KR20230147099A - B 세포 매개 면역 반응을 조절하기 위한 방법 및 수단(method and means for modulating b-cell mediated immune responses) - Google Patents

B 세포 매개 면역 반응을 조절하기 위한 방법 및 수단(method and means for modulating b-cell mediated immune responses) Download PDF

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Abstract

본 발명은 특정 비율의 가용성 단일 1가 항원 및 복합 다가 항원과 B 세포가 접촉하게 하여 B 세포 매개 면역 반응을 표적화하여 조절하기 위한 방법 및 수단에 관한 것이다. B 세포 면역의 표적화 조절은 항체 매개 면역과 연관된 다양한 병태의 진단 및 치료를 위해 포유동물에서 사용될 수 있다. 이러한 병태는 암과 같은 증식성 장애, 자가면역 장애, 병원성 감염, 염증성 질환, 알레르기 및 음식 과민증을 포함한다. 본 발명은 복합 다가 항원성 구조가 강력한 IgG 유형 항체 B 세포 반응을 유도하며 놀랍게도 1가 항원성 구조가 이러한 IgG 반응을 억제하거나 심지어 자가항원 보호 IgM 반응, 특히, 보호 올리고머 항인슐린 항체의 경우 유도하는 능력을 갖는다는 관찰에 입각한다. 이와 관련하여 본 발명은 방법, 조성물, 치료제, 진단제 및 식품 첨가제를 제공한다.

Description

B 세포 매개 면역 반응을 조절하기 위한 방법 및 수단(METHOD AND MEANS FOR MODULATING B-CELL MEDIATED IMMUNE RESPONSES)
본 발명은 특정 비율의 가용성 단일 1가 항원 및 복합 다가 항원과 B 세포가 접촉하게 하여 B 세포 매개 면역 반응을 표적화하여 조절하기 위한 방법 및 수단에 관한 것이다. B 세포 면역의 표적화 조절은 항체 매개 면역과 연관된 다양한 병태의 진단 및 치료를 위해 포유동물에서 사용될 수 있다. 이러한 병태는 암과 같은 증식성 장애, 자가면역 장애, 병원성 감염, 염증성 질환, 알레르기 및 음식 과민증을 포함한다. 본 발명은 복합 다가 항원성 구조가 강력한 IgG 유형 항체 B 세포 반응을 유도하며 놀랍게도 1가 항원성 구조가 이러한 IgG 반응을 억제하거나 심지어 자가항원 보호 IgM 반응, 특히, 보호 올리고머 항인슐린 항체의 경우 유도하는 능력을 갖는다는 관찰에 입각한다. 이와 관련하여 본 발명은 방법, 조성물, 치료제, 진단제 및 식품 첨가제를 제공한다.
자가내성은 자가면역 반응을 회피하여 생리적 무결성을 유지하는 데 중요하다. 현재, 절대 중추 및 말초 내성은 B 세포 발달 동안 B 세포 수용체(BCR) 레퍼토리를 제어하여 자가반응성 B 세포의 양성 선택을 예방하는 것으로 여겨진다[1,2,4]. 중추 내성이 골수에서 초기 B 세포 발달 동안 자가반응성 B 세포의 결실을 강제하는 것으로 추정된다[2,5-7]. 또한, 클론 결실을 피하는 자가반응성 B 세포는 수용체 편집을 거쳐 비자가반응성 BCR 특이성을 초래한다[8-10]. 중추 내성을 회피하고 말초로 이동하는 자가반응성 B 세포는 주로 IgM BCR 발현의 하향조절에 의해 무반응성으로 이어지는 클론성 아네르기(말초 내성)의 저항을 받는다[1,11-13]. 그러나, 대부분의 혈청 IgM이 자가반응성이라는 발견은 자가반응성의 일반적인 제거라는 개념과 대조되는 것으로 보인다[14]. 사실 소위 천연 다반응성 IgM은 항상성에서 중요한 역할을 하는데, 이는 자가반응성 항체의 절대적인 제거에 대한 반대 근거가 될 수 있다[15].
흥미롭게도 질환 특이적 자가 반응성 B세포가 면역 전 레퍼토리 내에 존재하며, 일반적인 자가항원인 인슐린에 특이적인 배중심(GC)이 야생형 생쥐에서 생성될 수 있다는 것이 입증되었는데, 이는 중추 B세포 내성의 개념과 모순이다[16,17].
지난 수십 년 동안, B 세포 자가면역 연구는 유전자이식 마우스 모델에 주로 주목하였다[1,2,5,18,19]. 자가면역 연구를 위한 이러한 모델의 유용성은 여러 이유로 심도 있게 논의되었다[20]. 고친화도 돌연변이 자가반응성 BCR에 의한 생식계열 구성의 대체는 B 세포 발달 동안 비전형적 상황으로 이어질 뿐만 아니라 단일특이적 레퍼토리도 생성한다[1,5,19]. 또한, 가용성, 원자가 및 형태(가용성 대 막결합)와 관련된 이러한 항원의 특성은 적절하게 다루어지지 않았다[5, 18]. 또한, 항원 자체는 알려진 자가면역 질환과 임의의 관련성이 없다[21, 22].
역학 연구는 공업화 국가 인구의 최대 5%가 류마티스 관절염(RA), 전신성 홍반성 루푸스(SLE) 또는 제1형 당뇨병(T1D)과 같은 자가면역 질환을 앓고 있다는 것을 나타낸다[21]. 특히, 자가항체는 대부분의 자가면역 질환에서 존재하며 종종 병인의 원동력이다[22]. 또한, 항인슐린 항체는 인슐린 활성, 당뇨병 발달 및 인슐린 치료에 중요한 역할을 한다[57-59].
따라서, 대상체에서 면역 반응, 특히, 인슐린에 대한 면역 반응의 존재 또는 활성에 의해 유도되거나 이를 특징으로 하는 병태를 검출하거나 치료하거나 회피하기 위해 면역 반응의 제어 가능한 조절을 위한 접근법을 개발할 계속적인 필요성이 있다.
일반적으로 그리고 간략한 설명을 통해, 본 발명의 주요 실시양태는 다음과 같이 설명될 수 있다.
1. 올리고머성 항인슐린 항체로서, 상기 항체는
(i)바람직하게는 표면 플라즈몬 공명에 의해 측정된 바와 같이 , Kd < 5 x 10-7의 인슐린 및/또는 프로인슐린에 대한 친화도를 갖고/갖거나;
(ii)인슐린 및/또는 프로인슐린에 대해 단일특이적인 올리고머성 항인슐린 항체.
2. 제1 실시양태에 있어서, 상기 올리고머성 항인슐린 항체는 IgM 동형의 항인슐린 항체인 올리고머성 항인슐린 항체.
3. 제1 실시양태 또는 제2 실시양태에 있어서, 상기 올리고머성 항인슐린 항체는 키메라, 인간화 또는 인간 항체인 올리고머성 항인슐린 항체.
4. 제1 실시양태 내지 제3 실시양태에 있어서, 상기 면역글로불린은
a) 서열 식별 번호: 2에서 정의된 바와 같은 CDR1, 서열 식별 번호: 3에서 정의된 바와 같은 CDR2 및 서열 식별 번호: 4에서 정의된 바와 같은 CDR3을 포함하는 가변 중(VH)쇄 및 서열 식별 번호: 6에서 정의된 바와 같은 CDR1, 서열 DAS에 의해 정의된 바와 같은 CDR2 및 서열 식별 번호: 7에서 정의된 바와 같은 CDR3을 포함하는 가변 경(VL)쇄;
b) 서열 식별 번호: 9에서 정의된 바와 같은 CDR1, 서열 식별 번호: 10에서 정의된 바와 같은 CDR2 및 서열 식별 번호: 11에서 정의된 바와 같은 CDR3을 포함하는 가변 중(VH)쇄 및 서열 식별 번호: 13에서 정의된 바와 같은 CDR1, 서열 GAS에 의해 정의된 바와 같은 CDR2 및 서열 식별 번호: 14에서 정의된 바와 같은 CDR3을 포함하는 가변 경(VL)쇄; 또는
c) 서열 식별 번호: 16에서 정의된 바와 같은 CDR1, 서열 식별 번호: 17에서 정의된 바와 같은 CDR2 및 서열 식별 번호: 18에서 정의된 바와 같은 CDR3을 포함하는 가변 중(VH)쇄 및 서열 식별 번호: 20에서 정의된 바와 같은 CDR1, 서열 DAS에 의해 정의된 바와 같은 CDR2 및 서열 식별 번호: 21에서 정의된 바와 같은 CDR3을 포함하는 가변 경(VL)쇄;를 포함하는 올리고머성 항인슐린 항체.
5. 제4 실시양태에 있어서, 상기 올리고머성 항인슐린 항체는
a) 서열 식별 번호: 1의 아미노산 서열 또는 서열 식별 번호: 1과 적어도 90%, 바람직하게는, 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 가변 중(VH)쇄 서열 및 서열 식별 번호: 4의 아미노산 서열 또는 서열 식별 번호: 4와 적어도 90%, 바람직하게는, 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 가변 경(VL)쇄 서열;
b) 서열 식별 번호: 8의 아미노산 서열 또는 서열 식별 번호: 8과 적어도 90%, 바람직하게는, 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 가변 중(VH)쇄 서열 및 서열 식별 번호: 12의 아미노산 서열 또는 서열 식별 번호: 12와 적어도 90%, 바람직하게는, 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 가변 경(VL)쇄 서열; 또는
c) 서열 식별 번호: 15의 아미노산 서열 또는 서열 식별 번호: 15와 적어도 90%, 바람직하게는, 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 가변 중(VH)쇄 서열 및 서열 식별 번호: 19의 아미노산 서열 또는 서열 식별 번호: 19와 적어도 90%, 바람직하게는, 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 가변 경(VL)쇄 서열;을 포함하는 올리고머성 항인슐린 항체.
6. 제1 실시양태 내지 제5 실시양태 중 어느 한 실시양태의 올리고머성 항인슐린 항체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드.
7. 제6 실시양태의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포.
8. 제7 실시양태의 숙주세포를 배양하는 단계를 포함하는 올리고머성 항인슐린 항체를 생성하기 위한 방법.
9. 제1 실시양태 내지 제5 실시양태 중 어느 한 실시양태의 올리고머성 항인슐린 항체, 제6 실시양태의 폴리뉴클레오티드, 제7 실시양태의 숙주세포 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
10. 제9 실시양태에 있어서, 추가 치료제를 포함하는 약제학적 조성물.
11. 제1 실시양태 내지 제5 실시양태 중 어느 한 실시양태의 올리고머성 항인슐린 항체, 제6 실시양태의 폴리뉴클레오티드, 제7 실시양태의 숙주 세포 또는 제9 실시양태 내지 제10 실시양태의 약제학적 조성물의 치료에서의 용도.
12. 제1 실시양태 내지 제5 실시양태 중 어느 한 실시양태의 올리고머성 항인슐린 항체, 제6 실시양태의 폴리뉴클레오티드, 제7 실시양태의 숙주 세포 또는 제9 실시양태 내지 제10 실시양태의 약제학적 조성물의 인슐린 연관 질환 또는 장애의 치료에서의 용도.
13. 인슐린 연관 질환 또는 장애를 진단 및/또는 예측하는 방법으로서, 상기 방법은
(i) 검체로부터 유래한 프로인슐린 및/또는 인슐린에 대한 항인슐린 IgM 항체의 결합의 친화도를 결정하는 단계로서,
상기 검체는 대상체로부터 수득되었고 상기 대상체는 인슐린 연관 질환 또는 장애가 있다고 진단되었거나 이의 위험이 있는 단계;
(ii) 단계 (i)에서 결정되는 수치(들)를 기준 값과 비교하는 단계; 및
(iii) 단계 (ii)에서 이루어진 비교에 기반하여 상기 대상체에서 인슐린 연관 질환 또는 장애를 진단 및/또는 예측하는 단계로서, 바람직하게는 프로인슐린 및/또는 인슐린에 대한 항인슐린 IgM 항체의 결합의 더 낮은 친화도는 인슐린 연관 질환 또는 장애에 대한 더 높은 위험을 나타내는 단계;를 포함하는 인슐린 연관 질환 또는 장애를 진단 및/또는 예측하는 방법.
14. 대상체가 인슐린 연관 질환 또는 장애의 치료에 민감한지 여부를 결정하기 위한 방법으로서, 상기 방법은
(i) 검체로부터 유래한 프로인슐린 및/또는 인슐린에 대한 항인슐린 IgM 항체의 결합의 친화도를 결정하는 단계로서,
상기 검체는 대상체로부터 수득되었고 상기 대상체는 인슐린 연관 질환 또는 장애가 있다고 진단되었거나 이의 위험이 있는 단계;
(ii) 단계 (i)에서 결정되는 수치(들)를 기준 값과 비교하는 단계; 및
(iii) 상기 대상체가 인슐린 연관 질환 또는 장애의 치료에 민감한지 여부를 결정하는 단계로서, 바람직하게는 프로인슐린 및/또는 인슐린에 대한 항인슐린 IgM 항체의 결합의 더 낮은 친화도는 인슐린 연관 질환 또는 장애의 치료에 대한 더 높은 민감성을 나타내는 단계;를 포함하는 대상체가 인슐린 연관 질환 또는 장애의 치료에 민감한지 여부를 결정하기 위한 방법.
15. 올리고머성 항인슐린 항체의 제12 실시양태의 용도, 폴리뉴클레오티드의 제12 실시양태의 용도 또는 숙주 세포의 제12 실시양태의 용도, 또는 약제학적 조성물의 제12 실시양태의 용도, 제13 실시양태 또는 제14 실시양태의 방법에 있어서, 상기 인슐린 연관 질환 또는 장애는 췌장 손상, 제1형 당뇨병, 제2형 당뇨병, 외인성 인슐린 항체 증후군, 임신성 당뇨병 및 이상혈당증의 군으로부터 선택되는, 용도 또는 방법.
16. 올리고머성 항인슐린 항체의 제15 실시양태의 용도, 폴리뉴클레오티드의 제15 실시양태의 용도 또는 숙주 세포의 제15 실시양태의 용도, 또는 약제학적 조성물의 제15 실시양태의 용도, 또는 제15 실시양태의 방법에 있어서, 상기 이상혈당증은 췌장 손상, 제1형 당뇨병, 제2형 당뇨병, 외인성 인슐린 항체 증후군 및 임신성 당뇨병의 군으로부터 선택되는 인슐린 연관 질환 또는 장애가 있는 환자의 이상혈당증인, 용도 또는 방법.
17. 올리고머성 항인슐린 및/또는 항프로인슐린 항체, 바람직하게는 IgM 동형의 올리고머성 항인슐린 및/또는 항프로인슐린 항체를 생성하기 위한 방법으로서, 포유동물을 적어도 하나의 1가 인슐린 입자 및 적어도 하나의 다가 인슐린 입자의 혼합물로 면역화하는 단계를 포함하는, 올리고머성 항인슐린 및/또는 항프로인슐린 항체, 바람직하게는 IgM 동형의 올리고머성 항인슐린 및/또는 항프로인슐린 항체를 생성하기 위한 방법.
18. 인슐린 연관 질환 또는 장애의 치료 및/또는 예방하기 위한 방법으로서, 상기 방법은 치료적 유효량의 제1 실시양태 내지 제5 실시양태 중 어느 한 실시양태의 올리고머성 항인슐린 항체, 제6 실시양태의 폴리뉴클레오티드, 제7 실시양태의 숙주 세포 또는 제9 실시양태 내지 제10 실시양태의 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 인슐린 연관 질환 또는 장애의 치료 및/또는 예방하기 위한 방법.
도면은 다음을 나타낸다.
도 1은 가용성 합텐이 합텐-담체 복합체에 의해 유도되는 항체 면역 반응을 억제한다는 것을 나타낸다. a: IgM(녹색) 및 IgD(황색) B 세포 수용체를 발현하는 도식적 야생형 B 세포. b: 표시되는 일차에 ELISA로 측정한 NP-KLH 면역화(적색 및 녹색) 및 CI 마우스(회색)의 혈청 항NP-Ig 역가. 표시되는 비율은 가용성 대 복합 NP(sNP:cNP)의 몰비를 지칭한다. 점은 마우스를 나타낸다(평균 ± SD). c: 표시되는 일차에 ELISA로 측정한 혈청 항KLH-IgG 역가. 점은 마우스를 나타낸다(평균 ± SD). d: NP 특이적 면역글로불린 생성 세포를 나타내는 ELISpot 검정. n = 2/군, 평균 ± SD. e: 도식적 IgD BCR-녹아웃 B 세포. f: 표시되는 일차에 ELISA(IgD-/- 마우스)에 의해 측정되는 NP-KLH 면역화(적색 및 녹색) 및 CI 마우스의 혈청 항NP-Ig 역가. 점은 마우스를 나타낸다(평균 ± SD). CI: 대조군 면역화.
도 2는 가용성 대 복합 NP의 매우 높은 비율이 항원 특이적 IgM 반응을 억제한다는 것을 나타낸다. a: 가용성 또는 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH)에 접합되는 4-히드록시-3-니트로페닐아세틸합텐을 나타내는 개략도. b: 가용성/복합 NP 및 CpG-ODN1826을 사용한 면역화 일정을 나타내는 개략도. c: NP-원자가 주사된 마우스의 항체 역가를 ELISA를 통해 분석하였다. 혈청을 NP-BSA 코팅 플레이트에 2회 도포하고 1:3 시리즈로 희석하였다.
도 3은 자가항체의 유도가 자가항원 원자가에 의존하고 이의 비율에 의해 조절된다는 것을 나타낸다. a: KLH 담체에 결합되는 프로인슐린 유래 전장 CP의 개략도. b: 인간과 뮤린의 CP 및 인슐린-A 사슬 아미노산 서열을 비교하는 표. 펩티드로서 사용되는 서열은 밑줄로 나타내었으며 보존된 아미노산은 굵게 나타내었다. c: 개략적 예방 접종 일정. d - e: 표시되는 일차에 ELISA로 측정한 CP-SAV 면역화(적색 및 녹색) 및 CI 마우스(회색)의 혈청 항CP-Ig 역가. 42일차의 부스트는 CpG 없이 수행되었다(e). 점은 마우스를 나타낸다(평균 ± SD). f: 14일차에서 CP 특이적 면역글로불린 생성 비장 유래 세포를 나타내는 ELISpot 검정. 웰의 대표적인 사진을 나타내는 상단 레인. n = 4 마우스/군, 평균 ± SD. g: ELISA로 측정한 CP-SAV 면역화(적색 및 녹색) 및 CI IgD-/- 마우스(회색)의 혈청 항CP-Ig 역가. 점은 마우스를 나타낸다(평균 ± SD). CP: C-펩티드, KLH: 키홀 림펫 헤모시아닌, SAV: 스트렙트아비딘, CI: 대조군 면역화.
도 4는 가용성 항원이 형질 세포 분화를 간섭하는 것을 나타낸다. a: C-펩티드(CP) 면역화 마우스로부터 유래한 비장 세포의 유세포 분석(FACS). 2개의 독립적인 실험을 나타내는 데이터(n = 4). X축의 비율은 1가(sCP) 대 다가(cCP) CP의 몰비를 지칭한다. CD138+ 및 B220- 세포는 형질 세포로 식별되었다. 상단 패널은 0:1 및 하단 패널은 20:1 주사된 마우스를 나타낸다. b: 제시된 FACS 데이터의 통계 분석. 평균 +- SD. c: C-펩티드(CP) 면역화 마우스로부터 유래한 비장 세포의 유세포(FACS) 분석. 2개의 독립적인 실험을 나타내는 데이터(n = 4). X축의 비율은 1가(sCP) 대 다가(cCP) CP의 몰비를 지칭한다. 상단 패널은 0:1 및 하단 패널은 20:1 주사된 마우스를 나타낸다. 우측 패널: 정량화. d: C-펩티드(CP) 마우스 혈청을 1차 항체로 사용한 췌장 용해물의 웨스턴 블롯. 프로인슐린(15kD). e: C-펩티드(CP) 면역화 마우스의 스트렙트아비딘(담체) 특이적 IgG 역가를 ELISA를 통해 측정하였다. CP:SAV 면역화 마우스의 혈청을 CP 코팅된 ELISA 플레이트에 2회 도포하고 1:3 시리즈로 희석하였다.
도 5는 복합 천연 인슐린(InsNat)이 야생형 마우스에서 자가면역 당뇨병 증상을 유도하는 자가반응성 IgG 반응을 유발한다는 것을 나타낸다. a: 표시되는 일차에 ELISA로 측정한 InsNat 면역화 및 CI 마우스의 혈청 항인슐린-Ig 역가. 점은 마우스를 나타낸다(평균 ± SD). b: 야생형(좌측) 및 B 세포 결핍(우측) 마우스의 B 세포(CD19+ Thy1.2-) 및 T 세포(Thy1.2+ CD19-)를 나타내는 혈액의 유세포 분석. 세포는 림프구에 사전 게이팅되었다. 3개의 독립적인 실험을 나타낸다. c: InsNat 면역화(적색: WT, 황색: B 세포 결핍) 및 CI 마우스(회색)의 혈당 수치를 면역화 후 표시되는 일차에 평가하였다. 점은 마우스를 나타낸다(평균 ± SD). d: InsNat 면역화(적색) 및 CI 마우스(회색)의 요당 수치를 면역화 후 표시되는 일차에 모니터링하였다. 포도당 표준(상단 레인)의 시각화 및 시험 동물의 대표적인 사진(중간 및 하단 레인)을 나타내는 좌측 패널. 정량화를 나타내는 우측 패널. 점은 마우스를 나타낸다(평균 ± SD). e: CI 및 InsNat 면역 마우스의 물 섭취량은 21일차에서 26일차까지 모니터링되었다. f: 27일차에 InsNat 면역화(적색) 및 CI 마우스(회색)의 췌장의 유세포 분석. 살아있는 세포에 사전 게이팅된 췌장 대식세포(CD11b+ Ly6G-), 호중구(Ly6G+ CD11b+) 및 B 세포(CD19+)를 나타내는 좌측 패널. 인슐린 결합(상단) 및 스트렙트아비딘(SAV) 결합(하단)에 대한 히스토그램을 나타내는 우측 패널. n = 5/군인 2개의 독립적인 실험을 나타낸다. g: 인슐린 특이적 IgG 생성 비장 유래 세포(27일차)를 나타내는 InsNat 면역화(적색) 및 CI 마우스(회색)의 ELISpot. 대표적인 웰이 나타나 있다(상단 레인). n = 3/군, 평균 ± SD. h: InsNat 면역화 마우스의 혈청 IgG 정제 후 총(적색) 및 인슐린 특이적(연주황색) IgG의 정량화. i: 환원(β-ME), 좌측 레인 및 비환원 조건, 우측 레인 하에서 InsNat 면역화(적색) 및 CI 마우스(회색)의 정제된 혈청 IgG를 나타내는 쿠마시(Coomassie) 염색 SDS 페이지. HC: 중쇄, LC: 경쇄. 2개의 독립적인 실험을 나타낸다. j: 정맥내(i.v.) 주사된 WT 마우스의 혈당 수치. 주사 후 표시되는 시간에 InsNat 면역된 마우스(적색) 또는 CI 마우스(회색)의 정제된 혈청 IgG 20μg. 점은 마우스를 나타낸다(평균 ± SD). CI: 대조군 면역화, InsNat: 복합 천연 인슐린, β-ME: β-메르캅토에탄올.
도 6은 자가 항원을 사용한 면역화가 비장 B 세포 구획을 변경하지 않는다는 것을 나타낸다. a: InsNat 면역화 및 CI 마우스로부터 유래한 비장 세포의 유세포 분석. 림프구 및 단일 세포 단일 세포에 대한 게이팅 전략 상단 패널. 림프구에 사전 게이팅된 B 세포를 나타내는 중간 패널. B 세포 상의 IgM 및 IgD 발현을 나타내는 하단 패널. 좌측: 대조군 면역화(CI), 우측: InsNat 면역화(복합 천연 인슐린). n = 3/군.
도 7은 자가면역 반응의 유해성을 조절하고 보호 IgM을 유도하는 자가 항원 특이적 IgM 대 IgG의 비율을 나타낸다. a: 표시되는 일차에 ELISA로 측정한 InsA 펩티드 면역화(적색 및 녹색) 및 CI 마우스(회색)의 혈청 항인슐린-Ig 역가. 점은 마우스를 나타낸다(평균 ± SD). b: InsA 펩티드 면역화(적색 및 녹색) 및 CI 마우스(회색)의 혈당 수치가 표시되는 일차에 평가되었다. 점은 마우스를 나타낸다(평균 ± SD). c: InsA 펩티드 면역화(적색 및 녹색) 및 CI 마우스(회색)의 요당 수치가 면역화 후 표시되는 일차에 모니터링되었다. 점은 마우스를 나타낸다(평균 ± SD). d: 항원의 몰비에 대해 표시되는 ELISA 값으로부터 유래한 IgG 대 IgM의 비율. n = 5/군, 평균 ± SD. e: InsA 펩티드 면역화 마우스로부터 유래한 인슐린-특이적 혈청 IgG의 웨스턴 블롯 분석. 상단 패널(녹색): 100:1 혈청, 하단 패널(적색): 0:1 혈청(sInsA:cInsA). 흑색 채움 화살표: 프로인슐린(12kD), 흑색 비채움 화살표: 인슐린(6kD), -액틴(42kD, 부하 제어). 2개의 독립적인 실험을 나타낸다. f: 인슐린 특이적 IgG 생성 비장 유래 세포를 나타내는 14일차의 InsA 펩티드 면역화(적색) 및 CI 마우스(회색)의 ELISpot. 대표적인 웰이 나타나 있다(상단 레인). n = 4/군, 평균 ± SD. g: 혈당 수치(좌측 패널) 및 요당 수치(우측 패널)에 대한 2차원 그래프에 표시되는 ELISA 값으로부터 유래한 IgG 대 IgM의 비율. n = 5/군, 평균 ± SD. h: 표시되는 일차에 InsA 펩티드 면역화 마우스(/μ 비율 < 0.1, 흑색) 및 CI 마우스(회색)의 혈청 항인슐린-Ig 역가를 ELISA로 측정하였다. 점은 마우스를 나타낸다(평균 ± SD). i: 면역화 후 표시되는 일차에 InsA 펩티드 면역화 마우스(/μ < 0.1; 흑색) 및 CI 마우스(회색)의 혈당 수치를 평가하였다. 점은 마우스를 나타낸다(평균 ± SD). j: 표시되는 일차에 InsA-펩티드 면역화 마우스(좌측 패널) 및 바이러스-펩티드 면역화 마우스(우측 패널)의 인슐린 특이적 IgM 친화도 성숙화를 ELISA로 측정하였다. k: cInsA(적색) 및 cInsA + pIgM (연주황색) i.v.로 면역화된 마우스의 혈당 및 요당 수치. 점은 마우스를 나타낸다(평균 ± SD). CI: 대조군 면역화, cInsA: 복합 인슐린-A 펩티드.
도 8은 1가 가용성 바이러스 유래 펩티드 항원이 상응하는 복합 항원에 의해 유도되는 IgG 대 IgM 항체 반응을 조절한다는 것을 나타낸다. a: 바이러스-펩티드 특이적 혈청 면역글로불린 역가의 결정. 바이러스-펩티드 면역화된 마우스의 혈청을 바이러스-펩티드-바이오:스트렙트아비딘(SAV) 코팅 플레이트에 1:3 연속 희석으로 2회 도포하였다. 평균 +- SD. b - c: KLH(담체)-특이적 혈청 IgG 역가의 결정. X축에 표시되는 비율은 가용성 대 복합 바이러스-펩티드의 분자 비율을 지칭한다. 평균 +- SD.
도 9는 IgG를 통해 InsA 펩티드와 결합하는 외부 항원 및 췌장 대식세포가 아닌 자가항원으로 면역화 시 IgM높음/IgD낮음 양성 구획이 증가한 것을 나타낸다. a - b: 바이러스-펩티드 또는 인슐린-펩티드 면역화 마우스로부터 유래한 비장 세포의 유세포 분석. 림프구에 사전 게이팅된 B 세포(CD19+ B220+)를 나타내는 상단 패널(a). B 세포 하위 집합을 나타내는 하단 패널(b): 성숙 B 세포(IgDhi IgMlo), 전이/변연 영역 B 세포(IgDlo IgMhi). 세포는 B 세포에 사전 게이팅되었다. 좌측: PBS(회색), 중간: 바이러스 펩티드(자주색), 우측: 인슐린-펩티드(청록색). 우측 바깥쪽은 정량화를 나타낸다. 평균 +- SD. c: 췌장 세포의 유세포 분석. 세포(상단) 및 대식세포(하단)에 대한 게이팅 전략을 나타내는 좌측 패널. 표시되는 바와 같이 InsA-펩티드 및 펩티드 대조군 결합에 대한 히스토그램을 나타내는 우측 패널.
도 10은 비장 대식세포가 cInsA-펩티드 면역화 마우스에서 인슐린 특이적 IgG에 결합한다는 것을 나타낸다. a: cInsA 펩티드 면역화 마우스의 비장 세포의 유세포 분석(FACS). 대식세포(CD11b+ CD19-)에 대한 게이팅 전략을 나타내는 좌측 패널. 대조군 면역화(흑색) 및 cInsA-면역화(적색) 마우스의 IgG 결합 히스토그램을 나타내는 상단 패널. 대식세포의 InsA-펩티드 결합을 나타내는 하단 패널. 3개의 독립적인 실험을 나타내는 데이터.
도 11은 이상 조절되는 포도당 대사가 cInsA 복합체로 반복하여 재시도 시 IgM이 증가하여 예방된다는 것을 나타낸다. a: 인슐린 특이 혈청 면역글로불린 역가의 결정. InsA-펩티드 면역화 마우스의 혈청을 천연 인슐린 코팅 ELISA 플레이트에 1:3 연속 희석액으로 2회 도포하였다. 49일차 상의 항인슐린 IgM을 나타내는 좌측 패널, 임의 단위(AU)의 항인슐린 IgG를 나타내는 우측 패널. X축에 표시되는 비율은 가용성 대 복합 InsA-펩티드의 분자 비율을 지칭한다. 평균 +- SD. b: 요당 수치는 시험 스트립으로 모니터링하였다. 평균 +- SD.
도 12는 InsA 펩티드 면역화에 의해 유도되는 다반응성 IgM이 항원 원자가 및 일차에 따라 당뇨병 증상으로 이어진다는 것을 나타낸다. a: 혈당 수치는 AccuCheck 시스템(Roche)으로 모니터링하였다. 꼬리 정맥에서 갓 뽑은 혈액을 시험 스트립에 도포하고 혈당을 mmol/L 단위로 측정하였다. 평균 +- SD. b: 요당 수치는 Combur M 스트립(Roche)으로 모니터링하였다. 갓 수득한 소변을 시험 스트립의 포도당 필드에 도포하고 제조업체의 표준에 따라 분석하였다. 녹색 막대는 100:1(가용성:복합체) InsA-펩티드를 표시한다. 평균 +- SD. 점은 이 연구에서 사용된 마우스를 나타낸다.
도 13은 1가 항원(100:1, sInsA:cInsA)의 증가된 비율에 의한 자가반응성 IgM의 생성은 복합 항원(0:1, sInsA:cInsA)에 의해 유도되는 이상조절되는 포도당 대사로부터 보호한다는 것을 나타낸다. a: 혈당 수치는 AccuCheck 시스템(Roche)으로 모니터링하였다. 꼬리 정맥에서 갓 뽑은 혈액을 시험 스트립에 도포하고 혈당을 mmol/L 단위로 측정하였다. 평균 +- SD. b: 요당 수치는 Combur M 스트립(Roche)으로 모니터링하였다. 갓 수득한 소변을 시험 스트립의 포도당 필드에 도포하고 제조업체의 표준에 따라 분석하였다. 녹색 막대는 100:1(가용성:복합체) InsA-펩티드를 표시한다. 평균 +- SD. 점은 마우스를 나타낸다. c: 인슐린 특이 혈청 면역글로불린 역가의 결정. InsA-펩티드 면역화 마우스의 혈청을 천연 인슐린 코팅 ELISA 플레이트에 1:3 연속 희석액으로 2회 도포하였다. (a) 59일차 상에서 항인슐린 IgM을 나타냄, 반면 (b) 임의 단위(AU)로 항인슐린 IgG를 나타냄. X축에 표시되는 비율은 가용성 대 복합 InsA-펩티드의 분자 비율을 지칭한다. 평균 +- SD.
도 14는 cInsA 복합체를 사용한 반복되는 재시도는 인슐린-특이적 IgM+ B 세포의 축적을 야기한다는 것을 나타낸다. a: cInsA 면역화(d71) WT 마우스의 비장 세포(d79)의 유세포 분석(FACS). 림프구 게이팅이 있는 전방 및 측면 산란을 나타내는 좌측 패널. 림프구에 사전 게이트된 중간 패널은 B 세포(CD19+ B220+)를 나타낸다. B 세포에 사전 게이트된 우측 패널은 InsA-펩티드 결합의 히스토그램을 나타낸다. 적색: g/μ< 0.1; 흑색: g/μ< 0.1 SAV 대조군만.
도 15는 정제된 혈청 pIgM의 정맥내 투여가 자가면역 이상혈당증을 유발하지 않는다는 것을 나타낸다. a: 쿠마시 염색 SDS 페이지는 환원(b-ME) 조건(좌측 레인) 및 비 환원 조건(우측 레인)에서 InsA 펩티드 (d49) 면역화(적색) 및 CI 마우스(회색)의 정제된 혈청 IgM을 나타낸다. HC: 중쇄, LC: 경쇄. 2개의 독립적인 실험을 나타내는 데이터. b - c: 20μg CI IgM(회색) 또는 InsA IgM(흑색)을 정맥내 주사한 마우스의 혈당 수치. 점은 마우스를 나타낸다(평균 ± SD). CI: 대조군 면역화, pIgM: 보호 IgM. d: ELISA에 의해 측정된 항KLH-IgM 혈청 역가.
도 16은 1차 대 기억 IgM 제어 자가면역 반응의 친화도 및 특이성의 차이를 나타낸다. a: 복합　Ins-A-펩티드(cInsA)를 복강내로 그리고 인슐린 특이적 보호 IgM(PR-IgM)을 48시간 주기로 정맥내로(i.v.) 사용한 면역화 일정의 개략도. *모니터링: 당뇨병 증상은 cInsA 단독 군 내에서만 관찰되었다. b: 복합 InsA-펩티드(cInsA)(적색, n=5) 및 cInsA + 정맥내 주사(i.v.) pIgM(연주황색, n=5)으로 면역화된 7일차 야생형 마우스의 혈당 및 요당 수치. 점은 개별 마우스를 나타낸다(평균 ± SD). c: ELISA에 의해 측정된 7일차(n=8) 및 85일차(n=4) 인슐린-A-펩티드 면역화 마우스의 혈청 항dsDNA-IgM 역가. 점은 개별 마우스를 나타낸다(평균 ± SD). d, f: HEp-2 슬라이드를 통해 분석된 총 혈청 또는 인슐린 특이 IgM(동형 대조군: n=3, 7일차: n=3, 85일차: n=3)을 사용한 7일차(n=3) 및 85일차(n=3)의 대조군 면역화 마우스(CI, n=3), 인슐린-A-펩티드 면역화 마우스의 혈청 항핵-IgM(ANA). 스케일 바: 10μm. 녹색 형광은 핵 구조에 결합된 IgM을 표시한다. e: 쿠마시 염색 SDS 페이지는 인슐린/DNA를 사용한 배양 및 10.000kD(>/< 104kD 지칭)에서 차단된 크기 배제 후 1차(cInsA d7) 및 기억(cInsA d85) 인슐린 특이적 IgM을 나타낸다. IgM 중쇄: 69kD, IgM 경쇄: 25kD, J-세그먼트: 15kD. 제시되는 데이터는 3개의 독립적인 실험을 나타낸다. g: 인슐린 풀다운 후 IgM 동형 대조군(회색, n=6), 기억 PR-IgM(흑색, 보호 인슐린-IgM d85, n=5) 또는 1차 인슐린-IgM(적색, d7, n=4)을 정맥내 주사한 야생형 마우스의 혈당 수치. 평균 ± SD. 통계 분석은 적색 라인 시점과 흑색 라인 시점을 비교한다.
