KR20190117467A - IFN-γ-유도성 조절 T 세포 전환가능 항암 (IRTCA) 항체 및 그의 용도 - Google Patents

IFN-γ-유도성 조절 T 세포 전환가능 항암 (IRTCA) 항체 및 그의 용도 Download PDF

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Abstract

활성화-유도성 TNFR (AITR) 폴리펩티드에 결합하는 IFN-γ-유도성 조절 T 세포 전환가능 항암 (IRTCA) 항체 및 그의 항원-결합 단편이 제공된다. 본원에 기재된 IRTCA 항체와 관련된 다양한 시험관내 및 생체내 방법 및 조성물이 또한 제공된다. 방법은, 예를 들어 IRTCA 항체 또는 그의 단편을 사용하여 생체내 또는 시험관내에서 T 세포로부터의 시토카인 분비를 변화시키는 것 및 암을 예방 및/또는 치유적 치료하는 것을 포함한다.

Description

IFN-γ-유도성 조절 T 세포 전환가능 항암 (IRTCA) 항체 및 그의 용도
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2017년 2월 10일에 출원된 미국 특허 출원 번호 62/457,422에 대한 우선권 및 이익을 주장하며, 상기 출원의 개시내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
서열 목록
본 명세서는 서열 목록 (2018년 2월 9일에 "2012994-0030_SL.txt"로 명명된 .txt 파일로서 전자적으로 제출됨)을 참조한다. .txt 파일은 2018년 2월 9일에 생성되었고, 크기가 19,405 바이트이다. 서열 목록의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다.
암은 세계에서 주요 사망 원인 중 하나로 남아있다. 최근 통계는 세계 인구의 13%가 암으로 사망하는 것으로 보고한다. 국제 암 연구 기관 (IARC)으로부터의 추정에 따르면, 2012년에 세계적으로 14.1백만건의 새로운 암 사례 및 8.2백만건의 암 사망이 존재하였다. 2030년까지, 세계적 부담은 인구 성장 및 노화, 및 흡연, 건강하지 않은 식이 및 신체 무활동과 같은 위험 인자에 대한 노출로 인해 21.7백만건의 새로운 암 사례 및 13백만건의 암 사망으로 증가할 것으로 예상된다. 추가로, 통증 및 암 치료에 대한 의학적 비용은 암 환자 및 그의 가족 둘 다에 대한 삶의 질 감소를 초래한다. 무엇보다도, 암은 개선된 치료 방법을 시급히 발견할 필요가 있는 질환이라는 것이 분명하다.
본 개시내용은, 특히, 인간 활성화-유도성 TNFR 패밀리 수용체 (AITR) 폴리펩티드에 결합하는 항체 및 그의 단편을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 (a) 서열식별번호(SEQ ID NO): 8 또는 24의 서열을 포함하는 중쇄 CDR1, 서열식별번호: 9 또는 25의 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 및 서열식별번호: 10, 14, 15, 16 및 17로부터 선택된 적어도 1개의 서열을 포함하는 중쇄 CDR3, 및 (b) 서열식별번호: 11의 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, 서열식별번호: 12의 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 서열식별번호: 13 또는 18의 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하며, 각각의 서열식별번호: 8의 서열을 포함하는 중쇄 CDR1, 서열식별번호: 9의 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 서열식별번호: 10의 서열을 포함하는 중쇄 CDR3, 서열식별번호: 11의 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, 서열식별번호: 12의 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 서열식별번호: 13의 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하지 않는, IFN-γ-유도성 조절 T 세포 전환가능 항암 (IRTCA) 항체 및/또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 하기: (a) 서열식별번호: 3, 4, 5, 6, 20 및 21로부터 선택된 서열에 대해 적어도 90% 동일한 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인; (b) 서열식별번호: 7, 22 및 23으로부터 선택된 서열에 대해 적어도 90% 동일한 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인; 또는 (c) 서열식별번호: 3, 4, 5, 6, 20 및 21로부터 선택된 서열에 대해 적어도 90% 동일한 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 서열식별번호: 7, 22 및 23으로부터 선택된 서열에 대해 적어도 98% 동일한 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 중 어느 하나를 포함하는 IRTCA 항체 또는 항원-결합 단편을 추가로 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 또한 하기: (a) 서열식별번호: 3, 4, 5, 6, 20 및 21로부터 선택된 서열에 대해 적어도 98% 동일한 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인; (b) 서열식별번호: 7, 22 및 23으로부터 선택된 서열에 대해 적어도 98% 동일한 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인; 또는 (c) 서열식별번호: 3, 4, 5, 6, 20 및 21로부터 선택된 서열에 대해 적어도 98% 동일한 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 서열식별번호: 7, 22 및 23으로부터 선택된 서열에 대해 적어도 98% 동일한 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 중 어느 하나를 포함하는 IRTCA 항체 또는 항원-결합 단편을 제공한다.
일부 실시양태에서, 제공된 IRTCA 항체 또는 항원-결합 단편은 하기: (a) 서열식별번호: 3, 4, 5, 6, 20 및 21로부터 선택된 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인; (b) 서열식별번호: 7, 22 및 23으로부터 선택된 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인; 또는 (c) 서열식별번호: 3, 4, 5, 6, 20 및 21로부터 선택된 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 서열식별번호: 7, 22 및 23으로부터 선택된 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 중 어느 하나를 포함한다.
일부 실시양태에서, IRTCA 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 각각의 서열식별번호: 8의 서열을 포함하는 중쇄 CDR1, 서열식별번호: 9의 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 서열식별번호: 10의 서열을 포함하는 중쇄 CDR3, 서열식별번호: 11의 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, 서열식별번호: 12의 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 서열식별번호: 13의 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하지 않는다.
임의의 다양한 실시양태에 따르면, 제공된 IRTCA 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 및/또는 제공된 조성물은 소정 범위의 결합 친화도를 나타낼 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 제공된 IRTCA 항체 또는 항원-결합 단편은 인간 활성화-유도성 종양 괴사 인자 수용체 (TNFR) 패밀리 수용체 (AITR) 분자에 대해 1x10-7 내지 1x10-12 M의 결합 친화도 (KD)를 갖는다. 일부 실시양태에서, 제공된 IRTCA 항체 또는 항원-결합 단편은 인간 AITR 폴리펩티드의 세포외 도메인 내의 에피토프에 결합한다. 일부 실시양태에서, 인간 AITR 폴리펩티드의 세포외 도메인 내의 에피토프는 서열식별번호: 19를 포함한다.
일부 실시양태에서, 제공된 항체 또는 항원-결합 단편은 인간화 항체이거나 이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제공된 IRTCA 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 모노클로날 항체이거나 이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제공된 IRTCA 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 이뮤노글로불린 불변 도메인을 포함하며, 여기서 불변 도메인은 IgG1 또는 그의 변이체, IgG2 또는 그의 변이체, IgG4 또는 그의 변이체, IgA 또는 그의 변이체, IgE 또는 그의 변이체, IgM 또는 그의 변이체, 및 IgD 또는 그의 변이체로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 제공된 IRTCA 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 인간 IgG1이거나 이를 포함한다. 일부 실시양태에서, IgG1은 서열식별번호: 26에 대해 적어도 95% 동일한 서열이거나 이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제공된 IRTCA 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')2 단편, Fv 단편, 디술피드-결합된 Fv 단편, scFv 단편, 단일 도메인 항체, 휴마바디, 나노바디 또는 디아바디이거나 이를 포함한다.
다양한 실시양태에 따르면, 본 발명은, 특히, 소정량의 제공된 IRTCA 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 제공된 조성물의 전달 및/또는 발현을 용이하게 하기 위한 다양한 분자 및 조성물을 제공한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 본 발명은 IRTCA 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 코딩하는 핵산 분자를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 또한 이러한 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 또한 제공된 재조합 벡터 및/또는 제공된 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 박테리아, 효모, 곤충 또는 포유동물 세포로부터 선택될 수 있다. 일부 실시양태에서 숙주 세포는 이. 콜라이(E. coli), 피. 파스토리스(P. pastoris), Sf9, COS, HEK293, Expi293, CHO-S, CHO-DG44, CHO-K1 및 포유동물 림프구로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 (a) 1종 이상의 제공된 IRTCA 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 1종 이상의 제공된 핵산 분자, 1종 이상의 제공된 재조합 벡터, 및/또는 1종 이상의 제공된 숙주 세포, 및 (b) 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 임의의 다양한 제약상 허용되는 담체가 다양한 실시양태에 따라 사용될 수 있다.
본원에 제공된 다양한 강력한 새로운 항체, 그의 항원-결합 단편 및 조성물 이외에도, 본 발명은 또한, 다양한 실시양태에서, 다양한 새로운 치료 방법을 또한 제공한다. 예를 들어, 및 다양한 실시양태에 따르면, 본 발명은 치료를 필요로 하는 대상체에게 제공된 IRTCA 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 제공된 핵산 분자, 및/또는 제공된 재조합 벡터를 포함하거나 이를 전달하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 상기 대상체를 치료하는 방법을 제공한다.
추가의 예로서, 본 발명은 또한, 일부 실시양태에서, 면역 반응의 유도를 필요로 하는 대상체에게 제공된 IRTCA 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 제공된 핵산 분자, 및/또는 제공된 재조합 벡터를 포함하거나 이를 전달하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 상기 대상체에서 면역 반응을 유도하는 방법을 제공한다.
추가의 예로서, 일부 실시양태에서, 본 발명은 또한 면역 반응의 증진 또는 면역 세포의 활성의 증가를 필요로 하는 대상체에게 제공된 IRTCA 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 제공된 핵산 분자, 및/또는 제공된 재조합 벡터를 포함하거나 이를 전달하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 상기 대상체에서 면역 반응을 증진시키거나 면역 세포의 활성을 증가시키는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 또한 T 세포를 소정량의 제공된 IRTCA 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하거나 이를 전달하는 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는, 생체내 또는 시험관내에서 T 세포에 의한 IFN-γ의 분비를 증가시키는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 또한 T 세포를 소정량의 제공된 IRTCA 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하거나 이를 전달하는 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는, 생체내 또는 시험관내에서 T 세포에 의한 TGF-β의 분비를 감소시키는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 또한 T 세포를 소정량의 제공된 IRTCA 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하거나 이를 전달하는 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는, T 세포를 유형 1 헬퍼 T (TH1) 세포로 전환시키는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 대상체는 암을 갖거나 암 발병 위험이 있다. 일부 실시양태에서, 암은 방광암, 유방암, 자궁경부암, 결장암, 자궁내막암, 식도암, 난관암, 담낭암, 위장암, 두경부암, 혈액암, 후두암, 간암, 폐암, 림프종, 흑색종, 중피종, 난소암, 원발성 복막암, 타액선암, 육종, 위암, 갑상선암, 췌장암, 신세포 암종, 교모세포종 및 전립선암으로부터 선택된다.
다양한 실시양태가 1종 이상의 조합 치료 요법에 사용하기 적합한 것으로 구체적으로 고려된다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 대상체는 1종 이상의 추가의 항암 요법이 투여되었거나 투여될 것이다. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 추가의 암 요법은 이온화 방사선, 화학요법제, 항체 작용제 및 세포-기반 요법으로부터 선택되어, 대상체가 둘 다를 사용한 치료를 받는다. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 추가의 항암 요법은 면역 체크포인트 억제제, IL-12, GM-CSF, 항-CD4 작용제, 시스플라틴, 플루오로우라실, 독소루비신, 이리노테칸, 파클리탁셀, 인돌아민 2,3-디옥시게나제-1 (IDO1) 억제제 또는 시클로포스파미드를 포함한다.
본 발명의 다양한 실시양태는 또한 1종 이상의 제공된 IRTCA 항체 및/또는 그의 항원 결합 단편, 핵산 분자, 재조합 벡터 및/또는 숙주 세포에 대한 유리한 투여 요법을 결정하는데 유용할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 본 발명은 (a) 치유적 치료를 위한 IRTCA 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 용량의 결정을 필요로 하는 대상체로부터의 생물학적 샘플 중 분비된 IFN-γ의 측정치를 제공 또는 수득하며, 여기서 대상체는 소정량의 제공된 IRTCA 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하거나 이를 전달하는 조성물이 투여된 것인 단계, 및 (b) 분비된 IFN-γ의 측정치를 참조 값과 비교하는 단계를 포함하며, 여기서 분비된 IFN-γ의 측정치가 참조 값보다 더 높거나 더 낮은 경우에, 투여될 IRTCA 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 양을 조정하여, 이에 의해 대상체의 치유적 치료를 위한 용량을 결정하는 것인, 상기 대상체의 치유적 치료를 위한 IRTCA 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 용량을 결정하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 참조 값은 제공된 IRTCA 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 투여 전 대상체로부터의 생물학적 샘플 중 IFN-γ의 수준일 수 있다. 일부 실시양태에서, 대상체로부터의 생물학적 샘플 중 분비된 IFN-γ의 측정된 양이 참조 값보다 더 높으면, 치료는 이전에 주어진 것과 동일한 수준으로 유지되거나, 또는 치료는 소정 기간 동안 중지된다.
추가의 예로서, 일부 실시양태에서, 본 발명은 (a) 치유적 치료를 위한 IRTCA 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 용량의 결정을 필요로 하는 대상체로부터의 생물학적 샘플 중 Treg 세포 집단의 측정치를 제공 또는 수득하며, 여기서 대상체는 소정량의 제공된 IRTCA 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하거나 이를 전달하는 조성물이 투여된 것인 단계; 및 (b) Treg 세포 집단의 측정치를 참조 값과 비교하는 단계를 포함하며, 여기서 Treg 세포 집단의 측정치가 참조 값보다 더 높거나 더 낮은 경우에, 투여될 IRTCA 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 양을 조정하여, 이에 의해 대상체의 치유적 치료를 위한 용량을 결정하는 것인, 상기 대상체의 치유적 치료를 위한 IRTCA 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 용량을 결정하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 참조 값은 제공된 IRTCA 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 투여 전 대상체로부터의 생물학적 샘플 중 Treg 세포 집단의 수준일 수 있다. 일부 실시양태에서, 대상체로부터의 생물학적 샘플 중 Treg 세포 집단의 측정된 양이 참조 값보다 더 낮으면, 치료는 이전에 주어진 것과 동일한 수준으로 유지되거나, 또는 치료는 소정 기간 동안 중지된다.
추가의 예로서, 일부 실시양태에서, 본 발명은 (a) 치유적 치료를 위한 IRTCA 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 용량의 결정을 필요로 하는 대상체로부터의 생물학적 샘플 중 IFN-γ-분비 T 세포 집단의 측정치를 제공 또는 수득하며, 여기서 대상체는 소정량의 제공된 IRTCA 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하거나 이를 전달하는 조성물이 투여된 것인 단계; (b) 상기 대상체로부터의 생물학적 샘플 중 Treg 세포 집단의 측정치를 제공 또는 수득하며, 여기서 대상체는 소정량의 제공된 IRTCA 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하거나 이를 전달하는 조성물이 투여된 것인 단계; (c) IFN-γ-분비 T 세포 집단의 측정치 대 Treg 세포 집단의 측정치의 비를 계산하는 단계; 및 (d) 비를 참조 값과 비교하는 단계를 포함하며, 여기서 비가 참조 값보다 더 높거나 더 낮은 경우에, 투여될 IRTCA 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 양을 조정하여, 이에 의해 대상체의 치유적 치료를 위한 용량을 결정하는 것인, 상기 대상체의 치유적 치료를 위한 IRTCA 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 용량을 결정하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 참조 값은 대상체로부터의 생물학적 샘플 중 IFN-γ-분비 T 세포 집단의 수준 대 제공된 IRTCA 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 투여 전 대상체로부터의 동일한 생물학적 샘플 중 Treg 세포 집단의 수준의 비일 수 있다. 일부 실시양태에서, 대상체로부터의 생물학적 샘플 중 계산된 비가 참조 값보다 더 높으면, 치료는 이전에 주어진 것과 동일한 수준으로 유지되거나, 또는 치료는 소정 기간 동안 중지된다.
일부 실시양태에서, 참조 값은 1명 이상의 건강한 대상체로부터 유래된 값 또는 1명 이상의 암-진단된 대상체로부터 유래된 값을 포함하는 인덱스 값을 포함한다. 일부 실시양태에서, 생물학적 샘플은 전혈, 혈장, 종양 조직 또는 혈청의 샘플이다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 또한 T 세포를 소정량의 제공된 IRTCA 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하거나 이를 전달하는 조성물과 접촉시키는 단계, 및 T 세포로부터의 시토카인 분비를 측정하는 단계를 포함하며, 여기서 시토카인 분비는 IRTCA 항체의 면역 반응 증진, 항암 효과 및/또는 항종양 효과와 상관관계가 있는 것인, AITR에 대한 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 친화도를 검증하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, T 세포는 AITR 단백질을 발현한다. 일부 실시양태에서, T 세포는 조절 T 세포 (Treg 세포)이다. 일부 실시양태에서, T 세포는 이펙터 T 세포 (Teff 세포)이다.
본 출원에 사용된 용어 "약" 및 "대략"은 동의어로서 사용된다. 본원에서 공개, 특허 또는 특허 출원에 대한 임의의 인용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 본 출원에서 약/대략의 존재 또는 부재 하에 사용된 임의의 수치는 관련 기술분야의 통상의 기술자가 인지하는 임의의 정상적인 변동을 포괄하는 것으로 의도된다.
본 발명의 다른 특색, 목적 및 이점은 하기 상세한 설명에서 분명하다. 그러나, 본 발명의 실시양태를 나타내는 상세한 설명은 제한이 아니라 단지 예시로서 주어지는 것임을 이해해야 한다. 본 발명의 범주 내에서의 다양한 변화 및 변형은 상세한 설명으로부터 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 분명해질 것이다.
하기 도로 구성된 본원에 포함된 도면은 단지 예시 목적을 위한 것이며 제한을 위한 것이 아니다. 본 개시내용의 상기 및 다른 목적, 측면, 특색 및 이점은 첨부 도면과 함께 취해진 하기 설명을 참조로 하여 보다 분명해질 것이고 더 잘 이해될 것이다.
도 1은 IRTCA-A의 Fab 유형 아미노산 서열을 보여주며, 여기서 a 및 b는 각각 IRTCA-A Fab 유형의 아미노산 서열 및 정지 코돈이 삽입되어 있는 IRTCA-A 아미노산 서열 (별표가 정지 코돈을 나타냄)을 나타낸다.
도 2는 무작위화 PCR 구성 및 돌연변이가 유도된 IRTCA-A의 아미노산 영역을 보여준다. 패널 a는 IRTCA-A 경쇄를 보여주고, 패널 b는 IRTCA-A 중쇄를 보여준다. 무작위 프라이머를 사용하여 돌연변이가 CDR3 영역에서 유도될 수 있도록 하였고, 돌연변이가 CDR3 영역에 집중된 파지 디스플레이 라이브러리를 제작하였다.
도 3은 IRTCA-A 시리즈의 16개 중쇄 돌연변이체 및 9개 경쇄 돌연변이체의 AITR 항원에 대한 해리 곡선 오버레이 플롯을 보여준다.
도 4는 IRTCA-A 시리즈의 22개 경쇄 돌연변이체의 AITR 항원에 대한 해리 곡선 오버레이 플롯을 보여준다.
도 5는 CD4+ T 세포에서의 IRTCA-A에 의한 시토카인 IFN-γ의 분비의 그래프를 보여준다. IRTCA-A는 IFN-γ 분비를 용량 의존성 방식으로 유도한다.
도 6a는 IRTCA-A를 사용한 처리 후 Treg 세포로부터의 IFN-γ의 분비의 용량-의존성 변화를 정량화하는 그래프를 도시한다. 도 6b는 IRTCA-A를 사용한 처리 후 Treg 세포로부터의 TGF-β의 분비의 용량-의존성 변화를 정량화하는 그래프를 도시한다.
도 7a는 여러 IRTCA-A 돌연변이체를 사용한 처리 후 CD4 T 세포에서의 IFN-γ의 분비의 용량-의존성 변화를 정량화하는 그래프를 도시한다. 도 7b는 여러 IRTCA-A 돌연변이체를 사용한 처리 후 Treg 세포에서의 IFN-γ의 분비의 용량-의존성 변화를 정량화하는 그래프를 도시한다. 도 7c는 여러 IRTCA-A 돌연변이체를 사용한 처리 후 Treg 세포에서의 TGF-β의 분비의 용량-의존성 변화를 정량화하는 그래프를 도시한다.
도 8은 IRTCA 항체를 사용한 Hu-PBL-SCID 마우스의 처리 후 (결장직장암 세포에 의한 주사로부터의) 종양 부피의 용량-의존성 감소를 보여주는 그래프를 도시한다.
도 9는 종양 크기에 대한 대조군 hIgG, H1F1 항체, MK4166 및 키트루다의 효과를 정량화하는 그래프를 도시한다. 화살표는 처리 또는 대조군 항체에 의한 주사일을 나타낸다.
도 10a는 항체 처리의 3회 투여 (화살표) 후 종양 크기 (삼중 음성 유방암)에 대한 H1F1 또는 대조군 항체의 효과를 정량화하는 그래프를 도시한다. 도 10b는 항체 처리의 3회 투여 (화살표) 후 종양 크기 (결장암)에 대한 H1F1 또는 대조군 항체의 효과를 정량화하는 그래프를 도시한다. 도 10c는 항체 처리의 3회 투여 (화살표) 후 종양 크기 (흑색종)에 대한 H1F1 또는 대조군 항체의 효과를 정량화하는 그래프를 도시한다. 도 10d는 항체 처리의 3회 투여 (화살표) 후 종양 크기 (흑색종)에 대한 H1F1 또는 대조군 항체의 효과를 정량화하는 그래프를 도시한다.
도 11은 마카카 파시쿨라리스(Macaca fascicularis)의 CD4+CD25고Foxp3+ T 세포에서의 시토카인 분비에 대한 H1F1의 효과를 정량화하는 그래프를 도시한다.
도 12는 마카크 생체내에서 조절 T 세포의 TH1 세포로의 H1F1-매개된 전환을 정량화하는 그래프를 도시한다. hIgG-처리된 대조군 (A)과 달리, 22 mg/kg H1F1 (B), 45 mg/kg H1F1 (C) 및 90 mg/kg H1F1 (D)로 처리된 세포는 3주의 과정에 걸쳐 IFN-γ 양성 CD4+T 세포의 증가를 나타냈다.
도 13은 H1F1에 의한 시토카인 유도가 차별적이었다는 것을 보여주는 그래프를 도시한다. 시토카인 IL-4 (B) 및 IL-5 (C)의 분비는 H1F1로 처리된 세포에서 나타나지 않았으며, 반면에 IL-2 (A) 및 IFN-γ 분비 (D)는 H1F1을 사용한 처리 후 증가하였다.
도 14는 CD4+CD25+Foxp3고 (A), TGF-β (B), CD4+IFN-γ (C) 및 CD4+T-bet+ (D)를 발현하는 세포의 집단에 대한 H1F1의 용량-의존성 효과를 정량화하는 그래프를 도시한다.
도 15는 EBV-양성 위암 세포 및 AML 환자로부터의 골수에서의 H1F1-특이적 염색을 도시한다.
도 16a는 AITR-5에 결합하지 않은 음성 대조군 mAb EU101과 비교하였을 때, 10, 5, 2.5 및 1.25 μg/mL의 농도에서의 AITR-5에 대한 H1F1의 결합을 도시한다. 도 16b는 용량 의존성 방식으로의 AITR-5에 대한 H1F1M69 및 H1F1M74의 결합을 도시한다.
도 17은 hIgG 대조군 (A)에 비해 H1F1M69 (B) 및 H1F1M74 (C)에 의한 자극 시 nTreg 세포의 TH1-유사 세포로의 전환을 도시한다. 각각의 패널 내 수는 양성 세포의 백분율을 나타낸다.
도 18은 nTreg 세포에서의 TGF-β 및 IFN-γ에 대한 H1F1M69 및 H1F1M74의 용량-의존성 효과를 정량화하는 그래프를 도시한다.
도 19는 6일 동안 항-CD3, CD28 비드, IL-2 및 TGF-β에 의한 자극 후 CD4+ T 세포로부터의 iTreg 세포의 생성을 도시한다.
도 20은 iTreg 세포 상의 AITR에 대한 H1F1M69 및 H1F1M74의 결합 효율을 도시한다. 패널 A 및 B는 게이팅 파라미터를 예시한다. 패널 C는 이소형 대조군을 예시한다. 패널 D-G는 표면 AITR이 경쟁자 항-AITR 항체 TRX518 (F) 및 MK4166 (G)에 의해서보다 더 빈번하게 H1F1M69 (D) 및 H1F1M74 (E)에 의해 검출되었다는 것을 보여준다.
도 21은 항-AITR 항체 자극 시 iTreg 세포의 TH1-유사 세포로의 전환을 도시한다. 패널 A는 hIgG 대조군을 보여준다. 패널 B-E는 iTreg 세포에 대한 H1F1M69 (B), H1F1M74 (C), TRX518 (D) 및 MK4166 (E)의 효과를 보여준다.
