BR112020017925A2 - Anticorpos contra b7-h4 e métodos de uso dos mesmos - Google Patents

Anticorpos contra b7-h4 e métodos de uso dos mesmos Download PDF

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Abstract

a presente divulgação fornece anticorpos e seus fragmentos de ligação a antígeno que se ligam especificamente à b7-h4 humana. os anticorpos anti-b7-h4 ou seus fragmentos de ligação a antígeno são úteis, por exemplo, na detecção de b7-h4. a imuno-histoquímica (ihc) pode ser usada para detectar a b7-h4. a presente divulgação também fornece métodos para o tratamento de câncer, em que foi detectado um aumento da b7-h4, através da administração de um anticorpo anti-b7-h4 terapêutico ou de seu fragmento de ligação a antígeno.

Description

ANTICORPOS CONTRA B7-H4 E MÉTODOS DE USO DOS MESMOS
CAMPO DA INVENÇÃO
[0001] A presente divulgação se refere a anticorpos que se ligam especificamente ao B7-H4 humano e métodos de produção e uso desses anticorpos, por exemplo, para detectar B7-H4.
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO
[0002] O B7-H4 (também conhecido como B7x, B7-S1 e VTCN1) é uma molécula reguladora imune que compartilha homologia com outros membros da família B7, incluindo PD-L1. É uma proteína transmembrana do tipo I, composta por ectodomínios IgV e IgC. Enquanto a expressão do B7-H4 em tecidos saudáveis é relativamente limitado no nível proteico, o B7-H4 é expresso em vários tumores sólidos, como carcinomas ginecológicos da mama, ovário e endométrio. A expressão do B7-H4 nos tumores tende a se correlacionar com um mau prognóstico. O receptor para o B7-H4 é desconhecido, mas acredita-se que seja expresso nas células T. Acredita-se que o B7-H4 iniba diretamente a atividade das células T.
[0003] Dada a expressão e função do B7-H4, os anticorpos que se ligam especificamente ao B7-H4, e o uso desses anticorpos para detectar o B7-H4 que incluem, por exemplo, o uso de imuno-histoquímica (IHC) para detectar o B7- H4 em amostras de câncer, são necessários.
SUMÁRIO
[0004] São fornecidos neste documento anticorpos que se ligam especificamente ao B7-H4 e o uso desses anticorpos para detectar o B7-H4, incluindo, por exemplo, o uso de imuno-histoquímica (IHC) para detectar o B7-H4 em amostras de câncer.
[0005] Em certas modalidades, é fornecido neste documento um anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que se liga especificamente ao B7-H4 humano, que compreende uma região 1 determinante de complementariedade (CDR) de região variável de cadeia pesada (VH), que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 22, uma VH CDR2 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 23, uma VH CDR3 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 24, uma região variável de cadeia leve (VL) CDR1 que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ
ID NO: 25, uma VL CDR2 que compreende a sequência de aminoácidos das SEQ ID NO: 26, 27 ou 28, e uma sequência VL CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 29.
[0006] Em certas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma VH que compreende a sequência de aminoácidos das SEQ ID NO: 6, 7 ou 8. Em certas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma VL que compreende o amino sequência de ácido de SEQ ID NO: 9, 10 ou 11.
[0007] Em certas modalidades, é fornecido neste documento um anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga especificamente ao B7-H4 humano, em que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma região variável da cadeia pesada e uma região variável da cadeia leve, em que a região variável da cadeia compreende a sequência de aminoácidos das SEQ ID NO: 6, 7 ou 8.
[0008] Em certas modalidades, é fornecido neste documento um anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga especificamente ao B7-H4 humano, em que o anticorpo compreende uma região variável da cadeia pesada e uma região variável da cadeia leve, em que a região variável da cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos das SEQ ID NO: 9, 10 ou 11.
[0009] Em certas modalidades, é fornecido neste documento um anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que se liga especificamente ao B7-H4 humano, compreendendo uma região variável da cadeia pesada e uma região variável da cadeia leve compreendendo as sequências de aminoácidos das: (a) SEQ ID NOs:6 e 9, respectivamente; (b) SEQ ID NOs:6 e 10, respectivamente; (c) SEQ ID NOs:6 e 11, respectivamente; (d) SEQ ID NOs:7 e 9, respectivamente; (e) SEQ ID NOs:7 e 10, respectivamente; (f) SEQ ID NOs:7 e 11, respectivamente; (g) SEQ ID NOs:8 e 9, respectivamente; (h) SEQ ID NOs:8 e 10, respectivamente; (i) SEQ ID NOs:8 e 11, respectivamente, (j) SEQ ID NOs: 89 e 19, respectivamente; (k) SEQ ID NOs: 90 e 19, respectivamente; ou (l) SEQ ID NOs: 91 e 19, respectivamente.
[0010] Em certas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende adicionalmente uma região constante da cadeia pesada. Em certas modalidades, a região constante de cadeia pesada é uma região constante de cadeia pesada de IgG1 ou IgG2a murina.
[0011] Em certas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende adicionalmente uma região constante da cadeia leve. Em certas modalidades, a região constante da cadeia leve é uma região constante da cadeia leve da IgGκ murina.
[0012] Em certas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos das SEQ ID NO: 16, 17, 18, 89, 90 ou 91. Em certas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos das SEQ ID NO: 19, 30 ou 31.
[0013] Em certas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende uma cadeia pesada e uma cadeia leve que compreende as sequências de aminoácidos das: (a) SEQ ID NOs:16 e 19, respectivamente; (b) SEQ ID NOs:16 e 30, respectivamente; (c) SEQ ID NOs:16 e 31, respectivamente; (d) SEQ ID NOs:17 e 19, respectivamente; (e) SEQ ID NOs:17 e 30, respectivamente; (f) SEQ ID NOs:17 e 31, respectivamente; (g) SEQ ID NOs:18 e 19, respectivamente; (h) SEQ ID NOs:18 e 30, respectivamente; ou (i) SEQ ID NOs:18 e 31, respectivamente.
[0014] Em certas modalidades, é fornecido neste documento um anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga especificamente à B7-H4 humana, em que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende as VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2, e VL CDR3 de um anticorpo selecionado do grupo que consiste em J512, J513, J514, J515, J516, J517, J518, J519, J520, J521 e J522. Em certas modalidades, as CDRs são as CDRs definidas por Kabat, as CDRs definidas por Chothia ou as CDRs definidas por AbM.
[0015] Em certas modalidades, é fornecido neste documento um anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga especificamente ao mesmo epítopo do B7-H4 humano como um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, fornecido neste documento.
[0016] Em certas modalidades, é fornecido neste documento um anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que inibe competitivamente a ligação do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de outro anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo fornecido neste documento para B7-H4 humano.
[0017] Em certas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno dos mesmo é um anticorpo murino ou fragmento de ligação ao antígeno dos mesmo.
[0018] Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é um anticorpo de comprimento completo. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é um fragmento de ligação ao antígeno. Em certas modalidades, o fragmento de ligação ao antígeno compreende um Fab, Fab', F(ab')2, Fv de cadeia única (scFv), Fv ligado por dissulfeto, minibody, F(ab')3, diabody, (scFv)2, ou scFv-Fc.
[0019] Em certas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende adicionalmente um marcador detectável.
[0020] Em certas modalidades, é fornecido neste documento um polinucleotídeo isolado que compreende uma molécula de ácido nucleico que codifica a região variável da cadeia pesada ou a cadeia pesada de um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo fornecido neste documento. Em certas modalidades, a molécula de ácido nucleico codifica a VH das SEQ ID NO: 6, 7 ou 8 ou a cadeia pesada da SEQ ID NO: 16, 17 ou 18.
[0021] Em certas modalidades, a molécula de ácido nucleico compreende a sequência das SEQ ID NO: 12, 13, 14, 93, 94 ou 95.
[0022] Em certas modalidades, é fornecido neste documento um polinucleotídeo isolado compreendendo uma molécula de ácido nucleico que codifica a região variável da cadeia leve ou a cadeia leve de um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo fornecido neste documento. Em certas modalidades, a molécula de ácido nucleico codifica a VL das SEQ ID NO: 9, 10 ou 11 ou a cadeia leve das SEQ ID NO: 19, 30 ou 31. Em certas modalidades, a molécula de ácido nucleico compreende a sequência das SEQ ID NO: 15, 96 ou
97.
[0023] Em certas modalidades, é fornecido neste documento um polinucleotídeo isolado compreendendo uma molécula de ácido nucleico que codifica a região variável da cadeia pesada ou cadeia pesada de um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, fornecido neste documento, e a região variável da cadeia leve ou cadeia leve do anticorpo ou antígeno fragmento de ligação do mesmo fornecido neste documento.
[0024] Em certas modalidades, é fornecido neste documento um vetor isolado compreendendo um polinucleotídeo fornecido neste documento.
[0025] Em certas modalidades, é fornecida neste documento uma célula hospedeira (por exemplo, uma célula hospedeira isolada) compreendendo um polinucleotídeo fornecido neste documento, um vetor fornecido neste documento ou um primeiro vetor, compreendendo um polinucleotídeo que codifica uma região variável de cadeia leve ou cadeia leve fornecida neste documento, e um segundo vetor compreendendo um polinucleotídeo que codifica uma região variável de cadeia pesada ou cadeia pesada fornecida neste documento. Em certas modalidades, a célula hospedeira é uma célula CHO ou HEK.
[0026] Em certas modalidades, é fornecido neste documento um método de produção de um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga especificamente à B7-H4 humana, que compreende a cultura de uma célula hospedeira fornecida neste documento, de modo que a molécula de ácido nucleico seja expressa e o anticorpo ou ligação ao antígeno fragmento do mesmo seja produzido.
[0027] Em certas modalidades, é fornecido neste documento um anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga especificamente à B7-H4 humano e é codificado por um polinucleotídeo fornecido neste documento.
[0028] Em certas modalidades, é fornecido neste documento um método para detectar o B7-H4 em uma amostra que compreende o contato da amostra com um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, fornecido neste documento. Em certas modalidades, é fornecido neste documento um método para detectar o B7-H4 em uma amostra compreendendo o contato da amostra com um anticorpo anti-B7-H4 ou fragmento de ligação ao antígeno, fornecido neste documento, e detectar a ligação do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo para o B7-H4. Em certas modalidades, a amostra é obtida de um câncer em um sujeito. Em certas modalidades, o método compreende adicionalmente a administração de um anticorpo anti-B7-H4 terapêutico ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo ao sujeito após B7-H4 ter sido detectada.
[0029] Em certas modalidades, é fornecido neste documento um método de tratamento de um câncer que expressa B7-H4 em um sujeito, sendo que o método compreende a administração ao sujeito de um anticorpo anti-B7-H4 terapêutico ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, em que B7-H4 foi detectada em uma amostra obtida do câncer, usando um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo fornecido neste documento.
