：VH结构域，其包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列；以及VL结构域，其包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列，
并且与LAG3特异性结合的第二抗原结合结构域包含：VH结构域，其包含SEQ IDNO:37的氨基酸序列；以及VL结构域，其包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列。
在另一个方面，包含与PD-1特异性结合的第一抗原结合结构域和与LAG3特异性结合的第二抗原结合结构域的双特异性抗体是人、人源化或嵌合抗体。具体地，所述抗体是人源化或嵌合抗体。
在一个方面，包含与PD-1特异性结合的第一抗原结合结构域和与LAG3特异性结合的第二抗原结合结构域的双特异性抗体是二价的。这意指双特异性抗体包含与PD-1特异性结合的一个抗原结合结构域和与LAG3特异性结合的一个抗原结合结构域(1+1形式)。
在一个方面，提供了一种双特异性抗体，其包含与PD-1特异性结合的第一抗原结合结构域和与LAG3特异性结合的第二抗原结合结构域，其中双特异性抗体包含Fc结构域、第一Fab片段和第二Fab片段，该第一Fab片段包含与PD-1特异性结合的抗原结合结构域，该第二Fab片段包含与LAG3特异性结合的抗原结合结构域。在一个特定方面，在Fab片段中的一个中，可变结构域VL和VH彼此替换，使得VH结构域是轻链的一部分而VL结构域是重链的一部分。在一个特定方面，在包含与PD-1特异性结合的抗原结合结构域的第一Fab片段中，可变结构域VL和VH彼此替换。
在一个特定方面，提供了一种双特异性抗体，其包含与PD-1特异性结合的第一抗原结合结构域和与LAG3特异性结合的第二抗原结合结构域，其中该双特异性抗体包含第一重链，其包含与SEQ ID NO:39的序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；第一轻链，其包含与SEQ ID NO:40的序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；第二重链，其包含与SEQ ID NO:41的序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；和第二轻链，其包含与SEQID NO:42的序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。例如，在一个方面，双特异性抗体包含第一重链，该第一重链包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列；第一轻链，其包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列；第二重链，其包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列；和第二轻链，其包含SEQID NO:42(PD1-LAG3)的氨基酸序列。
在另一个方面，提供了一种双特异性抗体，其包含与PD-1特异性结合的第一抗原结合结构域和与LAG3特异性结合的第二抗原结合结构域，其中双特异性抗体包含Fc结构域、第一Fab片段和第二Fab片段，该第一Fab片段包含与PD-1特异性结合的抗原结合结构域，该第二Fab片段包含与LAG3特异性结合的抗原结合结构域，该第二Fab片段与Fc结构域的C末端融合。具体地，包含与LAG3特异性结合的抗原结合结构域的Fab片段经由其VH结构域与Fc结构域的C末端融合(反式1+1形式)。
在一个方面，双特异性抗体包含第一重链，其包含与SEQ ID NO:39的序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；第一轻链，其包含与SEQ ID NO:40的序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；第二重链，其包含与SEQ ID NO:61的序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；和第二轻链，其包含与SEQ ID NO:42的序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。更特别地，双特异性抗体可以包含第一重链，其包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列；第一轻链，其包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列；第二重链，其包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列；和第二轻链，其包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列。
i.减少Fc受体结合和/或效应子功能的Fc结构域修饰
在某些方面，提供了一种双特异性抗体，其包含与PD-1特异性结合的第一抗原结合结构域和与LAG3特异性结合的第二抗原结合结构域，其中双特异性抗体包含Fc结构域，该Fc结构域包含一个或多个氨基酸修饰，该一个或多个氨基酸修饰减少与Fc受体的结合，具体地是与Fcγ受体的结合，并且降低或消除效应子功能。
在某些方面，一个或多个氨基酸修饰可引入本文提供的抗体的Fc区中，从而生成Fc区变体。Fc区变体可包含人Fc区序列(例如人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc区)，其在一个或多个氨基酸位置处包含氨基酸修饰(例如取代)。
以下部分描述了包含降低Fc受体结合和/或效应子功能的Fc结构域修饰的本发明的双特异性抗原结合分子的优选方面。在一个方面，本发明涉及包含与PD-1特异性结合的第一抗原结合结构域和与LAG3特异性结合的第二抗原结合结构域的双特异性抗体，其中Fc结构域包含一个或多个氨基酸取代，该一个或多个氨基酸取代减少与Fc受体的结合，具体地是与Fcγ受体的结合。具体地，Fc结构域属于人IgG1亚类，具有氨基酸突变L234A、L235A和P329G(根据Kabat EU索引编号)。
Fc结构域对本发明的双特异性抗体赋予有利的药代动力学特性，包括有助于靶组织中的良好积聚的长血清半衰期和有利的组织-血液分配比率。然而，与此同时，可能导致本发明的双特异性抗体不期望地靶向表达Fc受体的细胞，而不是优选的抗原携带细胞。因此，在特定实施例中，与天然IgG Fc结构域，具体地是IgG1 Fc结构域或IgG4 Fc结构域相比，本发明的双特异性抗体的Fc结构域表现出降低的对Fc受体的结合亲和力和/或降低的效应子功能。更具体地，Fc结构域是IgG1 FC结构域。
在一个此类方面，与天然IgG1 Fc结构域(或包含天然IgG1 Fc结构域的本发明的双特异性抗原结合分子)相比，该Fc结构域(或包含该Fc结构域的本发明的双特异性抗原结合分子)表现出对Fc受体的结合亲和力的小于50％、优选地少小20％、更优选地小于10％且最优选地小于5％；和/或与天然IgG1 Fc结构域(或包含天然IgG1 Fc结构域的本发明的双特异性抗原结合分子)相比，该Fc结构域(或包含该Fc结构域的本发明的双特异性抗原结合分子)表现出效应子功能的小于50％、优选地小于20％、更优选地小于10％且最优选地小于5％。在一个方面，Fc结构域(或包含该Fc结构域的本发明的双特异性抗原结合分子)不显著结合Fc受体和/或诱导效应子功能。在特定方面，Fc受体为Fcγ受体。在一个方面，Fc受体是人Fc受体。在一个方面，Fc受体是活化性Fc受体。在一个具体的方面，Fc受体是活化性人Fcγ受体，更具体地是人FcγRIIIa、FcγRI或FcγRIIa，最具体地是人FcγRIIIa。在一个方面，Fc受体是抑制性Fc受体。在一个具体方面，Fc受体是抑制性人Fcγ受体，更具体地是人FcγRIIB。在一个方面，效应子功能是CDC、ADCC、ADCP和细胞因子分泌中的一个或多个。在特定方面，效应子功能为ADCC。在一个方面，与天然IgG1 Fc结构域相比较，Fc结构域表现出基本上类似的对新生Fc受体(FcRn)的结合亲和力。当Fc结构域(或包含所述Fc结构域的本发明的双特异性抗原结合分子)表现出天然IgG1 Fc结构域(或包含天然IgG1 Fc结构域的本发明的双特异性抗原结合分子)对FcRn的结合亲和力的大于约70％、具体地大于约80％、更具体地大于约90％时，实现了基本上类似的与FcRn的结合。
在特定方面，Fc结构域经过工程化改造，以与非工程化改造的Fc结构域相比具有降低的对Fc受体的结合亲和力和/或降低的效应子功能。在特定方面，本发明的双特异性抗原结合分子的Fc结构域包含降低Fc结构域对Fc受体的结合亲和力和/或效应子功能的一个或多个氨基酸突变。典型地，相同的一个或多个氨基酸突变存在于Fc结构域的两个亚基中的每一个中。在一个方面，氨基酸突变降低Fc结构域对Fc受体的结合亲和力。在另一方面，氨基酸突变将Fc结构域对Fc受体的结合亲和力降低至少2倍、至少5倍或至少10倍。在一个方面，与包含非工程化改造的Fc结构域的本发明的双特异性抗体相比，包含工程化改造的Fc结构域的本发明的双特异性抗原结合分子表现出对Fc受体的结合亲和力的少于20％、具体地少于10％、更具体地少于5％。在特定方面，Fc受体是Fcγ受体。在其他方面，Fc受体是人Fc受体。在一个方面，Fc受体是抑制性Fc受体。在一个具体方面，Fc受体是抑制性人Fcγ受体，更具体地是人FcγRIIB。在一些方面，Fc受体是活化的Fc受体。在一个具体的方面，Fc受体是活化性人Fcγ受体，更具体地是人FcγRIIIa、FcγRI或FcγRIIa，最具体地是人FcγRIIIa。优选地，与这些受体中的每一个的结合降低。在一些方面，对互补组分的结合亲和力，尤其对C1q的特异性结合亲和力也降低了。在一个方面，对新生Fc受体(FcRn)的结合亲和力不降低。当Fc结构域(或包含所述Fc结构域的本发明的双特异性抗原结合分子)表现出Fc结构域的非工程化改造形式(或包含Fc结构域的所述非工程化改造形式的本发明的双特异性抗原结合分子)对FcRn的结合亲和力的大于约70％时，实现了基本上类似的与FcRn的结合，即实现了Fc结构域对所述受体的结合亲和力的保留。Fc结构域或包含所述Fc结构域的本发明的双特异性抗原结合分子可表现出这种亲和力的大于约80％或甚至大于约90％。在某些实施例中，本发明的双特异性抗原结合分子的Fc结构域被工程化改造，以相比于非工程化改造的Fc结构域具有降低的效应子功能。降低的效应子功能可以包括但不限于以下中的一个或多个：降低的补体依赖性细胞毒性(CDC)、降低的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、降低的抗体依赖性细胞吞噬(ADCP)、减少的细胞因子分泌、减少的免疫复合物介导的抗原呈递细胞的抗原摄取、减少的与NK细胞的结合、减少的与巨噬细胞的结合、减少的与单核细胞的结合、减少的与多形核细胞的结合、减少的直接信号传导诱导性细胞凋亡、降低的树突细胞成熟或减少的T细胞引发。
具有降低的效应子功能的抗体包括具有Fc区残基238、265、269、270、297、327和329中的一者或多者的取代的那些(美国专利号6,737,056)。此类Fc突变体包括具有在第265、269、270、297和327位氨基酸处的两个或更多个处具有取代的Fc突变体，包括所谓的“DANA”Fc突变体，其残基265和297被取代为丙氨酸(美国专利号7,332,581)。描述了具有改善的或降低的与FcR的结合的某些抗体变体。(例如，美国专利号6,737,056；WO 2004/056312，以及Shields,R.L.等人,J.Biol.Chem.276(2001)6591-6604)。
在本发明的一个方面，Fc结构域在E233、L234、L235、N297、P331和P329位处包含氨基酸取代。在一些方面，Fc结构域包含氨基酸取代L234A和L235A(“LALA”)。在一个这样的实施例中，Fc结构域是IgG1 Fc结构域，特别是人IgG1 Fc结构域。在一个方面，所述Fc结构域在位置P329处包含氨基酸取代。在一个更具体的方面，氨基酸取代是P329A或P329G，特别是P329G。在一个实施例中，Fc结构域在位置P329处包含氨基酸取代并且包含选自由E233P、L234A、L235A、L235E、N297A、N297D或P331S组成的组的另外的氨基酸取代。在更特定的实施例中，Fc结构域包含氨基酸突变L234A、L235A和P329G(“P329G LALA”)。氨基酸取代的“P329G LALA”组合几乎完全消除人IgG1 Fc结构域的Fcγ受体结合，如PCT专利申请号WO2012/130831A1中所述。所述文档还描述了制备此类突变Fc结构域的方法和用于确定其性质(诸如Fc受体结合或效应子功能)的方法。此类抗体是具有突变L234A和L235A或具有突变L234A、L235A和P329G的IgG1(根据Kabat等人，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,第5版Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD,1991的EU索引进行编号)。
在一个方面，本发明的双特异性抗体包含(所有位置均根据Kabat的EU索引)(i)任选地具有突变P329G、L234A和L235A的人IgG1亚类的同二聚体Fc区，或(ii)任选地具有突变P329G、S228P和L235E的人IgG4亚类的同二聚体Fc区，或(iii)任选地具有突变P329G、L234A、L235A、I253A、H310A和H435A，或任选地具有突变P329G、L234A、L235A、H310A、H433A和Y436A的人IgG1亚类的同二聚体Fc区，或(iv)异二聚体Fc区，其中一个Fc区多肽包含突变T366W并且另一个Fc区多肽包含突变T366S、L368A和Y407V，或者其中一个Fc区多肽包含突变T366W和Y349C并且另一个Fc区多肽包含突变T366S、L368A、Y407V和S354C，或者其中一个Fc区多肽包含突变T366W和S354C并且另一个Fc区多肽包含突变T366S、L368A、Y407V和Y349C，或(v)人IgG1亚类的异二聚体Fc区，其中两个Fc区多肽均包含突变P329G、L234A和L235A，并且一个Fc区多肽包含突变T366W，而另一个Fc区多肽包含突变T366S、L368A和Y407V；或其中一个Fc区多肽包含突变T366W和Y349C，而另一个Fc区多肽包含突变T366S、L368A、Y407V和S354C；或其中一个Fc区多肽包含突变T366W和S354C，并且另一个Fc区多肽包含突变T366S、L368A、Y407V和Y349C。
在一个方面，Fc结构域为IgG4 Fc结构域。在一个更具体的实施例中，Fc结构域是在S228位处(Kabat编号)包含氨基酸取代，具体地是氨基酸取代S228P的IgG4 Fc结构域。在一个更具体的实施例中，Fc结构域是包含氨基酸取代L235E和S228P以及P329G的IgG4 Fc结构域。这种氨基酸取代减少IgG4抗体的体内Fab臂交换(参见Stubenrauch等人，DrugMetabolism and Disposition 38,84-91(2010))。因此，在一个方面，提供了一种双特异性抗体，其包含(所有位置均根据Kabat的EU索引)人IgG4亚类的异二聚体Fc区，其中两个Fc区多肽均包含突变P329G、S228P和L235E并且一个Fc区多肽包含突变T366W而另一个Fc区多肽包含突变T366S、L368A和Y407V，或其中一个Fc区多肽包含突变T366W和Y349C而另一个Fc区多肽包含突变T366S、L368A、Y407V和S354C，或其中一个Fc区多肽包含突变T366W和S354C而另一个Fc区多肽包含突变T366S、L368A、Y407V和Y349C。
具有增加的半衰期和改善的与新生儿Fc受体(FcRn)的结合，负责将母体IgG转移至胎儿的抗体(Guyer,R.L.等人,J.Immunol.117(1976)587-593和Kim,J.K.等人,J.Immunol.24(1994)2429-2434)描述于US 2005/0014934中。那些抗体包含Fc区，该Fc区中具有改善Fc区与FcRn的结合的一个或多个取代。此类Fc变体包括在以下Fc区残基中的一处或多处具有取代的Fc变体：238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434，例如对Fc区残基434的取代(美国专利号7,371,826)。关于Fc区变体的其他示例，还参见Duncan,A.R.和Winter,G.,Nature 322(1988)738-740；US 5,648,260；US 5,624,821；以及WO 94/29351。
与Fc受体的结合可以例如通过ELISA或通过表面等离子体共振(SPR)使用标准仪器(诸如BIAcore仪器(GE Healthcare))容易地确定，并且Fc受体诸如可以通过重组表达获得。本文描述了合适的此类结合测定。另选地，可以使用已知表达特定Fc受体的细胞系(诸如表达FcγIIIa受体的人NK细胞)来评价Fc结构域或包含Fc结构域的细胞活化双特异性抗原结合分子对Fc受体的结合亲和力。Fc结构域的效应子功能，或本发明的包含Fc结构域的双特异性抗体，可以通过本领域已知的方法来测量。本文描述了用于测量ADCC的合适测定。评定目的分子的ADCC活性的体外测定的其他示例描述于美国专利号5,500,362；Hellstrom等人Proc Natl Acad Sci USA 83,7059-7063(1986)和Hellstrom等人,Proc Natl AcadSci USA 82,1499-1502(1985)；美国专利号5,821,337；Bruggemann等人,J Exp Med 166,1351-1361(1987)中。另选地，可以使用非放射性测定方法(参见例如，用于流式细胞术的ACTITM非放射性细胞毒性测定(CellTechnology,Inc.Mountain View,CA)；以及CytoTox非放射性细胞毒性测定(Promega,Madison,WI))。用于此类测定的有用效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和自然杀伤(NK)细胞。可替代地或另外地，可例如在诸如在Clynes等人，Proc Natl Acad Sci USA 95,652-656(1998)中公开的动物模型中体内评定感兴趣的分子的ADCC活性。
以下部分描述了包含降低Fc受体结合和/或效应子功能的Fc结构域修饰的本发明的双特异性抗体的优选方面。在一个方面中，本发明涉及双特异性抗体，其包含与PD-1特异性结合的第一抗原结合结构域和与LAG3特异性结合的第二抗原结合结构域，其中Fc结构域包含一个或多个氨基酸取代，该一个或多个氨基酸取代降低抗体与Fc受体的结合亲和力，特别是对Fcγ受体的结合亲和力。在另一个方面中，本发明涉及双特异性抗体，其包含与PD-1特异性结合的第一抗原结合结构域和与LAG3特异性结合的第二抗原结合结构域，其中所述Fc结构域包含降低效应子功能的一个或多个氨基酸取代。在特定方面，Fc结构域属于人IgG1亚类，其具有氨基酸突变L234A、L235A和P329G(根据Kabat EU索引编号)。
ii.促进异源二聚化的Fc结构域修饰
本发明的双特异性抗原结合分子包含与Fc结构域的两个亚基中的一个或另一个融合的不同抗原结合结构域，因此Fc结构域的两个亚基可包含在两个不相同的多肽链中。这些多肽的重组共表达和随后的二聚化导致了两种多肽的几种可能的组合。为了在重组生产中提高本发明的双特异性抗体的产率和纯度，因此在本发明的双特异性抗原结合分子的Fc结构域中引入促进所需多肽的缔合的修饰将是有利的。
因此，在特定的方面，本发明涉及一种双特异性抗体，其包含与PD-1特异性结合的第一抗原结合结构域和与LAG3特异性结合的第二抗原结合结构域，其中该Fc结构域包含促进Fc结构域的第一亚基和第二亚基的缔合的修饰。人IgG Fc结构域的两个亚基之间最广泛的蛋白质间相互作用位点在Fc结构域的CH3结构域中。因此，在一个方面，所述修饰在Fc结构域的CH3结构域中。
在具体方面，该修饰是所谓的“杵臼结构”修饰，该修饰包括Fc结构域的两个亚基中的一个中的“杵”修饰和Fc结构域的两个亚基中的另一个中的“臼”修饰。因此，本发明涉及一种双特异性抗体，其包含与PD-1特异性结合的第一抗原结合结构域和与LAG3特异性结合的第二抗原结合结构域，其中根据杵臼结构方法，Fc结构域的第一亚基包含杵并且Fc结构域的第二亚基包含臼。在特定方面，Fc结构域的第一亚基包含氨基酸取代S354C和T366W(EU编号)并且Fc结构域的第二亚基包含氨基酸取代Y349C、T366S和Y407V(根据Kabat EU索引编号)。
杵臼结构技术描述于例如US 5,731,168；US 7,695,936；Ridgway等人，Prot Eng9，617-621(1996)和Carter，J Immunol Meth 248，7-15(2001)中。通常，该方法涉及在第一多肽的界面处引入突起(“杵”)并在第二多肽的界面中引入相应的空腔(“臼”)，使得该突起可以定位在该空腔中，以便促进异二聚体的形成并阻碍同二聚体的形成。突起是通过用较大侧链(例如酪氨酸或色氨酸)取代来自第一多肽的界面的小氨基酸侧链而构建的。具有与突起相同或相似大小的补偿空腔是通过用较小的氨基酸侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)取代大氨基酸侧链而在第二多肽的界面中创建的。
因此，在一个方面，在本发明的双特异性抗原结合分子的Fc结构域的第一亚基的CH3结构域中，氨基酸残基被具有较大侧链体积的氨基酸残基替换，从而在第一亚基的CH3结构域内产生突起，该突起可定位于第二亚基的CH3结构域内的空腔中，并且在Fc结构域的第二亚基的CH3结构域中，氨基酸残基被具有较小侧链体积的氨基酸残基替换，从而在第二亚基的CH3结构域内产生空腔，第一亚基的CH3结构域内的突起可定位在该空腔内。凸起和空腔可以通过改变编码多肽的核酸(例如通过位点特异性诱变或通过肽合成)来制备。在具体方面，在Fc结构域的第一亚基的CH3结构域中，366位处的苏氨酸残基被色氨酸残基(T366W)替换，而在Fc结构域的第二亚基的CH3结构域中，407位处的酪氨酸残基被缬氨酸残基(Y407V)替换。在一个方面，另外在Fc结构域的第二亚基中，366位处的苏氨酸残基被丝氨酸残基(T366S)替代，并且368位处的亮氨酸残基被丙氨酸残基(L368A)替代。
在又进一步的方面，另外在Fc结构域的第一亚基中，354位处的丝氨酸残基被半胱氨酸残基(S354C)替代，并且另外在Fc结构域的第二亚基中，349位的酪氨酸残基被半胱氨酸残基(Y349C)替代。引入这两个半胱氨酸残基导致在Fc结构域的两个亚基之间形成二硫桥，从而进一步稳定化二聚体(Carter(2001),J Immunol Methods 248,7-15)。在特定方面，Fc结构域的第一亚基包含氨基酸取代S354C和T366W(EU编号)并且Fc结构域的第二亚基包含氨基酸取代Y349C、T366S和Y407V(根据Kabat EU索引编号)。
但是，也可以替代地或另外地使用如EP 1 870 459所述的其他杵臼结构技术。在一个实施例中，多特异性抗体包含“杵链”的CH3结构域中的突变R409D和K370E，以及“臼链”的CH3结构域中的突变D399K和E357K(根据Kabat EU索引编号)。
在一个方面中，双特异性抗体包含“杵链”的CH3结构域中的T366W突变和“臼链”的CH3结构域中的突变T366S、L368A和Y407V，以及另外“杵链”的CH3结构域中的突变R409D和K370E和“臼链”的CH3结构域中的突变D399K和E357K(根据Kabat EU索引编号)。
在一个方面中，双特异性抗体包含在所述两个CH3结构域中的一个中的突变Y349C和T366W和在所述两个CH3结构域中的另一个中的突变S354C、T366S、L368A和Y407V，或者多特异性抗体包含在所述两个CH3结构域中的一个中的突变Y349C和T366W和在所述两个CH3结构域中的另一个中的突变S354C、T366S、L368A和Y407V以及另外在“杵链”的CH3结构域中的突变R409D和K370E和在“臼链”的CH3结构域中的突变D399K和E357K(根据Kabat EU索引编号)。
在一个替代的方面，促进Fc结构域的第一亚基和第二亚基的缔合的修饰包括介导静电转向效应的修饰，例如在PCT公开WO 2009/089004中所描述的。通常，该方法涉及用带电荷的氨基酸残基取代两个Fc结构域亚基的界面处的一个或多个氨基酸残基，使得同源二聚体形成变得在静电上不利，但异源二聚化在静电上有利。
除了“杵臼结构技术”之外，用于修饰多特异性抗体的重链的CH3结构域以实施异源二聚化的其他技术也是本领域中已知的。这些技术，尤其是在WO 96/27011、WO 98/050431、EP 1870459、WO 2007/110205、WO 2007/147901、WO 2009/089004、WO 2010/129304、WO 2011/90754、WO 2011/143545、WO 2012/058768、WO 2013/157954和WO 2013/096291中描述的技术，在本文中被认为是“杵臼结构技术”与双特异性抗体的组合的替代方案。
在一个方面中，在双特异性抗体中，使用EP 1870459中描述的方法来支持多特异性抗体的第一重链和第二重链的异源二聚化。该方法基于在第一和第二重链两者之间的CH3/CH3-结构域-界面中的特定氨基酸位处引入带相反电荷的带电氨基酸。
因此，在多特异性抗体的三级结构的该方面中，第一重链的CH3结构域和第二重链的CH3结构域形成位于相应的抗体CH3结构域之间的界面，其中第一重链的CH3结构域的相应氨基酸序列和第二重链的CH3结构域的氨基酸序列各自包含位于所述抗体的三级结构中的所述界面内的一组氨基酸，其中从位于一条重链的CH3结构域中的界面中的所述一组氨基酸，第一氨基酸被带正电荷的氨基酸取代，并且从位于另一条重链的CH3结构域中的界面中的所述一组氨基酸，第二氨基酸被带负电荷的氨基酸取代。根据该方面的双特异性抗体在本文中也称为“CH3(+/-)工程化的双特异性抗体”(其中缩写“+/-”代表在相应CH3结构域中引入的带相反电荷的氨基酸)。
在一个方面中，在CH3(+/-)工程化的双特异性抗体中，带正电荷的氨基酸选自K、R和H，而带负电荷的氨基酸选自E或D。
在一个方面中，在CH3(+/-)工程化的双特异性抗体中，带正电荷的氨基酸选自K和R，而带负电荷的氨基酸选自E或D。
在一个方面中，在CH3(+/-)工程化的双特异性抗体中，带正电荷的氨基酸是K，而带负电荷的氨基酸是E。
在一个方面中，在一条重链的CH3结构域中的CH3(+/-)工程化的双特异性抗体中，409位处的氨基酸R被D取代并且位处的氨基酸K被E取代，而在另一条重链的CH3结构域中，399位的氨基酸D被K取代并且357位处的氨基酸E被K取代(根据Kabat EU索引编号)。
在一个方面中，使用WO 2013/157953中描述的方法来支持多特异性抗体的第一重链和第二重链的异源二聚化。在一个实施例中，在一条重链的CH3结构域中，366位处的氨基酸T被K取代，而在另一条重链的CH3结构域中，351位处的氨基酸L被D取代(根据Kabat EU索引编号)。在另一个实施例中，在一条重链的CH3结构域中，366位处的氨基酸T被K取代并且351位处的氨基酸L被K取代，而在另一条重链的CH3结构域中，351位处的氨基酸L被D取代(根据Kabat EU索引编号)。
在另一个方面中，在一条重链的CH3结构域中，366位处的氨基酸T被K取代并且351位处的氨基酸L被K取代，而在另一条重链的CH3结构域中，351位处的氨基酸L被D取代(根据Kabat EU索引编号)。另外，下列取代中的至少一种取代包含在另一条重链的CH3结构域中：349位处的氨基酸Y被E取代，349位处的氨基酸Y被D取代，并且368位处的氨基酸L被E取代(根据Kabat EU索引编号)。在一个实施例中，368位处的氨基酸L被E取代(根据Kabat EU索引编号)。
在一个方面中，使用WO 2012/058768中描述的方法来支持多特异性抗体的第一重链和第二重链的异源二聚化。在一个方面中，在一条重链的CH3结构域中，351位处的氨基酸L被Y取代并且407位处的氨基酸Y被A取代，而在另一条重链的CH3结构域中，366位处的氨基酸T被A取代并且409位处的氨基酸K被F取代(根据Kabat EU索引编号)。在另一个实施例中，除了上述取代之外，在另一条重链的CH3结构域中，411位处的氨基酸(最初为T)、399位处的氨基酸(最初为D)、400位处的氨基酸(最初为S)、405位处的氨基酸(最初为F)、390位处的氨基酸(最初为N)和392位处的氨基酸(最初为K)中的至少一个氨基酸被取代(根据Kabat EU索引编号)。优选的取代是：
-用选自N、R、Q、K、D、E和W的氨基酸取代411位处的氨基酸T(根据Kabat EU索引编号)，
-用选自R、W、Y和K的氨基酸取代399位处的氨基酸D(根据Kabat EU索引编号)，
-用选自E、D、R和K的氨基酸取代400位处的氨基酸S(根据Kabat EU索引编号)，
-用选自I、M、T、S、V和W的氨基酸取代405位处的氨基酸F(根据Kabat EU索引编号)；
-用选自R、K和D的氨基酸取代390位处的氨基酸N(根据Kabat EU索引编号)；以及
-用选自V、M、R、L、F和E的氨基酸取代392位处的氨基酸K(根据Kabat EU索引编号)。
在另一个方面中，根据WO 2012/058768对双特异性抗体进行工程化，即在一条重链的CH3结构域中，351位处的氨基酸L被Y取代并且407位处的氨基酸Y被A取代，而在另一条重链的CH3结构域中，366位处的氨基酸T被V取代并且409位处的氨基酸K被F取代(根据Kabat EU索引编号)。在多特异性抗体的另一个实施例中，在一条重链的CH3结构域中，407位处的氨基酸Y被A取代，而在另一条重链的CH3结构域中，366位处的氨基酸T被A取代并且409位处的氨基酸K被F取代(根据Kabat EU索引编号)。在最后一个上述实施例中，在另一条重链的CH3结构域中，392位处的氨基酸K被E取代，411位处的氨基酸T被E取代，399位处的氨基酸D被R取代，并且400位处的氨基酸S被R取代(根据Kabat EU索引编号)。
在一个方面中，使用WO 2011/143545中描述的方法来支持多特异性抗体的第一重链和第二重链的异源二聚化。在一个方面中，在两条重链的CH3结构域中在368和/或409位处引入氨基酸修饰(根据Kabat EU索引编号)。
在一个方面中，使用WO 2011/090762中描述的方法来支持双特异性抗体的第一重链和第二重链的异源二聚化。WO 2011/090762涉及根据“杵臼结构”(KiH)技术的氨基酸修饰。在一个实施例中，在一条重链的CH3结构域中，366位处的氨基酸T被W取代，而在另一条重链的CH3结构域中，407位处的氨基酸Y被A取代(根据Kabat EU索引编号)。在另一个实施例中，在一条重链的CH3结构域中，366位处的氨基酸T被Y取代，而在另一条重链的CH3结构域中，407位处的氨基酸Y被T取代(根据Kabat EU索引编号)。
在一个方面中，使用WO 2009/089004中描述的方法来支持双特异性抗体的第一重链和第二重链的异源二聚化。在一个实施例中，在一条重链的CH3结构域中，392位处的氨基酸K或N被带负电荷的氨基酸取代(在一个实施例中被E或D取代，在一个优选实施例中被D取代)，而在另一条重链的CH3结构域中，399位处的氨基酸D、356位处的氨基酸E或D或357位处的氨基酸E被带正电荷的氨基酸取代(在一个实施例中被K或R取代，在一个优选实施例中被K取代，在一个优选的实施例中，399或356位处的氨基酸被K取代)(根据Kabat EU索引编号)。在另一个实施例中，除了上述取代之外，在一条重链的CH3结构域中，409位处的氨基酸K或R被带负电荷的氨基酸取代(在一个实施例中被E或D取代，在一个优选实施例中被D取代)(根据Kabat EU索引编号)。在另一方面中，作为上述取代的补充或作为上述取代的替代，在一条重链的CH3结构域中，439位处的氨基酸K和/或370位处的氨基酸K彼此独立地被带负电荷的氨基酸取代(在一个实施例中被E或D取代，在一个优选实施例中被D取代)(根据Kabat EU索引编号)。
在一个方面中，使用WO 2007/147901中描述的方法来支持多特异性抗体的第一重链和第二重链的异源二聚化。在一个实施例中，在一条重链的CH3结构域中，253位处的氨基酸K被E取代，282位处的氨基酸D被K取代，并且322位的氨基酸K被D取代，而在另一条重链的CH3结构域中，239位处的氨基酸D被K取代，240位处的氨基酸E被K取代，并且292位处的氨基酸K被D取代(根据Kabat EU索引编号)。
如本文报道的双特异性抗体的重链的C末端可以是以氨基酸残基PGK结束的完整C末端。重链的C末端可以是缩短的C末端，在所述缩短的C末端中已经去除了一个或两个C末端氨基酸残基。在一个优选的方面，重链的C末端是以PG结束的缩短的C末端。
在本文报道的所有方面中的一个方面，如本文所指定的包含含有C-末端CH3结构域的重链的双特异性抗体，包含C-末端甘氨酸-赖氨酸二肽(G446和K447，根据Kabat EU索引编号)。在本文报道的所有方面的一个实施例中，如本文所指定的包含含有C末端CH3结构域的重链的双特异性抗体，包含C末端甘氨酸残基(G446，根据Kabat EU索引编号)。
iii.Fab结构域中的修饰
在一个方面，本发明涉及一种双特异性抗体，其包含与PD-1特异性结合的第一Fab片段和与LAG3特异性结合的第二Fab片段，其中在Fab片段的一个中，可变结构域VH和VL或恒定结构域CH1和CL被交换。根据Crossmab技术制备双特异性抗体。
在WO2009/080252、WO2009/080253和Schaefer,W.等人，PNAS,108(2011)11187-1191中详细描述了在一个结合臂中具有结构域置换/交换的多特异性抗体(CrossMabVH-VL或CrossMabCH-CL)。它们明显减少了由针对第一抗原的轻链与针对第二抗原的错误重链的错配导致的副产物(与没有此类结构域交换的方法相比)。
