JP4668498B2 - ポリペプチドの製造方法 - Google Patents
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Description
技術分野
本発明は、ラット細胞を用いた所望のポリペプチドの製造方法に関する。詳しくは、ＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０（以下、ＹＢ２／０という）等のラット細胞、好ましくは免疫機能分子等の所望のポリペプチドをコードするＤＮＡを含有する組換え体ＤＮＡを導入してなるラット細胞を、血清を含有しない培地（以下、無血清培地という）で培養することによる、該ポリペプチドの製造方法に関する。本発明の方法で得られる所望のポリペプチドのうち、例えばＹＢ２／０の形質転換細胞を用いて得られる抗体は抗体依存性細胞障害活性（以下、ＡＤＣＣ活性ともいう）が高く、医薬品として有用である。
背景技術
抗体等の免疫機能を有するポリペプチドは、さまざまな医薬品用途を示し、その有用性は腎移植の拒絶反応の低減化、ＲＳＶ小児感染に対する抗ウイルス剤、乳がんに対する抗ガン剤として医薬品に応用されている。また、抗体医薬はその重要性が今後ますます高くなると予想されている。
例えば、抗体をコードする遺伝子を用いて抗体を製造するには、抗体をコードする遺伝子を導入したベクターを保有する組換え細胞を培養し、培養物中に生産される抗体を採取することにより行うが、当該遺伝子組換え抗体は動物細胞からしか完全な形で生産されることはないため、遺伝子組換え抗体の製造は動物細胞を用いて行うことが好ましい。
動物細胞または組換え動物細胞を用いての有用物質の生産は、研究や産業化を目的として広く行われている。動物細胞を培養して物質を生産する方法においては、通常培地中に血清を存在させて培養する。しかしながら、血清が存在するとそのロット差が細胞収率や物質生産に大きな影響を与える。従って、動物細胞を用いて物質生産をする場合、血清を含有しない培地で培養することが望まれる。
ラットミエローマ細胞系であるＹＢ２／３．０Ａｇ３０（以下、ＹＯという）を無蛋白培地中で培養する方法は知られている〔Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１７，１９３（１９９５）〕。また、無血清培地を用いて動物細胞を培養し、ポリペプチドを生産する方法は知られている。〔Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．，１０，８７（１９９４）、Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９，２７（１９９６）、特公平６−７０７５７〕さらに、血清を含む培地中で増殖させたラット細胞の形質転換体を無血清培地に接種し、該培地中で培養してポリペプチドを生産する方法も知られている（特表昭６２−５０２３７７）。
しかし、無血清培地に馴化させたラット細胞を用いて所望のポリペプチドを長期間安定に生産する方法は知られていない。
一方、動物細胞の培養方法としては、新鮮培地へ細胞を接種し、そのまま一定時間後に培養を終了する培養方法、すなわち、バッチ培養方法が主として用いられている。しかし、バッチ培養で動物細胞を培養すると、培養中における栄養分の枯渇、細胞からの老廃物の蓄積等、培養環境の劣化が顕著に現れるため、細胞増殖や所望のポリペプチドの生産性が低くなることが知られている。結果として、培養物中に含まれる該ポリペプチドの濃度が低くなるため、培養物中に占める所望のポリペプチド以外の蛋白質成分、例えば細胞に由来する蛋白質または培地に由来する蛋白質などの濃度が相対的に高くなる。このため、該ポリペプチドを分離、精製する工程における負荷が増大し、生産コストが高くなるという欠点がある。
発明の開示
本発明の目的は、ラット細胞を用いて所望のポリペプチドを効率よく製造する方法を提供することにある。
本発明は、以下の（１）〜（２４）に関する。
（１）無血清培地に馴化したラット細胞株を無血清培地で培養し、培養物中から所望のポリペプチドを採取することを特徴とするポリペプチドの製造方法。
（２）無血清培地に馴化したラット細胞株が無血清培地に２ヶ月以上増殖継代できるラット細胞株である、（１）に記載の製造方法。
（３）ラット細胞がミエローマ細胞またはミエローマ細胞系の雑種細胞である（１）または（２）に記載の方法。
（４）ラット細胞がＹＢ２／０である（１）または（２）に記載の方法。
（５）細胞が所望のポリペプチドをコードするＤＮＡを含有する組換え体ＤＮＡを導入してなる細胞である、（１）〜（４）のいずれかに記載の方法。
（６）培養がバッチ培養、フェドバッチ培養またはパーフュージョン培養である、（１）〜（５）のいずれかに記載の方法。
（７）培養中に、栄養因子および生理活性物質から選ばれる少なくとも一種を培地に添加する、（１）〜（６）のいずれかに記載の方法。
（８）栄養因子がグルコース、アミノ酸およびビタミンから選ばれる少なくとも一種である、（７）に記載の方法。
（９）生理活性物質が、インシュリン、トランスフェリンおよびアルブミンから選ばれる少なくとも一種である（７）に記載の製造方法。
（１０）所望のポリペプチドが免疫機能分子である、（１）〜（９）のいずれかに記載の方法。
（１１）免疫機能分子が蛋白質またはペプチドである、（１０）に記載の方法。
（１２）蛋白質またはペプチドが、抗体、抗体の断片または抗体のＦｃ領域を有する融合蛋白質である、（１１）に記載の方法。
（１３）抗体が、腫瘍関連抗原を認識する抗体、アレルギーもしくは炎症に関連する抗原を認識する抗体、循環器疾患に関連する抗原を認識する抗体、自己免疫疾患に関連する抗原を認識する抗体、またはウイルスもしくは細菌感染に関連する抗原を認識する抗体である、（１２）に記載の方法。
（１４）腫瘍関連抗原を認識する抗体が抗ＧＤ２抗体、抗ＧＤ３抗体、抗ＧＭ２抗体、抗ＨＥＲ２抗体、抗ＣＤ５２抗体、抗ＭＡＧＥ抗体、抗塩基性繊維芽細胞増殖因子抗体、抗塩基性繊維芽細胞増殖因子受容体抗体、抗ＦＧＦ８抗体、抗ＦＧＦ８受容体抗体、抗インシュリン様増殖因子抗体、抗ＰＭＳＡ抗体、抗血管内皮細胞増殖因子抗体または抗血管内皮細胞増殖因子受容体抗体であり、アレルギーまたは炎症に関連する抗原を認識する抗体が抗インターロイキン６抗体、抗インターロイキン６受容体抗体、抗インターロイキン５抗体、抗インターロイキン５受容体抗体、抗インターロイキン４抗体、抗インターロイキン４受容体抗体、抗腫瘍壊死因子抗体、抗腫瘍壊死因子受容体抗体、抗ＣＣＲ４抗体、抗ケモカイン抗体または抗ケモカイン受容体抗体であり、循環器疾患に関連する抗原を認識する抗体が抗ＧｐＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体、抗血小板由来増殖因子抗体、抗血小板由来増殖因子受容体抗体または抗血液凝固因子抗体であり、自己免疫疾患に関連する抗原を認識する抗体が抗自己ＤＮＡ抗体であり、ウイルスまたは細菌感染に関連する抗原を認識する抗体が抗ｇｐ１２０抗体、抗ＣＤ４抗体、抗ＣＣＲ４抗体または抗ベロ毒素抗体である、（１３）に記載の方法。
（１５）抗体が抗ＧＤ３ヒト型キメラ抗体、ヒト化抗インターロイキン５受容体α鎖抗体または抗ＧＭ２ヒト型ＣＤＲ移植抗体である、（１３）に記載の方法。
（１６）ラット細胞を、培養液中のインシュリン濃度を１０ｍｇ／Ｌ以上に維持して培養した後、培養液中のインシュリン濃度を１０ｍｇ／Ｌ以下に維持して培養する、（１）〜（１５）のいずれかに記載の方法。
（１７）細胞密度を１×１０５〜１×１０６細胞／ｍｌとなるように、ラット細胞を馴化培地へ接種することを特徴とする、ラット細胞の無血清培地への馴化方法。
（１８）ラット細胞がミエローマ細胞またはミエローマ細胞系の雑種細胞である（１７）に記載の方法。
（１９）ラット細胞がＹＢ２／０である（１７）に記載の方法。
（２０）細胞が所望のポリペプチドをコードするＤＮＡを含有する組換え体ＤＮＡを導入された細胞である、（１７）〜（１９）のいずれかに記載の方法。
（２１）（１７）〜（２０）のいずれかに記載の方法でラット細胞を無血清培地に馴化させた後、クローン化することを特徴とする、無血清培地に馴化したラット細胞株の製造方法。
（２２）（２１）に記載の方法で得られる無血清培地に馴化したラット細胞株。
（２３）無血清培地に馴化したラット細胞株が無血清培地に２ヶ月以上増殖継代できるラット細胞株である、（２２）に記載の細胞株。
（２４）無血清培地に馴化したラット細胞株６１−３３γ（ＦＥＲＭ ＢＰ−７３２５）。
本発明の細胞としては、ラット細胞であればいずれも用いられるが、所望のポリペプチドをコードするＤＮＡを含有する組換え体ＤＮＡを導入してなるラット細胞が好ましい。ラット細胞としては、例えばＹ３ Ａｇ１．２．３．（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６３１）、ＹＯ（ＥＣＡＣＣ Ｎｏ：８５１１０５０１）、ＹＢ２／０（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６６２）等、ミエローマ細胞またはミエローマ細胞系の雑種細胞が好適に用いられる。また、これらの細胞に変異処理を施したり、ヒト以外の哺乳動物に抗原を免疫して取得されたＢ細胞と細胞融合等によって得られ、これらの細胞と同等の性質を有する細胞も、本発明の細胞に含まれる。
本発明の所望のポリペプチドとしては、真核細胞ポリペプチドが好ましく、ほ乳動物細胞ポリペプチドがさらに好ましい。真核細胞ポリペプチドは少なくとも１部分が真核細胞ポリペプチドであれば、融合ポリペプチド等、人工的に改変されたポリペプチドであっても、その部分断片であってよい。
また、本発明のポリペプチドは、抗体等の免疫機能分子、酵素等の生体触媒分子、構造蛋白質等の構造の形成・保持分子など、いずれであってもよいが、免疫機能分子であることが好ましい。
免疫機能分子としては、生体内で免疫反応に関与する蛋白質またはペプチド等のポリペプチドであれば、例えばインターフェロン分子であるインターロイキン−２（ＩＬ−２）［Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９３，１００７（１９７６）］、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）［Ｊ．Ｌｅｕｃ．Ｂｉｏｌ．，５５，２８０（１９９４）］、コロニー刺激因子である顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５８，９０１７（１９８３）］、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）［Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７３，２６９（１９９２）］、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５２，１９９８（１９７７）］、増殖因子であるエリスロポイエチン（ＥＰＯ）［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５２，５５５８（１９７７）］、トロンボポイエチン（ＴＰＯ）［Ｎａｔｕｒｅ，３６９，５３３（１９９４）］等、いかなるものであってもよい。
抗体とは、外来抗原刺激の結果、免疫反応によって生体内に産生される蛋白質で、抗原と特異的に結合する活性を有するものをいう。
抗体としては、動物に抗原を免疫し、免疫動物の脾臓細胞より作製したハイブリドーマ細胞が分泌する抗体の他、遺伝子組換え技術により作製された抗体、すなわち、抗体遺伝子を挿入した抗体発現ベクターを、宿主細胞へ導入することにより取得された抗体などがあげられる。具体的には、ハイブリドーマが生産する抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体などをあげることができる。
本発明において、ハイブリドーマとは、ヒト以外の哺乳動物に抗原を免疫して取得されたＢ細胞と、ラットに由来するミエローマ細胞とを細胞融合させて得られる、所望の抗原特異性を有したモノクローナル抗体を産生する細胞を意味する。
ヒト化抗体としては、ヒト型キメラ抗体、ヒト型相同性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ：以下、ＣＤＲという）移植抗体などがあげられる。
ヒト型キメラ抗体は、ヒト以外の動物の抗体重鎖可変領域（以下、重鎖はＨ鎖として、可変領域はＶ領域としてＨＶまたはＶＨともいう）および抗体軽鎖可変領域（以下、軽鎖はＬ鎖としてＬＶまたはＶＬともいう）とヒト抗体の重鎖定常領域（以下、定常領域はＣ領域としてＣＨともいう）およびヒト抗体の軽鎖定常領域（以下、ＣＬともいう）とからなる抗体を意味する。ヒト以外の動物としては、マウス、ラット、ハムスター、ラビット等、ハイブリドーマを作製することが可能であれば、いかなるものも用いることができる。
ヒト型キメラ抗体は、モノクローナル抗体を生産するハイブリドーマよりＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ヒト抗体ＣＨおよびヒト抗体ＣＬをコードする遺伝子を有する宿主細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築し、宿主細胞へ導入することにより発現させ、製造することができる。
ヒト型キメラ抗体のＣＨとしては、ヒトイムノグロブリン（以下、ｈＩｇという）に属すればいかなるものでもよいが、ｈＩｇＧクラスのものが好適であり、さらにｈＩｇＧクラスに属するｈＩｇＧ１、ｈＩｇＧ２、ｈＩｇＧ３、ｈＩｇＧ４といったサブクラスのいずれも用いることができる。また、ヒト型キメラ抗体のＣＬとしては、ｈＩｇに属すればいかなるものでもよく、κクラスあるいはλクラスのものを用いることができる。
ヒト型ＣＤＲ移植抗体は、ヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列をヒト抗体のＶＨおよびＶＬの適切な位置に移植した抗体を意味する。
ヒト型ＣＤＲ移植抗体は、ヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲ配列を任意のヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲ配列に移植したＶ領域をコードするｃＤＮＡを構築し、ヒト抗体のＣＨおよびヒト抗体のＣＬをコードする遺伝子を有する宿主細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト型ＣＤＲ移植抗体発現ベクターを構築し、該発現ベクターを宿主細胞へ導入することによりヒト型ＣＤＲ移植抗体を発現させ、製造することができる。
ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＣＨとしては、ｈＩｇに属すればいかなるものでもよいが、ｈＩｇＧクラスのものが好適であり、さらにｈＩｇＧクラスに属するｈＩｇＧ１、ｈＩｇＧ２、ｈＩｇＧ３、ｈＩｇＧ４といったサブクラスのいずれも用いることができる。また、ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＣＬとしては、ｈＩｇに属すればいかなるものでもよく、κクラスまたはλクラスのものを用いることができる。
免疫機能分子としては、例えば、ヒト型キメラ抗体、ヒト化抗体、一本鎖抗体等が挙げられる。具体的には、ガングリオシドＧＤ３に対する抗体（以下、抗ＧＤ３抗体という）、ヒトインターロイキン５受容体α鎖に対する抗体（以下、抗ＩＬ−５受容体α鎖抗体という）等があげられる。例えば、抗ＧＤ３抗体としては、抗ガングリオシドＧＤ３ヒト型キメラ抗体（以下、抗ＧＤ３キメラ抗体という）ＫＭ−８７１（特開平５−３０４９８９）、抗ＩＬ−５受容体α鎖抗体としては、ヒト化抗ＩＬ−５受容体α鎖抗体ＫＭ８３９９（ＷＯ９７／１０３５４）、抗ＧＭ２ヒト型ＣＤＲ移植抗体ＫＭ８９６６、ＫＭ８９６７、ＫＭ８９６９またはＫＭ８９７０（特開平１０−２５７８９３）等をコードするＤＮＡがあげられる。
所望のポリペプチドをコードするＤＮＡは、該ポリペプチドを発現できるものであればいずれでも用いられるが、免疫機能分子をコードするＤＮＡであることが好ましい。
所望のポリペプチドをコードするＤＮＡを含有する組換え体ベクターを調製するために用いらる発現ベクターとしては、例えば、ｐｃＤＮＡＩ、ｐｃＤＭ８（フナコシ社製）、ｐＡＧＥ１０７〔特開平３−２２９７９、Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）〕、ｐＡＳ３−３（特開平２−２２７０７５）、ｐＣＤＭ８〔Ｎａｔｕｒｅ，３２９，８４０（１９８７）〕、ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＲＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＡＧＥ１０３〔Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０１，１３０７（１９８７）〕、ｐＡＧＥ２１０等があげられる。
プロモーターとしては、本発明で用いる動物細胞中で機能するものであればいずれも用いることができ、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のＩＥ（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ ｅａｒｌｙ）遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０の初期プロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、ＳＲαプロモーター等をあげることができる。また、ヒトＣＭＶのＩＥ遺伝子のエンハンサーをプロモーターとともに用いてもよい。
宿主細胞としては、ラット細胞であればいずれも用いられるが、例えばＹ３Ａｇ１．２．３．、ＹＯ、ＹＢ２／０等、ミエローマ細胞またはミエローマ細胞系の雑種細胞が好適に用いられる。また、これらの細胞に変異処理を施したり、ヒト以外の哺乳動物に抗原を免疫して取得されたＢ細胞と細胞融合等によって得られ、これらの細胞と同等の性質を有する細胞も、本発明の細胞に含まれる。