[0030] Em certas modalidades, o método compreende adicionalmente detectar o B7-H4 na amostra obtida a partir do câncer.
[0031] Em certas modalidades, o B7-H4 detectado é a membrana celular B7-H4. Em certas modalidades, o B7-H4 detectado é B7-H4 citoplasmática. Em certas modalidades, o B7-H4 detectado é B7-H4 de célula inteira.
[0032] Em certas modalidades, o B7-H4 é detectado em células tumorais circulantes.
[0033] Em certas modalidades, a amostra é tecido sólido, biópsia, ascite, um aspirado, um extrato fluídico, plasma sanguíneo, soro, fluido espinhal, fluido linfático, a seção externa da pele, trato respiratório, intestinal ou de trato geniturinário, lágrimas, saliva, leite, um tumor ou um órgão de um sujeito.
[0034] Em certos aspectos, o câncer é selecionado do grupo que consiste em câncer de mama, carcinoma ductal, carcinoma do endométrio, câncer de ovário, câncer de pulmão de células não pequenas, câncer de pâncreas, câncer de tireoide, câncer de rim e câncer de bexiga. Em certas modalidades, o câncer de mama é o câncer de mama triplo negativo ou em que o câncer de pulmão de células não pequenas é o carcinoma de células escamosas.
[0035] Em certas modalidades, o método de detecção usa um ensaio imunoabsorvente ligado a enzima (ELISA), um ensaio com separador celular ativado por fluorescência (FACS) ou imuno-histoquímica (IHC). Em certas modalidades, o método de detecção usa a IHC e a concentração do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, fornecido neste documento, é de cerca de 1 a cerca de 50 μg/ml. Em certas modalidades, a concentração do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, fornecido neste documento, é de cerca de 1 a cerca de 20 μg/ml. Em certas modalidades, a concentração do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, fornecido neste documento, é de cerca de 10 μg/mL.
[0036] Em modalidades específicas, o sujeito é um ser humano.
[0037] Em certas modalidades, é fornecido neste documento um kit que compreende um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, fornecido neste documento, e a) um reagente de detecção, b) um antígeno B7-H4, c) um anticorpo anti-B7-H4 terapêutico, ou d) um combinação dos mesmos.
[0038] Em certas modalidades do método ou kit fornecido neste documento, o anticorpo terapêutico ou fragmento de ligação ao antígeno compreende VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2 e VL CDR3 de 20502 ou 22213. Em certas modalidades, as CDRs são as CDRs definidas por Kabat, as CDRs definidas por Chothia ou as CDRs definidas por AbM.
[0039] Em certas modalidades, a VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2 e VL CDR3 compreendem as sequências de aminoácidos da SEQ ID NOs: 32-37, respectivamente, ou as sequências de aminoácidos da SEQ ID NOs: 58- 63, respectivamente. Em certas modalidades, o anticorpo terapêutico ou fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável da cadeia pesada e uma região variável da cadeia leve, em que a região variável da cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos das SEQ ID NO:54 ou SEQ ID NO:64. Em certas modalidades, o anticorpo terapêutico ou fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável da cadeia pesada e uma região variável da cadeia leve, em que a região variável da cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:55 ou SEQ ID NO:65. Em certas modalidades, o anticorpo terapêutico ou fragmento de ligação ao antígeno compreende (i) uma região variável da cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:54 e uma região variável da cadeia leve, que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:55 ou (ii) uma região variável da cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:64 e uma região variável da cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:65. Em certas modalidades, o anticorpo terapêutico ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos das SEQ ID NO:56 ou SEQ ID NO:74. Em certas modalidades, o anticorpo terapêutico ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos das SEQ ID NO: 57 ou SEQ ID NO: 75. Em certas modalidades, o anticorpo terapêutico ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende (i) uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 56 e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 57 ou (ii) uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 74 e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 75.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[0040] A Figura 1 mostra as imagens de coloração IHC geradas usando os anticorpos anti-B7-H4 A57.1, AET_AB_J516 e AET_AB_J512. (Ver Exemplo 4.)
[0041] A Figura 2 mostra a análise de imagem computacional (Definiens) da coloração IHC. (Ver Exemplo 4.)
[0042] A Figura 3 mostra a segmentação de células positivas com diferentes níveis de intensidade. (Ver Exemplo 4.)
[0043] A Figura 4 mostra o número e a proporção de células associadas a cada nível de intensidade de coloração obtido usando os anticorpos anti-B7-H4 A57.1, AET_AB_J516 e AET_AB_J512. (Ver Exemplo 4.)
[0044] As Figuras 5A-5C mostram uma comparação da expressão de B7-H4 (intensidade DAB) em células inteiras, membranas e citoplasmas de células positivas do B7-H4. A Figura 5A mostra a expressão do B7-H4 (intensidade DAB) usando o anticorpo A57.1. A Figura 5B mostra a expressão do B7-H4 (intensidade DAB) usando o anticorpo J512. A Figura 5C mostra a expressão de B7-H4 (intensidade DAB) usando o anticorpo J516. (Ver Exemplo 4.)
DESCRIÇÃO DETALHADA
[0045] São fornecidos neste documento anticorpos (por exemplo, anticorpos monoclonais) e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos que se ligam especificamente à B7-H4 (por exemplo, B7-H4 humana). Os anticorpos anti- B7-H4 e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos podem ser usados para detectar B7-H4, por exemplo, usando imuno-histoquímica em uma amostra de câncer.
[0046] Também são fornecidos ácidos nucleicos isolados (polinucleotídeos), como DNA complementar (cDNA), que codifica esses anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos. Além disso, são fornecidos vetores (por exemplo, vetores de expressão) e células (por exemplo, células hospedeiras) compreendendo ácidos nucleicos (polinucleotídeos) que codificam esses anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos. Também são fornecidos métodos de produção desses anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos. Em outros aspectos, são fornecidos neste documento métodos para detectar B7-H4, por exemplo, em uma amostra de câncer. Também são fornecidos composições relacionadas (por exemplo, composições de detecção) e kits. Terminologia
[0047] Conforme usado neste documento, o termo "B7-H4" refere-se a polipeptídeos B7-H4 de mamíferos, incluindo, mas não se limitando a, polipeptídeos B7-H4 nativos e isoformas de polipeptídeos B7-H4. O "B7-H4" abrange polipeptídeos B7-H4 não processados de comprimento completo, bem como formas de polipeptídeos B7-H4 que resultam do processamento dentro da célula. Tal como utilizado neste documento, o termo "B7-H4 humano" refere-se a um polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1. Um “polinucleotídeo B7-H4”, “nucleotídeo B7-H4” ou “ácido nucleico B7-H4” referem-se a um polinucleotídeo que codifica B7-H4.
[0048] O termo "anticorpo" significa uma molécula de imunoglobulina que reconhece e se liga especificamente a um alvo, tal como uma proteína, polipeptídeo, peptídeo, carboidrato, polinucleotídeo, lipídio, ou combinações dos anteriores através de, pelo menos, um sítio de reconhecimento de antígeno no interior da região variável da molécula de imunoglobulina. Conforme usado neste documento, o termo "anticorpo" abrange anticorpos policlonais intactos, anticorpos monoclonais intactos, anticorpos quiméricos, anticorpos humanizados, anticorpos humanos, proteínas de fusão que compreendem um anticorpo e qualquer outra molécula de imunoglobulina modificada, contanto que os anticorpos exibam a atividade biológica desejada. Um anticorpo pode ser de qualquer uma das cinco classes principais de imunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, ou suas subclasses (isotipos) (por exemplo IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2), com base na identidade de seus domínios constantes de cadeia pesada, referidos como alfa, delta, épsilon, gama e mu, respectivamente. As diferentes classes de imunoglobulinas têm estruturas de subunidade diferentes e conhecidas e configurações tridimensionais. Os anticorpos podem ser puros ou conjugados a outras moléculas, tais como toxinas, radioisótopos, etc.
[0049] O termo "fragmento de anticorpo" refere-se a uma porção de um anticorpo intacto. Um "fragmento de ligação ao antígeno", "domínio de ligação ao antígeno" ou "região de ligação ao antígeno" refere-se a uma porção de um anticorpo intacto que se liga especificamente a um antígeno. Um fragmento de ligação ao antígeno pode conter um sítio de reconhecimento antigênico de um anticorpo intacto (por exemplo, regiões determinantes da complementariedade (CDRs) suficientes para ligar especificamente o antígeno). Exemplos de fragmentos de anticorpos de ligação ao antígeno incluem, mas não estão limitados a fragmentos Fab, Fab ', F (ab') 2 e Fv, anticorpos lineares e anticorpos de cadeia única. Um fragmento de ligação ao antígeno de um anticorpo pode ser derivado de qualquer espécie animal, como roedores (por exemplo, camundongo, rato ou hamster) e humanos ou pode ser produzido artificialmente.
[0050] Os termos "anticorpo anti-B7-H4", "anticorpo contra B7-H4" e "anticorpo que se liga a B7-H4" referem-se a um anticorpo que é capaz de se ligar especificamente ao B7-H4 com afinidade suficiente, de modo que o anticorpo seja útil como um agente diagnóstico e/ou terapêutico no direcionamento do B7-H4. Conforme usado neste documento, os termos "ligação específica", "ligação imunoespecífica", "reconhecimento imunoespecífico" e "reconhecimento específico" são termos análogos no contexto de anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos. Estes termos indicam que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo se liga a um epítopo por meio de seu domínio de ligação ao antígeno, e que a ligação implica alguma complementariedade entre o domínio de ligação ao antígeno e o epítopo. Em conformidade, um anticorpo que "se liga especificamente" ao B7-H4 humano (SEQ ID NO: 1) também pode se ligar ao B7-H4 de outras espécies (por exemplo, B7-H4 de macaco cynomolgus, camundongo e/ou rato) e/ou proteínas B7-H4 produzidas a partir de outros alelos humanos, mas a extensão da ligação a um anticorpo anti- B7-H4 a um não relacionado, não proteína B7-H4 (por exemplo, outros membros da família da proteína B7, como PD-L1) é menor que cerca de 10% da ligação do anticorpo para B7-H4 como medido, por exemplo, por um radioimunoensaio (RIA).
[0051] Um anticorpo "monoclonal" ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo refere-se a um anticorpo homogêneo ou população de fragmento de ligação ao antígeno envolvido no reconhecimento e ligação de um único determinante antigênico ou epítopo. Isto contrasta com os anticorpos policlonais que normalmente incluem anticorpos diferentes direcionados contra diferentes determinantes antigênicos. O termo anticorpo "monoclonal" ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo engloba tanto os anticorpos monoclonais intactos e completos, como os fragmentos de anticorpos (tais como Fab, Fab', F(ab')2, Fv), mutantes de cadeia única (scFv), proteínas de fusão que compreende uma porção de anticorpo e qualquer outra molécula de imunoglobulina modificada compreendendo um sítio de reconhecimento do antígeno. Adicionalmente, o anticorpo "monoclonal" ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo refere-se a tais anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno do mesmo produzidos de qualquer número de maneiras, incluindo, mas não limitado a, por hibridoma, seleção por fago, expressão recombinante e animais transgênicos.
