DE69930630T2 - B2-Mikroglobulin-Fusionsproteine und Varianten mit hoher Affinität - Google Patents

B2-Mikroglobulin-Fusionsproteine und Varianten mit hoher Affinität Download PDF

Info

Publication number
DE69930630T2
DE69930630T2 DE69930630T DE69930630T DE69930630T2 DE 69930630 T2 DE69930630 T2 DE 69930630T2 DE 69930630 T DE69930630 T DE 69930630T DE 69930630 T DE69930630 T DE 69930630T DE 69930630 T2 DE69930630 T2 DE 69930630T2
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
cell
protein
fusion protein
cells
tumor
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
DE69930630T
Other languages
English (en)
Other versions
DE69930630D1 (de
Inventor
K. Randall Silver Spring RIBAUDO
Michael San Diego SHIELDS
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
US Department of Health and Human Services
Original Assignee
US Department of Health and Human Services
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by US Department of Health and Human Services filed Critical US Department of Health and Human Services
Publication of DE69930630D1 publication Critical patent/DE69930630D1/de
Application granted granted Critical
Publication of DE69930630T2 publication Critical patent/DE69930630T2/de
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70532—B7 molecules, e.g. CD80, CD86
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70525—ICAM molecules, e.g. CD50, CD54, CD102
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70539—MHC-molecules, e.g. HLA-molecules
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55516—Proteins; Peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence

Description

  • Bereich der Erfindung
  • Diese Erfindung betrifft Zusammensetzungen, die auf β2-Mikroglobulin basieren und die Verwendung von solchen Zusammensetzungen bei immunologischen Verfahren, die das Abzielen von Proteinen auf Zelloberflächen betreffen. Die offenbarten Zusammensetzungen und Verfahren weisen eine besondere Anwendbarkeit bei Vakzination und Tumortherapie auf.
  • Hintergrund der Erfindung
  • MHC I und Aktivierung von cytotoxischen T-Zellen
  • Das Beta-2-Mikroglobulin (β2m) Protein ist eine Komponente der Klasse I des Haupthistokompatibilitätskomplexes (MHC I). MHC I wird durch die Assoziation von β2m und einem Alpha-Protein (auch als die "schwere" Kette bekannt) gebildet, das drei Domänen a1, a2 und a3 umfaßt. MHC I wird auf der Oberfläche der meisten Arten von kernhaltigen Zellen gefunden, wo es den CD8+ T-Zellen Antigene präsentiert, die von Proteinen abgeleitet werden, die im Cytosol synthetisiert werden. Es sind zwei Signale für die Aktivierung von naiven CD8+ T-Zellen nötig. Das erste Signal wird durch die Interaktion des T-Zell-Rezeptors (TCR) mit dem MHC I-Antigenkomplex auf der Antigen-präsentierenden Zelloberfläche bereitgestellt. Das zweite Signal wird durch die Interaktion eines Liganden auf der Antigen-präsentierende Zelle (APC) mit einem zweiten Rezeptor generiert, der auf der T-Zell-Oberfläche vorhanden ist. Dieses zweite Signal wird als Co-Stimulation bezeichnet, und der APC-Ligand wird häufig als ein co-stimulatorisches Molekül bezeichnet. Die am besten charakterisierten co-stimulatorischen Moleküle auf APCs sind die strukturell verwandten Glycoproteine B7.1 (CD80) und B7.2 (CD86), die mit dem CD28-Rezeptor auf der T-Zell-Oberfläche interagieren. Die Aktivierung von CD8+ T-Zellen durch diese beiden Signale führt zu der Proliferation von Antigen-spezifischen cytotoxischen T-Zellen, die Zellen erkennen und zerstören, die das Signalantigen präsentieren. Diese cytotoxischen T-Zellen spielen eine wichtige Rolle bei der immunologischen Abwehr gegen intrazelluläre Pathogene, wie z.B. Viren und Tumore. Eine ausführliche Darstellung der immunologischen Basis der cytotoxischen T-Zell-Antwort kann in "Janeway and Travers" gefunden werden (Immunobiology: the immune system in health and disease, Current Biology Ltd./Garland Publishing, Inc. New York, 1997).
  • Das Versagen eines exogenen (nicht-eigenen) Antigens, eine cytotoxische T-Zell-Antwort zu stimulieren, kann auf einer Blockierung eines der vielen Punkte des oben beschriebenen cytotoxischen T-Zell-Aktivierungswegs zurückgeführt werden (s. Ploeg, 1998, Science 280:248-53). Das Versagen des cytotoxischen T-Zell-Aktivierungswegs ist von großer Bedeutung in zwei bestimmten Bereichen der Medizin: Vakzinierung und Tumorimmunologie.
  • Cytotoxische T-Zellen und Vakzinierung
  • Die Vakzin-Technologie hat sich in den letzten Jahren auf die Untereinheiten-Vakzine fokussiert. Untereinheiten-Vakzine umfassen isolierte pathogene Bestandteile, wie z.B. virales Capsid oder virale Hülle oder synthetische Peptide, die eine antigenische Determinante auf einem Pathogen-verwandten Protein nachahmen. Zum Beispiel beschreibt das U.S. Patent Nr. 4,974,168 Leukämie-assoziierte Immunogene, die Peptide sind, die auf Hüllenproteinen eines Leukämie-assoziierten Virus basieren. Allerdings, während Untereinheit-Vakzine CD4+ T-Helfer-Zellen stimulieren können (die eine Schlüsselrolle bei humoraler Immunität spielen), waren Versuche, CD8+ cytotoxische T-Zellen mit solchen Impfstoffen in vivo zu stimulieren, weitgehend erfolglos. Es wurde postuliert, daß der Grund dafür die Unfähigkeit des exogen verabreichten Vakzin-Peptids, ist mit den MHC-I-Molekülen auf der Zelloberfläche zu assoziieren (Liu, 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:10496-8). Mit anderen Worten, die Blockierung in dem cytotoxischen T-Zell-Aktivierungsweg tritt in der Phase auf, wo das Antigen in das MHC I -Molekül geladen wird.
  • Eine für dieses Problem vorgeschlagene Lösung ist es, das antigen Peptid mit einem Molekül zu kombinieren, das leicht in Zellen aufgenommen wird (zusammengefaßt von Liu, 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:10496-8). Folglich basiert diese Strategie darauf, das Antigen in das Cytosol zu bekommen, so daß es sich dem normalen Weg anschließen kann, durch den Antigene zur Präsentation durch MHC I verarbeitet werden. Demgegenüber nahmen sich Rock et al. (J. Immunol. 150:1244-52, 1993) einer Strategie zum Erhöhen der Bindung des Vakzin-Peptids auf MHC-I an, das bereits auf der Zelloberfläche vorhanden ist. Rock et al., (J. Immunol. 150:1244-52, 1993) berichteten, daß die Verabreichung von exogenem gereinigtem β2m zusammen mit dem Vakzin-Peptid eine erhöhte Beladung des Peptids auf MHC I in vivo bewirkt und dabei eine cytotoxische T-Zell-Antwort gegen das Peptid stimuliert. Die Verwendung von exogenem β2m als ein Vakzin-Hilfsstoff wird auch im U.S. Patent Nr. 5,733,550 (von Rock et al.) beschrieben, das hiermit durch Bezugnahme aufgenommen wird. Shields et al., The Journal of Virology, Vol. 160 Nr. 5 und Björkman et al., Nature, Vol. 329, S. 506–512 betreffen MHC Klasse I Antigene.
  • Tumorzellen und Evasion des Immunsystems
  • Eine Immunität gegen Tumorzellen ist hauptsächlich zellvermittelt, was sowohl CD8+ cytotoxische T-Zellen als auch CD4+ T-Helfer-Zellen einschließt. Allerdings, trotz der Tatsache, daß Tumorzellen tumorspezifische Proteine exprimieren, die als Selbst-Antigene nicht durch das Immunsystem erkannt werden, entkommen sie häufig der Erkennung durch das Immunsystem. Es können eine Anzahl von Faktoren an der Fähigkeit der Tumorzellen teilnehmen, eine Immunerkennung zu vermeiden, einschließlich des Herunter-Regulierens der Expression von co-stimulatorischen Proteinen. Die TCR-Stimulierung in Abwesenheit von co-stimulatorischen Molekülen führt zu einem Versagen, die T-Zelle und die Induktion einer klonalen Anergie zu aktivieren. Folglich beugt eine Herunter-Regulierung der co-stimulatorischen Proteine in Tumorzellen einer normalen Aktivierung von T-Zellen vor, die an Tumorantigenen auf der Zelloberfläche binden und erlaubt es der Tumorzelle daher, der Erkennung zu entkommen.
  • Es haben einige Forschergruppen versucht, dieses Problem durch Entnehmen von Tumorzellen von einem Patienten, Bereitstellen von exogenen co-stimulatorischen Molekülen auf der Oberfläche der entnommenen Tumorzellen und anschließendem Wiedereinführen der Tumorzellen in den Patienten, so daß Immunerkennung stattfinden kann, zu adressieren. Zum Beispiel offenbart die Europäische Patentanmeldung Nr. 96302009.4 ein Verfahren, bei dem Tumorzellen von einem Patienten entnommen werden, transfiziert werden, um sowohl B7 als auch CD2 (einen Co-Rezeptor, der bei T-Zellenadhäsion und Aktivierung involviert ist) auf der Tumorzelloberfläche zu exprimieren und anschließend in dem Patienten wiedereingeführt werden. Es wird von den wieder eingeführten Zellen berichtet, eine breite immunologische Antwort gegen sowohl die wiedereingeführten transfizierten Tumorzellen als auch die nicht-transfizierten Tumorzellen innerhalb des Patientenkörpers zu stimulieren, was zu einer Tumorregression führt.
  • Sich eines alternativen Ansatzes zu diesem Problem annehmend, beschreiben Gerstmayer et al. (J Immunol. 158:4584-90, 1997) ein chimäres B7-Antikörperprotein, in dem der Antikörper für das erbB2 Proto-onkogene Produkt spezifisch ist. Dieses chimäre Molekül ist spezifisch auf der Oberfläche von erbB2 exprimierenden Tumorzellen lokalisiert und präsentiert den cytotoxischen T-Zellen die B7 co-stimulatorischen Moleküle, was zu einer erhöhten Proliferation von cytotoxischen T-Zellen führt. Folglich schlägt Gerstmayer et al. vor, (J. Immunol. 158:4584-90, 1997), daß Fusionsproteine, die einen Anti-Tumorantikörper und ein co-stimulatorisches Molekül umfassen, als Tumor-Immunotherapeutika nützlich sein können. Allerdings würde dieser Ansatz dievorherige Kenntnis und Charakterisierung von tumorspezifischen Antigenen, die auf den Tumorzellen jedes individuellen Patienten exprimiert werden und die Verwendung eines Antikörpers, der für die bestimmte Art der Tumorzellen spezifisch ist, voraussetzen.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung verwendet eine Form eines Beta-2-Mikroglobulins, wie beansprucht, um die Probleme zu adressieren, die mit Versagen des cytotoxischen T-Zell-Aktivierungsweg bei sowohl Vakzinierung als auch Tumortherapie assoziiert sind. Die beanspruchte Erfindung stellt auch Zusammensetzungen und Verfahren bereit, die auf β2m basieren, die breit anwendbar sind, um eine Expression jedes erwünschte Zielprotein auf der Oberfläche jeder Säugetierzelle zu erhalten.
  • In einer Ausführungsform stellt die Erfindung Fusionsproteine bereit, die eine erste Aminosäuresequenz und eine zweite Aminosäuresequenz umfassen, wobei die zweite Aminosäuresequent das β2-Mikroglobulin hβ2m S55V ist. Bei besonderen Anwendungen kann die erste Aminosäuresequenz ein co-stimulatorisches Protein, wie z.B. B7.1 oder B7.2 oder ein anderes Protein sein, das eine immunologische Aktivität aufweist, wie z.B. ein Cytokin, ein Integrin oder ein zelluläres Adhäsionsmolekül. Beispiele von solchen Proteinen schließen Interleukin (z.B. IL-2, IL-12), Granulocyten-Macrophagen koloniestimulierender Faktor (GM-CSF), Lymphozyten Funktions-assoziierte Proteine (z.B. LFA-1, LFA-3) und intrazelluläre Adhäsionsmoleküle (z.B. ICAM-1, ICAM-2) ein. In anderen Ausführungsformen kann die erste Aminosäure des Fusionsproteins jedes Protein sein, von dem erwünscht ist, daß es auf der Oberfläche einer Zelle exprimiert wird. Es wird gezeigt, daß diese Fusionsproteine ein wirksamer Weg sind, um ein erwünschtes Protein, wie z.B. B7, auf die äußere Membran einer Zelle abzuzielen. ("B7" wird generisch verwendet, um entweder auf B7.1 oder B7.2 hinzuweisen.)
  • Im Hinblick auf die Tumortherapie wird gezeigt, daß ein Exprimieren eines Fusionsproteins auf der Oberfläche einer Tumorzelle, das ein β2m zusammen mit einem co-stimulatorischen Protein umfaßt, die Immunantwort eines Tiers auf die Tumorzelle signifikant erhöhen kann. In einem Beispiel wird ein Fusionsprotein, umfassend das hβ2m zusammen mit dem co-stimulatorischen Protein B7 (genannt B7-β2m) auf die Oberfläche der Tumorzellen abgezielt, so daß die Tumorzellen das B7-β2m-Fusionsprotein den T-Zellen präsentieren. Diese Zellen werden anschließen abgeschwächt und in Mäuse eingeführt. Von T-Zellen, die aus diesen Mäusen entfernt wurden, wurde gezeigt, daß diese signifikant wirksamer gegen die gleiche Art von Tumorzellen ware, als äquivalente Zellen von Mäusen, die mit Tumorzellen behandelt wurden, die nur β2m präsentierten.
  • Die durch die Erfindung bereitgestellten β2m-Fusionsproteine weisen eine breite Anwendung auf, indem sie nützlich sind, jedes erwünschte Protein auf die äußere Membran einer Zelle zu abzuzielen. Diese Fusionsproteine können auf die Oberfläche einer Zelle in etlichen Wegen abgezielt werden. In einem Ansatz werden Zellen, die MHC-I exprimieren, einfach mit einer Präparation des Fusionsproteins inkubiert, was zum Einschließen des Fusionsproteins auf der Zelloberfläche fährt. Alternativ kann das Fusionsprotein in die Zelle eingeführt werden, so daß es in den MHC I-Weg eingeschlossen wird. In einem anderen Ansatz wird ein Nukleinsäwemolekül, das für das Fusionsprotein kodiert, durch Transformation in eine Zelle eingeführt. Die Expression dieses Nukleinsäuremoleküls führt dazu, daß das Fusionsprotein innerhalb der Zelle produziert wird und auf die Zellmembran exportiert wird. Wo das Fusionsprotein in das Cytosol zum Export auf die äußere Membran eingeführt wird oder wo es durch ein Nukleinsäuremolekül innerhalb der Zelle exprimiert wird, ist es wünschenswert, ein Signalpeptid am N-Terminus des Fusionspeptids einzuschließen, so daß das Fusionsprotein zu der äußeren Membran der Zelle transportiert wird. Zu diesem Zweck kann das β2m Signalpeptid verwendet werden. In all diesen Ansätzen ist das Ergebnis, daß das β2m Fusionsprotein auf der Oberfläche der Zelle präsentiert wird.
  • In einer Ausführungsform schließt die Erfindung Nukleinsäuremoleküle ein, die für die offenbarten Fusionsproteine codieren, sowie Nukleinsäurevektoren, die solche Nukleinsäuremo leküle umfassen. Transgene Zellen, die diese Nukleinsäuremoleküle umfassen, werden auch durch die Erfindung bereitgestellt.
  • Verfahren zum Exprimieren des beanspruchten β2m Fusionsproteins auf der Oberfläche einer Zelle werden durch die Erfindung bereitgestellt. Solche Verfahren schließen in Kontakt bringen einer Zelle mit einem Fusionsprotein, umfassend eine erste Aminosäuresequenz und eine zweite Aminosäuresequenz, wobei die zweite Aminosäuresequenz ein β2m ist, ein. Ein alternatives Verfahren, das durch die Erfindung bereitgestellt wird, umfaßt Transformieren der Zelle mit einem Nukleinsäuremolekül, das für so ein Fusionsprotein codiert.
  • Die Erfindung stellt weiter die Verwendung der beanspruchten Proteine in Verfahren zum Verstärken der Immunantwort eines Tieres auf ein Antigen, das auf der Oberfläche einer Zelle präsentiert wird, bereit. Solche Verfahren umfassen ein Bereitstellen eines β2m Fusionsproteins auf der Oberfläche der Zelle und ein Verabreichen der Zelle dem Säugetier. Bei solchen Anwendungen umfaßt das Fusionsprotein vorzugsweise β2m, das an ein co-stimulierendes Protein, wie z.B. B7 oder ein anderes Protein fusioniert ist, das eine immunologische Aktivität aufweist. Exprimieren des β2m Fusionsproteins auf der Zelloberfläche kann durch In Kontakt bringen der Zelle mit dem Fusionsprotein oder Transformieren der Zelle mit einem Nukleinsäuremolekül, das für das Protein codiert, erreicht werden. Diese Verfahren können für die Behandlung von Tumoren angewendet werden; in solchen Behandlungen ist das Antigen gegen das eine erhöhte Immunantwort erwünscht ist, ein Tumorantigen und die Zelle, die das Antigen trägt, eine Tumorzelle. Die Tumorzelle kann aus dem Körper eines Säugetiers, das einen Tumor aufweist, entnommen werden oder kann in vitro von einer sich vermehrenden Tumorzellinie abgeleitet werden. Das β2m Fusionsprotein wird in die Tumorzelle eingeführt (z.B. durch Inkubation der Tumorzelle mit dem Protein oder durch Transformation der Tumorzelle mit einer Nukleinsäure, die für das Fusionsprotein kodiert), so daß die Tumorzelle das Fusionsprotein auf ihrer Oberfläche präsentiert. Die Tumorzelle, die das Fusionsprotein trägt, wird anschließend einem Säugetier verabreicht. In bestimmten Ausführungsformen kann die Tumorzelle abgeschwächt werden, bevor sie dem Säugetier verabreicht wird. Solche Abschwächung kann mittels Standardmitteln, wie z.B. radioaktive Strahlung, Hitze oder chemische Behandlung, erreicht werden. Sobald im Körper des Säugetiers, wird die Kombination von Tumorartigenen und dem β2m-Fusionsprotein auf der Oberfläche der Tumorzellen durch CD8+ T-Zellen erkannt, was zu T-Zell-Aktivierung, Proliferation und dadurch einer erhöhten cytolytischen T-Zell-Antwort gegen sowohl die eingeführten Tumorzellen und andere Tumorzellen in dem Säugetier führt, die das gleiche Tumorantigen exprimieren.
  • Die vorliegende Erfindung stellt auch modifizierte humane β2m (hβ2m) Proteine bereit, die eine erhöhte Affinität für MHC-I aufweisen. Von solchen Proteinen wurde gezeigt, daß sie an die Alphakette von MHC I mit höherer Affinität als Wild-Typ hβ2m binden und daß sie eine T-Zellerkennung von APCs erhöhen, die modifiziertes hβ2m tragen. In bestimmten Ausführungsformen weisen die modifizierten hβ2m Proteine einen Valin-Rest an Position 55 anstelle des Serinrests auf, der in der reifen Form des natürlich vorkommendem hβ2m (d.h. Wild-Typ) gefunden wird. Solche modifizierten hβ2m Proteine werden als hβ2m S55V bezeichnet.
  • hβ2m S55V ist als ein Vakzinhilfsstoff anstelle des Wild-Typ hβ2m brauchbar. Folglich ist ein Aspekt der Erfindung eine Vakzin-Präparation, die wenigstens ein Antigen und hβ2m S55V umfaßt. hβ2m S55V kann auch anstelle von Wild-Typ hβ2m bei den oben diskutierten Fusionsproteinen verwendet werden. Zusätzlich können β2m-Fusionsproteine auch in solchen Vakzinpräparationen verwendet werden, die entweder ein Wild-Typs β2m, oder im Falle von hβ2m, hβ2m S55V verwenden.
