CN102746404B - 对FcRn的结合被改变的Fc变体 - Google Patents

Abstract

本申请涉及优化的IgG免疫球蛋白变体，产生他们的加工方法以及他们的应用，特别是用于治疗目的。本申请涉及对FcRn的结合被改变的Fc变体。

Description

对FcRn的结合被改变的Fc变体

此案是申请日为2005年11月14日、中国申请号为200580046520.5、发明名称为“对FcRn的结合被改变的Fc变体”的发明申请的分案申请。

本申请依照35U.S.C.119(e)要求2004年11月12日提交的USSN，60/627,763；2005年1月11日提交的USSN，60/642,886；2005年2月2日提交的USSN60/649,508；2005年3月15日提交的USSN60/662,468；2005年4月6日提交的USSN60/669,311；2005年5月16日提交的USSN60/681,607；2005年6月13日提交的USSN60/690,200；2005年7月15日提交的USSN60/696,609；2005年7月27日提交的USSN60/703,018；和2005年10月12日提交的USSN60/726,453的优先权，在此将他们全部引入作为参考。

发明领域

本申请涉及优化的IgG免疫球蛋白变体，产生他们的加工方法以及他们的应用，特别是用于治疗目的。

发明背景

抗体是结合特异性抗原的免疫蛋白。在包括人和小白鼠的大多数哺乳动物中，可以从配对的重多肽链和轻多肽链构建抗体。每条链都由独立的免疫球蛋白(Ig)域组成，因此统称术语免疫球蛋白被用来描述这种蛋白。每条链由称为可变区和恒定区的两个不同的区组成。轻链和重链可变区显示出抗体之间显著的序列多样性，他们负责结合靶抗原。恒定区显示出较低的序列多样性，而且他们负责结合许多天然蛋白以引起重要的生化事件。人类有五种不同类别的抗体，包括IgA(包括亚类IgA1和IgA2)、IgD、IgE、IgG(包括亚类IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)和IgM。虽然这些抗体的V区可以存在细微的差异，但他们之间的区别特征在他们的恒定区。图1显示了在这里作为描述免疫球蛋白一般结构特点的实例的IgG1抗体。IgG抗体是由两条重链和两条轻链组成的四聚体蛋白。IgG重链由从N-到C-末端依次为VH-CH1-CH2-CH3的四个免疫球蛋白域组成，VH-CH1-CH2-CH3分别被称为重链可变域、重链恒定域1、重链恒定域2和重链恒定域3(也称为VH-Cγ1-Cγ2-Cγ3，分别指重链可变域、恒定γ1域、恒定γ2域和恒定γ3域)。IgG轻链由从N-到C-末端依次为VL-CL的两个免疫球蛋白域组成，VL-CL分别被称为轻链可变域和轻链恒定域。

抗体的可变区包含该分子的抗原结合决定簇，因此它决定了抗体对靶抗原的特异性。可变区的序列与来自同一类别的其他抗体的序列差异最大，可变区也因此得名。序列差异性大部分发生在互补决定区(CDRs)。总共有6个CDRs，重链和轻链各三个，被命名为VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3、VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3。CDRs外的可变区被称为骨架(FR)区。虽然FR区的变化不如CDRs大，但不同抗体之间的FR区也会出现序列差异。总的说来，抗体的这些特征性结构提供了稳定的支架(FR区)，免疫***基于该支架能探索实质性的抗原结合多样性(CDRs)以获得针对较宽抗原系列的特异性。可以获取来自不同生物体的多种可变区片段的大量高分辨率结构，其中一些可变区片段是非结合的，一些与抗原形成了复合物。已经能很好地表征抗体可变区的序列和结构特点(Moreaetal.,1997,BiophysChem68:9-16；Moreaetal.,2000,Methods20:267-279,全部引入作为参考)、抗体的保守特征已经使大家能开发大量的抗体工程技术(Maynardetal.,2000,AnnuRevBiomedEng2:339-376，全部引入作为参考)。例如：将来自一种抗体，例如鼠抗体的CDRs嫁接到另一种抗体，例如人抗体的框架区上是可的。在本领域被称为"人源化"的这一过程能从非人类抗体产生免疫原性较低的抗体治疗剂。当不存在抗体其他区时，包含可变区的片段可以存在，包括，例如包含VH-Cγ1和VH-CL的抗原结合片段(Fab)、包含VH和VL的可变区片段(Fv)、在同一条链中包含连接在一起的VH和VL的单链可变区片段(scFv)，以及多种其他可变区片段。

抗体的Fc区与大量Fc受体和配体相互作用，赋予抗体一系列重要的被称为效应器功能的性能。如图1和2所示，IgG的Fc区包含Ig域Cγ2，Cγ3和引入Cγ2的N-末端铰链。IgG类Fc受体的重要家族是Fcγ受体(FcγRs)。这些受体介导抗体和免疫***细胞臂之间的联系(Raghavanetal.,1996,AnnuRevCellDevBiol12:181-220；Ravetchetal.,2001,AnnuRevImmunol19:275-290，都全部引入作为参考)。在人类中，这些蛋白家族包括包含亚型FcγRIa、FcγRIb和FcγRIc的FcγRI(CD64)，包含亚型FcγRIIa(包括同种异型H131和R131)、FcγRIIb(包括FcγRIIb-1和FcγRIIb-2)和FcγRIIc的FcγRII(CD32)；以及包含亚型FcγRIIIa(包括同种异型V158和F158)和FcγRIIIb(包括同种异型FcγRIIIb-NA1和FcγRIIIb-NA2)的FcγRIII(CD16)(Jefferisetal.,2002,ImmunolLett82:57-65，全部引入作为参考)。这些受体通常具有介导与Fc结合的胞外域、跨膜区和介导细胞内一些信号事件的胞内域。这些受体在包括单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、树突状细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、血小板、B细胞、大颗粒淋巴细胞、郎格罕氏细胞、自然杀伤(NK)细胞和γγT细胞的多种免疫细胞中表达。Fc/FcγR复合物的形成将这些效应细胞招募到结合抗原的位点，通常会导致细胞内发生信号发送事件和随后重要的免疫反应，例如炎症介质的释放、B细胞激活、内吞作用、吞噬作用和细胞毒素攻击。调节细胞毒素和吞噬效应器功能的能力是抗体破坏靶细胞的潜在机制。细胞介导的其中表达FcγRs的非特异性细胞毒性细胞识别靶细胞上结合的抗体并随后导致靶细胞裂解的反应被称为抗体依赖细胞介导的细胞毒作用(ADCC)(Raghavanetal.,1996,AnnuRevCellDevBiol12:181-220；Ghetieetal.,2000,AnnuRevImmunol18:739-766；Ravetchetal.,2001,AnnuRevImmunol19:275-290,全部引入作为参考)。细胞介导的其中表达FcγRs的非特异性细胞毒性细胞识别靶细胞上结合的抗体并随后引起靶细胞吞噬作用的反应被称为抗体依赖细胞介导的吞噬作用(ADCP)。已经弄清楚人FcγRs，包括FcγRIIa(pdb登记入册代码1H9V，全部引入作为参考)(Sondermannetal.,2001,JMolBiol309:737-749，全部引入作为参考)(pdb登记入册代码1FCG，全部引入作为参考)(Maxwelletal.,1999,NatStructBiol6:437-442，全部引入作为参考)、FcγRIIb(pdb登记入册代码2FCB，全部引入作为参考)(Sondermannetal.,1999,EmboJ18:1095-1103，全部引入作为参考)和FcγRIIIb(pdb登记入册代码1E4J，全部引入作为参考)(Sondermannetal.,2000,Nature406:267-273,全部引入作为参考)的细胞外域的大量结构。所有FcγRs都结合图1显示的Fc上的Cγ2域的N-末端和铰链之前的相同区。从结构上可以很好地表征这一相互作用(Sondermannetal.,2001,JMolBiol309:737-749，全部引入作为参考)，已经弄清楚结合到人FcγRIIIb的细胞外域的人Fc的几个结构(pdb登记入册代码1E4K，全部引入作为参考)(Sondermannetal.,2000,Nature406:267-273,entirelyincorporatedbyreference，全部引入作为参考)(pdb登记入册代码1IIS和1IIX，全部引入作为参考)(Radaevetal.,2001,JBiolChem276:16469-16477，全部引入作为参考)，而且他们具有人IgEFc/FcεRIα复合物的结构(pdb登记入册代码1F6A，全部引入作为参考)(Garmanetal.,2000,Nature406:259-266，全部引入作为参考)。

不同的IgG亚类对FcγRs具有不同的亲和力，IgG1和IgG3通常比IgG2和IgG4能更好地结合受体(Jefferisetal.,2002,ImmunolLett82:57-65，全部引入作为参考)。所有的FcγRs可以结合IgGFc上的相同区，但亲和力不同：高亲和力结合剂FcγRI结合IgG1的Kd为10^-8M^-1，而低亲和力受体FcγRII和FcγRIII结合时的Kd通常分别为10^-6和10^-5。FcγRIIIa和FcγRIIIb的细胞外域的96%是相同的；但是，FcγRIIIb没有胞内信号发送域。而且，FcγRI、FcγRIIa/c和FcγRIIIa是免疫复合物触发激活的正调节物，其特征在于具有有基于酪氨酸的免疫受体激活基序(ITAM)的胞内域，而FcγRIIb具有基于酪氨酸的免疫受体抑制基序(ITIM)，因此它是抑制性的。因此前者被称为激活受体，FcγRIIb被称为抑制性受体。该受体的表达模式和水平在不同的免疫细胞上也不相同。复杂的另一水平在于人蛋白组中存在大量FcγR多态性。具有临床意义的特别相关的多态性是V158/F158FcγRIIIa。人IgG1结合到V158同种异型上的亲和力比结合到F158同种异型上的亲和力大。已经证明亲和力差异，以及推测的该差异对ADCC和/或ADCP的影响是抗CD20抗体利妥昔单抗(BiogenIdec)功效重要的决定因素。具有V158同种异型的病人能更顺利地对利妥昔单抗治疗作出响应；但是，具有较低亲和力的F158同种异型的病人的响应弱(Cartronetal.,2002,Blood99:754-758，全部引入作为参考)。大约10-20%的人是V158/V158纯合子，45%是V158/F158杂合体，35-45%的人是F158/F158纯合子(Lehrnbecheretal.,1999,Blood94:4220-4232；Cartronetal.,2002,Blood99:754-758，都全部完全引入作为参考)。因此，80-90%的人是弱应答者，也就是说他们拥有F158FcγRIIIa的至少一个等位基因。

图1显示的Fc上的重叠但分离的位点起补体蛋白C1q分界面的作用。Fc/C1q的结合介导补体依赖性细胞毒性(CDC)，方式与Fc/FcγR结合介导ADCC相同。C1q与丝氨酸蛋白酶C1r和C1s形成复合物以产生C1复合物。C1q能结合六个抗体，但是结合两个IgGs就足以激活补体级联反应。与Fc和FcγRs的相互作用相似，不同的IgG亚类对C1q具有不同的亲和力，IgG1和IgG3通常比IgG2和IgG4能更好地结合FcγRs(Jefferisetal.,2002,ImmunolLett82:57-65，全部引入作为参考)。

在IgG中，位于Fc上Cg2和Cg3域之间的位点(图1)介导与新生受体FcRn的相互作用，其中结合可以让来自内体的内吞抗体再循环到血流中(Raghavanetal.,1996,AnnuRevCellDevBiol12:181-220；Ghetieetal.,2000,AnnuRevImmunol18:739-766，都全部引入作为参考)。这一过程与防止大的全长分子引起的肾脏滤过一起产生一到三周的有利的抗体血清半衰期。Fc与FcRn的结合在抗体转运中也起关键作用。Fc上结合FcRn的位点也是细菌蛋白A和G结合的位点。与这些蛋白的紧密结合通常可以用作蛋白纯化期间，使用蛋白A或蛋白G亲和色谱法纯化抗体的方式。因此，Fc上该区域的保真度对抗体的临床特性和他们的纯化都很重要。可利用的大鼠Fc/FcRn复合物(Burmeisteretal.,1994,Nature,372:379-383；Martinetal.,2001,MolCell7:867-877，都全部引入作为参考)、以及Fc与蛋白A和G的复合物(Deisenhofer，1981,Biochemistry20:2361-2370；Sauer-Erikssonetal.,1995,Structure3:265-278；Tashiroetal.,1995,CurrOpinStructBiol5:471-481，都全部引入作为参考)的结构提供了洞察Fc与这些蛋白相互作用的方式。FcRn受体也负责将IgG转移到新生儿的肠道和成年人的肠上皮腔中(GhetieandWard,Annu.Rev.Immunol.,2000,18:739-766；Yoshidaetal.,Immunity,2004,20(6):769-783，都全部引入作为参考)。

对大鼠和人Fc域的研究表明，一些Fc残基对结合FcRn很重要。大鼠和人序列在Fc区(Kabat等编号的残基237-443)具有大约64%的序列同一性。大鼠/人Fc、FcRn重链和FcRn轻链(β-2-微球蛋白)的比对参见图3，4和5。根据现有大鼠Fc/FcRn复合物结构构建了人Fc/FcRn复合物模型(Burmeisteretal.,1994,Nature,372:379-383；Martinetal.,2001,MolCell7:867-877，全部引入作为参考)。大鼠和人序列共用一些对FcRn结合起关键作用的残基，例如H310和H435(Medesanetal.,1997J.Immunol.158(5):221-7；Shieldsetal.,2001,J.Biol.Chem.276(9):6591-6604,都全部引入作为参考)。但是，人和大鼠蛋白在多个位点具有不同的氨基酸，致使上述残基在人序列中与在大鼠序列中相比，处于不同的环境，并且可以有不同的特性。这种差异性限制了将特性从一种同系物转移到另一种同系物的能力。

在鼠Fcγ中，位点T252、T254和T256的随机突变和噬菌体展示选择导致产生了FcRn亲和力增加3.5倍，血清半衰期增加1.5倍的三联突变体T252L/T254S/T256F(Ghetieetal.,1997,Nat.Biotech.15(7):637-640，全部引入作为参考)。

大鼠Fc/FcRn复合物的晶体结构鉴定了对FcRn结合重要的Fc残基(Burmeisteretal.Nature.372:379-383(1994)；Martinetal.MolecularCell.7:867-877(2001)，都全部引入作为参考)。在1994年已经确定了分辨率为的原始Fc/FcRn复合结构(表2a,Burmeisteretal.Nature.372:379-383(1994)，全部引入作为参考)。Marin等在2001年确定的更高分辨率结构显示了侧链位置更详细的视图(Martinetal.MolecularCell.7:867-877(2001)，全部引入作为参考)。利用包含破坏FcRn结合的突变T252G/I253G/T254G/H310E/H433E/H435E的一个单体与包含野生型Fc单体的一个单体的Fc二聚体确定了结合大鼠FcRn的大鼠Fc的晶体结构。

人Fcγ的突变研究已经对结合FcRn重要的一些残基进行了研究，结果表明他们具有增加的血清半衰期。Hinton等在人Fcγ1中逐一地将三个残基突变成了另外19种常见的氨基酸。Hinton等发现一些点突变的双重突变体增加了FcRn结合亲和力(Hintonetal.,2004,J.Biol.Chem.279(8):6213-6216，全部引入作为参考)。两种突变增加了在猴中的半衰期。Shields等几乎专门将残基突变成了Ala，并研究了他们对FcRn和FcγR的结合(Shieldsetal.,2001,J.Biol.Chem.,276(9):6591-6604，全部引入作为参考)。

Dall'Acqua等利用噬菌体展示选择了结合FcRn的亲和力增加的Fc突变(Dall'Acquaetal.2002,J.Immunol.169:5171-5180，全部引入作为参考)。选择的DNA序列主要是双重和三重突变体。参考文献中已经表达了由许多所选择的序列编码的蛋白，而且发现一些蛋白能比野生型Fc更紧密地结合FcRn。

施用作为治疗剂的抗体和Fc融合蛋白需要以与蛋白清除和半衰期特征相关的规定频率进行注射。体内半衰期较长可以容许次数更少的注射或以较低的剂量给药，而这显而易见是有利的。虽然过去对Fc域的突变已经导致一些蛋白对FcRn的结合亲和力增加和体内半衰期延长，但还没有从这些突变中鉴定出具有增强的体内半衰期的最佳突变。

Fc区的一个特征是发生在图1显示的N297上的保守N连接糖基化。有时提到这种糖或低聚糖对抗体的结构和功能起决定性作用，而且也是必须利用哺乳动物表达***生产抗体的主要原因之一。etal.,1999,NatBiotechnol17:176-180；Daviesetal.,2001,BiotechnolBioeng74:288-294；Mimuraetal.,2001,JBiolChem276:45539-45547.；Radaevetal.,2001,JBiolChem276:16478-16483；Shieldsetal.,2001,JBiolChem276:6591-6604；Shieldsetal.,2002,JBiolChem277:26733-26740；Simmonsetal.,2002,JImmunolMethods263:133-147；Radaevetal.,2001,JBiolChem276:16469-16477和Krappetal.,2003,JMolBiol325:979-989，都全部引入作为参考)。

已经开发出用于治疗的抗体。与这种治疗相关的代表性的出版物包括Chamowetal.,1996,TrendsBiotechnol14:52-60；Ashkenazietal.,1997,CurrOpinImmunol9:195-200,Craggetal.,1999,CurrOpinImmunol11:541-547；Glennieetal.,2000,ImmunolToday21:403-410,McLaughlinetal.,1998,JClinOncol16:2825-2833和Cobleighetal.,1999,JClinOncol17:2639-2648，都全部引入作为参考。在目前的抗癌治疗中，死亡率方面的任何小的改进都能决定成功。这里公开的某些IgG变体增强了抗体限制靶癌细胞进一步生长或破坏，至少部分破坏靶癌细胞的能力。

抗体的抗肿瘤效能是通过他们介导细胞毒素效应器功能，例如ADCC、ADCP和CDC的能力的增强实现的。实施包括Clynesetal.,1998,ProcNatlAcadSciUSA95:652-656；Clynesetal.,2000,NatMed6:443-446和Cartronetal.,2002,Blood99:754-758，都全部引入作为参考。

人IgG1是最经常用于治疗目的的抗体，在上下文中已经构建了大部分加工设计研究过程。IgG类的不同同种型，包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4具有独特的物理、生物和临床特性。本领域需要设计改善的IgG1、IgG2、IgG3和IgG4变体。更进一步地需要设计与天然IgG多肽相比，对FcRn的结合被改善和/或体内半衰期延长的这种变体。本申请满足了这些需要及其他需要。

发明概述

本发明公开了对FcRn受体的结合增强和体内血清滞留延长的Fc域新变体的产生，Fc域包括在抗体、Fc融合物和免疫粘附物中发现的那些Fc域。本发明另一方面是，使FcRn结合相对于野生型增加(具体在较低pH，大约pH6.0时)，以促进内体中的Fc/FcRn结合。本发明另一方面是，设计的变体在大约pH6时的结合优于它们在大约pH7.4时的结合，这样可以促进Fc在细胞内再循环后再次释放到血液中。

本发明另一方面涉及，设计对FcRn的结合降低和体内半衰期缩短的Fc变体。这种蛋白包含使FcRn亲和力降低和/或使体内半衰期缩短的突变，它们可用于多种治疗和诊断，包括递送和监测放疗，在所述放疗中，放射标记物的半衰期理论上大约等于它的蛋白偶联物的体内半衰期。

本发明另一方面涉及改变与FcR，例如人中的FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIIa结合的Fc域。这些受体负责诱导抗体的各种效应器功能。因此，本发明另一方面涉及改变Fc域的效应器功能，例如抗体依赖细胞介导的细胞毒作用(ADCC)、补体依赖性细胞毒性(CDC)和抗体依赖细胞介导的吞噬作用(ADCP)。

本发明另一方面涉及一种Fc变体，其FcRn结合有变且Fcg结合有变，导致对包含该Fc的蛋白的体内半衰期和效应器功能都产生影响。例如：这些变体可具有延长的体内半衰期和改进的ADCC。例如，所述变体可具有延长的半衰期和降低的CDC。

本发明另一方面提供了编码变体Fc蛋白的重组核酸、表达载体和宿主细胞。

另一方面，本发明提供了产生包含Fc变体的蛋白的方法，该方法包括在适合表达该蛋白的条件下培养本发明的宿主细胞。

本发明另一方面提供了包含本发明的变体Fc蛋白和药学载体的药物组合物。

本发明另一方面提供了治疗紊乱的方法，包括给病人施用包含本发明的变体Fc的蛋白。

另一方面，本发明提供了在所述亲代多肽的Fc区包含至少一个修饰的亲代Fc多肽的Fc区变体，其中与亲代多肽相比，所述变体蛋白对FcRn的结合显示出改变，而且其中所述Fc变体包含至少一个选自由246H，246S，247D，247T，248H，248P，248Q，248R，248Y，249T，249W，251D，251E，251H，251I，251K，251M，251N，251T，251V，251Y，252F，252L，253L，253T，253V，254H，254L，254N，254T，254V，^254N，255E，255F，255H，255K，255S，255V，256E，256H，256V，257A，257C，257D，257E，257F，257G，257H，257I，257K，257L，257M，257N，257Q，257R，257S，257T，257V，257W，257Y，258R，258V，279A，279C，279D，279F，279G，279H，279I，279K，279L，279M，279N，279P，279Q，279R，279S，279T，279W，279Y，280E，280H，^281A，^281D，^281S，^281T，282D，282F，282H，282I，282T，283F，283I，283L，283Y，284H，284K，284P，284Q，284R，284S，284Y，285S，285V，286#，286L，287H，287S，287V，287Y，288H，288Q，288R，288S，305H，305T，306F，306H，306I，306N，306T，306V，306Y，307D，307V，307Y，308A，308C，308D，308E，308F，308G，308H，308I，308K，308L，308M，308N，308P，308Q，308R，308S，308T，308W，308Y，309F，309H，309I，309N，309P，309Q，309V，309Y，310K，310N，310T，311H，311L，311S，311T，311V，311W，312H，313Y，315E，315G，315H，315Q，315S，315T，317H，317S，339P，340P，341S，374H，374S，376H，376L，378H，378N，380T，380Y，382H，383H，383K，383Q，384E，384G，384H，385A，385C，385D，385E，385F，385H，385I，385K，385L，385M，385N，385P，385Q，385R，385S，385T，385V，385W，385Y，386E，386H，386K，387#，387A，387H，387K，387Q，389E，389H，426E，426H，426L，426N，426R，426V，426Y，427I，429D，429F，429K，429N，429Q，429S，429T，429Y，430D，430H，430K，430L，430Q，430Y，431G，431H，431I，431P，431S，432F，432H，432N，432S，432V，433E，433N，433P，433R，433S，434H，434Q，434S，434Y，435N，436E，436F，436H，436L，436Q，436V，436W，437E，437V，438E，438H和438K组成的群组的修饰。其中参照EU指数进行编号，^表示在指定位置后的***，#表示指定位置的缺失。