도 17은 인슐린-반응성 IgM을 함유하는 cInsA 면역화 마우스의 혈청의 인슐린-특이적 풀다운을 나타낸다. a: cInsA 면역화 마우스 혈청의 인슐린 특이적 풀다운의 웨스턴 블롯 분석. CI: 대조군 면역화. 상단 패널(녹색)은 IgM 중쇄(IgM HC, 69kD)를 나타내며 하단 패널은 IgG 중쇄(IgG HC, 55kD)를 나타낸다. b: ELISA를 통해 측정된 DNA(좌측) 및 인슐린(우측)에 대한 대조군 면역화 마우스의 혈청 IgM. 평균 +- SD. 점은 개별 마우스를 나타낸다.
도 18은 인슐린의 경우에서의 그래픽 요약을 나타낸다. 인슐린 특이적 B 세포의 반응성은 생리적 조건 하에서 유도 가능한 보호 자가반응성 IgM으로 이어지는 항원 원자가에 의해 조절된다: pIgM: 보호 IgM, sInsulin: 가용성(1가), cInsulin: 복합(다가).
도 19 SARS-CoV-2 유래 RBD를 사용한 면역화 후 항체 반응. 마우스는 면역화 2주 전에 지시된 바와 같이 전처리되었다. 이어서, 마우스를 1일차 및 21일차에 면역화하였다. 혈청을 면역화 농도 후 28일차에 수집하였고 ELISA에 사용하여 Ig 농도를 결정하였다.
도 20: cInsulin으로 마우스를 면역화하면 급성 염증성 췌장염이 유도된다.
A) 천연 인슐린에 결합하는 배중심 B 세포를 나타내는 FACS 측정
B) 췌장 손상에 대한 마커로 사용된 혈청 췌장 리파아제를 나타내는 ELISA 측정. 다가 인슐린에 의해 유도된 자가면역 반응과 일치하게도, 혈청 췌장 리파아제의 현저한 증가가 장기 손상에 대한 명확한 징후로 검출되었다.
C) IgM에 대한 인슐린 결합에 대한 경쟁 검정. cInsA를 사용하여 면역화된 야생형 마우스의 혈청을 BSA(미치료 대조군, UT) 또는 50μg/mL 송아지 흉선 dsDNA(+ DNA)와 사전 배양하였다. 데이터는 dsDNA와 사전 배양 후 1차 IgM(d7)에 대한 인슐린 결합의 상대적 감소를 보여주며, 이는 dsDNA가 1차 IgM에 결합하기 위해 인슐린과 경쟁한다는 것을 시사하며, 이는 PR-IgM과 대조적으로 다중특이적이다
D) PR-IgM과 비교하여 1차 IgM의 친화도 차이를 나타내는 직접 인슐린:IgM 상호작용에 대한 친화도 측정 간섭법 검정을 위한 정량적 데이터.
E) cInsulin(n=3) 또는 대조군 면역화(n=3)를 사용하여 면역화된 마우스의 췌장 상청액의 유세포 분석 기반 비드 검정. 사이토카인 비드(좌측) 및 사이토카인 검출(우측)의 대표적인 히스토그램.
F) 친화도 측정을 위한 정량적 데이터. PR-IgM과 비교하여 1차 IgM의 친화도 차이를 나타내는 직접적인 인슐린:IgM 상호작용에 대한 간섭법 검정.
도 21 자가 항체가 마우스에서 항상성의 균형을 맞추기 위해 필요하다.
A: ELISA(코팅: 천연 인슐린)를 통해 측정된 상이한 IgG 풀다운의 인슐린 특이적 IgG 농도. 총계: 단백질 G(n=5)를 통한 총 IgG 풀다운, 인슐린 특이적: 인슐린 베이트 컬럼(n=5)을 통한 IgG 풀다운, 대조군 IgG(n=3). B: 총 IgG(혈청으로부터의 풀다운) 및 IgG 대조군(항인슐린-IgG에 대해 고갈된 총 IgG)을 나타내는 쿠마시 염색 SDS 페이지. 제시되는 이미지는 3개의 독립적인 실험을 나타낸다. 좌측 마커는 킬로달톤(kD)으로 나타나 있다. C: ELISpot(코팅: 천연 인슐린)에 의해 측정된 나이브 야생형 및 B 세포-결핍(B 세포-결핍) 마우스의 항인슐린-IgG 분비 비장 세포. 세포를 300.000 세포/웰로 시딩하고 48시간 동안 배양하였다. D: 상업적으로 이용 가능한 혈당 모니터(mmol/L)로 측정한 나이브 야생형 및 B 세포 결핍 마우스의 혈당 수치. E: 지시된 시간에 측정된 항인슐린-IgG에 대해 고갈된 IgG인 총 200μg의 IgG가 정맥 주사된 야생형 및 B 세포 결핍 마우스의 혈당 수치. F: 와이어 행잉 테스트(온 와이어 초 단위)로 측정한 야생형(WT) 및 B 세포 결핍(B 세포 결핍) 마우스의 운동 기능. 회색: WT 미치료, 청색: B 세포 결핍 미치료, 녹색: 총 IgG 200μg을 주사한 B 세포 결핍. G: 표시되는 시점에 ELISA에 의해 측정된 바와 같이 100μg의 상업적으로 이용 가능한 인간 IVIg를 주사한 B 세포 결핍(B 세포 결핍) 마우스의 인슐린 역가. H: 표시되는 시간에 상업용 혈당 모니터(mmol/L)에 의해 측정된 항인슐린-IgG에 대해 고갈된 상업적으로 이용 가능한 인간 IVIg(회색) 및 상업적으로 이용 가능한 인간 IVIg(흑색)가 200μg 주사된 야생형 마우스의 혈당 수치. I: 건강한 공여체(HD) 대조군과 비교하여 치료 전(사전) 및 후(사후) IVIg(500mg/kg)를 받은 면역결핍 환자(공통 가변 면역결핍, CVID)의 혈청 포도당 수치.
J: 생물층 간섭법(BLI)에 의해 결정된 인간 항인슐린-IgG의 인슐린 결합 친화도. Kd(해리 상수)는 Ka(결합 상수)를 사용하여 계산되었다: 1/Ka. 나타낸 데이터는 3개의 독립적인 실험을 나타낸다.
도 22 중화 및 PR-IgM은 인간에서 존재한다.
A: ELISA(코팅: 천연 인슐린)를 통해 측정된 청년층(< 30세) 및 노년층(> 65세) 개체의 혈청 항인슐린-IgM 농도. 여성(청년층): n=25, 여성(노년층): n=11, 남성(청년층): n=15, 남성(노년층): n=12. 평균, ± SD, 통계적 유의성은 크러스컬-월리스 시험을 사용하여 계산하였다. B: 저친화도 분획 및 고친화도 분획으로 분획화된 인슐린 특이적 IgM의 컬럼 기반 정제를 나타내는 개략도. C: 정제 후 저친화도 항인슐린 IgM(적색) 및 고친화도 항인슐린 IgM(녹색)을 나타내는 쿠마시 염색 SDS 페이지. 제시되는 이미지는 3개의 독립적인 실험을 나타낸다. 좌측 마커는 킬로달톤(kD)로 나타나 있다, HC(중쇄): 70kD, LC(경쇄): 25kD, J(J 세그먼트): 15kD. D: 인슐린 특이적 IgM 풀다운의 항DNA 반응성 IgM을 나타내는 HEp2 슬라이드. 흑색: 단클론 IgM 대조군(n=6), 적색: 저친화도 항인슐린 IgM(n=6), 녹색: 고친화도 항인슐린 IgM(n=6). 스케일 바: 10μm. 녹색 형광은 HEp2 세포 결합을 표시한다. 3개의 독립적인 실험을 나타내는 이미지. E: ELISA(코팅: 송아지-흉선 DNA)에 의해 측정된 바와 같은 인슐린 특이적 IgM 풀다운의 항dsDNA-IgM 농도. IgM 대조군(대조군, n=3), IgM낮음(n=3), IgM높음(n=3). 평균, ± SD, 통계적 유의성은 크러스컬-월리스 시험을 사용하여 계산하였다. F: 생물층 간섭법(BLI)에 의해 결정된 인간 항인슐린-IgM 풀다운의 인슐린 결합 친화도. Kd(해리 상수)는 Ka(결합 상수)를 사용하여 계산되었다: 1/Ka. 나타낸 데이터는 3개의 독립적인 실험을 나타낸다. 대문자는 친화도 분수를 나타낸다. G: 100μg 인간 인슐린 특이적 IgM(대문자는 친화도 분획을 지칭함) 및 인간 IgM 대조군을 정맥내 주사한 야생형 마우스의 혈당 수치. H, I: 100μg 인간 인슐린 특이적 IgM(대문자는 친화도 분획을 지칭함) 및 인간 IgM 대조군을 500ng 천연 인슐린(H) 및 100μg 인간 항인슐린-IgG(I)와 함께 정맥 주사한 야생형 마우스의 혈당 수치. J: ELISA에 의해 결정된 청년층(< 30세) 및 노년층(> 65세) 개체의 인슐린 특이적 IgM의 비율. 인슐린 특이적 IgM은 실험 전 인슐린 베이트 컬럼을 통해 단리되었다.
도 23 내인성 인슐린 복합체는 마우스에서 강력한 자가면역을 유도한다.
A: 1,2-페닐렌-비스-말레이미드를 통한 티올기 매개 이황화물 가교결합에 의해 생성된 인슐린 사량체(cInsulin)의 개략도. 흑색 선: 내인성 이황화 결합, 적색 선: 유도된 이황화 결합. B: 10 kD 크기 배제 컬럼(우측 패널)으로 정제한 후 인슐린(좌측 레인) 및 가교결합된 인슐린(우측 레인; 좌측 패널) 및 cInsulin 복합체를 나타내는 쿠마시 염색 SDS 페이지. 제시되는 이미지는 3개의 독립적인 실험을 나타낸다. 좌측 마커는 킬로달톤(kD)으로 나타나 있다. C: PBS(대조군 주사; CI, n=5), cInsulin(n=5), 인슐린:SAV(n=5)로 0일차에 복강내 주사된 야생형 마우스의 혈당 수치. 평균, ± SD, 통계적 유의성을 반복 측정 ANOVA 시험을 사용하여 계산하였다. D: 표시되는 일차에 ELISA(코팅: 천연 인슐린)에 의해 측정된 PBS(대조군 주사; CI, n=5) 및 cInsulin(n=3)으로 0일차에 복강내 주사된 야생형 마우스의 혈청 항인슐린-IgM 농도. 평균, ± SD, 통계적 유의성은 크러스컬-월리스 시험을 사용하여 계산하였다. E: PBS(대조군 주사; CI, n=5) 및 cInsulin(n=5)으로 0일차와 21일차에 복강내 주사 후 100μg의 항인슐린 IgM(고친화도) 또는 100μg IgM 대조군을 22일차에 정맥내 주사한 야생형 마우스의 혈당 수치. F: 정맥내 100μg 항인슐린-IgM(고친화도) 또는 100μg IgM 대조군과 함께 PBS(n=5) 및 cInsulin(n=5/군)을 복강내 주사한 마우스의 유세포 분석. 패널은 생존 가능한 세포에 사전 게이팅된 췌장 대식세포(CD11b+) 및 호중구(Ly6G+)를 나타낸다. 이미지는 3개의 독립적인 실험을 나타낸다. G: 정맥내 100μg 항인슐린-IgM(고친화도) 또는 100μg IgM 대조군과 함께 PBS(n=5) 및 cInsulin(n=5/군)을 복강내 주사한 야생형 마우스의 혈청 췌장 리파제 수치. H: 식균작용 활성을 평가하는 데 사용되는 대식세포 검정의 개략도. I: 고친화도 또는 저친화도 뮤린 항인슐린-IgM으로 수행된 비드 기반 식균 작용 검정의 유세포 분석. 좌측 패널은 고친화도 또는 저친화도 IgM의 존재 하에서 대식세포 식균율에 대한 대표적인 FACS 플롯을 나타낸다. 우측 패널은 대식세포 식균율에 대한 정량 분석을 나타낸다.
도 24 단클론 인간 인슐린-IgM은 생체 내(in vivo)에서 인슐린을 보호할 수 있다.
A: 정제 후 단클론 항인슐린-IgM 및 IgG를 나타내는 쿠마시 염색 SDS 페이지. 제시되는 이미지는 3개의 독립적인 실험을 나타낸다. 좌측 마커는 킬로달톤(kD)으로 나타나 있다. B: 생물층 간섭법(BLI)에 의해 결정된 단클론 인간 항인슐린-Ig의 인슐린 결합 친화도. Kd(해리 상수)는 Ka(결합 상수)를 사용하여 계산되었다: 1/Ka. 나타낸 데이터는 3개의 독립적인 실험을 나타낸다. C: ELISA(코팅: 송아지-흉선 DNA)에 의해 측정된 바와 같은 인슐린 특이적 IgM 풀다운의 항dsDNA-IgM 농도. IgM 대조군(대조군, n=4), IgMMY(n=4), IgGMY(n=4). D: 항DNA-반응성 단클론 IgMMY(n=6) 및 IgGMY(n=6)를 나타내는 HEp2 슬라이드. 스케일 바: 10μm. 녹색 형광은 HEp2 세포 결합을 표시한다. 3개의 독립적인 실험을 나타내는 이미지. E: PBS(대조군 주사; CI, n=5) 및 cInsulin(n=5)으로 0일차와 21일차에 복강내 주사 후 100μg의 항인슐린 IgM(고친화도) 또는 100μg IgM 대조군을 22일차에 정맥내 주사한 야생형 마우스의 혈당 수치. F: PBS(대조군 주사; CI, n=5) 및 cInsulin(n=5)으로 0일차와 21일차에 복강내 주사 후 100μg의 항인슐린 IgM(고친화도) 또는 100μg IgM 대조군을 22일차에 정맥내 주사한 야생형 마우스의 혈당 수치. G: PBS(대조군 주사; CI, n=5) 및 cInsulin(n=5)으로 0일차와 21일차에 복강내 주사 후 100μg의 항인슐린 IgM(고친화도) 또는 100μg IgM 대조군을 22일차에 정맥내 주사한 야생형 마우스의 요당 수치.
도 25 mb1-결핍 마우스에서 항체 분비 세포 없음.
A: 야생형 및 B 세포 결핍 마우스의 혈액에 대한 유세포 분석. 전방 및 측면 분산 상태의 세포를 나타내는 좌측 패널. 림프구에 사전 게이팅된 세포를 나타내는 중간 및 우측 패널.
B: ELISpot으로 측정한 야생형 및 B 세포 결핍 마우스의 IgG 분비 비장 세포. 50.000개의 비장 세포를 웰마다 시딩하였다.
C, D: ELISA에 의해 측정된 야생형 및 B 세포 결핍 마우스의 혈청 총 IgG(C) 및 총 IgM(D) 역가.
다음에서, 본 발명의 구성요소가 설명될 것이다. 이러한 구성요소는 특정 실시양태와 함께 열거된다. 그러나, 추가 실시양태를 생성하기 위해 임의의 방식으로 그리고 임의의 개수로 조합될 수 있음을 이해하여야 한다. 다양하게 설명된 예 및 바람직한 실시양태는 명시적으로 설명된 실시양태로만 본 발명을 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 이 설명은 2개 이상의 명시적으로 설명되는 실시양태를 조합하거나 1개 이상의 명시적으로 설명되는 실시양태를 임의의 수의 개시내용 및/또는 바람직한 구성요소와 조합하는 실시양태를 뒷받침하고 이를 포함하는 것으로 이해하여야 한다. 또한, 본 출원에서 모든 설명되는 구성요소의 임의의 순열 및 조합은 문맥상 달리 나타내지 않는 한 본 출원의 설명에 의해 개시되는 것으로 간주되어야 한다.
따라서, 본 발명은 올리고머성 항인슐린 항체에 관한 것이며, 항체는 (i) Kd < 5 x 10-7의 인슐린 및/또는 프로인슐린에 대한 친화도를 갖는다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 올리고머성 항인슐린 항체에 관한 것이며, 항체는 (i) 바람직하게는, 표면 플라즈몬 공명에 의해 측정된 바와 같이, Kd < 5 x 10-7의 인슐린 및/또는 프로인슐린에 대한 친화도를 갖고/갖거나; (ii) 인슐린 및/또는 프로인슐린에 대해 단일특이적이다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 올리고머성 항인슐린 항체에 관한 것이며, 항체는 (i) Kd < 5 x 10-7의 인슐린 및/또는 프로인슐린에 대한 친화도를 갖고/갖거나; (ii) 인슐린 및/또는 프로인슐린에 대해 단일특이적이다.
본원에서 사용되는 바와 같은 항체의 맥락에서 용어 "단일특이적"은 각각 동일한 항원의 동일한 에피토프에 결합하는 하나 이상의 결합 부위를 갖는 항체를 의미한다. 더 중요한 것은, 본 발명의 맥락에서 용어 "단일특이적"은 인슐린과 같은 하나의 항원에 대해 높은 친화도를 갖고 임의의 다른 항원에 특이적으로 결합하지 않는 이러한 항체에 관한 것이다. 본 실시양태에서, 단일특이적 항체는 10-7nM 미만, 바람직하게는, 10-8nM 미만, 더 바람직하게는, 10-9nM 미만 및 가장 바람직하게는 약 10-10nM의 KD를 갖는 인슐린과 같은 자가면역 장애와 연관된 항원에 결합한다. 따라서 이러한 단클론 IgM은 자가면역 장애와 연관된 항원 이외의 항원인 비관련 항원에 결합하지 않으며, 그렇기 때문에 본 발명을 통한 치료는 바람직하게는 자가면역 장애와 연관된 항원 이외의 항원인 비관련 항원에 특이적인 다중특이적 항체의 사용을 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 항체의 단일특이성은 항체가 ELISA에서 dsDNA를 인식하지 않고 Hep-2 슬라이드에서 결합을 나타내지 않는다는 점에서 정의된다(예를 들어, 실시예 4, 도 16c, 16d 및 물질 및 방법 참조).
본원에서 사용되는 바와 같이 용어 "KD"는 Kd 대 Ka의 비율(즉, Kd/Ka)로부터 수득되며 몰 농도(M)로서 표현되는 해리 상수를 지칭하는 것으로 의도된다. 항체에 대한 KD 값은 플라즈몬 공명(BIAcore®), 생물층 간섭법(BLI), ELISA 및 KINEXA와 같은 해당 기술분야에서 잘 확립된 방법을 사용하여 결정될 수 있다. 항체의 KD를 결정하기 위한 바람직한 방법은 표면 플라즈몬 공명을 사용하는 것, 바람직하게는, BIAcore® 시스템과 같은 바이오센서 시스템을 사용하거나 ELISA를 사용하는 것이다. 본원에서 사용되는 바와 같이 "Ka"(또는 "K-assoc")는 특정 항체-항원 상호작용의 결합 속도를 광범위하게 지칭하는 반면, 본원에서 사용되는 바와 같이 용어 "Kd"(또는 "K-diss")는 특정 항체-항원 상호작용의 해리 속도를 지칭한다. 다른 바람직한 방법은 BLI의 사용이다. 용어 "생물층 간섭법" 또는 "BLI"는 두 표면, 즉, 바이오센서 팁의 고정화 단백질 층과 내부 참조 층으로부터 반사되는 백색광의 간섭 패턴을 분석하는 광학 분석 기법을 지칭한다. 바이오센서 팁에 결합된 분자 수의 임의의 변화는 실시간으로 측정될 수 있는 간섭 패턴의 변경을 야기한다. 일부 실시양태에서, Kd는 표면 플라즈몬 공명에 의해 측정된다.
본원에서 설명되는 인슐린은 임의의 공급원으로부터 유래할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에서 설명되는 인슐린은 포유동물 인슐린, 부분 또는 완전 합성 인슐린, 바람직하게는, 인간 인슐린이다. 일부 실시양태에서, 본원에서 설명되는 인슐린은 인슐린 변이체 또는 아스파르트, 리스프로, 글루리신, 글라르긴, 데테미르, 데글루텍의 군으로부터 선택되는 인슐린 유사체와 같은 인슐린 유사체이다.
또한, 본원에서 설명되는 바와 같은 항인슐린 항체는 항프로인슐린 항체 또는 항프로인슐린 및 항인슐린 항체일 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이 용어 "프로인슐린"은 B 및 A 인슐린 폴리펩티드 사슬을 연결하는 연결 펩티드 또는 "C-펩티드"를 포함하는 인슐린 폴리펩티드를 지칭한다.
본 발명자들은 인슐린 활성이 건강한 대상체 및 당뇨병 대상체에서 상이한 항인슐린 항체에 의해 조절된다는 것을 입증한다(예를 들어, 실시예 6, 7 참조). 본원에는 이러한 조절 시스템을 사용하고/하거나 이에 영향을 주는 수단 및 방법이 제공된다. 특히, 본 발명자들은 인슐린에 대한 단일특이적 및/또는 고친화도 결합과 결합하는 올리고머성 항인슐린 항체가 인슐린 기능에 대한 보호 효과를 갖는다는 것을 입증한다. 이론에 얽매이지 않고, 본원에서 설명되는 올리고머성 항인슐린 항체는 덜 선택적 및/또는 특이적인 항체의 결합 시 분해로부터 인슐린을 보호한다(실시예 7).
따라서, 본 발명은 적어도 부분적으로 인슐린 활성에 대한 올리고머성 항인슐린 항체의 보호/조절 효과에 기반한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은대상체에서 세포 매개 표적 항원 특이적 면역 반응을 유발 및/또는 조절하는 방법에 관한 것이며, 방법은 대상체의 (B 세포와 같은) 하나 이상의 면역 세포를
(i) 질환 연관 항원에 대한 항체 매개 면역 반응을 유도할 수 있는 1개 이하의 항원성 구조를 포함하는 항원성부로 구성되는 1가 항원 입자 및
(ii) 질환 연관 항원에 대한 항체 매개 면역 반응을 유도할 수 있는 2개 이상의 항원성 구조를 포함하는 항원성부로 구성되는 다가 항원 입자를 포함하는 조합과 접촉하게 하는 단계를 포함하며 여기서 2개 이상의 항원성 구조는 공유 또는 비공유 가교결합된다.
제1 양태에 대한 대안인 일부 실시양태에서, 본 발명은 대상체에서 세포 매개 표적 항원 특이적 면역 반응을 유발 및/또는 조절하는데 사용하기 위한 조합에 관한 것이며, 조합은
(i) 질환 연관 항원에 대한 항체 매개 면역 반응을 유도할 수 있는 1개 이하의 항원성 구조를 포함하는 항원성부로 구성되는 1가 항원 입자 및
(ii) 질환 연관 항원에 대한 항체 매개 면역 반응을 유도할 수 있는 2개 이상의 항원성 구조를 포함하는 항원성부로 구성되는 다가 항원 입자를 포함하며 여기서 2개 이상의 항원성 구조는 공유 또는 비공유 가교결합되며;
여기서 조합은 대상체의 하나 이상의 면역 세포를 조합과 접촉하게 하여 사용된다.
제1 및 제2 양태의 추가 대안에서, 조합은 대상체 또는 환자에서 질환의 치료 또는 예방(백신접종)에 사용하기 위한 것이며 이는 조합 또는 조합의 적어도 (i) 또는 (ii)를 대상체 또는 환자에게 치료적 또는 예방적 유효량으로 투여하는 것을 포함한다. 본 발명의 맥락에서 치료적 유효량은 IgG 유형 또는 IgM 유형(또는 IgA) 면역 반응과 같은 특정 B 세포 매개 면역 반응을 유도하거나 이를 억제하는 양이다.
본 발명은 항원이 가용성 항원으로서 또는 복합 다가 항원으로서 면역 세포에 제시되는지 여부에 따라 상이한 면역 반응을 유도할 수 있다는 놀라운 발견에 입각한다. 후자는 특히 강력하고 기억력 있는 IgG 항체 반응으로 이어지는 반면, 전자는 이러한 IgG 반응을 억제할 수 있으며 보호 IgM(또는 IgA) 항체 반응을 유도할 수 있다. 따라서, 본 발명은 B 세포 면역의 초점을 제어하기 위해 복합 면역 반응에 대해 가용성인 비율을 조절하는 것을 제안한다. 해당 접근법은 신규 제어 백신접종 치료에서 또는 당뇨병과 같은 자가면역 질환에 대처하기 위해 사용될 수 있다.
본원에서 설명되는 방법은 일부 실시양태에서 비치료적 및 비외과적 방법이다. 본 실시양태에서, 본 발명의 방법은 대상체를 치료하기 위한 것이 아니라, 예를 들어, 후속 단계에서 단리되는, 신규 항체의 생성 및 단리를 위한 면역 반응을 유도하기 위한 것이다. 본 실시양태에서, 대상체는 방법을 수행하여 치료되는 임의의 질환을 앓지 않는 일반적으로 건강한 대상체이다. 본 실시양태에서, 대상체는 바람직하게는 비인간 척추동물이다.
본 발명의 맥락에서 "세포 매개 표적 항원 특이적 면역 반응"은 하나 이상의 B 림프구(B 세포)를 수반하는 면역 반응, 바람직하게는, B 세포 매개 면역 반응을 지칭할 것이다. 본원에서 사용되는 바와 같이 용어 "B 림프구" 또는 "B 세포"는 적응 면역계의 체액성 면역에서 역할을 하는 림프구를 지칭하며, 이는 세포 표면 상의 B 세포 수용체(BCR)의 존재를 특징으로 한다. B 세포 유형은 형질 세포, 기억 B 세포, B-1 세포, B-2 세포, 변연부 B 세포, 여포성 B 세포 및 조절 B 세포(Breg)를 포함한다.
현재 출원 내에서 사용되는 바와 같이 용어 "가(valent)"는 각각 항체 또는 항원 분자에서 특정 수의 결합 부위의 존재를 나타낸다. 이와 같이, 항체의 결합 부위는 파라토프인 반면, 항원에서 있는 결합 부위는 일반적으로 에피토프라고 지칭한다. 본 발명에 따른, 예를 들어, 천연 항체 또는 전장 항체는 2개의 결합 부위를 가지며 2가이다. 항원 단백질은 (단량체로서 존재하는 경우) 1가이나, 이러한 항원 단백질이 다량체로 제공되는 경우, 2개 이상의 동일한 에피토프를 포함할 수 있으며, 따라서, 2가, 3가, 4가 등일 수 있는 다가이다. 이와 같이, 용어 "3가"는 항체 분자에서 3개의 결합 부위가 존재함을 의미한다. 이와 같이, 용어 "4가"는 항체 분자에서 4개의 결합 부위가 존재함을 의미한다.
용어 "1가 항원 입자"는 본원에서 개시되는 발명의 맥락에서 분자 또는 분자 복합체, 예컨대, 단백질 또는 단백질 복합체를 지칭하며, 이는 항원성이며, 따라서, 척추동물에서 면역 반응을 자극할 수 있다. 전형적으로, 1가 항원 입자는 이러한 항원성 구조에 대해 항체 매개 면역 반응을 유도할 수 있는 1개 이하의 항원성 구조를 포함하는 항원성부로 구성된다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "항원성 구조"는 항체 매개 면역 반응을 자극하는 능력을 보유하는 항원 단백질의 단편을 지칭한다. 이러한 항원성 구조는 항체와 특이적으로 반응하는, 보다 특이적으로, 항체의 파라토프와 반응하는 분자의 영역을 지칭하는 항원 결정자 또는 "에피토프"를 제공하는 것으로 이해된다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 1가 항원 입자는 항원성 구조의 하나의 특정 에피토프의 1개 이하의 복제를 포함한다. 따라서, 바람직하게는, 특이적 파라토프를 갖는 특정 항체 종의 단 하나의 항체 분자가 본 발명에 따른 1가 항원 입자에 결합할 수 있다.
용어 "다가 항원 입자"는 본원에서 개시되는 발명의 맥락에서 분자 또는 분자 복합체, 예컨대, 단백질 또는 단백질 복합체를 지칭하며, 이는 항원성이며, 따라서, 척추동물에서 면역 반응을 자극할 수 있다. 본 발명에서, 1가 항원 입자와 달리, 다가 항원 입자는 항체 매개 면역 반응을 유도할 수 있는 2개 이상의 항원성 구조를 포함하는 항원성부로 구성된다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 다가 항원 입자는 항원성 구조의 하나의 특이적 에피토프의 2개 이상의 복제를 포함한다. 따라서, 바람직하게는, 특정 파라토프를 갖는 특정 항체 종의 2개 이상의 항체 분자가 본 발명에 따른 1가 항원 입자에 결합할 수 있다. 이러한 다가 항원 입자는 2개 이상의 항원성 구조가 서로 공유 또는 비공유 가교결합되는 구조를 가질 수 있다. 따라서, 다가 항원 입자는, 바람직한 실시양태에서, 적어도 2개, 적어도 3개 또는 적어도 4개의 동일한 에피토프를 포함하는 복합체를 포함하며, 이는 동시에 다가 항원 입자에 대한 2개의 항체의 결합을 가능하게 한다. 바람직하게는, 다가 항원 입자의 항원성부에 포함되는 2개 이상의 항원성 구조는 다수의 동일한 항원성 구조를 포함한다.
바람직하게는, 본 발명의 다가 항원 입자는 바람직하게는 1nm 내지 10μm, 더 바람직하게는, 1nm 내지 5μm, 1nm 내지 1000nm, 1nm 내지 500nm, 1nm 내지 100nm, 1nm 내지 50nm 및 1nm 내지 10nm 범위로부터 선택되는 나노미터 범위 내의 서로 공간적으로 근접한 항원성 구조의 적어도 2개의 복제를 포함한다.
본 발명의 맥락에서, 본 발명의 1가 항원 입자는 종종 "가용성" 입자 또는 항원으로 지칭되는 반면 다가 항원 입자는 "복합" 입자 또는 항원으로 지칭된다.
본 발명의 다른 실시양태에서, 1가 항원 입자는 항원성부에, 선택적으로, 링커를 통해, 결합되는 담체 부분을 더 포함하며, 여기서 담체 및, 선택적으로, 링커는 항원성 구조의 다른 복제를 포함하지 않으며, 여기서 담체 부분 및, 선택적으로, 링커는 표적 항원에 대한 세포 매개 면역 반응을 유발할 수 없다. 본 발명의 다른 대안적인 또는 추가 실시양태에서, 다가 항원 입자는 항원성부에, 선택적으로, 링커를 통해, 결합되는 담체 부분을 더 포함한다. 본 발명의 맥락에서 "링커"는 본 발명의 화합물의 2개 부분을 서로 공유 또는 비공유 연결하기 위해 사용될 수 있는 임의의 분자 또는 분자들, 단백질 또는 펩티드를 포함할 수 있다.
본원에서 개시되는 발명의 맥락에서 용어 "담체 부분"은 바람직하게는 본 발명의 입자의 항원성 구조를 나타내거나 이를 포함하는 물질 또는 구조에 관한 것이다. 담체 부분은 바람직하게는 면역원성 또는 비면역원성 폴리펩티드, 면역 CpG 섬(CpG island), 림펫 헤모시아닌(KLH), 파상풍 톡소이드(TT), 콜레라 독소 소단위체 B(CTB), 박테리아 또는 박테리아 고스트, 리포좀, 키토좀, 비로좀, 마이크로스피어, 수지상 세포, 입자, 마이크로입자, 나노입자 또는 비드로부터 선택되는 물질 또는 구조이다.
바람직하게는, 담체 부분, 및 선택적으로, 링커는 자가면역 장애와 연관된 항원과 같은 표적 항원에 대해 세포 매개 면역 반응을 유발할 수 없다.
본 발명의 맥락에서 "링커"는 바람직하게는 본 발명의 맥락에서 주어진 응용분야를 위해 적합한 임의의 크기 및 길이를 가질 수 있는 펩티드 링커이다. 링커는 1 내지 100개 아미노산, 바람직하게는 2개 내지 50개 아미노산의 길이를 가질 수 있다. 링커는 2회, 3회, 4회, 5회, 6회 또는 그 이상 반복되는 전형적인 4GS 링커일 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 대상체 또는 환자의 하나 이상의 면역세포를 1가 항원 입자 및 다가 항원 입자를 포함하는 조합과 접촉하게 하는 단계는 (i) 1가 항원 입자의 대상체로의 투여를 (ii) 다가 항원 입자의 대상체로의 투여를 또는 (iii) 1가 항원 입자 및 다가 항원 입자의 대상체로의 투여를 수반하며, (i), (ii) 및 (iii)에서 대상체의 면역 세포는 1가 항원 입자 및 다가 항원 입자의 조합과 접촉한 투여의 결과이다. 일반적으로, "접촉"이라는 용어는 이러한 항원 입자를 대상체의 면역계에, 바람직하게는, B 세포 매개 면역 반응을 유도하기 위해, 제시하는 것으로 이해하여야 한다. 바람직하게는, (i)에서, 대상체는 1가 항원 입자의 투여 전의 다가 항원 입자의 존재를 특징으로 하며, (ii)에서, 대상체는 다가 항원 입자의 투여 전의 1가 항원 입자의 존재를 특징으로 한다.
본 발명의 맥락에서, 1가 및 다가 항원의 특정 비율이 B 세포에 의해 매개되는 항체 면역 반응을 조절할 수 있다는 것이 밝혀졌다. 따라서, 1가 항원 입자 및 다가 항원 입자를 포함하는 조합이 본 발명의 바람직한 실시양태이며, 이는 특정 항원비를 포함하며, 이는 바람직하게는 1가 항원 입자 대 다가 항원 입자의 비율이다. 특히, 대상체에서 세포 매개 표적 항원 특이적 면역반응을 조절하는 이러한 바람직한 실시양태는 대상체의 하나 이상의 B 세포를 1보다 큰, 바람직하게는, 101, 102, 103, 104 또는 그 이상보다 큰 특정 항원비를 포함하는 조합과 접촉하게 하여 대상체의 IgG 유형(또는 IgM) 표적 항원 특이적 B 세포 반응의 제어를 구성한다. 본 발명의 다른 실시양태에서, 대상체의 하나 이상의 B 세포를 조합과 접촉하게 하는 단계는 대상체에 1보다 큰, 바람직하게는, 101, 102, 103, 104 또는 그 이상보다 큰, 특정 항원비를 생성하는 데 효과적인 1가 항원 입자의 양을 투여하는 단계를 수반한다.
본 발명의 추가 특정 실시양태에서, 대상체의 하나 이상의 B 세포를 다량의 1가 항원 입자와 접촉하게 하는 단계는 다가 항원 입자를 대상체에 투여하는 단계와 직접적으로 조합하거나 조합하지 않고 투여되는 방법이 바람직하다.
본 발명의 맥락에서. 대상체에서 세포 매개 표적 항원 특이적 면역 반응을 조절하는 단계는 바람직하게는 대상체의 하나 이상의 B 세포를 1보다 작은 바람직하게는 10-1, 10-2, 10-3, 10-4 또는 그 미만보다 작은 특정 항원비를 포함하는 조합과 접촉하게 하여 대상체의 IgG 유형 표적 항원 특이적 B 세포 반응의 증가를 구성한다. 바람직하게는 대상체의 하나 이상의 B 세포를 조합과 접촉하게 하는 단계는 대상체에 1보다 작은, 바람직하게는, 10-1, 10-2, 10-3, 10-4 또는 그 미만보다 작은 특정 항원비를 생성하는 데 효과적인 다가 항원 입자의 양을 투여하는 단계를 포함한다.