  • Sequenzprotokoll
  • Die Nuklein- und Aminosäuresequenzen, die im Sequenzprotokoll aufgelistet sind, werden mittels Standard-Buchstabenabkürzungen für Nukleotidbasen und dem Drei-Buchstaben-Code für Aminosäuren gezeigt. Es wird nur ein Strang jeder Nukleinsäuresequenz gezeigt, aber es ist selbstverständlich, daß der komplementäre Strang durch jede Bezugnahme des gezeigten Strangs eingeschlossen wird.
    • SEQ ID Nr. 1 zeigt die Aminosäuresequenz des Wild-Typ (natürlich vorkommenden) hβ2m.
    • SEQ ID Nr. 2 zeigt die Aminosäuresequenz des B7-β2m-Fusionsproteins (umfassend das B7.2 co-stimulatorische Molekül).
    • SEQ ID Nr. 3 zeigt die Aminosäuresequenz des B7-β2m-Fusionsproteins, das die β2m Signalsequenz aufweist, die an den N-Terminus der B7-Domäne angegliedert ist.
    • SEQ ID Nr. 4 bis 7 zeigen Primer, die zur Konstruktion des hβ2m S55V verwendet werden.
    • SEQ ID Nr. 8 und 9 zeigen Primer, die zum Amplifizieren, des B7.2-Proteins verwendet werden.
    • SEQ ID Nr. 10 zeigt die Aminosäuresequenz des reifen hβ2m S55V.
    • SEQ ID Nr. 11 und 12 zeigen die Aminosäure-Linker-Sequenzen, die zwischen den zwei Domänen eines Fusionsproteins verwendet werden können.
    • SEQ ID Nr. 13 und 14 zeigen Aminosäuresequenzen von Signalpeptiden, die zur Richtung, der Expression eines Proteins in einer Zelle verwendet werden können.
    • SEQ ID Nr. 15 zeigt die Aminosäuresequenz für einen c-myc tag.
    • SEQ ID Nr. 16 bis 20 zeigt die Aminosäuresequenzen für Peptide, die in dem HLA-Stabilisierungstest verwendet werden.
  • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • 1 zeigt die Aminosäuresequenz des natürlich vorkommenden (z.B. Wild-Typ) β2m; das Signalpeptid ist doppelt unterstrichen und die Aminosäurenumerierung beginnt an dem Isoleucin-Rest, der der erste Rest des reifen Proteins ist. Das Serin an Position 55, das in S55V durch Valin ausgetauscht ist, wird in Fettdruck gezeigt.
  • 2 ist eine schematische Darstellung des B7.2-β2 Mikroglobulinfusionspeptidkonstrukts.
  • 3 zeigt die Sequenz des B7.2-β2m Fusionspeptids. Rest 1 ist ein Methionin, das zur Expression nötig ist, die Reste 2 bis 220 sind der extrazelluläre Teil von murinem B7-2, die Reste 221 bis 225 (Kursivschrift) sind eine Sequenz, die durch die Einführung einer Restriktionsstelle in die Nukleinsäuresequenz erzeugt werden, die Reste 226 bis 240 (unterstrichen) sind die Verknüpfungs-("Linker")-Sequenz und die Reste 241 bis 339 sind die reife Form des β2m.
  • 4 zeigt die Sequenz eines B7-β2m Fusionspeptids, das die hβ2m-Signalsequenz aufweist (Reste 1 bis 20, doppelt unterstrichen). Die Reste 21 bis 223 sind der extrazelluläre Teil von murinem B7-2, die Reste 240 bis 244 (Kursivschrift) sind eine Sequenz, die durch die Einführung einer Restriktionsstelle in die Nukleinsäurese quenz erzeugt werden, die Reste 245 bis 259 (unterstrichen) sind die Linker-Sequenz und die Reste 260 bis 358 sind die reife Form von β2m.
  • 5 ist ein Graph, der den Effekt von Plättchen-gebundenem B7-β2m auf die BALB/c Milz-T-Zell-Proliferation bei Anwesenheit einer suboptimalen Konzentration an löslichem 2C11 zeigt.
  • 6 ist ein Graph, der die Wirksamkeit von P815 "Antigen-primed" T-Zellen (die mit P815-Zellen, die nur P815 Antigene oder P815 Antigene und entweder B7-β2m oder β2m präsentieren, geprimed sind), P815-Tumorzellen zu lysieren, zeigt.
  • 7 ist ein Graph, der die Stabilisierung von Zelloberflächen HLA-A1(a), -A2(b), und -A3(c) durch mutiertes β2m und Peptid verdeutlicht. Alle Werte sind als mittlere Fluoreszenzintensität angegeben.
  • 8 zeigt die Inhibierung der myc-β2m-Bindung durch S55V und nβ2m auf Zelloberflächen HLA-A1(a), -A2(b) und -A3(c). Alle Werte sind als mittlere Fluoreszenzintensität angegeben.
  • 9 zeigt, daß die S55V-Mutante die CTL-Erkennung besser als Wild-Typ nβ2m in sowohl Hmy2-C1R-A2 (a) und Hmy2.C1R-A3 (b) Zielzellen erhöht.
  • Genaue Beschreibung der Erfindung
  • Abkürzungen und Definitionen
  • Um die Überprüfung und das Verständnis der Erfindung zu erleichtern, wird die folgende Erklärung von Abkürzungen und Definitionen von Ausdrücken bereitgestellt:
    β2m: Beta-2-Mikroglobulin. Dieser Ausdruck umfaßt jedes Säugetier-beta-2 Mikroglobulinprotein, einschließlich humane und murine Beta-2-Mikroglobuline. Der Ausdruck "hβ2m" betrifft spezifisch humanes Beta-2-Mikroglobulin. cDNAs und Gene, die für Säugetier-β2ms kodieren, sind im Stand der Technik gut bekannt, sowie die entsprechenden β2m-Sequenzen. Beispiele schließen solche Sequenzen ein, die in Parnes and Seidman (Cell 29:661-9, 1982), Gates et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:554-8, 1981) (murin); Suggs et al (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:6613-7, 1981), Guessow et al. (J. Immunol. 139:3132-8, 1987), Cunningham et al. (Biochem. 12:4811-22, 1973) (Mensch); und Ellis et al. (Immunogenetics 38:310, 1993) (Rinder) beschrieben werden. Diese Sequenzen sind auch in der GenBank unter http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Entrez/index.html verfügbar.
  • Der Ausdruck "Wild-Typ β2m" und "natürlich vorkommendes β2m" betrifft das β2m-Protein, das aus der bestimmten in Frage kommenden Säugetierspezies isoliert wird. Zum Beispiel betrifft Wild-Typ β2m ein Beta-2-Mikroglobulinprotein, das eine Aminosäuresequenz von hβ2m aufweist, das aus einer humanen Quelle (z.B. Serum) isoliert wurde. Folglich ist ein Beispiel eines Wild-Typ β2m das hβ2m-Protein, das in Cunningham et al. (Biochem. 12:4881-1973) offenbart wird und das auch in der GenBank unter der Zugangsnummer A90371 erhältlich ist und in 1 und SEQ ID Nr. 1 gezeigt wird. Der Ausdruck "modifiziertes β2m" betrifft ein Beta-2-Mikroglobulinprotein, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die von einer Wild-Typ β2m-Aminosäuresequenz modifiziert wurde. Zum Beispiel ist hβ2m S55V eine mutierte Form von hβ2m, in dem der Serinrest, der an Position 55 im reifen Wild-Typ hβ2m (siehe 1 und SEQ ID Nr. 1) vorkommt, durch einem Valinrest ersetzt wird. Der Ausdruck hβ2m S55V umfaßt Formen von hβ2m, die sich vom Wild-Typ hβ2m durch Substitution von Serin für ein Valin an Position 55 unterscheiden, sowie Formen von hβ2m, die die S55V-Modifikation und zusätzliche Aminosäuresequenzmodifikationen aufweisen.
  • Fusionsprotein: Ein Protein, umfassend zwei Aminosäuresequenzen, die in der Natur nicht zusammen verknüpft gefunden werden. Der Ausdruck "β2m-Fusionsprotein" betrifft ein Protein, das eine erste Aminosäuresequenz und eine zweite Aminosäuresequenz umfaßt, wobei die zweite Aminosäuresequenz ein β2-Mikroglobulin ist. Die β2m Aminosäuresequenz und die erste Aminosäuresequenz können alternativ als Domänen des Fusionsproteins bezeichnet werden. Folglich stellt die vorliegende Erfindung zum Beispiel Fusionsproteine bereit, umfassend erste und zweite Domänen, wobei die zweite Domäne ein β2m-Protein ist. Die Brücke zwischen der ersten und zweiten Domäne des Fusionsproteins ist üblicherweise, aber nicht notwendigerweise, eine Peptidverknüpfung. Bei bestimmten β2m-Fusionsproteinen können die zwei Domänen mittels eines Verknüpfungspeptids verbunden sein. In β2m-Fusionsproteinen ist die erste Domäne vorzugsweise, aber nicht notwendigerweise, mit dem N-Terminus der β2m-Domäne verknüpft.
  • Diese Fusionsproteine können auch durch die Formel X-Y dargestellt werden, wobei X ein Protein ist, wie z.B. ein co-stimulatorisches Protein, und Y ein β2m-Protein ist. In einer weiteren Ausführungsform des offenbarten Fusionsproteins kann eine Signalpeptidsequenz an den N-Terminus des ersten Proteins verknüpft vorliegen. So ein dreiteiliges Protein kann folglich als S-X-Y dargestellt werden, wobei S das Signalpeptid ist, X ein Protein ist, wie z.B. ein co- stimulatorisches Protein und X ein β2m-Protein ist. Wo das Fusionsprotein in einer eukaryontischen Zelle exprimiert wird, ist das Signalpeptid vorzugsweise ein eukaryontisches Signalpeptid, das eine abgezielte Expression des Fusionsproteins auf der Zellmembran bewirkt. Während eine Anzahl von Signalpeptiden zu diesem Zweck verwendet werden kann, ist das bevorzugte Signalpeptid das β2m-Signalpeptid (in 1 gezeigt). Wo das Fusionsprotein in einer prokaryontischen Zelle exprimiert wird, ist das Signalpeptid vorzugsweise ein prokaryontisches Signalpeptid, das zu der Sekretion des Fusionspeptids in das Wachstumsmedium führt, wo es leicht geerntet und gereinigt werden kann. Geeignete prokaryontische Signalpeptide sind im Stand der Technik gut bekannt. Wo das X-Protein und β2m durch eine Peptidbrücke verknüpft sind, kann das Fusionsprotein als X-L-Y dargestellt werden oder falls ein Signalpeptid vorhanden ist, als S-X-L-Y, wobei L die Peptidbrücke ist.
  • Bestimmte β2m-Fusionsproteine der vorliegenden Erfindung schließen als ihre β2m-Komponente das hβ2m S55V Protein ein. Bestimmte Reste in der β2m-Komponente solcher Fusionsproteine können durch die Zahl der Reste, die sie von dem ersten Rest des reifen hβ2m (was Isoleucin ist) entfernt sind, bezeichnet werden. Folglich kann die β2m-Komponente eines Fusionsproteins, das hβ2m S55V einschließt, als ein humanes β2-Mikroglobulin bezeichnet werden, das ein Valin an Position 55 aufweist.
  • Transformiert: Eine transformierte Zelle ist eine Zelle, in der ein Nukleinsäuremolekül durch molekularbiologische Techniken eingeführt wurde. Wie hier verwendet, umfaßt der Ausdruck Transformation alle Techniken, durch die ein Nukleinsäuremolekül in solch eine Zelle eingeführt werden kann, einschließlich Transfektion mit viralen Vektoren, Transformation mit Plasmidvektoren und Einführung von nackter DNA durch Elektroporation, Lipofektion und Partikel Gun-Beschleunigung.
  • Isoliert: Eine "isolierte" biologische Komponente (wie z. B. eine Nukleinsäure oder ein Protein) wurde im wesentlichen von anderen biologischen Komponenten in der Zelle des Organismus, in dem die Komponente natürlicherweise vorkommt, z.B. andere chromosomale oder extrachromosomale DNA und RNA und Proteine, getrennt und gereinigt. Nukleinsäuren und Proteine, die "isoliert" wurden, schließen folglich Nukleinsäuren und Proteine ein, die durch Standardreinigungsmethoden gereinigt wurden. Der Ausdruck umfaßt auch Nukleinsäuren und Proteine, die durch rekombinante Expression in einer Wirtszelle hergestellt werden, sowie chemisch synthetisierte Nukleinsäuren.
  • Vektor: Ein Nukleinsäuremolekül wie in eine Wirtszelle eingeführt, wodurch eine transformierte Wirtszelle hergestellt wird. Ein Vektor kann Nukleinsäuresequenzen einschließen, die es ihm erlauben, sich in der Wirtszelle zu replizieren, wie z.B. einen Replikations-Ursprung. Ein Vektor kann auch eines oder mehrere auswählbare Markergene und andere genetische Elemente einschließen, wie im Stand der Technik bekannt.
  • Gereinigt: Der Ausdruck gereinigt erfordert nicht absolute Reinheit, er ist eher als ein relativer Ausdruck gedacht. Folglich ist z.B. ein gereinigtes β2m-Proteinpräparat eines, in dem das β2m Protein reiner als das Protein in seiner natürlichen Umgebung innerhalb einer Zelle ist. Vorzugsweise wird ein Präparat eines Proteinpräparats so gereinigt, daß das Protein wenigstens 50 % des Gesamtproteininhalts des Präparats umfaßt.
  • Funktionsfähig verknüpft: Eine erste Nukleinsäuresequenz ist mit einer zweiten Nukleinsäuresequenz funktionsfähig verknüpft, wenn die erste Nukleinsäuresequenz in einer funktionalen Beziehung mit der zweiten Nukleinsäuresequenz plaziert wird. Zum Beispiel wird ein Promoter funktionsfähig an eine kodierende Sequenz verknüpft, wenn der Promoter die Transkription oder Expression der kodierenden Sequenz beeinflußt. Im allgemeinen sind funktionsfähig verknüpfte DNA-Sequenzen fortlaufend und, wo notwendig, um zwei Proteinkodierende Regionen zu verbinden, in dem gleichen Leserahmen.
  • Rekombinant: Eine rekombinante Nukleinsäure ist eine, die eine Sequenz aufweist, die nicht natürlich vorkommt oder eine Sequenz aufweist, die durch künstliche Kombination von zwei anderweitig getrennten Segmenten einer Sequenz hergestellt wird. Diese künstliche Kombination wird häufig durch chemische Synthese oder, allgemein üblicher, durch die künstliche Manipulation von isolierten Segmenten der Nukleinsäuren, z.B. durch Gentechnik, erhalten.
  • Tumorzellen: Eine neoplastische Zelle, die entweder maligne oder nicht-maligne sein kann. Tumorzellen schließen Zellen von sowohl soliden als auch nicht-soliden Tumoren (wie z.B. hämatologische Malignitäten) ein. Tumore können Muttergeschwulste sein, die aus einem bestimmten Organ abstammen (wie z.B. Brust, Prostata, Blase oder Lunge). Tumore gleichen Gewebetyps können in Tumore unterschiedlicher Unterarten eingeteilt werden (ein klassisches Beispiel sind bronchogene Karzinome (Lungentumore), die ein Adenokarzinom, kleine Zelle-, schwammartige Zelle- oder großer Zelltumor sein können).
  • Säugetier: Dieser Ausdruck schließt sowohl humane als auch nicht-humane Säugetiere ein. Ähnlich schließt der Ausdruck "Patient" sowohl humane als auch tierische Subjekte ein.
  • Herstellung und Verwendung von β2m-Fusionsproteinen
  • In der vorliegenden Erfindung werden, soweit nicht anders beschrieben, Standardmolekularbiologische, biochemische und immunologische Methoden verwendet. Solche Standardmethoden sind beschrieben in Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York, 1989), Ausubel et al. (Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates und Wiley-Intersciences, 1987), Innis et al. (PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, Innis et al. (eds.), Academic Press, Inc., San Diego, Kalifornien, 1990) und "Harlow and Lane" (Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1988). Methoden zum Herstellen von Nukleinsäuresequenzen, die Fusionsproteine exprimieren, sowie Methoden zum Exprimieren und Reinigen von Fusionsproteinen sind im Stand der Technik gut bekannt und werden z.B. in den U.S. Patenten Nr. 5,580,756 und 5,698,679 beschrieben. Die folgenden Absätze werden als Leitlinie bereitgestellt.
  • Standardtechniken können verwendet werden, um genetische Konstrukte herzustellen, die β2m-Fusionsproteine exprimieren, einschließlich Verdauung mit Restriktionsendonukleasen, Ligation und die Polymerasekettenreaktion. Jedes Säugetiergen oder cDNA, die für β2m kodieren, können als Quelle der β2m kodierenden Sequenz verwendet werden. Solche Sequenzen sind im Stand der Technik bekannt und in öffentlichen Datenbanken, wie z.B. GenBank, verfügbar. Als Beispiel wird die Sequenz der humanen β2m cDNA in Guessow et al. (J. Immunol. 139:3132-8, 1987 GenBank: Zugangsnummer: M 17986) beschrieben. Besonders schließt diese cDNA-Sequenz Regionen ein, die für das Signalpeptid hβ2m kodiert (s. 1).
  • In gleicher Weise sind Nukleinsäuresequenzen, die für Proteine kodieren, die als die zweite Domäne des Fusionsproteins ausgewählt werden können, im Stand der Technik gut bekannt. Während die Auswahl der zweiten Proteindomäne üblicherweise ein co-stimulatorisches Protein oder ein Protein sein wird, das irgendeine andere immunologische Aktivität aufweist, können Fusionsproteine erzeugt werden, die β2m als die zweite Domäne verwenden und jedes andere Protein, von dem gewünscht wird, das es auf die Oberfläche einer Zelle abgeliefert wird, als die erste Domäne. Beispiele von cDNAs, die für Proteine kodieren, die costimulatorische Aktivität aufweisen, schließen die ein, die für humanes B7.1 (Freeman et al., 1989, J. Immunol. 143:2714-22, GenBank, Zugangsnummer: M27533), B7.2 (Azuma et al., 1993, Nature 366:76-9, GenBank, Zugangsnummer: L25259), LFA-3 (Wallner et al., 1987, J. Exp. Med. 166:923-32, GenBank, Zugangsnummer Y00636) und ICAM-1 (Simmons et al., 1988, Nature 331;624-7), GenBank, Zugangsnummer X06990) kodieren. Beispiele von anderen immunologisch aktiven Proteinen schließen ICAM-3 (Fawcett et al., 1992, Nature 360:481-4, GenBank, Zugangsnummer 550015), VCAM-1 (Damle et al., 1992, J. Immunol. 148;1985-92), CD59 (Menu et al., 1994, J. Immunol. 153:2444-56), CD40 (Hancock et al., 1996, Proc Natl. Acad. Sci USA 93:13967-72) und GM-CSF (Takashi et al., JP 1991155798-A, GenBank, Zugangsnummer E02975) ein. Proteine, die andere Aktivitäten aufweisen, wie z.B. Tumornekrosefaktor (TNF, Masaaki et al., JP 1985185799 , GenBank, Zugangsnummer E00423) können auch als die erste Domäne in dem Fusionsprotein verwendet werden. Als Beispiel können Proteine, die Apoptose (wie z.B. TNF) oder Anergie induzieren, verwendet werden, um bestimmte Klassen von antigenspezifischen aktivierten T-Zellen zu zerstören. Folglich können Myelin-basisches Protein (MBP)-spezifische autoreaktive T-Zellen, die an der Stelle der Entzündung bei Multiple Sklerose-Patienten gefunden werden, durch Einführen von Zielzellen in den Patienten, die MBP exprimieren und die auch ein TNF-β2m Fusionsprotein präsentieren, zerstört werden.