在另一方面，本发明提供了包含至少一个选自由246H，246S，247D，247T，248H，248P，248Q，248R，248Y，249T，249W，251D，251E，251H，251I，251K，251M，251N，251T，251V，251Y，252L，253L，253T，253V，254H，254L，254N，254V，^254N，255E，255F，255H，255K，255S，255V，256H，256V，257A，257C，257D，257E，257F，257G，257H，257I，257K，257L，257M，257N，257Q，257R，257S，257T，257V，257W，257Y，258R，258V，279A，279C，279D，279F，279G，279H，279I，279K，279M，279N，279P，279Q，279R，279S，279T，279W，279Y，280H，^281A，^281D，^281S，^281T，282D，282F，282H，282I，282T，283F，283I，283L，283Y，284H，284K，284P，284Q，284R，284S，284Y，285S，285V，286#，286L，287H，287S，287V，287Y，288H，288Q，288S，305H，305T，306F，306H，306I，306N，306T，306V，306Y，307D，307V，307Y，308C，308E，308F，308G，308H，308I，308K，308L，308M，308N，308P，308Q，308R，308S，308W，308Y，309F，309H，309N，309Q，309V，309Y，310K，310N，310T，311L，311T，311V，311W，312H，313Y，315E，315G，315H，315Q，315S，315T，317H，317S，339P，340P，341S，374H，374S，376H，376L，378H，378N，380T，380Y，382H，383H，383K，383Q，384E，384G，384H，385A，385C，385F，385H，385I，385K，385L，385M，385N，385P，385Q，385S，385T，385V，385W，385Y，386E，386H，386K，387#，387A，387H，387K，387Q，389E，389H，426E，426H，426L，426N，426R，426V，426Y，427I，429D，429F，429K，429N，429Q，429S，429T，429Y，430D，430H，430K，430L，430Q，430Y，431G，431H，431I，431P，431S，432F，432H，432N，432S，432V，433E，433N，433P，433S，434H，434Q，434S，435N，436E，436F，436L，436V，436W，437E，437V，438H和438K组成的群组的修饰的Fc变体。

在另一方面，本发明提供了包含至少一个选自由246H，246S，247D，247T，248P，248Q，248Y，249T，249W，251D，251E，251H，251I，251T，251V，252L，253L，253T，253V，254H，254L，254N，254V，^254N，255E，255H，255K，255V，256H，256V，257A，257C，257F，257G，257I，257L，257M，257N，257Q，257S，257T，257V，257W，257Y，258V，279A，279C，279F，279I，279P，279S，279T，279W，279Y，^281A，^281D，^281S，^281T，282F，282I，282T，283F，283I，283L，283Y，284P，285V，286#，286L，287V，288Q，288S，305T，306F，306H，306I，306N，306T，306V，306Y，307V，308C，308F，308G，308L，308M，308N，308P，308Q，308S，308W，308Y，309F，309N，309Q，309V，309Y，310T，311L，311T，311V，311W，313Y，315G，315Q，315S，315T，339P，340P，341S，374H，374S，376L，378H，378N，380T，380Y，382H，383Q，384E，384G，384H，385A，385C，385F，385I，385L，385M，385N，385P，385Q，385S，385T，385V，385W，385Y，386E，386H，386K，387#，387A，387H，387K，387Q，389H，426L，426N，426V，426Y，427I，429D，429F，429K，429N，429Q，429S，429T，429Y，430L，431G，431I，431P，431S，432F，432H，432V，433E，433N，433P，433S，434H，434Q，434S，435N，436F，436L，436V，436W，437E和437V组成的群组的修饰的Fc变体。

本发明涉及

1.亲代多肽的Fc变体，其在所述亲代多肽的Fc区包含至少一个修饰，与亲代多肽相比，所述变体蛋白对FcRn的结合显示出改变，且所述Fc变体包含至少一个选自由246H，246S，247D，247T，248H，248P，248Q，248R，248Y，249T，249W，251D，251E，251H，251I，251K，251M，251N，251T，251V，251Y，252F，252L，253L，253T，253V，254H，254L，254N，254T，254V，^254N，255E，255F，255H，255K，255S，255V，256E，256H，256V，257A，257C，257D，257E，257F，257G，257H，257I，257K，257L，257M，257N，257Q，257R，257S，257T，257V，257W，257Y，258R，258V，279A，279C，279D，279F，279G，279H，279I，279K，279L，279M，279N，279P，279Q，279R,279S，279T，279W，279Y，280E，280H，^281A，^281D，^281S，^281T，282D，282F，282H，282I，282T，283F，283I，283L，283Y，284H，284K，284P，284Q，284R，284S，284Y，285S，285V，286#，286L，287H，287S，287V，287Y，288H，288Q，288R，288S，305H，305T，306F，306H，306I，306N，306T，306V，306Y，307D，307V，307Y，308A，308C，308D，308E，308F，308G，308H，308I，308K，308L，308M，308N，308P，308Q，308R，308S，308T，308W，308Y，309F，309H，309I，309N，309P，309Q，309V，309Y，310K，310N，310T，311H，311L，311S，311T，311V，311W，312H，313Y，315E，315G，315H，315Q，315S，315T，317H，317S，339P，340P，341S，374H，374S，376H，376L，378H，378N，380T，380Y，382H，383H，383K，383Q，384E，384G，384H，385A，385C，385D，385E，385F，385H，385I，385K，385L，385M，385N，385P，385Q，385R，385S，385T，385V，385W，385Y，386E，386H，386K，387#，387A，387H，387K，387Q，389E，389H，426E，426H，426L，426N，426R，426V，426Y，427I，429D，429F，429K，429N，429Q，429S，429T，429Y，430D，430H，430K，430L，430Q，430Y，431G，431H，431I，431P，431S，432F，432H，432N，432S，432V，433E，433N，433P，433R，433S，434H，434Q，434S，434Y，435N，436E，436F，436H，436L，436Q，436V，436W，437E，437V，438E，438H和438K组成的群组的修饰，其中参照EU指数进行编号，^表示在指定位置后的***，#表示指定位置的缺失。

2.依照项1的Fc变体，其中所述Fc变体包含至少一个选自由246H，246S，247D，247T，248H，248P，248Q，248R，248Y，249T，249W，251D，251E，251H，251I，251K，251M，251N，251T，251V，251Y，252L，253L，253T，253V，254H，254L，254N，254V，^254N，255E，255F，255H，255K，255S，255V，256H，256V，257A，257C，257D，257E，257F，257G，257H，257I，257K，257L，257M，257N，257Q，257R，257S，257T，257V，257W，257Y，258R，258V，279A，279C，279D，279F，279G，279H，279I，279K，279M，279N，279P，279Q，279R，279S，279T，279W，279Y，280H，^281A，^281D，^281S，^281T，282D，282F，282H，282I，282T，283F，283I，283L，283Y，284H，284K，284P，284Q，284R，284S，284Y，285S，285V，286#，286L，287H，287S，287V，287Y，288H，288Q，288S，305H，305T，306F，306H，306I，306N，306T，306V，306Y，307D，307V，307Y，308C，308E，308F，308G，308H，308I，308K，308L，308M，308N，308P，308Q，308R，308S，308W，308Y，309F，309H，309N，309Q，309V，309Y，310K，310N，310T，311L，311T，311V，311W，312H，313Y，315E，315G，315H，315Q，315S，315T，317H，317S，339P，340P，341S，374H，374S，376H，376L，378H，378N，380T，380Y，382H，383H，383K，383Q，384E，384G，384H，385A，385C，385F，385H，385I，385K，385L，385M，385N，385P，385Q，385S，385T，385V，385W，385Y，386E，386H，386K，387#，387A，387H，387K，387Q，389E，389H，426E，426H，426L，426N，426R，426V，426Y，427I，429D，429F，429K，429N，429Q，429S，429T，429Y，430D，430H，430K，430L，430Q，430Y，431G，431H，431I，431P，431S，432F，432H，432N，432S，432V，433E，433N，433P，433S，434H，434Q，434S，435N，436E，436F，436L，436V，436W，437E，437V，438H和438K组成的群组的修饰。

3.依照项2的Fc变体，其中所述Fc变体包含至少一个选自由246H，246S，247D，247T，248P，248Q，248Y，249T，249W，251D，251E，251H，251I，251T，251V，252L，253L，253T，253V，254H，254L，254N，254V，^254N，255E，255H，255K，255V，256H，256V，257A，257C，257F，257G，257I，257L，257M，257N，257Q，257S，257T，257V，257W，257Y，258V，279A，279C，279F，279I，279P，279S，279T，279W，279Y，^281A，^281D，^281S，^281T，282F，282I，282T，283F，283I，283L，283Y，284P，285V，286#，286L，287V，288Q，288S，305T，306F，306H，306I，306N，306T，306V，306Y，307V，308C，308F，308G，308L，308M，308N，308P，308Q，308S，308W，308Y，309F，309N，309Q，309V，309Y，310T，311L，311T，311V，311W，313Y，315G，315Q，315S，315T，339P，340P，341S，374H，374S，376L，378H，378N，380T，380Y，382H，383Q，384E，384G，384H，385A，385C，385F，385I，385L，385M，385N，385P，385Q，385S，385T，385V，385W，385Y，386E，386H，386K，387#，387A，387H，387K，387Q，389H，426L，426N，426V，426Y，427I，429D，429F，429K，429N，429Q，429S，429T，429Y，430L，431G，431I，431P，431S，432F，432H，432V，433E，433N，433P，433S，434H，434Q，434S，435N，436F，436L，436V，436W，437E，和437V组成的群组的修饰。

4.依照项1的Fc变体，其中所述Fc变体包含至少一个选自由257C，257M，257L，257N，257Y，279Q，279Y，308F和308Y组成的群组的替换。

5.依照项1的Fc变体，其中所述Fc变体包含G385H或N434Y。

依照项3或4的Fc变体，其中所述Fc变体在所述亲代多肽的Fc区包含至少两个修饰。

6.依照项3或4的Fc变体，其中所述Fc变体更进一步地包含至少一个选自由248D，248E，248K，249H，249K，249R，250A，250C，250D，250E，250F，250G，250H，2501，250K，250L，250M，250N，250P，250Q，250R，250S，250V，250W，250Y，251C，251G，251L，251Q，251S，252A，252C，252G，252N，252Q，252S，252T，252V，252W，252Y，253A，254A，254S，255C，255G，255N，255Q，255R，255S，255T，255Y，256A，256D，256F，256K，256Q，256R，256S，256T，258C，258D，258E，258G，258H，258K，258N，258Q，258S，258T，258Y，277A，277C，277D，277E，277F，277G，277H，277I，277K，277L，277M，277N，277P，277Q，277R，277S，277T，277V，277W，277Y，279E，279R，280K，280R，281D，281E，281H，281K，281Q，281R，282E，282K，282R，284C，284D，284E，284G，284N，284T，285A，285C，285D，285G，285H，285N，285Q，285R，285T，285Y，286E，286M，286T，287C，287D，287E，287G，287H，287K，287N，287Q，288D，288E，288H，288K，288R，287R，287S，287T，288A，288C，288D，288E，288F，288G，288H，288K，288L，288M，288N，288P，288T，288V，288W，288Y，304C，305A，305C，305D，305E，305G，305K，305N，305Q，305R，305S，305Y，306A，306C，306D，306E，306G，306K，306L，306M，306N，306P，306Q306R，306R，306S，306T，306V，306W，306Y，309D，309E，309K，309R，310A，310C，310D，310E，310G，310H，311A，311K，311R，312A，312C，312D，312G，312K，312N，312Q，312R，312S，312T，312Y，313D，313E，313H，313K，313R，314A，314C，314D，314E，314F，314G，314H，314I，314L，314M，314N，314P，314Q，314R，314S，314T，314V，314W，314Y，315D，315K，315R，316H，316K，316R，317A，317C，317D，317E，317G，317K，317N，317Q，317R，317T，317Y，340D，340E，340H，340K，340R，343C，343D，343E，343G，343H，343K，343N，343Q，343R，343S，343T，343Y，344L，345C，345D，345E，345G，345H，345K，345N，345Q，345R，345S，345T，345Y，360A，362A，376C，376D，376E，376G，376K，376N，376Q，376R，376S，376T，376Y，378S，380A，382A，383D，383E，383R，386P，386T，387P，387R，389D，389N，389P，389S，415A，424A，424D，424E，424H，424K，424R，426D，426K，428A，428C，428D，428E，428F，428G，428H，428I，428K，428L，428M，428N，428P，428Q，428R，428S，428T，428V，428W，428Y，430C，430E，430G，430N，430R，430S，430T，431D，431E，431K，431R，432C，432G，432Q，432T，432Y，433A，433K，434A，434F，434K，434L，434R，435A，436A，436D，436R，436T，436Y，438D，438E和438R组成的群组的替换。

7.亲代多肽的Fc变体，其在所述亲代多肽的Fc区包含至少一个修饰，与所述亲代多肽相比，所述变体蛋白对FcRn的结合显示出改变，且所述至少一个修饰包括***或缺失。

8.依照项7的Fc变体，其中所述修饰显示对FcRn的结合增高。

9.依照项7的Fc变体，其中所述修饰是***。

10.依照项9的Fc变体，其中所述***位于环中。

11.依照项9的Fc变体，其中所述***位于位点254或281之后。

12.依照项11的Fc变体，其中所述***是^281S。

13.依照项7的Fc变体，其中所述修饰是缺失，附带条件是在同种型IgG1的位点G236没有缺失。

14.依照项13的Fc变体，其中至少一个所述的缺失发生在环内。

15.依照项14的Fc变体，其中至少一个所述的缺失是位点286或387的缺失。

16.亲代多肽的Fc变体，其在所述亲代多肽的Fc区包含至少一个修饰，与所述亲代多肽相比，所述变体蛋白对FcRn和FcγR的结合显示出改变。

17.依照项16的Fc变体，其中所述Fc变体在所述亲代Fc多肽的Fc区包含至少两个氨基酸修饰。

18.依照项16的Fc变体，其中所述Fc变体在所述亲代Fc多肽的Fc区包含至少三个氨基酸修饰。

19.依照项16的Fc变体，其中所述Fc变体在所述亲代Fc多肽的Fc区包含至少四个氨基酸修饰。

20.依照项16的Fc变体，其中与所述亲代多肽相比，所述Fc变体对FcRn的结合显示出增高。

21.依照项16的Fc变体，其中与所述亲代多肽相比，所述Fc变体对FcRn的结合显示出降低。

22.依照项16的Fc变体，其中与所述亲代多肽相比，所述Fc变体对FcγR的结合显示出增高。

23.依照项16的Fc变体，其中所述Fc变体对FcγR和FcRn的结合显示出增高。

24.依照项16的Fc变体，其中所述Fc变体对FcγR和FcRn的结合显示出降低。

25.依照项16的Fc变体，其中所述Fc变体对FcγR的结合显示出降低，对FcRn的结合显示出增高。

26.依照项16的Fc变体，其中所述Fc变体对FcγR的结合显示出增高，对FcRn的结合显示出降低。

27.亲代多肽的Fc变体，其在所述亲代多肽的Fc区包含至少一个氨基酸修饰，与所述亲代多肽相比，所述Fc变体对FcRn的结合显示出改变，且所述Fc变体包含在特异于靶分子的多肽中，所述靶分子是从细胞因子、可溶性蛋白因子和癌细胞上表达的蛋白组成的群组中选出的。

本发明还涉及

1.包含亲代Fc多肽的Fc变体的多肽，其在相当于所述亲代多肽的Fc区含有至少一个修饰，与亲代Fc多肽相比，所述Fc变体对FcRn的结合显示出改变，且所述Fc变体包含至少一个选自由246S，257L，257N，257Q，257Y，279A，279F，279G，279H，279I，279K，279M，279N，279P，279Q，279S，279T，279W，279Y，284H，284K，284P，284Q，284R，284S，308C，308E，308F，308G，308H，308L，308M，308N，308P，308Q，308S，308T，308W，308Y，385C，385F，385H，385I，385L，385M，385N，385P，385Q，385V，385W，385Y，387K和387Q组成的群组的修饰，其中参照EU指数进行编号。

2.依照项1的多肽，其中所述Fc变体包含至少一个选自由257L，257N，257Y，279Q，279Y，308F和308Y组成的群组的替换。

3.依照项1或2的多肽，其中所述Fc变体包含G385H。

4.依照项1-3任何一项的多肽，其中所述Fc变体在所述亲代多肽的Fc区包含至少两个修饰。

5.依照项1-4任何一项的多肽，其中所述Fc变体更进一步地包含至少一个选自由248D，248E，248K，249H，249K，249R，250A，250C，250D，250E，250F，250G，250H，2501，250K，250L，250M，250N，250P，250Q，250R，250S，250V，250W，250Y，251C，251G，251L，251Q，251S，252A，252C，252G，252N，252Q，252S，252T，252V，252W，252Y，253A，254A，254S，255C，255G，255N，255Q，255R，255S，255T，255Y，256A，256D，256F，256K，256Q，256R，256S，256T，258C，258D，258E，258G，258H，258K，258N，258Q，258S，258T，258Y，277A，277C，277D，277E，277F，277G，277H，277I，277K，277L，277M，277N，277P，277Q，277R，277S，277T，277V，277W，277Y，279E，279R，280K，280R，281D，281E，281H，281K，281Q，281R，282E，282K，282R，284C，284D，284E，284G，284N，284T，285A，285C，285D，285G，285H，285N，285Q，285R，285T，285Y，286E，286M，286T，287C，287D，287E，287G，287H，287K，287N，287Q，288D，288E，288H，288K，288R，287R，287S，287T，288A，288C，288D，288E，288F，288G，288H，288K，288L，288M，288N，288P，288T，288V，288W，288Y，304C，305A，305C，305D，305E，305G，305K，305N，305Q，305R，305S，305Y，306A，306C，306D，306E，306G，306K，306L，306M，306N，306P，306Q306R，306R，306S，306T，306V，306W，306Y，309D，309E，309K，309R，310A，310C，310D，310E，310G，310H，311A，311K，311R，312A，312C，312D，312G，312K，312N，312Q，312R，312S，312T，312Y，313D，313E，313H，313K，313R，314A，314C，314D，314E，314F，314G，314H，314I，314L，314M，314N，314P，314Q，314R，314S，314T，314V，314W，314Y，315D，315K，315R，316H，316K，316R，317A，317C，317D，317E，317G，317K，317N，317Q，317R，317T，317Y，340D，340E，340H，340K，340R，343C，343D，343E，343G，343H，343K，343N，343Q，343R，343S，343T，343Y，344L，345C，345D，345E，345G，345H，345K，345N，345Q，345R，345S，345T，345Y，360A，362A，376C，376D，376E，376G，376K，376N，376Q，376R，376S，376T，376Y，378S，380A，382A，383D，383E，383R，386P，386T，387P，387R，389D，389N，389P，389S，415A，424A，424D，424E，424H，424K，424R，426D，426K，428A，428C，428D，428E，428F，428G，428H，428I，428K，428L，428M，428N，428P，428Q，428R，428S，428T，428V，428W，428Y，430C，430E，430G，430N，430R，430S，430T，431D，431E，431K，431R，432C，432G，432Q，432T，432Y，433A，433K，434A，434F，434K，434L，434R，435A，436A，436D，436R，436T，436Y，438D，438E和438R组成的群组的替换。

6.依照项1-5任何一项的多肽，其中与所述亲代Fc多肽相比，所述Fc变体对FcRn和FcγR的结合显示出改变。

7.依照项1-6任何一项的多肽，其中所述Fc变体在相当于亲代Fc多肽的Fc区包含至少两个氨基酸修饰。

8.依照项1-6任何一项的多肽，其中所述Fc变体在相当于亲代Fc多肽的Fc区包含至少三个氨基酸修饰。

9.依照项1-6任何一项的多肽，其中所述Fc变体在相当于亲代Fc多肽的Fc区包含至少四个氨基酸修饰。

10.依照项1-9任何一项的多肽，其中与所述亲代Fc多肽相比，所述Fc变体对FcRn的结合显示出增高。

11.依照项1-9任何一项的多肽，其中与所述亲代Fc多肽相比，所述Fc变体对FcRn的结合显示出降低。

12.依照项1-9任何一项的多肽，其中与所述亲代Fc多肽相比，所述Fc变体对FcγR的结合显示出增高。

13.依照项1-9任何一项的多肽，其中所述Fc变体对FcγR和FcRn的结合显示出增高。

14.依照项1-9任何一项的多肽，其中所述Fc变体对FcγR和FcRn的结合显示出降低。

15.依照项1-9任何一项的多肽，其中所述Fc变体对FcγR的结合显示出降低，对FcRn的结合显示出增高。

16.依照项1-9任何一项的多肽，其中所述Fc变体对FcγR的结合显示出增高，对FcRn的结合显示出降低。

17.依照项1-9任何一项的多肽，其中与所述亲代Fc多肽相比，所述Fc变体对FcRn的结合显示出改变，而且其中所述Fc变体包含在特异于靶分子的多肽中，所述靶分子是从细胞因子、可溶性蛋白因子和癌细胞上表达的蛋白组成的群组中选出的。

18.包含依照项1-17任何一项的Fc变体的抗体。

19.包含依照项1-17任何一项的Fc变体的Fc融合物。

附图简述

图1.抗体结构和功能。显示全长人IgG1抗体的模型，利用来自pdb登记入册代码1CE1(Jamesetal.,1999,JMolBiol289:293-301，全部引入作为参考)的人源化Fab结构和来自pdb登记入册代码1DN2(DeLanoetal.,2000,Science287:1279-1283，全部引入作为参考)的人IgG1Fc结构构建模型。没有显示连接Fab和Fc区的可弯曲铰链。IgG1是同型二聚体，具有多个由两条轻链和两条重链组成的异二聚体。包含抗体的Ig域已经被标记，包括轻链的VL和CL，以及重链的VHCgamma1(Cγ1)、Cgamma2(Cγ2)和Cgamma3(Cγ3)。标记了Fc区。标记了相关蛋白的结合部位，包括可变区的抗原结合部位，以及Fc区中结合FcγR、FcRn、C1q，以及蛋白A和G的结合部位。

