KR20200092328A - 항-cxcr5 항체 및 그의 조성물 및 용도 - Google Patents

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레이철 그로쓰
윌리엄 브라이언 스나이더
셴쥔 차오
로버트 조셉 던
조셉 달 포르토
마이클 카린
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화이자 인코포레이티드
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Abstract

본 발명은 CXCR5에 특이적으로 결합하는 결합하는 항체 및 그의 항원-결합 단편을 제공한다. 항체는 비-푸코실화될 수 있고, 달리 동일한 푸코실화 항체와 비교하여 증가된 ADCC를 나타낸다. 본 발명은 항체의 용도, 및 항체를 사용하는 연관된 방법을 포함한다.

Description

항-CXCR5 항체 및 그의 조성물 및 용도
관련 출원
본 출원은 2017년 12월 1일에 출원된 미국 일련 번호 62/593,830 및 2018년 9월 18일에 출원된 미국 일련 번호 62/732,985를 우선권 주장하며, 이들 각각의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
서열 목록
본 명세서는 2018년 11월 28일에 제출된 서열 목록을 추가로 참조로 포함한다. 37 C.F.R. § 1.52(e)(5)에 따라, PC72320A_Seq_Listing_ST25.txt로 확인되는 서열 목록 텍스트 파일은 112,891 바이트이고, 2018년 11월 15일에 생성되었다. 본원과 함께 전자 제출된 서열 목록은 본 명세서의 범주를 넘어 연장되지 않고, 따라서 새로운 내용을 함유하지 않는다.
공동 연구 성명서 당사자
본원에 청구된 발명은 하기 열거된 공동 연구 협정 당사자에 의해 또는 그를 대신하여 이루어졌다. 공동 연구 협정은 청구된 발명이 이루어진 날짜 또는 그 이전에 발효되었으며 청구된 발명은 공동 연구 협정의 범주 내에서 수행된 활동의 결과로서 이루어졌다. 공동 연구 협정 당사자는 샌디에고 캠퍼스를 대표하는 더 리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아(THE REGENTS OF THE UNIVERSITY OF CALIFORNIA) 및 화이자 인크.(PFIZER INC.)이다.
기술분야
본 발명은 C-X-C 케모카인 수용체 유형 5 (CXCR5)에 특이적으로 결합하는 항체 및 그의 항원-결합 단편, 및 그의 조성물, 방법 및 용도에 관한 것이다. 항체는 푸코실화 및/또는 비-푸코실화되고, 변경된 이펙터 기능을 나타낼 수 있다.
또한 CD185 또는 버킷 림프종 수용체 1 (BLR1)로도 공지되어 있는 C-X-C 케모카인 수용체 유형 5 (CXCR5)는 B 세포, 진정한 여포성 T 헬퍼 (Tfh) 세포, 및 순환 Tfh-유사 세포 (본원에서 "cTfh" 및 "Tfh-유사" 세포와 상호교환가능하게 지칭됨)에 의해 발현되는 자연 발생 G-단백질-커플링된 수용체이다. CXCR5는 면역 반응에서 중요한 역할을 하고, 자가면역 질환, 예컨대 전신 홍반성 루푸스 (SLE)를 치료하기 위한 잠재적 표적이다.
체액성 면역 반응의 중요한 성분인 배 중심 (GC)은 항원-활성화된 B 세포가 증식하고, 분화하고, 이들이 생산하는 항체의 체성 과다돌연변이 및 이뮤노글로불린 (Ig) 부류 전환이 일어나는 부위이다. 진정한 Tfh 세포는 이러한 과정을 보조하기 위한 지시 신호를 제공하고, 이는 친화도-성숙 항체의 생산에서 정점에 달한다. GC 반응의 체액성 "기억"은 항체 수준을 지속시키는 수명이 긴 형질 세포에 의해 유지되고, 또한 기억 B 세포에 의해 유지되며, 이는 항원에 의한 재-챌린지 시, 기억 Tfh 세포로부터 동족 도움을 받아 2차 GC 반응을 촉발시켜 보다 고친화도의 형질 세포가 생산되게 한다 (McHeyzer-Williams et al., 2011, Nature Rev. Immunol. 12(1):24-34). 순환 Tfh-유사 세포 (이하 "Tfh-유사" 또는 "cTfh"로 지칭됨)는 항원을 다시 직면하면 진정한 Tfh 세포로 분화하여 이들 기억 반응을 또한 지지하는 것으로 생각된다 (Crotty et al., 2011, Annu. Rev. Immmunol. 29:621-663).
중요한 것으로, 자가반응성 B 세포의 생성이 또한 GC 반응으로부터 발생할 수 있고, 이는 바람직하지 않은 결과를 낳는다. 실제로, 수많은 만성, 전신 자가면역 질환, 예컨대 SLE, RA, 근염, 쇼그렌 증후군, ANCA-연관 혈관염, 및 경피증은 자가반응성 체액성 반응의 증거를 보여준다. 예를 들어, 이들 질환의 특징인 많은 자가항체는 고친화도이고, 체성 돌연변이되고, Ig-전환되며, 이는 이들이 자가반응성 GC 반응으로부터 발생한다는 것을 시사한다 (Vinuesa et al., 2009, Nature Rev. Immunol. 9(12):845-857). 또한, 순환 Tfh-유사 세포의 증가된 빈도가 많은 이들 자가면역 질환을 갖는 환자의 말초 혈액에서 검출되었고, 그 수준은 종종 자가항체 역가 및/또는 질환 중증도와 상관된다 (Tangye et al., 2013, Nature Rev. Immunol. 13(6):412-426). 종합하면, 이들 데이터는 많은 전신 자가면역 질환에 대한 잠재적인 치료 표적으로서 B 세포, 진정한 Tfh 세포, 및 순환 Tfh-유사 세포를 강조한다.
CXCR5는 B 세포, 진정한 Tfh 세포, 및 순환 Tfh-유사 세포에 의해 발현되고, CXCR5 리간드, CXCL13의 구배에 따라 그의 트래픽킹 및 GC 반응에의 참여를 매개한다 (Vinuesa and Cyster, 2011, Immunity 35(5):671-680; Ansel et al., 1999, J. Exp. Med. 190(8):1123-1134; Ansel et al., 2000, Nature 406(6793):309-314; Cyster et al., 1999, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 246:87-92; Hardtke et al., 2005, Blood 106(6):1924-1931; Haynes et al., 2007, J. Immunol. 179(8):5099-5108). 따라서, CXCR5를 표적화하는 것은 자가면역 질환의 치료를 위한 치료 이익을 가질 수 있다.
또한, CXCR5를 표적화하는 것은 CXCR5를 발현하는 세포의 증식을 특징으로 하는 암, 예컨대 췌장암, 결장암, 방광암, T-세포 백혈병, 및 B-세포 백혈병에서 치료 이익을 가질 수 있다.
본 출원은 CXCR5 (C-X-C 케모카인 수용체 유형 5)에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 및 그의 항원-결합 단편을 개시한다. 특정 측면에서, 항체 및 그의 항원-결합 단편은 CXCR5에 결합하고, CXCL13에 대한 CXCR5 결합을 감소시킨다. 다른 측면에서, 항체는 푸코실화될 수 있지만, 보다 바람직하게는 이들은 비-푸코실화된다. 특정 측면에서, 항체 및 그의 항원-결합 단편은 변경된 이펙터 기능을 나타낸다. 특정 측면에서, 항체 및 그의 항원-결합 단편은 비-푸코실화되고, 달리 동일하지만 푸코실화된 항체 및 그의 항원-결합 단편과 비교하여 증가된 항체-의존성 세포성 세포독성 (ADCC)을 나타낸다.
특정 측면에서, 본 개시내용은, 서열식별번호(SEQ ID NO): 32의 넘버링에 따른 아미노산 잔기 번호 11에서 류신 (Leu; L) (L11)을 포함하는 에피토프에 결합하는, CXCR5에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 및 그의 항원-결합 단편을 제공한다.
또 다른 측면에서, 개시내용은, 서열식별번호: 32의 넘버링에 따른 아미노산 잔기 번호 22에서 아스파르테이트 (Asp; D)를 포함하는 에피토프에 결합하는, CXCR5에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다.
관련 기술분야의 통상의 기술자는 상용 실험에 지나지 않는 것을 사용하여 본원에 기재된 본 발명의 구체적 실시양태에 대한 많은 등가물을 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 이러한 등가물은 하기 실시양태 (E)에 의해 포괄되는 것으로 의도된다.
E1. 인간 C-X-C-케모카인 수용체 5 (CXCR5) (hCXCR5) 또는 시노몰구스 원숭이 CXCR5 (시노CXCR5)의 N 도메인 내의 에피토프에 결합하는, CXCR5에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
E2. E1에 있어서, 서열식별번호: 32의 아미노산 서열의 넘버링에 따른 hCXCR5의 아미노산 잔기 1-50 내의 에피토프에 결합하거나, 또는 서열식별번호: 33의 넘버링에 따른 시노CXCR5의 아미노산 잔기 1-50 내의 에피토프에 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
E3. E1-E2 중 어느 하나에 있어서, 서열식별번호: 32의 아미노산 서열의 넘버링에 따른 아미노산 잔기 번호 11에서 류신을 포함하는 에피토프에 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
E4. E1-E3 중 어느 하나에 있어서, 서열식별번호: 32의 아미노산 서열의 넘버링에 따른 아미노산 잔기 번호 22에서 아스파르테이트를 포함하는 에피토프에 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
E5. E1-E4 중 어느 하나에 있어서, 서열식별번호: 32의 아미노산 서열의 넘버링에 따른 아미노산 잔기 번호 11에서 류신을 포함하고 아미노산 잔기 번호 22에서 아스파르테이트를 포함하는 에피토프에 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
E6. E1-E5 중 어느 하나에 있어서, 서열식별번호: 32의 아미노산 서열의 넘버링에 따른 아미노산 잔기 번호 11에서 류신을 포함하는 에피토프에 결합하지만, 상기 잔기가 류신이 아닌 hCXCR5에는 결합하지 않는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
E7. E1-E6 중 어느 하나에 있어서, 서열식별번호: 32의 아미노산 서열의 넘버링에 따른 아미노산 잔기 번호 11에서 류신을 포함하는 에피토프에 결합하지만, 상기 잔기가 트레오닌인 hCXCR5에는 결합하지 않는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
E8. E1-E7 중 어느 하나에 있어서, 서열식별번호: 32의 아미노산 서열의 넘버링에 따른 아미노산 잔기 번호 22에서 아스파르테이트를 포함하는 에피토프에 결합하지만, 상기 잔기가 아스파르테이트가 아닌 hCXCR5에는 결합하지 않는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
E9. E1-E8 중 어느 하나에 있어서, 서열식별번호: 32의 아미노산 서열의 넘버링에 따른 아미노산 잔기 번호 22에서 아스파르테이트를 포함하는 에피토프에 결합하지만, 상기 잔기가 알라닌인 hCXCR5에는 결합하지 않는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
E10. E1-E9 중 어느 하나에 있어서, 서열식별번호: 32의 아미노산 서열의 넘버링에 따른 아미노산 잔기 번호 11에서 류신을 포함하고 아미노산 잔기 번호 22에서 아스파르테이트를 포함하는 에피토프에 결합하지만, 류신이 트레오닌으로 치환되고/거나 아스파르테이트가 알라닌으로 치환된 상기 에피토프에는 결합하지 않는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
E11. E1-E10 중 어느 하나에 있어서, EC50 약 6.60 pM, 표준 편차 약 플러스 또는 마이너스 2.33 pM의 겉보기 친화도로 인간 B 세포 상에서 발현된 hCXCR5에 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
E12. E1-E11 중 어느 하나에 있어서, EC50 약 5.89 pM, 표준 편차 약 플러스 또는 마이너스 1.40 pM의 겉보기 친화도로 인간 순환 여포성 T 헬퍼-유사 (Tfh-유사) 세포 상에서 발현된 hCXCR5에 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
E13. E1-E12 중 어느 하나에 있어서, EC50 약 10.6 pM의 겉보기 친화도로 인간 여포성 T 헬퍼 (Tfh) 세포 상에서 발현된 hCXCR5에 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
E14. E1-E13 중 어느 하나에 있어서, EC50 약 1.32 pM의 겉보기 친화도로 시노몰구스 원숭이 B 세포 상에서 발현된 시노CXCR5에 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
E15. E1-E14 중 어느 하나에 있어서, EC50 약 10.5 pM의 겉보기 친화도로 시노몰구스 원숭이 Tfh-유사 세포 상에서 발현된 시노CXCR5에 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
E16. E1-E15 중 어느 하나에 있어서, cAMP 리포터 검정에서 EC50 약 961 pM로 CXCR5-CXCL13 신호전달을 길항작용하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
E17. E1-E16 중 어느 하나에 있어서, EC50 약 2.01 pM, 표준 편차 약 플러스 또는 마이너스 2.28 pM로 hCXCR5를 발현하는 인간 B 세포에 대해 ADCC 활성을 나타내는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
E18. E1-E17 중 어느 하나에 있어서, EC50 약 4.28 pM, 표준 편차 약 플러스 또는 마이너스 2.88 pM로 hCXCR5를 발현하는 인간 Tfh-유사 세포에 대해 ADCC 활성을 나타내는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
E19. E1-E18 중 어느 하나에 있어서, EC50 약 0.11 pM로 hCXCR5를 발현하는 인간 Tfh 세포에 대해 ADCC 활성을 나타내는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
E20. E1-E19 중 어느 하나에 있어서, EC50 약 15.3 pM, 표준 편차 약 플러스 또는 마이너스 11.7 pM로 시노CXCR5를 발현하는 시노몰구스 원숭이 B 세포에 대해 ADCC 활성을 나타내는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
E21. E1-E20 중 어느 하나에 있어서, hCXCR5에 결합하지만, 인간 케모카인 수용체 CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCR9, CCR10, CMKLR1, CXCR3R1, CXCR1, CXCR2, CXCR3, CXCR4, CXCR6, CXCR7, 및 XCR1에는 검출가능하게 결합하지 않는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
E22. E1-E21 중 어느 하나에 있어서, 말초 혈액 내의 B 세포를 고갈시키는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
E23. E22에 있어서, 말초 혈액 내의 B 세포의 고갈이 가역적인 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
E24. E1-E23 중 어느 하나에 있어서, 말초 혈액 내의 Tfh-유사 세포를 고갈시키는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
E25. E1-E24 중 어느 하나에 있어서, 비장 내의 Tfh 세포를 고갈시키는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
E26. E1-E24 중 어느 하나에 있어서, 체액성 면역 기억 반응을 손상시키는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
E27. E26에 있어서, 손상된 체액성 면역 기억 반응이 시노몰구스 원숭이에서 파상풍 톡소이드에 대한 것인 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
E28. E1-E27 중 어느 하나에 있어서, CXCL13에 대한 CXCR5의 결합을 억제하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
E29. E1-E28 중 어느 하나에 있어서, 달리 포르스콜린에 의해 촉발되는 세포에서의 cAMP 생산의 CXCL13 억제를 억제하여, 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 부재 하의 cAMP의 수준과 비교하여, cAMP 수준의 증가를 발생시키는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
E30. E1-E29 중 어느 하나에 있어서, EC50 약 961 pM로 cAMP 생산의 CXCL13 억제를 억제하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
E31. E30에 있어서, CXCL13 억제의 최대 억제가 적어도 약 60%, 70% 또는 80%인 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
E32. E1-E31 중 어느 하나에 있어서, EC50 약 26 pM 미만의 겉보기 친화도로 CXCR5-발현 인간 B 세포 (예를 들어, CXCR5+ 인간 B 세포)에 결합하지만, CXCR5 마우스, 래트 또는 토끼 오르토로그를 발현하는 세포에는 결합하지 않는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
E33. E1-E32 중 어느 하나에 있어서, 인간 공여자 및 시노몰구스 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 및 인간 공여자 편도 단핵 세포 (TMC)에서 CXCR5-발현 세포의 ADCC를 촉발하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
E34. hCXCR5에 특이적으로 결합하고, E1-E33 중 어느 하나의 항체 또는 그의 항원-결합 단편과 경쟁하는 단리된 항체.
E35. E1-E34 중 어느 하나에 있어서, EC50 약 26 pM 미만의 겉보기 친화도로 CXCR5+ 인간 B 세포에 결합하지만, CXCR5 오르토로그를 발현하는 세포에는 실질적으로 결합하지 않는 항체 또는 그의 항원-결합 단편. 일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 CXCR5 오르토로그를 발현하는 세포에 대해, 예를 들어 임의의 본원에 기재된 검정에 기초하여, 검출불가능한 결합을 나타내거나; 또는 CXCR5 오르토로그를 발현하는 세포에 hCXCR5에의 결합보다 적어도 10,000-배 더 큰 EC50의 겉보기 친화도로 결합한다.
E36. E1-E35 중 어느 하나에 있어서, 서열식별번호: 2의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; 서열식별번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 서열식별번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3; 서열식별번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; 서열식별번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 및 서열식별번호: 9의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
E37. E1-E36 중 어느 하나에 있어서, 서열식별번호: 2의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; 서열식별번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 서열식별번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3; 서열식별번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; 서열식별번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 및 서열식별번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
E38. E1-E37 중 어느 하나에 있어서, 서열식별번호: 14의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; 서열식별번호: 15의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 서열식별번호: 16의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3; 서열식별번호: 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; 서열식별번호: 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 및 서열식별번호: 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
E39. E1-E38 중 어느 하나에 있어서, 서열식별번호: 1, 5, 13, 35, 37, 48-51, 39 및 58-62의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 VL, 및 서열식별번호: 6, 10, 12, 17, 18, 36, 40, 53-57 및 63의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
E40. E1-E39 중 어느 하나에 있어서, 서열식별번호: 1, 5, 13, 35, 37, 48-51, 39 및 58-62의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 VL, 및 서열식별번호: 6, 10, 12, 17, 18, 36, 40, 53-57 및 63의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
E41. E1-E40 중 어느 하나에 있어서, 수탁 번호 PTA-124324로 ATCC에 기탁된 플라스미드의 삽입물에 의해 코딩된 아미노산 서열을 포함하는 VL 및 수탁 번호 PTA-124323으로 ATCC에 기탁된 플라스미드의 삽입물에 의해 코딩된 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
E42. E1-E35 및 E39-E40 중 어느 하나에 있어서, 서열식별번호: 13의 아미노산 서열을 포함하는 VL 및 서열식별번호: 17의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
E43. E1-E35 및 E38-E40 중 어느 하나에 있어서, 서열식별번호: 13의 아미노산 서열을 포함하는 VL 및 서열식별번호: 18의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
E44. E1-E35 및 E38-E40 중 어느 하나에 있어서, 서열식별번호: 37의 아미노산 서열을 포함하는 VL 및 서열식별번호: 38의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
E45. E1-E36 및 E39-E41 중 어느 하나에 있어서, 서열식별번호: 35의 아미노산 서열을 포함하는 VL 및 서열식별번호: 36의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
E46. E1-E36 및 E39-E41 중 어느 하나에 있어서, 서열식별번호: 47의 아미노산 서열을 포함하는 VL 및 서열식별번호: 52의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
E47. E1-E36 및 E39-E41 중 어느 하나에 있어서, 서열식별번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 VL 및 서열식별번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
E48. E1-E36 및 E39-E41 중 어느 하나에 있어서, 서열식별번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 VL 및 서열식별번호: 10의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
E49. E1-E36 및 E39-E41 중 어느 하나에 있어서, 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 VL 및 서열식별번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
E50. E1-E35, E37 및 E39-E41 중 어느 하나에 있어서, 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 VL 및 서열식별번호: 12의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
E51. E1-E35, E37 및 E39-E41 중 어느 하나에 있어서, 서열식별번호: 39의 아미노산 서열을 포함하는 VL 및 서열식별번호: 40의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
E52. E1-E35, E37 및 E39-E41 중 어느 하나에 있어서, 서열식별번호: 22의 아미노산 서열을 포함하는 LC 및 서열식별번호: 23의 아미노산 서열을 포함하는 HC를 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
E53. E1-E35 및 E38-E40 중 어느 하나에 있어서, 서열식별번호: 24의 아미노산 서열을 포함하는 LC 및 서열식별번호: 25의 아미노산 서열을 포함하는 HC를 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
E54. E1-E35, E37 및 E39-E41 중 어느 하나에 있어서, 서열식별번호: 26의 아미노산 서열을 포함하는 LC 및 서열식별번호: 27의 아미노산 서열을 포함하는 HC를 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
E55. E1-E35, E37 및 E39-E41 중 어느 하나에 있어서, 서열식별번호: 28의 아미노산 서열을 포함하는 LC 및 서열식별번호: 29의 아미노산 서열을 포함하는 HC를 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
E56. E1-E35, E37 및 E39-E41 중 어느 하나에 있어서, 서열식별번호: 95의 핵산 서열에 의해 코딩된 VL 및 서열식별번호: 96의 핵산 서열에 의해 코딩된 VH를 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
E57. E1-E35, E37 및 E39-E41 중 어느 하나에 있어서, 서열식별번호: 97의 핵산 서열에 의해 코딩된 LC 및 서열식별번호: 98의 핵산 서열에 의해 코딩된 HC를 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
E58. E1-E57 중 어느 하나에 있어서, VL 프레임워크 서열 및 VH 프레임워크 서열을 포함하고, 여기서 VL 프레임워크 서열 또는 VH 프레임워크 서열 중 하나 또는 둘 다는 그것이 유래된 인간 배선 서열 형태와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하고, 여기서 VL 프레임워크 서열이 유래된 인간 배선 VL 서열은 DPK9, DPK12, DPK18, DPK24, HK102_V1, DPK1, DPK8, DPK3, DPK21, Vg_38K, DPK22, DPK15, DPL16, DPL8, V1-22, Vλ 컨센서스, Vλ1 컨센서스, Vλ3 컨센서스, Vκ 컨센서스, Vκ1 컨센서스, Vκ2 컨센서스 및 Vκ3으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서 VH 프레임워크 서열이 유래된 인간 배선 VH 서열은 DP54, DP47, DP50, DP31, DP46, DP71, DP75, DP10, DP7, DP49, DP51, DP38, DP79, DP78, DP73, VH3, VH5, VH1 및 VH4로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
E59. E1-E58 중 어느 하나에 있어서, 비-푸코실화된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
E60. E59에 있어서, 증진된 ADCC를 나타내는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
E61. 서열식별번호: 6, 7, 8, 25, 17, 18, 23, 27, 52, 53, 54, 55, 56, 57 및 63의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 VH의 CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3 서열을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
E62. 서열식별번호: 1, 2, 13, 22, 24, 26, 47, 48, 49, 50, 51, 58, 59, 60, 61 및 62의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 VL의 CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3 서열을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
E63. E1-E62 중 어느 하나에 있어서, 서열식별번호: 6의 아미노산 서열에 제시된 바와 같은 CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3 서열을 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
E64. E1-E62 중 어느 하나에 있어서, 서열식별번호: 1의 아미노산 서열의 CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3 서열을 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
E65. E1-E64 중 어느 하나에 있어서, 하기 아미노산 치환:
인간 배선 VL 서열의 상응하는 잔기로의 CDR-L1에서의 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 치환,
인간 VL 배선 서열의 상응하는 잔기로의 CDR-L2에서의 1, 2, 3, 4 또는 5개의 치환,
인간 배선 VL 서열의 상응하는 잔기로의 CDR L3에서의 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 치환,
인간 배선 VH 서열의 상응하는 잔기로의 CDR-H1에서의 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 치환,
인간 배선 VH 서열의 상응하는 잔기로의 CDR H2에서의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개의 치환
중 1개 이상을 포함하며,
여기서 인간 배선 VL 서열은 DPK9, DPK12, DPK18, DPK24, HK102_V1, DPK1, DPK8, DPK3, DPK21, Vg_38K, DPK22, DPK15, DPL16, DPL8, V1-22, Vκ1 컨센서스, Vκ2 컨센서스 및 Vκ3 컨센서스로 이루어진 군으로부터 선택되고, 인간 배선 VH는 DP54, DP47, DP50, DP31, DP46, DP71, DP75, DP10, DP7, DP49, DP51, DP38, DP79, DP78, DP73, VH3, VH5, VH1, 및 VH4로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
E66. E61-E65 중 어느 하나에 있어서, DP54, DP47, DP50, DP31, DP46, DP71, DP75, DP10, DP7, DP49, DP51, DP38, DP79, DP78, DP73, VH3, VH5, VH1, 및 VH4로 이루어진 군으로부터 선택된 인간 배선 VH 서열로부터 유래된 VH 프레임워크 서열을 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
E67. E61-E66 중 어느 하나에 있어서, 인간 VH3 배선 서열로부터 유래된 프레임워크 VH 서열을 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
E68. E61-E67 중 어느 하나에 있어서, DP54, DP47, DP50, DP31, DP46, DP49, 및 DP51로 이루어진 군으로부터 선택된 인간 배선 VH 서열로부터 유래된 프레임워크 VH 서열을 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
E69. E61-E68 중 어느 하나에 있어서, DP54, DP47, DP50, 및 DP31로 이루어진 군으로부터 선택된 인간 배선 VH 서열로부터 유래된 프레임워크 VH 서열을 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
E70. E61-E69 중 어느 하나에 있어서, 인간 배선 DP54 서열로부터 유래된 VH 프레임워크 서열을 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
E71. E61-E70 중 어느 하나에 있어서, DPK9, DPK12, DPK18, DPK24, HK102_V1, DPK1, DPK8, DPK3, DPK21, Vg_38K, DPK22, DPK15, DPL16, DPL8, V1-22, Vκ 컨센서스, Vκ1 컨센서스, Vκ2 컨센서스, 및 Vκ3 컨센서스로 이루어진 군으로부터 선택된 인간 배선 VL 서열로부터 유래된 VL 프레임워크 서열을 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
E72. E61-E71 중 어느 하나에 있어서, DPK9, DPK12, DPK18, DPK24, HK102_V1, DPK1, DPK8, DPK3, DPK21, Vg_38K, DPK22, DPK15, Vκ 컨센서스, Vκ1 컨센서스, Vκ2 컨센서스, 및 Vκ3으로 이루어진 군으로부터 선택된 인간 배선 VL 서열로부터 유래된 VL 프레임워크 서열을 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
E73. E61-E72 중 어느 하나에 있어서, 인간 배선 Vκ1 서열로부터 유래된 VL 프레임워크 서열을 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
E74. E61-E73 중 어느 하나에 있어서, DPK9, HK102_V1, DPK1, 및 DPK8로 이루어진 군으로부터 선택된 인간 배선 VL 서열로부터 유래된 VL 프레임워크 서열을 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
E75. E61-E74 중 어느 하나에 있어서, 인간 배선 DPK9 서열로부터 유래된 VL 프레임워크 서열을 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
E76. E61-E75 중 어느 하나에 있어서, VL 프레임워크 서열 및 VH 프레임워크 서열을 포함하고, 여기서 VL 프레임워크 서열 또는 VH 프레임워크 서열 중 하나 또는 둘 다는 그것이 유래된 인간 배선 서열과 적어도 90% 동일한 것인 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
E77. E61-E76 중 어느 하나에 있어서, VL 프레임워크 서열 및 VH 프레임워크 서열을 포함하고, 여기서 VL 프레임워크 서열 또는 VH 프레임워크 서열 중 하나 또는 둘 다는 그것이 유래된 인간 배선 서열과 적어도 66%, 76%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 것인 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
E78. E61-E77 중 어느 하나에 있어서, VL 프레임워크 서열 및 VH 프레임워크 서열을 포함하고, 여기서 VL 프레임워크 서열 또는 VH 프레임워크 서열 중 하나 또는 둘 다는 그것이 유래된 인간 배선 서열과 동일한 것인 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
E79. E61-E78 중 어느 하나에 있어서, 서열식별번호: 6과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
E80. E61-E79 중 어느 하나에 있어서, 서열식별번호: 6과 적어도 92% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
E81. E61-E80 중 어느 하나에 있어서, 서열식별번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
E82. E61-E81 중 어느 하나에 있어서, 서열식별번호: 1과 적어도 66% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
E83. E61-E82 중 어느 하나에 있어서, 서열식별번호: 1과 적어도 66%, 76%, 80%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
E84. E61-E83 중 어느 하나에 있어서, 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
E85. E1-E84 중 어느 하나에 있어서, Fc 도메인을 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
E86. E85에 있어서, Fc 도메인이 IgA (예를 들어 IgA1 또는 IgA2), IgD, IgE, IgM, 또는 IgG (예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4)의 Fc 도메인인 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
E87. E86에 있어서, Fc 도메인이 IgG의 Fc 도메인인 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
E88. E87에 있어서, IgG가 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
E89. E88에 있어서, IgG가 IgG1인 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
E90. E1-E89 중 어느 하나에 있어서, 서열식별번호: 29와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
E91. E1-E89 중 어느 하나에 있어서, 서열식별번호: 29와 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
E92. E1-E89 중 어느 하나에 있어서, 서열식별번호: 29의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
E93. E1-E93 중 어느 하나에 있어서, 서열식별번호: 28과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 LC를 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
E94. E1-E93 중 어느 하나에 있어서, 서열식별번호: 28과 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 LC를 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
E95. E1-E94 중 어느 하나에 있어서, 서열식별번호: 28의 아미노산 서열을 포함하는 LC를 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
E96. ATCC 수탁 번호 PTA-124323으로 ATCC에 기탁된 플라스미드의 삽입물에 의해 코딩된 VH 서열을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
E97. ATCC 수탁 번호 PTA-124324로 ATCC에 기탁된 플라스미드의 삽입물에 의해 코딩된 VL 서열을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
E98. 인간 CXCR5에의 결합에 대해 마우스 11G2, 키메라 11G2, h11G2 VH (XC152)/VL (XC151), h11G2 VH (XC152)/VL (XC153), h11G2 VH (XC152)/VL (XC154), h11G2 VH (XC152)/VL (XC346), h11G2 VH (XC152)/VL (XC347), h11G2 VH (XC152)/VL (XC348), h11G2 VH (XC152)/VL (XC349), h11G2 VH (XC155)/VL (XC151), h11G2 VH (XC155)/VL (XC153), h11G2 VH (XC155)/VL (XC154), h11G2 VH (XC155)/VL (XC346), h11G2 VH (XC155)/VL (XC347), h11G2 VH (XC155)/VL (XC3484), h11G2 VH (XC155)/VL (XC349), h11G2 VH (XC156)/VL (XC151), h11G2 VH (XC156)/VL (XC153), h11G2 VH (XC156)/VL (XC154), h11G2 VH (XC156)/VL (XC346), h11G2 VH (XC156)/VL (XC347), h11G2 VH (XC156)/VL (XC348), h11G2 VH (XC156)/VL (XC349), h11G2 VH (XC157)/VL (XC151), h11G2 VH (XC157)/VL (XC153), h11G2 VH (XC157)/VL (XC154), h11G2 VH (XC157)/VL (XC346), h11G2 VH (XC157)/ VL (XC347), h11G2 VH (XC157)/ VL (XC348), h11G2 VH (XC157)/ VL (XC349), h11G2 VH (XC350)/ VL (XC151), h11G2 VH (XC350)/ VL (XC153), h11G2 VH (XC350)/ VL (XC154), h11G2 VH (XC350)/ VL (XC346), h11G2 VH (XC350)/ VL (XC347), h11G2 VH (XC350)/ VL (XC348), h11G2 VH (XC350)/ VL (XC349), h11G2 VH (XC351)/ VL (XC151), h11G2 VH (XC351)/ VL (XC153), h11G2 VH (XC351)/ VL (XC154), h11G2 VH (XC351)/ VL (XC346), h11G2 VH (XC351)/ VL (XC347), h11G2 VH (XC351)/ VL (XC348), 및 h11G2 VH (XC351)/ VL (XC349), h11G2 VH (XC352)/ VL (XC151), h11G2 VH (XC352)/ VL (XC153), h11G2 VH (XC352)/ VL (XC154), h11G2 VH (XC352)/ VL (XC346), h11G2 VH (XC352)/ VL (XC347), h11G2 VH (XC352)/ VL (XC348), h11G2 VH (XC352)/ VL (XC349), h11G2 VH (XC353)/ VL (XC151), h11G2 VH (XC353)/ VL (XC153), h11G2 VH (XC353)/ VL (XC154), h11G2 VH (XC353)/ VL (XC346), h11G2 VH (XC353)/ VL (XC347), h11G2 VH (XC353)/ VL (XC348), h11G2 VH (XC353)/ VL (XC349), h11G2 VH (XC354)/ VL (XC151), h11G2 VH (XC354)/ VL (XC153), h11G2 VH (XC354)/ VL (XC154), h11G2 VH (XC354)/ VL (XC346), h11G2 VH (XC354)/ VL (XC347), h11G2 VH (XC354)/ VL (XC348), h11G2 VH (XC354)/ VL (XC349), 마우스 41A10, 키메라 41A10, h41A10 VH (XC147)/ VL (XC142), h41A10 VH (XC147)/ VL (XC143), h41A10 VH (XC147)/ VL (XC144), h41A10 VH (XC147)/ VL (XC145), h41A10 VH (XC147)/ VL (XC146), h41A10 VH (XC147)/ VL (XC149), h41A10 VH (XC148)/ VL (XC142), h41A10 VH (XC148)/ VL (XC143), h41A10 VH (XC148)/ VL (XC144), h41A10 VH (XC148)/ VL (XC145), h41A10 VH (XC148)/ VL (XC146), h41A10 VH (XC148)/ VL (XC149), h41A10 VH (XC150)/ VL (XC142), h41A10 VH (XC150)/ VL (XC143), h41A10 VH (XC150)/ VL (XC144), h41A10 VH (XC150)/ VL (XC145), h41A10 VH (XC150)/ VL (XC146), h41A10 VH (XC150)/ VL (XC149), 마우스 5H7, 및 키메라 5H7 중 1종 이상과 경쟁하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
E99. CXCL13에 의한 인간 CXCR5에의 결합에 대해 E1-E98 중 어느 하나의 항체와 경쟁하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
E100. E1-E99 중 어느 하나에 있어서, Fc 융합체 단백질, 모노바디, 맥시바디, 이중기능적 항체, scFab, scFv, 펩티바디인 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
E101. E1-E100 중 어느 하나에 있어서, 약 10nM, 5nM, 2nM, 1nM, 900pM, 800pM, 700pM, 600pM, 500pM, 400pM, 300pM, 250pM, 200pM, 150pM, 100pM, 50pM, 40pM, 30pM, 25pM, 20pM, 15pM, 10pM, 5pM, 및 1pM로 이루어진 군으로부터 선택된 대략적인 KD 값 또는 그 미만으로 인간 CXCR5에 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
E102. E1-E101 중 어느 하나에 있어서, 약 10nM, 5nM, 2nM, 1nM, 900pM, 800pM, 700pM, 600pM, 500pM, 400pM, 300pM, 250pM, 200pM, 150pM, 100pM, 50pM, 40pM, 30pM, 25pM, 20pM, 15pM, 13pM,10pM, 5pM, 및 1pM로 이루어진 군으로부터 선택된 대략적인 KD 값 또는 그 미만으로 시노몰구스 원숭이 CXCR5에 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
E103. E1-E102 중 어느 하나에 있어서, 시노몰구스 CXCR5에 대한 항체 또는 항원-결합 단편의 결합 KD가 인간 CXCR5에 대한 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 결합 KD의 크기의 한 자릿수 내인 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
E104. E1-E103 중 어느 하나에 있어서, 인간 CXCR5에 대한 항체 또는 항원 결합 단편의 결합 KD의 비가 시노몰구스 CXCR5에 대한 결합과 비교하여 5:1 내지 1:5인 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
E105. E1-E104 중 어느 하나에 있어서, 인간 CXCR5에 대한 항체 또는 항원 결합 단편의 결합 KD의 비가 시노몰구스 CXCR5에 대한 결합과 비교하여 2:1 내지 1:2인 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
E106. E1-E105 중 어느 하나에 있어서, 시노몰구스 CXCR5에 대한 항체 또는 항원 결합 단편의 결합 KD의 비가 인간 CXCR5에 대한 결합과 비교하여 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7,1.8, 1.9, 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3.0, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4.0, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 및 6.2로 이루어진 군으로부터 선택된 하한 값, 및 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3.0 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4.0, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 6.2, 9, 9.2, 및 10으로 이루어진 군으로부터 선택된 상한 값의 범위 내인 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
E107. E1-E106 중 어느 하나에 있어서, 서열식별번호: 33의 시노몰구스 CXCR5에 대한 항체 또는 항원 결합 단편의 결합 KD의 비가 서열식별번호: 32의 인간 CXCR5에 대한 결합과 비교하여 약 1.0 내지 약 10.0인 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
E108. E1-107 중 어느 하나에 있어서, 인간에서의 예측 반감기가 약 1일 내지 21일의 범위인 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
E109. E1-108 중 어느 하나에 있어서, 인간에서의 예측 반감기가 약 17일인 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
E110. 마우스 11G2 VH, 마우스 11G2 VL, 키메라 11G2 VH, 키메라 11G2 VL, 인간화 11G2 VH (XC152), h11G2 VH (XC155), h11G2 VH (XC156), h11G2 VH (XC157), h11G2 VH (XC350), h11G2 VH (XC351), h11G2 VH (XC352), h11G2 VH (XC353), h11G2 VH (XC354), h11G2 VL (XC151), h11G2 VL (XC153), h11G2 VL (XC154), h11G2 VL (XC346), h11G2 VL (XC347), h11G2 VL (XC348), h11G2 VL (XC349), 마우스 41A10 VH, 마우스 41A10 VL, 키메라 41A10 VH, 키메라 41A10 VL, 인간화 41A10 VH (XC147), h41A10 VH (XC148), h41A10 VH (XC150), h41A10 VL (XC142), h41A10 VL (XC143), h41A10 VL (XC144), h41A10 VL (XC145), h41A10 VL (XC146), h41A10 VL (XC149), 마우스 5H7 VH, 마우스 5H7 VL, 키메라 5H7 VH, 및 키메라 5H7 VL로 이루어진 군으로부터 선택된 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 CDR을 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
E111. 마우스 11G2 VH, 마우스 11G2 VL, 키메라 11G2 VH, 키메라 11G2 VL, h11G2 VH (XC152), h11G2 VH (XC155), h11G2 VH (XC156), h11G2 VH (XC157), h11G2 VH (XC350), h11G2 VH (XC351), h11G2 VH (XC352), h11G2 VH (XC353), h11G2 VH (XC354), h11G2 VL (XC151), h11G2 VL (XC153), h11G2 VL (XC154), h11G2 VL (XC346), h11G2 VL (XC347), h11G2 VL (XC348), h11G2 VL (XC349), 마우스 41A10 VH, 마우스 41A10 VL, 키메라 41A10 VH, 키메라 41A10 VL, 인간화 41A10 VH (XC147), h41A10 VH (XC148), h41A10 VH (XC150), h41A10 VL (XC142), h41A10 VL (XC143), h41A10 VL (XC144), h41A10 VL (XC145), h41A10 VL (XC146), h41A10 VL (XC149), 마우스 5H7 VH, 마우스 5H7 VL, 키메라 5H7 VH, 및 키메라 5H7 VL로 이루어진 군으로부터 선택된 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 VL 및 VH를 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
E112. 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 항체 또는 그의 항원-결합 단편:
a. 마우스 11G2 VH 및 마우스 11G2 VL을 포함하는 항체;
b. 키메라 11G2 VH 및 키메라 11G2 VL을 포함하는 항체;
c. 인간화 11G2 VH (XC152) 및 마우스 11G2 VL, 키메라 11G2 VL, h11G2 VL (XC151), h11G2 VL (XC153), h11G2 VL (XC154), h11G2 VL (XC346), h11G2 VL (XC347), h11G2 VL (XC348), 및 h11G2 VL (XC349)로 이루어진 군으로부터 선택된 VL을 포함하는 항체;
d. 인간화 11G2 VH (XC155) 및 마우스 11G2 VL, 키메라 11G2 VL, h11G2 VL (XC151), h11G2 VL (XC153), h11G2 VL (XC154), h11G2 VL (XC346), h11G2 VL (XC347), h11G2 VL (XC348), 및 h11G2 VL (XC349)로 이루어진 군으로부터 선택된 VL을 포함하는 항체;
e. 인간화 11G2 VH (XC156) 및 마우스 11G2 VL, 키메라 11G2 VL, h11G2 VL (XC151), h11G2 VL (XC153), h11G2 VL (XC154), h11G2 VL (XC346), h11G2 VL (XC347), h11G2 VL (XC348), 및 h11G2 VL (XC349)로 이루어진 군으로부터 선택된 VL을 포함하는 항체;
f. 인간화 11G2 VH (XC157) 및 마우스 11G2 VL, 키메라 11G2 VL, h11G2 VL (XC151), h11G2 VL (XC153), h11G2 VL (XC154), h11G2 VL (XC346), h11G2 VL (XC347), h11G2 VL (XC348), 및 h11G2 VL (XC349)로 이루어진 군으로부터 선택된 VL을 포함하는 항체;
g. 인간화 11G2 VH (XC350) 및 마우스 11G2 VL, 키메라 11G2 VL, h11G2 VL (XC151), h11G2 VL (XC153), h11G2 VL (XC154), h11G2 VL (XC346), h11G2 VL (XC347), h11G2 VL (XC348), 및 h11G2 VL (XC349)로 이루어진 군으로부터 선택된 VL을 포함하는 항체;
h. h11G2 VH (XC351) 및 마우스 11G2 VL, 키메라 11G2 VL, h11G2 VL (XC151), h11G2 VL (XC153), h11G2 VL (XC154), h11G2 VL (XC346), h11G2 VL (XC347), h11G2 VL (XC348), 및 h11G2 VL (XC349)로 이루어진 군으로부터 선택된 VL을 포함하는 항체;
i. h11G2 VH (XC352) 및 마우스 11G2 VL, 키메라 11G2 VL, h11G2 VL (XC151), h11G2 VL (XC153), h11G2 VL (XC154), h11G2 VL (XC346), h11G2 VL (XC347), h11G2 VL (XC348), 및 h11G2 VL (XC349)로 이루어진 군으로부터 선택된 VL을 포함하는 항체;
j. h11G2 VH (XC353) 및 마우스 11G2 VL, 키메라 11G2 VL, h11G2 VL (XC151), h11G2 VL (XC153), h11G2 VL (XC154), h11G2 VL (XC346), h11G2 VL (XC347), h11G2 VL (XC348), 및 h11G2 VL (XC349)로 이루어진 군으로부터 선택된 VL을 포함하는 항체;
k. h11G2 VH (XC354) 및 마우스 11G2 VL, 키메라 11G2 VL, h11G2 VL (XC151), h11G2 VL (XC153), h11G2 VL (XC154), h11G2 VL (XC346), h11G2 VL (XC347), h11G2 VL (XC348), 및 h11G2 VL (XC349)로 이루어진 군으로부터 선택된 VL을 포함하는 항체;
l. h11G2 VL (XC151) 및 마우스 11G2 VH, 키메라 11G2 VH, h11G2 VH (XC152), h11G2 VH (XC155), h11G2 VH (XC156), h11G2 VH (XC157), h11G2 VH (XC350), h11G2 VH (XC351), h11G2 VH (XC352), h11G2 VH (XC353), 및 h11G2 VH (XC354)로 이루어진 군으로부터 선택된 VH를 포함하는 항체;
m. h11G2 VL (XC153) 및 마우스 11G2 VH, 키메라 11G2 VH, h11G2 VH (XC152), h11G2 VH (XC155), h11G2 VH (XC156), h11G2 VH (XC157), h11G2 VH (XC350), h11G2 VH (XC351), h11G2 VH (XC352), h11G2 VH (XC353), 및 h11G2 VH (XC354)로 이루어진 군으로부터 선택된 VH를 포함하는 항체;
n. h11G2 VL (XC154) 및 마우스 11G2 VH, 키메라 11G2 VH, h11G2 VH (XC152), h11G2 VH (XC155), h11G2 VH (XC156), h11G2 VH (XC157), h11G2 VH (XC350), h11G2 VH (XC351), h11G2 VH (XC352), h11G2 VH (XC353), 및 h11G2 VH (XC354)로 이루어진 군으로부터 선택된 VH를 포함하는 항체;
o. h11G2 VL (XC346) 및 마우스 11G2 VH, 키메라 11G2 VH, h11G2 VH (XC152), h11G2 VH (XC155), h11G2 VH (XC156), h11G2 VH (XC157), h11G2 VH (XC350), h11G2 VH (XC351), h11G2 VH (XC352), h11G2 VH (XC353), 및 h11G2 VH (XC354)로 이루어진 군으로부터 선택된 VH를 포함하는 항체;
p. h11G2 VL (XC347) 및 마우스 11G2 VH, 키메라 11G2 VH, h11G2 VH (XC152), h11G2 VH (XC155), h11G2 VH (XC156), h11G2 VH (XC157), h11G2 VH (XC350), h11G2 VH (XC351), h11G2 VH (XC352), h11G2 VH (XC353), 및 h11G2 VH (XC354)로 이루어진 군으로부터 선택된 VH를 포함하는 항체;
q. h11G2 VL (XC348) 및 마우스 11G2 VH, 키메라 11G2 VH, h11G2 VH (XC152), h11G2 VH (XC155), h11G2 VH (XC156), h11G2 VH (XC157), h11G2 VH (XC350), h11G2 VH (XC351), h11G2 VH (XC352), h11G2 VH (XC353), 및 h11G2 VH (XC354)로 이루어진 군으로부터 선택된 VH를 포함하는 항체;
r. h11G2 VL (XC349) 및 마우스 11G2 VH, 키메라 11G2 VH, h11G2 VH (XC152), h11G2 VH (XC155), h11G2 VH (XC156), h11G2 VH (XC157), h11G2 VH (XC350), h11G2 VH (XC351), h11G2 VH (XC352), h11G2 VH (XC353), 및 h11G2 VH (XC354)로 이루어진 군으로부터 선택된 VH를 포함하는 항체;
s. 마우스 41A10 VH 및 마우스 41A10 VL, 키메라 41A10 VL, h41A10 VL (XC142), h41A10 VL (XC143), h41A10 VL (XC144), h41A10 VL (XC145), h41A10 VL (XC146), 및 h41A10 VL (XC149)로 이루어진 군으로부터 선택된 VL을 포함하는 항체;
t. 키메라 41A10 VH 및 마우스 41A10 VL, 키메라 41A10 VL, h41A10 VL (XC142), h41A10 VL (XC143), h41A10 VL (XC144), h41A10 VL (XC145), h41A10 VL (XC146), 및 h41A10 VL (XC149)로 이루어진 군으로부터 선택된 VL을 포함하는 항체;
u. 인간화 41A10 VH (XC147) 및 마우스 41A10 VL, 키메라 41A10 VL, h41A10 VL (XC142), h41A10 VL (XC143), h41A10 VL (XC144), h41A10 VL (XC145), h41A10 VL (XC146), 및 h41A10 VL (XC149)로 이루어진 군으로부터 선택된 VL을 포함하는 항체;
v. h41A10 VH (XC148) 및 마우스 41A10 VL, 키메라 41A10 VL, h41A10 VL (XC142), h41A10 VL (XC143), h41A10 VL (XC144), h41A10 VL (XC145), h41A10 VL (XC146), 및 h41A10 VL (XC149)로 이루어진 군으로부터 선택된 VL을 포함하는 항체;
w. h41A10 VH (XC150) 및 마우스 41A10 VL, 키메라 41A10 VL, h41A10 VL (XC142), h41A10 VL (XC143), h41A10 VL (XC144), h41A10 VL (XC145), h41A10 VL (XC146), h41A10 VL (XC149), 및 h41A10 VL (XC142)로 이루어진 군으로부터 선택된 VL;
x. 마우스 41A10 VL 및 마우스 41A10 VH, 키메라 41A10 VH, h41A10 VH (XC147), h41A10 VL (XC148), 및 h41A10 VH (XC150)로 이루어진 군으로부터 선택된 VH를 포함하는 항체;
y. 키메라 41A10 VL 및 마우스 41A10 VH, 키메라 41A10 VH, h41A10 VH (XC147), h41A10 VL (XC148), 및 h41A10 VH (XC150)로 이루어진 군으로부터 선택된 VH를 포함하는 항체;
z. h41A10 VL (XC143) 및 마우스 41A10 VH, 키메라 41A10 VH, h41A10 VH (XC147), h41A10 VL (XC148), 및 h41A10 VH (XC150)로 이루어진 군으로부터 선택된 VH를 포함하는 항체;
aa. h41A10 VL (XC144) 및 마우스 41A10 VH, 키메라 41A10 VH, h41A10 VH (XC147), h41A10 VL (XC148), 및 h41A10 VH (XC150)로 이루어진 군으로부터 선택된 VH를 포함하는 항체;
bb. h41A10 VL (XC145) 및 마우스 41A10 VH, 키메라 41A10 VH, h41A10 VH (XC147), h41A10 VL (XC148), 및 h41A10 VH (XC150)로 이루어진 군으로부터 선택된 VH를 포함하는 항체;
cc. h41A10 VL (XC146) 및 마우스 41A10 VH, 키메라 41A10 VH, h41A10 VH (XC147), h41A10 VL (XC148), 및 h41A10 VH (XC150)로 이루어진 군으로부터 선택된 VH를 포함하는 항체;
dd. h41A10 VL (XC149) 및 마우스 41A10 VH, 키메라 41A10 VH, h41A10 VH (XC147), h41A10 VL (XC148), 및 h41A10 VH (XC150)로 이루어진 군으로부터 선택된 VH를 포함하는 항체;
ee. 마우스 5H7 VH 및 마우스 5H7 및 키메라 5H7 VL로 이루어진 군으로부터 선택된 VL을 포함하는 항체;
ff. 마우스 5H7 VL 및 마우스 5H7 VH 및 키메라 5H7 VH로 이루어진 군으로부터 선택된 VH;
gg. h11G2 VH (XC152) 및 h11G2 VL (XC151)을 포함하는 항체;
hh. h11G2 VH (XC155) 및 h11G2 VL (XC153)을 포함하는 항체;
ii. h11G2 VH (XC155) 및 h11G2 VL (XC154)을 포함하는 항체;
jj. h11G2 VH (XC156) 및 h11G2 VL (XC153)을 포함하는 항체;
kk. h11G2 VH (XC157) 및 h11G2 (XC154)를 포함하는 항체;
ll. 마우스 11G2 VH 및 마우스 11G2 VL을 포함하는 항체;
mm. 키메라 11G2 HC 및 키메라 11G2 LC를 포함하는 항체;
nn. h11G2 VH (XC152) 및 h11G2 VL (XC151)을 포함하는 항체;
oo. h11G2 VH (XC155) 및 h11G2 VL (XC154)을 포함하는 항체;
pp. h11G2 VH (XC156) 및 h11G2 VL (XC153)을 포함하는 항체;
qq. h11G2 VH (XC157) 및 h11G2 VL (XC154)을 포함하는 항체;
rr. 마우스 41A10 VH 및 마우스 41A10 VL을 포함하는 항체;
ss. 키메라 41A10 HC 및 키메라 41A10 LC를 포함하는 항체;
tt. h41A10 VH (XC147) 및 h41A10 VL(XC142)을 포함하는 항체;
uu. h41A10 VH(XC147) 및 h41A10 VL(XC143)을 포함하는 항체;
vv. h41A10 VH(XC147) 및 h41A10 VL(XC144)을 포함하는 항체;
ww. h41A10 VH(XC147) 및 h41A10 VL(XC145)을 포함하는 항체;
xx. h41A10 VH(XC148) 및 h41A10 VL(XC142)을 포함하는 항체;
yy. h41A10 VH(XC148) 및 h41A10 VL(XC143)을 포함하는 항체;
zz. h41A10 VH(XC148) 및 h41A10VL(XC144)을 포함하는 항체;
aaa. 마우스 5H7 VH 및 마우스 5H7 VL을 포함하는 항체; 및
bbb. 키메라 5H7 HC 및 키메라 5H7 LC를 포함하는 항체.
E113. 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 항체 또는 그의 항원-결합 단편:
(a) 서열식별번호: 36의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 35의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 항체;
(b) 서열식별번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열식별번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 서열식별번호: 9의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3, 서열식별번호: 2의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열식별번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열식별번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 항체;
(c) 서열식별번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열식별번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 서열식별번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3, 서열식별번호: 2의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열식별번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열식별번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 항체;
(d) 서열식별번호: 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열식별번호: 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 서열식별번호: 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3, 서열식별번호: 14의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열식별번호: 15의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열식별번호: 16의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 항체;
(e) 서열식별번호: 6의 아미노산 서열에 제시된 바와 같은 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, 및 서열식별번호: 1의 아미노산 서열에 제시된 바와 같은 CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3을 포함하는 항체;
(f) 수탁 번호 PTA-124323으로 ATCC에 기탁된 플라스미드의 삽입물에 의해 코딩된 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, 및 수탁 번호 PTA-124324로 ATCC에 기탁된 플라스미드의 삽입물에 의해 코딩된 CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3을 포함하는 항체;
(g) 서열식별번호: 52 (XC152)의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 1, 5, 35, 47, 48, 49, 50, 및 51로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 항체;
(h) 서열식별번호: 6 (XC155)의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 1, 5, 35, 47, 48, 49, 50, 및 51로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 항체;
(i) 서열식별번호: 10 (XC156)의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 1, 5, 35, 47, 48, 49, 50, 및 51로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 항체;
(j) 서열식별번호: 12 (XC157)의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 1, 5, 35, 47, 48, 49, 50, 및 51로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 항체;
(k) 서열식별번호: 53 (XC350)의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 1, 5, 35, 47, 48, 49, 50, 및 51로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 항체;
(l) 서열식별번호: 54 (XC351)의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 1, 5, 35, 47, 48, 49, 50, 및 51로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 항체;
(m) 서열식별번호: 55 (XC352)의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 1, 5, 35, 47, 48, 49, 50, 및 51로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 항체;
(n) 서열식별번호: 56 (XC353)의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 1, 5, 35, 47, 48, 49, 50, 및 51로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 항체;
(o) 서열식별번호: 55 (XC354)의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 1, 5, 35, 47, 48, 49, 50, 및 51로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 항체;
(p) 서열식별번호: 47 (XC151)의 아미노산 서열을 포함하는 VL 및 서열식별번호: 6, 10, 12, 36, 52, 53, 54, 55, 56, 및 57로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하는 항체;
(q) 서열식별번호: 5 (XC153)의 아미노산 서열을 포함하는 VL 및 서열식별번호: 6, 10, 12, 36, 52, 53, 54, 55, 56, 및 57로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하는 항체;
(r) 서열식별번호: 1 (XC154)의 아미노산 서열을 포함하는 VL 및 서열식별번호: 6, 10, 12, 36, 52, 53, 54, 55, 56, 및 57로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하는 항체;
(s) 서열식별번호: 48 (XC346)의 아미노산 서열을 포함하는 VL 및 서열식별번호: 6, 10, 12, 36, 52, 53, 54, 55, 56, 및 57로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하는 항체;
(t) 서열식별번호: 49 (XC347)의 아미노산 서열을 포함하는 VL 및 서열식별번호: 6, 10, 12, 36, 52, 53, 54, 55, 56, 및 57로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하는 항체;
(u) 서열식별번호: 50 (XC348)의 아미노산 서열을 포함하는 VL 및 서열식별번호: 6, 10, 12, 36, 52, 53, 54, 55, 56, 및 57로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하는 항체;
(v) 서열식별번호: 51 (XC349)의 아미노산 서열을 포함하는 VL 및 서열식별번호: 6, 10, 12, 36, 52, 53, 54, 55, 56, 및 57로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하는 항체;
(w) 서열식별번호: 38 (m 41A10 VH)의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 13, 37, 58, 59, 60, 61 및 62로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 항체;
(x) 서열식별번호: 17 (XC148)의 아미노산 서열을 포함하는 VH, 및 서열식별번호: 13, 37, 58, 59, 60, 61 및 62로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 항체;
(y) 서열식별번호: 18 (XC147)의 아미노산 서열을 포함하는 VH, 및 서열식별번호: 13, 37, 58, 59, 60, 61 및 62로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 항체;
(z) 서열식별번호: 63 (XC150)의 아미노산 서열을 포함하는 VH, 및 서열식별번호: 13, 37, 58, 59, 60, 61 및 62로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 항체;
(aa) 서열식별번호: 37 (마우스 h41A10 VL)의 아미노산 서열을 포함하는 VL, 및 서열식별번호: 17, 18, 38 및 63으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하는 항체;
(bb) 서열식별번호: 13 (h41A10 XC142 VL)의 아미노산 서열을 포함하는 VL, 및 서열식별번호: 17, 18, 38 및 63으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하는 항체;
(cc) 서열식별번호: 58 (h41A10 XC143 VL)의 아미노산 서열을 포함하는 VL, 및 서열식별번호: 17, 18, 38 및 63으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하는 항체;
(dd) 서열식별번호: 59 (h41A10 XC144 VL)의 아미노산 서열을 포함하는 VL, 및 서열식별번호: 17, 18, 38 및 63으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하는 항체;
(ee) 서열식별번호: 60 (h41A10 XC145 VL)의 아미노산 서열을 포함하는 VL, 및 서열식별번호: 17, 18, 38 및 63으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하는 항체;
(ff) 서열식별번호: 61 (h41A10 XC1446 VL)의 아미노산 서열을 포함하는 VL, 및 서열식별번호: 17, 18, 38 및 63으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하는 항체;
(gg) 서열식별번호: 62 (h41A10 XC149 VL)의 아미노산 서열을 포함하는 VL, 및 서열식별번호: 17, 18, 38 및 63으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하는 항체;
(hh) 서열식별번호: 40 (마우스 5H7 VH)의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 39의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 항체;
(ii) 서열식별번호: 52의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 47의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 항체;
(jj) 서열식별번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 항체;
(kk) 서열식별번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 항체;
(ll) (ii) 서열식별번호: 10의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 항체;
(mm) 서열식별번호: 10의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 항체; 및
(nn) 서열식별번호: 12의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 항체.
E114. 인간 CXCR5에의 결합에 대해 E1-E113 중 어느 하나의 항체 또는 그의 항원-결합 단편과 경쟁하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
E115. E1-E114 중 어느 하나의 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 코딩하는 단리된 핵산.
E116. E1-E109 중 어느 하나의 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 코딩하는 적어도 1개의 핵산 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자.
E117. 서열식별번호: 95, 96, 97 및 98로서 제시된 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자.
E118. 서열식별번호: 95로서 제시된 바와 같은 핵산 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자.
E119. 서열식별번호: 96으로서 제시된 바와 같은 핵산 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자.
E120. 서열식별번호: 95로서 제시된 바와 같은 핵산 서열, 및 서열식별번호: 96으로서 제시된 바와 같은 핵산 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자.
E121. 서열식별번호: 97로서 제시된 바와 같은 핵산 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자.
E122. 서열식별번호: 98로서 제시된 바와 같은 핵산 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자.
E123. 서열식별번호: 97로서 제시된 바와 같은 핵산 서열, 및 서열식별번호: 98로서 제시된 바와 같은 핵산 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자.
E124. 수탁 번호 PTA-124323으로 ATCC에 기탁된 플라스미드의 삽입물의 핵산 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자.
E125. 수탁 번호 PTA-124324로 ATCC에 기탁된 플라스미드의 삽입물의 핵산 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자.
E126. CXCR5에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 VH, VL, 또는 둘 다를 코딩하는 단리된 핵산이며, 서열식별번호: 95의 핵산 서열, 서열식별번호: 107의 핵산 서열, 또는 둘 다를 포함하는 단리된 핵산.
E127. CXCR5에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 중쇄, 경쇄, 또는 둘 다를 코딩하는 단리된 핵산이며, 서열식별번호: 97의 핵산 서열, 서열식별번호: 98의 핵산 서열, 또는 둘 다를 포함하는 단리된 핵산.
E128. CXCR5에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 VH를 코딩하는 단리된 핵산이며, 수탁 번호 PTA-124323으로 ATCC에 기탁된 플라스미드의 삽입물의 핵산 서열을 포함하는 단리된 핵산.
E129. CXCR5에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 VL을 코딩하는 단리된 핵산이며, 수탁 번호 PTA-124324로 ATCC에 기탁된 플라스미드의 삽입물의 핵산 서열을 포함하는 단리된 핵산.
E130. CXCR5에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 VL 및 VH를 코딩하는 단리된 핵산이며, 수탁 번호 PTA-124324로 ATCC에 기탁된 플라스미드의 삽입물의 핵산 서열 및 수탁 번호 PTA-124323으로 ATCC에 기탁된 플라스미드의 삽입물의 핵산 서열을 포함하는 단리된 핵산.
E131. E115-E130 중 어느 하나의 핵산 분자를 포함하는 벡터.
E132. E115-E131 중 어느 하나의 핵산 분자 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포.
E133. E132에 있어서, 포유동물 세포인 숙주 세포.
E134. E133에 있어서, CHO 세포, COS 세포, HEK-293 세포, NS0 세포, PER.C6® 세포, 또는 Sp2.0 세포인 숙주 세포.
E135. E132-134 중 어느 하나에 있어서, 기능적 알파-1,6-푸코실트랜스퍼라제 (FUT8)가 결여된 숙주 세포.
E136. E132-135 중 어느 하나에 있어서, 기능적 알파-1,6-푸코실트랜스퍼라제 효소를 발현하지 않는 숙주 세포.
E137. E132-136 중 어느 하나에 있어서, 기능적 효소를 코딩하는 FUT8 유전자가 결여된 숙주 세포.
E138. E132-137 중 어느 하나에 있어서, 기능적 FUT8 유전자를 코딩하는 유전자가 결여된 숙주 세포.
E139. E132-139 중 어느 하나에 있어서, 포텔리젠트(Potelligent)® CHOK1SV 세포 또는 Lec13 CHO 세포인 숙주 세포.
E140. E139에 있어서, 포텔리젠트® CHOK1SV 세포인 숙주 세포.
E141. 항체 또는 항원-결합 단편이 E1-E114 중 어느 하나의 숙주 세포에 의해 발현되는 조건 하에 상기 숙주 세포를 배양하는 것을 포함하는, 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제조하는 방법.
E142. E141에 있어서, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 단리하는 것을 추가로 포함하는 방법.
E143. E115-E131 중 어느 하나의 핵산 분자 또는 벡터를 포함하는, 기능적 FUT8이 결여된 숙주 세포를 배양하는 것을 포함하는, 비-푸코실화 항-CXCR5 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제조하는 방법.
E144. E143에 있어서, 숙주 세포가 포텔리젠트® CHOK1SV 세포인 방법.
E145. E141-E114 중 어느 하나의 방법을 사용하여 생산된, 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
E146. E1-E114 중 어느 하나에 있어서, 비-푸코실화된 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
E147. E146에 있어서, 푸코실화된 달리 동일한 항체 또는 그의 항원-결합 단편과 비교하여 증진된 항체-의존성 세포성 세포독성 (ADCC)을 나타내는, 비-푸코실화 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
E148. E146에 있어서, 푸코실화된 달리 동일한 항체 또는 그의 항원-결합 단편과 비교하여 약 2-배, 약 5-배, 약 7-배, 약 10-배, 약 20-배, 약 30-배, 약 40-배, 약 50-배, 약 60-배, 약 70-배, 약 80-배, 약 90-배, 약 100-배, 약 110-배, 약 120-배, 약 130-배, 약 140-배, 및 약 143-배 더 큰 ADCC를 나타내는 비-푸코실화 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
E149. E1-E114 및 E145-E148 중 어느 하나의 항체 또는 그의 항원-결합 단편 및 제약상 허용되는 담체 또는 부형제를 포함하는 제약 조성물.
E150. E149에 있어서, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 비-푸코실화된 것인 제약 조성물.
E151. CXCR5의 활성의 감소를 필요로 하는 대상체에게 치료 유효량의 E1-E114 및 E145-E148 중 어느 하나의 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 E149 또는 E150의 제약 조성물을 투여하는 것을 포함하는, CXCR5의 활성을 감소시키는 방법.