대상체의 하나 이상의 B 세포를 다량의 다가 항원 입자와 접촉하게 하는 단계는 1가 항원 입자를 대상체에게 투여하는 단계와 직접적으로 조합하거나 조합하지 않고 투여되는 것이 바람직하다.
용어 "항원"은 항원성 구조를 포함하는 임의의, 바람직하게는 질환 연관 분자 또는 구조를 지칭할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 항원은 자가항원, 암 연관 항원 또는 병원체 연관 항원이다. 본 발명의 일 매우 구체적인 예시적인 실시양태에서, 항원은 인슐린이며 연관 질환은 당뇨병이다. 인간 인슐린 단백질은 c-펩티드, 인슐린 B 사슬 및 활성 인슐린 펩티드를 포함하는 프로인슐린으로서 생성된다. 아미노산 서열 및 추가 특성은 통상의 기술자에게 잘 알려져 있으며 2020년 1월 27일 버전의 UniProt 데이터베이스 수탁번호 제P01308호(https://www.uniprot.org/uniprot/P01308) 하에서 도출될 수 있다.
본 발명의 병원체 연관 항원은 병원성 바이러스 또는 미생물과 같은 병원체에서, 병원체 상에서 또는 병원체에 의해 발현되는 임의의 항원일 수 있으며, 바람직하게는 병원체는 기생충, 단세포 진핵생물, 박테리아, 바이러스 또는 비리온으로부터 선택된다.
본 발명의 항원은 바람직하게는 질환 또는 병태, 바람직하게는, 대상체가 앓고 있거나 앓을 것으로 의심되는 질환 또는 병태와 연관된 항원이다. 이러한 질환은, 언급되는 바와 같이, 병원체 연관, 자가면역 연관, 예를 들어, 치료용 항체와 같은 치료제로서 항원 단백질을 사용하는 경우 치료 연관, 또는 암 연관 등일 수 있다. 본 발명의 항원은 면역원성 물질의 전체, 단편 또는 부분와 같은 천연 또는 합성 면역원성 물질일 수 있으며, 면역원성 물질은 핵산, 탄수화물, 펩티드, 합텐 또는 임의의 이들의 조합으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 맥락에서, 질환 또는 병태는 증가되거나 감소되는 세포 매개 면역 반응이 치료에 유익한 것을 특징으로 하는 질환 또는 병태로부터 선택된다. 따라서, 본 발명은 염증성 장애, 자가면역 질환, 증식성 장애 또는 감염성 질환으로부터 선택되는 질환 또는 병태와 같은 질환의 치료로서 본원에서 설명되는 방법에 따른 면역계의 본원에서 설명되는 조절을 제공한다.
용어 "B 세포"("B 림프구"로도 알려짐)는 세포 표면 면역글로불린 분자를 발현하고 활성화 시 최종적으로 항체를 분비하는 세포로 분화되는 면역 세포를 지칭한다. 따라서, 이는 예를 들어, 통상적인 B 세포, CD5 B 세포(B-1 세포 및 전이 CD5 B 세포로도 알려짐)를 포함한다. 또한, "B 세포"는 B 세포 돌연변이에 대한 지칭을 포함하는 것으로 이해하여야 한다. "돌연변이"는 유전자 변형된 세포와 같이 자연적으로 또는 비자연적으로 변형된 B 세포를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 또한, "B 세포"에 대한 지칭은 B 세포 이미지에 대한 예정(commitment)을 나타내는 B 세포로 확장되는 것으로 이해하여야 한다. 이러한 세포는 발달의 임의의 분화 단계에 있을 수 있으며, 따라서, 반드시 표면 면역글로불린 분자를 발현하지는 않을 수 있다. B 세포 예정은 면역글로불린 유전자 재배열의 시작을 특징으로 할 수 있거나 CD45R, MHCII, CD10, CD19 및 CD38의 세포 표면 발현과 같은 일부 다른 표현형 또는 기능적 특징을 특징으로 하는 초기 예정 단계에 해당할 수 있다. 분화의 다양한 단계에 있는 B 세포의 예는 초기 B 세포 전구체, 초기 프로(pro)-B 세포, 후기 프로-B 세포, 프리(pre)-B 세포, 미성숙 B 세포, 성숙 B 세포, 형질 세포 및 기억 (B) 세포를 포함한다. 본 발명의 맥락에서, B 세포는 주로 IgM 유형 B 세포 수용체를 발현하는 미성숙 B 세포, 주로 IgD 유형 B 세포 수용체를 발현하는 성숙 B 세포 또는 IgG 유형 B 세포 수용체를 발현하는 기억 B 세포로 볼 수 있다. IgM 유형과 IgD 유형 B 세포 수용체의 차이점은 μ 또는 δ 유형 중 하나인 중쇄 서열의 유형이다.
본 발명의 맥락에서, 용어 "세포 매개 표적 항원 특이적 면역 반응"은 바람직하게는, 면역 세포, 예컨대, 림프구, 바람직하게는, B 림프구(B 세포 매개 면역 반응)를 포함하는 세포성 면역 유형 반응에 관한 것이며, 이는 바람직하게는 표적 항원에 특이적인 하나 이상의 항체 또는 이의 변이체 및/또는 B 세포 수용체 및/또는 이의 변이체를 포함하고/하거나 발현한다. 바람직하게는, 세포 매개 표적 항원 특이적 면역 반응은 면역글로불린(Ig)M, IgD, IgA 또는 IgG 유형 항체 및/또는 B 세포 수용체를 발현하는 B 세포를 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "항체"는 이의 에피토프에 결합할 수 있는 임의의 면역글로불린(Ig)으로 최광의로 이해할 수 있다. 이와 같은 항체는 ABP의 종이다. 전장 "항체" 또는 "면역글로불린"은 일반적으로 2개의 동일한 경쇄 및 2개의 동일한 중쇄로 구성되는 약 150kDa의 이종사량체 당단백질이다. 각 경쇄는 하나의 공유 이황화 결합에 의해 중쇄에 연결되는 반면, 이황화 결합의 수는 상이한 면역글로불린 동형의 중쇄 사이에서 다양하다. 또한, 각 중쇄 및 경쇄는 규칙적으로 이격되는 쇄내 이황화 브리지(bridge)를 갖는다. 각각의 중쇄는 아미노 말단 가변 도메인(VH)에 이어서 3개의 카르복시 말단 불변 도메인(CH)을 갖는다. 각 경쇄는 가변 N 말단 도메인(VL) 및 단일 C 말단 불변 도메인(CL)을 갖는다. VH 및 VL 영역은 프레임워크 영역(FR)이라고 하는 더 보존된 영역이 산재된, 상보성 결정 영역(CDR)이라고 하는 초가변 영역으로 추가로 세분될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성되며, 아미노-말단부터 카르복시-말단까지 다음 순서로 배열된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 함유한다. 항체의 불변 영역은 면역계의 다양한 세포(예를 들어, 효과기 세포) 및 고전적 보체 시스템의 제1 성분(C1q)을 포함하는 세포 또는 인자에 대한 면역글로불린의 결합을 매개할 수 있다. 다른 형태의 항체는 중쇄 항체를 포함하며, 이는 2개의 중쇄로만 구성되고 항체에서 일반적으로 발견되는 2개의 경쇄가 결여된다. 중쇄 항체는 단봉낙타, 낙타, 라마 및 알파카와 같은 낙타류의 hcIgG(IgG 유사) 항체 및 연골 어류(예를 들어, 상어)의 IgNAR 항체를 포함한다. 그리고, 또 다른 형태의 항체는 단일 단량체 가변 항체 도메인으로 구성되는 항체 단편인 단일 도메인 항체(개발사 Ablynx에서 Nanobody라고 하는 sdAb)를 포함한다. 단일 도메인 항체는 전형적으로 중쇄 항체로부터 생성되나 통상적인 항체에서 유래될 수도 있다.
본 발명의 맥락에서 논의되는 전형적인 항체 Ig 변이체는 IgG, IgM, IgE, IgA 또는 IgD 항체를 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "IgG"는 해당 기술분야에서 이의 일반적인 의미를 가지며 중 g 쇄를 보유하는 면역글로불린을 지칭한다. 항원에 대한 2차 면역 반응의 일부로서 생성되는 이러한 면역글로불린 부류는 총 혈청 Ig의 대략 75%를 구성한다. IgG는 인간에서 태반을 통과할 수 있는 유일한 Ig 부류이며 생후 1개월 동안 신생아를 보호하는 데 큰 역할을 한다. IgG는 혈액, 림프액, 뇌척수액 및 복막액의 주요 면역글로불린이며 체액성 면역 반응의 핵심 역할을 한다. 건강한 인간의 혈청 IgG는 알부민, 효소, 다른 글로불린 등 외에 총 단백질의 약 15%를 제시한다. 인간, 마우스 및 래트에서 설명되는 4개의 IgG 하위부류가 있다(예를 들어, 인간에서 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4). 하위부류는 이황화 결합의 수와 힌지 영역의 길이 및 유연성이 상이하다. 가변 영역을 제외하고 한 부류 내의 모든 면역글로불린은 약 90%의 상동성을 공유하나 부류 사이에는 60%만 공유한다. IgG1은 전체 주요 하위부류 IgG의 60 내지 65%를 구성하며 단백질 및 폴리펩티드 항원에 대한 흉선 매개 면역 반응을 주로 담당한다. IgG1은 식세포의 Fc 수용체에 결합하며 C1 복합체에 대한 결합을 통해 보체 캐스케이드를 활성화할 수 있다. IgG1 면역 반응은 신생아에서 이미 측정할 수 있으며 유아기에서 전형적인 농도에 도달한다. 두 번째로 큰 IgG 동형인 IgG2는 주요 하위부류의 20 내지 25%를 구성하며 탄수화물/다당류 항원에 대한 일반적인 면역 반응이다. "성인" 농도는 보통 6 내지 7세에 도달한다. IgG3는 총 IgG의 약 5 내지 10%를 구성하며 단백질 또는 폴리펩티드 항원에 대한 면역 반응에서 중요한 역할을 한다. IgG3의 친화도는 IgG1의 친화도보다 높을 수 있다. 일반적으로 전체 IgG의 4% 미만을 포함하는 IgG4는 다당류에 결합하지 않는다. 과거에 IgG4에 대한 검사는 음식 알레르기와 연관되어 있었으며, 최근 연구에 따르면 IgG4 양성 형질 세포의 침윤으로 인해 야기되는 경화성 췌장염, 담관염 및 간질성 폐렴을 앓고 있는 환자에서 IgG4의 혈청 수치가 상승하는 것으로 나타났다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 올리고머성 항인슐린 항체에 관한 것이며, 여기서 올리고머성 항인슐린 항체는 IgM 동형의 항인슐린 항체이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "IgM"은 해당 기술분야에서 이의 일반적인 의미를 가지며 중 m 쇄를 보유하는 면역글로불린을 지칭한다. 혈청 IgM은 포유동물에서 오량체(또는 육량체)로 존재하며 정상 인간 혈청 Ig 함량의 대략 10%를 구성한다. 이는 대부분의 항원에 대한 1차 면역 반응에서 우세하며 가장 효율적인 보체 고정 면역글로불린이다. 또한, IgM은 B 림프구의 원형질막에서 막 연관 면역글로불린(막에서 다단백질 군집으로 구성될 수 있음)으로 발현된다. 이러한 형태에서, 이는 막에서 고정하기 위한 추가 소수성 도메인을 각각 함유하는 H 사슬을 갖는 B 세포 항원 수용체이다. 혈청 IgM의 단량체는 이황화 결합과 결합(J) 사슬에 의해 함께 결합된다. 오량체 구조 내의 각각의 5개의 단량체는 2개의 경쇄(각각 카파 또는 람다) 및 2개의 중쇄로 구성된다. IgG(및 위에서 나타낸 일반화된 구조)와 달리 IgM 단량체의 중쇄는 하나의 가변 영역과 4개의 불변 영역으로 구성되며, 힌지 영역을 대체하는 추가 불변 도메인을 갖는다. IgM은 침입하는 미생물의 에피토프를 인식하며, 이는 세포 응집을 유도할 수 있다. 이러한 항체-항원 면역 복합체는 보체 고정 또는 대식세포에 의한 수용체 매개 내포작용에 의해 파괴된다. IgM은 신생아에 의해 합성되는 최초의 면역글로불린 부류이며 일부 자가면역 질환의 병인에서 역할을 한다. 면역글로불린 M은 세 번째로 가장 일반적인 혈청 Ig이며 모든 중쇄가 동일한 오량체 또는 모든 경쇄가 동일한 오량체(또는 일부 상황 하에서 육량체)의 2개의 형태 중 하나를 취한다. 막 연관 형태는 막에 다량체 군집을 형성할 수 있는 (예를 들어, B 세포 수용체로서 B 림프구에서 발견되는) 단량체이다.
IgM은 면역 반응 동안 구축되는 최초의 항체이다. 이는 이론적으로 이의 오량체 구조가 10개의 유리 항원 결합 부위를 제공하고 높은 결합활성을 보유하기 때문에 응집 및 세포용해 반응을 담당한다. 10개의 Fab 부분 간의 구조적 제약으로 인해 IgM는 5의 원자가만을 갖는다. 또한, IgM은 IgG만큼 다용도가 아니다. 그러나, 보체 활성화 및 응집에서 매우 중요하다. IgM은 주로 림프액과 혈액에서 발견되며 질환의 초기 단계에서 매우 효과적인 중화제이다. 상승된 수치는 최근 감염 또는 항원에 대한 노출의 징후일 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "IgA"는 해당 기술분야에서 이의 일반적인 의미를 가지며 중 α 쇄를 보유하는 면역글로불린을 지칭한다. IgA는 건강한 혈청에서 모든 면역글로불린의 대략 15%를 구성한다. 혈청에 있는 IgA는 주로 단량체이나, 타액, 누액, 초유, 점액, 땀, 위액 등의 분비물에서는 IgA가 결합 펩티드로 연결되는 이량체로 발견된다. 대부분의 IgA는 분비형으로 존재한다. 이는 상피 표면에 부착 및 침투하여 병원체의 침입을 예방하는 특성 때문인 것으로 여겨진다. IgA는 매우 약한 보체 활성화 항체이며, 따라서, 보체 시스템을 통해 박테리아 세포 용해를 유도하지 않는다. 그러나, 분비 IgA는 리소자임(또한 많은 분비액에 존재)과 함께 작용하며, 이는 박테리아 세포벽의 탄수화물을 가수분해하여 면역계가 감염을 제거할 수 있게 한다. IgA는 주로 중화 항체로 작용하는 상피 세포 표면에서 발견된다. 2개의 IgA 하위 유형인 IgA1과 IgA2가 인간에서 존재하는 반면 마우스는 하나의 하위부류만을 갖는다. 이들은 중쇄의 분자량과 혈청에서의 농도가 상이하다. IgA1은 혈청의 총 IgA 농도의 대략 85%를 구성한다. IgA1은 여러 프로테아제에 대해 광범위한 저항성을 나타내나 힌지 영역에 영향을 미치거나 이에 접합할 수 있는 일부가 있다. IgA1은 단백질 항원에 대해 및, 정도는 덜하지만, 다당류 및 지질다당류에 대해 우수한 면역 반응을 나타낸다. 혈청 내 총 IgA의 최대 15%에 불과한 IgA2는 기도, 안구 및 위장관의 점막에서 다당류 및 지질다당류 항원에 대항하는 데 중요한 역할을 한다. 또한 이는 단백질 가수 분해 및 많은 박테리아 프로테아제에 대한 우수한 저항성을 보여 박테리아 감염에 대항하는 데 있어서 IgA2의 중요성을 뒷받침한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "IgD"는 해당 기술분야에서 이의 일반적인 의미를 가지며 중 d 쇄를 보유하는 면역글로불린을 지칭한다. IgD는 일반적으로 다른 세포 표면 항체 IgM과 공동발현되는 미성숙 B 림프구의 원형질막에서 단백질의 약 1%를 구성하는 면역글로불린이다. 또한, IgD는 혈청 내 면역글로불린의 0.25%에 해당하는 매우 소량의 혈청에서 발견되는 분비형으로 생성된다. 분비된 IgD는 델타(δ) 부류의 2개의 중쇄 및 2개의 Ig 경쇄를 갖는 단량체 항체로 생성된다.
본원에서 사용되는 바와 같이 용어 "환자"(또는 "대상체")는 포유동물로 분류된 모든 동물을 지칭하며 장애나 질환을 앓고 있는 가축 및 농장 동물, 영장류 및 인간, 예를 들어, 인간, 비인간 영장류, 소, 말, 돼지, 양, 염소, 개, 고양이 또는 설치류를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 환자는 임의의 연령 또는 인종의 남성 또는 여성 인간이다.
본원에서 사용되는 바와 같이 용어 "면역 매개 염증성 질환" 또는 "IMID"는 명확한 병인이 결여되어 있지만 염증을 유발하는 일반적인 염증 경로를 특징으로 하는 병태 또는 질환의 임의의 군을 지칭하며, 이는 정상적인 면역 반응의 이상조절로 인해 초래되거나 촉발될 수 있다. 염증은 많은 의학적 및 자가면역 장애를 매개하고 이의 주요 동인이기 때문에, 본 발명의 맥락에서, 면역 매개 염증성 질환이라는 용어는 또한 자가면역성 질환 및 염증성 질환을 포함하는 것을 의미한다.
용어 "자가면역 장애" 또는 "자가면역 질환"은 대상체 자신의 세포, 조직 및/또는 기관에 대한 대상체의 면역학적 반응으로 인해 야기되는 세포, 조직 및/또는 기관 손상을 특징으로 하는 대상체의 병태를 지칭한다. 본 발명의 방법 또는 약제학적 조성물로 치료될 수 있는 자가면역 질환의 예시적이고 비제한적인 예는 원형 탈모증, 류마티스 관절염(RA), 강직성 척추염, 항인지질 증후군, 자가면역 애디슨병, 부신의 자가면역 질환, 자가면역 용혈성 빈혈, 자가면역 간염, 자가면역 난소염 및 고환염, 자가면역성 혈소판감소증, 베체트병, 수포성 유천포창, 심근증, 복강 스프루-피부염, 만성 피로 면역 기능 장애 증후군(CFIDS), 만성 염증성 탈수초성 다발성 신경병증, 처그-스트라우스 증후군, 반흔성 유천포창, CREST 증후군, 한랭응집소병, 원판상 루푸스, 본태성 혼합 한랭글로불린혈증, 섬유근육통-섬유근염, 사구체신염, 그레이브스병, 길랭-바레, 하시모토 갑상선염, 특발성 폐섬유증, 특발성 혈소판감소증 자반증(ITP), IgA 신증, 연소성 관절염, 편평 태선, 메니에르병, 혼합 결합 조직 질환, 다발성 경화증, 제1형 또는 면역 매개 당뇨병, 중증 근무력증, 천포창, 악성 빈혈, 결절성 다발동맥염, 다발연골염, 다선성 증후군, 류마티스성 다발근통증, 다발성근염 및 피부근염, 원발성 무감마글로불린혈증, 원발성 담즙성 간경변증 , 건선, 건선성 관절염, 레이놀드 현상, 라이터 증후군, 유육종증, 피부경화증, 진행성 전신 경화증, 쇼그렌 증후군, 구드파스트어 증후군, 강직 증후군, 전신성 홍반성 루푸스, 홍반성 루푸스, 타카야수 동맥염, 측두 동맥염/거대 세포 동맥염, 궤양성 대장염, 포도막염, 포진성 피부염 혈관염과 같은 혈관염, 백반증, 베게너 육아종증, 항사구체 기저막 질환, 항인지질 증후군, 신경계의 자가면역 질환, 가족성 지중해열, 램버트-이튼 근무력증 증후군, 교감성 안염, 다발성 내분비병, 건선, 등을 포함한다.
용어 "염증성 질환"은 염증, 예를 들어, 만성 염증을 특징으로 하는 대상체의 병태를 지칭한다. 염증성 장애의 예시적이고 비제한적인 예는 셀리악병, 류마티스 관절염(RA), 염증성 장 질환(IBD), 천식, 뇌염, 만성 폐쇄성 폐질환(COPD), 염증성 골용해, 크론병, 궤양성 대장염, 알레르기 장애, 패혈성 쇼크, 폐 섬유증(예를 들어, 특발성 폐 섬유증), 염증성 공포증(예를 들어, 결절성 다발동맥염, 베게너 육아종증, 타카야수 동맥염, 측두 동맥염 및 림프종양 육아종증), 외상 후 혈관 성형술(예를 들어, 혈관성형술 후 재협착증), 미분화 척추관절병증, 미분화 관절병증, 관절염, 염증성 골용해, 만성 간염, 만성 바이러스 또는 박테리아 감염으로 인한 만성 염증, 패혈증과 같은 급성 염증을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
본원에서 사용되는 용어 "치료하다" 또는 "치료" 또는 "치료하는"은 환자 또는 대상체와 관련하여 직접 사용되는 경우 질환 또는 장애와 연관된 하나 이상의 증상의 개선을 위해 상기 치료를 필요로 하는 환자 대상체에게 치료법을 투여하는 것을 의미하는 것으로 간주되어야 한다. 치료를 필요로 하는 자는 이미 병태 또는 장애를 갖고 있는 자 뿐만 아니라 병태 또는 장애를 갖기 쉬운 자 또는 병태 또는 장애가 예방되어야 하는 자를 포함한다. 손상된 조직과 관련하여 직접 사용되는 경우 "치료하다" 또는 "치료" 또는 "치료하는"이라는 용어는 손상된 조직의 재생, 손상된 조직의 수리 또는 (예를 들어, 흉터 조직에 의한) 대체와 같은 직접적인 메커니즘 및 예를 들어 염증이 감소하게 하여 조직을 형성하게 하는 간접적인 메커니즘에 의한 이러한 손상의 개선을 의미하는 것으로 간주해야 한다.
본 발명의 맥락에서, 다가 항원 입자에 반대되는 1가 항원 입자가 구별된다. 각 입자는 공유 또는 비공유 연결되는 부분을 포함할 수 있는 단일 분자 실체로 간주된다. 그러나, 본 발명에 따르면, 각 입자는 특정 항원에 대한 면역원성 활성을 갖는다. 따라서, 1가 항원 입자는 항원에 대한 면역 반응을 유발할 수 있는 단일 항원성 구조만을 포함하는 반면, 다가 항원 입자는 이러한 항원성 구조의 다중 복제를 포함하는 것으로 이해된다. 본 발명의 맥락에서, 때때로 또한 용어 "가용성" 항원은 다가 항원 입자에 대한 "복합" 항원에 반대되는 1가 항원 입자에 대해 사용된다. 대부분의 경우에 항원성 구조는 항체 면역 반응을 유발하는 에피토프를 포함하거나 이로 구성되며, 결국, 본원의 다른 부분에서 정의된 바와 같은 세포 매개 면역 반응 시 생성되는 항체에 대한 결합 부위인 것으로 이해된다. 다시 말해, 본 발명은 가용성 단일 에피토프로서 또는 복합 배열 동일 에피토프에서 면역 유발 에피토프의 제시를 구별한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 대상체에서 질환 연관 항원에 특이적인 면역글로불린 G(IgG) 유형 항체의 존재를 특징으로 하는 질환을 치료 또는 예방하기 위한 방법에 관한 것으로, 방법은 치료적 유효량의 1가 항원 입자를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 1가 항원 입자는 질환 연관 항원에 대해 항체 매개 면역 반응을 유도할 수 있는 1개 이하의 항원성 구조를 포함하는 항원성부으로 구성된다.
본 발명의 대안적인 양태에서, 대상체에서 질환 연관 항원에 특이적인 IgG 이외의 항체의 존재를 특징으로 하는 질환을 치료 또는 예방하기 위한 방법이 제공되며, 방법은 치료적 유효량의 1가 항원 입자를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 1가 항원 입자는 질환 연관 항원에 대해 항체 매개 면역 반응을 유도할 수 있는 1개 이하의 항원성 구조를 포함하는 항원성부로 구성된다. 대안적인 제3 양태의 이러한 장애는 예를 들어 IgE 매개 알레르기일 수 있다.
질환 연관 항원에 특이적인 면역글로불린 G(IgG) 유형 항체의 존재를 특징으로 하는 질환은 바람직하게는 자가면역 및 동종면역 IgG 항체와 같은 병리학적 IgG 분자가 대상체의 혈청에 존재하는 것을 특징으로 하는 질환이다. 따라서, 용어 "IgG 매개 질환"은 자가면역 및 동종면역 질환을 포함한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "동종면역 질환"은 다른 개체의 외래 항원(예를 들어, 주요 또는 비주요 조직적합성 동종항원)에 대한 숙주 면역 반응이 있는 경우, 예를 들어, 숙주 대 이식편 거부가 있는 경우 또는 이식편 대 숙주병이 있는 경우를 지칭하며, 여기서 이식되는 면역 세포는 이식편을 수용하는 숙주에 대해 유해한 효과를 매개한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 대상체에서 질환 연관 항원에 특이적인 면역글로불린 G(IgG) 유형 항체의 존재를 특징으로 하는 질환을 치료 또는 예방하는데 사용하기 위한 1가 항원 입자에 관한 것이며, 여기서 1가 항원 입자는 질환 연관 항원에 대한 항체 매개 면역 반응을 유도할 수 있는 1개 이하의 항원성 구조를 포함하는 항원성부로 구성된다.
본 실시양태에서, 위에서 개시되는 특정 실시양태가 동등하게 적용된다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 대상체에서 백신접종으로 질환을 치료 또는 예방하는데 사용하기 위한 방법에 관한 것이며, 방법은
(i) 질환 연관 항원에 대한 항체 매개 면역 반응을 유도할 수 있는 1개 이하의 항원성 구조를 포함하는 항원성부로 구성되는 1가 항원 입자 및
(ii) 질환 연관 항원에 대한 항체 매개 면역 반응을 유도할 수 있는 2개 이상의 항원성 구조를 포함하는 항원성부로 구성되는 다가 항원 입자를 포함하는 유효량의 백신접종 조성물을 투여하는 단계를 포함하며 여기서 2개 이상의 항원성 구조는 공유 또는 비공유 가교결합된다.
본 실시양태에서, 본원의 다른 부분에서 개시되는 바와 같이 프라이밍/부스팅 계획을 포함하는 백신접종 계획으로 대상체에게 치료를 투여하는 것이 바람직할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 대상체에서 질환을 치료 또는 예방하는데 사용하기 위한 백신접종 조성물에 관한 것이며, 백신접종 조성물은
(i) 질환 연관 항원에 대한 항체 매개 면역 반응을 유도할 수 있는 1개 이하의 항원성 구조를 포함하는 항원성부로 구성되는 1가 항원 입자 및
(ii) 질환 연관 항원에 대한 항체 매개 면역 반응을 유도할 수 있는 2개 이상의 항원성 구조를 포함하는 항원성부로 구성되는 다가 항원 입자를 포함하며 여기서 2개 이상의 항원성 구조는 공유 또는 비공유 가교결합된다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 면역원성 조성물에 관한 것이며, 이는
(i) 항원에 대한 항체 매개 면역 반응을 유도할 수 있는 1개 이하의 항원성 구조를 포함하는 항원성부로 구성되는 1가 항원 입자 및
(ii) 항원에 대한 항체 매개 면역 반응을 유도할 수 있는 2개 이상의 항원성 구조를 포함하는 항원성부로 구성되고 2개 이상의 항원성 구조가 공유 또는 비공유 가교결합된 다가 항원 입자를 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이 "[본] 발명의", "본 발명에 따른", "본 발명에 따르면" 등의 용어는 본원에서 설명되고/되거나 청구되는 본 발명의 모든 양태 및 실시양태를 지칭하도록 의도된다.
특정 실시양태에서 본 발명의 다양한 양태의 방법은 척추동물에서 특정 원하는 항체 반응을 생성하기 위한 면역화 방법으로 볼 수 있다. 이러한 맥락에서, 본 발명의 방법의 바람직한 실시양태는 대상체의 프라이밍/부스팅 면역화 계획을 포함한다.
용어 항원에 대한 면역 반응을 "프라이밍"은 단일 면역원성 조성물을 사용하는 투여에 의해 수득되는 면역 반응보다 동일한 또는 제2 조성물로 후속 투여 시 항원에 대한 더 높은 수준의 면역 반응을 유도하는 면역원성 조성물을 사용하는 대상체에 대한 투여를 지칭한다.
용어 항원에 대한 면역 반응을 "부스팅"은 프라이밍 면역원성 조성물의 투여 후 제2의 부스팅 면역원성 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 지칭한다. 일 실시양태에서, 면역원성 조성물의 부스팅 투여는 프라이밍 용량의 투여 후 약 2 내지 27주, 바람직하게는 1 내지 10주, 더 바람직하게는 1 내지 5주 및 가장 바람직하게는 약 3주차에 제공된다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 프라이밍 단계는 질환 연관 항원에 대해 항체 매개 면역 반응을 유도할 수 있는 1개 이하의 항원성 구조를 포함하는 항원성부로 구성되는 1가 항원 입자로 수행되는 반면, 부스팅 단계는 질환 연관 항원에 대한 항체 매개 면역 반응을 유도할 수 있는 2개 이상의 항원성 구조를 포함하는 항원성부로 구성되는 다가 항원 입자의 투여를 포함하며, 여기서 2개 이상의 항원성 구조는 공유 또는 비공유 가교결합된다. 본 발명의 이러한 프라이밍/부스팅 실시양태에서, 프라이밍 및 부스팅 단계에서 면역 반응을 유도하기 위해 사용되는 항원성 구조는 동일한 항원성 구조이다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 부스팅 단계는 본원에서 설명되는 바와 같이 1가 및 다가 항원 입자의 조합으로 수행될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 자가면역 장애의 치료에서 사용하기 위한 단일특이적 IgM 유형 항체 또는 이의 변이체에 관한 것이며, 여기서 단클론 IgM 유형 항체는 특이적이고 자가면역 장애와 연관되는 항원에 대해 높은 친화도를 갖는다.
다른 실시양태에서, 본 발명의 단일특이적 IgM 유형 항체 또는 이의 변이체는 다클론 항체가 아니거나, 항원 결합 단편은 다클론 항체의 단편이 아니다. 더 구체적인 실시양태에서, 본 발명의 단일특이적 IgM 유형 항체 또는 이의 변이체는 1차(다중특이적) IgM 유형 항체가 아니다.
본 발명의 모든 단일특이적 IgM 유형 항체 또는 이의 변이체의 대안적이고 바람직한 실시양태에서, 단일특이적 IgM 유형 항체 또는 이의 변이체는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이며, 항체는 단클론 항체이며, 또는 여기서 항원 결합 단편은 단클론 항체의 단편이다.
본원에서 사용되는 바와 같이 용어 "단클론 항체" 또는 "mAb"는 아미노산 서열에 기반하여 실질적으로 동일한 항체 집단으로부터 수득되는 항체를 지칭한다. 단클론 항체는 전형적으로 고도로 특이적이다. 또한, 항원의 상이한 결정자(에피토프)에 대해 지시된 상이한 항체를 전형적으로 포함하는 통상적인(다클론) 항체 제조물과 대조적으로, 각각의 mAb는 전형적으로 항원 상의 단일 결정자에 대해 지시된다. 이들의 특이성 외에도, mAb는 다른 면역글로불린에 의해 오염되지 않은 세포 배양물(하이브리도마, 재조합 세포 등)에 의해 합성될 수 있다는 점에서 유리하다. 본원에서 mAb는 예를 들어, 키메라, 인간화 또는 인간 항체 또는 항체 단편을 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 올리고머성 항인슐린 항체에 관한 것이며, 여기서 올리고머 항인슐린 항체는 키메라, 인간화 또는 인간이다.
본 발명에 따른 단클론 IgM 항체는 통상의 기술자에게 잘 알려진 방법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 마우스, 래트, 염소, 낙타, 알파카, 라마 또는 토끼는 보조제와 함께 관심 항원(또는 관심 항원을 인코딩하는 핵산)으로 면역화될 수 있다. 비장 세포는 혈청 항체 역가를 평가하기 위해 수행되는 시험 출혈과 함께 특정 간격으로 여러 면역화가 투여되는 동물의 풀(pool)로부터 채취된다. 비장 세포는 융합 실험에서 즉시 사용되거나 향후 융합에서 사용하기 위해 액체 질소에서 보관되도록 제조된다. 그 후, 융합 실험을 문헌[Stewart & Fuller, J. Immunol. Methods 1989, 123:45-53]의 절차에 따라 수행한다. 하이브리드가 성장하는 웰로부터 유래한 상청액은 예를 들어 mAb 분비자에 대한 효소 결합 면역흡착 검정(ELISA)에 의해 선별된다. ELISA 양성 배양물은 제한 희석 또는 형광 활성화 세포 분류에 의해 클로닝되며, 이는 전형적으로 단일 균락에서 확립된 하이브리도마를 초래한다. 특정 항원에 결합하는 항체 단편 또는 하위 단편을 포함하는 항체의 능력은 예를 들어 관심 항원을 결합 파트너로 사용하는 해당 기술분야에서 알려진 결합 검정에 의해 결정될 수 있다. 대안적으로, 면역화 항원에 결합하는 비장 B 세포는 단일 세포로 분류되며 이어서 중쇄 및 경쇄를 인코딩하는 cDNA가 단일 세포로부터 클로닝된다. 그 후, 클로닝된 cDNA는 면역화 항원에 대한 특이성과 친화도를 기반하여 더 특징으로 하는 단클론 재조합 항체의 시험관 내(in vitro) 생성을 위해 사용된다.
본 발명에 따른 단일특이적 IgM 유형 항체 또는 이의 변이체는 천연 단백질이 정상적인 전사후 변형으로 생체 내(in vivo)에서 발현되는 유전자 면역화 방법에 의해 제조될 수 있으며, 이는 항원 단리 또는 합성을 회피한다. 예를 들어, 네이키드 플라스미드(naked plasmid) DNA 발현 벡터의 유체역학적 꼬리 또는 사지 정맥 전달을 사용하여 마우스, 래트 및 토끼에서 생체 내(in vivo) 관심 항원을 생성하여 항원 특이적 항체를 유도할 수 있다(Tang 등, Nature 356: 152 (1992); Tighe 등, Immunol. Today 19: 89 (1998); Bates 등, Biotechniques, 40:199 (2006); Aldevron-Genovac, Freiburg DE). 이를 통해 진단 및/또는 연구 목적에 특히 유용할 수 있는 높은 역가의 항원 특이적 항체를 효율적으로 생성할 수 있다. 이러한 유전적 면역화를 위해, 네이키드 플라스미드 DNA를 골격근, 림프절 또는 진피에 직접 주사하는 방법, 전기천공법, 탄도(유전자총) 전달 및 바이러스 벡터 전달을 포함하는 다양한 유전자 전달 방법을 사용할 수 있다.
추가 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 단일특이적 IgM 유형 항체 또는 이의 변이체는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이며, 여기서 항체는 인간 항체, 인간화 항체 또는 키메라-인간 항체이거나, 또는 여기서 항원 결합 단편은 인간 항체, 인간화 항체 또는 키메라-인간 항체의 단편이다.
