TW202342519A - 人源化抗ｔｄｐ－４３結合分子及其用途 - Google Patents

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Abstract

本發明屬於分子量為43kDa的反式啟動應答DNA結合蛋白(TARDB或也稱為TDP-43)的領域。本發明涉及人源化TDP-43特異性結合分子、特別是人源化抗TDP-43抗體或其抗原結合片段或衍生物及其用途。本發明提供了診斷、預防、減輕和/或治療與TDP-43聚集體相關的包括但不限於以下的疾病、障礙和/或異常的手段和方法：額顳葉失智症(Frontotemporal Dementia，FTD)、肌肉萎縮性脊髓側索硬化症(Amyotrophic Lateral Sclerosis，ALS)、阿茲海默症(Alzheimer’s Disease，AD)、帕金森病(Parkinson’s Disease，PD)、慢性創傷性腦病(Chronic Traumatic Encephalopathy，CTE)和邊緣為主的年齡相關性TDP-43腦病(Limbic-predominant Age-related TDP-43 Encephalopathy，LATE)。

Description

人源化抗TDP-43結合分子及其用途
本發明屬於分子量為43kDa的反式啟動應答DNA結合蛋白(TARDB或也為TDP-43)的領域。本發明涉及人源化TDP-43特異性結合分子、特別是人源化抗TDP-43抗體或其抗原結合片段或衍生物及其用途。本發明提供了診斷、預防、減輕和/或治療與TDP-43相關、特別是與TDP-43聚集體相關的疾病、障礙和/或異常、或TDP-43蛋白質病(proteinopathy)的手段和方法，所述疾病、障礙和/或異常、或TDP-43蛋白質病包括但不限於額顳葉失智症(Frontotemporal Dementia，FTD)、肌肉萎縮性脊髓側索硬化症(Amyotrophic Lateral Sclerosis，ALS)、阿茲海默症(Alzheimer’s Disease，AD)、帕金森病(Parkinson’s Disease，PD)、慢性創傷性腦病(Chronic Traumatic Encephalopathy，CTE)和邊緣為主的年齡相關性TDP-43腦病(Limbic-predominant Age-related TDP-43 Encephalopathy，LATE)。
以蛋白質在中樞神經系統(Central Nervous System，CNS)(蛋白質病)和外周器官中病理性聚集為特徵的年齡相關性腦病是世界上失能和死亡率的主要原因之一。形成聚集體的最佳表徵的蛋白質是阿茲海默症和相關障礙中的β澱粉樣蛋白。導致神經變性的其他疾病相關的、傾向於聚集的蛋白質包括但不限於Tau、α-突觸核蛋白(aSyn、a-syn)、亨廷頓蛋白(Huntingtin)、肉瘤融合蛋白(Fused in Sarcoma，FUS)、通過C9orf72重複擴增的非常規翻譯產生的二肽重複蛋白(Dipeptide Repeat Protein，DPR)、超氧化物歧化酶1(Superoxide Dismutase 1，SOD1)和TDP-43。涉及TDP-43聚集體的疾病通常被列為TDP-43蛋白質病，包括但不限於ALS和FTD。
I. TDP-43介紹
反式啟動應答(Transactive Response，TAR)DNA結合蛋白43kDa(TDP-43)是由染色體1p36.2(ALS10)上的TARDBP基因編碼的具有414個胺基酸的蛋白質。TARDBP由六個外顯子(外顯子1是非編碼的；外顯子2至6是蛋白質編碼的)構成。TDP-43屬於異質核糖核蛋白(hnRNP)RNA結合蛋白家族(Wang et al.,Trends in Molecular Medicine Vol.14 No.11,2008,479-485；Lagier-Tourenne et al.,Human Molecular Genetics,2010,Vol.19,Review Issue 1 R46-R64)。TDP-43包含五個功能結構域(Warraich et al.,The International Journal of Biochemistry & Cell Biology 42(2010)1606-1609，圖1)：兩個RNA識別基序(RRM1和RRM2)，其具有兩個高度保守的六聚核糖核蛋白2(RNP2)和八聚核糖核蛋白1(RNP1)區域；核輸出信號(Nuclear Export Signal，NES)和核定位信號(Nuclear Localization Signal，NLS)，使其能夠在細胞核和細胞質之間穿梭，轉運結合的mRNA；以及位於C末端的富含甘胺酸的結構域，其介導蛋白質間相互作用。TDP-43涉及RNA加工的多個方面，包括轉錄、剪接、轉運和穩定化(Buratti and Baralle,FEBS Journal 277(2010)2268-2281)。TDP-43是高度保守、普遍表達且表達水準嚴格自調節的蛋白質，其不斷在細胞核與細胞質之間穿梭，但主要定位於細胞核。2006年，TDP-43被鑒定為在絕大部分具有tau陰性、泛素陽性包涵體的額顳葉變性(Drontotemporal Lobar Degeneration，FTLD)(之後稱為FTLD-TDP)的病例中，以及在大多數肌肉萎縮性脊髓側索硬化症(ALS)病例中積累的蛋白質(Arai et al.,Biochemical and Biophysical Research Communications 351(2006)602-611；Neumann et al.,Science 314,(2006),130-133)。
已在散發性和家族性ALS患者以及患有遺傳性FTD的患者中鑒定了38個TDP-43負顯性突變，其主要位於富含甘胺酸的結構域中(Lagier-Tourenne and Cleveland,Cell 136,2009,1001-1004，圖1)。TDP-43本質上是傾向聚集的，如沉降測定所示，並且這種傾向由於一些ALS相關的TARDBP突變而進一步提高(Ticozzi et al.,CNS Neurol.Disord.Drug Targets.2010,9(3),285-296.)使TDP-43聚集與臨床疾病表現相聯繫。
II. 神經變性中的TDP-43
已在越來越多的神經退行性病症中鑒定出TDP-43聚集體(Lagier-Tourenne et al.,Human Molecular Genetics,2010,Vol.19,Review Issue 1 R46-R64)，包括但不限於：額顳葉失智症(FTD，例如散發性或家族性、伴有或不伴有運動神經元疾病(Motor-neuron Disease，MND)、有顆粒蛋白前體(GRN)突變、有C9orf72突變、有結合蛋白(TAR DNA Binding Protein，TARDBP)突變、有含纈酪肽蛋白(Valosine-containing Protein，VCP)突變、與9p染色體連鎖、皮質基底節變性、有泛素陽性TDP-43包涵體的額顳葉變性(FTLD)(FTLD-TDP)、嗜銀顆粒病(Argyrophilic Grain Disease)、皮克病(Pick’s Disease)、語義變異型原發性進行性失語(Semantic Variant Primary Progressive Aphasia，svPPA)、行為變異型FTD(Behavioural Variant FTD，bvFTD)、非流利性變異型原發性進行性失語(Nonfluent Variant Primary Progressive Aphasia，nfvPPA)，等)、肌肉萎縮性脊髓側索硬化症(ALS，例如散發性ALS、有TARDBP突變、有血管生成蛋白(angiogenin，ANG)突變)、亞歷山大病(Alexander Disease，AxD)、邊緣為主的年齡相關性TDP-43腦病(LATE)、慢性創傷性腦病(CTE)、佩里綜合症(Perry syndrome)、阿茲海默症(AD，包括散發性和家族性形式的AD)、唐氏綜合症(Down Syndrome)、家族性英國型癡呆(Familial British Dementia)、多聚谷氨醯胺病(亨廷頓病和脊髓小腦共濟失調3型(SCA3(spinocerebellar ataxia type 3)；也稱為馬-約病(Machado Joseph Disease)))、海馬硬化性癡呆和肌病(散發性包涵體肌炎；包涵體肌病，有含纈酪肽蛋白(Valosin-containing Protein，VCP)突變；以及佩吉特骨病(Paget disease of bone)和額顳葉失智症)；有鑲邊空泡的眼咽肌營養不良；有肌收縮蛋白(Myotilin，MYOT)基因突變或編碼結蛋白(DES)之基因的突變的肌原纖維肌病、創傷性腦損傷(Traumatic Brain Injury，TBI)、路易體失智症(Dementia with Lewy Body，DLB)或帕金森病(PD)。術語LATE旨在涵蓋與TDP-43蛋白質病相關的幾個先前使用的名稱，這些名稱可能與認知損害相關，包括海馬硬化、衰老性海馬硬化、海馬硬化性癡呆、腦年齡相關性TDP-43及硬化(CARTS)，和老年人中的TDP-43病理狀況(綜述參見Kuslansky et al.，2004；Lippa and Dickson，2004；Nelson et al.，2013，2016b；Dutra et al.，2015)。
來自患者腦的聚集TDP-43顯示出大量異常修飾，包括過度磷酸化、泛素化、乙醯化和通過蛋白水解切割的C末端片段(Arai et al.,Biochemical and Biophysical Research Communications 351(2006)602-611；Neumann et al., Science 314,(2006),130-133；Neumann et al.,Acta Neuropathol.(2009)117：137-149；Hasegawa et al.,(2008)Annals of Neurology Vol 64 No 1,60-70；Cohen et al.,Nat Commun.6：5845,2015)。TDP-43病理狀況的另一個特徵性特徵是TDP-43從細胞核到細胞質的重分佈和積累。FTLD-TDP的標誌性病變是神經元胞質包涵體和膠質細胞胞質包涵體(分別為NCI(neuronal cytoplasmic inclusion)和GCI(glial cytoplasmic inclusion))和營養不良性神經突(dystrophic neurite，DN)，其對TDP-43以及泛素和p62具有免疫反應性，但對其他神經退行性疾病相關蛋白呈陰性。包涵體形態及其組織分佈的差異與特定突變和/或臨床表現相關。迄今為止，通過組織學分類描述了四種類型的TDP-43病理狀況(Mackenzie and Neumann,J.Neurochem.(2016)138(增刊1),54-70)。FTLD-TDP A型病例的特徵在於大量的短的營養不良性神經突(dystrophic neuritis，DN)和緊湊的橢圓形或新月形NCI，主要在新皮質II層(Mackenzie et al.,2016 J.Neurochem.138(增刊1),54-70，圖2f)。這種病理的情況通常在臨床上在行為變異型額顳葉失智症(bvFTD)或非流利性/語法變異型原發性進行性失語(nfvPPA)的情況下出現，並且與顆粒蛋白前體(GRN)突變相關。B型病例在淺表和深皮質層二者中均顯示出中等數目的緊湊或顆粒狀NCI，且具有相對較少的DN和NII(神經元核內包涵體(neuronal intranuclear inclusion)；Mackenzie et al.,2016 J.Neurochem.138(增刊1),54-70，圖2g)。發現大多數同時出現FTD和ALS症狀的病例具有FTLD-TDP B型病理。C型病例有大量長而彎曲的神經突，主要在淺表皮質層中，具有很少或沒有NCI(Mackenzie et al.,2016 J.Neurochem.138(增刊1),54-70，圖2j)。這種病理特別地在出現語義變異型原發性進行性失語(svPPA)的病例中發現。FTLD-TDP D型顯示在新皮質層中具有豐富的豆狀神經元核內包涵體(Neuronal Intranuclear Inclusion，NII)和短的DN，且具有僅稀少的NCI(Mackenzie et al.,2016 J.Neurochem.138(增刊1),54-70，圖2k)。E型的特徵在於：除白質中的曲線性少突膠質細胞包涵體之外還有顆粒絲狀神經元包涵體(Granulofilamentous Neuronal Inclusion，GFNI)和非常細的點狀神經氈聚集體，其影響所有新皮質層(Edward B.Lee et al.,Acta Neuropathol.2017 July；134(1)：65-78.)。這種病理模式僅在VCP與包涵體肌炎相關的病例中發現。
III. FTD中的TDP-43
額顳葉失智症(FTD)是一個臨床術語，其涵蓋基於額和顳葉的變性-稱為額顳葉變性(FTLD)的病理性特徵的廣譜障礙。FTD是65歲以下年齡組中早期退行性癡呆的第二大最主要原因(Le Ber,Revue Neurologique 169(2013)811-819)。FTD表現為數種綜合症，包括以人格和行為變化為特徵的bvFTD；以語言功能變化為特徵的語義癡呆(semantic dementia，SD)和進行性非流利性失語(Progressive Nonfluent Aphasia，PNFA)；以運動功能障礙為特徵的皮質基底節綜合症(Corticobasal Syndrome，CBS)、進行性核上性麻痹綜合症和運動神經元疾病(FTD-MND)。這些綜合症的臨床診斷複雜並且最終結論只能通過進行死後組織病理學分析以檢測聚集的蛋白質並確定受影響的腦區域而得出。就病理性蛋白質包涵體而言，約45%的病例顯示出錯折疊Tau的病理性積累，45%的病例具有病理性TDP-43並且較小的亞組具有FUS和其他蛋白質的聚集體。
IV. ALS中的TDP-43
肌肉萎縮性脊髓側索硬化症(ALS)是一種神經退行性疾病，其特徵在於上和下運動神經元的過早喪失。ALS的進展以致命性麻痹和呼吸衰竭為特徵，其病程從診斷到死亡為1至5年。在大多數散發性ALS病例中，該神經病理的特徵在於初級運動皮質、腦幹運動核、脊髓和相關白質道的神經元和膠質細胞中TDP-43的異常細胞質積累。伴有癡呆的ALS涉及運動外新皮質和海馬中TDP-43的積累。TDP-43磷酸化在ALS患者中的作用已借助於抗體進行了探索，所述抗體與細胞核和細胞質包涵體中磷酸化TDP-43特異性結合，其中胺基酸S379、S403、S404、S409、S410為TDP-43磷酸化的主要位點(Hasegawa et al.,Ann Neurol 2008；64：60-70；Neumann et al.,Acta Neuropathol(2009)117：137-149)。
V. AD和其他疾病中的TDP-43
TDP-43病理狀況發生在多達57%的患有阿茲海默症的患者的腦中(Josephs KA et al.,Acta Neuropathol.2014；127(6)：811-824；Josephs KA et al.,Acta Neuropathol.2014；127(3)：441-450；McAleese et al.,Brain Pathol.2017 Jul；27(4)：472-479)。TDP-43聚集與患者的年齡相關，並且與AD中認知下降、記憶喪失和顳內側萎縮相關。顯然，在AD中，TDP-43代表與顳葉內側中β澱粉樣 蛋白和tau病理共有重疊腦分佈的第二或獨立的病理。病理性TDP-43遵循常規的進行性沉積模式，這種模式已通過所謂的AD中TDP-43(TAD)分期方案進行了描述：TDP-43首先在杏仁核中沉積(I期)，然後在海馬、邊緣、顳並且最終是額葉紋狀體(frontostriatum)(V期)中沉積(Josephs KA et al.,Acta Neuropathol.2014；127(6)：811-824；Josephs KA et al.,Acta Neuropathol.2014；127(3)：441-450)。
VI. TDP-43擴散
儘管ALS和FTD發作和初始症狀在患者間明顯不同，但疾病進展的共同特徵是病理從最初的病灶區域向大多數神經元擴散。症狀的持續惡化可通過TDP-43病理狀況的進行性擴散來解釋。ALS患者腦中的TDP-43病理狀況顯示以四階段過程擴散並且認為使用順行軸突運輸通過離皮質軸突透射經突觸發生傳播(Brettschneider et al.,Ann Neurol.2013 July；74(1)：20-38.)。最近的實驗證據支持β澱粉樣蛋白、Tau、α-突觸核蛋白和TDP-43通過朊病毒樣機制在神經元組織中進行蛋白質傳播的假設(Hasegawa et al.,2017)，其中起點和地形學擴散模式對於四種蛋白質是不同的(Brettschneider J et al.,Nature Rev.Neuroscience,2015,109)。認為常見的疾病統一機制是基於病理性蛋白質聚集體的細胞間擴散。該機制由以下組成：聚集體從病變細胞釋放，被幼稚細胞攝取，以及通過內源性蛋白質的範本化構象變化對病理性蛋白質構象進行播種(seed)。能夠誘導生理性(即非病理性TDP-43)聚集的病理性TDP-43被定義為具有播種能力的TDP-43。事實上，已經發現TDP-43錯折疊並聚集成種子(seed)，這些種子是具有引發從頭錯折疊的能力的繁殖媒介(propagating agent)。這種“類朊病毒”的範例被懷疑是疾病發展的關鍵因素之一。
TDP-43細胞間擴散已在分子水準上在少數體外模型中進行了研究，其中來自患者腦的不溶性TDP-43製備物能夠誘導接受體細胞中的細胞內聚集體形成(Nonaka et al.,Cell Reports 4(2013),124-134；Feiler et al.,2015；Porta et al.,Nat.Comm.,2018)。此外，已觀察到細胞內TDP-43聚集體在擴散至下一個細胞之前與外排體聯合釋放(Nonaka et al.,Cell Reports 4(2013,124-134))。類似地，腺病毒轉導的TDP-43表達導致磷酸化、泛素化且更重要地充當啟動細胞間擴散的種子的細胞質聚集體(Ishii et al.,PLoS ONE 12(6)：e0179375,2017)。患者來源的病理性TDP-43在顱內接種到轉基因小鼠和野生型小鼠之後可導致 內源性TDP-43廣泛沉積(Porta et al.,Nat.Comm.,2018)。
VII. TDP-43蛋白質病的預防和治療
TDP-43聚集和病理擴散是ALS和FTD-目前不可治癒的致命性疾病的主要標誌。因此，需要新的方法來治療和預防TDP-43蛋白質病。TDP-43中的突變與ALS和FTD的家族性病例相關，提供了TDP-43錯折疊與疾病進展之間的因果聯繫。
VIII. TDP-43蛋白質病的診斷
基於臨床表現的FTD診斷是不充分的，因為臨床表現可與其他疾病重疊，特別是在早期階段。
許多方法旨在開發生物化學生物標誌物來區分不同類型的FTD病理。針對TDP-43不同構象的抗體的開發可允許產生更加靈敏且特異性的診斷工具。與生物化學生物標誌物並行，成像生物標誌物的開發能夠實現TDP-43蛋白質病中病理的早期且特異性檢測。對腦中TDP-43沉積成像的能力可為TDP-43蛋白質病的診斷和藥物開發的重大成就。使用細胞可滲透的抗體片段可實現這樣的檢測。
基於不同蛋白質的錯折疊的神經退行性疾病中最早的事件是獲得使蛋白質有毒的替代構象。此外，這種錯折疊的構象可通過將內源性正常蛋白質募集到錯折疊的構象中而自傳播，作為觀察到的通過受影響組織擴散的機制基礎。
為了開發針對給定蛋白質的不同構象狀態的抗體，設計了超分子抗原性構建體，其中控制所呈遞抗原的構象以產生針對特定構象狀態下給定靶標的構象特異性抗體(WO2012/055933和WO2012/020124)。構象特異性抗體提供許多優勢，因為其可區分這些蛋白質的疾病相關構象與功能性內源性構象。該方法在治療應用中提供了許多優勢，因為這樣的抗體在靶向蛋白質的錯折疊疾病相關異形體的同時不太可能被其正常構象吸引。與此類似，在診斷應用中，這樣的抗體僅識別蛋白質的疾病相關結構狀態，這對於靈敏且特異性的診斷的開發至關重要。
基於TDP-43的生物標誌物在TDP-43蛋白質病中的應用仍有待建立。這樣的評價受到阻礙，部分是由於缺乏可用於合適免疫測定中用來對生物 流體中病理性TDP-43進行定量的高親和力抗體(Feneberg et al.,Molecular Neurobiology,2018)。
因此，明確需要能夠檢測，特別是在人樣品中檢測錯折疊的聚集TDP-43和非聚集生理性TDP-43的生物標誌物，用於診斷不同類型的TDP-43蛋白質病和/或用於監測用於治療與TDP-43相關、特別是與TDP-43聚集體相關的疾病、障礙和異常、或TDP-43蛋白質病的治療藥物的效力。
TDP-43蛋白質病定義為一組以病理性TDP-43為特徵的神經退行性疾病。
IX. 現有技術
專利申請WO2008/151055公開了使用生物流體中TDP-43多肽和/或TDP-43多肽切割產物(例如25kD和35kD TDP-43多肽切割產物)的水準來確定哺乳動物是否患有神經退行性疾病的方法和材料。
專利申請WO2013/061163公開了TDP-43特異性結合分子，其包括多肽例如人抗體及其片段、衍生物和變體。
專利申請WO2020/234473公開了特異性結合分子，包括多肽，例如鼠抗體或其抗原結合片段。
給藥方案是藥物目標產品特性的關鍵要素之一。由於生物製劑的次優腦滲透，目前只有在重複施用抗體之後才能達到藥物暴露。為了確保抗體的期望藥理作用所需的有效藥物分佈，合適的藥代動力學譜對於其體內治療應用至關重要。對於一些抗體，優化藥代動力學參數，例如清除率和/或分佈體積，可以使體內的藥物暴露最大化。
抗體通過其Fc結構域與新生Fc受體(FcRn)的相互作用而再循環。通過蛋白質工程可以提高對FcRn的親和力，將其並轉化為改善的再循環譜和更長的抗體半衰期。已經描述了數個突變組，例如YTE(Dall’ Acqua et al.journal of immunology,2002,69：5171-5180)或LS(Zalevsky,J et al,Nat Biotechnol 28(2)：157-9,2010)突變，其導致體內藥代動力學譜的改善。在一些情況下，高pI和正電荷斑塊已顯示出對抗體清除有負面影響(Igawa et al,PEDS.2010；vol.23 no.5 pp.385-392,Bumbaca et al,JBC,VOL.290,NO.50,pp.29732-29741,2015)。
由於目前市場上沒有TDP-43抗體治療，因此需要具有用於體內治療應用的適合的藥代動力學參數的抗TDP-43抗體。不希望受任何特定理論的束縛，認為本發明的結合分子，特別是人源化抗體或其抗原結合片段，包含人源化受體框架，其導致用於體內治療應用的最佳半衰期。本文顯示本發明的結合分子(尤其是hACI-7069-633B12-Ab1_H33L27和hACI-7069-633B12-Ab1_H32L27)提供了有益的藥物動力學和藥效學特性。參見本文的實施例5-14以及表9、10和11。本發明的結合分子顯示出用於治療用途的合適的半衰期和清除值。
存在對結合錯折疊的聚集TDP-43和非聚集的生理性TDP-43、具有用於體內治療應用的適合的藥代動力學參數的人源化抗TDP-43結合分子的需求。這樣的人源化結合分子、特別是抗體及其抗原結合片段可與人TDP-43(SEQ ID NO：1)的特定表位結合。此外，開發可區分FTD譜內病理狀況類型的敏感和特異性生物標誌物是一項緊迫的任務。
本文中提供的一些實施方案解決了該技術問題。
本發明的結合分子是鼠抗體的人源化形式，特別地，它們是與人TDP-43(SEQ ID NO：1)結合的鼠單克隆抗體的人源化形式。選擇本文中稱為ACI-7069-633B12-Ab1的抗體來開發人源化結合分子。如本文中所述，該抗體源自雜交瘤克隆633B12C8。它與人TDP-43(SEQ ID NO：1)的第397至411位胺基酸內的表位結合。更特別地，它與來自人TDP-43(SEQ ID NO：1)的第400至405位胺基酸的表位結合。該抗體具有SEQ ID NO：28中所示的VH核苷酸序列和SEQ ID NO：29中所示的VL核苷酸序列(由其編碼)，參見WO2020/234473的表10。該抗體具有SEQ ID NO：20中所示的VH胺基酸序列和SEQ ID NO：24中所示的VL胺基酸序列，參見WO2020/234473的表11。該抗體具有SEQ ID NO：21中所示的VH CDR1胺基酸序列、SEQ ID NO：22中所示的VH CDR2胺基酸序列和ES的VH CDR3胺基酸序列，參見WO2020/234473的表11。該抗體具有SEQ ID NO：25中所示的VL CDR1胺基酸序列、SEQ ID NO：16中所示的VL CDR2胺基酸序列和SEQ ID NO：27中所示的VL CDR3胺基酸序列，參見WO2020/234473的表11。
所選擇的CDR序列可在特定位置處發生突變。在一些實施方案 中，進行這樣的突變以避免潛在的翻譯後修飾位點。在一些具體的實施方案中，以下殘基中的一個或更多個、直至所有在VH區(CDRH2)中發生突變：N53、N54和G55。一些具體突變包括：N53G、N53S、N53Q、N54Q、N54G和G55A。殘基根據Kabat進行編號。在一些具體的實施方案中，以下殘基中的一個或更多個、直至所有在VL區(CDRL1和/或CDRL2和/或CDRL3)中發生突變：K24、D28、G29、D55、S56和W89。殘基根據Kabat進行編號。一些具體突變包括：K24R、D28E、D28G、G29A、D55E、S56A、W89Y、W89F和W89L。
在一些具體的實施方案中，本發明的人源化結合分子、特別是人源化抗體或其抗原結合片段包含人重鏈可變結構域亞家族1框架序列。更特別地，本發明的人源化結合分子、特別是人源化抗體或其抗原結合片段可包含IGHV1-69-2(IMGT登錄號KF698734、Z29977、Z12305；UniProtKB A0A0G2JMI3)、IGHV1-3(IMGT登錄號X62109、X62107、MK540645、MH779622和MN337616；UniProtKB-A0A0C4DH29)、IGHV1-2(IMGT登錄號X07448、X62106、X92208、KF698733、HM855674、MH267285和MN337615；UniProtKB-P23083)、IGHV1-46(IMGT登錄號X92343、J00240、L06612和MK540650；UniProtKB-P01743)、IGHV1-24(IMGT登錄號M99642；UniProtKB-A0A0C4DH33)、IGHV5-51(IMGT登錄號M99686、M18806、X56368、X56367、Z27449、MK321694、IMGT000055；UniProtKB A0A0C4DH38)或IGHV3-43(IMGT登錄號M99672、HM855392；UniProtKB A0A0B4J1X8)VH框架序列，優選IGHV1-69-2 VH框架序列。
在一些具體的實施方案中，本發明的人源化結合分子、特別是人源化抗體或其抗原結合片段包含人輕鏈可變結構域κ亞家族2框架序列。更特別地，本發明的人源化結合分子、特別是人源化抗體或其抗原結合片段可包含IGKV2-30(IMGT登錄號X63403和FM164408；UniProtKB-P06310)、IGKV2-29(IMGT登錄號X63396、U41645和AJ783437；UniProtKB-A2NJV5)、IGKV2D-29(IMGT登錄號M31952和U41644；UniProtKB-A0A075B6S2)、IGKV2-28(IMGT登錄號X63397；UniProtKB-A0A075B6P5)、IGKV2-24(IMGT登錄號X12684；UniProtKB-A0A0C4DH68)、IGKV2D-28(IMGT登錄號X12691；UniProtKB-P01615)、IGKV2-40(IMGT登錄號X59314和X59317；UniProtKB -A0A087WW87)、IGKV2D-40(IMGT登錄號X59311；UniProtKB-P01614)或IGKV4-1(IMGT登錄號Z00023和MW316673；UniProtKB-P06312)VL框架序列，優選IGKV2-40、IGKV2D-40、IGKV2D-28、IGKV4-1或IGKV2-28 VL框架序列，最優選IGKV2-28(IMGT登錄號X63397；UniProtKB-A0A075B6P5)VL框架序列。
在一個實施方案中，本發明的人源化結合分子，特別是本發明的人源化抗體或其抗原結合片段包含IGHV1-69-2和IGKV2-28框架序列。
所選擇的框架序列可在特定位置處發生突變。在一些實施方案中，進行這樣的突變以積極影響CDR環構象和/或VH和VL結構域之間的可變結構域堆積(packing)。在某些實施方案中，下表2中所列的根據Kabat編號的殘基中的一個或更多個、直至所有發生突變。在一些具體的實施方案中，進行了根據Kabat編號的以下VH突變中的一個或更多個、直至所有：V24T、Y27F、M48I、Q64K、A71V、T73K、T94R。在一些具體實施方案中，進行了以下VL突變(根據Kabat編號)中的一個或更多個、直至所有：I2V、Y36L、Q45K、L46R、G57R。在一些具體的實施方案中，進行了以下VH突變中的一個或更多個、直至所有：V24T、Y27F、M48I、Q64K、A71V、T73K、T94R，以及以下VL突變中的一個或更多個、直至所有：I2V、Y36L、Q45K、L46R、G57R，所有都根據Kabat編號。
因此，本發明涉及特異性識別錯折疊的聚集TDP-43和非聚集生理性TDP-43的人源化結合分子、特別是人源化抗體或其抗原結合片段。在本發明中，錯折疊的TDP-43包括錯折疊的單體TDP-43和/或錯折疊的寡聚TDP-43和/或錯折疊的聚集和/或經翻譯後修飾的TDP-43和/或錯折疊的截短TDP-43。經翻譯後修飾的TDP-43包含磷酸化、泛素化、乙醯化、類泛素化和/或甲基化的TDP-43。生理性TDP-43包括可溶性細胞核TDP-43。本文中表明，本發明的人源化結合分子能夠結合病理性TDP-43，包括TDP-43聚集體和磷酸化TDP-43。因此，本發明提供了特異性識別錯折疊的聚集TDP-43和非聚集生理性TDP-43的人源化結合分子、特別是人源化抗體或其抗原結合片段。這樣的結合分子在本文中稱為人源化“泛-TDP-43”結合分子、特別是人源化泛-TDP-43抗體。如本文中說明的，本發明的人源化TDP-43結合分子可同等地結合錯折疊的聚集TDP- 43和非聚集生理性TDP-43，或者在與兩種類型的TDP-43特異性結合時相對於一者優先與另一者結合。本發明還提供了用於預防、減輕、治療和/或診斷與TDP-43相關、特別是與TDP-43聚集體相關的疾病、障礙和異常、或TDP-43蛋白質病的人源化結合分子、特別是人源化抗體或其抗原結合片段。本發明還提供了用於檢測和/或瞭解(即鑒定)引起神經變性的特定病理類型的人源化結合分子、特別是人源化抗體或其抗原結合片段。設想了用作診斷性生物標誌物，實現臨床研究中縱向監測的更有效且精確的對象選擇，支援TDP-43蛋白質病的新治療的開發的用途。