도 22는 iTreg 세포에서의 TGF-β 및 IFN-γ에 대한 H1F1M69 및 H1F1M74의 용량-의존성 효과를 정량화하는 그래프를 도시한다.
도 23은 iTreg 세포에서의 Foxp3에 대한 고정화된 모노클로날 항체 hIgG (A), H1F1M69 (B), H1F1M74 (C), TRX518 (D) 및 MK4166 (E)의 효과를 도시한다.
도 24는 IL-2 및 H1F1M69 (A) 또는 H1F1M74 (B)로 코팅된 웰에 첨가된 후 iTreg 세포의 TH1-유사 세포로의 전환을 도시한다. 각각의 패널 내 수는 양성 세포의 백분율을 나타낸다.
도 25는 항체를 사용한 처리 후 Teff 세포의 TH1 세포로의 분극을 도시한다. 패널 A는 대조군 hIgG의 효과를 보여준다. 패널 B는 H1F1M69 및 H1F1M74의 효과를 보여준다. 패널 C는 항체 TRX518 및 MK4166의 효과를 보여준다.
도 26은 Teff 세포에서의 IFN-γ에 대한 H1F1M69 및 H1F1M74의 용량-의존성 효과를 정량화하는 그래프를 도시한다.
특정 정의
하기 설명에서, 재조합 DNA 및 면역학에서 사용되는 다수의 용어가 광범위하게 이용된다. 이러한 용어가 제공되는 범주를 포함한 명세서 및 청구범위의 보다 명확하고 일관된 이해를 제공하기 위해, 하기 정의가 제공된다.
약: 용어 "약"은, 값에 관하여 본원에 사용되는 경우에, 언급된 값에 대한 문맥에서 유사한 값을 지칭한다. 일반적으로, 상기 문맥에 친숙한 관련 기술분야의 통상의 기술자는 그러한 문맥에서 "약"에 의해 포괄되는 분산의 관련 정도를 인지할 것이다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 용어 "약"은 언급된 값의 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 또는 그 미만 이내의 값의 범위를 포괄할 수 있다.
투여: 본원에 사용된 용어 "투여"는 전형적으로 조성물인 작용제 또는 조성물에 포함된 작용제의 전달을 달성하기 위한 대상체 또는 시스템에의 조성물의 투여를 지칭한다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는, 적절한 상황에서, 대상체, 예를 들어 인간에게의 투여에 이용될 수 있는 다양한 경로를 인식할 것이다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 투여는 안구, 경구, 비경구, 국소 등일 수 있다. 일부 특정한 실시양태에서, 투여는 기관지 (예를 들어, 기관지 점적주입에 의함), 협측, 피부 (예를 들어, 진피, 피내, 피간, 경피 등에 대한 국소 중 1개 이상일 수 있거나 이를 포함할 수 있음), 경장, 동맥내, 피내, 위내, 수질내, 근육내, 비강내, 복강내, 척수강내, 정맥내, 뇌실내, 특정 기관 내 (예를 들어 간내), 점막, 비강, 경구, 직장, 피하, 설하, 국소, 기관 (예를 들어, 기관내 점적주입에 의함), 질, 유리체 등의 투여일 수 있다. 일부 실시양태에서, 투여는 단지 단일 용량만을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 투여는 고정 수의 용량의 적용을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 투여는 간헐적 (예를 들어, 시간에 맞춰 분리된 복수의 용량) 및/또는 주기적 (예를 들어, 공통 기간에 의해 분리된 개별 용량) 투여인 투여를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 투여는 적어도 선택된 기간 동안 연속 투여 (예를 들어, 관류)를 포함할 수 있다.
친화도: 관련 기술분야에 공지된 바와 같이, "친화도"는 특정한 리간드가 그의 파트너에 결합하는 경우의 견고성의 척도이다. 친화도는 상이한 방식으로 측정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 친화도는 정량적 검정에 의해 측정된다. 일부 이러한 실시양태에서, 결합 파트너 농도는 생리학적 조건을 모방하기 위해 리간드 농도를 초과하도록 고정될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 일부 실시양태에서, 결합 파트너 농도 및/또는 리간드 농도는 달라질 수 있다. 일부 이러한 실시양태에서, 친화도는 대등한 조건 (예를 들어, 농도) 하에서 참조와 비교될 수 있다.
효능제: 관련 기술분야의 통상의 기술자는 용어 "효능제"가, 그의 존재, 수준, 정도, 유형 또는 형태가 또 다른 작용제 (즉, 효능화되는 작용제)의 활성의 증가된 수준과 상관관계가 있는 것인 작용제 상태 또는 사건을 지칭하는 것으로 사용될 수 있다는 것을 인지할 것이다. 일반적으로, 효능제는, 예를 들어 소분자, 폴리펩티드, 핵산, 탄수화물, 지질, 금속 및/또는 관련 활성화 활성을 나타내는 임의의 다른 개체를 포함한 임의의 화학적 부류의 작용제일 수 있거나 이를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 효능제는 직접적일 수 있고 (이 경우에 그의 표적에 대해 직접적으로 그의 영향을 발휘함); 일부 실시양태에서, 효능제는 간접적일 수 있다 (이 경우에 그의 표적에 대한 결합 이외의 다른 방식으로; 예를 들어, 표적의 수준 또는 활성이 변경되도록 표적의 조절제와 상호작용함으로써 그의 영향을 발휘함).
동물: 본원에 사용된 동물은 동물계의 임의의 구성원을 지칭한다. 일부 실시양태에서, "동물"은 어느 하나의 성별을 갖고 임의의 발달 단계에 있는 인간을 지칭한다. 일부 실시양태에서, "동물"은 임의의 발달 단계에 있는 비-인간 동물을 지칭한다. 특정 실시양태에서, 비-인간 동물은 포유동물 (예를 들어, 설치류, 마우스, 래트, 토끼, 원숭이, 개, 고양이, 양, 소, 영장류 및/또는 돼지)이다. 일부 실시양태에서, 동물은 포유동물, 조류, 파충류, 양서류, 어류, 곤충류 및/또는 충류를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 동물은 트랜스제닉 동물, 유전자 조작된 동물 및/또는 클론일 수 있다.
길항제: 관련 기술분야의 통상의 기술자는 본원에 사용된 용어 "길항제"가, 그의 존재, 수준, 정도, 유형 또는 형태가 또 다른 작용제 (즉, 억제되는 작용제 또는 표적)의 감소된 수준 또는 활성과 상관관계가 있는 것인 작용제 상태 또는 사건을 지칭하는 것으로 사용될 수 있다는 것을 인지할 것이다. 일반적으로, 길항제는, 예를 들어 소분자, 폴리펩티드, 핵산, 탄수화물, 지질, 금속 및/또는 관련 억제 활성을 나타내는 임의의 다른 개체를 포함한 임의의 화학적 부류의 작용제일 수 있거나 이를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 길항제는 직접적일 수 있고 (이 경우에 그의 표적에 대해 직접적으로 그의 영향을 발휘함); 일부 실시양태에서, 길항제는 간접적일 수 있다 (이 경우에 그의 표적에 대한 결합 이외의 다른 방식으로; 예를 들어, 표적의 수준 또는 활성이 변경되도록 표적의 조절제와 상호작용함으로써 그의 영향을 발휘함).
항체: 본원에 사용된 용어 "항체"는 특정한 표적 항원에 특이적 결합을 부여하기에 충분한 정규 이뮤노글로불린 서열 요소를 포함하는 폴리펩티드를 지칭한다. 관련 기술분야에 공지된 바와 같이, 자연에서 생산된 무손상 항체는 서로 회합되어 통상적으로 "Y-형상" 구조로 불리는 것을 형성하는, 2개의 동일한 중쇄 폴리펩티드 (각각 약 50 kD) 및 2개의 동일한 경쇄 폴리펩티드 (각각 약 25 kD)로 구성된 대략 150 kD의 사량체 작용제이다. 각각의 중쇄는 다음 적어도 4개의 도메인 (각각 약 110개 아미노산 길이)으로 구성된다- 아미노-말단 가변 (VH) 도메인 (Y 구조의 선단에 위치함), 이어서 3개의 불변 도메인: CH1, CH2, 및 카르복시-말단 CH3 (Y의 스템의 기저에 위치함). "스위치"로 공지된 짧은 영역은 중쇄 가변 및 불변 영역을 연결한다. "힌지"는 CH2 및 CH3 도메인을 항체의 나머지에 연결한다. 이 힌지 영역 내의 2개의 디술피드 결합은 무손상 항체에서 2개의 중쇄 폴리펩티드를 서로 연결한다. 각각의 경쇄는 또 다른 "스위치"에 의해 서로 분리된, 다음 2개의 도메인으로 구성된다 - 아미노-말단 가변 (VL) 도메인, 이어서 카르복시-말단 불변 (CL) 도메인. 무손상 항체 사량체는 중쇄 및 경쇄가 단일 디술피드 결합에 의해 서로 연결된 2개의 중쇄-경쇄 이량체로 구성되고; 2개의 다른 디술피드 결합은 중쇄 힌지 영역을 서로 연결하여, 이량체가 서로 연결되고 사량체가 형성되도록 한다. 자연 생산된 항체는 또한 전형적으로 CH2 도메인에서 글리코실화된다. 천연 항체 내 각각의 도메인은 압축된 역평행 베타 배럴에서 서로에 대해 패킹된 2개의 베타 시트 (예를 들어, 3-, 4- 또는 5-가닥 시트)로 형성된 "이뮤노글로불린 폴드"를 특징으로 하는 구조를 갖는다. 각각의 가변 도메인은 "상보성 결정 영역"으로 공지된 3개의 초가변 루프 (CDR1, CDR2 및 CDR3) 및 4개의 다소 불변인 "프레임워크" 영역 (FR1, FR2, FR3 및 FR4)을 포함한다. 천연 항체가 폴딩되면, FR 영역은 도메인에 구조적 프레임워크를 제공하는 베타 시트를 형성하고, 중쇄 및 경쇄 둘 다로부터의 CDR 루프 영역은 3-차원 공간에서 함께 결합하여 Y 구조의 선단에 위치하는 단일 초가변 항원 결합 부위를 생성한다. 자연 발생 항체의 Fc 영역은 보체 시스템의 요소, 및 또한 예를 들어 세포독성을 매개하는 이펙터 세포를 포함한 이펙터 세포 상의 수용체에 결합한다. 관련 기술분야에 공지된 바와 같이, Fc 수용체에 대한 Fc 영역의 친화도 및/또는 다른 결합 속성은 글리코실화 또는 다른 변형을 통해 조정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명에 따라 생산 및/또는 이용된 항체는 변형 또는 조작된 글리코실화를 갖는 Fc 도메인을 포함한 글리코실화된 Fc 도메인을 포함한다. 본 발명의 목적을 위해, 특정 실시양태에서, 천연 항체에서 발견되는 바와 같은 충분한 이뮤노글로불린 도메인 서열을 포함하는 임의의 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체는 이러한 폴리펩티드가 자연 생산되든지 (예를 들어, 항원에 반응하는 유기체에 의해 생성됨), 또는 재조합 조작, 화학적 합성, 또는 다른 인공 시스템 또는 방법론에 의해 생산되든지 간에 "항체"로 지칭되고/거나 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체는 폴리클로날이고; 일부 실시양태에서, 항체는 모노클로날이다. 일부 실시양태에서, 항체는 마우스, 토끼, 영장류 또는 인간 항체에 특징적인 불변 영역 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, 항체 서열 요소는 관련 기술분야에 공지된 바와 같이 인간화, 영장류화, 키메라 요소 등이다. 더욱이, 본원에 사용된 용어 "항체"는 적절한 실시양태에서 (달리 언급되거나 문맥상 명확하지 않는 한) 대안적 제시로 항체 구조 및 기능적 특색을 이용하기 위한 임의의 관련 기술분야-공지 또는 개발된 구축물 또는 포맷을 지칭할 수 있다. 예를 들어, 실시양태에서, 본 발명에 따라 이용된 항체는, 비제한적으로, 무손상 IgA, IgG, IgE 또는 IgM 항체; 이중- 또는 다중-특이적 항체 (예를 들어, 지바디(Zybody)®); 항체 단편, 예컨대 Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')2 단편, Fd' 단편, Fd 단편 및 단리된 CDR 또는 그의 세트; 단일 쇄 Fv; 폴리펩티드-Fc 융합체; 단일 도메인 항체 (예를 들어, 상어 단일 도메인 항체, 예컨대 IgNAR 또는 그의 단편); 낙타류 항체; 차폐된 항체 (예를 들어, 프로바디(Probody)®); 소형 모듈 면역제약 ("SMIP™"); 단일 쇄 또는 탠덤 디아바디 (탠드Ab(TandAb)®); 휴마바디, VHH; 안티칼린(Anticalin)®; 나노바디(Nanobody)® 미니바디; BiTE®; 안키린 반복 단백질 또는 DARPIN®; 아비머(Avimer)®; DART; TCR-유사 항체; 애드넥틴(Adnectin)®; 아필린(Affilin)®; 트랜스-바디(Trans-body)®; 아피바디(Affibody)®; 트라이머X(TrimerX)®; 마이크로단백질; 피노머(Fynomer)®; 센티린(Centyrin)®; 및 칼비토르(KALBITOR)®로부터 선택된 포맷이다. 일부 실시양태에서, 항체는 자연 생산될 경우 갖게될 공유 변형 (예를 들어, 글리칸의 부착)이 결여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체는 공유 변형 (예를 들어, 글리칸, 페이로드 [예를 들어, 검출가능한 모이어티, 치료 모이어티, 촉매 모이어티 등], 또는 다른 펜던트 기 [예를 들어, 폴리-에틸렌 글리콜 등]의 부착)을 함유할 수 있다.
항체 단편: 본원에 사용된 "항체 단편"은 본원에 기재된 바와 같은 항체 또는 항체 작용제의 부분을 지칭하고, 전형적으로 그의 항원-결합 부분 또는 가변 영역을 포함하는 부분을 지칭한다. 항체 단편은 임의의 수단에 의해 생산될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 항체 단편은 무손상 항체 또는 항체 작용제의 단편화에 의해 효소적으로 또는 화학적으로 생산될 수 있다. 대안적으로, 일부 실시양태에서, 항체 단편은 재조합적으로 생산될 수 있다 (즉, 조작된 핵산 서열의 발현에 의함). 일부 실시양태에서, 항체 단편은 완전히 또는 부분적으로 합성적으로 생산될 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체 단편 (특히 항원-결합 항체 단편)은 적어도 약 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190개 또는 그 초과의 아미노산, 일부 실시양태에서 적어도 약 200개의 아미노산의 길이를 가질 수 있다.
결합: 본원에 사용된 용어 "결합"은 전형적으로 2종 이상의 개체 사이 또는 이들 중에서의 비-공유 회합을 지칭하는 것으로 이해될 것이다. "직접" 결합은 개체 또는 모이어티 사이의 물리적 접촉을 포함하고; 간접 결합은 1종 이상의 중간 개체와의 물리적 접촉을 통한 물리적 상호작용을 포함한다. 2종 이상의 개체 사이의 결합은 전형적으로 상호작용하는 개체 또는 모이어티가 단리되어 또는 보다 복잡한 시스템의 상황에서 (예를 들어, 담체 개체 및/또는 생물학적 시스템 또는 세포와 공유 또는 달리 회합된 상황에서) 연구되는 경우를 포함한 임의의 다양한 상황에서 평가될 수 있다.
암: 용어 "암", "악성종양", "신생물", "종양" 및 "암종"은 비교적 비정상적, 비제어 및/또는 자율 성장을 나타내어 세포 증식 제어의 상당한 상실을 특징으로 하는 이상 성장 표현형을 나타내는 세포를 지칭하는 것으로 본원에서 사용된다. 일부 실시양태에서, 종양은 전암성 (예를 들어, 양성), 악성, 전-전이성, 전이성, 및/또는 비-전이성인 세포일 수 있거나 이를 포함할 수 있다. 본 개시내용은 그의 교시가 특히 관련될 수 있는 특정 암을 구체적으로 확인한다. 일부 실시양태에서, 관련 암은 고형 종양을 특징으로 할 수 있다. 일부 실시양태에서, 관련 암은 혈액 종양을 특징으로 할 수 있다. 일반적으로, 관련 기술분야에 공지된 암의 상이한 유형의 예는, 예를 들어, 백혈병, 림프종 (호지킨 및 비-호지킨), 골수종 및 골수증식성 장애를 포함한 조혈암; 육종, 흑색종, 선종, 고체 조직의 암종, 구강, 인후, 후두 및 폐의 편평 세포 암종, 간암, 비뇨생식기암, 예컨대 전립선, 자궁경부, 방광, 자궁 및 자궁내막암 및 신세포 암종, 골암, 췌장암, 피부암, 피부 또는 안내 흑색종, 내분비계암, 갑상선암, 부갑상선암, 두경부암, 유방암, 위장암 및 신경계암, 양성 병변, 예컨대 유두종 등을 포함한다.
CDR: 본원에 사용된 바와 같이, 항체 가변 영역 내의 상보성 결정 영역을 지칭한다. 중쇄 및 경쇄의 각각의 가변 영역에 3개의 CDR이 존재하며, 이는 각각의 가변 영역에 대해 CDR1, CDR2 및 CDR3으로 지정된다. "세트의 CDR" 또는 "CDR 세트"는 항원에 결합할 수 있는 단일 가변 영역에서 발생하는 3개 또는 6개의 CDR, 또는 항원에 결합할 수 있는 동족 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 CDR의 군을 지칭한다. CDR 경계를 정의하기 위한 특정 시스템 (예를 들어, 카바트, 코티아 등)이 관련 기술분야에서 확립되었으며; 관련 기술분야의 통상의 기술자는 이들 시스템 사이 및 이들 중에서의 차이를 인지하고 청구된 발명을 이해 및 실시하는데 요구되는 정도로 CDR 경계를 이해할 수 있다.
화학요법제: 본원에 사용된 용어 "화학요법제"는, 예를 들어 구체적으로 바람직하지 않은 세포 증식과 연관된 1종 이상의 질환, 장애 또는 상태를 치료하는데 사용하기 위해 이용 및/또는 권장되는 작용제를 포함한, 1종 이상의 아폽토시스촉진, 세포증식억제성 및/또는 세포독성 작용제를 지칭함을 의미하는 것으로 관련 기술분야에서 이해된다. 많은 실시양태에서, 화학요법제는 암의 치료에 유용하다. 일부 실시양태에서, 화학요법제는 1종 이상의 알킬화제, 1종 이상의 안트라시클린, 1종 이상의 세포골격 파괴제 (예를 들어 미세관 표적화제, 예컨대 탁산, 메이탄신 및 그의 유사체), 1종 이상의 에포틸론, 1종 이상의 히스톤 데아세틸라제 억제제 (HDAC), 1종 이상의 토포이소머라제 억제제 (예를 들어, 토포이소머라제 I 및/또는 토포이소머라제 II의 억제제), 1종 이상의 키나제 억제제, 1종 이상의 뉴클레오티드 유사체 또는 뉴클레오티드 전구체 유사체, 1종 이상의 펩티드 항생제, 1종 이상의 백금-기반 작용제, 1종 이상의 레티노이드, 1종 이상의 빈카 알칼로이드, 및/또는 하기 중 1종 이상의 1종 이상의 유사체 (즉, 관련 항증식 활성을 공유하는 것)이거나 이를 포함할 수 있다. 일부 특정한 실시양태에서, 화학요법제는 악티노마이신, 올-트랜스 레티노산, 아우리스타틴, 아자시티딘, 아자티오프린, 블레오마이신, 보르테조밉, 카르보플라틴, 카페시타빈, 시스플라틴, 클로람부실, 시클로포스파미드, 쿠르쿠민, 시타라빈, 다우노루비신, 도세탁셀, 독시플루리딘, 독소루비신, 에피루비신, 에포틸론, 에토포시드, 플루오로우라실, 겜시타빈, 히드록시우레아, 이다루비신, 이마티닙, 이리노테칸, 메이탄신 및/또는 그의 유사체 (예를 들어 DM1), 메클로레타민, 메르캅토퓨린, 메토트렉세이트, 미톡산트론, 메이탄시노이드, 옥살리플라틴, 파클리탁셀, 페메트렉세드, 테니포시드, 티오구아닌, 토포테칸, 발루비신, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 빈데신, 비노렐빈, 및 그의 조합 중 1종 이상이거나 이를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 화학요법제는 항체-약물 접합체와 관련하여 이용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 화학요법제는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 항체-약물 접합체에서 발견된 것이다: hLL1-독소루비신, hRS7-SN-38, hMN-14-SN-38, hLL2-SN-38, hA20-SN-38, hPAM4-SN-38, hLL1-SN-38, hRS7-Pro-2-P-Dox, hMN-14-Pro-2-P-Dox, hLL2-Pro-2-P-Dox, hA20-Pro-2-P-Dox, hPAM4-Pro-2-P-Dox, hLL1-Pro-2-P-Dox, P4/D10-독소루비신, 겜투주맙 오조가미신, 브렌툭시맙 베도틴, 트라스투주맙 엠탄신, 이노투주맙 오조가미신, 글렘바투무맙 베도틴, SAR3419, SAR566658, BIIB015, BT062, SGN-75, SGN-CD19A, AMG-172, AMG-595, BAY-94-9343, ASG-5ME, ASG-22ME, ASG-16M8F, MDX-1203, MLN-0264, 항-PSMA ADC, RG-7450, RG-7458, RG-7593, RG-7596, RG-7598, RG-7599, RG-7600, RG-7636, ABT-414, IMGN-853, IMGN-529, 보르세투주맙 마포도틴, 및 로르보투주맙 메르탄신.
상응하는: 본원에 사용된 용어 "상응하는"은 적절한 참조 화합물 또는 조성물과의 비교를 통해 화합물 또는 조성물 내 구조적 요소의 위치/동일성을 지정하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 중합체 내 단량체 잔기 (예를 들어, 폴리펩티드 내 아미노산 잔기 또는 폴리뉴클레오티드 내 핵산 잔기)는 적절한 참조 중합체 내 잔기에 "상응하는" 것으로서 확인될 수 있다. 예를 들어, 통상의 기술자는 단순성의 목적으로 폴리펩티드 내 잔기가 참조 관련 폴리펩티드를 기준으로 한 정규 넘버링 시스템을 사용하여 종종 지정되어, 예를 들어 위치 190에서의 잔기에 "상응하는" 아미노산은 실제로 특정한 아미노산 쇄에서 190번째 아미노산일 필요는 없고 오히려 참조 폴리펩티드에서 190번째에 발견되는 잔기에 상응하도록 한다는 것을 인지할 것이며; 관련 기술분야의 통상의 기술자는 "상응하는" 아미노산을 확인하는 방법을 용이하게 인지한다. 예를 들어, 관련 기술분야의 통상의 기술자는, 예를 들어 본 개시내용에 따라 폴리펩티드 및/또는 핵산 내 "상응하는" 잔기를 확인하기 위해 이용될 수 있는 소프트웨어 프로그램, 예컨대, 예를 들어 BLAST, CS-BLAST, CUSASW++, DIAMOND, FASTA, GGSEARCH/GLSEARCH, Genoogle, HMMER, HHpred/HHsearch, IDF, Infernal, KLAST, USEARCH, parasail, PSI-BLAST, PSI-Search, ScalaBLAST, Sequilab, SAM, SSEARCH, SWAPHI, SWAPHI-LS, SWIMM, 또는 SWIPE를 포함한 다양한 서열 정렬 전략을 인식할 것이다.
조작된: 일반적으로, 용어 "조작된"은 인간의 손에 의해 조작된 측면을 지칭한다. 예를 들어, 폴리펩티드는 폴리펩티드 서열이 인간의 손에 의해 조작되었을 때 "조작된" 것으로 간주된다. 예를 들어, 본 발명의 일부 실시양태에서, 조작된 폴리펩티드는 인간의 손에 의해 참조 폴리펩티드 서열 내로 도입된 1개 이상의 아미노산 돌연변이, 결실 및/또는 삽입을 포함하는 서열을 포함한다. 대등하게, 세포 또는 유기체는 그것이 조작되어 그의 유전 정보가 변경되는 경우 (예를 들어, 이전에 존재하지 않은 새로운 유전 물질이, 예를 들어 형질전환, 교배, 체성 혼성화, 형질감염, 형질도입, 또는 다른 메카니즘에 의해 도입되거나, 또는 이전에 존재하는 유전 물질이, 예를 들어 치환 또는 결실 돌연변이에 의해 또는 교배 프로토콜에 의해 변경 또는 제거되는 경우) "조작된" 것으로 간주된다. 관례로서 및 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 이해되는 바와 같이, 조작된 폴리펩티드 또는 세포의 유도체 및/또는 자손은 실제 조작이 이전 개체에 대해 수행되었더라도 전형적으로 여전히 "조작된" 것으로 지칭된다.
