CN106565836B - 高亲和力的可溶性pdl-1分子 - Google Patents

高亲和力的可溶性pdl-1分子 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种PDL‑1分子，所述PDL‑1分子与PD‑1分子的亲和力是野生型PDL‑1分子与PD‑1分子的亲和力的至少2倍。同时，本发明的PDL‑1分子能够有效地提高淋巴细胞的杀伤能力。另外，本发明还提供了编码本发明PDL‑1分子的核酸，以及本发明PDL‑1分子的复合物。本发明的PDL‑1分子可以单独使用，也可与其他分子联用。

Description

高亲和力的可溶性PDL-1分子
技术领域
本发明涉及生物技术领域，更具体地涉及对程序性死亡受体(Programmed Death-1,PD-1)分子具有高亲和力的可溶性程序性死亡受体配体(Programmed Death Ligand-1,PDL-1)分子，以及该分子的制备方法和用途。
背景技术
PD-1是在激活的T细胞和B细胞上表达的免疫抑制性受体。PDL-1是PD-1的配体，属于B7家族，具有IgV和IgC样区、跨膜区及胞浆区尾部，PDL-1与淋巴细胞上的受体PD-1相互作用，在免疫应答的负调控方面发挥着重要作用。许多肿瘤细胞系和肿瘤细胞高表达PDL-1分子(Konishi J et al.，Clin.Cancer Res.，2004，10(15):5094－5100)，其与淋巴细胞表面的PD-1分子结合后，削弱了机体的抗肿瘤免疫应答(Radziewicz H et al.，J Virol，2007，81(6):2545－2553)，从而导致肿瘤免疫逃逸的发生。研究发现在***和肝癌中，有近半数的肿瘤浸润CD8+T细胞表达PD-1分子，其与肿瘤细胞表达的PDL-1结合后，可能导致CTL细胞的耗尽及凋亡(Dong H et al.,J Mol Med(Berl)，2003，81(5):281－287；Karim Ret al.，Clin Cancer Res,2009，15(20):6341－6347；Zhao Q et al.,Eur J Immunol,2011,41(8):2314－2322)。
针对上述肿瘤免疫逃逸问题，阻断淋巴细胞表面的PD-1与肿瘤细胞表面的PDL-1的相互作用可使淋巴细胞的免疫性提高，因此，有助于由免疫***清除肿瘤细胞。针对这一问题，进行了大量研究。在侵袭性胰腺癌的鼠模型中，T.Nomi等(Clin.Cancer Res.13：2151-2157(2007))证明阻断PD-1与PDL-1相互作用的治疗功效。本领域技术人员致力于研究PDL-1与PD-1的相互作用，以期找到提高淋巴细胞杀伤能力的有效途径。
发明内容
本发明的目的在于提供一种对PD-1分子具有较高亲和力的PDL-1分子。
本发明的再一目的是提供一种上述高亲和力的PDL-1分子的制备方法及用途。
在本发明的第一方面，提供了一种PDL-1分子，所述PDL-1分子在SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中含有突变。
在另一优选例中，所述PDL-1分子的氨基酸序列基于SEQ ID NO.:1所示的氨基酸序列，并且对SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列进行一个或多个氨基酸残基的突变或氨基酸残基的***从而获得所述PDL-1分子。
在另一优选例中，所述PDL-1分子的氨基酸序列与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列有至少90％(优选地，至少92％；更优选地，至少94％)的序列相同性。
在另一优选例中，所述PDL-1分子与PD-1分子的亲和力是野生型PDL-1分子与PD-1分子的亲和力的至少2倍；优选地，至少5倍；更优选地，至少10倍；最优选地，至少50倍。
在另一优选例中，所述PDL-1分子与PD-1分子的亲和力是野生型PDL-1分子与PD-1分子的亲和力的至少100倍；优选地，至少200倍；更优选地，至少500倍。
在另一优选例中，所述PDL-1分子中突变的氨基酸残基位点为1～3、35～50、和/或95～105位氨基酸残基中的一个或多个，其中氨基酸残基编号采用SEQ ID NO:1所示的编号。
在另一优选例中，所述PDL-1分子中突变的氨基酸残基位点为1、36～40、47～48和/或95～101位氨基酸残基中的一个或多个，其中氨基酸残基编号采用SEQ ID NO:1所示的编号。
在另一优选例中，突变的氨基酸残基位点的数量为n，其中1≤n≤15；优选地，3≤n≤11；更优选地，4≤n≤10，如n可以为5、6、7、8、9、10。在另一优选例中，所述PDL-1分子中突变的氨基酸残基位点包括1F、36I、38Y、40E、47I、48Q、95R、97M、99S、101G中的一个或多个或102G后有一个或多个氨基酸的***，其中氨基酸残基编号采用SEQ ID NO:1所示的编号。