本發明還提供了作為藥物(治療劑)的人源化TDP-43結合分子、特別是人源化抗體或其抗原結合片段。
不希望受理論束縛，本發明是基於以下假設而開發的：來源於TDP-43蛋白的經修飾構象特異性抗原性肽和肽片段或整個TDP-43蛋白以及可通過或通過使用所述肽或片段或整個TDP-43蛋白作為抗原而獲得的人源化抗體阻斷TDP-43細胞間傳播，和/或使TDP-43聚集體解聚和/或阻斷TDP-43播種和/或中和具有播種能力的TDP-43和/或抑制TDP-43蛋白或其片段的聚集和/或增強TDP-43清除。本發明的人源化結合分子、特別是人源化多肽、更特別是人源化抗體或其抗原結合片段，與錯折疊的聚集TDP-43，特別是與細胞質錯折疊TDP-43和胞外錯折疊TDP-43結合。本發明的人源化結合分子、特別是人源化多肽、更特別是人源化抗體或其抗原結合片段，與全長TDP-43和/或截短的TDP-43結合。在一個實施方案中，本發明的人源化結合分子、特別是人源化多肽、更特別是人源化抗體或其抗原結合片段，與細胞質錯折疊TDP-43特異性結合。在一個實施方案中，本發明的人源化TDP-43結合分子，特別是人源化抗體或其抗原結合片段，結合並中和具有播種能力的TDP-43。在一個實施方案中，本發明的人源化TDP-43結合分子，特別是人源化抗體或其抗原結合片段，結合胞外和/或聚集的TDP-43，並通過抗體依賴性細胞吞噬作用(Antibody Dependent Cellular Phagocytosis，ADCP)增強免疫細胞如小膠質細胞對其的清除。
錯折疊的聚集TDP-43或病理相關TDP-43由失去其正常折疊(即是錯折疊的)和定位的TDP-43蛋白構成。錯折疊的聚集TDP-43可在以下中發現：前包涵體(preinclusion)，以及神經元胞質包涵體和膠質細胞胞質包涵體(分 別為NCI和GCI)、神經元核內包涵體(NII)和營養不良性神經突(DN)，其對TDP-43具有免疫反應性。
非聚集生理性TDP-43是主要位於細胞核並穿梭至細胞質，處於能夠在體內細胞環境中展示其期望功能的狀態的生理功能性TDP-43蛋白。
本發明的人源化TDP-43結合分子、特別是人源化抗TDP-43抗體或其抗原結合片段，出乎意料地具有以下特徵中的至少一個，優選兩個，更優選三個，甚至更優選四個，還更優選五個，還甚至更優選六個，最優選全部七個：- 阻斷TDP-43細胞間傳播；- 使TDP-43聚集體解聚；- 抑制TDP-43蛋白或其片段的聚集；- 阻斷TDP-43播種；- 中和具有播種能力的TDP-43；- 阻斷TDP-43擴散；以及- 增強TDP-43清除。
獨立於一個、兩個、三個、四個、五個、六個或七個上述列舉特徵的組合，本發明的人源化抗TDP-43結合分子，優選人源化抗TDP-43抗體或其抗原結合片段，可改善/抑制/降低TDP-43蛋白質病體內模型中並且更重要地患有TDP-43病理狀況的患者中TDP-43病理狀況的形成。
人源化抗TDP-43結合分子與人TDP-43(SEQ ID NO：1)的第397至411位胺基酸內的區域結合，更特別地，人源化TDP-43結合分子與人TDP-43(SEQ ID NO：1)第400至405位胺基酸殘基內的表位結合。
根據本發明，提供了人源化TDP-43結合分子，特別是人源化TDP-43抗體或其抗原結合片段，其包含：a. VH-CDR1，其包含SEQ ID NO：21的胺基酸序列；b. VH-CDR2，其選自SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：92、SEQ ID NO：102、SEQ ID NO：112或SEQ ID NO：122的胺基酸序列；c. VH-CDR3，其包含胺基酸序列ES(Glu-Ser)；d. VL-CDR1，其選自SEQ ID NO：25或SEQ ID NO：85的胺基酸序列；e. VL-CDR2，其選自SEQ ID NO：16的胺基酸序列； f. VL-CDR3，其選自SEQ ID NO：27或SEQ ID NO：87的胺基酸序列；和g. 重鏈可變結構域(VH)的受體框架，其選自IGHV1-69-2、IGHV5-51或IGHV3-43，優選IGHV1-69-2；和/或者h. 輕鏈可變結構域(VL)的受體框架，其選自IGKV2-28、IGKV2-24、IGKV2D-28、IGKV2-40、IGKV2D-40或IGKV4-1，優選IGKV2-28。
在一些優選的實施方案中，人源化TDP-43結合分子：包含VH的受體框架，所述VH的受體框架包含以下VH突變中的一個或更多個、以及優選所有：a. V24T；b. M48I；c. A71V；d. T73K；和e. T94R；和/或者包含VL的受體框架，所述VL的受體框架包含以下VL突變中的一個或更多個：f. I2V；g. Y36L；h. Q45K；i. L46R；和j. G57R(根據Kabat編號)。
在一些優選的實施方案中，人源化TDP-43結合分子：包含VH的受體框架，所述VH的受體框架包含以下VH突變中的一個或更多個、以及優選所有：a. V24T；b. Y27F c. M48I；d. A71V；e. T73K；和f. T94R；和/或者包含VL的受體框架，所述VL的受體框架包含以下VL突變中的一個或更多個： g. I2V；h. Y36L；i. Q45K；j. L46R；和k. G57R(根據Kabat編號)。
在一些更優選的實施方案中，人源化TDP-43結合分子：包含VH的受體框架，所述VH的受體框架包含所有以下VH突變：a. V24T；b. M48I；c. A71V；d. T73K；和e. T94R；和/或者包含VL的受體框架，所述VL的受體框架包含以下VL突變中的一個或更多個、優選全部：f. Y36L；g. L46R；和h. G57R(根據Kabat編號)。
在一些更優選的實施方案中，人源化TDP-43結合分子：包含VH的受體框架，所述VH的受體框架包含所有以下VH突變：a. V24T；b. Y27F c. M48I；d. A71V；e. T73K；和f. T94R；和/或者包含VL的受體框架，所述VL的受體框架包含以下VL突變中的一個或更多個、優選全部：i. Y36L；j. L46R；和k. G57R(根據Kabat編號)。
在一個優選的實施方案中，人源化TDP-43結合分子：包含VH 的受體框架，所述VH的受體框架包含所有以下VH突變：a. V24T；b. M48I；c. A71V；d. T73K；和e. T94R；以及包含VL的受體框架，所述VL的受體框架包含以下VL突變中的一個或更多個、優選全部：f. Y36L；g. L46R；和h. G57R(根據Kabat編號)。
在一個優選的實施方案中，人源化TDP-43結合分子：包含VH的受體框架，所述VH的受體框架包含所有以下VH突變：a. V24T；b. Y27F c. M48I；d. A71V；e. T73K；和f. T94R；以及包含VL的受體框架，所述VL的受體框架包含所有以下VL突變：i. Y36L；j. L46R；和k. G57R(根據Kabat編號)。
人源化TDP-43結合分子，特別是人源化TDP-43抗體或其抗原結合片段，可以包含：a. VH-CDR1，其包含SEQ ID NO：21的胺基酸序列；b. VH-CDR2，其選自SEQ ID NO：112、SEQ ID NO：122或SEQ ID NO：102的胺基酸序列；c. VH-CDR3，其包含胺基酸序列ES(Glu-Ser)；d. VL-CDR1，其選自SEQ ID NO：25或SEQ ID NO：85的胺基酸序列； e. VL-CDR2，其選自SEQ ID NO：16的胺基酸序列；和f. VL-CDR3，其選自SEQ ID NO：27或SEQ ID NO：87的胺基酸序列。
在一些優選的實施方案中，人源化TDP-43結合分子，特別是人源化TDP-43抗體或其抗原結合片段，包含：a. VH-CDR1，其包含SEQ ID NO：21的胺基酸序列；b. VH-CDR2，其選自SEQ ID NO：112或SEQ ID NO：122的胺基酸序列；c. VH-CDR3，其包含胺基酸序列ES(Glu-Ser)；d. VL-CDR1，其選自SEQ ID NO：25或SEQ ID NO：85的胺基酸序列；e. VL-CDR2，其選自SEQ ID NO：16的胺基酸序列；和f. VL-CDR3，其選自SEQ ID NO：27或SEQ ID NO：87的胺基酸序列。
在一些實施方案中，本發明的人源化TDP-43結合分子包含：- 包含SEQ ID NO：21的胺基酸序列的VH-CDR1、包含SEQ ID NO：22的胺基酸序列的VH-CDR2和包含胺基酸序列ES(Glu-Ser)的VH-CDR3；以及包含SEQ ID NO：25的胺基酸序列的VL-CDR1、包含SEQ ID NO：16的胺基酸序列的VL-CDR2和包含SEQ ID NO：27的胺基酸序列的VL-CDR3；或者- 包含SEQ ID NO：21的胺基酸序列的VH-CDR1、包含SEQ ID NO：112的胺基酸序列的VH-CDR2和包含胺基酸序列ES(Glu-Ser)的VH-CDR3；以及包含SEQ ID NO：25的胺基酸序列的VL-CDR1、包含SEQ ID NO：16的胺基酸序列的VL-CDR2和包含SEQ ID NO：27的胺基酸序列的VL-CDR3；- 包含SEQ ID NO：21的胺基酸序列的VH-CDR1、包含SEQ ID NO：112的胺基酸序列的VH-CDR2和包含胺基酸序列ES(Glu-Ser)的VH-CDR3；以及包含SEQ ID NO：85的胺基酸序列的VL-CDR1、包含SEQ ID NO：16的胺基酸序列的VL-CDR2和包含SEQ ID NO：87的胺基酸序列的VL-CDR3；- 包含SEQ ID NO：21的胺基酸序列的VH-CDR1、包含SEQ ID NO：122的胺基酸序列的VH-CDR2和包含胺基酸序列ES(Glu-Ser)的VH-CDR3；以及包含SEQ ID NO：25的胺基酸序列的VL-CDR1、包含SEQ ID NO：16的胺基酸序列的VL-CDR2和包含SEQ ID NO：27的胺基酸序列的VL-CDR3；- 包含SEQ ID NO：21的胺基酸序列的VH-CDR1、包含SEQ ID NO：122的胺基酸序列的VH-CDR2和包含胺基酸序列ES(Glu-Ser)的VH-CDR3；以及 包含SEQ ID NO：85的胺基酸序列的VL-CDR1、包含SEQ ID NO：16的胺基酸序列的VL-CDR2和包含SEQ ID NO：87的胺基酸序列的VL-CDR3；- 包含SEQ ID NO：21的胺基酸序列的VH-CDR1、包含SEQ ID NO：112的胺基酸序列的VH-CDR2和包含胺基酸序列ES(Glu-Ser)的VH-CDR3；以及包含SEQ ID NO：25的胺基酸序列的VL-CDR1、包含SEQ ID NO：16的胺基酸序列的VL-CDR2和包含SEQ ID NO：87的胺基酸序列的VL-CDR3；- 包含SEQ ID NO：21的胺基酸序列的VH-CDR1、包含SEQ ID NO：122的胺基酸序列的VH-CDR2和包含胺基酸序列ES(Glu-Ser)的VH-CDR3；以及包含SEQ ID NO：25的胺基酸序列的VL-CDR1、包含SEQ ID NO：16的胺基酸序列的VL-CDR2和包含SEQ ID NO：87的胺基酸序列的VL-CDR3。
本發明尤其另外涉及：(i)包含人源化TDP-43結合分子的免疫綴合物，(ii)包含人源化TDP-43結合分子的經標記抗體，(iii)包含人源化TDP-43結合分子和可藥用載體和/或賦形劑和/或稀釋劑的藥物組合物，(iv)人源化TDP-43結合分子，其用於人用或獸用藥物用途，(v)人源化TDP-43結合分子，其用於預防、減輕、治療與TDP-43相關的疾病、障礙和/或異常、或TDP-43蛋白質病，(vi)人源化TDP-43結合分子，其用於診斷用途(特別是用於體內診斷，但也用於體外測試)，(vii)人源化TDP-43結合分子，其用於研究用途，特別是作為分析工具或參考分子，(viii)人源化TDP-43結合分子，其用作監測與TDP-43相關的疾病、障礙和/或異常、或TDP-43蛋白質病的診斷工具，(ix)通過用人源化TDP-43結合分子治療患有與TDP-43相關的疾病、障礙和/或異常、或TDP-43蛋白質病的個體來在所述個體中保持或提高認知記憶能力或減緩記憶喪失的方法，(x)通過用人源化TDP-43結合分子治療所述個體來降低個體中聚集TDP-43和/或磷酸化TDP-43水準的方法，(xi)編碼人源化TDP-43結合分子的核酸分子，(xii)包含本發明核酸分子的重組表達載體，(xiii)包含本發明核酸和/或載體的宿主細胞，(xiv)包含本發明重組表達載體的無細胞表達系統，(xv)用於產生人源化TDP-43結合分子的方法，(xvi)使用人源化TDP-43結合分子對從對象獲得的樣品中的TDP-43進行定量的方法，以及(xvii)包含本發明的人源化TDP-43結合分子和/或核酸、表達載體、宿主細胞和/或用於產生它們的無細胞表達系統的試劑盒。
本發明的人源化TDP-43結合分子、特別是人源化抗TDP-43抗體或其抗原結合片段，可募集和/或啟動小膠質細胞。更特別地，本發明的人源化TDP-43結合分子可在細胞尺寸和活化狀態方面影響小膠質細胞形態。這可有助於由本發明的TDP-43結合分子表明的TDP-43病理狀況降低。
在本發明中，人源化結合分子、特別是人源化抗體或其抗原結合片段，特異性識別TDP-43。本發明的人源化結合分子包括對TDP-43蛋白具有特異性的人源化多肽和/或人源化抗體和/或其抗原結合片段。“特異性識別TDP-43”意指，與其他表位相比，本發明的人源化結合分子特異性地、一般地且共同地以更大的親和力與TDP-43，特別是TDP-43中的一些表位，特別是TDP-43蛋白的以一種或更多種病理性構象暴露/可及的表位結合。本發明的與TDP-43特異性結合的人源化結合分子、特別是人源化多肽，更特別是人源化抗體或其抗原結合片段，特異性識別錯折疊的聚集TDP-43和非聚集生理性TDP-43。
本發明的人源化TDP-43結合分子，特別是人源化抗體或其抗原結合片段，與非聚集生理性TDP-43和聚集TDP-43二者結合。因此，本發明的人源化TDP-43結合分子，特別是人源化抗體或其抗原結合片段，可與可溶性TDP-43和聚集TDP-43大致同等良好地結合。本發明的人源化TDP-43結合分子，特別是人源化抗體或其抗原結合片段，與非聚集TDP-43相比，可與聚集TDP-43大致同等地結合。更具體地，本發明的人源化TDP-43結合分子，特別是人源化抗體或其抗原結合片段，與細胞核中的非聚集TDP-43相比，可與細胞質中的聚集TDP-43大致同等地結合。在另一些實施方案中，當與兩種類型的TDP-43結合時，本發明的人源化TDP-43結合分子，特別是人源化抗體或其抗原結合片段，與非聚集TDP-43相比，可優先與聚集TDP-43結合。更具體地，當與兩種類型的TDP-43結合時，本發明的人源化TDP-43結合分子，特別是人源化抗體或其抗原結合片段，與細胞核中的非聚集TDP-43相比，可優先與細胞質中的聚集TDP-43結合。或者，在另一些實施方案中，當與兩種類型的TDP-43結合時，本發明的人源化TDP-43結合分子，特別是人源化抗體或其抗原結合片段，與聚集TDP-43相比，可優先與非聚集TDP-43結合。更特別地，當與兩種類型的TDP-43結合時，本發明的人源化TDP-43結合分子，特別是人源化抗體或其抗原結合片段，與細胞質中聚集TDP-43相比，可優先與細胞核中的非 聚集TDP-43結合。這些結合特性可例如使用免疫組織化學來證明。
在一些實施方案中，本發明涵蓋特異性結合TDP-43的本文中所述的本發明的人源化結合分子、特別是人源化抗體及其抗原結合片段，以及這些人源化結合分子診斷、預防、減輕和/或治療與TDP-43相關、特別是與TDP-43聚集體相關的疾病、障礙和/或異常、或TDP-43蛋白質病的用途，所述疾病、障礙和/或異常、或TDP-43蛋白質病包括但不限於：額顳葉失智症(FTD)、肌肉萎縮性脊髓側索硬化症(ALS)、阿茲海默症(AD)、帕金森病(PD)、慢性創傷性腦病(CTE)和邊緣為主的年齡相關性TDP-43腦病(LATE)。本文中公開的方法和組合物可應用於診斷、預防、減輕和/或治療與TDP-43相關、特別是與TDP-43聚集體相關的疾病、障礙和/或異常、或TDP-43蛋白質病，包括但不限於額顳葉失智症(FTD)、肌肉萎縮性脊髓側索硬化症(ALS)。優選地，這些人源化結合分子診斷、預防、減輕和/或治療與TDP-43相關、特別是與TDP-43聚集體相關的疾病、障礙和/或異常、或TDP-43蛋白質病的用途針對肌肉萎縮性脊髓側索硬化症(ALS)、阿茲海默症(AD)或額顳葉失智症(FTD)。更優選地，該用途針對肌肉萎縮性脊髓側索硬化症(ALS)。更優選地，該用途針對阿茲海默症(AD)。更優選地，該用途針對額顳葉失智症(FTD)。
在另一個實施方案中，使對TDP-43具有特異性的本文中所述的本發明的人源化TDP-43結合分子、特別是人源化抗TDP-43抗體或其抗原結合片段與樣品接觸以檢測、診斷和/或監測與TDP-43相關、特別是與TDP-43聚集體相關的疾病、障礙和/或異常、或TDP-43蛋白質病，其選自額顳葉失智症(FTD，例如散發性或家族性、伴有或不伴有運動神經元病(MND)、有顆粒蛋白前體(GRN)突變、有C9orf72突變、有TARDBP突變、有含纈酪肽蛋白(VCP)突變、與9p染色體連鎖、皮質基底節變性、有泛素陽性TDP-43包涵體的額顳葉變性(FTLD)(FTLD-TDP)、嗜銀顆粒病、皮克病、語義變異型原發性進行性失語(svPPA)、行為變異型FTD(bvFTD)、非流利性變異型原發性進行性失語(nfvPPA)，等)、肌肉萎縮性脊髓側索硬化症(ALS，例如散發性ALS、有TARDBP突變、有血管生成蛋白(ANG)突變)、亞歷山大病(AxD)、邊緣為主的年齡相關性TDP-43腦病(LATE)、慢性創傷性腦病(CTE)、佩里綜合症、阿茲海默症(AD，包括散發性和家族性形式的AD)、唐氏綜合症、家族性英國型 癡呆、多聚谷氨醯胺病(亨廷頓病和脊髓小腦共濟失調3型(SCA3；也稱為馬-約病))、海馬硬化性癡呆和肌病(散發性包涵體肌炎、包涵體肌病，有含纈酪肽蛋白((VCP)突變；以及佩吉特骨病和額顳葉失智症)、有鑲邊空泡的眼咽肌營養不良、有肌收縮蛋白(MYOT)基因突變或編碼結蛋白(DES)之基因的突變的肌原纖維肌病、創傷性腦損傷(TBI)、路易體失智症(Dementia with Lewy Bodies，DLB)或帕金森病(PD)。
在一個實施方案中，本發明涵蓋特異性結合TDP-43的本文中所述的本發明的人源化結合分子、特別是人源化抗體或其抗原結合片段，以及這些人源化結合分子，特別是這些人源化抗體檢測樣品中TDP-43的存在的用途。因此，本發明的人源化TDP-43結合分子，例如本文中所述的人源化抗TDP43抗體可特別用於針對樣品中TDP-43的存在篩選臨床樣品，特別是人血液、腦脊液(Cerebro-spinal Fluid，CSF)、組織間液(Interstitial Fluid，ISF)和/或尿，例如，通過使用基於ELISA的測定或表面適應測定進行。在一些情況下，可使用組織樣品，例如腦組織樣品。本發明的方法和組合物還可應用於診斷症狀前疾病和/或監測疾病進展和/或治療效力。根據一些實施方案，使對TDP-43具有特異性的人源化抗體(例如，全長人源化抗體或人源化抗體的TDP-43結合片段或衍生物)與樣品(例如，血液、尿液、腦脊液(CSF)、組織間液(ISF)或腦組織)接觸以檢測、診斷和/或監測額顳葉失智症(FTD，例如散發性或家族性、伴有或不伴有運動神經元病(MND)、有顆粒蛋白前體(GRN)突變、有C9orf72突變、有TARDBP突變、有含纈酪肽蛋白(VCP)突變、與9p染色體連鎖、皮質基底節變性、有泛素陽性TDP-43包涵體的額顳葉變性(FTLD)(FTLD-TDP)、嗜銀顆粒病、皮克病、語義變異型原發性進行性失語(svPPA)、行為變異型FTD(bvFTD)、非流利性變異型原發性進行性失語(nfvPPA)，等)、肌肉萎縮性脊髓側索硬化症(ALS，例如散發性ALS、有TARDBP突變、有血管生成蛋白(ANG)突變)、亞歷山大病(AxD)、邊緣為主的年齡相關性TDP-43腦病(LATE)、慢性創傷性腦病(CTE)、佩里綜合症、阿茲海默症(AD，包括散發性和家族性形式的AD)、唐氏綜合症、家族性英國型癡呆、多聚谷氨醯胺病(亨廷頓病和脊髓小腦共濟失調3型(SCA3；也稱為馬-約病))、海馬硬化性癡呆和肌病(散發性包涵體肌炎、包涵體肌病，有含纈酪肽蛋白(VCP)突變；以及佩吉特骨病和 額顳葉失智症)、有鑲邊空泡的眼咽肌營養不良、有肌收縮蛋白(MYOT)基因突變或編碼結蛋白(DES)之基因的突變的肌原纖維肌病、創傷性腦損傷(TBI)、路易體失智症(DLB)或帕金森病(PD)。本發明的人源化TDP-43結合分子可用於對合適樣品，特別是臨床樣品，例如血液、腦組織、CSF、ISF或尿中的TDP-43進行定量，其中與合適的對照相比，相對高的TDP-43水準指示患病和/或患有較晚期的疾病。許多合適的免疫測定形式是已知的。因此，可出於診斷目的進行該方法(例如ELISA、MSD(中尺度發現(Meso Scale Discovery))、HTRF(均相時間分辨螢光(Homogeneous Time Resolved Fluorescence))和AlphaLISA)，其中高TDP-43水準指示患病。或者，可出於監測目的進行該方法。隨時間提高的水準可指示疾病進展。隨時間降低的水準可指示疾病消退。該方法還可用於監測治療，特別是監測特定治療的效力。成功的治療可參考治療之後穩定或下降的TDP-43水準來測量。在WO2020/234473的實施例12中表明，來自TDP-43蛋白質病患者的CSF樣品中的TDP-43水準高於取自健康對象(健康對照)的對照樣品中的。對照樣品可以或可以不與受試樣品並行運行。在一些實施方案中，對照水準是在類似或相同的實驗條件下由取自健康對象的一系列對照樣品確定的，並且用作在受試樣品中確定的水準的比較水準。使用本發明的人源化結合分子對合適樣品中TDP-43進行定量的方法也可用於選擇治療(用於對象的另外的治療)。因此，設想了個性化治療方法。在治療之前和之後取樣。如果使用該治療的治療導致在治療之後穩定或優選降低的TDP-43水準，則可為該對象選擇該治療。如果該治療在治療之後不導致穩定或優選降低的TDP-43水準，則不為對象選擇該治療。該治療可以是用於治療TDP-43蛋白質病的任何合適的候選治療劑。在一些優選實施方案中，所述治療包含本發明的人源化TDP-43結合分子，通常以如本文中所述的藥物組合物的形式。
本發明的人源化TDP-43結合分子還可用於將疾病分類為特定類型或亞型。因此，提供了用於對與TDP-43相關、特別是與TDP-43聚集體相關的疾病、障礙和/或異常進行分類或用於對TDP-43蛋白質病進行分類的方法，其包括：a. 進行本發明的方法，其中與合適的對照相比較地對TDP-43的水準進行定量； b. 任選地鑒定來自對象的樣品中的突變，包括但不限於顆粒蛋白前體(GRN)突變、C9orf72突變、TARDBP突變、血管生成蛋白(ANG)突變、含纈酪肽蛋白(VCP)突變、肌收縮蛋白(MYOT)基因突變或編碼結蛋白(DES)之基因的突變；以及c. 對與TDP-43相關、特別是與TDP-43聚集體相關的疾病、障礙和/或異常、或TDP-43蛋白質病進行分類。
類似地，提供了用於對與TDP-43相關、特別是與TDP-43聚集體相關的疾病、障礙和/或異常進行分類或用於對TDP-43蛋白質病進行分類的方法，其包括：進行本發明的方法，其中對從患有與TDP-43相關的疾病、障礙和/或異常、或TDP-43蛋白質病的對象獲得的樣品中的TDP-43的水準進行定量，其中將該水準與取自患有不同類型或亞型的與TDP-43相關、特別是與TDP-43聚集體相關的疾病、障礙和/或異常、或TDP-43蛋白質病的對象的對照樣品(即，針對目標類型或亞型確定一組代表性對照水準)進行比較；並基於比較結果對與TDP-43相關、特別是與TDP-43聚集體相關的疾病、障礙和/或異常、或TDP-43蛋白質病進行分類。因此，分類基於確定受試樣品與一個或更多個對照樣品之間的最接近的匹配。這些方法還可包括鑒定樣品中的突變，包括但不限於顆粒蛋白前體(GRN)突變、C9orf72突變、TADBP突變、血管生成蛋白(ANG)突變)、含纈酪肽蛋白(VCP)突變、肌收縮蛋白(MYOT)基因突變或編碼結蛋白(DES)的基因的突變，其中鑒定出的突變也用於對與TDP-43相關、特別是與TDP-43聚集體相關的疾病、障礙和/或異常、或TDP-43蛋白質病進行分類。為免生疑問，對樣品中突變的鑒定可通過任何合適的方法進行；例如，基於樣品內核酸分子的核酸測序。樣品可與其中測定TDP-43水準的樣品分開和不同，但來自同一對象。
在另一些實施方案中，本發明提供了用於預防、減輕和/或治療與TDP-43相關、特別是與TDP-43聚集體相關的疾病、障礙和/或異常、或TDP-43蛋白質病的方法。根據一個實施方案，本發明的方法包括向對象施用有效濃度的本文中所述的對TDP-43具有特異性的本發明的人源化結合分子、特別是人源化抗體(例如，全長抗體或抗體的TDP-43結合片段或衍生物)。在另一個實施方案中，本發明提供了用於預防、減輕和/或治療TDP-43蛋白質病的方法。根 據一些實施方案，施用對TDP-43具有特異性的本文中所述的人源化結合分子、特別是本發明的人源化抗體或其抗原結合片段，以治療、減輕和/或預防額顳變性(FTD)或肌肉萎縮性脊髓側索硬化症(ALS)。在另一個實施方案中，施用對TDP-43具有特異性的本文中所述的人源化結合分子、特別是本發明的人源化抗體或其抗原結合片段以預防、減輕和/或治療選自以下的神經退行性疾病：額顳葉失智症(FTD)、肌肉萎縮性脊髓側索硬化症(ALS)、阿茲海默症(AD，包括散發性和家族性形式的AD)、帕金森病(PD)、慢性創傷性腦病(CTE)、邊緣為主的年齡相關性TDP-43腦病(LATE)。
在另一個實施方案中，施用對TDP-43具有特異性的本文中所述的人源化結合分子、特別是本發明的人源化抗體或其抗原結合片段以預防、減輕和/或治療選自以下的疾病：額顳葉失智症(FTD，例如散發性或家族性、伴有或不伴有運動神經元病(MND)、有顆粒蛋白前體(GRN)突變、有C9orf72突變、有TARDBP突變、有含纈酪肽蛋白(VCP)突變、與9p染色體連鎖、皮質基底節變性、有泛素陽性TDP-43包涵體的額顳葉變性(FTLD)(FTLD-TDP)、嗜銀顆粒病、皮克病、語義變異型原發性進行性失語(svPPA)、行為變異型FTD(bvFTD)、非流利性變異型原發性進行性失語(nfvPPA)，等)、肌肉萎縮性脊髓側索硬化症(ALS，例如散發性ALS、有TARDBP突變、有血管生成蛋白(ANG)突變)、亞歷山大病(AxD)、邊緣為主的年齡相關性TDP-43腦病(LATE)、慢性創傷性腦病(CTE)、佩里綜合症、阿茲海默症(AD，包括散發性和家族性形式的AD)、唐氏綜合症、家族性英國型癡呆、多聚谷氨醯胺病(亨廷頓病和脊髓小腦共濟失調3型(SCA3；也稱為馬-約病))、海馬硬化性癡呆和肌病(散發性包涵體肌炎、包涵體肌病，有含纈酪肽蛋白((VCP)突變；以及佩吉特骨病和額顳葉失智症)、有鑲邊空泡的眼咽肌營養不良、有肌收縮蛋白(MYOT)基因突變或編碼結蛋白(DES)之基因的突變的肌原纖維肌病、創傷性腦損傷(TBI)、路易體失智症(DLB)或帕金森病(PD)。
X、定義
本文中使用的“抗原結合分子”是可與抗原、特別是TDP-43特異性或選擇性結合的任何分子。結合分子可包括或可以是抗體或其片段。抗TDP-43結合分子是在特定識別位點(表位)與TDP-43蛋白結合的分子，例如抗TDP-43抗體或其片段。即，本發明的抗原結合分子與SEQ ID NO：1的胺基酸序列中的表位結合。本文中提供的抗原結合分子、特別是抗體或其抗原結合片段，識別全長TDP-43。另一些抗TDP-43結合分子也可包括多價分子、多特異性分子(例如，雙抗體(diabody))、融合分子、適配體、親合體(avimer)或者其他天然存在或重組產生的分子。可用於本發明的舉例說明性抗原結合分子包括抗體樣分子。抗體樣分子是可通過與靶分子結合而發揮功能的分子(參見，例如，Current Opinion in Biotechnology 2006,17：653-658；Current Opinion in Biotechnology 2007,18：1-10；Current Opinion in Structural Biology 1997,7：463-469；Protein Science 2006,15：14-27)，並且包括例如DARPin(WO 2002/020565)、親和體(Affibody)(WO 1995/001937)、親合體(WO 2004/044011；WO 2005/040229)、Adnectin(WO 2002/032925)和fynomer(WO 2013/135588)。
本文中使用的術語“抗TDP-43抗體”和“與TDP-43結合的抗體”或簡稱為“抗體”是指以下抗體，其能夠以足夠的親和力結合TDP-43，使得該抗體可用作靶向TDP-43的診斷劑和/或治療劑。一般而言，術語“抗體”在本文中以最廣義使用，並且涵蓋多種抗體結構，包括但不限於單克隆抗體、多克隆抗體、多特異性抗體(例如，雙特異性或雙互補位抗體)、全人抗體和抗體片段，只要它們表現出所期望的抗原結合活性即可。在本發明內的抗體也可以是嵌合抗體、重組抗體、重組抗體的抗原結合片段、人源化抗體或者展示在噬菌體表面上或展示在嵌合抗原受體(Chimeric Antigen Receptor，CAR)T細胞表面上的抗體。
抗體的“抗原結合片段”或“其功能片段”是指不同於完整或全長抗體的包含完整或全長抗體的一部分並且結合(完全或部分地)與完整或全長抗體結合的抗原的分子。抗體片段的一些實例包括但不限於Fv、Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)2；雙抗體；線性抗體；單鏈抗體分子(例如scFv)；以及由抗體片段形成的多特異性抗體。抗原結合片段也可稱為“功能片段”，因為它們保留了它們所來源的原始抗體的結合功能。
“與蛋白質限定區域中表位結合的抗體”是要求該區域中存在一 個或更多個胺基酸以與蛋白質結合的抗體。
在某些實施方案中，“與蛋白質限定區域中表位結合的抗體”通過突變分析來鑒定，其中對該蛋白質的胺基酸進行突變，並且該抗體與所得經改變蛋白質(例如，包含該表位的經改變蛋白質)的結合確定為與未經改變蛋白質的結合的至少20%。在一些實施方案中，“與蛋白質限定區域中表位結合的抗體”通過突變分析來鑒定，其中對該蛋白質的胺基酸進行突變，並且該抗體與所得經改變蛋白質(例如，包含該表位的經改變蛋白質)的結合確定為與未經改變蛋白質的結合的至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%或至少90%。在某些實施方案中，抗體的結合通過FACS、WB或通過合適的結合測定例如ELISA來確定。
在本發明的上下文中使用的術語“與......結合”定義至少兩個“抗原相互作用位點”彼此的結合(相互作用)。根據本發明，術語“抗原相互作用位點”定義多肽的基序，即本發明的抗體或抗原結合片段的一部分，其顯示出與TDP-43抗原中的特定抗原或特定組特異性相互作用的能力。所述結合/相互作用也應理解為定義“特異性識別”。根據本發明，術語“特異性識別”意指抗體能夠與如本文中定義的TDP-43的至少兩個胺基酸特異性相互作用和/或結合，特別地與人TDP-43(SEQ ID NO：1)的第397至411位胺基酸殘基中的至少兩個胺基酸相互作用/結合，甚至更特別地與人TDP-43(SEQ ID NO：1)的第400至405位、第400至406位或第400至412位胺基酸殘基中的至少兩個胺基酸相互作用/結合。