  • cDNA-Klone, die für β2m und das zweite Protein kodieren, können wie in den zitierten Referenzen oder durch PCR-Amplifikation aus mRNA (oder cDNA-Banken) von Zellen, die das bestimmte Protein exprimieren, erhalten werden. Die cDNA-Amplifikation wird, wie durch Innis et al. beschrieben (PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, Innis et al. (eds), Academic Press, Inc., San Diego, Kalifornien, 1990) mittels Primer durchgeführt, die so aufgebaut sind, um die erwünschten Teile der cDNA zu amplifizieren. Zum Beispiel können cDNA Primer so aufgebaut werden, um nur den Teil der β2m cDNA zu amplifizieren, der für die reife Form von β2m kodiert. PCR kann auch verwendet werden, um die amplifizierten Fragmente für die Ligation anzupassen.
  • Zusätzlich zu einer β2m Domäne und einer zweiten Proteindomäne (z.B. B7) können β2m Fusionsproteine auch zusätzliche Elemente einschließen, wie z.B. eine Linkersequenz zwischen der β2m Domäne und der zweiten Domäne und ein Signalpeptid. Die Linkersequenz ist üblicherweise zwischen 10 und 25 Aminosäuren lang und dient zum Bereitstellen einer Rota tions-Freiheit im Fusionskonstrukt, wobei die entsprechende Konformationsfaltung der zwei angrenzenden Proteindomänen erhöht wird. Solche Linkersequenzen sind im Stand der Technik gut bekannt und schließen den Glycin(4)-Serinspacer (GGGGS x3, SEQ ID Nr. 11) ein, der von Chaudhary et al. (Nature 339:394-397, 1989) beschrieben wird. Eine Version dieses Linkers, in dem die dritte Wiederholung des Verknüpfungsmotivs zu GGGAS (SEQ ID Nr. 12) modifiziert ist, wird auch in 3 und in SEQ ID Nr. 2 gezeigt. Um die β2m-Fusionsproteine herzustellen, können auch andere Verknüpfungssequenzen verwendet werden.
  • Signalpeptide dienen zur gerichteten Expression eines bestimmten Proteins an eine bestimmte Stelle in der Zelle. Abhängig davon, ob entweder das Fusionsprotein in einer prokaryontischen oder eukaryontischen Zelle exprimiert werden soll, wird ein prokaryontisches oder eukaryontisches Signalpeptid ausgewählt. Prokaryontische Singalpeptide, die die direkte Sekretion von Peptiden in das Medium richten, können besonders nützlich sein, wenn große Mengen von Fusionspeptid hergestellt werden. Beispiele von solchen Signalsequenzen schließen die prokaryontische Signalsequenz des Pectatlyasegens pelB (Power et al., 1992, Gene 113:95-9,
    (KYLLPTAAAGLLLLAAQPAMA; SEQ ID Nr. 13)) und das äußere Membranprotein ompT (Ouzzine et al., 1994, Febs Lett 339:195-9 (MRAKLLGIVLTPIAISFAST, SEQ ID Nr. 14)) ein. Eukaryontische Signalpeptide, die die Expression eines Peptids auf der Zelloberfläche regeln, sind nützlich, wo das Fusionsprotein auf der Oberfläche der Zelle präsentiert werden soll. Das Signalpeptid von β2m (in 3 und SEQ ID Nr. 2 gezeigt) ist für diesem Zweck besonders geeignet.
  • In ihrer grundlegendsten Form werden Nukleinsäuren, die für β2m-Fusionsproteine kodieren, x-y umfassen, worin x eine Nukleinsäuresequenz ist, die für die erste Proteindomäne (z.B. B7) kodiert und y eine Nukleinsäuresequenz ist, die für die β2m-Proteindomäne codiert. Wo eine Linkersequenz einzuführen ist, kann die Nukleinsäure als x-1-y dargestellt werden, wobei 1 eine Nukleinsäuresequenz ist, die für das Linkerpeptid codiert. Wo eine Signalsequenz einzuführen ist, kann die Nukleinsäure als s-x-1-y dargestellt werden, wobei s eine Nukleinsäuresequenz ist, die für das Signalpeptid kodiert. Vorzugsweise, aber nicht notwendigerweise, ist die relative Orientierung der Nukleinsäuresequenz so, daß in dem kodierten Fusionsprotein das N-terminale Ende des β2m-Proteins mit dem C-terminalen Ende der zweiten Proteindomäne verknüpft ist. In allen Fällen sind die verschiedenen Nukleinsäuresequenzen, die das β2m-Fusionsproteinkonstrukt umfassen (z.B. s, 1, x und y) funktionsfähig verknüpft, so daß die Elemente in einem einzelnen Leserahmen vorbunden sind.
  • Nukleinsäurekonstrukte, die Fusionsproteine exprimieren, können auch regulatorische Elemente einschließen, wie z.B. Promotoren, Enhancer und 3'-regulatorische Regionen, wobei deren Auswahl von diesen basierend, auf der Art der Zelle bestimmt werden, in der das Protein zu exprimieren ist. Die Konstrukte werden in einen Vektor eingeführt, der geeignet ist, das β2m-Fusionsprotein in dem ausgewählten Zelltyp zu exprimieren.
  • Ein ausgewähltes β2m-Fusionsprotein kann durch Expression in einem prokaryontischen oder eukaryontischen Expressionssystem erhalten werden, von denen viele im Stand der Technik bekannt sind. Heterologe Proteine können in prokaryontischen Zellen durch Plazieren eines starken, regulierten Promotors und einer wirksamen ribosomalen Bindungsstelle stromaufwärts des β2m-Fusionsproteinkonstrukts produziert werden. Geeignete Promotorsequenzen schließen Beta-Lactamase, Tryptophan (trp) und Lambda-abgeleitete PL-Promotoren ein. Prokaryontische Expressionsvektoren und Expressionssysteme, die zum Produzieren hoher Spiegel an Protein-bakteriellen Zellen geeignet sind, sind kommerziell erhältlich und schließen das pBAD, PL und Superlinkerexpressionssysteme ein, die durch Invitrogen (Carlsbad, CA) hergestellt werden, und das pMAL-Expressionssystem, das durch New England Biolabs (Beverly, MA), hergestellt wird. Zusätzlich sind Methoden und Plasmidvektoren zum Produzieren von heterologen Proteinen in Bakterien in Sambrook et al. beschrieben (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York, 1989). Häufig werden Proteine, die in hohen Spiegeln exprimiert werden, in unlöslichen Einschlußkörpern gefunden; Methoden, um Proteine aus diesen Aggregaten zu extrahieren, werden durch Sambrook et al. beschrieben (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York, 1989, Kapitel 17). Vektoren, die zum Produzieren von intakten nativen Proteinen geeignet sind, schließen pKC30 (Shimatake and Rosenberg, 1981, Nature 292:128), pKK177-3 (Amann and Brosius, 1985, Gene 40:183) und pET-3 (Studiar and Moffatt, 1986, J. Mol. Biol. 189:113) ein. Geeignete prokaryontische Zellen zur Expression von großen Mengen an β2m Fusionsproteinen schließen Escherichia coli und Bacillus subtilis ein.
  • Eukaryontische Zellen, wie z.B. Chinese Hamster Ovary- (CHO), Affennieren- (COS), HeLa-Spodoptera frugiperda- und Saccharomyces cerivisiae-Zellen können auch verwendet werden, um β2m Fusionsproteine zu exprimieren. Regulatorische Regionen, die zur Verwendung in diesen Zellen geeignet sind, schließen für Säugetierzellen virale Promotoren, wie z.B. solche von CMV, Adenovirus und SV40 und für Hefezellen den Promotor für 3-Phosphoglyceratkinase and Alkoholdehydrogenase ein. Eukaryontische Zellexpressionssysteme sind auch kommerziell erhältlich und schließen Pichia pastoris, Drosophila, Baculovirus und das Sindbis Expressionssystem, das durch Invitrogen hergestellt wird (Carlsbad, CA), ein.
  • Der Transfer von DNA in eukaryontische, insbesondere humane oder andere Säugetierzellen ist mittlerweile eine herkömmliche Technik. Die Vektoren werden in die Empfängerzellen als reine DNA (Transfektion) durch z.B. Präzipitation mit Kalziumphosphat (Graham and vander Eb, 1973, Virology 52:466) oder Strontiumphosphat (Brash et al., 1987, Mol Cell Biol. 7:2013), Elektroporation (Neumann et al., 1982, EMBO J 1:841), Lipofektion (Felgner et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci USA 84:7413), DEAE Dextran (McCuthan et al., 1968, J. Natl. Cancer Inst. 41:351), Mikroinjektion (Mueller et al., 1978, Cell 15:579), Protoplastenfusion (Schafner, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:2163-7) oder Pelletkanonen (Klein et al., 1987, Nature 327:70) eingeführt. Alternativ können die Nukleinsäuremoleküle durch Infektion mit Virusvektoren eingeführt werden. Es sind Systeme entwickelt worden, die z.B. Retroviren (Bernstein et al., 1985, Gen. Engr'g 7:235), Adenoviren (Ahmad et al., 1968, J. Virol. 57:267) oder Herpesvirus (Spaete et al., 1982, Cell 30:295) verwenden.
  • Das β2m-Fusionsprotein, das in Säugetierzellen produziert wird, kann im Anschluß an die Freisetzung des Proteins in den Überstand extrahiert werden und kann mittels einer Immunoaffinitätssäule gereinigt werden, die mittels anti-β2m Antikörpern hergestellt wird. Alternativ kann das β2m-Infusionsprotein als ein chimäres Protein mit z.B. β-Globulin exprimiert werden. Danach wird ein Antikörper gegen β-Globulin verwendet, um das chimäre Protein zu reinigen. Anschließend werden entsprechende Proteaseschnittstellen, die zwischen dem β-Globulin-Gen und der Nukleinsäuresequenz, die das β2m-Fusionsprotein kodiert, konstruiert werden, verwendet, um die zwei Polypeptidfragmente nach Translation voneinander zu trennen. Ein nützlicher Expressionsvektor zur Erzeugung von β-Globulin chimärer Proteine ist pSG5 (Stratagene).
  • Als Beispiel kann eine cDNA die für ein β2m Fusionsprotein mit einem N-terminalen Methionin zur Initiierung der Translation, kodiert, in pET2I-d (Novagen) subkloniert werden, was das rekombinante Protein in Einschlußkörper richtet. Alternativ können kommerziell er hältliche Insektenzellexpressionssysteme, wie z.B. das Baculovirus Expression Vektor System von Pharmingen (San Diego, CA), für die kombinierten Expression und Faltung von β2m und β2m Fusionsproteinen verwendet werden, wobei die exprimierten Proteine nur anschließende Reinigung benötigen.
  • Proteine, die wie oben beschrieben exprimiert werden, können durch eine Immunaffinitätssäule weiter gereinigt werden und direkt zur Behandlung von Säugetierzellen verwendet werden. Alternativ kann die Expression eines β2m Fusionsproteins in einer Säugetierzelle durch Einführen eines Vektors erhalten werden, der eine Nukleinsäuresequenz in die Zelle trägt, die für das Protein kodiert. Nukleinsäuremoleküle, die für β2m Fusionsproteine kodieren, tragen eine Signalsequenz, wie z.B. die β2m Signalsequenz, die für diesen Zweck besonders bevorzugt ist.
  • In einem Aspekt der Erfindung werden die beanspruchten β2m Fusionsproteine als Immuntherapeutika verwendet, und die Säugetierzelle ist eine Tumorzelle. Bei vielen Krebspatienten entkommen Tumorzellen der Immunerkennung durch Herabregulierung von MHC und/oder co-stimulatorischer Molekülexpression. Entsprechend ist eine Behandlungsmethode, die früher vorgeschlagen wurde, ein Entnehmen von Tumorzellen aus einem Patienten, Einführen eines co-stimulatorischen Moleküls, wie z.B. B7, in die Zellen und anschließende Zurückgabe der Zellen in den Patienten (siehe z.B. europäische Patentanmeldung, Veröffentlichungsnummer EP 0 733 373 A2 ). Von der Anwendung der hier offenbarten Entdeckung in solchen Verfahren, wird von dem Einführen eines β2m Fusionsproteins in Tumorzellen erwartet, das es einen beachtlichen Vorteil bereitstellt.
  • Erhalten der β2m Fusionsproteinexpression auf der Oberfläche von Tumorzellen kann entweder durch direktes Inkubieren von Tumorzellen mit einer gereinigten Präparation des Fusionsproteins oder durch Einführen eines Vektors, der das Fusionsprotein exprimiert, in die Zellen erhalten werden. Es sind alle Tumorarten potentiell der Behandlung durch diesen Ansatz zugänglich, einschließlich z.B. Karzinome der Brust, der Lunge, des Pankreas, der Eierstöcke, der Niere, des Darms und der Blase sowie Melanome und Sarkome.
  • Ein Einschließen des β2m-Fusionsproteins auf der Oberfläche von Tumorzellen durch Inkubation des gereinigten Fusionsproteins mit den Zellen kann durch Inkubation der Tumorzellen mit dem rekombinanten Protein (1–5 μM) in serumfreiem Medium für 2 bis 16 Stunden erhal ten werden. Zusätzlich können Tumorzellen kurz mit einem niedrigen pH-Puffer (pH 2,5 bis 3,5) behandelt werden, um endogenes β2m und Peptide von Zelloberflächen MHC I Molekülen zu entfernen, gefolgt durch Rekonstitution mit dem β2m-Fusionsprotein und relevanten MHC I Bindungspeptiden für 1 bis 16 Stunden.
  • Wo eine Nukleinsäure, die für das Fusionsprotein kodiert, in die Tumorzellen einzuführen ist, wird die Nukleinsäure vorzugsweise in einen geeigneten Expressionsvektor eingeschlossen. Geeignete Vektoren schließen Plasmid-, Cosmid- und virale Vektoren, wie z.B. Retroviren, Adenoviren und Herpesviren, ein. Funktionsunfähige Viren, wie z. B. solche, die im U.S. Patent Nr. 5,665,362 beschrieben werden, können zu diesem Zweck verwendet werden. Aufgrund der hohen Effizienz, mit der virale Vektoren Säugetierzellen infizieren, wird von viralen Vektoren erwartet, daß sie Vorteile gegenüber anderen Vektortypen bereitzustellen. Der Vektor wird anschließend in die Tumorzelle durch Eine aus einer Auswahl an Techniken eingeführt, wie z.B. Elektroporation, Lipofektion, Co-Kultivierung mit Virus-produzierenden Zellen oder anderen Standardmitteln. In einer bevorzugten Ausführungsform sind Tumorzellen Zellen, die von dem zu behandelnden Patienten entnommen werden, aber alternativ können die Tumorzellen Zellen aus einer Tumorzellinie sein, wie z.B. die humanen Tumorzellinien, die durch die "American Type Culture Collection" (ATCC, Manassas, VA) erhältlich sind. Wenn es erwünscht ist, die Zellen zu screenen, um diejenigen zu selektieren, in die der Vektor eingeführt wurde, kann dies durch eine Vielzahl von Mitteln einschließlich Selektieren auf die Expression des Auswahlmarkers, falls einer verwendet wird, oder Screenen der Expression des β2m Fusionsproteins auf den Oberflächen der Zellen erreicht werden. Das letztere Verfahren kann bequem mittels eines fluoreszenzaktivierten Zellsorters (FACS) durchgeführt werden.
  • Die Tumorzellen werden dem Patienten anschließend in Kombination mit einem geeigneten Träger, wie z.B. gepuffertem Wasser, Salzlösung oder Glycin, verabreicht. In einer bevorzugten Ausführungsform, wobei die Tumorzellen Zellen sind, die ursprünglich dem Patienten entnommen wurden, werden diese abgeschwächt bevor sie dem Patienten verabreicht werden. Eine abgeschwächte Zelle ist eine Zelle, die metabolisch aktiv ist, aber nicht länger fähig ist, zu proliferieren. Verfahren zum Abschwächen von Tumorzellen sind gut bekannt und schließen solche ein, die in EP 0 733 373 A2 beschrieben werden.
  • In einer alternativen Ausführungsform können Zellmembranen der Tumorzellen, die das β2m Fusionsprotein einschließen, dem Patienten anstelle von intakten Tumorzellen verabreicht werden. Eine Zellmembranpräparation kann leicht durch Aufbrechen oder Lysieren der Zellen mittels Standardtechniken, wie z.B. einer "French Press", Einfrieren-Auftauen oder Ultraschallbehandlung hergestellt werden. Im Anschluß an das Aufbrechen der Zellen kann eine Membran-angereicherte Fraktion durch Zentrifugation erhalten werden.