图2.按照Kabat等进行EU编号的用于本发明的人IgG序列。

图3.按照Kabat等进行EU编号的用于本发明的人和啮齿类动物的IgG序列实例。

图4.用于本发明的人和啮齿类动物FcRn重链序列的实例。

图5.用于本发明的人和啮齿类动物β-2-微球蛋白序列的实例。

图6.从大鼠结构(Burmeisteretal.,1994,Nature,372:379-383；Martinetal.,2001,MolCell7:867-877，都全部引入作为参考)产生的人Fc/FcRn复合模型。一些组氨酸残基显示在FcRn链(淡灰)和Fc多肽(深灰)上填充空间的原子中。

图7.用于设计包含***或缺失的变体的一些概念的说明。

图8a-图8b.本发明的变体。

图9a-图9b.本发明的变体。

图10a-图10b.本发明的变体。

图11.用于构建Fc变体的载体pcDNA3.1Zeo+的图。

图12a-图12b.野生型Fc和本发明的Fc变体竞争结合FcRn的数据。在每个画面中，本发明的Fc变体都用左边的曲线显示(红或深灰)，野生型曲妥单抗(trastuzumab)都用右边的曲线显示(蓝或淡灰)。

图13a-图13j.Fc变体结合FcRn特性的概要。从右到左的栏分别显示FcRn结合的修饰、使用的免疫球蛋白、其他修饰、通过AlphaScreen^TM竞争试验测定的与野生型相比的相对FcRn亲和力(中值)、实施测定的数目和蛋白的的参考号。相对FcRn亲和力编号大于1.0表明结合相对于野生型增加了。

图14a-图14d.本发明的Fc变体结合FcRn的数据。Fc变***于阿仑单抗(alemtuzumab)或曲妥单抗中。与野生型相比，显示出成倍增加的结合力。

图15.对FcRn的结合有改进的Fc变体的表面质子共振实验的概要。条形图显示相对于野生型Fc域，每个变体的FcRn结合亲和力成倍增加。

图16a-图16b.野生型抗体和本发明的变体的表面质子共振实验。踪迹显示在pH6.0时，Fc变体抗体与FcRn的结合和解离。

图17a-图17c.本发明Fc变体对FcRn的结合的测定。显示的是在pH6.0(a和b)和pH7.0(c)时，AlphaScreen^TM测量的直接结合测定。

图18.本发明Fc变体对FcRn的结合的测定。显示的是变体Fc结合到表面结合的FcRn上时产生的表面质子共振单位。

发明详述

本发明公开了对FcRn受体的结合增强的Fc域新变体的产生，Fc域包括在抗体、Fc融合物和免疫粘附物中发现的那些Fc域。如上所述，结合RcRn导致体内较久的血清滞留。

为了增加Fc蛋白的体内滞留，结合亲和力的增加必须是pH6左右时的增加，同时不伴随pH7.4左右时亲和力的增加。虽然仍在研究中，但仍认为Fc区具有较久的体内半衰期是因为pH6时在内体中与FcRn的结合隔离了Fc(GhetieandWard,1997ImmunolToday.18(12):592-598，全部引入作为参考)。内体室然后将Fc再循环到细胞表面。一旦该室向细胞间隙开放，更高的pH(~7.4)将导致Fc释放回血液中。Dall'Acqua等显示在pH6和pH7.4时具有增加的FcRn结合力的Fc突变体实际上具有降低的血清浓度和与野生型相同的半衰期(Dall'Acquaetal.2002,J.Immunol.169:5171-5180，全部引入作为参考)。认为pH7.4时Fc对FcRn的亲和力的增加阻止了Fc释放回血液中。因此，增加Fc体内半衰期的Fc突变理论上将增加较低pH时的FcRn结合，但仍然允许在更高的pH释放Fc。在pH6.0-7.4的范围内，氨基酸组氨酸可以改变它的电荷状态。因此，在Fc/FcRn复合物的重要位点发现His残基并不会令人觉得惊讶(图6)。

本发明另一方面是，使FcRn结合相对于野生型增加(具体在较低pH，大约pH6.0时)，以促进内体中的Fc/FcRn结合。本发明也公开了对FcRn的结合有变且对另一类Fc受体FcγR的结合有变的Fc变体，对FcγR的差异结合，特别是对FcγRIIIb的结合增加和对FcγRIIb的结合降低，导致功效增强。

定义

为了更完全地理解本申请，下文阐述了几个定义。这种定义有意包括语法上的同等物。

这里使用的"ADCC"或"抗体依赖细胞介导的细胞毒作用"指一种细胞介导反应，在该反应中，表达FcγR的非特异性细胞毒活性细胞识别靶细胞上结合的抗体并随后引起该靶细胞裂解。

这里使用的"ADCP"或"抗体依赖细胞介导的吞噬作用"指一种细胞介导的反应，在该反应中，表达FcγR的非特异性细胞毒活性细胞识别靶细胞上结合的抗体并随后引起该靶细胞的吞噬。

这里的"氨基酸修饰"指多肽序列中的氨基酸替换、***和/或缺失。

这里的"氨基酸替换"或"替换"指用另一个氨基酸替换亲代多肽序列特殊位点的一个氨基酸。例如：替换物E272Y指变体多肽，在这种情况下指位点272的谷氨酸被酪氨酸替换的Fc变体。

这里的"氨基酸***"或"***"指在亲代多肽序列的特殊位点添加一个氨基酸。例如：-233E或^233E指在位点233之后和位点234之前***谷氨酸。另外，-233ADE或^233ADE指在位点233之后和位点234之前***AlaAspGlu。

这里的"氨基酸缺失"或"缺失"指在亲代多肽序列的特殊位点除去一个氨基酸。例如：E233-或E233#指位点233的谷氨酸缺失。另外，EDA233-或EDA233指从位点233开始的序列GluAspAla的缺失。

这里使用的"变体蛋白"或"蛋白变体"或"变体"指由于至少一个氨基酸修饰而不同于亲代蛋白的蛋白。蛋白变体可以参考蛋白本身，包含该蛋白组合物或编码它的氨基序列。与亲代蛋白相比，蛋白变体优选具有最少一个氨基酸修饰，例如大约一个到大约十个氨基酸修饰，优选与亲代相比大约一个到大约五个的氨基酸修饰。这里的蛋白变体序列优选具有与亲代蛋白序列至少大约80%的同源性，最优选至少大约90%的同源性，更优选至少大约95%的同源性。蛋白变体可以参考变体蛋白本身，包含该蛋白变体的组合物或编码它的氨基酸序列。因此，这里使用的"抗体变体"或"变体抗体"或"变体"指由于至少一个氨基酸修饰而不同于亲代抗体的抗体。这里使用的"IgG变体"或"变体IgG"指由于至少一个氨基酸修饰而不同于亲代IgG的抗体,这里使用的"免疫球蛋白变体"或"变体免疫球蛋白"或"变体"指由于至少一个氨基酸修饰而不同于亲代免疫球蛋白序列的免疫球蛋白序列。变体可以包含非天然氨基酸。实例包括US6586207；WO98/48032；WO03/073238；US2004-0214988A1；WO05/35727A2；WO05/74524A2；J.W.Chinetal.,(2002),JournaloftheAmericanChemicalSociety124:9026-9027；J.W.Chin,&P.G.Schultz,(2002),ChemBioChem11:1135-1137；J.W.Chin,etal.,(2002),PICASUnitedStatesofAmerica99:11020-11024；and,L.Wang,&P.G.Schultz,(2002),Chem.1-10，都全部引入作为参考

这里使用的"蛋白"指至少两个共价连接的氨基酸，包括蛋白、多肽、寡肽和肽。肽基可以包含天然发生的氨基酸和肽键，或合成的肽模拟结构，即"类似物"，例如类肽(参见Simonetal.,PNASUSA89(20):9367(1992)，全部引入作为参考)。正如本领域所理解的那样，氨基酸可以是天然发生或非天然发生的氨基酸。例如：同型苯丙氨酸、瓜氨酸和noreleucie被认为是可用于本发明目的的氨基酸，而且D和L(R或S)构型的氨基酸都可以被使用。本发明的变体可以包含包括利用，例如Schultz和其同事的技术，包括但不限于Cropp&Shultz,2004,TrendsGenet.20(12):625-30，Andersonetal.,2004,ProcNatlAcadSciUSA101(2):7566-71，Zhangetal.,2003,303(5656):371-3和Chinetal.,2003,Science301(5635):964-7描述的方法整合的非天然氨基酸的修饰。另外，多肽可以包括一个或多个侧链或末端的合成衍生作用、糖基化、PEG化、环状排列、环化、与其他分子连接、融合到蛋白或蛋白域和添加肽标签或标记。

这里使用的"残基"指蛋白中的位置，以及它伴随的氨基酸同一性。例如：天冬酰胺297(也称为Asn297，也称为N297)是人抗体IgG1中的残基。

这里使用的"Fab"或"Fab区"指包含VH、CH1、VL和CL免疫球蛋白区的多肽。Fab可以指分离状态的这些区，或处于全长抗体或抗体片段前后关系中的这些区。

这里使用的"IgG亚类修饰"指将一种IgG同种型中的一个氨基酸转换成配对的不同IgG同种型中的对应氨基酸的氨基酸修饰。例如：因为IgG1在EU位点296包含酪氨酸，而IgG2包含苯丙氨酸，因此IgG2中的F296Y替换被认为是IgG亚类修饰。

这里使用的"非天然发生的修饰"指不是同型的氨基酸修饰。例如：因为没有IgGs在位点332包含谷氨酸，因此在IgG1、IgG2、IgG3或IgG4中的I332E替换被认为是非天然发生的修饰。

这里使用的"氨基酸"和"氨基酸特性"指20个天然氨基酸或出现在具体指定位点的任何非天然类似物中的一个。

这里使用的"效应器功能"指由抗体Fc区与Fc受体或配体的相互作用引起的生物化学事件。效应器功能包括，但不局限于ADCC、ADCP和CDC。

这里使用的"效应细胞"指表达一种或多种Fc受体并介导一种或多种效应器功能的免疫***细胞。效应细胞包括，但不局限于单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、树突状细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、血小板、B细胞、大颗粒淋巴细胞、郎格罕氏细胞、自然杀伤(NK)细胞和γδT细胞，而且他们可以来源于包括但不限于人、小白鼠、大鼠、兔子和猴的任何生物体。

这里使用的"IgGFc配体"指结合IgG抗体的Fc区以形成Fc/Fc配体复合物的来自任何生物体的分子，优选多肽。Fc配体包括，但不局限于FcγRs、FcγRs、FcγRs、FcRn、C1q、C3、甘露聚糖结合凝集素、甘露糖受体、葡萄球菌蛋白A、链球菌蛋白G和病毒FcγR。Fc配体也包括是Fc受体家族的与FcγRs同源的Fc受体同系物(FcRH)(Davisetal.,2002,ImmunologicalReviews190:123-136，全部引入作为参考)。Fc配体可以包括未发现的结合Fc的分子。具体IgGFc配体有FcRn和Fcγ受体。这里使用的"Fc配体"指结合抗体Fc区以形成Fc/Fc配体复合物的来自任何生物体的分子，优选多肽。

这里使用的"Fcγ受体"或"FcγR"指结合IgG抗体Fc区的由FcγR基因编码的蛋白家族的任何成员。在人类中，这些蛋白家族包括但不局限于包括亚型FcγRIa、FcγRIb和FcγRIc的FcγRI(CD64)；包括亚型FcγRIIa(包括同种异型H131和R131)、FcγRIIb(包括FcγRIIb-1和FcγRIIb-2)和FcγRIIc的FcγRII(CD32)；和包括亚型FcγRIIIa(包括同种异型V158和F158)和FcγRIIIb(包括同种异型FcγRIIIb-NA1和FcγRIIIb-NA2)的FcγRIII(CD16)(Jefferisetal.,2002,ImmunolLett82:57-65，全部引入作为参考)，以及未发现的人FcγRs或FcγR亚型或同种异型。FcγR可以来源于包括但不限于人、小白鼠、大鼠、兔子和猴的任何生物体。小白鼠FcγRs包括但不局限于FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)、FcγRIII(CD16)和FcγRIII-2(CD16-2)，以及任何未发现的小白鼠FcγRs或FcγR亚型或同种异型。

这里使用的"FcRn"或"新生Fc受体"指结合IgG抗体Fc区的至少部分由FcRn基因编码的蛋白。FcRn可以来源于包括但不限于人、小白鼠、大鼠、兔子和猴的任何生物体。功能性FcRn蛋白包含经常被称为重链和轻链的两条多肽，轻链是β-2-微球蛋白，重链由FcRn基因编码。除非这里记录了其他方式，否则FcRn或FcRn蛋白指FcRn重链与β-2-微球蛋白的复合物。具有特殊意义的FcRn序列，特别是人类的序列显示在附图中。

这里使用的"亲代多肽"指随后被修饰以产生变体的未经修饰的多肽。亲代多肽可以是天然发生多肽，或天然发生多肽的变体或经过加工的形式。亲代多肽可以参考多肽本身，包含该亲代多肽的组合物或编码它的氨基酸序列。因此，这里使用的"亲代免疫球蛋白"指被修饰以产生变体的未经修饰的免疫球蛋白多肽，这里使用的"亲代抗体"指被修饰以产生变体抗体的未经修饰的抗体。应注意"亲代抗体"包括下文列出的已知的市场上可买到的重组生产的抗体。

这里使用的"位点"指蛋白序列中的位置。可以对位点进行连续编号，或者可以依照已确定的形式，例如Kabat等的EU指数进行编号。例如：位点297是人抗体IgG1中的位点。

这里使用的"靶抗原"指被给定抗体的可变区特异结合的分子。靶抗原可以是蛋白、糖、脂质或其他化合物。

这里使用的"靶细胞"指表达靶抗原的细胞。

这里使用的"可变区"指包含一个或多个基本上由Vκ、Vλ和/或VH基因中的任何一种编码的Ig域的免疫球蛋白区域，其中Vκ、Vλ和/或VH基因分别组成κ、λ和免疫球蛋白重链基因位点。

这里的"野生型或WT"指在自然界中发现的包括等位基因变异的氨基酸序列或核苷酸序列。WT蛋白具有没有被故意修饰的氨基酸序列或核苷酸序列。

本发明涉及对FcRn的结合被调节的抗体(调节包括增加以及降低结合)。例如：在有些情况下，增加的结合会导致细胞再循环抗体，并由此延长，例如治疗抗体的半衰期。有时，降低FcRn结合是合乎需要的，例如用作包含放射标记的诊断抗体或治疗抗体。另外，对FcRn的结合显示出增加，同时对其他Fc受体，例如FcγRs的结合被改变的抗体可以用于本发明。因此，本发明提供抗体。

抗体

本申请涉及包含调节对FcRn的结合力的氨基酸修饰的抗体。具有特殊意义的是在较低的pH时，对FcRn的结合亲和力显示出增加，而在更高的pH时，结合基本上不显示出改变的最低限度地包含Fc区的抗体或其功能性变体。

传统的抗体结构单位通常包含四聚体。每个四聚体通常由两个相同的多肽链对组成，每对具有一条"轻"链(通常具有大约25kDa的分子量)和一条"重"链(通常具有大约50-70kDa的分子量)。人轻链被分为κ和λ轻链。重链被分为μ、Δ、γ、α或ε，限定的抗体同种型分别为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。IgG具有几个亚类，包括但不限于IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。IgM也具有亚类，包括但不限于IgM1和IgM2。因此，这里使用的"同种型"指由免疫球蛋白的恒定区的化学和抗原特性限定的任何免疫球蛋白亚类。已知的人免疫球蛋白同种型有IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgM1、IgM2、IgD和IgE。

每条链的氨基末端部分包含主要负责抗原识别的有大约100到110或更多氨基酸的可变区。在可变区中，重链V域中的三个环和轻链V域中的三个环聚集在一起形成抗原结合簇。每个环被称为互补决定区(以下简称为"CDR")，互补决定区中氨基酸序列变化最显著。

每条链的羧基末端部分限定了主要负责效应器功能的恒定区。Kabat等收集了重链和轻链可变区的许多一级序列。他们基于序列保守程度，将各个一级序列分为CDR和框架，并制作了他们的列表(参见SEQUENCESOFIMMUNOLOGICALINTEREST,5thedition,NIHpublication,No.91-3242,E.A.Kabatetal.，全部引入作为参考)。

免疫球蛋白IgG亚类的重链中有几个免疫球蛋白功能区。这里的"免疫球蛋白(Ig)域"指具有独特三级结构的免疫球蛋白区域。在本发明中有意义的有重链域，包含重链恒定(CH)域和铰链域。在IgG抗体背景中，每个IgG同种型具有三个CH区。因此，IgG背景中的"CH"域显示如下："CH1″指依照Kabat的EU指数进行编号的位点118-220。"CH2"指依照Kabat的EU指数进行编号的位点237-340，"CH3"指依照Kabat的EU指数进行编号的位点341-447。

另一种重链Ig域是绞链区。这里的"铰链"或"绞链区"或"抗体绞链区"或"免疫球蛋白绞链区"指在抗体的第一和第二恒定域之间包含氨基酸的可弯曲的多肽。在结构上，IgGCH1域终止于EU位点220，IgGCH2域起始于EU位点237的残基。因此，对IgG来说，这里限定的抗体铰链包含位点221(IgG1中的D221)到236(IgG1中的G236)，其中依照Kabat等的EU指数进行编号。在一些实施例中，例如在Fc区背景中，可以包含较少的铰链，"较少的铰链"泛指位点226或230。

在本发明中有特殊意义的是Fc区。这里使用的"Fc"或"Fc区"指包含排除第一恒定区免疫球蛋白功能区，有时还排除部分铰链的抗体恒定区的多肽。因此，Fc指IgA、IgD和IgG的最后两个恒定区免疫球蛋白功能域，IgE和IgM的最后三个恒定区免疫球蛋白功能域，和这些域N-末端的可弯曲的铰链。对IgA和IgM来说，Fc可以包含J链。对IgG来说，Fc包含免疫球蛋白功能域Cγ2和Cγ3(Cγ2和Cγ3)，以及Cγ1(Cγ1)和Cγ2(Cγ2)之间较低的绞链区，这一点如图1所示。虽然，Fc区的分界线可以变化，但通常限定人IgG重链Fc区包含残基C226或P230到羧基末端，其中依照Kabat的EU指数进行编号。如下所述，Fc可以指分离状态的这些区，或处于Fc多肽前后关系中的这些区。这里使用的"Fc多肽"指包含全部或部分Fc区的多肽。Fc多肽包括抗体、Fc融合物、分离的Fcs和Fc片段。

在一些实施例中，抗体是全长的。这里的"全长抗体"指组成抗体天然生物类型的包括可变区和恒定区的包括这里列出的一种或多个修饰的结构。

或者，抗体可以具有多种结构，包括但不限于抗体片段、单克隆抗体、双特异抗体、微型抗体(minibodies)、域抗体、合成抗体(这里有时称为"抗体模拟物")、嵌合抗体、人源化抗体、抗体融合物(有时称为"抗体偶联物")，以及每一种的片段。

抗体片段

在一个实施例中，抗体是抗体片段。尤其感兴趣的是包含重链Fc区、Fc融合物和恒定区(CH1-铰链-CH2-CH3)的抗体，还可包括重链恒定区融合物。

特异性抗体片段包括，但不局限于(i)由VL、VH、CL和CH1域组成的Fab片段、(ii)由VH和CH1域组成Fd片段、(iii)由单个抗体的VL和VH域组成Fv片段；(iv)由单个可变区组成的dAb片段(Wardetal.,1989,Nature341:544-546，全部引入作为参考)、(v)分离的CDR区、(vi)包含两个连接的Fab片段的二价片段F(ab')2片段(vii)单链Fv分子(scfv)，其中通过允许两个域联合形成抗原结合部位的肽接头连接VH域和VL域(Birdetal.,1988,Science242:423-426,Hustonetal.,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85:5879-5883,全部引入作为参考)(viii)双特异单链Fv(WO03/11161，引入作为参考)和(ix)通过基因融合构建的"双体"或"三体"，多价或多特异性片段(Tomlinsonet.al.,2000,MethodsEnzymol.326:461-479；WO94/13804；Holligeretal.,1993,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90:6444-6448,都全部引入作为参考)。可以修饰抗体片段。例如：可以通过整合连接VH和VL域的二硫键稳定该分子(Reiteretal.,1996,NatureBiotech.14:1239-1245，全部引入作为参考)。

嵌合抗体和人源化抗体

在一些实施例中，支架成分可以是来自不同物种的混合物。这时，如果所述抗体是一种抗体，那么这种抗体可以是嵌合抗体和/或人源化抗体。一般而言，"嵌合抗体"和"人源化抗体"都指组合来自多个物种的功能区的抗体。例如：传统的"嵌合抗体"包含来自小白鼠(或者有时是大鼠)的可变区和来自人的恒定区。"人源化抗体"泛指可变区的框架区被换成人抗体中发现的序列的非人抗体。通常，在人源化抗体中，除CDRs之外的全部抗体是由人来源的多核苷酸编码的，或者除CDRs之外等同于这种人来源的抗体。由起源于非人生物体的核酸编码的一些或所有CDRs被移植到人抗体可变区的β-片层骨架中以产生抗体，其中特异性由移入的CDRs决定。都全部引入作为参考的WO92/11018,Jones,1986,Nature321:522-525,Verhoeyenetal.,1988,Science239:1534-1536中描述了制备这种抗体的过程。经常需要将选择的受体骨架残基"回复突变"为对应的供体残基以恢复初期被移植的构建物中丧失的亲和力(US5530101；US5585089；US5693761；US5693762；US6180370；US5859205；US5821337；US6054297；US6407213，都全部引入作为参考)。最佳的人源化抗体还将包含免疫球蛋白恒定区的至少一部分，通常是人免疫球蛋白的至少一部分，因此将通常包含人Fc区。还可以利用免疫***被遗传操纵的小白鼠产生人源化抗体。Roqueetal.,2004,Biotechnol.Prog.20:639-654,全部引入作为参考。人源化和改造非人抗体的多种技术和方法在本领域为大家所熟知(参见SeeTsurushita&Vasquez,2004,HumanizationofMonoclonalAntibodies,MolecularBiologyofBCells,533-545,ElsevierScience(USA)和其中引用的参考文献，都全部引入作为参考)。人源化方法包括但不限于都全部引入作为参考的Jonesetal.,1986,Nature321:522-525；Riechmannetal.,1988；Nature332:323-329；Verhoeyenetal.,1988,Science,239:1534-1536；Queenetal.,1989,ProcNatlAcadSci,USA86:10029-33；Heetal.,1998,J.Immunol.160:1029-1035；Carteretal.,1992,ProcNatlAcadSciUSA89:4285-9,Prestaetal.,1997,CancerRes.57(20):4593-9；Gormanetal.,1991,Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:4181-4185；O'Connoretal.,1998,ProteinEng11:321-8中描述的方法。降低非人类抗体可变区的免疫原性的人源化或其他方法包括表面重建方法，例如，引入作为参考的Roguskaetal.,1994,Proc.Natl.Acad.Sci.USA91:969-973中描述了该方法。在一个实施例中，亲代抗体已经被亲合成熟，这一点本领域已经已知。基于结构的方法可以用于人源化和亲合成熟，例如USSN11/004,590中对此进行了描述。基于选择的方法可以用于人源化和/或亲合成熟抗体可变区，包括但不限于都全部引入作为参考的Wuetal.,1999,J.Mol.Biol.294:151-162；Bacaetal.,1997,J.Biol.Chem.272(16):10678-10684；Rosoketal.,1996,J.Biol.Chem.271(37):22611-22618；Raderetal.,1998,Proc.Natl.Acad.Sci.USA95:8910-8915；Kraussetal.,2003,ProteinEngineering16(10):753-759中描述的方法。其他人源化方法涉及仅嫁接部分CDRs，包括但不限于都全部引入作为参考USSN09/810,510；Tanetal.,2002,J.Immunol.169:1119-1125；DePascalisetal.,2002,J.Immunol.169:3076-3084中描述的方法。