術語“泛TDP-43抗體”是指與錯折疊的聚集TDP-43和非聚集生理性TDP-43，包括單體TDP-43、寡聚TDP-43、經翻譯後修飾的TDP-43(例如磷酸化、泛素化、乙醯化、類泛素化和/或甲基化)、聚集TDP-43和截短TDP-43結合的抗體。
根據本發明使用的術語“特異性相互作用”意指本發明的抗體或其抗原結合片段不與或基本上不與具有相似結構的(多)肽交叉反應。因此，本發明的抗體或其抗原結合片段與由人TDP-43(SEQ ID NO：1)的第397至411位胺基酸殘基中特定胺基酸序列形成的TDP-43結構特異性結合/相互作用，更特別地，與由人TDP-43(SEQ ID NO：1)的第400至405位、第400至406位 或第400至412位胺基酸殘基中特定胺基酸序列形成的TDP-43結構結合/相互作用。
正在研究的抗原結合分子、特別是抗體或其抗原結合片段的組的交叉反應性可例如通過以下來測試：評估在常規條件下(參見例如Harlow and Lane,Antibodies：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,(1988)和Using Antibodies：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,(1999))抗體或其抗原結合片段的所述組與目的(多)肽以及與許多或多或少(結構上和/或功能上)緊密相關的(多)肽的結合。只有與如本文中定義的某些TDP-43結構，例如如本文中定義的TDP-43的特定表位或(多)肽/蛋白質結合但不與或基本上不與同一TDP-43的任何其他表位或(多)肽結合的那些構建體(即抗體、其抗原結合片段等)被認為對目的表位或(多)肽/蛋白質具有特異性，並選擇用以根據本文中提供的方法進行進一步研究。這些方法尤其可包括與結構和/或功能上密切相關的分子的結合研究、阻斷和競爭研究。這些結合研究還包括FACS分析、表面等離子體共振(Surface Plasmon Resonance，SPR，例如用BIACORETM進行)、分析型超離心、等溫滴定量熱法、螢光各向異性、螢光光譜術或通過經放射性標記配體結合測定。
因此，特異性可通過本領域中已知的方法和如本文中所述的方法通過實驗確定。這樣的方法包括但不限於Western印跡、ELISA-、RIA-、ECL-、IRMA-測試和肽掃描。
本文中使用的術語“單克隆抗體”是指從基本上同質抗體的群體中獲得的抗體，即，除可能以少量存在的可能天然存在的突變之外，構成該群體的單獨抗體是相同的。單克隆抗體具有高度特異性，針對單一抗原位點。單克隆抗體的優點在於：其可通過雜交瘤培養物合成，基本上不受其他免疫球蛋白污染。修飾語“單克隆”指示該抗體在基本上同質的抗體群體中的特徵，並且不應解釋為要求該抗體通過任何特定方法來產生。如上所述，根據本發明使用的單克隆抗體可通過由Kohler,Nature 256(1975),495描述的雜交瘤方法來製備。
本文中使用的術語“多克隆抗體”是指在一種或更多種其他不同抗體之中或者在存在一種或更多種其他不同抗體的情況下產生的抗體。一般而言，多克隆抗體由B淋巴細胞在存在數種產生不同抗體的其他B淋巴細胞的情 況下產生。通常，多克隆抗體從經免疫接種的動物中直接獲得。
本文中使用的術語“完全人抗體”是指僅包含人免疫球蛋白蛋白質序列的抗體。如果在小鼠中、小鼠細胞中或來源於小鼠細胞的雜交瘤中產生，則完全人抗體可包含鼠糖鏈。類似地，“小鼠抗體”或“鼠抗體”是指僅包含小鼠/鼠免疫球蛋白蛋白質序列的抗體。或者，如果在大鼠中、大鼠細胞中、來源於大鼠細胞的雜交瘤中產生，則“完全人抗體”可包含大鼠糖鏈。類似地，術語“大鼠抗體”是指僅包含大鼠免疫球蛋白序列的抗體。完全人抗體也可例如通過噬菌體展示來產生，噬菌體展示是廣泛使用的篩選技術，其能夠產生和篩選完全人抗體。噬菌體抗體也可用於本發明的背景。噬菌體展示方法描述於例如US 5,403,484、US 5,969,108和US 5,885,793中。能夠開發完全人抗體的另一項技術涉及對小鼠雜交瘤技術的改進。對小鼠進行轉基因以包含人免疫球蛋白基因座，以交換其自身的小鼠基因(參見，例如，US 5,877,397)。
術語“嵌合抗體”是指包含與來自另一、人或非人物種(例如，小鼠、馬、兔、狗、牛、雞)的抗體區域(例如，恆定區)融合或嵌合的本發明的可變區的抗體。
術語抗體還涉及重組人抗體、異源抗體和異雜合抗體。術語“重組(人)抗體”包括通過重組手段製備、表達、產生或分離的所有人序列抗體，例如從針對人免疫球蛋白基因進行轉基因的動物(例如，小鼠)中分離的抗體；使用轉染到宿主細胞中的重組表達載體表達的抗體；從重組、組合人抗體文庫中分離的抗體；或者通過涉及將人免疫球蛋白基因序列剪接至其他DNA序列的任何其他手段製備、表達、產生或分離的抗體。這樣的重組人抗體具有來源於人種系免疫球蛋白序列的可變區和恆定區(如果存在的話)。然而，這樣的抗體可進行體外誘變(或，當使用針對人Ig序列轉基因的動物時，進行體內體細胞誘變)，並且因此重組抗體的VH和VL區的胺基酸序列是這樣的序列：其儘管來源於人種系VH和VL序列並且與之相關但在體內人抗體種系庫中可能非天然存在。
“異源抗體”相對於產生這樣的抗體的轉基因非人生物體進行定義。該術語是指具有與存在於不由轉基因非人動物組成的生物體中的胺基酸序列或編碼核酸序列對應的胺基酸序列或編碼核酸序列的抗體，並且該生物體通常來自除轉基因非人動物的物種之外的物種。
術語“異雜合抗體”是指具有不同生物體來源的輕鏈和重鏈的抗體。例如，具有與鼠輕鏈締合的人重鏈的抗體是異雜合抗體。異雜合抗體的一些實例包括嵌合抗體和人源化抗體。
本發明特別地涉及人源化抗體。“人源化”形式的非人(例如，鼠或兔)抗體是包含來源於非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈，或其片段(例如Fv、Fab、Fab’、F(ab’)2或者抗體的其他抗原結合子序列)。通常，人源化抗體是人免疫球蛋白(接受體抗體)，其中來自接受體的互補決定區(Complementary Determining Region，CDR)的殘基被具有所期望的特異性、親和力和能力的來自非人物種(供體抗體)(例如小鼠、大鼠或兔)的CDR的殘基替換。在一些情況下，人免疫球蛋白的Fv框架殘基被相應的非人殘基替換。因此，當本文中提及特定的人框架序列，例如IGHV1-3 VH框架序列時，這旨在不僅涵蓋種系序列而且還涵蓋突變形式。此外，人源化抗體可包含在接受體抗體中或導入的CDR或框架序列中均未發現的殘基。進行這些修飾是為了進一步完善和優化抗體性能。一般而言，人源化抗體將包含至少一個，並且通常兩個可變結構域中的基本全部，其中所有或基本上所有的CDR區對應於非人免疫球蛋白的那些，並且所有或基本上所有的FR區是人免疫球蛋白共有序列的那些。人源化抗體還可包含免疫球蛋白恆定區(Fc)(通常是人免疫球蛋白的恆定區)的至少一部分。對於另外的細節，參見：Jones et al.,Nature 321(1986),522-525；Reichmann Nature 332(1998),323-327和Presta Curr Op Struct Biol 2(1992),593-596。可參考實施例1以描述可根據本發明使用的抗體人源化方法，包括特定突變。
用於抗體人源化的流行方法涉及CDR接枝，其中將來自非人“供體”抗體的功能性抗原結合位點接枝到人“接納體”抗體上。CDR接枝方法是本領域中已知的，並且描述於例如US 5,225,539、US 5,693,761和US 6,407,213中。另一相關方法是從轉基因動物中產生人源化抗體，該動物經遺傳改造以包含能夠進行基因重排和基因轉換的一個或更多個人源化免疫球蛋白基因座(參見，例如，US 7,129,084)。
因此，在本發明的上下文中，術語“抗體”涉及完整的免疫球蛋白分子以及這樣的免疫球蛋白分子的部分(即，“其抗原結合片段”)。此外，如上 所述，該術語涉及經修飾和/或經改變的抗體分子。該術語還涉及重組或合成產生/合成的抗體。該術語還涉及完整的抗體及其抗體片段，例如分離的輕鏈和重鏈、Fab、Fv、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)2。術語抗體還包括但不限於完全人抗體、嵌合抗體、人源化抗體、CDR接枝的抗體和抗體構建體，例如單鏈Fv(scFv)或抗體融合蛋白。
在本發明的上下文中，“單鏈Fv”或“scFv”抗體片段具有抗體的VH和VL結構域，其中這些結構域存在於單個多肽鏈中。通常，scFv多肽還在VH與VL結構域之間包含多肽接頭，其使scFv能夠形成所期望的抗原結合結構。描述用於產生單鏈抗體的技術描述於例如Plückthun,The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,Rosenburg and Moore eds.Springer-Verlag,N.Y.(1994),269-315中。
本文中使用的“Fab片段”包含一條輕鏈，以及一條重鏈的CH1和可變區。Fab分子的重鏈不能與另一重鏈分子形成二硫鍵。
“Fc”區包含兩個含有抗體的CH2和CH3結構域的重鏈片段。兩個重鏈片段通過兩個或更多個二硫鍵以及通過CH3結構域的疏水相互作用保持在一起。
“Fab’片段”包含一條輕鏈，以及一條重鏈的一部分，所述一條重鏈的一部分包含VH結構域和CH1結構域以及還具有在CH1與CH2結構域之間的區域，使得可在兩個Fab’片段的兩條重鏈之間形成鏈間二硫鍵以形成F(ab’)2分子。
“F(ab’)2片段”包含兩條輕鏈和兩條重鏈，所述重鏈包含在CH1與CH2結構域之間的恆定區的一部分，使得在兩條重鏈之間形成鏈間二硫鍵。因此，F(ab’)2片段由通過兩條重鏈之間的二硫鍵保持在一起的兩個Fab’片段構成。
“Fv區”包含來自重鏈和輕鏈二者的可變區，但缺少恆定區。
根據本發明使用的人源化抗體、人源化抗體構建體、人源化抗體片段、人源化抗體衍生物(全部是Ig來源的)，或其相應的免疫球蛋白鏈可使用本領域中已知的常規技術進一步修飾，例如通過單獨或組合使用胺基酸缺失、***、替換、添加和/或重組和/或本領域中已知的任何其他修飾。用於在以免疫球蛋白鏈的胺基酸序列為基礎的DNA序列中引入這樣的修飾的方法是本領域技 術人員公知的；參見，例如，Sambrook et al.,Molecular Cloning：A Laboratory Manual；Cold Spring Harbor Laboratory Press，第2版(1989)和第3版(2001)。術語“Ig來源的結構域”特別地涉及包含至少一個CDR的(多)肽構建體。所列舉的Ig來源的結構域的片段或衍生物定義以下(多肽)肽，其是以上抗體分子的一部分和/或通過化學/生物化學或分子生物學方法進行修飾。相應的方法是本領域中已知的，並且尤其描述於實驗室手冊(參見，Sambrook et al.,Molecular Cloning：A Laboratory Manual；Cold Spring Harbor Laboratory Press，第2版(1989)和第3版(2001)；Gerhardt et al.,Methods for General and Molecular Bacteriology ASM Press(1994)；Lefkovits,Immunology Methods Manual：The Comprehensive Sourcebook of Techniques；Academic Press(1997)；Golemis,Protein-Protein Interactions：A Molecular Cloning Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press(2002))中。
本文中使用的術語“CDR”涉及“互補決定區”，其是本領域中公知的。CDR是免疫球蛋白的一部分，其決定所述分子的特異性並且與特定配體接觸。CDR是所述分子的最可變的部分，並且有助於這些分子的多樣性。每個V結構域中均存在三個CDR區：CDR1、CDR2和CDR3。CDR-H示出了可變重鏈的CDR區，而CDR-L涉及可變輕鏈的CDR區。VH意指可變重鏈，VL意指可變輕鏈。Ig來源區域的CDR區可如Kabat“Sequences of Proteins of Immunological Interest”，第5版.NIH出版物no.91-3242 U.S.Department of Health and Human Services(1991)中所述確定。本文中提供的CDR序列根據Kabat進行定義。然而，技術人員將理解，本發明旨在涵蓋其中根據任何有用的標識/編號方案定義CDR序列的結合分子。例如，可採用以下編號方案以定義CDR：Chothia(Canonical structures for the hypervariable regions of immunoglobulins.Chothia C,Lesk AM.J Mol Biol.1987 Aug 20；196(4)：901-17)；IMGT(IMGT,the international ImMunoGeneTics database.Giudicelli V,Chaume D,Bodmer J,Müller W,Busin C,Marsh S,Bontrop R,Marc L,Malik A,Lefranc MP.Nucleic Acids Res.1997 Jan 1；25(1)：206-11和Unique database numbering system for immunogenetic analysis.Lefranc MP.Immunol Today.1997 Nov；18(11)：509)；MacCallum(MacCallum RM,Martin AC,Thornton JM,J Mol Biol.1996 Oct 11；262(5)：732-45)以及Martin (Abhinandan KR,Martin ACR.Analysis and improvements to Kabat and structurally correct numbering of antibody variable domains.Mol Immunol.(2008)45：3832-9.10.1016/j.molimm.2008.05.022)。
因此，在本發明的上下文中，本文中以上所述的人源化抗體分子選自完整抗體(免疫球蛋白，例如IgG1、IgG2、IgA1、IgGA2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgD或IgE)、F(ab)-、Fab’-SH-、Fv-、Fab’-、F(ab’)2-片段、嵌合抗體、CDR接枝抗體、完全人抗體、二價抗體構建體、抗體融合蛋白、合成抗體、二價單鏈抗體、三價單鏈抗體和多價單鏈抗體。
“人源化方法”在本領域中是公知的，並且特別針對抗體分子，例如Ig來源的分子來描述。術語“人源化”是指包含來源於非人抗體的序列的一些部分的非人(例如，鼠)抗體或其片段(例如Fv、Fab、Fab’、F(ab’)、scFv或抗體的其他抗原結合部分序列)的人源化形式。人源化抗體包括人免疫球蛋白，其中來自人免疫球蛋白互補決定區(CDR)的殘基被具有所期望結合特異性、親和力和能力的來自非人物種(例如小鼠、大鼠或兔)的CDR的殘基替換。一般而言，人源化抗體將包含至少一個，並且通常兩個可變結構域中的基本全部，其中所有或基本上所有的CDR區對應於非人免疫球蛋白的那些，並且所有或基本上所有的FR區是人免疫球蛋白共有序列的那些。最佳地，人源化抗體還將包含免疫球蛋白恆定區(Fc)(通常是人免疫球蛋白的恆定區)的至少一部分；尤其參見：Jones et al.,Nature 321(1986),522-525，Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2(1992),593-596。用於使非人抗體人源化的方法是本領域中公知的。通常，人源化抗體具有從非人來源中引入其中的一個或更多個胺基酸，仍保留了該抗體的原始結合活性。用於使抗體/抗體分子人源化的方法還詳述於Jones et al.,Nature 321(1986),522-525；Reichmann et al.,Nature 332(1988),323-327；以及Verhoeyen et al.,Science 239(1988),1534-1536中。人源化抗體的一些具體實例，例如針對EpCAM的抗體在本領域中是已知的(參見例如LoBuglio,Proceedings of the American Society of Clinical Oncology Abstract(1997),1562和Khor,Proceedings of the American Society of Clinical Oncology Abstract(1997),847)。
因此，在本發明的上下文中，提供了抗體分子或其抗原結合片段，其是人源化的並且可成功地用於藥物組合物中。
本發明的人源化抗體或抗原結合片段的特異性不僅可由如上定義的該人源化抗體或抗原結合片段的胺基酸序列的性質來表示，而且還可由該抗體能夠結合的表位來表示。因此，在一個實施方案中，本發明涉及與本發明的抗體識別相同表位的抗錯折疊人源化TDP-43抗體或其抗原結合片段。
本領域技術人員可理解，表位可以包含在TDP-43蛋白中，但是也可包含在其降解產物中或者可以是化學合成的肽。僅指出胺基酸位置是為了顯示相應胺基酸序列在TDP-43蛋白序列中的位置。本發明涵蓋所有包含表位的肽。所述肽可以是長度大於100個胺基酸的多肽的一部分，或者可以是小於100個，優選小於50個，更優選小於25個胺基酸，甚至更優選小於16個胺基酸的小肽。這樣的肽的胺基酸可以是天然胺基酸或非天然胺基酸(例如，β胺基酸、γ胺基酸、D-胺基酸)或其組合。此外，本發明可涵蓋表位的相應逆反肽(retro-inverso peptide)。所述肽可以是未結合的或結合的。其可與例如小分子(例如，藥物或螢光團)、高分子量聚合物(例如，聚乙二醇(Polyethylene glycol，PEG)、聚乙烯亞胺(Polyethylene imine，PEI)、甲基丙烯酸羥丙酯(Hydroxypropylmethacrylate，HPMA)等)或蛋白質、脂肪酸、糖部分結合或者可***膜中。
為了測試所討論的抗體和本發明的抗體是否識別相同的表位，可進行以下競爭研究：將以3種MOI(感染複數)感染的Vero細胞在20小時之後與不同濃度的作為競爭者的所討論抗體孵育1小時。在第二孵育步驟中，以100nM的恆定濃度施加本發明的抗體，並使用針對本發明抗體的恆定結構域的螢光標記抗體，通過流式細胞術檢測其結合。以與所討論的抗體的濃度成反比例(成反比)進行結合指示兩種抗體識別相同表位。然而，可使用本領域中已知的許多其他測定。
本發明還涉及針對TDP-43的天然多肽和重組多肽的特異性抗體的產生。該產生例如基於動物如小鼠的免疫接種。然而，在本發明中還設想了用於產生抗體/抗血清的其他動物。例如，單克隆抗體和多克隆抗體可由兔、小鼠、山羊、驢等產生。可將編碼TDP-43的相應選擇的多肽的多核苷酸亞克隆到合適的載體中，其中使重組多肽在能夠表達的生物體，例如在細菌中表達。因此，可將表達的重組蛋白腹膜內注射到小鼠中，並且所得特異性抗體可例如從通過心 臟內血液穿刺提供的小鼠血清中獲得。本發明還設想通過使用如所附實施例中例示的DNA/RNA疫苗策略來產生針對天然多肽和重組多肽的特異性抗體。DNA疫苗策略是本領域中公知的，並且涵蓋脂質體介導的遞送、通過基因槍或噴射注射以及肌內或皮內注射。因此，針對TDP-43的多肽或蛋白質或表位，特別是本文中提供的抗體表位的抗體可通過肌內直接注射表達TDP-43的所期望多肽或蛋白質或表位的載體對動物直接進行免疫接種來獲得，所述表位特別地是以下本發明抗體表位，其位於SEQ ID NO：1的第397至411位胺基酸殘基中；更特別地是以下本發明抗體表位，其位於SEQ ID NO：1的第400至405位、第400至406位或第400至412位胺基酸殘基中。可使用ELISA對獲得的特異性抗體的量進行定量，這也在下文中描述。用於產生抗體的另外的方法是本領域中公知的，參見，例如Harlow and Lane,“Antibodies,A Laboratory Manual”,CSH Press,Cold Spring Harbor,1988。
因此，在指定的測定條件下，特定的抗體與TDP-43的相應表位彼此結合，而不與樣品中存在的其他組分以顯著量結合。在這樣的條件下與靶分析物的特異性結合可需要結合部分，該結合部分針對其對特定靶分析物的特異性進行選擇。可使用多種免疫測定形式來選擇與特定抗原特異性反應的抗體。例如，常規地使用固相ELISA免疫測定來選擇與分析物特異性免疫反應的單克隆抗體。參見Shepherd and Dean(2000),Monoclonal Antibodies：A Practical Approach,Oxford University Press and/or Howard and Bethell，對可用於確定特異性免疫反應性的免疫測定形式和條件的描述。通常來說，特異性或選擇性反應將是背景信噪比的至少兩倍，並且更通常是背景的超過10至100倍大。本領域技術人員能夠提供和產生針對新多肽的特異性結合分子。對於特異性結合測定，其可容易地用於避免不期望的交叉反應性，例如，可通過已知方法容易地純化和選擇多克隆抗體(參見Shepherd and Dean,loc.cit.)。
抗體的“類別”是指其重鏈所具有的恆定結構域或恆定區的類型。抗體存在五種主要類別：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，並且這些中的數種可進一步劃分為亞類(同種型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。對應於不同類別的免疫球蛋白的重鏈恆定結構域分別稱為α、δ、ε、γ和μ。
在某些實施方案中，考慮了本文中提供的抗體的胺基酸序列變體。 例如，可期望改善抗體的結合親和力和/或其他生物學特性。抗體的胺基酸序列變體可通過將合適的修飾引入編碼抗體的核苷酸序列中，或通過肽合成來製備。這樣的修飾包括，例如，抗體胺基酸序列中殘基的缺失和/或其中的***和/或其替換。可進行缺失、***和替換的任意組合以獲得最終的構建體，前提是最終的構建體具有所期望的特徵，例如抗原結合。
在某些實施方案中，提供了具有一個或更多個胺基酸替換的抗體變體。替換型誘變的目的位點包括CDR和FR。保守替換示於表1中“優選替換”的標題下。更多的替換型變化提供於表1中“示例性替換”的標題下，並且如以下參考胺基酸側鏈類別進一步描述的。可將胺基酸替換引入目的抗體中，並針對所期望活性，例如，保留/改善的抗原結合、降低的免疫原性或改善的ADCC或CDC篩選產物。
Figure 112105586-A0304-12-0036-1
胺基酸可根據共同的側鏈特性進行分組：(1)疏水性：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile； (2)中性親水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；(3)酸性：Asp、Glu；(4)鹼性：His、Lys、Arg；(5)影響鏈取向的殘基：Gly、Pro；(6)芳香族：Trp、Tyr、Phe。
非保守替換將需要將這些類別之一的成員更換為另一類別。
一種類型的替換型變體涉及替換親本抗體(例如人源化或人抗體)的一個或更多個高變區殘基。通常，選擇用於進一步研究的所得變體將相對於親本抗體在某些生物學特性方面具有改進(例如，改善)(例如，提高的親和力、降低的免疫原性)和/或將基本上保留親本抗體的某些生物學特性。一種示例性替換型變體是親和力成熟抗體，其可例如使用基於噬菌體展示的親和力成熟技術，例如本文中所述的那些方便地產生。簡言之，使一個或更多個CDR殘基突變，將變體抗體展示在噬菌體上並針對特定的生物活性(例如，結合親和力)進行篩選。
可在CDR中進行改變(例如，替換)，例如以提高抗體親和力。這樣的改變可在CDR“熱點”，即由在體細胞成熟過程期間以高頻率發生突變的密碼子編碼的殘基(參見，例如，Chowdhury,Methods Mol.Biol.207：179-196(2008))和/或SDR(a-CDR)中進行，並測試所得變體VH或VL的結合親和力。通過構建二級文庫和從二級文庫中再選擇而進行的親和力成熟已描述於例如Hoogenboom et al.,Methods in Molecular Biology 178：1-37(O’Brien et al.,ed.,Human Press,Totowa,NJ,(2001))中。在親和力成熟的一些實施方案中，通過多種方法(例如，易錯PCR、鏈混編或寡核苷酸定向誘變)中的任一種將多樣性引入選擇用於成熟的可變基因中。然後創建二級文庫。然後篩選該文庫以鑒定具有所期望親和力的任何抗體變體。用於引入多樣性的另一方法涉及CDR指導的方法，其中數個CDR殘基(例如，一次4至6個殘基)是隨機化的。涉及抗原結合的CDR殘基可例如使用丙胺酸掃描誘變或建模來特別地鑒定。特別地，CDR-H3和CDR-L3通常被靶向。
在某些實施方案中，替換、***或缺失可在一個或更多個CDR中發生，只要這樣的改變基本上不降低抗體結合抗原的能力即可。例如，可在 CDR中進行基本上不降低結合親和力的保守改變(例如，如本文中提供的保守替換)。這樣的改變可在CDR“熱點”或SDR之外。在上文提供的變體VH和VL序列的某些實施方案中，每個CDR是未經改變的，或包含不超過一個、兩個或三個胺基酸替換。
用於鑒定抗體的可靶向誘變的殘基或區域的可用方法稱為“丙胺酸掃描誘變”，如由Cunningham and Wells(1989)Science,244：1081-1085所述。在該方法中，鑒定殘基或靶殘基組(例如，帶電荷的殘基，例如Arg、Asp、His、Lys和Glu)，並將其用中性或帶負電荷的胺基酸(例如，丙胺酸或聚丙胺酸)進行替換以確定抗體與抗原的相互作用是否受到影響。可在胺基酸位置引入另外的替換，顯示對初始替換的功能敏感性。作為替代或補充，抗原-抗體複合體的晶體結構用於鑒定抗體與抗原之間的接觸點。這樣的接觸殘基和鄰近殘基可作為替換的候選物被靶向或消除。可對變體進行篩選以確定其是否包含所期望的特性。
胺基酸序列***包括長度為一個殘基至包含100或更多個殘基的多肽的胺基和/或羧基端融合，以及單個或多個胺基酸殘基的序列內***。末端***的一些實例包括具有N端甲硫氨醯基殘基的抗體。抗體分子的另一些***型變體包括抗體的N或C端與提高抗體的血清半衰期的酶(例如，對於ADEPT)或多肽的融合體。
在某些實施方案中，本文中提供的抗體被改變以提高或降低抗體被糖基化的程度。針對抗體的糖基化位點的添加或缺失可通過改變胺基酸序列使得產生或去除一個或更多個糖基化位點而方便地實現。
當抗體包含Fc區時，與其連接的碳水化合物可被改變。由哺乳動物細胞產生的天然抗體通常包含通常通過N鍵與Fc區之CH2結構域的Asn297連接的分支的雙觸角寡糖。參見，例如，Wright et al.,TIBTECH 15：26-32(1997)。寡糖可包括多種碳水化合物，例如甘露糖、N-乙醯基葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖和唾液酸，以及在雙觸角寡糖結構的“莖(stem)”中與GlcNAc連接的岩藻糖。在一些實施方案中，可對本發明的抗體中的寡糖進行修飾，以產生具有某些改善的特性的抗體變體。
在一個實施方案中，提供了具有缺少與Fc區(直接或間接)連 接的岩藻糖的碳水化合物結構的抗體變體。例如，這樣的抗體中岩藻糖的量可以是1%至80%、1%至65%、5%至65%、或20%至40%。岩藻糖的量通過計算在Asn297的糖鏈中岩藻糖的平均量來確定，這相對於與Asn 297連接的所有糖結構(例如，複合、雜合和高甘露糖結構)的總和進行，如通過MALDI-TOF質譜測量的，例如，如WO2008/077546中所述。Asn297是指位於Fc區中約第297位的天門冬醯胺殘基(Fc區殘基的Eu編號；參見Edelman,G.M.et al.,Proc.Natl.Acad.USA,63,78-85(1969))；然而，由於抗體中的微小序列變化，Asn297也可位於第297位上游或下游約±3個胺基酸，即在第294位與第300位處。這樣的岩藻糖基化變體可具有改善的ADCC功能。參見，例如，美國專利公開No.US 2003/0157108(Presta,L.)；US 2004/0093621(Kyowa Hakko Kogyo Co.,Ltd)。與“去岩藻糖基化”或“岩藻糖缺陷型”抗體變體有關的出版物的一些實例包括：US2003/0157108；WO2000/61739；WO2001/29246；US2003/0115614；US2002/0164328；US2004/0093621；US2004/0132140；US2004/0110704；US 2004/0110282；US2004/0109865；WO2003/085119；WO2003/084570；WO2005/035586；WO2005/035778；WO2005/053742；WO2002/031140；Okazaki et al.,J.Mol.Biol.336：1239-1249(2004)；Yamane-Ohnuki et al.,Biotech.Bioeng.87：614(2004)。能夠產生去岩藻糖基化抗體的細胞系的一些實例包括蛋白質岩藻糖基化缺陷型Lec13 CHO細胞(Ripka et al.,Arch.Biochem.Biophys.249：533-545(1986)；美國專利申請No US 2003/0157108 A1，Presta,L；以及WO2004/056312 A1，Adams et al.，尤其在實施例11)，以及敲除細胞系，例如α-1,6-岩藻糖基轉移酶基因FUT8敲除CHO細胞(參見，例如，Yamane-Ohnuki et al.,Bioteeh.Bioeng.87：614(2004)；Kanda,Y.et al.,Bioteehnol.Bioeng.,94(4)：680-688(2006)；以及WO2003/085 l07)。
還提供了具有二等分的寡糖的抗體變體，例如，其中與抗體的Fc區連接的雙觸角寡糖被GlcNAc二等分。這樣的抗體變體可具有降低的岩藻糖基化和/或改善的ADCC功能。這樣的抗體變體的一些實例描述於例如WO 2003/011878(Jean-Mairet et al.)；美國專利No.6,602,684(Umana et al.)；以及US 2005/0123546(Umana et al.)中。還提供了在與Fc區連接的寡糖中具有至少一個半乳糖殘基的抗體變體。這樣的抗體變體可具有改善的CDC功能。這樣的 抗體變體描述於例如WO 1997/30087(Patel et al.)；WO 1998/58964(Raju,S.)；以及WO 1999/22764(Raju,S.)中。
在某些實施方案中，可將一種或更多種胺基酸修飾引入本文中提供的抗體的Fc區中，從而產生Fc區變體。Fc區變體可包含在一個或更多個胺基酸位置包含胺基酸修飾(例如，替換)的人Fc區序列(例如，人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc區)。