  • Die vorliegende Beschreibung umfaßt auch andere immuntherapeutische Verfahren zum Behandeln von Zuständen, wie z.B. Krebs, einschließlich adoptiver Immuntherapie. Wie im Stand der Technik bekannt, schließt die adoptive Immuntherapie, ein Erhalten von Lymphoid-Zellen, die einem bestimmten Antigen ausgesetzt sind, Kultivieren dieser Zellen ex vivo unter Bedingungen, wodurch die Aktivität der Zellen erhöht wird und anschließend Verabreichen der Zellen an ein Inidividuum ein. Die Lymphoid-Zellen sind vorzugsweise T-Zellen, die von einem Krebspatienten entnommen wurden, z.B. T-Zellen von einem dränierten Lymphknoten. Diese T-Zellen werden mit Tumorzellen inkubiert, die, wie oben beschrieben, von dem Patienten entnommen werden, die so behandelt wurden, daß sie ein β2m-Fusionsprotein auf ihrer Zelloberfläche präsentieren. Dementsprechend ist ein Aspekt der vorliegenden Beschreibung eine Form der adoptiven Immuntherapie, in der die Inkubation von Lymphoid-Zellen ex vivo in einem Medium durchgeführt wird, das Tumorzellen enthält, die ein β2m Fusionsprotein präsentieren vor einer Verabreichung der Zellen an einen Patienten. Die technischen Details von Verfahren zum Entnehmen von lymphoiden Zellen, ex vivo Kultivierung solcher Zellen mit Immunstimulantien und Verabreichungen an Patienten sind im Stand der Technik bekannt und werden z.B. in den U.S. Patenten Nr. 4,690,915 ("Adoptive immunotherapy as a treatment modality in humans"), 5,229,115 ("Adoptive immunotherapy with interleukin-7"), 5,631,006 ("Immunotherapy protocol of culturing leukocytes in the presence of interleukin-2 in a hollow fiber cartridge") und 4,902,288 ("Implantable immunotherapy system using stimulated cells") und den darin zitierten Referenzen beschrieben.
  • Herstellung und Verwendung von β2m S55V und β2m-Fusionsproteinen in Vakzinpräparationen
  • Verfahren für die Herstellung und Verwendung von β2m als ein Vakzinadjuvans sind im Stand der Technik bekannt und schließen solche ein, die im U.S. Patent Nr. 5,733,550 beschrieben werden, das hiermit durch Bezugnahme eingeschlossen wird. Solche Verfahren können für die Verwendung von β2m S55V sowie β2m Fusionsproteinen bei Vakzinpräparaten sowie der Verfahren von Vakzination angewendet werden.
  • Die β2m-Fusionsproteine können wie oben beschrieben hergestellt werden. Nukleinsäuremoleküle, die für Formen von hβ2m kodieren, die die S55V Aminosäuresubstitution tragen, können mittels Standard-Mutagenesetechniken hergestellt werden, wie z.B. stellengerichtete Mutagenese oder durch PCR, wie in Beispiel 4 unten beschrieben. Das kodierte hβ2m S55V kann in und prokaryontischen oder eukaryontischen Expressionssystemen, wie oben für die β2m-Fusionsproteine beschrieben, exprimiert und von dieser gereinigt werden.
  • β2m Fusionsproteine und hβ2m S55V können als Hilfsstoffe in Vakzinpräparationen verwendet werden, wobei sie in diesem Fall mit einem Antigen in einer Vakzinpräparation kombiniert werden können oder sie können dem Patienten entweder kurz oder nach Verabreichung einer herkömmlichen Vakzinpräparation verabreicht werden. Vorzugsweise wird das β2m Fusionsprotein oder hβ2m S55V an der gleichen Stelle und gleichzeitig mit der Antigenpräparation verabreicht. Wo ein hβ2m Fusionsprotein als ein Vakzinadjuvans verwendet wird, kann die hβ2m-Komponente des Proteins eine S55V Form des hβ2m sein. Das Protein, mit dem das β2m fusioniert ist, wird vorzugsweise ein co-stimulatorisches Protein, wie z.B. B7, sein.
  • Üblicherweise ist das Antigen, das einem Patienten zusammen mit einem β2m-Präparat der vorliegenden Erfindung (z.B. einer Präparation eines beanspruchten β2m Fusionsmoleküls oder eines S55V hβ2m) verabreicht wird, ein Peptidantigen, das an die Klasse I MHC Moleküle des Patienten binden kann. Peptidantigene, die verwendet werden können, schließen Tumorantigene sowie Antigene von pathogenen Organismen einschließlich Viren und Bakterien ein. Beispiele von geeigneten Antigenen schließen HIV gp120, Untereinheiten von Influenzanukleoprotein oder Hämagglutinin und Tumorantigene, wie diskutiert durch Boon et al., (Ann. Rev. Immunol. 12:337-65, 1994); Finn (Curr. Opin. Immunol. 5:701-8) und Sligluff et al. (Curr. Opin. Immunol. 6:733-40, 1994) ein. Solche Antigene können aus einer ursprünglichen Quelle (z.B. Tumorzellen) isoliert oder extrahiert werden oder durch rekombinante Mittel hergestellt oder chemisch synthetisiert werden. Die Vakzinierung kann durch Verabreichung eines einzelnen Peptidantigens oder eines Cocktails von Antigenen, die von einer oder mehreren Antigenquellen abgeleitet werden, durchgeführt werden.
  • Das β2m, das die Basis des in den Vakzin-Zusammensetzungen und Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendete β2m S55V bildet, kann jedes Säugetier-β2m sein. Es kann bevorzugt sein, ein β2m zu verwenden, das von der gleichen Säugetierspezies abgeleitet wird, wie das Säugetier, das geimpft werden soll, um das Risiko einer Immunantwort auf das verabreichte β2m-Präparat zu verringern. Allerdings, da xenogenes β2m in vivo üblicherweise nicht inflammatorisch ist, kann dies nicht erforderlich sein.
  • Vakzinpräparationen entsprechend der vorliegenden Erfindung können durch jedes bekannte Mittel verabreicht werden, einschließlich intramuskuläre und intravenöse Injektion. In seiner einfachsten Form wird die β2m-Präparation, die einem Säugetier verabreicht wird, in einer herkömmlichen Dosierungsform, vorzugsweise kombiniert mit einem pharmazeutischen Hilfsstoff, Träger oder Verdünnungsmittel verabreicht. Geeignete pharmazeutische Träger können fest oder flüssig sein und können Puffer, Antioxidantien, wie z.B. Ascorbinsäure, andere Polypeptide oder Proteine, wie z.B. Serumalbumin, Kohlenwasserstoffe, Chelatbildner oder andere Stabilisatoren und Hilfsmittel einschließen. Geeignete feste Träger schließen Lactose, Magnesiumstearat, Kaolin, Saccharose, Talkum, Stearinsäure, Gelatine, Agar, Pektid, Akazie und Kakaobutter ein. Die Menge eines festen Trägers wird in Abhängigkeit davon, welcher Träger ausgewählt wird, stark variieren, ist aber vorzugsweise ungefähr von 25 mg bis ungefähr 1 g pro Dosis des wirksamen Mittels. Geeignete flüssige Träger schließen neutrale gepufferte Salzlösung, wahlweise mit geeigneten Konservierungsmitteln, Stabilisatoren und Hilfsstoffen ein. Der Träger oder Verdünnungsmittel kann auch zeitverzögernde Materialien, die im Stand der Technik gut bekannt sind, einschließen, wie z.B. Glycerindiastearat, entweder allein oder mit einem Wachs. Die vorhergehenden Beispiele von geeigneten pharmazeutischen Trägern sind lediglich beispielhaft und ein Fachmann wird erkennen, daß ein sehr großer Bereich von solchen Trägern angewendet werden kann. Es können auch Liposomen-basierte Abgabesysteme zur Abgabe von β2m-Präparaten verwendet werden. Liposomen-basierende Systeme, die angewendet werden können, um eine meßbare Freisetzung in den Blutstrom des Mittels über Zeit bereitzustellen, sind im Stand der Technik gut bekannt und werden durch die Systeme beispielhaft erläutert, die in den U.S: Patenten Nr. 4,356,167 ("Liposome drug delivery systems"), 5,580,575 ("Therapeutic drug delivery systems"), 5,595,756 ("Liposomal compositions for enhanced retention of bioactive agents") und 5,188,837 ("Lipospheres for controlled delivery of substances") und in den darin zitierten Dokumenten, beschrieben wurden.
  • Die Formulierung der β2m-Präparation mit einem pharmazeutischen Träger kann viele physikalische Formen annehmen, ist aber vorzugsweise eine sterile flüssige Suspension oder Lösung, die zur direkten Injektion geeignet ist. Vorzugsweise wird dem Patienten die β2m-Präparation in einer wie oben beschriebenen Formulierung verabreicht (z.B. in Kombination mit einem pharmazeutischen Träger), wobei die Formulierung eine klinisch wirksame Menge des Mittels einschließt. Im Kontext der Vakzinierung ist "eine klinisch wirksame Menge" der β2m-Präparation eine Menge, die ausreichend ist, um eine Erhöhung der Immunantwort auf das Zielantigen zu erhöhen, z.B. um eine cytotoxische T-Zell-Antwort herzustellen, die größer ist als die bei fehlender Verabreichung der β2m-Präparation. Die Quantifizierung der Immunantwort, die von einer Vakzinierung herrückt, kann durch Standardmethoden, wie z.B. Lymphoproliferation als Antwort gegen das Testartigen an vitro oder Lyse der Zielzellen durch spezifische cytotoxische T-Lymphozyten erhalten werden.
  • Es versteht sich, daß eine klinisch wirksame Dosis einer β2m-Präparation abhängig von dem tatsächlich verwendeten β2m (z.B. ob es ein β2m Fusionsprotein oder β2m-S55V allein ist) und den Charakteristika des Patienten (Alter, Gewicht, andere eingenommene Medikamente, usw.) variieren wird. Folglich wird die Abschätzung einer klinisch wirksamen Dosierung letztendlich durch einen Mediziner, Veterinär oder anderen Mitarbeiter des Gesundheitssystems, der mit dem Patienten vertraut sind, entschieden. Üblicherweise wird ein Verabreichen einer β2m-Präparation die ein Säugetier als ein Bestandteil eines Vakzinierungsschema die Verabreichung von ungefähr 10 ng bis 1 g an β2m-Präparation pro Dosis einschließen, wobei Einzeldosiseinheiten von ungefähr 10 mg bis 100 mg, allgemein verwendet werden, und spezifische Dosierungen von bis zu 1 mg oder 10 mg auch innerhalb des allgemein verwendeten Bereichs liegen. Die Menge an Antigen, die in der Vakzinpräparation eingeschlossen wird, die ein β2m-Adjuvans verwendet, wird üblicherweise die gleiche sein wie die, die in Vakzinpräparationen ohne das β2m-Adjuvans eingeschlossen werden, obwohl größere oder kleinere Menge an Antigen verwendet können, wie klinisch geeignet.
  • Wo das β2m dem Säugetier in einer einzelnen Präparation mit den Vakzinantigenen verabreicht wird, kann die Präparation einfach durch Mischen einer klinisch wirksamen Menge des β2m mit der Antigenpräparation formuliert werden. Vakzine umfassend Tumorantigene und ein β2m können von Tumorzellen hergestellt werden, die transformiert wurden, um das β2m zu exprimieren.
  • Beispiele
  • Die folgenden Beispiele dienen zum Veranschaulichen der Erfindung.
  • Beispiel 1
  • Herstellung des β2m-B7 Fusionsproteins
  • Das murine B7.2:humane β2m-Fusionsprotein (mb7β2) wurde in vielen Schritten wie folgt hergestellt: Die extrazelluläre Domäne des murinen B7.2 (Freeman et al., 1993, J. Exp. Med. 178:2185-92, GenBank: Zugangsnummer L25606) wurde durch PCR von dem Plasmid mB7-2 (von Richard Hodes, NIH) mittels der folgenden zwei Oligonukleotide amplifiziert:
    mB7-2 5' PCR Oligo: AGGGTACCATGGTTTCCGTGGAGACGCAAGC (SEQ ID. Nr. 8)
    und
    mB7-2 3' PCT Oligo: TCGAATTCATGATGCTAGCCCAATACGTTTGAGGAGATGG (SEQ ID Nr. 9), die eingebaute Restriktionsstellen zum Klonieren aufweisen (Fettdruck):
    KpnI: GAATTC; NcoI: CCATGG; und BspH1: TGATGA.
  • Das resultierende PCR-Fragment wurde mit NcoI und BspH1 geschnitten und als eine aminoterminale Verlängerung in einen NcoI geschnittenen Bluescript SK-Vektor ligiert, der das Signalpeptid von hβ2m (Guessow et al., 1987, J. Immunol. 139:3132-8, GenBank: Zugangsnummer: M17986), den c-myc-Tag EQKLISEEDLN (Zhou et al., 1996, Mol Immunol. 33:1127-34, SEQ-ID Nr. 15), und mit Vollängen-hβ2m (Plasmid #267) enthält. Das resultierende Konstrukt (Plasmid #392) wurde anschließend mit NheI geschnitten, um es 5' von der myc-Sequenz zu linearisieren. Es wurden synthetische Oligonukleotide, die für einen [Gly4Ser]3-Spacer kodieren, mit NheI kompatiblen Enden konstruiert und in den linearisierten Vektor ligiert, um Plasmid #396 zu erzeugen. Schließlich wurde die gesamte kodierende Sequenz des Wild-Typ hβ2m (ohne einen myc-Tag) aus einer hβ2m-cDNA PCR-amplifiziert, mit dem Zusatz einer NheI-5'-Stelle und einer Not I-Stelle-3' der kodierende Sequenz. Dieses Produkt wurde mit NheI und NotI verdaut und in das Plasmid #396 subkloniert, das auch mit NheI und NotI verdaut wurde, um Plamid #406 zu generieren. Dieses Plasmid enthielt die Signalsequenz von hβ2m, gefolgt von der extrazellulären Domäne von mB7.2, einem 15 Aminosäure-Spacer, und dann reifem hβ2m. Für die Expression in Bakterien wurde die eukaryontische Signalsequenz entfernt. Folglich wurde das Plasmid #406 mit NcoI und NotI verdaut, um das Fusionsprotein freizusetzen, das ohne daß das Signalpeptid vorhanden ist, und dies wurde dann anschließend in den bakteriellen Expressionsvektor pET21-d subkloniert, der mit NcoI und NotI linearisiert wurde.
  • Im Anschluß an die Transfektion des BL21 (DE3) Bakterienstammes von E. coli wurde die Proteinsynthese mit IPTG induziert, die Zellen wurden geerntet, lysiert und Einschlußkörper wurden gewaschen und solubilisiert. Im Anschluß an das Rückfalten des rekombinanten Materials wurde es weiter durch Gelfiltration und/oder Affinitätschromatographie mit anti-β2m-Antikörpern gereinigt. Experimente, in denen mit Säure behandelten Zellen, die nur HLA-A2 exprimieren, unter verschiedenen Bedingungen mit dem, wie oben beschrieben hergestellten, B7-β2m Fusionsprotein induziert wurden, und anschließend einer FACS-Analyse mittels Konformations-sensitiven Antikörper von verschiedenen Spezifizitäten unterzogen wurden, bestätigten das Folgende: (1) die B7-Domäne des Fusionsproteins ist nativ gefaltet; (2) die β2m-Domäne des Fusionsproteins ist nativ gefaltet; und (3) die β2m-Domäne des Fusionsproteins funktioniert, um die MHC I Expression (Daten nicht gezeigt) zu stabilisieren.
  • Beispiel 2
  • Das B7-β2m Fusionsprotein co-stimuliert T-Zellen
  • Die Fähigkeit von B7-β2m, Milz-T-Zellen zu co-stimulieren, wurde in vitro festgestellt. Antikörper, die für den B7-Rezeptor CD28 spezifisch sind, wurden als eine Kontrolle verwendet. β2m, rekombinantes B7-β2m oder anti-CD28 wurden zu den Wells einer Mikrotiterplatte hinzugegeben und bei 37°C für zwei Stunden inkubiert, um das Binden zu unterstützen. Anschließend wurden die Platten gewaschen, um überschüssiges Reagenz zu entfernen, und Milz-T-Zellen von BALB/c-Mäusen wurden zu den Wells in Anwesenheit von suboptimalen Konzentrationen des löslichen anti-T-Zellrezeptors 2C11 gegeben. Die Platten wurden für 48 Stunden inkubiert und anschließend wurde 3H-Thymidin zugegeben und es ihm ermöglicht, für 20 h sich in die proliferierenden Zellen einzubauen. Am Ende der Zeitdauer wurden die Zellen entfernt, und die Menge an aufgenommenen 3H-Thymidin wurde gemessen.
  • Die Ergebnisse dieser Experimente zeigen, daß, während keine T-Zell-Proliferation in den Wells beobachtet wurden, die allein β2m enthielten, rekombinantes B7-β2m eine co-Stimulierung der T-Zellen bereitstellt, die wenigstens so effektiv war, wie die des anti-CD28 Antikörpers. Ein typisches Ergebnis wird in 5 gezeigt.
  • BEISPIEL 3
  • Behandlung von Tumorzellen mit dem β2m-B7 Fusionsprotein erhöht die Erzeugung von tumorspezifischen cytotoxischen T-Zellen
  • Die Fähigkeit des B7-β2m Fusionsproteins, eine T-Zell-Erkennung und -Antwort gegen Tumorzellantigenen zu stimulieren, wurde mit der entsprechenden Aktivität von hβ2m allein verglichen. DMA/2 Mäuse wurden jeweils mit 3 × 106 syngenischen P816 Tumorzellen vakziniert, die vorher in serumfreiem Iscove-modifziertem Dulbecco's Medium (SF IMDM) mit entweder 0,2 μM B7-β2m, 0,2 μM hβ2m allein oder keinem zusätzlichen Reagenz inkubiert wurden. Proben jedes Typs wurden mittels Durchflußcytometrie analysiert, um zu zeigen, daß sie auf B7 oder hβ2m färben. Diese Tumorzellen wurden anschließend mit 20.000 Rad bestrahlt und in die Mäuse injiziert. Eine Woche später wurden die Mäuse mit identisch präparierten Zellen re-immunisiert. Nach einer weiteren Woche wurden die Mäuse getötet, und ihre Milzzellen wurden in Kultur mit bestrahlten P815 stimulatorischen Zellen für eine Woche restimuliert. Die resultierenden kultivierten T-Zellen wurden anschließend auf ihre Fähigkeit hin untersucht, unbehandelte P815 Tumorzellen abzutöten.
  • Die in 6 dargestellten Ergebnisse zeigen, daß die Milzzellen von den Mäusen, die mit den B7-β2m Infusionsprotein behandelten Tumorzellen immunisiert wurden, dreifach wirksamer bei der Abtötung von Tumorzellen waren als Zellen von Mäusen, die entweder mit den hβ2m behandelten oder unbehandelten Tumorzellen immunisiert wurden. Diese Daten zeigen, daß die Anwesenheit des Fusionsproteins auf der Tumorzellenoberfläche die Immunsystemantwort gegen die auf der Tumorzellenoberfläche präsentierten Tumorantigene erhöhten.
  • BEISPIEL 4
  • Herstellung einer hochaffinen Variante von hβ2m
  • Es wurde eine Anzahl von Varianten von hβ2m erzeugt und mittels MHC-Stabilisierung, T-Lymphozytenlyse und myc-β2m Bindungs- und Inhibierungstests auf Aktivität hin untersucht. Der hydrophile Serin 55 (S55)-Rest von hβ2m, der an der hβ2m/Schwerekette-Schnittstelle verdeckt und direkt angrenzend an ein angeordnetes Wassermolekül ist, wurde als der Zielrest für die Mutagenese identifiziert. Dieser Rest wurde zu hydrophoben Resten mit ansteigender Masse (Valin, Isoleucin, Phenylalanin) mutagenisiert, um die hydrophoben Interaktionen zu unterstützen, und das angeordnete Wasser abzuschließen.