ラット細胞への組換え体ベクターの導入方法としては、当該細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法〔Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）〕、リン酸カルシウム法（特開平２−２２７０７５）、リポフェクション法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，７４１３（１９８７）、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２，４５６（１９７３）〕等をあげることができる。
上記方法で組換え体ベクターを導入された細胞を、適当な培地中で培養することにより、細胞内または培養上清中に、所望のポリペプチドを生産することができる。
本発明の細胞としては、例えば抗ＧＤ３ヒト型キメラ抗体を生産する形質転換細胞７−９−５１（ＦＥＲＭ ＢＰ−６６９１）、抗ＩＬ−５受容体α鎖キメラ抗体を生産する形質転換細胞ＫＭ７３９９（ＦＥＲＭ ＢＰ−５６４９）、抗ＩＬ−５受容体α鎖ヒト型ＣＤＲ移植抗体を生産する形質転換細胞ＫＭ９３９９（ＦＥＲＭ ＢＰ−５６４７）、抗ＧＭ２ヒト型ＣＤＲ移植抗体を生産する形質転換細胞ＫＭ８９６６（ＦＥＲＭ ＢＰ−５１０５）、ＫＭ８９６７（ＦＥＲＭ ＢＰ−５１０６）、ＫＭ８９６９（ＦＥＲＭ ＢＰ−５５２７）およびＫＭ８９７０（ＦＥＲＭ ＢＰ−５５２８）等があげられる。
本発明の無血清培地への馴化方法としては、血清を含有する培地で継代したラット細胞を市販の無血清培地等へ直接馴化させる方法や連続馴化の方法（Ｃｅｌｌ ＆ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ，ＪＯＨＯＮ ＷＩＬＥＹ ＆ ＳＯＮＳ ２Ｃ：１）等があげられる。
無血清馴化中には細胞の生存率が一時的に低下し、細胞が死滅してしまうことがある。このため、細胞の生存率を戻し、あるいは高く維持するためには、無血清馴化培地への細胞接種時に細胞密度を１×１０５〜１０×１０５細胞／ｍｌ、好ましくは４×１０５〜６×１０５細胞／ｍｌとなるように接種することが好ましい。例えば、直接馴化法では、培地中に細胞を接種し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターでのバッチ培養等、通常の動物細胞の培養方法を用いて培養し、細胞濃度が１０×１０５〜４０×１０５細胞／ｍｌに達したら、無血清培地中に細胞を接種し、同様な条件で培養を繰り返す。
無血清培地にラット細胞を１×１０５〜１０×１０５細胞／ｍｌ、好ましくは４×１０５〜６×１０５細胞／ｍｌとなるように接種し、通常の動物細胞の培養方法を用いて４〜７日後に、細胞密度が１０×１０５〜４０×１０５細胞／ｍｌに達したラット細胞を無血清培地に馴化した細胞として選択する。
無血清培地に馴化した細胞は、細胞濃度が下記のバッチ培養で用いられる培地中に１０×１０５〜３０×１０５細胞／ｍｌとなるように接種し、下記のバッチ培養で用いられる培養条件で３〜５日間培養して、継代培養を行うことができる。なお、継代培養の期間中、無血清培地に馴化した細胞の生存率は、９０％以上に維持しておくことが望ましい。また、ラット細胞、例えばＹＢ２／０細胞またはＹＢ２／０の形質転換細胞について、無血清培地に馴化した細胞が所望のポリペプチドの生産性を維持するためには、アルブミンを好ましくは０．１〜１０ｇ／Ｌ、さらに好ましくは０．５〜３ｇ／Ｌとなるように無血清培地へ添加しておくとよい。
本発明の細胞を無血清培地に馴化させた後、９６ウェルプレートによる限界希釈方法、コロニー形成方法等を用いることにより、クローン（単一細胞）化した細胞株を調製することができる。
以下に、限界希釈法を用いたクローン化した細胞株を調製する方法を示す。
細胞懸濁液を希釈し、ひとつのウェルに１個以下の確率で細胞が入るように接種し、市販の無血清培地などを用いて、３０〜４０℃、５％ＣＯ２インキュベーター内で数週間培養する。培養終了後、細胞増殖の認められた細胞の培養上清中の所望のポリペプチドの濃度を調べ、該ポリペプチドの生産性の高い細胞を選択する。
コロニー形成方法を用いてクローン化する方法は以下のとおりである。
付着性細胞の場合は、細胞懸濁液を希釈し、シャーレに細胞を接種して培養後、コロニーの形成を確認する。ペニシリンキャップ等のリングでコロニーを分離し、トリプシン等の酵素で細胞を分離後、適当な培養器に移し、所望のポリペプチドの生産量を調べ、該ポリペプチドの生産性の高い細胞を選択する。
浮遊細胞の場合は、細胞懸濁液を希釈し、軟寒天中に細胞を接種して培養し、生じたコロニーを顕微鏡下でピックアップした後、静置培養に戻して所望のポリペプチドの生産量を調べ、生産性の高い細胞を選択する。
上記方法を繰り返して行なうことで、無血清に馴化され、かつ目的とする細胞特性を持ったクローン化されたラット細胞株を選択することができる。
上記方法により、無血清培地に馴化したラット細胞株、好ましくは無血清培地中で２ヶ月以上継代培養できるラット細胞株を得ることができる。また、無血清培地に馴化した細胞を長期培養するためには、無血清培地中で２ヶ月以上継代培養できるラット細胞株であることがさらに好ましい。
なお、無血清培地に馴化したラット細胞株は、上記の無血清培地に馴化した細胞を継代培養する方法で継代培養することができる。無血清培地に馴化したラット細胞株としては、６１−３３γ（ＦＥＲＭ ＢＰ−７３２５）が例示される。
本発明の細胞を培養する方法としては、所望のポリペプチドを効率よく生産できる培養方法であれば、通常用いられる動物細胞の培養法のいずれでも用いられる。例えば、バッチ培養、リピートバッチ培養、フェドバッチ培養、パーフュージョン培養等があげられるが、所望のポリペプチドの生産性を高めるにはフェドバッチ培養またはパーフュージョン培養が好ましい。
１．バッチ培養
本発明の方法において用いられる無血清培地は、通常の動物細胞の培養に用いられる基礎培地に血清の代わりに、各生理活性物質、栄養因子が添加され、かつ動物細胞が同化しうる炭素源、窒素源等を含有させたものが用いられる。
具体的には、ＲＰＭＩ１６４０培地〔Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，１９９，５１９（１９６７）〕、ＥａｇｌｅのＭＥＭ培地〔Ｓｃｉｅｎｃｅ，１２２，５０１（１９５２）〕、ダルベッコ改変ＭＥＭ培地〔Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８，３９６（１９５９）〕、１９９培地〔Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，７３，１（１９５０）〕、Ｆ１２培地〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，５３，２８８（１９６５）〕、ＩＭＤＭ培地〔Ｊ．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１４７，９２３（１９７８）〕等があげられるが、好ましくは、ＤＭＥＭ培地、Ｆ１２培地、ＩＭＤＭ培地等が用いられる。
無血清培地には、必要に応じて動物細胞の生育に必要な栄養因子、生理活性物質等を添加する。これらの添加物は、培養前に予め培地に含有させる。
栄養因子としては、グルコース、アミノ酸、ビタミン等があげられる。
アミノ酸としては、Ｌ−アラニン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−シスチン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン等があげられ、１種または２種以上組み合わせて用いられる。
ビタミンとしては、ｄ−ビオチン、Ｄ−パントテン酸、コリン、葉酸、ｍｙｏ−イノシトール、ナイアシンアミド、ピリドキサール、リボフラビン、チアミン、シアノコバラミン、ＤＬ−α−トコフェロール等があげられ、１種または２種以上組み合わせて用いられる。
生理活性物質としては、インシュリン、トランスフェリン、アルブミン等があげられる。
栄養因子の濃度として、グルコースの濃度は２００〜６０００ｍｇ／Ｌ、好ましくは３０００〜５０００ｍｇ／Ｌである。
アミノ酸の濃度は、例えば、Ｌ−アラニン１〜１６０ｍｇ／Ｌ（好ましくは３〜１２０ｍｇ／Ｌ）、Ｌ−アルギニン一塩酸１０〜１０００ｍｇ／Ｌ（好ましくは３０〜８００ｍｇ／Ｌ）、Ｌ−アスパラギン一水和物１０〜２００ｍｇ／Ｌ（好ましくは２０〜１５０ｍｇ／Ｌ）、Ｌ−アスパラギン酸５〜１００ｍｇ／Ｌ（好ましくは１０〜７５ｍｇ／Ｌ）、Ｌ−シスチン二塩酸１０〜２００ｍｇ／Ｌ（好ましくは２０〜１５０ｍｇ／Ｌ）、Ｌ−グルタミン酸５〜２００ｍｇ／Ｌ（好ましくは１０〜１５０ｍｇ／Ｌ）、Ｌ−グルタミン５０〜２０００（好ましくは１００〜１５００ｍｇ／Ｌ）、グリシン２〜１００ｍｇ／Ｌ（好ましくは５〜７５ｍｇ／Ｌ）、Ｌ−ヒスチジン一塩酸二水和物５〜２００ｍｇ／Ｌ（好ましくは１０〜１５０ｍｇ／Ｌ）、Ｌ−イソロイシン２〜３００ｍｇ／Ｌ（好ましくは４〜２００ｍｇ／Ｌ）、Ｌ−ロイシン５〜３００ｍｇ／Ｌ（好ましくは１０〜２００ｍｇ／Ｌ）、Ｌ−リジン一塩酸１０〜３００ｍｇ／Ｌ（好ましくは２０〜２５０ｍｇ／Ｌ）、Ｌ−メチオニン５〜１００ｍｇ／Ｌ（好ましくは１０〜７５ｍｇ／Ｌ）、Ｌ−フェニルアラニン５〜２００ｍｇ／Ｌ（好ましくは１０〜１５０ｍｇ／Ｌ）、Ｌ−プロリン５〜２００ｍｇ／Ｌ（好ましくは１０〜１５０ｍｇ／Ｌ）、Ｌ−セリン５〜２００ｍｇ／Ｌ（好ましくは１０〜１５０ｍｇ／Ｌ）、Ｌ−スレオニン５〜２００ｍｇ／Ｌ（好ましくは１０〜１５０ｍｇ／Ｌ）、Ｌ−トリプトファン１〜４０ｍｇ／Ｌ（好ましくは２〜３０ｍｇ／Ｌ）、Ｌ−チロシン二ナトリウム二水和物２〜３００ｍｇ／Ｌ（好ましくは４〜２００ｍｇ／Ｌ）、Ｌ−バリン５〜３００ｍｇ／Ｌ（好ましくは１０〜２００ｍｇ／Ｌ）である。
ビタミンの濃度は、例えば、ｄ−ビオチン０．００１〜０．４ｍｇ／Ｌ（好ましくは０．００２〜０．３ｍｇ／Ｌ）、Ｄ−パントテン酸カルシウム０．００１〜１０．０ｍｇ／Ｌ（好ましくは０．００２〜７．５ｍｇ／Ｌ）、塩化コリン０．１〜２０．０ｍｇ／Ｌ（好ましくは０．２〜１５．０ｍｇ／Ｌ）、葉酸０．００５〜２０．０ｍｇ／Ｌ（好ましくは０．０１〜１５．０ｍｇ／Ｌ）、ｍｙｏ−イノシトール０．０１〜３００ｍｇ／Ｌ（好ましくは０．０５〜２００ｍｇ／Ｌ）、ナイアシンアミド０．０１〜２０．０ｍｇ／Ｌ（好ましくは０．０２〜１５．０ｍｇ／Ｌ）、ピリドキサール一塩酸０．０１〜１５．０ｍｇ／Ｌ（好ましくは０．０２〜１０．０ｍｇ／Ｌ）、リボフラビン０．００５〜２．０ｍｇ／Ｌ（好ましくは０．０１〜１．５ｍｇ／Ｌ）、チアミン一塩酸０．００５〜２０．０ｍｇ／Ｌ（好ましくは０．０１〜１５．０ｍｇ／Ｌ）、シアノコバラミン０．００１〜５．０ｍｇ／Ｌ（好ましくは０．００２〜３．０ｍｇ／Ｌ）である。
生理活性物質の濃度は、例えば、インシュリン１０〜５００ｍｇ／Ｌ、好ましくは５０〜３００ｍｇ／Ｌ、トランスフェリン１０〜５００ｍｇ／Ｌ、好ましくは５０〜３００ｍｇ／Ｌ、アルブミン２００〜６０００ｍｇ／Ｌ、好ましくは７００〜４０００ｍｇ／Ｌである。
バッチ培養は、通常ｐＨ６〜８、３０〜４０℃等の条件下で３〜１２日間行う。また、培養中必要に応じて、ストレプトマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。なお、溶存酸素濃度制御、ｐＨ制御、温度制御、攪拌などは通常の動物細胞の培養に用いられる方法に準じて行うことができる。
２．フェドバッチ培養
本発明の方法において使用される無血清培地は、通常の動物細胞の培養に用いられる基礎培地に血清の代わりに、各生理活性物質、栄養因子が添加され且つ通常動物細胞が同化しうる炭素源、窒素源等を含有させたものが用いられる。具体的には、ＲＰＭＩ１６４０培地〔Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，１９９，５１９（１９６７）〕、ＥａｇｌｅのＭＥＭ培地〔Ｓｃｉｅｎｃｅ，１２２，５０１（１９５２）〕、ダルベッコ改変ＭＥＭ培地〔Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８，３９６（１９５９）〕、１９９培地〔Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，７３，１（１９５０）〕、Ｆ１２培地〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，５３，２８８（１９６５）〕、ＩＭＤＭ培地〔Ｊ．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１４７，９２３（１９７８）〕等があげられるが、好ましくは、ＤＭＥＭ培地、Ｆ１２培地、ＩＭＤＭ培地等が用いられる。上記培地以外に、バッチ培養で記載した無血清培地を用いてもよい。
無血清培地には、必要に応じて動物細胞の生育に必要な生理活性物質、栄養因子等を添加する。これらの添加物は、予め培養前に培地に含有させるか、または必要に応じて、培養中に培養液へ適宜追加供給する。
栄養因子としては、グルコース、アミノ酸、ビタミン等があげられる。
アミノ酸としては、Ｌ−アラニン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−シスチン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン等があげられ、１種または２種以上組み合わせて用いられる。
ビタミンとしては、ｄ−ビオチン、Ｄ−パントテン酸、コリン、葉酸、ｍｙｏ−イノシトール、ナイアシンアミド、ピリドキサール、リボフラビン、チアミン、シアノコバラミン、ＤＬ−α−トコフェロール等があげられ、１種または２種以上組み合わせて用いられる。
生理活性物質としては、インシュリン、トランスフェリン、アルブミン等があげられる。
培地または培養液中への栄養因子の最終添加量として、グルコースは２００〜６０００ｍｇ／Ｌ、好ましくは１０００〜５０００ｍｇ／Ｌである。
アミノ酸は、例えば、Ｌ−アラニン１〜９６０ｍｇ／Ｌ（好ましくは１〜６４０ｍｇ／Ｌ）、Ｌ−アルギニン一塩酸１０〜６０００ｍｇ／Ｌ（好ましくは１１〜４０００ｍｇ／Ｌ）、Ｌ−アスパラギン一水和物１０〜１２００ｍｇ／Ｌ（好ましくは１１〜８００ｍｇ／Ｌ）、Ｌ−アスパラギン酸５〜６００ｍｇ／Ｌ（好ましくは５〜４００ｍｇ／Ｌ）、Ｌ−シスチン二塩酸１０〜１２００ｍｇ／Ｌ（好ましくは１１〜８００ｍｇ／Ｌ）、Ｌ−グルタミン酸５〜１２００ｍｇ／Ｌ（好ましくは５〜８００ｍｇ／Ｌ）、Ｌ−グルタミン５３〜１２０００（好ましくは５５〜８０００ｍｇ／Ｌ）、グリシン２〜６００ｍｇ／Ｌ（好ましくは２〜４００ｍｇ／Ｌ）、Ｌ−ヒスチジン一塩酸二水和物５〜１２００ｍｇ／Ｌ（好ましくは５〜８００ｍｇ／Ｌ）、Ｌ−イソロイシン４〜１８００ｍｇ／Ｌ（好ましくは４〜１２００ｍｇ／Ｌ）、Ｌ−ロイシン１３〜１８００ｍｇ／Ｌ（好ましくは１４〜１２００ｍｇ／Ｌ）、Ｌ−リジン一塩酸１０〜１８００ｍｇ／Ｌ（好ましくは１１〜１２００ｍｇ／Ｌ）、Ｌ−メチオニン４〜６００ｍｇ／Ｌ（好ましくは５〜４００ｍｇ／Ｌ）、Ｌ−フェニルアラニン５〜１２００ｍｇ／Ｌ（好ましくは５〜８００ｍｇ／Ｌ）、Ｌ−プロリン５〜１２００ｍｇ／Ｌ（好ましくは５〜８００ｍｇ／Ｌ）、Ｌ−セリン５〜１２００ｍｇ／Ｌ（好ましくは５〜８００ｍｇ／Ｌ）、Ｌ−スレオニン５〜１２００ｍｇ／Ｌ（好ましくは５〜８００ｍｇ／Ｌ）、Ｌ−トリプトファン１〜２４０ｍｇ／Ｌ（好ましくは１〜１６０ｍｇ／Ｌ）、Ｌ−チロシン二ナトリウム二水和物８〜１８００ｍｇ／Ｌ（好ましくは８〜１２００ｍｇ／Ｌ）、Ｌ−バリン１２〜１８００ｍｇ／Ｌ（好ましくは１２〜１２００ｍｇ／Ｌ）である。
ビタミンは、例えば、ｄ−ビオチン０．００１〜２．４ｍｇ／Ｌ（好ましくは０．００１〜１．６ｍｇ／Ｌ）、Ｄ−パントテン酸カルシウム０．０１１〜６０ｍｇ／Ｌ（好ましくは０．０１１〜４０ｍｇ／Ｌ）、塩化コリン０．１１〜９０ｍｇ／Ｌ（好ましくは０．１１〜６０ｍｇ／Ｌ）、葉酸０．０１〜１２０ｍｇ／Ｌ（好ましくは０．０１〜８０ｍｇ／Ｌ）、ｍｙｏ−イノシトール０．０５〜１８００ｍｇ／Ｌ（好ましくは０．０５〜１２００ｍｇ／Ｌ）、ナイアシンアミド０．０２〜１２０ｍｇ／Ｌ（好ましくは０．０３〜８０ｍｇ／Ｌ）、ピリドキサール一塩酸０．０２〜９０ｍｇ／Ｌ（好ましくは０．０３〜６０ｍｇ／Ｌ）、リボフラビン０．０１〜１２ｍｇ／Ｌ（好ましくは０．０１〜９８ｍｇ／Ｌ）、チアミン一塩酸０．０１〜１２０ｍｇ／Ｌ（好ましくは０．０１〜８０ｍｇ／Ｌ）、シアノコバラミン０．００１〜３０ｍｇ／Ｌ（好ましくは０．００１〜２０ｍｇ／Ｌ）である。
培地または培養液中への生理活性物質の最終添加量として、例えば、インシュリン１０〜３０００ｍｇ／Ｌ、好ましくは１１〜２０００ｍｇ／Ｌ、トランスフェリン１０〜３０００ｍｇ／Ｌ、好ましくは１１〜２０００ｍｇ／Ｌ、アルブミン２００〜３６０００ｍｇ／Ｌ、好ましくは２２０〜２４０００ｍｇ／Ｌである。
本発明において物質の「最終添加量」は、フェドバッチ培養中に添加する濃縮培養液を最終的に添加し終わった後、培地に含まれる該物質の重量と培養液中に添加した該物質の重量との合計量を、培地量と添加した濃縮培養液量との合計量で除した値として表わされる。
フェドバッチ培養においては、生理活性物質、栄養因子等は通常に使用される濃度よりも高い濃度で添加することが好ましい。例えば、培養液量の１／３０〜１／３好ましくは１／２０〜１／５を一回分として添加する。培養液中に添加する場合は、培養期間中、連続的にまたは数回〜十数回に分けて追加供給することが好ましい。生理活性物質、栄養因子等を連続的、または間欠的に少量づつ追加供給する上記フェドバッチ培養法は、細胞の代謝効率が高く、培養液中の老廃物が蓄積されることによる培養細胞の到達細胞密度の低下を防止することができ、また、回収された培養液中の所望のポリペプチドの濃度はバッチ培養法に比べて高濃度であるため、該ポリペプチドの分離・精製が容易になり、バッチ培養に比べ、培地当りの該ポリペプチドの生産量を増大させることができる。
フェドバッチ培養は、通常ｐＨ６〜８、３０〜４０℃で、３〜１２日間行う。また、培養中必要に応じて、ストレプトマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。なお、溶存酸素濃度制御、ｐＨ制御、温度制御、攪拌などは通常の動物細胞の培養に用いられる方法に準じて行うことができる。
３．パーフュージョン培養