在另一优选例中，所述PDL-1分子中突变的氨基酸残基位点包括36I、38Y、和40E，其中氨基酸残基编号采用SEQ ID NO:1所示的编号。
在另一优选例中，所述PDL-1分子中突变的氨基酸残基位点还包括40E、和47I，其中氨基酸残基编号采用SEQ ID NO:1所示的编号。
在另一优选例中，所述PDL-1分子中突变的氨基酸残基位点还包括95R、和97M，其中氨基酸残基编号采用SEQ ID NO:1所示的编号。
在另一优选例中，突变后的PDL-1分子包括选自下组的一个或多个氨基酸残基：1W；36Q、36E、36T或36N；38F、38N、38H或38A；40M、40F、40L、40W或40Y；47L、47V、47F、47S、47Y、47P或47A；48S；95T、95V或95L；97L；99G或99A；101D、101K、101E或101H；102G后***氨基酸G；其中氨基酸残基编号采用SEQ ID NO:1所示的编号。
在另一优选例中，所述PDL-1分子包括：36Q、38H、和40F；或
36E、38H、和40F；或
36Q、38F、和40M；或
36Q、38F、和40M,其中氨基酸残基编号采用SEQ ID NO:1所示的编号。
在另一优选例中，所述PDL-1分子还包括：48S,其中氨基酸残基编号采用SEQ IDNO:1所示的编号。
在另一优选例中，所述PDL-1分子还包括：47V、和48S；或
47F、和48S,其中氨基酸残基编号采用SEQ ID NO:1所示的编号。
在另一优选例中，所述PDL-1分子还包括：97L，其中氨基酸残基编号采用SEQ IDNO:1所示的编号。
在另一优选例中，所述PDL-1分子还包括：95T、97L、99G、和101K；或
95V、97L、99A、和101K，其中氨基酸残基编号采用SEQ ID NO:1所示的编号。
在另一优选例中，所述PDL-1分子的氨基酸序列选自SEQ ID NO:5-34之一。
在另一优选例中，所述PDL-1分子是可溶的。
在另一优选例中，所述PDL-1分子的C或N末端结合有偶联物。
在另一优选例中，与所述PDL-1分子结合的偶联物为T细胞受体，优选地，所述T细胞受体为高亲和性T细胞受体。
本发明的第二方面，提供了一种多价PDL-1复合物，其包含至少两个PDL-1分子，并且其中的至少一个PDL-1分子为本发明第一方面所述的PDL-1。
本发明的第三方面，提供了一种核酸分子，所述核酸分子包含编码本发明第一方面PDL-1分子的核酸序列或其互补序列。
本发明第四方面，提供了一种载体，所述的载体含有本发明第三方面所述的核酸分子。
本发明的第五方面，提供了一种宿主细胞，所述的宿主细胞中含有本发明第四方面所述的载体或染色体中整合有外源的本发明第三方面所述的核酸分子。
本发明的第六方面，提供了一种药物组合物，所述组合物含有药学上可接受的载体以及本发明第一方面所述的PDL-1分子、或本发明第二方面所述的PDL-1复合物。
在另一优选例中，所述药物组合物中还包括ImmTAC或HATac。
本发明的第七方面，提供了一种治疗疾病的方法，包括给需要治疗的对象施用适量的本发明第一方面所述的PDL-1分子、本发明第二方面所述的PDL-1复合物、或本发明的第六方面所述的药物组合物。
在另一优选例中，所述疾病为肿瘤。
本发明的第八方面，提供了本发明第一方面所述的PDL-1分子、本发明第二方面所述的PDL-1复合物的用途，其特征在于，用于制备***的药物。
本发明的第九方面，提供了一种制备本发明第一方面所述的PDL-1的方法，其特征在于，包括步骤：
(i)培养本发明第五方面所述的宿主细胞，从而表达本发明第一方面所述的PDL-1分子；
(ii)分离或纯化出所述的PDL-1分子。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1a和图1b分别为野生型PDL-1分子的胞外氨基酸序列和核苷酸序列。
图2为野生型PDL-1蛋白纯化后的SDS-PAGE胶图。
图3a和图3b分别为本发明实施例2中所复性、纯化的PD-1的氨基酸序列和核苷酸序列。
图4为野生型PDL-1分子与PD-1分子结合的BIAcore图谱。
图5为本发明高亲和性PDL-1分子的氨基酸序列，突变或***的氨基酸残基以加下划线表示。
图6为ImmTAC的α和β链氨基酸序列。
图7显示了本发明高亲和力PDL-1分子对PBMC的杀伤作用有显著提高。
图8显示了本发明高亲和力PDL-1分子对CD8+T细胞的杀伤作用有显著提高。
具体实施方式
本发明通过广泛而深入的研究，意外地发现对PD-1分子具有高亲和力的可溶性PDL-1分子能够有效地提高淋巴细胞的杀伤能力。因此，本发明提供了一种对PD-1的亲和力是野生型PDL-1分子对PD-1的亲和力至少两倍的可溶性高亲和力PDL-1分子。
