JP6475167B2

JP6475167B2 - ジスルフィド結合した多価ｍｈｃクラスｉを含む多機能タンパク質

Info

Publication number: JP6475167B2
Application number: JP2015548483A
Authority: JP
Inventors: ガイゲオルゲス; サビーネイムホフ−ユング; ヘンドリッククノエゲン; マルティナシュミットネゲル
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2012-12-21
Filing date: 2013-12-18
Publication date: 2019-02-27
Anticipated expiration: 2033-12-18
Also published as: JP2016501900A; PL2935328T3; EP2935328B1; HK1214276A1; RU2015129640A; SG11201504414UA; IL238499B; EP2935328A1; MX2015007239A; ES2700984T3; AU2013360775B2; IL238499A0; MX361076B; KR20150097688A; WO2014096015A1; CA2889788A1; US10501521B2; CN104884474A; AU2013360775A1; US20150344586A1

Description

本明細書では、1つの抗体断片および1つ、2つまたはそれを上回るジスルフィド結合したMHCクラスI構成要素を含むジスルフィド結合型多価多機能タンパク質（disulfide-linked multivalent multi-function protein）、ならびに流血中ウイルス特異的細胞傷害性T細胞の標的化誘引による癌細胞またはウイルス感染細胞の除去のためのその使用について報告する。

発明の背景
MHCクラスIタンパク質は、α鎖（α-1〜3ドメインおよび膜貫通ドメイン）およびβ2-ミクログロブリンからなる。これは多遺伝子性であり（一倍体ゲノム中にMHC-クラスIタンパク質の遺伝子座は3つある）、それにより、6種類のMHCクラスIタンパク質α鎖（ヒトでは2種のHLA-A、2種のHLA-B、2種のHLA-C）が生じる。MHCはさらに多形性でもある。ヒトHLA-AのアレルA^*0201は、白人集団の約30％〜50％に広く認められる（例えば、Player, et al., J. Immunother. Emphasis Tumor Immunol. 19 (1996) 357-363を参照）。

ヒトサイトメガロウイルスhuCMV（＝ヒトヘルペスウイルス5、HHV-5）は、最も大きいヒトウイルスの1つである。そのゲノムは230,000bp前後の線状二本鎖DNAを含み、160種を超えるタンパク質をコードする（例えば、Davison, A.J., et al., J. Gen. Virol. 84 (2003) 17-28を参照）。

CMVはヒトゲノムの際立った寄生生物へと進化しており、これは強力な免疫原であり、免疫系のすべての部門から強い免疫応答を誘発する。このウイルスは、公知のものの中で、ヒト免疫系にとって最も免疫優性性の高い抗原の一つであり、CD8⁺-T細胞応答を従来にない大きさで刺激する。

CMVの「潜伏期」は、ウイルス転写のパターンの変化ではなく、CMVウイルスの長期的な免疫抑制に依存する（例えば、Moss & Khan, Human Immunology 65 (2004) 456-464を参照）。

CD8⁺-T細胞免疫応答は、すべてのCMVタンパク質に対して均等に向けられるのではなく、対象が絞られている。CMVタンパク質pp65およびIE-1が主たる標的である（例えば、McLaughlin-Taylor, E., et al., J. Med. Virol. 43 (1994) 103-110；Moss & Khan, Human Immunology 65 (2004) 456-464を参照）。

CMV特異的T細胞の頻度は非常に高く、個々のペプチドに対する頻度は、CD8⁺-T細胞レパートリー全体のうち最大で1〜2％のオーダーである（例えば、Moss & Khan, Human Immunology 前記；Wills, M.R., et al., J. Virol. 70 (1996) 7569-7579を参照）。

CMV特異的CD8⁺-T細胞応答は加齢とともに顕著に増大し、個々のHLA-ペプチド四量体は、CD8⁺-T細胞プール全体の10％超で高頻度に染色される（例えば、Khan, N., et al., J. Immunol. 169 (2002) 1984-1992を参照）。

健康な高齢ドナーにおける総CD8⁺-T細胞応答は、CD8⁺-T細胞レパートリーのおよそ50％を占めることがある。

極めて高度のCD8⁺-T細胞増大は多くの場合、極めてクローン限定的であり、加齢に伴って末梢血中に認められるクローン性CD8⁺-T細胞増大の少なくとも30％はCMVが原因であると推定される。60歳以上のCMV血清陽性ドナーでは、CMV血清陰性コホートと比較して、総CD8⁺-T細胞数が2倍の多さである（例えば、Looney, R.J., et al., Clin. Immunol. 90 (1999) 213-219を参照）。

可溶性HLAとβ-2-ミクログロブリンとの融合物は、Mottez et al.（Eur. J. Immunol. 21 (1991) 467-471）；Godeau et al.（J. Biol. Chem. 267 (1992) 24223-24229）およびMage et al.（Proc. Natl. Acad. Sci. 89 (1992) 10658-10662）によって報告されている。可溶性HLAを有するウイルス由来ペプチドとβ-2-ミクログロブリンとの融合物は、Mottez et al.（J. Exp. Med. 181 (1995) 493-502）によって報告されている。可溶性HLAを有する免疫グロブリン重鎖と共発現させたβ-2-ミクログロブリンとの融合物は、Dal Porto et al.（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 6671-6675）によって報告されている。ビオチン化ペプチド-可溶性HLAと、ストレプトアビジンによってFabと化学的に結合させたβ-2-ミクログロブリンとの四量体多機能タンパク質は、Robert et al.（Eur. J. Immun. 30 (2000) 3165-3170）によって記載されている。可溶性HLAを有するウイルス由来ペプチドとβ-2-ミクログロブリンとの融合物と化学的に結合させたFabは、Robert et al.（Cancer Immunity 1 (2001) 2）によって報告されている。可溶性HLAおよびβ-2-ミクログロブリンを有するウイルス由来ペプチドとマウスモノクローナル抗体重鎖との融合物は、Greten et al.（J. Immunol. Methods 271 (2002) 125-135）によって報告されている。ペプチドを有しないscFv融合物の大腸菌での発現、インビトロでのリフォールディングおよびペプチドのローディングは、Lev et al.（J. Immunol. 169 (2002) 2988-2996；Proc. Natl. Acad. Sci. 101 (2004) 9051-9056）、およびNovak et al.（Int. J. Cancer 120 (2006) 329-336）によって報告されている。ペプチドが負荷され、ストレプトアビジンと融合させたFabまたはscFv抗体とカップリングされたビオチン化可溶性MHCの使用は、Mous et al.（Leukemia 20 (2006) 1096-1102）によって報告されている。

WO 2005／099361号には、改変β-2-ミクログロブリンを有するMHCクラスI-ペプチド-抗体コンジュゲートが報告されている。WO 2005／099361号に報告されている例示的なコンジュゲートは、MHC-多機能タンパク質（HLA）のα鎖とのインビトロでのコンジュゲーションによって、または別々の遺伝子の同一細胞内での共発現によって得られる。

US 2004／0091488号には、特定の担体分子を有する主要組織適合性多機能タンパク質クラスI抗原の抗原構築物が報告されている。報告されているこれらの融合ポリペプチドは、ヒンジ領域を欠いている。

WO 99／13095号には、抗原特異的T細胞依存性免疫応答を検出するため、活性化するため、または抑制するための、ペプチドが負荷された多価キメラ性MHC／IG分子の使用がある。癌の治療において特に有用な、免疫除去（immune depletion）のための方法および薬学的組成物は、WO 02／102299号に報告されている。Oelke, M., et al.（Nat. Med. 9 (2003) 619-624）は、HLA-Igでコーティングされた人工抗原提示細胞による抗原特異的細胞傷害性T細胞のエクスビボ誘導および増大を報告している。MHCクラスIを含む複合体を用いた、流血中ウイルス特異的細胞傷害性T細胞による標的細胞の除去は、WO 2012／175508号に報告されている。Robert, B., et al.（Eur. J. Immunol. 30 (2000) 3165-3170）は、抗体とコンジュゲートさせたMHCクラスI四量体が、Tリンパ球による特異的溶解に向けて腫瘍細胞を標的とすることができると報告している。

本明細書では、1つ、2つまたはそれを上回り、1つの態様においては1つ、もう1つの態様においては2つまたは4つである抗原提示ドメインを第1の部分として含み、1つの抗体Fc領域を第2の部分として含み、かつ、抗体に由来し、標的抗原と特異的に結合する少なくとも1つの抗原結合部位を第3の部分として含む、ジスルフィド結合型多価多機能タンパク質について報告する。

本明細書において報告されるジスルフィド結合型多価多機能タンパク質を用いると、個体の既存のウイルス特異的な流血中細胞傷害性T細胞（T-メモリー細胞および／またはT-エフェクター細胞）を、ジスルフィド結合型多価多機能タンパク質の抗体由来部分が特異的に結合する標的抗原を発現する細胞に対して向かわせることができる。その後に、これらの細胞をMHCクラスI複合体で飾り付けることにより、MHCクラスIタンパク質多機能タンパク質と連結しているウイルス由来ペプチドによる急性ウイルス感染が模倣され、細胞傷害性細胞が誘引されて、その結果、標的化された細胞の除去がもたらされる。

本明細書において報告される1つの局面は、
‐1つ、2つまたは2つを上回る抗原提示ドメイン、
‐厳密に1つの抗体Fc領域、および
‐1つまたは複数の抗原結合部位
を含み、
抗原提示ドメインが互いに独立に、N末端からC末端への方向に、
（i）β2-ミクログロブリン、ならびに
（ii）相対頻度が1％未満であるクラスI MHC分子の細胞外ドメインα1、α2およびα3、
または
（i）T細胞応答誘発ペプチド、
（ii）β2-ミクログロブリン、ならびに
（iii）相対頻度が1％であるかもしくはそれを上回るクラスI MHC分子の細胞外ドメインα1、α2およびα3、
または
（i）相対頻度が1％未満であるクラスI MHC分子の細胞外ドメインα1、α2およびα3、ならびに
（ii）β2-ミクログロブリン、
または
（i）T細胞応答誘発ペプチド、
（ii）相対頻度が1％であるかもしくはそれを上回るクラスI MHC分子の細胞外ドメインα1、α2およびα3、ならびに
（iii）β2-ミクログロブリン、
のいずれかを含み、
1つまたは複数の抗原結合部位が癌細胞表面抗原またはウイルス感染細胞表面抗原と結合し、かつ
抗原提示ドメインが、鎖内／ドメイン間ジスルフィド結合を形成する少なくとも2つの非天然システイン残基を有する
ことを特徴とする、ジスルフィド結合型多価多機能タンパク質である。

1つの態様において、抗原提示ドメイン内の1つの非天然システイン残基はT細胞応答誘発ペプチドとの間のリンカー内にあり、1つの非天然システイン残基はクラスI MHC分子の細胞外ドメインα1、α2およびα3のうち1つの中にある。1つの態様において、抗原提示ドメインは少なくとも位置11および位置227にシステイン残基を有し、位置11および位置227にあるシステイン残基はジスルフィド結合を形成する（位置11はリンカーの位置2に対応する；位置227はSEQ ID NO：72またはSEQ ID NO：140の位置84に対応する）。

1つの態様において、抗原提示ドメイン内の1つの非天然システイン残基はT細胞応答誘発ペプチドとの間のリンカー内にあり、1つの非天然システイン残基はクラスI MHC分子の細胞外ドメインα1、α2およびα3のうち1つの中にある。1つの態様において、抗原提示ドメインは少なくとも位置11および位置108にシステイン残基を有し、位置11および位置108にあるシステイン残基はジスルフィド結合を形成する（位置11はリンカーの位置2に対応する；位置108はSEQ ID NO：71の位置84に対応する）。

1つの態様において、抗原提示ドメイン内の1つの非天然システイン残基はT細胞応答誘発ペプチドとの間のリンカー内にあり、1つの非天然システイン残基はβ2-ミクログロブリン内にある。

1つの態様において、抗原提示ドメイン内の1つの非天然システイン残基はT細胞応答誘発ペプチドとの間のリンカー内にあり、1つの非天然システイン残基はβ2-ミクログロブリンとクラスI MHC分子の細胞外ドメインα1との間のリンカー内にある。

1つの態様において、抗体Fc領域は第1および第2のジスルフィド結合型Fc領域ポリペプチドを含み、ここで1つの抗原結合部位または複数の抗原結合部位のうち1つは第1のFc領域ポリペプチドを含み、かつ第2の抗原結合部位は存在するならば、第2のFc領域ポリペプチドを含む。

1つの態様において、抗原結合部位は、i）抗体重鎖と抗体軽鎖の（コグネイト）ペア、ここで個々の鎖は野生型鎖であっても、もしくは改変鎖（置換された、突然変異した、もしくはドメイン交換されたもの）であってもよい、ペア、またはii）N末端からC末端への方向にscFv抗体断片および抗体Fc領域ポリペプチドを含むscFv融合ポリペプチド、またはiii）N末端からC末端への方向にscFabおよび抗体Fc領域ポリペプチドを含むscFab融合ポリペプチド、を含む。

1つの態様において、抗原結合部位は互いに独立に、i）抗体重鎖と抗体軽鎖の（コグネイト）ペア、ここで個々の鎖は野生型鎖であっても、もしくは改変鎖（置換された、突然変異した、もしくはドメイン交換されたもの）であってもよい、ペア、またはii）N末端からC末端への方向にscFv抗体断片および抗体Fc領域ポリペプチドを含むscFv融合ポリペプチド、またはiii）N末端からC末端への方向にscFabおよび抗体Fc領域ポリペプチドを含むscFab融合ポリペプチド、を含む。

1つの態様において、i）抗原提示ドメインは抗原結合部位の重鎖のN末端もしくは軽鎖のN末端と連結している（1つの抗原提示ドメインが存在する場合）、またはii）1つの抗原提示ドメインは各抗原結合部位の重鎖の各N末端もしくは軽鎖の各N末端と連結している（2つの抗原提示ドメインが存在する場合）、またはiii）抗原提示ドメインは抗原結合部位の重鎖のC末端もしくは軽鎖のC末端と連結している（1つの抗原提示ドメインが存在する場合）、またはvi）1つの抗原提示ドメインは各抗原結合部位の重鎖の各C末端もしくは軽鎖の各C末端と連結している（2つの抗原提示ドメインが存在する場合）、またはv）抗原提示ドメインはscFv融合ポリペプチドのN末端もしくはC末端と連結している（1つの抗原提示ドメインが存在する場合）、またはvi）1つの抗原提示ドメインは各scFv融合ポリペプチドの各N末端もしくはC末端と連結している（2つの抗原提示ドメインが存在する場合）、またはvii）抗原提示ドメインはscFab融合ポリペプチドのN末端もしくはC末端と連結している（1つの抗原提示ドメインが存在する場合）、またはviii）1つの抗原提示ドメインは各scFab融合ポリペプチドの各N末端もしくはC末端と連結している（2つの抗原提示ドメインが存在する場合）、またはix）抗原提示ドメインは第2のFc領域ポリペプチドのN末端もしくはC末端と連結している（1つの抗原提示ドメインが存在する場合）、またはx）1つの抗原提示ドメインは第1のFc領域ポリペプチドのN末端もしくはC末端と連結しており、かつ1つの抗原提示ドメインは第2のFc領域ポリペプチドのN末端もしくはC末端と連結している（2つの抗原提示ドメインが存在する場合）。

1つの態様において、細胞表面抗原は癌細胞表面抗原である。1つの態様において、癌細胞表面抗原は黒色腫関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（MCSP）である。

1つの態様において、ジスルフィド結合型多価多機能タンパク質は共有結合性ジスルフィド結合型多価多機能タンパク質である。

1つの態様において、T細胞応答誘発ペプチドはウイルス由来ペプチドである。1つの態様において、T細胞応答誘発ペプチドはCD8⁺-T細胞応答誘発ペプチドである。

1つの態様において、ウイルスは、ヒトサイトメガロウイルス、アデノウイルス、ヒトヘルペスウイルス1、ヒトヘルペスウイルス2、ヒトヘルペスウイルス4（エプスタイン・バーウイルス）、B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、ヒトパピローマウイルス16型、ヒトパピローマウイルス18型、ヒトパピローマウイルス31型、ヒトパピローマウイルス33型、ヒトパピローマウイルス35型、ヒトパピローマウイルス39型、ヒトパピローマウイルス45型、ヒトパピローマウイルス51型、ヒトパピローマウイルス52型、ヒトパピローマウイルス56型、ヒトパピローマウイルス58型、ヒトパピローマウイルス59型、ヒトパピローマウイルス68型、ヒトパピローマウイルス73型、ヒトパピローマウイルス82型、ヒトT細胞リンパ親和性ウイルスI型、ヒトインフルエンザAウイルス、ヒトインフルエンザBウイルス、ワクシニアウイルス、デングウイルスから選択される。

1つの態様において、ウイルス由来ペプチドは、ペプチド

、
または1つ〜3つのアミノ酸交換、付加および／もしくは欠失を含むそれらの変異体から選択される。

1つの態様において、ウイルス由来ペプチドはヒトサイトメガロウイルス由来ペプチドである。1つの態様において、ウイルス由来ペプチドは、SEQ ID NO：01〜SEQ ID NO：70の群から選択されるアミノ酸配列を有する。1つの態様において、ウイルス由来ペプチドは、SEQ ID NO：01〜SEQ ID NO：47の群から選択されるアミノ酸配列を有する。

1つの態様において、ウイルス由来ペプチドはSEQ ID NO：01のアミノ酸配列を有する。

1つの態様において、相対頻度が1％であるかもしくはそれを上回るクラスI MHC分子は、10％またはそれを上回る相対頻度を有する。

1つの態様において、相対頻度が1％であるかまたはそれを上回るクラスI MHC分子は、HLA-A^*0201、またはHLA-A^*1101、またはHLA-A^*2402、またはHLA-A^*340101、またはHLA-C^*0304、またはHLA-C^*0401、またはHLA-C^*0702である。

1つの態様において、相対頻度が1％であるかまたはそれを上回るクラスI MHC分子は、ジスルフィド結合型多価多機能タンパク質を投与しようとする個体の地域に応じて、以下のように選択される：
‐欧州出身の個体の場合、クラスI MHC分子は、HLA-A^*0101、HLA-A^*0201、HLA-A^*0301、HLA-B^*0702、HLA-B^*0801、HLA-B^*4402、HLA-C^*0401、HLA-C^*0501、HLA-C^*0701およびHLA-C^*0702を含む群から選択され、
‐オーストラリア出身の個体の場合、クラスI MHC分子は、HLA-A^*0201、HLA-A^*1101、HLA-A^*2402、HLA-A^*340101、HLA-B^*1301、HLA-B^*1521、HLA-B^*5601、HLA-B^*5602、HLA-C^*0102、HLA-C^*0401、HLA-C^*0403およびHLA-C^*1502を含む群から選択され、
‐北米出身の個体の場合、クラスI MHC分子は、HLA-A^*0201、HLA-A^*2402、HLA-C^*0202、HLA-C^*0304、HLA-C^*0401およびHLA-C^*0702を含む群から選択され、そして
‐東南アジア出身の個体の場合、クラスI MHC分子は、HLA-A^*1101、HLA-A^*2402、HLA-B^*1504、HLA-C^*0102、HLA-C^*0304、HLA-C^*0702およびHLA-C^*0801を含む群から選択される。

1つの態様において、相対頻度が1％であるかまたはそれを上回るクラスI MHC分子は、ジスルフィド結合型多価多機能タンパク質を投与しようとする個体の地域に応じて、以下のように選択される：
‐欧州出身の個体の場合、クラスI MHC分子はHLA-A^*0201であり、
‐オーストラリア出身の個体の場合、クラスI MHC分子は、HLA-A^*2402、HLA-B^*1301、HLA-C^*0102およびHLA-C^*0401を含む群から選択され、
‐北米出身の個体の場合、クラスI MHC分子は、HLA-A^*2402およびHLA-C^*0304を含む群から選択され、そして
‐東南アジア出身の個体の場合、クラスI MHC分子はHLA-A^*2402である。

1つの態様において、抗原提示ドメインは、N末端からC末端への方向に、T細胞応答誘発ペプチド、β2-ミクログロブリン、ならびに相対頻度が1％であるかまたはそれを上回るクラスI MHC分子の細胞外ドメインα1、α2およびα3を含み、ここで抗原提示ドメインは少なくとも位置11および位置227にシステイン残基を有し、位置11および位置227にあるシステイン残基はジスルフィド結合を形成する。

1つの態様において、抗原提示ドメインは、N末端からC末端への方向に、T細胞応答誘発ペプチド、相対頻度が1％であるかまたはそれを上回るクラスI MHC分子の細胞外ドメインα1、α2およびα3、ならびにβ2-ミクログロブリンを含み、ここで抗原提示ドメインは少なくとも位置11および位置108にシステイン残基を有し、位置11および位置108にあるシステイン残基はジスルフィド結合を形成する。

1つの態様において、抗原提示ドメインは、N末端からC末端への方向に、T細胞応答誘発ペプチド、β2-ミクログロブリン、ならびに相対頻度が1％未満であるクラスI MHC分子の細胞外ドメインα1、α2およびα3を含み、ここで抗原提示ドメインは少なくとも位置11および位置227にシステイン残基を有し、位置11および位置227にあるシステイン残基はジスルフィド結合を形成する。

1つの態様において、抗原提示ドメインは、N末端からC末端への方向に、T細胞応答誘発ペプチド、相対頻度が1％未満であるクラスI MHC分子の細胞外ドメインα1、α2およびα3、ならびにβ2-ミクログロブリンを含み、ここで抗原提示ドメインは少なくとも位置11および位置108にシステイン残基を有し、位置11および位置108にあるシステイン残基はジスルフィド結合を形成する。

1つの態様において、相対頻度が1％未満であるクラスI MHC分子は、HLA-B^*4201、HLA-B^*5901、HLA-B^*6701およびHLA-B^*7802を含む群から選択される。

1つの態様において、抗原提示ドメインは、
（i）ウイルス由来ペプチド、
（ii）β2-ミクログロブリン、
（iii）可溶性HLA-AアレルA^*0201、ならびに
（iv）少なくとも位置11および位置227にあるシステイン残基であって、位置11および位置227にあるものがジスルフィド結合を形成するシステイン残基
を含む。

1つの態様において、抗原提示ドメインは、
（i）ウイルス由来ペプチド、
（ii）可溶性HLA-AアレルA^*0201、および
（iii）β2-ミクログロブリン、
（iv）少なくとも位置11および位置108にあるシステイン残基であって、位置11および位置108にあるものがジスルフィド結合を形成するシステイン残基
を含む。

1つの態様において、β2-ミクログロブリンはヒトβ2-ミクログロブリンである。

1つの態様において、β2-ミクログロブリンは野生型ヒトβ2-ミクログロブリンである。

1つの態様において、β2-ミクログロブリンは、SEQ ID NO：71のアミノ酸配列からなるか、または1つ〜10つのアミノ酸交換、付加および／もしくは欠失を含むそれらの変異体である。

1つの態様において、β2-ミクログロブリンはヒトβ2-ミクログロブリンであり、相対頻度が10％であるかまたはそれを上回るクラスI MHC分子はヒトHLA-A^*0201である。

1つの態様において、クラスI MHC分子の細胞外ドメインα1、α2およびα3は、SEQ ID NO：140のアミノ酸配列からなるか、または1つ〜10つのアミノ酸交換、付加および／もしくは欠失を含むそれらの変異体である。

1つの態様において、抗原提示ドメインは、N末端からC末端への方向に、β2-ミクログロブリン、ならびに1％未満の相対出現頻度を有するクラスI MHC分子の細胞外ドメインα1、α2およびα3を含み、ここで抗原提示ドメインは少なくとも位置11および位置227にシステイン残基を有し、位置11および位置227にあるシステイン残基はジスルフィド結合を形成する。

1つの態様において、抗原提示ドメインは、N末端からC末端への方向に、1％未満の相対出現頻度を有するクラスI MHC分子の細胞外ドメインα1、α2およびα3、ならびにβ2-ミクログロブリンを含み、ここで抗原提示ドメインは少なくとも位置11および位置108にシステイン残基を有し、位置11および位置108にあるシステイン残基はジスルフィド結合を形成する。

1つの態様において、ウイルス由来ペプチドは、第1のリンカーペプチドを介してβ2-ミクログロブリンと融合している。

1つの態様において、ウイルス由来ペプチドはβ2-ミクログロブリンのN末端と融合している。

1つの態様において、β2-ミクログロブリンは、第2のリンカーペプチドを介してクラスI MHC分子の細胞外ドメインα1と融合している。

1つの態様において、クラスI MHC分子の細胞外ドメインα3は、第3のリンカーペプチドを介してジスルフィド結合型ポリペプチド鎖の1つと融合している。

1つの態様において、第1、第2および第3のリンカーペプチドは同じであるか、または異なる。

1つの態様において、第1のリンカーペプチド、第2のリンカーペプチドおよび第3のリンカーペプチドは、アミノ酸配列

から互いに独立に選択される。

すべての局面の1つの態様において、第1のリンカーペプチドはSEQ ID NO：139のアミノ酸配列を含む。

すべての局面の1つの態様において、第2のリンカーペプチドはSEQ ID NO：83のアミノ酸配列を含む。

すべての局面の1つの態様において、第3のリンカーペプチドはSEQ ID NO：136のアミノ酸配列を含む。

1つの態様において、抗原提示ドメインは、N末端からC末端への方向に、
（i）SEQ ID NO：01〜SEQ ID NO：70を含む群から選択されるアミノ酸配列を有するウイルス由来ペプチド、
（ii）SEQ ID NO：77、78、79、82、83、84および139を含む群から選択されるアミノ酸配列を有する第1のリンカーペプチド、
（iii）SEQ ID NO：71のアミノ酸配列を有するβ2-ミクログロブリン、
（iv）SEQ ID NO：77、78、79、82、83および84を含む群から選択されるアミノ酸配列を有する第2のリンカーペプチド、
（v）SEQ ID NO：140のアミノ酸配列を有するクラスI MHC分子の細胞外ドメインα1、α2およびα3、
（vi）SEQ ID NO：73、77、78、79、82、83、84および136を含む群から選択されるアミノ酸配列を有する第3のリンカーペプチド、ならびに
（vii）少なくとも位置11および位置227にあるシステイン残基ならびに位置11および位置227にあるシステイン残基間のジスルフィド結合
を含む。

1つの態様において、抗原提示ドメインは、N末端からC末端への方向に、
（i）SEQ ID NO：01〜SEQ ID NO：70を含む群から選択されるアミノ酸配列を有するウイルス由来ペプチド、
（ii）SEQ ID NO：77、78、79、82、83、84および139を含む群から選択されるアミノ酸配列を有する第1のリンカーペプチド、
（iii）SEQ ID NO：140のアミノ酸配列を有するクラスI MHC分子の細胞外ドメインα1、α2およびα3、
（iv）SEQ ID NO：71のアミノ酸配列を有するβ2-ミクログロブリン、
（v）SEQ ID NO：77、78、79、82、83および84を含む群から選択されるアミノ酸配列を有する第2のリンカーペプチド、
（vi）SEQ ID NO：73、77、78、79、82、83、84および136を含む群から選択されるアミノ酸配列を有する第3のリンカーペプチド、ならびに
（vii）少なくとも位置11および位置108にあるシステイン残基、ならびに位置11および位置108にあるシステイン残基間のジスルフィド結合
を含む。

1つの態様において、
‐第1のリンカーペプチドSEQ ID NO：139のアミノ酸配列を有し、かつ／または
‐第2のリンカーペプチドはSEQ ID NO：83のアミノ酸配列を有し、かつ／または
‐第3のリンカーペプチドはSEQ ID NO：136のアミノ酸配列を有する。

1つの態様において、ジスルフィド結合型多価多機能タンパク質は、抗原提示ドメインが、N末端からC末端への方向に、
（i）SEQ ID NO：01〜SEQ ID NO：70を含む群から選択されるアミノ酸配列を有するウイルス由来ペプチド、
（ii）SEQ ID NO：77、78、79、82、83、84および139を含む群から選択されるアミノ酸配列を有する第1のリンカーペプチド、
（iii）SEQ ID NO：71のアミノ酸配列を有するか、または1つ〜10つのアミノ酸交換、付加および／もしくは欠失を含むそれらの変異体であるβ2-ミクログロブリン、
（iv）SEQ ID NO：77、78、79、82、83および84を含む群から選択されるアミノ酸配列を有する第2のリンカーペプチド、
（v）SEQ ID NO：140のアミノ酸配列を有するか、または1つ〜10つのアミノ酸交換、付加および／もしくは欠失を含むそれらの変異体である、クラスI MHC分子の細胞外ドメインα1、α2およびα3、
（vi）SEQ ID NO：73、77、78、79、82、83、84および136を含む群から選択されるアミノ酸配列を有する第3のリンカーペプチド、ならびに
（vii）少なくとも位置11および位置227にあるシステイン残基、ならびに位置11および位置227にあるシステイン残基間のジスルフィド結合
を含むことを特徴とする。

1つの態様において、ジスルフィド結合型多価多機能タンパク質は、抗原提示ドメインが、N末端からC末端への方向に、
（i）SEQ ID NO：01〜SEQ ID NO：70を含む群から選択されるアミノ酸配列を有するウイルス由来ペプチド、
（ii）SEQ ID NO：77、78、79、82、83、84および139を含む群から選択されるアミノ酸配列を有する第1のリンカーペプチド、
（iii）クラスI MHC分子の細胞外ドメインα1、α2およびα3that hasSEQ ID NO：140のアミノ酸配列を有するか、または1つ〜10つのアミノ酸交換、付加および／もしくは欠失を含むそれらの変異体である、
（iv）SEQ ID NO：71のアミノ酸配列を有するか、または1つ〜10つのアミノ酸交換、付加および／もしくは欠失を含むそれらの変異体であるβ2-ミクログロブリン、
（v）SEQ ID NO：77、78、79、82、83および84を含む群から選択されるアミノ酸配列を有する第2のリンカーペプチド、
（vi）SEQ ID NO：73、77、78、79、82、83、84および136を含む群から選択されるアミノ酸配列を有する第3のリンカーペプチド、ならびに
（vii）少なくとも位置11および位置108にあるシステイン残基、ならびに位置11および位置108にあるシステイン残基間のジスルフィド結合
を含むことを特徴とする。

1つの態様において、抗体Fc領域は、クラスIgGまたはクラスIgEのヒト抗体の抗体Fc領域から選択される。

1つの態様において、抗体Fc領域は、サブクラスIgG1またはIgG2またはIgG3またはIgG4のヒト抗体の抗体Fc領域から選択される。

1つの態様において、抗体Fc領域はサブクラスIgG1またはIgG2のヒト抗体のものであり、E233、L234、L235、G236、D265、D270、N297、E318、K320、K322、A327、P329、A330および／またはP331（KabatのEUインデックスによる番号付け）に少なくとも1つの突然変異を含む。

1つの態様において、抗体Fc領域は、突然変異L234AおよびL235A、ならびに／または突然変異D265AおよびN297Aを有する、かつ／またはPVA236突然変異を含む、かつ／または突然変異P329Gを含む、サブクラスIgG1またはヒトサブクラスIgG2のヒト抗体のものである。

1つの態様において、抗体Fc領域は、突然変異L234AおよびL235Aおよび／またはP329Gを有するサブクラスIgG1のヒト抗体のものである。

1つの態様において、抗体Fc領域は、突然変異S228Pおよび／またはL235Eを有するサブクラスIgG4のヒト抗体のものである。

1つの態様において、第1および第2の抗体Fc領域ポリペプチドは、SEQ ID NO：87〜101を含む群から互いに独立に選択される。

1つの態様において、抗体Fc領域は、SEQ ID NO：94のアミノ酸配列を有する2つのFc領域ポリペプチドを含む。

1つの態様において、抗体Fc領域は、SEQ ID NO：100のアミノ酸配列を有する2つのFc領域ポリペプチドを含む。

1つの態様において、抗体Fc領域は、SEQ ID NO：101のアミノ酸配列を有する2つのFc領域ポリペプチドを含む。

1つの態様において、抗体Fc領域は、SEQ ID NO：89のアミノ酸配列を有する第1のFc領域ポリペプチド、およびSEQ ID NO：90のアミノ酸配列を有する第2のFc領域ポリペプチドを含む。

1つの態様において、抗体Fc領域は、SEQ ID NO：97のアミノ酸配列を有する第1のFc領域ポリペプチド、およびSEQ ID NO：98のアミノ酸配列を有する第2のFc領域ポリペプチドを含む。

1つの態様において、抗体Fc領域は、SEQ ID NO：102のアミノ酸配列を有する第1のFc領域ポリペプチド、およびSEQ ID NO：103のアミノ酸配列を有する第2のFc領域ポリペプチドを含む。

本明細書において報告される1つの局面は、
‐互いに独立に、N末端からC末端への方向に、
（i）β2-ミクログロブリン、ならびに
（ii）相対頻度が1％未満であるクラスI MHC分子の細胞外ドメインα1、α2およびα3、
または
（i）相対頻度が1％未満であるクラスI MHC分子の細胞外ドメインα1、α2およびα3、ならびに
（ii）β2-ミクログロブリン、
または
（i）T細胞応答誘発ペプチド、
（ii）β2-ミクログロブリン、ならびに
（iii）相対頻度が1％であるかもしくはそれを上回るクラスI MHC分子の細胞外ドメインα1、α2およびα3、
または
（i）T細胞応答誘発ペプチド、
（ii）相対頻度が1％であるかもしくはそれを上回るクラスI MHC分子の細胞外ドメインα1、α2およびα3、ならびに
（iii）β2-ミクログロブリン、
のいずれかを含む、1つまたは2つの抗原提示ドメインであって、少なくとも位置11と位置108または位置227とにあるシステイン残基を有し、位置11と位置108または227とにあるシステイン残基がスルフィド結合を形成する抗原提示ドメイン、
‐厳密に1つの抗体Fc領域、ならびに
‐1つまたは複数の抗原結合部位
を含むことを特徴とする、ジスルフィド結合型多価多機能タンパク質である。

本明細書において報告される1つの局面は、
‐N末端からC末端への方向に、
（i）T細胞応答誘発ペプチド、
（ii）β2-ミクログロブリン、ならびに
（iii）相対頻度が1％であるかまたはそれを上回るクラスI MHC分子の細胞外ドメインα1、α2およびα3
を含む1つまたは2つの抗原提示ドメインであって、少なくとも位置11および位置227にシステイン残基を有し、位置11および位置227にあるシステイン残基がジスルフィド結合を形成する抗原提示ドメイン、
‐厳密に1つの抗体Fc領域、ならびに
‐1つまたは複数の抗原結合部位
を含むことを特徴とする、ジスルフィド結合型多価多機能タンパク質である。

本明細書において報告される1つの局面は、
‐N末端からC末端への方向に、
（i）T細胞応答誘発ペプチド、
（iii）相対頻度が1％であるかまたはそれを上回るクラスI MHC分子の細胞外ドメインα1、α2およびα3、ならびに
（ii）β2-ミクログロブリン
を含む1つまたは2つの抗原提示ドメインであって、少なくとも位置11および位置108にシステイン残基を有し、位置11および位置108にあるシステイン残基がジスルフィド結合を形成する抗原提示ドメイン、
‐厳密に1つの抗体Fc領域、ならびに
‐1つまたは複数の抗原結合部位
を含むことを特徴とする、ジスルフィド結合型多価多機能タンパク質である。