本発明の方法において使用される無血清培地は、通常の動物細胞の培養に用いられる基礎培地に血清の代わりに、各生理活性物質、栄養因子が添加され且つ通常動物細胞が同化しうる炭素源、窒素源等を含有させたものが用いられる。具体的には、ＲＰＭＩ１６４０培地〔Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，１９９，５１９（１９６７）〕、ＥａｇｌｅのＭＥＭ培地〔Ｓｃｉｅｎｃｅ，１２２，５０１（１９５２）〕、ダルベッコ改変ＭＥＭ培地〔Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８，３９６（１９５９）〕、１９９培地〔Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，７３，１（１９５０）〕、Ｆ１２培地〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，５３，２８８（１９６５）〕、ＩＭＤＭ培地〔Ｊ．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１４７，９２３（１９７８）〕等があげられるが、好ましくは、ＤＭＥＭ培地、Ｆ１２培地、ＩＭＤＭ培地等が用いられる。上記培地以外に、バッチ培養で記載した無血清培地を用いてもよい。
無血清培地には、必要に応じて動物細胞の生育に必要な生理活性物質、栄養因子等を添加する。これらの添加物は、培養前の培地または培養液中に供給する培地に含有させておくとよい。
栄養因子としては、グルコース、アミノ酸、ビタミン等があげられる。
アミノ酸としては、Ｌ−アラニン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−シスチン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン等があげられ、１種または２種以上組み合わせて用いられる。
ビタミンとしては、ｄ−ビオチン、Ｄ−パントテン酸、コリン、葉酸、ｍｙｏ−イノシトール、ナイアシンアミド、ピリドキサール、リボフラビン、チアミン、シアノコバラミン、ＤＬ−α−トコフェロール等があげられ、１種または２種以上組み合わせて用いられる。
生理活性物質としては、インシュリン、トランスフェリン、アルブミン等があげられる。
栄養因子の濃度として、グルコースの濃度は５００〜６０００ｍｇ／Ｌ、好ましくは１０００〜２０００ｍｇ／Ｌにコントロールされる。
栄養因子としては、アミノ酸、ビタミン等があげられる。他の生理活性物質または栄養因子の添加量は、例えば、インシュリン４〜５６０ｍｇ／Ｌ、好ましくは２０〜３６０ｍｇ／Ｌ、トランスフェリン４〜５６０ｍｇ／Ｌ、好ましくは２０〜３６０ｍｇ／Ｌ、アルブミン８０〜６５００ｍｇ／Ｌ、好ましくは２８０〜４５００ｍｇ／Ｌである。
アミノ酸としては、Ｌ−アラニン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−シスチン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン等があげられ、１種または２種以上組み合わせて用いられる。アミノ酸濃度は、例えば、Ｌ−アラニン１〜２００ｍｇ／Ｌ（好ましくは２〜１６０ｍｇ／Ｌ）、Ｌ−アルギニン一塩酸１０〜１１４０ｍｇ／Ｌ（好ましくは３０〜９４０ｍｇ／Ｌ）、Ｌ−アスパラギン一水和物１０〜２５０ｍｇ／Ｌ（好ましくは２０〜２００ｍｇ／Ｌ）、Ｌ−アスパラギン酸５〜１４８ｍｇ／Ｌ（好ましくは１０〜１２０ｍｇ／Ｌ）、Ｌ−シスチン二塩酸１０〜３５０ｍｇ／Ｌ（好ましくは２０〜３００ｍｇ／Ｌ）、Ｌ−グルタミン酸５〜３２０ｍｇ／Ｌ（好ましくは１０〜２７０ｍｇ／Ｌ）、Ｌ−グルタミン５０〜３３００（好ましくは１００〜１８００ｍｇ／Ｌ）、グリシン２〜１４８ｍｇ／Ｌ（好ましくは５〜１２３ｍｇ／Ｌ）、Ｌ−ヒスチジン一塩酸二水和物５〜２７０ｍｇ／Ｌ（好ましくは１０〜２２０ｍｇ／Ｌ）、Ｌ−イソロイシン４〜４７０ｍｇ／Ｌ（好ましくは４〜３７０ｍｇ／Ｌ）、Ｌ−ロイシン１０〜４７０ｍｇ／Ｌ（好ましくは１３〜３７０ｍｇ／Ｌ）、Ｌ−リジン一塩酸１０〜５３０ｍｇ／Ｌ（好ましくは２０〜４８０ｍｇ／Ｌ）、Ｌ−メチオニン４〜１５０ｍｇ／Ｌ（好ましくは４〜１２０ｍｇ／Ｌ）、Ｌ−フェニルアラニン４〜３１０ｍｇ／Ｌ（好ましくは４〜２６０ｍｇ／Ｌ）、Ｌ−プロリン５〜２７０ｍｇ／Ｌ（好ましくは１０〜２１０ｍｇ／Ｌ）、Ｌ−セリン５〜２７０ｍｇ／Ｌ（好ましくは１０〜２２０ｍｇ／Ｌ）、Ｌ−スレオニン５〜３５０ｍｇ／Ｌ（好ましくは１０〜３００ｍｇ／Ｌ）、Ｌ−トリプトファン１〜６５ｍｇ／Ｌ（好ましくは２〜５５ｍｇ／Ｌ）、Ｌ−チロシン二ナトリウム二水和物４〜４７０ｍｇ／Ｌ（好ましくは８〜３７０ｍｇ／Ｌ）、Ｌ−バリン１０〜４５０ｍｇ／Ｌ（好ましくは１１〜３５０ｍｇ／Ｌ）である。
ビタミンとしては、ｄ−ビオチン、Ｄ−パントテン酸、コリン、葉酸、ｍｙｏ−イノシトール、ナイアシンアミド、ピリドキサール、リボフラビン、チアミン、シアノコバラミン、ＤＬ−α−トコフェロール等があげられ、１種または２種以上組み合わせて用いられる。ビタミンの最終添加量は、例えば、ｄ−ビオチン０．００１〜０．４４ｍｇ／Ｌ（好ましくは０．０２〜０．３４ｍｇ／Ｌ）、Ｄ−パントテン酸カルシウム０．０１〜１６ｍｇ／Ｌ（好ましくは０．０２〜１４ｍｇ／Ｌ）、塩化コリン０．１〜２１ｍｇ／Ｌ（好ましくは３０．２〜１６ｍｇ／Ｌ）、葉酸０．０１〜２６ｍｇ／Ｌ（好ましくは０．０１〜２１ｍｇ／Ｌ）、ｍｙｏ−イノシトール０．０５〜３１０ｍｇ／Ｌ（好ましくは０．０５〜２１１ｍｇ／Ｌ）、ナイアシンアミド０．０２〜２６ｍｇ／Ｌ（好ましくは０．０２〜２１ｍｇ／Ｌ）、ピリドキサール一塩酸０．０２〜２１ｍｇ／Ｌ（好ましくは０．０２〜１６ｍｇ／Ｌ）、リボフラビン０．０１〜２．６ｍｇ／Ｌ（好ましくは０．０１〜２．１ｍｇ／Ｌ）、チアミン一塩酸０．０１〜２６ｍｇ／Ｌ（好ましくは０．０１〜２１ｍｇ／Ｌ）、シアノコバラミン０．００１〜５ｍｇ／Ｌ（好ましくは０．００２〜３ｍｇ／Ｌ）である。
本発明において培養液は、通常使われている培養液と細胞を分離する装置により効率的に分離され、濃縮された細胞液が元の培養槽に戻り、減少した分の新鮮培地が新たに供給される。このことにより常に培養環境が良好に保たれる。
本発明の細胞の場合、新鮮培地での培地交換率とは別に、増殖する細胞を細胞の増殖率に合わせて、培養系外へ捨てることによって系を安定させ、所望のポリペプチドの生産性を高めることができる。例えば、細胞を系外へ捨てる速度を細胞増殖率に合わせて、目的とする細胞密度が維持されるよう細胞の倍加時間に培養槽にある全細胞の２／５〜３／５を系外に出すことにより生産性の高い培養が可能となる。
本発明において培養は、通常ｐＨ６〜８、３０〜４０℃等の条件下で１０〜４０日間行う。また、培養中必要に応じて、ストレプトマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。なお、溶存酸素濃度制御、ｐＨ制御、温度制御、攪拌などは通常の動物細胞の培養に用いられる方法に準じて行うことができる。
上記のとおり、本発明にかかるラット細胞を培養し、所望のポリペプチドを生成蓄積させ、該培養物より該ポリペプチドを採取することにより、該ポリペプチドを製造することができる。
本発明の培養において、細胞を増殖させる場合には、培養液中のインシュリン濃度を１０ｍｇ／Ｌ以上、好ましくは２０ｍｇ／Ｌ以上に維持して培養することが好ましい。一方、所望のポリペプチドを生産させる場合には、例えば培養液中のインシュリン濃度を、１０ｍｇ／Ｌ以下、好ましくは５ｍｇ／Ｌ以下に維持して培養することが好ましい。なお、前培養において培地中にインシュリンが含まれていれば、抗体の生産性を高めるために、インシュリンは添加しなくてよいが、通常は培養液中にインシュリン濃度を０．０１〜１０ｍｇ／Ｌ、好ましくは０．０１〜５ｍｇ／Ｌになるように維持することが好ましい。
培養液中のインシュリン濃度を調節する方法は、インシュリンの濃度調整が可能である培養、例えばフェドバッチ培養、パーフージョン培養等の培養方法において、好適に用いられる。
本発明の製造方法としては、宿主細胞内にポリペプチドを生産させる直接発現方法、宿主細胞外にポリペプチドを分泌生産させる方法（モレキュラー・クローニング第２版）等があげられる。
所望のポリペプチドは、ポールソンらの方法〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４，１７６１９（１９８９）〕、ロウらの方法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６，８２２７（１９８９）、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖｅｌｏｐ．，４，１２８８（１９９０）〕、または特開平５−３３６９６３、ＷＯ９４／２３０２１等に記載の方法を準用することにより、宿主細胞外へ積極的に分泌させることができる。すなわち、遺伝子組換えの手法を用いて、本発明にかかるの手前にシグナルペプチドを付加した形で発現させることにより、所望のポリペプチドを宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。
また、特開平２−２２７０７５に記載されている方法に準じて、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子等を用いた遺伝子増幅系を利用することにより、所望のポリペプチドの生産量を上昇させることもできる。
本発明の方法により製造される所望のポリペプチドは、通常のポリペプチドの単離精製法を用いて単離精製することができる。
本発明の方法により製造されるポリペプチドが細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後、細胞を遠心分離により回収し、水系緩衝液にけん濁後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー、ダイノミル等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られる上清から、通常の酵素の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−セファロース、ＤＩＡＩＯＮ ＨＰＡ−７５（三菱化成社製）等のレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、Ｓ−セファロースＦＦ（ファルマシア社製）等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、プロテインＡを用いたアフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等を、単独あるいは組合わせて用い、精製標品を得ることができる。
本発明の方法により製造されるポリペプチドが細胞外に分泌された場合には、培養上清に該ポリペプチドを回収することができる。即ち、該培養物を上記と同様の遠心分離等の手法により処理することにより培養上清を取得し、該培養上清から、上記と同様の単離精製法を用いることにより、精製標品を得ることができる。
本発明の方法により製造されるポリペプチドのうち、免疫機能分子、特に抗体は抗体依存性細胞障害活性（ＡＤＣＣ活性）が高く、腫瘍、炎症、アレルギー等の疾患の治療等に有用である。
発明を実施するための最良の形態
以下に本発明の実施例を示す。
実施例１．抗ＧＤ３キメラ抗体の作製
１．抗ＧＤ３ヒトキメラ抗体のタンデム型発現ベクターｐＣｈｉＬＨＧＭ４の構築
抗ＧＤ３キメラ抗体のＬ鎖の発現ベクターｐＣｈｉ６４１ＬＧＭ４［Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１６７，２７１（１９９４）］を制限酵素ＭｌｕＩ（宝酒造社製）とＳａｌＩ（宝酒造社製）で切断して得られるＬ鎖ｃＤＮＡを含む約４．０３ｋｂの断片と動物細胞用発現ベクターｐＡＧＥ１０７［Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）］を制限酵素ＭｌｕＩ（宝酒造社製）とＳａｌＩ（宝酒造社製）で切断して得られるＧ４１８耐性遺伝子およびスプライシングシグナルを含む約３．４０ｋｂの断片をＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（宝酒造社製）を用いて連結し、大腸菌ＨＢ１０１株［モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ），ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９］を形質転換してプラスミドｐＣｈｉ６４１ＬＧＭ４０を構築した。
次に、上記で構築したプラスミドｐＣｈｉ６４１ＬＧＭ４０を制限酵素ＣｌａＩ（宝酒造社製）で切断後、ＤＮＡ Ｂｌｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ（宝酒造社製）を用いて平滑末端化し、さらにＭｌｕＩ（宝酒造社製）で切断して得られるＬ鎖ｃＤＮＡを含む約５．６８ｋｂの断片と抗ＧＤ３キメラ抗体のＨ鎖の発現ベクターｐＣｈｉ６４１ＨＧＭ４［Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ），１６７，２７１（１９９４）］を制限酵素ＸｈｏＩ（宝酒造社製）で切断後、ＤＮＡＢｌｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ（宝酒造社製）を用いて平滑末端化し、さらにＭｌｕＩ（宝酒造社製）で切断して得られるＨ鎖ｃＤＮＡを含む約８．４０ｋｂの断片をＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（宝酒造社製）を用いて連結、大腸菌ＨＢ１０１株［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９］を形質転換して抗ＧＤ３キメラ抗体のタンデム型発現ベクターｐＣｈｉ６４１ＬＨＧＭ４を構築した。
２．ラットミエローマ細胞ＹＢ２／０を用いた生産細胞の作製
実施例１の１項で構築した抗ＧＤ３キメラ抗体のタンデム型発現ベクターｐＣｈｉ６４１ＬＨＧＭ４の５μｇを４×１０６細胞／ｍｌのラットミエローマＹＢ２／０へエレクトロポレーション法［Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）］により導入後、４０ｍｌのＲＰＭＩ１６４０−ＦＢＳ（１０）［ＦＢＳ（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製）を１０％含むＲＰＭＩ１６４０培地］に懸濁し、９６ウェル培養用プレート（住友ベークライト社製）に２００μｌ／ウェルずつ分注した。５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃、２４時間培養した後、Ｇ４１８を０．５ｍｇ／ｍｌになるように添加して１〜２週間培養した。Ｇ４１８耐性を示す形質転換株のコロニーが出現し、増殖の認められたウェルより培養上清を回収し、上清中の抗ＧＤ３キメラ抗体の抗原結合活性を実施例１の３項に示すＥＬＩＳＡ法により測定した。
培養上清中に抗ＧＤ３キメラ抗体の生産が認められたウェルの形質転換株については、ＤＨＦＲ遺伝子増幅系を利用して抗体生産量を増加させる目的で、Ｇ４１８を０．５ｍｇ／ｍｌ、ＤＨＦＲの阻害剤であるメソトレキセート（以下、ＭＴＸという；シグマ社製）を５０ｎＭ含むＲＰＭＩ１６４０−ＦＢＳ（１０）培地に１〜２×１０５細胞／ｍｌになるように懸濁し、２４ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）に２ｍｌずつ分注した。５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃で１〜２週間培養して、５０ｎＭ ＭＴＸ耐性を示す形質転換株を誘導した。
形質転換株の増殖が認められたウェルの培養上清中の抗ＧＤ３キメラ抗体の抗原結合活性を実施例１の３項に示すＥＬＩＳＡ法により測定した。培養上清中に抗ＧＤ３キメラ抗体の生産が認められたウェルの形質転換株については、上記と同様の方法により、ＭＴＸ濃度を１００ｎＭ、２００ｎＭと順次上昇させ、最終的にＧ４１８を０．５ｍｇ／ｍｌ、ＭＴＸを２００ｎＭの濃度で含むＲＰＭＩ１６４０−ＦＢＳ（１０）培地で増殖可能かつ、抗ＧＤ３キメラ抗体を高生産する形質転換株を得た。得られた形質転換株については、２回の限界希釈法によるクローン化（単一細胞化）を行った。
このようにして得られた抗ＧＤ３キメラ抗体を生産する形質転換細胞クローン７−９−５１は、平成１１年４月５日付で工業技術院生命工学工業技術研究所（日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号）にＦＥＲＭ ＢＰ−６６９１として寄託されている。
３．抗体のＧＤ３に対する結合活性の測定（ＥＬＩＳＡ法）
抗体のＧＤ３に対する結合活性は以下のようにして測定した。
４ｎｍｏｌのＧＤ３を１０μｇのジパルミトイルフォスファチジルコリン（シグマ社製）と５μｇのコレステロール（シグマ社製）とを含む２ｍｌのエタノール溶液に溶解した。該溶液の２０μｌ（４０ｐｍｏｌ／ウェルとなる）を９６ウェルのＥＬＩＳＡ用のプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）の各ウェルにそれぞれ分注し、風乾後、１％牛血清アルブミン（シグマ社製：以下、ＢＳＡという）を含むＰＢＳ（以下、１％ＢＳＡ−ＰＢＳという）を１００μｌ／ウェルで加え、室温で１時間反応させて残存する活性基をブロックした。１％ＢＳＡ−ＰＢＳを捨て、形質転換株の培養上清或いは精製したヒト型キメラ抗体の各種希釈溶液を５０μｌ／ウェルで加え、室温で１時間反応させた。反応後、各ウェルを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（和光純薬社製）を含むＰＢＳ（以下、Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳという）で洗浄後、１％ＢＳＡ−ＰＢＳで３０００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＆Ｌ）抗体溶液（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｑｕａｌｅｘ社製）を二次抗体溶液として、５０μｌ／ウェルで加え、室温で１時間反応させた。反応後、Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、ＡＢＴＳ基質液［２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）アンモニウムの０．５５ｇを１Ｌの０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ４．２）に溶解し、使用直前に過酸化水素を１μｌ／ｍｌで添加した溶液）を５０μｌ／ウェルで加えて発色させ、４１５ｎｍの吸光度（以下、ＯＤ４１５という）を測定した。