[0052] Conforme usado neste documento, os termos "região variável" ou "domínio variável" são usados de forma intercambiável e são comuns na técnica. A região variável refere-se tipicamente a uma porção de um anticorpo, geralmente, uma porção de uma cadeia leve ou pesada, tipicamente sobre os aminoácidos 110 a 120 aminoácidos ou 110 a 125 aminoácidos na cadeia pesada madura e cerca de 90 a 115 aminoácidos na cadeia leve madura, que diferem na sequência entre os anticorpos e são utilizados na ligação e especificidade de um anticorpo específico para seu antígeno específico. A variabilidade na sequência é concentrada naquelas regiões denominadas regiões determinantes de complementariedade (CDRs), enquanto as regiões mais altamente conservadas no domínio variável são denominadas regiões de framework (FR). Sem querer estar ligado a qualquer mecanismo ou teoria particular, acredita-se que as CDRs das cadeias leves e pesadas são principalmente responsáveis pela interação e especificidade do anticorpo com o antígeno. Em certas modalidades, a região variável é uma região variável humana. Em certas modalidades, a região variável é uma região variável de roedor ou murina.
[0053] Os termos "VL" e "domínio VL" são usados de forma intercambiável para se referir à região variável da cadeia leve de um anticorpo.
[0054] Os termos "VH" e "domínio VH" são usados de forma intercambiável para se referir à região variável da cadeia pesada de um anticorpo.
[0055] O termo "numeração de Kabat" e termos semelhantes são reconhecidos na técnica e referem-se a um sistema de numeração de resíduos de aminoácidos, nas regiões variáveis de cadeia pesada e leve de um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo. Em certos aspectos, as CDRs podem ser determinadas, de acordo com o sistema de numeração de Kabat (ver, por exemplo, Kabat EA & Wu TT (1971) Ann NY Acad Sci 190: 382-391 e Kabat EA et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edição, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242). Usando o sistema de numeração de Kabat, as CDRs dentro de uma molécula de cadeia pesada de anticorpo estão tipicamente presentes nas posições de aminoácidos 31 a 35, que opcionalmente podem incluir um ou dois aminoácidos adicionais, após 35 (referido no esquema de numeração de Kabat como 35A e 35B) (CDR1), posições de aminoácidos 50 a 65 (CDR2) e posições de aminoácidos 95 a 102 (CDR3). Usando o sistema de numeração de Kabat, as CDRs dentro de uma molécula de cadeia leve de anticorpo estão tipicamente presentes nas posições de aminoácidos 24 a 34 (CDR1), posições de aminoácidos 50 a 56 (CDR2) e posições de aminoácidos 89 a 97 (CDR3). Em uma modalidade específica, as CDRs dos anticorpos descritos neste documento foram determinadas de acordo com o esquema de numeração de Kabat.
[0056] Chothia refere-se, em vez disso, à localização das alças estruturais (Chothia e Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). A extremidade da alça de CDR-H1 de Chothia, quando numerada usando a convenção de numeração de Kabat, varia entre H32 e H34, dependendo do comprimento da alça (isto porque o esquema da numeração de Kabat coloca as inserções em H35A e H35B; se nem 35A ou 35B estiverem presentes, a alça termina em 32; se apenas 35A estiver presente, a alça termina em 33; se ambas 35A e 35B estiverem presentes, a alça termina em 34). As regiões hipervariáveis AbM representam um comprometimento entre as CDRs de Kabat e alças estruturais de Chothia, e são usadas pelo software de modelagem de anticorpo AbM da Oxford Molecular.
Alça Kabat AbM Chothia L1 L24-L34 L24-L34 L24-L34
L2 L50-L56 L50-L56 L50-L56 L3 L89-L97 L89-L97 L89-L97 H1 H31-H35B H26-H35B H26-H32..34 (Numeração Kabat) H1 H31-H35 H26-H35 H26-H32 (Numeração Chothia) H2 H50-H65 H50-H58 H52-H56 H3 H95-H102 H95-H102 H95-H102
[0057] Conforme usado neste documento, os termos "região constante" e "domínio constante" são intercambiáveis e têm seus significados comuns na técnica. A região constante é uma porção de anticorpo, por exemplo, uma porção de terminal carboxila de uma cadeia leve e/ou pesada que não está diretamente envolvida na ligação de um anticorpo ao antígeno, mas que pode exibir várias funções efetoras, como a interação com o receptor Fc. A região constante de uma molécula de imunoglobulina tem geralmente uma sequência de aminoácidos mais conservada em relação a um domínio variável de imunoglobulina. Em certos aspectos, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região constante ou uma porção do mesmo que é suficiente para citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpo (ADCC).
[0058] Como usado neste documento, o termo "cadeia pesada" quando usado em referência a um anticorpo pode se referir a qualquer tipo distinto, por exemplo, alfa (α), delta (δ), épsilon (ε), gama (γ) e mu (µ), com base na sequência de aminoácidos do domínio constante, que dá origem às classes de anticorpos IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, respectivamente, incluindo subclasses de IgG, por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. As sequências de aminoácidos da cadeia pesada são bem conhecidas na técnica. Em modalidades específicas, a cadeia pesada é uma cadeia pesada humana. Em modalidades específicas, a cadeia pesada é uma cadeia pesada de roedor ou murina.
[0059] Conforme usado neste documento, o termo "cadeia leve" quando usado em referência a um anticorpo pode se referir a qualquer tipo distinto, por exemplo, kappa (κ) ou lambda (λ) com base na sequência de aminoácidos dos domínios constantes. As sequências de aminoácidos da cadeia leve são bem conhecidas na técnica. Em modalidades específicas, a cadeia leve é uma cadeia leve humana. Em modalidades específicas, a cadeia leve é uma cadeia leve de roedor ou murina.
[0060] O termo anticorpos "quiméricos" ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos refere-se aos anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, em que a sequência de aminoácidos é derivada de duas ou mais espécies. Normalmente, a região variável tanto de cadeias leve quanto pesada corresponde à região variável de anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos derivados de uma espécie de mamíferos (por exemplo, camundongo, rato, coelho, etc.) com a especificidade, afinidade e capacidade desejadas, enquanto as regiões constantes são homólogas às sequências nos anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos derivados de outra (geralmente, humana) para evitar que provoque uma resposta imune nessa espécie.
[0061] O termo anticorpo "humanizado" ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo refere-se a formas de anticorpos não humanos (por exemplo, murino) ou fragmentos de ligação ao antígeno que são cadeias de imunoglobulinas específicas, imunoglobulinas quiméricas ou fragmentos dos mesmos que contêm o mínimo de sequências não humanos (por exemplo, murino). Normalmente, os anticorpos humanizados ou fragmentos de ligação ao antígeno do mesmo são imunoglobulinas humanas nas quais os resíduos da região determinante complementar (CDR) são substituídos por resíduos da CDR de uma espécie não humana (por exemplo, camundongo, rato, coelho, hamster) que possuem o especificidade, afinidade e capacidade desejadas ("CDR enxertado") (Jones et al., Nature 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332: 323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science 239: 1534-1536 (1988)). Em alguns casos, certos resíduos da região de framework de Fv (FR) de uma imunoglobulina humana são substituídos pelos resíduos correspondentes em um anticorpo ou fragmento a partir de uma espécie não humana que tenha a especificidade, afinidade e capacidade desejadas. O anticorpo humanizado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo pode ser modificado adicionalmente pela substituição de resíduos adicionais na região de framework de Fv e/ou dentro dos resíduos não humanos de CDR para refinar e otimizar a especificidade, afinidade e/ou capacidade do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno. Geralmente, o anticorpo humanizado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreenderá domínios variáveis contendo todas ou substancialmente todas as regiões CDR que correspondem à imunoglobulina não-humana, considerando que todas ou substancialmente todas as regiões FR são aquelas de uma sequência consenso da imunoglobulina humana. O anticorpo humanizado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo também pode compreender pelo menos uma porção de uma região ou domínio constante de imunoglobulina (Fc), normalmente de uma imunoglobulina humana. Exemplos de métodos utilizados para gerar anticorpos humanizados são descritos na Patente US 5,225,539; Roguska et ai., Proc. Natl. Acad. Sci., EUA, 91 (3): 969-973 (1994), e Roguska et al., Protein Eng. 9 (10): 895- 904 (1996). Em algumas modalidades, um "anticorpo humanizado" é um anticorpo de superfície modificada.
[0062] O termo anticorpo "humano" ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo significa um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo tendo uma sequência de aminoácidos derivada de um locus do gene da imunoglobulina humana, onde tal anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno é feito usando qualquer técnica conhecida no técnica. Esta definição de um anticorpo humano ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo inclui anticorpos intactos ou de comprimento total e fragmentos dos mesmos.
[0063] "Afinidade de ligação" geralmente se refere à força da soma total de interações não covalentes entre um único sítio de ligação de uma molécula (por exemplo, um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo) e seu parceiro de ligação (por exemplo, um antígeno). A menos que indicado de outra forma, conforme usado neste documento, "afinidade de ligação" se refere à afinidade de ligação intrínseca que reflete uma interação de 1:1 entre membros de um par de ligação (por exemplo, anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo e antígeno). A afinidade de uma molécula X pelo seu parceiro Y geralmente pode ser representada pela constante de dissociação (KD). A afinidade pode ser medida e/ou expressa de várias maneiras conhecidas na técnica, incluindo, mas não se limitando a, constante de dissociação de equilíbrio (K D), e constante de associação de equilíbrio (KA). O KD é calculado a partir do quociente de koff/kon, enquanto kA é calculado a partir do quociente de kon/koff.kon refere-se à constante de taxa de associação de, por exemplo, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo a um antígeno, e koff refere-se à dissociação de, por exemplo, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo de um antígeno. A kon e a koff podem ser determinadas por técnicas conhecidas por alguém de conhecimento comum à técnica, tais como BIAcore® ou KinExA.