E152. 염증성 질환의 치료를 필요로 하는 대상체에게 치료 유효량의 E1-E114 및 E145-E148 중 어느 하나의 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 E149 또는 E150의 제약 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 염증성 질환을 치료하는 방법.
E153. 면역억제를 필요로 하는 대상체에게 치료 유효량의 E1-E114 및 E145-E148 중 어느 하나의 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 E149 또는 E150의 제약 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 면역억제를 필요로 하는 대상체를 치료하는 방법.
E154. 자가면역 질환, 장애 또는 상태의 치료를 필요로 하는 대상체에게 치료 유효량의 E1-E114 및 E145-E148 중 어느 하나의 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 E149 또는 E150의 제약 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 자가면역 질환, 장애 또는 상태를 치료하는 방법.
E155. CXCR5를 발현하는 세포의 수의 감소를 필요로 하는 대상체에게 치료 유효량의 E1-E114 및 E145-E148 중 어느 하나의 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 E149 또는 E150의 제약 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 CXCR5를 발현하는 세포의 수를 감소시키는 방법.
E156. E155에 있어서, 세포가 그의 표면 상에 CXCR5를 발현하는 것인 방법.
E157. E156에 있어서, 세포가 B 세포 및 Tfh-유사 세포인 방법.
E158. E151-E157 중 어느 하나에 있어서, 상기 대상체가 인간인 방법.
E159. E151-E158 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 제약 조성물을 정맥내로 투여하는 것을 포함하는 방법.
E160. E151-E158 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 제약 조성물을 피하로 투여하는 것을 포함하는 방법.
E161. E151-E160 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 제약 조성물이 약 1주 2회, 1주 1회, 2주마다 1회, 3주마다 1회, 4주마다 1회, 5주마다 1회, 6주마다 1회, 7주마다 1회, 8주마다 1회, 9주마다 1회, 10주마다 1회, 1개월 2회, 1개월 1회, 2개월마다 1회, 3개월마다 1회, 4개월마다 1회, 5개월마다 1회, 6개월마다 1회, 7개월마다 1회, 8개월마다 1회, 9개월마다 1회, 10개월마다 1회, 11개월마다 1회 또는 12개월마다 1회 투여되는 것인 방법.
E162. 샘플 내의 CXCR5+ 세포를 E1-E114 및 E145-E148 중 어느 하나의 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 E149 또는 E150의 제약 조성물과 접촉시키는 것을 포함하는, 샘플 내의 CXCR5+ 세포의 수를 감소시키는 방법.
E163. E1-E114 및 E145-E150 중 어느 하나에 있어서, 의약으로 사용하기 위한 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 제약 조성물.
E164. E1-E114 및 E145-E150 중 어느 하나에 있어서, 대상체에서 CXCR5의 활성을 감소시키는데 사용하기 위한 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 제약 조성물.
E165. E1-E114 및 E145-E150 중 어느 하나에 있어서, 면역억제를 필요로 하는 대상체를 치료하는데 사용하기 위한 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 제약 조성물.
E166. E1-E114 및 E145-E150 중 어느 하나에 있어서, 대상체에서 자가면역 질환, 장애 또는 상태를 치료하는데 사용하기 위한 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 제약 조성물.
E167. 면역 질환, 장애 또는 상태를 치료하기 위한 의약의 제조에서의 E1-E114 및 E145-E148 중 어느 하나의 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 용도.
E168. 면역 질환, 장애 또는 상태를 치료하기 위한 의약의 제조에서의 E149 또는 E150의 제약 조성물의 용도.
E169. 의학적 상태의 치료를 필요로 하는 대상체에게 치료 유효량의 E1-E114 및 E145-E148 중 어느 하나의 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 E149 또는 E150의 제약 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 의학적 상태를 치료하는 방법.
E170. E169에 있어서, 상태가 염증 반응 예컨대 건선 및 피부염 (예를 들어 아토피성 피부염)을 포함한 염증성 피부 질환; 피부근염; 전신 경피증 및 경화증; 염증성 장 질환 (예컨대 크론병 및 궤양성 결장염)과 연관된 반응; 호흡 곤란 증후군 (성인 호흡 곤란 증후군; ARDS 포함); 피부염; 수막염; 뇌염; 포도막염; 결장염; 위염; 사구체신염; 알레르기성 상태 예컨대 습진 및 천식 및 T 세포의 침윤 및 만성 염증 반응을 수반하는 다른 상태; 아테롬성동맥경화증; 백혈구 부착 결핍; 류마티스 관절염; 전신 홍반성 루푸스 (SLE); 당뇨병 (예를 들어, 제I형 당뇨병 또는 인슐린 의존성 당뇨병); 다발성 경화증; 레이노 증후군; 자가면역 갑상선염; 알레르기성 뇌척수염; 쇼그렌 증후군; 소아 발병 당뇨병; 및 전형적으로 결핵, 사르코이드증, 다발근염, 육아종증 및 혈관염에서 발견되는 시토카인 및 T-림프구에 의해 매개되는 급성 및 지연형 과민성과 연관된 면역 반응; 베게너병; 악성 빈혈 (애디슨병); 백혈구 누출을 수반하는 질환; 중추 신경계 (CNS) 염증성 장애; 다발성 기관 손상 증후군; 용혈성 빈혈 (한랭글로불린혈증 또는 쿰스 양성 빈혈을 포함하나 이에 제한되지는 않음); 중증 근무력증; 항원-항체 복합체 매개 질환; 항-사구체 기저막 질환; 항인지질 증후군; 알레르기성 신경염; 그레이브스병; 램버트-이튼 근무력 증후군; 수포성 유천포창; 천포창; 자가면역 다발내분비병증; 백반증; 라이터병; 강직-사람 증후군; 베체트병; 거대 세포 동맥염; 면역 복합체 신염; IgA 신병증; IgM 다발신경병증; 면역 혈소판감소성 자반증 (ITP) 또는 자가면역 혈소판감소증 및 자가면역 용혈성 질환; 하시모토 갑상선염; 자가면역 간염; 자가면역 혈우병; 자가면역 림프증식성 증후군 (ALPS); 자가면역 포도막망막염; 길랑-바레 증후군; 굿패스쳐 증후군; 혼합 결합 조직 질환; 자가면역-연관 불임; 결절성 다발동맥염; 원형 탈모증; 특발성 점액수종; 이식편 대 숙주 질환; 근육 이영양증 (뒤시엔느, 베커, 근긴장성, 지대, 안면견갑상완, 선천성, 안인두, 원위, 에머리-드레이푸스)으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 췌장암, 결장암, 방광암, T-세포 백혈병, 및 B-세포 백혈병과 같은 CXCR5를 발현하는 암 세포의 증식을 제어하는 것인 방법.
E171. E1-E114 및 E145-E148 중 어느 하나의 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 E149 또는 E150의 제약 조성물을 사용하여, 샘플, 조직 또는 세포를 항체와 접촉시키고, 상기 항체를 검출하는 것을 포함하는, 샘플, 조직 또는 세포에서 CXCR5를 검출하는 방법.
E172. CXCR5에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편이며, 여기서 항체는
(a) 서열식별번호: 2의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; 서열식별번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 서열식별번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3; 서열식별번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; 서열식별번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 및 서열식별번호: 9의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 항체;
(b) 서열식별번호: 2의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; 서열식별번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 서열식별번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3; 서열식별번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; 서열식별번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 및 서열식별번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 항체;
(c) 서열식별번호: 14의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; 서열식별번호: 15의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 서열식별번호: 16의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3; 서열식별번호: 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; 서열식별번호: 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 및 서열식별번호: 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 항체;
(d) 수탁 번호 PTA-124324로 ATCC에 기탁된 플라스미드의 삽입물에 의해 코딩된 아미노산 서열을 포함하는 VL 및 수탁 번호 PTA-124323으로 ATCC에 기탁된 플라스미드의 삽입물에 의해 코딩된 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하는 항체;
(e) 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 VL 및 서열식별번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하는 항체;
(f) 서열식별번호: 13의 아미노산 서열을 포함하는 VL 및 서열식별번호: 18의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하는 항체;
(g) 서열식별번호: 47의 아미노산 서열을 포함하는 VL 및 서열식별번호: 52의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하는 항체;
(h) 서열식별번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 VL 및 서열식별번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하는 항체;
(i) 서열식별번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 VL 및 서열식별번호: 10의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하는 항체;
(j) 서열식별번호: 13의 아미노산 서열을 포함하는 VL 및 서열식별번호: 17의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하는 항체;
(k) 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 VL 및 서열식별번호: 12의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하는 항체;
(l) 서열식별번호: 22의 아미노산 서열을 포함하는 LC 및 서열식별번호: 23의 아미노산 서열을 포함하는 HC를 포함하는 항체;
(m) 서열식별번호: 24의 아미노산 서열을 포함하는 LC 및 서열식별번호: 25의 아미노산 서열을 포함하는 HC를 포함하는 항체;
(n) 서열식별번호: 26의 아미노산 서열을 포함하는 LC 및 서열식별번호: 27의 아미노산 서열을 포함하는 HC를 포함하는 항체;
(o) 서열식별번호: 28의 아미노산 서열을 포함하는 LC 및 서열식별번호: 29의 아미노산 서열을 포함하는 HC를 포함하는 항체;
(p) 서열식별번호: 95의 핵산 서열에 의해 코딩된 VL 및 서열식별번호: 96의 핵산 서열에 의해 코딩된 VH를 포함하는 항체; 및
(q) 서열식별번호: 97의 핵산 서열에 의해 코딩된 LC 및 서열식별번호: 98의 핵산 서열에 의해 코딩된 HC를 포함하는 항체
로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개의 항체인, CXCR5에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
E173. C-X-C-케모카인 수용체 5 (CXCR5)에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편이며, 여기서 항체 또는 그의 항원-결합 단편은
(a) 서열식별번호: 32의 아미노산 서열의 넘버링에 따른 아미노산 잔기 번호 11에서 류신을 포함하는 hCXCR5 에피토프에 결합하지만, 상기 잔기가 류신이 아닌 상기 에피토프에는 결합하지 않는 항체 또는 그의 항원-결합 단편;
(b) 서열식별번호: 32의 아미노산 서열의 넘버링에 따른 아미노산 잔기 번호 11에서 류신을 포함하는 hCXCR5 에피토프에 결합하지만, 상기 잔기가 트레오닌인 상기 에피토프에는 결합하지 않는 항체 또는 그의 항원-결합 단편;
(c) 서열식별번호: 32의 아미노산 서열의 넘버링에 따른 아미노산 잔기 번호 22에서 아스파르테이트를 포함하는 hCXCR5 에피토프에 결합하지만, 상기 잔기가 아스파르테이트가 아닌 상기 에피토프에는 결합하지 않는 항체 또는 그의 항원-결합 단편;
(d) 서열식별번호: 32의 아미노산 서열의 넘버링에 따른 아미노산 잔기 번호 22에서 아스파르테이트를 포함하는 hCXCR5 에피토프에 결합하지만, 상기 잔기가 알라닌인 상기 에피토프에는 결합하지 않는 항체 또는 그의 항원-결합 단편;
(e) 서열식별번호: 32의 아미노산 서열의 넘버링에 따른 아미노산 잔기 번호 11에서 류신을 포함하고 아미노산 잔기 번호 22에서 아스파르테이트를 포함하는 hCXCR5 에피토프에 결합하지만, 상기 류신이 트레오닌으로 치환되고/거나 상기 아스파르테이트가 알라닌으로 치환된 상기 에피토프에는 결합하지 않는 항체 또는 그의 항원-결합 단편;
(f) 서열식별번호: 32의 아미노산 서열의 넘버링에 따른 아미노산 잔기 번호 11에서 류신을 포함하는 hCXCR5 또는 그의 단편에 결합하지만, 상기 잔기가 류신이 아닌 hCXCR5 또는 그의 단편에는 결합하지 않는 항체 또는 그의 항원-결합 단편;
(g) 서열식별번호: 32의 아미노산 서열의 넘버링에 따른 아미노산 잔기 번호 11에서 류신을 포함하는 hCXCR5 또는 그의 단편에 결합하지만, 상기 잔기가 트레오닌인 hCXCR5 또는 그의 단편에는 결합하지 않는 항체 또는 그의 항원-결합 단편;
(h) 서열식별번호: 32의 아미노산 서열의 넘버링에 따른 아미노산 잔기 번호 22에서 아스파르테이트를 포함하는 hCXCR5 또는 그의 단편에 결합하지만, 상기 잔기가 아스파르테이트가 아닌 hCXCR5 또는 그의 단편에는 결합하지 않는 항체 또는 그의 항원-결합 단편;
(i) 서열식별번호: 32의 아미노산 서열의 넘버링에 따른 아미노산 잔기 번호 22에서 아스파르테이트를 포함하는 hCXCR5 또는 그의 단편에 결합하지만, 상기 잔기가 알라닌인 hCXCR5 또는 그의 단편에는 결합하지 않는 항체 또는 그의 항원-결합 단편; 및
(j) 서열식별번호: 32의 아미노산 서열의 넘버링에 따른 아미노산 잔기 번호 11에서 류신을 포함하고 아미노산 잔기 번호 22에서 아스파르테이트를 포함하는 hCXCR5 또는 그의 단편에 결합하지만, 상기 류신이 트레오닌으로 치환되고/거나 상기 아스파르테이트가 알라닌으로 치환된 hCXCR5 또는 그의 단편에는 결합하지 않는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개의 항체인, CXCR5에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
E174. C-X-C-케모카인 수용체 5 (CXCR5)에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편이며, 여기서 항체 또는 그의 항원-결합 단편은
(a) EC50 약 6.60 pM, 표준 편차 약 플러스 또는 마이너스 2.33 pM의 겉보기 친화도로 인간 B 세포 상에서 발현된 hCXCR5에 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편;
(b) EC50 약 5.89 pM, 표준 편차 약 플러스 또는 마이너스 1.40 pM의 겉보기 친화도로 인간 순환 여포성 T 헬퍼-유사 세포 상에서 발현된 hCXCR5에 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편;
(c) EC50 약 10.6 pM의 겉보기 친화도로 인간 여포성 T 헬퍼 (Tfh) 세포 상에서 발현된 hCXCR5에 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편;
(d) EC50 약 1.32 pM의 겉보기 친화도로 시노몰구스 원숭이 B 세포 상에서 발현된 시노CXCR5에 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편;
(e) EC50 약 10.5 pM의 겉보기 친화도로 시노몰구스 원숭이 Tfh-유사 세포 상에서 발현된 시노CXCR5에 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편;
(f) cAMP 리포터 검정에서 EC50 약 961 pM로 CXCR5-CXCL13 신호전달을 길항작용하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편;
(g) EC50 약 2.01 pM, 표준 편차 약 플러스 또는 마이너스 2.28 pM로 hCXCR5를 발현하는 인간 B 세포에 대해 ADCC 활성을 나타내는 항체 또는 그의 항원-결합 단편;
(h) EC50 약 4.28 pM, 표준 편차 약 플러스 또는 마이너스 2.88 pM로 hCXCR5를 발현하는 인간 Tfh-유사 세포에 대해 ADCC 활성을 나타내는 항체 또는 그의 항원-결합 단편;
(i) EC50 약 0.11 pM로 hCXCR5를 발현하는 인간 Tfh 세포에 대해 ADCC 활성을 나타내는 항체 또는 그의 항원-결합 단편;
(j) EC50 약 15.3 pM, 표준 편차 약 플러스 또는 마이너스 11.7 pM로 시노CXCR5를 발현하는 시노몰구스 원숭이 B 세포에 대해 ADCC 활성을 나타내는 항체 또는 그의 항원-결합 단편;
(k) hCXCR5에 결합하지만, 인간 케모카인 수용체 CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCR9, CCR10, CMKLR1, CXCR3R1, CXCR1, CXCR2, CXCR3, CXCR4, CXCR6, CXCR7, 및 XCR1에는 검출가능하게 결합하지 않는 항체 또는 그의 항원-결합 단편;
(l) CXCL13에 대한 CXCR5의 결합을 억제하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편;
(m) EC50 약 26 pM 미만의 겉보기 친화도로 CXCR5+ 인간 B 세포에 결합하지만, CXCR5 마우스, 래트 또는 토끼 오르토로그를 발현하는 세포에는 결합하지 않는 항체 또는 그의 항원-결합 단편;
(n) 포르스콜린에 의해 촉발된 cAMP 방출의 CXCL13 억제를 길항작용하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편;
(o) 인간 공여자 및 시노몰구스 PBMC 및 인간 공여자 TMC에서 CXCR5-발현 세포의 ADCC를 촉발하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편;
(p) 인간 CXCR5에 결합하지만, 인간 케모카인 수용체 CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCR9, CCR10, CMKLR1, CXCR3R1, CXCR1, CXCR2, CXCR3, CXCR4, CXCR6, CXCR7, 또는 XCR1에는 결합하지 않는 항체 또는 그의 항원-결합 단편;
(q) 말초 혈액 내의 B 세포를 고갈시키는 항체 또는 그의 항원-결합 단편;
(r) 말초 혈액 내의 Tfh-유사 세포를 고갈시키는 항체 또는 그의 항원-결합 단편;
(s) 비장 내의 진정한 Tfh 세포를 고갈시키는 항체 또는 그의 항원-결합 단편; 및
(t) 체액성 면역 기억 반응을 손상시키는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개의 항체인, CXCR5에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
E175. E172-E174 중 어느 하나에 있어서, 하기 생물학적 활성 중 적어도 하나를 나타내는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
(a) CXCR5+ 인간 B 세포에 EC50 약 26 pM 미만의 겉보기 친화도로 결합하지만, CXCR5 마우스, 래트 또는 토끼 오르토로그를 발현하는 세포에는 결합하지 않음;
(b) 포르스콜린에 의해 촉발된 cAMP 방출의 CXCL13 억제를 길항작용함;
(c) 인간 공여자 및 시노몰구스 PBMC 및 인간 공여자 TMC에서 CXCR5-발현 세포의 ADCC를 촉발함;
(d) 인간 CXCR5에 결합하지만, 인간 케모카인 수용체 CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCR9, CCR10, CMKLR1, CXCR3R1, CXCR1, CXCR2, CXCR3, CXCR4, CXCR6, CXCR7, 또는 XCR1에는 결합하지 않음;
(e) 말초 혈액 내의 B 세포를 고갈시킴;
(f) 말초 혈액 내의 Tfh-유사 세포를 고갈시킴;
(g) 비장 내의 진정한 Tfh 세포를 고갈시킴; 또는
(h) 체액성 면역 기억 반응을 손상시킴.
E176. E172-E175 중 어느 하나에 있어서, 비-푸코실화된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
E177. E172-E176 중 어느 하나의 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 코딩하는 단리된 핵산.
E178. 서열식별번호: 95의 핵산 서열, 서열식별번호: 96의 핵산 서열, 또는 둘 다를 포함하는, CXCR5에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 VH, VL, 또는 둘 다를 코딩하는 단리된 핵산.
E179. 서열식별번호: 97의 핵산 서열, 서열식별번호: 98의 핵산 서열, 또는 둘 다를 포함하는, CXCR5에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 중쇄, 경쇄, 또는 둘 다를 코딩하는 단리된 핵산.
E180. 수탁 번호 PTA-124323으로 ATCC에 기탁된 플라스미드의 삽입물의 핵산 서열, 수탁 번호 PTA-124324로 ATCC에 기탁된 플라스미드의 삽입물의 핵산 서열, 또는 둘 다를 포함하는, CXCR5에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 VH, VL, 또는 둘 다를 코딩하는 단리된 핵산.
E181. E177-E180 중 어느 하나의 핵산을 포함하는 벡터.
E182. E181의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
E183. E182에 있어서, CHO 세포, COS 세포, HEK-293 세포, NS0 세포, PER.C6® 세포, 또는 Sp2.0 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 포유동물 세포인 숙주 세포.
E184. E183에 있어서, 기능적 알파-1,6-푸코실트랜스퍼라제 (FUT8)가 결여된 숙주 세포.
E185. E184에 있어서, 포텔리젠트® CHOK1SV 세포 또는 Lec13 CHO 세포인 숙주 세포.
E186. 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 E185의 포텔리젠트® CHOK1SV 세포에 의해 발현되고 비-푸코실화되는 조건 하에 상기 숙주 세포를 배양하는 것을 포함하는, 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제조하는 방법.
E187. E186에 있어서, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 단리하는 것을 추가로 포함하는 방법.
E188. E186에 있어서, 푸코실화된 달리 동일한 항체 또는 그의 항원-결합 단편과 비교할 경우 증진된 ADCC 활성을 나타내는, 비-푸코실화 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
E189. E172-E176 및 E188 중 어느 하나의 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 및 제약상 허용되는 담체 또는 부형제를 포함하는 제약 조성물.
E190. E172-E176, E188 및 E189 중 어느 하나에 있어서, 면역 질환, 장애 또는 상태를 치료하는데 사용하기 위한 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 제약 조성물.
E191. 면역 질환, 장애 또는 상태를 치료하기 위한, E172-E176 및 E188 중 어느 하나의 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 E189의 제약 조성물의 용도.
E192. CXCR5에 의해 매개되는 면역 질환, 장애 또는 상태의 치료 또는 예방을 필요로 하는 인간 대상체에게 유효량의 E189의 제약 조성물을 투여하는 것을 포함하는, CXCR5에 의해 매개되는 면역 질환, 장애 또는 상태의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 CXCR5에 의해 매개되는 면역 질환, 장애 또는 상태를 치료 또는 예방하는 방법 및 췌장암, 결장암, 방광암, T-세포 백혈병, 및 B-세포 백혈병과 같은 CXCR5를 발현하는 암 세포의 증식을 제어하는 방법이며, 여기서 상기 질환, 장애 또는 상태는 염증 반응 예컨대 건선 및 피부염 (예를 들어 아토피성 피부염)을 포함한 염증성 피부 질환; 피부근염; 전신 경피증 및 경화증; 염증성 장 질환 (예컨대 크론병 및 궤양성 결장염)과 연관된 반응; 호흡 곤란 증후군 (성인 호흡 곤란 증후군; ARDS 포함); 피부염; 수막염; 뇌염; 포도막염; 결장염; 위염; 사구체신염; 알레르기성 상태 예컨대 습진 및 천식 및 T 세포의 침윤 및 만성 염증 반응을 수반하는 다른 상태; 아테롬성동맥경화증; 백혈구 부착 결핍; 류마티스 관절염 (RA); 전신 홍반성 루푸스 (SLE); 당뇨병 (예를 들어, 제I형 당뇨병 또는 인슐린 의존성 당뇨병); 다발성 경화증; 레이노 증후군; 자가면역 갑상선염; 알레르기성 뇌척수염; 쇼그렌 증후군; 소아 발병 당뇨병; 및 전형적으로 결핵, 사르코이드증, 다발근염, 육아종증 및 혈관염에서 발견되는 시토카인 및 T-림프구에 의해 매개되는 급성 및 지연형 과민성과 연관된 면역 반응; 베게너병; 악성 빈혈 (애디슨병); 백혈구 누출을 수반하는 질환; 중추 신경계 (CNS) 염증성 장애; 다발성 기관 손상 증후군; 용혈성 빈혈 (한랭글로불린혈증 또는 쿰스 양성 빈혈을 포함하나 이에 제한되지는 않음); 중증 근무력증; 항원-항체 복합체 매개 질환; 항-사구체 기저막 질환; 항인지질 증후군; 알레르기성 신경염; 그레이브스병; 램버트-이튼 근무력 증후군; 수포성 유천포창; 천포창; 자가면역 다발내분비병증; 백반증; 라이터병; 강직-사람 증후군; 베체트병; 거대 세포 동맥염; 면역 복합체 신염; IgA 신병증; IgM 다발신경병증; 면역 혈소판감소성 자반증 (ITP) 또는 자가면역 혈소판감소증 및 자가면역 용혈성 질환; 하시모토 갑상선염; 자가면역 간염; 자가면역 혈우병; 자가면역 림프증식성 증후군 (ALPS); 자가면역 포도막망막염; 길랑-바레 증후군; 굿패스쳐 증후군; 혼합 결합 조직 질환; 자가면역-연관 불임; 결절성 다발동맥염; 원형 탈모증; 특발성 점액수종; 이식편 대 숙주 질환; 근육 이영양증 (뒤시엔느, 베커, 근긴장성, 지대, 안면견갑상완, 선천성, 안인두, 원위, 에머리-드레이푸스)으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
E193. E192에 있어서, 상기 질환이 SLE 또는 류마티스 관절염인 방법.
E194. 면역 질환, 장애 또는 상태를 치료하기 위한 의약의 제조에서의 E172-E176 및 E188 중 어느 하나의 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 용도.
E195. E172-E176 중 어느 하나의 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 사용하여, 샘플, 조직 또는 세포를 항체와 접촉시키고, 상기 항체를 검출하는 것을 포함하는, 샘플, 조직 또는 세포에서 CXCR5를 검출하는 방법.
E196. 치료 유효량의 E172-E176 및 E188 중 어느 하나의 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 E189의 제약 조성물을 투여하는 것을 포함하는, CXCR5의 생물학적 활성의 감소를 필요로 하는 대상체에서 CXCR5의 생물학적 활성을 감소시키는 방법.
E197. E196에 있어서, 항체가 비장 내의 Tfh 세포, 말초 혈액 내의 B 세포, 및 말초 혈액 내의 Tfh-유사 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 CXCR5를 발현하는 적어도 1종의 세포의 고갈을 매개하는 것인 방법.
E198. 치료 유효량의 E172-E176 및 E188 중 어느 하나의 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 E189의 제약 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 체액성 면역 반응의 억제를 필요로 하는 대상체에서 체액성 면역 반응을 억제하는 방법.
E199. E198에 있어서, 항체가 비장 내의 Tfh 세포, 말초 혈액 내의 B 세포, 및 말초 혈액 내의 Tfh-유사 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 CXCR5를 발현하는 적어도 1종의 세포의 고갈을 매개하는 것인 방법.
본 발명의 상기 발명의 내용 뿐만 아니라 하기 발명의 상세한 설명은 첨부 도면과 함께 읽을 경우 더 잘 이해될 것이다. 본 발명을 예시하기 위해 도면 실시양태(들)에 제시한다. 그러나, 본 발명이 제시된 정확한 배열 및 수단으로 제한되지는 않는다는 것을 이해해야 한다.
도 1은 이뮤노글로불린 중쇄 불변 영역 내에 전형적으로 존재하는 정규 이중안테나 당형태를 예시한 다이어그램이다. 다이어그램은 문헌 [Kabat et al., 1991]에 기재된 바와 같이 문헌 [Edelman et al., 1969, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 63(1):78-85]의 Eu 넘버링에 따라 아미노산 잔기 번호 297 (아스파라긴 297; Asn297)에서의 IgG 불변 도메인 상의 아스파라긴-연결된 (N-연결된) 당형태를 보여준다.
도 2a-2g는 이뮤노글로불린 중쇄 불변 영역에 전형적으로 존재하는 예시적인 이중안테나 당형태를 도시한 다이어그램이다. "G0"은 말단 시알산 (NeuAc) 또는 Gal이 존재하지 않는 이중안테나 구조를 지칭하고, "G1"은 1개의 Gal을 가지며 NeuAc는 없는 이중안테나 구조를 지칭하고, "G2"는 2개의 말단 Gal을 가지며 NeuAc는 없는 이중안테나 구조를 지칭한다. 각각의 당형태에서, 푸코스는 전형적으로 포유동물 세포, 예를 들어 CHO 세포에서 생산된 항체에 존재한다. 도 2a는 G2S2를 나타내고, 도 2b는 G2S1을 나타내고, 도 2c는 G2를 나타내고, 도 2d는 G1을 나타내고, 도 2e는 G0을 나타내고, 도 2f는 G-1을 나타내고, 도 2g는 G-2를 나타낸다.
도 3은 인간 CXCR5를 발현하는 HEK 293 세포 (hCXCR5 293) (더 밝은 막대) 및/또는 시노몰구스 CXCR5를 발현하는 HEK 293 세포 (시노CXCR5 293) (보다 어두운 막대)에 대한 다양한 모노클로날 항체 (x-축 상에 표시됨)의 결합을 보여주는 막대 그래프를 도시한다. 도 3에 제시된 모노클로날 항체는, 좌측에서 우측으로, 11B9, 18C7, 21A3, 23F1, 30C3, 31F3, 39H4, 47D11, 51D11, 52E7, 56A9, 56G2, 57H5, 58C12, 59F3, 4F1, 6E9, 12E11, 16D10, 18G4, 19D9, 19F8, 20G4, 26E2, 41A10, 48A10, 13F4, 17D5, 18H9, 23C6, 1A11, 1D10, 1C11, 3A1, 5H3, 6D6, 9G11, 10G2, 12C1, 12C3, 15A11, 15C10, 15D5, 18A11, 19C11, 20D10, 21B2, 21G3, 25D4, 25E1, 5H7, 11G2, 18B11, 23D5, 23F7, 31E5, 19G2, 및 31G7이다.
도 4a는 CXCR1을 발현하는 세포에 대한 다양한 항-CXCR5 항체의 검출가능한 결합의 결여를 보여주는 다이어그램을 도시한다.
도 4b는 CXCR2를 발현하는 세포에 대한 다양한 항-CXCR5 항체의 결합의 결여를 보여주는 다이어그램을 도시한다.
도 4c는 CXCR3을 발현하는 세포에 대한 다양한 항-CXCR5 항체의 결합의 결여를 보여주는 다이어그램을 도시한다.
도 4d는 CXCR4를 자연 발현하는 Jurkat 세포에 대한 다양한 항-CXCR5 항체의 결합을 보여주는 다이어그램을 도시한다.
도 5는 항체: 비-푸코실화 h11G2 XC154/XC155 (흰색 원), 푸코실화 h11G2 XC154/XC155 (흑색 원), 2C9 (흑색 삼각형), 16D7 (흑색 사각형), 및 11A7 (흑색 타원)의 CXCR5 발현 세포에 대한 결합 친화도를 보여주는 그래프를 도시한다.
도 6은 인간 및 마우스 CXCR5 아미노산 서열의 정렬을 보여준다. 도면은 또한 밑줄친 "N", "L1", "L2", 및 "L3"으로 라벨링된 CXCR5의 다양한 세포외 도메인을 보여준다.
도 7은 특정 아미노산 잔기가 hCXCR5에 대한 항체 결합에 중요하다는 것을 보여주는 막대 그래프를 도시한다. 즉, 인간 서열분석된 것에서 D10G를 변화시키거나 SI를 삽입하는 것은 항체 2C9에 의한 결합을 제거하지만, 다른 3개의 항체에 의한 결합에는 영향을 미치지 않는다. 보다 중요한 것으로, L11T 또는 D22A 치환은 11G2에 의한 결합을 제거하였지만, 2C9, 16D7 또는 11A7의 결합에는 영향을 미치지 않았다. 아미노산 잔기 번호 19에서 W를 K로 변화시키는 것 (W19K)은 항체 16D7 및 11A7에 의한 결합을 제거하였지만, 11G2 및 2C9에 의한 결합에는 영향을 미치지 않았다. 이들 데이터는 이들 4개의 항체가 hCXCR5 상의 동일한 에피토프를 공유하지 않는다는 것을 입증한다.
도 8a는 수컷 시노몰구스 원숭이에서의 말초 혈액 B 세포의 고갈 및 재구성을 보여주는 그래프를 도시한다. 수컷에서의 혈액 μl당 말초 혈액 B 세포 수가 탐색적 독성 연구의 제352일까지 제시된다. B 세포는 CD3-CD20+로서 규정되었다. 개별 동물 데이터를 제시한다. 수컷 원숭이에서의 B 세포의 이력 범위 (μL당 272-2503개 세포)를 파선으로 나타낸다.
도 8b는 암컷 시노몰구스 원숭이에서의 말초 혈액 B 세포의 고갈 및 재구성을 보여주는 그래프를 도시한다. 암컷에서의 혈액 μl당 말초 혈액 B 세포 수가 탐색적 독성 연구의 제352일까지 제시된다. B 세포는 CD3-CD20+로서 규정되었다. 개별 동물 데이터를 제시한다. 암컷 원숭이에서의 B 세포의 이력 범위 (μL당 233-1700개 세포)를 파선으로 나타낸다.
도 8c는 수컷 시노몰구스 원숭이에서의 Tfh-유사 (또한 "cTfh" 또는 "순환 Tfh" 세포로도 지칭됨) 세포의 고갈 및 재구성을 보여주는 그래프를 도시한다. 수컷에서의 혈액 μl당 말초 혈액 Tfh-유사 세포 수가 탐색적 독성 연구의 제352일까지 제시된다. 시험 물품은 면역표현형결정에 사용되는 CXCR5 항체를 방해하기 때문에, Tfh-유사 세포는 CD3+CD4+CD95+CXCR5+ 세포 및 CD3+CD4+CD95+hIgG+ 세포의 합으로 규정되었다. 개별 동물 데이터를 제시한다.
도 8d는 암컷 시노몰구스 원숭이에서의 Tfh-유사 (또한 "cTfh" 또는 "순환 Tfh" 세포로도 지칭됨) 세포의 고갈 및 재구성을 보여주는 그래프를 도시한다. 암컷에서의 혈액 μl당 말초 혈액 Tfh-유사 세포 수가 탐색적 독성 연구의 제352일까지 제시된다. 시험 물품은 면역표현형결정에 사용되는 CXCR5 항체를 방해하기 때문에, Tfh-유사 세포는 CD3+CD4+CD95+CXCR5+ 세포 및 CD3+CD4+CD95+hIgG+ 세포의 합으로 규정되었다. 개별 동물 데이터를 제시한다.
도 9a는 시노몰구스 원숭이에서의 말초 혈액 B 세포의 고갈 및 재구성을 보여주는 그래프를 도시한다. 원숭이에서의 혈액 μl당 말초 혈액 B 세포 수가 중추적 GLP 독성 연구의 제393일까지 제시된다. B 세포는 CD3-CD20+ HLA-DR+ 세포로서 규정되었다. 군 평균 데이터 (수컷 및 암컷 조합) +/- 표준 편차가 제시된다.
도 9b는 시노몰구스 원숭이에서의 말초 혈액 CXCR5+ B 세포의 고갈 및 재구성을 보여주는 그래프를 도시한다. 원숭이에서의 혈액 μl당 말초 혈액 CXCR5+ B 세포 수가 중추적 GLP 독성 연구의 제393일까지 제시된다. B 세포는 CD3-CD20+ HLA-DR+ 세포로서 규정되었다. 군 평균 데이터 (수컷 및 암컷 조합) +/- 표준 편차가 제시된다.
도 9c는 시노몰구스 원숭이에서의 말초 혈액 순환 여포성 T 헬퍼 세포 (cTfh; 또한 본원의 다른 곳에서 "Tfh-유사 세포"로도 지칭됨)의 고갈 및 재구성을 보여주는 그래프를 도시한다. 원숭이에서의 혈액 μl당 말초 혈액 cTfh 세포 수가 중추적 GLP 독성 연구의 제393일까지 제시된다. cTfh 세포는 CD3+CD4+CD95+ 세포로서 규정되었다. 군 평균 데이터 (수컷 및 암컷 조합) +/- 표준 편차가 제시된다.
도 9d는 시노몰구스 원숭이에서 검출가능한 표면 CXCR5를 갖는 말초 혈액 CXCR5+ cTfh 세포 (또한 본원의 다른 곳에서 "Tfh-유사 세포"로도 지칭됨)의 고갈 및 재구성을 보여주는 그래프를 도시한다. 원숭이에서의 혈액 μl당 말초 혈액 CXCR5+ cTfh 세포 수가 중추적 GLP 독성 연구의 제393일까지 제시된다. cTfh 세포는 CD3+CD4+CD95+ 세포로서 규정되었다. 군 평균 데이터 (수컷 및 암컷 조합) +/- 표준 편차가 제시된다.
CXCR5에 특이적으로 결합하는 항체, 및 추가로 CXCR5 활성 또는 CXCL13과 그의 상호작용을 길항작용하는 항체가 본원에 개시된다. CXCR5 항체를 제조하는 방법, 이들 항체를 포함하는 조성물, 및 이들 항체를 사용하는 방법이 제공된다.
CXCR5에 결합하는 푸코실화 및 비-푸코실화 항체가 제공된다. 일부 실시양태에서, CXCR5에 결합하는 항체를 형성할 수 있는 비-푸코실화 항체 중쇄 및 경쇄가 또한 제공된다. 일부 실시양태에서, 1개 이상의 특정한 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함하는 비-푸코실화 항체, 중쇄 및 경쇄가 제공된다. 일부 실시양태에서, 비-푸코실화 항-CXCR5 항체는 변경된 이펙터 기능을 갖는다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체는 본 발명의 달리 동일한 푸코실화 항-CXCR5 항체에 비해 증진된 ADCC 활성을 갖는다.
CXCR5에 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 제공된다. 항체 중쇄 또는 경쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 또한 제공된다. 푸코실화 및/또는 비-푸코실화 항-CXCR5 항체를 발현하는 숙주 세포가 제공된다. CXCR5에 대한 비-푸코실화 및 푸코실화 항체를 사용하는 치료 방법이 제공된다. 이러한 방법은 염증성 및 면역 질환을 포함하나 이에 제한되지 않는, CXCR5 발현 및/또는 CXCL13에의 결합과 연관되거나 또는 그에 의해 매개되는 질환을 치료하는 방법을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
본원에 사용된 섹션 표제는 단지 조직화 목적을 위한 것이며, 기재된 대상을 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
특허 출원, 특허 공개, 및 진뱅크 수탁 번호를 포함한 본원에 인용된 모든 참고문헌은 각각의 개별 참고문헌이 구체적으로 및 개별적으로 그 전문이 참조로 포함되는 것으로 표시되는 바와 같이 본원에 참조로 포함된다.
본원에 기재되거나 언급된 기술 및 절차는, 예를 들어 문헌 [Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd. edition (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F. M. Ausubel, et al. eds., (2003)); the series METHODS IN ENZYMOLOGY (Academic Press, Inc.): PCR 2: A PRACTICAL APPROACH (M. J. MacPherson, B. D. Hames and G. R. Taylor eds. (1995)), Harlow and Lane, eds. (1988) ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL, and ANIMAL CELL CULTURE (R. I. Freshney, ed. (1987)); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J. E. Cellis, ed., 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R. I. Freshney), ed., 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J. P. Mather and P. E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture Laboratory Procedures (A. Doyle, J. B. Griffiths, and D. G. Newell, eds., 1993-8) J. Wiley and Sons; Handbook of Experimental Immunology (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J. M. Miller and M. P. Calos, eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al, eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J. E. Coligan et al, eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999); Immunobiology (C. A. Janeway and P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: A Practical Approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal Antibodies: A Practical Approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using Antibodies: A Laboratory Manual (E. Harlow and D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999)); The Antibodies (M. Zanetti and J. D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995); and Cancer: Principles and Practice of Oncology (V. T. DeVita et al., eds., J.B. Lippincott Company, 1993)]; 및 그의 업데이트된 버전에 기재된 널리 이용되는 방법론과 같이, 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 일반적으로 널리 이해되고, 통상적인 방법론을 이용하여 통상적으로 사용된다.
CXCR5 항체는, 푸코실화된 것이든 또는 비-푸코실화된 것이든, CXCR5 활성에 의해 유발되고/거나 그와 연관된 질환, 장애 또는 상태의 예방, 치료, 및/또는 개선에 사용될 수 있다. 이러한 질환, 장애 또는 상태는, 본원에 개시된 교시내용을 제공받는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 인지될 바와 같은, 염증 반응, 예컨대 전신 홍반성 루푸스 (SLE); 만성 염증 반응; 아테롬성동맥경화증; 백혈구 부착 결핍; 류마티스 관절염; 당뇨병 (예를 들어, 제I형 당뇨병 또는 인슐린 의존성 당뇨병); 다발성 경화증; 레이노 증후군; 자가면역 갑상선염; 알레르기성 뇌척수염; 쇼그렌 증후군; 소아 발병 당뇨병; 및 전형적으로 결핵, 사르코이드증, 다발근염, 육아종증 및 혈관염에서 발견되는 시토카인 및 T-림프구에 의해 매개되는 급성 및 지연형 과민성과 연관된 면역 반응; 베게너병; 악성 빈혈 (애디슨병); 백혈구 누출을 수반하는 질환; 중추 신경계 (CNS) 염증성 장애; 다발성 기관 손상 증후군; 용혈성 빈혈 (한랭글로불린혈증 또는 쿰스 양성 빈혈을 포함하나 이에 제한되지는 않음); 중증 근무력증; 항원-항체 복합체 매개 질환; 항-사구체 기저막 질환; 항인지질 증후군; 알레르기성 신경염; 그레이브스병; 램버트-이튼 근무력 증후군; 수포성 유천포창; 천포창; 자가면역 다발내분비병증; 백반증; 라이터병; 강직-사람 증후군; 베체트병; 거대 세포 동맥염; 면역 복합체 신염; IgA 신병증; IgM 다발신경병증; 면역 혈소판감소성 자반증 (ITP) 또는 자가면역 혈소판감소증 및 자가면역 용혈성 질환; 하시모토 갑상선염; 자가면역 간염; 자가면역 혈우병; 자가면역 림프증식성 증후군 (ALPS); 자가면역 포도막망막염; 길랑-바레 증후군; 굿패스쳐 증후군; 혼합 결합 조직 질환; 자가면역-연관 불임; 결절성 다발동맥염; 원형 탈모증; 특발성 점액수종; 이식편 대 숙주 질환; 근육 이영양증 (뒤시엔느, 베커, 근긴장성, 지대, 안면견갑상완, 선천성, 안인두, 원위, 에머리-드레이푸스)을 포함하나 이에 제한되지는 않는다; 및 췌장암, 결장암, 방광암, T-세포 백혈병, 및 B-세포 백혈병과 같은 CXCR5를 발현하는 암 세포의 증식을 제어하는 것.
I. 정의
본 발명은 본 발명의 예시적인 실시양태의 하기 상세한 설명 및 그 안에 포함된 실시예를 참조하여 보다 용이하게 이해될 수 있다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 과학 용어는 본 발명이 속하는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 상충되는 경우에는, 정의를 비롯하여 본 명세서가 우선할 것이다.
또한, 내용에 의해 달리 요구되거나 명백하게 지시되지 않는 한, 단수 용어는 복수형을 포함할 것이고, 복수 용어는 단수형을 포함할 것이다.
본원에 기재된 발명의 측면 및 실시양태는 측면 및 실시양태로 "이루어진 것" 및/또는 "본질적으로 이루어진 것"을 포함하는 것으로 이해된다. 본원에 사용된 단수 형태는 달리 나타내지 않는 한 복수 지시대상을 포함한다.
본 출원에서, "또는"의 사용은 달리 명백하게 언급되지 않거나 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 이해되지 않는 한 "및/또는"을 의미한다. 다중 종속항의 문맥에서, "또는"의 사용은 이전의 하나 초과의 독립항 또는 종속항을 인용하는 것이다.
"약" 또는 "대략"은, 측정가능한 수치 변수와 관련하여 사용될 때, 변수의 표시된 값 및 표시된 값의 실험 오차 내 (예를 들어, 평균에 대한 95% 신뢰 구간 내) 또는 표시된 값의 10 퍼센트 내 (이 중 더 큰 쪽)에 있는 변수의 모든 값을 지칭한다. 수치 범위는 범위를 규정하는 수를 포함한다.
본 발명의 넓은 범주를 명시한 수치 범위 및 파라미터는 근사치이지만, 구체적 예에서 명시된 수치 값은 가능한 정확하게 기록된 것이다. 그러나, 임의의 수치 값은 그의 각각의 시험 측정에서 확인되는 표준 편차로부터 필연적으로 생성되는 특정 오차를 고유하게 포함한다. 더욱이, 본원에 개시된 모든 범위는 그에 포함된 임의의 및 모든 하위범위를 포괄하는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들어, "1 내지 10"으로 언급된 범위는 1의 최소 값과 10의 최대 값 사이 (및 그 자체도 포함)의 임의의 및 모든 하위범위; 즉, 1 또는 그 초과의 최소 값, 예를 들어 1 내지 6.1로 시작하여 10 또는 그 미만의 최대 값, 예를 들어 5.5 내지 10으로 끝나는 모든 하위범위를 포함하는 것으로 간주되어야 한다.
본 명세서 및 청구범위 전반에 걸쳐, 용어 "포함하다", 또는 "포함한다" 또는 "포함하는"과 같은 변형은 언급된 정수 또는 정수 군을 포함하지만, 임의의 다른 정수 또는 정수 군을 배제하지는 않는다는 것을 의미하는 것으로 이해될 것이다. 문맥에서 달리 요구되지 않는 한, 단수 용어는 복수형을 포함할 것이고, 복수 용어는 단수형을 포함할 것이다. 용어 "예를 들어" 또는 "예를 들면"에 이어지는 임의의 예(들)는 포괄적인 것으로 또는 제한적인 것으로 의도되지 않는다.
실시양태가 표현 "포함하는"을 사용하여 본원에 기재된 경우에, "로 이루어진" 및/또는 "로 본질적으로 이루어진"과 관련하여 기재된 다른 유사한 실시양태가 또한 제공되는 것으로 이해된다.
본 발명의 측면 또는 실시양태가 마쿠쉬 군 또는 다른 대안적 그룹화와 관련하여 기재되는 경우에, 본 발명은 총괄적으로 열거된 전체 군, 뿐만 아니라 상기 군의 개별적인 각각의 구성원, 및 주요 군의 모든 가능한 하위군, 뿐만 아니라 군 구성원 중 1개 이상이 부재하는 주요 군을 포괄한다. 본 발명은 또한 청구된 발명에서 임의의 군 구성원 중 1개 이상의 명확한 배제를 고려한다.
본원에 사용된 용어는 특정한 실시양태의 기재를 목적으로 할 뿐이며, 이를 제한하는 것으로 의도되지 않는 것으로 이해되어야 한다. 본 명세서 및 하기 청구범위에서, 하기 의미를 갖는 것으로 정의될 다수의 용어가 언급될 것이다:
용어 "단리된 분자" (여기서 분자는, 예를 들어 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 또는 항체 또는 그의 단편임)는 그의 유래 기원 또는 공급원에 의해 (1) 그의 천연 상태에서 동반되는 자연적으로 회합되는 성분과 회합되지 않거나, (2) 동일한 종으로부터의 다른 분자가 실질적으로 없거나, (3) 상이한 종으로부터의 세포에 의해 발현되거나, 또는 (4) 자연에서 발생하지 않는 분자이다. 따라서, 화학적으로 합성되거나, 또는 그것이 자연적으로 유래되는 세포와 상이한 세포 시스템에서 발현되는 분자는 그의 자연적으로 회합되는 성분으로부터 "단리"될 것이다. 관련 기술분야에 널리 공지된 정제 기술을 사용하여, 단리에 의해 자연적으로 회합된 성분이 분자에 실질적으로 없게 할 수 있다. 관련 기술분야에 널리 공지된 다수의 수단에 의해 분자 순도 또는 균질성을 검정할 수 있다. 예를 들어, 폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 사용하고 관련 기술분야에 널리 공지된 기술을 사용하여 폴리펩티드를 가시화하도록 겔을 염색하여 폴리펩티드 샘플의 순도를 검정할 수 있다. 특정 목적을 위해, HPLC 또는 정제를 위해 관련 기술분야에 널리 공지된 다른 수단을 사용함으로써 보다 고도의 분할이 제공될 수 있다.
본원에 사용된 "실질적으로 순수한"은, 대상 종이 존재하는 우세한 종이고 (즉, 몰 기준으로 조성물 중의 임의의 다른 개별 종보다 더 풍부함), 바람직하게는 실질적으로 정제된 분획은, 대상 종 (예를 들어, 항체 또는 수용체를 비롯한 당단백질)이 존재하는 모든 거대분자 종의 적어도 약 50 퍼센트 (몰 기준으로)를 구성하는 조성물이다. 일반적으로, 실질적으로 순수한 조성물은 조성물 중에 존재하는 모든 거대분자 종의 약 80 퍼센트 초과, 보다 바람직하게는 약 85%, 90%, 95%, 및 99% 초과를 구성할 것이다. 가장 바람직하게는, 대상 종은 본질적으로 균질하게 정제되며 (오염물 종이 통상적인 검출 방법에 의해 조성물에서 검출될 수 없음), 여기서 조성물은 본질적으로 단일 거대분자 종으로 이루어진다. 특정 실시양태에서, 실질적으로 순수한 물질은 적어도 50% 순수하고 (즉, 오염물이 없음), 보다 바람직하게는 적어도 90% 순수하고, 보다 바람직하게는 적어도 95% 순수하고, 보다 더 바람직하게는 적어도 98% 순수하고, 가장 바람직하게는 적어도 99% 순수하다.
용어 "동일성"은, 관련 기술분야에 공지된 바와 같이, 서열을 비교함으로써 결정되는 바와 같은, 2종 이상의 폴리펩티드 분자 또는 2종 이상의 핵산 분자의 서열들 사이의 관계를 지칭한다. 관련 기술분야에서, "동일성"은 또한, 경우에 따라 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열의 스트링 사이의 매치에 의해 결정되는 바와 같은, 폴리펩티드 또는 핵산 분자 서열 사이의 서열 관련성의 정도를 의미한다. "동일성"은 컴퓨터 프로그램의 특정한 수학적 모델 (즉, "알고리즘")에 의해 어드레싱된 갭 정렬에 의해 2개 이상의 서열 사이의 동일한 매치의 퍼센트를 측정한다.
용어 "유사성"은 "동일성"에 관련된 개념이지만, 그와는 대조적으로 동일한 매치 및 보존적 치환 매치 둘 다를 포함하는 유사성의 척도를 지칭한다. 보존적 치환은 폴리펩티드에 적용되고 핵산 분자에는 적용되지 않기 때문에, 유사성은 단지 폴리펩티드 서열 비교만을 다룬다. 2개의 폴리펩티드 서열이, 예를 들어 20개 중 10개의 동일한 아미노산을 가지며, 나머지는 모두 비보존적 치환이라면, 퍼센트 동일성 및 유사성은 둘 다 50%일 것이다. 동일한 예에서, 보존적 치환이 있는 위치가 5개 더 있다면, 퍼센트 동일성은 여전히 50%이지만 퍼센트 유사성은 75%일 것이다 (20개 중 15개). 따라서, 보존적 치환이 있는 경우에, 2개의 폴리펩티드 서열 사이의 유사성 정도는 그 2개의 서열 사이의 퍼센트 동일성보다 더 클 것이다.
본 발명에 따른 폴리펩티드 또는 항체 "단편" 또는 "부분"은 절단에 의해, 예를 들어 폴리펩티드의 N 및/또는 C-말단 끝으로부터 1개 이상의 아미노산을 제거하는 것에 의해 제조될 수 있다. 이러한 방식으로 최대 10개, 최대 20개, 최대 30개, 최대 40개 또는 그 초과의 아미노산을 N 및/또는 C 말단으로부터 제거할 수 있다. 단편 또는 부분은 또한, 1개 이상의 내부 결실에 의해 생성될 수 있다.
변이체 항체는 상기 논의된 특이적 서열 및 단편으로부터 1, 2, 3, 4, 5, 최대 10개, 최대 20개, 또는 최대 30개 또는 그 초과의 아미노산 치환 및/또는 결실 및/또는 삽입을 포함할 수 있다. "결실" 변이체는 개개의 아미노산의 결실, 작은 아미노산 군, 예컨대 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산의 결실, 또는 보다 큰 아미노산 영역의 결실, 예컨대 특이적 아미노산 도메인 또는 다른 특색의 결실을 포함할 수 있다. "삽입" 변이체는 개개의 아미노산의 삽입, 작은 아미노산 군, 예컨대 2, 3, 4 또는 5개 아미노산의 삽입, 또는 보다 큰 아미노산 영역의 삽입, 예컨대 특이적 아미노산 도메인 또는 다른 특색의 삽입을 포함할 수 있다. "치환" 변이체는 바람직하게는, 1개 이상의 아미노산의 동일한 수의 아미노산으로의 대체 및 보존적 아미노산 치환시키는 것을 수반한다. 예를 들어, 아미노산은 유사한 특성을 갖는 대안적 아미노산, 예를 들어 또 다른 염기성 아미노산, 또 다른 산성 아미노산, 또 다른 중성 아미노산, 또 다른 하전된 아미노산, 또 다른 친수성 아미노산, 또 다른 소수성 아미노산, 또 다른 극성 아미노산, 또 다른 방향족 아미노산 또는 또 다른 지방족 아미노산으로 치환될 수 있다. 적합한 치환기를 선택하기 위해 사용될 수 있는 20개의 주요 아미노산의 일부 특성은 다음과 같다.
치환 변이체는, 항체 분자 내의 적어도 1개의 아미노산 잔기가 제거되고 그 위치에 상이한 잔기가 삽입된다. 치환 돌연변이유발을 위한 가장 관심 부위는 초가변 영역을 포함하지만, 프레임워크 변경도 또한 고려된다. 보존적 치환은 표 1에서 "보존적 치환"의 표제 하에 제시된다. 이러한 치환이 생물학적 활성에서 변화를 발생시키는 경우에, 하기에 제시되거나 또는 아미노산 부류와 관련하여 하기에 추가로 기재되는 바와 같은 "예시적인 치환"으로 명명된 보다 실질적인 변화가 도입될 수 있고 생성물이 스크리닝될 수 있다.
표 1
아미노산 및 치환
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항체의 생물학적 특성에 있어서의 실질적인 변형은 (a) 예를 들어 베타-시트 또는 나선형 입체형태로서, 치환 영역 내의 폴리펩티드 백본의 구조, (b) 표적 부위에서의 분자의 전하 또는 소수성, 또는 (c) 측쇄의 벌크를 유지하는 것에 대한 그의 효과가 유의하게 상이한 치환을 선택함으로써 달성된다. 자연 발생 잔기는 공통적인 측쇄 특성에 기초하여 하기 군으로 분류된다:
i. 비극성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
ii. 비하전 극성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
iii. 산성 (음으로 하전): Asp, Glu;
iv. 염기성 (양으로 하전): Lys, Arg;
v. 쇄 배향에 영향을 미치는 잔기: Gly, Pro; 및
vi. 방향족: Trp, Tyr, Phe, His.
비-보존적 치환은 이들 부류 중 1개의 구성원을 또 다른 부류로 교환하는 것에 의해 이루어진다.
예를 들어, 이루어질 수 있는 치환 중 한 유형은 화학적으로 반응성일 수 있는 항체 내의 1개 이상의 시스테인을 또 다른 잔기, 예컨대 비제한적으로 알라닌 또는 세린으로 변화시키는 것이다. 예를 들어, 비-정규 시스테인의 치환이 있을 수 있다. 치환은 항체의 가변 도메인의 CDR 또는 프레임워크 영역에서 또는 불변 영역에서 이루어질 수 있다. 일부 실시양태에서, 시스테인은 정규 시스테인이다. 또한, 항체의 적절한 입체형태 유지에 관여하지 않는 임의의 시스테인 잔기는 일반적으로 세린으로 치환되어 분자의 산화 안정성을 개선시키고 이상 가교를 방지할 수 있다. 반대로, 시스테인 결합(들)이 항체에 첨가되어 그의 안정성을 개선시킬 수 있고, 이는 특히 항체가 Fv 단편과 같은 항체 단편인 경우에 그러하다.
"항체"는 이뮤노글로불린 분자의 가변 영역 내에 위치하는 적어도 1개의 항원 인식 부위를 통해 표적, 예컨대 탄수화물, 폴리뉴클레오티드, 지질, 폴리펩티드 등에 특이적으로 결합할 수 있는 이뮤노글로불린 분자이다. 본원에 사용된 상기 용어는 무손상 폴리클로날 또는 모노클로날 항체 뿐만 아니라 달리 명시되지 않는 한, 특이적 결합에 대해 무손상 항체와 경쟁하는 그의 임의의 항원-결합 단편, 항원-결합 단편을 포함하는 융합 단백질, 및 항원 인식 부위를 포함하는 이뮤노글로불린 분자의 임의의 다른 변형된 형상을 포괄한다. 항원-결합 단편은, 예를 들어 Fab, Fab', F(ab')2, Fd, Fv, 도메인 항체 (dAb, 예를 들어 상어 및 낙타류 항체), 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함한 단편, 단일 쇄 가변 단편 항체 (scFv), 맥시바디, 미니바디, 인트라바디, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, v-NAR 및 비스-scFv, 및 폴리펩티드에 대한 특이적 항원 결합을 부여하기에 충분한 이뮤노글로불린의 적어도 단편을 함유하는 폴리펩티드를 포함한다. 항체는 임의의 부류, 예컨대 IgG, IgA, 또는 IgM (또는 그의 하위부류)의 항체를 포함하고, 항체가 임의의 특정한 부류일 필요는 없다. 그의 중쇄의 불변 영역의 항체 아미노산 서열에 따라, 이뮤노글로불린은 상이한 부류로 할당될 수 있다. 이뮤노글로불린의 5종의 주요 부류: IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM이 존재하고, 이들 중 몇몇은 하위부류 (이소형), 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2로 추가로 나뉘어질 수 있다. 이뮤노글로불린의 상이한 부류에 상응하는 중쇄 불변 영역은 각각 알파, 델타, 엡실론, 감마 및 뮤로 불린다. 상이한 부류의 이뮤노글로불린의 서브유닛 구조 및 3차원 형상은 널리 공지되어 있다.
본원에서 상호교환가능하게 사용되는 용어 항체의 "항원-결합 부분" 또는 "항원-결합 단편" (또는 간단히 "항체 부분")은 항원 (예를 들어, CXCR5)과 특이적으로 결합할 수 있는 능력을 보유하는 항체의 1개 이상의 단편을 지칭한다. 항체의 항원-결합 기능은 전장 항체의 단편에 의해 수행될 수 있는 것으로 밝혀졌다. 용어 항체의 "항원-결합 단편" 내에 포괄되는 결합 단편의 예는 (i) VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어진 1가 단편인 Fab 단편; (ii) 힌지 영역에서 디술피드 가교에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab')2 단편; (iii) VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 아암의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편; (v) VH 도메인으로 이루어진 dAb 단편 (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546); 및 (vi) 단리된 상보성 결정 영역 (CDR), 디술피드-연결된 Fv (dsFv), 및 항-이디오타입 (항-Id) 항체 및 인트라바디를 포함한다. 게다가, Fv 단편의 2개의 도메인 VL 및 VH가 별개의 유전자에 의해 코딩되지만, 재조합 방법을 사용하여 이들이 단일 단백질 쇄로서 제조되게 할 수 있는 합성 링커에 의해 이들을 연결시킬 수 있고, 여기서 VL 및 VH 영역은 쌍형성하여 1가 분자를 형성한다 (단일 쇄 Fv (scFv)로서 공지됨; 예를 들어, 문헌 [Bird et al. Science 242:423-426 (1988) and Huston et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883 (1988)] 참조). 이러한 단일 쇄 항체는 또한 용어 항체의 "항원-결합 단편"에 포괄되는 것으로 의도된다. 다른 형태의 단일 쇄 항체, 예컨대 디아바디도 또한 포괄된다. 디아바디는 VH 및 VL 도메인이 단일 폴리펩티드 쇄 상에서 발현되지만 동일한 쇄 상의 2개의 도메인 사이의 쌍형성을 허용하기에는 너무 짧은 링커를 사용함으로써 도메인이 또 다른 쇄의 상보적 도메인과 쌍형성하게 되어 2개의 항원 결합 부위를 생성하는 2가의 이중특이적 항체이다 (예를 들어, 문헌 [Holliger et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993); Poljak et al., 1994, Structure 2:1121-1123] 참조).
항체는 인간, 원숭이, 돼지, 말, 토끼, 개, 고양이, 마우스 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는 임의의 포유동물, 또는 다른 동물, 예컨대 조류 (예를 들어, 닭), 어류 (예를 들어, 상어), 및 낙타류 (예를 들어, 라마)로부터 유래될 수 있다.
항체의 "가변 영역"은 단독의 또는 조합된 항체 경쇄의 가변 영역 (VL) 또는 항체 중쇄의 가변 영역 (VH)을 지칭한다. 관련 기술분야에 공지된 바와 같이, 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 각각, 초가변 영역 (HVR)으로도 공지되어 있는 3개의 상보성 결정 영역 (CDR)에 의해 연결된 4개의 프레임워크 영역 (FR)으로 이루어지고, 항체의 항원 결합 부위의 형성에 기여한다. 특히 CDR 영역 외부의 (즉, 프레임워크 영역 내의) 아미노산 잔기에서 치환을 포함하는, 대상 가변 영역의 변이체가 요망되는 경우에, 대상 가변 영역을 대상 가변 영역과 동일한 정규 부류의 CDR1 및 CDR2 서열을 함유하는 다른 항체의 가변 영역과 비교함으로써 적절한 아미노산 치환, 바람직하게는 보존적 아미노산 치환을 확인할 수 있다 (Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196(4): 901-917, 1987).
특정 실시양태에서, CDR의 한정적 묘사 및 항체의 결합 부위를 포함하는 잔기의 확인은 항체의 구조를 해석하고/하거나 항체-리간드 복합체의 구조를 해석함으로써 달성된다. 특정 실시양태에서, 이는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 임의의 다양한 기술, 예컨대 X선 결정학에 의해 달성될 수 있다. 특정 실시양태에서, 다양한 분석 방법을 사용하여 CDR 영역을 확인하거나 근사화할 수 있다. 특정 실시양태에서, 다양한 분석 방법을 사용하여 CDR 영역을 확인하거나 근사화할 수 있다. 이러한 방법의 예는 카바트(Kabat) 정의, 코티아(Chothia) 정의, AbM 정의, 접촉 정의, 및 입체형태적 정의를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
카바트 정의는 항체에서 잔기를 넘버링하기 위한 표준이고, 전형적으로 CDR 영역을 확인하는데 사용된다. 예를 들어, 문헌 [Johnson & Wu, 2000, Nucleic Acids Res., 28: 214-8]을 참조한다. 코티아 정의는 카바트 정의와 유사하지만, 코티아 정의는 특정 구조적 루프 영역의 위치를 고려한다. 예를 들어, 문헌 [Chothia et al., 1986, J. Mol. Biol., 196: 901-17; Chothia et al., 1989, Nature, 342: 877-83]을 참조한다. AbM 정의는 항체 구조를 모델링하는 옥스포드 몰레큘라 그룹(Oxford Molecular Group)에서 제조된 컴퓨터 프로그램의 통합 스위트를 사용한다. 예를 들어, 문헌 [Martin et al., 1989, Proc Natl Acad Sci (USA), 86:9268-9272; "AbM™, A Computer Program for Modeling Variable Regions of Antibodies," Oxford, UK; Oxford Molecular, Ltd]을 참조한다. AbM 정의는 지식 데이터베이스와 순이론적 방법, 예컨대 문헌 [Samudrala et al., 1999, "Ab Initio Protein Structure Prediction Using a Combined Hierarchical Approach," in PROTEINS, Structure, Function and Genetics Suppl., 3:194-198]에 기재된 것의 조합을 사용하여 1차 서열로부터 항체의 3차 구조를 모델링한다.