具体地，本发明中所述PDL-1分子在SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中含有突变。更具体地，所述PDL-1分子的氨基酸序列与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列有至少90％的序列相同性。
在描述本发明之前，应当理解本发明不限于所述的具体方法和实验条件，因为这类方法和条件可以变动。还应当理解本文所用的术语其目的仅在于描述具体实施方案，并且其意图不是限制性的，本发明的范围将仅由所附的权利要求书限制。
除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
虽然在本发明的实施或测试中可以使用与本发明中所述相似或等价的任何方法和材料，本文在此处例举优选的方法和材料。
术语
野生型PDL-1分子：本发明中所述的野生型PDL-1分子是指野生型PDL-1分子的胞外区，其氨基酸序列和核苷酸序列分别如图1a和1b所示。
PBMC：外周血单个核细胞(PBMC)是具有圆形胞核的血细胞，如淋巴细胞或单核细胞。这些血细胞是免疫***抵抗感染并适应于入侵者的关键组分。淋巴细胞群体由T细胞(CD4和CD8阳性约75％)、B细胞和NK细胞(合并约25％)组成。
高亲和性T细胞受体：是指与其配体的亲和力是相应野生型T细胞受体与其配体亲和力至少两倍的T细胞受体。
肿瘤：指包括所有类型的癌细胞生长或致癌过程，转移性组织或恶性转化细胞、组织或器官，不管病理类型或侵染的阶段。肿瘤的实施例非限制性地包括：实体瘤，软组织瘤，和转移性病灶。实体瘤的实施例包括：不同器官***的恶性肿瘤，例如肉瘤，肺鳞癌和癌症。例如：感染的***，肺，***，淋巴，肠胃(例如：结肠)，和生殖泌尿道(例如：肾脏，上皮细胞)，咽头。肺鳞癌包括恶性肿瘤，例如，多数的结肠癌，直肠癌，肾细胞癌，肝癌，肺部的非小细胞癌，小肠癌和食道癌。上述癌症的转移性病变可同样用本发明的方法和组合物来治疗和预防。
药用载体：还称作赋形剂或稳定剂，使用剂量和浓度对其暴露的细胞或个体无毒。经常地，生理可接受载体是pH缓冲的水溶液。生理可接受载体的例子包括缓冲剂如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他糖类，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；络合剂如EDTA；糖醇如甘露醇或山梨醇；成盐反离子如钠；和/或非离子表面活性剂如TWEENTM、聚乙二醇(PEG)和PLURONICSTM。
发明详述
PD-1是在激活的T细胞和B细胞上表达的免疫抑制性受体。PDL-1是PD-1的配体，属于B7家族，具有IgV和IgC样区、跨膜区及胞浆区尾部，PDL-1与淋巴细胞上的受体PD-1相互作用，在免疫应答的负调控方面发挥着重要作用。本发明通过广泛而深入的研究，意外地发现对PD-1分子具有高亲和力的可溶性PDL-1分子能够有效地提高淋巴细胞的杀伤能力。因此，本发明提供了一种对PD-1的亲和力是野生型PDL-1分子对PD-1的亲和力至少两倍的可溶性高亲和力PDL-1分子。
可通过任何合适的方法测定上述PDL-1分子与PD-1的结合亲和力(与解离平衡常数KD成反比)和结合半衰期(表示为T1/2)。应了解，亲和力翻倍将导致KD减半。T1/2计算为In2除以解离速率(Koff)。因此，Koff翻倍会导致T1/2减半。优选采用相同的试验方案检测结合亲和力或结合半衰期数次，例如3次或更多，取结果的平均值。在优选的实施方式中，采用本发明实施例中的表面等离振子共振(BIAcore)方法进行这些检测。
该方法检测到本发明中野生型PDL-1分子对PD-1分子的解离平衡常数KD为2.462E-05M，其BIAcore结合图谱如图4所示。由于亲和力翻倍将导致KD减半，所以若检测到高亲和力PDL-1分子对PD-1分子的解离平衡常数KD为1.231E-05M，则说明该高亲和力PDL-1分子对PD-1分子的亲和力是野生型PDL-1分子对PD-1的亲和力的2倍。本领域技术人员熟知KD值单位间的换算关系，即1M＝1000μM，1μM＝1000nM，1nM＝1000pM。
在本发明的一个优选例中，利用本发明优选的测定亲和力的方式测得本发明PDL-1分子与PD-1分子的亲和力是野生型PDL-1分子与PD-1分子的亲和力的至少2倍；优选地，至少5倍；更优选地，至少10倍；最优选地，至少50倍。
在另一优选例中，所述PDL-1分子与PD-1分子的亲和力是野生型PDL-1分子与PD-1分子的亲和力的至少100倍；优选地，至少200倍；更优选地，至少500倍。
具体地，本发明高亲和力PDL-1分子与PD-1的亲和力KD≤1.231E-05M；优选地，1.0E-06M≤KD≤1.0E-05M；更优选地，1.0E-07M≤KD≤1.0E-06M；最优选地，1.0E-08M≤KD≤1.0E-07M。