在一个具体方面中，本发明涉及一种双特异性抗体，其包含特异性结合PD-1的第一Fab片段和特异性结合LAG3的第二Fab片段，其中在所述Fab片段中的一个中，可变结构域VL和VH彼此替换，使得所述VH结构域是轻链的一部分而所述VL结构域是重链的一部分。在一个具体方面中，双特异性抗体是这样的双特异性抗体，其中在包含与PD-1特异性结合的抗原结合结构域的第一Fab片段中，可变结构域VL和VH彼此替换。
在另一方面中，并且为了进一步改善正确的配对，包含特异性结合PD-1的第一Fab片段和特异性结合LAG3的第二Fab片段的双特异性抗体可含有不同的带电氨基酸取代(所谓的“带电残基”)。将这些修饰引入交叉或非交叉的CH1和CL结构域中。例如在WO2015/150447、WO2016/020309和PCT/EP2016/073408中描述了此类修饰。
在一个特定方面中，本发明涉及一种双特异性抗体，其包含特异性结合PD-1的第一Fab片段和特异性结合LAG3的第二Fab片段，其中在恒定结构域CL中的Fab片段的一个中，124位处的氨基酸被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)独立地取代(根据Kabat EU索引编号)，而在恒定结构域CH1中147位和213位处的氨基酸被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)独立地取代(根据Kabat EU索引编号)。在一个特定方面中，双特异性抗体是这样的双特异性抗体，其中在包含特异性结合TIM3的抗原结合结构域的第二Fab片段中，在恒定结构域CL中124位处的氨基酸被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)独立地取代(根据Kabat EU索引编号)，并且在恒定结构域CH1中，147位和213位处的氨基酸被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)独立地取代(根据Kabat EU索引编号)。
在一个特定方面中，本发明涉及一种双特异性抗体，其包含特异性结合PD-1的第一Fab片段和特异性结合LAG3的第二Fab片段，其中在CL结构域中的一个中，123位(EU编号)处的氨基酸已经被精氨酸(R)取代并且124位(EU编号)处的氨基酸已经被赖氨酸(K)取代，而其中在CH1结构域的一个中，147位(EU编号)和213位(EU编号)处的氨基酸已经被谷氨酸(E)取代。在一个特定的方面中，双特异性抗体是这样的双特异性抗体，其中在包含与LAG3特异性结合的抗原结合结构域的第二Fab片段中，第123位(EU编号)的氨基酸已被精氨酸(R)取代并且第124位(EU编号)的氨基酸已被赖氨酸(K)取代，而其中在CH1结构域中的一个中，第147位(EU编号)和第213位(EU编号)的氨基酸已被谷氨酸(E)取代。
在另一方面中，双特异性抗体是二价抗体，其包含
a)特异性结合第一抗原的抗体的第一轻链和第一重链，以及
b)特异性结合第二抗原的抗体的第二轻链和第二重链，其中所述第二轻链和所述第二重链的可变结构域VL和VH彼此替换。
a)下的抗体不含有如b)下报道的修饰，并且a)下的重链和轻链是分离的链。
在b)下的抗体中，在轻链内可变轻链结构域VL被所述抗体的可变重链结构域VH替换，而在重链内可变重链结构域VH被所述抗体的可变轻链结构域VL替换。
在一个方面，(i)在a)下的第一轻链的恒定结构域CL中，124位(根据Kabat编号)处的氨基酸被带正电荷的氨基酸取代，而其中在a)下的第一重链的恒定结构域CH1中，147位处的氨基酸或213位处的氨基酸(根据Kabat EU索引编号)被带负电荷的氨基酸取代；或(ii)在b)下的第二轻链的恒定结构域CL中，124位(根据Kabat编号)处的氨基酸被带正电荷的氨基酸取代，而其中在b)下的第二重链的恒定结构域CH1中，147位处的氨基酸或213位处的氨基酸(根据Kabat EU索引编号)被带负电荷的氨基酸取代。
在另一方面中，(i)在a)下的第一轻链的恒定结构域CL中，124位处的氨基酸被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)独立地取代(根据Kabat编号)(在一个优选的实施例中，被赖氨酸(K)或精氨酸(R)独立地取代)，而其中在a)下的第一重链的恒定结构域CH1中，147位处的氨基酸或213位处的氨基酸被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)独立地取代(根据Kabat EU索引编号)；或(ii)在b)下的第二轻链的恒定结构域CL中，124位处的氨基酸被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)独立地取代(根据Kabat编号)(在一个优选的实施例中，被赖氨酸(K)或精氨酸(R)独立地取代)，而其中在b)下的第二重链的恒定结构域CH1中，147位处的氨基酸或213位处的氨基酸被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)独立地取代(根据Kabat EU索引编号)。
在一个方面中，在第二重链的恒定结构域CL中，124位和123位处的氨基酸被K取代(根据Kabat EU索引编号)。
在一个方面中，在第二重链的恒定结构域CL中，123位处的氨基酸被R取代并且124位处的氨基酸被K取代(根据Kabat EU索引编号)。
在一个方面中，在第二轻链的恒定结构域CH1中，147位和213位处的氨基酸被E取代(根据Kabat EU索引编号)。
在一个方面中，在第一轻链的恒定结构域CL中，124位和123位处的氨基酸被K取代，而在第一重链的恒定结构域CH1中，147位和213位处的氨基酸被E取代(根据Kabat EU索引编号)。
在一个方面中，在第一轻链的恒定结构域CL中，123位处的氨基酸被R取代并且124位处的氨基酸被K取代，而在第一重链的恒定结构域CH1中，147位和213位的氨基酸都被E取代(根据Kabat EU索引编号)。
在一个方面中，在第二重链的恒定结构域CL中，124位和123位处的氨基酸被K取代，并且其中在第二轻链的恒定结构域CH1中，147位和213位处的氨基酸被E取代；在第一轻链的可变结构域VL中，38位处的氨基酸被K取代；在第一重链的可变结构域VH中，39位处的氨基酸被E取代；在第二重链的可变结构域VL中，38位处的氨基酸被K取代；并且在第二轻链的可变结构域VH中，39位处的氨基酸被E取代(根据Kabat EU索引编号)。
在一个方面中，双特异性抗体是二价抗体，其包含
a)特异性结合第一抗原的抗体的第一轻链和第一重链，以及
b)特异性结合第二抗原的抗体的第二轻链和第二重链，其中第二轻链和第二重链的可变结构域VL和VH彼此替换，而其中第二轻链和第二重链的恒定结构域CL和CH1彼此替换。
a)下的抗体不含有如b)下报道的修饰，并且a)下的重链和轻链是分离的链。在b)下的抗体中，在轻链内，可变轻链结构域VL被所述抗体的可变重链结构域VH替换，而恒定轻链结构域CL被所述抗体的恒定重链结构域CH1替换；在重链内，可变重链结构域VH被所述抗体的可变轻链结构域VL替换，而恒定重链结构域CH1被所述抗体的恒定轻链结构域CL替换。
在一个方面中，双特异性抗体是二价抗体，其包含
a)特异性结合第一抗原的抗体的第一轻链和第一重链，以及
b)特异性结合第二抗原的抗体的第二轻链和第二重链，其中所述第二轻链和所述第二重链的恒定结构域CL和CH1彼此替换。
a)下的抗体不含有如b)下报道的修饰，并且a)下的重链和轻链是分离的链。在b)下的抗体中，在轻链内，恒定轻链结构域CL被所述抗体的恒定重链结构域CH1替换；而在重链内，恒定重链结构域CH1被所述抗体的恒定轻链结构域CL替换。
在一个方面中，双特异性抗体是包含以下各项的双特异性抗体
a)全长抗体，其特异性结合第一抗原并由两条抗体重链和两条抗体轻链组成；以及
b)特异性结合第二抗原的一个、两个、三个或四个单链Fab片段，
其中b)下的所述单链Fab片段经由在所述全长抗体的重链或轻链的C末端或N末端处的肽接头与a)下的所述全长抗体融合。
在一个方面中，结合第二抗原的一个或两个相同的单链Fab片段经由在所述全长抗体的重链或轻链的C末端处的肽接头与所述全长抗体融合。
在一个方面中，结合第二抗原的一个或两个相同的单链Fab(scFab)片段经由在所述全长抗体的重链的C末端处的肽接头与所述全长抗体融合。
在一个方面中，结合第二抗原的一个或两个相同的单链Fab(scFab)片段经由在所述全长抗体的轻链的C末端处的肽接头与所述全长抗体融合。
在一个方面中，结合第二抗原的两个相同的单链Fab(scFab)片段经由在所述全长抗体的每条重链或轻链的C末端处的肽接头与所述全长抗体融合。
在一个方面中，结合第二抗原的两个相同的单链Fab(scFab)片段经由在所述全长抗体的每条重链的C末端处的肽接头与所述全长抗体融合。
在一个方面中，结合第二抗原的两个相同的单链Fab(scFab)片段经由在所述全长抗体的每条轻链的C末端处的肽接头与所述全长抗体融合。
在一个方面中，双特异性抗体是三价抗体，其包含
a)全长抗体，所述全长抗体特异性结合第一抗原并由两条抗体重链和两条抗体轻链组成，
b)第一多肽，其由以下项组成：
ba)抗体重链可变结构域(VH)，或
bb)抗体重链可变结构域(VH)和抗体恒定结构域1(CH1)，
其中所述第一多肽以其VH结构域的N末端经由肽接头与所述全长抗体的两条重链中的一条的C末端融合，
c)第二多肽，其由以下项组成：
ca)抗体轻链可变结构域(VL)，或
cb)抗体轻链可变结构域(VL)和抗体轻链恒定结构域(CL)，
其中所述第二多肽以VL结构域的N末端经由肽接头与所述全长抗体的两条重链中的另一条的C末端融合，并且
其中第一多肽的抗体重链可变结构域(VH)和第二多肽的抗体轻链可变结构域(VL)一起形成特异性结合第二抗原的抗原结合结构域。
在一个方面中，b)下的多肽的抗体重链可变结构域(VH)和c)下的多肽的抗体轻链可变结构域(VL)通过在以下位置之间引入二硫键而经由链间二硫桥连接和稳定化：
(i)重链可变结构域44位至轻链可变结构域100位，或
(ii)重链可变结构域105位至轻链可变结构域43位，或
(iii)重链可变结构域101位至轻链可变结构域100位(总是根据Kabat EU索引编号)。
引入非天然二硫桥以稳定化的技术描述于例如WO 94/029350，Rajagopal,V.等人,Prot.Eng.(1997)1453-1459；Kobayashi,H.等人,Nucl.Med.Biol.25(1998)387-393；和Schmidt,M.等人,Oncogene 18(1999)1711-1721。在一个实施例中，b)和c)下多肽的可变结构域之间的任选二硫键在重链可变结构域44位与轻链可变结构域100位之间。在一个实施例中，b)和c)下多肽的可变结构域之间的任选二硫键在重链可变结构域105位与轻链可变结构域43位之间(总是根据Kabat编号)。在一个实施例中，在单链Fab片段的可变结构域VH与VL之间没有所述任选的二硫键稳定化的三价双特异性抗体是优选的。
在一个方面中，双特异性抗体是包含以下项的三特异性或四特异性抗体
a)特异性结合第一抗原的全长抗体的第一轻链和第一重链，以及
b)特异性结合第二抗原的全长抗体的第二(修饰的)轻链和第二(修饰的)重链，其中可变结构域VL和VH彼此替换，和/或其中恒定结构域CL和CH1彼此替换，并且
c)其中特异性结合一种或两种其他抗原(即第三种和/或第四种抗原)的一至四个抗原结合结构域经由肽接头与a)和/或b)的轻链或重链的C末端或N末端融合。
a)下的抗体不含有如b)下报道的修饰，并且a)下的重链和轻链是分离的链。
在一个方面中，在c)下三特异性或四特异性抗体包含特异性结合一种或两种其他抗原的一个或两个抗原结合结构域。
在一个方面中，抗原结合结构域选自由scFv片段和scFab片段组成的组。
在一个方面中，抗原结合结构域是scFv片段。
在一个方面中，抗原结合结构域是scFab片段。
在一个方面中，抗原结合结构域与a)和/或b)下的重链的C末端融合。
在一个方面中，在c)下三特异性或四特异性抗体包含特异性结合另一种抗原的一个或两个抗原结合结构域。
在一个方面中，在c)下三特异性或四特异性抗体包含特异性结合第三抗原的两个相同的抗原结合结构域。在一个优选的实施例中，此类两个相同的抗原结合结构域均经由相同的肽接头与a)和b)下的重链的C末端融合。在一个优选的实施例中，两个相同的抗原结合结构域是scFv片段或scFab片段。
在一个方面中，在c)下三特异性或四特异性抗体包含特异性结合第三和第四抗原的两个抗原结合结构域。在一个实施例中，所述两个抗原结合结构域经由相同的肽接头与a)和b)下的重链的C末端融合。在一个优选的实施例中，所述两个抗原结合结构域是scFv片段或scFab片段。
在一个方面中，双特异性抗体是双特异性的四价抗体，其包含
a)特异性结合第一抗原(并包含两个Fab片段)的抗体的两条轻链和两条重链，
b)特异性结合第二抗原的抗体的另外两个Fab片段，其中所述另外的Fab片段均经由肽接头与a)的重链的C末端或N末端融合，并且
其中在Fab片段中执行以下修饰
(i)在a)的两个Fab片段中，或在b)的两个Fab片段中，可变结构域VL和VH彼此替换，和/或恒定结构域CL和CH1彼此替换，或者
(ii)在a)的两个Fab片段中，可变结构域VL和VH彼此替换，并且恒定结构域CL和CH1彼此替换，而在b)的两个Fab片段中，可变结构域VL和VH彼此替换，或恒定结构域CL和CH1彼此替换，或者
(iii)在a)的两个Fab片段中，可变结构域VL和VH彼此替换，或恒定结构域CL和CH1彼此替换，而在b)的两个Fab片段中，可变结构域VL和VH彼此替换，并且恒定结构域CL和CH1彼此替换，或者
(iv)在a)的两个Fab片段中，可变结构域VL和VH彼此替换，而在b)的两个Fab片段中，恒定结构域CL和CH1彼此替换，或者
(v)在a)的两个Fab片段中，恒定结构域CL和CH1彼此替换，而在b)的两个Fab片段中，可变结构域VL和VH彼此替换。
在一个方面中，所述另外的Fab片段均经由肽接头与a)的重链的C末端或a)的重链的N末端融合。
在一个方面中，所述另外的Fab片段经由肽接头与a)的重链的C末端融合。
在一个方面中，所述另外的Fab片段经由肽接头与a)的重链的N末端融合。
在一个方面中，在Fab片段中，执行以下修饰：在a)的两个Fab片段中，或在b)的两个Fab片段中，可变结构域VL和VH彼此替换，和/或恒定结构域CL和CH1彼此替换。
在一个方面中，双特异性抗体是四价抗体，其包含：
a)特异性结合第一抗原并且包含第一VH-CH1结构域对的第一抗体的(经修饰的)重链，其中所述第一抗体的第二VH-CH1结构域对的N末端经由肽接头与所述重链的C末端融合，
b)a)的所述第一抗体的两条轻链，
c)特异性结合第二抗原并包含第一VH-CL结构域对的第二抗体的(经修饰的)重链，其中所述第二抗体的第二VH-CL结构域对的N末端经由肽接头与所述重链的C末端融合，以及
d)c)的所述第二抗体的两条(经修饰的)轻链，每条轻链包含CL-CH1结构域对。
在一个方面中，双特异性抗体包含
a)特异性结合第一抗原的第一全长抗体的重链和轻链，以及
b)特异性结合第二抗原的第二全长抗体的重链和轻链，其中所述重链的N末端经由肽接头连接至所述轻链的C末端。
a)下的抗体不含有如b)下报道的修饰，并且重链和轻链是分离的链。
在一个方面中，双特异性抗体包含
a)全长抗体，其特异性结合第一抗原并由两条抗体重链和两条抗体轻链组成；以及
b)特异性结合第二抗原的Fv片段，所述Fv片段包含VH2结构域和VL2结构域，其中所述两个结构域经由二硫桥相互连接，
其中只有VH2结构域或VL2结构域中的一者经由肽接头与特异性结合第一抗原的全长抗体的重链或轻链融合。
在双特异性抗体中，a)下的重链和轻链是分离的链。
在一个方面中，VH2结构域或VL2结构域中的另一个不经由肽接头与特异性结合第一抗原的全长抗体的重链或轻链融合。
在本文报道的所有方面中，第一轻链包含VL结构域和CL结构域，并且第一重链包含VH结构域、CH1结构域、铰链区、CH2结构域和CH3结构域。
在一个方面中，双特异性抗体是三价抗体，其包含
a)特异性结合第一抗原的两个Fab片段，
b)特异性结合第二抗原的一个CrossFab片段，在所述CrossFab片段中CH1和CL结构域彼此交换，
c)一个Fc区，其包含第一Fc区重链和第二Fc区重链，
其中两个Fab片段的CH1结构域的C末端连接到重链Fc区多肽的N末端，而其中CrossFab片段的CL结构域的C末端连接到Fab片段中的一个的VH结构域的N末端。
在一个方面中，双特异性抗体是三价抗体，其包含
a)特异性结合第一抗原的两个Fab片段，
b)特异性结合第二抗原的一个CrossFab片段，在所述CrossFab片段中CH1和CL结构域彼此交换，
c)一个Fc区，其包含第一Fc区重链和第二Fc区重链，
其中第一Fab片段的CH1结构域的C末端连接到重链Fc区多肽中的一个的N末端，并且CrossFab片段的CL结构域的C末端连接到另一重链Fc区多肽的N末端，而其中第二Fab片段的CH1结构域的C末端连接到第一Fab片段的VH结构域的N末端或连接到CrossFab片段的VH结构域的N末端。
在一个方面中，双特异性抗体包含
a)全长抗体，其特异性结合第一抗原并由两条抗体重链和两条抗体轻链组成；以及
b)特异性结合第二抗原的Fab片段，所述Fab片段包含构成重链片段和轻链片段的VH2结构域和VL2结构域，其中在所述轻链片段内，可变轻链结构域VL2被所述抗体的可变重链结构域VH2替换，而在所述重链片段内，可变重链结构域VH2被所述抗体的可变轻链结构域VL2替换，
其中重链Fab片段***在所述全长抗体的重链中的一条的CH1结构域与所述全长抗体的相应Fc区之间，并且轻链Fab片段的N末端缀合至所述全长抗体的轻链的C末端，所述全长抗体的轻链与已***所述重链Fab片段的所述全长抗体的重链配对。
在一个方面中，双特异性抗体包含
a)全长抗体，其特异性结合第一抗原并由两条抗体重链和两条抗体轻链组成；以及
b)特异性结合第二抗原的Fab片段，所述Fab片段包含含有重链片段和轻链片段的VH2结构域和VL2结构域，其中在所述轻链片段内，可变轻链结构域VL2被所述抗体的可变重链结构域VH2替换，而在所述重链片段内，可变重链结构域VH2被所述抗体的可变轻链结构域VL2替换，并且其中所述Fab片段的所述重链片段的C末端缀合至所述全长抗体的重链中的一条的N末端，并且所述Fab片段的所述轻链片段的C末端缀合至所述全长抗体的所述轻链的N末端，所述全长抗体的轻链与所述Fab片段的重链片段缀合至的所述全长抗体的重链配对。
B.与PD-1和LAG3结合的双特异性抗体的给药
为了预防或治疗疾病，本发明的包含与PD-1特异性结合的第一抗原结合结构域和与LAG3特异性结合的第二抗原结合结构域的双特异性抗体(当单独使用或与一种或多种附加治疗剂组合使用时)的适当剂量将取决于待治疗疾病的类型、施用途径、受试者的体重、融合蛋白的类型、疾病的严重程度和进程、双特异性抗体是出于预防还是治疗目的而施用、先前或同时进行的治疗性干预、受试者的临床病史和对融合蛋白的反应，以及主治医师的判断力。在任何情况下，负责施用的执业者将针对个体受试者来确定组合物中活性成分的浓度和适当剂量。本文考虑了各种投配时间安排，包括但不限于在各个时间点处的单次或多次施用、推注施用，以及脉冲输注。
如本文所定义的包含与PD-1特异性结合的第一抗原结合结构域和与LAG3特异性结合的第二抗原结合结构域的双特异性抗体在一个时刻或在一系列治疗中被适当地施用于受试者。取决于疾病的类型和严重性，约1μg/kg至15mg/kg(例如0.1mg/kg-10mg/kg)的双特异性抗体可以是例如通过一次或多次单独施用或通过连续输注而施用于受试者的初始候选剂量。取决于上述因素，一种典型的日剂量的范围可以为约1μg/kg至100mg/kg或更多。对于数天或更长时间的重复施用，取决于病症，治疗通常会持续直至发生所需的疾病症状抑制。双特异性抗体的一种示例性的剂量的范围为约0.005mg/kg至约10mg/kg。在其他示例中，剂量还可包括每次施用约1μg/kg体重、约5μg/kg体重、约10μg/kg体重、约50μg/kg体重、约100μg/kg体重、约200μg/kg体重、约350μg/kg体重、约500μg/kg体重、约1mg/kg体重、约5mg/kg体重、约10mg/kg体重、约50mg/kg体重、约100mg/kg体重、约200mg/kg体重、约350mg/kg体重、约500mg/kg体重至约1000mg/kg体重或更多，以及其中可推导出的任何范围。在从本文所列数字可推导出的范围的示例中，可以基于上述数字施用约5mg/kg体重至约100mg/kg体重、约5μg/kg体重至约500mg/kg体重等的范围。因此，可以向受试者施用约0.5mg/kg、2.0mg/kg、5.0mg/kg或10mg/kg(或它们的任何组合)中的一种或多种剂量。此类剂量可以间歇地施用，例如，每周或每三周施用(例如，使得受试者接受约两个至约二十个或例如约六个剂量的融合蛋白)。可施用初始较高负荷剂量，然后施用一种或多种较低剂量。然而，其他剂量方案可能有用。通过常规技术和测定可以容易地监测该疗法的进展。
在一个特定方面，每三周(Q3W)以约600mg的固定剂量，例如以600mg Q3W的固定剂量向受试者施用靶向PD-1和LAG3的双特异性抗体。
在另一个方面，每三周以约1200mg的固定剂量，例如以1200mg Q3W的固定剂量向受试者施用靶向PD-1和LAG3的双特异性抗体。
在另一个方面，每两周(Q2W)以约2100mg的固定剂量，例如以2100mg Q2W的固定剂量向受试者施用靶向PD-1和LAG3的双特异性抗体。
IX.VEGF拮抗剂
VEGF拮抗剂包括能够与VEGF结合、降低VEGF表达水平或中和、阻断、抑制、消除、降低或干扰VEGF生物活性的任何分子。示例性的人VEGF在UniProtKB/Swiss-Prot登录号P15692，基因ID(NCBI)：7422中示出。
在一些情况下，VEGF拮抗剂为抗VEGF抗体。在一些实施例中，抗VEGF抗体为贝伐单抗，也称为“rhuMab VEGF”或贝伐单抗为根据Presta等人(CancerRes.57:4593-4599,1997)生成的重组人源化抗VEGF单克隆抗体。它包含突变的人IgG1框架区和来自鼠抗hVEGF单克隆抗体A.4.6.1的阻断人VEGF与其受体结合的抗原结合互补决定区。贝伐珠单抗的约93％的氨基酸序列，包括大部分框架区，来源于人IgG1，并且约7％的序列来源于鼠抗体A4.6.1。贝伐单抗具有约149,000道尔顿的分子量并且经糖基化。贝伐单抗和其他人源化抗VEGF抗体进一步描述于2005年2月26日授权的美国专利号6,884,879，其全部公开内容通过引用明确并入本文。
其他优选的抗体包括G6或B20系列抗体(例如，G6-31、B20-4.1)，如PCT申请公开号WO 2005/012359中所述。对于另外的优选抗体，参见美国专利号7,060,269、6,582,959、6,703,020；6,054,297；WO98/45332；WO 96/30046；WO94/10202；EP 0666868B1；美国专利申请公开号2006009360、20050186208、20030206899、20030190317、20030203409和20050112126；和Popkov等人(Journal of Immunological Methods 288:149-164,2004)。其他优选抗体包括与人VEGF上的功能表位结合的抗体，该表位包含残基F17、M18、D19、Y21、Y25、Q89、191、K101、E103和C104，或者替代地，包含残基F17、Y21、Q22、Y25、D63、183和Q89。
在其他情况下，VEGF拮抗剂为抗VEGFR2抗体或相关分子(例如，雷莫芦单抗(ramucirumab)、tanibirumab、阿柏西普(aflibercept))；抗VEGFR1抗体或相关分子(例如，艾芦库单抗(icrucumab)、阿柏西普(VEGF Trap-Eye；)或ziv-阿柏西普(VEGFTrap；/>))；双特异性VEGF抗体(例如MP-0250、伐努赛珠单(vanucizumab)(VEGF-ANG2)或US2001/0236388中公开的双特异性抗体)；双特异性抗体，其包括抗VEGF、抗VEGFR1和抗VEGFR2臂中的两者的组合；抗VEGFA抗体(例如，贝伐单抗、塞伐单抗(sevacizumab))；抗VEGFB抗体；抗VEGFC抗体(例如，VGX-100)；抗VEGFD抗体；或非肽小分子VEGF拮抗剂(例如，帕唑帕尼(pazopanib)、阿西替尼(axitinib)、凡德他尼(vandetanib)、瑞戈非尼(stivarga)、卡博替尼(cabozantinib)、乐伐替尼(lenvatinib)、尼达尼布(nintedanib)、奥兰替尼(orantinib)、泰拉替尼(telatinib)、多维替尼(dovitinig)、西地拉尼(cediranib)、莫特塞尼(motesanib)、磺胺替尼(sulfatinib)、阿帕替尼(apatinib)、福瑞替尼(foretinib)、法米替尼(famitinib)或替沃扎尼(tivozanib))。在一些示例中，VEGF拮抗剂可以是酪氨酸激酶抑制剂，包括受体酪氨酸激酶抑制剂(例如，多重靶向受体酪氨酸激酶抑制剂，诸如舒尼替尼或阿西替尼)。
X.PD-1轴结合拮抗剂
PD-1轴结合拮抗剂可包括PD-L1结合拮抗剂、PD-1结合拮抗剂和PD-L2结合拮抗剂。任何合适的PD-1轴结合拮抗剂可以用于治疗患有癌症的受试者。
A.PD-L1结合拮抗剂
在一些情况下，PD-L1结合拮抗剂抑制PD-L1与其配体结合配偶体中的一者或多者的结合。在其他情况下，PD-L1结合拮抗剂抑制PD-L1与PD-1的结合。在又一些情况下，PD-L1结合拮抗剂抑制PD-L1与B7-1的结合。在一些情况下，PD-L1结合拮抗剂抑制PD-L1与PD-1和B7-1两者的结合。PD-L1结合拮抗剂可以是但不限于抗体、其抗原结合片段、免疫粘附素、融合蛋白、寡肽或小分子。在一些情况下，PD-L1结合拮抗剂为抑制PD-L1的小分子(例如，GS-4224、INCB086550、MAX-10181、INCB090244、CA-170或ABSK041)。在一些情况下，PD-L1结合拮抗剂为抑制PD-L1和VISTA的小分子。在一些情况下，PD-L1结合拮抗剂为CA-170(也称为AUPM-170)。在一些情况下，PD-L1结合拮抗剂为抑制PD-L1和TIM3的小分子。在一些情况下，该小分子为WO 2015/033301和WO 2015/033299中所述的化合物。
在一些情况下，PD-L1结合拮抗剂为抗PD-L1抗体。本文考虑并描述了多种抗PD-L1抗体。在本文的任何情况下，分离的抗PD-L1抗体可以与人PD-L1(例如UniProtKB/Swiss-Prot登录号Q9NZQ7-1中所示的人PD-L1，或其变体)结合。在一些情况下，抗PD-L1抗体能够抑制PD-L1与PD-1之间和/或PD-L1与B7-1之间的结合。在一些情况下，抗PD-L1抗体为单克隆抗体。在一些情况下，抗PD-L1抗体是选自由Fab、Fab'-SH、Fv、scFv和(Fab')2片段组成的组的抗体片段。在一些情况下，抗PD-L1抗体是人源化抗体。在一些情况下，抗PD-L1抗体是人抗体。示例性抗PD-L1抗体包括阿特珠单抗、MDX-1105、MEDI4736(德瓦鲁单抗)、MSB0010718C(阿维单抗)、SHR-1316、CS1001、恩沃利单抗、TQB2450、ZKAB001、LP-002、CX-072、IMC-001、KL-A167、APL-502、柯希利单抗、洛达利单抗、FAZ053、TG-1501、BGB-A333、BCD-135、AK-106、LDP、GR1405、HLX20、MSB2311、RC98、PDL-GEX、KD036、KY1003、YBL-007和HS-636。可用于本发明方法的抗PD-L1抗体的示例及其制备方法在国际专利申请公开号WO2010/077634和美国专利号8,217,149中描述，其各自通过引用整体并入本文。
在一些情况下，抗PD-L1抗体包含：
(a)GFTFSDSWIH(SEQ ID NO:64)、AWISPYGGSTYYADSVKG(SEQ ID NO:65)和RHWPGGFDY(SEQ ID NO:66)各自的HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3序列，以及
(b)RASQDVSTAVA(SEQ ID NO:67)、SASFLYS(SEQ ID NO:68)和QQYLYHPAT(SEQ IDNO:69)各自的HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3序列。
在一个实施例中，抗PD-L1抗体包含：
(a)包含以下氨基酸序列的重链可变区(VH)：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:70)，和
(b)包含以下氨基酸序列的轻链可变区(VL)：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYLYHPATFGQGTKVEIKR(SEQ ID NO:71)。
在一些情况下，抗PD-L1抗体包含(a)包含氨基酸序列的VH，该氨基酸序列包含与SEQ ID NO:9的序列具有至少95％的序列同一性(例如，至少95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性)或SEQ ID NO:9的序列；(b)包含氨基酸序列的VL，该氨基酸序列包含与SEQID NO:10的序列具有至少95％的序列同一性(例如，至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)或SEQ ID NO:10的序列；或者(c)如(a)中的VH和如(b)中的VL。
在一个实施例中，抗PD-L1抗体包括阿特珠单抗，其包含：
(a)以下重链氨基酸序列：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(SEQ ID NO:62)，和
(b)以下轻链氨基酸序列：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYLYHPATFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ IDNO:63)。
在一些情况下，抗PD-L1抗体为阿维单抗(CAS登记号：1537032-82-8)。阿维单抗，也称为MSB0010718C，是人单克隆IgG1抗PD-L1抗体(默克集团(Merck KGaA)，辉瑞公司)。
在一些情况下，抗PD-L1抗体为德瓦鲁单抗(CAS登记号：1428935-60-7)。德瓦鲁单抗，也称为MEDI4736，为WO 2011/066389和US 2013/034559中所述的Fc优化的人单克隆IgG1κ抗PD-L1抗体(MedImmune，阿斯利康)。
在一些情况下，抗PD-L1抗体为MDX-1105(百时美施贵宝公司(Bristol MyersSquibb))。MDX-1105，也称为BMS-936559，为WO 2007/005874中所述的抗PD-L1抗体。
在一些情况下，抗PD-L1抗体为LY3300054(礼来公司(Eli Lilly))。
在一些情况下，抗PD-L1抗体为STI-A1014(索伦托公司)。STI-A1014是人抗PD-L1抗体。
在一些情况下，抗PD-L1抗体为KN035(苏州康宁杰瑞公司(Suzhou Alphamab))。KN035是从骆驼噬菌体展示文库生成的单结构域抗体(dAB)。
在一些情况下，抗PD-L1抗体包含可裂解的部分或接头，当被(例如，通过肿瘤微环境中的蛋白酶)裂解时，该部分或连接子活化抗体抗原结合结构域以使其结合其抗原，例如，通过去除非结合空间部分进行。在一些情况下，抗PD-L1抗体为CX-072(CytomXTherapeutics)。
在一些情况下，抗PD-L1抗体包含来自以下专利中描述的抗PD-L1抗体的六个HVR序列(例如，三个重链HVR和三个轻链HVR)和/或重链可变结构域和轻链可变结构域：US20160108123、WO 2016/000619、WO 2012/145493、美国专利号9,205,148、WO 2013/181634或WO 2016/061142。
在更进一步具体方面，抗PD-L1抗体具有降低的或最小的效应子功能。在更进一步具体方面，最小的效应子功能来自“无效应子的Fc突变”或无糖基化突变。在更进一步的情况下，无效应子Fc突变是恒定区中的N297A或D265A/N297A取代。在更进一步的情况下，无效应子Fc突变是恒定区中的N297A取代。在一些情况下，分离的抗PD-L1抗体为无糖基化的。抗体的糖基化通常为N-连接或O-连接的。N-连接的是指碳水化合物部分连接至天冬酰胺残基的侧链。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸(其中X为脯氨酸以外的任何氨基酸)为用于将碳水化合物部分酶促连接至天冬酰胺侧链的识别序列。因此，多肽中这些三肽序列中任一者的存在产生潜在的糖基化位点。O-联糖基化是指糖N-乙酰基半乳糖胺、半乳糖或木糖中的一者与羟基氨基酸(最通常为丝氨酸或苏氨酸，尽管也可以使用5-羟基脯氨酸或5-羟基赖氨酸)的连接。通过改变氨基酸序列以去除上述三肽序列之一(对于N-连接的糖基化位点)，可以方便地从抗体去除糖基化位点。可以通过将糖基化位点内的天冬酰胺、丝氨酸或苏氨酸残基取代为另一氨基酸残基(例如，甘氨酸、丙氨酸或保守取代)来进行变异。
B.PD-1结合拮抗剂
在一些情况下，PD-1轴结合拮抗剂为PD-1结合拮抗剂。例如，在一些情况下，PD-1结合拮抗剂抑制PD-1与其配体结合配偶体中的一个或多个的结合。在一些情况下，PD-1结合拮抗剂抑制PD-1与PD-L1的结合。在其他情况下，PD-1结合拮抗剂抑制PD-1与PD-L2的结合。在又一些情况下，PD-1结合拮抗剂抑制PD-1与PD-L1和PD-L2两者的结合。PD-1结合拮抗剂可以是但不限于抗体、其抗原结合片段、免疫粘附素、融合蛋白、寡肽或小分子。在一些情况下，PD-1结合拮抗剂为免疫粘附素(例如，包含与恒定区(例如，免疫球蛋白序列的Fc区)融合的PD-L1或PD-L2的细胞外或PD-1结合部分的免疫粘附素)。例如，在一些情况下，PD-1结合拮抗剂为Fc融合蛋白。在一些情况下，PD-1结合拮抗剂为AMP-224。AMP-224也称为B7-DCIg，为WO 2010/027827和WO 2011/066342中所述的PD-L2-Fc融合可溶性受体。在一些情况下，PD-1结合拮抗剂为肽或小分子化合物。在一些情况下，PD-1结合拮抗剂为AUNP-12(皮尔法伯公司(PierreFabre)/Aurigene)。参见例如，WO 2012/168944、WO 2015/036927、WO2015/044900、WO 2015/033303、WO 2013/144704、WO 2013/132317和WO 2011/161699。在一些情况下，PD-1结合拮抗剂为抑制PD-1的小分子。