에피토프: 본원에 사용된 바와 같이, 이뮤노글로불린 (예를 들어, 항체 또는 수용체) 결합 성분에 의해 특이적으로 인식되는 임의의 모이어티를 포함한다. 일부 실시양태에서, 에피토프는 항원 상의 복수의 화학적 원자 또는 기로 구성된다. 일부 실시양태에서, 이러한 화학적 원자 또는 기는 항원이 적절한 3-차원 입체형태를 취할 때 표면-노출된다. 일부 실시양태에서, 이러한 화학적 원자 또는 기는 항원이 이러한 입체형태를 취할 때 공간에서 서로 물리적으로 가까이 있다. 일부 실시양태에서, 적어도 일부 이러한 화학적 원자 또는 기는 항원이 대안적 입체형태를 취할 때 (예를 들어, 선형화될 때) 서로로부터 물리적으로 분리된다.
생체외: 본원에 사용된 바와 같이, 다세포 유기체의 환경 밖에서 발생하는 생물학적 사건을 지칭한다. 예를 들어, 세포-기반 시스템과 관련하여, 용어는 인공 환경에서 세포의 집단 중에서 발생하는 사건 (예를 들어, 세포 증식, 시토카인 분비 등)을 지칭하는 것으로 사용될 수 있다.
프레임워크 또는 프레임워크 영역: 본원에 사용된 바와 같이, CDR을 뺀 가변 영역의 서열을 지칭한다. CDR 서열이 상이한 시스템에 의해 결정될 수 있기 때문에, 마찬가지로 프레임워크 서열은 상응하게 상이한 해석에 적용된다. 6개의 CDR은 중쇄 및 경쇄 상의 프레임워크 영역을 각각의 쇄 상에서 4개의 하위-영역 (FR1, FR2, FR3 및 FR4)으로 나누며, 여기서 CDR1은 FR1과 FR2 사이에, CDR2는 FR2와 FR3 사이에, CDR3은 FR3과 FR4 사이에 위치해 있다. 특정한 하위-영역을 FR1, FR2, FR3 또는 FR4로서 명시하지 않으면서, 기타로 지칭되는 프레임워크 영역은 단일 자연 발생 이뮤노글로불린 쇄의 가변 영역 내의 복합 FR을 나타낸다. 본원에 사용된 바와 같이, 하나의 FR은 4개의 하위-영역 중 하나를 나타내며, 예를 들어 FR1은 가변 영역의 아미노 말단 단부 및 CDR1에 대한 5'에 가장 가까운 제1 프레임워크 영역을 나타내고, FR들은 프레임워크 영역을 구성하는 하위-영역 중 2개 이상을 나타낸다.
인간화: 관련 기술분야에 공지된 바와 같이, 용어 "인간화"는 통상적으로 그의 아미노산 서열이 비-인간 종 (예를 들어, 마우스)에서 생성된 참조 항체로부터의 VH 및 VL 영역 서열을 포함하지만, 또한 이들을 보다 "인간-유사", 즉 보다 인간 배선 가변 서열과 유사한 상태가 되도록 하기 위해 참조 항체에 비해 상기 서열 내에 변형을 포함하는 항체 (또는 항체 성분)을 지칭하는 것으로 사용된다. 일부 실시양태에서, "인간화" 항체 (또는 항체 성분)는, 관심 항원에 면역특이적으로 결합하며 실질적으로 인간 항체의 것으로서의 아미노산 서열을 갖는 프레임워크 (FR) 영역 및 실질적으로 비-인간 항체의 것으로서의 아미노산 서열을 갖는 상보성 결정 영역 (CDR)을 갖는 것이다. 인간화 항체는 모든 또는 실질적으로 모든 CDR 영역이 비-인간 이뮤노글로불린 (즉, 공여자 이뮤노글로불린)의 것에 상응하고 모든 또는 실질적으로 모든 프레임워크 영역이 인간 이뮤노글로불린 컨센서스 서열의 것인 실질적으로 모든 적어도 1개, 및 전형적으로 2개의 가변 도메인 (Fab, Fab', F(ab')2, FabC, Fv)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간화 항체는 또한 이뮤노글로불린 불변 영역 (Fc)의 적어도 한 부분, 전형적으로 인간 이뮤노글로불린 불변 영역의 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간화 항체는 경쇄, 뿐만 아니라 적어도 중쇄의 가변 도메인 둘 다를 함유한다. 항체는 또한 중쇄 불변 영역의 CH1, 힌지, CH2, CH3, 및 임의로 CH4 영역을 포함할 수 있다.
시험관내: 본원에 사용된 용어 "시험관내"는 다세포 유기체 내에서보다는 인공 환경에서, 예를 들어 시험 튜브 또는 반응 용기에서, 세포 배양물 등에서 발생하는 사건을 지칭한다.
생체내: 본원에 사용된 바와 같이, 다세포 유기체, 예컨대 인간 및 비-인간 동물 내에서 발생하는 사건을 지칭한다. 세포-기반 시스템과 관련하여, 용어는 (예를 들어, 시험관내 시스템과 대조적으로) 살아있는 세포 내에서 발생하는 사건을 지칭하는 것으로 사용될 수 있다.
단리된: 본원에 사용된 바와 같이, (1) 초기에 생산될 때 (자연에서이든지 및/또는 실험 상황에서이든지 간에) 회합된 성분 중 적어도 일부로부터 분리되고/거나, (2) 인간의 손에 의해 설계, 생산, 제조 및/또는 제작된 물질 및/또는 개체를 지칭한다. 단리된 물질 및/또는 개체는 초기에 회합된 다른 성분의 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 또는 약 99% 초과로부터 분리될 수 있다. 일부 실시양태에서, 단리된 작용제는 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 또는 약 99% 초과로 순수하다. 본원에 사용된 바와 같이, 물질은 다른 성분이 실질적으로 없는 경우에 "순수"하다. 일부 실시양태에서, 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 이해될 바와 같이, 물질은 특정 다른 성분, 예컨대, 예를 들어 1종 이상의 담체 또는 부형제 (예를 들어, 완충제, 용매, 물 등)와 조합된 후에 "단리된" 또는 심지어 "순수한" 것으로 여전히 간주될 수 있으며; 이러한 실시양태에서, 물질의 단리 또는 순도 퍼센트는 이러한 담체 또는 부형제를 포함하지 않으면서 계산된다. 하나의 예를 제공하자면, 일부 실시양태에서, 자연에서 발생하는 생물학적 중합체, 예컨대 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드는 a) 그의 기원 또는 유래 공급원에 의해, 자연에서 그를 그의 천연 상태로 동반하는 성분의 일부 또는 모두와 회합되지 않는 경우; b) 자연에서 그를 생산하는 종으로부터 동일한 종의 다른 폴리펩티드 또는 핵산이 실질적으로 없는 경우; c) 자연에서 그를 생산하는 종이 아닌 세포 또는 다른 발현계로부터의 성분에 의해 발현되거나 또는 그러한 성분과 달리 회합되는 경우, "단리된" 것으로 간주된다. 따라서, 예를 들어, 일부 실시양태에서, 화학적으로 합성되거나 또는 자연에서 그를 생산하는 것과는 상이한 세포 시스템에서 합성된 폴리펩티드는 "단리된" 폴리펩티드인 것으로 간주된다. 대안적으로 또는 추가적으로, 일부 실시양태에서, 1종 이상의 정제 기술에 적용된 폴리펩티드는 a) 자연에서 회합된 다른 성분; 및/또는 b) 초기에 생산될 때 회합된 다른 성분으로부터 분리된 정도로 "단리된" 폴리펩티드인 것으로 간주될 수 있다.
KD: 본원에 사용된 바와 같이, 결합제 (예를 들어, 항체 또는 그의 결합 성분)의 그의 파트너 (예를 들어, 항체 또는 그의 결합 성분이 결합하는 에피토프)와의 복합체로부터의 해리 상수를 지칭한다.
제약 조성물: 본원에 사용된 용어 "제약 조성물"은 활성제가 1종 이상의 제약상 허용되는 담체와 함께 제제화된 조성물을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 인간 또는 동물 대상체에 대한 투여에 적합하다. 일부 실시양태에서, 활성제는 관련 집단에 투여될 때 미리 결정된 치료 효과를 달성할 통계적으로 유의한 확률을 나타내는 치료 요법에서의 투여에 적절한 단위 투여 양으로 존재한다.
폴리펩티드: 본원에 사용된 용어 "폴리펩티드"는 일반적으로 적어도 3개의 아미노산의 중합체인 관련 기술분야에서 인식되는 의미를 갖는다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 용어 "폴리펩티드"가 본원에 언급된 완전한 서열을 갖는 폴리펩티드를 포괄할 뿐만 아니라 이러한 완전한 폴리펩티드의 기능적 단편 (즉, 적어도 1종의 활성을 유지하는 단편)을 나타내는 폴리펩티드도 포괄한다는 것이 충분히 일반적인 것으로 의도된다는 것을 인지할 것이다. 더욱이, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 단백질 서열이 활성을 파괴하지 않으면서 일부 치환을 일반적으로 허용한다는 것을 이해한다. 따라서, 활성을 유지하고, 동일한 부류의 또 다른 폴리펩티드와 적어도 약 30-40%, 종종 약 50%, 60%, 70%, 또는 80% 초과의 전체 서열 동일성을 공유하며, 통상적으로 적어도 3-4개 및 종종 최대 20개 또는 그 초과의 아미노산을 포괄하는 1개 이상의 고도로 보존된 영역에서 훨씬 더 높은 동일성, 종종 90% 또는 심지어 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 초과의 동일성의 적어도 1개의 영역을 추가로 통상적으로 포함하는 임의의 폴리펩티드는 본원에 사용된 바와 같은 관련 용어 "폴리펩티드" 내에 포괄된다. 폴리펩티드는 L-아미노산, D-아미노산, 또는 둘 다를 함유할 수 있고, 관련 기술분야에 공지된 다양한 아미노산 변형 또는 유사체 중 임의의 것을 함유할 수 있다. 유용한 변형은, 예를 들어 말단 아세틸화, 아미드화, 메틸화 등을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단백질은 천연 아미노산, 비-천연 아미노산, 합성 아미노산, 및 그의 조합을 포함할 수 있다. 용어 "펩티드"는 일반적으로 약 100개 미만의 아미노산, 약 50개 미만의 아미노산, 20개 미만의 아미노산, 또는 10개 미만의 아미노산의 길이를 갖는 폴리펩티드를 지칭하는 것으로 사용된다. 일부 실시양태에서, 단백질은 항체, 그의 항체 단편, 생물학적 활성 부분 및/또는 그의 특징적인 부분이다.
예방하다 또는 예방: 본원에 사용된 바와 같이, 질환, 장애 및/또는 상태의 발생과 관련하여 사용될 때, 질환, 장애 및/또는 상태의 발생 위험을 감소시키는 것 및/또는 질환, 장애 또는 상태의 1종 이상의 특징 또는 증상의 발병 및/또는 중증도를 지연시키는 것을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 예방은 집단 기준으로 평가되어, 특정한 질환, 장애 또는 상태에 걸리기 쉬운 집단에서 그 질환, 장애 또는 상태의 1종 이상의 증상의 발생, 빈도 및/또는 강도의 통계적으로 유의한 감소가 관찰되는 경우에, 작용제가 그 질환, 장애 또는 상태를 "예방"하는 것으로 간주된다.
재조합: 본원에 사용된 바와 같이, 재조합 수단에 의해 설계, 조작, 제조, 발현, 생성, 제작 및/또는 단리되는 폴리펩티드, 예컨대 숙주 세포 내로 형질감염된 재조합 발현 벡터를 사용하여 발현된 폴리펩티드; 재조합, 조합 인간 폴리펩티드 라이브러리로부터 단리된 폴리펩티드; 트랜스제닉이거나 또는 달리 폴리펩티드 또는 그의 1종 이상의 성분(들), 부분(들), 요소(들) 또는 도메인(들)의 발현을 코딩 및/또는 지시하는 유전자 또는 유전자들 또는 유전자 성분을 발현하도록 조작된 동물 (예를 들어, 마우스, 토끼, 양, 어류 등)로부터 단리된 폴리펩티드; 및/또는 선택된 핵산 서열 요소를 서로에게 스플라이싱 또는 라이게이션하는 것, 선택된 서열 요소를 화학적으로 합성하는 것, 및/또는 달리 폴리펩티드 또는 그의 1종 이상의 성분(들), 부분(들), 요소(들) 또는 도메인(들)의 발현을 코딩 및/또는 지시하는 핵산을 생성하는 것을 포함하는 임의의 다른 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 폴리펩티드를 지칭하는 것으로 의도된다. 일부 실시양태에서, 이러한 선택된 서열 요소 중 1종 이상은 자연에서 발견된다. 일부 실시양태에서, 이러한 선택된 서열 요소 중 1종 이상은 인 실리코로 설계된다. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 이러한 선택된 서열 요소는, 예를 들어 자연 또는 합성 공급원, 예컨대, 예를 들어 관심 공급원 유기체 (예를 들어, 인간, 마우스 등)의 배선으로부터의 공지된 서열 요소의 돌연변이유발 (예를 들어, 생체내 또는 시험관내)로부터 생성된다.
특이적 결합: 본원에 사용된 용어 "특이적 결합"은 결합이 발생하는 환경에서 가능한 결합 파트너 사이를 구별할 수 있는 능력을 지칭한다. 다른 잠재적 표적이 존재하는 경우에 하나의 특정한 표적과 상호작용하는 결합제는 그와 상호작용하는 표적에 "특이적으로 결합"한다고 언급된다. 일부 실시양태에서, 특이적 결합은 결합제와 그의 파트너 사이의 회합의 정도를 검출 또는 결정함으로써 평가되고; 일부 실시양태에서, 특이적 결합은 결합제-파트너 복합체의 해리의 정도를 검출 또는 결정함으로써 평가되고; 일부 실시양태에서, 특이적 결합은 결합제가 그의 파트너와 또 다른 개체 사이의 대안적 상호작용과 경쟁하는 능력을 검출 또는 결정함으로써 평가된다. 일부 실시양태에서, 특이적 결합은 소정 범위의 농도에 걸쳐 이러한 검출 또는 결정을 수행함으로써 평가된다.
대상체: 본원에 사용된 용어 "대상체"는 유기체, 전형적으로 포유동물 (예를 들어, 인간, 일부 실시양태에서 출생전 인간 형태를 포함함)을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 대상체는 관련 질환, 장애 또는 상태를 앓고 있다. 일부 실시양태에서, 대상체는 질환, 장애 또는 상태에 걸리기 쉽다. 일부 실시양태에서, 대상체는 질환, 장애 또는 상태의 1종 이상의 증상 또는 특징을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 대상체는 질환, 장애 또는 상태의 임의의 증상 또는 특징을 나타내지 않는다. 일부 실시예에서, 대상체는 질환, 장애 또는 상태에 대한 감수성 또는 위험에 특징적인 1종 이상의 특색을 갖는 대상체이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 환자이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 진단 및/또는 요법이 시행되고/거나 시행된 개체이다.
치료제: 본원에 사용된 어구 "치료제"는 일반적으로 유기체에게 투여되는 경우에 목적하는 약리학적 효과를 도출하는 임의의 작용제를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 작용제는 그것이 적절한 집단에 걸쳐 통계학적으로 유의한 효과를 나타내는 경우 치료제인 것으로 간주된다. 일부 실시양태에서, 적절한 집단은 모델 유기체의 집단일 수 있다. 일부 실시양태에서, 적절한 집단은 다양한 기준, 예컨대 특정 연령 군, 성별, 유전적 배경, 기존 임상 조건 등에 의해 정의될 수 있다. 일부 실시양태에서, 치료제는 질환, 장애 및/또는 상태의 1종 이상의 증상 또는 특색을 완화시키고/거나, 호전시키고/거나, 경감시키고/거나, 억제하고/거나, 예방하고/거나, 그의 발병을 지연시키고/거나, 그의 중증도를 감소시키고/거나, 그의 발병률을 감소시키기 위해 사용될 수 있는 물질이다. 일부 실시양태에서, "치료제"는 그것이 인간에 대한 투여용으로 시판될 수 있기 전에 정부 기관에 의해 승인된 또는 승인될 것이 요구되는 작용제이다. 일부 실시양태에서, "치료제"는 인간에게 투여하기 위해 의료 처방이 요구되는 작용제이다.
치료 유효량: 본원에 사용된 용어 "치료 유효량"은 치료 투여 요법에 따라 질환, 장애 및/또는 상태를 앓고 있거나 이에 걸리기 쉬운 대상체에게 투여되는 경우에 질환, 장애 및/또는 상태를 치료하기에 충분한 양을 의미한다. 일부 실시양태에서, 치료 유효량은 질환, 장애 및/또는 상태의 발병률 및/또는 중증도를 감소시키고/거나, 그의 1종 이상의 특징을 안정화시키고/거나, 그의 1종 이상의 증상의 발병을 지연시키는 양이다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 용어 "치료 유효량"이 실제로 특정한 개체에게서 달성되는 성공적인 치료를 요구하지 않는다는 것을 인지할 것이다. 오히려, 치료 유효량은 이러한 치료를 필요로 하는 환자에게 투여되는 경우에 유의한 수의 대상체에서 특정한 목적하는 약리학적 반응을 제공하는 양일 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 용어 "치료 유효량"은, 본 발명의 요법과 관련하여 그를 필요로 하는 개체에게 투여되는 경우에, 상기 개체에서 발생하는 암-지지 과정을 차단, 안정화, 약화 또는 반전시키거나, 또는 상기 개체에서 암-억제 과정을 증진 또는 증가시킬 양을 지칭한다. 암 치료와 관련하여, "치료 유효량"은 암으로 진단된 개체에게 투여되는 경우에, 개체에서 추가의 암의 발생을 예방, 안정화, 억제 또는 감소시킬 양이다. 본원에 기재된 조성물의 특히 바람직한 "치료 유효량"은 (치유적 치료에서) 악성종양, 예컨대 췌장 암종의 발생을 반전시키거나 또는 악성종양의 완화를 달성 또는 연장하는 것을 돕는다. 개체에서 암을 치료하기 위해 그러한 개체에게 투여된 치료 유효량은 완화를 촉진하거나 전이를 억제하기 위해 투여된 치료 유효량과 동일하거나 상이할 수 있다. 대부분의 암 요법에서와 같이, 본원에 기재된 치료 방법은 암에 대한 "치유"로서 해석되지 않거나, 이에 한정되지 않거나, 또는 달리 이에 제한되지 않고; 오히려 치료 방법은 암을 "치료"하기 위한, 즉 암을 갖는 개체의 건강에 바람직하거나 유익한 변화를 가져오기 위한 기재된 조성물의 사용에 관한 것이다. 이러한 이익은 종양학의 분야에서 숙련된 건강관리 제공자에 의해 인식되고, 환자 상태의 안정화, 종양 크기의 감소 (종양 퇴행), 생명 기능의 개선 (예를 들어, 암성 조직 또는 기관의 개선된 기능), 추가의 전이의 감소 또는 억제, 기회 감염의 감소, 증가된 생존성, 통증의 감소, 개선된 운동 기능, 개선된 인지 기능, 개선된 에너지감 (활력, 감소된 권태감), 개선된 행복감, 정상 식욕의 회복, 건강한 체중 증가의 회복, 및 그의 조합을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 추가로, 개체에서의 특정한 종양의 퇴행 (예를 들어, 본원에 기재된 치료의 결과로서)은 또한, 종양의 부위로부터 암 세포의 샘플을 취하고 (예를 들어, 치료 과정에 걸쳐), 암 세포의 보다 덜 악성인 표현형으로의 퇴행을 분자 수준에서 검증하기 위해 암 세포의 상태를 모니터링하기 위해 암 세포를 대사 및 신호전달 마커의 수준에 대해 시험함으로써 평가될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 방법을 사용함으로써 유도된 종양 퇴행은 상기 논의된 임의의 혈관신생촉진 마커의 감소, 본원에 기재된 항-혈관신생 마커의 증가, 암으로 진단된 개체에서 비정상적 활성을 나타내는 대사 경로, 세포간 신호전달 경로 또는 세포내 신호전달 경로의 정상화 (즉, 암을 앓고 있지 않는 정상 개체에서 발견된 상태를 향한 변경)를 발견함으로써 나타날 것이다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 일부 실시양태에서 치료 유효량이 단일 용량으로 제제화 및/또는 투여될 수 있다는 것을 인지할 것이다. 일부 실시양태에서, 치료 유효량은, 예를 들어 투여 요법의 일부로서 복수의 용량으로 제제화 및/또는 투여될 수 있다.
변이체: 분자, 예를 들어 핵산, 단백질 또는 소분자와 관련하여 본원에 사용된 용어 "변이체"는 참조 분자와 유의한 구조적 동일성을 나타내지만, 예를 들어 참조 개체와 비교하여 1종 이상의 화학적 모이어티의 존재 또는 부재 또는 그의 수준에 있어서 참조 분자와 구조적으로 상이한 분자를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 변이체는 또한 그의 참조 분자와 기능적으로 상이하다. 일반적으로, 특정한 분자가 참조 분자의 "변이체"인 것으로 적절하게 간주되는지 여부는 그의 참조 분자와의 구조적 동일성 정도에 기초한다. 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 인지될 바와 같이, 임의의 생물학적 또는 화학적 참조 분자는 특정 특징적 구조적 요소를 갖는다. 변이체는, 정의에 의하면, 참조 분자로부터 1종 이상의 이러한 특징적 구조적 요소를 공유하지만 적어도 한 측면에서 상이한 특유의 분자이다. 몇몇 예를 제공하자면, 폴리펩티드는 선형 또는 3-차원 공간에서 서로에 대해 지정된 위치를 갖고/거나 특정한 구조적 모티프 및/또는 생물학적 기능에 기여하는 복수의 아미노산으로 구성된 특징적 서열 요소를 가질 수 있고; 핵산은 선형 또는 3-차원 공간에서 서로에 대해 지정된 위치를 갖는 복수의 뉴클레오티드 잔기로 구성된 특징적 서열 요소를 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 변이체 폴리펩티드 또는 핵산은 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열에서의 1개 이상의 차이의 결과로서 참조 폴리펩티드 또는 핵산과 상이할 수 있다. 일부 실시양태에 있어서, 변이체 폴리펩티드 또는 핵산은 참조 폴리펩티드 또는 핵산과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 또는 99%인 전체 서열 동일성을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 변이체 폴리펩티드 또는 핵산은 참조 폴리펩티드 또는 핵산과 적어도 1종의 특징적 서열 요소를 공유하지 않는다. 일부 실시양태에서, 참조 폴리펩티드 또는 핵산은 1종 이상의 생물학적 활성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 변이체 폴리펩티드 또는 핵산은 참조 폴리펩티드 또는 핵산의 생물학적 활성 중 1종 이상을 공유한다.
벡터: 본원에 사용된 바와 같이, 그에 연결된 또 다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 벡터의 하나의 유형은 "플라스미드"이며, 이는 추가의 DNA 절편이 라이게이션될 수 있는 원형 이중 가닥 DNA 루프를 지칭한다. 또 다른 유형의 벡터는 바이러스 벡터이며, 여기서 추가의 DNA 절편은 바이러스 게놈 내로 라이게이션될 수 있다. 특정 벡터는 이들이 도입되는 숙주 세포에서 자율 복제될 수 있다 (예를 들어, 박테리아 복제 기점을 갖는 박테리아 벡터 및 에피솜 포유동물 벡터). 다른 벡터 (예를 들어, 비-에피솜 포유동물 벡터)는 숙주 세포 내로의 도입 시 숙주 세포의 게놈 내로 통합될 수 있고, 이에 의해 숙주 게놈과 함께 복제된다. 더욱이, 특정 벡터는 이들이 작동가능하게 연결된 유전자의 발현을 지시할 수 있다. 이러한 벡터는 본원에서 "발현 벡터"로 지칭된다. 표준 기술은 재조합 DNA, 올리고뉴클레오티드 합성, 및 조직 배양 및 형질전환 (예를 들어, 전기천공, 리포펙션)에 사용될 수 있다. 효소적 반응 및 정제 기술은 제조업체의 설명서에 따라 또는 관련 기술분야에서 통상적으로 수행되는 바와 같이 또는 본원에 기재된 바와 같이 수행될 수 있다. 상기 기술 및 절차는 일반적으로 관련 기술분야에 널리 공지된 통상적인 방법에 따라 및 본 명세서 전반에 걸쳐 인용되고 논의된 다양한 일반적이고 보다 구체적인 참고문헌에 기재된 바와 같이 수행될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989))]을 참조하며, 이는 임의의 목적을 위해 본원에 참조로 포함된다.
예시적 실시양태의 상세한 설명
본 발명은 조절 T 세포의 TH1-유사 세포로의 전환을 위한 항-AITR 항체에 관한 것이다. 예를 들어, 본원에 제공된 조작된 항체는 인간 AITR의 세포외 도메인 내의 에피토프를 특이적으로 인식하는 모 항체에 비해 항원 친화도를 증진시키도록 변형되었다. 구체적으로, 본원에 기재된 바와 같이, 본 발명자들은 인간 AITR에 대한 개선된 친화도를 갖는 여러 예시를 생성하였다. 주목할 만하게, 예시적인 항-AITR 항체는 조절 T 세포 (Treg 세포)를 TH1 세포로 전환시킬 수 있고, 특정 T 세포 시토카인 분비의 양을 조절할 수 있다. 따라서 본 개시내용은 참조 항체에 비해 개선된 특성을 갖는 조작된 항-AITR 항체를 제공하고, 더욱이 이들 항체가 놀랍게도 시험관내 및 생체내에서 유익한 활성을 갖는다는 것을 입증한다.