双特异性抗体

在一个实施例中，本发明的抗体是多特异性抗体，特别是双特异性抗体，有时也称为"双体"。这些抗体结合两种(或更多种)不同的抗原。可以利用本领域已知的多种方式制造双体(HolligerandWinter,1993,CurrentOpinionBiotechnol.4:446-449，完全引入作为参考)，例如，可以用化学方法制备或从杂种杂交瘤制备。

微型抗体(Minibodies)

在一个实施例中，抗体是微型抗体(minibody)。微型抗体(minibody)是包含与CH3域相连的scFv的最小化抗体样蛋白。Huetal.,1996,CancerRes.56:3055-3061，全部引入作为参考。在有些情况下，scFv可以与Fc区连接，还可以包括部分或全部绞链区。

人抗体

在一个实施例中，抗体是具有这里列出的至少一个修饰的完全的人抗体。"完全的人抗体"指具有来源于人染色体的抗体的基因序列、并具有这里列出的修饰的人抗体。

抗体融合物

在一个实施例中，本发明的抗体是抗体融合蛋白(有时在这里称为"抗体偶联物")。抗体融合的一种类型包括将Fc区与偶联配偶体连接的Fc融合物。这里使用的"Fc融合物"指其中一种或多种多肽操作性地与Fc区连接的蛋白。Fc融合物在这里与现有技术中使用的术语"免疫粘合素"、"Ig融合物"、"Ig嵌合体"和"受体球蛋白"(有时带破折号)同义(Chamowetal.,1996,TrendsBiotechnol14:52-60；Ashkenazietal.,1997,CurrOpinImmunol9:195-200，都全部引入作为参考)。Fc融合物将免疫球蛋白的Fc区与通常是任何蛋白或小分子的融合配偶体连接。事实上任何蛋白或小分子都可以连接到Fc上以产生Fc融合物。蛋白融合配偶体包括，但不局限于任何抗体的可变区、受体的靶标结合区、粘附分子、配体、酶、细胞因子、趋化因子或一些其它的蛋白或蛋白域。小分子融合配偶体可以包括指导Fc融合物到治疗靶的任何治疗剂。这种靶可以是任何分子，优选是参与疾病的胞外受体。因此，该IgG变体可以连接到一种或多种融合配偶体上。在一个可选择的实施例中，IgG变体被连接或操作性地连接到另一种治疗化合物上。治疗化合物可以是细胞毒活性制剂、化疗剂、毒素、放射性同位素、细胞因子，或其他治疗活性剂。IgG可以与多种非蛋白聚合物中的一种，例如聚乙二醇、聚丙二醇、聚氧化烯，或聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物连接。

除Fc融合物之外，抗体融合物包括重链恒定区与一种或多种融合配偶体的融合(此外又包括任何抗体的可变区)，而其他抗体融合是基本全长抗体或完全全长抗体与融合配偶体的融合。在一个实施例中，融合配偶体的作用是介导靶标结合，因此它在功能上类似于抗体可变区(而且实际上可以就是抗体可变区)。事实上任何蛋白或小分子都可以连接到Fc上产生Fc融合物(或抗体融合物)。蛋白融合配偶体包括，但不局限于受体的靶标结合区、粘附分子、配体、酶、细胞因子、趋化因子或一些其它的蛋白或蛋白域。小分子融合配偶体可以包括指导Fc融合物到治疗靶位的任何治疗剂。这种靶可以是任何分子，优选是与疾病有关的胞外受体。

偶联配偶体可以是蛋白性的或非蛋白性的；后者通常是利用抗体和偶联配偶体上的功能基团产生的。例如，衔接物在本领域是已知的，例如：同或异双功能衔接物是众所周知的(参见，1994PierceChemicalCompanycatalog,technicalsectiononcross-linkers,pages155-200，在这里引入作为参考)。

适当的偶联物包括，但不局限于如下所述的标记、药物和细胞毒活性制剂，其中药物和细胞毒活性制剂包括但不限于细胞毒类药物(例如化疗剂)，毒素或这种毒素的活性片段。适当的毒素和他们的对应片段包括白喉毒素A链、外毒素A链、篦麻毒素A链、相思豆毒素A链、泻果素、巴豆毒素、酚霉素、伊诺霉素等等。细胞毒活性制剂也包括通过将放射性同位素连接到抗体上或者让放射性核素结合已经共价附着于抗体的螯合剂上制备的放射化学试剂。另外的实施例利用了刺孢霉素(calicheamicin)、auristatins、格尔德霉素(geldanamycin)、美登素(maytansine)，以及duocarmycins和类似物；后者参见在此全部引入作为参考的美国2003/0050331A1。

抗体的共价修饰

抗体的共价修饰包括在本发明的范围内，而且通常在翻译后进行，但不总是如此。例如，通过让抗体的特异氨基酸残基与有机衍生剂反应可以将几种类型的抗体共价修饰引入该分子中，其中有机衍生剂能与选择的侧链或N或C末端残基反应。

半胱氨酰残基与α-卤乙酸(和对应的胺)，例如氯乙酸或氯乙酰胺反应产生羧甲基或羧酰氨甲基衍生物是最常见的。也可以通过与溴三氟丙酮(bromotrifluoroacetone)、α-溴-β-(5-咪唑基(imidozoyl))丙酸、氯乙酰基磷酸盐、N-烷基马来酰亚胺、3-硝基-2-吡啶二硫化物、甲基2-吡啶二硫化物、p-对氯汞苯甲酸、2-氯汞基-4-硝基苯酚或氯-7-硝基苯-2-氧杂-1,3-二唑等等反应衍生化半胱氨酰残基。

通过在pH5.5-7.0时与焦碳酸二乙酯反应可以衍化组氨酰残基，因为这种情况下这种制剂可以相对特异地针对组氨酰侧链。对-溴苯酰基溴化物也是有用的；优选在pH6.0时，在0.1M二甲胂酸钠中实施该反应。

赖氨酰基(Lysinyl)和氨基末端残基与琥珀酸酐或其他羧酸酐反应。这些制剂的衍生作用具有逆转赖氨残基电荷的效果。衍生包含α氨基的残基的其他适当试剂包括亚氨酸酯，例如甲基皮考啉亚氨酸酯(methylpicolinimidate)；磷酸吡哆醛；吡哆醛；硼氢化氯(chloroborohydride)；三硝基苯磺酸；O-甲基异尿素；2,4-戊二酮和由转氨酶催化的与乙醛酸的反应。

通过与苯甲酰甲醛、2,3-丁二酮(butanedione)、1,2-环己二酮和茚三酮中的一种或几种常规试剂反应可以修饰精氨酰残基。因为胍功能团的pKa高，因此精氨酸残基的衍生作用要求在碱性条件下实施反应。而且，这些试剂可以与赖氨酸基团，以及精氨酸ε氨基反应。

通过与芳香族重氮化合物或四硝基甲烷反应可以对酪氨酰残基进行特异修饰，实现引入光谱标记到酪氨酰残基中的特殊目的。用N-acetylimidizole和四硝基甲烷分别形成O-乙酰酪氨酰种类和3-硝基衍生物是最常见的。可以利用125I或131I碘化酪氨酰残基以制备供放射免疫测定用的标记蛋白，如上所述的氯胺T法是适当的方法。

通过与碳化二亚胺(R'-N=C=N--R')反应可以有选择地修饰羧基侧基(天冬氨酰基或谷氨酰)，其中R和R'随意地是不同的烷基，例如1-环己基-3-(2-吗啉基-4-乙基)碳化二亚胺或1-乙基-3-(4-氮-4,4-二甲戊(dimethylpenyl))碳化二亚胺。而且，通过与铵离子反应，可以将天冬氨酰基和谷氨酰残基转化为天冬酰胺酰和谷氨酰胺酰基残基。

与双功能试剂的衍生作用可用于将抗体交联到不溶于水的支持基质或表面上，其中所述基质或表面还用于除如下所述方法之外的多种方法。通常使用的交联剂包括，例如，1,1-二(重氮乙酰)-2-苯乙烷、戊二醛、N-羟基琥珀酰亚胺酯，例如：具有4-叠氮水杨酸的酯、同(基)双功能亚氨酸酯，包括双琥珀酰酯(disuccinimidylesters)，例如3,3'-dithiobis(琥珀酰丙酸盐)、双功能马来酰亚胺，例如双氮马来酰亚胺-1,8辛烷。衍生试剂，例如甲基-3-(p-叠氮苯)二硫代]propioimidate可产生存在光时能形成交联的光敏化中间物。或者，都全部引入作为参考的美国专利Nos.3,969,287；3,691,016；4,195,128；4,247,642；4,229,537和4,330,440中描述的不溶于水的反应性基质，例如溴化氰激活的糖和反应性底物可以用于蛋白固定。

谷氨酰胺酰基和天冬酰胺酰基残基经常分别被脱去酰胺基而成为对应的谷氨酰和天冬氨酰残基。或者，在温和的酸性条件下可以使这些残基脱去酰胺基。这些残基的两种形式中的任何一种都在本发明的范围内。

其他修饰包括脯氨酸和赖氨酸的羟基化作用、丝氨酰或苏氨酰残基的羟基的磷酸化、赖氨酸、精氨酸和组氨酸侧链α氨基的甲基化(T.E.Creighton,Proteins:StructureandMolecularProperties,W.H.FreemanCo.,SanFrancisco,pp.79-86[1983]，全部引入作为参考)、N-末端胺的乙酰化和任何C末端羧基的酰胺化。

糖基化

另一种共价修饰是糖基化。在另一个实施例中，可以修饰这里公开的IgG变体以包括一种或多种加工的糖形。这里使用的"加工的糖形"指共价附着于IgG的糖组合物，其中所述的糖组合物化学上不同于亲代IgG的糖。加工的糖形可用于多种目的，包括但不限于增强或降低效应器功能。可以通过本领域已知的多种方法产生加工的糖形(etal.,1999,NatBiotechnol17:176-180；Daviesetal.,2001,BiotechnolBioeng74:288-294；Shieldsetal.,2002,JBiolChem277:26733-26740；Shinkawaetal.,2003,JBiolChem278:3466-3473；US6,602,684；USSN10/277,370；USSN10/113,929；PCTWO00/61739A1；PCTWO01/29246A1；PCTWO02/31140A1；PCTWO02/30954A1,都全部引入作为参考；(Potelligent^TM技术[Biowa,Inc.,Princeton,NJ]；糖基化工程技术[GlycartBiotechnologyAG，Zürich,Switzerland])。这些技术中的许多都基于控制共价附着于Fc区的岩藻糖化的寡糖和/或等分的寡糖的水平，例如可通过在各种生物体或细胞系中表达IgG、加工或其他方法(例如Lec-13CHO细胞或大鼠杂交瘤YB2/0细胞)、通过调节参与糖基化路径的酶(例如FUT8[1，6-墨角藻糖基转移酶]和/或β1-4-N-乙酰葡糖氨基转移酶III[GnTIII])、或通过在表达IgG后修饰糖进行控制。加工的糖形通常指不同的碳水化合物或寡糖，因此IgG变体，例如抗体或Fc融合物可以包含加工的糖形。或者，加工的糖形可以指包含不同碳水化合物或寡糖的IgG变体。糖基化模式既取决于蛋白序列(例如存在或缺少下述具体糖基化氨基酸残基)，又取决于生产蛋白的宿主细胞或生物体，这一点本领域是已知的。下文讨论了具体表达***。

多肽的糖基化通常是N-连接或O-连接。N-连接指碳水化物部分附着到天冬酰胺残基的侧链上。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸是酶催化碳水化物部分附着到天冬酰胺侧链上的识别顺序，其中X是除脯氨酸之外的任何氨基酸。因此，多肽中存在这些三肽序列中的任何一个就可以产生潜在的糖基化位点。O-连接糖基化指糖N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖中的一个附着到羟氨基酸上，虽然可以使用5-羟脯氨酸或5-羟基赖氨酸，但通常大多数附着到丝氨酸或苏氨酸上。

通过改变氨基酸序列使其包含一个或多个上述的三肽序列(适合于N-连接的糖基化位点)，可以方便地添加糖基化位点到抗体上。也可以通过添加或替换一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基到起始序列上来实施改变(适合于O-连接糖基化位点)。简单说来，优选通过DNA水平的变化来改变抗体的氨基酸序列，特别是通过突变编码靶多肽的DNA的预选碱基以产生将翻译成目的氨基酸的密码子来进行改变。

另一个增加抗体上碳水化合物部分的数目的方式是通过化学偶合或酶催化偶合糖苷到蛋白上。这些过程是有利的，因为他们不需要在具有N-和O-连接糖基化能力的宿主细胞中产生蛋白。糖可以附着于(a)精氨酸和组氨酸、(b)自由羧基、(c)自由硫氢基，例如半胱氨酸的那些硫氢基、(d)自由羟基，例如丝氨酸、苏氨酸或羟脯氨酸中的那些羟基、(e)芳香族残基，例如苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸中的那些残基、或(f)谷氨酰胺的酰胺基，具体附着方式取决于使用的偶合方式。都全部引入作为参考的WO87/05330和AplinandWriston,1981,CRCCrit.Rev.Biochem.,pp.259-306中描述了这些方法。

可以用化学方法或酶方法完成除去存在于起始抗体上的碳水化合物部分的过程。化学去糖基化需要将蛋白暴露于化合物三氟甲磺酸或同等化合物。这种处理会导致除连接糖(Ｎ-乙酰葡糖胺或N-乙酰半乳糖胺)之外的大部分或全部糖被切割，剩下完整无缺的多肽。都全部引入作为参考的Hakimuddinetal.,1987,Arch.Biochem.Biophys.259:52andbyEdgeetal.,1981,Anal.Biochem.118:131中描述了化学去糖基化。通过利用全部引入作为参考的Thotakuraetal.,1987,Meth.Enzymol.138:350描述的多种内-和外糖苷酶可以实现用酶从多肽上切割糖部分。通过利用全部引入作为参考的Duskinetal.,1982,J.Biol.Chem.257:3105描述的化合物衣霉素可以防止潜在糖基化位点发生糖基化。衣霉素阻断蛋白-N-糖苷连接形成。

抗体的另一种共价修饰包括按照，例如都全部引入作为参考的2005-2006PEGCatalogfromNektarTherapeutics(从Nektar网站可以获得)美国专利4,640,835；4,496,689；4,301,144；4,670,417；4,791,192或4,179,337列出的方式，将抗体连接到多种非蛋白聚合物上，包括但不限于连接到各种多元醇，例如聚乙二醇、聚丙二醇、聚氧化烯上。另外，可以在抗体内的多个位点进行氨基酸替换以促进聚合物，例如PEG的添加，这一点本领域已经已知。例如，参见完全引入作为参考的美国公开No.2005/0114037A1。

标记抗体

在一些实施方式中，本发明的抗体的共价修饰包括添加一种或多种标记。有些情况下，这些也被认为是抗体融合物。术语"标记基团"指任何可检测的标记。在一些实施方式中，通过减少潜在空间阻碍的各种长度的间隔臂将标记基团连接到抗体上。标记蛋白的多种方法本领域已经已知，而且这些方法都可以用于实施本发明。

通常，依据检测标记的测定将标记分为多种类别：a)同位素标记，可以是放射性同位素或重同位素；b)磁性标记(例如，磁颗粒)；c)氧化还原活性部分；d)荧光染料；酶催化基团(例如，辣根过氧化酶、β-半乳糖苷酶、荧光素酶、碱性磷酸酶)；e)生物素化基团；和f)被第二报告物识别的预先确定的多肽表位(例如，亮氨酸拉链配对序列、第二抗体结合部位、金属结合域、表位标签等等)。在一些实施方式中，通过减少潜在空间阻碍的各种长度的间隔臂将标记基团连接到抗体上。标记蛋白的多种方法本领域已经已知，而且这些方法都可以用于实施本发明。

特异性标记包括光学染料，包括但不限于生色团、磷和荧光团，后者在许多情况下是特异性的。荧光团可以是″小分子"或蛋白性质的fluores。

"荧光标记"指通过固有的荧光特性被检测的任何分子。适当的荧光标记包含，但不局限于荧光素、若丹明(rhodamine)、四甲基若丹明、伊红(eosin)、藻红(erythrosin)、香豆素(coumarin)、甲基香豆素、芘(pyrene)、孔雀绿(Malacitegreen)、1-2-二苯乙烯、荧光黄、CascadeBlueJ、得克萨斯红、IAEDANS、EDANS、BODIPYFL、LCRed640、Cy5、Cy5.5、LCRed705、Oregongreen、Alexa-Fluor染料(AlexaFluor350、AlexaFluor430、AlexaFluor488、AlexaFluor546、AlexaFluor568、AlexaFluor594、AlexaFluor633、AlexaFluor660、AlexaFluor680)、CascadeBlue、CascadeYellow和R-藻红蛋白(PE)(MolecularProbes,Eugene,OR)、FITC、若丹明和得克萨斯红(Pierce,Rockford,IL)、Cy5、Cy5.5、Cy7(AmershamLifeScience,Pittsburgh,PA)。全部引入作为参考的MolecularProbesHandbookbyRichardP.Haugland中描述了包括荧光团在内的适当的光学染料。

适当的蛋白性质的荧光标记也包括，但不局限于绿色荧光蛋白、包括Renilla、Ptilosarcus或Aequorea物种的GFP(Chalfieetal.,1994,Science263:802-805)、EGFP(ClontechLaboratories,Inc.,Genbank登记入藏号U55762)、蓝荧光蛋白(BFP，QuantumBiotechnologies,Inc.1801deMaisonneuveBlvd.West,8thFloor，Montreal,Quebec,CanadaH3H1J9；Stauber,1998,Biotechniques24:462-471；Heimetal.,1996,Curr.Biol.6:178-182)、增强的黄色荧光蛋白(EYFP，ClontechLaboratories,Inc.)、荧光素酶(Ichikietal.,1993,J.Immunol.150:5408-5417)、β半乳糖苷酶(Nolanetal.,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85:2603-2607)和Renilla(WO92/15673,WO95/07463,WO98/14605,WO98/26277,WO99/49019,美国专利Nos.5292658,5418155,5683888,5741668,5777079,5804387,5874304,5876995,5925558)。本段中引用的所有文献引入这里作为参考。

IgG变体

在一个实施方式中，本发明提供了IgG变体蛋白。IgG变体至少包含含有重链CH2-CH3区的抗体片段。另外，适当的IgG变体包含Fc域(例如包含较低的绞链区)，包含重链恒定区(CH1-铰链-CH2-CH3)的IgG变体在本发明中也是有用的，所有这些变体都可以融合到融合配偶体上。

相对于亲代IgG多肽，有时是相对于野生型IgG，IgG变体包含一种或多个氨基酸修饰。IgG变体可以具有一种或多种优化的特性。至少一个氨基酸修饰导致IgG变体的氨基酸序列不同于它的亲代IgG。因此，与亲代相比，IgG变体具有至少一个氨基酸修饰。或者，与亲代相比，IgG变体具有一个以上的氨基酸修饰，例如大约一个到大约五十个氨基酸修饰，优选与亲代相比大约一个到大约十个的氨基酸修饰，最优选与亲代相比大约一个到大约五个的氨基酸修饰。

因此，IgG变体的序列和亲代Fc多肽的序列基本上是同源的。例如，这里的IgG变体序列与亲代IgG变体序列将具有大约80%的同源性，优选至少大约90%的同源性，最优选至少大约95%的同源性。可以利用分子生物学产生遗传修饰，或者可以用化学方法或酶方法产生修饰。