在一些情况下，PD-1结合拮抗剂为抗PD-1抗体。在本文公开的方法和用途中可以利用多种抗PD-1抗体。在本文的任何情况下，PD-1抗体可以与人PD-1或其变体结合。在一些情况下，抗PD-1抗体是单克隆抗体。在一些情况下，抗PD-1抗体为选自由以下项组成的组的抗体片段：Fab、Fab'、Fab'-SH、Fv、scFv和(Fab')2片段。在一些情况下，抗PD-1抗体为人源化抗体。在其他情况下，抗PD-1抗体为人抗体。示例性的抗PD-1拮抗剂抗体包括纳武单抗、帕博利珠单抗、MEDI-0680、PDR001(斯巴达珠单抗)、REGN2810(西米普利单抗)、BGB-108、帕洛利单抗、卡瑞利珠单抗、信迪利单抗、替雷利珠单抗、特瑞普利单抗、多塔利单抗、瑞弗利单抗、萨善利单抗、派安普利单抗、CS1003、HLX10、SCT-I10A、赛帕利单抗、巴替利单抗、杰诺单抗、BI 754091、西利单抗、YBL-006、BAT1306、HX008、布格利单抗、AMG 404、CX-188、JTX-4014、609A、Sym021、LZM009、F520、SG001、AM0001、ENUM 244C8、ENUM 388D4、STI-1110、AK-103和hAb21。
在一些情况下，抗PD-1抗体为纳武单抗(CAS登记号：946414-94-4)。纳武单抗(百时美施贵宝/大野制药(Ono))，也称为MDX-1106-04、MDX-1106、ONO-4538、BMS-936558和为WO 2006/121168中所述的抗PD-1抗体。
在一些情况下，抗PD-1抗体为帕博利珠单抗(CAS登记号：1374853-91-4)。帕博利珠单抗(默克)，也称为MK-3475、Merck 3475、派姆单抗、SCH-900475和为WO 2009/114335中所述的抗PD-1抗体。
在一些情况下，抗PD-1抗体为MEDI-0680(AMP-514；阿斯利康)。MEDI-0680为人源化IgG4抗PD-1抗体。
在一些情况下，抗PD-1抗体为PDR001(CAS注册号1859072-53-9；诺华)。PDR001为人源化IgG4抗PD-1抗体，可阻断PD-L1和PD-L2与PD-1的结合。
在一些情况下，抗PD-1抗体为REGN2810(再生元公司(Regeneron))。REGN2810是人抗PD-1抗体。
在一些情况下，抗PD-1抗体为BGB-108(百济神州)。
在一些情况下，抗PD-1抗体为BGB-A317(百济神州)。
在一些情况下，抗PD-1抗体为JS-001(上海君实生物)。JS-001为人源化抗PD-1抗体。
在一些情况下，抗PD-1抗体为STI-A1110(索伦托公司)。STI-A1110是人抗PD-1抗体。
在一些情况下，抗PD-1抗体为INCSHR-1210(因赛特医疗公司(Incyte))。INCSHR-1210为人IgG4抗PD-1抗体。
在一些情况下，抗PD-1抗体为PF-06801591(辉瑞公司)。
在一些情况下，抗PD-1抗体为TSR-042(也称为ANB011；Tesaro/AnaptysBio)。
在一些情况下，抗PD-1抗体为AM0001(ARMO Biosciences)。
在一些情况下，抗PD-1抗体为ENUM 244C8(Enumeral Biomedical Holdings)。ENUM 244C8为抗PD-1抗体，可抑制PD-1的功能而不阻止PD-L1与PD-1的结合。
在一些情况下，抗PD-1抗体为ENUM 388D4(Enumeral Biomedical Holdings)。ENUM 388D4是抗PD-1抗体，可竞争性抑制PD-L1与PD-1的结合。
在一些情况下，抗PD-1抗体包含来自以下专利中所述的抗PD-1抗体的六个HVR序列(例如，三个重链HVR和三个轻链HVR)和/或重链可变结构域和轻链可变结构域：WO 2015/112800、WO 2015/112805、WO 2015/112900、US20150210769、WO2016/089873、WO 2015/035606、WO 2015/085847、WO 2014/206107、WO 2012/145493、US 9,205,148、WO 2015/119930、WO 2015/119923、WO 2016/032927、WO 2014/179664、WO 2016/106160和WO 2014/194302。
在更进一步具体方面，抗PD-1抗体具有降低的或最小的效应子功能。在更进一步具体方面，最小的效应子功能来自“无效应子的Fc突变”或无糖基化突变。在更进一步的情况下，无效应子Fc突变是恒定区中的N297A或D265A/N297A取代。在一些情况下，分离的抗PD-1抗体为无糖基化的。
C.PD-L2结合拮抗剂
在一些情况下，PD-1轴结合拮抗剂为PD-L2结合拮抗剂。在一些情况下，PD-L2结合拮抗剂为抑制PD-L2与其配体结合配偶体结合的分子。在具体方面，PD-L2结合配体配偶体为PD-1。PD-L2结合拮抗剂可以是但不限于抗体、其抗原结合片段、免疫粘附素、融合蛋白、寡肽或小分子。
在一些情况下，PD-L2结合拮抗剂为抗PD-L2抗体。在本文的任何情况下，抗PD-L2抗体可以与人PD-L2或其变体结合。在一些情况下，抗PD-L2抗体为单克隆抗体。在一些情况下，抗PD-L2抗体为选自由以下项组成的组的抗体片段：Fab、Fab'、Fab'-SH、Fv、scFv和(Fab')2片段。在一些情况下，抗PD-L2抗体为人源化抗体。在其他情况下，抗PD-L2抗体为人抗体。在更进一步具体方面，抗PD-L2抗体具有降低的或最小的效应子功能。在更进一步具体方面，最小的效应子功能来自“无效应子的Fc突变”或无糖基化突变。在更进一步的情况下，无效应子Fc突变是恒定区中的N297A或D265A/N297A取代。在一些情况下，分离的抗PD-L2抗体为无糖基化的。
XI.药物组合物和制剂
本文还提供了药物组合物和制剂，其包含靶向PD-1和LAG3的双特异性抗体和任选的药用载体。本公开还提供了：(i)药物组合物和制剂，其包含靶向PD-1和LAG3的双特异性抗体和抗VEGF抗体(例如，贝伐单抗)以及任选的药用载体；和(ii)药物组合物和制剂，其包含抗TIGIT拮抗剂抗体和靶向PD-1和LAG3的双特异性抗体以及任选的药用载体。靶向PD-1和LAG3的双特异性抗体和/或本文所述的其他药剂(例如，***)的药物组合物和制剂可以通过将具有所需纯度的一种或多种药剂与一种或多种任选的药用载体(Remington’sPharmaceutical Sciences第16版,Osol,A.编(1980))混合来制备为冻干制剂或水溶液的形式。在一些实施例中，莫妥珠单抗被配制用于皮下施用。在一些实施例中，莫妥珠单抗被配制用于静脉内施用。
本文所述的药物组合物和制剂可以通过将具有所需纯度的活性成分(例如，靶向PD-1和LAG3的双特异性抗体、抗TIGIT拮抗剂抗体和/或抗VEGF抗体)与一种或多种任选的药用载体(参见例如，Remington’s Pharmaceutical Sciences第16版,Osol,A.编(1980))混合来制备，例如制备为冻干制剂或水溶液的形式。
示例性的替瑞利尤单抗制剂包含组氨酸溶液，该组氨酸溶液含有聚山梨醇酯20、蔗糖、L-甲硫氨酸和WFI。替瑞利尤单抗可以在15mL小瓶中提供，该小瓶中含有10mL替瑞利尤单抗药物产品，替瑞利尤单抗抗体的近似浓度为60mg/mL。
药用载体在所用的剂量和浓度下对受治疗者一般无毒，并且包括但不限于：缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和蛋氨酸；防腐剂(诸如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲双铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚、丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖，诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐抗衡离子，诸如钠；金属络合物(例如锌蛋白络合物)；和/或非离子表面活性剂，诸如聚乙二醇(PEG)。本文的示例性药用载体进一步包括间质药物分散剂，诸如可溶中性活性透明质酸酶糖蛋白(sHASEGP)，例如人可溶性PH-20透明质酸酶糖蛋白，诸如rHuPH20(Baxter International,Inc.)。某些示例性sHASEGP和使用方法，包括rHuPH20，描述于美国专利公开号2005/0260186和2006/0104968中。在一个方面中，将sHASEGP与一种或多种另外的糖胺聚糖酶(诸如软骨素酶)组合。
示例性的冻干抗体制剂描述于美国专利号6,267,958中。水性抗体制剂包括在美国专利号6,171,586和WO2006/044908中描述的那些，后一者中的制剂包括组氨酸-乙酸盐缓冲液。
本文的制剂还可含有多于一种对于所治疗的特定适应症是必需的活性成分，优选是具有不会彼此不利地影响的互补活性的活性成分。例如，可以期望进一步提供另外的治疗剂(例如，化疗剂、细胞毒性剂、生长抑制剂和/或抗激素剂，诸如上文所述的那些)。此类活性成分适当地以对预期目的有效的量组合存在。
活性成分可以包埋在例如通过凝聚技术或通过界面聚合而制备的微胶囊(例如，分别为羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)中；包埋在胶体药物递送***(例如，脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米粒子和纳米胶囊)中；或包埋在粗乳液中。此类技术公开于Remington's Pharmaceutical Sciences第16版,Osol,A.编(1980)。
可以制备缓释制备物。缓释制备物的合适实例包括含有抗体的固态疏水聚合物的半透性基质，所述基质是例如膜或微胶囊等成型制品的形式。
用于体内施用的制剂通常是无菌的。例如，无菌可以通过无菌过滤膜过滤而容易地实现。
XII.制品或试剂盒
A.包括靶向PD-1和LAG3的双特异性抗体和抗TIGIT拮抗剂抗体的试剂盒
在另一个方面，本文提供了包括靶向PD-1和LAG3的双特异性抗体和抗TIGIT拮抗剂抗体(例如，替瑞利尤单抗)的制品或试剂盒。在一些情况下，制品或试剂盒进一步包括包装插页，该包装插页包括使用抗TIGIT拮抗剂抗体与靶向PD-1和LAG3的双特异性抗体的组合来治疗受试者的癌症或延缓受试者的癌症进展的说明。在制品或试剂盒中可以包括本文所述的靶向PD-1和LAG3的双特异性抗体中的任一种和/或抗TIGIT拮抗剂抗体中的任一种。
在本发明的另一实施例中，提供了一种试剂盒，其包括靶向PD-1和LAG3的双特异性抗体，该双特异性抗体用于根据本文所述的任何方法与抗TIGIT拮抗剂抗体组合使用来治疗患有癌症的受试者。在一些情况下，该试剂盒进一步包括抗TIGIT拮抗剂抗体。在一些情况下，制品或试剂盒进一步包括包装插页，该包装插页包括使用靶向PD-1和LAG3的双特异性抗体与抗TIGIT拮抗剂抗体(例如，替瑞利尤单抗)的组合来治疗受试者的癌症或延缓受试者的癌症进展的说明。
在一些情况下，靶向PD-1和LAG3的双特异性抗体和抗TIGIT拮抗剂抗体在同一容器中或分开的容器中。合适的容器包括例如瓶、小瓶、袋子和注射器。容器可以由多种材料形成，例如玻璃、塑料(诸如聚氯乙烯或聚烯烃)或金属合金(诸如不锈钢或哈氏合金)。在一些情况下，容器容纳制剂，容器上或与容器相关的标签可以指示使用说明。制品或试剂盒还可以包括从商业和用户角度出发期望的其它材料，包括其它缓冲剂、稀释剂、过滤器、针头、注射器和带有使用说明的包装插页。在一些情况下中，制品进一步包括一种或多种其他药剂(例如，额外化疗剂和抗肿瘤剂)。用于一种或多种试剂的合适容器包括例如瓶、小瓶、袋子和注射器。
在制品或试剂盒中可以包括本文所述的靶向PD-1和LAG3的双特异性抗体中的任一种和/或抗TIGIT拮抗剂抗体。制品或试剂盒中的任一者可以包括根据本文所述的任何方法，例如上述第III节中详述的任何方法，向受试者施用靶向PD-1和LAG3的双特异性抗体和/或抗TIGIT拮抗剂抗体的说明。
B.包括靶向PD-1和LAG3的双特异性抗体和抗VEGF抗体的试剂盒
在另一个方面，本文提供了包括靶向PD-1和LAG3的双特异性抗体和抗VEGF抗体(例如，贝伐单抗)的制品或试剂盒。在一些情况下，制品或试剂盒进一步包括包装插页，该包装插页包括使用抗VEGF抗体与靶向PD-1和LAG3的双特异性抗体的组合来治疗受试者的癌症或延缓受试者的癌症进展的说明。在制品或试剂盒中可以包括本文所述的靶向PD-1和LAG3的双特异性抗体中的任一种和/或抗VEGF抗体中的任一种。
在本发明的另一实施例中，提供了一种试剂盒，其包括靶向PD-1和LAG3的双特异性抗体，该双特异性抗体用于根据本文所述的任何方法与抗VEGF抗体组合使用来治疗患有癌症的受试者。在一些情况下，该试剂盒进一步包括抗VEGF抗体。在一些情况下，制品或试剂盒进一步包括包装插页，该包装插页包括使用靶向PD-1和LAG3的双特异性抗体与抗VEGF抗体的组合来治疗受试者的癌症或延缓受试者的癌症进展的说明。
在一些情况下，靶向PD-1和LAG3的双特异性抗体和抗VEGF抗体在同一容器中或分开的容器中。合适的容器包括例如瓶、小瓶、袋子和注射器。容器可以由多种材料形成，例如玻璃、塑料(诸如聚氯乙烯或聚烯烃)或金属合金(诸如不锈钢或哈氏合金)。在一些情况下，容器容纳制剂，容器上或与容器相关的标签可以指示使用说明。制品或试剂盒还可以包括从商业和用户角度出发期望的其它材料，包括其它缓冲剂、稀释剂、过滤器、针头、注射器和带有使用说明的包装插页。在一些情况下中，制品进一步包括一种或多种其他药剂(例如，额外化疗剂和抗肿瘤剂)。用于一种或多种试剂的合适容器包括例如瓶、小瓶、袋子和注射器。
在制品或试剂盒中可以包括本文所述的靶向PD-1和LAG3的双特异性抗体中的任一种和/或抗VEGF抗体中的任一种。制品或试剂盒中的任一者可以包括根据本文所述的任何方法，例如上述第III节中详述的任何方法，向受试者施用靶向PD-1和LAG3的双特异性抗体和/或抗VEGF抗体的说明。
实例
实例1：一项评估多个治疗组合在患有黑素瘤的患者中的疗效和安全性的Ib/II期、开放标签、多中心、随机、伞式研究
黑素瘤是潜在致命形式的皮肤癌，并且是生长最快的恶性肿瘤之一(Algazi等人Cancer Manag Res.2:197-211,2010；Finn等人BMC Med.10:23,2012)。目前，全球每年有超过300,000人被诊断患有黑素瘤，并且57,000人死于该疾病。患有黑素瘤的患者的临床结果高度依赖于呈现时的分期。大多数呈现更晚期黑素瘤的人的预后差(Finn等人BMC Med.10:23，2012)。具有***转移(III期)的患者术后局部和远端复发的风险高，并且该患者组的5年存活率为32％-93％(Gershenwald等人CA Cancer J Clin.67:472-492,2017)。极少数患者在就诊时患有转移性疾病(IV期)，但有些患者在其最初的确定性治疗后出现转移。免疫疗法和靶向疗法改善了那些患者的结果，并且5年存活率为约50％(Larkin等人N Engl JMed.373:23-34,2015；Wolchok等人N Engl J Med.377:1345-1356,2017；Larkin等人NEngl J Med.381:1535-1546,2019；Robert等人Lancet Oncol.20:1239-1251,2019；Long等人J Clin Oncol.38(增刊15):10013，2020)。尽管最近的治疗取得了进展，但黑素瘤仍然是严重的健康问题，医疗需求高，并且过去30年来发病率稳步上升(Bataille.Expert RevDermatol.4:533-539,2009)。
BO43328是一项在患有可切除的III期(队列1)或IV期(队列2)黑素瘤的患者中的Ib/II期、开放标签、多中心、随机、伞式研究。该研究的设计具有灵活性，以在新疗法可用时开放新的治疗臂，关闭表现出最小临床活动性或不可接受的毒性的现有治疗臂，调整患者群体(例如，关于先前抗癌治疗或生物标志物状态)，或者引入额外的患有其他类型的黑素瘤的患者队列。
A.研究设计概述
本研究评估了治疗组合在未经癌症免疫疗法(CIT)处理的患有可切除的III期黑素瘤的患者(队列1)和在患有IV期黑素瘤的患者(队列2)中的疗效、安全性和药代动力学。下面概述了队列1(见表5)和队列2(见表6)的具体研究目标和相应终点。
表5.队列1的目标和相应终点
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ADA＝抗药物抗体；ASTCT＝美国移植和细胞治疗学会；CLND＝完全***清扫术；CR＝完全缓解；CRS＝细胞因子释放综合征；EFS＝无事件存活期；NCI CTCAE v5.0＝美国国家癌症研究所不良事件通用术语标准，5.0版；ORR＝客观缓解率；OS＝总存活期；pCR＝病理学完全缓解；PK＝药代动力学；pnCR＝病理学接近完全缓解；pPR＝病理学部分缓解；PR＝部分缓解；pRR＝病理学缓解率；RECIST v1.1＝实体瘤疗效评估标准，1.1版；RFS＝无复发存活期。
表6.队列2的目标和相应终点
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ADA＝抗药物抗体；ASTCT＝美国移植和细胞治疗学会；CR＝完全缓解；CRS＝细胞因子释放综合征；DOR＝缓解持续时间；iRECIST＝针对基于免疫的疗法修订的RECISTv1.1；NCI CTCAE v5.0＝美国国家癌症研究所不良事件通用术语标准，5.0版；ORR＝客观缓解率；OS＝总存活期；PFS＝无进展存活期；PK＝药代动力学；PR＝部分缓解；RECIST v1.1＝实体瘤疗效评估标准，1.1版。
注：研究人员使用RECIST v1.1评定单个时间点的总体应答。
本研究同时纳入两个队列。队列1纳入患有可切除的III期黑素瘤的患者，该患者具有可被活检的可测量的***转移(根据实体瘤疗效评估标准1.1版(RECIST v1.1))，该患者在过去6个月内没有移行转移史并且尚未接受针对其疾病的全身性CIT，例如，PD-1/PD-L1和/或CTLA-4阻断剂或其他药剂。
队列2纳入患有IV期黑素瘤的患者，该患者在针对转移性疾病的至少一种但不超过两种治疗线期间或之后经历了疾病进展。允许最多两种检查点抑制疗法线(单一疗法或组合疗法)。患有BRAF突变型疾病的患者可以已经接受额外的靶向疗法线(在检查点抑制疗法之前、之间或之后)，或者可以同时已接受作为一种组合治疗的靶向疗法和检查点抑制疗法。
治疗分配
在队列1中，患者被随机分配到对照臂(纳武单抗加伊匹单抗(Nivo+Ipi))或由RO7247669(与PD-1和LAG3结合的双特异性抗体)、阿特珠单抗与替瑞利尤单抗的组合(Atezo+Tira)或RO7247669与替瑞利尤单抗的组合(RO7247669+Tira)组成的实验臂。患者按地理区域(澳大利亚与世界其他地区)和基线LDH(≤正常上限(ULN)与>ULN)进行分层。表7和图1提供了治疗方案的详细信息。
在队列2中，患者被纳入到由RO7247669与替瑞利尤单抗的组合(RO7247669+Tira)组成的实验臂。入组从6名患者的安全性导入期开始。
研究期间纳入大约61-191名患者，其中包括被纳入队列2的安全性导入期的大约6名患者。实验臂的入组分两期进行，即初步期和扩展期。在初步阶段期间将大约15-20名患者纳入每个治疗臂。如果在初步期在实验臂中观察到临床活动性(队列1中的病理性缓解)，则在扩展期可将大约20名的额外患者纳入该臂中。
主办方可以决定延迟或暂停给定治疗臂的入组。具有不足的临床活动性或不可接受的毒性的实验臂不扩展。可以纳入额外患者以确保治疗臂之间在人口统计学和基线特征方面的平衡，包括潜在的预测性生物标志物，以便进行进一步的亚组分析。
随机化比率取决于可用的实验臂的数量(例如，如果增加一个臂或暂停一个臂的入组以等待初步阶段的结果分析)，其中规定划拨到对照臂的可能性不超过35％。随机化考虑了特定于臂的排除标准。如果患者满足为该臂概述的任何排除标准，则他们不符合加入特定臂的条件。
表7提供了治疗方案的细节。
表7.治疗方案
a主办方可以决定延迟或暂停给定治疗臂的入组。因此，所有实验臂可能不会同时开放入组。
b在安全性导入阶段中，患者被分配到可用的治疗臂。治疗分配比例取决于开放入组的实验臂数量。
c随机化比率取决于开放随机化的实验臂的数量(例如，如果增加一个臂或暂停一个臂的随机化以等待初步期的结果分析)，其中规定划拨到对照臂的可能性不超过35％。
d如果在初步期在实验臂中观察到临床活动性，则在扩展期将大约20名的额外患者纳入该臂中。具有最小临床活动性或不可接受的毒性的实验臂不会进行扩展。
e队列1RO7247669、Atezo+Tira和RO7247669+Tira臂中的入组暂停，以允许对至少6名患者进行安全性评估。
f在对队列2中的治疗组合进行安全性评定后，队列1中RO7247669+Tira臂开放入组。
在队列1中，对照臂和实验臂的患者在6周时段期间接受新辅助治疗。新辅助治疗完成后，或由于毒性而中止且没有疾病进展的情况下，患者在第7周经历手术(完全***清扫术(CLND))。根据研究人员的判断，在本研究之外，患者随后在第13周开始启动辅助疗法或观察(图2)。
由于在用CIT的T细胞应答(称为假性进展)的环境中，免疫细胞浸润可能导致转移性***大小的初始增加，因此怀疑根据RECIST v1.1的临床或放射影像学进展可能不指示真正的疾病进展。在不存在不可接受的毒性的情况下，在接受用CIT药物治疗期间满足根据RECIST v1.1的疾病进展标准的患者允许继续研究治疗直至手术。在中止研究治疗和/或取消手术之前，由额外的专家评审员通过活检或重复放射影像学评定来确认进展。期望所有患者都继续进行手术，条件是没有远处转移并且外科医生认为疾病会被完全切除。
在队列2，患者继续接受治疗，直到由研究人员在综合评定放射影像学和生化数据、局部活检结果(如果有)和临床状态(例如，症状恶化，诸如疾病继发性疼痛)后确定的不可接受的毒性或临床益处丧失。由于在用阿特珠单抗和其他CIT的T细胞应答(称为假性进展)的环境中，免疫细胞浸润可能导致肿瘤负荷的初始增加，因此根据RECIST v1.1的放射影像学进展可能不指示真正的疾病进展。在不存在不可接受的毒性的情况下，在接受用CIT组合治疗期间满足根据RECIST v1.1的疾病进展标准的患者如果满足以下所有标准，则允许继续治疗：
·临床益处的证据，如由研究人员在审查所有可用数据后所确定。
·不存在指示明确的疾病进展的症状和体征(包括实验室值诸如新的或恶化的高钙血症)。
·不存在可归因于疾病进展的东部肿瘤协作组(ECOG)体能状态下降。
·在方案允许的医学干预措施无法解决的关键解剖部位(例如软脑膜疾病)无肿瘤进展。
研究人员告知符合进展后治疗条件的患者，他们可能会放弃已知赋予临床益处的其他治疗选择，同时继续接受研究治疗。患者有权随时以任何理由自愿退出研究。此外，研究人员有权因研究人员或主办方确定如果患者继续研究则可能会危及患者安全的医学状况而使患者退出研究。
如果在随后的肿瘤评定中，排除假性进展并确认疾病的进展，则中止患者的研究治疗。
安全性评估期(队列1)
为了评估新辅助设置中实验治疗的毒性，在已纳入大约6名患者后暂停入组，以允许进行安全性评估。安全性评估基于来自最少6名患者的安全性数据，这些患者已接受治疗的至少一个剂量(即给定组合的每种药剂的一个剂量)并完成了安全性随访评定直至手术。值得注意的是，及时进行手术(CLND)是治疗耐受性的指示物。在6名患者的安全性评估期间，或在安全性评估后的任一时间，如果≥30％的患者经历一个或多个以下被认为至少可能与研究治疗相关的事件，则将该组合的入组暂停，同时主办方评估该治疗的益处风险概况：
·在2周内未改善(无论是否接受治疗)至2级或更好的治疗相关的≥3级不良事件。
·导致手术延迟>2周的治疗相关的不良事件。
·治疗相关的严重不良事件。
·需要永久中止研究药物的治疗相关的不良事件。
·死亡，但无可争议地与疾病进展或诸如事故的外部原因相关的死亡除外。
如果没有检测到新的安全性信号，则该臂中的入组将恢复。
安全性导入期(队列2)
为了评定首次临床测试的新型组合的安全性和耐受性，在队列2中实施了初始安全性导入期。大约6名患有转移性疾病的患者用新型组合(即RO7247669+Tira)进行治疗，并进行了至少28天的安全性和耐受性评定。
队列2中的最少6名患者必须完成初始安全性导入期。如果确定RO7247669+Tira组合可以耐受，则可以开放初步期的入组，并且可以开放队列1中的RO7247669+Tira臂的入组。处于安全性导入期的患者以顺序方式纳入和治疗，第一名患者和其余患者之间至少间隔一周。
评定基于来自最少6名患者的安全性数据，这些患者已接受治疗的至少一个剂量(即，每种药剂的一个剂量)并在至少28天内完成了安全性随访评定。如果≥30％的患者经历一个或多个以下被认为至少可能与研究治疗相关的事件，则将该组合的入组暂停，同时主办方评估该治疗的益处风险概况：
·在2周内未改善(无论是否接受治疗)至2级或更好的治疗相关的≥3级不良事件。
·治疗相关的严重不良事件。
·需要永久中止研究药物的治疗相关的不良事件。
·死亡，但无可争议地与疾病进展或诸如事故的外部原因相关的死亡除外。
如果没有检测到新的安全性信号，则也在队列1中启动该组合。
B.研究结束和研究时长
本研究的结束定义为当最后一名患者完成最后一次访视之日，包括通过电话或在诊所进行的存活随访。研究的总长度(从第一个患者的筛选到研究终点)预计为大约5年。
C.研究设计的基本原理
患者群体的基本原理
队列1纳入患有可切除的III期黑素瘤的患者，这些患者具有可以被活检的可测量的***转移(根据RECIST v1.1)，并且在过去6个月内没有移行转移史。纳入的患者之前不得接受针对其疾病的免疫疗法。
同样的患者群体被纳入OpACIN和OpACIN-neo研究，包括PRADO扩展队列。这些研究评估了在患有可切除的黑素瘤的患者中的纳武单抗和伊匹单抗的新辅助(和辅助)组合。发现与辅助疗法相比，新辅助疗法具有统计学上显著且临床上有意义的益处(Rozeman等人Lancet Oncol.20:948-960,2019；Blank等人J Clin Oncol.38:15S,2020；Rozeman等人NatMed.27:256-263,2021)。此外，发现在优化的治疗时间表中，治疗的安全性概况是可耐受的。
尽管最近证明了检查点抑制疗法的益处，但仍然需要对患有可切除的黑素瘤的患者更有效(即，手术样本中更广泛和更深的病理应答)和更好耐受的治疗方案。这项研究中的多个治疗选择预计将通过多种机制刺激免疫***。目的是将CIT的益处扩展到目前检查点抑制以外的更大的患有可切除黑素瘤的群体。
队列2纳入患有IV期黑素瘤的患者，该患者在针对转移性疾病的至少一种但不超过两种治疗线期间或之后经历了疾病进展。允许最多两种检查点抑制疗法线(单一疗法或组合疗法)。患有BRAF突变型疾病的患者可以已经接受额外的靶向疗法线(在检查点抑制疗法之前、之间或之后)，或者可以同时已接受作为一种组合治疗的靶向疗法和检查点抑制疗法。
在队列2中研究了尚未经过临床测试的具有针对抗黑素瘤活性的临床和/或生物学基本原理的化合物的新型组合。重要的是，对于考虑用于新型组合的单个化合物，其他研究已经确定了安全性和耐受性，并且可以使用安全剂量和时间表。队列2安全性导入期评定了新型组合在潜在重叠毒性方面的安全性。
D.纳入标准
队列1和队列2的共同纳入标准
患者必须满足所有以下标准以取得进入队列1和队列2的资格：
·签署知情同意书时年龄为≥18岁。
·代表性的肿瘤标本的可用性，该标本适用于经由中心测试确定PD-L1和/或其他生物标志物状态。
-通过在筛选时对转移性***(队列1)或其他转移性病灶(队列2)进行活检，从所有患者(队列2安全性导入期的患者除外)收集基线肿瘤组织样品。
-此外，如果有的话，提交来自所有患者的存档原发性肿瘤组织。如果没有可用的存档原发性组织(例如，对于原发性肿瘤未知的患者)，则允许入组。对于存档组织，石蜡块中的***固定、石蜡包埋(FFPE)的肿瘤样本(优选)具有足够的大小和肿瘤内容物代表性，优选包括侵入边缘，或至少16张含有未染色、新切割、连续切片的载玻片必须与相关的病理报告一起提交。如果只有10至15张载玻片可用，则患者仍符合该研究的条件。
·适当的血液和终末器官功能，通过在研究治疗启动前14天内获得的以下实验室测试结果定义：嗜中性粒细胞绝对计数(ANC)≥1.5×109/L(1500/μL)；淋巴细胞计数≥0.5×109个细胞/L(500/μL)(边缘机器淋巴细胞计数可以通过手动计数来确认)；血小板计数≥100×109/L(100,000/μL)；血红蛋白≥90g/L(9g/dL)；AST、ALT和ALP≤2.5×ULN(有肝转移记录的参与者的AST和ALT可以≤5×ULN；有肝或骨转移记录的参与者的ALP可以≤5×ULN)；总胆红素≤1.5×ULN(已知患有吉尔伯特病的患者的胆红素水平可以≤3×ULN)；肌酐≤1.5×ULN或肌酐清除率≥30mL/min(使用Cockcroft-Gault公式计算)；血清白蛋白≥25g/L(2.5g/dL)。未接受治疗性抗凝的患者的INR和aPTT可以≤1.5×ULN。
·对于接受治疗性抗凝的患者：稳定的抗凝剂方案(即，研究治疗开始前3个月内没有新的血栓形成、血栓栓塞事件或出血事件)。
·筛选时HIV测试呈阴性。除非当地法规不允许，否则没有先前HIV测试结果呈阳性的患者在筛选时接受HIV测试。
·筛选时乙型肝炎表面抗体(HBsAb)呈阴性，并且总乙型肝炎核心抗体(HBcAb)测试呈阴性。如果患者在筛选时乙型肝炎表面抗原(HBsAg)测试呈阴性且总HBcAb测试呈阳性，则还必须进行乙型肝炎病毒(HBV)DNA测试以排除活动性HBV。
·筛选时丙型肝炎病毒(HCV)抗体测试呈阴性；或筛选时HCV抗体测试呈阳性，之后HCV RNA测试呈阴性。仅对HCV抗体测试呈阳性的患者进行HCV RNA测试。
·对于有生育能力的女性：同意保持禁欲(避免异性***)或使用避孕措施。
·对于男性：同意保持禁欲(避免异性***)或使用避孕措施，并同意不捐赠***，如每个具体治疗臂所概述的。
队列1的入选标准
患者必须满足所有以下标准以取得进入队列1的资格：
·ECOG体能状态(PS)为0或1。
·组织学证实的可切除的III期黑素瘤(T：T0、Tx或T1-4；N：cN1-3，pN1b/2b/3b；M：M0，根据AJCC-8(Gershenwald等人CA Cancer J Clin.67:472-492,2017))并且在过去6个月内没有移行转移史。
-患者可能呈现原发性黑素瘤伴有区域***转移，或者呈现原发性黑素瘤或未知的原发性黑素瘤史且具有临床检测到的区域***复发，并且可能属于任何组中的任一个：原发性皮肤黑素瘤伴有临床/放射学明显的区域***转移；临床/放射学检测到的近端区域***凹陷的复发性黑素瘤；或者临床/放射学检测到的由未知原发灶引起的***黑素瘤(如果是单个位点)。
·适合并计划进行CLND(由外科医生在随机化之前根据当地指南进行评定)。
·根据RECIST v1.1的可测量的疾病(至少一个靶病灶)。待进行活检的至少一个肉眼可见的***转移(可根据RECIST v1.1测量)。
队列2的入选标准
患者必须满足所有以下标准以取得进入队列2的资格：
·ECOGPS为0、1或2。
·预期寿命≥3个月，如由研究人员所确定。
·组织学证实的IV期(转移性)黑素瘤，根据AJCC-8(Gershenwald等人CA CancerJ Clin.67:472-492,2017)。
·在至少一种但不超过两种转移性疾病治疗线期间或之后的疾病进展。允许最多两种检查点抑制疗法线(单一疗法或组合疗法)。患有BRAF突变型疾病的患者可以已经接受额外的靶向疗法线(在检查点抑制疗法之前、之间或之后)，或者可以同时已接受作为一种组合治疗的靶向疗法和检查点抑制疗法。
·在局部黑素瘤辅助疗法期间或完成后6个月内复发或***性进展的患者可能符合资格。
·根据RECIST v1.1的可测量的疾病(至少一个靶病灶)。
至少一个转移(可根据RECIST v1.1测量)。
E.排除标准
如果患者符合后续章节中概述的任何适用标准(如下面的治疗臂所指定)，则该患者将被拒绝入组特定臂：
队列1和队列2的排除标准
符合以下任何条件的患者将被排除在研究之外：
·粘膜和葡萄膜黑素瘤。
-队列1排除肢端雀斑样黑素瘤。
-对于队列2，允许肢端雀斑样黑素瘤；然而，患者比例不应超过应答可评估患者的20％。
·在研究治疗启动前28天内用研究性疗法治疗。
·在研究治疗启动前4周内或5个药物消除半衰期(以较长者为准)内，用全身性免疫刺激剂(包括但不限于，IFN和IL-2)治疗。
·先前异基因干细胞或实体器官移植。
·已知的免疫缺陷或需要全身免疫抑制药物(包括但不限于环磷酰胺、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、沙利度胺和抗肿瘤坏死因子-α药剂)治疗的病症，或者预期在研究治疗期间需要全身性免疫抑制药物，以下例外：使用替代剂量皮质类固醇治疗垂体功能低下或肾上腺功能不全的患者符合该研究的条件；接受急性、低剂量、全身性免疫抑制药物或一次性脉冲剂量的全身性免疫抑制药物(例如，用于造影剂过敏的48小时皮质类固醇)的患者在与医学监查员讨论后符合该研究的条件；接受盐皮质激素(例如，氟氢可的松)、用于慢性阻塞性肺病或哮喘的皮质类固醇或用于直立性低血压或肾上腺功能不全的低剂量皮质类固醇的患者符合该研究的条件。
·在开始研究治疗之前4周内用减毒活疫苗治疗，或者预期在研究治疗期间或在最后一剂研究治疗后5个月内需要此类疫苗。
·自身免疫性疾病或免疫缺陷活动期或病史，包括但不限于重症肌无力、肌炎、自身免疫性肝炎、***性红斑狼疮、类风湿性关节炎、炎症性肠病、抗磷脂抗体综合征、韦格纳肉芽肿病、干燥综合征、格林-巴雷综合征或多发性硬化症，但以下情况除外：
