TW201825515A - Ｍｅｔ抗體以及其免疫結合物及用途 - Google Patents

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Abstract

MET為在腫瘤細胞表面上發現之受體酪胺酸激酶。本發明包括具有優越物理及功能性質之抗MET抗體、形式及片段；免疫結合物、組合物、診斷試劑、抑制生長之方法、治療方法、改良之抗體及細胞株；以及編碼其之聚核苷酸、載體及基因構建體。

Description

MET抗體以及其免疫結合物及用途
MET，亦稱為c-Met、HGFR、RCCP2或AUTS9，為一種糖基化受體酪胺酸激酶，其在上皮形態發生及癌症發展中起重要作用。其亦稱為肝細胞生長因子或HGF受體、分散因子或SF受體、met原癌基因酪胺酸激酶或原癌基因c-Met。
MET係合成為單鏈前驅體，其經歷共轉譯蛋白水解裂解。由此產生成熟MET，其為二硫鍵連接之二聚體，由50kDa細胞外α鏈及145kDa跨膜β鏈構成(Birchmeier,C.等人，Nat.Rev.Mol.Cell Biol.2003；4：915：Corso,S.等人，Trends Mol.Med.2005；11：284)。細胞外域(ECD)含有七槳式β螺旋槳sema結構域、富半胱胺酸PSI/MRS結構域及四個Ig樣E-set結構域，而細胞質區包括酪胺酸激酶結構域及銜接子蛋白靠泊位點(Gherardi,E.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.2003；100：12039；Park,M.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.1987；84：6379)。該sema結構域係由MET之α及β鏈二者形成，其介導配位體結合及受體二聚(Gherardi,E.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.2003；100：12039；Kong-Beltran,M.等人，Cancer Cell 2004；6：75)。
肝細胞生長因子(HGF)為MET配位體(Gheradi,E.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.2003；100：12039)。HGF亦稱為分散因子(SF)及肝細胞生成素A，且其屬於S1肽酶之纖維蛋白溶酶原子家族。產生人類HGF且分泌為非活性728個胺基酸(AA)之單鏈前肽。其在第四個Kringle結構域之後被絲胺酸蛋白酶裂解，從 而形成HGF之活性形式，亦即，具有60kDa α鏈及30kDa β鏈之二硫鍵連接之異源二聚體。
HGF藉由誘導細胞分散及分支管形成來調控上皮形態發生(Maeshima,A.等人，Kid.Int.2000；58：1511；Montesano,R.等人，Cell 1991；67：901)。因而，MET與HGF之間的相互作用在哺乳動物發育、組織生長及修復期間起重要作用。然而，MET之不當活化亦可支持腫瘤細胞增殖及侵襲，驅動腫瘤相關之血管生成，且因此已牽涉若干種類型癌症之形成及進展。
MET之異常信號傳導可能為多種機制之結果，該等機制包括非配位體依賴性活化，諸如經由MET過度表現或MET活化突變，以及以旁分泌或自分泌方式之配位體依賴性活化。上皮細胞分散及分支管形成之旁分泌誘導引起自相鄰間充質細胞釋放之HGF刺激未分化上皮上之MET(Sonnenberg,E.等人，J.Cell Biol.1993；123：223)。自分泌誘導為MET陽性細胞之HGF產生的結果。
MET受體在存在或不存在配位體時之二聚誘導細胞質區中之酪胺酸磷酸化，由此又活化激酶結構域且對多個含SH2之分子提供靠泊位點(Naldini,L.等人，Mol.Cell.Biol.1991；11：1793；Ponzetto,C.等人，Cell 1994；77：261)。由此引起諸如Src、MAPK、PI3K及Akt之涉及關鍵信號轉導因子之下游信號傳導途徑的活化。
MET亦可與多種膜蛋白，包括CD44v6、CD151、EGF R、Fas、整合素α6/β4、Plexin B1、Plexin B2、Plexin B3及MSP R/Ron形成非共價複合物(Orian Rousseau,V.等人，Genes Dev.2002；16：3074；Follenzi,A.等人，Oncogene 2000；19：3041)。一種複合物組分之連結觸發其他複合物組分之活化，繼而達成協作信號傳導效應。一些此等異質複合物之形成可導致上皮細胞形態發生及腫瘤細胞侵襲(Trusolino,L.等人，Cell 2001；107：643；Giordano,S.等人，Nat.Cell Biol.2002；4：720)。最近，已將MET途徑活化視作EGFR抑制劑抗性之機制(Engelman J.A. 等人，Science 2001；316：1039-1043)。
眾多研究已隱含受體酪胺酸激酶MET在人類癌瘤進展及轉移中，包括在胰臟癌、胃癌、***癌、卵巢癌、乳癌、肝細胞癌(HCC)、黑色素瘤、骨肉瘤及結腸直腸癌(CRC)、包括小細胞肺癌(SCLC)及非小細胞肺癌(NSCLC)在內之肺癌、頭頸部鱗狀細胞癌(HNSCC)、腎臟癌及甲狀腺癌中之異常功能。
已在多種癌症中描述MET之基因擴增事件、激酶結構域中之活化突變、基因多型性、染色體易位、過度表現以及其他間接及蛋白水解裂解(Birchmeier,C.等人，Nat.Rev.Mol.Cell Biol.2003；4：915)。值得注意的是，已在患有遺傳性乳頭狀腎癌之患者中鑑定出MET中之引起組成性活化之活化突變，直接表明MET牽涉人類腫瘤發生(Nat.Genet.1997；16：68-73)。
另外，在諸如HNSCC(Cancer Res 2009；69(7)：3021-31)、肺癌(Oncology 1996；53：392-7)、胃癌(Apmis 2000；108：195-200)、胰臟癌(Cancer Res 1994 5775-8；Jin,Cancer Res 2008；68：4360-8)及骨肉瘤(Oncogene 1995；10：739-49)之癌症中已記錄MET受體及HGF配位體兩者之過度表現。相同細胞或組織共同表現MET報告因子及HGF配位體可導致自分泌信號傳導及異常受體活化。
近年來已開發出MET之若干種小分子抑制劑且當前正在臨床試驗中進行測試(關於評論，參見Comoglio PM.等人，Nat Rev Drug Discov 2008；7,504-516；Eder JP.等人，Clin Cancer Res 2009；15：2207-2214；Wang MH等人，Acta Pharmacologica Sinica 2010；31：1181-1188)。另一種策略為開發針對HGF或HGF拮抗劑之中和抗體以防止MET之配位體依賴性活化。
開發針對MET之治療性抗體非常困難，因為競爭HGF結合之抗體通常引起MET受體二聚且因此充當促效劑(Prat M等人，J Cell Sci 1998；111(第2部分)，237-247)。舉例而言，已描述稱為5D5之抗MET抗體，其阻斷HGF與MET結合且充當呈二價抗體形式之有效促效劑(Schwall,US 5,686,292)。作為反 應，5D5被工程改造為單價Fab型式或單臂型式(OA5D5)且隨後充當拮抗劑(Dennis,US 7,476,724)。選擇單臂型式以便在臨床試驗中進行進一步開發且稱為MetMab(Jin H等人，Cancer Res 2008；68,4360-4368)。然而，此單臂型式不能被視為完全抗體，而是代表具有不理想性質，包括削弱之效應功能及減少之半衰期的抗體片段。
已描述可阻斷HGF與MET結合之其他抗體(Morton P.A.US 2004/0166544及WO 2005/016382)。選擇WO 2009/007427(Goetsch L.)中所揭示之其他抗MET抗體，諸如11E1、224G11、223C4及227H1來防止MET受體二聚。
抗體-藥物結合物(ADC)為一種類型之免疫結合物，其包含經由專用化學連接子與抗體共價連接之細胞毒性劑。在治療癌症時使用ADC局部遞送細胞毒性劑或細胞抑制劑，例如殺死或抑制腫瘤細胞之藥物(參見Syrigos及Epenetos(1999)Anticancer Research 19：605-614；Niculescu-Duvaz及Springer(1997)Adv.Drug Del.Rev.26：151-172；美國專利第4,975,278號)允許將藥物部分靶向遞送至腫瘤且在其中發生細胞內積聚，其中全身性投與此等未結合藥劑可能造成對正常細胞以及設法消除之腫瘤細胞不可接受之水準的毒性(Baldwin等人，(1986)Lancet pp.(1986年3月15日)：603-05；Thorpe,(1985)「Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy：A Review」,Monoclonal Antibodies '84：Biological And Clinical Applications,A.Pinchera等人(編)，第475-506頁)。尋求最大效力與最低毒性。多株抗體及單株抗體兩者有時報導為適用於此方面(參見Rowland等人，(1986)Cancer Immunol.Immunother.,21：183-87)。已知以此方式使用之藥物包括道諾黴素(daunomycin)、阿黴素(doxorubicin)、胺甲葉酸(methotrexate)及長春地辛(vindesine)(Rowland等人，Cancer Immunol.Immunother.21：183-87(1986))。抗體-毒素結合物中所使用之毒素包括細菌毒素，諸如白喉毒 素；植物毒素，諸如篦麻毒素；小分子毒素，諸如格爾德黴素(geldanamycin)。Kerr等人，(1997)Bioconjugate Chem.8(6)：781-784；Mandler等人，(2000)Journal of the Nat.Cancer Inst.92(19)：1573-1581；Mandler等人，(2000)Bioorganic & Med.Chem.Letters 10：1025-1028；Mandler等人，(2002)Bioconjugate Chem.13：786-791)、類美登素(EP 1391213；Liu等人，(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：8618-8623)及卡奇黴素(calicheamicin)(Lode等人，(1998)Cancer Res.58：2928；Hinman等人，(1993)Cancer Res.53：3336-3342。毒素可藉由不同的機制，包括微管蛋白結合、DNA結合或拓撲異構酶抑制來發揮細胞毒性及/或細胞抑制效應。Meyer,D.L.及Senter,P.D.「Recent Advances in Antibody Drug Conjugates for Cancer Therapy」,Annual Reports in Medicinal Chemistry，第38卷(2003)，第23章，229-237。但許多細胞毒性藥物在與大抗體或蛋白質受體配位體結合時傾向於不具活性或具有較弱活性。
因而，仍舊需要開發與已知治療劑相比有所改良及優越之c-Met靶向治療劑，包括展現特異性、降低之毒性、穩定性以及增強之物理及化學性質的抗體或抗體片段。本發明解決彼等需要。
本發明提供抗MET免疫結合物，其在MET過度表現-未擴增之情形下展現特異性且有效之細胞毒性活性。此外，在表現少於30,000個細胞表面受體/細胞之具有正常MET基因複本數之細胞中，即使在高濃度下，本發明之抗MET免疫結合物亦顯示邊界細胞毒性水準並且無特異性。總而言之，此等性質使得免疫結合物有效治療癌症，例如cMET過度表現-未擴增型癌症。
現將詳細參考本發明之某些態樣，其實例在所附結構及結構式中加以說明。儘管將結合所列舉之態樣來描述本發明，但應理解其不意欲本發明僅限於彼等態樣。相反，本發明意欲涵蓋可包括在如申請專利範圍所限定之本發 明範疇內的所有替代方案、修改方案及等效方案。熟習此項技術者將認識到可用於實施本發明之與本文中所描述之彼等方法及材料相似或等效的許多方法及材料。
在一個態樣中，本發明提供一種經分離之單株抗體或其抗原結合片段，其特異性結合人類cMET之細胞外區中的抗原決定基，其中該抗體或其抗原結合片段包含具有選自由以下各項組成之群的序列的輕鏈互補決定區LC CDR1、LC CDR2及LC CDR3以及重鏈互補決定區HC CDR1、HC CDR2及HC CDR3：(a)分別SEQ ID NO：4、5及7以及SEQ ID NO：13、14及15；(b)分別SEQ ID NO：1、2及3以及SEQ ID NO：8、9及10；(c)分別SEQ ID NO：1、2及3以及SEQ ID NO：8、12及10；(d)分別SEQ ID NO：4、5及6以及SEQ ID NO：13、14及15；(e)分別SEQ ID NO：4、5及6以及SEQ ID NO：13、17及15；(f)分別SEQ ID NO：4、5及7以及SEQ ID NO：13、17及15；以及(g)分別SEQ ID NO：4、5及8以及SEQ ID NO：13、17及15。
在某些實施例中，該抗體為鼠類抗體、非人類哺乳動物抗體、嵌合抗體、人類化抗體或人類抗體。在某些實施例中，該人類化抗體為CDR移植抗體或表面重整抗體。在某些實施例中，該抗體為全長抗體。
在某些實施例中，該抗原結合片段為Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、單鏈Fv或scFv、二硫鍵連接之Fv、V-NAR結構域、IgNar、內抗體、IgG△CH2、微型抗體、F(ab')3、四功能抗體、三功能抗體、雙功能抗體、單域抗體、DVD-Ig、Fcab、mAb2、(scFv)2或scFv-Fc。
在某些實施例中，該抗體或其抗原結合片段包含具有與選自由以下各項組成之群的序列具有至少95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性的 序列的輕鏈可變域(VL)及重鏈可變域(VH)：(a)分別SEQ ID NO：32及SEQ ID NO：36；(b)分別SEQ ID NO：18及SEQ ID NO：19；(c)分別SEQ ID NO：20及SEQ ID NO：21；(d)分別SEQ ID NO：22及SEQ ID NO：23；(e)分別SEQ ID NO：24及SEQ ID NO：25；(f)分別SEQ ID NO：26及SEQ ID NO：27；(g)分別SEQ ID NO：28及SEQ ID NO：31；(h)分別SEQ ID NO：29及SEQ ID NO：31；(i)分別SEQ ID NO：30及SEQ ID NO：31；(j)分別SEQ ID NO：32及SEQ ID NO：35；(k)分別SEQ ID NO：32及SEQ ID NO：36；(l)分別SEQ ID NO：33及SEQ ID NO：36；(m)分別SEQ ID NO：33及SEQ ID NO：35；以及(n)分別SEQ ID NO：33及SEQ ID NO：34。
在某些實施例中，該抗體或其抗原結合片段包含具有選自由以下各項組成之群的序列的輕鏈及重鏈：(a)分別SEQ ID NO：49及SEQ ID NO：54；(b)分別SEQ ID NO：39及SEQ ID NO：40；(c)分別SEQ ID NO：41及SEQ ID NO：42；(d)分別SEQ ID NO：43及SEQ ID NO：44；(e)分別SEQ ID NO：45及SEQ ID NO：48；(f)分別SEQ ID NO：46及SEQ ID NO：48；(g)分別SEQ ID NO：47及SEQ ID NO：48； (h)分別SEQ ID NO：49及SEQ ID NO：53；(i)分別SEQ ID NO：49及SEQ ID NO：52；(j)分別SEQ ID NO：49及SEQ ID NO：51；(k)分別SEQ ID NO：50及SEQ ID NO：53；(l)分別SEQ ID NO：50及SEQ ID NO：52；(m)分別SEQ ID NO：50及SEQ ID NO：51；(n)分別SEQ ID NO：49及SEQ ID NO：77；(o)分別SEQ ID NO：49及SEQ ID NO：78；(p)分別SEQ ID NO：49及SEQ ID NO：79；(q)分別SEQ ID NO：49及SEQ ID NO：80；(r)分別SEQ ID NO：49及SEQ ID NO：81；(s)分別SEQ ID NO：49及SEQ ID NO：82；(t)分別SEQ ID NO：49及SEQ ID NO：83；以及(u)分別SEQ ID NO：49及SEQ ID NO：84。
在某些實施例中，該經分離之抗體或其抗原結合片段係由雜交瘤247.27.16、247.2.26、247.48.38、247.3.14、247.22.2、248.69.4及247.16.8中之任一種產生。
在某些實施例中，本發明提供一種多肽，其包含本文中所描述之VL及VH序列。
在一個態樣中，本發明提供一種細胞，其產生本文中所描述之抗體或其抗原結合片段或者多肽。
在另一態樣中，本發明提供一種產生本文中所描述之抗體或其抗原結合片段或者多肽的方法，其中該方法包括：(a)培養該產生本文中所描述之抗體或其抗原結合片段或者多肽的細胞；及 (b)自該培養之細胞分離該抗體、其抗原結合片段或多肽。
在某些實施例中，該細胞為真核細胞。
在另一態樣中，本發明提供一種診斷試劑，其包含本文中所描述之抗體或其抗原結合片段。在某些實施例中，該抗體或抗體片段經標記。在某些實施例中，該標記物係選自由以下各項組成之群：放射性標記、螢光團、發色團、顯像劑及金屬離子。
在另一態樣中，本發明提供一種編碼本文中所描述之抗體或其抗原結合片段的聚核苷酸，其中該聚核苷酸具有選自由SEQ ID NO：55-72組成之群的序列。
在又一態樣中，本發明提供一種載體，其包含本文中所描述之聚核苷酸。在某些實施例中，該載體為表現載體。
在又一態樣中，本發明提供一種宿主細胞，其包含本文中所描述之表現載體。
本發明亦提供一種免疫結合物，其係由下式表示： 其中：CBA為本文中所描述之抗體或其抗原結合片段或者多肽，其係經由離胺酸殘基共價連接至CyL1；WL為1至20之整數；且CyL1係由以下各式表示： 或其醫藥學上可接受之鹽，其中：介於N與C之間的雙線表示單鍵或雙鍵，限制條件為當其為雙鍵時，X不存在且Y為-H或(C1-C4)烷基；並且當其為單鍵時，X為-H或胺保護部分，且Y為-OH或-SO3H或其醫藥學上可接受之鹽；W'為-NRe'；Re'為-(CH2-CH2-O)n-Rk；n為2至6之整數；Rk為-H或-Me；Rx3為(C1-C6)烷基；L'係由以下各式表示：-NR5-P-C(=O)-(CRaRb)m-C(=O)-(B1')；或-NR5-P-C(=O)-(CRaRb)m-S-Zs1-(B2')；R5為-H或(C1-C3)烷基；P為胺基酸殘基或含有介於2至20個之間的胺基酸殘基的肽；Ra及Rb在每次出現時各自獨立地為-H、(C1-C3)烷基或帶電取代基或可離子化基團Q；m為1至6之整數；且Zs1係選自以下各式中之任一者： ；及 其中q為1至5之整數。
在某些實施例中，本發明提供一種免疫結合物，其係由下式表示： 其中：CBA為本文中所描述之抗體或其抗原結合片段或者多肽，其係經由離胺酸殘基共價連接至CyL2；WL為1至20之整數；且CyL2係由以下各式表示： 或其醫藥學上可接受之鹽，其中： 介於N與C之間的雙線表示單鍵或雙鍵，限制條件為當其為雙鍵時，X不存在且Y為-H或(C1-C4)烷基；並且當其為單鍵時，X為-H或胺保護部分，且Y為-OH或-SO3H；Rx1及Rx2獨立地為(C1-C6)烷基；Re為-H或(C1-C6)烷基；W'為-NRe'；Re'為-(CH2-CH2-O)n-Rk；n為2至6之整數；Rk為-H或-Me；Zs1係選自以下各式中之任一者： ；及 其中q為1至5之整數。
在某些實施例中，本發明之免疫結合物係由下式表示： 其中： CBA為上文所描述之MET結合劑(例如，抗MET抗體或其抗體片段)，其係經由Lys殘基共價連接至CyL3；WL為1至20之整數；CyL3係由下式表示： m'為1或2；R1及R2各自獨立地為H或(C1-C3)烷基；且Zs1係選自以下各式中之任一者： ；及 其中q為1至5之整數。
在某些實施例中，對於式(L3)之免疫結合物，m'為1，且R1及R2均為H；並且其餘變數如以上所描述。
在某些實施例中，對於式(L3)之免疫結合物，m'為2，且R1及R2均為Me；並且其餘變數如以上所描述。
在某些實施例中，本發明之免疫結合物係由以下各式表示： 或其醫藥學上可接受之鹽，其中WL為1至10之整數。
在某些實施例中，本發明之免疫結合物係由以下式表示： 或其醫藥學上可接受之鹽，其中CBA為如申請專利範圍第1項之單株抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含分別具有序列SEQ ID NO：4、5及7以及SEQ ID NO：13、14及15之輕鏈互補決定區LC CDR1、LC CDR2及LC CDR3以及重鏈互補決定區HC CDR1、HC CDR2及HC CDR3；且WL為1至10之整數。在某些實施例中，該經分離之單株抗體或其抗原結合片段包含分別具有序列SEQ ID NO：32及SEQ ID NO：36之重鏈可變域(VH)及輕鏈可變域(VL)。在某些實施例中，該經分離之單株抗體包含分別具有序列SEQ ID NO：49及SEQ ID NO：53之重鏈及輕鏈。在某些實施例中，該經分離之單株抗體包含分別具有序列SEQ ID NO：49及SEQ ID NO：82之重鏈及輕鏈。在某些實施例中，包含該等免疫結合物之組合物(例如醫藥組合物)的DAR值在1.0至5.0、1.0至4.0、1.0至3.4、1.0至3.0、1.5至2.5、2.0至2.5或1.8至2.2之範圍內。在一些實施例中，該DAR小於4.0、小於3.8、小於3.6、小於3.5、小於3.0或小於2.5。
在某些實施例中，本發明提供一種免疫結合物，其係由下式表示： 其中：CBA為本文中所描述之抗體或其抗原結合片段或者多肽，其係經由半胱胺酸殘基共價連接至CyC1；WC為1或2；CyC1係由以下各式表示： 或其醫藥學上可接受之鹽，其中：介於N與C之間的雙線表示單鍵或雙鍵，限制條件為當其為雙鍵時，X不存在且Y為-H或(C1-C4)烷基；並且當其為單鍵時，X為-H或胺保護部分，Y為-OH或-SO3H或其醫藥學上可接受之鹽；R5為-H或(C1-C3)烷基；P為胺基酸殘基或含有2至20個胺基酸殘基之肽；Ra及Rb在每次出現時獨立地為-H、(C1-C3)烷基或帶電取代基或可離子化基團Q；m為1至6之整數；W'為-NRe'；Re'為-(CH2-CH2-O)n-Rk；n為2至6之整數；Rk為-H或-Me；Rx3為(C1-C6)烷基；且LC係由表示，s1為與CBA共價連接之位點，且s2為與CyC1上之-C(=O)-基團共價連接之位點；其中：R19及R20在每次出現時獨立地為-H或(C1-C3)烷基； m"為介於1與10之間的整數；且Rh為-H或(C1-C3)烷基。
在某些實施例中，本發明提供一種免疫結合物，其係由下式表示： 其中：CBA為本文中所描述之抗體或其抗原結合片段或者多肽，其係經由半胱胺酸殘基共價連接至CyC2；WC為1或2；CyC2係由以下各式表示： 或其醫藥學上可接受之鹽，其中：介於N與C之間的雙線表示單鍵或雙鍵，限制條件為當其為雙鍵時，X不存在且Y為-H或(C1-C4)烷基；並且當其為單鍵時，X為-H或胺保護部分，Y為-OH或-SO3H或其醫藥學上可接受之鹽；Rx1為(C1-C6)烷基；Re為-H或(C1-C6)烷基；W'為-NRe'； Re'為-(CH2-CH2-O)n-Rk；n為2至6之整數；Rk為-H或-Me；Rx2為(C1-C6)烷基；LC'係由以下各式表示： 其中：s1為與該CBA共價連接之位點且s2為與CyC2上之-S-基團共價連接之位點；Z為-C(=O)-NR9-或-NR9-C(=O)-；Q為-H、帶電取代基或可離子化基團；R9、R10、R11、R12、R13、R19、R20、R21及R22在每次出現時獨立地為-H或(C1-C3)烷基；q及r在每次出現時獨立地為介於0與10之間的整數；m及n各自獨立地為介於0與10之間的整數；Rh為-H或(C1-C3)烷基；且P'為胺基酸殘基或含有2至20個胺基酸殘基之肽。
在某些實施例中，本發明之免疫結合物係由下式表示： 或其醫藥學上可接受之鹽，其中：介於N與C之間的雙線表示單鍵或雙鍵，限制條件為當其為雙鍵時，X不存在且Y為-H；並且當其為單鍵時，X為-H且Y為-SO3H或其醫藥學上可接受之鹽；CBA為經分離之單株抗體或其抗原結合片段，其特異性結合人類cMET之細胞外區中的抗原決定基，其中該抗體或其抗原結合片段包含分別具有序列SEQ ID NO：4、5及7以及SEQ ID NO：13、14及15之輕鏈互補決定區LC CDR1、LC CDR2及LC CDR3以及重鏈互補決定區HC CDR1、HC CDR2及HC CDR3。在某些實施例中，該經分離之單株抗體或其抗原結合片段包含分別具有序列SEQ ID NO：32及SEQ ID NO：36之重鏈可變域(VH)及輕鏈可變域(VL)。在其他實施例中，該經分離之單株抗體包含具有序列SEQ ID NO：49及SEQ ID NO：54之重鏈及輕鏈。
本發明亦提供一種醫藥組合物，其包含本文中所描述之抗體或其抗原結合片段或者多肽或者免疫結合物及醫藥學上可接受之載劑。
本發明亦提供一種抑制異常細胞增殖之方法，其包括使表現MET之細胞與本文中所描述之經分離之單株抗體或抗原結合片段或者多肽或者免疫結合物接觸，其中該接觸抑制該等細胞之異常增殖。在某些實施例中，該接觸誘導該等細胞之細胞凋亡。在某些實施例中，該表現MET之細胞為癌細胞。在某 些實施例中，該癌細胞為cMet過度表現-未擴增型。在某些實施例中，該癌細胞為cMet擴增型。
本發明亦提供一種治療患者之細胞增殖病症的方法，其包括向該患者投與治療有效量之本文中所描述之經分離之單株抗體或其抗原結合片段、多肽、免疫結合物或者其醫藥組合物。
本發明亦提供一種本文中所描述之經分離之單株抗體或其抗原結合片段、多肽、免疫結合物或者其醫藥組合物的用途，其係用於治療患者之細胞增殖病症。本發明亦提供一種本文中所描述之經分離之單株抗體或其抗原結合片段、多肽、免疫結合物或者其醫藥組合物的用途，其係用於製造用以治療患者之細胞增殖病症的藥物。
在某些實施例中，該患者已被鑑定具有過度表現-未擴增之cMet。在某些實施例中，該患者已被鑑定具有擴增之cMet。
在某些實施例中，該細胞增殖病症為癌症。在某些實施例中，該癌症為選自由以下各項組成之群的癌症：神經膠質母細胞瘤、胰臟癌、胃癌、***癌、卵巢癌、乳癌、肝細胞癌(HCC)、黑色素瘤、骨肉瘤及結腸直腸癌(CRC)、包括小細胞肺癌(SCLC)及非小細胞肺癌(NSCLC)在內之肺癌、頭頸部鱗狀細胞癌(HNSCC)、腎臟癌、腎癌、食道癌及甲狀腺癌。在某些實施例中，該癌症為Met擴增型NSCLC。
圖1描繪使用與含有不同的抗MET抗體之獲自融合物247之雜交瘤上清液一起培育的MKN45(實心條形)或BxPC3細胞(空心條形)的HGF結合分析之結果。
圖2描繪使用與含有不同的抗MET抗體之獲自融合物248之雜交瘤上清液一起培育的MKN45(實心條形)或BxPC3細胞(空心條形)的HGF結合分 析之結果。
圖3A及圖3B顯示CDR移植hucMET-27構建體之序列比對。
圖4A及圖4B顯示CDR移植hucMET-27構建體中之回復突變的位置。
圖5顯示如藉由FACS測定的hucMET-27抗體與表現人類cMET抗原之NCI-H441細胞的結合。
圖6A、圖6B、圖6C及圖6D顯示huCMET-27抗體及結合物與EBC-1之FACS結合資料。
圖7顯示huCMET-27抗體及結合物在NCI-H441中之pErk刺激。
圖8顯示huCMET-27抗體及結合物在NCI-H441中之pAkt刺激。
圖9顯示huCMET-27抗體及結合物在NCI-H441中之細胞增殖資料。
圖10A、圖10B、圖10C及圖10D顯示cMET抗體藥物結合物在EBC-1及NCI-H441細胞株中之試管內細胞毒性。
圖11A、圖11B、圖11C及圖11D顯示cMET抗體藥物結合物在EBC-1細胞株中在HGF存在下之試管內細胞毒性。
圖12A、圖12B及圖12C顯示cMET抗體藥物結合物在胃細胞株中之試管內細胞毒性。
圖13顯示cMET抗體藥物結合物在HEP3B細胞株中之試管內細胞毒性。
圖14A、圖14B、圖14C及圖14D顯示cMET SMCC-DM1抗體藥物結合物在不同的細胞株中之試管內細胞毒性。
圖15顯示cMET SMCC-DM1抗體藥物結合物之活體內抗腫瘤活性。
圖16顯示hucMETv1.2-sSPDB-DM4(5mg/kg)及hucMETv1.2-DGN549(離胺酸連接；3μg/kg及10μg/kg，以有效負載計)在EBC-1 人類非小細胞肺鱗狀細胞癌異種移植模型中之抗腫瘤活性。
圖17顯示hucMETGv1.3-sSPDB-DM4(5mg/kg)及hucMETGv1.3-S442C-DGN549(3μg/kg及10μg/kg，以有效負載計)在HSC2 HNSCC異種移植模型中之抗腫瘤活性。
圖18顯示hucMETGv1.3-sSPDB-DM4(5mg/kg)及hucMET27Gv1.3-DGN549(3μg/kg及10μg/kg，以有效負載計)在H1975人類非小細胞肺鱗狀細胞癌異種移植模型中之抗腫瘤活性。
圖19顯示不同的cMET參考抗體、huCMET-27抗體及結合物之細胞增殖、pAKT及pERK刺激。
圖20顯示huCMET-27結合物及游離有效負載在不同的過度表現cMET之NSCLC細胞株中的EC50值。
圖21顯示cMET抗體藥物結合物在THLE-2轉型肝細胞中之試管內細胞毒性。
圖22顯示如藉由FACS測定之有及無抗體鉸鏈修飾之hucMET-27抗體及結合物與表現人類cMET抗原之EBC-1細胞的結合。
圖23顯示不同的cMET參考抗體及有及無鉸鏈修飾之huCMET-27抗體的細胞增殖。
圖24顯示不同的cMET參考抗體以及有及無鉸鏈修飾之huCMET-27抗體的pAKT刺激。
圖25顯示不同的cMET參考抗體以及有及無鉸鏈修飾之huCMET-27抗體的pERK刺激。
圖26顯示有及無抗體鉸鏈修飾之cMET抗體藥物結合物在EBC-1及Hs746T細胞株中之試管內細胞毒性。
圖27顯示huCMET-27-DM4結合物及游離有效負載在過度表現 cMET之細胞株及cMET擴增型細胞株中的EC50值。
相關申請案
本申請案根據美國法典第35章第119條(e)款主張2017年1月4日申請之美國臨時申請案第62/442,066號及2017年3月27日申請之美國臨時申請案第62/477,017號的申請日期權益。以上所提及之申請案中之每一者的全部內容係以引用之方式併入本文中。
定義
為了促進理解本發明，以下定義許多術語及片語。
如本文中所使用，術語「MET」或「c-MET」或「cMET」或「MET抗原」或HGFR或HGF受體係指在天然情況下表現或在經HGFR基因轉染之細胞上表現之MET多肽及任何變異體、同功型及物種同系物或其類似物。人類MET亦稱為肝細胞生長因子或HGF受體、分散因子或SF受體，並且為受體酪胺酸激酶家族之成員。此項技術中公認之其他MET同義語包括HGFR、HGFR抗原、MET受體、c-MET、c-MET受體、met原癌基因酪胺酸激酶或原癌基因c-Met、RCCP2或AUTS9。對於人類MET，已發現編碼不同的同功型的兩種轉錄物變異體。轉錄物變異體1表示對應於GenBank ID(GI)42741654之較長轉錄物。其編碼較長同功型(a)且包含由GenBank Protein ID 42741655描述之1408個胺基酸之蛋白質。與變異體1相比，轉錄物變異體2在外顯子末端使用交替同框剪接接合，且對應於GenBank ID(GI)188595715。所得同功型(b)包含由GenBank Protein ID 188595716描述之1390個胺基酸之蛋白質且與同功型(a)相比，具有相同的N末端及C末端但較短。
如本文中所使用，「異常MET受體活化」係指MET表現及/或MET信號傳導失調，包括但不限於c-Met及/或HGF過度表現(例如，在存在或不存在 基因擴增之情況下，例如cMET過度表現-擴增或cMET過度表現-未擴增)、在存在基因擴增(亦即，cMET擴增情形)或不存在基因擴增(cMET未擴增情形)之情況下的c-Met組成性激酶活化、c-Met之活化突變及由HGF所致之c-Met自分泌活化。
舉例而言，「異常MET受體活化」可意謂且包括組織中之MET蛋白的任何增高或改變之表現或過度表現，例如藉由任何手段引起蛋白質之量增加，包括增強表現或轉譯、調節啟動子或蛋白質之調控因子、擴增蛋白質之基因或者增強半衰期或穩定性，使得存在更多蛋白質或看在任何時間加以偵測，與未過度表現狀態相反。異常MET表現包括且涵蓋MET蛋白質表現或轉譯後修飾得以過度表現之任何情形或變化，包括表現改變之MET蛋白質(如在由於序列變化、缺失或***所產生之突變MET蛋白質或變異體中)或改變之摺疊。
在一個實施例中，「異常MET受體活化」可能係指增強MET受體信號傳導活性，從而活化關鍵致癌信號傳導途徑，包括但不限於無線電諮詢機構、PI3激酶、STAT、β-連鎖蛋白、Notch、Src、MAPK及Akt信號傳導途徑。「異常MET受體活化」可能與增強之血管生成及細胞轉移相關。
在其他實施例中，「異常MET受體活化」係指MET受體活化、受體二聚及相關酪胺酸激酶及/或絲胺酸/蘇胺酸激酶活性之活化。
在另一實施例中，當MET受體相關之酪胺酸激酶活性得以活化時，存在「異常MET受體活化」。在一個態樣中，當MET相關之酪胺酸激酶活性可偵測時，MET受體相關之酪胺酸激酶活性得以活化。
如本文中所使用，「抗體」或片段及其類似物包括含有包含免疫球蛋白分子之至少一部分，諸如但不限於重鏈或輕鏈之至少一個互補性決定區(CDR)或其配位體結合部分、重鏈可變區或輕鏈可變區、重鏈或輕鏈恆定區、構架區或其任何部分或者抗原或抗原受體或結合蛋白質之至少一部分的分子的任 何蛋白質或肽，其可併入本發明之抗MET抗體中。此種抗體視情況進一步影響特定配位體，諸如但不限於此種抗體在試管內、原位、活體內及離體內調節、降低、增加、拮抗、促效、部分促效、部分拮抗、緩解、減輕、阻斷、抑制、消除及/或干擾至少一種抗原活性或結合或者抗原受體活性或結合。作為一非限制性實例，揭示多種MET特異性抗體，其中規定部分或變異體可結合至少一個抗原分子或規定部分、變異體或其結構域。適合之抗原特異性抗體、規定部分或變異體亦可視情況影響至少一種活性或功能，諸如但不限於配位體結合、受體二聚、受體磷酸化、受體信號傳導、膜締合、細胞遷移、細胞增殖、受體結合活性、RNA、DNA或蛋白質產生及/或合成。
抗體為異源四聚糖蛋白，由兩個一致輕鏈(LC)及兩個一致重鏈(HC)構成。通常，各輕鏈經由一個共價二硫鍵與重鏈連接，而二硫鍵聯之數目因不同免疫球蛋白同型之重鏈而各異。各重鏈及輕鏈亦具有間隔之鏈內二硫橋。各重鏈在一端具有可變域(VH)，繼之以眾多恆定域。各輕鏈在一端具有可變域(VL)且在其另一端具有恆定域；輕鏈之恆定域與重鏈之第一恆定域對準，且輕鏈可變域與重鏈之可變域對準。任何脊椎動物物種之抗體輕鏈均可基於其恆定域胺基酸序列而分配至兩個明顯不同的類型，亦即κ及λ之一。免疫球蛋白可視重鏈恆定域胺基酸序列而分配至五個主要類別，亦即，IgA、IgD、IgE、IgG及IgM。IgA及IgG進一步細分為同型IgA1、IgA2、IgG1、IgG2、IgG3及IgG4。
術語「抗體」亦包括片段、規定部分及其變異體，包括抗體模擬物或包含模擬抗體或其規定片段或部分之結構及/或功能的抗體部分，包括單鏈抗體及其片段。功能片段包括結合哺乳動物抗原，諸如MET(單獨或與其他抗原組合)之抗原結合片段。舉例而言，本發明涵蓋能夠結合抗原或其部分之抗體片段，包括但不限於Fab(例如，藉由木瓜蛋白酶消化)、Fab'(例如，藉由胃蛋白酶消化及部分還原)及F(ab')2(例如，藉由胃蛋白酶消化)、facb(例如，藉由胞漿素消 化)、pFc'(例如，藉由胃蛋白酶或胞漿素消化)、Fd(例如，藉由胃蛋白酶消化、部分還原及再聚集)、Fv或scFv(例如，藉由分子生物學技術)片段(參見例如Colligan,Immunology)。
此種片段可藉由如此項技術中已知及/或如本文中所描述之酶促裂解、合成或重組技術來產生。亦可使用已在天然終止位點上游引入一或多個終止密碼子之抗體基因來產生呈多種截短形式之抗體。舉例而言，可設計編碼F(ab')2重鏈部分之組合基因包括編碼重鏈CH1結構域及/或鉸鏈區之DNA序列。抗體的不同部分化學可藉由習知技術接合在一起，或可使用基因工程改造技術製備為連續蛋白質。
術語「抗體片段」係指完整抗體之一部分，一般為完整抗體之抗原結合區或可變區。抗體片段之實例尤其包括但不限於Fab、Fab'、F(ab')2、單鏈(scFv)及Fv片段、雙功能抗體、線性抗體、單鏈抗體分子、單一Fab臂「單臂」抗體及由抗體片段形成之多特異性抗體。
抗體片段包括含有包含免疫球蛋白分子之至少一部分，諸如但不限於重鏈或輕鏈之至少一個互補性決定區(CDR)或其配位體結合部分、重鏈或輕鏈可變區、重鏈或輕鏈恆定區、構架區或其任何部分，或者抗原或抗原受體或結合蛋白質之至少一部分的分子的任何蛋白質或肽，其可併入本發明之抗MET抗體中。
術語「可變」係指可變域之某些部分的序列在抗體間廣泛不同，且用於各特定抗體對其特定抗原之結合及特異性。然而，可變性並非均勻分佈在抗體之可變域中。其集中於輕鏈及重鏈可變域兩者中稱為互補性決定區(CDR)或高變區之三個區段中。可變域中更高度保守之部分稱為構架區(FR)。天然重鏈及輕鏈之可變域各包含主要採用β片構形之四個FR區，由三個CDR連接，由此形成連接β片結構且在一些情況下形成β片結構之一部分的環。各鏈中之CDR 由FR區維持緊密鄰近，且與來自於另一鏈之CDR一起促成抗體抗原結合位點之形成。恆定域不直接參與抗體與抗原之結合，而是展現不同的效應功能，諸如抗體參與抗體依賴性細胞毒性。存在至少兩種用於測定CDR之技術：(1)基於跨物種序列可變性之方法(亦即，Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，(第5版，1991,National Institutes of Health,Bethesda Md.))；及(2)基於抗原抗體複合物之結晶學研究的方法(Al-lazikani等人，(1997)J.Molec.Biol.273：927-948))。另外，此項技術中有時使用此兩種方法之組合來測定CDR。
當提及可變域(約輕鏈中之殘基1至107及重鏈中之殘基1至113)中之殘基時一般使用Kabat編號系統(例如Kabat等人，Sequences of Immunological Interest.第5版.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991))。
如Kabat中之胺基酸位置編號係指用於如Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991)中之抗體編集之重鏈可變域或輕鏈可變域的編號系統。使用此編號系統，實際線性胺基酸序列可對應於可變域FR或CDR之縮短或***而含有更少或額外胺基酸。舉例而言，重鏈可變域可包括處於H2殘基52之後的單胺基酸***(殘基52a，根據Kabat)及處於重鏈FR殘基82之後的諸多***殘基(例如，殘基82a、82b及82c等，根據Kabat)。對於指定抗體，殘基之Kabat編號可藉由在抗體序列之同源性區域上與「標準」Kabat編號序列進行比對來確定。而Chothia係指結構環之位置(Chothia及Lesk,J.Mol.Biol.196：901-917(1987))。當使用Kabat編號慣例進行編號時，Chothia CDR-H1環之末端視環長度而在H32與H34之間變化(此係因為Kabat編號方案將***置於H35A及H35B處，若35A或35B皆不存在，則環終止於32；若僅存在35A， 則環終止於33；若35A及35B兩者皆存在，則環終止於34)。AbM高變區表示Kabat CDR與Chothia結構環之間的折中，且由Oxford Molecular之AbM抗體建模軟體使用。
術語「抗原決定基」係指能夠特異性結合抗體之蛋白質決定子。抗原決定基通常由諸如胺基酸或糖側鏈之化學活性表面分子群組組成，且通常具有特定三維結構特徵以及特定電荷特徵。當抗原為多肽時，抗原決定基可由連續胺基酸及藉由蛋白質之三級摺疊而毗鄰之非連續胺基酸形成。由連續胺基酸形成之抗原決定基在蛋白質變性後通常得以保留，而由三級摺疊形成之抗原決定基在蛋白質變性後通常喪失。在獨特空間構形下，抗原決定基通常包括至少3個且更通常至少5或8至10個胺基酸。
「阻斷」抗體為抑制或降低其所結合之抗原，諸如MET之生物活性的抗體。較佳阻斷抗體實質上或完全抑制抗原之生物活性。理想地，使生物活性降低10%、20%、30%、50%、70%、80%、90%、95%或甚至100%。在一個實施例中，阻斷抗體使MET相關酪胺酸激酶活性降低10%、20%、30%、50%、70%、80%、90%、95%或甚至100%。