[0064] Conforme usado neste documento, um "epítopo" é um termo na técnica e se refere a uma região localizada de um antígeno ao qual um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo pode se ligar especificamente. Um epítopo pode ser, por exemplo, aminoácidos contíguos de um polipeptídeo (epítopo linear ou contíguo) ou um epítopo pode, por exemplo, vir junto de duas ou mais regiões não contíguas de um polipeptídeo ou polipeptídeos (conformacional, não linear, epítopo descontínuo ou não contíguo). Em certas modalidades, o epítopo ao qual um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo se liga especificamente pode ser determinado por, por exemplo, espectroscopia de NMR, estudos de cristalografia por difração de raios-X, ensaios ELISA, troca de hidrogênio/deutério acoplada à espectrometria de massa (por exemplo, espectrometria de massa por electrospray e cromatografia líquida), ensaios de varredura de oligopeptídeos baseados em matriz e/ou mapeamento de mutagênese (por exemplo, mapeamento de mutagênese sítio-direcionada). Para cristalografia de raios X, a cristalização pode ser realizada usando qualquer um dos métodos conhecidos na técnica (por exemplo, Giegé R et al., (1994) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 50(Pt 4): 339-350; McPherson A (1990) Eur J Biochem 189: 1-23; Chayen NE (1997) Structure 5: 1269-1274; McPherson A (1976) J Biol Chem 251: 6300-6303). Anticorpo/fragmento de ligação ao antígeno do mesmo: os cristais de antígeno podem ser estudados usando técnicas conhecidas de difração de raios-X e podem ser refinados usando um software de computador como o X- PLOR (Universidade de Yale, 1992, distribuído por Molecular Simulations, Inc.; ver, por exemplo, Meth Enzymol (1985) volumes 114 & 115, eds Wyckoff HW et al.,; US 2004/0014194), e BUSTER (Bricogne G (1993) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 49(Pt 1): 37-60; Bricogne G (1997) Meth Enzymol 276A: 361-423, ed Carter CW; Roversi P et al., (2000) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 56(Pt 10): 1316-1323). Os estudos de mapeamento de mutagênese podem ser realizados usando qualquer método conhecido por um versado na técnica. Ver, por exemplo, Champe M et al., (1995) J. Biol Chem 270: 1388-1394 e Cunningham BC & Wells JA (1989) Science
244: 1081-1085 para uma descrição de técnicas de mutagênese, incluindo técnicas de mutagênese de varredura de alanina.
[0065] Um anticorpo contra B7-H4 que "se liga ao mesmo epítopo" que um anticorpo contra B7-H4 de referência se refere a um anticorpo que se liga aos mesmos resíduos de aminoácidos de B7-H4 que o anticorpo contra B7-H4 de referência. A capacidade de um anticorpo contra B7-H4 em se ligar ao mesmo epítopo que um anticorpo contra B7-4 de referência é determinada por um ensaio de troca de hidrogênio/deutério (ver Coales et al. Rapid Commun. Mass Spectrom. 2009; 23: 639–647).
[0066] Diz-se que um anticorpo "inibe competitivamente" a ligação de um anticorpo de referência a um determinado epítopo se ele se liga ao mesmo epítopo ou a um epítopo de sobreposição do anticorpo de referência, de modo que bloqueie, em algum grau, a ligação do anticorpo de referência ao epítopo. A inibição competitiva pode ser determinada por qualquer método conhecido na técnica, por exemplo, ensaios de ELISA de competição. Pode-se dizer que um anticorpo inibe competitivamente a ligação do anticorpo de referência a um determinado epítopo em pelo menos 90%, pelo menos 80%, pelo menos 70%, pelo menos 60% ou pelo menos 50%.
[0067] Um polipeptídeo, anticorpo, polinucleotídeo, vetor, célula ou composição que é "isolada" é um polipeptídeo, anticorpo, polinucleotídeo, vetor, célula ou composição, que é uma forma não encontrada na natureza. Polipeptídeos, anticorpos, polinucleotídeos, vetores, célula ou composições isoladas incluem aqueles que foram purificados a um grau no qual já não estão em uma forma na qual eles são encontrados na natureza. Em algumas modalidades, um anticorpo, polinucleotídeos, vetor, célula ou composição que é isolada é substancialmente pura. Conforme usado neste documento, "substancialmente pura" refere-se ao material que é pelo menos 50% puro (ou seja, livre de contaminantes), pelo menos 90% puro, pelo menos, 95% puro, pelo menos 98% puro, ou pelo menos 99% puro.
[0068] Os termos "polipeptídeo", "peptídeo" e "proteína" são usados indistintamente neste documento para se referir aos polímeros de aminoácidos de qualquer comprimento. Os polímeros podem ser lineares ou ramificados, podem compreender aminoácidos modificados, e podem ser interrompidos por não aminoácidos. Os termos também englobam um polímero de aminoácido que tenha sido modificado naturalmente ou por intervenção; por exemplo, pela formação da ligação de dissulfeto, glicosilação, lipidação, acetilação, fosforilação ou qualquer outra manipulação ou modificação, como conjugação com um componente de marcação. Também estão incluídos na definição, por exemplo, polipeptídeos contendo um ou mais análogos de um aminoácido (incluindo, por exemplo, aminoácidos não naturais, etc.), bem como outras modificações conhecidas na técnica. Entende-se que, devido os polipeptídeos desta invenção serem baseados em anticorpos, em certas modalidades, os polipeptídeos podem ocorrer como cadeias únicas ou cadeias associadas.
[0069] "Porcentagem de identidade" refere-se à extensão da identidade entre duas sequências (por exemplo, sequências de aminoácidos ou sequências de ácido nucleico). A identidade percentual pode ser determinada alinhando duas sequências, introduzindo lacunas para maximizar a identidade entre as sequências. Os alinhamentos podem ser gerados usando programas conhecidos na técnica. Para fins neste documento, o alinhamento de sequências de nucleotídeos pode ser realizado com o programa blastn definido em parâmetros padrão, e o alinhamento de sequências de aminoácidos pode ser realizado com o programa blastp definido em parâmetros padrão (ver National Center for Biotechnology Information (NCBI) no site mundial web, ncbi.nlm.nih.gov).
[0070] Conforme usado neste documento, o termo "célula hospedeira" pode ser qualquer tipo de célula, por exemplo, uma célula primária, uma célula em cultura ou uma célula de uma linha celular. Em modalidades específicas, o termo "célula hospedeira" refere-se a uma célula transfectada com uma molécula de ácido nucleico e a progênie ou progênie potencial dessa célula. A progênie dessa célula pode não ser idêntica à célula parental transfectada com a molécula de ácido nucleico, por exemplo, devido a mutações ou influências ambientais que podem ocorrer em gerações sucessivas ou integração da molécula de ácido nucleico no interior genoma da célula hospedeira.
[0071] O termo "superexpressão" de B7-H4 em um determinado tumor, tecido ou amostra de célula refere-se ao B7-H4 (um polipeptídeo B7-H4 ou um ácido nucleico que codifica tal polipeptídeo) que esteja presente em um nível superior ao que é presente no tecido não doente ou nas células do mesmo tipo, ou origem ou outras células na proximidade de um tumor ou câncer. Essa superexpressão pode ser causada, por exemplo, por mutação, amplificação do gene, aumento da transcrição ou aumento da translação.
[0072] O termo anticorpo "primário" ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, neste documento, se refere a um anticorpo ou fragmento que se liga especificamente ao antígeno alvo em uma amostra. Um anticorpo primário é geralmente o primeiro anticorpo usado em um procedimento de imuno- histoquímica (IHC). Em uma modalidade, o anticorpo primário é o único anticorpo usado em um procedimento IHC. O termo anticorpo "secundário" ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, neste documento, se refere a um anticorpo ou fragmento que se liga especificamente a um anticorpo primário, formando assim uma ponte entre o anticorpo primário e um reagente subsequente, se houver. O anticorpo secundário é geralmente o segundo anticorpo usado em um procedimento de imuno-histoquímica. O termo "anticorpo terciário", neste documento, refere-se a um anticorpo que se liga especificamente a um anticorpo secundário, formando assim uma ponte entre o anticorpo secundário e um reagente subsequente, se houver.
[0073] Uma "amostra" da presente invenção é de origem biológica. Em modalidades preferidas, a amostra é uma amostra humana, mas as amostras de animais também podem ser usadas na prática da invenção. Fontes não limitativas de uma amostra para uso na presente invenção incluem tecido sólido, biópsia, ascite, aspirados, extratos fluidos, sangue (incluindo células tumorais circulantes), plasma, soro, fluido espinhal, fluido linfático, as seções externas da pele, tratos respiratório, intestinal e geniturinário, lágrimas, saliva, leite, tumores, órgãos, culturas de células e/ou constituintes de cultura de células, por exemplo. Uma "amostra cancerosa" é uma amostra que contém uma célula cancerosa.
[0074] Para os fins deste documento, uma "seção" de uma amostra de tecido refere-se a uma única parte ou peça de uma amostra de tecido, por exemplo, uma fatia fina de tecido ou células de uma amostra de tecido. Entende-se que várias seções de amostras de tecido podem ser tomadas e submetidas a análise, de acordo com a presente invenção. Em alguns casos, a porção ou seção selecionada de tecido é composta por uma população homogênea de células. Em outros casos, a porção selecionada compreende uma região de tecido, por exemplo, o lúmen como um exemplo não-limitante. A parte selecionada pode ser tão pequena quanto uma célula ou duas células, ou pode representar muitos milhares de células, por exemplo. Na maioria dos casos, a coleta de células é importante e, embora a invenção tenha sido descrita para uso na detecção de componentes celulares, o método também pode ser usado para detectar componentes não celulares de um organismo (por exemplo, componentes solúveis no sangue como um exemplo não limitativo).
[0075] O termo "marcação" quando usado neste documento refere-se a um composto ou composição detectável que é conjugada direta ou indiretamente ao anticorpo para, desta forma, gerar um anticorpo "marcado". O marcador pode ser detectável por si só (por exemplo, marcadores de radioisótopo ou marcadores fluorescentes) ou, no caso de um marcador enzimático, pode catalisar a alteração química de um composto ou composição de substrato que é detectável.
[0076] O termo "formulação farmacêutica" refere-se a uma preparação, de maneira, que ela permita que a atividade biológica do ingrediente ativo seja eficaz, e que não contenha componentes adicionais que sejam inaceitavelmente tóxicos em um objeto para o qual a formulação será administrada. A formulação pode ser estéril.
[0077] Os termos "administrar", "administrando", "administração" e semelhantes, conforme usados neste documento, referem-se a métodos que podem ser usados para permitir a distribuição de uma droga, por exemplo, um anticorpo anti-B7-H4 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo para o sítio de ação biológica desejado (por exemplo, administração intravenosa). As técnicas de administração que podem ser empregadas com os agentes e métodos descritos neste documento são encontradas em, por exemplo, Goodman e Gilman, The Pharmacological Basis of Therapeutics, edição atual, Pergamon; e Remington's, Pharmaceutical Sciences, edição atual, Mack Publishing Co., Easton, Pa.