또한, 인간 항체는 생체 내(in vitro) 방법에 의해 유래될 수 있다. 적합한 예는 파지 디스플레이(CAT, Morphosys, Dyax, Biosite/Medarex, Xoma, Yumab, Symphogen, Alexion, Affimed) 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 파지 디스플레이에서, 단일 Fab 또는 Fv 항체 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 파지 입자의 표면에서 발현된다(예를 들어, Hoogenboom 등, J. Mol. Biol., 227: 381 (1991); Marks 등, J Mol Biol 222: 581 (1991); 미국 특허 번호 5,885,793 참조). 파지는 "선별"되어 표적에 대한 친화도를 갖는 항체 단편을 식별한다. 따라서, 특정 이러한 과정은 필라멘트성 박테리오파지(filamentous bacteriophage) 표면에 항체 단편 레퍼토리의 표시를 통해 면역 선택 및 표적에 대한 결합에 의한 파지의 후속 선택을 모방한다. 특정 이러한 절차에서, 고친화도 기능적 중화 항체 단편이 단리된다. 따라서, 인간 항체 유전자의 완전한 레퍼토리는 말초 혈액 림프구로부터 자연적으로 재배열되는 인간 V 유전자를 클로닝하여(예를 들어, Mullinax 등, Proc Natl Acad Sci (USA), 87: 8095-8099 (1990) 참조) 또는 인간 항체 서열을 갖는 완전 합성 또는 반합성 파지 디스플레이 라이브러리를 생성하여(Knappik 등 2000; J Mol Biol 296:57; de Kruif 등, 1995; J Mol Biol 248):97참조) 생성될 수 있다.
대안적으로, 본원에서 설명되는 항체는 XenoMouse® 기술의 활용을 통해 제조될 수 있다. 이러한 마우스는 인간 면역글로불린 분자 및 항체를 생성할 수 있으며 뮤린 면역글로불린 분자 및 항체 생성이 결핍되어 있다. 특히, 마우스 및 항체의 유전자이식 생성의 바람직한 실시양태는 1996년 12월 3일자로 출원된 미국 특허 출원 일련번호 제08/759,620호, 및 1998년 6월 11일에 공개된 국제 특허 출원 제WO 98/24893호 및 2000년 12월 21일에 공개된 국제 특허 출원 제WO 00/76310호에서 개시되어 있다. 또한, Mendez 등, Nature Genetics, 15:146-156 (1997) 참조. 이러한 기술의 사용을 통해, 다양한 항원에 대한 완전 인간 단클론 항체가 생성되어 왔다. 기본적으로 XenoMouse® 마우스 라인은 관심 항원으로 면역화되며, 예를 들어, 과면역화된 마우스로부터 IGSF11(VSIG3) (B 세포와 같은 )림프 세포를 회수하며, 회수되는 림프구를 골수형 세포주와 융합하여 불멸의 하이브리도마 세포주를 제조한다. 이러한 하이브리도마 세포주를 선별하고 선택하여 관심 항원에 특이적인 항체를 생성하는 하이브리도마 세포주를 식별한다. 다른 "인간화" 마우스, 예를 들어, Medarex - HuMab 마우스, Kymab - Kymouse, Regeneron - Velocimmune 마우스, Kirin - TC 마우스, Trianni - Trianni 마우스, OmniAb - OmniMouse, Harbour Antibodies - H2L2 마우스, Merus - MeMo 마우스도 상업적으로 이용 가능하다. 또한 "인간화"된 다른 종도 이용 가능하다. 래트: OmniAb - OmniRat, OMT - UniRat. 닭: OmniAb - OmniChicken.
본 발명에 따른 용어 "인간화 항체"는 면역글로불린 사슬 또는 이의 단편(예컨대, Fab, Fab', F(ab')2, Fv 또는 항체의 다른 항원-결합 하위 서열)을 지칭하며, 이는 비인간 면역글로불린으로부터 유래되는 (그러나, 전형적으로 여전히 적어도 일부인) 최소한의 서열을 함유한다. 대부분의 경우, 인간화 항체는 수증체 항체의 CDR 잔기가 원하는 특이성, 친화도 및 능력을 갖는 마우스, 래트 또는 토끼와 같은 비인간 종 면역글로불린(공여체 항체)로부터 유래한 CDR 잔기로 대체되는 인간 면역글로불린(수용체 항체)이다. 이와 같이, 상기 항체 또는 이의 단편의 프레임워크 서열의 적어도 일부는 인간 컨센서스 프레임워크 서열일 수 있다. 일부 경우에서, 인간 면역글로불린의 Fv 프레임워크 잔기는 특이성 또는 친화도를 증가시키기 위해 상응하는 비인간 잔기로 대체될 필요가 있다. 또한, 인간화 항체는 수용체 항체에서도 또는 이입되는 CDR 또는 프레임워크 서열에서도 다 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 변형은 항체 성능을 더욱 개선하고 최대화하도록 이루어진다. 일반적으로, 인간화 항체는 적어도 1개, 전형적으로 적어도 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이며, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 CDR 영역은 비인간 면역글로불린의 CDR 영역에 상응하고 모든 또는 실질적으로 모든 프레임워크 영역은 인간 면역글로불린 컨센서스 서열의 프레임워크 영역이다. 또한, 인간화 항체는 최적으로 (예를 들어, 인간) 면역글로불린 불변 영역이 이러한 영역의 하나 이상의 특성을 최적화하고/하거나 (예를 들어, 치료용) 항체의 기능을 개선하기 위해, 예컨대, Fc 효과기 기능이 증가하게 하거나 감소하게 하기 위해 또는 혈청 반감기가 증가하게 하기 위해 (예를 들어, 돌연변이 또는 당공학(glycoengineering)에 의해) 수정될 수 있는 면역글로불린 불변 영역의 적어도 일부, 전형적으로 인간 면역글로불린 불변 영역의 적어도 일부를 포함할 것이다. 예시적인 이러한 Fc 변형(예를 들어, Fc 조작 또는 Fc 향상)은 본원의 다른 부분에서 설명되어 있다.
인간 불변 영역은 아마도 뮤 사슬 서열로부터 유래될 것이나, 이의 임의의 변이체, 예를 들어, 감마 사슬 불변 서열이 감쇠되는 Fc 영역 결합은 본 발명에 따른 IgM 변이체로 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 용어 "키메라 항체"는 경쇄 및/또는 중쇄 유전자가 마우스 및 인간과 같은 상이한 종의 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 상동인 면역글로불린 가변 및 불변 영역으로부터 전형적으로 유전자 조작에 의해 구축되는 항체를 지칭한다. 대안적으로, 가변 영역 유전자는 특정 항체 부류 또는 하위부류로부터 유래하는 반면 사슬의 나머지는 동일하거나 상이한 종의 다른 항체 부류 또는 하위부류로부터 유래한다. 또한 이는 이러한 항체의 단편도 포함한다. 예를 들어, 전형적인 치료용 키메라 항체는 마우스 항체로부터 유래한 가변 또는 항원 결합 도메인과 인간 항체로부터 유래한 불변 또는 효과기 도메인으로 구성되는 하이브리드 단백질이나, 다른 포유류 종도 사용될 수 있다.
특히, 이러한 실시양태에서, 본 발명의 단일특이적 IgM -유형 항체 또는 이의 변이체는 항원 결합 도메인이 인간 항체의 것인 항체의 항원 결합 도메인을 포함한다. 바람직하게는, 단일특이적 IgM-유형 항체 또는 이의 변이체는 인간 항원 결합 도메인인 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 항원 결합 도메인을 포함하며; (ii) 항체가 단클론 항체이거나 항원 결합 단편이 단클론 항체의 단편이며; (iii) 항체가 인간 항체 또는 인간화 항체이거나, 항원 결합 단편이 인간 항체, 인간화 항체 또는 키메라-인간 항체의 단편이다.
인간 항체의 경쇄는 일반적으로 카파 및 람다 경쇄로 분류되며, 이들 각각은 하나의 가변 영역과 하나의 불변 도메인을 함유한다. 중쇄는 전형적으로 뮤, 델타, 감마, 알파 또는 엡실론 사슬로 분류되며, 이들은 위에서 설명되는 바와 같이 항체의 동형을 각각 IgM, IgD, IgG, IgA 및 IgE로 정의한다. 인간 IgG는 lgG1, lgG2, lgG3 및 lgG4를 포함하나 이에 제한되지 않는 여러 하위유형을 갖는다. 인간 IgM 하위유형은 IgM을 포함한다. 인간 IgA 하위유형은 lgA1 및 lgA2를 포함한다. 인간에서, IgA 동형은 4개의 중쇄와 4개의 경쇄를 함유하며, IgG 및 IgE 동형은 2개의 중쇄와 2개의 경쇄를 함유하며, IgM 동형은 10개 또는 12개의 중쇄와 10개 또는 12개의 경쇄를 함유한다. 본 발명에 따른 항체는 IgG, IgE, IgD, IgA 또는 IgM 면역글로불린일 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 단일특이적 IgM 유형 항체 또는 이의 변이체는 IgM 항체 또는 이의 단편이다. 바람직하게는, 본 발명의 항체는 IgG 면역글로불린 또는 이의 단편; 예컨대, 인간, 인간 유래 IgM 면역글로불린, 또는 토끼 또는 래트 유래 IgM이거나, 이를 포함하거나 또는 이로부터 유래된다.
면역글로불린 불변 영역의 적어도 일부(전형적으로 인간 면역글로불린 불변 영역의 적어도 일부)를 포함하는 본 발명의 단일특이적 IgM 유형 항체 또는 이의 변이체는 (예를 들어, 인간) 면역글로불린 불변 영역이 이러한 영역의 하나 이상의 특성을 최적화하고/하거나 (예를 들어, 치료용) 항체의 기능을 개선하기 위해, 예컨대, Fc 효과기 기능이 증가하게 하거나 감소하게 하기 위해 또는 혈청 반감기가 증가하게 하기 위해 (예를 들어, 돌연변이 또는 당공학(glycoengineering)에 의해) 수정될 수 있는 이러한 (예를 들어, 인간) 면역글로불린 불변 영역을 가질 수 있다.
따라서, 위에서 설명되는 본 발명의 임의의 ABP는 상이한 Fc-감마 수용체에 대한 결합 정도를 제어하기 위해 상이한 항체 동형 또는 돌연변이 동형으로 생성될 수 있다. Fc 영역이 결핍되는 항체(예를 들어, Fab 단편)는 상이한 Fc-감마 수용체에 대한 결합이 결여된다. 또한, 동형의 선택은 상이한 Fc-감마 수용체에 대한 결합에 영향을 미친다. 3개의 상이한 Fc-감마 수용체, Fc-감마-RI, Fc-감마-RII 및 Fc-감마-RIII에 대한 다양한 인간 IgG 동형의 각각의 친화도가 결정되었다. (Ravetch & Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9, 457 (1991) 참조). Fc-감마-RI는 단량체 형태의 IgG에 결합하는 고친화도 수용체이며, 후자의 2개는 다량체 형태의 IgG에만 결합하는 저친화도 수용체이다. 일반적으로, IgG1 및 IgG3는 모두 3개의 수용체에, IgG4는 Fc-감마-RI에 및 IgG2는 IIaLR이라고 지칭되는 한 유형의 Fc-감마-RII에 유의한 결합 활성을 갖는다(Parren 등, J. Immunol. 148, 695 (1992) 참조). 따라서, 인간 동형 IgG1은 일반적으로 Fc-감마 수용체에 대한 더 강한 결합을 위해 선택되며 IgG2 또는 IgG4는 일반적으로 더 약한 결합을 위해 선택된다. 본 발명의 바람직한 실시양태는 Fc 수용체 결합이 감소되거나 제거되는 이러한 항체를 제공한다.
증가된 Fc-감마-R 결합과 돌연변이된 Fc 사이의 상관관계는 표적화된 세포독성 세포 기반 검정을 사용하여 입증되었다(Shields et ah, 2001, J. Biol. Chem. 276:6591-6604; Presta et ah, 2002, Biochem Soc. Trans. 30:487-490). 특정 Fc 영역 돌연변이를 통해 ADCC 활성을 증가하게 하는 방법은 234, 235, 239, 240, 241, 243, 244, 245, 247, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 269, 296, 297, 298, 299, 313, 325, 327, 328, 329, 330 및 332로 구성되는 군으로부터 선택되는 위치에서 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하는 Fc 변이체를 포함하며, 여기서 Fc 영역 내의 잔기의 번호는 Kabat에서와 같은 EU 인덱스의 번호이다(Kabat et ah, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institute of Health, Bethesda, Md. 1987).
특정 구체적인 실시양태에서, 상기 Fc 변이체는 L234D, L234E, L234N, L234Q, L234T, L234H, L234Y, L234I, L234V, L234F, L235D, L235S, L235N, L235Q, L235T, L235H, L235Y, L235I, L235V, L235F, S239D, S239E, S239N, S239Q, S239F, S239T, S239H, S239Y, V240I, V240A, V240T, V240M, F241W, F241L, F241Y, F241E, F241R, F243W, F243L, F243Y, F243R, F243Q, P244H, P245A, P247V, P247G, V262I, V262A, V262T, V262E, V263I, V263A, V263T, V263M, V264L, V264I, V264W, V264T, V264R, V264F, V264M, V264Y, V264E, D265G, D265N, D265Q, D265Y, D265F, D265V, D265I, D265L, D265H, D265T, V266I, V266A, V266T, V266M, S267Q, S267L, E269H, E269Y, E269F, E269R, Y296E, Y296Q, Y296D, Y296N, Y296S, Y296T, Y296L, Y296I, Y296H, N297S, N297D, N297E, A298H, T299I, T299L, T299A, T299S, T299V, T299H, T299F, T299E, W313F, N325Q, N325L, N325I, N325D, N325E, N325A, N325T, N325V, N325H, A327N, A327L, L328M, L328D, L328E, L328N, L328Q, L328F, L328I, L328V, L328T, L328H, L328A, P329F, A330L, A330Y, A330V, A330I, A330F, A330R, A330H, I332D, I332E, I332N, I332Q, I332T, I332H, I332Y 및 I332A로 구성되는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 치환을 포함하며, 여기서 Fc 영역 내의 잔기의 번호는 Kabat에서와 같은 EU 인덱스의 번호이다.
또한, Fc 변이체는 V264L, V264I, F241W, F241L, F243W, F243L, F241L/F243L/V262I/V264I, F241W/F243W, F241W/F243W/V262A/V264A, F241L/V262I, F243L/V264I, F243L/V262I/V264W, F241Y/F243Y/V262T/V264T, F241E/F243R/V262E/V264R, F241E/F243Q/V262T/V264E, F241R/F243Q/V262T/V264R, F241E/F243Y/V262T/V264R, L328M, L328E, L328F, I332E, L3238M/I332E, P244H, P245A, P247V, W313F, P244H/P245A/P247V, P247G, V264I/I332E, F241E/F243R/V262E/V264R/I332E, F241E/F243Q/V262T/264E/I332E, F241R/F243Q/V262T/V264R/I332E, F241E/F243Y/V262T/V264R/I332E, S298A/I332E, S239E/I332E, S239Q/I332E, S239E, D265G, D265N, S239E/D265G, S239E/D265N, S239E/D265Q, Y296E, Y296Q, T299I, A327N, S267Q/A327S, S267L/A327S, A327L, P329F, A330L, A330Y, I332D, N297S, N297D, N297S/I332E, N297D/I332E, N297E/I332E, D265Y/N297D/I332E, D265Y/N297D/T299L/I332E, D265F/N297E/I332E, L328I/I332E, L328Q/I332E, I332N, I332Q, V264T, V264F, V240I, V263I, V266I, T299A, T299S, T299V, N325Q, N325L, N325I, S239D, S239N, S239F, S239D/I332D, S239D/I332E, S239D/I332N, S239D/I332Q, S239E/I332D, S239E/I332N, S239E/I332Q, S239N/I332D, S239N/I332E, S239N/I332N, S239N/I332Q, S239Q/I332D, S239Q/I332N, S239Q/I332Q, Y296D, Y296N, F241Y/F243Y/V262T/V264T/N297D/I332E, A330Y/I332E, V264I/A330Y/I332E, A330L/I332E, V264I/A330L/I332E, L234D, L234E, L234N, L234Q, L234T, L234H, L234Y, L234I, L234V, L234F, L235D, L235S, L235N, L235Q, L235T, L235H, L235Y, L235I, L235V, L235F, S239T, S239H, S239Y, V240A, V240T, V240M, V263A, V263T, V263M, V264M, V264Y, V266A, V266T, V266M, E269H, E269Y, E269F, E269R, Y296S, Y296T, Y296L, Y296I, A298H, T299H, A330V, A330I, A330F, A330R, A330H, N325D, N325E, N325A, N325T, N325V, N325H, L328D/I332E, L328E/I332E, L328N/I332E, L328Q/I332E, L328V/I332E, L328T/I332E, L328H/I332E, L328I/I332E, L328A, I332T, I332H, I332Y, I332A, S239E/V264I/I332E, S239Q/V264I/I332E, S239E/V264I/A330Y/I332E, S239E/V264I/S298A/A330Y/I332E, S239D/N297D/I332E, S239E/N297D/I332E, S239D/D265V/N297D/I332E, S239D/D265I/N297D/I332E, S239D/D265L/N297D/I332E, S239D/D265F/N297D/I332E, S239D/D265Y/N297D/I332E, S239D/D265H/N297D/I332E, S239D/D265T/N297D/I332E, V264E/N297D/I332E, Y296D/N297D/I332E, Y296E/N297D/I332E, Y296N/N297D/I332E, Y296Q/N297D/I332E, Y296H/N297D/I332E, Y296T/N297D/I332E, N297D/T299V/I332E, N297D/T299I/I332E, N297D/T299L/I332E, N297D/T299F/I332E, N297D/T299H/I332E, N297D/T299E/I332E, N297D/A330Y/I332E, N297D/S298A/A330Y/I332E, S239D/A330Y/I332E, S239N/A330Y/I332E, S239D/A330L/I332E, S239N/A330L/I332E, V264I/S298A/I332E, S239D/S298A/I332E, S239N/S298A/I332E, S239D/V264I/I332E, S239D/V264I/S298A/I332E 및 S239D/264I/A330L/I332E로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있으며, 여기서 Fc 영역의 잔기의 번호는 Kabat에서와 같은 EU 인덱스의 번호이다. 또한, WO2004029207 참조, 이는 본원에 참조로 원용된다.
특정 실시양태에서, 힌지 연결 영역의 부위 상의, 이에 인접한 또는 이에 근접한 돌연변이(예를 들어, 잔기(234, 235, 236 및/또는 237)를 다른 잔기로 대체함)가 모든 동형에서 이루어져 Fc-감마 수용체, 특히 Fc-감마-RI 수용체에 대한 친화도가 감소하게 할 수 있다(예를 들어, US6624821 참조). 선택적으로, 위치 234, 236 및/또는 237은 알라닌으로 치환되고 위치 235는 글루타메이트로 치환된다. (예를 들어, US5624821 참조) 위치 236은 인간 IgG2 동형에서 누락된다. 인간 IgG2에 대한 위치 234, 235 및 237에 대한 예시적인 아미노산 세그먼트는 Ala Ala Gly, Val Ala Ala, Ala Ala Ala, Val Glu Ala 및 Ala Glu Ala이다. 돌연변이체의 바람직한 조합은 L234A, L235E 및 G237A이거나, 인간 동형 IgG1의 경우 L234A, L235A 및 G237A이다. 본 발명의 단일특이적 IgM 유형 항체의 특히 바람직한 변이체는 인간 동형 IgG1 및 Fc 영역의 이러한 3가지 돌연변이 중 하나를 갖는 항체이다. Fc-감마 수용체에 대한 결합이 감소하게 하는 다른 치환은 E233P 돌연변이(특히, 마우스 IgG1에서) 및 D265A(특히, 마우스 IgG2a에서)이다. Fc 및/또는 C1q 결합이 감소하게 하는 돌연변이 및 돌연변이 조합의 다른 예는 E318A/K320A/R322A(특히, 마우스 IgG1에서), L235A/E318A/K320A/K322A (특히, 마우스 IgG2a에서)이다. 유사하게도, 인간 IgG4의 잔기 241(Ser)은 예를 들어 프롤린으로 대체되어 Fc 결합을 파괴할 수 있다.
추가 돌연변이를 불변 영역에 제조하여 효과기 활성을 조절할 수 있다. 예를 들어, A330S, P331S 또는 둘 모두에서 IgG1 또는 IgG2 불변 영역에 돌연변이가 이루어질 수 있다. IgG4의 경우, 돌연변이는 G236 결실 E233P, F234V 및 L235A, 또는 이들의 임의의 조합에서 이루어질 수 있다. 또한, IgG4는 다음의 돌연변이 S228P 및 L235E 중 하나 또는 모두를 가질 수 있다. 효과기 기능을 조절하기 위한 파괴된 불변 영역 서열의 사용은 예를 들어 WO2006118,959 및 WO2006036291에서 더 설명되어 있다.
추가적인 돌연변이가 효과기 활성을 조절하기 위해 인간 IgG의 불변 영역에 제조될 수 있다(예를 들어, WO200603291 참조). 이는 다음의 치환을 포함하며: (i) A327G, A330S, P331S; (ii) E233P, L234V, L235A, G236 결실; (iii) E233P, L234V, L235A; (iv) E233P, L234V, L235A, G236 결실, A327G, A330S, P331S; 및 (v) 인간 IgG1에 대한 E233P, L234V, L235A, A327G, A330S, P331S; 또는 특히, (vi) (예를 들어, 인간 IgG1에 대한) L234A, L235E, G237A, A330S 및 P331S, 여기서 Fc 영역의 잔기의 번호는 Kabat에서와 같은 EU 인덱스의 번호이다. 또한, WO2004029207 참조, 이는 본원에 참조로 원용된다.
Fc-감마-R에 대한 항체의 친화도는 중쇄 불변 영역의 특정 잔기를 돌연변이시켜 변경될 수 있다. 예를 들어, 인간 IgG1의 글리코실화 부위의 파괴는 항체의 Fc-감마-R 결합 및 이에 따른 효과기 기능을 감소하게 할 수 있다(예를 들어, WO2006036291 참조). X가 프롤린 이외의 임의의 아미노산인 트리펩티드 서열 NXS 및 NXT는 N 잔기의 글리코실화를 위한 효소 인식 부위이다. 특히, IgG의 CH2 영역에서, 임의의 트리펩티드 아미노산이 파괴되면 해당 부위에서 글리코실화가 예방된다. 예를 들어, 인간 IgG1의 N297 돌연변이는 글리코실화를 예방하고 항체에 대한 Fc-감마-R 결합을 감소시킨다.
ADCC 및 CDC의 활성화가 종종 치료용 항체에 대해 바람직하나, 본 발명의 단일특이적 IgM 유형 항체 또는 이의 변이체가 효과기 기능을 활성화할 수 없는 상황이 우선적이다(예를 들어, 전천후 조절자(agnostic modulator)인 본 발명의 항체). 이러한 목적을 위해, IgG4가 일반적으로 사용되어 왔으나, 이는 이러한 하위 부류가 Fab-아암(arm) 교환을 거칠 수 있는 고유한 능력으로 인해 최근 몇 년 동안 선호되지 않았으며, 여기서 중쇄는 생체 내(in vivo) IgG4와 잔류 ADCC 활성 사이에서 교체될 수 있다. 따라서, Fc 조작 접근법을 사용하여 Fc-감마 수용체 및 C1q와의 Fc 도메인에 대한 주요 상호 작용 부위를 결정한 다음 본 발명의 단일 특이적 IgM 유형 항체 또는 이의 변이체의 Fc와 같은 이러한 위치를 돌연변이시켜 결합을 감소시키거나 제거할 수 있다. 알라닌 스캐닝을 통해, Duncan 및 Winter(1998; Nature 332:738)는 먼저 C1q의 결합 부위를 Fc 도메인의 힌지 및 상부 CH2를 커버하는 영역으로 단리하였다. Genmab의 연구원들은 돌연변이 K322A, L234A 및 L235A를 식별하였으며, 조합하여 이들은 Fc-감마-R 및 C1q 결합을 거의 완전히 제거하기에 충분하다(Hezareh 등, 2001; J Virol 75:12161). 유사한 방식으로, MedImmune은 나중에 3개의 돌연변이 세트인 L234F/L235E/P331S(TM이라고 함)를 식별하였는데, 이는 매우 유사한 효과를 나타낸다(Oganesyan 등, 2008; Acta Crystallographica 64:700). 대안적인 접근법은 Fc 도메인의 아스파라긴 297 상의 글리코실화의 변형이며, 이는 최적의 FcR 상호작용에 필요한 것으로 알려져 있다. Fc-감마-R에 대한 결합 손실이 N297 포인트 돌연변이(Tao 등, 1989; J Immunol 143:2595), 효소적으로 탈글리코실화된 Fc 도메인(Mimura 등, 2001; J Biol Chem 276:45539), 글리코실화 억제제의 존재 하에서 재조합적으로 발현되는 항체(Walker 등, 1989; Biochem J 259:347) 및 박테리아 내 Fc 도메인의 발현(Mazor 등 2007; Nat Biotechnol 25:563)에서 관찰되었다. 따라서, 본 발명은 또한 이러한 기술 또는 돌연변이가 효과기 기능을 감소시키기 위해 사용되는 단일특이적 IgM 유형 항체 또는 이의 변이체의 실시양태를 포함한다.
IgG는 FcRn 매개 재활용으로 인해 (예를 들어, 인간) 혈청에서 장기간 자연적으로 지속되며, 이는 대략 21일의 전형적인 반감기를 제공한다. 그럼에도 불구하고 Fc 도메인과 FcRn의 pH 의존적 상호 작용을 조작하여 pH 6.0에서 친화도가 증가하게 하는 동시에 pH 7.4에서 최소한의 결합을 유지하려는 많은 노력이 있었다. PDL BioPharma의 연구원들은 붉은털원숭이에서 IgG 반감기가 약 2배 증가한 돌연변이 T250Q/M428L를 식별하였고(Hinto 등, 2004; J Biol Chem 279:6213), MedImmune의 연구원들은 돌연변이 M252Y/S254T/T256E(YTE라고 함)를 식별하였으며, 이는 사이노몰거스 원숭이에서 IgG 반감기가 대략 4배 증가하는 결과를 초래하였다(Dall'Acqua, 등 2006; J Biol Chem 281:23514). M252Y/S254T/T256E 돌연변이와 포인트 돌연변이 H433K/N434F의 조합은 유사한 효과를 야기한다(Vaccaro 등, 2005, Nat Biotechnol. Oct;23(10):1283-8). 또한, 본 발명의 ABP는 PEG화될 수 있다. PEG화, 즉, 합성 중합체 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과의 화학적 결합은 현재까지 약 10개의 임상적으로 승인된 단백질 및 펩티드 약물과 함께 장기간 작용을 하는 생물학적 제제 개발을 위한 허용된 기술로 부상하였다(Jevsevar 등, 2010; Biotechnol J 5:113). 또한, 본 발명의 단일특이적 IgM 유형 항체 또는 이의 변이체는 약제학적 활성 단백질의 혈장 반감기를 연장하기 위한 PEG화에 대한 생물학적 대안인 PAS화에 적용될 수 있다(Schlapschy 등, 2013; Protein Eng Des Sel 26:489; XL-protein GmbH, Germany). 유사하게도, Amunix의 XTEN 반감기 연장 기술은 PEG화에 대한 다른 생물학적 대안을 제공한다(Schellenberger, 2009, Nat Biotechnol.;27(12):1186-90. doi: 10.1038/nbt.1588). 따라서, 본 발명은 또한 이러한 기술 또는 돌연변이가 특히 인간 혈청에서 혈청 반감기를 연장하기 위해 사용되는 항체의 실시양태를 포함한다.
항체 단편은 "Fab 단편"을 포함하며, 이는 경쇄의 인접 불변 영역과 중쇄의 제1 불변 도메인(CH1)에 의해 함께 유지되는 각각의 중쇄 및 경쇄의 하나의 불변 도메인 및 하나의 가변 도메인으로 구성된다. 이들은 통상적인 항체로부터 프로테아제 소화에 의해, 예를 들어, 파파인을 사용하여 형성될 수 있으나, 유사한 Fab 단편도 유전자 조작으로 생성될 수 있다. Fab 단편은 Fab', Fab 및 "Fab-SH"(적어도 하나의 유리 설프하이드릴기를 함유하는 Fab 단편임)를 포함한다.
Fab' 단편은 항체 힌지 영역으로부터 유래한 하나 이상의 시스테인을 포함하는 중쇄의 제1 불변 도메인의 카르복시 말단에 추가 잔기를 함유한다는 점에서 Fab 단편과 상이하다. Fab' 단편은 "Fab'-SH"(적어도 하나의 유리 설프하이드릴기를 함유하는 Fab' 단편임)를 포함한다.
또한, 항체 단편은 F(ab')2 단편을 포함하며, 이는 CH1 및 CH2 도메인 사이의 불변 영역의 부분("힌지 영역")을 함유하는 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄를 함유하여 쇄간 이황화 결합이 2개의 중쇄 사이에서 형성되도록 한다. 따라서, F(ab')2 단편은 2개의 중쇄 사이의 이황화 결합에 의해 함께 유지되는 2개의 Fab' 단편으로 구성된다. F(ab')2 단편은 힌지 영역 아래를 절단하는 효소를 사용한, 예를 들어, 펩신을 사용한, 단백질 가수 분해 절단에 의해 또는 유전자 조작에 의해 통상적인 항체로부터 제조될 수 있다.
"Fv 영역"은 중쇄 및 경쇄 모두로부터 유래한 가변 영역을 포함하나 불변 영역이 결여되어 있다. "단쇄 항체" 또는 "scFv"는 중쇄 및 경쇄 가변 영역이 항원 결합 영역을 형성하는 단일 폴리펩티드 사슬을 형성하기 위해 가요성 링커에 의해 연결된 Fv 분자이다.
"Fc 영역"은 항체의 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 2개의 중쇄 단편을 포함한다. 2개의 중쇄 단편은 2개 이상의 이황화 결합에 의해 및 CH3 도메인의 소수성 상호작용에 의해 함께 유지된다.
따라서, 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체는 Fab', Fab, Fab'-SH, Fab-SH, Fv, scFv 및 F(ab')2로 구성되는 목록으로부터 선택되는 항체 단편이다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 상기 항체 또는 이의 단편의 프레임워크 서열의 적어도 일부가 인간 컨센서스 프레임워크 서열인 항체이고, 예를 들어 인간 생식계열-인코딩된 프레임워크 서열을 포함한다.
다른 특정 실시양태에서, 본 발명의 단일특이적 IgM 유형 항체 또는 이의 변이체는, 특히 인간 혈청에서, 혈청 반감기를 연장하도록 변형된다. 예를 들어, 본 발명의 항체는 PEG화 및/또는 PAS화되거나 T250Q/M428L, H433K/N434F/Y436 또는 M252Y/S254T/T256E/H433K/N434F 변형이 있는 Fc 영역을 가질 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 적어도 하나의 항체 불변 도메인을 포함할 수 있으며, 특히, 여기서 적어도 하나의 항체 불변 도메인은 CH1, CH2 또는 CH3 도메인 또는 이들의 조합이다.
추가의 이러한 실시양태에서, 항체 불변 도메인을 갖는 본 발명의 항체는, 예를 들어, Fc 영역과 Fc 수용체(면역 효과기 세포 상의 Fc 수용체)의 상호작용을 감소하게 하기 위해, 돌연변이 Fc 영역을 포함한다(예를 들어, Saxena & Wu, 2016; Front Immunol 7:580). 이의 예 및 실시양태는 본원의 다른 부분에서 설명된다.
다른 실시양태에서, 본 발명의 단일특이적 IgM 유형 항체 또는 이의 변이체는 효과기 작용기 및/또는 표지 작용기를 포함할 수 있다. 용어 "효과기 작용기"는 임의의 작용기, 특히, 항원 결합 단백질과 같은 다른 분자에 결합되어 세포독성제로 작용하는 작용기를 의미한다. 적합한 효과기 작용기의 예는 방사성 동위원소 또는 방사성 핵종이다. 다른 적합한 효과기 작용기는 독소, 치료 작용기 또는 화학요법 작용기를 포함한다. 적합한 효과기 작용기의 예는 칼리케아미신, 오리스타틴, 겔다나마이신, 알파-아마니틴, 피롤로벤조디아제핀 및 메이탄신을 포함한다.
용어 "표지" 또는 "표지 작용기"는 검출 가능한 임의의 표지를 지칭한다. 일반적으로, 표지는 검출되는 검정에 따라 다양한 부류로 나뉜다: a) 방사성 동위원소 또는 중동위원소일 수 있는 동위원소 표지; b) 자성 표지(예를 들어, 자성 입자); c) 산화환원 활성 모이어티; d) 광학 염료; 효소 작용기(예를 들어, 겨자무 퍼옥시다아제, β-갈락토시다아제, 루시페라아제, 알칼리 포스파타아제); e) 비오티닐화된 작용기; 및 f) 2차 리포터에 의해 인식되는 사전결정되는 폴리펩티드 에피토프(예를 들어, 류신 지퍼 쌍 서열, 2차 항체에 대한 결합 부위, 금속 결합 도메인, 에피토프 태그 등).
특정 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 올리고머성 항인슐린 항체에 관한 것이며, 여기서 면역글로불린은 서열 식별 번호: 2에서 정의된 바와 같은 CDR1, 서열 식별 번호: 3에서 정의된 바와 같은 CDR2 및 서열 식별 번호: 4에서 정의된 바와 같은 CDR3을 포함하는 가변 중(VH)쇄 및 서열 식별 번호: 6에서 정의된 바와 같은 CDR1, 서열 DAS에 의해 정의된 바와 같은 CDR2 및 서열 식별 번호: 7에서 정의된 바와 같은 CDR3을 포함하는 가변 경(VL)쇄; b) 서열 식별 번호: 9에서 정의된 바와 같은 CDR1, 서열 식별 번호: 10에서 정의된 바와 같은 CDR2 및 서열 식별 번호: 11에서 정의된 바와 같은 CDR3을 포함하는 가변 중(VH)쇄 및 서열 식별 번호: 13에서 정의된 바와 같은 CDR1, 서열 GAS에 의해 정의된 바와 같은 CDR2 및 서열 식별 번호: 14에서 정의된 바와 같은 CDR3을 포함하는 가변 경(VL)쇄; 또는 c) 서열 식별 번호: 16에서 정의된 바와 같은 CDR1, 서열 식별 번호: 17에서 정의된 바와 같은 CDR2 및 서열 식별 번호: 18에서 정의된 바와 같은 CDR3을 포함하는 가변 중(VH)쇄 및 서열 식별 번호: 20에서 정의된 바와 같은 CDR1, 서열 DAS에 의해 정의된 바와 같은 CDR2 및 서열 식별 번호: 21에서 정의된 바와 같은 CDR3을 포함하는 가변 경(VL)쇄;를 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 올리고머성 항인슐린 항체에 관한 것이며, 여기서 올리고머성 항인슐린 항체는 a) 서열 식별 번호: 1의 아미노산 서열 또는 서열 식별 번호: 1과 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%, 바람직하게는, 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 가변 중(VH)쇄 서열 및 서열 식별 번호: 4의 아미노산 서열 또는 서열 식별 번호: 4와 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%, 바람직하게는, 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 가변 경(VL)쇄 서열을 포함하거나; b) 서열 식별 번호: 8의 아미노산 서열 또는 서열 식별 번호: 8과 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%, 바람직하게는, 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 가변 중(VH)쇄 서열 및 서열 식별 번호: 12의 아미노산 서열 또는 서열 식별 번호: 12와 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%, 바람직하게는, 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 가변 경(VL)쇄 서열을 포함하거나; 또는 c) 서열 식별 번호: 15의 아미노산 서열 또는 서열 식별 번호: 15와 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%, 바람직하게는, 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 가변 중(VH)쇄 서열 및 서열 식별 번호: 19의 아미노산 서열 또는 서열 식별 번호: 19와 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%, 바람직하게는, 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 가변 경(VL)쇄 서열을 포함한다.