在某些實施方案中，本文提供的抗體與病理性TDP-43結合並形成可被抗體依賴性細胞吞噬作用(ADCP)清除的免疫複合物，其結果是增強TDP-43清除。ADCP由抗體Fc片段與Fc受體(如Fcγ受體)的相互作用介導，Fc受體(如Fcγ受體)在先天免疫細胞(如小膠質細胞或樹突細胞)的表面表達。通過修飾抗體的Fc部分，可以調節Fc介導的功能以達到所需的效果。
在某些實施方案中，本發明考慮了以下抗體變體，其具有一些但並非全部效應物功能，這使其成為其中抗體的體內半衰期是重要的而某些效應物功能(例如補體啟動和ADCC)是不必要或有害的應用的所期望候選物。可進行體外和/或體內細胞毒性測定，以確定CDC和/或ADCC活性的降低/耗盡。例如，可進行Fc受體(Fc receptor，FcR)結合測定以確保抗體缺乏FcγR結合(因此可能缺乏ADCC活性)，但是保留FcRn結合能力。介導ADCC的主要細胞NK細胞僅表達FcγRIII，而單核細胞和小膠質細胞表達FcγRI、FcγRII和FcγRIII。造血細胞上的FcR表達概述於Ravetch and Kinet,Annu.Rev.Immunol.9：457-492(1991)的第464頁的表3中。評估目的分子的ADCC活性的體外測定的一些非限制性實例描述於美國專利No.5,500,362(參見，例如，Hellstrom,I.et al.,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 83：7059-7063(1986))和Hellstrom,I et al.,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 82：1499-1502(1985)；5,821,337(參見Bruggemann,M.et al.,J.Exp.Med.166：1351-1361(1987))中。
或者，可採用非放射性測定方法(參見，例如用於流式細胞術的ACTITM非放射性細胞毒性測定(CellTechnology,Inc.Mountain View,CA)；以及CytoTox 96®非放射性細胞毒性測定(Promega，Madison，WI))。用於這樣的測定的可用效應細胞包括外周血單個核細胞(Peripheral Blood Mononuclear Cell，PBMC)和自然殺手細胞(Natural Killer cell，NK cell)。
作為替代或補充，可在體內，例如在動物模型例如公開於Clynes et al.,Proc.Nat’l Acad.sci.USA 95：652-656(1998)的動物模型中評估目的分子的ADCC活性。也可進行C1q結合測定以確定抗體不能結合C1q，並且因此缺乏CDC活性。參見，例如，WO 2006/029879和WO 2005/100402中的C1q和C3c結合ELISA。為了評估補體啟動，可進行CDC測定(參見，例如，Gazzano-Santoro et al.,J.Immunol.Methods 202：163(1996)；Cragg,M.S.et al.,Blood 101：1045-1052(2003)；以及Cragg,M.S.and M.J.Glennie,Blood 103：2738-2743(2004))。還可使用本領域中已知的方法進行FcRn結合和體內清除/半衰期的確定(參見，例如，Petkova,S.B.et al.,Int’l.Immunol.18(12)：1759-1769(2006))。
具有降低的效應物功能的抗體包括Fc區第234位、第235位、第238位、第265位、第269位、第270位、第297位、第327位和第329位殘基中的一個或更多個被替換的抗體(美國專利No.6,737,056)。描述了與FcR的結合增強或減弱的某些抗體變體。(參見，例如，美國專利No.6,737,056；WO 2004/056312，和Shields et al.,J.Biol.Chem.9(2)：6591-6604(2001))。這樣的Fc突變體包括在第265位、第269位、第270位、第297位和第327位胺基酸中的兩個或更多個處進行替換的Fc突變體，包括第265位和第297位殘基被替換為丙胺酸的所謂的“DANA”Fc突變體(美國專利No.7,332,581)，或者第265位殘基被替換為丙胺酸以及第297位殘基被替換為甘胺酸的所謂的“DANG”FC突變體。或者，具有降低的效應物功能的抗體包括Fc區第234位、第235位和第329位殘基中的一個或更多個被替換的抗體，即第234位和第235位殘基被替換為丙胺酸以及第329位被替換為甘胺酸的所謂的“PG-LALA”Fc突變體(Lo,M.et al.,Journal of Biochemistry,292,3900-3908)。可使用在第234位、第235位和第321位的其他已知突變，即在CH2結構域中包含突變L234F/L235E/P331S的所謂的TM突變體(Oganesyan et al.Acta Cryst.D64,700-704.(2008))。來自人IgG4同種型的抗體包含突變S228P/L235E以使鉸鏈穩定並降低FgR結合(Schlothauer et al,PEDS,29(10)：457-466)。恆定結構域根據EU編號系統進行編號。
另一些Fc變體包括在以下Fc區殘基中的一個或更多個處進行替換的Fc變體：第238位、第256位、第265位、第272位、第286位、第303 位、第305位、第307位、第311位、第312位、第317位、第340位、第356位、第360位、第362位、第376位、第378位、第380位、第382位、第413位、第424位或第434位，例如Fc區第434位殘基被替換的Fc變體(美國專利No.7,371,826)。還參見Duncan & Winter,Nature 322：738-40(1988)；美國專利No.5,648,260；美國專利No.5,624,821。
在某些實施方案中，Fc區進行突變以提高其在pH 6.0下對FcRn的親和力並因此延長抗體半衰期。對FcRn具有增強的親和力的抗體包括以下Fc區殘基中的一個或更多個被替換的那些：第252位、第253位、第254位、第256位、第428位、第434位，包括具有替換M252Y/S254T/T256E的所謂的YTE突變(Dall’ Acqua et al,J Immunol.169：5171-5180(2002))或LS突變M428L/N434S(Zalevsky et al,Nat Biotechnol.28(2)：157-159(2010))。
在某些實施方案中，可期望產生半胱胺酸改造抗體，例如“thioMAb”，其中抗體的一個或更多個殘基被半胱胺酸殘基替換。在一些具體實施方案中，所替換的殘基出現在抗體的可及位點。通過用半胱胺酸替換這些殘基，反應性巰基由此位於抗體的可及位點，並且可用於將抗體與其他部分，例如藥物部分或接頭-藥物部分綴合，以產生免疫綴合物，如本文中進一步所述。在某些實施方案中，以下殘基中的任意一個或更多個可被半胱胺酸替換：輕鏈的V205(Kabat編號)；重鏈的A118(EU編號)；以及重鏈Fc區的S400(EU編號)。半胱胺酸改造抗體可如例如美國專利No.7,521,541中所述產生。
在某些實施方案中，本文中提供的抗體還可被修飾以包含本領域中已知且容易獲得的另外的非蛋白質性部分。適合於抗體衍生化的部分包括但不限於水溶性聚合物。水溶性聚合物的一些非限制性實例包括但不限於聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇的共聚物、羧甲基纖維素、右旋糖酐、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1,3-二氧戊環、聚1,3,6-三噁烷、乙烯/馬來酸酐共聚物、聚胺基酸(均聚物或無規共聚物)和右旋糖酐或聚(正乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚環氧丙烷/環氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化多元醇(例如，甘油)、聚乙烯醇，及其混合物。聚乙二醇丙醛由於其在水中穩定而在製造中可具有優勢。該聚合物可具有任意分子量，並且可以是支鏈或非支鏈的。與抗體連接的聚合物的數目可變化，並且如果連接多於一個聚合物，則它們可以是相同或不同的分子。 一般而言，用於衍生化的聚合物的數目和/或類型可基於以下考慮因素來確定，所述考慮因素包括但不限於待改進抗體的特定特性或功能、抗體衍生物是否將用於以下限定條件下的治療中，等。
在另一個實施方案中，提供了抗體與可通過暴露於輻射而選擇性加熱的非蛋白質性部分的綴合物。在一個實施方案中，非蛋白質性部分是碳納米管(Kam et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102：11600-11605(2005))。輻射可以是任何波長，包括但不限於不損害普通細胞但將非蛋白質性部分加熱至殺傷鄰近抗體-非蛋白質性部分的細胞的溫度的波長。
可使用重組方法和組合物產生抗體，例如，如美國專利No.4,816,567中所述。在一個實施方案中，提供了編碼本文中所述的抗錯折疊TDP-43抗體的分離的核酸。這樣的核酸可編碼包含抗體的VL的胺基酸序列和/或包含抗體的VH的胺基酸序列(例如，抗體的輕鏈和/或重鏈)。在另一個實施方案中，提供了包含這樣的核酸的一種或更多種載體(例如，表達載體)。在另一個實施方案中，提供了包含這樣的核酸的宿主細胞。在一個這樣的實施方案中，宿主細胞包含以下(例如，已經用以下轉化)：(1)載體，其包含編碼包含抗體VL的胺基酸序列和包含抗體VH的胺基酸序列的核酸；或(2)第一載體和第二載體，所述第一載體包含編碼包含抗體VL的胺基酸序列的核酸，所述第二載體包含編碼包含抗體VH的胺基酸序列的核酸。在一個實施方案中，宿主細胞是真核的，例如，中國倉鼠卵巢(Chinese Hamster Ovary，CHO)細胞或淋巴樣細胞(例如YO、NSO、Sp20)。在一個實施方案中，提供了製備抗錯折疊TDP-43抗體的方法，其中該方法包括：在適合於表達抗體的條件下，培養如上所提供的包含編碼抗體的核酸的宿主細胞，以及任選地從宿主細胞(或宿主細胞培養基)中回收抗體。
對於重組產生抗錯折疊TDP-43抗體，分離例如如上所述的編碼抗體的核酸，並將其***一個或更多個載體中，以進一步克隆和/或在宿主細胞或無細胞表達系統中表達。這樣的核酸可容易地使用常規操作分離和測序(例如，通過使用能夠與編碼抗體的重鏈和輕鏈的基因特異性結合的寡核苷酸探針來進行)。
用於克隆或表達抗體編碼載體的合適宿主細胞包括本文中所述 的原核或真核細胞。例如，可在細菌中產生抗體，特別是在不需要糖基化和Fc效應物功能時。對於抗體片段和多肽在細菌中的表達，參見，例如，美國專利No.5,648,237、5,789,199和5,840,523。(還參見Charlton,Methods in Molecular Biology,Val.248(B.K.C.Lo,ed.,Humana Press,Totowa,NJ,2003)，pp.245-254，描述了抗體片段在大腸桿菌(E.coli)中的表達)。在表達之後，可從細菌細胞糊中分離在可溶性級分中的抗體，並可將其進一步純化。
除原核生物之外，真核微生物例如絲狀真菌或酵母也是適合於抗體編碼載體的克隆或表達宿主，包括其中糖基化途徑已被“人源化”從而導致產生具有部分或完全人糖基化模式的抗體的真菌和酵母菌株。參見Gerngross,Nat.Biotech.22：1409-1414(2004)以及Li et al.,Nat.Biotech.24：210-215(2006)。
用於表達糖基化抗體的合適宿主細胞也來源於多細胞生物體(無脊椎動物和脊椎動物)。無脊椎動物細胞的一些實例包括植物和昆蟲細胞。已鑒定出許多杆狀病毒株，其可與昆蟲細胞結合使用，特別地用於轉染草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda)細胞。
植物細胞培養物也可用作宿主。參見例如美國專利No5,959,177、6,040,498、6,420,548、7,125,978和6,417,429(描述了用於在轉基因植物中產生抗體的PLANTIBODIESTM技術)。
脊椎動物細胞也可用作宿主。例如，可使用適於懸浮培養的哺乳動物細胞系。可用的哺乳動物宿主細胞系的另一些實例是由SV40轉化的獼猴腎CVl系(COS-7)；人胚腎細胞系(293或293細胞，如描述於例如Graham et al.,J.Gen Viral.36：59(1977)中)；幼倉鼠腎細胞(baby hamster kidney cell，BHK)；小鼠塞托利細胞(TM4細胞，如描述於例如Mather,Biol.Reprod.23：243-251(1980)中)；獼猴腎細胞(CV1)；非洲綠獼猴腎細胞(VERO-76)；人宮頸癌細胞(HeLa)；犬腎細胞(MDCK)；布法羅大鼠肝細胞(BRL3A)；人肺細胞(WI38)；人肝細胞(Hep G2)；小鼠乳腺腫瘤(MMT 060562)；TRI細胞，如描述於例如Mather et al.,Annals N.Y Aead.Sei.383：44-68(1982)中；MRC 5細胞；以及FS4細胞。另一些可用的哺乳動物宿主細胞系包括中國倉鼠卵巢(CHO)細胞，包括DHFR CHO細胞(Urlaub et al.,Proc.Natl.Acad.cii.USA 77：4216(1980))；以及骨髓瘤細胞系，例如YO、NSO和Sp2/0。對於適合於抗體產生的某些哺乳動物宿主細 胞系的綜述，參見，例如，Yazaki and Wu,Methods in Molecular Biology,Val.248(B.K.C.Lo,ed.,Humana Press,Totowa,NJ),pp.255-268(2003)。
對於遞送分子穿過血腦屏障(Blood Brain Barrier，BBB)，存在數種本領域已知的方法，例如施用途徑的改變、對BBB的破壞及其通透性的改變、納米粒遞送、特洛伊木馬方法(Trojan Horse Approach)、受體介導的轉運以及細胞和基因治療。
施用途徑的改變可通過以下來實現：直接注射到腦中(參見，例如，Papanastassiou et al.,Gene Therapy 9：398-406(2002))，在腦中植入遞送裝置(參見，例如，Gillet al.,Nature Med.9：589-595(2003)；和Gliadel WafersTM,Guildford Pharmaceutical)，以及繞過BBB的鼻內施用(Mittal et al,Drug Deliv.21(2)：75-86.(2014))。
屏障破壞的方法包括但不限於：超聲(參見，例如，美國專利公開No.2002/0038086)；滲透壓(例如，通過施用高滲甘露醇(Neuwelt,E.A.,Implication of the Blood-Brain Barrier and its Manipulation,Vols 1 & 2,Plenum Press,N.Y.(1989)))；透化，通過例如緩激肽或透化劑A-7(參見，例如，美國專利No.5,112,596、5,268,164、5,506,206和5,686,416)。
改變BBB通透性的方法包括但不限於：使用糖皮質激素阻斷劑來提高血腦屏障的通透性(參見，例如，美國專利申請公開No.2002/0065259、2003/0162695和2005/0124533)；啟動鉀通道(參見，例如，美國專利申請公開No.2005/0089473)；以及抑制ABC藥物轉運蛋白(參見，例如，美國專利申請公開No.2003/0073713)。
遞送人源化抗體或其人源化抗體片段穿過血腦屏障的特洛伊木馬遞送方法包括但不限於：使抗體陽離子化(參見，例如，美國專利No.5,004,697)，以及使用細胞穿透肽例如Tat肽以得以進人CNS。(參見，例如，Dietz et al.,J.Neurochem.104：757-765(2008))。
遞送人源化抗體或其抗原結合片段穿過血腦屏障的納米粒遞送方法包括但不限於：將抗體或其抗原結合片段包封在脂質體或胞外囊泡例如外泌體中，所述脂質體或胞外囊泡與與血腦屏障的血管內皮上的受體結合的抗體或抗原結合片段或作為替代的肽偶聯(不限於此)(參見，例如，美國專利申請 公開No.20020025313)；以及將抗體或其抗原結合片段包被在低密度脂蛋白顆粒中(參見，例如，美國專利申請公開No.20040204354)或包被在載脂蛋白E中(參見，例如，美國專利申請公開No.20040131692)。
本發明的人源化抗體可被另外修飾以增強血腦屏障穿透。
本發明的人源化抗體或其抗原結合片段可與與血腦屏障受體結合的多肽融合。BBB受體包括但不限於運鐵蛋白受體、胰島素受體或低密度脂蛋白受體。多肽可以是肽、受體配體、單結構域抗體(VHH)、scFv或Fab片段。
本發明的人源化抗體也可作為編碼所述人源化抗體的相應核酸遞送。這樣的核酸分子可以是用於靶向遞送至血腦屏障或CNS中的任何其他細胞類型的病毒載體的一部分。病毒載體可以是選自本領域已知的任何AAV血清型(包括但不限於AAV1至AAV12)的重組腺相關病毒載體(recombinant adeno-associated viral vector，rAAV)，以使得人源化抗體或人源化抗體片段或人源化抗體衍生物能夠在細胞內表達或在腦實質中表達。
遞送本發明的人源化抗體或人源化抗體片段或人源化抗體衍生物穿過血腦屏障的細胞治療方法包括但不限於：使用用我們具有所有權的載體離體轉染的內皮祖細胞(Endothelial Progenitor Cell，EPC)的歸巢能力，以及通過這些細胞分泌抗體或抗體片段並向腦遞送所述抗體或抗體片段，以克服BBB的強大過濾活動(參見，例如，Heller and al.,J Cell Mol Med.00：1-7(2020))；或者使用裝載有經遺傳改造細胞的聚合物細胞植入裝置來分泌抗體或抗體片段(參見，例如Marroquin Belaunzaran et al.PLoS ONE 6(4)：e18268(2011))。
可藥用載體、稀釋劑、輔料和賦形劑是製藥領域公知的，並且在例如以下中描述：Remington’s Pharmaceutical Sciences，第15版或第18版.(Alfonso R.Gennaro,ed.；Mack Publishing Company,Easton,PA,1990)；Remington：the Science and Practice of Pharmacy第19版.(Lippincott,Williams & Wilkins,1995)；Handbook of Pharmaceutical Excipients，第3版.(Arthur H.Kibbe,ed.；Amer.Pharmaceutical Assoc,1999)；Pharmaceutical Codex：Principles and Practice of Pharmaceutics第12版.(Walter Lund ed.；Pharmaceutical Press,London,1994)；The United States Pharmacopeia：The National Formulary(United States Pharmacopeial Convention)；Fiedler’s“Lexikon der Hilfstoffe”第5版.，Edition Cantor Verlag Aulendorf 2002；“The Handbook of Pharmaceutical Excipients”，第4版.，American Pharmaceuticals Association,2003；以及Goodman and Gilman’s：the Pharmacological Basis of Therapeutics(Louis S.Goodman and Lee E.Limbird,eds.；McGraw Hill,1992)，其公開內容在此通過引用併入。
載體、稀釋劑、輔料和藥用賦形劑可根據預期的施用途徑和標準藥學實踐進行選擇。這些化合物必須是在對其接受者無害的意義上可接受的。參見Remington’s Pharmaceutical Sciences，第15版或第18版.(Alfonso R.Gennaro,ed.；Mack Publishing Company,Easton,PA,1990)；Remington：the Science and Practice of Pharmacy第19版.(Lippincott,Williams & Wilkins,1995)；Handbook of Pharmaceutical Excipients，第3版.(Arthur H.Kibbe,ed.；Amer.Pharmaceutical Assoc,1999)；Pharmaceutical Codex：Principles and Practice of Pharmaceutics第12版.(Walter Lund ed.；Pharmaceutical Press,London,1994)；The United States Pharmacopeia：The National Formulary(United States Pharmacopeial Convention)；Fiedler’s“Lexikon der Hilfstoffe”第5版.，Edition Cantor Verlag Aulendorf 2002；“The Handbook of Pharmaceutical Excipients”，第4版.，American Pharmaceuticals Association,2003；以及Goodman and Gilman’s：the Pharmacological Basis of Therapeutics(Louis S.Goodman and Lee E.Limbird,eds.；McGraw Hill,1992)，其公開內容在此通過引用併入。
待施用於對象的化合物的“有效量”是根據合理的醫學判斷適合於治療、預防或減輕疾病、障礙或異常的劑量。具體的劑量水準和劑量頻率可取決於例如多種因素，包括：所用特定化合物的活性、該化合物的代謝穩定性和作用時長、施用方式和時間。待施用於對象的化合物的“有效量”是根據合理的醫學判斷適合於治療、預防或減輕病症、疾病、障礙或異常的劑量。具體的劑量水準和劑量頻率可取決於例如多種因素，包括：所用特定化合物的活性、該化合物的代謝穩定性和作用時長、施用方式和時間、***速率和藥物組合。患者特異性的因素，例如年齡、體重、一般健康、性別、飲食以及特定病症的嚴重程度，也會影響待施用的量。
術語“清除”(也稱為“清除值”或“CL”或“全身清除”)涉及物質從體內消除的效率。物質(在這種情況下是本發明的結合分子)的清除是尿液清除 和腎外清除的總和；對於通過腎途徑和腎外途徑清除的物質，血漿清除超過尿液清除。mAb的PK特性是其大尺寸(150kDa)、相對極性、Fc-受體結合和與靶抗原特異性結合的函數。mAb的主要消除途徑是細胞攝取，隨後是蛋白水解降解。mAb從體循環中的低清除使其給藥頻率低於肽或小分子，這對患者來說通常更方便(Betts et al.,MABs.2018)。
XI. TDP-43特異性結合分子的一些發明性實施方案
在一些實施方案中，提供了人源化TDP-43結合分子，特別是人源化TDP-43抗體或其抗原結合片段，其包含：a)包含SEQ ID NO：21的胺基酸序列的VH-CDR1；包含SEQ ID NO：22的胺基酸序列的VH-CDR2；和包含胺基酸序列ES(Glu-Ser)的VH-CDR3；或者b)包含SEQ ID NO：21的胺基酸序列的VH-CDR1；包含SEQ ID NO：82的胺基酸序列的VH-CDR2；和包含胺基酸序列ES(Glu-Ser)的VH-CDR3；或者c)包含SEQ ID NO：21的胺基酸序列的VH-CDR1；包含SEQ ID NO：92的胺基酸序列的VH-CDR2；和包含胺基酸序列ES(Glu-Ser)的VH-CDR3；d)包含SEQ ID NO：21的胺基酸序列的VH-CDR1；包含SEQ ID NO：102的胺基酸序列的VH-CDR2；和包含胺基酸序列ES(Glu-Ser)的VH-CDR3；或者e)包含SEQ ID NO：21的胺基酸序列的VH-CDR1；包含SEQ ID NO：112的胺基酸序列的VH-CDR2；和包含胺基酸序列ES(Glu-Ser)的VH-CDR3；或者f)包含SEQ ID NO：21的胺基酸序列的VH-CDR1；包含SEQ ID NO：122的胺基酸序列的VH-CDR2；和包含胺基酸序列ES(Glu-Ser)的VH-CDR3。
在一些實施方案中，提供了人源化TDP-43結合分子，特別是人源化TDP-43抗體或其抗原結合片段，其包含：a)包含SEQ ID NO：25的胺基酸序列的VL-CDR1；包含SEQ ID NO：16的胺基酸序列的VL-CDR2；和包含SEQ ID NO：27的胺基酸序列的VL-CDR3；或者 b)包含SEQ ID NO：85的胺基酸序列的VL-CDR1；包含SEQ ID NO：16的胺基酸序列的VL-CDR2；和包含SEQ ID NO：87的胺基酸序列的VL-CDR3；或者c)包含SEQ ID NO：25的胺基酸序列的VL-CDR1；包含SEQ ID NO：16的胺基酸序列的VL-CDR2；和包含SEQ ID NO：87的胺基酸序列的VL-CDR3。
在一些實施方案中，提供了人源化TDP-43結合分子，特別是人源化TDP-43抗體或其抗原結合片段，其包含：a)重鏈可變區(VH)，其包含：i. 包含SEQ ID NO：21的胺基酸序列的VH-CDR1；包含SEQ ID NO：22的胺基酸序列的VH-CDR2；和包含胺基酸序列ES(Glu-Ser)的VH-CDR3；或者ii. 包含SEQ ID NO：21的胺基酸序列的VH-CDR1；包含SEQ ID NO：82的胺基酸序列的VH-CDR2；和包含胺基酸序列ES(Glu-Ser)的VH-CDR3；或者iii. 包含SEQ ID NO：21的胺基酸序列的VH-CDR1；包含SEQ ID NO：92的胺基酸序列的VH-CDR2；和包含胺基酸序列ES(Glu-Ser)的VH-CDR3；或者iv. 包含SEQ ID NO：21的胺基酸序列的VH-CDR1；包含SEQ ID NO：102的胺基酸序列的VH-CDR2；和包含胺基酸序列ES(Glu-Ser)的VH-CDR3；或者v. 包含SEQ ID NO：21的胺基酸序列的VH-CDR1；包含SEQ ID NO：112的胺基酸序列的VH-CDR2；和包含胺基酸序列ES(Glu-Ser)的VH-CDR3；或者vi. 包含SEQ ID NO：21的胺基酸序列的VH-CDR1；包含SEQ ID NO：122的胺基酸序列的VH-CDR2；和包含胺基酸序列ES(Glu-Ser)的VH-CDR3；以及b)輕鏈可變區(VL)，其包含：i. 包含SEQ ID NO：25的胺基酸序列的VL-CDR1；包含SEQ ID NO：16的胺基酸序列的VL-CDR2；和包含SEQ ID NO：27的胺基酸序列的VL-CDR3；或者ii. 包含SEQ ID NO：85的胺基酸序列的VL-CDR1；包含SEQ ID NO：16的胺基酸序列的VL-CDR2；和包含SEQ ID NO：87的胺基酸序列的VL-CDR3；或者iii. 包含SEQ ID NO：25的胺基酸序列的VL-CDR1；包含SEQ ID NO：16的胺基酸序列的VL-CDR2；和包含SEQ ID NO：87的胺基酸序列的VL-CDR3。
在一些實施方案中，提供了人源化TDP-43結合分子，特別是人源化TDP-43抗體或其抗原結合片段，其包含：a)重鏈可變區(VH)，其包含：i. 包含SEQ ID NO：21的胺基酸序列的VH-CDR1或包含與SEQ ID NO：21具有至少80%、90%、95%或100%序列同一性的胺基酸序列的VH-CDR1；包含SEQ ID NO：22的胺基酸序列的VH-CDR2或包含與SEQ ID NO：22具有至少80%、90%、95%或100%序列同一性的胺基酸序列的VH-CDR2；和包含胺基酸序列ES(Glu-Ser)的VH-CDR3；或者ii. 包含SEQ ID NO：21的胺基酸序列的VH-CDR1或包含與SEQ ID NO：21具有至少80%、90%、95%或100%序列同一性的胺基酸序列的VH-CDR1；包含SEQ ID NO：82的胺基酸序列的VH-CDR2或包含與SEQ ID NO：82具有至少80%、90%、95%或100%序列同一性的胺基酸序列的VH-CDR2；和包含胺基酸序列ES(Glu-Ser)的VH-CDR3；或者iii. 包含SEQ ID NO：21的胺基酸序列的VH-CDR1或包含與SEQ ID NO：21具有至少80%、90%、95%或100%序列同一性的胺基酸序列的VH-CDR1；包含SEQ ID NO：92的胺基酸序列的VH-CDR2或包含與SEQ ID NO：92具有至少80%、90%、95%或100%序列同一性的胺基酸序列的VH-CDR2；和包含胺基酸序列ES(Glu-Ser)的VH-CDR3；或者iv. 包含SEQ ID NO：21的胺基酸序列的VH-CDR1或包含與SEQ ID NO：21具有至少80%、90%、95%或100%序列同一性的胺基酸序列的VH-CDR1；包含SEQ ID NO：102的胺基酸序列的VH-CDR2或包含與SEQ ID NO：102具有至少80%、90%、95%或100%序列同一性的胺基酸序列的VH-CDR2；和包含胺基酸序列ES(Glu-Ser)的VH-CDR3；或者v. 包含SEQ ID NO：21的胺基酸序列的VH-CDR1或包含與SEQ ID NO：21具有至少80%、90%、95%或100%序列同一性的胺基酸序列的VH-CDR1；包含SEQ ID NO：112的胺基酸序列的VH-CDR2或包含與SEQ ID NO：112具有至少80%、90%、95%或100%序列同一性的胺基酸序列的VH-CDR1；和包含胺基酸序列ES(Glu-Ser)的VH-CDR3；或者vi. 包含SEQ ID NO：21的胺基酸序列的VH-CDR1或包含與SEQ ID NO：21 具有至少80%、90%、95%或100%序列同一性的胺基酸序列的VH-CDR1；包含SEQ ID NO：122的胺基酸序列的VH-CDR2或包含與SEQ ID NO：122具有至少80%、90%、95%或100%序列同一性的胺基酸序列的VH-CDR2；和包含胺基酸序列ES(Glu-Ser)的VH-CDR3；或者b)輕鏈可變區(VL)，其包含：i. 包含SEQ ID NO：25的胺基酸序列的VL-CDR1或包含與SEQ ID NO：25具有至少80%、90%、95%或100%序列同一性的胺基酸序列的VL-CDR1；包含SEQ ID NO：16的胺基酸序列的VL-CDR2或包含與SEQ ID NO：16具有至少80%、90%、95%或100%序列同一性的胺基酸序列的VL-CDR2；和包含SEQ ID NO：27的胺基酸序列的VL-CDR3或包含與SEQ ID NO：27具有至少80%、90%、95%或100%序列同一性的胺基酸序列的VL-CDR3；或者ii. 包含SEQ ID NO：85的胺基酸序列的VL-CDR1或包含與SEQ ID NO：85具有至少80%、90%、95%或100%序列同一性的胺基酸序列的VL-CDR1；包含SEQ ID NO：16的胺基酸序列的VL-CDR2或包含與SEQ ID NO：16具有至少80%、90%、95%或100%序列同一性的胺基酸序列的VL-CDR2；和包含SEQ ID NO：87的胺基酸序列的VL-CDR3或包含與SEQ ID NO：87具有至少80%、90%、95%或100%序列同一性的胺基酸序列的VL-CDR1；或者iii. 包含SEQ ID NO：25的胺基酸序列的VL-CDR1或包含與SEQ ID NO：25具有至少80%、90%、95%或100%序列同一性的胺基酸序列的VL-CDR1；包含SEQ ID NO：16的胺基酸序列的VL-CDR2或包含與SEQ ID NO：16具有至少80%、90%、95%或100%序列同一性的胺基酸序列的VL-CDR2；和包含SEQ ID NO：87的胺基酸序列的VL-CDR3或包含與SEQ ID NO：87具有至少80%、90%、95%或100%序列同一性的胺基酸序列的VL-CDR3。