AITR
인간 활성화-유도성 종양 괴사 인자 수용체 (AITR)는 TNFR 슈퍼패밀리의 구성원이고, 또한 GITR (글루코코르티코이드-유도된 TNFR-관련 단백질), TNFRSF 18 (TNF 수용체 슈퍼패밀리 구성원 18) 또는 CD357로 공지되어 있다 (Kwon et al., J Biol Chem, 274:6056-6061, 1999). AITR은 Treg 세포 (조절 T 세포) 및 활성화된 T 세포에서 특히 높은 수준으로 발현된다. AITR은 세포에 의해 자연적으로 발현되는 임의의 변이체, 이소형 및 상동체를 지칭하고, 구체적으로 인간 AITR을 의미할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. AITR에 대한 정보는 공지된 데이터베이스, 예컨대 NCBI 진뱅크로부터 이용가능하고, 그의 예는 NP_004186을 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. AITR의 자극은 조절 T 세포의 면역억제 기능을 감소시키고 Teff 세포 (이펙터 T 세포) 활성을 촉진하는 고유한 세포내 신호를 생성한다 (Shimizu et al., Nat Immunol., 3:135-142, 2002). 따라서, 면역-종양학의 관점에서, AITR 신호는 종양에 대한 인간 면역을 증가시키고, 암 세포 사멸을 유도한다 (Sakaguchi, Cell, 101:455-458, 2000).
AITR은 생리학적 조건 하에서 단일 분자보다는 삼량체로서 작용하고, 그의 리간드의 기능적 단위는 삼량체이다. TNFRSF (TNF 수용체 슈퍼패밀리) 및 TNF에 대한 구조 연구에 따르면, 3종의 수용체 분자 및 TNF 삼량체는 대칭적으로 결합되고, 각각의 수용체 단편은 2개의 인접한 TNF의 홈에 결합된다. 따라서, TNF와 TNFR 사이의 접촉 계면은 TNFR-TNF 상호작용 및 구조에서 중추적 역할을 한다. 이러한 기능적 유의성은 접촉 표면의 아미노산 서열이 종들 사이뿐만 아니라 TNFR 슈퍼패밀리에서 고도로 보존되는 이유를 설명해줄 수 있다 (Chan et al., Immunity, 13:419-422, 2000).
추가로, 특정 조건에 노출된 세포는 수용체 삼량체로부터 진행하여 삼량체의 사량체를 달성한 다음 내부에 진행성 초-신호를 생성할 수 있다. 이러한 이유로, AITR 신호는 단일 온-오프 신호의 단순한 전달이 아니라, 오히려 신호 전달의 미세하게-조정되는 조절이고, 그것은 Treg 세포의 항암 능력을 제어하는데 있어서 중요한 인자가 된다 (Zhou et al., PNAS., 105:5465-5470, 2008). TNFR과 그의 리간드 사이의 상호작용의 복잡성 및 다양성, 및 수많은 이용가능한 에피토프는 매우 정확한 신호 조절을 가능하게 한다. 따라서, 특정한 구조적 에피토프를 인식할 수 있는 모노클로날 항체 (mAb)는 AITR과 관련된 치료제를 개발하기 위한 최적 후보이다. 즉, 특정한 제공된 항-AITR 항체에 의해 인식되는 에피토프가 AITR 분자 상의 어디에 있는지에 따라, 특정한 항-AITR 항체는 AITR의 천연 리간드를 다양한 정도로 모방할 수 있으며, 예를 들어 활성이 선택적으로 조정될 수 있고/거나 또한 AITR을 통한 반응이 다양한 방식으로 조정될 수 있도록 수용체 올리고머화가 조정될 수 있다.
항-AITR 항체 및 그의 단편
본 개시내용은, 적어도 부분적으로, 시험관내 및/또는 생체내에서 현저하게 및 예상외로 우수한 특징을 나타내는 조작된 항-AITR 항체 (또한 IFN-γ-유도성 조절 T 세포 전환가능 항암 mAb (IRTCA)로서 본원에 기재됨) 및 그의 단편을 제공한다. 예를 들어, 특정 제공된 항체는 참조 항-AITR 항체에 비해 증가된 친화도를 갖는다.
일부 실시양태에서, IRTCA 항체 또는 항원-결합 항체 단편은 서열식별번호: 8, 9, 10, 14, 15, 16, 17, 24 및 25로부터 선택된 서열이거나 이를 포함하는 1, 2 또는 3개의 중쇄 CDR 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, IRTCA 항체 또는 항원-결합 항체 단편은 다음 중 1개 이상을 포함한다: 서열식별번호: 8 및 24로부터 선택된 서열이거나 이를 포함하는 중쇄 CDR1, 서열식별번호: 9 및 25로부터 선택된 서열이거나 이를 포함하는 중쇄 CDR2, 서열식별번호: 10, 14, 15, 16 및 17로부터 선택된 서열이거나 이를 포함하는 중쇄 CDR3. 일부 실시양태에서, IRTCA 항체 또는 항원-결합 항체 단편은 다음 중 각각을 포함한다: 서열식별번호: 8 및 24로부터 선택된 서열이거나 이를 포함하는 중쇄 CDR1, 서열식별번호: 9 및 25로부터 선택된 서열이거나 이를 포함하는 중쇄 CDR2, 및 서열식별번호: 10, 14, 15, 16 및 17로부터 선택된 서열이거나 이를 포함하는 중쇄 CDR3.
일부 실시양태에서, IRTCA 항체 또는 항원-결합 항체 단편은 서열식별번호: 11, 12, 13 및 18로부터 선택된 서열이거나 이를 포함하는 1, 2 또는 3개의 경쇄 CDR 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, IRTCA 항체 또는 항원-결합 항체 단편은 다음 중 1개 이상을 포함한다: 서열식별번호: 11의 서열이거나 이를 포함하는 경쇄 CDR1, 서열식별번호: 12의 서열이거나 이를 포함하는 경쇄 CDR2, 및 서열식별번호: 13 및 18로부터 선택된 서열이거나 이를 포함하는 경쇄 CDR3. 일부 실시양태에서, IRTCA 항체 또는 항원-결합 항체 단편은 다음 중 각각을 포함한다: 서열식별번호: 11의 서열이거나 이를 포함하는 경쇄 CDR1, 서열식별번호: 12의 서열이거나 이를 포함하는 경쇄 CDR2, 및 서열식별번호: 13 및 18로부터 선택된 서열이거나 이를 포함하는 경쇄 CDR3.
일부 실시양태에서, IRTCA 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 (a) 서열식별번호: 8 또는 24의 서열을 포함하는 중쇄 CDR1, 서열식별번호: 9 또는 25의 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 및 서열식별번호: 14, 15, 16 및 17로부터 선택된 적어도 1개의 서열을 포함하는 중쇄 CDR3; 및 (b) 서열식별번호: 11의 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, 서열식별번호: 12의 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 서열식별번호: 13 또는 18의 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하며, 여기서 IRTCA 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 각각의 서열식별번호: 8의 서열을 포함하는 중쇄 CDR1, 서열식별번호: 9의 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 서열식별번호: 10의 서열을 포함하는 중쇄 CDR3, 서열식별번호: 11의 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, 서열식별번호: 12의 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 서열식별번호: 13의 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하지 않는다.
일부 실시양태에서, IRTCA 항체 또는 항원-결합 항체 단편은 서열식별번호: 1, 3, 4, 5, 6, 20 및 21로부터 선택된 서열이거나 이를 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 항체 또는 항체 단편에 대한 실질적 상동성을 포함한다. 일부 실시양태에서, IRTCA 항체 또는 항원-결합 항체 단편은 서열식별번호: 1, 3, 4, 5, 6, 20 및 21로부터 선택된 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4% 또는 99.5% 동일한 서열이거나 이를 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, IRTCA 항체 또는 항원-결합 항체 단편은 서열식별번호: 1, 3, 4, 5, 6, 20 및 21로부터 선택된 서열이거나 이를 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, IRTCA 항체 또는 항원-결합 항체 단편은 서열식별번호: 2, 7, 22 및 23으로부터 선택된 서열이거나 이를 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항체 또는 항체 단편에 대한 실질적 상동성을 포함한다. 일부 실시양태에서, IRTCA 항체 또는 항원-결합 항체 단편은 서열식별번호: 2, 7, 22 및 23으로부터 선택된 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4% 또는 99.5% 동일한 서열이거나 이를 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, IRTCA 항체 또는 항원-결합 항체 단편은 서열식별번호: 2, 7, 22 및 23으로부터 선택된 서열이거나 이를 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, IRTCA 항체 또는 항원-결합 항체 단편은 서열식별번호: 1, 3, 4, 5, 6, 20 및 21로부터 선택된 서열이거나 이를 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 서열식별번호: 2, 7, 22 및 23으로부터 선택된 서열이거나 이를 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항체 또는 항체 단편에 대한 실질적 상동성을 포함한다. 일부 실시양태에서, IRTCA 항체 또는 항원-결합 항체 단편은 서열식별번호: 1, 3, 4, 5, 6, 20 및 21로부터 선택된 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4% 또는 99.5% 동일한 서열이거나 이를 포함하는 중쇄 가변 도메인, 및 서열식별번호: 2, 7, 22 및 23으로부터 선택된 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4% 또는 99.5% 동일한 서열이거나 이를 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, IRTCA 항체 또는 항원-결합 항체 단편은 서열식별번호: 1, 3, 4, 5, 6, 20 및 21로부터 선택된 서열이거나 이를 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 서열식별번호: 2, 7, 22 및 23으로부터 선택된 서열이거나 이를 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다.
본 개시내용의 IRTCA 항체 또는 항원-결합 단편의 아미노산 서열은 보존적 치환을 통해 치환될 수 있다. 본원에 사용된 용어 "보존적 치환"은 폴리펩티드 내 1개 이상의 아미노산이 상응하는 폴리펩티드의 생물학적 또는 생화학적 기능의 상실을 초래하지 않도록 유사한 생화학적 특성을 갖는 아미노산으로 치환된 것인 폴리펩티드의 변형을 지칭한다. 본원에 사용된 용어 "보존적 서열 변이체" 또는 "보존적 아미노산 치환"은 아미노산 잔기를 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 치환한 것이다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기는 관련 기술분야에 정의되어 있다. 그러한 잔기는 염기성 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어, 리신, 아르기닌 및 히스티딘), 산성 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어, 아스파르트산 및 글루타메이트), 비-하전된 극성 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신 및 시스테인), 비-극성 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌 및 트립토판), 베타-분지형 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어, 트레오닌, 발린 및 이소류신), 및 방향족 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판 및 히스티딘)을 포괄한다. 따라서, 본 발명의 항체는 보존적 아미노산 치환을 가질 수 있고, 여전히 활성을 보장할 수 있는 것으로 예상된다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 IRTCA 항체 또는 항원-결합 단편은 IgG1 불변 도메인, IgG2 불변 도메인, IgG1/IgG2 하이브리드 불변 도메인, 인간 IgG4 불변 도메인, IgA 불변 도메인, IgE 불변 도메인, IgM 불변 도메인 및 IgD 불변 도메인으로부터 선택된 불변 영역을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 IRTCA 항체 또는 항원-결합 단편은 IgA, IgD, IgE, IgM, IgG 또는 그의 변이체이거나 이를 포함한다.
일부 실시양태에서, IRTCA 항체 또는 항원-결합 단편은 경쇄 불변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, IRTCA 항체 또는 항원-결합 단편은 카파 (κ) 및/또는 람다 (λ) 경쇄 및/또는 그의 변이체를 포함한다.
일부 실시양태에서, IRTCA 항체 또는 항원-결합 단편은 모노클로날 항체이다. 일부 실시양태에서, IRTCA 항체 또는 항원-결합 단편은 Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')2 단편, Fv 단편, 디술피드-결합된 Fv 단편, scFv 단편, 단일 도메인 항체, 휴마바디, 나노바디 및/또는 디아바디이다. 일부 실시양태에서, IRTCA 항체 또는 항원-결합 단편은 1가 항체이다. 일부 실시양태에서, IRTCA 항체 또는 항원-결합 단편은 다가 항체이다. 일부 실시양태에서, IRTCA 항체 또는 항원-결합 단편은 다중-특이적 항체 (예를 들어, 이중특이적 항체)이다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 글리코실화 부위를 부가 또는 결실시킴으로써 본 개시내용의 항체의 탄수화물 함량을 변형시키는 방법을 포함한다. 항체의 탄수화물 함량을 변형시키는 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고 본 개시내용 내에 포괄된다 (예를 들어, 미국 특허 번호 6,218,149; EP 0 359 096 B1; 미국 공개 번호 US 2002/0028486; WO 03/035835; 미국 공개 번호 2003/0115614; 미국 특허 번호 6,218,149; 미국 특허 번호 6,472,511 참조; 이들 모두는 그 전문이 본원에 참조로 포함됨). 다른 실시양태에서, 본 개시내용은 항체의 1종 이상의 내인성 탄수화물 모이어티를 결실시킴으로써 본 개시내용의 항체의 탄수화물 함량을 변형시키는 방법을 포함한다.
조작된 당형태는 이펙터 기능의 증진 또는 감소를 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 목적에 유용할 수 있다. 조작된 당형태는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 임의의 방법에 의해, 예를 들어 조작된 또는 변이된 발현 균주를 사용하거나, 1종 이상의 효소, 예컨대 DI N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 III (GnTI11)과 함께 공-발현시키거나, 다양한 유기체 또는 다양한 유기체로부터의 세포주에서 Fc 영역을 포함하는 분자를 발현시키거나, Fc 영역을 포함하는 분자가 발현된 후 탄수화물(들)을 변형시킴으로써 생성될 수 있다. 조작된 당형태를 생성하는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있으며, 문헌 [Umana et al., 1999, Nat. Biotechnol 17:176-180; Davies et al., 20017 Biotechnol Bioeng 74:288-294; Shields et al., 2002, J Biol Chem 277:26733-26740; Shinkawa et al., 2003, J Biol Chem 278:3466-3473]; 미국 특허 번호 6,602,684; 미국 일련 번호 10/277,370; 미국 일련 번호 10/113,929; PCT WO 00/61739A1; PCT WO 01/292246A1; PCT WO 02/311140A1; PCT WO 02/30954A1에 기재된 것; 포틸레전트(POTILLEGENT)™ 기술 (바이오와, 인크., 뉴저지주 프린스톤); 글리코맙(GLYCOMAB)™ 글리코실화 조작 기술 (글리카르트 바이오테크놀로지 아게, 스위스 취리히) (이들 각각은 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 예를 들어, WO 00061739; EA01229125; US 20030115614; [Okazaki et al., 2004, JMB, 336: 1239-49] 참조 (이들 각각은 그 전문이 본원에 참조로 포함됨).
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 IRTCA 항체 또는 항원-결합 단편은 인간 AITR의 길항제로서의 것이다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 IRTCA 항체 또는 항원-결합 단편은 인간 AITR 분자에 결합한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 IRTCA 항체 또는 항원-결합 단편은 인간 AITR 분자에 특이적으로 결합한다.
일부 실시양태에서, IRTCA 항체 또는 항원-결합 단편은 서열식별번호: 19의 서열이거나 이를 포함하는 서열에 결합한다. 일부 실시양태에서, IRTCA 항체 또는 항원-결합 단편은 서열식별번호: 19의 서열이거나 이를 포함하는 IRTCA 세포외 도메인의 에피토프에 결합한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 IRTCA 항체 또는 항원-결합 단편은 1x10-7 내지 1x10-12 M의 결합 친화도 (KD)로 AITR 분자에 결합한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 IRTCA 항체 또는 항원-결합 단편은 1x10-8 내지 1x10-12 M의 결합 친화도 (KD)로 인간 AITR 분자에 결합한다. 결합 친화도 (KD)는, 예를 들어 표면 플라즈몬 공명에 의해, 예를 들어 비아코어 시스템을 사용하여 측정될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 IRTCA 항체 또는 항원-결합 단편은 1.0x10-8 M 미만의 결합 친화도 (KD)로 인간 AITR 분자 또는 그의 단편에 결합한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 IRTCA 항체 또는 항원-결합 단편은 1.0x10-9 M 미만의 결합 친화도 (KD)로 인간 AITR 분자 또는 그의 단편에 결합한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 IRTCA 항체 또는 항원-결합 단편은 1.0x10-10 M 미만의 결합 친화도 (KD)로 인간 AITR 분자 또는 그의 단편에 결합한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 IRTCA 항체 또는 항원-결합 단편은 비-영장류 AITR 폴리펩티드 (예를 들어, 개, 마우스 및 래트 AITR 폴리펩티드)에 결합하는데 실패하거나 또는 약하게 결합한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 IRTCA 항체 또는 항원-결합 단편은 인간 또는 원숭이 AITR에 효율적으로 결합한다. 이러한 결합 친화도는 영장류 AITR 항체에 대한 에피토프의 구조 및/또는 서열이 개, 마우스 및 래트와 꽤 상이할 수 있다는 것을 시사한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 IRTCA 항체 또는 항원-결합 단편은 인간 AITR을 발현하는 CD4+ T 세포에 결합한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 IRTCA 항체 또는 항원-결합 단편은 T 세포 집단에 영향을 준다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 IRTCA 항체 또는 항원-결합 단편은 조절 T 세포 (nTreg 세포)를 TH1-유사 (IFN-γ-양성) 세포로 전환시킨다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 IRTCA 항체 또는 항원-결합 단편은 유도성 조절 T 세포 (iTreg 세포)를 TH1-유사 (IFN-γ-양성) 세포로 전환시킨다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 IRTCA 항체 또는 항원-결합 단편은 이펙터 T 세포 (Teff 세포)를 TH1 (IFN-γ-양성) 세포로 전환시킨다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 IRTCA 항체 또는 항원-결합 단편은 조절 T 세포 (Treg 세포)의 집단을 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 IRTCA 항체 또는 항원-결합 단편은 세포의 집단이 Treg 시토카인 (예를 들어, TGF-β)의 분비를 감소시키도록 한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 IRTCA 항체 또는 항원-결합 단편은 낮은 독성 (예를 들어, 낮은 정도의 투여후 세포 사멸)을 특징으로 한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 IRTCA 항체 또는 항원-결합 단편은 낮은 간독성을 특징으로 한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 IRTCA 항체 또는 항원-결합 단편이 치료 용량으로 투여된 대상체는 정상 범위 내의 ALT, AST 및 총 빌리루빈 중 1종 이상의 수준을 갖는다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 IRTCA 항체 또는 항원-결합 단편은 측정가능한 증상의 완화 및 낮고/거나 허용가능한 독성으로 연장된 기간 동안 환자를 치료하는 능력을 특징으로 한다. 낮거나 허용가능한 면역원성 및/또는 고친화도 뿐만 아니라 다른 적합한 특성은 달성되는 치료 결과에 기여할 수 있다. "낮은 면역원성"은 치료된 환자의 약 75% 미만, 또는 바람직하게는 약 50% 미만에서 유의한 HAHA, HACA 또는 HAMA 반응을 일으키고/거나 치료된 환자에서 낮은 역가를 일으키는 것으로 본원에서 정의된다 (문헌 [Elliott et al., Lancet 344:1125-1127 (1994)], 전문이 본원에 참조로 포함됨).
핵산
본 개시내용은 본 개시내용의 IRTCA 항체 및 그의 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 본원에 기재된 바와 같은 IRTCA 항체 및 그의 단편은 관련 기술분야에 공지된 분자 생물학적 방법을 사용하여 핵산 분자로부터 생산될 수 있다. 본 개시내용의 핵산은, 예를 들어 DNA 및/또는 RNA를 포함한다.
일부 실시양태에서, 핵산 구축물은 IRTCA 항체 또는 그의 단편 (예를 들어, H1F1, H1F1M69, H1F1M74)을 코딩하는 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 이러한 항체 또는 그의 단편은 VH 및/또는 VL 영역을 포함할 것이다. IRTCA 항체 또는 그의 단편은 목적하는 결합 및/또는 기능적 특성에 대해 확인 및/또는 선택될 수 있고, 상기 항체의 가변 영역이 단리, 증폭, 클로닝 및/또는 서열분석될 수 있다. 아미노산을 코딩하고/거나 제한 부위를 보유하는 뉴클레오티드 서열의 부가, 및/또는 아미노산을 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 치환을 포함한 변형이 VH 및 VL 뉴클레오티드 서열에 대해 이루어질 수 있다. 일부 실시양태에서, 핵산 서열은 인트론 서열을 포함할 수 있거나 포함하지 않을 수 있다.
적절한 경우에, IRTCA 항체 및 그의 단편 (예를 들어, H1F1, H1F1M69, H1F1M74)을 코딩하는 핵산 서열은 특정한 세포 유형 또는 유기체에서의 발현을 위해 최적화된 코돈을 포함하도록 변형될 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,670,356 및 미국 특허 번호 5,874,304 참조). 코돈 최적화된 서열은 합성 서열이고, 바람직하게는 코돈 최적화되지 않은 모 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 동일한 폴리펩티드 (또는 전장 폴리펩티드와 실질적으로 동일한 활성을 갖는 전장 폴리펩티드의 생물학적으로 활성인 단편)를 코딩한다. 일부 실시양태에서, 항체 성분을 코딩하는 유전 물질의 코딩 영역은, 전체로 또는 일부로, 특정한 세포 유형 (예를 들어, 진핵 또는 원핵 세포)에 대한 코돈 용법을 최적화하기 위해 변경된 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 인간화 중쇄 (또는 경쇄) 가변 영역에 대한 코딩 서열은 박테리아 세포에서의 발현을 위해 최적화될 수 있다. 대안적으로, 코딩 서열은 포유동물 세포 (예를 들어, CHO 세포)에서의 발현을 위해 최적화될 수 있다. 이러한 서열은 코돈-최적화된 서열로서 기재될 수 있다.
본 개시내용의 핵산 구축물은 관련 기술분야에 공지된 방법에 의해 발현 벡터 또는 바이러스 벡터 내로 삽입될 수 있고, 핵산 분자는 발현 제어 서열에 작동가능하게 연결될 수 있다. 상기 기재된 핵산 분자 또는 그의 단편 중 임의의 것을 포함하는 벡터가 본 개시내용에 의해 추가로 제공된다. 상기 핵산 분자 또는 그의 단편 중 임의의 것은 임의의 적합한 벡터 내로 클로닝될 수 있고, 임의의 적합한 숙주를 형질전환 또는 형질감염시키는데 사용될 수 있다. 벡터의 선택 및 이를 구축하는 방법은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 통상적으로 공지되어 있고, 일반 기술 참고문헌에 기재되어 있다 (일반적으로, 문헌 ["Recombinant DNA Part D," Methods in Enzymology, Vol. 153, Wu and Grossman, eds., Academic Press (1987)] 참조).
일부 실시양태에서, 통상적으로 사용되는 기술, 예컨대, 예를 들어 전기영동, 인산칼슘 침전, DEAE-덱스트란 형질감염, 리포펙션 등은 외래 핵산 (DNA 또는 RNA)을 원핵 또는 진핵 숙주 세포 내로 도입하는데 사용될 수 있다. 바람직하게는, 벡터는 적절한 경우에 및 벡터가 DNA인지 또는 RNA인지를 고려하여, 벡터가 도입될 숙주의 유형 (예를 들어, 박테리아, 진균, 식물 또는 동물)에 특이적인 조절 서열, 예컨대 전사 및 번역 개시 및 종결 코돈을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 벡터는 숙주의 속에 특이적인 조절 서열을 포함한다. 바람직하게는, 벡터는 숙주의 종에 특이적인 조절 서열을 포함한다.
복제 시스템 및 삽입된 핵산 이외에도, 핵산 구축물은 형질전환 또는 형질감염된 숙주의 선택을 가능하게 하는 1종 이상의 마커 유전자를 포함할 수 있다. 마커 유전자는 살생물제 내성, 예를 들어 항생제, 중금속 등에 대한 내성, 원영양성을 제공하는 영양요구성 숙주에서의 보완 등을 포함한다.
적합한 벡터는 증식 및 확장을 위해 또는 발현을 위해 또는 둘 다를 위해 설계된 것을 포함한다. 예를 들어, 클로닝 벡터는 pUC 시리즈, pBluescript 시리즈 (스트라타진, 캘리포니아주 라호야), pET 시리즈 (노바젠, 위스콘신주 매디슨), pGEX 시리즈 (파마시아 바이오테크, 스웨덴 웁살라), 및 pEX 시리즈 (클론테크, 캘리포니아주 팔로 알토)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 박테리오파지 벡터, 예컨대 λGT10, λGT11, λZapII (스트라타진), λEMBL4, 및 λNM1149가 또한 사용될 수 있다. 식물 발현 벡터의 예는 pBI110, pBI101.2, pBI101.3, pBI121 및 pBIN19 (클론테크)를 포함한다. 동물 발현 벡터의 예는 pEUK-C1, pMAM 및 pMAMneo (클론테크)를 포함한다. TOPO 클로닝 시스템 (인비트로젠, 캘리포니아주 칼스배드)이 또한 제조업체의 권장사항에 따라 사용될 수 있다.