有自身免疫相关的甲状腺功能减退症病史并且正在接受稳定剂量的甲状腺替代激素的患者符合该研究的条件。
患有1型糖尿病且正在接受稳定的胰岛素方案的患者符合该研究的条件。
-患有湿疹、银屑病、慢性单纯性苔藓或仅具有皮肤病表现的白癜风的患者(例如，排除患有银屑病关节炎的患者)符合该研究的条件，条件是满足所有以下条件：皮疹必须覆盖<体表面积的10％；疾病在基线时得到良好控制，并且仅需要低效局部皮质类固醇；在过去12个月内，没有发生需要补骨脂素加紫外线A辐射、甲氨蝶呤、类维生素A、生物制剂、口服钙调神经磷酸酶抑制剂或者高效或口服皮质类固醇的基础病症的急性加重。
·具有特发性肺纤维化、机化性肺炎(例如，闭塞性细支气管炎)、药源性肺部炎症或特发性肺部炎症的病史，或在胸部计算机断层扫描(CT)扫描中发现存在活动性肺部炎症的证据。有CIT相关肺炎<2级史的患者在与医疗监查员讨论后可能符合条件。
·筛选前2年内有除恶性黑素瘤以外的恶性肿瘤病史，但转移或死亡风险可忽略不计(例如，5年OS率>90％)的恶性肿瘤除外，诸如经过充分治疗的宫颈原位癌、非黑素瘤皮肤癌、局部***癌、导管原位癌或I期子宫癌。
·活动性肺结核(TB)。
·在研究治疗启动前4周内发生过严重感染，包括但不限于，因感染、菌血症或严重肺炎的并发症或研究人员认为可能影响患者安全的任何活动性感染而住院。
·在研究治疗启动前2周内用治疗性或预防性口服或IV抗生素治疗。
·显著的心血管疾病，诸如纽约心脏协会心脏病(II级或更高级别)、在研究治疗启动前3个月内发生过心肌梗塞或脑血管意外、不稳定心律失常或不稳定心绞痛。
·不受控制的高血压(定义为在两次或超过两次的连续测量中，静息收缩压>150mmHg和/或舒张压>100mmHg)。
·在研究治疗启动前4周内进行过除用于诊断外的大手术或预计在研究期间需要进行除CLND外的大手术。
-放置中心静脉通路导管(例如，端口或类似导管)不视为大手术，因此是允许的。
·任何其他疾病、新陈代谢功能障碍、体格检查发现或临床实验室发现，这些发现禁止使用研究药物，可能影响对结果的解释，损害患者参与研究的能力或可能使患者处于治疗并发症的高风险中的疾病或病症。
·对嵌合抗体或人源化抗体或融合蛋白的重度过敏反应史。
·已知对中国仓鼠卵巢细胞产物或重组人抗体超敏。
·已知对任何研究药物或其赋形剂的***过敏或超敏。
·已知对预防性用药所需的任何药物(对乙酰氨基酚、雷尼替丁、苯海拉明和甲基强的松龙)不耐受。
·妊娠或哺乳，或打算在研究期间妊娠。
-有生育能力的女性在研究治疗启动前14天内的血清妊娠试验结果必须呈阴性。
·仅符合对照臂的条件。
队列1的排除标准
将满足以下任何标准的患者排除在队列1之外：
·远处转移的黑素瘤
·过去6个月内有移行转移史
·先前放射疗法
·先前免疫疗法，包括抗CTLA-4、抗PD-1和抗PD-L1治疗抗体，以及其他黑素瘤全身性疗法
队列2的排除标准
将满足以下任何标准的患者排除在队列2之外：
·有症状的、未经治疗的或进展的CNS转移。
-具有经治疗的CNS病灶的无症状患者符合条件，前提是满足以下所有标准：根据RECIST v1.1的可测量的疾病必须存在于CNS之外；患者无颅内出血或脊髓出血史；CNS转移在研究开始前稳定≥4周，或神经外科切除发生在研究治疗开始前≥28天；在开始研究治疗前至少14天，患者不需要皮质类固醇作为CNS疾病的疗法；允许稳定剂量的抗惊厥疗法。
·活动性癌性脑膜炎/软脑膜疾病或癌性脑膜炎/软脑膜疾病史。
·不受控制的肿瘤相关疼痛。需要止痛药的患者在筛选时必须采用稳定的方案。适合姑息性放疗后的症状性病灶(例如，骨转移或引起神经碰触的转移)应在入组前进行治疗。患者应当已从放射治疗的影响中恢复。不要求最短恢复期。在进一步增长的情况下可能导致功能缺陷或顽固性疼痛的无症状性转移性病灶(例如，目前与脊髓压迫无关的硬膜外转移)，应在入组前考虑进行局部区域治疗(如果合适的话)。
·不受控制的胸腔积液、心包积液或腹水，需要反复引流(每月一次或更频繁)。留置导管(例如，)的患者是允许的。
·不受控制或有症状的高钙血症(离子化钙>1.5mmol/L，钙>12mg/dL，或校正钙>ULN)。
·任何归因于先前CIT的免疫介导4级不良事件发生史(通过替代疗法得到控制的内分泌疾病或无症状的血清淀粉酶或脂肪酶升高除外)，该不良事件导致先前免疫治疗剂永久中止。
·没有完全消退至基线的所有与先前免疫调节疗法相关的免疫介导不良事件(通过替代疗法得到控制的内分泌疾病或稳定型白斑病除外)。因免疫介导的不良事件而用皮质类固醇治疗的患者(用于肾上腺功能不全的皮质类固醇替代疗法(条件是患者接受≤10mg***/天或等同物)除外)在皮质类固醇中止后≥4周内不得出现相关症状或体征。
·与任何先前放射疗法、化学疗法、靶向疗法、CPI疗法或外科手术相关的不良事件必须已消退至1级或更好，处于稳定剂量的激素替代疗法(例如，甲状腺素、氢化可的松、***龙等)的脱发(任何级别)、2级周围神经病变以及甲状腺功能减退症和/或垂体功能减退症除外。
含有RO7247669的臂的排除标准(队列1和队列2)
将满足以下标准中的任一种的患者排除在含有RO7247669的臂之外：
·先前使用抗LAG-3药剂治疗。
·心肌炎史(无论病因如何)。
·在开始研究治疗前6个月内，通过经胸超声心动图(TTE)或多门控采集(MUGA)扫描(TTE首选测试)评定的左心室射血分数(LVEF)<50％。
·肌钙蛋白T(TnT)或肌钙蛋白I(TnI)>机构ULN。如果24小时内重复水平≤1×ULN，则TnT或TnI水平在>1至<2×ULN之间的患者符合条件。如果24小时内重复水平在>1至<2×ULN之间，则患者需要进行心脏评估，并且如果没有临床意义的发现，则可以考虑治疗。
含有替瑞利尤单抗的臂的排除标准(队列1和队列2)
将满足以下任何标准的患者排除在含有替瑞利尤单抗的臂之外：
·先前使用抗TIGIT药剂治疗。
·筛选时活动***泼斯坦-巴尔病毒(EBV)感染或已知或疑似慢性活动性EBV感染。将筛选时EBV病毒衣壳抗原(VCA)IgM测试呈阳性的患者排除在含有替瑞利尤单抗的臂之外。应根据临床指征进行EBV PCR测试，以筛选活动性感染或疑似慢性活动性感染。将EBVPCR测试呈阳性的患者排除在含有替瑞利尤单抗的臂之外。
F.研究治疗
本研究的研究药品是阿特珠单抗、替瑞利尤单抗、RO7247669、纳武单抗和伊匹单抗。
对照臂(纳武单抗+伊匹单抗)
纳武单抗加伊匹单抗(Nivo+Ipi)对照臂的患者接受表8中概述的2个周期(6周)的治疗，直到手术，或直到出现不可接受的毒性或临床益处丧失，以先发生者为准。建议不迟于随机化后7天启动治疗。
表8.纳武单抗+伊匹单抗臂的治疗方案
纳武单抗在每个21天周期的第1天(Q3W)通过IV输注以3mg/kg的剂量施用。伊匹单抗在每个21天周期的第1天(Q3W)通过IV输注以1mg/kg的剂量施用。
RO7247669臂
RO7247669臂的患者接受表9中概述的2个周期(6周)的治疗，直到手术，或直到出现不可接受的毒性或临床益处丧失，以先发生者为准。建议不迟于随机化后7天启动治疗。
表9.RO7247669臂的治疗方案
RO7247669以2100mg Q3W的固定剂量施用(在每个21天周期的第1天，2100mg)。RO7247669的施用在受监测的环境中进行，在该环境中，可以立即接触到训练有素的人员以及足够的设备和药物来管理潜在的危重反应。根据表10中概述的说明施用RO7247669输注。
表10.第一次和第二次RO7247669输注的施用
IRR＝输注相关反应。
对于经历2级输注相关反应(IRR)的患者，在随后的输注之前需要扑热息痛500-1000mg口服(PO)或IV以及苯海拉明25-50mg PO或IV(或足够剂量的替代组胺H1/2拮抗剂)的预防性用药。如果出现与研究治疗相关的3级或4级IRR，则患者应永久中止研究治疗。
不允许对RO7247669进行剂量调整。
阿特珠单抗+替瑞利尤单抗
阿特珠单抗加替瑞利尤单抗(Atezo+Tira)臂的患者将接受表11中概述的2个周期(6周)的治疗，直到手术，或直到出现不可接受的毒性或临床益处丧失，以先发生者为准。建议不迟于随机化后7天启动治疗。
表11.阿特珠单抗+替瑞利尤单抗臂的治疗方案
阿特珠单抗以1200mg每3周(Q3W)的固定剂量施用(在每个21天周期的第1天，1200mg)。阿特珠单抗的施用在受监测的环境中进行，在该环境中，可以立即接触到训练有素的人员以及足够的设备和药物来管理潜在的危重反应。根据表12中概述的说明施用阿特珠单抗输注。
不允许对阿特珠单抗进行剂量调整。
表12.第一次和第二次阿特珠单抗输注的施用
IRR＝输注相关反应。
替瑞利尤单抗以600mg IV Q3W的固定剂量施用(在每个21天周期的第1天，600mg)。替瑞利尤单抗的施用在受监测的环境中进行，在该环境中，可以立即接触到训练有素的人员以及足够的设备和药物来管理潜在的危重反应。根据表13中概述的说明施用替瑞利尤单抗输注。
表13.第一次和后续替瑞利尤单抗输注的施用
IRR＝输注相关反应。
在经历被认为与研究治疗相关的毒性的患者中，可能会暂时暂停阿特珠单抗和替瑞利尤单抗治疗。如果启动皮质类固醇治疗毒性，则必须在研究治疗能够恢复(如有必要)之前历经≥1个月逐渐减量至等效于≤10mg/天口服***的等效剂量，然后才能恢复用药。在新辅助设置中，研究治疗限于6周的术前窗口。在此期间的治疗不应中断，除非患者经历毒性。如果毒性符合中断/停用阿特珠单抗和/或替瑞利尤单抗的标准，则应中断/停用阿特珠单抗和/或替瑞利尤单抗。毒性消退后，只有当益处/风险概况可接受且手术可以在计划日期后2周内进行，才应考虑后续治疗周期。否则，应省略后续治疗周期，以便患者直接进行手术而不再拖延。
基于现有的作用机制特征，替瑞利尤单抗可能引起与阿特珠单抗相似但独立于阿特珠单抗的不良事件。替瑞利尤单抗还可能加剧与阿特珠单抗相关的不良事件的频率或严重程度，或者可能具有与阿特珠单抗不重叠的毒性。由于这些情况在临床环境中可能无法彼此区分，不良事件通常应归因于两种药剂，并且应将不良事件的剂量中断或治疗中止应用于替瑞利尤单抗和阿特珠单抗两者。如果阿特珠单抗被停用或中止，则替瑞利尤单抗也应被停用或中止。如果替瑞利尤单抗被停用或中止，则阿特珠单抗也应被停用或中止。
RO7247669+替瑞利尤单抗(队列1和队列2)
RO7247669加替瑞利尤单抗(RO7247669+Tira)臂的患者接受如表14中概述的治疗。
队列1的患者接受2个周期(6周)的治疗，直到手术，或直到出现不可接受的毒性或临床益处丧失，以先发生者为准。
队列2的患者接受治疗，直到由研究人员在综合评定影像学和生化数据、局部活检结果(如果有)和临床状态(例如，症状恶化，诸如疾病继发性疼痛)后确定的不可接受的毒性或临床益处丧失。
建议不迟于随机化(队列1)或入组(队列2)后7天启动治疗。
表14.RO7247669+替瑞利尤单抗臂的治疗方案
a安全性导入完成后，主办方可以决定探索较低剂量(例如，1200mg和600mg)。
RO7247669在每个21天周期的第1天通过IV输注以2100mg的固定剂量施用。替瑞利尤单抗在每个21天周期的第1天通过IV输注以600mg的固定剂量施用，具有输注后观察期，如表13中所述。
RO7247669的施用在受监测的环境中进行，在该环境中，可以立即接触到训练有素的人员以及足够的设备和药物来管理潜在的危重反应。根据表15中概述的说明施用RO7247669输注。
表15.第一次、第二次和后续RO7247669输注的施用
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IRR＝输注相关反应。
对于经历≥2级输注相关反应(IRR)的患者，在随后的输注之前需要扑热息痛500-1000mg口服(PO)或IV以及苯海拉明25-50mg PO或IV(或足够剂量的替代组胺H1/2拮抗剂)的预防性用药。如果出现与研究治疗相关的3级或4级IRR，则患者应永久中止研究治疗。
不允许对RO7247669进行剂量调整。然而，根据新出现的安全性和有效性数据，主办方可以探索较低剂量(例如，1200mg和600mg)。RO7247669治疗可能因毒性以外的原因(例如，外科手术)而中断。
研究人员和医疗监查员将确定可接受的治疗中断长度。
在经历被认为与研究治疗相关的毒性的患者中，可能会暂时暂停使用RO7247669和替瑞利尤单抗的治疗。如果启动皮质类固醇治疗毒性，则必须在研究治疗能够恢复(如有必要)之前历经≥1个月逐渐减量至等效于≤10mg/天口服***的等效剂量，然后才能恢复用药。
对于队列1，在新辅助设置中，研究治疗限于6周的术前窗口。在此期间的治疗不应中断，除非患者经历毒性。如果毒性符合中断/停用RO7247669和替瑞利尤单抗的标准，则应中断/停用RO7247669和替瑞利尤单抗。毒性消退后，只有当益处/风险概况可接受且手术可以在计划日期后2周内进行，才应考虑后续治疗周期。否则，应省略后续治疗周期，以便患者直接进行手术而不再拖延。
对于队列2，如果由于毒性而停用RO7247669和替瑞利尤单抗12周或更长时间，则患者应中止RO7247669和替瑞利尤单抗。然而，RO7247669和替瑞利尤单抗可能会停用超过12周，以便患者在恢复治疗前逐渐减少皮质类固醇。如果医学监查员同意患者可能获得临床益处，则可在停用超过12周后恢复RO7247669和替瑞利尤单抗。RO7247669和替瑞利尤单抗治疗可能因毒性以外的原因(例如，外科手术)而暂停。可接受的延长时间段的长度必须得到研究人员和医疗监查员的同意。
基于现有的作用机制特征，替瑞利尤单抗可能引起类似于但独立于RO7247669的不良事件。替瑞利尤单抗还可能加剧与RO7247669相关的不良事件的频率或严重程度，或者可能具有与RO7247669不重叠的毒性。由于这些情况在临床环境中可能无法彼此区分，不良事件通常应归因于两种药剂，并且应将不良事件的剂量中断或治疗中止应用于替瑞利尤单抗和RO7247669两者。如果RO7247669被停止或中止，则替瑞利尤单抗也应被停止或中止。如果替瑞利尤单抗被停止或中止，则RO7247669也应被停止或中止。
G.伴随疗法
伴随疗法由患者使用除方案规定的研究治疗外的任何用药(例如，处方药、非处方药、疫苗、草药或顺势疗法药物、营养补充剂)从研究治疗启动前7天到治疗中止访视组成。
一般而言，按照当地护理实践，研究人员应使用支持疗法而不是根据临床指征定义为谨慎或禁止疗法的疗法来管理患者的护理(包括既往病症)。出现输注相关症状的患者可以使用对乙酰氨基酚、布洛芬、苯海拉明和/或H2受体拮抗剂(例如法莫替丁、西咪替丁)或当地标准做法的等效药物进行对症治疗。严重的输注相关事件表现为呼吸困难、低血压、喘息、支气管痉挛、心动过速、血氧饱和度降低或呼吸窘迫，并应根据临床指示采用支持疗法进行治疗(例如，补充氧和β2肾上腺素能激动剂)。
RO7247669、Atezo+Tira和RO7247669+Tira臂的允许疗法
允许患者在研究期间使用以下疗法：
·年失败率<1％的口服避孕药。
·激素替代疗法。
·预防性或治疗性抗凝疗法(诸如稳定剂量的华法林或低分子量肝素)。
·灭活疫苗(例如，流感疫苗)。
·施用甲地孕酮醋酸酯作为食欲刺激剂
·盐皮质激素(例如，氟氢可的松)
·施用皮质类固醇用于慢性阻塞性肺疾病(COPD)或哮喘。
·施用低剂量皮质类固醇用于***性低血压或肾上腺皮质功能不全。
·局部疗法(例如，手术(完全***清扫术(CLND)和非黑素瘤特异性的除外)。
对于RO7247669臂，由研究人员酌情决定，抗组胺药、解热药和/或镇痛药的预防性用药仅可针对第二次RO7247669输注施用。
对于阿特珠单抗加替瑞利尤单抗臂，由研究人员酌情决定，抗组胺药、解热药和/或镇痛药的预防性用药仅可针对第二次阿特珠单抗和替瑞利尤单抗输注施用。
队列2中RO7247669+Tira臂的额外允许疗法
允许患者在研究期间使用以下疗法：
·如下概述的姑息性放射疗法(例如，治疗已知的骨转移灶或缓解疼痛症状)：姑息性放射疗法是允许的，只要它不干扰对肿瘤靶病灶的评定(例如，待辐射的病灶不能是可测量疾病的唯一部位)。姑息性放射疗法期间可继续用替瑞利尤单抗治疗。在姑息性如下期间可以继续使用RO7247669进行治疗，但有一个例外：在施用RO7247669的日子里不允许进行姑息性放射疗法。
·如下概述的局部疗法(例如，手术、立体定向放射外科、放射疗法、射频消融)：在获得医学监察员批准后，经历需要局部疗法以控制三个或更少病灶的混合应答的患者仍符合继续研究治疗的条件。接受针对靶病灶的局部疗法的患者将不再可评估放射影像学应答，但仍可评估进展。
由研究人员酌情决定，抗组胺药、解热药和/或镇痛药的预防性用药仅可针对第二次和后续RO7247669和替瑞利尤单抗输注施用。
H.评定
在整个研究过程中密切监测所有患者的不良事件。根据美国国家癌症研究所不良事件通用术语标准第5.0版(NCI CTCAE v5.0)对不良事件进行分级。细胞因子释放综合征(CRS)的严重程度也根据美国移植和细胞治疗学会(ASTCT)CRS共识分级量表进行分级。
队列1的患者接受2个周期(6周)的新辅助治疗，并在第7周进行手术(CLND)。期望所有患者都继续进行手术，条件是没有远处转移并且外科医生认为疾病会被完全切除。病理应答通过当地的且独立的病理审查进行评定。
由于不可接受的毒性而中止治疗并且继续没有转移性疾病证据的患者仍然符合手术的条件，并在不良事件已消退并且重新分期确认III期疾病后继续进行CLND。如果患者已确认疾病进展，则患者管理和治疗选择由主治医生决定。这些患者留在研究中进行随访。
患者在手术(CLND)前第6周(在第1周期的第1天开始)进行放射学肿瘤评定。应答由研究人员根据RECIST v1.1进行评定和确定，但不需要通过后续影像学研究进行确认。
队列2的患者在前54周内每9周(在第1周期的第1天开始)进行肿瘤评定，然后每12周进行肿瘤评定。应答由研究人员使用RECIST v1.1评定。基于研究人员评定的个体病灶数据由主办方以编程方式确定按照修改后的基于免疫的治疗剂(iRECIST)的RECIST v1.1的应答。
对于队列1和队列2，如果在实验臂中证明了临床活动性，则主办方可能要求提交该臂的肿瘤评定扫描以供独立审查机构进行评估。
肿瘤和应答评估
所有可测量和可评估的病灶均应在筛选时进行评定和记录。在获得知情同意前和随机化/入组前14天内作为护理标准进行的肿瘤评定不必在筛选时重复。
对于队列1和队列2，在基线确定的所有可测量和/或可评估的病灶应在后续肿瘤评估中***。后续肿瘤评定应使用在筛选时用来评定疾病部位的相同放射学过程(例如，与CT扫描相同的造影剂方案)。
队列1肿瘤和应答评估
评定队列1中患者对治疗的病理和放射学应答。患者在基线时和手术(CLND)治疗6周后进行病理肿瘤评定。在第7周完全切除III期***(CLND)必须按照治疗性***清扫的适当手术程序标准进行。如果患者正在接受皮质类固醇或其他抗炎药物来治疗免疫介导的不良事件，则应按计划进行CLND，条件是这些药物以稳定或逐渐减少的剂量给予，并且不良事件的严重程度为2级或更好。如果在计划手术时研究治疗相关的不良事件没有得到充分改善，则CLND可能会延迟最多2周。病理应答由当地的且独立的病理学审查根据INMC指南(Tetzlaff等人Ann Oncol.29:1861-1868,2018)确定。
手术并发症根据Clavien-Dindo分类进行评分。针对进行CLND的患者报告每个级别的并发症比率并进行评分。
患者在基线、手术(CLND)前治疗6周后以及第13周治疗完成/中止时进行根据RECIST v1.1的放射影像学肿瘤评定。
研究人员使用RECIST v1.1评定单个时间点的总体应答。
疾病随访以及疾病进展或复发的确认
在新辅助治疗期间，疾病进展的诊断应通过临床、实验室、放射学和/或组织学检查结果来确认。手术后，在开始辅助治疗或观察之前，在第13周进行肿瘤评定以结束新辅助疗法-手术干预窗口。
此后，在研究之外的辅助治疗/观察阶段(即，在第13周开始)期间，必须对所有患者进行随访，以评定针对每臂概述的疾病复发和存活。
完成治疗期的患者在手术后3个月进行其首次存活随访。过早中止研究药物的患者在最后一个研究治疗剂量后3个月进行其首次存活随访。只有当临床、实验室、放射学和/或组织学检查结果证实诊断时，才能指定疾病复发，无论是局部、区域还是远处。
在术后期期间，应根据机构指南对疾病状况进行临床评估和记录(例如，前2年每3个月一次；第三年每6个月一次；第四年及以后每年一次)。此外，当临床表明排除转移性疾病时，可以考虑肝功能测试、骨扫描、胸部X射线/诊断性CT扫描、肝脏成像和/或其他放射影像学方式。
只要临床可能，就应通过组织学手段确认进展或复发的诊断。应使用并记录疾病进展或复发性疾病的最早诊断日期。该日期应基于客观的临床、放射学、组织学或细胞学证据。复发性疾病包括局部、区域或远处复发。
下面提供了随访时疾病复发、死亡和其他值得注意的事件的定义和确认程序。复发的记录需要指定所有涉及的部位以建立复发模式。以下治疗失败标准构成疾病复发的唯一可接受的证据：
·肺：细胞学或活检呈阳性，存在单个新病灶或出现与转移性疾病一致的多个病灶
·肝：细胞学或活检呈阳性，存在单个新病灶或出现与转移性疾病一致的多个病灶
·中枢神经***：脑CT或MRI扫描或CSF细胞学呈阳性
·皮肤、皮下和***复发：细胞学或活检呈阳性，存在单个新病灶或出现与转移性疾病一致的多个病灶
·骨和其他器官：细胞学或活检呈阳性，存在单个新病灶或出现在两项不同放射学研究中鉴定的与转移性疾病一致的多个病灶(即，阳性核素骨扫描或PET扫描以及造影GI系列或者针对腹部疾病的腹部超声、X射线或CT)。
队列2肿瘤和应答评估
队列2的患者在前54周内每9(±1)周(在第1周期的第1天开始)进行肿瘤评定，然后每12(±2)周进行肿瘤评定，无论剂量延迟与否。例外情况是在放射影像学疾病进展后继续治疗的患者。此类患者每9周进行肿瘤评定，直至研究人员确定丧失临床益处。因此，对于因临床益处丧失以外的原因中止治疗的患者，即使他们开始新的非方案指定的抗癌疗法，肿瘤评定仍应按计划继续进行。由研究人员酌情决定，如果怀疑疾病进展，则随时重复肿瘤评定。
用放射疗法或手术治疗的脑转移灶不视为可测量或可评估的，但作为转移性疾病的部位在筛选时记录。在基线时鉴定的已用放射疗法或手术治疗的脑转移灶不视为可测量或可评估的，除非大脑中存在疑似疾病进展(即患者出现症状)。因此，除非有临床指征，否则不需要后续的头部扫描。
为了在队列2中促进评估根据iRECIST的应答，对于在进展后继续接受治疗的患者，必须在根据RECIST v1.1的疾病进展后继续进行肿瘤评定。这包括持续测量靶病灶，评估非靶病灶(包括监测任何已显示明确进展的非靶病灶的进一步恶化)，以及在所有后续评定中评估任何新鉴定的病灶(包括测量，如果病灶是可测量的)。
研究人员使用RECIST v1.1评定单个时间点的总体应答。
生物标志物评定
通过在筛选时对转移性***(队列1)或其他转移性病灶(队列2)进行活检，从所有患者(队列2安全性导入期的患者除外)收集基线肿瘤组织样品。对于队列1的患者，在第2周期的第1天和手术(CLND)时通过活检收集治疗中的组织样品。对于纳入队列2的患者，在第2周期的第8天通过活检收集治疗中的组织样品。
进行探索性生物标志物分析以了解生物标志物与对研究药物的应答的关联，同时考虑疗效和安全性终点。探索性生物标志物研究可包括但不限于与肿瘤免疫生物学相关联的基因或基因特征、PD-L1、淋巴细胞亚群、T细胞受体谱系或与T细胞活化相关联的细胞因子的分析。研究可能涉及DNA或RNA提取、体细胞突变分析以及下一代测序(NGS)(包括全外显子组测序(WES))的使用。研究可能涉及提取DNA、无细胞DNA或RNA；分析突变、单核苷酸多态性和其他基因组变异；以及通过使用全面基因组的NGS进行基因组分析。从血液中提取的DNA可以与从组织中提取的DNA进行比较，以通过区分种系变体与体细胞变体来鉴定体细胞变体。
NGS方法可能包括组织和血液样品的全基因组测序(WGS)或WES。在参与站点，收集血液样品用于DNA提取，以能够进行WGS或WES，从而鉴定可预测对研究药物的应答、与进展为更严重的疾病状态相关、与对研究药物的获得性耐药性相关、与发展不良事件易感性相关的变体，这可以改善不良事件监测或调查，或者可以增加对疾病生物学和药物安全性的知识和了解。从血液中提取的DNA可以与从组织中提取的DNA进行比较，以通过区分种系变体与体细胞变体来鉴定体细胞变体。
I.分析
最终研究分析基于通过研究终止收集的患者数据。如果没有另外指定，则疗效分析基于疗效可评估群体，定义为所有患者在他们的分配的治疗方案中接受每种药物的至少一个剂量，并且安全性分析基于安全性可评估群体，定义为所有接受任何量的研究治疗的患者。
入组按地区、国家和治疗臂的研究人员进行总结。患者情况按治疗臂进行总结。主要方案偏差，包括关于纳入和排除标准方面的主要偏差，按治疗臂进行总结。
对于可评估安全性的患者，研究药物施用数据按治疗臂制成表格或列出，并标记任何剂量修改。平均值和标准差用于总结每种研究药物的总剂量和剂量强度。将中止研究药物的原因制成表格。
人口统计学和基线特征(包括年龄、性别、种族/民族、体重、恶性肿瘤持续时间、转移性疾病部位(如果适用)和基线ECOGPS)总体且按治疗臂进行总结。
样品大小的确定
本研究并非旨在为假设测试做出明确的疗效和I类错误考虑。相反，本研究旨在获得治疗或治疗组合在向患有黑素瘤的患者施用时的初步疗效、安全性和PK数据。队列1由患有可切除的III期黑素瘤的患者组成，该患者未接受过针对其疾病的先前全身性疗法。队列2由患有IV期黑素瘤的患者组成，该患者在针对转移性疾病的至少一种但不超过两种治疗线期间或之后经历了疾病进展。
在队列1中，在研究期间，将大约55至145名患者随机划拨到对照臂和实验臂。在队列2中，将大约6至46名患者分配到实验臂。
疗效分析
队列1的主要疗效终点
队列1的主要疗效终点是手术时的pRR。pRR在CLND时新辅助治疗完成后(第7周)进行评定。pRR定义为达到由独立病理学审查确定的pCR(治疗的肿瘤床中完全不存在活肿瘤)，病理学接近完全缓解(pnCR；治疗的肿瘤床中活肿瘤<10％)；以及病理学部分缓解(pPR；<50％的***床被活肿瘤细胞占有)的患者比例。计算每臂的pRR以及90％CI。还计算实验臂与对照臂之间的pRR差异，以及90％CI。置信区间是通过精确方法或Wald方法估计的，取决于样品体量。
队列1的次要疗效终点
队列1的次要疗效终点是手术时由局部病理学评定确定的pRR、无事件存活期(EFS)、RFS、OS和手术前的ORR。pRR的定义见表5。
EFS，定义为从随机化到以下任何事件(以先发生者为准)的时间：由研究人员根据RECIST v1.1评定的排除手术的疾病进展；局部、区域或远处疾病复发；或因任何原因死亡。未经历过此类事件的患者在最后一次肿瘤后肿瘤评定时删失。
RFS，定义为从手术到首次记录的疾病复发或因任何原因死亡的时间。对于没有记录的疾病复发或死亡的患者，RFS在最后一次肿瘤评定当天删失。
OS定义为从随机化到任何原因导致的死亡的时间。在OS分析时仍然存活的患者在已知他们存活的最后日期删失。
Kaplan-Meier方法用于估计RFS、EFS和OS的中位数，使用Brookmeyer和Crowley方法构建90％CI。还使用Kaplan-Meier方法估计特定时间点的RFS、EFS和OS率，且基于针对方差的Greenwood估计来计算90％CI。
根据RECIST v1.1的ORR在新辅助治疗完成后(第7周)进行评定，并定义为由研究人员根据RECIST v1.1确定的CR或PR患者的比例。将缺失或无应答评定的患者归类为无应答者。注意到ORR是使用未经确认的术前放射学应答确定的。尽管RECIST v1.1要求在初始应答后至少4周完成确认性影像学评定，但由于CLND的时间安排，这些应答无法通过后续影像学来确认。
使用Clopper-Pearson方法计算每臂的ORR以及90％CI。还计算实验臂与对照臂之间的ORR差异，以及90％CI。CI是通过精确方法或Wald方法估计的，取决于样品体量。
队列1中的探索性疗效终点
队列1的探索性疗效终点是特定时间点(1年、2年、3年和5年)的界标EFS、界标RFS和界标OS。
使用Kaplan-Meier方法估计每个研究臂的界标EFS率、界标RFS率和界标OS率，通过使用Greenwood公式计算90％的CI。
队列2的主要疗效终点
队列2的主要疗效终点是ORR，如表6中所定义。ORR由研究人员根据RECIST v1.1确定。将缺失或无应答评定的患者归类为无应答者。
计算每个臂的ORR，即完全或部分缓解的患者比例，以及90％CI(Clopper-Pearson方法)。CI是通过精确方法或Wald方法估计的，取决于样品体量。
队列2的次要疗效终点
队列2的次要疗效终点是PFS、OS、特定时间点(例如6个月)的OS、缓解持续时间(DOR)和疾病控制，如表6中所定义。PFS、DOR和疾病控制由研究人员根据RECIST v1.1确定。
DOR源自具有CR或PR的疗效可评估的患者。
对于不曾记录疾病进展或死亡的患者，在最后一次肿瘤评定当天删失PFS和DOR。
在OS分析时仍然存活的患者在已知他们存活的最后日期删失。
Kaplan-Meier方法用于估计PFS、OS和DOR的中位数，且通过使用Brookmeyer和Crowley方法构建90％CI。还使用Kaplan-Meier方法估计特定时间点的OS率，且基于针对方差的Greenwood估计来计算90％CI。
计算每个治疗臂的疾病控制率(具有SD达≥12周的患者比例)、PR或CR，且通过使用Clopper-Pearson精确方法估计90％CI。
队列2中的探索性疗效终点
探索性疗效终点是研究人员根据iRECIST确定的ORR、PFS、DOR和疾病控制。
ORR、PFS、DOR和疾病控制通过使用上述章节“队列2中的主要疗效终点”和“队列2中的次要疗效终点”中描述的相同方法进行分析。DOR是针对具有完全或部分缓解的疗效可评估的患者得出的。
安全性分析
不良事件术语逐字映射到监管活动医学词典同义词库术语，并且不良事件严重程度根据NCI CTCAE v5.0以及根据CRS的ASTCT CRS共识分级量表进行分级。
通过汇总不良事件、实验室测试结果的变化、生命体征和ECG的变化以及对研究药物的暴露来评定安全性。联合治疗的暴露和安全性随访的长度按治疗臂进行总结。
所有不良事件术语均逐字映射至监管活动医学词典同义词库术语。不良事件严重程度根据NCI CTCAE v5.0进行分级，并且CRS的严重程度也将由研究人员根据ASTCT共识分级(Lee等人Biol Blood Marrow Transplant.25:625-638,2019)进行分级。在第一次研究治疗给药期间或之后发生的所有不良事件、危重不良事件、导致死亡的不良事件、特别关注的不良事件和导致研究治疗终止的不良事件(即治疗中出现的不良事件)通过映射的术语、适当的词库水平和严重性等级进行汇总。对于不同严重程度的事件，在总结中使用最高等级。总结死亡和死因。
相关实验室、生命体征(脉搏率、呼吸率、血压、脉搏血氧饱和度和体温)和ECG数据将按时间显示，并在适当处标明等级。此外，使用选定实验室测试结果的转置表来汇总基线和最大基线后严重程度等级。汇总了生命体征和ECG的变化。
此外，在队列1中，前12周期间等级≥3的免疫相关不良事件的发生率、性质，以及由于治疗相关不良事件导致的延迟手术的比率和持续时间将按治疗臂进行总结。如果在计划手术时研究治疗相关的不良事件没有得到充分改善，则CLND可能会延迟最多2周。
此外，手术并发症根据Clavien-Dindo分类进行评分。针对进行CLND的患者报告每个级别的并发症比率并进行评分。
免疫原性分析
若合适，可以评定阿特珠单抗和其他研究治疗的免疫原性。免疫原性分析包括所有进行至少一种抗药物抗体(ADA)评定的患者。根据接受的治疗将患者分组，或者如果在研究中止前未接受治疗，则根据分配的治疗分组。
对于阿特珠单抗，按治疗组汇总基线时(基线发生率)和药物施用后(基线后发生率)的ADA阳性和ADA阴性患者的数量和比例。在确定基线后发生率时，如果患者为ADA阴性或基线数据缺失，但在研究药物暴露后出现ADA应答(治疗诱导的ADA应答)，或者如果他们在基线时为ADA阳性并且一个或多个基线后样品的滴度比基线样品的滴度高至少0.60个滴度单位(治疗增强的ADA应答)，则认为患者为ADA阳性。如果患者为ADA阴性或基线数据缺失且所有基线后样本均为阴性，或者如果他们在基线时为ADA阳性但没有任何基线后样品的滴度比基线样品的滴度高至少0.60个滴度单位(治疗不受影响)，则认为患者为ADA阴性。
对于测试针对其的ADA的其他研究治疗，阳性是根据在该药物的先前研究中建立的标准方法确定的。
ADA状态与安全性、疗效、PK和生物标志物终点之间的关系可经由描述性统计进行分析和报告。
中期分析
鉴于本研究的探索性，预计在研究期间进行中期分析，最早的中期分析是在至少一个实验臂已完成初步期的入组并且患者已完成其病理应答评定(队列1)，或者至少一个实验臂已完成初步期的入组，并且已对患者进行至少9周的主要终点分析(ORR)随访(队列2)时进行的。若主办方认为适合，可进行进一步的中期分析。在队列1，基于实验臂与对照臂相比的临床活动性的中期分析，后验概率可用于指导进一步入组。如果中期分析表明实验臂的活动性高于对照臂，则实验臂可进一步入组20名额外患者(扩展期)。
在队列2，基于实验臂与预定ORR阈值(定义为与护理标准相比的改进)相比的临床活性的中期分析，后验概率可用于指导治疗臂的进一步入组。例如，如果可用数据表明护理标准ORR为10％，并且ORR改进10％被认为是临床有意义的变化，则这将导致计算后验概率时的ORR阈值为20％。
对于在分析时已接受至少两种先前治疗线的队列2患者群体，护理标准治疗的ORR基于同类免疫调节研究和其他化合物的新出现的内部和外部数据。
主办方可以基于可用数据的总量，包括但不限于观察到的缓解持续时间、PFS和潜在的早期OS数据，决定扩大臂的入组。从充分的益处-风险评定的角度，还考虑安全性和生物标志物数据(在做出此决定时可用)。
实例2：600mg Q3W剂量和时间表的基本原理
A.前言
RO7247669(PD1-LAG3)是正在研究用于治疗发炎实体瘤类型的新型双特异性抗体。它旨在通过阻断两种共抑制性检查点受体PD-1和LAG-3来重振T细胞。RO7247669将与PD-1的单价高亲和力结合和与LAG-3的单价高亲和力结合(比PD-1低20倍)结合，从而实现亲合力介导的选择性增加。LAG-3在调节性T细胞上的表达水平高于其他T细胞，并且据报道，单特异性抗LAG3抗体对其的阻断会不利地增强其抑制活性。然而，与功能失调的T细胞相比，Treg表达的PD-1水平较低，因此不太可能响应于使用RO7247669的治疗而被靶向和“激活”，其中与PD-1的结合也充当途径。最近，LAG3已被验证为黑素瘤一线(1L)治疗的临床靶标，并且最近批准了抗LAG3抗体瑞拉利单抗与抗PD-1抗体纳武单抗的组合。