抗体的靶抗原

事实上，IgG变体可以靶向任何抗原，包括但不限于属于下列列表中的靶抗原的蛋白、亚单位、域、基序和/或表位，下列列表包括如细胞因子的可溶性因子和膜结合因子，膜结合因子包括跨膜受体：17-IA，4-1BB，4Dc，6-keto-PGF1a，8-iso-PGF2a，8-oxo-dG，腺苷受体，A33，ACE，ACE-2，活化素，活化素A，活化素AB，活化素B，活化素C，活化素RIA，活化素RIAALK-2，活化素RIBALK-4，活化素RIIA，活化素RIIB，ADAM，ADAM10，ADAM12，ADAM15，ADAM17/TACE，ADAM8，ADAM9，ADAMTS，ADAMTS4，ADAMTS5，地址素，aFGF，ALCAM，ALK，ALK-1，ALK-7，α-1-抗胰蛋白酶，α-V/β-1拮抗剂，ANG，Ang，APAF-1，APE，APJ，APP，APRIL，AR，ARC，ART，Artemin，抗-Id，ASPARTIC，心房利钠因子，av/b3整联蛋白，Axl，b2M，B7-1，B7-2，B7-H，B-淋巴细胞刺激物(BlyS)，BACE，BACE-1，Bad，BAFF，BAFF-R，Bag-1，BAK，Bax，BCA-1，BCAM，Bcl，BCMA，BDNF，b-ECGF，bFGF，BID，Bik，BIM，BLC，BL-CAM，BLK，BMP，BMP-2BMP-2a，BMP-3成骨蛋白(Osteogenin)，BMP-4BMP-2b，BMP-5，BMP-6Vgr-1，BMP-7(OP-1)，BMP-8(BMP-8a，OP-2)，BMPR，BMPR-IA(ALK-3)，BMPR-IB(ALK-6)，BRK-2，RPK-1，BMPR-II(BRK-3)，BMPs，b-NGF，BOK，蛙皮素(Bombesin)，骨衍生神经营养因子，BPDE，BPDE-DNA，BTC,补体因子3(C3)，C3a，C4，C5，C5a，C10，CA125，CAD-8，降钙素，cAMP，癌胚抗原(CEA)，癌相关抗原，组织蛋白酶A，组织蛋白酶B，组织蛋白酶C/DPPI，组织蛋白酶D，组织蛋白酶E，组织蛋白酶H，组织蛋白酶L，组织蛋白酶O，组织蛋白酶S，组织蛋白酶V，组织蛋白酶X/Z/P，CBL，CCI，CCK2，CCL，CCL1，CCL11，CCL12，CCL13，CCL14，CCL15，CCL16，CCL17，CCL18，CCL19，CCL2，CCL20，CCL21，CCL22，CCL23，CCL24，CCL25，CCL26，CCL27，CCL28，CCL3，CCL4，CCL5，CCL6，CCL7，CCL8，CCL9/10，CCR，CCR1，CCR10，CCR10，CCR2，CCR3，CCR4，CCR5，CCR6，CCR7，CCR8，CCR9，CD1，CD2，CD3，CD3E，CD4，CD5，CD6，CD7，CD8，CD10，CD11a，CD11b，CD11c，CD13，CD14，CD15，CD16，CD18，CD19，CD20，CD21，CD22，CD23，CD25，CD27L，CD28，CD29，CD30，CD30L，CD32，CD33(p67蛋白)，CD34，CD38，CD40，CD40L，CD44，CD45，CD46，CD49a，CD52，CD54，CD55，CD56，CD61，CD64，CD66e，CD74，CD80(B7-1)，CD89，CD95，CD123，CD137，CD138，CD140a，CD146，CD147，CD148，CD152，CD164，CEACAM5，CFTR，cGMP，CINC，肉毒杆菌毒素，产气荚膜梭菌毒素，CKb8-1，CLC，CMV，CMVUL，CNTF，CNTN-1，COX，C-Ret，CRG-2，CT-1，CTACK，CTGF，CTLA-4，CX3CL1，CX3CR1，CXCL，CXCL1，CXCL2，CXCL3，CXCL4，CXCL5，CXCL6，CXCL7，CXCL8，CXCL9，CXCL10，CXCL11，CXCL12，CXCL13，CXCL14，CXCL15，CXCL16，CXCR，CXCR1，CXCR2，CXCR3，CXCR4，CXCR5，CXCR6，细胞角蛋白肿瘤相关抗原,DAN，DCC，DcR3，DC-SIGN，衰变加速因子，des(1-3)-IGF-I(脑IGF-1)，Dhh，地高辛，DNAM-1，Dnase，Dpp，DPPIV/CD26，Dtk，ECAD，EDA，EDA-A1，EDA-A2，EDAR，EGF，EGFR(ErbB-1)，EMA，EMMPRIN，ENA，内皮素受体，脑啡肽酶，eNOS，Eot，嗜酸细胞活化趋化因子1(eotaxin1)，EpCAM，EphrinB2/EphB4，EPO，ERCC，E-选择素(E-selectin)，ET-1，因子IIa，因子VII，因子VIIIc，因子IX，成纤维细胞激活蛋白(FP)，Fas，FcR1，FEN-1，铁蛋白，FGF，FGF-19，FGF-2，FGF3，FGF-8，FGFR，FGFR-3，纤维蛋白，FL，FLIP，Flt-3，Flt-4，促卵泡激素，Fractalkine，FZD1，FZD2，FZD3，FZD4，FZD5，FZD6，FZD7，FZD8，FZD9，FZD10，G250，Gas6，GCP-2，GCSF，GD2，GD3，GDF，GDF-1，GDF-3(Vgr-2)，GDF-5(BMP-14，CDMP-1)，GDF-6(BMP-13，CDMP-2)，GDF-7(BMP-12，CDMP-3)，GDF-8(筒箭毒碱)，GDF-9，GDF-15(MIC-1)，GDNF，GDNF，GFAP，GFRa-1，GFR-α1，GFR-α2，GFR-α3，GITR，胰高血糖素，Glut4，糖蛋白IIb/IIIa(GPIIb/IIIa)，GM-CSF，gp130，gp72，GRO，生长激素释放因子，半抗原(NP-cap或NIP-cap)，HB-EGF，HCC，HCMVgB包膜糖蛋白，HCMV)gH包膜糖蛋白,HCMVUL，造血生长因子(HGF)，HepBgp120，类肝素酶，Her2，Her2/neu(ErbB-2)，Her3(ErbB-3)，Her4(ErbB-4)，单纯疱疹病毒(HSV)gB糖蛋白，HSVgD糖蛋白，HGFA，高分子量黑素瘤相关抗原(HMW-MAA)，HIVgp120，HIVIIIBgp120V3环，HLA，HLA-DR，HM1.24，HMFGPEM，HRG，Hrk，人心脏肌球蛋白，人巨细胞病毒(HCMV)，人生长激素(HGH)，HVEM,I-309，IAP，ICAM，ICAM-1，ICAM-3，ICE，ICOS，IFNg，Ig，IgA受体，IgE，IGF，IGF结合蛋白，IGF-1R，IGFBP，IGF-I，IGF-II，IL，IL-1，IL-1R，IL-2，IL-2R，IL-4，IL-4R，IL-5，IL-5R，IL-6，IL-6R，IL-8，IL-9，IL-10，IL-12，IL-13，IL-15，IL-18，IL-18R，IL-23，干扰素(INF)-α，INF-β，INF-γ，抑制素，iNOS，胰岛素A-链，胰岛素B-链，***1，整联蛋白α2，整联蛋白α3，整联蛋白α4，整联蛋白α4/β1，整联蛋白α4/β7，整联蛋白α5(αV)，整联蛋白α5/β1，整联蛋白α5/β3，整联蛋白α6，整联蛋白β1，整联蛋白β2，干扰素γ，IP-10，I-TAC，JE，激肽释放酶2，激肽释放酶5，激肽释放酶6，激肽释放酶11，激肽释放酶12，激肽释放酶14，激肽释放酶15，激肽释放酶L1，激肽释放酶L2，激肽释放酶L3，激肽释放酶L4，KC，KDR，角质化细胞生长因子(KGF)，层粘连蛋白5，LAMP，LAP，LAP(TGF-1)，潜在TGF-1，潜在TGF-1bp1，LBP，LDGF，LECT2，Lefty，Lewis-Y抗原，Lewis-Y相关抗原，LFA-1，LFA-3，Lfo，LIF，LIGHT，脂蛋白，LIX，LKN，Lptn，L-选择蛋白，LT-a，LT-b，LTB4，LTBP-1，肺表面活性物质，促黄体发生激素，淋巴细胞毒素B受体，Mac-1，MAdCAM，MAG，MAP2，MARC，MCAM，MCAM，MCK-2，MCP，M-CSF，MDC，Mer，金属蛋白酶，MGDF受体，MGMT，MHC(HLA-DR)，MIF，MIG，MIP，MIP-1-α，MK，MMAC1，MMP，MMP-1，MMP-10，MMP-11，MMP-12，MMP-13，MMP-14，MMP-15，MMP-2，MMP-24，MMP-3，MMP-7，MMP-8，MMP-9，MPIF，Mpo，MSK，MSP，粘蛋白(Muc1)，MUC18，Muellerian-抑制素(inhibitin)物质，Mug，MuSK，NAIP，NAP，NCAD，N-Cadherin，NCA90，NCAM，NCAM，Neprilysin，神经营养因子-3,-4或-6，Neurturin，神经生长因子(NGF)，NGFR，NGF-β，nNOS，NO，NOS，Npn，NRG-3，NT，NTN，OB，OGG1，OPG，OPN，OSM，OX40L，OX40R，p150，p95，PADPr，甲状旁腺激素，PARC，PARP，PBR，PBSF，PCAD，胎盘钙粘蛋白(P-Cadherin)，PCNA，PDGF，PDGF，PDK-1，PECAM，PEM，PF4，PGE，PGF，PGI2，PGJ2，PIN，PLA2，胎盘碱性磷酸酶(PLAP)，PlGF，PLP，PP14，前胰岛素，前松弛素(Prorelaxin)，蛋白C，PS，PSA，PSCA，***特异性膜抗原(PSMA)，PTEN，PTHrp，Ptk，PTN，R51，RANK，RANKL，RANTES，RANTES，松弛素A-链，松弛素B-链，肾素，呼吸道合胞病毒(RSV)F，RSVFgp，Ret，类风湿因子，RLIP76，RPA2，RSK，S100，SCF/KL，SDF-1，SERINE，血清白蛋白，sFRP-3，Shh，SIGIRR，SK-1，SLAM，SLPI，SMAC，SMDF，SMOH，SOD，SPARC，Stat，STEAP，STEAP-II，TACE，TACI，TAG-72(肿瘤相关糖蛋白-72)，TARC，TCA-3，T-细胞受体(例如T-细胞受体α/β)，TdT，TECK，TEM1，TEM5，TEM7，TEM8，TERT，睾丸PLAP样碱性磷酸酶，TfR，TGF，TGF-α，TGF-β，TGF-βPan特异，TGF-βRI(ALK-5)，TGF-βRII，TGF-βRIIb，TGF-βRIII，TGF-β1，TGF-β2，TGF-β3，TGF-β4，TGF-β5，凝血酶，胸腺Ck-1，促甲状腺激素，Tie，TIMP，TIQ，凝血激酶(TissueFactor)，TMEFF2，Tmpo，TMPRSS2，TNF，TNF-α，TNF-αβ，TNF-β2，TNFc，TNF-RI，TNF-RII，TNFRSF10A(TRAILR1Apo-2，DR4)，TNFRSF10B(TRAILR2DR5，KILLER，TRICK-2A，TRICK-B)，TNFRSF10C(TRAILR3DcR1，LIT，TRID)，TNFRSF10D(TRAILR4DcR2，TRUNDD)，TNFRSF11A(RANKODFR，TRANCER)，TNFRSF11B(OPGOCIF，TR1)，TNFRSF12(TWEAKRFN14)，TNFRSF13B(TACI)，TNFRSF13C(BAFFR)，TNFRSF14(HVEMATAR，HveA，LIGHTR，TR2)，TNFRSF16(NGFRp75NTR)，TNFRSF17(BCMA)，TNFRSF18(GITRAITR)，TNFRSF19(TROYTAJ，TRADE)，TNFRSF19L(RELT)，TNFRSF1A(TNFRICD120a，p55-60)，TNFRSF1B(TNFRIICD120b，p75-80)，TNFRSF26(TNFRH3)，TNFRSF3(LTbRTNFRIII，TNFCR)，TNFRSF4(OX40ACT35，TXGP1R)，TNFRSF5(CD40p50)，TNFRSF6(FasApo-1，APT1，CD95)，TNFRSF6B(DcR3M68，TR6)，TNFRSF7(CD27)，TNFRSF8(CD30)，TNFRSF9(4-1BBCD137，ILA)，TNFRSF21(DR6)，TNFRSF22(DcTRAILR2TNFRH2)，TNFRST23(DcTRAILR1TNFRH1)，TNFRSF25(DR3Apo-3，LARD，TR-3，TRAMP，WSL-1)，TNFSF10(TRAILApo-2配体，TL2)，TNFSF11(TRANCE/RANK配体ODF，OPG配体)，TNFSF12(TWEAKApo-3配体，DR3配体)，TNFSF13(APRILTALL2)，TNFSF13B(BAFFBLYS，TALL1，THANK，TNFSF20)，TNFSF14(LIGHTHVEM配体，LTg)，TNFSF15(TL1A/VEGI)，TNFSF18(GITR配体AITR配体，TL6)，TNFSF1A(TNF-aConectin，DIF，TNFSF2)，TNFSF1B(TNF-bLTa，TNFSF1)，TNFSF3(LTbTNFC，p33)，TNFSF4(OX40配体gp34，TXGP1)，TNFSF5(CD40配体CD154，gp39，HIGM1，IMD3，TRAP)，TNFSF6(Fas配体Apo-1配体，APT1配体)，TNFSF7(CD27配体CD70)，TNFSF8(CD30配体CD153)，TNFSF9(4-1BB配体CD137配体)，TP-1，t-PA，Tpo，TRAIL，TRAILR，TRAIL-R1，TRAIL-R2，TRANCE，转移因子，TRF，Trk，TROP-2，TSG，TSLP，肿瘤相关抗原CA125，肿瘤相关抗原表达LewisY相关碳水化合物，TWEAK，TXB2，Ung，uPAR，uPAR-1，尿激酶，VCAM，VCAM-1，VECAD，VE-钙粘蛋白，VE-钙粘蛋白-2，VEFGR-1(flt-1)，VEGF，VEGFR，VEGFR-3(flt-4)，VEGI，VIM，病毒抗原，VLA，VLA-1，VLA-4，VNR整联蛋白，vonWillebrands因子，WIF-1，WNT1，WNT2，WNT2B/13，WNT3，WNT3A，WNT4，WNT5A，WNT5B，WNT6，WNT7A，WNT7B，WNT8A，WNT8B，WNT9A，WNT9A，WNT9B，WNT10A，WNT10B，WNT11，WNT16，XCL1，XCL2，XCR1，XCR1，XEDAR，XIAP，XPD，以及激素和生长因子受体。

本领域熟练技术人员应理解上述靶标列表不仅指具体蛋白和生物分子，而且也指包含他们的生物化学路径。例如：CTLA-4作为靶抗原暗示组成T细胞共同刺激路径的配体和受体也是靶标，其中配体和受体包括CTLA-4、B7-1、B7-2、CD28和任何其他的未发现的结合这些蛋白的配体或受体。因此，这里使用的靶标不仅指具体的生物分子，而且指与所述靶标相互作用的一类蛋白和所述靶标属于其中的生物化学路径的成员。本领域熟练技术人员应更进一步地理解上述任何目标抗原、结合他们的配体或受体、或他们对应的生物化学路径的其他成员可以操作性地与本发明的Fc变体连接以产生Fc融合物。因此，通过将Fc变体操作性地连接到EGF、TGF-b或任何发现或未发现的结合EGFR的其他配体上可以构建靶向EGFR的Fc融合物。因此，可以将本发明的Fc变体操作性地连接到EGFR上以产生结合EGF、TGF-b或任何发现或未发现的结合EGFR的其他配体的Fc融合物。因此，事实上任何多肽，不论配体、受体或其它蛋白或蛋白域，包括但不限于上述靶标和组成他们的对应生物化学路径的蛋白，都可以操作性地连接到本发明的Fc变体上以产生Fc融合物。

适当抗原的选择取决于想要实现的用途。对抗癌治疗来说，具有表达只限于癌细胞的靶标是合乎需要的。已经证明一些特别适合用于抗体治疗的靶标是那些具有信号发送功能的靶标。其他的治疗抗体通过抑制受体和它的同族配体之间的结合阻断受体发送信号来发挥他们的作用。治疗抗体的另一种作用机制是使受体下调。其他抗体不通过发送信号通过他们的目标抗原起作用。有时使用针对传染病因子的抗体。

在一个实施方案中，本发明的Fc变体被掺入抗细胞因子抗体中。或者，Fc变体与细胞因子融合或偶联。这里使用的"细胞因子"是一群细胞释放的作为细胞间介质作用于另一细胞的蛋白总称。例如：正如特别引入作为参考的Penichetetal.,2001,JImmunolMethods248:91-101中所述，可以将细胞因子融合到抗体上以提供合乎需要的特性组。这种细胞因子的实例有淋巴因子、单核因子和传统的多肽激素。包括在细胞因子之中的有生长激素，例如人生长激素、N-甲硫氨酰人生长激素和牛生长素；甲状旁腺激素；甲状腺素；胰岛素；胰岛素原；松弛肽；前松弛素；糖蛋白激素，例如促卵泡激素(FSH)、促甲状腺激素(TSH)和促黄体生成激素(LH)；肝脏生长因子；成纤维细胞生长因子；催乳素；胎盘催乳素；肿瘤坏死因子-α和-β；mullerian-抑制物质；小白鼠***相关肽；抑制素；活化素；血管内皮生长因子；整联蛋白；促血小板生成素(TPO)；神经生长因子，例如NGF-β；血小板生长因子；转化生长因子(TGFs)，例如TGF-α和TGF-β；***-I和-II；***(EPO)；骨诱导性因子；干扰素，例如干扰素-α、β和-γ；集落刺激因子(CSFs)，例如巨噬细胞-CSF(M-CSF)；粒细胞-巨噬细胞-CSF(GM-CSF)和粒细胞-CSF(G-CSF)；白细胞介素(IL)，例如IL-1，IL-1α，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-8，IL-9，IL-10，IL-11，IL-12,IL-15；肿瘤坏死因子，例如TNF-α或TNF-β；C5a；及其他多肽因子，包括LIF和试剂盒配体(KL)。这里使用的术语细胞因子包括来自天然来源或来自重组细胞培养物的蛋白，以及天然序列细胞因子的生物学活性同等物。

细胞因子和可溶性靶标，例如TNF超家族成员是用于本发明变体的优选靶标。例如：抗VEGF、抗CTLA-4和抗TNF抗体或其片段是用于增加FcRn结合的Fc变体的特别优良的抗体。针对这些靶标的治疗经常涉及治疗自身免疫疾病，而且需要长期多次注射。因此，本发明变体带来的较长的血清半衰期和较低的治疗频率是特别优选的。

批准在临床试验或在研发中使用的大量抗体和Fc融合物可以从本发明的Fc变体得益。这些抗体和Fc融合物在这里称为"临床产物和候选物"。因此，在优选实施方案中，本发明的Fc多肽可以用于大量临床产物和候选物。例如：大量靶向CD20的抗体可以从本发明的Fc多肽得益。例如，本发明的Fc多肽可以用于基本上与嵌合的批准用于治疗非何杰金(氏)淋巴瘤的抗CD20抗体利妥昔单抗(rituximab,IDEC/Genentech/Roche)(例如参见US5,736,137)相似的抗体；Genmab目前的抗CD20HuMax-CD20、US5,500,362中描述的抗CD20抗体、AME-133(AppliedMolecularEvolution)、hA20(Immunomedics,Inc.)、HumaLYM(Intracel)和PRO70769(PCT/US2003/040426，题为"免疫球蛋白变体及其用途")。靶向表皮生长因子受体家族成员，包括EGFR(ErbB-1)、Her2/neu(ErbB-2)、Her3(ErbB-3)、Her4(ErbB-4)的大量抗体可以从本发明的Fc多肽得益。例如，本发明的Fc多肽可以用于基本上与批准用于治疗乳腺癌的人源化抗Her2/neu抗体曲妥单抗(trastuzumab,Genentech)(例如参见US5,677,171)相似的抗体；Genentech目前的pertuzumab(rhuMab-2C4,Omnitarg^TM)；US4,753,894中描述的抗-Her2抗体；在多种癌的临床试验中使用的嵌合的抗EGFR抗体西妥昔单抗(cetuximab,Imclone)(US4,943,533；PCTWO96/40210)；Abgenix-Immunex-Amgen目前的ABX-EGF(US6,235,883)；Genmab目前的HuMax-EGFr(USSN10/172,317)；425、EMD55900、EMD62000和EMD72000(MerckKGaA)(US5,558,864；Murthyetal.1987,ArchBiochemBiophys.252(2):549-60；Rodecketal.,1987,JCellBiochem.35(4):315-20；Kettleboroughetal.,1991,ProteinEng.4(7):773-83)；ICR62(InstituteofCancerResearch)(PCTWO95/20045；Modjtahedietal.,1993,J.CellBiophys.1993,22(1-3):129-46；Modjtahedietal.,1993,BrJCancer.1993,67(2):247-53；Modjtahedietal,1996,BrJCancer,73(2):228-35；Modjtahedietal,2003,IntJCancer，105(2):273-80)；TheraCIMhR3(YMBiosciences,CanadaandCentrodeImmunologiaMolecular，Cuba(US5,891,996；US6,506,883；Mateoetal,1997,Immunotechnology,3(1):71-81)；an-Kettering)(Jungbluthetal.2003,ProcNatlAcadSciUSA.100(2):639-44)；KSB-102(KSBiomedix)；MR1-1(IVAX,NationalCancerInstitute)(PCTWO0162931A2)和SC100(Scancell)(PCTWO01/88138)。在另一个优选实施方案中，本发明的Fc多肽可以用于目前批准用于治疗B细胞慢性淋巴细胞性白血病的人源化单克隆抗体阿仑单抗(alemtuzumab,Millenium)。本发明的Fc多肽可以用于基本上与其他临床产物和候选物相似的多种抗体或Fc融合物，包括但不限于OrthoBiotech/Johnson&Johnso的抗CD3抗体莫罗单抗(muromonab)-CD3(Orthoclone)、IDEC/ScheringAG的抗CD20抗体替伊莫单抗(ibritumomabtiuxetan,)、Celltech/Wyeth的抗CD33(p67蛋白)抗体gemtuzumabozogamicinBiogen的抗LFA-3Fc融合物alefaceptCentocorLilly的阿昔单抗(abciximab,)、Novartis的巴利昔单抗(basiliximab,)、MedImmune的帕利珠单抗(palivizumab,)、Centocor的抗TNFα抗体英夫利昔单抗(infliximab,)、Abbott的抗TNFα抗体阿达木单抗(adalimumab,)、Celltech的抗TNFα抗体Humicade^TM、Immunex/Amgen的抗TNFαFc融合物etanercept(Enbrel))、Abgenix的抗CD147抗体ABX-CBL、Abgenix的抗IL8抗体ABX-IL8、Abgenix的抗MUC18抗体ABX-MA1、Antisoma正在的抗MUC1Pemtumomab(R1549,90Y-muHMFG1)、Antisoma的抗MUC1抗体Therex(R1550)、Antisoma的AngioMab(AS1405)、Antisoma的HuBC-1、Antisoma的Thioplatin(AS1407)、Biogen的抗α-4-β-1(VLA-4)和α-4-β-7抗体Antegren(那他珠单抗(natalizumab))、Biogen的抗VLA-1整联蛋白抗体VLA-1mAb、Biogen的抗淋巴细胞毒素β受体(LTBR)抗体LTBRmAb、CambridgeAntibodyTechnology的抗TGF-β2抗体CAT-152、CambridgeAntibodyTechnology和Abbott的抗IL-12抗体J695、CambridgeAntibodyTechnology和Genzyme的抗TGFβ1抗体CAT-192、CambridgeAntibodyTechnology的抗嗜酸细胞活化趋化因子抗体CAT-213、CambridgeAntibodyTechnology和HumanGenomeSciencesInc.的抗Blys抗体LymphoStat-B^TM、CambridgeAntibodyTechnology和HumanGenomeSciencesInc.的抗TRAIL-R1抗体TRAIL-R1mAb、Genentech的抗VEGF抗体Avastin^TM(贝伐单抗(bevacizumab),rhuMAb-VEGF)、Genentech的抗HER受体家族抗体、Genentech的抗组织因子抗体抗组织因子(ATF)、Genentech的抗IgE抗体Xolair^TM(Omalizumab)、Genentech和Xoma的抗CD11a抗体Raptiva^TM(Efalizumab)、Genentech和MilleniumPharmaceuticals的MLN-02抗体(以前的LDP-02)、Genmab的抗CD4抗体HuMaxCD4、Genmab和Amgen的抗IL15抗体HuMax-IL15、Genmab和Medarex的HuMax-Inflam、Genmab和Medarex和OxfordGcoSciences的抗类肝素酶I抗体HuMax-癌、Genmab和Amgen的HuMax-淋巴瘤、Genmab的HuMax-TAC、IDECPharmaceuticals的抗CD40L抗体IDEC-131、IDECPharmaceuticals的抗CD40L抗体IDEC-151(克立昔单抗(clenoliximab))、IDECPharmaceuticals的抗CD80抗体IDEC-114、IDECPharmaceuticals的抗CD23抗体IDEC-152、IDECPharmaceuticals的抗巨噬细胞迁移因子(MIF)抗体、Imclone的抗独特型抗体BEC2、Imclone的抗KDR抗体IMC-1C11、Imclone的抗flk-1抗体DC101、Imclone的抗VE钙粘蛋白抗体、Immunomedics的抗癌胚抗原(CEA)抗体CEA-Cide^TM(labetuzumab)、Immunomedics的抗CD22抗体LymphoCide^TM(依帕珠单抗(Epratuzumab))、Immunomedics的AFP-Cide、Immunomedics的MyelomaCide、Immunomedics的LkoCide、Immunomedics的ProstaCide、Medarex的抗CTLA4抗体MDX-010、MDMedarex的抗CD30抗体MDX-060、Medarex的MDX-070、Medarex的MDX-018、Medarex和Immuno-DesignedMolecules的抗Her2抗体Osidem^TM(IDM-1)、Medarex和Genmab的抗CD4抗体HuMax^TM-CD4、Medarex和Genmab的抗IL15抗体HuMax-IL15、Medarex和Centocor/J&J的抗TNFα抗体CNTO148、Centocor/J&J的抗细胞因子抗体CNTO1275、MorphoSys的抗在细胞间粘附分子-1(ICAM-1)(CD54)抗体MOR101和MOR102、MorphoSys的抗成纤维细胞生长因子受体3(FGFR-3)抗体MOR201、ProteinDesignLabs的抗CD3抗体(visilizumab)、ProteinDesignLabs的抗γ干扰素抗体HuZAF^TM、ProteinDesignLabs的抗α5β1整联蛋白、ProteinDesignLabs的抗IL-12、Xoma的抗Ep-CAM抗体ING-1、和Xoma的抗B2整联蛋白抗体MLN01，本段中引用的所有文献引入这里作为参考。