実施例２
抗ＧＤ３抗体を生産する形質転換細胞クローン７−９−５１（ＦＥＲＭ ＢＰ−６６９１）の無血清培地への馴化を行った。培養はいずれも温度３７℃、ＣＯ２濃度５％、培養液量５ｍｌでの、Ｔ型フラスコによる静置継代培養とし、継代時には遠心分離により、培養液から新鮮培地への全量交換を実施した。
ＦＥＲＭ ＢＰ−６６９１を、ＩＭＤ培地（ライフテクノロジー社製）および２００ｎＭ ＭＴＸ（シグマ社製）からなる無血清馴化用基本培地に牛血清アルブミン（ＢＳＡ：ＪＲＨ社製）、インシュリン（ライフテクノロジー社製）およびトランスフェリン（ライフテクノロジー社製）を含有してなる血清添加培地に、２〜４×１０５細胞／ｍｌ接種し、継代期間を２〜４日として継代培養を行った。
上記継代培養で得られた細胞を該基本培地に５％（ｖ／ｖ）γ線照射透析牛胎児血清（ｄＦＢＳ；ライフテクノロジー社製）および１００ｎＭ Ｔ３を含有してなる血清添加培地により継代培養を行った後、該基本培地に０．２％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ、５０ｍｇ／Ｌインシュリンおよび５０ｍｇ／Ｌトランスフェリンを含有してなる培地で９継代２７日間、該基本培地に０．２％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ、２０ｍｇ／Ｌインシュリンおよび２０ｍｇ／Ｌトランスフェリンを含有してなる培地で１継代３日間、該基本培地に０．１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ、２０ｍｇ／Ｌインシュリンおよび２０ｍｇ／Ｌトランスフェリンを含有してなる培地で１継代３日間、該基本培地に０．０５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ、１０ｍｇ／Ｌインシュリンおよび１０ｍｇ／Ｌトランスフェリンを含有する培地で、１継代３日間の継代培養を連続的に実施した。
無血清培地に馴化した細胞株を作製する際に、該基本培地に０．２％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ、５０ｍｇ／Ｌインシュリンおよび５０ｍｇ／Ｌトランスフェリンを含有してなる培地で２７日間の培養期間中、細胞の生存率が断続的に低下した。そこで、種々検討した結果、培地への細胞接種時の細胞密度を４×１０５細胞／ｍｌにすることにより、細胞の生存率を維持しながら無血清培地に馴化させることができた。
無血清培地に馴化させたラット細胞について、限界希釈法により細胞の単一化を、以下のとおり実施した。
９６ウエルプレートに０．２５細胞／ウエル、０．２ｍｌ／ウエルになるよう細胞懸濁液を調製して接種した。合計１６３２ウエルに播種した結果、７２クローンを得た。６ウエルプレート、三角フラスコと拡大し、生産性と増殖性を考慮しながら、３クローンを選択した。このうち、生産性の高いクローン株を６１−３３γ株とした。無血清培地に馴化した細胞株６１−３３γ株は、平成１２年１０月１３日付で工業技術院生命工学工業技術研究所（日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号）にＦＥＲＭ ＢＰ−７３２５として寄託されている。
なお、上記方法で得られた無血清培地に馴化した細胞株６１−３３γ株は、無血清培地である該基本培地に０．２％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ、１０ｍｇ／Ｌインシュリン、１０ｍｇ／Ｌトランスフェリンおよび２００ｎＭ ＭＴＸを含有してなる培地中で継代期間を３〜５日として継代培養を行うことより、１１０日間にわたって安定して継代培養を行うことができた。
また、ＦＥＲＭ ＢＰ−７３２５をＨｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ培地に０．１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡおよび２００ｎＭ ＭＴＸを含有してなる無血清培地に３×１０６細胞／ｍｌとなるよう接種し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで３日間のバッチ培養を行った。その結果、培養終了時において、細胞濃度は１７．５×１０６細胞／ｍｌであり、上清から得られる抗体濃度は３９ｍｇ／Ｌであった。
一方、ＦＥＲＭ ＢＰ−６６９１をＩＭＤ培地に１０％（ｖ／ｖ）ｄＦＢＳおよび２００ｎＭ ＭＴＸを含有してなる血清培地に３×１０６細胞／ｍｌとなるよう接種し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで３日間のバッチ培養を行った。その結果、培養終了時において、細胞濃度は１４．２×１０６細胞／ｍｌであり、上清から得られる抗体濃度は２８ｍｇ／Ｌであった。
実施例３
スピナーフラスコに無血清培地を加え、ＦＥＲＭ ＢＰ−７３２５のバッチ培養を行った。
ＦＥＲＭ ＢＰ−７３２５を無血清培地（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ培地；ライフテクノロジー社製）３０ｍｌを入れたＴ−２２５ｃｍ２フラスコを用いて、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内で３日間静置培養した。得られたＦＥＲＭ ＢＰ−７３２５を、０．７Ｌの無血清培地（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ培地；ライフテクノロジー社製）を入れた１Ｌ容スピナーフラスコ（柴田ハリオ社製）に、３×１０５細胞／ｍｌ接種した。
培養液のｐＨを７．１±０．１、溶存酸素濃度を５±０．２ｐｐｍに制御しながら、攪拌速度３０ｒｐｍで攪拌培養を行った。通気はスピナーフラスコ内に設置した多孔性テフロンチューブを用い空気、酸素、二酸化炭素の混合ガスを供給した。ｐＨの制御は空気と二酸化炭素の比率を変えること、および１Ｍ炭酸ナトリウム溶液の供給することにより行った。また、溶存酸素濃度の制御は空気と酸素の比率を変えることにより行った。
結果を図１および図２に示す。
図１および図２に示されるとおり、細胞増殖は培養３日目までは対数増殖を示したものの、培養３日目以降は比増殖速度が低下した。生細胞濃度は４日目に最大値約３×１０６細胞／ｍｌに達した後、急激に低下し、培養６日目には生存率が１０％以下に低下したため、培養を終了した。
抗体の生産量は、培養６日間で４５ｍｇ／Ｌであり、バッチ培養による抗体生産速度は７．５ｍｇ／Ｌ／日であった。
実施例４
スピナーフラスコに無血清培地を加え、ＦＥＲＭ ＢＰ−７３２５のフェドバッチ培養を行った。
ＦＥＲＭ ＢＰ−７３２５を無血清培地（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ培地；ライフテクノロジー社製）３０ｍｌを入れたＴ−２２５ｃｍ２フラスコを用いて、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内で３日間静置培養した。得られたＦＥＲＭ ＢＰ−７３２５を、０．７ＬのＨｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ培地を入れた１Ｌ容スピナーフラスコ（柴田ハリオ社製）に、３×１０５細胞／ｍｌ接種した。
通常の添加濃度より高濃度に調整された、アミノ酸（Ｌ−アラニン０．１４０ｇ／Ｌ、Ｌ−アルギニン一塩酸０．４７０ｇ／Ｌ、Ｌ−アスパラギン一水和物０．１５９ｇ／Ｌ、Ｌ−アスパラギン酸０．１６８ｇ／Ｌ、Ｌ−シスチン二塩酸０．５１１ｇ／Ｌ、Ｌ−グルタミン酸０．４２０ｇ／Ｌ、Ｌ−グルタミン４．６７７ｇ／Ｌ、グリシン０．１６８ｇ／Ｌ、Ｌ−ヒスチジン一塩酸二水和物０．２３５ｇ／Ｌ、Ｌ−イソロイシン０．５８８ｇ／Ｌ、Ｌ−ロイシン０．５８８ｇ／Ｌ、Ｌ−リジン一塩酸０．８１８ｇ／Ｌ、Ｌ−メチオニン０．１６８ｇ／Ｌ、Ｌ−フェニルアラニン０．３７０ｇ／Ｌ、Ｌ−プロリン０．２２４ｇ／Ｌ、Ｌ−セリン０．２３５ｇ／Ｌ、Ｌ−スレオニン０．５３２ｇ／Ｌ、Ｌ−トリプトファン０．０９０ｇ／Ｌ、Ｌ−チロシン二ナトリウム二水和物０．５８１ｇ／Ｌ、Ｌ−バリン０．５２６ｇ／Ｌ）、ビタミン（ｄ−ビオチン０．０７２８ｍｇ／Ｌ、Ｄ−パントテン酸カルシウム０．０２２４ｇ／Ｌ、塩化コリン０．０２２４ｇ／Ｌ、葉酸０．０２２４ｇ／Ｌ、ｍｙｏ−イノシトール０．０４０３ｇ／Ｌ、ナイアシンアミド０．０２２４ｇ／Ｌ、ピリドキサール塩酸０．０２２４ｇ／Ｌ、リボフラビン０．００２２４ｇ／Ｌ、チアミン塩酸０．０２２４ｇ／Ｌ、シアノコバラミン０．０７２８ｍｇ／Ｌ）、インシュリン０．２ｇ／Ｌ、トランスフェリン０．２ｇ／Ｌ、アルブミン１．６ｇ／Ｌから構成されるフィード培地を、アミノ酸の比消費速度から推測される消費量を補う目的で累積生細胞濃度が４×１０６細胞／ｍｌ×日を超えた場合に、１回以内／１日の頻度で０．０７Ｌずつ添加するようにした。すなわち、培養３日目、５日目、６日目、７日目、８日目に、フィード培地を０．０７Ｌずつ添加した。また、培養３日目以降、添加直後の培養液中のグルコース濃度が約２５００ｍｇ／Ｌとなるように、１００ｇ／Ｌグルコース溶液を適時添加した。
培養液のｐＨを７．１±０．１、溶存酸素濃度を５±０．２ｐｐｍに制御しながら、攪拌速度３０ｒｐｍで攪拌培養を行った。通気はスピナーフラスコ内に設置した多孔性テフロンチューブを用い空気、酸素、二酸化炭素の混合ガスを供給した。ｐＨの制御は空気と二酸化炭素の比率を変えること、および１Ｍ炭酸ナトリウム溶液を供給することにより行った。また、溶存酸素濃度の制御は空気と酸素の比率を変えることにより行った。
その結果を図１および図２に示す。
細胞増殖は培養５日目まで対数増殖を示し、培養５日目以降は比増殖速度が低下するものの、培養６日目に生細胞濃度は約１×１０７細胞／ｍｌにまで達した。
生細胞濃度が最大値に達した後、生細胞濃度および生存率が緩やかに低下し、培養１０日目に生存率が２０％以下に低下したため、培養を終了した。
抗体の生産量は、培養１０日間で２６０ｍｇ／Ｌを示した。フェドバッチ培養による抗体生産速度は２６．０ｍｇ／Ｌ／日であり、同一スケールのバッチ培養と比較して、抗体生産速度が約３．５倍に向上した。
実施例５
スピナーフラスコに無血清培地を加え、ＦＥＲＭ ＢＰ−７３２５の連続培養を行った。なお、連続培養におけるパーフュージョンを実施するため、細胞濃縮液と培養上清の固液分離には、遠心分離器を用いた。
ＦＥＲＭ ＢＰ−７３２５を無血清培地（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ培地；ライフテクノロジー社製）３０ｍｌを入れたＴ−２２５ｃｍ２フラスコを用いて、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内で３日間静置培養した。得られたＦＥＲＭ ＢＰ−７３２５を、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ培地にアミノ酸（Ｌ−アラニン０．２２０ｇ／Ｌ、Ｌ−アルギニン一塩酸０．７３９ｇ／Ｌ、Ｌ−アスパラギン一水和物０．２６４ｇ／Ｌ、Ｌ−アスパラギン酸０．２２０ｇ／Ｌ、Ｌ−シスチン二塩酸塩０．８０３ｇ／Ｌ、１−グルタミン酸０．６６０ｇ／Ｌ、Ｌ−グルタミン７．３４ｇ／Ｌ、グリシン０．２６４ｇ／Ｌ、Ｌ−ヒスチジン一塩酸二水和物０．３７０ｇ／Ｌ、Ｌ−イソロイシン０．９２４ｇ／Ｌ、Ｌ−ロイシン０．９２４ｇ／Ｌ、Ｌ−リジン一塩酸１．２８５ｇ／Ｌ、Ｌ−メチオニン０．２６４ｇ／Ｌ、Ｌ−フェニルアラニン０．５８１ｇ／Ｌ、Ｌ−プロリン０．３５２ｇ／Ｌ、Ｌ−セリン０．３７０ｇ／Ｌ、Ｌ−スレオニン０．８３６ｇ／Ｌ、Ｌ−トリプトファン０．１４１ｇ／Ｌ、Ｌ−チロシン二ナトリウム二水和物０．９１５ｇ／Ｌ、Ｌ−バリン０．８２７ｇ／Ｌ）、ビタミン（ｄ−ビオチン０．１１４ｍｇ／Ｌ、Ｄ−ｐンｔｐテン酸カルシウム０．０３５２ｇ／Ｌ、塩化コリン０．０３５２ｇ／Ｌ、葉酸０．０３５２ｇ／Ｌ、ｍｙｏ−イノシトール０．０６３４ｇ／Ｌ、ナイアンシンアミド０．０３５２ｇ／Ｌ、ピリドキサール塩酸０．０３５２ｇ／Ｌ、リボフラビン０．００３５２ｇ／Ｌ、チアミン塩酸塩０．０３５２ｇ／Ｌ、シアノコバラミン０．１１４ｍｇ／Ｌ）、インシュリン（０．３ｇ／Ｌ）、トランスフェリン（０．３ｇ／Ｌ）およびアルブミン（２．５ｇ／Ｌ）からなる補強培地を１８％（ｖ／ｖ）添加した培地を１Ｌ入れた１Ｌ容スピンナーフラスコ（柴田ハリオ社製）に、３×１０５細胞／ｍｌとなるように播種した。
パーフュージョンは１×１０６細胞／ｍｌに到達したところで開始した。その後、パーフュージョン速度（ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ ｒａｔｅ）、すなわち１日当たりの培地交換率を細胞数に応じて上昇させ、１Ｌ／日としたところで、生細胞数の維持期間に入った。なお、固液分離装置は培養細胞用の小型連続遠心機（Ｌａｂ−ＩＩ：ソーバル社製）を使用した。
培養細胞用の小型連続遠心機の回転速度は、培養開始から生細胞濃度が１×１０７細胞／ｍｌに達するまで８００ｒｐｍとし、生細胞濃度が１×１０７細胞／ｍｌに達した後は４００ｒｐｍ（１８×Ｇ）とし、３５日間の培養を行った。
なお、回転速度を８００ｒｐｍに設定した場合、ほぼ全ての細胞が系内に回収され、系外には細胞がほとんど含まれない培養上清のみが排出された。また、４００ｒｐｍに設定した場合、全細胞数の１／２の細胞が系外へ排出されるため、系外へ排出される細胞数と増殖した細胞数とが均衡し、細胞濃度が一定に保持された。
ＦＥＲＭ ＢＰ−７３２５のパーフュージョン培養期間中の生細胞濃度および生存率を図３に示す。
図３に示されるとおり、生細胞濃度は培養開始５日目以降の３０日間は１×１０７細胞／ｍｌに、生存率は培養期間を通じて９０％に、それぞれ維持されていた。また、抗体の生産量は、培養３５日間で２２００ｍｇ／Ｌを示した。パーフュージョン培養による抗体の生産速度は、６２．９ｍｇ／Ｌ／日であった。
実施例６
ＦＥＲＭ ＢＰ−７３２５を、インシュリンを含有しないＨｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ培地（ライフテクノロジー社製）に２０ｍｇ／Ｌとなるようにインシュリンを添加した培地の入ったＴ−７５フラスコ中に接種して、継代培養した。培養終了後、培養液を遠心分離して上清を除去し、細胞を回収した。回収した細胞をインシュリンを含有しないＨｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ培地の入ったＴ−７５の静置培養フラスコ中に接種し、３日間培養した。培養終了後、培養液を遠心分離して上清を除去し、細胞を回収した。
回収した細胞を、インシュリンを含有しないＨｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ培地にそれぞれ０、５、１０および２０ｍｇ／Ｌとなるようにインシュリンを添加した培地に懸濁した後、Ｔ−フラスコへ接種し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内で６日間静置培養した。
培養終了後、培養液中の生細胞数と抗体濃度を測定し、抗体濃度の比生産速度を算出した。
結果を、第１表に示す。
第１表に示されるとおり、インシュリンを添加しなかった培地、つまりインシュリンがごく微量に残っている培地で抗体の生産性が一番高くなり、インシュリンを５ｍｇ／Ｌ含有する培地でも抗体の生産性が高くなった。
なお、細胞増殖率はインシュリンの濃度依存的に若干低下したが、顕著な低下は認められなかった。
産業上の利用可能性
本発明によれば、ラット細胞を用いた所望のポリペプチドの製造方法を提供することができる。特に、本発明の方法で得られる抗体は、ＡＤＣＣ活性が高く、医薬品として有用である。
【図面の簡単な説明】
図１ 無血清培地に馴化した抗ＧＤ３キメラ抗体生産細胞株６１−３３γ（ＦＥＲＭ ＢＰ−７３２５）の培養における、生細胞濃度と生存率の推移を示す。
図２ 無血清培地に馴化した抗ＧＤ３キメラ抗体生産細胞株６１−３３γ（ＦＥＲＭ ＢＰ−７３２５）の培養における、抗ＧＤ３キメラ抗体ＫＭ−８７１の抗体濃度の推移を示す。
図３ 無血清培地に馴化した抗ＧＤ３キメラ抗体生産細胞株６１−３３γ（ＦＥＲＭ ＢＰ−７３２５）のパーフュージョン培養における、生細胞濃度と生存率の推移を示す。
本発明は、ラット細胞を用いた所望のポリペプチドの製造方法に関する。詳しくは、ＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０（以下、ＹＢ２／０という）等のラット細胞、好ましくは免疫機能分子等の所望のポリペプチドをコードするＤＮＡを含有する組換え体ＤＮＡを導入してなるラット細胞を、血清を含有しない培地（以下、無血清培地という）で培養することによる、該ポリペプチドの製造方法に関する。本発明の方法で得られる所望のポリペプチドのうち、例えばＹＢ２／０の形質転換細胞を用いて得られる抗体は抗体依存性細胞障害活性（以下、ＡＤＣＣ活性ともいう）が高く、医薬品として有用である。
背景技術
抗体等の免疫機能を有するポリペプチドは、さまざまな医薬品用途を示し、その有用性は腎移植の拒絶反応の低減化、ＲＳＶ小児感染に対する抗ウイルス剤、乳がんに対する抗ガン剤として医薬品に応用されている。また、抗体医薬はその重要性が今後ますます高くなると予想されている。
例えば、抗体をコードする遺伝子を用いて抗体を製造するには、抗体をコードする遺伝子を導入したベクターを保有する組換え細胞を培養し、培養物中に生産される抗体を採取することにより行うが、当該遺伝子組換え抗体は動物細胞からしか完全な形で生産されることはないため、遺伝子組換え抗体の製造は動物細胞を用いて行うことが好ましい。
動物細胞または組換え動物細胞を用いての有用物質の生産は、研究や産業化を目的として広く行われている。動物細胞を培養して物質を生産する方法においては、通常培地中に血清を存在させて培養する。しかしながら、血清が存在するとそのロット差が細胞収率や物質生産に大きな影響を与える。従って、動物細胞を用いて物質生産をする場合、血清を含有しない培地で培養することが望まれる。