本明細書において報告される1つの局面は、
‐N末端からC末端への方向に、
（i）SEQ ID NO：01のT細胞応答誘発ペプチド、
（ii）SEQ ID NO：71のβ2-ミクログロブリン、ならびに
（iii）SEQ ID NO：72のクラスI MHC分子の細胞外ドメインα1、α2およびα3
を含む1つまたは2つの抗原提示ドメインであって、少なくとも位置11および位置227にシステイン残基を有し、位置11および位置227にあるシステイン残基がジスルフィド結合を形成する抗原提示ドメイン、
‐厳密に1つの抗体Fc領域、ならびに
‐1つまたは複数の抗原結合部位
を含むことを特徴とする、ジスルフィド結合型多価多機能タンパク質である。

本明細書において報告される1つの局面は、
‐N末端からC末端への方向に、
（i）SEQ ID NO：01のT細胞応答誘発ペプチド、
（ii）SEQ ID NO：72のクラスI MHC分子の細胞外ドメインα1、α2およびα3、ならびに
（ii）SEQ ID NO：71のβ2-ミクログロブリン
を含む1つまたは2つの抗原提示ドメインであって、少なくとも位置11および位置108にシステイン残基を有し、位置11および位置108にあるシステイン残基がジスルフィド結合を形成する抗原提示ドメイン、
‐厳密に1つの抗体Fc領域、ならびに
‐1つまたは複数の抗原結合部位
を含むことを特徴とする、ジスルフィド結合型多価多機能タンパク質である。

本明細書において報告される1つの局面は、
‐N末端からC末端への方向に、
（i）SEQ ID NO：01のT細胞応答誘発ペプチド、
（ii）SEQ ID NO：71のβ2-ミクログロブリン、ならびに
（iii）SEQ ID NO：72のクラスI MHC分子の細胞外ドメインα1、α2およびα3
を含む1つまたは2つの抗原提示ドメインであって、少なくとも位置11および位置227にシステイン残基を有し、位置11および位置227にあるシステイン残基がジスルフィド結合を形成する抗原提示ドメイン、
‐2つのジスルフィド結合型Fc領域ポリペプチドを含み、そのうち第1のジスルフィド結合型Fc領域ポリペプチドがSEQ ID NO：97のアミノ酸配列を有し、第2のジスルフィド結合型Fc領域ポリペプチドがSEQ ID NO：98のアミノ酸配列を有する、厳密に1つの抗体Fc領域、ならびに
‐1つまたは複数の抗原結合部位
を含むことを特徴とする、ジスルフィド結合型多価多機能タンパク質である。

本明細書において報告される1つの局面は、
‐N末端からC末端への方向に、
（i）SEQ ID NO：01のT細胞応答誘発ペプチド、
（ii）SEQ ID NO：72のクラスI MHC分子の細胞外ドメインα1、α2およびα3、
（iii）SEQ ID NO：71のβ2-ミクログロブリン
を含む1つまたは2つの抗原提示ドメインであって、少なくとも位置11および位置108にシステイン残基を有し、位置11および位置108にあるシステイン残基がジスルフィド結合を形成する抗原提示ドメイン、
‐2つのジスルフィド結合型Fc領域ポリペプチドを含み、そのうち第1のジスルフィド結合型Fc領域ポリペプチドがSEQ ID NO：97のアミノ酸配列を有し、第2のジスルフィド結合型Fc領域ポリペプチドがSEQ ID NO：98のアミノ酸配列を有する、厳密に1つの抗体Fc領域、ならびに
‐1つまたは複数の抗原結合部位
を含むことを特徴とする、ジスルフィド結合型多価多機能タンパク質である。

本明細書において報告される1つの局面は、
‐N末端からC末端への方向に、
（i）SEQ ID NO：01のT細胞応答誘発ペプチド、
（ii）SEQ ID NO：71のβ2-ミクログロブリン、ならびに
（iii）SEQ ID NO：72のクラスI MHC分子の細胞外ドメインα1、α2およびα3
を含む1つまたは2つの抗原提示ドメインであって、少なくとも位置11および位置227にシステイン残基を有し、位置11および位置227にあるシステイン残基がジスルフィド結合を形成する抗原提示ドメイン、
‐2つのジスルフィド結合型Fc領域ポリペプチドを含み、そのうち第1のジスルフィド結合型Fc領域ポリペプチドがSEQ ID NO：102のアミノ酸配列を有し、第2のジスルフィド結合型Fc領域ポリペプチドがSEQ ID NO：103のアミノ酸配列を有する、厳密に1つの抗体Fc領域、ならびに
‐1つまたは複数の抗原結合部位
を含むことを特徴とする、ジスルフィド結合型多価多機能タンパク質である。

本明細書において報告される1つの局面は、
‐N末端からC末端への方向に、
（i）SEQ ID NO：01のT細胞応答誘発ペプチド、
（ii）SEQ ID NO：72のクラスI MHC分子の細胞外ドメインα1、α2およびα3、ならびに
（iii）SEQ ID NO：71のβ2-ミクログロブリン
を含む1つまたは2つの抗原提示ドメインであって、少なくとも位置11および位置108にシステイン残基を有し、位置11および位置108にあるシステイン残基はジスルフィド結合を形成する抗原提示ドメイン、
‐2つのジスルフィド結合型Fc領域ポリペプチドを含み、そのうち第1のジスルフィド結合型Fc領域ポリペプチドがSEQ ID NO：102のアミノ酸配列を有し、第2のジスルフィド結合型Fc領域ポリペプチドがSEQ ID NO：103のアミノ酸配列を有する、厳密に1つの抗体Fc領域、ならびに
‐1つまたは複数の抗原結合部位
を含むことを特徴とする、ジスルフィド結合型多価多機能タンパク質である。

本明細書において報告される1つの局面は、
‐N末端からC末端への方向に、
（i）SEQ ID NO：01のT細胞応答誘発ペプチド、
（ii）SEQ ID NO：71のβ2-ミクログロブリン、ならびに
（iii）SEQ ID NO：72のクラスI MHC分子の細胞外ドメインα1、α2およびα3
を含む1つまたは2つの抗原提示ドメインであって、少なくとも位置11および位置227にシステイン残基を有し、位置11および位置227にあるシステイン残基がジスルフィド結合を形成する抗原提示ドメイン、
‐2つのジスルフィド結合型Fc領域ポリペプチドを含み、そのうち第1のジスルフィド結合型Fc領域ポリペプチドがSEQ ID NO：97のアミノ酸配列を有し、第2のジスルフィド結合型Fc領域ポリペプチドがSEQ ID NO：98のアミノ酸配列を有する、厳密に1つの抗体Fc領域、ならびに
‐SEQ ID NO：104〜106から選択されるアミノ酸配列を含む抗体軽鎖可変ドメインおよびSEQ ID NO：108〜110を含む抗体重鎖可変ドメインを含み、黒色腫関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（MCSP）と特異的に結合する、1つまたは複数の抗原結合部位
を含むことを特徴とする、ジスルフィド結合型多価多機能タンパク質である。

本明細書において報告される1つの局面は、
‐N末端からC末端への方向に、
（i）SEQ ID NO：01のT細胞応答誘発ペプチド、
（ii）SEQ ID NO：71のβ2-ミクログロブリン、ならびに
（iii）SEQ ID NO：72のクラスI MHC分子の細胞外ドメインα1、α2およびα3
を含む1つまたは2つの抗原提示ドメインであって、少なくとも位置11および位置227にシステイン残基を有し、位置11および位置227にあるシステイン残基がジスルフィド結合を形成する抗原提示ドメイン、
‐2つのジスルフィド結合型Fc領域ポリペプチドを含み、そのうち第1のジスルフィド結合型Fc領域ポリペプチドがSEQ ID NO：102のアミノ酸配列を有し、第2のジスルフィド結合型Fc領域ポリペプチドがSEQ ID NO：103のアミノ酸配列を有する、厳密に1つの抗体Fc領域、ならびに
‐黒色腫関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（MCSP）と特異的に結合し、かつSEQ ID NO：104〜106を含む可変ドメインを有する抗体軽鎖およびSEQ ID NO：108〜110を含む可変ドメインを有する抗体重鎖を含む、1つまたは複数の抗原結合部位
を含むことを特徴とする、ジスルフィド結合型多価多機能タンパク質である。

本明細書において報告される1つの局面は、
‐N末端からC末端への方向に、
（i）SEQ ID NO：01のT細胞応答誘発ペプチド、
（ii）SEQ ID NO：71のβ2-ミクログロブリン、ならびに
（iii）SEQ ID NO：72のクラスI MHC分子の細胞外ドメインα1、α2およびα3
を含む1つまたは2つの抗原提示ドメインであって、少なくとも位置11および位置227にシステイン残基を有し、位置11および位置227にあるシステイン残基がジスルフィド結合を形成する抗原提示ドメイン
‐2つのジスルフィド結合型Fc領域ポリペプチドを含み、そのうち第1のジスルフィド結合型Fc領域ポリペプチドがSEQ ID NO：97のアミノ酸配列を有し、第2のジスルフィド結合型Fc領域ポリペプチドがSEQ ID NO：98のアミノ酸配列を有する、厳密に1つの抗体Fc領域、ならびに
‐黒色腫関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（MCSP）と特異的に結合し、かつそれぞれが、SEQ ID NO：105〜107を含む可変ドメインを有する抗体軽鎖およびSEQ ID NO：110〜112を含む可変ドメインを有する抗体重鎖を含む、2つの抗原結合部位
を含むことを特徴とする、ジスルフィド結合型多価多機能タンパク質である。

本明細書において報告される1つの局面は、
‐N末端からC末端への方向に、
（i）SEQ ID NO：01のT細胞応答誘発ペプチド、
（ii）SEQ ID NO：71のβ2-ミクログロブリン、ならびに
（iii）SEQ ID NO：72のクラスI MHC分子の細胞外ドメインα1、α2およびα3
を含む1つまたは2つの抗原提示ドメインであって、少なくとも位置11および位置227にシステイン残基を有し、位置11および位置227にあるシステイン残基がジスルフィド結合を形成する抗原提示ドメイン、
‐2つのジスルフィド結合型Fc領域ポリペプチドを含み、そのうち第1のジスルフィド結合型Fc領域ポリペプチドがSEQ ID NO：102のアミノ酸配列を有し、第2のジスルフィド結合型Fc領域ポリペプチドがSEQ ID NO：103のアミノ酸配列を有する、厳密に1つの抗体Fc領域、ならびに
‐黒色腫関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（MCSP）と特異的に結合し、かつSEQ ID NO：105〜107を含む可変ドメインを有する抗体軽鎖およびSEQ ID NO：110〜112を含む可変ドメインを有する抗体重鎖を含み、ここで抗体重鎖のFc領域がジスルフィド結合型Fc領域ポリペプチドの1つである、1つまたは複数の抗原結合部位
を含むことを特徴とする、ジスルフィド結合型多価多機能タンパク質である。

本明細書において報告される1つの局面は、
‐N末端からC末端への方向に、
（i）SEQ ID NO：01のT細胞応答誘発ペプチド、
（ii）SEQ ID NO：71のβ2-ミクログロブリン、ならびに
（iii）SEQ ID NO：72のクラスI MHC分子の細胞外ドメインα1、α2およびα3
を含む1つまたは2つの抗原提示ドメインであって、少なくとも位置11および位置227にシステイン残基を有し、位置11および位置227にあるシステイン残基がジスルフィド結合を形成する抗原提示ドメイン、
‐2つのジスルフィド結合型Fc領域ポリペプチドを含み、そのうち第1のジスルフィド結合型Fc領域ポリペプチドがSEQ ID NO：97のアミノ酸配列を有し、第2のジスルフィド結合型Fc領域ポリペプチドがSEQ ID NO：98のアミノ酸配列を有する、厳密に1つの抗体Fc領域、ならびに
‐黒色腫関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（MCSP）と特異的に結合し、かつSEQ ID NO：104〜106を含む可変ドメインを有する抗体軽鎖およびSEQ ID NO：108〜110を含む可変ドメインを有する抗体重鎖を含み、ここで抗体重鎖のFc領域がジスルフィド結合型Fc領域ポリペプチドの1つである、1つまたは複数の抗原結合部位
を含み、抗原提示ドメインが可変ドメインの1つのN末端と連結していることを特徴とする、ジスルフィド結合型多価多機能タンパク質である。

本明細書において報告される1つの局面は、
‐N末端からC末端への方向に、
（i）SEQ ID NO：01のT細胞応答誘発ペプチド、
（ii）SEQ ID NO：71のβ2-ミクログロブリン、ならびに
（iii）SEQ ID NO：72のクラスI MHC分子の細胞外ドメインα1、α2およびα3
を含む1つまたは2つの抗原提示ドメインであって、少なくとも位置11および位置227にシステイン残基を有し、位置11および位置227にあるシステイン残基がジスルフィド結合を形成する抗原提示ドメイン、
‐2つのジスルフィド結合型Fc領域ポリペプチドを含み、そのうち第1のジスルフィド結合型Fc領域ポリペプチドがSEQ ID NO：102のアミノ酸配列を有し、第2のジスルフィド結合型Fc領域ポリペプチドがSEQ ID NO：103のアミノ酸配列を有する、厳密に1つの抗体Fc領域、ならびに
‐黒色腫関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（MCSP）と特異的に結合し、かつそれぞれが、SEQ ID NO：104〜106を含む可変ドメインを有する抗体軽鎖およびSEQ ID NO：108〜110を含む可変ドメインを有する抗体重鎖を含み、ここで抗体重鎖のFc領域がジスルフィド結合型Fc領域ポリペプチドである、2つの抗原結合部位
を含み、抗原提示ドメインが可変ドメインのうち1つのN末端と連結していることを特徴とする、ジスルフィド結合型多価多機能タンパク質である。

本明細書において報告される1つの局面は、
‐N末端からC末端への方向に、
（i）SEQ ID NO：01のT細胞応答誘発ペプチド、
（ii）SEQ ID NO：71のβ2-ミクログロブリン、ならびに
（iii）SEQ ID NO：72のクラスI MHC分子の細胞外ドメインα1、α2およびα3
を含む1つまたは2つの抗原提示ドメインであって、少なくとも位置11および位置227にシステイン残基を有し、位置11および位置227にあるシステイン残基がジスルフィド結合を形成する抗原提示ドメイン
‐2つのジスルフィド結合型Fc領域ポリペプチドを含み、そのうち第1のジスルフィド結合型Fc領域ポリペプチドがSEQ ID NO：97のアミノ酸配列を有し、第2のジスルフィド結合型Fc領域ポリペプチドがSEQ ID NO：98のアミノ酸配列を有する、厳密に1つの抗体Fc領域、ならびに
‐黒色腫関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（MCSP）と特異的に結合し、かつそれぞれが、SEQ ID NO：105〜107を含む可変ドメインを有する抗体軽鎖およびSEQ ID NO：110〜112を含む可変ドメインを有する抗体重鎖を含み、ここで抗体重鎖のFc領域がジスルフィド結合型Fc領域ポリペプチドである、2つの抗原結合部位
を含み、抗原提示ドメインが重鎖可変ドメインのうち1つのN末端と連結していることを特徴とする、ジスルフィド結合型多価多機能タンパク質である。

本明細書において報告される1つの局面は、
‐N末端からC末端への方向に、
（i）SEQ ID NO：01のT細胞応答誘発ペプチド、
（ii）SEQ ID NO：71のβ2-ミクログロブリン、ならびに
（iii）SEQ ID NO：72のクラスI MHC分子の細胞外ドメインα1、α2およびα3
を含む1つまたは2つの抗原提示ドメインであって、少なくとも位置11および位置227にシステイン残基を有し、位置11および位置227にあるシステイン残基がジスルフィド結合を形成する抗原提示ドメイン、
‐2つのジスルフィド結合型Fc領域ポリペプチドを含み、そのうち第1のジスルフィド結合型Fc領域ポリペプチドがSEQ ID NO：102のアミノ酸配列を有し、第2のジスルフィド結合型Fc領域ポリペプチドがSEQ ID NO：103のアミノ酸配列を有する、厳密に1つの抗体Fc領域、ならびに
‐黒色腫関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（MCSP）と特異的に結合し、かつそれぞれが、SEQ ID NO：105〜107を含む可変ドメインを有する抗体軽鎖およびSEQ ID NO：110〜112を含む可変ドメインを有する抗体重鎖を含み、ここで抗体重鎖のFc領域がジスルフィド結合型Fc領域ポリペプチドである、2つの抗原結合部位
を含み、抗原提示ドメインが重鎖可変ドメインのうち1つのN末端と連結していることを特徴とする、ジスルフィド結合型多価多機能タンパク質である。

本明細書において報告される1つの局面は、
‐SEQ ID NO：117の1つのポリペプチド鎖、
‐SEQ ID NO：118の1つのポリペプチド鎖、
‐それぞれがSEQ ID NO：119である2つのポリペプチド鎖
を含み、抗原提示ドメインが少なくとも位置11および位置227にシステイン残基を有し、位置11および位置227にあるシステイン残基がジスルフィド結合を形成することを特徴とする、ジスルフィド結合型多価多機能タンパク質である。

本明細書において報告される1つの局面は、
‐SEQ ID NO：137の1つのポリペプチド鎖、
‐SEQ ID NO：118の1つのポリペプチド鎖、
‐それぞれがSEQ ID NO：119である2つのポリペプチド鎖
を含み、抗原提示ドメインが少なくとも位置11および位置227にシステイン残基を有し、位置11および位置227にあるシステイン残基がジスルフィド結合を形成することを特徴とする、ジスルフィド結合型多価多機能タンパク質である。

本明細書において報告される1つの局面は、
‐SEQ ID NO：117の1つのポリペプチド鎖、
‐SEQ ID NO：118の1つのポリペプチド鎖、
‐それぞれがSEQ ID NO：119である2つのポリペプチド鎖
を含み、抗原提示ドメインが少なくとも位置11および位置108にシステイン残基を有し、位置11および位置108にあるシステイン残基がジスルフィド結合を形成することを特徴とする、ジスルフィド結合型多価多機能タンパク質である。

本明細書において報告される1つの局面は、
‐SEQ ID NO：137の1つのポリペプチド鎖、
‐SEQ ID NO：118の1つのポリペプチド鎖、
‐それぞれがSEQ ID NO：119である2つのポリペプチド鎖
を含み、抗原提示ドメインが少なくとも位置11および位置108にシステイン残基を有し、位置11および位置108にあるシステイン残基がジスルフィド結合を形成することを特徴とする、ジスルフィド結合型多価多機能タンパク質である。

本明細書において報告される1つの局面は、
‐SEQ ID NO：117の2つのポリペプチド鎖、
‐それぞれがSEQ ID NO：119である2つのポリペプチド鎖
を含み、抗原提示ドメインが少なくとも位置11および位置227にシステイン残基を有し、位置11および位置227にあるシステイン残基がジスルフィド結合を形成することを特徴とする、ジスルフィド結合型多価多機能タンパク質である。

本明細書において報告される1つの局面は、
‐SEQ ID NO：137の2つのポリペプチド鎖、
‐それぞれがSEQ ID NO：119である2つのポリペプチド鎖
を含み、抗原提示ドメインが少なくとも位置11および位置227にシステイン残基を有し、位置11および位置227にあるシステイン残基がジスルフィド結合を形成することを特徴とする、ジスルフィド結合型多価多機能タンパク質である。

本明細書において報告される1つの局面は、
‐SEQ ID NO：117の2つのポリペプチド鎖、
‐それぞれがSEQ ID NO：119である2つのポリペプチド鎖
を含み、抗原提示ドメインが少なくとも位置11および位置108にシステイン残基を有し、位置11および位置108にあるシステイン残基がジスルフィド結合を形成することを特徴とする、ジスルフィド結合型多価多機能タンパク質である。

本明細書において報告される1つの局面は、
‐SEQ ID NO：137の2つのポリペプチド鎖、
‐それぞれがSEQ ID NO：119である2つのポリペプチド鎖
を含み、抗原提示ドメインが少なくとも位置11および位置108にシステイン残基を有し、位置11および位置108にあるシステイン残基がジスルフィド結合を形成することを特徴とする、ジスルフィド結合型多価多機能タンパク質である。

1つの態様において、MCSP結合部位は、SEQ ID NO：108のアミノ酸配列を含むHVR-H1、SEQ ID NO：109のアミノ酸配列を含むHVR-H2、およびSEQ ID NO：110のアミノ酸配列を含むHVR-H3を含む抗体重鎖可変ドメインを含む。

1つの態様において、MCSP結合部位は、SEQ ID NO：104のアミノ酸配列を含むHVR-L1；SEQ ID NO：105のアミノ酸配列を含むHVR-L2；およびSEQ ID NO：106のアミノ酸配列を含むHVR-L3を含む抗体軽鎖可変ドメインを含む。

1つの態様において、MCSP結合部位は、SEQ ID NO：108のアミノ酸配列を含むHVR-H1；SEQ ID NO：109のアミノ酸配列を含むHVR-H2；SEQ ID NO：110のアミノ酸配列を含むHVR-H3を含む抗体重鎖可変ドメイン、ならびにSEQ ID NO：104のアミノ酸配列を含むHVR-L1；SEQ ID NO：105のアミノ酸配列を含むHVR-L2；およびSEQ ID NO：106のアミノ酸配列を含むHVR-L3を含む抗体軽鎖可変ドメインを含む。

1つの態様において、MCSP結合部位は、SEQ ID NO：111のアミノ酸配列を含むHVR-H1、SEQ ID NO：112のアミノ酸配列を含むHVR-H2、およびSEQ ID NO：110のアミノ酸配列を含むHVR-H3を含む抗体重鎖可変ドメインを含む。

1つの態様において、MCSP結合部位は、SEQ ID NO：107のアミノ酸配列を含むHVR-L1；SEQ ID NO：105のアミノ酸配列を含むHVR-L2；およびSEQ ID NO：106のアミノ酸配列を含むHVR-L3を含む抗体軽鎖可変ドメインを含む。

1つの態様において、MCSP結合部位は、SEQ ID NO：111のアミノ酸配列を含むHVR-H1；SEQ ID NO：112のアミノ酸配列を含むHVR-H2；SEQ ID NO：110のアミノ酸配列を含むHVR-H3を含む抗体重鎖可変ドメイン、ならびにSEQ ID NO：107のアミノ酸配列を含むHVR-L1；SEQ ID NO：105のアミノ酸配列を含むHVR-L2；およびSEQ ID NO：106のアミノ酸配列を含むHVR-L3を含む抗体軽鎖可変ドメインを含む。

1つの態様において、MCSP結合部位は、SEQ ID NO：114のアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性を有する抗体重鎖可変ドメイン；およびSEQ ID NO：113のアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性を有する抗体軽鎖可変ドメインを含む。

1つの態様において、MCSP結合部位は、SEQ ID NO：114の抗体重鎖可変ドメインおよびSEQ ID NO：113の抗体軽鎖可変ドメインを含む。

1つの態様において、MCSP結合部位はSEQ ID NO：114およびSEQ ID NO：113を含む。

1つの態様において、MCSP結合部位は、SEQ ID NO：116のアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性を有する抗体重鎖可変ドメイン；およびSEQ ID NO：115のアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性を有する抗体軽鎖可変ドメインを含む。

1つの態様において、MCSP結合部位は、SEQ ID NO：116の抗体重鎖可変ドメイン；およびSEQ ID NO：115の抗体軽鎖可変ドメインを含む。

1つの態様において、MCSP結合部位はSEQ ID NO：116およびSEQ ID NO：115を含む。

1つの局面において、本発明は、MCSPと結合する単離された抗体の、結合特異性、すなわちHVRまたは可変ドメインを含む、ジスルフィド結合型多価多機能タンパク質を提供する。特に、本明細書において提供されるジスルフィド結合型多価多機能タンパク質に含まれる抗MCSP抗体結合特異性、すなわちHVRまたは可変ドメインは、ヒトMCSPの膜近位エピトープと結合する。Staub, E., et al.（FEBS Lett. 527 (2002) 114-118）において考察されているように、MCSPの膜近位領域は、CSPGリピートドメインと称される複数の新規反復ドメインによって構成される。

本明細書において報告される1つの局面は、本明細書において報告されるジスルフィド結合型多価多機能タンパク質をコードする核酸である。

1つの態様において、核酸は、種々の異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする構造遺伝子を含む2つ〜4つの発現カセットを含む。

本明細書において報告される1つの局面は、本明細書において報告される核酸を含む宿主細胞である。

本明細書において報告される1つの局面は、本明細書において報告されるジスルフィド結合型多価多機能タンパク質を生産する方法であって、本明細書において報告される宿主細胞をジスルフィド結合型多価多機能タンパク質が産生されるように培養する段階を含む方法である。

1つの態様において、ジスルフィド結合型多価多機能タンパク質は、細胞または培養培地から回収され、それによってジスルフィド結合型多価多機能タンパク質が生産される。

本明細書において報告される1つの局面は、本明細書において報告されるジスルフィド結合型多価多機能タンパク質と、任意で薬学的に許容される担体とを含む医薬製剤である。

1つの態様において、医薬製剤は、さらなる治療薬をさらに含む。

本明細書において報告される1つの局面は、医薬として用いるための、本明細書において報告されるジスルフィド結合型多価多機能タンパク質である。

本明細書において報告される1つの局面は、癌を治療するのに用いるための、本明細書において報告されるジスルフィド結合型多価多機能タンパク質である。

本明細書において報告される1つの局面は、ウイルス感染症を治療するのに用いるための、本明細書において報告されるジスルフィド結合型多価多機能タンパク質である。

本明細書において報告される1つの局面は、個体のウイルス特異的細胞傷害性T細胞を標的に対して誘引させるのに用いるための、本明細書において報告されるジスルフィド結合型多価多機能タンパク質である。

本明細書において報告される1つの局面は、癌細胞の排除（除去）に用いるための、本明細書において報告されるジスルフィド結合型多価多機能タンパク質である。

本明細書において報告される1つの局面は、ウイルス感染細胞の排除（除去）に用いるための、本明細書において報告されるジスルフィド結合型多価多機能タンパク質である。

本明細書において報告される1つの局面は、医薬の製造における、本明細書において報告されるジスルフィド結合型多価多機能タンパク質の使用である。

1つの態様において、医薬は癌の治療用である。

1つの態様において、医薬はウイルス感染症の治療用である。

1つの態様において、医薬は、個体のウイルス特異的細胞傷害性T細胞を標的に対して誘因させるためのものである。

1つの態様において、医薬は、癌細胞の排除（除去）用である。

1つの態様において、医薬は、ウイルス感染細胞の排除（除去）用である。

本明細書において報告される1つの局面は、癌を有する個体を治療する方法であって、個体に対して、本明細書において報告されるジスルフィド結合型多価多機能タンパク質の有効量を投与する段階を含む方法である。

1つの態様において、本方法は、さらなる治療薬を個体に投与する段階をさらに含む。

本明細書において報告される1つの局面は、ウイルス感染を有する個体を治療する方法であって、個体に対して、本明細書において報告されるジスルフィド結合型多価多機能タンパク質の有効量を投与する段階を含む。

本明細書において報告される1つの局面は、個体のウイルス特異的細胞傷害性T細胞を個体における標的に対して誘引させる方法であって、個体のウイルス特異的細胞傷害性T細胞を標的に対して誘引させるために、個体に対して、本明細書において報告されるジスルフィド結合型多価多機能タンパク質の有効量を投与する段階を含む方法である。

本明細書において報告される1つの局面は、個体における癌細胞の除去の方法であって、癌細胞を除去／解体するために、個体に対して、本明細書において報告されるジスルフィド結合型多価多機能タンパク質の有効量を投与する段階を含む方法である。

本明細書において報告される1つの局面は、個体におけるウイルス感染細胞の除去の方法であって、ウイルス感染細胞を除去／解体するために、個体に対して、本明細書において報告されるジスルフィド結合型多価多機能タンパク質の有効量を投与する段階を含む方法である。

本明細書において報告される1つの局面は、i）β2-ミクログロブリンとクラスI MHC分子の細胞外ドメインα1、α2およびα3との融合ポリペプチド、ii）それぞれが抗体ヒンジ領域を含む、ジスルフィド結合型ポリペプチド鎖のペア、ならびにiii）真核細胞における抗体軽鎖可変ドメインおよび抗体重鎖可変ドメインの少なくとも1つのペアを含むジスルフィド結合型多価多機能タンパク質の組換え生産のための方法であって、i）ジスルフィド結合型多価多機能タンパク質をコードする1つまたは複数の核酸を含む真核細胞を培養する段階、およびii）ジスルフィド結合型多価多機能タンパク質を細胞または培養培地から回収する段階を含み、ジスルフィド結合型多価多機能タンパク質がβ2-ミクログロブリンとクラスI MHC分子の細胞外ドメインα1、α2およびα3との1つ、2つまたはそれを上回るジスルフィド結合型融合ポリペプチドを含み、ジスルフィド結合が残基11と227との間である、方法である。

1つの態様において、ジスルフィド結合型多価多機能タンパク質は、1つのMHC由来ポリペプチド、またはあるMHC由来分子を含む1つの融合ポリペプチドである。

1つの態様において、ジスルフィド結合型多価多機能タンパク質は、2つのMHC由来ポリペプチド、またはあるMHC由来分子を含む2つの融合ポリペプチドである。

1つの態様において、ジスルフィド結合型多価多機能タンパク質は、培養培地中に、1mg／Lまたはそれを上回る濃度で得られる。1つの態様において、ジスルフィド結合型多価多機能タンパク質は、培養培地中に、4mg／Lまたはそれを上回る濃度で得られる。

1つの態様において、真核細胞は哺乳動物細胞である。1つの態様において、哺乳動物細胞は、ヒト胚性腎臓細胞、またはチャイニーズハムスター卵巣細胞、またはベビーハムスター腎臓細胞、またはマウス骨髄腫細胞である。

[本発明1001]
‐1つまたは2つの抗原提示ドメイン、
‐1つの抗体Fc領域、および
‐1つまたは複数の抗原結合部位
を含み、
抗原提示ドメインが、N末端からC末端への方向に、
（i）β2-ミクログロブリン、ならびに
（ii）相対頻度が1％未満であるクラスI MHC分子の細胞外ドメインα1、α2およびα3、
または
（i）相対頻度が1％未満であるクラスI MHC分子の細胞外ドメインα1、α2およびα3、ならびに
（ii）β2-ミクログロブリン、
または
（i）T細胞応答誘発ペプチド、
（ii）β2-ミクログロブリン、ならびに
（iii）相対頻度が1％もしくはそれ以上である、クラスI MHC分子の細胞外ドメインα1、α2およびα3、
または
（i）T細胞応答誘発ペプチド、
（ii）相対頻度が1％もしくはそれ以上である、クラスI MHC分子の細胞外ドメインα1、α2およびα3、ならびに
（iii）β2-ミクログロブリン
のいずれかを含み、
抗原結合部位が癌細胞表面抗原と結合し、
抗原提示ドメインが、鎖内／ドメイン間ジスルフィド結合を形成する少なくとも2つの非天然システイン残基を有する
ことを特徴とする、ジスルフィド結合型多価多機能タンパク質。
[本発明1002]
抗原提示ドメイン内の1つの非天然システイン残基がT細胞応答誘発ペプチドとの間のリンカー内にあり、かつ1つの非天然システイン残基がクラスI MHC分子の細胞外ドメインα1、α2およびα3のうち1つの中にあることを特徴とする、本発明1001のジスルフィド結合型多価多機能タンパク質。
[本発明1003]
抗原提示ドメインが少なくとも位置11および位置227にシステイン残基を有し、かつ位置11および位置227にあるシステイン残基がジスルフィド結合を形成するか、または
抗原提示ドメインが少なくとも位置11および位置108にシステイン残基を有し、かつ位置11および位置108にあるシステイン残基がジスルフィド結合を形成する
ことを特徴とする、本発明1001または1002のいずれかのジスルフィド結合型多価多機能タンパク質。
[本発明1004]
抗体Fc領域が第1および第2のジスルフィド結合型Fc領域ポリペプチドを含み、ここで1つの抗原結合部位または複数の抗原結合部位のうち1つが第1のFc領域ポリペプチドを含み、かつ、第2の抗原結合部位が存在するならば、第2のFc領域ポリペプチドを含むことを特徴とする、本発明1001〜1003のいずれかのジスルフィド結合型多価多機能タンパク質。
[本発明1005]
抗原結合部位が、i）抗体重鎖と抗体軽鎖のペア、もしくはii）N末端からC末端への方向にscFv抗体断片および抗体Fc領域ポリペプチドを含むscFv融合ポリペプチド、もしくはiii）N末端からC末端への方向にscFabおよび抗体Fc領域ポリペプチドを含むscFab融合ポリペプチド
を含むこと、または
複数の抗原結合部位が、互いに独立に、i）抗体重鎖と抗体軽鎖の（コグネイト）ペア、ここで個々の鎖は野生型鎖であってもまたは改変鎖（置換された、突然変異した、もしくはドメイン交換されたもの）であってもよい、ペア、もしくはii）N末端からC末端への方向にscFv抗体断片および抗体Fc領域ポリペプチドを含むscFv融合ポリペプチド、もしくはiii）N末端からC末端への方向にscFabおよび抗体Fc領域ポリペプチドを含むscFab融合ポリペプチド
を含むこと
を特徴とする、本発明1001〜1004のいずれかのジスルフィド結合型多価多機能タンパク質。
[本発明1006]
i）抗原提示ドメインが抗原結合部位の重鎖のN末端もしくは軽鎖のN末端と連結していること、またはii）1つの抗原提示ドメインが各抗原結合部位の重鎖の各N末端もしくは軽鎖の各N末端と連結していること、またはiii）抗原提示ドメインが抗原結合部位の重鎖のC末端もしくは軽鎖のC末端と連結していること、またはvi）1つの抗原提示ドメインが各抗原結合部位の重鎖の各C末端もしくは軽鎖の各C末端と連結していること、またはv）抗原提示ドメインがscFv融合ポリペプチドのN末端もしくはC末端と連結していること、またはvi）1つの抗原提示ドメインが各scFv融合ポリペプチドの各N末端もしくはC末端と連結していること、またはvii）抗原提示ドメインがscFab融合ポリペプチドのN末端もしくはC末端と連結していること、またはviii）1つの抗原提示ドメインが各scFab融合ポリペプチドの各N末端もしくはC末端と連結していること、またはix）抗原提示ドメインが第2のFc領域ポリペプチドのN末端もしくはC末端と連結していること、またはx）1つの抗原提示ドメインが第1のFc領域ポリペプチドのN末端もしくはC末端と連結し、かつ1つの抗原提示ドメインが第2のFc領域ポリペプチドのN末端もしくはC末端と連結していることを特徴とする、本発明1001〜1005のいずれかのジスルフィド結合型多価多機能タンパク質。
[本発明1007]
T細胞応答誘発ペプチドがヒトサイトメガロウイルス由来ペプチドであることを特徴とする、本発明1001〜1006のいずれかのジスルフィド結合型多価多機能タンパク質。
[本発明1008]
ウイルス由来ペプチドがSEQ ID NO：01のアミノ酸配列を有することを特徴とする、本発明1001〜1007のいずれかのジスルフィド結合型多価多機能タンパク質。
[本発明1009]
相対頻度が1％またはそれ以上であるクラスI MHC分子が、HLA-A ^* 0201、HLA-A ^* 1101、HLA-A ^* 2402、HLA-A ^* 340101、HLA-C ^* 0304、HLA-C ^* 0401およびHLA-C ^* 0702を含む群から選択されることを特徴とする、本発明1001〜1008のいずれかのジスルフィド結合型多価多機能タンパク質。
[本発明1010]
相対頻度が1％未満であるクラスI MHC分子が、HLA-B ^* 4201、HLA-B ^* 5901、HLA-B ^* 6701およびHLA-B ^* 7802を含む群から選択されることを特徴とする、本発明1001〜1009のいずれかのジスルフィド結合型多価多機能タンパク質。
[本発明1011]
抗原提示ドメインが、
（i）ウイルス由来ペプチド、
（ii）β2-ミクログロブリン、
（iii）可溶性HLA-AアレルA ^* 0201、および
（iv）少なくとも位置11および位置227にあるシステイン残基であって、位置11および位置227にあるシステイン残基がジスルフィド結合を形成する、システイン残基
を含むことを特徴とする、本発明1001〜1010のいずれかのジスルフィド結合型多価多機能タンパク質。
[本発明1012]
抗原提示ドメインが、N末端からC末端への方向に、
（i）SEQ ID NO：01〜SEQ ID NO：70を含む群から選択されるアミノ酸配列を有するウイルス由来ペプチド、
（ii）SEQ ID NO：77、78、79、82、83、84および139を含む群から選択されるアミノ酸配列を有する第1のリンカーペプチド、
（iii）SEQ ID NO：71のアミノ酸配列を有するβ2-ミクログロブリン、
（iv）SEQ ID NO：77、78、79、82、83および84を含む群から選択されるアミノ酸配列を有する第2のリンカーペプチド、
（v）SEQ ID NO：140のアミノ酸配列を有するクラスI MHC分子の細胞外ドメインα1、α2およびα3、
（vi）SEQ ID NO：73、77、78、79、82、83、84および136を含む群から選択されるアミノ酸配列を有する第3のリンカーペプチド、ならびに
（vii）少なくとも位置11および位置227にあるシステイン残基、ならびに位置11および位置227にあるシステイン残基間のジスルフィド結合
を含むことを特徴とする、本発明1001〜1011のいずれかのジスルフィド結合型多価多機能タンパク質。
[本発明1013]
本発明1001〜1012のいずれかのジスルフィド結合型多価多機能タンパク質と、任意で薬学的に許容される担体とを含む、医薬製剤。
[本発明1014]
医薬として用いるための、本発明1001〜1012のいずれかのジスルフィド結合型多価多機能タンパク質。
[本発明1015]
癌を治療するのに用いるための、本発明1001〜1012のいずれかのジスルフィド結合型多価多機能タンパク質。
[本発明1016]
個体のウイルス特異的細胞傷害性T細胞を標的に対して誘引するのに用いるための、本発明1001〜1012のいずれかのジスルフィド結合型多価多機能タンパク質。
[本発明1017]
癌細胞またはウイルス感染細胞の除去に用いるための、本発明1001〜1012のいずれかのジスルフィド結合型多価多機能タンパク質。
以下の態様は、本明細書において報告された局面の任意のものと組み合わせることができる。また、本明細書において報告された任意の態様を、任意の他の態様と、または本明細書において報告された態様の組み合わせと組み合わせることもできる。