[0078] Conforme usado neste documento, os termos "sujeito" e "paciente" são usados de forma intercambiável. O sujeito pode ser um animal. Em algumas modalidades, o sujeito é um mamífero, como um animal não humano (por exemplo, vaca, porco, cavalo, gato, cachorro, rato, camundongo, macaco ou outro primata, etc). Em algumas modalidades, o sujeito é um humano.
[0079] O termo "quantidade terapeuticamente eficaz" refere-se a uma quantidade de uma droga, por exemplo, um anticorpo anti-B7-H4 ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, eficaz para tratar uma doença ou distúrbio em um sujeito. No caso do câncer, a quantidade terapeuticamente eficaz da droga pode reduzir o número de células cancerígenas; reduzir o tamanho do fardo ou do tumor; inibir, em certa medida, a infiltração de célula de câncer em órgãos periféricos; inibir, em certa medida, metástase do tumor; inibir, em certa medida, crescimento do tumor; aliviar, em certa medida, um ou mais sintomas associados ao câncer; e/ou resultar em uma resposta favorável, como maior sobrevivência livre de progressão (PFS), sobrevivência livre de doença (DFS) ou sobrevivência total (OS), resposta completa (CR), resposta parcial (PR), ou, em alguns casos, doença estável (SD), redução da doença progressiva (PD), tempo reduzido para progressão (TTP), ou qualquer combinação destes. À medida que a droga pode impedir o crescimento e/ou matar as células cancerígenas já existentes, ela pode ser citostática e/ou citotóxica.
[0080] Termos como "tratando" ou "tratamento" ou "para tratar" ou "aliviando" ou "aliviar" referem-se às medidas terapêuticas que curam, reduzem, diminuem os sintomas de, e/ou interrompem a progressão de uma condição ou desordem patológica diagnosticada. Portanto, aqueles que precisam de tratamento incluem aqueles já diagnosticado ou suspeitos de ter o distúrbio. Em determinadas modalidades, um sujeito é "tratado" de câncer com sucesso, de acordo com os métodos da presente invenção se o paciente apresentar um ou mais das seguintes: uma redução no número de ou ausência completa de células cancerígenas; uma redução do tamanho do tumor; inibição ou ausência de infiltração de células de câncer em órgãos periféricos, incluindo, por exemplo, a propagação do câncer em tecidos moles e osso; inibição de ou ausência de metástases de tumor; inibição ou ausência do crescimento do tumor; alívio de um ou mais sintomas associados com o câncer específico; redução de morbidade e mortalidade; melhoria na qualidade de vida; redução de tumorigenicidade, frequência tumorigênica ou capacidade tumorigênica de um tumor; redução no número ou frequência de células-tronco de câncer em um tumor; diferenciação de células tumorigênicas a um estado não- tumorigênico; aumento da sobrevivência sem progressão (PFS), sobrevivência sem doença (DFS), sobrevivência total (OS), resposta completa (CR), resposta parcial (PR), doença estável (SD), uma diminuição na doença progressiva (PD), uma redução do tempo para progressão (TTP) ou qualquer combinação das mesmas.
[0081] Os termos "câncer" e "canceroso" referem-se ou descrevem a condição fisiológica nos mamíferos na qual a população de células é caracterizada pelo crescimento desregulado das células. Exemplos de câncer incluem, mas não estão limitados a, cânceres ginecológicos (por exemplo, câncer de mama (incluindo câncer de mama triplo negativo, carcinoma ductal, câncer de ovário e câncer de endométrio), câncer de pulmão de células não pequenas, câncer pancreático, câncer de tireoide, rim câncer (por exemplo, carcinoma de células renais) e câncer de bexiga (por exemplo, carcinoma de células uroteliais). O câncer pode ser um "câncer que expressa B7-H4" ou "B7-H4 que expressa câncer". Tais termos se referem a um câncer compreendendo células que expressam o B7-H4. O câncer pode ser um tumor sólido que expressa B7-H4. O câncer pode ser um tumor primário ou pode ser um câncer avançado ou metastático.
[0082] Um câncer "refratário" é um que avança apesar de um tratamento antitumoral, como quimioterapia, sendo administrado ao paciente com câncer.
[0083] Um câncer "recorrente" é uma que cresceu novamente, no sítio inicial ou em um sítio distante, após uma resposta à terapia inicial.
[0084] Conforme usadas na presente divulgação e reivindicações, as formas "um", "uma", e "o(a)" incluem as formas no plural, salvo determinação clara em contrário.
[0085] Entende-se que, sempre que as modalidades são descritas neste documento com a linguagem "compreendendo", também são fornecidas modalidades análogas descritas em termos de "consistindo em" e/ou "consistindo essencialmente em". Nesta divulgação, "compreende", "compreendendo", "contendo" e "tendo" e semelhantes pode ter o significado atribuído a eles na lei de patentes dos EUA e pode significar "inclui", "incluindo" e semelhantes; "consistindo essencialmente em" ou "consiste essencialmente", da mesma forma, tem o significado atribuído na lei de patentes dos EUA e o termo é aberto, permitindo a presença de mais do que o que é recitado, desde que características básicas ou novas daquilo que é recitado não são alterados pela presença de mais do que o que é recitado, mas exclui modalidades da técnica anterior
[0086] A menos que especificamente indicado ou evidente a partir do contexto, tal como utilizado neste documento, o termo "ou" é entendido como sendo inclusivo. O termo "e/ou" como usado em uma frase como "A e/ou B" neste documento destina-se a incluir ambos "A e B," "A ou B," "A" e "B." Da mesma forma, o termo "e/ou", conforme usado em uma expressão tal como "A, B e/ou C" destina- se a abranger cada um das seguintes modalidades: A, B e C; A, B ou C; A ou C; A ou B; B ou C; A e C; A e B; B e C; A (por si só); B (por si só); e C (por si só).
[0087] Conforme usado neste documento, os termos “cerca de” e “aproximadamente”, quando usados para modificar uma valor numérico ou faixa numérica, indicam que os desvios de 5% a 10% acima e 5% a 10% abaixo do valor ou da faixa permanecem dentro do objetivo significado do valor ou faixa recitada.
[0088] Quaisquer composições ou métodos fornecidos neste documento podem ser combinados com um ou mais de qualquer das outras composições e métodos fornecidos neste documento. Anticorpos
[0089] Em um aspecto específico, são fornecidos neste documento anticorpos (por exemplo, anticorpos monoclonais) e fragmentos de ligação ao antígeno do mesmo que se ligam especificamente ao B7-H4 (por exemplo, B7-H4 humano). As sequências de aminoácidos para o B7-H4 humano são conhecidas na técnica e também fornecidas neste documento como representadas na SEQ ID NO:
1. B7-H4 humano:
MASLGQILFWSIISIIIILAGAIALIIGFGISGRHSITVTTVASAGNIGEDGILSCT FEPDIKLSDIVIQWLKEGVLGLVHEFKEGKDELSEQDEMFRGRTAVFADQVIVGN ASLRLKNVQLTDAGTYKCYIITSKGKGNANLEYKTGAFSMPEVNVDYNASSETLR CEAPRWFPQPTVVWASQVDQGANFSEVSNTSFELNSENVTMKVVSVLYNVTIN
NTYSCMIENDIAKATGDIKVTESEIKRRSHLQLLNSKASLCVSSFFAISWALLPLSP YLMLK (SEQ ID NO:1)
[0090] Em certas modalidades, um anticorpo anti-B7-H4 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é um anticorpo divulgado na Tabela 1 ou é um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreendendo as regiões determinantes de complementariedade (CDRs), cadeia pesada variável e/ou cadeia leve variável e/ou cadeia pesada e/ou cadeia leve de um anticorpo divulgado na Tabela 1.
Tabela 1: Anticorpos anti-B7-H4 exemplares ID de Hibridoma Anticorpo SEQ ID NOs Clone VH/VL CDRs VH VL H L J511 M6 mIgG1 22-26, 29 6 9 89 19 J512 M6 mIGg2a 22-26, 29 6 9 16 19 J517 M6 – mIGg2a 22-25, 27, 6 10 16 30 De-N- 29 glicosilado (1) J518 M6 mIGg2a 22-25, 28, 6 11 16 31 De-N- 29 glicosilado (2) J513 M11 mIgG1 22-26, 29 7 9 90 19 J514 M11 mIGg2a 22-26, 29 7 9 17 19 J519 M11 – mIGg2a 22-25, 27, 7 10 17 30 De-N- 29 glicosilado (1) J520 M11 mIGg2a 22-25, 28, 7 11 17 31 De-N- 29 glicosilado (2) J515 M15 mIgG1 22-26, 29 8 9 91 19 J516 M15 mIGg2a 22-26, 29 8 9 18 19 J521 M15 – mIGg2a 22-25, 27, 8 10 18 30 De-N- 29 glicosilado (1) J522 M15 mIGg2a 22-25, 28, 8 11 18 31 De-N- 29 glicosilado (2)
[0091] Em certas modalidades, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, descrito neste documento, se liga especificamente ao B7- H4 humano e compreende seis CDRs listados na Tabela 2, ou seja, as seis CDRs das SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 26-28 e SEQ ID NO: 29. Tabela 2: Sequências de Aminoácidos CDR Descrição do CDR Sequência de Aminoácidos CDR (SEQ ID
NO) VH-CDR1 GFSLSTYG (SEQ ID NO: 22) VH-CDR2 WWNDD (SEQ ID NO: 23) VH-CDR3 VDGYYWYFDV (SEQ ID NO:24) VL-CDR1 RSSQSIVHSNRNTYLE (SEQ ID NO:25) VL-CDR2 NVSNRFS (SEQ ID NO:26) VL-CDR2, De-N-glicosilado (1) NVANRFS (SEQ ID NO:27) VL-CDR2, De-N-glicosilado (2) QVSNRFS (SEQ ID NO:28) VL-CDR3 FQGSHVPLT (SEQ ID NO:29)
[0092] Em certas modalidades, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, descrito neste documento, se liga especificamente ao B7- H4 humano e compreende uma VH listada na Tabela 3, por exemplo, em combinação com uma VL. Tabela 3: Sequências de aminoácidos de cadeia pesada variável (VH) Descrição da VH Sequência de aminoácidos VH (SEQ ID NO)
QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTYGLGVGWIRQ M6 VH
PSGKGLDWLANIWWNDDKYYNSALKSRLTISKDTSNNQVF (J511, J512,
LKISSVDTADTGTYYCAQVDGYYWYFDVWGAGTTVTVSS J517, J518) (SEQ ID NO:6)
QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSLSGFSLSTYGLGVGWIRQ M11 VH
PSGKGLGWLANIWWNDDKYYNSALKSRLTISKDTSNNQVF (J513, J514,
LKISSVDTADTGTYYCAQVDGYYWYFDVWGAGTTVTVSS J519, J520) (SEQ ID NO:7)
QVTLKESGPGILQSSQTLSLTCSFSGFSLSTYGLGVGWIRQ M15 VH
PSGKGLDWLANIWWNDDKYYNSALKSRLTISKDTSNNQVF (J515, J516,
LKISSVDTADTGTYYCAQVDGYYWYFDVWGAGTTVTVSS J521, J522) (SEQ ID NO:8)
[0093] Em certas modalidades, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, descrito neste documento, se liga especificamente ao B7- H4 humano e compreende uma VL listada na Tabela 4, por exemplo, em combinação com uma VH. Tabela 4: Sequências de aminoácidos de cadeia leve variável (VL) Descrição da VL Sequência de aminoácidos VL (SEQ ID NO)
DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSNRNTYLE M6, M11, M15 VL WYLQKPGQSPKLLIYNVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTL (J511-J516) KISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPLTFGAGTKLELK (SEQ ID NO:9) VL Des-N- DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSNRNTYLE glicosilado (1) WYLQKPGQSPKLLIYNVANRFSGVPDRFSGSGSGTDFTL (J517, J519, J521) KISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPLTFGAGTKLELK (SEQ ID
NO:10)
DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSNRNTYLE VL Des-N-
WYLQKPGQSPKLLIYQVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTL glicosilado (2) KISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPLTFGAGTKLELK (SEQ ID (J518, J520, J522) NO:11)
[0094] Em certas modalidades, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, descrito neste documento, se liga especificamente ao B7- H4 humano e compreende uma VH listada na Tabela 3 e uma VL listada na Tabela
4. Em certas modalidades, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, descrito neste documento, liga-se especificamente ao B7-H4 humano e compreende uma VH que compreende ou consiste em uma sequência listada na Tabela 3 e uma VL que compreende ou consiste estar listado na Tabela 4.