本发明Fc多肽可以整合到上述临床候选物和产物中，或者整合到与他们基本相似的抗体和Fc融合物中。本发明Fc多肽可以整合到上述临床候选物和产物的用某种其他方法人源化、亲合成熟、加工或修饰的形式中。

在一个实施方式中，本发明的Fc多肽被用来治疗自身免疫、炎性或移植适应症。与这种疾病相关的靶抗原和临床产物和候选物包括但不局限于抗-α4β7整联蛋白抗体，例如LDP-02,抗β2整联蛋白抗体，例如LDP-01,抗补体(C5)抗体，例如5G1.1,抗CD2抗体，例如BTI-322,MEDI-507,抗CD3抗体，例如OKT3,SMART抗CD3,抗CD4抗体，例如IDEC-151,MDX-CD4,OKT4A,抗CD11a抗体,抗CD14抗体，例如IC14,抗CD18抗体,抗CD23抗体，例如IDEC152,抗CD25抗体，例如Zenapax,抗CD40L抗体，例如5c8,Antova,IDEC-131,抗CD64抗体，例如MDX-33,抗CD80抗体，例如IDEC-114,抗CD147抗体，例如ABX-CBL,抗E-选择素抗体，例如CDP850,抗gpIIb/IIIa抗体，例如ReoPro/Abcixima,抗ICAM-3抗体，例如ICM3,抗ICE抗体，例如VX-740,抗FcR1抗体，例如MDX-33,抗IgE抗体，例如rhuMab-E25,抗IL-4抗体，例如SB-240683,抗IL-5抗体，例如SB-240563,SCH55700,抗IL-8抗体，例如ABX-IL8,抗干扰素γ抗体,抗-TNF(TNF,TNFa,TNFa,TNF-α)抗体，例如CDP571,CDP870,D2E7,英夫利昔单抗,MAK-195F和VLA-4抗体，例如Antegren。

本发明的Fc变体，例如那些对FcRn的结合增强的变体可以用在TNF抑制剂分子中以提供增强的特性。有用的TNF抑制剂分子包括在哺乳动物中抑制TNF-α作用的任何分子。适当的实例包括Fc融合物(etanercept)，抗体(阿达木单抗)和(英夫利昔单抗)。利用本发明的Fc变体加工以增加FcFn结合的单克隆抗体(例如Remicade和Humira)可以通过延长的半衰期转变为最好的功效。

在一些实施方案中，可以使用针对传染性疾病的抗体。针对真核细胞的抗体包括靶向酵母细胞的抗体，包括但不限于酿酒酵母(Saccharomyceserevisiae)、多形汉森酵母(Hansenulapolymorpha)、脆壁克鲁维酵母(Kluyveromycesfragilis)和乳酸克鲁维酵母(K.lactis)、Pichiaguillerimondii和巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)、稷酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)、恶性疟原虫(plasmodiumfalciparium)和解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)。

针对其他真菌细胞的抗体也是有用的，包括与包含光滑假丝酵母(Candidaglabrata)、白色念珠菌(C.albicans)、克柔氏念珠菌(C.krusei)、葡萄牙念珠菌(C.lusitaniae)和麦芽糖假丝酵母(C.maltosa)的念珠菌属菌株，以及曲霉(Aspergillus)、隐球菌属(Cryptococcus)、组织胞浆菌属(Histoplasma)、球孢子菌属(Coccidioides)、芽生菌(Blastomyces)和青霉菌(Penicillium)的菌种有关的靶抗原。

针对与原生动物有关的靶抗原的抗体包括，但不局限于与锥虫属(Trypanosoma)、包括杜氏利什曼原虫(L.donovanii)的利什曼虫(Leishmania)种、疟原虫种(Plasmodiumspp.)、卡氏肺囊虫(Pneumocystiscarinii)、小球隐孢子虫(Cryptosporidiumparvum)、兰氏贾第鞭毛虫(Giardialamblia)、溶组织内阿米巴(Entamoebahistolytica)和圆孢子虫(Cyclosporacayetanensis)有关的抗体。

针对原核生物抗原的抗体也是有用的，包括针对适当的细菌，例如致病和不致病原核生物的抗体，其中致病和不致病原核生物包括但不限于芽孢杆菌属(Bacillus)，包括炭疽杆菌(B.anthracis)；弧菌属(Vibrio)，例如霍乱弧菌(V.cholerae)；埃希氏菌属(Escherichia)，例如肠产毒性大肠杆菌(EnterotoxigenicE.coli)；志贺氏菌属(Shigella)、例如痢疾志贺氏菌(S.dysenteriae)；沙门氏菌属(Salmonella)，例如伤寒沙门氏菌(S.typhi)；分枝杆菌属(Mycobacterium)，例如结核分枝杆菌(M.tuberculosis)、麻风分枝杆菌(M.leprae)；梭菌属(Clostridium)，例如肉毒梭菌(C.botulinum)、破伤风梭菌(C.tetani)、艰难梭菌(C.difficile)、产气荚膜梭菌(C..perfringens)；棒状杆菌属(Cornyebacterium)，例如白喉杆菌(C.diphtheriae)；链球菌属(Streptococcus)，脓链球菌(S.pyogenes)、肺炎链球菌(S.pneumoniae)；葡萄球菌属(Staphylococcus)，例如金黄色葡萄球菌(S.aureus)；嗜血杆菌属(Haemophilus)，例如流感嗜血杆菌(H.influenzae)；奈瑟氏菌属(Neisseria)，例如脑膜炎奈奈瑟菌(N.meningitidis)、淋病奈瑟菌(N.gonorrhoeae)；耶尔森氏菌属(Yersinia)，例如贾第鞭毛虫耶尔森氏菌(Y.lamblia)、鼠疫耶尔森氏菌(Y.pestis,)、假单胞菌属(Pseudomonas)，例如铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)、恶臭假单胞菌(P.putida)；衣原体(Chlamydia)，例如沙眼衣原体(C.trachomatis)；博德特氏菌属(Bordetella)，例如百日咳博德特氏菌(B.pertussis)；***(Treponema)，例如***(T.palladium)；B.anthracis、布鲁氏杆菌(Brucellaspp.)、F.tularensis、B.mallei、B.pseudomallei、沙门氏菌(Salmonellaspp.)、SEBV.霍乱毒素B、大肠杆菌O157:H7、李斯特菌(Listeriaspp.)、白色毛孢子菌(Trichosporonbeigelii)、红酵母(Rhodotorulaspecies)、异常汉逊氏酵母(Hansenulaanomala)、肠杆菌(Enterobactersp.)、克雷伯氏杆菌(Klebsiellasp.)、李斯特菌(Listeriasp.)、支原体(Mycoplasmasp.)等等。

在一些方案中，抗体针对病毒感染；这些病毒包括，但不局限于包括正粘病毒(例如流感病毒)、副粘病毒(例如呼吸道合胞病毒(respiratorysyncytialvirus)、腮腺炎病毒(mumpsvirus)、麻疹病毒(measlesvirus))、腺病毒、鼻病毒(rhinovirus)、冠状病毒(coronavirus)、呼肠病毒(reovirus)、披膜病毒(togavirus)(例如风疹病毒(rubellavirus))、细小病毒(parvovirus)、痘病毒(例如类天花病毒(variolavirus)、痘苗病毒(vacciniavirus))、肠道病毒(例如脊髓灰质炎病毒(poliovirus)、柯萨奇病毒(coxsackievirus))、肝炎病毒(包括甲、乙和丙型)、疱疹病毒(例如单纯疱疹病毒、水痘-带状疱疹病毒(varicella-zostervirus)、巨细胞病毒、EB病毒)、轮状病毒、诺瓦克病毒(Norwalkvirus)、汉坦病毒(hantavirus)、沙粒病毒(arenavirus)、棒状病毒(rhabdovirus)(例如狂犬病病毒)、逆转录病毒(包括艾滋病病毒、HTLV-I和-II)、乳多空病毒(papovavirus)(例如***瘤病毒(papillomavirus))、多瘤病毒(polyomavirus)和细小核糖核酸病毒(picornavirus)等等。

优化的IgG变体特性

本申请也提供了多种治疗相关特性被优化的IgG变体。被加工或预计显示出一种或多种优化特性的IgG变体在这里被称为"优化的IgG变体"。可以被优化的最优选的特性包括，但不局限于对FcRn的亲和力增强或降低和体内半衰期延长或降低。适当的实施方式包括在较低的pH，例如与内体有关的pH，例如pH6.0时显示出对FcRn的结合亲和力增加，而在更高的pH，例如7.4时不显示出相应的增高的结合亲和力以允许内体吸收增加，同时保持正常的释放速率。同样，FcRn结合被调节的这些抗体可以随意地具有其他合乎需要的特性，例如经调节的FcγR结合，如U.S.S.N.s11/174,287,11/124,640,10/822,231,10/672,280,10/379,392和2005年10月21日提交的标题为具有优化的效应器功能的IgG免疫球蛋白变体的申请号为no.

的专利申请所列出的其他特性。也就是说，优化特性也包括，但不局限于对FcγR的亲和力增强或降低。在一个随意的实施方式中，可以优化IgG变体使其对人激活FcγR具有增强的亲和力，除FcRn结合谱之外，还优选对FcγRIIIa具有增强的亲和力。在另一随意的可替换的实施方案中，可以优化IgG变体使其对人抑制性受体FcγRIIb具有降低的亲和力。也就是说，具体实施方式包括利用对FcRn的结合显示出增加和对FcγRIIIa的结合显示出增加的抗体。其他的实施方式利用了对FcRn的结合显示出增加和对FcγRIIIa的结合显示出增加的抗体的用途。预期这些实施例可以提供在人中具有增强的治疗特性，例如具有增强的效应器功能和更高的抗癌效能的IgG多肽。在可选择的实施方式中，可以优化IgG变体使其具有增加或降低的FcRn亲和力，以及增加或降低的人FcγR，包括但不限于FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIc、FcγRIIIa和包括他们的等位基因变异的FcγRIIIb亲和力。预期这些实施例可以提供在人中具有增强的治疗特性，例如具有延长的血清半衰期和降低的效应器功能的IgG多肽。在其他实施方式中，IgG变体提供了增强的FcRn亲和力，以及增强的一种或多种FcγRs亲和力，但对一种或多种其他FcγRs的亲和力降低。例如：IgG变体对FcRn和FcγRIIIa的结合可以增强，但对FcγRIIb的结合降低。或者，IgG变体对FcRn和FcγR的结合可以降低。在另一个实施方式中，IgG变体具有降低的FcRn亲和力，以及增强的FcγRIIb亲和力，但对一种或多种激活FcγRs的亲和力降低。在另一实施方式中，IgG变体具有延长的血清半衰期和降低的效应器功能。

优选实施方案包括优化对人FcRn和FcγR的结合，但是在可选择的实施方案中，IgG变体对来自非人类生物体，包括但不限于啮齿类动物和非人灵长目动物的FcRn和FcγR具有增强或降低的亲和力。对非人类FcRn的结合被优化的IgG变体可以用于实验中。例如：可以获得能测试给定药物候选者的特性，例如功效、毒性和药物动力学的多种疾病的小白鼠模型。可以通过称为异种移植的方法将癌细胞移植或注入到小白鼠中以模仿人类癌症，这一点本领域已经已知。对IgG变体的测试可以提供关于蛋白清除特性、它的清除机制等有价值的信息，其中IgG变体包括对FcRn的结合被优化的IgG变体。也可以优化IgG变体以使其在非糖基化(aglycosylated)形式中具有增强的功能性和/或溶解特性。Fc配体包括，但不局限于FcRn、FcγRs、C1q和蛋白A和G，而且可以来自任何来源，包括但不限于人、小白鼠、大鼠、兔子或猴，优选人。在可选择的优选实施方案中，可以优化IgG变体使其比亲代IgG变体的非糖基化形式更稳定和/或更可溶。

IgG变体可以包括调节与除FcRn和FcγRs以外的Fc配体，包括但不限于补体蛋白和Fc受体同系物(FcRHs)的相互作用的修饰。FcRHs包括但不局限于FcRH1、FcRH2、FcRH3、FcRH4、FcRH5和FcRH6(Davisetal.,2002,Immunol.Reviews190:123-136,全部引入作为参考)。

优先地，IgG变体的Fc配体特异性将决定它的治疗应用。给定IgG变体用于治疗目的将取决于靶抗原的表位或形式，以及待治疗的疾病或适应症。对大多数靶和适应症来说，增强的FcRn结合可是更优选的，因为增强的FcRn结合可以导致血清半衰期延长。较长的血清半衰期允许治疗时以较低的频率和剂量给药。为了使需要重复给药的适应症作出反应而施用该治疗剂时，这种特性可是特别优选的。对一些靶和适应症来说，当需要变体Fc具有增加的清除或降低的血清半衰期时，例如当Fc多肽用作显象剂或放射治疗剂时，降低的FcRn亲和力可是特别优选的。

可以使用包含提供了增强的FcRn亲和力，增强的激活FcγRs亲和力和/或降低的抑制性FcγRs亲和力的IgG变体的IgG变体。对一些靶和适应症来说，使用对不同激活FcγRs提供了差异选择性的IgG变体可是更有利的；例如：有时可需要对FcγRIIa和FcγRIIIa，而不是FcγRI的结合增强，而在其它情况下，仅仅只有对FcγRIIa的结合增强可是优选的。对某些靶和适应症来说，利用改变了FcRn结合和增强了FcγR介导的效应器功能和补体介导的效应器功能的IgG变体可是优选的，但在其他情况下，利用FcRn结合增强或血清半衰期延长，以及FcγR介导的效应器功能或补体介导的效应器功能增强的IgG变体可是有利的。对一些靶或癌症适应症来说，降低或消除一种或多种效应器功能，例如通过敲除对C1q、一种或多种FcγR、FcRn或一种或多种其他Fc配体的结合可是有利的。对其他靶或适应症来说，利用对抑制性FcγRIIb的结合增加，但对激活FcγRs的结合为WT水平，降低或消除的IgG变体可是优选的。例如，当IgG变体的目的是抑制炎症或自身免疫病，或在某些方面调节免疫***时，这种IgG变体可是特别有用的。因为自身免疫疾病通常持续时间久，而且需要重复给药进行治疗，用对FcRn的结合增加的具有延长的半衰期的Fc变体对他们进行治疗是特别优选的。

修饰可以改善IgG稳定性、可溶性、功能或临床用途。在优选实施方案中，IgG变体可以包含减少在人体内的免疫原性的修饰。在最优选的实施方案中，利用完全引入作为参考的USSN11/004,590描述的方法降低了IgG变体的免疫原性。在可选择的实施方案中，IgG变体是人源化的(Clark,2000,ImmunolToday21:397-402，完全引入作为参考)。

IgG变体可以包含降低免疫原性的修饰。降低免疫原性的修饰包括降低来源于亲代序列的经过处理的肽对MHC蛋白的结合的修饰。例如：可以设计氨基酸修饰使没有或有最少数量的免疫表位，其中免疫表位预计会以高亲和力结合任何普遍的MHC等位基因。鉴定蛋白序列中MHC结合表位的几种方法本领域已经已知，而且可以用来对IgG变体中的表位进行评分。列如，参见WO98/52976；WO02/079232；WO00/3317；USSN09/903,378；USSN10/039,170；USSN60/222,697；USSN10/754,296；PCTWO01/21823；和PCTWO02/00165；Mallios,1999,Bioinformatics15:432-439；Mallios,2001,Bioinformatics17:942-948；Sturnioloetal.,1999,NatureBiotech.17:555-561；WO98/59244；WO02/069232；WO02/77187；Marshalletal.,1995,J.Immunol.154:5927-5933和Hammeretal.,1994,J.Exp.Med.180:2353-2358,都全部引入作为参考。基于序列的信息可用于确定给定肽-MHC相互作用的结合得分(例如，参见Mallios,1999,Bioinformatics15:432-439；Mallios,2001,Bioinformatics17:p942-948；Sturnioloet.al.,1999,NatureBiotech.17:555-561，都全部引入作为参考)。

加工的IgG变体

可以通过多种方式设计本发明的变体。本文所述变体可以是***、缺失、替换、其他的修饰，或这些及其他改变的组合。本发明的特别新的实施方案是设计改善或降低Fc多肽对Fc配体的结合的***和缺失。正象这里所公开的那样，可以实施增加或降低Fc多肽对FcRn的亲和力的***或缺失。可以通过合理的方法，或者通过包括用途或随机分量的方法，例如随机或半随机库建立或筛选设计***和缺失。在可选择的实施方式中，公开了增加或降低Fc多肽对FcRn的亲和力的替换。

***和缺失

用变体氨基酸代替Fc多肽上某位点的亲代氨基酸可以创造制备Fc多肽变体。通过将Fc多肽中的一个或多个氨基酸替换成变体氨基酸，可以改变那些位点的侧链。大多数有用的替换通过改变Fc侧链修饰Fc特性。替换的侧链可以直接或间接地与Fc结合配偶体作用，其中Fc结合配偶体与Fc功能或特性相关。至少一个替换改变了亲代Fc多肽的一个或多个侧链的共价结构。

或者，改变亲代Fc多肽骨架的共价结构可以创造制备出Fc多肽变体。蛋白中的骨架原子有肽氮、α碳、羰基或肽碳和羰基氧。改变骨架的共价结构提供了附加的改变Fc多肽特性的方法。通过添加原子到骨架中，例如***一个或多个氨基酸、或从骨架中除去原子，例如删除一个或多个氨基酸可以改变Fc骨架的共价结构。通过将骨架的单个原子变为其他原子也可以改变骨架的共价结构(Deechongkitetal.,JAmChemSoc.2004.126(51):16762-71，全部引入作为参考)。通过***或删除编码Fc多肽的DNA中的对应核苷酸，可以实施在Fc多肽中***或缺失氨基酸，这一点本领域已经已知，在这里也进行了说明。或者，可以在合成Fc多肽期间实现氨基酸的***或缺失，这一点本领域已经已知。

通过考虑Fc多肽和它的结合配偶体的复合物的结构可以实现***或缺失氨基酸的设计过程，其中***或缺失氨基酸会改变Fc多肽与一种或多种结合配偶体(例如FcγR's、FcRn、C1q)的相互作用。在优选程度较低的实施方案中，通过考虑Fc多肽的结构和参与与结合配偶体的结合的Fc区域的信息可以完成设计。通过诱变实验、噬菌体展示实验、同源性比较、计算机模型或其他方式可以获得这些信息。

氨基酸序列中影响Fc结合相互作用，但不影响Fc多肽的整体结构、稳定性、表达或用途的***或缺失优选位置位于参与Fc/Fc结合配偶体相互作用的环内。为了改变Fc多肽对FcRn的结合，位点244-257、279-284、307-317、383-390和428-435是***或缺失的优选环位置(编号来自EUindexofKabatetal.,Burmeisteretal.,1994,Nature,372:379-383；Martinetal.,2001,MolCell7:867-877，全部引入作为参考)。为了改变Fc多肽对Fcγ受体的结合，位点229-239、266-273、294-299和324-331是***或缺失的优选环位置(编号来自EUindexofKabatetal.,PDBcode1E4K.pdbSondermannetal.Nature.2000406:267，全部引入作为参考)。环是不涉及α螺旋或β片层结构的多肽区域。环位点是不在α螺旋或β片层中的位点(vanHolde,JohnsonandHo.PrinciplesofPhysicalBiochemistry.PrenticeHall,NewJersey1998,Chapter1pp2-67，全部引入作为参考)。环位点是优选的，因为与α螺旋和β片层的骨架原子相比，该骨架原子通常更容易弯曲，而且参与氢键的可性更小。因此，***或缺失一个或多个氨基酸导致环延长或缩短很少会导致Fc多肽发生大的破裂性变化，包括稳定性、表达或其他问题。