在一些實施方案中，提供了人源化TDP-43結合分子，特別是人源化TDP-43抗體或其抗原結合片段，其包含：a)重鏈可變區(VH)，其包含：包含SEQ ID NO：21的胺基酸序列的VH-CDR1或包含與SEQ ID NO：21具有至少80%、90%、95%或100%序列同一性的胺基酸序列的VH-CDR1；包含SEQ ID NO：22的胺基酸序列的VH-CDR2或包含與SEQ ID NO：22具有至少80%、90%、95%或100%序列同一性的胺基酸 序列的VH-CDR2；和包含胺基酸序列ES(Glu-Ser)的VH-CDR3；或者b)重鏈可變區(VH)，其包含：包含SEQ ID NO：21的胺基酸序列的VH-CDR1或包含與SEQ ID NO：21具有至少80%、90%、95%或100%序列同一性的胺基酸序列的VH-CDR1；包含SEQ ID NO：112的胺基酸序列的VH-CDR2或包含與SEQ ID NO：112具有至少80%、90%、95%或100%序列同一性的胺基酸序列的VH-CDR2；和包含胺基酸序列ES(Glu-Ser)的VH-CDR3；c)重鏈可變區(VH)，其包含：包含SEQ ID NO：21的胺基酸序列的VH-CDR1或包含與SEQ ID NO：21具有至少80%、90%、95%或100%序列同一性的胺基酸序列的VH-CDR1；包含SEQ ID NO：122的胺基酸序列的VH-CDR2或包含與SEQ ID NO：122具有至少80%、90%、95%或100%序列同一性的胺基酸序列的VH-CDR2；和包含胺基酸序列ES(Glu-Ser)的VH-CDR3；以及d)輕鏈可變區(VL)，其包含：包含SEQ ID NO：25的胺基酸序列的VL-CDR1或包含與SEQ ID NO：25具有至少80%、90%、95%或100%序列同一性的胺基酸序列的VL-CDR1；包含SEQ ID NO：16的胺基酸序列的VL-CDR2或包含與SEQ ID NO：16具有至少80%、90%、95%或100%序列同一性的胺基酸序列的VL-CDR2；和包含SEQ ID NO：27的胺基酸序列的VL-CDR3或包含與SEQ ID NO：27具有至少80%、90%、95%或100%序列同一性的胺基酸序列的VL-CDR3；或者e)輕鏈可變區(VL)，其包含：包含SEQ ID NO：85的胺基酸序列的VL-CDR1或包含與SEQ ID NO：85具有至少80%、90%、95%或100%序列同一性的胺基酸序列的VL-CDR1；包含SEQ ID NO：16的胺基酸序列的VL-CDR2或包含與SEQ ID NO：16具有至少80%、90%、95%或100%序列同一性的胺基酸序列的VL-CDR2；和包含SEQ ID NO：87的胺基酸序列的VL-CDR3或包含與SEQ ID NO：87具有至少80%、90%、95%或100%序列同一性的胺基酸序列的VL-CDR3；或者f)輕鏈可變區(VL)，其包含：包含SEQ ID NO：25的胺基酸序列的VL-CDR1或包含與SEQ ID NO：25具有至少80%、90%、95%或100%序列同一性的胺基酸序列的VL-CDR1；包含SEQ ID NO：16的胺基酸序列的VL-CDR2或 包含與SEQ ID NO：16具有至少80%、90%、95%或100%序列同一性的胺基酸序列的VL-CDR2；和包含SEQ ID NO：87的胺基酸序列的VL-CDR3或包含與SEQ ID NO：87具有至少80%、90%、95%或100%序列同一性的胺基酸序列的VL-CDR3。
更具體地，在一些實施方案中，提供了人源化TDP-43結合分子，特別是人源化TDP-43抗體或其抗原結合片段，其包含：a)重鏈可變區(VH)，其包含：包含SEQ ID NO：21的胺基酸序列的VH-CDR1或包含與SEQ ID NO：21具有至少80%、90%、95%或100%序列同一性的胺基酸序列的VH-CDR1；包含SEQ ID NO：122的胺基酸序列的VH-CDR2或包含與SEQ ID NO：122具有至少80%、90%、95%或100%序列同一性的胺基酸序列的VH-CDR2；和包含胺基酸序列ES(Glu-Ser)的VH-CDR3；以及b)輕鏈可變區(VL)，其包含：包含SEQ ID NO：85的胺基酸序列的VL-CDR1或包含與SEQ ID NO：85具有至少80%、90%、95%或100%序列同一性的胺基酸序列的VL-CDR1；包含SEQ ID NO：16的胺基酸序列的VL-CDR2或包含與SEQ ID NO：16具有至少80%、90%、95%或100%序列同一性的胺基酸序列的VL-CDR2；和包含SEQ ID NO：87的胺基酸序列的VL-CDR3或包含與SEQ ID NO：87具有至少80%、90%、95%或100%序列同一性的胺基酸序列的VL-CDR3。
更具體地，在一些實施方案中，提供了人源化TDP-43結合分子，特別是人源化TDP-43抗體或其抗原結合片段，其包含：a)重鏈可變區(VH)，其包含：包含SEQ ID NO：21的胺基酸序列的VH-CDR1或包含與SEQ ID NO：21具有至少80%、90%、95%或100%序列同一性的胺基酸序列的VH-CDR1；包含SEQ ID NO：112的胺基酸序列的VH-CDR2或包含與SEQ ID NO：112具有至少80%、90%、95%或100%序列同一性的胺基酸序列的VH-CDR2；和包含胺基酸序列ES(Glu-Ser)的VH-CDR3；以及b)輕鏈可變區(VL)，其包含：包含SEQ ID NO：25的胺基酸序列的VL-CDR1或包含與SEQ ID NO：25具有至少80%、90%、95%或100%序列同一性的胺基酸序列的VL-CDR1；包含SEQ ID NO：16的胺基酸序列的VL-CDR2或包含與SEQ ID NO：16具有至少80%、90%、95%或100%序列同一性的胺基酸 序列的VL-CDR2；和包含SEQ ID NO：87的胺基酸序列的VL-CDR3或包含與SEQ ID NO：87具有至少80%、90%、95%或100%序列同一性的胺基酸序列的VL-CDR3。
更具體地，在一些實施方案中，提供了人源化TDP-43結合分子，特別是人源化TDP-43抗體或其抗原結合片段，其包含：a)重鏈可變區(VH)，其包含：包含SEQ ID NO：21的胺基酸序列的VH-CDR1或包含與SEQ ID NO：21具有至少80%、90%、95%或100%序列同一性的胺基酸序列的VH-CDR1；包含SEQ ID NO：122的胺基酸序列的VH-CDR2或包含與SEQ ID NO：122具有至少80%、90%、95%或100%序列同一性的胺基酸序列的VH-CDR2；和包含胺基酸序列ES(Glu-Ser)的VH-CDR3；以及b)輕鏈可變區(VL)，其包含：包含SEQ ID NO：25的胺基酸序列的VL-CDR1或包含與SEQ ID NO：25具有至少80%、90%、95%或100%序列同一性的胺基酸序列的VL-CDR1；包含SEQ ID NO：16的胺基酸序列的VL-CDR2或包含與SEQ ID NO：16具有至少80%、90%、95%或100%序列同一性的胺基酸序列的VL-CDR2；和包含SEQ ID NO：87的胺基酸序列的VL-CDR3或包含與SEQ ID NO：87具有至少80%、90%、95%或100%序列同一性的胺基酸序列的VL-CDR3。
在一些實施方案中，人源化TDP-43抗體包含選自以下的CDR：(a)包含SEQ ID NO：21的胺基酸序列的VH-CDR1；(b)包含SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：112或SEQ ID NO：122的胺基酸序列的VH-CDR2；(c)包含胺基酸序列ES(Glu-Ser)的VH-CDR3；(d)包含SEQ ID NO：25或SEQ ID NO：85的胺基酸序列的VL-CDR1；(e)包含SEQ ID NO：16的胺基酸序列的VL-CDR2；和(f)包含SEQ ID NO：27或SEQ ID NO：87的胺基酸序列的VL-CDR3。
在一些實施方案中，人源化TDP-43抗體包含選自以下的CDR：(a)包含SEQ ID NO：21的胺基酸序列的VH-CDR1；(b)包含SEQ ID NO：22的胺基酸序列的VH-CDR2；(c)包含胺基酸序列ES(Glu-Ser)的VH-CDR3；(d)包含SEQ ID NO：25的胺基酸序列的VL-CDR1；(e)包含SEQ ID NO：16的胺基酸序列的VL-CDR2；和(f)包含SEQ ID NO：27的胺基酸序列的VL-CDR3。
在一些實施方案中，人源化TDP-43抗體包含選自以下的CDR：(a)包含SEQ ID NO：21的胺基酸序列的VH-CDR1；(b)包含SEQ ID NO：112的胺基酸序列的VH-CDR2；(c)包含胺基酸序列ES(Glu-Ser)的VH-CDR3；(d)包含SEQ ID NO：25的胺基酸序列的VL-CDR1；(e)包含SEQ ID NO：16的胺基酸序列的VL-CDR2；和(f)包含SEQ ID NO：27的胺基酸序列的VL-CDR3。
在一些實施方案中，人源化TDP-43抗體包含選自以下的CDR：(a)包含SEQ ID NO：21的胺基酸序列的VH-CDR1；(b)包含SEQ ID NO：112的胺基酸序列的VH-CDR2；(c)包含胺基酸序列ES(Glu-Ser)的VH-CDR3；(d)包含SEQ ID NO：85的胺基酸序列的VL-CDR1；(e)包含SEQ ID NO：16的胺基酸序列的VL-CDR2；和(f)包含SEQ ID NO：87的胺基酸序列的VL-CDR3。
在一些實施方案中，人源化TDP-43抗體包含選自以下的CDR：(a)包含SEQ ID NO：21的胺基酸序列的VH-CDR1；(b)包含SEQ ID NO：122的胺基酸序列的VH-CDR2；(c)包含胺基酸序列ES(Glu-Ser)的VH-CDR3；(d)包含SEQ ID NO：25的胺基酸序列的VL-CDR1；(e)包含SEQ ID NO：16的胺基酸序列的VL-CDR2；和(f)包含SEQ ID NO：27的胺基酸序列的VL-CDR3。
在一些實施方案中，人源化TDP-43抗體包含選自以下的CDR：(a)包含SEQ ID NO：21的胺基酸序列的VH-CDR1；(b)包含SEQ ID NO：122的胺基酸序列的VH-CDR2；(c)包含胺基酸序列ES(Glu-Ser)的VH-CDR3；(d)包含SEQ ID NO：85的胺基酸序列的VL-CDR1；(e)包含SEQ ID NO：16的胺基酸序列的VL-CDR2；和(f)包含SEQ ID NO：87的胺基酸序列的VL-CDR3。
在一些實施方案中，人源化TDP-43抗體包含選自以下的CDR：(a)包含SEQ ID NO：21的胺基酸序列的VH-CDR1；(b)包含SEQ ID NO：112的胺基酸序列的VH-CDR2；(c)包含胺基酸序列ES(Glu-Ser)的VH-CDR3；(d)包含SEQ ID NO：25的胺基酸序列的VL-CDR1；(e)包含SEQ ID NO：16的胺基酸序列的VL-CDR2；和(f)包含SEQ ID NO：87的胺基酸序列的VL- CDR3。
在一些實施方案中，人源化TDP-43抗體包含選自以下的CDR：(a)包含SEQ ID NO：21的胺基酸序列的VH-CDR1；(b)包含SEQ ID NO：122的胺基酸序列的VH-CDR2；(c)包含胺基酸序列ES(Glu-Ser)的VH-CDR3；(d)包含SEQ ID NO：25的胺基酸序列的VL-CDR1；(e)包含SEQ ID NO：16的胺基酸序列的VL-CDR2；和(f)包含SEQ ID NO：87的胺基酸序列的VL-CDR3。
在另一個實施方案中，人源化TDP-43抗體包含重鏈可變結構域(VH)，其選自SEQ ID NO：30、40、50、60、70、80、90、100、110和120，並且包括所述序列的翻譯後修飾。在一個具體實施方案中，重鏈可變結構域(VH)包含選自以下的至少一個、兩個或三個CDR：(a)包含SEQ ID NO：21的胺基酸序列的VH-CDR1；(b)包含選自SEQ ID NO：22、82、92、102、112和122的胺基酸序列的VH-CDR2；(c)包含胺基酸序列ES(Glu-Ser)的VH-CDR3。
在另一個實施方案中，人源化TDP-43抗體包含輕鏈可變結構域(VL)，其選自SEQ ID NO：34、44、54、64、74、84和94，並且包括所述序列的翻譯後修飾。在一個具體實施方案中，輕鏈可變結構域(VL)包含選自以下的至少一個、兩個或三個CDR：(a)包含選自SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：85的胺基酸序列的VH-CDR1；和(b)包含胺基酸序列SEQ ID NO：16的VL-CDR2；以及(c)包含選自SEQ ID NO：27和87的胺基酸序列的VL-CDR3。
在一些實施方案中，人源化TDP-43抗體包含：a. 包含SEQ ID NO：30的序列的重鏈可變區(VH)或與SEQ ID NO：30的胺基酸序列具有至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的重鏈可變區(VH)；或者b. 包含SEQ ID NO：40的序列的重鏈可變區(VH)或與SEQ ID NO：40的胺基酸序列具有至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的重鏈可變區(VH)；或者c. 包含SEQ ID NO：50的序列的重鏈可變區(VH)或與SEQ ID NO：50的胺基酸序列具有至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的重鏈可變區(VH)；或者 d. 包含SEQ ID NO：60的序列的重鏈可變區(VH)或與SEQ ID NO：60的胺基酸序列具有至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的重鏈可變區(VH)；或者e. 包含SEQ ID NO：70的序列的重鏈可變區(VH)或與SEQ ID NO：70的胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的重鏈可變區(VH)；或者f. 包含SEQ ID NO：80的序列的重鏈可變區(VH)或與SEQ ID NO：80的胺基酸序列具有至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的重鏈可變區(VH)；或者g. 包含SEQ ID NO：90的序列的重鏈可變區(VH)或與SEQ ID NO：90的胺基酸序列具有至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的重鏈可變區(VH)；或者h. 包含SEQ ID NO：100的序列的重鏈可變區(VH)或與SEQ ID NO：100的胺基酸序列具有至少89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的重鏈可變區(VH)；或者i. 包含SEQ ID NO：110的序列的重鏈可變區(VH)或與SEQ ID NO：110的胺基酸序列具有至少89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的重鏈可變區(VH)；或者j. 包含SEQ ID NO：120的序列的重鏈可變區(VH)或與SEQ ID NO：120的胺基酸序列具有至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的重鏈可變區(VH)。
在一些實施方案中，人源化TDP-43抗體包含：a. 包含SEQ ID NO：34的序列的輕鏈可變區(VL)或與SEQ ID NO：34的胺基酸序列具有至少97%、98%或99%序列同一性的輕鏈可變區(VL)；或者b. 包含SEQ ID NO：44的序列的輕鏈可變區(VL)或與SEQ ID NO：44的胺基酸序列具有至少96%、97%、98%或99%序列同一性的輕鏈可變區(VL)；或者c. 包含SEQ ID NO：54的序列的輕鏈可變區(VL)或與SEQ ID NO：54的胺基酸序列具有至少98%或99%序列同一性的輕鏈可變區(VL)；或者 d. 包含SEQ ID NO：64的序列的輕鏈可變區(VL)或與SEQ ID NO：64的胺基酸序列具有至少97%、98%或99%序列同一性的輕鏈可變區(VL)；或者e. 包含SEQ ID NO：74的序列的輕鏈可變區(VL)或與SEQ ID NO：74的胺基酸序列具有至少96%、97%、98%或99%序列同一性的輕鏈可變區(VL)；或者f. 包含SEQ ID NO：84的序列的輕鏈可變區(VL)或與SEQ ID NO：84的胺基酸序列具有至少97%、98%或99%序列同一性的輕鏈可變區(VL)；或者g. 包含SEQ ID NO：94的序列的輕鏈可變區(VL)或與SEQ ID NO：94的胺基酸序列具有至少96%、97%、98%或99%序列同一性的輕鏈可變區(VL)。
在一些實施方案中，人源化TDP-43結合分子，特別是人源化TDP-43抗體或抗原結合片段，包含：a)重鏈可變區(VH)，其選自：i. 包含SEQ ID NO：30的序列的重鏈可變區(VH)或與SEQ ID NO：30的胺基酸序列具有至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的重鏈可變區(VH)；或者ii. 包含SEQ ID NO：40的序列的重鏈可變區(VH)或與SEQ ID NO：40的胺基酸序列具有至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的重鏈可變區(VH)；或者iii. 包含SEQ ID NO：50的序列的重鏈可變區(VH)或與SEQ ID NO：50的胺基酸序列具有至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的重鏈可變區(VH)；或者iv. 包含SEQ ID NO：60的序列的重鏈可變區(VH)或與SEQ ID NO：60的胺基酸序列具有至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的重鏈可變區(VH)；或者v. 包含SEQ ID NO：70的序列的重鏈可變區(VH)或與SEQ ID NO：70的胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的重鏈可變區(VH)；或者vi. 包含SEQ ID NO：80的序列的重鏈可變區(VH)或與SEQ ID NO：80的胺基酸序列具有至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序 列同一性的重鏈可變區(VH)；或者vii. 包含SEQ ID NO：90的序列的重鏈可變區(VH)或與SEQ ID NO：90的胺基酸序列具有至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的重鏈可變區(VH)；或者viii. 包含SEQ ID NO：100的序列的重鏈可變區(VH)或與SEQ ID NO：100的胺基酸序列具有至少89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的重鏈可變區(VH)；或者ix. 包含SEQ ID NO：110的序列的重鏈可變區(VH)或與SEQ ID NO：110的胺基酸序列具有至少89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的重鏈可變區(VH)；或者x. 包含SEQ ID NO：120的序列的重鏈可變區(VH)或與SEQ ID NO：120的胺基酸序列具有至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的重鏈可變區(VH)；以及b)輕鏈可變區(VL)，其選自：i. 包含SEQ ID NO：34的序列的輕鏈可變區(VL)或與SEQ ID NO：34的胺基酸序列具有至少97%、98%或99%序列同一性的輕鏈可變區(VL)；或者ii. 包含SEQ ID NO：44的序列的輕鏈可變區(VL)或與SEQ ID NO：44的胺基酸序列具有至少96%、97%、98%或99%序列同一性的輕鏈可變區(VL)；或者iii. 包含SEQ ID NO：54的序列的輕鏈可變區(VL)或與SEQ ID NO：54的胺基酸序列具有至少98%或99%序列同一性的輕鏈可變區(VL)；或者iv. 包含SEQ ID NO：64的序列的輕鏈可變區(VL)或與SEQ ID NO：54的胺基酸序列具有至少97%、98%或99%序列同一性的輕鏈可變區(VL)；或者v. 包含SEQ ID NO：74的序列的輕鏈可變區(VL)或與SEQ ID NO：74的胺基酸序列具有至少96%、97%、98%或99%序列同一性的輕鏈可變區(VL)；或者vi. 包含SEQ ID NO：84的序列的輕鏈可變區(VL)或與SEQ ID NO：84的胺基酸序列具有至少97%、98%或99%序列同一性的輕鏈可變區(VL)；或者vii. 包含SEQ ID NO：94的序列的輕鏈可變區(VL)或與SEQ ID NO：94的 胺基酸序列具有至少96%、97%、98%或99%序列同一性的輕鏈可變區(VL)。
在一些實施方案中，人源化TDP-43結合分子，特別是人源化TDP-43抗體或其抗原結合片段，包含：a. 包含SEQ ID NO：60的序列的重鏈可變區(VH)或與SEQ ID NO：60的胺基酸序列具有至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的重鏈可變區(VH)；和包含SEQ ID NO：54的序列的輕鏈可變區(VL)或與SEQ ID NO：54的胺基酸序列具有至少98%或99%序列同一性的輕鏈可變區(VL)；或者b. 包含SEQ ID NO：70的序列的重鏈可變區(VH)或與SEQ ID NO：70的胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的重鏈可變區(VH)；和包含SEQ ID NO：44的序列的輕鏈可變區(VL)或與SEQ ID NO：44的胺基酸序列具有至少96%、97%、98%或99%序列同一性的輕鏈可變區(VL)；或者c. 包含SEQ ID NO：70的序列的重鏈可變區(VH)或與SEQ ID NO：70的胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的重鏈可變區(VH)；和包含SEQ ID NO：54的序列的輕鏈可變區(VL)或與SEQ ID NO：54的胺基酸序列具有至少98%或99%序列同一性的輕鏈可變區(VL)；或者d. 包含SEQ ID NO：70的序列的重鏈可變區(VH)或與SEQ ID NO：70的胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的重鏈可變區(VH)；和包含SEQ ID NO：64的序列的輕鏈可變區(VL)或與SEQ ID NO：64的胺基酸序列具有至少97%、98%或99%序列同一性的輕鏈可變區(VL)；或者e. 包含SEQ ID NO：110的序列的重鏈可變區(VH)或與SEQ ID NO：110的胺基酸序列具有至少89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的重鏈可變區(VH)；和包含SEQ ID NO：64的序列的輕鏈可變區(VL)或與SEQ ID NO：64的胺基酸序列具有至少97%、98%或99%序列同一性的輕鏈可變區(VL)；或者f. 包含SEQ ID NO：110的序列的重鏈可變區(VH)或與SEQ ID NO：110 的胺基酸序列具有至少89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的重鏈可變區(VH)；和包含SEQ ID NO：84的序列的輕鏈可變區(VL)或與SEQ ID NO：84的胺基酸序列具有至少97%、98%或99%序列同一性的輕鏈可變區(VL)；或者g. 包含SEQ ID NO：120的序列的重鏈可變區(VH)或與SEQ ID NO：120的胺基酸序列具有至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的重鏈可變區(VH)；和包含SEQ ID NO：64的序列的輕鏈可變區(VL)或與SEQ ID NO：64的胺基酸序列具有至少97%、98%或99%序列同一性的輕鏈可變區(VL)；或者h. 包含SEQ ID NO：120的序列的重鏈可變區(VH)或與SEQ ID NO：120的胺基酸序列具有至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的重鏈可變區(VH)；和包含SEQ ID NO：84的序列的輕鏈可變區(VL)或與SEQ ID NO：84的胺基酸序列具有至少97%、98%或99%序列同一性的輕鏈可變區(VL)；或者i. 包含SEQ ID NO：110的序列的重鏈可變區(VH)或與SEQ ID NO：110的胺基酸序列具有至少89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的重鏈可變區(VH)；和包含SEQ ID NO：94的序列的輕鏈可變區(VL)或與SEQ ID NO：94的胺基酸序列具有至少96%、97%、98%或99%序列同一性的輕鏈可變區(VL)；或者j. 包含SEQ ID NO：120的序列的重鏈可變區(VH)或與SEQ ID NO：120的胺基酸序列具有至少91%、92、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的重鏈可變區(VH)；和包含SEQ ID NO：94的序列的輕鏈可變區(VL)或與SEQ ID NO：94的胺基酸序列具有至少96%、97%、98%或99%序列同一性的輕鏈可變區(VL)；或者在一些實施方案中，人源化TDP-43抗體包含：a. 包含SEQ ID NO：60的序列的重鏈可變區(VH)和包含SEQ ID NO：54的序列的輕鏈可變區(VL)；或者b. 包含SEQ ID NO：70的序列的重鏈可變區(VH)和包含SEQ ID NO：44的序列的輕鏈可變區(VL)；或者 c. 包含SEQ ID NO：70的序列的重鏈可變區(VH)和包含SEQ ID NO：54的序列的輕鏈可變區(VL)；或者d. 包含SEQ ID NO：70的序列的重鏈可變區(VH)和包含SEQ ID NO：64的序列的輕鏈可變區(VL)；或者e. 包含SEQ ID NO：110的序列的重鏈可變區(VH)和包含SEQ ID NO：64的序列的輕鏈可變區(VL)；或者f. 包含SEQ ID NO：110的序列的重鏈可變區(VH)和包含SEQ ID NO：84的序列的輕鏈可變區(VL)；或者g. 包含SEQ ID NO：120的序列的重鏈可變區(VH)和包含SEQ ID NO：64的序列的輕鏈可變區(VL)；或者h. 包含SEQ ID NO：120的序列的重鏈可變區(VH)和包含SEQ ID NO：84的序列的輕鏈可變區(VL)；或者i. 包含SEQ ID NO：110的序列的重鏈可變區(VH)和包含SEQ ID NO：94的序列的輕鏈可變區(VL)；或者j. 包含SEQ ID NO：120的序列的重鏈可變區(VH)和包含SEQ ID NO：94的序列的輕鏈可變區(VL)。
在一些實施方案中，人源化TDP-43抗體包含：a. 包含SEQ ID NO：120的序列的重鏈可變區(VH)和包含SEQ ID NO：84的序列的輕鏈可變區(VL)；或者b. 包含SEQ ID NO：110的序列的重鏈可變區(VH)和包含SEQ ID NO：94的序列的輕鏈可變區(VL)；或者c. 包含SEQ ID NO：120的序列的重鏈可變區(VH)和包含SEQ ID NO：94的序列的輕鏈可變區(VL)。
在一些實施方案中，人源化TDP-43抗體包含：a. 包含SEQ ID NO：110的序列的重鏈可變區(VH)和包含SEQ ID NO：84的序列的輕鏈可變區(VL)；或者b. 包含SEQ ID NO：110的序列的重鏈可變區(VH)和包含SEQ ID NO：94的序列的輕鏈可變區(VL)；或者c. 包含SEQ ID NO：120的序列的重鏈可變區(VH)和包含SEQ ID NO： 94的序列的輕鏈可變區(VL)。
在一些實施方案中，本發明涉及人源化TDP-43結合分子，其選自：hACI-7069-633B12-Ab1_H27L23、hACI-7069-633B12-Ab1_H28L22、hACI-7069-633B12-Ab1_H28L23、hACI-7069-633B12-Ab1_H28L24、hACI-7069-633B12-Ab1_H32L24、hACI-7069-633B12-Ab1_H32L26、hACI-7069-633B12-Ab1_H33L24、hACI-7069-633B12-Ab1_H33L26、hACI-7069-633B12-Ab1_H32L27或hACI-7069-633B12-Ab1_H33L27。
優選地，人源化TDP-43結合分子選自：hACI-7069-633B12-Ab1_H33L26、hACI-7069-633B12-Ab1_H32L27或hACI-7069-633B12-Ab1_H33L27。
甚至更優選地，人源化TDP-43結合分子選自hACI-7069-633B12-Ab1_H32L26、hACI-7069-633B12-Ab1_H32L27或hACI-7069-633B12-Ab1_H33L27。
在一個優選的實施方案中，人源化TDP-43結合分子是hACI-7069-633B12-Ab1_H33L27。
在一些實施方案中，本發明的人源化TDP-43結合分子，特別是人源化TDP-43抗體或其抗原結合片段，包含pI低於7.8、優選低於7.5、更優選低於7.0的Fv。
在一些實施方案中，本發明的人源化TDP-43結合分子，特別是人源化TDP-43抗體或其抗原結合片段，包含pH 7.4下的淨電荷低於0.2、優選低於-0.8、更優選低於-1.8的Fv。
在一些實施方案中，本發明的人源化TDP-43結合分子，特別是人源化TDP-43抗體或其抗原結合片段，包含pI低於7.0且淨電荷低於-1.8的Fv。
在本發明的一些實施方案中，本發明的人源化抗TDP-43結合分子在小鼠中的清除率等於或小於0.50mL/小時/kg，特別是等於或小於0.25mL/小時/kg，更特別是等於或小於0.18mL/小時/kg。在一些實施方案中，本發明的人源化TDP-43結合分子，特別是人源化TDP-43抗體或其抗原結合片段，在 Tg32小鼠中呈現至少8天、優選至少10天、更優選至少12天的半衰期。在一個實施方案中，人源化TDP-43結合分子可以是hACI-7069-633B12-Ab1_H33L27或hACI-7069-633B12-Ab1_H32L27。關於清除率(如全身性，CL)和半衰期(T1/2β)的測量結果可參考實施例5。