「分離」之抗體為自其天然環境中分離及/或回收之抗體。其天然環境之污染組分為會干擾該抗體之診斷或治療用途的物質，且可包括酶、激素及其他蛋白質或非蛋白質類溶質。在較佳態樣中，將抗體純化至(1)如藉由例如羅 氏方法(Lowry method)所測定，存在超過95重量%且最佳超過99重量%之抗體；(2)足以藉由使用旋杯式定序儀獲得N末端或內部胺基酸序列之至少15個殘基的程度；或(3)在還原或非還原條件下使用考馬斯藍(Coomassie blue)或較佳銀染色藉由十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)確定達到均質。經分離之抗體包括重組細胞內之原位MET抗體，此係因為該抗體之天然環境之至少一種組分將不存在。然而，一般將藉由至少一個純化步驟來製備經分離之抗體。
「人類抗體」係指由人類產生之抗體或使用此項技術中已知的任何技術製造的具有對應於由人類產生之抗體的胺基酸序列的抗體。人類抗體之此定義包括完整或全長抗體、其片段，及/或包含至少一個人類重鏈及/或輕鏈多肽之抗體，諸如例如包含鼠類輕鏈及人類重鏈多肽之抗體。
如本文中所使用，術語「嵌合抗體」係指免疫球蛋白分子之胺基酸序列來源於兩個或更多個物種之抗體。通常，輕鏈及重鏈兩者之可變區對應於來源於一個哺乳動物物種(例如，小鼠、大鼠、兔等)且具有所要特異性、親和力及容量之抗體的可變區，而恆定區與來源於另一物種(通常人類)之抗體中的序列同源，以避免在該物種中引發免疫反應。
如本文中所使用，術語「人類化抗體」係指非人類(例如鼠類)抗體之形式，其為含有最小非人類(例如鼠類)序列之特定免疫球蛋白鏈、嵌合免疫球蛋白或其片段。通常，人類化抗體為人類免疫球蛋白，其中來自互補決定區(CDR)之殘基經來自非人類物種(例如小鼠、大鼠、兔、倉鼠)之CDR中具有所要特異性、親和力及容量之殘基置換(Jones等人，1986,Nature,321：522-525；Riechmann等人，1988,Nature,332：323-327；Verhoeyen等人，1988,Science,239：1534-1536)。在一些情況下，人類免疫球蛋白之Fv構架區(FR)殘基經來自非人類物種之抗體中具有所要特異性、親和力及容量的相應殘基置換。人類化抗體可藉由取代Fv構架區中及/或經置換之非人類殘基內之其他殘基來進行進一步修飾，以改進並 優化抗體特異性、親和力及/或容量。一般而言，人類化抗體將包含實質上所有至少一個且通常兩或三個含有所有或實質上所有對應於非人類免疫球蛋白之CDR區的可變域，而所有或實質上所有FR區為人類免疫球蛋白一致序列之FR區。人類化抗體亦可包含免疫球蛋白恆定區或域(Fc)，通常人類免疫球蛋白恆定區或域之至少一部分。用於產生人類化抗體之方法的實例描述於以下文獻中：美國專利5,225,539。
如本文中所使用，術語「工程改造之抗體」或「改變之抗體」包括具有顯著人類構架區及恆定區(CL結構域、CH結構域(例如，CH1、CH2、CH3)及鉸鏈)及來源於諸如抗MET抗體或其片段之抗原結合抗體的CDR的抗體。完全人類構架包含對應於人類生殖系序列以及具有體細胞突變之序列的構架。CDR可來源於在任何抗體構架之情形下或之外與抗原締合或結合之一或多個CDR。舉例而言，本發明之針對MET之人類工程改造之抗體的CDR可來源於在小鼠抗體構架之情形下結合抗原，隨後經工程改造以便在人類構架之情形下結合抗原的CDR。通常，人類工程改造之抗體在人類中實質上無免疫原性。
類似地，命名為靈長類(猴、狒狒、黑猩猩等)、囓齒動物(小鼠、大鼠、兔、豚鼠、倉鼠及其類似囓齒動物)及其他哺乳動物之抗體表示此種物種、亞屬、屬、亞家族及家族特異性抗體。此外，嵌合抗體可包括以上抗體之任何組合。相對於未經修飾之抗體，此種變化或變異視情況且較佳在人類或其他物種中保留或降低免疫原性。人類工程改造之抗體不同於嵌合抗體或人類化抗體。
工程改造之抗體可由能夠表現功能重排之人類免疫球蛋白或人類工程改造之免疫球蛋白(例如，重鏈及/或輕鏈)基因的非人類動物或原核生物或真核生物細胞產生。此外，當工程改造之抗體為單鏈抗體時，其可包含在天然人類或非人類抗體中未發現之連接子肽。舉例而言，Fv可包含連接子肽，諸如2至約8個甘胺酸或其他胺基酸殘基，其連接重鏈可變區與輕鏈可變區。此種連 接子肽被視為具有人類起源。
亦可使用雙特異性抗體、異特異性抗體、異源結合抗體或類似抗體，其為對至少兩個不同的抗原，諸如MET及非MET抗原具有結合特異性之單株抗體，較佳為人類、人類工程改造、表面重整或人類化之抗體。在當前情況下，結合特異性之一係針對至少一種抗原蛋白，而另一種係針對另一抗原蛋白。用於製造雙特異性抗體之方法在此項技術中為已知的。按傳統，雙特異性抗體之重組產生係基於共同表現兩個免疫球蛋白重鏈-輕鏈配對，其中該兩個重鏈具有不同的特異性(Milstein及Cuello,Nature 305：537(1983))。由於免疫球蛋白重鏈及輕鏈之隨機分配分組，此等雜交瘤(四價瘤)產生約10個不同的抗體分子的潛在混合物，其中僅一個抗體分子具有正確雙特異性結構。通常藉由親和層析步驟或如本文中另外描述來進行正確分子之純化。類似程序揭示於例如以下文獻中：WO 93/08829、美國專利第6,210,668號、第6,193,967號、第6,132,992號、第6,106,833號、第6,060,285號、第6,037,453號、第6,010,902號、第5,989,530號、第5,959,084號、第5,959,083號、第5,932,448號、第5,833,985號、第5,821,333號、第5,807,706號、第5,643,759號、第5,601,819號、第5,582,996號、第5,496,549號、第4,676,980號、WO 91/00360、WO 92/00373、EP 03089；Traunecker等人，EMBO J.10：3655(1991)；Suresh等人，Methods in Enzymology 121：210(1986)；U.S.20090258026、U.S.20060140946及U.S.20070298040，各文獻以引用之方式整體併入本文中。
抗體「效應功能」係指可歸因於抗體Fc區(天然序列Fc區或胺基酸序列變異Fc區)且隨抗體同型而變化之彼等生物活性。抗體效應功能之實例包括：C1q結合及補體依賴性細胞毒性(CDC)；Fc受體結合；抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)；及抗體依賴性細胞介導之吞噬作用(ADCP)。
「人類效應細胞」為表現一或多種FcR且執行效應功能之白血球。 在某些態樣中，該等細胞至少表現FcyRIII且執行ADCC或ADCP效應功能。介導ADCC或ADCP之人類白血球之實例包括外周血單核細胞(PBMC)、天然殺手(NK)細胞、單核細胞、細胞毒性T細胞及嗜中性球。該等效應細胞可自天然來源，例如自血液分離。
如本文中所使用之術語「結合物」、「免疫結合物」或「ADC」係指連接至細胞結合劑(亦即，抗MET抗體或其片段)之化合物或其衍生物且由以下通式定義：C-L-A，其中C=化合物，L=連接子，且A=細胞結合劑(CBA)(例如抗MET抗體或片段)。在一些實施例中，亦可以相同方式使用以下通式：D-L-A，其中D=藥物，L=連接子且A=細胞結合劑(例如抗MET抗體或片段)。
連接子為能夠以穩定共價方式將化合物(通常為藥物，諸如類美登素或吲哚啉并苯并二氮呯化合物)連接至諸如抗MET抗體或其片段之細胞結合劑的任何化學部分。連接子可在化合物或抗體保持活性之條件下對酸誘導之裂解、光誘導之裂解、肽酶誘導之裂解、酯酶誘導之裂解及二硫鍵裂解敏感或具有實質性抗性。適合之連接子在此項技術中為熟知的且包括例如二硫基、硫醚基、酸不穩定基團、光不穩定基團、肽酶不穩定基團及酯酶不穩定基團。連接子亦包括如本文中所描述且如此項技術中已知的帶電連接子及其親水性形式。
除非另外指示，否則如本文中所使用之「異常細胞生長」或「異常細胞增殖」係指不依賴正常調控機制(例如，喪失接觸抑制)之細胞生長。此包括例如以下項之異常生長：(1)藉由表現突變之酪胺酸激酶或過度表現受體酪胺酸激酶而增殖之腫瘤細胞(腫瘤)；(2)發生異常酪胺酸激酶活化之其他增殖性疾病之良性及惡性細胞；(3)藉由受體酪胺酸激酶而增殖之任何腫瘤；(4)藉由異常絲胺酸/蘇胺酸激酶活化而增殖之任何腫瘤；(5)發生異常絲胺酸/蘇胺酸激酶活化之其他增殖性疾病之良性及惡性細胞；以及(6)其他增殖性疾病之良性及惡性細胞。
術語「癌症」及「癌性」係指或描述哺乳動物中通常以不受調節之 細胞生長為特徵的生理狀況。「腫瘤」包含一或多個癌性細胞。癌症之實例包括但不限於癌瘤、母細胞瘤、肉瘤、骨髓瘤、白血病或淋巴樣惡性病。如本文中所定義之術語「癌症」或「癌性」包括若不加治療則可能演化成癌性病狀之「癌前」病狀。
術語「癌細胞」、「腫瘤細胞」及語法等效物係指來源於腫瘤或癌前病變之細胞的總群體，包括構成腫瘤細胞群體之大部分的非腫瘤生成細胞及腫瘤生成幹細胞(癌症幹細胞)。
如本文中所使用，術語「細胞毒性劑」係指抑制或阻止一或多種細胞功能及/或造成細胞死亡之物質。
如本文中所使用，術語「治療」係指試圖改變所治療之個體或細胞之天然過程的臨床干預，且可為了預防或在臨床病理學過程中進行。治療之理想效果包括預防疾病發生或復發、減輕症狀、減輕疾病之任何直接或間接病理學後果、預防轉移、降低疾病進展速率、改善或減輕疾病狀態及緩解或改良之預後。在一些實施例中，本發明之方法及組合物適用於試圖延遲疾病或病症之發展。
「治療有效量」係指在達成所要治療結果所必需之劑量及時段下有效的量。治療劑(例如，結合物或免疫結合物)之「治療有效量」可根據諸多因素變化，諸如個體疾病狀態、年齡、性別及體重，以及抗體在個體中引發所要反應之能力。治療有效量亦為治療劑之治療有益效應勝過任何毒性或不利效應的量。
除非另外指示，否則如本文中所使用之術語「肝細胞生長因子」或「HGF」係指能夠在允許發生HGF/c-met信號傳導途徑活化之條件下活化HGF/c-met信號傳導途徑的任何天然或變異(無論是天然的或是合成的)HGF多肽。
「治療劑」涵蓋生物製劑，諸如抗體、肽、蛋白質、酶、化學治療劑，或者結合物或免疫結合物。
如本文中可互換使用之「多肽」或「核酸」係指任何長度之核苷酸之聚合物且包括DNA及RNA。核苷酸可為去氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、經修飾核苷酸或鹼基及/或其類似物，或可由DNA或RNA聚合酶併入聚合物中之任何受質。聚核苷酸可包含經修飾之核苷酸，諸如甲基化核苷酸及其類似物。若存在，則可在組裝聚合物前後賦予核苷酸結構以修飾。核苷酸序列可間雜非核苷酸組分。聚核苷酸可在聚合後經進一步修飾，諸如藉由與標記組分結合。其他類型之修飾包括例如「蓋帽」；用類似物取代一或多個天然存在之核苷酸；核苷酸間修飾，諸如，例如具有不帶電鍵聯(例如膦酸甲酯、膦酸三酯、胺基膦酸酯、胺基甲酸酯等)之核苷酸間修飾及具有帶電鍵聯(例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)之核苷酸間修飾；含有懸垂部分諸如例如蛋白質(例如核酸酶、毒素、抗體、信號肽、聚-L-離胺酸等)之核苷酸間修飾、具有***劑(例如吖啶、補骨脂內酯等)之核苷酸間修飾、含有螯合劑(例如金屬、放射性金屬、硼、氧化性金屬等)之核苷酸間修飾、含有烷基化劑之核苷酸間修飾、具有經修飾鍵聯(例如α變旋異構核酸等)之核苷酸間修飾以及聚核苷酸之未修飾形式。此外，一般存在於糖中之任何羥基均可置換為例如膦酸酯基、磷酸酯基、藉由標準保護基加以保護，或活化以製備與額外核苷酸之額外鍵聯，或可與固體載體結合。5'及3'末端OH可經磷酸化或經1至20個碳原子之胺或有機封端基團部分取代。其他羥基亦可衍生化至標準保護基。聚核苷酸亦可含有此項技術中一般已知的核糖或去氧核糖的類似形式，包括例如2'-O-甲基-、2'-O-烯丙基、2'-氟-核糖或2'-疊氮基-核糖、碳環狀糖類似物、α-變旋異構糖、諸如***糖、木糖或來蘇糖之差向異構糖、哌喃糖、呋喃糖、景天糖、非環狀類似物及無鹼基核苷類似物，諸如甲基核糖核苷。一或多個磷酸二酯鍵聯可替換為替代連接基團。此等替代 連接基團包括但不限於其中磷酸根置換為P(O)S(「硫代磷醯根」)、P(S)S(「二硫代磷醯根」)、(O)NR2(「醯胺根」)、P(O)R、P(O)OR'、CO或CH2(「甲乙縮醛」)之實施例，其中各R或R’獨立地為H或者視情況含有醚(--O--)鍵聯之經取代或未經取代之烷基(1-20 C)、芳基、烯基、環烷基、環烯基或芳烷基。並非聚核苷酸中之所有鍵聯均需要一致。先前描述適用於本文中所提及之所有聚核苷酸，包括RNA及DNA。
術語「載體」意謂構建體，其能夠在宿主細胞中遞送並視情況表現一或多個相關基因或序列。載體之實例包括但不限於病毒載體、裸DNA或RNA表現載體、質體、黏質體或噬菌體載體、與陽離子凝聚劑締合之DNA或RNA表現載體、囊封於脂質體中之DNA或RNA表現載體及某些真核細胞，諸如生產細胞。
術語「多肽」、「肽」及「蛋白質」在本文中可互換用於指任何長度之胺基酸之聚合物。該聚合物可為線性或分支的，其可包含經修飾之胺基酸，且其可間雜非胺基酸。該等術語亦涵蓋經天然或藉由干預加以修飾之胺基酸聚合物；例如二硫鍵形成、糖基化、脂質化、乙醯化、磷酸化或任何其他處理或修飾，諸如與標記組分結合。該定義內亦包括例如含有一或多種胺基酸類似物(包括例如非天然胺基酸等)以及此項技術中已知的其他修飾的多肽。應理解，由於本發明之多肽係基於抗體，故在某些實施例中，該等多肽可呈單鏈或締合鏈形式存在。在一些實施例中，多肽、肽或蛋白質為非天然存在的。在一些實施例中，多肽、肽或蛋白質為自其他天然存在之組分中純化而來。在該些實施例中，多肽、肽或蛋白質為重組產生的。
如此項技術中已知的，術語「一致」或「一致性」百分比為兩個聚核苷酸或兩個多肽之間的關係的量度，如藉由比較其序列所確定。就序列而言之一致性或相似性在本文中定義為在將序列對準且必要時引入間隙以達成最大 序列一致性百分比之後候選序列中與抗MET抗體殘基一致(亦即，相同的殘基)或相似(亦即，基於普通側鏈性質來自同一組之胺基酸殘基，參見下文)之胺基酸殘基的百分比。N末端、C末端或內部延伸、缺失或***可變域外之抗體序列中均不應被視為影響序列一致性或相似性。一般將所比較之兩個序列對準以得到序列之間的最大相關性。檢查該兩個序列之對準，並且將所測定之該兩個序列之間獲得完全胺基酸或核苷酸對應性的位置數除以比對之總長度並乘以100來獲得一致性%數值。此一致性%數值可相對於所比較之序列之整個長度來確定，此情形尤其適用於具有相同或非常相似之長度且高度同源之序列；或相對於較短定義長度來確定，此情形更適合於具有不相等之長度或具有較低同源性水準之序列。同樣，可基於一致及相似殘基之存在而以類似方式確定相似性百分比。
一致性百分比可使用序列比較軟體或算法或藉由肉眼觀察來量測。此項技術中已知各種算法及軟體可用於獲得胺基酸或核苷酸序列之比對。序列比對算法之一個此種非限制性實例為Karlin等人，1990,Proc.Natl.Acad.Sci.,87：2264-2268中所描述、如Karlin等人，1993,Proc.Natl.Acad.Sci.,90：5873-5877中加以改進且併入NBLAST及XBLAST程式(Altschul等人，Nucleic Acids Res.25：3389-3402,1991)中之算法。在某些實施例中，可使用如Altschul等人，1997,Nucleic Acids Res.25：3389-3402中所描述之Gapped BLAST；BLAST-2、WU-BLAST-2(Altschul等人，1996,Methods in Enzymology,266：460-480)、ALIGN、ALIGN-2(Genentech，South San Francisco，California)或Megalign(DNASTAR)為可用於比對序列之其他公開可利用軟體程式。在某些實施例中，使用GCG軟體中之GAP程式測定兩個核苷酸序列之間的一致性百分比(例如，使用NWSgapdna.CMP矩陣以及40、50、60、70或90之間隙權重及1、2、3、4、5或6之長度權重)。在某些替代實施例中，併入有Needleman及Wunsch(J.Mol.Biol.(48)：444-453(1970))之算法的GCG套裝軟體中之GAP程序可用於測定兩個 胺基酸序列之間的一致性百分比(例如，使用Blossum 62矩陣或PAM250矩陣，以及16、14、12、10、8、6或4之間隙權重及1、2、3、4、5之長度權重)。或者，在某些實施例中，使用Myers及Miller(CABIOS,4：11-17(1989))之算法測定核苷酸或胺基酸序列之間的一致性百分比。舉例而言，可使用ALIGN程式(第2.0版)且使用具有殘基表之PAM120、間隙長度罰分12及間隙罰分4來測定一致性百分比。適用於藉由特定比對軟體進行最大程度對準之參數可由熟習此項技術者確定。在某些實施例中，使用比對軟體之缺省參數。在某些實施例中，第一胺基酸序列與第二序列胺基酸之一致性百分比「X」計算為100×(Y/Z)，其中Y為比對第一序列與第二序列時評分為一致匹配之胺基酸殘基數(如藉由肉眼觀察或特定序列比對程式所比對)且Z為第二序列中之殘基總數。若第一序列之長度比第二序列長，則第一序列與第二序列之一致性百分比將大於第二序列與第一序列之一致性百分比。
作為一非限制性實例，在某些實施例中，任何特定聚核苷酸是否與參考序列具有某一百分比序列一致性(例如，至少80%一致、至少85%一致、至少90%一致及在一些實施例中至少95%、96%、97%、98%或99%一致)可使用Bestfit程式(Wisconsin Sequence Analysis Package，用於Unix之第8版，Genetics Computer Group，University Research Park，575 Science Drive，Madison，WI 53711)來測定。Bestfit使用Smith及Waterman,Advances in Applied Mathematics 2：482 489(1981)之局部同源性算法來發現兩個序列之間的最佳同源性節段。當根據本發明使用Bestfit或任何其他序列比對程式來確定特定序列與參考序列是否例如具有95%一致性時，設定參數以便在參考核苷酸序列之全長上計算一致性百分比且允許佔參考序列中核苷總酸數至多5%的同源性間隙。
在一些實施例中，當比較並對準以達成最大對應性時，如使用序列比較算法或藉由肉眼觀察所量測，本發明之兩個核酸或多肽「實質上一致」， 意謂其具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%且在一些實施例中至少95%、96%、97%、98%、99%核苷酸或胺基酸殘基一致性。可在至少約10、約20、約40-60個殘基長度或介於其之間的任何整值之序列區域上存在一致性，或可在比60-80個殘基長、例如至少約90-100個殘基之區域上存在一致性，且在一些實施例中，序列在所比較之序列的全長，舉例而言，諸如核苷酸序列之編碼區上實質上一致。
「保守胺基酸取代」為一個胺基酸殘基置換為具有類似側鏈之另一胺基酸殘基的取代。此項技術中已限定具有類似側鏈之胺基酸殘基家族，包括例如鹼性側鏈(例如離胺酸、精胺酸、組胺酸)、酸性側鏈(例如天冬胺酸、麩胺酸)、不帶電極性側鏈(例如甘胺酸、天冬醯胺酸、麩醯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、半胱胺酸)、非極性側鏈(例如丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、***酸、甲硫胺酸、色胺酸)、β分枝側鏈(例如蘇胺酸、纈胺酸、異白胺酸)及芳族側鏈(例如酪胺酸、***酸、色胺酸、組胺酸)。舉例而言，***酸取代酪胺酸為保守取代。在一些實施例中，本發明多肽及抗體序列中之保守取代不消除含有該胺基酸序列之多肽或抗體與該多肽或抗體所結合之抗原的結合。鑑別不消除抗原結合之核苷酸及胺基酸保守取代之方法在此項技術中為熟知的(參見例如Brummell等人，Biochem.32：1180-1187(1993)；Kobayashi等人，Protein Eng.12(10)：879-884(1999)；及Burks等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94：.412-417(1997))。
如本文中所使用，「BxPC3腫瘤細胞」係指人類胰臟腫瘤細胞株(ATCC編號：CRL-1687；Tan MH等人，Characterization of a new primary human pancreatic tumor line.Cancer Invest.4：15-23,1986)。
如本文中所使用，「MKN45腫瘤細胞」係指人類胃腺癌細胞株(DSMZ編號：ACC 409；Naito等人，Virchows Arch B Cell Pathol Incl Mol Pathol 46： 145-154(1984)；Motoyama等人，Acta Pathol Jpn 36：65-83(1986)；Rege-Cambrin等人，Cancer Genet Cytogenet 64：170-173(1992)；DSMZ：德國微生物菌種保存中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH；German Collection of Microorganisms and Cell Cultures))。
如本文中所使用之「烷基」係指具有1至20個碳原子之飽和直鏈或分支鏈單價烴基。烷基之實例包括但不限於甲基、乙基、1-丙基、2-丙基、1-丁基、2-甲基-1-丙基、-CH2CH(CH3)2)、2-丁基、2-甲基-2-丙基、1-戊基、2-戊基、3-戊基、2-甲基-2-丁基、3-甲基-2-丁基、3-甲基-1-丁基、2-甲基-1-丁基、1-己基)、2-己基、3-己基、2-甲基-2-戊基、3-甲基-2-戊基、4-甲基-2-戊基、3-甲基-3-戊基、2-甲基-3-戊基、2,3-二甲基-2-丁基、3,3-二甲基-2-丁基、1-庚基、1-辛基及其類似基團。烷基較佳具有1至10個碳原子。烷基更佳具有1至4個碳原子。
基團中之碳原子數在本文中可藉由字首「Cx-xx」來指定，其中x及xx為整數。舉例而言，「C1-4烷基」為具有1至4個碳原子之烷基。
術語「化合物」或「細胞毒性化合物」或「細胞毒性劑」可互換使用。其意欲包括其結構或化學式或任何衍生物已揭示於本發明中或者其結構或化學式或任何衍生物已以引用之方式併入的化合物。該術語亦包括具有本發明中所揭示之所有化學式的化合物的立體異構體、幾何異構體、互變異構體、溶劑合物、代謝物及鹽(例如醫藥學上可接受之鹽)。該術語亦包括上述任一者之任何溶劑合物、水合物及多晶型物。本申請案中所描述之某些本發明態樣中之「立體異構體」、「幾何異構體」、「互變異構體」、「溶劑合物」、「代謝物」、「鹽」、「結合物」、「結合物鹽」、「溶劑合物」、「水合物」或「多晶型物」之特定敍述不應解釋為其他本發明態樣中在未敍述此等其他形式之情況下使用術語「化合物」時意欲省略此等形式。
術語「對掌性」係指具有鏡像搭配物之不可疊加性的分子，而術語 「非對掌性」係指可疊加於其鏡像搭配物上之分子。
術語「立體異構體」係指具有一致化學組成及連接性但其原子在空間中之取向不同，從而不能藉由繞單一鍵旋轉來相互轉化的化合物。
「非對映異構體」係指具有兩個或更多個對掌性中心且其分子彼此不為鏡像的立體異構體。非對映異構體具有不同的物理性質，例如熔點、沸點、光譜性質及反應性。非對映異構體之混合物可在諸如結晶、電泳及層析之高解析度分析程序下分離。
「對映異構體」係指彼此為不可疊加之鏡像的兩種化合物立體異構體。
本文中所使用之立體化學定義及規定大體上遵循S.P.Parker編，McGraw-Hill,Dictionary of Chemical Terms(1984)McGraw-Hill Book Company,New York；以及Eliel,E.及Wilen,S.,Stereochemistry of Organic Compounds,John Wiley & Sons,Inc.,New York,1994。本發明化合物可含有不對稱或對掌性中心，且因此以不同的立體異構形式存在。意欲本發明化合物之所有立體異構形式，包括但不限於非對映異構體、對映異構體及阻轉異構體以及其混合物，諸如外消旋混合物，形成本發明之一部分。許多有機化合物以光學活性形式存在，亦即其能夠使平面偏振光之平面旋轉。在描述光學活性化合物時，字首D及L或R及S用於表示分子關於其對掌性中心之絕對構型。字首d及l或(+)及(-)用於指定由化合物所致之平面偏振光旋轉標識，其中(-)或l意謂該化合物左旋。以(+)或d為字首之化合物右旋。對於指定化學結構，此等立體異構體為相同的，但其彼此為鏡像。特定立體異構體亦可稱為對映異構體，且此類異構體之混合物通常稱為對映異構混合物。對映異構體之50：50混合物稱為外消旋混合物或外消旋物，其可在化學反應或過程中無立體選擇或立體特異性之情況下存在。術語「外消旋混合物」及「外消旋物」係指缺乏光學活性之兩種對映異構種類的等 莫耳混合物。
術語「互變異構體」或「互變異構形式」係指具有不同能量之結構異構體，其可經由低能量屏障相互轉化。舉例而言，質子互變異構體(亦稱為質子移變互變異構體)包括經由質子遷移而相互轉化，諸如酮-烯醇及亞胺-烯胺異構化。原子價互變異構體包括藉由一些鍵結電子之重組而相互轉化。
術語「亞胺反應性試劑」係指能夠與亞胺基團反應之試劑。亞胺反應性試劑之實例包括但不限於亞硫酸鹽(H2SO3、H2SO2或者HSO3 -、SO3 2-或HSO2 -與陽離子形成之鹽)、偏亞硫酸氫鹽(H2S2O5或S2O5 2-與陽離子形成之鹽)、單硫代磷酸鹽、二硫代磷酸鹽、三硫代磷酸鹽及四硫代磷酸鹽(PO3SH3、PO2S2H3、POS3H3、PS4H3或者PO3S3-、PO2S2 3-、POS3 3-或PS4 3-與陽離子形成之鹽)、硫代磷酸酯((RiO)2PS(ORi)、RiSH、RiSOH、RiSO2H、RiSO3H)、各種胺(羥基胺(例如NH2OH)、肼(例如NH2NH2)、NH2O-Ri、Ri'NH-Ri、NH2-Ri)、NH2-CO-NH2、NH2-C(=S)-NH2’、硫代硫酸鹽(H2S2O3或S2O3 2-與陽離子形成之鹽)、二亞硫酸鹽(H2S2O4或S2O4 2-與陽離子形成之鹽)、二硫代磷酸鹽(P(=S)(ORk)(SH)(OH)或其與陽離子形成之鹽)、異羥肟酸(RkC(=O)NHOH或與陽離子形成之鹽)、醯肼(RkCONHNH2)、甲醛次硫酸鹽(HOCH2SO2H或HOCH2SO2 -與陽離子形成之鹽，諸如HOCH2SO2 -Na+)、糖基化核苷酸(諸如GDP-甘露糖)、氟達拉濱(fludarabine)或其混合物，其中Ri及Ri'各自獨立地為具有1至10個碳原子之直鏈或分支鏈烷基且經至少一個選自-N(Rj)2、-CO2H、-SO3H及-PO3H之取代基取代；Ri及Ri'可進一步視情況經本文中所描述之用於烷基之取代基取代；Rj為具有1至6個碳原子之直鏈或分支鏈烷基；且Rk為具有1至10個碳原子之直鏈、分支鏈或環狀烷基、烯基或炔基、芳基、雜環基或雜芳基(Rk較佳為具有1至4個碳原子之直鏈或分支鏈烷基；Rk更佳為甲基、乙基或丙基)。陽離子較佳為單價陽離子，諸如Na+或K+。亞胺反應性試劑較佳係選自亞硫酸鹽、羥基胺、脲及肼。亞胺反 應性試劑更佳為NaHSO3或KHSO3。
術語「陽離子」係指具有正電荷之離子。陽離子可為單價(例如Na+、K+、NH4+等)、二價(例如Ca2+、Mg2+等)或多價(例如Al3+等)。陽離子較佳為單價。
如本文中所使用之片語「醫藥學上可接受之鹽」係指本發明化合物之醫藥學上可接受之有機或無機鹽。例示性鹽包括但不限於硫酸鹽、檸檬酸鹽、乙酸鹽、草酸鹽、氯化物、溴化物、碘化物、硝酸鹽、硫酸氫鹽、磷酸鹽、酸式磷酸鹽、異菸鹼酸鹽、乳酸鹽、水楊酸鹽、酸式檸檬酸鹽、酒石酸鹽、油酸鹽、丹寧酸鹽、泛酸鹽、酒石酸氫鹽、抗壞血酸鹽、琥珀酸鹽、馬來酸鹽、龍膽酸鹽、富馬酸鹽、葡糖酸鹽、葡糖醛酸鹽、糖酸鹽、甲酸鹽、苯甲酸鹽、麩胺酸鹽、甲烷磺酸鹽「甲磺酸鹽」、乙烷磺酸鹽、苯磺酸鹽、對甲苯磺酸鹽及雙羥萘酸鹽(亦即，1,1'-亞甲基-雙-(2-羥基-3-萘甲酸鹽))鹽、鹼金屬(例如鈉及鉀)鹽、鹼土金屬(例如鎂)鹽及銨鹽。醫藥學上可接受之鹽可涉及包括另一分子，諸如乙酸根離子、琥珀酸根離子或其他相對離子。相對離子可為使母體化合物上之電荷穩定的任何有機或無機部分。此外，醫藥學上可接受之鹽可在其結構中具有多於一個帶電原子。多個帶電原子為醫藥學上可接受之鹽的一部分的情形下可具有多個相對離子。因此，醫藥學上可接受之鹽可具有一或多個帶電原子及/或一或多個相對離子。
若本發明化合物為鹼，則所要醫藥學上可接受之鹽可藉由本領域中可利用之任何適合方法來製備，例如用以下各物處理游離鹼：無機酸，諸如鹽酸、氫溴酸、硫酸、硝酸、甲磺酸、磷酸及其類似酸；或有機酸，諸如乙酸、馬來酸、琥珀酸、杏仁酸、富馬酸、丙二酸、丙酮酸、草酸、乙醇酸、水楊酸、哌喃糖基酸(諸如葡糖醛酸或半乳糖醛酸)、α醇酸(諸如檸檬酸或酒石酸)、胺基酸(諸如天冬胺酸或麩胺酸)、芳族酸(諸如苯甲酸或肉桂酸)、磺酸(諸如對甲苯磺 酸或乙磺酸)或其類似物。
適合鹽之說明性實例包括但不限於來源於諸如甘胺酸及精胺酸之胺基酸、氨、一級胺、二級胺及三級胺以及諸如哌啶、嗎啉及哌嗪之環胺的有機鹽，及來源於鈉、鈣、鉀、鎂、錳、鐵、銅、鋅、鋁及鋰之無機鹽。
如本文中所使用，術語「溶劑合物」意謂進一步包括藉由非共價分子間力結合之化學計算量或非化學計算量之諸如水、異丙醇、丙酮、乙醇、甲醇、DMSO、乙酸乙酯、乙酸及乙醇胺二氯甲烷、2-丙醇或其類似物之溶劑的化合物。藉由向化合物中添加至少一莫耳當量之諸如甲醇、乙醇、1-丙醇、2-丙醇或水之羥基溶劑以溶解或水合該亞胺部分而容易地製備化合物之溶劑合物或水合物。
「代謝物」或「分解代謝物」為藉由在體內代謝或分解代謝指定化合物、其衍生物或其結合物或其鹽而產生的產物。可使用此項技術中已知的常規技術來鑑別化合物、其衍生物或其結合物之代謝物且使用諸如本文中所描述之彼等測試來測定其活性。此種產物可例如由所投與化合物之氧化、羥基化、還原、水解、醯胺化、脫醯胺化、酯化、脫酯化、酶促裂解及類似過程產生。因此，本發明包括本發明之化合物、其衍生物或其結合物之代謝物，包括由包括使本發明之化合物、其衍生物或其結合物與哺乳動物接觸足以產生其代謝產物之時段的方法產生的化合物、其衍生物或其結合物。
片語「醫藥學上可接受」指示物質或組合物必須在化學上及/或在毒理學上與構成調配物之其他成分及/或用其治療之哺乳動物相容。
術語「保護基」或「保護部分」係指常用於封閉或保護特定官能基，而同時使該化合物、其衍生物或其結合物上之其他官能基反應的取代基。舉例而言，「胺保護基」或「胺基保護部分」為與胺基附接由此封閉或保護化合物中之胺基官能基的取代基。此種基團在此項技術中為熟知的(參見例如P.Wuts 及T.Greene,2007,Protective Groups in Organic Synthesis,Chapter 7,J.Wiley & Sons,NJ)且例示為胺基甲酸酯，諸如胺基甲酸甲酯及胺基甲酸乙酯、FMOC、經取代之胺基甲酸乙酯、藉由1,6-β-消除(亦稱為「自犧牲」)而裂解之胺基甲酸酯、脲、醯胺、肽、烷基及芳基衍生物。適合之胺基保護基包括乙醯基、三氟乙醯基、第三丁氧基羰基(BOC)、苯甲氧基羰基(CBZ)及9-茀基甲氧基羰基(Fmoc)。關於保護基及其用途之一般描述，參見P.G.M.Wuts及T.W.Greene,Protective Groups in Organic Synthesis,John Wiley & Sons,New York,2007。
術語「胺基酸」係指天然存在之胺基酸或非天然存在之胺基酸。在一個實施例中，胺基酸由NH2-C(Raa'Raa)-C(=O)OH表示，其中Raa及Raa'各自獨立地為H、具有1至10個碳原子之視情況經取代之直鏈、分支鏈或環狀烷基、烯基或炔基、芳基、雜芳基或雜環基，或Raa與N末端氮原子可共同形成雜環狀環(例如，如脯胺酸中)。術語「胺基酸殘基」係指當自胺基酸之胺及/或羧基端移除一個氫原子時的相應殘基，諸如-NH-C(Raa'Raa)-C(=O)O-。
術語「肽」係指由肽(醯胺)鍵連接之胺基酸單體之短鏈。在一些實施例中，肽含有2至20個胺基酸殘基。在其他實施例中，肽含有2至10個胺基酸殘基。在又其他實施例中，肽含有2至5個胺基酸殘基。如本文中所使用，當肽為本文中所描述之由特定胺基酸序列表示之細胞毒性劑或連接子之一部分時，肽可在兩個方向上連接至細胞毒性劑或連接子之其餘部分。舉例而言，二肽X1-X2包括X1-X2及X2-X1。類似地，三肽X1-X2-X3包括X1-X2-X3及X3-X2-X1，且四肽X1-X2-X3-X4包括X1-X2-X3-X4及X4-X2-X3-X1。X1、X2、X3及X4表示胺基酸殘基。
術語「反應性酯基」係指可容易地與胺基反應以形成醯胺鍵之基團酯基。例示性反應性酯基包括但不限於N-羥基琥珀醯亞胺酯、N-羥基酞醯亞胺酯、N-羥基-磺酸基-琥珀醯亞胺酯、對硝基苯基酯、二硝基苯基酯、五氟苯基酯 及其衍生物，其中該等衍生物促進醯胺鍵形成。在某些實施例中，反應性酯基為N-羥基琥珀醯亞胺酯或N-羥基磺酸基-琥珀醯亞胺酯。
術語「胺反應性基團」係指可與胺基反應以形成共價鍵之基團。例示性胺反應性基團包括但不限於反應性酯基、醯基鹵化物、磺醯基鹵化物、醯亞胺酯或反應性硫酯基。在某些實施例中，胺反應性基團為反應性酯基。在一個實施例中，胺反應性基團為N-羥基琥珀醯亞胺酯或N-羥基磺酸基-琥珀醯亞胺酯。
術語「硫醇反應性基團」係指可與硫醇(-SH)基團反應以形成共價鍵之基團。例示性硫醇反應性基團包括但不限於馬來醯亞胺、鹵基乙醯基、鹵基乙醯胺、乙烯基碸、乙烯基磺醯胺或乙烯基吡啶。在一個實施例中，硫醇反應性基團為馬來醯亞胺。
除非上下文另外清楚指示，否則如本發明及申請專利範圍中所使用，單數形式「一個/種(a/an)」及「該」包括複數形式。
應理解，在本文中以措辭「包含」描述實施例之情況下，亦提供以「由......組成」及/或「基本上由......組成」加以描述之其他類似實施例。
I.抗MET抗體及其抗體片段
本發明提供特異性結合MET之藥劑。此等藥劑在本文中稱為「MET結合劑」。人類MET之全長胺基酸序列在此項技術中為已知的。
在某些實施例中，MET結合劑為抗體、抗體片段或免疫結合物。在一些實施例中，MET結合劑為人類化抗體。
在某些實施例中，MET結合劑具有以下效應中之一或多種：抑制腫瘤細胞增殖、藉由減少腫瘤中之癌症幹細胞頻率而降低腫瘤之致腫瘤性、抑制腫瘤生長、觸發腫瘤細胞之細胞死亡、使致腫瘤細胞分化至非致腫瘤狀態或預防腫瘤細胞轉移。
在某些實施例中，MET結合劑為二價抗MET抗體。在某些實施例中，MET結合劑為抑制HGF與表現MET之細胞結合的二價抗MET抗體、抗體片段或免疫結合物。
在某些實施例中，MET結合劑為抑制增殖之二價抗MET抗體、抗體片段或免疫結合物。
在某些實施例中，MET結合劑為能夠抑制HGF誘導之增殖，同時在不存在HGF時不誘導表現MET之細胞增殖的二價抗MET抗體、抗體片段或免疫結合物。在某些實施例中，MET結合劑為能夠抑制HGF與表現MET之細胞結合並且抑制HGF誘導之增殖，同時在不存在HGF時不誘導增殖的二價抗MET抗體、抗體片段或免疫結合物。
在一個實施例中，「c-MET結合劑」可為使用重組程序，例如噬菌體呈現或雙雜交篩檢及其類似程序鑑定之c-MET結合多肽。
A.例示性抗MET抗體
以下描述本發明之較佳抗原特異性MET抗體。較佳抗體為由本文中所描述之個別可變輕鏈或可變重鏈之一構成的多肽。抗體及多肽亦可包含可變輕鏈及可變重鏈兩者。鼠類抗MET抗體之可變輕鏈及可變重鏈序列係例如由雜交瘤247.27.16、247.2.26、247.48.38、247.3.14、247.22.2、248.69.4及247.16.8產生。
亦提供人類化(藉由表面重整法及CDR移植法)抗體。
亦提供多肽，其包含：(a)與由雜交瘤247.27.16、247.2.26、247.48.38、247.3.14、247.22.2、248.69.4及247.16.8產生之抗體的重鏈可變區中之任一者的胺基酸序列具有至少約10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的多肽，及/或(b)與由雜交瘤247.27.16、247.2.26、247.48.38、 247.3.14、247.22.2、248.69.4及247.16.8產生之抗體的輕鏈可變區中之任一者的胺基酸序列具有至少約10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的多肽。在某些實施例中，該多肽包含與由雜交瘤247.27.16、247.2.26、247.48.38、247.3.14、247.22.2、248.69.4及247.16.8產生之抗體的重鏈可變區中之任一者的胺基酸序列具有至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性的多肽。因而，在某些實施例中，該多肽包含(a)與由雜交瘤247.27.16、247.2.26、247.48.38、247.3.14、247.22.2、248.69.4及247.16.8產生之抗體的重鏈可變區中之任一者的胺基酸序列具有至少約95%序列一致性的多肽，及/或(b)與由雜交瘤247.27.16、247.2.26、247.48.38、247.3.14、247.22.2、248.69.4及247.16.8產生之抗體的輕鏈可變區中之任一者的胺基酸序列具有至少約95%序列一致性的多肽。在某些實施例中，該多肽包含(a)具有由雜交瘤247.27.16、247.2.26、247.48.38、247.3.14、247.22.2、248.69.4及247.16.8產生之抗體的重鏈可變區中之任一者的胺基酸序列的多肽；及/或(b)具有由雜交瘤247.27.16、247.2.26、247.48.38、247.3.14、247.22.2、248.69.4及247.16.8產生之抗體的輕鏈可變區中之任一者的胺基酸序列的多肽。在某些實施例中，該多肽為抗體及/或該多肽特異性結合MET。在某些實施例中，該多肽為特異性結合MET之鼠類抗體、嵌合抗體或者人類化或表面重整抗體。在某些實施例中，與由雜交瘤247.27.16、247.2.26、247.48.38、247.3.14、247.22.2、248.69.4及247.16.8產生之抗體的重鏈可變區或輕鏈可變區中之任一者的胺基酸序列具有某一百分比之序列一致性的多肽與由雜交瘤247.27.16、247.2.26、247.48.38、247.3.14、247.22.2、248.69.4及247.16.8產生之抗體的重鏈可變區或輕鏈可變區中之任一者的胺基酸序列的不同之處在於保守胺基酸取代。
較佳抗體為含有本文中所描述之CDR序列之一的多肽。舉例而言， 本發明之抗原特異性抗體包括以下表1中所顯示之輕鏈CDR序列(亦即，LC CDR1、LC CDR2及LC CDR3)之一及/或重鏈CDR序列(亦即，HC CDR1、HC CDR2及HC CDR3)之一。
在特定實施例中，該抗MET抗體或其抗MET抗體片段包含具有選自由以下各項組成之群的序列的LC CDR1、LC CDR2及LC CDR3以及HC CDR1、HC CDR2及HC CDR3：(a)分別SEQ ID NO：1、2及3以及SEQ ID NO：8、9及10；(b)分別SEQ ID NO：1、2及3以及SEQ ID NO：8、12及10；(c)分別SEQ ID NO：4、5及6以及SEQ ID NO：13、14及15；(d)分別SEQ ID NO：4、5及6以及SEQ ID NO：13、17及15；(e)分別SEQ ID NO：4、5及7以及SEQ ID NO：13、17及15；(f)分別SEQ ID NO：4、5及8以及SEQ ID NO：13、17及15；以及(g)分別SEQ ID NO：4、5及7以及SEQ ID NO：13、14及15。
在某些實施例中，該抗MET抗體或其抗MET抗體片段包含分別具有序列SEQ ID NO：4、5及7以及SEQ ID NO：13、14及15的LC CDR1、LC CDR2及LC CDR3以及HC CDR1、HC CDR2及HC CDR3。
亦提供包含本文中所描述之個別可變輕鏈或可變重鏈的人類化抗體。該等人類化抗體亦可包含可變輕鏈及可變重鏈兩者。嵌合及人類化cMET-22及cMET-27抗體之可變輕鏈及可變重鏈序列見於以下表2中。
在一些實施例中，該抗MET抗體或其片段包含具有與如下序列具有至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或100%序列一致性的序列的可變輕鏈(VL)及可變重鏈(VH)：(a)分別SEQ ID NO：18及SEQ ID NO：19；(b)分別SEQ ID NO：20及SEQ ID NO：21；(c)分別SEQ ID NO：22及SEQ ID NO：23；(d)分別SEQ ID NO：24及SEQ ID NO：25；(e)分別SEQ ID NO：26及SEQ ID NO：27；(f)分別SEQ ID NO：28及SEQ ID NO：31；(g)分別SEQ ID NO：29及SEQ ID NO：31；(h)分別SEQ ID NO：30及SEQ ID NO：31；(i)分別SEQ ID NO：32及SEQ ID NO：36；(j)分別SEQ ID NO：32及SEQ ID NO：35；(k)分別SEQ ID NO：32及SEQ ID NO：34；(l)分別SEQ ID NO：33及SEQ ID NO：36；(m)分別SEQ ID NO：33及SEQ ID NO：35；以及(n)分別SEQ ID NO：33及SEQ ID NO：34。
在特定實施例中，該抗MET抗體或其片段包含具有序列SEQ ID NO：32及SEQ ID NO：36之VL及VH。