ラットミエローマ細胞系であるＹＢ２／３．０Ａｇ３０（以下、ＹＯという）を無蛋白培地中で培養する方法は知られている〔Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１７，１９３（１９９５）〕。また、無血清培地を用いて動物細胞を培養し、ポリペプチドを生産する方法は知られている。〔Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．，１０，８７（１９９４）、Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９，２７（１９９６）、特公平６−７０７５７〕さらに、血清を含む培地中で増殖させたラット細胞の形質転換体を無血清培地に接種し、該培地中で培養してポリペプチドを生産する方法も知られている（特表昭６２−５０２３７７）。
しかし、無血清培地に馴化させたラット細胞を用いて所望のポリペプチドを長期間安定に生産する方法は知られていない。
一方、動物細胞の培養方法としては、新鮮培地へ細胞を接種し、そのまま一定時間後に培養を終了する培養方法、すなわち、バッチ培養方法が主として用いられている。しかし、バッチ培養で動物細胞を培養すると、培養中における栄養分の枯渇、細胞からの老廃物の蓄積等、培養環境の劣化が顕著に現れるため、細胞増殖や所望のポリペプチドの生産性が低くなることが知られている。結果として、培養物中に含まれる該ポリペプチドの濃度が低くなるため、培養物中に占める所望のポリペプチド以外の蛋白質成分、例えば細胞に由来する蛋白質または培地に由来する蛋白質などの濃度が相対的に高くなる。このため、該ポリペプチドを分離、精製する工程における負荷が増大し、生産コストが高くなるという欠点がある。
発明の開示
本発明の目的は、ラット細胞を用いて所望のポリペプチドを効率よく製造する方法を提供することにある。
本発明は、以下の（１）〜（２４）に関する。
（１）無血清培地に馴化したラット細胞株を無血清培地で培養し、培養物中から所望のポリペプチドを採取することを特徴とするポリペプチドの製造方法。
（２）無血清培地に馴化したラット細胞株が無血清培地に２ヶ月以上増殖継代できるラット細胞株である、（１）に記載の製造方法。
（３）ラット細胞がミエローマ細胞またはミエローマ細胞系の雑種細胞である（１）または（２）に記載の方法。
（４）ラット細胞がＹＢ２／０である（１）または（２）に記載の方法。
（５）細胞が所望のポリペプチドをコードするＤＮＡを含有する組換え体ＤＮＡを導入してなる細胞である、（１）〜（４）のいずれかに記載の方法。
（６）培養がバッチ培養、フェドバッチ培養またはパーフュージョン培養である、（１）〜（５）のいずれかに記載の方法。
（７）培養中に、栄養因子および生理活性物質から選ばれる少なくとも一種を培地に添加する、（１）〜（６）のいずれかに記載の方法。
（８）栄養因子がグルコース、アミノ酸およびビタミンから選ばれる少なくとも一種である、（７）に記載の方法。
（９）生理活性物質が、インシュリン、トランスフェリンおよびアルブミンから選ばれる少なくとも一種である（７）に記載の製造方法。
（１０）所望のポリペプチドが免疫機能分子である、（１）〜（９）のいずれかに記載の方法。
（１１）免疫機能分子が蛋白質またはペプチドである、（１０）に記載の方法。
（１２）蛋白質またはペプチドが、抗体、抗体の断片または抗体のＦｃ領域を有する融合蛋白質である、（１１）に記載の方法。
（１３）抗体が、腫瘍関連抗原を認識する抗体、アレルギーもしくは炎症に関連する抗原を認識する抗体、循環器疾患に関連する抗原を認識する抗体、自己免疫疾患に関連する抗原を認識する抗体、またはウイルスもしくは細菌感染に関連する抗原を認識する抗体である、（１２）に記載の方法。
（１４）腫瘍関連抗原を認識する抗体が抗ＧＤ２抗体、抗ＧＤ３抗体、抗ＧＭ２抗体、抗ＨＥＲ２抗体、抗ＣＤ５２抗体、抗ＭＡＧＥ抗体、抗塩基性繊維芽細胞増殖因子抗体、抗塩基性繊維芽細胞増殖因子受容体抗体、抗ＦＧＦ８抗体、抗ＦＧＦ８受容体抗体、抗インシュリン様増殖因子抗体、抗ＰＭＳＡ抗体、抗血管内皮細胞増殖因子抗体または抗血管内皮細胞増殖因子受容体抗体であり、アレルギーまたは炎症に関連する抗原を認識する抗体が抗インターロイキン６抗体、抗インターロイキン６受容体抗体、抗インターロイキン５抗体、抗インターロイキン５受容体抗体、抗インターロイキン４抗体、抗インターロイキン４受容体抗体、抗腫瘍壊死因子抗体、抗腫瘍壊死因子受容体抗体、抗ＣＣＲ４抗体、抗ケモカイン抗体または抗ケモカイン受容体抗体であり、循環器疾患に関連する抗原を認識する抗体が抗ＧｐＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体、抗血小板由来増殖因子抗体、抗血小板由来増殖因子受容体抗体または抗血液凝固因子抗体であり、自己免疫疾患に関連する抗原を認識する抗体が抗自己ＤＮＡ抗体であり、ウイルスまたは細菌感染に関連する抗原を認識する抗体が抗ｇｐ１２０抗体、抗ＣＤ４抗体、抗ＣＣＲ４抗体または抗ベロ毒素抗体である、（１３）に記載の方法。
（１５）抗体が抗ＧＤ３ヒト型キメラ抗体、ヒト化抗インターロイキン５受容体α鎖抗体または抗ＧＭ２ヒト型ＣＤＲ移植抗体である、（１３）に記載の方法。
（１６）ラット細胞を、培養液中のインシュリン濃度を１０ｍｇ／Ｌ以上に維持して培養した後、培養液中のインシュリン濃度を１０ｍｇ／Ｌ以下に維持して培養する、（１）〜（１５）のいずれかに記載の方法。
（１７）細胞密度を１×１０５〜１×１０６細胞／ｍｌとなるように、ラット細胞を馴化培地へ接種することを特徴とする、ラット細胞の無血清培地への馴化方法。
（１８）ラット細胞がミエローマ細胞またはミエローマ細胞系の雑種細胞である（１７）に記載の方法。
（１９）ラット細胞がＹＢ２／０である（１７）に記載の方法。
（２０）細胞が所望のポリペプチドをコードするＤＮＡを含有する組換え体ＤＮＡを導入された細胞である、（１７）〜（１９）のいずれかに記載の方法。
（２１）（１７）〜（２０）のいずれかに記載の方法でラット細胞を無血清培地に馴化させた後、クローン化することを特徴とする、無血清培地に馴化したラット細胞株の製造方法。
（２２）（２１）に記載の方法で得られる無血清培地に馴化したラット細胞株。
（２３）無血清培地に馴化したラット細胞株が無血清培地に２ヶ月以上増殖継代できるラット細胞株である、（２２）に記載の細胞株。
（２４）無血清培地に馴化したラット細胞株６１−３３γ（ＦＥＲＭ ＢＰ−７３２５）。
本発明の細胞としては、ラット細胞であればいずれも用いられるが、所望のポリペプチドをコードするＤＮＡを含有する組換え体ＤＮＡを導入してなるラット細胞が好ましい。ラット細胞としては、例えばＹ３ Ａｇ１．２．３．（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６３１）、ＹＯ（ＥＣＡＣＣ Ｎｏ：８５１１０５０１）、ＹＢ２／０（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６６２）等、ミエローマ細胞またはミエローマ細胞系の雑種細胞が好適に用いられる。また、これらの細胞に変異処理を施したり、ヒト以外の哺乳動物に抗原を免疫して取得されたＢ細胞と細胞融合等によって得られ、これらの細胞と同等の性質を有する細胞も、本発明の細胞に含まれる。
本発明の所望のポリペプチドとしては、真核細胞ポリペプチドが好ましく、ほ乳動物細胞ポリペプチドがさらに好ましい。真核細胞ポリペプチドは少なくとも１部分が真核細胞ポリペプチドであれば、融合ポリペプチド等、人工的に改変されたポリペプチドであっても、その部分断片であってよい。
また、本発明のポリペプチドは、抗体等の免疫機能分子、酵素等の生体触媒分子、構造蛋白質等の構造の形成・保持分子など、いずれであってもよいが、免疫機能分子であることが好ましい。
免疫機能分子としては、生体内で免疫反応に関与する蛋白質またはペプチド等のポリペプチドであれば、例えばインターフェロン分子であるインターロイキン−２（ＩＬ−２）［Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９３，１００７（１９７６）］、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）［Ｊ．Ｌｅｕｃ．Ｂｉｏｌ．，５５，２８０（１９９４）］、コロニー刺激因子である顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５８，９０１７（１９８３）］、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）［Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７３，２６９（１９９２）］、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５２，１９９８（１９７７）］、増殖因子であるエリスロポイエチン（ＥＰＯ）［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５２，５５５８（１９７７）］、トロンボポイエチン（ＴＰＯ）［Ｎａｔｕｒｅ，３６９，５３３（１９９４）］等、いかなるものであってもよい。
抗体とは、外来抗原刺激の結果、免疫反応によって生体内に産生される蛋白質で、抗原と特異的に結合する活性を有するものをいう。
抗体としては、動物に抗原を免疫し、免疫動物の脾臓細胞より作製したハイブリドーマ細胞が分泌する抗体の他、遺伝子組換え技術により作製された抗体、すなわち、抗体遺伝子を挿入した抗体発現ベクターを、宿主細胞へ導入することにより取得された抗体などがあげられる。具体的には、ハイブリドーマが生産する抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体などをあげることができる。
本発明において、ハイブリドーマとは、ヒト以外の哺乳動物に抗原を免疫して取得されたＢ細胞と、ラットに由来するミエローマ細胞とを細胞融合させて得られる、所望の抗原特異性を有したモノクローナル抗体を産生する細胞を意味する。
ヒト化抗体としては、ヒト型キメラ抗体、ヒト型相同性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ：以下、ＣＤＲという）移植抗体などがあげられる。
ヒト型キメラ抗体は、ヒト以外の動物の抗体重鎖可変領域（以下、重鎖はＨ鎖として、可変領域はＶ領域としてＨＶまたはＶＨともいう）および抗体軽鎖可変領域（以下、軽鎖はＬ鎖としてＬＶまたはＶＬともいう）とヒト抗体の重鎖定常領域（以下、定常領域はＣ領域としてＣＨともいう）およびヒト抗体の軽鎖定常領域（以下、ＣＬともいう）とからなる抗体を意味する。ヒト以外の動物としては、マウス、ラット、ハムスター、ラビット等、ハイブリドーマを作製することが可能であれば、いかなるものも用いることができる。
ヒト型キメラ抗体は、モノクローナル抗体を生産するハイブリドーマよりＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ヒト抗体ＣＨおよびヒト抗体ＣＬをコードする遺伝子を有する宿主細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築し、宿主細胞へ導入することにより発現させ、製造することができる。
ヒト型キメラ抗体のＣＨとしては、ヒトイムノグロブリン（以下、ｈＩｇという）に属すればいかなるものでもよいが、ｈＩｇＧクラスのものが好適であり、さらにｈＩｇＧクラスに属するｈＩｇＧ１、ｈＩｇＧ２、ｈＩｇＧ３、ｈＩｇＧ４といったサブクラスのいずれも用いることができる。また、ヒト型キメラ抗体のＣＬとしては、ｈＩｇに属すればいかなるものでもよく、κクラスあるいはλクラスのものを用いることができる。
ヒト型ＣＤＲ移植抗体は、ヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列をヒト抗体のＶＨおよびＶＬの適切な位置に移植した抗体を意味する。
ヒト型ＣＤＲ移植抗体は、ヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲ配列を任意のヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲ配列に移植したＶ領域をコードするｃＤＮＡを構築し、ヒト抗体のＣＨおよびヒト抗体のＣＬをコードする遺伝子を有する宿主細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト型ＣＤＲ移植抗体発現ベクターを構築し、該発現ベクターを宿主細胞へ導入することによりヒト型ＣＤＲ移植抗体を発現させ、製造することができる。
ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＣＨとしては、ｈＩｇに属すればいかなるものでもよいが、ｈＩｇＧクラスのものが好適であり、さらにｈＩｇＧクラスに属するｈＩｇＧ１、ｈＩｇＧ２、ｈＩｇＧ３、ｈＩｇＧ４といったサブクラスのいずれも用いることができる。また、ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＣＬとしては、ｈＩｇに属すればいかなるものでもよく、κクラスまたはλクラスのものを用いることができる。
免疫機能分子としては、例えば、ヒト型キメラ抗体、ヒト化抗体、一本鎖抗体等が挙げられる。具体的には、ガングリオシドＧＤ３に対する抗体（以下、抗ＧＤ３抗体という）、ヒトインターロイキン５受容体α鎖に対する抗体（以下、抗ＩＬ−５受容体α鎖抗体という）等があげられる。例えば、抗ＧＤ３抗体としては、抗ガングリオシドＧＤ３ヒト型キメラ抗体（以下、抗ＧＤ３キメラ抗体という）ＫＭ−８７１（特開平５−３０４９８９）、抗ＩＬ−５受容体α鎖抗体としては、ヒト化抗ＩＬ−５受容体α鎖抗体ＫＭ８３９９（ＷＯ９７／１０３５４）、抗ＧＭ２ヒト型ＣＤＲ移植抗体ＫＭ８９６６、ＫＭ８９６７、ＫＭ８９６９またはＫＭ８９７０（特開平１０−２５７８９３）等をコードするＤＮＡがあげられる。
所望のポリペプチドをコードするＤＮＡは、該ポリペプチドを発現できるものであればいずれでも用いられるが、免疫機能分子をコードするＤＮＡであることが好ましい。
所望のポリペプチドをコードするＤＮＡを含有する組換え体ベクターを調製するために用いらる発現ベクターとしては、例えば、ｐｃＤＮＡＩ、ｐｃＤＭ８（フナコシ社製）、ｐＡＧＥ１０７〔特開平３−２２９７９、Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）〕、ｐＡＳ３−３（特開平２−２２７０７５）、ｐＣＤＭ８〔Ｎａｔｕｒｅ，３２９，８４０（１９８７）〕、ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＲＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＡＧＥ１０３〔Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０１，１３０７（１９８７）〕、ｐＡＧＥ２１０等があげられる。
プロモーターとしては、本発明で用いる動物細胞中で機能するものであればいずれも用いることができ、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のＩＥ（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ ｅａｒｌｙ）遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０の初期プロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、ＳＲαプロモーター等をあげることができる。また、ヒトＣＭＶのＩＥ遺伝子のエンハンサーをプロモーターとともに用いてもよい。
宿主細胞としては、ラット細胞であればいずれも用いられるが、例えばＹ３Ａｇ１．２．３．、ＹＯ、ＹＢ２／０等、ミエローマ細胞またはミエローマ細胞系の雑種細胞が好適に用いられる。また、これらの細胞に変異処理を施したり、ヒト以外の哺乳動物に抗原を免疫して取得されたＢ細胞と細胞融合等によって得られ、これらの細胞と同等の性質を有する細胞も、本発明の細胞に含まれる。
ラット細胞への組換え体ベクターの導入方法としては、当該細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法〔Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）〕、リン酸カルシウム法（特開平２−２２７０７５）、リポフェクション法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，７４１３（１９８７）、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２，４５６（１９７３）〕等をあげることができる。
上記方法で組換え体ベクターを導入された細胞を、適当な培地中で培養することにより、細胞内または培養上清中に、所望のポリペプチドを生産することができる。
本発明の細胞としては、例えば抗ＧＤ３ヒト型キメラ抗体を生産する形質転換細胞７−９−５１（ＦＥＲＭ ＢＰ−６６９１）、抗ＩＬ−５受容体α鎖キメラ抗体を生産する形質転換細胞ＫＭ７３９９（ＦＥＲＭ ＢＰ−５６４９）、抗ＩＬ−５受容体α鎖ヒト型ＣＤＲ移植抗体を生産する形質転換細胞ＫＭ９３９９（ＦＥＲＭ ＢＰ−５６４７）、抗ＧＭ２ヒト型ＣＤＲ移植抗体を生産する形質転換細胞ＫＭ８９６６（ＦＥＲＭ ＢＰ−５１０５）、ＫＭ８９６７（ＦＥＲＭ ＢＰ−５１０６）、ＫＭ８９６９（ＦＥＲＭ ＢＰ−５５２７）およびＫＭ８９７０（ＦＥＲＭ ＢＰ−５５２８）等があげられる。
本発明の無血清培地への馴化方法としては、血清を含有する培地で継代したラット細胞を市販の無血清培地等へ直接馴化させる方法や連続馴化の方法（Ｃｅｌｌ ＆ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ，ＪＯＨＯＮ ＷＩＬＥＹ ＆ ＳＯＮＳ ２Ｃ：１）等があげられる。
無血清馴化中には細胞の生存率が一時的に低下し、細胞が死滅してしまうことがある。このため、細胞の生存率を戻し、あるいは高く維持するためには、無血清馴化培地への細胞接種時に細胞密度を１×１０５〜１０×１０５細胞／ｍｌ、好ましくは４×１０５〜６×１０５細胞／ｍｌとなるように接種することが好ましい。例えば、直接馴化法では、培地中に細胞を接種し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターでのバッチ培養等、通常の動物細胞の培養方法を用いて培養し、細胞濃度が１０×１０５〜４０×１０５細胞／ｍｌに達したら、無血清培地中に細胞を接種し、同様な条件で培養を繰り返す。