本发明的高亲和力PDL-1分子在SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中含有一个或多个突变。具体地，所述PDL-1分子的氨基酸序列与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列有至少90％(优选地，至少92％；更优选地，至少94％，如95％、96％、97％、98％、99％)的序列相同性。
更具体地，本发明高亲和力PDL-1分子中突变的氨基酸残基位点包括1F、36I、38Y、40E、47I、48Q、95R、97M、99S、101G中的一个或多个或102G后有一个或多个氨基酸的***，其中氨基酸残基编号采用SEQ ID NO:1所示的编号。
在另一优选例中，突变后的PDL-1分子包括选自下组的一个或多个氨基酸残基：1W；36Q、36E、36T或36N；38F、38N、38H或38A；40M、40F、40L、40W或40Y；47L、47V、47F、47S、47Y、47P或47A；48S；95T、95V或95L；97L；99G或99A；101D、101K、101E或101H；102G后***氨基酸G；其中氨基酸残基编号采用SEQ ID NO:1所示的编号。
在另一优选例中，所述PDL-1分子的氨基酸序列选自SEQ ID NO:5-34之一。
为获得可溶性的高亲和力PDL-1分子，本发明所用的野生型PDL-1分子不含跨膜区。因此，在本发明的一个优选例中，所述PDL-1分子是可溶的。
可采用任何合适的方法进行突变，包括但不限于依据聚合酶链式反应(PCR)的那些、依据限制性酶的克隆或不依赖连接的克隆(LIC)方法。许多标准分子生物学教材详述了这些方法。聚合酶链式反应(PCR)诱变和依据限制性酶的克隆的更多细节可参见Sambrook和Russell,(2001)分子克隆-实验室手册(Molecular Cloning-A Laboratory Manual)(第三版)CSHL出版社。LIC方法的更多信息可见(Rashtchian,(1995)Curr Opin Biotechnol 6(1):30-6)。
产生本发明的高亲和力PDL-1分子的方法可以是但不限于从展示此类PDL-1分子的噬菌体颗粒的多样性文库中筛选出对PD-1具有高亲和性的PDL-1，如文献(Li,et al(2005)Nature Biotech 23(3):349-354)中所述。
应理解，表达本发明野生型PDL-1的基因或者表达略作修饰的本发明野生型PDL-1的基因都可用来制备模板链。然后在编码该模板链的DNA中引入产生本发明的高亲和力PDL-1所需的改变。
本发明的PDL-1分子也可以多价复合体的形式提供。本发明的多价PDL-1包含两个、三个、四个或更多个本发明PDL-1分子相结合而形成的多聚物，如可以用IgGFC段制备二聚体，或p53的四聚结构域来产生四聚体，或多个本发明PDL-1与另一分子结合而形成的复合物。
本发明的高亲和力PDL-1分子可以单独使用，也可与偶联物以共价或其他方式结合，优选以共价方式结合。所述偶联物优选为T细胞受体，更优选地，所述T细胞受体为高亲和性T细胞受体。
本发明的高亲和力PDL-1分子也可与其他分子联用，产生有效的协同作用。优选地，所述其他分子为ImmTAC或HATac。两种分子都能够重新定向T细胞，从而起到杀伤靶细胞的作用。所述ImmTAC分子是αβ恒定区之间含有人工链间二硫键的可溶性双链TCR分子与抗CD3抗体的融合分子，具体可参见文献(Joanne Oates，Bent K.Jakobsen.(ImmTACs)Novelbi-specific agents for targeted cancer thrapy.OncoImmunology2:2,e22891,February2013)。所述HATac分子是高亲和性T细胞活化芯(High Affinity T-cellactivation core),其中一种形式可由疏水芯突变的α与β链可变域连接而成的可溶性单链TCR分子与抗CD3抗体的融合分子，所述可溶性单链TCR分子具体可参见专利文献WO2014/206304。
本发明还涉及编码本发明PDL-1的核酸分子。本发明的核酸分子可以是DNA形式或RNA形式。DNA可以是编码链或非编码链。例如，编码本发明TCR的核酸序列可以与本发明附图中所示的核酸序列相同或是简并的变异体。举例说明“简并的变异体”的含义，如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO:1的蛋白序列，但与SEQ ID NO:2的序列有差别的核酸序列。
本发明的核酸分子全长序列或其片段通常可以用但不限于PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明PDL-1(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。
本发明也涉及包含本发明的核酸分子的载体，以及用本发明的载体或编码序列经基因工程产生的宿主细胞。
本发明还提供一种药物组合物，所述药物组合物含有药学上可接受的载体以及本发明PDL-1、或本发明PDL-1复合物。