발현 벡터는 상기 기재된 바와 같이 단리 또는 정제된 핵산 분자에 작동가능하게 연결된 천연 또는 비천연 프로모터를 포함할 수 있다. 프로모터, 예를 들어 강, 약, 유도성, 조직-특이적 및 발생-특이적 프로모터의 선택은 관련 기술분야의 기술 내에 있다. 유사하게, 상기 기재된 바와 같은 핵산 분자 또는 그의 단편과 프로모터와의 조합이 또한 관련 기술분야의 기술 내에 있다.
적합한 바이러스 벡터는, 예를 들어 레트로바이러스 벡터, 파보바이러스-기반 벡터, 예를 들어 아데노-연관 바이러스 (AAV)-기반 벡터, AAV-아데노바이러스 키메라 벡터 및 아데노바이러스-기반 벡터, 및 렌티바이러스 벡터, 예컨대 단순 포진 바이러스 (HSV)-기반 벡터를 포함한다. 이들 바이러스 벡터는, 예를 들어 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual, 2d edition, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989); 및 Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and John Wiley & Sons, New York, N.Y. (1994)]에 기재된 표준 재조합 DNA 기술을 사용하여 제조될 수 있다.
레트로바이러스 벡터는 레트로바이러스로부터 유래한다. 레트로바이러스는 매우 다양한 숙주 세포를 감염시킬 수 있는 RNA 바이러스이다. 감염 시, 레트로바이러스 게놈은 그의 숙주 세포의 게놈 내로 통합되어 숙주 세포 DNA와 함께 복제됨으로써, 레트로바이러스 게놈 내로 혼입된 임의의 핵산 서열 및 바이러스 RNA를 지속적으로 생산한다. 따라서, 레트로바이러스를 사용할 때 치료 인자(들)의 장기 발현이 달성가능하다. 병원성 레트로바이러가 존재하기는 하지만, 유전자 요법에서 사용하기 위해 고려되는 레트로바이러스는 비교적 비-병원성이다. 병원성 레트로바이러스, 예를 들어 인간 면역결핍 바이러스 (HIV) 또는 인간 T-세포 림프영양성 바이러스 (HTLV)를 사용하는 경우에, 바이러스 게놈을 변경하여 숙주에 대한 독성을 제거하는 관리가 수행되어야 한다. 레트로바이러스 벡터는 추가적으로 바이러스 복제가 결핍되도록 조작될 수 있다. 따라서, 레트로바이러스 벡터는 생체내 안정한 유전자 전달에 특히 유용한 것으로 간주된다. 렌티바이러스 벡터, 예컨대 HIV-기반 벡터는 유전자 전달에 사용되는 레트로바이러스 벡터의 예시이다. 다른 레트로바이러스와 달리, HIV-기반 벡터는 그의 패신저 유전자를 비-분열 세포 내로 혼입시키는 것으로 공지되어 있으며, 따라서 질환의 지속성 형태를 치료하는데 사용될 수 있다.
이러한 클로닝 및/또는 발현 서열에 추가의 서열이 부가되어 클로닝 및/또는 발현에서의 이들의 기능을 최적화하거나, 폴리뉴클레오티드의 단리를 돕거나, 폴리뉴클레오티드의 세포 내로의 도입을 개선시킬 수 있다. 클로닝 벡터, 발현 벡터, 어댑터 및 링커의 사용은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다 (예를 들어, [Ausubel, 상기 문헌]; 또는 [Sambrook, 상기 문헌] 참조).
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 핵산 및 벡터는 단리 및/또는 정제될 수 있다. 본 개시내용은 또한 상기 기재된 단리 또는 정제된 핵산 분자를, 임의로 벡터의 형태로 포함하는 조성물을 제공한다. 단리된 핵산 및 벡터는, 예를 들어 알칼리/SDS 처리, CsCl 결합, 칼럼 크로마토그래피, 아가로스 겔 전기영동 및 관련 기술분야에 널리 공지된 다른 기술을 포함한 관련 기술분야에 공지된 표준 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 조성물은 본원에 추가 기재된 바와 같은 다른 성분을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 핵산 분자는 적절한 숙주 세포 내로 도입되는 경우에 IRTCA 항체 또는 그의 단편을 발현시킬 수 있는 벡터 내로 삽입된다. 적절한 숙주 세포는 박테리아, 효모, 곤충 및 포유동물 세포를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 예시적인 숙주 세포는 원핵생물 (예를 들어, 이. 콜라이) 및 진핵생물 (예를 들어, COS 또는 CHO 세포)을 포함한다. 사용될 수 있는 포유동물 숙주 세포는 인간 HeLa, HEK293, H9 및 Jurkat 세포, 마우스 NIH3T3 및 C127 세포, Cos 1, Cos 7 및 CV 1, 메추라기 QC1-3 세포, 마우스 L 세포 및 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포 (예를 들어, DG44 세포)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체의 발현에 적합한 포유동물 숙주 세포는 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포 (예를 들어, DHFR-선택 마커와 함께 사용되는 DHFR-CHO 세포 포함), NSO 골수종 세포, COS 세포 또는 SP2 세포일 수 있다. 일부 실시양태에서 숙주 세포는 이. 콜라이, 피. 파스토리스, Sf9, COS, HEK293, Expi293, CHO-S, CHO-DG44, CHO-K1 및 포유동물 림프구로 이루어진 군으로부터 선택된다.
DNA 단편의 벡터 내로의 삽입에 대한 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 임의의 방법(들)은 전사/ 번역 제어 신호의 제어 하에 본 개시내용의 IRTCA 항체 또는 그의 단편을 코딩하는 발현 벡터를 구축하는데 사용될 수 있다. 이들 방법은 시험관내 재조합 DNA 및 합성 기술, 및 생체내 재조합을 포함할 수 있다 (예를 들어, [Ausubel, 상기 문헌]; 또는 [Sambrook, 상기 문헌] 참조).
항체의 생산
본 발명의 항체 및 항원-결합 단편은 관련 기술분야에 공지된 임의의 기술에 의해 제조 및/또는 정제될 수 있으며, 이는 안정한 항체 또는 항체 단편의 후속 형성을 가능하게 한다.
본 개시내용의 IRTCA 항체 및/또는 항원-결합 단편을 코딩하는 핵산은 통상적인 절차에 의해 용이하게 단리되고 서열분석될 수 있다. 예를 들어, 하이브리도마 또는 파지 주형 DNA로부터 상응하는 중쇄 및 경쇄-코딩 영역을 특이적으로 증폭시키도록 설계된 올리고뉴클레오티드 프라이머가 사용될 수 있다. 단리된 핵산은 발현 벡터 내로 삽입될 수 있고, 이어서 목적하는 모노클로날 항체는 발현 벡터를 숙주 세포에 도입함으로써 형질전환된 적합한 숙주 세포 (즉, 형질전환체)로부터 생산될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 IRTCA 항체 및/또는 항원-결합 단편을 제조하는 방법은 항체를 코딩하는 핵산을 포함하는 발현 벡터를 증폭시키는 것을 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시양태에서, 숙주 세포는, 예를 들어 효모, 고등 식물, 곤충 및 포유동물 세포를 포함한 진핵 숙주 세포이다. 재조합 생산 절차에 사용된 숙주에 따라, 본 개시내용의 항체 및 항체 단편은 글리코실화될 수 있거나 또는 비-글리코실화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 IRTCA 항체 및/또는 항원-결합 단편을 코딩하는 재조합 발현 벡터는 포유동물 숙주 세포 내로 도입되고, 항체는 항체를 발현시키기에 충분한 시간 동안 숙주 세포를 배양함으로써 제조될 수 있다. 일부 실시양태에서, 포유동물 숙주 세포는 배양 배지에서 본 개시내용의 항체 또는 항체 단편을 분비하기에 충분한 시간 동안 배양된다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 발현된 항체는 숙주 세포로부터 단리된 후 균일하게 정제될 수 있다. 본 개시내용의 항체의 단리 및/또는 정제는 단백질을 단리 및 정제하는 통상적인 방법에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어, 이론에 얽매이는 것을 원하지는 않지만, 본 개시내용의 IRTCA 항체 및/또는 항원-결합 단편은 단백질 A 정제, 단백질 G 정제, 황산암모늄 또는 에탄올 침전, 산 추출, 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 포스포셀룰로스 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 히드록실아파타이트 크로마토그래피 및 렉틴 크로마토그래피를 포함하나 이에 제한되지는 않는 널리 공지된 방법에 의해 재조합 세포 배양물로부터 회수 및 정제될 수 있다. 고성능 액체 크로마토그래피 ("HPLC")가 또한 정제를 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Colligan, Current Protocols in Immunology, or Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, N.Y., (1997-2001)], 예를 들어 챕터 1, 4, 6, 8, 9 및 10 (각각은 전문이 본원에 참조로 포함됨)을 참조한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항체는 추가적으로 여과, 초여과, 염석, 투석 등을 조합함으로써 단리/또는 정제될 수 있다.
본 개시내용의 정제된 IRTCA 항체 및/또는 항원-결합 단편은, 예를 들어 ELISA, ELISPOT, 유동 세포측정법, 면역세포학, 비아코어(BIACORE)™ 분석, 사피다인 키넥사(KINEXA)™ 동역학적 배제 검정, SDS-페이지 및 웨스턴 블롯, 또는 HPLC 분석, 뿐만 아니라 본원에 개시된 다수의 다른 기능적 검정에 의해 특징화될 수 있다.
치료 용도
본 개시내용은 조작된 항체 및 항원-결합 단편이 특정 질환, 예컨대, 예를 들어 암의 진단, 예방 및/또는 치료에 유용할 수 있다는 인식을 포괄한다. 본원에 제공된 임의의 IRTCA 항체 또는 항원-결합 단편은 치료 방법에 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 개시내용의 IRTCA 항체 또는 항원-결합 단편은, 예를 들어 악성 질환 (예를 들어, 암)의 치료에서 면역요법제로서 사용될 수 있다.
본 개시내용은 대상체에게 본 개시내용의 IRTCA 항체 또는 항원-결합 단편을 투여하는 것을 포함하는, 악성 질환을 치료 및/또는 예방하는 방법을 제공한다. 세포, 조직, 기관, 동물 또는 환자에서 적어도 1종의 악성 질환을 조정 또는 치료하는 방법은 암을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
본 개시내용과 관련된 암 치료는 TH1-유사 세포 및 연관 시토카인 (예를 들어, IFN-γ)을 증가시키는 것을 통해 매개될 수 있다. IFN-γ를 분비하는 TH1 세포는 세포내 병원체에 대한 면역 반응을 매개하고 종양-관련 암을 예방하는 것으로 공지되어 있다. 종양에서 TH1 세포에 의해 유발된 염증은 암을 자극하는 것이 아니라 오히려 암을 예방하는 것으로 공지되어 있다 (Haabeth OA et al., Nat Commun, 2:240, 2011). 종양에서, Treg 세포는 국부 종양 성장을 촉진한다. 따라서, 종양에서 조절 T 세포를 하향-조절하는 것이 암 치료를 위한 중요한 부분인 것으로 간주된다 (Liu Z et al., J Immunol, 182(10): 6160-7, 2009). 따라서, Treg 세포의 TH1 세포로의 전환은 암의 예방 또는 치료에 매우 유용할 수 있다.
Treg 세포의 TH1 세포로의 전환은 TH1 분화와 관련된 신호전달 경로 및 전사 인자에 관련된다. 특히, Foxp3 전사 인자는 Treg 세포의 특이적 세포내 마커이고, Treg 세포가 TH1 세포로 분화되는 경우에, Foxp3의 세포내 수준은 하향조절된다.
구체적으로, 인간 AITR에 대한 본 개시내용의 IRTCA 항체 또는 항원-결합 단편의 결합이 조절 T 세포 (nTreg 세포), 유도성 조절 T 세포 (iTreg 세포) 또는 이펙터 T 세포 (Teff 세포)의 TH1-유사 (IFN-γ-양성) 세포로의 전환을 증가시키는 것으로 입증되었다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 IRTCA 항체 또는 항원-결합 단편을 사용한 치유적 치료는 암 세포의 성장을 감소시키고/거나 억제할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 본 개시내용의 IRTCA 항체 또는 항원-결합 단편을 투여함으로써 생체내 또는 시험관내에서 시토카인 분비를 조절하는 것을 포함하는, 종양 성장을 지연시키거나 억제하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 본 개시내용의 IRTCA 항체 또는 항원-결합 단편을 투여함으로써 생체내 또는 시험관내에서 시토카인 분비를 조절하는 것을 포함하는, 종양 부담을 감소시키는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 (i) 대상체에게 본 개시내용의 IRTCA 항체 또는 항원-결합 단편을 투여하는 단계, (ii) 이어서, 대상체로부터 생물학적 샘플을 분리하는 단계, (iii) 샘플로부터 INF-γ 또는 TGF-β의 분비 양을 측정하고 비율 비를 추정하는 단계, 및 (iv) IRTCA 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 투여되거나 또는 투여되지 않은 대조군 샘플을 비교함으로써 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 치료 유효량을 결정하는 단계를 포함하는, 치료될 암 또는 종양의 생물학적 대상체를 모니터링함으로써 암 또는 종양을 치료하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 치료를 필요로 하는 대상체에게 본 개시내용의 IRTCA 항체 또는 항원-결합 단편 및/또는 그의 핵산을 포함하거나 이를 전달하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 상기 대상체를 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 대상체는 암을 갖거나 암 발병 위험이 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 암 또는 종양을 갖는 환자에게 치료 유효량의 IRTCA 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 투여하는 것을 포함하는, 환자의 암 또는 종양을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 면역 반응의 유도를 필요로 하는 대상체에게 본 개시내용의 IRTCA 항체 또는 항원-결합 단편 및/또는 그의 핵산을 포함하거나 이를 전달하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 상기 대상체에서 면역 반응을 유도하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 대상체는 암을 갖거나 암 발병 위험이 있다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 면역 반응의 증진 또는 면역 세포의 활성의 증가를 필요로 하는 대상체에게 본 개시내용의 IRTCA 항체 또는 항원-결합 단편 및/또는 그의 핵산을 포함하거나 이를 전달하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 상기 대상체에서 면역 반응을 증진시키거나 또는 면역 세포의 활성을 증가시키는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 대상체는 암을 갖거나 암 발병 위험이 있다.
본 개시내용의 방법을 사용한 치료에 적합한 암은 방광암, 유방암, 자궁경부암, 결장암, 자궁내막암, 식도암, 난관암, 담낭암, 위장암, 두경부암, 혈액암, 후두암, 간암, 폐암, 림프종, 흑색종, 중피종, 난소암, 원발성 복막암, 타액선암, 육종, 위암, 갑상선암, 췌장암, 신세포 암종, 교모세포종 및 전립선암을 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 IRTCA 항체 또는 항원-결합 단편을 사용한 치료를 위한 암은 암종, 림프종 (예를 들어, 호지킨 및 비-호지킨 림프종), 모세포종, 육종 및 백혈병을 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 암은 편평 세포 암종, 소세포 폐암, 비소세포 폐암, 폐 선암종, 폐의 편평 세포 암종, 복막암, 간세포성 암종, 위암, 췌장암, 신경교종, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간세포성 암종, 유방암, 결장암, 결장직장암, 자궁내막 또는 자궁 암종, 타액선 암종, 신장암, 전립선암, 외음부암, 갑상선암, 간 암종, 백혈병 및 다른 림프증식성 장애, 및 다양한 유형의 두경부암을 포함할 수 있다.
본 개시내용의 IRTCA 항체 또는 항원-결합 단편을 포함하는 조성물은 암 세포 또는 그의 전이를 치료하거나 또는 암의 성장을 억제하기 위해 제약 유효량으로 투여될 수 있다. 치료 방법에 사용하기 위해, 본 개시내용의 IRTCA 항체 또는 항원-결합 단편은 양호한 의료 행위와 일치하는 방식으로 제제화, 투약 및 투여될 것이다. 이와 관련하여 고려할 인자는 치료될 특정한 장애, 치료될 특정한 포유동물, 개별 환자의 임상 상태, 환자의 연령, 환자의 체중, 장애의 원인, 작용제의 전달 부위, 투여 방법, 투여 스케줄링, 및 의료 진료의에게 공지된 다른 인자를 포함한다.
본 개시내용은 참조 항체에 비해 우수한 특성을 가질 수 있는 고친화도 IRTCA 항체를 제공한다. 본 개시내용은 이들 항체가 T 세포 전환 및/또는 시토카인, 예컨대 IFN-γ의 분비를 유도하는 개선된 능력을 가질 수 있다는 인식을 포괄한다. 따라서, 본 개시내용은 본 개시내용의 IRTCA 항체 또는 항원 결합 단편이 참조 항체보다 더 낮은 용량으로 투여될 수 있다는 인식을 포괄한다.
일부 실시양태에서 본 개시내용의 IRTCA 항체 또는 항원-결합 단편을 포함하는 조성물은 필요한 경우에 볼루스로서 또는 연속 주사에 의해 환자에게 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 볼루스 투여는 본 개시내용의 IRTCA Fab의 투여이고, 0.0025 내지 100 mg/kg, 0.025 내지 0.25 mg/kg, 0.010 내지 0.10 mg/kg 또는 0.10 내지 0.50 mg/kg의 용량으로 투여될 수 있다. 연속 주사의 경우에, Fab 단편으로 제공된 본 발명의 항체는 1 내지 24시간, 1 내지 12시간, 2 내지 12시간, 6 내지 12시간, 2 내지 8시간 또는 1 내지 2시간 동안 0.001 내지 100 mg/kg/분, 0.0125 내지 1.25 mg/kg/분, 0.010 내지 0.75 mg/kg/분, 0.010 내지 1.0 mg/kg/분 또는 0.10 내지 0.50 mg/kg/분의 용량으로 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항체는 전장 항체 (완전한 불변 도메인을 갖는 것)이거나 이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 전장 항체는 대략 0.01 내지 10 mg/kg, 1 내지 8 mg/kg 또는 2 내지 6 mg/kg의 용량으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 전장 항체는 30 내지 35분 동안 주사에 의해 투여된다. 투여 빈도는 상태의 중증도에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, 빈도는 2 내지 7일마다 1회, 1주에 1회, 또는 1, 2, 3 또는 4주마다 1회일 수 있다.
일부 실시양태에서, 조성물은 피하 주사에 의해 환자에게 투여될 수 있다. 구체적으로, 항체는 2 내지 7일마다 1회, 매주, 2주마다 1회 또는 매달 피하 주사에 의해 0.1 내지 100 mg의 용량으로 환자에게 투여될 수 있다.
본 개시내용의 IRTCA 항체 또는 항원-결합 단편을 포함하는 조성물은 이온화 방사선, 화학요법제, 항체 작용제 및 세포-기반 요법으로부터 선택된 1종 이상의 추가의 항암 요법이 투여되었거나 투여될 대상체에게 투여될 수 있어서, 대상체가 둘 다를 사용한 치료를 받는다. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 추가의 항암 요법은 면역 체크포인트 억제제, IL-12, GM-CSF, 항-CD4 작용제, 시스플라틴, 플루오로우라실, 독소루비신, 이리노테칸, 파클리탁셀, 인돌아민 2,3-디옥시게나제-1 (IDO1) 억제제 또는 시클로포스파미드를 포함한다.
본 발명의 다양한 실시양태는 또한 1종 이상의 제공된 IRTCA 항체 및/또는 그의 항원 결합 단편, 핵산 분자, 재조합 벡터 및/또는 숙주 세포에 대한 유리한 투여 요법을 결정하는데 유용할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 본 발명은 (a) 치유적 치료를 위한 IRTCA 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 용량의 결정을 필요로 하는 대상체로부터의 생물학적 샘플 중 분비된 IFN-γ의 측정치를 제공 또는 수득하며, 여기서 대상체는 소정량의 제공된 IRTCA 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하거나 이를 전달하는 조성물이 투여된 것인 단계, 및 (b) 분비된 IFN-γ의 측정치를 참조 값과 비교하는 단계를 포함하며, 여기서 분비된 IFN-γ의 측정치가 참조 값보다 더 높거나 더 낮은 경우에, 투여될 IRTCA 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 양을 조정하여, 이에 의해 대상체의 치유적 치료를 위한 용량을 결정하는 것인, 상기 대상체의 치유적 치료를 위한 IRTCA 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 용량을 결정하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 참조 값은 제공된 IRTCA 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 투여 전 대상체로부터의 생물학적 샘플 중 IFN-γ의 수준일 수 있다. 일부 실시양태에서, 대상체로부터의 생물학적 샘플 중 분비된 IFN-γ의 측정된 양이 참조 값보다 더 높으면, 치료는 이전에 주어진 것과 실질적으로 동일한 수준으로 유지된다. 일부 실시양태에서, 대상체로부터의 생물학적 샘플 중 분비된 IFN-γ의 측정된 양이 참조 값보다 더 높으면, 다음 치료는 이전 치료보다 더 낮은 용량으로 주어진다. 일부 실시양태에서, 대상체로부터의 생물학적 샘플 중 분비된 IFN-γ의 측정된 양이 참조 값보다 더 높으면, 치료는 소정 기간 동안 중지된다. 일부 실시양태에서, 대상체로부터의 생물학적 샘플 중 분비된 IFN-γ의 측정된 양이 참조 값과 실질적으로 동일하거나 더 낮으면, 다음 치료는 이전 치료보다 더 높은 용량으로 주어진다.
추가의 예로서, 일부 실시양태에서, 본 발명은 (a) 치유적 치료를 위한 IRTCA 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 용량의 결정을 필요로 하는 대상체로부터의 생물학적 샘플 중 Treg 세포 집단의 측정치를 제공 또는 수득하며, 여기서 대상체는 소정량의 제공된 IRTCA 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하거나 이를 전달하는 조성물이 투여된 것인 단계; 및 (b) Treg 세포 집단의 측정치를 참조 값과 비교하는 단계를 포함하며, 여기서 Treg 세포 집단의 측정치가 참조 값보다 더 높거나 더 낮은 경우에, 투여될 IRTCA 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 양을 조정하여, 이에 의해 대상체의 치유적 치료를 위한 용량을 결정하는 것인, 상기 대상체의 치유적 치료를 위한 IRTCA 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 용량을 결정하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 참조 값은 제공된 IRTCA 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 투여 전 대상체로부터의 생물학적 샘플 중 Treg 세포 집단의 수준일 수 있다. 일부 실시양태에서, 대상체로부터의 생물학적 샘플 중 Treg 세포 집단의 측정된 양이 참조 값보다 더 낮으면, 치료는 이전에 주어진 것과 실질적으로 동일한 수준으로 유지된다. 일부 실시양태에서, 대상체로부터의 생물학적 샘플 중 Treg 세포 집단의 측정된 양이 참조 값보다 더 낮으면, 다음 치료는 이전 치료보다 더 낮은 용량으로 주어진다. 일부 실시양태에서, 대상체로부터의 생물학적 샘플 중 Treg 세포 집단의 측정된 양이 참조 값보다 더 낮으면, 치료는 소정 기간 동안 중지된다. 일부 실시양태에서, 대상체로부터의 생물학적 샘플 중 Treg 세포 집단의 측정된 양이 참조 값과 실질적으로 동일하거나 더 높으면, 다음 치료는 이전 치료보다 더 높은 용량으로 주어진다.
추가의 예로서, 일부 실시양태에서, 본 발명은 (a) 치유적 치료를 위한 IRTCA 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 용량의 결정을 필요로 하는 대상체로부터의 생물학적 샘플 중 IFN-γ-분비 T 세포 집단의 측정치를 제공 또는 수득하며, 여기서 대상체는 소정량의 제공된 IRTCA 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하거나 이를 전달하는 조성물이 투여된 것인 단계; (b) 상기 대상체로부터의 생물학적 샘플 중 Treg 세포 집단의 측정치를 제공 또는 수득하며, 여기서 대상체는 소정량의 제공된 IRTCA 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하거나 이를 전달하는 조성물이 투여된 것인 단계; (c) IFN-γ-분비 T 세포 집단의 측정치 대 Treg 세포 집단의 측정치의 비를 계산하는 단계; 및 (d) 비를 참조 값과 비교하는 단계를 포함하며, 여기서 비가 참조 값보다 더 높거나 더 낮은 경우에, 투여될 IRTCA 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 양을 조정하여, 이에 의해 대상체의 치유적 치료를 위한 용량을 결정하는 것인, 상기 대상체의 치유적 치료를 위한 IRTCA 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 용량을 결정하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 참조 값은 대상체로부터의 생물학적 샘플 중 IFN-γ-분비 T 세포 집단의 수준 대 제공된 IRTCA 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 투여 전 대상체로부터의 동일한 생물학적 샘플 중 Treg 세포 집단의 수준의 비일 수 있다. 일부 실시양태에서, 대상체로부터의 생물학적 샘플 중 계산된 비가 참조 값보다 더 높으면, 치료는 이전에 주어진 것과 동일한 수준으로 유지된다. 일부 실시양태에서, 대상체로부터의 생물학적 샘플 중 계산된 비가 참조 값보다 더 높으면, 다음 치료는 이전 치료보다 더 낮은 용량으로 주어진다. 일부 실시양태에서, 대상체로부터의 생물학적 샘플 중 계산된 비가 참조 값보다 더 높으면, 치료는 소정 기간 동안 중지된다. 일부 실시양태에서, 대상체로부터의 생물학적 샘플 중 계산된 비가 참조 값과 실질적으로 동일하거나 더 낮으면, 다음 치료는 이전 치료보다 더 높은 용량으로 주어진다.