在某些實施例中，該多肽為抗體及/或該多肽特異性結合MET。在某些實施例中，該多肽為特異性結合MET之鼠類抗體、嵌合抗體或人類化(藉由表面重整法或藉由CDR移植法)抗體。在某些實施例中，該多肽因保守胺基酸取代而與SEQ ID NO：18-36具有某一百分比之序列一致性。
亦提供包含本文中所描述之個別輕鏈或重鏈的多肽。此等亦可包含輕鏈及重鏈兩者。人類化cMET-22及cMET-27抗體之輕鏈及重鏈序列於以下表4中。
在一些實施例中，該抗MET抗體或其片段包含與如下序列具有至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或100%序列一致性的輕鏈及重鏈序列： (a)分別SEQ ID NO：39及SEQ ID NO：40；(b)分別SEQ ID NO：41及SEQ ID NO：42；(c)分別SEQ ID NO：43及SEQ ID NO：44；(d)分別SEQ ID NO：45及SEQ ID NO：48；(e)分別SEQ ID NO：46及SEQ ID NO：48；(f)分別SEQ ID NO：47及SEQ ID NO：48；(g)分別SEQ ID NO：49及SEQ ID NO：54；(h)分別SEQ ID NO：49及SEQ ID NO：53；(i)分別SEQ ID NO：49及SEQ ID NO：52；(j)分別SEQ ID NO：49及SEQ ID NO：51；(k)分別SEQ ID NO：50及SEQ ID NO：53；(l)分別SEQ ID NO：50及SEQ ID NO：52；(m)分別SEQ ID NO：50及SEQ ID NO：51；(n)分別SEQ ID NO：49及SEQ ID NO：77；(o)分別SEQ ID NO：49及SEQ ID NO：78；(p)分別SEQ ID NO：49及SEQ ID NO：79；(q)分別SEQ ID NO：49及SEQ ID NO：80；(r)分別SEQ ID NO：49及SEQ ID NO：81；(s)分別SEQ ID NO：49及SEQ ID NO：82；(t)分別SEQ ID NO：49及SEQ ID NO：83；以及(u)分別SEQ ID NO：49及SEQ ID NO：84。
在特定實施例中，該抗MET抗體或其片段包含具有序列SEQ ID NO：49及SEQ ID NO：54之輕鏈及重鏈。在一些實施例中，該抗MET抗體或其片段包含具有序列SEQ ID NO：49及SEQ ID NO：53之輕鏈及重鏈。在一些實施 例中，該抗MET抗體或其片段包含具有序列SEQ ID NO：49及SEQ ID NO：82之輕鏈及重鏈。
在某些實施例中，該多肽為抗體及/或該多肽特異性結合MET。在某些實施例中，該多肽為特異性結合MET之鼠類抗體、嵌合抗體或人類化(藉由表面重整法或CDR移植法)抗體。在某些實施例中，該多肽因保守胺基酸取代而與SEQ ID NO：39-54具有某一百分比之序列一致性。
業內普通技術人員應理解本申請案中之序列為非限制性實例。
在某些實施例中，本發明之抗MET抗體包括降低該抗體之促效活性的鉸鏈區修飾，其中該修飾包括選自由SEQ ID NO：85-108組成之群的胺基酸序列。在特定實施例中，該等抗MET抗體或其抗MET抗體片段包含分別具有序列SEQ ID NO：4、5及7以及SEQ ID NO：13、14及15之LC CDR1、LC CDR2及LC CDR3以及HC CDR1、HC CDR2及HC CDR3，其中該抗體或其抗MET抗體片段進一步以該抗體或其片段亦包含包括如表13中所揭示之胺基酸序列的鉸鏈區修飾為特徵。
B.工程改造之抗MET抗體
本發明之抗MET抗體及其片段、結合物、組合物及方法可為突變抗體及其類似物。抗MET抗體可為「工程改造之抗體」或改變之抗體，諸如抗MET抗體之胺基酸序列變異體，其中抗MET抗體之一或多個胺基酸殘基已經修飾。除非本文中另外指示或已知，否則對抗MET抗體胺基酸序列之修飾包括例如用於改良抗體或片段對其抗原之親和力或親合力的對多肽及/或聚核苷酸序列之修飾，用於改良穩定性之修飾，及/或用於改良抗體之產生的對多肽及/或聚核苷酸序列之修飾，及/或用於改良效應功能的對抗體Fc部分之修飾。可對任何已知抗MET抗體或如本文中所描述之已鑑定之抗MET抗體進行修飾。此種改變之抗體必需與參考抗MET抗體具有小於100%序列一致性或相似性。在一較佳態樣中，改變之抗體將具有與抗MET抗體之重鏈或輕鏈可變域之胺基酸序列具有至少20%、25%、35%、45%、55%、65%或75%，更佳至少80%、更佳至少85%、更佳至少90%且最佳至少95%胺基酸序列一致性或相似性的胺基酸序列。在一較佳態樣中，改變之抗體將具有與抗MET抗體之重鏈CDR1、CDR2或CDR3之胺基酸序列具有至少25%、35%、45%、55%、65%或75%，更佳至少80%、更佳至少85%、更佳至少90%且最佳至少95%胺基酸序列一致性或相似性的胺基酸序列。在一較佳態樣中，改變之抗體將具有與抗MET抗體之輕鏈CDR1、 CDR2或CDR3之胺基酸序列具有至少25%、35%、45%、55%、65%或75%，更佳至少80%、更佳至少85%、更佳至少90%且最佳至少95%、96%、97%、98%、99%胺基酸序列一致性或相似性的胺基酸序列。在一較佳態樣中，改變之抗體將維持人類MET結合能力。在某些態樣中，本發明之抗MET抗體包含與由雜交瘤247.27.16、247.2.26、247.48.38、247.3.14、247.22.2、248.69.4或247.16.8產生之抗體的重鏈可變區之胺基酸序列具有約10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更大一致性的重鏈。在某些態樣中，本發明之抗MET抗體包含與由雜交瘤247.27.16、247.2.26、247.48.38、247.3.14、247.22.2、248.69.4或247.16.8產生之抗體的輕鏈可變區之胺基酸序列具有約10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更大一致性的輕鏈。
在本發明之一些實施例中，抗MET抗體可為「工程改造之抗體」或改變之抗體，諸如抗MET抗體之胺基酸序列變異體，其中抗MET抗體之一或多個胺基酸殘基已經修飾。在一較佳態樣中，改變之抗體將具有當與抗MET抗體之重鏈或輕鏈可變域之胺基酸序列相比時具有至少1-5、1-3、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45或50個保守胺基酸取代之胺基酸序列。在一較佳態樣中，改變之抗體將具有當與抗MET抗體之重鏈CDR1、CDR2或CDR3之胺基酸序列相比時具有至少1-20、1-15、1-10、1-5、1-3、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1個保守胺基酸取代之胺基酸序列。在一較佳態樣中，改變之抗體將具有當與由雜交瘤247.27.16、247.2.26、247.48.38、247.3.14、247.22.2、248.69.4或247.16.8產生之抗MET抗體之輕鏈CDR1、CDR2或CDR3之胺基酸序列相比時具有至少 1-20、1-15、1-10、1-5、1-3、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1個保守胺基酸取代之胺基酸序列。在一較佳態樣中，改變之抗體將維持人類MET結合能力。在某些態樣中，本發明之抗MET抗體包含具有當與由雜交瘤247.27.16、247.2.26、247.48.38、247.3.14、247.22.2、248.69.4或247.16.8產生之抗體之重鏈可變區之胺基酸序列相比時具有約1-20、1-15、1-10、1-5、1-3、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45或50個保守胺基酸取代之胺基酸序列的重鏈。在某些態樣中，本發明之抗MET抗體包含具有當與由雜交瘤247.27.16、247.2.26、247.48.38、247.3.14、247.22.2、248.69.4或247.16.8產生之抗體之輕鏈可變區之胺基酸序列相比時具有約1-20、1-15、1-10、1-5、1-3、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45或50個保守胺基酸取代之胺基酸序列的輕鏈。在一較佳態樣中，改變之抗體將具有當與由雜交瘤247.27.16、247.2.26、247.48.38、247.3.14、247.22.2、248.69.4或247.16.8產生之抗MET抗體之重鏈CDR1、CDR2或CDR3之胺基酸序列相比時具有至少1-20、1-15、1-10、1-5、1-3、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1個保守胺基酸取代之胺基酸序列。
為了產生改變之抗體，在抗體之一或多個高變區中引入一或多個胺基酸變化(例如取代)。替代地，或另外，可在抗MET抗體中引入一或多個構架區殘基變化(例如取代)，其中此等變化改良抗體突變體對抗原之結合親和力。欲修飾之構架區殘基之實例包括直接非共價結合抗原之殘基(Amit等人，Science,233：747-753(1986))；與CDR相互作用/影響CDR之構形的殘基(Chothia等人，J.Mol.Biol.,196：901-917(1987))；及/或參與VL VH界面之殘基。在某些態樣中， 對一或多個此種構架區殘基之修飾可增強抗體對抗原之結合親和力。舉例而言，在本發明之此態樣中，可改變約1至約5個構架殘基(例如，1、2、3、4或5個)。有時，此舉可能足以產生具有增強之結合親和力的抗體，即使在不改變高變區殘基之情況下。然而，在正常情況下，改變之抗體將包含其他高變區變化。
所改變之高變區殘基可隨機變化，尤其在抗MET抗體對抗原之初始結合親和力使得可容易地篩檢此種隨機產生之改變之抗體時。
一種適用於產生此種改變之抗體的程序稱為「丙胺酸掃描誘變」(Cunningham及Wells,Science,244：1081-1085(1989))。藉由丙胺酸或聚丙胺酸殘基置換一或多個高變區殘基以影響胺基酸與抗原之相互作用。隨後藉由在取代位點處或針對取代位點引入額外或其他突變來改良對取代顯示出功能敏感性之彼等高變區殘基。因而，儘管用於引入胺基酸序列變化之位點為預定的，但無需預定突變本身之性質。如本文中所描述及/或如此項技術中已知來篩檢此方式產生之Ala突變體的生物活性。
另一種用於產生此種改變之抗體的程序包括使用噬菌體呈現進行親和力成熟(Hawkins等人，J.Mol.Biol.,254：889-896(1992)；及Lowman等人，Biochemistry,30(45)：10832-10837(1991))。
抗體序列中之突變可包括取代、缺失(包括內部缺失)、添加(包括產生融合蛋白質之添加)或對胺基酸序列內及/或與胺基酸序列相鄰之胺基酸殘基的保守取代，但保守取代產生「沉默」變化，因為該變化產生功能上等效之抗MET抗體或片段。可基於在所涉及之殘基的極性、電荷、溶解性、疏水性、親水性及/或兩親性性質方面的相似性進行保守胺基酸取代。舉例而言，非極性(疏水性)胺基酸包括丙胺酸、白胺酸、異白胺酸、纈胺酸、脯胺酸、***酸、色胺酸及甲硫胺酸；極性中性胺基酸包括甘胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、半胱胺酸、 酪胺酸、天冬醯胺酸及麩醯胺酸；帶正電(鹼性)胺基酸包括精胺酸、離胺酸及組胺酸；且帶負電(酸性)胺基酸包括天冬胺酸及麩胺酸。另外，甘胺酸及脯胺酸為可影響鏈取向之殘基。非保守取代將需要將此等類別之一的成員交換為另一類別之成員。此外，需要時，可將非經典胺基酸或化學胺基酸類似物作為取代或添加引入抗體序列中。非經典胺基酸一般包括但不限於普通胺基酸之D-異構體、α-胺基異丁酸、4-胺基丁酸、Abu、2-胺基丁酸、γ-Abu、ε-Ahx、6-胺基己酸、Aib、2-胺基異丁酸、3-胺基丙酸、鳥胺酸、正白胺酸、正纈胺酸、羥基脯胺酸、肌胺酸、瓜胺酸、磺酸基丙胺酸、第三丁基甘胺酸、第三丁基丙胺酸、苯基甘胺酸、環己基丙胺酸、β-丙胺酸、氟基胺基酸、設計胺基酸諸如β-甲基胺基酸、Cα-甲基胺基酸、Nα-甲基胺基酸及胺基酸類似物。
出於在抗體序列中產生胺基酸取代之目的，或為了產生/缺失限制位點以有助於進一步操作，可使用此項技術中已知的任何誘變技術來修飾DNA序列中之個別核苷酸。此種技術包括但不限於化學誘變、試管內定點誘變(Kunkel,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82：488(1985)；Hutchinson,C.等人，J.Biol.Chem.,253：6551(1978))、寡核苷酸定向誘變(Smith,Ann.Rev.Genet.,19：423-463(1985)；Hill等人，Methods Enzymol.,155：558-568(1987))、基於PCR之重疊延伸(Ho等人，Gene,77：51-59(1989))、基於PCR之大引子誘變(Sarkar等人，Biotechniques,8：404-407(1990))等。可藉由雙鏈雙去氧DNA定序來證實修飾。
C.抗體人類化及表面重整
用於對非人類抗體或人類抗體進行工程改造、人類化或表面重整之方法亦可使用且在此項技術中為熟知的。人類化、表面重整或類似工程改造之抗體可具有一或多個來自非人類來源，例如但不限於小鼠、大鼠、兔、非人類靈長類或其他哺乳動物之胺基酸殘基。此等非人類胺基酸殘基被通常取自已知人類序列之「輸入」可變域、恆定域或其他域之通常稱為「輸入」殘基之殘基 置換。
在許多可利用資源中，人類Ig序列揭示於以下例示性網頁：國家生物技術資訊中心(National Center for Biotechnology Information)之Entrez及IgBlast網頁；免疫球蛋白(IG)、T細胞受體(TR)及主要組織相容性複合物(MHC)及相關免疫系統蛋白(RPI)全球免疫遺傳學網資源之ImMunoGeneTics(「IMGT」)網頁；編輯：Marie-Paule Lefranc(LIGM，Universite-Montpellier II，CNRS，Montpellier，France)；免疫學相關蛋白質序列之Kabat資料庫；及國家生物技術資訊中心之FTP KABAT儲存庫。
此等資源及引用文獻中每一者之內容在此以全文引用之方式併入本文中。
此種輸入序列可用於降低免疫原性，或者降低、增強或調節結合、親和力、締合速率、解離速率、親合力、特異性、半衰期或如此項技術中已知的任何其他適合之特徵。一般而言，CDR殘基直接且最實質性地參與影響MET結合。因此，維持部分或所有非人類或人類CDR序列，同時可用人類胺基酸或其他胺基酸置換可變區及恆定區之非人類序列。
抗體亦可視情況為經工程改造而保留對抗原MET之高親和力及其他適宜生物學性質的人類化抗體、表面重整抗體、工程改造之抗體或人類抗體。為了達成此目標，可視情況藉由使用親本序列、工程改造序列及人類化序列之三維模型分析親本序列及多種設想人類化及工程改造產物的方法來製備人類化(或人類)或工程改造之抗MET抗體及表面重整抗體。三維免疫球蛋白模型為常用的且為熟習此項技術者所熟知。可利用電腦程式，其說明並顯示所選擇之候選免疫球蛋白序列之大概三維構形結構。觀察此等顯示允許分析殘基在候選免 疫球蛋白序列發揮功能時之可能作用，亦即，分析會影響候選免疫球蛋白結合其抗原，諸如MET之能力的殘基。以此方式，可自一致及輸入序列中選擇構架(FR)殘基並組合，從而達成所要抗體特徵，諸如對靶抗原之增加之親和力。
本發明抗體之人類化、表面重整或工程改造可使用任何已知方法來進行，諸如但不限於以下文獻中所描述之彼等方法：Winter(Jones等人，Nature 321：522(1986)；Riechmann等人，Nature 332：323(1988)；Verhoeyen等人，Science 239：1534(1988))；Sims等人，J.Immunol.151：2296(1993)；Chothia及Lesk,J.Mol.Biol.196：901(1987)；Carter等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89：4285(1992)；Presta等人，J.Immunol.151：2623(1993)；美國專利第5,639,641號、第5,723,323號、第5,976,862號、第5,824,514號、第5,817,483號、第5,814,476號、第5,763,192號、第5,723,323號、第5,766,886號、第5,714,352號、第6,204,023號、第6,180,370號、第5,693,762號、第5,530,101號、第5,585,089號、第5,225,539號、第4,816,567號；PCT/US98/16280、PCT/US96/18978、PCT/US91/09630、PCT/US91/05939、PCT/US94/01234、PCT/GB89/01334、PCT/GB91/01134、PCT/GB92/01755；WO90/14443；WO90/14424；WO90/14430；EP 229246；美國專利第7,557,189號、第7,538,195號及第7,342,110號，各文獻係以引用之方式整體併入本文中，包括其中所引用之參考文獻。
D.可變Fc區及工程改造之效應功能
本發明提供包含可變Fc區之蛋白質的調配物。其為非天然存在之Fc區，例如包含一或多個非天然存在之胺基酸殘基的Fc區。本發明之可變Fc區亦涵蓋包含胺基酸缺失、添加及/或修飾之Fc區。
在某些態樣中，該抗體包含改變(例如突變)之Fc區。舉例而言，在一些態樣中，已改變Fc區以減少或增強抗體之效應功能、改變抗體之血清半衰期或其他功能性質。在一些態樣中，Fc區為選自IgM、IgA、IgG、IgE或其他 同型之同型。
應理解，如本文中所使用之Fc區包括包含除第一恆定區免疫球蛋白域以外之抗體恆定區的多肽。因而，Fc係指IgA、IgD及IgG之最後兩個恆定區免疫球蛋白域以及IgE及IgM之最後兩個恆定區免疫球蛋白域以及在此等結構域N末端之可撓性鉸鏈。對於IgA及IgM，Fc可包括J鏈。對於IgG而言，Fc包含免疫球蛋白域Cγ2及Cγ3(Cγ2及Cγ3)以及介於Cγ1(Cγ1)與Cγ2(Cγ2)之間的鉸鏈。雖然Fc區之邊界可變化，但人類IgG重鏈Fc區通常定義為在其羧基末端包含殘基C226或P230，其中編號係根據如Kabat等人，(1991,NIH Publication 91-3242,National Technical Information Service,Springfield,Va.)中之EU指數。「如Kabat中所闡述之EU指數」係指如Kabat等人，同上中所描述之人類IgG1 EU抗體之殘基編號。Fc可指呈分離狀態之此區域，或在抗體、抗體片段或Fc融合蛋白質之情形下的此區域。Fc變異蛋白可為抗體、Fc融合物或者包含Fc區之任何蛋白質或蛋白質結構域。尤佳為包含變異Fc區，亦即非天然存在之Fc變異體之蛋白質。已在許多Fc位置上觀測到多態現象，包括但不限於Kabat 270、272、312、315、356及358，且因而，所提供之序列與現有技術序列之間可能存在輕微差異且熟習此項技術者將基於本教示內容而獲知。
可將Fc突變引入工程改造之抗體中以改變其與新生兒Fc受體(FcRn)之相互作用且改良其藥物動力學性質。已描述與FcRn具有改良之結合的眾多人類Fc變異體，且包括例如Shields等人，2001.High resolution mapping of the binding site on human IgG1 for FcγRI,FcγRII,FcγRIII,and FcRn and design of IgG1 variants with improved binding to the FcγR,J.Biol.Chem.276：6591-6604)中所揭示之彼等人類Fc變異體，該文獻以引用之方式整體併入在此。
因而，可藉由增加Fc區對FcRn之結合親和力來增加包含Fc區之蛋白質之血清半衰期。在一個態樣中，Fc變異蛋白相對於相當分子具有增強之血 清半衰期。
亦可對Fc鉸鏈區進行工程改造以改變Fab臂可撓性作為操縱抗體之抗體結合、效應因子效能或其他功能性質的手段。抗體Fc鉸鏈之可撓性在很大程度上隨其長度以及半胱胺酸殘基之數目及位置而變化。已描述可引發改變之ADCC或CDC活性(Dall'Acqua WF等人，2006；J Immunol；177：1129-38)或其他抗體結合介導之功能活性(WO 2010064090)的對Fc鉸鏈半胱胺酸殘基或長度之胺基酸變化。可能因此需要在Fc鉸鏈區中進行此種胺基酸修飾，包括胺基酸缺失及取代。
亦可能需要修飾本發明之抗MET抗體的效應功能，以便例如增強該抗體在治療癌症方面之有效性。可使用此項技術中已知的試管內分析法來確定本發明之抗MET抗體、組合物、結合物及方法例如是否能夠介導效應功能，諸如ADCC或CDC，諸如本文中所描述之彼等試管內分析法。
「抗體依賴性細胞介導之細胞毒性」或「ADCC」係指與某些細胞毒性細胞(例如天然殺手(NK)細胞、嗜中性球及巨噬細胞)上所呈現之Fc受體(FcR)結合的分泌Ig使得此等細胞毒性效應細胞能夠特異性結合攜帶抗原之靶細胞且隨後用細胞毒素殺死該靶細胞的細胞毒性形式。舉例而言，指向靶細胞表面之高親和力IgG抗體「武裝」細胞毒性細胞且提供此種殺死。靶細胞之溶解發生在細胞外，需要直接細胞與細胞接觸，且不涉及補體。預期除抗體以外，包含Fc區之其他蛋白質，特定言之能夠特異性結合攜帶抗原之靶細胞的Fc融合蛋白質亦將能夠實現細胞介導之細胞毒性。為簡單起見，由Fc融合蛋白質之活性引起的細胞介導之細胞毒性在本文中亦稱為ADCC活性。
可分析任何特定Fc變異蛋白藉由ADCC介導靶細胞溶解之能力。為了評定ADCC活性，將相關Fc變異蛋白添加至與免疫效應細胞組合之靶細胞中，可藉由抗原抗體複合物使其活化，從而引起靶細胞之細胞溶解。一般藉由 自溶解之細胞釋放標記(例如，放射性基質、螢光染料或天然細胞內蛋白質)來偵測細胞溶解。適用於此種分析之效應細胞包括外周血單核細胞(PBMC)及天然殺手(NK)細胞。試管內ADCC分析之特定實例描述於以下文獻中：Wisecarver等人，1985,79：277-282；Bruggemann等人，1987,J Exp Med,166：1351-1361；Wilkinson等人，2001,J Immunol Methods,258：183-191；及Patel等人，1995,J Immunol Methods,184：29-38。替代地，或另外，可在活體內，例如在動物模型，諸如Clynes等人，1998,PNAS USA,95：652-656中所揭示之動物模型中評定相關Fc變異蛋白之ADCC活性。
「補體依賴性細胞毒性」及「CDC」係指靶細胞在補體存在下溶解。補體活化途徑係由補體系統之第一組分(C1q)與分子(例如與同源抗原複合之抗體)結合而引發。為了評定補體活化，可進行CDC分析，例如Gazzano-Santoro等人，1996,J.Immunol.Methods,202：163中所描述。
可設計本發明抗體之Fc區具有改變之效應功能，包括但不限於：C1q結合；補體依賴性細胞毒性(CDC)；Fc受體結合；抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)；吞噬作用；細胞表面受體(例如，B細胞受體；BCR)下調等。此種效應功能可能需要Fc區與結合結構域(例如抗體可變域)組合，且可使用不同的分析法(例如，Fc結合分析法、ADCC分析法、CDC分析法等)加以評定。
舉例而言，可產生工程改造之抗MET抗體的具有改良之C1q結合及改良之FcγRIII結合(例如，兼具改良之ADCC活性及改良之CDC活性)的變異Fc區。替代地，若需要減少或消除效應功能，則可將變異Fc區工程改造為具有降低之CDC活性及/或降低之ADCC活性。在其他態樣中，僅可增加此等活性之一且視情況亦減少另一活性(例如，為了產生具有改良之ADCC活性但降低之CDC活性的Fc區變異體，反之亦然)。例示性Fc突變體為三殘基變化S239D、A330L及I332E(EU編號系統)，其中ADCC得以增強且CDC活性得以降低。用 於設計此種突變體之非限制性方法可見於例如以下文獻中：Lazar等人，(2006,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.103(11)：4005-4010)；及Okazaki等人，(2004,J.Mol.Biol.336(5)：1239-49)。亦參見WO 03/074679、WO 2004/029207、WO 2004/099249、WO2006/047350、WO 2006/019447、WO 2006/105338、WO 2007/041635。
工程改造之抗體之Fc區以改變效應功能之其他方法在此項技術中為已知的(例如美國專利公開案第20040185045號及PCT公開案第WO 2004/016750號，兩者皆頒予Koenig等人，其描述改變Fc區以便與對FCγRIIA之結合親和力相比增強對FcγRIIB之結合親和力；亦參見頒予Armour等人之PCT公開案第WO99/58572號；頒予Idusogie等人之WO99/51642；及頒予Deo等人之美國專利第6,395,272號；各案之揭示內容整體併入本文中)。修飾Fc區以降低對FcγRIIB之結合親和力的方法在此項技術中亦為已知的(例如美國專利公開案第20010036459號及PCT公開案第WO 01/79299號，兩者均頒予Ravetch等人，其揭示內容整體併入本文中)。存在與野生型Fc區相比對FcγRIIIA及/或FcγRIIA具有增強之結合親和力的變異Fc區的經修飾抗體為已知的(例如，PCT公開案第WO2004/063351號，頒予Stavenhagen等人；其揭示內容整體併入本文中)。
在其他實例中，可將半胱胺酸殘基引入Fc區中，從而允許此區中之鏈間二硫鍵形成。如此產生之均二聚抗體可具有改良之內在化能力及/或增加之補體介導之細胞殺死及/或抗體依賴性細胞毒性(ADCC)。參見Caron等人，J.Exp Med.,176：1191-1195(1992)；及Shopes,B.,J.Immunol.,148：2918-2922(1992)。亦可使用如Wolff等人，Cancer Research,53：2560-2565(1993)中所描述之異雙官能交聯劑來製備具有增強之活性的均二聚抗體。替代地，可對抗體進行工程改造以使其具有雙Fc區，且可由此具有增強之補體溶解及ADCC能力。參見Stevenson等人，Anti-Cancer Drug Design,3：219-230(1989)。
本發明涵蓋Fc變異蛋白，其具有相對於相當分子(例如，具有相同胺基酸序列但具有野生型Fc區之蛋白質)對Fc配位體(例如，Fc受體、C1q)具有改變之結合性質。結合性質之實例包括但不限於結合特異性、平衡解離常數(KD)、解離及締合速率(Koff及Kon)、結合親和力及/或親合力。一般應理解，具有低KD之結合分子(例如，Fc變異蛋白，諸如抗體)優於具有高KD之結合分子。然而，在一些情況下，Kon或Koff之值可能比KD之值更相關。熟習此項技術者可確定對指定抗體應用最重要之動力學參數。
可藉由此項技術中已知的用於測定Fc-FcγR相互作用，亦即，Fc區與FcγR之特異性結合的多種試管內分析方法(基於生物化學或免疫學之分析法)來測定Fc結構域對其配位體之親和力及結合性質，包括但不限於平衡法(例如，酶聯免疫吸附分析法(ELISA)或放射免疫分析法(RIA))或動力學方法(例如，BIACORE.TM分析)及其他方法，諸如間接結合分析法、競爭性抑制分析法、螢光共振能量傳遞(FRET)、凝膠電泳及層析法(例如，凝膠過濾)。此等及其他方法可利用所檢查之一或多種組分上的標記及/或採用多種偵測方法，包括但不限於發色標記、螢光標記、發光標記或同位素標記。結合親和力及動力學之詳細描述可見於例如Paul,W.E.編，Fundamental Immunology，第4版，Lippincott-Raven,Philadelphia(1999)中。
舉例而言，增強Fc與一或多種正調控因子(例如FcγRIIIA)之結合同時不改變或甚至減少Fc與負調控因子FcγRIIB之結合的修飾對於增強ADCC活性而言將更佳。替代地，減少與一或多種正調控因子之結合及/或增強與FcγRIIB之結合的修飾對於降低ADCC活性而言將較佳。相應地，若Fc變異體之ADCC活性有所增強或降低，則可指示結合親和力之比值(例如，平衡解離常數(KD))。舉例而言，FcγRIIIA/FcγRIIB平衡解離常數之比值(KD)降低將與改良之ADCC活性相關，而該比值之增加將與ADCC活性降低相關。另外，增強與C1q之結 合的修飾對於增強CDC活性而言將較佳，而減少與C1q之結合的修飾對於降低或消除CDC活性而言將較佳。
在一個態樣中，本發明之Fc變異體相對於相當分子以增加之親和力結合FcγRIIIA。在另一態樣中，本發明之Fc變異體相對於相當分子以增加之親和力結合FcγRIIIA且以無變化之結合親和力結合FcγRIIB。在再另一態樣中，本發明之Fc變異體相對於相當分子以增加之親和力結合FcγRIIIA且以降低之親和力結合FcγRIIB。在又另一態樣中，本發明之Fc變異體具有相對於相當分子有所降低之FcγRIIIA/FcγRIIB平衡解離常數比值(KD)。
在一個態樣中，Fc變異蛋白相對於相當分子具有增強之與一或多個Fc配位體之結合。在另一態樣中，Fc變異蛋白對Fc配位體之親和力為相當分子對Fc配位體之親和力的至少2倍，或至少3倍，或至少5倍，或至少7倍，或至少10倍，或至少20倍，或至少30倍，或至少40倍，或至少50倍，或至少60倍，或至少70倍，或至少80倍，或至少90倍，或至少100倍，或至少200倍。在一特定態樣中，Fc變異蛋白具有增強之與Fc受體之結合。在另一特定態樣中，Fc變異蛋白具有增強之與Fc受體FcγRIIIA之結合。在再另一特定態樣中，Fc變異蛋白具有增強之與Fc受體FcRn之結合。在又另一特定態樣中，Fc變異蛋白相對於相當分子具有增強之與C1q之結合。
在另一態樣中，本發明之Fc變異體之平衡解離常數(KD)相對於相當分子降低約2倍與約10倍之間，或約5倍與約50倍之間，或約25倍與約250倍之間，或約100倍與約500倍之間，或約250倍與約1000倍之間。在另一態樣中，本發明之Fc變異體之平衡解離常數(KD)相對於相當分子降低2倍與10倍之間，或5倍與50倍之間，或25倍與250倍之間，或100倍與500倍之間，或250倍與1000倍之間。在一特定態樣中，Fc變異體對FcγRIIIA之平衡解離常數(KD)相對於相當分子降低至少2倍，或至少3倍，或至少5倍，或至少7倍， 或至少10倍，或至少20倍，或至少30倍，或至少40倍，或至少50倍，或至少60倍，或至少70倍，或至少80倍，或至少90倍，或至少100倍，或至少200倍，或至少400倍，或至少600倍。
在一個態樣中，Fc變異蛋白相對於相當分子具有增強之ADCC活性。在一特定態樣中，Fc變異蛋白之ADCC活性為相當分子之ADCC活性的至少2倍，或至少3倍，或至少5倍，或至少10倍，或至少50倍，或至少100倍。在另一特定態樣中，Fc變異蛋白相對於相當分子具有增強之與Fc受體FcγRIIIA之結合，且具有增強之ADCC活性。在其他態樣中，Fc變異蛋白相對於相當分子具有增強之ADCC活性及增強之血清半衰期。
在一個態樣中，Fc變異蛋白相對於相當分子具有增強之CDC活性。在一特定態樣中，Fc變異蛋白之CDC活性為相當分子之CDC活性的至少2倍，或至少3倍，或至少5倍，或至少10倍，或至少50倍，或至少100倍。在其他態樣中，Fc變異蛋白相對於相當分子具有增強之CDC活性及增強之血清半衰期。
在一個態樣中，本發明提供諸多調配物，其中在藉由如Kabat中所闡述之EU指數加以編號時，Fc區在選自由以下各項組成之群的一或多個位置上包含非天然存在之胺基酸殘基：234、235、236、239、240、241、243、244、245、247、252、254、256、262、263、264、265、266、267、269、296、297、298、299、313、325、326、327、328、329、330、332、333及334。視情況，Fc區可在熟習此項技術者已知(參見例如美國專利第5,624,821號、第6,277,375號、第6,737,056號、PCT專利公開案WO 01/58957、WO 02/06919、WO 04/016750、WO 04/029207、WO 04/035752及WO 05/040217)或如本文中所揭示之額外及/或替代位置上包含非天然存在之胺基酸殘基。
在一特定態樣中，本發明提供一種Fc變異蛋白調配物，其中在藉由如Kabat中所闡述之EU指數加以編號時，Fc區包含至少一個選自由以下各項組 成之群的非天然存在之胺基酸殘基：234D、234E、234N、234Q、234T、234H、234Y、234I、234V、234F、235A、235D、235R、235W、235P、235S、235N、235Q、235T、235H、235Y、235I、235V、235F、236E、239D、239E、239N、239Q、239F、239T、239H、239Y、240I、240A、240T、240M、241W、241L、241Y、241E、241 R.243W、243L 243Y、243R、243Q、244H、245A、247V、247G、252Y、254T、256E、262I、262A、262T、262E、263I、263A、263T、263M、264L、264I、264W、264T、264R、264F、264M、264Y、264E、265G、265N、265Q、265Y、265F、265V、265I、265L、265H、265T、266I、266A、266T、266M、267Q、267L、269H、269Y、269F、269R、296E、296Q、296D、296N、296S、296T、296L、296I、296H、269G、297S、297D、297E、298H、298I、298T、298F、299I、299L、299A、299S、299V、299H、299F、299E、313F、325Q、325L、325I、325D、325E、325A、325T、325V、325H、327G、327W、327N、327L、328S、328M、328D、328E、328N、328Q、328F、328I、328V、328T、328H、328A、329F、329H、329Q、330K、330G、330T、330C、330L、330Y、330V、330I、330F、330R、330H、332D、332S、332W、332F、332E、332N、332Q、332T、332H、332Y及332A。視情況，Fc區可包含熟習此項技術者已知(參見例如美國專利第5,624,821號、第6,277,375號、第6,737,056號、PCT專利公開案WO 01/58957、WO 02/06919、WO 04/016750、WO 04/029207、WO 04/035752及WO 05/040217)的額外及/或替代非天然存在之胺基酸殘基。
在另一態樣中，本發明提供一種Fc變異蛋白調配物，其中在藉由如Kabat中所闡述之EU指數加以編號時，Fc區在選自由以下各項組成之群的一或多個位置上包含至少一個非天然存在之胺基酸：239、330及332。在一特定態樣中，本發明提供一種Fc變異蛋白調配物，其中在藉由如Kabat中所闡述之EU指數加以編號時，Fc區包含至少一個選自由以下各項組成之群的非天然存在之 胺基酸：239D、330L及332E。視情況，在藉由如Kabat中所闡述之EU指數加以編號時，Fc區可在選自由以下各項組成之群的一或多個位置上進一步包含額外非天然存在之胺基酸：252、254及256。在一特定態樣中，本發明提供一種Fc變異蛋白調配物，其中在藉由如Kabat中所闡述之EU指數加以編號時，Fc區包含至少一個選自由以下各項組成之群的非天然存在之胺基酸：239D、330L及332E，以及在藉由如Kabat中所闡述之EU指數加以編號時，處於選自由以下各項組成之群的一或多個位置上的至少一個非天然存在之胺基酸：252Y、254T及256E。
在一個態樣中，本發明之Fc變異體可與其他已知Fc變異體組合，諸如以下文獻中所揭示之彼等Fc變異體：Ghetie等人，1997,Nat.Biotech.15：637-40；Duncan等人，1988,Nature 332：563-564；Lund等人，1991,J.Immunol.,147：2657-2662；Lund等人，1992,Mol.Immunol.,29：53-59；Alegre等人，1994,Transplantation 57：1537-1543；Hutchins等人，1995,Proc Natl.Acad Sci USA,92：11980-11984；Jefferis等人，1995,Immunol.Lett.,44：111-117；Lund等人，1995,Faseb J.,9：115-119；Jefferis等人，1996,Immunol Lett.,54：101-104；Lund等人，1996,J.Immunol.,157：4963-4969；Armour等人，1999,Eur.J.Immunol.29：2613-2624；Idusogie等人，2000,J.Immunol.,164：4178-4184；Reddy等人，2000,J.Immunol.,164：1925-1933；Xu等人，2000,Cell Immunol.,200：16-26；Idusogie等人，2001,J.Immunol.,166：2571-2575；Shields等人，2001,J Biol.Chem.,276：6591-6604；Jefferis等人，2002,Immunol Lett.,82：57-65；Presta等人，2002,Biochem Soc Trans.,30：487-490)；美國專利第5,624,821號、第5,885,573號、第5,677,425號、第6,165,745號、第6,277,375號、第5,869,046號、第6,121,022號、第5,624,821號、第5,648,260號、第6,528,624號、第6,194,551號、第6,737,056號、第6,821,505號、第6,277,375號；美國專利公開案第2004/0002587號及PCT公開案WO 94/29351、WO 99/58572、WO 00/42072、WO 02/060919、WO 04/029207、WO 04/099249及WO 04/063351，該等文獻揭示例示性Fc變異體。本發明亦涵蓋包含缺失、添加及/或修飾之Fc區。Fc結構域之再其他修飾/取代/添加/缺失對熟習此項技術者應顯而易見。
替代地或另外，可能適用於組合胺基酸修飾與一或多個其他胺基酸修飾，從而改變抗原結合分子Fc區之C1q結合及/或補體依賴性細胞毒性(CDC)功能。尤其相關之起始多肽可為結合C1q且顯示補體依賴性細胞毒性之多肽。可對預先存在C1q結合活性、視情況更能夠介導CDC之多肽進行修飾，從而增強此等活性之一或兩者。改變C1q及/或修飾其補體依賴性細胞毒性功能之胺基酸修飾描述於例如WO0042072中，該案以引用之方式整體併入在此。
用於產生非天然存在之Fc區的方法在此項技術中為已知的。舉例而言，可藉由諸多誘變方法來產生胺基酸取代及/或缺失，包括但不限於定點誘變(例如，Kunkel,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82：488-492(1985))、PCR誘變(例如，Higuchi,「PCR Protocols：A Guide to Methods and Applications」,Academic Press,San Diego，第177-183頁(1990))及卡匣誘變(例如，Wells等人，Gene,34：315-323(1985))。較佳藉由重疊延伸PCR方法(例如，Higuchi,「PCR Technology：Principles and Applications for DNA Amplification」,Stockton Press,New York，第61-70頁(1989))來進行定點誘變。適用於產生變異Fc區之其他例示性方法在此項技術中為已知的(參見例如美國專利第5,624,821號、第5,885,573號、第5,677,425號、第6,165,745號、第6,277,375號、第5,869,046號、第6,121,022號、第5,624,821號、第5,648,260號、第6,528,624號、第6,194,551號、第6,737,056號、第6,821,505號、第6,277,375號；美國專利公開案第2004/0002587號；及PCT公開案WO 94/29351、WO 99/58572、WO 00/42072、WO 02/060919、WO 04/029207、WO 04/099249、WO 04/063351，各案之全部內容以引用之方式併入本文中)。