***和缺失可以用来改变多肽的长度。例如：在环区域中，改变环的长度会导致环的屈曲性和构象熵发生改变。环中的***通常会增加环的构象熵，构象熵被定义为乘以可构象数目的自然对数的波耳兹曼常数(Boltzman'sconstant)(vanHolde,JohnsonandHo.PrinciplesofPhysicalBiochemistry.PrenticeHall,NewJersey1998,pp78，都全部引入作为参考)。将至少一个氨基酸***到多肽中，可以使多肽可获得的构象的总数增加。这些附加的构象可对形成有利的Fc/Fc-结合配偶体相互作用有好处，因为Fc多肽在结合Fc-结合蛋白时可以利用附加构象中的一种。在这种情况下，***可以产生更强的Fc/Fc结合配偶体相互作用。如果附加的构象没有用于结合界面，那么***可导致更弱的Fc/Fc结合配偶体相互作用，因为附加的构象将与有结合能力的构象竞争。同样，多肽片段的缺失也可以产生更强或更弱的Fc/Fc结合配偶体相互作用。如果降低骨架构象可数目的片段缺失消除了有结合能力的构象，那么缺失可以产生更弱的Fc/Fc结合配偶体相互作用。如果缺失没有消除有结合能力的构象，那么缺失可以产生更强的Fc/Fc结合配偶体相互作用，因为缺失可以除去与有结合能力的构象竞争的构象。

***和缺失可以用来改变Fc多肽中氨基酸的的位置与方向。因为***和缺失导致骨架的共价结构发生变化，因此他们必然会引起骨架原子位点的变化。图7比较了三个不同骨架中标记为L1-L4的一些环片段上的骨架位点。参考的骨架结构包含四个环节段，缺失骨架缺乏节段L1，***节段在节段L1之前，即节段L1的N-末端包含附加的节段。缺失和***会导致靠近***或缺失位点的骨架结构发生最大的变化。删除靠近环N-末端的节段，例如节段L1，环可以缩短，剩余的节段会改变他们靠近环N末端的位置。这会产生朝着L1节段在前位点和环N末端方向移动L2节段的影响。当初始信息表明位于L2的氨基酸位于L1时能与Fc结合配偶体产生有利的相互作用时，L2节段位点朝着L1节段方向的变化可以增强Fc/Fc结合配偶体复合物的结合，因此也是优选的。例如：如果L2包含丙氨酸和酪氨酸，那么以前的两个L1氨基酸替换成丙氨酸和酪氨酸将导致Fc变体结合增加，因此缺失L1可以产生对Fc结合配偶体的亲和力增加的Fc变体。

同样，在环的N-末端侧将多肽节段***Fc多肽会导致环节段的位点朝着环C末端侧的方向改变。图7中，在节段L1之前，即节段L1的N末端***一个或多个氨基酸会改变骨架构象，其中骨架构象包括L1节段朝着环C末端的方向改变。当已知位于节段L1的氨基酸位于L2位点时能产生有利的相互作用时，这类***是优选的，因为***可以产生更强的Fc/Fc结合配偶体相互作用。如果想要较弱的Fc/Fc结合配偶体相互作用，那么***可以用来将不利的氨基酸移动到新位点。***、删除和参考节段(图7中的L1到L4)可以是Fc多肽中多于一个氨基酸的一个或多个节段。

或者，可以以类似于环N-末端***或缺失的方式，在环的C末端利用***或缺失。环C末端的***可以导致***N-末端的位点朝着环N末端的方向运动。环C末端的缺失可以导致缺失的N-末端的位点朝着环C末端的方向运动。基于位于环中的氨基酸、想要增加或降低Fc/Fc-结合配偶体亲和力的渴望和想要的位置改变，选择利用环N-末端或C末端的***或缺失。

***或缺失可以用于Fc多肽的任何区域，包括环、α螺旋和β片层区域。***和缺失的优选位置包括不是α螺旋或β片层区域的环区域。环是优选的，因为他们通常比α螺旋或β片层能更好地接受骨架中的改变。产生更强蛋白/蛋白相互作用的特别优选的***或缺失位置是环的N-末端或C末端边缘。如果环的侧链参与Fc/Fc结合配偶体相互作用，那么边缘的***或缺失很少会导致结合相互作用发生强烈的有害变化。环正中的缺失很可会除去Fc/Fc结合配偶体界面中重要的残基，环正中的***很可会在Fc/Fc结合配偶体界面产生不利的相互作用。通过骨架改变的容量可以确定删除或***的残基数目，***或缺失15个或更少残基是优选的，***或缺失10个或更少残基是更优选的，***或缺失5个或更少残基是最优选的。

一旦设计了Fc缺失变体的位置和大小，就可以完全确定全部多肽序列，通过本领域已知的方法可以构建该多肽。

但是，Fc***变体具有设计至少一个被***氨基酸的序列的附加步骤。在Fc多肽中预期将被暴露的位点***极性残基，包括Ser、Thr、Asn、Gln、Ala、Gly、His是优选的。较小的氨基酸，包括Ser、Thr和Ala是特别优选的，因为尺寸小很少会在空间上干扰Fc/Fc结合配偶体的相互作用。Ser和Thr也具有与Fc结合配偶体上的原子形成氢键的能力。

***物也可以具有增加的屈曲性，当希望Fc/Fc结合配偶体的结合更强时，***的多肽被设计成与Fc结合配偶体产生有利相互作用的形式将是合乎需要的。通过构建变体骨架与一般简单的待***序列的模型可以确定骨架***物的长度。例如：可以构建不同长度的聚丝氨酸、聚甘氨酸或聚丙氨酸***物，并将其模型化。通过多种方法，包括基于包含***物的同系物的已知的三维结构进行的同源模型构建、包括都全部引入作为参考的MODELLER(M.A.Marti-Renometal.Annu.Rev.Biophys.Biomol.Struct.29,291-325,2000)和ROSETTA(Kuhlmanetal.(2003).Science302,1364-8)的计算机模型构建可以实施建模过程。通常，开始先产生各种骨架构象，然后在确定侧链的同一性之后再确定最后的骨架结构。可以通过算法(US6,188,965；6,269,312；6,403,312；6,801,861；6,804,611；6,792,356,6,950,754和USSN09/782,004；09/927,790；10/101,499；10/666,307；10/666311；10/218,102，都全部引入作为参考)设计侧链。

可以通过本文所述方法设计除Fc多肽之外的任何多肽的***和缺失。例如：借助于APRIL三维结构的帮助可以在TNF超家族成员APRIL中设计***或缺失(DBcode1XU1.pdb,Hymowitz,etal.(2005)J.Biol.Chem.280:7218，全部引入作为参考)。可以设计***或缺失以增加APRIL对它的受体TACI的结合。作为***或缺失位点的优选的环残基有残基Ser118-Val124、Asp164-Phe167、Pro192-Ala198、Pro221-Lys226。这些环与APRIL/TACI复合物中的TACI相互作用并介导结合。

整合多肽的变体

IgG变体可以基于人IgG序列，因此人IgG序列可以用作其他序列与之比较的"基础"序列，其他序列包括但不限于来自其他生物体的序列，例如啮齿类动物和灵长目动物的序列。IgG变体也可以包含来自其他免疫球蛋白类，例如IgA、IgE、IgD、IgM等等的序列。注意到虽然是在一个亲代IgG背景中加工设计IgG变体，但也可以在另外的第二亲代IgG背景中设计变体，或者将变体"转移"到另外的第二亲代IgG背景中。通常，以IgGs序列之间的序列或结构同源性为基础，通过确定第一和第二IgG之间"同等"或"对应"的残基和替换可以实现这一目的。可以直接将这里列出的第一IgG的氨基酸序列与第二IgG的序列相比较以确定同源性。在利用本领域已知的一个或多个同源性比对程序(例如，利用物种之间的保守残基)比对序列之后，可以限定第一个IgG变体的一级序列中相当于特殊氨基酸的残基，其中比对时为了维持配对考虑了必需的***和缺失(即避免通过任意的缺失和***消除保守残基)。保守残基的比对应该保全100%的这种残基。但是，保守残基大于75%或低至50%的配对也足以限定同等残基。通过确定第一和第二IgG结构上的同源性也可以限定同等残基，其中结构同源性是结构已经确定的IgGs的三级结构水平的同源性。在这种情况下，同等残基被定义为比对后，亲代或前体的特殊氨基酸残基的两个或多个主链原子的原子坐标(N上的N、CA上的CA、C上的C和O上的O)在0.13nm的区域之内，优选在0.1nm的区域之内的那些残基。在已经定向和定位最好的模型蛋白使非氢蛋白原子的原子坐标出现最大重叠之后，可以实现比对。无论怎样确定同等或对应的残基，无论产生IgGs的亲代IgG的同一性是多少，所要传达的意思是发现的IgG变体可以加工成与IgG变体具有显著的序列或结构同源性的任何第二亲代IgG。因此，如果通过利用如上所述的方法或其他确定同等残基的方法产生了其中亲代抗体是人IgG1的变体抗体，那么可以在结合不同抗原的另一个IgG1亲代抗体、人IgG2亲代抗体、人IgA亲代抗体、小白鼠IgG2a或IgG2b亲代抗体等等中加工变体抗体。如上所述，亲代IgG变体的背景不影响转移IgG变体到其他亲代IgGs的能力。

提供了加工、生产和筛选IgG变体的方法。所描述的方法无意限制于任何具体应用或操作理论。相反，提供的方法通常是用于举例说明可以用实验方法加工、生产和筛选一个或多个IgG变体以获得具有优化的效应器功能的IgG变体。在都全部引入作为参考的USSN10/754,296和USSN10/672,280中描述了设计、生产和测试抗体和蛋白变体的多种方法。

多种蛋白工程方法可以用来设计具有优化的效应器功能的IgG变体。在一个实施方案中，可以使用基于结构的加工操纵方法，在该方法中可得到的结构信息可用来指导替换、***或缺失。在优选实施方案中，可以使用计算机操作的筛选法，其中以计算机操作计算的能量适应性为基础设计替换。例如，参见USSN10/754,296和USSN10/672,280，以及其中引用的参考文献，所有都全部引入作为参考。

序列比对可以用来指导所鉴定位点的替换。本领域熟练技术人员应理解利用序列信息可以抑制引入潜在有害于蛋白结构的替换。序列的来源很广泛，包括一个或多个已知的数据库，包括但不限于Kabat数据库(NorthwesternUniversity)；Johnson&Wu,2001,NucleicAcidsRes.29:205-206；Johnson&Wu,2000,NucleicAcidsRes.28:214-218),IMGT数据库(IMGT，theinternationalImMunoGeneTicsinformation；；Lefrancetal.,1999,NucleicAcidsRes.27:209-212；Ruizetal.,2000NucleicAcidsRes.28:219-221；Lefrancetal.,2001,NucleicAcidsRes.29:207-209；Lefrancetal.,2003,NucleicAcidsRes.31:307-310)和VBASE,所有都全部引入作为参考。可以从种系序列或来自任何生物体，包括但不限于哺乳动物的天然发生抗体的序列的序列比对获得、编辑和/或产生抗体序列信息。本领域熟练技术人员应理解在施用给人时，利用人序列或基本上是人的序列更进一步地具有免疫原性更低的优势。是更普遍的核酸或蛋白数据库的其他数据库，即不为抗体所特有的其他数据库包括但不局限于SwissProt、GenBankEntrez和EMBL核苷酸序列数据库。比对的序列可以包括VH、VL、CH和/或CL序列。本领域已经已知许多基于序列的比对程序和方法，所有这些程序和方法都可以用于进行序列比对。

或者，随机或半随机诱变方法可以用来在想要的位点产生氨基酸修饰。这样的话，可以随机选择位点，或者可以利用过分简化的规则产生氨基酸改变。例如，可以将全部残基突变为丙氨酸，这称为丙氨酸扫描。这种方法可以与使用选择法以筛选较高层次的序列多样性的更复杂的加工设计方法联合使用。多种选择技术可以用于这种方法，例如包括显示技术，例如如下所述的噬菌体展示、核糖体展示、细胞表面展示等等，这一点本领域已经公知。

生产和筛选IgG变体的方法为大家所熟知。Duebel&Kontermann编辑的AntibodyEngineering,Springer-Verlag,Heidelberg,2001；Hayhurst&Georgiou,2001,CurrOpinChemBiol5:683-689；Maynard&Georgiou,2000,AnnuRevBiomedEng2:339-76中描述了抗体分子生物学、表达、纯化和筛选的一般方法。此外还参见都全部引入作为参考的USSN10/754,296；USSN10/672,280；USSN10/822,231和11/124,620中描述的方法。

本发明优选的变体包括图8中的那些。或者，本发明优选的变体包括图9中的那些。另外或者，本发明优选的变体包括图10中的那些。本发明特别优选的变体包括G385H和N434Y。本发明最优选的变体包括257C、257M、257L、257N、257Y、279Q、279Y、308F和308Y。

制备IgG变体

通过本领域已知的任何方法可以制备IgG变体。在一个实施方案中，IgG变体序列被用来产生编码成员序列的核酸，而且如果想要的话可以将他们克隆到宿主细胞中，进行表达和测定。利用众所周知的方法可以实施这些实际操作，都全部引入作为参考的MolecularCloning-ALaboratoryManual,3rdEd.(Maniatis,ColdSpringHarborLaboratoryPress,NewYork,2001)和CurrentProtocolsinMolecularBiology(JohnWiley&Sons)中描述了多种有用的方法。编码IgG变体的核酸可以整合到表达载体中以表达蛋白。表达载体通常包括操作性地与控制或调节序列、可选择标记、任何融合配偶体和/或附加元件连接，即被放入功能关系中的蛋白。通过在诱导或引起蛋白表达的适当条件下培养用核酸，优选用包含编码IgG变体的核酸的表达载体转化的宿主细胞可以生产IgG变体。可以使用多种适当的宿主细胞，包括但不限于哺乳动物细胞、细菌、昆虫细胞和酵母。例如：从完全引入作为参考的美国典型培养菌种库获得的ATCC细胞系目录中描述了多种可有用的细胞系。将外源性核酸***宿主细胞中的方法在本领域为大家所熟知，而且该方法随使用的宿主细胞而变化。

在优选实施方案中，在表达后纯化或分离IgG变体。可以用本领域熟练技术人员所知的多种方式分离或纯化抗体。标准提纯法包括色谱技术、电泳、免疫、沉淀、透析、过滤、浓缩和色谱聚焦技术。本领域已知多种天然蛋白与抗体结合，例如细菌蛋白A、G和L，因此这些蛋白可用于纯化。通过具体融合配偶体常常能实现纯化。例如：如果使用了GST融合物，就可以利用谷胱甘肽树脂纯化蛋白，如果使用了His标签，就可以使用Ni⁺²亲和色谱法，如果使用了flag标签，就可以使用固定的抗flag抗体。适当的纯化技术的总指导参见引入作为参考的AntibodyPurification:PrinciplesandPractice,3rdEd.,Scopes,Springer-Verlag,NY，1994。

筛选IgG变体

可以利用多种方法,包括但不限于那些使用体外测定、体内和基于细胞的测定和选择技术的方法筛选IgG变体。可以在筛选程序中使用自动化高通量筛选技术。可以通过利用融合配偶体或标记，例如免疫标记、同位素标记或小分子标记，例如荧光或比色染料进行筛选。

在优选实施方案中，体外测定筛选IgG变体的功能性和/或生物物理学特性。在优选实施方案中，筛选蛋白的功能性，例如催化反应的能力或对它的靶的结合亲和力。利用本领域已知的多种方法，包括但不限于基于FRET(荧光共振能量转移)和BRET(生物发光共振能量转移)的测定、AlphaScreen^TM(扩增发光光均质邻近测定)、闪烁邻近分析法、ELISA(酶联免疫吸附测定)、SPR(表面质子共振，又名)、等温滴定量热术、差示扫描量热法、凝胶电泳和包括凝胶过滤的色谱法可以进行结合测定。这些及其他方法可以利用一些融合配偶体或标记。测定可以使用包括但不限于产色、荧光、发光或同位素标记的多种检测方法。利用本领域已知的多种方法，可以筛选蛋白的生物物理学特性，例如稳定性和可溶性。通过测量折叠和展开状态之间的热力学平衡可以确定蛋白的稳定性。例如：利用化学变性剂、加热或pH可以展开IgG变体，利用包括但不限于圆二色谱学、荧光光谱学、吸光光谱学、NMR光谱学、量热法和蛋白水解的方法可以监测这一转换。本领域熟练技术人员应理解，利用这些及其他技术也可以监测折叠和展开转换的动力参数。利用本领域已知的各式各样的方法可以定量或定性地确定IgG变体的可溶性和总的结构完整性。可用于表征IgG变体生物物理学特性的方法包括凝胶电泳、色谱法，例如分子排阻色谱和反相高效液相色谱法、质谱分析法、紫外光吸收光谱法、荧光光谱学、圆二色谱学、等温滴定量热法、差示扫描量热法、分析超速离心、动态光散射、蛋白水解，交联、浊度测定、过滤阻滞测定、免疫测定、荧光染料结合测定、蛋白染色测定、显微镜检查，检测ELISA聚集物或其他结合测定。也可以使用利用X射线结晶技术和NMR光谱学的结构分析。

本领域已知，一类筛选法包括选择库中有利成员的方法。在这里该方法被称为"选择方法"，这些方法可以用于筛选IgG变体。当利用选择方法筛选蛋白库时，只有那些有利的库成员，也就是满足一些选择标准的成员会被繁殖，分离和/或观察。应理解因为只有最合适的变体被观察到，因此这种方法能筛选的库比逐一测定库成员拟合的方法能筛选的库大。通过任何方法、技术、共价或非共价连接蛋白表型和它的基因型，即共价或非共价连接蛋白功能和编码它的核酸的融合配偶体可以进行选择。例如，将库成员融合到基因III蛋白中使大家能利用噬菌体展示作为选择方法。因此，选择或分离满足一些标准的IgG变体，例如对蛋白靶具有结合亲和力的IgG变体也是选择或分离编码它的核酸。一旦分离出来，就可以扩增编码Fc变体的基因。可以重复允许富集库中有利的IgG变体的被称为淘洗的分离和扩增过程。附着核酸的核酸测序最终考虑了基因鉴定。

本领域已知的多种选择方法可以用于筛选蛋白库。这些包括但不限于噬菌体展示(Phagedisplayofpeptidesandproteins:alaboratorymanual,Kayetal.,1996,AcademicPress,SanDiego,CA,1996；Lowmanetal.,1991,Biochemistry30:10832-10838；Smith,1985,Science228:1315-1317)和其衍生方法，例如选择性噬菌体感染(Malmborgetal.,1997,JMolBiol273:544-551),选择感染性噬菌体(Krebberetal.,1997,JMolBiol268:619-630),和延迟的感染性淘洗(Benharetal.,2000,JMolBiol301:893-904),细胞表面展示(Witrrup,2001,CurrOpinBiotechnol,12:395-399)，例如细菌(Georgiouetal.,1997,NatBiotechnol15:29-34；Georgiouetal.,1993,TrendsBiotechnol11:6-10；Leeetal.,2000,NatBiotechnol18:645-648；Junetal.,1998,NatBiotechnol16:576-80)，酵母(Boder&Wittrup,2000,MethodsEnzymol328:430-44；Boder&Wittrup,1997,NatBiotechnol15:553-557)和哺乳动物细胞(Whitehornetal.,1995,Bio/technology13:1215-1219)上的展示,以及体外展示技术(Amstutzetal.,2001,CurrOpinBiotechnol12:400-405)，例如多核糖体展示(Mattheakisetal.,1994,ProcNatlAcadSciUSA91:9022-9026),核糖体展示(Hanesetal.,1997,ProcNatlAcadSciUSA94:4937-4942),mRNA展示(Roberts&Szostak,1997,ProcNatlAcadSciUSA94:12297-12302；Nemotoetal.,1997,FEBSLett414:405-408)和核糖体失活展示***(Zhouetal.,2002,JAmChemSoc124,538-543)。这段中的所有参考文献都全部引入作为参考。

其他有用的选择方法包括，不依赖展示的方法，例如体内方法，包括但不限于胞质表达和细胞计数筛选(Chenetal.,2001,NatBiotechnol19:537-542，全部引入作为参考)、蛋白片段互补测定(Johnsson&Varshavsky,1994,ProcNatlAcadSciUSA91:10340-10344；Pelletieretal.,1998,ProcNatlAcadSciUSA95:12141-12146，全部引入作为参考)，用于选择方式(Visintinetal.,1999,ProcNatlAcadSciUSA96:11723-11728，全部引入作为参考)的酵母双杂交筛选(Fields&Song,1989,Nature340:245-246，全部引入作为参考)。在可选择的实施方式中，能通过结合表达载体上的特异序列的融合配偶体进行选择，因此融合配偶体能共价或非共价地连接联合的Fc变体库成员和编码他们的核酸。例如：都全部引入作为参考的USSN09/642,574；USSN10/080,376；USSN09/792,630；USSN10/023,208；USSN09/792,626；USSN10/082,671；USSN09/953,351；USSN10/097,100；USSN60/366,658；PCTWO00/22906；PCTWO01/49058；PCTWO02/04852；PCTWO02/04853；PCTWO02/08023；PCTWO01/28702和PCTWO02/07466描述了可以使用的这种融合配偶体和技术。在可选择的实施方案中，如果蛋白的表达赋予细胞一些生长、繁殖或存活优点，那么就可以进行体内选择。