近年来，由于从细胞毒性药剂转向癌症免疫疗法和分子靶向药剂，肿瘤学中的剂量优化和剂量选择范式需要转变。尽管在注册试验之前需要充分表征剂量和时间表，但仍然存在更高的剂量提供更高的疗效的观点。
阻断抑制性检查点受体的药剂的药理作用是通过与免疫细胞上的受体接合来驱动的。因此，靶标接合(TE)饱和可以用作药理学饱和(即对下游信号传导的最大影响)的替代物。因此，在靶受体达到饱和后，额外的药物预计不会产生额外的药理作用。因此，肿瘤靶标饱和所需的剂量可以建议为推荐的II期剂量。
B.方法
i.临床研究
RO7247669目前正在I期研究NP41300中作为单一药剂进行评估。研究NP41300是一项开放标签、多中心、剂量递增的I期研究，旨在评估RO7247669在患有局部晚期和/或转移性实体瘤的患者中的安全性/耐受性、药代动力学(PK)、药效学和初步抗肿瘤活性。该研究由具有两个时间表的剂量递增臂(A部分)和肿瘤特异性扩展臂(B部分)组成。A部分由A1部分(每两周给药一次(Q2W))和A2部分(每三周给药一次(Q3W))剂量递增设计组成，以确定RO7247669在患有实体瘤的患者中的最大耐受剂量(MTD)和/或扩展推荐剂量(RDE)。B部分由以MTD和/或RDE以及其他目的剂量施用的RO7247669的肿瘤特异性扩展组成，以供未来在具有选定实体瘤适应症的患者子集中进行开发。根据方案纳入患有晚期和/或转移性实体瘤的成年患者。
ii.临床药代动力学
使用经过验证的靶标结合能力PK测定来确定RO7247669血清浓度。为了评定RO7247669 PK，在NP41300研究中在规则的预先指定的时间点收集患者的血清样品。这些包括峰(输注结束后30分钟内)和谷(下一剂量前24小时内)样品以及在第1周期和第5周期采集的丰富样品。
使用非线性混合效应建模方法进行群体PK分析。评估一室和两室模型，然后测试不同的残余误差结构。然后通过测试每个PK参数的个体间变化性来精修模型，然后检查随机效应值之间的相关性，以指导简约ω结构的开发。模型选择基于对数似然标准、拟合优度图和科学合理性。
iii.肿瘤受体占有建模
PD1-LAG3的药理作用是由PD1和LAG3对CD8+T细胞的接合驱动的。因此，CD8细胞上这些受体的饱和可以用作对下游信号传导最大作用的替代物；额外的PD1-LAG3预计不会引起额外的药理作用。
进行肿瘤受体占有建模。目标是将肿瘤内PD1和LAG3的接合表征为RO7247669浓度和剂量的函数。为了用PK数据估计使靶标饱和所需的剂量，使用最小基于生理学的药代动力学(mPBPK)模型。该模型将不同的组织/器官简化为足以描述RO7247669的全身性浓度的两种不同类型的组织，并且包括肿瘤区室来描述瘤内RO7247669浓度以及PD1和LAG3的接合，从而提供合用方法。两个肿瘤亚区室代表血管和间质空间。PD1-LAG3基于肿瘤血流速率进入和离开肿瘤血管空间。一旦在肿瘤内部，PD1-LAG3就可以与肿瘤相关免疫细胞上的PD-1和/或LAG3结合，经由靶标介导的药物处置(TMDD)消除，或者通过对流消除。模型中还添加了肿瘤区室来描述RO7247669的肿瘤摄取。Li等人,Clinical Pharmacology andTherapeutics,110(1):200-209,2021先前描述了更简单的模型(只有一个靶标)来预测帕博利珠单抗的推荐2期剂量(图3)。后来的随机剂量比较研究证实了Li等人提出的RP2D作为跨肿瘤类型的关键剂量。添加到PD1-LAG3模型中的额外LAG3受体显示于图4。群体PK模型参数显示于表16。Li等人报告的帕博利珠单抗模型之外的模型参数提供于表17。
表16.群体PK模型参数
参数 估计 相对标准误差 95％置信区间 收缩率
CL(L/h) 0.0086 4.70 0.00785-0.00944 -
V1(L) 3.11 2.08 2.98-3.24 -
Q(L/h) 0.0229 7.77 0.0194-0.0264 -
V2(L) 1.98 7.64 1.68-2.27 -
V1上的HT 1.99 43.1 0.31-3.67 -
CL上的WT 2.35 12.7 1.76-2.93 -
Q上的HT 0.572 52.3 -0.0146-1.16 -
IIV-CL 0.114 17.7 0.0748-0.154 11.2
IIV-V1 0.0217 20.1 0.0131-0.0303 12.8
IIV-Q 0.214 31.6 0.0814-0.346 32.1
IIV-V2 0.209 22.8 0.116-0.303 23.6
比例误差 0.148 4.61 0.134-0.161 -
相加误差 0.712 35.6 0.214-1.21 -
CL：清除率；V1：中心体积；Q：室间清除率；V2：外周体积；IIV：个体间变化性。
表17.除帕博利珠单抗模型外的模型参数
/>
C.结果
i.临床疗效和安全性
在临床数据截止时(2022年3月1日)，共有35名患者在A1部分(Q2W)中通过六个RO7247669剂量水平进行治疗。在B部分中，共有83名患者被治疗。表18提供了在NP41300中接受RO7247669的患者的总结。
从50mg至2100mg Q2W的剂量递增期间，未达到最大耐受剂量(MTD)，且未观察到剂量限制性毒性(DLT)。首次施用50mg RO7247669后，观察到外周CD8+细胞上PD-1和LAG3受体的占有率超过90％，并且在直至2100mg的所有剂量下均观察到饱和。在不到20％的患者中，观察到针对RO7247669的持续ADA形成。在一些接受300mg或更少剂量的ADA阳性患者中发生暴露减少。在剂量递增期期间，在600mg及更高的剂量下观察到临床应答。
在整个临床剂量范围(50至2100mg Q2W)中，平均暴露随着剂量的增加以与剂量成比例的方式增加。
表18.NP41300中接受RO7247669的患者总结
截至2022年3月1日，研究NP41300 A部分的疾病控制率(DCR)为51.4％(18/35名患者)，并且客观缓解率(ORR)为17.1％(6/35名患者)。在以2100mg Q2W的RDE给药的患者中，13名患者中有7名(53.8％)的最佳应答为疾病稳定或更好(DCR 53.8％)，并且ORR为30.8％(4/13名患者)。
除了在RDE中观察到的已确认的部分缓解(cPR)之外，在600mg剂量水平下还存在2例cPR(ORR 50.0％)。
在该研究的B部分中，截至2022年3月1日，在以2100mq Q2W的RDE治疗的研究的患者中(B1、B2和B3部分)，DCR为48.3％(28/58)，并且ORR为5.2％(3/58)。在用600mg Q2W(B5部分)治疗的患者中，DCR为40％(4/10)，并且ORR为10％(1/10)。在用600mg Q3W治疗的患者中，DCR为28.6％(2/7)，并且ORR为14.3％(1/7)。
截至2022年3月1日，B1部分的经历检查点抑制剂(CPI)的黑素瘤患者的DCR为43.8％(14/32)，并且ORR为6.3％(2/32)。在B2部分的经历CPI的NSCLC中，50％的患者经历了临床益处(9/10DCR)，但没有一个患者有应答。在B3部分的未经CPI处理的食管鳞状细胞癌(ESCC)中，DCR为62.5％，并且ORR为12.5％(1/8名患者)。在生物标志物队列中，B5部分和B6部分的DCR分别为40％(44/10)和28.6％(2/7)，而ORR分别为10％(1/10)和14.3％(1例部分缓解(PR)/7)。
在A1部分(Q2W给药)中，大多数患者(94.3％)报告了至少一个不良事件(AE)。最常报告的AE(在至少20％的患者中发生)是贫血(37.1％)、便秘(31.4％),、呼吸困难(28.6％)、疲劳(25.7％)、乏力和食欲下降(各22.9％)、腹泻和发热(各20.0％)。总体而言，62.9％的患者报告了与治疗相关的AE。严重不良事件(SAE)的发生率为25.7％，其中6例(17.1％)是与治疗相关的SAE。共有6名患者经历了研究人员认为与研究治疗相关的SAE。与治疗相关的SAE包括150mg队列中的一例血胆红素升高AE、600mg队列中的一例肌炎AE、1200mg队列中的2例AE(一例呼吸困难AE和一例甲状腺功能亢进症)以及2100mg队列中的2例AE(一例胸腔积液AE和一例贫血AE)。
截至2022年3月1日临床截止日期，可获得针对A1部分和B部分中接受RO7247669单一疗法Q2W或Q3W的118名患有实体瘤的患者的初步安全性数据。118名患者中的112名患者(94.9％)总计报告了748例不良事件(AE)。总体而言，19名(54.3％)患者报告了1级或2级AE作为最大严重程度，并且14名(40.0％)患者报告了21例3级AE。没有观察到4-5级AE。在21例3级AE中，6名(17.1％)患者报告了6例3级AE，并被认为与研究治疗相关。在这6例相关的3级AE中，有4例AE被认为是严重的。图5和6提供了研究的剂量递增(A1部分，Q2W)部分中安全性可评估患者的不良事件概述。
ii.临床药代动力学
PopPK模型用于模拟Q2W和Q3W两种给药方案的600mg和1200mg的C谷。如图7所示，预计600mg和1200mg的Q3W和Q2W之后的谷浓度在第一次和第三次施用后重叠。
由于数据集有限，尚未对PD1-LAG3 PopPK模型进行包括肿瘤类型的协变量分析；然而，纳武单抗和帕博利珠单抗的分析已报告了肿瘤类型对药代动力学的影响极小。在纳武单抗的分析中，清除率(CL)在整个肿瘤类型(NSCLC、黑素瘤和RCC)中相似，表明PK与肿瘤类型无关。(Bajaj等人,CPT Pharmacometrics Syst Pharmacol,6(1):49-57,2017)。在帕博利珠单抗的分析中，PopPK模型包括来自晚期黑素瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)和其他实体瘤类型的患者数据。NSCLC患者的清除率比其他肿瘤类型增加13.9％；然而，这与临床无关。(Ahamadi等人,CPT Pharmacometrics Syst Pharmacol,6(1):58-66,2017)。
iii.肿瘤受体接合建模
RO7247669的多种剂量模拟了PD1和LAG3的接合，包括Q3W施用的0.015至1500mg(图8)。模拟显示，在60mg Q3W时，预计PD1和LAG3在肿瘤中饱和，在60mg时，LAG3受体占有率(RO)为90％，并且在2.37mg Q3W时，PD1 RO为90％。从群体PK模型来看，该剂量下的清除率呈线性，表明靶标介导的药物处置(TMDD)饱和，这与肿瘤受体接合模型的预测一致。
为了解释肿瘤在空间上异质的事实以及RO7247669将具有一系列肿瘤渗透的预测，该模型模拟了一系列血管化，其中血管化不良比血管化良好的区域低25倍。此外，预计在RO7247669暴露下存在一定的受试者间变化性水平：因此，预计600mg Q3W将确保大多数患者具有至少90％LAG3 RO，无论肿瘤摄取水平如何。
D.讨论
使用实体瘤剂量递增研究NP41003的临床和PK数据估计推荐的RO7247669剂量和600mg Q3W的时间表。使用基于已公开模型并结合RO7247669PopPK模型以及PD1和LAG3靶标特性数据的定量模型来模拟Q3W方案中跨越一系列临床剂量的靶标接合。考虑到受试者间和受试者内肿瘤暴露和血管化的差异，预计600mg Q3W会使肿瘤中CD8细胞上的PD1和LAG3受体饱和。阻断抑制性检查点受体的药理作用通过将受体与免疫细胞接合来驱动；因此，靶标接合的饱和可以用作药理学饱和(即，对下游信号传导的最大作用)的替代物。因此，在靶受体达到饱和后，额外的药物预计不会产生额外的药理作用。
这一结论得到了NP41300临床数据的支持，其中在600mg Q2W及更高的剂量队列中观察到了应答。此外，剂量递增队列中600mg Q2W的耐受性良好。600mg Q2W和Q3W的预测C谷重叠，并且因此预计两个时间表之间不会存在临床相关差异。因此选择更以患者为中心的600mg Q3W时间表进行进一步研究。
实例3：RO7247669的多个剂量在患有先前未经治疗的不可切除或转移性黑素瘤的参与者中的随机、开放标签、多中心、II期研究
A.研究设计
尽管有若干种新药剂为患者提供存活益处，但癌症仍为全世界范围内的主要死亡原因。许多癌症适应症的预后较差，并且由于肿瘤复发率高或发生远程转移，大多数晚期实体肿瘤的管理仍具有挑战性。尽管目前可用的检查点抑制剂(CPI)疗法对包括黑素瘤在内的各种肿瘤类型均有效，但仍需要靶向免疫检查点的其他治疗选择，因为患者在初始应答后最终会进展，或者无法应答PD-1/L1或细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)检查点阻断。
目前转移性黑素瘤的护理标准包括使用单独或组合的免疫检查点抑制剂(CPI)进行治疗，以及使用靶向v-Raf鼠肉瘤病毒癌基因同源物B1(BRAF)和丝裂原激活蛋白激酶(MEK)抑制剂疗法进行治疗。白介素2(IL-2)、溶瘤病毒和干扰素(IFN)疗法仍然是患者子集的选择。总体而言，尽管治疗选择取得了进展，但患有转移性黑素瘤的患者仍然经历不良的长期临床结果，反映了疾病的侵袭性和复杂的病因学，并凸显了持续未得到满足的医疗需求。
RO7247669(PD1-LAG3)是抗程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)/淋巴细胞活化基因3(LAG3)双特异性抗体(BsAb)，其设计为靶向功能失调的肿瘤抗原特异性T淋巴细胞，以建立或恢复医疗需求高度未满足的癌症患者的有效抗肿瘤免疫应答。通过使PD-1和LAG3都靶向功能失调的肿瘤特异性T淋巴细胞，RO7247669旨在恢复有效的抗肿瘤免疫应答，并为癌症患者提供比现有药剂更多的存活益处。与单独阻断PD-1相比，组合阻断LAG3和PD-1可能具有改善疗效而不增加显著毒性并且成为黑素瘤患者的治疗选择的潜力。
最近，瑞拉利单抗和纳武单抗的组合在患有先前未经治疗的转移性或不可切除的黑素瘤的患者中提供了PD-1和LAG3双重抑制的临床概念验证(Tawbi等人,N Engl J Med,386(1):24-34,2022)。与单独抑制PD-1相比，抑制两个免疫检查点在无进展存活期(PFS)方面提供了更大的益处。
本实例中描述的研究BP43963的目的是评定两个剂量水平的RO7247669在患有不可切除或转移性黑素瘤的参与者中的疗效、安全性、药代动力学(PK)和药效学，以选择用于进一步开发的推荐剂量。表19中总结了研究的目标和终点。
表19.BP43963研究的目标和终点
/>
主要目标通过表20中描述的五个属性在估计框架中表达。
表20.估计
/>
ORR：客观缓解率；PFS：无进展存活期；Q3W：每3周一次；TA：肿瘤评定。
i.整体设计
BP43963是一项II期、随机、开放标签、全球、多中心研究，其设计为评估两种不同剂量水平的RO7247669在患有不可切除或转移性黑素瘤的参与者中的安全性和临床活性，这些参与者之前未接受过针对其转移性或不可切除疾病的全身性疗法。图9中提供了研究设计的概述。
该研究纳入了大约80名年龄≥18岁的参与者，其东部肿瘤协作组(ECOG)体能状态为0或1。参与者以1:1的比例随机接受600mg每3周(Q3W)或1200mg Q3W的RO7247669。先前辅助或新辅助CPI治疗(是与否)和PD-L1表达(≥1％与<1％表达，基于使用抗体克隆22C3、SP263或28-8的免疫组织化学(IHC))用作分层因素。
只要参与者正在经历如由研究人员所评定的临床益处，在综合评定最多24个月的放射影像学数据、活检结果(如果可用)和临床状态后没有归因于疾病进展的不可接受的毒性或症状恶化就可继续治疗。满足根据RECIST v1.1的疾病进展标准的参与者如果满足进展后的所有治疗标准，则允许继续研究治疗。
参与者在相对于第1周期第1天(C1D1)日期的12周(±1周)时进行第一次肿瘤评定。随后的肿瘤评定每9周(±1周)进行一次，直至48周，并且然后相对于C1D1日期的每12周(±1周)进行一次，无论治疗是否延迟。
根据RECIST v1.1评定应答。研究人员根据RECIST v1.1确定单个时间点的客观缓解。研究治疗中止和根据RECIST v1.1的疾病进展后，大约每3个月通过电话、参与者医疗记录和/或门诊就诊收集存活随访信息，直至死亡、失访、研究终止或随机化后最多24个月，
以先发生者为准。
在研究期间，收集血清样品以评定RO7247669 PK，并检测针对RO7247669的抗体的存在。还采集参与者样品，包括存档和新鲜肿瘤组织、血清、血浆和血液样品，以用于生物标志物评定。
安全性评定包括不良事件(AE)的发生率、性质和严重程度，以及其他方案指定的测试，诸如实验室异常，这些测试被认为对
研究的安全性评估至关重要。
研究时长和研究结束
每个参与者从筛选到安全随访的研究持续时间最多约25个月(不包括长期随访(LTFU))。
每个参与者的每个研究时段的持续时间如下：
·筛选：随机化前最多28天
·治疗期：第1周期第1天(C1D1)直至最多24个月。
·存活随访：最后一剂研究治疗后90(±1周)天；然后每3个月(±2周)一次，直至死亡、失访、研究终止或随机化后最多24个月。
研究的终点被定义为对最后一例参与者接受末次观察(LPLO)的日期。LPLO预计将在最后一名参与者被随机化后最迟24个月发生。
参与者群体
参与者群体由患有不可切除或转移性黑素瘤且无针对不可切除或转移性疾病的先前全身性抗癌疗法的女性和男性参与者组成。
参与者数量
随机化至研究治疗的计划参与者数量为80名，使得大约80名参与者将可用于主要终点分析的评估。
伴随用药
一般来说，除了治疗不良事件(AE)的药物外，不允许同时使用治疗黑素瘤的药物，除非讨论并明确记录了例外的基本原理。
有关黑素瘤的背景信息
皮肤癌是所有癌症中最常见的。黑素瘤仅占所有皮肤癌的1％，是由黑素细胞发展而来的最具侵袭性和最危险的皮肤癌形式。根据美国癌症协会，2022年美国将诊断出约100,000例新的侵袭性黑素瘤病例。尽管及时诊断的浅表肿瘤的结果良好，但在转移情况下，黑素瘤仍然是最致命的癌症之一，5年存活率为27％(监测、流行病学和最终结果(SEER)2021，可在美国癌症协会网页上得到)。2011年之前，批准的治疗转移性黑素瘤的疗法有限，并且包括化学疗法和免疫疗法(IL-2)。此后，新的治疗选择已获得批准，其中包括靶向酪氨酸激酶通路的药物、靶向CTLA-4和PD-1受体的CPI疗法以及疫苗。
抗CTLA-4抗体伊匹单抗是第一个显示临床结果显著改善的CPI，并且因此被批准用于不可切除或转移性黑素瘤(Hodi等人,N Engl J Med,363:711-723,2010)。随后，与PD-1受体结合的单克隆抗体(帕博利珠单抗或纳武单抗)产生了改善的结果并降低了毒性(Robert等人,N Engl J Med,372:320-330,2010；Robert等人,N Engl J Med,372(26):2521-2532,2010；Weber等人,Lancet Oncol,16(4):375-384,2015)。与各自的单一药剂活性相比，组合的CTLA-4/PD-1阻断产生了更高的缓解率和更长的OS。然而，组合疗法伴随着毒性的增加(Wolchok等人,摘要9506ASCO年会2021)。
在先前未经治疗的转移性或不可切除黑素瘤中的2/3期研究(RELATIVITY-047)的最新结果表明，与单独抑制PD-1相比，组合阻断PD-1(经由纳武单抗)和LAG3(经由瑞拉利单抗)改善了PFS(Tawbi等人,N Engl J Med,386(1):24-34,2022)。该组合观察到的PFS益处似乎与纳武单抗和伊匹单抗的组合相似，但具有更有利的安全性概况(Tawbi等人,N EnglJ Med,386(1):24-34,2022,Wolchok等人,摘要9506ASCO年会2021)。与此同时，与使用单独的纳武单抗进行治疗相比，瑞拉利单抗和纳武单抗的组合没有显示出新的安全性信号。
目前转移性黑素瘤的护理标准包括使用单独或组合的免疫CPI进行治疗，以及使用靶向BRAF和MEK抑制剂疗法进行治疗。IL-2、溶瘤病毒和IFN疗法仍然是患者子集的选择。
总体而言，尽管治疗选择取得了进展，但患有转移性黑素瘤的患者仍然经历不良的长期临床结果，反映了疾病的侵袭性和复杂的病因学，并凸显了持续未得到满足的医疗需求。
有关RO7247669的背景信息
RO7247669是新型基于Fc沉默IgG1的双特异性抗体，采用1+1形式，掺入与以下两个CPI中的每一个的单价结合：PD-1和LAG3。RO7247669经工程化以优先与肿瘤微环境中共表达PD-1和LAG3二者的T细胞，或者在较小程度上表达单独的PD-1或LAG3的T细胞结合。优先与肿瘤微环境中的T细胞结合避免了靶向其他LAG3表达细胞，诸如肿瘤和外周中的调节性T细胞(不表达高水平的PD-1)。与LAG3的单价结合减少了抗体(Ab)在与T细胞表面结合后的内化。PD-1BsAb的另一个特点是工程化的基于IgG1的Fc区，其通过引入LALA P329G突变来防止与Fcγ受体结合。这避免了药物剃除(drug-shaving)，从而避免了肿瘤相关的巨噬细胞抗性机制，该机制已在基于IgG4的抗体(诸如帕博利珠单抗和纳武单抗)中观察到(Arlauckas等人,Sci Transl Med,9(389):eaal3604,2017)。
RO7247669目前在以下四个正在进行的临床研究中进行评估：
1.在患有晚期和/或转移性实体瘤的参与者(包括二线黑素瘤扩展队列)中的I期进入人体研究(研究NP41300)；
2.在患有晚期或转移性食管鳞状细胞癌的二线参与者中的II期研究(研究BP42772)；
3.在患有晚期肝细胞癌的一线参与者中与贝伐单抗组合的Ib/II期研究(研究GO42216)；和
4.在使用或不使用替瑞利尤单抗的新辅助可切除III期和随后线IV期黑素瘤参与者中的Ib/II期研究(研究BO43328)。
在所有研究中，RO7247669直至最大测试剂量(2100mg Q2W)均具有良好的耐受性，并且未鉴定与RO7247669相关的特定安全问题。在研究NP41300的剂量递增部分期间，未观察到剂量限制毒性(DLT)，并且未鉴定最大耐受剂量(MTD)。
研究BP42772是双盲研究，并且研究GO42216和BO43328最近才开始招募。目前可从研究NP41300获得相关疗效数据。截至数据截止日期2022年1月14日，该研究剂量递增的疾病控制率(DCR)为51％(35名可评估参与者中的18名)，并且客观缓解率(ORR)为17％(35名参与者中的6名)。在600mg每两周(Q2W)和2100mg Q2W下，在未经CPI处理和经历过CPI的参与者中，观察到跨越肿瘤类型的应答。虽然剂量<600mg时没有应答者(N＝12)，但剂量≥600mg Q2W时有7/23名应答者，表明剂量-应答关系。在剂量≥600mg Q2W时，未观察到暴露与最佳总缓解(BOR)之间的明显关系。疾病进展患者的平均Cavess(稳态平均浓度)与600和2100mg队列中部分缓解的患者相似。
截至2022年1月14日，已在NP41300扩展队列中评估了28名经历过CPI的葡萄膜(28名参与者中的9名)和非葡萄膜(28名参与者中的19名)PDL-1和LAG3全部黑素瘤参与者在2100mg Q2W下的疗效。在非葡萄膜黑素瘤参与者中，ORR为21％(4/19)，并且DCR为58％(11/19)。
在两名先前接受帕博利珠单抗的参与者、一名接受纳武单抗的参与者以及一名接受纳武单抗和伊匹单抗组合治疗的参与者中观察到了应答。入组仍在进行中。
益处-风险评定
尽管RO7247669的临床经验有限，但抗PD-1/PD-L1单克隆抗体的临床疗效和安全性概况已得到充分表征和确定。近年来，三种CPI，即帕博利珠单抗、纳武单抗和伊匹单抗，已由美国食品药品监督管理局(FDA)和其他卫生当局批准用于治疗不可切除或转移性黑素瘤。据报道，患有晚期黑素瘤的患者的中位总存活期(OS)为：纳武单抗和伊匹单抗的组合为72.1个月，纳武单抗单一疗法为36.9个月，并且伊匹单抗单一疗法为19.9个月(Wolchok等人,摘要9506ASCO年会2021)。
下一代组合疗法可能会产生更高的缓解率、更大的缓解深度、更长或类似的OS，以及临床上有意义的改善的安全性概况，正如抗PD-1和抗CTLA-4组合在晚期黑素瘤患者中所主要到的那样。因此，与单特异性PD-1定向抗体相比，人们可能期望更好的疗效主要来自于同时靶向PD-1和LAG3介导的免疫抗性机制。
如上所讨论的，瑞拉利单抗和纳武单抗的组合在患有先前未经治疗的转移性或不可切除的黑素瘤的患者中提供了PD-1和LAG3双重抑制的临床概念验证(Tawbi等人,N EnglJ Med,386(1):24-34,2022)。与单独抑制PD-1相比，抑制两个免疫检查点在PFS方面提供了更大的益处。同时，瑞拉利单抗和纳武单抗的组合没有显示出新的安全性信号，并且与纳武单抗和伊匹单抗的组合相比，回顾时显示出显著改善的安全性概况(Tawbi等人,N Engl JMed,386(1):24-34,2022,Wolchok等人,摘要9506ASCO年会2021)。
如上所讨论的，RO7247669显示出能够在患有黑素瘤和其他肿瘤类型的患者中诱导应答，这些患者已证明对CPI疗法(包括纳武单抗和伊匹单抗的组合治疗)具有抗性。特别地，在研究NP41300中观察到的在非葡萄膜黑素瘤参与者中21％的ORR与可比患者群体中瑞拉利单抗和纳武单抗组合的11.5％的过度提供缓解率相比表现良好(Ascierto等人,AnnOncol,v611-v612,2017)。
RO7247669在高达2100mg Q2W的剂量下已被耐受；AE是可控的，并且观察到安全性概况跨越不同实体瘤适应症以及已批准的PD-1定向抗体呈现一致性。总之，与纳武单抗单一疗法相比，RO7247669具有增加益处的潜力，并且具有相似的安全性概况。
考虑到初步疗效和可控的安全性概况，以及由于其双重检查点抑制作用机制而改善结果的潜力，用RO7247669治疗对诸如黑素瘤的实体瘤具有治疗潜力。基于上述考虑、当前可用的数据以及计划的安全性监测和管理指南，拟议的研究治疗被认为对本研究中包括的群体具有适当的益处/风险概况。
B.基本原理
研究群体的基本原理
该研究纳入患有不可切除或转移性黑素瘤且未接受过针对不可切除或转移性疾病的先前全身性抗癌疗法的参与者。最近在这种疗法环境中进行了单特异性抗LAG3抗体与单特异性抗PD-1抗体组合的临床验证(Tawbi等人,N Engl J Med,386(1):24-34,2022)。结合正在进行的研究NP41300中经历过CPI的黑素瘤队列的新出现的疗效数据，预计用RO7247669治疗将在该适应症中提供临床益处。
选择一线黑素瘤还因为它允许测试两种不同剂量水平的单一疗法RO7247669，因为不进行化学疗法的CPI治疗是该群体当前的护理标准。因此，在不存在组合搭配的潜在混杂效应的情况下，可以评定剂量依赖性效应。
本研究的疾病特异性资格标准与RELATIVITY-047中使用的那些类似。与单独的纳武单抗相比，观察到用瑞拉利单抗和纳武单抗组合治疗的益处，这与肿瘤PD-L1和LAG3表达无关，并且与患者的BRAF突变状态无关。因此，参与者符合该研究的条件，而与肿瘤PD-L1和LAG3
表达及其BRAF突变状态无关。将患有BRAF突变黑素瘤的参与者纳入也被认为是合理的，因为目前的指南建议在使用BRAF和MEK抑制剂治疗之前考虑使用免疫疗法进行治疗，因为即使在停止治疗后，它也可以提供非常长期的疾病控制(Keilholz等人,Ann Oncol,31(11):1435-1448,2020)。
主要终点的基本原理
虽然OS仍然是证明临床益处的黄金标准，但测量该终点需要比其他终点更多的患者数量和更长的随访时间，并且可能与后续疗法混淆(Pazdur等人,Oncologist,13增刊2:19-21,2008)。相比之下，PFS(包括界标PFS)是早期读数，其允许区分过去一线黑素瘤的治疗益处(Wolchok等人,摘要9506ASCO年会2021)。因此，PFS已被认为是可接受的调控终点。例如，基于以PFS为主要终点的3期临床试验，FDA批准达拉非尼和曲美替尼作为单一疗法和组合用于治疗不可切除或转移性黑素瘤(Flaherty等人,N Engl J Med,367:107-114,2012；Hauschild等人,Lancet,380:358-365,2012；Long等人,ASCO年会摘要；32:9011,2014)。PFS也已是RELATIVITY-047试验的主要终点，并且治疗6个月后已经证明了益处(Tawbi等人,N Engl J Med,386(1):24-34,2022)。
与OS相比，PFS不会与研究后治疗疗法混淆。因此，我们认为PFS是选定患者群体的优选选择，因为临床活性治疗选择(例如，纳武单抗、伊匹单抗、维莫非尼、达拉非尼和曲美替尼)可越来越多地用于患有不可切除或转移性黑素瘤的患者，并且其在当前研究中于疾病进展后使用可能会混淆OS终点。
出于这些原因，选择6个月时的PFS作为疗效的主要终点。
分层因素的基本原理
为了最大限度地减少跨治疗臂不平衡的可能性，试验中使用了以下两个分层因素：先前辅助或新辅助检查点抑制剂治疗(是与否)和PD-L1表达(基于使用抗体克隆22C3、SP263或28-8的IHC，≥1％肿瘤细胞表面表达与<1％肿瘤细胞表面表达)。
选择先前辅助或新辅助CPI治疗(是或否)是因为使用CPI治疗已经改善了高风险II/III期黑素瘤完全切除后的无复发存活期(RFS)。利用CPI的辅助和新辅助治疗已经或将成为黑素瘤治疗的护理标准的一部分。因此，在最后一剂与复发日期之间的至少6个月内完成辅助或新辅助抗PD-1或抗CTLA-4疗法的参与者符合该研究的条件。由于先前辅助或新辅助抗PD-1或抗CTLA-4疗法对不可切除或转移性疾病中对抗PD-1和抗LAG3组合疗法的应答性的影响尚不清楚，所以当前试验中的参与者被相应分层。
关于PD-L1表达，先前使用纳武单抗单一疗法的临床研究表明，具有PD-L1阳性肿瘤的患者可能比表达不确定的患者具有更高的缓解率(Robert等人,N Engl J Med,372:320-330,2010)。同样，据报道，在PD-L1表达为1％或更高的患者中，用瑞拉利单抗和纳武单抗的组合治疗的患者的中位PFS为12.6个月，而对于PD-L1表达低于1％的患者，使用瑞拉利单抗和纳武单抗组合的中位PFS为6.4个月(Tawbi等人,N Engl J Med,386(1):24-34,2022)。
生物标志物评定的基本原理
该研究的主要假设是经由PD-1-LAG3进行的额外检查点阻断将重新激活耗尽的T细胞，并引起肿瘤微环境中CD8 T细胞浸润和增殖的增加。因此，治疗引起的生物标志物探索将侧重于肿瘤微环境和外周血二者中与PD-1-LAG3相关的从基线的变化。还进行了外周血的连续血液采样，以评定免疫细胞概况的动力学变化，然后检查该概况与用RO7247669治疗的关联。
为了探索对RO7247669的应答的预测标志物，最初的假设侧重于应答与基线PD-L1、CD8、LAG3和/或PD-1表达的关联。其他探索性生物标志物包括评定外周血和肿瘤微环境中的基线免疫细胞子集/效应基因签名或其他可溶性标志物(诸如血液肿瘤突变负荷、循环肿瘤脱氧核糖核酸(ctDNA)等)。如果初始数据为这些测量产生了强有力的科学基本原理，则可以测量其他生物标志物。
剂量合理性
RO7247669以600mg或1200mg Q3W的剂量施用(在每个21天周期的第1天)。
如实例2中所讨论的，在研究NP41300中，RO7247669是耐受的，并且没有鉴定出与RO7247669相关的新的安全问题。直至最高剂量2100mg Q2W均未观察到DLT，并且未鉴定出MTD。
·在600mg和2100mg Q2W剂量下观察到通过放射摄影学PR测量的抗肿瘤活性(研究NP41300)。
·RO7247669的PK在研究NP41300中测试的剂量范围内呈剂量线性。
·使用最小基于生理学的药代动力学模型对肿瘤中的PD-1和LAG3靶标接合进行进一步建模，以描述肿瘤内RO7247669浓度，并估计以RO7247669的结合特性为特征的靶标介导的药物处置。据估计，考虑到参与者间PK变化性和肿瘤内RO7247669分布的空间异质性两者，在整个治疗期，在大多数参与者中，600mg Q3W RO7247669将在肿瘤部位处产生>90％的PD-1和LAG3靶标接合。使用类似的方法来确认推荐的II期剂量作为帕博利珠单抗的关键剂量(Li等人,Clinical Pharmacology and Therapeutics,110(1):200-209,2021)。
·针对600mg Q2W和600mg Q3W进行了肿瘤受体占有率模拟，并且两种方案在整个治疗期均产生>90％的PD-1和LAG3受体占有率，因此选择频率较低的Q3W方案以最小化参与者的治疗负担。
·RO7247669的免疫原性以及抗药物抗体(ADA)开发对暴露和疗效的影响尚未完全了解。然而，有证据表明，在研究NP41300中，在≤300mg的剂量下观察到ADA介导的对暴露的影响。迄今为止，在600mg剂量下未观察到ADA，这使得在600mg下ADA介导的对暴露的潜在影响存在不确定性。
迄今为止，尚未观察到在1200mg和2100mg下发展ADA的参与者中对暴露的影响：因此，预计1200mg将使循环ADA饱和并最小化对暴露的影响。
因此，本研究选择600mg和1200mg Q3W的剂量和方案向参与者施用。
C.纳入和排除标准
参与者群体由诊断为患有不可切除或转移性黑素瘤且无针对不可切除或转移性疾病的先前全身性抗癌疗法的参与者组成，该参与者满足所有给定的纳入标准，且不满足任何排除标准。
纳入标准
只有当满足所有下列标准时，参与者才有资格被纳入研究中：
常规
1.能够并愿意提供书面知情同意书，并遵守国际协调委员会(ICH)和当地法规的研究方案。
2.年龄≥18岁
参与者类型和疾病特征
3.根据AJCC分期***(不可切除的III期或IV期)，参与者必须患有组织学证实的不可切除或转移性黑素瘤。
4.根据RECIST v1.1的放射学可测量疾病。除非放射疗法后出现明显进展，否则先前照射的病灶不应计为靶病灶。
5.ECOG体能状态为0至1。
6.参与者必须已知BRAF V600突变状态。
7.参与者必须已知PD-L1状态。
·PD-L1表达定义为使用抗体克隆22C3、SP263或28-8进行经批准的IHC测定，显示出任何强度的质膜PD-L1染色的肿瘤细胞的百分比。
·PD-L1表达需要在入组前3个月内获得的组织样品上确定，并且在采集时和PD-L1测试之间没有进行干预治疗。
8.必须提供来自不可切除或转移性疾病部位的肿瘤组织用于生物标志物分析。
9.根据治疗医生的临床判断，参与者必须具有至少一个可进行活检的非靶肿瘤病灶，并同意进行强制性治疗活检。
医学状况
10.足够的心血管功能。
11.来自任何先前放射性疗法、化学疗法或手术程序的AE必须已消退至≤1级，脱发(任何级别)、白癜风、通过替代疗法管理的内分泌病和2级周围神经病除外。