[0095] Em certas modalidades, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, descrito neste documento, se liga especificamente ao B7- H4 humano, compreende uma VH que compreende uma sequência de pelo menos 80% idêntica a uma sequência VH na Tabela 3 e uma VL que compreende uma sequência de pelo menos 80% idêntica a uma sequência VL na Tabela 4. Em certas modalidades, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, descrito neste documento, se liga especificamente ao B7-H4 humano, compreende uma VH que compreende uma sequência de pelo menos 85% idêntica a uma sequência VH na Tabela 3 e uma VL compreendendo uma sequência de pelo menos 85% idêntica a uma sequência VL na Tabela 4.
[0096] Em certas modalidades, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, descrito neste documento, se liga especificamente ao B7- H4 humano, compreende uma VH que consiste em uma sequência pelo menos 80% idêntica a uma sequência VH na Tabela 3 e uma VL que consiste em uma sequência pelo menos 80% idêntica a uma sequência de VL na Tabela 4. Em certas modalidades, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, descrito neste documento, se liga especificamente ao B7-H4 humano, compreende uma VH que consiste em uma sequência pelo menos 85% idêntica a uma sequência de VH na Tabela 3 e uma VL que consiste em uma sequência pelo menos 85% idêntica a uma sequência VL na Tabela 4.
[0097] Em certas modalidades, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, descrito neste documento, se liga especificamente ao B7- H4 humano, compreende uma VH que compreende uma sequência pelo menos 90% idêntica a uma sequência VH na Tabela 3, e uma VL que compreende uma sequência pelo menos 90% idêntica a uma sequência VL na Tabela 4. Em certas modalidades, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, descrito neste documento, se liga especificamente ao B7-H4 humano, compreende uma VH que compreende uma sequência pelo menos 95% idêntica a uma sequência VH na Tabela 3, e uma VL compreendendo uma sequência pelo menos 95% idêntica a uma sequência VL na Tabela 4.
[0098] Em certas modalidades, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, descrito neste documento, se liga especificamente ao B7- H4 humano, compreende uma VH que compreende uma sequência pelo menos 96% idêntica a uma sequência VH, na Tabela 3, e uma VL que compreende uma sequência pelo menos 96% idêntica a uma sequência VL, na Tabela 4. Em certas modalidades, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, descrito neste documento, se liga especificamente ao B7-H4 humano, compreende uma VH que compreende uma sequência pelo menos 97% idêntica a uma sequência VH, na Tabela 3, e um VL compreendendo uma sequência pelo menos 97% idêntica a uma sequência VL na Tabela 4. Em certas modalidades, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, descrito neste documento, se liga especificamente ao B7-H4 humano, compreende um VH compreendendo uma sequência de pelo menos 98% idêntica a uma sequência VH, na Tabela 3 e uma VL compreendendo uma sequência pelo menos 98% idêntica a uma sequência VL, na Tabela 4. Em certas modalidades, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, descrito neste documento, se liga especificamente ao B7-H4 humano, compreende uma VH compreendendo uma sequência pelo menos 99% idêntica a uma sequência VH, na Tabela 3, e uma VL compreendendo uma sequência pelo menos 99% idêntica a uma sequência VL na Tabela 4.
[0099] Em certas modalidades, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, descrito neste documento, se liga especificamente ao B7- H4 humano, compreende uma VH que consiste em uma sequência pelo menos 96% idêntica a uma sequência VH, na Tabela 3, e uma VL que consiste em uma sequência de pelo menos 96% idêntica a uma sequência VL na Tabela 4. Em certas modalidades, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, descrito neste documento, se liga especificamente ao B7-H4 humano, compreende uma VH que consiste em uma sequência de pelo menos 97% idêntica a uma sequência VH em Tabela 3 e um VL que consiste em uma sequência pelo menos 97% idêntica a uma sequência de VL na Tabela 4. Em certas modalidades, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, descrito neste documento, se liga especificamente ao B7-H4 humano, compreende um VH que consiste em um sequência pelo menos 98% idêntica a uma sequência VH na Tabela 3 e uma VL consistindo em uma sequência pelo menos 98% idêntica a uma sequência VL na Tabela 4. Em certas modalidades, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, descrito neste documento, se liga especificamente ao B7-H4 humano, compreende uma VH consistindo em uma sequência pelo menos 99% idêntica a uma sequência VH, na Tabela 3, e uma VL consistindo em uma sequência pelo menos 99% idêntica a uma sequência VL na Tabela 4.
[0100] Em certos aspectos, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, descrito neste documento, é descrito por seu domínio VL sozinho, seu domínio VH sozinho, suas 3 VL CDRs sozinhas ou suas 3 VH CDRs sozinhas. Ver, por exemplo, Rader C et al., (1998) PNAS 95: 8910-8915, que é incorporado neste documento por referência em sua totalidade, descrevendo a humanização do anticorpo anti-αvβ3 de camundongo pela identificação de uma cadeia leve ou pesada complementar, respectivamente, a partir de uma cadeia leve humana ou biblioteca de cadeia pesada, resultando em variantes de anticorpos humanizados com afinidades tão altas ou maiores do que a afinidade do anticorpo original. <Ver também Clackson T et al., (1991) Nature 352: 624-628, que é incorporado neste documento por referência em sua totalidade, descrevendo métodos de produção de anticorpos que se ligam especificamente a um antígeno específico usando um domínio VL específico (ou domínio VH) e triando uma biblioteca para o domínio VH complementar (ou domínio VL). A triagem produziu 14 novos parceiros para um domínio VH específico e 13 novos parceiros para um domínio VL específico, que eram fortes aglutinantes, conforme determinado pelo ELISA. Ver também Kim SJ & Hong HJ, (2007) J Microbiol 45: 572-577, que é incorporado neste documento por referência em sua totalidade, descrevendo métodos de produção de anticorpos que se ligam especificamente a um antígeno específico usando um domínio VH específico e rastreando uma biblioteca (por exemplo, biblioteca VL humana) para domínios VL complementares; os domínios VL selecionados, por sua vez, podem ser usados para orientar a seleção de domínios VH complementares adicionais (por exemplo, humanos).
[0101] Em certos aspectos, os CDRs de um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo podem ser determinados de acordo com o esquema de numeração de Chothia, que se refere à localização de alças estruturais de imunoglobulina (ver, por exemplo, Chothia C & Lesk AM, (1987), J Mol Biol 196: 901-917; Al-Lazikani B et al., (1997) J Mol Biol 273: 927-948; Chothia C et al., (1992) J Mol Biol 227: 799-817; Tramontano A et al. , (1990) J Mol Biol 215 (1): 175-82; e Patente US 7,709,226). Tipicamente, quando se usa a convenção de numeração de Kabat, a alça de Chothia CDR-H1 está presente nos aminoácidos da cadeia pesada 26 a 32, 33 ou 34, a alça de Chothia CDR-H2 está presente nos aminoácidos da cadeia pesada 52 a 56, e a alça A de Chothia CDR-H3 está presente nos aminoácidos da cadeia pesada 95 a 102, enquanto a alça de Chothia CDR-L1 está presente nos aminoácidos da cadeia leve 24 a 34, a alça de Chothia CDR-L2 está presente nos aminoácidos da cadeia leve 50 a 56 e a alça de Chothia CDR-L3 está presente nos aminoácidos da cadeia leve 89 a 97. A extremidade da alça de CDR-H1 de Chothia, quando numerada usando a convenção de numeração de Kabat, varia entre H32 e H34, dependendo do comprimento da alça (isto porque o esquema da numeração de Kabat coloca as inserções em H35A e H35B; se nem 35A ou 35B estiverem presentes, a alça termina em 32; se apenas 35A estiver presente, a alça termina em 33; se ambas 35A e 35B estiverem presentes, a alça termina em 34).
[0102] Em certos aspectos, são fornecidos neste documento anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos que se ligam especificamente ao B7-H4 (por exemplo, B7-H4 humano) e compreendem as CDRs de Chothia VH e VL de um anticorpo. Em certas modalidades, anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos que se ligam especificamente ao B7-H4 (por exemplo, B7-H4 humano) e compreendem um ou mais CDRs, em que as CDRs de Chothia e Kabat têm a mesma sequência de aminoácidos. Em certas modalidades, são fornecidos neste documento anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos que se ligam especificamente ao B7-H4 (por exemplo, B7-H4 humano) e compreendem combinações de CDRs de Kabat e CDRs de Chothia.
[0103] Em certos aspectos, as CDRs de um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo podem ser determinadas de acordo com o sistema de numeração IMGT, conforme descrito em Lefranc M-P, (1999) The Immunologist 7: 132-136 e Lefranc M-P et al., (1999) Nucleic Acids Res 27: 209-
212. De acordo com o esquema de numeração IMGT, a VH-CDR1 está nas posições 26 a 35, a VH-CDR2 está nas posições 51 a 57, a VH-CDR3 está nas posições 93 a 102, a VL-CDR1 está nas posições 27 a 32, a VL-CDR2 está nas posições 50 a 52 e a VL-CDR3 está nas posições 89 a 97. Em uma modalidade particular, são fornecidos neste documento anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos que se ligam especificamente ao B7-H4 (por exemplo, B7- H4 humano) e compreendem as CDRs de IMGT VH e VL de um anticorpo listado nas Tabelas 3 e 4, por exemplo, conforme descrito em Lefranc M-P (1999) supra and Lefranc M-P et al., (1999) supra).