無血清培地にラット細胞を１×１０５〜１０×１０５細胞／ｍｌ、好ましくは４×１０５〜６×１０５細胞／ｍｌとなるように接種し、通常の動物細胞の培養方法を用いて４〜７日後に、細胞密度が１０×１０５〜４０×１０５細胞／ｍｌに達したラット細胞を無血清培地に馴化した細胞として選択する。
無血清培地に馴化した細胞は、細胞濃度が下記のバッチ培養で用いられる培地中に１０×１０５〜３０×１０５細胞／ｍｌとなるように接種し、下記のバッチ培養で用いられる培養条件で３〜５日間培養して、継代培養を行うことができる。なお、継代培養の期間中、無血清培地に馴化した細胞の生存率は、９０％以上に維持しておくことが望ましい。また、ラット細胞、例えばＹＢ２／０細胞またはＹＢ２／０の形質転換細胞について、無血清培地に馴化した細胞が所望のポリペプチドの生産性を維持するためには、アルブミンを好ましくは０．１〜１０ｇ／Ｌ、さらに好ましくは０．５〜３ｇ／Ｌとなるように無血清培地へ添加しておくとよい。
本発明の細胞を無血清培地に馴化させた後、９６ウェルプレートによる限界希釈方法、コロニー形成方法等を用いることにより、クローン（単一細胞）化した細胞株を調製することができる。
以下に、限界希釈法を用いたクローン化した細胞株を調製する方法を示す。
細胞懸濁液を希釈し、ひとつのウェルに１個以下の確率で細胞が入るように接種し、市販の無血清培地などを用いて、３０〜４０℃、５％ＣＯ２インキュベーター内で数週間培養する。培養終了後、細胞増殖の認められた細胞の培養上清中の所望のポリペプチドの濃度を調べ、該ポリペプチドの生産性の高い細胞を選択する。
コロニー形成方法を用いてクローン化する方法は以下のとおりである。
付着性細胞の場合は、細胞懸濁液を希釈し、シャーレに細胞を接種して培養後、コロニーの形成を確認する。ペニシリンキャップ等のリングでコロニーを分離し、トリプシン等の酵素で細胞を分離後、適当な培養器に移し、所望のポリペプチドの生産量を調べ、該ポリペプチドの生産性の高い細胞を選択する。
浮遊細胞の場合は、細胞懸濁液を希釈し、軟寒天中に細胞を接種して培養し、生じたコロニーを顕微鏡下でピックアップした後、静置培養に戻して所望のポリペプチドの生産量を調べ、生産性の高い細胞を選択する。
上記方法を繰り返して行なうことで、無血清に馴化され、かつ目的とする細胞特性を持ったクローン化されたラット細胞株を選択することができる。
上記方法により、無血清培地に馴化したラット細胞株、好ましくは無血清培地中で２ヶ月以上継代培養できるラット細胞株を得ることができる。また、無血清培地に馴化した細胞を長期培養するためには、無血清培地中で２ヶ月以上継代培養できるラット細胞株であることがさらに好ましい。
なお、無血清培地に馴化したラット細胞株は、上記の無血清培地に馴化した細胞を継代培養する方法で継代培養することができる。無血清培地に馴化したラット細胞株としては、６１−３３γ（ＦＥＲＭ ＢＰ−７３２５）が例示される。
本発明の細胞を培養する方法としては、所望のポリペプチドを効率よく生産できる培養方法であれば、通常用いられる動物細胞の培養法のいずれでも用いられる。例えば、バッチ培養、リピートバッチ培養、フェドバッチ培養、パーフュージョン培養等があげられるが、所望のポリペプチドの生産性を高めるにはフェドバッチ培養またはパーフュージョン培養が好ましい。
１．バッチ培養
本発明の方法において用いられる無血清培地は、通常の動物細胞の培養に用いられる基礎培地に血清の代わりに、各生理活性物質、栄養因子が添加され、かつ動物細胞が同化しうる炭素源、窒素源等を含有させたものが用いられる。
具体的には、ＲＰＭＩ１６４０培地〔Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，１９９，５１９（１９６７）〕、ＥａｇｌｅのＭＥＭ培地〔Ｓｃｉｅｎｃｅ，１２２，５０１（１９５２）〕、ダルベッコ改変ＭＥＭ培地〔Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８，３９６（１９５９）〕、１９９培地〔Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，７３，１（１９５０）〕、Ｆ１２培地〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，５３，２８８（１９６５）〕、ＩＭＤＭ培地〔Ｊ．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１４７，９２３（１９７８）〕等があげられるが、好ましくは、ＤＭＥＭ培地、Ｆ１２培地、ＩＭＤＭ培地等が用いられる。
無血清培地には、必要に応じて動物細胞の生育に必要な栄養因子、生理活性物質等を添加する。これらの添加物は、培養前に予め培地に含有させる。
栄養因子としては、グルコース、アミノ酸、ビタミン等があげられる。
アミノ酸としては、Ｌ−アラニン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−シスチン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン等があげられ、１種または２種以上組み合わせて用いられる。
ビタミンとしては、ｄ−ビオチン、Ｄ−パントテン酸、コリン、葉酸、ｍｙｏ−イノシトール、ナイアシンアミド、ピリドキサール、リボフラビン、チアミン、シアノコバラミン、ＤＬ−α−トコフェロール等があげられ、１種または２種以上組み合わせて用いられる。
生理活性物質としては、インシュリン、トランスフェリン、アルブミン等があげられる。
栄養因子の濃度として、グルコースの濃度は２００〜６０００ｍｇ／Ｌ、好ましくは３０００〜５０００ｍｇ／Ｌである。
アミノ酸の濃度は、例えば、Ｌ−アラニン１〜１６０ｍｇ／Ｌ（好ましくは３〜１２０ｍｇ／Ｌ）、Ｌ−アルギニン一塩酸１０〜１０００ｍｇ／Ｌ（好ましくは３０〜８００ｍｇ／Ｌ）、Ｌ−アスパラギン一水和物１０〜２００ｍｇ／Ｌ（好ましくは２０〜１５０ｍｇ／Ｌ）、Ｌ−アスパラギン酸５〜１００ｍｇ／Ｌ（好ましくは１０〜７５ｍｇ／Ｌ）、Ｌ−シスチン二塩酸１０〜２００ｍｇ／Ｌ（好ましくは２０〜１５０ｍｇ／Ｌ）、Ｌ−グルタミン酸５〜２００ｍｇ／Ｌ（好ましくは１０〜１５０ｍｇ／Ｌ）、Ｌ−グルタミン５０〜２０００（好ましくは１００〜１５００ｍｇ／Ｌ）、グリシン２〜１００ｍｇ／Ｌ（好ましくは５〜７５ｍｇ／Ｌ）、Ｌ−ヒスチジン一塩酸二水和物５〜２００ｍｇ／Ｌ（好ましくは１０〜１５０ｍｇ／Ｌ）、Ｌ−イソロイシン２〜３００ｍｇ／Ｌ（好ましくは４〜２００ｍｇ／Ｌ）、Ｌ−ロイシン５〜３００ｍｇ／Ｌ（好ましくは１０〜２００ｍｇ／Ｌ）、Ｌ−リジン一塩酸１０〜３００ｍｇ／Ｌ（好ましくは２０〜２５０ｍｇ／Ｌ）、Ｌ−メチオニン５〜１００ｍｇ／Ｌ（好ましくは１０〜７５ｍｇ／Ｌ）、Ｌ−フェニルアラニン５〜２００ｍｇ／Ｌ（好ましくは１０〜１５０ｍｇ／Ｌ）、Ｌ−プロリン５〜２００ｍｇ／Ｌ（好ましくは１０〜１５０ｍｇ／Ｌ）、Ｌ−セリン５〜２００ｍｇ／Ｌ（好ましくは１０〜１５０ｍｇ／Ｌ）、Ｌ−スレオニン５〜２００ｍｇ／Ｌ（好ましくは１０〜１５０ｍｇ／Ｌ）、Ｌ−トリプトファン１〜４０ｍｇ／Ｌ（好ましくは２〜３０ｍｇ／Ｌ）、Ｌ−チロシン二ナトリウム二水和物２〜３００ｍｇ／Ｌ（好ましくは４〜２００ｍｇ／Ｌ）、Ｌ−バリン５〜３００ｍｇ／Ｌ（好ましくは１０〜２００ｍｇ／Ｌ）である。
ビタミンの濃度は、例えば、ｄ−ビオチン０．００１〜０．４ｍｇ／Ｌ（好ましくは０．００２〜０．３ｍｇ／Ｌ）、Ｄ−パントテン酸カルシウム０．００１〜１０．０ｍｇ／Ｌ（好ましくは０．００２〜７．５ｍｇ／Ｌ）、塩化コリン０．１〜２０．０ｍｇ／Ｌ（好ましくは０．２〜１５．０ｍｇ／Ｌ）、葉酸０．００５〜２０．０ｍｇ／Ｌ（好ましくは０．０１〜１５．０ｍｇ／Ｌ）、ｍｙｏ−イノシトール０．０１〜３００ｍｇ／Ｌ（好ましくは０．０５〜２００ｍｇ／Ｌ）、ナイアシンアミド０．０１〜２０．０ｍｇ／Ｌ（好ましくは０．０２〜１５．０ｍｇ／Ｌ）、ピリドキサール一塩酸０．０１〜１５．０ｍｇ／Ｌ（好ましくは０．０２〜１０．０ｍｇ／Ｌ）、リボフラビン０．００５〜２．０ｍｇ／Ｌ（好ましくは０．０１〜１．５ｍｇ／Ｌ）、チアミン一塩酸０．００５〜２０．０ｍｇ／Ｌ（好ましくは０．０１〜１５．０ｍｇ／Ｌ）、シアノコバラミン０．００１〜５．０ｍｇ／Ｌ（好ましくは０．００２〜３．０ｍｇ／Ｌ）である。
生理活性物質の濃度は、例えば、インシュリン１０〜５００ｍｇ／Ｌ、好ましくは５０〜３００ｍｇ／Ｌ、トランスフェリン１０〜５００ｍｇ／Ｌ、好ましくは５０〜３００ｍｇ／Ｌ、アルブミン２００〜６０００ｍｇ／Ｌ、好ましくは７００〜４０００ｍｇ／Ｌである。
バッチ培養は、通常ｐＨ６〜８、３０〜４０℃等の条件下で３〜１２日間行う。また、培養中必要に応じて、ストレプトマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。なお、溶存酸素濃度制御、ｐＨ制御、温度制御、攪拌などは通常の動物細胞の培養に用いられる方法に準じて行うことができる。
２．フェドバッチ培養
本発明の方法において使用される無血清培地は、通常の動物細胞の培養に用いられる基礎培地に血清の代わりに、各生理活性物質、栄養因子が添加され且つ通常動物細胞が同化しうる炭素源、窒素源等を含有させたものが用いられる。具体的には、ＲＰＭＩ１６４０培地〔Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，１９９，５１９（１９６７）〕、ＥａｇｌｅのＭＥＭ培地〔Ｓｃｉｅｎｃｅ，１２２，５０１（１９５２）〕、ダルベッコ改変ＭＥＭ培地〔Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８，３９６（１９５９）〕、１９９培地〔Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，７３，１（１９５０）〕、Ｆ１２培地〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，５３，２８８（１９６５）〕、ＩＭＤＭ培地〔Ｊ．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１４７，９２３（１９７８）〕等があげられるが、好ましくは、ＤＭＥＭ培地、Ｆ１２培地、ＩＭＤＭ培地等が用いられる。上記培地以外に、バッチ培養で記載した無血清培地を用いてもよい。
無血清培地には、必要に応じて動物細胞の生育に必要な生理活性物質、栄養因子等を添加する。これらの添加物は、予め培養前に培地に含有させるか、または必要に応じて、培養中に培養液へ適宜追加供給する。
栄養因子としては、グルコース、アミノ酸、ビタミン等があげられる。
アミノ酸としては、Ｌ−アラニン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−シスチン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン等があげられ、１種または２種以上組み合わせて用いられる。
ビタミンとしては、ｄ−ビオチン、Ｄ−パントテン酸、コリン、葉酸、ｍｙｏ−イノシトール、ナイアシンアミド、ピリドキサール、リボフラビン、チアミン、シアノコバラミン、ＤＬ−α−トコフェロール等があげられ、１種または２種以上組み合わせて用いられる。
生理活性物質としては、インシュリン、トランスフェリン、アルブミン等があげられる。
培地または培養液中への栄養因子の最終添加量として、グルコースは２００〜６０００ｍｇ／Ｌ、好ましくは１０００〜５０００ｍｇ／Ｌである。
アミノ酸は、例えば、Ｌ−アラニン１〜９６０ｍｇ／Ｌ（好ましくは１〜６４０ｍｇ／Ｌ）、Ｌ−アルギニン一塩酸１０〜６０００ｍｇ／Ｌ（好ましくは１１〜４０００ｍｇ／Ｌ）、Ｌ−アスパラギン一水和物１０〜１２００ｍｇ／Ｌ（好ましくは１１〜８００ｍｇ／Ｌ）、Ｌ−アスパラギン酸５〜６００ｍｇ／Ｌ（好ましくは５〜４００ｍｇ／Ｌ）、Ｌ−シスチン二塩酸１０〜１２００ｍｇ／Ｌ（好ましくは１１〜８００ｍｇ／Ｌ）、Ｌ−グルタミン酸５〜１２００ｍｇ／Ｌ（好ましくは５〜８００ｍｇ／Ｌ）、Ｌ−グルタミン５３〜１２０００（好ましくは５５〜８０００ｍｇ／Ｌ）、グリシン２〜６００ｍｇ／Ｌ（好ましくは２〜４００ｍｇ／Ｌ）、Ｌ−ヒスチジン一塩酸二水和物５〜１２００ｍｇ／Ｌ（好ましくは５〜８００ｍｇ／Ｌ）、Ｌ−イソロイシン４〜１８００ｍｇ／Ｌ（好ましくは４〜１２００ｍｇ／Ｌ）、Ｌ−ロイシン１３〜１８００ｍｇ／Ｌ（好ましくは１４〜１２００ｍｇ／Ｌ）、Ｌ−リジン一塩酸１０〜１８００ｍｇ／Ｌ（好ましくは１１〜１２００ｍｇ／Ｌ）、Ｌ−メチオニン４〜６００ｍｇ／Ｌ（好ましくは５〜４００ｍｇ／Ｌ）、Ｌ−フェニルアラニン５〜１２００ｍｇ／Ｌ（好ましくは５〜８００ｍｇ／Ｌ）、Ｌ−プロリン５〜１２００ｍｇ／Ｌ（好ましくは５〜８００ｍｇ／Ｌ）、Ｌ−セリン５〜１２００ｍｇ／Ｌ（好ましくは５〜８００ｍｇ／Ｌ）、Ｌ−スレオニン５〜１２００ｍｇ／Ｌ（好ましくは５〜８００ｍｇ／Ｌ）、Ｌ−トリプトファン１〜２４０ｍｇ／Ｌ（好ましくは１〜１６０ｍｇ／Ｌ）、Ｌ−チロシン二ナトリウム二水和物８〜１８００ｍｇ／Ｌ（好ましくは８〜１２００ｍｇ／Ｌ）、Ｌ−バリン１２〜１８００ｍｇ／Ｌ（好ましくは１２〜１２００ｍｇ／Ｌ）である。
ビタミンは、例えば、ｄ−ビオチン０．００１〜２．４ｍｇ／Ｌ（好ましくは０．００１〜１．６ｍｇ／Ｌ）、Ｄ−パントテン酸カルシウム０．０１１〜６０ｍｇ／Ｌ（好ましくは０．０１１〜４０ｍｇ／Ｌ）、塩化コリン０．１１〜９０ｍｇ／Ｌ（好ましくは０．１１〜６０ｍｇ／Ｌ）、葉酸０．０１〜１２０ｍｇ／Ｌ（好ましくは０．０１〜８０ｍｇ／Ｌ）、ｍｙｏ−イノシトール０．０５〜１８００ｍｇ／Ｌ（好ましくは０．０５〜１２００ｍｇ／Ｌ）、ナイアシンアミド０．０２〜１２０ｍｇ／Ｌ（好ましくは０．０３〜８０ｍｇ／Ｌ）、ピリドキサール一塩酸０．０２〜９０ｍｇ／Ｌ（好ましくは０．０３〜６０ｍｇ／Ｌ）、リボフラビン０．０１〜１２ｍｇ／Ｌ（好ましくは０．０１〜９８ｍｇ／Ｌ）、チアミン一塩酸０．０１〜１２０ｍｇ／Ｌ（好ましくは０．０１〜８０ｍｇ／Ｌ）、シアノコバラミン０．００１〜３０ｍｇ／Ｌ（好ましくは０．００１〜２０ｍｇ／Ｌ）である。
培地または培養液中への生理活性物質の最終添加量として、例えば、インシュリン１０〜３０００ｍｇ／Ｌ、好ましくは１１〜２０００ｍｇ／Ｌ、トランスフェリン１０〜３０００ｍｇ／Ｌ、好ましくは１１〜２０００ｍｇ／Ｌ、アルブミン２００〜３６０００ｍｇ／Ｌ、好ましくは２２０〜２４０００ｍｇ／Ｌである。
本発明において物質の「最終添加量」は、フェドバッチ培養中に添加する濃縮培養液を最終的に添加し終わった後、培地に含まれる該物質の重量と培養液中に添加した該物質の重量との合計量を、培地量と添加した濃縮培養液量との合計量で除した値として表わされる。
フェドバッチ培養においては、生理活性物質、栄養因子等は通常に使用される濃度よりも高い濃度で添加することが好ましい。例えば、培養液量の１／３０〜１／３好ましくは１／２０〜１／５を一回分として添加する。培養液中に添加する場合は、培養期間中、連続的にまたは数回〜十数回に分けて追加供給することが好ましい。生理活性物質、栄養因子等を連続的、または間欠的に少量づつ追加供給する上記フェドバッチ培養法は、細胞の代謝効率が高く、培養液中の老廃物が蓄積されることによる培養細胞の到達細胞密度の低下を防止することができ、また、回収された培養液中の所望のポリペプチドの濃度はバッチ培養法に比べて高濃度であるため、該ポリペプチドの分離・精製が容易になり、バッチ培養に比べ、培地当りの該ポリペプチドの生産量を増大させることができる。
フェドバッチ培養は、通常ｐＨ６〜８、３０〜４０℃で、３〜１２日間行う。また、培養中必要に応じて、ストレプトマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。なお、溶存酸素濃度制御、ｐＨ制御、温度制御、攪拌などは通常の動物細胞の培養に用いられる方法に準じて行うことができる。
３．パーフュージョン培養
本発明の方法において使用される無血清培地は、通常の動物細胞の培養に用いられる基礎培地に血清の代わりに、各生理活性物質、栄養因子が添加され且つ通常動物細胞が同化しうる炭素源、窒素源等を含有させたものが用いられる。具体的には、ＲＰＭＩ１６４０培地〔Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，１９９，５１９（１９６７）〕、ＥａｇｌｅのＭＥＭ培地〔Ｓｃｉｅｎｃｅ，１２２，５０１（１９５２）〕、ダルベッコ改変ＭＥＭ培地〔Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８，３９６（１９５９）〕、１９９培地〔Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，７３，１（１９５０）〕、Ｆ１２培地〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，５３，２８８（１９６５）〕、ＩＭＤＭ培地〔Ｊ．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１４７，９２３（１９７８）〕等があげられるが、好ましくは、ＤＭＥＭ培地、Ｆ１２培地、ＩＭＤＭ培地等が用いられる。上記培地以外に、バッチ培養で記載した無血清培地を用いてもよい。
無血清培地には、必要に応じて動物細胞の生育に必要な生理活性物質、栄養因子等を添加する。これらの添加物は、培養前の培地または培養液中に供給する培地に含有させておくとよい。
栄養因子としては、グルコース、アミノ酸、ビタミン等があげられる。
アミノ酸としては、Ｌ−アラニン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−シスチン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン等があげられ、１種または２種以上組み合わせて用いられる。
ビタミンとしては、ｄ−ビオチン、Ｄ−パントテン酸、コリン、葉酸、ｍｙｏ−イノシトール、ナイアシンアミド、ピリドキサール、リボフラビン、チアミン、シアノコバラミン、ＤＬ−α−トコフェロール等があげられ、１種または２種以上組み合わせて用いられる。
生理活性物質としては、インシュリン、トランスフェリン、アルブミン等があげられる。