称为"定向进化"方法的一类选择方法是那些在选择期间包括交配或再生有利序列，有时整合新突变的方法。本领域熟练技术人员应理解定向进化方法可以促进对库中最有利序列的鉴定，而且可以增加筛选序列的多样性。多种定向进化方法在本领域是已知的，他们可用于筛选IgG变体，包括但不限于DNA重排(PCTWO00/42561A3；PCTWO01/70947A3),外显子改组(US6,365,377；Kolkman&Stemmer,2001,NatBiotechnol19:423-428),家族重排(Cramerietal.,1998,Nature391:288-291；US6,376,246),RACHITT^TM(Cocoetal.,2001,NatBiotechnol19:354-359；PCTWO02/06469),STEP合体外重组随机引物法(Zhaoetal.,1998,NatBiotechnol16:258-261；Shaoetal.,1998,NucleicAcidsRes26:681-683),外切核酸酶介导的基因组合(US6,352,842；US6,361,974),GeneSiteSaturationMutagenesis^TM(US6,358,709),GeneReassembly^TM(US6,358,709),SCRATCHY(Lutzetal.,2001,ProcNatlAcadSciUSA98:11248-11253),DNA断裂方法(Kikuchietal.,Gene236:159-167),单链DNA重排(Kikuchietal.,2000,Gene243:133-137)和AMEsystem^TM定向进化蛋白工程技术(AppliedMolecularEvolution)(US5,824,514；US5,817,483；US5,814,476；US5,763,192；US5,723,323)。这段中的所有参考文献都全部引入作为参考。

在优选实施方案中，利用一种或多种基于细胞的测定或体内测定筛选IgG变体。进行这种测定时，通常需要外源添加纯化或未纯化的蛋白，以使细胞暴露于独立的变体或属于库的变体库。这些测定通常是，但不总是以IgG功能为基础，IgG功能也就是IgG结合它的靶和介导一些生物化学事件的的能力，例如效应器功能、配体/受体结合抑制、凋亡等等。这种测定经常涉及监测细胞对IgG的反应，例如细胞存活率、细胞死亡、细胞形态学方面的变化或翻译激活，例如天然基因或报告基因的细胞表达。例如：这种测定可以测量IgG变体引发ADCC、ADCP或CDC的能力。在一些测定中，除靶细胞之外，可需要添加另外的细胞或组分，例如血清补体或效应细胞，例如外周血单核细胞(PBMCs)、NK细胞、巨噬细胞等等。这种另外的细胞可以来自任何生物体，优选来自人、小白鼠、大鼠、兔子和猴。抗体可以引起某些表达靶的细胞系凋亡，或者他们可以介导已经添加到测定中的免疫细胞攻击靶细胞。监测细胞死亡或成活力的方法在本领域是已知的，包括利用染料、免疫化学试剂、细胞化学试剂和放射性试剂。例如：半胱天冬酶染色测定能测量凋亡，而且放射性底物或荧光染料，例如alamar蓝的吸收或释放能使细胞生长或激活被监测。在优选实施方案中，使用了基于细胞毒性测定的EuTDA(PerkinElmer,MA)。或者，通过测量一种或多种天然胞内蛋白，例如乳酸脱氢酶的释放可以监测死亡或损害的靶细胞。转录激活也可以作为在基于细胞的测定中测定功能的方法。在这种情况下，通过测定可被上调的天然基因或蛋白，例如测量某些白细胞间介素的释放，或者由报告构建物获取读数可以监测反应。基于细胞的测定也可以涉及测量细胞的形态变化作为对蛋白存在的反应。这种测定的细胞类型可以是原核或真核细胞，可以使用本领域已知的多种细胞系。或者，可利用已经用编码变体的核酸转化或转染的细胞实施基于细胞的筛选。也就是说，没有外源添加IgG变体到细胞中。例如：在一个实施方案中，基于细胞的筛选使用了细胞表面展示。可以使用能在细胞表面上显示IgG变体的融合配偶体(Witrrup,2001,CurrOpinBiotechnol,12:395-399，完全引入作为参考)。

在优选实施方案中，利用一种或多种基于细胞的测定实验确定IgG变体的免疫原性。几种方法可以用于表位的试验性确认。在优选实施方案中，利用体外T细胞激活测定以实验性定量免疫原性。在该方法中，用目标肽或完整蛋白攻击抗原呈递细胞和来自匹配供体的天然T细胞一次或多次。然后，利用许多方法，例如监测细胞因子的生产或测量氚化胸腺嘧啶的吸收可以检测T细胞激活。在最优选的实施方案中，利用Elispot测定监测干扰素γ的生产(Schmittelet.al.,2000,J.Immunol.Meth.24:17-24，全部引入作为参考)。

可以在细胞、组织和完整生物体实验中表征IgG变体的生物学特性。为了测量药物治疗疾病或疾病模型的功效、或测量药物的药物动力学、毒性及其他特性，经常在包括但不限于小白鼠、大鼠、兔子、狗、猫、猪和猴的动物中测试药物，这一点本领域已经已知。动物可以被称为疾病模型。经常在包括但不限于裸鼠、SCID小白鼠、异种移植小白鼠和转基因小白鼠(包括敲入和敲除)的小白鼠中测试治疗剂。这种实验可以提供有价值的数据以确定蛋白被用作治疗剂的潜力。任何生物体，优选哺乳动物可以被用来进行测试。例如，因为猴与人的遗传相似性，因此猴可以作为适当的治疗模型，用来测试IgGs的功效、毒性、药物动力学或其他特性。批准作为药物最终需要在人体内进行测试，因此毫无疑问已经打算进行这些实验。因此，可以在人体内测试IgGs以确定他们的治疗功效、毒性、免疫原性、药物动力学和/或其他临床特性。

IgG变体的使用方法

IgG变体可以用于范围广泛的产物中。在一个实施方案中，IgG变体是治疗试剂、诊断试剂或研究试剂，优选是治疗试剂。IgG变体可用于是单克隆或多克隆的抗体组合物中。在优选实施方案中，IgG变体可以用来杀死负载靶抗原的靶细胞，例如癌细胞。在可选择的实施方案中，IgG变体被用来阻断、对抗或干扰靶抗原，例如对抗细胞因子或细胞因子受体。在可选择的优选实施方案中，IgG变体被用来阻断、对抗或干扰靶抗原，并杀死负载靶抗原的靶细胞。

IgG变体可以用于多种治疗目的。在优选实施方案中，可以给病人施用包含IgG变体的抗体以治疗与抗体相关的紊乱。适合于该目的的"病人"包括人及其他动物，优选哺乳动物，最优选人。在这里"抗体相关紊乱"或"抗体应答紊乱"或"状况"或"疾病"指通过施用包含IgG变体的药物组合物能改善的紊乱。抗体相关紊乱包括，但不限于自身免疫疾病、免疫疾病、感染性疾病、炎性疾病、神经学上的疾病，以及肿瘤和新生物疾病，包括癌症。在这里"癌症"和"癌"指或描述的是哺乳动物中通常以无限制的细胞生长/增殖为特征的生理状态。癌症的实例包括，但不局限于癌、淋巴瘤、胚细胞瘤、肉瘤(包括脂肪肉瘤)、神经内分泌肿瘤、间皮瘤、雪旺氏瘤(schwanoma)、脑膜瘤、腺癌、黑素瘤，以及白血病和淋巴***的恶性肿瘤。

在一个实施方案中，IgG变体是施用给人的唯一治疗活性剂。或者，可以与一种或多种其他治疗剂，包括但不限于细胞毒活性制剂、化疗剂、细胞因子、生长抑制制剂、抗激素制剂、激酶抑制剂、抗血管生成制剂、心脏保护剂或其他治疗剂结合施用IgG变体。施用IgG变体时，可以伴随施用一种或多种其他治疗方式。例如：可以将IgG变体与化疗、放疗、或者放化疗一起施用给病人。在一个实施方案中，可以和是或不是IgG变体的一种或多种抗体一起施用IgG变体。依照另一个实施方案，可以使用IgG变体和一种或多种其他抗癌治疗在体外治疗癌细胞。预计这种体外治疗可对骨髓移植有用，对自体骨髓移植可特别有用。当然，应考虑到这种IgG变体仍然可以与其他治疗技术，例如手术组合使用。

多种其他治疗剂可以用于和IgG变体一起施用。在一个实施方案中，与抗血管生成剂一起施用IgG。在这里使用的"抗血管生成剂"指阻断或一定程度上干扰血管发生的化合物。抗血管生成因子可以是，例如结合涉及促进血管发生的生长因子或生长因子受体的小分子或蛋白，例如抗体、Fc融合物或细胞因子。这里优选的抗血管生成因子是结合血管内皮细胞生长因子(VEGF)的抗体。在可选择的实施方案中，与诱导或增强适当免疫反应的治疗剂，例如靶向CTLA-4的抗体一起施用IgG。在可选择的实施方案中，与酪氨酸激酶抑制剂一起施用IgG。这里使用的"酪氨酸激酶抑制剂"指在一定程度上抑制酪氨酸激酶的酪氨酸激酶活性的分子。在可选择的实施方案中，与细胞因子一起施用IgG变体。

其中配制了IgG变体和一种或多种治疗活性剂的药物组合物也在考虑之中。通过将具有想要纯度的IgG与任意的药学可接受载体、赋形剂或稳定剂混合(Remington'sPharmaceuticalSciences16thedition,Osol,A.Ed.,1980，全部引入作为参考)，可以制备冻干剂型或水溶液形式的用于储藏的IgG变体制剂。用于体内给药的制剂优选是无菌的。通过过滤通过过滤除菌膜或其他方法很容易实现这一目的。也可以以免疫脂质体形式配制这里公开的IgG变体及其他治疗活性剂，和/或将他们俘获在微胶囊中。

制剂中治疗活性IgG变体的浓度按重量计在大约0.1-100%之间变化。在优选实施方案中，IgG浓度在0.003-1.0摩尔的范围之内。为了治疗病人，可以施用治疗有效量的IgG变体。这里的"治疗有效量"指施用时产生效果的剂量。准确剂量取决于治疗目的，本领域普通技术人员利用已知技术可确定准确剂量。剂量可以在从0.01-100mg/kg体重或更大的范围中变化，例如为0.01、0.1、1.0、10或50mg/kg体重，其中1-10mg/kg是优选的。本领域已经已知调节蛋白降解，与局部递送相比较的***递送、新蛋白酶合成的速度，以及年龄、体重、大体健康、性别、饮食、给药时间、药物相互作用和状况的严重可是必需的，本领域熟练技术人员通过常规实验可确定这一点。

包含IgG变体的药物组合物，优选无菌水溶液形式的药物组合物的给药可以通过多种途径进行，包括但不限于口服、皮下、静脉内、胃肠外、耳内(intraotically)、眼内、直肠、***、经皮、局部(例如凝胶剂、油膏剂、洗剂、乳膏等等。)、腹膜内、肌内、肺内(例如从Aradigm可买到的AERx吸入技术或从NektarTherapeutics可买到的Inhance肺递送***)等等。可以与其他治疗伴随施用本文所述治疗剂，即本文所述治疗剂可以与其他治疗或治疗剂，包括例如小分子、其他生物制剂、放疗、手术等等一起施用。

实施例

以下实施例举例说明本发明。这些实施例无意将本发明限制于任何特殊应用或操作理论。本发明所述所有位点都依照Kabat中的EU指数进行编号(Kabatetal.,1991,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,5thEd.,UnitedStatesPublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda，全部引入作为参考)。抗体领域的熟练技术人员应理解，这一规定由免疫球蛋白序列具体区域的非顺序编号组成，因此能参照免疫球蛋白家族中的保守位点进行标准化。因此，EU指数所指任何给定免疫球蛋白的位点不一定对应于它的有序序列。

实施例1：Fc变体的DNA构建、表达和纯化

利用人IgG1Fc域和曲妥单抗(Genentech)的可变域构建Fc变体。Fc多肽是阿仑单抗、曲妥单抗或AC10的一部分。阿仑单抗(Millenium的注册商标)是目前批准用于治疗B细胞慢性淋巴细胞性白血病的人源化单克隆抗体(Haleetal.,1990,TissueAntigens35:118-127，全部引入作为参考)。曲妥单抗(Genentech的注册商标)是治疗转移性乳腺癌的抗HER2/neu抗体。AC10是抗CD30单克隆抗体。Herceptin可变区利用回归PCR来组装。然后将该可变区与人IgG1一起克隆到pcDNA3.1/Zeo(+)载体(Invitrogen)中，见图11。质粒在OneShotTOP10大肠杆菌细胞(Invitrogen)中繁殖，并利用Hi-SpeedPlasmidMaxiKit(Qiagen)纯化。质粒经测序证实存在克隆的***物。

定点诱变利用Quikchange^TM方法(Stratagene)进行。包含所需替换、***和缺失的质粒在OneShotTOP10大肠杆菌细胞(Invitrogen)中繁殖，并利用Hi-SpeedPlasmidMaxiKit(Qiagen)纯化。DNA测序证实序列的保真度。

将含重链基因(VH-Cγ1-Cγ2-Cγ3)(野生型或变体)的质粒与含轻链基因(VL-Ck)的质粒共转染到293T细胞中。转染5天后，收获培养基，利用蛋白A亲和色谱法(Pierce)从上清液中纯化抗体。通过双金鸡宁酸(bicinchoninicacid)(BCA)测定(Pierce)确定抗体浓度。

实施例2：结合亲和力测量

用表面质子共振测量测定Fc多肽对Fc配体的结合。利用BIAcore3000仪器(BIAcoreAB)实施表面质子共振(SPR)测量。利用固相蛋白L(PierceBiotechnology,Rockford,IL)捕获野生型或变体抗体，并测量对受体分析物的结合。在CM5传感器芯片上利用5ul/min流速的N-羟基琥珀酰亚胺/N-乙基-N'-(-3-二甲氨基-丙基)碳化二亚胺(NHS/EDC)，将存在于pH4.5的10mM醋酸钠中的浓度为1uM的蛋白L共价连接到CM5传感器芯片上。用NHS/EDC模拟(mock)每个传感器芯片的流动细胞1作为结合的阴性对照。所用缓冲液是0.01MHEPESpH7.4、0.15MNaCl、3mMEDTA、0.005%v/v表面活性剂P20(HBS-EP，Biacore,Uppsala,Sweden)，芯片再生缓冲液是10mM甘氨酸-HClpH1.5。将125nM野生型或变体曲妥单抗以流速1ul/min与HBS-EP中的蛋白LCM5芯片结合5分钟。注入在1和250nM之间连续稀释的FcRn-His-GST分析物(FcRn与His标签和谷胱甘肽S转移酶融合)，在HBS-EP中结合20分钟，解离10分钟，流速10ul/min。在注射受体之后的1200秒，获取按共振单位(RU)计量的反映近稳态结合的反应。用抗体和缓冲液进行的循环仅提供基线反应。产生RU对1/log浓度的曲线图，并利用GraphPadPrism进行非线性回归，将其调整为S形曲线剂量反应。

Fc多肽对Fc配体的结合也利用AlphaScreen^TM(扩增发光邻近均质测定，AmplifiedLuminescentProximityHomogeneousAssay)确定。AlphaScreen^TM是基于珠的非放射发光邻近测定。供体珠激发出激光，从而激发氧，当氧离受体珠足够近时，产生一连串化学发光事件，最终导致在520-620nm发射荧光。AlphaScreen^TM的主要优点在于它的敏感性。因为一个供体珠每秒发射多达60,000个激发态氧分子，信号放大程度非常高，其允许检测低至阿托摩尔(attomolar，10^-18)的水平。野生型抗体通过标准方法生物素化，以附着链亲和素供体珠，标记的Fc配体(例如FcRn)与螯合谷胱甘肽的受体珠连接。用AlphaScreen^TM作为直接结合测定，其中Fc/Fc配体的相互作用将供体和受体珠带到一起。另外，用AlphaScreen^TM作为竞争测定，来筛选所设计的Fc多肽。缺乏竞争型Fc多肽时，野生型抗体与FcRn相互作用，在520-620nm产生信号。未标记的Fc域竞争野生型Fc/FcRn相互作用，使荧光大大减弱，从而能确定相对结合亲和力。

实施例3：Fc变体的FcRn结合特性

IgG1Fc对FcRn的结合亲和力用变体抗体和AlphaScreen^TM测量。Fc多肽是阿仑单抗、曲妥单抗的一部分。阿仑单抗(Ilex)是目前批准用于治疗B细胞慢性淋巴细胞性白血病的人源化单克隆抗体(Haleetal.,1990,TissueAntigens35:118-127，全部引入作为参考)。曲妥单抗(Genentech)是治疗转移性乳腺癌的抗HER2/neu抗体。

收集竞争性AlphaScreen^TM数据以测量pH6.0时，Fc变体与野生型抗体相比的相对结合。AlphaScreen^TM信号相对于竞争型抗体的函数的实例见图12。图中显示12个变体曲线，其中P257L、P257N、V279E、V279Q、V279Y、^281S、E283F、V284E、L306YT307V、V308F和Q311V的曲线表现出增加的亲和力，每一变体曲线在其框中移到野生型曲线左侧。本发明Fc变体的竞争AphaScreen^TM数据概括在图13和14中。变体与野生型相比的相对FcRn结合已列表。值大于1表明，与野生型相比，Fc变体对FcRn的结合增强。例如：变体E283L和V284E的结合分别比野生型的强9.5倍和26倍。多咯变体经表面质子共振测量也显示对FcRn的结合增加，见图15和16。

在位点257，除去亚氨基酸、脯氨酸以及将不带骨架N的氨基酸替换成侧链共价键所得的所有变体都使骨架屈曲性更强，这样可以允许Fc域更自由以便更好地结合FcRn。特别地，位点257变成L和N后得到的变体在pH6时具有强烈的FcRn结合，这表明四原子侧链和该侧链的γ分支形式可以帮助Fc域产生有价值的，即强烈的FcRn相互作用。位点308与位点257相互作用。这两个位点依次与直接参与Fc/FcRn相互作用的H310相互作用(表2，Burmeisteretal(1994)Nature372:379-383，全部引入作为参考)。相对于野生型，Fc变体V308F和V08Y的FcRn亲和力增加2.9倍和4.3倍。位点279和385与FcRn相互作用，因为变体V279E、V279Q和V279Y和G385H和G385N全都具有更强的FcRn相互作用。这些变体都替换成了能进行氢键连接的氨基酸。

Fc变体N434Y在pH6.0时对FcRn的结合特别强，见图13。单个变体N434Y的结合增加16倍。该变体与其他修饰联合导致更强的结合。例如：P257L/N434Y、^281S/N434Y和V308F/N434Y的FcRn结合增加830倍、180倍和350倍。

实施例4：整合***和缺失的变体

构建改变Fc/FcRn相互作用强度的***和缺失，并测量它们对各种Fc配体的结合特性。设计一种Fc变体，其在残基281和282(按Kabat等的EU编号)之间***Ser残基，以增加Fc域的FcRn结合特性。该变体称^281S，"^"表示指定位点后的***。在位点编号后给出***序列，其可以超过一个残基。利用本文所述方法，在κIgG1抗体曲妥单抗(HGenetech)中构建该Fc变体。在残基281和282之间进行***，使残基281C末端的Fc环残基移向该环C末端，并改变了该侧链的位置。一些Fc变体在位点282、283和284包含替换，它们表明该环C末端的移位是有益的(参见图14)。另构建了一个N286缺失变体(也称N286#)，以改变该FcRn结合环的位置。在pH6.0时，这两个变体对FcRn的结合亲和力都显示出增加。

ΑlphaScreen^TM数据显示了^281S变体及其他变体对FcRn的结合。收集ΑlphaScreen^TM数据作为直接的结合测定。较高水平的化学发光信号表明更强的结合。因为测定中变体的浓度提高了，因此产生了更强的信号。图17a和17b中pH6.0时的这些数据表明，相对于野生型Fc，^281S、P257L、P257L/^281S(替换/***组合变体)及其他变体的亲和力增加。另有一种双重替换T250Q/M428L，以前的报道称，其在猴体内具有延长的血清半衰期(Hintonetal.,2004,J.Biol.Chem.279(8):6213-6216，全文引入作为参考)。单独的^281S***增加了Fc/FcRn结合。另外，如～40nM的数据点所示，当在变体P257L/^281S中组合两个修饰时，^281S更进一步地增强了P257L的结合。图17c中的数据表明，这些变体在pH7.0时未显示FcRn结合增加。pH7.0时降低的亲和力是延长体内半衰期所希望的，因为它允许Fc多肽从FcRn释放到细胞外间隙中，这是Fc再循环中的重要步骤。

表面质子共振实验也表明，^281S对FcRn的结合被改进。图18显示了各种Fc变体与芯片表面FcRn结合时产生的响应单位。在变体完全结合到芯片上后，记录响应单位并将其显示在纵坐标上。^281S***显示出与本文所述其他变体相当的结合特性，即相比于野生型，对FcRn的亲和力增加(例如参见图13、14和15)。

缺失变体N286#包含N286的缺失，其相对于野生型，也显示出增加的FcRn亲和力。如图13所示，该变体的FcRn亲和力增加2.0倍。其中的数据也是pH6.0时从作为竞争实验的ΑlphaScreen^TM收集的数据。用这些变体抑制连接供体珠的野生型Fc与连接受体珠的FcRn的结合。通过Fc/FcRn复合物抑制供体/受体珠的结合需要比游离野生型Fc少两倍的游离N286#。这表明N286#比野生型的结合强2倍。

包含***或缺失的其他Fc变体对FcRn亲和力的降低。***变体^254N对FcRn的结合大大降低，这可从该变体的性质和定位预期到。该变体在FcRn结合环的中间位置***Asn。该***物仅有野生型的结合亲和力的1.1%(图13)。

本发明如上所述的具体实施例是为了进行解释说明，本领域熟练技术人员应理解不脱离附加要求所描述的本发明可以对细节实施数目众多的变异。所有这里引用的参考文献都全部引入作为参考。

Claims (8)

1.一种抗体，其包含人IgGFc多肽的修饰的Fc区，其中所述修饰的Fc区因第434位用丝氨酸对天冬酰胺的替换产生，并且其中参照Kabat等的EU指数进行编号。

2.权利要求1所述的抗体，其中所述包含修饰的Fc区的抗体具有对于选自下组的靶分子的特异性：细胞因子，可溶性蛋白因子和癌细胞上表达的蛋白质。

3.权利要求1所述的抗体，其中所述抗体选自：嵌合抗体、人源化抗体、或人抗体。

4.权利要求1-3任一项所述的包含修饰的Fc区的抗体，其中所述抗体是Fc融合物。

5.制备权利要求1-4任一项所述的包含修饰的Fc区的抗体之方法，所述方法包括提供包含编码所述抗体的核酸之细胞，其中所述细胞在适合所述抗体表达的条件下培养。

6.权利要求5的方法，其中所述核酸包含在表达载体中。

7.宿主细胞，包含编码权利要求1-4任一项所述的包含修饰的Fc区的抗体之核酸。

8.表达载体，其中所述表达载体编码权利要求1-4任一项所述的包含修饰的Fc区的抗体。