本发明还提供了一种治疗疾病的方法，包括给需要治疗的对象施用适量的本发明PDL-1、或本发明PDL-1复合物、或本发明的药物组合物；尤其是，本发明的PDL-1分子与其他分子联用，优选地，其他分子为ImmTAC或HATac。
应理解，本文中氨基酸名称采用国际通用的单英文字母标识，与其相对应的氨基酸名称三英文字母简写分别是：Ala(A)、Arg(R)、Asn(N)、Asp(D)、Cys(C)、Gln(Q)、Glu(E)、Gly(G)、His(H)、Ile(I)、Leu(L)、Lys(K)、Met(M)、Phe(F)、Pro(P)、Ser(S)、Thr(T)、Trp(W)、Tyr(Y)、Val(V)；在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的结构和功能。
本发明还包括对本发明PDL-1略作修饰后的PDL-1分子。修饰(通常不改变一级结构)形式包括：本发明PDL-1的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在本发明PDL-1的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的PDL-1分子。这种修饰可以通过将PDL-1暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的PDL-1。
本发明的PDL-1或PDL-1复合物可与药学上可接受的载体一起在药物组合物中提供。本发明的PDL-1、多价PDL-1复合物通常作为无菌药物组合物的一部分提供，所述组合物通常包括药学上可接受的载体。该药物组合物可以是任何合适的形式(取决于给予患者的所需方法)。其可采用单位剂型提供，通常在密封的容器中提供，可作为试剂盒的一部分提供。此类试剂盒(但非必需)包括使用说明书。其可包括多个所述单位剂型。此外，本发明的PDL-1可以单用，也可与其他治疗剂结合或偶联在一起使用(如配制在同一药物组合物中)。
药物组合物还可含有药学上可接受的载体。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体。该术语指这样一些药剂载体：它们本身不诱导产生对接受该组合物的个体有害的抗体，且给药后没有过分的毒性。这些载体是本领域普通技术人员所熟知的。在雷明顿药物科学(Remington's Pharmaceutical Sciences(Mack Pub.Co.，N.J.1991))中可找到关于药学上可接受的赋形剂的充分讨论。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、佐剂、及其组合。
治疗性组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、盐水、甘油和乙醇。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。通常，可将治疗性组合物制成可注射剂，例如液体溶液或悬液；还可制成在注射前适合配入溶液或悬液中、液体载体的固体形式。一旦配成本发明的组合物，可将其通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：眼内、肌内、静脉内、皮下、皮内、或局部给药，优选为胃肠外包括皮下、肌肉内或静脉内。待预防或治疗的对象可以是动物；尤其是人。
当本发明的药物组合物被用于实际治疗时，可根据使用情况而采用各种不同剂型的药物组合物。较佳地，可以例举的有针剂、口服剂等。这些药物组合物可根据常规方法通过混合、稀释或溶解而进行配制，并且偶尔添加合适的药物添加剂，如赋形剂、崩解剂、粘合剂、润滑剂、稀释剂、缓冲剂、等渗剂(isotonicities)、防腐剂、润湿剂、乳化剂、分散剂、稳定剂和助溶剂，而且该配制过程可根据剂型用惯常方式进行。
本发明的药物组合物还可以缓释剂形式给药。例如，本发明PDL-1可被掺入以缓释聚合物为载体的药丸或微囊中，然后将该药丸或微囊通过手术植入待治疗的组织。作为缓释聚合物的例子，可例举的有乙烯-乙烯基乙酸酯共聚物、聚羟基甲基丙烯酸酯(polyhydrometaacrylate)、聚丙烯酰胺、聚乙烯吡咯烷酮、甲基纤维素、乳酸聚合物、乳酸-乙醇酸共聚物等，较佳地可例举的是可生物降解的聚合物如乳酸聚合物和乳酸-乙醇酸共聚物。
当本发明的药物组合物被用于实际治疗时，作为活性成分的本发明PDL-1或PDL-1复合物，可根据待治疗的每个病人的体重、年龄、性别、症状程度而合理地加以确定，最终由医师决定合理的用量。
本发明的主要优点在于：
(1)本发明获得了对PD-1具有高亲和力的PDL-1分子。
(2)本发明的高亲和力PDL-1分子能够有效地提高淋巴细胞的杀伤能力。