접촉 정의는 입수가능한 복합체 결정 구조의 분석에 기초한다. 예를 들어, 문헌 [MacCallum et al., 1996, J. Mol. Biol., 5:732-45]을 참조한다. 본원에서 CDR의 "입체형태적 정의"로 지칭되는 또 다른 접근법에서, CDR의 위치는 항원 결합에 대한 엔탈피 기여를 이루는 잔기로서 확인될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Makabe et al., 2008, Journal of Biological Chemistry, 283:1156-1166]을 참조한다. 또 다른 CDR 경계 정의는 상기 접근법 중 하나를 엄격하게 따르지 않을 수 있지만, 그럼에도 불구하고 이들이 특정한 잔기 또는 잔기의 군이 항원 결합에 유의하게 영향을 미치지 않는다는 예측 또는 실험적 발견에 비추어 보다 짧아지거나 보다 길어질 수 있을지라도, 적어도 카바트 CDR의 일부와 중첩될 것이다. 본원에 사용된 CDR은 접근법들의 조합을 포함하여, 관련 기술분야에 공지된 임의의 접근법에 의해 정의되는 CDR을 지칭할 수 있다. 본원에 사용된 방법은 임의의 이들 접근법에 따라 정의된 CDR을 사용할 수 있다. 1개 초과의 CDR을 함유하는 임의의 주어진 실시양태의 경우에, CDR은 카바트, 코티아, 확장형, AbM, 접촉, 및/또는 입체형태적 정의 중 임의의 것에 따라 정의될 수 있다.
항체 또는 그에 의해 특이적으로 결합되는 항원과 관련하여 본원에 사용된 "접촉 잔기"는 동족 항체/항원 상에 존재하는 아미노산 잔기의 중원자의 4 Å이하 이내에 있는 적어도 1개의 중원자 (즉, 수소가 아님)를 포함하는 항체/항원 상에 존재하는 아미노산 잔기를 지칭한다.
"프레임워크" (FR) 잔기는 CDR 잔기 이외의 항체 가변 도메인 잔기이다. VH 또는 VL 도메인 프레임워크는 하기 구조: FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4의, CDR이 사이에 배치된 4개의 프레임워크 하부-영역, FR1, FR2, FR3 및 FR4를 포함한다.
상기 본원에 언급된 바와 같이, 가변 도메인 내의 잔기는 전형적으로, 항체 컴파일링의 중쇄 가변 도메인 또는 경쇄 가변 도메인에 대해 사용되는 넘버링 시스템인 카바트에 따라 넘버링된다. 문헌 [Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD.]을 참조한다. 이러한 넘버링 시스템을 사용하여, 실제 선형 아미노산 서열은 가변 도메인의 FR 또는 CDR의 단축 또는 그 내로의 삽입에 상응하는, 더 적은 또는 추가의 아미노산을 함유할 수 있다. 예를 들어, 중쇄 가변 도메인은 H2의 잔기 52 다음에 단일 아미노산 삽입물 (카바트에 따라 잔기 52a), 및 중쇄 FR 잔기 82 다음에 삽입된 잔기 (예를 들어, 카바트에 따라 잔기 82a, 82b 및 82c)를 포함할 수 있다. 잔기의 카바트 넘버링은 항체 서열을 "표준" 카바트 넘버링된 서열과 상동성 영역에서 정렬함으로써 주어진 항체에 대해 결정될 수 있다. 카바트 넘버링을 배정하기 위한 다양한 알고리즘이 이용가능하다. 가변 영역 CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H2, 및 CDR-H3에 카바트 넘버링을 배정하기 위해 아비시스(Abysis)의 버전 2.3.3 배포로 실행되는 알고리즘 (www.abysis.org)이 사용될 수 있고, 이어서 CDR-H1에 대해 AbM 정의가 사용될 수 있다.
본원에 사용된 "모노클로날 항체"는 실질적으로 동종의 항체들의 집단으로부터 수득된 항체를 지칭하고, 즉 집단을 구성하는 개별 항체들은 미량으로 존재할 수 있는 가능한 자연 발생 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 모노클로날 항체는 고도로 특이적이고, 단일 항원 부위에 대해 지시되는 것이다. 추가로, 전형적으로 상이한 결정기 (에피토프)에 대해 지시된 상이한 항체를 포함하는 폴리클로날 항체 제제와 대조적으로, 각각의 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정기에 대해 지시된다. 수식어 "모노클로날"은 항체의 특징이 실질적으로 동종인 항체 집단으로부터 수득된 것임을 나타내며, 임의의 특정한 방법에 의한 항체 생산을 요구하는 것으로 해석되어서는 안된다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용될 모노클로날 항체는 문헌 [Kohler and Milstein, 1975, Nature 256:495]에 최초로 기재되었던 하이브리도마 방법에 의해 제조될 수 있거나, 또는 미국 특허 번호 4,816,567에 기재된 것과 같은 재조합 DNA 방법에 의해 제조될 수도 있다. 모노클로날 항체는 또한 예를 들어 문헌 [McCafferty et al., 1990, Nature 348:552-554]에 기재된 기술을 사용하여 생성된 파지 라이브러리로부터 단리될 수 있다. 본원에 사용된 "인간화" 항체는 비-인간 이뮤노글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 이뮤노글로불린, 이뮤노글로불린 쇄, 또는 그의 단편 (예컨대 Fv, Fab, Fab', F(ab')2 또는 항체의 다른 항원-결합 하위서열)인, 비-인간 (예를 들어, 뮤린) 항체 형태를 지칭한다. 바람직하게는, 인간화 항체는 수용자의 CDR로부터의 잔기가 목적하는 특이성, 친화도 및 능력을 갖는 비-인간 종 (공여자 항체), 예컨대 마우스, 래트 또는 토끼의 CDR로부터의 잔기에 의해 대체된 인간 이뮤노글로불린 (수용자 항체)이다. 인간화 항체는 수용자 항체에서도, 이입된 CDR 또는 프레임워크 서열에서도 발견되지 않지만, 항체 성능을 추가로 정밀화 및 최적화시키기 위해 포함되는 잔기를 포함할 수 있다.
본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 친화도 성숙될 수 있다. 예를 들어, 친화도 성숙 항체는 관련 기술분야에 공지된 절차에 의해 생산될 수 있다 (Marks et al., 1992, Bio/Technology, 10:779-783; Barbas et al., 1994, Proc Nat. Acad. Sci, USA 91:3809-3813; Schier et al., 1995, Gene, 169:147-155; Yelton et al., 1995, J. Immunol., 155:1994-2004; Jackson et al., 1995, J. Immunol., 154(7):3310-9; Hawkins et al., 1992, J. Mol. Biol., 226:889-896; 및 WO2004/058184).
"인간 항체"는 인간에 의해 생산된 항체의 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열을 보유하고/거나 본원에 개시된 바와 같은 인간 항체를 제조하는 임의의 기술을 사용하여 제조된 것이다. 인간 항체의 이러한 정의는 구체적으로 비-인간 항원 결합 잔기를 포함하는 인간화 항체를 배제한다.
용어 "키메라 항체"는 가변 영역 서열이 하나의 종으로부터 유래되고 불변 영역 서열이 또 다른 종으로부터 유래된 항체, 예컨대 가변 영역 서열이 마우스 항체로부터 유래되고 불변 영역 서열이 인간 항체로부터 유래되거나 또는 그 반대인 항체를 지칭하는 것으로 의도된다. 상기 용어는 또한 하나의 종으로부터의 하나의 개체 (예를 들어, 제1 마우스)로부터의 V 영역 및 동일한 종으로부터의 또 다른 개체 (예를 들어, 제2 마우스)로부터의 불변 영역을 포함하는 항체를 포괄한다.
용어 "항원 (Ag)"은 Ag를 인식하는 항체 (Ab)를 생성하거나 또는 발현 라이브러리 (예를 들어, 특히 파지, 효모 또는 리보솜 디스플레이 라이브러리)를 스크리닝하기 위해 면역적격 척추동물의 면역화에 사용되는 분자 엔티티를 지칭한다. 본원에서, Ag는 보다 광범위하게 언급되고, 일반적으로 Ab에 의해 특이적으로 인식되는 표적 분자를 포함하는 것으로 의도되며, 따라서 Ab를 생성하기 위한 면역 공정에 사용되거나 또는 Ab를 선택하기 위한 라이브러리 스크리닝에 사용되는 분자의 단편 또는 모방체를 포함한다. 따라서, CXCR5에 결합하는 본 발명의 항체의 경우에, 포유동물 종으로부터의 전장 CXCR5 (예를 들어, 인간, 원숭이, 마우스 및 래트 CXCR5) (그의 단량체 및 다량체, 예컨대 이량체, 삼량체 등 포함), 뿐만 아니라 CXCR5의 말단절단된 및 다른 변이체가 항원으로서 지칭된다.
일반적으로, 용어 "에피토프"는 항체가 특이적으로 결합하는 항원 (예를 들어, 단백질, 핵산, 탄수화물, 또는 지질 등)의 부위 또는 영역, 즉 항체와 물리적으로 접촉하는 부위 또는 영역을 지칭한다. 따라서, 용어 "에피토프"는 항체의 항원-결합 영역 중 1개 이상에서 항체에 의해 인식되고 결합될 수 있는 분자의 그 부분을 지칭한다. 전형적으로, 에피토프는 "항체 또는 그의 항원-결합 단편" (Ab)과 그의 상응하는 항원 사이의 분자 상호작용의 맥락에서 정의된다. 에피토프는 종종 분자, 예컨대 아미노산 또는 당 측쇄의 표면 그룹화로 이루어지고, 특정의 3차원 구조적 특징 뿐만 아니라 특정의 전하 특징을 갖는다. 일부 실시양태에서, 에피토프는 단백질 에피토프일 수 있다. 단백질 에피토프는 선형 또는 입체형태적일 수 있다. 선형 에피토프에서, 단백질 및 상호작용하는 분자 (예컨대, 항체) 사이의 모든 상호작용 지점은 단백질의 1차 아미노산 서열을 따라 선형으로 발생한다. "비선형 에피토프" 또는 "입체형태적 에피토프"는 에피토프에 특이적인 항체가 결합하는 항원성 단백질 내의 불연속 폴리펩티드 (또는 아미노산)를 포함한다. 본원에 사용된 용어 "항원성 에피토프"는 관련 기술분야에 널리 공지된 임의의 방법에 의해, 예를 들어 통상적인 면역검정에 의해 결정되는 바와 같은, 항체가 특이적으로 결합할 수 있는 항원의 일부로서 정의된다. 대안적으로, 발견 과정 동안, 항체의 생성 및 특징화는 바람직한 에피토프에 대한 정보를 규명할 수 있다. 이어서 이러한 정보로부터, 동일한 에피토프에 대한 결합에 대해 항체를 경쟁적으로 스크리닝할 수 있다. 이를 달성하기 위한 접근법은 CXCR5에의 결합에 대해 서로 경쟁 또는 교차 경쟁하는 항체, 예를 들어 항원에의 결합에 대해 경쟁하는 항체를 발견하기 위한 경쟁 및 교차 경쟁 연구를 수행하는 것이다.
에피토프에 "우선적으로 결합"하거나 "특이적으로 결합" (본원에서 상호교환가능하게 사용됨)하는 항체는 관련 기술분야에서 널리 이해되는 용어이고, 이러한 특이적 또는 우선적 결합을 측정하는 방법도 또한 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 대안적 세포 또는 물질보다 특정한 세포 또는 물질과 보다 빈번하게, 보다 신속하게, 보다 긴 지속기간으로 및/또는 보다 큰 친화도로 반응하거나 회합하는 경우에, 분자는 "특이적 결합" 또는 "우선적 결합"을 나타내는 것으로 언급된다. 항체는 다른 물질에 결합하는 것보다 보다 큰 친화도, 결합력으로, 보다 용이하게, 및/또는 보다 긴 지속기간으로 결합하는 경우에, 표적에 "특이적으로 결합"하거나 "우선적으로 결합"한다. 또한, 항체는 샘플 중에 존재하는 다른 물질에 결합하는 것보다 샘플 중 표적에 대해 보다 큰 친화도, 결합력으로, 보다 용이하게, 및/또는 보다 긴 지속기간으로 결합하는 경우에, 표적에 "특이적으로 결합"하거나 "우선적으로 결합"한다. 예를 들어, CXCR5 에피토프에 특이적으로 또는 우선적으로 결합하는 항체는 다른 CXCR5 에피토프 또는 비-CXCR5 에피토프에 결합하는 것보다 이 에피토프에 보다 큰 친화도, 결합력으로, 보다 용이하게 및/또는 보다 긴 지속기간으로 결합하는 항체이다. 또한, 이러한 정의는, 예를 들어 제1 표적에 특이적으로 또는 우선적으로 결합하는 항체 (또는 모이어티 또는 에피토프)는 제2 표적에 특이적으로 또는 우선적으로 결합할 수도 있고 그렇지 않을 수도 있다는 것으로 해석되는 것으로 이해된다. 따라서, "특이적 결합" 또는 "우선적 결합"은 배타적 결합을 (포함할 수는 있지만) 반드시 필요로 하지는 않는다. 일반적으로, 반드시 그러한 것은 아니지만, 결합에 대한 언급은 우선적 결합을 의미한다. "특이적 결합" 또는 "우선적 결합"은 특이적 분자를 인식하고 그에 결합하지만, 샘플 중의 다른 분자는 실질적으로 인식하지 않거나 결합하지 않는 화합물, 예를 들어 단백질, 핵산, 항체 등을 포함한다. 예를 들어, 샘플 중의 동족 리간드 또는 결합 파트너 (예를 들어, CXCR5에 결합하는 항-CXCR5 항체)를 인식하고 그에 결합하지만, 샘플 중의 다른 분자는 실질적으로 인식하지 않거나 결합하지 않는 항체 또는 펩티드 수용체는 그러한 동족 리간드 또는 결합 파트너에 특이적으로 결합한다. 따라서, 지정된 검정 조건 하에, 명시된 결합 모이어티 (예를 들어, 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 수용체 또는 그의 리간드 결합 단편)가 특정한 표적 분자에 우선적으로 결합하며, 시험 샘플 중에 존재하는 다른 성분에는 유의한 양으로 결합하지 않는다.
다양한 검정 포맷을 사용하여 관심 분자에 특이적으로 결합하는 항체 또는 펩티드를 선택할 수 있다. 항원 또는 수용체와 특이적으로 반응하는 항체, 또는 동족 리간드 또는 결합 파트너와 특이적으로 결합하는 그의 리간드 결합 단편을 확인하는데 사용될 수 있는 많은 검정 중에서 특히, 예를 들어 고체 상 ELISA 면역검정, 면역침전, 비아코어(Biacore)™ (지이 헬스케어, 뉴저지주 피스카타웨이), KinExA, 형광-활성화 세포 분류 (FACS), 옥테트(Octet)™ (포르테바이오, 인크.(ForteBio, Inc.), 캘리포니아주 멘로 파크) 및 웨스턴 블롯 분석이 있다. 전형적으로, 특이적 또는 선택적 반응은 배경 신호 또는 노이즈의 적어도 2배, 보다 전형적으로 배경의 10배 초과, 보다 더 전형적으로 배경의 50배 초과, 보다 전형적으로 배경의 100배 초과, 보다 더 전형적으로 배경의 500배 초과, 보다 더 전형적으로 배경의 1000배 초과, 보다 더 전형적으로 배경의 10,000배 초과일 것이다. 추가적으로, 항체는 평형 해리 상수 (KD)가 ≤ 1 μM, 바람직하게는 ≤ 100 nM, 보다 바람직하게는 ≤ 10 nM, 보다 더 바람직하게는 ≤ 100 pM, 보다 더 바람직하게는 ≤ 10 pM, 및 보다 더 바람직하게는 ≤ 1 pM인 경우에 항원에 "특이적으로 결합"하는 것으로 언급된다. 일부 실시양태에서, 항체는 평형 해리 상수 (KD)가 ≤ 7 nM인 경우에 항원에 "특이적으로 결합"하는 것으로 언급된다.
용어 "결합 친화도"는 2개의 분자, 예를 들어 항체 또는 그의 단편과 항원 사이의 비-공유 상호작용의 강도의 척도로서 본원에 사용된다. 용어 "결합 친화도"는 1가 상호작용 (내인성 활성)을 기재하는데 사용된다.
추가적으로, CXCR5-발현 세포에 대한 CXCR5 항체의 결합 친화도를 결정하기 위해, 세포 결합 실험을 수행하여 겉보기 친화도를 결정할 수 있다. 표적을 발현하는 세포에 대한 항체 결합의 겉보기 친화도는, 항원 결합 집단의 기하 평균 형광 강도 (gMFI)를 유동 세포측정법에 의해 정량화한 평형 결합 적정 곡선의 EC50으로서 계산될 수 있다.
1가 상호작용을 통한 2개의 분자, 예를 들어 항체 또는 그의 단편과 항원 사이의 결합 친화도는 해리 상수 (KD)의 결정에 의해 정량화될 수 있다. 다음으로 KD는, 예를 들어 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 방법 (비아코어)을 사용하여 복합체 형성 및 해리의 동역학을 측정함으로써 결정될 수 있다. 1가 복합체의 회합 및 해리에 상응하는 속도 상수는 각각 회합 속도 상수 ka (또는 kon) 및 해리 속도 상수 kd (또는 koff)로 지칭된다. KD는 방정식 KD = kd / ka를 통해 ka 및 kd와 관련된다. 해리 상수의 값은 널리 공지된 방법에 의해 직접적으로 결정될 수 있고, 예를 들어 문헌 [Caceci et al. (1984, Byte 9: 340-362)]에 제시된 바와 같은 방법에 의해 심지어 복합 혼합물에 대해서도 연산될 수 있다. 예를 들어, KD는 문헌 [Wong & Lohman (1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5428-5432)]에 개시된 바와 같은 이중-필터 니트로셀룰로스 필터 결합 검정을 사용하여 확립될 수 있다. 표적 항원에 대한 리간드, 예컨대 항체의 결합 능력을 평가하기 위한 다른 표준 검정이 관련 기술분야에 공지되어 있고, 이는 예를 들어, ELISA, 웨스턴 블롯, RIA, 및 유동 세포측정 분석, 및 본원의 다른 곳에 예시된 다른 검정을 포함한다. 항체의 결합 동역학 및 결합 친화도는 또한, 관련 기술분야에 공지된 표준 검정, 예컨대 표면 플라즈몬 공명 (SPR)에 의해, 예를 들어 비아코어™ 시스템 또는 KinExA를 사용하여 평가될 수 있다.
항원에 대한 항체의 결합을, 표적의 또 다른 리간드, 예컨대 또 다른 항체 또는 표적과 달리 결합하는 가용성 수용체에 의한 표적의 결합과 비교하는 경쟁적 결합 검정이 실시될 수 있다. 50% 억제가 발생되는 농도는 Ki로서 공지되어 있다. 이상적 조건 하에, Ki는 KD와 등가이다. Ki 값은 결코 KD보다 낮지 않을 것이므로, KD에 대한 상한치를 제공하기 위해 Ki의 측정을 편리하게 대체시킬 수 있다.
상이한 분자 상호작용과 연관된 결합 친화도의 상기 정의에 따라, 예를 들어 주어진 항원에 대한 상이한 항체의 결합 친화도를 비교하는 것은 개개의 항체/항원 복합체에 대한 KD 값을 비교하는 것에 의해 비교될 수 있다. 항체 또는 다른 결합 파트너에 대한 KD 값은 관련 기술분야에 널리 확립된 방법을 사용하여 결정될 수 있다. KD를 결정하기 위한 하나의 방법은, 전형적으로 바이오센서 시스템, 예컨대 비아코어® 시스템을 사용하여 표면 플라즈몬 공명을 사용하는 것이다.
유사하게, 상호작용의 특이성은 관심 상호작용, 예를 들어 항체와 항원 사이의 특이적 상호작용에 대한 KD 값을 결정하고, 이를 비관심 상호작용, 예를 들어 CXCR5에 결합하지 않는 것으로 공지된 대조 항체의 상호작용의 KD 값과 비교함으로써 평가될 수 있다.
그의 표적과 특이적으로 결합하는 항체는 그의 표적과 고친화도로 결합할 수 있고, 즉 상기 논의된 바와 같이 낮은 KD를 나타낼 수 있고, 다른 비-표적 분자와 보다 낮은 친화도로 결합할 수 있다. 예를 들어, 항체는 비-표적 분자에 1 x 10-6M 이상, 보다 바람직하게는 1 x 10-5 M 이상, 보다 바람직하게는 1 x 10-4 M 이상, 보다 바람직하게는 1 x 10-3 M 이상, 보다 더 바람직하게는 1 x 10-2 M 이상의 KD로 결합할 수 있다. 본 발명의 항체는 바람직하게는, 또 다른 비-CXCR5 분자에의 결합에 대한 그의 친화도보다 적어도 2-배, 10-배, 50-배, 100-배, 200-배, 500-배, 1,000-배 또는 10,000-배 또는 그 초과의 친화도로 그의 표적에 결합할 수 있다.
항체와 관련하여 본원에 사용된 용어 "경쟁하다"는 제1 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 제2 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 결합과 충분히 유사한 방식으로 에피토프에 결합하여, 제1 항체와 그의 동족 에피토프의 결합의 결과가 제2 항체의 부재 하에서의 제1 항체의 결합과 비교하여 제2 항체의 존재 하에 검출가능하게 감소되는 것을 의미한다. 제2 항체가 그의 에피토프에 결합하는 것이 또한 제1 항체의 존재 하에 검출가능하게 감소되는 대안적인 경우도 가능하지만, 반드시 그러할 필요는 없다. 즉, 제2 항체는 제1 항체가 그의 각각의 에피토프에 결합하는 것을 억제하지 않으면서 제1 항체는 제2 항체가 그의 에피토프에 결합하는 것을 억제할 수 있다. 그러나, 각각의 항체가 동일한 정도, 보다 큰 정도, 또는 보다 적은 정도와 관계없이 다른 항체와 그의 동족 에피토프 또는 리간드의 결합을 검출가능하게 억제하는 경우에, 항체는 그의 각각의 에피토프(들)의 결합에 대해 서로 "교차 경쟁"하는 것으로 언급된다. 경쟁 및 교차 경쟁 항체 둘 다가 본 발명에 포괄된다. 이러한 경쟁 또는 교차 경쟁이 일어나는 메카니즘 (예를 들어, 입체 장애, 입체형태적 변화, 또는 공통 에피토프 또는 그의 부분에 대한 결합)과는 관계없이, 통상의 기술자는 본원에 제공되는 교시내용에 기초하여 본원에 개시된 방법에 이러한 경쟁 및/또는 교차 경쟁 항체가 포괄되며 유용할 수 있음을 인지할 것이다.
표준 경쟁 검정을 사용하여 2종의 항체가 서로 경쟁하는지 여부를 결정할 수 있다. 항체 경쟁에 대한 하나의 적합한 검정은, 전형적으로 바이오센서 시스템 (예컨대 비아코어® 시스템)을 사용하는 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 기술을 사용하여 상호작용의 정도를 측정할 수 있는 비아코어 기술의 사용을 수반한다. 예를 들어, SPR은 하나의 항체가 제2 항체의 결합을 억제하는 능력을 결정하는 시험관내 경쟁적 결합 억제 검정에 사용될 수 있다. 항체 경쟁을 측정하기 위한 또 다른 검정은 ELISA-기반 접근법을 사용한다.
추가로, 경쟁에 기초하여 항체를 "비닝"하기 위한 고처리량 과정이 국제 특허 출원 번호 WO2003/48731에 기재되어 있다. 하나의 항체 (또는 단편)가 또 다른 항체 (또는 단편)의 CXCR5에의 결합을 감소시킨다면, 경쟁이 존재한다. 예를 들어, 상이한 항체가 순차적으로 첨가되는, 순차적 결합 경쟁 검정이 사용될 수 있다. 제1 항체는 포화에 근접한 결합에 도달할 때까지 첨가될 수 있다. 이어서, 제2 항체가 첨가된다. 제2 항체의 CXCR5에 대한 결합이 검출되지 않거나, 또는 제1 항체 부재 하의 병행 검정 (이 값은 100%로 설정될 수 있음)과 비교하여 유의하게 감소 (예를 들어, 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 90% 감소)되는 경우에, 2종의 항체는 서로 경쟁하는 것으로 간주된다.
또한, 여러 항체 사이의 잠재적 에피토프를 평가하기 위해 인간 및 마우스 CXCR5 단백질 사이의 도메인 스와핑을 사용하는 예시적인 항체 에피토프 비닝 검정이 실시예 8에 제공된다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 본원에 제공된 교시내용에 기초하여, 서로에 대해 적어도 2개의 항체의 표적에 대한 결합을 결정하기 위해 사용될 수 있는 관련 기술분야에 공지된 매우 다양한 검정이 존재하고, 이러한 검정은 본원에 포함된다는 것을 인지할 것이다.
CXCR5 항체는 관련 기술분야에 널리 공지된 방법을 사용하여 특징화될 수 있다. 예를 들어, 한 방법은 그것이 결합하는 에피토프를 확인하는 것, 또는 "에피토프 맵핑"이다. 예를 들어, 문헌 [Chapter 11 of Harlow and Lane, Using Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1999]에 기재된 바와 같이, 항체-항원 복합체의 결정 구조 규명, 경쟁 검정, 유전자 단편 발현 검정, 및 합성 펩티드-기반 검정을 비롯하여 단백질 상에서 에피토프의 위치를 맵핑하고 특징화하는 관련 기술분야에 공지된 많은 방법이 존재한다. 추가 예에서, 에피토프 맵핑을 사용하여 CXCR5 항체가 결합하는 서열을 결정할 수 있다. 에피토프 맵핑은 다양한 공급업체, 예를 들어 펩스캔 시스템즈(Pepscan Systems) (네덜란드 8219 피에이치 렐리스타드 에델헤르트벡 15)로부터 상업적으로 입수가능하다. 에피토프는 선형 에피토프, 즉 아미노산의 단일 스트레치 내에 함유된 것일 수 있거나, 또는 반드시 단일 스트레치 내에 함유된 것은 아닐 수 있는 아미노산의 3차원 상호작용에 의해 형성된 입체형태적 에피토프일 수 있다. 다양한 길이의 펩티드 (예를 들어, 적어도 4-6개 아미노산 길이)가 단리 또는 합성되어 (예를 들어, 재조합적으로), CXCR5 항체를 사용한 결합 검정에 사용될 수 있다.
또한, CXCR5 항체가 결합하는 에피토프는 CXCR5 서열로부터 유래된 중첩 펩티드를 사용하고 이러한 항체에 의한 결합을 결정하는 것에 의한 체계적 스크리닝에서 결정될 수 있다. 유전자 단편 발현 검정에 따라, CXCR5를 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 무작위로 또는 특이적 유전적 구축에 의해 단편화할 수 있고, CXCR5의 발현된 단편과 시험하고자 하는 항체의 반응성을 결정한다. 유전자 단편은, 예를 들어 방사성 아미노산의 존재 하에 PCR에 의해 생성된 후 시험관내에서 전사되고 단백질로 번역될 수 있다. 이어서, 방사성 표지된 CXCR5 단편에의 항체의 결합을 면역침전 및 겔 전기영동에 의해 결정한다.
특정 에피토프는 또한 파지 입자의 표면 상에 디스플레이된 무작위 펩티드 서열의 큰 라이브러리 (파지 라이브러리) 또는 효모 (효모 디스플레이)를 사용하여 확인할 수 있다. 대안적으로, 중첩 펩티드 단편의 한정된 라이브러리를 시험 항체와의 결합에 대해 간단한 결합 검정에서 시험할 수 있다. 추가의 예에서, 항원의 돌연변이유발, 도메인 스와핑 실험 및 알라닌 스캐닝 돌연변이유발을 수행하여, 에피토프 결합에 요구되고/거나 충분하고/거나 필요한 잔기를 확인할 수 있다. 예를 들어, CXCR5 폴리펩티드의 다양한 잔기를 알라닌으로 대체시킨 돌연변이체 CXCR5를 사용하여 알라닌 스캐닝 돌연변이유발 실험을 수행할 수 있다. 돌연변이체 CXCR5에 대한 항체의 결합을 평가함으로써, 항체 결합에 대한 특정한 CXCR5 잔기의 중요성을 평가할 수 있다.
CXCR5 항체를 특징화하는데 사용될 수 있는 또 다른 방법은 동일한 항원, 즉 CXCR5 상의 다양한 단편에 결합하는 것으로 공지된 다른 항체와의 경쟁 검정을 사용하여, CXCR5 항체가 다른 항체와 동일한 에피토프에 결합하는지 여부를 결정하는 것이다. 경쟁 검정은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다.
추가로, 주어진 항체/항원 결합 쌍에 대한 에피토프는 다양한 실험적 및 컴퓨터적 에피토프 맵핑 방법을 사용하여 상이한 상세 수준에서 규정되고 특징화될 수 있다. 실험적 방법은 돌연변이유발, X선 결정학, 핵 자기 공명 (NMR) 분광분석법, 수소/중수소 교환 질량 분광측정법 (H/D-MS) 및 관련 기술분야에 널리 공지되어 있는 다양한 경쟁 결합 방법을 포함한다. 각 방법은 고유한 원리에 의존하기 때문에, 에피토프의 기재는 이를 결정하는 방법과 밀접하게 연결된다. 따라서, 주어진 항체/항원 쌍에 대한 에피토프는 사용된 에피토프 맵핑 방법에 따라 차별적으로 규정될 것이다.
그의 가장 상세한 수준에서, Ag와 Ab 사이의 상호작용에 대한 에피토프는 Ag-Ab 상호작용에 존재하는 원자 접촉을 규정하는 공간 좌표 뿐만 아니라 결합 열역학에 대한 그의 상대적 기여도에 관한 정보에 의해 규정될 수 있다. 덜 상세한 수준에서는, 에피토프가 Ag와 Ab 사이의 원자 접촉을 규정하는 공간 좌표에 의해 특징화될 수 있다. 추가로 덜 상세한 수준에서, 에피토프는 특정 기준에 의해, 예를 들어 Ab 및 Ag 내의 원자 (예를 들어, 중원자, 즉 비-수소 원자) 사이의 거리에 의해 규정되는 바와 같이 그것이 포함하는 아미노산 잔기에 의해 특징화될 수 있다. 추가로 덜 상세한 수준에서, 에피토프는 기능을 통해, 예를 들어 다른 Ab와의 경쟁 결합에 의해 특징화될 수 있다. 에피토프는 또한, 또 다른 아미노산에 의한 치환이 Ab와 Ag 사이의 상호작용의 특징을 변경시킬 아미노산 잔기를 포함하는 것으로서 보다 일반적으로 규정될 수 있다 (예를 들어, 알라닌 스캐닝 사용).
사용된 에피토프 맵핑 방법에 따라 에피토프의 기재 및 정의가 상이한 상세 수준에서 수득된다는 사실로부터, 동일한 Ag 상의 상이한 Ab에 대한 에피토프를 비교하는 것은 상이한 상세 수준에서 유사하게 수행될 수 있다는 결론이 나온다.
아미노산 수준에서 기재된, 예를 들어 X선 구조로부터 결정된 에피토프는, 이들이 동일한 아미노산 잔기 세트를 함유하는 경우에 동일한 것으로 언급된다. 에피토프는 적어도 1개의 아미노산이 에피토프에 의해 공유되는 경우에 중첩되는 것으로 언급된다. 에피토프는 에피토프에 의해 공유되는 아미노산 잔기가 전혀 없는 경우에 별개인 (고유한) 것으로 언급된다.
경쟁 결합을 특징으로 하는 에피토프는 상응하는 항체의 결합이 상호 배타적인 경우, 즉 한 항체의 결합이 다른 항체의 동시 또는 연속 결합을 배제하는 경우에 중첩되는 것으로 언급된다. 에피토프는 항원이 상응하는 항체 둘 다의 결합을 동시에 수용할 수 있는 경우에 별개인 (고유한) 것으로 언급된다.
용어 "파라토프"의 정의는 상기 "에피토프"의 정의로부터 관점을 반전시킴으로써 유래된다. 따라서, 용어 "파라토프"는 항원에 특이적으로 결합하는 항체 상의 부위 또는 영역, 즉 본원의 다른 곳에서 "접촉"으로서 정의된 바와 같이 항원 (CXCR5)과 접촉하는 항체 상의 아미노산 잔기를 지칭한다.
주어진 항체/항원 쌍에 대한 에피토프 및 파라토프는 상용 방법에 의해 확인할 수 있다. 예를 들어, 에피토프의 일반적인 위치는 상이한 단편 또는 변이체 CXCR5 폴리펩티드에 결합할 수 있는 항체의 능력을 평가함으로써 결정할 수 있다. 항체와 접촉하는 CXCR5 내의 특이적 아미노산 (에피토프), 및 CXCR5와 접촉하는 항체 내의 특이적 아미노산 (파라토프)은 또한, 상용 방법, 예컨대 실시예에 기재된 방법을 사용하여 결정할 수 있다. 예를 들어, 항체와 표적 분자를 합할 수 있고, 항체/항원 복합체를 결정화할 수 있다. 복합체의 결정 구조를 결정할 수 있고, 이를 사용하여 항체와 그의 표적 사이의 상호작용의 특이적 부위를 확인할 수 있다.
본 발명에 따른 항체는 본원에 구체적으로 개시된 본 발명의 항체와 동일한 CXCR5의 에피토프 또는 도메인과 결합할 수 있다. 이러한 확인 목적을 위해 사용될 수 있는 분석 및 검정은 실시예 1-10에 기재된 바와 같은 생물학적 활성 검정에서, 및 항체의 결정 구조의 분석에서 관심 항체와 CXCR5 수용체 사이의 CXCR5의 결합에 대한 경쟁을 평가하는 검정을 포함한다.
본 발명의 항체는 본원에 기재된 바와 같이 CXCR5와의 결합에 대해 본 발명의 또 다른 항체와 경쟁 또는 교차-경쟁하는 능력을 가질 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항체는 CXCR5 또는 본원에 개시된 항체에 의해 결합되는 CXCR5의 적합한 단편 또는 변이체에의 결합에 대해 본원에 기재된 항체와 경쟁 또는 교차-경쟁할 수 있다.
즉, 제1 항체가 CXCR5에의 결합에 대해 제2 항체와 경쟁하지만, 제2 항체가 먼저 CXCR5에 결합된 경우에는 경쟁하지 않는다면, 이는 제2 항체와 "경쟁"하는 것으로 간주된다 (또한 단방향성 경쟁으로도 지칭됨). 어느 항체가 먼저 CXCR5에 결합되었는지에 상관없이 항체가 또 다른 항체와 경쟁하는 경우이면, 항체는 CXCR5에의 결합에 대해 다른 항체와 "교차-경쟁"한다. 이러한 경쟁 또는 교차-경쟁 항체는 표준 결합 검정에서 본 발명의 공지된 항체와 경쟁/교차-경쟁하는 능력에 기초하여 확인될 수 있다. 예를 들어 비아코어™ 시스템을 사용하는 것에 의한, 예를 들어 SPR, ELISA 검정 또는 유동 세포측정법을 사용하여 경쟁/교차-경쟁을 입증할 수 있다. 이러한 경쟁/교차 경쟁은 2개의 항체가 동일하거나, 중첩되거나 또는 유사한 에피토프에 결합한다는 것을 시사할 수 있다.
따라서, 본 발명의 항체는 시험 항체가 표적 분자 상의 결합 부위에 대해 참조 항체와 경쟁/교차-경쟁할 수 있는지 여부를 평가하는 결합 검정을 포함하는 방법에 의해 확인할 수 있다. 경쟁적 결합 검정을 수행하는 방법은 본원에 개시되어 있고/거나 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어 이는 본 발명의 참조 항체가 표적 분자에 결합할 수 있는 조건을 사용하여 항체를 표적 분자에 결합시키는 것을 수반할 수 있다. 이어서, 항체/표적 복합체를 시험/제2 항체에 노출시킬 수 있고, 시험 항체가 항체/표적 복합체로부터 본 발명의 참조 항체를 대체할 수 있는 정도를 평가할 수 있다. 대안적 방법은 항체 결합을 허용하는 조건 하에 시험 항체를 표적 분자와 접촉시킨 다음, 그러한 표적 분자가 결합할 수 있는 본 발명의 참조 항체를 첨가하고, 본 발명의 참조 항체가 항체/표적 복합체로부터 시험 항체를 대체할 수 있는 정도 또는 표적에 동시에 결합할 수 있는 정도 (즉, 비-경쟁 항체)를 평가하는 것을 수반할 수 있다.
본 발명의 참조 항체가 표적에 결합하는 것을 억제하는 시험 항체의 능력은, 시험 항체가 표적에의 결합에 대해 본 발명의 참조 항체와 경쟁할 수 있으므로, 시험 항체가 본 발명의 참조 항체와 동일한, 또는 실질적으로 동일한 CXCR5 단백질 상의 에피토프 또는 영역에 결합한다는 것을 입증한다. 이러한 방법에서 본 발명의 참조 항체와 경쟁하는 것으로 확인된 시험 항체도 또한 본 발명의 항체이다. 시험 항체가 본 발명의 참조 항체와 동일한 영역에서 CXCR5에 결합할 수 있고 본 발명의 참조 항체와 경쟁할 수 있다는 사실은, 시험 항체가 본 발명의 항체와 동일한 결합 부위에서 리간드로서 작용할 수 있고, 따라서 시험 항체가 참조 항체의 작용을 모방할 수 있고, 따라서 본 발명의 항체라는 것을 시사한다. 이는 본원의 다른 곳에서 보다 충분하게 기재된 바와 같은 검정을 사용하여, 시험 항체의 존재 하의 CXCR5의 활성을 달리 동일한 조건 하에 참조 항체의 존재 하의 CXCR5의 활성과 비교하는 것에 의해 확인될 수 있다.
본 발명의 참조 항체는 본원에 기재된 바와 같은 항체, 예컨대 11G2, 41A10, 5H7, 및 CXCR5에 결합하는 능력을 보유하는 본원에 기재된 바와 같은 그의 임의의 변이체 또는 부분일 수 있다. 본 발명의 항체는 본원에 기재된 참조 항체 또는 CXCR5에 결합하는 능력을 보유하는 본원에 기재된 바와 같은 그의 임의의 변이체 또는 부분과 동일한 에피토프에 결합할 수 있다.
앞서 본원의 다른 곳에 언급된 바와 같이, 특이적 결합은 표적이 아닌 분자에 대한 항체의 결합을 참조하여 평가될 수 있다. 이러한 비교는 표적에 결합할 수 있는 항체의 능력을 또 다른 분자에 결합할 수 있는 항체의 능력과 비교함으로써 이루어질 수 있다. 이러한 비교는 KD 또는 Ki의 평가에서 상기 기재된 바와 같이 이루어질 수 있다. 이러한 비교에 사용된 다른 분자는 표적 분자가 아닌 임의의 분자일 수 있다. 바람직하게는, 다른 분자는 표적 분자와 동일하지 않다. 바람직하게는 표적 분자는 표적 분자의 단편이 아니다.
특이적 결합을 결정하기 위해 사용된 다른 분자는 표적에 대한 구조 또는 기능에 있어서 비관련될 수 있다. 예를 들어, 다른 분자는 비관련 물질 또는 환경에 수반되는 물질일 수 있다.
특이적 결합을 결정하기 위해 사용된 다른 분자는 표적 분자, 즉 CXCR5와 동일한 생체내 경로에 관여하는 또 다른 분자일 수 있다. 본 발명의 항체가 이러한 또 다른 분자를 초과하는 CXCR5에 대한 특이성을 반드시 갖게 함으로써, 원치않는 생체내 교차 반응성을 회피할 수 있다.
본 발명의 항체는 표적 분자와 관련된 일부 분자에 결합할 수 있는 능력을 보유할 수 있다.
대안적으로, 본 발명의 항체는 특정한 표적 분자에 대한 특이성을 가질 수 있다. 예를 들어, 이는 본원에 기재된 바와 같은 하나의 표적 분자에 결합할 수 있지만, 본원에 기재된 것과 상이한 표적 분자에는 결합할 수 없거나 또는 유의하게 감소된 친화도로 결합할 수 있다. 예를 들어, 전장 성숙한 인간 CXCR5를 표적으로서 사용할 수 있지만, 그러한 표적에 결합하는 항체는, 예를 들어 다른 종으로부터의 다른 CXCR5 단백질, 예컨대 다른 포유동물 CXCR5에는 결합할 수 없거나 또는 보다 낮은 친화도로 결합할 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체는 인간 및 마우스 CXCR5 둘 다에 결합한다.
"Fc 융합" 단백질은 1종 이상의 폴리펩티드가 Fc 폴리펩티드에 작동가능하게 연결된 단백질이다. Fc 융합체는 이뮤노글로불린의 Fc 영역을 융합 파트너와 조합한다.
"천연 서열 Fc 영역"은 자연에서 발견되는 Fc 영역의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 포함한다. "변이체 Fc 영역"은 적어도 1개의 아미노산 변형으로 인해 천연 서열 Fc 영역의 아미노산 서열과 상이하지만 천연 서열 Fc 영역의 적어도 하나의 이펙터 기능은 유지하는 아미노산 서열을 포함한다. 바람직하게는, 변이체 Fc 영역은 천연 서열 Fc 영역 또는 모 폴리펩티드의 Fc 영역과 비교하여 적어도 1개의 아미노산 치환, 예를 들어 약 1 내지 약 10개의 아미노산 치환을 갖고, 바람직하게는 천연 서열 Fc 영역 또는 모 폴리펩티드의 Fc 영역 내에 약 1 내지 약 5개의 아미노산 치환을 갖는다. 본원에서 변이체 Fc 영역은 바람직하게는 천연 서열 Fc 영역 및/또는 모 폴리펩티드의 Fc 영역과 적어도 약 80% 서열 동일성, 가장 바람직하게는 이와 적어도 약 90% 서열 동일성, 보다 바람직하게는 이와 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 서열 동일성을 보유할 것이다.
관련 기술분야에 공지된 바와 같이, 항체의 "불변 영역"은 단독의 또는 조합된 항체 경쇄의 불변 영역 또는 항체 중쇄의 불변 영역을 지칭한다.
본원에서 상호교환가능하게 사용되는 용어 "IgG Fc 영역", "Fc 영역", "Fc 도메인" 및 "Fc"는 IgG 분자의 파파인 소화에 의해 수득되는 결정화가능한 단편과 상관된 IgG 분자의 부분을 지칭한다. 본원에 사용된 용어는 제1 불변 영역 이뮤노글로불린 도메인을 제외한 항체의 불변 영역에 관한 것이고, 추가로 그 영역의 부분에 관한 것이다. 따라서, Fc는 IgA, IgD, 및 IgG의 마지막 2개의 불변 영역 이뮤노글로불린 도메인, 및 IgE 및 IgM의 마지막 3개의 불변 영역 이뮤노글로불린 도메인, 및 이들 도메인에 대한 가요성 힌지 N-말단, 또는 그의 부분을 지칭한다. IgA 및 IgM의 경우, Fc는 J 쇄를 포함할 수 있다. IgG의 경우, Fc는 이뮤노글로불린 도메인 Cγ2 및 Cγ3 (C 감마 2 및 C 감마 3) 및 Cγ1 (C 감마 1) 및 Cγ2 (C 감마 2) 사이의 힌지를 포함한다. Fc 영역의 경계는 다양할 수 있지만, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 통상적으로 C226 또는 P230에서 그의 카르복실-말단까지의 잔기를 포함하는 것으로 정의되고, 여기서 넘버링은 문헌 [Kabat et al., 1991]에 기재된 바와 같은 문헌 [Edelman et al., 1969, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 63(1):78-85]의 EU 인덱스에 따른다. 전형적으로, Fc 도메인은 인간 IgG1 불변 도메인의 아미노산 잔기 약 236에서 약 447을 포함한다. 예시적인 인간 야생형 IgG1 Fc 도메인 아미노산 서열은 서열식별번호: 31에 제시된다. Fc 폴리펩티드는 단리된 이 영역을 지칭할 수 있거나, 또는 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 또는 Fc 융합 단백질과 관련하여 이 영역을 지칭할 수 있다.
중쇄 불변 도메인은 Fc 영역을 포함하고, 추가로 IgG 중쇄의 CH1 도메인 및 힌지 뿐만 아니라 CH2 및 CH3 (및, 임의로, IgA 및 IgE의 CH4) 도메인을 포함한다.
"기능적 Fc 영역"은 천연 서열 Fc 영역의 적어도 하나의 이펙터 기능을 보유한다. 예시적인 "이펙터 기능"은 C1q 결합; 보체 의존성 세포독성; Fc 수용체 결합; 항체-의존성 세포-매개 세포독성; 식세포작용; 세포 표면 수용체 (예를 들어, B 세포 수용체)의 하향-조절 등을 포함한다. 이러한 이펙터 기능에는 일반적으로 Fc 영역이 결합 도메인 (예를 들어, 항체 가변 도메인 또는 그의 항원-결합 단편)과 조합될 것이 요구되고, 이러한 항체 이펙터 기능을 평가하기 위해 관련 기술분야에 공지된 다양한 검정을 사용하여 평가할 수 있다.
"천연 서열 Fc 영역"은 자연에서 발견되는 Fc 영역의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 천연 서열 인간 Fc 영역은 천연 서열 인간 IgG1 Fc 영역 (비-A 및 A 동종이형); 천연 서열 인간 IgG2 Fc 영역; 천연 서열 인간 IgG3 Fc 영역; 및 천연 서열 인간 IgG4 Fc 영역 뿐만 아니라 그의 자연 발생 변이체를 포함한다.
"변이체 Fc 영역"은 적어도 1개의 아미노산 변형에 의해 천연 서열 Fc 영역의 것과 상이한 아미노산 서열을 포함한다.
"Fc 수용체" 및 "FcR"은 항체의 Fc 영역에 결합하는 수용체를 기재한다. 일부 실시양태에서, FcyR은 천연 인간 FcR이다. 일부 실시양태에서, FcR은 IgG 항체에 결합하는 것 (감마 수용체)이고, FcyRI, FcyRII, 및 FcyRIII 하위부류의 수용체를 포함하며, 이들은 이들 수용체의 대립유전자 변이체 및 대안적으로 스플라이싱된 형태를 포함한다. FcyRII 수용체는 FcyRIIA ("활성화 수용체") 및 FcyRIIB ("억제 수용체")를 포함하며, 이들은 주로 그의 세포질 도메인이 상이한 유사한 아미노산 서열을 갖는다. 활성화 수용체 FcyRIIA는 그의 세포질 도메인에 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 (ITAM)를 함유한다. 억제 수용체 FcyRIIB는 그의 세포질 도메인에 면역수용체 티로신-기반 억제 모티프 (ITIM)를 함유한다 (예를 들어, 문헌 [Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)] 참조). FcR은, 예를 들어, 문헌 [Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991); Capel et ah, Immunomethods 4:25-34 (1994); 및 de Haas et ah, J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995)]에 고찰되어 있다. 향후 확인될 것을 포함한 다른 FcR이 본원의 용어 "FcR"에 포괄된다.
용어 "Fc 수용체" 또는 "FcR"은 또한 모체 IgG의 태아로의 전달 (Guyer et ah, J. Immunol. 117:587 (1976) 및 Kim et ah, J. Immunol. 24:249 (1994)) 및 이뮤노글로불린의 항상성 조절을 담당하는 신생아 수용체 FcRn을 포함한다. FcRn에의 결합의 측정 방법은 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Ghetie and Ward., Immunol. Today 18(12):592-598 (1997); Ghetie et ah, Nature Biotechnology, 15(7):637- 640 (1997); Hinton et ah, J. Biol. Chem. 279(8):6213-6216 (2004); WO 2004/92219 (Hinton et al.)] 참조).
"이펙터 기능"은 항체 이소형에 따라 달라지는, 항체의 Fc 영역에서 기인하는 생물학적 활성을 지칭한다. 항체 이펙터 기능의 예는 Clq 결합 및 보체 의존성 세포독성 (CDC); Fc 수용체 결합; 항체-의존성 세포-매개 세포독성 (ADCC); 식세포작용; 세포 표면 수용체 (예를 들어 B 세포 수용체)의 하향 조절; 및 B 세포 활성화를 포함한다.
"인간 이펙터 세포"는 1개 이상의 FcR을 발현하고 이펙터 기능을 수행하는 백혈구이다. 특정 실시양태에서, 세포는 적어도 FcyRIII을 발현하고 ADCC 이펙터 기능(들)을 수행한다. ADCC를 매개하는 인간 백혈구의 예는 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC), 자연 킬러 (NK) 세포, 단핵구, 대식세포, 세포독성 T 세포 및 호중구를 포함한다. 이펙터 세포는 천연 공급원, 예를 들어 혈액으로부터 단리될 수 있다.
"항체-의존성 세포-매개 세포독성" 또는 "ADCC"는 특정 세포독성 세포 (예를 들어 NK 세포, 호중구 및 대식세포) 상에 존재하는 Fc 수용체 (FcR) 상에 결합된 분비된 Ig가, 이들 세포독성 이펙터 세포가 항원-보유 표적 세포에 특이적으로 결합한 후 세포독소로 표적 세포를 사멸시킬 수 있도록 하는 세포독성의 형태를 지칭한다. ADCC를 매개하기 위한 일차 세포인 NK 세포는 FcyRIII만을 발현하는 반면, 단핵구는 FcyRI, FcyRII, 및 FcyRIII을 발현한다. 조혈 세포 상에서의 FcR 발현은 문헌 [Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991)]의 464페이지의 표 3에 요약되어 있다. 관심 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위해, 미국 특허 번호 5,500,362 또는 5,821,337 또는 미국 특허 번호 6,737,056 (Presta)에 기재된 바와 같은 시험관내 ADCC 검정을 수행할 수 있다. 이러한 검정에 유용한 이펙터 세포는 PBMC 및 NK 세포를 포함한다. 대안적으로 또는 추가적으로, 관심 분자의 ADCC 활성은 생체 내에서, 예를 들어 문헌 [Clynes et al. Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 95:652-656 (1998)]에 개시된 바와 같이 동물 모델에서 평가될 수 있다. 변경된 Fc 영역 아미노산 서열을 갖는 추가의 항체 및 증가 또는 감소된 ADCC 활성은, 예를 들어, 미국 특허 번호 7,923,538 및 미국 특허 번호 7,994,290에 기재되어 있다.
"증진된 ADCC 활성"을 갖는 항체는 모 항체와 비교하여 시험관내 또는 생체내에서 ADCC를 매개하는데 더 효과적인 항체를 지칭하고, 여기서 항체 및 모 항체는 적어도 1개의 구조적 측면에서 상이하고, 검정에 사용되는 이러한 항체 및 모 항체의 양은 본질적으로 동일하다. 일부 실시양태에서, 항체 및 모 항체는 동일한 아미노산 서열을 갖지만, 항체는 비-푸코실화된 것이고 모 항체는 푸코실화된 것이다. 일부 실시양태에서, ADCC 활성은 본원에 개시된 바와 같은 시험관내 ADCC 검정을 사용하여 결정될 것이지만, 예를 들어 동물 모델 등에서의, ADCC 활성을 결정하기 위한 다른 검정 또는 방법이 고려된다. 일부 실시양태에서, 증진된 ADCC 활성을 갖는 항체는 Fc 감마 RIIIA에 대해 증진된 친화도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 증진된 ADCC 활성을 갖는 항체는 Fc 감마 RIIIA (V158)에 대해 증진된 친화도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 증진된 ADCC 활성을 갖는 항체는 Fc 감마 RIIIA (F158)에 대해 증진된 친화도를 갖는다.
"변경된" FcR 결합 친화도 또는 ADCC 활성을 갖는 항체는 모 항체와 비교하여 증진되거나 감소된 FcR 결합 활성 및/또는 ADCC 활성을 갖는 것이고, 여기서 항체 및 모 항체는 적어도 1개의 구조적 측면에서 상이하다. FcR에 대해 "증가된 결합을 나타내는" 항체는 모 항체보다 더 나은 친화도로 적어도 1개의 FcR에 결합한다. FcR에 대해 "감소된 결합을 나타내는" 항체는 모 항체보다 더 낮은 친화도로 적어도 1개의 FcR에 결합한다. FcR에 대해 감소된 결합을 나타내는 이러한 항체는 FcR에 대해 인지가능한 결합을 거의 또는 전혀 보유하지 않을 수 있고, 예를 들어 천연 서열 IgG Fc 영역과 비교하여 FcR에 대해 0-20 퍼센트 결합을 보유할 수 있다.
"Fc 감마 RIIIA에 대한 증진된 친화도"는 모 항체보다 Fc 감마 RIIIA (또한, 일부 경우에, CD 16a로도 지칭됨)에 대해 더 큰 친화도를 갖는 항체를 지칭하고, 여기서 항체 및 모 항체는 적어도 1개의 구조적 측면에서 상이하다. 일부 실시양태에서, 항체 및 모 항체는 동일한 아미노산 서열을 갖지만, 항체는 비-푸코실화된 것이고 모 항체는 푸코실화된 것이다. Fc 감마 RIIIA에 대한 친화도를 결정하는 임의의 적합한 방법이 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, Fc 감마 RIIIA에 대한 친화도는 본원에 기재된 방법에 의해 결정된다. 일부 실시양태에서, Fc 감마 RIIIA에 대해 증진된 친화도를 갖는 항체는 증진된 ADCC 활성을 갖는다. 일부 실시양태에서, Fc 감마 RIIIA에 대해 증진된 친화도를 갖는 항체는 Fc 감마 RIIIA(V158)에 대해 증진된 친화도를 갖는다. 일부 실시양태에서, Fc 감마 RIIIA에 대해 증진된 친화도를 갖는 항체는 Fc 감마 RIIIA(F158)에 대해 증진된 친화도를 갖는다.
6-데옥시-L-갈락토스로도 지칭되는 L-푸코스는 동물에서 일부 N- 및 O-연결된 글리칸 및 당지질의 성분인 모노사카라이드이다. 문헌 [Becker and Lowe, Glycobiology 13:41R-51R (2003)]을 참조한다. 푸코스는 전형적으로 혈액형 항원, 셀렉틴 및 항체에 부착된 글리칸을 비롯한, 글리칸에 대한 말단 변형으로서 부가된다. 푸코스는 특정 푸코실트랜스퍼라제에 의해 α(1,2)-, α(1,3)-, α(1,4)- 및 α(1,6)-연결을 통해 글리칸에 부착될 수 있다. α(1,2)-푸코스 연결은 전형적으로 H-혈액형 항원과 연관된다. α(1,3)- 및 α(1,4)-푸코스 연결은 루이스X 항원의 변형과 연관된다. α(1,6)-푸코스 연결은 항체 상의 것과 같은 N-연결된 GlcNAc 분자와 연관된다.
본 발명의 탄수화물 모이어티는 올리고사카라이드의 기재의 경우에 통상적으로 사용되는 명명법을 참조하여 기재될 것이다. 이러한 명명법을 사용한 탄수화물 화학의 검토는 문헌 [Hubbard and Ivatt (1981) Ann. Rev. Biochem. 50:555-583]에서 확인된다. 이러한 명명법은, 예를 들어, 만노스를 나타내는 Man, 2-N-아세틸글루코사민을 나타내는 GIcNAc; 갈락토스를 나타내는 Gal; 푸코스에 대한 Fuc; 및 포도당을 나타내는 Glc를 포함한다. 시알산은 5-N-아세틸뉴라민산에 대해 NeuNAc, 및 5-글리콜릴뉴라민산에 대해 NeuNGc의 약칭 표기법으로 기재된다 (IUB-IUPAC Joint Commission on Biochemical Nomenclature, 1982, J. Biol. Chem. 257: 3347-3351; (1982) J. Biol. Chem. 257: 3352).
본 발명의 탄수화물 구조는 단백질 상에서 발생하며, N-연결된 올리고사카라이드로 표현된다. "N-연결된 글리코실화"는 탄수화물 모이어티가 GlcNAc를 통해 폴리펩티드 쇄 내의 아스파라긴 잔기에 부착된 것을 지칭한다. N-연결된 탄수화물은 모두 공통의 Man 1-6(Man1-3)Manβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAcβ-R 코어 구조를 함유한다. 따라서, 기재된 코어 구조에서, R은 생산된 당단백질의 아스파라긴 잔기를 나타낸다. 생산된 단백질의 서열은 아스파라긴-X-세린, 아스파라긴-X-트레오닌, 및 아스파라긴-X-시스테인을 함유할 것이고, 여기서 X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산이다 (Asn-Xaa-Ser/Thr). 이와 대조적으로, "O-연결된" 탄수화물은 GalNAc가 트레오닌 또는 세린의 히드록실 기에 부착되어 있지만 컨센서스 서열은 요구되지 않는 공통의 코어 구조를 특징으로 한다. N-연결된 탄수화물에서 가장 중요한 것은 "복잡한" N-연결된 탄수화물, 예컨대 본원에 기재된 "이중-안테나" 구조이다.
관련 기술분야의 통상의 기술자는 당단백질 이뮤노글로불린 G (IgG)가, 통상적으로 각각 G0, G1 및 G2로 공지되어 있는, 0, 1 또는 2개의 갈락토스 잔기를 함유하는 3가지 유형의 복잡한 이중안테나 구조와 연관된다는 것을 인식할 것이다 (Wormland et al., 1997, Biochemistry 36:1370-1380). IgG 부류의 인간 항체 분자와 관련하여, 각각은 Fc 영역의 CH2 도메인 내부 면의 β-4 벤드의 Asn 297의 아미드 측쇄에 부착된 N-연결된 올리고사카라이드를 갖는다 (Beale and Feinstein, 1976, Q. Rev. Biophys. 9:253-259; Jefferis et al., 1995, Immunol. Letts. 44:111-117). IgG CH2 도메인의 Asn 297에 부착된 올리고사카라이드 모이어티는 확인된 헥사사카라이드 코어 구조 및 가변 외부 당 잔기를 갖는 복잡한 이중안테나 유형이다 (문헌 [Jefferis et al., 1997, 상기 문헌; Wyss and Wagner, 1996, Current Opinions in Biotech. 7:409-416] 참조). 코어 구조 (GIcNAc2Man3GIcNAc)는 전형적인 이중안테나 올리고사카라이드이고, 이는 도 1에 개략적으로 제시된다.
각각의 코어 구조가 이등분된 N-아세틸글루코사민, 코어 푸코스, 및 갈락토스 또는 시알산 외부 사카라이드 중 어느 하나를 가질 수 있으므로, Asn 297 부위를 점유할 수 있는 구조적으로 독특한 올리고사카라이드는 총 36가지가 존재한다 (Jefferis and Lund, 상기 문헌). 또한, 상이한 올리고사카라이드 쇄가 2개의 쇄 Fc 도메인 내의 어느 하나의 Asn 297 잔기에 부착되므로 특정한 CH2 도메인 내에서 Asn 297에서의 글리코실화는 비대칭일 수 있다는 것이 인식될 것이다. 예를 들어, 단일 항체-분비 세포에서 합성된 중쇄는 그의 아미노산 서열이 균일할 수 있지만, 이는 일반적으로 차등 글리코실화되어 수많은 구조적으로 독특한 Ig 당형태를 생성한다.
IgG의 CH2 도메인에서 발견되는, "당형태"로도 지칭되는 복잡한 올리고사카라이드 구조의 주요 유형은 국제 특허 공개 번호 WO99/22764, 7 페이지에 도시되어 있다.
본 발명에 따르면 G0은 말단 시알산 (NeuAc) 또는 Gal이 존재하지 않는 이중안테나 구조를 지칭하고, G1은 1개의 Gal을 가지며 NeuAc는 없는 이중안테나 구조를 지칭하고, G2는 2개의 말단 Gal을 가지며 NeuAc는 없는 이중안테나 구조를 지칭한다. 예를 들어, G0, G1, G-1 및 G2의 예시적인 구조를 도시한 도 2a-2g를 참조한다.
"비-푸코실화" 항체 또는 "푸코스가 결여된" 항체는 그의 불변 영역 글리코실화에서 푸코스가 결여된 IgG1 또는 IgG3 이소형 항체를 지칭한다. 인간 IgG1 또는 IgG3의 글리코실화는 Asn297에서 최대 2개의 Gal 잔기로 종결되는 코어 푸코실화 이중안테나 복잡한 올리고사카라이드 글리코실화로서 일어난다. 일부 실시양태에서, 비-푸코실화 항체는 Asn297에서 푸코스가 결여되어 있다. 이들 구조는 말단 Gal 잔기의 양에 따라 G0, G1 (1,6 또는 1,3) 또는 G2 글리칸 잔기로서 지정된다. 예를 들어, 문헌 [Raju, T. S., BioProcess Int. 1: 44-53 (2003)]을 참조한다. 항체 Fc의 CHO 유형 글리코실화는, 예를 들어, 문헌 [Routier, F. FL, Glycoconjugate J. 14: 201-207 (1997)]에 기재되어 있다. 다양한 항체 당형태가 도 2a-2g에 제시된다.
일부 실시양태에서, 본원에서 상호교환적으로 사용되는 "푸코실" 또는 "비-푸코실화"는 코어 푸코스가 결여되도록 당조작된 항체를 지칭한다. 글리칸 모이어티 내에 감소된 푸코스 함량을 갖는 항체는 FcγRIIIa (CD16)에 대해 증가된 친화도를 갖고, 그 결과, 증진된 활성-의존성 세포성 세포독성 (ADCC) 활성을 보유한다. 비-푸코실 항체는 푸코스 부가를 담당하는 유전자의 대립유전자 둘 다가 결여되어 있는 (α1,6-푸코실트랜스퍼라제) 포텔리젠트® CHOK1SV 세포주 (론자 바이올로직스(Lonza Biologics))를 사용하여 생산할 수 있다. 또한, 비-푸코실 또는 감소된 푸코스 항체는 다양한 방식으로 올리고사카라이드 생합성 활성을 변형시킴으로써 생성될 수 있다. 예를 들어, 생산 세포주의 골지체에서의 N-아세틸글루코사민-트랜스퍼라제 III (GnTIII)의 과다발현은, 항체의 Fc 불변 영역과 회합된 이등분된 올리고사카라이드 구조를 생성하고 푸코실화를 억제한다. 이러한 발현 시스템에서, GnTIII 발현 수준은 비-푸코실화 IgG1 당형태의 생성 및 생성된 증진된 ADCC 활성과 상관된다. 푸코실화는 또한 당 유사체, 예컨대 비제한적으로 WO2012/019165에 기재된 바와 같은 푸코스 유사체의 사용에 의해 세포 배양물에서 감소될 수 있다. 따라서, 비-푸코실화 또는 감소된 푸코스 항체는 관련 기술분야에 널리 공지된 매우 다양한 방법을 사용하여 생산될 수 있다.
일부 실시양태에서, 비-푸코실화 항체는 Fc 감마 RIIIA에 대해 증진된 친화도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 비-푸코실화 항체는 Fc 감마 RIIIA(V158)에 대해 증진된 친화도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 비-푸코실화 항체는 Fc 감마 RIIIA(F158)에 대해 증진된 친화도를 갖는다.
"당형태"는 다양한 탄수화물 단위의 연결을 포함하는 복잡한 올리고사카라이드 구조를 지칭한다. 이러한 구조는, 예를 들어, 문헌 [Essentials of Glycobiology Varki et al., eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1999)]에 기재되어 있으며, 문헌은 또한 표준 당생물학 명명법에 대한 개관을 제공한다. 이러한 당형태는 G2, G1, G0, G-1, 및 G-2를 포함하나 이에 제한되지는 않는다 (예를 들어, 국제 특허 공개 번호 WO 99/22764 참조).
"글리코실화 패턴"은 단백질 (예를 들어, 당형태)에, 뿐만 아니라 당형태 (들)가 단백질의 펩티드 백본에 공유 부착되는 부위(들)에, 보다 구체적으로는 이뮤노글로불린 단백질에 공유 부착된 탄수화물 단위의 패턴으로 정의된다.
일부 실시양태에서, 비-글리코변형된 CHO 숙주 세포에서 재조합적으로 발현된 항체의 배치의 적어도 85 퍼센트가 Asn297에서 푸코실화된다. 복수의 항체를 포함하는 조성물이 언급되는 경우에, 조성물 중의 항체의 약 5 퍼센트 미만이 적어도 1개의 Asn297에서 푸코스를 포함하는 경우에 항체는 비-푸코실화된 것으로 간주된다. 보다 더 바람직하게는, 비-푸코실화의 수준은 약 100%이고, 즉, 항체의 푸코실화를 측정하기 위한 표준 방법을 사용하여 어느 하나의 중쇄 Asn297 당형태 상에서도 푸코스가 검출되지 않는다. 푸코스를 측정하는 방법은 본원에 기재된 방법을 포함하여, 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법을 포함한다. 일부 실시양태에서, 푸코스는 복수의 비-푸코실화 항체를 포함하는 조성물에서 검출가능하지 않다. 일부 실시양태에서, 비-푸코실화 항체는 증진된 ADCC 활성을 갖는다.