本明細書において報告される例示的なジスルフィド結合型二価ジスルフィド結合型多価多機能タンパク質の注釈付きスキーム；HLA-Fc領域融合ポリペプチドのN末端からC末端までの配列：1-2-3-4-5-6-（3-6ジスルフィド結合）-7-8-9-12-13-14（IIを有する）；HLA-重鎖融合ポリペプチドのN末端からC末端までの配列：1-2-3-4-5-6-（3-6ジスルフィド結合）-7-8-9-10-11-12-13-14（Iを有する）；軽鎖：a-b。本明細書において報告される多機能タンパク質に含まれる例示的なポリペプチド：融合ポリペプチドを、抗体軽鎖、または抗体重鎖ヒンジ領域を含むポリペプチドのいずれかとN末端で融合させた。対応する発現プラスミドをトランスフェクトさせたHEK 293細胞の細胞培養物上清のa SDSポリアクリルアミドゲルのウエスタンブロット。染色は、ペルオキダーゼ結合ポリクローナルウサギ抗ヒトκ-軽鎖抗体および西洋ワサビペルオキダーゼと結合させたポリクローナルウサギ抗ヒトIgG抗体を用いて行った。レーン：1：2アーム型（two-armed）ペプチド-β2-ミクログロブリン-HLA-A0201-IgG-Fc；2：1アーム型（one-armed）ペプチド-β2-ミクログロブリン-HLA-A0201-IgG-Fc＋IgG-Fc；3：1アーム型ペプチド-β2-ミクログロブリン-HLA-A0201-IgG-重鎖＋IgG-軽鎖＋IgG-Fc；4：1アーム型ペプチド-β2-ミクログロブリン-HLA-A0201-IgG-重鎖＋IgG-重鎖＋IgG-軽鎖；5：2アーム型β2-ミクログロブリン-HLA-A0201-IgG-軽鎖＋IgG-重鎖；6：2アーム型ペプチド-β2-ミクログロブリン-HLA-A0201-IgG-軽鎖＋IgG-重鎖；7：2アーム型ペプチド-β2-ミクログロブリン-HLA-A0201-IgG-重鎖＋IgG-軽鎖；8：2アーム型ペプチド-β2-ミクログロブリン-HLA-A0201-IgG-Fc-scFv；9：1アーム型ペプチド-β2-ミクログロブリン-HLA-A0201-IgG-Fc＋1アーム型IgG（重鎖および軽鎖）；10：分子量マーカー；11：参照標準IgG1抗体。特定のペプチドによるインビトロ刺激の前および後の種々のドナー由来のCMV特異的細胞傷害性T細胞の数を決定するためのフローサイトメトリー分析：4例のヒトドナー由来の末梢血リンパ球（PBL）の分析；FITC標識染色（BD、カタログ番号345772）と結合させた抗CD8抗体と、Pro5五量体APC（ProImmune、カタログ番号F008-4A-E）で染色した、CMV由来ペプチド（NLVPMVATV、SEQ ID NO：01）をロードしたTCR認識性MHC-クラスI（HLA-A^*0201）との組み合わせ；丸印：CMV特異的CD8⁺-T細胞；A：ドナー1；B：ドナー3。 A：クーマシー染色を行ったSDS-PAGEゲル：レーン1：分子量標準物質、レーン2：1アーム型ペプチド-β2-ミクログロブリン-HLA-A0201-IgG-Fc＋1アーム型IgG（重鎖および軽鎖）、非還元条件；レーン3：1アーム型ペプチド-β2-ミクログロブリン-HLA-A0201-IgG-Fc＋1アーム型IgG多機能タンパク質（重鎖および軽鎖）、還元条件。B：サイズ排除クロマトグラフィーのクロマトグラム；1：高分子量形態（面積の0.7％）；2：単量体多機能タンパク質（面積の99.3％）。C：模式的分子。 A：a）プロテインA HPLCおよびSECの後にクーマシー染色を行ったSDS-PAGEゲル；非還元条件；レーン1：分子量標準物質、レーン2：ペプチド-β2-ミクログロブリン-HLA-A0201-HC＋LC＋IgG-Fc、レーン3：ペプチド-β2-ミクログロブリン-HLA-A0201-HC＋LC＋1アーム型IgG（重鎖および軽鎖）、b）：プロテインA HPLCおよびSECの後にクーマシー染色を行ったSDS-PAGEゲル；還元条件；レーン1：分子量標準物質、レーン2：ペプチド-β2-ミクログロブリン-HLA-A0201-HC＋LC＋IgG-Fc、レーン3：ペプチド-β2-ミクログロブリン-HLA-A0201-HC＋LC＋1アーム型IgG（重鎖および軽鎖）。B：a）ペプチド-β2-ミクログロブリン-HLA-A0201-HC＋LC＋IgG-Fcのサイズ排除クロマトグラフィークロマトグラム；1：高分子量形態（面積の1.9％）；2：単量体多機能タンパク質（面積の98.1％）。b）ペプチド-β2-ミクログロブリン-HLA-A0201-HC＋LC＋1アーム型IgG（重鎖および軽鎖）のサイズ排除クロマトグラフィークロマトグラム；1：高分子量形態（面積の2.1％）；2：単量体多機能タンパク質（面積の97.9％）C：模式的分子2：ペプチド-β2-ミクログロブリン-HLA-A0201-HC＋LC＋IgG-Fc、3：ペプチド-β2-ミクログロブリン-HLA-A0201-HC＋LC＋1アーム型IgG。 MCSP+標的細胞（Colo38）上での種々のMHC-I-多機能タンパク質の結合：Colo38細胞を5分間、Accutase（PAA、カタログ番号Ll1-007）とともにインキュベートして、単細胞懸濁液を得た。バイアル当たり2×10⁵個の細胞を、100μlのPBS／2％ FCS中にて1μg／mlのMHC-I-多機能タンパク質とともに4℃で45分間インキュベートした。インキュベーションの後に、細胞を1mlの冷PBS／2％ FCSで洗浄し、910rpmで7分間遠心処理した。細胞を、二次抗体（ヤギ抗ヒトIgG1抗体PEコンジュゲート、Jackson、カタログ番号109-116-088）（2μg／ml）を含む100μlのPBS／2％ FCS中に再懸濁させて、4℃でさらに45分間インキュベートした。細胞を1ml PBS％2％ FCSで2回洗浄し、BD Canto II Flow Cytometerによって測定した。細胞傷害性アッセイ：本明細書において報告される抗原結合性多機能タンパク質は、ヒトCMV特異的T細胞を通じてのH460M2腫瘍細胞の溶解を誘発する。a）（6h）標的細胞：CMV特異的エフェクターT細胞 1：1.5；b）（6h）標的細胞：CMV特異的エフェクターT細胞 1：0.75；c）（6h）標的細胞：CMV特異的エフェクターT細胞 1：0.5；左のバー：本明細書において報告される多機能タンパク質；右のバー MAB IGF-1R-アフコシル化。細胞傷害性アッセイ：本明細書において報告される抗原結合性多機能タンパク質は、ヒトCMV特異的T細胞を通じてのI24 3T3腫瘍細胞の溶解を誘発する；a）（9h）標的細胞：CMV特異的エフェクターT細胞 1：1.5；b）（9h）標的細胞：CMV特異的エフェクターT細胞 1：0.75；c）9h）標的細胞：CMV特異的エフェクターT細胞 1：0.5；左のバー：本明細書において報告される多機能タンパク質；中央のバー：MAB IGF-1R-afu；右のバー：抗ジゴキシゲニン抗体。抗IGF-lR抗体および本明細書において報告される多機能タンパク質の肺腺癌細胞株H460M2との結合のFACS分析；a）二次抗体のみ（ヤギ抗ヒトIgG（H＋L）（Jackson Laboratories、カタログ番号109-116-088））；b）融合ポリペプチドが可変ドメインの1つのペアのみを含む抗IGF-lR抗体の重鎖のN末端と融合している、本明細書において報告される多機能タンパク質；c）抗IGF-lR抗体。本明細書において報告される種々の多機能タンパク質のインビトロ有効性および特異性（細胞傷害性アッセイ）；a）一価抗IGF1R抗体およびCMV由来ペプチドを含む多機能タンパク質；b）一価抗IGF1R抗体およびEBV由来ペプチドを含む多機能タンパク質（対照）；c）二価抗IGF1R抗体およびCMV由来ペプチドを含む多機能タンパク質；d）抗IGF-lR抗体（対照）；e）抗ジゴキシゲニン抗体（対照）。融合ポリペプチドが完全抗IGF-1R抗体の重鎖のN末端と融合している、本明細書において報告される多機能タンパク質の、種々の標的（T）対エフェクター（E）細胞比で決定したインビトロ有効性および特異性（EC50値）。 a）一価抗IGF1R抗体とCMV由来ペプチドを含む融合ポリペプチドとを含む多機能タンパク質、およびb）抗IGF-1R抗体との、標的対エフェクター細胞比1：1.5での6時間のインキュベーション後の標的細胞の溶解。 MHC-I-抗MCSP多機能タンパク質とインキュベートしたColo38細胞に関する正規化細胞インデックスの推移；多機能タンパク質の濃度1μg／ml（MHCI-0008（1）、MHCI-0010（2）、MHCI-0030（3）、MHCI-0031（4））、エフェクター対標的細胞比10：1；ドナー3由来のPBMC（細胞200.000個、ドナー3はCMV陽性であるがEBV陰性である）および黒色腫腫瘍細胞株Colo38（細胞20.000個）、96ウェル当たり、データは三重反復試験による。 A：MHC-I-抗MCSP多機能タンパク質とともにインキュベートしたColo38細胞に関する正規化細胞インデックスの推移；多機能タンパク質の濃度1μg／ml（MHCI-0008（1）、MHCI-0010（2）、PBMC only（3））、エフェクター対標的細胞比10：1；ドナー3由来のPBMC（細胞200.000個、ドナー3はCMV陽性であるがEBV陰性である）および黒色腫腫瘍細胞株Colo38（細胞20.000個）、96ウェル当たり、データは三重反復試験による。B：MHC-I-抗MCSP多機能タンパク質とともにインキュベートしたWM266細胞に関する正規化細胞インデックスの推移；多機能タンパク質の濃度1μg／ml（MHCI-0008（1）、MHCI-0010（2）、MHCI-0030（3）、MHCI-0031（4）、標的細胞のみ（5）、標的細胞＋T細胞（6））、エフェクター対標的細胞比10：1；ドナー3由来のPBMC（細胞200.000個、ドナー3はCMV陽性であるがEBV陰性である）および黒色腫腫瘍細胞株MW266（細胞20.000個）、96ウェル当たり、データは三重反復試験による。多機能タンパク質MHCI-0008（一価、CMVペプチドを負荷、1）、MHCI-0010（一価、EBVペプチドを負荷した対照、2）、MHC-0026（二価、CMVペプチドを負荷、非結合対照、3）、MHCI-0030（一価、CMVペプチドを負荷、活性、4）およびMHCI-0031（二価、CMVペプチドを負荷、活性、5）による、非刺激PBMCの存在下における多機能タンパク質との42時間のインキュベーション後の標的細胞の溶解。多機能タンパク質MHCI-0008（一価、CMVペプチドを負荷、1）、MHCI-0010（一価、EBVペプチドを負荷した対照、2）、MHC-0026（二価、CMVペプチドを負荷、非結合対照、3）、MHCI-0030（一価、CMVペプチドを負荷、活性、4）およびMHCI-0031（二価、CMVペプチドを負荷、活性、5）による、非刺激PBMCの存在下で生じさせた多機能タンパク質との48時間のインキュベーション後のLDH放出。 A：濃度1μg／mlでの、多機能タンパク質MHCI-0008（一価、CMVペプチドを負荷、1）、MHCI-0010（一価、EBVペプチドを負荷した対照、2）、MHC-0026（二価、CMVペプチドを負荷、非結合対照、3）、MHCI-0030（一価、CMVペプチドを負荷、活性、4）およびMHCI-0031（二価、CMVペプチドを負荷、活性、5）による、刺激PBMCの存在下における多機能タンパク質との10時間のインキュベーション後のColo38細胞の溶解。B：濃度1μg／mlでの、多機能タンパク質MHCI-0008（一価、CMVペプチドを負荷、1）、MHCI-0010（一価、EBVペプチドを負荷した対照、2）、MHC-0026（二価、CMVペプチドを負荷、非結合対照、3）、MHCI-0030（一価、CMVペプチドを負荷、活性、4）およびMHCI-0031（二価、CMVペプチドを負荷、活性、5）による、刺激PBMCの存在下における多機能タンパク質との10時間のインキュベーション後のWM266細胞の溶解。プロテインAアフィニティークロマトグラフィーの後、ただしジスルフィドで安定化されていない多機能タンパク質（A）およびジスルフィドで安定化された多機能タンパク質（B）の調製用サイズ排除クロマトグラフィーの前の分析用サイズ排除クロマトグラム。濃度1μg／mlでの、多機能タンパク質MHCI-0031（二価、CMVペプチドを負荷、活性、non-ジスルフィド結合型、1）およびMHCI-0054（二価、CMVペプチドを負荷、活性、ジスルフィド結合型バージョンのMHCI-0031、2）による、刺激PBMCの存在下におけるColo38細胞の溶解。野生型完全長IgG（三角形）、本明細書において報告される例示的なジスルフィド結合型多価多機能タンパク質（菱形）、ジスルフィド結合安定化を伴わない多価多機能タンパク質（星印）の熱安定性。

配列の簡単な説明
SEQ ID NO：01〜47 ヒトサイトメガロウイルス由来ペプチド。
SEQ ID NO：48 ヒト免疫不全ウイルス由来ペプチド。
SEQ ID NO：49 ヒトヘルペスウイルス4由来ペプチド。
SEQ ID NO：50 インフルエンザAウイルス由来ペプチド。
SEQ ID NO：51 B型肝炎ウイルス由来ペプチド。
SEQ ID NO：52 ヒトT細胞リンパ親和性ウイルス1型由来ペプチド。
SEQ ID NO：53 V-jun肉腫ウイルス17癌遺伝子ホモログ（JUN）由来ペプチド。
SEQ ID NO：54 ヒトアデノウイルス3型由来ペプチド。
SEQ ID NO：55 C型肝炎ウイルス由来ペプチド。
SEQ ID NO：56〜70 デングウイルス由来ペプチド。
SEQ ID NO：71 ヒトβ2-ミクログロブリンアミノ酸配列。
SEQ ID NO：72 ヒトHLA-A^*0201 α1〜α3鎖アミノ酸配列。
SEQ ID NO：73〜84 リンカーペプチドアミノ酸配列。
SEQ ID NO：85 ヒトIgG1 CH2ドメインアミノ酸配列。
SEQ ID NO：86 ヒトIgG1 CH2ドメインアミノ酸配列。
SEQ ID NO：87 ヒトIgG1 Fc領域アミノ酸配列。
SEQ ID NO：88 ヒトIgG1 Fc領域L234A、L235A突然変異型アミノ酸配列。
SEQ ID NO：89 ヒトIgG1 Fc領域T366S、L368A、Y407V突然変異型アミノ酸配列。
SEQ ID NO：90 ヒトIgG1 Fc領域T366W突然変異型アミノ酸配列。
SEQ ID NO：91 ヒトIgG1 Fc領域L234A、L235A、T366S、L368A、Y407V突然変異型アミノ酸配列。
SEQ ID NO：92 ヒトIgG1 Fc領域L234A、L235A、T366W突然変異型アミノ酸配列。
SEQ ID NO：93 ヒトIgG1 Fc領域P329G突然変異型アミノ酸配列。
SEQ ID NO：94 ヒトIgG1 Fc領域L234A、L235A、P329G突然変異型アミノ酸配列。
SEQ ID NO：95 ヒトIgG1 Fc領域P329G、T366S、L368A、Y407V突然変異型アミノ酸配列。
SEQ ID NO：96 ヒトIgG1 Fc領域P329G、T366W突然変異型アミノ酸配列。
SEQ ID NO：97 ヒトIgG1 Fc領域L234A、L235A、P329G、T366S、L368A、Y407V突然変異型アミノ酸配列。
SEQ ID NO：98 ヒトIgG1 Fc領域L234A、L235A、P329G、T366W突然変異型アミノ酸配列。
SEQ ID NO：99 ヒトIgG4 Fc領域アミノ酸配列。
SEQ ID NO：100 ヒトIgG4 Fc領域S228P、L235E突然変異型アミノ酸配列。
SEQ ID NO：101 ヒトIgG4 Fc領域S228P、L235E、P329G突然変異型アミノ酸配列。
SEQ ID NO：102 ヒトIgG4 Fc領域S228P、L235E、P329G、T366S、L368A、Y407V突然変異型アミノ酸配列。
SEQ ID NO：103 ヒトIgG4 Fc領域S228P、L235E、P329G、T366W突然変異型アミノ酸配列。
SEQ ID NO：104 HVR-L1
SEQ ID NO：105 HVR-L2
SEQ ID NO：106 HVR-L3
SEQ ID NO：107 HVR-L1
SEQ ID NO：108 HVR-H1
SEQ ID NO：109 HVR-H2
SEQ ID NO：110 HVR-H3
SEQ ID NO：111 HVR-H1
SEQ ID NO：112 HVR-H2
SEQ ID NO：113 VL
SEQ ID NO：114 VH
SEQ ID NO：115 VL
SEQ ID NO：116 VH
SEQ ID NO：117 MHC-I-VH（MCSP）-IgG1 Fc領域L234A、L235A、P329G、T366S、L368A、Y407V突然変異型アミノ酸配列。
SEQ ID NO：118 VH（MCSP）-IgG1 Fc領域L234A、L235A、P329G、T366W突然変異型アミノ酸配列。
SEQ ID NO：119 VL（MCSP）-CLアミノ酸配列。
SEQ ID NO：120 ヒト化抗IGF-1Rモノクローナル軽鎖抗体アミノ酸配列（κ）。
SEQ ID NO：121 ヒト化抗IGF-1Rモノクローナル重鎖抗体アミノ酸配列（IgG1 L234A、L235A突然変異体）。
SEQ ID NO：122 ヒト化抗IGF-1Rモノクローナル重鎖抗体アミノ酸配列（IgG1 L234A、L235A突然変異体およびknob変異体）。
SEQ ID NO：123 ヒト化抗IGF-1Rモノクローナル重鎖抗体アミノ酸配列（IgG1 L234A、L235A突然変異体およびhole変異体）。
SEQ ID NO：124 ヒトIgG1 Fc領域突然変異型ヒンジ領域およびL234A、L235A突然変異体およびknob変異体。
SEQ ID NO：125 ヒト化抗IGF-1Rモノクローナル抗体のジスルフィドで安定化された単鎖Fv。
SEQ ID NO：126 マウス抗MCSPモノクローナル軽鎖抗体アミノ酸配列（κ）。
SEQ ID NO：127 ヒト化抗MCSPモノクローナル軽鎖抗体アミノ酸配列（κ）。
SEQ ID NO：128 マウス抗MCSPモノクローナル重鎖抗体アミノ酸配列（IgG1 L234A、L235A突然変異体）。
SEQ ID NO：129 ヒト化抗MCSPモノクローナル重鎖抗体アミノ酸配列（IgG1 L234A、L235A突然変異体）。
SEQ ID NO：130 マウス抗MCSPモノクローナル重鎖抗体アミノ酸配列（IgG1 L234A、L235A突然変異体およびknob変異体）。
SEQ ID NO：131 ヒト化抗MCSPモノクローナル重鎖抗体アミノ酸配列（IgG1 L234A、L235A突然変異体およびknob変異体）。
SEQ ID NO：132 マウス抗MCSPモノクローナル重鎖抗体アミノ酸配列（IgG1 L234A、L235A突然変異体およびhole変異体）。
SEQ ID NO：133 ヒト化抗MCSPモノクローナル重鎖抗体アミノ酸配列（IgG1 L234A、L235A突然変異体およびhole変異体）。
SEQ ID NO：134 マウス抗MCSPモノクローナル抗体のジスルフィドで安定化された単鎖Fv。
SEQ ID NO：135 ヒト化抗MCSPモノクローナル抗体のジスルフィドで安定化された単鎖Fv。
SEQ ID NO：136 リンカーペプチド13。
SEQ ID NO：137 ジスルフィドで安定化されたMHC-I-VH（MCSP）-IgG1 Fc領域L234A、L235A、P329G、T366S、L368A、Y407V突然変異型アミノ酸配列。
SEQ ID NO：138 ヒトMCSPのアミノ酸配列。
SEQ ID NO：139 ジスルフィド結合型多機能タンパク質用のリンカー。
SEQ ID NO：140 ジスルフィド結合型多機能タンパク質用の改変されたヒトHLA-A^*0201 α1〜α3鎖アミノ酸配列。
SEQ ID NO：141 VH（MCSP）-IgG1 Fc領域L234A、L235A、P329G、T366S、L368A、Y407V突然変異型アミノ酸配列。
SEQ ID NO：142 VH（MCSP）-IgG1 Fc領域L234A、L235A、P329G、T366W突然変異型アミノ酸配列。

I．定義
「親和性」とは、分子（例えば、抗体）の単一の結合部位とその結合パートナー（例えば、抗原）との間の非共有結合性相互作用の強さの総和のことを指す。別に指示する場合を除き、本明細書で用いる場合、「結合親和性」とは、結合ペアのメンバー（例えば、抗体および抗原）の間の1：1の相互作用を反映する固有の結合親和性のことを指す。分子XのそのパートナーYに対する親和性は、一般に、解離定数（Kd）によって表すことができる。親和性は、本明細書に記載されるものを含む、当技術分野において公知の一般的な方法によって測定することができる。結合親和性を測定するための具体的で説明的な態様および例示的な態様は、以下に記載される。

本出願において用いられる「アミノ酸」という用語は、直接的に、または前駆体の形態で、核酸によってコードされうるカルボキシα-アミノ酸の群を表す。個々のアミノ酸は3つのヌクレオチドからなる核酸、いわゆるコドンまたは塩基トリプレットによってコードされる。各アミノ酸は少なくとも1つのコドンによってコードされる。これは「遺伝暗号の縮重」として公知である。本出願の中で用いられる「アミノ酸」という用語は、アラニン（3文字コード：ala、1文字コード：A）、アルギニン（arg、R）、アスパラギン（asn、N）、アスパラギン酸（asp、D）、システイン（cys、C）、グルタミン（gln、Q）、グルタミン酸（glu、E）、グリシン（gly、G）、ヒスチジン（his、H）、イソロイシン（ile、I）、ロイシン（leu、L）、リジン（lys、K）、メチオニン（met、M）、フェニルアラニン（phe、F）、プロリン（pro、P）、セリン（ser、S）、トレオニン（thr、T）、トリプトファン（trp、W）、チロシン（tyr、Y）、およびバリン（val、V）を含む、天然のカルボキシα-アミノ酸のことを表す。

「抗標的抗体」および「標的と結合する抗体」という用語は、抗体が標的の標的化において診断薬および／または治療薬として有用であるように、標的と十分な親和性で結合しうる抗体のことを指す。ある態様において、標的と結合する抗体は、≦10nM、≦1nM、≦0.1nM、≦0.01nM、または≦0.001nMの解離定数（Kd）を有する（例えば、10^-8Mまたはそれ未満、例えば、10^-8M〜10^-13M、例えば、10^-9M〜10^-13Mなど）。

本明細書において「抗体」という用語は、最も広い意味で用いられ、所望の抗原結合活性を示す限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）および抗体断片を非限定的に含むさまざまな抗体構造を範囲に含む。

「抗体断片」とは、完全な抗体が結合する抗原と結合する完全な抗体の一部分を含む、完全な抗体以外の分子のことを指す。抗体断片の例には、Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')₂；ダイアボディ；線状抗体；単鎖抗体分子（例えば、scFv）；単一ドメイン抗体；および抗体断片から形成された多重特異性抗体が非限定的に含まれる。

「抗原結合部位」という用語は、標的と特異的に結合しうるタンパク質性モイエティーを表す。例示的な抗原結合部位には、ペプチド、抗体断片、ドメイン抗体、または単鎖抗体（例えば、ラクダ抗体もしくはサメ抗体）の可変ドメインがある。抗原結合部位は、天然の抗原結合部位であってもよく、または組換え（engineered）抗原結合部位であってもよい。例示的な組換え抗原結合部位には、DARPIN、ドメイン交換抗体またはドメイン交換抗体断片、および二重可変ドメイン抗体がある。

抗体の「クラス」とは、その重鎖が有する定常ドメインまたは定常領域の種類のことを指す。抗体には、IgA、IgD、IgE、IgGおよびIgMという5つの主要なクラスがあり、これらのうちいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えばIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1およびIgA2にさらに分けることができる。免疫グロブリンの種々のクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γおよびμと呼ばれる。

「相対頻度が〜であるクラスI MHC分子」という用語は、各々のクラスI MHC分子が、特定のヒト集団において、または所与の相対頻度を有するすべてのヒトにおいて、ある出現頻度を有することを表す。すなわち、相対頻度が10％であるかまたはそれを上回るクラスI MHC分子は、ある特定の集団のすべてのヒトのうち10％またはそれを上回って、例えば、欧州出身のすべてのヒトの27.2％に見いだすことができる。

多機能タンパク質のそのコンジュゲーションパートナーとの「コンジュゲーション」は、種々の方法によって、例えば、化学結合、または特異的な結合ペアを介した結合、もしくは遺伝子融合などによって行うことができる。「コンジュゲーションパートナー」という用語は、例えば、ポリペプチド、検出可能な標識、特異的結合ペアのメンバーのメンバーなどを表す。1つの態様において、ジスルフィド結合型多価多機能タンパク質のそのコンジュゲーションパートナーとのコンジュゲーションは、N末端基および／もしくはε-アミノ基（リジン）、異なるリジンのε-アミノ基、ジスルフィド結合型多価多機能タンパク質の一部のアミノ酸配列のカルボキシ-、スルフヒドリル-、ヒドロキシル-および／もしくはフェノール官能基、ならびに／またはジスルフィド結合型多価多機能タンパク質の糖鎖構造の糖アルコール基を介した化学的結合によって行われる。1つの態様において、ジスルフィド結合型多価多機能タンパク質は、特異的結合ペアを介して、そのコンジュゲーションパートナーとコンジュゲートされる。

「細胞傷害性薬物」という用語は、本明細書で用いる場合、細胞機能を阻害するかもしくは妨げる、および／または細胞死もしくは細胞破壊を引き起こす物質のことを指す。細胞傷害性物質には、放射性同位体（例えば、At²¹¹、I¹³¹、I¹²⁵、Y⁹⁰、Re¹⁸⁶、Re¹⁸⁸、Sm¹⁵³、Bi²¹²、P³²、Pb²¹²、およびLuの放射性同位体）；化学療法用の薬剤または薬物（例えば、メトトレキサート、アドリアマイシン、ビンカアルカロイド（ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド）、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンC、クロラムブシル、ダウノルビシンまたは他のインターカレート剤）；増殖阻害物質；酵素およびその断片、例えば核酸分解酵素など；抗生物質；毒素、例えば小分子毒素、または細菌、真菌、植物もしくは動物由来の酵素活性毒素に、その断片および／もしくは変異体を含めたものなど；ならびにさまざまな抗腫瘍薬または抗癌薬が非限定的に含まれる。

色原体（蛍光性または発光性の基および色素）、酵素、NMR活性基または金属粒子、ハプテン、例えばジゴキシゲニンなどは、「検出可能な標識」の例である。検出可能な標識はまた、光励起性架橋基、例えば、アジド基またはアジリン基であってもよい。電気化学発光によって検出可能な金属キレートが適したシグナル放出基であることもあり、ルテニウムキレート、例えばルテニウム(ビスピリジル)₃ ²⁺キレートには特に関心が寄せられている。適したルテニウム標識基は、例えば、EP 0 580 979号、WO 90／05301号、WO 90／11511号、およびWO 92／14138号に記載されている。直接検出のためには、標識基は、任意の公知の検出可能なマーカー基、例えば色素など、発光性標識基、例えば化学発光基、例えばアクリジニウムエステルまたはジオキセタンなど、または蛍光性色素、例えば、フルオロセイン、クマリン、ローダミン、オキサジン、レゾルフィン、シアニンおよびそれらの誘導体などから選択することができる。標識基の他の例には、発光性金属複合体、例えばルテニウム錯体またはユーロピウム錯体、酵素、例えば、ELISA用またはCEDIA用（Cloned Enzyme Donor Immunoassay、例えば、EP-A-0 061 888号）に用いられるもの、および放射性同位体がある。

「エフェクター機能」とは、抗体のFc領域に起因する生物活性のことを指し、これは抗体アイソタイプによってさまざまである。抗体エフェクター機能の例には、以下のものが含まれる：C1q結合および補体依存性細胞傷害性（CDC）；Fc受容体結合；抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性（ADCC）；食作用；細胞表面受容体（例えば、B細胞受容体）のダウンレギュレーション；およびB細胞活性化。

薬剤、例えば医薬製剤の「有効量」とは、必要な投与量および期間で、所望の治療的または予防処置的な結果を達成するために有効な量のことを指す。

「発現」という用語は、本明細書で用いる場合、細胞内で起こる、転写および／または翻訳および分泌のプロセスのことを指す。細胞内での関心対象の核酸配列の転写のレベルは、細胞内に存在する対応するmRNAの量に基づいて決定することができる。例えば、関心対象の配列から転写されるmRNAは、RT-PCRによって、またはノーザンハイブリダイゼーションによって定量することができる（Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)を参照）。核酸によってコードされるポリペプチドは、さまざまな方法によって、例えば、ELISAによって、ポリペプチドの生物活性をアッセイすることによって、またはそのような活性とは無関係なアッセイ、例えば、ポリペプチドを認識してそれと結合する免疫グロブリンを用いるウエスタンブロット法もしくはラジオイムノアッセイなどを使用することによって、定量することができる（Sambrook, et al., (1989)、前記）。

「発現カセット」とは、少なくとも細胞内に含有される核酸の発現のために必要な調節エレメント、例えばプロモーターおよびポリアデニル化部位などを含有する構築物のことを表す。

「発現機構」という用語は、核酸または遺伝子の転写段階（すなわち、「遺伝子発現機構」とも呼ばれる）に始まり、核酸によってコードされるポリペプチドの翻訳後修飾までに至る段階に関与する、細胞の酵素、補因子などの総体のことを表す。発現機構は、例えば、DNAのプレmRNAへの転写、プレmRNAの成熟mRNAへのスプライシング、mRNAのポリペプチドへの翻訳、およびポリペプチドの翻訳後修飾という段階を含む。

「発現プラスミド」とは、宿主細胞における、それに含まれる構造遺伝子の発現のために必要なすべてのエレメントを提供する核酸のことである。典型的には、発現プラスミドは、原核生物プラスミド増殖ユニット、例えば大腸菌用の、複製起点および選択用マーカーを含むもの、真核生物選択マーカー、ならびに、プロモーター、構造遺伝子、およびポリアデニル化シグナルを含む転写ターミネーターをそれぞれが含む関心対象の構造遺伝子の発現のための1つまたは複数の発現カセットを含む。遺伝子発現は通常、プロモーターの制御下に置かれ、そのような構造遺伝子は、プロモーターと「機能的に連結された」といわれる。同様に、調節エレメントとコアプロモーターも、調節エレメントがコアプロモーターの活性をモジュレートするのであれば、機能的に連結している。

「Fc領域」という用語は、免疫グロブリン重鎖のC末端領域を表す。Fc領域は、2つのジスルフィド結合型抗体重鎖ポリペプチドを含む二量体分子である。Fc領域は、完全な（完全長）抗体のパパイン消化、もしくはIdeS消化、もしくはトリプシン消化によって作製することもでき、または組換え法によって産生させることもできる。