栄養因子の濃度として、グルコースの濃度は５００〜６０００ｍｇ／Ｌ、好ましくは１０００〜２０００ｍｇ／Ｌにコントロールされる。
栄養因子としては、アミノ酸、ビタミン等があげられる。他の生理活性物質または栄養因子の添加量は、例えば、インシュリン４〜５６０ｍｇ／Ｌ、好ましくは２０〜３６０ｍｇ／Ｌ、トランスフェリン４〜５６０ｍｇ／Ｌ、好ましくは２０〜３６０ｍｇ／Ｌ、アルブミン８０〜６５００ｍｇ／Ｌ、好ましくは２８０〜４５００ｍｇ／Ｌである。
アミノ酸としては、Ｌ−アラニン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−シスチン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン等があげられ、１種または２種以上組み合わせて用いられる。アミノ酸濃度は、例えば、Ｌ−アラニン１〜２００ｍｇ／Ｌ（好ましくは２〜１６０ｍｇ／Ｌ）、Ｌ−アルギニン一塩酸１０〜１１４０ｍｇ／Ｌ（好ましくは３０〜９４０ｍｇ／Ｌ）、Ｌ−アスパラギン一水和物１０〜２５０ｍｇ／Ｌ（好ましくは２０〜２００ｍｇ／Ｌ）、Ｌ−アスパラギン酸５〜１４８ｍｇ／Ｌ（好ましくは１０〜１２０ｍｇ／Ｌ）、Ｌ−シスチン二塩酸１０〜３５０ｍｇ／Ｌ（好ましくは２０〜３００ｍｇ／Ｌ）、Ｌ−グルタミン酸５〜３２０ｍｇ／Ｌ（好ましくは１０〜２７０ｍｇ／Ｌ）、Ｌ−グルタミン５０〜３３００（好ましくは１００〜１８００ｍｇ／Ｌ）、グリシン２〜１４８ｍｇ／Ｌ（好ましくは５〜１２３ｍｇ／Ｌ）、Ｌ−ヒスチジン一塩酸二水和物５〜２７０ｍｇ／Ｌ（好ましくは１０〜２２０ｍｇ／Ｌ）、Ｌ−イソロイシン４〜４７０ｍｇ／Ｌ（好ましくは４〜３７０ｍｇ／Ｌ）、Ｌ−ロイシン１０〜４７０ｍｇ／Ｌ（好ましくは１３〜３７０ｍｇ／Ｌ）、Ｌ−リジン一塩酸１０〜５３０ｍｇ／Ｌ（好ましくは２０〜４８０ｍｇ／Ｌ）、Ｌ−メチオニン４〜１５０ｍｇ／Ｌ（好ましくは４〜１２０ｍｇ／Ｌ）、Ｌ−フェニルアラニン４〜３１０ｍｇ／Ｌ（好ましくは４〜２６０ｍｇ／Ｌ）、Ｌ−プロリン５〜２７０ｍｇ／Ｌ（好ましくは１０〜２１０ｍｇ／Ｌ）、Ｌ−セリン５〜２７０ｍｇ／Ｌ（好ましくは１０〜２２０ｍｇ／Ｌ）、Ｌ−スレオニン５〜３５０ｍｇ／Ｌ（好ましくは１０〜３００ｍｇ／Ｌ）、Ｌ−トリプトファン１〜６５ｍｇ／Ｌ（好ましくは２〜５５ｍｇ／Ｌ）、Ｌ−チロシン二ナトリウム二水和物４〜４７０ｍｇ／Ｌ（好ましくは８〜３７０ｍｇ／Ｌ）、Ｌ−バリン１０〜４５０ｍｇ／Ｌ（好ましくは１１〜３５０ｍｇ／Ｌ）である。
ビタミンとしては、ｄ−ビオチン、Ｄ−パントテン酸、コリン、葉酸、ｍｙｏ−イノシトール、ナイアシンアミド、ピリドキサール、リボフラビン、チアミン、シアノコバラミン、ＤＬ−α−トコフェロール等があげられ、１種または２種以上組み合わせて用いられる。ビタミンの最終添加量は、例えば、ｄ−ビオチン０．００１〜０．４４ｍｇ／Ｌ（好ましくは０．０２〜０．３４ｍｇ／Ｌ）、Ｄ−パントテン酸カルシウム０．０１〜１６ｍｇ／Ｌ（好ましくは０．０２〜１４ｍｇ／Ｌ）、塩化コリン０．１〜２１ｍｇ／Ｌ（好ましくは３０．２〜１６ｍｇ／Ｌ）、葉酸０．０１〜２６ｍｇ／Ｌ（好ましくは０．０１〜２１ｍｇ／Ｌ）、ｍｙｏ−イノシトール０．０５〜３１０ｍｇ／Ｌ（好ましくは０．０５〜２１１ｍｇ／Ｌ）、ナイアシンアミド０．０２〜２６ｍｇ／Ｌ（好ましくは０．０２〜２１ｍｇ／Ｌ）、ピリドキサール一塩酸０．０２〜２１ｍｇ／Ｌ（好ましくは０．０２〜１６ｍｇ／Ｌ）、リボフラビン０．０１〜２．６ｍｇ／Ｌ（好ましくは０．０１〜２．１ｍｇ／Ｌ）、チアミン一塩酸０．０１〜２６ｍｇ／Ｌ（好ましくは０．０１〜２１ｍｇ／Ｌ）、シアノコバラミン０．００１〜５ｍｇ／Ｌ（好ましくは０．００２〜３ｍｇ／Ｌ）である。
本発明において培養液は、通常使われている培養液と細胞を分離する装置により効率的に分離され、濃縮された細胞液が元の培養槽に戻り、減少した分の新鮮培地が新たに供給される。このことにより常に培養環境が良好に保たれる。
本発明の細胞の場合、新鮮培地での培地交換率とは別に、増殖する細胞を細胞の増殖率に合わせて、培養系外へ捨てることによって系を安定させ、所望のポリペプチドの生産性を高めることができる。例えば、細胞を系外へ捨てる速度を細胞増殖率に合わせて、目的とする細胞密度が維持されるよう細胞の倍加時間に培養槽にある全細胞の２／５〜３／５を系外に出すことにより生産性の高い培養が可能となる。
本発明において培養は、通常ｐＨ６〜８、３０〜４０℃等の条件下で１０〜４０日間行う。また、培養中必要に応じて、ストレプトマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。なお、溶存酸素濃度制御、ｐＨ制御、温度制御、攪拌などは通常の動物細胞の培養に用いられる方法に準じて行うことができる。
上記のとおり、本発明にかかるラット細胞を培養し、所望のポリペプチドを生成蓄積させ、該培養物より該ポリペプチドを採取することにより、該ポリペプチドを製造することができる。
本発明の培養において、細胞を増殖させる場合には、培養液中のインシュリン濃度を１０ｍｇ／Ｌ以上、好ましくは２０ｍｇ／Ｌ以上に維持して培養することが好ましい。一方、所望のポリペプチドを生産させる場合には、例えば培養液中のインシュリン濃度を、１０ｍｇ／Ｌ以下、好ましくは５ｍｇ／Ｌ以下に維持して培養することが好ましい。なお、前培養において培地中にインシュリンが含まれていれば、抗体の生産性を高めるために、インシュリンは添加しなくてよいが、通常は培養液中にインシュリン濃度を０．０１〜１０ｍｇ／Ｌ、好ましくは０．０１〜５ｍｇ／Ｌになるように維持することが好ましい。
培養液中のインシュリン濃度を調節する方法は、インシュリンの濃度調整が可能である培養、例えばフェドバッチ培養、パーフージョン培養等の培養方法において、好適に用いられる。
本発明の製造方法としては、宿主細胞内にポリペプチドを生産させる直接発現方法、宿主細胞外にポリペプチドを分泌生産させる方法（モレキュラー・クローニング第２版）等があげられる。
所望のポリペプチドは、ポールソンらの方法〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４，１７６１９（１９８９）〕、ロウらの方法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６，８２２７（１９８９）、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖｅｌｏｐ．，４，１２８８（１９９０）〕、または特開平５−３３６９６３、ＷＯ９４／２３０２１等に記載の方法を準用することにより、宿主細胞外へ積極的に分泌させることができる。すなわち、遺伝子組換えの手法を用いて、本発明にかかるの手前にシグナルペプチドを付加した形で発現させることにより、所望のポリペプチドを宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。
また、特開平２−２２７０７５に記載されている方法に準じて、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子等を用いた遺伝子増幅系を利用することにより、所望のポリペプチドの生産量を上昇させることもできる。
本発明の方法により製造される所望のポリペプチドは、通常のポリペプチドの単離精製法を用いて単離精製することができる。
本発明の方法により製造されるポリペプチドが細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後、細胞を遠心分離により回収し、水系緩衝液にけん濁後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー、ダイノミル等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られる上清から、通常の酵素の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−セファロース、ＤＩＡＩＯＮ ＨＰＡ−７５（三菱化成社製）等のレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、Ｓ−セファロースＦＦ（ファルマシア社製）等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、プロテインＡを用いたアフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等を、単独あるいは組合わせて用い、精製標品を得ることができる。
本発明の方法により製造されるポリペプチドが細胞外に分泌された場合には、培養上清に該ポリペプチドを回収することができる。即ち、該培養物を上記と同様の遠心分離等の手法により処理することにより培養上清を取得し、該培養上清から、上記と同様の単離精製法を用いることにより、精製標品を得ることができる。
本発明の方法により製造されるポリペプチドのうち、免疫機能分子、特に抗体は抗体依存性細胞障害活性（ＡＤＣＣ活性）が高く、腫瘍、炎症、アレルギー等の疾患の治療等に有用である。
発明を実施するための最良の形態
以下に本発明の実施例を示す。
実施例１．抗ＧＤ３キメラ抗体の作製
１．抗ＧＤ３ヒトキメラ抗体のタンデム型発現ベクターｐＣｈｉＬＨＧＭ４の構築
抗ＧＤ３キメラ抗体のＬ鎖の発現ベクターｐＣｈｉ６４１ＬＧＭ４［Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１６７，２７１（１９９４）］を制限酵素ＭｌｕＩ（宝酒造社製）とＳａｌＩ（宝酒造社製）で切断して得られるＬ鎖ｃＤＮＡを含む約４．０３ｋｂの断片と動物細胞用発現ベクターｐＡＧＥ１０７［Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）］を制限酵素ＭｌｕＩ（宝酒造社製）とＳａｌＩ（宝酒造社製）で切断して得られるＧ４１８耐性遺伝子およびスプライシングシグナルを含む約３．４０ｋｂの断片をＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（宝酒造社製）を用いて連結し、大腸菌ＨＢ１０１株［モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ），ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９］を形質転換してプラスミドｐＣｈｉ６４１ＬＧＭ４０を構築した。
次に、上記で構築したプラスミドｐＣｈｉ６４１ＬＧＭ４０を制限酵素ＣｌａＩ（宝酒造社製）で切断後、ＤＮＡ Ｂｌｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ（宝酒造社製）を用いて平滑末端化し、さらにＭｌｕＩ（宝酒造社製）で切断して得られるＬ鎖ｃＤＮＡを含む約５．６８ｋｂの断片と抗ＧＤ３キメラ抗体のＨ鎖の発現ベクターｐＣｈｉ６４１ＨＧＭ４［Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ），１６７，２７１（１９９４）］を制限酵素ＸｈｏＩ（宝酒造社製）で切断後、ＤＮＡＢｌｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ（宝酒造社製）を用いて平滑末端化し、さらにＭｌｕＩ（宝酒造社製）で切断して得られるＨ鎖ｃＤＮＡを含む約８．４０ｋｂの断片をＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（宝酒造社製）を用いて連結、大腸菌ＨＢ１０１株［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９］を形質転換して抗ＧＤ３キメラ抗体のタンデム型発現ベクターｐＣｈｉ６４１ＬＨＧＭ４を構築した。
２．ラットミエローマ細胞ＹＢ２／０を用いた生産細胞の作製
実施例１の１項で構築した抗ＧＤ３キメラ抗体のタンデム型発現ベクターｐＣｈｉ６４１ＬＨＧＭ４の５μｇを４×１０６細胞／ｍｌのラットミエローマＹＢ２／０へエレクトロポレーション法［Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）］により導入後、４０ｍｌのＲＰＭＩ１６４０−ＦＢＳ（１０）［ＦＢＳ（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製）を１０％含むＲＰＭＩ１６４０培地］に懸濁し、９６ウェル培養用プレート（住友ベークライト社製）に２００μｌ／ウェルずつ分注した。５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃、２４時間培養した後、Ｇ４１８を０．５ｍｇ／ｍｌになるように添加して１〜２週間培養した。Ｇ４１８耐性を示す形質転換株のコロニーが出現し、増殖の認められたウェルより培養上清を回収し、上清中の抗ＧＤ３キメラ抗体の抗原結合活性を実施例１の３項に示すＥＬＩＳＡ法により測定した。
培養上清中に抗ＧＤ３キメラ抗体の生産が認められたウェルの形質転換株については、ＤＨＦＲ遺伝子増幅系を利用して抗体生産量を増加させる目的で、Ｇ４１８を０．５ｍｇ／ｍｌ、ＤＨＦＲの阻害剤であるメソトレキセート（以下、ＭＴＸという；シグマ社製）を５０ｎＭ含むＲＰＭＩ１６４０−ＦＢＳ（１０）培地に１〜２×１０５細胞／ｍｌになるように懸濁し、２４ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）に２ｍｌずつ分注した。５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃で１〜２週間培養して、５０ｎＭ ＭＴＸ耐性を示す形質転換株を誘導した。
形質転換株の増殖が認められたウェルの培養上清中の抗ＧＤ３キメラ抗体の抗原結合活性を実施例１の３項に示すＥＬＩＳＡ法により測定した。培養上清中に抗ＧＤ３キメラ抗体の生産が認められたウェルの形質転換株については、上記と同様の方法により、ＭＴＸ濃度を１００ｎＭ、２００ｎＭと順次上昇させ、最終的にＧ４１８を０．５ｍｇ／ｍｌ、ＭＴＸを２００ｎＭの濃度で含むＲＰＭＩ１６４０−ＦＢＳ（１０）培地で増殖可能かつ、抗ＧＤ３キメラ抗体を高生産する形質転換株を得た。得られた形質転換株については、２回の限界希釈法によるクローン化（単一細胞化）を行った。
このようにして得られた抗ＧＤ３キメラ抗体を生産する形質転換細胞クローン７−９−５１は、平成１１年４月５日付で工業技術院生命工学工業技術研究所（日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号）にＦＥＲＭ ＢＰ−６６９１として寄託されている。
３．抗体のＧＤ３に対する結合活性の測定（ＥＬＩＳＡ法）
抗体のＧＤ３に対する結合活性は以下のようにして測定した。
４ｎｍｏｌのＧＤ３を１０μｇのジパルミトイルフォスファチジルコリン（シグマ社製）と５μｇのコレステロール（シグマ社製）とを含む２ｍｌのエタノール溶液に溶解した。該溶液の２０μｌ（４０ｐｍｏｌ／ウェルとなる）を９６ウェルのＥＬＩＳＡ用のプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）の各ウェルにそれぞれ分注し、風乾後、１％牛血清アルブミン（シグマ社製：以下、ＢＳＡという）を含むＰＢＳ（以下、１％ＢＳＡ−ＰＢＳという）を１００μｌ／ウェルで加え、室温で１時間反応させて残存する活性基をブロックした。１％ＢＳＡ−ＰＢＳを捨て、形質転換株の培養上清或いは精製したヒト型キメラ抗体の各種希釈溶液を５０μｌ／ウェルで加え、室温で１時間反応させた。反応後、各ウェルを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（和光純薬社製）を含むＰＢＳ（以下、Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳという）で洗浄後、１％ＢＳＡ−ＰＢＳで３０００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＆Ｌ）抗体溶液（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｑｕａｌｅｘ社製）を二次抗体溶液として、５０μｌ／ウェルで加え、室温で１時間反応させた。反応後、Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、ＡＢＴＳ基質液［２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）アンモニウムの０．５５ｇを１Ｌの０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ４．２）に溶解し、使用直前に過酸化水素を１μｌ／ｍｌで添加した溶液）を５０μｌ／ウェルで加えて発色させ、４１５ｎｍの吸光度（以下、ＯＤ４１５という）を測定した。
実施例２
抗ＧＤ３抗体を生産する形質転換細胞クローン７−９−５１（ＦＥＲＭ ＢＰ−６６９１）の無血清培地への馴化を行った。培養はいずれも温度３７℃、ＣＯ２濃度５％、培養液量５ｍｌでの、Ｔ型フラスコによる静置継代培養とし、継代時には遠心分離により、培養液から新鮮培地への全量交換を実施した。
ＦＥＲＭ ＢＰ−６６９１を、ＩＭＤ培地（ライフテクノロジー社製）および２００ｎＭ ＭＴＸ（シグマ社製）からなる無血清馴化用基本培地に牛血清アルブミン（ＢＳＡ：ＪＲＨ社製）、インシュリン（ライフテクノロジー社製）およびトランスフェリン（ライフテクノロジー社製）を含有してなる血清添加培地に、２〜４×１０５細胞／ｍｌ接種し、継代期間を２〜４日として継代培養を行った。
上記継代培養で得られた細胞を該基本培地に５％（ｖ／ｖ）γ線照射透析牛胎児血清（ｄＦＢＳ；ライフテクノロジー社製）および１００ｎＭ Ｔ３を含有してなる血清添加培地により継代培養を行った後、該基本培地に０．２％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ、５０ｍｇ／Ｌインシュリンおよび５０ｍｇ／Ｌトランスフェリンを含有してなる培地で９継代２７日間、該基本培地に０．２％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ、２０ｍｇ／Ｌインシュリンおよび２０ｍｇ／Ｌトランスフェリンを含有してなる培地で１継代３日間、該基本培地に０．１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ、２０ｍｇ／Ｌインシュリンおよび２０ｍｇ／Ｌトランスフェリンを含有してなる培地で１継代３日間、該基本培地に０．０５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ、１０ｍｇ／Ｌインシュリンおよび１０ｍｇ／Ｌトランスフェリンを含有する培地で、１継代３日間の継代培養を連続的に実施した。