"보체 의존성 세포독성" 또는 "CDC"는 보체의 존재 하에서의 표적 세포의 용해를 지칭한다. 전형적 보체 경로의 활성화는 그의 동족 항원에 결합되는 (적절한 하위부류의) 항체에의 보체 시스템의 제1 성분 (Clq)의 결합에 의해 개시된다. 보체 활성화를 평가하기 위하여, 예를 들어 문헌 [Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202: 163 (1996)]에 기재된 바와 같은 CDC 검정이 수행될 수 있다. 변경된 Fc 영역 아미노산 서열 및 증가 또는 감소된 Clq 결합 능력을 갖는 항체는, 예를 들어 미국 특허 번호 6,194,551 B l, 미국 특허 번호 7,923,538, 미국 특허 번호 7,994,290 및 WO 1999/51642에 기재되어 있다. 또한 예를 들어, 문헌 [Idusogie et al., J.]을 참조한다.
본원에 사용된 용어 "야생형 아미노산", "야생형 IgG", "야생형 항체" 또는 "야생형 mAb"는 특정 집단 (예를 들어, 인간, 마우스, 래트, 세포 등) 내에서 자연적으로 발생하는 아미노산 또는 핵산의 서열을 지칭한다.
관련 기술분야에서 또한 "CD185" 및 "버킷 림프종 수용체 1 (BLR1)"로도 지칭되는, 본원에서 상호교환가능하게 사용되는 "C-X-C 케모카인 수용체 유형 5" 또는 "CXCR5"는 특정 세포 상에서 발현된 G-단백질-커플링된 수용체이다. 용어 CXCR5는 CXCR5 상동체, 및 특히 인간, 시노몰구스 원숭이, 래트, 토끼 및 마우스를 비롯한 오르토로그를 포함한다. 본원에 사용된 "CXCR5"는 포유동물 CXCR5, 예컨대 인간, 래트 또는 마우스, 뿐만 아니라 비-인간 영장류, 소, 양 또는 돼지 CXCR5를 지칭한다. CXCR5의 비제한적인 예시적인 예는 인간 (예를 들어, 진뱅크 수탁 번호 P60568, 서열식별번호: 32 참조), 시노몰구스 원숭이 (예를 들어, 진뱅크 수탁 번호 Q29615, 서열식별번호: 33 참조), 및 마우스 (서열식별번호: 34) CXCR5를 포함한다. 용어 "CXCR5"는 또한 이러한 CXCR5 분자의 단편, 변이체, 이소형, 및 다른 상동체를 포괄한다. 변이체 CXCR5 분자는 일반적으로 자연 발생 CXCR5와 동일한 유형의 활성, 예컨대 CXCR5 수용체에 결합하는 능력, 수용체-매개 활성을 유도하는 능력, 및 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편에 결합하거나 그렇지 않은 능력을 갖는 것을 특징으로 할 것이다.
CXCR5는 CXCR5의 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 10개 이상, 12개 이상 또는 15개 이상의 표면 접근가능한 잔기를 포함할 수 있다. 도 6은 예시적인 표면 접근가능한 잔기가 밑줄표시된 야생형 마우스 및 인간 CXCR5의 아미노산 서열을 보여준다. CXCR5가 동종다량체 형태의 CXCR5를 포함하는 경우에, 표적은 CXCR5의 제1 서브유닛의 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 10개 이상, 12개 이상, 또는 15개 이상의 표면 접근가능한 잔기, 및 CXCR5의 제2 서브유닛의 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 10개 이상, 12개 이상, 또는 15개 이상의 표면 접근가능한 잔기를 포함할 수 있다. 표적 분자는 CXCR5로부터의 공지된 에피토프를 포함할 수 있다.
앞서 언급된 바와 같이, 단백질의 다양한 예시적인 세포외 영역 ("N," "L1," "L2," 및 "3"으로 라벨링됨)을 표시한 (밑줄표시된) 야생형 인간 CXCR5 (hCXCR5) 및 마우스 CXCR5 (mCXCR5)의 정렬된 아미노산 서열이 도 5에 제시된다.
본원의 다른 곳에 요약된 바와 같이, 항체 분자의 특정 위치는 변경될 수 있다. 본원에 사용된 "위치"는 단백질의 서열 내의 자리를 의미한다. 위치는 순차적으로 또는 확립된 포맷에 따라 넘버링될 수 있고, 예를 들어 EU 인덱스 및 카바트 인덱스를 사용하여 항체의 아미노산 잔기를 넘버링할 수 있다. 예를 들어, 위치 297은 인간 항체 IgG1 내의 위치이다. 상응하는 위치는 일반적으로 다른 모 서열과의 정렬을 통해 상기 요약된 바와 같이 결정된다.
본원에 사용된 "잔기"는 단백질 내의 위치 및 그의 연관 아미노산 실체를 의미한다. 예를 들어, 아스파라긴 297 (또한 Asn297로도 지칭됨, 또한 N297로도 지칭됨)은 인간 항체 IgG1 내의 잔기이다.
본원에서 상호교환가능하게 사용되는 용어 "Tfh 세포" 또는 "Tfh" 또는 "진정한 Tfh" 또는 "배 중심 Tfh 세포" 또는 "GC Tfh 세포"는 GC Tfh 세포, GC B 세포, 여포성 수지상 세포 (FDC), 대식세포, 및 기질로 이루어진 구조인 배 중심 (GC) 내에서 발견되는 여포성 헬퍼 T 세포를 지칭한다. 문헌 [Crotty, 2014, Immunity 41(4):529-542]을 참조한다. Tfh 세포는 B 세포 여포 귀소 수용체 CXCR5의 구성적 발현에 의해 확인된다. 기능상, Tfh 세포는 B 세포에게 지시 신호를 제공하여 종자 배 중심에게 이소형 전환, 체성 과다돌연변이, 및 신속한 세포 분열을 가이드하게 한다.
본원에서 상호교환가능하게 사용되는 용어 "Tfh-유사 세포", "순환 Tfh 세포" 및 "cTfh"는 배 중심을 빠져나온 Tfh 세포를 지칭한다. GC를 빠져나가면, 세포는 덜 활성화되고 덜 분극화된 표현형을 획득하고, 이는 "순환 여포성 헬퍼 T 세포" (cTfh) 또는 "Tfh-유사 세포"로 지칭된다. 문헌 [Crotty, 2014, Immunity 41(4):529-542]을 참조한다. 이들 세포는 CXCR5를 발현한다. 배 중심 Tfh 세포 (즉, "진정한 Tfh 세포" 또는 "GC Tfh 세포" 또는 "Tfh")와 대조적으로, cTfh 세포 (즉, Tfh-유사 세포)는 감소된 수준의 ICOS, Bcl-6, 및 세포 활성화 마커, 예를 들어 CD69 및 HLA-DR을 발현하지만, 동족 항원에 의한 재활성화시 시험관내 B 세포에서 Ab 생산 및 Ig 부류 전환을 자극하는 능력은 유지한다.
관련 기술분야에 공지된 바와 같이, 본원에서 상호교환가능하게 사용되는 "폴리뉴클레오티드" 또는 "핵산"은 임의의 길이의 뉴클레오티드 쇄를 지칭하며, DNA 및 RNA를 포함한다. 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드, 변형된 뉴클레오티드 또는 염기, 및/또는 그의 유사체, 또는 DNA 또는 RNA 폴리머라제에 의해 쇄 내로 혼입될 수 있는 임의의 기질일 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드, 예컨대 메틸화 뉴클레오티드 및 그의 유사체를 포함할 수 있다. 뉴클레오티드 구조에 대한 변형이 존재하는 경우에, 이는 쇄의 어셈블리 전에 또는 후에 부여될 수 있다. 뉴클레오티드의 서열에 비-뉴클레오티드 성분이 개재될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는, 예컨대 표지 성분과의 접합에 의해, 중합 후에 추가로 변형될 수 있다. 다른 유형의 변형은 예를 들어 자연 발생 뉴클레오티드 중 1개 이상의 유사체로의 "캡" 치환, 뉴클레오티드간 변형, 예컨대 예를 들어 비하전된 연결 (예를 들어, 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포아미데이트, 카르바메이트 등) 및 하전된 연결 (예를 들어, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)을 갖는 것, 펜던트 모이어티, 예컨대 예를 들어 단백질 (예를 들어, 뉴클레아제, 독소, 항체, 신호 펩티드, 폴리-L-리신 등)을 함유하는 것, 삽입제 (예를 들어, 아크리딘, 프소랄렌 등)를 갖는 것, 킬레이트화제 (예를 들어, 금속, 방사성 금속, 붕소, 산화 금속 등)를 함유하는 것, 알킬화제를 함유하는 것, 변형된 연결 (예를 들어, 알파 아노머 핵산 등)을 갖는 것 뿐만 아니라, 폴리뉴클레오티드(들)의 비변형된 형태를 포함한다. 추가로, 당에 원래 존재하는 임의의 히드록실 기는, 예를 들어 포스포네이트 기, 포스페이트 기에 의해 대체되거나, 표준 보호기에 의해 보호되거나, 또는 추가의 뉴클레오티드에 대한 추가의 연결을 제조하기 위해 활성화될 수 있거나, 또는 고체 지지체에 접합될 수 있다. 5' 및 3' 말단 OH가 인산화되거나, 또는 아민 또는 1 내지 20개의 탄소 원자의 유기 캡핑 기 모이어티로 치환될 수 있다. 다른 히드록실이 또한 표준 보호기로 유도체화될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 또한, 예를 들어 2'-O-메틸-, 2'-O-알릴, 2'-플루오로- 또는 2'-아지도-리보스, 카르보시클릭 당 유사체, 알파- 또는 베타-아노머 당, 에피머 당, 예컨대 아라비노스, 크실로스 또는 릭소스, 피라노스 당, 푸라노스 당, 세도헵툴로스, 비-시클릭 유사체 및 무염기성 뉴클레오시드 유사체, 예컨대 메틸 리보시드를 비롯하여, 일반적으로 관련 기술분야에 공지된 유사한 형태의 리보스 또는 데옥시리보스 당을 함유할 수 있다. 1개 이상의 포스포디에스테르 연결이 대안적인 연결 기에 의해 대체될 수 있다. 이러한 대안적인 연결 기는 포스페이트가 P(O)S ("티오에이트"), P(S)S ("디티오에이트"), (O)NR2 ("아미데이트"), P(O)R, P(O)OR', CO 또는 CH2 ("포름아세탈")로 대체된 실시양태를 포함하나 이에 제한되지는 않으며, 여기서 각각의 R 또는 R'는 독립적으로 H 또는 임의로 에테르 (-O-) 연결을 함유하는 치환되거나 비치환된 알킬 (1-20 C), 아릴, 알케닐, 시클로알킬, 시클로알케닐 또는 아랄딜이다. 폴리뉴클레오티드 내의 모든 연결이 동일할 필요는 없다. 상기 기재는 RNA 및 DNA를 비롯하여 본원에서 지칭되는 모든 폴리뉴클레오티드에 적용된다.
본원에 사용된 "벡터"는 숙주 세포 내에 1개 이상의 관심 유전자(들) 또는 서열(들)을 전달할 수 있는, 바람직하게는 이를 발현시킬 수 있는 구축물을 의미한다. 벡터의 예는 바이러스 벡터, 네이키드 DNA 또는 RNA 발현 벡터, 플라스미드, 코스미드 또는 파지 벡터, 양이온성 축합제와 회합된 DNA 또는 RNA 발현 벡터, 리포솜 내에 캡슐화된 DNA 또는 RNA 발현 벡터, 및 특정 진핵 세포, 예컨대 생산자 세포를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
"숙주 세포"는 폴리뉴클레오티드 삽입물의 혼입을 위한 벡터(들)의 수용자일 수 있거나 수용자였던 개별 세포 또는 세포 배양물을 포함한다. 숙주 세포는 단일 숙주 세포의 자손을 포함하고, 상기 자손은 자연적, 우연적 또는 고의의 계획적인 돌연변이로 인해 원래의 모 세포와 반드시 (형태학적으로 또는 게놈 DNA 상보성에서) 완전하게 동일할 필요는 없을 수 있다. 숙주 세포는 본 발명의 폴리뉴클레오티드에 의해 생체내 형질감염 및/또는 형질전환된 세포를 포함한다.
숙주 세포는 원핵 세포 또는 진핵 세포일 수 있다. 예시적인 진핵 세포는 포유동물 세포, 예컨대 영장류 또는 비-영장류 동물 세포; 진균 세포, 예컨대 효모; 식물 세포; 및 곤충 세포를 포함한다.
세포 배양, 및 단백질 또는 폴리펩티드의 발현에 감수성인 임의의 숙주 세포가 본 발명에 따라 이용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 숙주 세포는 포유동물이다. 발현을 위한 숙주로서 입수가능한 포유동물 세포주는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection) (ATCC)으로부터 입수가능한 다수의 불멸화된 세포주를 포함한다. 비제한적인 예시적인 포유동물 세포는 NS0 세포, HEK 293 및 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포, 및 그의 유도체, 예컨대 293-6E 및 CHO DG44 세포, CHO DXB11, 및 포텔리젠트® CHOK1SV 세포 (바이오와(BioWa)/론자, 뉴저지주 앨런데일)를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 포유동물 숙주 세포는 또한 인간 자궁경부 암종 세포 (HeLa, ATCC CCL 2), 새끼 햄스터 신장 (BHK, ATCC CCL 10) 세포, 원숭이 신장 세포 (COS), 및 인간 간세포성 암종 세포 (예를 들어, Hep G2)를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 본 발명에 따라 사용될 수 있는 포유동물 세포의 다른 비제한적 예는 인간 망막모세포 (PER.C6®; 크루셀(CruCell), 네덜란드 라이덴); SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주 (COS-7, ATCC CRL 1651); 인간 배아 신장 세포주 293 (HEK 293) 또는 현탁 배양물 중 성장을 위해 서브클로닝된 293 세포 (Graham et al., 1977, J. Gen Virol. 36:59); 마우스 세르톨리 세포 (TM4, Mather, 1980, Biol. Reprod. 23:243-251); 원숭이 신장 세포 (CV1 ATCC CCL 70); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포 (VERO-76, ATCC CRL-1 587); 개 신장 세포 (MDCK, ATCC CCL 34); 버팔로 래트 간 세포 (BRL 3A, ATCC CRL 1442); 인간 폐 세포 (W138, ATCC CCL 75); 인간 간 세포 (Hep G2, HB 8065); 마우스 유방 종양 (MMT 060562, ATCC CCL51); TR1 세포 (Mather et al., 1982, Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68); MRC 5 세포; FS4 세포; 인간 간세포암 세포주 (Hep G2); 및 BALB/c 마우스 골수종 세포주 (NS0/1, ECACC 번호 85110503), NS0 세포 및 Sp2/0 세포를 포함하나 이에 제한되지는 않는 수많은 골수종 세포주를 포함한다.
추가적으로, 폴리펩티드 또는 단백질을 발현하는 임의의 수의 상업적으로 및 비상업적으로 입수가능한 세포주가 본 발명에 따라 이용될 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 상이한 세포주가 상이한 영양 요건을 가질 수 있고/거나 최적 성장 및 폴리펩티드 또는 단백질 발현을 위해 상이한 배양 조건을 필요로 할 수 있다는 것을 인지할 것이며, 필요에 따라 조건들을 변형시킬 수 있을 것이다.
본 발명은 곤충 세포계, 효모 발현 시스템, 또는 포유동물 세포계, 예컨대 비제한적으로 CHO 세포에서의 관심 단백질의 생산, 예컨대 발현을 위한 관련 기술분야에 공지되어 있거나 본원에 개시된 임의의 진핵 발현 시스템을 포함한다.
본원에 사용된 "발현 제어 서열"은 핵산의 전사를 지시하는 핵산 서열을 의미한다. 발현 제어 서열은 프로모터, 예컨대 구성적 또는 유도성 프로모터, 또는 인핸서일 수 있다. 발현 제어 서열은 전사될 핵산 서열에 작동가능하게 연결된다.
본원에 사용된 "치료"는 유익하거나 목적하는 임상 결과를 수득하기 위한 접근법이다. 본 발명의 목적상, 유익하거나 목적하는 임상 결과는 다음 중 한 가지 이상을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다: 생존율 개선 (사망률 감소), 질환에 대한 염증 반응의 감소, 조직 섬유증의 양의 감소, 질환 병변의 외관 상의 개선, 국소 부위에 대한 병리학적 병변의 제한, 질환으로부터의 손상 정도의 감소, 질환의 지속기간 감소, 및/또는 질환과 관련된 증상의 수, 정도 또는 지속기간 감소. 용어는 본 발명의 화합물 또는 작용제를 투여하여 질환의 증상, 합병증, 또는 생화학적 징후의 개시를 방지 또는 지연시키거나, 증상을 완화시키거나, 또는 질환, 상태, 또는 장애의 추가적인 발달을 저지 또는 억제하는 것을 포함한다. 치료는 예방적 (질환의 개시를 방지 또는 지연시키거나, 또는 그의 임상적 또는 준임상적 증상의 징후를 방지하기 위함)이거나, 또는 질환의 징후 이후에 증상의 치료적 억제 또는 완화일 수 있다.
"완화시키는 것"은 CXCR5 항체를 투여하지 않은 것과 비교하여 1종 이상의 증상을 약화시키는 것 또는 개선을 의미한다. "완화시키는 것"은 또한 증상의 지속기간을 단축시키는 것 또는 감소를 포함한다.
본원에 사용된 약물, 화합물 또는 제약 조성물의 "유효 투여량" 또는 "유효량"은 어느 1종 이상의 유익하거나 목적하는 결과에 영향을 미치기에 충분한 양이다. 보다 구체적 측면에서, 유효량은 질환 또는 감염의 증상을 방지, 경감 또는 완화시켜 주고/거나 치료하고자 하는 대상체의 생존을 연장시킨다. 예방적 사용의 경우에, 유익하거나 목적하는 결과는 위험의 제거 또는 감소, 중증도의 감소, 또는 질환의 생화학적, 조직학적 및/또는 거동적 증상, 질환의 발달 동안 나타나는 그의 합병증 및 중간 병리학적 표현형을 비롯한 질환의 개시의 지연을 포함한다. 치료적 사용의 경우에, 유익하거나 목적하는 결과는 CXCR5 매개된 질환, 장애 또는 상태의 1종 이상의 증상의 감소, 질환을 치료하는데 요구되는 다른 의약의 용량의 감소, 또 다른 의약의 효과의 증진, 및/또는 환자의 질환 진행의 지연과 같은 임상 결과를 포함한다. 유효 투여량은 1회 이상의 투여로 투여될 수 있다. 본 발명의 목적상, 약물, 화합물 또는 제약 조성물의 유효 투여량은 예방적 또는 치유적 치료를 직접적으로 또는 간접적으로 달성하기에 충분한 양이다. 임상적 문맥에서 이해되는 바와 같이, 약물, 화합물 또는 제약 조성물의 유효 투여량은 또 다른 약물, 화합물 또는 제약 조성물과 함께 달성될 수 있거나 또는 달성되지 않을 수 있다. 따라서, "유효 투여량"은 1종 이상의 치료제의 투여와 관련하여 고려될 수 있고, 단일 작용제는 1종 이상의 다른 작용제와 함께 바람직한 결과가 달성될 수 있거나 달성되는 경우에 유효량으로 주어진 것으로 간주될 수 있다.
"개체" 또는 "대상체"는 포유동물, 보다 바람직하게는 인간이다. 포유동물은 또한, 가축 (예를 들어, 소, 돼지, 말, 닭 등), 스포츠 동물, 애완동물, 영장류, 말, 개, 고양이, 마우스 및 래트를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 개체는 CXCR5의 그의 수용체에 대한 결합 및 그에 의해 매개되는 신호전달에 의해 매개되거나 또는 그와 연관된 질환, 장애 또는 상태에 걸릴 위험이 있는 것으로 간주된다. 특정 실시양태에서, 대상체는 자가면역 질환, 장애 또는 상태, 예컨대 제1형 당뇨병을 갖는다. 특정 실시양태에서, 대상체는 면역억제 요법을 필요로 한다.
본원에 사용된 "제약상 허용되는 담체" 또는 "제약상 허용되는 부형제"는 활성 성분과 조합되는 경우에 상기 성분이 생물학적 활성을 보유하게 하고 대상체의 면역계와 비-반응성인 임의의 물질을 포함한다. 예는 임의의 표준 제약 담체, 예컨대 포스페이트 완충 염수 용액, 물, 에멀젼, 예컨대 오일/물 에멀젼, 및 다양한 유형의 습윤제를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 에어로졸 또는 비경구 투여에 바람직한 희석제는 포스페이트 완충 염수 (PBS) 또는 통상의 (0.9%) 염수이다. 이러한 담체를 포함하는 조성물은 널리 공지된 통상적인 방법에 의해 제제화된다 (예를 들어, 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, A. Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990; 및 Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. Mack Publishing, 2000] 참조).
예시적인 방법 및 물질이 본원에 기재되어 있지만, 본원에 기재된 것과 유사하거나 동등한 방법 및 물질도 또한 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있다. 물질, 방법 및 예는 단지 예시적이며, 제한적인 것으로 의도되지 않는다.
II. 항-CXCR5 항체
본 발명은 CXCR5에 결합하는 항체에 관한 것이다. 바람직하게는, 항체는 CXCR5에 특이적으로 결합하며, 즉 이는 CXCR5에 결합하지만, 다른 분자에는 검출가능하게 결합하지 않거나 보다 낮은 친화도로 결합한다. 본 발명은 추가로 변경된 이펙터 기능을 나타내는 항-CXCR5 항체에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 변경된 이펙터 기능은 증가된 ADCC이다. 일부 실시양태에서, 항체는 푸코스가 결여되어 있거나, 또는 검출가능하게 감소된 수준의 푸코스를 함유한다 (즉, 비-푸코실화됨). 본 발명은 또한 이러한 항체를 포함하는 조성물, 뿐만 아니라 치료 및 제약 용도를 비롯한 이러한 항체의 용도에 관한 것이다.
한 실시양태에서, 개시내용은 하기 항체: 11G2, 41A10, 및 5H7 중 임의의 것으로부터 유래된 경쇄 서열 또는 그의 단편 및 중쇄 또는 그의 단편을 갖는 하기 항체 중 임의의 것, 또는 그러한 항체를 포함하는 조성물 (제약 조성물 포함)을 제공한다.
본 발명에 유용한 항체는 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 항체 단편 (예를 들어, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, Fc 등), 키메라 항체, 이중특이적 항체, 이종접합체 항체, 단일 쇄 (ScFv), 그의 돌연변이체, 항체 단편을 포함하는 융합 단백질 (예를 들어, 도메인 항체), 인간화 항체, 및 항체의 글리코실화 변이체, 항체의 아미노산 서열 변이체, 및 공유 변형된 항체를 비롯한 필요한 특이성의 항원 인식 부위를 포함하는 임의의 다른 변형된 형상의 이뮤노글로불린 분자를 포괄할 수 있다. 항체는 뮤린, 래트, 인간, 또는 임의의 다른 기원일 수 있다 (키메라 또는 인간화 항체 포함). 일부 실시양태에서, CXCR5 항체는 모노클로날 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체는 인간 또는 인간화 항체이다.
본 발명의 CXCR5 항체는 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 인간 및 마우스 항체의 생산을 위한 일반적 기술은 관련 기술분야에 공지되어 있고/거나 본원에 기재되어 있다.
초기 확인에 이어, 후보 CXCR5 항체의 활성은 표적화된 생물학적 활성을 시험하는 것으로 공지된 생물검정에 의해 추가로 확인되고 정밀화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 시험관내 세포 검정을 사용하여 후보 CXCR5 항체를 추가로 특징화한다. 예를 들어, 생물검정을 사용하여 후보를 직접적으로 스크리닝할 수 있다. CXCR5 항체를 확인하고 특징화하는 방법의 일부가 실시예에 상세하게 기재되어 있다.
일부 측면에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 마우스 11G2 VH, 마우스 11G2 VL, h11G2 VH (XC155), h11G2 VH (XC156), h11G2 VH (XC157), h11G2 VH (XC350), h11G2 VH (XC351), h11G2 VH (XC352), h11G2 VH (XC353), h11G2 VH (XC354), h11G2 VL (XC151), h11G2 VL (XC153), h11G2 VL (XC154), h11G2 VL (XC346), h11G2 VL (XC347), h11G2 VL (XC348), h11G2 VL (XC349), 마우스 41A10 VH, 마우스 41A10 VL, h41A10 VH (XC147), h41A10 VH (XC148), h41A10 VH (XC150), h41A10 VL (XC142), h41A10 VL (XC143), h41A10 VL (XC144), h41A10 VL (XC145), h41A10 VL (XC146), h41A10 VL (XC149), 마우스 5H7 VH, 및 마우스 5H7 VL의 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 측면에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 CXCR5에의 결합에 대해 상기 항체 중 임의의 것과 경쟁한다.
일부 측면에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 하기 조합을 포함하는 VH 아미노산 서열 및 VL 아미노산 서열을 포함한다: 인간 CXCR5에의 결합에 대해 마우스 11G2, 키메라 11G2, h11G2 VH (XC152)/ VL (XC151), h11G2 VH (XC152)/ VL (XC153), h11G2 VH (XC152)/ VL (XC154), h11G2 VH (XC152)/ VL (XC346), h11G2 VH (XC152)/ VL (XC347), h11G2 VH (XC152)/ VL (XC348), h11G2 VH (XC152)/ VL (XC349), h11G2 VH (XC155)/ VL (XC151), h11G2 VH (XC155)/ VL (XC153), h11G2 VH (XC155)/ VL (XC154), h11G2 VH (XC155)/ VL (XC346), h11G2 VH (XC155)/ VL (XC347), h11G2 VH (XC155)/ VL (XC3484), h11G2 VH (XC155)/ VL (XC349), h11G2 VH (XC156)/ VL (XC151), h11G2 VH (XC156)/ VL (XC153), h11G2 VH (XC156)/ VL (XC154), h11G2 VH (XC156)/ VL (XC346), h11G2 VH (XC156)/ VL (XC347), h11G2 VH (XC156)/ VL (XC348), h11G2 VH (XC156)/ VL (XC349), h11G2 VH (XC157)/ VL (XC151), h11G2 VH (XC157)/ VL (XC153), h11G2 VH (XC157)/ VL (XC154), h11G2 VH (XC157)/ VL (XC346), h11G2 VH (XC157)/ VL (XC347), h11G2 VH (XC157)/ VL (XC348), h11G2 VH (XC157)/ VL (XC349), h11G2 VH (XC350)/ VL (XC151), h11G2 VH (XC350)/ VL (XC153), h11G2 VH (XC350)/ VL (XC154), h11G2 VH (XC350)/ VL (XC346), h11G2 VH (XC350)/ VL (XC347), h11G2 VH (XC350)/ VL (XC348), h11G2 VH (XC350)/ VL (XC349), h11G2 VH (XC351)/ VL (XC151), h11G2 VH (XC351)/ VL (XC153), h11G2 VH (XC351)/ VL (XC154), h11G2 VH (XC351)/ VL (XC346), h11G2 VH (XC351)/ VL (XC347), h11G2 VH (XC351)/ VL (XC348), 및 h11G2 VH (XC351)/ VL (XC349), h11G2 VH (XC352)/ VL (XC151), h11G2 VH (XC352)/ VL (XC153), h11G2 VH (XC352)/ VL (XC154), h11G2 VH (XC352)/ VL (XC346), h11G2 VH (XC352)/ VL (XC347), h11G2 VH (XC352)/ VL (XC348), h11G2 VH (XC352)/ VL (XC349), h11G2 VH (XC353)/ VL (XC151), h11G2 VH (XC353)/ VL (XC153), h11G2 VH (XC353)/ VL (XC154), h11G2 VH (XC353)/ VL (XC346), h11G2 VH (XC353)/ VL (XC347), h11G2 VH (XC353)/ VL (XC348), h11G2 VH (XC353)/ VL (XC349), h11G2 VH (XC354)/ VL (XC151), h11G2 VH (XC354)/ VL (XC153), h11G2 VH (XC354)/ VL (XC154), h11G2 VH (XC354)/ VL (XC346), h11G2 VH (XC354)/ VL (XC347), h11G2 VH (XC354)/ VL (XC348), h11G2 VH (XC354)/ VL (XC349), 마우스 41A10, 키메라 41A10, h41A10 VH (XC147)/ VL (XC142), h41A10 VH (XC147)/ VL (XC143), h41A10 VH (XC147)/ VL (XC144), h41A10 VH (XC147)/ VL (XC145), h41A10 VH (XC147)/ VL (XC146), h41A10 VH (XC147)/ VL (XC149), h41A10 VH (XC148)/ VL (XC142), h41A10 VH (XC148)/ VL (XC143), h41A10 VH (XC148)/ VL (XC144), h41A10 VH (XC148)/ VL (XC145), h41A10 VH (XC148)/ VL (XC146), h41A10 VH (XC148)/ VL (XC149), h41A10 VH (XC150)/ VL (XC142), h41A10 VH (XC150)/ VL (XC143), h41A10 VH (XC150)/ VL (XC144), h41A10 VH (XC150)/ VL (XC145), h41A10 VH (XC150)/ VL (XC146), h41A10 VH (XC150)/ VL (XC149), 마우스 5H7, 및 키메라 5H7 중 1종 이상과 경쟁하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
일부 측면에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 CXCR5에의 결합에 대해 상기 항체 중 임의의 것과 경쟁한다.
일부 측면에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열식별번호: 1, 5, 35, 47, 48, 49, 50, 및 51 중 적어도 1개의 아미노산 서열에 제시된 바와 같은 CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3을 포함한다.
일부 측면에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열식별번호: 6, 10, 12, 36, 52, 53, 54, 55, 56, 57 중 적어도 1개의 아미노산 서열에 제시된 바와 같은 CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3을 추가로 포함한다.
일부 측면에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열식별번호: 1의 아미노산 서열에 제시된 바와 같은 CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, 및 서열식별번호: 6의 아미노산 서열에 제시된 바와 같은 CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3을 포함한다.
일부 측면에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열식별번호: 1의 아미노산 서열에 제시된 바와 같은 CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, 및 서열식별번호: 10의 아미노산 서열에 제시된 바와 같은 CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3을 포함한다.
일부 측면에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열식별번호: 1의 아미노산 서열에 제시된 바와 같은 CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, 및 서열식별번호: 12의 아미노산 서열에 제시된 바와 같은 CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3을 포함한다.
일부 측면에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열식별번호: 1의 아미노산 서열에 제시된 바와 같은 CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, 및 서열식별번호: 52의 아미노산 서열에 제시된 바와 같은 CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3을 포함한다.
일부 측면에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열식별번호: 6의 아미노산 서열에 제시된 바와 같은 CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3, 및 서열식별번호: 1, 5, 35, 47, 48, 49, 50, 및 51 중 적어도 1개의 아미노산 서열에 제시된 바와 같은 CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3을 추가로 포함한다.
일부 측면에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열식별번호: 10의 아미노산 서열에 제시된 바와 같은 CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3, 및 서열식별번호: 1, 5, 35, 47, 48, 49, 50, 및 51 중 적어도 1개의 아미노산 서열에 제시된 바와 같은 CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3을 추가로 포함한다.
일부 측면에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열식별번호: 12의 아미노산 서열에 제시된 바와 같은 CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3, 및 서열식별번호: 1, 5, 35, 47, 48, 49, 50, 및 51 중 적어도 1개의 아미노산 서열에 제시된 바와 같은 CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3을 추가로 포함한다.
일부 측면에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열식별번호: 52의 아미노산 서열에 제시된 바와 같은 CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3, 및 서열식별번호: 1, 5, 35, 47, 48, 49, 50, 및 51 중 적어도 1개의 아미노산 서열에 제시된 바와 같은 CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3을 추가로 포함한다.
일부 측면에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열식별번호: 27의 아미노산 서열에 제시된 바와 같은 CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3, 및 서열식별번호: 26의 아미노산 서열에 제시된 바와 같은 CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3을 추가로 포함한다.
일부 측면에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 수탁 번호 PTA-124324로 ATCC에 기탁된 플라스미드의 삽입물에 의해 코딩된 아미노산 서열에 제시된 바와 같은 CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3을 포함한다.
일부 측면에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 수탁 번호 PTA-124323으로 ATCC에 기탁된 플라스미드의 삽입물에 의해 코딩된 아미노산 서열에 제시된 바와 같은 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3을 포함한다.
일부 측면에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 수탁 번호 PTA-124324로 ATCC에 기탁된 플라스미드의 삽입물에 의해 코딩된 CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3 아미노산 서열, 및 수탁 번호 PTA-124323으로 ATCC에 기탁된 플라스미드의 삽입물에 의해 코딩된 CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3 아미노산 서열을 포함한다.
일부 측면에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 CXCR5에의 결합에 대해 상기 항체 중 임의의 것과 경쟁한다.
일부 측면에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열식별번호: 2의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열식별번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 서열식별번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3, 서열식별번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열식별번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 서열식별번호: 9의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함한다.
일부 측면에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열식별번호: 2의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열식별번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 서열식별번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3, 서열식별번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열식별번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 서열식별번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함한다.
일부 측면에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열식별번호: 2의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열식별번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 서열식별번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3, 서열식별번호: 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열식별번호: 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 서열식별번호: 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함한다.
일부 측면에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열식별번호: 14의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열식별번호: 15의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 서열식별번호: 16의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3, 서열식별번호: 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열식별번호: 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 서열식별번호: 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함한다.
일부 측면에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열식별번호: 14의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열식별번호: 15의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 서열식별번호: 16의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3, 서열식별번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열식별번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 서열식별번호: 9의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함한다.
일부 측면에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열식별번호: 14의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열식별번호: 15의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 서열식별번호: 16의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3, 서열식별번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열식별번호: 9의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 서열식별번호: 10의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함한다.
일부 측면에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열식별번호: 6, 10, 12, 36, 52, 53, 54, 55, 56, 및 57의 서열 중 적어도 1개에 제시된 바와 같은 CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3 아미노산 서열을 포함한다.
일부 측면에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열식별번호: 1, 5, 35, 47, 48, 49, 50 및 51의 서열 중 적어도 1개에 제시된 바와 같은 CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3 아미노산 서열을 포함한다.
일부 측면에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열식별번호: 5에 제시된 바와 같은 CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3 아미노산 서열을 포함한다.
항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열식별번호: 6의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함할 수 있다. VH는 서열식별번호: 6의 아미노산 서열과 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다. VH는 서열식별번호: 6의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열식별번호: 10의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 VH를 포함할 수 있다. VH는 서열식별번호: 10의 아미노산 서열과 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다. VH는 서열식별번호: 10의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열식별번호: 12의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 VH를 포함할 수 있다. VH는 서열식별번호: 12의 아미노산 서열과 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다. VH는 서열식별번호: 12의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
항체 또는 항원-결합 단편은 서열식별번호: 1의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 VL을 포함할 수 있다. VL은 아미노산 서열 서열식별번호: 1과 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다. VL은 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
항체 또는 항원-결합 단편은 서열식별번호: 5의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 VL을 포함할 수 있다. VL은 서열식별번호: 5의 아미노산 서열과 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다. VL은 서열식별번호: 5의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
항체 또는 그의 항원-결합 단편은 아미노산 서열 서열식별번호: 17과 적어도 90% 동일한 VH를 포함할 수 있다. VH는 서열식별번호: 17의 아미노산 서열과 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다. VH는 서열식별번호: 17의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열식별번호: 18의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 VH를 포함할 수 있다. VH는 서열식별번호: 18의 아미노산 서열과 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다. VH는 서열식별번호: 18의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
항체 또는 항원-결합 단편은 서열식별번호: 13의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 VL을 포함할 수 있다. VL은 서열식별번호: 13의 아미노산 서열과 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다. VL은 서열식별번호: 13의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
항체 또는 항원-결합 단편은 서열식별번호: 58의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 VL을 포함할 수 있다. VL은 서열식별번호: 58의 아미노산 서열과 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다. VL은 서열식별번호: 58의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
한 측면에서, 비-푸코실화 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열식별번호: 10, 서열식별번호: 12, 서열식별번호: 36, 서열식별번호: 52, 서열식별번호: 53, 서열식별번호: 54, 서열식별번호: 55, 서열식별번호: 56, 또는 서열식별번호: 57의 아미노산 서열을 포함하는 VH로부터 선택된 VH를 포함하고, 추가로 IgG1 불변 도메인 (서열식별번호: 31)을 포함하는 중쇄를 포함할 수 있다. 한 측면에서, 상기 항체 변이체는 전장 중쇄에 대해 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개의 보존적 또는 비-보존적 치환 및/또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개의 부가 및/또는 결실을 포함한다. 추가 측면에서, 상기 변이체는 전장 중쇄와 적어도 65%, 적어도 75%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 공유하고, 여기서 상기 항체 또는 항원-결합 단편은 CXCR5에 특이적으로 결합한다.
개시내용의 비-푸코실화 항체는 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 5, 서열식별번호: 35, 서열식별번호: 47, 서열식별번호: 48, 서열식별번호: 49, 서열식별번호: 50, 또는 서열식별번호: 51의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 경쇄를 포함할 수 있으며, 여기서 항체는 추가로 경쇄 불변 도메인을 포함한다. 본원의 다른 곳에서 보다 충분히 제시된 바와 같이, 비-푸코실화 항체 경쇄 불변 도메인은 Cκ 또는 Cλ 불변 영역, 예를 들어 서열식별번호: 30의 Cκ 불변 영역으로부터 선택될 수 있다. 한 측면에서, 상기 항체 변이체는 전장 경쇄에 대해 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개의 보존적 또는 비-보존적 치환 및/또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개의 부가 및/또는 결실을 포함한다. 추가 측면에서, 상기 변이체는 전장 경쇄와 적어도 65%, 적어도 75%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 공유하고, 여기서 상기 항체 또는 항원-결합 단편은 CXCR5에 특이적으로 결합한다.
항체 또는 항원-결합 단편은 서열식별번호: 29의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 HC를 포함할 수 있다. HC는 서열식별번호: 29의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 항체는 비-푸코실화된다.
항체 또는 항원-결합 단편은 서열식별번호: 28과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 LC를 포함할 수 있다. LC는 서열식별번호: 28의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 항체는 비-푸코실화된다.
바람직하게는, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 비-푸코실화된다. 보다 더 바람직하게는, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 비-푸코실화되고, 푸코실화된 달리 동일한 항체와 비교하여 증가된 ADCC 이펙터 기능을 나타낸다.
배선 치환
특정 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 하기 중쇄 CDR 서열: (i) 서열식별번호: 7을 포함하는 CDR-H1, 서열식별번호: 8을 포함하는 CDR-H2, 및 서열식별번호: 9 또는 11을 포함하는 CDR-H3; 및/또는 (ii) 하기 경쇄 CDR 서열: 서열식별번호: 2를 포함하는 CDR-L1, 서열식별번호: 3을 포함하는 CDR-L2, 및 서열식별번호: 4를 포함하는 CDR-L3을 포함한다. 이들은 마우스 CDR이고, 바람직하게는 인간 VH 및 VL 도메인의 맥락으로 그라프팅되거나 달리 부가된다. 매우 다양한 수용자 인간 배선 서열이 이용가능하고, 비-인간 종 항체를 인간에서 사용하기 위해 "인간화"하는 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있을 것이고, 또한 본원의 다른 곳에서 논의될 것이다. 따라서, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 상기 마우스 CDR 서열이 인간 V 도메인 아미노산 서열의 맥락으로 위치할 수 있음을 인지할 것이다. 그렇게 함에 있어서, 일반적으로 항체 결합 및 원래의 모 (즉, 공여자) 항체의 다른 바람직한 특징을 보존하기 위해 수용자 인간 배선 서열에 대한 변화가 이루어진다. CDR 및 프레임워크 영역 (FW) 둘 다는 다음과 같이 조작될 수 있다.
특정 실시양태에서, CDR-L1에서, 서열식별번호: 2의 아미노산 서열 대비 11개 이하, 또는 10개 이하, 9개 이하, 8개 이하, 7개 이하, 6개 이하, 5개 이하, 4개 이하, 3개 이하, 2개 이하, 또는 1개 이하의 치환이 이루어진다. 특정 실시양태에서, CDR-L2에서, 서열식별번호: 3의 아미노산 서열 대비 6개 이하, 5개 이하, 4개 이하, 3개 이하, 3개 이하, 2개 이하, 또는 1개 이하의 치환이 이루어진다. 특정 실시양태에서, CDR-L3에서, 서열식별번호: 4의 아미노산 서열 대비 8개 이하, 7개 이하, 6개 이하, 5개 이하, 4개 이하, 3개 이하, 3개 이하, 2개 이하, 또는 1개 이하의 치환이 이루어진다. 일부 실시양태에서, CDR-H1에서, 서열식별번호: 7의 아미노산 서열 대비 10개 이하, 9개 이하, 8개 이하, 7개 이하, 6개 이하, 5개 이하, 4개 이하, 3개 이하, 2개 이하, 또는 1개 이하의 치환이 이루어진다. 일부 실시양태에서, CDR-H2에서, 서열식별번호: 8의 아미노산 서열 대비 17개 이하, 16개 이하, 15개 이하, 14개 이하, 13개 이하, 12개 이하, 11개 이하, 또는 10개 이하, 9개 이하, 8개 이하, 7개 이하, 6개 이하, 5개 이하, 4개 이하, 3개 이하, 2개 이하, 또는 1개 이하의 치환이 이루어진다. 일부 실시양태에서, CDR-H3에서, 서열식별번호: 9의 아미노산 서열 대비 또는 서열식별번호: 11의 아미노산 서열 대비 12개 이하, 11개 이하, 또는 10개 이하, 9개 이하, 8개 이하, 7개 이하, 6개 이하, 5개 이하, 4개 이하, 3개 이하, 2개 이하, 또는 1개 이하의 치환이 이루어진다. 특정 실시양태에서, 치환(들)은 결합 친화도 (KD) 값을 1000-배 초과, 100-배 초과, 또는 10-배 초과로 변화시키지 않는다. 특정 실시양태에서, 치환은 표 1에 따른 보존적 치환이다.
특정 실시양태에서, 치환은 예를 들어 미국 특허 출원 공개 번호 2017/0073395 및 문헌 [Townsend et al., 2015, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 112(50):15354-15359)]에 기재된 바와 같은, 인간 아미노산 함량을 증가시키고 항체의 면역원성을 잠재적으로 감소시키기 위한, (공여자) CDR 잔기를 상응하는 인간 배선 (수용자) 잔기로 대체하는 인간 배선 치환이다. 예를 들어, 인간 배선 DPK9 프레임워크를 사용하고 예시적인 항체 마우스 또는 인간화 (XC154) 11G2 VL을 비교하는 경우에, 11G2 VL (마우스 및 인간화 XC154) 항체 (서열식별번호: 2) 및 인간 배선 DPK9의 CDR-L1의 정렬은 다음과 같다:
Figure pct00002
아미노산 위치 번호 28 (이탤리체)의 경우, 인간 배선 잔기 (수용자) 및 상응하는 11G2 VL (XC154) 잔기 (공여자)는 동일하고, 배선 치환이 불가능하다. 위치 27, 29, 30, 31, 32, 33, 34 및 35 (볼드체 및 밑줄표시)의 경우, 인간 배선 (수용자) 잔기 및 상응하는 11G2 VL (XC154) (공여자) 잔기는 상이하다. 이들 위치에서 11G2 VL (XC154)의 잔기를 상응하는 인간 배선 DPK9 잔기로 대체하여 인간 잔기 함량을 추가로 증가시킬 수 있다. 각각의 중쇄 및 경쇄 CDR에 대해서도 동일한 과정을 따라 결합 특징, 예를 들어, 에피토프 결합, 친화도 등은 보존하면서 인간 아미노산 잔기의 함량을 증가시킬 수 있는 한편, 마우스 잔기의 함량을 최소화함으로써, 인간에서 항체에 대한 임의의 잠재적인 면역원성, 예를 들어 인간 항 마우스 항체 (HAMA) 면역 반응을 감소시킬 수 있다.
항체 CDR에 인간 배선 잔기를 도입하기 위한 방법 및 라이브러리는 미국 특허 출원 공개 번호 2017/0073395, 및 문헌 [Townsend et al., 2015, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 112(50):15354-15359]에 상세하게 기재되어 있고, 둘 다는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
항체 또는 그의 항원-결합 단편은 인간 배선 VH 프레임워크 서열을 포함하는 VH 프레임워크를 포함할 수 있다. VH 프레임워크 서열은 인간 VH3 배선, VH1 배선, VH5 배선, 또는 VH4 배선으로부터의 것일 수 있다. 바람직한 인간 배선 중쇄 프레임워크는 VH1, VH3, 또는 VH5 배선으로부터 유래된 프레임워크이다. 예를 들어, 하기 배선으로부터의 VH 프레임워크가 사용될 수 있다: IGHV3-23, IGHV3-7 또는 IGHV1-69 (배선 명칭은 IMGT 배선 정의에 기초함). 바람직한 인간 배선 경쇄 프레임워크는 Vκ 또는 Vλ 배선으로부터 유래된 프레임워크이다. 예를 들어, 하기 배선으로부터의 VL 프레임워크가 사용될 수 있다: IGKV1-39 또는 IGKV3-20 (배선 명칭은 IMGT 배선 정의에 기초함). 대안적으로 또는 추가로, 프레임워크 서열은 인간 배선 컨센서스 프레임워크 서열, 예컨대 인간 Vλ1 컨센서스 서열, Vκ1 컨센서스 서열, Vκ2 컨센서스 서열, Vκ3 컨센서스 서열, VH3 배선 컨센서스 서열, VH1 배선 컨센서스 서열, VH5 배선 컨센서스 서열, 또는 VH4 배선 컨센서스 서열의 프레임워크일 수 있다. 인간 배선 프레임워크의 서열은 다양한 공중 데이터베이스, 예컨대 V-베이스, IMGT, NCBI 또는 아비시스로부터 입수가능하다.
항체 또는 그의 항원-결합 단편은 인간 배선 VL 프레임워크 서열을 포함하는 VL 프레임워크를 포함할 수 있다. VL 프레임워크는 그것이 유래된 배선과의 기능적 및 구조적 유사성을 여전히 유지하면서 1개 이상의 아미노산 치환, 부가 또는 결실을 포함할 수 있다. 일부 측면에서, VL 프레임워크는 인간 배선 VL 프레임워크 서열과 적어도 90% 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일하다. 일부 측면에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 인간 배선 VL 프레임워크 서열에 비해 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개의 아미노산 치환, 부가 또는 결실을 포함하는 VL 프레임워크를 포함한다. 일부 측면에서, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 아미노산 치환, 부가 또는 결실은 단지 프레임워크 영역에만 존재한다. 일부 측면에서, % 동일성은 CDR로서 본원에 정의된 그러한 단편을 제외한 VL과의 유사성에 기초한다.
인간 배선 VL 프레임워크는 DPK9 (IMGT 명칭: IGKV1-39)의 프레임워크일 수 있다. 인간 배선 VL 프레임워크는 DPK12 (IMGT 명칭: IGKV2D-29)의 프레임워크일 수 있다. 인간 배선 VL 프레임워크는 DPK18 (IMGT 명칭: IGKV2-30)의 프레임워크일 수 있다. 인간 배선 VL 프레임워크는 DPK24 (IMGT 명칭: IGKV4-1)의 프레임워크일 수 있다. 인간 배선 VL 프레임워크는 HK102_V1 (IMGT 명칭: IGKV1-5)의 프레임워크일 수 있다. 인간 배선 VL 프레임워크는 DPK1 (IMGT 명칭: IGKV1-33)의 프레임워크일 수 있다. 인간 배선 VL 프레임워크는 DPK8 (IMGT 명칭: IGKV1-9)의 프레임워크일 수 있다. 인간 배선 VL 프레임워크는 DPK3 (IMGT 명칭: IGKV1-6)의 프레임워크일 수 있다. 인간 배선 VL 프레임워크는 DPK21 (IMGT 명칭: IGKV3-15)의 프레임워크일 수 있다. 인간 배선 VL 프레임워크는 Vg_38K (IMGT 명칭: IGKV3-11)의 프레임워크일 수 있다. 인간 배선 VL 프레임워크는 DPK22 (IMGT 명칭: IGKV3-20)의 프레임워크일 수 있다. 인간 배선 VL 프레임워크는 DPK15 (IMGT 명칭: IGKV2-28)의 프레임워크일 수 있다. 인간 배선 VL 프레임워크는 DPL16 (IMGT 명칭: IGLV3-19)의 프레임워크일 수 있다. 인간 배선 VL 프레임워크는 DPL8 (IMGT 명칭: IGLV1-40)의 프레임워크일 수 있다. 인간 배선 VL 프레임워크는 V1-22 (IMGT 명칭: IGLV6-57)의 프레임워크일 수 있다. 인간 배선 VL 프레임워크는 인간 Vλ 컨센서스 서열의 프레임워크일 수 있다. 인간 배선 VL 프레임워크는 인간 Vλ1 컨센서스 서열의 프레임워크일 수 있다. 인간 배선 VL 프레임워크는 인간 Vλ3 컨센서스 서열의 프레임워크일 수 있다. 인간 배선 VL 프레임워크는 인간 Vκ 컨센서스 서열의 프레임워크일 수 있다. 인간 배선 VL 프레임워크는 인간 Vκ1 컨센서스 서열의 프레임워크일 수 있다. 인간 배선 VL 프레임워크는 인간 Vκ2 컨센서스 서열의 프레임워크일 수 있다. 인간 배선 VL 프레임워크는 인간 Vκ3 컨센서스 서열의 프레임워크일 수 있다.
일부 측면에서, VL 프레임워크는 DPK9이다. DPK-9의 FW 영역에 대해 각각 99, 97, 97, 96, 80, 76, 66, 97, 97, 96, 76, 및 74 % 동일성을 포함하고 공통 구조적 특색 (카바트 넘버링) (A) CDR 바로 아래의 잔기 (버니어 구역), L2, L4, L35, L36, L46, L47, L48, L49, L64, L66, L68, L69, L71 , (B) VH/VL 쇄 패킹 잔기: L36, L38, L44, L46, L87 및 (C) 정규 CDR 구조 지지 잔기 L2, L48, L64, L71에서 1개 미만의 아미노산 차이를 포함하는, DPK5, DPK4, DPK1, IGKV1-5*01, DPK24, DPK21, DPK15, IGKV1-13*02, IGKV1-17*01, DPK8, IGKV3-11*01, 및 DPK22를 포함한, 서열식별번호: 2, 3, 4, 7, 8, 9, 11, 14, 15, 16의 CDR; 및 하기 VL 아미노산 서열: 1, 5, 13, 28, 35, 37, 39, 47, 48, 48, 50, 51, 58, 59, 60, 61, 62, 97, 98에 의해 명시된 CDR을 포함하는 다른 유사한 프레임워크 영역도 또한 본 발명의 유리한 항체를 전달할 것으로 예측된다 (문헌 [Lo, "Antibody Humanization by CDR Grafting", (2004) Antibody Engineering, Vol. 248, Methods in Molecular Biology pp 135-159 및 O'Brien and Jones, "Humanization of Monoclonal Antibodies by CDR Grafting", (2003) Recombinant Antibodies for Cancer Therapy, Vol. 207, Methods in Molecular Biology pp 81-100] 참조). 특히 바람직한 것은 DPK9에 대해 각각 99, 97, 97, 96, 80, 76, 66% 동일성을 공유하고 이들 공통 구조적 특색에서 어떠한 아미노산 차이도 갖지 않는 DPK5, DPK4, DPK1, IGKV1-5*01, DPK24, DPK21, 및 DPK15의 프레임워크 영역이다. 일부 측면에서, % 동일성은 CDR로서 본원에 정의된 그러한 단편을 제외한 VL과의 유사성에 기초한다.
항체 또는 그의 항원-결합 단편은 인간 배선 VH 프레임워크 서열을 포함하는 VH 프레임워크를 포함할 수 있다. VH 프레임워크는 그것이 유래된 배선과의 기능적 및 구조적 유사성을 여전히 유지하면서 1개 이상의 아미노산 치환, 부가 또는 결실을 포함할 수 있다. 일부 측면에서, VH 프레임워크는 인간 배선 VH 프레임워크 서열과 적어도 90% 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일하다. 일부 측면에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 인간 배선 VH 프레임워크 서열에 비해 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개의 아미노산 치환, 부가 또는 결실을 포함하는 VH 프레임워크를 포함한다. 일부 측면에서, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 아미노산 치환, 부가 또는 결실은 단지 프레임워크 영역에만 존재한다. 일부 측면에서, % 동일성은 CDR로서 본원에 정의된 그러한 단편을 제외한 VH와의 유사성에 기초한다.
인간 배선 VH 프레임워크는 DP54 또는 IGHV3-7의 프레임워크일 수 있다. 인간 배선 VH 프레임워크는 DP47 또는 IGHV3-23의 프레임워크일 수 있다. 인간 배선 VH 프레임워크는 DP71 또는 IGHV4-59의 프레임워크일 수 있다. 인간 배선 VH 프레임워크는 DP75 또는 IGHV1-2_02의 프레임워크일 수 있다. 인간 배선 VH 프레임워크는 DP10 또는 IGHV1-69의 프레임워크일 수 있다. 인간 배선 VH 프레임워크는 DP7 또는 IGHV1-46의 프레임워크일 수 있다. 인간 배선 VH 프레임워크는 DP49 또는 IGHV3-30의 프레임워크일 수 있다. 인간 배선 VH 프레임워크는 DP51 또는 IGHV3-48의 프레임워크일 수 있다. 인간 배선 VH 프레임워크는 DP38 또는 IGHV3-15의 프레임워크일 수 있다. 인간 배선 VH 프레임워크는 DP79 또는 IGHV4-39의 프레임워크일 수 있다. 인간 배선 VH 프레임워크는 DP78 또는 IGHV4-30-4의 프레임워크일 수 있다. 인간 배선 VH 프레임워크는 DP73 또는 IGHV5-51의 프레임워크일 수 있다. 인간 배선 VH 프레임워크는 DP50 또는 IGHV3-33의 프레임워크일 수 있다. 인간 배선 VH 프레임워크는 DP46 또는 IGHV3-30-3의 프레임워크일 수 있다. 인간 배선 VH 프레임워크는 DP31 또는 IGHV3-9의 프레임워크일 수 있다. 인간 배선 VH 프레임워크는 인간 VH 배선 컨센서스 서열의 프레임워크일 수 있다. 인간 배선 VH 프레임워크는 인간 VH3 배선 컨센서스 서열의 프레임워크일 수 있다. 인간 배선 VH 프레임워크는 인간 VH5 배선 컨센서스 서열의 프레임워크일 수 있다. 인간 배선 VH 프레임워크는 인간 VH1 배선 컨센서스 서열의 프레임워크일 수 있다. 인간 배선 VH 프레임워크는 인간 VH4 배선 컨센서스 서열의 프레임워크일 수 있다.
일부 측면에서, VH 프레임워크는 DP-54이다. DP-54의 FW 영역에 대해 각각 93, 92, 92, 99, 97, 97, 96, 96, 94, 94, 93, 92% 동일성을 포함하고 공통 구조적 특색 (카바트 넘버링) (A) CDR 바로 아래의 잔기 (버니어 구역), H2, H47, H48, 및 H49, H67, H69, H71, H73, H93, H94 , (B) VH/VL 쇄 패킹 잔기: H37, H39, H45, H47, H91, H93 및 (C) 정규 CDR 구조 지지 잔기 H24, H71, H94에서 1개 미만의 아미노산 차이를 포함하는, DP-50, IGHV3-30*09, IGHV3-30*15, IGHV3-48*01, DP-77, DP-51, IGHV3-66*01, DP-53, DP-48, IGHV3-53*01, IGHV3-30*02, 및 DP-49를 포함한, 서열식별번호: 7, 8, 9, 11,19, 20, 21의 CDR; 및 하기 VH 아미노산 서열: 6, 10, 12, 17, 18, 36, 38, 40, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 63, 96에 의해 명시된 CDR을 포함하는 다른 유사한 프레임워크 영역도 또한 본 발명의 유리한 항체를 전달할 것으로 예측된다 (문헌 [Lo 2004, 및 O'Brien and Jones 2003] 참조). 특히 바람직한 것은 DP-54에 대해 각각 93, 92 및 92 % 동일성을 공유하고 이들 공통 구조적 특색에서 어떠한 아미노산 차이도 갖지 않는 DP-50, IGHV3-30*09, IGHV3-30*15의 프레임워크 영역이다. 일부 측면에서, % 동일성은 CDR로서 본원에 정의된 그러한 단편을 제외한 VH와의 유사성에 기초한다.
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 (i) 서열식별번호: 8의 아미노산 서열과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH, 및/또는 (ii) 서열식별번호: 1의 아미노산 서열과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 66%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 이들 VL 및 VH 서열의 임의의 조합이 또한 본 발명에 포괄된다.
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 (i) 서열식별번호: 29의 아미노산 서열과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 HC; 및/또는 (ii) 서열식별번호: 28의 아미노산 서열과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 LC를 포함한다. 이들 HC 및 LC 서열의 임의의 조합이 또한 본 발명에 포괄된다.
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 Fc 도메인을 포함한다. Fc 도메인은 IgA (예를 들어, IgA1 또는 IgA2), IgG, IgE, 또는 IgG (예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4)로부터 유래될 수 있다.
또한, 인간 CXCR5에의 결합에 대해 본원에 기재된 항체 또는 그의 항원-결합 단편 중 임의의 것, 예컨대 본원에 제공된 항체 (또는 그의 항원-결합 단편) 중 어느 하나와 경쟁하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 본 발명에 제공된다. 예를 들어, 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 인간 CXCR5에의 결합이 CXCL13에 의한 인간 CXCR5에의 후속 결합을 방해하는 경우에, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 CXCL13과 인간 CXCR5 결합에 대해 경쟁한다.
본 발명에 의해 제공된 항체 및 항원-결합 단편은 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 항체 단편 (예를 들어, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, Fc 등), 키메라 항체, 이중특이적 항체, 이종접합체 항체, 단일 쇄 (ScFv), 그의 돌연변이체, 항체 부분을 포함하는 융합 단백질, 도메인 항체 (dAb), 인간화 항체, 및 항체의 글리코실화 변이체, 항체의 아미노산 서열 변이체 및 공유 변형된 항체를 포함한, 요구되는 특이성의 항원 인식 부위를 포함하는 임의의 다른 변형된 구성의 이뮤노글로불린 분자를 포함한다. 항체 및 항원-결합 단편은 뮤린, 래트, 인간 또는 임의의 다른 기원 (키메라 또는 인간화 항체 포함)의 것일 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체는 모노클로날 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체는 키메라, 인간화 또는 인간 항체이다. 특정 실시양태에서, 항체는 인간 항체이다. 특정 실시양태에서, 항체는 인간화 항체이다.
에피토프 맵핑
또한, 본 발명은 본원에 기재된 항체 또는 그의 항원-결합 단편과 동일한 인간 CXCR5 에피토프에 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다. 예를 들어, 항체 경쟁 검정 (및 중첩 에피토프 분석)은 SPR, 유동 세포측정법, 및 관련 기술분야에 공지된 임의의 다른 검정에 의해 평가될 수 있다.
한 측면에서, 본 발명은 인간 CXCR5 및 시노몰구스 CXCR5에 결합하지만, 마우스 CXCR5에는 결합하지 않는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포괄한다.
본 발명은 또한 인간 CXCR5의 N-말단 영역 ("N")에 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함한다. CXCR5의 N-말단은 서열식별번호: 31의 아미노산 서열의 넘버링에 기초한 아미노산 잔기 번호 1-51을 포함한다.
본 발명은 서열식별번호: 32의 아미노산 서열의 넘버링에 따른 아미노산 잔기 위치 번호 11에서 류신 (L)을 포함하는 에피토프에서 CXCR5에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함한다.
한 측면에서, 본 발명은 서열식별번호: 32의 아미노산 서열의 넘버링에 따른 아미노산 잔기 위치 번호 22에서 아스파르테이트 (D)를 포함하는 에피토프에서 CXCR5에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함한다.
한 측면에서, 본 발명은 서열식별번호: 32의 아미노산 서열의 넘버링에 따른 아미노산 잔기 위치 번호 11에서 류신 및 아미노산 잔기 위치 번호 22에서 아스파르테이트를 포함하는 에피토프에서 CXCR5에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함한다.
본 발명은 서열식별번호: 32의 아미노산 서열의 넘버링에 따른 위치 번호 11의 아미노산 잔기가 류신인 CXCR5에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함한다.
본 발명은 서열식별번호: 32의 아미노산 서열의 넘버링에 따른 위치 번호 11의 아미노산 잔기가 류신인 CXCR5에는 특이적으로 결합하지만 위치 번호 11의 아미노산 잔기가 트레오닌인 CXCR5에는 결합하지 않는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함한다.
한 측면에서, 본 발명은 야생형 인간 CXCR5에는 특이적으로 결합하지만, 서열식별번호: 32의 아미노산 서열의 넘버링에 따른 아미노산 잔기 위치 번호 11이 류신이 아닌 것에는 결합하지 않는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함한다.
본 발명은 서열식별번호: 32의 아미노산 서열의 넘버링에 따른 위치 번호 22의 아미노산 잔기가 아스파르테이트인 CXCR5에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함한다.
한 측면에서, 본 발명은 야생형 인간 CXCR5에는 특이적으로 결합하지만, 서열식별번호: 32의 아미노산 서열의 넘버링에 따른 위치 번호 22의 아미노산 잔기가 아스파르테이트가 아닌 것에는 결합하지 않는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함한다.
한 측면에서, 본 발명은 야생형 인간 CXCR5에는 특이적으로 결합하지만, 서열식별번호: 32의 아미노산 서열의 넘버링에 따른 아미노산 잔기 위치 번호 22가 알라닌인 것에는 결합하지 않는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함한다.
본 발명은 서열식별번호: 32의 아미노산 서열의 넘버링에 따른 위치 번호 11의 아미노산 잔기가 류신이고 위치 번호 22의 아미노산 잔기가 아스파르테이트인 CXCR5에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함한다.
한 측면에서, 본 발명은 인간 CXCR5에는 특이적으로 결합하지만, 서열식별번호: 32의 아미노산 서열의 넘버링에 따른 위치 번호 11의 아미노산 잔기가 류신이 아니고 위치 번호 22의 아미노산 잔기가 아스파르테이트가 아닌 CXCR5에는 결합하지 않는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함한다.
한 측면에서, 본 발명은 인간 CXCR5에는 특이적으로 결합하지만, 서열식별번호: 32의 아미노산 서열의 넘버링에 따른 위치 번호 11의 아미노산 잔기가 트레오닌이고 위치 번호 22의 아미노산 잔기가 알라닌인 것에는 결합하지 않는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함한다.