在一些態樣中，Fc變異蛋白包含一或多種工程改造之糖型，亦即，共價附接至包含Fc區之分子的碳水化合物組合物。工程改造之糖型可能適用於多種目的，包括但不限於增強或降低效應功能。可藉由本文中所揭示之方法及熟習此項技術者已知的任何方法來產生工程改造之糖型，例如藉由使用工程改造或變異之表現品系、藉由使用影響糖基化之生長條件或培養基、藉由與一或多種酶(例如DI N-乙醯基葡萄糖胺基轉移酶III(GnTIII))共同表現、藉由在不同的生物體或來自於不同的生物體的細胞株中表現包含Fc區之分子或藉由在已表現包含Fc區之分子之後修飾碳水化合物。用於產生工程改造之糖型的方法在此項技術中為已知的，且包括但不限於以下文獻中所描述之彼等方法：Umana等人，1999,Nat.Biotechnol.,17：176-180；Davies等人，20017 Biotechnol Bioeng.,74：288-294；Shields等人，2002,J Biol.Chem.,277：26733-26740；Shinkawa等人，2003,J Biol.Chem.,278：3466-3473)；美國專利第6,602,684號；美國申請案序號第10/277,370號；美國申請案序號第10/113,929號；PCT WO 00/61739A1；PCT WO 01/292246A1；PCT WO 02/311140A1；PCT WO 02/30954A1；PotelligentTM技術(Biowa,Inc.，Princeton，N.J.)；GlycoMAbTM糖基化工程改造技術(GLYCARTTM biotechnology AG，Zurich，Switzerland)。亦參見例如WO 00061739；EA01229125；US 20030115614；Okazaki等人，2004,JMB,336：1239-49。
在某些態樣中，具有工程改造之糖型的Fc變異蛋白含有附接至Fc區的缺乏岩藻糖之碳水化合物結構。此種變異體具有改良之ADCC功能。與「去岩藻糖基化」或「岩藻糖缺乏」抗體相關之公開案的實例包括：美國專利申請案第US 2003/0157108號(Presta,L.)及第US 2004/0093621號(Kyowa Hakko Kogyo Co.,Ltd)；US 2003/0157108；WO 2000/61739；WO 2001/29246；US 2003/0115614；US 2002/0164328；US 2004/0093621；US 2004/0132140；US 2004/0110704；US 2004/0110282；US 2004/0109865；WO 2003/085119；WO 2003/084570；WO 2005/035586；WO 2005/035778；W02005/053742；Okazaki等人，J.Mol.Biol.,336：1239-1249(2004)；Yamane Ohnuki等人，Biotech.Bioeng.,87：614(2004)。
舉例而言，WO 2003/011878(Jean-Mairet等人)及美國專利第6,602,684號(Umana等人)中提及附接至抗體Fc區之碳水化合物中具有二等分N-乙醯基葡萄糖胺(GlcNAc)之抗體。舉例而言，WO 1997/30087(Patel等人)中報導附接至抗體Fc區之寡糖中具有至少一個半乳糖殘基之抗體。關於具有附接至其Fc區之改變之碳水化合物的抗體，亦參見WO 1998/58964及WO 1999/22764(Raju,S.)。關於具有經修飾之糖基化的抗原結合分子，亦參見例如US 2005/0123546(Umana等人)。
產生去岩藻糖基化抗體之細胞株的非限制性實例包括缺乏蛋白質岩藻糖基化之Lec13 CHO細胞(Ripka等人，Arch.Biochem.Biophys.249：533-545(1986)；美國專利申請案第US 2003/0157108 AI號(Presta,L)；及WO 2004/056312 AI(Adams等人)，尤其在實例11中)；敲除細胞株，諸如敲除α-1,6-岩藻糖基轉移酶基因FUT8之CHO細胞(Yamane-Ohnuki等人，Biotech.Bioeng.,87：614(2004))；及藉由在細胞培養基中使用岩藻糖基化途徑抑制劑，諸如例如栗樹精胺(美國專利申請案第2009/0041765號)。
在某些實施例中，在表現β(1,4)-N-乙醯基葡萄糖胺基轉移酶III(GnT III)之細胞中表現本發明之抗體，以便GnT III將GlcNAc添加至人類工程改造之抗原特異性抗體。以此方式產生抗體之方法提供於WO/9954342、WO/03011878、專利公開案20030003097A1及Umana等人，Nature Biotechnology,17：176-180,1999年2月中。
改變抗體Fc區之糖基化模式的另一種方法為藉由胺基酸取代。Fc區之糖基化為例如N連接或O連接的。
N連接一般係指碳水化合物部分附接至天冬醯胺酸殘基之側鏈。碳 水化物部分酶促附接至天冬醯胺酸側鏈肽序列之識別序列為天冬醯胺酸-X-絲胺酸及天冬醯胺酸-X-蘇胺酸，其中X為除脯胺酸以外之任何胺基酸。因而，多肽中存在此等肽序列中之任一者均產生潛在糖基化位點。
O連接之糖基化一般係指糖N-乙醯基半乳糖胺、半乳糖或木糖之一附接至羥基胺基酸，最通常為絲胺酸或蘇胺酸，但亦可使用5-羥基脯胺酸或5-羥基離胺酸。
可改變抗體或其片段之糖基化模式，例如，藉由缺失多肽中所發現之一或多個糖基化位點及/或添加一或多個多肽中不存在之糖基化位點。移除抗體或抗體片段之Fc區中的糖基化位點係藉由改變胺基酸序列以使其消除以上所描述之三肽序列中的一或多個而便利地實現(對於N連接之糖基化位點)。
例示性糖基化變異體具有重鏈殘基N297至A297之胺基酸取代(EU編號系統)。亦可藉由用絲胺酸或蘇胺酸以外之任何胺基酸取代一或多個糖基化絲胺酸或蘇胺酸殘基來達成移除O連接之糖基化位點。
E.功能等效物、抗體變異體及衍生物
功能等效物更包括具有與整抗體或完整抗體相同或相當之結合特徵的抗體片段。此種片段可含有Fab片段或F(ab')2片段之一或兩者。該等抗體片段較佳含有整抗體之所有六個互補性決定區，但含有少於所有此種區域，諸如一、二、三、四或五個CDR之片段亦具有功能。此外，功能等效物可為或可組合以下免疫球蛋白類別中之任一種的成員：IgG、IgM、IgA、IgD或IgE，及其子類。
在本發明之某些態樣中，可修飾抗MET抗體以產生融合蛋白質；亦即，與異源蛋白質、多肽或肽融合之抗體或片段。在某些態樣中，與抗MET抗體之該部分融合的蛋白質為ADEPT之酶組分。可工程改造為與抗MET抗體之融合蛋白質的其他蛋白質或多肽的實例包括但不限於毒素，諸如篦麻毒素、相 思子毒素、核糖核酸酶、DNase I、葡萄球菌腸毒素-A、美洲商陸抗病毒蛋白質、白樹毒素、白喉毒素毒素、假單胞菌外毒素及假單胞菌內毒素。參見例如Pastan等人，Cell,47：641(1986)；及Goldenberg等人，Cancer Journal for Clinicians,44：43(1994)。可使用之酶活性毒素及其片段包括但不限於白喉(diphtheria)A鏈、白喉毒素之非結合活性片段、外毒素A鏈(來自於綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa))、篦麻毒素(ricin)A鏈、相思子毒素(abrin)A鏈、蒴蓮根毒素(modeccin)A鏈、α-帚麴菌素(alpha-sarcin)、油桐(Aleurites fordii)蛋白、香石竹(dianthin)蛋白、美洲商陸(Phytolaca americana)蛋白(PAPI、PAPII及PAP-S)、苦瓜(momordica charantia)抑制劑、麻瘋樹毒素(curcin)、巴豆毒素(crotin)、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制劑、白樹毒素、米托黴素(mitogellin)、侷限麴菌素(restrictocin)、酚黴素(phenomycin)、伊諾黴素(enomycin)及單端孢黴烯類(tricothecenes)。非限制性實例包括在例如1993年10月28日公開之WO 93/21232中，該案以引用之方式整體併入本文中。
可藉由基因改組、基元改組、外顯子改組及/或密碼子改組技術(統稱為「DNA改組」)來產生其他融合蛋白質。可採用DNA改組來改變抗體或其片段(例如，具有較高親和力及較低解離速率之抗體或其片段)之活性。一般參見美國專利第5,605,793號、第5,811,238號、第5,830,721號、第5,834,252號及第5,837,458號；及Patten等人，1997,Curr.Opinion Biotechnol.,8：724-33；Harayama,1998,Trends Biotechnol.,16(2)：76-82；Hansson等人，1999,J.Mol.Biol.,287：265-76；以及Lorenzo及Blasco,1998,Biotechniques,24(2)：308-313，各文獻以引用之方式整體併入在此。抗體可進一步為如頒予Ledbetter等人之美國公開案20030118592、美國公開案200330133939及PCT公開案WO 02/056910中所描述之結合結構域免疫球蛋白融合蛋白，各案均以引用之方式整體併入本文中。
結構域抗體. 本發明之組合物及方法之抗MET抗體可為結構域抗 體，例如含有對應於人類抗體重鏈可變區(VH)或輕鏈可變區(VL)之抗體小功能結合單元的抗體。結構域抗體之實例包括但不限於可得自Domantis Limited(Cambridge，UK)及Domantis Inc.(Cambridge，Mass.，USA)之對治療標靶具有特異性之彼等結構域抗體(參見例如WO04/058821、WO04/003019、美國專利第6,291,158號、第6,582,915號、第6,696,245號及第6,593,081號)。可使用市售結構域抗體庫來鑑定抗MET結構域抗體。在某些態樣中，本發明之抗MET抗體包含MET功能結合單元及Fcγ受體功能結合單元。
雙功能抗體. 術語「雙功能抗體」係指具有兩個抗原結合位點之小抗體片段，該等片段包含與輕鏈可變域(VL)連接在同一多肽鏈(VH-VL)中之重鏈可變域(VH)。藉由使用因過短而不允許在同一鏈上之兩個結構域之間進行配對的連接子，迫使該等結構域與另一鏈之互補結構域配對並且產生兩個抗原結合位點。雙功能抗體更充分描述於例如以下文獻中：EP 404,097；WO 93/11161；及Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448(1993)。
疫苗抗體. 在本發明之某些態樣中，抗MET抗體為疫苗抗體。疫苗抗體為二聚多肽。疫苗抗體之各單體由對APC上之表面分子具有特異性之scFv經由鉸鏈區及Cg3結構域連接至第二scFv組成。在本發明之其他態樣中，可使用含有抗MET抗體片段作為scFv之一的疫苗抗體毗鄰欲破壞之B細胞及介導ADCC之效應細胞。舉例而言，參見Bogen等人，美國專利申請公開案第20040253238號。
線性抗體. 在本發明之某些態樣中，抗MET抗體為線性抗體。線性抗體包含形成抗原結合區配對之串聯Fd區段(VH-CH1-VH-CH1)配對。線性抗體可為雙特異性或單特異性的。線性抗體之非限制性實例揭示於例如Zapata等人，Protein Eng.,8(10)：1057-1062(1995)中。
親本抗體. 在本發明之某些態樣中，抗MET抗體為親本抗體。「親 本抗體」為包含與如本文中所揭示之改變/突變抗體相比在其一或多個高變區中或相鄰處缺乏或缺少一或多個胺基酸殘基的胺基酸序列的抗體。因而，親本抗體具有比本文中所揭示之抗體突變體之相應高變區短的高變區。親本多肽可包含天然序列(亦即，天然存在)抗體(包括天然存在之對偶基因變異體)或具有天然存在之序列的預先存在之胺基酸序列修飾(諸如其他***、缺失及/或取代)的抗體。親本抗體較佳為人類化抗體或人類抗體。
抗體片段. 「抗體片段」包含全長抗體之一部分，一般為其抗原結合或可變區。抗體片段之實例尤其包括Fab、Fab'、F(ab')2及Fv片段；雙功能抗體；線性抗體；單鏈抗體分子；單一Fab臂「單臂」抗體；及由抗體片段形成之多特異性抗體。
按傳統，片段係經由完整抗體之蛋白水解消化而獲得(參見例如Morimoto等人，Journal of Biochemical and Biophysical Methods,24：107-117(1992)；及Brennan等人，Science,229：81(1985))。然而，現可由重組宿主細胞直接產生片段。舉例而言，可如本文中所論述自抗體噬菌體庫中分離抗體片段。替代地，可自大腸桿菌中直接回收Fab'-SH片段且化學偶聯以形成F(ab')2片段(Carter等人，Bio Technology,10：163-167(1992))。根據另一種方法，可自重組宿主細胞培養物中直接分離F(ab')2片段。可藉由產生Fc「杵及臼」突變，使得可在含有存在完全二聚Fc區之單一Fab臂的細菌或哺乳動物宿主中表現所得分子來產生單一Fab臂「單臂」抗體(Merchant等人，Nat.Biotechnol.,1998年7月，16(7)：677-81；WO 2005/063816 A2)。鑒於本說明書中之詳細教示內容，用於產生抗體片段之其他技術對熟習此項技術者為顯而易見的。在其他態樣中，所選抗體為單鏈Fv片段(scFv)。參見例如WO 93/16185。在某些態樣中，抗體不為Fab片段。
雙特異性抗體. 雙特異性抗體為對至少兩個不同的抗原決定基具有 結合特異性之抗體。例示性雙特異性抗體可結合MET之兩個不同的抗原決定基。其他此種抗體可結合MET且進一步結合第二抗原。替代地，可將MET結合臂與結合白血球上之觸發分子，諸如T細胞受體分子(例如CD2或CD3)或IgG之Fc受體(FcγR)的臂組合，以便使細胞防衛機制聚焦於標靶。亦可使用雙特異性抗體將細胞毒性劑定位至標靶處。此等抗體具有細胞標記物結合臂及結合細胞毒性劑(例如肥皂草素、抗干擾素α、長春花生物鹼、篦麻毒素A鏈、胺甲喋呤或放射性同位素半抗原)之臂。雙特異性抗體可製備為全長抗體或抗體片段(例如F(ab')：雙特異性抗體)。
用於製造雙特異性抗體之方法在此項技術中為已知的。參見例如Millstein等人，Nature,305：537-539(1983)；Traunecker等人，EMBO J.,10：3655-3659(1991)；Suresh等人，Methods in Enzymology,121：210(1986)；Kostelny等人，J.Immunol.,148(5)：1547-1553(1992)；Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90：6444-6448(1993)；Gruber等人，J.Immunol.,152：5368(1994)；美國專利第4,474,893號、第4,714,681號、第4,925,648號、第5,573,920號、第5,601,81號、第95,731,168號、第4,676,980號及第4,676,980號、WO 94/04690、WO 91/00360、WO 92/200373、WO 93/17715、WO 92/08802、EP 03089及US 2009/0048122。
在本發明之某些態樣中，該等組合物及方法包含對人類MET及T細胞受體之CD3 ε鏈具有特異性的雙特異性鼠類抗體或其片段及/或其結合物，諸如Daniel等人，Blood,92：4750-4757(1998)所描述之雙特異性抗體。在較佳態樣中，在本發明組合物及方法之抗MET抗體或其片段及/或其結合物為雙特異性的時，該抗MET抗體為人類或人類化的，且對人類MET及T細胞上之抗原決定基具有特異性，或能夠結合人類效應細胞，諸如例如單核細胞/巨噬細胞及/或天然殺手細胞以影響細胞死亡。
F.抗體結合親和力
本發明之抗體以大範圍之親和力(KD)結合人類MET。在一較佳態樣中，本發明之至少一種mAb可視情況以高親和力結合人類抗原。舉例而言，人類或人類工程改造或人類化或表面重整mAb可以等於或小於約10-7M，諸如但不限於0.1-9.9(或其中之任何範圍或值)×10-7、10-8、10-9、10-10、10-11、10-12、10-13、10-14、10-15或其中之任何範圍或值的KD結合人類抗原，如藉由熟習此項技術者實施之基於流式細胞術之分析法、酶聯免疫吸附分析法(ELISA)、表面電漿子共振(SPR)或KinExA®方法所測定。抗MET抗體以約10-9M或更低、更特定言之約10-9至10-10M之Kd結合。
抗體對抗原之親和力或親合力可使用此項技術中所熟知的任何適合方法以實驗測定，例如，流式細胞術、酶聯免疫吸附分析法(ELISA)或放射免疫分析法(RIA)或動力學(例如BIACORETM分析)。可容易地採用直接結合分析法以及競爭性結合分析形式。(參見例如Berzofsky等人，「Antibody-Antigen Interactions」,Fundamental Immunology,Paul,W.E.編，Raven Press：New York,N.Y.(1984)；Kuby,Janis Immunology,W.H.Freeman and Company：New York,N.Y.(1992)；以及其中所描述之方法。若在不同的條件(例如，鹽濃度、pH值、溫度)下量測，則特定抗體-抗原相互作用之量測親和力可變化。因而，親和力及其他抗原結合參數(例如，KD或Kd、Kon、Koff)之量測較佳用抗體及抗原之標準化溶液及如此項技術中已知且諸如本文中所描述之緩衝液的標準化緩衝液來進行。
在一個態樣中，可使用流式細胞術對表面上表現MET抗原之細胞進行結合分析。舉例而言，可使用1×105個細胞/樣品在100μL FACS緩衝液(補充有2%正常山羊血清之RPMI-1640培養基)中將此種MET陽性細胞與不同濃度之抗MET抗體一起培育。隨後，可使細胞球粒化，洗滌，且與100μL FITC結合 之山羊抗小鼠IgG抗體(諸如可獲自Jackson ImmunoResearch)一起於FACS緩衝液中培育1小時。隨後再次將細胞球粒化，用FACS緩衝液洗滌且再懸浮於含有1%甲醛之200μL PBS中。例如使用具有HTS多孔取樣器之FACSCalibur流式細胞儀獲取樣品，且使用CellQuest Pro加以分析(均來自BD Biosciences，San Diego，US)。對於各樣品，輸出FL1之平均螢光強度(MFI)且針對抗體濃度繪於半對數圖中以產生結合曲線。將蛇形劑量反應曲線針對結合曲線進行擬合，且使用諸如GraphPad Prism v4之程式以缺省參數(GraphPad軟體，San Diego，CA)計算EC50值。EC50值可用作各抗體之表觀解離常數「Kd」或「KD」的量度。
在本發明之某些態樣中，可修飾抗MET抗體以改變其對MET及其抗原片段之結合親和力。可藉由此項技術中已知的多種試管內分析方法，例如酶聯免疫吸附分析法(ELISA)或放射免疫分析法(RIA))或動力學(例如BIACORETM分析)來測定結合性質。一般應理解，具有低KD之結合分子較佳。
在本發明之一個態樣中，抗體或抗體片段以小於10-5M，或小於10-6M，或小於10-7M，或小於10-8M，或小於10-9M，或小於10-10M，或小於10-11M，或小於10-12M，或小於10-13M之解離常數或KD或Kd(koff/kon)特異性結合MET及其抗原片段。
在另一態樣中，本發明之抗體或片段以小於1×10-3 s-1，或小於3×10-3 s-1之Koff結合MET及/或其抗原片段。在其他態樣中，該抗體以小於10-3 s-1、小於5×10-3 s-1、小於10-4 s-1、小於5×10-4 s-1、小於10-5 s-1、小於5×10-5 s-1、小於10-6 s-1、小於5×10-6 s-1、小於10-7 s-1、小於5×10-7 s-1、小於10-8 s-1、小於5×10-8 s-1、小於10-9 s-1、小於5×10-9 s-1或小於10-10 s-1之Koff結合HGFR及其抗原片段。
在另一態樣中，本發明之抗體或片段以至少105 M-1 s-1、至少5×105 M-1 s-1、至少106 M-1 s-1、至少5×106 M-1 s-1、至少107 M-1 s-1、至少5×107 M-1 s-1，或至少108 M-1 s-1，或至少109 M-1 s-1之締合速率常數或kon速率結合MET及/ 或其抗原片段。
熟習此項技術者應理解，本發明之結合物可與本文中所描述之彼等結合物具有相同的性質。
G.抗體pI及Tm
在本發明之某些態樣中，可修飾抗MET抗體以改變其等電點(pI)。如同所有多肽，抗體具有pI，一般定義為多肽不攜帶淨電荷時之pH值。此項技術中已知，當溶液pH值等於蛋白質之等電點(pI)時，蛋白質溶解度通常最低。如本文中所使用，pI值定義為主要電荷形式之pI。可藉由多種方法來測定蛋白質之pI，包括但不限於等電聚焦及不同的電腦算法(參見例如Bjellqvist等人，1993,Electrophoresis,14：1023)。另外，抗體Fab結構域之熱熔融溫度(Tm)可為抗體熱穩定性之良好指標，且可進一步提供儲架壽命之指示。Tm愈低，指示聚集程度愈大/穩定性愈低，而Tm愈高，指示聚集程度愈小/穩定性愈高。因而，在某些態樣中，具有較高Tm之抗體較佳。可使用此項技術中已知的任何標準方法來量測蛋白質結構域(例如Fab結構域)之Tm，例如藉由差示掃描量熱術(參見例如Vermeer等人，2000,Biophys.J.78：394-404；Vermeer等人，2000,Biophys.J.79：2150-2154)。
相應地，本發明之額外非排他性態樣包括具有某些較佳生物化學特徵，諸如特定等電點(pI)或熔融溫度(Tm)的經修飾之抗體。
II.聚核苷酸、載體、宿主細胞及重組方法
本發明進一步提供包含編碼本發明抗體或其抗原決定基結合片段之核苷酸序列的聚核苷酸。
亦提供編碼如以上所描述之此種抗MET抗體的聚核苷酸。
亦提供一種聚核苷酸，其與編碼或轉錄由雜交瘤247.27.16、247.2.26、247.48.38、247.3.14、247.22.2、248.69.4及247.16.8產生之抗體的重 鏈可變區中之任一者的胺基酸序列的聚核苷酸具有至少約10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性；及/或(b)一種聚核苷酸，其與編碼或轉錄由雜交瘤247.27.16、247.2.26、247.48.38、247.3.14、247.22.2、248.69.4及247.16.8產生之抗體的輕鏈可變區中之任一者的胺基酸序列的聚核苷酸具有至少約10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性。
本發明提供一種聚核苷酸，其編碼包含選自由SEQ ID NO：55-72組成之群的序列的多肽。本發明進一步提供一種聚核苷酸，其包含選自以下表5及表6中所示之序列的人類化可變區DNA序列。
亦提供一種聚核苷酸，其與表5中之序列(SEQ ID NO：55-67)具有至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性。在特定實施例中，亦提供一種聚核苷酸，其與以下序列具有至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性：
亦提供一種聚核苷酸，其與表6中之序列(SEQ ID NO：68-72)具有至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性。在特定實施例中，亦提供一種聚核苷酸，其與以下序列具有至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性：SEQ ID NO：68及/或72 SEQ ID NO：69及/或72 SEQ ID NO：68及/或71 SEQ ID NO：69及/或71 SEQ ID NO：68及/或70 SEQ ID NO：69及/或70 SEQ ID NO：68及/或109 SEQ ID NO：68及/或110 SEQ ID NO：68及/或111 SEQ ID NO：68及/或112 SEQ ID NO：68及/或113 SEQ ID NO：68及/或114 SEQ ID NO：68及/或115 SEQ ID NO：68及/或116
在一個實施例中，該聚核苷酸具有序列SEQ ID NO：68及SEQ ID NO：114。
本發明進一步提供上文所描述之編碼聚核苷酸的變異體，例如片段、類似物及衍生物。
聚核苷酸變異體可在編碼區、非編碼區或兩者中含有變化。在一些實施例中，聚核苷酸變異體含有產生沉默取代、添加或缺失但不改變所編碼之多肽的性質或活性的變化。在一些實施例中，由於基因密碼簡併而藉由沉默取代來產生核苷酸變異體。可出於多種原因而產生聚核苷酸變異體，例如，以最佳化特定宿主之密碼子表現(人類mRNA中之密碼子變成諸如大腸桿菌之細菌宿主優選之密碼子)。
本發明亦涵蓋編碼可結合MET且在嚴格雜交條件下與編碼本發明 抗體之聚核苷酸雜交的多肽的聚核苷酸，其中該等嚴格雜交條件包括：在60℃下在6×SSC、0.5% SDS、5×丹哈特氏溶液及100μg/ml熱變性鮭魚***DNA中預雜交2小時；在60℃下雜交18小時；在60℃下在4×SSC、0.5% SDS、0.1%焦磷酸鈉中進行兩次30分鐘洗滌，且在60℃下在2×SSC、0.1% SDS中進行兩次30分鐘洗滌。
可使用此項技術中已知的方法獲得聚核苷酸並且測定聚核苷酸之核苷酸序列。舉例而言，若抗體之核苷酸序列為已知的，則可由化學合成之寡核苷酸來組裝編碼該抗體之聚核苷酸(例如，如Kutmeier等人，1994,BioTechniques 17：242中所描述)，簡而言之，其包括合成含有編碼該抗體之序列之一部分的重疊寡核苷酸，黏接並連結彼等寡核苷酸，且隨後藉由PCR來擴增已連結之寡核苷酸。
用於構建含有抗體編碼序列以及適當轉錄及轉譯控制信號之重組載體的方法在此項技術中為熟知的。一旦已重組表現本發明之抗體分子後，便可藉由此項技術中已知的用於純化免疫球蛋白分子之任何方法，例如藉由層析法(例如離子交換、親和力(特定言之，藉由在蛋白A之後對特定抗原之親和力)及粒度分級管柱層析法)、離心、差異性溶解度或藉由用於純化蛋白質之任何其他標準技術對其進行純化。就此而言，本發明中已參考美國專利第7,538,195號，該案之教示內容以引用之方式整體併入在此。
在另一態樣中，可藉由側接一組特定CDR之可變及恆定區序列內的突變、缺失及/或***而容易地產生不同的抗體及抗體片段以及抗體模擬物。因而，舉例而言，對於一組指定CDR，藉由取代不同的重鏈，由此例如可產生IgG1-4、IgM、IgA1-2、IgD、IgE抗體類型及同型，可能獲得不同類別之抗體。類似地，可藉由將一組指定CDR嵌入完全合成之構架內而產生本發明範疇內之人工抗體。術語「可變」在本文中用於描述可變域之某些部分在序列方面因抗 體而各異且用於各特定抗體對其抗原之結合及特異性。然而，可變性通常並非均勻分佈在抗體之可變域中。其通常集中於輕鏈及重鏈可變域兩者中稱為互補性決定區(CDR)或高變區之三個區段內。可變域中更高度保守之部分稱為構架區(FR)。重鏈及輕鏈之可變域各包含主要採用β片構形之四個構架區，由三個CDR連接，由此形成連接β-片結構且在一些情況下形成β片結構之一部分的環。各鏈中之CDR由FR區維持緊密鄰近，且與來自於另一鏈之CDR一起促成抗體抗原結合位點之形成(參見例如E.A.Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，1991,NIH)。恆定域不直接參與抗體與抗原之結合，而是展現不同的效應功能，諸如抗體參與抗體依賴性細胞毒性。
可使用若干技術，諸如表面重整及CDR移植來產生人類化抗體或經改適以便其他哺乳動物不排斥之抗體。在表面重整技術中，組合分子模型化、統計分析及誘變將可變區之非CDR表面調節至類似於靶宿主之已知抗體的表面。用於對抗體進行表面重整之策略及方法以及用於降低抗體在不同的宿主內之免疫原性的其他方法揭示於例如美國專利5,639,641中，該專利以引用之方式整體併入在此。在CDR移植技術中，將鼠類重鏈及輕鏈CDR移植至完全人類構架序列中。
本發明亦包括本說明書中所描述之抗體的功能等效物。功能等效物具有與該等抗體之結合特徵相當的結合特徵，且包括例如嵌合化、人類化及單鏈抗體以及其片段。產生此種功能等效物之例示性方法揭示於PCT申請案WO 93/21319、歐洲專利申請案第239,400號、PCT申請案WO 89/09622、歐洲專利申請案338,745及歐洲專利申請案EP 332,424中，各案分別以引用之方式整體併入。
功能等效物包括具有與本發明抗體之可變區或高變區之胺基酸序列實質上相同的胺基酸序列的多肽。「實質上相同」在應用於胺基酸序列時在本 文中定義為與另一胺基酸序列具有至少約90%且更佳至少約95%、96%、97%、98%及99%序列一致性的序列，如藉由根據Pearson及Lipman,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85,2444-2448(1988)之FASTA查找法所確定。
嵌合抗體較佳可具有實質上或排他性地來源於人類抗體恆定區之恆定區及實質上或排他性地來源於除人類以外之哺乳動物的可變區序列的可變區。可藉由將例如小鼠抗體之互補性決定區(CDR)取代至人類構架結構域中來產生抗體之人類化形式，例如PCT公開案第WO92/22653號。人類化抗體較佳可具有除實質上或排他性地來源於相應人類抗體區域之恆定區及可變區以及實質上或排他性地來源於除人類以外之哺乳動物的CDR。
功能等效物亦包括單鏈抗體片段，亦稱為單鏈抗體(scFv)。此等片段含有在存在或不存在一或多個互連連接子之情況下繫拴至抗體可變輕鏈序列(VL)之至少一個片段的抗體可變重鏈胺基酸序列(VH)之至少一個片段。此種連接子可為選擇用於確保(VL)及(VH)結構域在連接後發生適當三維摺疊，以便維持單鏈抗體片段所來源之整抗體的靶分子結合特異性的短可撓性肽。一般而言，(VL)或(VH)序列之羧基末端可由此種肽連接子共價連接至互補(VL)及(VH)序列之胺基酸末端。可藉由分子選殖、抗體噬菌體呈現庫或類似技術來產生單鏈抗體片段。可在真核細胞或原核細胞，包括細菌中產生此等蛋白質。
單鏈抗體片段可含有具有本說明書中所描述之完整抗體之可變區或互補性決定區(CDR)中之至少一者但缺乏彼等抗體之一些或所有恆定域的胺基酸序列。此等恆定域對於抗原結合並非必需的，但構成完整抗體結構之主要部分。單鏈抗體片段可因此克服與使用含有一部分或所有恆定域之抗體相關的一些問題。舉例而言，單鏈抗體片段傾向於不含生物分子與重鏈恆定區之間的不合需要之相互作用或其他不需要之生物活性。另外，單鏈抗體片段顯著小於完整抗體或整抗體，且可因此具有比完整抗體更大之毛細血管滲透性，從而允許 單鏈抗體片段更有效地定位並結合至靶抗原結合位點。亦可以相對較大之規模在原核細胞中產生抗體片段，因而促進其產生。此外，單鏈抗體片段之相對較小尺寸使其在接受者中激起免疫反應之可能性比完整抗體更小。
對本文中所描述之抗MET抗體及其表面重整或人類化變異體之胺基酸及核酸序列的知識可用於開發許多亦結合人類MET之抗體。若干研究已調查基於一級抗體序列之知識在抗體序列中不同的位置上引入一或多個胺基酸變化對其性質，諸如結合及表現水準的影響(例如Yang,W.P.等人，1995,J.Mol.Biol.,254,392-403；Rader,C.等人，1998,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,95,8910-8915；Vaughan,T.J.等人，1998,Nature Biotechnology,16,535-539)。
在此等研究中，已藉由使用諸如寡核苷酸介導之定點誘變、卡匣誘變、易出錯PCR、DNA改組或大腸桿菌突變菌株之方法來改變CDR1、CDR2、CDR3或構架區中之重鏈及輕鏈基因序列而產生一級抗體之變異體(Vaughan,T.J.等人，1998,Nature Biotechnology,16,535-539；Adey,N.B.等人，1996，第16章，第277-291頁，「Phage Display of Peptides and Proteins」,Kay,B.K.等人編，Academic Press)。此等改變一級抗體序列之方法已改良二級抗體之親和力(例如Gram,H.等人，1992,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89,3576-3580；Boder,E.T.等人，2000,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,97,10701-10705；Davies,J.及Riechmann,L.,1996,Immunotechnolgy,2,169-179；Thompson,J.等人，1996,J.Mol.Biol.,256,77-88；Short,M.K.等人，2002,J.Biol.Chem.,277,16365-16370；Furukawa,K.等人，2001,J.Biol.Chem.,276,27622-27628)。
藉由改變抗體之一或多個胺基酸殘基的類似定向策略，可使用本發明中所描述之抗體序列來開發具有改良之功能的抗MET抗體，諸如專利申請公開案20090246195中所描述之彼等方法，該案之內容以引用之方式整體併入本文中。
III.免疫結合物
在一個態樣中，本發明係關於包含本文中所描述之MET結合劑(例如抗MET抗體或其抗體片段)與本文中所描述之細胞毒性劑結合或共價連接的免疫結合物。細胞毒性劑包括不利於細胞的任何藥劑，諸如例如假單胞菌外毒素、白喉毒素、肉毒毒素A至肉毒毒素F、篦麻毒素、相思子毒素、肥皂草素及此種藥劑之細胞毒性片段。細胞毒性劑亦包括對預防性或治療性地治療病症具有治療效應之任何藥劑。此種治療劑可為化學治療劑、蛋白質或多肽治療劑，且包括具有所要生物活性及/或調節指定生物反應之治療劑。治療劑之實例包括烷基化劑、血管生成抑制劑、抗有絲***劑、激素治療劑及適用於治療細胞增殖病症之抗體。在某些實施例中，治療劑為類美登素化合物，諸如美國專利第5,208,020號及第7,276,497號中所描述之彼等類美登素化合物，該等專利以引用之方式整體併入本文中。在某些實施例中，治療劑為苯并二氮呯化合物，諸如吡咯并苯并二氮呯(PBD)(諸如WO2010/043880、WO2011/130616、WO2009/016516、WO 2013/177481及WO 2012/112708中所描述之彼等吡咯并苯并二氮呯)及吲哚啉并苯并二氮呯(IGN)化合物(諸如WO/2010/091150及WO 2012/128868以及2016年6月28日申請之標題為「CONJUGATES OF CYSTEINE ENGINEERED ANTIBODIES」之美國申請案第15/195,269號中所描述之彼等吲哚啉并苯并二氮呯)。所有此等專利、專利公開案及申請案之全部教示內容均以引用之方式整體併入本文中。
如本文中所使用，「吡咯并苯并二氮呯」(PBD)化合物為具有吡咯并苯并二氮呯核心結構之化合物。吡咯并苯并二氮呯可經取代或未經取代。其亦包括具有由連接子連接之兩個吡咯并苯并二氮呯核心的化合物。可還原作為吲哚啉并苯并二氮呯核心之一部分的亞胺官能基(-C=N-)。
在某些實施例中，吡咯并苯并二氮呯化合物包含由 表示之核心結構，其可視情況經取代。
在某些實施例中，吡咯并苯并二氮呯化合物包含由表示之核心結構，其可視情況經取代。
如本文中所使用，「吲哚啉并苯并二氮呯」(IGN)化合物為具有吲哚啉并苯并二氮呯核心結構之化合物。吲哚啉并苯并二氮呯可經取代或未經取代。其亦包括具有由連接子連接之兩個吲哚啉并苯并二氮呯核心的化合物。可還原作為吲哚啉并苯并二氮呯核心之一部分的亞胺官能基(-C=N-)。
在某些實施例中，吲哚啉并苯并二氮呯化合物包含由 表示之核心結構，其可視情況經取代。
在某些實施例中，吲哚啉并苯并二氮呯化合物包含由 表示之核心結構，其可經進一步取代。
可使用此項技術中已知的技術使細胞毒性劑直接或經由連接子間接地偶聯或結合至MET結合劑，以產生「免疫結合物」、「結合物」或「ADC」。
A.例示性免疫結合物
在第一實施例中，本發明之免疫結合物包含本文中所描述之MET結合劑(例如，抗MET抗體或其抗體片段)，其係經由位於該MET結合劑上之一或多個離胺酸殘基之ε-胺基共價連接至本文中所描述之細胞毒性劑。
在第一實施例之第一特定實施例中，本發明之免疫結合物係由下式表示： 其中：CBA為上文所描述之MET結合劑(例如，抗MET抗體或其抗體片段)，其經由離胺酸殘基共價連接至CyL1；WL為1至20之整數；且CyL1為由以下各式表示之細胞毒性化合物： ；或 或其醫藥學上可接受之鹽，其中：介於N與C之間的雙線表示單鍵或雙鍵，限制條件為當其為雙鍵時，X不存在且Y為-H或(C1-C4)烷基；並且當其為單鍵時，X為-H或胺保護部分，且Y為-OH或-SO3H或其醫藥學上可接受之鹽；W'為-NRe'； Re'為-(CH2-CH2-O)n-Rk；n為2至6之整數；Rk為-H或-Me；Rx3為(C1-C6)烷基；L'係由以下各式表示：-NR5-P-C(=O)-(CRaRb)m-C(=O)-(B1')；或-NR5-P-C(=O)-(CRaRb)m-S-Zs1-(B2')；R5為-H或(C1-C3)烷基；P為胺基酸殘基或含有介於2至20個之間的胺基酸殘基的肽；Ra及Rb在每次出現時各自獨立地為-H、(C1-C3)烷基或帶電取代基或可離子化基團Q；m為1至6之整數；且Zs1係選自以下各式中之任一者： ；及 其中q為1至5之整數。
在第二特定實施例中，對於式(L1)之結合物，CyL1係由式(L1a)或(L1a1)表示；且其餘變數如以上在第一特定實施例中所描述。
在第三特定實施例中，對於式(L1)之結合物，CyL1係由式(L1b)或(L1b1)表示；且其餘變數如以上在第一特定實施例中所描述。更特定言之，Rx3為(C2-C4)烷基。
在第四特定實施例中，對於式(L1)之結合物，CyL1係由式(L1a)表示；Ra及Rb均為H；R5為H或Me，且其餘變數如以上在第一特定實施例中所描述。
在第五特定實施例中，P為含有2至5個胺基酸殘基之肽；且其餘變數如以上在第一、第二或第四特定實施例中所描述。在一更特定實施例中，P係選自由以下各項組成之群：Gly-Gly-Gly、Ala-Val、Val-Ala、Val-Cit、Val-Lys、Phe-Lys、Lys-Lys、Ala-Lys、Phe-Cit、Leu-Cit、Ile-Cit、Trp、Cit、Phe-Ala、Phe-N9-甲苯磺醯基-Arg、Phe-N9-硝基-Arg、Phe-Phe-Lys、D-Phe-Phe-Lys、Gly-Phe-Lys、Leu-Ala-Leu、Ile-Ala-Leu、Val-Ala-Val、Ala-Leu-Ala-Leu(SEQ ID NO：74)、β-Ala-Leu-Ala-Leu(SEQ ID NO：75)、Gly-Phe-Leu-Gly(SEQ ID NO：76)、Val-Arg、Arg-Val、Arg-Arg、Val-D-Cit、Val-D-Lys、Val-D-Arg、D-Val-Cit、D-Val-Lys、D-Val-Arg、D-Val-D-Cit、D-Val-D-Lys、D-Val-D-Arg、D-Arg-D-Arg、Ala-Ala、Ala-D-Ala、D-Ala-Ala、D-Ala-D-Ala、Ala-Met、Met-Ala、Gln-Val、Asn-Ala、Gln-Phe及Gln-Ala。更特定言之，P為Gly-Gly-Gly、Ala-Val、Ala-Ala、Ala-D-Ala、D-Ala-Ala或D-Ala-D-Ala。
在第六特定實施例中，Q為-SO3H或其醫藥學上可接受之鹽；且其餘變數如以上在第一、第二、第四或第五特定實施例或其中所描述之任何更特定實施例中所描述。
在第七特定實施例中，該第一實施例之免疫結合物係由以下各式表示： 或其醫藥學上可接受之鹽，其中WL為1至10之整數；介於N與C之間的雙線表示單鍵或雙鍵，限制條件為當其為雙鍵時，X不存在且Y為-H；並且當其為單鍵時，X為-H且Y為-OH或-SO3H或其醫藥學上可接受之鹽。在一更特定實施例中，介於N與C之間的雙線表示雙鍵，X不存在且Y為-H。在另一更特定實施例中，介於N與C之間的雙線表示單鍵，X為-H且Y為-SO3H或其醫藥學上可接受之鹽。
在第八特定實施例中，該第一實施例之免疫結合物係由下式表示： 其中：CBA為上文所描述之MET結合劑(例如，抗MET抗體或其抗體片段)，其經由離胺酸殘基共價連接至CyL2；WL為1至20之整數；且CyL2為由以下各式表示之細胞毒性化合物： ；或 或其醫藥學上可接受之鹽，其中：介於N與C之間的雙線表示單鍵或雙鍵，限制條件為當其為雙鍵時，X不存在且Y為-H或(C1-C4)烷基；並且當其為單鍵時，X為-H或胺保護部分，且Y為-OH或-SO3H或其醫藥學上可接受之鹽；Rx1及Rx2獨立地為(C1-C6)烷基；Re為-H或(C1-C6)烷基；W'為-NRe'；Re'為-(CH2-CH2-O)n-Rk；n為2至6之整數；Rk為-H或-Me；Zs1係選自以下各式中之任一者： ；及 其中q為1至5之整數。
在第九特定實施例中，對於式(L2)之免疫結合物，CyL2係由式(L2a)或(L2a1)表示；且其餘變數如以上在第八特定實施例中所描述。
在第十特定實施例中，對於式(L2)之免疫結合物，CyL2係由式(L2b)或(L2b1)表示；且其餘變數如以上在第八特定實施例中所描述。
在第十一特定實施例中，對於式(L2)之免疫結合物，Re為H或Me；Rx1及Rx2獨立地為-(CH2)p-(CRfRg)-，其中Rf及Rg各自獨立地為-H或(C1-C4)烷基；且p為0、1、2或3；且其餘變數如以上在第八、第九或第十特定實施例中所描述。更特定言之，Rf與Rg相同或不同並且係選自-H及-Me。