在本發明的一些實施方案中，本發明的人源化抗TDP-43結合分子的NHP清除率等於或小於0.27mL/小時/kg，特別是等於或小於0.12mL/小時/kg，更特別是等於或小於0.08mL/小時/kg。在一些實施方案中，本發明的人源化TDP-43結合分子，特別是人源化TDP-43抗體或其抗原結合片段，在NHP中呈現至少6天、優選至少8天、例如至少10或12天的半衰期。在一個實施方案中，人源化TDP-43結合分子可以是hACI-7069-633B12-Ab1_H33L27或hACI-7069-633B12-Ab1_H32L27。關於清除率(如全身性，CL)和半衰期(T1/2β)的測量結果可參考實施例6。
在一些實施方案中，本發明的人源化TDP-43結合分子，特別是人源化TDP-43抗體或其抗原結合片段，呈現至少20天、優選至少24天、例如至少26天的所預測人半衰期。所預測的人半衰期可以是27至30天，或17至22天。人源化TDP-43結合分子可以是hACI-7069-633B12-Ab1_H33L27或hACI-7069-633B12-Ab1_H32L27。關於如何從Tg32小鼠和/或食蟹猴的半衰期計算所預測的人半衰期，可參考實施例9。
在一些實施方案中，提供了(分離的)核酸，其中所述(分離的)核酸編碼人源化TDP-43結合分子，特別是本文所述的人源化TDP-43抗體及其片段。
在一些實施方案中，提供了(分離的)核酸，其中所述(分離的)核酸包含編碼人源化抗TPD-43抗體的SEQ ID NO：38。
在一些實施方案中，提供了(分離的)核酸，其中所述(分離的)核酸包含編碼人源化抗TPD-43抗體的SEQ ID NO：48。
在一些實施方案中，提供了(分離的)核酸，其中所述(分離的)核酸包含編碼人源化抗TPD-43抗體的SEQ ID NO：58。
在一些實施方案中，提供了(分離的)核酸，其中所述(分離的)核酸包含編碼人源化抗TPD-43抗體的SEQ ID NO：68。
在一些實施方案中，提供了(分離的)核酸，其中所述(分離的)核酸包含編碼人源化抗TPD-43抗體的SEQ ID NO：78。
在一些實施方案中，提供了(分離的)核酸，其中所述(分離的)核酸包含編碼人源化抗TPD-43抗體的SEQ ID NO：88。
在一些實施方案中，提供了(分離的)核酸，其中所述(分離的)核酸包含編碼人源化抗TPD-43抗體的SEQ ID NO：98。
在一些實施方案中，提供了(分離的)核酸，其中所述(分離的)核酸包含編碼人源化抗TPD-43抗體的SEQ ID NO：108。
在一些實施方案中，提供了(分離的)核酸，其中所述(分離的)核酸包含編碼人源化抗TPD-43抗體的SEQ ID NO：118。
在一些實施方案中，提供了(分離的)核酸，其中所述(分離的)核酸包含編碼人源化抗TPD-43抗體的SEQ ID NO：128。
在一些實施方案中，提供了(分離的)核酸，其中所述(分離的)核酸包含編碼人源化抗TPD-43抗體的SEQ ID NO：39。
在一些實施方案中，提供了(分離的)核酸，其中所述(分離的)核酸包含編碼人源化抗TPD-43抗體的SEQ ID NO：49。
在一些實施方案中，提供了(分離的)核酸，其中所述(分離的)核酸包含編碼人源化抗TPD-43抗體的SEQ ID NO：59。
在一些實施方案中，提供了(分離的)核酸，其中所述(分離的)核酸包含編碼人源化抗TPD-43抗體的SEQ ID NO：69。
在一些實施方案中，提供了(分離的)核酸，其中所述(分離的)核酸包含編碼人源化抗TPD-43抗體的SEQ ID NO：79。
在一些實施方案中，提供了(分離的)核酸，其中所述(分離的)核酸包含編碼人源化抗TPD-43抗體的SEQ ID NO：89。
在一些實施方案中，提供了(分離的)核酸，其中所述(分離的)核酸包含編碼人源化抗TPD-43抗體的SEQ ID NO：99。
XII. 組合物和方法
本發明還涉及包含如本文中所述的本發明人源化TDP-43結合分 子，特別是人源化抗體或其抗原結合片段以及可藥用載體和/或賦形劑和/或稀釋劑的藥物組合物。
在一些實施方案中，提供了藥物組合物，其包含本文中所述的(分離的)人源化抗體和可藥用載體。
在一些實施方案中，提供了包含以下的綴合的結合分子，特別是抗體或其抗原結合片段：本文中所述的結合分子，特別是抗體或其抗原結合片段，和綴合分子。本發明的綴合物可被稱為免疫綴合物。根據本發明可使用任何合適的綴合分子。一些合適的實例包括但不限於：酶(例如鹼性磷酸酶或辣根過氧化物酶)、親和素、鏈黴親和素、生物素、蛋白A/G、磁珠、螢光團、放射性同位素(即放射性綴合物)、核酸分子、可檢測標記、治療劑、毒素和血腦屏障穿透部分。綴合方法是本領域公知的，並且用於使抗體與標記或其他分子綴合的數種技術是可商購的。綴合通常是通過包含在本發明結合分子內的胺基酸殘基(例如離胺酸、組胺酸或半胱胺酸)的。它們可依賴於例如NHS(琥珀醯亞胺)酯法、異硫氰酸酯法、碳二亞胺法和高碘酸鹽法的方法。綴合可通過例如產生融合蛋白來實現。這在結合分子與另一蛋白質分子綴合的情況下是合適的。因此，可形成合適的遺傳構建體，其允許本發明的結合分子與標記或其他分子的融合體的表達。綴合可以是通過合適的接頭部分的，以確保抗體與綴合分子(例如可檢測標記)的合適空間分離。但是，並非在所有情況下都需要接頭。在一些實施方案中，本發明的人源化TDP-43特異性結合分子與可檢測標記連接。
本發明還涉及包含與一種或更多種治療劑綴合的本文中提供的人源化TDP-43結合分子的免疫綴合物，所述治療劑例如：化學治療劑或藥物、生長抑制劑、毒素(例如細菌、真菌、植物或動物來源的蛋白質毒素、酶活性毒素，或其片段)、放射性同位素(即放射性綴合物)、血腦屏障穿透部分或可檢測標記。存在多種用於改善如本文中所討論的穿過血腦屏障(BBB)的藥物遞送的技術，該討論加以必要的修改應用。非侵入性技術包括所謂的“特洛伊木馬方法”，其中綴合分子通過與BBB受體結合並介導轉運來遞送本發明的結合分子。合適的分子可包含內源性配體或抗體，特別是單克隆抗體，其結合BBB受體上的特定表位。
在一些實施方案中，提供了免疫綴合物，其中所述免疫綴合物包 含本文中所述的(分離的)人源化抗體和治療劑。在一些實施方案中，提供了經標記人源化抗體，其包含本文中所述的人源化抗體和可檢測標記。
在一些實施方案中，人源化TDP-43特異性結合分子是其中人源化TDP-43特異性結合分子與另一合適的治療劑共價連接的免疫綴合物的一部分。
在一些實施方案中，人源化TDP-43特異性結合分子或包含其的免疫綴合物作為包含人源化TDP-43特異性結合分子的組合物存在。
在一些實施方案中，人源化TDP-43特異性結合分子是包含與可藥用載體和/或賦形劑和/或稀釋劑組合的以下的藥物組合物的一部分：人源化TDP-43特異性結合分子，或其中人源化TDP-43特異性結合分子與另一合適的治療劑共價連接的免疫綴合物，或包含人源化TDP-43特異性結合分子的組合物。
在一些實施方案中，人源化TDP-43特異性結合分子是包含以下的檢測和/或診斷試劑盒的一部分：人源化TDP-43特異性結合分子，或其中人源化TDP-43特異性結合分子與另一合適的治療劑共價連接的免疫綴合物，或包含人源化TDP-43特異性結合分子的組合物。
還提供了包含本發明的人源化結合分子的試劑盒。特別地，這樣的試劑盒可用於進行本發明的診斷方法(其包括分類、監測和治療選擇方法)。因此，提供了用於診斷與TDP-43相關、特別是與TDP-43聚集體相關的疾病、障礙和/或異常、或TDP-43蛋白質病或者用於本發明方法的試劑盒，其包含本發明的人源化TDP-43特異性結合分子。這樣的試劑盒可包含用於進行本文中提供的方法的所有必要組分。通常來說，每種組分單獨儲存在單個整體包裝中。包含在試劑盒中的合適的另外的組分是例如緩衝劑、可檢測染料、實驗室設備、反應容器、說明書，等。使用說明書可針對待使用試劑盒的具體方法進行定制。還提供了經適當標記的本發明的人源化TDP-43結合分子，其可包含在這樣的試劑盒中。
在一些實施方案中，人源化TDP-43特異性結合分子用於用於預防、診斷或治療TDP-43蛋白質病的免疫診斷方法中。
在一些實施方案中，人源化TDP-43特異性結合分子，或其中人 源化TDP-43特異性結合分子與另一合適的治療劑共價連接的免疫綴合物，或包含人源化TDP-43特異性結合分子的組合物向有此需要的對象施用，或用於診斷、預防、減輕或治療包括但不限於以下的與TDP-43相關、特別是與TDP-43聚集體相關的疾病、障礙和/或異常、或TDP-43蛋白質病：額顳葉失智症(FTD)、肌肉萎縮性脊髓側索硬化症(ALS)、阿茲海默症(AD)、帕金森病(PD)、慢性創傷性腦病(CTE)、邊緣為主的年齡相關性TDP-43腦病(LATE)。
在一些實施方案中，人源化TDP-43特異性結合分子，或其中人源化TDP-43特異性結合分子與另一合適的治療劑共價連接的免疫綴合物，或包含人源化TDP-43特異性結合分子的組合物向有此需要的對象施用，或用於診斷或監測選自以下的與TDP-43相關、特別是與TDP-43聚集體相關的疾病、障礙和/或異常、或TDP-43蛋白質病的方法中：額顳葉失智症(FTD，例如散發性或家族性、伴有或不伴有運動神經元病(MND)、有顆粒蛋白前體(GRN)突變、有C9orf72突變、有TARDBP突變、有含纈酪肽蛋白(VCP)突變、與染色體9p相關、皮質基底節變性、有泛素陽性TDP-43包涵體的額顳葉變性(FTLD)(FTLD-TDP)、嗜銀顆粒病、皮克病、語義變異型原發性進行性失語(svPPA)、行為變異型FTD(bvFTD)、非流利性變異型原發性進行性失語(nfvPPA)，等)、肌肉萎縮性脊髓側索硬化症(ALS，例如散發性ALS、有TARDBP突變、有血管生成蛋白(ANG)突變)、亞歷山大病(AxD)、邊緣為主的年齡相關性TDP-43腦病(LATE)、慢性創傷性腦病(CTE)、佩里綜合症、阿茲海默症(AD，包括散發性和家族性形式的AD)、唐氏綜合症、家族性英國型癡呆、多聚谷氨醯胺病(亨廷頓病和脊髓小腦共濟失調3型(SCA3；也稱為馬-約病))、海馬硬化性癡呆和肌病(散發性包涵體肌炎；包涵體肌病，有含纈酪肽蛋白(VCP)突變；以及佩吉特骨病和額顳葉失智症)；有鑲邊空泡的眼咽肌營養不良；有肌收縮蛋白(MYOT)基因突變或編碼結蛋白(DES)之基因的突變的肌原纖維肌病、創傷性腦損傷(TBI)、路易體失智症(DLB)或帕金森病(PD)。
在另一些實施方案中，本發明涉及用於檢測、診斷或監測選自以下的與TDP-43相關、特別是與TDP-43聚集體相關的疾病、障礙和/或異常、或TDP-43蛋白質病的任何方法：額顳葉失智症(FTD)、肌肉萎縮性脊髓側索硬化症(ALS)、阿茲海默症(AD)、帕金森病(PD)、慢性創傷性腦病(CTE)和邊 緣為主的年齡相關性TDP-43腦病(LATE)。
優選地，與TDP-43相關、特別是與TDP-43聚集體相關的疾病、障礙和/或異常、或TDP-43蛋白質病選自肌肉萎縮性脊髓側索硬化症(ALS)、阿茲海默症(AD)和額顳葉失智症(FTD)。更優選地，與TDP-43相關、特別是與TDP-43聚集體相關的疾病、障礙和/或異常、或TDP-43蛋白質病是肌肉萎縮性脊髓側索硬化症(ALS)。更優選地，與TDP-43相關、特別是與TDP-43聚集體相關的疾病、障礙和/或異常、或TDP-43蛋白質病是阿茲海默症(AD)。更優選地，與TDP-43相關、特別是與TDP-43聚集體相關的疾病、障礙和/或異常、或TDP-43蛋白質病是額顳葉失智症(FTD)。
在一些實施方案中，人源化TDP-43特異性結合分子用於這樣的方法中：其用於診斷症狀前疾病或用於監測疾病進展和治療效力，或用於預測回應性，或用於選擇可能對用人源化TDP-43特異性結合分子進行的治療作出回應的對象。所述方法優選地使用人血液或尿的樣品進行。最優選地，所述方法涉及基於ELISA的測定或表面適應測定。
在一些實施方案中，人源化TDP-43特異性結合分子用於其中使本發明的人源化TDP-43特異性結合分子與樣品(例如，血液、尿液、腦脊液、組織間液(ISF)或腦組織)接觸以檢測、診斷或監測以下的方法中：額顳變性(FTD)或肌肉萎縮性脊髓側索硬化症(ALS)、阿茲海默症(AD)、慢性創傷性腦病(CTE)、佩里綜合症、邊緣為主的年齡相關性TDP-43腦病(LATE)和/或帕金森病(PD)。
在一些實施方案中，人源化TDP-43特異性結合分子用於其中使本發明的人源化TDP-43特異性結合分子與樣品(例如，血液、尿液、腦脊液、組織間液(ISF)或腦組織)接觸以檢測、診斷或監測選自以下的疾病的方法中：額顳葉失智症(FTD，例如散發性或家族性、伴有或不伴有運動神經元病(MND)、有顆粒蛋白前體(GRN)突變、有C9orf72突變、有TARDBP突變、有含纈酪肽蛋白(VCP)突變、與染色體9p相關、皮質基底節變性、有泛素陽性TDP-43包涵體的額顳葉變性(FTLD)(FTLD-TDP)、嗜銀顆粒病、皮克病、語義變異型原發性進行性失語(svPPA)、行為變異型FTD(bvFTD)、非流利性變異型原發性進行性失語(nfvPPA)，等)、肌肉萎縮性脊髓側索硬化症(ALS，例如散發性 ALS，有TARDBP突變、有血管生成蛋白(ANG)突變)、亞歷山大病(AxD)、邊緣為主的年齡相關性TDP-43腦病(LATE)、慢性創傷性腦病(CTE)、佩里綜合症、阿茲海默症(AD，包括散發性和家族性形式的AD)、唐氏綜合症、家族性英國型癡呆、多聚谷氨醯胺病(亨廷頓病和脊髓小腦共濟失調3型(SCA3；也稱為馬-約病))、海馬硬化性癡呆和肌病(散發性包涵體肌炎；包涵體肌病，有含纈酪肽蛋白(VCP)突變；以及佩吉特骨病和額顳葉失智症)；有鑲邊空泡的眼咽肌營養不良；有肌收縮蛋白(MYOT)基因突變或編碼結蛋白(DES)之基因的突變的肌原纖維肌病、創傷性腦損傷(TBI)、路易體失智症(DLB)或帕金森病(PD)。
在一些實施方案中，人源化TDP-43特異性結合分子，或其中人源化TDP-43特異性結合分子與另一合適的治療劑共價連接的免疫綴合物，或包含人源化TDP-43特異性結合分子的組合物施用於有此需要的對象，或者用於預防、減輕或治療與TDP-43相關、特別是與TDP-43聚集體相關的疾病、障礙和/或異常、或TDP-43蛋白質病、或額顳變性(FTD)或肌肉萎縮性脊髓側索硬化症(ALS)、阿茲海默症(AD，包括散發性和家族性形式的AD)、慢性創傷性腦病(CTE)、佩里綜合症和邊緣為主的年齡相關性TDP-43腦病(LATE)和/或帕金森病(PD)。
在一些實施方案中，人源化TDP-43特異性結合分子，或其中人源化TDP-43特異性結合分子與另一合適的治療劑共價連接的免疫綴合物，或包含人源化TDP-43特異性結合分子的組合物施用於有此需要的對象，或者用於治療選自以下的疾病：額顳葉失智症(FTD，例如散發性或家族性、伴有或不伴有運動神經元病(MND)、有顆粒蛋白前體(GRN)突變、有C9orf72突變、有TARDBP突變、有含纈酪肽蛋白(VCP)突變、與染色體9p相關、皮質基底節變性、有泛素陽性TDP-43包涵體的額顳葉變性(FTLD)(FTLD-TDP)、嗜銀顆粒病、皮克病、語義變異型原發性進行性失語(svPPA)、行為變異型FTD(bvFTD)、非流利性變異型原發性進行性失語(nfvPPA)，等)、肌肉萎縮性脊髓側索硬化症(ALS，例如散發性ALS、有TARDBP突變、有血管生成蛋白(ANG)突變)、亞歷山大病(AxD)、邊緣為主的年齡相關性TDP-43腦病(LATE)、慢性創傷性腦病(CTE)、佩里綜合症、阿茲海默症(AD，包括散發性和家族性形式的AD)、 唐氏綜合症、家族性英國型癡呆、多聚谷氨醯胺病(亨廷頓病和脊髓小腦共濟失調3型(SCA3；也稱為馬-約病))、海馬硬化性癡呆和肌病(散發性包涵體肌炎；包涵體肌病，有含纈酪肽蛋白(VCP)突變；以及佩吉特骨病和額顳葉失智症)；有鑲邊空泡的眼咽肌營養不良；有肌收縮蛋白(MYOT)基因突變或編碼結蛋白(DES)之基因的突變的肌原纖維肌病、創傷性腦損傷(TBI)、路易體失智症(DLB)或帕金森病(PD)。優選地，所述疾病治療有助於保持或提高心理認知，和/或降低腦中TDP-43聚集體的水準。
在一些實施方案中，人源化TDP-43特異性結合分子，或其中人源化TDP-43特異性結合分子與另一合適的治療劑共價連接的免疫綴合物，或包含人源化TDP-43特異性結合分子的組合物施用於有此需要的對象，或者用於製造用於治療以下的藥物：與TDP-43相關、特別是與TDP-43聚集體相關的疾病、障礙和/或異常、或TDP-43蛋白質病、或額顳變性(FTD)或肌肉萎縮性脊髓側索硬化症(ALS)、阿茲海默症(AD，包括散發性和家族性形式的AD)、慢性創傷性腦病(CTE)、佩里綜合症和邊緣為主的年齡相關性TDP-43腦病(LATE)和/或帕金森病(PD)。
如本文中所述的人源化抗TDP-43抗體(TDP-43特異性結合分子的優選類型)或免疫綴合物的藥物製劑通過將具有所期望純度的這樣的人源化抗體或免疫綴合物與一種或更多種任選的可藥用載體和/或賦形劑和/或稀釋劑(Remington’s Pharmaceutical Sciences第16版，Osol,A.Ed.(1980))混合來製備。通常來說，抗體或其片段被製備為凍幹製劑或水溶液。可藥用載體通常在所採用的劑量和濃度下對接受者無毒，並且包括但不限於：緩衝劑，例如磷酸鹽、檸檬酸鹽和其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸和甲硫胺酸；防腐劑(例如十八烷基二甲基苄基氯化銨；氯化六甲雙銨；苯紮氯銨；苄索氯銨；酚、丁醇或苄醇；對羥基苯甲酸烷基酯，例如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯；鄰苯二酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇和間甲酚)；低分子量(少於約10個殘基)多肽；蛋白質，例如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；胺基酸，例如甘胺酸、谷氨醯胺、天門冬醯胺、組胺酸、精胺酸或離胺酸；單糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，例如EDTA；糖，例如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成鹽反離子，例如鈉；金屬絡合物 (例如Zn蛋白質絡合物)；和/或非離子表面活性劑，例如聚乙二醇(PEG)。本文中的示例性可藥用載體還包括間質藥物分散劑，例如可溶性中性活性透明質酸酶糖蛋白(soluble neutral-active hyaluronidase glycoprotein，sHASEGP)，例如人可溶性PH-20透明質酸酶糖蛋白，例如rHuPH20(HYLENEX®，Baxter International，Inc.)。某些示例性sHASEGP和使用方法，包括rHuPH20，描述於美國專利公開No.2005/0260186和2006/0104968中。在一個方面中，將sHASEGP與一種或更多種另外的糖胺聚糖酶(glycosaminoglycanase)例如軟骨素酶組合。可用於配製組合物的可藥用賦形劑包括但不限於：離子交換劑、氧化鋁、硬脂酸鋁、卵磷脂、血清蛋白例如人血清白蛋白、緩衝物質例如磷酸鹽、甘胺酸、山梨酸、山梨酸鉀、飽和植物脂肪酸的偏甘油酯混合物、水、鹽或電解質，例如硫酸魚精蛋白、磷酸氫二鈉、磷酸氫鉀、氯化鈉、鋅鹽、膠體二氧化矽、三矽酸鎂、聚乙烯吡咯烷酮、基於纖維素的物質(例如羧甲基纖維素鈉)、聚乙二醇、聚丙烯酸酯、蠟、聚乙烯-聚氧丙烯-嵌段聚合物、聚乙二醇和羊毛脂。稀釋劑可以是緩衝劑。其可包含選自磷酸鹽、乙酸鹽、檸檬酸鹽、琥珀酸鹽和酒石酸鹽的鹽，和/或其中緩衝劑包含組胺酸、甘胺酸、TRIS甘胺酸、Tris或其混合物。在本發明的上下文中進一步設想稀釋劑是選自磷酸鉀、乙酸/乙酸鈉、檸檬酸/檸檬酸鈉、琥珀酸/琥珀酸鈉、酒石酸/酒石酸鈉、和組胺酸/組胺酸HCl或其混合物的緩衝劑。
示例性的凍幹抗體或免疫綴合物製劑描述於美國專利No.6,267,958中。水性抗體或免疫綴合物製劑包括描述於美國專利No.6,171,586和WO2006/044908中的那些，後者的製劑包含組胺酸-乙酸鹽緩衝劑。
針對所治療的特定適應證，本文中的製劑必要時還可包含多於一種的活性成分，優選具有不彼此不利影響的互補活性的那些。
可將活性成分包封在例如通過凝聚技術或通過介面聚合而製備的微囊，例如分別羥甲基纖維素或明膠微囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微囊中；在膠體藥物遞送系統(例如，脂質體、白蛋白微球、微乳劑、納米粒和納米囊)中；或在粗乳劑(macroemulsion)中。這樣的技術公開於Remington’s Pharmaceutical Sciences第16版，Osol,A.Ed.(1980)中。
可製備緩釋製劑。緩釋製劑的一些合適實例包括包含抗體或免疫 綴合物的固體疏水聚合物的半透性基質，該基質為成型製品的形式，例如，膜或微囊。用於體內施用的製劑通常是無菌的。無菌可例如通過經由無菌濾膜進行過濾容易地實現。
本文中提供的任何人源化抗原結合分子、人源化抗TDP-43抗體或免疫綴合物可用於方法，例如治療方法中。
在另一個方面中，提供了用作藥物的人源化抗TDP-43抗體(人源化TDP-43特異性結合分子的優選類型)或免疫綴合物。在另外的方面中，提供了用於治療方法中的抗錯折疊人源化TDP-43抗體(人源化TDP-43特異性結合分子的優選類型)或免疫綴合物。在某些實施方案中，提供了用於預防、診斷和/或治療TDP-43蛋白質病的人源化抗TDP-43抗體(人源化TDP-43特異性結合分子的優選類型)或免疫綴合物。在本發明的一個優選實施方案中，提供了人源化抗TDP-43抗體(人源化TDP-43特異性結合分子的優選類型)或免疫綴合物，用於預防、診斷和/或治療包括但不限於以下的與TDP-43相關、特別是與TDP-43聚集體相關的疾病、障礙和/或異常、或TDP-43蛋白質病：額顳葉失智症(FTD)、肌肉萎縮性脊髓側索硬化症(ALS)、阿茲海默症(AD)、帕金森病(PD)、慢性創傷性腦病(CTE)和/或邊緣為主的年齡相關性TDP-43腦病(LATE)。
在另一個方面中，本發明提供了人源化抗TDP-43抗體(人源化TDP-43特異性結合分子的優選類型)或免疫綴合物在製造或製備藥物中的用途。在一個這樣的實施方案中，該方法還包括向個體施用有效量的至少一種另外的治療劑，例如，如下所述。
根據一些實施方案中的任一個，“對象”或“個體”可以是動物，哺乳動物，優選人。
在另一個方面中，本發明提供了例如用於治療方法中任一種的包含本文中提供的任何人源化抗TDP-43抗體(人源化TDP-43特異性結合分子的優選類型)或免疫綴合物的藥物製劑。在一個實施方案中，藥物製劑包含本文中提供的任何人源化抗TDP-43抗體(人源化TDP-43特異性結合分子的優選類型)或免疫綴合物，以及可藥用載體和/或賦形劑和/或稀釋劑(如在本文中其他部分討論的)。在另一個實施方案中，藥物製劑包含本文中提供的任何人源化抗TDP-43抗體(人源化TDP-43特異性結合分子的優選類型)或免疫綴合物，以及至少 一種另外的治療劑，例如如下所述。
本發明的人源化抗體或免疫綴合物在治療中可單獨使用或與其他藥劑組合使用。例如，本發明的人源化抗體(人源化TDP-43特異性結合分子的優選類型)或免疫綴合物可與靶向α-突觸核蛋白、BACE1、Tau、β-澱粉樣蛋白、TDP-43或神經炎症蛋白的至少一種另外的治療劑共施用。
例如，本發明的人源化抗體(人源化TDP-43特異性結合分子的優選類型)或免疫綴合物可與至少一種另外的治療劑共施用，所述治療劑選自但不限於神經藥物、抗-β澱粉樣蛋白抗體、抗Tau抗體、Tau聚集抑制劑(包括小分子)、β-澱粉樣蛋白聚集抑制劑(包括小分子)、抗BACE1抗體、BACE1抑制劑、抗α-突觸核蛋白抑制劑、抗α-突觸核蛋白抗體和神經炎症抑制劑。
以上所述的這樣的組合治療涵蓋組合施用(其中兩種或更多種治療劑包含在同一或分開的製劑中)和分開施用，在分開施用的情況下，本發明的人源化抗體(人源化TDP-43特異性結合分子的優選類型)或免疫綴合物的施用可在施用另外的治療劑和/或輔助劑之前、同時和/或之後發生。本發明的人源化抗體(人源化TDP-43特異性結合分子的優選類型)或免疫綴合物也可與放射治療組合使用。
本發明的人源化抗體(人源化TDP-43特異性結合分子的優選類型)或免疫綴合物(和任何另外的治療劑)可通過任何合適的手段施用，包括腸胃外、肺內和鼻內、以及如果需要的話，進行局部治療、病灶內、子宮內或膀胱內施用。腸胃外輸注包括肌內、靜脈內、動脈內、腹膜內或皮下施用。給藥可通過任何合適的途徑，例如通過注射，例如靜脈內或皮下注射來進行，這部分取決於短暫還是長期施用。本文中考慮了多種給藥方案，包括但不限於單次施用或在不同時間點內的多次施用、推注施用(bolus administration)和脈衝輸注。
本發明的人源化抗體(人源化TDP-43特異性結合分子的優選類型)或免疫綴合物可以以與良好醫學實踐一致的方式配製、給藥和施用。在該情況下考慮的因素包括：治療的與TDP-43相關、特別是與TDP-43聚集體相關的特定疾病、障礙和/或異常、或TDP-43蛋白質病；治療的特定哺乳動物；個體對象的臨床狀況；與TDP-43相關、特別是與TDP-43聚集體相關的疾病、障礙和/或異常、或TDP-43蛋白質病的原因；藥劑的遞送部位；施用方法；施用方案； 以及醫學實踐者已知的其他因素。人源化抗體或免疫綴合物不需要但任選地與目前用於預防或治療所討論的與TDP-43相關、特別是與TDP-43聚集體相關的疾病、障礙和/或異常、或TDP-43蛋白質病的一種或更多種藥劑一起配製。這樣的其他藥劑的有效量取決於存在於製劑中的人源化抗體或免疫綴合物的量；與TDP-43相關、特別是與TDP-43聚集體相關的疾病、障礙和/或異常、或TDP-43蛋白質病的類型；或者治療，以及上述其他因素。這些通常以與如本文中所述的相同的劑量和施用途徑，或以本文中所述劑量的約1%至99%，或以憑經驗/在臨床上確定合適的任何劑量和任何途徑使用。
對於預防或治療疾病，本發明的人源化抗體(人源化TDP-43特異性結合分子的優選類型)或免疫綴合物(當單獨地或與一種或更多種其他另外的治療劑組合使用時)的合適劑量將取決於待治療的疾病類型、抗體或免疫綴合物的類型、疾病的嚴重程度和原因、是出於預防目的還是治療目的施用抗體或免疫綴合物、先前治療、對象的臨床史和對抗體或免疫綴合物的回應，以及主治醫師的判斷。將人源化抗體(人源化TDP-43特異性結合分子的優選類型)或免疫綴合物適當地一次或通過一系列治療施用於對象。根據疾病的類型和嚴重程度，約1μg/kg至15mg/kg(例如0.1mg/kg至10mg/kg)的人源化抗體(人源化TDP-43特異性結合分子的優選類型)或免疫綴合物可以是用於向對象施用的初始候選劑量，無論例如是通過一次或更多次分開的施用，還是通過連續輸注。根據上述因素，一種典型的日劑量可以是約1μg/kg至100mg/kg或更高。對於在數天或更長時間內的重複施用，根據病症，通常將持續治療直至出現所期望的疾病症狀抑制。人源化抗體或免疫綴合物的一個示例性劑量是約0.05mg/kg至約10mg/kg。因此，可向對象施用約0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg或10mg/kg的一個或更多個劑量(或其任意組合)。這樣的劑量可間歇地施用，例如，每週或每三周(例如，使對象接受約2至約20，或例如約6個劑量的抗體)。可施用較高的初始負荷劑量，隨後施用一個或更多個較低的劑量。然而，可使用其他劑量方案。該治療的進展通過常規技術和測定容易地監測。
應當理解，任何以上製劑或治療方法可使用本發明的免疫綴合物和人源化抗TDP-43抗體(人源化TDP-43特異性結合分子的優選類型)二者來進行。
在本發明的另一個方面中，提供了包含上述可用於治療、預防和/或診斷與TDP-43相關、特別是與TDP-43聚集體相關的疾病、障礙或異常、或TDP-43蛋白質病的材料的製品。該製品包含容器以及在容器上或與容器相聯接的標記或包裝***物。合適的容器包括例如瓶、小瓶、注射器、IV溶液袋等。容器可由多種材料，例如玻璃或塑膠形成。容器容納單獨地或與另一組合物組合有效治療、預防和/或診斷與TDP-43相關、特別是與TDP-43聚集體相關的疾病、障礙和/或異常、或TDP-43蛋白質病的組合物，並且可具有無菌進入口(例如，容器可以是靜脈內溶液袋或具有可通過皮下注射針刺穿的塞的小瓶)。組合物中的至少一種活性劑是本發明的人源化抗體或免疫綴合物。標記或包裝***物指示所述組合物用於治療所選擇的病症。
此外，該製品可包含：(a)第一容器，其中包含組合物，其中所述組合物包含本發明的人源化抗體(人源化TDP-43特異性結合分子的優選類型)或免疫綴合物；以及(b)第二容器，其中包含組合物，其中所述組合物包含另外的治療劑。在本發明的該實施方案中的製品可還包含指示所述組合物可用於治療特定病症的包裝***物。作為替代或補充，該製品可還包含第二(或第三)容器，所述第二(或第三)容器包含可藥用緩衝劑，例如抑菌注射用水(Bacteriostatic Water For Injection，BWFI)、磷酸緩衝鹽水、林格溶液或右旋糖溶液。其還可包含從商業和使用者的角度來看所期望的其他材料，包括其他緩衝劑、稀釋劑、濾器、針和注射器。
在另一個實施方案中，本發明涉及在對象中保持或提高認知記憶能力、運動和語言功能或者預防和/或減慢認知記憶能力、運動和語言功能的衰退的方法，其包括施用本發明的人源化結合分子、本發明的免疫綴合物、本發明的組合物或本發明的藥物組合物。
在另一個實施方案中，本發明涉及降低TDP-43水準的方法，其包括施用本發明的人源化結合分子、本發明的免疫綴合物、本發明的組合物或本發明的藥物組合物。
本發明的方法可包括施用至少一種另外的治療，優選地其中所述另外的治療選自但不限於：靶向α-突觸核蛋白、BACE1、tau、β-澱粉樣蛋白、TDP-43或神經炎症蛋白的抗體或小分子，特別是神經藥物、抗β-澱粉樣蛋白抗 體、抗Tau抗體、Tau聚集抑制劑、β-澱粉樣蛋白聚集抑制劑、抗BACE1抗體、BACE1抑制劑、抗α-突觸核蛋白抗體和神經炎症抑制劑。
本發明還涉及檢測TDP-43的方法，其包括使樣品與本發明的人源化結合分子，優選本發明的人源化抗體接觸，其中所述樣品是腦樣品、腦脊液樣品、組織間液(ISF)樣品、尿樣品或血液樣品。
在另一些實施方案中，本發明涉及檢測和/或測量TDP-43水準的方法，其包括使用單分子陣列(SIMOA®)技術將樣品與本發明的人源化結合分子、優選本發明的人源化抗體接觸，其中樣品是人血液樣品、腦脊液樣品(CSF)、組織間液(ISF)樣品或尿樣品，優選CSF樣品。
在某些實施方案中，如本文中提供的人源化TDP-43結合分子，特別是人源化TDP-43抗體及其片段的解離常數(dissociation constant，KD)為
Figure 112105586-A0304-12-0077-87
1μM、
Figure 112105586-A0304-12-0077-88
100nM、
Figure 112105586-A0304-12-0077-89
10nM、
Figure 112105586-A0304-12-0077-90
1nM、
Figure 112105586-A0304-12-0077-91
0.1nM、
Figure 112105586-A0304-12-0077-92