관련 기술분야의 통상의 기술자는, 본 발명의 교시내용을 통해, 서열식별번호: 32의 아미노산 서열의 넘버링에 따른 위치 번호 11 및/또는 위치 번호 22의 아미노산 잔기가 본 발명의 항체의 결합에 중요하다는 것을 인지할 것이다. 보다 구체적으로, 이들 아미노산 잔기는 항체 11G2 또는 그의 항원-결합 단편에 의한 CXCR5에의 결합에 중요하다. 따라서, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 본 발명이 위치 11의 아미노산 잔기가 류신이고 위치 22의 아미노산 잔기가 아스파르테이트인 CXCR5에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함한다는 것을 이해할 것이다. 이들 아미노산 잔기의 치환 또는 결실은 CXCR5에 대한 결합의 상실을 초래할 수 있다. 위치 11의 아미노산 잔기의 특정 치환은 결합을 보존할 수 있지만, 트레오닌에 의한 그러한 (류신) 아미노산 잔기의 치환은 그렇지 않다. 유사하게, 위치 22의 아미노산 잔기의 특정 치환 또는 결실은 결합을 보존할 수 있지만, 알라닌에 의한 그러한 아미노산 잔기 번호에서의 아스파르테이트의 치환은 그렇지 않다. 따라서, 11G2 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 또는 결합에 대해 그와 경쟁하는 항체의 특색은, 서열식별번호: 32의 아미노산 서열의 넘버링에 따라 류신 11 및 아스파르테이트 22가 존재하는 인간 CXCR5에는 항체가 결합하지만, 류신 11이 트레오닌 또는 또 다른 아미노산 잔기로 대체된 것에 항체가 결합하지 않고, 아스파르테이트 22가 알라닌 또는 또 다른 아미노산 잔기로 대체된 것에 항체가 결합하지 않는다는 것이다. 아미노산 잔기 위치 번호 11 및/또는 번호 22에서의 아미노산 치환 후 결합의 상실에 대한 시험은 본원에 예시된 방법에 따라 점 돌연변이 폴리펩티드를 사용하는 결합 분석을 비롯한, 관련 기술분야에 널리 공지된 매우 다양한 방법을 사용하여 수행할 수 있다.
본원에 제공된 교시내용에 기초하여, 관련 기술분야의 통상의 기술자는, 본 발명의 항체가 예를 들어 11G2와 경쟁할 수 있으나, 서열식별번호: 32의 아미노산 서열의 넘버링에 따른 아미노산 잔기 번호 11에서 류신 및/또는 아미노산 잔기 번호 22에서 아스파르테이트를 포함하는 에피토프는 포함하지 않을 수 있다는 것을 인지할 것이다. 즉, 항체는 본 발명의 항체와 CXCR5에의 결합에 대해 경쟁할 수 있지만, 경쟁적 항체 결합은 아미노산 잔기 번호 11에서의 류신 또는 아미노산 잔기 번호 22에서의 아스파르테이트가 상이한 아미노산으로 (예를 들어, 류신이 트레오닌으로 및/또는 아스파르테이트가 알라닌으로) 치환된 경우에는 영향을 받지 않는다 (예를 들어, 2C9, 11A7 및 16D7). 따라서, 본 발명의 항체는 CXCR5에의 결합에 대해 경쟁하며, 또한 아미노산 잔기 번호 11이 류신이 아니고, 보다 구체적으로, 그것이 트레오닌인 경우 및/또는 아미노산 잔기 번호 22가 아스파르테이트가 아니고, 보다 구체적으로, 그것이 알라닌인 경우의 CXCR5에는 결합하지 않는다. 본원의 다른 곳에서 앞서 언급된 바와 같이, 돌연변이체 CXCR5 단백질의 생산 및 항체 경쟁 결합을 평가하기 위한 검정은 본원에 기재된 방법을 포함하여 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 따라서, 본원에 제공된 교시내용에 기초하여, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 CXCR5에 결합하고, 결합에 대해 본 발명의 항체와 경쟁하고, 특정 아미노산, 예를 들어 류신 11, 아스파르테이트 22, 또는 둘 다 (모두는 서열식별번호: 32의 아미노산 서열의 넘버링에 따름)가 치환된 CXCR5 뮤테인에 결합하는 능력을 상실한 항체를 용이하게 확인할 수 있을 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 항체 11G2 또는 그의 항원-결합 단편과 결합에 대해 경쟁하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하며, 여기서 항체는 서열식별번호: 32의 아미노산 서열의 넘버링에 따라 아미노산 잔기 번호 11이 류신이 아닌 CXCR5에는 결합하지 않는다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 항체 11G2 또는 그의 항원-결합 단편과 결합에 대해 경쟁하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하며, 여기서 항체는 서열식별번호: 32의 아미노산 서열의 넘버링에 따라 아미노산 잔기 번호 22가 아스파르테이트가 아닌 CXCR5에는 결합하지 않는다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 항체 11G2 또는 그의 항원-결합 단편과 결합에 대해 경쟁하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하며, 여기서 항체는 서열식별번호: 32의 아미노산 서열의 넘버링에 따라 아미노산 잔기 번호 11이 류신이 아니고 아미노산 잔기 번호 22가 아스파르테이트가 아닌 CXCR5에는 결합하지 않는다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 항체 11G2 또는 그의 항원-결합 단편과 결합에 대해 경쟁하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하며, 여기서 항체는 서열식별번호: 32의 아미노산 서열의 넘버링에 따라 아미노산 잔기 번호 11이 트레오닌인 CXCR5에는 결합하지 않는다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 항체 11G2 또는 그의 항원-결합 단편과 결합에 대해 경쟁하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하며, 여기서 항체는 서열식별번호: 32의 아미노산 서열의 넘버링에 따라 아미노산 잔기 번호 22가 알라닌인 CXCR5에는 결합하지 않는다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 항체 11G2 또는 그의 항원-결합 단편과 결합에 대해 경쟁하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하며, 여기서 항체는 서열식별번호: 32의 아미노산 서열의 넘버링에 따라 아미노산 잔기 번호 11이 트레오닌이고 아미노산 잔기 번호 22가 알라닌인 CXCR5에는 결합하지 않는다.
항-CXCR5 항체의 생물학적 활성
CXCR5 상의 에피토프에 결합하는 것에 더하여, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 생물학적 활성을 매개할 수 있다. 즉, 본 발명은 CXCR5에 특이적으로 결합하고, 하기로부터 선택된 적어도 1종의 검출가능한 활성을 매개하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함한다: (a) 높은 겉보기 친화도로 CXCR5+ 세포에 결합하지만, CXCR5 마우스, 래트 또는 토끼 오르토로그를 발현하는 세포에는 결합하지 않음; (b) 포르스콜린에 의해 촉발된 cAMP 방출의 CXCL13 억제를 길항작용함; (c) 인간 공여자 및 시노몰구스 PBMC 및 인간 공여자 TMC에서 CXCR5-발현 세포의 ADCC를 촉발함; (d) 인간 CXCR5에 결합하지만, 인간 케모카인 수용체 CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCR9, CCR10, CMKLR1, CXCR3R1, CXCR1, CXCR2, CXCR3, CXCR4, CXCR6, CXCR7, 또는 XCR1에는 결합하지 않음; (e) 말초 혈액 및/또는 2차 림프성 기관 (즉 림프절, 비장, 파이어 패치 및 점막-연관 림프성 조직) 내의 B 세포를 고갈시킴; (f) 말초 혈액 내의 Tfh-유사 세포를 고갈시킴; (g) 2차 림프성 기관 내의 진정한 Tfh 세포를 고갈시킴; 및 (h) 체액성 면역 기억 반응을 손상시킴.
한 측면에서, 본 발명은 높은 겉보기 친화도로 CXCR5+ 세포에 결합하지만, CXCR5 마우스, 래트 또는 토끼 오르토로그를 발현하는 세포에는 결합하지 않는 항체를 포함한다. 겉보기 친화도 결합은 표적 단백질 (예를 들어, CXCR5)을 발현하는 세포에 대한 항체 결합을 검출하기 위해 유동 세포측정법을 사용하여 평가할 수 있다. 세포는 CXCR5를 코딩하는 핵산에 의해 일시적으로 또는 안정적으로 형질감염될 수 있다. 대안적으로 세포는 그의 표면 상에 CXCR5를 자연 발현하는 세포일 수 있다. CXCR5+ 세포의 공급원과 무관하게, 세포에 대한 항체의 결합은 관련 기술분야에서 인식되는 다양한 방법을 사용하여 용이하게 평가될 수 있다. 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 인간 CXCR5 또는 시노 CXCR5에 결합하지만, 마우스, 래트 또는 토끼 CXCR5에는 검출가능하게 결합하지 않거나 또는 훨씬 더 낮은 정도로 결합한다.
본 발명은 CXCR5에 특이적으로 결합하고 CXCR5에 대한 CXCL13 결합에 의해 매개되는 활성을 길항작용하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함한다. CXCR5-CXCL13 신호전달에 의해 매개되는 활성의 억제를 결정하기 위한 많은 검정이 관련 기술분야에 공지되어 있다. 하나의 이러한 검정은 cAMP 리포터 검정이다. 이러한 검정에서, 포르스콜린은 CXCR5를 안정하게 발현하는 세포에서 CXCR5-CXCL13 신호전달에 의해 억제되는 cAMP 생산을 유도한다. 따라서, CXCR5에 결합하고 CXCR5-CXCL13 신호전달의 효과를 길항작용하는 항-CXCR5 항체의 능력은 항체의 존재 또는 부재 하에서 생산된 cAMP의 수준을 측정함으로써 평가된다. 바람직하게는, 항체는 약 50 pM, 약 100 pM, 약 200, pM, 약 400 pM, 약 600 pM, 약 700 pM, 약 750 pM, 약 790 pM, 약 800 pM, 약 850 pM, 약 900 pM, 약 950 pM, 약 960 pM, 약 970 pM, 약 980 pM, 약 990 pm, 또는 약 1000 pM의 EC50으로 cAMP 수준의 용량-의존성 증가를 매개할 수 있다. 보다 바람직하게는, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 약 961 pM의 EC50으로 포르스콜린에 의해 촉발된 cAMP의 CXCL13 억제를 억제한다.
본 발명은 CXCR5에 특이적으로 결합하고 인간 공여자 및 시노몰구스 PBMC 및 인간 공여자 편도 단핵 세포 (TMC)에서 CXCR5-발현 세포의 ADCC를 촉발하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함한다. 많은 ADCC 검정을 사용하여 항체의 ADCC 활성을 평가할 수 있다. 이러한 예시적인 검정이 본원의 실시예 6 및 7에 기재되어 있지만, 본 발명은 이러한 특정 ADCC 검정으로 제한되지 않는다. 본 발명은 약 0.11 pM, 0.2 pM, 0.5 pM, 1 pM. 1.5 pM, 2.0 pM, 2.5 pM, 3.0 pM, 4.5 pM, 4.8 pM, 5.0 pM, 6.0 pM, 7.0 pM, 8.0 pM, 9.0 pM, 10 pM, 11 pM, 12 pM, 15 pM, 20, pM, 25 pM, 30 pM, 35 pM, 또는 40 pM의 EC50으로 인간 B 세포, 인간 Tfh-유사 세포, 인간 Tfh 세포 및 시노몰구스 원숭이 B 세포에 대해 ADCC 활성을 나타내는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함한다. 보다 바람직하게는, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 인간 B 세포에 대해 약 2.01 ± 2.28 pM, 인간 Tfh-유사 세포에 대해 약 4.82 ± 2.88 pM, 인간 Thf 세포에 대해 약 0.11 pM, 및 시노 B 세포에 대해 약 15.3 ± 11.7 pM의 EC50으로 ADCC 활성을 나타낸다. 보다 더 바람직하게는, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 비-푸코실화된다.
본 발명은 인간 CXCR5에 결합하지만, 인간 단백질 CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCR9, CCR10, CMKLR1, CXCR3R1, CXCR1, CXCR2, CXCR3, CXCR4, CXCR6, CXCR7, 또는 XCR1에는 검출가능하게 결합하지 않는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포괄한다.
본 발명은 CXCR5에 특이적으로 결합하고 말초 혈액 내의 B 세포의 용량-의존성 고갈을 나타내는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포괄한다. 고갈은 영구적일 수 있거나, 또는 보다 바람직하게는, 고갈은 일시적 및/또는 가역적이다. 한 측면에서, B 세포 고갈을 매개하기에 충분한 항체 용량은 0.001 내지 약 0.2 mg 범위일 수 있고, 여기서 0.0001 mg/kg은, 항체가 투여되지 않은 경우의 말초 혈액 내의 B 세포 및 Tfh-유사 세포의 백분율과 비교하여 약 50%의 시노몰구스 원숭이의 말초 혈액 내의 B 세포 및 Tfh-유사 세포의 고갈을 매개할 수 있다. 또한, 항체는 정맥내로 (IV) 투여된 5 mg/kg 미만의 용량으로 투여된 시노몰구스 원숭이의 말초 혈액에서 B 세포 및 Tfh-유사 세포의 최대 고갈을 매개할 수 있다. 바람직하게는, 항체의 투여 후에 B 세포, Tfh-유사 및 Tfh 세포의 부분적 내지 완전한 회복이 일어난다.
본 발명은 CXCR5에 특이적으로 결합하고 체액성 면역 기억 반응을 손상시키는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함한다. 한 측면에서, 체액성 기억 반응은 백신 회상 검정을 사용하여 평가된다. 즉, 이전에 항원, 예를 들어 파상풍 톡소이드 (TT)로 백신접종된 대상체에게 항체가 투여된다. 대상체에게 항원의 제2 투여가 제공되고, 면역 반응, 예를 들어 IgM 및 IgG 역가가, 항체가 투여되지 않은 달리 동일한 대상체에서의 면역 반응과 비교된다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는, 본원에 개시된 교시내용이 제공되면, 체액성 기억 반응을 결정하기 위한 많은 검정을 사용하여 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 체액성 기억 반응을 손상시키는 능력을 평가할 수 있음을 인지할 것이다. 또한, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 체액성 기억 반응을 손상시키는 능력이 면역 질환의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 면역 질환을 치료 또는 예방하기 위한 치료제로서 사용될 항체 또는 그의 항원-결합 단편에 대한 바람직한 특징이라는 것을 인지할 것이다.
본 발명은 상기 논의된 생물학적 활성 중 적어도 1종, 바람직하게는 2종, 보다 바람직하게는 3종, 보다 더 바람직하게는 4종, 보다 더 바람직하게는 5종, 보다 더 바람직하게는 6종, 보다 바람직하게는 7종, 및 보다 더 바람직하게는 모든 것을 나타내는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포괄한다.
III. 비-푸코실화 항-CXCR5 항체
한 실시양태에서, Fc 영역에 (직접적으로 또는 간접적으로) 부착된 푸코스가 결여된 탄수화물 구조를 갖는 항체 (즉, 비-푸코실화 항체)가 제공된다. 예를 들어, 복수의 이러한 항체를 포함하는 조성물 중 푸코스의 양은 0 퍼센트 내지 약 30 퍼센트, 0 퍼센트 내지 약 20 퍼센트, 0 퍼센트 내지 약 15 퍼센트, 0 퍼센트 내지 약 10 퍼센트, 및 보다 바람직하게는, 0 퍼센트 내지 약 5 퍼센트일 수 있다. 일부 실시양태에서, 복수의 이러한 항체를 포함하는 조성물은 적어도 80 퍼센트, 보다 바람직하게는, 적어도 85 퍼센트, 보다 더 바람직하게는, 적어도 90 퍼센트, 보다 더 바람직하게는, 적어도 95 퍼센트의 비-푸코실화 항체, 보다 더 바람직하게는, 적어도 99 퍼센트, 및 가장 바람직하게는, 적어도 99.5 퍼센트의 비-푸코실화 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 100 퍼센트 비-푸코실화되며; 즉, 항체에서 푸코스를 검출하기 위한 관련 기술분야에서 인식되는 방법을 사용할 경우 Asn297에서 푸코스가 검출되지 않는다. 푸코스의 양은 Asn297에 부착된 모든 당구조물 (예를 들어, 복합체, 하이브리드 및 고 만노스 구조)을 합한 것 대비 Asn297에서의 당 쇄 내의 푸코스의 평균 양을 계산함으로써 결정된다.
일부 실시양태에서, 푸코실화의 수준은 0.5% 이하이고, 이는 시험 방법에 대한 정량 한계 (LOQ)에 기초한다. 따라서, 일부 실시양태에서, 비-푸코실화의 수준은 99.5% 이상이다. N-연결된 올리고사카라이드 프로파일 방법을 사용하여 샘플 중 푸코실화, 시알릴화, 만노실화, 및 말단 갈락토실화 수준을 결정할 수 있다. N-연결된 올리고사카라이드 방법을 사용하여 N-연결된 글리칸을 평가할 수 있다. 간략하게, N-연결된 글리칸은 펩티드-N-글리코시다제 F에 의해 단백질로부터 효소적으로 방출된다. 이어서 글리칸은 형광 작용제에 의해 유도체화되고, 친수성 상호작용 액체 크로마토그래피 및 형광 검출에 의해 분석된다. 이어서, 크로마토그래피 프로파일이 참조 물질의 것과 비교된다. 항체의 푸코실화를 평가하기 위한 이러한 방법 및 많은 다른 방법이 관련 기술분야에 공지되어 있고, 본 발명의 항체에 존재하는 푸코실화의 수준을 결정하는데 사용될 수 있다.
항체에서 푸코스를 검출하는 비제한적인 예시적인 방법은 MALDI-TOF 질량 분광측정법을 포함한다 (예를 들어 WO 2008/077546 참조).
방출된 형광 표지된 올리고사카라이드의 HPLC 측정 (예를 들어, 문헌 [Schneider et al., "N-Glycan analysis of monoclonal antibodies and other glycoproteins using UHPLC with fluorescence detection," Agilent Technologies, Inc. (2012); Lines, J. Pharm. Biomed. Analysis, 14: 601-608 (1996); Takahasi, J. Chrom., 720: 217-225 (1996)] 참조), 방출된 형광 표지된 올리고사카라이드의 모세관 전기영동 측정 (예를 들어, 문헌 [Ma et al., Anal. Chem., 71: 5185-5192 (1999)] 참조), 및 모노사카라이드 조성을 측정하기 위한 펄스형 전류측정 검출 동반 HPLC (예를 들어, 문헌 [Hardy, et al., Analytical Biochem., 170: 54-62 (1988)] 참조). Asn297은 Fc 영역 내의 대략 위치 297 (Fc 영역 잔기의 EU 넘버링)에 위치하는 아스파라긴 잔기를 지칭하지만; Asn297은 또한 항체에서의 부차적 서열 변이로 인해, 위치 297의 약 플러스 또는 마이너스 3개 아미노산 상류 또는 하류, 즉 위치 294 내지 300 사이에 위치할 수 있다. 본원에 기재된 CXCR5 항체에서, Asn297은 서열 QYNST에서 발견되며, 이는 표 16에서 볼드체 및 밑줄표시된다 (예를 들어, 야생형 인간 IgG1 Fc 도메인의 서열식별번호: 31).
푸코실화 변이체는 개선된 ADCC 기능을 가질 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 공개 번호 US 2003/0157108 (Presta, L.); US 2004/0093621 (교와 핫코 고교 캄파니, 리미티드(Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd))을 참조한다. "비-푸코실화" 또는 "푸코스-결핍" 항체에 관한 공개의 예는: US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO2005/053742; WO2002/031140; 문헌 [Okazaki et al. J. Mol. Biol. 336: 1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004)]을 포함한다. 비-푸코실화 항체를 생산할 수 있는 세포주의 예는 단백질 푸코실화가 결핍된 Lec 13 CHO 세포 (Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986); 미국 특허 출원 번호 US 2003/0157108 Al, Presta, L; 및 WO 2004/056312, Adams et al., 특히 실시예 11), 및 녹아웃 세포주, 예컨대 기능적 알파-1,6-푸코실트랜스퍼라제 유전자, FUT8이 결여된 세포주, 예를 들어, 녹아웃 CHO 세포 (예를 들어, 문헌 [Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004); Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng, 94(4):680-688 (2006)]; 및 WO2003/085107 참조)를 포함한다.
이등분된 올리고사카라이드를 갖는, 예를 들어, 항체의 Fc 영역에 부착된 이중안테나 올리고사카라이드가 GlcNAc에 의해 이등분된 항체가 추가로 제공된다. 이러한 항체는 감소된 푸코실화 및/또는 개선된 ADCC 기능을 가질 수 있다. 이러한 항체의 예는, 예를 들어, WO 2003/011878 (Jean-Mairet et al.); 미국 특허 번호 6,602,684 (Umana et al.); 및 US 2005/0123546 (Umana et al.)에 기재되어 있다. Fc 영역에 부착된 올리고사카라이드에 적어도 1개의 갈락토스 잔기를 갖는 항체가 또한 제공된다. 이러한 항체는 개선된 CDC 기능을 가질 수 있다. 이러한 항체는, 예를 들어, WO 1997/30087 (Patel et al.); WO 1998/58964 (Raju, S.); 및 WO 1999/22764 (Raju, S.)에 기재되어 있다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 비-푸코실화 항체는 푸코스를 포함하는 모 항체보다 인간 이펙터 세포의 존재 하에서 보다 효과적으로 ADCC를 매개한다. 일반적으로, ADCC 활성은 본원에 개시된 바와 같은 시험관내 ADCC 검정을 사용하여 결정될 수 있지만, 예를 들어, 동물 모델 등에서 ADCC 활성을 결정하기 위한 다른 검정 또는 방법이 고려된다.
일부 실시양태에서, 비-푸코실화 항-CXCR5 항체는 시험관내 및/또는 생체내에서 증진된 ADCC 활성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 비-푸코실화 항-CXCR5 항체는 시험관내에서 증진된 ADCC 활성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 시험관내 ADCC 활성은 본원에 기재된 방법에 의해 결정된다. 간략하게, 항-CXCR5 항체 또는 이소형 대조군의 연속 희석물이 건강한 인간 공여자 또는 시노몰구스 원숭이로부터의 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)와 함께 인큐베이션된다. 본 검정에서, PBMC는 자연 킬러 (NK) 이펙터 세포 및 표적 CXCR5+ B 및 Tfh-유사 세포의 공급원이다. 유동 세포측정법은 대략 20시간 후에 잔류하는 B 및 Tfh-유사 세포의 수를 정량화하는데 사용된다. 세포독성 적정 곡선은 PF-06835375 항체 농도의 로그에 대해 항원 결합 집단의 세포독성의 백분율을 플롯팅함으로써 생성되었다. EC50 값은 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism)® (버전 6.0, 그래프패드 소프트웨어, 인크.(GraphPad Software, Inc.), 캘리포니아주 샌디에고) 비선형-회귀 곡선 피트 및 효능제 용량-반응 모델의 S자형 로그를 사용하여 하기 방정식에 따라 결정하였다:
로그 (효능제) vs. 반응 - 가변 기울기 (4개 파라미터)
Y = 최저 + (최고 - 최저 / (1 + 10^((LogEC50 - X)*힐기울기))
여기서, Y는 세포독성의 백분율이고, X는 항체 농도이고, 최고는 S자형 곡선의 상부 플래토에 상응하는 최대 Y-값이고, 최저는 S자형 곡선의 하부 플래토에 상응하는 최소 Y-값이고 (0으로 한정됨), LogEC50은 곡선의 변곡점에서의 항체 농도의 로그이다.
평균 및 표준 편차 (STDEV)를 사용하여 실험에 걸쳐 EC50 값을 요약하였다. 일부 실시양태에서, PBMC로부터 단리된 NK 세포를 첨가한, 편도 단핵 세포로부터 단리된 CD4+ T 세포를 사용하여 인간화 mAb가 인간 편도로부터 진정한 Tfh 세포의 ADCC를 유도하는 능력을 유사하게 평가하였다. 일부 실시양태에서, CXCR5를 발현하는 Ba/F3 세포가 표적 세포로서 사용된다. 일부 실시양태에서, 세포독성은 시토톡스(CytoTox) 비-방사성 세포독성 검정 (프로메가(Promega), 위스콘신주 매디슨)을 사용하여 LDH 방출을 정량화함으로써 결정된다.
일부 실시양태에서, 최대 용해는 5 퍼센트 트리톤 X-100을 사용하여 결정되고, 자발적 방출은 항체의 부재 하에 결정된다. 일부 실시양태에서, 특이적 용해의 백분율은 하기 식을 사용하여 결정될 수 있다: (실험적 - 자발적 방출) / (최대 - 자발적 방출) x 100 = 퍼센트 특이적 용해. 일부 실시양태에서, 증진된 ADCC 활성을 갖는 비-푸코실화 항-CXCR5 항체는 시험된 항체의 적어도 하나의 농도에서, 동일한 양의 푸코실화 항체에 의한 특이적 용해보다 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 65, 적어도 70, 또는 적어도 75 백분율 포인트 더 큰 특이적 용해를 발생시킨다. 일부 실시양태에서, 증진된 ADCC 활성을 갖는 비-푸코실화 항-CXCR5 항체는 푸코실화 항체에 의한 특이적 용해보다 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 65, 적어도 70, 또는 적어도 75 백분율 포인트 더 큰 특이적 용해를 발생시키고, 여기서 각각의 항체는 0.01 내지 1 마이크로g/ml의 농도이고, 표적 세포는 CXCR5를 발현하는 Ba/F3 세포이다. 일부 실시양태에서, 항체는 0.000005 마이크로g/ml 내지 5 마이크로g/ml 범위의 농도에서 시험된다.
일부 실시양태에서, 비-푸코실화 항-CXCR5 항체는 Fc 감마 RIIIA에 대해 증진된 친화도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 비-푸코실화 항-CXCR5 항체는 Fc 감마 RIIIA(V158)에 대해 증진된 친화도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 비-푸코실화 항-CXCR5 항체는 Fc 감마 RIIIA(F158)에 대해 증진된 친화도를 갖는다. 일부 실시양태에서, Fc 감마 RIIIA에 대한 항체 친화도는 표면 플라즈몬 공명을 사용하여 결정되고/거나, Fc 감마 RIIIA(V158)에 관하여 기재되어 있지만 Fc 감마 RIIIA(F158)에 대한 친화도를 결정하는 데에도 또한 적합한 하기에 따라 결정된다. 간략하게, 일부 실시양태에서, 푸코실화 또는 비-푸코실화 항-CXCR5 항체는 단백질 A-코팅된 덱스트란 칩 상에 포획된다. Fc 감마 RIIIA (V158) (예를 들어 알앤디 시스템즈(R and D Systems)로부터 입수가능함)는 다양한 농도로 주입된다. 푸코실화 및 비-푸코실화 항-CXCR5 항체에 대한 Fc 감마 RIIIA (V158)의 회합 상수, 해리 상수, 및 친화도는, 예를 들어, 표면 플라즈몬 공명 시스템과 함께 제공되는 소프트웨어 (예를 들어, 비아코어 T200 평가 소프트웨어 1:1 결합 모델)를 사용하여 결정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 비-푸코실화 항-CXCR5 항체는 Fc 감마 RIIIA (예컨대 Fc 감마 RIIIA(V158) 또는 Fc 감마 RIIIA(F158))에 대해 증진된 친화도를 가질 수 있고, Fc 감마 RIIIA에 푸코실화 항-CXCR5 항체보다 적어도 2-배, 적어도 3 -배, 적어도 4-배, 적어도 5-배, 적어도 7-배, 적어도 10-배, 적어도 12-배, 적어도 15-배, 적어도 17-배, 20-배, 30-배, 50-배, 100-배, 500-배, 또는 적어도 1000-배 더 큰 친화도로 결합할 수 있다.
IV. 항-CXCR5 항체 발현 및 생산
항-CXCR5 항체를 코딩하는 핵산
본 발명은 또한 본원에 기재된 항체 단편 및 변형된 항체를 포함한 임의의 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 본 발명은 또한 본원에 기재된 임의의 폴리뉴클레오티드를 제조하는 방법을 제공한다. 폴리뉴클레오티드는 관련 기술분야에 공지된 절차에 의해 제조 및 발현될 수 있다.
목적하는 항체, 정의된 항체 단편, 또는 그의 항원-결합 단편, 및 이러한 항체 또는 그의 단편을 코딩하는 핵산의 서열은 표준 서열분석 기술을 사용하여 결정될 수 있다. 목적하는 항체, 정의된 항체 단편, 또는 그의 항원-결합 단편을 코딩하는 핵산 서열은 재조합 생산 및 특징화를 위해 다양한 벡터 (예컨대 클로닝 및 발현 벡터) 내로 삽입될 수 있다. 중쇄, 정의된 항체 단편, 또는 중쇄의 항원-결합 단편을 코딩하는 핵산, 및 경쇄, 정의된 항체 단편, 또는 경쇄의 항원-결합 단편을 코딩하는 핵산은 동일한 벡터 또는 상이한 벡터 내로 클로닝될 수 있다.
한 측면에서, 본 발명은 임의의 하기 CXCR5 항체 및 그의 항원-결합 단편의 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다: 마우스 11G2 VH, 마우스 11G2 VL, 키메라 11G2 VH, 키메라 11G2 VL, h11G2 VH (XC152), h11G2 VH (XC155), h11G2 VH (XC156), h11G2 VH (XC157), h11G2 VH (XC350), h11G2 VH (XC351), h11G2 VH (XC352), h11G2 VH (XC353), h11G2 VH (XC354), h11G2 VL (XC151), h11G2 VL (XC153), h11G2 VL (XC154), h11G2 VL (XC346), h11G2 VL (XC347), h11G2 VL (XC348), h11G2 VL (XC349), 마우스 41A10 VH, 마우스 41A10 VL, 키메라 41A10 VH, 키메라 41A10 VL, 인간화 41A10 VH (XC147), h41A10 VH (XC148), h41A10 VH (XC150), h41A10 VL (XC142), h41A10 VL (XC143), h41A10 VL (XC144), h41A10 VL (XC145), h41A10 VL (XC146), h41A10 VL (XC149), 마우스 5H7 VH, 마우스 5H7 VL, 키메라 5H7 VH, 및 키메라 5H7 VL. 상기 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 본원에 개시된 바와 같은 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 아미노산 서열과 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%, 및 보다 바람직하게는 동일한 아미노산 서열을 코딩한다.
본 발명은 키메라 41A10, 인간화 41A10 (142/147), 인간화 41A10 (142/148), 키메라 11G2, 비-푸코실 키메라 11G2, 인간화 11G2 (151/152), 인간화 11G2 (153/155), 인간화 11G2 (153/156), 인간화 11G2 (154/155), 인간화 11G2 (154/157) 및 비-푸코실화 인간화 11G2 (154/155)로 이루어진 군으로부터 선택된 항체와 실질적으로 동일한 에피토프에 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명은 CXCR5에의 결합에 대해 키메라 41A10, 인간화 41A10 (142/147), 인간화 41A10 (142/148), 키메라 11G2, 비-푸코실 키메라 11G2, 인간화 11G2 (151/152), 인간화 11G2 (153/155), 인간화 11G2 (153/156), 인간화 11G2 (154/155), 인간화 11G2 (154/157) 및 비-푸코실 인간화 11G2 (154/155)로 이루어진 군으로부터 선택된 항체와 경쟁하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명은 서열식별번호: 1-29, 서열식별번호: 35-40, 및 서열식별번호: 47-63으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 1종 이상의 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명은 서열식별번호: 106, 107, 108 및 109 중 1개 이상에 제시된 바와 같은 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 본 발명은 서열식별번호: 95에 제시된 바와 같은 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 본 발명은 서열식별번호: 96에 제시된 바와 같은 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 본 발명은 서열식별번호: 97에 제시된 바와 같은 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 본 발명은 서열식별번호: 98에 제시된 바와 같은 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명은 수탁 번호 PTA-124323 및 수탁 번호 PTA-124324로 ATCC에 기탁된 플라스미드의 DNA 삽입물의 핵산 서열 중 하나 또는 둘 다를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명은 수탁 번호 PTA-124323으로 ATCC에 기탁된 플라스미드 내의 삽입물의 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명은 수탁 번호 PTA-124324로 ATCC에 기탁된 플라스미드 내의 삽입물의 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명은 수탁 번호 PTA-124323 및 수탁 번호 PTA-124324로 ATCC에 기탁된 플라스미드의 삽입물의 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명은 수탁 번호 PTA-124323으로 ATCC에 기탁된 플라스미드의 삽입물의 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명은 수탁 번호 PTA-124324로 ATCC에 기탁된 플라스미드의 삽입물의 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명은 서열식별번호: 106, 107, 108, 및 109 중 1개 이상에 제시된 바와 같은 1개 이상의 핵산 분자를 포함하는 세포를 제공한다. 본 발명은 서열식별번호: 106 및 107에 제시된 바와 같은 1개 이상의 핵산 분자를 포함하는 세포를 제공한다. 본 발명은 서열식별번호: 108 및 109에 제시된 1개 이상의 핵산 분자를 포함하는 세포를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 항-CXCR5 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 그의 변이체를 제공하며, 여기서 이러한 변이체 폴리뉴클레오티드는 본원에 개시된 임의의 특정 핵산 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 87%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 공유한다. 이들 양은 제한적인 것으로 의도되지 않고, 언급된 백분율 사이의 증분은 개시내용의 일부로서 구체적으로 고려된다.
본 발명은 본원에 기재된 핵산 분자에 의해 코딩된 폴리펩티드를 제공한다.
한 실시양태에서, VH 및 VL 도메인, 또는 그의 항원-결합 단편, 또는 전장 HC 또는 LC는 별개의 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된다. 대안적으로, VH 및 VL 둘 다, 또는 그의 항원-결합 단편, 또는 HC 및 LC는 단일 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된다.
임의의 이러한 서열에 상보적인 폴리뉴클레오티드도 또한 본 개시내용에 포괄된다. 폴리뉴클레오티드는 단일 가닥 (코딩 또는 안티센스) 또는 이중 가닥일 수 있고, DNA (게놈, cDNA 또는 합성) 또는 RNA 분자일 수 있다. RNA 분자는 인트론을 함유하고 1-대-1 방식으로 DNA 분자에 상응하는 HnRNA 분자, 및 인트론을 함유하지 않는 mRNA 분자를 포함한다. 추가의 코딩 또는 비-코딩 서열이 본 개시내용의 폴리뉴클레오티드 내에 존재할 수 있으나 반드시 그럴 필요는 없고, 폴리뉴클레오티드는 다른 분자 및/또는 지지체 물질에 연결될 수 있으나 반드시 그럴 필요는 없다.
폴리뉴클레오티드는 천연 서열 (즉, 항체 또는 그의 부분을 코딩하는 내인성 서열)을 포함할 수 있거나, 또는 이러한 서열의 변이체를 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드 변이체는 코딩된 폴리펩티드의 면역반응성이 천연 면역반응성 분자에 비해 저하되지 않도록 1개 이상의 치환, 부가, 결실 및/또는 삽입을 함유한다. 코딩된 폴리펩티드의 면역반응성에 대한 효과는 일반적으로 본원에 기재된 바와 같이 평가될 수 있다. 일부 실시양태에서, 변이체는 천연 항체 또는 그의 부분을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 약 70% 동일성, 일부 실시양태에서 적어도 약 80% 동일성, 일부 실시양태에서 적어도 약 90% 동일성, 및 일부 실시양태에서 적어도 약 95% 동일성을 나타낸다. 이들 양은 제한적인 것으로 의도되지 않고, 언급된 백분율 사이의 증분은 개시내용의 일부로서 구체적으로 고려된다.
2개의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열은, 2개의 서열 내 뉴클레오티드 또는 아미노산의 서열이 하기 기재된 바와 같이 최대한 상응하게 정렬되었을 때 동일하면 "동일"한 것으로 언급된다. 전형적으로, 2개의 서열 사이의 비교는 비교 윈도우에 걸쳐 서열을 비교하여 서열 유사성의 국부 영역을 확인하고 비교함으로써 수행된다. 본원에 사용된 "비교 윈도우"는 적어도 약 20개의 인접 위치, 통상적으로는 30개 내지 약 75개, 또는 40개 내지 약 50개 인접 위치의 절편을 지칭하고, 여기서 2개의 서열을 최적으로 정렬한 후에 서열을 인접 위치의 수가 동일한 참조 서열과 비교할 수 있다.
비교를 위한 서열의 최적 정렬은, 디폴트 파라미터를 사용하여 생물정보학 소프트웨어의 레이저진(Lasergene)® 스위트 내의 메갈라인(MegAlign)® 프로그램 (디엔에이스타®, 인크.(DNASTAR®, Inc.), 위스콘신주 매디슨)을 사용하여 수행될 수 있다. 이 프로그램은 하기 참고 문헌에 기재된 여러 정렬 도식을 구체화한다: 문헌 [Dayhoff, M.O., 1978, A model of evolutionary change in proteins - Matrices for detecting distant relationships. In Dayhoff, M.O. (ed.) Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, Washington DC Vol. 5, Suppl. 3, pp. 345-358; Hein J., 1990, Unified Approach to Alignment and Phylogenes pp. 626-645 Methods in Enzymology vol. 183, Academic Press, Inc., San Diego, CA; Higgins, D.G. and Sharp, P.M., 1989, CABIOS 5:151-153; Myers, E.W. and Muller W., 1988, CABIOS 4:11-17; Robinson, E.D., 1971, Comb. Theor. 11:105; Santou, N., Nes, M., 1987, Mol. Biol. Evol. 4:406-425; Sneath, P.H.A. and Sokal, R.R., 1973, Numerical Taxonomy the Principles and Practice of Numerical Taxonomy, Freeman Press, San Francisco, CA; Wilbur, W.J. and Lipman, D.J., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:726-730].
일부 실시양태에서, "서열 동일성의 백분율"은 적어도 20개 위치의 비교 윈도우에 걸쳐 2개의 최적으로 정렬된 서열을 비교함으로써 결정되고, 여기서 비교 윈도우 내의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열의 일부는 2개 서열의 최적의 정렬을 위해 참조 서열 (부가 또는 결실을 포함하지 않음)과 비교 시 20 퍼센트 이하, 통상적으로 5 내지 15 퍼센트, 또는 10 내지 12 퍼센트의 부가 또는 결실 (즉, 갭)을 포함할 수 있다. 백분율은 동일한 핵산 염기 또는 아미노산 잔기가 둘 다의 서열에서 발생한 위치의 수를 결정하여 매칭되는 위치의 수를 산출하고, 매칭되는 위치의 수를 참조 서열 내의 전체 위치의 수 (즉, 윈도우 크기)로 나누고, 그 결과에 100을 곱하여 서열 동일성의 백분율을 산출함으로써 계산된다.
변이체는 또한 또는 대안적으로, 천연 유전자, 또는 그의 일부 또는 상보체에 실질적으로 상동성일 수 있다. 이러한 폴리뉴클레오티드 변이체는 천연 항체를 코딩하는 자연 발생 DNA 서열 (또는 상보적 서열)에 중간 정도의 엄격한 조건 하에 혼성화될 수 있다.
적합한 "중간 정도의 엄격한 조건"은 5X SSC, 0.5% SDS, 1.0 mM EDTA (pH 8.0)의 용액에서 사전세척하고; 50℃-65℃, 5X SSC에서 밤새 혼성화시킨 후; 0.1 % SDS를 함유하는 각각 2X, 0.5X 및 0.2X SSC로 65℃에서 20분 동안 2회 세척하는 것을 포함한다.
본원에 사용된 "고도로 엄격한 조건" 또는 "고 엄격도 조건"은 (1) 세척 동안 낮은 이온 강도 및 높은 온도, 예를 들어 50℃에서 0.015 M 염화나트륨/0.0015 M 시트르산나트륨/0.1% 소듐 도데실 술페이트를 사용하거나; (2) 혼성화 동안 42℃에서 변성제, 예컨대 포름아미드, 예를 들어 0.1% 소 혈청 알부민/0.1% 피콜/0.1% 폴리비닐피롤리돈/750 mM 염화나트륨, 75 mM 시트르산나트륨을 함유하는 50 mM 인산나트륨 완충제 (pH 6.5)를 함유하는 50% (v/v) 포름아미드를 사용하거나; 또는 (3) 42℃에서 50% 포름아미드, 5X SSC (0.75 M NaCl, 0.075 M 시트르산나트륨), 50 mM 인산나트륨 (pH 6.8), 0.1% 피로인산나트륨, 5X 덴하르트 용액, 초음파처리된 연어 정자 DNA (50 μg/mL), 0.1% SDS 및 10% 덱스트란 술페이트를 사용하고, 42℃에서 0.2X SSC (염화나트륨/시트르산나트륨) 및 55℃에서 50% 포름아미드 중에서 세척한 다음, 55℃에서 EDTA가 함유된 0.1X SSC로 이루어진 고엄격도 세척을 수행하는 것이다. 통상의 기술자는 프로브 길이 등과 같은 인자를 조절하기 위해 필요한 온도, 이온 강도 등의 조정 방법을 인식할 것이다.
유전자 코드의 축중성으로 인해 본원에 기재된 바와 같은 폴리펩티드를 코딩하는 많은 뉴클레오티드 서열이 존재한다는 것을 관련 기술분야의 통상의 기술자는 인지할 것이다. 이들 폴리뉴클레오티드 중 일부는 임의의 천연 유전자의 뉴클레오티드 서열에 대해 최소의 상동성을 보유한다. 그럼에도 불구하고, 코돈 용법에서의 차이로 인해 달라지는 폴리뉴클레오티드가 본 개시내용에서 구체적으로 고려된다. 추가로, 본원에 제공되는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 유전자의 대립유전자는 본 개시내용의 범주 내에 속한다. 대립유전자는 뉴클레오티드의 1개 이상의 돌연변이, 예컨대 결실, 부가 및/또는 치환의 결과로서 변경된 내인성 유전자이다. 생성된 mRNA 및 단백질은 변경된 구조 또는 기능을 가질 수 있지만, 반드시 그러할 필요는 없다. 대립유전자는 표준 기술 (예컨대, 혼성화, 증폭 및/또는 데이터베이스 서열 비교)을 사용하여 확인될 수 있다.
본 개시내용의 폴리뉴클레오티드는 화학적 합성, 재조합 방법 또는 PCR을 사용하여 수득될 수 있다. 화학적 폴리뉴클레오티드 합성 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 본원에 상세하게 기재될 필요가 없다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 본원에 제공되는 서열 및 상업적 DNA 합성기를 사용하여 목적하는 DNA 서열을 생성할 수 있다.
재조합 방법을 사용하여 폴리뉴클레오티드를 제조하는 경우에, 본원에 추가로 논의된 바와 같이, 목적 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 적합한 벡터 내로 삽입할 수 있고, 이어서 상기 벡터를 복제 및 증폭을 위해 적합한 숙주 세포 내로 도입할 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 관련 기술분야에 공지된 임의의 수단에 의해 숙주 세포 내로 삽입될 수 있다. 직접 흡수, 세포내이입, 형질감염, F-정합 또는 전기천공에 의해 외인성 폴리뉴클레오티드를 도입하여 세포를 형질전환시킨다. 도입되면, 외인성 폴리뉴클레오티드는 세포 내에서 비-통합 벡터 (예컨대, 플라스미드)로서 유지될 수 있거나, 또는 숙주 세포 게놈 내로 통합될 수 있다. 이와 같이 증폭된 폴리뉴클레오티드는 관련 기술분야에 널리 공지된 방법에 의해 숙주 세포로부터 단리될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Sambrook et al., 1989]을 참조한다.
대안적으로, PCR은 DNA 서열의 재생산을 허용한다. PCR 기술은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 미국 특허 번호 4,683,195, 4,800,159, 4,754,065 및 4,683,202, 뿐만 아니라 문헌 [PCR: The Polymerase Chain Reaction, Mullis et al. eds., Birkauswer Press, Boston, 1994]에 기재되어 있다.
RNA는 적절한 벡터 내의 단리된 DNA를 사용하여 이를 적합한 숙주 세포 내로 삽입함으로써 수득할 수 있다. 세포가 복제되고 DNA가 RNA로 전사되면, 예를 들어 문헌 [Sambrook et al., 1989]에 제시된 바와 같이 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지된 방법을 사용하여 RNA를 단리할 수 있다.
일부 실시양태에서, 제1 벡터는 중쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 제2 벡터는 경쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 벡터 및 제2 벡터는 유사한 양 (예컨대 유사한 몰량 또는 유사한 질량 양)으로 숙주 세포 내로 형질감염된다. 일부 실시양태에서, 5:1 내지 1:5의 제1 벡터 및 제2 벡터의 몰- 또는 질량-비가 숙주 세포 내로 형질감염된다. 일부 실시양태에서, 중쇄를 코딩하는 벡터 및 경쇄를 코딩하는 벡터에 대해 1:1 내지 1:5의 질량 비가 사용된다. 일부 실시양태에서, 중쇄를 코딩하는 벡터 및 경쇄를 코딩하는 벡터에 대해 1:2의 질량비가 사용된다.
벡터
일부 실시양태에서, CHO 또는 CHO-유래 세포에서의, 또는 NSO 세포에서의 폴리펩티드의 발현에 최적화된 벡터가 선택된다. 예시적인 이러한 벡터는, 예를 들어, 문헌 [Running Deer et al, Biotechnol. Prog. 20:880-889 (2004)]에 기재되어 있다.
적합한 클로닝 및 발현 벡터는 다양한 성분, 예컨대 프로모터, 인핸서, 및 다른 전사 조절 서열을 포함할 수 있다. 벡터는 또한 상이한 벡터 내로의 항체 가변 도메인의 후속 클로닝을 가능하게 하도록 구축될 수 있다. 적합한 클로닝 벡터는 표준 기술에 따라 구축될 수 있거나, 또는 관련 기술분야에서 이용가능한 다수의 클로닝 벡터로부터 선택될 수 있다. 선택된 클로닝 벡터는 사용하고자 하는 숙주 세포에 따라 달라질 수 있지만, 유용한 클로닝 벡터는 일반적으로 자기-복제 능력을 가질 것이고/거나 특정한 제한 엔도뉴클레아제에 대한 단일 표적을 보유할 수 있고/있거나 벡터를 함유하는 클론을 선택하는데 사용될 수 있는 마커에 대한 유전자를 보유할 수 있다. 적합한 예는 플라스미드 및 박테리아 바이러스, 예를 들어 pUC18, pUC19, 블루스크립트(Bluescript) (예를 들어, pBS SK+) 및 그의 유도체, mp18, mp19, pBR322, pMB9, ColE1, pCR1, RP4, 파지 DNA, 및 셔틀 벡터, 예컨대 pSA3 및 pAT28을 포함한다. 이들 및 많은 다른 클로닝 벡터는 바이오라드(BioRad), 스트라테진(Strategene) 및 인비트로젠(Invitrogen)과 같은 판매업체로부터 입수가능하다. 발현 벡터가 추가로 제공된다. 발현 벡터는 일반적으로 개시내용에 따른 폴리뉴클레오티드를 함유하는 복제가능한 폴리뉴클레오티드 구축물이다. 이는 발현 벡터가 숙주 세포 내에서 에피솜으로서 또는 염색체 DNA의 통합 부분으로서 복제가능하여야 한다는 것을 의미한다. 적합한 발현 벡터는 플라스미드, 바이러스 벡터, 예컨대 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스, 레트로바이러스, 코스미드, 및 PCT 공개 번호 WO 87/04462에 개시된 발현 벡터(들)를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 벡터 성분은 일반적으로 하기 중 하나 이상을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다: 신호 서열; 복제 기점; 1개 이상의 마커 유전자; 적합한 전사 제어 요소 (예컨대, 프로모터, 인핸서 및 종결인자). 발현 (즉, 번역)을 위해서는 통상적으로 1개 이상의 번역 제어 요소, 예컨대 리보솜 결합 부위, 번역 개시 부위 및 정지 코돈이 또한 필요하다.
관심 폴리뉴클레오티드를 함유하는 벡터 및/또는 폴리뉴클레오티드 그 자체는 전기천공; 염화칼슘, 염화루비듐, 인산칼슘, DEAE-덱스트란 또는 다른 물질을 사용한 형질감염; 미세발사체 충격; 리포펙션; 및 감염 (예를 들어, 벡터가 감염원, 예컨대 백시니아 바이러스인 경우)을 비롯한, 수많은 적절한 수단 중 임의의 것에 의해 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 도입 벡터 또는 폴리뉴클레오티드의 선택은 종종 숙주 세포의 특색에 따라 달라질 것이다.
숙주 세포
항체 또는 그의 항원-결합 단편은 적합한 숙주 세포를 사용하여 재조합적으로 제조될 수 있다. 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 코딩하는 핵산은 발현 벡터 내로 클로닝될 수 있고, 이는 이어서 숙주 세포, 예컨대 이. 콜라이(E. coli) 세포, 효모 세포, 곤충 세포, 원숭이 COS 세포, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포, 또는 달리 이뮤노글로불린 단백질을 생산하지 않는 골수종 세포 내로 도입되어, 재조합 숙주 세포에서 항체의 합성이 수득될 수 있다. 바람직한 숙주 세포는 관련 기술분야에 널리 공지된 많은 세포 중, CHO 세포, 인간 배아 신장 HEK-293 세포, 또는 Sp2.0 세포를 포함한다. 항체 단편은 전장 항체의 단백질분해 또는 다른 분해에 의해, 재조합 방법에 의해, 또는 화학적 합성에 의해 생산될 수 있다. 항체의 폴리펩티드 단편, 특히 최대 약 50개의 아미노산의 보다 짧은 폴리펩티드는 화학적 합성에 의해 편리하게 제조될 수 있다. 단백질 및 펩티드에 대한 화학적 합성 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있고 상업적으로 입수가능하다.
다양한 실시양태에서, 항-CXCR5 중쇄 및/또는 항-CXCR5 경쇄는 원핵 세포, 예컨대, 박테리아 세포에서; 또는 진핵 세포, 예컨대, 진균 세포 (예컨대, 효모), 식물 세포, 곤충 세포 및 포유동물 세포에서 발현될 수 있다. 이러한 발현은 예를 들어, 관련 기술분야에 공지된 절차에 따라 수행될 수 있다. 폴리펩티드를 발현시키는데 사용될 수 있는 예시적인 진핵 세포는 COS 7 세포를 포함한 COS 세포; 293-6E 세포를 포함한 293 세포; CHO-S, DG44. Lecl3 CHO 세포, 및 FUT8 CHO 세포를 포함한 CHO 세포; PER.C6® 세포 (크루셀); 및 NSO 세포를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 항-CXCR5 중쇄 및/또는 항-CXCR5 경쇄는 효모에서 발현될 수 있다. 예를 들어, 미국 공개 번호 US 2006/0270045 Al을 참조한다. 일부 실시양태에서, 항-CXCR5 중쇄 및/또는 항-CXCR5 경쇄에 목적하는 번역후 변형을 만드는 능력에 기초하여 특정한 진핵 숙주 세포가 선택된다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, CHO 세포는 293 세포에서 생산된 동일한 폴리펩티드보다 더 높은 시알릴화 수준을 갖는 폴리펩티드를 생산한다.
1개 이상의 핵산을 목적하는 숙주 세포 내로 도입하는 것은 인산칼슘 형질감염, DEAE-덱스트란 매개 형질감염, 양이온성 지질-매개 형질감염, 전기천공, 형질도입, 감염 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는 임의의 방법에 의해 달성될 수 있다. 비제한적인 예시적인 방법은 예를 들어 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)]에 기재되어 있다. 핵산은 임의의 적합한 방법에 따라 목적하는 숙주 세포를 일시적으로 또는 안정하게 형질감염시킬 수 있다.
일부 실시양태에서 비-푸코실화 항-CXCR5 항체는 비-푸코실화 항체를 생산할 수 있는 세포, 예컨대 단백질 푸코실화가 결핍된 Lec3 CHO 세포 (Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986); 미국 특허 출원 번호 US 2003/0157108; 및 WO 2004/056312, 특히 실시예 11), 및 녹아웃 세포주, 예컨대 기능적 알파-1,6-푸코실트랜스퍼라제 유전자, FUT8이 결여된 세포주, 예를 들어, 녹아웃 CHO 세포 (예를 들어, 문헌 [Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004); Kanda et al., Biotechnol. Bioeng, 94(4):680-688 (2006)]; 및 WO2003/085107 참조)에서 생산된다. 일부 실시양태에서, 비-푸코실화 항-CXCR5 항체는 기능적 FUT8 유전자가 결여된 CHO 세포에서 생산된다. 일부 실시양태에서, 비-푸코실화 항-CXCR5 항체는 포텔리젠트® CHOK1SV 세포 (바이오와/론자, 뉴저지주 앨런데일)에서 생산된다.
항-CXCR5 항체는 임의의 적합한 방법에 의해 정제될 수 있다. 이러한 방법은 친화성 매트릭스 또는 소수성 상호작용 크로마토그래피의 사용을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 적합한 친화성 리간드는 CXCR5 ECD 및 항체 불변 영역에 결합하는 리간드를 포함한다. 예를 들어, 불변 영역에 결합하고, 항-CXCR5 항체를 정제하는 데 단백질 A, 단백질 G, 단백질 A/G, 또는 항체 친화성 칼럼이 사용될 수 있다. 소수성 상호작용 크로마토그래피, 예를 들어, 부틸 또는 페닐 칼럼이 또한 일부 폴리펩티드를 정제하는데 적합할 수 있다. 많은 폴리펩티드 정제 방법이 관련 기술분야에 공지되어 있다.
일부 실시양태에서, 항-CXCR5 항체는 무세포 시스템에서 생산된다. 비제한적인 예시적인 무세포 시스템은, 예를 들어, 문헌 [Sitaraman et al., Methods Mol. Biol. 498: 229-44 (2009); Spirin, Trends Biotechnol. 22: 538-45 (2004); Endo et al., Biotechnol. Adv. 21: 695-713 (2003)]에 기재되어 있다.
V. 용도 및 의료 요법
일부 측면에서, 본 개시내용은 항-CXCR5 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 제약 조성물의 치료 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 항-CXCR5 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 사용하여 CXCR5 활성 또는 신호전달을 제거하거나, 억제하거나 또는 감소시키는 치료 방법을 제공한다. 치료되는 장애는 CXCR5 활성 또는 신호전달의 제거, 억제 또는 감소에 의해 개선되거나, 호전되거나, 억제되거나 또는 예방되는 임의의 질환 또는 상태이다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 CXCR5 활성 또는 신호전달을 제거, 억제 또는 감소시키는데 사용하기 위한 항-CXCR5 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다. 일부 실시양태에서, 용도는 항-CXCR5 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 제약 조성물의 치료 유효량을 투여하는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, CXCR5 활성 또는 신호전달의 억제 또는 감소는 CXCR5 활성 또는 신호전달의 제거, 억제 또는 감소에 의해 개선되거나, 호전되거나, 억제되거나 또는 예방되는 임의의 질환 또는 상태를 치료할 수 있다.
이러한 질환, 장애 또는 상태는, 본원에 개시된 교시내용을 제공받는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 인지될 바와 같은, 염증 반응, 예컨대 전신 홍반성 루푸스 (SLE); 만성 염증 반응; 아테롬성동맥경화증; 백혈구 부착 결핍; 류마티스 관절염; 당뇨병 (예를 들어, 제I형 당뇨병 또는 인슐린 의존성 당뇨병); 다발성 경화증; 레이노 증후군; 자가면역 갑상선염; 알레르기성 뇌척수염; 쇼그렌 증후군; 소아 발병 당뇨병; 및 전형적으로 결핵, 사르코이드증, 다발근염, 육아종증 및 혈관염에서 발견되는 시토카인 및 T-림프구에 의해 매개되는 급성 및 지연형 과민성과 연관된 면역 반응; 베게너병; 악성 빈혈 (애디슨병); 백혈구 누출을 수반하는 질환; 중추 신경계 (CNS) 염증성 장애; 다발성 기관 손상 증후군; 용혈성 빈혈 (한랭글로불린혈증 또는 쿰스 양성 빈혈을 포함하나 이에 제한되지는 않음); 중증 근무력증; 항원-항체 복합체 매개 질환; 항-사구체 기저막 질환; 항인지질 증후군; 알레르기성 신경염; 그레이브스병; 램버트-이튼 근무력 증후군; 수포성 유천포창; 천포창; 자가면역 다발내분비병증; 백반증; 라이터병; 강직-사람 증후군; 베체트병; 거대 세포 동맥염; 면역 복합체 신염; IgA 신병증; IgM 다발신경병증; 면역 혈소판감소성 자반증 (ITP) 또는 자가면역 혈소판감소증 및 자가면역 용혈성 질환; 하시모토 갑상선염; 자가면역 간염; 자가면역 혈우병; 자가면역 림프증식성 증후군 (ALPS); 자가면역 포도막망막염; 길랑-바레 증후군; 굿패스쳐 증후군; 혼합 결합 조직 질환; 자가면역-연관 불임; 결절성 다발동맥염; 원형 탈모증; 특발성 점액수종; 이식편 대 숙주 질환; 근육 이영양증 (뒤시엔느, 베커, 근긴장성, 지대, 안면견갑상완, 선천성, 안인두, 원위, 에머리-드레이푸스)을 포함하나 이에 제한되지는 않는다; 및 췌장암, 결장암, 방광암, T-세포 백혈병, 및 B-세포 백혈병과 같은 CXCR5를 발현하는 암 세포의 증식을 제어하는 것.
본 발명의 항-CXCR5 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 또한, 예를 들어 진단 목적을 위해, 샘플 내의 CXCR5 또는 CXCR5-발현 세포를 검출 및/또는 측정하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 항-CXCR5 항체 또는 그의 단편은 CXCR5의 이상 발현 (예를 들어, 과다발현, 과소발현, 발현의 결여 등)을 특징으로 하는 상태 또는 질환을 진단하는데 사용될 수 있다. CXCR5에 대한 예시적인 진단 검정은 환자로부터 수득한 샘플을 본 발명의 항-CXCR5 항체와 접촉시키는 것을 포함할 수 있고, 여기서 항-CXCR5 항체는 검출가능한 표지 또는 리포터 분자로 표지된다.
본원에 사용된 "제약상 허용되는 담체" 또는 "제약상 허용되는 부형제"는 활성 성분과 조합되는 경우에 상기 성분이 생물학적 활성을 보유하게 하고 대상체의 면역계와 비-반응성인 임의의 물질을 포함한다. 예는 임의의 표준 제약 담체, 예컨대 포스페이트 완충 염수 용액, 물, 에멀젼, 예컨대 오일/물 에멀젼, 및 다양한 유형의 습윤제를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 에어로졸 또는 비경구 투여에 바람직한 희석제는 포스페이트 완충 염수 (PBS) 또는 통상의 (0.9%) 염수이다. 이러한 담체를 포함하는 조성물은 널리 공지된 통상적인 방법에 의해 제제화된다 (예를 들어, 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, A. Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990; 및 Remington, The Science and Practice of Pharmacy, 20th Ed., Mack Publishing, 2000] 참조).
VI. 조성물
개시내용은 또한 유효량의 본원에 기재된 CXCR5 항체, 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 이러한 조성물의 예 뿐만 아니라 제제화 방법이 또한 본원에 기재되어 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 1종 이상의 CXCR5 항체를 포함한다. 다른 실시양태에서, CXCR5 항체는 CXCR5를 인식한다. 다른 실시양태에서, CXCR5 항체는 인간 항체이다. 다른 실시양태에서, CXCR5 항체는 인간화 항체이다. 일부 실시양태에서, CXCR5 항체는 목적하는 면역 반응, 예컨대 항체-매개 용해 또는 ADCC를 촉발할 수 있는 불변 영역을 포함한다. 다른 실시양태에서, CXCR5 항체는 비-푸코실화된 불변 영역을 포함하며, 푸코실화된 달리 동일한 항체와 비교하여 증진된 ADCC를 제공한다. 다른 실시양태에서, CXCR5 항체는 항체의 1개 이상의 CDR(들) (예컨대, 1, 2, 3, 4, 5개, 또는 일부 실시양태에서는 모든 6개의 CDR)을 포함한다.
조성물은 1종 초과의 CXCR5 항체 또는 그의 항원-결합 단편 (예를 들어, CXCR5의 상이한 에피토프를 인식하는 CXCR5 항체의 혼합물)를 포함할 수 있는 것으로 이해된다. 다른 예시적인 조성물은 동일한 에피토프(들)를 인식하는 1종 초과의 CXCR5 항체, 또는 CXCR5의 상이한 에피토프에 결합하는 상이한 종의 CXCR5 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 CXCR5의 상이한 변이체를 인식하는 CXCR5 항체의 혼합물을 포함한다.
본 개시내용에 사용되는 조성물은 동결건조 제제 또는 수용액의 형태로 제약상 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제를 추가로 포함할 수 있다 (Remington: The Science and practice of Pharmacy 20th Ed., 2000, Lippincott Williams and Wilkins, Ed. K. E. Hoover). 허용되는 담체, 부형제, 또는 안정화제는 투여량 및 농도에서 수용자에게 비독성이고, 완충제, 예컨대 포스페이트, 시트레이트, 및 다른 유기산; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 항산화제; 보존제 (예컨대 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 알킬 파라벤, 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 시클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량 (약 10개 미만의 잔기) 폴리펩티드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 이뮤노글로불린; 친수성 중합체, 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌, 또는 리신; 모노사카라이드, 디사카라이드, 및 글루코스, 만노스, 또는 덱스트란을 포함하는 다른 탄수화물; 킬레이트화제, 예컨대 EDTA; 당, 예컨대 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염-형성 반대-이온, 예컨대 나트륨; 금속 착물 (예를 들어 Zn-단백질 착물); 및/또는 비-이온 계면활성제, 예컨대 트윈(TWEEN)™, 플루로닉스(PLURONICS)™ 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 포함할 수 있다. 제약상 허용되는 부형제는 본원에 추가로 기재되어 있다.
CXCR5 항체, 그의 항원-결합 단편 및 그의 조성물은 또한 작용제의 유효성을 증진 및/또는 보충하는 역할을 하는 다른 작용제와 조합되어 사용될 수 있다.
특정 실시양태에서, CXCR5 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 투여 전에 CXCR5와 복합체화된다. 특정 실시양태에서, CXCR5 항체는 투여 전에 CXCR5와 복합체화되지 않는다.
개시내용은 또한 개시내용의 임의의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제약 조성물을 비롯한 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 본원에 기재된 바와 같은 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 포함한다. 다른 실시양태에서, 조성물은 본원에 기재된 임의의 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 포함한다. 다른 실시양태에서, 조성물은 서열식별번호: 1 및 서열식별번호: 6에 제시된 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 중 어느 하나 또는 둘 다, 서열식별번호: 1 및 서열식별번호: 10에 제시된 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 중 어느 하나 또는 둘 다, 서열식별번호: 1 및 서열식별번호: 12에 제시된 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 중 어느 하나 또는 둘 다, 서열식별번호: 5 및 서열식별번호: 6에 제시된 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 중 어느 하나 또는 둘 다, 서열식별번호: 5 및 서열식별번호: 10에 제시된 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 중 어느 하나 또는 둘 다, 서열식별번호: 5 및 서열식별번호: 12에 제시된 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 중 어느 하나 또는 둘 다, 서열식별번호: 13 및 서열식별번호: 17에 제시된 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 중 어느 하나 또는 둘 다, 서열식별번호: 13 및 서열식별번호: 18에 제시된 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 중 어느 하나 또는 둘 다, 서열식별번호: 13 및 서열식별번호: 63에 제시된 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 중 어느 하나 또는 둘 다, 서열식별번호: 1 및 서열식별번호: 52에 제시된 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 중 어느 하나 또는 둘 다, 서열식별번호: 1 및 서열식별번호: 53에 제시된 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 중 어느 하나 또는 둘 다, 서열식별번호: 1 및 서열식별번호: 54에 제시된 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 중 어느 하나 또는 둘 다, 서열식별번호: 1 및 서열식별번호: 55에 제시된 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 중 어느 하나 또는 둘 다, 서열식별번호: 1 및 서열식별번호: 56에 제시된 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 중 어느 하나 또는 둘 다, 서열식별번호: 1 및 서열식별번호: 57에 제시된 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 중 어느 하나 또는 둘 다, 서열식별번호: 6 및 서열식별번호: 48에 제시된 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 중 어느 하나 또는 둘 다, 서열식별번호: 6 및 서열식별번호: 49에 제시된 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 중 어느 하나 또는 둘 다, 서열식별번호: 6 및 서열식별번호: 50에 제시된 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 중 어느 하나 또는 둘 다, 서열식별번호: 6 및 서열식별번호: 51에 제시된 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 중 어느 하나 또는 둘 다, 서열식별번호: 17 및 서열식별번호: 58에 제시된 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 중 어느 하나 또는 둘 다, 서열식별번호: 17 및 서열식별번호: 59에 제시된 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 중 어느 하나 또는 둘 다, 서열식별번호: 17 및 서열식별번호: 60에 제시된 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 중 어느 하나 또는 둘 다, 서열식별번호: 17 및 서열식별번호: 61에 제시된 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 중 어느 하나 또는 둘 다, 서열식별번호: 17 및 서열식별번호: 62에 제시된 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 중 어느 하나 또는 둘 다, 서열식별번호: 52 및 서열식별번호: 1에 제시된 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 중 어느 하나 또는 둘 다, 서열식별번호: 52 및 서열식별번호: 5에 제시된 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 중 어느 하나 또는 둘 다, 서열식별번호: 52 및 서열식별번호: 47에 제시된 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 중 어느 하나 또는 둘 다, 서열식별번호: 52 및 서열식별번호: 48에 제시된 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 중 어느 하나 또는 둘 다, 서열식별번호: 52 및 서열식별번호: 49에 제시된 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 중 어느 하나 또는 둘 다, 서열식별번호: 52 및 서열식별번호: 50에 제시된 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 중 어느 하나 또는 둘 다, 서열식별번호: 52 및 서열식별번호: 51에 제시된 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 중 어느 하나 또는 둘 다, 또는 서열식별번호: 35 및 서열식별번호: 36에 제시된 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 중 어느 하나 또는 둘 다를 포함한다.