在第十二特定實施例中，該第一實施例之免疫結合物係由以下各式表示： 或其醫藥學上可接受之鹽，其中WL為1至10之整數；介於N與C之間的雙線表示單鍵或雙鍵，限制條件為當其為雙鍵時，X不存在且Y為-H；並且當其為單鍵時，X為-H且Y為-OH或-SO3H或其醫藥學上可接受之鹽。在一更特定實施例中，介於N與C之間的雙線表示雙鍵。在另一更特定實施例中，介於N與C之間的雙線表示單鍵，X為-H且Y為-SO3H或其醫藥學上可接受之鹽。
在第十三特定實施例中，該第一實施例之免疫結合物係由下式表示： 其中：CBA為上文所描述之MET結合劑(例如，抗MET抗體或其抗體片段)，其經由Lys殘基共價連接於CyL3；WL為1至20之整數；CyL3係由下式表示： m'為1或2；R1及R2各自獨立地為H或(C1-C3)烷基；且Zs1係選自以下各式中之任一者： ；及 其中q為1至5之整數。
在第十四特定實施例中，對於式(L3)之免疫結合物，m'為1，且R1及R2均為H；且其餘變數如以上在第十三特定實施例中所描述。
在第十五特定實施例中，對於式(L3)之免疫結合物，m'為2，且R1及R2均為Me；且其餘變數如以上在第十三特定實施例中所描述。
在第十六特定實施例中，該第一實施例之免疫結合物係由以下各式表示： 或其醫藥學上可接受之鹽，其中WL為1至10之整數。
在第十七特定實施例中，對於該第一實施例之免疫結合物，Y為-SO3H、-SO3Na或-SO3K；且其餘變數如以上在第一至第十六特定實施例或其中所描述之任何更特定實施例中之任一者中所描述。在一個實施例中，Y為-SO3Na。
在某些實施例中，對於包含第一實施例或者第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十三、第十四、第十五、第十六或第十七特定實施例之免疫結合物的組合物(例如，醫藥組合物)，該組合物中每個抗體分子之細胞毒性劑平均數(亦即，wL之平均值)，亦稱為藥物-抗體比(DAR)，在1.0至8.0之範圍內。在一些實施例中，DAR在1.0至5.0、1.0至4.0、1.0至3.4、1.0至3.0、1.5至2.5、2.0至2.5或1.8至2.2之範圍內。在一些實施例中，該DAR小於4.0、小於3.8、小於3.6、小於3.5、小於3.0或小於2.5。
在第二實施例中，本發明之免疫結合物包含上文所描述之MET結合劑(例如，抗MET抗體或其抗體片段)，其係經由位於該MET結合劑上之一或多個硫醇基(-SH)共價連接至本文中所描述之細胞毒性劑。
在第一特定實施例中，該第二實施例之免疫結合物係由下式表示： 其中：CBA為本文中所描述之MET結合劑(例如，抗MET抗體或其抗體片段)，其經 由半胱胺酸殘基共價連接至CyC1；WC為1或2；CyC1係由以下各式表示： ；或 或其醫藥學上可接受之鹽，其中：介於N與C之間的雙線表示單鍵或雙鍵，限制條件為當其為雙鍵時，X不存在且Y為-H或(C1-C4)烷基；並且當其為單鍵時，X為-H或胺保護部分，Y為-OH或-SO3H或其醫藥學上可接受之鹽；R5為-H或(C1-C3)烷基；P為胺基酸殘基或含有2至20個胺基酸殘基之肽；Ra及Rb在每次出現時獨立地為-H、(C1-C3)烷基或帶電取代基或可離子化基團Q；m為1至6之整數； W'為-NRe'；Re'為-(CH2-CH2-O)n-Rk；n為2至6之整數；Rk為-H或-Me；Rx3為(C1-C6)烷基；且LC係由下式表示： 其中s1為與CBA共價連接之位點，且s2為與CyC1上之-C(=O)-基團共價連接之位點；其中：R19及R20在每次出現時獨立地為-H或(C1-C3)烷基；m"為介於1與10之間的整數；且Rh為-H或(C1-C3)烷基。
在第二特定實施例中，對於式(C1)之免疫結合物，CyC1係由式(C1a)或(C1a1)表示；且其餘變數如以上在第二實施例之第一特定實施例中所描述。
在第三特定實施例中，對於式(C1)之免疫結合物，CyC1係由式(C1b)或(C1b1)表示；且其餘變數如以上在第二實施例之第一特定實施例中所描述。
在第四特定實施例中，對於式(C1)之免疫結合物，CyC1係由式(C1a)或(C1a1)表示；Ra及Rb均為H；且R5為H或Me，且其餘變數如以上在第二實施例之第一或第二特定實施例中所描述。
在第五特定實施例中，對於式(C1)之免疫結合物，P為含有2至5個胺基酸殘基之肽；且其餘變數如以上在第二實施例之第一、第二或第四特定實施例中所描述。在一更特定實施例中，P係選自Gly-Gly-Gly、Ala-Val、Val-Ala、Val-Cit、Val-Lys、Phe-Lys、Lys-Lys、Ala-Lys、Phe-Cit、Leu-Cit、Ile-Cit、Trp、 Cit、Phe-Ala、Phe-N9-甲苯磺醯基-Arg、Phe-N9-硝基-Arg、Phe-Phe-Lys、D-Phe-Phe-Lys、Gly-Phe-Lys、Leu-Ala-Leu、Ile-Ala-Leu、Val-Ala-Val、Ala-Leu-Ala-Leu(SEQ ID NO：74)、β-Ala-Leu-Ala-Leu(SEQ ID NO：75)、Gly-Phe-Leu-Gly(SEQ ID NO：76)、Val-Arg、Arg-Val、Arg-Arg、Val-D-Cit、Val-D-Lys、Val-D-Arg、D-Val-Cit、D-Val-Lys、D-Val-Arg、D-Val-D-Cit、D-Val-D-Lys、D-Val-D-Arg、D-Arg-D-Arg、Ala-Ala、Ala-D-Ala、D-Ala-Ala、D-Ala-D-Ala、Ala-Met、Met-Ala、Gln-Val、Asn-Ala、Gln-Phe及Gln-Ala。在另一更特定實施例中，P為Gly-Gly-Gly、Ala-Val、Ala-Ala、Ala-D-Ala、D-Ala-Ala或D-Ala-D-Ala。
在第六特定實施例中，對於式(C1)之免疫結合物，Q為-SO3H或其醫藥學上可接受之鹽；且其餘變數如以上在第二實施例之第一、第二、第四或第五特定實施例或其中所描述之任何更特定實施例中所描述。
在第七特定實施例中，對於式(C1)之免疫結合物，R19及R20均為H；且m"為1至6之整數；且其餘變數如以上在第二實施例之第一、第二、第三、第四、第五或第六特定實施例或其中所描述之任何更特定實施例中所描述。
在第八特定實施例中，對於式(C1)之免疫結合物，-L-LC-係由下式表示： 且其餘變數如以上在第二實施例之第一、第二、第三、第四、第五、第六或第七特定實施例或其中所描述之任何更特定實施例中所描述。
在第九特定實施例中，該第二實施例之免疫結合物係由以下各式表示： 或其醫藥學上可接受之鹽，其中介於N與C之間的雙線表示單鍵或雙鍵，限制條件為當其為雙鍵時，X不存在且Y為-H；並且當其為單鍵時，X為-H且Y為-OH或-SO3H或其醫藥學上可接受之鹽。在一更特定實施例中，介於N與C 之間的雙線表示雙鍵，X不存在且Y為-H。在另一更特定實施例中，介於N與C之間的雙線表示單鍵，X為-H且Y為-SO3H或其醫藥學上可接受之鹽。
在第十特定實施例中，該第二實施例之免疫結合物係由下式表示： 其中：CBA為上文所描述之MET結合劑(例如，抗MET抗體或其抗體片段)，其經由半胱胺酸殘基共價連接至CyC2；WC為1或2；CyC2係由以下各式表示： ；或 或其醫藥學上可接受之鹽，其中： 介於N與C之間的雙線表示單鍵或雙鍵，限制條件為當其為雙鍵時，X不存在且Y為-H或(C1-C4)烷基；並且當其為單鍵時，X為-H或胺保護部分，Y為-OH或-SO3H或其醫藥學上可接受之鹽；Rx1為(C1-C6)烷基；Re為-H或(C1-C6)烷基；W'為-NRe'；Re'為-(CH2-CH2-O)n-Rk；n為2至6之整數；Rk為-H或-Me；Rx2為(C1-C6)烷基；LC'係由以下各式表示： 其中：s1為與該CBA共價連接之位點且s2為與CyC2上之-S-基團共價連接之位點；Z為-C(=O)-NR9-或-NR9-C(=O)-；Q為-H、帶電取代基或可離子化基團；R9、R10、R11、R12、R13、R19、R20、R21及R22在每次出現時獨立地為-H或(C1-C3)烷基；q及r在每次出現時獨立地為介於0與10之間的整數；m及n各自獨立地為介於0與10之間的整數； Rh為-H或(C1-C3)烷基；且P'為胺基酸殘基或含有2至20個胺基酸殘基之肽。
在一更特定實施例中，q及r各自獨立地為介於1至6之間的整數，更特定言之，介於1至3之間的整數。甚至更特定言之，R10、R11、R12及R13均為H。
在另一更特定實施例中，m及n各自獨立地為介於1與6之間的整數，更特定言之，介於1至3之間的整數。甚至更特定言之，R19、R20、R21及R22均為H。
在第十一特定實施例中，對於式(C2)之免疫結合物，CyC2係由式(C2a)或(C2a1)表示；且其餘變數如以上在第二實施例之第十特定實施例或其中所描述之任何更特定實施例中所描述。
在第十二特定實施例中，對於式(C2)之免疫結合物，CyC2係由式(C2b)或(C2b1)表示；且其餘變數如以上在第二實施例之第十特定實施例中所描述。
在第十三特定實施例中，對於式(C2)之免疫結合物，P'為含有2至5個胺基酸殘基之肽；且其餘變數如以上在第二實施例之第十、第十一或第十二特定實施例或其中所描述之任何更特定實施例中所描述。在一更特定實施例中，P'係選自Gly-Gly-Gly、Ala-Val、Val-Ala、Val-Cit、Val-Lys、Phe-Lys、Lys-Lys、Ala-Lys、Phe-Cit、Leu-Cit、Ile-Cit、Trp、Cit、Phe-Ala、Phe-N9-甲苯磺醯基-Arg、Phe-N9-硝基-Arg、Phe-Phe-Lys、D-Phe-Phe-Lys、Gly-Phe-Lys、Leu-Ala-Leu、Ile-Ala-Leu、Val-Ala-Val、Ala-Leu-Ala-Leu(SEQ ID NO：74)、β-Ala-Leu-Ala-Leu(SEQ ID NO：75)、Gly-Phe-Leu-Gly(SEQ ID NO：76)、Val-Arg、Arg-Val、Arg-Arg、Val-D-Cit、Val-D-Lys、Val-D-Arg、D-Val-Cit、D-Val-Lys、D-Val-Arg、D-Val-D-Cit、D-Val-D-Lys、D-Val-D-Arg、D-Arg-D-Arg、Ala-Ala、Ala-D-Ala、D-Ala-Ala、D-Ala-D-Ala、Ala-Met、Met-Ala、Gln-Val、Asn-Ala、Gln-Phe及 Gln-Ala。在另一更特定實施例中，P'為Gly-Gly-Gly、Ala-Val、Ala-Ala、Ala-D-Ala、D-Ala-Ala或D-Ala-D-Ala。
在第十四特定實施例中，對於式(C2)之免疫結合物，-LC'-係由以下各式表示：
在第十五特定實施例中，對於式(C2)之免疫結合物，Re為H或Me；Rx1為-(CH2)p-(CRfRg)-，且Rx2為-(CH2)p-(CRfRg)-，其中Rf及Rg各自獨立地為-H或(C1-C4)烷基；且p為0、1、2或3；且其餘變數如以上在第二實施例之第十、第十一、第十二、第十三或第十四特定實施例中所描述。更特定言之，Rf與Rg相同或不同且係選自-H及-Me。
在第十六特定實施例中，第二實施例之免疫結合物係由以下各式表示： 或其醫藥學上可接受之鹽，其中介於N與C之間的雙線表示單鍵或雙鍵，限制條件為當其為雙鍵時，X不存在且Y為-H；並且當其為單鍵時，X為-H且Y為-OH或-SO3H或其醫藥學上可接受之鹽。在一更特定實施例中，介於N與C之間的雙線表示雙鍵，X不存在且Y為-H。在另一更特定實施例中，介於N與C之間的雙線表示單鍵，X為-H且Y為-SO3H或其醫藥學上可接受之鹽。
在第十七特定實施例中，第二實施例之免疫結合物係由下式表示： 其中：CBA為上文所描述之MET結合劑(例如，抗MET抗體或其抗體片段)，其經由半胱胺酸殘基共價連接至CyC3； WC為1或2；CyC3係由下式表示： 其中：m'為1或2；R1及R2各自獨立地為-H或(C1-C3)烷基；LC'係由以下各式表示： 其中：s1為與該CBA共價連接之位點且s2為與CyC3上之-S-基團共價連接之位點；Z為-C(=O)-NR9-或-NR9-C(=O)-；Q為H、帶電取代基或可離子化基團；R9、R10、R11、R12、R13、R19、R20、R21及R22在每次出現時獨立地為-H或(C1-C3)烷基；q及r在每次出現時獨立地為介於0與10之間的整數；m及n各自獨立地為介於0與10之間的整數；Rh為-H或(C1-C3)烷基；且 P'為胺基酸殘基或含有2至20個胺基酸殘基之肽。
在一更特定實施例中，q及r各自獨立地為介於1至6之間的整數，更特定言之，1至3之整數。甚至更特定言之，R10、R11、R12及R13均為H。
在另一更特定實施例中，m及n各自獨立地為介於1與6之間的整數，更特定言之，1至3之整數。甚至更特定言之，R19、R20、R21及R22均為H。
在第十八特定實施例中，對於式(C3)之免疫結合物，P'為含有2至5個胺基酸殘基之肽；且其餘變數如第二實施例之第十七特定實施例或其中所描述之任何更特定實施例中所描述。在一更特定實施例中，P'係選自Gly-Gly-Gly、Ala-Val、Val-Ala、Val-Cit、Val-Lys、Phe-Lys、Lys-Lys、Ala-Lys、Phe-Cit、Leu-Cit、Ile-Cit、Trp、Cit、Phe-Ala、Phe-N9-甲苯磺醯基-Arg、Phe-N9-硝基-Arg、Phe-Phe-Lys、D-Phe-Phe-Lys、Gly-Phe-Lys、Leu-Ala-Leu、Ile-Ala-Leu、Val-Ala-Val、Ala-Leu-Ala-Leu(SEQ ID NO：74)、β-Ala-Leu-Ala-Leu(SEQ ID NO：75)、Gly-Phe-Leu-Gly(SEQ ID NO：76)、Val-Arg、Arg-Val、Arg-Arg、Val-D-Cit、Val-D-Lys、Val-D-Arg、D-Val-Cit、D-Val-Lys、D-Val-Arg、D-Val-D-Cit、D-Val-D-Lys、D-Val-D-Arg、D-Arg-D-Arg、Ala-Ala、Ala-D-Ala、D-Ala-Ala、D-Ala-D-Ala、Ala-Met、Met-Ala、Gln-Val、Asn-Ala、Gln-Phe及Gln-Ala。在另一更特定實施例中，P'為Gly-Gly-Gly、Ala-Val、Ala-Ala、Ala-D-Ala、D-Ala-Ala或D-Ala-D-Ala。
在第十九特定實施例中，對於式(C3)之免疫結合物，-LC'-係由以下各式表示： 其中M為H+或陽離子；且其餘變數如以上在第二實施例之第十七或第十八特定實施例或其中所描述之任何更特定實施例中所描述。
在第二十特定實施例中，對於式(C3)之免疫結合物，m'為1，且R1及R2均為H；且其餘變數如以上在第二實施例之第十七、第十八或第十九特定實施例或其中所描述之任何更特定實施例中所描述。
在第二十一特定實施例中，對於式(C3)之免疫結合物，m'為2，且R1及R2均為Me；且其餘變數如以上在第二實施例之第十七、第十八或第十九特定實施例或其中所描述之任何更特定實施例中所描述。
在第二十二特定實施例中，第二實施例之免疫結合物係由以下各式表示： 或其醫藥學上可接受之鹽，其中DM為由下式表示之藥物部分：
在第二十三特定實施例中，對於第二實施例之免疫結合物，Y為-SO3H、-SO3Na或-SO3K；且其餘變數如第二實施例之第一至第二十二特定實施例或其中所描述之任何更特定實施例中之任一者中所描述。在一個實施例中，Y為-SO3Na。
B.例示性連接子分子
此項技術中已知的任何適合之連接子均可用於製備本發明之免疫結合物。在某些實施例中，連接子為雙官能連接子。如本文中所使用，術語「雙官能連接子」係指具有兩個反應基團之修飾劑；其中一個能夠與細胞結合劑反應，而另一個與細胞毒性化合物反應，從而將兩個部分連接在一起。此種雙官能交聯劑在此項技術中為熟知的(參見例如Isalm及Dent in Bioconjugation第5章，第218-363頁，Groves Dictionaries Inc.New York,1999)。舉例而言，使得能夠經由硫醚鍵連接之雙官能交聯劑包括用於引入馬來醯亞胺基之4-(N-馬來醯亞胺基甲基)-環己-1-甲酸N-琥珀醯亞胺酯(SMCC)或用於引入碘乙醯基之4-(碘乙醯基)-胺基苯甲酸N-琥珀醯亞胺酯(SIAB)。將馬來醯亞胺基或鹵基乙醯基引入至細胞結合劑上之其他雙官能交聯劑在此項技術中為熟知的(參見美國專利申請案2008/0050310、20050169933，可得自Pierce Biotechnology Inc.P.O.Box 117，Rockland，IL 61105，USA)，且包括但不限於雙馬來醯亞胺基聚乙二醇(BMPEO)、BM(PEO)2、BM(PEO)3、N-(β-馬來醯亞胺基丙氧基)琥珀醯亞胺酯(BMPS)、γ-馬來醯亞胺基丁酸N-琥珀醯亞胺酯(GMBS)、ε-馬來醯亞胺基己酸N-羥基丁二醯亞胺酯(EMCS)、5-馬來醯亞胺基戊酸NHS、HBVS、4-(N-馬來醯 亞胺基甲基)-環己烷-1-羧基-(6-醯胺基己酸N-琥珀醯亞胺酯)(SMCC之「長鏈」類似物(LC-SMCC))、間馬來醯亞胺基苯甲醯基-N-羥基琥珀醯亞胺酯(MBS)、4-(4-N-馬來醯亞胺基苯基)-丁酸醯肼或鹽酸鹽(MPBH)、3-(溴乙醯胺基)丙酸N-琥珀醯亞胺酯(SBAP)、碘乙酸N-琥珀醯亞胺酯(SIA)、κ-馬來醯亞胺基十一烷酸N-琥珀醯亞胺酯(KMUA)、4-(對馬來醯亞胺基苯基)-丁酸N-琥珀醯亞胺酯(SMPB)、6-(β-馬來醯亞胺基丙醯胺基)己酸琥珀醯亞胺酯(SMPH)、(4-乙烯基磺醯基)苯甲酸琥珀醯亞胺酯(SVSB)、二硫基雙馬來醯亞胺基乙烷(DTME)、1,4-雙馬來醯亞胺基丁烷(BMB)、1,4-雙馬來醯亞胺基-2,3-二羥基丁烷(BMDB)、雙馬來醯亞胺基己烷(BMH)、雙馬來醯亞胺基乙烷(BMOE)、4-(N-馬來醯亞胺基-甲基)環己烷-1-甲酸磺酸基琥珀醯亞胺酯(磺酸基-SMCC)、(4-碘-乙醯基)胺基苯甲酸磺酸基琥珀醯亞胺酯(磺酸基-SIAB)、間馬來醯亞胺基苯甲醯基-N-羥基磺酸基琥珀醯亞胺酯(磺酸基-MBS)、N-(γ-馬來醯亞胺基丁醯氧基)磺酸基琥珀醯亞胺酯(磺酸基-GMBS)、N-(ε-馬來醯亞胺基己醯氧基)磺酸基琥珀醯亞胺酯(磺酸基-EMCS)、N-(κ-馬來醯亞胺基十一醯氧基)磺酸基琥珀醯亞胺酯(磺酸基-KMUS)及4-(對馬來醯亞胺基苯基)丁酸磺酸基琥珀醯亞胺酯(磺酸基-SMPB)。
異雙官能交聯劑為具有兩個不同的反應基團之雙官能交聯劑。亦可使用含有胺反應性N-羥基丁二醯亞胺基團(NHS基團)及羰基反應性肼基之異雙官能交聯劑來連接本文中所描述之細胞毒性化合物與細胞結合劑(例如抗體)。此種市售異雙官能交聯劑之實例包括琥珀醯亞胺基6-肼基菸鹼醯胺丙酮腙(SANH)、4-肼基對酞酸琥珀醯亞胺酯鹽酸鹽(SHTH)及菸鹼酸琥珀醯亞胺基肼鹽酸鹽(SHNH)。亦可使用本發明之攜帶肼之苯并二氮呯衍生物來製備攜帶酸不穩定鍵聯之結合物。可使用之雙官能交聯劑之實例包括對甲醯基苯甲酸琥珀醯亞胺酯(SFB)及對甲醯基苯氧基乙酸琥珀醯亞胺酯(SFPA)。
使得細胞結合劑能夠經由二硫鍵與細胞毒性化合物連接之雙官能交 聯劑在此項技術中為已知的，且包括用於引用二硫基吡啶基之3-(2-吡啶基二硫)丙酸N-琥珀醯亞胺酯(SPDP)、4-(2-吡啶基二硫)戊酸N-琥珀醯亞胺基酯(SPP)、4-(2-吡啶基二硫)丁酸N-琥珀醯亞胺酯(SPDB)、4-(2-吡啶基二硫)2-磺酸基丁酸N-琥珀醯亞胺酯(磺酸基-SPDB)。可用於引入二硫基之其他雙官能交聯劑在此項技術中為已知的，且揭示於美國專利6,913,748、6,716,821以及美國專利公開案20090274713及20100129314中，該等專利及專利公開案均以引用之方式併入本文中。替代地，亦可使用諸如2-亞胺基硫雜戊環、升半胱胺酸硫基內酯或S-乙醯基琥珀酸酐之引入硫醇基之交聯劑。
在某些實施例中，雙官能連接子係由以下所描述之式(a1L)至式(a10L)中之任一者表示。
C.例示性細胞毒性劑 1.類美登素
在某些實施例中，細胞毒性劑為類美登素化合物，諸如美國專利第5,208,020號及第7,276,497號中所描述之彼等類美登素化合物，該等專利以引用之方式整體併入本文中。在某些實施例中，類美登素化合物係由下式表示： 其中變數如以上在以上第一實施例之第十三至第十五特定實施例及其中所描述之任何更特定實施例中之任一者中所描述。
在一更特定實施例中，類美登素化合物為DM4：
在另一實施例中，類美登素化合物為DM1：
2.苯并二氮呯
在某些實施例中，細胞毒性劑為苯并二氮呯化合物，諸如吡咯并苯并二氮呯(PBD)(諸如WO2010/043880、WO2011/130616、WO2009/016516、WO 2013/177481及WO 2012/112708中所描述之彼等吡咯并苯并二氮呯)及吲哚啉并苯并二氮呯(IGN)化合物(諸如WO/2010/091150及WO 2012/128868以及2016年6月28日申請之標題為「CONJUGATES OF CYSTEINE ENGINEERED ANTIBODIES」之美國申請案第15/195,269號中所描述之彼等吲哚啉并苯并二氮呯。所有此等專利、專利公開案及申請案之全部教示內容均以引用之方式整體併入本文中。
如本文中所使用，「苯并二氮呯」化合物為苯并二氮呯核心結構之化合物。苯并二氮呯核心可經取代或未經取代，及/或與一或多個環結構稠合。其亦包括具有由連接子連接之兩個苯并二氮呯核心的化合物。可還原作為苯并二氮呯核心之一部分的亞胺官能基(-C=N-)。
如本文中所使用，「吡咯并苯并二氮呯」(PBD)化合物為具有吡咯并苯并二氮呯核心結構之化合物。吡咯并苯并二氮呯可經取代或未經取代。其亦 包括具有由連接子連接之兩個吡咯并苯并二氮呯核心的化合物。可還原作為吲哚啉并苯并二氮呯核心之一部分的亞胺官能基(-C=N-)。
在某些實施例中，細胞毒性劑為由以下各式表示之吲哚啉并苯并二氮呯化合物： ；或 或其醫藥學上可接受之鹽，其中：Lc'係由以下各式表示：-NR5-P-C(=O)-(CRaRb)m-C(=O)E(B1)；或-NR5-P-C(=O)-(CRaRb)m-S-Zs (B2)；C(=O)E為反應性酯基，諸如N-羥基琥珀醯亞胺酯、N-羥基磺酸基琥珀醯亞胺酯、硝基苯基(例如2-硝基苯基或4-硝基苯基)酯、二硝基苯基(例如，2,4-二硝基苯基)酯、磺酸基四氟苯基(例如，4-磺酸基-2,3,5,6-四氟苯基)酯或五氟苯基酯，較佳N-羥基琥珀醯亞胺酯；Zs係由以下各式表示： ；及 其中：q為1至5之整數；且U為-H或SO3H或其醫藥學上可接受之鹽；且其餘變數如以上所描述之第一實施例之第一至第十二及第十七特定實施例或其中所描述之任何更特定實施例中之任一者中所描述。
在某些實施例中，細胞毒性劑為由以下各式表示之吲哚啉并苯并二氮呯化合物： ；或 或其醫藥學上可接受之鹽，其中：式(C1a')、式(C1a'1)、式(C1b')及式(C1b'1)之-LC c係由下式表示： 其中變數如以上在第二實施例之第一至第九及第二十三特定實施例或其中所描述之任何更特定實施例中之任一者中所描述；且式(C2a")、式(C2a"1)、式(C2b")及式(C2b"1)之Lcc'係由以下各式表示： 其中變數如以上在第二實施例之第十至第十六及第二十三特定實施例或其中所描述之任何更特定實施例中之任一者中所描述。
在某些實施例中，細胞毒性劑為以下任一種吲哚啉并苯并二氮呯化合物或其醫藥學上可接受之鹽：
可根據美國專利第9,381,256號、第8,765,740號號、第8,426,402號及第9,353,127號以及美國申請公開案US2016/0082114中所描述之程序來製備以上所示之化合物D1、sD1、D2、sD2、DGN462、sDGN462、D3及sD3，該等專利及申請公開案均以引用之方式整體併入本文中。
在某些實施例中，以上所示之化合物(例如sD1、sD2、sD4、sDGN462、sD3、sD4、sD5、sD5'、sD6或sD7)的醫藥學上可接受之鹽為鈉鹽或鉀鹽。更特定言之，醫藥學上可接受之鹽為鈉鹽。
在一特定實施例中，細胞毒性劑係由以下各式表示： 或其醫藥學上可接受之鹽。在一特定實施例中，醫藥學上可接受之鹽為鈉鹽或鉀鹽。
在另一特定實施例中，細胞毒性劑係由下式表示：
IV.藥物結合
可根據此項技術中已知的任何方法來製備如以上第一實施例或其中所描述之任何特定實施例中所描述之包含經由位於MET結合劑上之一或多個離胺酸殘基之ε-胺基共價連接至細胞毒性劑之MET結合劑的免疫結合物，參見例如WO 2012/128868及WO2012/112687，該兩案以引用之方式併入本文中。
在某些實施例中，可藉由包括使CBA(亦即，本文中所描述之MET結合劑)與具有胺反應性基團之細胞毒性劑反應之步驟的第一方法來製備第一實施例之免疫結合物。
在一個實施例中，對於以上所描述之第一方法，該反應係在諸如NaHSO3之亞胺反應性試劑存在下進行。
在一個實施例中，對於以上所描述之第一方法，該具有胺反應性基團之細胞毒性劑係由以下各式表示： ；或 或其醫藥學上可接受之鹽，其中變數之定義如以上針對式(L1a')、式(L1a'1)、式(L1b')及式(L1b'1)所描述。
在某些實施例中，可藉由包括以下步驟之第二方法來製備第一實施例之免疫結合物：(a)使細胞毒性劑與具有胺反應性基團及硫醇反應性基團之連接子化合物反應，以形成具有與其結合之胺反應性基團的細胞毒性劑-連接子化合物；及(b)使CBA與細胞毒性劑-連接子化合物反應。
在一個實施例中，對於以上所描述之第二方法，步驟(a)中之反應係在亞胺反應性試劑(例如，NaHSO3)存在下進行。
在一個實施例中，對於以上所描述之第二方法，在未進行純化之情況下使細胞毒性劑-連接子化合物與CBA反應。或者，在與CBA反應之前首先對細胞毒性劑-連接子化合物進行純化。
在某些實施例中，可藉由包括以下步驟之第三方法來製備第一實施例之免疫結合物：(a)使CBA與具有胺反應性基團及硫醇反應性基團之連接子化合物反應，以形成具有與其結合之硫醇反應性基團的經修飾之CBA；及(b)使該經修飾之CBA與細胞毒性劑反應。
在一個實施例中，對於以上所描述之第三方法，步驟(b)中之反應係在亞胺反應性試劑(例如，NaHSO3)存在下進行。
在某些實施例中，可藉由包括使CBA、細胞毒性化合物及具有胺反應性基團及硫醇反應性基團之連接子化合物反應之步驟的第四方法來製備第一實施例之免疫結合物。
在一個實施例中，對於第四方法，該反應係在亞胺反應劑(例如NaHSO3)存在下進行。
在某些實施例中，對於以上所描述之第二、第三或第四方法，具有胺反應性基團及硫醇反應性基團之連接子化合物係由以下各式表示： ；及 其中X為鹵素、JD-SH、-SSRd或-SC(=O)Rg；Rd為苯基、硝基苯基、二硝基苯基、羧基硝基苯基、吡啶基或硝基吡啶基；Rg為烷基；且其餘變數如以上針對式(a1)至式(a10)所描述；且細胞毒性劑係由以下各式表示： ；或 或其醫藥學上可接受之鹽，其中變數如以上針對式(L1a')、式(L1a'1)、式(L1b')、式(L1b'1)、式(L2a')、式(L2a'1)、式(L2b')及式(L2b'1)所描述。
在某些實施例中，對於以上所描述之第二、第三或第四方法，具有胺反應性基團及硫醇反應性基團之連接子化合物係由式(a1L)至式(a10L)中之任一者表示，且細胞毒性劑係由以下各式表示： 其中變數如以上在以上所描述之第一實施例之第十三至第十五特定實施例及其中所描述之任何更特定實施例中之任一者中所描述。
在一特定實施例中，對於以上所描述之第二、第三或第四方法，連接子為磺酸基-SPDB，細胞毒性劑為DM4且免疫結合物係由下式表示： 或其醫藥學上可接受之鹽，其中WL為1至10之整數。
可藉由使具有一或多個游離半胱胺酸之CBA與具有本文中所描述之硫醇反應性基團之細胞毒性劑反應來製備如以上第二實施例中所描述之包含 經由位於MET結合劑上之一或多個半胱胺酸殘基之硫醇基(-SH)共價連接至細胞毒性劑之MET結合劑的免疫結合物(例如，第一至第二十三特定實施例或其中所描述之任何更特定實施例中之任一者的免疫結合物)。
在一個實施例中，具有硫醇反應性基團之細胞毒性劑係由以下各式表示： ；或 或其醫藥學上可接受之鹽，其中-LC c係由下式表示： 其中變數如以上在第二實施例之第一至第九及第二十三特定實施例或其中所描述之任何更特定實施例中之任一者中所描述。
在另一實施例中，具有硫醇反應性基團之細胞毒性劑係由以下各式表示： 或其醫藥學上可接受之鹽，其中Lcc'係由以下各式表示： 其中變數如以上在第二實施例之第十至第十六及第二十三特定實施例或其中所描述之任何更特定實施例中之任一者中所描述。
在又另一實施例中，具有硫醇反應性基團之細胞毒性劑係由下式表示： 或其醫藥學上可接受之鹽，其中LC c'如以上所描述，且其餘變數如以上在第二實施例之第十七至第二十三特定實施例或其中所描述之任何更特定實施例中之任一者中所描述。
在某些實施例中，在CBA與細胞毒性劑之反應中使用有機溶劑來溶解細胞毒性劑。例示性有機溶劑包括但不限於二甲基乙醯胺(DMA)、丙二醇等。在一個實施例中，在DMA及丙二醇存在下進行CBA與細胞毒性劑之反應。
在一特定實施例中，使由下式表示之細胞毒性劑： 或其醫藥學上可接受之鹽，與CBA(例如抗MET抗體或其抗體片段)反應，以形成由下式表示之免疫結合物： 或其醫藥學上可接受之鹽，其中：介於N與C之間的雙線表示單鍵或雙鍵，限制條件為當其為雙鍵時，X不存在且Y為-H；並且當其為單鍵時，X為-H且Y為-SO3H或其醫藥學上可接受之鹽；且WC為1或2。在一更特定實施例中，介於N與C之間的雙線表示雙鍵，X不存在且Y為-H。在另一更特定實施例中，介於N與C之間的雙線表示單鍵，X為-H且Y為-SO3H或其醫藥學上可接受之鹽。甚至更特定言之，醫藥學上可接受之鹽為鈉鹽或鉀鹽。
在某些實施例中，當Y為-SO3H或其醫藥學上可接受之鹽時，可藉由以下方式來製備免疫結合物：(a)使以上所描述之具有硫醇反應性基團之含亞胺細胞毒性劑(亦即，式(C1a')、式(C1a'1)、式(C1b')、式(C1b'1)、式(C2a")、式(C2a"1)、式(C2b")或式(C2b"1)，其中介於N與C之間的雙線表示雙鍵，X不存在且Y為-H)中的亞胺部分與二氧化硫、亞硫酸氫鹽或偏亞硫酸氫鹽在水溶液中在pH 1.9至5.0下反應以形成經修飾之細胞毒性劑，該經修飾之細胞毒性劑包含由下式表示之經修飾之亞胺部分： 或其醫藥學上可接受之鹽；及(b)使該經修飾之細胞毒性劑與本文中所描述之MET結合劑(例如抗MET抗體或其抗體片段)反應以形成免疫結合物。
在第一態樣中，對於以上所描述之方法，在pH 1.9至5.0下進行步 驟(a)之反應。更特定言之，pH值為2.5至4.9、1.9至4.8、2.0至4.8、2.5至4.5、2.9至4.5、2.9至4.0、2.9至3.7、3.1至3.5或3.2至3.4。在另一特定實施例中，在pH 1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9或5.0下進行步驟(a)之反應。在又另一特定實施例中，在pH 3.3下進行步驟(a)之反應。
如本文中所使用，特定pH值意謂特定值±0.05。
在一些實施例中，在緩衝溶液存在下進行步驟(a)之反應。此項技術中已知的任何適合之緩衝溶液均可用於本發明之方法中。適合之緩衝溶液包括例如但不限於檸檬酸鹽緩衝液、乙酸鹽緩衝液、琥珀酸鹽緩衝液、磷酸鹽緩衝液、含甘胺酸之緩衝液(例如甘胺酸-鹽酸緩衝液)、酞酸鹽緩衝液(例如包含酞酸氫鈉或酞酸氫鉀之緩衝溶液)及其組合。在一些實施例中，緩衝溶液為琥珀酸鹽緩衝液。在一些實施例中，緩衝溶液為磷酸鹽緩衝液。在一些實施例中，緩衝液為檸檬酸鹽-磷酸鹽緩衝液。在一些實施例中，緩衝液為包含檸檬酸及Na2HPO4之檸檬酸鹽-磷酸鹽緩衝液。在其他實施例中，緩衝液為包含檸檬酸及K2HPO4之檸檬酸鹽-磷酸鹽緩衝液。在一些實施例中，以上所描述之緩衝溶液之濃度可在10至250mM、10至200mM、10至150mM、10至100mM、25至100mM、25至75mM、10至50mM或20至50mM之範圍內。
在第二態樣中，在不存在緩衝溶液(例如，第一態樣中所描述之緩衝液)之情況下進行反應步驟(a)。在一些實施例中，本方法包括以下步驟：(a)使以上所描述之具有硫醇反應性基團之含亞胺細胞毒性劑(亦即，式(C1a')、式(C1a'1)、式(C1b')、式(C1b'1)、式(C2a")、式(C2a"1)、式(C2b")或式(C2b"1)，其中介於N與C之間的雙線表示雙鍵，X不存在且Y為-H)中的亞胺部分與二氧化硫、亞硫酸氫鹽或偏亞硫酸氫鹽在水溶液中反應以形成經修飾之細胞毒性 劑，該經修飾之細胞毒性劑包含由下式表示之經修飾之亞胺部分： 或其醫藥學上可接受之鹽，其中該水溶液不包含緩衝液；及(b)使經修飾之細胞毒性劑與本文中所描述之MET結合劑(例如，抗MET抗體或其抗體片段)反應以形成免疫結合物。在一些實施例中，在有機溶劑與水之混合物中進行步驟(a)之反應。更特定言之，在二甲基丙烯醯胺(DMA)與水之混合物中進行步驟(a)之反應。在一些實施例中，DMA與水之混合物包含少於60體積%之DMA。甚至更特定言之，DMA與水之體積比為1：1。
在第三態樣中，對於以上或者第一或第二態樣中所描述之方法，在步驟(a)之反應中，每1當量含亞胺之細胞毒性劑使用0.5至5.0當量亞硫酸氫鹽或者0.25或2.5當量偏亞硫酸氫鹽。在一些實施例中，針對每1當量含亞胺之細胞毒性劑使用0.5至4.5、0.5至4.0、0.5至3.5、0.5至4.0、0.5至3.5、0.5至3.0、0.5至2.5、0.8至2.0、0.9至1.8、1.0至1.7、1.1至1.6或1.2至1.5當量亞硫酸氫鹽或者0.25至2.25、0.25至2.0、0.25至1.75、0.25至2.0、0.25至1.75、0.25至1.5、0.25至1.25、0.4至1.0、0.45至0.9、0.5至0.85、0.55至0.8或0.6至0.75當量偏亞硫酸氫鹽。在其他實施例中，針對每1當量含亞胺之細胞毒性劑使用0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.31.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、4.0、4.5或5.0當量亞硫酸氫鹽或者0.25、0.3、0.35、0.4、0.45、0.5、0.55、0.6、0.650.7、0.75、0.8、0.85、0.9、0.95、1.0、1.05、1.1、1.15、1.2、1.25、1.3、1.35、1.4、1.45、1.5、1.55、1.6、1.65、1.7、1.75、2.0、2.25或2.5當量偏亞硫酸氫鹽。在又其他實施例中，針對每1當量含亞胺之細胞毒性劑使用1.4當量亞硫酸氫鹽或0.7當量偏亞硫酸氫鹽。在其他實施例中，針對每1當量含亞胺之細胞毒性劑 使用1.2當量亞硫酸氫鹽或0.6當量偏亞硫酸氫鹽。
如本文中所使用，特定當量意謂特定值±0.05。
在第四態樣中，對於以上所描述之方法，在pH 2.9至3.7下進行步驟(a)之反應，且使1.0至1.8當量亞硫酸氫鹽或0.5至0.9當量偏亞硫酸氫鹽與1當量含亞胺之細胞毒性劑反應。在一些實施例中，在pH 3.1至3.5下進行步驟(a)之反應，且使1.1至1.6當量亞硫酸氫鹽或0.55至0.8當量偏亞硫酸氫鹽與1當量含亞胺之細胞毒性劑反應。在其他實施例中，在pH 3.2至3.4下進行步驟(a)之反應，且使1.3至1.5當量亞硫酸氫鹽或0.65至0.75當量偏亞硫酸氫鹽與1當量含亞胺之細胞毒性劑反應。在其他實施例中，在pH 3.3下進行步驟(a)之反應，且使1.4當量亞硫酸氫鹽或0.7當量偏亞硫酸氫鹽與1當量含亞胺之細胞毒性劑反應。在又其他實施例中，在pH 3.3下進行步驟(a)之反應，且使1.4當量亞硫酸氫鈉與1當量含亞胺之細胞毒性劑反應。
在第五態樣中，對於以上或者第一、第二、第三或第四態樣中所描述之方法，在有機溶劑與水之混合物中進行步驟(a)之反應。可使用任何適合之有機溶劑。例示性有機溶劑包括但不限於醇(例如甲醇、乙醇、丙醇等)、二甲基甲醯胺(DMF)、二甲亞碸(DMSO)、乙腈、丙酮、二氯甲烷等。在一些實施例中，有機溶劑可與水混溶。在其他實施例中，有機溶劑不可與水混溶，亦即，在兩相溶液中進行步驟(a)之反應。在一些實施例中，有機溶劑為二甲基乙醯胺(DMA)。以水及有機溶劑之總體積計，有機溶劑(例如DMA)可以1%-99%、1%-95%、10%-80%、20%-70%、30%-70%、1%-60%、5%-60%、10%-60%、20%-60%、30%-60%、40%-60%、45%-55%、10%-50%或20%-40%之量存在。在一些實施例中，在DMA與水之混合物中進行步驟(a)之反應，其中DMA與水之體積比為1：1。
在第六態樣中，對於以上或者第一、第二、第三、第四或第五態樣 中所描述之方法，可在任何適合之溫度下進行步驟(a)之反應。在一些實施例中，在0℃至50℃、10℃至50℃、10℃至40℃或10℃至30℃之溫度下進行反應。在其他實施例中，在15℃至30℃、20℃至30℃、15℃至25℃、16℃至24℃、17℃至23℃、18℃至22℃或19℃至21℃之溫度下進行反應。在又其他實施例中，可在15℃、16℃、17℃、18℃、19℃、20℃、21℃、22℃、23℃、24℃或25℃下進行反應。在一些實施例中，可在0℃至15℃、0℃至10℃、1℃至10℃、5℃至15℃或5℃至10℃下進行反應。
在第七態樣中，對於以上或者第一、第二、第三、第四、第五或第六態樣中所描述之方法，步驟(a)之反應進行1分鐘至48小時、5分鐘至36小時、10分鐘至24小時、30分鐘至24小時、30分鐘至20小時、1小時至20小時、1小時至15小時、1小時至10小時、2小時至10小時、3小時至9小時、3小時至8小時、4小時至6小時或1小時至4小時。在一些實施例中，允許反應進行4至6小時。在其他實施例中，允許反應進行10分鐘、15分鐘、20分鐘、30分鐘、1小時、2小時、3小時、4小時、5小時、6小時、7小時、8小時、9小時、10小時、11小時、12小時、13小時、14小時、15小時等。在其他實施例中，允許反應進行4小時。在又其他實施例中，允許反應進行2小時。
在第八態樣中，對於本文中或者第一、第二、第三、第四、第五、第六或第七態樣中所描述之本發明方法，在pH 4至9下進行步驟(b)之反應。在一些實施例中，在pH 4.5至8.5、5至8.5、5至8、5至7.5、5至7、5至6.5或5.5至6.5下進行步驟(b)之反應。在其他實施例中，在pH 5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9或8.0下進行步驟(b)之反應。
在一些實施例中，對於以上或者第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七或第八態樣中所描述之方法，在包含水與有機溶劑之混合物的水溶 液中進行步驟(b)之反應。可使用以上所描述之任何適合之有機溶劑。更特定言之，有機溶劑為DMA。在一些實施例中，水溶液包含以體積計少於50%、少於40%、少於30%、少於25%、少於20%、少於15%、少於10%、少於5%、少於3%、少於2%或少於1%之有機溶劑(例如DMA)。
在一些實施例中，對於本文中或者第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七或第八態樣中所描述之方法，亞硫酸氫鹽為亞硫酸氫鈉或亞硫酸氫鉀，且偏亞硫酸氫鹽為偏亞硫酸氫鈉或偏亞硫酸氫鉀。在一特定實施例中，亞硫酸氫鹽為亞硫酸氫鈉，且偏亞硫酸氫鹽為偏亞硫酸氫鈉。
在一些實施例中，對於本文中或第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七或第八態樣中所描述之方法，經修飾之細胞毒性劑在步驟(b)中與細胞結合劑反應之前未經純化。替代地，經修飾之細胞毒性劑在步驟(b)中與細胞結合劑反應之前經純化。本文中所描述之任何適合之方法均可用於純化經修飾之細胞毒性劑。
在一些實施例中，對於以上所描述之方法，步驟(a)之反應未引起馬來醯亞胺基團之實質性磺酸化。在一些實施例中，少於50%、40%、30%、20%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%或1%之馬來醯亞胺基團得以磺酸化。馬來醯亞胺磺酸化之百分比等於馬來醯亞胺磺酸化之細胞毒性劑(僅馬來醯亞胺上具有磺酸化之細胞毒性劑)與二磺酸化細胞毒性劑(馬來醯亞胺及亞胺部分兩者上皆具有磺酸化之細胞毒性劑)的總量除以含亞胺之細胞毒性劑在其與亞硫酸氫鹽或偏亞硫酸氫鹽反應之前的起始量。
在一些實施例中，對藉由以上所描述之任何方法製備的免疫結合物進行純化步驟。就此而言，可使用切向流過濾(TFF)、非吸附層析法、吸附層析法、吸附過濾、選擇性沈澱或任何其他適合之純化方法以及其組合自混合物之其他組分中純化出免疫結合物。
在一些實施例中，使用單一純化步驟(例如TFF)純化免疫結合物。較佳使用單一純化步驟(例如TFF)純化結合物且交換成適當調配物。在本發明之其他實施例中，使用兩個連續純化步驟來純化免疫結合物。舉例而言，可首先藉由選擇性沈澱、吸附過濾、吸附層析法或非吸附層析法純化免疫結合物，繼而用TFF進行純化。熟習此項技術者應瞭解，對免疫結合物進行純化使得能夠分離包含與細胞毒性劑化學偶聯之細胞結合劑的穩定結合物。
任何適合之TFF系統均可用於純化，包括Pellicon型系統(Millipore，Billerica，Mass.)、Sartocon卡匣系統(Sartorius AG，Edgewood，N.Y.)及Centrasette型系統(Pall Corp.，East Hills，N.Y.)