下面的具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如(Sambrook和Russell等人，分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning-A LaboratoryManual)(第三版)(2001)CSHL出版社)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。
实施例1野生型PDL-1的表达、复性和纯化
野生型PDL-1的胞外氨基酸序列及核苷酸序列分别为SEQ ID NO:1和2，如图1a和图1b所示，将携带野生型PDL-1的胞外序列的目的基因经NcoⅠ和NotⅠ双酶切，与经过NcoⅠ和NotⅠ双酶切的pET28a载体连接。连接产物转化至E.coli DH5α，涂布含卡那霉素的LB平板，37℃倒置培养过夜，挑取阳性克隆进行PCR筛选，对阳性重组子进行测序，确定序列正确后抽提重组质粒转化至E.coli BL21(DE3),用于表达。
将上述含有重组质粒pET28a-PDL-1的BL21(DE3)菌落全部接种于含有卡那霉素的LB培养基中,37℃培养至OD600为0.6-0.8，加入IPTG至终浓度为0.5mM，37℃继续培养4h。5000rpm离心15min收获细胞沉淀物，用BugbusterMaster Mix(Merck)裂解细胞沉淀物，6000rpm离心15min回收包涵体，再用Bugbuster(Merck)进行洗涤以除去细胞碎片和膜组分，6000rpm离心15min,收集包涵体。将包涵体溶解在缓冲液(50mM Tris-HCl,200mM NaCl,2mM EDTA,6M guanidine HCl,pH 8.0)中，高速离心去除不溶物，上清液用BCA法定量后进行分装，于-80℃保存备用。
向7mg溶解的PDL-1包涵体蛋白中，加入2mL缓冲液(50mM Tris-HCl,200mM NaCl,2mM EDTA,6M guanidine HCl,pH 8.0)，再加入DTT至终浓度为10mM,37℃处理30min。用注射器向100mL复性缓冲液(50mM HEPES,pH 7.5,500mM L-arginine,9mM glutathione,1mMglutathione disulfide,24mM NaCl,1mM KCl)中滴加上述处理后的PDL-1，4℃搅拌30min，然后将复性液装入截留量为3.5kDa的纤维素膜透析袋,透析袋置于2L预冷的水中，4℃缓慢搅拌过夜。24小时后，将透析液换成2L预冷的缓冲液(10mMTris-HCl pH 8.0)，4℃继续透析24h，然后将透析液换成相同的新鲜缓冲液继续透析24小时，样品经0.45μm滤膜过滤，真空脱气后通过阴离子交换柱(HiTrap Q HP,GE Healthcare)，用10mMTris-HCl pH 8.0配制的0-1M NaCl线性梯度洗脱液纯化蛋白，收集的洗脱组分进行SDS-PAGE分析，其SDS-PAGE胶图如图2所示。PDL-1组分浓缩后进一步用凝胶过滤柱(Superdex 7510/300,GE Healthcare)进行纯化，目标组分也进行SDS-PAGE分析。
用于BIAcore分析的洗脱组分进一步采用凝胶过滤法测试其纯度。条件为：色谱柱Agilent Bio SEC-3(300A，φ7.8×300mm)，流动相为150mM磷酸盐缓冲液，流速0.5mL/min，柱温25℃，紫外检测波长214nm。
实施例2结合表征
BIAcore分析
使用BIAcore T200实时分析***检测野生型PDL-1分子与PD-1的结合活性。将抗链霉亲和素的抗体(GenScript)加入偶联缓冲液(10mM醋酸钠缓冲液，pH 4.77)，然后将抗体流过预先用EDC和NHS活化过的CM5芯片，使抗体固定在芯片表面，最后用乙醇胺的盐酸溶液封闭未反应的活化表面，完成偶联过程，偶联水平约为15，000RU。
使低浓度的链霉亲和素流过已包被抗体的芯片表面，然后将生物素化的PD-1流过检测通道，另一通道作为参比通道，再将0.05mM的生物素以10μL/min的流速流过芯片2min，封闭链霉亲和素剩余的结合位点。采用单循环动力学分析方法测定其亲和力，将PDL-1用HEPES-EP缓冲液(10mM HEPES,150mMNaCl，3mM EDTA,0.005％P20，pH 7.4)稀释成几个不同的浓度，以30μL/min的流速，依次流过芯片表面，每次进样的结合时间为120s，最后一次进样结束后让其解离600s。每一轮测定结束后用pH 1.75的10mMGly-HCl再生芯片。利用BIAcore Evaluation软件计算动力学参数。
本实施例中所用的PD-1的氨基酸序列和核苷酸序列分别如图3a和3b所示，其表达、复性和纯化过程与实施例1中野生型PDL-1的表达、复性和纯化过程相同。其生物素化的过程如下：
a.生物素化
用Millipore超滤管将纯化的PD-1分子浓缩，同时将缓冲液置换为10mMTrispH8.0，然后加入生物素化试剂0.05M Bicine pH 8.3、10mM ATP、10mMMgOAc、50μM D-Biotin、100μg/ml BirA酶(GST-BirA)，室温孵育混合物过夜，SDS-PAGE检测生物素化是否完全。