12.足够的血液学功能。
13.足够的肝功能。
14.足够的肾功能。
15.获得的其他足够的实验室参数：
·血清白蛋白≥25g/L(2.5g/dL)
·对于未接受抗凝治疗的参与者：凝血酶原时间(PT)和活化部分凝血活酶时间≤1.5x ULN
·对于接受治疗性抗凝的参与者：稳定的抗凝剂方案。
避孕
16.男性和/或女性参与者：
避孕和禁欲要求旨在防止胚胎暴露于研究治疗。应该根据临床研究的持续时间以及参与者的优选和惯常生活方式来评估针对男性和/或女性入组资格的性禁欲的可靠性。***(例如日历、***、症状体温或***后方法)和体外***为不可接受的避孕方法。
·女性参与者：女性参与者如果没有怀孕、没有哺乳，并且至少符合以下条件之一，便是合格的：
·没有生育能力的女性(WOCBP)。
·WOCBP，她们：
·同意在治疗期期间和最后一剂研究药物后至少4个月内保持禁欲(避免异性***)或使用导致每年失败率<1％的高效避孕方法。
·在该同一时期，女性必须避免捐献卵子。
·随机化前7天内妊娠测试(血液)呈阴性。
·男性参与者：在治疗期期间和最后一剂研究药物后至少4个月内，同意：
·与WOCBP或怀孕的女***保持禁欲(避免异性***)或使用诸如避孕套的避孕措施，以避免暴露胚胎。
·避免捐献***。
排除标准
如果满足下列标准中的任何一个，则将参与者从该研究排除：
常规
1.妊娠、泌乳或哺乳。
2.已知对RO7247669的组分中的任一种超敏，包括但不限于对中国仓鼠卵巢细胞产品或其他重组人或人源化抗体超敏。
参与者类型和疾病特征
3.参与者不得患有眼部黑素瘤。
医学状况
4.有症状的中枢神经***(CNS)转移。先前治疗过脑转移的参与者可以参加，条件是他们：
·稳定(随机化前至少28天没有通过计算机断层扫描(CT)或磁共振成像(MRI)产生的进展证据)。
·随机化前至少28天没有新的或扩大的脑转移的证据。
·随机化前至少28天未接受全身性类固醇治疗。
5.未经手术和/或放射进行明确治疗的脊髓压迫症，或没有证据表明随机化前疾病在临床上稳定≥14天。
6.活动性癌性脑膜炎/软脑膜疾病或癌性脑膜炎/软脑膜疾病史。
7.无症状的CNS原发性肿瘤或转移，条件是它们在随机化前的最后28天内需要类固醇或酶诱导抗惊厥药。
8.不受控制的肿瘤相关疼痛。需要止痛药的参与者在进入研究时必须采用稳定的方案。
9.患有活动性第二恶性肿瘤的参与者。同时发生的恶性肿瘤例外包括：经治愈性治疗的宫颈原位癌、预后良好的乳腺原位导管癌、基底细胞或鳞状细胞皮肤癌、或低级别的早期局限性***癌以及任何先前治疗过的已缓解至少两年的早期非血液恶性肿瘤。
10.可能影响方案依从性或结果解释的重大、不受控制的伴随疾病的证据，包括糖尿病、相关肺部疾患史、已知的自身免疫性疾病或免疫缺陷，或其他正在进行纤维化的疾病(诸如硬皮病、肺纤维化、肺气肿、神经纤维瘤病、掌/跖纤维瘤病等)。
11.知情同意前一年内的脑炎、脑膜炎或不受控制的癫痫发作。
12.随机化前6个月内的重大心血管/脑血管疾病，包括以下中的任一种：
·高血压危象/脑病。
·不稳定型心绞痛。
·短暂性脑缺血发作/卒中。
·充血性心力衰竭。
·需要治疗的严重心律失常(房颤、阵发性室上性心动过速除外)。
·血栓栓塞事件史(诸如心肌梗塞、卒中或肺栓塞)
13.随机化前28天内已知的活动性或不受控制的细菌、病毒、真菌、分枝杆菌(包括但不限于结核病和典型分枝杆菌疾病)、寄生虫或其他感染(不包括甲床的真菌感染)或任何需要IV抗生素或住院(与完成抗生素疗程有关，肿瘤热除外)治疗的重大感染发作。
14.已知的临床上显著的肝病，包括酒精性肝炎、肝硬化和遗传性肝病。
15.在随机化前28天内的大手术程序或重大外伤(不包括活检)，或者预期研究过程期间需要进行大手术。
16.任何其他疾病、新陈代谢功能障碍、体格检查发现或临床实验室发现，根据这些发现合理怀疑存在症禁忌使用研究药物或可能影响对结果的解释或可能使参与者处于治疗并发症的高风险中的疾病或病症。
17.会禁止知情同意的痴呆或精神状态改变。
18.不受控制的胸腔积液(留置导管(例如)的参与者除外)、心包积液或需要反复引流程序(预计每月一次或更频繁地发生)的腹水。
19.活动性自身免疫性疾病或免疫缺陷或者自身免疫性疾病或免疫缺陷史，但以下情况除外：
·有自身免疫介导的甲状腺功能减退症或内分泌病史并且正在接受稳定的甲状腺替代激素或适当替代疗法的参与者符合该研究的条件。
·患有1型糖尿病且正在接受胰岛素方案的参与者符合该研究的条件。
·如果满足以下所有条件，患有湿疹、银屑病、慢性单纯性苔藓或仅具有皮肤病表现的白癜风(例如，患有银屑病关节炎的参与者除外)的参与者符合本研究的资格：
·皮疹必须覆盖<10％的身体表面积。
·疾病被良好控制在基线并且仅需要使用低效局部皮质类固醇。
·在过去12个月内没有发生需要补骨脂素加紫外线A辐射、甲氨蝶呤、类视黄醇、生物制剂、口服钙调神经磷酸酶抑制剂或高效或口服皮质类固醇的潜在病症的急性恶化。
20.筛选时人类免疫缺陷病毒(HIV)测试呈阳性。
21.筛选时乙型肝炎表面抗原(HBsAg)呈阳性或总乙型肝炎核心抗体(HBcAb)测试呈阳性。筛选时HBsAg或总HBcAb测试呈阳性，随后乙型肝炎病毒(HBV)脱氧核糖核酸(DNA)测试呈阴性的参与者符合条件。
22.筛选时丙型肝炎病毒(HCV)抗体测试呈阳性。筛选时HCV抗体测试呈阳性随后HCV核糖核酸(RNA)测试呈阴性的参与者符合条件。
先前/伴随疗法
23.针对不可切除或转移性黑素瘤的先前全身性抗癌疗法。
24.利用任何免疫调节剂(包括CPI(诸如抗PD-L1/PD-1和抗CTLA-4))的先前抗癌疗法。如果所有相关AE均已恢复至基线或稳定，则允许以下先前辅助或新辅助黑素瘤疗法：
·在最后一剂与复发日期之间至少6个月内进行的基于抗PD-1和/或抗CTLA-4的疗法。在(新)辅助治疗期间或完成后6个月内复发的参与者不符合条件。
·在随机化前至少6周进行最后一剂IFN疗法。
25.利用抗LAG3疗法的先前治疗。
26.任何与先前免疫疗法(例如，抗CTLA-4或抗PD-1/PD-L1治疗或特异性靶向T细胞共刺激或免疫检查点途径的任何其他抗体或药物)相关的危及生命的毒性史，通过标准对策(例如，肾上腺危象后的激素替代)不太可能再次发生的那些除外。
27.随机化前28天内接种活疫苗，或预期在研究期间需要减毒活疫苗。
28.在随机化之前14天内利用治疗性口服或IV抗生素治疗。
29.随机化前与任何其他研究药物(定义为目前没有监管机构批准的适应症的治疗)同时治疗<28天或药物的5个半衰期(以较短者为准)。
30.随机化前<5个半衰期或28天(以较短者为准)使用免疫调节剂和免疫抑制剂/药物进行治疗，但以下情况除外：
·允许使用吸入皮质类固醇和盐皮质激素(例如，氟氢可的松)。
·允许接受急性和/或低剂量全身性免疫抑制药物(例如，用于恶心的有限使用***或长期使用≤10mg/天的***或等效剂量的皮质类固醇)的参与者。
31.定期免疫抑制疗法(即，器官移植、慢性风湿病)。
32.不允许在开始使用RO7247669治疗前的最后28天内进行放射疗法，有限的姑息性放射疗法除外。
33.利用过继细胞疗法(诸如嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)疗法)的先前治疗。
D.研究治疗
表21总结了施用的治疗。
表21.施用的治疗的总结
研究治疗名称 RO7247669
IMP和NIMP IMP
剂量制剂 液体
单位剂量规格/剂量水平 300mg/6mL
剂量 600mg或1200mg Q3W，持续最多24个月
施用途径 IV输注
包装和标签 研究治疗在小瓶中提供。
IMP＝研究药物产品；NIMP＝非研究药物产品
RO7247669静脉内(IV)施用。施用期间输注装置必须使用0.2μm或0.22μm串联过滤器。
RO7247669的初始剂量历经60±10分钟递送(对于经历输注相关症状的参与者，输注可能会减慢或中断)，之后进行60分钟的观察期。如果60分钟的输注被耐受且没有输注相关的AE，则所有后续输注可历经30±10分钟递送，之后进行30分钟的观察期。
前驱用药
首次施用RO7247669之前预计无需进行预防性用药。
在之前的输注中经历2级输注相关反应(IRR)的参与者对于后续输注应进行预防性用药。未来周期的预防性用药方案可能会减少，或者如果参与者在当前输注中没有经历2级或更高的IRR事件的话。
允许的疗法
允许参与者在研究期间使用以下疗法：
·年失败率<1％的口服避孕药。
·激素替代疗法。
·预防性或治疗性抗凝疗法(诸如稳定剂量的华法林或低分子量肝素)。
·灭活流感疫苗。
·施用甲地孕酮醋酸酯作为食欲刺激剂。
·吸入皮质类固醇和盐皮质激素(例如，氟氢可的松)。
·急性和/或低剂量全身性免疫抑制用药(例如，用于恶心的一次剂量的***或长期使用≤10mg/天的***或等效剂量的皮质类固醇)。
·研究期间的任何时间都允许进行有限的现场姑息性放射疗法，但施用RO7247669的日子除外。
不建议同时使用草药疗法，因为它们的PK、安全性和潜在的药物-药物相互作用通常是未知的。但是，在研究期间，可以使用并非旨在治疗癌症的草药疗法。
禁止疗法
一般来说，除了治疗AE的药物外，不允许伴随药物。
在研究期间(不包括存活随访)以及随机化之前至少28天或药物的5个半衰期(以较短者为准)内和研究治疗期间禁止使用以下疗法，除非下文另有说明：
·研究药剂或未经许可/未经批准的药剂。
·旨在用于治疗癌症的疗法(包括但不限于化学疗法、激素疗法、免疫疗法、手术切除靶病灶和放射疗法(有限姑息性放射疗法除外)，以及标签中具有抗癌活性的草药疗法或中药)。
·在≤10mg***/天(或等效物)基线下，长期使用类固醇(允许吸入和局部类固醇)。同时的高剂量全身性皮质类固醇。
·在研究期间或施用最终剂量的研究药物后4个月内，施用减毒活疫苗或预期需要此类减毒活疫苗。
·全身性免疫刺激剂(包括但不限于IFN和IL-2)，因为这些药剂与CPI组合时可能会增加自身免疫性病症的风险。
·在全身性免疫抑制用药(包括但不限于环磷酰胺、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤和沙利度胺)，因为这些药剂可能会改变研究药物的疗效和安全性。
·过继细胞疗法，诸如CAR-T疗法。
E.疗效评定
参与者在相对于随机化日期的第12周(±1周)时进行其第一次肿瘤评定。随后的肿瘤评定每9周(±1周)进行一次，直至48周，并且然后相对于随机化日期的每12周(±1周)进行一次，无论治疗是否延迟。无论治疗是否延迟，均按照所描述的时间间隔进行肿瘤评定，直至根据RECIST v1.1的放射摄影学疾病进展、开始新的抗癌疗法、撤回同意、死亡、研究终止或随机化后最多24个月，以先发生者为准。因此，在因疾病进展或临床益处丧失以外的原因中止治疗的参与者中，肿瘤评定将按照时间表继续进行。对于根据RECIST v1.1的疾病进展后继续治疗的参与者，肿瘤评定将按照时间表继续进行，直至研究治疗中止。
F.东部肿瘤协作组体能状态
ECOG体能状态在筛选时、每次研究治疗施用前以及中止访视时进行评定。如果可能，建议在整个研究过程中由同一人评定参与者的体能状态。
G.输注相关反应
治疗性抗体的施用可能引起IRR，其特征在于诸如发烧、寒战、头晕、高血压、低血压、呼吸困难、烦躁、出汗、潮红、皮疹、心动过速、呼吸急促、头痛、肿瘤疼痛、恶心和/或呕吐的症状。也可能出现呼吸道和心脏症状，诸如支气管痉挛、喉部和咽喉刺激、喘息、喉部水肿和心房颤动。此类反应通常发生在输注期间或输注后不久，或研究治疗输注后24小时内，主要是在第一次输注时。发病率和严重程度通常随着后续输注而减少。
参与者还可能发展免疫球蛋白(Ig)E介导的超敏反应。IRR可能难以与过敏反应区分；然而，在IgE介导的超敏的情况下，症状通常在先前暴露之后出现，并且很少在第一次输注时出现。如果确认IgE介导的超敏反应，则应永久中止治疗。表22提供了输注相关反应预防和管理的建议。
表22.输注相关反应预防和管理的建议
IRR＝输注相关反应；NCI CTCAE＝美国国家癌症研究所通用术语不良事件的标准。
a症状分级参见NCI-CTCAE，v5.0量表。
b支持性治疗：对于支持性治疗，如果患者在前4小时内未接受过对乙酰氨基酚/扑热息痛和抗组胺药诸如苯海拉明治疗，则接受这些药物治疗。可以根据临床指示施用静脉内液(例如，生理盐水)。对于支气管痉挛、荨麻疹或呼吸困难，可以根据机构实践施用抗组胺药、氧气、皮质类固醇(例如，100mg IV***龙或等效物)和/或支气管扩张剂。
H.统计考虑
样品量确定
计划纳入的参与者数量为80名，以1:1的比例随机化接受RO7247669Q3W，剂量为600mg或1200mg。为了评估主要终点，对参与者进行跟踪直至最后一个参与者后至少6个月，确保在计算6个月PFS时不存在施用删失。该研究旨在定性表征两种剂量水平，并了解剂量之间的任何明显差异。然而，该研究对于检测所有临床上有意义的差异不是足够有效的。
假设在6个月之前没有进行删失，可以在6个月PFS终点周围考虑一些样品量。如果不进行删失，6个月的PFS将与前6个月内未经历任何进展或死亡的参与者的比例一致，这可以通过二项分布来描述。
表23显示了6个月PFS中几个可能的真正潜在差异的功效，假设最不有效臂在6个月时未经历任何进展或死亡的参与者比例为约43％(RELATIVITY-047试验中纳武单抗臂的观察到的6个月PFS)。
该表显示，对于检测6个月PFS中20％的差异存在70％的功效(假设20％的2侧α)，而在存在15％的差异时，该功效会降至53％。
表23.几种可能的真正6个月PFS率的功效(假设6个月之前没有删失)
最不有效臂的6个月PFS率 最有效臂的6个月PFS率 功率
43％ 53％ 36％
43％ 58％ 53％
43％ 63％ 70％
PFS＝无进展存活期
分析设置
出于分析目的，群体的定义如表24所示。
表24.分析群体
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人口统计和基线特征
研究入组、研究药物施用、研究药物中止的原因以及中止研究的原因按治疗臂进行总结。人口统计(包括年龄、性别和自我报告的种族/民族)和基线疾病特征(例如，ECOG体能状态)总体并且按治疗臂进行总结。根据需要，对连续数据提供描述性统计(平均值、中位数、标准差和范围)，并且对分类数据提供频率和百分比。
基线测量是参与者接受研究治疗之前获得的最后可用数据。
疗效分析
主要和次要疗效分析包括意向治疗(ITT)群体中的所有参与者，参与者根据随机时分配的剂量水平进行分组。疗效统计分析方法显示于表25中。
表25.疗效统计分析方法
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CI＝置信区间；CR＝完全缓解；DCR＝疾病控制率；DoR＝缓解持续时间；EORTC＝欧洲癌症研究与治疗组织；
HR＝风险比；ORR＝客观缓解率；OS＝总存活期；PFS＝无进展存活期；PR＝部分缓解；RECIST＝实体瘤疗效评估标准。
实例4：一项评估多个基于免疫疗法的治疗组合在患有晚期肝癌(MORPHEUS-肝)的患者中的疗效和安全性的Ib/II期、开放标签、多中心、随机、伞式研究
A.研究设计
GO42216是一项Ib/II期、开放标签、多中心、随机、伞式研究，其评估基于免疫疗法的治疗组合在患有晚期肝癌的患者中的疗效、安全性和药代动力学。该研究的设计具有灵活性，以在新疗法可用时开放新的治疗臂，关闭表现出最小临床活动性或不可接受的毒性的现有治疗臂，调整患者群体(例如，关于先前抗癌治疗或生物标志物状态)或者引入额外的患有其他类型的晚期原发性肝癌(例如，肝内胆管癌(iCCA))的患者队列。
队列1纳入患有局部晚期或转移性肝细胞癌(HCC)的患者，这些患者未接受过针对其疾病的先前全身性疗法(图10和11)。最初将符合条件的患者随机分配到几个治疗臂中的一个(第1阶段)。在第1阶段期间经历临床益处丧失或不可接受的毒性的患者可能符合接受利用不同治疗组合治疗的条件(第2阶段)。
第1阶段
在第1阶段期间，患者被随机分配到对照臂(阿特珠单抗加贝伐单抗(Atezo+bev))或由贝伐单抗与RO7247669的组合组成的实验臂(RO7247669+bev)。下表26中概述了研究的具体目标和相对应的终点。
表26.疗效统计分析方法
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ADA＝抗药物抗体；DOR＝缓解持续时间；HCC＝肝细胞癌；HCC mRECIST＝特定于HCC修改的RECIST；NCI CTCAE v5.0＝美国国家癌症研究所不良事件通用术语标准5.0版；ORR＝客观缓解率；OS＝总存活期；PFS＝无进展存活期；PK＝药代动力学；RECIST v1.1＝实体瘤疗效评估标准1.1版。注：研究人员使用RECIST v1.1和HCC mRECIST评定单个时间点的总缓解。
在第1阶段期间入组大约170至320名患者。实验臂的入组分两期进行：初步期和扩展期。对于大部分臂，在初步期期间，大约有20名患者被纳入。如果在初步期在实验臂中观察到临床活动性，则在扩展期可将大约20名的额外患者纳入该臂中。在一些臂中，暂停随机化以允许对最少6名患者进行安全性评估。具有最小临床活动性或不可接受的毒性的实验臂不会进行扩展。可以纳入额外患者以确保治疗臂之间在人口统计学和基线特征方面的平衡，包括潜在的预测性生物标志物，以进行进一步的亚组分析。
通过修订方案，可以在研究过程期间添加新的实验臂。将第1阶段的患者随机分配到治疗臂，且随机化比率取决于开放入组的实验臂的数量(例如，如果增加一个臂或暂停一个臂的入组以等待初步期的结果分析)，其中规定划拨到对照臂的可能性将不超过35％。随机化考虑了特定于臂的排除标准。如果患者满足为该臂概述的任何排除标准，则他们不符合加入特定臂的条件。表27提供了治疗分配和随机化的详细信息。
表27.第1阶段治疗方案
Atezo＝阿特珠单抗；Bev＝贝伐单抗；Q2W＝每2周；Q3W＝每3周。
aRO7247669 2100mg Q2W+Bev臂的入组暂停，以允许对至少6名患者进行安全性评估。
对照和实验臂中的患者继续接受治疗，直到在综合评定放射影像学和生化数据、局部活检结果(如果有)和临床状态(例如，症状恶化，诸如疾病继发性疼痛)后确定的不可接受的毒性或临床益处丧失。由于在用癌症免疫疗法(CIT)的T细胞应答(称为假性进展)的环境中，免疫细胞浸润可能导致肿瘤负荷的初始增加，因此根据实体瘤疗效评估标准1.1版(RECIST v1.1)的放射影像学进展可能不指示真正的疾病进展。在不存在不可接受的毒性的情况下，在接受用CIT药物治疗期间满足根据RECIST v1.1的疾病进展标准的患者如果满足以下所有标准，则将允许继续研究治疗：
·临床益处的证据，如在审查所有可用数据后所确定。
·不存在指示明确的疾病进展的症状和体征(包括实验室值诸如新的或恶化的高钙血症)。
·不存在可归因于疾病进展的东部肿瘤协作组(ECOG)体能状态下降。
·在方案允许的医学干预措施无法解决的关键解剖部位(例如软脑膜疾病)无肿瘤进展。
安全性评估期
考虑到RO7247669 2100mg每2周(Q2W)+Bev臂中的潜在重叠毒性，在大约6名患者已被纳入后暂停入组以允许进行安全性评估。安全性评估基于来自最少6名患者的安全性数据，这些患者接受治疗的至少一个剂量(即给定组合的每种药剂的一个剂量)并在至少一个完整治疗周期内完成了安全性随访评定。如果确定该组合足够安全，则再恢复该臂的入组。不恢复入组的决定是基于与研究治疗相关的≥3级事件，这些事件无法控制并导致至少三分之一的患者中止所有研究药物。
第2阶段
在第1阶段期间经历临床益处丧失(如上所述)的对照或实验臂中的患者可以选择在第2阶段期间接受不同的治疗组合，前提是他们满足合格标准且第2阶段臂开放入组。在第1阶段期间经历不可接受的毒性的患者可能符合在第2阶段期间接受治疗的条件。
第2阶段治疗必须在患者在第1阶段已经历临床益处丧失或不可接受的毒性后3个月内开始并持续直到不可接受的毒性或临床益处丧失。但是，建议患者尽快开始第2阶段治疗。目前尚无可用的第2阶段治疗方案。
评定和监测
在整个研究过程中密切监测所有患者的不良事件，并根据美国国家癌症研究所不良事件通用术语标准5.0版(NCI CTCAE v5.0)对不良事件进行分级。细胞因子释放综合征(CRS)的严重程度也根据美国移植和细胞治疗学会CRS共识分级量表分级。
患者在前48周期间进行每6周(从第1周期的第1天开始)一次的肿瘤评定，然后进行每6或12周一次的肿瘤评定。使用RECIST v1.1和HCC特定改良的RECIST(HCC mRECIST)评定应答。
从所有患者收集基线肿瘤组织样品，优选通过进入研究时进行的活检。这些样品用于生物标志物研究。
为了表征治疗剂的药代动力学(PK)特性和/或免疫原性，在研究治疗施用之前和期间的不同时间点提取血液样品。
在审查实时安全性数据和可用的PK数据的基础上，可以在认为适当时修改治疗方案。
靶标群体
第1阶段的纳入标准
患者必须满足所有以下标准以取得进入第1阶段的资格：
·年龄≥18岁。
·随机化前7天内ECOG体能状态为0或1。
·在肝硬化患者中通过组织学/细胞学或临床美国肝病研究协会(AASLD)标准确诊的局部晚期或转移性和/或不可切除的HCC。对于没有组织学确诊的肝硬化患者，需要根据AASLD标准进行临床确认。
·随机化前7天内Child-Pugh A级。
·不适合根治性手术和/或局部区域疗法的疾病。在手术和/或局部区域疗法后疾病进展的患者符合条件。
·没有进行针对HCC的先前全身性治疗(包括全身性研究药剂)。允许用在标签中注明具有抗癌活性的草药疗法(包括传统中药)进行的先前治疗，前提是这些药物在随机化之前已终止。
·预期寿命≥3个月。
·代表性的肿瘤标本的可用性，该标本适用于经由中心测试确定PD-L1和/或其他生物标志物状态。从所有患者收集基线肿瘤组织样品，优选通过进入研究时进行的活检。
第1阶段和第2阶段的纳入标准
患者必须满足所有以下标准以取得进入第1阶段的资格和取得进入第2阶段的资格：
·依从研究方案的能力。
·根据RECIST v1.1的可测量的疾病(至少一个靶病灶)。接受先前局部区域疗法(例如，射频消融、经皮乙醇或醋酸注射、冷冻消融、高强度聚焦超声、经动脉化疗栓塞、经动脉栓塞等)的患者符合条件，条件是靶病灶先前未用局部区域疗法治疗或局部疗法区域内的靶病灶随后已出现根据RECIST v1.1的进展。
·适当的血液和终末器官功能，通过在研究治疗启动前7天内获得的以下实验室测试结果定义：
-无粒细胞集落刺激因子支持下，ANC≥1.5x109/L(≥1500/μL)。
-淋巴细胞计数≥0.5×109/L(≥500/μL)。
-无输血的情况下，血小板计数≥75×109/L(≥75,000/μL)。
-无输血的情况下，血红蛋白≥90g/L(≥9.0g/dL)。
-患者在筛选期间或筛选前2周内不得需要输血来满足此标准。
-AST、ALT和ALP≤5×正常值上限(ULN)。
-胆红素≤3×ULN。
-肌酐≤1.5×ULN或肌酐清除率≥50mL/min(使用Cockcroft-Gault公式计算)。
-无输血的情况下，白蛋白≥28g/L(≥2.8g/dL)。
-对于未接受抗凝治疗的患者：INR或aPTT≤1.5×ULN。
·经记录的肝炎的病毒学状态，如通过乙型肝炎病毒(HBV)和丙型肝炎病毒(HCV)筛选测试所证实。对于患有活动性HBV的患者：筛选期间HBV DNA<500IU/mL，在随机化前至少14天开始抗HBV治疗，并且愿意在研究期间继续抗HBV治疗(根据当地护理标准；例如恩替卡韦)。HCV患者，无论是感染已消退(通过可检测到的抗体证明)还是慢性感染(通过可检测到的HCV RNA证明)，均符合条件。
·筛选时HIV测试呈阴性。
·对于有生育能力的女性：同意保持禁欲(避免异性***)或使用避孕措施。
·对于男性：同意保持禁欲(避免异性***)或使用避孕，并同意不捐赠***。
第2阶段的入选标准
患者必须满足所有以下标准以取得进入第2阶段的资格：
·ECOG体能状态为0、1或2。
·在接受第1阶段治疗时经历与阿特珠单抗或RO7247669无关的不可接受的毒性或临床益处丧失后3个月内能够开始第2阶段治疗。
·来自在第1阶段中止时进行的活检的肿瘤标本的可用性(如果临床上可行)。
排除标准
如果患者符合下述标准中的任一者，则他们被排除在第1阶段期间特定臂的入组，或者被排除在第2阶段期间的入组。
第1阶段的排除标准
·满足以下标准中的任一者的患者将排除在第1阶段之外：
·用CD137激动剂或免疫检查点阻断疗法进行先前治疗，包括抗CTLA-4、抗PD-1和抗PD-L1治疗性抗体。
·在研究治疗启动前28天内用研究性疗法治疗。
·研究治疗开始前28天内用肝脏局部区域疗法(例如，射频消融、经皮乙醇或醋酸注射、冷冻消融、高强度聚焦超声、经动脉化疗栓塞、经动脉栓塞等)进行治疗，或未从任何此类程序的副作用中恢复。
·未经治疗或治疗不完全的食管和/或胃静脉曲张并伴有出血或出血风险高。
·患者必须进行食管胃十二指肠镜检查(EGD)，并且在入组前必须根据当地护理标准对所有大小的静脉曲张(从小到大)进行评定和治疗。在开始研究治疗前6个月内进行EGD的患者无需重复该程序。
·在开始研究治疗前6个月内因食管和/或胃静脉曲张导致的先前出血事件。
·来自先前抗癌疗法的不良事件尚未消退至1级或更好，但任何等级的脱发除外。
·高血压控制不充分，定义为收缩压(BP)>150mmHg和/或舒张BP>100mmHg(两个或更多个读数中至少三个读数的平均值)。允许进行抗高血压治疗以实现这些参数。
·高血压危象或高血压脑病史。
·在研究治疗启动前6个月内的显著血管疾病(例如，需要手术修复的主动脉瘤或最近发生的外周动脉血栓形成)。
·研究治疗启动前1个月内有咯血史(每次发作≥2.5mL鲜红色血液)。
·出血素质或显著凝血障碍的证据(在不存在治疗性抗凝的情况下)。
·当前或最近(研究治疗启动前≤10天)使用阿司匹林(>325mg/天)或使用氯吡格雷、双嘧达莫、噻氯匹定或西洛他唑进行治疗。
·当前或近期(研究治疗启动前≤10天)出于治疗(而非预防)目的使用全剂量口服或肠胃外抗凝剂或溶栓剂。允许预防性抗凝以开发静脉通路装置，条件是药剂活性引起INR<1.5x ULN并且在研究治疗启动前14天内aPTT在正常范围内。对于预防性使用抗凝剂或溶栓疗法，可以使用当地标签中描述的批准剂量。
·在研究治疗启动前3天内进行芯活检或其他小手术，不包括放置血管通路装置。
·研究治疗启动前6个月内有腹部或气管食管瘘、胃肠道(GI)穿孔或腹腔内脓肿病史。
·有肠梗阻史和/或GI梗阻的临床体征或症状，包括与潜在疾病相关的亚闭塞性或闭塞性综合征，或者需要在研究治疗启动前进行常规肠外水化、肠外营养或管饲。如果患者已接受确定性(手术)治疗以消退症状，则在初步诊断时出现亚闭塞或闭塞综合征的体征或症状或肠梗阻的患者可以入组。
·腹腔穿刺术或最近的手术无法解释的腹部游离空气的证据。
·危重、不愈合或裂开的伤口、活动性溃疡或未经治疗的骨折。
·≥2级蛋白尿，如通过试纸尿液分析中≥2+蛋白质和24小时尿液收集物中≥1.0g蛋白质所证明。所有筛选时具有试纸尿液分析中≥2+蛋白质的患者都必须进行24小时尿液收集以获取蛋白质。具有试纸尿液分析中<2+蛋白质的患者符合研究条件。
·涉及主要气道或血管的转移性疾病，或位于中央的大体积纵隔肿瘤肿块(距隆突<30mm)。具有门静脉或肝静脉血管侵犯的患者可以被纳入。
·研究治疗启动前6个月内的腹腔内炎症过程史，包括但不限于消化性溃疡病、憩室炎或结肠炎。
·在研究治疗启动前28天内的放射疗法或在研究治疗启动前60天内的腹部/骨盆放射疗法，但在研究治疗启动前7天内对骨病灶进行姑息性放射疗法除外。
·研究治疗启动前28天内的大手术、开放活检或显著外伤；或在研究治疗启动前60天内的腹部手术、腹部干预或严重的腹部外伤；或预期在研究过程中需要进行大手术或未从任何此类手术的副作用中恢复。
·长期每日使用非甾体抗炎药(NSAID)进行治疗。允许偶尔使用NSAID来缓解诸如头痛或发烧的医疗状况的症状。
第1阶段和第2阶段的排除标准
将满足以下任何标准的患者排除在第1阶段和第2阶段之外：
·已知的纤维板层样HCC、肉瘤样HCC或混合胆管癌和HCC。
·肝性脑病史。
·中度或重度腹水。
·HBV和HCV合并感染。有HCV感染史但聚合酶链反应(PCR)中HCV RNA呈阴性的患者被视为未感染HCV。
·有症状的、未经治疗的或积极进展的中枢神经***(CNS)转移。具有经治疗的CNS病灶的无症状患者符合条件，前提是满足以下所有标准：
-根据RECIST v1.1的可测量疾病必须存在于CNS之外。
-患者无颅内出血或脊髓出血史。
-患者在研究治疗启动前的7天内未进行立体定向放射疗法，在研究治疗启动前的14天内未进行全脑放射疗法，或在研究治疗启动前的28天内未进行神经外科切除术。
-患者没有对于作为CNS疾病疗法的皮质类固醇的持续需求。允许使用稳定剂量的抗惊厥疗法。
-转移仅限于小脑或幕上区域(即没有转移至中脑、脑桥、髓质或脊髓)。
-没有证据表明在完成CNS定向疗法与研究治疗启动之间存在中期进展。筛选时新检测到CNS转移的无症状患者在接受放射疗法或手术后符合该研究的条件，无需重复筛选脑部扫描。
·软脑膜疾病的病史。
·不受控制的肿瘤相关疼痛。需要止痛药的患者在进入研究时必须采用稳定的治疗方案。适合姑息性放疗后的症状性病灶(例如，骨转移或引起神经碰触的转移)应在入组前进行治疗。患者应当已从放射治疗的影响中恢复。不要求最短恢复期。在进一步增长的情况下可能导致功能缺陷或顽固性疼痛的无症状性转移性病灶(例如，目前与脊髓压迫无关的硬膜外转移)，应在入组前考虑进行局部区域疗法(如果合适的话)。
·不受控制的胸腔积液、心包积液或腹水，需要反复引流(每月一次或更频繁)。留置导管(例如，)的患者是允许的。
·不受控制或有症状的高钙血症(离子化钙＞1.5mmol/L，钙>12mg/dL，或校正钙>ULN)。
·自身免疫性疾病或免疫缺陷活动期或病史，包括但不限于重症肌无力、肌炎、自身免疫性肝炎、***性红斑狼疮、类风湿性关节炎、炎症性肠病、抗磷脂抗体综合征、韦格纳肉芽肿病、干燥综合征、格林-巴雷综合征或多发性硬化症，但以下情况除外：
-有自身免疫相关的甲状腺功能减退症病史并且正在接受稳定剂量的甲状腺替代激素的患者符合该研究的条件。
-患有1型糖尿病且正在接受胰岛素方案的患者符合该研究的条件。
-如果满足以下所有条件，患有湿疹、银屑病、慢性单纯性苔藓或仅具有皮肤病表现的白癜风(例如，银屑病关节炎患者除外)的患者符合本研究的资格：
-皮疹必须覆盖<10％的身体表面积。
-疾病被良好控制在基线并且仅需要使用低效局部皮质类固醇。
-在过去12个月内没有发生需要补骨脂素加紫外线A辐射、甲氨蝶呤、类视黄醇、生物制剂、口服钙调神经磷酸酶抑制剂或高效或口服皮质类固醇的潜在病症的急性恶化。
·具有特发性肺纤维化、机化性肺炎(例如，闭塞性细支气管炎)、药源性肺部炎症或特发性肺部炎症的病史，或在胸部计算机断层扫描中发现存在活动性肺部炎症的证据。允许有辐射场中的放射性肺炎(纤维化)病史。
·活动性结核病(TB)，通过纯化蛋白衍生物(PPD)皮试或TB血检呈阳性记录，并在研究治疗启动前3个月内通过胸部X射线呈阳性证实。PPD皮试或TB血检呈阳性随后胸部X射线呈阴性的患者可能符合该研究的条件。
·开始研究治疗前3个月内患有显著的心血管疾病(诸如纽约心脏协会II级或更高级别的心脏病、心肌梗塞或脑血管意外)、不稳定心律失常或不稳定心绞痛。
·在研究治疗启动前4周内进行过除用于诊断外的大手术或预计在研究期间需要进行大手术。
·筛选前5年内有除HCC以外的恶性肿瘤病史，但转移或死亡风险可忽略不计(例如，5年OS率>90％)的恶性肿瘤除外，诸如经过充分治疗的宫颈原位癌、非黑素瘤皮肤癌、局部***癌、导管原位癌或I期子宫癌。
·在研究治疗启动前4周内发生过严重感染，包括但不限于，因感染、菌血症或严重肺炎的并发症或可能影响患者安全的任何活动性感染而住院。
·在研究治疗启动前2周内用治疗性口服或IV抗生素治疗。
接受预防性抗生素(例如，用于预防***或慢性阻塞性肺疾病恶化)的患者符合该研究的条件。
·先前异基因干细胞或实体器官移植。
·任何其他疾病、新陈代谢功能障碍、体格检查发现或临床实验室发现，这些发现禁止使用研究药物，可能影响对结果的解释或可能使患者处于治疗并发症的高风险中的疾病或病症。
·怀孕或哺乳，或打算在研究期间怀孕。
·在研究治疗启动前4周内用减毒活疫苗治疗。
·对嵌合抗体或人源化抗体或融合蛋白的重度***过敏反应史。
·已知对中国仓鼠卵巢细胞产物或重组人抗体超敏。
·已知对任何研究药物或其赋形剂过敏或超敏。
·在研究治疗启动前4周内或5个药物消除半衰期(以较长者为准)内，用全身性免疫刺激剂(包括但不限于，干扰素和白介素2)治疗。
·在研究治疗启动前的2周内用全身性免疫抑制用药(包括但不限于皮质类固醇、环磷酰胺、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、沙利度胺和抗-肿瘤坏死因子剂)治疗，或预期在研究治疗期间需要全身性免疫抑制剂用药，但以下情况除外：
-接受急性、低剂量全身性免疫抑制剂用药或一次性脉冲剂量全身性免疫抑制剂用药(例如，48小时皮质类固醇用于造影剂过敏)的患者符合条件。
-接受盐皮质激素(例如，氟氢可的松)、用于慢性阻塞性肺病或哮喘的皮质类固醇或用于治疗***性低血压或肾上腺功能不全的低剂量皮质类固醇的患者符合该研究的条件。
·研究治疗启动开始前8周内发生≥3级出血或出血事件
·进入第2阶段的患者：在同意时，免疫疗法相关不良事件尚未消退至1级或更好或基线，但以下情况例外：具有使用补充疗法得到充分管理的持续内分泌事件的患者符合条件。
含有RO7247669的臂的排除标准
将满足以下标准中任一者的患者排除在第1阶段期间含有RO7247669的臂之外：
·使用抗淋巴细胞活化基因3(LAG-3)药剂进行的先前治疗。
·首次研究药物施用后6个月内，通过经胸超声心动图(TTE)或多门控采集(MUGA)扫描(TTE首选测试)评定的左心室射血分数(LVEF)<50％。
·肌钙蛋白T(TnT)或肌钙蛋白I(TnI)>机构ULN。如果24小时内重复水平≤1xULN,则TnT或TnI水平在>1与<2x ULN之间的患者符合条件。如果24小时内重复水平在1>与<2x ULN之间,则患者可能会进行心脏评估并考虑治疗。
研究结束和研究时长
本研究的结束定义为当最后一名患者完成最后一次访视之日，包括通过电话或在诊所进行的存活随访。研究的总长度(从第一个患者的筛选到研究终点)预计为大约3-5年。
RO7247669剂量和时间表的基本原理