任何適合之吸附層析樹脂均可用於純化。較佳吸附層析樹脂包括羥基磷灰石層析法、疏水性電荷誘導層析法(HCIC)、疏水性相互作用層析法(HIC)、離子交換層析法、混合模式離子交換層析法、固定金屬親和層析法(IMAC)、染料配位體層析法、親和層析法、逆相層析法及其組合。適合之羥基磷灰石樹脂的實例包括陶瓷羥基磷灰石(I型及II型CHT，Bio-Rad Laboratories，Hercules，Calif.)、HA Ultrogel羥基磷灰石(Pall Corp.，East Hills，N.Y.)及陶瓷氟基磷灰石(I型及II型CFT，Bio-Rad Laboratories，Hercules，Calif.)。適合之HCIC樹脂的實例為MEP Hypercel樹脂(Pall Corp.，East Hills，N.Y.)。適合之HIC樹脂的實例包括丁基瓊脂糖、己基瓊脂糖、苯基瓊脂糖及辛基瓊脂糖樹脂(均來自於GE Healthcare，Piscataway，N.J.)以及Macro-prep甲基樹脂及Macro-Prep第三丁基樹脂(Biorad Laboratories，Hercules，Calif.)。適合之離子交換樹脂的實例包括SP-瓊脂糖、CM-瓊脂糖及Q-瓊脂糖樹脂(均來自於GE Healthcare，Piscataway，N.J.)及Unosphere S樹脂(Bio-Rad Laboratories，Hercules，Calif.)。適合之混合模式離子交換劑的實例包括Bakerbond ABx樹脂(JT Baker，Phillipsburg，N.J.)。適合之IMAC樹脂的實例包括螯合瓊脂糖樹脂(GE Healthcare，Piscataway，N.J.)及Profinity IMAC樹脂(Bio-Rad Laboratories，Hercules，Calif.)。適合之染料配位體樹脂的實例包括藍色瓊脂糖樹脂(GE Healthcare，Piscataway，N.J.)及Affi-gel藍色樹脂(Bio-Rad Laboratories，Hercules，Calif.)。適合之親和力樹脂的實例包括蛋白A瓊脂糖樹脂(例如，MabSelect，GE Healthcare，Piscataway，N.J.)，其中細胞結合劑為抗體；及凝集素親和力樹脂，例如Lentil凝集素瓊脂糖樹脂(GE Healthcare，Piscataway，N.J.)，其中細胞結合劑攜帶適當之凝集素結合位點。替代地，可使用細胞結合劑特異性抗體。此種抗體可固定至例如瓊脂糖4快速流樹脂(GE Healthcare，Piscataway，N.J.)。適合之逆相樹脂的實例包括C4、C8及C18樹脂(Grace Vydac，Hesperia，Calif.)。
任何適合之非吸附層析樹脂均可用於純化。適合之非吸附層析樹脂的實例包括但不限於SEPHADEXTM G-25、G-50、G-100、SEPHACRYLTM樹脂(例如S-200及S-300)、SUPERDEXTM樹脂(例如SUPERDEXTM 75及SUPERDEXTM 200)、BIO-GEL®樹脂(例如P-6、P-10、P-30、P-60及P-100)及業內普通技術人員已知的其他非吸附層析樹脂。
V.診斷及研究應用
除本文中所論述的抗體之治療用途以外，本發明之抗體及/或片段亦可用於眾多已知的診斷及研究應用。本發明之抗體及或片段可用於例如純化、偵測及靶向MET，包括在試管內及活體內診斷方法中。舉例而言，抗體及/或片段可用於免疫分析中以便定性及定量地量測生物樣品中由細胞表現之MET的水準。參見例如Harlow等人，Antibodies：A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press，第2版，1988)，該文獻以引用之方式整體併入本文中。
本發明之抗體可用於例如競爭性結合分析、直接及間接夾層分析以及免疫沈澱分析(Zola,Monoclonal Antibodies：A Manual of Techniques，第147-158頁(CRC Press,Inc.,1987))。
舉例而言，本發明亦提供如以下所描述加以可偵測地標記之以上抗MET肽及抗體，以供在診斷或預後或患者分層方法中用於偵測已知或疑似患有MET介導之病狀的患者中MET。本發明之抗MET肽及/或抗體適用於偵測或定量樣品中之MET或抗MET抗體的免疫分析法。針對MET之免疫分析法通常包括在能夠選擇性地結合MET之經可偵測地標記之本發明高親和力抗MET肽及/或抗體的存在下培育生物樣品，及偵測樣品中已結合之經標記肽或抗體。多種臨床分析程序在此項技術中為熟知的，例如，如Immunoassays for the 80's,A.Voller等人編，University Park,1981中所描述。因而，可將抗MET肽或抗體或其片段添加至硝化纖維或者能夠固定細胞、細胞粒子或可溶性蛋白質之另一固體支撐物。隨後可用適合之緩衝液洗滌支撐物，繼而用經可偵測地標記之MET特異性肽或抗體或其片段進行處理。隨後可第二次用緩衝液洗滌固相支撐物以移除未結合之肽或抗體或其片段。隨後可藉由已知的方法步驟來偵測固體支撐物上已結合之標記的量。
「固相支撐物」或「載體」意謂能夠結合肽、抗原或抗體或其片段之任何支撐物。熟知支撐物或載體包括玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、葡聚糖、耐綸、澱粉酶、天然及改質纖維素、聚丙烯醯胺、瓊脂糖及磁鐵礦。出於本發明之目的，載劑之性質可為在一定程度上可溶或不可溶的。熟習此項技術者將已知許多其他適用於結合抗體或其片段、肽或抗原之載體，或可藉由常規實驗來確定該等載體。
熟知的方法步驟可測定眾多指定抗MET肽及/或抗體或其片段之結合活性。熟習此項技術者可藉由常規實驗來確定有效及最佳分析條件。
可偵測地標記MET特異性肽及/或抗體或其片段可藉由連接至用於酶免疫分析(EIA)或酶聯免疫吸附分析(ELISA)之酶來實現。使所連接之酶與所曝露之受質反應，以產生可例如藉由分光光度手段、螢光手段或藉由目視手段加 以偵測之化學部分。可用於可偵測地標記本發明之MET特異性抗體或其片段的酶包括但不限於蘋果酸脫氫酶、葡萄球菌核酸酶、δ-5-類固醇異構酶、酵母乙醇脫氫酶、α-磷酸甘油脫氫酶、磷酸丙糖異構酶、辣根過氧化物酶、鹼性磷酸酶、天冬醯胺酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、尿素酶、過氧化氫酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、葡萄糖澱粉酶及乙醯膽鹼酯酶。
藉由放射性標記MET特異性抗體及/或其片段，有可能藉由使用放射免疫分析法(RIA)來偵測MET(參見例如Work等人，Laboratory Techniques and Biochemistry in Molecular Biology,North Holland Publishing Company,N.Y.(1978))。可藉由諸如使用伽瑪計數器或閃爍計數器之手段或藉由自動放射攝影術來偵測放射性同位素。尤其適用於本發明之目的的同位素為3H、125I、131I、35S、14C，且較佳為125I。
亦有可能用螢光化合物標記MET特異性抗體及或其片段。當螢光標記抗體曝露於適當波長之光時，隨後可由於螢光而偵測到其存在。最常用之螢光標記化合物為異硫氰酸螢光素、若丹明、藻紅素、藻青素、別藻藍素、鄰苯二甲醛及螢光胺。
亦可使用發射螢光之金屬來可偵測地標記MET特異性抗體或其片段，諸如125Eu或其他鑭系金屬。可使用諸如二伸乙三胺五乙酸(DTPA)或乙二胺四乙酸(EDTA)之金屬螯合基團將此等金屬附接至MET特異性抗體或其片段。
亦可藉由偶聯至化學發光化合物來可偵測地標記MET特異性抗體或其片段。隨後藉由偵測化學反應過程中產生之螢光的存在來確定經化學發光標記之抗體的存在。尤其適用之化學發光標記化合物的實例為發光胺、異發光胺、芳族吖啶酯、咪唑、吖啶鹽及草酸酯。同樣，可使用生物發光化合物來標記本發明之MET特異性抗體、其片段或衍生物。生物發光為生物系統中發現之一種化學發光類型，其中催化性蛋白質增加化學發光反應之效率。藉由偵測螢 光之存在來確定生物發光蛋白質之存在。用於標記之目的的重要生物發光化合物為螢光素、螢光素酶及水母素。
MET特異性抗體、其片段或衍生物之偵測可藉由閃爍計數器(例如在可偵測標記為放射性γ發射體時)或藉由螢光計(例如在標記為螢光物質時)來實現。在酶標記之情況下，可藉由採用酶受質之比色方法來實現偵測。亦可藉由直觀比較受質相較於以類似方式製備之標準物的酶促反應程度來實現偵測。
出於本發明之目的，可藉由以上分析法來偵測生物樣品中所存在之MET。可使用任何含有MET之樣品。較佳地，樣品為生物流體，諸如血液、血清、淋巴、尿液、炎症滲出液、腦脊髓液、羊水、組織提取液或勻漿及其類似物。然而，本發明不限於僅使用此等樣品之分析法，業內普通技術人員有可能確定允許使用其他樣品之適合條件。
可藉由自患者移出組織學樣品且提供本發明之經標記抗體與此種樣品之組合來實現原位偵測。較佳藉由對生物樣品施加或覆蓋經標記之抗體或其片段來提供抗體或其片段。藉由使用此種程序，有可能不僅測定MET之存在而且確定MET在所檢查之組織中的分佈。使用本發明，業內普通技術人員將容易地察覺到可改進多種組織學方法(諸如染色程序)中之任一種以達成此種原位偵測。
可對本發明之抗體或其片段進行改適以用於免疫計量分析，亦稱為「雙位點」或「夾層」分析。在一典型免疫計量分析中，使一定量的未標記抗體或其片段與不溶於測試流體中之固體支撐物結合，並且添加一定量的經可偵測地標記之可溶性抗體以允許對固相抗體、抗原與經標記抗體之間形成的三元複合物進行偵測及/或定量。
典型且較佳之免疫計量分析包括「正向」分析，其中首先使與固相結合之抗體與測試樣品接觸以藉由形成二元固相抗體-MET複合物而自樣品中 提取MET。在適合之培育時段之後，洗滌固體支撐物以移除流體樣品之殘餘物，包括未反應之MET(若存在)，隨後與含有已知量之經標記抗體(其充當「報告分子」)的溶液接觸。在旨在允許經標記之抗體與經由未標記之抗體或其片段與固體支撐物結合之MET複合的第二培育時段之後，第二次洗滌固體支撐物以移除未反應之經標記抗體或其片段。此類型之正向夾層分析可為用於確定MET是否存在或可藉由比較經標記抗體或其片段之量測值與針對含有已知量之MET的標準樣品所獲得的量測值來進行定量的簡單「是/否」分析。Wide(Radioimmune Assay Method,Kirkham編，Livingstone,Edinburgh,1970，第199-206頁)描述此種「雙位點」或「夾層」分析。
亦可適用於MET之其他類型「夾層」分析為所謂的「同時」及「反向」分析。同時分析包括單一培育步驟，其中將與固體支撐物結合之抗體及經標記之抗體兩者同時添加至測試樣品中。在培育完畢之後，洗滌固體支撐物以移除流體樣品之殘餘物及未複合之經標記抗體。隨後如同習知「正向」夾層分析中來測定與固體支撐物締合之經標記抗體的存在。
在「反向」分析中，利用首先逐步添加經標記抗體之溶液至流體樣品，繼而在適合之培育時段之後添加與固體支撐物結合之未標記抗體。在第二培育之後，以習知方式洗滌固相以使其不含測試樣品之殘餘物及未反應之經標記抗體之溶液。隨後如同「同時」及「正向」分析中來測定與固體支撐物締合之經標記抗體的測定。在一態樣中，可使用對個別抗原決定基具有特異性之本發明抗體的組合來構建敏感三位點免疫放射分析法。
本發明之抗體或其片段亦適用於活體內成像，其中將經諸如放射遮蔽劑或放射性同位素之可偵測部分標記的抗體或其片段投與至個體，較佳至血流中，且分析經標記抗體在宿主體內之存在及位置。此成像技術適用於對惡性病進行階段劃分及治療。可用在宿主體內可藉由核磁共振、放射學或此項技術 中已知的其他偵測手段加以偵測之任何部分來標記抗體或其片段。
標記可為能夠直接或間接地產生可偵測信號之任何可偵測部分。舉例而言，標記可為生物素標記、酶標記(例如螢光素酶、鹼性磷酸酶、β-半乳糖苷酶及辣根過氧化物酶)、放射性標記(例如3H、14C、32P、35S及125I)、螢光團諸如螢光化合物或化學發光化合物(例如異硫氰酸螢光素、若丹明)、顯像劑(例如Tc-m99及銦(111In))及金屬離子(例如鎵及銪)。
可採用此項技術中已知的用於使抗體或其片段與標記結合的任何方法，包括以下文獻所描述之彼等例示性方法：Hunter,等人，1962,Nature 144：945；David等人，1974,Biochemistry 13：1014；Pain等人，1981,J.Immunol.Meth.40：219；Nygren,J.,1982,Histochem.and Cytochem.30：407。
本發明之抗體或其片段亦適用作親和力純化劑。在此方法中，使用此項技術中所熟知的方法將抗體例如固定於諸如Sephadex樹脂或濾紙之適合支撐物上。因而，可自生物樣品分離並純化MET。
VI.治療應用
本發明亦包括抑制表現MET之細胞之生長的方法。如本文中所提供，本發明之免疫結合物能夠結合細胞表面上所存在之MET且介導細胞殺死。特定言之，包含細胞毒性有效負載，例如吲哚啉并苯并二氮呯DNA烷基化劑之本發明免疫結合物得以內在化，並且經由細胞毒性有效負載，例如苯并二氮呯，例如吲哚啉并苯并二氮呯DNA烷基化劑之活性來介導細胞殺死。可藉由誘導抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)及/或補體依賴性細胞毒性(CDC)之免疫結合物來加強此種細胞殺死活性。
如本文中所使用，術語「抑制」應理解為包括對細胞生長之任何抑制效應，包括細胞死亡。抑制效應包括暫時效應、持續效應及永久效應。
本發明之治療應用包括治療患有疾病之個體的方法。用本發明方法 治療之疾病為以MET表現(例如在存在或不存在基因擴增之情況下的cMET過度表現)及/或活化(例如，存在或不存在基因擴增)為特徵之彼等疾病。此種疾病包括例如神經膠質母細胞瘤、胰臟癌、胃癌、***癌、卵巢癌、乳癌、肝細胞癌(HCC)、黑色素瘤、骨肉瘤及結腸直腸癌(CRC)、包括小細胞肺癌(SCLC)及非小細胞肺癌(NSCLC)在內之肺癌、頭頸部鱗狀細胞癌(HNSCC)、腎臟癌、腎癌、食道癌及甲狀腺癌。熟習此項技術者應理解本發明之方法亦可用於治療尚未描述但以MET表現為特徵之其他疾病。
在其他特定實施例中，本發明之免疫結合物可能適用於治療非小細胞肺癌(鱗狀細胞腺癌或大細胞未分化癌)、結腸直腸癌(腺癌、胃腸類癌腫瘤、胃腸基質腫瘤、原發性結腸直腸淋巴瘤、平滑肌肉瘤、黑色素瘤或鱗狀細胞癌)及胃癌。
亦可在試管內及離體內實踐本發明之治療應用。
本發明亦包括本發明之抗體或結合物的治療應用，其中該等抗體或結合物可以醫藥學上可接受之劑型投與個體。其可作為藥團或藉由在一定時段內連續輸注而經靜脈內、藉由經肌肉內、經皮下、非經腸、經關節內、經滑膜內、經鞘內、經口、經局部或經吸入途徑投與。其亦可藉由經腫瘤內、經腫瘤周圍、經病變內或經病變周圍途徑投與，以發揮局部以及全身性治療效應。
VII.醫藥組合物
本發明之組合物包括適用於製造醫藥組合物之散裝藥物組合物(例如，不純或非無菌組合物)及可用於製備單位劑型之醫藥組合物(亦即，適合於投與個體或患者之組合物)。此種組合物包含預防或治療有效量之本發明之免疫結合物或此種藥劑與醫藥學上可接受之載劑的組合。
本發明之組合物較佳包含預防或治療有效量之本發明之免疫結合物及醫藥學上可接受之載劑。本發明亦涵蓋此種醫藥組合物，其另外包括對特定 癌症抗原具有特異性之第二治療抗體(例如腫瘤特異性單株抗體)及醫藥學上可接受之載劑。
在一特定實施例中，術語「醫藥學上可接受」意謂經聯邦或州政府管理機構批准或者在美國藥典或其他普遍認可之藥典中列出用於動物，且更特定言之，用於人類。術語「載劑」係指與治療劑一起投與之稀釋劑、佐劑(例如弗氏佐劑(Freund’s adjuvant)(完全弗氏佐劑及不完全弗氏佐劑)、賦形劑或媒劑。一般而言，本發明組合物之成分係單獨供應或以單位劑型混合在一起供應，例如，作為乾燥凍乾粉末或無水濃縮物處於諸如安瓿或藥囊之指示活性劑之量的密閉容器中。在藉由輸注投與組合物時，其可用含有無菌醫藥等級水或生理食鹽水之輸液瓶進行分散。在藉由注射投與組合物時，可提供無菌注射用水或生理食鹽水之安瓿，以便可在投與之前混合該等成分。
本發明亦提供一種醫藥包裝或套組，其包括一或多個填充有單獨或與此種醫藥學上可接受之載劑一起的本發明免疫結合物的容器。本發明亦提供一種醫藥包裝或套組，其包括一或多個填充有本發明醫藥組合物之一或多種成分的容器。視情況與此種容器相關聯者可為由管理醫藥或生物產品之製造、使用或銷售的政府機構規定之書表形式的注意事項，該注意事項體現該機構批准製造、使用或銷售以用於人類投與。
本發明提供可用於以上方法中之套組。套組可包含本發明之任何免疫結合物。
VIII.投與方法
可提供本發明之組合物以便藉由向個體投與治療有效量之本發明免疫結合物來治療、預防及改善與疾病、病症相關之一或多種症狀。在一較佳態樣中，此種組合物實質上經純化(亦即，實質上不含界限其效應或產生不合需要之副作用的物質)。在一特定實施例中，該個體為動物，較佳哺乳動物，諸如非 靈長類動物(例如牛、馬、貓、犬、囓齒動物等)或靈長類動物(例如猴(諸如食蟹獼猴)、人類等)。在一較佳實施例中，該個體為人類。
投與本發明之免疫結合物的方法包括但不限於非經腸投與(例如，經皮內、經肌肉內、經腹膜內、經靜脈內及經皮下)、經硬膜外及經黏膜(例如，經鼻內及經口途徑)。在一特定實施例中，經肌肉內、經靜脈內或經皮下投與本發明之免疫結合物。可藉由任何適宜途徑，例如藉由輸注或藥團注射來投與組合物，且可與其他生物活性劑一起投與。投與可為全身性或局部的。
本發明亦提供包裝於諸如安瓿或藥囊之指示分子之量的密閉容器中的本發明免疫結合物之製劑。在一個實施例中，此種分子係作為處於密閉容器中之乾燥滅菌凍乾粉末或無水濃縮物供應，且可例如用水或生理食鹽水復原至適當濃度以便投與個體。本發明之免疫結合物較佳作為處於密閉容器中之乾燥無菌凍乾粉末供應。
本發明免疫結合物之凍乾製劑應於其原始容器中儲存在2℃與8℃之間，且該等分子應在得以復原之後12小時內、較佳在6小時內、5小時內、3小時內或1小時內投與。在一替代實施例中，此種分子呈液態於指示分子、融合蛋白質或結合分子之量及濃度的密閉容器中供應。較佳地，此種免疫結合物當呈液態提供時係於密閉容器中供應。
如本文中所使用，醫藥組合物之「治療有效量」為足以實現有益或所要結果之量，該等有益或所要結果包括但不限於臨床結果，諸如減輕由疾病引起之症狀、減輕感染症狀(例如病毒負載、發熱、疼痛、敗血症等)或癌症症狀(例如癌細胞增殖、腫瘤存在、腫瘤轉移等)，從而增強另一藥物治療之效應(諸如經由靶向及/或內在化)、延遲疾病進展及/或延長個體存活時間。
可分一或多次投與來投與治療有效量。出於本發明之目的，藥物、化合物或醫藥組合物之治療有效量為足以直接或間接地減少病毒存在之增殖(或 影響)以及減少及/或延遲病毒性疾病之發展的量。在一些實施例中，藥物、化合物或醫藥組合物之治療有效量可能在或可能不在連同另一藥物、化合物或醫藥組合物時得以達成。
舉例而言，可藉由以諸如脂質化之修飾來增強分子之吸收及組織滲透而減少或改變本發明之免疫結合物的劑量及投與頻率。
本發明之醫藥組合物可局部投與至需要治療之區域；此舉可藉由例如但不限於局部輸注、藉由注射或利用植入物來達成，該植入物為多孔、無孔或凝膠狀材料，包括膜(諸如矽彈性體膜)或纖維。較佳地，當投與本發明之免疫結合物時，必須小心使用分子不吸附之材料。
本發明之組合物可於囊泡、特定言之脂質體中遞送(參見Langer(1990)「New Methods Of Drug Delivery」,Science 249：1527-1533)；Treat等人，LIPOSOMES IN THE THERAPY OF INFECTIOUS DISEASE AND CANCER,Lopez-Berestein及Fidler(編)，Liss,New York，第353-365頁(1989)；Lopez-Berestein，同上，第317-327頁)。
用治療或預防有效量之本發明之免疫結合物治療個體可包括單次治療或較佳可包括一系列治療。亦應瞭解，用於治療之分子之有效劑量在特定治療過程中可增加或減少。
實例 實例1.鼠類MET抗體之產生及雜交瘤篩檢 細胞株及生長
除非另外指示，否則在37℃下，在濕潤5% CO2培育箱中使本文中所使用之細胞株在適當培養基，例如補充有10%胎牛血清、2mM麩醯胺酸及1%青黴素-鏈黴素(所有試劑均來自於Invitrogen)之DMEM或RPMI-1640培養基中生長。使細胞每週繼代兩次，並且維持在0.2至1×106個細胞/ml之間。
鼠類MET抗體之產生
構建含有側接KpnI及XhoI限制位點之MET細胞外域及跨膜域序列的表現質體pSRa-MET，從而允許表現人類MET之截短型式，該截短型式對應於由GenBank蛋白質ID 188595716所描述之1390個胺基酸之蛋白質的前1077個胺基酸。此截短型式不含有包含受體自磷酸化位點及銜接子蛋白靠泊位點之細胞內受體激酶結構域。然而，其確實含有MET之整個細胞外部分，包括配位體結合位點。用此表現質體轉染來源於Balb/c小鼠之前驅B細胞株300-19細胞(Reth等人，Nature,317：353-355(1985))，以便在細胞表面上穩定表現高水準之截短人類MET，並且用於使Balb/c VAF小鼠免疫。兩週後，首先用含10μg重組人類HGFR/cMET-Fc嵌合蛋白質(R&D systems；358-MT/CF)之完全弗氏佐劑(CFA)，繼而用含相同抗原之不完全弗氏佐劑(IFA)經皮下使小鼠免疫。隨後藉由熟習此項技術者已知的標準免疫方案，例如，諸如ImmunoGen,Inc所使用之彼等免疫方案進行三次5×106個表現MET之300-19細胞/小鼠/2週之免疫來對小鼠進行加強免疫。在處死以用於雜交瘤產生之前三天，用5×106個表現MET之300-19細胞/小鼠對已免疫之小鼠進行再一次加強免疫。根據標準動物方案自小鼠收集脾臟，諸如，例如在兩個無菌磨砂載玻片之間研磨組織以獲得處於RPMI-1640培養基中之單一細胞懸浮液。使用聚乙二醇-1500(Roche 783 641)對脾細胞進行離心，球粒化，洗滌並且與鼠類骨髓瘤，諸如P3X63Ag8.653細胞融合(Kearney等人，J.Immunol.,123：1548-1550(1979))。使已融合之細胞再懸浮於含有次黃嘌呤-胺基蝶呤-胸苷(HAT)(Sigma H-0262)之RPMI-1640選擇培養基中，且經選擇用於在37℃與5%二氧化碳(CO2)下在96孔平底培養板(Corning-Costar 3596，200μL細胞懸浮液/孔)中生長。培育5天之後，自各孔移出100μL培養物上清液且替換為100μL含次黃嘌呤-胸苷(HT)補充劑(Sigma H-0137)之RPMI-1640培養基。在37℃與5% CO2下培育持續直至雜交瘤純系準 備好進行抗體篩檢。亦可使用其他免疫及雜交瘤產生技術，包括Langone等人(編，「Immunochemical Techniques,Part I」,Methods in Enzymology,Academic Press，第121卷，Florida)；及Harlow等人(「Antibodies：A Laboratory Manual」；Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York(1988))中所描述之彼等技術。
針對MET結合之雜交瘤篩檢
藉由流式細胞術，針對結合抗原陽性細胞而不結合抗原陰性細胞之小鼠單株抗體的分泌對來自於雜交瘤之培養物上清液進行篩檢。所使用之抗原陽性細胞為例如表現MET之300-19細胞或MKN45胃細胞，而所使用之抗原陰性細胞為例如未轉染之300-19細胞。在100μL FACS緩衝液(補充有2%正常山羊血清之RPMI-1640培養基)中將100μl雜交瘤上清液與表現MET之細胞或未轉染之300-19細胞(1×105個細胞/樣品)一起培育3小時。隨後，對細胞進行離心，球粒化，洗滌，並且與100μL PE結合之山羊抗小鼠IgG抗體(諸如可獲自例如Jackson Laboratory)一起以6μg/mL在FACS緩衝液中培育1小時。對細胞進行離心，再次球粒化，用FACS緩衝液洗滌且再懸浮於200μL含1%甲醛之PBS中。可使用具有HTS多孔取樣器之FACSCalibur流式細胞儀或FACS陣列流式細胞儀獲取細胞，且使用CellQuestPro加以分析(均來自於BD Biosciences，San Diego，US)。使鑑定為分泌抗MET抗體之雜交瘤純系擴增並生長，以收集含抗體之上清液供額外篩檢。
實例2.參考抗體之表現
為了比較經分離之抗體的活性，選殖並表現先前鑑定之抗MET抗體。224G11抗體之HC及LC可變區之胺基酸序列來源於WO 2009007427(Goetsch L.)，SEQ ID NO：18用於HC可變區且SEQ ID NO：21用於LC可變區。5D5抗體之HC及LC可變區之胺基酸序列來源於US07476724，SEQ ID NO 187至193用於HC可變區且SEQ ID NO 179至185用於LC可變區。
兩種抗體之可變區序列皆經密碼子最佳化且由Blue Heron Biotechnology合成。該等序列側接限制酶位點以便與相應恆定序列一起在單鏈哺乳動物表現質體中進行同框選殖。如以上所描述來進行選殖、表現及純化。
為了評定5D5之單價型式的活性，使用Pierce® Fab製備套組(Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA)自完整IgG分離Fab製劑。簡而言之，將0.5ml經純化之5D5 IgG以4.7mg/ml之濃度緩衝液交換成含有20mM半胱胺酸之Fab消化緩衝液(pH 7.0)，並且與30μg(0.88個BAEE單位)已於相同消化緩衝液中平衡之固定木瓜蛋白酶混合。在37℃下用翻轉式混合器將消化反應培育6小時以維持樹脂之恆定混合。隨後藉由以在5000×g下離心而自樹脂中移出IgG消化液來終止消化。隨後將已消化之抗體溶液與已於磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中平衡之預包裝固定蛋白A管柱一起培育10分鐘。Fab片段收集為流過溶離份，而Fc片段及未消化之IgG與管柱結合。隨後使用Amicon離心過濾單元(Millipore，Billerica，MA)將5D5 Fab片段緩衝液交換成PBS。利用粒徑排阻層析法及SDS-PAGE評定Fab純度，且藉由在280nm下使用1.66ml mg-1 cm-1之消光係數進行吸光度量測來測定其濃度。
實例3.抑制HGF結合之雜交瘤篩檢
利用基於流式細胞術之分析法，使用完整BxPC3及MKN45細胞來評估抗體抑制HGF配位體與MET之結合的能力。因此，在細胞表面上存在MET之情形下，不使用重組來源之受體來量測配位體抑制。簡而言之，收集靶細胞且以400,000個細胞/ml再懸浮於結合緩衝液(1×PBS、0.1% BSA、0.05%疊氮化鈉)中並且以50μL/孔添加至96孔板。將雜交瘤上清液以50μL/孔添加至細胞中，並且在冰上將混合物培育30分鐘。隨後，添加50μL 150ng/mL之HGF以產生50ng/mL之最終濃度。在冰上將混合物培育30分鐘，隨後用結合緩衝液洗滌三次。在結合緩衝液中將生物素化山羊抗HGF抗體稀釋至0.4μg/mL，並且每 孔添加100μL。在冰上將諸板培育45分鐘，隨後用結合緩衝液洗滌三次。在結合緩衝液中將別藻藍素(APC)結合之鏈黴親和素(Jackson ImmunoResearch)稀釋至1：200，每孔添加100μL且在冰上將諸板培育45分鐘。用結合緩衝液將諸板洗滌三次，並且將細胞再懸浮於150μL/孔之固定緩衝液(含1%甲醛之1×PBS)中。使用具有HTS多孔取樣器之FACSCalibur流式細胞儀獲取樣品，且使用CellQuest Pro(BD Biosciences，San Diego，US)加以分析。針對各已處理樣品以及細胞，在存在HGF但不存在抗體處理之情況下測定FL4之平均螢光強度(MFI)。對照物包括在存在HGF之情況下培育的未處理細胞(0%抑制)及在不存在HGF之情況下培育的未處理細胞(100%抑制)。藉由使用下式將已處理樣品之MFI值相對於對照樣品之MFI值進行標準化來計算抑制百分比：抑制百分比=100×[1-(已處理樣品-不存在HGF之情況下的未處理細胞)/(存在HGF之情況下的未處理細胞-不存在HGF之情況下的未處理細胞)]。對各處理之抑制百分比值進行繪圖。
來自於若干經分離之雜交瘤純系的上清液在基於流式細胞術之HGF結合分析中顯示強活性，並且能夠顯著抑制HGF與BxPC3以及MKN45細胞結合(參見圖1及圖2)。若對HGF與BxPC3及MKN45細胞結合之抑制%為至少50%或更大，則考慮對純系進行進一步分析。先前描述之抗MET抗體224G11(專利申請案WO 2009007427)用於比較，且其對HGF與BxPC3及MKN45細胞結合分別產生50%及67%之抑制%。經分離之雜交瘤純系中有若干種與224G11相比具有更有效之活性。諸如247.7、247.22、247.26、247.32、247.33、247.48、248.51、248.61、248.62、248.66、248.67、248.69、248.71、248.74、248.76、248.78、248.81、248.83、248.90、248.91、248.92及248.96之雜交瘤純系對HGF與BxPC3及MKN45兩者之結合產生至少80%抑制。雜交瘤純系247.22、247.48及248.69分別為雜交瘤247.22.2、247.48.38及248.69.4之親本純系，如以下在此實例及隨 後實例中所描述。
使用試管內細胞毒性分析來量測例示性抗體抑制細胞生長之能力。簡而言之，將靶細胞以4,000個細胞/孔接種於100μL無血清RPMI培養基(RPMI-1640、2mM麩醯胺酸、1%青黴素-鏈黴素，所有試劑均來自於Invitrogen)中。將抗體稀釋至無血清培養基中且每孔添加100μL。在無血清培養基中將重組人類HGF(R&D Systems)稀釋至500ng/ml，並且每孔添加50μL以產生100ng/mL之最終濃度。在37℃下，在濕潤5% CO2培育器中將細胞培育3至4天。藉由比色WST-8分析(Dojindo Molecular Technologies,Inc.，Rockville，MD，US)測定其餘細胞之生存力。WST-8在活細胞中由脫氫酶還原成可溶於組織培養基中之橙色甲臢產物。所產生之甲臢之量與活細胞數目成正比。添加WST-8至最終體積之10%，且在37℃下在濕潤5% CO2培育箱中將諸板再培育2至4小時。藉由在多孔板讀數器中量測在450nm下之吸光度(A450)來分析諸板。對照物包括在存在HGF之情況下培育的未處理細胞(0%抑制)及在不存在HGF之情況下培育的未處理細胞(100%抑制)。藉由使用下式將已處理樣品之MFI值相對於對照樣品之MFI值進行標準化來計算抑制百分比：抑制百分比=100×[1-(已處理樣品-不存在HGF之情況下的未處理細胞)/(存在HGF之情況下的未處理細胞-不存在HGF之情況下的未處理細胞)]。評估各處理之抑制百分比值。
來自於若干經分離之雜交瘤純系的上清液對HGF誘導之BxPC3增殖顯示強抑制。若對HGF誘導之BxPC3細胞增殖的抑制%為至少40%或更大，則考慮對純系進行進一步分析。
雜交瘤次選殖及次純系篩檢
藉由限制稀釋對理想雜交瘤純系進行次選殖。藉由如以上概述之流式細胞術，針對與表現MET之細胞的結合再次篩檢來自於次純系之雜交瘤上清液。選擇來自於各親本雜交瘤純系之依據流式細胞術對MET顯示與親本純系相 同之反應性的一或兩個次純系用於後續分析。
如以上所概述來測試來自於陽性次純系之雜交瘤上清液對HGF與MKN45及BxPC3細胞結合之抑制。測定各樣品之抑制百分比。通常，次純系如所預期般對HGF與MKN45及BxPC3細胞結合顯示實質性抑制。
選擇來自於各親本雜交瘤之對HGF與MKN45及BxPC3細胞結合顯示實質性抑制之一個次純系用於後續分析。培養穩定次純系，且使用市售同型分析試劑(Roche編號1493027或EY Laboratories,Inc.編號IC-IS-002-20)來鑑定各分泌之抗MET抗體之同型。
實例4.抗體純化
使用標準方法，諸如蛋白A或蛋白G層析法自雜交瘤次純系上清液中純化抗體。
為了純化抗體，使用所要標準方法，諸如利用MabSelectSuRe、HiTrap蛋白A或蛋白GHP之層析法(Amersham Biosciences)。簡而言之，藉由添加1/10體積之1M Tris/HCl緩衝液(pH 8.0)來製備用於層析之上清液。使經pH值調節之上清液濾過0.22μm濾膜，並且負載至用結合緩衝液(PBS，pH 7.3)平衡之管柱上。用結合緩衝液洗滌管柱，直至獲得穩定基線且在280nm下不存在吸光度。用含有0.15M NaCl之0.1M乙酸緩衝液(pH 2.8)，使用0.5mL/min之流速來溶析抗體。收集約0.25mL之溶析份且藉由添加1/10體積之1M Tris/HCl pH 8.0加以中和。使峰溶析份針對1×PBS透析隔夜兩次，且藉由濾過0.2μm濾膜進行滅菌。藉由在A280下之吸光度對經純化之抗體進行定量。
使用離子交換色層法(IEX)與針對鼠類抗體之四級銨(Q)層析法對經蛋白A純化之溶析份進行進一步精製。簡而言之，來自於蛋白A純化之樣品緩衝液交換成結合緩衝液(10mM Tris、10mM氯化鈉，pH 8.0)，並且濾過0.22μm過濾器。隨後將所製備之樣品以120cm/小時之流速負載至用結合緩衝液平衡之 Q快速流樹脂(GE Lifesciences)上。選擇管柱尺寸，以具有足以結合樣品中之所有MAb的容量。隨後用結合緩衝液洗滌管柱，直至獲得穩定基線且在280nm下不存在吸光度。藉由起始10mM至500mM氯化鈉之梯度以20倍管柱體積(CV)溶析抗體。基於在280nm下之吸光度量測(A280)來收集峰溶析份。使用Agilent HPLC 1100系統(Agilent，Santa Clara，CA)，在具有SWXL保護管柱6.0×40mm之TSK gel G3000SWXL 7.8×300mm(Tosoh Bioscience，Montgomeryville，PA)上用粒徑排阻層析法(SEC)評定單體之百分比。彙集單體含量高於95%之溶析份，使用TFF系統緩衝液交換成PBS(pH 7.4)，且藉由濾過0.2μm濾膜進行滅菌。藉由A280，使用1.47之消光係數來測定經純化之抗體的IgG濃度。亦使用諸如陶瓷羥基磷灰石(CHT)之替代方法以良好選擇性對抗體進行精製。使用具有40μm粒度之II型CHT樹脂(Bio-Rad Laboratories)與跟針對IEX層析法所描述之方案類似的方案。CHT之結合緩衝液對應於20mM磷酸鈉pH 7.0，且用20-160mM磷酸鈉之梯度以20倍CV溶析抗體。
實例5.抗MET抗體之定序、嵌合及人類化 抗MET抗體之定序及嵌合
使用RNeasy套組(QIAgen)，根據製造商之方案由5×106個MET雜交瘤細胞製備總細胞RNA。隨後使用SuperScript II cDNA合成套組(Invitrogen)由總RNA合成cDNA。
來源於雜交瘤細胞之cDNA上的簡併PCR反應的程序係基於Wang等人((2000)J Immunol Methods.233：167-77)及Co等人((1992)J Immunol.148：1149-54)中所描述之方法。修飾引子及載體以有助於在能夠表現鼠類抗體之嵌合型式的哺乳動物表現載體中直接同框選殖雜交瘤RT-PCR產物與人類恆定區序列。在此方案中，起初用PCR引子對PCR產物自身進行定序，隨後在選殖後，用載體特異性引子對可變區進行再定序。因為在抗體可變區之5'及3'端使用 簡併PCR引子，使用藉由在NCBI IgBlast網站(www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)檢索鼠類生殖系序列而獲得之生殖系序列資訊來預測N及C末端鼠類序列，但引子產生之殘基保留在嵌合表現質體中。
隨後使用改進之聚乙亞胺(PEI)程序，使用此等表現質體在懸浮HEK-293T細胞中表現嵌合抗體(Durocher,Y.等人，Nucleic Acids Res.30：E9(2002))。使用如以上所描述之標準蛋白A層析程序來純化上清液，但使用羧甲基(CM)快速流離子交換(IEX)樹脂(GE Lifesciences)及10mM磷酸鉀、10mM氯化鈉結合緩衝液(pH 7.5)或以上所描述之替代CHT方法來進行精製層析步驟。用嵌合抗體進行結合實驗，以證實所選殖之序列保留鼠類抗體之預期結合性質。
與抗體選殖及表現有關之所有程序均遵循習知分子生物學方法，諸如標準實驗手冊(Ausubel,F.等人，Wiley,2010)中所描述之彼等方法，或根據製造商之說明書來進行。
藉由表面重整方法進行人類化
遵循先前於例如以下文獻中描述之表面重整方法將247.22.2及247.27.16抗體人類化：Roguska等人，Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,91(3)：969-973(1994)；及Roguska等人，Protein Eng.9(10)：895-904(1996)，該等文獻以引用之方式整體併入本文中。表面重整一般涉及鑑定輕鏈及重鏈中之可變區表面殘基且用人類等效物對其進行置換。表面殘基位置定義為具有30%或更大相對可及性之任何位置(Pedersen等人，J.Mol.Biol.,235(3)：959-973(1994))。比對表面殘基與人類生殖系表面序列以鑑定最同源之人類表面序列，且基於此等比對用人類等效殘基進行置換。
如下表中所指示來定義247.22.2之例示性CDR。
如下表中所指示來定義247.27.16之例示性CDR。
舉例而言，如針對表面重整所定義之輕鏈及重鏈CDR提供於表7及表8中。對於鼠類及人類序列，亦提供重鏈CDR2之Kabat定義。加下劃線之序列標記Kabat重鏈CDR2中不被視為用於表面重整之CDR的部分。
247.27.16輕鏈之CDR3含有潛在蛋白酶裂解位點。因此，產生兩種替代表面重整型式LC CDR31.2及LC CDR31.3，以移除此位點。
藉由CDR移植方法進行人類化
遵循Jones等人，Nature 321：604-608(1986)、Verhoeyen等人，Science 239：1534-1536(1988)、美國專利第5225539 A號(1993)及美國專利第5585089 A號(1996)中所描述之互補決定區(CDR)移植程序將鼠類CMET-27抗體人類化。CDR移植由用人類抗體Fv構架區置換小鼠抗體之Fv構架區(FR)而保留小鼠CDR殘基組成。遵循Kabat編號方案及Kabat CDR定義之CMET-27抗體之例示性CDR如表9中所指示。CDR移植方法開始於利用如Ehrenmann等人，Nucleic Acids Res.38：D301-307(2010)中所描述之International ImMunoGeneTics information system®(IMGT，http：//www.imgt.org/)之交互工具DomainGapAlign來選擇與親本鼠類抗體具有最高序列同源性之適當人類受體構架，通常為來源於人類抗體基因之彼等人類受體構架。選擇作為cMET-27抗體VL及VH結構域之受體構架的人類生殖系序列分別為IGKV3-11*01及IGHV3-48*03(圖3A及圖3B以及表3中)。
此外，兩個連續LC CDR3殘基、位置L94處之天門冬胺酸及位置L95處之脯胺酸被視為潛在裂解位點。藉由在位置L94處用同源殘基麩胺酸置換天冬胺酸成功地移除此種潛在序列傾向性，與親本抗體相比，不影響結合親和力。此外，已充分確定構架殘基可對抗原結合作出重要結構貢獻，且可能需要作為回復突變再引入以恢復抗原結合親和力，Foote及Winter,J.Mol.Biol.224：487-499(1992)。作為在製造並評估初始CDR移植CMET-27構建體之後相繼引入回復突變的替代，在製造初始構建體的同時構建一種在位置L68處含有回復突變之額外人類化VL型式(VLGv2)及一種在位置H47、H49及H73處含有三個回復突變之額外人類化VH型式(VHGv2)(圖4A及圖4B)。VL結構域(G68R)及VH結構域(W47L、S49A及N73I)中之所有四個回復突變均屬於游標區殘基。