0.01nM或
Figure 112105586-A0304-12-0077-93
0.001nM(例如10-8M或更少，例如10-8M至10-13M，例如10-9M至10-13M)，特別是關於結合TDP-43，特別是可溶性TDP-43。例如，本發明的人源化TDP-43結合分子對於可溶性全長TDP-43的KD可以為2nM或更小，在一些具體實施方案中為1nM或更小，在一些更具體的實施方案中，對於可溶性全長TDP-43的KD為700pM或更小，優選250pM或更小。參考表8，在實施例3中對本發明的人源化TDP-43結合分子證明了這一點。在一個實施方案中，對全長(Full Length，FL)TDP-43的結合親和力可通過使用表面等離激元共振(surface plasmon resonance，SPR；Biacore 8K，GE Healthcare Life Sciences)測定解離常數(KD)來評價。對於可採用的合適SPR方法的詳細描述，可參考實施例3。
本發明的人源化TDP-43結合分子對於TP-51肽的KD可為15nM或更小，在一些具體實施方案中為10nM或更小，例如4nM或更小並且優選2nM或更小。參考表8，在實施例3中對本發明的人源化TDP-43結合分子也證明了這一點。
因此，本發明的人源化TDP-43結合分子對於可溶性全長TDP-43的KD為575pM或更小且對於TP-51肽的KD為2.2nM或更小，對於可溶性全長TDP-43的KD為575pM或更小且對於TP-51肽的KD為1.6nM或更小，對於可溶性全長TDP-43的KD為550pM或更小且對於TP-51肽的KD為 2.2nM或更小，優選對於可溶性全長TDP-43的KD為550pM或更小且對於TP-51肽的KD為2nM或更小，更優選對於可溶性全長TDP-43的KD為250pM或更小且對於TP-51肽的KD為1.6nM或更小，甚至更優選對於可溶性全長TDP-43的KD為150pM或更小且對於TP-51肽的KD為1.0nM或更小，還更優選對於可溶性全長TDP-43的KD為130pM或更小且對於TP-51肽的KD為0.8nM或更小。
本發明的人源化TDP-43結合分子可以中和具有播種能力的TDP-43。播種組分TDP-43的中和可以通過即時振盪誘導轉化(RT-QuIC)測定來評價。對於可以使用的合適的RT-QuIC測定的詳細描述，可以參考實施例11。“具有播種能力的TDP-43”是指能夠誘導生理性(即非病理性TDP-43)聚集的病理性TDP-43。
本發明的人源化TDP-43結合分子可以增強TDP-43清除。TDP-43清除的增強可以通過使用THP-1細胞的體外測定來評價。對於可以使用的使用THP-1細胞的合適測定的詳細描述，可以參考實施例12。一般來說，本發明的抗體通過與病理性TDP-43結合並形成可被抗體依賴性細胞吞噬作用(ADCP)清除的免疫複合物來增強TDP-43清除。ADCP由抗體Fc片段與Fc受體(如Fcγ受體)的相互作用介導，Fc受體(如Fcγ受體)在先天免疫細胞(如小膠質細胞或樹突細胞)的表面表達。通過修飾抗體的Fc部分，可以調節Fc介導的功能以達到所需的效果。
在一些實施方案中，本發明的人源化TDP-43結合分子對於人CSF中的TDP-43的EC50小於250pM，優選小於或等於237pM。人源化TDP-43結合分子可以是hACI-7069-633B12-Ab1_H33L27。關於如何測量EC50，可以參考實施例14。
圖式說明
圖1。hACI-7069-633B12-Ab1_H33L27、hACI-7069-633B12-Ab1_H32L 27和hACI-7069-633B12-Ab1_H32L26體外抑制TDP-43的聚集。簡而言之，在存在hACI-7069-633B12-Ab1_H32L26和hACI-7069-633B12-Ab1_H33L27、hACI-7069-633B12-Ab1_H32L27中任一者的情況下，分析從MBP標籤切割之後隨時間的重組TDP-43從頭聚集，並與嵌合抗體cACI-7069- 633B12-Ab1或同種型對照進行比較。在1.5小時時聚集的TDP-43的百分比相對於同種型對照條件歸一化，並且在ACI-7069-633B12-Ab1、hACI-7069-633B12-Ab1_H33L27、hACI-7069-633B12-Ab1_H32L27和hACI-7069-633B12-Ab1_H32L26情況下顯示出對聚集的強烈抑制。使用了單因素ANOVA分析，隨後是用於多重比較的Dunnett事後檢驗。****p<0.0001。
圖2。單次IV推注施用40mg/kg的hACI-7069-633B12-Ab1_H33L27(圓圈)或hACI-7069-633B12-Ab1_H32L27(正方形)之後，純合子Tg32小鼠血清中的藥代動力學譜。每個化合物使用21只雄性小鼠，每個時間點3只動物。研究的總持續時間為6周(1008小時)。
圖3。單次IV推注施用40mg/kg的hACI-7069-633B12-Ab1_H33L27(A)或hACI-7069-633B12-Ab1_H32L27(B)之後，食蟹猴血清中的藥代動力學譜。每種化合物使用4只雄性食蟹猴，研究持續時間為8周(1344小時)。
圖4。單次IV推注施用40mg/kg的hACI-7069-633B12-Ab1_H33L27(A)或hACI-7069-633B12-Ab1_H32L27(B)之後，食蟹猴血清中TDP-43的藥效學譜。評估了hACI-7069-633B12-Ab1_H33L27(A)和hACI-7069-633B12-Ab1_H32L27(B)二者在血清中的靶向接合。
圖5。在來自散發性ALS(圖5A)或健康對照(圖5B)供體的腦脊液(CSF)的存在下，合成TDP-43肽(TP-51)的即時振盪誘導轉化(RT-QuIC)聚集動力學。使用硫磺素T(ThT)螢光來量化聚集和原纖維形成。
圖6。在hACI-7069-633B12-Ab1_H33L27或嵌合抗體cACI-7069-633B12-Ab1存在下，THP-1細胞對pHrodoTM-TDP-43聚集體的攝取顯著加快，但在同種型抗體對照存在下則沒有。(A)顯示了在24小時內(X軸)每小時測量的針對以下的螢光強度(Y軸)：聚集體TDP-43、同種型對照情況下的聚集體TDP-43、cACI-7069-633B12-Ab1情況下的聚集體TDP-43和hACI-7069-633B12-Ab1_H33L27孵育的細胞的情況下的聚集體TDP-43。(B)顯示了10小時時間點的相對於細胞匯合歸一化的針對以下的螢光強度的差異：聚集體TDP-43、同種型對照情況下的聚集體TDP-43、cACI-7069-633B12-Ab1情況下的聚集體TDP-43和hACI-7069-633B12-Ab1_H33L27孵育的細胞的情況下的聚集體TDP-43。
圖7。(A)在通過hACI-7069-633B12-Ab1_H33L27(泳道1)、cACI-7069-633B12-Ab1(泳道2)或同種型抗體對照(泳道3)進行免疫耗竭之後，來自FTLD-TDP腦來源的提取物的TDP-43免疫印跡的代表性圖像。(B)顯示了對總TDP-43(B-上圖)或TDP-43的C末端片段(即低於25kDa，CTF)(B-下圖)獲得的信號的定量分析，其相對於輸入中的相應信號歸一化。
圖8。人CSF樣品中hACI-7069-633B12-Ab1_H33L27的TDP-43靶標接合的圖示。
圖9。在以40、120和360mg/kg的劑量每週一次IV輸注持續四周之後，食蟹猴中hACI-7069-633B12-Ab1_H33L27的血清暴露。
圖10。(A)在以40mg/kg單次IV推注施用hACI-7069-633B12-Ab1_H33L27、hACI-7069-633B12-Ab1_H19L18或cACI-7069-633B12-Ab1之後，純合子Tg32小鼠血清中的藥代動力學譜。(B)以40mg/kg單次IV推注hACI-7069-633B12-Ab1_H33L27、hACI-7069-633B12-Ab1_H19L18或cACI-7069-633B12-Ab1之後，食蟹猴血清中的藥代動力學譜。
實施例
實施例1. 抗人TDP-43鼠單克隆抗體的人源化
人源化可變區的設計
ACI-7069-633B12-Ab1的可變結構域在生理pH下的理論pI為8.5，淨電荷為+3.1。已經表明，在一些情況下，抗體的高淨正電荷涉及體內抗體的快速清除(Igawa et al,PEDS.2010；vol.23 no.5 pp.385-392,Bumbaca et al,JBC,VOL.290,NO.50,pp.29732-29741,2015)。為了優化分子的電荷譜，選擇具有低pI的受體框架對來接枝ACI-7069-633B12-Ab1 CDR(如WO2020/234473中所述的CDR)。首先，根據與鼠重鏈和輕鏈V區(分別為SEQ ID NO：20和24)的序列同一性，對重鏈和輕鏈框架進行排序。人和小鼠種系可變基因的資料庫，如IMGT資料庫(Ehren mann,F et al,(2010)Nucl.Acids Res.,38(S1)：D301-D307)或IgBlast(Ye J.et al,(2013),Nucleic Acids Res.2013 Jul；41(Web Server issue)：W34-W40)可用於鑒定這樣的種系可變基因。第二，使用webserve等電點計算器2.0(Kozlowski LP et al,Nucleic Acids Res.49(W1)：W285-W292.)計算了每 個獨立鏈的理論pI。考慮了所有可用模型的平均pI值以及在pH 7.4下計算的淨電荷。
對於重鏈可變結構域，框架IGHV1-69-2、IGHV1-24、IGHV5-51或IGHV3-43可用作受體框架，而對於輕鏈可變結構域，IGKV2-24、IGKV2-40、IGKV2D-40、IGKV2D-28、IGKV4-1或IGKV2-28可用作受體框架。所有列出的框架的理論pI和淨電荷等於或低於ACI-7069-633B12-Ab1的可變結構域。
雖然在人框架如IGHV 1-24和IGKV2-40中觀察到pI的邊際降低，但由IGHV1-69-2和IGKV2-28形成的對顯著降低了Fv淨電荷並提供了平衡的電荷分佈。使用IGHV1-69-2作為人受體框架通過用替換K64Q、R82aS和K73T替代鼠帶正電荷的殘基，破壞了一大片正電荷。在較低的程度上，對於VL使用種系IGKV2-28，有助於框架2中替換K45Q的電荷減少，這去除了正電荷，同時保持了分子的親水性。從該分析中，基於IGHV1-69-2和IGKV2-28人框架產生了新的人源化變體(表3)。
分別選擇IGHV1-69-2和IGKV2-28作為重鏈和輕鏈可變結構域的受體框架。IGHV1-69-2與ACI-7069-633B12-Ab1 VH具有64.9%的序列同一性，同時在生理pH下具有4.3的pI和-6.9的淨電荷。IGKV2-28與ACI-7069-633B12-Ab1 VH具有72%的序列同一性，同時在生理pH下具有4.7的pI和-2.9的淨電荷。IGHJ2*01和IGKJ2*02分別用作重鏈和輕鏈可變結構域的J連接基因。
作為人源化過程的起點，將鼠CDR接枝到VH和VL區二者的人受體框架上。為了適應人受體框架上的CDR，通過將人殘基替換為小鼠殘基來修飾關鍵位置。
為了鑒定可能最大程度影響CDR構象和/或VH/VL取向的殘基，使用Abodybuilder伺服器(8)通過同源性建模產生了人-小鼠雜交VH-VL對的3D模型。模型分析允許選擇胺基酸位置的亞群，包括表2中列出的位置。根據Kabat編號系統進行編號。
Figure 112105586-A0304-12-0081-3
Figure 112105586-A0304-12-0082-5
在ACI-7069-633B12-Ab1 CDR序列中鑒定了潛在的翻譯後修飾位點。在可變重鏈中，N53、N54和G55被鑒定為兩個脫醯胺位點。在可變輕鏈中，在D28和G29位識別出異構化位點，而在W89位識別出氧化位點(根據Kabat編號系統)。在一些構建體中，包括N53Q和/或G55A的點突變被引入VH區而G29A和/或W89F被引入VL區以去除CDR L1和L3中的翻譯後修飾位點。
pI和電荷的減少在表3中舉例說明。
Figure 112105586-A0304-12-0082-6
Figure 112105586-A0304-12-0083-7
將表2中的反向突變組合，以產生分別列於表4和6中的序列。表5和7示出了編碼人源化TDP-43結合分子的相應核酸序列。
Figure 112105586-A0304-12-0083-8
Figure 112105586-A0304-12-0084-9
*針對哺乳動物細胞表達優化的DNA序列
Figure 112105586-A0304-12-0085-10
Figure 112105586-A0304-12-0085-11
Figure 112105586-A0304-12-0086-12
*針對哺乳動物細胞表達優化的DNA序列
實施例2. 人源化抗體變體的產生
使用標準分子生物學技術合成重鏈和輕鏈可變結構域的DNA編碼序列，並將其克隆到允許在哺乳動物細胞中表達的質粒中。將重鏈可變結構域與人IgG1恆定結構域融合，並將輕鏈可變結構域克隆到含有恆定κ輕鏈結構域的質粒中。通過使用ExpiCHOTM表達系統試劑盒(ThermoFischer scientific，A29133)共轉染重鏈和輕鏈質粒，使嵌合抗體和人源化變體在expi CHO-S(thermo fischer scientific，A29127)細胞中暫態表達。轉染後，將細胞在150rpm攪拌和8% CO2水準下保持在37℃下。轉染之後6天，收穫上清液並用蛋白A (Cytiva，17127903)純化。通過在室溫下以及在於滾筒上攪拌下與蛋白A一起孵育2小時來捕獲抗體。將混合物倒入重力流色譜柱(BioRad，7321010)中，用10CV的2×PBS洗滌樹脂，並用0.1M甘胺酸pH 3.2洗脫。然後通過添加0.1M Tris pH 7.4中和洗脫液。然後將樣品在PBS緩衝液中透析。
實施例3. 通過表面等離激元共振(SPR)對ACI-7069-633B12-Ab1人源化變體進行的表徵
通過將可溶性TDP-43固定在CM5系列S感測器晶片(GE Healthcare，BR-1005-30)上來在Biacore 8K儀器(GE Healthcare Life Sciences)上進行測量。
通過SPR進行的針對可溶性TDP-43的KD測定
儀器用運行緩衝液PBS-P+進行準備，並且通道1至8的流動池(Fc)1和2用EDC/NHS(胺偶聯試劑盒，兩種試劑的比例為1：1，GE Healthcare Life Sciences，BR-1006-33)的新鮮溶液以10μL/分鐘啟動，持續420秒。將可溶性TDP-43(Selvita)在乙酸鈉pH 4.5中稀釋至5μg/mL的終濃度並以5μL/分鐘的流量注射到Fc 2上，持續900秒。所有流通池均用1M乙醇胺(GE Healthcare Life Sciences，BR-1006-33)以10μL/分鐘猝滅，持續420秒。乙醇胺猝滅之後的固定水準在所有八個通道上均為680RU。在分析之前，運行了兩個啟動週期。將1.2至100nM的提高的mAb濃度以單循環動力學注射，其由運行緩衝液中的3倍連續稀釋來製備，接觸時間為300秒，並且解離時間為3600秒，流量為30μL/分鐘。每個循環之後是一次再生，其使用10mM甘胺酸-HCl pH 1.7以30μL/分鐘、以30秒的接觸時間進行，隨後是300秒的穩定期。從單循環動力學獲得的結果使用空白Fc 1和緩衝液循環進行雙重參考，並使用Biacore 8K評價軟體使用具有RI和整體Rmax的1：1動力學擬合模型進行評價。獲得以下動力學參數：結合速率常數(ka)、解離速率常數(kd)、親和常數(KD)和飽和回應(Rmax)。
通過SPR進行的針對TP-51肽的KD測定
儀器用運行緩衝液PBS-P+進行準備，並且通道1至8(8K)的Fc 1至2用EDC/NHS(胺偶聯試劑盒，兩種試劑的比例為1：1，GE Healthcare Life Sciences，BR-1006-33)的新鮮溶液以10μL/分鐘啟動，持續420秒，並且山羊抗人抗體(GE Healthcare Life Sciences，29234600)以25μg/mL在10mM乙酸鈉pH 5中固定，持續420秒。接下來，所有Fc均用1M乙醇胺(GE Healthcare Life Sciences，BR-1006-33)猝滅，持續420秒。任何非共價結合的抗體均通過兩次用10mM甘胺酸-HCl pH 1.7進行的持續30秒的再生來去除。在乙醇胺猝滅之後評價固定水準(所有通道均為10000RU)。
每個循環都以人源化變體的非共價捕獲開始，這些人源化變體在運行緩衝液中稀釋至2μg/mL的終濃度，並以10μL/分鐘的流量注射，持續60秒。TDP-43 mAb在通道1至8上被捕獲，使Fc 1作為空白Fc。在每次mAb注射之後的120秒穩定期之後，評價捕獲水準，並且其範圍為300至500RU。
TP-51由TDP-43(SEQ ID NO：1)的第352至414位胺基酸組成。TP-51肽(Pepscan)的注射以單循環動力學進行，其為1.2至100nM的提高的濃度，由連續的3倍稀釋來製備。以25μL/分鐘的流量以300秒/注射的接觸時間進行注射。3600秒的解離階段在最後一次注射之後。通過以10μL/分鐘的流量一次注射10mM甘胺酸-HCl pH 1.7 120秒來使感測器表面再生，隨後是300秒的穩定期。從單循環動力學獲得的結果使用空白Fc 1和緩衝液循環進行雙重參考，並通過Biacore 8K評價軟體用具有RI和整體Rmax的1：1動力學擬合模型進行評價。獲得以下動力學參數：結合速率常數(ka)、解離速率常數(kd)、親和常數(KD)和飽和回應(Rmax)。
所有參數(Rmax除外)均在表8中報告為來自2-6個獨立實驗的平均值±SD。
Figure 112105586-A0304-12-0089-13
總體而言，所有人源化變體都保留了對TDP-43和TP-51肽的良好親和力(表8)，如先前針對鼠抗體ACI-7069-633B12-Ab1所觀察到的。來自在該實驗組中測試的變體的具有最佳親和力的變體是hACI-7069-633B12-Ab1_H28L24、hACI-7069-633B12-Ab1_H33L24、hACI-7069-633B12-Ab1_H32L26、hACI-7069-633B12-Ab1_H33L26、hACI-7069-633B12-Ab1_H32L27和hACI-7069-633B12-Ab1_H33L27。
人源化變體對TDP-43表現出與鼠親本抗體ACI-7069-633B12-Ab1(328pM，表8)相比相似的結合親和力(1156至126pM，表8)，其中hACI-7069-633B12-Ab1_H33L27對TDP-43具有最佳的親和力(最低KD)。值得注意的是，人源化變體hACI-7069-633B12-Ab1_H33L27的pI和淨電荷的變化不影響其熱穩定性(通過差示掃描螢光測定法(DSF)測量，保持在對於標準人IgG1 預期的70℃之上)，也不影響其對FcRn的親和力。
實施例4. ACI-7069-633B12-Ab1人源化變體在體外抑制TDP-43聚集
hACI-7069-633B12-Ab1_H33L27、hACI-7069-633B12-Ab1_H32L27和hACI-7069-633B12-Ab1_H32L26在依賴於TDP-43的聚集特性的體外功能測定中進行了表徵(Wang et al.EMBO 2018)。為此，將TDP-43與麥芽糖結合蛋白在C末端融合(TDP-43-MBP)，重組產生，並通過使用煙草蝕刻病毒(Tobacco Etch Virus，TEV)蛋白酶去除MBP蛋白來誘導聚集。然後通過測量600nm處的吸光度來監測隨時間的聚集。據報導，600nm處吸光度的增加與聚集體的量相關。在1.5小時時，hACI-7069-633B12-Ab1_H33L27、hACI-7069-633B12-Ab1_H32L27和hACI-7069-633B12-Ab1_H32L26保持了抑制TDP-43聚集的功能效力，類似於人IgG嵌合體cACI-7069-633B12-Ab1抗體(ACI-7069-633B12-Ab1鼠抗體的VH和VL與人IgG1恆定區的嵌合體)。相比之下，添加同種型對照mAb不會抑制TDP-43聚集(圖1)。
實施例5. 兩種ACI-7069-633B12-Ab1人源化變體在Tg32小鼠中的藥代動力學評價
轉基因Tg32小鼠過表達人新生Fc受體，並表現出對PK評價和預計的人PK建模的強烈益處(Avery et al.,Mabs 2016)。對於每種化合物，向21只雄性Tg32小鼠給予hACI-7069-633B12-Ab1_H33L27或hACI-7069-633B12-Ab1_H32L27的單次IV推注(40mg/kg)。在6周內，進行血液取樣(如圖2中y軸所示)並分析血清(每個時間點3只小鼠)。總的來說，兩種抗體都表現出良好且相似的PK參數，這使得它們成為其中抗體體內半衰期很重要的應用(例如用於人中的治療用途)的理想候選物(圖2，表9)。
Figure 112105586-A0304-12-0090-14
Figure 112105586-A0304-12-0091-15
CL：全身清除；Vc：分佈的中心體積；Q1：跨區室清除；Vp1：分佈的週邊體積；T1/2β：終半衰期
實施例6. 兩種ACI-7069-633B12-Ab1人源化變體在食蟹猴中的藥代動力學評價
為了評估hACI-7069-633B12-Ab1_H33L27和hACI-7069-633B12-Ab1_H32L27在非人靈長類中的藥代動力學，對於每種化合物，向4只雄性食蟹猴給予單次IV推注(40mg/kg)。在56天(1344小時)的時間內，進行血液取樣(如圖3中y軸所示)並分析血清(每個時間點4個食蟹猴樣品)。檢測到8只動物中的3只具有抗藥物抗體(ADA，通過ELISA確認)，該百分比與之前在非人靈長類(NHP)中針對人IgG施用所描述的百分比(Valente et al.,Mabs 2020)一致。排除具有ADA的動物後，計算PK參數。兩種抗體都顯示出良好的PK參數(圖3，表10)，這使得它們適合作為治療候選物進行進一步的臨床開發。
Figure 112105586-A0304-12-0091-16
CL：全身清除；Vc：分佈的中心體積；Q1：跨區室清除；Vp1：分佈的週邊體積；T1/2β：終半衰期
為了評估非人靈長類中的初步耐受性、毒性和毒代動力學資料，以40、120和360mg/kg的劑量每週一次對食蟹猴靜脈內施用hACI-7069-633B12-Ab1_H33L27，持續四周。最後一次施用之後一周，處死動物。在不同的時間點採集血清樣品，並分析hACI-7069-633B12-Ab1_H33L27的濃度。在研究持續時間期間，觀察到血清中hACI-7069-633B12-Ab1_H33L27暴露的劑量成比例增加，且無免疫原性跡象(圖9)。此外，在食蟹猴的體重、臨床觀察、臨床病理學、尿液分析、顯微檢查或器官重量方面沒有觀察到不利影響，這確定了ACI-7069-633B12-Ab1人源化變體適合於進一步的臨床開發。
實施例7. ACI-7069-633B12-Ab1_H33L27與親本抗體在Tg32小鼠中的藥代動力學譜的比較
為了進一步評估ACI-7069-633B12人源化變體的藥代動力學，對於每種化合物，向21只雄性Tg32小鼠給予單次IV推注(40mg/kg)hACI-7069-633B12-Ab1_H33L27、hACI-7069-633B12-Ab1_H19L18(如WO2022/034228中所述)或cACI-7069-633B12-Ab1。如實施例5所述進行血液取樣和血清分析。資料表示為3-4只動物/組的平均值±標準差(圖10A)。與親本hACI-7069-633B12-Ab1_H19L18和cACI-7069-633B12-Ab1抗體相比，人源化變體ACI-7069-633B12-Ab1_H33L27呈現出更優的PK譜(圖10A)，再次證明其適於進一步臨床開發。
實施例8. ACI-7069-633B12-Ab1_H33L27與親本抗體在食蟹猴中的藥代動力學譜的比較
在NHP中在單次IV推注施用(40mg/kg)hACI-7069-633B12-Ab1_H33L27、hACI-7069-633B12-Ab1_H19L18(如WO2022/034228所述)或cACI-7069-633B12-Ab1的情況下進一步評估ACI-7069-633B12人源化變體的藥代動力學(每種抗體4只雄性食蟹猴)。如實施例6所述進行血液取樣和血清分析。資料表示為3-4只動物/組的平均值±標準差(圖10B)。如在Tg32小鼠中所見，與親本hACI-7069-633B12-Ab1_H19L18和cACI-7069-633B12-Ab1抗體相比，人源化變體ACI-7069-633B12-Ab1_H33L27呈現出更優的PK譜(圖10B)。 該結果證實了hACI-7069-633B12-Ab1_H33L27的用於進一步臨床開發的合適的PK譜。
實施例9. 來自Tg32小鼠和食蟹猴的人PK預測
Tg32小鼠和食蟹猴被用作預測mAb人清除率的體內工具。使用文獻中報告的固定指數，通過異速生長換算將從Tg32和食蟹猴中估計的PK參數換算為70kg人(Betts et al.,2018)(表11)。在Tg32小鼠和食蟹猴中的所預測的人清除率分別為：對於hACI-7069-633B12-Ab1_H19L18(在WO2022/034228中描述)為0.195mL/小時/kg和0.256mL/小時/kg，對於hACI-7069-633B12-Ab1_H33L27為0.082mL/小時/kg和0.043mL/小時/kg(表11)。這導致了hACI-7069-633B12-Ab1_H33L27的預測人半衰期為27至30天，hACI-7069-633B12-Ab1_H19L18的預測人半衰期為17至22天，並證實了hACI-7069-633B12-Ab1_H33L27的有利的所預測人PK譜。
Figure 112105586-A0304-12-0093-17
CL：全身清除；Vc：分佈的中心體積；Q1：跨區室清除；Vp1：分佈的週 邊體積；T1/2β：終半衰期
實施例10. 兩種ACI-7069-633B12-Ab1人源化變體的NHP血清藥效學
為了評估血清藥效學，使用單分子陣列(SIMOA®)技術測量了用化合物給藥的NHP中的未結合TDP-43水準。在給藥前(pre-dosed)的時間點測得平均500pg/ml的TDP-43(圖4A-B)，作為基線TDP-43水準。在IV注射hACI-7069-633B12-Ab1_H33L27或hACI-7069-633B12-Ab1_H32L27之後3分鐘(0.05小時)，測量到游離/未結合的TDP-43快速下降(超過80%)，表明這兩種mAb完全且快速地達到目標飽和，其中天然TDP-43蛋白存在於這些NHP的血清中。除了呈現ADA的動物(如實施例6中所述)之外，TDP-43保持與抗體的結合，直到研究結束，證明了施用的抗體的靶標接合(圖4A-B)。
實施例11. 通過ACI-7069-633B12-Ab人源化變體中和散發性ALS腦脊液中具有播種能力的TDP-43
為了確定ACI-7069-633B12-Ab1人源化變體的效力和作用方式，使用合成的TDP-43肽(TP-51)作為底物(以10μM使用)，如前所述(Scialò,C.et al.Brain Commun,fcaa142-(2020))進行即時振盪誘導轉化(RT-QuIC)測定。與健康對照(圖5B)相比，在來自散發性ALS供體的腦脊液(CSF)的存在下觀察到的底物的加速聚集(圖5A)確定了在ALS CSF中存在具有播種能力的TDP-43物質。然後用hACI-7069-633B12-Ab1_H33L27或同種型對照(以0.006μM使用)預孵育在該測定中用作種子的每種CSF。在來自ALS供體的CSF中在ACI-7069-633B12-Ab1_H33L27人源化變體的情況下觀察到TDP-43肽(TP-51)底物聚集的顯著延遲(圖5A-B)，表明抗體可以結合並中和ALS患者CSF中的具有播種能力的TDP-43。
實施例12. ACI-7069-633B12-Ab1人源化變體增強THP-1細胞對TDP-43的攝取
為了評價和確定小膠質細胞通過Fc依賴性機制直接參與清除TDP-43聚集體，如前所述(Lindner et al.,2020)建立了使用THP-1細胞(人白 血病單核細胞系)的體外測定。為此，用pHrodoTM染料(ThermoFisher Scientific，P36013)根據製造商的說明標記重組TDP-43聚集體。pHrodoTM染料在酸性細胞區室中內化之後變成有螢光的，從而允許即時監測THP-1細胞對TDP-43聚集體的內化。然後在24小時時期內每小時自動定量pHrodoTM螢光強度(圖6A)。資料代表每種條件下4至6次重複的平均值±SEM。在10小時時間點歸一化為細胞匯合的螢光強度的差異在條件之間用單向ANOVA進行比較，隨後用Tukey事後檢驗進行多重比較(圖6B)。在單獨或在30nM同種型對照抗體的存在下用30nM TDP-43聚集體孵育時，觀察到TDP-43聚集體的有限內化。然而，在存在30nM的hACI-7069-633B12-Ab1_H33L27或嵌合抗體cACI-7069-633B12-Ab1的情況下，與單獨和與同種型對照抗體組合的陰性對照即pHrodoTM標記的TDP-43相比，觀察到pHrodoTM標記的TDP-43聚集體的攝取顯著增加(圖6A-B)。這些結果確定了ACI-7069-633B12人源化變體與TDP-43聚集體的結合可以增強它們被免疫細胞如小膠質細胞的攝取，從而增強它們的清除。
實施例13. ACI-7069-633B12-Ab1人源化變體對人腦提取物中TDP-43的免疫耗竭
為了評價ACI-7069-633B12-Ab1人源化變體在體外對範本化TDP-43聚集的作用，如前所述(WO2022/034228)，用從FTLD-TDP腦提取物中富集的聚集和磷酸化的TDP-43進行免疫耗竭實驗。與同種型對照相比，使用hACI-7069-633B12-Ab1_H33L27或嵌合抗體cACI-7069-633B12-Ab1，免疫耗竭的級分顯示出顯著的TDP-43耗竭(圖7A)。對於定量分析，將對於總TDP-43或TDP-43的C末端片段(即低於25kDa，CTF)獲得的信號歸一化為輸入中的相應信號(圖7B)。這些結果確定了ACI-7069-633B12-Ab1人源化變體結合來自FTLD-TDP患者腦的聚集和磷酸化的TDP-43的能力，確定了其治療潛力。
實施例14. ACI-7069-633B12-Ab1人源化變體以高親和力結合CSF中的人TDP-43
為了表徵ACI-7069-633B12-Ab1人源化變體對人CSF中TDP-43的結合親和力，將來自健康供體的CSF樣品用漸增濃度的hACI-7069-633B12- Ab1_H33L27預孵育，並使用如實施例10中的基於SIMOA的靶接合測定來測量未結合的TDP-43的量。hACI-7069-633B12-Ab1_H33L27與CSF樣品中的人TDP-43結合的EC50為35.58ng/ml(237pM)(圖8)。該結果確定了ACI-7069-633B12-Ab1人源化變體以高親和力結合CSF中的TDP-43的能力。
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Claims (66)