기준 폴리펩티드 서열에 대한 "아미노산 서열 동일성 백분율(%)"은 서열을 정렬하고 필요하다면 갭을 도입하여 서열 동일성의 최대 백분율을 달성하고, 서열 동일성의 일부로서 임의의 보존적 치환을 고려함이 없이, 기준 폴리펩티드 서열의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열의 아미노산 잔기의 백분율로서 정의된다. 아미노산 서열 동일성 백분율을 결정하기 위한 목적의 정렬은, 예를 들어, BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 Megalign (DNASTAR) 소프트웨어와 같은 공개적으로 이용 가능한 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여, 해당 기술분야의 범위 내에 있는 다양한 방식으로 달성될 수 있다. 통상의 기술자는 비교되는 서열의 전장에 걸쳐 최대 정렬을 달성하는 데 필요한 임의의 알고리즘을 포함하는 서열을 정렬하기에 적절한 매개변수를 결정할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 올리고머성 항인슐린 항체는 서열 식별 번호: 4, 서열 식별 번호: 12 또는 서열 식별 번호: 21의 아미노산 서열과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 가변 경(VL)쇄 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 올리고머성 항인슐린 항체는 서열 식별 번호: 4, 서열 식별 번호: 12 또는 서열 식별 번호: 21의 아미노산 서열과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 가변 경(VL)쇄 서열을 포함하고 참조 서열과 관련된 치환, 삽입 또는 결실을 함유하나, 높은 친화도로 및/또는 단일특이적으로 인슐린 및/또는 프로인슐린에 결합하는 능력을 유지한다. 선택적으로, 본 발명의 올리고머성 항인슐린 항체는 해당 서열의 번역 후 변형을 포함하는 서열 식별 번호: 4, 서열 식별 번호: 12 또는 서열 식별 번호: 21의 VL 서열을 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 올리고머성 항인슐린 항체는 서열 식별 번호: 1, 서열 식별 번호: 8 또는 서열 식별 번호: 15의 아미노산 서열과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 가변 중(VH)쇄를 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 올리고머성 항인슐린 항체는 서열 식별 번호: 1, 서열 식별 번호: 8 또는 서열 식별 번호: 15의 아미노산 서열과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 가변 중(VH)쇄 서열을 포함하고 참조 서열과 관련된 치환, 삽입 또는 결실을 함유하나, 높은 친화도로 및/또는 단일특이적으로 인슐린 및/또는 프로인슐린에 결합하는 능력을 유지한다. 선택적으로, 본 발명의 올리고머성 항인슐린 항체는 해당 서열의 번역 후 변형을 포함하는 서열 식별 번호: 1, 서열 식별 번호: 8 또는 서열 식별 번호: 15의 VH 서열을 포함한다.
특정 실시양태에서, 총 1 내지 10개의 아미노산은 서열 식별 번호: 1, 서열 식별 번호: 4, 서열 식별 번호: 8, 서열 식별 번호: 12, 서열 식별 번호: 15 및/ 또는 서열 식별 번호:21에서 치환되고/되거나 삽입되고/되거나 결실된다. 특정 실시양태에서, 총 1 내지 5개의 아미노산은 서열 식별 번호: 1, 서열 식별 번호: 4, 서열 식별 번호: 8, 서열 식별 번호: 12, 서열 식별 번호: 15 및/ 또는 서열 식별 번호:21에서 치환되고/되거나 삽입되고/되거나 결실된다.
특정 실시양태에서, 치환, 삽입 또는 결실은 CDR 외부 영역에서(즉, FR에서) 발생한다. 바람직한 실시양태에서, 서열 식별 번호: 1, 서열 식별 번호: 4, 서열 식별 번호: 8, 서열 식별 번호: 12, 서열 식별 번호: 15 및/또는 서열 식별 번호: 21의 총 6개의 아미노산은 포유동물 세포에서 발현을 최적화하기 위해 치환되었다.
항체의 아미노산 서열 변이체는 항체를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열에 적절한 변형을 도입하여 또는 펩티드 합성에 의해 제조될 수 있다. 이러한 변형은, 예를 들어, 항체의 아미노산 서열 내의 잔기로부터의 결실 및/또는 이에 대한 삽입 및/또는 이의 치환을 포함한다. 최종 작제물이 원하는 특성, 예를 들어, 항원 결합을 보유하기만 한다면, 결실, 삽입 및 치환의 임의의 조합이 최종 작제물에 도달하기 위해 이루어질 수 있다.
특정 실시양태에서, 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 항체 변이체가 제공된다. 아미노산 치환은 관심 항체에 도입될 수 있고, 원하는 활성, 예를 들어, 유지/개선된 항원 결합, 저하된 면역원성, 또는 변경된 ADCC 또는 CDC에 대해 생성물이 선별될 수 있다.
치환적 변이체의 하나의 유형은 모체 항체(예를 들어, 인간화 또는 인간 항체)의 하나 이상의 초가변 영역 잔기를 치환하는 것을 수반한다. 일반적으로, 추가 연구를 위해 선택되는 결과적인 변이체(들)는 모 항체에 비해 특정 생물학적 특성(예를 들어, 친화도 증가, 면역원성 감소)에서 변형(예를 들어, 개선)이 있을 것이고/것이거나 모 항체의 특정 생물학적 특성이 실질적으로 유지될 것이다. 예시적인 치환 변이체는 친화도 성숙 항체이며, 이는, 예를 들어, 본원에서 설명되는 기법과 같은 파지 디스플레이 기반 친화도 성숙화 기법을 사용하여 편리하게 생성될 수 있다. 간단히 말해서, 하나 이상의 CDR 잔기가 돌연변이되고 변이체 항체가 파지에서 디스플레이되고 특정 생물학적 활성(예를 들어, 결합 친화도)에 대해 선별된다.
변경(예를 들면, 치환)은, 예를 들어, 항체 친화도를 개선하기 위해, CDR에서 이루어질 수 있다. 이러한 변경은 CDR "핫스팟", 즉, 체세포 성숙화 과정 동안 높은 빈도로 돌연변이를 거치는 코돈에 의해 인코딩되는 잔기(예를 들어, Chowdhury, 2008, Methods Mol. Biol. 207:179-196 참조), 및/또는 SDR(a-CDR)에서 이루어질 수 있으며, 결과적인 변이체 VH 또는 VL은 결합 친화도에 대하여 시험된다. 2차 라이브러리의 작제화 및 재선택화에 의한 친화도 성숙화는 예를 들어, 문헌[Hoogenboom 등, 2002 Methods in Molecular Biology 178:1-37]에서 설명되었다. 친화도 성숙화의 일부 실시양태에서, 다양성은 임의의 다양한 방법(예를 들어, 오류-경향 PCR, 쇄 셔플링, 또는 올리고뉴클레오티드-관련 돌연변이생성)에 의해 성숙화를 위하여 선정되는 가변 유전자에 도입된다. 그 후, 2차 라이브러리가 생성된다. 그 후, 라이브러리는 선별되어 원하는 친화도를 갖는 임의의 항체 변이체를 식별한다. 다양성을 도입하는 다른 방법은 CDR-관련 접근법을 포함하고, 여기서 여러 CDR 잔기(예를 들어, 한 번에 4 내지 6개 잔기)는 무작위화된다. 항원 결합에 관여하는 CDR 잔기는, 예를 들어, 알라닌 스캐닝 돌연변이생성 또는 모델링을 사용하여 구체적으로 식별될 수 있다. 특히, CDR- H3 및 CDR-L3이 종종 표적화된다. 또 다른 실시양태에서, 룩-쓰루(look-through) 돌연변이생성은 선택되는 아미노산의 조합 돌연변이를 동시에 평가하고 최적화하는 다차원 돌연변이생성 방법으로 항체 친화도를 최적화하기 위해 사용된다(Rajpal, Arvind 등, 2005, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America vol. 102,24:8466-71).
특정 실시양태에서, 치환, 삽입 또는 결실은 이러한 변경이 항원에 결합하는 항체의 능력을 실질적으로 감소하게 하지 않는 한 하나 이상의 CDR 내에서 발생할 수 있다. 예를 들어, 결합 친화도 및/또는 단일특이성을 실질적으로 감소하게 하지 않는 보존적 변경(예를 들어, 본원에서 제공되는 바와 같은 보존적 치환)은 CDR에서 이루어질 수 있다. 이러한 변경은 CDR "핫스팟" 또는 SDR의 외부일 수 있다. 위에서 제공되는 변이체 VH 및 VL 서열의 특정 실시양태에서, 각각의 CDR 어느 하나는 변경되지 않거나, 1, 2 또는 3개 이하의 아미노산 치환을 함유한다.
돌연변이생성의 표적에 대해 표적화될 수 있는 항체의 잔기 또는 영역을 식별하는 유용한 방법은 문헌[Cunningham 및 Wells, 1989, Science, 244: 1081-1085]에서 설명되는 바와 같이 "알라닌 스캐닝 돌연변이생성"이라고 한다. 이 방법에서, 잔기 또는 표적 잔기(예를 들어, arg, asp, his, lys 및 glu와 같은 하전된 잔기)의 그룹을 식별하고 중성 또는 음전하를 띤 아미노산(예를 들어, 알라닌 또는 폴리알라닌)으로 대체하여 항체와 항원의 상호작용이 영향을 받는지 여부를 결정한다. 추가 치환이 초기 치환에 대한 기능적 민감도를 나타내는 아미노산 위치에 도입될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 항원-항체 복합체의 결정 구조는 항체와 항원 사이의 접촉점을 식별하기 위해 사용된다. 이러한 접촉 잔기 및 인접 잔기는 치환 후보로서 표적화되거나 제거될 수 있다. 변이체를 선별하여 원하는 특성을 갖는지 여부를 결정할 수 있다.
특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 항체는 항체가 글리코실화되는 정도가 증가하거나 감소하도록 변경된다. 항체의 글리코실화 부위의 첨가 또는 결실은 하나 이상의 글리코실화 부위가 생성되거나 제거되도록 아미노산 서열을 변경하여 편리하게 성취될 수 있다.
항체가 Fc 영역을 포함하는 경우, 이에 부착된 탄수화물이 변경될 수 있다. 포유동물 세포에 의해 생성되는 천연 항체는 전형적으로 Fc 영역의 CH2 도메인의 Asn297에 N-결합에 의해 일반적으로 부착되는 분지형 바이안테너리(biantennary) 올리고당을 포함한다. 예를 들어, Wright 등, 1997, TIBTECH 15:26-32 참조. 올리고당은 다양한 탄수화물, 예를 들어 만노스, N-아세틸 글루코사민(GlcNAc), 갈락토스 및 시알산뿐만 아니라 바이안테너리 올리고당 구조의 "줄기"에서 GlcNAc에 부착되는 푸코스를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체에서 올리고당의 변형이 특정 개선된 특성을 갖는 항체 변이체를 생성하기 위해 이루어질 수 있다.
일 실시양태에서, Fc 영역에 (직접적으로 또는 간접적으로) 부착되는 푸코스가 결여되는 탄수화물 구조를 갖는 항체 변이체가 제공된다. 예를 들어, 이러한 항체에서 푸코스의 양은 1% 내지 80%, 1% 내지 65%, 5% 내지 65% 또는 20% 내지 40%일 수 있다. 푸코스의 양은 예를 들어, WO 2008/077546에서 설명되는 바와 같이 MALDI-TOF 질량 분광법에 의해 측정된 바와 같이 Asn 297에서 부착되는 모든 글리코구조(예를 들어, 복합, 하이브리드 및 고만노스(high mannose) 구조)의 합에 대한 Asn297에서 당 사슬 내의 푸코스의 평균량을 계산하여 결정된다. Asn297은 Fc 영역에서 약 위치 297에 위치하는 아스파라긴 잔기를 지칭하나(Fe 영역 잔기의 Eu 번호); 또한, Asn297은 항체의 사소한 서열 변이로 인해 위치 297의 약 ±3 아미노산 업스트림 또는 다운스트림, 즉 위치 294와 300 사이에 위치할 수 있다. 이러한 푸코스화 변이체는 염증에 변경된 영향을 미칠 수 있다(Irvine, Edward B, 및 Galit Alter., 2020, Glycobiology vol. 30,4: 241-253). 예를 들어, US 2003/0157108; US 2004/0093621 참조. "탈푸코스화" 또는 "푸코스 결핍" 항체 변이체와 관련되는 문헌의 예는 다음을 포함한다. US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO 2005/053742; WO 2002/031140; Okazaki 등. 2004 J. Mol. Biol. 336:1239-1249; Yamane-Ohnuki 등, 2004, Biotech. Bioeng. 87: 614. 탈푸코스화 항체를 생성할 수 있는 세포주의 예는 단백질 푸코스화에서 결핍되는 Lec13 CHO 세포(Ripka 등, 1986, Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545; US 2003/0157108; 및 WO 2004/056312, 특히, 실시예 11), 및 녹아웃(knockout) 세포주, 예컨대, 알파-1,6-푸코실트렌스페라제 유전자, FUT8, 녹아웃 CHO 세포(예를 들어, Yamane-Ohnuki 등, 2004, Biotech. Bioeng. 87: 614; Kanda, Y. 등, 2006, Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688; 및 WO 2003/085l07 참조)를 포함한다.
예를 들어, 항체의 Fc 영역에 부착되는 바이안테너리 올리고당이 GlcNAc에 의해 이등분되는 이등분되는 올리고당을 갖는 항체 변이체가 더 제공된다. 이러한 항체 변이체는 변경되는 푸코스화 및/또는 염증에 대한 변경되는 영향을 가질 수 있다(Irvine, Edward B, 및 Galit Alter., 2020, Glycobiology vol. 30,4: 241-253). 이러한 항체 변이체의 예는 예를 들어, WO 2003/011878; 미국 특허 제6,602,684호; 및 US 2005/0123546에서 설명되어 있다. 또한, Fc 영역에 부착되는 올리고당에서 적어도 하나의 갈락토스 잔기를 갖는 항체 변이체가 제공된다. 이러한 항체 변이체는 개선된 CDC 기능을 가질 수 있다. 이러한 항체 변이체는 예를 들어 WO 1997/30087; WO 1998/58964; 및 WO 1999/22764에서 설명되어 있다.
특정 실시양태에서, 하나 이상의 아미노산 변형은 본원에서 제공되는 항체의 Fc 영역으로 도입되어 Fc 영역 변이체를 생성할 수 있다. Fc 영역 변이체는 하나 이상의 아미노산 위치에 아미노산 변형(예를 들어, 치환)을 포함하는 인간 Fc 영역 서열(예를 들어, 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 Fc 영역)을 포함할 수 있다.
반감기가 증가하고 모체 IgG를 태아로 전달하는 역할을 하는 신생아 Fc 수용체(FcRn)에 대한 결합이 개선된 항체(Guyer 등, 1976, J. Immunol. 117:587 및 Kirn 등, 1994 J. Immunol. 24:249)는 US2005/0014934에서 설명되어 있다. 이러한 항체는 FcRn에 대한 Fc 영역의 결합을 개선하는 하나 이상의 치환을 갖는 Fc 영역을 포함한다. 이러한 Fc 변이체는 Fc 영역 잔기 중 하나 이상에 치환을 갖는 것을 포함한다: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 또는 434, 예를 들어, Fc 영역 잔기 434의 치환(US 2006/0194291).
특정 실시양태에서, 항체의 하나 이상의 잔기가 시스테인 잔기로 치환되는 시스테인 조작 항체, 예를 들어 "thioMAb"를 생성하는 것이 바람직할 수 있다. 특정 실시양태에서, 치환되는 잔기는 항체의 접근 가능한 부위에서 발생한다. 이러한 잔기를 시스테인으로 치환하여, 반응성 티올기가 항체의 접근 가능한 부위에 위치되고, 본원에서 더 설명되는 바와 같이 약물 모이어티 또는 링커-약물 모이어티와 같은 다른 모이어티에 항체가 접합하게 하기 위해 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 아래의 잔기 중 임의의 하나 이상이 시스테인으로 치환될 수 있다: 경쇄의 V205(Kabat 번호); 중쇄의 A118(EU 번호); 및 중쇄 Fc 영역의 S400(EU 번호). 시스테인 조작된 항체는 예를 들어, US 7521541에서 설명되는 바와 같이 생성될 수 있다.
특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 항체는 해당 기술분야에서 알려져 있고 쉽게 이용 가능한 추가 비단백질성 모이어티를 함유하도록 더 변형될 수 있다. 항체의 유도체화에 적합한 모이어티는 수용성 중합체를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 수용성 중합체의 비제한적 예는 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜의 공중합체, 카르복시메틸셀룰로오스, 덱스트란, 폴리비닐 알코올, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리-1,3-디옥솔란, 폴리- 1,3,6-트리옥산, 에틸렌/말레산 무수물 공중합체, 폴리아미노산(단독중합체 또는 무작위 공중합체), 덱스트란 또는 폴리(n-비닐 피롤리돈)폴리에틸렌 글리콜, 프로프로필렌 글리콜 단독중합체, 프로프로필렌 옥사이드/에틸렌 옥사이드 공중합체, 폴리옥시에틸화 폴리올(예를 들어, 글리세롤), 폴리비닐 알코올 및 이들의 혼합물을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데히드는 물에 대한 안정성으로 인해 제조에 유리할 수 있다. 중합체는 임의의 분자량일 수 있고 분지형 또는 비분지형일 수 있다. 항체에 부착되는 중합체의 수는 다양할 수 있으며, 2개 이상의 중합체가 부착되는 경우 동일한 분자이거나 상이한 분자일 수 있다. 일반적으로, 유도체화에 사용되는 중합체의 수 및/또는 유형은 개선될 항체의 특정 특성 또는 기능, 항체 유도체가 정의된 조건 하에서 치료에서 사용될 것인지 여부 등을 포함하나 이에 제한되지 않는 고려사항에 기초하여 결정될 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 올리고머성 항인슐린 항체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.
본원에서 사용되는 바와 같이 용어 "폴리뉴클레오티드"는 핵산 서열을 지칭한다. 핵산 서열은 DNA 또는 RNA 서열일 수 있으며, 바람직하게는, 핵산 서열은 DNA 서열이다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 전술한 핵산 서열로 본질적으로 구성되거나 전술한 핵산 서열을 포함한다. 따라서, 추가 핵산 서열도 함유할 수 있다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 바람직하게는 단리된 폴리뉴클레오티드(즉, 천연 환경으로부터 단리된 것) 또는 유전자 변형된 형태로 제공되어야 한다. 또한, 본원에서 지칭되는 단리된 폴리뉴클레오티드는 천연 세포 환경 이외의 세포 환경에서 존재하는 폴리뉴클레오티드, 즉, 이종 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 용어 폴리뉴클레오티드는 단일 및 이중 가닥 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 또한, 글리코실화 또는 메틸화 폴리뉴클레오티드와 같은 천연 발생 변형 폴리뉴클레오티드 또는 비오티닐화 폴리뉴클레오티드와 같은 인공 변형 폴리뉴클레오티드를 포함하는 화학적으로 변형된 폴리뉴클레오티드도 포함된다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 서열 식별 번호: 22의 뉴클레오티드 서열 또는 서열 식별 번호: 22와 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 바람직하게는, 서열 식별 번호: 23, 서열 식별 번호: 24 및 서열 식별 번호: 25의 서열을 포함하는 가변 중(VH)쇄 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열에 관한 것이다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 서열 식별 번호: 26의 뉴클레오티드 서열 또는 서열 식별 번호: 26과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 바람직하게는, 서열 식별 번호: 27, GATGCATCC 및 서열 식별 번호: 28의 서열을 포함하는 가변 경(VL)쇄 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열에 관한 것이다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 a) 서열 식별 번호: 22의 뉴클레오티드 서열 또는 서열 식별 번호: 22와 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 바람직하게는, 서열 식별 번호: 23, 서열 식별 번호: 24 및 서열 식별 번호: 25의 서열을 포함하는 가변 중(VH)쇄 서열; 및 b) 서열 식별 번호: 서열 식별 번호: 26의 뉴클레오티드 서열 또는 서열 식별 번호: 26과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 바람직하게는, 서열 식별 번호: 27, GATGCATCC 및 서열 식별 번호: 28의 서열을 포함하는 가변 경(VL)쇄 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열에 관한 것이다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 서열 식별 번호: 29의 뉴클레오티드 서열 또는 서열 식별 번호: 29과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 바람직하게는, 서열 식별 번호: 30, 서열 식별 번호: 31 및 서열 식별 번호: 32의 서열을 포함하는 가변 중(VH)쇄 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열에 관한 것이다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 서열 식별 번호: 33의 뉴클레오티드 서열 또는 서열 식별 번호: 33과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 바람직하게는, 서열 식별 번호: 34, GGTGCATCC 및 서열 식별 번호: 35의 서열을 포함하는 가변 경(VL)쇄 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열에 관한 것이다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 a) 서열 식별 번호: 29의 뉴클레오티드 서열 또는 서열 식별 번호: 29과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 바람직하게는, 서열 식별 번호: 30, 서열 식별 번호: 31 및 서열 식별 번호: 32의 서열을 포함하는 가변 중(VH)쇄 서열; 및 b) 서열 식별 번호: 33의 뉴클레오티드 서열 또는 서열 식별 번호: 33과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 바람직하게는, 서열 식별 번호: 34, GGTGCATCC 및 서열 식별 번호: 35의 서열을 포함하는 가변 경(VL)쇄 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열에 관한 것이다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 서열 식별 번호: 36의 뉴클레오티드 서열 또는 서열 식별 번호: 36과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 바람직하게는, 서열 식별 번호: 37, 서열 식별 번호: 38 및 서열 식별 번호: 39의 서열을 포함하는 가변 중(VH)쇄 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열에 관한 것이다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 서열 식별 번호: 40의 뉴클레오티드 서열 또는 서열 식별 번호: 40과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 바람직하게는, 서열 식별 번호: 41, GATGCATCC 및 서열 식별 번호: 42의 서열을 포함하는 가변 경(VL)쇄 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열에 관한 것이다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 a) 서열 식별 번호: 36의 뉴클레오티드 서열 또는 서열 식별 번호: 36과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 바람직하게는, 서열 식별 번호: 37, 서열 식별 번호: 38 및 서열 식별 번호: 39의 서열을 포함하는 가변 중(VH)쇄 서열; 및 b) 서열 식별 번호: 40의 뉴클레오티드 서열 또는 서열 식별 번호: 40과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 바람직하게는, 서열 식별 번호: 41, GATGCATCC 및 서열 식별 번호: 42의 서열을 포함하는 가변 경(VL)쇄 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열에 관한 것이다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 본원에서 설명되는 항체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 벡터로서 사용하기에 적합하다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다.
용어 "숙주 세포", "숙주 세포주" 및 "숙주 세포 배양물"은 상호교환적으로 사용되며 외인성 핵산이 도입된 세포, 예컨대, 이러한 세포의 자손을 지칭한다. 숙주 세포는 1차 형질전환된 세포 및 계대 횟수에 관계없이 이로부터 유래된 자손을 포함하는, "형질전환체" 및 "형질전환된 세포"를 포함한다. 자손은 핵산 함량이 부모 세포와 완전히 동일하지 않을 수 있지만, 돌연변이를 함유할 수 있다. 원래 형질전환된 세포에서 스크리닝되거나 선택된 것과 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 돌연변이 자손이 본원에 포함된다.
특정 실시양태에서, 숙주 세포는 요법(예를 들어, 세포 요법)에서 직접적으로 또는 간접적으로 사용된다. 특정 실시양태에서 세포 요법을 위한 방법은 (i) 대상체로부터 세포를 수득하는 단계; (ii) 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 도구(예를 들어, 벡터)를 사용하여 세포를 형질전환시키고/시키거나 세포를 형질전환시켜 본 발명의 항체를 생성하는 단계; 및 (iii) 형질전환된 세포를 대상체에 투여하는 단계를 포함한다. 특정 실시양태에서, 세포 요법을 위한 방법의 단계 (i) 및 단계 (iii)의 대상체는 동일한 대상체이다. 특정 실시양태에서, 세포 요법을 위한 방법의 단계 (i) 및 단계 (iii)의 대상체는 상이한 대상체이다. 특정 실시양태에서, 세포 요법을 위한 방법의 단계 (i) 및 단계 (iii)의 대상체는 상이한 종에 속하는 상이한 대상체이다. 특정 실시양태에서, 세포 요법을 위한 방법의 단계 (i)의 대상체는 Sus 속의 대상체이고 세포 요법을 위한 방법의 단계 (iii)의 대상체는 호모 사피엔스 종의 대상체이다.
특정 실시양태에서, 숙주 세포는 줄기 세포이다. 특정 실시양태에서, 숙주 세포는 분화 세포이다.
따라서, 본 발명은 본 발명의 숙주 세포가 항원 기능 제한 항원 결합제의 결합과 경쟁하여 표적 항원, 특히 인슐린의 기능을 보호하고/하거나 조절하는 항체, 변이체 또는 단편의 생성을 가능하게 한다는 놀라운 발견에 적어도 부분적으로 기반한다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는 올리고머성 항인슐린 항체를 생성하기 위한 방법에 관한 것이다.
특정 실시양태에서, 항체를 생성하는 방법은 본 발명의 항체를 효율적으로 생산하기에 적합한 조건 하에서 본 발명의 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함한다.
한 이러한 실시양태에서, 숙주 세포는 (1) 본 발명의 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열 및 항체의 VH를 포함하는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산을 포함하는 벡터, 또는 (2) 본 발명의 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산을 포함하는 제1 벡터 및 항체의 VH를 포함하는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산을 포함하는 제2 벡터를 포함한다(예를 들어, 형질전환된다). 일 실시양태에서, 숙주 세포는 진핵생물, 예를 들어 중국 햄스터 난소(CHO) 세포 또는 림프성 세포(예를 들어, YO, NSO, Sp20 세포)이다. 일 실시양태에서, 항체를 제조하는 방법이 제공되며, 여기서 방법은 항체의 발현에 적합한 조건 하에서, 위에서 제공되는 바와 같은, 항체를 인코딩하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 배양하는 단계 및, 선택적으로, 숙주 세포(또는 숙주 세포 배양 배지)로부터 항체를 회수하는 단계를 포함한다.
본 발명에 따른 항체(예를 들어, 보호-조절 항체)의 재조합 생성을 위해, 항체를 인코딩하는 핵산, 예를 들어, 위에서 설명되는 바와 같은 핵산이 단리되고, 숙주 세포에서 추가 클로닝 및/또는 발현을 위해 하나 이상의 벡터에 삽입된다. 이러한 핵산은 통상적인 절차(예를 들어, 항체 중쇄 및 경쇄를 인코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용)에 의해 쉽게 단리 및 시퀀싱될 수 있다.
항체-인코딩 벡터의 클로닝 또는 발현에 적합한 숙주 세포는 본원에서 설명되는 원핵 또는 진핵 세포를 포함한다. 예를 들어, 항체는, 특히, 글리코실화 및 Fc 효과기 기능이 필요하지 않은 경우에, 박테리아에서 생성될 수 있다. 박테리아 내 항체 단편 및 폴리펩티드의 발현에 대해, 예를 들어 US 5648237, US 5789199, 및 US 5840523; Charlton, 2003, Methods in Molecular Biology, Vol. 248; BKC Lo, 2003, Humana Press, pp. 245-254 참조. 발현 후, 항체는 가용성 분획에서 박테리아 세포 페이스트로부터 단리될 수 있고 추가로 정제될 수 있다.
원핵생물 외에도, 사상 진균 또는 효모와 같은 진핵 미생물은 글리코실화 경로가 "인간화"되어 부분 또는 완전 인간 글리코실화 패턴을 갖는 항체의 생성을 초래하는 진균 및 효모 균주를 포함하는 항체 인코딩 벡터에 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이다. Gerngross, 2004, Nat. Biotech. 22:1409-1414, 및 Li 등, 2006, Nat. Biotech. 24:210-215 참조.
글리코실화된 항체의 발현에 적합한 숙주 세포는 또한 다세포 유기체(무척추동물 및 척추동물)로부터 유래된다. 무척추동물 세포의 예는 식물 및 곤충 세포를 포함한다. 특히, 스포돕테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) 세포의 형질감염을 위해 곤충 세포와 함께 사용될 수 있는 수많은 바큘로바이러스 균주가 식별되어 있다.
식물 세포 배양물은 또한 숙주로서 이용될 수 있다. 예를 들어, US 5959177; US 6040498, US 6420548, US 7125978 및 US 6417429 참조(유전자이식 식물에서 항체를 생성하기 위한 PLANTIBODIES? 기술을 설명함).
척추동물 세포도 숙주로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 현탁액에서 성장하도록 적응된 포유동물 세포주가 유용할 수 있다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 다른 예는 SV40에 의해 형질전환된 마카크 신장 CVl 주(COS-7); 인간 배아 신장 주(293 또는 293 세포, 예를 들어, Graham 등, 1997, J. Gen Viral. 36:59에서 설명되는 바와 같음); 새끼 햄스터 신장 세포(BHK); 마우스 세르톨리 세포(TM4 세포, 예를 들어, Mather, 1980, Biol. Reprod. 23:243-251에서 설명되는 바와 같음); 마카크 신장 세포(CV l); 아프리카 녹색 마카크 신장 세포(VER0-76); 인간 자궁경부 암종 세포(HELA); 개 신장 세포(MDCK); 버팔로 래트 간 세포(BRL 3A); 인간 폐 세포(W138); 인간 간 세포(Hep G2); 마우스 유선 종양(MMT 060562); TRI 세포(예를 들어, Mather 등, 1982, Annals N. Y Aead. Sei. 383:44-68에서 설명되는 바와 같음); MRC 5 세포; 및 FS4 세포이다. 다른 유용한 포유동물 숙주 세포주는 DHFR CHO 세포를 포함하는 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포를 포함한다(Urlaub 등, 1980, Proc. Natl. Acad. Sc. USA 77:4216); 및 골수종 세포주, 예컨대, YO, NSO 및 Sp2/0를 포함한다. 항체 생성에 적합한 특정 포유동물 숙주 세포주의 검토를 위해, 예를 들어, 문헌[Yazaki 및 Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 BKC Lo, 2003., Humana Press, pp. 255-268] 참조.
수득되는 특이적 항체의 양은 ELISA를 사용하여 정량화할 수 있으며, 이는 또한 아래에 본원에서 설명된다. 항체의 생성을 위한 추가 방법은 해당 기술분야에서 잘 알려져 있다(예를 들어, Harlow 및 Lane, 1988, CSH Press, Cold Spring Harbor 참조).
특정 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 올리고머성 항인슐린 항체 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다 특정 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 폴리뉴클레오티드 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 숙주 세포 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
본원에서 사용되는 용어 "약제학적으로 허용 가능한 담체"는 사용되는 투여량 및 농도에서 수용자에게 무독성인 활성 성분(들) 이외의 조성물에 있는 성분을 지칭한다.
약제학적으로 허용 가능한 담체는 인산염, 구연산염 및 다른 유기산과 같은 완충제; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 항산화제; 보존제(예를 들어, 실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤잘코늄 클로라이드; 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 메틸 또는 프로필 파라벤과 같은 알킬 파라벤; 카테콜; 레조르시놀;사이클로헥사놀; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량(약 10개 미만의 잔기) 폴리펩티드; 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린과 같은 단백질; 폴리비닐피롤리돈과 같은 친수성 중합체; 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신과 같은 아미노산; 포도당, 만노스 또는 덱스트린을 포함하는 단당류, 이당류 및 기타 탄수화물; EDTA와 같은 킬레이트제; 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨과 같은 당류; 나트륨과 같은 염 형성 반대 이온; 금속 복합체(예를 들어, Zn-단백질 복합체); 및/또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 같은 비이온성 계면활성제를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 본원에서 예시적인 약제학적으로 허용 가능한 담체는 간질(interstitial) 약물 분산제, 예컨대, 가용성 중성-활성 히알루로니다제 당단백질(sHASEGP), 예를 들어 인간 가용성 PH-20 히알루로니다제 당단백질, 예컨대, rHuPH20(HYLENEX®, Baxter International, Inc.)을 더 포함한다. rHuPH20을 포함하는 특정 예시적인 sHASEGP 및 사용 방법은 US 2005/0260186 및 US 2006/0104968에서 설명되어 있다.
약제학적으로 허용 가능한 담체 및/또는 부형제는 본 발명의 수단의 안정성, 전달 및/또는 약동학/약력학 특성을 용이하게 할 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 추가 치료제를 포함하는 본 발명의 약제학적 조성물에 관한 것이다.
본원에서 사용되는 바와 같이 용어 "치료제"는 대상체에게 치료적 유효량으로 투여시 대상체에게 치료적 이점을 제공하는 화합물을 지칭한다. 치료제는 질환 또는 의학적 병태를 치료, 제어 또는 예방하기 위해 사용되는 임의의 유형의 약물, 의약품, 제약품, 호르몬, 항생제, 단백질, 유전자, 성장 인자, 생리활성 물질일 수 있다. 통상의 기술자는 "치료제"라는 용어가 규제 승인을 받은 약물에 제한되지 않는다는 것을 이해할 것이다.
일부 실시양태에서, 치료제는 소분자 약물, 단백질/폴리펩티드, 항체, 항생제 활성을 갖는 분자 약물, 파지 기반 요법, 핵산 분자 및 siRNA의 군으로부터 선택될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에서 설명되는 치료제는 펩티드이다. 일부 실시양태에서, 본원에서 설명되는 치료제는 호르몬이다. 일부 실시양태에서, 본원에서 설명되는 치료제는 인슐린이다.
본 발명자들은 본원에서 설명되는 수단 및 방법이 내인성 인슐린을 조절하는 데 유용하다는 것을 입증한다(예를 들어, 실시예 6 및 7 참조). 동일한 메커니즘을 사용하여 포도당 항상성에 영향을 미치는 치료제, 예를 들어, 인슐린과 같은 치료제의 효과를 향상시키거나 보호할 수 있다.
따라서, 본 발명은 본원에서 설명되는 수단 및 방법이 다른 치료제의 효과를 개선할 수 있다는 발견에 적어도 부분적으로 기반한다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 올리고머성 항인슐린 항체의 치료에서의 용도에 관한 것이다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 치료에서의 용도에 관한 것이다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 숙주 세포의 치료에서의 용도에 관한 것이다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 약제학적 조성물의 치료에서의 용도에 관한 것이다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 올리고머성 항인슐린 항체, 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 본 발명의 숙주 세포 또는 본 발명의 약제학적 조성물의 인슐린 연관 질환 또는 장애의 치료에서의 용도에 관한 것이다.
본원에서 사용되는 용어 "인슐린 연관 질환 또는 장애"는 인슐린 생성, 인슐린 효과, 인슐린 신호전달, 인슐린 분포, 인슐린 대사 및/또는 인슐린 제거가 이상조절되는 임의의 질환 또는 장애를 지칭한다.
일부 실시양태에서, 인슐린 연관 질환 또는 장애는 다낭성 난소 증후군, 대사 증후군 및 당뇨병의 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 질환 또는 장애이다.
일부 실시양태에서, 인슐린 연관 질환 또는 장애는 아드레날린, 글루카곤, 코르티솔, 소마토스타틴의 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 제제의 증가되는 수준과 연관되는 적어도 하나의 질환 또는 장애이다.
일부 실시양태에서, 인슐린 연관 질환 또는 장애는 인슐린 조절제의 치료의 적어도 하나의 부작용이다. 일부 실시양태에서, 인슐린 조절제는 아드레날린, 글루카곤, 스테로이드 및 소마토스타틴 군으로부터 선택된다.