完全長抗体または免疫グロブリンから入手可能なFc領域は、完全長重鎖の少なくとも残基226（Cys）からC末端までを含み、それ故に、ヒンジ領域の一部、および2つまたは3つの定常ドメイン、すなわち、CH2ドメイン、CH3ドメイン、そしてIgEおよびIgMクラス抗体の場合には、さらなる／追加のCH4ドメインを含む。しかし、Fc領域のC末端リジン（Lys447）は存在してもよく、または存在しなくてもよい。本明細書において別に指定する場合を除き、Fc領域または定常領域におけるアミノ酸残基の番号付けは、Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91-3242に記載されているような、EUインデックスとも呼ばれるEU付番方式による。

同一な、または同一でない2つの抗体重鎖Fc領域ポリペプチドを含む二量体性Fc領域の形成は、それに含まれるCH3ドメインの非共有結合性二量体化によって媒介される（かかわるアミノ酸残基については、例えば、Dall'Acqua, Biochem. 37 (1998) 9266-9273を参照）。Fc領域は、ヒンジ領域内でのジスルフィド結合の形成によって、共有結合性に安定化される（例えば、Huber, et al., Nature 264 (1976) 415-420；Thies, et al., J. Mol. Biol. 293 (1999) 67-79を参照）。

US 5,648,260号およびUS 5,624,821号により、Fc領域における所定のアミノ酸残基の改変は表現型効果をもたらすことが公知である。

本明細書において報告されるジスルフィド結合型多価多機能タンパク質は、1つの態様において、抗体重鎖ヒンジ領域ポリペプチドとして、ヒトFc領域またはヒト起源に由来するFc領域を含みうる。1つのさらなる態様において、Fc領域は、Fcγ受容体（例えば、FcγRIIIa）結合および／またはC1q結合が全く検出されないように改変されている、サブクラスIgG4のヒト抗体のFc領域、またはサブクラスIgG1、IgG2もしくはIgG3のヒト抗体のFc領域のいずれかである。1つの態様において、Fc領域はヒトFc領域であり、特にヒトIgG4サブクラス由来、またはヒトIgG1サブクラス由来の突然変異型Fc領域のいずれかである。1つの態様において、Fc領域は、突然変異L234AおよびL235AおよびP329Gを有するヒトIgG1サブクラス由来である。IgG4はFcγ受容体（FcγRIIIa）結合の低下を示すが、他のIgGサブクラスの抗体は強い結合を示す。しかし、Pro238、Asp265、Asp270、Asn297（Fc糖鎖の喪失）、Pro329、Leu234、Leu235、Gly236、Gly237、Ile253、Ser254、Lys288、Thr307、Gln311、Asn434、または／およびHis435は、変更された場合には、Fcγ受容体結合の低下をももたらす残基である（Shields, R.L., et al., J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604；Lund, J., et al., FASEB J. 9 (1995) 115-119；Morgan, A., et al., Immunology 86 (1995) 319-324；EP 0 307 434号）。1つの態様において、本明細書において報告されるジスルフィド結合型多価多機能タンパク質は、L234、L235、P329および／もしくはD265に突然変異を有するか、ならびに／またはPVA236突然変異を含む、IgG4サブクラスの、またはIgG1もしくはIgG2サブクラスのFcγ受容体結合にかかわる。1つの態様において、突然変異は、S228P、L234A、L235A、L235E、PVA236（PVA236は、IgG1のアミノ酸位置233から236までのアミノ酸配列ELLG（一文字アミノ酸コードで提示）またはIgG4のEFLGがPVAによって置き換えられることを表す）および／またはP329Gである。1つの態様において、突然変異はIgG4のS228PおよびP329G、ならびにIgG1のL234A、L235AおよびP329Gである。抗体のFc領域は、ADCC（抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性）およびCDC（補体依存性細胞傷害性）に直接的に関与する。Fcγ受容体および／または補体因子C1qと結合しないジスルフィド結合型多価多機能タンパク質は、抗体依存性細胞細胞傷害性（ADCC）および／または補体依存性細胞傷害性（CDC）を誘発しない。

IgG1アイソタイプの野生型ヒトFc領域のポリペプチド鎖は、以下のアミノ酸配列を有する：

突然変異L234A、L235Aを有するIgG1アイソタイプの変異型ヒトFc領域のポリペプチド鎖は、以下のアミノ酸配列を有する：

T366S、L368AおよびY407V突然変異を有するIgG1アイソタイプの変異型ヒトFc領域のポリペプチド鎖は、以下のアミノ酸配列を有する：

T366W突然変異を有するIgG1アイソタイプの変異型ヒトFc領域のポリペプチド鎖は、以下のアミノ酸配列を有する：

L234A、L235AおよびT366S、L368AおよびY407V突然変異を有するIgG1アイソタイプの変異型ヒトFc領域のポリペプチド鎖は、以下のアミノ酸配列を有する：

L234A、L235AおよびT366W突然変異を有するIgG1アイソタイプの変異型ヒトFc領域のポリペプチド鎖は、以下のアミノ酸配列を有する：

P329G突然変異を有するIgG1アイソタイプの変異型ヒトFc領域のポリペプチド鎖は、以下のアミノ酸配列を有する：

L234A、L235AおよびP329G突然変異を有するIgG1アイソタイプの変異型ヒトFc領域のポリペプチド鎖は、以下のアミノ酸配列を有する：

P239GおよびT366S、L368AおよびY407V突然変異を有するIgG1アイソタイプの変異型ヒトFc領域のポリペプチド鎖は、以下のアミノ酸配列を有する：

P329GおよびT366W突然変異を有するIgG1アイソタイプの変異型ヒトFc領域のポリペプチド鎖は、以下のアミノ酸配列を有する：

L234A、L235A、P329GおよびT366S、L368AおよびY407V突然変異を有するIgG1アイソタイプの変異型ヒトFc領域のポリペプチド鎖は、以下のアミノ酸配列を有する：

L234A、L235A、P329GおよびT366W突然変異を有するIgG1アイソタイプの変異型ヒトFc領域のポリペプチド鎖は、以下のアミノ酸配列を有する：

IgG4アイソタイプの野生型ヒトFc領域のポリペプチド鎖は、以下のアミノ酸配列を有する：

S228PおよびL235E突然変異を有するIgG4アイソタイプの変異型ヒトFc領域のポリペプチド鎖は、以下のアミノ酸配列を有する：

S228P、L235EおよびP329G突然変異を有するIgG4アイソタイプの変異型ヒトFc領域のポリペプチド鎖は、以下のアミノ酸配列を有する：

S228P、L235E、P329GおよびT366S、L368AおよびY407V突然変異を有するIgG4アイソタイプの変異型ヒトFc領域のポリペプチド鎖は、以下のアミノ酸配列を有する：

S228P、L235E、P329GおよびT366W突然変異を有するIgG4アイソタイプの変異型ヒトFc領域のポリペプチド鎖は、以下のアミノ酸配列を有する：

「宿主細胞」、「宿主細胞株」および「宿主細胞培養物」という用語は互換的に用いられ、外因性核酸が導入された細胞のことを、そのような細胞の子孫を含めて指す。宿主細胞には「形質転換体」および「形質転換細胞」が含まれ、これらには、初代形質転換細胞およびそれらに由来する子孫が、継代数とは関係なく含まれる。子孫は核酸の内容の点で親細胞と完全に同一でなくてもよく、突然変異を含んでもよい。最初に形質転換された細胞においてスクリーニングまたは選択されたものと同じ機能または生物活性を有する突然変異型子孫が、本明細書において含まれる。

「細胞」という用語は、プラスミドの増殖のために用いられる原核細胞、および核酸の発現のために用いられる真核細胞の両方を含む。1つの態様において、真核細胞は哺乳動物細胞である。1つの態様において、哺乳動物細胞は、CHO細胞（例えば、CHO K1、CHO DG44）、BHK細胞、NS0細胞、Sp2/0細胞、HEK 293細胞、HEK 293 EBNA細胞、PER.C6（登録商標）細胞、およびCOS細胞を含む哺乳動物細胞の群から選択される。

「ヒト抗体」は、ヒトもしくはヒト細胞によって産生されるか、またはヒト抗体レパートリーもしくはヒト抗体をコードする他の配列を利用する非ヒト供給源に由来する抗体のそれに対応するアミノ酸配列を有するもののことである。ヒト抗体のこの定義からは、非ヒト性抗原結合残基を含むヒト化抗体は明確に除外される。

「イムノコンジュゲート」とは、本明細書において報告されるジスルフィド結合型多価多機能タンパク質が、細胞傷害性薬物を非限定的に含む1つまたは複数の異種分子とコンジュゲートされたものを表す。

「個体」または「対象」とは、哺乳動物のことである。哺乳動物には、飼い慣らされた動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌおよびウマ）、霊長動物（例えば、ヒト、およびサルなどの非ヒト霊長動物）、ウサギおよび齧歯動物（例えば、マウスおよびラット）が非限定的に含まれる。ある態様において、個体または対象はヒトである。

「単離された」ジスルフィド結合型多価多機能タンパク質とは、その天然環境の構成要素から分離されたもののことである。いくつかの態様において、ジスルフィド結合型多価多機能タンパク質は、例えば、電気泳動（例えば、SDS-PAGE、等電点電気泳動（IEF）、キャピラリー電気泳動）またはクロマトグラフィー（例えば、イオン交換または逆相HPLC）による決定で、95％または99％を上回る純度になるように精製される。

「単離された」核酸とは、その天然環境の構成要素から分離された核酸分子のことを指す。単離された核酸には、その核酸分子を通常含有する細胞内に含有される核酸分子が含まれるが、その核酸分子は染色体外に、またはその天然の染色***置とは異なる染色***置に存在する。

「MCSP」という用語は、本明細書で用いる場合、別に指示する場合を除き、霊長動物（例えば、ヒト）および齧歯動物（例えば、マウスおよびラット）などの哺乳動物を含む、あらゆる脊椎動物供給源に由来する、あらゆるネイティブ性MCSP（黒色腫コンドロイチン硫酸プロテオグリカン）のことを指す。この用語は、「完全長」のプロセシングされていないMCSPのほかに、細胞内でのプロセシングの結果として生じるあらゆる形態のMCSPも範囲に含む。この用語はまた、MCSPの天然の変異体、例えば、スプライス変異体またはアレル変異体も範囲に含む。MCSPはまた、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン4（CSPG4）、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンNG2、高分子量-黒色腫関連抗原（HMW-MAA）、および黒色腫コンドロイチン硫酸プロテオグリカンとしても公知である。例示的なヒトMCSPのアミノ酸配列はSEQ ID NO：1に示されている。また、Pluschke, G., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 (1996) 9710-9715、Staub, E., et al., FEBS Lett. 527 (2002) 114-118、およびGenBankアクセッション番号：NP_001888も参照されたい。

「1つの抗原提示ドメイン」という用語は、厳密に1つの、すなわち単一の、定義された通りの抗原提示ドメインを表し、さらなる、すなわち第2の、定義された抗原提示ドメインの存在は否定される。「1つの」という用語は、「厳密に1つの」または「単一の」を表す。

「2つの抗原提示ドメイン」という用語は、ちょうど2つの、定義された通りの抗原提示ドメインの存在を表し、単一の、すなわち1つのみの抗原提示ドメインの存在は否定される。

「機能的に連結された」とは、そのように説明される構成要素がそれらの意図された様式で機能することを可能にする関係にある、2つまたはそれを上回る構成要素の並置のことを指す。例えば、プロモーターおよび／またはエンハンサーは、それがシス性に作用して、連結された配列の転写を制御またはモジュレートするならば、コード配列と機能的に連結されている。一般に、しかし必然的にそうではないが、「機能的に連結している」DNA配列は連続しており、分泌性リーダーおよびポリペプチドなどの2つのタンパク質をつなぐために必要である場合には、連続しており、かつ（リーディング）フレーム内にある。しかし、機能的に連結されたプロモーターは一般にコード配列の上流に位置するものの、必ずしもそれと連続していない。エンハンサーは連続している必要はない。エンハンサーがコード配列の転写を増加させるならば、エンハンサーはコード配列と機能的に連結されている。機能的に連結されたエンハンサーは、コード配列の上流、内部または下流に、プロモーターとかなりの距離を隔てて位置することができる。ポリアデニル化部位は、それがコード配列の下流端に位置する場合、転写がコード配列を経由してポリアデニル化配列へと進行するように、コード配列と機能的に連結されている。翻訳終止コドンは、翻訳がコード配列を経由して終止コドンまで進行し、そこで終了するように、それがコード配列の下流端（3'末端）に位置する場合、エクソン核酸配列と機能的に連結されている。連結は、当技術分野において公知の組換え方法によって、例えば、PCR法を用いて、および／または好都合な制限部位でのライゲーションによって実現される。好都合な制限部位が存在しない場合には、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーを従来の慣行に従って用いる。

「添付文書」という用語は、治療用製品の市販品パッケージの中に慣例的に含められる、そのような治療用製品の使用にかかわる適応症、用法、投与量、投与、併用療法、禁忌、および／または警告に関する情報を含む説明書のことを指す。

「ペプチドリンカー」という用語は、天然および／または合成起源のアミノ酸配列を表す。それらは、20種の天然アミノ酸が単量体構成単位である線状アミノ酸鎖からなる。ペプチドリンカーは1〜50アミノ酸の長さを有し、1つの態様においては1〜28アミノ酸、1つのさらなる態様においては2〜25アミノ酸である。ペプチドリンカーは、反復アミノ酸配列または天然のポリペプチドの配列を含んでもよい。リンカーは、互いにコンジュゲートしたポリペプチドが、ポリペプチドが正しくフォールディングして適正に提示されるようにすることによって、それらの生物活性を確実に遂行させる機能を有する。1つの態様において、ペプチドリンカーは、グリシン、グルタミンおよび／またはセリン残基に富む。これらの残基は、例えば、最大5アミノ酸の小さな反復単位、例えばGS（SEQ ID NO：73）、GGS（SEQ ID NO：74）、GGGS（SEQ ID NO：75）およびGGGGS（SEQ ID NO：80）などとして並んでいる。この小さな反復単位は1〜5回反復されうる。多量体単位のアミノ末端および／またはカルボキシ末端に、最大6つのさらなる任意の天然アミノ酸を付加することができる。他の合成ペプチドリンカーは、10〜20回反復される単一のアミノ酸で構成され、アミノ末端および／またはカルボキシ末端に、最大6つのさらなる任意の天然アミノ酸を含みうる。ペプチドリンカーはすべて、核酸分子によってコードされることができ、それ故、組換え法によって発現させることができる。リンカーはそれ自体がペプチドであるので、リンカーによって接続されたポリペプチドは、2つのアミノ酸の間に形成されるペプチド結合を介してリンカーと接続されている。

「医薬製剤」という用語は、その中に含有される有効成分の生物活性が有効であるような形態にあり、かつ、製剤が投与される対象にとって容認できない毒性を持つさらなる構成要素を全く含有しない調製物のことを指す。

「薬学的に許容される担体」とは、対象にとって毒性でない、医薬製剤中の有効成分以外の成分のことを指す。薬学的に許容される担体には、緩衝剤、添加剤、安定化剤、または保存料が非限定的に含まれる。

「ポリペプチド」とは、天然または合成のいずれによって生成されるかによらず、ペプチド結合によってつながれたアミノ酸からなる重合体のことである。約25アミノ酸残基未満のポリペプチドは「ペプチド」と称してもよく、一方、2つもしくはそれを上回るポリペプチドからなるか、または100アミノ酸残基を上回る1つのポリペプチドを含む分子は「タンパク質」と称してもよい。ポリペプチドはまた、糖鎖基、金属イオンまたはカルボン酸エステルなどの非アミノ酸構成要素を含んでもよい。非アミノ酸構成要素はポリペプチドが発現される細胞によって付加されてもよく、それは細胞の種類によって異なりうる。ポリペプチドは、本明細書において、それらのアミノ酸骨格構造またはそれをコードする核酸の点から定義される。糖鎖基などの付加は一般に指定されないが、それにもかかわらず存在しうる。

「構造遺伝子」は、シグナル配列を伴わない遺伝子の領域、すなわちコード領域のことを表す。

「T細胞応答誘発ペプチド」という用語は、クラスI MHC多機能タンパク質のペプチド結合溝に提示されて、流血中のメモリーT細胞またはエフェクターT細胞によって認識されるペプチドを表す。このペプチドの認識により、そのようなペプチド-クラスI MHC多機能タンパク質を提示する細胞の除去を生じさせる免疫応答がもたらされる。

本明細書で用いる場合、「治療」（および「治療する（treat）」または「治療すること（treating）」などの、その文法上の変形物）とは、治療される個体の自然経過を変えようと試みる臨床的介入のことを指し、予防処置のために、または臨床病理の過程の中のいずれかで行うことができる。治療の望ましい効果には、疾患の発生または再発を予防すること、症状の軽減、疾患の任意の直接的または間接的な病理学的帰結の縮小、転移を予防すること、疾患進行の速度を遅らせること、疾患状態の改善または緩和、および寛解または予後改善が非限定的に含まれる。いくつかの態様において、本発明の抗体は、疾患の発症を遅らせるか、または疾患の進行を緩徐にするために用いられる。

「可変領域」または「可変ドメイン」という用語は、結合抗体の抗原との結合に関与する、抗体の重鎖または軽鎖のドメインのことを指す。ネイティブ性抗体の重鎖および軽鎖の可変ドメイン（それぞれVHおよびVL）は一般に類似の構造を有し、各ドメインは4つの保存的フレームワーク領域（FR）および3つの超可変領域（HVR）を含む（例えば、Kindt, T.J., et al., Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., N.Y. (2007), page 91を参照）。単一のVHまたはVLドメインで、抗原結合特異性を付与するのに十分なことがある。その上、特定の抗原と結合する抗体は、相補的なVLまたはVHドメインのそれぞれをスクリーニングするために、抗原と結合する抗体由来のVHまたはVLドメインを用いて単離することもできる。例えば、Portolano, S., et al., J. Immunol. 150 (1993) 880-887；Clackson, T., et al., Nature 352 (1991) 624-628を参照）。

「ベクター」という用語は、本明細書で用いる場合、それと連結している別の核酸を増やすことのできる核酸分子のことを指す。この用語は、自己複製性核酸構造としてのベクターのほか、それが導入された宿主細胞のゲノム中に組み込まれたベクターも含む。ある種のベクターは、それらが機能的に連結された核酸の発現を導くことができる。そのようなベクターは、本明細書において「発現ベクター」と称される。

II．組成物および方法
A．例示的なジスルフィド結合型多価多機能タンパク質
本明細書では、標的抗原と特異的に結合する抗体由来部分を第1の部分として含み、かつ、ウイルス由来ペプチドがMHCクラスIタンパク質複合体と連結したものを第2の部分として含む、抗原結合ジスルフィド結合型多価多機能タンパク質について報告する。

本明細書において報告されるジスルフィド結合型多価多機能タンパク質を用いると、個体の既存のウイルス特異的な流血中細胞傷害性T細胞（T-メモリー細胞および／またはT-エフェクター細胞）を、ジスルフィド結合型多価多機能タンパク質の抗体由来部分が特異的に結合する標的抗原を発現する細胞に対して、これらの細胞をMHCクラスI多機能複合体で飾り付けることによって急性ウイルス感染を模倣して、向かわせることができる。

1つの局面において、本発明は、一部には、ウイルス由来ペプチドがMHCクラスIタンパク質と連結されたものを第1の部分として含み、かつ抗体由来のジスルフィド結合型分子を第2の部分として含む、本明細書において報告されるジスルフィド結合型多価多機能タンパク質を用いることにより、個体の既存のウイルス特異的細胞傷害性T細胞を抗原を発現する細胞に向かわせて、急性ウイルス感染を模倣させて、それにより、標的抗原を発現する細胞の排除（除去）を開始させることができるという知見に基づく。

組換え生産を可能にするために、せいぜい単一のMHCクラスIユニットを抗体ヒンジ領域と組み合わせて提示することしかできない、ジスルフィド結合していないMHCクラスIを含む多機能タンパク質とは対照的に、ジスルフィド結合したMHCクラスIを含む多機能タンパク質では、1つ、2つまたはそれを上回るジスルフィド結合したMHCクラスIユニットを、組換え生産を妨げることなく、多価多機能タンパク質における抗体ヒンジ領域と組み合わせて提示しうることが見いだされている。

1つの、すなわち単一の抗原提示ドメインを含む、本明細書において報告されるジスルフィド結合型多価多機能タンパク質を用いることにより、2つまたはそれを上回る抗原提示ドメインを含む本明細書において報告されるジスルフィド結合型多価多機能タンパク質の作用機序のいくつか、例えばT細胞受容体の架橋などはもはや不可能となる。さらに、1つの抗原提示ドメインを含む、本明細書において報告されるジスルフィド結合型多価多機能タンパク質は、改良された収量で生産することができ、かつ改良された熱安定性を有する。さらに、この理論に拘束されるわけではないが、1つの抗原提示ドメインを含む、本明細書において報告されるジスルフィド結合型多価多機能タンパク質は、T細胞活性化の点でより特異的である（実施例15参照）。

ある態様においては、それぞれが（i）ウイルス由来ペプチド、（ii）可溶性HLA-AアレルA^*0201、および（iii）β2-ミクログロブリンを含む1つ、2つまたはそれを上回る抗原提示ドメインを含む、ジスルフィド結合型多価多機能タンパク質であって、抗原提示ドメインが少なくとも位置11および位置227にシステイン残基を有し、位置11および位置227にあるシステイン残基がジスルフィド結合を形成する、ジスルフィド結合型多価多機能タンパク質が提供される。

ある態様においては、それぞれが（i）ウイルス由来ペプチド、（ii）可溶性HLA-AアレルA^*0201、および（iii）β2-ミクログロブリンを含む1つ、2つまたはそれを上回る抗原提示ドメインを含む、ジスルフィド結合型多価多機能タンパク質であって、抗原提示ドメインが少なくとも位置11および位置108にシステイン残基を有し、位置11および位置108にあるシステイン残基がジスルフィド結合を形成する、ジスルフィド結合型多価多機能タンパク質が提供される。

本明細書において報告されるジスルフィド結合型多価多機能タンパク質は、例えば、癌またはウイルス感染症のようなさまざまな疾患の診断または治療のために有用である。

1つの局面において、本発明は、（i）細胞表面抗原および（ii）細胞傷害性T細胞と結合する、多機能タンパク質を提供する。

本明細書において報告されるジスルフィド結合型多価多機能タンパク質は、標的細胞、例えば腫瘍細胞またはウイルス感染細胞を排除／除去／解体する、天然に存在する非常に有効な抗ウイルス免疫応答を利用する。細胞排除は、活性化のためにいかなる共刺激も必要としない、個体自身の極めて強力な流血中T細胞を用いることによって達成される。さらに、この作用機序のためには、少数の治療用分子が細胞表面に必要である（例えば、Mottez et al., J. Exp. Med. 181 (1995) 493-502を参照）。

治療の間に、ジスルフィド結合型多価多機能タンパク質は、免疫処置と同様に、個体の抗ウイルス免疫応答を誘発することができる。その結果、複数回の治療／適用により、治療の有効性を強化することができる。したがって、前処置としての免疫処置を、有効性を強化する目的で用いることができる。

また、集団内での頻度が極めて低く、1つの態様においては1％未満であるアロタイプを用いることもできる。そのようなアロタイプを用いると、アロタイプが個体の免疫系によって外来性と認識されて免疫応答が惹起されるため、免疫処置段階を不要にすることができる。

標的指向性の抗原結合部位は、毒性および副作用を抑えるためには、細胞または抗原に対して高度に特異的である必要がある。

このように、本明細書において報告されるジスルフィド結合型多価多機能タンパク質を用いることにより、
（i）高度に特異的なT細胞集団のみが活性化され（ジスルフィド結合型多価多機能タンパク質のMHC-Iタンパク質複合体内に提示された単一のウイルス由来ペプチドに対して特異的なCD8陽性エフェクター／メモリー細胞）、他のすべてのCD3⁺細胞は影響を受けない（CD4⁺ T細胞：TH1、TH2、TH17、調節性T細胞）；
（ii）個体の免疫系の自然な応答が模倣される（ウイルス感染細胞の正常な除去）；かつ
（iii）ジスルフィド結合型多価多機能タンパク質の／による適用／治療に対する応答は最初は低いと考えられるが、治療の間に強化され（特異的T細胞が活性化されて、数が増えると考えられる）、それにより、初期注入反応および初期サイトカイン放出を軽減することができる。

1つの態様において、本方法は、選択されたウイルス由来ペプチド、例えばヒトサイトメガロウイルス（huCMV）由来ペプチドの適用によって、CD8陽性細胞傷害性T細胞を刺激する段階を含む。1つの好ましい態様において、ペプチドは、SEQ ID NO：01のアミノ酸配列を有する。

活性化されたCMV-ペプチド特異的T細胞は、インビトロで腫瘍細胞（インビトロでCMV由来ペプチドをロードされた腫瘍細胞）の効果的な除去を媒介することが示されている。

ウイルス感染細胞は、その細胞表面上に、ウイルス由来ペプチドとMHCクラスIタンパク質との複合体を提示する。これらは、ウイルス由来ペプチド提示細胞を除去する／激減させる特異的CD8⁺ T細胞によって認識される。細胞溶解性（細胞傷害性）CD8⁺ T細胞（CTL）は、その特異的T細胞受容体により、MHCクラスIタンパク質の中のペプチドを認識する。CTLは、補助刺激シグナルを必要とせずにウイルス感染細胞の除去を誘発する。

本明細書において報告される融合ポリペプチド中に含まれるようなCMV由来ペプチドによって予備刺激しうるエフェクター細胞、例えば、末梢血単核細胞（PBMC）またはFACSで選別されたCD8⁺ T細胞を用いることができる。

治療しようとする個体のHLA-アロタイプは識別されなければならない。

NCBIによれば、頻度が10％であるかまたはそれを上回るHLA-アロタイプは、以下の表に示されているように分布している。

表

したがって、本明細書において報告される1つの局面は、
‐1つ、2つまたはそれを上回る抗原提示ドメイン、
‐1つの抗体Fc領域、ならびに
‐1つまたは複数の抗原結合部位
を含み、
抗原提示ドメインが、互いに独立に、N末端からC末端への方向に、
（i）β2-ミクログロブリン、ならびに
（ii）相対頻度が1％未満であるクラスI MHC分子の細胞外ドメインα1、α2およびα3、
または
（i）相対頻度が1％未満であるクラスI MHC分子の細胞外ドメインα1、α2およびα3、ならびに
（ii）β2-ミクログロブリン、
または
（i）T細胞応答誘発ペプチド、
（ii）β2-ミクログロブリン、ならびに
（iii）相対頻度が1％であるかもしくはそれを上回るクラスI MHC分子の細胞外ドメインα1、α2およびα3、
または
（i）T細胞応答誘発ペプチド、
（ii）相対頻度が1％であるかもしくはそれを上回るクラスI MHC分子の細胞外ドメインα1、α2およびα3、ならびに
（iii）β2-ミクログロブリン、
のいずれかを含み、
抗原結合部位が癌細胞表面抗原と結合し、
抗原提示ドメインが少なくとも位置11および位置227にシステイン残基を有し、位置11および位置227にあるシステイン残基がジスルフィド結合を形成する
ことを特徴とする、抗原結合性のジスルフィド結合型多価多機能タンパク質である。

1つの態様において、N末端からC末端への方向に、β2-ミクログロブリンならびに相対頻度が1％未満であるクラスI MHC分子の細胞外ドメインα1、α2およびα3を含む抗原提示ドメインは、そのN末端に、MHC-ペプチドの結合溝と結合するペプチドをさらに含み、ここで抗原提示ドメインは少なくとも位置11および位置227にシステイン残基を有し、位置11および位置227にあるシステイン残基はジスルフィド結合を形成する。1つの態様において、ペプチドはT細胞応答誘発ペプチドである。

1つの態様において、T細胞応答誘発ペプチドはウイルス由来ペプチドである。1つの態様において、ウイルスは、アデノウイルス、ヒトヘルペスウイルス1、ヒトヘルペスウイルス2、ヒトヘルペスウイルス4（エプスタイン・バーウイルス）、B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス、ヒトサイトメガロウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、ヒトパピローマウイルス16型、ヒトパピローマウイルス18型、ヒトパピローマウイルス31型、ヒトパピローマウイルス33型、ヒトパピローマウイルス35型、ヒトパピローマウイルス39型、ヒトパピローマウイルス45型、ヒトパピローマウイルス51型、ヒトパピローマウイルス52型、ヒトパピローマウイルス56型、ヒトパピローマウイルス58型、ヒトパピローマウイルス59型、ヒトパピローマウイルス68型、ヒトパピローマウイルス73型、ヒトパピローマウイルス82型、ヒトT細胞リンパ親和性ウイルスI型、ヒトインフルエンザAウイルス、ヒトインフルエンザBウイルス、またはワクシニアウイルスから選択される。

1つの態様において、ウイルス由来ペプチドは、

から選択される。

1つの態様において、β2-ミクログロブリンはヒトβ2-ミクログロブリンである。1つの態様において、β2-ミクログロブリンは、SEQ ID NO：71のアミノ酸配列からなる。

1つの態様において、相対頻度が1％であるかもしくはそれを上回るクラスI MHC分子は、ヒトHLA-A^*0201である。1つの態様において、クラスI MHC分子の細胞外ドメインα1、α2およびα3は、SEQ ID NO：140のアミノ酸配列からなる。

1つの態様において、クラスI MHC分子の細胞外ドメインα3は、第3のリンカーペプチドを介して（ジスルフィド結合またはジスルフィド結合以外のいずれかで）ポリペプチドと融合している。

から互いに独立に選択される。

1つの態様において、第1のリンカーペプチドはSEQ ID NO：82のアミノ酸配列を含む。

1つの態様において、第2のリンカーペプチドはSEQ ID NO：83のアミノ酸配列を含む。

1つの態様において、第3のリンカーペプチドはSEQ ID NO：73のアミノ酸配列を含む。

1つの態様において、第1のジスルフィド結合型ポリペプチドおよび第2のジスルフィド結合型ポリペプチドは、ヒト起源のCH2ドメインおよびCH3ドメインを含む。1つの態様において、ヒト起源のCH2ドメインおよびCH3は、クラスIgGまたはIgEのヒト抗体のものである。1つの態様において、CH2ドメインおよびCH3ドメインは、サブクラスIgG1またはIgG2またはIgG3またはIgG4のヒト抗体のものである。1つの態様において、CH2ドメインはSEQ ID NO：85のアミノ酸配列を含む。1つの態様において、CH2ドメインはサブクラスIgG1またはIgG2のヒト抗体のものであり、E233、L234、L235、G236、D265、D270、N297、E318、K320、K322、A327、P329、A330および／またはP331（KabatのEUインデックスによる番号付け）の少なくとも1つの突然変異を含む。1つの態様において、CH2ドメインは、突然変異L234AおよびL235A、ならびに／または突然変異D265AおよびN297A、ならびに／またはPVA236突然変異を含む、かつ／または突然変異P329Gを含む、サブクラスIgG1またはヒトサブクラスIgG2のヒト抗体のものである。1つの態様において、CH2ドメインは、突然変異L234AおよびL235A、ならびに／またはP329Gを有するサブクラスIgG1のヒト抗体のものである。1つの態様において、CH2ドメインは、突然変異S228Pおよび／またはL235Eを有するサブクラスIgG4のヒト抗体のものである。

1つの態様において、第1のジスルフィド結合型ポリペプチドはSEQ ID NO：89のアミノ酸配列を含み、第2のジスルフィド結合型ポリペプチドはSEQ ID NO：90のアミノ酸配列を含む。

1つの態様において、第1および第2のジスルフィド結合型ポリペプチドは、SEQ ID NO：94またはSEQ ID NO：101のアミノ酸配列を含む。

1つの態様において、第1のジスルフィド結合型ポリペプチドまたは第2のジスルフィド結合型ポリペプチドは、SEQ ID NO：97またはSEQ ID NO：98のアミノ酸配列からなる。

1つの態様において、第1のジスルフィド結合型ポリペプチドはSEQ ID NO：102のアミノ酸配列を含み、第2のジスルフィド結合型ポリペプチドはSEQ ID NO：103のアミノ酸配列を含む。

1つの態様において、ジスルフィド結合型ポリペプチドは、2つまたは3つまたは4つのジスルフィド結合によって連結されている。

1つの態様において、抗原提示ドメインは、N末端からC末端への方向に、
（i）SEQ ID NO：01のアミノ酸配列を有するウイルス由来ペプチド、
（ii）SEQ ID NO：139のアミノ酸配列を有する第1のリンカーペプチド、
（iii）SEQ ID NO：71のアミノ酸配列を有するβ2-ミクログロブリン、
（iv）SEQ ID NO：83のアミノ酸配列を有する第2のリンカーペプチド、
（v）SEQ ID NO：140のアミノ酸配列を有するクラスI MHC分子の細胞外ドメインα1、α2およびα3、
（vi）SEQ ID NO：136のアミノ酸配列を有する第3のリンカーペプチド、ならびに
（vii）少なくとも位置11および位置227にあるシステイン残基であって、位置11および位置227にあるものがジスルフィド結合を形成するシステイン残基
を含むことを特徴とする。

1つの態様において、抗原提示ドメインは、N末端からC末端への方向に、
（i）SEQ ID NO：01のアミノ酸配列を有するウイルス由来ペプチド、
（ii）SEQ ID NO：139のアミノ酸配列を有する第1のリンカーペプチド、
（iii）SEQ ID NO：71のアミノ酸配列を有するβ2-ミクログロブリン、
（iv）SEQ ID NO：83のアミノ酸配列を有する第2のリンカーペプチド、
（v）SEQ ID NO：140のアミノ酸配列を有するクラスI MHC分子の細胞外ドメインα1、α2およびα3、
（vi）SEQ ID NO：136のアミノ酸配列を有する第3のリンカーペプチド、ならびに
（vii）少なくとも位置11および位置108にあるシステイン残基であって、位置11および位置108にあるものがジスルフィド結合を形成するシステイン残基
を含むことを特徴とする。

図10からは、多機能タンパク質が、それと組み合わされる抗原結合部位の結合特性を維持することが見てとれる（図10b）およびc））。

図11および13には、多機能タンパク質のインビトロでの有効性および特異性が示されている。

細胞傷害性アッセイをCMV特異的CD8⁺ T細胞の存在下で行った。CMV由来ウイルスペプチドを含む多機能タンパク質は、標的細胞の溶解／除去／解体／排除を誘導することが見てとれる一価抗体については図11a、二価抗体については図11b参照）。EBV由来ウイルスペプチド（図11b）および対照抗体（図11dおよびe）を含む多機能タンパク質とのインキュベーションでは広範な細胞溶解が生じないため（自然溶解は約3.5％である）、標的細胞の溶解が高度に特異的であることもさらに見てとれる。

図13には、IGF-1R陽性肺腺癌細胞株H460M2の溶解が示されている。

CMV由来ペプチドおよび二価抗体を含む多機能タンパク質のEC₅₀値は約10ng／mlであり、これは約50pMに対応する。決定されたEC₅₀値は、標的細胞対エフェクター細胞比とは無関係である（図12参照；1：3〜1：1の標的細胞対エフェクター細胞比は1：0.44〜1：0.14の実効比に対応する（エフェクター細胞の76％はCD8陽性であり、19％はCMV特異的である））。