조성물
일부 실시양태에서, AITR 폴리펩티드의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체 및 항원 결합 단편을 포함하는 조성물이 본원에 제공된다. 본 개시내용의 조성물 (예를 들어, IRTCA 항체 또는 항체 단편을 전달하는 조성물)은 상기 조정, 치료 또는 요법을 필요로 하는 세포, 조직, 기관, 동물 또는 환자에게 제공된 IRTCA 항체 또는 항체 단편을 전달하는데 사용하기 위한 조성물의 임의의 적합한 및 유효한 양을 포함할 수 있다. 본 개시내용의 방법 (예를 들어, 세포를 IRTCA 항체 또는 항체 단편과 접촉시키는 단계를 포함하는 방법)을 통해 생성된 전환된 세포 집단 (예를 들어, TH1-유사 세포로)을 포함하는 조성물이 또한 본원에 제공된다.
본 개시내용의 조성물은 본원에 개시된 IRTCA 항체 또는 항원-결합 단편 및/또는 본원에 개시된 방법에 의해 수득된 세포 집단을 포함하는 제약 조성물을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제약 조성물은 완충제, 희석제, 부형제 또는 그의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은, 원하는 경우에, 또한 1종 이상의 추가의 치료 활성 물질을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 IRTCA 항체, 항원-결합 단편 및/또는 세포 집단은 포유동물 (예를 들어, 인간)에 대한 투여에 적합하다. 본원에 제공된 제약 조성물의 설명이 주로 인간에 대한 윤리적 투여에 적합한 제약 조성물에 관한 것이지만, 이러한 조성물은 일반적으로 모든 종류의 동물에 대한 투여에 적합하다는 것이 통상의 기술자에 의해 이해될 것이다. 인간에 대한 투여에 적합한 제약 조성물을 다양한 동물에게 투여하기에 적합하게 만들기 위해 조성물을 변형시키는 것은 잘 이해되며, 통상의 숙련된 수의학 약리학자는, 존재하는 경우, 단지 상용 실험에 의해 이러한 변형을 설계하고/거나 수행할 수 있다.
일부 실시양태에서, 제공된 조성물은 비경구 투여를 위해 제제화될 수 있다. 예를 들어, 본원에 제공된 제약 조성물은 멸균 주사가능 형태 (예를 들어, 피하 주사 또는 정맥내 주입에 적합한 형태)로 제공될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 제약 조성물은 주사에 적합한 액체 투여 형태로 제공된다. 일부 실시양태에서, 제약 조성물은 주사 전에 수성 희석제 (예를 들어, 물, 완충제, 염 용액 등)로 재구성될 수 있는, 임의로 진공 하의 분말로서 (예를 들어, 동결건조 및/또는 멸균된 것) 제공된다. 일부 실시양태에서, 제약 조성물은 물, 염화나트륨 용액, 아세트산나트륨 용액, 벤질 알콜 용액, 포스페이트 완충 염수 등으로 희석 및/또는 재구성된다. 일부 실시양태에서, 분말은 수성 희석제와 서서히 (예를 들어, 진탕하지 않으면서) 혼합되어야 한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 IRTCA 항체, 항원-결합 단편 및/또는 세포 집단은 제약상 허용되는 비경구 비히클과 함께 제제화된다. 이러한 비히클의 예는 물, 염수, 링거액, 덱스트로스 용액 및 1-10% 인간 혈청 알부민이다. 리포솜 및 비-수성 비히클, 예컨대 고정 오일이 또한 사용될 수 있다. 비히클 또는 동결건조된 분말은 등장성을 유지하는 첨가제 (예를 들어, 염화나트륨, 만니톨) 및 화학적 안정성을 유지하는 첨가제 (예를 들어, 완충제 및 보존제)를 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 제제는 공지된 또는 적합한 기술에 의해 멸균된다.
본원에 기재된 제약 조성물의 제제는 약리학 기술분야에 공지되어 있거나 또는 이후에 개발된 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 일반적으로, 이러한 제조 방법은 활성 성분을 희석제 또는 또 다른 부형제 및/또는 1종 이상의 다른 보조 성분과 회합하고, 이어서 필요하고/거나 바람직한 경우, 제품을 목적하는 단일- 또는 다중-용량 단위로 성형 및/또는 포장하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 IRTCA 항체, 항원-결합 단편 및/또는 세포 집단을 포함하는 제약 조성물은 저장 또는 투여를 위한 용기, 예를 들어 바이알, 시린지 (예를 들어, IV 시린지) 또는 백 (예를 들어, IV 백)에 포함될 수 있다. 본 개시내용에 따른 제약 조성물은 벌크, 단일 단위 용량, 및/또는 복수의 단일 단위 용량으로 제조, 포장 및/또는 판매될 수 있다. 본원에 사용된 "단위 용량"은 미리 결정된 양의 활성 성분을 포함하는 제약 조성물의 개별 양이다. 활성 성분의 양은 일반적으로 대상체에게 투여될 활성 성분의 투여량 및/또는 이러한 투여량의 편리한 분율, 예컨대, 예를 들어 이러한 투여량의 1/2 또는 1/3과 동등하다.
본 개시내용에 따른 제약 조성물 중 활성 성분, 제약상 허용되는 부형제, 및/또는 임의의 추가의 성분의 상대량은 치료되는 대상체의 정체, 크기 및/또는 상태에 따라 및 추가로 조성물이 투여되는 경로에 따라 달라질 것이다. 하기 실시예는, 부분적으로, 설치류 및 원숭이에 대한 예시적인 IRTCA 항체의 투여를 기재한다. 표준 방법은 동물 시스템에서 투여를 규모조정하는 방법의 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [J Basic Clin Pharm. March 2016-May 2016; 7(2): 27-31]을 참조하며, 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 예로서, 조성물은 0.1% 내지 100% (w/w) 활성 성분을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 조성물은 본 개시내용의 IRTCA 항체 또는 항원-결합 단편을 0.01 mg/kg 내지 100 mg/kg의 용량으로 포함하거나 이를 전달한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 하한치 및 상한치에 의해 한정되는 범위 (상한치는 하한치보다 더 큼) 내 양의 용량으로 IRTCA 항체 또는 항원-결합 단편을 포함하거나 이를 전달한다. 일부 실시양태에서, 하한치는 약 0.01 mg/kg, 0.025 mg/kg, 0.05 mg/kg, 0.075 mg/kg, 0.1 mg/kg, 0.25 mg/kg, 0.5 mg/kg, 0.75 mg/kg, 1 mg/kg, 2 mg/kg, 3 mg/kg, 4 mg/kg, 5 mg/kg, 8 mg/kg, 10 mg/kg, 20 mg/kg, 25 mg/kg, 30 mg/kg, 40 mg/kg, 50 mg/kg, 50 mg/kg, 70 mg/kg, 80 mg/kg, 또는 90 mg/kg일 수 있다. 일부 실시양태에서, 상한치는 약 0.025 mg/kg, 0.05 mg/kg, 0.075 mg/kg, 0.1 mg/kg, 0.25 mg/kg, 0.5 mg/kg, 0.75 mg/kg, 1 mg/kg, 2 mg/kg, 3 mg/kg, 4 mg/kg, 5 mg/kg, 8 mg/kg, 10 mg/kg, 20 mg/kg, 25 mg/kg, 30 mg/kg, 40 mg/kg, 50 mg/kg, 50 mg/kg, 70 mg/kg, 80 mg/kg, 90 mg/kg, 또는 100 mg/kg일 수 있다.
제약 조성물은 제약상 허용되는 부형제를 추가로 포함할 수 있으며, 이는 본원에 사용된 바와 같이 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 희석제, 또는 다른 액체 비히클, 분산 또는 현탁 보조제, 표면 활성제, 등장화제, 증점제 또는 유화제, 보존제, 고체 결합제, 윤활제 등을, 원하는 특정한 투여 형태에 적합한 바에 따라 포함한다. 문헌 [Remington's The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, A. R. Gennaro (Lippincott, Williams & Wilkins, Baltimore, MD, 2006)]은 제약 조성물 제제화에 사용된 다양한 부형제 및 그의 제조를 위한 공지된 기술을 개시한다. 임의의 통상적인 부형제 매질이, 예컨대 임의의 바람직하지 않은 생물학적 효과를 생성하거나 또는 달리 제약 조성물의 임의의 다른 성분(들)과 유해한 방식으로 상호작용함으로써 물질 또는 그의 유도체와 비상용성인 경우를 제외하고, 그의 사용은 본 개시내용의 범주 내에 있는 것으로 고려된다.
일부 실시양태에서, 제약상 허용되는 부형제는 적어도 95% 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 순수하다. 일부 실시양태에서, 부형제는 인간에서의 사용 및 수의학적 사용에 대해 승인된 것이다. 일부 실시양태에서, 부형제는 미국 식품 의약품국에 의해 승인된 것이다. 일부 실시양태에서, 부형제는 제약 등급이다. 일부 실시양태에서, 부형제는 미국 약전 (USP), 유럽 약전 (EP), 영국 약전, 및/또는 국제 약전의 표준을 충족한다.
제약 조성물의 제조에 사용된 제약상 허용되는 부형제는 불활성 희석제, 분산제 및/또는 과립화제, 표면 활성제 및/또는 유화제, 붕해제, 결합제, 보존제, 완충제, 윤활제 및/또는 오일을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 이러한 부형제는 제약 제제에 임의로 포함될 수 있다. 부형제, 예컨대 코코아 버터 및 좌제 왁스, 착색제, 코팅제, 감미제, 향미제 및/또는 퍼퓸제는 제제화자의 판단에 따라 조성물에 존재할 수 있다.
일부 실시양태에서, 제공된 제약 조성물은 1종 이상의 제약상 허용되는 부형제 (예를 들어, 보존제, 불활성 희석제, 분산제, 표면 활성제 및/또는 유화제, 완충제 등)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제약 조성물은 1종 이상의 보존제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제약 조성물은 보존제를 포함하지 않는다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 IRTCA 항체 또는 항원-결합 단편을 포함하는 조성물은 안정하게 제제화된다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 IRTCA 항체 또는 항원-결합 단편의 안정한 제제는 염수 또는 선택된 염을 갖는 포스페이트 완충제, 뿐만 아니라 보존된 용액 및 보존제를 함유하는 제제, 뿐만 아니라 제약 또는 수의학적 용도에 적합한 다중-사용의 보존된 제제를 포함할 수 있다. 보존된 제제는 수성 희석제 중 적어도 1종의 공지된 보존제, 또는 적어도 1종의 페놀, m-크레졸, p-크레졸, o-크레졸, 클로로크레졸, 벤질 알콜, 아질산페닐제2수은, 페녹시에탄올, 포름알데히드, 클로로부탄올, 염화마그네슘 (예를 들어, 6수화물), 알킬파라벤 (메틸, 에틸, 프로필, 부틸 등), 벤즈알코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드, 소듐 데히드로아세테이트 및 티메로살 또는 그의 혼합물로 이루어진 군으로부터 임의로 선택된 것을 함유한다. 임의의 적합한 농축물 또는 혼합물은, 예컨대 0.001-5%, 또는 그 안의 임의의 범위 또는 값, 예컨대, 비제한적으로, 0.001, 0.003, 0.005, 0.009, 0.01, 0.02, 0.03, 0.05, 0.09, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3.0, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4.0, 4.3, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 또는 그 안의 임의의 범위 또는 값으로 관련 기술분야에 공지된 바와 같이 사용될 수 있다. 비제한적인 예는, 보존제 부재, 0.1-2% m-크레졸 (예를 들어, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.9, 1.0%), 0.1-3% 벤질 알콜 (예를 들어, 0.5, 0.9, 1.1, 1.5, 1.9, 2.0, 2.5%), 0.001-0.5% 티메로살 (예를 들어, 0.005, 0.01), 0.001-2.0% 페놀 (예를 들어, 0.05, 0.25, 0.28, 0.5, 0.9, 1.0%), 0.0005-1.0% 알킬파라벤(들) (예를 들어, 0.00075, 0.0009, 0.001, 0.002, 0.005, 0.0075, 0.009, 0.01, 0.02, 0.05, 0.075, 0.09, 0.1, 0.2, 0.3, 0.5, 0.75, 0.9, 1.0%) 등을 포함한다.
일부 실시양태에서, 제약 조성물은 냉장 및/또는 동결될 수 있는 형태로 제공된다. 일부 실시양태에서, 제약 조성물은 냉장 및/또는 동결될 수 없는 형태로 제공된다. 일부 실시양태에서, 재구성된 용액 및/또는 액체 투여 형태는 재구성 후 특정 기간 동안 (예를 들어, 2시간, 12시간, 24시간, 2일, 5일, 7일, 10일, 2주, 1개월, 2개월 또는 그 초과) 저장될 수 있다. 일부 실시양태에서, 명시된 시간보다 더 긴 기간 동안의 항체 조성물의 저장은 항체 분해를 유발한다.
액체 투여 형태 및/또는 재구성된 용액은 투여 전에 미립자 물질 및/또는 변색을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 변색 또는 흐린 경우 및/또는 여과 후에 미립자 물질이 남아있는 경우에는 용액이 사용되지 않아야 한다.
제약 작용제의 제제화 및/또는 제조에서의 일반적 고려사항은, 예를 들어 문헌 [Remington: The Science and Practice of Pharmacy 21st ed., Lippincott Williams & Wilkins, 2005]에서 찾아볼 수 있다.
키트
본 개시내용은 본원에 기재된 바와 같은 적어도 1종의 IRTCA 항체 또는 항체 단편이 채워진 1종 이상의 용기를 포함하는 제약 팩 및/또는 키트를 추가로 제공한다. 키트는, 예를 들어 치료 방법, 진단 방법, 세포 증식 및/또는 단리 방법 등을 포함한 임의의 적용가능한 방법에서 사용될 수 있다. 임의로, 이러한 용기(들)에는 제약 또는 생물학적 제품의 제조, 사용 또는 판매를 규제하는 정부 기관에 의해 지정된 형태의 통지서가 부착될 수 있으며, 이러한 통지서는 (a) 인간 투여를 위한 제조, 사용 또는 판매에 대한 기관의 승인, (b) 사용 지침서, 또는 둘 다를 반영하고 있다.
일부 실시양태에서, 키트는 검출 (예를 들어, IRTCA 항체 또는 항체 단편의 검출)을 위한 1종 이상의 시약을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 키트는 검출가능한 형태 (예를 들어, 검출가능한 모이어티 또는 개체와 공유 회합됨)의 IRTCA 항체 또는 항체 단편을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 바와 같은 IRTCA 항체 또는 항체 단편은 대상체의 치료에 사용되는 키트에 포함될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 바와 같은 IRTCA 항체 또는 항체 단편은 T 세포의 전환 (예를 들어, 조절 T 세포가 TH1-유사 (IFN-γ-양성) 세포로 전환됨)에 사용되는 키트에 포함될 수 있다.
본 출원 전반에 걸쳐 인용된 모든 인용 참고문헌 (문헌 참고문헌, 허여된 특허, 공개 특허 출원 및 동시-계류 특허 출원 포함)의 내용은 본원에 명백히 참조로 포함된다.
본 발명의 다른 특색은 하기 예시적인 실시양태의 설명 과정에서 분명해질 것이다. 그러나, 하기 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위해 제공된 것이며, 본 발명의 범주는 하기 실시예로 제한되지 않는다.
실시예
본 개시내용은, 적어도 부분적으로, hAITR에 대한 고친화도를 갖는 신규 IRTCA 항체 및 그의 단편을 제공하며, 여기서 T 세포 상에 hAITR을 발현하는 T 세포에 대한 예시적인 IRTCA 항체의 결합은 면역 증진 및/또는 항암 활성을 유도할 수 있다. 신규 IRTCA 항체 및 그의 단편의 생성 및 특징화는 하기 실시예에서 추가로 상세하게 기재된다.
실시예 1: IRTCA-A를 포함한 항-AITR 항체의 클로닝
본 실시예는 예시적인 IRTCA 항체의 생산을 기재한다. 모노클로날 항체 (mAb)인 IRTCA-A를 주형으로서 사용하였고, 각각의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 유전자 및 인간 불변 영역 유전자를 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)을 사용하여 증폭시킨 후에, Sfi-1 제한 효소를 사용한 처리, 라이게이션, 발현 벡터 내로의 삽입을 수행하였다. 변형을 위해 박테리아 주변세포질 영역으로의 전달을 매개하는 pelB 리더 서열을 중쇄 유전자의 상류에 삽입하고 분비를 유도하는 신호 펩티드를 경쇄 유전자의 상류에 삽입하여 이. 콜라이에서의 발현이 주변세포질 영역으로 국재화될 수 있도록 하였다. IRTCA 가변 영역의 특이적 서열을 경쇄에 대해 인간 카파 쇄에 연결하고 중쇄에 대해 인간 불변 영역과 연결하여 클로닝을 수행함으로써 천연 Fab와의 구조적 동일성이 유지될 수 있도록 하였다 (도 1, 패널 a 참조). 본 발명에 사용된 AITR (hGITR) 유래된 에피토프의 아미노산 서열은 'HCGDPCCTTC' (서열식별번호: 19)이다. 이것은 AITR (hGITR) 내 세포외 도메인의 55번째-64번째 아미노산에 상응한다.
모 IRTCA-A의 가변 영역 내 앰버 정지 코돈의 삽입
1개의 뉴클레오티드 상의 부위-지정 돌연변이유발의 기술을 사용하여 모 IRTCA-A 가변 영역의 CDR3 영역의 바로 상류에 앰버 정지 코돈을 생성하였다 (즉, IRTCA-A: TGC->TGA이다). IRTCA-A에서, 모 형태의 경쇄 내 위치 89에서의 시스테인 및 모 형태의 중쇄 내 위치 96에서의 시스테인을 정지 코돈으로 돌연변이시켜 CDR3 무작위화 라이브러리를 구축하였다. 모 서열의 선택을 방지하여 유전자 발현의 빈도를 낮추고 오염을 방지함으로써 스크리닝이 설계를 위해 효율적으로 달성될 수 있도록 하였다 (도 1, 패널 b 참조).
실시예 2: 항-AITR 항체 라이브러리의 구축 및 항-AITR 항체의 제작
정지 코돈이 삽입된 IRTCA-A의 모 염기 서열을 포함하는 Fab를 주형으로서 사용하였고, 무작위화 PCR을 수행하여 CDR3 영역 내 무작위 돌연변이를 제공하였다 (도 2).
CDR3 내 서열 변화는 항체의 항원 결정기에 유의한 변화를 유발하지 않지만 변이를 증가시키는 반면, 선택될 항체의 에피토프를 변화시키는 가능성은 또한 유도된 돌연변이를 갖는 아미노산의 수를 갖는 비율을 증가시킨다. 따라서, LCDR3-R 프라이머 및 HCDR3-F 프라이머의 돌연변이 비율을 무작위화 PCR의 설계 동안 조정하여 IRTCA-A에 의해 인식되는 원래 에피토프가 변형되지 않을 수 있도록 하고 각각의 아미노산 서열의 돌연변이 비율이 70% 이하일 수 있도록 하였다. 경쇄에 대해, 스플라이싱 PCR 기술을 사용하여 중쇄 서열을 고정하였고, omp 프라이머 및 LCDR3-R을 사용하여 증폭된 단편 1 (350 bp) 및 LFR4-R 및 dp seq.를 사용하여 증폭된 단편 2 (~1200 bp)를 주형으로서 사용하여, omp 프라이머 및 dp seq.를 사용하여 증폭된 경쇄 CDR3 영역에 무작위 돌연변이를 가진 대략 1500 bp의 단편 3을 수득하였다 (도 2, 패널 a 참조). 중쇄에 대해, 동일한 방식에 의해 수행된 증폭 후에 (도 2, 패널 b 참조), 생성된 염기 서열을 검증한 다음, 발현 벡터 내로 클로닝하여 파지 표면 상의 발현을 달성하였다. 즉, 항체 구조에 대한 영향을 최소화하기 위해, 가변 경쇄 내 CDR3 (CDR-L3) 영역의 길이 및 중쇄 내 CDR3 (CDR-H3) 영역의 길이가 유지되는 조건 하에 있었다. 돌연변이를 초래한 클론의 빈도를 측정하였으며, 이는 높게는 대략 86%인 것으로 밝혀졌다. 결론적으로, 경쇄 및 중쇄의 다양성이 1 x 108 또는 그 초과에 도달한 파지 디스플레이 라이브러리를 구축하였다 (표 1 참조).
표 1은 IRTCA-A의 Fab를 발현하는 파지 라이브러리의 변이를 제시한다. 즉, "라이브러리 다양성 = 형질전환체 수 x 정상 Fab 클로닝 비율"은 다양성을 계산하는데 사용될 수 있다.
표 1
Figure pct00001
다른 한편으로, 2가 형태의 항-AITR 항체를 생성하기 위해, 파지 디스플레이 라이브러리로부터 수득된 Fab (VH (중쇄 가변 영역) 및 VL (경쇄 가변 영역))를 CH (중쇄 가변 영역) 및 CL (경쇄 가변 영역) 유전자와 연결한 다음, 동물 세포를 위한 단백질 발현 벡터에 삽입하였다. 항-AITR 항체 유전자가 삽입된 벡터를 HEK293 및/또는 CHO 세포를 포함한 동물 세포주 내로 형질감염시켰고, 단백질 A 또는 단백질 G 칼럼을 사용하여 배양물 상청액 용액으로부터 정제를 수행하였으며, 이로써 2가 형태의 항-인간 AITR 모노클로날 항체가 제조되었다 (데이터는 제시되지 않음).
실시예 3: 개선된 친화도를 갖는 항-AITR 항체의 선택
제작된 Fab (단편 항원-결합) 라이브러리를 고정된 GST-AITR 항원을 사용한 선택 과정에 적용하고 4회 반복하였다. IRTCA-A에 대해, 반복 패닝을 수행한 후, 강한 양성 신호를 갖는 17개의 중쇄 클론 및 33개의 경쇄 클론을 획득하였다. 친화도의 증가가 Koff 값을 감소시키기 때문에, 총 50개의 클론으로부터 47개의 Fab를 선택하고 이를 정제하여 SPR (표면 플라즈몬 공명)에 기반하여 Koff를 측정하였다 (도 3 및 도 4 참조). 감소된 값을 갖는 5개 (4개 중쇄, 1개 경쇄) Fab에 대해, 그의 KD 값을 SPR (표면 플라즈몬 공명)로 측정하였다 (표 2 참조).
표 3에 나타낸 바와 같이, 모든 선택된 최종 IRTCA-A Fab가 증가된 친화도를 갖는다는 것 및 증가율이 8-44배로 달라졌다는 것이 후속적으로 밝혀졌다.
표 2는 AITR 항원에 대한 5종의 선택된 IRTCA-A Fab 종에 대한 Koff 및 KD 측정 값을 열거한다.
표 2
Figure pct00002
표 3은 AITR 항원에 대한 5종의 IRTCA-A Fab 종의 결합 친화도 측정치 및 배수 비를 열거한다 (KD = Koff/Kon, KD 비 = 돌연변이체 KD/IRTCA-A KD)
표 3
Figure pct00003
표 4는 표 2 내지 표 3 내 클론 항체에 대한 중쇄 가변 영역, 경쇄 가변 영역, 중쇄 CDR 및 경쇄 CDR의 아미노산 서열과 연관된 서열식별번호를 열거한다.
표 5는 표 2 내지 표 3 내 클론 항체에 대한 중쇄 가변 영역, 경쇄 가변 영역, 중쇄 CDR 및 경쇄 CDR의 아미노산 서열을 열거한다.