본 발명에 의해 제공되는 수단 및 방법은 인슐린에 대한 면역 반응의 조절을 가능하게 한다. 인슐린에 대한 면역 반응은 건강한 대상체 및/또는 환자에서 및/또는 인슐린 치료 동안 발생할 수 있다(예를 들어, 실시예 6 및 7 참조). 본 발명자들은 광범위한 인슐린 연관 증상이 본 발명의 수단 및 방법에 의해 영향을 받을 수 있음을 나타낸다(예를 들어, 도 11, 12, 16, 실시예 6 및 7 참조). 따라서, 수단 및 방법은 투여되는 및/또는 내인성 인슐린의 효과를 개선하고 임의의 인슐린 연관 질환 또는 장애가 감소하게 할 수 있다.
따라서, 본 발명은 본 발명의 수단 및 방법이 인슐린 기능을 보호하고/하거나 조절하기 위해 사용될 수 있다는 놀라운 발견에 적어도 부분적으로 기반한다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 인슐린 연관 질환 또는 장애를 진단 및/또는 예측하는 방법에 관한 것으로, 방법은
(i) 검체로부터 유래한 프로인슐린 및/또는 인슐린에 대한 항인슐린 IgM 항체의 결합의 친화도를 결정하는 단계로서, 검체는 대상체로부터 수득되었고 대상체는 인슐린 연관 질환 또는 장애가 있다고 진단되었거나 이의 위험이 있는 단계; (ii) 단계 (i)에서 결정되는 수치(들)를 기준 값과 비교하는 단계; 및 (iii) 단계 (ii)에서 이루어진 비교에 기반하여 대상체에서 인슐린 연관 질환 또는 장애를 진단 및/또는 예측하는 단계로서, 바람직하게는 프로인슐린 및/또는 인슐린에 대한 항인슐린 IgM 항체의 결합의 더 낮은 친화도는 인슐린 연관 질환 또는 장애에 대한 더 높은 위험을 나타내는 단계를 포함한다.
또한, 검체로부터 유래한 프로인슐린 및/또는 인슐린에 대한 항인슐린 IgM 항체의 결합의 친화도를 결정하는 단계는 측정 기기 또는 데이터베이스로부터 상응하는 정보를 검색하여 달성될 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 대상체가 인슐린 연관 질환 또는 장애의 치료에 민감한지 여부를 결정하기 위한 방법으로서, 방법은 (i) 검체로부터 유래한 프로인슐린 및/또는 인슐린에 대한 항인슐린 IgM 항체의 결합의 친화도를 결정하는 단계로서, 검체는 대상체로부터 수득되었고 대상체는 인슐린 연관 질환 또는 장애가 있다고 진단되었거나 이의 위험이 있는 단계; (ii) 단계 (i)에서 결정되는 수치(들)를 기준 값과 비교하는 단계; 및 (iii) 대상체가 인슐린 연관 질환 또는 장애의 치료에 민감한지 여부를 결정하는 단계로서, 바람직하게는 프로인슐린 및/또는 인슐린에 대한 항인슐린 IgM 항체의 결합의 더 낮은 친화도는 인슐린 연관 질환 또는 장애의 치료에 대한 더 높은 민감성을 나타내는 단계를 포함한다.
본 발명자들은 IgM 항체의 친화도가 인슐린 연관 질환 또는 장애에서 질환 발달, 진행 및 결과를 예측할 수 있음을 발견하였다(실시예 10).
따라서, 본 발명은 대상체의 IgM 항체 친화도 상태에 포함되는 예측 정보에 적어도 부분적으로 기반한다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 올리고머성 항인슐린 항체의 본 발명의 용도, 폴리뉴클레오티드의 본 발명의 용도 또는 숙주 세포의 본 발명의 용도, 또는 약제학적 조성물의 본 발명의 용도, 본 발명의 방법에 관한 것이며, 인슐린 연관 질환 또는 장애는 췌장 손상, 제1형 당뇨병, 제2형 당뇨병, 외인성 인슐린 항체 증후군, 임신성 당뇨병 및 이상혈당증의 군으로부터 선택된다.
본원에서 설명되는 바와 같이 용어 "췌장 손상"은 인슐린 생성, 인슐린 활성 및/또는 아드레날린, 글루카곤, 스테로이드 및 소마토스타틴과 같은 인슐린 효과를 조절하는 호르몬을 탈조절하는 임의의 형태의 췌장 이상을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 본원에서 설명되는 췌장 손상은 약물 유도 췌장 손상, 비만 유도 췌장 손상 및 암 유도 췌장 손상의 군으로부터 선택된다.
본원에서 사용되는 바와 같이 용어 "제1형 당뇨병"은 주로 감소된 인슐린 생성을 특징으로 하는 당뇨병을 지칭한다. 전형적으로 제1형 당뇨병은 췌장의 인슐린 생성 베타 세포를 손상시키는 자가면역 반응을 특징으로 한다.
본원에서 사용되는 바와 같이 용어 "제2형 당뇨병"은 주로 증가된 인슐린 저항성을 특징으로 하는 당뇨병을 지칭한다. 제2형 당뇨병은 종종 인슐린 수치가 정상이거나 심지어 상승할 때 발생하며 조직이 인슐린에 적절하게 반응하지 못하는 결과로 나타난다. 대부분의 제2형 당뇨병 환자는 비만이다.
본원에서 사용되는 바와 같이 용어 "임신성 당뇨병"은 임신 동안의 당뇨병, 임신성 당뇨병을 지칭한다. 임신성 당뇨병의 증상은 자간전증과 같은 임신 관련 증상 및 성장 이상(예를 들어, 거구증), 포도당 항상성 장애, 황달, 적혈구증가증, 저칼슘혈증 및 저마그네슘혈증을 포함하나 이에 제한되지 않는 임신성 당뇨병이 있는 산모의 아이에 대한 증상을 더 포함한다. 일부 실시양태에서, 임신성 당뇨병은 임신 동안 진단된다. 일부 실시양태에서, 임신성 당뇨병은 임신 전 진단된다.
본원에서 사용되는 바와 같이 용어 "외인성 인슐린 항체 증후군"은 외인성 인슐린에 대한 과민성 및/또는 인슐린으로 치료되는 환자에서 순환하는 인슐린 항체와 연관되는 인슐린 저항성을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이 용어 "이상혈당증"은 혈당 안정성의 이상을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 본원에서 설명되는 이상혈당증은 저혈당증이다. 일부 실시양태에서, 본원에서 설명되는 이상혈당증은 고혈당증이다. 일부 실시양태에서, 이상혈당증은 경구 당 내성 시험 동안 당 섭취(전형적으로, 75g의 당) 2시간 후 140 mg / dl, 150 mg / dl, 160 mg / dl, 170 mg / dl, 180 mg / dl, 190 mg / dl, 200 mg / dl, 210 mg / dl 또는 220 mg / dl보다 높은 혈당 수치이다. 일부 실시양태에서, 이상혈당증은 100 mg/dl 또는 110 mg/dl보다 높은 공복 혈당 수치이다.
본원에서 설명되는 수단 및 방법은 인슐린 작용 및/또는 인슐린에 대한 면역 반응에 의해 영향을 받는 조절되지 않은 항상성 인슐린 및 호르몬을 복원하는 데 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명은 본원에서 제공되는 수단 및 방법이 다양한 인슐린 연관 질환 또는 장애에서 조절되지 않은 항상성을 회복할 수 있다는 발견에 적어도 부분적으로 기초한다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 올리고머성 항인슐린 항체의 본 발명의 용도, 폴리뉴클레오티드의 본 발명의 용도 또는 숙주 세포의 본 발명의 용도, 약제학적 조성물의 본 발명의 용도 또는 본 발명의 방법에 관한 것이며, 이상혈당증은 췌장 손상, 제1형 당뇨병, 제2형 당뇨병, 외인성 인슐린 항체 증후군 및 임신성 당뇨병의 군으로부터 선택되는 인슐린 연관 질환 또는 장애가 있는 환자의 이상혈당증이다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 올리고머성 항인슐린 항체의 인슐린 효과를 향상시키기 위한 용도에 관한 것이다. 또한, 인슐린 효과는 환자에서 또는 건강한 대상체에서 향상될 수 있으며, 인슐린 효과는 반드시 질환 또는 장애를 유도하지 않고 항체에 의해 조절된다. 예를 들어, 표적 항원이 인슐린인 본 발명의 조성물, 본 발명의 약제학적 생성물, 본 발명의 벡터 또는 본 발명의 보호-조절 항체, 변이체 또는 단편은 근육 증가와 같은 체중 증가를 증가시키기 위해 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 인슐린 효과의 향상은 글루코스 흡수 증가, DNA 복제 증가, 단백질 합성 증가, 지방 합성 증가, 지방산 에스테르화 증가, 지방분해 감소, 글리코겐 합성 유도, 포도당신생합성 및 글리코겐분해 감소, 단백질 가수 분해 감소, 자가포식 감소, 아미노산 흡수 증가, 혈류 증가, 위에서 염산 분비 증가, 칼륨 흡수 증가, 신장 나트륨 배설 감소를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 의해 제공되는 수단 및 방법은 인슐린에 대한 면역 반응의 조절을 가능하게 한다. 인슐린에 대한 면역 반응은 모든 형태의 당뇨병에서 및 모든 형태의 인슐린 치료에서 발생할 수 있다. 따라서, 수단 및 방법은 투여되는 및/또는 내인성 인슐린의 효과를 개선할 수 있고 임의의 인슐린 결핍 관련 증상, 예를 들어 당뇨병을 감소시킬 수 있다.
따라서, 본 발명은 본 발명의 수단 및 방법이 당뇨병에서 이상조절된 인슐린 기능을 보호하고/하거나 조절한다는 놀라운 발견에 적어도 부분적으로 기반한다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 올리고머성 항인슐린 항체의 본 발명의 용도, 폴리뉴클레오티드의 본 발명의 용도 또는 숙주 세포의 본 발명의 용도, 또는 약제학적 조성물의 본 발명의 용도, 본 발명의 방법에 관한 것이며, 인슐린 연관 질환 또는 장애는 당뇨병 또는 이의 증상이다.
본원에서 사용되는 바와 같이 용어 "당뇨병"은 고혈당증을 특징으로 하는 질환 또는 장애를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 당뇨병은 경구 당 내성 시험 동안 당 섭취(전형적으로, 75g의 당) 2시간 후 140 mg / dl, 150 mg / dl, 160 mg / dl, 170 mg / dl, 180 mg / dl, 190 mg / dl, 200 mg / dl, 210 mg / dl 또는 220 mg / dl보다 높은 혈당 수치에 의해 진단된다. 일부 실시양태에서, 당뇨병은 100 mg/dl 또는 110 mg/dl보다 높은 공복 당 수치에 의해 진단된다.
당뇨병의 증상은 고혈당증, 저인슐린혈증, 인슐린 저항성, 다뇨증, 다갈증, 체중 감소, 케톤산증, 포도당뇨, 피로, 과민성, 흐린 시야, 느리게 치유되는 궤양, 빈번한 감염(예를 들어, 잇몸 또는 피부 감염 및 질 감염) 및 염증 증가(예를 들어, 만성 저등급 염증)을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 올리고머성 항인슐린 항체, 바람직하게는 IgM 동형의 올리고머성 항체를 생성하기 위한 방법에 관한 것이며, 이는 포유동물을 적어도 하나의 1가 인슐린 입자 및 적어도 하나의 다가 인슐린 입자의 혼합물로 면역화하는 단계를 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이 용어 "인슐린 입자"는 항원 입자(예를 들어, 다가 또는 1가 항원 입자)를 지칭하며, 여기서 항원은 인슐린 및/또는 프로인슐린에 적어도 부분적으로 포함된다. 일부 실시양태에서, 인슐린 입자는 인슐린 및/또는 프로인슐린의 적어도 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 ,19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 또는 모든 아미노산을 포함하는 항원을 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 인슐린 연관 질환 또는 장애의 치료 및/또는 예방하기 위한 방법에 관한 것으로, 방법은 치료적 유효량의 본 발명의 임의의 하나의 올리고머성 항인슐린 항체, 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 본 발명의 숙주 세포 또는 본 발명의 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
위에 더하여, 본 발명은 다음의 특정 항목별 실시양태에 관한 것이다.
항목1. 대상체에서 체액성 및/또는 세포 매개 표적 항원 특이적 면역 반응을 유발 및/또는 조절하는 방법으로서, 방법은 대상체의 하나 이상의 면역 세포를
(i) 질환 연관 항원에 대한 항체 매개 면역 반응을 유도할 수 있는 1개 이하의 항원성 구조를 포함하는 항원성부로 구성되는 1가 항원 입자 및
(ii) 질환 연관 항원에 대한 항체 매개 면역 반응을 유도할 수 있는 2개 이상의 항원성 구조를 포함하는 항원성부로 구성되는 다가 항원 입자를 포함하는 조합과 접촉하게 하는 단계를 포함하며 여기서 2개 이상의 항원성 구조는 공유 또는 비공유 가교결합되는, 방법.
항목2. 항목 1에 있어서, 세포 매개 표적 항원 특이적 면역 반응은 림프구, 바람직하게는 B 림프구(B 세포 매개 면역 반응)를 포함하며, 이는 바람직하게는 하나 이상의 항체 또는 이의 변이체, 및/또는 B 세포 수용체 및/또는 이의 변이체를 포함하고/하거나 발현하며, 이는 표적 항원에 특이적인, 방법.
항목3. 항목 1 또는 항목 2에 있어서, 세포 매개 표적 항원 특이적 면역 반응은 면역글로불린(Ig)M, IgD, IgA 또는 IgG 유형 항체 및/또는 B 세포 수용체를 발현하는 B 세포를 수반하는, 방법.
항목4. 항목 1 내지 항목 3 중 어느 한 항목에 있어서, 다가 항원 입자의 항원성부에 포함되는 2개 이상의 항원성 구조는 다수의 동일한 항원성 구조를 포함하는, 방법.
항목5. 항목 1 내지 항목 4 중 어느 한 항목에 있어서, 1가 항원 입자는 항원성부에, 선택적으로 링커를 통해, 결합되는 담체 부분을 더 포함하며, 여기서 담체 및, 선택적으로 링커는 항원성 구조의 다른 복제를 포함하지 않으며, 여기서 담체 부분 및, 선택적으로 링커는 표적 항원에 대한 세포 매개 면역 반응을 유발할 수 없는, 방법.
항목6. 항목 1 내지 항목 5 중 어느 한 항목에 있어서, 다가 항원 입자는 항원성부에, 선택적으로, 링커를 통해, 결합되는 담체 부분을 더 포함하는, 방법.
항목7. 항목 6에 있어서, 담체 부분, 및 선택적으로, 링커는 표적 항원에 대해 세포 매개 면역 반응을 유발할 수 없는, 방법.
항목8. 항목 5 내지 항목 7 중 어느 한 항목에 있어서, 담체 부분은 면역원성 또는 비면역원성 폴리펩티드, 면역 CpG 섬(CpG island), 림펫 헤모시아닌(KLH), 파상풍 톡소이드(TT), 콜레라 독소 소단위체 B(CTB), 박테리아 또는 박테리아 고스트, 리포좀, 키토좀, 비로좀, 마이크로스피어, 수지상 세포, 입자, 마이크로입자, 나노입자 또는 비드로부터 선택되는 물질 또는 구조인, 방법.
항목9. 항목 1 내지 항목 8 중 어느 한 항목에 있어서, 대상체의 하나 이상의 면역세포를 1가 항원 입자 및 다가 항원 입자를 포함하는 조합과 접촉하게 하는 단계는 (i) 1가 항원 입자의 대상체로의 투여를 (ii) 다가 항원 입자의 대상체로의 투여를 또는 (iii) 1가 항원 입자 및 다가 항원 입자의 대상체로의 투여를 수반하며, (i), (ii) 및 (iii)에서 대상체의 면역 세포는 1가 항원 입자 및 다가 항원 입자의 조합과 접촉한 투여의 결과인, 방법.
항목10. 항목 9에 있어서, (i)에서, 대상체는 1가 항원 입자의 투여 전의 다가 항원 입자의 존재를 특징으로 하며, (ii)에서, 대상체는 다가 항원 입자의 투여 전의 1가 항원 입자의 존재를 특징으로 하는, 방법.
항목11. 항목 1 내지 항목 10 중 어느 한 항목에 있어서,1가 항원 입자 및 다가 항원 입자를 포함하는 조합은 특정 항원비 1가 항원 입자:다가 항원 입자를 포함하는, 방법.
항목12. 항목 11에 있어서, 대상체에서 세포 매개 표적 항원 특이적 면역반응을 조절하는 단계는 대상체의 하나 이상의 B 세포를 1보다 큰, 바람직하게는, 101, 102, 103, 104 또는 그 이상보다 큰 특정 항원비를 포함하는 조합과 접촉하게 하여 대상체의 IgG 유형 표적 항원 특이적 B 세포 반응의 감소를 구성하는, 방법.
항목13. 항목 12에 있어서, 대상체의 하나 이상의 B 세포를 조합과 접촉하게 하는 단계는 대상체에 1보다 큰, 바람직하게는, 101, 102, 103, 104 또는 그 이상보다 큰, 특정 항원비를 생성하는 데 효과적인 1가 항원 입자의 양을 투여하는 단계를 수반하는, 방법.
항목14. 항목 12 또는 13에 있어서,대상체의 하나 이상의 B 세포를 다량의 1가 항원 입자와 접촉하게 하는 단계는 다가 항원 입자를 대상체에 투여하는 단계와 직접적으로 조합하거나 조합하지 않고 투여되는, 방법.
항목15. 항목 11에 있어서, 대상체에서 세포 매개 표적 항원 특이적 면역 반응을 조절하는 단계는 대상체의 하나 이상의 B 세포를 1보다 작은 바람직하게는 10-1, 10-2, 10-3, 10-4 또는 그 미만보다 작은 특정 항원비를 포함하는 조합과 접촉하게 하여 대상체의 IgG 유형 표적 항원 특이적 B 세포 반응의 증가를 구성하는, 방법.
항목16. 항목 15에 있어서, 대상체의 하나 이상의 B 세포를 조합과 접촉하게 하는 단계는 대상체에 1보다 작은, 바람직하게는, 10-1, 10-2, 10-3, 10-4 또는 그 미만보다 작은 특정 항원비를 생성하는 데 효과적인 다가 항원 입자의 양을 투여하는 단계를 수반하는, 방법.
항목17. 항목 15 또는 항목 16에 있어서, 대상체의 하나 이상의 B 세포를 다량의 다가 항원 입자와 접촉하게 하는 단계는 1가 항원 입자를 대상체에게 투여하는 단계와 직접적으로 조합하거나 조합하지 않고 투여되는, 방법.
항목18. 항목 1 내지 항목 17 중 어느 한 항목에 있어서, 다가 항원 입자는 바람직하게는 나노미터 범위 내의 서로 공간적으로 근접한 항원성 구조의 적어도 2개의 복제를 포함하는, 방법.
항목19. 항목 1 내지 항목 18 중 어느 한 항목에 있어서, 항원은 자가항원, 암 연관 항원 또는 병원체 연관 항원인, 방법.
항목20. 항목 19에 있어서, 병원체는 기생충, 단세포 진핵생물, 박테리아, 바이러스 또는 비리온으로부터 선택되는, 방법.
항목21. 항목 1 내지 항목 20 중 어느 한 항목에 있어서, 항원은 질환 또는 병태, 바람직하게는, 대상체가 앓고 있거나 앓을 것으로 의심되는 질환 또는 병태와 연관된 항원인, 방법.
항목22. 항목 1 내지 항목 21 중 어느 한 항목에 있어서, 항원은 면역원성 물질의 전체, 단편 또는 부분와 같은 천연 또는 합성 면역원성 물질이며, 면역원성 물질은 핵산, 탄수화물, 펩티드, 합텐 또는 임의의 이들의 조합으로부터 선택되는, 방법.
항목23. 항목 1 내지 항목 22 중 어느 한 항목에 있어서, 방법은 대상체에서 질환 또는 병태를 치료하기 위한, 방법.
항목24. 항목 23에 있어서, 질환 또는 병태는 증가되거나 감소되는 세포 매개 면역 반응이 치료에 유익한 것을 특징으로 하는 질환 또는 병태로부터 선택되는, 방법.
항목25. 항목 23 또는 항목 24에 있어서, 질환 또는 병태는 염증성 장애, 자가면역 질환, 증식성 장애 또는 감염성 질환으로부터 선택되는, 방법.
항목26. 대상체에서 질환 연관 항원에 특이적인 면역글로불린 G(IgG) 유형 항체의 존재를 특징으로 하는 질환을 치료 또는 예방하기 위한 방법으로서, 방법은 치료적 유효량의 1가 항원 입자를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 1가 항원 입자는 질환 연관 항원에 대해 항체 매개 면역 반응을 유도할 수 있는 1개 이하의 항원성 구조를 포함하는 항원성부로 구성되는, 방법.
항목27. 항목 26에 있어서, 질환은 자가면역 질환인, 방법.
항목28. 항목 26 또는 항목 27에 있어서, 질환 연관 항원은 자가항원인, 방법.
항목29. 항목 26 내지 항목 28 중 어느 한 항목에 있어서, 질환은 질환 연관 항원에 대해 항체 매개 면역 반응을 유도할 수 있는 2개 이상의 항원성 구조를 포함하는 항원성부로 구성되는 내인성 다가 항원 입자의 존재를 특징으로 하며 2개 이상의 항원성 구조는 공유 또는 비공유 가교결합되어 복합 질환 연관 항원성 구조를 형성하는, 방법.
항목30. 항목 29에 있어서, 1가 항원 입자의 치료적 유효량은 대상체에 투여되는 경우 투여되는 1가 항원 입자 대 내인성 다가 항원 입자의 (혈청/조직) 비율이 1보다 큰 양인, 방법.
항목31. 대상체에서 백신접종으로 질환을 치료 또는 예방하는데 사용하기 위한 방법으로서, 방법은
(i) 질환 연관 항원에 대한 항체 매개 면역 반응을 유도할 수 있는 1개 이하의 항원성 구조를 포함하는 항원성부로 구성되는 1가 항원 입자 및
(ii) 질환 연관 항원에 대한 항체 매개 면역 반응을 유도할 수 있는 2개 이상의 항원성 구조를 포함하는 항원성부로 구성되는 다가 항원 입자를 포함하는 유효량의 백신접종 조성물을 투여하는 단계를 포함하며 여기서 2개 이상의 항원성 구조는 공유 또는 비공유 가교결합된다.
항목32. 항목 31에 있어서, 질환 연관 항원은 외래 항원인, 방법.
항목33. 항목 31 또는 항목 32에 있어서, 백신접종 조성물은 1보다 작은 (i) 대 (ii)의 비율을 포함하는, 방법.
항목34. 면역원성 조성물로서,
(i) 항원에 대한 항체 매개 면역 반응을 유도할 수 있는 1개 이하의 항원성 구조를 포함하는 항원성부로 구성되는 1가 항원 입자 및
(ii) 항원에 대한 항체 매개 면역 반응을 유도할 수 있는 2개 이상의 항원성 구조를 포함하는 항원성부로 구성되고 2개 이상의 항원성 구조가 공유 또는 비공유 가교결합된 다가 항원 입자를 포함하는, 면역원성 조성물.
항목35. 항목 30에 있어서, (i) 및 (ii)의 항원에 대한 항체 매개 면역 반응을 유도할 수 있는 항원성 구조는 동일한, 면역원성 조성물.
항목36. 항목 34 또는 항목 35에 있어서, 약제학적으로 허용 가능한 담체 및/또는 부형제를 더 포함하는, 면역원성 조성물.
항목37. 자가면역 장애의 치료에서 사용하기 위한 단일특이적 IgM 유형 항체 또는 이의 변이체로서, 여기서 단클론 IgM 유형 항체는 특이적이고 자가면역 장애와 연관되는 항원에 대해 높은 친화도를 갖는, 단일특이적 IgM 유형 항체 또는 이의 변이체.
항목38. 항목 37에 있어서, 항체는 10-7 미만, 바람직하게는, 10-8 미만, 더 바람직하게는, 10-9 미만 및 가장 바람직하게는 약 10-10의 KD를 갖는 자가면역 장애와 연관된 항원에 결합하는, 단일특이적 IgM 유형 항체 또는 이의 변이체.
항목39. 항목 37 또는 항목 38에 있어서, 단클론 IgM은 자가면역 장애와 연관된 항원 이외의 항원인 비관련 항원에 결합하지 않는, 단일특이적 IgM 유형 항체 또는 이의 변이체.
항목40. 항목 37 내지 항목 39 중 어느 한 항목에 있어서, 치료는 자가면역 장애와 연관된 항원 이외의 항원인 비관련 항원에 특이적인 다중특이적 항체의 사용을 포함하지 않는, 단일특이적 IgM 유형 항체 또는 이의 변이체.
항목41. 항목 37 내지 항목 40 중 어느 한 항목에 있어서, 변이체는 단일특이적 IgG 유형 항체 또는 이의 변이체이며, 이는 Fc 약독화되며, 바람직하게는 자가면역 장애 또는 동종면역 장애의 치료에 사용하기 위한 Fc-감마 수용체 또는 C1q와의 상호작용에 결함이 있는, 단일특이적 IgM 유형 항체 또는 이의 변이체.
본원에서 사용되는 바와 같인 용어 "포함"은 "포함" 및 "구성"을 모두 포함하는 것으로 해석되어야 하며, 두 의미 모두 구체적으로 의도되며 따라서 본 발명에 따라 개별적으로 개시되는 실시양태이다. 본원에서 사용되는 경우 "및/또는(하고/하거나)"은 2개의 명시된 특징 또는 구성요소 각각을 다른 하나가 있거나 없이 특정하게 개시하는 것으로 여겨져야 한다. 예를 들어, "A 및/또는 B"는 (i) A, (ii) B 및 (iii) A 및 B 각각을 특정하게 개시하는 것으로 여겨져야 하며, 이는 각각 본원에서 개별적으로 명시되는 것과 같다. 본 발명의 맥락에서, 용어 "약" 및 "대략"은 해당 특징의 기술적 효과를 여전히 보장하기 위해 통상의 기술자가 이해할 정확성의 구간을 의미한다. 이 용어는 전형적으로 표시되는 수치로부터 ±20%, ±15%, ±10% 및 예를 들어 ±5%까지의 편차를 나타낸다. 통상의 기술자에 의해 이해되는 바와 같이, 주어진 기술적 효과에 대한 수치에 대한 구체적인 이러한 편차는 기술적 효과의 특성에 따라 좌우될 것이다. 예를 들어, 자연적 또는 생물학적 기술적 효과는 일반적으로 인공적 또는 공학적 기술적 효과보다 이러한 편차가 더 클 수 있다. 통상의 기술자에 의해 이해되는 바와 같이, 주어진 기술적 효과에 대한 수치에 대한 구체적인 이러한 편차는 기술적 효과의 특성에 따라 좌우될 것이다. 예를 들어, 자연적 또는 생물학적 기술적 효과는 일반적으로 인공적 또는 공학적 기술적 효과보다 이러한 편차가 더 클 수 있다. 한정사가 예를 들어, 단수 명사를 지칭할 때 사용되는 경우 달리 구체적으로 언급하지 않는 한 해당 명사의 복수형을 포함한다.
특정 문제 또는 환경에 대한 본 발명의 교시의 적용, 및 본 발명의 변형 또는 이에 대한 추가 특징(예를 들어, 추가 양태 및 실시양태)의 포함은 본원에서 포함되는 교시에 비추어 통상의 기술자의 능력 내에 있다는 것을 이해할 것이다.
특히 본 발명의 일 양태의 맥락에서 제공되는 개별 정의 및 설명되는 특정 실시양태는 본 발명의 다른 양태에도 동일하게 적용될 것이다.
문맥상 달리 지시하지 않는 한, 위에서 제시되는 특징의 설명 및 정의는 본 발명의 임의의 특정 양태 또는 실시양태에 제한되지 않으며 설명되어 있는 모든 양태 및 실시양태에 동일하게 적용된다.
본원에서 설명되는 방법 및 기법은 일반적으로 해당 기술분야에서 알려진 통상적인 방법에 따라 그리고 달리 나타내지 않는 한 본 명세서 전반에 걸쳐 인용되고 논의되는 다양한 일반적이고 보다 구체적인 참조문헌에서 설명되어 있는 바와 같이 수행된다. 예를 들어, Sambrook 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989) 및 Ausubel 등, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992), 및 Harlow 및 Lane Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1990) 참조.
본원에서 인용되는 모든 참고문헌, 특허 및 간행물은 전문이 본원에서 참조에 의해 원용된다.
실시예
본 발명의 특정 양태 및 실시양태는 이제 예로서 그리고 본원에서 명시되는 설명, 도면 및 표를 참조하여 예시될 것이다. 본 발명의 방법, 용도 및 다른 양태의 이러한 예는 단지 대표적인 것이며, 본 발명의 범위를 이러한 대표적인 예만으로 제한하는 것으로 간주되어서는 안 된다.
예는 다음을 나타낸다.
실시예 1: 면역화 실험 및 항체 반응
가용성 합텐의 존재는 IgG 생성을 억제한다: 생체 내(in vivo) B 세포의 상대적인 반응성 개념을 시험하기 위해, 담체로서 KLH(키홀 림펫 헤모시아닌)에 결합된 합텐으로서 NP(4-히드록시-3-니트로페닐아세틸)를 사용하여 면역화 실험을 수행하였다(도 2a 및 b). 이를 위해, 야생형 마우스 군에 가용성 화합물(sNP)로서의 NP 또는 NP에 대해 동일한 몰비로, 다가 복합 항원(cNP)이라고 지칭되는, NP-KLH를 주사하였다(도 1a). 항체 반응을 면역화 후 7일차(IgM) 및 14일차(IgG)에 측정하였다(도 1b). 연구된 항원(CI)이 결여된 대조군 면역화(CI)와 유사하게, 가용성 합텐(sNP:cNP, 1:0)의 주사는 명확한 IgM 또는 IgG 항체 반응을 유도하지 못한 반면, 다가 항원(sNP:cNP, 0:1)으로서 cNP의 주사는 명확한 IgM 또는 IgG 항체 반응을 유도할 수 있다. 상이한 몰비로 cNP에 sNP를 첨가하여 항체 반응을 간섭하였다. 흥미롭게도, IgG 반응은 sNP 대 cNP에 대해 이미 100:1 비율에서 유의하게 방해를 받았다. 또한, 더 높은 sNP 대 cNP 비율(>10.000:1)을 사용하여 NP 합텐에 대한 IgM 항체 반응을 유의하게 억제할 수 있었다(도 2c). 중요한 것은, 담체(KLH)에 대한 IgG 반응은 가용성 합텐의 양과 관계없이 유사하였다는 것이다(도 1c).
이러한 결과를 더 확인하기 위해, ELISpot 검정을 수행하여 항체 분비 세포의 비율을 직접 평가하였다. 혈청 면역글로불린 데이터와 일치하게도, ELISpot 결과는 가용성 합텐과 합텐 결합 담체를 100:1 비율로 결합하면 IgG 분비 세포의 수가 감소하는 반면 IgM 분비 세포는 영향을 받지 않는다는 것을 나타내었다(도 1d). 이러한 데이터는 가용성 1가 항원이 동일한 항원의 복합 형태에 대한 면역 반응을 억제한다는 본 발명자의 개념과 일치한다. IgM과 대조적으로, IgG 면역 반응에 대한 억제 효과는 저농도의 가용성 1가 항원에서 관찰된다.
중요하게도, IgD-유형 BCR의 존재가 이러한 조절에 중요하다는 점이 시사되었다. 따라서, IgD의 역할을 IgD-유형 BCR이 결여된 IgD 녹아웃 마우스에서 NP 면역 실험을 수행하여 시험하였다. IgD 녹아웃 마우스는 가용성 NP가 cNP 면역화에 첨가되는 경우 억제 효과를 나타내지 않았다(도 1e, f; 도 2c).
종합하면, 이러한 데이터는 성숙한 B 세포가 항원 결정기의 밀도에 따라 면역 반응을 미세 조정할 수 있으므로 동일한 항원의 상이한 에피토프에 대해 구별되는 IgM 및 IgG 반응을 유도할 수 있다는 것을 시사한다.
가용성 펩티드의 존재는 IgM 항체 반응을 향상시킨다: 합텐 특이적 항체 반응을 시험한 후, 이 개념이 자가항원에 유효한지 여부를 시험하였으며 따라서 B 세포 선택 및 자기파괴적 면역 반응 제어에 대한 상이한 시나리오를 제공할 수 있다. 이식유전자 생성물 또는 내인성 구조를 인식하는 정의된 BCR을 발현하는 단일특이적 B 세포를 인공적으로 포함하는 유전자이식 마우스의 사용을 회피하기 위해, 인슐린 연관 자가항원을 자가면역 질환에 대한 생리학적 관련 시스템으로 선택하였다. 췌장에서 생합성하는 동안, 프로인슐린은 잘 알려진 호르몬인 인슐린과 소위 C-펩티드(CP)로 절단되며 둘 모두 혈류로 분비된다. 인슐린은 혈액에서 나노몰 양으로 발견되고 혈당 수치 및 당뇨병의 조절에 중추적인 역할을 하는 반면, C-펩티드는 거의 검출 불가능하며 혈액에서 낮은 피코몰 양으로 존재하며 항상성 기능이 없는 것으로 사료된다[30]. 전장 C-펩티드 또는 인슐린 유래 펩티드를 사용하여 풍부하고 기능적으로 중요한(인슐린)에 대한 자가반응성 항체 반응을 생리학적 기능이 없는 거의 검출 불가능한 자가항원(C-펩티드)과 비교하여 조사해야 한다(도 3a). 또한, 인슐린과 대조적으로, C-펩티드는 보존되지 않는다(도 3b).
배양에 의해 복합체화된 비오티닐화 C-펩티드는 스트렙트아비딘(SAV)과 함께 사용되었다. 대안적으로, KLH는 다가 복합 항원(cCP)을 생성하기 위해 C-펩티드에 결합된 담체로서 사용되었다. 비복합체 형태의 C-펩티드(sCP)를 가용성 항원으로 사용하였다. NP 합텐과 마찬가지로 야생형 마우스에 sCP, cCP 또는 이들의 조합을 주사하여 자가반응성 항체 반응을 유도할 가능성을 시험하였다(도 3c). 예상한 바와 같이, sCP는 검출 가능한 IgM 또는 IgG 면역 반응을 유도하지 않은 반면, 다가 형태 cCP는 각각 7일차 및 14일차에 측정된 바와 같이 IgM 및 IgG 모두를 유도하였다(도 3d). ELISA 실험에 더해, 면역화 마우스로부터 유래한 혈청을 사용하여 생성된 항체 반응의 특이성을 결정하였다. 마우스 혈청을 사용한 웨스턴 블롯 분석은 cCP를 사용하여 면역화된 마우스가 췌장 C-펩티드를 인식하는 IgG 항체에 대해 양성이라는 것을 나타내었다(도 4a). 이는 합텐 면역화와 전적으로 일치하며 단독으로는 검출 가능한 면역 반응을 유도할 수 없는 가용성 펩티드가 IgG 기억 B 세포의 생성을 방지한다는 것을 나타낸다. 실제로, 21일차에 동일한 항원을 사용한 이후의 시도는 sCP:cCP 비율이 0:1인 cCP로만 면역화된 마우스와 비교하여 sCP:cCP 비율이 20:1인 마우스에서 약한 IgG 반응을 초래하였다(도 3d, 14일차 및 28일차 IgG). 자가항원으로서 C-펩티드에 대한 기억 반응을 확인하기 위해, 42일차에 리콜 면역화를 보조제 CpG 없이 cCP를 사용하여 수행하였고 0:1의 sCP:cCP 비율로만 면역화된 마우스에서 C-펩티드에 대한 강력한 IgG 반응을 검출하였다(도 3e).