  1. 人源化TDP-43結合分子，特別是人源化TDP-43抗體或其抗原結合片段，其包含：a. VH-CDR1，其包含SEQ ID NO：21的胺基酸序列；b. VH-CDR2，其選自SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：92、SEQ ID NO：102、SEQ ID NO：112或SEQ ID NO：122的胺基酸序列；c. VH-CDR3，其包含胺基酸序列ES(Glu-Ser)；d. VL-CDR1，其選自SEQ ID NO：25或SEQ ID NO：85的胺基酸序列；e. VL-CDR2，其選自SEQ ID NO：16的胺基酸序列；f. VL-CDR3，其選自SEQ ID NO：27或SEQ ID NO：87的胺基酸序列；和：g. 重鏈可變結構域(VH)的受體框架，其選自IGHV1-69-2、IGHV5-51或IGHV3-43，優選IGHV1-69-2；和/或者h. 輕鏈可變結構域(VL)的受體框架，其選自IGKV2-28、IGKV2-24、IGKV2D-28、IGKV2-40、IGKV2D-40或IGKV4-1，優選IGKV2-28。
  2. 如請求項1所述的人源化TDP-43結合分子，其中：所述VH的受體框架包含以下VH突變中的一個或更多個、以及優選所有：a. V24T b. Y27F c. M48I d. A71V e. T73K；和f. T94R；和/或者所述VL的受體框架包含以下VL突變中的一個或更多個：g. I2V h. Y36L i. Q45K j. L46R；和k. G57R。
  3. 如請求項2所述的人源化TDP-43結合分子，其中所述VH的受體框架包含所有以下VH突變：a. V24T b. Y27F c. M48I d. A71V e. T73K；和f.T94R；並且所述VL的受體框架包含以下VL突變中的一個或更多個、優選所有：g. Y36L h. L46R；和i. G57R。
  4. 人源化TDP-43結合分子，特別是人源化TDP-43抗體或其抗原結合片段，任選地如請求項1至3中任一項所限定的，其包含：a. VH-CDR1，其包含SEQ ID NO：21的胺基酸序列；b. VH-CDR2，其選自SEQ ID NO：112、SEQ ID NO：122或SEQ ID NO：102的胺基酸序列；c. VH-CDR3，其包含胺基酸序列ES(Glu-Ser)；d. VL CDR1，其選自SEQ ID NO：25或SEQ ID NO：85的胺基酸序列；e. VL-CDR2，其選自SEQ ID NO：16的胺基酸序列；和f. VL-CDR3，其選自SEQ ID NO：27或SEQ ID NO：87的胺基酸序列。
  5. 前述請求項中任一項所述的人源化TDP-43結合分子，特別是人源化TDP-43抗體或其抗原結合片段，其包含：a. VH-CDR1，其包含SEQ ID NO：21的胺基酸序列；b. VH-CDR2，其選自SEQ ID NO：112或SEQ ID NO：122的胺基酸序列；c. VH-CDR3，其包含胺基酸序列ES(Glu-Ser)；d. VL-CDR1，其選自SEQ ID NO：25或SEQ ID NO：85的胺基酸序列；e. VL-CDR2，其選自SEQ ID NO：16的胺基酸序列；和f. VL-CDR3，其選自SEQ ID NO：27或SEQ ID NO：87的胺基酸序列。
  6. 前述請求項中任一項所述的人源化TDP-43結合分子，其包含：a. 重鏈可變結構域(VH)，其包含含有SEQ ID NO：21的胺基酸序列的VH-CDR1、含有SEQ ID NO：22的胺基酸序列的VH-CDR2、含有胺基酸序列ES(Glu-Ser)的VH-CDR3；以及輕鏈可變結構域(VL)，其包含含有SEQ ID NO：25的胺基酸序列的VL-CDR1、含有SEQ ID NO：16的胺基酸序列的VL-CDR2和含有SEQ ID NO：27的胺基酸序列的VL-CDR3；或者b. 重鏈可變結構域(VH)，其包含含有SEQ ID NO：21的胺基酸序列的VH-CDR1、含有SEQ ID NO：112的胺基酸序列的VH-CDR2、含有胺基酸序列ES(Glu-Ser)的VH-CDR3；以及輕鏈可變結構域(VL)，其包含含有SEQ ID NO：25的胺基酸序列的VL-CDR1、含有SEQ ID NO：16的胺基酸序列的VL-CDR2和含有SEQ ID NO：27的胺基酸序列的VL-CDR3；或者c. 重鏈可變結構域(VH)，其包含含有SEQ ID NO：21的胺基酸序列的VH-CDR1、含有SEQ ID NO：112的胺基酸序列的VH-CDR2、含有胺基酸序列ES(Glu-Ser)的VH-CDR3；以及輕鏈可變結構域(VL)，其包含含有SEQ ID NO：85的胺基酸序列的VL-CDR1、含有SEQ ID NO：16的胺基酸序列的VL-CDR2和含有SEQ ID NO：87的胺基酸序列的VL-CDR3；或者d. 重鏈可變結構域(VH)，其包含含有SEQ ID NO：21的胺基酸序列的VH-CDR1、含有SEQ ID NO：122的胺基酸序列的VH-CDR2、含有胺基酸序列ES(Glu-Ser)的VH-CDR3；以及輕鏈可變結構域(VL)，其包含含有SEQ ID NO：25的胺基酸序列的VL-CDR1、含有SEQ ID NO：16的胺基酸序列的VL-CDR2和含有SEQ ID NO：27的胺基酸序列的VL-CDR3；或者e. 重鏈可變結構域(VH)，其包含含有SEQ ID NO：21的胺基酸序列的VH-CDR1、含有SEQ ID NO：122的胺基酸序列的VH-CDR2、含有胺基酸序列ES(Glu-Ser)的VH-CDR3；以及輕鏈可變結構域(VL)，其包含含有SEQ ID NO：85的胺基酸序列的VL-CDR1、含有SEQ ID NO：16的胺基酸序列的VL-CDR2和含有SEQ ID NO：87的胺基酸序列的VL-CDR3；或者f. 重鏈可變結構域(VH)，其包含含有SEQ ID NO：21的胺基酸序列的VH-CDR1、含有SEQ ID NO：112的胺基酸序列的VH-CDR2、含有胺基酸序列ES (Glu-Ser)的VH-CDR3；以及輕鏈可變結構域(VL)，其包含含有SEQ ID NO：25的胺基酸序列的VL-CDR1、含有SEQ ID NO：16的胺基酸序列的VL-CDR2和含有SEQ ID NO：87的胺基酸序列的VL-CDR3；或者g. 重鏈可變結構域(VH)，其包含含有SEQ ID NO：21的胺基酸序列的VH-CDR1、含有SEQ ID NO：122的胺基酸序列的VH-CDR2、含有胺基酸序列ES(Glu-Ser)的VH-CDR3；以及輕鏈可變結構域(VL)，其包含含有SEQ ID NO：25的胺基酸序列的VL-CDR1、含有SEQ ID NO：16的胺基酸序列的VL-CDR2和含有SEQ ID NO：87的胺基酸序列的VL-CDR3。
  7. 前述請求項中任一項所述的人源化TDP-43結合分子：a. 其中所述重鏈可變結構域(VH)的受體框架選自IGHV1-69-2、IGHV5-51或IGHV3-43，優選IGHV1-69-2；並且b. 其中所述輕鏈可變結構域(VL)的受體框架選自IGKV2-28、IGKV2-24、IGKV2D-28、IGKV2-40、IGKV2D-40或IGKV4-1，優選IGKV2-28。
  8. 請求項7所述的人源化TDP-43結合分子：a. 其中所述重鏈可變結構域(VH)的受體框架為IGHV1-69-2；並且b. 其中所述輕鏈可變結構域(VL)的受體框架為IGKV2-28。
  9. 前述請求項中任一項所述的人源化TDP-43結合分子，其包含：a. 重鏈可變區(VH)，其選自：i. 包含SEQ ID NO：30的序列的重鏈可變區(VH)或與SEQ ID NO：30的胺基酸序列具有至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的重鏈可變區(VH)；或者ii. 包含SEQ ID NO：40的序列的重鏈可變區(VH)或與SEQ ID NO：40的胺基酸序列具有至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的重鏈可變區(VH)；或者iii. 包含SEQ ID NO：50的序列的重鏈可變區(VH)或與SEQ ID NO：50的胺基酸序列具有至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的重鏈可變區(VH)；或者iv. 包含SEQ ID NO：60的序列的重鏈可變區(VH)或與SEQ ID NO：60 的胺基酸序列具有至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的重鏈可變區(VH)；或者v. 包含SEQ ID NO：70的序列的重鏈可變區(VH)或與SEQ ID NO：70的胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的重鏈可變區(VH)；或者vi. 包含SEQ ID NO：80的序列的重鏈可變區(VH)或與SEQ ID NO：80的胺基酸序列具有至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的重鏈可變區(VH)；或者vii. 包含SEQ ID NO：90的序列的重鏈可變區(VH)或與SEQ ID NO：90的胺基酸序列具有至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的重鏈可變區(VH)；或者viii. 包含SEQ ID NO：100的序列的重鏈可變區(VH)或與SEQ ID NO：100的胺基酸序列具有至少89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的重鏈可變區(VH)；或者ix. 包含SEQ ID NO：110的序列的重鏈可變區(VH)或與SEQ ID NO：110的胺基酸序列具有至少89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的重鏈可變區(VH)；或者x. 包含SEQ ID NO：120的序列的重鏈可變區(VH)或與SEQ ID NO：120的胺基酸序列具有至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的重鏈可變區(VH)；以及b. 輕鏈可變區(VL)，其選自：i. 包含SEQ ID NO：34的序列的輕鏈可變區(VL)或與SEQ ID NO：34的胺基酸序列具有至少97%、98%或99%序列同一性的輕鏈可變區(VL)；或者ii. 包含SEQ ID NO：44的序列的輕鏈可變區(VL)或與SEQ ID NO：44的胺基酸序列具有至少96%、97%、98%或99%序列同一性的輕鏈可變區(VL)；或者iii. 包含SEQ ID NO：54的序列的輕鏈可變區(VL)或與SEQ ID NO：54的胺基酸序列具有至少98%或99%序列同一性的輕鏈可變區(VL)；或者iv. 包含SEQ ID NO：64的序列的輕鏈可變區(VL)或與SEQ ID NO：64 的胺基酸序列具有至少97%、98%或99%序列同一性的輕鏈可變區(VL)；或者v. 包含SEQ ID NO：74的序列的輕鏈可變區(VL)或與SEQ ID NO：74的胺基酸序列具有至少96%、97%、98%或99%序列同一性的輕鏈可變區(VL)；或者vi. 包含SEQ ID NO：84的序列的輕鏈可變區(VL)或與SEQ ID NO：84的胺基酸序列具有至少97%、98%或99%序列同一性的輕鏈可變區(VL)；或者vii. 包含SEQ ID NO：94的序列的輕鏈可變區(VL)或與SEQ ID NO：94的胺基酸序列具有至少96%、97%、98%或99%序列同一性的輕鏈可變區(VL)。
  10. 前述請求項中任一項所述的人源化TDP-43結合分子，其包含：a. 包含SEQ ID NO：60的序列的重鏈可變區(VH)或與SEQ ID NO：60的胺基酸序列具有至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的重鏈可變區(VH)；和包含SEQ ID NO：54的序列的輕鏈可變區(VL)或與SEQ ID NO：54的胺基酸序列具有至少98%或99%序列同一性的輕鏈可變區(VL)；或者b. 包含SEQ ID NO：70的序列的重鏈可變區(VH)或與SEQ ID NO：70的胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的重鏈可變區(VH)；和包含SEQ ID NO：44的序列的輕鏈可變區(VL)或與SEQ ID NO：44的胺基酸序列具有至少96%、97%、98%或99%序列同一性的輕鏈可變區(VL)；或者c. 包含SEQ ID NO：70的序列的重鏈可變區(VH)或與SEQ ID NO：70的胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的重鏈可變區(VH)；和包含SEQ ID NO：54的序列的輕鏈可變區(VL)或與SEQ ID NO：54的胺基酸序列具有至少98%或99%序列同一性的輕鏈可變區(VL)；或者d. 包含SEQ ID NO：70的序列的重鏈可變區(VH)或與SEQ ID NO：70的胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的重鏈可變區(VH)；和包含SEQ ID NO：64的序列的輕鏈可變區(VL)或與SEQ ID NO：64的胺基酸序列具有至少97%、98%或99%序 列同一性的輕鏈可變區(VL)；或者e. 包含SEQ ID NO：110的序列的重鏈可變區(VH)或與SEQ ID NO：110的胺基酸序列具有至少89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的重鏈可變區(VH)；和包含SEQ ID NO：64的序列的輕鏈可變區(VL)或與SEQ ID NO：64的胺基酸序列具有至少97%、98%或99%序列同一性的輕鏈可變區(VL)；或者f. 包含SEQ ID NO：110的序列的重鏈可變區(VH)或與SEQ ID NO：110的胺基酸序列具有至少89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的重鏈可變區(VH)；和包含SEQ ID NO：84的序列的輕鏈可變區(VL)或與SEQ ID NO：84的胺基酸序列具有至少97%、98%或99%序列同一性的輕鏈可變區(VL)；或者g. 包含SEQ ID NO：120的序列的重鏈可變區(VH)或與SEQ ID NO：120的胺基酸序列具有至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的重鏈可變區(VH)；和包含SEQ ID NO：64的序列的輕鏈可變區(VL)或與SEQ ID NO：64的胺基酸序列具有至少97%、98%或99%序列同一性的輕鏈可變區(VL)；或者h. 包含SEQ ID NO：120的序列的重鏈可變區(VH)或與SEQ ID NO：120的胺基酸序列具有至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的重鏈可變區(VH)；和包含SEQ ID NO：84的序列的輕鏈可變區(VL)或與SEQ ID NO：84的胺基酸序列具有至少97%、98%或99%序列同一性的輕鏈可變區(VL)；或者i. 包含SEQ ID NO：110的序列的重鏈可變區(VH)或與SEQ ID NO：110的胺基酸序列具有至少89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的重鏈可變區(VH)；和包含SEQ ID NO：94的序列的輕鏈可變區(VL)或與SEQ ID NO：94的胺基酸序列具有至少96%、97%、98%或99%序列同一性的輕鏈可變區(VL)；或者j. 包含SEQ ID NO：120的序列的重鏈可變區(VH)或與SEQ ID NO：120的胺基酸序列具有至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的重鏈可變區(VH)；和包含SEQ ID NO：94的序列的輕鏈可變區 (VL)或與SEQ ID NO：94的胺基酸序列具有至少96%、97%、98%或99%序列同一性的輕鏈可變區(VL)。
  11. 前述請求項中任一項所述的人源化TDP-43結合分子，其包含：a. 包含SEQ ID NO：60的序列的重鏈可變區(VH)和包含SEQ ID NO：54的序列的輕鏈可變區(VL)；或者b. 包含SEQ ID NO：70的序列的重鏈可變區(VH)和包含SEQ ID NO：44的序列的輕鏈可變區(VL)；或者c. 包含SEQ ID NO：70的序列的重鏈可變區(VH)和包含SEQ ID NO：54的序列的輕鏈可變區(VL)；或者d. 包含SEQ ID NO：70的序列的重鏈可變區(VH)和包含SEQ ID NO：64的序列的輕鏈可變區(VL)；或者e. 包含SEQ ID NO：110的序列的重鏈可變區(VH)和包含SEQ ID NO：64的序列的輕鏈可變區(VL)；或者f. 包含SEQ ID NO：110的序列的重鏈可變區(VH)和包含SEQ ID NO：84的序列的輕鏈可變區(VL)；或者g. 包含SEQ ID NO：120的序列的重鏈可變區(VH)和包含SEQ ID NO：64的序列的輕鏈可變區(VL)；或者h. 包含SEQ ID NO：120的序列的重鏈可變區(VH)和包含SEQ ID NO：84的序列的輕鏈可變區(VL)；或者i. 包含SEQ ID NO：110的序列的重鏈可變區(VH)和包含SEQ ID NO：94的序列的輕鏈可變區(VL)；或者j. 包含SEQ ID NO：120的序列的重鏈可變區(VH)和包含SEQ ID NO：94的序列的輕鏈可變區(VL)。
  12. 前述請求項中任一項所述的人源化TDP-43結合分子，其包含：a. 包含SEQ ID NO：120的序列的重鏈可變區(VH)和包含SEQ ID NO：84的序列的輕鏈可變區(VL)；或者b. 包含SEQ ID NO：110的序列的重鏈可變區(VH)和包含SEQ ID NO： 94的序列的輕鏈可變區(VL)；或者c. 包含SEQ ID NO：120的序列的重鏈可變區(VH)和包含SEQ ID NO：94的序列的輕鏈可變區(VL)。
  13. 前述請求項中任一項所述的人源化TDP-43結合分子，其與錯折疊的聚集TDP-43和非聚集生理性TDP-43結合。
  14. 前述請求項中任一項所述的人源化TDP-43結合分子，其與單體和/或寡聚和/或聚集和/或翻譯後修飾和/或截短的TDP-43、優選人TDP-43結合。
  15. 前述請求項中任一項所述的人源化TDP-43結合分子，其與錯折疊的聚集人TDP-43和非聚集生理性人TDP-43結合。
  16. 前述請求項中任一項所述的人源化TDP-43結合分子，其表現出以下特徵中的一種或更多種、直至所有：a. 抑制TDP-43蛋白或其片段的聚集，b. 阻斷TDP-43細胞間傳播；c. 使TDP-43聚集體解聚；d. 阻斷TDP-43播種；e. 中和具有播種能力的TDP-43；f. 阻斷TDP-43擴散；以及g. 增強TDP-43清除。
  17. 前述請求項中任一項所述的人源化TDP-43結合分子，其中和具有播種能力的TDP-43。
  18. 前述請求項中任一項所述的人源化TDP-43結合分子，其增強TDP-43清除。
  19. 前述請求項中任一項所述的人源化TDP-43結合分子，其減輕體內TDP-43病理狀況。
  20. 前述請求項中任一項所述的人源化TDP-43結合分子，其降低體內錯折疊的聚集TDP-43和/或磷酸化TDP-43的水準。
  21. 前述請求項中任一項所述的人源化TDP-43結合分子，其與人TDP-43(SEQ ID NO：1)的第397至411位胺基酸殘基內的表位結合。
  22. 前述請求項中任一項所述的人源化TDP-43結合分子，其是抗體或其抗原結合片段。
  23. 前述請求項中任一項所述的人源化TDP-43結合分子，其對於可溶性TDP-43(SEQ ID NO：1)結合的解離常數(KD)為小於1nM、優選小於250pM。
  24. 前述請求項中任一項所述的人源化TDP-43結合分子，其對於可溶性TP-51(SEQ ID NO：1的第352-414位胺基酸)肽結合的解離常數(KD)為小於4nM、優選小於2nM。
  25. 前述請求項中任一項所述的人源化TDP-43結合分子，其是IgA、IgD、IgE、IgM、IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗體或者其抗原結合片段。
  26. 前述請求項中任一項所述的人源化TDP-43結合分子，其是IgG1或IgG4抗體或其抗原結合片段。
  27. 前述請求項中任一項所述的人源化TDP-43結合分子，其包含Fc突變，優選S228P突變。
  28. 前述請求項中任一項所述的人源化TDP-43結合分子，其包含pI低於7.5、優選低於7.0的Fv。
  29. 前述請求項中任一項所述的人源化TDP-43結合分子，其包含在pH 7.4下淨電荷低於0.2、優選低於-0.8、更優選低於-1.8的Fv。
  30. 免疫綴合物，其包含根據前述請求項中任一項所述的人源化TDP-43結合分子。
  31. 免疫綴合物，其包含根據請求項1至29中任一項所述的人源化TDP-43結合分子，其中所述免疫綴合物使用遞送載劑或血腦屏障部分穿過血腦屏障。
  32. 如請求項30或31所述的免疫綴合物，其中所述遞送載劑包含脂質體或胞外囊泡。
  33. 如請求項30或31所述的免疫綴合物，其中所述人源化TDP-43結合分子與血腦屏障部分連接。
  34. 如請求項33所述的免疫綴合物，其中所述血腦屏障部分是多肽或小分子，優選肽、受體配體、單結構域抗體(VHH)、scFv或Fab片段。
  35. 如請求項31、33或34所述的免疫綴合物，其中所述血腦屏障部分結合血腦屏障受體。
  36. 如請求項35所述的免疫綴合物，其中血腦屏障受體包括但不限於運鐵蛋白受體、胰島素受體或低密度脂蛋白受體。
  37. 經標記結合分子，特別是經標記抗體，其包含根據請求項1至29中任一項所述的人源化TDP-43結合分子。
  38. 藥物組合物，其包含請求項1至29中任一項所述的人源化TDP-43結合分子或根據請求項30至36中任一項所述的免疫綴合物以及可藥用載體和/或賦形劑和/或稀釋劑。
  39. 如請求項1至29中任一項所述的人源化TDP-43結合分子或根據請求項30至36中任一項所述的免疫綴合物或請求項38所述的藥物組合物，其用於人用或獸用藥物用途。
  40. 如請求項1至29中任一項所述的人源化TDP-43結合分子或根據請求項30至36中任一項所述的免疫綴合物或請求項38所述的藥物組合物，其用於預防、減輕、治療與TDP-43相關的疾病、障礙和/或異常、或TDP-43蛋白質病。
  41. 如請求項1至29中任一項所述的人源化TDP-43結合分子或根據請求項30至36中任一項所述的免疫綴合物、請求項37所述的經標記結合分子或請求項38所述的藥物組合物，其用於診斷用途。
  42. 如請求項41中所述應用的人源化TDP-43結合分子或免疫綴合物、經標記結合分子或藥物組合物，其用於診斷與TDP-43相關的疾病、障礙和/或異常、或TDP-43蛋白質病。
  43. 如請求項1至29中任一項所述的人源化TDP-43結合分子或根據請求項30至36中任一項所述的免疫綴合物、請求項37所述的經標記結合分子或請求項38所述的藥物組合物，其用於研究用途，特別是作為分析工具或參考分子。
  44. 如請求項1至29中任一項所述的人源化TDP-43結合分子或根據請求項30至36中任一項所述的免疫綴合物、請求項37所述的經標記結合分子或請求項38所述的藥物組合物，其用作監測與TDP-43相關的疾病、障 礙和/或異常、或TDP-43蛋白質病的診斷工具。
  45. 如請求項40、42或44中任一項所述應用的人源化TDP-43結合分子或免疫綴合物或經標記結合分子或藥物組合物，其中所述與TDP-43相關的疾病、障礙和/或異常、或TDP-43蛋白質病是：額顳葉失智症(FTD，例如散發性或家族性、伴有或不伴有運動神經元病(MND)、有顆粒蛋白前體(GRN)突變、有C9orf72突變、有TARDBP突變、有含纈酪肽蛋白(VCP)突變、與9p染色體連鎖、皮質基底節變性、有泛素陽性TDP-43包涵體的額顳葉變性(FTLD)(FTLD-TDP)、嗜銀顆粒病、皮克病、語義變異型原發性進行性失語(svPPA)、行為變異型FTD(bvFTD)、非流利性變異型原發性進行性失語(nfvPPA)，等)、肌肉萎縮性脊髓側索硬化症(ALS，例如散發性ALS、有TARDBP突變、有血管生成蛋白(ANG)突變)、亞歷山大病(AxD)、邊緣為主的年齡相關性TDP-43腦病(LATE)、慢性創傷性腦病(CTE)、佩里綜合症、阿茲海默症(AD，包括散發性和家族性形式的AD)、唐氏綜合症、家族性英國型癡呆、多聚谷胺醯胺病(亨廷頓病和脊髓小腦共濟失調3型(SCA3；也稱為馬-約病))、海馬硬化性癡呆和肌病(散發性包涵體肌炎、包涵體肌病，有含纈酪肽蛋白(VCP)突變；以及佩吉特骨病和額顳葉失智症)、有鑲邊空泡的眼咽肌營養不良、有肌收縮蛋白(MYOT)基因突變或編碼結蛋白(DES)之基因的突變的肌原纖維肌病、創傷性腦損傷(TBI)、路易體失智症(DLB)或帕金森病(PD)。
  46. 如請求項45所述應用的人源化TDP-43結合分子或免疫綴合物或經標記結合分子或藥物組合物，其中所述與TDP-43相關的疾病、障礙和/或異常、或TDP-43蛋白質病是：額顳葉失智症(FTD)、肌肉萎縮性脊髓側索硬化症(ALS)、阿茲海默症(AD)、帕金森病(PD)、慢性創傷性腦病(CTE)或邊緣為主的年齡相關性TDP-43腦病(LATE)。
  47. 如請求項46所述應用的人源化TDP-43結合分子或免疫綴合物或經標記結合分子或藥物組合物，其中所述與TDP-43相關的疾病、障礙和/或異常、或TDP-43蛋白質病是肌肉萎縮性脊髓側索硬化症(ALS)。
  48. 如請求項46所述應用的人源化TDP-43結合分子或免疫綴合物或經標記結合分子或藥物組合物，其中所述與TDP-43相關的疾病、障礙和 /或異常、或TDP-43蛋白質病是阿茲海默症(AD)。
  49. 如請求項46所述應用的人源化TDP-43結合分子或免疫綴合物或經標記結合分子或藥物組合物，其中所述與TDP-43相關的疾病、障礙和/或異常、或TDP-43蛋白質病是額顳葉失智症(FTD)。
  50. 在患有與TDP-43相關的疾病、障礙和/或異常、或TDP-43蛋白質病的個體中保持或提高認知記憶能力或減緩記憶喪失的方法，其包括向所述個體施用請求項1至29中任一項所述的人源化TDP-43結合分子根據或請求項30至36中任一項所述的免疫綴合物或請求項38所述的藥物組合物。
  51. 降低個體中聚集TDP-43和/或磷酸化TDP-43的水準的方法，其包括向所述個體施用請求項1至29所述的人源化TDP-43結合分子或根據請求項30至36中任一項所述的免疫綴合物或請求項38所述的藥物組合物。
  52. 如請求項50或51所述的方法，其中所述方法包括施用至少一種另外的治療劑。
  53. 如請求項52所述的方法，其中所述另外的治療劑靶向α-突觸核蛋白、BACE1、Tau、β-澱粉樣蛋白、TDP-43或神經炎症蛋白。
  54. 核酸分子，其編碼請求項1至29中任一項所述的人源化TDP-43結合分子。
  55. 編碼人源化TDP-43結合分子的核酸分子，其包含SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：98、SEQ ID NO：108、SEQ ID NO：118、SEQ ID NO：128、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：79、SEQ ID NO：89或SEQ ID NO：99中提供的核苷酸序列。
  56. 編碼人源化TDP-43結合分子的核酸分子，其包含如下所示的核苷酸序列：a. 由SEQ ID NO：68編碼的重鏈可變區(VH)和由SEQ ID NO：59編碼的輕鏈可變區(VL)；或者b. 由SEQ ID NO：78編碼的重鏈可變區(VH)和由SEQ ID NO：49編碼的輕鏈可變區(VL)；或者c. 由SEQ ID NO：78編碼的重鏈可變區(VH)和由SEQ ID NO：59編碼 的輕鏈可變區(VL)；或者d. 由SEQ ID NO：78編碼的重鏈可變區(VH)和由SEQ ID NO：69編碼的輕鏈可變區(VL)；或者e. 由SEQ ID NO：118編碼的重鏈可變區(VH)和由SEQ ID NO：69編碼的輕鏈可變區(VL)；或者f. 由SEQ ID NO：118編碼的重鏈可變區(VH)和由SEQ ID NO：89編碼的輕鏈可變區(VL)；或者g. 由SEQ ID NO：128編碼的重鏈可變區(VH)和由SEQ ID NO：69編碼的輕鏈可變區(VL)；或者h. 由SEQ ID NO：128編碼的重鏈可變區(VH)和由SEQ ID NO：89編碼的輕鏈可變區(VL)；或者i. 由SEQ ID NO：118編碼的重鏈可變區(VH)和由SEQ ID NO：99編碼的輕鏈可變區(VL)；或者j. 由SEQ ID NO：128編碼的重鏈可變區(VH)和由SEQ ID NO：99編碼的輕鏈可變區(VL)。
  57. 如請求項54至56中任一項所述的核酸，其中所述核酸是用於靶向遞送至血腦屏障或CNS中的任何其他細胞類型的病毒載體的一部分。
  58. 如請求項57所述的核酸，其中所述病毒載體是重組腺相關病毒載體(rAAV)，優選是選自AAV1至AAV12的重組腺相關病毒載體。
  59. 重組表達載體，其包含請求項54至58中任一項所述的核酸。
  60. 宿主細胞，其包含請求項54至58中任一項所述的核酸和/或請求項59所述的載體。
  61. 宿主細胞，其表達根據請求項1至29中任一項所述的人源化TDP-43結合分子。
  62. 無細胞表達系統，其包含請求項59所述的重組表達載體。
  63. 用於產生人源化TDP-43結合分子、特別是人源化抗體或其抗原結合片段的方法，其包括以下步驟：a. 在適合產生所述人源化TDP-43結合分子、特別是所述人源化抗體或其 抗原結合片段的條件下培養請求項60或61所述的宿主細胞或請求項62所述的無細胞表達系統；以及b. 分離所述人源化TDP-43結合分子，特別是所述人源化抗體或其抗原結合片段。
  64. 對從對象獲得的樣品中的TDP-43進行檢測和/或定量的方法，所述方法包括使所述樣品與根據請求項1至29中任一項所述的人源化TDP-43結合分子接觸，以及將所述樣品中的TDP-43水準與對照樣品中的TDP-43水準進行比較。
  65. 如請求項64所述的方法，其中所述樣品是人的血液、腦脊液(CSF)、組織間液(ISF)和/或尿液，優選CSF。
  66. 試劑盒，其用於診斷與TDP-43相關的疾病、障礙和/或異常、或TDP-43蛋白質病，或根據請求項39至49中任一項所述應用，或用於請求項50至53中任一項所述的方法，所述試劑盒包含根據請求項1至29中任一項所述的人源化TDP-43結合分子。
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