RO7247669以600mg Q3W(每个21天周期的第1天600mg)、2100mg Q2W(每个28天周期的第1和15天2100mg)或1200mg Q3W(每个21天周期的第1天1200mg)的固定剂量施用，以鉴定RO7247669与贝伐单抗组合施用时治疗患有HCC的患者的最佳剂量。根据研究NP41300的现有临床药代动力学、疗效和安全性数据，选择600mg Q3W的固定给药方案。在研究的剂量递增A部分阶段期间，RO7247669在患者中具有良好的耐受性，并且没有鉴定出与RO7247669相关的特定安全性问题。直至最高剂量2100mg每两周(Q2W)均未观察到DLT，并且未鉴定出MTD。从600mg Q2W剂量开始观察到通过放射摄影学PR测量的抗肿瘤活性。RO7247669的药代动力学在研究NP41300中测试的剂量范围内呈剂量线性。使用估计的靶标特性对瘤内PD-1和LAG3靶标接合进行进一步建模。据估计，RO7247669 600mg Q3W的剂量和时间表将引起整个治疗期肿瘤部位的PD-1和LAG3靶标接合>90％。此外，在良好实验室规范毒理学和剂量范围寻找猴毒理学研究中，直至最高剂量100mg/kg，RO7247669均具有良好的耐受性。毒理学结果与利用市售CPI的食蟹猴研究的报告结果一致。
贝伐单抗剂量和时间表的基本原理
在Q3W治疗臂中，贝伐单抗以15mg/kg Q3W(每个21天周期的第1天15mg/kg)的剂量施用，这是贝伐单抗的批准剂量。
在Q2W治疗臂中，贝伐单抗以10mg/kg Q2W(每个28天周期的第1和15天10mg/kg)的剂量施用，这是贝伐单抗的批准剂量。
对照臂(atezo+bev)
阿特珠单抗加贝伐单抗(Atezo+bev)臂中的患者接受如表28中概述的治疗，直到在综合评定影像学和生化数据、局部活检结果(如果有)和临床状态(例如，症状恶化，诸如疾病继发性疼痛)后确定的不可接受的毒性或临床益处丧失。建议在不迟于随机化后7天启动治疗；但是，研究治疗的第一次给药不应在芯活检或其他手术过程后3天内进行。
表28.atezo+bev臂的治疗方案
Atezo+Bev＝阿特珠单抗加贝伐单抗。
a在每个周期的第1天，贝伐单抗在完成阿特珠单抗输注后至少5分钟施用。
RO7247669 2100mg Q2W+bev
RO7247669 2100 Q2W+bev臂中的患者将接受如表29中概述的治疗，直到在综合评定影像学和生化数据、局部活检结果(如果有)和临床状态(例如，症状恶化，诸如疾病继发性疼痛)后确定的不可接受的毒性或临床益处丧失。建议在不迟于随机化后7天启动治疗；但是，研究治疗的第一次给药不应在芯活检或其他手术过程后3天内进行。
表29.RO7247669 2100mg Q2W+bev臂的治疗方案
Q2W＝每2周。RO7247669+Bev＝RO7247669加贝伐单抗。
a在第1周期的第1天，贝伐单抗在完成RO7247669输注后至少90分钟施用。如果第一次输注被耐受且无输注相关反应(IRR)，则在RO7247669输注后至少60分钟施用贝伐单抗。如果第二次输注被耐受且无IRR，则在所有后续RO7247669输注后至少30分钟施用贝伐单抗。
RO7247669 1200mg Q3W+bev
RO7247669 1200 Q3W+bev臂中的患者接受如表30中概述的治疗，直到由研究人员在综合评定影像学和生化数据、局部活检结果(如果有)和临床状态(例如，症状恶化，诸如疾病继发性疼痛)后确定的不可接受的毒性或临床益处丧失。建议在不迟于随机化后7天启动治疗；但是，研究治疗的第一次给药不应在芯活检或其他手术过程后3天内进行。
表30.RO7247669 1200mg Q3W+bev臂的治疗方案
Q3W＝每3周。RO7247669+Bev＝RO7247669加贝伐单抗。
a在第1周期的第1天，贝伐单抗在完成RO7247669输注后至少90分钟施用。如果第一次输注被耐受且无输注相关反应(IRR)，则在RO7247669输注后至少60分钟施用贝伐单抗。如果第二次输注被耐受且无IRR，则在所有后续RO7247669输注后至少30分钟施用贝伐单抗。
RO7247669 600mg Q3W+bev
RO7247669 600Q3W+bev臂中的患者接受如表31中概述的治疗，直到由研究人员在综合评定影像学和生化数据、局部活检结果(如果有)和临床状态(例如，症状恶化，诸如疾病继发性疼痛)后确定的不可接受的毒性或临床益处丧失。建议在不迟于随机化后7天启动治疗；但是，研究治疗的第一次给药不应在芯活检或其他手术过程后3天内进行。
表31.RO7247669 600mg Q3W+bev臂的治疗方案
Q3W＝每3周。RO7247669+bev＝RO7247669加贝伐单抗。
a在第1周期的第1天，贝伐单抗在完成RO7247669输注后至少90分钟施用。如果第一次输注被耐受且无输注相关反应(IRR)，则在RO7247669输注后至少60分钟施用贝伐单抗。如果第二次输注被耐受且无IRR，则在所有后续RO7247669输注后至少30分钟施用贝伐单抗。
B.统计学方法
初步分析
主要疗效终点是第1阶段期间的客观缓解率(ORR)，如表26.ORR根据RECIST v1.1来确定。将缺失或无应答评定的患者归类为无应答者。计算每个臂的ORR，即完全或部分缓解的患者比例，以及95％CI(Clopper-Pearson方法)。还使用二项分布的正态近似来计算实验臂与对照臂之间的ORR差异，以及95％CI。
样品大小的确定
该研究设计为获得基于免疫疗法的治疗组合在向患有晚期肝癌的患者施用时的初步疗效、安全性和PK数据。队列1由患有局部晚期或转移性HCC的患者组成，该患者未接受过针对其疾病的先前全身性疗法。在研究期间，将大约170至320名患者随机划拨到对照臂和实验臂。
中期分析
预计中期分析将在研究期间进行，最早(第1阶段)的中期分析发生在至少一个实验臂已完成初步期的入组并且患者已随访至少6周时。基于实验臂与对照臂相比的临床活性的中期分析，后验概率可用于指导治疗臂的进一步入组。如果中期分析表明实验臂的活动性高于对照臂，则实验臂可进一步入组20名额外患者。
在大约15名患者已被纳入第2阶段治疗臂并随访至少6周后，还进行了中期分析。如果在阶段2治疗臂中未观察到临床活性，则停止该臂的进一步入组。
C.背景和基本原理
患者群体的基本原理
该研究纳入了未接受过针对其疾病的先前全身性疗法的患有局部晚期或转移性HCC的患者，无论PD-L1表达或HCC病因如何。这一广泛的群体与纳入以下两项研究的群体相似，这些研究评估了在患有HCC的患者中的阿特珠单抗加贝伐单抗的组合：研究GO30140(初始Ib期研究)和研究YO40245(随机化III期研究)，这些研究证明了与索拉非尼相比，该组合的统计学上显著和临床上有意义的益处。
晚期HCC是具有高度未满足的医疗需求的不能治愈的疾病。索拉非尼目前被批准用于患有晚期HCC的患者的一线治疗，并被视为该疾病环境中的护理标准。然而，预后仍然差，中位OS为6.5-10.7个月，并且治疗与显著的毒性相关。尽管最近证明了阿特珠单抗加贝伐单抗的临床益处，但对于患有局部晚期或转移性HCC的患者，仍然持续需要更有效、耐受性更好的治疗组合方案。
纳入该研究的患者还需要具有足够的肝功能，定义为Child-Pugh A级。具有Child-Pugh B级或C级肝功能的患者因潜在肝硬化而死亡的风险增加，这可能会混淆治疗相关的抗肿瘤疗效的适当评估；因此，这些患者被排除在研究之外。正如美国肝病研究协会(AASLD)召集的专家小组所指出的，拟议的研究群体是在针对HCC的新药剂或药剂组合的初始研究中推荐的患者群体(Llovet等人,N Engl J Med,359:378-380,2008)。
在初始放射影像学进展后进行的基于免疫疗法的治疗的基本原理
在免疫治疗剂的研究中，完全缓解、部分缓解和疾病稳定均显示在肿瘤负荷明显增加的影像学证据之后发生。在T细胞应答的情况下由免疫细胞浸润引起的肿瘤负荷的这一初始增加称为假性进展(Hales等人,Ann Oncol,21:1944-1951,2010)。已在几种肿瘤类型中观察到肿瘤生长之后的应答的证据。此外，在一些有影像学进展证据的有应答患者中，新病灶或现有病灶中新生长区域的活检显示免疫细胞但没有存活的癌细胞。由于假性进展后可能出现应答，该研究允许随机划拨到基于免疫疗法的治疗组的患者在根据RECISTv1.1的明显影像学进展后继续联合治疗，前提是益处-风险比被判断为有利的。
使用HCC特定的修改的RECIST的基本原理
对于晚期HCC，RECIST被发现与SHARP试验和其他索拉非尼临床研究中证明的临床益处弱相关(Llovet等人,N Engl J Med,359:378-380,2008；Liu等人,Clin Cancer Res,20:1623-1631,2014；Takada等人,BMC Res Notes,8:609,2015)。在对HCC进行局部区域疗法(诸如射频消融和化疗栓塞)后发现了类似的结果。这些疗法减少了肿瘤的血管分布，产生坏死，但不一定引起肿瘤整体大小的变化。为了给HCC临床试验的设计提供通用框架，AASLD提出了修改后的标准(HCC mRECIST)，该标准仅量化肿瘤的可行部分，以提供改善的评定终点(Llovet等人,J Natl Cancer Inst,100:698-711,2008；Lencioni和Llovet,Semin Liver Des,30:52-60,2010；Lencioni等人,J Hepatol,66:1166-1172,2017)。
考虑到贝伐单抗的抗血管生成作用模式，探索性疗效终点包括基于HCC mRECIST的分析。这些分析允许对HCC mRECIST进行评估，作为相对于标准RECIST v1.1改善的对患有局部晚期或转移性HCC的患者的疗效量度。
肝癌的背景
肝癌为全球第五大常见癌症，也是癌症相关死亡的第二大常见原因，每年有854,000例新病例和810,000例死亡。肝细胞癌(HCC)为最常见的原发性肝癌形式，占所有原发性肝恶性肿瘤的大约90％。不太常见的原发性肝癌包括肝内胆管癌(iCCA)、血管肉瘤和肝母细胞瘤。诊断后，大多数患有原发性肝癌的患者呈现晚期疾病，这是不推荐使用治愈性疗法治疗的阶段。WHO估计，2030年将有超过100万人死于肝癌，这凸显了一个重大的全球公共卫生问题(Villanueva,N Engl J Med,380:1450-1462,2019)。
肝细胞癌的背景
大多数HCC发生在患有基础肝病的患者中，主要是由于乙型肝炎病毒(HBV)或丙型肝炎病毒(HCV)感染或酒精滥用造成的。HBV感染占全球HCC病例的大多数；然而，在西方国家和日本，HCV是HCC的主要原因(Villanueva,N Engl J Med,380:1450-1462,2019)。普遍HBV疫苗接种和广泛实施针对HCV的直接作用抗病毒剂可能会改变HCC的病因学格局。然而，作为HCC风险因素的非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)的发病率在全球范围内不断增加，并且NAFLD很快将成为西方国家肝癌的主要原因(Villanueva,N Engl J Med,380:1450-1462,2019)。
HCC是一种高度致死的疾病，其死亡率与发病率之比(0.98)是任一实体瘤中最高的(Kamangar等人,J Clin Oncol,24:2137-2150,2006)。由于症状出现较晚，多达80％的首次呈现HCC的患者患有晚期不可切除的或转移性疾病。这是一种医学上复杂且难以治疗的疾病，因为大多数患有HCC的患者患有潜在的肝硬化，需要同时管理恶性肿瘤和肝硬化。在美国，患有HCC的患者的5年总存活(OS)率为17％，且如果存在远处转移，则大幅下降至仅3％(Siegel等人,CA Cancer J Clin,66:7-30,2016)。在中国，患有HCC的患者的5年OS率为10.1％(Chen等人,CA Cancer J Clin,66:115-132,2016)。
晚期肝细胞癌的一线治疗
索拉非尼是口服多激酶抑制剂，目前被认为是患有晚期HCC的患者的一线治疗的全球护理标准。索拉非尼的疗效已在以下两项大型多中心、随机、双盲、安慰剂对照III期试验中得到证明：索拉非尼HCC评定随机化方案(SHARP)试验和在亚太地区进行的试验。这两项研究均证明索拉非尼与安慰剂相比具有存活益处。在SHARP试验中，索拉非尼的中位OS为10.7个月，而安慰剂的中位OS为7.9个月；在亚太试验中，中位OS为6.5个月与4.2个月。还证明了到放射摄影学进展的中位时间的益处：SHARP试验中为5.5个月与2.8个月，并且亚太试验中为2.8个月与1.4个月。SHARP试验中的客观缓解率(根据实体瘤疗效评估标准1.0版(RECIST v1.0))为2.3％(299名患者中的7名)，并且亚太试验中的客观缓解率为3.3％(150名患者中的5名)。亚太试验中OS和益处持续时间在数字上较短可能是由于患者在招募时患有更晚期的疾病的事实，并且也可能是由于病因和支持护理的区域差异(Llovet等人,NEngl J Med,359:378-380,2008；Cheng等人,Eur J Cancer,48:1452-1465,2009；Cheng等人,Lancet Oncol,10:25-34,2012)。
尽管这两项III期研究报告了存活益处，但由于已知的毒性，索拉非尼的总体益处风险比并不高。两项索拉非尼研究中均报告的常见不良事件包括手足皮肤反应、腹泻、高血压、体重减轻、疲劳、厌食、脱发、恶心和皮疹/脱屑。自索拉非尼批准以来，已有多项与索拉非尼(包括舒尼替尼、布立尼布和利尼伐尼)进行头对头比较的阴性III期研究(Cheng等人,J Clin Oncol,31:4067-4075,2013；Johnson等人,J Clin Oncol,31:3517-3524,2013；Cainap等人,J Clin Oncol,33:172-179,2015)。虽然使用乐伐替尼(多靶标受体酪氨酸激酶抑制剂)的一线治疗对于OS而言显示不劣于索拉非尼，但与护理治疗相比，OS方面临床上有意义的差异直到最近仍然难以捉摸(Kudo等人2018)。
研究YO40245(IMbrave150)是一项随机III期研究，评估在患有晚期或转移性HCC的患者中与作为一线治疗的索拉非尼相比的阿特珠单抗加贝伐单抗。这项研究首次证明了在与索拉非尼的头对头比较中，一种新颖治疗组合在OS和无进展存活期(PFS)方面具有统计学显著和临床显著的改善。在初步分析时，与索拉非尼臂相比，阿特珠单抗加贝伐单抗臂的死亡风险降低了42％(分层危害比(HR)＝0.58(95％CI：0.42至0.79)；p＝0.0006；中位OS，不可估计(NE)与13.24个月)。独立审查机构根据RECIST v1.1评定的PFS也证明了有利于组合治疗的统计上显著和临床上有意义的改善(分层HR＝0.59(95％CI：0.47至0.76)；p<0.0001；中位PFS，6.83与4.27个月)。总体而言，在HCC中，阿特珠单抗加贝伐单抗组合通常具有良好的耐受性和可管理的毒性，且安全性概况与个别研究治疗的已知风险一致并且与潜在疾病一致(Finn等人,N Engl J Med,382:1894-1905,2020)。
研究基本原理
癌症免疫疗法(CIT)已证明了明显的临床疗效，在多种晚期恶性肿瘤中观察到显著的存活益处。目前，普遍的CIT方法是通过靶向T细胞抑制性因子诸如PD-L1/PD-1来规避免疫逃逸机制并且重振抗肿瘤应答。尽管这些靶标已为各种癌症适应症带来了显著的临床治疗成功，但正在进行的研究指示，一系列逐步事件对于生成连续抗肿瘤免疫应答而言是必需的(Chen和Mellman,Immunity,39:1-10,2013)。每个事件对于有效应答都至关重要，并且每个事件也容易受到若干肿瘤免疫逃逸机制的影响。因此，需要鉴定和规避导致有效抗癌免疫应答缺乏的各种因素，这对于传播癌症免疫和推进CIT领域而言至关重要，最有可能是通过组合靶向疗法方案来实现。
当前的Ib/II期伞式研究设计为通过鉴定早期信号并建立患有晚期肝癌的患者的概念验证临床数据来加速CIT组合的开发。
该研究评定了通过免疫细胞启动和激活、肿瘤浸润和/或识别肿瘤细胞以进行消除来同时靶向多种免疫逃避机制的重要性。为了改善实验臂临床信号检测的置信度，该研究包括对照臂。此外，在初始治疗方案(第1阶段)中经历疾病进展的患者可能符合继续使用不同的治疗方案(第2阶段)进行治疗的条件，这可能会促进对在使用CIT方案进行治疗期间未能应答或经历疾病进展的患者的免疫逃逸机制的科学理解。
该研究最初招募了患有局部晚期或转移性HCC的患者，这些患者未接受过针对其疾病的先前全身性疗法。尽管最近证明了阿特珠单抗加贝伐单抗的临床益处，但对于患有不可切除的局部晚期或转移性HCC的患者来说，仍然存在高度未满足的医疗需求，需要进一步评估新颖、更有效的治疗组合。
表32总结了每种实验研究药品(IMP)的靶标和拟议的作用机制分类。
表32.实验研究药品的靶标和拟议的作用机制分类
IMP＝研究药品；LAG-3＝淋巴细胞活化基因-3；NK＝自然杀伤；VEGF＝血管内皮生长因子。
aWallin等人,Nat Commun,7:12624,2016。
D.安全性的评定
安全性评定由监测和记录不良事件组成，包括严重不良事件和特别关注的不良事件，执行方案指定的安全实验室评定，测量方案指定的生命体征，以及进行其他方案指定的被认为对研究的安全评估至关重要的测试。
根据ICH的良好临床实践指南，不良事件是指在临床研究受试者中使用药品时发生的任何不良医学事件，无论其因果关系如何。因此，不良事件可以是以下任何一种：
·与使用药品暂时相关的任何不利和非预期的体征(包括异常的实验室检查结果)、症状或疾病，无论是否被认为与该药品有关。
·任何新疾病或现有疾病的恶化(已知疾病的特征、频率或严重程度恶化)。
·基线时不存在的间歇性医疗状况(例如，头痛)的复发。
·与症状相关的实验室值或其他临床测试(例如，ECG、X射线)的任何恶化或导致研究治疗或伴随治疗改变或研究治疗终止。
·与方案规定的干预相关的不良事件，包括在分配研究治疗之前发生的不良事件(例如，筛选侵入性程序，诸如活检)。
E.统计考虑因素和分析计划
最终研究分析基于通过研究终止收集的患者数据。如果没有另外指定，则疗效分析基于疗效可评估群体，定义为所有患者在他们的分配的治疗方案中接受每种药物的至少一个剂量，并且安全性分析基于安全性可评估群体，定义为所有接受任何量的研究治疗的患者。
分析结果按患者实际接受的治疗方案以及按阶段(第1阶段或第2阶段)进行总结。按样品体量对数据进行描述和汇总。通过均值、标准偏差、中位数和范围汇总连续变量。通过使用计数和百分比来汇总分类变量。如果样品量小，则使用列表代替表格。
为第2阶段疗效和安全性分析建立了新的基线值。
主要疗效终点
主要疗效终点是第1阶段期间的ORR，如上文所定义。ORR根据RECIST v1.1来确定。缺失或无应答评定的患者将被归类为无应答者。
计算每个臂的ORR，即完全或部分缓解的患者比例，以及95％CI(Clopper-Pearson方法)。还使用二项分布的正态近似来计算实验臂与对照臂之间的ORR差异，以及95％CI。
次要疗效终点
次要疗效终点为PFS、OS、特定时间点(例如，6个月)的OS、缓解持续时间(DOR)和第1阶段期间的疾病控制，如上文所定义。PFS、DOR和疾病控制根据RECIST v1.1确定。
DOR是针对具有完全或部分缓解的疗效可评估的患者得出的。对于在研究阶段不曾记录疾病进展或死亡的患者，在最后一次肿瘤评定当天删失PFS和DOR。在OS分析时仍然存活的患者在已知他们存活的最后日期删失。
Kaplan-Meier方法用于估计PFS、OS和DOR的中位数，且通过使用Brookmeyer和Crowley方法构建95％CI。还使用Kaplan-Meier方法估计特定时间点的OS率，且基于针对方差的Greenwood估计来计算95％CI。计算每个治疗臂的疾病控制率(疾病稳定≥12周的患者比例)、部分缓解或完全缓解，且通过使用Clopper-Pearson精确方法估计95％CI。
探索性疗效终点
探索性疗效终点为根据HCC mRECIST确定的第1阶段期间的ORR、PFS、DOR和疾病控制；根据RECIST v1.1和HCC mRECIST确定的第2阶段期间的ORR、PFS、DOR和疾病控制。ORR、PFS、DOR和疾病控制通过使用如上所述的相同方法进行分析。得到可评估疗效的完全或部分缓解的患者的DOR。
F.RO7247669+bev臂特异的研究详细信息
RO7247669的背景
RO7247669是新型片段可结晶的基于(Fc)沉默IgG1的双特异性抗体(bsAb)，采用1+1格式，掺入与以下两种免疫检查点蛋白的单价结合：PD-1和淋巴细胞活化基因-3(LAG-3)。RO7247669设计为靶向功能失调的肿瘤抗原特异性T淋巴细胞(表达PD-1和LAG-3)，以建立或重建癌症患者的有效抗肿瘤免疫应答，这可能会引起比现有疗法更好的治疗应答。此外，RO7247669经工程化以防止与Fc-γ受体结合，从而有可能避免肿瘤相关巨噬细胞抗性机制，该机制已在基于IgG4的抗PD-1抗体(诸如帕博利珠单抗和纳武单抗)中观察到(Arlauckas等人,Sci Transl Med,9:389,2017)。
RO7247669的临床评估正在首次人体剂量发现研究(NP41300)中在有或没有先前检查点抑制剂(CPI)暴露的患者中作为单一药剂进行。
贝伐单抗的背景
贝伐单抗是重组人源化单克隆抗体，其识别血管内皮生长因子(VEGF)的所有亚型。它可以通过结合并清除肿瘤微环境中的VEGF来发挥直接的抗血管生成作用。额外的抗肿瘤活性可能作用于肿瘤血管、间质压力和血管通透性，从而提供对肿瘤细胞的增强的化学疗法递送(Jain,Nat Med,7:987-989,2001)。
贝伐单抗被批准用于转移性结直肠癌(mCRC)的一线和二线治疗、晚期非小细胞肺癌(NSCLC)、转移性乳腺癌、晚期肾细胞癌(RCC)和卵巢癌的一线治疗以及复发性胶质母细胞瘤的治疗。贝伐单抗目前正在I-III期临床试验中与阿特珠单抗组合进行测试。贝伐单抗总体耐受性良好，并且不良事件也已可以控制。
RO7247669 600mg Q3W+bev臂的基本原理
PD-1/PD-L1通路
肿瘤免疫疗法领域令人鼓舞的临床数据证明，侧重于增强T细胞抗癌应答的疗法可以在患有晚期恶性肿瘤的患者中产生显著的存活益处(Hodi等人,N Engl J Med,363:711-723,2010；Kantoff等人,N Engl J Med,363:411-422,2010；Chen等人,Clin CancerRes,18:6580-6587,2012)。
PD-1/PD-L1通路用作一种免疫检查点，以暂时抑制在慢性抗原刺激(诸如慢性感染或癌症)状态下的免疫应答。PD-1是抑制性受体，在激活和耗尽的T细胞上表达，包括识别突变肿瘤抗原(新抗原)的肿瘤浸润CD8+T细胞。PD-L1与PD-1的结合会抑制T细胞增殖、激活、细胞因子产生和溶细胞活性，从而导致功能失活和耗尽的T细胞状态(Butte等人,Immunity,27:111-122.2007；Yang等人,J Immunol,187:1113-1119,2011)。
治疗靶向PD-1/PD-L1通路(作为单一药剂和与化学疗法和其他靶向药剂组合)以增强抗肿瘤T细胞应答已在多种实体瘤中得到临床验证。癌症免疫疗法(CIT)药剂，特别是免疫CPI，近年来已对患有晚期恶性肿瘤的患者的治疗产生了重大影响。然而，尽管这些疗法具有显著的临床疗效，但已经明显地是，它们作为单一疗法对于许多患者来说还不够有活性。迄今为止，使用靶向PD-1/PD-L1通路的单一药剂CPI的治疗在患有肝细胞癌(HCC)的患者中显示出的活性极小。
LAG-3通路
LAG-3是参与抗肿瘤免疫和慢性感染的调节的免疫检查点蛋白。LAG-3在激活的T细胞、B细胞、自然杀伤(NK)细胞和致耐受性浆细胞样树突状细胞(DC)的子集上表达，并且在T调节细胞上组成型表达(Huard等人,Immunogenetics,39:213-217,1994)。LAG-3的结构与CD4相似，是Ig超家族的成员，并且与II类主要组织相容性复合体(MHC-II)结合。LAG-3与MHC-II的相互作用抑制T细胞增殖、激活、溶细胞功能和促炎细胞因子产生(Goldberg和Drake,Curr Top Microbiol Immunol,344:269-278,2011)。LAG-3表达对T调节细胞的影响存在争议。一份早期报告得出结论：LAG-3促进T调节细胞介导的免疫抑制(Camisaschi等人,J Immunol,184:6545-6551,2010)。然而，同一作者最近的一份报告描述了LAG-3限制T调节细胞介导的免疫抑制(Zhang等人,Sci Immunol,2eaah4569,2017)。
据报道，LAG-3已在多种肿瘤类型中表达，包括乳腺癌、卵巢癌、NSCLC、黑素瘤、RCC、***癌和HCC，并且与不良预后相关(Matsuzaki等人,Proc Natl Acad Sci USA,107:7875-7800,2010；Baitsch等人,J Clin Invest,121:2350-2360,2011；Thommen等人,Cancer Immunol Res,31344-55,2015；He等人,Cancer Sci,107:1193-1197,2016；Norstrom等人,Oncotarget,7:23581-23593,2016)。作为单一药剂和与其他CPI组合给予的抗LAG-3剂的临床评估正在患有晚期实体瘤的患者中在多项早期研究中进行(Long等人,Genes Cancer,9(5-6):176-189,2018)。
初步数据表明，作为单一药剂和与抗PD-1疗法组合的抗LAG-3疗法具有良好的耐受性，并且安全性概况与其他CPI的安全性概况一致(Ascierto等人,Ann Onco,28(增刊5):c611-612,2017；Hong等人,J Clin Oncol,36:3012,2018；Stratton等人,Society forImmunotherapy of Cancer(SITC)摘要P325 2018)。
新出现的临床数据强调了LAG-3通路在HCC发病机制中的作用。与外周血淋巴细胞相比，乙型肝炎病毒感染的患有HCC的患者的肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)上LAG-3的表达显著升高，并且这与肿瘤部位严重的功能性T细胞缺陷有关(Li等人,Immunol Lett,150:1116-1122,2013)。据报道，在未接受过针对其疾病的先前全身性疗法的患有HCC的患者中，TIL上LAG-3表达有类似升高，并且没有鉴定出LAG-3表达与任何疾病相关特征(包括病毒状态)之间的关系(Yarchoan等人,Clin Cancer Res,23:7333-7339,2017)。
LAG-3表达最近也被鉴定为患有HCC的患者存活结果不佳的预后因素(除了血管侵犯、肿瘤大小和肝硬化之外)(Guo等人,J Transl Med,18:306,2020)。
总而言之，LAG-3的治疗靶向可能代表了治疗患有HCC的患者的有吸引力的策略。
VEGF通路
VEGF-A是由内皮、肿瘤和肿瘤相关巨噬细胞产生的促血管生成分子。除了促进肿瘤血管生成之外，越来越多的证据表明，VEGF通路还通过经由多种机制发挥和维持免疫抑制性肿瘤微环境，在癌症免疫逃避中发挥重要作用。
VEGF-A抑制树突状细胞(DC)的成熟，促进瘤内CD8+T细胞上抑制性免疫检查点分子的表达，并诱导内皮细胞上Fas配体(FasL)的表达，从而获得杀伤效应CD8+T细胞而不是T调节细胞的能力(Gabrilovich等人,Nat Med,2:1096-1103,1996；Huang等人,Blood,110:624-631,2007；Motz等人,Nat Med,20:607-615,2014；Voron等人,J Exp Med,212:139-148,2015)。利用激活的内皮细胞的实验还表明，VEGF可能会减少肿瘤微环境中淋巴细胞对血管壁的粘附，从而有助于减少肿瘤部位的免疫细胞募集(Bouzin等人,J Immunol,178:1505-1511,2007)。此外，VEGF将巨噬细胞募集到具有M2极化状态的肿瘤微环境中，这通常参与伤口愈合。这些M2肿瘤相关巨噬细胞最终有助于建立和维持免疫抑制微环境(Chen和Mellman,Immunity,39:1-10,2013)。
使用诸如贝伐单抗的药剂靶向VEGF通路已得到临床验证，在患有多种晚期恶性肿瘤的患者中展示出抗肿瘤活性。然而，当作为单一药剂施用于患有HCC的患者时，贝伐单抗仅展示出极小的活性(Siegel等人,J Clin Oncol,26:2992-2998,2008；Boige等人,Oncologist,17:1063-1072,2012)。
抗PD-1/LAG-3双特异性抗体和抗VEGF剂的组合治疗
持久的临床益处限于用单一药剂PD-L1/PD-1抑制剂治疗的少数患者。需要靶向对抗PD-L1/PD-1疗法具有抗性的机制的疗法来改善患有实体瘤癌症的患者的结果。强有力的科学基本原理和新出现的临床数据表明，组合的PD-1、LAG-3和VEGF抑制可能对多种肿瘤类型具有临床益处。
抗VEGF剂促进肿瘤血管的正常化，从而增加治疗剂的可及性(Jain,Nat Med,7:987-989,2001)。此外，贝伐单抗可以恢复和/或维持DC的抗原呈递能力，从而增强肿瘤中的T细胞浸润(Oelkrug和Ramage,Clin Exp Immunol,178:1-8,2014；Wallin等人,NatCommun,7:12624,2016)。抗VEGF-A的施用已显示减弱肿瘤内皮FasL的表达，并且产生显著增加的肿瘤排斥CD8+T细胞的流入，从而引起肿瘤生长抑制(Motz等人,Nat Med,20:607-615,2014)。抗VEGF疗法还可以降低骨髓源性抑制细胞的频率并减少抑制性细胞因子的产生(Roland等人,PLoS One,4:e7669,2009)。此外，VEGF-A显示诱导CD8+T细胞上PD-1和其他抑制性免疫检查点蛋白(包括TIM-3和LAG-3)的表达，这可以通过VEGF抑制来逆转(Voron等人,J Exp Med,212:139-148,2015)。
贝伐单抗的免疫调节作用预计会增加CD8+T细胞的募集并缓解瘤内免疫抑制，从而增强免疫疗法的效果。事实上，临床数据已经证明在PD-L1/PD-1通路阻断的背景下抗血管生成和免疫调节的有益作用。早期研究已经证明，抗PD-1疗法纳武单抗和帕博利珠单抗与不同抗血管生成剂的组合治疗可以在患有转移性尿路上皮癌、RCC、卵巢癌和子宫内膜癌的患者中引发应答(Apolo等人,J Clin Oncol,35(增刊6):293,2017；Lee等人,Ann Oncol,28(增刊5):v295-v329,2017；Makker等人,J Clin Oncol,35(增刊15):5598,2017；Liu等人,JAMA Oncol,5:1731-1738,2019；Dudek等人,J Clin Oncol,38:1138-1145,2020)。使用抗PD-L1疗法阿特珠单抗和贝伐单抗的组合治疗的活性也已在患有NSCLC、RCC和HCC的患者中在多项大型随机III期临床研究中得到证明(Socinski等人,N Engl J Med,378:2288-2301,2018；Rini等人,Lancet,393:2404-2415,2019；Finn等人,N Engl J Med,382:1894-1905,2020)。对PD-L1/PD-1阻断的抗性可能导致多个共抑制免疫检查点在效应T细胞表面上表达。LAG-3经常与肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)上的PD-1共表达，并且PD-1和LAG-3的双重阻断已显示增强CD8+T细胞效应子功能并加强在非临床模型中的抗肿瘤免疫。在患有结肠肿瘤、纤维肉瘤或卵巢肿瘤的小鼠中阻断这两种受体引起大约80％的动物的肿瘤得到缓解，与作为单一药剂的10％至40％相比(Woo等人,Cancer Res,72:917-927,2012；Huang等人,Oncotarget,6:27359-27377,2015)。来自患有卵巢癌的患者的TIL显示，与表达一种检查点分子的CD8+T细胞相比，共表达PD-1和LAG-3的抗原特异性CD8+T细胞在其应答同源抗原刺激的能力方面表现出更大的损害(Matsuzaki等人,Proc Natl Acad Sci USA,107:7875-7880,2010)。在患有NSCLC的患者中，TIL上LAG-3的过度表达与PD-1/PD-L1表达相关，并与较高的复发风险和差的存活结果相关(He等人,J Thorac Oncol,12:814-823,2017)。在来自患有未经治疗的HCC的患者的临床样品中，大多数显示LAG-3和PD-1共染色，与背景肝组织中的表达相比，TIL中的表达更高(Yarchoan等人,Clin Cancer Res,23:7333-7339,2017)。基于上述数据，推测bsAb RO7247669同时靶向PD-1和LAG-3通路与贝伐单抗的免疫调节作用的组合可能会增强抗肿瘤免疫应答，从而在患有HCC的患者中产生改善和更持久的临床益处。
其他实施例
尽管为了清楚理解的目的先前已经通过举例说明和实例相当详细地描述了本发明，但是这些描述和实例不应解释为限制本发明的范围。

Claims (129)

1.一种用于治疗患有癌症的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用一个或多个给药周期的靶向PD-1和LAG3的双特异性抗体，所述双特异性抗体包含与PD-1特异性结合的第一抗原结合结构域和与LAG3特异性结合的第二抗原结合结构域，其中所述方法包括每三周以600mg的固定剂量向所述受试者施用所述双特异性抗体。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述癌症为实体瘤。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述癌症是局部晚期或转移性的。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述癌症为皮肤癌、肝癌、肺癌、肾癌、膀胱癌、乳腺癌或食管癌。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述皮肤癌为黑素瘤。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其中所述皮肤癌为先前未经治疗的不可切除或转移性的黑素瘤。
7.根据权利要求5所述的方法，其中所述黑素瘤为：
(a)具有可测量的***转移的III期黑素瘤；
(b)不可切除的III期黑素瘤；或者
(c)IV期黑素瘤，
任选地其中所述黑素瘤并非黏膜黑素瘤或葡萄膜黑素瘤。
8.根据权利要求5所述的方法，其中所述肝癌为肝细胞癌(HCC)。
9.根据权利要求5所述的方法，其中所述肺癌为非小细胞肺癌(NSCLC)。
10.根据权利要求5所述的方法，其中所述肾癌为肾细胞癌(RCC)。