IgG와 대조적으로, C-펩티드 특이적 IgM 항체 반응은 20:1 비율로 sCP:cCP의 리콜 면역화 시 유도되었다(도 3d, 28일차 IgM). 비장 B 세포의 FACS 분석은 상이한 군의 마우스에서 유의한 차이를 나타내지 않았다(보충 도 3b, c). 또한, C-펩티드에 대한 담체에 대한 IgG 반응에서 어떠한 차이도 검출되지 않았다(도 4d).
이러한 데이터는 가용성 1가 항원이 면역 반응을 조절하고 면역 반응 동안 항체 분비 세포의 IgG:IgM 비율을 결정한다는 것을 시사한다. 이러한 결론은 상이한 마우스 군에서 IgG 또는 IgM 분비 세포의 수를 결정하기 위해 ELISpot 분석을 수행하여 확인되었다. 혈청 Ig 결과와 전적으로 일치하는 ELISpot 실험은 20:1의 sCP:cCP 비율로 면역화된 마우스가 증가된 수의 IgM 분비 세포를 보유하는 반면, IgG 분비 세포의 수는 0:1의 sCP:cCP 비율인 cCP로 면역화된 마우스와 비교하여 감소한다는 것을 나타내었다(도 3f).
NP 면역화 실험과 유사하게 IgD가 sCP:cCP 비율에 의한 B 세포 반응성 조절에 필요한지 여부를 시험하기 위해, C-펩티드 면역화를 IgD 녹아웃 마우스에서 수행하였다. IgD 녹아웃 마우스는 일반적으로 감소된 IgG 반응을 보였고 0:1 비율의 sCP:cCP로 면역화된 마우스에서 관찰된 IgG 항체 반응에 대한 가용성 펩티드의 조절 효과가 없었다(도 3g).
종합하면, 이러한 데이터는 항체 반응이 자가항원에 대해 지시될 수 있음을 보여주며, 이는 각각의 자가반응성 B 세포가 중추 관용에 의해 클론적으로 결실되지도 않고 아네르기에 의해 기능적으로 침묵되지도 않음을 시사한다. 가장 중요한 것은, 자가 또는 비자기 항원에 관계없이, 결과는 B 세포 반응이 다가 항원에 의해 유도되고 가용성 대응물에 의해 조절되어 B 세포 반응성 및 생성된 항체의 동형을 조절한다는 것을 나타낸다는 것이다. 그 결과 현재 관점과 완전히 상이한 역동적이고 중추적인 B 세포 기능이 초래된다.
실시예 2: 인슐린에 대한 자가항체 반응
다가 천연 인슐린은 유해한 항인슐린 IgG 반응을 유도한다: C-펩티드는 혈액에서 거의 검출되지 않고 생리학적 관련성이 알려져 있지 않기 때문에 자가항체 반응이 매우 낮은 농도로 존재하는 자가항원에 대해 가능할 수 있음을 배제할 수 없다. 따라서, 인슐린에 대한 자가항체 반응을 시험하였다. 우선, 자가반응성 B 세포는 자연적으로 말초부에 존재하며 현재 관점에서 제안되는 바와 같이 중추 관용에 의해 결실되거나 아네르기에 의해 무반응으로 변경되지 않는다는 기본 가정을 시험하였다. 이러한 개념에 따르면, 자가항원 복합체의 형성은 자연적으로 존재하는 자가반응성 말초 B 세포로부터 자가반응성 항체의 분비를 촉발한다. 이를 시험하기 위해, 비오티닐화 천연 뮤린 인슐린을 스트렙트아비딘(InsNat)과 함께 배양하여 자가항원 복합체를 생성하였다. 중요한 것은, 비오티닐화 마우스 인슐린은 가용성 형태로 주사되었을 때 비오티닐화되지 않은 내인성 대응물과 유사하게 포도당 대사를 조절하기 때문에 생물학적으로 활성이라는 것이다(데이터는 나타내지 않음). 야생형 마우스에 10㎍의 InsNat 복합체를 주사하고 혈청 내 항인슐린 항체의 존재 여부를 시간에 따라 모니터링하였다. 동시에, 혈액 및 소변 내 포도당 수치를 모니터링하여 면역화된 마우스가 당뇨병과 같은 포도당 대사 이상조절을 일으키는지 여부를 시험하였다. 7일차에 상당한 양의 항인슐린 IgM이 검출되었으며, 항인슐린 IgG는 복합체 인슐린 주사 후 14일차에 검출되었다(도 5a). 두 동형 모두 부스트 면역화(21일차) 후 28일차에 검출되었다. 중요한 것은, 마우스는 7일차(데이터는 나타내지 않음)부터 시작하여 14일차까지 계속되고 부스트(21일차) 후 26일차에서 더 증가하는 혈당 농도 증가에 의해 측정된 바와 같이 당뇨병의 분명한 징후를 나타내었다는 것이다(도 5c). 상승되는 혈당 수치가 자가항체 생성에 의존한다는 것을 나타내기 위해, 10μg InsNat 복합체를 B 세포 결핍 마우스(BCR 성분 Igα가 결여된 mb-1 녹아웃 마우스, CD79A라고도 함)에 주사하고 혈당을 모니터링하였다(도 5b, c). 흥미롭게도, B 세포 결핍 마우스에서는 혈당 증가가 관찰되지 않았으며 이는 B 세포의 존재와 자가항체 분비가 야생형 마우스에서 관찰되는 당뇨병 증상의 발달에 결정적임을 시사한다(도 5c). 또한, 혈당의 증가는 복합 InsNat를 주사한 야생형 마우스의 소변에서 검출 가능한 포도당을 동반하였다(도 5d). 당뇨병 발달과 일치하게도, 복합 InsNat가 주사된 야생형 마우스의 물 소비량이 극적으로 증가하였다(도 5e). 예상하지 못한 당뇨병 증상의 중증도 때문에 마우스를 27일차에 안락사시키고 췌장 및 비장을 분석하였다.
대조군 마우스와 대조적으로, 복합 InsNat 면역화 마우스는 대식세포, 호중구 및 B 세포의 췌장으로의 모집이 크게 증가한 것으로 나타났다(도 5f). 또한, InsNat 복합 면역화 마우스의 IgG+ 대식세포는 천연 인슐린의 결합을 나타내었다(도 5f). 따라서, 이는 췌장에서 자가항체 매개 급성 염증 과정을 시사한다. FACS 분석에서 대조군 마우스와 복합 InsNat로 면역화된 마우스 사이에 비장 B 세포의 차이가 나타나지 않았지만(도 6), ELISpot 분석에서 복합 InsNat가 주사된 마우스에서 항인슐린 IgG를 분비하는 비장 B 세포 수가 유의하게 증가한 것으로 나타났다(도 5g).
분비된 IgG가 당뇨병 증상의 원인인지 여부를 시험하기 위해 복합 InsNat및 대조군 면역화를 주사한 마우스의 혈청을 사용하여 IgG 풀다운 실험을 수행하였다(도 5h, i). IgG 정제는 혈청 인슐린 특이적 IgG로부터 내인성 인슐린의 해리를 초래할 것으로 예상되기 때문에(방법 부분 참조), 정제 후 총 IgG 내에서 항인슐린 IgG를 결정하였다. InsNat 마우스로부터 단리된 IgG의 최대 40%(0.4mg/mg)가 인슐린에 반응하는 것으로 나타났는데, 이는 직접적인 혈청 IgG 측정이 내인성 인슐린에 대한 결합으로 인해 전체 인슐린 특이적 IgG를 검출하지 못한다는 것을 시사한다(도 5a 및 5h 비교). 단리된 항인슐린 IgG의 병원성을 시험하기 위해, 대조군 면역화로부터 유래한 동일한 양의 IgG를 정맥내 주사하거나 복합 인슐린을 야생형 동물에 주사하고 혈당을 모니터링하였다. 2μg의 항인슐린 IgG를 함유하는 총 IgG를 주사하는 것이 수용자 마우스에서 혈당 증가를 유도하기에 충분하다는 것을 발견하였으며 이는 복합 인슐린이 주사된 마우스의 IgG가 당뇨병 증상을 야기한다는 것을 시사한다(도 5j).
이러한 데이터는 중추적인 대사 호르몬을 인식하는 자가반응성 B 세포가 결실되거나 기능적으로 침묵하지 않지만 말초부에 존재하며 자가항원의 균형이 다가 형태로 전환될 때 심각한 자가면역을 유도할 수 있다는 것을 입증한다.
인슐린 유래 에피토프는 유해한 항인슐린 IgG 반응을 유도한다: 위의 결과를 더 확인하기 위해, 인슐린에 대한 자가 항체 반응에서 자주 보고되는 에피토프인 InsA(도 3b)로 지칭되는 인슐린-A 사슬 유래 펩티드 서열을 사용한 면역화 실험을 수행하였다[32]. HIV gp12033의 바이러스 유래 펩티드는 비관련 외래 펩티드(바이러스 펩티드)로 포함되었다. C-펩티드의 경우, 선택된 펩티드가 담체 KLH에 결합되어 복합 다가 항원(cInsA)을 생성하였으며, 이는 그 후 단독으로 또는 가용성 펩티드(sInsA)와 조합하여 면역화 실험에 사용되었다. 후속적으로, 면역원, InsA 펩티드 또는 천연 인슐린에 대한 항체 반응을 측정하여 유해한 자가항체 반응 유도를 확인하였다. InsA는 천연 인슐린을 인식하는 IgM 및 IgG 자가항체 반응을 유도하는 것으로 밝혀졌다(도 7a). 부스트(21일차) 1주일 후인 28일차에, 다가 인슐린 유래 펩티드 단독(0:1의 sInsA:cInsA 비율)은 항인슐린 IgG의 생성을 용이하게 유도하였으며, 가용성 펩티드(100:1의 sInsA:cInsA 비율)를 첨가하여 28일차에 이러한 자가반응성 IgG가 크게 감소하였다(도 7a). 중요한 것은, 내인성 인슐린에 결합된 항인슐린 IgG가 위에서 설명되는 바와 같이 검출을 회피함에 따라 자가반응성 항인슐린 IgG의 양이 직접 혈청 ELISA에서 검출된 것보다 더 높을 가능성이 있다는 것이다(도 5a, i).
특히, 가용성 InsA의 존재는 28일차에 강력한 인슐린 특이적 IgM 생성을 초래하였으며, 이는 다가 펩티드 단독(0:1의 sInsA:cInsA 비율)으로 면역화된 마우스에서 다소 감소하여 28일차에 검출 가능한 항인슐린 IgM을 나타낸다(도 7a). 이는 바이러스 펩티드로 면역화된 마우스에서는 관찰되지 않았다(도 8a, b). 대조군 펩티드와 대조적으로, 인슐린은 유기체에서 상대적으로 많은 양으로 존재하며, 이는 내인성 가용성 인슐린의 존재가 다가 InsA의 면역 반응을 조절하여 자가반응성 부스터 IgM 반응을 증가시킬 수 있다는 것을 시사한다. 종합하면, 데이터는 부스터 면역화 후 28일차에 항원 특이 IgG 대 IgM(/μ비율) 항체 반응의 비에 의해 다가 항원 대 1가 항원의 비가 반영된다는 것을 나타낸다(도 7b).
가용성 펩티드(100:1의 sInsA:cInsA 비율) 존재 하에서 면역화된 마우스의 혈청 IgG와 대조적으로, 다가 펩티드만으로 면역화된 마우스의 혈청 IgG(0:1의 sInsA:cInsA 비율)는 웨스턴 블롯 분석에서 천연 인슐린을 쉽게 검출하였다(도 7c). 또한, cInsA로 면역화된 마우스의 비장 B 세포를 사용한 ELISpot 분석은 각 마우스에서 자가반응성 IgG 분비 세포의 증가된 존재를 확인하였다(도 7d).
증가된 항인슐린 IgG가 유해한 자가면역 반응과 연관이 있는지 확인하기 위해, cInsA(0:1의 sInsA:cInsA 비율)로 면역화된 마우스가 당뇨병의 징후를 나타내는지 여부를 시험하였다. 부스터 면역화(21일차) 약 1주 후인 28일차에, 이러한 군의 마우스는 27일차에서 33일차까지 증가된 혈당 및 물 섭취량을 나타내었다(도 7e 및 도 10). 또한, 다가 인슐린 펩티드(sInsA:cInsA, 0:1)로 면역화된 마우스의 소변에서도 포도당 농도가 증가하는지 여부를 시험하였다. 전적으로 일치하게도, 자가반응성 항인슐린 IgG 증가는 요당 농도를 증가시켰다(도 7f). 자가반응성 IgG와 대조적으로, 자가면역 당뇨병의 어떠한 검출가능한 징후도 부스터 면역화에서 증가된 양의 자가반응성 항인슐린 IgM을 보유하는 마우스에서 관찰되지 않았다(도 7e 및 f).
면역화 후 28일차에 항원 특이적 B 세포의 존재가 FACS 분석에 의해 확인되었다(도 9a 및 b). 대조군과 비교하여 복합 펩티드(sInsA:cInsA 비율 0:1)로만 면역화된 마우스는 증가된 InsA 펩티드 결합에 의해 결정된 바와 같이 자가반응성 IgG에 결합하는 췌장 내 대식세포의 증가된 비율을 나타낸다(도 9c). 유사한 결과가 비장에서 관찰되었다(도 10).
종합하면, 데이터는 증가된 복합 다가 자가 항원의 비율이 야생형 동물에서 증가된 자가반응성 IgG의 양 및 후속적인 자기파괴적 자가면역 반응으로 이어진다는 것을 시사한다.
실시예 3: InsA-펩티드 면역화 후 보호 항인슐린-IgM 발현
1가 자가항원은 보호 IgM에 의해 면역 내성을 유도한다. 자가반응성 IgG의 자기파괴적 역할과는 별개로, 이전에 언급한 데이터는 당뇨병에서 자가반응성 IgM의 보호 역할을 가리킨다. 사실, 결과는 상응하는 항인슐린 IgG와 비교하여 높은 항-인슐린 IgM이 InsA로 면역화된 마우스에서 포도당 대사의 탈조절 및 당뇨병으로부터 보호한다는 것을 시사한다(도 7a 내지 도 7f). 전적으로 일치하게도, 인슐린 반응성 IgG 대 IgM의 낮은 비율(/μ<0.1)을 나타내는 마우스는 28일차에 당뇨병으로부터 보호되었다(도 7g). 42일차에 제2 InsA 부스터 면역으로 항인슐린 IgM이 생성되었지만 1가 펩티드가 포함되었던 경우(sInsA:cInsA 비율 100:1) IgG는 생성되지 않았으며, 해당 마우스는 42일차와 49일차 사이에서 당뇨병의 징후를 나타내지 않았다(도 11a 및 도 11b).
자가반응성 항인슐린 IgM의 증가된 비율이 자가 반응성 항인슐린 IgG에 의해 유도된 포도당 대사에 대한 부정적인 영향을 상쇄하는지 여부를 직접 시험하기 위해, 1가 InsA 펩티드(sInsA:cInsA 비율 100:1)의 존재 하에서 초기에 면역화된 마우스를 51일차에 다가 항원(sInsA:cInsA, 0:1)으로만 시도하였다. 흥미롭게도, 14일차에서 28일차까지 자가면역 당뇨병을 유도한 치료(도 12, 7일차 대 14일차)는 51일차에서 59일차까지 자가반응성 항인슐린 IgM 반응만 생성하였을 뿐 항인슐린 IgG 또는 포도당 대사의 탈조절은 생성하지 않았다(도 13a 내지 13c).
이러한 데이터는 1가 InsA 펩티드(sInsA:cInsA 비율 100:1)가 존재하는 1차 면역화가 다가 InsA(sInsA:cInsA 비율 0:1)를 사용한 병원성 면역화에 대한 내성을 유도했다는 것을 시사한다. 또한, 이 연구 결과는 이러한 고유한 내성 메커니즘이 보호 자가반응성 IgM(pIgM)의 생성을 유발하고 유지하여 새로운 부류의 기억 응답을 생성한다는 것을 나타낸다. 이를 더 시험하기 위해 시간 경과에 따른 항인슐린 IgM 농도의 감소에 이어 항인슐린 리콜 반응을 모니터링하였다(도 7h). 본 발명자들은 항인슐린 IgM이 몇 주 동안 지속되고 71일차에 부스터 cInsA 면역화는 IgM만을 유도하며 탈조절된 포도당 대사의 징후 없이 IgG는 유도하지 않는다는 것을 나타낸다(도 7h, i 및 도 14). 항원에 대한 항체 친화도의 증가는 일반적으로 기억 반응과 연관이 있기 때문에 ELISA 실험을 수행하여 상이한 시점에서 인슐린 특이 항체의 친화도를 비교하였다. 부스터 InsA 면역화 후 생성된 IgM은 7일차에 수집된 1차 IgM과 비교하여 더 높은 항인슐린 친화도를 나타내는 것으로 밝혀졌다(도 7j). 또한, pIgM의 보호 역할을 검토하기 위해, 마우스를 0일차부터 시작해서 48시간마다 cInsA 또는 5μg의 pIgM을 함유하는 50μg의 정제된 IgM의 정맥내 주사와 함께 cInsA로 면역화하였다(도 15a, b). 흥미롭게도, 인슐린 특이적 pIgM의 존재는 자가면역 이상혈당증을 완화하고 cInsA만으로 면역화된 마우스에서 관찰된 바와 같이 당뇨를 완전히 예방하였다(도 7k). pIgM i.v. 주사가 면역원(cInsA, i.p.)을 중화시키는 것을 배제하기 위해, 항담체-ELISA를 수행하였다. 예상한 바와 같이, 항KLH-IgM 수치의 차이는 7일차에 관찰되지 않았다(도 15c).
특히 인슐린 및 InsA 펩티드는 마우스와 인간 사이에서 매우 보존되어 있기 때문에(도 3b), 데이터는 B 세포 내성에 대한 새롭고 역동적인 개념을 제시할 뿐만 아니라 인간의 항인슐린 항체에 의해 촉발된 자가 면역 당뇨병을 이해하기 위한 기본적인 동물 모델을 도입한다.
실시예 4: 보호 기억 항인슐린-IgM은 단일특이적이다.
위에서 제시되는 결과는 자가반응성 1차 IgM과 PR-IgM 사이의 예상하지 못한 근본적인 차이를 가리킨다. 사실, 1차 항인슐린-IgM은 더 높은 인슐린 친화도를 갖지만 병리를 유도하지 않았던 기억 PR-IgM에 비해 훨씬 적은 양으로 생성되었으나 당뇨병 증상을 유도하였다. 파괴적 자가면역에 대한 자가반응성 기억 PR-IgM의 보호 기능을 직접 시험하기 위해, 마우스를 0일차부터 시작하여 48시간마다 cInsA 단독 또는 5μg의 항인슐린 메모리 PR-IgM을 함유하는 50μg의 총 IgM 정맥내 주사와 함께 cInsA로 면역화하였다(도 16a 및 도 16b). 흥미롭게도, 인슐린 특이적 PR-IgM의 존재는 cInsA 단독으로 면역된 마우스와 비교하여 7일차에 자가면역 이상혈당증을 완화하고 당뇨를 완전히 예방하였다(도 16b). PR-IgM 주사가 주사된 cInsA를 중화시키는 것을 배제하기 위해, 항담체(KLH) ELISA를 수행하였으며 7일차에 2개의 군 사이에서 항KLH-IgM 수치의 차이를 발견하지 못하였다(도 15c). 이러한 데이터는 기억 항인슐린 PR-IgM이 1차 항인슐린 IgM에 의한 인슐린의 고갈을 방지하여 당뇨병의 개시를 예방한다는 것을 시사한다. 자가반응성 1차 및 기억 PR-IgM 사이의 차이에 대한 한 가지 설명은 1차 IgM이 다반응성이고 면역 보호의 제1 라인으로 B1 B 세포에 의해 생성될 수 있다는 것이다. 짐작건대, 이러한 다반응성은 식세포에 의한 제거를 허용하여 결합된 인슐린을 고갈시키는 다수의 자가항원을 포함하는 고분자량의 관절 면역 복합체를 초래한다. 대조적으로, 자가반응성 기억 PR-IgM은 자가항원에 대해 단일특이적일 수 있으며 따라서 면역 복합체의 형성 없이 결합 후 자가항원을 방출할 수 있다. 이를 시험하기 위해, 기억 PR-IgM과 비교하여 1차 IgM의 다반응성 가능성을 분석하였다. 항DNA ELISA(도 16c) 및 HEp-2 슬라이드를 이용한 간접 면역 형광(도 16d)은, 1차 IgM과 대조적으로, 메모리 PR-IgM은 다반응성이 아니지만 인슐린에 특이적으로 결합한다는 것을 나타내었다(도 16c 및 도 16d).
항인슐린 IgM이 관찰된 효과에 대한 구체적인 원인이라는 점을 나타내기 위해, 인슐린 특이적 풀다운 검정을 InsA 면역화 마우스로부터 유래한 혈청을 사용하여 수행하였다. 풀다운은 인슐린에 대한 웨스턴 블롯 분석에 의해 밝혀진 바와 같이 순수한 인슐린 특이적 IgM을 초래하였다(도 17). 정제된 1차 항인슐린 IgM 또는 기억 항인슐린 PR-IgM을 사용하여 항DNA ELISA(도 16e) 및 HEp-2 슬라이드 상에서 간접 면역 형광을 수행하였다(도 16f). 해당 결과는, 1차 IgM과 대조적으로, 정제된 항인슐린 PR-IgM이 다반응성이 아니며 인슐린에 특이적으로 결합한다는 결과를 확정한다(도 16e 및 도 16f). 1차 항인슐린 IgM은 대형 면역 복합체를 형성하지만 PR-IgM은 형성하지 않는다는 가설을 직접 시험하기 위해, 인슐린 및 DNA를 사용하여 항인슐린 1차 IgM 또는 PR-IgM을 배양하고 크기 배제 스핀 컬럼을 사용하여 면역 복합체 형성을 결정하였다. PR-IgM과 대조적으로, 1차 항인슐린 IgM이 주로 104kD보다 큰 대형 복합체를 형성한다는 것을 발견하였다(도 16g). 정제된 1차 항인슐린 IgM이 포도당 대사의 이상조절의 원인이라는 것을 나타내기 위해, 정제된 항인슐린 1차 IgM 또는 PR-IgM 5μg을 정맥내 주사하였고 혈당을 모니터링하였다. PR-IgM과 대조적으로, 정제된 1차 항인슐린 IgM을 주사한 후 혈당이 크게 증가하는 것을 관찰하였다(도 16h). 흥미롭게도, 혈당의 증가는 총 1차 IgM에 비해 정제된 항인슐린 1차 IgM을 주사한 후 더 빠르게 나타났다(도 16h).
요약하면, 이러한 데이터는 자가항원에 대한 특이성 증가가 자가반응 기억 PR-IgM이 면역 반응 동안 예방적이기 위해 중요하다는 것을 시사한다(도 18). 또한, 자가반응성 PR-IgM의 유도된 생성은 B 세포 내성의 중요한 단계일 가능성이 높다.
실시예 5: 면역화 계획
백신 설계와 관련하여 본 발명의 면역 개념의 영향은 코로나19를 유발하는 SARS-CoV-2 코로나바이러스에서 유래한 병원체 특이적 항원을 사용하여 시험되었다. 감염 동안, SARS-CoV-2 코로나바이러스는 수용체 결합 도메인(RBD)을 통해 숙주 세포 표면의 안지오텐신 전환 효소 2(ACE2)에 결합한다. 따라서, RBD/ACE2 상호작용을 차단하는 항체 반응을 촉발하는 것이 코로나바이러스 감염 예방의 핵심으로 간주된다. 따라서, SARS-CoV-2의 RBD를 면역화 동안 면역 반응에서 항원 형태의 역할에 사용하였다.
복합 RBD(cRBD)를 사용한 면역화(예를 들어, 스트렙트아비딘 및 비오티닐화 RBD를 사용한 복합화를 4:1의 비율로 사용함)는 가용성 RBD(sRBD)과 비교하여 더 강한 IgG 면역 반응을 유도하는 것으로 나타났다. RBD의 생산을 위해, 헥사히스티딘 태그된 버전의 RBD를 인코딩하는 발현 벡터가 HEK293-6E 세포로 일시적으로 형질감염되었다(Amanat, F., 등, 2020, Nature medicine, 26(7), 1033-1036). 가용성 RBD는 니켈 기반 고정화 금속 친화도 크로마토그래피(TaKaRa)에 의해 형질감염 5일 후 상청액으로부터 정제되었다. 그러나, 항체 농도가 시험관내(in vitro) 감염 실험을 사용하여 바이러스 중화를 허용하기에 충분하지 않았다. 따라서, 면역화 전에 sRBD로 마우스를 전처리하는 것이 면역 반응을 증진하는지 실험하였다. 실제로, 면역화 2주 전에 가용성 RBD로 마우스를 전처리하면 결과 면역 반응이 크게 증가하였다(도 19). 중요한 것은, 전처리된 마우스의 혈청이 시험관내(in vitro)에서 SARS-CoV-2 감염을 예방할 수 있는 엄청나게 높은 능력을 나타내었다는 것이다.
또한, 면역화 칵테일의 조성물에서 sRBD 대 cRBD의 상이한 비율은 면역화 후 면역 반응의 정제된 제어를 허용하는 면역글로불린 동형의 상이한 비율(즉, IgG 대 IgM)을 초래한다는 것을 발견하였다.
실시예 6: 항인슐린 IgG는 혈당 농도를 조절한다
우리는 야생형(WT) 마우스로부터 단리된 상당량의 총 IgG가 인슐린에 반응한다는 것을 알아내었다(도 21A 및 21B). 이러한 데이터를 확인하기 위해, ELISpot 분석을 수행하였고 항인슐린 IgG 분비 B 세포가 WT 마우스의 비장에 존재한다는 것을 발견하였다(도 21C). 항체를 생산할 수 없는 WT 및 B 세포 결핍 마우스의 혈당 농도를 측정하였을 때, 놀라운 차이를 발견하였다. 예상외로, B 세포 결핍 마우스는 WT 대조군과 비교하여 비정상적으로 감소한 혈당 수치를 나타내었다(도 21D).
이러한 비정상적 감소가 항체 결핍으로 인해 야기되는지 시험하기 위해, WT 마우스의 총 IgG 또는 동일한 총 IgG의 항인슐린 IgG 고갈 대조군을 B 세포 결핍 마우스에 정맥내 주사하였다. 혈당 농도는 총 뮤린 IgG와 함께 증가하나 항인슐린 IgG 고갈 대조군과는 함께 증가하지 않는다는 것을 발견하였다(도 21E). 정상 상태 혈당 감소가 체력에 미치는 결과를 시험하기 위해, 와이어 행잉 시험을 수행하여 운동 기능을 평가한 결과 B세포 결핍 마우스가 WT 대조군과 비교하여 와이어 행잉 시간이 유의하게 감소하였다는 것을 발견하였다. 중요한 것은, 와이어 행잉 시간의 이러한 결손이 총 뮤린 IgG의 정맥내 주사 후 회복되었다는 것이다(도 21F). 또한, B 세포 결핍 마우스는 로타로드 운동 후 혈당 수치 이상조절을 나타내었다.
건강한 공여체의 총 IgG 제제는 종종 면역결핍 치료에 정맥내 면역글로불린(IVIg) 주사로 사용되기 때문에 이러한 제제에서 항인슐린 IgG의 존재를 시험하였다. 모든 제제는 상당한 양의 항인슐린 IgG을 함유하였다. 그러나, 미국이 원산지인 경우 항인슐린 IgG 농도가 증가하는 것으로 나타났다. 인슐린은 사람과 마우스 사이에서 고도로 보존되어 있기 때문에, 인간 IVIg를 B 세포 결핍 마우스에 주사하여 인슐린 농도의 감소를 검출하였다(도 21G). 또한, 50μg의 인간 IVIg를 WT 마우스에 주사하면 혈당이 증가하였으며, 이러한 효과는 인간 IVIg로부터 항인슐린 IgG가 고갈되면 IVIg 유도 혈당 증가를 방지하였기 때문에 항인슐린 IgG가 필요하였다(다 21H).
항체 결핍을 앓고 있는 인간 환자에서 IVIg 주사가 유사한 결과를 나타내는지 시험하기 위해, IVIg 주사 전후 혈당을 모니터링하였다. B 세포 결핍 마우스와 유사하게도, 항체 결핍 환자는 건강한 공여체와 비교하여 혈당 농도가 감소한 것으로 나타났다. 중요한 것은, IVIg 주사 후 혈당 농도가 증가하여 정상 수준에 도달하였다는 것이다(도 21I). 또한 IVIg를 투여받은 면역결핍 환자는 혈청 인슐린 수치가 감소한 것으로 나타났다.
IVIg에 존재하는 항인슐린 IgG가 인슐린에 특이적이라는 것을 나타내기 위해, 생물층 간섭법(BLI)을 통해 친화도를 결정하였다. 10 내지 11의 해리 상수는 항IgG가 인슐린에 대해 고도로 특이적임을 시사한다(도 21J).
이러한 데이터는 항인슐린 IgG가 건강한 개체에서 존재하며 혈당 농도 조절에 필요할 수 있다는 것을 시사한다.
실시예 7: 항인슐린 IgM에 의한 혈당 조절
건강한 개체에서 항인슐린 항체의 존재에 대한 발견을 더 확인하기 위해, 상이한 연령대의 혈액으로부터 유래한 항인슐린 IgG 및 IgM을 평가하였다. 항인슐린 IgG가 청년층과 노년층에서 유사하다는 것을 발견하였음, 항인슐린 IgM은 남성과 여성에서 나이가 들면서 감소하는 것으로 보였다(도 22A). 흥미롭게도 인간 항인슐린 IgM은 인슐린의 다수의 에피토프를 인식한다.
높은 특이성과 일치하게도, 항인슐린 IgG는 항핵 항체 검출에 일반적으로 사용되는 HEp-2 세포에 대한 간접 면역형광 검정(IIFA)에서 어떠한 세포 구조에도 결합하지 않는 것으로 나타났다. 그러나, 항인슐린 IgM은 인슐린에 대한 친화도에 따라 생화학적으로 분리될 수 있는 2개의 분획으로 구성되었다. 저친화도 항인슐린 IgM은 용출을 위해 산성 조건(pH= 2.8)을 필요로 하는 고친화도 항인슐린 IgM과 비교하여 더 높은 pH(5)에서 인슐린 컬럼으로부터 용출된다(도 22B, 도 22C). 저친화도 IgM은 IIFA에서 핵 구조에 결합하고 ELISA에서 dsDNA 결합에 의해 검출되는 다반응성을 나타내는 반면, 고친화도 IgM은 이러한 검정에서 사실상 음성이다(도 22D, 도 22E). 또한, BLI 검정을 수행하여 친화도의 차이를 확인하였으며, 고친화도 및 저친화도 IgM이 각각 10-10 및 10-7의 해리 상수를 보유한다는 것을 발견하였다(도 22F). 상이한 IgM 분획이 포도당 대사에 미치는 영향을 시험하기 위해, 동일한 양의 인슐린 반응성 IgM높음 및 IgM낮음을 WT 마우스에 주사하였다. IgM낮음을 투여한 마우스에서 주사 후 2시간 이내에 혈당 증가가 관찰된 반면, IgM높음은 혈당 수치를 유의하게 변경하지 않았다(도 22G). 또한 저혈당증을 야기할 수 있는 인슐린 농도가 비정상적으로 증가한 조건 하에서 IgM높음이 조절 역할을 하는지 시험하였다. 이를 위해 IgM높음 또는 비특이적 IgM 동형 대조군과 함께 0.1μg 인슐린을 주사하였다. 놀랍게도, 항인슐린 IgM높음은 존재하나 IgM 동형 대조군은 그렇지 않아 인슐린 주사 직후 발생하는 급격한 혈당 감소를 방지하였다(도 22H). IgG 매개 분해로부터 인슐린을 보호하는 IgM높음의 규제 역할을 더 시험하기 위해, 항인슐린 IgM높음이 IVIg 제제로부터 정제된 항인슐린 IgG와 결합하게 하였다. 데이터는 항인슐린 IgM높음이 PR-IgM으로 작용하여 혈당 수치를 증가하게 하는 인슐린의 IgG 매개 중화를 예방한다는 것을 나타낸다(도 22I). 이러한 데이터는 항인슐린 IgM높음이 IgG 매개 중화로부터 인슐린을 보호하고 과량의 인슐린에 결합하여 인슐린 농도의 급격한 감소를 방지하여 포도당 대사를 조절하는 데 중요하다는 것을 시사한다. 연령에 따른 인슐린 반응성 IgM의 감소(도 21A)는 항인슐린 IgM높음 또는 IgM낮음이 이러한 감소에 의해 영향을 받는지 시험하도록 하였다. 청년층 및 노년층의 건강한 공여체에서 항인슐린 IgM높음 또는 IgM낮음의 양을 결정하였으며 항인슐린 IgM높음의 비율이 연령에 따라 증가한다는 것을 발견하였다(도 22J).
종합하면, 이러한 데이터는 포도당 대사가 상이한 부류의 항체에 의해 조절되며 항인슐린 IgM높음이 연령에 따라 특히 중요한 것으로 보이는 인슐린 항상성을 조절하여 포도당 대사를 조절하는 PR-IgM으로 작용한다는 것을 시사한다.
실시예 8: 인슐린 복합체에 의한 항인슐린 항체의 유도
복합 자가항원이 보조제와 무관하게 자가반응성 항체 반응을 유도할 수 있는지 여부를 조사하기 위해, 인슐린을 유리 설프하이드릴기와 공유 결합하여 관심 단백질과 가교결합하는 전형적인 동종이작용성 가교결합제인 1,2-페닐렌-비스-말레이미드를 사용하여 배양하였다(도 23A). 중요한 것은, 설프하이드릴기 함유 약물이 항인슐린 자가 항체를 유도하는 것으로 보고되었다는 것이다. 또한, 췌장 활성 증가 및 인슐린 생성 증가는 인슐린 펩티드 사이의 이황화 결합의 비정상적인 형성을 초래하며, 이는 설프하이드릴기 매개 가교결합에 더 민감한 비정상적인 인슐린 형태를 생성할 수 있으며, 따라서 산화 스트레스 조건 하에서 복합체 형성이 가능하다. 1,2-페닐렌-비스-말레이미드와 인슐린의 동종이작용성 가교결합은 SDS 페이지에서 시험되었으며 가교결합된 인슐린은 단량체 및 이량체 인슐린을 배제하는 크기 배제 스핀 컬럼을 사용하여 정제되었다(도 23B). 인슐린 복합체를 추가 보조제 없이 투석하였으며 WT 마우스에 마우스당 5μg로 주사하였다. 대조군으로, CpG를 보조제로 사용하고 스트렙타비딘을 외래 운반체로 사용하여 전형적인 면역화를 수행하였다. 인슐린 복합체가 면역화와 유사한 처리의 7일차에 증가된 혈당 및 항인슐린 IgM으로 이어진다는 것을 발견하였다(도 23C, 도 23D). 또한 인슐린 반응성 IgG를 14일차 및 26일차에 ELISA로 검출할 수 있었다. 21일차에 인슐린 복합체의 반복적인 주사는 포도당 대사의 추가 탈조절을 초래하였다(도 23E). 따라서, 인슐린 복합체 주사 1일 후인 22일차에 항인슐린 IgM높음을 주사하였다. 항인슐린 IgM높음이 인슐린 복합체의 주사에 의해 유도된 혈당 탈조절을 방지할 수 있다는 것을 발견하였다(도 23E).