[0104] Em certos aspectos, as CDRs de um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo podem ser determinados de acordo com MacCallum RM et al., (1996) J Mol Biol 262: 732-745. Ver também, por exemplo, Martin A. “Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains,” in Antibody Engineering, Kontermann and Dübel, eds., Chapter 31, pp. 422-439, Springer-Verlag, Berlin (2001). Em uma modalidade particular, são fornecidos neste documento anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos que se ligam especificamente ao B7-H4 (por exemplo, B7-H4 humano) são determinados pelo método em MacCallum RM et al.
[0105] Em certos aspectos, as CDRs de um anticorpo ou fragmento do mesmo podem ser determinadas de acordo com o esquema de numeração AbM, o qual se refere às regiões hipervariáveis de AbM, que representam um compromisso entre as alças estruturais de Kabat CDRs e Chothia, e são usadas pelo software de modelagem de anticorpos AbM da Oxford Molecular (Oxford Molecular Group, Inc.). Em uma modalidade particular, são fornecidos neste documento anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos que se ligam especificamente ao B7-H4 (por exemplo, B7-H4 humano) são determinados pelo esquema de numeração AbM.
[0106] Em certas modalidades, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, descrito neste documento, se liga especificamente ao B7- H4 humano e compreende uma cadeia pesada listada na Tabela 5, por exemplo, em combinação com uma cadeia leve. Tabela 5: Sequências de aminoácidos de cadeia pesada Descrição da Sequência de aminoácidos de cadeia pesada (SEQ ID NO) corrente pesada
QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTYGLGVGWIRQP SGKGLDWLANIWWNDDKYYNSALKSRLTISKDTSNNQVFLKI SSVDTADTGTYYCAQVDGYYWYFDVWGAGTTVTVSSAKTT PPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGS
LSSGVHTFPAVLESDLYTLSSSVTVPSSPRPSETVTCNVAHP M6 H
ASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTIT (J511)
LTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQ FNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISK TKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVE
WQWNGQPAENYKNTQPIMNTNGSYFVYSKLNVQKSNWEAG NTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK (SEQ ID NO: 89)
QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTYGLGVGWIRQP SGKGLDWLANIWWNDDKYYNSALKSRLTISKDTSNNQVFLKI SSVDTADTGTYYCAQVDGYYWYFDVWGAGTTVTVSSAKTT
PPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGS M6 H LSSGVHTFPAVLESDLYTLSSSVTVPSSPRPSETVTCNVAHP (J512, J517, ASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKIKDVLMIS J518) LSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDY
NSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISK PKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYV
EWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVE RNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK (SEQ ID NO: 16)
QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSLSGFSLSTYGLGVGWIRQP SGKGLGWLANIWWNDDKYYNSALKSRLTISKDTSNNQVFLKI SSVDTADTGTYYCAQVDGYYWYFDVWGAGTTVTVSSAKTT PPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGS
LSSGVHTFPAVLESDLYTLSSSVTVPSSPRPSETVTCNVAHP M11 H
ASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTIT (J513)
LTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQ FNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISK TKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVE
WQWNGQPAENYKNTQPIMNTNGSYFVYSKLNVQKSNWEAG NTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK (SEQ ID NO: 90)
QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSLSGFSLSTYGLGVGWIRQP M11 H SGKGLGWLANIWWNDDKYYNSALKSRLTISKDTSNNQVFLKI (J514, J519, SSVDTADTGTYYCAQVDGYYWYFDVWGAGTTVTVSSAKTT J520) PPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGS
LSSGVHTFPAVLESDLYTLSSSVTVPSSPRPSETVTCNVAHP ASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKIKDVLMIS LSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDY NSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISK PKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYV
EWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVE RNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK (SEQ ID NO: 17)
QVTLKESGPGILQSSQTLSLTCSFSGFSLSTYGLGVGWIRQP SGKGLDWLANIWWNDDKYYNSALKSRLTISKDTSNNQVFLKI SSVDTADTGTYYCAQVDGYYWYFDVWGAGTTVTVSSAKTT PPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGS
LSSGVHTFPAVLESDLYTLSSSVTVPSSPRPSETVTCNVAHP M15 H
ASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTIT (J515)
LTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQ FNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISK TKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVE
WQWNGQPAENYKNTQPIMNTNGSYFVYSKLNVQKSNWEAG NTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK (SEQ ID NO: 91)
QVTLKESGPGILQSSQTLSLTCSFSGFSLSTYGLGVGWIRQP SGKGLDWLANIWWNDDKYYNSALKSRLTISKDTSNNQVFLKI SSVDTADTGTYYCAQVDGYYWYFDVWGAGTTVTVSSAKTT
PPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGS M15 H LSSGVHTFPAVLESDLYTLSSSVTVPSSPRPSETVTCNVAHP (J516, J521, ASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKIKDVLMIS J522) LSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDY
NSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISK PKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYV
EWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVE RNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK (SEQ ID NO: 18)
[0107] Em certas modalidades, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, descrito neste documento, se liga especificamente ao B7- H4 humano e compreende uma cadeia leve listada na Tabela 6, por exemplo, em combinação com uma cadeia pesada. Tabela 6: Sequências de aminoácidos de cadeia leve Descrição da Sequência de aminoácidos de cadeia leve (SEQ ID NO) cadeia leve
DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSNRNTYLEW
YLQKPGQSPKLLIYNVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKI M6, M11, M15 L SRVEAEDLGVYYCFQGSHVPLTFGAGTKLELKRADAAPTV (J511 a J516) SIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSER
QNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTC EATHKTSTSPIVKSFNRNEC (SEQ ID NO: 19)
DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSNRNTYLEW L (1) Des-N-
YLQKPGQSPKLLIYNVANRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKI glicosilado
SRVEAEDLGVYYCFQGSHVPLTFGAGTKLELKRADAAPTV (J517, J519, J521)
SIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSER
QNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTC EATHKTSTSPIVKSFNRNEC (SEQ ID NO: 30)
DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSNRNTYLEW
YLQKPGQSPKLLIYQVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKI L (2) Des-N-
SRVEAEDLGVYYCFQGSHVPLTFGAGTKLELKRADAAPTV glicosilado
SIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSER (J518, J520, J522)
QNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTC EATHKTSTSPIVKSFNRNEC (SEQ ID NO: 31)
[0108] Em certas modalidades, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, descrito neste documento, se liga especificamente ao B7- H4 humano e compreende uma cadeia pesada listada na Tabela 5 e uma cadeia leve listada na Tabela 6.
[0109] Em aspectos específicos, são fornecidos neste documento anticorpos que compreendem uma cadeia pesada e uma cadeia leve. Com respeito à cadeia pesada, em uma modalidade específica, a cadeia pesada de um anticorpo descrito neste documento pode ser uma cadeia pesada alfa (α), delta (δ), épsilon (ε), gama (γ) ou mu (µ). Em uma modalidade particular, um anticorpo descrito neste documento, que se liga imunoespecificamente ao B7-H4 (por exemplo, B7-H4 humano) compreende uma cadeia pesada em que a sequência de aminoácidos do domínio VH compreende a sequência de aminoácidos estabelecida na Tabela 3, e em que a região constante da cadeia pesada compreende a sequência de uma região constante da cadeia pesada de lgG2a murina.
[0110] Em uma modalidade particular, um anticorpo descrito neste documento, que se liga imunoespecificamente ao B7-H4 (por exemplo, B7-H4 humano), compreende uma cadeia pesada em que a sequência de aminoácidos do domínio VH compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na Tabela 3, e em que a região constante da cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 87:
AKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSG VHTFPAVLESDLYTLSSSVTVPSSPRPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGC KPCICTVPEVSSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEV HTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKP KGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKN
TEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPG K (SEQ ID NO: 87)
[0111] Em uma modalidade particular, um anticorpo descrito neste documento, que se liga imunoespecificamente ao B7-H4 (por exemplo, B7-H4 humano), compreende uma cadeia pesada em que a sequência de aminoácidos do domínio VH compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na Tabela 3, e em que a região constante da cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de uma região constante da cadeia pesada de IgG1 murina.
[0112] Em uma modalidade particular, um anticorpo descrito neste documento, que se liga imunoespecificamente ao B7-H4 (por exemplo, B7-H4 humano), compreende uma cadeia pesada em que a sequência de aminoácidos do domínio VH compreende uma sequência de aminoácidos estabelecida na Tabela 3, e em que a região constante da cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 92:
AKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSG VHTFPAVLESDLYTLSSSVTVPSSPRPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGC KPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVE VHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISK TKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYK
NTQPIMNTNGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSP GK (SEQ ID NO: 92)
[0113] Com respeito à cadeia leve, em uma modalidade específica, a cadeia leve de um anticorpo descrito neste documento é uma cadeia leve kappa ou uma cadeia leve lambda. Em uma modalidade particular, um anticorpo descrito neste documento, que se liga imunoespecificamente ao B7-H4 (por exemplo, B7- H4 humano), compreende uma cadeia leve em que a sequência de aminoácidos do domínio VL compreende uma sequência de aminoácidos estabelecida na Tabela 4 e em que a região constante da cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 88:
RADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQN
GVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNR NEC (SEQ ID NO: 88).
[0114] Em outra modalidade específica, um anticorpo descrito neste documento, que se liga imunoespecificamente ao B7-H4 (por exemplo, B7-H4 humano) compreende (i) uma cadeia pesada em que a sequência de aminoácidos do domínio VH compreende uma sequência de aminoácidos estabelecida na Tabela 3, e em que a região constante da cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 87 e (ii) uma cadeia leve em que a sequência de aminoácidos do domínio VL compreende uma sequência de aminoácidos estabelecida na Tabela 4, e em que o a região constante da cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 88.
[0115] Em outra modalidade específica, um anticorpo descrito neste documento, que se liga imunoespecificamente ao B7-H4 (por exemplo, B7-H4 humano) compreende (i) uma cadeia pesada em que a sequência de aminoácidos do domínio VH compreende uma sequência de aminoácidos estabelecida na Tabela 3, e em que a região constante da cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 92 e (ii) uma cadeia leve, em que a sequência de aminoácidos do domínio VL compreende uma sequência de aminoácidos estabelecida na Tabela 4, e em que a região constante da cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 88.