b.纯化生物素化后的复合物
用Millipore超滤管将生物素化标记后的PD-1分子浓缩至1ml，采用凝胶过滤层析纯化生物素化的PD-1，利用Akta纯化仪(GE通用电气公司)，用过滤过的PBS预平衡HiPrepTM16/60S200HR柱(GE通用电气公司)，加载1ml浓缩过的生物素化PD-1分子，然后用PBS以1ml/min流速洗脱。生物素化的PD-1分子在约10ml时作为单峰洗脱出现。合并含有蛋白质的组分，用Millipore超滤管浓缩，BCA法(Thermo)测定蛋白质浓度，将生物素化的PD-1分子分装保存在-80℃。
通过本实施例上述过程检测到野生型PDL-1分子与PD-1分子的结合亲和力的KD值为2.462E-05M，其BIAcore结合图谱如图4所示。
实施例3高亲和力PDL-1分子的产生
将实施例1中所述的野生型PDL-1的胞外序列作为模板链，根据Li等((2005)Nature Biotech 23(3):349-354)描述的噬菌体展示和筛选方法，进行高亲和力PDL-1的筛选。经过几轮筛选后的噬菌体文库均和PD-1有较强的结合信号，从中挑取单克隆，并进行序列分析。
按照实施例1中所述方法表达、复性和纯化本发明高亲和性PDL-1分子，并按实施例2中所述方法测定其与PD-1分子的亲和力。本发明中获得的高亲和力PDL-1分子与PD-1分子的亲和力是野生型PDL-1分子与PD-1分子的亲和力的至少2倍，其氨基酸序列如图5所示，其与PD-1分子的亲和力数值如下表1所示。
表1
Figure BDA0000819246080000091
实施例4高亲和力PDL-1分子对PBMC(外周血单个核细胞)杀伤肿瘤细胞株(A375)效力的影响
本实施例采用非放射性细胞毒性试验来验证杀伤作用。该试验是51Cr释放细胞毒性试验的比色替代试验，定量测定细胞裂解后释放的乳酸脱氢酶(LDH)。采用30-分钟偶联的酶试验检测培养上清液中释放的LDH，其将四唑盐(INT)转化成红色甲暨产物。形成的颜色量与裂解细胞的数量成比例。利用标准96孔平板读数计收集490nm的吸光度数据。
所用材料如下：CytoTox96非放射性细胞毒性试验(普罗迈格公司)(G1780)含有底物混合物、试验缓冲液、裂解溶液和终止溶液；试验培养基:10％FBS(热灭活的，吉布可公司，目录号10108-165)、VIVO-15(Lonza)，目录号:04-418)；Nunc微孔圆底96孔组织培养板(纽克公司(Nunc)，目录号163320)；Nunc-免疫平板Maxisorb(纽克公司，目录号442404)。
本实施例所用的靶细胞是A375细胞(购自ATCC，货号CRL-1619)。在试验培养基中制备靶细胞；靶细胞浓度调节至2x10^5个细胞/毫升，从而得到2x10^4个细胞/孔，100μl。
本实施例中所用的效应细胞(PBMC细胞)是从健康人的新鲜白膜中分选获得，细胞以1×10^6个细胞/ml重悬在试验培养基中，从而得到1x10^5个细胞/孔，100μl。
试验中ImmTAC终浓度为10^-10M，ImmTAC的储存浓度为13X10^-6M，稀释130000倍，直接加入制备好的效应细胞中。不同高亲和力PDL1的终浓度为30ug/ml。本实施例中所用的ImmTAC的α和β链氨基酸序列分别如图6a和6b所示。
采用以下顺序将试验的诸组分加入平板:100μl靶细胞(如上所述制备)加入各孔；100μl效应细胞(如上所述制备)加入各孔；不同高亲和力PDL1加入各孔。
如下所述制备几个对照:效应细胞自发释放：仅有200μl效应细胞；靶细胞自发释放:仅有200μl靶细胞；靶细胞最大释放:仅有200μl靶细胞。所有孔一式三份制备，终体积为200μl。以250x g离心平板4分钟，然后在37℃温育24小时。将20μl裂解溶液加入靶细胞最大释放对照孔，45分钟后收集上清液。以250x g离心平板4分钟。将试验平板各孔的50μl清液转移至平底96孔NuncVlnxisorb板的相应孔。利用试验缓冲液(12m1)重建底物混合物。然后将50μl重建的底物混合物加入平板的各孔。平板盖上铝箔，室温下温育30分钟。将50μl终止溶液加入平板的各孔以终止反应。加入终止溶液后1小时内用Elisa平板读数计记录490nm的吸光度。
结果计算:从实验、靶细胞自发释放吸光度值中扣除背景的平均吸光度值,从靶细胞最大释放对照获得的吸光度值中扣除体积校正对照的平均吸光度值。前两步骤中获得的校正值用于下式以计算细胞毒性百分比:％细胞毒性＝100x(实验－靶细胞自发-效应细胞自发)/(靶细胞最大－靶细胞自发)。
实验结果如图7所示，图7中下标为“PBMC+A375+ImmTAC+PDL1”的柱状图中PDL1为野生型PDL-1分子。图中裂解率的提高或降低是相对于“PBMC+A375+ImmTAC”柱状图而言。具体计算方式为|(“PBMC+A375+ImmTAC+PDL-1分子”-“PBMC+A375+ImmTAC”)|/“PBMC+A375+ImmTAC”。该结果显示本发明高亲和力PDL-1分子均对PBMC的杀伤作用有显著提高。