  • Die hβ2m-Sequenzvarianten wurden durch Mutieren von hβ2m cDNA in Bluescript SK (Stragene, La Jolla, CA), mittels dem "ExSite mutagenesis system" (Stratagene) entsprechend den Anweisungen des Herstellers erzeugt. Die mutierten cDNAs wurden in den bakteriellen Expressionsvektor pET-2Id(+) (Novagen, Madison, WI) mittels erzeugter NcoI- und BamHI-Stellen jeweils an dem 5'- bzw. 3'-Ende der reifen Proteinsequenz subkloniert. Die verwendeten Oligonukleotide, um Varianten der hβ2m-Sequenz zu erzeugen, waren wie folgt:
    • Sense S55F: 5' TTC TTC AGC AAG GAC TGG TCT TTC 3' (SEQ ID Nr. 4)
    • Sense S55I: 5' ATT TTC AGC AAG GAC TGG TCT TTC 3' (SEQ ID Nr. 5)
    • Sense S55V: 5' GTG TTC AGC AAG GAC TGG TCT TTC 3' (SEQ ID Nr. 6)
    • Gemeinsames Antisense: 5' TAA GTC TGA ATG CTC CAC TTT TTC 3' (SEQ ID Nr. 7)
  • Die Expression und Reinigung der mutierten hβ2ms wurden wie vorher durch Shields et al. (J. Immunol. 160:2297-307, 1998) beschrieben durchgeführt. In Kürze wurden, hβ2m-Konstrukte in pET-21d(+) in den BL21(DE3) Bakterienstamm von E. coli transformiert. Bei einer O.D.600nm von 0,6 wurden die Kulturen mit 1 mM IPTG für vier Stunden induziert, und Einschlußkörper wurden durch Zentrifugation nach Ultraschallbehandlung der Bakterien in 200 nM Tris, 2 mM EDTA, 10 % Triton X-100, pH 7,6 isoliert und in 200 mM Tris, 2 mM EDTA und pH 7,6 gewaschen. Die Einschlußkörper wurden in 6 M Guanidin-HCI, das 0,3 M DDT, 100 mM Tris, pH 8,0 und eine Mischung an Proteaseninhibitoren enthält (5 μg/ml Leupeptin, 0,5 mM AEBSF, 1 % Aprotinin) solubilisiert. Im Anschluß an einer Übernacht-Dialyse in 6 M Guanidin bei pH 2,0 wurde rekombinantes Protein über 72 Stunden in 0,4 M Arginin, 5 mM oxidiertem Glutathion, 100 mM Tris, 2 mM EDTA bei 10°C rückgefaltet. Im Anschluß die an Rückfaltung wurden die Präpärationen erschöpfend gegen 0,4 M Arginin, 100 mM Tris, 2 mM EDTA bei pH 8,0 und anschließend mit PBS bei 4°C dialysiert. Die Zubereitungen wurden als ein einzelner Peak durch präparative FPLC auf einer Superdex 75 pg Gelfiltrationssäule (Pharmacia, Uppsala, Schweden) gereinigt, mittels Centriprep-3 konzentrierenden Einheiten (Amicon, Beverly, MA) aufkonzentriert, sterilfiltriert, und die Konzentrationen wurden auf O.D.280nm Meßwerten basierend, berechnet. Rekombinantes hβ2m wurde bewertet, ≥ 95 % rein zu sein, basierend auf einer Analyse durch SDS-PAGE und analytische FPLC.
  • BEISPIEL 5
  • hβ2m S55V erzeugt erhöhte MHC I Stabilisierung
  • Ein HLA-Stabilisierungstest wurde verwendet, um die hβ2m-Varianten zu screenen. Eine Anzahl von HLA-Allelen, HLA-A1, HLA-A2, und HLA-A3 wurde analysiert, um festzustellen, ob eine der Punktmutanten Allel-spezifische Effekte zeigte.
  • In diesem und den folgenden Experimenten waren die verwendeten Zellinien, monoklonalen Antikörper (mAKs) und Peptide wie folgt:
    Zellinien und Antikörper: Hmy2.C1R-Zellen (Storkus et al., 1987, J. Immunol. 138:1657) wurden mit HLA-A1, -A2 und -A3 wie vorher beschrieben (Winter et al., 1991, J. Immunol. 146:3508; DiBrino et al., 1993, J. Immunol. 151:5930) stabil transfiziert. Der HLA-A2/HTLV-1 TAX 11-19 Peptid-spezifische CTL-Klon N1218 und HLA-A3/Influenza NP 265-273-Peptidklon 2G12 wurden isoliert und, wie vorher durch Biddison et al. (J. Immunol. 159:2018, 1997) beschrieben, restimuliert. Alle mAKs wurden als Kulturüberstände verwendet, die in DMEM gewachsen waren, das mit 10 % fötales Kälberserum, 20 mM HEPES, 2 mM L-Glutamin, 1 % nicht-essentiellen Aminosäuren, 1 % Pen-strep und 0,04 mg/ml Gentamicinsulfat (Vollständiges-DMEM) ergänzt war. GAP.A3 (HLA-A3 spezifische) und BB7.5 (pan-HLA-ABC-spezifische) Hybridome wurden von der "American Type Culture Collection" (Manassas, VA) erhalten. Das myc-spezifische 9E10-Hybridom wurde zuvor von Evan et al. (Mol Cell Biol. 5:3610-6, 1985) beschrieben. Sofern nicht anders angegeben, wurden alle Lösungen zum Zellwachstum von Biofluids (Rockville, MD) erhalten.
  • Peptide: Die verwendeten Peptide waren die HLA-A1-bindende Ornithindecarboxylase 309-317 (OD 309): SSEQTFMYY (SEQ ID Nr. 16)- das HLA-A2-bindende HTLV-I-TAX 11-19: LLFGYPVYV (SEQ ID Nr. 17) und HIV gag 77-85: SLYNTVATL (SEQ ID Nr. 18); und das HLA-A3-bindende pn2a.A3: KLYEKVYTYK (SEQ ID Nr. 19) und Influenza NP 265-273: ILRGSVAHK (SEQ ID Nr. 20) (DiBrino et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci USA 90:1508, DiBrino et al., 1994, J. Immunol. 152:620; Honma et al., 1997, J. Neuroimmunol. 73:7; Parker et al., 1992, J. Immunol. 149:3580; Parker et al., 1994, J. Immunol. 152:163; und Parker et al., 1995, Immunol. Res. 14:34). Diese Peptide wurden von Bachem (Torrance, CA) erworben oder durch Dr. John E. Coligan (Natl. Inst. of Allergy and Infectious Diseases, NIH) bereitgestellt. Alle Peptide wurden durch Reverse-Phase-HPLC gereinigt und waren > 95% rein, was durch analytische HPLC und Massenspektrometrie festgestellt wurde.
  • Die MHC-Stabilisierung wurde im wesentlichen wie vorher beschrieben mit kleinen Modifikationen durchgeführt (Bremers et al., 1995, J. Immunol. Emphasis Tumor Immunol. 18:77; van der Burg et al., 1995, Hum. Immunul. 44:189; Sugawara et al., 1987, J. Immunol. Methods 100:83). In Kürze, wurde Hmy2.C1R-Zellen (Storkus et al., 1987, J. Immunol. 138: 1657) wurden mit HLA-A1, -A2 und -A3 wie zuvor beschrieben stabil transfiziert (Winter et al., 1991; J. Immunol. 146:3508; DiBrino et al., 1993, J. Immunol. 151:5930). Hmy2.C1R-A1, -A2 und A3-Zellen wurden zweimal mit PBS gewaschen, in 0,13M Zitronensäure, 66 mM Na2HPO4, bei pH 2,9 (pH 3,2 für A2-Zellen) für 90 Sekunden bei 4°C resuspendiert, mit zwei 50 ml Wechsel von IMDM gewaschen und in SF IMDM (identisch zu SF DMEM, wobei IMDM verwendet wurde) resuspendiert. Es wurden 105 Zellen pro Well in eine 96 Well Mikrotiterplatte gegeben, die Hybridoma-Überstände, Peptide und hβ2m-Verdünnungen in einem Gesamtvolumen von 150 μl enthielt. Die HLA-A1-transfizierten Hmy2.C1R-Zellen wurden mit BB7.5 mAK und 10 μg/ml A1-bindendem OD 309-Peptid kombiniert. HLA-A2-transfizierte Hmy2.C1K-Zellen wurden mit BB7.5 mAK und 2,5 μg/ml A2-bindendem HIV gag-Peptid kombiniert. HLA-A3-transfizierte Hmy2.C1R-Zellen wurden mit GAP.A3 mAK und 1,25 μg/ml A3-bindendem pn2a.A3-Peptid kombiniert. Nach 4 Stunden Inkubation bei 23°C wurden die Zellen zweimal mit FACS-Puffer (PBS, 2 mg/ml BSA, 0,02% NaN3) gewaschen und mit FITC-konjugiertem Ziegen-anti-Maus IgG (H+L) F(ab')2-Fragment (Cappel/Organon Teknika, Durham, NC) für eine Stunde bei 4°C gefärbt. Die Zellen wurden zweimal mit FACS-Puffer gewaschen und in 1% Formaldehyd in PBS fixiert, gefolgt von Durchflußzytometrieanalyse auf einer FACScanII Maschine (Becton Dickinson, Mountain View, CA).
  • 7 zeigt die Fähigkeit der S55-Variante, hβ2m HLA-A1 (7a), HLA-A2 (7b) und HLA-A3 (7c) in Anwesenheit eines spezifischen Bindungspeptids und eines entsprechenden HLA-spezifischen Antikörpers zu stabilisieren. Die S55V-Variante („X"-Symbol in 7) stabilisiert HLA-A1 und HLA-A3 ungefähr zweifach bzw. dreifach besser als Wild-Typ-hβ2m (Raute) bei einem molaren Spiegel, und die Wirkungen auf HLA-A2-Stabilisierung durch S55V waren leicht besser als die, die mit Wild-Typ-hβ2m erhalten wurden. S55F (Quadrate) war ähnlich zu Wild-Typ-hβ2m für alle getesteten Allele, während die Wirkungen von S55V (Dreiecke) in Abhängigkeit von den Allelen varierte (besser mit HLA-A1 und schlechter mit -A2 und -A3).
  • Beispiel 6
  • hβ2m S55V bindet an MHC I mit einer höheren Affinität als Wild-Typ-hβ2m
  • Die in den Experimenten in dem vorhergehenden Beispiel verwendeten Antikörper wurden aufgrund ihrer Abhängigkeit von sowohl hβ2m und Peptid ausgewählt, um "vollständige" Moleküle nachzuweisen, d.h. schwere Kette/hβ2m/Peptide, die zu trimeren Komplexen nativ gefaltet sind. Da dieser Bindungs-Test die Anwesenheit eines Antikörpers zusätzlich zu hβ2m und Peptid (van der Burg, 1995, Hum. Immunol. 44:189) erfordert, gab es die Möglichkeit, daß der Antikörper selber einen Effekt ausübt, der für eine bestimmte hβ2m-Mutante spezifisch ist. Aufgrund von Bedenken bezüglich der potentiellen Mitwirkung der Antikörper auf die Stabilisierung der Zelloberflächen-MHC I-Komplexe wurde ein Bindung-Inhibierungstest entwickelt, der direkt die relativen Fähigkeiten von hβ2ms misst, an MHCI-Moleküle zu binden. Dieser Test erfordert markiertes hβ2m, um die Inhibierung zu messen. Verfahren zum Markieren, wie z. B. Biotinylierung und Jodinierung sind zufällige Reaktionen und erzeugen vielfach markierte Spezies, die weitere Reinigung vor Verwendung in einem geeignetem kompetetiven Test erfodern (Hochman et al., 1988, J. Immunol. 140:2322). Allerdings erzeugt endogenes Markieren mit einem Epitoptag eine einheitlich markierte Spezies von hβ2m. Zusätzlich würden Tyrosin- und Lysinreste (übliche Ziele der Biotinylierung und Jodinierung), von denen bekannt ist, daß die an der MHC-schwere Kette/hβ2m-Schnittstelle sind, nicht durch einen endogenen Marker beeinträchtigt werden. Daher wurde ein Epitoptag (myc) an dem Aminoterminus von hβ2m erzeugt, und die Fähigkeit der verschiedenen hβ2m-Mutanten, mit dem myc-hβ2m um die Bindung an die Zelloberflächen zu konkurrieren, wurde unter Verwendung des anti-myc mAb 9E10 untersucht.
  • Um die funktionelle Aktivität des myc-hβ2m selber zu etablieren, wurden direkte Bindungstudien durchgeführt. In Kürze, wurden Hmy2.C1R-transfizierte Zellen mit 2,5 × 105 pro Röhrchen in einem 500 μl Volumen bei 37°C für 16 Stunden in SF IMDM mit 2,5 μM myc-β2m, 20 μg/ml Peptid und den angegebenen Konzentrationen des Inhibitors β2m inkubiert. Das OD 309-Peptid wurde für HLA-A1, das HIV gag-Peptid für HLA-A2 und das pn2aA3-Peptid für HLA-A3 verwendet. Die Zellen wurden dreimal in einfachem IMDM gewaschen, gefolgt durch Inkubation mit 9E10 (anti-myc)-Hybridom-Überstand bei 4°C für eine Stunde. Nach Waschen mit IMDM wurden die Zellen für eine Stunde mit FITC-anti-Maus-IgG bei 4°C gefärbt. Die Zellen wurden ein letztes Mal in FACS-Puffer gewaschen und durch Durchflusszytometrie analysiert, wobei auf lebende (Propidium-Jodid) ausschließende Zellen gefiltert wurde. Bei Anwesenheit eines entsprechenden Peptids gab es eine Konzentrations-abhängige myc-β2m-Bindung für alle untersuchten Allele. Jedoch, falls die Zellen in Abwesenheit des Peptids mit myc-β2m inkubiert wurden, wurde keine nennenswerte myc-β2m-Bindung erhalten.
  • Die relativen Fähigkeiten von Wild-Typ hβ2m und S55V, die Bindung von myc-β2m an HLA-Moleküle zu inhibieren, wurden als nächstes mittels eines Inhibierungstestverfahrens verglichen. Der Inhibierungstest war identisch zu dem Bindungstest, mit den folgenden Modifikationen: Es wurden in allen Fällen 2,5 μM myc-hβ2m verwendet und verschiedene Konzentrationen an nicht-myc-markierten rekombinanten hβ2m wurden eingeschlossen, um die myc-hβ2m-Bindung auf die Zelloberflächen MHC zu inhibieren. Die Prozent Inhibierung wurde durch die folgende Gleichung berechnet: (1-((experimenteller Hintergrund)/(kein Inhibitor-Hintergrund))) × 100. 10-20000 geschleuste Ereignisse pro Probe wurden gezählt, und alle Experimente wurden wenigstens zweimal wiederholt. Im Vergleich mit Wild-Typ-hβ2m inhibierte die S55V-Mutante die myc-hβ2m-Bindung bei einem molaren Spiegel für HLA-A1, -A2 und -A3 (8) ungefähr 2,5-fach besser. Diese Ergebnisse zeigen die höhere relative Affinität der S55V-Mutante für HLA-A1 (8a), -A2 (8b) und -A3 (8c) im Vergleich zu Wild-Typ-hβ2m.
  • Beispiel
  • hβ2m S55V erhöht die CTL-Erkennung von Zielzellen
  • Die Wirksamkeit von hβ2m bei der Erhöhung der exogenen Peptidbeladung auf MHC I – Moleküle wurde mittels eines CTL-Lysis-Tests (Depierreux et al., 1997, J. Immunol. Methods 203:77) wie folgt gemessen: Mit HLA-A2 oder HLA-A3-transfizierte Hmy2.C1R-Zellen wurden auf 4 × 106 Zellen/ml in vollständigem DMEM, das mit 20 μM BATD (das ein fluoreszierendes Chelat mit Europium bildet; Wallac, Gaithersburg, MD) ergänzt war, resuspendiert und für 30 bis 60 Minuten bei 37°C inkubiert. Die Zellen wurden in 10 ml serumfreiem (sf) CTL-Medium (IMDM, das mit 5 mg/ml Rinderserumalbumin (Sigma, St. Louis, MO), 2 mM L-Glutamin, 1,25 mM Sulfinpyrazon (Sigma) und 1% Pen-strep ergänzt war) resuspendiert, zentrifugiert und einmal mit SF CTL-Medium gewaschen. Die Zellen wurden anschließend mit Peptid- und/oder β2m SF CTL-Medium für 60 bis 90 Minuten bei 37°C gepulst. Die Zellen wurden zweimal in SF CTL-Medium gewaschen, in CTL-Medium (5% fötalem Kälberserum anstelle von BSA) resuspendiert und im erwünschten Effektor: Ziel-Verhältnis mit CTL-Klonen in Rundbodenmikrotiterplatten (CTL-Klon N1218 bei einem E:T-Verhältnis von 4:1 (9a) oder der NP-spezifische HLA-A3-begrenzte CTL-Klon 2711 bei einem E:T-Verhältnis von 2:1 (9b) kombiniert. Die Platten wurden sanft bei 100 × g für 2 Minuten zentrifugiert und anschließend bei 37°C für 2 Stunden inkubiert. Schließlich wurden die Platten bei 300 × g zentrifugiert und 20 μl/Well wurden zu 200 μl an 0,3 M Essigsäure, 60 mM Natriumazetat, 7,5 μg/ml Europium (Aldrich, Milwaukee, WI), überführt, und die Platte wurde auf einem Wallac 1234 DELFIA Fluorometer gelesen. Die Prozent spezifische Lyse wurde mit der folgenden Gleichung berechnet:
    100 × ((experimentelle Blindprobe)-(spontane Blindprobe))/((maximale Blindprobe)-(spontane Blindprobe)).
  • In diesem Test korreliert die Zielzell-Lyse nicht nur mit der Behandlung eines spezifischen Peptidantigens, er zeigt auch, daß das Peptid in einer immunologisch relevanten Art gebunden wird. Die Hmy2.C1R-A2-Zielzellen (eine humane lymphoblastoide Zelle, im wesentlichen Null für HLA-Moleküle außer für transfizierte HLA-A2.1) (Winter et al., 1991; J. Immunol. 146:3508; DiBrino et al., 1993, J. Immunol. 151:5930) wurden mit einer suboptimalen Konzentration an HTLV-1 TAX-Peptid (9,3 × 10–12m/l) oder Kontroll-A2-bindendes HIV gag-Peptid bei 1 × 10–9 m/l für 90 Minuten in serumfreien CTL-Medium in Abwesenheit oder Abwesenheit von ansteigenden Konzentrationen von gereinigtem, rekombinanten hβ2m pulsiert und anschließend als Ziel in einem herkömmlichen Lysetest verwendet. Die Anwesenheit von Wild-Typ-hβ2m erhöhte drastisch die spezifische Lyse durch das TAX-spezifischen CTL-Klon in einer dosisabhängigen Weise. Mittels dieser suboptimalen Peptidkonzentration gab es 20% Lyse in Abwesenheit von hβ2m. Der Zusatz von 8 μM hβ2m erhöht die Lyse auf das Maximum, das bei diesem E:T-Verhältnis erhalten wurde. In Abwesenheit von hβ2m wären 100-fach höhere Peptidkonzentrationen erforderlich, um vergleichbare Spiegel der Lyse (Daten nicht gezeigt) zu erhalten.
  • Nachdem die Fähigkeit des Wildtyp-hβ2m etabliert wurde das Beladen von antigenem Peptid auf Zellen zu erhöhen, wurde die Aktivität der S55V-Variante in diesem Test untersucht.
  • Zwei CTL-Klone, die spezifisch für ein HTLV-1-TAX-Peptid im Kontext von HLA-A2 und einem Influenza Nukleoprotein-Peptid im Kontext sind, wurden in dem Test wie oben beschrieben verwendet, unter Verwendung von Hmy2.C1R-Transfektanten, mit einer suboptimalen Konzentration an Antigenpeptid (NP 265-273, 1 × 10–10 M/l) oder Kontroll-A3-bindendem pn2a.A3-Peptid bei 1 × 10–6 M/l gepulst wurden. Die S55V-Mutante war bei einem molaren Spiegel vierfach effektiver als Wild-Typ hβ2m beim Erhöhen der Zielzellenlyse für HLA-A2 (9a) und 6- bis 7-fach besser für HLA-A3 (9b). Kontrollen mit irrelevanten A2 und -A3 bindenden Peptiden führten nur zum Hintergrundspiegel von Abtötung bei den höchsten verwendeten Konzentrationen an hβ2m. Zusätzlich zeigten viele TAX-spezifische A2-restringierte Klone ähnliche Spiegel an S55V-erhöhter Abtötung, relativ zum Wild-Typ-hβ2m (Daten nicht gezeigt).
  • Angesichts der vielen möglichen Ausführungsformen, in denen die Grundsätze der Erfindung angewendet werden können, wird es erkannt werden, daß die vorhergehenden Beispiele nur zum Zweck der Veranschaulichung angeboten werden und den Bereich der Erfindung nicht begrenzen. Vielmehr wird der Bereich der Erfindung durch die folgenden Ansprüche definiert.
  • Sequenzprotokoll
    Figure 00340001
  • Figure 00350001
  • Figure 00360001
  • Figure 00370001
  • Figure 00380001
  • Figure 00390001
  • Figure 00400001
  • Figure 00410001
  • Figure 00420001