또 다른 측면에서, 폴리뉴클레오티드는 개시내용의 항체의 VH, VL 및/또는 VH 및 VL 둘 다를 코딩할 수 있다. 즉, 조성물은 개시내용의 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 코딩하는 단일 폴리뉴클레오티드 또는 1종 초과의 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
본 개시내용의 제약 조성물은 또한 조합 요법으로, 예컨대 다른 작용제와 조합되어 투여될 수 있다. 예를 들어, 조합 요법은 적어도 하나의 다른 요법과 조합된 본 개시내용의 CXCR5 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함할 수 있고, 여기서 요법은 수술, 면역요법, 또는 약물 요법일 수 있다.
본 개시내용의 제약 화합물은 1종 이상의 제약상 허용되는 염을 포함할 수 있다. 이러한 염의 예는 산 부가염 및 염기 부가염을 포함한다. 산 부가염은 비독성 무기 산, 예컨대 염산, 질산, 인산, 황산, 브로민화수소산, 아이오딘화수소산, 아인산 등으로부터 유래된 것, 뿐만 아니라 비독성 유기 산, 예컨대 지방족 모노- 및 디카르복실산, 페닐-치환된 알칸산, 히드록시 알칸산, 방향족 산, 지방족 및 방향족 술폰산 등으로부터 유래된 것을 포함한다. 염기 부가염은 알칼리 토금속, 예컨대 나트륨, 칼륨, 마그네슘, 칼슘 등으로부터 유래된 것, 뿐만 아니라 비독성 유기 아민, 예컨대 N,N'-디벤질에틸렌디아민, N-메틸글루카민, 클로로프로카인, 콜린, 디에탄올아민, 에틸렌디아민, 프로카인 등으로부터 유래된 것을 포함한다.
본 개시내용의 제약 조성물은 또한 제약상 허용되는 항산화제를 포함할 수 있다. 제약상 허용되는 항산화제의 예는 다음을 포함한다: (1) 수용성 항산화제, 예컨대 아스코르브산, 시스테인 히드로클로라이드, 중황산나트륨, 메타중아황산나트륨, 아황산나트륨 등; (2) 유용성 항산화제, 예컨대 아스코르빌 팔미테이트, 부틸화 히드록시아니솔 (BHA), 부틸화 히드록시톨루엔 (BHT), 레시틴, 프로필 갈레이트, 알파-토코페롤 등; 및 (3) 금속 킬레이트화제, 예컨대 시트르산, 에틸렌디아민 테트라아세트산 (EDTA), 소르비톨, 타르타르산, 인산 등을 포함한다.
본 개시내용의 제약 조성물에 사용될 수 있는 적합한 수성 및 비-수성 담체의 예는 물, 에탄올, 폴리올 (예컨대, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 그의 적합한 혼합물, 식물성 오일, 예컨대 올리브 오일, 및 주사가능한 유기 에스테르, 예컨대 에틸 올레에이트를 포함한다. 적절한 유동성은 예를 들어 코팅 물질, 예컨대 레시틴의 사용에 의해, 분산액의 경우에 요구되는 입자 크기의 유지에 의해, 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다.
이들 조성물은 또한 아주반트, 예컨대 보존제, 습윤제, 유화제 및 분산제를 함유할 수 있다. 미생물의 존재의 방지는 멸균 절차, 및 다양한 항박테리아제 및 항진균제, 예를 들어 파라벤, 클로로부탄올, 페놀 소르브산 등을 함유시키는 것 둘 다에 의해 보장될 수 있다. 등장화제, 예컨대 당, 염화나트륨 등을 조성물에 포함시키는 것이 또한 바람직할 수 있다. 또한, 주사가능한 제약 형태의 지속 흡수는 흡수를 지연시키는 작용제, 예컨대 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 포함시키는 것에 의해 이루어질 수 있다.
제약 조성물은 전형적으로, 제조 및 저장 조건 하에서 멸균되고 안정해야 한다. 조성물은 용액, 마이크로에멀젼, 리포솜, 또는 높은 약물 농도에 적합한 다른 정렬된 구조로서 제제화될 수 있다. 담체는, 예를 들어 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 그의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적절한 유동성은 예를 들어 코팅제, 예컨대 레시틴의 사용에 의해, 분산액의 경우에 요구되는 입자 크기의 유지에 의해, 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 많은 경우에, 등장화제, 예를 들어 당, 폴리알콜, 예컨대 만니톨, 소르비톨 또는 염화나트륨을 조성물에 포함시키는 것이 적합할 것이다. 주사가능한 조성물의 지속 흡수는 흡수를 지연시키는 작용제, 예를 들어 모노스테아레이트 염 및 젤라틴을 조성물에 포함시키는 것에 의해 이루어질 수 있다.
멸균 주사가능한 용액은 필요량의 활성 화합물을 상기 열거된 성분 중 하나 또는 그의 조합과 함께 적절한 용매 중에 혼입시킨 후에, 필요에 따라 멸균 마이크로여과하여 제조될 수 있다.
일반적으로, 분산액은 활성 화합물을 염기성 분산 매질 및 상기 열거된 것으로부터의 필요한 다른 성분을 함유하는 멸균 비히클 내에 혼입시켜 제조한다. 멸균 주사가능한 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우에, 바람직한 제조 방법은 활성 성분 플러스 이전에 멸균-여과된 그의 용액으로부터의 임의의 추가의 목적하는 성분의 분말을 생성하는 진공 건조 및 냉동-건조 (동결건조)이다.
본 개시내용의 제약 조성물은 안과적 투여에 적합한 제제로 제조, 패키지 또는 판매될 수 있다. 이러한 제제는, 예를 들어 수성 또는 유성 액체 담체 중 활성 성분의 0.1%-1.0% (w/w) 용액 또는 현탁액을 포함하는 점안제의 형태일 수 있다. 이러한 점안제는 완충제, 염, 또는 본원에 기재된 1종 이상의 다른 추가의 성분을 추가로 포함할 수 있다. 유용한 다른 안과적으로 투여가능한 제제는 미세결정질 형태 또는 리포좀 제제로 활성 성분을 포함하는 것을 포함한다.
본원에 사용된 "추가의 성분"은 하기: 부형제; 표면 활성제; 분산제; 불활성 희석제; 과립화제 및 붕해제; 결합제; 윤활제; 감미제; 향미제; 착색제; 보존제; 생리학상 분해성 조성물, 예컨대 젤라틴; 수성 비히클 및 용매; 유성 비히클 및 용매; 현탁화제; 분산제 또는 습윤제; 유화제, 완화제; 완충제; 염; 증점제; 충전제; 유화제; 항산화제; 항생제; 항진균제; 안정화제; 및 제약상 허용되는 중합체성 또는 소수성 물질 중 1종 이상을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 개시내용의 제약 조성물에 포함될 수 있는 다른 "추가의 성분"은 관련 기술분야에 공지되어 있고, 예를 들어 본원에 참조로 포함되는 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, Genaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA (1985)]에 기재되어 있다.
한 실시양태에서, CXCR5 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 5 mg/mL, 또는 일부 실시양태에서, 약 10 mg/mL, 또는 일부 실시양태에서, 약 15 mg/mL, 또는 일부 실시양태에서, 약 20 mg/mL의 항체, 또는 일부 실시양태에서, 약 25 mg/mL, 또는 일부 실시양태에서, 약 50 mg/mL를 아세트산나트륨, 폴리소르베이트 80, 및 염화나트륨과 함께 함유하는 pH 약 5 내지 6 범위의 멸균 수용액으로서 정맥내 제제로 투여된다. 일부 실시양태에서, 정맥내 제제는 5 또는 10 mg/mL의 항체를 20 mM 아세트산나트륨, 0.2 mg/mL 폴리소르베이트 80, 및 140 mM 염화나트륨과 함께 함유하는 pH 5.5의 멸균 수용액이다. 추가로, 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 용액은 많은 다른 화합물 중에서, 히스티딘, 만니톨, 수크로스, 트레할로스, 글리신, 폴리(에틸렌) 글리콜, EDTA, 메티오닌 및 그의 임의의 조합, 및 관련 기술분야에 공지된 많은 다른 화합물을 포함할 수 있다.
한 실시양태에서, 본 개시내용의 제약 조성물은 하기 성분: 50 mg/mL 본 개시내용의 CXCR5 항체 또는 항원-결합 단편, 20 mM 히스티딘, 8.5% 수크로스, 및 0.02% 폴리소르베이트 80, 0.005% EDTA, pH 5.8을 포함하고; 또 다른 실시양태에서 본 발명의 제약 조성물은 하기 성분: 100 mg/mL 본 개시내용의 CXCR5 항체 또는 항원-결합 단편, 10 mM 히스티딘, 5% 수크로스, 및 0.01% 폴리소르베이트 80, pH 5.8을 포함한다. 이러한 조성물은 액체 제제 또는 동결건조 분말로서 제공될 수 있다. 분말이 전체 부피로 재구성되는 경우에, 조성물은 동일한 제제를 유지한다. 대안적으로, 분말은 절반 부피로 재구성될 수 있고, 그러한 경우에 조성물은 100 mg 본 개시내용의 CXCR5 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 20 mM 히스티딘, 10% 수크로스, 및 0.02% 폴리소르베이트 80, pH 5.8을 포함한다.
한 실시양태에서, 용량의 일부는 정맥내 볼루스에 의해 투여되고, 나머지는 항체 제제의 주입에 의해 투여된다. 예를 들어, CXCR5 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 0.01 mg/kg 정맥내 주사는 볼루스로서 주어질 수 있고, 항체 용량의 나머지는 정맥내 주사에 의해 투여될 수 있다. CXCR5 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 미리결정된 용량은, 예를 들어 1시간 30분 내지 2시간 내지 5시간의 기간에 걸쳐 투여될 수 있다.
작용제가 예를 들어 소분자인 치료제와 관련하여, 이는 관련 기술분야에 널리 공지된 바와 같이 생리학상 허용되는 에스테르 또는 염의 형태로, 예컨대 생리학상 허용되는 양이온 또는 음이온과 조합되어 제약 조성물 중에 존재할 수 있다.
본원에 기재된 제약 조성물의 제제는 약리학 기술분야에 공지되어 있거나 이후에 개발될 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 일반적으로, 이러한 정제용 방법은 활성 성분을 담체 또는 1종 이상의 다른 보조 성분과 회합시키는 단계, 및 이어서, 필요한 경우 또는 바람직한 경우에, 생성물을 목적하는 단일- 또는 다중-용량 단위로 성형 또는 패키지하는 단계를 포함한다.
한 실시양태에서, 본 개시내용의 조성물은 내독소 및/또는 관련 발열성 물질이 실질적으로 없는 발열원-무함유 제제이다. 내독소는 미생물 내부에 한정되고 미생물이 붕괴되거나 사멸되는 경우에 방출되는 독소를 포함한다. 발열성 물질은 또한, 박테리아 및 다른 미생물의 외막으로부터의 열-유도성, 열안정성 물질 (당단백질)을 포함한다. 이들 물질 둘 다는 인간에게 투여되는 경우에 열, 저혈압 및 쇼크를 유발할 수 있다. 잠재적으로 유해한 효과로 인해, 정맥내로 투여되는 제약 약물 용액으로부터 심지어 적은 양의 내독소도 제거하는 것이 유리하다. 미국 식품 의약품국 ("FDA")은 정맥내 약물 적용을 위한 단일 1시간 기간 내에 체중 킬로그램당 용량당 5 내독소 단위 (EU)의 상한치를 설정하였다 (The United States Pharmacopeial Convention, Pharmacopeial Forum 26 (1):223 (2000)). 치료 단백질을 체중 킬로그램당 수백 또는 수천 밀리그램의 양으로 투여하는 경우에, 심지어 미량의 내독소도 제거하는 것이 유리하다. 한 실시양태에서, 조성물 중의 내독소 및 발열원 수준은 10 EU/mg 미만, 또는 5 EU/mg 미만, 또는 1 EU/mg 미만, 또는 0.1 EU/mg 미만, 또는 0.01 EU/mg 미만, 또는 0.001 EU/mg 미만이다. 또 다른 실시양태에서, 조성물 중의 내독소 및 발열원 수준은 약 10 EU/mg 미만, 또는 약 5 EU/mg 미만, 또는 약 1 EU/mg 미만, 또는 약 0.1 EU/mg 미만, 또는 약 0.01 EU/mg 미만, 또는 약 0.001 EU/mg 미만이다.
한 실시양태에서, 본 개시내용은 조성물을 투여하는 것을 포함하며, 여기서 상기 투여는 경구, 비경구, 근육내, 비강내, 질, 직장, 설측, 설하, 협측, 협부내, 정맥내, 피부, 피하 또는 경피이다.
또 다른 실시양태에서, 본 개시내용은 조성물을 다른 요법, 예컨대 수술, 화학요법, 호르몬 요법, 생물학적 요법, 면역요법 또는 방사선 요법과 조합하여 투여하는 것을 추가로 포함한다.
VII. 투약/투여
본 개시내용의 CXCR5 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 제약 또는 멸균 조성물을 제조하기 위해, 항체는 제약상 허용되는 담체 또는 부형제와 혼합된다. 치료 및 진단제의 제제는 예를 들어 동결건조 분말, 슬러리, 수용액, 로션 또는 현탁액 형태로 생리학상 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제와 함께 혼합함으로써 제조될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Hardman, et al. (2001) Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, McGraw-Hill, New York, N.Y.; Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott, Williams, and Wilkins, New York, N. Y.; Avis, et al. (eds.) (1993) Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications, Marcel Dekker, NY; Lieberman, et al. (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets, Marcel Dekker, NY; Lieberman, et al. (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems, Marcel Dekker, NY; Weiner and Kotkoskie (2000) Excipient Toxicity and Safety, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y.] 참조).
치료를 위한 투여 요법을 선택하는 것은 엔티티의 혈청 또는 조직 교체율, 증상 수준, 엔티티의 면역원성 및 생물학적 매트릭스에서의 표적 세포의 접근성을 비롯한 여러 인자에 따라 달라진다. 특정 실시양태에서, 투여 요법은 허용되는 부작용 수준과 일치하여 환자에게 전달되는 치료제의 양을 최대화한다. 따라서, 전달되는 생물제제의 양은 부분적으로 특정한 엔티티 및 치료되는 상태의 중증도에 따라 달라진다. 항체, 시토카인, 및 소분자의 적절한 용량을 선택하는 것에 대한 지침은 입수 가능하다 (예를 들어, 문헌 [Wawrzynczak, 1996, Antibody Therapy, Bios Scientific Pub. Ltd, Oxfordshire, UK; Kresina (ed.), 1991, Monoclonal Antibodies, Cytokines and Arthritis, Marcel Dekker, New York, N.Y.; Bach (ed.),1993, Monoclonal Antibodies and Peptide Therapy in Autoimmune Diseases, Marcel Dekker, New York, N. Y.; Baert, et al., 2003, New Engl. J. Med. 348:601-608; Milgrom, et al., 1999, New Engl. J. Med. 341:1966-1973; Slamon, et al., 2001, New Engl. J. Med. 344:783-792; Beniaminovitz, et al., 2000, New Engl. J. Med. 342:613-619; Ghosh, et al., 2003, New Engl. J. Med. 348:24-32; Lipsky, et al., 2000, New Engl. J. Med. 343:1594-1602] 참조).
적절한 용량을 결정하는 것은 예를 들어 치료에 영향을 미치는 것으로 관련 기술분야에 공지되어 있거나 그러한 것으로 의심되거나, 또는 치료에 영향을 미칠 것으로 예측되는 파라미터 또는 인자를 사용하여 임상의에 의해 이루어진다. 일반적으로, 용량은 최적 용량보다 다소 적은 양에서 시작하며, 그후 임의의 부정적 부작용에 비해 목적하거나 최적인 효과가 달성될 때까지 소량 증분으로 증가된다. 중요한 진단 척도는, 예를 들어 염증의 증상 또는 생산된 염증성 시토카인의 수준을 포함한다.
본 개시내용의 제약 조성물 중 활성 성분의 실제 투여량 수준은 환자에게 독성이지 않으면서, 특정한 환자, 조성물 및 투여 방식에 대해 목적하는 치료 반응을 달성하는데 효과적인 활성 성분의 양을 수득하도록 달라질 수 있다. 선택되는 투여량 수준은 사용된 본 개시내용의 특정한 조성물, 또는 그의 에스테르, 염 또는 아미드의 활성, 투여 경로, 투여 시간, 사용되는 특정한 화합물의 배출 속도, 치료의 지속기간, 사용된 특정한 조성물과 조합되어 사용되는 다른 약물, 화합물 및/또는 물질, 치료되는 환자의 연령, 성별, 체중, 상태, 전반적 건강 및 과거 병력, 및 의학 기술분야에 널리 공지되어 있는 기타 인자를 비롯한 다양한 약동학적 인자에 따라 달라질 것이다.
본 개시내용의 CXCR5 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 조성물은 연속 주입에 의해, 또는 예를 들어 1일, 1주, 또는 1주에 1-7회 간격의 투여에 의해 제공될 수 있다. 용량은 정맥내로, 피하로, 국소로, 경구로, 비강으로, 직장으로, 근육내, 뇌내로 또는 흡입에 의해 제공될 수 있다. 구체적 용량 프로토콜은 유의한 바람직하지 않은 부작용을 회피하는 최대 용량 또는 투여 빈도를 수반하는 것이다. 전체 매주 용량은 적어도 0.05 μg/kg 체중, 적어도 0.2 μg/kg, 적어도 0.5 μg/kg, 적어도 1 μg/kg, 적어도 10 μg/kg, 적어도 100 μg/kg, 적어도 0.2 mg/kg, 적어도 1.0 mg/kg, 적어도 2.0 mg/kg, 적어도 10 mg/kg, 적어도 15 mg/kg, 적어도 20 mg/kg, 적어도 25 mg/kg, 또는 적어도 50 mg/kg일 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Yang, et al., 2003, New Engl. J. Med. 349:427-434; Herold, et al., 2002, New Engl. J. Med. 346:1692-1698; Liu, et al., 1999, J. Neurol. Neurosurg. Psych. 67:451-456; Portielji, et al., 2003, Cancer. Immunol. Immunother. 52: 133-144] 참조). 용량은 적어도 15 μg, 적어도 20 μg, 적어도 25 μg, 적어도 30 μg, 적어도 35 μg, 적어도 40 μg, 적어도 45 μg, 적어도 50 μg, 적어도 55 μg, 적어도 60 μg, 적어도 65 μg, 적어도 70 μg, 적어도 75 μg, 적어도 80 μg, 적어도 85 μg, 적어도 90 μg, 적어도 95 μg, 또는 적어도 100 μg일 수 있다. 대상체에게 투여되는 용량은 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12회, 또는 그 초과 회일 수 있다.
본 개시내용의 CXCR5 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 경우에, 환자에게 투여되는 투여량은 환자의 체중의 0.0001 mg/kg 내지 100 mg/kg일 수 있다. 투여량은 환자의 체중의 0.0001 mg/kg 내지 20 mg/kg, 0.0001 mg/kg 내지 10 mg/kg, 0.0001 mg/kg 내지 5 mg/kg, 0.0001 내지 2 mg/kg, 0.0001 내지 1 mg/kg, 0.0001 mg/kg 내지 0.75 mg/kg, 0.0001 mg/kg 내지 0.5 mg/kg, 0.0001 mg/kg 내지 0.25 mg/kg, 0.0001 내지 0.15 mg/kg, 0.0001 내지 0.10 mg/kg, 0.001 내지 0.5 mg/kg, 0.01 내지 0.25 mg/kg 또는 0.01 내지 0.10 mg/kg일 수 있다.
CXCR5 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 투여량은 환자의 체중 (킬로그램 (kg) 단위)을 사용하여 mg/kg으로 투여되는 용량을 곱하여 계산될 수 있다. 본 개시내용의 항체의 투여량은 환자의 체중의 150 μg/kg 이하, 125 μg/kg 이하, 100 μg/kg 이하, 95 μg/kg 이하, 90 μg/kg 이하, 85 μg/kg 이하, 80 μg/kg 이하, 75 μg/kg 이하, 70 μg/kg 이하, 65 μg/kg 이하, 60 μg/kg 이하, 55 μg/kg 이하, 50 μg/kg 이하, 45 μg/kg 이하, 40 μg/kg 이하, 35 μg/kg 이하, 30 μg/kg 이하, 25 μg/kg 이하, 20 μg/kg 이하, 15 μg/kg 이하, 10 μg/kg 이하, 5 μg/kg 이하, 2.5 μg/kg 이하, 2 μg/kg 이하, 1.5 μg/kg 이하, 1 μg/kg 이하, 0.5 μg/kg 이하, 또는 0.1 μg/kg 이하일 수 있다.
본 개시내용의 CXCR5 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 단위 용량은 0.1 mg 내지 200 mg, 0.1 mg 내지 175 mg, 0.1 mg 내지 150 mg, 0.1 mg 내지 125 mg, 0.1 mg 내지 100mg, 0.1 mg 내지 75 mg, 0.1 mg 내지 50 mg, 0.1 mg 내지 30 mg, 0.1 mg 내지 20 mg, 0.1 mg 내지 15 mg, 0.1 mg 내지 12 mg, 0.1 mg 내지 10 mg, 0.1 mg 내지 8 mg, 0.1 mg 내지 7 mg, 0.1 mg 내지 5 mg, 0.1 내지 2.5 mg, 0.25 mg 내지 20 mg, 0.25 내지 15 mg, 0.25 내지 12 mg, 0.25 내지 10 mg, 0.25 내지 8 mg, 0.25 mg 내지 7 mg, 0.25 mg 내지 5 mg, 0.5 mg 내지 2.5 mg, 1 mg 내지 20 mg, 1 mg 내지 15 mg, 1 mg 내지 12 mg, 1 mg 내지 10 mg, 1 mg 내지 8 mg, 1 mg 내지 7 mg, 1 mg 내지 5 mg, 또는 1 mg 내지 2.5 mg일 수 있다.
본 개시내용의 CXCR5 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 투여량은 대상체에서 적어도 0.1 μg/mL, 적어도 0.5 μg/mL, 적어도 1 μg/mL, 적어도 2 μg/mL, 적어도 5 μg/mL, 적어도 6 μg/mL, 적어도 10 μg/mL, 적어도 15 μg/mL, 적어도 20 μg/mL, 적어도 25 μg/mL, 적어도 50 μg/mL, 적어도 100 μg/mL, 적어도 125 μg/mL, 적어도 150 μg/mL, 적어도 175 μg/mL, 적어도 200 μg/mL, 적어도 225 μg/mL, 적어도 250 μg/mL, 적어도 275 μg/mL, 적어도 300 μg/mL, 적어도 325 μg/mL, 적어도 350 μg/mL, 적어도 375 μg/mL, 또는 적어도 400 μg/mL의 항체 역가를 달성할 수 있다. 대안적으로, 본 개시내용의 항체의 투여량은 대상체에서 적어도 0.1 μg/mL, 적어도 0.5 μg/mL, 적어도 1 μg/mL, 적어도 2 μg/mL, 적어도 5 μg/mL, 적어도 6 μg/mL, 적어도 10 μg/mL, 적어도 15 μg/mL, 적어도 20 μg/mL, 적어도 25 μg/mL, 적어도 50 μg/mL, 적어도 100 μg/mL, 적어도 125 μg/mL, 적어도 150 μg/mL, 적어도 175 μg/mL, 적어도 200 μg/mL, 적어도 225 μg/mL, 적어도 250 μg/mL, 적어도 275 μg/mL, 적어도 300 μg/mL, 적어도 325 μg/mL, 적어도 350 μg/mL, 적어도 375 μg/mL, 또는 적어도 400 μg/mL의 항체 역가를 달성할 수 있다.
본 개시내용의 CXCR5 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 용량은 반복될 수 있고, 투여는 적어도 1일, 2일, 3일, 5일, 10일, 15일, 30일, 45일, 2개월, 75일, 3개월, 또는 적어도 6개월만큼 분리될 수 있다.
특정한 환자에 대한 유효량은 치료하고자 하는 상태, 환자의 전반적 건강, 투여 방법, 경로 및 용량, 및 부작용의 중증도와 같은 인자에 따라 달라질 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Maynard, et al., 1996, A Handbook of SOPs for Good Clinical Practice, Interpharm Press, Boca Raton, FIa.; Dent, 2001, Good Laboratory and Good Clinical Practice, Urch Publ, London, UK] 참조).
투여 경로는 예를 들어 국소 또는 피부 적용, 정맥내, 복강내, 뇌내, 근육내, 안내, 동맥내, 뇌척수내, 병변내 주사 또는 주입, 또는 지속 방출 시스템 또는 임플란트에 의할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Sidman et al., 1983, Biopolymers 22:547-556; Langer, et al., 1981, J. Biomed. Mater. Res. 15: 167-277; Langer, 1982, Chem. Tech. 12:98-105; Epstein, et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688-3692; Hwang, et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4030-4034]; 미국 특허 번호 6,350466 및 6,316,024 참조). 필요한 경우에, 조성물은 가용화제 및 주사 부위에서 통증을 완화시키기 위한 국부 마취제, 예컨대 리도카인을 또한 포함할 수 있다. 또한, 예를 들어 흡입기 또는 네뷸라이저의 사용, 및 에어로졸화제를 사용한 제제화에 의한 폐 투여도 또한 사용될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 6,019,968, 5,985,320, 5,985,309, 5,934,272, 5,874,064, 5,855,913, 5,290,540, 및 4,880,078; 및 PCT 공개 번호 WO 92/19244, WO 97/32572, WO 97/44013, WO 98/31346, 및 WO 99/66903을 참조하고, 이는 각각 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 한 실시양태에서, 본 개시내용의 CXCR5 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 또는 조성물은 알케르메스 에어(Alkermes AIR)™ 폐 약물 전달 기술 (알케르메스, 인크.(Alkermes, Inc.); 매사추세츠주 캠브리지)을 사용하여 투여된다.
본 개시내용의 조성물은 또한, 관련 기술분야에 공지된 다양한 방법 중 하나 이상을 이용하여 하나 이상의 투여 경로를 통해 투여될 수 있다. 통상의 기술자가 인지할 바와 같이, 투여 경로 및/또는 방식은 목적하는 결과에 따라 달라질 것이다. 본 개시내용의 항체에 대해 선택된 투여 경로는, 예를 들어 주사 또는 주입에 의한 정맥내, 근육내, 피내, 복강내, 피하, 척수 또는 다른 비경구 투여 경로를 포함한다. 비경구 투여는 경장 및 국소 투여 이외의 다른, 통상적으로 주사에 의한 투여 방식을 나타낼 수 있고, 비제한적으로 정맥내, 근육내, 동맥내, 척수강내, 피막내, 안와내, 심장내, 피내, 복강내, 경기관, 피하, 표피하, 관절내, 피막하, 지주막하, 척수내, 경막외 및 흉골내 주사 및 주입을 포함한다. 대안적으로, 본 개시내용의 조성물은 비-비경구 경로, 예컨대 국소, 표피 또는 점막 투여 경로를 통해, 예를 들어 비강내로, 경구로, 질내로, 직장으로, 설하로 또는 국소로 투여될 수 있다.
본 개시내용의 CXCR5 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 제어 방출 또는 지속 방출 시스템으로 투여되는 경우에, 제어 또는 지속 방출을 달성하기 위해 펌프가 사용될 수 있다 (상기 문헌 [Langer]; 문헌 [Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:20; Buchwald et al., 1980, Surgery 88:501; Saudek et al., 1989, N. Engl. J. Med. 321:514] 참조).
중합체 물질이 본 개시내용의 치료제의 제어 또는 지속 방출을 달성하기 위해 사용될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, FIa. (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York (1984); Ranger and Peppas, 1983, J., Macromol. ScL Rev. Macromol. Chem. 23:61] 참조; 또한 문헌 [Levy et al, 1985, Science 11 225:190; During et al., 19Z9, Ann. Neurol. 25:351; Howard et al, 1989, J. Neurosurg. 71: 105]; 미국 특허 번호 5,679,377; 미국 특허 번호 5,916,597; 미국 특허 번호 5,912,015; 미국 특허 번호 5,989,463; 미국 특허 번호 5,128,326; PCT 공개 번호 WO 99/15154; 및 PCT 공개 번호 WO 99/20253 참조). 지속 방출 제제에 사용되는 중합체의 예는 폴리(2-히드록시 에틸 메타크릴레이트), 폴리(메틸 메타크릴레이트), 폴리(아크릴산), 폴리(에틸렌-코-비닐 아세테이트), 폴리(메타크릴산), 폴리글리콜리드 (PLG), 폴리무수물, 폴리(N-비닐 피롤리돈), 폴리비닐 알콜, 폴리아크릴아미드, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리락티드 (PLA), 폴리락티드-코-글리콜리드 (PLGA), 및 폴리오르토에스테르를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 한 실시양태에서, 지속 방출 제제에 사용되는 중합체는 불활성이고, 침출가능한 불순물이 없고, 저장, 멸균에 대해 안정하고, 생분해성이다. 제어 또는 지속 방출 시스템은 예방적 또는 치료적 표적에 인접하여 위치할 수 있고, 따라서 오직 전신 용량의 분획만을 필요로 한다 (예를 들어, 문헌 [Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, 상기 문헌, vol. 2, pp. 115-138 (1984)] 참조).
제어 방출 시스템은 문헌 [Langer, 1990, Science 249:1527-1533]에 의한 검토에서 논의되어 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 임의의 기술을 사용하여 본 개시내용의 1종 이상의 항체 또는 그의 접합체를 포함하는 지속 방출 제제를 생성할 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 4,526,938, 국제 특허 공개 번호 WO 91/05548, WO 96/20698, 문헌 [Ning et al., 1996, "Intratumoral Radioimmunotheraphy of a Human Colon Cancer Xenograft Using a Sustained-Release Gel," Radiotherapy and Oncology 59:179-189, Song et al., 1995, "Antibody Mediated Lung Targeting of Long-Circulating Emulsions," PDA Journal of Pharmaceutical Science and Technology 50:372-397, Cleek et ah, 1997, "Biodegradable Polymeric Carriers for a bFGF Antibody for Cardiovascular Application," Pro. Ml. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:853-854, and Lam et al., 1997, "Microencapsulation of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody for Local Delivery," Proc. Ml. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24:759-160]을 참조하고, 이들 각각은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
본 개시내용의 CXCR5 항체, 또는 그의 항원-결합 단편이 국소로 투여되는 경우에, 이는 연고, 크림, 경피 패치, 로션, 겔, 샴푸, 스프레이, 에어로졸, 용액, 에멀젼, 또는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지된 다른 형태로 제제화될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences and Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms, 19th ed., Mack Pub. Co., Easton, Pa. (1995)]을 참조한다. 비-분무가능한 국소 투여 형태의 경우에, 국소 적용에 상용성인 담체 또는 1종 이상의 부형제를 포함하고 일부 경우에 물보다 큰 동적 점도를 갖는 점성 내지 반고체 또는 고체 형태가 전형적으로 사용된다. 적합한 제제는, 원하는 경우에 멸균되거나, 또는 예를 들어 삼투압과 같은 다양한 특성에 영향을 미치기 위한 보조제 (예를 들어, 보존제, 안정화제, 습윤제, 완충제, 또는 염)와 혼합되는, 용액, 현탁액, 에멀젼, 크림, 연고, 분말, 도찰제, 살브 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 다른 적합한 국소 투여 형태는 활성 성분이 일부 경우에 고체 또는 액체 불활성 담체와 조합되어 가압 휘발성 물질 (예를 들어, 기체상 추진제, 예컨대 프레온)과의 혼합물 중에 또는 압착병 내에 패키지되는 분무가능한 에어로졸 제제를 포함한다. 보습제 또는 함습제가 또한 원하는 경우에 제약 조성물 및 투여 형태에 첨가될 수 있다. 이러한 추가의 성분의 예는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다.
CXCR5 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 조성물이 비강내로 투여되는 경우에, 이는 에어로졸 형태, 스프레이, 미스트 또는 점적제의 형태로 제제화될 수 있다. 특히, 본 개시내용에 따라 사용하기 위한 예방제 또는 치료제는 적합한 추진제 (예를 들어, 디클로로디플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 또는 다른 적합한 기체)를 사용하여, 가압 팩 또는 네뷸라이저로부터 에어로졸 스프레이 제공물의 형태로 편리하게 전달될 수 있다. 가압 에어로졸의 경우에, 투여 단위는 계량된 양을 전달하기 위해 밸브를 제공함으로써 결정될 수 있다. 흡입기 또는 취입기에 사용하기 위한 캡슐 및 카트리지 (예를 들어, 젤라틴으로 구성됨)는 화합물의 분말 믹스 및 적합한 분말 베이스, 예컨대 락토스 또는 전분을 함유하여 제제화될 수 있다.
제2 치료제, 예를 들어 시토카인, 스테로이드, 화학요법제, 항생제 또는 방사선과 함께 공동-투여 또는 치료하는 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Hardman, et al. (eds.) (2001) Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10 th ed., McGraw-Hill, New York, N.Y.; Poole and Peterson (eds.) (2001) Pharmacotherapeutics for Advanced Practice: A Practical Approach, Lippincott, Williams and Wilkins, Phila., Pa.; Chabner and Longo (eds.) (2001) Cancer Chemotherapy and Biotherapy, Lippincott, Williams and Wilkins, Phila., Pa.] 참조). 치료제의 유효량은 증상을 적어도 10퍼센트; 적어도 20퍼센트; 적어도 약 30퍼센트; 적어도 40퍼센트, 또는 적어도 50퍼센트만큼 감소시킬 수 있다
본 개시내용의 CXCR5 항체 또는 항원-결합 단편과 조합되어 투여될 수 있는 추가의 요법 (예를 들어, 예방제 또는 치료제)은 본 개시내용의 항체와 5분 미만의 간격, 30분 미만의 간격, 1시간 간격, 약 1시간 간격, 약 1 내지 약 2시간 간격, 약 2시간 내지 약 3시간 간격, 약 3시간 내지 약 4시간 간격, 약 4시간 내지 약 5시간 간격, 약 5시간 내지 약 6시간 간격, 약 6시간 내지 약 7시간 간격, 약 7시간 내지 약 8시간 간격, 약 8시간 내지 약 9시간 간격, 약 9시간 내지 약 10시간 간격, 약 10시간 내지 약 11시간 간격, 약 11시간 내지 약 12시간 간격, 약 12시간 내지 18시간 간격, 18시간 내지 24시간 간격, 24시간 내지 36시간 간격, 36시간 내지 48시간 간격, 48시간 내지 52시간 간격, 52시간 내지 60시간 간격, 60시간 내지 72시간 간격, 72시간 내지 84시간 간격, 84시간 내지 96시간 간격, 또는 96시간 내지 120시간 간격으로 투여될 수 있다. 2종 이상의 요법은 1회의 동일한 환자 방문에서 투여될 수 있다.
본 개시내용의 CXCR5 항체 또는 그의 항원-결합 단편 및 다른 요법은 주기적으로 투여될 수 있다. 주기 요법은 시간 기간 동안 제1 요법 (예를 들어, 제1 예방제 또는 치료제)의 투여에 이어서 시간 기간 동안 제2 요법 (예를 들어, 제2 예방제 또는 치료제)의 투여, 임의로 그에 이어서 시간 기간 동안의 제3 요법 (예를 들어, 예방제 또는 치료제)의 투여 등, 및 이러한 순차적 투여의 반복, 즉 요법 중 하나에 대한 내성의 발생을 감소시키고/거나, 요법 중 하나의 부작용을 회피 또는 감소시키고/거나, 요법의 효능을 개선시키기 위한 주기를 수반한다.
한 실시양태에서, 개시내용의 CXCR5 항체는 아드리아마이신, 아자티오퓨린, 부술판, 시클로포스파미드, 시클로스포린 A, 시톡산, 플루다라빈, 5-플루오로우라실, 메토트렉세이트, 미코페놀레이트 모페틸, 6-메르캅토퓨린, 코르티코스테로이드, 비스테로이드성 항염증제, 시롤리무스 (라파마이신) 및 타크롤리무스 (FK-506)를 포함하나 이에 제한되지는 않는, 자가면역 질환 및 장애를 치료하기 위한 조성물과 공-투여될 수 있다. 대안적 실시양태에서, 면역조정제 또는 면역억제제는 무로모납-CD3, 알렘투주맙 (캄파트(Campath)®), 바실릭시맙, 다클리주맙, 무로모납 (OKT3®), 리툭시맙, 항흉선세포 글로불린 및 IVIg, 및 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 다른 것으로 이루어진 군으로부터 선택된 항체이다.
한 실시양태에서, 개시내용의 CXCR5 항체는 비구아니드 (예를 들어, 부포르민, 메트포르민, 및 펜포름), 호르몬 및 그의 유사체 (아밀린, 인슐린, 인슐린 아스파르트, 인슐린 데테미르, 인슐린 글라진, 인슐린 글루리신, 인슐린 리스프로, 리라글루티드, 및 프람린티드), 술포닐우레아 유도체 (아세토헥사미드, 카르부타미드, 클로르프로파미드, 글리보르누리드, 글리클라지드, 글리메피리드, 글리피지드, 글리퀴돈, 글리속세피드, 글리부리드, 글리부티아졸, 글리부졸, 글리헥사미드, 글리미딘, 톨라자미드, 톨부타미드, 및 톨시클라미드), 티아졸리딘디온 (피오글리타존, 로시글리타존, 및 트로글리타존), 아카르보스, 엑세나티드, 미글리톨, 미티글리니드, 무라글리타자르, 나테글리니드, 레파글리니드, 시타글립틴, 테사글리타자르, 빌다글립틴, 및 보글리보스를 포함하나 이에 제한되지는 않는, 당뇨병을 치료하기 위한 조성물과 공-투여될 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용의 CXCR5 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 생체내 적절한 분포를 보장하기 위해 제제화될 수 있다. 예를 들어, 혈액-뇌 장벽 (BBB)은 많은 고도로 친수성인 화합물을 배제시킨다. 본 개시내용의 치료 화합물이 (원하는 경우에) BBB를 횡단하도록 보장하기 위해, 이를 예를 들어 리포솜 내에 제제화할 수 있다. 리포솜을 제조하는 방법에 대해서는, 예를 들어 미국 특허 4,522,811; 5,374,548; 및 5,399,331을 참조한다. 리포솜은 특정 세포 또는 기관 내로 선택적으로 수송되는 1개 이상의 모이어티를 포함할 수 있고, 따라서 표적화 약물 전달을 증진시킬 수 있다 (예를 들어, 문헌 [V.V. Ranade, 1989, J. Clin. Pharmacol. 29:685] 참조). 예시적인 표적화 모이어티는 폴레이트 또는 비오틴 (예를 들어, 미국 특허 5,416,016); 만노시드 (Umezawa et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 153: 1038); 항체 (P. G. Bloeman et al., 1995, FEBS Lett. 357: 140; M. Owais et al., 1995, Antimicrob. Agents Chemother. 39: 180); 계면활성제 단백질 A 수용체 (Briscoe et al. (1995) Am. J. Physiol. 1233: 134); pl20 (Schreier et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:9090)을 포함하며; 또한 문헌 [K. Keinanen; M.L. Laukkanen, 1994, FEBS Lett. 346:123; Killion; Fidler, 1994; Immunomethods 4:273]을 참조한다.
본 개시내용은 본 개시내용의 CXCR5 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 제약 조성물을 단독으로 또는 다른 요법 조합하여, 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하기 위한 프로토콜을 제공한다. 본 개시내용의 조합 요법의 요법 (예를 들어, 예방제 또는 치료제)은 대상체에게 병용 또는 순차 투여될 수 있다. 본 개시내용의 조합 요법의 요법 (예를 들어, 예방제 또는 치료제)은 또한, 주기적으로 투여될 수 있다. 주기 요법은 시간 기간 동안 제1 요법 (예를 들어, 제1 예방제 또는 치료제)의 투여에 이어서 시간 기간 동안 제2 요법 (예를 들어, 제2 예방제 또는 치료제)의 투여, 및 이러한 순차적 투여의 반복, 즉 요법 (예를 들어, 작용제) 중 하나에 대한 내성의 발생을 감소시키고/거나, 요법 (예를 들어, 작용제) 중 하나의 부작용을 회피 또는 감소시키고/거나, 요법의 효능을 개선시키기 위한 주기를 수반한다.
본 개시내용의 조합 요법의 요법 (예를 들어, 예방제 또는 치료제)은 대상체에게 공동으로 투여될 수 있다. 용어 "공동으로"는 요법 (예를 들어, 예방제 또는 치료제)을 정확하게 동시에 투여하는 것으로 제한되지 않고, 오히려 본 개시내용의 CXCR5 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 제약 조성물을, 본 개시내용의 항체 또는 그의 접합체가 다른 요법(들)과 함께 작용하여 이들을 달리 투여한 경우보다 증가된 이익을 제공할 수 있도록 하는 순서로 그러한 시간 간격 내에 대상체에게 투여한다는 것을 의미한다. 예를 들어, 각각의 요법은 동시에 또는 상이한 시점에 임의의 순서로 순차적으로 대상체에게 투여될 수 있지만; 동시에 투여되지 않을 경우에도, 이들은 목적하는 치료 또는 예방 효과를 제공하기 위해 충분히 가까운 시간 내에 투여되어야 한다. 각각의 요법은 임의의 적절한 형태로 및 임의의 적합한 경로에 의해 대상체에게 개별적으로 투여될 수 있다. 다양한 실시양태에서, 요법 (예를 들어, 예방제 또는 치료제)는 대상체에게 15분 미만, 30분 미만, 1시간 미만 간격, 약 1시간 간격, 약 1시간 내지 약 2시간 간격, 약 2시간 내지 약 3시간 간격, 약 3시간 내지 약 4시간 간격, 약 4시간 내지 약 5시간 간격, 약 5시간 내지 약 6시간 간격, 약 6시간 내지 약 7시간 간격, 약 7시간 내지 약 8시간 간격, 약 8시간 내지 약 9시간 간격, 약 9시간 내지 약 10시간 간격, 약 10시간 내지 약 11시간 간격, 약 11시간 내지 약 12시간 간격, 24시간 간격, 48시간 간격, 72시간 간격, 또는 1주 간격으로 투여된다. 다른 실시양태에서, 2종 이상의 요법 (예를 들어, 예방제 또는 치료제)는 동일한 환자 방문에서 투여된다.
조합 요법의 예방제 또는 치료제는 대상체에게 동일한 제약 조성물로 투여될 수 있다. 대안적으로, 조합 요법의 예방제 또는 치료제는 대상체에게 개별 제약 조성물로 공동으로 투여될 수 있다. 예방제 또는 치료제는 대상체에게 동일한 또는 상이한 투여 경로에 의해 투여될 수 있다.
VIII. 키트
개시내용은 또한 본원에 기재된 임의의 또는 모든 항체를 포함하는 키트를 제공한다. 개시내용의 키트는 본원에 기재된 CXCR5 항체를 포함하는 1개 이상의 용기, 및 본원에 기재된 개시내용의 임의의 방법에 따른 사용에 대한 지침서를 포함한다. 일반적으로, 이들 지침서는 상기 기재된 치유적 치료를 위한 항체의 투여에 관한 설명을 포함한다. 일부 실시양태에서, 키트는 단일-용량 투여 단위를 생성하기 위해 제공된다. 특정 실시양태에서, 키트는 건조된 단백질을 갖는 제1 용기 및 수성 제제를 갖는 제2 용기 둘 다를 함유할 수 있다. 특정 실시양태에서, 어플리케이터, 예를 들어 단일 및 다중 챔버 사전-충전 시린지 (예를 들어, 액체 시린지 및 리오시린지)를 함유하는 키트가 포함된다.
CXCR5 항체의 사용에 관한 지침서는 일반적으로 의도된 치료를 위한 투여량, 투약 스케쥴, 및 투여 경로에 대한 정보를 포함한다. 용기는 단위 용량, 벌크 패키지 (예를 들어, 다중-용량 패키지) 또는 하위-단위 용량일 수 있다. 개시내용의 키트에 제공되는 지침서는 전형적으로 라벨 또는 패키지 삽입물 (예를 들어, 키트에 포함되어 있는 종이 시트) 상의 서면 지침서이지만, 기계-판독식 지침서 (예를 들어, 자기 또는 광학 저장 디스크에 저장된 지침서)가 또한 허용된다.
개시내용의 키트는 적합한 패키지 내에 존재한다. 적합한 패키지는 바이알, 병, 단지, 가요성 패키지 (예를 들어, 밀봉 마일라(Mylar) 또는 플라스틱 백) 등을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 또한, 특정 장치, 예컨대 흡입기, 비강 투여 장치 (예를 들어, 아토마이저) 또는 주입 장치, 예컨대 미니펌프와 조합하여 사용하기 위한 패키지가 고려된다. 키트는 멸균 접근 포트를 가질 수 있다 (예를 들어, 용기는 정맥내 용액 백 또는 피하 주사 바늘로 뚫을 수 있는 마개를 갖는 바이알일 수 있음). 또한 용기도 멸균 접근 포트를 가질 수 있다 (예를 들어, 용기는 정맥내 용액 백 또는 피하 주사 바늘로 뚫을 수 있는 마개를 갖는 바이알일 수 있음). 조성물 내의 적어도 1종의 활성제는 개시내용의 CXCR5 항체이다. 용기는 제2의 제약 활성제를 추가로 포함할 수 있다.
키트는 임의로 추가의 성분, 예컨대 완충제 및 해석 정보를 제공할 수 있다. 통상적으로, 키트는 용기, 및 용기 상의 또는 그와 결합된 라벨 또는 패키지 삽입물(들)을 포함한다.
개시내용은 또한, 본원에 기재된 임의의 또는 모든 항체를 포함하는 진단 키트를 제공한다. 진단 키트는, 예를 들어 샘플에서 CXCR5의 존재를 검출하는데 유용하다. 일부 실시양태에서, 진단 키트는 CXCR5-매개 질환, 장애 또는 상태 또는 CXCR5 결핍 질환, 장애 또는 상태가 발생할 위험에 처하게 될 수 있는 잠재성 질환, 장애 또는 상태를 가진 개체를 확인하기 위해 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 진단 키트는 CXCR5 매개 질환 또는 CXCR5 결핍 질환, 장애 또는 상태를 갖는 것으로 의심되는 개체에서 CXCR5의 존재 및/또는 수준을 검출하는데 사용될 수 있다.
개시내용의 진단 키트는 본원에 기재된 CXCR5 항체를 포함하는 1개 이상의 용기, 및 본원에 기재된 개시내용의 임의의 방법에 따른 사용에 대한 지침서를 포함한다. 일반적으로, 이들 지침서는 CXCR5 매개 질환 또는 CXCR5 결핍 질환, 장애 또는 상태에 걸릴 위험이 있거나 이러한 질환에 걸린 것으로 의심되는 개체에서 CXCR5의 존재를 검출하기 위한 CXCR5 항체의 사용에 관한 설명을 포함한다. 일부 실시양태에서, 예시적인 진단 키트는 시약, 예컨대 예를 들어 CXCR5 항체, 음성 대조군 샘플, 양성 대조군 샘플, 및 키트의 사용에 대한 지침서를 함유하도록 구성될 수 있다.
IX. 등가물
상기 설명 및 하기 실시예는 개시내용의 특정의 구체적인 실시양태를 상술하고, 본 발명자들이 고려하는 최적 방식을 기재한다. 그러나, 상기 상세한 내용이 텍스트로 나타날 수 있더라도, 본 개시내용은 많은 방식으로 실시될 수 있고, 본 개시내용은 첨부된 청구범위 및 그의 임의의 등가물에 따라 해석되어야 한다는 것이 인지될 것이다.
개시된 교시내용이 다양한 용도, 방법, 키트 및 조성물과 관련하여 기재되었지만, 본원의 교시내용 및 하기의 청구된 개시내용을 벗어나지 않으면서 다양한 변화 및 변형이 이루어질 수 있다는 것이 인지될 것이다. 하기 예는 개시된 교시내용을 더 잘 예시하기 위해 제공되며, 본원에 제시된 교시내용의 범주를 제한하는 것으로 의도되지는 않는다. 본 발명의 교시내용이 이들 예시적 실시양태와 관련하여 기재되었지만, 이들 예시적 실시양태의 수많은 변경 및 변형이 과도한 실험 없이 가능하다는 것을 관련 기술분야의 통상의 기술자는 쉽게 이해할 것이다. 모든 이러한 변경 및 변형은 본 발명의 교시내용의 범주 내에 속한다.
특허, 특허 출원, 논문, 교과서 등 및 그에 인용된 참고문헌을 비롯하여 본원에 인용된 모든 참고문헌은 이미 인용되지 않은 정도까지 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 정의된 용어, 용어 용법, 기재된 기술 등을 포함하나 이에 제한되지 않는, 포함된 문헌 및 유사한 자료 중 하나 이상이 본 출원과 상이하거나 상충되는 경우에, 본 출원이 우선한다.
X. 일반적 기술
본 발명은 구체적 합성 제조 방법으로 제한되지 않고, 이는 당연히 다양화될 수 있다는 것을 이해하여야 한다. 본원에서 달리 정의되지 않는 한, 본 발명과 관련하여 사용된 과학 기술 용어는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 의미를 가질 것이다. 또한, 문맥에서 달리 요구되지 않는 한, 단수 용어는 복수대상을 포함할 것이고, 복수 용어는 단수대상을 포함할 것이다. 일반적으로, 본원에 기재된 세포 및 조직 배양, 분자 생물학, 면역학, 미생물학, 유전학 및 단백질 및 핵산 화학 및 혼성화와 관련하여 사용된 명명법 및 이들의 기술은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있으며 통상적으로 사용되는 것들이다.
본 발명의 실시는, 달리 나타내지 않는 한, 관련 기술분야의 기술 내에 있는 분자 생물학 (재조합 기술 포함), 미생물학, 세포 생물학, 생화학 및 면역학의 통상적인 기술을 사용할 것이다. 이러한 기술은 문헌, 예컨대 [Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition (Sambrook et al., 1989) Cold Spring Harbor Press; Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cellis, ed., 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed., 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J.P. Mather and P.E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths, and D.G. Newell, eds., 1993-1998) J. Wiley and Sons; Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir and C.C. Blackwell, eds.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller and M.P. Calos, eds., 1987); Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel et al., eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan et al., eds., 1991); Sambrook and Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd. ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (2001); Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (2002); Harlow and Lane Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1998); Coligan et al., Short Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY (2003); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999); Immunobiology (C.A. Janeway and P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: a practical approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal antibodies: a practical approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using antibodies: a laboratory manual (E. Harlow and D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti and J.D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995)]에 충분히 설명되어 있다.
효소적 반응 및 정제 기술은 제조업체의 설명서에 따라, 관련 기술분야에서 통상적으로 수행되는 바와 같이 또는 본원에 기재된 바와 같이 수행된다. 본원에 기재된 분석 화학, 생화학, 면역학, 분자 생물학, 합성 유기 화학, 및 의약 및 제약 화학과 관련하여 사용된 명명법 및 이들의 실험실 절차 및 기술은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있으며 통상적으로 사용되는 것들이다. 화학적 합성, 화학적 분석, 제약 제제, 제제화, 및 전달, 및 환자의 치료를 위해 표준 기술이 사용된다.
XI. 생물학적 기탁
본 발명의 대표적인 물질은 미국 20110-2209 버지니아주 마나사스 유니버시티 불러바드 10801의 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection)에 2017년 7월 26일에 기탁되었다. ATCC 수탁 번호 PTA-124323을 갖는 벡터 h11G2-VH (XC155)는 항체 h11G2 (XC155)의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 DNA 삽입물을 포함하고, ATCC 수탁 번호 PTA-124324를 갖는 벡터 h11G2-VL (XC154)은 항체 h11G2 (XC154)의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 DNA 삽입물을 포함한다. 기탁은 특허절차상 미생물 기탁의 국제적 승인에 관한 부다페스트 조약 및 이러한 조약 (부다페스트 조약) 하의 규정의 조항 하에 이루어졌다. 이것은 기탁일로부터 30년 동안 기탁물의 살아있는 배양물의 유지를 보장한다. 기탁은 부다페스트 조약의 조항 하에 ATCC에 의해 입수가능하고, 어느 것이든 먼저 도래하는 관련 미국 특허의 허여 시 또는 임의의 미국 또는 해외 특허 출원의 공중에게의 공개 시 공중에게 기탁 배양물의 자손의 영구적이고 비제한적인 입수가능성을 보증하고, 35 U.S.C. 섹션 122에 따라 그에 대한 권리가 있는 미국 특허 상표 감독관 및 그에 따르는 감독관의 규칙 (37 C.F.R. 섹션 1.14 포함, 특히 886 OG 638 참조)에 의해 결정된 것에 대한 자손의 입수가능성을 보증하는, 화이자 인크.(Pfizer Inc.)와 ATCC 사이의의 합의에 따를 것이다.
본 출원의 소유자는 기탁된 물질의 배양물이 적합한 조건 하에서의 배양 시 사멸하거나 또는 손실 또는 파괴될 경우에, 그 물질을 통지 하에 또 다른 동일한 것으로 신속하게 대체할 것에 동의하였다. 기탁 물질의 입수가능성은 그의 특허법에 따른 임의의 정부의 권한 하에 보장된 권리에 반하여 본 발명을 실시하는 것에 대한 허가로 간주되지 않는다.
실시예
개시내용은 하기 실험 실시예를 참조하여 추가로 상세하게 기재된다. 이들 실시예는 단지 예시의 목적으로 제공되고, 달리 명시되지 않는 한 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 따라서, 개시내용은 어떠한 방식으로든 하기 실시예로 제한되는 것으로서 해석되어서는 안되고, 오히려 본원에 제공된 교시내용의 결과로서 명백해지는 임의의 및 모든 변형을 포괄하는 것으로 해석되어야 한다.
실시예 1: 인간 CXCR5 및 시노 CXCR5에 결합하는 하이브리도마
암컷 BALB/c 마우스를, 1x106개의 인간 CXCR5 (서열식별번호: 32)를 과다발현하는 BaF3 세포 또는 인간 CXCR5 (서열식별번호: 32)를 발현하는 300.19 세포와 5 μg CPG (ODN1826) (인비보젠(Invivogen)) 아주반트를 함유하는 혼합물로 3주 간격으로 연속해서 3회 면역화시켰다. 최종 부스팅에서, 멤브레인프로(MembranePro)™ 기능적 단백질 발현 시스템 (써모 피셔(Thermo Fisher))을 사용하여 인간 CXCR5 (서열식별번호: 32)를 과다발현하는 HEK-293 세포로부터 만들어진 바이러스-유사 입자 (VLP) 20 μg으로 마우스를 면역화시켰다. 5회의 융합 라운드를 수행하고, 인간 CXCR5를 발현하는 HEK-293 세포 (hCXCR5-293)에 결합하는 88개의 클론을 생성하였다. 그러한 모노클로날 항체를 단백질 A에 의해 정제하고, hCXCR5 HEK-293 및 시노몰구스 원숭이 CXCR5 (서열식별번호: 33)를 발현하는 HEK-293 세포, 즉 시노CXCR5-293에 대한 결합에 대해 시험하였다. hCXCR5-293 또는 시노CXCR5-293 세포를 모노클로날 항체 10 μg/ml로 염색한 후 항-마우스 IgG PE (서던 바이오테크(Southern Biotech))로 염색하였다. 세포를 FACS벌스(FACSVerse) 분석기 (비디 바이오사이언시즈(BD Biosciences))를 사용하여 유동 세포측정법에 의해 분석하였다. hCXCR5 HEK-293 및 시노CXCR5 HEK-293 세포에의 결합에 대한 스크리닝은 인간 및 시노몰구스 원숭이 CXCR5 둘 다에 결합하는 34개의 항체를 확인시켜주었다 (도 3).
실시예 2: Raji 세포에 대한 항-CXCR5 항체 결합 및 칼슘 유동 검정에서의 길항제 활성
hCXCR5-293 및 시노CXCR5-293 세포 둘 다에 결합하는 항체를 Raji 세포에 대한 세포 결합에 대해 FACS벌스 분석기 (비디 바이오사이언시즈, 뉴저지주 프랭클린 레이크스)를 사용하여 유동 세포측정법에 의해 추가로 분석하였다. Raji 세포에 대한 항체 결합의 겉보기 친화도를, 항원 결합 집단의 기하 평균 형광 강도 (gMFI)를 유동 세포측정법에 의해 정량화한 평형 결합 적정 곡선의 EC50으로서 계산하였고, 결과를 표 2에 제시한다.
데이터는 특정 항체가 Raji 세포에 다른 항체보다 더 큰/더 작은 정도로 결합하였음을 입증하였다. 이들 데이터는 항체가 버킷 림프종 환자로부터 유래된 Raji 세포 상의 내인성 CXCR5를 인식한다는 것을 입증하며, 이는 항체가 생체내에서 B 세포에 결합할 수 있다는 것을 시사한다. 추가로, Raji 세포 상의 CXCR5에 대한 항체 11G2의 친화도는 참조 항-CXCR5 항체 16D7 (WO 2009/032661)보다 더 높았고, 이는 11G2가 16D7보다 더 강력할 수 있다는 것을 시사한다.
hCXCR5-293 및 시노CXCR5-293 둘 다에 결합하는 항체를 또한 길항작용 활성에 대해 칼슘 유동 검정에서 시험하였다. 또한, 참조 항-CXCR5 항체 16D7 (WO2009/032661)을 대조군으로서 포함시켰다. 간략하게, hCXCR5 HEK-293 세포를 DMEM 고 글루코스 배지 중의 96 웰 플레이트에 플레이팅하였다. 밤새 인큐베이션한 후, 배지를 제거하고, 1X 플루오-4 NW (써모 피셔 사이언티픽, 매사추세츠주 월섬) 100 μl를 세포에 첨가하였다. 이어서, 세포를 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 모노클로날 항체의 연속 희석물을 세포에 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 재조합 hCXCL13 (비피에스 바이오사이언스(BPS Bioscience), 캘리포니아주 샌디에고) 111 nM을 첨가함으로써, 플렉스스테이션 (몰레큘라 디바이시스(Molecular Devices), 캘리포니아주 서니베일) 상에서 여기 485 nM 및 방출 525 nM에서 칼슘 유동을 측정하였다. 데이터를 1.52초 간격으로 수집하였다. 기기는 최고 판독치로부터 최저 판독치를 차감하여 칼슘 유동을 결정하였다. 그래프패드 프리즘® (버전 6.0, 그래프패드 소프트웨어, 인크., 캘리포니아주 샌디에고) 비선형-회귀 곡선 피트 및 효능제 용량-반응 모델의 S자형 로그를 사용하여 리간드-유도된 칼슘 유동의 억제에 대한 IC50 값을 결정하였다 (표 2). 칼슘 유동의 억제는 기능적 길항작용의 증거이다. 따라서, 11G2 항체는 ADCC를 통한 강력한 고갈자일 뿐만 아니라, 제2 작용 메카니즘을 제공하는 길항제이다. 항체 11G2의 길항작용은 비교자 항체, 예를 들어 2C9 (참조 항체, 예를 들어 WO 2012/010582 참조) 및 16D7 (참조 항체, 예를 들어, WO 2009/032661 참조)과 동등하다. cAMP 리포터 검정 데이터는 또한 기능적 길항작용을 입증한다 (하기 참조).
표 2
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Figure pct00004
실시예 3: 항-CXCR5 항체 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 클로닝
실시예 2에서 검정된 항체를 생산하는 하이브리도마를 RN이지(RNeasy) 미니 키트 (퀴아젠(Qiagen), 독일 힐덴)를 사용하여 용해시키고, 이어서 슈퍼스크립트 III 제1 가닥 합성 시스템 (써모 피셔 사이언티픽, 매사추세츠주 월섬)을 사용하여 cDNA의 제1 가닥을 합성하였다. 표 16에 제시된 서열식별번호: 64-88의 핵산 서열을 포함하는 마우스 경쇄 및 중쇄 축중성 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 경쇄 및 중쇄 가변 영역 (VL 및 VH)을 증폭시켰다. PCR 후, VL 및 VH를 제로 블런트(Zero blunt) TA 벡터 (써모 피셔 사이언티픽, 매사추세츠주 월섬) 내로 클로닝한 다음, 서열분석하였다. 11G2, 5H7 및 41A10 항체의 마우스 VL 및 VH에 대한 아미노산 서열을 표 16의 서열식별번호: 35-40에 제시한다. CDR은 밑줄표시된다.
실시예 4: 비-푸코실화 및 푸코실화 키메라 항체의 생성
항체 활성에 대한 비-푸코실화 및 푸코실화의 효과를 평가하기 위해, 실시예 3으로부터의 항체의 푸코실화 및 비-푸코실화 버전을 포유동물 세포에서 생산하였다.
관심 항체의 VL 및 VH를 각각 인간 카파 불변 및 인간 IgG1 불변 영역을 함유하는 벡터 내로 추가로 클로닝하였다. 가변 중쇄 영역을 인간 IgG1 불변 영역 (서열식별번호: 89)을 함유하는 pSMED2 포유동물 발현 벡터 내로 클로닝하여 키메라 마우스-인간 전장 중쇄를 생산하였다. 가변 경쇄 영역을 인간 카파 불변 영역 (Cκ) (서열식별번호: 90)을 함유하는 pSMEN3 포유동물 발현 벡터 내로 클로닝하여 키메라 마우스-인간 전장 경쇄를 생산하였다.
키메라 항체 유전자를 함유하는 벡터를 HEK-293F 세포 (써모 피셔 사이언티픽, 매사추세츠주 월섬) 내로 일시적으로 형질감염시켜, 푸코실화 키메라 항체를 생산하였다. 이어서, 푸코실화 키메라 항체를 단백질 A 칼럼을 사용하여 정제하였다. Raji 세포에 대한 키메라 항체 결합의 겉보기 친화도 (세포 결합 EC50)를 FACS벌스 분석기 (비디 바이오사이언스, 뉴저지주 프랭클린 레이크스)를 사용하여 유동 세포측정법에 의해 결정하였고, 이를 표 3에 제시한다.