1．親和性
ある態様において、本明細書において提供されるジスルフィド結合型多価多機能タンパク質は、抗体に由来する抗原結合部位、例えば、抗体可変ドメインのペアまたは単一ドメイン抗体を含む。ある態様において、抗原結合部位は、その抗原に対して、≦10nM、≦1nM、≦0.1nM、≦0.01nM、または≦0.001nMの解離定数（Kd）を有する（例えば、10^-8Mまたはそれ未満、例えば、10^-8M〜10^-13M、例えば、10^-9M〜10^-13Mなど）。

1つの態様において、Kdは表面プラズモン共鳴アッセイを用いて測定される。

例えば、これはBIACORE（登録商標）-2000またはBIACORE（登録商標）-3000機器（BIAcore, Inc., Piscataway, NJ）を、ほぼ10反応単位（RU）の固定化抗原CM5チップとともに25℃で用いることによって行うことができる。手短に述べると、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ（CM5, BIAcore, Inc.）を、供給元の説明書に従って、N-エチル-N'-(3-ジメチルアミノプロピル)-カルボジイミド塩酸塩（EDC）およびN-ヒドロキシスクシンイミド（NHS）で活性化する。抗原を10mM酢酸ナトリウム、pH 4.8によって5μg／ml（ほぼ0.2μM）に希釈した後に、5μl／分の流速で注入して、およそ10反応単位（RU）のカップリングしたタンパク質を得る。抗原の注入後に、1Mエタノールアミンを注入して未反応基をブロックする。反応速度測定のためには、Fabの二倍系列希釈物（0.78nM〜500nM）を、0.05％ポリソルベート20（TWEEN-20（商標））界面活性剤（PBST）を有するPBSに、25℃にて、およそ25μl／分の流速で注入する。会合速度（kon）および解離速度（koff）は、単純な1対1ラングミュア結合モデル（BIACORE（商標登録）評価ソフトウェア、バージョン3.2）を用いて、会合および解離のセンサーグラムを同時に適合させることによって計算する。平衡解離定数（Kd）は、koff／kon比として計算される。例えば、Chen, Y., et al., J. Mol. Biol. 293 (1999) 865-881を参照のこと。

2．発現
HEK 293細胞およびCHO細胞における種々の非ジスルフィド結合型二価多機能タンパク質（異なるリンカー、HLAとβ2-ミクログロブリンの異なる組み合わせ）の発現は、検出可能であった場合でも、小胞体における非ジスルフィド結合型二価多機能タンパク質の蓄積をもたらし、すなわち、非ジスルフィド結合型二価多機能タンパク質の単離および分泌は、検出可能であった場合でも、著しく損なわれていた。

非ジスルフィド結合型多機能タンパク質の培養培地への分泌は、多機能タンパク質が以下の表に概説したようなポリペプチドのうち1つを含むように意図した場合、検出することができなかった。

表

表

ウイルス由来ペプチドがMHCクラスIタンパク質複合体と連結したもの、および少なくとも1つの可変ドメイン、および抗体の1つの定常ドメインで形成される2つの非ジスルフィド結合型抗原提示ドメインを含む多機能タンパク質の発現、および特に分泌は、真核細胞では不可能であることが見いだされている。

さらに、ウイルス由来ペプチドがMHCクラスIタンパク質多機能タンパク質と連結されたもの、少なくとも1つの可変ドメイン、および抗体ヒンジ領域で形成される2つの非ジスルフィド結合型抗原提示ドメインを含む多機能タンパク質の発現、および特に分泌も、真核細胞では不可能であることが見いだされている。

しかし、ウイルス由来ペプチドがMHCクラスIタンパク質複合体と連結したもの、および少なくとも1つの可変ドメイン、および抗体の1つの定常ドメインで形成される1つまたは2つのジスルフィド結合型抗原提示ドメインを含む多機能タンパク質の発現、および特に分泌は、真核細胞において可能であることが見いだされた。さらに、発現収量は非ジスルフィド結合型複合体と比較して増加している。

したがって、本明細書において報告される多機能タンパク質において、ウイルス由来ペプチドがMHCクラスIタンパク質と連結されたもの、および1つまたは複数の抗体可変ドメイン、および1つの抗体定常ドメインを含む1つ、2つまたはそれを上回るジスルフィド結合型抗原提示ドメインは、真核細胞を用いるジスルフィド結合型多価多機能タンパク質の組換え生産および分泌を可能にしながら、それでもなお存在可能である。

したがって、ウイルス由来ペプチドがMHCクラスIタンパク質と連結されたもの、抗体重鎖ヒンジ領域、および1つまたは複数の抗体可変ドメイン、および1つの抗体定常ドメインを有する1つ、2つまたはそれを上回るジスルフィド結合型抗原提示ドメインを含む多機能タンパク質を、真核細胞において組換え法によって産生させて分泌させることができる。

したがって、抗体重鎖ヒンジ領域、少なくとも1つの抗体可変ドメインのペア、任意で抗体定常ドメイン、および、ウイルス由来ペプチドがMHCクラスIタンパク質と連結されたものを有する1つ、2つまたはそれを上回るジスルフィド結合型抗原提示ドメインを含む多機能タンパク質を、真核細胞において組換え法によって産生させて分泌させることができる。

さまざまな組み合わせを試験した。多機能タンパク質の分泌性発現は、例えば、ウイルス由来ペプチドがクラスI MHC分子とN末端で融合している免疫グロブリン由来シグナルペプチドのN末端融合物によって実現させることができる。クラスI MHC分子の重鎖（膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを欠くα1-α2-α3）および軽鎖（β2-ミクログロブリン）を順番に変えることができる。種々の抗原提示ドメインを、抗体軽鎖または抗体重鎖ヒンジ領域のいずれかを含むポリペプチドとN末端で融合させた。例示的な組み合わせを図2に示す。

以下の表から見てとれるように、MHC-Iタンパク質複合体を含有する1つ、2つまたはそれを上回る抗原提示ドメインを含む多機能タンパク質は、抗原提示ドメインをジスルフィド結合させた場合、可変抗体ドメインおよび抗体ヒンジ領域由来のポリペプチドの存在下で発現させることができた。さらに、得ることのできる収量も増加している。

表

いくつかの態様において、本明細書において報告されるジスルフィド結合型多価多機能タンパク質は、ポリペプチドの異なるペアを含む。ポリペプチドの適切なペアリングを可能にする目的で、knobs-into-holes技術またはクロスmAb技術を、正しく会合していない多機能タンパク質の量を減少させるために用いることができる。

knob修飾は抗体のCH3ドメインにおける突然変異T366Wを表す（KabatのEUインデックスによる番号付け）。

hole修飾は抗体のCH3ドメインにおける突然変異T366S、L368AおよびY407Vを表す（KabatのEUインデックスによる番号付け）。

knobおよびhole修飾に加えて、一方のCH3ドメインにおける突然変異S354Cおよび他方のCH3ドメインにおける突然変異Y349Cも存在しうる。

クロスmAb技術は、例えば、WO 2009／080251号、WO 2009／080252号、WO 2009／080254号、WO 2009／080253号、WO 2010／112193号、WO 2010／115589号、WO 2010／136172号、WO 2010／145792号、およびWO 2010／145793号に報告されている。

3．変異体
ある態様においては、本明細書において提供されるジスルフィド結合型多価多機能タンパク質のアミノ酸配列変異体を想定している。例えば、ジスルフィド結合型多価多機能タンパク質の結合親和性および／または他の生物学的特性を改善することが望ましい場合がある。ジスルフィド結合型多価多機能タンパク質のアミノ酸配列変異体は、ジスルフィド結合型多価多機能タンパク質のポリペプチド鎖をコードするヌクレオチド配列に適切な改変を導入することによって、またはペプチド合成によって調製することができる。そのような改変には、例えば、ジスルフィド結合型多価多機能タンパク質のポリペプチドのアミノ酸配列における残基の欠失、および／または挿入、および／または置換が含まれる。最終的な構築物が所望の特徴、例えば抗原結合性を有していることを条件として、最終的な構築物に到達するために欠失、挿入および置換の任意の組み合わせを加えることができる。

a）置換、挿入、および欠失変異体
ある態様においては、ポリペプチド鎖の1つまたは複数に1つまたは複数のアミノ酸置換を有するジスルフィド結合型多価多機能タンパク質変異体が提供される。例示的な変化は、「例示的な置換」の見出しが付いた以下の表に提示されているほか、アミノ酸側鎖クラスに言及して以下にさらに説明している。保存的置換は、以下の表の「好ましい置換」の見出しの下に示されている。アミノ酸置換を関心対象のジスルフィド結合型多価多機能タンパク質に導入して、その産物を所望の活性、例えば抗原結合の保持／改善、免疫原性低下、またはADCCもしくはCDCの改善についてスクリーニングすることができる。

表

アミノ酸は、共通の側鎖特性に応じてグループ分けすることができる：
（1）疎水性：ノルロイシン、Met、Ala、Val、Leu、Ile；
（2）中性親水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；
（3）酸性：Asp、Glu；
（4）塩基性：His、Lys、Arg；
（5）鎖の配向に影響する残基：Gly、Pro；
（6）芳香族：Trp、Tyr、Phe。

非保存的置換は、これらのクラスの1つのメンバーを別のクラスに交換することを必要とするであろう。

アミノ酸配列挿入には、1つの残基から、100またはそれを上回る残基を含有するポリペプチドまでの範囲にわたる長さでのアミノおよび／またはカルボキシル末端融合、ならびに単一または複数のアミノ酸残基の配列内挿入が含まれる。末端挿入の例には、N末端メチオニン残基を有するポリペプチドを含むジスルフィド結合型多価多機能タンパク質が含まれる。他の挿入変異体には、ジスルフィド結合型多価多機能タンパク質のポリペプチド鎖のN末端またはC末端と酵素との融合物が含まれる。

b）グリコシル化変異体
ある態様において、本明細書において提供されるジスルフィド結合型多価多機能タンパク質の1つまたは複数のポリペプチドは、ポリペプチドがグリコシル化される程度が増加または減少するように改変することができる。ポリペプチドへのグリコシル化部位の付加または欠失は、1つまたは複数のグリコシル化部位が作出または除去されるようにアミノ酸配列を変えることによって好都合に実現することができる。

ジスルフィド結合型多価多機能タンパク質は抗体Fc領域を含み、それに結びついた糖鎖を変更することができる。哺乳動物細胞によって産生されたネイティブ性Fc領域は、典型的には、Fc領域のCH2ドメインのAsn297とN結合によって一般に結びついた分枝状の二分岐オリゴ糖を含む。例えば、Wright, A. and Morrison, S.L., TIBTECH 15 (1997) 26-32を参照。オリゴ糖は、さまざまな糖質、例えば、二分岐オリゴ糖構造の「ステム」におけるGlcNAcに結びついた、マンノース、N-アセチルグルコサミン（GlcNAc）、ガラクトース、シアル酸、ならびにフコースを含みうる。いくつかの態様において、本明細書において報告されるジスルフィド結合型多価多機能タンパク質におけるオリゴ糖の改変は、ある一定の改善された特性を有する抗体変異体を作り出す目的で行われうる。

1つの態様においては、Fc領域と（直接的または間接的に）結びついたフコースを欠く糖鎖構造を有する、ポリペプチド変異体を含むジスルフィド結合型多価多機能タンパク質が提供される。例えば、そのようなFc領域におけるフコースの量は、1％〜80％、1％〜65％、5％〜65％、または20％〜40％であってよい。フコースの量は、例えば、WO 2008／077546号に記載されているように、MALDI-TOF質量分析法によって測定される、Asn297に結びついているすべての糖構造の合計（例えば、ジスルフィド結合型多価多機能タンパク質、ハイブリッド構造および高マンノース構造）と対比して、Asn297の糖鎖中のフコースの平均量を計算することによって決定される。Asn297は、Fc領域内のおよそ297の位置（Fc領域残基のEU番号付け）に位置するアスパラギン残基のことを指す；しかし、Asn297が、抗体の軽微な配列変異に起因して、位置297の上流または下流のおよそ±3アミノ酸に、すなわち位置294〜300の間に位置してもよい。そのようなフコシル化変異体ではADCC機能が改善している可能性がある。例えば、US 2003／0157108号；US 2004／0093621号を参照。「脱フコシル化」または「フコース欠損」抗体変異体に関連する刊行物の例には、以下のものが含まれる：US 2003／0157108号；WO 2000／61739号；WO 2001／29246号；US 2003／0115614号；US 2002／0164328号；US 2004／0093621号；US 2004／0132140号；US 2004／0110704号；US 2004／0110282号；US 2004／0109865号；WO 2003／085119号；WO 2003／084570号；WO 2005／035586号；WO 2005／035778号；WO 2005／053742号；WO 2002／031140号；Okazaki, A., et al., J. Mol. Biol. 336 (2004) 1239-1249；Yamane-Ohnuki, N., et al., Biotech. Bioeng. 87 (2004) 614-622。脱フコシル化抗体を産生する能力を有する細胞株の例には、タンパク質フコシル化能が欠損しているLec13 CHO細胞（Ripka, J., et al., Arch. Biochem. Biophys. 249（1986）533-545；US 2003／0157108号；およびWO 2004／056312号、特に実施例11）、およびノックアウト細胞株、例えばα-1,6-フコシルトランスフェラーゼ遺伝子、FUT8ノックアウトCHO細胞（例えば、Yamane-Ohnuki, N., et al., Biotech. Bioeng. 87（2004）614-622; Kanda, Y., et al., Biotechnol. Bioeng. 94（2006）680-688；およびWO 2003／085107号）が含まれる。

例えば、Fc領域に結びついた二分岐オリゴ糖がGlcNAcによって二分されている二分オリゴ糖を有する、Fc領域変異体を含むジスルフィド結合型多価多機能タンパク質がさらに提供される。そのような変異体では、フコシル化が減少している、かつ／またはADCC機能が改善している可能性がある。そのような抗体変異体の例は、例えば、WO 2003／011878号；US 6,602,684号；およびUS 2005／0123546号に記載されている。Fc領域に結びついたオリゴ糖内に少なくとも1つのガラクトース残基を有するFc領域変異体も提供される。そのようなFc領域変異体ではCDC機能が改善している可能性がある。対応する抗体変異体は、例えば、WO 97／30087号；WO 98／58964号；およびWO 99／22764号に記載されている。

c）Fc領域変異体
ある態様においては、1つまたは複数のアミノ酸改変を、本明細書において提供されるジスルフィド結合型多価多機能タンパク質のFc領域に導入することができ、それによってFc領域変異体を作製することができる。Fc領域変異体は、1つまたは複数のアミノ酸位置に、アミノ酸修飾（例えば、置換）を含むヒトFc領域の配列（例えば、ヒトIgG1、IgG2、IgG3またはIgG4のFc領域）を含みうる。

ある態様において、本発明は、インビボでのジスルフィド結合型多価多機能タンパク質の半減期が重要であるものの、ある種のエフェクター機能（例えば、補体およびADCCなど）は不要または有害である用途のための望ましい候補となる、すべてではないが一部のエフェクター機能を保有するFc領域変異体を想定している。インビトロおよび／またはインビボでの細胞傷害性アッセイを、CDC活性および／またはADCC活性の減少／枯渇を確認するために行うことができる。例えば、Fc受容体（FcR）結合アッセイを、ジスルフィド結合型多価多機能タンパク質がFcγR結合性を欠く（それ故、おそらくADCC活性を欠く）が、FcRn結合能力は保持していることを確認するために実施することができる。ADCCを媒介する主な細胞であるNK細胞は、FcγRIIIのみを発現するが、単球はFcγRI、FcγRIIおよびFcγRIIIを発現する。造血細胞におけるFcRの発現は、Ravetch, J.V. and Kinet, J.P., Annu. Rev. Immunol. 9 (1991) 457-492の464ページの表3に要約されている。関心対象の分子のADCC活性を評価するためのインビトロアッセイの非限定的な例は、米国特許第5,500,362号に記載されている（例えば、Hellstrom, I., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 (1986) 7059-7063；およびHellstrom, I., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 (1985) 1499-1502)；米国特許第5,821,337号（Bruggemann, M., et al., J. Exp. Med. 166 (1987) 1351-1361を参照）。または、非放射性アッセイ法を用いることもできる（例えば、フローサイトメトリー用のACTI（商標）非放射性細胞傷害性アッセイ（CellTechnology, Inc. Mountain View, CA；およびCytoTox96（登録商標）非放射性細胞傷害性アッセイ（Promega, Madison, WI）を参照。そのようなアッセイのために有用なエフェクター細胞には、末梢血単核細胞（PBMC）およびナチュラルキラー（NK）細胞が含まれる。代替的または追加的に、関心対象の分子のADCC活性を、Clynes, R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 (1998) 652-656に開示されているように、インビボで、例えば動物モデルにおいて評価することもできる。また、C1q結合アッセイを、抗体がC1qと結合できず、それ故にCDC活性を欠くことを確認するために行うこともできる。例えば、WO 2006／029879号およびWO 2005／100402号におけるC1qおよびC3c結合ELISAを参照。補体活性化を評価するために、CDCアッセイを行うことができる（例えば、Gazzano-Santoro, H., et al., J. Immunol. Methods 202 (1996) 163-171；Cragg, M.S., et al., Blood 101 (2003) 1045-1052；およびCragg, M.S. and Glennie, M.J., Blood 103 (2004) 2738-2743を参照）。FcRn結合およびインビボでのクリアランス／半減期の測定を、当技術分野において公知の方法を用いて行うこともできる（例えば、Petkova, S.B., et al., Int. Immunol. 18（2006）1759-1769を参照）。

エフェクター機能が低下したFc領域には、Fc領域の残基234、235、238、265、269、270、297、327および329の1つまたは複数の置換を有するものが含まれる（例えば、US 6,737,056号を参照）。そのようなFc突然変異体には、残基265および297のアラニンへの置換を有する、いわゆる「DANA」Fc突然変異体を含む、アミノ酸位置265、269、270、297および327の2つまたはそれを上回る置換を有するFc変異体が含まれる（US 7,332,581号）。

FcRに対する結合性が改善するかまたは低下した、特定のFc領域変異体が記載されている（例えば、US 6,737,056号；WO 2004／056312号、およびShields, R.L., et al., J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604を参照）。

ある態様において、ジスルフィド結合型多価多機能タンパク質変異体は、ADCCを改善する1つまたは複数のアミノ酸置換、例えば、Fc領域の位置298、333および／または334における置換（EUの残基番号付け）を有するFc領域を含む。

いくつかの態様においては、改変された（すなわち、改善するかまたは低下した）C1q結合および／または補体依存性細胞傷害作用（CDC）を生じる、Fc領域における改変が行われており、例えば、US 6,194,551号、WO 99／51642号、およびIdusogie, E.E., et al., J. Immunol. 164 (2000) 4178-4184に記載されている。

半減期が延長しており、かつ胎児への母性IgGの移行を担う新生児Fc受容体（FcRn）に対する結合性が改善された抗体（Guyer, R.L., et al., J. Immunol. 117（1976）587-593、およびKim, J.K., et al., J. Immunol. 24（1994）2429-2434）が、US 2005／0014934号に記載されている。そのような抗体は、FcRnに対するFc領域の結合性を改善する1つまたは複数の置換を内部に有するFc領域を含む。そのようなFc領域変異体には、Fc領域の残基：238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424または434のうち1つまたは複数の置換、例えば、Fc領域の残基434の置換を有するものが含まれる（US 7,371,826号）。

Fc領域の変異体の他の例に関しては、Duncan, A.R. and Winter, G., Nature 322（1988）738-740；US 5,648,260号；US 5,624,821号；および、WO 94／29351号も参照されたい。

B．組換え方法および組成物
本明細書において報告されるジスルフィド結合型多価多機能タンパク質は、例えば、US 4,816,567号に記載されているように、組換え方法および組成物を用いて作製することができる。1つの態様においては、本明細書において記載されるジスルフィド結合型多価多機能タンパク質のポリペプチドをコードする単離された核酸が提供される。1つのさらなる態様においては、そのような核酸を含む1つまたは複数のベクター（例えば、発現ベクター）が提供される。さらなる態様においては、そのような核酸を含む宿主細胞が提供される。1つの態様において、宿主細胞は以下のものを含む（例えば、以下のものによって形質転換されている）：（1）抗体のVLを含むアミノ酸配列および抗体のVHを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含むベクター、または（2）抗体のVLを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第1のベクターおよび抗体のVHを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第2のベクター。1つの態様において、宿主細胞は、真核細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞またはリンパ系細胞（例えば、Y0、NS0、Sp2／0細胞）である。1つの態様においては、本明細書において報告されるジスルフィド結合型多価多機能タンパク質を作製する方法であって、上記に提供されたような、ジスルフィド結合型多価多機能タンパク質のポリペプチドをコードする核酸を含む宿主細胞を、ポリペプチドの発現およびジスルフィド結合型多価多機能タンパク質の形成に適した条件下で培養する段階、ならびに任意で宿主細胞（または宿主細胞培養培地）からジスルフィド結合型多価多機能タンパク質を回収する段階を含む方法が提供される。

ジスルフィド結合型多価多機能タンパク質の組換え生産のためには、例えば上記のように、ジスルフィド結合型多価多機能タンパク質のポリペプチドをコードする核酸を単離して、さらなるクローニングおよび／または宿主細胞内での発現のために1つまたは複数のベクターに挿入する。そのような核酸は、従来の手順を用いて（例えば、抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子と特異的に結合しうるオリゴヌクレオチドプローブを用いることによって）、容易に単離して配列を決定することができる。

ベクターのクローニングまたは発現のために適した宿主細胞には、本明細書に記載の原核細胞または真核細胞が含まれる。例えば、特に、グリコシル化およびFcエフェクター機能が必要ない場合には、ジスルフィド結合型多価多機能タンパク質を細菌において産生させることができる。細菌における抗体断片およびポリペプチドの発現については、例えば、US 5,648,237号、US 5,789,199号およびUS 5,840,523号を参照されたい（また、大腸菌における抗体断片の発現を記述しているCharlton, K.A., In: Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo, B.K.C. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ (2003), pp. 245-254も参照されたい）。発現の後に、ジスルフィド結合型多価多機能タンパク質を可溶性画分中の細菌細胞ペーストから単離して、さらに精製することができる。

原核生物に加えて、糸状菌または酵母菌などの真核微生物も、ポリペプチドをコードするベクターのための適したクローニング宿主または発現宿主であり、これには、そのグリコシル化経路が「ヒト化」されており、部分的または完全なヒトのグリコシル化パターンを有する抗体の生成をもたらす菌類および酵母菌株が含まれる。Gerngross, T.U., Nat. Biotech. 22（2004）1409-1414；およびLi, H., et al., Nat. Biotech. 24（2006）210-215を参照。

また、グリコシル化されたジスルフィド結合型多価多機能タンパク質の発現のために適した宿主細胞は、多細胞生物（無脊椎動物および脊椎動物）からも得られる。無脊椎動物細胞の例には、植物細胞および昆虫細胞が含まれる。昆虫細胞と組み合わせて用いうる、特にヨトウガ（Spodoptera frugiperda）細胞のトランスフェクションのために用いうる、多数のバキュロウイルス株が同定されている。

また、植物細胞培養物を宿主として利用することもできる。例えば、US 5,959,177号、US 6,040,498号、US 6,420,548号、US 7,125,978号、およびUS 6,417,429号（トランスジェニック植物における抗体産生に関するPLANTIBODIES（商標）技術を記載している）を参照されたい。

脊椎動物細胞を宿主として用いることもできる。例えば、懸濁液中で増殖するように適合化された哺乳動物細胞株は有用でありうる。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例には、SV40によって形質転換されたサル腎臓CV1株（COS-7）；ヒト胚性腎臓株（例えば、Graham, F.L., et al., J. Gen Virol. 36（1977）59-74に記載されたHEK 293細胞または293細胞）；ベビーハムスター腎臓細胞（BHK）；マウスのセルトリ細胞（例えば、Mather, J.P., Biol. Reprod. 23（1980）243-252に記載されたTM4細胞）；サル腎細胞（CV1）；アフリカミドリザル腎細胞（VERO-76）；ヒト子宮頸癌細胞（HELA）；イヌ腎細胞（MDCK；バッファローラット肝臓細胞（BRL 3A）；ヒト肺細胞（W138）；ヒト肝細胞（HepG2）；マウス乳腺腫瘍（MMT060562）；例えばMather, J.P., et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383（1982）44-68に記載されたようなTRI細胞；MRC5細胞；およびFS4細胞が含まれる。他の有用な哺乳動物宿主細胞株には、DHFR^- CHO細胞（Urlaub, G., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77（1980）4216-4220）を含むチャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞；ならびにY0、NS0およびSp2／0などの骨髄腫細胞株が含まれる。抗体産生に適した特定の哺乳動物宿主細胞系の総説については、例えば、Yazaki, P. and Wu, A.M., Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo, B.K.C. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ (2004), pp. 255-268を参照されたい。

C．医薬製剤
本明細書において記載されるジスルフィド結合型多価多機能タンパク質の医薬製剤は、所望の程度の純度を有するそのようなジスルフィド結合型多価多機能タンパク質と、1つまたは複数の任意の薬学的に許容される担体（Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. (ed.) (1980)）とを、凍結乾燥製剤または水性溶液の形態として混合することによって調製される。薬学的に許容される担体は、使用される投与量および濃度でレシピエントに対して毒性がなく、これには以下のものが非限定的に含まれる：リン酸塩、クエン酸塩および他の有機酸などの緩衝液；アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤；保存料（例えば、オクタデシルジメチオルベンジルアンモニウムクロライド；ヘキサメトニウムクロライド；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えばメチルまたはプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；3-ペンタノール；およびm-クレゾール）；低分子量（約10残基未満の）ポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンなど；親水性ポリマー、例えば、ポリ(ビニルピロリドン)など；アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニンまたはリジンなど；単糖類、二糖類、およびグルコース、マンノースまたはデキストリンを含む他の糖質；キレート剤、例えば、EDTAなど；糖、例えば、スクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトールなど；塩形成対イオン、例えば、ナトリウムなど；金属錯体（例えば、Zn-タンパク質錯体）；および／または非イオン性界面活性剤、例えばポリエチレングリコール（PEG）など。本明細書における、例示的な薬学的に許容される担体には、介在性薬物分散剤、例えば、水溶性の中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質（sHASEGP）、例えば、rhuPH20（HYLENEX（登録商標）、Baxter International, Inc.）などのヒト可溶性PH-20ヒアルロニダーゼ糖タンパク質がさらに含まれる。rhuPH20を含む、ある種の例示的なsHASEGPおよび使用方法は、US 2005／0260186号およびUS 2006／0104968号に記載されている。1つの局面において、sHASEGPは、コンドロイチナーゼなどの1つまたは複数の追加のグルコサミノグリカンと組み合わされる。

例示的な凍結乾燥抗体製剤は、US 6,267,958号に記載されている。水性抗体製剤には、US 6,171,586号およびWO 2006／044908号に記載されているものが含まれ、後者の製剤はヒスチジン-酢酸緩衝液を含む。

本明細書における製剤はまた、治療される特定の適応症に対して必要な複数の有効成分、好ましくは、互いに悪影響を及ぼさない補完的活性を持つものも含有しうる。そのような有効成分は、意図した目的のために有効な量で組み合わされて適した形で存在する。

有効成分を、例えば、コアセルベーション技術または界面重合法によって調製されたマイクロカプセル、例えば、それぞれヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン-マイクロカプセルおよびポリ(メタクリル酸メチル)マイクロカプセル、コロイド薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフィア、ミクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル）またはマクロエマルジョン内に封入することもできる。そのような手法は、Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. (ed.) (1980)に開示されている。

徐放性製剤を調製することもできる。徐放性製剤の適した例には、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスが含まれ、これらのマトリックスは成形品、例えばフィルムまたはマイクロカプセルの形をしている。

インビボ投与のために用いられる製剤は、一般に無菌である。無菌性は、例えば、滅菌濾過膜を通して濾過することによって実現することができる。

D．治療方法および組成物
本明細書において提供されるジスルフィド結合型多価多機能タンパク質の任意のものを、治療方法に用いることができる。

1つの局面においては、医薬として用いるための、本明細書において報告されるジスルフィド結合型多価多機能タンパク質が提供される。

さらなる局面においては、癌を治療するのに用いるための、本明細書において報告されるジスルフィド結合型多価多機能タンパク質が提供される。

ある態様においては、治療の方法に用いるための、本明細書において報告されるジスルフィド結合型多価多機能タンパク質が提供される。

ある態様において、本発明は、癌またはウイルス感染症を有する個体を治療する方法であって、本明細書において報告されるジスルフィド結合型多価多機能タンパク質の有効量を投与する段階を含む方法に用いるための、本明細書において報告されるジスルフィド結合型多価多機能タンパク質を提供する。1つのそのような態様において、本方法は、個体に対して、例えば以下に記載するような、少なくとも1つのさらなる治療薬を投与する段階をさらに含む。

さらなる態様において、本発明は、癌細胞またはウイルス感染細胞の除去に用いるための、本明細書において報告されるジスルフィド結合型多価多機能タンパク質を提供する。ある態様において、本発明は、個体における癌細胞またはウイルス感染細胞の除去の方法であって、個体に対して、癌細胞を除去するために有効な、本明細書において報告されるジスルフィド結合型多価多機能タンパク質を投与する段階を含む方法に用いるための、本明細書において報告されるジスルフィド結合型多価多機能タンパク質を提供する。上記の態様の任意のものによる「個体」はヒトであってよい。

1つのさらなる局面において、本発明は、医薬の製造または調製における、本明細書において報告されるジスルフィド結合型多価多機能タンパク質の使用を提供する。1つの態様において、医薬は、癌またはウイルス感染症の治療用である。1つのさらなる態様において、医薬は、癌またはウイルス感染症を治療する方法であって、癌またはウイルス感染症を有する個体に対して、医薬の有効量を投与する段階を含む方法に用いるためのものである。1つのそのような態様において、本方法は、個体に対して、少なくとも1つのさらなる治療薬の有効量を投与する段階をさらに含む。1つのさらなる態様において、医薬は癌細胞またはウイルス感染細胞の除去のためのものである。1つのさらなる態様において、医薬は、個体における癌細胞またはウイルス感染細胞の除去の方法であって、個体に対して、癌細胞またはウイルス感染細胞を除去するのに有効な量の医薬を投与する段階を含む方法に用いるためのものである。上記の態様の任意のものによる「個体」はヒトであってよい。

1つのさらなる局面において、本発明は、癌またはウイルス感染症を治療するための方法を提供する。1つの態様において、本方法は、そのような癌またはウイルス感染症を有する個体に対して、本明細書において報告されるジスルフィド結合型多価多機能タンパク質の有効量を投与する段階を含む。1つのそのような態様において、本方法は、個体に対して、少なくとも1つのさらなる治療薬の有効量を投与する段階をさらに含む。上記の態様の任意のものによる「個体」はヒトであってよい。

1つのさらなる局面において、本発明は、個体における癌細胞またはウイルス感染細胞の除去のための方法を提供する。1つの態様において、本方法は、癌細胞またはウイルス感染細胞を除去するために、個体に対して、本明細書において報告されるジスルフィド結合型多価多機能タンパク質の有効量を投与する段階を含む。1つの態様において、「個体」はヒトである。

1つのさらなる局面において、本発明は、例えば、上記の治療方法のいずれかに用いるための、本明細書において報告されるジスルフィド結合型多価多機能タンパク質のいずれかを含む医薬製剤を提供する。1つの態様において、医薬製剤は、本明細書において報告されるジスルフィド結合型多価多機能タンパク質のいずれかと、薬学的に許容される担体とを含む。もう1つの態様において、医薬製剤は、本明細書において報告されるジスルフィド結合型多価多機能タンパク質のいずれかと、少なくとも1つのさらなる治療薬とを含む。

本発明のジスルフィド結合型多価多機能タンパク質は、治療法において、単独で、または他の薬剤と組み合わせて治療することができる。例えば、本発明のジスルフィド結合型多価多機能タンパク質は、少なくとも1つのさらなる治療薬と共投与することができる。

上述のそのような併用療法は、併用投与（2つまたはそれを上回る治療薬が、同一または別々の製剤に含まれている）、ならびに、本発明の多機能タンパク質の投与が、さらなる治療薬および／または補助剤の投与の前、それと同時、および／またはその後に起こりうる場合である別々の投与を範囲に含む。また、本発明の多機能タンパク質を放射線療法と併用することもできる。

本発明のジスルフィド結合型多価多機能タンパク質（および任意のさらなる治療薬）は、経口、肺内および鼻腔内、ならびに局所治療が所望される場合には病巣内投与をも含む、任意の適切な手段によって投与することができる。非経口注入には、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、または皮下投与が含まれる。投薬は、その投与が短期間かまたは長期であるかどうかにある程度応じた、任意の適切な経路、例えば、静脈内または皮下注射などの注射によって行うことができる。単回投与、またはさまざまな時点にわたっての複数回投与、ボーラス投与、およびパルス注入を非限定的に含む、さまざまな投与スケジュールを本明細書では想定している。

本発明のジスルフィド結合型多価多機能タンパク質は、適正な医療行為に合致した方法で製剤化され、投薬され、投与されると考えられる。この状況において考慮すべき要因には、治療される具体的な障害、治療される具体的な哺乳動物、個々の患者の臨床状態、障害の原因、薬剤の送達部位、投与方法、投与スケジュール、および医療従事者に公知である他の要因が含まれる。ジスルフィド結合型多価多機能タンパク質は、必ずというわけではないが任意で、問題となる障害の予防または治療のために現在使用している1つまたは複数の薬剤ともに製剤化される。そのような他の薬剤の有効量は、製剤中に存在するジスルフィド結合型多価多機能タンパク質の量、障害または治療の種類、および上記に考察した他の因子に依存する。これらは一般に、本明細書に記載されるのと同じ投与量および投与経路で、または本明細書に記載された投与量の約1％〜99％で、または経験的／臨床的に妥当であると判定された任意の投与量および任意の経路で用いられる。

疾患の予防または治療の目的での、本発明のジスルフィド結合型多価多機能タンパク質の適切な用量（単独で用いるか、または1つもしくは複数のさらなる治療薬と併用する場合）は、治療しようとする疾患の種類、ジスルフィド結合型多価多機能タンパク質の種類、疾患の重症度および経過、ジスルフィド結合型多価多機能タンパク質を予防または治療のいずれの目的で投与するか、過去の治療、患者の病歴およびジスルフィド結合型多価多機能タンパク質に対する反応、ならびに担当医の判断に依存する。ジスルフィド結合型多価多機能タンパク質は、患者に対して、単回、または一連の治療にわたって適切に投与される。疾患の種類および重症度に応じて、例えば1回または複数回の別個の投与によるか、連続注入によるかにかかわらず、ジスルフィド結合型多価多機能タンパク質の約1μg／kg〜15mg／kg（例えば、0.5mg／kg〜10mg／kg）が、患者に対する投与のための初期用量の候補となりうる。1つの典型的な1日投与量は、上述した要因に応じて、約1μg／kg〜100mg／kgまたはそれ以上の範囲である。数日間以上にわたる反復投与の場合には、状態に応じて、治療は一般に、疾患症状の所望の抑制が得られるまで継続されるであろう。ジスルフィド結合型多価多機能タンパク質の1つの例示的な投与量は約0.05mg／kg〜約10mg／kgの範囲である。したがって、約0.5mg／kg、2.0mg／kg、4.0mg／kgまたは10mg／kgの1つまたは複数の用量（またはこれらのいずれかの組み合わせ）を患者に投与することができる。そのような用量を、間欠的に、例えば毎週または3週毎（例えば、患者が抗体の約2〜約20回、例えば約6回の投与を受けるように）投与してもよい。初期の高負荷用量の後に、1回または複数回の低用量を投与してもよい。しかし、他の投薬レジメンも有用な可能性がある。この治療法の進展は、従来の手法およびアッセイによって容易にモニターされる。