Claims (29)

  1. Fusionsprotein, umfassend eine erste und zweite Domäne, wobei die zweite Domäne ein menschliches β2-Mikroglobulin ist, das einen Valin-Rest an der Postition 55 aufweist (h β2 S55V).
  2. Fusionsprotein nach Anspruch 1, wobei die erste Domäne mit dem Amino-Terminus der zweiten Domäne verbunden ist.
  3. Fusionsprotein nach Anspruch 1, wobei die erste Domäne ein co-stimulierendes Protein ist.
  4. Fusionsprotein nach Anspruch 3, wobei das co-stimulierende Protein ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus B7.1 und B7.2.
  5. Fusionsprotein nach Anspruch 1, wobei die erste Domäne ein Integrin, ein Cytokin oder ein Zelladhäsionsmolekül ist.
  6. Fusionsprotein nach Anspruch 1, wobei die ersten und zweiten Domänen durch einen Peptidlinker verknüpft sind.
  7. Fusionsprotein nach Anspruch 1, wobei das Fusionsprotein weiterhin ein Signalpeptid, das mit dem N-Terminus der ersten Domäne verbunden ist, umfaßt.
  8. Fusionsprotein nach Anspruch 1, wobei das h β2 S55V eine Aminosäuresequenz wie in SEQ ID NO: 10 gezeigt aufweist.
  9. Zelle, die eine Zellmembran umfassend ein Fusionsprotein nach Anspruch 1 aufweist.
  10. Zelle nach Anspruch 9, wobei die Zelle eine Tumorzelle ist.
  11. Protein nach Anspruch 1, umfassend eine Struktur X-Y, wobei X eine Proteindomäne und Y ein h β2 S55V ist.
  12. Protein nach Anspruch 11, umfassend eine Struktur X-L-Y, wobei L ein Peptidlinker ist.
  13. Protein nach Anspruch 12, umfassend S-X-L-Y, wobei S ein Signalpeptid ist.
  14. Protein nach Anspruch 7 oder 13, wobei das Signalpeptid ein β2m-Signalpeptid ist.
  15. Nukleinsäuremolekül, das für ein Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 8 oder 11 bis 14 kodiert.
  16. Vektor, umfassend ein Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 15.
  17. Transformierte Zelle, umfassend ein Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 15.
  18. Protein nach Anspruch 1 oder 11, wobei das Protein eine Aminosäuresequenz wie in SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 3 gezeigt aufweist.
  19. Fusionsprotein nach Anspruch 1, zur Verwendung in einem Verfahren zur Verstärkung der Immunantwort eines Säugetiers auf ein Antigen, das auf der Oberfläche einer Zelle präsentiert wird, wobei das Verfahren ein: In Kontakt bringen der Zelle mit dem Protein umfaßt, so daß das Fusionsprotein auf der Zelloberfläche präsentiert wird; wobei die Zelle einem Säugetier verabreicht werden soll.
  20. Protein nach Anspruch 19, wobei die Zelle eine Tumorzelle ist und wobei die erste Domäne ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus B7.1 und B7.2.
  21. Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 15, das für ein Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 8 kodiert, zur Verwendung in einem Verfahren zur Verstärkung der Immunantwort eines Säugetiers auf ein Antigen, das auf der Zelloberfläche präsentiert wird, wobei das Verfahren: Transformieren der Zelle mit dem Nukleinsäuremolekül umfaßt, so daß die Expression des Nukleinsäuremoleküls in einer Expression eines Fusionsproteins resultiert, das durch das Nukleinsäuremolekül kodiert wird und das auf der Oberfläche der Zelle präsentiert wird; und wobei die Zelle einem Säugetier verabreicht werden soll.
  22. Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 21, wobei das Molekül für ein Protein nach Anspruch 4 kodiert und wobei die Zelle eine Tumorzelle ist.
  23. Humanes β2-Mikroglobulinmolekül, das einen Valin-Rest an der Position 55 aufweist.
  24. Humanes β2-Mikroglobulinmolekül nach Anspruch 23, wobei das Molekül die Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID NO: 10 gezeigt umfaßt.
  25. Impfstoffzusammensetzung, umfassend mindestens ein Antigen und ein Molekül ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: (a) einem menschlichen β2-Mikroglobulinmolekül, das ein Valin an der Position 55 aufweist; und (b) einem Fusionsprotein, umfassend eine erste Aminosäuresequenz und eine zweite Aminosäuresequenz, wobei die zweite Aminosäuresequenz h β2 S55V ist.
  26. Impfstoffzusammensetzung nach Anspruch 25, wobei das Antigen ausgewählt ist aus Gruppe bestehend aus bakteriellen, viralen und Tumor-Antigenen.
  27. Impfstoffzusammensetzung nach Anspruch 25, zur Verwendung bei einem Verfahren zur Impfung eines Säugetiers.
  28. Zusammensetzung, umfassend ein Antigen und ein Mikroglobulinprotein, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: (a) eiem menschlichen β2-Mikroglobulinprotein, das ein Valin an der Position 55 aufweist; und (b) einem Fusionsprotein, umfassend eine erste Aminosäuresequenz und eine zweite Aminosäuresequenz, wobei die zweite Aminosäuresequenz h β2 S55V ist, zur Verwendung bei einem Verfahren zur Impfung eines Säugetiers.
  29. Fusionsprotein nach Anspruch 1, zur Verwendung in einem Verfahren zur Stimulierung einer Tumor-reaktiven zytotoxischen T-Zell-Antwort, umfassend: (a) Inkubieren von Tumorzellen, die aus einem Patienten isoliert wurden, mit dem Protein, so daß das Fusionsprotein auf der Oberfläche der Tumorzellen präsentiert wird; (b) Inkubieren von T-Zellen, die aus dem Patienten isoliert wurden, in der Anwesenheit der Tumorzellen, die das Fusionsprotein präsentieren, um die Anzahl der Tumor-reaktiven T-Zellen zu erhöhen; und wobei eine therapeutisch wirksame Dosis an Tumor-reaktiven T-Zellen an den Patienten zu verabreicht werden soll.
DE69930630T 1998-06-10 1999-06-03 B2-Mikroglobulin-Fusionsproteine und Varianten mit hoher Affinität Expired - Fee Related DE69930630T2 (de)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US8881398P 1998-06-10 1998-06-10
US88813P 1998-06-10
PCT/US1999/012309 WO1999064597A1 (en) 1998-06-10 1999-06-03 β2 MICROGLOBULIN FUSION PROTEINS AND HIGH AFFINITY VARIANTS