표 3
Figure pct00005
비-푸코실화 키메라 항체는 푸코스 부가를 담당하는 유전자 (α-1,6-푸코실트랜스퍼라제, FUT8)의 둘 다의 대립유전자가 결여된 포텔리젠트® CHOK1SV 세포주 (바이오와/론자, 뉴저지주 앨런데일)를 사용하여 생성하였다. 인간 카파 불변 영역을 함유하는 키메라 경쇄를 론자 pEE12.4 GS 벡터 (론자 바이올로직스(Lonza Biologics), 스위스 바젤) 내로 클로닝하고, 인간 IgG1 불변 영역을 함유하는 키메라 중쇄를 론자 pEE6.4 GS 벡터 (론자 바이올로직스, 스위스 바젤) 내로 클로닝하였다. pEE6.4로부터의 중쇄 발현 카세트를 NotI 및 PvuI의 소화에 의해 정제하고, 이어서 키메라 경쇄를 함유하는 pEE12.4 내의 NotI 및 PvuI 부위 내로 클로닝하였다. 중쇄 및 경쇄 발현 카세트 둘 다를 함유하는 최종 벡터 DGV를 PvuI에 의해 선형화한 후, 포텔리젠트® CHOK1SV 세포 내로 전기천공시켰다. 형질감염 24시간 후에, 포텔리젠트® 세포를 1XHT (써모 피셔 사이언티픽, 매사추세츠주 월섬), 1 mM 우리딘 (시그마(Sigma), 미주리주 세인트 루이스) 및 50 μM MSX (EMD 밀리포어(EMD Millipore), 매사추세츠주 빌레리카)가 보충된 CDCHO 배지 (써모 피셔 사이언티픽, 매사추세츠주 월섬) 중에 3-5K 세포/웰로 96 웰 플레이트에 플레이팅하였다. 3 내지 4주 인큐베이션 후, 클론으로부터의 상청액을 옥텟 (폴 포르테바이오(Pall Fortebio), 캘리포니아주 프레몬트) 상에서 항체 역가에 대해 검정하였다. 항체 생산을 위해 고발현 클론을 추가로 규모 확대하였다. 이어서, 비-푸코실화 키메라 항체를 단백질 A 칼럼 상에서 정제하였다.
CXCR5에 대한 항체의 특이성을 결정하기 위해, 다른 시토카인을 발현하는 세포에 대한 항체의 결합을 평가하였다. 간략하게, CXCR1, CXCR2 또는 CXCR3을 발현하는 플로우셀렉트(FlowCellect) 케모카인 수용체 세포주 (EMD 밀리포어, 매사추세츠주 빌레리카), 및 CXCR4를 발현하는 Jurkat (ATCC, 버지니아주 마나사스)를 각각의 항-CXCR5 키메라 항체 5 μg/ml 또는 10 μg/ml로 염색하였다. 이어서, 세포를 PE와 접합된 염소 항-인간 (서던 바이오테크, 알라바마주 버밍햄)과 함께 인큐베이션한 후, FACS벌스 분석기 (비디 바이오사이언시즈, 뉴저지주 프랭클린 레이크스)를 사용하여 유동 세포측정법에 의해 분석하였다. 도 4a-4d에 제시된 바와 같이, 모든 키메라 항체는 양성 대조군과 비교하여 CXCR1 (도 4a), CXCR2 (도 4b), CXCR3 (도 4c)을 발현하는 세포 또는 CXCR4/Jurkat 세포 (도 4d)에 대해 매우 낮은 결합을 나타내었다.
실시예 5: 마우스 모노클로날 항체의 인간화
임의의 잠재적인 HAMA (인간 항 마우스 항체) 면역원성을 피하기 위해, IGKV1-39 (DPK9 경쇄 가변 도메인, 진뱅크 수탁 번호 X93627.1, 서열식별번호: 93)로부터의 인간 배선 프레임워크 서열 및 IGHV3 (DP54 중쇄 가변, 진뱅크 수탁 번호 AB019440, 서열식별번호: 91)으로부터의 인간 배선 프레임워크 서열을 사용하여 41A10 (C-41A10) 및 11G2 (C-11G2) 키메라 항체를 인간화하였다.
키메라 항체 11G2 (C-11G2) 및 키메라 41A10 (C-41A10)의 인간화 버전을 상보성 결정 영역 (CDR) 그라프팅 (이하, "CDR-그라프팅된"으로 지칭함)에 의해 생성하였다. 즉, 중쇄 CDR을 JH4 절편 (서열식별번호: 92)을 갖는 인간 DP-54 프레임워크 영역 (VH3 하위-군; 서열식별번호: 91) 상에 그라프팅하는 한편, 경쇄 CDR을 JK4 절편 (서열식별번호: 94)을 갖는 인간 DPK9 프레임워크 (VKI 하위-군; 서열식별번호: 93) 상에 그라프팅하였다.
인간화 VH 영역을 인간 IgG1 불변 영역 (서열식별번호: 89)에 연결하고, 이어서 독점적 발현 벡터 내로 서브클로닝하여, 서열식별번호: 96 (11G2 CDR 그라프트 VH)을 포함하나 이에 제한되지는 않는 CDR-그라프팅된 중쇄를 생성하였다. 인간화 VL 영역을 인간 카파 불변 영역 (서열식별번호: 90)에 융합시킨 다음, 독점적 발현 벡터 내로 서브클로닝하여, 서열식별번호: 97 (11G2 CDR 그라프트 VL)을 포함하나 이에 제한되지는 않는 CDR-그라프팅된 경쇄를 생성하였다.
실시예 6: 비-푸코실화 또는 푸코실화 항-CXCR5 항체의 결합 친화도
키메라 및 인간화 CXCR5 푸코실화 및 비-푸코실화 항체의 세포 표면 CXCR5에 대한 겉보기 친화도를 평가하였다. 보다 구체적으로, CXCR5-발현 세포에 대한 키메라 및 인간화 CXCR5 항체의 겉보기 친화도를 결정하기 위해, 인간 및 시노몰구스 원숭이 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 및 인간 편도 단핵 세포 (TMC)에 대해 세포 결합 실험을 수행하였다. CXCR5+ 세포 (B 세포, 진정한 Tfh 세포, 및 순환 Tfh-유사 세포)에 대한 CXCR5 mab 결합의 겉보기 친화도는, 유동 세포측정법에 의해 항원 결합 집단의 기하 평균 형광 강도 (gMFI)를 정량화한 평형 결합 적정 곡선의 EC50으로서 계산하였다.
퍼시픽 혈액 센터(Blood Centers of the Pacific) (캘리포니아주 샌프란시스코)로부터 PBMC에 대해 풍부화된, 건강한 인간 공여자로부터의 트리마(Trima)® 잔류물, 트리마® 분리반출술 수집물을 수득하였다. 제조업체의 지침 (스템셀 테크놀로지스(STEMCELL Technologies), 캐나다 브리티쉬 콜럼비아주 밴쿠버)에 따라 셉메이트(SepMate)™ 튜브 및 림포프렙(Lymphoprep)™을 사용하여 밀도 구배 원심분리에 의해 PBMC를 단리하였다.
바이오옵션즈(BioOptions) (캘리포니아주 브레아)로부터 수득한 인간 편도로부터 편도 단핵 세포 (TMC)를 단리하였다. 간략하게, 멸균 스칼펠을 사용하여 차가운 RPMI 1640 배지 중에서 편도를 작은 단편 (3-4 mm)으로 절제하였다. 이어서, 편도 조직을 소화 배지 (3 mL 10x 콜라게나제, 300 μL 100x 데옥시리보뉴클레아제 (DNase), 6.7 mL RPMI 1640) 중에서 37℃에서 30분 동안 소화시켰다. 10% 태아 소 혈청 (FBS)이 보충된 RPMI 1640을 첨가하여 효소 활성을 중화시킨 다음, 조직을 나일론 필터 세포 스트레이너 (70 μm 및 40 μm 메쉬 크기 나일론)를 통해 순차적으로 여과하였다. 원심분리 후, 염화암모늄 용해 완충제를 사용하여 펠릿 상에서 적혈구 세포 용해를 수행하였다. 포스페이트-완충 염수 (PBS)/2% FBS/2 mM 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA) 중에서 10분 동안 저속 원심분리 (200 x g)를 사용하여 혈소판을 제거하였다. 이지셉(EasySep)™ 인간 CD4+ T 세포 풍부화 키트를 제조업체의 지침 (스템셀 테크놀로지스, 캐나다 브리티쉬 콜럼비아주 밴쿠버)에 따라 사용하여 TMC 혼합물로부터 CD4+ T 세포를 정제하였다.
단리 후, PBMC를 웰당 1.0 X 105개 세포의 밀도로 플레이팅하고, CD4+ TMC를 96 웰 U-바닥 플레이트에서 단리 완충제 (1% FBS 및 1 mM EDTA를 함유하는 PBS) 중 웰당 2.0 X 105개 세포의 밀도로 플레이팅하였다. 이어서, 플레이트를 1500 rpm에서 5분 동안 실온에서 원심분리하였다. PBMC 및 CD4+ TMC를 인간 결정화 단편 Fc 블록 (웰당 2 μL; 바이오레전드(Biolegend)) 및 항체의 4-배 연속 희석물 (PBMC의 경우 5000 ng/mL 및 CD4+ TMC의 경우 312.5 ng/mL에서 시작한 11-포인트 일련의 희석물)을 함유하는 형광-활성화 세포 분류 (FACS) 완충제 (1% FBS를 함유하는 PBS) 중에 재현탁시키고, 얼음 상에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, PBMC 및 CD4+ TMC를 FACS 완충제로 3회 세척하고, 림프구 하위세트를 염색하기 위한 형광-접합된 항체 및 CXCR5 모노클로날 항체 (mAb)를 검출하기 위한 인간 Ig에 대한 형광-접합된 2차 항체를 함유하는 50-100 μL의 FACs 완충제 중에 재현탁시켰다. 4℃에서 30분 동안 인큐베이션한 후, PBMC 및 CD4+ TMC를 FACS 완충제로 2회 세척하고, PBS 중 0.5% 파라포름알데히드 (PFA) 125 μL 중에 재현탁시켰다. 플레이트를 유동 세포측정법 (BD LSR포르테사(BD LSRFortessa)™ 세포 분석기, 비디 바이오사이언시즈, 뉴저지주 프랭클린 레이크스)에 의한 분석 시까지 4℃에서 저장하였다.
CXCR5 항체 농도의 로그에 대해 항원 결합 집단의 gMFI를 플롯팅하여 세포 결합 적정 곡선을 생성하였다. 그래프패드 프리즘® (버전 6.0, 그래프패드 소프트웨어, 인크., 캘리포니아주 샌디에고) 비선형-회귀 곡선 피트 및 효능제 용량-반응 모델의 S자형 로그를 사용하여 하기 방정식에 따라 EC50 값을 결정하였다.
로그 (효능제) vs. 반응 - 가변 기울기 (4개 파라미터)
Y = 최저 + (최고 - 최저 / (1 + 10^((LogEC50 - X)*힐기울기))
여기서, Y는 gMFI이고, X는 항체 농도이고, 최고는 S자형 곡선의 상부 플래토에 상응하는 최대 Y-값이고, 최저는 S자형 곡선의 하부 플래토에 상응하는 최소 Y-값이고, LogEC50은 곡선의 변곡점에서의 항체 농도의 로그이다.
다수회 반복을 수행한 평균 및 표준 편차 (STDEV)를 사용하여 실험에 걸쳐 EC50 값을 요약하였다. 결과 (즉, CXCR5-발현 세포에 대한 푸코실화 또는 비-푸코실화된 키메라 및 인간화 CXCR5 mAb의 평균 겉보기 친화도)를 표 4에 제시한다. 또한 결과는, 비교를 위해 포함된 항-CXCR5 대조 항체 2C9 (WO 2012/010582), 16D7 (WO 2009/032661), 및 11A7 (WO 2016/028573)을 사용하여 수득된 친화도 결합 데이터를 포함한다. 다양한 VL 및 VH 조합을 갖는 푸코실화 및 비-푸코실화 키메라 및 인간화 11G2 항체 (즉, h11G2 XC51/XC152, h11G2 XC153/XC155, h11Gh11G2 XC153/XC156, h11G2 XC154/XC155, 및 h11G2 XC154/XC157)는 인간 B 세포에 대해 대략 동등한 겉보기 친화도를 갖는다는 것에 주목한다. 즉, 데이터는 비-푸코실화가 CXCR5-발현 세포에 대한 항체의 친화도에 영향을 미치는 것으로 보이지 않음을 보여준다. 또한, 데이터는 h11G2 XC154/XC155 항체 (푸코실화 및 비-푸코실화)가 대조군 항-CXCR5 항체 2C9보다 대략 10-배 더 높은 친화도 및 11A7보다 약 100-배 더 높은 친화도를 입증하였음을 보여준다. 대조군 항-CXC5 항체 16D7은 포화가능한 결합을 나타내지 않았다. 이들 데이터는 비-푸코실화가 CXCR5-발현 세포에의 결합에 대한 11G2 항체의 친화도에 영향을 미치지 않음을 입증한다. 친화도는 에피토프 및 항체 항원 결합 부위 (예를 들어, 파라토프) 사이의 상호작용 강도의 척도이기 때문에, 이들 데이터는 항체가 유사한 에피토프에 결합하더라도, 이들은 11G2와 동일한 강도로 에피토프에 결합하지 않는다는 것을 나타낸다.
표 4
Figure pct00006
실시예 7: 푸코실화 참조 항체와 비교한 비-푸코실화 또는 푸코실화 인간화 11G2 항체의 농도-의존성 결합
푸코실화 인간화 11G2 (h11G2 VL XC154/VH XC155 또한 h11G2 154/155 또는 h11G2 XC154/XC155로도 지칭됨) 및 비-푸코실화 인간화 11G2 CXCR5 (비-푸코실화 h11G2 154/155)의 인간 PBMC로부터의 B 세포에 대한 농도-의존성 결합을, 비교자 mAb 2C9, 16D7, 및 11A7의 결합과 비교하였다. CXCR5 항체 농도의 로그에 대해 항원 결합 집단의 gMFI를 플롯팅하여 세포 결합 적정 곡선을 생성하였고, 이를 도 5에 제시한다.
데이터는 푸코실화 및 비-푸코실화 h11G2 154/155가 동일한 곡선을 가짐을 입증하며, 이는 항체 불변 쇄 중 적어도 하나, 그러나 바람직하게는 둘 다의 Asn297에 존재하는 N-연결된 당형태 상에서의 푸코스의 존재 또는 부재가 세포 상에 존재하는 CXCR5에 대한 항체의 친화도에 영향을 미치지 않는다는 것을 나타낸다.
또한, 데이터는 푸코실화 (흑색 원, 9.630 x 10-12 M) 및 비-푸코실화 (흰색 원, 1.188x10-11 M) h11G2 154/155 항체의 EC50이 비교자 항체: 2C9 (흑색 삼각형, 6.24 x10-11), 11A7 (흑색 다이아몬드형, 9.265x10-10) 및 16D7 (흑색 사각형, 대략 0.004945 및 포화가능하지 않음)의 EC50보다 훨씬 낮다는 것을 추가로 입증한다. 이들 데이터는 h11G2 154/155 항체가 비교자 항체와 상이한 결합 특징을 갖는다는 것을 보여준다. 따라서, 이들 데이터는 11G2 항체 및 2C9, 11A7 및 16D7이 CXCR5 상의 동일한 에피토프에 결합하지 않는다는 것을 나타낸다.
실시예 8: 키메라 및 인간화 CXCR5 항체의 ADCC 활성
키메라 및 인간화 CXCR5 항체의 코호트가 활성-의존성 세포성 세포독성 (ADCC)을 자극하는 효력 및 효능을 결정하기 위해, CXCR5 항체 또는 이소형 대조군의 연속 희석액을 건강한 인간 공여자 또는 시노몰구스 원숭이로부터의 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)와 함께 인큐베이션하였다. 이러한 검정에서, PBMC는 자연 킬러 (NK) 이펙터 세포 및 표적 B 및 Tfh-유사 세포의 공급원이다. 유동 세포측정법을 사용하여 대략 20시간 후에 남아있는 B 및 Tfh-유사 세포의 수를 정량화하였다. 유사하게, PBMC로부터 단리된 NK 세포를 첨가한, 편도 단핵 세포로부터 단리된 CD4+ T 세포를 사용하여 인간화 항체가 인간 편도로부터 진정한 Tfh 세포의 ADCC를 유도하는 능력을 평가하였다.
실시예 6에 기재된 바와 같이, 퍼시픽 혈액 센터 (캘리포니아주 샌프란시스코)로부터 PBMC에 대해 풍부화된, 건강한 인간 공여자로부터의 트리마® 잔류물, 트리마® 분리반출술 수집물을 수득하였다. 제조업체의 지침 (스템셀 테크놀로지스, 캐나다 브리티쉬 콜럼비아주 밴쿠버)에 따라 셉메이트™ 튜브 및 림포프렙™을 사용하여 밀도 구배 원심분리에 의해 PBMC를 단리하였다. 단리 후, PBMC를 U-바닥 96-웰 플레이트에서 완전 RPMI 배지 중 웰당 2.0 X 105개 세포의 밀도로 플레이팅하였다.
이러한 검정에서, PBMC는 자연 킬러 (NK) 이펙터 세포 및 표적 B 및 Tfh-유사 세포의 공급원이다. CXCR5 mAb 또는 이소형 대조군의 연속 희석물을 웰에 첨가하고, 세포를 37℃, 5% CO2에서 대략 20시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 플레이트를 1800 rpm에서 5분 동안 실온 (RT)에서 원심분리하였다. 이어서, PBMC를 빙냉 FACS로 세척하고, 림프구 하위세트를 염색하기 위한 형광-접합된 항체를 함유하는 50 μl의 빙냉 FACs 완충제 중에 재현탁시켰다. 4℃에서 15-30분 동안 인큐베이션한 후, PBMC를 빙냉 FACS 완충제로 2회 세척하고, PBS 중 0.5% 파라포름알데히드 (PFA) 100 μL 중에 재현탁시켰다. 카운트브라이트(CountBright)™ 절대 카운팅 비드 (써모 피셔 사이언티픽)를 각각의 웰에 첨가하였다 (웰당 15 μl). 플레이트를 유동 세포측정법 (BD LSR포르테사™ 세포 분석기)에 의한 분석 시까지 4℃에서 저장하였다.
편도 단핵 세포 (TMC)를 또한 앞서 실시예 6에 기재된 바와 같이 단리하였다.
실시예 6에 대해 기재된 방법에 따라 세포독성 적정 곡선을 제조하였다. 다수회 반복을 수행한 평균 및 표준 편차 (STDEV)를 사용하여 실험에 걸쳐 EC50 값을 요약하였다. 결과를 표 5에 제시한다. 항-CXCR5 참조 항체 2C9, 16D7, 및 11A7을 사용하여 수득한 데이터를 비교를 위해 포함시켰다.
표 5
CXCR5-발현 세포에 대한 키메라 및 인간화 CXCR5 mAb의 평균 세포독성
Figure pct00007
본원에 개시된 데이터는 심지어 푸코실화된 h11G2 154/155 항체도 비교자 항체 2C9 (380.31 ± 757.04) 및 16D7 (2590.61 ± 6343.88)보다 더 큰 ADCC 활성 (253.72 ± 672.14)을 갖는다는 것을 입증한다. 푸코실화 항체 11A7은 시험된 임의의 푸코실화 항체보다 더 큰 ADCC 활성을 입증하였다. 그러나, 데이터는 비-푸코실화 h11G2 154/155가 푸코실화 11A7을 비롯한 시험된 임의의 항체보다 더 높은 ADCC 활성을 갖는다는 것을 보여준다. 본원에 제시된 특징화 연구는 키메라 CXCR5 mAb 41A10 및 11G2가 각각 EC50 11.73 nM 및 0.56 nM으로 인간 B 세포의 ADCC를 촉발하였음을 입증하였다. 키메라 CXCR5 mAb 41A10 및 11G2의 비-푸코실 버전은 ADCC 활성의 효력을 적어도 약 100-배 증가시켰다. 인간화 변이체는 그의 상응하는 키메라 대응물과 대등하거나 그보다 뛰어난 효력으로 인간 B 세포의 ADCC를 촉발하였다. 키메라 CXCR5 mAb와 마찬가지로, 비-푸코실 인간화 변이체는 그의 정상적으로 푸코실화된 대응물과 비교하여 ADCC의 효력을 적어도 약 100-배 증가시켰다. 비-푸코실 h11G2는 2C9 및 16D7의 푸코실화 버전보다 ADCC에서 더 강력하였고, 비-푸코실 h11G2는 푸코실화 11A7과 적어도 동등하였다.
실시예 9: 11G2 항체는 CXCL13 신호전달을 길항작용한다
CXCR5 항체가 CXCL13 신호전달을 기능적으로 길항작용하는지 결정하기 위해, 인간 CXCR5를 안정하게 발현하는 조작된 세포주에서 시클릭 아데노신 모노포스페이트 (cAMP) 리포터 검정을 사용하였다. 이들 세포에서, CXCL13은 포르스콜린에 의해 촉발된 cAMP 생산을 농도-의존성 방식으로 억제한다.
CXCR5 항체가 CXCL13 신호전달을 기능적으로 길항작용하는지 결정하기 위해, 인간 CXCR5를 안정하게 발현하는 CHO-K1 세포에서 히트 헌터(Hit Hunter)® cAMP 검정 (디스커버엑스 코포레이션(DiscoveRx Corporation), 캘리포니아주 프리몬트)을 수행하였다. 이러한 검정에서, cAMP가 생성되는 경우에 효소 단편 상보성에 의해 활성 β-갈락토시다제 (β-gal)가 형성된다. 이어서, β-gal은 화학발광 기질을 전환시켜, 표준 마이크로플레이트 판독기 상에서 검출가능한 출력 신호를 생성할 수 있다. CXCR5의 리간드 CXCL13은 포르스콜린 (20 μM)에 의해 촉발된 cAMP 생산을 농도-의존성 방식으로 억제한다. CXCL13-매개 포르스콜린-유도된 cAMP 생산을 억제하는데 있어서 CXCR5 항체의 효력 및 효능을 시험하기 위해, 각각의 CXCR5 항체의 연속 희석물을 포르스콜린 (20 μM) 및 CXCL13 (그의 IC80 600 pM에서 사용됨)의 존재 하의 CXCR5-발현 CHO-K1 세포에 첨가하였다.
실시예 6에 대해 기재된 것에 따라 EC50 값 결정을 포함하여 기능적 길항작용 적정 곡선을 제조하였다. 결과를 표 6에 제시한다.
표 6
CXCR5+ CHO-K1 세포에서의 CXCL13-억제된 cAMP 생산의 시험관내 자극
Figure pct00008
별도의 연구에서, 비-푸코실 인간화 11G2 154/155를 기능적 길항작용에 대해 시험하였고, 이는 인간화 푸코실화 11G2 154/155와 유사하게 거동하였다 (즉, EC50 = 961.4 pM).
데이터는 h11G2 154/155가 적어도 참조 항체 2C9, 16D7, 11A7만큼 CXCL13 신호전달을 억제하였음을 입증하였다. 실제로, h11G2는 16D7 (102.4%) 및 11A7 (105.9%) 보다 유의하게 더 큰 정도로 CXCL13 신호전달을 억제하였다 (120.6%). 이들 데이터는 11G2 항체가 CXCR5-매개된 CXCL13 신호전달에 의해 매개되거나 그와 연관된 질환, 장애 또는 상태를 치료하기 위한 유용한 신규 치료제일 수 있음을 시사한다.
실시예 10: 11G2 항체의 hCXCR5에 대한 결합 부위의 맵핑
마우스 CXCR5의 세포외 N-말단으로부터의 아미노산을 인간 CXCR5 상에 그라프팅하여 CXCR5 상의 비-푸코실 인간화 11G2 154/155 결합 부위를 확인하였다.
보다 구체적으로, 맵핑 전략은 11G2가 인간 CXCR5 (서열식별번호: 32)에 결합하지만, 마우스 CXCR5 (서열식별번호: 34)에는 결합하지 않는다는 사실을 이용하였다. 인간 CXCR5 (hCXCR5) 및 마우스 CXCR5 (mCXCR5)의 아미노산 서열의 정렬을 도 6에 제시한다. CXCR5의 세포외 도메인의 아미노산 잔기는 밑줄표시된다. 마우스 및 인간 CXCR5 단백질 둘 다의 세포외 도메인 (ECD)은 볼드체로 표시되고, 도 6에서 각각의 영역의 서열 아래에 "N", "L1"," L2" 및 "L3"으로 라벨링된다. 이들 ECD를 마우스와 인간 단백질 사이에서 스와핑하여, 인간 CXCR5에 대한 11G2의 특이성 및 mCXCR5에 대한 결합의 결여를 담당하는 영역(들)을 확인하였다. 마우스 CXCR5로부터의 각각의 그러한 영역을 인간 CXCR5에서의 동일한 영역과 교환하여, XC251, XC252, XC253, XC254, XC255 및 XC256으로 지정된 키메라 단백질을 생산하였고, 여기서 인간 CXCR5 단백질은 명시된 상응하는 마우스 CXCR5 도메인을 함유하였다. 표 7은 마우스 (m) 영역이 인간 CXCR5 내로 스와핑된 것을 보여주는 색인을 제공한다.
표 7
(ECD - 스와핑된 마우스/인간 키메라 CXCR5 단백질)
Figure pct00009
보다 구체적으로, 마우스 L3 도메인을 상응하는 인간 L3 도메인에 대해 스와핑하여 인간 CXCR5 단백질의 맥락에서 마우스 L3 도메인을 포함하는 키메라 단백질 XC251 (hCXCR5-mL3)을 생산하였다. 유사하게, 마우스 L2를 상응하는 인간 도메인에 대해 스와핑하여 키메라 단백질 XC252 (hCXCR5-mL2)를 생산하였고; 마우스 N 도메인을 상응하는 인간 N 도메인에 대해 스와핑하여 키메라 단백질 XC253 (hCXCR5-mN)을 생산하였고; 마우스 L2 및 L3 도메인을 상응하는 인간 도메인에 대해 스와핑하여 키메라 단백질 XC254 (hCXCR5-mL2-mL3)를 생산하였고; 마우스 mN 및 L3 도메인을 상응하는 인간 도메인에 대해 스와핑하여 키메라 단백질 XC255 (hCXCR5-mN-mL3)를 생산하였고; 마우스 mN 및 L2 도메인을 상응하는 인간 도메인에 대해 스와핑하여 키메라 단백질 XC255 (hCXCR5-mN-mL2)를 생산하였다.
마우스 CXCR5, 인간 CXCR5, 및 다양한 ECD-스와핑된 마우스-인간 키메라 CXCR5 단백질 (XC251-XC256)에 대한 11G2의 결합을 평가하고, 다양한 항체, 즉 래트 항-마우스 CXCR5 (래트) (카탈로그 MAB6198, 알앤디 시스템즈(R&D systems), 미네소타주 미네아폴리스), 토끼 항-인간 CXCR5 (Rb) (카탈로그, ab46218, 압캠(Abcam), 매사추세츠주 캠브리지), 2C9, 16D7의 결합과 비교하였다. 결과를 표 8에 제시한다. 볼드체 숫자는 단백질에 대한 항체 결합을 나타낸다.
표 8
(ECD-스와핑된 마우스-인간 CXCR5 키메라 단백질에 대한 항체 결합의 FACS 분석)
Figure pct00010
데이터는 항체가 마우스 CXCR5에 대해 특이적인 경우, 키메라가 마우스 N 도메인을 포함하는 한 이는 ECD-스와핑된 마우스-인간 키메라 CXCR5에 결합하였음을 보여준다. 유사하게, 인간 CXCR5에 결합하는 항체 (11G2, 2C9, 16D7, 및 Rb)의 경우, 인간 N 도메인이 키메라 내에 존재하면 항체는 키메라 CXCR5에 결합하였다. 따라서, 항체의 종 특이성은 N 도메인에 위치한 결합에 의해 유래되는 것으로 보인다. 보다 중요한 것으로, 이들 데이터는 인간 CXCR5의 N 도메인이 항체 11G2, 2C9 및 16D7의 결합에 필요하다는 것을 입증하였다.
실시예 11: hCXCR5에 대한 11G2 항체 결합에 특유한 아미노산 잔기의 확인
hCXCR5에 대한 항체 결합에 중요한 구체적 아미노산 잔기를 보다 정확하게 결정하고 항-인간 CXCR5 항체 사이를 추가로 구별하기 위해, CXCR5의 N 도메인의 보다 상세한 연구를 수행하였다. 보다 구체적으로, 인간 CXCR5의 N 도메인 단편 (서열식별번호: 32의 넘버링에 따른 아미노산 1-58)에 점 돌연변이를 만들어, CXCR5의 상응하는 마우스 아미노산 잔기를 각각 포함하는 점 돌연변이 단백질을 생산하였다. 각각의 뮤테인을 발현하는 안정한 형질감염체를 생성하고, 유동 세포측정법을 사용하여 항체 결합에 대해 세포를 검사하였다. 즉, 표 9에 예시된 바와 같이, CXCR5의 인간 잔기가 상응하는 마우스 잔기로 대체된, 각각 단일 아미노산 치환을 함유하는 XC276-XC294로 지칭되는 19개의 인간 CXCR5 N 도메인 돌연변이체 단백질을 생산하였다. 인간 CXCR5 뮤테인은 발현 수준에 기초하여 정규화를 허용하는, 표 9에 소문자로 제시된 FLAG 에피토프 (DYKDDDDK)를 N-말단에 추가로 포함하였고; FLAG 태그는 뮤테인에 대한 항체 결합에 영향을 미치지 않았다. 치환은 전형적으로 인간에서 마우스 아미노산 잔기 치환이 보존적 치환이 되는 경우에는 이루어지지 않았고, 이들 잔기는 이탤릭체로 표시되었다.
표 9는 hCXCR5의 N 영역의 아미노산 서열 (처음 58개의 아미노산이 제시됨)을 마우스 CXCR5의 N 영역의 아미노산 서열과 비교하여 제시한다. 2개의 서열 사이에 상이한 아미노산은 밑줄표시된다. 도면은 또한, hCXC5에서 상응하는 인간 아미노산을 마우스 아미노산 잔기로 치환하여 생산한 다양한 구축물 (XC276-XC294)을 보여준다. 예를 들어, XC276은 D (인간)를 G (마우스)로 변화시킨 단일 아미노산 치환을 갖는 인간 CXCR5이다. hCXCR5 아미노산 서열 (서열식별번호: 32)의 나머지는 변화되지 않았기 때문에 제시하지 않았다. 시험된 항체가 마우스 CXCR5에 결합하지 않았기 때문에, 어떠한 아미노산 잔기(들)가 hCXCR5에 대한 항체 결합에 중요한지 결정하기 위해 뮤테인을 생산하였다.
표 9
Figure pct00011
각각의 돌연변이체 펩티드를 코딩하는 핵산을 HEK-293T 세포 내로 일시적으로 형질감염시켰다. 형질감염 2일 후에, 세포를 수거하고, 1 μg/ml 항-FLAG PE (바이오레전드(Biolegend)) 또는 1 μg/ml 또는 3 μg/ml 비-푸코실 인간화 11G2 154/155; 2C9; S16D7 또는 11A7, 이어서 항-인간 IgG PE (서던 바이오테크, 알라바마주 버밍햄)로 염색하였다. 세포를 아큐리(Accuri) (비디 바이오사이언시즈, 뉴저지주 프랭클린 레이크스)를 사용하여 유동 세포측정법에 의해 분석하였다. 기하 평균 형광 강도 (gMFI)를 결정하고, 각각의 CXCR5 항체 및 항-flag의 gMFI에 대한 비를 계산하였다.
도 7에 제시된 바와 같이, 모든 4개의 항체는 야생형 인간 CXCR5 (XC275; WT)에 결합하였다. 이어서, 항체는 다양한 점 돌연변이체 펩티드에 대한 상이한 결합 패턴을 제공하였다. 즉, 2C9는 XC276 (돌연변이 D10G0을 포함함) 또는 XC277 (아미노산 잔기 S 및 I의 인간 CXCR5 N 도메인 내로의 삽입을 포함함)에 결합하지 않는 반면에, 11G2, 16D7, 및 11A7은 그러한 단백질에 결합하였다. 이들 데이터는 hCXCR5 서열 내로의 이들 2개의 아미노산의 삽입이 2C9 결합을 제거하지만, 3개의 다른 항체의 결합에는 영향을 미치지 않는다는 것을 시사하였고, 이는 2C9에 대한 에피토프가 11G2, 16D7 및 11A7의 것과 상이하다는 것을 시사한다. 보다 중요한 것으로, 아미노산 잔기 위치 11 (서열식별번호: 32의 서열의 넘버링을 기초로 함)에서 류신 (L)의 트레오닌 (T)으로의 돌연변이는 단지 11G2의 XC278에 대한 결합만을 완전히 폐지하였지만, 항체 2C9, 16D7 또는 11A7의 이러한 단백질에 대한 결합에는 영향을 미치지 않았다. 따라서, 위치 번호 11 (서열식별번호: 32에 제시된 아미노산 서열 대비)에 존재하는 류신 잔기는 11G2가 인간 CXCR5에 결합하는데 중요하지만, 2C9, 16D7 또는 11A7이 hCXCR5에 결합하는 데에는 중요하지 않은 것으로 보인다. 이들 데이터는 11G2의 에피토프가 이들 항체에 대한 에피토프와 동일하지 않다는 것을 입증한다. 또한, 도 7은 모든 4개의 항체가 XC279에 결합하여, 아미노산 잔기 번호 12 (서열식별번호: 32의 서열 대비)에서 E의 Y로의 치환이 hCXCR5에 대한 임의의 이들 항체의 결합에 중요하지 않다는 것을 보여준다.
아미노산 잔기 번호 19 (서열식별번호: 32의 서열의 넘버링에 따름)에서 W의 리신(K)으로의 치환을 포함하는 XC280에 대한 이들 4개의 항체의 결합은, 항체 16D7 및 11A7에 의한 XC280에의 결합의 상실을 초래하였지만, 뮤테인에 대한 항체 11G2 및 2C9의 결합에는 영향을 미치지 않았다 (도 7). 이들 결과는 이들 4개의 항체가 hCXCR5 상의 동일한 에피토프에 결합하지 않는다는 것을 추가로 입증한다.
도 7은 또한 위치 22 (서열식별번호: 32의 서열의 넘버링에 따름)의 D를 알라닌 (A)으로 변화시킨 것은 XC281 뮤테인에 대한 11G2의 결합을 완전히 폐지하지만, 항체 2C9, 16D7, 및 11A7의 결합에는 영향을 미치지 않는다는 것을 보여준다. 이는 11G2에 대한 에피토프가 항체 2C9, 16D7, 및 11A7의 에피토프(들)와 동일하지 않다는 것을 추가로 강조한다.
모든 4개의 항체는 XC285-294에 동등하게 결합하였고, 그의 결합은 이들 뮤테인 내의 임의의 아미노산 치환에 의해 영향을 받지 않았다. 이들 데이터는 이들 위치 (27, 28, 30, 31, 33, 35, 36, 37, 39 및 40; 표 9 참조)에서의 아미노산 잔기가 항체 11G2, 2C9, 11A7 및 16D7의 경우 CXCR5에 대한 항체 결합에 참여하지 않는다는 것을 시사한다.
따라서, 이들 데이터는 아미노산 위치 번호 11에서의 류신 (L) 잔기 및 아미노산 위치 번호 22에서의 아스파르테이트 (D) 잔기 (둘 다 서열식별번호: 32의 아미노산 서열의 넘버링 대비)가, 그러한 위치에서의 이들 잔기 중 어느 하나 (또는 그의 둘 다)를 상응하는 마우스 아미노산 잔기로 치환한 것이 hCXCR5에 대한 11G2 항체의 결합을 폐지하였기 때문에, hCXCR5에 대한 항체의 결합에 중요하다는 것을 입증한다. 이들 데이터는 또한, L11 및/또는 W22의 변화가 hCXCR5에 대한 이들 항체의 결합에 영향을 미치지 않았기 때문에, 항체 11G2는 항체 2C9, 16D7 또는 11A7과 동일한 에피토프를 갖지 않는다는 것을 보여준다.
도 7은 또한 모든 4개의 항체가 돌연변이체 CXCR5 단백질 XC282 내지 XC284에 결합하였음을 보여준다. 모든 4개의 항체는 또한 단백질 XC285 내지 XC294에 결합하였다. 이들 데이터는 항체 11G2, 2C9, 16D7 및 11A7에 대한 에피토프가 뮤테인 XC282 내지 XC294에 의해 제시된 hCXCR5의 N 도메인의 영역에는 존재하지 않는다는 것을 시사한다.
실시예 12: 11G2는 CXCR5에 대해 선택적이고 케모카인 GPCR 패밀리의 다른 구성원에는 결합하지 않는다
β-아레스틴 커플링 검정 (디스커버엑스)을 사용하여 케모카인 GPCR 패밀리의 20종의 구성원에 대해 비-푸코실 인간화 11G2 154/155의 선택성을 평가하였다. 이러한 검정은 각각의 수용체로 안정하게 형질감염된 전체 세포를 사용하고, 활성화된 GPCR과 β-아레스틴의 상호작용을 검출함으로써 GPCR 활성을 직접 측정한다. 아레스틴 동원은 G-단백질 신호전달에 비의존적이기 때문에, 이들 검정은 실질적으로 임의의 Gi, Gs, 또는 Gq-커플링된 수용체에 사용될 수 있는 보편적인 스크리닝 및 프로파일링 플랫폼을 제공하고, 수용체 또는 수용체 패밀리 (G-단백질 커플링과 상관 없이)에 걸쳐 표준화되고 효율적인 비교를 제공한다. 효능제 (리간드의 부재 하에) 및 길항제 방식 (EC90의 리간드의 존재 하에)으로 검정을 수행하였다. 하기 케모카인 수용체를 선택성 패널에 포함시켰다: CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCR9, CCR10, CMKLR1, CXCR3R1, CXCR1, CXCR2, CXCR3, CXCR4, CXCR5, CXCR6, CXCR7, XCR1.
효능제 방식으로 시험하였을 때, 어떠한 다른 케모카인 수용체에 대해서도 비-푸코실 인간화 11G2 154/155 (200 nM로 시험됨)의 유의한 활성이 관찰되지 않았고, 평가된 모든 다른 케모카인 수용체에 대해 길항제 방식으로 비교하였을 때 유일하게 CXCR5의 길항제로서만 유의하게 활성이었으며 (리간드-유도된 β-아레스틴 커플링의 92% 억제), 즉 시험된 어떠한 다른 케모카인 수용체에 대해서도 유의한 억제는 관찰되지 않았다.
실시예 13: h11G2는 DNA, 인슐린 또는 LPS에 대해 다반응성을 입증하지 않는다
항체가 생체내에서 다양한 비관련 항원과 잠재적으로 반응할 수 있는지 결정하기 위해 다반응성 검정을 사용하였다. 다반응성의 결여는 11G2가 CXCR5 특이적 항체이고, 생체내에서 오프 타겟에는 결합하지 않는다는 것을 시사한다.
흑색 DELFIA 플레이트 (써모사이언티픽)를 10 μg/ml의 이중-가닥 DNA (dsDNA; 밀리포어), 5 μg/ml 리포폴리사카라이드 (LPS; 시그마), 10 μg/ml 인슐린 (시그마, 미주리주 세인트 루이스), 또는 포스페이트-완충 염수 (PBS)로 코팅하고, 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 이어서, 플레이트를 바이오텍 ELx405 마이크로플레이트 세척기 (바이오텍, 버몬트주 위누스키)를 사용하여 물로 세척한 다음, 플레이트를 1xPBS, 0.05% 트윈 20 및 1mM EDTA를 함유하는 검정 완충제 200 μl로 1시간 동안 실온에서 차단하였다. 추가의 세척 단계 후에, 플레이트를 실온에서 1시간 동안 항-CXCR5 항체 (모든 항체는 푸코실화됨)의 연속 희석물과 함께 인큐베이션하였다. 검출을 위해, 100 μl의 DELFIA-Eu-N1-항-인간 IgG (50 μg/ml; 퍼킨 엘머(Perkin Elmer), 매사추세츠주 월섬)를 플레이트에 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 마지막으로, DELFIA 증진 용액 100 μl를 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 실온에서 15분 동안 진탕시킨 후, 빅토르엑스4(VictorX4) 멀티라벨 플레이트 판독기 (퍼킨엘머, 매사추세츠주 월섬) 상에서 유로퓸 형광 하에 판독하였다. 데이터를 표 10에 제시한다.
표 10
CXCR5 mAb 다반응성에 대한 형광 (카운트)
Figure pct00012
별도의 연구에서, 비-푸코실화 인간화 11G2 154/155를 다반응성에 대해 시험하였고, 이는 상기 표 10에 제시된 푸코실화 인간화 11G2 154/155에 대한 결과와 일치하게 인슐린, DNA, LPS, 또는 PBS에 대한 결합을 나타내지 않았다.
이들 데이터는 11G2가 인슐린, DNA 또는 LPS와 반응성이 아니고, 비교자 항체 2C9, 16D7, 및 11A7보다 덜 반응성이라는 것을 입증한다. 이들 데이터는 11G2가 잠재적인 유용한 신규 치료제임을 시사한다. 정의상, 다반응성 항체는 소정 범위의 생물학적 분자에 비-특이적 방식으로 결합한다. 11G2는 일반적인 다반응성 검정에서 반응하지 않았고, 이는 11G2가 CXCR5에 대해 특이적이라는 것을 추가로 지지한다. PK, TK, 및 tox 데이터도 또한 11G2가 CXCR5에 대해 특이성을 갖는다는 것을 지지한다.
실시예 14: 11G2 및 비교자 항체 사이의 차이의 요약
하기 표 11은 11G2 및 본원의 다른 곳에서 앞서 기재된 다양한 비교자 항체의 특징을 요약한다. ND는 결정되지 않았음을 의미한다.
이들 데이터는 항체 11G2가, 푸코실화된 것 및 비-푸코실화된 것 둘 다, 비교자 항체 2C9, 16D7 및 11A7과 매우 상이하다는 것을 입증한다. 즉, 11G2 결합은 위치 11 및 22의 마우스 아미노산 잔기의 치환에 의해 제거되는 반면에, 비교자 항체의 결합은 이들 잔기의 치환에 의해 영향을 받지 않는다 (서열식별번호: 32의 아미노산 서열에 따라 넘버링됨). 추가로, 2C9의 결합은 hCXCR5에의 결합을 위해 아미노산 잔기 W19, D22 및 R23의 존재를 필요로 하지만, 항체 중 어떠한 것도 모든 3개를 필요로 하지는 않으며, 단 hCXCR5에 대한 11A7 결합은 위치 19의 W의 알라닌으로의 치환에 의해 제거된다 (서열식별번호: 32의 아미노산 서열의 넘버링에 따름). 모든 다른 항체와 달리, hCXCR5에 대한 16D7의 결합은 인간 CXCR5의 D10 및 L11 사이에의 2개의 마우스 잔기의 삽입에 의해 제거된다 (서열식별번호: 32의 아미노산 서열의 넘버링에 따름) (도 7 참조). 따라서, 본원에 제공된 데이터는 11G2가 항체 2C9, 16D7 및 11A7과 동일한 에피토프를 갖지 않고, 이들 항체는 또한 그들 사이에서 상이한 에피토프를 갖는다는 것을 시사한다.
또한, 본원에 제공된 데이터는 11G2가 2C9 (65.59 pM)보다 적어도 10-배 더 크고, 11A7 (563.63pM)보다 적어도 100-배 더 크고, 16D7과 매우 상이한 (이는 포화가능하지 않기 때문에 비교될 수 없음) hCXCR5에 대한 친화도 (7.08 pM) (EC50으로 표현됨)를 갖는다는 것을 입증한다.
표 11
Figure pct00013
이들 데이터는 모두 11G2가 비교자 항체 2C9, 16D7 및 11A7과 실질적으로 상이하고, CXCR5-매개된 CXCL13 신호전달을 포함하나 이에 제한되지는 않는 CXCR5의 생물학적 활성에 의해 매개되거나 또는 그와 연관된 질환, 장애 또는 상태의 치료 또는 예방을 위한 잠재적인 신규한 유용한 치료제임을 시사한다. 이는, 매우 증진된 ADCC 활성을 입증하여 예를 들어 CXCR5의 세포 발현에 의해 매개되거나 또는 그와 연관된 면역 질환을 치료하기 위한 치료제로서의 그의 잠재적 유용성이 증가된, 11G2의 비-푸코실화 버전의 경우에 특히 그러하다.
실시예 15: 비-푸코실화 h11G2 XC154/XC155의 생체내 약역학
비-푸코실 인간화 11G2 154/155에 대한 다중 시노몰구스 원숭이 연구에서 0.001 내지 400 mg/kg/용량 IV 또는 SC 범위의 생체내 용량을 연구하였다. 본 실험 전반에 걸쳐 사용된 바와 같이, IV 및 SC 제제는 하기 성분 50 mg/mL 본 개시내용의 CXCR5 항체 또는 항원-결합 단편, 20 mM 히스티딘, 8.5% 수크로스, 및 0.02% 폴리소르베이트 80, 0.005% EDTA, pH5.8을 포함하였다. 하기 표 12는 시노몰구스 원숭이에서의 비-푸코실화 11G2 XC154/XC155 연구의 생체내 연구 설계를 제시한다.
표 12
Figure pct00014
말초 혈액 내의 B 세포 및 Tfh-유사 세포의 용량-의존성 고갈이 시노몰구스 원숭이에서 0.001 내지 0.2 mg/kg 범위의 비-푸코실화 h11G2 VL XC154/VH XC155 (비-푸코실 h11G2 XC154/XC155)의 단일 용량에서 관찰되었고; 시험된 최저 용량 (0.001 mg/kg)은 말초 혈액 내의 B 세포 및 Tfh-유사 (즉, cTfh) 세포의 대략 50% 고갈을 발생시켰다.
시노몰구스 원숭이에서의 탐색적 및 중추적 GLP 독성 연구에서, 비-푸코실 h11G2 XC154/XC155 ≥ 5 mg/kg IV의 용량은 말초 혈액 내의 B 세포 및 Tfh-유사 세포의 현저한 고갈 및 비장 및 다른 림프 조직 (액와 및 장간막 림프절 및 장 연관 림프성 조직)에서 림프성 여포의 감소된 세포충실성을 발생시켰고; 이들 효과는 면역조직화학적으로 관찰된 B 세포 구역의 약리학적으로-매개된 감소된 세포충실성과 상관되었다. 탐색적 및 중추적 연구에서, B 세포, Tfh-유사 세포, 및 Tfh 세포의 부분적 내지 완전한 회복이 관찰되었다. 고갈 및 후속 충만의 동역학은 비-푸코실 h11G2 XC154/XC155의 노출 수준과 관련되었다.
비-푸코실 h11G2 XC154/XC155가 체액성 기억 반응을 손상시키는지 결정하기 위해, 시노몰구스 원숭이에서 백신 회상 반응 연구를 수행하였다. 간략하게, 비-푸코실 h11G2 XC154/XC155를, 연구 전에 TT (파상풍 톡소이드)에 대해 백신접종된 시노몰구스 원숭이 (군당 N = 6)에게 제1일 및 제8일에 2 및 10 mg/kg/용량으로 IV 볼루스 주사에 의해 제공하였다. 비-푸코실 h11G2 XC154/XC155의 투여는 잘 허용되었고, 이는 예상된 약리학 (즉, 순환 B 세포 및 Tfh-유사 세포의 감소)을 발생시켰다. 제15일과 비교하여 2차 TT 면역화 7일 후인 제22일에 모든 동물에서, 모든 용량 군에서, 증가된 이뮤노글로불린 M (IgM) 및 IgG 기억 반응이 관찰되었다. 이들 반응은 비-푸코실 H11G2 XC154/XC155 (10 mg/kg/용량)를 투여한 동물에서 감쇠되었고, 피크 항-TT IgG 평균 역가는 대조군의 경우의 72,000과 비교하여 42,667이었고, 피크 항-TT IgM 평균 역가는 대조군의 경우의 3500과 비교하여 1583이었다. 비교자로서 사용된 B 세포 고갈 항체인 리툭산(Rituxan)® (리툭시맙)은 항-TT IgG 기억 반응에 영향을 미치지 않았다. 결론적으로, 이들 데이터는 비-푸코실 h11G2 XC154/XC155가 생체내 체액성 기억 반응을 손상시킨다는 것을 입증한다.
안전성 약리학
심전도검사 및 심박수 측정을 중추적 독성 연구 설계에 포함시켰다. 비-푸코실 h11G2 XC154/XC155의 투여에 기인한 비정상적인 심전도 발견사항은 없었다. 모든 심전도는 정성적으로 및 정량적으로 정상 한계 내에 있었고, 부정맥은 존재하지 않았다.
실시예 16: 비-푸코실화 h11G2 XC154/XC155의 생체내 약동학 및 대사
전기화학발광 (ECL) 검정을 확인하여 메소 스케일 디스커버리(Meso Scale Discovery)® (MSD) 검정 플랫폼 상에서 시노몰구스 원숭이 혈청 내의 ADA의 존재를 검출하였다. 시노몰구스 원숭이 혈청 내에 섞여있는 양성 대조군, 항-CXCR5 항-이디오타입 항체, 및 풀링된 정상 시노몰구스 원숭이 혈청으로 이루어진 음성 대조군을 각각의 플레이트에 포함시켜 검정 성능을 모니터링하였다. 비오틴-표지된 비-푸코실 h11G2 XC154/XC155 및 루테늄-표지된 비-푸코실 h11G2 XC154/XC155를 연구 샘플, 양성 대조군 및 음성 대조군과 함께 공동-인큐베이션하였다. 샘플 내에 존재하는 비-푸코실 h11G2 XC154/XC155에 대한 항체는 본 검정에서 검출될 비-푸코실 h11G2 XC154/XC155의 비오틴- 및 루테늄-표지된 버전 둘 다에 결합하여야 한다. 복합체는 비오티닐화된 비-푸코실 h11G2 XC154/XC155를 통해 스트렙타비딘 코팅된 MSD 멀티-어레이 플레이트에 포획되었고, 이를 MSD 섹터 이미저 기기 상에서 판독하였다. 최종 검출은 루테늄-표지된 비-푸코실 h11G2 XC154/XC155 및 트리프로필아민을 사용하여 수행하여 MSD 섹터 이미저 기기 내에 ECL 신호 (RLU)를 생성하였다.
계층 전략을 사용하여 연구 샘플을 ADA에 대해 시험하였다. 샘플을 초기에 스크리닝 검정에서 희석 배율 75로 시험하였다. 검정 컷포인트 미만의 RLU를 생성하는 샘플은 음성 (< 1.88)으로 보고하였다. 검정 컷포인트 이상의 RLU를 생성하는 샘플은 전체 일련의 희석물에서 재분석하여 항체 역가를 결정하였다. 항체 역가는 컷포인트 RLU와 동등한 RLU를 생성하는 샘플의 희석 역수로서 정의되었다. 그러한 역가의 로그 (밑 10)를 보고하였다.
연구 제1일에 투여 전에 수집한 샘플 및 투여후 샘플 결과의 비교에 기초하여 ADA의 유도에 관하여 결론내렸다. 투여전 샘플이 ADA에 대해 음성으로 시험되고 상응하는 투여후 샘플이 양성으로 시험되면, 동물은 ADA의 유도에 대해 양성인 것으로 간주되었다. 투여전 및 투여후 샘플 둘 다가 ADA에 대해 양성으로 시험되면, 동물은 투여후 샘플 역가가 적어도 0.48 (로그 3, 연속 희석 배율)이거나 투여전 샘플의 역가보다 더 높은 경우에만 ADA의 유도에 대해 양성인 것으로 간주되었다.
단일-용량 약동학
수컷 및 암컷 시노몰구스 원숭이 (n = 1/성별/용량 군)에서 말초 혈액 B 세포 및 여포성 T 헬퍼 (Tfh)-유사 (Tfh-유사) 세포의 고갈 및 충만을 평가하기 위한 연구의 일부로서, 비-푸코실 h11G2 XC154/XC155를 0.001, 0.002, 0.005, 0.1 또는 0.2 mg/kg으로 단일 IV 투여한 후, 비-푸코실 h11G2 XC154/XC155 PK를 특징화하였다. 본 실험 전반에 걸쳐 사용된 바와 같이, IV 및 SC 제제는 하기 성분 50 mg/mL 본 개시내용의 CXCR5 항체 또는 항원-결합 단편, 20 mM 히스티딘, 8.5% 수크로스, 및 0.02% 폴리소르베이트 80, 0.005% EDTA, pH 5.8을 포함하였다.
단일 IV 투여 후에, 전신 노출은 용량이 증가함에 따라 증가하였고, 비-푸코실 h11G2 XC154/XC155 PK는 낮은 CL 및 낮은 Vss를 특징으로 하였고, 평균 값은 용량 수준에 걸쳐 각각 대략 0.2 내지 2.6 mL/h/kg 및 0.03 내지 0.1 L/kg 범위였다. 용량 수준에 걸친 평균 t½ 값은 대략 1 내지 4일 범위였다. 저용량 (0.001-0.005 mg/kg)에서 더 높은 CL의 증거가 존재하였고, 이는 아마도 비-푸코실 h11G2 XC154/XC155/CXCR5 복합체의 클리어런스를 또한 발생시킬 수 있는 항체-의존성 세포 세포독성 (ADCC)-매개된 세포 고갈로 인한 것일 수 있다 (Kryzanski et al., 2016, J. Pharmacokinet. Pharmacodyn. 43(5):513-527; Wang et al., 2010, AAPS J. 12(4):729-740). 유사한 클리어런스 메카니즘/비 선형성이 인간에서 저용량에서 관찰될 수 있다. 본원의 다른 곳에서 앞서 기재된 바와 같이, 말초 혈액 내의 B 세포 및 Tfh-유사 세포의 용량-의존성 고갈이 관찰되었고, 순환 B 세포의 고갈이 Tfh-유사 세포의 고갈보다 더 강건하였다.
시노몰구스 원숭이에서의 반복-용량 독성학 (TK)
GLP 반복-용량 독성 연구의 일부로서 수컷 및 암컷 시노몰구스 원숭이 (n = 3 또는 4/성별/용량 군)에게 5 (IV), 20 (SC), 또는 200(IV) mg/kg으로 비-푸코실 h11G2 XC154/XC155를 격주로 (2주마다) IV 또는 SC 투여한 후 (총 5회 용량) TK 및 ADA 평가를 수행하였다.
비히클 대조군으로부터 수집하고 분석한 샘플에서는 비-푸코실 h11G2 XC154/XC155의 정량화가능한 농도가 존재하지 않았다. 용량 군에 걸쳐 전신 노출에 있어서 명백한 성별-관련 차이가 존재하지 않았고; 따라서 군 평균 TK 파라미터를 수컷 및 암컷 시노몰구스 원숭이 둘 다로부터의 조합 데이터를 사용하여 제시하였다 (표 13).
5 (IV), 20 (SC) 또는 200 (IV) mg/kg으로의 격주 투여 후, 전신 노출은 반복 투여 후에 더 높았고, 축적 비 (연구 제43일/연구 제1일)는 대략 1.4 내지 1.7 범위였다. 추가로, 전신 노출은 IV 투여 후에 용량-비례 방식으로 증가하였다. 5 mg/kg (IV) 용량 군으로부터의 회복 동물에서 비-푸코실 h11G2 XC154/XC155의 최종 정량화가능한 농도는 11-개월 회복 기간의 연구 제148일에서 제281일까지 관찰되었다. SC 투여 후, 비-푸코실 h11G2 XC154/XC155의 생체이용률은 적어도 약 50%인 것으로 추정되었다.
비-푸코실 h11G2 XC154/XC155에 대한 ADA의 발생률은 각각 5 (IV), 20 (SC) 또는 200 (IV) mg/kg으로의 비-푸코실 h11G2 XC154/XC155의 투여 후 19% (3/16 동물), 17% (1/6 동물) 및 0% (0/6 동물)이었고, 연구 제43일의 혈청 농도는 일반적으로 ADA-음성 동물과 비교하여 ADA-양성 동물에서 더 낮았다. 비-푸코실 h11G2 XC154/XC155의 순환 농도는 ADA의 검출을 방해할 수 있음을 주목해야 한다.
표 13
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분포
단백질 결합 및 조직 분포 연구는 비임상 종에서 비-푸코실 h11G2 XC154/XC155에 대해 수행하지 않았다. 시노몰구스 원숭이에서 비-푸코실 h11G2 XC154/XC155의 Vss는 단일 IV 투여 후에 대략 0.03 내지 0.1 L/kg의 범위로, IgG에 대해 예상된 제한된 분포와 일치하였다 (Lin et al., 1999, J. Pharmacol. Exp. Ther. 288(1):371-378; Mascelli et al., 2007, J. Clin. Pharmacol. 47(5):553-565).
대사
비-푸코실 h11G2 XC154/XC155를 사용한 대사 연구는 수행하지 않았다. 사구체 여과 컷-오프를 초과하는 분자량을 갖는 다른 치료 단백질과 유사하게, 비-푸코실 h11G2 XC154/XC155는 주로 이화 분해에 의해 대사될 것으로 예상된다 (Lobo et al., 2004, J. Pharm. Sci. 93(11):2645-2668; Mascelli et al., 2007, 상기 문헌; Vugmeyster et al., 2012, World J. Biol. Chem. 3(4):73-95). 약동학 약물 상호작용
시험관내 또는 생체내 약동학 약물 상호작용 연구는 수행하지 않았다. 비-푸코실 h11G2 XC154/XC155는 CXCR5에 대해 지시된 인간화 모노클로날 항체 (mAb)이고, 시험관내에서 시토카인 방출을 조정하는 것으로 밝혀졌지만, 생체내에서는 그렇지 않았다. 시토카인은 시토크롬 P450 (CYP) 효소 및 수송체의 발현을 조정하는 것으로 밝혀졌다 (Lee et al., 2010, Clin. Pharmacokinet. 49(5):295-310; Mahmood & Green, 2007, J. Clin. Pharmacol. 47(12):1540-1554). 따라서, 비-푸코실 h11G2 XC154/XC155를 사용한 처리는 CYP 효소 및 수송체 수준에 잠재적으로 영향을 미칠 수 있고, 결과적으로 이들 효소 또는 수송체에 대한 기질인 병용 의약의 클리어런스를 조정할 수 있다. 그러나, 다른 약물에 대해 임상에서 관찰된 시토카인-매개 약물 상호작용은 보통 정도로, 공-투여된 소분자 약물의 노출에서 2-배 미만의 변화를 초래하였다 (Huang et al., 2010, Clin. Pharmacol. Ther. 87(4):497-503; Evers et al., 2013, Drug Metab. Dispos. 41(9):1598-1609). 따라서, 어떠한 특정한 이론에 얽매이는 것을 원하지는 않지만, 병용 의약이 표적 발현을 변경시키는 경우, 이는 잠재적으로 비-푸코실 h11G2 XC154/XC155의 PK에 영향을 미칠 수 있다.
인간 약동학의 예측
시노몰구스 원숭이에서 비-푸코실 h11G2 XC154/XC155의 PK 프로파일은 원숭이에서의 인간 IgG1 mAb에 대한 것에 전형적이었다. 따라서, 인간에서 예측된 2-구획 PK 파라미터 값은 전형적인 치료 IgG1 mAb의 것과 동일할 것으로 예상되고, 시험될 용량 범위에 걸쳐 선형일 것으로 가정된다. 사용된 PK 파라미터 값은 앞서 보고된 것과 유사하였다 (Singh et al., 2015, In: Developability of Biotherapeutics: Computational Approaches, S. Kumar, Singh S. Kumar, Eds., CRC Press). 이들 파라미터는 하기와 같았다: 중심 부피 (Vc) 3.2 L, 말초 부피 (Vp) 2.2 L, 중심 클리어런스 (CLc) 0.25 L/일, 분포 클리어런스 (Q) 0.45 L/일, SC 흡수 속도 상수 (ka) 0.261/일 및 SC 생체이용률 60%. 본원에 개시된 데이터에 기초하여, 비-푸코실화 h11G2 XC154/XC155의 예측된 인간 혈청 반감기는 약 17일이다.
인간 유효 용량의 예측
용량, 비-푸코실 h11G2 XC154/XC155 농도, 및 시노몰구스 원숭이 혈청 내의 B 및 Tfh-유사 세포의 조정 사이의 관계를 특징화하기 위해 모델-기반 접근법을 채택하였다. 후속적으로, 리툭시맙(RITUXIMAB)과 같은, B 세포 상의 CD-20에 결합하고 B 세포를 고갈시키는 인간화 소형 모듈 면역제약 (SMIP)인 SBI-087에 대한 공개된 원숭이 및 인간 약동학/약역학 (PK/PD) 데이터를 사용하여, 비-푸코실 h11G2 XC154/XC155에 대한 B 세포 고갈 파라미터를 원숭이로부터 인간까지 해석하였다 (Cohen et al., 2016, Clin. Ther. 38(6):1417-1434; Dunussi-Joannopoulos et al., 2008, Ann. Rheum. Dis. 64(Suppl II):190 (Abstr THU0171)). B 세포와 달리, 어떠한 인간 데이터도 Tfh-유사 고갈에 이용가능하지 않았고; 따라서, Tfh-유사 세포 고갈의 해석은 B 세포의 것과 유사한 것으로 가정되었다. SLE 환자에서의 기준선 B 및 Tfh-유사 세포 카운트 (Belouski et al., 2010, Cytometry B Clin. Cytom. 78(1):49-58) 및 예측된 인간 세포 고갈 파라미터를 사용하여, 인간에서 비-푸코실 h11G2 XC154/XC155 투여 후의 B 및 Tfh-유사 세포 고갈 동역학을 시뮬레이션하였다.
비-푸코실 h11G2 XC154/XC155의 예측된 인간 유효 용량은 대략 10 내지 30 mg (IV)이고, 이는 혈액 내의 B 세포가 임상 효능을 위해 대략 8주 동안 ≤1개 세포/μL로 고갈될 필요가 있다는 가정을 기초로 한다. 10 내지 30 mg IV의 제2 용량 (제1일 및 제29일의 용량) 후의 비-푸코실 h11G2 XC154/XC155 혈청 농도를 상기 언급된 바와 같이 추정하였고, 예측된 Cmax는 대략 5 내지 15 μg/mL였고, 투여 간격 타우에 걸친 예측된 농도 시간 곡선하 면적 (AUC타우)은 대략 38 내지 114 μg/일/mL였고, 예측된 평균 농도 (Cav; AUC타우/28로 계산됨)는 1.36 내지 4.06 μg/mL였다.
실시예 17: 비-푸코실화 h11G2 XC154/XC155의 독성학 연구
비-푸코실화 h11G2 XC154/XC155를 표 14에 요약된 바와 같이 독성 시험 연구 개관의 일련의 비임상 독성 연구에서 평가하였다. 정맥내 (IV) 또는 피하 (SC) 투여 경로는 이것이 의도된 임상 투여 경로이기 때문에 선택하였다. 본 실험 전반에 걸쳐 사용된 바와 같이, IV 및 SC 제제는 하기 성분, 50 mg/mL의 본 개시내용의 CXCR5 항체 또는 항원-결합 단편, 20 mM 히스티딘, 8.5% 수크로스, 및 0.02% 폴리소르베이트 80, 0.005% EDTA, pH5.8을 포함하였다. 본원의 다른 곳에서 앞서 논의된 바와 같이, 인간 또는 시노몰구스 원숭이 말초 혈액 단핵 세포를 사용한 연구는 비-푸코실 h11G2 XC154/XC155가 CXCR5 발현 세포에 대등한 친화도로 결합하고, 인간 및 원숭이 세포 사이에서 유사하게 항체-의존성 세포성 세포독성 (ADCC)을 촉발한다는 것을 입증하였다. 또한, 본원의 다른 곳에서 앞서 입증된 바와 같이, 비-푸코실 h11G2 XC154/XC155는 마우스, 래트, 또는 토끼 CXCR5 오르토로그에는 결합하지 않는다. 따라서, 비임상 독성 연구는 시노몰구스 원숭이에서만 수행하였다.
표 14
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표 14의 약어는 다음과 같다: GLP = 우수 실험실 관리기준; IV = 정맥내; OECD = 경제 협력 개발 기구; PBMC = 말초 혈액 단핵 세포; SC= 피하.