实施例5高亲和力PDL-1分子对CD8+T细胞杀伤肿瘤细胞株(A375)效力的影响
本实施例采用实施例4中所述方法验证本发明高亲和力PDL-1分子对CD8+T细胞杀伤肿瘤细胞株(A375)效力的影响。
所用材料如下：CytoTox96非放射性细胞毒性试验(普罗迈格公司)(G1780)含有底物混合物、试验缓冲液、裂解溶液和终止溶液；试验培养基:10％FBS(热灭活的，吉布可公司，目录号10108-165)、VIVO-15(Lonza)，目录号:04-418)；Nunc微孔圆底96孔组织培养板(纽克公司(Nunc)，目录号163320)；Nunc-免疫平板Maxisorb(纽克公司，目录号442404)。
本实施例所用的靶细胞是A375细胞。在试验培养基中制备靶细胞；靶细胞浓度调节至2x10^5个细胞/毫升，从而得到2x10^4个细胞/孔，100μl。
本实施例中所用的效应细胞(CD8+T细胞)是从健康人的新鲜白膜中分选获得，细胞以2×10^5个细胞/ml重悬在试验培养基中，从而得到2x10^4个细胞/孔，100μl。
试验中ImmTAC终浓度为10^-10M，ImmTAC的储存浓度为13X10^-6M，稀释130000倍，直接加入制备好的效应细胞中。不同高亲和力PDL-1的终浓度为30ug/ml。ImmTAC序列与实施例4中相同。
采用以下顺序将试验的诸组分加入平板:100μl靶细胞(如上所述制备)加入各孔；100μl效应细胞(如上所述制备)加入各孔；不同高亲和力PDL-1加入各孔。
按实施例4中所述方式进行对照试验，并计算结果。结果如图8所示，图8中下标为“CD8T+A375+ImmTAC+PDL1”的柱状图中PDL1为野生型PDL-1分子。图中裂解率的提高或降低是相对于“CD8T+A375+ImmTAC”柱状图而言。具体计算方式为|(“CD8T+A375+ImmTAC+PDL-1分子”-“CD8T+A375+ImmTAC”)|/“CD8T+A375+ImmTAC”。该结果显示本发明高亲和力PDL-1分子对CD8+T细胞的杀伤作用有显著提高。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
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Claims (12)

1.一种PDL-1分子，其特征在于，所述PDL-1分子的氨基酸序列基于SEQ ID NO.:1所示的氨基酸序列，并且对SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列进行一个或多个氨基酸残基的突变或氨基酸残基的***从而获得所述PDL-1分子；
并且，所述PDL-1分子的氨基酸序列选自SEQ ID NO:5-34之一；
并且，所述PDL-1分子与PD-1分子的亲和力是野生型PDL-1分子与PD-1分子的亲和力的至少2倍。
2.如权利要求1所述的PDL-1分子，其特征在于，所述PDL-1分子是可溶的。
3.如权利要求1所述的PDL-1分子，其特征在于，所述PDL-1分子的C或N末端结合有偶联物。
4.如权利要求3所述的PDL-1分子，其特征在于，与所述PDL-1分子结合的偶联物为T细胞受体。
5.如权利要求4所述的PDL-1分子，其特征在于，所述T细胞受体为高亲和性T细胞受体。
6.一种多价PDL-1复合物，其特征在于，所述多价PDL-1复合物包含至少两个PDL-1分子，并且其中的至少一个PDL-1分子为权利要求1-5中任一项所述的PDL-1分子。
7.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子包含编码权利要求1-5中任一项所述的PDL-1分子的核酸序列或其互补序列。
8.一种载体，其特征在于，所述的载体含有权利要求7中所述的核酸分子。
9.一种宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞中含有权利要求8中所述的载体或染色体中整合有外源的权利要求7中所述的核酸分子。
10.一种药物组合物，其特征在于，所述组合物含有药学上可接受的载体以及权利要求1-5中任一项所述的PDL-1分子、或权利要求6中所述的PDL-1复合物。
11.权利要求1-5任一项所述的PDL-1分子、权利要求6中所述的PDL-1复合物的用途，其特征在于，用于制备***的药物。
12.一种制备权利要求1-5中任一所述的PDL-1的方法，其特征在于，包括步骤：
(i)培养权利要求9所述的宿主细胞，从而表达权利要求1-5中任一所述的PDL-1分子；
(ii)分离或纯化出所述的PDL-1分子。
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