11.根据权利要求5所述的方法，其中所述膀胱癌为转移性尿路上皮癌(mUC)。
12.根据权利要求5所述的方法，其中所述乳腺癌为三阴性乳腺癌(TNBC)。
13.根据权利要求5所述的方法，其中所述食管癌为食管鳞状细胞癌(ESCC)。
14.一种用于治疗患有黑素瘤的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用一个或多个给药周期的靶向PD-1和LAG3的双特异性抗体，所述双特异性抗体包含与PD-1特异性结合的第一抗原结合结构域和与LAG3特异性结合的第二抗原结合结构域，其中所述方法包括每三周以600mg的固定剂量向所述受试者施用所述双特异性抗体，并且其中所述黑素瘤为：
(a)不可切除的III期黑素瘤；或者
(b)IV期黑素瘤。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述受试者未患有眼部黑素瘤。
16.一种用于治疗患有肝癌的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用一个或多个给药周期的靶向PD-1和LAG3的双特异性抗体，所述双特异性抗体包含与PD-1特异性结合的第一抗原结合结构域和与LAG3特异性结合的第二抗原结合结构域，其中所述方法包括每三周以600mg的固定剂量向所述受试者施用所述双特异性抗体。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述肝癌为肝细胞癌(HCC)。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述HCC是局部晚期、转移性和/或不可切除的。
19.根据权利要求16至18中任一项所述的方法，其中所述受试者先前未接受过全身性抗癌疗法。
20.根据权利要求1至19中任一项所述的方法，其中所述一个或多个给药周期中的每一个的长度为21天。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述方法包括在所述一个或多个给药周期中的每一个的第1天向所述受试者施用所述双特异性抗体。
22.根据权利要求1至21中任一项所述的方法，其中所述方法包括向所述受试者静脉内施用所述双特异性抗体。
23.根据权利要求1至22中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括每三周以约15mg/kg的剂量向所述受试者施用贝伐单抗。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述一个或多个给药周期中的每一个的长度为21天并且所述方法包括在所述一个或多个给药周期中的每一个的第1天向所述受试者施用所述贝伐单抗。
25.根据权利要求23或24所述的方法，其中静脉内施用所述贝伐单抗。
26.根据权利要求1至25中任一项所述的方法，其中所述受试者先前未针对转移性或不可切除的疾病进行过治疗。
27.根据权利要求1至25中任一项所述的方法，其中所述受试者先前未用包括免疫调节剂的抗癌疗法进行过治疗。
28.根据权利要求1至25中任一项所述的方法，其中所述受试者先前未用抗LAG3疗法进行过治疗。
29.根据权利要求1至28中任一项所述的方法，其中靶向PD-1和LAG3的所述双特异性抗体包含与PD-1特异性结合的第一抗原结合结构域，所述第一抗原结合结构域包含：VH结构域，其包含：
(i)HVR-H1序列，其包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列；
(ii)HVR-H2序列，其包含氨基酸序列GGR；和
(iii)HVR-H3序列，其包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列；以及
VL结构域，其包含：
(i)HVR-L1序列，其包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列；
(ii)HVR-L2序列，其包含氨基酸序列RSS；和
(iii)HVR-L3序列，其包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列。
30.根据权利要求29所述的方法，其中靶向PD-1和LAG3的所述双特异性抗体包含与LAG3特异性结合的第二抗原结合结构域，所述第二抗原结合结构域包含：VH结构域，其包含：
(i)HVR-H1序列，其包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列；
(ii)HVR-H2序列，其包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列；和
(iii)HVR-H3序列，其包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列；以及
VL结构域，其包含：
(i)HVR-L1序列，其包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列；
(ii)HVR-L2序列，其包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列；和
(iii)HVR-L3序列，其包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列。
31.根据权利要求29或30所述的方法，其中所述第一抗原结合结构域包含：VH结构域，其包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列；以及VL结构域，其包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列，并且所述第二抗原结合结构域包含：VH结构域，其包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列；以及VL结构域，其包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列。
32.根据权利要求29至31中任一项所述的方法，其中所述双特异性抗体为全长抗体。
33.根据权利要求32所述的方法，其中靶向PD-1和LAG3的所述双特异性抗体包含Fc结构域，所述Fc结构域为IgG，任选地其中IgGFc结构域为IgG1 Fc结构域或IgG4 Fc结构域。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述Fc结构域包含减少与Fc受体的结合的一个或多个氨基酸取代，任选地其中所述Fc受体为Fcγ受体。
35.根据权利要求29至34中任一项所述的方法，其中靶向PD-1和LAG3的所述双特异性抗体包含：
(a)属于人IgG1亚类的Fc结构域，其具有氨基酸突变L234A、L235A和P329G(根据KabatEU索引编号)；和/或
(b)包含促进所述Fc结构域的第一亚基和第二亚基缔合的修饰的Fc结构域。
36.根据权利要求33至35中任一项所述的方法，其中所述Fc结构域的第一亚基包含氨基酸取代S354C和T366W(根据Kabat EU索引编号)，并且所述Fc结构域的第二亚基包含氨基酸取代Y349C、T366S和Y407V(根据Kabat EU索引编号)。
37.根据权利要求29至36中任一项所述的方法，其中靶向PD-1和LAG3的所述双特异性抗体包含：Fc结构域、包含所述第一抗原结合结构域的第一Fab片段以及包含所述第二抗原结合结构域的第二Fab片段。
38.根据权利要求37所述的方法，其中在靶向PD-1和LAG3的所述双特异性抗体的所述Fab片段中的一者中，可变结构域VL和VH彼此替换，使得所述VH结构域为轻链的一部分并且所述VL结构域为重链的一部分，任选地其中在所述第一Fab片段中，所述可变结构域VL和VH彼此替换。
39.根据权利要求37或38所述的方法，其中在所述Fab片段中的一者的恒定结构域CL中，位置124处的氨基酸独立地被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)取代(根据Kabat EU索引编号)，并且在恒定结构域CH1中，位置147和213处的氨基酸独立地被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)取代(根据Kabat EU索引编号)，任选地其中在所述第二Fab片段的恒定结构域CL中，位置124处的氨基酸独立地被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)取代(根据Kabat EU索引编号)，并且在恒定结构域CH1中，位置147和213处的氨基酸独立地被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)取代(根据Kabat EU索引编号)。
40.根据权利要求29至39中任一项所述的方法，其中所述双特异性抗体包含：第一重链，其包含与SEQ ID NO:39的序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；第一轻链，其包含与SEQ ID NO:40的序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；第二重链，其包含与SEQID NO:41的序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；和
第二轻链，其包含与SEQ ID NO:42的序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。
41.根据权利要求40所述的方法，其中所述双特异性抗体包含：第一重链，其包含SEQID NO:39的氨基酸序列；第一轻链，其包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列；第二重链，其包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列；和第二轻链，其包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列。
42.根据权利要求2至41中任一项所述的方法，其中所述双特异性抗体在肿瘤中实现至少90％的LAG3受体占有率(RO)。
43.根据权利要求1至42中任一项所述的方法，其中所述受试者为人。
44.一种用于在治疗患有癌症的受试者的方法中使用的靶向PD-1和LAG3的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体包含与PD-1特异性结合的第一抗原结合结构域和与LAG3特异性结合的第二抗原结合结构域，并且其中所述方法包括每三周以600mg的固定剂量向所述受试者施用所述双特异性抗体。
45.根据权利要求44所述的用于在方法中使用的双特异性抗体，其中所述癌症为实体瘤。
46.根据权利要求44或45所述的用于在方法中使用的双特异性抗体，其中所述癌症是局部晚期或转移性的。
47.根据权利要求44至46中任一项所述的用于在方法中使用的双特异性抗体，其中所述癌症为皮肤癌、肝癌、肺癌、肾癌、膀胱癌、乳腺癌或食管癌。
48.根据权利要求47所述的用于在方法中使用的双特异性抗体，其中所述皮肤癌为黑素瘤。
49.根据权利要求47或48所述的用于在方法中使用的双特异性抗体，其中所述皮肤癌为先前未经治疗的不可切除或转移性的黑素瘤。
50.根据权利要求48所述的用于在方法中使用的双特异性抗体，其中所述黑素瘤为：
(a)具有可测量的***转移的III期黑素瘤；
(b)不可切除的III期黑素瘤；或者
(c)IV期黑素瘤，
任选地其中所述黑素瘤并非黏膜黑素瘤或葡萄膜黑素瘤。
51.根据权利要求47所述的用于在方法中使用的双特异性抗体，其中所述肝癌为肝细胞癌(HCC)。
52.根据权利要求47所述的用于在方法中使用的双特异性抗体，其中所述肺癌为非小细胞肺癌(NSCLC)。
53.根据权利要求47所述的用于在方法中使用的双特异性抗体，其中所述肾癌为肾细胞癌(RCC)。
54.根据权利要求47所述的用于在方法中使用的双特异性抗体，其中所述膀胱癌为转移性尿路上皮癌(mUC)。
55.根据权利要求47所述的用于在方法中使用的双特异性抗体，其中所述乳腺癌为三阴性乳腺癌(TNBC)。
56.根据权利要求47所述的用于在方法中使用的双特异性抗体，其中所述食管癌为食管鳞状细胞癌(ESCC)。
57.一种用于在治疗患有黑素瘤的受试者的方法中使用的靶向PD-1和LAG3的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体包含与PD-1特异性结合的第一抗原结合结构域和与LAG3特异性结合的第二抗原结合结构域，其中所述方法包括每三周以600mg的固定剂量向所述受试者施用所述双特异性抗体，并且其中所述黑素瘤为：
(a)不可切除的III期黑素瘤；或者
(b)IV期黑素瘤。
58.根据权利要求57所述的用于在方法中使用的双特异性抗体，其中患者未患有眼部黑素瘤。
59.一种用于在用于治疗患有肝癌的受试者的方法中使用的靶向PD-1和LAG3的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体包含与PD-1特异性结合的第一抗原结合结构域和与LAG3特异性结合的第二抗原结合结构域，并且其中所述方法包括每三周以600mg的固定剂量向所述受试者施用所述双特异性抗体。
60.根据权利要求59所述的用于在方法中使用的双特异性抗体，其中所述肝癌为HCC。
61.根据权利要求60所述的用于在方法中使用的双特异性抗体，其中所述HCC为局部晚期、转移性和/或不可切除的。
62.根据权利要求59至61中任一项所述的用于在方法中使用的双特异性抗体，其中所述受试者先前未接受过全身性抗癌疗法。
63.根据权利要求44至62中任一项所述的用于在方法中使用的双特异性抗体，其中所述一个或多个给药周期中的每一个的长度为21天。
64.根据权利要求63所述的用于在方法中使用的双特异性抗体，其中所述方法包括在所述一个或多个给药周期中的每一个的第1天向所述受试者施用所述双特异性抗体。
65.根据权利要求44至64中任一项所述的用于在方法中使用的双特异性抗体，其中所述方法包括向所述受试者静脉内施用所述双特异性抗体。
66.根据权利要求44至65中任一项所述的用于在方法中使用的双特异性抗体，其中所述方法进一步包括每三周以约15mg/kg的剂量向所述受试者施用贝伐单抗。
67.根据权利要求66所述的用于在方法中使用的双特异性抗体，其中所述一个或多个给药周期中的每一个的长度为21天并且所述方法包括在所述一个或多个给药周期中的每一个的第1天向所述受试者施用所述贝伐单抗。
68.根据权利要求66或67所述的用于在方法中使用的双特异性抗体，其中静脉内施用所述贝伐单抗。
69.根据权利要求44至68中任一项所述的用于在方法中使用的双特异性抗体，其中所述受试者先前未针对转移性或不可切除的疾病进行过治疗。
70.根据权利要求44至69中任一项所述的用于在方法中使用的双特异性抗体，其中所述受试者先前未用包括免疫调节剂的抗癌疗法进行过治疗。
71.根据权利要求44至70中任一项所述的用于在方法中使用的双特异性抗体，其中所述受试者先前未用抗LAG3疗法进行过治疗。
72.根据权利要求44至71中任一项所述的用于在方法中使用的双特异性抗体，其中靶向PD-1和LAG3的所述双特异性抗体包含与PD-1特异性结合的第一抗原结合结构域，所述第一抗原结合结构域包含：VH结构域，其包含：
(i)HVR-H1序列，其包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列；
(ii)HVR-H2序列，其包含氨基酸序列GGR；和
(iii)HVR-H3序列，其包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列；以及
VL结构域，其包含：
(i)HVR-L1序列，其包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列；
(ii)HVR-L2序列，其包含氨基酸序列RSS；和
(iii)HVR-L3序列，其包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列。
73.根据权利要求72所述的用于在方法中使用的双特异性抗体，其中靶向PD-1和LAG3的所述双特异性抗体包含与LAG3特异性结合的第二抗原结合结构域，所述第二抗原结合结构域包含：VH结构域，其包含：
(i)HVR-H1序列，其包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列；
(ii)HVR-H2序列，其包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列；和
(iii)HVR-H3序列，其包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列；以及
VL结构域，其包含：
(i)HVR-L1序列，其包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列；
(ii)HVR-L2序列，其包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列；和
(iii)HVR-L3序列，其包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列。
74.根据权利要求72或73所述的用于在方法中使用的双特异性抗体，其中所述第一抗原结合结构域包含：VH结构域，其包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列；以及VL结构域，其包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列，并且所述第二抗原结合结构域包含：VH结构域，其包含SEQ IDNO:37的氨基酸序列；以及VL结构域，其包含SEQID NO:38的氨基酸序列。
75.根据权利要求72至74中任一项所述的用于在方法中使用的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体为全长抗体。
76.根据权利要求75所述的用于在方法中使用的双特异性抗体，其中靶向PD-1和LAG3的所述双特异性抗体包含Fc结构域，所述Fc结构域为IgG，任选地其中IgG Fc结构域为IgG1Fc结构域或IgG4Fc结构域。
77.根据权利要求76所述的用于在方法中使用的双特异性抗体，其中所述Fc结构域包含减少与Fc受体的结合的一个或多个氨基酸取代，任选地其中所述Fc受体为Fcγ受体。
78.根据权利要求72至77中任一项所述的用于在方法中使用的双特异性抗体，其中靶向PD-1和LAG3的所述双特异性抗体包含：
(a)属于人IgG1亚类的Fc结构域，其具有氨基酸突变L234A、L235A和P329G(根据KabatEU索引编号)；和/或
(b)包含促进所述Fc结构域的第一亚基和第二亚基缔合的修饰的Fc结构域。
79.根据权利要求76至78中任一项所述的用于在方法中使用的双特异性抗体，其中所述Fc结构域的第一亚基包含氨基酸取代S354C和T366W(根据Kabat EU索引编号)，并且所述Fc结构域的第二亚基包含氨基酸取代Y349C、T366S和Y407V(根据Kabat EU索引编号)。
80.根据权利要求72至79中任一项所述的用于在方法中使用的双特异性抗体，其中靶向PD-1和LAG3的所述双特异性抗体包含：Fc结构域、包含所述第一抗原结合结构域的第一Fab片段以及包含所述第二抗原结合结构域的第二Fab片段。
81.根据权利要求80所述的用于在方法中使用的双特异性抗体，其中在靶向PD-1和LAG3的所述双特异性抗体的所述Fab片段中的一者中，可变结构域VL和VH彼此替换，使得所述VH结构域为轻链的一部分并且所述VL结构域为重链的一部分，任选地其中在所述第一Fab片段中，所述可变结构域VL和VH彼此替换。
82.根据权利要求80或81所述的用于在方法中使用的双特异性抗体，其中在所述Fab片段中的一者的恒定结构域CL中，位置124处的氨基酸独立地被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)取代(根据Kabat EU索引编号)，并且在恒定结构域CH1中，位置147和213处的氨基酸独立地被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)取代(根据KabatEU索引编号)，任选地其中在所述第二Fab片段的恒定结构域CL中，位置124处的氨基酸独立地被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)取代(根据Kabat EU索引编号)，并且在恒定结构域CH1中，位置147和213处的氨基酸独立地被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)取代(根据Kabat EU索引编号)。
83.根据权利要求44至82中任一项所述的用于在方法中使用的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体包含：第一重链，其包含与SEQ ID
NO:39的序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；第一轻链，其包含与SEQ ID NO:40的序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；第二重链，其包含与SEQ ID NO:41的序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；和第二轻链，其包含与SEQ ID NO:42的序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。
84.根据权利要求83所述的用于在方法中使用的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体包含：第一重链，其包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列；第一轻链，其包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列；第二重链，其包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列；和第二轻链，其包含SEQ IDNO:42的氨基酸序列。
85.根据权利要求44至84中任一项所述的用于在方法中使用的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体在肿瘤中实现至少90％的LAG3受体占有率(RO)。
86.根据权利要求44至85中任一项所述的用于在方法中使用的双特异性抗体，其中所述受试者为人。
87.靶向PD-1和LAG3的双特异性抗体在制造用于治疗患有癌症的受试者的药物中的用途，其中所述双特异性抗体包含与PD-1特异性结合的第一抗原结合结构域和与LAG3特异性结合的第二抗原结合结构域，并且其中每三周以600mg的固定剂量向所述受试者施用所述双特异性抗体。
88.根据权利要求87所述的用途，其中所述癌症为实体瘤。
89.根据权利要求87或88所述的用途，其中所述癌症是局部晚期或转移性的。
90.根据权利要求87至89中任一项所述的用途，其中所述癌症为皮肤癌、肝癌、肺癌、肾癌、膀胱癌、乳腺癌或食管癌。
91.根据权利要求90所述的用途，其中所述皮肤癌为黑素瘤。
92.根据权利要求90或91所述的用途，其中所述皮肤癌为先前未经治疗的不可切除或转移性的黑素瘤。
93.根据权利要求91所述的用途，其中所述黑素瘤为：
(a)具有可测量的***转移的III期黑素瘤；
(b)不可切除的III期黑素瘤；或者
(c)IV期黑素瘤，
任选地其中所述黑素瘤并非黏膜黑素瘤或葡萄膜黑素瘤。
94.根据权利要求90所述的用途，其中所述肝癌为肝细胞癌(HCC)。
95.根据权利要求90所述的用途，其中所述肺癌为非小细胞肺癌(NSCLC)。
96.根据权利要求90所述的用途，其中所述肾癌为肾细胞癌(RCC)。
97.根据权利要求90所述的用途，其中所述膀胱癌为转移性尿路上皮癌(mUC)。
98.根据权利要求90所述的用途，其中所述乳腺癌为三阴性乳腺癌(TNBC)。
99.根据权利要求90所述的用途，其中所述食管癌为食管鳞状细胞癌(ESCC)。
100.靶向PD-1和LAG3的双特异性抗体在制造用于治疗患有黑素瘤的受试者的药物中的用途，其中所述双特异性抗体包含与PD-1特异性结合的第一抗原结合结构域和与LAG3特异性结合的第二抗原结合结构域，其中每三周以600mg的固定剂量向所述受试者施用所述双特异性抗体，并且其中所述黑素瘤为：
(a)不可切除的III期黑素瘤；或者
(b)IV期黑素瘤。
101.根据权利要求100所述的用途，其中所述受试者未患有眼部黑素瘤。
102.靶向PD-1和LAG3的双特异性抗体在制造用于治疗患有肝癌的受试者的药物中的用途，其中所述双特异性抗体包含与PD-1特异性结合的第一抗原结合结构域和与LAG3特异性结合的第二抗原结合结构域，其中每三周以600mg的固定剂量向所述受试者施用所述双特异性抗体。
103.根据权利要求102所述的用途，其中所述肝癌为HCC。
104.根据权利要求103所述的用途，其中所述HCC是局部晚期、转移性和/或不可切除的。
105.根据权利要求102至104中任一项所述的用途，其中所述受试者先前未接受过全身性抗癌疗法。
106.根据权利要求87至105中任一项所述的用途，其中一个或多个给药周期中的每一个的长度为21天。
107.根据权利要求106所述的用途，其中在所述一个或多个给药周期中的每一个的第1天向所述受试者施用所述双特异性抗体。
108.根据权利要求87至107中任一项所述的用途，其中向所述受试者静脉内施用所述双特异性抗体。
109.根据权利要求87至108中任一项所述的用途，其中每三周以约15mg/kg的剂量向所述受试者施用贝伐单抗。
110.根据权利要求109所述的用途，其中所述一个或多个给药周期中的每一个的长度为21天并且在所述一个或多个给药周期中的每一个的第1天向所述受试者施用所述贝伐单抗。
111.根据权利要求109或110所述的用途，其中静脉内施用所述贝伐单抗。
112.根据权利要求87至111中任一项所述的用途，其中所述受试者先前未针对转移性或不可切除的疾病进行过治疗。
113.根据权利要求87至111中任一项所述的用途，其中所述受试者先前未用包括免疫调节剂的抗癌疗法进行过治疗。
114.根据权利要求87至111中任一项所述的用途，其中所述受试者先前未用抗LAG3疗法进行过治疗。
115.根据权利要求87至114中任一项所述的用途，其中靶向PD-1和LAG3的所述双特异性抗体包含与PD-1特异性结合的第一抗原结合结构域，所述第一抗原结合结构域包含：VH结构域，其包含：
(i)HVR-H1序列，其包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列；
(ii)HVR-H2序列，其包含氨基酸序列GGR；和
(iii)HVR-H3序列，其包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列；以及
VL结构域，其包含：
(i)HVR-L1序列，其包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列；
(ii)HVR-L2序列，其包含氨基酸序列RSS；和
(iii)HVR-L3序列，其包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列。
116.根据权利要求115所述的用途，其中靶向PD-1和LAG3的所述双特异性抗体包含与LAG3特异性结合的第二抗原结合结构域，所述第二抗原结合结构域包含：VH结构域，其包含：
(i)HVR-H1序列，其包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列；
(ii)HVR-H2序列，其包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列；和
(iii)HVR-H3序列，其包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列；以及
VL结构域，其包含：
(i)HVR-L1序列，其包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列；
(ii)HVR-L2序列，其包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列；和
(iii)HVR-L3序列，其包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列。
117.根据权利要求115或116所述的用途，其中所述第一抗原结合结构域包含：VH结构域，其包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列；以及
VL结构域，其包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列，并且所述第二抗原结合结构域包含：VH结构域，其包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列；以及VL结构域，其包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列。
118.根据权利要求115至117中任一项所述的用途，其中所述双特异性抗体为全长抗体。
119.根据权利要求118所述的用途，其中靶向PD-1和LAG3的所述双特异性抗体包含Fc结构域，所述Fc结构域为IgG，任选地其中IgG Fc结构域为IgG1 Fc结构域或IgG4 Fc结构域。
120.根据权利要求119所述的用途，其中所述Fc结构域包含减少与Fc受体的结合的一个或多个氨基酸取代，任选地其中所述Fc受体为Fcγ受体。
121.根据权利要求115至120中任一项所述的用途，其中靶向PD-1和LAG3的所述双特异性抗体包含：
(a)属于人IgG1亚类的Fc结构域，其具有氨基酸突变L234A、L235A和P329G(根据KabatEU索引编号)；和/或
(b)包含促进所述Fc结构域的第一亚基和第二亚基缔合的修饰的Fc结构域。
122.根据权利要求119至121中任一项所述的用途，其中所述Fc结构域的第一亚基包含氨基酸取代S354C和T366W(根据Kabat EU索引编号)，并且所述Fc结构域的第二亚基包含氨基酸取代Y349C、T366S和Y407V(根据Kabat EU索引编号)。
123.根据权利要求115至122中任一项所述的用途，其中靶向PD-1和LAG3的所述双特异性抗体包含：Fc结构域、包含所述第一抗原结合结构域的第一Fab片段以及包含所述第二抗原结合结构域的第二Fab片段。
124.根据权利要求123所述的用途，其中在靶向PD-1和LAG3的所述双特异性抗体的所述Fab片段中的一者中，可变结构域VL和VH彼此替换，使得所述VH结构域为轻链的一部分并且所述VL结构域为重链的一部分，任选地其中在所述第一Fab片段中，所述可变结构域VL和VH彼此替换。
125.根据权利要求123或124所述的用途，其中在所述Fab片段中的一者的恒定结构域CL中，位置124处的氨基酸独立地被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)取代(根据Kabat EU索引编号)，并且在恒定结构域CH1中，位置147和213处的氨基酸独立地被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)取代(根据Kabat EU索引编号)，任选地其中在所述第二Fab片段的恒定结构域CL中，位置124处的氨基酸独立地被赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)取代(根据Kabat EU索引编号)，并且在恒定结构域CH1中，位置147和213处的氨基酸独立地被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)取代(根据Kabat EU索引编号)。
126.根据权利要求115至125中任一项所述的用途，其中所述双特异性抗体包含：第一重链，其包含与SEQ ID NO:39的序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；第一轻链，其包含与SEQ ID NO:40的序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；第二重链，其包含与SEQ ID NO:41的序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；和第二轻链，其包含与SEQID NO:42的序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。
127.根据权利要求126所述的用途，其中所述双特异性抗体包含：第一重链，其包含SEQID NO:39的氨基酸序列；第一轻链，其包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列；第二重链，其包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列；和第二轻链，其包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列。
128.根据权利要求87至127中任一项所述的用途，其中所述双特异性抗体在肿瘤中实现至少90％的LAG3受体占有率(RO)。
129.根据权利要求87至128中任一项所述的用途，其中所述受试者为人。
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