Publications (2)

Publication Number Publication Date
DE69930630D1 DE69930630D1 (de) 2006-05-18
DE69930630T2 true DE69930630T2 (de) 2007-01-18

Family

ID=22213644

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE69930630T Expired - Fee Related DE69930630T2 (de) 1998-06-10 1999-06-03 B2-Mikroglobulin-Fusionsproteine und Varianten mit hoher Affinität

Country Status (5)

Country Link
EP (1) EP1086224B1 (de)
AT (1) ATE321859T1 (de)
AU (1) AU4545799A (de)
DE (1) DE69930630T2 (de)
WO (1) WO1999064597A1 (de)

Families Citing this family (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH11507843A (ja) 1996-03-28 1999-07-13 ザ・ジョンズ・ホプキンス・ユニバーシティー タンパク質の可溶性二価および多価ヘテロ二量体類縁体
US6458354B1 (en) 1996-03-28 2002-10-01 The Johns Hopkins University Molecular complexes which modify immune responses
US6268411B1 (en) 1997-09-11 2001-07-31 The Johns Hopkins University Use of multivalent chimeric peptide-loaded, MHC/ig molecules to detect, activate or suppress antigen-specific T cell-dependent immune responses
CA2392477A1 (en) 1999-11-30 2001-06-07 Mayo Foundation For Medical Education And Research B7-h1, a novel immunoregulatory molecule
GB9929993D0 (en) * 1999-12-17 2000-02-09 Avidex Ltd Substances
US7030219B2 (en) 2000-04-28 2006-04-18 Johns Hopkins University B7-DC, Dendritic cell co-stimulatory molecules
GB0026812D0 (en) * 2000-11-02 2000-12-20 Isis Innovation Cancer therapy
WO2003029475A1 (en) * 2001-09-28 2003-04-10 Dnavec Research Inc. MAMMALIAN CELL-INFECTING VIRUS VECTOR ENCODING EPITOPE-BOUND β2m AND UTILIZATION THEREOF
US9809654B2 (en) 2002-09-27 2017-11-07 Vaccinex, Inc. Targeted CD1d molecules
US7432351B1 (en) 2002-10-04 2008-10-07 Mayo Foundation For Medical Education And Research B7-H1 variants
US20040210037A1 (en) * 2003-03-28 2004-10-21 Vaccinex, Inc. Targeted MHC class I alpha3 vaccine delivery systems
WO2005099361A2 (en) * 2003-07-10 2005-10-27 Vaccinex, Inc. MHC CLASS I - PEPTIDE-ANTIBODY CONJUGATES WITH MODIFIED β2-MICROGLOBULIN
AU2005295038B2 (en) 2004-10-06 2012-05-17 Mayo Foundation For Medical Education And Research B7-H1 and methods of diagnosis, prognosis, and treatment of cancer
CA2678618C (en) 2007-02-21 2019-03-12 Vaccinex, Inc. Modulation of nkt cell activity with antigen-loaded cd1d molecules
BRPI0917891A2 (pt) * 2008-08-25 2015-11-24 Amplimmune Inc antagonistas de pd-1 e métodos de utilização dos mesmos
JP2012514476A (ja) 2009-01-08 2012-06-28 アルバート アインシュタイン カレッジ オブ メディシン オブ イェシバ ユニバーシティ，ア ディビジョン オブ イェシバ ユニバーシティ 細胞壁結合セラミド様糖脂質による細菌ワクチンおよびその使用
CN103649125A (zh) * 2011-06-22 2014-03-19 霍夫曼-拉罗奇有限公司 利用包含mhc i类的复合物通过循环中的病毒特异性细胞毒性t细胞清除靶细胞
CN102391377B (zh) * 2011-11-01 2013-11-06 孙嘉琳 一种可诱导和激活癌靶向t细胞的融合蛋白及制备方法及用途
SG11201504414UA (en) 2012-12-21 2015-07-30 Hoffmann La Roche Disulfide-linked multivalent mhc class i comprising multi-function proteins
US9371352B2 (en) 2013-02-08 2016-06-21 Vaccinex, Inc. Modified glycolipids and methods of making and using the same
AU2014214770B2 (en) 2013-02-08 2018-09-06 Albert Einstein College Of Medicine Inc. Modified glycolipids and methods of making and using the same
US9302005B2 (en) 2013-03-14 2016-04-05 Mayo Foundation For Medical Education And Research Methods and materials for treating cancer
US10259875B2 (en) 2013-10-01 2019-04-16 Mayo Foundation For Medical Education And Research Methods for treating cancer in patients with elevated levels of BIM
US10302653B2 (en) 2014-05-22 2019-05-28 Mayo Foundation For Medical Education And Research Distinguishing antagonistic and agonistic anti B7-H1 antibodies
US10517875B2 (en) 2014-07-23 2019-12-31 Mayo Foundation for Medical Engineering and Research Targeting DNA-PKcs and B7-H1 to treat cancer
US10875923B2 (en) 2015-10-30 2020-12-29 Mayo Foundation For Medical Education And Research Antibodies to B7-H1

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5574205A (en) * 1989-07-25 1996-11-12 Cell Genesys Homologous recombination for universal donor cells and chimeric mammalian hosts
US5733550A (en) * 1990-05-10 1998-03-31 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Method for enhancing the association of exogenous peptides with class I MHC molecules on the surface of antigen presenting cells with β-microglobulin
US5314813A (en) * 1992-02-19 1994-05-24 Scripps Research Institute Drosophila cell lines expressing genes encoding MHC class I antigens and B2-microglobulin and capable of assembling empty complexes and methods of making said cell lines
GB9307371D0 (en) * 1993-04-08 1993-06-02 Walls Alan J Fusion proteins

Also Published As

Publication number Publication date
ATE321859T1 (de) 2006-04-15
EP1086224A1 (de) 2001-03-28
DE69930630D1 (de) 2006-05-18
AU4545799A (en) 1999-12-30
WO1999064597A1 (en) 1999-12-16
EP1086224B1 (de) 2006-03-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE69930630T2 (de) B2-Mikroglobulin-Fusionsproteine und Varianten mit hoher Affinität
DE69636891T2 (de) Immunstimulierende zusammensetzung und verfahren
DE69628154T2 (de) Antigen präsentierendes system und aktivierung von t-zellen
DE69927262T2 (de) Cd40 bindende antikörper und ctl peptide zur behandlung von tumoren
DE69730693T2 (de) Mhc-komplexe und ihre verwendungen
DE69519101T3 (de) Mhc-komplexe und ihre verwendung
DE60030450T2 (de) Von MUC-1 abgeleitete Peptide
KR100376544B1 (ko) 티(t)세포조절물질및방법
DE69839273T2 (de) Krebsimmuntherapie mit semi-allogenen zellen
DE69535375T2 (de) Lösliche polypeptidfraktionen des lag-3-proteins; verfahren zur herstellung; therapeutische zusamensetzung; antiidiotypischer antikörper
EP1673460B9 (de) Rekombinate impfstoffe und deren verwendung
AU784634B2 (en) B7-H1, a novel immunoregulatory molecule
DE69838648T2 (de) Verwendung von multivalenten chimären peptidbeladenen mhc/ig-molekülen zum nachweis, zur aktivierung oder unterdrückung einer antigenspezifischen t-zellabhängigen immunantwort
DE69334062T2 (de) In vitro Aktivierung von cytotoxischen T Zellen
EP1919943B1 (de) Melanom-assoziierte mhc klasse i assoziierte oligopeptide und deren verwendungen
DE69834330T2 (de) Verwendung von mhc klasse ii liganden als adjuvantien zur impfung und von lag-3 zur krebstherapie
DE69535719T2 (de) Fas-antigenbindender ligand
JPH06501161A (ja) 抗腫瘍免疫性の強化と遺伝子治療のための組成物及び方法
DE60133287T2 (de) Tumorantigen
WO1999015553A2 (de) Ko-stimulierendes polypeptid von t-zellen, monoklonale antikörper sowie die herstellung und deren verwendung
DE69937055T2 (de) Methode zur produktion oder verstärkung einer t-zell antwort gegen eine zielzelle durch verwendung eines komplexes aus einem hla klasse i moleküls und einer vorrichtung zum anheften
DE69837896T2 (de) Peptidagonisten von karzinoembryonalem Antigen (CEA)
EP0463080A1 (de) Auf cd-8 basierte heilmittel
JPH10513347A (ja) 組換え型ヒトα−フェトプロテインおよびその利用
JPH10502372A (ja) 共通のサイトカイン受容体ガンマ鎖を操作することによるｔ細胞応答の変調方法

Legal Events

Date Code Title Description
8364 No opposition during term of opposition
8339 Ceased/non-payment of the annual fee