合成人類化DNA構建體，經由瞬時轉染HEK 293T細胞進行表現，並且將用標準方法加以純化以供後續cMET結合分析之重組抗體與親本抗體相比較。如圖5中所顯示，所測試之所有人類化型式，包括不含回復突變之v1.1、 僅在VH結構域中含有回復突變之v1.2、僅在VL結構域中含有回復突變之v2.1及在VL及VH結構域兩者中皆含有回復突變之v2.2，在直接FACS結合中均保留親本與表現人類cMET抗原之細胞株的結合。將憑直覺挑選v1.1作為最終人類化型式，因為其不含回復突變，從而保持CDR移植抗體儘可能為「人類」的。然而，直接比較四種型式之瞬時表現效價顯示v1.1以低水準6mg/L表現(表10)。瞬時表現之低產率使得研究材料不太可及；另外，基於吾等之經驗，低瞬時效價指示難以獲得高表現穩定性之細胞株。同時，儘管以可接受之瞬時產率表現型式1.2，但基於Abysis資料庫(http：//www.abysis.org/)，VH結構域中之三個回復突變中有兩個(W47L及N73I)在人類抗體分子中具有極低相對頻率，由此引起潛在免疫原性憂慮。因此，又構建一種移除兩個低頻率回復突變之人類化VH型式(VHGv3)(圖4B)。以中等水準瞬時表現VH結構域中含有一個S49A回復突變之hucMET27G v1.3，且選擇作為較佳CDR移植cMET-27構建體。如以上所概述來製造含有鉸鏈修飾之huCMET27Gv1.3抗體(亦即，包含具有胺基酸序列SEQ ID NO：49之輕鏈及具有胺基酸序列SEQ ID NO：77、SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：79、SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：83或SEQ ID NO：84之重鏈的抗MET抗體)。在一特定實施例中，含有鉸鏈修飾之抗MET抗體存在具有胺基酸序列SEQ ID NO：49之輕鏈及具有胺基酸序列SEQ ID NO：82之重鏈。
人類抗體之表現
hu247.22.2及hu247.27.16之可變區序列皆經密碼子最佳化且由Blue Heron Biotechnology合成。該等序列側接限制酶位點以便與相應恆定序列一起在單鏈哺乳動物表現質體中進行同框選殖。將輕鏈可變區選殖至LC表現質體中之EcoRI及BsiWI位點中。將重鏈可變區選殖至HC表現質體中之HindIII及Apa1位點中。此等質體可用於在哺乳動物細胞中在瞬時或穩定轉染時表現人類抗體。可使用改進之PEI程序進行瞬時轉染以便HEK-293T細胞中表現人類抗體(Durocher,Y.等人，Nucleic Acids Res.30(2)：E9(2002))。可藉由蛋白A及精製層析步驟，使用如以上針對嵌合抗體所描述之標準程序來純化上清液。
可如針對以上實例中之鼠類抗體所描述來評估嵌合或人類化抗體之活性。
實例6.標靶表現分析
在胃癌及非小細胞肺癌(NSCLC)中進行MET表現之初步盛行率分析。
所分析之所有樣品均為FFPE(甲醛固定且石蠟包埋)樣品。NSCLC(105份)及胃癌樣品(15份)係購自Avaden Biosciences。使用Ventana Discovery Ultra自動染色器進行cMet之免疫組織化學染色。cMET之一級抗體(SP44)為市 售兔單株抗體。在ImmunoGen開發IHC分析以供初步研究使用。
由訓練過評分算法之委員會認證病理學家對所有樣品進行評估及評分。需要存在至少100個活腫瘤細胞以便評分。按0至3之半定量整數量表對染色強度進行評分，其中0表示無染色，1表示弱染色，2表示中度染色且3表示強染色。記錄各強度水準下陽性染色之細胞的百分比。評分係基於cMET相對於僅細胞膜之位置以及相對於細胞質及細胞膜兩者之位置的評估。藉由組合染色強度分量與陽性細胞百分比分量之H評分來分析染色結果。其具有介於0與300之間的值，且定義為：1*(以1+強度染色之細胞的百分比)；+2*(以2+強度染色之細胞的百分比)；+3*(以3+強度染色之細胞的百分比)。
對於NSCLC，將86個腺癌完整組織切片及19個鱗狀細胞癌完整組織切片染色並且評估。對於胃癌，分析15個腺癌完整組織切片。對所有此等樣品之膜染色進行評分，並且將結果彙總於下表中。
實例7.MET抗體及結合物之跨物種反應性及結合親和力研究
使用ForteBio分析來研究人類化cMet靶向抗體對人類cMet(hu cMet)及食蟹獼猴cMet(cyno cMet)之相對結合親和力，其中將可溶性重組hu cMet或cyno cMet蛋白(含有與含組胺酸肽融合之cMet細胞外域)與負載有固定抗cMet抗體之生物感測器一起培育。簡而言之，使各抗體結合並固定至抗hIgG Fc俘獲生物感測器上，隨後在不同濃度(2.6-30nM)之His標籤化之可溶性cMet的存在下進行培育。經由ForteBio結合分析，使用1：1結合擬合模型來確定結合 動力學。來自於此等研究之計算ka、kd及KD提供於表12中。此等研究之結果顯示人類化抗cMet抗體對人類及食蟹獼猴cMet具有相似之結合親和力，由此將允許進行毒理學及安全性研究以驗證抗cMet免疫結合物作為藥物療法之用途。
為了評估結合對抗原結合之後果，藉由FACS分析在內源性地表現人類cMet之EBC-1細胞上測定各抗cMet免疫結合物及其相應未結合抗體與cMet之相對結合親和力。簡而言之，在4℃下，在FACS緩衝液(PBS、0.1% BSA、0.01% NaN3)中將EBC-1細胞與抗cMet抗體或免疫結合物之稀釋系列一起培育30分鐘。隨後洗滌樣品且在4℃下與螢光標記之二級抗體一起培育30分鐘。對各濃度下之幾何平均螢光強度進行繪圖，且使用非線性回歸分析(GraphPad Prims 6)計算結合之EC50。所有測試抗cMet抗體及免疫結合物均以類似親和力與人類cMet結合，據藉由流式細胞術所量測，EC50為約0.4nM，指示結合未明顯改變抗體結合親和力(圖6A至圖6D)。類似地，含有鉸鏈修飾之抗cMET抗體及免疫結合物以類似之親和力結合人類cMet(圖22)。
實例8.對抗cMet抗體之促效活性的評估
評估例示性抗體在無血清條件下在不存在HGF時對細胞生長之潛在 誘導。簡而言之，將3,000個NCI-H441細胞接種於無血清培養基(SFM；含0.1% BSA之RPMI1640培養基)中。次日在37℃下、在濕潤5% CO2培育器中將細胞與1nM所指示之抗cMet抗體一起在SFM或100ng/mL HGF中培育4天。使用WST-8測試生存力，將其添加至10%最終體積，並且在37℃下、在濕潤5% CO2培育器中將樣品再培育2至4小時。藉由在多孔板讀數器中量測在450nm下之吸光度(A450)來分析諸樣品。自所有值減去僅含培養基及WST-8之諸孔的背景A450吸光度。對照物包括在存在100ng/mL HGF之情況下生長的未處理細胞(100%誘導)及在不存在HGF之情況下生長的未處理細胞(0%誘導)。藉由使用下式將已處理樣品之A450值相對於對照樣品之A450值進行標準化來計算誘導百分比：誘導百分比=100×(已處理樣品-不存在HGF之情況下的未處理細胞)/(存在HGF之情況下的細胞-不存在HGF之情況下的未處理細胞)。結果示於圖9中。對各處理之誘導百分比值進行繪圖。已知促效抗體5D5單獨誘導細胞生長至藉由HGF處理所觀測之細胞生長的92%。然而，在1nM下，hucMet22Gv2.2顯示72%生長誘導且hucMet27抗體引起小於45%之誘導。因此，所有例示性抗cMet抗體誘導之NCI-H441細胞增殖均顯著低於經cMet配位體、HGF或已知促效抗體處理之細胞，且增殖水準與具有已知低促效活性之其他cMET靶向抗體相當(參見圖19)。
亦評估例示性含鏈修飾之抗體在不存在HGF之情況下在無血清條件下對細胞生長之潛在誘導。簡而言之，將3,000個NCI-H441細胞接種於無血清培養基(SFM；含0.1% BSA之RPMI1640培養基)中。次日在37℃下、在濕潤5% CO2培育器中將細胞與10μg/mL所指示之抗cMet抗體一起在SFM中培育4天。使用WST-8測試生存力，將其添加至10%最終體積，並且在37℃下、在濕潤5% CO2培育器中將樣品再培育2至4小時。藉由在多孔板讀數器中量測在450nm下之吸光度(A450)來分析諸樣品。自所有值減去僅含培養基及WST-8之諸孔的背 景A450吸光度。對照物包括在SFM中生長之未處理細胞。所得結果示於圖23中。對各處理之A450吸光度值進行繪圖。已知促效抗體5D5單獨誘導細胞生長，如由增加之A450值所指示。然而，hucMet27Gv1.3且特定言之hucMet27Gv1.3鉸鏈28及hucMet27Gv1.3鉸鏈IgG2S127C抗體在10μg/mL下引起顯著低於5D5及ARGX-111之誘導，其中信號類似於ABT-700及5D5-F'ab。
為了確定抗cMet抗體對c-Met之酪胺酸激酶活性之活化的影響，使用基於ELISA之分析對由cMet活化觸發之下游信號傳導事件進行定量。如以上所描述，將NCI-H441細胞接種於SFM中。次日將細胞與1nM所指示之抗cMet抗體/ADC一起在SFM或100ng/mL HGF中培育15分鐘。溶解樣品且藉由ELISA分析澄清溶解產物之磷酸化-Erk及磷酸化-Akt。簡而言之，固定俘獲抗體結合磷酸化及未磷酸化之Erk或Akt。洗去未結合之物質之後，利用標準HRP形式，使用生物素化偵測抗體來偵測僅磷酸化之蛋白質。藉由在多孔板讀數器中量測在450nm下之吸光度(A450)來分析諸樣品。對照物包括經100ng/mL HGF處理之細胞(100%誘導)及在單獨培養基中處理之未處理細胞(0%誘導)。藉由使用下式將已處理樣品之A450值相對於對照樣品之A450值進行標準化來計算誘導百分比：誘導百分比=100×(已處理樣品-不存在HGF之情況下的未處理細胞)/(存在HGF之情況下的細胞-不存在HGF之情況下的未處理細胞)。對各處理之誘導百分比值進行繪圖。結果示於圖7、圖8、圖24及圖25中。儘管用促效cMet抗體5D5處理引起Erk之中度磷酸化，但5D5誘導升高水準之磷酸化Akt，此物模擬天然配位體HGF之活性。相反，hucMet22Gv2.2及hucMet27抗體且特定言之hucMet27Gv1.3鉸鏈28及hucMet27Gv1.3鉸鏈IgG2S127C抗體誘導顯著較低水準之磷酸化Erk及尤其是磷酸化Akt。與同5D5相比具有較低促效活性之其他cMET靶向抗體相比，hucMET27抗體及結合物顯示相似水準之下游信號傳導(參見圖19)。
實例9.N-(2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基)-11-(3-((((S)-8-甲氧基-6-側氧基-11,12,12a,13-四氫-6H-苯并[5,6][1,4]二氮呯并[1,2-a]吲哚-9-基)氧基)甲基)-5-((((S)-8-甲氧基-6-側氧基-12a,13-二氫-6H-苯并[5,6][1,4]二氮呯并[1,2-a]吲哚-9-基)氧基)甲基)苯基)-13,13-二甲基-2,5,8-三氧雜-14,15-二硫雜-11-氮雜十九-19-醯胺，即化合物D6之合成
步驟1：向游離硫醇DGN462(40mg，0.042mmol)及4-(2-吡啶基二硫)丁酸NHS酯(35mg，80%純度，0.085mmol)於無水二氯甲烷(0.5mL)中之溶液中添加無水二異丙基乙胺(0.015mL，0.085mmol)且在室溫下攪拌16小時。用飽和氯化銨淬滅反應混合物且用二氯甲烷稀釋。在分液漏斗中分離所獲得之混合物。用鹽水洗滌有機層，經無水硫酸鈉乾燥，過濾且在減壓下汽提。藉由半製備型逆相HPLC(C18管柱，CH3CN/H2O)純化殘餘物。合併含有純產物之溶析份，冷凍並凍乾，得到所要NHS酯，即化合物6a(29.7mg，60%產率)。LCMS=9.1min(15min方法)。MS(m/z)：1157.3(M+1)+。
步驟2：向NHS酯，即化合物6a(12.3mg，0.011mmol)及N-(2-胺基乙基)馬來醯亞胺鹽酸鹽(2.0mg，0.011mmol)於無水二氯甲烷(0.3mL)中之溶液中添加DIPEA(0.0022mL，0.013mmol)。在室溫下將混合物攪拌3小時，隨後在減壓下對其進行汽提。藉由半製備型逆相HPLC(C18管柱，CH3CN/H2O)純化殘餘物。合併含有純產物之溶析份，冷凍並凍乾，得到所要馬來醯亞胺， 即化合物D6(10mg，80%產率)。LCMS=8.3min(15min方法)。MS(m/z)：1181.8(M+1)+。
實例10.N1-(2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基)-N6-((S)-1-(((S)-1-((3-((((S)-8-甲氧基-6-側氧基-11,12,12a,13-四氫-6H-苯并[5,6][1,4]二氮呯并[1,2-a]吲哚-9-基)氧基)甲基)-5-((((S)-8-甲氧基-6-側氧基-12a,13-二氫-6H-苯并[5,6][1,4]二氮呯并[1,2-a]吲哚-9-基)氧基)甲基)苯基)胺基)-1-側氧基丙-2-基)胺基)-1-側氧基丙-2-基)己二醯胺，即化合物D5之合成
在室溫下將NHS酯，即化合物5a(8.2mg，7.6μmol)及1-(2-胺基乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮鹽酸鹽(2.2mg，0.011mmol)溶解於無水二氯甲烷(305μL)中。添加DIPEA(2.66μL，0.015mmol)且將反應物攪拌3.5小時。濃縮反應混合物且藉由RPHPLC(C18管柱，CH3CN/H2O，梯度35%至55%)加以純化。將所要產物溶析份冷凍並凍乾，得到呈固體白色粉末狀之馬來醯亞胺，即化合物D5(5.3mg，58%產率)。LCMS=5.11min(8min方法)。MS(m/z)：1100.6(M+1)+。
實例11.1-((2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基)胺基)-4-((5-((3-((((S)-8-甲氧基-6-側氧基-11,12,12a,13-四氫-6H-苯并[5,6][1,4]二氮呯并[1,2-a]吲哚-9-基)氧基)甲基)-5-((((S)-8-甲氧基-6-側氧基-12a,13-二氫-6H-苯并[5,6][1,4]二氮呯并[1,2-a]吲哚-9-基)氧基)甲基)苯基)胺基)-2-甲基-5-側氧基戊-2-基)二氫硫基)-1-側氧基丁烷-2-磺酸，即化合物D4之合成
在室溫下，在氮氣下向游離硫醇D1(88mg，0.105mmol)及1-((2,5-二側氧基吡咯啶-1-基)氧基)-1-側氧基-4-(吡啶-2-基二氫硫基)丁烷-2-磺酸(磺酸基-SPDB)(64.0mg，0.158mmol)於無水二氯甲烷(2.10mL)中之懸浮液中添加DIPEA(55.0μL，0.315mmol)。將該混合物攪拌16小時，且隨後添加1-(2-胺基乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮鹽酸鹽(55.6mg，0.315mmol)、無水二氯甲烷(1.0mL)及DIPEA(0.055mL，0.315mmol)。在室溫下將該混合物再攪拌5小時，此後在真空中濃縮反應物。藉由RP-HPLC(C18，CH3CN/H2O)純化所得殘餘物。將含有所要產物之溶析份冷凍並凍乾，得到呈白色固體狀之馬來醯亞胺D4(20mg，16%產率)。LCMS=4.92min(8min方法)。MS(m/z)：1158.6(M+1)+。
實例12.N-(2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基)-11-(3-((((S)-8-甲氧基-6-側氧基-11,12,12a,13-四氫-6H-苯并[5,6][1,4]二氮呯并[1,2-a]吲哚-9-基)氧基)甲基)-5-((((S)-8-甲氧基-6-側氧基-12a,13-二氫-6H-苯并[5,6][1,4]二氮呯并[1,2-a]吲哚-9-基)氧基)甲基)苯基)-2,5,8-三氧雜-11-氮雜十五-15-醯胺，即化合物D7之合成
在氮氣下向NHS酯7a(5mg，4.82μmol)及1-(2-胺基乙基)-1H-吡咯-2，5-二酮鹽酸鹽(1.7mg，9.64μmol)於無水二氯甲烷(200μL)中之溶液中添加DIPEA(1.512μL，8.68μmol)。在室溫下將該混合物攪拌4小時，且隨後在真空中濃縮。藉由RP-HPLC(C18，CH3CN/H2O)純化所得殘餘物。將含有所要產物之溶析份冷凍並凍乾，得到馬來醯亞胺化合物D7(3.5mg，68%產率)。LCMS=4.61min(15min方法)。MS(m/z)：1062.8(M+1)+。
實例13.攜帶馬來醯亞胺基團之含亞胺細胞毒性劑的選擇性磺酸化
向50mM琥珀酸鈉pH 3.3(116.5mL)與DMA(98.5mL)之混合物中添加溶解於21.4mL DMA中之化合物D5(263.6mg)。隨後將處於含有1 v/v% DMA之水中的3.4mL 100mM亞硫酸氫鈉溶液(1.4當量)引入反應中。在25℃下允許均質混合物反應2小時，此時藉由UPLC-MS分析獲悉反應完畢。反應混合物適用於不經進一步純化便用於結合。對反應混合物之UPLC-MS分析顯示92.5%亞胺-磺酸基D5、1.9%未反應之D5、0.8%馬來醯亞胺-磺酸基D5及4.8%二磺酸基D5。ESI-MS陰離子模式[M-H]-亞胺-磺酸基D5(C60H62N9O15S-)計算值：1180.41；實驗值：1180.03。
實例14.使用藉由選擇性磺酸化製備之細胞毒性劑進行抗體-細胞毒性劑結合物之製備
隨後將根據實例13製備之磺酸化反應混合物(240mL，3.5當量)引入至含有10g具有2個工程改造之半胱胺酸的hucMet27Gv1.3-C442抗體的50mM磷酸鉀pH 6.0溶液中。在2mg/mL抗體及15 v/v% DMA之最終濃度下，允許結合反應在25℃下進行18小時。對反應產物之SEC分析獲得ADC具有1.9之DAR(藥物：抗體比)以及4.4%之%HMW(高分子量物質百分比)，相比之下結合前為3.7%。
實例15.MET抗體結合物之製備 hucMET27v1.2-磺酸基-SPDB-DM4結合物之製備
將sSPDB連接子溶解於DMA中達至32.0mM之濃度。在25℃水浴中，在含50mM氯化鈉、2mM EDTA及5%最終DMA之60mM EPPS pH 8.0緩衝液中將抗體以3.8mg/mL與21.5倍莫耳過量之sSPDB連接子一起培育約2小時。經由Sephadex G-25管柱將經修飾之抗體純化至50mM EPPS、50mM氯化鈉、2mM EDTA之pH 8.0緩衝液中。藉由對所釋放之硫基吡啶基團進行還原及定量並且假定每個sSPDB連接一個硫基吡啶來計算連接子：抗體比(LAR)。隨後將結合反應設定在1.5mg/mL抗體濃度下且含有5% DMA及相對於計算LAR 1.5倍莫耳過量之DM4。在25℃水浴中進行15至20小時培育之後，經由在10mM琥珀酸鹽、250mM甘胺酸、0.5%蔗糖、0.01% Tween 20之pH 5.5緩衝液中平衡之Sephadex G-25管柱來純化反應混合物，並且濾過0.22μm PVDF注射器式過濾器。如以下「分析」下所描述來測定每個抗體連接之DM4分子數及總游離類美登素物質之百分比。獲得每個抗體具有平均3至4個DM4分子之結合物，其中<2%作為未結合之類美登素存在。
對於DM結合物，根據比爾定律(Beer's law)，使用在280及343nm下之UV/Vis吸光度值及其消光係數來計算抗體及連接子之莫耳濃度。Ab-連接子之1：20稀釋用於280nm值，而在含50mM DTT之pH 7.5緩衝液中之1：5稀釋用於343nm值。經DTT處理之樣品代表sSPDB連接子與所釋放之硫基吡啶呈現1：1比率。由所得[Ab]及[sSPDB]值計算最終連接子：抗體比。藉由量測252及280nm下之UV/Vis吸光度且使用說明各群組分之貢獻的二項方程計算[Ab]及[DM4]來確定每個抗體之DM4分子數。由經由HISEP管柱(Supelco編號58919 25cm×4.6mm，5μm)分析之樣品中所見之所得峰面積來計算最終cMet-DM4結合物中所存在之未結合類美登素之量。使用以下等式計算結合物樣品中所存在之游離類美登素百分比(%FM)：游離類美登素%=(歸因於DM1之逆相PA 252)/(歸因於DM1之逆相PA 252+歸因於DM1之流過PA 252)×100%。
SMCC-DM1結合物之製備
將4-(N-馬來醯亞胺基甲基)環己烷-1-甲酸磺酸基琥珀醯亞胺基酯(磺酸基-SMCC，Thermo Scientific Pierce)連接子溶解於二甲基乙醯胺(DMA)中，且以1.3倍莫耳過量在50mM琥珀酸鹽pH 5.0與DMA之60：40混合物中與N2'-去乙醯基-N-2'(3-巰基-1-側氧基丙基)-美登素(DM1)反應。10分鐘之後，添加0.2mM N-乙基馬來醯亞胺(NEM)之乙醇溶液以淬滅未反應之硫醇。15分鐘之後，將5至6當量之此連接子-藥物混合物添加至含抗體之60mM 4-(2-羥基乙基)-1-哌嗪丙磺酸(EPPS)、10mM磷酸鹽、139mM氯化鈉之pH 8緩衝液中，該緩衝液含有10% DMA且抗體濃度為2.5mg/mL。在25℃水浴中進行15至20小時培育之後，使用在含有10mM Tris-HCl、80mM氯化鈉、3.5%蔗糖、0.01%聚山梨醇酯20之pH 7.5緩衝液中平衡之SEPHADEXTM G25管柱來純化反應混合物。
使用抗體及DM1之先前報導之消光係數(Liu等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,93,8618-8623(1996))來確定每個抗體分子連接之DM1分子數。藉由將50至200μg結合物注射至於含25%乙腈之100mM乙酸銨緩衝液(pH 7.0)中平衡之SUPELCOSILTM HisepTM管柱(Sigma-Aldrich)上且在乙腈中溶析來測定結合反應之後存在之游離類美登素之百分比。使用設定至252nm波長之吸光度偵測器來量測總游離類美登素物質(溶析在梯度中且藉由將溶析時間與已知標準物相比較來鑑定)之峰面積，並且與結合之類美登素(溶析在管柱流過溶析份中之結合物峰中)相關之峰面積進行比較以計算總游離類美登素物質之百分比。獲得每個抗體具有平均3至4個DM1分子之結合物，其中<3%作為未結合之類美登素存在。
使用基於流式細胞術之方法來量測抗MET抗體及結合物對表現MET之BxPC3細胞的結合親和力。一級抗體及結合物係以1.5μg/mL至0.03 ng/mL之濃度使用。所使用之二級抗體為含5μg/mL FITC結合之山羊抗人類IgG抗體(來自於Jackson ImmunoResearch)的FACS緩衝液。人類化抗體hu247.22.2以及其-SMCC-DM1及-SPDB-DM4結合物分別以0.09nM、0.08nM及0.07nM之親和力結合BxPC3細胞。人類化抗體hu247.27.16以及其-SMCC-DM1及-SPDB-DM4結合物分別以0.39nM、0.44nM及0.84nM之親和力結合BxPC3細胞。此結果指示此等抗體之類美登素結合不顯著改變MET抗原之結合親和力。
hucMet27Gv1.3-磺酸基-SPDB-DM4結合物之製備
將sSPDB連接子溶解於DMA中達至22.8mM之濃度。在25℃水浴中，在含50mM氯化鈉、2mM EDTA及5%最終DMA之60mM EPPS pH 8.0緩衝液中將抗體以4mg/mL與21.5倍莫耳過量之sSPDB連接子一起培育約2小時。經由Sephadex G-25管柱將經修飾之抗體純化至50mM EPPS、50mM氯化鈉、2mM EDTA之pH 8.0緩衝液中。藉由對所釋放之硫基吡啶基團進行還原及定量並且假定每個sSPDB連接一個硫基吡啶來計算連接子：抗體比(LAR)。隨後將結合反應設定在1.4-1.5mg/mL抗體濃度下且含有5% DMA及相對於計算LAR 1.5倍莫耳過量之DM4。在25℃水浴中進行15至20小時培育之後，經由在10mM琥珀酸鹽、250mM甘胺酸、0.5%蔗糖、0.01% Tween 20之pH 5.5緩衝液中平衡之Sephadex G-25管柱來純化反應混合物，並且濾過0.22μm PVDF注射器式過濾器。如以下「分析」下所描述來測定每個抗體連接之DM4分子數及總游離類美登素物質之百分比。獲得每個抗體具有平均3至4個DM4分子之結合物，其中<2%作為未結合之類美登素存在。
hucMet22-磺酸基-SPDB-DM4結合物之製備
將sSPDB連接子溶解於DMA中達至22.8mM之濃度。在25℃水浴中，在含50mM磷酸鉀、50mM氯化鈉、2mM EDTA、pH 7.5、5%最終DMA及相對於連接子1.5倍莫耳過量之DM4的60mM EPPS pH 8.5緩衝液中將抗體 以4mg/mL與10倍莫耳過量之sSPDB連接子一起培育15至20小時。在25℃水浴中進行15至20小時培育之後，經由在10mM琥珀酸鹽、250mM甘胺酸、0.5%蔗糖、0.01% Tween 20之pH 5.5緩衝液中平衡之Sephadex G-25管柱來純化反應混合物，並且濾過0.22μm PVDF注射器式過濾器。如以下「分析」下所描述來測定每個抗體連接之DM4分子數及總游離類美登素物質之百分比。獲得每個抗體具有平均3至4個DM4分子之結合物，其中<2%作為未結合之類美登素存在。
hucMet27Gv1.3 DGN549結合物(離胺酸連接)之製備
使用預磺酸化之DGN549-NHS試劑(或D2)製造cMet-DGN549結合物。在DMA(9.4-15mM)中製備DGN549-NHS儲備液，且藉由在25℃下與5倍莫耳過量之亞硫酸氫鈉(於50mM琥珀酸鹽pH 5.0中之1M儲備液)一起培育三小時(最終組成為約90%有機物、10%水性物質)，繼而在4℃下培育15至20小時來使反應性亞胺磺酸化。在結合之前將抗體自PBS pH 7.4緩衝液交換成15mM HEPES pH 8.5。在25℃水浴中，在含有10% DMA及相對於Ab為3.1至3.5倍莫耳過量之磺酸化DGN549-NHS的15mM HEPES pH 8.5緩衝液中，在2.0mg/mL之Ab濃度下進行結合反應，持續4小時。經由在含有20mM組胺酸、50mM氯化鈉、8.5%蔗糖、0.01% Tween-20、50μM亞硫酸氫鈉之pH 6.2緩衝液中平衡之Sephadex G-25管柱來純化反應混合物，使用0.22μm PVDF注射器式過濾器進行過濾，並且分析。如以下「分析」下所描述來測定每個抗體連接之DGN549分子數及總游離DGN549物質之百分比。獲得每個抗體具有平均2至3個DGN549分子之結合物，其中<1%作為未結合之DGN549存在。
對於DGN結合物，藉由量測280及330nm下之UV/Vis吸光度且根據比爾定律計算[Ab]及[DGN549]來確定每個抗體之DGN549分子數。樣品係以純形式或在1：2稀釋度下進行讀取。為了測定未結合DGN549之量，藉由雙管柱 系統(TOSOH SEC QC-PAK GFC 300及Agilent Zorbax C18管柱)來分析結合物，以計算游離DGN549之總AUC。藉由使用相對於預先確定之標準曲線的所得峰AUC來測定游離DGN549濃度。
hucMet27Gv1.3-C442-DGN549結合物之製備
使用標準程序製備在還原狀態下攜帶兩個未配對半胱胺酸殘基之HucMet27Gv1.3抗體。使用以最終抗體濃度1mg/mL處於含有5mM EDTA之PBS pH 6.0中的此中間物及10莫耳當量之Mal-DGN549(或D5，呈處於DMA中之6.8mM儲備溶液形式)與2% v/v DMA及38% v/v丙二醇進行結合反應。在25℃水浴中進行結合反應，持續15至20小時。經由Sephadex G-25管柱將結合物純化至20mM琥珀酸鹽、8.5%蔗糖、50μM亞硫酸氫鈉、0.01% Tween 20之pH 4.2緩衝液中，藉由超過濾經由再生纖維素膜(Amicon Ultracel，10,000Da分子量截止值)進行濃縮，且濾過0.22μm PVDF注射器式過濾器。如以下「分析」下所描述來測定每個抗體連接之DGN549分子數及總游離DGN549物質之百分比。獲得每個抗體具有平均2至3個DGN549分子之結合物，其中<1%作為未結合之DGN549存在。
實例16.SMCC-DM1 MET抗體結合物之試管內細胞毒性 在MKN45細胞中之試管內細胞毒性活性
在表現MET之MKN45細胞中比較用抗MET抗體hu247.22.2、hu247.27.16、mu247.22.2及mu247.27.16製造之SMCC-DM1結合物的試管內細胞毒性與非特異性huIgG-SMCC-DM1結合物之活性，並且將來自於典型細胞毒性分析之結果顯示於圖14A中。與huIgG對照結合物相比，所有抗MET抗體結合物均引起特異性細胞殺死。對於hu247.22.2、hu247.27.16、mu247.22.2及mu247.27.16之SMCC-DM1結合物，EC50值分別對應於0.07nM、0.15nM、0.08nM及0.27nM。相反，非結合huIgG對照抗體之SMCC-DM1結合物在EC50值 >30nM之情況下引起細胞殺死。
在NCI-H441細胞中之試管內細胞毒性活性
在表現MET之NCI-H441細胞中比較用抗MET抗體hu247.22.2、hu247.27.16、mu247.22.2及mu247.27.16製造之SMCC-DM1結合物的試管內細胞毒性與非特異性huIgG-SMCC-DM1結合物之活性，並且將來自於典型細胞毒性分析之結果顯示於圖14B中。與huIgG對照結合物相比，所有抗MET抗體結合物均引起特異性細胞殺死。對於hu247.22.2、hu247.27.16、mu247.22.2及mu247.27.16之SMCC-DM1結合物，EC50值分別對應於0.04nM、0.08nM、0.04nM及0.09nM。相反，非結合huIgG對照抗體之SMCC-DM1結合物引起細胞殺死，EC50值為約25nM。
在BxPC3細胞中之試管內細胞毒性活性
在表現MET之BxPC3細胞中比較用抗MET抗體hu247.22.2、hu247.27.16及mu247.22.2製造之SMCC-DM1結合物的試管內細胞毒性與非特異性huIgG-SMCC-DM1結合物之活性，並且將來自於典型細胞毒性分析之結果顯示於圖14C中。與huIgG對照結合物相比，所有抗MET抗體結合物均引起特異性細胞殺死。對於hu247.22.2、hu247.27.16及mu247.22.2之SMCC-DM1結合物，EC50值分別對應於0.15nM、2.0nM及0.27nM。相反，非結合huIgG對照抗體之SMCC-DM1結合物引起細胞殺死，EC50值為約26nM。
在SNU-5細胞中之試管內細胞毒性活性
在表現MET之SNU-5細胞中比較hu247.27.16抗體之試管內細胞毒性與hu247.27.16-SMCC-DM1及hu247.27.16-SPDB-DM4結合物之活性，並且將來自於典型細胞毒性分析之結果顯示於圖14D中。
SNU-5細胞係獲自美國典型菌種收藏中心(ATCC)，且在37℃下在含有5% CO2之濕潤氛圍下維持在培養基(含20%胎牛血清之IMDM)中。將SNU-5 細胞以10,000個細胞/孔接種於96孔板中之相同培養基中，並且在37℃下培育隔夜。次日，將抗體或結合物稀釋至相同培養基中，並且以不同的濃度以200μL/孔之總體積添加至諸孔。在37℃下在濕潤5% CO2培育器中將細胞培育5天。隨後，溶解細胞且使用可對總細胞ATP含量進行定量之CellTiter Glo試劑(Promega)來評定生存力。利用Trilux光度計來量測各孔中之相對螢光單位(RLU)，且藉由將各已處理樣品值除以具有未處理細胞之孔的平均值來計算生存力百分比。對於各處理，將生存力百分比值相對於抗體濃度繪製於半對數圖中。藉由非線性回歸來產生劑量-反應曲線，且使用GraphPad Prism(GraphPad software，San Diego，CA)來計算各曲線之EC50值。
hu247.27.16-SMCC-DM1及hu247.27.16-SPDB-DM4結合物完全殺死SNU-5細胞，EC50值分別為約0.5及0.8nM。未結合之hu247.27.16抗體亦引起細胞殺死且使SNU-5生存力降至約50%，EC50為約0.5nM。此顯示hu247.27.16抗體可對表現MET之細胞具有抑制活性，且與諸如DM1或DM4之類美登素結合增強此細胞殺死活性。
實例17.MET抗體結合物之試管內細胞毒性
使用試管內細胞毒性分析來量測抗cMet抗體結合物殺死腫瘤細胞之能力。將靶細胞以2,000個細胞/孔接種於100μL完全RPMI培養基(RPMI-1640、10%胎牛血清、2mM麩醯胺酸、1%青黴素-鏈黴素，所有試劑均來自於Invitrogen)中。使用稀釋系列將結合物稀釋於完全RPMI培養基中，且每孔添加100μL各稀釋液。最終濃度通常對於DM4結合物而言介於3×10-8M至4.6×10-12M之範圍內且對於DGN549結合物而言介於1×10-8M至1.5×10-13M之範圍內。在37℃下在濕潤5% CO2培育器中將細胞培育4至5天。藉由比色WST-8分析(Dojindo Molecular Technologies)來測定其餘細胞之生存力。WST-8在活細胞中由脫氫酶還原成可溶於組織培養基中之橙色甲臢產物。所產生之甲臢之量 與活細胞數目成正比。添加WST-8至最終體積之10%，且在37℃下在濕潤5% CO2培育器中將諸板再培育2至4小時。藉由在多孔板讀數器中量測在450nm下之吸光度(A450)來分析諸板。自所有值減去僅含培養基及WST-8之諸孔的背景A450吸光度。藉由將各已處理樣品值除以具有未處理細胞之諸孔的平均值來計算生存力百分比。生存力百分比=100*(A450已處理樣品-A450背景)/(A450未處理樣品-A450背景)。對於各處理，將生存力百分比值相對於抗體濃度繪製於半對數圖中。藉由非線性回歸來產生劑量-反應曲線，且使用GraphPad Prism 6來計算各曲線之EC50值。
在胃癌細胞株中之試管內細胞毒性活性
在MET擴增-cMet過度表現之胃癌細胞株SNU5、MKN45及Hs746T中比較用抗cMet抗體hucMet27v1.2製造之sSBDP-DM4及sSBDP-DGN549結合物的試管內細胞毒性與非靶向IgG1結合物之活性。將來自典型細胞毒性分析之結果顯示於圖12A至圖12C中。與IgG1對照結合物相比，所有抗cMet抗體結合物均引起特異性細胞殺死。hucMet27v1.2-sSPDB-DM4結合物之EC50值在SNU5細胞為0.08nM，在MKN45細胞中為0.17nM，且在Hs746T細胞中為0.07nM。相反，非靶向IgG1對照抗體之sSPDB-DM4結合物引起細胞殺死，EC50值分別為10nM、12nM及3nM。引人注目的是，hucMet27v1.2-DGN549結合物即使在低濃度下在徹底降低細胞生存力方面亦極其有效。hucMet27v1.2-sSPDB-DM4結合物之EC50值在SNU5細胞中為0.008nM，在MKN45細胞中為0.013nM且在Hs746T細胞中為0.003nM，且所有情況下之活性為非靶向結合物之至少3倍對數倍數。
在NSCLC細胞株中之試管內細胞毒性活性
為了在hucMet27v1.2結合物於胃癌細胞株中顯現試管內細胞毒性活性後進行擴增，在過度表現cMet之NSCLC細胞株EBC-1(MET擴增-cMet過度 表現)及NCI-H411(MET未擴增-cMet過度表現)中比較其他抗cMet sSBDP-DM4及DGN549結合物與非靶向IgG1結合物之活性。將來自於典型細胞毒性分析之結果顯示於圖10A至圖10D中。在各測試情況下，觀察到良好特異性窗口，表明細胞毒性為抗cMet抗體與靶細胞結合之結果。對於抗cMet-sSPDB-DM4結合物，EC50值介於41至95pM之範圍內。特定言之，抗cMet-DGN549結合物非常有效，EC50值為1至5pM且活性為非靶向IgG1結合物之約3倍對數倍數。令人驚訝的是，抗cMet-DGN549結合物在未擴增-過度表現情形下亦非常有效，而huCMET27-sSPDB-DM4結合物對大多數過度表現c-MET之NSCLC細胞株未顯示靶向效能(參見圖20)。
huCMet27Gv1.3鉸鏈經修飾結合物在NSCLC及胃癌細胞株中之試管內細胞毒性活性
為了在hucMet27Gv1.3結合物於NSCLC及胃癌細胞株中顯現試管內細胞毒性活性後進行擴增，在EBC-1(MET擴增型NSCLC細胞株)及Hs746T(MET擴增型胃癌細胞株)中比較其他抗cMet-sSPDB-DM4結合物與非靶向IgG1結合物(chKTI-sSPDB-DM4)之活性。來自於典型細胞毒性分析之結果示於圖26中。在各測試情況下，觀察到良好特異性窗口，表明細胞毒性為抗cMet抗體與靶細胞結合之結果。hucMet27Gv1.3-sSPDB-DM4及hucMet27Gv1.3鉸鏈28-sSPDB-DM4結合物兩者皆非常有效，EC50值為0.05nM至0.07nM且活性為非靶向IgG1結合物之約2倍對數倍數。
當分析抗cMet-sSPDB-DM4結合物之EC50值時，觀測到MET擴增型細胞株具有低於過度表現型細胞株之EC50值。兩組細胞株同樣對DM4游離有效負載敏感且同樣對非靶向chKTI-sSPDB-DM4對照物不敏感(圖27)。
在Hep3B細胞中之試管內細胞毒性活性
為了評估抗cMet結合物在表現低水準cMet之細胞中的效能，吾等 在肝細胞癌Hep3B細胞株中比較抗cMet結合物與非靶向IgG1結合物之試管內細胞毒性活性。Hep3B細胞具有正常MET基因副本數且每個細胞表現少於30,000個細胞表面受體。將來自於典型細胞毒性分析之結果顯示於圖13中。即使在高濃度下，sSPDB-DM4及DGN54結合物亦僅顯示邊界水準之細胞毒性，且未觀測到特異性窗口，指示低水準活性為非靶向的。類似地，即使在高濃度下，huCMET27結合物對轉型肝細胞之效能亦低1000倍(參見圖21)。
實例18.抗cMet ADC在cMet配位體HGF存在下之試管內細胞毒性
cMET在腫瘤中活化可經由HGF依賴性自分泌及旁分泌機制發生。HGF自周圍基質細胞中釋放，從而引起組成性旁分泌cMET活化；或HGF及cMET可共表現於腫瘤中，從而引起自分泌活化，如在癌瘤、肉瘤、神經膠質瘤及B細胞腫瘤中所發現。為了測試抗cMet抗體結合物在天然c-Met配位體存在下之效能，在HGF存在下進行試管內細胞毒性分析。簡而言之，將2,000個EBC-1細胞/孔接種於96孔板中，並且添加含抗cMet結合物之稀釋系列的單獨或補充有100ng/mL或1000ng/mL HGF之完全RPMI培養基。各分析板中包括含有細胞但缺乏結合物之對照孔以及僅含有培養基之孔。對於各資料點，以一式三份進行分析。在37℃下在濕潤5% CO2培育器中將諸板培育5天。隨後使用基於WST-8之細胞計數套組-8(Dojindo Molecular Technologies)測定各孔中之活細胞的相對數目。藉由首先修正培養基背景吸光度，隨後將各值除以對照孔(未處理細胞)中之諸值的平均值來計算各孔中之細胞的存活分數。將存活細胞之百分比相對於結合物濃度進行繪圖，且使用非線性回歸分析(GraphPad Prims 6)來計算活性之EC50。
所有抗cMet-DGN549結合物在不存在配位體時顯示類似效能(圖11B至圖11D)。令人感興趣的是，結果顯示即使存在高濃度之HGF亦不影響hucMetGv2.2-DGN549、hucMetv1.2-DGN549及hucMetGv1.3-DGN549之效能。 相反，hu5D5-DGN549結合物之效能隨HGF濃度增加而顯著降低(圖11A)。此資料表明不同於hu5D5-DGN549，即使腫瘤位點處之HGF水準局部較高，hucMetGv2.2-DGN549、hucMetv1.2-DGN549及hucMetGv1.3-DGN549結合物亦將可能保留其全部效能。
實例19.MET抗體SMCC-DM1結合物之抗腫瘤活性