또한 항인슐린 IgM높음이 췌장의 대식세포(CD11b+/LY6G+) 및 호중구(LY6G+) 침윤 감소와 혈액 내 혈청 췌장 리파아제 감소로 나타난 바와 같이 췌장 염증 및 손상을 예방한다는 것을 발견하였다(도 23F, 도 23G).
항인슐린 IgM낮음과 비교하여 항인슐린 IgM높음의 보호 역할을 위한 메커니즘으로서, dsDNA를 결합하는 항인슐린 IgM낮음의 다반응성이 대식세포에 의해 식세포화될 수 있는 면역 복합체의 형성을 유도하는 반면, 항인슐린 IgM높음은 인슐린에 고도로 특이적이며 따라서 대식세포에 의해 식세포화되기 쉬운 대형 면역 복합체를 형성하지 않는다고 제안하였다. 이를 시험하기 위해, 게놈 dsDNA의 존재 하에서 항인슐린 IgM높음 또는 항인슐린 IgM낮음을 인슐린과 함께 배양하였다(도 23H). 항인슐린 IgM높음과 비교하여 항인슐린 IgM낮음의 증가된 결합/식균 작용을 발견하였다(도 23). 또한, IgM높음은 항인슐린 IgM높음 항체에 비해 항인슐린 IgM낮음을 포함하는 상청액에서 인슐린의 감소가 더 컸기 때문에 분해로부터 인슐린을 보호할 수 있었다.
이러한 데이터는 인슐린 복합체의 형성을 활성화하는 조건 하에서 항인슐린 항체가 생성될 수 있으며, 이는 PR-IgM으로 작용하는 항인슐린 IgM높음에 의해 대응될 수 있는 조절되지 않은 포도당 대사를 초래한다는 것을 나타낸다.
실시예 9 재조합 항인슐린 IgM은 혈당을 조절할 수 있다
위의 결과는 인슐린 특이적 PR-IgM이 인슐린 항상성을 조절하고 정상적인 생리 기능 및 당뇨병 예방에 필수적인 췌장 기능 부전을 예방할 수 있기 때문에 치료에 큰 치료적 관심대상일 수 있다는 것을 시사한다. 데이터에 따르면, 항인슐린 IgM은 인슐린에 대한 높은 친화도를 보유하고 있으며 IIFA에서 dsDNA 또는 핵 구조와 같은 자가항원에 반응하지 않는 경우 PR-IgM으로 작용할 수 있다. 인간 인슐린 특이적 IgG 항체가 불변 영역을 교환하여 인슐린 특이적 PR-IgM으로 전환될 수 있다고 가정하였다.
따라서 우리는 공개된 인간 인슐린 특이적 항체[60]를 IgG1(항인슐린 IgGrec) 및 IgM(항인슐린 IgMrec)으로 클로닝하고 발현되게 하였다(도 24A). 시험관내(in vitro)에서 생산된 항체의 품질을 시험하기 위해 ,PNGaseF 처리에 의한 글리코실화를 평가하였으며, 그 결과 기능적 글리코실화를 시사하는 미처리 대조군과 비교하여 분자량이 감소하였다. 우리는 IgG와 IgM 모두의 친화도가 10-9인 것으로 결정하였다(도 24B). 총 인간 혈청 IgM과 비교하여 ELISA에서 dsDNA 결합이 거의 관찰되지 않았고 IIFA에서 핵 염색이 관찰되지 않았다(도 24C, 24D). 또한 단량체 항인슐린-IgM이 인슐린을 분해로부터 보호할 수 있는지 시험하였다. 항인슐린 IgG는 단량체 항인슐린 IgM이 존재할 때 제거된 혈당 증가를 초래하였다(도 24E).
생성된 재조합 인간 항인슐린 IgMrec이 보호 조절 기능을 보유하는지 여부를 시험하기 위해, 이를 인슐린과 함께 주사하였고 항인슐린 IgMrec이 과량의 인슐린에 의해 유도된 포도당 농도의 급격한 강하를 예방한다는 것을 발견하였다(도 24F). 또한, 항인슐린 IgMrec은 항인슐린 IgGrec에 의해 유도된 혈당의 증가를 방지하기 때문에, 항인슐린 IgGrec 매개 중화로부터 인슐린을 보호한다(도 24G). 또한, 항인슐린 IgMrec은 소변으로 포도당이 누출되는 것을 방지한다(도 24H).
이러한 데이터는 IgM이 인슐린 항상성을 조절하고, 혈당 농도의 탈조절화를 방지하고, 인슐린 연관 질환 및 장애의 치료를 위한 새로운 전략을 제공함에 따라 고친화도 인슐린 특이적 항체를 발현한다는 것을 시사한다.
실시예 10: 질병 매개변수 예측
고도의 자가반응성 1차 IgM 레퍼토리는 고친화도 PR-IgM이 2차 면역 반응 및 체세포 과돌연변이에 의해 생성될 수 없는 경우 자가반응성 손상에 대한 높은 위험을 나타낸다. 따라서 기억 IgM 레퍼토리는 대부분 적응 내성 과정에서 생성된 PR-IgM으로 구성된다. 체세포 과돌연변이는 PR-IgM 생성의 실패와 1차 IgM에 의한 자가면역 손상을 초래한다. 또한 모든 형태의 고 IgM 증후군(HIGM)은 중증 자가면역과 연관이 있다. HIGM 환자는 특히 면역성 혈소판감소증, 용혈성 빈혈 및 신염과 같은 IgM 매개 자가면역 질환이 발생하기 쉽다. 우리는 자가면역 및/또는 인슐린 관련 질환을 야기하는 자가반응성 IgM 항체의 친화도를 측정하고 (i) 자가항원에 대한 저친화도를 질환 발생, 질환 진행 및/또는 사망의 위험 인자로 간주하며 (ii) 고친화도 자가반응성 IgM을 보호 인자로 간주한다.
물질 및 방법
실시예 1 내지 5를 위해 사용된 마우스
8 - 30주령 C57BL/6 마우스 및 B 세포 결핍 마우스에 1x PBS으로 13 - 50μg 항원과 50μg CpG-ODN1826(Biomers)의 혼합물을 복강내(i.p.) 면역화하였다. 대조군 면역화(CI) 마우스에 PBS 및 CpG-ODN1826(50μg/마우스)을 투여하였다. 천연 비오티닐화 뮤린 인슐린을 BioEagle에서 구입하였다.
실시예 6 내지 9를 위해 사용된 마우스
8-15주령 암컷 C57BL/6 마우스 및 mb1 마우스 45에 1x PBS으로 10μg 항원(cInsulin 또는 인슐린-바이오:SAV)의 혼합물을 복강내(i.p.) 주사하였다. 대조군 주사(CI) 마우스에 100μL/마우스의 총 부피로 PBS를 투여하였다. 동물 실험은 독일 튀빙겐 담당 지역 위원회에서 동물 실험에 대한 허가 1484에 따라 수행되었다. 이 연구에 사용된 모든 마우스를 특정 병원체가 없는 조건에서 울름 대학교(Universiry of Ulm)의 동물 시설 내에서 사육 및 보관하였거나 6주령에 Jackson 사로부터 수득하였다. 모든 동물 실험을 독일 법률의 지침을 준수하여 수행하였으며 이를 울름 대학교의 동물 보호 및 위원회(Animal Care and Committees of Ulm University)와 지방 정부가 승인하였다.
펩티드
C-펩티드 펩티드(RoyoBiotech, Shanghai), 인슐린 및 바이러스 유래 펩티드(서열 식별 번호: 43; 서열 식별 번호: 44)(Peptides&Elephants, Berlin)를 순수(pure water), 1% DMSO 또는 1% 디메틸포름아미드(DMF)에서 수용해도에 따라 용해되게 하였다. 바이러스 유래 펩티드(서열 식별 번호: 43; 서열 식별 번호: 44)는 각각 비오틴(Biotin) 또는 KLH에 결합하였다. 1mg의 양을 구입하여 1ml의 부피에 용해되게 하였다. 10 내지 50μg의 KLH 결합 펩티드를 복강내 주사를 통한 마우스의 면역화에 사용하였다. 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH)에 대한 펩티드의 공유 결합을 위해, N-말단 시스테인을 첨가하였다. 스트렙트아비딘(SAV, ThermoScientific)에 대한 펩티드의 결합을 비오틴을 N-말단에 첨가하여 수행하였다. 더 나은 취급을 위해 C-말단에 OH기가 남아있게 하였다.
천연 인슐린 및 InsA 펩티드의 가교결합
천연 인간 인슐린(Merck)을 PBS에서 1mg/mL로 사전에 희석하였다. 화학적 티올 가교결합을 1,2-페닐렌-비스-말레이미드(Santa Cruz, 13118-04-2)를 10μg/mL로 사용하여 수행한 후 10kD 차단 스핀 컬럼(Abcam, ab93349)을 사용하여 제거하였다. 정제된 인슐린 복합체(cInsulin)는 100μL의 총 부피로 마우스당 10μg의 복강내 주사에 사용되었다.
유세포 분석
세포 현탁액은 다클론 래트 IgG-UNLB(2,4G2; BD)로 차단되었으며 표준 프로토콜에 따라 염색된 Fc-수용체이다. 비오틴 결합 펩티드/항체는 스트렙트아비딘 Qdot605 (Molecular Probes; Invitrogen)을 사용하여 검출되었다. 살아있는 세포는 Fixable Viability Dye eFluor780(eBioscienc)을 사용하여 죽은 세포와 구별되었다. 세포는 Cato II 유세포 분석기(BD)에서 획득되었다. 달리 명시되지 않은 경우 플롯의 숫자는 각 게이트의 백분율을 나타내고 히스토그램 플롯의 숫자는 평균 형광 강도(MFI)를 나타낸다.
B. 효소 결합 면역흡착 검정(ELISA)
96-웰 플레이트(Nunc, Maxisorp)는 천연 인슐린(Sigma-Aldrich, Cat. 91077C), 스트렙타비딘(ThermoScientific, Cat. 21125) 또는 송아지 흉선 DNA(ThermoScientific, Cat. 15633019)를 10μg/mL로 사용하여 또는 항IgM, 항IgG-항체(SouthernBiotech)와 함께 코팅되었다. SAV-플레이트의 비오티닐화 펩티드(2.5μg/mL)로 로딩하고 1% BSA 차단 버퍼(Thermo Fisher)에서 차단을 수행하였다. 1:3 IgM 또는 IgG 항체(SouthernBiotech)의 연속 희석액을 표준품으로 사용하였다. 임의 단위(AU)로 표시되는 상대 농도는 각각 알칼리 포스파타아제(AP) 표지 항IgM/항IgG(SouthernBiotech)에 의한 검출을 통해 결정되었다. 디에탄올아민 중 p-니트로페닐포스페이트(pNPP; Genaxxon) 완충액을 첨가하고 Multiskan FC ELISA 플레이트 판독기(Thermo Scientific)를 사용하여 405nm에서 데이터를 획득하였다. 모든 샘플은 2회 반복하여 측정되었다.
친화도 성숙화 분석을 위해, 펩티드(1) 또는 펩티드(4)로 코팅된 플레이트로부터 유래한 결과는 펩티드(1)을 펩티드(4)로 나누어 계산하였다. 따라서 결과는 도면 내에서 상대 단위[RU]로 명시되었다.
효소 연결 면역-스팟 검정(ELISpot)
총 비장 세포는 300.000 세포/웰로 3회 측정되었다. ELISpot 플레이트는 천연 인슐린(Sigma-Aldrich, Cat. 91077C), C-펩티드(RoyoBiotech)로 사전에 코팅되었다. 37°C에서 세포를 12-24시간 배양한 후 항원 특이적 IgM 또는 IgG가 항IgM-bio:SAV-AP 또는 항IgG-bio:SAV-AP(Mabtech)를 통해 검출되었다. 플레이트 및 항체 농도의 취급은 제조업체의 권장 사항에 따라 수행되었다.
HEp-2 슬라이드 및 형광 현미경 검사
HEp-2 슬라이드(EUROIMMUN, F191108VA)를 사용하여 핵 항원(ANA)에 대한 혈청 IgM의 반응성을 평가하였다. 면역화 후 7일차 및 85일차에 인슐린-A-펩티드 면역화 마우스의 혈청을 동일한 농도의 IgM(두 면역화된 검체에서 약 300ng/mL 항인슐린-IgM)으로 희석하고 HEp-2 슬라이드에 도포하였다. 항-IgM-FITC(eBioscience, Cat. 11-5790-81)을 ANA-IgM 검출에 사용하였다. 염색된 HEp-2 슬라이드를 형광 현미경 Axioskop 2(Zeiss) 및 DMi8 소프트웨어(Leica)를 사용하여 분석하였다.
포도당 수치 모니터링
요당 수치의 평가는 Combur 10 M 시험 스트립(Roche Diagnostics, Mannheim)를 사용하여 수행되었다. 매일 마우스를 취급하는 동안 멸균 스트립을 사용하였으며 시험 후 나타나는 색상을 제조업체의 표준품 포도당 수치(mmol/L)과 비교하였다. AccuCheck(Roche Diagnostics, Mannheim) 혈당 모니터를 사용하여 마우스의 혈당 수치를 측정하였다. 자유롭게 급여한 마우스의 꼬리 정맥에서 혈액을 채취하여 무균 시험 스트립으로 이동시켰다. 포도당 수준은 그룹당 각 마우스에 대해 도면에 명시된 일차에 mmol/L로 측정되었다. 한배 새끼를 대상으로 통제 면역화를 실시하고 하루 중 비슷한 시간에 측정하였다.
SDS 페이지, 쿠마시 및 웨스턴 블롯
장기를 안락사 직후 채취하여 프로테아제 및 포스파타제 억제제(50mM TrisHCl, pH 7.4, 1% NP-40, 0.25% 데옥시콜산 나트륨, 150mM NaCl, 1mM EDTA(pH 8), 1mM 나트륨 오르토바나데이트, 1mM NaF, 프로테아제 억제제 칵테일(Sigma-Aldrich)을 함유하는 RIPA 완충제에서 용해되게 하였다. 검체를 10 - 20% SDS-폴리아크릴아미드 겔에서 분리하고 PVDF 멤브레인(Millipore)에 블롯팅하거나 45분 동안 쿠마시(쿠마시 브릴리언트 블루 R-250, ThermoFisher)와 함께 배양한 후 탈색시켰다. 이어서, 막은 실온에서 1시간 동안 5% BSA PBS에서 일정하게 교반하면서 차단되었다. 1차 항체를 5% BSA PBS(BIOMOL Research Laboratories)에 희석하였다. 2차 항체를 5% BSA PBS에 희석하였다. 막 개발 및 데이터 기록은 광학 시스템 Fusion SL(Vilber)로 수행되었다.
총 혈청 면역글로불린 풀다운
안락사 직후 면역화된 마우스의 혈청을 채취하여 IgM 또는 IgG를 정제하였다. 항체에 결합된 항원의 제거는 용출 동안 혈청의 반복된 동결-해동 주기 및 pH-이동에 의해 달성되었다[52]. IgG 단백질 G의 경우 제조업체 프로토콜에 따라 세파로스 비드(Thermo Fisher)를 사용하고 1x PBS에서 10배 검체 부피로 밤새 투석하였다. IgM의 경우 제조업체 프로토콜에 따라 HiTrap IgM 컬럼(GE Healthcare, Sigma-Aldrich)을 사용하고 샘플 부피의 10배인 1 x PBS에서 밤새 투석하였다. 분리된 면역글로불린의 품질 검사는 SDS 페이지 및 쿠마시 및 ELISA를 통해 결정된 인슐린 특이 면역글로불린의 양를 통해 해결하였다. 마지막으로 20- 50μg(1~10μg 인슐린 특이적 Ig)을 정맥내 주사하였다.
인슐린 특이적 혈청 면역글로불린의 분리
InsA의 혈청과 대조군 면역 마우스를 안락사 직후 채취하여 인슐린 특이 면역 글로불린 분리를 위해 준비하였다. 스트렙타비딘 비드 컬럼(Thermo-Scientific, Cat. 21115)에 10μg 바이오 인슐린(BioEagle)을 로딩하였다. 혈청을 실온에서 90분 동안 배양하여 비드에 대한 인슐린 특이적 항체의 결합을 보장하였다. 인슐린-항체의 분리는 제조업체 용출 및 중화 용액을 사용하여 pH 이동에 의해 수행되었다. 분리된 면역글로불린의 품질은 항IgM 중쇄(Thermo-Scientific, Cat. 62-6820) 및 항IgG 중쇄(Cell Signaling Technologies, Cat. 7076) 항체를 사용하여 쿠마시 및 웨스턴 블롯 분석을 통해 검사되었다. 추가 생체 내 실험을 위해 분리된 항체를 투석하였다.
생물층 간섭법(BLI)
간섭법 분석법(BLItz 장치, ForteBio)을 사용하여 단백질-단백질 상호작용의 친화도를 결정하였다[61]. 여기서, 인슐린 특이적 IgM(인슐린 특이적 면역글로불린의 단리 참조)과 인슐린 바이오(ThermoFisher)를 표적으로 사용하였다. 표적은 스트렙트아비딘 바이오센서(ForteBio)에 로드딩되었다. 인슐린에 대한 IgM의 결합 친화도는 nm 단위로 획득되었다. 이어서, 계산된 친화도 값(Ka)을 사용하여 해리 상수(Kd)를 결정하였다: Kd= 1/Ka. 다음 프로토콜이 사용되었다. 30초 기준선, 30초 로딩, 30초 기준선, 240초 결합, 120초 해리. 검체, 표적 및 프로브의 완충을 위해 제조업체의 샘플 완충제(ForteBio)를 사용하였다.
와이어 행잉 테스트
선형 와이어 행잉 테스트는 마우스의 운동 강도 및 기능을 평가하는 데 사용된다. 각각의 마우스를 케이지(cage) 위의 36cm 높이의 수평 와이어 위에 올려 놓았으며, 이어서 마우스는 발과 근력을 사용하여 와이어에 머물려고 하였다. 와이어에 머무르는 각 마우스의 시간(초) 능력을 기록하였다. 최대 시간은 240초로 설정되었다. 각 마우스는 연속으로 세 번 시험을 거쳤다. 평균값을 측정된 데이터로부터 계산하였다. 혈당 수치를 시험 전후 측정하였다.
통계 분석
GraphPad Prism(버전 6.0h) 소프트웨어를 사용하여 그래프를 생성하고 통계 분석을 수행하였다. 개별 복제 또는 마우스(n)의 수는 도면 또는 도면 범례 내에 명시되어 있다. P 값은 각 도면 범례에 명시된 시험으로 계산되었다. Welch 보정을 사용한 학생 t-시험을 사용하여 한 실험 내에서 2개의 군을 비교하였다. 0.05보다 큰 P 값은 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다(ns=유의하지 않음, * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001, **** p < 0.0001).
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SEQUENCE LISTING <110> Vaccinvent GmbH Universit채t Ulm <120> METHOD AND MEANS FOR MODULATING B-CELL MEDIATED IMMUNE RESPONSES <130> AE1593 PCT/A BS <150> EP21 189 995.0 <151> 2021-08-05 <150> PCT/EP2021/052000 <151> 2021-01-28 <160> 48 <170> BiSSAP 1.3.6 <210> 1 <211> 128 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mAb13 HCVD <400> 1 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Val Trp Val 35 40 45 Ser Arg Ile Asn Ser Asp Gly Ser Thr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Asp Arg Gly Ile Thr Met Val Arg Gly Ile Ile Leu Phe 100 105 110 Gly Phe Leu Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 2 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 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PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mAb48 HCDR2 <400> 10 Ile Trp Tyr Asp Gly Asn Asn Lys 1 5 <210> 11 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mAb48 HCDR3 <400> 11 Ala Arg Asp Ser Lys Phe Thr Val Val Val Ala Arg Arg Arg Tyr Tyr 1 5 10 15 Tyr Tyr Asp Met Asp Val 20 <210> 12 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mAb48 LCVD <400> 12 Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Thr Ile Ser Ser Asn 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ser 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Tyr Asn Arg Leu Pro Pro 85 90 95 Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 13 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mAb48 LCDR1 <400> 13 Gln Thr Ile Ser Ser Asn 1 5 <210> 14 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mAb48 LCDR3 <400> 14 Gln His Tyr Asn Arg Leu Pro Pro Trp Thr 1 5 10 <210> 15 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mAb49 HCVD <400> 15 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Thr Ile Ser Trp Val Gln Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Val Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Ser Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Lys Val Asn Phe Ser Gly Trp Tyr Tyr Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 16 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mAb49 HCDR1 <400> 16 Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr Thr 1 5 <210> 17 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mAb49 HCDR2 <400> 17 Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala 1 5 <210> 18 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mAb49 HCDR3 <400> 18 Ala Arg Ser Lys Val Asn Phe Ser Gly Trp Tyr Tyr Tyr 1 5 10 <210> 19 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mAb49 LCVD <400> 19 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Ala Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Thr Trp Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 20 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mAb49 LCDR1 <400> 20 Gln Ser Val Ser Ser Tyr 1 5 <210> 21 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mAb49 LCDR3 <400> 21 Gln Gln Arg Ser Thr Trp Pro Trp Thr 1 5 <210> 22 <211> 384 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mAb13 HCVD <400> 22 gaggtgcagc tggtggagtc cgggggaggc ttagttcagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt agctactgga tgcactgggt ccgccaagct 120 ccagggaagg ggctggtgtg ggtctcacgt attaatagtg atgggagtac cacaaggtac 180 gcggactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa tacgctgtat 240 ctgcaaatga acagtctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc aagagatgat 300 agggggatta ctatggttcg gggaattatt ctattcgggt tcctcgatct ctggggccgt 360 ggcaccctgg tcactgtctc ctca 384 <210> 23 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mAb13 HCDR1 <400> 23 ggattcacct tcagtagcta ctgg 24 <210> 24 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mAb13 HCDR2 <400> 24 attaatagtg atgggagtac caca 24 <210> 25 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mAb13 HCDR3 <400> 25 gcaagagatg atagggggat tactatggtt cggggaatta ttctattcgg gttcctcgat 60 ctc 63 <210> 26 <211> 322 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mAb13 LCVD <400> 26 gaaattgtgt tgacacagtc tccagccatc ctgtctttgt gtccagggga aagagccacc 60 ctctcctgca gggccagtca gaatgttagc agctacttag cctggtacca acagaaacct 120 ggccaggctc ccaggctcct catctctgat gcatccaaca gggccactgg catcccagcc 180 aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcactctca ccatcaacaa cctggagcct 240 gaagattttg cagtttatta ctgtcagcag cgtagcaact ggcctcagac gttcggccaa 300 gggaccaagg tggagatcaa ac 322 <210> 27 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mAb13 LCDR1 <400> 27 cagaatgtta gcagctac 18 <210> 28 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mAb13 LCDR3 <400> 28 cagcagcgta gcaactggcc tcagacg 27 <210> 29 <211> 387 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mAb48 HCVD <400> 29 caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cgtctggatt caccttcagt aactatggta tgcactgggt ccgccaggct 120 ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atatggtatg atggaaataa taaatactat 180 acagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa caccctatat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagagattcc 300 aaatttacag tagtggttgc acggcgacgg tactactact acgatatgga cgtctggggc 360 caagggacca cggtcaccgt ctcctca 387 <210> 30 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mAb48 HCDR1 <400> 30 ggattcacct tcagtaacta tggt 24 <210> 31 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mAb48 HCDR2 <400> 31 atatggtatg atggaaataa taaa 24 <210> 32 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mAb48 HCDR3 <400> 32 gcgagagatt ccaaatttac agtagtggtt gcacggcgac ggtactacta ctacgatatg 60 gacgtc 66 <210> 33 <211> 325 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mAb48 LCVD <400> 33 gaaatagtga tgacgcagtc tccagccacc ctgtctgtgt ctccagggga aagagccacc 60 ctctcctgca gggccagtca gactattagc agcaacttag cctggtacca gcagaaacct 120 ggccaggctc ccaggctcct catctatggt gcatccacca gggccactgg tatcccagct 180 aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagag ttcactctca ccatcagcag cctggagtct 240 gaagattttg cagtttatta ctgtcaacac tataataggc tgcctccgtg gacgttcggc 300 caagggacca gggtggaaat caaac 325 <210> 34 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mAb48 LCDR1 <400> 34 cagactatta gcagcaac 18 <210> 35 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mAb48 LCDR3 <400> 35 caacactata ataggctgcc tccgtggacg 30 <210> 36 <211> 360 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mAb49 HCVD <400> 36 caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60 tcctgcaagg cttctggagg caccttcagc agctatacta tcagctgggt gcaacaggcc 120 cctggacaag ggcttgagtg gatggtaggg atcatcccta tctttggtac agcaaactac 180 gcacagaagt tccagagcag agtcacgatt accgcggacg aatccacgag cacagcctac 240 atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagatcgaaa 300 gttaatttca gtggctggta ctactactgg ggccagggaa ccctggtcac cgtctcctca 360 <210> 37 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mAb49 HCDR1 <400> 37 ggaggcacct tcagcagcta tact 24 <210> 38 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mAb49 HCDR2 <400> 38 atcatcccta tctttggtac agca 24 <210> 39 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mAb49 HCDR3 <400> 39 gcgagatcga aagttaattt cagtggctgg tactactac 39 <210> 40 <211> 322 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mAb49 LCVD <400> 40 gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60 ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agctacttag cctggtacca acagaaagct 120 ggccaggctc ccaggctcct catctatgat gcatccaaca gggccactgg catcccagcc 180 aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcactctca ccatcagcag gctagagcct 240 gaagattttg cagtttatta ctgtcagcag cgtagcacct ggccgtggac gttcggccaa 300 gggaccaagg tggaaatcaa ac 322 <210> 41 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mAb49 LCDR1 <400> 41 cagagtgtta gcagctac 18 <210> 42 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mAb49 LCDR3 <400> 42 cagcagcgta gcacctggcc gtggacg 27 <210> 43 <211> 26 <212> PRT <213> Viruses <220> <223> SARS-CoV-2 #1 <400> 43 Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln 1 5 10 15 Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr 20 25 <210> 44 <211> 30 <212> PRT <213> Viruses <220> <223> SARS-CoV-2 #2 <400> 44 Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser 1 5 10 15 Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr 20 25 30 <210> 45 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> C-Peptide <400> 45 Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro 1 5 10 15 Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln 20 25 30 <210> 46 <211> 29 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <223> C-Peptide <400> 46 Glu Val Glu Asp Pro Gln Val Glu Gln Leu Glu Leu Gly Gly Ser Pro 1 5 10 15 Gly Asp Leu Gln Thr Leu Ala Leu Glu Val Ala Arg Gln 20 25 <210> 47 <211> 21 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Insulin-A chain <400> 47 Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu 1 5 10 15 Glu Asn Tyr Cys Asn 20 <210> 48 <211> 21 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <223> Insulin-A chain <400> 48 Gly Ile Val Asp Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu 1 5 10 15 Glu Asn Tyr Cys Asn 20

Claims (18)

  1. 올리고머성 항인슐린 항체로서, 상기 항체는
    (i) 바람직하게는 표면 플라즈몬 공명에 의해 측정된 바와 같이, Kd < 5 x 10-7의 인슐린 및/또는 프로인슐린에 대한 친화도를 갖고/갖거나;
    (ii) 인슐린 및/또는 프로인슐린에 대해 단일특이적인 올리고머성 항인슐린 항체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 올리고머성 항인슐린 항체는 IgM 동형의 항인슐린 항체인 올리고머성 항인슐린 항체.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 올리고머성 항인슐린 항체는 키메라, 인간화 또는 인간 항체인 올리고머성 항인슐린 항체.
  4. 제1항 내지 제3항에 있어서, 상기 면역글로불린은
    a) 서열 식별 번호: 2에서 정의된 바와 같은 CDR1, 서열 식별 번호: 3에서 정의된 바와 같은 CDR2 및 서열 식별 번호: 4에서 정의된 바와 같은 CDR3을 포함하는 가변 중(VH)쇄 및 서열 식별 번호: 6에서 정의된 바와 같은 CDR1, 서열 DAS에 의해 정의된 바와 같은 CDR2 및 서열 식별 번호: 7에서 정의된 바와 같은 CDR3을 포함하는 가변 경(VL)쇄;
    b) 서열 식별 번호: 9에서 정의된 바와 같은 CDR1, 서열 식별 번호: 10에서 정의된 바와 같은 CDR2 및 서열 식별 번호: 11에서 정의된 바와 같은 CDR3을 포함하는 가변 중(VH)쇄 및 서열 식별 번호: 13에서 정의된 바와 같은 CDR1, 서열 GAS에 의해 정의된 바와 같은 CDR2 및 서열 식별 번호: 14에서 정의된 바와 같은 CDR3을 포함하는 가변 경(VL)쇄; 또는
    c) 서열 식별 번호: 16에서 정의된 바와 같은 CDR1, 서열 식별 번호: 17에서 정의된 바와 같은 CDR2 및 서열 식별 번호: 18에서 정의된 바와 같은 CDR3을 포함하는 가변 중(VH)쇄 및 서열 식별 번호: 20에서 정의된 바와 같은 CDR1, 서열 DAS에 의해 정의된 바와 같은 CDR2 및 서열 식별 번호: 21에서 정의된 바와 같은 CDR3을 포함하는 가변 경(VL)쇄;를 포함하는 올리고머성 항인슐린 항체.
  5. 제4항에 있어서, 상기 올리고머성 항인슐린 항체는
    a) 서열 식별 번호: 1의 아미노산 서열 또는 서열 식별 번호: 1과 적어도 90%, 바람직하게는, 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 가변 중(VH)쇄 서열 및 서열 식별 번호: 4의 아미노산 서열 또는 서열 식별 번호: 4와 적어도 90%, 바람직하게는, 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 가변 경(VL)쇄 서열;
    b) 서열 식별 번호: 8의 아미노산 서열 또는 서열 식별 번호: 8과 적어도 90%, 바람직하게는, 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 가변 중(VH)쇄 서열 및 서열 식별 번호: 12의 아미노산 서열 또는 서열 식별 번호: 12와 적어도 90%, 바람직하게는, 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 가변 경(VL)쇄 서열; 또는
    c) 서열 식별 번호: 15의 아미노산 서열 또는 서열 식별 번호: 15와 적어도 90%, 바람직하게는, 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 가변 중(VH)쇄 서열 및 서열 식별 번호: 19의 아미노산 서열 또는 서열 식별 번호: 19와 적어도 90%, 바람직하게는, 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 가변 경(VL)쇄 서열;을 포함하는 올리고머성 항인슐린 항체.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 올리고머성 항인슐린 항체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  7. 제6항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포.
  8. 제7항의 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는 올리고머성 항인슐린 항체를 생성하기 위한 방법.
  9. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 올리고머성 항인슐린 항체, 제6항의 폴리뉴클레오티드, 제7항의 숙주세포 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 추가 치료제를 포함하는 약제학적 조성물.
  11. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 올리고머성 항인슐린 항체, 제6항의 폴리뉴클레오티드, 제7항의 숙주 세포 또는 제9항 내지 제10항의 약제학적 조성물의 치료에서의 용도.
  12. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 올리고머성 항인슐린 항체, 제6항의 폴리뉴클레오티드, 제7항의 숙주 세포 또는 제9항 내지 제10항의 약제학적 조성물의 인슐린 연관 질환 또는 장애의 치료에서의 용도.
  13. 인슐린 연관 질환 또는 장애를 진단 및/또는 예측하는 방법으로서, 상기 방법은
    (i) 검체로부터 유래한 프로인슐린 및/또는 인슐린에 대한 항인슐린 IgM 항체의 결합의 친화도를 결정하는 단계로서,
    상기 검체는 대상체로부터 수득되었고 상기 대상체는 인슐린 연관 질환 또는 장애가 있다고 진단되었거나 이의 위험이 있는 단계;
    (ii) 단계 (i)에서 결정되는 수치(들)를 기준 값과 비교하는 단계; 및
    (iii) 단계 (ii)에서 이루어진 비교에 기반하여 상기 대상체에서 인슐린 연관 질환 또는 장애를 진단 및/또는 예측하는 단계로서, 바람직하게는 프로인슐린 및/또는 인슐린에 대한 항인슐린 IgM 항체의 결합의 더 낮은 친화도는 인슐린 연관 질환 또는 장애에 대한 더 높은 위험을 나타내는 단계;를 포함하는 인슐린 연관 질환 또는 장애를 진단 및/또는 예측하는 방법.
  14. 대상체가 인슐린 연관 질환 또는 장애의 치료에 민감한지 여부를 결정하기 위한 방법으로서, 상기 방법은
    (i) 검체로부터 유래한 프로인슐린 및/또는 인슐린에 대한 항인슐린 IgM 항체의 결합의 친화도를 결정하는 단계로서, 상기 검체는 대상체로부터 수득되었고 상기 대상체는 인슐린 연관 질환 또는 장애가 있다고 진단되었거나 이의 위험이 있는 단계;
    (ii) 단계 (i)에서 결정되는 수치(들)를 기준 값과 비교하는 단계; 및
    (iii) 상기 대상체가 인슐린 연관 질환 또는 장애의 치료에 민감한지 여부를 결정하는 단계로서, 바람직하게는 프로인슐린 및/또는 인슐린에 대한 항인슐린 IgM 항체의 결합의 더 낮은 친화도는 인슐린 연관 질환 또는 장애의 치료에 대한 더 높은 민감성을 나타내는 단계;를 포함하는 대상체가 인슐린 연관 질환 또는 장애의 치료에 민감한지 여부를 결정하기 위한 방법.
  15. 올리고머성 항인슐린 항체의 제12항의 용도, 폴리뉴클레오티드의 제12항의 용도 또는 숙주 세포의 제12항의 용도, 또는 약제학적 조성물의 제12항의 용도, 제13항 또는 제14항의 방법에 있어서, 상기 인슐린 연관 질환 또는 장애는 췌장 손상, 제1형 당뇨병, 제2형 당뇨병, 외인성 인슐린 항체 증후군, 임신성 당뇨병 및 이상혈당증의 군으로부터 선택되는, 용도 또는 방법.
  16. 올리고머성 항인슐린 항체의 제15항의 용도, 폴리뉴클레오티드의 제12항의 용도 또는 숙주 세포의 제15항의 용도, 또는 약제학적 조성물의 제15항의 용도, 제15항의 방법에 있어서, 상기 이상혈당증은 췌장 손상, 제1형 당뇨병, 제2형 당뇨병, 외인성 인슐린 항체 증후군 및 임신성 당뇨병의 군으로부터 선택되는 인슐린 연관 질환 또는 장애가 있는 환자의 이상혈당증인, 용도 또는 방법.
  17. 올리고머성 항인슐린 및/또는 항프로인슐린 항체, 바람직하게는 IgM 동형의 올리고머성 항인슐린 및/또는 항프로인슐린 항체를 생성하기 위한 방법으로서, 포유동물을 적어도 하나의 1가 인슐린 입자 및 적어도 하나의 다가 인슐린 입자의 혼합물로 면역화하는 단계를 포함하는, 올리고머성 항인슐린 및/또는 항프로인슐린 항체, 바람직하게는 IgM 동형의 올리고머성 항인슐린 및/또는 항프로인슐린 항체를 생성하기 위한 방법.
  18. 인슐린 연관 질환 또는 장애의 치료 및/또는 예방하기 위한 방법으로서, 상기 방법은 치료적 유효량의 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 올리고머성 항인슐린 항체, 제6항의 폴리뉴클레오티드, 제7항의 숙주 세포 또는 제9항 내지 제10항의 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 인슐린 연관 질환 또는 장애의 치료 및/또는 예방하기 위한 방법.

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