표 4
Figure pct00004
표 5
Figure pct00005
표 6
Figure pct00006
실시예 4: 바이오마커로서의 IFN-γ 및 TGF-β의 사용
TH1 세포는 다양한 TH (헬퍼 T) 세포 유형 중에서 가장 효율적인 항암 능력을 갖는 것으로 평가되고, Treg 세포 및 TH2 세포는 종양 주위에 면역억제 환경을 생성함으로써 종양 형성을 촉진하는 것으로 공지되어 있다. Treg 세포는 억제자 T 세포인 것으로 공지되어 있을 뿐만 아니라 자가 항원에 대한 내성을 담당하여 자가면역 질환 및 과도한 면역 반응을 억제하는 것으로 공지되어 있다 (Sakaguchi et al., Cell, 133:775-787, 2008). 따라서, Treg 세포는 이러한 이유로 자가면역 질환을 치료하는데 유용할 수 있다. 반대로, 그것은 종양 세포에 대한 면역계의 활성을 약화시켜 환자의 항암 능력을 감소시키도록 한다. 그럼에도 불구하고, FoxP3의 발현이 불안정한 Treg 세포 내 일부 하위군은 이펙터-기억 표현형으로 전환될 수 있다 (Zhou et al., Nature immunology, 10:1000-1007, 2009). 추가로, Treg 세포 결여 VHL (폰 히펠-린다우)의 특성은 고정되어 있는 것이 아니라 특정 면역 환경에서 변화를 겪을 수 있으며, 예를 들어 그것은 IFN-γ를 생산하는 Teff 세포 (이펙터 T 세포)로 전환될 수 있다 (Lee et al., Immunity, 42:1062-1074, 2015). 따라서, Treg 세포에 기초한 면역조절은 효과적인 종양 억제의 수단을 나타내고, Treg 세포를 제거하거나 Teff 세포로 전환시키는 기술은 면역 세포를 사용한 항암 치료의 궁극적인 목표이다.
IFN-γ는 T-림프구 및 자연 킬러 세포 (NK 세포)로부터 분비되는 대표적인 시토카인이고, 증식 및 항바이러스 활성을 나타낸다. 그것은 또한 대식세포의 중요한 활성화제이고, 다른 세포 유형으로부터 TH1 세포를 분화시키는 특히 주요한 시토카인이다. 이러한 TH1 세포는 IFN-γ를 분비하여 그 자체로 분열을 자극하고, 미분화 CD4+ 세포 (TH0)를 TH1 세포로 분화시키는 능력을 갖는다. 분화된 TH1 세포는 세포독성 T 세포, 식세포 및 B 세포를 활성화시키는데 주요 역할을 한다. 다른 한편으로, TGF-β는 Foxp3+ Treg 세포의 면역조절을 위한 매우 중요한 인자인 것으로 공지되어 있고 (Maria et al., Immunity, 30:626-635, 2009), 특히, CD4+ T 세포에서 면역억제 능력을 갖는 Treg 세포 및 TH17 세포로의 분화를 촉진한다 (Basso et al., Cell Res., 4:399-411, 2009). 결국, 항암 약물의 효율은 TGF-β를 분비하는 Treg 세포의 감소 및 IFN-γ를 유도하는 TH1의 증가가 상대적으로 평가되어야만 한 후에 결정될 수 있다. 이러한 이유로 특정 자극에 대한 IFN-γ 및 TGF-β의 분비의 측정치는 T 세포 기능의 변화의 정량적 척도로서 이용될 수 있는 최적 표준일 수 있다.
따라서 바이오마커로서의 역할을 하는 IFN-γ (인터페론 감마) 및/또는 TGF-β (형질전환 성장 인자-베타)의 잠재력을 검증하고 Treg 세포에 대한 IRTCA-A의 활성을 결정하기 위해, CD4 및 CD25를 포함한 대표적인 Treg 세포 마커를 사용하여 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)로부터 CD4+CD25고FOXP3+ Treg 세포를 단리한 다음 모노클로날 항체 (mAb)에 의한 시토카인 분비를 측정하였다.
후속적으로, 도 6a 및 도 6b에 제시된 바와 같이, IRTCA-A는 Treg 세포의 AITR에 대해 작용하여 IFN-γ의 분비를 증가시키고 동시에 TGF-β의 분비를 감소시켰다. 추가적으로, IRTCA-A 처리는 CD4+ T 세포에서 IFN-γ 분비를 유도하고 TH1 세포로 분극시켰다 (도 5). 즉, IRTCA-A는 용량-의존성 방식으로 T 세포의 AITR을 효과적으로 자극하고 Treg의 TH1-유사 세포로의 전환을 촉진하였다. 이것은 IFN-γ 및 TGF-β가 AITR 신호전달 시스템을 자극하는 효과를 측정하는 기능적 도구로서 사용될 수 있다는 것을 나타냈다.
실시예 5: 친화도-성숙 IRTCA-A에 기초한 CD4+ T 세포의 활성화 및 분극
본 실시예는 시토카인 분비를 포함한, CD4+ T 세포에 대한 친화도-성숙 IRTCA-A 시리즈 항체의 효과를 기재한다.
먼저, Fab의 돌연변이가 이들이 결합할 수 있는 에피토프를 변화시켰는지 여부를 검증하기 위해, AITR의 결실 돌연변이체를 제작하였고, 모 형태와의 비교는, 예상된 바와 같이, IRTCA-A 시리즈 Fab가 AITR 에피토프에 결합하는 그의 능력을 유지하였다는 것을 나타냈다 (표 7). IRTCA-A와 비교하여 AITR과의 높은 결합 친화도를 갖는 5종의 친화도-성숙 IRTCA-A Fab 종 (표 7의 IRTCA-A1, 10, 12, 14, 15)의 기능성을 평가하기 위해, CD4+ T 세포를 TH1-유형 세포로 변화시키는 항체의 분극 효율을 측정하였다.
표 7은 IRTCA-A 시리즈의 Fab 클론으로부터 단리된 다음 정제된 Fab 형태의 명칭을 열거한다 (*: 에피토프-결합 능력이 검증된 Fab).
표 7
Figure pct00007
표 8 및 도 7a에 제시된 바와 같이, 정제된 CD4+ T 세포를 IRTCA-A의 친화도-성숙 mAb로 처리하고 배양물 상청액으로부터의 시토카인 분비의 양을 측정하였을 때, 친화도-성숙 mAb는 IFN-γ의 분비를 촉진하고, 또한 IFN-γ의 분비를 유도하였다. 이들 데이터는 IRTCA가 CD4+ T 세포에서 IFN-γ를 분비하는 TH1 세포로의 분극을 가속하는 기능을 갖는다는 것 및 동일한 시리즈의 Fab가 또한 CD4+ T 세포의 표면 상의 AITR과 상호작용한다는 것을 나타낸다. 특히, 0.5 μg IRTCA-A12, IRTCA-A14 및 IRTCA-A15의 투여는 세포가 IRTCA-A에 의해 유발된 IFN-γ 분비의 수준보다 대략 200% 이상만큼 더 큰 IFN-γ의 분비를 나타내도록 유도하였다 (도 7a 및 표 8 참조).
표 8은 IRTCA-A 시리즈 mAb의 투여 후 CD4+ T 세포에서의 IFN-γ 분비를 측정한 결과를 제시한다 (KD 비 = 돌연변이체 KD/IRTCA-A KD).
표 8
Figure pct00008
실시예 6: Treg 세포 (조절 T 세포)에 대한 항-AITR 항체의 효과
Treg 세포에 대한 IRTCA-A의 결합 친화도를 증가시킨 mAb의 영향을 결정하기 위해, CD4+CD25고FOXP3+ Treg 세포를 단리하고 IRTCA-A1, A10, A12, A14 및 A15로 처리하였다.
표 9 및 표 10에 제시된 바와 같이, IRTCA-A 항체를 사용한 처리 후, IFN-γ (TH1 분극의 마커)의 분비는 증가하였고 (도 7b) 반면에 TGF-β (Treg 세포의 대표적인 억제 시토카인)의 분비는 감소하였다 (도 7c).
상기 결과에 따르면, IRTCA-A 시리즈의 mAb는 항암 효과를 포함하는 미세환경이 생성되도록 Treg 세포의 억제 능력을 감소시키고 Teff 세포의 활성화를 증가시킬 것으로 예상된다. 추가적으로, 표 3, 표 9 및 표 10에 제시된 바와 같이, AITR에 대한 증가된 친화도는 IRTCA-A 항체의 항암 역할에 기여하는 시토카인 분비와 실질적인 상관관계를 가졌다. 보다 작은 KD 값을 가진 (표 3 참조), 즉, IRTCA-A와 비교하여 AITR과의 개선된 결합 친화도를 가진 IRTCA-A12 및 IRTCA-A15는 또한 IFN-γ의 증가된 분비를 유발하였다.
추가로, 상이한 CDR 서열을 갖는 IRTCA-A 시리즈 항체가 여전히 서로 유사하고, AITR 항원의 공통 에피토프에 결합하지만, 이들은 상이한 경향의 효과를 나타낸다는 것이 또한 주목할 만하다. 다시 말해서, 결합 친화도에 따라, IRTCA-A15는 IRTCA-A의 용량의 대략 25%로 CD4+CD25고 Treg 세포에서 동일한 항암 효과를 달성할 수 있는 것으로 예상되었다. 이것은 AITR mAb의 용량이 Treg 세포의 기능을 제어하기 위해 조절될 수 있을 뿐만 아니라 동일한 에피토프를 인식하지만 증진된 결합 친화도를 갖는 상이한 mAb 종이 상이한 강도의 신호를 보냄으로써 치료 효과를 제어하는데 사용될 수 있다는 것을 의미한다.
표 9는 IRTCA-A 시리즈 mAb의 투여 후 Treg 세포로부터 IFN-γ의 분비의 변화를 제시한다.
표 9
Figure pct00009
표 10은 IRTCA-A 시리즈 mAb의 투여 후 Treg 세포로부터 TGF-β의 분비의 변화를 제시한다.
표 10
Figure pct00010
실시예 7: NOD-SCID 마우스 내 인간 말초 혈액 단핵 세포의 생착 및 항-AITR 항체의 항종양 활성
본 실시예는 인간 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 및 인간 결장직장암 세포의 투여 후 NOD-SCID 마우스에 대한 항-AITR 항체의 항종양 효과를 기재한다.
먼저, HLA-A24 유형을 갖는 건강한 공여자로부터 수집된 말초 정맥 혈액을 헤파린으로 처리한 후, 피콜-파크 (지이 헬스케어, 뉴저지주 피스카타웨이) 밀도 구배 원심분리 분리를 수행하여 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 수득하였다. 다음에, 회수에 사용된 3시간 이내에, RPMI에 포함된 1x107개 인간 PBMC를 각각의 NOD-SCID 마우스 내로 복막으로 도입하였다. 상기 21마리의 이식된 마우스를 인간 PBMC (HLA-A24 유형)의 주사 5주 후에 분석하였다.
7-주령 NOD-SCID 마우스 (잭슨 래보러토리, 메인주 바하버)를 SPF (특이적 병원체 부재) 환경인 동물 방에서 사육하였다. 모든 동물 실험을 실험 동물 윤리 가이드라인에 따라 수행하였다.
항-AITR 모노클로날 항체 (IRTCA)의 항암 효과를 평가하기 위해, HT29의 인간 결장직장암 세포 (HLA-A24 유형, 1 x 107개 세포/마우스)를 Hu-PBL-SCID 마우스의 배측 상에 피하로 주사하고, 종양 크기가 ~2cm의 직경에 도달하였을 때, 항-AITR 모노클로날 항체 (IRTCA)를 총 3회 투여에 대해 5일마다 1 kg 체중 당 0.3mg, 0.6mg, 1.0mg, 3.0mg, 5.0mg 및 10.0mg의 용량으로 복강내로 투여하였다. 인간 IgG를 대조군으로서 사용하였다. 마우스 종양 부피 (mm3)를 군 및 날짜에 따라 측정하였다.
도 8에 제시된 바와 같이, 항-AITR 모노클로날 항체 (IRTCA)로 처리된 마우스 내 종양 크기는 항체 농도와 상관관계가 있는 방식으로 감소하였다. 특히, 3.0mg/kg의 IRTCA 농도는 종양이 제33일까지 완전히 근절되도록 하는 상기 효과를 나타냈다.
추가적으로, 도 9에 제시된 바와 같이, HT29 세포가 주사된 종양-챌린지된 마우스를 대조군 hIgG, H1F1, MK4166 (머크의 항-GITR 항체) 또는 펨브롤리주맙 (키트루다)에 의해 3.0 mg/kg의 투여량으로 1주 간격으로 i.v. 주사를 통해 처리하였을 때, 단지 H1F1만이 수주에 걸쳐 종양 크기의 감소를 유발하였다.
예시적인 항-AITR 모노클로날 항체 H1F1을 또한 (상기 기재된 바와 같이) 인간 PBMC로 인간화된 7-주령 암컷 NOD-SCID 마우스에 투여하여, 4종의 암: 삼중 음성 유방암 (MDA-MB231), 결장암 (HT-29) 및 흑색종 (MDA-MB435, SK-MEL2)에 대한 그의 항종양 효과를 시험하였다. 마우스에 마우스당 1x107개 종양 세포를 주사하고, 종양의 크기가 1000-1500 mm3의 부피에 도달하였을 때, 종양-챌린지된 마우스에 3회에 대해 3일마다 1회 H1F1 또는 hIgG를 복강내로 (i.p.) 주사하였다. 종양의 폭, 길이 및 높이를 도 10a-d에 나타낸 시점에서 캘리퍼로 측정하였다. 화살표는 H1F1 또는 대조군을 주사하였을 때의 시점을 나타낸다.
실시예 8: 시노몰구스 원숭이에서의 항-AITR 항체의 조직 교차 반응성, 독성학 & 작용 메카니즘의 분석
본 실시예는 시노몰구스 원숭이에 대한 예시적인 항-AITR 항체를 사용한 처리의 효과를 기재한다. 대략 25-35세 및 대략 2-3 kg 체중의 7마리의 시노몰구스 원숭이 (마카카 파시쿨라리스)를 이 연구에 사용하였다. 대조군은 39 mL/kg의 용량 부피를 받은 1마리의 암컷 원숭이를 포함하였다. 저용량 군은 각각 2.3 mg/kg의 농도의 22.5 mg/kg의 H1F1 투여량 및 9.75 mL/kg의 용량 부피를 받은 1마리의 수컷 원숭이 및 1마리의 암컷 원숭이를 포함하였다. 중앙 용량 군은 각각 2.3 mg/kg의 농도의 45 mg/kg의 H1F1 투여량 및 19.5 mL/kg의 용량 부피를 받은 1마리의 수컷 원숭이 및 1마리의 암컷 원숭이를 포함하였다. 고용량 군은 각각 2.3 mg/kg의 농도의 90 mg/kg의 H1F1 투여량 및 39 mL/kg의 용량 부피를 받은 1마리의 수컷 원숭이 및 1마리의 암컷 원숭이를 포함하였다.
독성학 시험을 원숭이에 대해 실행하였을 때, 임상 증상, 신체/기관 중량, 혈액 시험, 소변 시험, 조직병리학적 검사 또는 심전도검사에서 어떤 이상도 관찰되지 않았다. H1F1에 대한 무-관찰-유해-효과-수준 (NOAEL)은 마카크에서 90 mg/kg 초과인 것으로 밝혀졌다.
시험관내에서, 시토카인 분비에 대한 H1F1의 효과를 CD4+CD25고Foxp3+ T 세포에서 시험하였다. 도 11에 제시된 바와 같이, H1F1을 사용한 처리는 CD4+CD25고Foxp3+ T 세포의 TH1 세포로의 분극을 유도하였으며, 이는 H1F1을 사용한 처리 후 IFN-γ의 분비의 증가 및 TGF-β의 감소에 의해 입증되었다.
조절 T 세포에서 TH1 세포로의 H1F1-매개된 전환이 또한 마카크 생체내에서 관찰되었다. 도 12에 제시된 바와 같이, H1F1의 모든 3회 투여는 3주의 과정에 걸쳐 IFN-γ 양성 CD4+T 세포의 증가를 유도하였다. 추가적으로, H1F1 시토카인 유도는 도 13에 제시된 바와 같이 차별적이었으며, TH1-유형의 시토카인 (IL-2 및 IFN-γ)은 H1F1을 사용한 처리 후 증가하였고, 반면에 TH2-유형 시토카인 (IL-4 및 IL-5)의 수준은 변경되지 않았다. H1F1을 사용한 처리는 또한 마카크 생체내에서 Treg와 TH1 세포 사이의 균형에 영향을 주었다. 도 14에 제시된 바와 같이, H1F1-투여된 마카크의 비장세포에서, 조절 T 세포의 집단 및 연관된 시토카인 TGF-β는 감소하였고, 반면에 TH1-유형 세포의 집단은 증가하였다.
추가적으로, 15개의 상이한 래트 기관으로부터의 조직, 16개의 상이한 개 기관으로부터의 조직, 16개의 상이한 원숭이 기관으로부터의 조직, 13개의 상이한 인간 기관으로부터의 조직 (138개의 상이한 조직) 및 EBV-연관 위암을 갖는 암 환자로부터의 조직 및 급성 골수성 백혈병으로부터의 골수에서 조직 교차-반응성 연구를 수행하였다. H1F1-특이적 염색이 면역계에서 검출되었지만 다른 정상 인간 조직에서는 검출되지 않았다. 도 15는 H1F1-특이적 염색이 EBV-양성 위암 및 AML 환자로부터의 골수에서 관찰되었다는 것을 보여준다. 마카크 및 개 림프구에서 교차-반응성이 검출되었지만, 래트 조직에서는 교차-반응성이 관찰되지 않았다.
실시예 9: 개선된 항-AITR 항체의 생성
본 실시예는 최적화된 항-AITR 항체의 생산을 기재한다.
항-AITR 항체 생산
Expi293 세포를 125 mL 삼각 플라스크에 넣고, 37℃에서 회전 (125 rpm) 하에 8% CO2 인큐베이터 내 Expi293 발현 배지에서 배양하였다. 세포를 플라스크 내 2-2.5 x 106개 세포/ml로 배양하였다. 제-1일에, 세포 (플라스크당 2 x 106개 세포/ml)를 125 mL 삼각 플라스크 내 30 ml의 Expi293 발현 배지에서 제조하였다. 제0일에, Opti-MEM 배지를 약 30분 동안 37℃ 인큐베이터에서 사전-가온하였다. 튜브 1 및 2를 제조하고, 1.5 mL의 사전-가온된 Opti-MEM 배지를 각각의 튜브에 첨가하였다. 30 μg의 DNA (HC: 15 μg, LC: 15 μg)를 튜브 1에 첨가하고, 잘 혼합하였다. 80 μL의 에피펙타민 293 시약을 튜브 2에 첨가하고, 잘 혼합하였다. 실온에서 5분 동안 반응 후에, 튜브 2의 내용물을 튜브 1에 첨가하고, 잘 혼합하였다. 혼합물을 실온에서 20분 동안 반응하도록 하였다. 튜브 내 혼합물이 흐리게 변한 것으로 확인되었을 때, 3 mL의 DNA-복합체를 플라스크로부터 취하고, 적가하였다. 첨가한 후에, 인큐베이터 내에서 18-20분 동안 회전시키면서 배양하고, 에피펙타민 293 형질감염 키트에 제공된 인핸서 1 및 인핸서 2를 첨가하였다. 그것을 약 7일 동안 회전시키면서 배양하였다. 하기 표 11은 돌연변이 항-AITR 항체를 생성하는데 사용된 중쇄 (HC) 가변 도메인 및 경쇄 (LC) 가변 도메인을 요약한다. 하기 표 12는 돌연변이 항-AITR 항체에 상응하는 중쇄 및 경쇄 가변 도메인 및 CDR 서열식별번호를 포함한다.
표 11. H1F1 돌연변이 항체 Expi293 세포 형질감염 표
Figure pct00011
Figure pct00012
표 12
Figure pct00013
H1F1 돌연변이 항체 서열
H1F1.H8
Figure pct00014
H1F1.H2.J1
Figure pct00015
H1F1.L3.J1
Figure pct00016
H1F1.L3.J2
Figure pct00017
H1F1.H2.J1의 CDR1
Figure pct00018
H1F1.H2.J1 및 H1F1.H8의 CDR2
Figure pct00019
hIgG1_3mu
Figure pct00020
항-AITR 항체 정제
크로마토그래피 칼럼 제조
칼럼 (20 ml-부피)에 20% 에탄올을 채우고, 1회 세척하였다. 칼럼에 결합 완충제를 채우고, 1회 세척하였다. 임의의 남아있는 완충제는 피펫을 사용하여 칼럼으로부터 완전히 제거하였다. 3-5 ml의 20% 에탄올을 첨가하고, 1 ml의 맙셀렉트 슈어 LX 수지를 천천히 첨가하였으며, 이때 용리되는 에탄올의 양을 절차 동안 체크하였다. 모든 20% 에탄올이 배수되고 셀렉트 슈어 LX 수지가 2 ml에 도달할 때까지 절차를 계속하였다.
항체 혼합물의 제조
형질감염된 Expi293 세포로부터 수득된 항체 혼합물을 원심분리하고 (10,000 rpm, 10분), 세포 및 불순물을 펠릿화하였다 (10,000 rpm, 10분). 상청액을 0.22 μm 시린지 필터를 사용하여 여과하였다.
항체 정제 (개방-칼럼의 경우)
맙셀렉트 슈어 LX로 패키징된 칼럼에 채워진 20% 에탄올을 완전히 배수시키고, 칼럼을 18 ml의 결합 완충제로 1회 세척하였다. 전체 항체 혼합물을 로딩하였다. 칼럼을 18 ml 결합 완충제로 1회 세척하였다. 완충제가 완전히 배수되었을 때, 100 μl의 중화 완충제를 갖는 1.5 ml 튜브를 칼럼 아래에 배치하고, 칼럼에 부착된 항체를 매회 1 ml의 용리 완충제를 사용하여 정제하였다.
항체 정제 (FPLC의 경우)
맙셀렉트 슈어 (1 ml) 칼럼을 FPLC에 연결하고, 완충제 A (1X PBS)로 안정화시켰다. 다른 피크가 검출되지 않을 때까지 안정화시킨 후에, 샘플을 1 ml/분의 유량으로 칼럼에 적용함으로써 항체 결합를 수행하였다. UV 그래프가 대략 1500 mAU 내지 2000 mAU로 증가하고 10 mAU 미만으로 감소할 때까지 완충제 A를 칼럼에 적용하였다. 이것 후에, 완충제 B (0.1M 글리신 pH 3.0)를 적용함으로써 항체를 용리시키고, 용리 피크를 UV 그래프에 의해 확인하였다. 적용가능한 피크의 분획을 수득하였다.
항체 투석
항체 정제 후에, 발색 반응을 위해 250 μl의 용리된 샘플에 5 μl의 브래드포드 용액을 첨가하고, 항체 생성물을 4개 유닛의 아미콘 울트라 필터를 사용하여 1-1.5 ml의 부피로 농축시켰다. 농축된 항체 생성물을 투석 장치 내 43 ml의 1x DPBS를 갖는 원추형 튜브에 첨가하고, 진탕기를 사용하여 투석하였다 (120 rpm, 2시간). 이 단계를 새로운 1x DPBS로 대체시켜 2회 반복하였다. 항체 생성물을 투석 장치로부터 스핀-X 원심분리 튜브 필터 유닛으로 옮기고, 원심분리하고 (10000 rpm, 2분), 2 ml 저장 유리 병 안에 넣고, 사용시까지 -20℃ 및 -80℃에서 저장하였다.
실시예 10: 개선된 항-AITR 항체의 특징화
개선된 항-AITR 항체의 AITR 결합 친화도 결정
AITR을 과다발현하는 세포주를 5% CO2 인큐베이터 내 37℃에서 완전 배지 (H-DMEM + 10% FBS+ 1 x 페니실린-스트렙토마이신)에서 배양하였다. 세포주의 형태, 수 및 성장 속도를 모니터링하면서 3일마다 계대배양하였다.
AITR을 과다발현하는 세포주의 1x 트립신/EDTA 용액을 사용하여 세포를 제조한 후에, 세포를 FACS 튜브당 5x105개로 분취하였다. 10 μg, 5 μg, 2.5 μg 또는 1.25 μg의 H1F1 돌연변이 항체를 첨가한 후에, 반응을 4℃에서 30분 동안 수행하였다. 3 ml의 FACS 완충제 (1x DPBS + 1% FBS)를 첨가하고, 원심분리하고, 세척한 후에, 2차 항체 (염소 항-인간 다이라이트(DyLight)® 488)를 첨가하고, 30분 동안 2-8℃에서 인큐베이션하였다. 원심분리하고, 3 mL의 FACS 완충제로 세척한 후에, FACS 저장 완충제 (1x DPBS + 2.5% FBS)를 첨가한 후 FACS 분석을 수행하였다. 대조군을 위해, 항체가 없는 세포, 단지 2차 항체만을 갖는 세포, 및 AITR-PE 항체를 갖는 세포를 사용하였다.
실시예 11: AITR 항원과 항-AITR 항체 H1F1M69 및 H1F1M74 사이의 결합 능력의 분석
본 실시예는 모 항체 H1F1에 의해 인식되는 AITR 항원에 결합하는 돌연변이 항-AITR 항체의 능력을 평가한다. 표면 플라즈몬 공명을 사용하여 AITR에 결합하는 돌연변이 항-AITR 항체의 능력을 결정하였다.