上記の製剤または治療方法の任意のものを、本明細書において報告されるジスルフィド結合型多価多機能タンパク質の代わりに、またそれに追加して、本発明のイムノコンジュゲートを用いて実施しうることは理解されよう。

本明細書において報告される1つの局面は、患者における癌またはウイルス感染症を治療する方法に用いるための、本明細書において報告されるジスルフィド結合型多価多機能タンパク質であり、ここでジスルフィド結合型多価多機能タンパク質は、ジスルフィド結合型多価多機能タンパク質に含まれるウイルス由来ペプチドによる患者の免疫処置の前、同時または後に投与される。

本明細書において報告される1つの局面は、ジスルフィド結合型多価多機能タンパク質に含まれるウイルス由来ペプチドに対する免疫処置と併用して癌またはウイルス感染症を治療するための医薬の製造のための、本明細書において報告されるジスルフィド結合型多価多機能タンパク質の使用である。

第1の段階においては、ジスルフィド結合型多価多機能タンパク質に含まれるウイルス由来ペプチドが、治療しようとする個体に対して最初に投与される。所定の期間、すなわち4日〜28日の後に、本明細書において報告されるジスルフィド結合型多価多機能タンパク質が個体に投与される。

ウイルス由来ペプチドのこの連続的かつ分割的な適用により、本明細書において報告されるジスルフィド結合型多価多機能タンパク質の第1の段階単独および第2の段階において、ウイルス由来ペプチド特異的T細胞の数を増加させ、それ故に治療の有効性を高めることができる。

III．製造品
本発明のもう1つの局面においては、上記の障害の治療、予防および／または診断のために有用な物質を含む製造品が提供される。製造品は、容器、および容器上にあるかまたは容器に付属するラベルまたは添付文書を含む。適した容器には、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、IV輸液バッグなどが含まれる。容器はガラスまたはプラスチックなどのさまざまな物質でできていてよい。容器は、単独で、または他の組成物と併用されることで疾患の治療、予防および／または診断に有効な化合物を収容し、さらに無菌のアクセスポートを有してもよい（例えば、容器は皮下注射針による穴あきストッパーを有する静脈内溶液バッグまたはバイアルであってよい）。組成物中の少なくとも1つの有効薬剤は、本発明のジスルフィド結合型多価多機能タンパク質である。ラベルまたは添付文書は、組成物が特定の病状を治療するために用いられることを指し示している。さらに、製造品は、（a）本発明の多機能タンパク質を含有する組成物を内部収容する第1の容器；および（b）細胞傷害性物質または別の治療薬を含有する組成物を内部に収容する第2の容器を含みうる。本発明のこの態様における製造品は、組成物が特定の病状を治療するために用いうることを示す添付文書をさらに含んでもよい。代替的または追加的に、製造品は、薬学的に許容される緩衝液、例えば注射用静菌水（BWFI）、リン酸緩衝化塩水、リンゲル液およびデキストロース溶液を含む第2（または第3）の容器をさらに含んでもよい。これは、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針およびシリンジを含む、商業的および使用者の立場から望まれる他の物質をさらに含んでもよい。

上記の製造品の任意のものが、本明細書において報告される多機能タンパク質の代わりに、またはそれに追加して、本発明のイムノコンジュゲートを含みうることは理解されよう。

IV．具体的な態様
1．‐2つまたはそれを上回る抗原提示ドメイン、
‐1つの抗体Fc領域、および
‐1つまたは複数の抗原結合部位
を含み、
抗原提示ドメインのそれぞれが、互いに独立に、N末端からC末端への方向に、
（i）β2-ミクログロブリン、ならびに
（ii）相対頻度が1％未満であるクラスI MHC分子の細胞外ドメインα1、α2およびα3、
または
（i）相対頻度が1％未満であるクラスI MHC分子の細胞外ドメインα1、α2およびα3、ならびに
（ii）β2-ミクログロブリン、
または
（i）T細胞応答誘発ペプチド、
（ii）β2-ミクログロブリン、ならびに
（iii）相対頻度が1％であるかもしくはそれを上回るクラスI MHC分子の細胞外ドメインα1、α2およびα3、
または
（i）T細胞応答誘発ペプチド、
（ii）相対頻度が1％であるかもしくはそれを上回るクラスI MHC分子の細胞外ドメインα1、α2およびα3、ならびに
（iii）β2-ミクログロブリン、
のいずれかを含み、
1つまたは複数の抗原結合部位が癌細胞表面抗原またはウイルス感染細胞表面抗原と結合し、かつ
抗原提示ドメインの1つまたは複数が少なくとも位置11および位置227にシステイン残基を有し、位置11および位置227にあるシステイン残基がジスルフィド結合を形成するか、またはシステイン残基が少なくとも位置11および位置108にあって、位置11および位置108にあるシステイン残基がジスルフィド結合を形成する
ことを特徴とする、ジスルフィド結合型多価多機能タンパク質。

2．‐1つの抗原提示ドメイン、
‐1つの抗体Fc領域、および
‐1つまたは複数の抗原結合部位
を含み、
抗原提示ドメインが、N末端からC末端への方向に、
（i）β2-ミクログロブリン、ならびに
（ii）相対頻度が1％未満であるクラスI MHC分子の細胞外ドメインα1、α2およびα3、
または
（i）相対頻度が1％未満であるクラスI MHC分子の細胞外ドメインα1、α2およびα3、ならびに
（ii）β2-ミクログロブリン、
または
（i）T細胞応答誘発ペプチド、
（ii）β2-ミクログロブリン、ならびに
（iii）相対頻度が1％であるかもしくはそれを上回るクラスI MHC分子の細胞外ドメインα1、α2およびα3、
または
（i）T細胞応答誘発ペプチド、
（ii）相対頻度が1％であるかもしくはそれを上回るクラスI MHC分子の細胞外ドメインα1、α2およびα3、ならびに
（iii）β2-ミクログロブリン、
のいずれかを含み、
1つまたは複数の抗原結合部位が癌細胞表面抗原またはウイルス感染細胞表面抗原と結合し、かつ
抗原提示ドメインが少なくとも位置11および位置227にシステイン残基を有し、位置11および位置227にあるシステイン残基がジスルフィド結合を形成するか、またはシステイン残基が少なくとも位置11および位置108にあって、位置11および位置108にあるシステイン残基がジスルフィド結合を形成する
ことを特徴とする、ジスルフィド結合型多価多機能タンパク質。

3．抗体Fc領域が第1および第2のジスルフィド結合型Fc領域ポリペプチドを含み、ここで1つの抗原結合部位または複数の抗原結合部位のうち1つが第1のFc領域ポリペプチドを含み、かつ、第2の抗原結合部位が存在するならば、第2のFc領域ポリペプチドを含むことを特徴とする、項目1〜2のいずれかに記載の多機能タンパク質。

4．抗原結合部位が互いに独立に、i）抗体重鎖と抗体軽鎖のペア、またはii）N末端からC末端への方向にscFv抗体断片および抗体Fc領域ポリペプチドを含むscFv融合ポリペプチド、またはiii）N末端からC末端への方向にscFabおよび抗体Fc領域ポリペプチドを含むscFab融合ポリペプチド、を含むことを特徴とする、項目1〜3のいずれか一項記載の多機能タンパク質。

5．i）抗原提示ドメインが抗原結合部位の重鎖のN末端もしくは軽鎖のN末端と連結していること、またはii）1つの抗原提示ドメインが各抗原結合部位の軽鎖の各N末端もしくは重鎖の各N末端と連結していること、またはiii）1つの抗原提示ドメインが抗原結合部位の重鎖のC末端もしくは軽鎖のC末端と連結していること、またはvi）1つの抗原提示ドメインが各抗原結合部位の重鎖の各C末端もしくは軽鎖の各C末端と連結していること、またはv）1つの抗原提示ドメインがscFv融合ポリペプチドのN末端もしくはC末端と連結していること、またはvi）1つの抗原提示ドメインが各scFv融合ポリペプチドの各N末端もしくはC末端と連結していること、またはvii）抗原提示ドメインがscFab融合ポリペプチドのN末端もしくはC末端と連結していること、またはviii）1つの抗原提示ドメインが各scFab融合ポリペプチドの各N末端もしくはC末端と連結していること、またはix）1つの抗原提示ドメインが第2のFc領域ポリペプチドのN末端もしくはC末端と連結していること、またはx）1つの抗原提示ドメインが第1のFc領域ポリペプチドのN末端もしくはC末端と連結し、かつ1つの抗原提示ドメインが第2のFc領域ポリペプチドのN末端もしくはC末端と連結していること、を特徴とする、項目1〜4のいずれか一項記載の多機能タンパク質。

6．癌細胞表面抗原が黒色腫関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（MCSP）であることを特徴とする、項目1〜5のいずれか一項記載の多機能タンパク質。

7．T細胞応答誘発ペプチドがウイルス由来ペプチドであることを特徴とする、項目1〜6のいずれか一項記載の多機能タンパク質。

8．T細胞応答誘発ペプチドがCD8⁺-T細胞応答誘発ペプチドであることを特徴とする、項目1〜7のいずれか一項記載の多機能タンパク質。

9．ウイルス由来ペプチドがヒトサイトメガロウイルス由来ペプチドであることを特徴とする、項目7〜8のいずれかに記載の多機能タンパク質。

10．ウイルス由来ペプチドがSEQ ID NO：01〜SEQ ID NO：70の群から選択されるアミノ酸配列を有することを特徴とする、項目1〜9のいずれか一項記載の多機能タンパク質。

11．ウイルス由来ペプチドがSEQ ID NO：01のアミノ酸配列を有することを特徴とする、項目1〜10のいずれか一項記載の多機能タンパク質。

12．相対頻度が1％であるかまたはそれを上回るクラスI MHC分子が、HLA-A^*0201、HLA-A^*1101、HLA-A^*2402、HLA-A^*340101、HLA-C^*0304、HLA-C^*0401およびHLA-C^*0702を含む群から選択されることを特徴とする、項目1〜11のいずれか一項記載の多機能タンパク質。

13．相対頻度が1％であるかまたはそれを上回るクラスI MHC分子が、多機能タンパク質を投与しようとする個体の地域に応じて、以下のように選択されることを特徴とする、項目1〜12のいずれか一項記載の多機能タンパク質：
‐欧州出身の個体の場合、クラスI MHC分子は、HLA-A^*0101、HLA-A^*0201、HLA-A^*0301、HLA-B^*0702、HLA-B^*0801、HLA-B^*4402、HLA-C^*0401、HLA-C^*0501、HLA-C^*0701およびHLA-C^*0702を含む群から選択され、
‐オーストラリア出身の個体の場合、クラスI MHC分子は、HLA-A^*0201、HLA-A^*1101、HLA-A^*2402、HLA-A^*340101、HLA-B^*1301、HLA-B^*1521、HLA-B^*5601、HLA-B^*5602、HLA-C^*0102、HLA-C^*0401、HLA-C^*0403およびHLA-C^*1502を含む群から選択され、
‐北米出身の個体の場合、クラスI MHC分子は、HLA-A^*0201、HLA-A^*2402、HLA-C^*0202、HLA-C^*0304、HLA-C^*0401およびHLA-C^*0702を含む群から選択され、そして
‐東南アジア出身の個体の場合、クラスI MHC分子は、HLA-A^*1101、HLA-A^*2402、HLA-B^*1504、HLA-C^*0102、HLA-C^*0304、HLA-C^*0702およびHLA-C^*0801を含む群から選択される。

14．相対頻度が1％であるかまたはそれを上回るクラスI MHC分子が、多機能タンパク質を投与しようとする個体の地域に応じて以下のように選択されることを特徴とする、項目1〜13のいずれか一項記載の多機能タンパク質：
‐欧州出身の個体の場合、クラスI MHC分子はHLA-A^*0201であり、
‐オーストラリア出身の個体の場合、クラスI MHC分子は、HLA-A^*2402、HLA-B^*1301、HLA-C^*0102およびHLA-C^*0401を含む群から選択され、
‐北米出身の個体の場合、クラスI MHC分子は、HLA-A^*2402およびHLA-C^*0304を含む群から選択され、そして
‐東南アジア出身の個体の場合、クラスI MHC分子はHLA-A^*2402である。

15．相対頻度が1％未満であるクラスI MHC分子が、HLA-B^*4201、HLA-B^*5901、HLA-B^*6701およびHLA-B^*7802を含む群から選択されることを特徴とする、項目1〜14のいずれか一項記載の多機能タンパク質。

16．β2-ミクログロブリンがヒトβ2-ミクログロブリンであって、相対頻度が10％であるかまたはそれを上回るクラスI MHC分子がヒトHLA-A^*0201であることを特徴とする、項目1〜15のいずれか一項記載の多機能タンパク質。

17．抗原提示ドメインが、
（i）ウイルス由来ペプチド、
（ii）β2-ミクログロブリン、
（iii）可溶性HLA-AアレルA^*0201、ならびに
（iv）少なくとも位置11および位置227にあるシステイン残基であって、位置11および位置227にあるものがジスルフィド結合を形成するシステイン残基、もしくは少なくとも位置11および位置108にあるシステイン残基であって、位置11および位置108にあるものがジスルフィド結合を形成するシステイン残基、
または
（i）ウイルス由来ペプチド、
（ii）可溶性HLA-AアレルA^*0201、
（iii）β2-ミクログロブリン、ならびに
（iv）少なくとも位置11および位置227にあるシステイン残基であって、位置11および位置227にあるものがジスルフィド結合を形成するシステイン残基、もしくは少なくとも位置11および位置108にあるシステイン残基であって、位置11および位置108にあるものがジスルフィド結合を形成するシステイン残基
を含むことを特徴とする、項目1〜16のいずれか一項記載の多機能タンパク質。

18．β2-ミクログロブリンが、SEQ ID NO：71のアミノ酸配列からなるか、または1つ〜10つのアミノ酸交換、付加および／もしくは欠失を含むそれらの変異体であることを特徴とする、項目1〜17のいずれか一項記載の多機能タンパク質。

19．クラスI MHC分子の細胞外ドメインα1、α2およびα3がSEQ ID NO：72もしくはSEQ ID NO：140のアミノ酸配列からなるか、または1つ〜10つのアミノ酸交換、付加および／もしくは欠失を含むそれらの変異体であることを特徴とする、項目1〜18のいずれか一項記載の多機能タンパク質。

20．抗原提示ドメインが、N末端からC末端への方向に、
（i）SEQ ID NO：01〜SEQ ID NO：70を含む群から選択されるアミノ酸配列を有するウイルス由来ペプチド、
（ii）SEQ ID NO：77、78、79、82、83、84および139を含む群から選択されるアミノ酸配列を有する第1のリンカーペプチド、
（iii）SEQ ID NO：71のアミノ酸配列を有するβ2-ミクログロブリン、
（iv）SEQ ID NO：77、78、79、82、83および84を含む群から選択されるアミノ酸配列を有する第2のリンカーペプチド、
（v）SEQ ID NO：140のアミノ酸配列を有するクラスI MHC分子の細胞外ドメインα1、α2およびα3、
（vi）SEQ ID NO：73、77、78、79、82、83、84および136を含む群から選択されるアミノ酸配列を有する第3のリンカーペプチド、ならびに
（vii）少なくとも位置11および位置227にあるシステイン残基であって、位置11および位置227にあるものがジスルフィド結合を形成するシステイン残基、
を含むことを特徴とする、項目1〜19のいずれか一項記載の多機能タンパク質。

21．抗原提示ドメインが、N末端からC末端への方向に、
（i）SEQ ID NO：01〜SEQ ID NO：70を含む群から選択されるアミノ酸配列を有するウイルス由来ペプチド、
（ii）SEQ ID NO：77、78、79、82、83、84および139を含む群から選択されるアミノ酸配列を有する第1のリンカーペプチド、
（iii）SEQ ID NO：71のアミノ酸配列を有するか、または1つ〜10つのアミノ酸交換、付加および／もしくは欠失を含むそれらの変異体であるβ2-ミクログロブリン、
（iv）SEQ ID NO：77、78、79、82、83および84を含む群から選択されるアミノ酸配列を有する第2のリンカーペプチド、
（v）SEQ ID NO：140のアミノ酸配列を有するか、または1つ〜10つのアミノ酸交換、付加および／もしくは欠失を含むそれらの変異体である、クラスI MHC分子の細胞外ドメインα1、α2およびα3
（vi）SEQ ID NO：73、77、78、79、82、83、84、136を含む群から選択されるアミノ酸配列を有する第3のリンカーペプチド、ならびに
（vii）少なくとも位置11および位置227にあるシステイン残基であって、位置11および位置227にあるものがジスルフィド結合を形成するシステイン残基、
を含むことを特徴とすることを特徴とする、項目1〜20のいずれか一項記載の多機能タンパク質。

22．‐第1のリンカーペプチドがSEQ ID NO：139のアミノ酸配列を有すること、および／または
‐第2のリンカーペプチドがSEQ ID NO：83のアミノ酸配列を有すること、および／または
‐第3のリンカーペプチドがSEQ ID NO：136のアミノ酸配列を有すること、
を特徴とする、項目21記載の多機能タンパク質。

23．抗体Fc領域がクラスIgGまたはクラスIgEのヒト抗体の抗体Fc領域から選択されることを特徴とする、項目1〜22のいずれか一項記載の多機能タンパク質。

24．抗体Fc領域が、サブクラスIgG1またはIgG2またはIgG3またはIgG4のヒト抗体の抗体Fc領域から選択されることを特徴とする、項目1〜23のいずれか一項記載の多機能タンパク質。

25．抗体Fc領域がサブクラスIgG1またはIgG2のヒト抗体のものであり、E233、L234、L235、G236、D265、D270、N297、E318、K320、K322、A327、P329、A330および／またはP331（KabatのEUインデックスによる番号付け）に少なくとも1つの突然変異を含むことを特徴とする、項目1〜24のいずれか一項記載の多機能タンパク質。

26．抗体Fc領域が、突然変異L234AおよびL235A、ならびに／または突然変異D265AおよびN297Aを有する、かつ／またはPVA236突然変異を含む、かつ／または突然変異P329Gを含む、サブクラスIgG1またはヒトサブクラスIgG2のヒト抗体のものであることを特徴とする、項目1〜25のいずれか一項記載の多機能タンパク質。

27．抗体Fc領域が、突然変異L234AおよびL235A、ならびに／またはP329Gを有するサブクラスIgG1のヒト抗体のものであることを特徴とする、項目1〜26のいずれか一項記載の多機能タンパク質。

28．抗体Fc領域が、突然変異S228Pおよび／またはL235Eを有するサブクラスIgG4のヒト抗体のものであることを特徴とする、項目1〜26のいずれか一項記載の多機能タンパク質。

29．第1および第2の抗体Fc領域ポリペプチドが、SEQ ID NO：87〜103を含む群から互いに独立に選択されることを特徴とする、項目1〜26のいずれか一項記載の多機能タンパク質。

30．抗体Fc領域が、SEQ ID NO：94のアミノ酸配列を有する2つのFc領域ポリペプチドを含むことを特徴とする、項目1〜26のいずれか一項記載の多機能タンパク質。

31．抗体Fc領域が、SEQ ID NO：100のアミノ酸配列を有する2つのFc領域ポリペプチドを含むことを特徴とする、項目1〜26のいずれか一項記載の多機能タンパク質。

32．抗体Fc領域が、SEQ ID NO：101のアミノ酸配列を有する2つのFc領域ポリペプチドを含むことを特徴とする、項目1〜26のいずれか一項記載の多機能タンパク質。

33．抗体Fc領域が、SEQ ID NO：89のアミノ酸配列を有する第1のFc領域ポリペプチド、およびSEQ ID NO：90のアミノ酸配列を有する第2のFc領域ポリペプチドを含むことを特徴とする、項目1〜26のいずれか一項記載の多機能タンパク質。

34．抗体Fc領域が、SEQ ID NO：97のアミノ酸配列を有する第1のFc領域ポリペプチド、およびSEQ ID NO：98のアミノ酸配列を有する第2のFc領域ポリペプチドを含むことを特徴とする、項目1〜26のいずれか一項記載の多機能タンパク質。

35．抗体Fc領域が、SEQ ID NO：102のアミノ酸配列を有する第1のFc領域ポリペプチド、およびSEQ ID NO：103のアミノ酸配列を有する第2のFc領域ポリペプチドを含むことを特徴とする、項目1〜26のいずれか一項記載の多機能タンパク質。

36．‐N末端からC末端への方向に、
（i）β2-ミクログロブリン、ならびに
（ii）相対頻度が1％未満であるクラスI MHC分子の細胞外ドメインα1、α2およびα3、
または
（i）相対頻度が1％未満であるクラスI MHC分子の細胞外ドメインα1、α2およびα3、ならびに
（ii）β2-ミクログロブリン、
または
（i）T細胞応答誘発ペプチド、
（ii）β2-ミクログロブリン、ならびに
（iii）相対頻度が1％であるかもしくはそれを上回るクラスI MHC分子の細胞外ドメインα1、α2およびα3、
または
（i）T細胞応答誘発ペプチド、
（ii）相対頻度が1％であるかもしくはそれを上回るクラスI MHC分子の細胞外ドメインα1、α2およびα3、ならびに
（iii）β2-ミクログロブリン
のいずれかを含む2つの抗原提示ドメインであって、少なくとも位置11および位置227にシステイン残基を有し、位置11および位置227にあるシステイン残基がジスルフィド結合を形成するか、またはシステイン残基が少なくとも位置11および位置108にあって、位置11および位置108にあるシステイン残基がジスルフィド結合を形成する抗原提示ドメイン、
‐厳密に1つの抗体Fc領域、ならびに
‐1つまたは複数の抗原結合部位
を含むことを特徴とする、ジスルフィド結合型多価多機能タンパク質。

37．‐N末端からC末端への方向に
（i）T細胞応答誘発ペプチド、
（ii）β2-ミクログロブリン、ならびに
（iii）相対頻度が1％であるかまたはそれを上回るクラスI MHC分子の細胞外ドメインα1、α2およびα3
を含む2つの抗原提示ドメインであって、少なくとも位置11および位置227にシステイン残基を有し、位置11および位置227にあるシステイン残基がジスルフィド結合を形成するか、またはシステイン残基が少なくとも位置11および位置108にあって、位置11および位置108にあるシステイン残基がジスルフィド結合を形成する抗原提示ドメイン、
‐厳密に1つの抗体Fc領域、ならびに
‐1つまたは複数の抗原結合部位
を含むことを特徴とする、ジスルフィド結合型多価多機能タンパク質。

38．‐N末端からC末端への方向に
（i）SEQ ID NO：01のT細胞応答誘発ペプチド、
（ii）SEQ ID NO：71のβ2-ミクログロブリン、ならびに
（iii）SEQ ID NO：72のクラスI MHC分子の細胞外ドメインα1、α2およびα3
を含む2つの抗原提示ドメインであって、少なくとも位置11および位置227にシステイン残基を有し、位置11および位置227にあるシステイン残基がジスルフィド結合を形成するか、またはシステイン残基が少なくとも位置11および位置108にあって、位置11および位置108にあるシステイン残基がジスルフィド結合を形成する抗原提示ドメイン、
‐厳密に1つの抗体Fc領域、ならびに
‐1つまたは複数の抗原結合部位
を含むことを特徴とする、ジスルフィド結合型多価多機能タンパク質。

39．‐N末端からC末端への方向に
（i）SEQ ID NO：01のT細胞応答誘発ペプチド、
（ii）SEQ ID NO：71のβ2-ミクログロブリン、ならびに
（iii）SEQ ID NO：72のクラスI MHC分子の細胞外ドメインα1、α2およびα3
を含む2つの抗原提示ドメインであって、少なくとも位置11および位置227にシステイン残基を有し、位置11および位置227にあるシステイン残基がジスルフィド結合を形成するか、またはシステイン残基が少なくとも位置11および位置108にあって、位置11および位置108にあるシステイン残基がジスルフィド結合を形成する抗原提示ドメイン、
‐2つのジスルフィド結合型Fc領域ポリペプチドを含み、そのうち第1のジスルフィド結合型Fc領域ポリペプチドがSEQ ID NO：97のアミノ酸配列を有し、第2のジスルフィド結合型Fc領域ポリペプチドがSEQ ID NO：98のアミノ酸配列を有する、厳密に1つの抗体Fc領域、ならびに
‐1つまたは複数の抗原結合部位
を含むことを特徴とする、ジスルフィド結合型多価多機能タンパク質。

40．‐N末端からC末端への方向に
（i）SEQ ID NO：01のT細胞応答誘発ペプチド、
（ii）SEQ ID NO：71のβ2-ミクログロブリン、ならびに
（iii）SEQ ID NO：72のクラスI MHC分子の細胞外ドメインα1、α2およびα3
を含む2つの抗原提示ドメインであって、少なくとも位置11および位置227にシステイン残基を有し、位置11および位置227にあるシステイン残基がジスルフィド結合を形成するか、またはシステイン残基が少なくとも位置11および位置108にあって、位置11および位置108にあるシステイン残基がジスルフィド結合を形成する抗原提示ドメイン、
‐2つのジスルフィド結合型Fc領域ポリペプチドを含み、そのうち第1のジスルフィド結合型Fc領域ポリペプチドがSEQ ID NO：102のアミノ酸配列を有し、第2のジスルフィド結合型Fc領域ポリペプチドがSEQ ID NO：103のアミノ酸配列を有する、厳密に1つの抗体Fc領域、ならびに
‐1つまたは複数の抗原結合部位
を含むことを特徴とする、ジスルフィド結合型多価多機能タンパク質。

41．‐N末端からC末端への方向に、
（i）SEQ ID NO：01のT細胞応答誘発ペプチド、
（ii）SEQ ID NO：71のβ2-ミクログロブリン、ならびに
（iii）SEQ ID NO：72のクラスI MHC分子の細胞外ドメインα1、α2およびα3
を含む2つの抗原提示ドメインであって、少なくとも位置11および位置227にシステイン残基を有し、位置11および位置227にあるシステイン残基がジスルフィド結合を形成するか、またはシステイン残基が少なくとも位置11および位置108にあって、位置11および位置108にあるシステイン残基がジスルフィド結合を形成する抗原提示ドメイン、
‐2つのジスルフィド結合型Fc領域ポリペプチドを含み、そのうち第1のジスルフィド結合型Fc領域ポリペプチドがSEQ ID NO：97のアミノ酸配列を有し、第2のジスルフィド結合型Fc領域ポリペプチドがSEQ ID NO：98のアミノ酸配列を有する、厳密に1つの抗体Fc領域、ならびに
‐SEQ ID NO：104〜106を含む抗体軽鎖可変ドメインおよびSEQ ID NO：108〜110を含む抗体重鎖可変ドメインを含み、黒色腫関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（MCSP）と特異的に結合する、1つまたは複数の抗原結合部位
を含むことを特徴とする、ジスルフィド結合型多価多機能タンパク質。

42．‐N末端からC末端への方向に、
（i）SEQ ID NO：01のT細胞応答誘発ペプチド、
（ii）SEQ ID NO：71のβ2-ミクログロブリン、ならびに
（iii）SEQ ID NO：72のクラスI MHC分子の細胞外ドメインα1、α2およびα3
を含む2つの抗原提示ドメインであって、少なくとも位置11および位置227にシステイン残基を有し、位置11および位置227にあるシステイン残基がジスルフィド結合を形成するか、またはシステイン残基が少なくとも位置11および位置108にあって、位置11および位置108にあるシステイン残基がジスルフィド結合を形成する抗原提示ドメイン、
‐2つのジスルフィド結合型Fc領域ポリペプチドを含み、そのうち第1のジスルフィド結合型Fc領域ポリペプチドがSEQ ID NO：102のアミノ酸配列を有し、第2のジスルフィド結合型Fc領域ポリペプチドがSEQ ID NO：103のアミノ酸配列を有する、厳密に1つの抗体Fc領域、ならびに
‐黒色腫関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（MCSP）と特異的に結合し、かつSEQ ID NO：104〜106を含む可変ドメインを有する抗体軽鎖およびSEQ ID NO：108〜110を含む可変ドメインを有する抗体重鎖を含む、1つまたは複数の抗原結合部位
を含むことを特徴とする、ジスルフィド結合型多価多機能タンパク質。

43．‐N末端からC末端への方向に、
（i）SEQ ID NO：01のT細胞応答誘発ペプチド、
（ii）SEQ ID NO：71のβ2-ミクログロブリン、ならびに
（iii）SEQ ID NO：72のクラスI MHC分子の細胞外ドメインα1、α2およびα3
を含む2つの抗原提示ドメインであって、少なくとも位置11および位置227にシステイン残基を有し、位置11および位置227にあるシステイン残基がジスルフィド結合を形成するか、またはシステイン残基が少なくとも位置11および位置108にあって、位置11および位置108にあるシステイン残基がジスルフィド結合を形成する抗原提示ドメイン、
‐2つのジスルフィド結合型Fc領域ポリペプチドを含み、そのうち第1のジスルフィド結合型Fc領域ポリペプチドがSEQ ID NO：97のアミノ酸配列を有し、第2のジスルフィド結合型Fc領域ポリペプチドがSEQ ID NO：98のアミノ酸配列を有する、厳密に1つの抗体Fc領域、ならびに
‐黒色腫関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（MCSP）と特異的に結合し、かつそれぞれが、SEQ ID NO：105〜107を含む可変ドメインを有する抗体軽鎖およびSEQ ID NO：110〜112を含む可変ドメインを有する抗体重鎖を含む、2つの抗原結合部位
を含むことを特徴とする、ジスルフィド結合型多価多機能タンパク質。

44．‐N末端からC末端への方向に、
（i）SEQ ID NO：01のT細胞応答誘発ペプチド、
（ii）SEQ ID NO：71のβ2-ミクログロブリン、ならびに
（iii）SEQ ID NO：72のクラスI MHC分子の細胞外ドメインα1、α2およびα3
を含む2つの抗原提示ドメインであって、少なくとも位置11および位置227にシステイン残基を有し、位置11および位置227にあるシステイン残基がジスルフィド結合を形成するか、またはシステイン残基が少なくとも位置11および位置108にあって、位置11および位置108にあるシステイン残基がジスルフィド結合を形成する抗原提示ドメイン、
‐2つのジスルフィド結合型Fc領域ポリペプチドを含み、そのうち第1のジスルフィド結合型Fc領域ポリペプチドがSEQ ID NO：102のアミノ酸配列を有し、第2のジスルフィド結合型Fc領域ポリペプチドがSEQ ID NO：103のアミノ酸配列を有する、厳密に1つの抗体Fc領域、ならびに
‐黒色腫関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（MCSP）と特異的に結合し、かつSEQ ID NO：105〜107を含む可変ドメインを有する抗体軽鎖およびSEQ ID NO：110〜112を含む可変ドメインを有する抗体重鎖を含み、ここで抗体重鎖のFc領域がジスルフィド結合型Fc領域ポリペプチドの1つである、1つまたは複数の抗原結合部位
を含むことを特徴とする、ジスルフィド結合型多価多機能タンパク質。

45．‐N末端からC末端への方向に、
（i）SEQ ID NO：01のT細胞応答誘発ペプチド、
（ii）SEQ ID NO：71のβ2-ミクログロブリン、ならびに
（iii）SEQ ID NO：72のクラスI MHC分子の細胞外ドメインα1、α2およびα3
を含む2つの抗原提示ドメインであって、少なくとも位置11および位置227にシステイン残基を有し、位置11および位置227にあるシステイン残基がジスルフィド結合を形成するか、またはシステイン残基が少なくとも位置11および位置108にあって、位置11および位置108にあるシステイン残基がジスルフィド結合を形成する抗原提示ドメイン、
‐2つのジスルフィド結合型Fc領域ポリペプチドを含み、そのうち第1のジスルフィド結合型Fc領域ポリペプチドがSEQ ID NO：97のアミノ酸配列を有し、第2のジスルフィド結合型Fc領域ポリペプチドがSEQ ID NO：98のアミノ酸配列を有する、厳密に1つの抗体Fc領域、ならびに
‐黒色腫関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（MCSP）と特異的に結合し、かつSEQ ID NO：104〜106を含む可変ドメインを有する抗体軽鎖およびSEQ ID NO：108〜110を含む可変ドメインを有する抗体重鎖を含み、ここで抗体重鎖のFc領域がジスルフィド結合型Fc領域ポリペプチドの1つである、1つまたは複数の抗原結合部位
を含み、抗原提示ドメインが可変ドメインの1つのN末端と連結していることを特徴とする、ジスルフィド結合型多価多機能タンパク質。

46．‐N末端からC末端への方向に、
（i）SEQ ID NO：01のT細胞応答誘発ペプチド、
（ii）SEQ ID NO：71のβ2-ミクログロブリン、ならびに
（iii）SEQ ID NO：72のクラスI MHC分子の細胞外ドメインα1、α2およびα3
を含む2つの抗原提示ドメインであって、少なくとも位置11および位置227にシステイン残基を有し、位置11および位置227にあるシステイン残基がジスルフィド結合を形成するか、またはシステイン残基が少なくとも位置11および位置108にあって、位置11および位置108にあるシステイン残基がジスルフィド結合を形成する抗原提示ドメイン、
‐2つのジスルフィド結合型Fc領域ポリペプチドを含み、そのうち第1のジスルフィド結合型Fc領域ポリペプチドがSEQ ID NO：102のアミノ酸配列を有し、第2のジスルフィド結合型Fc領域ポリペプチドがSEQ ID NO：103のアミノ酸配列を有する、厳密に1つの抗体Fc領域、ならびに
‐黒色腫関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（MCSP）と特異的に結合し、かつそれぞれが、SEQ ID NO：104〜106を含む可変ドメインを有する抗体軽鎖およびSEQ ID NO：108〜110を含む可変ドメインを有する抗体重鎖を含み、ここで抗体重鎖のFc領域がジスルフィド結合型Fc領域ポリペプチドである、2つの抗原結合部位
を含み、抗原提示ドメインが可変ドメインの1つのN末端と連結していることを特徴とする、ジスルフィド結合型多価多機能タンパク質。