無血清培地に馴化した細胞株を作製する際に、該基本培地に０．２％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ、５０ｍｇ／Ｌインシュリンおよび５０ｍｇ／Ｌトランスフェリンを含有してなる培地で２７日間の培養期間中、細胞の生存率が断続的に低下した。そこで、種々検討した結果、培地への細胞接種時の細胞密度を４×１０５細胞／ｍｌにすることにより、細胞の生存率を維持しながら無血清培地に馴化させることができた。
無血清培地に馴化させたラット細胞について、限界希釈法により細胞の単一化を、以下のとおり実施した。
９６ウエルプレートに０．２５細胞／ウエル、０．２ｍｌ／ウエルになるよう細胞懸濁液を調製して接種した。合計１６３２ウエルに播種した結果、７２クローンを得た。６ウエルプレート、三角フラスコと拡大し、生産性と増殖性を考慮しながら、３クローンを選択した。このうち、生産性の高いクローン株を６１−３３γ株とした。無血清培地に馴化した細胞株６１−３３γ株は、平成１２年１０月１３日付で工業技術院生命工学工業技術研究所（日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号）にＦＥＲＭ ＢＰ−７３２５として寄託されている。
なお、上記方法で得られた無血清培地に馴化した細胞株６１−３３γ株は、無血清培地である該基本培地に０．２％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ、１０ｍｇ／Ｌインシュリン、１０ｍｇ／Ｌトランスフェリンおよび２００ｎＭ ＭＴＸを含有してなる培地中で継代期間を３〜５日として継代培養を行うことより、１１０日間にわたって安定して継代培養を行うことができた。
また、ＦＥＲＭ ＢＰ−７３２５をＨｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ培地に０．１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡおよび２００ｎＭ ＭＴＸを含有してなる無血清培地に３×１０６細胞／ｍｌとなるよう接種し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで３日間のバッチ培養を行った。その結果、培養終了時において、細胞濃度は１７．５×１０６細胞／ｍｌであり、上清から得られる抗体濃度は３９ｍｇ／Ｌであった。
一方、ＦＥＲＭ ＢＰ−６６９１をＩＭＤ培地に１０％（ｖ／ｖ）ｄＦＢＳおよび２００ｎＭ ＭＴＸを含有してなる血清培地に３×１０６細胞／ｍｌとなるよう接種し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで３日間のバッチ培養を行った。その結果、培養終了時において、細胞濃度は１４．２×１０６細胞／ｍｌであり、上清から得られる抗体濃度は２８ｍｇ／Ｌであった。
実施例３
スピナーフラスコに無血清培地を加え、ＦＥＲＭ ＢＰ−７３２５のバッチ培養を行った。
ＦＥＲＭ ＢＰ−７３２５を無血清培地（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ培地；ライフテクノロジー社製）３０ｍｌを入れたＴ−２２５ｃｍ２フラスコを用いて、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内で３日間静置培養した。得られたＦＥＲＭ ＢＰ−７３２５を、０．７Ｌの無血清培地（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ培地；ライフテクノロジー社製）を入れた１Ｌ容スピナーフラスコ（柴田ハリオ社製）に、３×１０５細胞／ｍｌ接種した。
培養液のｐＨを７．１±０．１、溶存酸素濃度を５±０．２ｐｐｍに制御しながら、攪拌速度３０ｒｐｍで攪拌培養を行った。通気はスピナーフラスコ内に設置した多孔性テフロンチューブを用い空気、酸素、二酸化炭素の混合ガスを供給した。ｐＨの制御は空気と二酸化炭素の比率を変えること、および１Ｍ炭酸ナトリウム溶液の供給することにより行った。また、溶存酸素濃度の制御は空気と酸素の比率を変えることにより行った。
結果を図１および図２に示す。
図１および図２に示されるとおり、細胞増殖は培養３日目までは対数増殖を示したものの、培養３日目以降は比増殖速度が低下した。生細胞濃度は４日目に最大値約３×１０６細胞／ｍｌに達した後、急激に低下し、培養６日目には生存率が１０％以下に低下したため、培養を終了した。
抗体の生産量は、培養６日間で４５ｍｇ／Ｌであり、バッチ培養による抗体生産速度は７．５ｍｇ／Ｌ／日であった。
実施例４
スピナーフラスコに無血清培地を加え、ＦＥＲＭ ＢＰ−７３２５のフェドバッチ培養を行った。
ＦＥＲＭ ＢＰ−７３２５を無血清培地（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ培地；ライフテクノロジー社製）３０ｍｌを入れたＴ−２２５ｃｍ２フラスコを用いて、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内で３日間静置培養した。得られたＦＥＲＭ ＢＰ−７３２５を、０．７ＬのＨｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ培地を入れた１Ｌ容スピナーフラスコ（柴田ハリオ社製）に、３×１０５細胞／ｍｌ接種した。
通常の添加濃度より高濃度に調整された、アミノ酸（Ｌ−アラニン０．１４０ｇ／Ｌ、Ｌ−アルギニン一塩酸０．４７０ｇ／Ｌ、Ｌ−アスパラギン一水和物０．１５９ｇ／Ｌ、Ｌ−アスパラギン酸０．１６８ｇ／Ｌ、Ｌ−シスチン二塩酸０．５１１ｇ／Ｌ、Ｌ−グルタミン酸０．４２０ｇ／Ｌ、Ｌ−グルタミン４．６７７ｇ／Ｌ、グリシン０．１６８ｇ／Ｌ、Ｌ−ヒスチジン一塩酸二水和物０．２３５ｇ／Ｌ、Ｌ−イソロイシン０．５８８ｇ／Ｌ、Ｌ−ロイシン０．５８８ｇ／Ｌ、Ｌ−リジン一塩酸０．８１８ｇ／Ｌ、Ｌ−メチオニン０．１６８ｇ／Ｌ、Ｌ−フェニルアラニン０．３７０ｇ／Ｌ、Ｌ−プロリン０．２２４ｇ／Ｌ、Ｌ−セリン０．２３５ｇ／Ｌ、Ｌ−スレオニン０．５３２ｇ／Ｌ、Ｌ−トリプトファン０．０９０ｇ／Ｌ、Ｌ−チロシン二ナトリウム二水和物０．５８１ｇ／Ｌ、Ｌ−バリン０．５２６ｇ／Ｌ）、ビタミン（ｄ−ビオチン０．０７２８ｍｇ／Ｌ、Ｄ−パントテン酸カルシウム０．０２２４ｇ／Ｌ、塩化コリン０．０２２４ｇ／Ｌ、葉酸０．０２２４ｇ／Ｌ、ｍｙｏ−イノシトール０．０４０３ｇ／Ｌ、ナイアシンアミド０．０２２４ｇ／Ｌ、ピリドキサール塩酸０．０２２４ｇ／Ｌ、リボフラビン０．００２２４ｇ／Ｌ、チアミン塩酸０．０２２４ｇ／Ｌ、シアノコバラミン０．０７２８ｍｇ／Ｌ）、インシュリン０．２ｇ／Ｌ、トランスフェリン０．２ｇ／Ｌ、アルブミン１．６ｇ／Ｌから構成されるフィード培地を、アミノ酸の比消費速度から推測される消費量を補う目的で累積生細胞濃度が４×１０６細胞／ｍｌ×日を超えた場合に、１回以内／１日の頻度で０．０７Ｌずつ添加するようにした。すなわち、培養３日目、５日目、６日目、７日目、８日目に、フィード培地を０．０７Ｌずつ添加した。また、培養３日目以降、添加直後の培養液中のグルコース濃度が約２５００ｍｇ／Ｌとなるように、１００ｇ／Ｌグルコース溶液を適時添加した。
培養液のｐＨを７．１±０．１、溶存酸素濃度を５±０．２ｐｐｍに制御しながら、攪拌速度３０ｒｐｍで攪拌培養を行った。通気はスピナーフラスコ内に設置した多孔性テフロンチューブを用い空気、酸素、二酸化炭素の混合ガスを供給した。ｐＨの制御は空気と二酸化炭素の比率を変えること、および１Ｍ炭酸ナトリウム溶液を供給することにより行った。また、溶存酸素濃度の制御は空気と酸素の比率を変えることにより行った。
その結果を図１および図２に示す。
細胞増殖は培養５日目まで対数増殖を示し、培養５日目以降は比増殖速度が低下するものの、培養６日目に生細胞濃度は約１×１０７細胞／ｍｌにまで達した。
生細胞濃度が最大値に達した後、生細胞濃度および生存率が緩やかに低下し、培養１０日目に生存率が２０％以下に低下したため、培養を終了した。
抗体の生産量は、培養１０日間で２６０ｍｇ／Ｌを示した。フェドバッチ培養による抗体生産速度は２６．０ｍｇ／Ｌ／日であり、同一スケールのバッチ培養と比較して、抗体生産速度が約３．５倍に向上した。
実施例５
スピナーフラスコに無血清培地を加え、ＦＥＲＭ ＢＰ−７３２５の連続培養を行った。なお、連続培養におけるパーフュージョンを実施するため、細胞濃縮液と培養上清の固液分離には、遠心分離器を用いた。
ＦＥＲＭ ＢＰ−７３２５を無血清培地（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ培地；ライフテクノロジー社製）３０ｍｌを入れたＴ−２２５ｃｍ２フラスコを用いて、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内で３日間静置培養した。得られたＦＥＲＭ ＢＰ−７３２５を、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ培地にアミノ酸（Ｌ−アラニン０．２２０ｇ／Ｌ、Ｌ−アルギニン一塩酸０．７３９ｇ／Ｌ、Ｌ−アスパラギン一水和物０．２６４ｇ／Ｌ、Ｌ−アスパラギン酸０．２２０ｇ／Ｌ、Ｌ−シスチン二塩酸塩０．８０３ｇ／Ｌ、１−グルタミン酸０．６６０ｇ／Ｌ、Ｌ−グルタミン７．３４ｇ／Ｌ、グリシン０．２６４ｇ／Ｌ、Ｌ−ヒスチジン一塩酸二水和物０．３７０ｇ／Ｌ、Ｌ−イソロイシン０．９２４ｇ／Ｌ、Ｌ−ロイシン０．９２４ｇ／Ｌ、Ｌ−リジン一塩酸１．２８５ｇ／Ｌ、Ｌ−メチオニン０．２６４ｇ／Ｌ、Ｌ−フェニルアラニン０．５８１ｇ／Ｌ、Ｌ−プロリン０．３５２ｇ／Ｌ、Ｌ−セリン０．３７０ｇ／Ｌ、Ｌ−スレオニン０．８３６ｇ／Ｌ、Ｌ−トリプトファン０．１４１ｇ／Ｌ、Ｌ−チロシン二ナトリウム二水和物０．９１５ｇ／Ｌ、Ｌ−バリン０．８２７ｇ／Ｌ）、ビタミン（ｄ−ビオチン０．１１４ｍｇ／Ｌ、Ｄ−ｐンｔｐテン酸カルシウム０．０３５２ｇ／Ｌ、塩化コリン０．０３５２ｇ／Ｌ、葉酸０．０３５２ｇ／Ｌ、ｍｙｏ−イノシトール０．０６３４ｇ／Ｌ、ナイアンシンアミド０．０３５２ｇ／Ｌ、ピリドキサール塩酸０．０３５２ｇ／Ｌ、リボフラビン０．００３５２ｇ／Ｌ、チアミン塩酸塩０．０３５２ｇ／Ｌ、シアノコバラミン０．１１４ｍｇ／Ｌ）、インシュリン（０．３ｇ／Ｌ）、トランスフェリン（０．３ｇ／Ｌ）およびアルブミン（２．５ｇ／Ｌ）からなる補強培地を１８％（ｖ／ｖ）添加した培地を１Ｌ入れた１Ｌ容スピンナーフラスコ（柴田ハリオ社製）に、３×１０５細胞／ｍｌとなるように播種した。
パーフュージョンは１×１０６細胞／ｍｌに到達したところで開始した。その後、パーフュージョン速度（ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ ｒａｔｅ）、すなわち１日当たりの培地交換率を細胞数に応じて上昇させ、１Ｌ／日としたところで、生細胞数の維持期間に入った。なお、固液分離装置は培養細胞用の小型連続遠心機（Ｌａｂ−ＩＩ：ソーバル社製）を使用した。
培養細胞用の小型連続遠心機の回転速度は、培養開始から生細胞濃度が１×１０７細胞／ｍｌに達するまで８００ｒｐｍとし、生細胞濃度が１×１０７細胞／ｍｌに達した後は４００ｒｐｍ（１８×Ｇ）とし、３５日間の培養を行った。
なお、回転速度を８００ｒｐｍに設定した場合、ほぼ全ての細胞が系内に回収され、系外には細胞がほとんど含まれない培養上清のみが排出された。また、４００ｒｐｍに設定した場合、全細胞数の１／２の細胞が系外へ排出されるため、系外へ排出される細胞数と増殖した細胞数とが均衡し、細胞濃度が一定に保持された。
ＦＥＲＭ ＢＰ−７３２５のパーフュージョン培養期間中の生細胞濃度および生存率を図３に示す。
図３に示されるとおり、生細胞濃度は培養開始５日目以降の３０日間は１×１０７細胞／ｍｌに、生存率は培養期間を通じて９０％に、それぞれ維持されていた。また、抗体の生産量は、培養３５日間で２２００ｍｇ／Ｌを示した。パーフュージョン培養による抗体の生産速度は、６２．９ｍｇ／Ｌ／日であった。
実施例６
ＦＥＲＭ ＢＰ−７３２５を、インシュリンを含有しないＨｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ培地（ライフテクノロジー社製）に２０ｍｇ／Ｌとなるようにインシュリンを添加した培地の入ったＴ−７５フラスコ中に接種して、継代培養した。培養終了後、培養液を遠心分離して上清を除去し、細胞を回収した。回収した細胞をインシュリンを含有しないＨｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ培地の入ったＴ−７５の静置培養フラスコ中に接種し、３日間培養した。培養終了後、培養液を遠心分離して上清を除去し、細胞を回収した。
回収した細胞を、インシュリンを含有しないＨｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ培地にそれぞれ０、５、１０および２０ｍｇ／Ｌとなるようにインシュリンを添加した培地に懸濁した後、Ｔ−フラスコへ接種し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内で６日間静置培養した。
培養終了後、培養液中の生細胞数と抗体濃度を測定し、抗体濃度の比生産速度を算出した。
結果を、第１表に示す。
なお、細胞増殖率はインシュリンの濃度依存的に若干低下したが、顕著な低下は認められなかった。
産業上の利用可能性
本発明によれば、ラット細胞を用いた所望のポリペプチドの製造方法を提供することができる。特に、本発明の方法で得られる抗体は、ＡＤＣＣ活性が高く、医薬品として有用である。
【図面の簡単な説明】
図１ 無血清培地に馴化した抗ＧＤ３キメラ抗体生産細胞株６１−３３γ（ＦＥＲＭ ＢＰ−７３２５）の培養における、生細胞濃度と生存率の推移を示す。
図２ 無血清培地に馴化した抗ＧＤ３キメラ抗体生産細胞株６１−３３γ（ＦＥＲＭ ＢＰ−７３２５）の培養における、抗ＧＤ３キメラ抗体ＫＭ−８７１の抗体濃度の推移を示す。
図３ 無血清培地に馴化した抗ＧＤ３キメラ抗体生産細胞株６１−３３γ（ＦＥＲＭ ＢＰ−７３２５）のパーフュージョン培養における、生細胞濃度と生存率の推移を示す。
Claims (15)
- 血清を含有しない培地（以下、無血清培地という）に馴化したラット由来のミエローマ細胞またはミエローマ細胞系の雑種細胞を無血清培地で培養し、培養物中から所望のポリペプチドを採取することを特徴とするポリペプチドの製造方法であって、無血清培地に２ヶ月以上増殖継代できる細胞株であり、かつ１×１０ ５ 〜１×１０ ６ 細胞／ｍｌの細胞密度となるように無血清培地へ接種することにより馴化された細胞株であり、該細胞の無血清培地への馴化において培養液中のインシュリン濃度を１０ｍｇ／Ｌ以下に維持する工程を経ることを特徴とする方法。
- ラット細胞がＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６６２：以下、ＹＢ２／０という）である請求の範囲１に記載の方法。
- 細胞が所望のポリペプチドをコードするＤＮＡを含有する組換え体ＤＮＡを導入してなる細胞である、請求の範囲１〜２のいずれかに記載の方法。
- 培養がバッチ培養、フェドバッチ培養またはパーフュージョン培養である、請求の範囲１〜３のいずれかに記載の方法。
- 培養中に、栄養因子および生理活性物質から選ばれる少なくとも一種を培地に添加する、請求の範囲１〜４のいずれかに記載の方法。
- 栄養因子がグルコース、アミノ酸およびビタミンから選ばれる少なくとも一種である、請求の範囲5に記載の方法。
- 生理活性物質が、インシュリン、トランスフェリンおよびアルブミンから選ばれる少なくとも一種である請求の範囲5に記載の製造方法。
- 所望のポリペプチドが免疫機能分子である、請求の範囲１〜７のいずれかに記載の方法。
- 免疫機能分子が蛋白質またはペプチドである、請求の範囲8に記載の方法。
- 蛋白質またはペプチドが、抗体、抗体の断片または抗体のＦｃ領域を有する融合蛋白質である、請求の範囲９に記載の方法。
- 抗体が、腫瘍関連抗原を認識する抗体、アレルギーもしくは炎症に関連する抗原を認識する抗体、循環器疾患に関連する抗原を認識する抗体、自己免疫疾患に関連する抗原を認識する抗体、またはウイルスもしくは細菌感染に関連する抗原を認識する抗体である、請求の範囲１０に記載の方法。
- 腫瘍関連抗原を認識する抗体が抗ＧＤ２抗体、抗ＧＤ３抗体、抗ＧＭ２抗体、抗ＨＥＲ２抗体、抗ＣＤ５２抗体、抗ＭＡＧＥ抗体、抗塩基性繊維芽細胞増殖因子抗体、抗塩基性繊維芽細胞増殖因子受容体抗体、抗ＦＧＦ８抗体、抗ＦＧＦ８受容体抗体、抗インシュリン様増殖因子抗体、抗ＰＭＳＡ抗体、抗血管内皮細胞増殖因子抗体または抗血管内皮細胞増殖因子受容体抗体であり、アレルギーまたは炎症に関連する抗原を認識する抗体が抗インターロイキン６抗体、抗インターロイキン６受容体抗体、抗インターロイキン５抗体、抗インターロイキン５受容体抗体、抗インターロイキン４抗体、抗インターロイキン４受容体抗体、抗腫瘍壊死因子抗体、抗腫瘍壊死因子受容体抗体、抗ＣＣＲ４抗体、抗ケモカイン抗体または抗ケモカイン受容体抗体であり、循環器疾患に関連する抗原を認識する抗体が抗ＧｐＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体、抗血小板由来増殖因子抗体、抗血小板由来増殖因子受容体抗体または抗血液凝固因子抗体であり、自己免疫疾患に関連する抗原を認識する抗体が抗自己ＤＮＡ抗体であり、ウイルスまたは細菌感染に関連する抗原を認識する抗体が抗ｇｐ１２０抗体、抗ＣＤ４抗体、抗ＣＣＲ４抗体または抗ベロ毒素抗体である、請求の範囲１１に記載の方法。
- 抗体が抗ＧＤ３ヒト型キメラ抗体、ヒト化抗インターロイキン５受容体α鎖抗体または抗ＧＭ２ヒト型ＣＤＲ移植抗体である、請求の範囲１１に記載の方法。
- ラット細胞を、培養液中のインシュリン濃度を１０ｍｇ／Ｌ以上に維持して培養した後、培養液中のインシュリン濃度を１０ｍｇ／Ｌ以下に維持して培養する、請求の範囲１〜１３のいずれかに記載の方法。
- 無血清培地に馴化したラット細胞株６１−３３γ（ＦＥＲＭ ＢＰ−７３２５）。
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