CM5 센서 칩을 갖는 비아코어 T200을 pH 7.4에서 HBS-EP 구동 완충제 및 3M 염화마그네슘 재생 완충제를 사용하여 구동하였다. 항-인간 IgG(Fc) 항체를 아민 커플링을 통해 CM5 칩에 고정화시키고, pH 5.0의 10 mM 아세트산나트륨의 고정화 완충제를 사용하여 5 μL/분의 유량으로 6분 주사를 수행하였다. 시험된 포획 항체는 모 항체 H1F1 및 돌연변이 항체 M69 및 M74였다. 글루타티온 S-트랜스퍼라제 (GST)-태그부착된 AITR 분석물을 3.12, 6.25, 12.5, 25, 50 및 100nM의 농도로, 150초의 회합 시간 및 240초의 해리 시간으로 주사하였다. 30초 동안 3M 염화마그네슘을 사용하여 재생을 달성하고, 1:1의 74개 결합을 평가하였다.
하기 표 12에 제시된 바와 같이, H1F1 돌연변이체 M69 및 M74는 모 항체 H1F1의 친화도에 대등한 친화도로 GST-AITR 분석물에 결합하였다.
표 12
Figure pct00021
항-AITR 항체 M69 및 M74를, 인간 AITR (AITR-5)을 과다발현하는 HEK293 세포주를 사용하여 AITR에의 결합에 대해 추가로 분석하였다. 도 16a에 제시된 바와 같이, 음성 대조군 mAb EU101은 AITR-5에 결합하지 않았고 (3.6%), 반면에 AITR-5 세포의 89.8%는 10 μg/mL의 농도의 H1F1로 염색되었다. 추가적으로, 도 16b에 제시된 바와 같이, AITR-5 세포의 89.1%는 M69로 염색되었고, 세포의 73.8%는 M74로 염색되었다. 이들 데이터는 H1F1, M69 및 M74 모두가 용량 의존성 방식으로 세포 표면 상에 발현된 인간 AITR 분자에 결합한다는 것을 나타낸다.
실시예 12: nTreg 세포 (조절 T 세포)에 대한 항-AITR 항체 H1F1M69 및 H1F1M74의 효과
본 실시예에서, 돌연변이 항-AITR 항체를, nTreg 세포를 TH1 세포로 전환시키는 그의 능력에 대해 시험하였다.
말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 피콜-파크 밀도 구배 원심분리를 통해 수집한 다음, FACS를 사용하여 CD4+CD25++CD127- (nTreg) 세포를 단리하였다. 이어서, nTreg 세포를 5일 동안 2-3일마다 100 U/mL IL-2로 처리하고, 2.5 및 10 μg/mL 농도의 모노클로날 항체 H1F1M69, H1F1M74, TRX518 및 MK4166으로 처리하고, 10 μg/mL의 hIgG를 음성 대조군으로서 사용하였다. 처리 5일 후에, 세포를 IFN-γ의 세포내 염색에 대해 시험하고, IFN-γ 및 TGF-β 분비에 대해 ELISA에 의해 시험하였다.
도 17에 제시된 바와 같이, H1F1M69 및 H1F1M74에 의한 자극 시에 nTreg 세포는 TH1-유사 세포로 전환되었다. Treg의 71%는 M69에 의해 IFN-γ-양성 세포로 전환되었고, Treg의 57%는 M74에 의해 IFN-γ-양성 세포로 전환되었다. 각각의 패널 내 수는 양성 세포의 백분율을 나타낸다.
IL-2 및 항-AITR 항체에 의한 자극 후 T 세포로부터의 IFN-γ 및 TGF-β의 분비를 시험하기 위해, 배양물 상청액을 사용하여 IFN-γ 및 TGF-β를 측정하였다. 도 18에서의 그래프는 ELISA 검정에 의해 수득된 결과를 요약한다. H1F1M69 및 H1F1M74는 TH1 시토카인인 IFN-γ의 분비를 자극하였고 (회색 막대), 반대로 Treg 시토카인인 TGF-β의 감소된 분비를 유도하였다 (흑색 막대). 웰당 5x104개 nTreg 세포를 본 검정에 사용하였다.
실시예 13: iTreg 세포 (유도성 조절 T 세포)에 대한 항-AITR 항체 H1F1M69 및 H1F1M74의 효과
본 실시예에서, 돌연변이 항-AITR 항체를, 유도성 Treg (iTreg) 세포를 TH1 세포로 전환시키는 그의 능력에 대해 시험하였다.
말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 피콜-파크 밀도 구배 원심분리를 통해 수집한 다음, CD4 마이크로비드 (밀테니)에 의한 자기-활성화 세포 분류 (MACS)를 사용하여 제조업체의 지침서에 따라 CD4+ T 세포를 단리하였다. 이어서, CD4+ T 세포를 6일 동안 항-CD3/항-CD28 비드 (25 μL, 인비트로젠), 100 U/mL IL-2 (노파르티스) 및 5 ng/mL TGF-β1에 의해 자극하였다. 자극 6일 후에, 세포는 그 때 CD4-BB515 및 Foxp3-APC에 대해 염색되었다. 이어서, CD3/CD28 비드를 MACS를 통해 제거하였다. 이어서, CD4+ T 세포를 5일 동안 2-3일마다 100 U/mL IL-2로 처리하고, 2.5, 5 및 10 μg/mL 농도의 모노클로날 항체 H1F1M69, H1F1M74, TRX518, 및 MK4166으로 처리하고, 10 μg/mL의 hIgG를 음성 대조군으로서 사용하였다. 처리 5일 후에, 세포를 IFN-γ의 세포내 염색에 대해 시험하고, IFN-γ 및 TGF-β 분비에 대해 ELISA에 의해 시험하였다.
전사 인자 포크헤드 박스 단백질 P3 (Foxp3)은 조절 T 세포의 특이적 마커이고, nTreg 및 iTreg 세포의 억제 활성에서 중추적 역할을 한다. Treg에서 AITR 신호전달의 효과를 평가하기 위해, 조절 T 세포를 시험관내에서 유도하고, Foxp3 발현을 측정하였다. 도 19에 제시된 바와 같이, 6일 동안 항-CD3, CD28 비드, IL-2 및 TGF-β에 의한 자극 후 CD4+ T 세포로부터 iTreg 세포가 생성되었다. iTreg의 83.7%는 Foxp3-양성 염색에 의해 확인되었다 (우측 패널). 이들 데이터는 CD4+ T 세포 집단이 상기 기재된 조건에 의해 iTreg로 분화되었다는 것을 나타낸다.
CD4+ T 세포 상의 AITR 발현이 활성화에 좌우되지만, 나이브 또는 유도성 조절 T 세포는 AITR을 구성적으로 발현한다. Foxp3 발현을 측정하기 전에, iTreg 세포 상의 AITR에 대한 H1F1의 결합 효율을 결정하였다. 도 20에 제시된 바와 같이, 표면 AITR이 돌연변이 H1F1 항체 (M69 - 패널 D 및 M74 - 패널 E)에 의해 검출되었다. 추가로, H1F1M69 및 H1F1M74는 세포의 대략 39%를 인간 AITR에 양성인 것으로 인식하였으며, 이는 경쟁자 항-AITR 항체보다 더 빈번하였다 (평균 세포의 19% - 도 20, 패널 F 및 G).
추가적으로, 도 21에 제시된 바와 같이, iTreg 세포는 H1F1M69 및 H1F1M74에 의한 자극 시 TH1-유사 세포로 전환되었다. iTreg의 78%는 M69에 의해 IFN-γ-양성 세포로 전환되고, iTreg의 57%는 M74에 의해 IFN-γ-양성 세포로 전환되었다. 각각의 패널 내 수는 양성 세포의 백분율을 나타낸다.
IL-2 및 항-AITR 항체에 의한 자극 후 T 세포로부터의 IFN-γ 및 TGF-β의 분비를 시험하기 위해, 배양물 상청액을 사용하여 IFN-γ 및 TGF-β를 측정하였다. 도 22에서의 그래프는 ELISA 검정에 의해 수득된 결과를 요약한다. H1F1M69 및 H1F1M74는 TH1 시토카인인 IFN-γ의 분비를 자극하였고 (회색 막대), 반대로 Treg 시토카인인 TGF-β의 감소된 분비를 유도하였다 (흑색 막대). 웰당 1x105개 iTreg 세포를 본 검정에 사용하였다.
실시예 14: iTreg 세포 (유도성 조절 T 세포)에 대한 고정화된 항-AITR 항체 H1F1M69 및 H1F1M74의 효과
본 실시예에서, 고정화된 돌연변이 항-AITR 항체를, 유도성 Treg (iTreg) 세포를 TH1 세포로 전환시키는 그의 능력에 대해 시험하였다.
말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 피콜-파크 밀도 구배 원심분리를 통해 수집한 다음, CD4 마이크로비드 (밀테니)에 의한 자기-활성화 세포 분류 (MACS)를 사용하여 제조업체의 지침서에 따라 CD4+ T 세포를 단리하였다. 이어서, CD4+ T 세포를 6일 동안 항-CD3/항-CD28 비드 (25 μL, 인비트로젠), 100 U/mL IL-2 (노파르티스) 및 5 ng/mL TGF-β1에 의해 자극하였다. 자극 6일 후에, 세포는 그 때 CD4-BB515 및 Foxp3-APC에 대해 염색되었다. 이어서, CD3/CD28 비드를 MACS를 통해 제거하였다. 이어서, CD4+ T 세포를 5일에 걸쳐 2-3일마다 100 U/mL IL-2로 처리하고, 대략 1일 동안 2.5, 5 및 10 μg/mL 농도의 고정화된 모노클로날 항체 M69 및 M74로 처리하였다. 처리 5일 후에, 세포를 IFN-γ의 세포내 염색에 대해 시험하고, IFN-γ 및 TGF-β 분비에 대해 ELISA에 의해 시험하였다.
Foxp3의 하향-조절이 iTreg의 억제 활성을 감소시키기 때문에, iTreg 세포를 제조하고 Foxp3의 발현에 대한 H1F1M69 및 H1F1M74의 효과를 평가하였다. 상기 기재된 바와 같이, iTreg 세포를 생성하기 위해, CD4+ T 세포를 항-CD3 및 항-CD28 비드에 의해 자극하고, 시험관내에서 iTreg로 분극시켰다. 도 23 (패널 B 및 C)에 제시된 바와 같이, 고정화된 H1F1M69 및 H1F1M74는 iTreg에서 Foxp3의 발현을 억제하였다. 추가로, TRX518 또는 MK4166은 Foxp3 발현을 감소시키는데 실패하였지만 (도 23, 패널 D 및 E), H1F1M69 및 H1F1M74는 심지어 그의 최저 농도 (2.5 μg/mL)에서도 Foxp3 발현을 감소시켰다. 따라서, H1F1M69 및 H1F1M74는 조절 T 세포의 면역-억제 활성을 유지하기 위한 본질적인 전사 인자인 Foxp3의 상실을 유도하였다.
도 24에 제시된 바와 같이, iTreg 세포는 IL-2 및 항-AITR 항체 H1F1M69 및 H1F1M74로 코팅된 웰에 첨가된 후 TH1-유사 세포로 전환되었다. iTreg의 90%는 M69에 의해 IFN-γ-양성 세포로 전환되고, iTreg의 68%는 용량-의존성 방식으로 M74에 의해 IFN-γ-양성 세포로 전환되었다. 각각의 패널 내 수는 양성 세포의 백분율을 나타낸다.
실시예 15: Teff 세포 (이펙터 T 세포)에 대한 항-AITR 항체 M69 및 M74의 효과
본 실시예에서, 돌연변이 항-AITR 항체를, Teff 세포를 TH1 세포로 전환시키는 그의 능력에 대해 시험하였다.
전혈을 건강한 공여자로부터 수집하고, PBMC를 피콜-파크 밀도 구배 원심분리에 의해 백혈구 연층에서 분리해내었다. PBMC를 혈장 층과 피콜-RBC 층 사이의 계면으로부터 수집하고, RPMI1640 배지로 세척하였다. PBMC를 사전-분류 완충제로 재현탁시키고, 항-인간 CD4, 항-CD25 및 항-CD127로 염색하였다. CD4+CD25-CD127+ (Teff) 세포를 FACS에 의해 분류하였다.
도 25에 제시된 바와 같이, 항-AITR 항체 H1F1M69 및 H1F1M74는 Teff 세포를 TH1 세포로 분극시켰다. Teff 세포의 81.1%는 H1F1M69 (10 μg/mL)에 의해 IFN-γ-양성 세포로 분극되고, Teff 세포의 75.3%는 H1F1M74 (10 μg/mL)에 의해 IFN-γ-양성 세포로 분극되었다. 각각의 패널 내 수는 양성 세포의 백분율을 나타낸다.
추가적으로, 분극된 Teff 세포를 IFN-γ 분비에 대해 시험하였다. 도 26에서의 그래프는 ELISA 검정에 의해 수득된 결과를 요약한다. H1F1M69 및 H1F1M74는 TH1 시토카인인 IFN-γ의 분비를 자극하였으며, 이는 Teff 세포가 TH1 세포로 분극되었다는 것을 나타낸다.
등가물
관련 기술분야의 통상의 기술자는 상용 실험에 지나지 않는 것을 사용하여, 본원에 기재된 본 발명의 구체적 실시양태에 대한 많은 등가물을 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 본 발명의 범주는 상기 설명에 제한되도록 의도된 것은 아니며, 오히려 첨부된 청구범위에 제시된 바와 같다.
SEQUENCE LISTING <110> EUTILEX CO., LTD. <120> IFN-gamma-INDUCIBLE REGULATORY T CELL CONVERTIBLE ANTI-CANCER (IRTCA) ANTIBODY AND USES THEREOF <130> 2012994-0030 <150> 62/457,422 <151> 2017-02-10 <160> 26 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 128 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized peptide <400> 1 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Thr Gln Val Lys Met Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Asp Asp Tyr 20 25 30 Gly Ile Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Ser Pro Tyr Thr His Arg Thr Asn Ser Ser Pro Lys Leu 50 55 60 Gln Asp Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Gly Thr Tyr Tyr Asp Phe Trp Ser Gly Tyr Phe Asp Asn 100 105 110 Gly Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 2 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 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180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Ala Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 225 230 235 240 Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330

Claims (38)

  1. (a) 서열식별번호: 8 또는 24의 서열을 포함하는 중쇄 CDR1, 서열식별번호: 9 또는 25의 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 및 서열식별번호: 14, 15, 16 및 17로부터 선택된 적어도 1개의 서열을 포함하는 중쇄 CDR3; 및
    (b) 서열식별번호: 11의 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, 서열식별번호: 12의 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 서열식별번호: 13 또는 18의 서열을 포함하는 경쇄 CDR3
    을 포함하며,
    각각의 서열식별번호: 8의 서열을 포함하는 중쇄 CDR1, 서열식별번호: 9의 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 서열식별번호: 10의 서열을 포함하는 중쇄 CDR3, 서열식별번호: 11의 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, 서열식별번호: 12의 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 서열식별번호: 13의 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하지 않는,
    IFN-γ-유도성 조절 T 세포 전환가능 항암 (IRTCA) 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  2. 제1항에 있어서, 하기:
    (a) 서열식별번호: 3, 4, 5, 6, 20 및 21로부터 선택된 서열에 대해 적어도 90% 동일한 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인;
    (b) 서열식별번호: 7, 22 및 23으로부터 선택된 서열에 대해 적어도 90% 동일한 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인; 또는
    (c) 서열식별번호: 3, 4, 5, 6, 20 및 21로부터 선택된 서열에 대해 적어도 90% 동일한 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 서열식별번호: 7, 22 및 23으로부터 선택된 서열에 대해 적어도 90% 동일한 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인
    중 어느 하나를 포함하는 IRTCA 항체 또는 항원-결합 단편.
  3. 제1항에 있어서, 하기:
    (a) 서열식별번호: 3, 4, 5, 6, 20 및 21로부터 선택된 서열에 대해 적어도 98% 동일한 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인;
    (b) 서열식별번호: 7, 22 및 23으로부터 선택된 서열에 대해 적어도 98% 동일한 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인; 또는
    (c) 서열식별번호: 3, 4, 5, 6, 20 및 21로부터 선택된 서열에 대해 적어도 98% 동일한 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 서열식별번호: 7, 22 및 23으로부터 선택된 서열에 대해 적어도 98% 동일한 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인
    중 어느 하나를 포함하는 IRTCA 항체 또는 항원-결합 단편.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 하기:
    (a) 서열식별번호: 3, 4, 5, 6, 20 및 21로부터 선택된 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인;
    (b) 서열식별번호: 7, 22 및 23으로부터 선택된 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인; 또는
    (c) 서열식별번호: 3, 4, 5, 6, 20 및 21로부터 선택된 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 서열식별번호: 7, 22 및 23으로부터 선택된 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인
    중 어느 하나를 포함하는 IRTCA 항체 또는 항원-결합 단편.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 활성화-유도성 종양 괴사 인자 수용체 (AITR) 분자에 대해 1x10-7 내지 1x10-12 M의 결합 친화도 (KD)를 갖는 IRTCA 항체 또는 항원-결합 단편.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 AITR 폴리펩티드의 세포외 도메인 내의 에피토프에 결합하는 IRTCA 항체 또는 항원-결합 단편.
  7. 제6항에 있어서, 인간 AITR 폴리펩티드의 세포외 도메인 내의 에피토프가 서열식별번호: 19를 포함하는 것인 IRTCA 항체 또는 항원-결합 단편.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 이뮤노글로불린 불변 도메인을 포함하며, 여기서 불변 도메인이 IgG1 또는 그의 변이체, IgG2 또는 그의 변이체, IgG4 또는 그의 변이체, IgA 또는 그의 변이체, IgE 또는 그의 변이체, IgM 또는 그의 변이체, 및 IgD 또는 그의 변이체로부터 선택된 것인 IRTCA 항체 또는 항원-결합 단편.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 인간 IgG1이거나 이를 포함하는 것인 IRTCA 항체 또는 항원-결합 단편.
  10. 제9항에 있어서, IgG1이 서열식별번호: 26에 대해 적어도 95% 동일한 서열이거나 이를 포함하는 것인 IRTCA 항체 또는 항원-결합 단편.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 모노클로날 항체인 IRTCA 항체 또는 항원-결합 단편.
  12. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 단편이 Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')2 단편, Fv 단편, 디술피드-결합된 Fv 단편, scFv 단편, 단일 도메인 항체, 휴마바디, 나노바디 또는 디아바디인 IRTCA 항체 또는 항원-결합 단편.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 IRTCA 항체 또는 항원-결합 단편을 코딩하는 핵산 분자.
  14. 제13항의 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터.
  15. 제15항의 재조합 벡터 및/또는 제13항의 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포.
  16. 제15항에 있어서, 박테리아, 효모, 곤충 또는 포유동물 세포로부터 선택된 숙주 세포.
  17. 제16항에 있어서, 이. 콜라이(E. coli), 피. 파스토리스(P. pastoris), Sf9, COS, HEK293, Expi293, CHO-S, CHO-DG44, CHO-K1 및 포유동물 림프구로 이루어진 군으로부터 선택된 숙주 세포.
  18. (a) 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 IRTCA 항체 또는 항원-결합 단편, 제14항의 핵산 분자, 제14항의 재조합 벡터, 또는 제15항의 숙주 세포; 및
    (b) 제약상 허용되는 담체
    를 포함하는 제약 조성물.
  19. 치료를 필요로 하는 대상체에게 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 IRTCA 항체 또는 항원-결합 단편, 제13항의 핵산 또는 제14항의 재조합 벡터를 포함하거나 이를 전달하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 상기 대상체를 치료하는 방법.
  20. 면역 반응의 유도를 필요로 하는 대상체에게 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 IRTCA 항체 또는 항원-결합 단편, 제13항의 핵산 또는 제14항의 재조합 벡터를 포함하거나 이를 전달하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 상기 대상체에서 면역 반응을 유도하는 방법.
  21. 면역 반응의 증진 또는 면역 세포의 활성의 증가를 필요로 하는 대상체에게 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 IRTCA 항체 또는 항원-결합 단편, 제13항의 핵산 또는 제14항의 재조합 벡터를 포함하거나 이를 전달하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 상기 대상체에서 면역 반응을 증진시키거나 면역 세포의 활성을 증가시키는 방법.
  22. 제19항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 암을 갖거나 암 발병 위험이 있는 것인 방법.
  23. 제22항에 있어서, 암이 방광암, 유방암, 자궁경부암, 결장암, 자궁내막암, 식도암, 난관암, 담낭암, 위장암, 두경부암, 혈액암, 후두암, 간암, 폐암, 림프종, 흑색종, 중피종, 난소암, 원발성 복막암, 타액선암, 육종, 위암, 갑상선암, 췌장암, 신세포 암종, 교모세포종 및 전립선암으로부터 선택된 것인 방법.
  24. 제19항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 이온화 방사선, 화학요법제, 항체 작용제 및 세포-기반 요법으로부터 선택된 1종 이상의 추가의 항암 요법이 투여되었거나 투여될 것이어서, 대상체가 둘 다를 사용한 치료를 받는 것인 방법.
  25. 제24항에 있어서, 1종 이상의 추가의 항암 요법이 면역 체크포인트 억제제, IL-12, GM-CSF, 항-CD4 작용제, 시스플라틴, 플루오로우라실, 독소루비신, 이리노테칸, 파클리탁셀, 인돌아민 2,3-디옥시게나제-1 (IDO1) 억제제 또는 시클로포스파미드를 포함하는 것인 방법.
  26. (a) 치유적 치료를 위한 IRTCA 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 용량의 결정을 필요로 하는 대상체로부터의 생물학적 샘플 중 분비된 IFN-γ의 측정치를 제공 또는 수득하며, 여기서 대상체는 소정량의 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 IRTCA 항체 또는 항원-결합 단편을 포함하거나 이를 전달하는 조성물이 투여된 것인 단계, 및
    (b) 분비된 IFN-γ의 측정치를 참조 값과 비교하는 단계
    를 포함하며, 여기서 분비된 IFN-γ의 측정치가 참조 값보다 더 높거나 더 낮은 경우에, 투여될 IRTCA 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 양을 조정하여, 이에 의해 대상체의 치유적 치료를 위한 용량을 결정하는 것인,
    상기 대상체의 치유적 치료를 위한 IRTCA 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 용량을 결정하는 방법.
  27. (a) 치유적 치료를 위한 IRTCA 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 용량의 결정을 필요로 하는 대상체로부터의 생물학적 샘플 중 Treg 세포 집단의 측정치를 제공 또는 수득하며, 여기서 대상체는 소정량의 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 IRTCA 항체 또는 항원-결합 단편을 포함하거나 이를 전달하는 조성물이 투여된 것인 단계; 및
    (b) Treg 세포 집단의 측정치를 참조 값과 비교하는 단계
    를 포함하며, 여기서 Treg 세포 집단의 측정치가 참조 값보다 더 높거나 더 낮은 경우에, 투여될 IRTCA 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 양을 조정하여, 이에 의해 대상체의 치유적 치료를 위한 용량을 결정하는 것인,
    상기 대상체의 치유적 치료를 위한 IRTCA 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 용량을 결정하는 방법.
  28. 제26항 또는 제27항에 있어서, 참조 값이 1명 이상의 건강한 대상체로부터 유래된 값 또는 1명 이상의 암-진단된 대상체로부터 유래된 값을 포함하는 인덱스 값을 포함하는 것인 방법.
  29. 제26항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 생물학적 샘플이 전혈, 혈장, 종양 조직 또는 혈청의 샘플인 방법.
  30. 제26항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 암을 갖거나 암 발병 위험이 있는 것인 방법.
  31. 제30항에 있어서, 암이 방광암, 유방암, 자궁경부암, 결장암, 자궁내막암, 식도암, 난관암, 담낭암, 위장암, 두경부암, 혈액암, 후두암, 간암, 폐암, 림프종, 흑색종, 중피종, 난소암, 원발성 복막암, 타액선암, 육종, 위암, 갑상선암, 췌장암, 신세포 암종, 교모세포종 및 전립선암으로부터 선택된 것인 방법.
  32. T 세포를 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 IRTCA 항체 또는 항원-결합 단편과 접촉시키는 단계를 포함하는, 생체내 또는 시험관내에서 T 세포에 의한 IFN-γ의 분비를 증가시키는 방법.
  33. T 세포를 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 IRTCA 항체 또는 항원-결합 단편과 접촉시키는 단계를 포함하는, 생체내 또는 시험관내에서 T 세포에 의한 TGF-β의 분비를 감소시키는 방법.
  34. T 세포를 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 IRTCA 항체 또는 항원-결합 단편과 접촉시키는 단계를 포함하는, T 세포를 유형 1 헬퍼 T (TH1) 세포로 전환시키는 방법.
  35. T 세포를 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 IRTCA 항체 또는 항원-결합 단편과 접촉시키는 단계; 및
    T 세포로부터의 시토카인 분비를 측정하는 단계
    를 포함하며, 여기서 시토카인 분비는 IRTCA 항체의 면역 반응 증진, 항암 효과 및/또는 항종양 효과와 상관관계가 있는 것인,
    AITR에 대한 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 친화도를 검증하는 방법.
  36. 제32항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, T 세포가 AITR 단백질을 발현하는 것인 방법.
  37. 제32항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, T 세포가 조절 T 세포 (Treg 세포)인 방법.
  38. 제32항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, T 세포가 이펙터 T 세포 (Teff 세포)인 방법.
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