47．‐N末端からC末端への方向に、
（i）SEQ ID NO：01のT細胞応答誘発ペプチド、
（ii）SEQ ID NO：71のβ2-ミクログロブリン、ならびに
（iii）SEQ ID NO：72のクラスI MHC分子の細胞外ドメインα1、α2およびα3
を含む2つの抗原提示ドメインであって、少なくとも位置11および位置227にシステイン残基を有し、位置11および位置227にあるシステイン残基がジスルフィド結合を形成するか、またはシステイン残基が少なくとも位置11および位置108にあって、位置11および位置108にあるシステイン残基がジスルフィド結合を形成する抗原提示ドメイン、
‐2つのジスルフィド結合型Fc領域ポリペプチドを含み、そのうち第1のジスルフィド結合型Fc領域ポリペプチドがSEQ ID NO：97のアミノ酸配列を有し、第2のジスルフィド結合型Fc領域ポリペプチドがSEQ ID NO：98のアミノ酸配列を有する、厳密に1つの抗体Fc領域、ならびに
‐黒色腫関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（MCSP）と特異的に結合し、かつそれぞれが、SEQ ID NO：105〜107を含む可変ドメインを有する抗体軽鎖およびSEQ ID NO：110〜112を含む可変ドメインを有する抗体重鎖を含み、ここで抗体重鎖のFc領域がジスルフィド結合型Fc領域ポリペプチドである、2つの抗原結合部位
を含み、抗原提示ドメインが重鎖可変ドメインのうち1つのN末端と連結していることを特徴とする、ジスルフィド結合型多価多機能タンパク質。

48．‐N末端からC末端への方向に、
（i）SEQ ID NO：01のT細胞応答誘発ペプチド、
（ii）SEQ ID NO：71のβ2-ミクログロブリン、ならびに
（iii）SEQ ID NO：72のクラスI MHC分子の細胞外ドメインα1、α2およびα3
を含む2つの抗原提示ドメインであって、少なくとも位置11および位置227にシステイン残基を有し、位置11および位置227にあるシステイン残基がジスルフィド結合を形成するか、またはシステイン残基が少なくとも位置11および位置108にあって、位置11および位置108にあるシステイン残基がジスルフィド結合を形成する抗原提示ドメイン、
‐2つのジスルフィド結合型Fc領域ポリペプチドを含み、そのうち第1のジスルフィド結合型Fc領域ポリペプチドがSEQ ID NO：102のアミノ酸配列を有し、第2のジスルフィド結合型Fc領域ポリペプチドがSEQ ID NO：103のアミノ酸配列を有する、厳密に1つの抗体Fc領域、ならびに
‐黒色腫関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（MCSP）と特異的に結合し、かつそれぞれが、SEQ ID NO：105〜107を含む可変ドメインを有する抗体軽鎖およびSEQ ID NO：110〜112を含む可変ドメインを有する抗体重鎖を含み、ここで抗体重鎖のFc領域がジスルフィド結合型Fc領域ポリペプチドである、2つの抗原結合部位
を含み、抗原提示ドメインが重鎖可変ドメインのうち1つのN末端と連結していることを特徴とする、ジスルフィド結合型多価多機能タンパク質。

49．‐SEQ ID NO：117または137の1つのポリペプチド鎖、
‐SEQ ID NO：118の1つのポリペプチド鎖、
‐それぞれがSEQ ID NO：119である2つのポリペプチド鎖
を含み、抗原提示ドメインが少なくとも位置11および位置227にシステイン残基を有し、位置11および位置227にあるシステイン残基がジスルフィド結合を形成するか、またはシステイン残基が少なくとも位置11および位置108にあって、位置11および位置108にあるシステイン残基がジスルフィド結合を形成することを特徴とする、ジスルフィド結合型多価多機能タンパク。

50．‐SEQ ID NO：117または137の2つのポリペプチド鎖、
‐それぞれがSEQ ID NO：119である2つのポリペプチド鎖
を含み、抗原提示ドメインが少なくとも位置11および位置227にシステイン残基を有し、位置11および位置227にあるシステイン残基がジスルフィド結合を形成するか、またはシステイン残基が少なくとも位置11および位置108にあって、位置11および位置108にあるシステイン残基がジスルフィド結合を形成することを特徴とする、ジスルフィド結合型多価多機能タンパク質。

51．‐N末端からC末端への方向に、
（i）β2-ミクログロブリン、ならびに
（ii）相対頻度が1％未満であるクラスI MHC分子の細胞外ドメインα1、α2およびα3、
または
（i）相対頻度が1％未満であるクラスI MHC分子の細胞外ドメインα1、α2およびα3、ならびに
（ii）β2-ミクログロブリン、
または
（i）T細胞応答誘発ペプチド、
（ii）β2-ミクログロブリン、ならびに
（iii）相対頻度が1％であるかもしくはそれを上回るクラスI MHC分子の細胞外ドメインα1、α2およびα3、
または
（i）T細胞応答誘発ペプチド、
（ii）相対頻度が1％であるかもしくはそれを上回るクラスI MHC分子の細胞外ドメインα1、α2およびα3、ならびに
（iii）β2-ミクログロブリン、
のいずれかを含む1つの抗原提示ドメインであって、少なくとも位置11および位置227にシステイン残基を有し、位置11および位置227にあるシステイン残基がジスルフィド結合を形成するか、またはシステイン残基が少なくとも位置11および位置108にあって、位置11および位置108にあるシステイン残基がジスルフィド結合を形成する抗原提示ドメイン、
‐厳密に1つの抗体Fc領域、ならびに
‐1つまたは複数の抗原結合部位
を含むことを特徴とする、ジスルフィド結合型多価多機能タンパク質。

52．‐N末端からC末端への方向に、
（i）T細胞応答誘発ペプチド、
（ii）β2-ミクログロブリン、ならびに
（iii）相対頻度が1％であるかまたはそれを上回るクラスI MHC分子の細胞外ドメインα1、α2およびα3
を含む1つの抗原提示ドメインであって、少なくとも位置11および位置227にシステイン残基を有し、位置11および位置227にあるシステイン残基がジスルフィド結合を形成するか、またはシステイン残基が少なくとも位置11および位置108にあって、位置11および位置108にあるシステイン残基がジスルフィド結合を形成する抗原提示ドメイン、
‐厳密に1つの抗体Fc領域、ならびに
‐1つまたは複数の抗原結合部位
を含むことを特徴とする、ジスルフィド結合型多価多機能タンパク質。

53．‐N末端からC末端への方向に
（i）SEQ ID NO：01のT細胞応答誘発ペプチド、
（ii）SEQ ID NO：71のβ2-ミクログロブリン、ならびに
（iii）SEQ ID NO：72のクラスI MHC分子の細胞外ドメインα1、α2およびα3
を含む1つの抗原提示ドメインであって、少なくとも位置11および位置227にシステイン残基を有し、位置11および位置227にあるシステイン残基がジスルフィド結合を形成するか、またはシステイン残基が少なくとも位置11および位置108にあって、位置11および位置108にあるシステイン残基がジスルフィド結合を形成する抗原提示ドメイン、
‐厳密に1つの抗体Fc領域、ならびに
‐1つまたは複数の抗原結合部位
を含むことを特徴とする、ジスルフィド結合型多価多機能タンパク質。

54．‐N末端からC末端への方向に、
（i）SEQ ID NO：01のT細胞応答誘発ペプチド、
（ii）SEQ ID NO：71のβ2-ミクログロブリン、ならびに
（iii）SEQ ID NO：72のクラスI MHC分子の細胞外ドメインα1、α2およびα3
を含む1つの抗原提示ドメインであって、少なくとも位置11および位置227にシステイン残基を有し、位置11および位置227にあるシステイン残基がジスルフィド結合を形成するか、またはシステイン残基が少なくとも位置11および位置108にあって、位置11および位置108にあるシステイン残基がジスルフィド結合を形成する抗原提示ドメイン、
‐2つのジスルフィド結合型Fc領域ポリペプチドを含み、そのうち第1のジスルフィド結合型Fc領域ポリペプチドがSEQ ID NO：97のアミノ酸配列を有し、第2のジスルフィド結合型Fc領域ポリペプチドがSEQ ID NO：98のアミノ酸配列を有する、厳密に1つの抗体Fc領域、ならびに
‐1つまたは複数の抗原結合部位
を含むことを特徴とする、ジスルフィド結合型多価多機能タンパク質。

55．‐N末端からC末端への方向に、
（i）SEQ ID NO：01のT細胞応答誘発ペプチド、
（ii）SEQ ID NO：71のβ2-ミクログロブリン、ならびに
（iii）SEQ ID NO：72のクラスI MHC分子の細胞外ドメインα1、α2およびα3
を含む1つの抗原提示ドメインであって、少なくとも位置11および位置227にシステイン残基を有し、位置11および位置227にあるシステイン残基がジスルフィド結合を形成するか、またはシステイン残基が少なくとも位置11および位置108にあって、位置11および位置108にあるシステイン残基がジスルフィド結合を形成する抗原提示ドメイン、
‐2つのジスルフィド結合型Fc領域ポリペプチドを含み、そのうち第1のジスルフィド結合型Fc領域ポリペプチドがSEQ ID NO：102のアミノ酸配列を有し、第2のジスルフィド結合型Fc領域ポリペプチドがSEQ ID NO：103のアミノ酸配列を有する、厳密に1つの抗体Fc領域、ならびに
‐1つまたは複数の抗原結合部位
を含むことを特徴とする、ジスルフィド結合型多価多機能タンパク質。

56．‐N末端からC末端への方向に、
（i）SEQ ID NO：01のT細胞応答誘発ペプチド、
（ii）SEQ ID NO：71のβ2-ミクログロブリン、ならびに
（iii）SEQ ID NO：72のクラスI MHC分子の細胞外ドメインα1、α2およびα3
を含む1つの抗原提示ドメインであって、少なくとも位置11および位置227にシステイン残基を有し、位置11および位置227にあるシステイン残基がジスルフィド結合を形成するか、またはシステイン残基が少なくとも位置11および位置108にあって、位置11および位置108にあるシステイン残基がジスルフィド結合を形成する抗原提示ドメイン、
‐2つのジスルフィド結合型Fc領域ポリペプチドを含み、そのうち第1のジスルフィド結合型Fc領域ポリペプチドがSEQ ID NO：97のアミノ酸配列を有し、第2のジスルフィド結合型Fc領域ポリペプチドがSEQ ID NO：98のアミノ酸配列を有する、厳密に1つの抗体Fc領域、ならびに
‐SEQ ID NO：104〜106を含む抗体軽鎖可変ドメインおよびSEQ ID NO：108〜110を含む抗体重鎖可変ドメインを含み、かつ黒色腫関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（MCSP）と特異的に結合する、1つまたは複数の抗原結合部位
を含むことを特徴とする、ジスルフィド結合型多価多機能タンパク質。

57．‐N末端からC末端への方向に、
（i）SEQ ID NO：01のT細胞応答誘発ペプチド、
（ii）SEQ ID NO：71のβ2-ミクログロブリン、ならびに
（iii）SEQ ID NO：72のクラスI MHC分子の細胞外ドメインα1、α2およびα3
を含む1つの抗原提示ドメインであって、少なくとも位置11および位置227にシステイン残基を有し、位置11および位置227にあるシステイン残基がジスルフィド結合を形成するか、またはシステイン残基が少なくとも位置11および位置108にあって、位置11および位置108にあるシステイン残基がジスルフィド結合を形成する抗原提示ドメイン、
‐2つのジスルフィド結合型Fc領域ポリペプチドを含み、そのうち第1のジスルフィド結合型Fc領域ポリペプチドがSEQ ID NO：102のアミノ酸配列を有し、第2のジスルフィド結合型Fc領域ポリペプチドがSEQ ID NO：103のアミノ酸配列を有する、厳密に1つの抗体Fc領域、ならびに
‐黒色腫関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（MCSP）と特異的に結合し、かつSEQ ID NO：104〜106を含む可変ドメインを有する抗体軽鎖およびSEQ ID NO：108〜110を含む可変ドメインを有する抗体重鎖を含む、1つまたは複数の抗原結合部位
を含むことを特徴とする、ジスルフィド結合型多価多機能タンパク質。

58．‐N末端からC末端への方向に、
（i）SEQ ID NO：01のT細胞応答誘発ペプチド、
（ii）SEQ ID NO：71のβ2-ミクログロブリン、ならびに
（iii）SEQ ID NO：72のクラスI MHC分子の細胞外ドメインα1、α2およびα3
を含む1つの抗原提示ドメインであって、少なくとも位置11および位置227にシステイン残基を有し、位置11および位置227にあるシステイン残基がジスルフィド結合を形成するか、またはシステイン残基が少なくとも位置11および位置108にあって、位置11および位置108にあるシステイン残基がジスルフィド結合を形成する抗原提示ドメイン、
‐2つのジスルフィド結合型Fc領域ポリペプチドを含み、そのうち第1のジスルフィド結合型Fc領域ポリペプチドがSEQ ID NO：97のアミノ酸配列を有し、第2のジスルフィド結合型Fc領域ポリペプチドがSEQ ID NO：98のアミノ酸配列を有する、厳密に1つの抗体Fc領域、ならびに
‐黒色腫関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（MCSP）と特異的に結合し、かつそれぞれが、SEQ ID NO：105〜107を含む可変ドメインを有する抗体軽鎖およびSEQ ID NO：110〜112を含む可変ドメインを有する抗体重鎖を含む、2つの抗原結合部位
を含むことを特徴とする、ジスルフィド結合型多価多機能タンパク質。

59．‐N末端からC末端への方向に、
（i）SEQ ID NO：01のT細胞応答誘発ペプチド、
（ii）SEQ ID NO：71のβ2-ミクログロブリン、ならびに
（iii）SEQ ID NO：72のクラスI MHC分子の細胞外ドメインα1、α2およびα3
を含む1つの抗原提示ドメインであって、少なくとも位置11および位置227にシステイン残基を有し、位置11および位置227にあるシステイン残基がジスルフィド結合を形成するか、またはシステイン残基が少なくとも位置11および位置108にあって、位置11および位置108にあるシステイン残基がジスルフィド結合を形成する抗原提示ドメイン、
‐2つのジスルフィド結合型Fc領域ポリペプチドを含み、そのうち第1のジスルフィド結合型Fc領域ポリペプチドがSEQ ID NO：102のアミノ酸配列を有し、第2のジスルフィド結合型Fc領域ポリペプチドがSEQ ID NO：103のアミノ酸配列を有する、厳密に1つの抗体Fc領域、ならびに
‐黒色腫関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（MCSP）と特異的に結合し、かつSEQ ID NO：105〜107を含む可変ドメインを有する抗体軽鎖およびSEQ ID NO：110〜112を含む可変ドメインを有する抗体重鎖を含む、1つまたは複数の抗原結合部位
を含み、抗体重鎖のFc領域がジスルフィド結合型Fc領域ポリペプチドの1つであることを特徴とする、ジスルフィド結合型多価多機能タンパク質。

60．‐N末端からC末端への方向に、
（i）SEQ ID NO：01のT細胞応答誘発ペプチド、
（ii）SEQ ID NO：71のβ2-ミクログロブリン、ならびに
（iii）SEQ ID NO：72のクラスI MHC分子の細胞外ドメインα1、α2およびα3
を含む1つの抗原提示ドメインであって、少なくとも位置11および位置227にシステイン残基を有し、位置11および位置227にあるシステイン残基がジスルフィド結合を形成するか、またはシステイン残基が少なくとも位置11および位置108にあって、位置11および位置108にあるシステイン残基がジスルフィド結合を形成する抗原提示ドメイン、
‐2つのジスルフィド結合型Fc領域ポリペプチドを含み、そのうち第1のジスルフィド結合型Fc領域ポリペプチドがSEQ ID NO：97のアミノ酸配列を有し、第2のジスルフィド結合型Fc領域ポリペプチドがSEQ ID NO：98のアミノ酸配列を有する、厳密に1つの抗体Fc領域、ならびに
‐黒色腫関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（MCSP）と特異的に結合し、かつ、SEQ ID NO：104〜106を含む可変ドメインを有する抗体軽鎖およびSEQ ID NO：108〜110を含む可変ドメインを有する抗体重鎖を含み、ここで抗体重鎖のFc領域がジスルフィド結合型Fc領域ポリペプチドの1つである、1つまたは複数の抗原結合部位
を含み、抗原提示ドメインが可変ドメインの1つのN末端と連結していることを特徴とする、ジスルフィド結合型多価多機能タンパク質。

61．‐N末端からC末端への方向に、
（i）SEQ ID NO：01のT細胞応答誘発ペプチド、
（ii）SEQ ID NO：71のβ2-ミクログロブリン、ならびに
（iii）SEQ ID NO：72のクラスI MHC分子の細胞外ドメインα1、α2およびα3
を含む1つの抗原提示ドメインであって、少なくとも位置11および位置227にシステイン残基を有し、位置11および位置227にあるシステイン残基がジスルフィド結合を形成するか、またはシステイン残基が少なくとも位置11および位置108にあって、位置11および位置108にあるシステイン残基がジスルフィド結合を形成する抗原提示ドメイン、
‐2つのジスルフィド結合型Fc領域ポリペプチドを含み、そのうち第1のジスルフィド結合型Fc領域ポリペプチドがSEQ ID NO：102のアミノ酸配列を有し、第2のジスルフィド結合型Fc領域ポリペプチドがSEQ ID NO：103のアミノ酸配列を有する、厳密に1つの抗体Fc領域、ならびに
‐黒色腫関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（MCSP）と特異的に結合し、かつそれぞれが、SEQ ID NO：104〜106を含む可変ドメインを有する抗体軽鎖およびSEQ ID NO：108〜110を含む可変ドメインを有する抗体重鎖を含み、ここで抗体重鎖のFc領域がジスルフィド結合型Fc領域ポリペプチドである、2つの抗原結合部位
を含み、抗原提示ドメインが可変ドメインの1つのN末端と連結していることを特徴とする、ジスルフィド結合型多価多機能タンパク質。

62．‐N末端からC末端への方向に、
（i）SEQ ID NO：01のT細胞応答誘発ペプチド、
（ii）SEQ ID NO：71のβ2-ミクログロブリン、ならびに
（iii）SEQ ID NO：72のクラスI MHC分子の細胞外ドメインα1、α2およびα3
を含む1つの抗原提示ドメインであって、少なくとも位置11および位置227にシステイン残基を有し、位置11および位置227にあるシステイン残基がジスルフィド結合を形成するか、またはシステイン残基が少なくとも位置11および位置108にあって、位置11および位置108にあるシステイン残基がジスルフィド結合を形成する抗原提示ドメイン、
‐2つのジスルフィド結合型Fc領域ポリペプチドを含み、そのうち第1のジスルフィド結合型Fc領域ポリペプチドがSEQ ID NO：97のアミノ酸配列を有し、第2のジスルフィド結合型Fc領域ポリペプチドがSEQ ID NO：98のアミノ酸配列を有する、厳密に1つの抗体Fc領域、ならびに
‐黒色腫関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（MCSP）と特異的に結合し、かつそれぞれが、SEQ ID NO：105〜107を含む可変ドメインを有する抗体軽鎖およびSEQ ID NO：110〜112を含む可変ドメインを有する抗体重鎖を含み、ここで抗体重鎖のFc領域がジスルフィド結合型Fc領域ポリペプチドである、2つの抗原結合部位
を含み、抗原提示ドメインが重鎖可変ドメインのうち1つのN末端と連結していることを特徴とする、ジスルフィド結合型多価多機能タンパク質。

63．‐N末端からC末端への方向に、
（i）SEQ ID NO：01のT細胞応答誘発ペプチド、
（ii）SEQ ID NO：71のβ2-ミクログロブリン、ならびに
（iii）SEQ ID NO：72のクラスI MHC分子の細胞外ドメインα1、α2およびα3
を含む1つの抗原提示ドメインであって、少なくとも位置11および位置227にシステイン残基を有し、位置11および位置227にあるシステイン残基がジスルフィド結合を形成するか、またはシステイン残基が少なくとも位置11および位置108にあって、位置11および位置108にあるシステイン残基がジスルフィド結合を形成する抗原提示ドメイン、
‐2つのジスルフィド結合型Fc領域ポリペプチドを含み、そのうち第1のジスルフィド結合型Fc領域ポリペプチドがSEQ ID NO：102のアミノ酸配列を有し、第2のジスルフィド結合型Fc領域ポリペプチドがSEQ ID NO：103のアミノ酸配列を有する、厳密に1つの‐抗体Fc領域、ならびに
黒色腫関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（MCSP）と特異的に結合し、かつそれぞれが、SEQ ID NO：105〜107を含む可変ドメインを有する抗体軽鎖およびSEQ ID NO：110〜112を含む可変ドメインを有する抗体重鎖を含み、ここで抗体重鎖のFc領域がジスルフィド結合型Fc領域ポリペプチドである、2つの抗原結合部位
を含み、抗原提示ドメインが重鎖可変ドメインのうち1つのN末端と連結していることを特徴とする、ジスルフィド結合型多価多機能タンパク質。

64．MCSP結合部位が、SEQ ID NO：108のアミノ酸配列を含むHVR-H1、SEQ ID NO：109のアミノ酸配列を含むHVR-H2、およびSEQ ID NO：110のアミノ酸配列を含むHVR-H3を含む抗体重鎖可変ドメインを含むことを特徴とする、項目1〜63のいずれか一項記載の多機能タンパク質。

65．MCSP結合部位が、SEQ ID NO：104のアミノ酸配列を含むHVR-L1；SEQ ID NO：105のアミノ酸配列を含むHVR-L2；およびSEQ ID NO：106のアミノ酸配列を含むHVR-L3を含む抗体軽鎖可変ドメインを含むことを特徴とする、項目1〜63のいずれか一項記載の多機能タンパク質。

66．MCSP結合部位が、SEQ ID NO：108のアミノ酸配列を含むHVR-H1；SEQ ID NO：109のアミノ酸配列を含むHVR-H2；SEQ ID NO：110のアミノ酸配列を含むHVR-H3を含む抗体重鎖可変ドメイン、ならびにSEQ ID NO：104のアミノ酸配列を含むHVR-L1；SEQ ID NO：105のアミノ酸配列を含むHVR-L2；およびSEQ ID NO：106のアミノ酸配列を含むHVR-L3を含む抗体軽鎖可変ドメインを含むことを特徴とする、項目1〜63のいずれか一項記載の多機能タンパク質。

67．MCSP結合部位が、SEQ ID NO：111のアミノ酸配列を含むHVR-H1、SEQ ID NO：112のアミノ酸配列を含むHVR-H2、およびSEQ ID NO：110のアミノ酸配列を含むHVR-H3を含む抗体重鎖可変ドメインを含むことを特徴とする、項目1〜63のいずれか一項記載の多機能タンパク質。

68．MCSP結合部位が、SEQ ID NO：107のアミノ酸配列を含むHVR-L1；SEQ ID NO：105のアミノ酸配列を含むHVR-L2；およびSEQ ID NO：106のアミノ酸配列を含むHVR-L3を含む抗体軽鎖可変ドメインを含むことを特徴とする、項目1〜63のいずれか一項記載の多機能タンパク質。

69．MCSP結合部位が、SEQ ID NO：111のアミノ酸配列を含むHVR-H1；SEQ ID NO：112のアミノ酸配列を含むHVR-H2；SEQ ID NO：110のアミノ酸配列を含むHVR-H3を含む抗体重鎖可変ドメイン、ならびにSEQ ID NO：107のアミノ酸配列を含むHVR-L1；SEQ ID NO：105のアミノ酸配列を含むHVR-L2；およびSEQ ID NO：106のアミノ酸配列を含むHVR-L3を含む抗体軽鎖可変ドメインを含むことを特徴とする、項目1〜63のいずれか一項記載の多機能タンパク質。

70．MCSP結合部位が、SEQ ID NO：114のアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性を有する抗体重鎖可変ドメイン；およびSEQ ID NO：113のアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性を有する抗体軽鎖可変ドメインを含むことを特徴とする、項目1〜63のいずれか一項記載の多機能タンパク質。

71．MCSP結合部位が、SEQ ID NO：114の抗体重鎖可変ドメイン；およびSEQ ID NO：113の抗体軽鎖可変ドメインを含むことを特徴とする、項目1〜63のいずれか一項記載の多機能タンパク質。

72．MCSP結合部位がSEQ ID NO：114およびSEQ ID NO：113を含むことを特徴とする、項目1〜63のいずれか一項記載の多機能タンパク質。

73．MCSP結合部位が、SEQ ID NO：116のアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性を有する抗体重鎖可変ドメイン；およびSEQ ID NO：115のアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性を有する抗体軽鎖可変ドメインを含むことを特徴とする、項目1〜63のいずれか一項記載の多機能タンパク質。

74．MCSP結合部位が、SEQ ID NO：116の抗体重鎖可変ドメイン；およびSEQ ID NO：115の抗体軽鎖可変ドメインを含むことを特徴とする、項目1〜63のいずれか一項記載の多機能タンパク質。

75．MCSP結合部位がSEQ ID NO：116およびSEQ ID NO：115を含むことを特徴とする、項目1〜63のいずれか一項記載の多機能タンパク質。

76．項目1〜75のいずれか一項記載のジスルフィド結合型多価多機能タンパク質をコードする核酸。

77．項目76記載の核酸を含む宿主細胞。

78．項目1〜75のいずれか一項記載のジスルフィド結合型多価多機能タンパク質と、任意で薬学的に許容される担体とを含む、医薬製剤。

79．医薬として用いるための、項目1〜75のいずれか一項記載の多機能タンパク質。

80．癌またはウイルス感染症を治療するのに用いるための、項目1〜75のいずれか一項記載の多機能タンパク質。

81．個体のウイルス特異的細胞傷害性T細胞を標的に対して誘引させるのに用いるための、項目1〜75のいずれか一項記載の多機能タンパク質。

82．癌細胞またはウイルス感染細胞の除去に用いるための、項目1〜75のいずれか一項記載の多機能タンパク質。

83．項目1記載のジスルフィド結合型多価多機能タンパク質の組換え生産のための方法であって、
‐項目76記載の核酸を含む真核細胞を培養する段階、および
‐ジスルフィド結合型多価多機能タンパク質を細胞または培養培地から回収する段階、
を含み、
ジスルフィド結合型多価多機能タンパク質が、β2-ミクログロブリンならびにクラスI MHC分子の細胞外ドメインα1、α2およびα3を含む、ちょうど2つまたはそれを上回る抗原提示ドメインを含み、抗原提示ドメインが少なくとも位置11および位置227にシステイン残基を有し、位置11および位置227にあるシステイン残基がジスルフィド結合を形成するか、または抗原提示ドメインが少なくとも位置11および位置108にシステイン残基を有し、位置11および位置108にあるシステイン残基がジスルフィド結合を形成する、方法。

84．医薬の製造における、項目1〜75のいずれか一項記載の多機能タンパク質の使用。

85．医薬が癌またはウイルス感染症の治療用である、項目84記載の使用。

86．医薬が、個体のウイルス特異的細胞傷害性T細胞を標的に誘引させるためのものである、項目84記載の使用。

87．医薬が癌細胞またはウイルス感染細胞の除去のためのものである、項目84記載の使用。

88．個体のウイルス特異的細胞傷害性T細胞個体における標的に対して誘引させる方法であって、個体のウイルス特異的細胞傷害性T細胞を標的に対して誘引させるために、個体に対して、項目1〜75のいずれか一項記載のジスルフィド結合型多価多機能タンパク質の有効量を投与する段階を含む方法。

89．個体における癌細胞またはウイルス感染細胞の除去の方法であって、癌細胞またはウイルス感染細胞を除去するために、個体に対して、項目1〜75のいずれか一項記載のジスルフィド結合型多価多機能タンパク質の有効量を投与する段階を含む方法。

前述の発明を、理解を明確にする目的で、例証および例によってある程度詳細に説明してきたが、説明および例は、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。本明細書において引用されるすべての特許および科学文献の開示内容は、それらの全体が参照により明示的に組み入れられる。

V．実施例
以下は、本発明の方法および組成物の例である。上記提供される一般的な説明を前提として、他のさまざまな態様が実施され得ることが理解される。

実施例1
ヒトドナーからのCMV特異的CD8陽性T細胞の単離および刺激のための手順
PBLの単離
PBLは、ヒトドナー血液（Greiner bio-one、カタログ番号227290）からFicoll勾配遠心分離によって単離した。PBLを、5％ヒト血清（Sigma カタログ番号H2520）、2mM L-グルタミン（PAN Biotech、カタログ番号P04-80100）、100μg／mlペニシリン／ストレプトマイシン（Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany、カタログ番号14001100）を加えたRPMI中で培養した。

PBLの刺激
細胞（2×10⁷個／ml）を、50μg／mlのCMV pp65由来ペプチド（SEQ ID NO：01）を加えた細胞培養培地中で、細胞培養条件下（37℃、5％ CO₂、湿度80％）で2時間培養した。その後、細胞懸濁液を培養培地で20倍希釈し、96ウェル当たり細胞2×10⁵個の播種密度で、平底96ウェルプレート中で培養した。4〜5日後に、20U／mlのIL-2（Roche、カタログ番号11011456001）、25ng／mlのIL-7（Peprotech、カタログ番号200-01）および25ng／mlのIL-15（Peprotech、カタログ番号200-15）を添加し、細胞をさらに7〜8日間培養した。T細胞の刺激は、顕微鏡下で細胞クラスターとして視認しうる。

PBLの再刺激
T細胞を、ペプチドでパルス刺激した同じドナーの自己一次PBL（新たに調製するか、または凍結ストックから得るかのいずれか）である刺激細胞とともに共培養した。刺激細胞を、上記のようにペプチドでパルス刺激した。ペプチドとのインキュベーションの2時間後に、PBLに放射線照射を行い（4000ラド；STS GmbH OB29 Nr.9510-5）、ペプチドを含まない培養培地中で2回洗浄した。再刺激は、96ウェルプレート丸底プレート中で行った。96ウェル当たり8×10⁴〜1×10⁵個の刺激細胞を用いた。初代培養物からの細胞を培養培地で2回洗浄し、200μlの培養培地中に再懸濁させて、80μlを刺激細胞の各ウェルに移した。3日後に、20U／mlのIL-2、25ng／mlのIL-7および25ng／mlのIL-15を添加した。細胞は増殖し、2〜3日毎に新鮮な培地を入れた新しいウェル中で増殖させた。

T細胞の分析
細胞をCD8発現（BD、カタログ番号345772）およびCMV特異的T細胞受容体（ProImmune、カタログ番号F008-4A-E）に関して染色し、FACSで分析した。

細胞培養培地
RPMI1640（PAN Biotech、カタログ番号P04-17500）、5％ヒト血清（HS；Sigma カタログ番号H2520）、2mM L-グルタミン（PAN Biotech、カタログ番号P04-80100）、100μg／mlペニシリン／ストレプトマイシン（Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany、カタログ番号14001100）。

結果
末梢血リンパ球（PBL）に由来する4人のヒトドナーのFACS分析を行った。CMV由来ペプチド（NLVPMVATV（SEQ ID NO：01））が負荷された、T細胞受容体（TCR）を認識するMHC-クラスI（HLA-A^*0201）を担持するT細胞を染色するために、細胞を、APC結合Pro5五量体（ProImmune、カタログ番号F008-4A-E）と組み合わされたFITC結合抗CD8抗体（BD、カタログ番号345772）で標識した。結果については図4を参照されたい。第0日に、ドナー1および4は少数のCMV特異的CD8T細胞を保有している（それぞれ0.08％および0.1％）。ドナー2および3は、より多くのCMV特異的CD8T細胞を末梢血中に保有している（それぞれ0.25％および3.12％）。CMV由来ペプチドでパルス刺激した自己細胞による刺激の14日後には、ドナー2および3のみがCMV特異的CD8T細胞の有意な増加を示し（それぞれ6.2％および71.2％）、一方、ドナー1および4はCMV特異的CD8T細胞数の増加を示していない（それぞれ0.01％および0.05％）。CMV由来ペプチドでパルス刺激した自己細胞による二次刺激の14日後、ドナー2および3はCMV特異的CD8T細胞の増加を示している（それぞれ15.1％および96.6％）。

実施例2
細胞傷害性アッセイ
急性リンパ芽球性白血病細胞MN60は、A^*0201 HLA-Aアレルを保有する。MN60細胞（1×10⁶個／ml）を、50μg／mlのCMV pp65ペプチド（SEQ ID NO：01）とともに細胞培養条件下（37℃、5％ CO₂、湿度80％）で45分間インキュベートした。インキュベーションにより、HLA-A^*0201ペプチド結合溝においてペプチド交換が生じる。ペプチド交換したMN60細胞を遠心分離して、PBS（PanBiotech、カタログ番号P04-36500）で1×10⁶個／mlの密度に希釈し、1μMの細胞トレーサーカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（CFSE, Invitrogen、カタログ番号34554）によって室温（RT）で15分間染色した。細胞をその後にPBSで1回洗浄し、AIM-V培地（Gibco、カタログ番号0870112DK）で1×10⁵個／mlに希釈した。アッセイのために、MN60細胞（標的細胞）を96ウェル丸底プレート中で、CMV特異的ヒトドナー3由来のCD8⁺ T細胞（エフェクター細胞、実施例1を参照）とともに細胞培養条件下で4時間共培養した。エフェクター対標的細胞比は4：1であった。死滅細胞を1μl／100μlのヨウ化プロピジウム（PI、Sigma、カタログ番号P-4864）で染色し、FACSで分析した。

結果
CMVペプチドを負荷されたMN60腫瘍細胞の溶解を通じての、刺激されたCTLの細胞溶解能力を分析するためにフローサイトメトリー分析を行った。

CMV由来ペプチドを負荷していないMN60細胞の共培養を行った。MN60細胞はFITC陽性である。エフェクター細胞はFITC陰性である。死滅細胞はPI陽性であり、生細胞はPI陰性である。CMV由来ペプチドが負荷されていない場合、MN60細胞の85％超が生存していることが見てとれる（Q2およびQ4）。

CMV由来ペプチドを負荷されたMN60細胞の共培養を行った。MN60細胞の80％超が死滅している（Q2およびQ4）が、一方、FACS分析の間で、生きているエフェクター細胞と死滅したエフェクター細胞との比は顕著には変化しておらず、このことはCMV-ペプチドを負荷された標的細胞の特異的溶解を指し示している。

エフェクター対標的細胞比に応じた、CMVペプチドを負荷されたMN60腫瘍細胞の溶解を通じての、刺激されたCTLの細胞溶解能力を分析するためのフローサイトメトリー分析。

細胞傷害性アッセイは上述のように実施した。さまざまなエフェクター細胞対標的細胞比を、標的細胞当たりエフェクター細胞0.5個から標的細胞当たりエフェクター細胞4個までの範囲で適用した。インキュベーション時間は4時間とした。CMV由来ペプチドを負荷されなかったMN60細胞は、エフェクター対標的比の増大を伴う死滅細胞の数の増加を示さず、すなわち、8％から13％までの範囲であり、比は0.5：1〜4：1である。

CMV由来ペプチドを負荷されたMN60細胞のほぼ20％は4時間以内に既に死滅しており、エフェクター対標的比は0.5：1である。死滅した細胞の数は急激に増加し、それに伴ってエフェクター対標的比も増大し、最大83％、エフェクター細胞／標的細胞比4：1に達する。

実施例3
DNAの調製、トランスフェクション、発現、精製および分析
DNAの調製
細菌の一晩LB培養液250mlを採集し、プラスミドDNAを、製造元のプロトコールに従って抽出した（High speed Maxi kit, Qiagen、カタログ番号12663）。得られたプラスミドDNAを1mlのTE緩衝液中に溶出させ、DNA濃度を分光光度測定によって測定した（Epoch, BioTek）。