모든 GLP 연구는 OECD 데이터 상호 인정 준수 회원국에서 수행하였다. 모든 생체내 연구를 수컷 및 암컷 동물을 사용하여 수행하였다. 달리 명시되지 않는 한, 모든 용량은 용량당 체중 kg당 mg 단백질로서 표현된다. 인간 전혈을 1, 10, 100, 또는 1000 μg/mL (가용성 상)로 검정하거나, 또는 인간 PBMC를 1, 10, 또는 100 μg/웰 (고체 상)로 검정하였다.
비-푸코실 h11G2 XC154/XC155를 IV 및 SC 연구에서 원숭이에게 17일 동안 최대 400 mg/kg/용량 (IV)으로 매주 투여하거나 (총 3회 용량) 또는 2개월 동안 최대 200 mg/kg/용량 (IV)으로 2주마다 투여하였다 (총 5회 용량). 17-일 탐색적 원숭이 연구는 제352일까지의 회복기를 포함하였다. 중추적 (GLP) 2-개월 원숭이 연구는 11-개월 회복기 (제401일)를 가졌다. 비-푸코실 h11G2 XC154/XC155는 시험관내 검정에서 시토카인 방출을 유도하였다. 이들 연구에서 확인된 표적 기관은 림프조혈계였다. 2-개월 원숭이 연구에서 무관찰 부작용 수준 (NOAEL)은 200 mg/kg/용량 (IV)의 시험된 최고 용량으로, 제43일에 Cmax는 5220 μg/mL이고, AUC168은 438,000 μg·h/mL였다.
반복-용량 독성
시노몰구스 원숭이에서 비-푸코실 h11G2 XC154/XC155를 사용하여 탐색적 및 중추적 반복-용량 독성 연구를 수행하였다.
탐색적 독성 연구
비-푸코실 h11G2 XC154/XC155를 탐색적 비-GLP 연구에서 IV 또는 SC 주사에 의해 원숭이 (1-2마리 성별/용량)에게 매주 1회 0 (IV, SC 비히클), 40 (IV), 260 (SC), 또는 400 (IV) mg/kg/용량 (총 3회 용량)으로 투여한 후, 비히클, 40(IV) 및 400 (IV) 군 (1마리/성별/군)에는 제352일까지 회복기를 두었다. 모든 동물은 제17일 또는 제352일의 그의 예정된 부검 시까지 생존하였다. 시험-물품 관련 임상 징후는 존재하지 않았고, 체중, 사료 소비, 또는 혈청 시토카인에 대한 영향도 존재하지 않았다.
투여기 동안, 제2일 또는 제3일에 시작된 기준선 (각각 0.00x-0.02x, 0.00x-0.02x, 및 0.03x -0.09x) 대비 말초 혈액 내 총 B 세포, CXCR5+ B 세포, 및 순환 Tfh-유사 세포에서의 감소가 존재하였고, 기준선으로부터 가장 큰 감소는 제17일에 관찰되었다. 고갈의 크기는 모든 용량에서 유사하였다. 비장에서, 대조군과 비교하여 모든 용량에서 현저하게 더 적은 수의 B 세포, CXCR5+ B 세포, 및 진정한 Tfh 세포 수가 관찰되었다 (각각 0.018x-0.144x, 0.003x-0.033x, 및 0.037x-0.245x). 말초 혈액에서, 제2일까지 ≥40 mg/kg/용량에서 1마리의 동물을 제외한 모든 동물에서 절대 림프구의 감소 (0.33x-0.67x 기준선) 및 제17일에 ≥40 mg/kg/용량에서 동물에서 이뮤노글로불린(Ig) G의 증가 (1.11x-1.81x 기준선)가 관찰되었다. 제2일에 자연 킬러 (NK) 세포 카운트에서 일시적인 감소가 존재하였고 (0.05x-0.14x 기준선), 대부분의 동물에서 제6일까지 부분적 내지 완전한 회복이 있었다. 비장 림프성 여포의 세포충실성의 중간 정도 내지 현저한 감소가 존재하였고; ≥40 mg/kg/용량에서 하악하, 액와 및 서혜 림프절 및 편도 내의 림프성 여포의 세포충실성의 최소 감소가 존재하였고, 260 mg/kg/용량 (SC)에서 주사 부위의 현미경적 혼합 세포 침윤이 존재하였다. 면역조직화학은 비장에서 비-용량 의존적으로 감소된 CD20-양성 세포 및 CXCR5-양성 세포, 및 하악하 및 서혜 림프절에서 감소된 CD20-양성 세포를 입증하였다. 림프성 조직에 대한 영향은 B 세포 및 Tfh-유사 세포 뿐만 아니라 말초 혈액 내의 총 림프구의 감소와 상관되었고, 이는 CXCR5-발현 세포를 표적화하는 고갈 항체인 비-푸코실 h11G2 XC154/XC155의 약리학과 일치하였다.
회복기 동안, B 세포, CXCR5+ B 세포, 및 Tfh-유사 세포 말초 혈액 카운트의 감소는 제199일까지 (서서히) 증가하였고, 제352일에 회복기 말미에, 모든 동물은 이들 세포 유형의 부분적 또는 완전한 회복을 가졌다. NK 세포 및 IgG는 회복기 동안 기준선 범위로 복귀하였다 (도 8a-8d). 어떠한 시험 물품-관련 현미경적 발견사항 (비장 및 하악하 및 서혜 림프절의 CD20 및 CXCR5 면역조직화학 평가 포함)은 존재하지 않았고, 비장에서, B 세포, CXCR5+ B 세포, 및 진정한 Tfh 세포 수는 비히클 대조군 동물에 대한 값과 유사하거나 그보다 더 높았고, 이는 완전한 회복을 시사한다.
어떠한 용량에서도 말초 혈액 또는 비장 내의 혈청 시토카인 또는 T 세포, T 헬퍼 세포, 또는 T 세포독성 세포에 대한 영향은 관찰되지 않았다. 본 연구에서 어떠한 명백한 항-약물 항체 (ADA)도 검출되지 않았다.
도 8a-8d는 시노몰구스 원숭이에서 말초 혈액 B 세포 및 Tfh-유사 세포의 고갈 및 재구성을 보여주는 그래프이다. 수컷 (도 8a 및 도 8c) 및 암컷 (도 8b 및 도 8d)의 혈액 μl당 말초 혈액 B 세포 (도 8a 및 8b) 및 Tfh-유사 세포 (도 8c 및 8d) 수준을 탐색적 독성 연구의 제352일까지 제시한다. B 세포는 CD3-CD20+로서 정의되었다. 시험 물품은 면역표현형결정에 사용되는 CXCR5 항체를 방해하기 때문에, Tfh-유사 세포는 CD3+CD4+CD95+CXCR5+ 세포 및CD3+CD4+CD95+hIgG+ 세포의 합으로 규정되었다. 수컷 원숭이 (도 8a, μL당 272-2503개 세포) 및 암컷 원숭이 (도 8b, μL당 233-1700개 세포)에서의 B 세포의 이력 범위를 파선으로 나타낸다.
중추적 (GLP) 독성 연구
비-푸코실 h11G2 XC154/XC155를 중추적 연구에서 IV 또는 SC 주사에 의해 원숭이 (3-8마리/성별/용량)에게 2주마다 0 (IV, SC), 5 (IV), 20 (SC), 또는 200 (IV) mg/kg/용량 (총 5회 용량)으로 투여한 후, 11-개월 회복기를 두었다 (제401일). 원숭이에게 제22일 (투여기) 및 제253일 (회복기)에 키홀 림펫 헤모시아닌 (KLH) 및 파상풍 톡소이드 (TT)를 주사하여 1차 및 2차 T 세포 의존성 항체 반응 (TDAR)을 각각 평가하였다. 연구 시작 전에 동물을 TT로 면역화하되 KLH-나이브로 두었다. 혈액 샘플을 연구 시작 전 (기준선) 제22일, 제25일, 제29일, 제36일, 제43일, 제58일, 제253일 (회복기 면역화 전), 제256일, 제260일, 제267일, 제274일, 및 제281일에 수집하고, 항-KLH-IgM, 항-KLH-IgG, 항-TT-IgM, 및 항-TT-IgG의 생산에 대해 평가하였다.
모든 투여기 동물은 제58일의 그의 예정된 부검 시까지 생존하였다. 시험-물품 관련 임상 징후는 존재하지 않았고, 체중, 사료 소비, 혈장 시토카인, 응고, 임상 화학, TDAR-KLH 파라미터, 또는 심전도 파라미터에 대한 영향도 존재하지 않았다. 본 연구에서의 모든 비-푸코실 h11G2 XC154/XC155-관련 발견사항은 5 및 200 mg/kg/용량 IV 및 20 mg/kg/용량 SC에서의 수컷 및 암컷에 대한 말초 혈액 내 혈액, 면역표현형결정 파라미터에서의 비-유해 및 가역 변화, TDAR-TT IgG 값에서의 용량-비의존성 감소, 및 비장 및/또는 림프절에서의 현미경적 발견사항 및 면역표현형결정 변화를 포함하였다. 회복기 동안, 1마리의 대조군 암컷을 혈액 수집 합병증으로 인해 제330일에 안락사시켰다. 모든 남아있는 회복 동물은 제401일의 부검 시까지 생존하였다.
비-푸코실 h11G2 XC154/XC155-관련 혈액 변화는 모든 용량에서의 일반적 용량-비의존성 경도 내지 중간 정도의 림프구 감소 (0.34x-0.60x 기준선)를 포함하였고, 이는 제2일에 발생률이 가장 높고 후속 시점에는 발생률이 더 낮았고, 모든 용량에서의 개별 동물에 대한 총 백혈구 카운트 (0.25x-0.59x 기준선)의 감소에 기여하였다. 림프구는 회복기의 처음 1 내지 2개월 내에 기준선 및/또는 대조군 값으로 근사화되었다. 또한, 제2일에 200 mg/kg/용량 IV에서 및 후속 시점에 5 mg/kg/용량 IV 및 20 mg/kg/용량 SC에서 개별 동물에 대해 호염기구의 경미한 감소가 존재하였고 (0.17x-0.50x), 이는 회복기의 처음 1 내지 3개월 내에 후속해서 회복되었고, 제6일에 200 mg/kg/용량 IV에서 암컷에 대해 적혈구 매스 (헤모글로빈, 적혈구 카운트, 및 적혈구용적률)의 일시적인 최소한의 감소가 존재하였다 (0.79x-0.82x).
제2일만큼 조기에 모든 동물 및 용량 군에서 기준선에 비해 말초 혈액 내의 총 B 세포, CXCR5+ B 세포, 및 Tfh-유사 세포에서 현저한 비-푸코실 h11G2 XC154/XC155-관련 감소가 존재하였고 (0.00x-0.56x), 이는 투여기 말미 (제58일)까지 지속되었고, 제393일까지의 회복기 동안 5 mg/kg/용량 IV 투여된 동물에서 각각의 하위세트에 대한 기준선으로 복귀되거나 비히클 대조군 동물에서 관찰되는 값의 범위 내인 절대값을 가졌다 (도 9a-9d). 또한 모든 동물에서 제2일에 말초 혈액 내의 NK 세포 수의 기준선 (0.04x-0.46x) 대비 현저한 감소가 존재하였지만; 대부분의 동물에 대해 제6일까지 부분적 내지 완전한 회복이 관찰되었고, 일부 동물의 경우 하나 이상의 후기 시점에서 NK 세포가 기준선 수준 미만으로 유지되었지만, 회복기의 말미에 기준선으로 복귀하였다. 또한, 일부 동물에서 제2일에 총 T 세포, T 헬퍼 세포, 및 T 세포독성 세포의 일시적 감소가 존재하였지만 (0.45x-0.66x); 이들 세포 집단은 대부분의 동물에서 제6일까지 및 모든 동물에서 제36일까지 기준선 수준으로 복귀하였다. 인터류킨 (IL)-2, IL-6, IL-10, IL-13, 인터페론 (IFN)-γ, 및 종양 괴사 인자 (TNF)-α에서는 어떠한 용량에서도 비-푸코실 h11G2 XC154/XC155-관련 변화가 존재하지 않았다.
비장 림프성 여포, 및 액와 및 장간막 림프절 내의 림프성 여포, 및 장 연관 림프성 조직 (GALT)의 비-푸코실 h11G2 XC154/XC155-관련 용량-비의존성 감소된 세포충실성이 ≥5 mg/kg/용량 IV 및 20 mg/kg/용량 SC에서 관찰되었다. 이는 20 mg/kg/용량 SC에서의 1마리의 수컷을 제외하고는 면역조직화학에 의해 평가된 비장에서의 CD20+ 및 CXCR5+ 세포의 감소된 림프성 여포 세포충실성과 연관되었지만; 이러한 동물에서의 비-푸코실 h11G2 XC154/XC155 노출은 제15일 이후 ADA의 만연으로 인해 영향을 받을 수 있었다. 또한, 비히클 대조군과 비교하여 제58일의 부검 시 비장에서 더 적은 수의 B 세포, CXCR5+ B 세포, 및 Tfh 세포가 존재하였다. 일부 동물은 대조군과 비교하여 비장에서 더 적은 NK 세포 수를 가졌다. 제401일의 회복 말미에, 비-푸코실 h11G2 XC154/XC155를 투여한 모든 동물에서 검사한 각각의 하위세트에 대한 절대값은 비히클 대조군에서의 동물에 대한 값의 범위 내에 있었고, 이는 연구의 투여기 동안 관찰된 비-푸코실 h11G2 XC154/XC155-관련 보다 적은 수로부터 회복을 나타낸다.
비장에서의 보다 적은 수의 B 세포, CXCR5+ B 세포, 및 Tfh 세포와 함께, 비장에서의 및 림프절 내 림프성 여포에서의 감소된 림프성 세포충실성은 ≥5 mg/kg/용량 IV 및 20 mg/kg/용량 SC에서의 총 림프구 및 말초 혈액 내 B 세포, CXCR5+ B 세포, 및 Tfh-유사 세포의 감소와 상관되었다. 회복기의 말미 (제401일)에, 5 mg/kg IV 용량 군에서는 비-푸코실 h11G2 XC154/XC155-관련 현미경적 발견사항이 존재하지 않았고, 이는 완전한 회복을 나타낸다. 이들 발견사항은 CXCR5-발현 세포를 고갈시키는 것으로 예상된 비-푸코실 h11G2 XC154/XC155의 약리학과 일치한다. 말초 혈액 및/또는 비장에서의 보다 적은 수의 NK 세포는 NK 이펙터 세포 사멸로 인한 것일 수 있고, 이는 항체-의존성 세포 세포독성 (Warren et al., 2011, J. Immunol. Meth. 370:86-92) 및/또는 조직 재분포 후의 NK 세포에서 기재되어 있지만; 다른 메카니즘이 배제될 수 없다.
키홀 림펫 헤모시아닌 (KLH)에 대한 1차 T 세포-의존성 항체 반응 (TDAR)에 대한 비-푸코실 h11G2 XC154/XC155-관련 효과는 존재하지 않았다. 항-KLH-이뮤노글로불린 (Ig)M 및 IgG 반응이 모든 군에서 관찰되었다. 모든 원숭이는 연구 전에 파상풍 톡소이드 (TT)에 대해 백신접종하였다. 모든 동물에서 모든 용량 군에서 증가된 IgM 및 IgG 기억 반응이 관찰되었다. 면역화의 7일, 14일, 21일 및 36일 후에 5 IV, 20 SC, 및/또는 200 IV mg/kg/용량 군에서 수컷 및 암컷 동물 둘 다에서 TT에 대한 2차 TDAR (IgG 중심점 역가 값)의 비-푸코실 h11G2 XC154/XC155-관련, 용량-비의존성 감소가 관찰되었다. 면역화 7일 후 5 및 200 mg/kg/용량 IV 군에 대해 군 평균 항-TT IgG 항체의 통계적으로 유의한 감소가 관찰되었다.
회복기 면역화 후, 1개 이상의 시점에 5 mg/kg 비-푸코실 h11G2 XC154/XC155 용량 군의 모든 동물에서 비히클 대조군 범위 내인 항-KLH IgM 및 IgG 기억 반응이 존재하였다. 회복 시점 동안, 회복기에서 면역화 7일 후에 5 mg/kg 용량 군 동물에서 관찰된 군 항-TT-IgG 중심점 역가 (CPT) 값에서 비-푸코실 h11G2 XC154/XC155-관련 통계적으로 유의한 감소가 존재하였다. 모든 회복기 동물의 CPT 값은, 회복기에서 TT 면역화 후 28-일까지 모든 회복 시점에서 대조군 범위보다 낮은 CPT 값을 가진 5 mg/kg 용량 군의 8마리의 동물 중 2마리를 제외하고, 대조군 범위 내에 있었다. 투여기 또는 회복기 동안 비-푸코실 h11G2 XC154/XC155 투여에 기인한 항-TT IgM 값의 변화는 존재하지 않았다.
모든 군에서 항-KLH IgM 및 IgG 1차 반응이 존재하였고; 5 및 200 mg/kg/용량 군의 일부 동물은 1차 면역화 후 1개 이상의 시점에 대조군의 범위 초과의 CPT를 가졌다. 임의의 시점에서 임의의 군의 군 평균 항-KLH IgM 또는 IgG 항체에서 통계적으로 유의한 차이는 존재하지 않았다. 개별 동물 변화가 산발성이고, 용량-의존성이 결여되어 있고, 군 CPT 값이 대조군 동물의 범위 내이기 때문에, 이는 비-푸코실 h11G2 XC154/XC155와 관련된 것으로 간주되지 않았다. 회복 시점 동안, 모든 동물은, KLH 면역화 후 14, 21, 및 28-일에 대조군의 범위보다 약간 낮은 CPT 값을 갖는 5 mg/kg 용량 군의 8마리의 동물 중 1마리를 제외하고, 대조군의 범위 내에 있었다. 이들 데이터 (용량 또는 회복기)는 모든 비-푸코실 h11G2 XC154/XC155 투여된 동물 (수컷 및 암컷 둘 다)이 대조군 동물과 유사한 KLH 면역화에 대한 1차 IgM 및 IgG 반응을 생성할 수 있음을 입증한다.
말초 혈액 내의 총 B 세포, CXCR5+ B 세포, Tfh-유사 세포, 및 NK 세포의 현저한 감소, 및 면역표현형 결정에 의해 검출된 바와 같은 비장 내의 B 세포, CXCR5+ B 세포, 및 Tfh 세포의 현저하게 더 적은 수, 림프구 카운트의 감소 및 비장, 림프절, 및 GALT에서의 림프성 세포충실성 감소에도 불구하고, 모든 발견사항은 연관 임상 징후의 결여 및 1차 TDAR에 대한 효과의 결여로 인해 비-유해하였다. 총 백혈구, 호염기구 및 적혈구 파라미터에서의 감소를 포함한 다른 혈액학적 발견사항은 제한된 중증도 및 현미경적 상관관계의 결여로 인해 유해하지 않았다. 제401일에는 비-푸코실 h11G2 XC154/XC155-관련 현미경적 및 면역조직화학적 발견사항이 나타나지 않았고, 이는 완전한 회복을 나타낸다.
2개월 동안 격주 SC 또는 IV 투여 후 원숭이에서의 비-푸코실 h11G2 XC154/XC155에 대한 NOAEL은 200 mg/kg/용량이었다. NOAEL에서의 전신 노출 (Cmax 및 AUC168)은 각각 5220 μg/mL 및 438,000 μg·h/mL였다. 항-비-푸코실 h11G2 XC154/XC155 항체를 본 연구에서 검출하였고, 데이터를 본원의 다른 곳에 요약하였다. 반복-용량 독성 프로그램에서 언급된 표적 기관 독성의 위험 평가를 본원의 다른 곳에 제공한다. 원숭이에서의 주요 반응과 연관된 비-푸코실 h11G2 XC154/XC155의 역치 농도는 본원의 다른 곳에서 확인할 수 있다.
생식 및 발생 독성
시노몰구스 원숭이에서 반복-용량 독성 연구에서 평가된 수컷 또는 암컷 생식 조직에서의 시험 물품-관련 효과는 존재하지 않았다.
국부 허용성
비-푸코실 h11G2 XC154/XC155를 사용한 독립적 국부 허용성 연구는 수행하지 않았지만, 생체내 독성 연구에서 주사 부위를 육안으로 및 현미경으로 검사하였다.
탐색적 원숭이 연구에서, 260 mg/kg/용량으로의 SC 주사 부위에서, 대조군 동물의 SC 주사 부위에서의 최소 내지 경도의 침윤과 비교하여 중간 정도의 혈관주위 혼합 백혈구 세포 침윤 (단핵 백혈구, 호중구, 및 더 적은 호산구)이 존재하였다. 260 mg/kg/용량 SC 수컷에서, 침윤물은 소혈관의 근막 내로 다초점성 연장되었다. 260 mg/kg/용량 SC 암컷에서, 여러 다핵 거대 세포가 피하 콜라겐을 침윤하였고, 이들 세포 내에 원섬유 물질의 세포질내 호염기성 또는 호산구성 비트가 존재하였다. 중추적 2-개월 원숭이 연구에서, IV 및 SC 투여 부위에서의 현미경적 발견사항은 시험 물품과 관련된 것으로 간주되지 않았다.
항원성
면역원성은 시노몰구스 원숭이에서의 반복-용량 독성 연구에서 ADA 수준을 측정함으로써 평가하였고; 이들 데이터는 본원에서 앞서 기재되었다.
면역독성
시험관내 및 생체내 연구는 면역계에 대한 비-푸코실 h11G2 XC154/XC155의 효과를 특징화하였다. 비-푸코실 h11G2 XC154/XC155가 시토카인 (TNF-α, IL-6, 및 IFN-γ)의 방출을 유도하는 잠재성을 인간 시토카인 방출 검정에서 2가지 상이한 시험관내 포맷: 전혈을 사용하는 가용성 상 검정, 및 고정된 비-푸코실 h11G2 XC154/XC155 및 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 사용하는 고체 상 검정을 사용하여 결정하였다. 8명의 건강한 인간 공여자로부터의 샘플을 각각의 이들 포맷에서 평가하였다. 둘 다의 시토카인 방출 검정 포맷에서, 비-푸코실 h11G2 XC154/XC155-유도된 시토카인 방출 (TNF-α, IL-6, 및 IFN-γ)이 관찰되었다. 생체내에서, 원숭이에서의 반복-용량 탐색적 및 중추적 독성 연구는 생체내 시토카인 방출 프로파일, 뿐만 아니라 면역계 세포 및 조직에 대한 비-푸코실 h11G2 XC154/XC155의 효과를 특징화하였다. 비-푸코실 h11G2 XC154/XC155는 생체내에서 시토카인을 유도하지 않았다. 본원의 다른 곳에 기재된 바와 같이, 비-푸코실 h11G2 XC154/XC155를 투여한 원숭이의 말초 혈액 및 비장에서 림프구, B 세포, CXR5+ B 세포, 및 Tfh/Tfh-유사 세포의 고갈이 관찰되었고, 이러한 효과는 CXCR5 고갈 항체의 예상된 작용 메카니즘과 일치하였다. 탐색적 및 중추적 독성 연구에서 회복기 후에, 비장 및 림프절에서의 림프구 파라미터는 비히클 대조군과 대등하였다.
각각 KLH 및 TT에 대한 1차 및 2차 TDAR 반응을 본원의 다른 곳에 논의된 바와 같은 중추적 2-개월 독성 연구에서 평가하였다. KLH에 대한 1차 TDAR에 대한 비-푸코실 h11G2 XC154/XC155-관련 효과는 존재하지 않았다. 모든 동물은 TT에 대한 2차 TDAR 반응을 생성하였지만, 연구의 투여기 및 회복기 동안 면역화 7일 후에 5 및 200 mg/kg/용량 IV 군에 대한 중심점 역가에서 비-푸코실 h11G2 XC154/XC155-관련 감소가 관찰되었다.
조직 교차 반응성 (TCR)
비-푸코실 h11G2 XC154/XC155를 사용한 예비 염색 방법 연구에서 다수의 시행 및 방법을 포함하는 광범위한 예비 방법 개발 작업을 수행하였다. 이들 검정 조건 중 어떠한 것도 예상된 세포 및 조직에서 막 염색을 일관되게 입증하지 않았다. GLP-준수 조직 교차-반응성 연구에서 시노몰구스 원숭이 및 인간 조직의 동결절편에 대한 비오티닐화된 비-푸코실 h11G2 XC154/XC155 (비-푸코실 h11G2 XC154/XC155-바이오; 1 및 5 μg/mL)의 결합을 평가하였다. 염색 패턴은 시노몰구스 원숭이와 인간 조직 사이에 중첩되었다. 인간 및 원숭이 둘 다에 공통인 염색은 단핵 세포, 세망내피 세포, 다양한 상피, 신경교 세포 및/또는 뇌하수체세포에서 관찰되었고, 이는 비-푸코실 h11G2 XC154/XC155 (Breitfeld et al., 2000, J Exp Med 192(11):1545-1552; Carlsen et al., 2002, Gut 51(3):364-371;Flynn et al., 2003, J. Neuroimmunol. 136(1-2):84-93; Schaerli et al., 2000, J. Exp. Med. 192(11):1553-1562; Schmutz et al., 2005, Arthritis Res. Ther. 7(2):R217-R229), 뿐만 아니라 갑상선 콜로이드의 예상된 반응성을 나타낸다. 양성 비-푸코실 h11G2 XC154/XC155 염색이 다른 원숭이 또는 인간 조직에 대해 관찰되었다. 인간 조직의 경우, 염색은 시신경 내의 신경 섬유 및 척수 신경근 내의 뉴런, 전립선의 평활 근세포, 고환 내의 간질 세포, 및 안구 내의 수정체 섬유에 대해 관찰되었다.
시노몰구스 원숭이에서만 염색된 조직은 골수 내의 조혈 전구체 세포, 피부 및 자궁경부의 비만 세포, 뇌 및 척수 내의 신경망, 심근세포, 및 태반 및 시신경초 내의 방추 세포였다. 이는 시험 물품의 예상외의 교차-반응성을 나타낼 수 있지만, 염색은 사실상 세포질 염색이었고, 미세해부학적 특이성은 갖지 않았고, 분명한 형질 막 염색은 결여되었다. 이러한 세포질 염색은 CXCR5-발현 대 비발현 세포 및 조직을 불량하게 구별하였다. 세포질 염색은 생체내 시험 물품에 접근가능할 것으로 예상되지 않을 것이고, 일반적으로 독성학적 유의성은 거의 내지 전혀 없는 것으로 간주된다 (Hall et al., 2008, In: Preclinical Safety Evaluation of Biopharmaceuticals: A Science-Based Approach to Facilitating Clinical Trials, p. 208-240, Cavagnaro, J.A., ed., Wiley-Interscience; Leach et al., 2010, Toxicol. Pathol. 38(7):1138-1166). 분명한 막 염색의 결여는 완전한 평가를 위한 강건한 방법은 수득가능하지 않다는 것을 시사한다. 2-개월 반복-용량 독성 연구에서의 유해한 발견사항의 결여는 생체외 조직 교차-반응성 연구에서 관찰된 염색이 생체내 효과로 해석되지 않는다는 것을 뒷받침한다. 강건한 TCR 방법을 수득하기 위해 다수의 시도가 이루어졌지만, 관찰된 결합은 의도된 약리학에 기초하여 예상되는 것을 넘어서는 안전성 우려는 발생시키지 않았다.
약동학에 대한 발견사항의 관계
2개월 동안 2주마다 5 (IV), 20 (SC), 또는 200 (IV) mg/kg/용량의 용량으로 수컷 및 암컷 원숭이에게 SC 또는 IV 투여한 후 (총 5회 용량) 비-푸코실 h11G2 XC154/XC155의 혈청 농도를 결정하였다. 용량 군에 걸쳐 전신 노출에 있어서 명백한 성별-관련 차이가 존재하지 않았고; 따라서 군 평균 TK 파라미터를 수컷 및 암컷 시노몰구스 원숭이 둘 다로부터의 조합 데이터를 사용하여 제시하였다. 전신 노출은 반복 투여 후에 더 높았고, 축적 비 (연구 제43일/연구 제1일)는 대략 1.4 내지 1.7 범위였다. 추가로, 전신 노출은 IV 투여 후에 용량-비례 방식으로 증가하였다. SC 투여 후, 비-푸코실 h11G2 XC154/XC155의 생체이용률은 >50%인 것으로 추정되었다.
주요 반응과 연관된 비-푸코실 h11G2 XC154/XC155의 역치 혈청 농도 및 이들 주요 반응에 대해 계산된 노출 한계를 표 15에 제공한다.
표 15
Figure pct00017
표 15에서 사용된 약어는 다음과 같다: AUC = 농도-시간 곡선하 면적; Cav = 평균 농도; Cmax = 최대 (평균) 혈장 농도; Tfh-유사 세포 (대안적으로, cTfh); CXCR5 = 케모카인 수용체 유형 5; GALT = 장-연관 림프 조직; IgG = 이뮤노글로불린 G; IV = 정맥내; NK = 자연 킬러; NOAEL = 무관찰 부작용 수준; SC = 피하; TDAR =T 세포 의존성 항체 반응; Tfh = 여포성 T 헬퍼 세포; TT = 파상풍 톡소이드; WBC = 백혈구.
반복-용량 연구에서, Cmax 값은 평균 혈장 농도를 나타낸다. Cav 값은 AUC를 샘플링 구간 (48 또는 168시간)으로 나눔으로써 계산된다. 보고된 값은 투여기 말미에 임박하여 수득하였다.
노출 한계는 동물 독성 연구에서의 Cav 값을 예측된 인간 유효 용량 30 mg, IV에서의 예측된 인간 Cav 4.06 μg/mL로 나눔으로써 계산하였다.
표적 기관 독성
수행된 비임상 연구에 기초하여, 림프조혈계 (비장, 림프절, GALT, 편도, 순환 림프구, 백혈구, 적혈구 파라미터, 시험관내 시토카인 방출)를 잠재적 표적 기관/조직으로서 확인하였다. 비-푸코실 h11G2 XC154/XC155를 사용하여 수행된 비중추적 17-일 원숭이 연구에서, 이들 조직에서의 시험 물품-관련 변화는 중추적 2-개월 독성 연구에서 관찰된 것과 일치하였다. 모든 비-푸코실 h11G2 XC154/XC155-관련 발견사항은 비중추적 및 중추적 독성 연구에서 회복기 동안 기준선 또는 비히클 대조군 값으로 완전히 또는 부분적으로 복귀되었다. 임의의 임상 발견사항 또는 기회 감염의 부재로 인해, 및 TDAR 검정에 의해 측정된 면역 기능에 대한 최소의 영향으로 인해, 어떠한 시험 물품-관련 효과도 유해한 것으로 간주되지 않았다. 따라서, 비-푸코실 h11G2 XC154/XC155-관련 효과에 대한 원숭이에서의 200 mg/kg/용량 IV의 NOAEL이 확립되었다.
림프조혈계
시노몰구스 원숭이에서의 반복-용량 독성 연구에서, 말초 혈액 림프구에서의 비-푸코실 h11G2 XC154/XC155-관련 감소는 용량 ≥5 mg/kg/용량 (IV) 및 20 mg/kg/용량 (SC)에서 연구 제2일부터 관찰되었다. 이들 감소는 총 B 세포, CXCR5+ B 세포, 및 Tfh-유사 세포에서 관찰된 감소와 상관되었고, 이는 제57일까지 지속되었다. 이들 림프구 하위세트에서의 감소는 탐색적 독성 연구에서 회복기 말미에 기준선 값으로의 완전한 또는 부분적 복귀를 입증하였다. 또한, ≥5 mg/kg/용량에서, NK 세포, 총 T 세포, T 헬퍼 세포, 및 T 세포독성 세포에서의 비-푸코실 h11G2 XC154/XC155-관련 감소가 제2일부터 존재하였지만, 기준선 값으로의 부분적 내지 완전한 복귀가 투여기 말미에 달성되었다. 말초 혈액 내 림프구 집단의 감소에 더하여, RBC 매스에서 일시적인, 최소 감소가 제6일에 200 mg/kg/용량을 투여한 암컷 원숭이에서 관찰되었다.
말초 혈액 내의 감소된 림프구 집단은 ≥5 mg/kg/용량에서 비장 및 림프절에서의 비-푸코실 h11G2 XC154/XC155-관련 보다 낮은 림프성 세포충실성과 상관되었다. 보다 낮은 림프성 세포충실성은 보다 적은 수의 총 B 세포, CXCR5+ B 세포, 진정한 Tfh 세포, 및 NK 세포, 및 비장 내의 보다 적은 여포 CD20+ 및 CXCR5+ 세포에 반영되었다. 림프절 및 GALT에서 ≥5 mg/kg/용량에서 및 편도에서 ≥40 mg/kg/용량에서, 보다 낮은 여포성 림프성 세포충실성이 관찰되었다.
탐색적 및 중추적 독성 연구에서 회복기 후에, 비장 및 림프절에서의 림프구 파라미터는 비히클 대조군과 대등하였다.
총 B 세포, CXCR5+ B 세포, 및 Tfh/ Tfh-유사 세포의 감소는 CXCR5-발현 세포를 고갈시킬 것으로 예상된 비-푸코실 h11G2 XC154/XC155의 예상된 작용 메카니즘과 일치하였다. 말초 혈액 및 비장에서의 보다 적은 NK 세포 수는 ADCC 후 NK 세포에서 발생하는 것으로 공지된 이펙터 세포 사멸로 인한 것일 수 있다.
림프구 파라미터의 감소가 비-푸코실 h11G2 XC154/XC155를 투여한 원숭이의 말초 혈액 및 비장에서 관찰되었지만, KLH에 대한 1차 TDAR에 대한 비-푸코실 h11G2 XC154/XC155-관련 효과는 존재하지 않았다. 모든 동물은 TT에 대한 2차 TDAR을 생성하였지만, ≥5 mg/kg/용량의 용량에서 통계적으로 유의한 감소가 관찰되었다.
모든 비-푸코실 h11G2 XC154/XC155-관련 발견사항은 연관 임상 징후 또는 기회 감염의 결여로 인해 비유해한 것으로 간주되었다. 말초 혈액 림프구, 총 B 세포, CXCR5+ B 세포, Tfh-유사 세포, 및 NK 세포, 뿐만 아니라 1차 및 2차 TDAR 반응에 대한 비-푸코실 h11G2 XC154/XC155의 영향은 임상에서 인간에서 모니터링할 수 있다.
둘 다의 가용성 및 고체 시험관내 시토카인 방출 검정 포맷에서, 비-푸코실 h11G2 XC154/XC155-유도된 시토카인 방출 (TNF-α, IL-6, 및 IFN-γ)이 관찰되었다. 시험관내 비-푸코실 h11G2 XC154/XC155 유도된 시토카인 방출이 이러한 분자의 예상되는 약리학으로 인해 기대된다. 비-푸코실 h11G2 XC154/XC155는 탐색적 또는 중추적 생체내 원숭이 연구에서 시토카인 방출을 유도하지 않았다. 혈청 시토카인 및 전신 시토카인 방출의 임상 지표는 임상에서 용이하게 모니터링된다.
표 16
(서열)
(CDR 아미노산 잔기는 밑줄표시됨)
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Figure pct00023
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다양한 변형 및 변경이 본 발명의 범주 또는 취지에서 벗어나지 않으면서 본 발명에서 이루어질 수 있다는 것이 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 분명할 것이다. 본원에 개시된 본 발명의 명세서 및 실시의 고려 사항으로부터 본 발명의 다른 실시양태는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 분명할 것이다. 명세서 및 실시예는 단지 예시적인 것으로 여겨지며, 본 발명의 실제 범주 및 취지는 하기 청구범위에 의해 제시되는 것으로 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> PFIZER INC. THE REGENTS OF THE UNIVERSITY OF CALIFORNIA GROTH, Rachel SNYDER, William B. CAO, Xianjun DUNN, Robert J. DAL PORTO, Joseph KARIN, Michael <120> ANTI-CXCR5 ANTIBODIES AND COMPOSITIONS AND USES THEREOF <130> W2023-706501 <140> concurrently herewith <141> concurrently herewith <150> 62/593,830 <151> 2017-12-01 <150> 62/732,985 <151> 2018-09-18 <160> 100 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 1 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Glu Tyr His 20 25 30 Gly Thr Ser Leu Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Val Glu Ser Gly Val Pro Ser 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 80 Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Arg 85 90 95 Lys Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 2 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 2 Glu Ser Val Glu Tyr His 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tggtntccnc anctcagttc cttg 44 <210> 73 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 73 atccacgcgg ccgcctcacc atgtatatat gtttgttgtc tatttct 47 <210> 74 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 74 atcacgcggc cgcctcacca tggaagcccc agctcagctt ctcttcc 47 <210> 75 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 75 cagttggtgc agcatccgta cgtttgattt ccag 34 <210> 76 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> misc_feature <222> (33)..(33) <223> n can be c or g <400> 76 actagcggcc gcatgaaatg cagctgggtc atnttcttc 39 <210> 77 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> misc_feature <222> (26)..(26) <223> n can be a or g <220> <221> misc_feature <222> (33)..(33) <223> n can be c or g <220> <221> misc_feature <222> (34)..(34) <223> n can be c or t <400> 77 actagcggcc gcatgggatg gagctntatc atnntct 37 <210> 78 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> misc_feature <222> (19)..(19) <223> n can be a or t <400> 78 actagcggcc gcatgaagnt gtggttaaac tgggtttttt 40 <210> 79 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> n can be a or g <220> <221> misc_feature <222> (25)..(25) <223> n can be c or t <220> <221> misc_feature <222> (34)..(34) <223> n can be a or g <400> 79 actagcggcc gcatgnactt tgggntcagc ttgnttt 37 <210> 80 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 80 actagcggcc gcatggactc caggctcaat ttagttttcc tt 42 <210> 81 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> misc_feature <222> (22)..(22) <223> n can be c or t <220> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> n can be g or a <220> <221> misc_feature <222> (26)..(26) <223> n can be c or g <220> <221> misc_feature <222> (30)..(30) <223> n can be g or a <400> 81 actagcggcc gcatggctgt cntngngctn ctcttctgc 39 <210> 82 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> misc_feature <222> (17)..(17) <223> n can be a or g <220> <221> misc_feature <222> (25)..(25) <223> n can be g or t <220> <221> misc_feature <222> (28)..(28) <223> n can be a or g <220> <221> misc_feature <222> (34)..(34) <223> n can be c or a <400> 82 actagcggcc gcatggnatg gagcnggntc tttntctt 38 <210> 83 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 83 actagcggcc gcatgagagt gctgattctt ttgtg 35 <210> 84 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> misc_feature <222> (17)..(17) <223> n can be a or c <220> <221> misc_feature <222> (29)..(29) <223> n can be a or c <400> 84 actagcggcc gcatggnttg ggtgtgganc ttgctattcc tg 42 <210> 85 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 85 actagcggcc gcatggattt tgggctgatt tttttattg 39 <210> 86 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 86 actagcggcc gcatgggcag acttacattc tcattcctg 39 <210> 87 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 87 actagcggcc gcatgatggt gttaagtctt ctgtacctg 39 <210> 88 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> misc_feature <222> (20)..(20) <223> n can be a or c <220> <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> n can be g or a <220> <221> misc_feature <222> (27)..(27) <223> n can be g or a <400> 88 gggggtgtcg tcgacgctgn ngagacngtg a 31 <210> 89 <211> 330 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 89 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 225 230 235 240 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 <210> 90 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 90 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 1 5 10 15 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 20 25 30 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 35 40 45 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 65 70 75 80 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 85 90 95 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 <210> 91 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 91 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Asn Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 100 105 110 Ser <210> 92 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 92 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 93 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 93 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 94 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 94 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 1 5 10 <210> 95 <211> 332 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 95 acatccagat gacccagagc ccttccagcc tgagcgcttc cgtgggagat agggtgacca 60 tcacctgcag ggccagcgag tccgtggagt accacggcac cagcctgatg cactggtacc 120 agcagaagcc cggcaaggcc cccaagctgc tgatctacgc cgccagcaac gtggagagcg 180 gcgtgcctag cagattcagc ggcagcggaa gcggcaccga cttcaccctg accattagca 240 gcctgcagcc cgaggacttc gccacctact actgtcagca gagcaggaag gtgccctgga 300 ccttcggcca gggcaccaag gtcgagatca ag 332 <210> 96 <211> 360 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 96 gaggtgcagc tggtggagag cggaggagga ctggtgcagc ctggcggaag cctgagactg 60 agctgcgccg ccagcggctt cacctttacc gacttctaca tgagctgggt gaggcaggct 120 cccggcaaag gactggagtg ggtgggtttc atcaggaaca aggccaacgg ctacaccacc 180 gagtatagcg cctccgtgaa gggcaggttc accatcagca gggacaacgc caagaacagc 240 ctgtacctgc agatgaacag cctgagggcc gaggacaccg ccgtgtacta ctgcgccaga 300 gtgtacggca gcacactgca ctactggggc cagggcaccc tggtgaccgt gagcagcgcg 360 <210> 97 <211> 657 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 97 gacatccaga tgacccagag cccttccagc ctgagcgctt ccgtgggaga tagggtgacc 60 atcacctgca gggccagcga gtccgtggag taccacggca ccagcctgat gcactggtac 120 cagcagaagc ccggcaaggc ccccaagctg ctgatctacg ccgccagcaa cgtggagagc 180 ggcgtgccta gcagattcag cggcagcgga agcggcaccg acttcaccct gaccattagc 240 agcctgcagc ccgaggactt cgccacctac tactgtcagc agagcaggaa ggtgccctgg 300 accttcggcc agggcaccaa ggtcgagatc aagcgtacgg tggctgcacc atctgtcttc 360 atcttcccgc catctgatga gcagttgaaa tctggaactg cctctgttgt gtgcctgctg 420 aataacttct atcccagaga ggccaaagta cagtggaagg tggataacgc cctccaatcg 480 ggtaactccc aggagagtgt cacagagcag gacagcaagg acagcaccta cagcctcagc 540 agcaccctga cgctgagcaa agcagactac gagaaacaca aagtctacgc ctgcgaagtc 600 acccatcagg gcctgagctc gcccgtcaca aagagcttca acaggggaga gtgttag 657 <210> 98 <211> 1347 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 98 gaggtgcagc tggtggagag cggaggagga ctggtgcagc ctggcggaag cctgagactg 60 agctgcgccg ccagcggctt cacctttacc gacttctaca tgagctgggt gaggcaggct 120 cccggcaaag gactggagtg ggtgggtttc atcaggaaca aggccaacgg ctacaccacc 180 gagtatagcg cctccgtgaa gggcaggttc accatcagca gggacaacgc caagaacagc 240 ctgtacctgc agatgaacag cctgagggcc gaggacaccg ccgtgtacta ctgcgccaga 300 gtgtacggca gcacactgca ctactggggc cagggcaccc tggtgaccgt gagcagcgcg 360 tcgaccaagg gcccatcggt cttccccctg gcaccctcct ccaagagcac ctctgggggc 420 acagcggccc tgggctgcct ggtcaaggac tacttccccg aaccggtgac ggtgtcgtgg 480 aactcaggcg ccctgaccag cggcgtgcac accttcccgg ctgtcctaca gtcctcagga 540 ctctactccc tcagcagcgt ggtgaccgtg ccctccagca gcttgggcac ccagacctac 600 atctgcaacg tgaatcacaa gcccagcaac accaaggtgg acaagaaagt tgagcccaaa 660 tcttgtgaca aaactcacac atgcccaccg tgcccagcac ctgaactcct ggggggaccg 720 tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag gacaccctca tgatctcccg gacccctgag 780 gtcacatgcg tggtggtgga cgtgagccac gaagaccctg aggtcaagtt caactggtac 840 gtggacggcg tggaggtgca taatgccaag acaaagccgc gggaggagca gtacaacagc 900 acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggag 960 tacaagtgca aggtctccaa caaagccctc ccagccccca tcgagaaaac catctccaaa 1020 gccaaagggc agccccgaga accacaggtg tacaccctgc ccccatcccg ggaggagatg 1080 accaagaacc aggtcagcct gacctgcctg gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc 1140 gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg 1200 gactccgacg gctccttctt cctctatagc aagctcaccg tggacaagag caggtggcag 1260 caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaacca ctacacgcag 1320 aagagcctct ccctgtcccc gggttga 1347 <210> 99 <211> 990 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 99 gcgtcgacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 60 ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120 tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180 ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 240 tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 300 aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 360 ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 420 gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 480 tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 540 agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 600 gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 660 aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggaggag 720 atgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 780 gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 840 ctggactccg acggctcctt cttcctctat agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 900 cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 960 cagaagagcc tctccctgtc cccgggttga 990 <210> 100 <211> 324 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 100 cgtacggtgg ctgcaccatc tgtcttcatc ttcccgccat ctgatgagca gttgaaatct 60 ggaactgcct ctgttgtgtg cctgctgaat aacttctatc ccagagaggc caaagtacag 120 tggaaggtgg ataacgccct ccaatcgggt aactcccagg agagtgtcac agagcaggac 180 agcaaggaca gcacctacag cctcagcagc accctgacgc tgagcaaagc agactacgag 240 aaacacaaag tctacgcctg cgaagtcacc catcagggcc tgagctcgcc cgtcacaaag 300 agcttcaaca ggggagagtg ttag 324

Claims (28)

  1. CXCR5에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편이며, 여기서 항체는
    a) 서열식별번호: 2의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; 서열식별번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 서열식별번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3; 서열식별번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; 서열식별번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 및 서열식별번호: 9의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 항체;
    b) 서열식별번호: 2의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; 서열식별번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 서열식별번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3; 서열식별번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; 서열식별번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 및 서열식별번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 항체;
    c) 서열식별번호: 14의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; 서열식별번호: 15의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 서열식별번호: 16의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3; 서열식별번호: 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; 서열식별번호: 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 및 서열식별번호: 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 항체;
    d) 수탁 번호 PTA-124324로 ATCC에 기탁된 플라스미드의 삽입물에 의해 코딩된 아미노산 서열을 포함하는 VL 및 수탁 번호 PTA-124323으로 ATCC에 기탁된 플라스미드의 삽입물에 의해 코딩된 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하는 항체;
    e) 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 VL 및 서열식별번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하는 항체;
    f) 서열식별번호: 13의 아미노산 서열을 포함하는 VL 및 서열식별번호: 18의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하는 항체;
    g) 서열식별번호: 47의 아미노산 서열을 포함하는 VL 및 서열식별번호: 52의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하는 항체;
    h) 서열식별번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 VL 및 서열식별번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하는 항체;
    i) 서열식별번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 VL 및 서열식별번호: 10의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하는 항체;
    j) 서열식별번호: 13의 아미노산 서열을 포함하는 VL 및 서열식별번호: 17의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하는 항체;
    k) 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 VL 및 서열식별번호: 12의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하는 항체;
    l) 서열식별번호: 22의 아미노산 서열을 포함하는 LC 및 서열식별번호: 23의 아미노산 서열을 포함하는 HC를 포함하는 항체;
    m) 서열식별번호: 24의 아미노산 서열을 포함하는 LC 및 서열식별번호: 25의 아미노산 서열을 포함하는 HC를 포함하는 항체;
    n) 서열식별번호: 26의 아미노산 서열을 포함하는 LC 및 서열식별번호: 27의 아미노산 서열을 포함하는 HC를 포함하는 항체;
    o) 서열식별번호: 28의 아미노산 서열을 포함하는 LC 및 서열식별번호: 29의 아미노산 서열을 포함하는 HC를 포함하는 항체;
    p) 서열식별번호: 95의 핵산 서열에 의해 코딩된 VL 및 서열식별번호: 96의 핵산 서열에 의해 코딩된 VH를 포함하는 항체; 및
    q) 서열식별번호: 97의 핵산 서열에 의해 코딩된 LC 및 서열식별번호: 98의 핵산 서열에 의해 코딩된 HC를 포함하는 항체
    로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개의 항체인, CXCR5에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  2. C-X-C-케모카인 수용체 5 (CXCR5)에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편이며, 여기서 항체 또는 그의 항원-결합 단편은
    a) 서열식별번호: 32의 아미노산 서열의 넘버링에 따른 아미노산 잔기 번호 11에서 류신을 포함하는 hCXCR5 에피토프에 결합하지만, 상기 잔기가 류신이 아닌 상기 에피토프에는 결합하지 않는 항체 또는 그의 항원-결합 단편;
    b) 서열식별번호: 32의 아미노산 서열의 넘버링에 따른 아미노산 잔기 번호 11에서 류신을 포함하는 hCXCR5 에피토프에 결합하지만, 상기 잔기가 트레오닌인 상기 에피토프에는 결합하지 않는 항체 또는 그의 항원-결합 단편;
    c) 서열식별번호: 32의 아미노산 서열의 넘버링에 따른 아미노산 잔기 번호 22에서 아스파르테이트를 포함하는 hCXCR5 에피토프에 결합하지만, 상기 잔기가 아스파르테이트가 아닌 상기 에피토프에는 결합하지 않는 항체 또는 그의 항원-결합 단편;
    d) 서열식별번호: 32의 아미노산 서열의 넘버링에 따른 아미노산 잔기 번호 22에서 아스파르테이트를 포함하는 hCXCR5 에피토프에 결합하지만, 상기 잔기가 알라닌인 상기 에피토프에는 결합하지 않는 항체 또는 그의 항원-결합 단편;
    e) 서열식별번호: 32의 아미노산 서열의 넘버링에 따른 아미노산 잔기 번호 11에서 류신을 포함하고 아미노산 잔기 번호 22에서 아스파르테이트를 포함하는 hCXCR5 에피토프에 결합하지만, 상기 류신이 트레오닌으로 치환되고/거나 상기 아스파르테이트가 알라닌으로 치환된 상기 에피토프에는 결합하지 않는 항체 또는 그의 항원-결합 단편;
    f) 서열식별번호: 32의 아미노산 서열의 넘버링에 따른 아미노산 잔기 번호 11에서 류신을 포함하는 hCXCR5 또는 그의 단편에 결합하지만, 상기 잔기가 류신이 아닌 hCXCR5 또는 그의 단편에는 결합하지 않는 항체 또는 그의 항원-결합 단편;
    g) 서열식별번호: 32의 아미노산 서열의 넘버링에 따른 아미노산 잔기 번호 11에서 류신을 포함하는 hCXCR5 또는 그의 단편에 결합하지만, 상기 잔기가 트레오닌인 hCXCR5 또는 그의 단편에는 결합하지 않는 항체 또는 그의 항원-결합 단편;
    h) 서열식별번호: 32의 아미노산 서열의 넘버링에 따른 아미노산 잔기 번호 22에서 아스파르테이트를 포함하는 hCXCR5 또는 그의 단편에 결합하지만, 상기 잔기가 아스파르테이트가 아닌 hCXCR5 또는 그의 단편에는 결합하지 않는 항체 또는 그의 항원-결합 단편;
    i) 서열식별번호: 32의 아미노산 서열의 넘버링에 따른 아미노산 잔기 번호 22에서 아스파르테이트를 포함하는 hCXCR5 또는 그의 단편에 결합하지만, 상기 잔기가 알라닌인 hCXCR5 또는 그의 단편에는 결합하지 않는 항체 또는 그의 항원-결합 단편; 및
    j) 서열식별번호: 32의 아미노산 서열의 넘버링에 따른 아미노산 잔기 번호 11에서 류신을 포함하고 아미노산 잔기 번호 22에서 아스파르테이트를 포함하는 hCXCR5 또는 그의 단편에 결합하지만, 상기 류신이 트레오닌으로 치환되고/거나 상기 아스파르테이트가 알라닌으로 치환된 hCXCR5 또는 그의 단편에는 결합하지 않는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
    으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개의 항체인, CXCR5에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  3. C-X-C-케모카인 수용체 5 (CXCR5)에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편이며, 여기서 항체 또는 그의 항원-결합 단편은
    a) EC50 약 6.60 pM, 표준 편차 약 플러스 또는 마이너스 2.33 pM의 겉보기 친화도로 인간 B 세포 상에서 발현된 hCXCR5에 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편;
    b) EC50 약 5.89 pM, 표준 편차 약 플러스 또는 마이너스 1.40 pM의 겉보기 친화도로 인간 순환 여포성 T 헬퍼-유사 세포 상에서 발현된 hCXCR5에 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편;
    c) EC50 약 10.6 pM의 겉보기 친화도로 인간 여포성 T 헬퍼 (Tfh) 세포 상에서 발현된 hCXCR5에 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편;
    d) EC50 약 1.32 pM의 겉보기 친화도로 시노몰구스 원숭이 B 세포 상에서 발현된 시노CXCR5에 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편;
    e) EC50 약 10.5 pM의 겉보기 친화도로 시노몰구스 원숭이 Tfh-유사 세포 상에서 발현된 시노CXCR5에 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편;
    f) cAMP 리포터 검정에서 EC50 약 961 pM로 CXCR5-CXCL13 신호전달을 길항작용하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편;
    g) EC50 약 2.01 pM, 표준 편차 약 플러스 또는 마이너스 2.28 pM로 hCXCR5를 발현하는 인간 B 세포에 대해 ADCC 활성을 나타내는 항체 또는 그의 항원-결합 단편;
    h) EC50 약 4.28 pM, 표준 편차 약 플러스 또는 마이너스 2.88 pM로 hCXCR5를 발현하는 인간 Tfh-유사 세포에 대해 ADCC 활성을 나타내는 항체 또는 그의 항원-결합 단편;
    i) EC50 약 0.11 pM로 hCXCR5를 발현하는 인간 Tfh 세포에 대해 ADCC 활성을 나타내는 항체 또는 그의 항원-결합 단편;
    j) EC50 약 15.3 pM, 표준 편차 약 플러스 또는 마이너스 11.7 pM로 시노CXCR5를 발현하는 시노몰구스 원숭이 B 세포에 대해 ADCC 활성을 나타내는 항체 또는 그의 항원-결합 단편;
    k) hCXCR5에 결합하지만, 인간 케모카인 수용체 CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCR9, CCR10, CMKLR1, CXCR3R1, CXCR1, CXCR2, CXCR3, CXCR4, CXCR6, CXCR7, 및 XCR1에는 검출가능하게 결합하지 않는 항체 또는 그의 항원-결합 단편;
    l) CXCL13에 대한 CXCR5의 결합을 억제하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편;
    m) EC50 약 26 pM 미만의 겉보기 친화도로 CXCR5+ 인간 B 세포에 결합하지만, CXCR5 마우스, 래트 또는 토끼 오르토로그를 발현하는 세포에는 결합하지 않는 항체 또는 그의 항원-결합 단편;
    n) 포르스콜린에 의해 촉발된 cAMP 방출의 CXCL13 억제를 길항작용하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편;
    o) 인간 공여자 및 시노몰구스 PBMC 및 인간 공여자 TMC에서 CXCR5-발현 세포의 ADCC를 촉발하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편;
    p) 인간 CXCR5에 결합하지만, 인간 케모카인 수용체 CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCR9, CCR10, CMKLR1, CXCR3R1, CXCR1, CXCR2, CXCR3, CXCR4, CXCR6, CXCR7, 또는 XCR1에는 결합하지 않는 항체 또는 그의 항원-결합 단편;
    q) 말초 혈액 내의 B 세포를 고갈시키는 항체 또는 그의 항원-결합 단편;
    r) 말초 혈액 내의 Tfh-유사 세포를 고갈시키는 항체 또는 그의 항원-결합 단편;
    s) 비장 내의 진정한 Tfh 세포를 고갈시키는 항체 또는 그의 항원-결합 단편; 및
    t) 체액성 면역 기억 반응을 손상시키는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
    으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개의 항체인, CXCR5에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 생물학적 활성 중 적어도 하나를 나타내는 항체 또는 그의 항원-결합 단편:
    a) CXCR5+ 인간 B 세포에 EC50 약 26 pM 미만의 겉보기 친화도로 결합하지만, CXCR5 마우스, 래트 또는 토끼 오르토로그를 발현하는 세포에는 결합하지 않음;
    b) 포르스콜린에 의해 촉발된 cAMP 방출의 CXCL13 억제를 길항작용함;
    c) 인간 공여자 및 시노몰구스 PBMC 및 인간 공여자 TMC에서 CXCR5-발현 세포의 ADCC를 촉발함;
    d) 인간 CXCR5에 결합하지만, 인간 케모카인 수용체 CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCR9, CCR10, CMKLR1, CXCR3R1, CXCR1, CXCR2, CXCR3, CXCR4, CXCR6, CXCR7, 또는 XCR1에는 결합하지 않음;
    e) 말초 혈액 내의 B 세포를 고갈시킴;
    f) 말초 혈액 내의 Tfh-유사 세포를 고갈시킴;
    g) 비장 내의 진정한 Tfh 세포를 고갈시킴; 또는
    h) 체액성 면역 기억 반응을 손상시킴.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 비-푸코실화된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 코딩하는 단리된 핵산.
  7. 서열식별번호: 95의 핵산 서열, 서열식별번호: 96의 핵산 서열, 또는 둘 다를 포함하는, CXCR5에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 VH, VL, 또는 둘 다를 코딩하는 단리된 핵산.
  8. 서열식별번호: 97의 핵산 서열, 서열식별번호: 98의 핵산 서열, 또는 둘 다를 포함하는, CXCR5에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 중쇄, 경쇄, 또는 둘 다를 코딩하는 단리된 핵산.
  9. 수탁 번호 PTA-124323으로 ATCC에 기탁된 플라스미드의 삽입물의 핵산 서열, 수탁 번호 PTA-124324로 ATCC에 기탁된 플라스미드의 삽입물의 핵산 서열, 또는 둘 다를 포함하는, CXCR5에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 VH, VL, 또는 둘 다를 코딩하는 단리된 핵산.
  10. 제6항 내지 제9항 중 어느 한 항의 핵산을 포함하는 벡터.
  11. 제10항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  12. 제11항에 있어서, CHO 세포, COS 세포, HEK-293 세포, NS0 세포, PER.C6® 세포, 또는 Sp2.0 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 포유동물 세포인 숙주 세포.
  13. 제12항에 있어서, 기능적 알파-1,6-푸코실트랜스퍼라제 (FUT8)가 결여된 숙주 세포.
  14. 제13항에 있어서, 포텔리젠트® CHOK1SV 세포 또는 Lec13 CHO 세포인 숙주 세포.
  15. 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 제14항의 포텔리젠트® CHOK1SV 세포에 의해 발현되고 비-푸코실화되는 조건 하에 상기 숙주 세포를 배양하는 것을 포함하는, 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제조하는 방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 단리하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  17. 푸코실화된 달리 동일한 항체 또는 그의 항원-결합 단편과 비교할 경우 증진된 ADCC 활성을 나타내는, 제15항의 비-푸코실화 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  18. 제1항 내지 제5항 및 제17항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 및 제약상 허용되는 담체 또는 부형제를 포함하는 제약 조성물.
  19. 제1항 내지 제5항, 제17항 및 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 면역 질환, 장애 또는 상태를 치료하는데 사용하기 위한 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 제약 조성물.
  20. 면역 질환, 장애 또는 상태를 치료하기 위한, 제1항 내지 제5항 및 제17항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 제18항의 제약 조성물의 용도.
  21. CXCR5에 의해 매개되는 면역 질환, 장애 또는 상태의 치료 또는 예방을 필요로 하는 인간 대상체에게 유효량의 제18항의 제약 조성물을 투여하는 것을 포함하는, CXCR5에 의해 매개되는 면역 질환, 장애 또는 상태의 치료 또는 예방을 필요로 하는 인간 대상체에서 CXCR5에 의해 매개되는 면역 질환, 장애 또는 상태를 치료 또는 예방하는 방법 및 췌장암, 결장암, 방광암, T-세포 백혈병, 및 B-세포 백혈병과 같은 CXCR5를 발현하는 암 세포의 증식을 제어하는 방법이며, 여기서 상기 질환, 장애 또는 상태는 염증 반응 예컨대 건선 및 피부염 (예를 들어 아토피성 피부염)을 포함한 염증성 피부 질환; 피부근염; 전신 경피증 및 경화증; 염증성 장 질환 (예컨대 크론병 및 궤양성 결장염)과 연관된 반응; 호흡 곤란 증후군 (성인 호흡 곤란 증후군; ARDS 포함); 피부염; 수막염; 뇌염; 포도막염; 결장염; 위염; 사구체신염; 알레르기성 상태 예컨대 습진 및 천식 및 T 세포의 침윤 및 만성 염증 반응을 수반하는 다른 상태; 아테롬성동맥경화증; 백혈구 부착 결핍; 류마티스 관절염 (RA); 전신 홍반성 루푸스 (SLE); 당뇨병 (예를 들어, 제I형 당뇨병 또는 인슐린 의존성 당뇨병); 다발성 경화증; 레이노 증후군; 자가면역 갑상선염; 알레르기성 뇌척수염; 쇼그렌 증후군; 소아 발병 당뇨병; 및 전형적으로 결핵, 사르코이드증, 다발근염, 육아종증 및 혈관염에서 발견되는 시토카인 및 T-림프구에 의해 매개되는 급성 및 지연형 과민성과 연관된 면역 반응; 베게너병; 악성 빈혈 (애디슨병); 백혈구 누출을 수반하는 질환; 중추 신경계 (CNS) 염증성 장애; 다발성 기관 손상 증후군; 용혈성 빈혈 (한랭글로불린혈증 또는 쿰스 양성 빈혈을 포함하나 이에 제한되지는 않음); 중증 근무력증; 항원-항체 복합체 매개 질환; 항-사구체 기저막 질환; 항인지질 증후군; 알레르기성 신경염; 그레이브스병; 램버트-이튼 근무력 증후군; 수포성 유천포창; 천포창; 자가면역 다발내분비병증; 백반증; 라이터병; 강직-사람 증후군; 베체트병; 거대 세포 동맥염; 면역 복합체 신염; IgA 신병증; IgM 다발신경병증; 면역 혈소판감소성 자반증 (ITP) 또는 자가면역 혈소판감소증 및 자가면역 용혈성 질환; 하시모토 갑상선염; 자가면역 간염; 자가면역 혈우병; 자가면역 림프증식성 증후군 (ALPS); 자가면역 포도막망막염; 길랑-바레 증후군; 굿패스쳐 증후군; 혼합 결합 조직 질환; 자가면역-연관 불임; 결절성 다발동맥염; 원형 탈모증; 특발성 점액수종; 이식편 대 숙주 질환; 근육 이영양증 (뒤시엔느, 베커, 근긴장성, 지대, 안면견갑상완, 선천성, 안인두, 원위, 에머리-드레이푸스)으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
  22. 제21항에 있어서, 상기 질환이 SLE 또는 류마티스 관절염인 방법.
  23. 면역 질환, 장애 또는 상태를 치료하기 위한 의약의 제조에서의 제1항 내지 제5항, 및 제17항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 용도.
  24. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 사용하여, 샘플, 조직 또는 세포를 항체와 접촉시키고, 상기 항체를 검출하는 것을 포함하는, 샘플, 조직 또는 세포에서 CXCR5를 검출하는 방법.
  25. 치료 유효량의 제1항 내지 제5항 및 제17항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 제18항의 제약 조성물을 투여하는 것을 포함하는, CXCR5의 생물학적 활성의 감소를 필요로 하는 대상체에서 CXCR5의 생물학적 활성을 감소시키는 방법.
  26. 제25항에 있어서, 항체가 비장 내의 Tfh 세포, 말초 혈액 내의 B 세포, 및 말초 혈액 내의 Tfh-유사 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 CXCR5를 발현하는 적어도 1종의 세포의 고갈을 매개하는 것인 방법.
  27. 치료 유효량의 제1항 내지 제5항 및 제17항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 제18항의 제약 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 체액성 면역 반응의 억제를 필요로 하는 대상체에서 체액성 면역 반응을 억제하는 방법.
  28. 제27항에 있어서, 항체가 비장 내의 Tfh 세포, 말초 혈액 내의 B 세포, 및 말초 혈액 내의 Tfh-유사 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 CXCR5를 발현하는 적어도 1종의 세포의 고갈을 매개하는 것인 방법.
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