如以上所描述在於雌性無胸腺nu/nu小鼠(Harlan，Livermore，CA)中建立之EBC-1異種移植模型中測試抗MET抗體及其相應SMCC-DM1結合物。當腫瘤達到約200mm3之平均腫瘤體積時，根據腫瘤體積將動物隨機分至處理組(n=10隻/組)中，且在腫瘤植入後第11天用10mg/kg媒劑、hu247.22.2-SMCC-DM1、hu247.27.16-SMCC-DM1或非結合huIgG-SMCC-DM1對照結合物處理一次。隨機分組且開始給藥後，如以上所描述來量測腫瘤異種移植物。藉由ANOVA來確定腫瘤體積差異之統計顯著性，且使用SigmaPlot藉由杜凱後測試(Tukey's post-test)進行逐對比較。將不同的處理組的平均腫瘤體積相對於腫瘤植入後時間繪製於圖15中。顯而易見，利用非結合huIgG-SMCC-DM1對照結合物之處理與媒劑對照相比未減小腫瘤體積。相反，利用hu247.22.2-SMCC-DM1或hu247.27.16-SMCC-DM1結合物之處理引起平均腫瘤體積顯著減小(p<0.001，與第24天之huIgG-SMCC-DM1對照組相比)。
實例20.MET抗體結合物在攜帶Ebc-1人類非小細胞肺鱗狀細胞癌異種移植物之裸鼠中的抗腫瘤活性
在人類非小細胞肺鱗狀細胞癌異種移植模型，亦即攜帶Ebc-1細胞之雌性無胸腺裸Foxn1nu小鼠中評估不同劑量之hucMet27v1.2-DGN549及單一劑量之hucMet27v1.2-sSPDB-DM4結合物的抗腫瘤活性。
收集Ebc-1細胞以便進行接種，其中依據台酚藍拒染測定細胞生存力為99%。藉由使用27號針在右脅進行皮下注射給小鼠接種含5×106個Ebc-1 細胞之0.1ml無血清培養基。依據腫瘤體積將80隻雌性裸鼠(6至7週齡)隨機分至8個群組(10隻小鼠/組)。平均腫瘤體積介於108至115mm3之間的範圍內。量測小鼠，隨機分組，且在植入後第7天基於腫瘤體積進行給藥。藉由使用配備27號針之1.0ml注射器經靜脈內進行測試藥劑及媒劑之投與。所包括之群組為給與媒劑(PBS)之對照組、chKTI-sSPDB-DM4 5mg/kg、hucMet27v1.2-sSPDB-DM4 5mg/kg、chKTI-DGN549 3μg/kg(以有效負載計；以抗體計0.18mg/kg)、chKTI-DGN549 10μg/kg(以有效負載計；以抗體計0.6mg/kg)、hucMet27v1.2-DGN549 3μg/kg(以有效負載計；以抗體計0.18mg/kg)、hucMet27v1.2-DGN549 10μg/kg(以有效負載計；以抗體計0.6mg/kg)。所有測試藥劑均作為單一靜脈內劑量投與。
每週3次記錄腫瘤量測值。根據卡尺量測值，藉由體積量測算式來評估腫瘤負擔(mm3)：腫瘤負擔(mm3)=(L×W2)/2，其中L及W為相應正交腫瘤長度及寬度量測值(mm)。用於評估效力之主要終點為腫瘤生長抑制、%T/C、完全及部分腫瘤反應及研究結束時無腫瘤存活者之數目。在此實驗中，當中值對照腫瘤負擔達至1080mm3(第24天)時，評估%T/C。
小鼠體重(BW)表示為相對於處理前體重之體重變化百分比，如下：BW變化%=[(BW後/BW前)-1]×100，其中BW後為處理後重量且BW前為治療前之初始體重。體重損失(BWL)百分比表示為處理後之平均體重變化。當腫瘤體積大於1000mm3或壞死時，或體重在研究中之任何時間點下降20%以上時，將動物處死。
研究結果顯示於圖16中。hucMet27v1.2-sSPDB-DM4結合物在5mg/kg劑量下具有高活性。hucMet27v1.2-sSPDB-DM4結合物在5mg/kg劑量下具有0%之腫瘤生長抑制(T/C)值(10/10完全消退)。hucMet27v1.2-DGN549在10μg/kg(以有效負載計；以抗體計0.6mg/kg)下具有高活性(10/10完全消退)且具有 腫瘤生長抑制(T/C)值0。儘管hucMet27v1.2-DGN549在3μg/kg(以有效負載計；以抗體計0.18mg/kg)下無活性，其中腫瘤生長抑制(T/C)值為45%，存在3/10完全消退。
利用chKTI-sSPDB-DM4、hucMet27v1.2-sSPDB-DM4、chKTI-DGN549及hucMet27v1.2-DGN549之治療在所指示之劑量下均得以良好耐受，且在此研究中未觀測到顯著體重損失。兩種方案，亦即，hucMet27v1.2-sSPDB-DM4 5mg/kg及hucMet27v1.2-DGN549 10μg/kg(以有效負載計；以抗體計0.6mg/kg)顯示誘導100%腫瘤消退發生率之有效活性，其中所有小鼠在第91天研究終止時保持無腫瘤。兩種方案之腫瘤消退即時發生，起始於第7天給藥後之早期時間點。所有其餘治療方案在此研究中無活性。
實例21.抗cMet抗體藥物結合物在攜帶HSC-2人類頭頸部鱗狀細胞癌(HNSCC)異種移植物之SCID小鼠中的抗腫瘤活性
在HNSCC異種移植模型，亦即攜帶HSC2細胞之雌性SCID小鼠中評估不同劑量之hucMet27Gv1.3-C442-DGN549及單一劑量之hMucMet27Gv1.3-sSPDB-DM4結合物的抗腫瘤活性。
收集HSC2細胞以便按9/16/16進行接種，其中依據台盼藍拒染測定生存力為100%。藉由在右後脅區域進行皮下注射給小鼠接種含5×106個HSC2細胞之0.1ml 50%基質膠/50%無血清培養基。自Charles River Laboratories獲得36隻雌性SCID小鼠(6週齡)。簽收後，觀察動物4天，隨後開始研究。動物在抵達時或處理前未顯示疾病跡象。
依據腫瘤體積將36隻小鼠隨機分成6個群組(6隻小鼠/組)。腫瘤體積介於84.77至118.74mm3之範圍內(諸群組之平均TV介於95.57至101.91mm3之間)。將小鼠隨機分組，且在植入後第6天基於腫瘤體積進行給藥。小鼠體重介於16.85至20.76公克之範圍內(諸群組之平均BW介於18.24至19.31公克之 間)。藉由耳號鉗方法來鑑別各群組中之小鼠。藉由使用配備27號½吋針之1.0ml注射器經靜脈內進行測試藥劑及媒劑之投與。該等群組包括：給與媒劑(PBS)150μL/小鼠之對照組、chKTI-sSPDB-DM4 5mg/kg、hucMet27Gv1.3-sSPDB-DM4 5mg/kg、huKTI-C442-DGN549 10μ/kg(以有效負載計；以抗體計0.5mg/kg)及hucMetGv271.3-C442-DGN549 3μ/kg及10μg/kg(以有效負載計；以抗體計分別為0.15mg/kg及0.5mg/kg)。所有測試藥劑均作為單一靜脈內劑量投與。
每週兩次使用卡尺在三個維度上量測腫瘤尺寸。使用算式V=長度×寬度×高度×½來表示腫瘤體積(mm3)。當腫瘤體積減小50%以上時，小鼠被視為部分消退(PR)；當無法偵測到明顯腫瘤時，完全腫瘤消退(CR)且無腫瘤存活者(TFS)為研究結束時無腫瘤之小鼠數目。每週兩次量測所有小鼠之體重作為藥物毒性之粗略指數。藉由StudyLog軟體來確定腫瘤體積及體重。
小鼠體重(BW)表示為相對於處理前體重之體重變化百分比，如下：BW變化%=[(BW後/BW前)-1]×100，其中BW後為處理後重量且BW前為治療前之初始體重。體重損失(BWL)百分比表示為處理後之平均體重變化。當腫瘤體積大於1000mm3或壞死時，或體重在研究中之任何時間點下降20%以上時，將動物處死。
研究結果顯示於圖17中。hMucMet27Gv1.3-sSPDB-DM4結合物在5mg/kg劑量下具有活性。hucMet27Gv1.3-sSPDB-DM4結合物在5mg/kg劑量下具有11%之腫瘤生長抑制(T/C)值(1/6部分消退及1/6完全消退)。hucMet27Gv1.3-C442-DGN549在3μg/kg(以有效負載計；以抗體計0.15mg/kg)下具有高活性(6/6部分消退及4/6完全消退)且具有腫瘤生長抑制(T/C)值4%。hucMet27Gv1.3-C442-DGN549在10μg/kg(以有效負載計；以抗體計0.5mg/kg)下具有高活性(6/6部分消退及4/6完全消退)且具有腫瘤生長抑制(T/C)值4%。
利用chKTI-sSPDB-DM4、hucMet27Gv1.3-sSPDB-DM4、 huKTI-C442-DGN549及hucMet27Gv1.3-C442-DGN549之治療在所指示之劑量下均得以良好耐受，且在此研究中未觀測到顯著體重損失。兩種方案，亦即，hucMet27Gv1.3-C442-DGN549 3μg/kg(以有效負載計；以抗體計0.15mg/kg)及10μg/kg(以有效負載計；以抗體計0.5mg/kg)顯示誘導66.7%腫瘤消退發生率之有效活性，其中6隻小鼠中之4隻小鼠在第72天時均保持無腫瘤。兩種方案之腫瘤消退即時發生，起始於第6天給藥後之早期時間點。一個額外處理組，hucMet27Gv1.3-sSPDB-DM45mg/kg，亦顯示誘導16.7%腫瘤消退發生率之相對良好抗腫瘤活性，其中一隻小鼠在第72天保持完全消退。除此三個處理組以外之所有其餘處理方案在此研究中均無活性。
實例22.抗cMet抗體藥物結合物在攜帶H1975人類非小細胞肺鱗狀細胞癌異種移植物之裸鼠中的抗腫瘤活性
在人類非小細胞肺鱗狀細胞癌異種移植模型，亦即攜帶H1975細胞之雌性無胸腺裸Foxnlnu小鼠中評估不同劑量之hucMet27Gv1.3-DGN549(離胺酸連接)及單一劑量之hucMet27Gv1.3-sSPDB-DM4結合物的抗腫瘤活性。
收集H1975細胞以便進行接種，其中依據台酚藍拒染測定細胞生存力為99%。藉由使用27號針在右脅進行皮下注射給小鼠接種含5×106個H1975細胞之0.1ml 50%基質膠/50%無血清培養基。依據腫瘤體積將60隻雌性裸鼠(6至7週齡)隨機分至6個群組(10隻小鼠/組)。平均腫瘤體積介於113至144mm3之間的範圍內。量測小鼠，隨機分組，且在植入後第5天基於腫瘤體積進行給藥。藉由使用配備27號針之1.0ml注射器經靜脈內進行測試藥劑及媒劑之投與。所包括之群組為給與媒劑(PBS)之對照組、chKTI-sSPDB-DM4 5mg/kg、hucMet27Gv1.3-sSPDB-DM4 5mg/kg、chKTI-DGN549 10μg/kg(以有效負載計；以抗體計0.5mg/kg)、hucMet27Gv1.3-DGN549 3μg/kg(以有效負載計；以抗體計0.15mg/kg)、hucMet27Gv1.3-DGN549 10μg/kg(以有效負載計；以抗體計0.5 mg/kg)。所有測試藥劑均作為單一靜脈內劑量投與。
每週3次記錄腫瘤量測值。根據卡尺量測值，藉由體積量測算式來評估腫瘤負擔(mm3)：腫瘤負擔(mm3)=(L×W2)/2，其中L及W為相應正交腫瘤長度及寬度量測值(mm)。用於評估效力之主要終點為腫瘤生長抑制、%T/C、完全及部分腫瘤反應及研究結束時無腫瘤存活者之數目。在此實驗中，當中值對照腫瘤負擔達至1183mm3(第18天)時，評估%T/C。
小鼠體重(BW)表示為相對於處理前體重之體重變化百分比，如下：BW變化%=[(BW後/BW前)-1]×100，其中BW後為處理後重量且BW前為治療前之初始體重。體重損失(BWL)百分比表示為處理後之平均體重變化。當腫瘤體積大於1000mm3或壞死時，或體重在研究中之任何時間點下降20%以上時，將動物處死。
研究結果顯示於圖18中。hucMet27Gv1.3-sSPDB-DM4結合物在5mg/kg劑量下無活性。hucMet27Gv1.3-sSPDB-DM4結合物在5mg/kg劑量下具有79%之腫瘤生長抑制(T/C)值(無PR或CR)。hucMet27Gv1.3-DGN549在10μg/kg(以有效負載計；以抗體計0.5mg/kg)下具有高活性(4/10完全消退)且具有腫瘤生長抑制(T/C)值6%。hucMet27Gv1.3-DGN549在3μg/kg(以有效負載計；以抗體計0.15mg/kg)下具有高活性(3/10完全消退)且具有腫瘤生長抑制(T/C)值10%。
利用chKTI-sSPDB-DM4、hucMet27Gv1.3-sSPDB-DM4、chKTI-DGN549及hucMet27Gv1.3-DGN549之治療在所指示之劑量下均得以良好耐受，且在此研究中未觀測到顯著體重損失。
儘管已詳細地且參考本發明之特定態樣描述本發明，但熟習此項技術者應顯而易知可在不背離本發明之精神及範疇的情況下對其進行各種變化及修改。
本文中所提及之所有參考文獻均以全文引用之方式併入。

Claims (86)

  1. 一種經分離之單株抗體或其抗原結合片段，其特異性結合人類cMET之細胞外區中的抗原決定基，其中該抗體或其抗原結合片段包含具有選自由以下各項組成之群的序列的輕鏈互補決定區LC CDR1、LC CDR2及LC CDR3以及重鏈互補決定區HC CDR1、HC CDR2及HC CDR3：(a)分別SEQ ID NO：4、5及7以及SEQ ID NO：13、14及15；(b)分別SEQ ID NO：1、2及3以及SEQ ID NO：8、9及10；(c)分別SEQ ID NO：1、2及3以及SEQ ID NO：8、12及10；(d)分別SEQ ID NO：4、5及6以及SEQ ID NO：13、14及15；(e)分別SEQ ID NO：4、5及6以及SEQ ID NO：13、17及15；(f)分別SEQ ID NO：4、5及7以及SEQ ID NO：13、17及15；以及(g)分別SEQ ID NO：4、5及8以及SEQ ID NO：13、17及15。
  2. 如申請專利範圍第1項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體為鼠類抗體、非人類哺乳動物抗體、嵌合抗體、人類化抗體或人類抗體。
  3. 如申請專利範圍第2項之抗體或其抗原結合片段，其中該人類化抗體為CDR移植抗體或表面重整抗體。
  4. 如申請專利範圍第1項至第3項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體為全長抗體。
  5. 如申請專利範圍第1項至第3項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該其抗原結合片段為Fab、Fab'、F(ab') 2、F d、單鏈Fv或scFv、二硫鍵連接之F v、V-NAR結構域、IgNar、內抗體、IgGΔCH 2、微型抗體、F(ab') 3、四功能抗體、三功能抗體、雙功能抗體、單域抗體、DVD-Ig、Fcab、mAb 2、(scFv) 2或scFv-Fc。
  6. 如申請專利範圍第1項至第5項中任一項之抗體或其抗原結合片 段，其中該抗體或其抗原結合片段包含具有與選自由以下各項組成之群的序列具有至少95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性的序列的輕鏈可變域(VL)及重鏈可變域(VH)：(a)分別SEQ ID NO：32及SEQ ID NO：36；(b)分別SEQ ID NO：18及SEQ ID NO：19；(c)分別SEQ ID NO：20及SEQ ID NO：21；(d)分別SEQ ID NO：22及SEQ ID NO：23；(e)分別SEQ ID NO：24及SEQ ID NO：25；(f)分別SEQ ID NO：26及SEQ ID NO：27；(g)分別SEQ ID NO：28及SEQ ID NO：31；(h)分別SEQ ID NO：29及SEQ ID NO：31；(i)分別SEQ ID NO：30及SEQ ID NO：31；(j)分別SEQ ID NO：32及SEQ ID NO：35；(k)分別SEQ ID NO：32及SEQ ID NO：36；(l)分別SEQ ID NO：33及SEQ ID NO：36；(m)分別SEQ ID NO：33及SEQ ID NO：35；以及(n)分別SEQ ID NO：33及SEQ ID NO：34。
  7. 如申請專利範圍第1項至第6項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含具有選自由以下各項組成之群的序列的輕鏈及重鏈：(a)分別SEQ ID NO：49及SEQ ID NO：54；(b)分別SEQ ID NO：39及SEQ ID NO：40；(c)分別SEQ ID NO：41及SEQ ID NO：42；(d)分別SEQ ID NO：43及SEQ ID NO：44； (e)分別SEQ ID NO：45及SEQ ID NO：48；(f)分別SEQ ID NO：46及SEQ ID NO：48；(g)分別SEQ ID NO：47及SEQ ID NO：48；(h)分別SEQ ID NO：49及SEQ ID NO：53；(i)分別SEQ ID NO：49及SEQ ID NO：52；(j)分別SEQ ID NO：49及SEQ ID NO：51；(k)分別SEQ ID NO：50及SEQ ID NO：53；(l)分別SEQ ID NO：50及SEQ ID NO：52；(m)分別SEQ ID NO：50及SEQ ID NO：51；(n)分別SEQ ID NO：49及SEQ ID NO：77；(o)分別SEQ ID NO：49及SEQ ID NO：78；(p)分別SEQ ID NO：49及SEQ ID NO：79；(q)分別SEQ ID NO：49及SEQ ID NO：80；(r)分別SEQ ID NO：49及SEQ ID NO：81；(s)分別SEQ ID NO：49及SEQ ID NO：82；(t)分別SEQ ID NO：49及SEQ ID NO：83；以及(u)分別SEQ ID NO：49及SEQ ID NO：84。
  8. 如申請專利範圍第1項至第6項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體包含具有序列SEQ ID NO：49之輕鏈及具有序列SEQ ID NO：53之重鏈。
  9. 如申請專利範圍第1項至第6項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體包含具有序列SEQ ID NO：49之輕鏈及具有序列SEQ ID NO：82之重鏈。
  10. 一種經分離之抗體或其抗原結合片段，其係由雜交瘤 247.27.16、247.2.26、247.48.38、247.3.14、247.22.2、248.69.4及247.16.8中之任一種產生。
  11. 一種多肽，其包含如申請專利範圍第6項之VL及VH序列。
  12. 一種細胞，其產生如申請專利範圍第1項至第10項中任一項之抗體或其抗原結合片段或者如申請專利範圍第11項之多肽。
  13. 一種產生如申請專利範圍第1項至第10項中任一項之抗體或其抗原結合片段或者如申請專利範圍第11項之多肽的方法，其包括：(a)培養如申請專利範圍第12項之細胞；及(b)自該培養之細胞分離該抗體、其抗原結合片段或多肽。
  14. 如申請專利範圍第13項之方法，其中該細胞為真核細胞。
  15. 一種診斷試劑，其包含如申請專利範圍第1項至第10項中任一項之抗體或其抗原結合片段。
  16. 如申請專利範圍第15項之診斷試劑，其中該抗體或抗體片段經標記。
  17. 如申請專利範圍第16項之診斷試劑，其中該標記物係選自由以下各項組成之群：放射性標記、螢光團、發色團、顯像劑及金屬離子。
  18. 一種編碼如申請專利範圍第1項至第10項之抗體或抗原結合片段的聚核苷酸，其中該聚核苷酸具有選自由SEQ ID NO：55-72及109-116組成之群的序列。
  19. 一種載體，其包含如申請專利範圍第18項之聚核苷酸。
  20. 一種宿主細胞，其包含如申請專利範圍第19項之表現載體。
  21. 一種免疫結合物，其係由下式表示： 其中：CBA為如申請專利範圍第1項至第10項中任一項之抗體或其抗原結合片段或者如申請專利範圍第11項之多肽，其係經由離胺酸殘基共價連接至Cy L1；W L為1至20之整數；且Cy L1係由以下各式表示： 或其醫藥學上可接受之鹽，其中：介於N與C之間的雙線 表示單鍵或雙鍵，限制條件為當其為雙鍵時，X不存在且Y為-H或(C 1-C 4)烷基；並且當其為單鍵時，X為-H或胺保護部分，且Y為-OH或-SO 3H或其醫藥學上可接受之鹽；W'為-NR e'；R e'為-(CH 2-CH 2-O) n-R k；n為2至6之整數；R k為-H或-Me；R x3為(C 1-C 6)烷基；L'係由以下各式表示：-NR 5-P-C(=O)-(CR aR b) m-C(=O)- (B1')；或 -NR 5-P-C(=O)-(CR aR b) m-S-Z s1- (B2')；R 5為-H或(C 1-C 3)烷基；P為胺基酸殘基或含有介於2至20個之間的胺基酸殘基的肽；R a及R b在每次出現時各自獨立地為-H、(C 1-C 3)烷基或帶電取代基或可離子化基團Q；m為1至6之整數；且Z s1係選自以下各式中之任一者： ；及 其中q為1至5之整數。
  22. 如申請專利範圍第21項之免疫結合物，其中R a及R b均為H；且R 5為H或Me。
  23. 如申請專利範圍第21項或第22項之免疫結合物，其中P為含有 2至5個胺基酸殘基之肽。
  24. 如申請專利範圍第21項至第23項中任一項之免疫結合物，其中P係選自Gly-Gly-Gly、Ala-Val、Val-Ala、Val-Cit、Val-Lys、Phe-Lys、Lys-Lys、Ala-Lys、Phe-Cit、Leu-Cit、Ile-Cit、Trp、Cit、Phe-Ala、Phe-N 9-甲苯磺醯基-Arg、Phe-N 9-硝基-Arg、Phe-Phe-Lys、D-Phe-Phe-Lys、Gly-Phe-Lys、Leu-Ala-Leu、Ile-Ala-Leu、Val-Ala-Val、Ala-Leu-Ala-Leu(SEQ ID NO：74)、β-Ala-Leu-Ala-Leu(SEQ ID NO：75)、Gly-Phe-Leu-Gly(SEQ ID NO：76)、Val-Arg、Arg-Val、Arg-Arg、Val-D-Cit、Val-D-Lys、Val-D-Arg、D-Val-Cit、D-Val-Lys、D-Val-Arg、D-Val-D-Cit、D-Val-D-Lys、D-Val-D-Arg、D-Arg-D-Arg、Ala-Ala、Ala-D-Ala、D-Ala-Ala、D-Ala-D-Ala、Ala-Met、Met-Ala、Gln-Val、Asn-Ala、Gln-Phe及Gln-Ala。
  25. 如申請專利範圍第24項之免疫結合物，其中P為Gly-Gly-Gly、Ala-Val、Ala-Ala、Ala-D-Ala、D-Ala-Ala或D-Ala-D-Ala。
  26. 如申請專利範圍第21項至第25項中任一項之免疫結合物，其中Q為-SO 3H或其醫藥學上可接受之鹽。
  27. 如申請專利範圍第21項之免疫結合物，其中該免疫結合物係由以下各式表示： 或其醫藥學上可接受之鹽，其中W L為1至10之整數；介於N與C之間的雙線 表示單鍵或雙鍵，限制條件為當其為雙鍵時，X不存在且Y為-H；並且當其為單鍵時，X為-H且Y為-OH或-SO 3H或其醫藥學上可接受之鹽。
  28. 一種免疫結合物，其係由下式表示： 其中：CBA為如申請專利範圍第1項至第10項中任一項之抗體或其抗原結合片段或者如申請專利範圍第11項之多肽，其係經由離胺酸殘基共價連接至Cy L2；W L為1至20之整數；且Cy L2係由以下各式表示： 或其醫藥學上可接受之鹽，其中： 介於N與C之間的雙線 表示單鍵或雙鍵，限制條件為當其為雙鍵時，X不存在且Y為-H或(C 1-C 4)烷基；並且當其為單鍵時，X為-H或胺保護部分，且Y為-OH或-SO 3H；R x1及R x2獨立地為(C 1-C 6)烷基；R e為-H或(C 1-C 6)烷基；W'為-NR e'；R e'為-(CH 2-CH 2-O) n-R k；n為2至6之整數；R k為-H或-Me；Z s1係選自以下各式中之任一者： ；及 其中q為1至5之整數。
  29. 如申請專利範圍第28項之免疫結合物，其中R e為H或Me；R x1及R x2獨立地為-(CH 2) p-(CR fR g)-，其中R f及R g各自獨立地為-H或(C 1-C 4)烷 基；且p為0、1、2或3。
  30. 如申請專利範圍第29項之免疫結合物，其中R f與R g相同或不同且係選自-H及-Me。
  31. 如申請專利範圍第28項之免疫結合物，其中該免疫結合物係由以下各式表示： 或其醫藥學上可接受之鹽，其中W L為1至10之整數；介於N與C之間的雙線 表示單鍵或雙鍵，限制條件為當其為雙鍵時，X不存在且Y為-H；並且當其為單鍵時，X為-H且Y為-OH或-SO 3H或其醫藥學上可接受之鹽。
  32. 如申請專利範圍第21項至第31項中任一項之免疫結合物，其中該介於N與C之間的雙線 表示雙鍵，X不存在且Y為-H。
  33. 如申請專利範圍第21項至第31項中任一項之免疫結合物，其中該介於N與C之間的雙線 表示單鍵，X為-H且Y為-SO 3H或其醫藥學上可接受之鹽。
  34. 如申請專利範圍第33項之免疫結合物，其中Y為-SO 3H、-SO 3Na或-SO 3K。
  35. 如申請專利範圍第33項之免疫結合物，其中Y為-SO 3Na。
  36. 一種免疫結合物，其係由下式表示： 其中：CBA為如申請專利範圍第1項至第10項中任一項之抗體或其抗原結合片 段或者如申請專利範圍第11項之多肽，其係經由離胺酸殘基共價連接至Cy L2；W L為1至20之整數；Cy L3係由下式表示： m'為1或2；R 1及R 2各自獨立地為H或(C 1-C 3)烷基；且Z s1係選自以下各式中之任一者： ；及 其中q為1至5之整數。
  37. 如申請專利範圍第36項之免疫結合物，其中m'為1，且R 1及R 2均為H。
  38. 如申請專利範圍第36項之免疫結合物，其中m'為2，且R 1及R 2均為Me。
  39. 如申請專利範圍第36項之免疫結合物，其中該免疫結合物係由以下各式表示： ；或 ；或 或其醫藥學上可接受之鹽，其中W L為1至10之整數。
  40. 如申請專利範圍第36項之免疫結合物，其中該免疫結合物係由下式表示： 或其醫藥學上可接受之鹽。
  41. 一種免疫結合物，其係由下式表示： 其中：CBA為如申請專利範圍第1項至第10項中任一項之抗體或其抗原結合片段或者如申請專利範圍第11項之多肽，其係經由半胱胺酸殘基共價連接至Cy C1；W C為1或2；Cy C1係由以下各式表示： 或其醫藥學上可接受之鹽，其中：介於N與C之間的雙線 表示單鍵或雙鍵，限制條件為當其為雙鍵時，X不存在且Y為-H或(C 1-C 4)烷基；並且當其為單鍵時，X為-H或胺保護部分，Y為-OH或-SO 3H或其醫藥學上可接受之鹽；R 5為-H或(C 1-C 3)烷基；P為胺基酸殘基或含有2至20個胺基酸殘基之肽；R a及R b在每次出現時獨立地為-H、(C 1-C 3)烷基或帶電取代基或可離子化基團Q；m為1至6之整數；W'為-NR e'；R e'為-(CH 2-CH 2-O) n-R k；n為2至6之整數；R k為-H或-Me；R x3為(C 1-C 6)烷基；且L C係由 表示，s1為與CBA共價連接之位點，且s2為與Cy C1上之-C(=O)-基團共價連接之位點；其中： R 19及R 20在每次出現時獨立地為-H或(C 1-C 3)烷基；m"為介於1與10之間的整數；且R h為-H或(C 1-C 3)烷基。
  42. 如申請專利範圍第41項之免疫結合物，其中R a及R b均為H；且R 5為H或Me。
  43. 如申請專利範圍第41項或第42項之免疫結合物，其中P為含有2至5個胺基酸殘基之肽。
  44. 如申請專利範圍第41項至第43項中任一項之免疫結合物，其中P係選自Gly-Gly-Gly、Ala-Val、Val-Ala、Val-Cit、Val-Lys、Phe-Lys、Lys-Lys、Ala-Lys、Phe-Cit、Leu-Cit、Ile-Cit、Trp、Cit、Phe-Ala、Phe-N 9-甲苯磺醯基-Arg、Phe-N 9-硝基-Arg、Phe-Phe-Lys、D-Phe-Phe-Lys、Gly-Phe-Lys、Leu-Ala-Leu、Ile-Ala-Leu、Val-Ala-Val、Ala-Leu-Ala-Leu(SEQ ID NO：74)、β-Ala-Leu-Ala-Leu(SEQ ID NO：75)、Gly-Phe-Leu-Gly(SEQ ID NO：76)、Val-Arg、Arg-Val、Arg-Arg、Val-D-Cit、Val-D-Lys、Val-D-Arg、D-Val-Cit、D-Val-Lys、D-Val-Arg、D-Val-D-Cit、D-Val-D-Lys、D-Val-D-Arg、D-Arg-D-Arg、Ala-Ala、Ala-D-Ala、D-Ala-Ala、D-Ala-D-Ala、Ala-Met、Met-Ala、Gln-Val、Asn-Ala、Gln-Phe及Gln-Ala。
  45. 如申請專利範圍第44項之免疫結合物，其中P為Gly-Gly-Gly、Ala-Val、Ala-Ala、Ala-D-Ala、D-Ala-Ala或D-Ala-D-Ala。
  46. 如申請專利範圍第41項至第45項中任一項之免疫結合物，其中Q為-SO 3H或其醫藥學上可接受之鹽。
  47. 如申請專利範圍第41項至第46項中任一項之免疫結合物，其中R 19及R 20均為H；且m"為1至6之整數。
  48. 如申請專利範圍第47項之免疫結合物，其中-L C-係由下式表示：
  49. 如申請專利範圍第41項之免疫結合物，其係由以下各式表示： 或其醫藥學上可接受之鹽，其中介於N與C之間的雙線 表示單鍵或雙鍵，限制條件為當其為雙鍵時，X不存在且Y為-H；並且當其為單鍵時，X為-H且Y為-OH或-SO 3H或其醫藥學上可接受之鹽。
  50. 如申請專利範圍第41項之免疫結合物，其係由下式表示： 或其醫藥學上可接受之鹽，其中： 介於N與C之間的雙線 表示單鍵或雙鍵，限制條件為當其為雙鍵時，X不存在且Y為-H；並且當其為單鍵時，X為-H且Y為-SO 3H或其醫藥學上可接受之鹽；CBA為如申請專利範圍第1項之單株抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含分別具有序列SEQ ID NO：4、5及7以及SEQ ID NO：13、14及15之輕鏈互補決定區LC CDR1、LC CDR2及LC CDR3以及重鏈互補決定區HC CDR1、HC CDR2及HC CDR3。
  51. 如申請專利範圍第50項之免疫結合物，其中該經分離之單株抗體或其抗原結合片段包含分別具有序列SEQ ID NO：32及SEQ ID NO：36之重鏈可變域(VH)及輕鏈可變域(VL)。
  52. 如申請專利範圍第51項之免疫結合物，其中該經分離之單株抗體包含具有序列SEQ ID NO：49及SEQ ID NO：54之重鏈及輕鏈。
  53. 一種免疫結合物，其係由下式表示： 其中：CBA為如申請專利範圍第1項至第10項中任一項之抗體或其抗原結合片段或者如申請專利範圍第11項之多肽，其係經由半胱胺酸殘基共價連接至Cy C2；W C為1或2；Cy C2係由以下各式表示： 或其醫藥學上可接受之鹽，其中：介於N與C之間的雙線 表示單鍵或雙鍵，限制條件為當其為雙鍵時，X不存在且Y為-H或(C 1-C 4)烷基；並且當其為單鍵時，X為-H或胺保護部分，Y為-OH或-SO 3H或其醫藥學上可接受之鹽；R x1為(C 1-C 6)烷基；R e為-H或(C 1-C 6)烷基；W'為-NR e'；R e'為-(CH 2-CH 2-O) n-R k；n為2至6之整數；R k為-H或-Me；R x2為(C 1-C 6)烷基；L C'係由以下各式表示： 其中：s1為與該CBA共價連接之位點且s2為與Cy C2上之-S-基團共價連接之位點；Z為-C(=O)-NR 9-或-NR 9-C(=O)-； Q為-H、帶電取代基或可離子化基團；R 9、R 10、R 11、R 12、R 13、R 19、R 20、R 21及R 22在每次出現時獨立地為-H或(C 1-C 3)烷基；q及r在每次出現時獨立地為介於0與10之間的整數；m及n各自獨立地為介於0與10之間的整數；R h為-H或(C 1-C 3)烷基；且P'為胺基酸殘基或含有2至20個胺基酸殘基之肽。
  54. 如申請專利範圍第53項之免疫結合物，其中P'為含有2至5個胺基酸殘基之肽。
  55. 如申請專利範圍第53項或第54項之免疫結合物，其中P'係選自Gly-Gly-Gly、Ala-Val、Val-Ala、Val-Cit、Val-Lys、Phe-Lys、Lys-Lys、Ala-Lys、Phe-Cit、Leu-Cit、Ile-Cit、Trp、Cit、Phe-Ala、Phe-N 9-甲苯磺醯基-Arg、Phe-N 9-硝基-Arg、Phe-Phe-Lys、D-Phe-Phe-Lys、Gly-Phe-Lys、Leu-Ala-Leu、He-Ala-Leu、Val-Ala-Val、Ala-Leu-Ala-Leu(SEQ ID NO：74)、β-Ala-Leu-Ala-Leu(SEQ ID NO：75)、Gly-Phe-Leu-Gly(SEQ ID NO：76)、Val-Arg、Arg-Val、Arg-Arg、Val-D-Cit、Val-D-Lys、Val-D-Arg、D-Val-Cit、D-Val-Lys、D-Val-Arg、D-Val-D-Cit、D-Val-D-Lys、D-Val-D-Arg、D-Arg-D-Arg、Ala-Ala、Ala-D-Ala、D-Ala-Ala、D-Ala-D-Ala、Ala-Met、Met-Ala、Gln-Val、Asn-Ala、Gln-Phe及Gln-Ala。
  56. 如申請專利範圍第55項之免疫結合物，其中P'為Gly-Gly-Gly、Ala-Val、Ala-Ala、Ala-D-Ala、D-Ala-Ala或D-Ala-D-Ala。
  57. 如申請專利範圍第53項之免疫結合物，其中-L C'-係由以下各式表示：
  58. 如申請專利範圍第53項至第57項中任一項之免疫結合物，R e為H或Me；R x1為-(CH 2) p-(CR fR g)-，且R x2為-(CH 2) p-(CR fR g)-，其中R f及R g各自獨立地為-H或(C 1-C 4)烷基；且p為0、1、2或3。
  59. 如申請專利範圍第58項之免疫結合物，其中R f與R g相同或不同且係選自-H及-Me。
  60. 如申請專利範圍第53項之免疫結合物，其係由以下各式表示： 或其醫藥學上可接受之鹽，其中介於N與C之間的雙線 表示單鍵或雙鍵，限制條件為當其為雙鍵時，X不存在且Y為-H；並且當其為單鍵時，X為-H且Y為-OH或-SO 3H或其醫藥學上可接受之鹽。
  61. 如申請專利範圍第41項至第60項中任一項之免疫結合物，其中該介於N與C之間的雙線 表示雙鍵，X不存在且Y為-H。
  62. 如申請專利範圍第41項至第60項中任一項之免疫結合物，其中該介於N與C之間的雙線 表示單鍵，X為-H且Y為-SO 3H或其醫藥學上可接受之鹽。
  63. 如申請專利範圍第62項之免疫結合物，Y為-SO 3H、-SO 3Na或-SO 3K。
  64. 如申請專利範圍第62項之免疫結合物，其中Y為-SO 3Na。
  65. 一種免疫結合物，其係由下式表示： 或其醫藥學上可接受之鹽，其中：w C為1或2；介於N與C之間的雙線 表示單鍵或雙鍵，限制條件為當其為雙鍵時，X不存在且Y為-H；並且當其為單鍵時，X為-H且Y為-SO 3H或其醫藥學上可接受之鹽；CBA為經分離之單株抗體或其抗原結合片段，其特異性結合人類cMET之細胞外區中的抗原決定基，其中該抗體或其抗原結合片段包含分別具有序列SEQ ID NO：4、5及7以及SEQ ID NO：13、14及15之輕鏈互補決定區LC CDR1、LC CDR2及LC CDR3以及重鏈互補決定區HC CDR1、HC CDR2及HC CDR3。
  66. 如申請專利範圍第65項之免疫結合物，其中該經分離之單株抗體或其抗原結合片段包含分別具有序列SEQ ID NO：32及SEQ ID NO：36之重鏈可變域(VH)及輕鏈可變域(VL)。
  67. 如申請專利範圍第66項之免疫結合物，其中該經分離之單株抗體包含具有序列SEQ ID NO：49及SEQ ID NO：54之重鏈及輕鏈。
  68. 一種免疫結合物，其係由下式表示： 或其醫藥學上可接受之鹽，其中：W L為1至10之整數；CBA為經分離之單株抗體或其抗原結合片段，其特異性結合人類cMET之細胞外區中的抗原決定基，其中該抗體或其抗原結合片段包含分別具有序列SEQ ID NO：4、5及7以及SEQ ID NO：13、14及15之輕鏈互補決定區LC CDR1、LC CDR2及LC CDR3以及重鏈互補決定區HC CDR1、HC CDR2及HC CDR3。
  69. 如申請專利範圍第68項之免疫結合物，其中該經分離之單株抗體或其抗原結合片段包含分別具有序列SEQ ID NO：32及SEQ ID NO：36之重鏈可變域(VH)及輕鏈可變域(VL)。
  70. 如申請專利範圍第68項之免疫結合物，其中該經分離之單株抗體包含具有序列SEQ ID NO：49及SEQ ID NO：53之重鏈及輕鏈。
  71. 如申請專利範圍第68項之免疫結合物，其中該經分離之單株抗體包含具有序列SEQ ID NO：49及SEQ ID NO：82之重鏈及輕鏈。
  72. 如申請專利範圍第21項至第71項中任一項之免疫結合物，其中該醫藥學上可接受之鹽為鈉鹽或鉀鹽。
  73. 一種醫藥組合物，其包含如申請專利範圍第1項至第10項中任一項之抗體或抗原結合片段或者如申請專利範圍第11項之多肽及醫藥學上可接受之載劑。
  74. 一種醫藥組合物，其包含如申請專利範圍第21項至第72項中任一項之免疫結合物及醫藥學上可接受之載劑。
  75. 一種抑制異常細胞增殖之方法，其包括使表現MET之細胞與如申請專利範圍第1項至第10項中任一項之經分離之單株抗體或抗原結合片段或者如申請專利範圍第11項之多肽接觸，其中該接觸抑制該等細胞之異常增殖。
  76. 一種抑制異常細胞增殖之方法，其包括使表現MET之細胞與如申請專利範圍第21項至第72項中任一項之免疫結合物接觸，其中該接觸抑制該等細胞之異常增殖。
  77. 如申請專利範圍第75項或第76項之抑制異常細胞增殖之方法，其中該接觸誘導該等細胞之細胞凋亡。
  78. 如申請專利範圍第75項或第76項之抑制異常細胞增殖之方法，其中該表現MET之細胞為癌細胞。
  79. 如申請專利範圍第78項之方法，其中該癌細胞為cMet過度表現-未擴增型。
  80. 如申請專利範圍第78項之方法，其中該癌細胞為cMet擴增型
  81. 一種治療患者之細胞增殖病症的方法，其包括向該患者投與治療有效量之如申請專利範圍第1項至第10項中任一項之經分離之單株抗體或其抗原結合片段或者如申請專利範圍第11項之多肽或者如申請專利範圍第73項之醫藥組合物。
  82. 一種治療患者之細胞增殖病症的方法，其包括向該患者投與治療有效量之如申請專利範圍第21項至第72項中任一項之免疫結合物或者如申請專利範圍第74項之醫藥組合物。
  83. 如申請專利範圍第81項或第82項之治療方法，其中該患者已被 鑑定為具有過度表現-未擴增之cMET。
  84. 如申請專利範圍第81項至第83項中任一項之治療方法，其中該細胞增殖病症為癌症。
  85. 如申請專利範圍第84項之治療方法，其中該癌症為選自由以下各項組成之群的癌症：神經膠質母細胞瘤、胰臟癌、胃癌、***癌、卵巢癌、乳癌、肝細胞癌(HCC)、黑色素瘤、骨肉瘤及結腸直腸癌(CRC)、包括小細胞肺癌(SCLC)及非小細胞肺癌(NSCLC)在內之肺癌、頭頸部鱗狀細胞癌(HNSCC)、腎臟癌、腎癌、食道癌及甲狀腺癌。
  86. 如申請專利範圍第84項之治療方法，其中該癌症為Met擴增型非小細胞肺癌(NSCLC)。
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