最終的な発現ベクターは、以下のエレメントを含んでいた。
‐エンドヌクレアーゼ制限部位HindIII、NheI、
‐CMV-プロモーター、
‐5'UTR 1（ヒトCMVに由来）、
‐イントロンA、
‐5'UTR 2、
‐アンピシリン耐性遺伝子、
‐BGHポリA部位（ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル）、
‐pUC Ori。

CMV由来ペプチドおよびIGF1R結合特異性（抗IGF1R抗体）を含む多機能タンパク質のエレメントのアミノ酸配列：

CMV由来ペプチドおよびMCSP結合特異性（抗MCSP抗体）を含む多機能タンパク質のエレメントのアミノ酸配列：

トランスフェクション
HEK 293細胞を、トランスフェクションの前日に8×10⁵個／mlに希釈した。約1〜1.6×10⁶個／mlを、製造元のプロトコールに従ってトランスフェクトした。30mlの最終トランスフェクション容積に対して、30μgのDNAをOpti-MEM（登録商標）I還元型血清培地（Gibco、カタログ番号31985070）で最終容積1mlに希釈した。1μgのDNA当たり2μlの293fectin（商標）試薬（Invitrogen、カタログ番号12347019）をOpti-MEM（登録商標）培地で1mlの最終容積に均等に希釈し、5分間インキュベートした。インキュベーションの後、希釈したDNAを、希釈した293fectin（商標）試薬に添加し、穏やかに混合し、さらに20〜30分間インキュベートし、その後、28mlのHEK293細胞に滴下ピペッティングして、30mlの最終容積を得た。細胞を、125rpmで回転するオービタルシェーカーで細胞培養条件下（37℃、8％ CO₂、湿度80％）でインキュベートし、72時間後に採集した。採集物を1000rpmで10分間、3000rpmで10分間遠心分離し、22μmの滅菌フィルターを通して濾過した（Millipore、カタログ番号SCGPU05RE）。

ウェスタンブロット法
細胞培養上清の500μlを、Pall Nanosep Omega-Membrane 30KD遠心分離デバイス（Pall、カタログ番号OD030C33）を用いて50μlの容積に濃縮した。各濃度の17.5μlを、4×XT試料緩衝液（Bio Rad、カタログ番号161-0791）および20×XT還元剤（BioRad、カタログ番号161-0792）で最終容積25μlに希釈し、96℃で8分間加熱し、4〜12％のCriterion XTプレキャストゲル（カタログ番号345-0124）に対して適用した。ブロット法は、Trans-blot Pureニトロセルロース膜（0.45μm）（BioRad、カタログ番号162-0117）上で、20Vで30分間、Trans-Blot SDセミドライトランスファーセル（BioRad）を用いて行った。膜のブロッキングは、室温で1時間、1×ウエスタンブロッキング試薬（Roche、カタログ番号11921681001）を用いて行った。染色は、室温で1時間、ペルオキシダーゼ結合ポリクローナルウサギ抗ヒトκ軽鎖（DAKO、カタログ番号P0129、1：3000に希釈）およびポリクローナルウサギ抗ヒトIgG抗体HRPコンジュゲート（DAKO、カタログ番号P0214、1：5000に希釈）を用いて行った。発光検出はLUMI-イメージャF1（Roche）を用いて行った。

精製
細胞を遠心分離によって培地から除去した。多機能タンパク質を、プロテインAアフィニティークロマトグラフィー（AKTA-Avant上のMabSelectセファロース）によって上清から精製した。溶出された多機能タンパク質を、Amicon遠心管を用いて3mg／mlのタンパク質濃度に濃縮した。アリコートを、サイズ排除クロマトグラフィーにて分析した（HPLC TSKgel GFC300 Sys89）。凝集物を除去するために、Superdex 200上で調製用SECを行い、20mMヒスチジン、140mM NaCl、pH6.0中に融合タンパク質をバッファリングした。溶出された多機能タンパク質を、Amicon遠心管を用いて1mg／mlのタンパク質濃度に濃縮し、滅菌濾過した（孔径0.2μm）。

分析法
多機能タンパク質の試料を、UV分光光度計を用いてOD280により分析し、溶液中のタンパク質濃度を決定した。このために必要な吸光係数は、Paceによるアミノ酸配列から計算した（Pace, et al., Protein Science 4 (1995) 2411-2423）。試料中の単量体性の凝集して分解した種の含有量を決定するために、サイズ排除クロマトグラフィー（SE-HPLC）を、移動相として0.25MのKCl、pH 7.0を含む0.2Mのリン酸カリウム緩衝液を用いて、TSK-Gel300SWXLまたはスーパーデックス200カラムで行った。ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）ポリアクリルアミドゲル電気泳動（還元および非還元）を、生成物関連の分解生成物および無関係な不純物に関して、多機能タンパク質製剤の純度を分析するために実施した。各鎖の正確な質量／実体を確認し、化学的修飾を検出するために、エレクトロスプレーイオン化質量分析（ESI-MS）を、還元された試料（TCEP）および脱グリコシル化した試料（N-グリコシダーゼF）を用いて行った。完全に構築されたタンパク質の性状および質を分析し、生成物に関連する潜在的な副生成物を検出するために、脱グリコシル化された試料のESI-MSを行った。

SDS-PAGEおよびクーマシー染色の方法
デバイス：Invitrogen XCell Sure Lock Mini-Cell
ゲル：4〜20％トリス-グリシンゲル、Invitrogen EC6025BOX
緩衝液：トリス-グリシンSDS泳動緩衝液（10×）、Invitrogen LC2675-5
試料緩衝液：トリス-グリシンSDS泳動緩衝液（2×）、Invitrogen LC2676
還元緩衝液：NuPAGE試料還元剤（10×）、Invitrogen NP0004
分子量マーカー：マーク12、分子量標準、Invitrogen LC5677

タンパク質試料の調製
試料を緩衝液により1mg／mlのタンパク質濃度に調整した。試料の還元のために以下の手順を行った：
‐還元緩衝液：4mlの試料緩衝液（2×）および1mlの還元緩衝液（10x）
‐試料を1：1に還元緩衝液で希釈する
‐70℃で5分間インキュベートする

ゲル電気泳動は、90分間125Vで行った。ゲルはSimply Blue Safe Stain（Invitrogen、カタログ番号LC6065）で染色した。

結果
表

前の表に従って選択された多機能タンパク質の番号1、2Aおよび3Aのクーマシー染色によるSDSゲルおよび対応するSECクロマトグラムを図5と6に示す。定義された多機能タンパク質が得られることが見てとれる。

実施例4
ヒトIGF-1R陽性細胞株に対するMHC-I-抗IGF-1R多機能タンパク質の結合
H460M2細胞を、AIM-V培地中で8×10⁵個／mlに希釈した（Gibco、カタログ番号0870112DK）。細胞懸濁液の500μlを、本明細書において報告される10μgのMHC-I-抗IGF-1R多機能タンパク質により、4℃または37℃のいずれかで1時間染色した。その後、細胞を氷冷AIM-V培地で1回洗浄し、R-PEとコンジュゲートさせたヤギF（ab'）₂抗ヒトIgG（H＋L）抗体である（Dianova、カタログ番号109-116-088、希釈1：50）第2の抗体により、4℃で30分間染色した。その後、細胞を氷冷AIM-V培地で1回洗浄し、生細胞をゲーティングしてFACS Canto II（BD Bioscience）を介して蛍光を測定した。二重特異性抗体をアイソタイプ対照としての役割を果たし、抗IGF-1R抗体（例えば、WO 2004／087756号およびWO 2007／115814号を参照）は陽性対照としての役割を果たした。

結果
PE-蛍光測定のシフト（X軸）を考慮すると、MHC-I-抗IGF-1R多機能タンパク質は、対照抗体と比較してH460M2標的細胞との結合の点では視認しうる違いを示さない。また、MHC-I-抗IGF-1R多機能タンパク質とのインキュベーションを4℃または37℃のいずれで行うかに関しても違いはみられない。アイソタイプ対照とのインキュベーションも、蛍光標識した二次抗体のみとのインキュベーションのいずれも、PEの蛍光測定にいかなるシフトをも示さない。クラスIのMHC分子の融合にもかかわらず、本明細書におけるMHC-I-抗IGF-1R多機能タンパク質の抗体可変ドメインは依然としてH460M2標的細胞と結合する。

実施例5
抗原発現細胞のインビトロでの除去
I24標的細胞（1x10⁵個／ml）を、WillCoガラスボトムディッシュ（FA. WillCo Wells BV, REF GWST-3522）上に、細胞培養培地（2mMのL-グルタミン、1mMのピルビン酸ナトリウム、0.1mMのNEAA、および10％（v／w）FCSを加えたRPMI 1640）中にて24〜48時間にわたって播種した。WillCoガラスボトムディッシュは、ディッシュ当たり50μg／mlのポリ-L-リジン塩酸塩（Sigma Aldrich、カタログ番号P2658）によってあらかじめ30分間コーティングしておいた。ディッシュをコーティングした後に、滅菌組織培養グレードの水で十分にすすぎ洗いし、2時間乾燥させた。

培養後に細胞培養培地を取り出し、1つの[CMV-pp65-ペプチド]-[リンカー1]-[β2-ミクログロブリン]-[リンカー2]-[HLA-A-α1-α2-α3]-「リンカー3]-[hole変異を有するIgG1-L234A、L235A突然変異体]融合ポリペプチド、1つのIgG1-L234A、L235A突然変異型Fc領域knob変異体ジスルフィド結合ポリペプチドおよび1つのIg軽鎖を含むIGF-1R結合性多機能タンパク質であって、本明細書において報告されるようにヒトIGF-1Rと特異的に結合する多機能タンパク質（実施例3参照）を、3mMのK⁺ Krebs Ringer HEPES緩衝液 pH7.3（0.5mM DL-ジチオスレイトール、1mMアスコルビン酸、および4mMグルタチオンを加えた）中で、5μg／mlの最終濃度になるように添加した。

T細胞は標的細胞対エフェクター細胞比が1：10となるように添加した。画像化はZeissのAxiovert135顕微鏡で4時間行った。

結果
IGF-1R結合性多機能タンパク質は、ヒトIGF-1Rを発現するI24 3T3細胞（大きく付着性に増殖している細胞）の溶解を媒介した。溶解は、ヒトCMV特異的T細胞によって媒介される（円形であるかまたはアメーバ状に遊走する小細胞）。I24細胞を、5μg／mlの濃度での多機能タンパク質、および（HLA-A0201+／CMVペプチドパルス化APCであらかじめ活性化された）ヒトCMV特異的T細胞とインキュベートする。56分および76分でのT細胞とのI24細胞の相互作用、およびその後125分後でのI24細胞の崩壊に注目されたい。

本明細書において報告される抗原結合性多機能タンパク質の非存在下での、ヒトCMV特異的T細胞（円形であるかまたはアメーバ状に遊走する小細胞）によるI24 3T3細胞（大きく付着性に増殖している細胞、白い矢印）の溶解の欠如を示す対照を実施した。I24細胞は（HLA-A0201⁺／CMVペプチドパルス化APCであらかじめ活性化された）特異的細胞傷害性T細胞とともにインキュベートされる。時間の経過はそれぞれの画像の下に表示されている。

実施例6
細胞傷害性アッセイ
細胞培養培地（50μl）を、バックグラウンド測定を行うためXcelligence 96ウェルE-プレート（Roche、カタログ番号05232368001）の各ウェルにピペッティングした。

I24細胞は細胞培養培地中（RPMI 1640、2mM L-グルタミン、1mM ピルビン酸ナトリウム、0.1mMのNEAA、10％（w／v）のFCS）で1×10⁶個／mlに希釈され、50μl（2×10⁴細胞／ウェル）をXcelligence 96ウェルプレートの各ウェルに最終容積100μlとしてピペッティングし、24時間培養した（37℃、8％ CO₂、湿度80％）。24時間後に、培地を除去し、細胞を200μlのAIM-V（無血清培地（Invitrogen）T細胞培地（カタログ番号）：12055-083）培地で洗浄した。本明細書において報告される、1つの[CMV-pp65-ペプチド]-[リンカー1]-[β2-ミクログロブリン]-[リンカー2]-[HLA-A-α1-α2-α3]-[リンカー3]-[hole変異を有するIgG1-L234A、L235A変異体]融合ポリペプチド、1つのIgG1-L234A、L235A突然変異型Fc領域knob変異体ジスルフィド結合ポリペプチド、および1つのIg軽鎖を含むIGF-1R結合性多機能タンパク質であって、ヒトIGF-1Rと特異的に結合する多機能タンパク質を、洗浄した標的細胞に対して、AIM-V培地中で最終濃度1μg／mlとなるように添加した。かなりの比率にあるエフェクター細胞を、150μlの最終容積となるまでAIM-V培地に添加した。ヒトIGF-1Rを対象とするアフコシル化IgG1モノクローナル抗体（抗IGF-1R抗体-アフコシル化）および非結合ヒト抗ジゴキシゲニン抗体（抗ジゴキシゲニン抗体）をそれぞれ、アイソタイプ対照および特異的抗体対照として用いた。測定はXcelligenceシステム（Roche）によってそれぞれ6〜9時間行った。

結果
IGF-1R結合多機能タンパク質は、ヒトCMV特異的T細胞を通じてのH460M2腫瘍細胞の溶解を誘発する。

腫瘍細胞を、1つの[CMV-pp65-ペプチド]-[リンカー1]-[β2-ミクログロブリン]-[リンカー2]-[HLA-A-α1-α2-α3]-[リンカー3]-[hole変異を有するIgG1-L234A、L235A突然変異体]融合ポリペプチド、1つのIgG1-L234A、L235A突然変異型Fc領域knob変異体ジスルフィド結合ポリペプチド、および1つのIg軽鎖を含む1μg／mlの多機能タンパク質であって、ヒトIGF-1Rと特異的に結合する多機能タンパク質、ならびにそれぞれの比率（1：1.5〜1：0.5）にある特異的T細胞とともに、4時間インキュベートした（図8を参照）。溶解のパーセンテージは各バーの上に示されている。ヒトIGF-1R（MAB IGF-1R-afu）を対象とするアフコシル化IgG1モノクローナル抗体は有意な腫瘍細胞溶解を誘発しなかった。

本明細書において報告される多機能タンパク質は、ヒトCMV特異的T細胞を通じてI24 3T3腫瘍細胞の溶解を誘発する。

標的細胞を、1つの[CMV-pp65-ペプチド]-[リンカー1]-[β2-ミクログロブリン]-[リンカー2]-[HLA-A-α1-α2-α3]-[リンカー3]-[hole変異を有するIgG1-L234A、L235A変異体]融合ポリペプチド、1つのIgG1-L234A、L235A突然変異型Fc領域knob変異体ジスルフィド結合ポリペプチド、および1つのIg軽鎖を含む1μg／mlの抗原結合性多機能タンパク質であって、ヒトIGF-1Rと特異的に結合する多機能タンパク質、ならびにそれぞれの比率（1：1.5〜1：0.5）にある特異的T細胞とともに、4時間インキュベートした（図9参照）。溶解のパーセンテージは各バーの上に示されている。ヒトIGF-1Rを対象とするアフコシル化IgG1モノクローナル抗体（抗IGF-1R抗体-アフコシル化）および非結合ヒト抗ジゴキシゲニン抗体（抗ジゴキシゲニン抗体）は、標的細胞の有意な溶解を誘発しなかった。

実施例7
インビトロでの有効性
IGF-1R陽性の肺腺癌細胞株H460M2を、hCMV由来ペプチドおよび抗IGF-1R抗体を含む1μg／mlの多機能タンパク質、ならびに低いエフェクター細胞対標的細胞比（腫瘍細胞当たり特異的T細胞が1.5〜0.5個）にあるヒトCMV特異的CD8陽性T細胞とともにインキュベートした。対照抗体は糖鎖改変（glyco-engineered）抗IGF-1R抗体とした。インキュベーション時間は6時間とした。多機能タンパク質とのインキュベーションにより、H460M2腫瘍細胞の強力な除去がもたらされる。

実施例8
MCSP陽性標的細胞に対する種々のMHC-I-抗MCSP多機能タンパク質の結合
Colo38細胞を、Accutase（PAA、カタログ番号L11-007）とともに5分間インキュベートして、単細胞懸濁液を得た。バイアル当たり2×10⁵個の細胞を、100μlのPBS／2％ FCS中にて1μg／mlのMHC-I-抗MCSP多機能タンパク質構築物とともに4℃で45分間インキュベートした。インキュベーションの後に、細胞を1mlの冷PBS／2％ FCSで洗浄し、910rpmで7分間遠心処理した。細胞を、二次抗体（ヤギ抗ヒトIgG1抗体PEコンジュゲート、Jackson Lab.、カタログ番号109-116-088）を2μg／mlで含む100μlのPBS／2％ FCS中に再懸濁させて、4℃でさらに45分間インキュベートした。細胞を1ml PBS％2％ FCSで2回洗浄し、BD CantoII Flow Cytometerによって測定した。結果を図7に示す。

実施例9
MCSP陽性細胞とMHC-I-抗MCSP多機能タンパク質とのインキュベーション
Colo38細胞またはWM266-4細胞を、Accutase（PAA、カタログ番号L11-007）とともに5分間インキュベートして、単細胞懸濁液を得た。ウェル当たり2×10⁴個のColo38細胞株または1×10⁴個のWM266-4細胞株を、Eplates96（Roche、カタログ番号05232368001）の中で、100μlの各々の細胞培養培地（Colo38細胞株：2mMグルタミン、10％ FCSを加えたRPMI1640；WM-266-4細胞株：2mMグルタミン、10％ FKS、2mMピルビン酸ナトリウム、2mM NEAAを加えたRPMI1640）中にて24時間インキュベートし、ACEA技術（Xcelligence RTCA）を用いて付着性（インピーダンス）を15分毎に測定した。24時間後（乱されていない増殖期）に、細胞を200μlのAIMV培地（Gibco、カタログ番号0870112DK）で洗浄した。細胞に対して、MHC-I-抗MCSP多機能タンパク質を最終濃度1μg／mlで、最終容積150μlのAIMV培地中に、刺激したT細胞またはPBMCとともに種々の比で添加した。インキュベーションをさらに4〜48時間続けながら、同時に5分毎にACEA測定を行った。読み取り値は、インピーダンス測定、Eplateの底から剥離した溶解細胞または崩壊細胞の検出に基づく。細胞インデックスは、多機能タンパク質の添加後の第1の測定ポイントを1として正規化した。96ウェル当たり、濃度1μg／mlの多機能タンパク質（MHCI-0008（1）、MHCI-0010（2）、MHCI-0030（3）、MHCI-0031（4））、エフェクター対標的細胞比10：1；ドナー3由来のPBMC（細胞200.000個、ドナー3はCMV陽性であるがEBV陰性である）および黒色腫腫瘍細胞株Colo38（細胞20.000個）での、データが三重反復試験による結果を図14に示している。96ウェル当たり、濃度1μg／mlの多機能タンパク質（MHCI-0008（1）、MHCI-0010（2）、PBMCのみ（3））、エフェクター対標的細胞比10：1；ドナー3由来のPBMC（細胞200.000個、ドナー3はCMV陽性であるがEBV陰性である）および黒色腫腫瘍細胞株Colo38（細胞20.000個）での、データが三重反復試験による結果を、図15A（Colo38）および15B（WM266）に示している。

実施例10
細胞傷害性アッセイ
細胞培養培地（50μl）を、バックグラウンド測定を行うためXcelligence 96ウェルE-プレート（Roche、カタログ番号05232368001）の各ウェルにピペッティングした。

Colo38細胞を、細胞培養培地中（2mMグルタミン、10％ FCSを加えたRPMI1640）で1×10⁶個／mlに希釈し、50μl（2×10⁴個／ウェル）をXcelligence 96ウェルプレートの各ウェルに最終容積100μlとなるようにピペッティングし、24時間培養した（37℃、8％ CO₂、湿度80％）。24時間後、培地を除去し、細胞を200μlのAIM-V（無血清培地（Invitrogen）T細胞培地（カタログ番号）：12055-083）培地で洗浄した。MCSP結合多機能タンパク質MHCI-0008（一価、CMVペプチドをロードした）、MHCI-0010（一価、EBVペプチドを負荷した対照）、MHC-0026（二価、CMVペプチドを負荷、非結合対照）、MHCI-0030（一価、CMVペプチドを負荷、活性）およびMHCI-0031（二価、CMVペプチドを負荷、活性）を、洗浄した標的細胞に個別に添加して、AIM-V培地での最終濃度1μg／mlとした。エフェクター細胞を、10：1（E：T）というかなりの比になるようにAIM-V培地に添加して、最終容積150μlとした。測定は、Xcelligence System（Roche）により、添加42時間後に行った。

20.000個の付着性Colo38細胞と共培養した（96ウェルプレートでの三重反復試験）、ドナー3から新たに単離した200.000個のPBMC（エフェクター細胞）に関して得られた結果を図16に示す（多機能タンパク質との42時間のインキュベーション後の細胞の溶解）。PBMCの25％はCD8陽性T細胞であり、そのうち3％はCMV-pp65-ペプチド特異的であることから、Colo38標的細胞20.000個当たりのCMV-pp65-ペプチド特異的CD8+ T細胞はおよそ1.500個である（実際のE：T（エフェクター対標的細胞比）＝1：13）。

結果
MCSP結合多機能タンパク質は、ヒトCMV特異的T細胞を通じてのColo38腫瘍細胞の溶解を誘発する。

実施例11
LDH放出アッセイ
ACEAプレートを910rpmで7分間遠心処理した。ACEA上清の50μlを別の96ウェル平底プレート（Costar）に移した。LDH試薬（細胞傷害性検出キット、Roche、カタログ番号11644793001）1および2を製造元の説明書に従って希釈し、溶液の50μlを上清に添加した。5〜25分間のインキュベーション期間後に、吸光度をTecan Reader Sunrise（Tecan）で検出した。総溶解は、遠心処理の前に、標的細胞への1％ Triton X-100（Sigma、カタログ番号T-8787）の添加によって検出する。

20.000個の付着性Colo38細胞と共培養した（96ウェルプレートでの三重反復試験）、ドナー3から新たに単離した200.000個のPBMC（エフェクター細胞）に関して得られた結果は、図17に示されている（多機能タンパク質との48時間のインキュベーション後のLDH放出）。ドナー3から新たに単離された200.000個のPBMCを、20.000個の付着性Colo38細胞と共培養した（96ウェルプレートでの三重反復試験）。PBMCの25％はCD8陽性T細胞であり、そのうち3％がCMV-pp65-ペプチド特異的であることから、Colo38標的細胞20.000個当たりのCMV-pp65-ペプチド特異的CD8+ T細胞はおよそ1.500個である（E：T（エフェクター対標的細胞比）＝1：13）。

実施例12
細胞傷害性アッセイ
PBMCを、Ficoll遠心分離を介して全血から入手した。1ml当たり1×10⁷個のPBMCをT細胞培地（10％ HS、2mMグルタミンを加えたRPMI1640）で希釈し、HLA-A0201分子上でのペプチド交換を50μg／mlのCMV pp65ペプチドの懸濁液への添加によって実現させた。2〜3時間のインキュベーション後に、PBMCを1：10に希釈し、96ウェル丸底プレート中に200μlをプレーティングした。第3日に20U／mlのIL-2、25ng／mlのIL-7およびIL-15を添加した。14日後に再刺激を行った。

刺激したT細胞を96ウェルプレート中で2回洗浄し、200μl T細胞培地で希釈した上で、そのうち80μlを新たな96ウェル丸底プレートに移した。

PBMCの刺激は上記のプロトコールに従って行った。刺激したPBMCに、ペプチド交換後に4000Grayの照射を行い、T細胞培地で2回洗浄して、1×10⁵個のPBMCをピペッティングによって80μlのT細胞に加えた。第3日に20U／mlのIL-2、25ng／mlのIL-7およびIL-15を添加した。再刺激したT細胞を用いて、第11日にXcelligence細胞傷害性アッセイを行った。

エフェクター細胞の63％はCMV-pp65-ペプチド特異的CD8⁺ T細胞である。

標的細胞対エフェクター細胞比は1：3.5であった。細胞溶解は、各々の多機能タンパク質の添加から10時間後に判定した。多機能融合タンパク質は最終濃度1μg／mlとして添加した。

結果は、Colo38細胞については図18Aに、WM266細胞については図18Bに示されている。

実施例13
ジスルフィドで安定化された多機能タンパク質
本明細書において報告される多機能タンパク質では抗原提示ドメインの位置11と227との間にジスルフィド架橋が導入されている。

ジスルフィドで安定化された抗原提示ドメインのアミノ酸配列は、以下である：

ジスルフィド安定化を伴わない場合には、1リットルの培養上清から、プロテインAアフィニティー精製後に6.4mgの多機能タンパク質が得られる。凝集物を分離するためのサイズ排除クロマトグラフィー後の最終的な収量は2.2mgであった。

ジスルフィド安定化がある場合には、1リットルの培養上清から、プロテインAアフィニティー精製後に17.8mgの多機能タンパク質が得られる。導入されたジスルフィド架橋による熱安定性の増大が原因で凝集物の量が減少したことが理由で、凝集物を分離するためのサイズ排除クロマトグラフィー後の最終的な収量は11.4mgであった。

プロテインAアフィニティークロマトグラフィーの後、ただし調製用サイズ排除クロマトグラフィーによる凝集物除去の前の分析用サイズ排除クロマトグラムは図19に示されている。

ジスルフィド結合型多機能タンパク質は、非ジスルフィド結合型多機能タンパク質と同じ機能性を示す（図20参照）。

PBMCを、Ficoll遠心分離を介して全血から入手した。1ml当たり1×10⁷個のPBMCをT細胞培地（10％ HS、2mMグルタミンを加えたRPMI1640）で希釈し、HLA-A0201分子上でのペプチド交換を50μg／mlのCMV pp65ペプチドの懸濁液への添加によって実現させた。2〜3時間のインキュベーション後に、PBMCを1：10に希釈し、96ウェル丸底プレート中に200μlをプレーティングした。第3日に20U／mlのIL-2、25ng／mlのIL-7およびIL-15を添加した。細胞を一次刺激から11日後に採取した；細胞の45％はCMV特異的であった。標的細胞対エフェクター細胞比1：3に関する結果を図20に示す。

ジスルフィド結合型多機能タンパク質は熱安定性の増大を示す（図21）。

実施例14
DNAの調製、トランスフェクション、発現、精製および分析
DNAの調製
細菌の一晩LB培養液250mlを採集し、プラスミドDNAを、製造元のプロトコールに従って抽出した（High speed Maxi kit, Qiagen、カタログ番号12663）。得られたプラスミドDNAを1mlのTE緩衝液中に溶出し、DNA濃度を分光光度測定により測定した（Epoch, BioTek）。

CMV由来ペプチドおよびMCSP結合特異性（抗MCSP抗体）を含む例示的な一価ジスルフィド結合型多機能タンパク質のエレメントのアミノ酸配列：

CMV由来ペプチドおよびMCSP結合特異性（抗MCSP抗体）を含む例示的な二価ジスルフィド結合型多機能タンパク質のエレメントのアミノ酸配列：

CMV由来ペプチドおよびMCSP結合特異性（抗MCSP抗体）を含むさらなる例示的な二価ジスルフィド結合型多機能タンパク質のエレメントのアミノ酸配列

トランスフェクション
HEK 293細胞を、トランスフェクションの前日に8×10⁵個／mlに希釈した。約1〜1.6×10⁶個／mlを、製造元のプロトコールに従ってトランスフェクトした。30mlの最終トランスフェクション容積に対して、30μgのDNAをOpti-MEM（登録商標）I還元型血清培地（Gibco、カタログ番号31985070）で最終容積1mlに希釈した。1μgのDNA当たり2μlの293fectin（商標）試薬（Invitrogen、カタログ番号12347019）をOpti-MEM（登録商標）培地で1mlの最終容積に均等に希釈し、5分間インキュベートした。インキュベーションの後に、希釈したDNAは、希釈した293fectin（商標）試薬に添加し、穏やかに混合し、さらに20〜30分間インキュベートし、その後に28mlのHEK 293細胞に対して滴下ピペッティングし、30mlの最終容積を得た。細胞を、125rpmで回転するオービタルシェーカーで細胞培養条件下（37℃、8％ CO₂、湿度80％）でインキュベートし、72時間後に採集した。採集物を1000rpmで10分間、3000rpmで10分間遠心分離し、22μmの滅菌フィルターを通して濾過した（Millipore、カタログ番号SCGPU05RE）。

ウェスタンブロット法
細胞培養上清の500μlをPall Nanosepオメガメンブレン30KD遠心分離デバイス（Pall、カタログ番号OD030C33）を用いて50μlの容積に濃縮した。各濃度の17.5μlを、4×XT試料緩衝液（Bio Rad、カタログ番号161-0791）および20×XT還元剤（BioRad、カタログ番号161-0792）で最終容積25μlに希釈し、96℃で8分間加熱して、4〜12％のCriterion XTプレキャストゲル（カタログ番号345-0124）に対して適用した。ブロット法は、Trans-blot Pureニトロセルロース膜（0.45μm）（BioRad、カタログ番号162-0117）上で、20Vで30分間、Trans-Blot SDセミドライトランスファーセル（BioRad）を用いて行った。膜のブロッキングは、室温で1時間、1×ウエスタンブロッキング試薬（Roche、カタログ番号11921681001）を用いて行った。染色は、室温で1時間、ペルオキシダーゼ結合ポリクローナルウサギ抗ヒトκ軽鎖（DAKO、カタログ番号P0129、1：3000に希釈）およびポリクローナルウサギ抗ヒトIgG抗体HRPコンジュゲート（DAKO、カタログ番号P0214、1：5000に希釈）を用いて行った。発光検出はLUMI-イメージャF1（Roche）を用いて行った。

結果
表

定義した多機能タンパク質が入手可能であることが見てとれる。

実施例15
2つの抗原提示ドメインを含む複合体と比較した、1つの抗原提示ドメインを含む複合体によるT細胞活性化
AIM-V培地（Gibco）中にあるウェル当たり20,000個のPBMCを、容積150μlのAIM-V培地中で、最終濃度100μg／ml、10μg／ml、1μg／ml、100ng／mlのMHCI-0054［1アーム型、ジスルフィドで安定化されたCMV-MHCIを有する二価抗MCSP結合剤］またはMHCI-0065［2アーム型、ジスルフィドで安定化されたCMV-MHCIを有する二価抗MCSP結合剤］構築物によって16時間刺激した。4つのウェルのPBMCをプールして、
1）PE-Cy7で標識された抗CD8抗体（BD＃557746）（5μl／100μl PBS／2％ FCS）、または
2）FITCで標識された抗CD4抗体（BD＃555346）（20μl／100μl PBS／2％ FCS）、または
3）Dextramer CMV APC（Immudex＃WB2132）（10μl／100μl PBS／2％ FCS）、または
4）PEで標識された抗CD25抗体（BioLegend＃302606）（5μl／100μl PBS／2％ FCS）、または
5）PerCP／Cy5.5で標識された抗CD69抗体（BioLegend＃310925）（5μl／100μl PBS／2％ FCS）
によって氷上で45分間かけて染色し、その後にPBS／2％ FCSで2回洗浄した（500×g、10分間）。

T細胞活性化の判定には、以下の読み取り値を用いた：
1）すべてのCMV特異的（NLVPMVATV pp65）CD8+細胞に占めるCD25+細胞の頻度、
2）CMV特異的（NLVPMVATV pp65）CD8+細胞に占めるCD69+細胞の頻度、および
3）CD8+細胞上でのHLA A^*0201 MHCクラスI複合体における、CMVのNLVPMVATV pp65ペプチド（NLVPMVATV pp65）のコグネイトTCRのダウンレギュレーション。

結果：
1）pp65-CMV-HLA A^*0201特異的CD8 T細胞上でのCD25アップレギュレーション：

このように、10μg／mlおよび100μg／mlのMHCI-0065を用いると、MHCI-0054と比較して、CD25発現のアップレギュレーションが見てとれる（それぞれ4.4倍および1.9倍）。

2）pp65-CMV-HLA A^*0201特異的CD8 T細胞上でのCD69アップレギュレーション：

このように、10μg／mlおよび100μg／mlのMHCI-0065を用いると、MHCI-0054と比較して、CD69発現のアップレギュレーションが見てとれる（それぞれ9.0倍および1.8倍）。

3）pp65-CMV-HLA A^*0201特異的CD8 T細胞上でのTCRダウンレギュレーション：

このように、10μg／mlおよび100μg／mlのMHCI-0065を用いると、MHCI-0054と比較して、TCR発現のダウンレギュレーションが見てとれる（それぞれ6.5倍および1.8倍）。

したがって、2つのMHC複合体を保持する二価ホモ二量体抗体融合物によるCMV特異的CD8 T細胞の活性化は、単一のMHC複合体のみを保持する二価ヘテロ二量体抗体融合物と比較して強い。

Claims

‐1つまたは2つの抗原提示ドメイン、
‐1つの抗体Fc領域、および
‐1つまたは複数の抗原結合部位
を含み、
抗原提示ドメインが、N末端からC末端への方向に、
（i）T細胞応答誘発ペプチド、
（ii）β2-ミクログロブリン、ならびに
（iii）HLA-A^*0201、HLA-A^*1101、HLA-A^*2402、HLA-A^*340101、HLA-C^*0304、HLA-C^*0401およびHLA-C^*0702を含む群から選択されるクラスI MHC分子の細胞外ドメインα1、α2およびα3、
を含み、
抗原結合部位が癌細胞表面抗原と結合し、
抗原提示ドメインが、T細胞応答誘発ペプチドおよびβ2-ミクログロブリンを連結するリンカーに配置されている第1のシステイン残基と、クラスI MHC分子の細胞外ドメインα1、α2およびα3のうち1つに挿入されている第2のシステイン残基との間に形成される、鎖内かつドメイン間のジスルフィド結合を含む
ことを特徴とする、ジスルフィド結合型多価多機能タンパク質。
抗原結合部位が、i）抗体重鎖と抗体軽鎖のペア、もしくはii）N末端からC末端への方向にscFv抗体断片および抗体Fc領域ポリペプチドを含むscFv融合ポリペプチド、もしくはiii）N末端からC末端への方向にscFabおよび抗体Fc領域ポリペプチドを含むscFab融合ポリペプチドを含むことを特徴とする、請求項1記載のジスルフィド結合型多価多機能タンパク質。
T細胞応答誘発ペプチドがヒトサイトメガロウイルス由来ペプチドであることを特徴とする、請求項1または2記載のジスルフィド結合型多価多機能タンパク質。
ヒトサイトメガロウイルス由来ペプチドがSEQ ID NO：01のアミノ酸配列を有することを特徴とする、請求項3記載のジスルフィド結合型多価多機能タンパク質。
請求項1〜4のいずれか一項記載のジスルフィド結合型多価多機能タンパク質と薬学的に許容される担体とを含む、医薬製剤。
請求項1〜4のいずれか一項記載のジスルフィド結合型多価多機能タンパク質を含む、医薬。
請求項1〜4のいずれか一項記載のジスルフィド結合型多価多機能タンパク質を含む、癌を治療するための医薬。
請求項1〜4のいずれか一項記載のジスルフィド結合型多価多機能タンパク質を含む、個体のウイルス特異的細胞傷害性T細胞を標的に対して誘引するための医薬。