[0116] Em uma modalidade específica, um anticorpo descrito neste documento, que se liga imunoespecificamente ao B7-H4 (por exemplo, B7-H4 humano) compreende um domínio VH e um domínio VL compreendendo qualquer sequência de aminoácidos descrita neste documento, e em que as regiões constantes compreendem o aminoácido sequências das regiões constantes de uma molécula de imunoglobulina IgG, IgE, IgM, IgD, IgA ou IgY, ou uma molécula de imunoglobulina IgG, IgE, IgM, IgD ou IgA murina. Em outra modalidade específica, um anticorpo descrito neste documento, que se liga imunoespecificamente ao B7-H4 (por exemplo, B7-H4 humano) compreende um domínio VH e um domínio VL que compreende qualquer sequência de aminoácidos descrita neste documento, e em que as regiões constantes compreendem as sequências de aminoácido das regiões constantes de uma molécula de imunoglobulina IgG, IgE, IgM, IgD, IgA ou IgY, qualquer classe (por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2), ou qualquer subclasse (por exemplo, IgG2a e IgG2b) de molécula de imunoglobulina. Em uma modalidade particular, as regiões constantes compreendem as sequências de aminoácidos das regiões constantes de uma molécula de imunoglobulina de IgG, IgE, IgM, IgD ou IgA murina, qualquer classe (por enquanto, IgG1, IgG2 e IgG3), ou qualquer subclasse (por exemplo, IgG2a e IgG2b) de molécula de imunoglobulina. Em uma modalidade particular, um anticorpo descrito neste documento, que se liga imunoespecificamente ao B7-H4 (por exemplo, B7-H4 humano) compreende um domínio VH e um domínio VL compreendendo qualquer sequência de aminoácidos, descrita neste documento, e domínios constantes murinos. Em uma modalidade particular, um anticorpo descrito neste documento, que se liga imunoespecificamente ao B7-H4 (por exemplo, B7- H4 humano) compreende um domínio VH e um domínio VL que compreendem qualquer sequência de aminoácidos descrita neste documento e domínios constantes de coelho.
[0117] Em modalidades específicas, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende as sequências VH e VL das sequências de aminoácidos da SEQ ID NOs: 6 e 9, respectivamente. Em modalidades específicas, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo em uma variante manipulada de um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que compreende as sequências de VH e VL das sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 6 e 9, em que a manipulação remove um ou mais sítios de glicosilação, por exemplo, em uma ou mais CDRs (por exemplo, VL- CDR2). Em modalidades específicas, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende as sequências VH e VL das sequências de aminoácidos da SEQ ID NOs: 6 e 10, respectivamente. Em modalidades específicas, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende as sequências VH e VL das sequências de aminoácidos da SEQ ID NOs: 6 e 11, respectivamente. Em modalidades específicas, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo (por exemplo, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que compreende uma VH da SEQ ID NO: 6 e uma VL das SEQ ID NO: 9, 10 ou 11) compreende adicionalmente o domínio constante de uma cadeia pesada de IgG1 murina (por exemplo, J511). Em modalidades específicas, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo (por exemplo, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que compreende uma VH da SEQ ID NO: 6 e uma VL da SEQ ID NO: 9, 10 ou 11) compreende adicionalmente o domínio constante de uma cadeia pesada de IgG2a murina (por exemplo, J512).
[0118] Em modalidades específicas, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende as sequências VH e VL das sequências de aminoácidos da SEQ ID NOs: 7 e 9, respectivamente. Em modalidades específicas, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo em uma variante manipulada de um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que compreende as sequências de VH e VL das sequências de aminoácidos da SEQ ID NOs: 7 e 9, em que a manipulação remove um ou mais sítios de glicosilação, por exemplo, em uma ou mais CDRs (por exemplo, VL- CDR2). Em modalidades específicas, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende as sequências VH e VL das sequências de aminoácidos da SEQ ID NOs: 7 e 10, respectivamente. Em modalidades específicas, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende as sequências VH e VL das sequências de aminoácidos da SEQ ID NOs: 7 e 11, respectivamente. Em modalidades específicas, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo (por exemplo, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que compreende uma VH da SEQ ID NO: 7 e uma VL das SEQ ID NO: 9, 10 ou 11) compreende adicionalmente o domínio constante de uma cadeia pesada de IgG1 murina (por exemplo, J513). Em modalidades específicas, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo (por exemplo, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que compreende uma VH da SEQ ID NO: 7 e uma VL das SEQ ID NO: 9, 10 ou 11), compreende adicionalmente o domínio constante de uma cadeia pesada de IgG2a murina (por exemplo, J514).
[0119] Em modalidades específicas, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende as sequências VH e VL das sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 8 e 9, respectivamente. Em modalidades específicas, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo em uma variante projetada de um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que compreende as sequências de VH e VL das sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 8 e 9, em que a manipulação remove um ou mais sítios de glicosilação, por exemplo, em um ou mais CDRs (por exemplo, VL-CDR2). Em modalidades específicas, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende as sequências VH e VL das sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 8 e 10, respectivamente. Em modalidades específicas, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende as sequências VH e VL das sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 8 e 11, respectivamente. Em modalidades específicas, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo (por exemplo, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que compreende uma VH da SEQ ID NO:8 e uma VL das SEQ ID NO: 9, 10 ou 11) compreende adicionalmente o domínio constante de uma cadeia pesada de IgG1 murina (por exemplo, J515). Em modalidades específicas, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo (por exemplo, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que compreende uma VH da SEQ ID NO:8 e uma VL das SEQ ID NO: 9, 10 ou 11), compreende adicionalmente o domínio constante de uma cadeia pesada deIgG2a murina (por exemplo, J516).
[0120] Em modalidades específicas, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo (i) compreende as sequências CDR de M6 (por exemplo, as sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 22-26 e 29), (ii) as sequências de VH e VL de M6 ou uma variante Des-N-glicosilada das mesmas (por exemplo, uma VH compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 6 e uma VL compreendendo a sequência de aminoácidos das SEQ ID NO: 9, 10 ou 11), (iii) as sequências de cadeia pesada e leve de IgG2a M6 murina ou uma variante De-N-glicosilada das mesmas (por exemplo, uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 16 e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos das SEQ ID NO: 19, 30 ou 31) ou (iv) as sequências de cadeia pesada e leve de IgG1 M6 murino (por exemplo, uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 89 e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 19).
[0121] Em modalidades específicas, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo (i) compreende as sequências de CDR de M11 (por exemplo, as sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 22-25, 27 e 29), (ii) as VH e VL sequências de M11 ou uma variante Des-N-glicosilada das mesmas (por exemplo, uma VH compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 7 e uma VL compreendendo a sequência de aminoácidos das SEQ ID NO: 9, 10 ou 11), (iii) as sequências de cadeia pesada e leve de IgG2a M11 murino ou uma variante De-N-glicosilada da mesma (por exemplo, uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 17 e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos das SEQ ID NO:19, 30 ou 31), ou (iv) as sequências de cadeia pesada e leve de IgG1 M11 murino (por exemplo, uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 90 e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 19).
[0122] Em modalidades específicas, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo (i) compreende as sequências de CDR de M15 (por exemplo, as sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 22-25, 28 e 29), (ii) as VH e VL sequências de M15 ou uma variante Des-N-glicosilada das mesmas (por exemplo, uma VH compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 8 e um VL compreendendo a sequência de aminoácidos das SEQ ID NO:9, 10 ou 11), (iii) as sequências de cadeia pesada e leve de IgG2a M15 murina ou uma variante De-N-glicosilada da mesma (por exemplo, uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 18 e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos das SEQ ID NO:19, 30 ou 31) ou (iv) as sequências de cadeia pesada e leve de IgG1 M15 murino (por exemplo, uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:91 e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:19).
[0123] Em outra modalidade particular, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, descrito neste documento, que se liga imunoespecificamente ao B7-H4 (por exemplo, B7-H4 humano), compreende uma cadeia pesada e uma cadeia leve, em que (i) a cadeia pesada compreende um Domínio VH compreendendo as sequências de aminoácidos VH CDR1, VH CDR2 e VH CDR3 de um anticorpo listado na Tabela 1 (por exemplo, SEQ ID NOs:22-24); (ii) a cadeia leve compreende um domínio VL que compreende as sequências de aminoácidos VL CDR1, VL CDR2 e VL CDR3 do mesmo anticorpo listado na Tabela 1 (por exemplo, SEQ ID NOs: 25, 26 e 29, 25, 27, e 29, ou 25, 28 e 29); (iii) a cadeia pesada compreende adicionalmente um domínio constante de IgG1 murino (por exemplo, compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 92) ou um domínio constante de IgG2a murino (por exemplo, compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 87); e (iv) a cadeia leve compreende adicionalmente um domínio constante kappa murino (por exemplo, compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 88).
[0124] Em outra modalidade particular, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, descrito neste documento, que se liga imunoespecificamente ao B7-H4 (por exemplo, B7-H4 humano), compreende uma cadeia pesada e uma cadeia leve, em que (i) a cadeia pesada compreende um Domínio VH que compreende a sequência de aminoácidos de um anticorpo listado na Tabela 1 (por exemplo, SEQ ID NOs: 6-8); (ii) a cadeia leve compreende um domínio VL compreendendo a sequência de aminoácidos do mesmo anticorpo listado na Tabela 1 (por exemplo, SEQ ID NOs: 9-11); (iii) a cadeia pesada compreende adicionalmente um domínio constante de IgG1 murino (por exemplo, compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 92) ou um domínio constante de IgG2a murino (por exemplo, compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 87); e (iv) a cadeia leve compreende adicionalmente um domínio constante kappa murino (por exemplo, compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 88).
[0125] Em certas modalidades, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, descrito neste documento, que se liga especificamente ao B7-H4 (por exemplo, B7-H4 humano), compreende uma, duas ou mais regiões de framework de VH (FRs) com as sequências de aminoácidos descritas neste documento para um anticorpo estabelecido na Tabela 7 (por exemplo, SEQ ID NOs: 38-49). Em algumas modalidades, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, descrito neste documento, que se liga especificamente ao B7-H4 (por exemplo, B7-H4 humano), compreende uma, duas ou mais regiões de framework de VL (FRs) com as sequências de aminoácidos descritas neste documento para um anticorpo estabelecido na Tabela 7 (por exemplo, SEQ ID NOs: 50-53). Em modalidades específicas, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, descrito neste documento, que se liga especificamente ao B7-H4 (por exemplo, B7-H4 humano), compreende uma, duas ou mais regiões de framework de VH tendo as sequências de aminoácidos, descritas neste documento, para um anticorpo apresentado na Tabela 7, supra, e uma, duas ou mais regiões de framework de VL possuindo as sequências de aminoácidos descritas neste documento para o mesmo anticorpo apresentado na Tabela 7 (por exemplo, SEQ ID NOs: 38-41 e 50-53; SEQ ID NOs: 42-45 e 50-53; ou SEQ ID NOs: 46-49 e 50- 53). Tabela 7: Sequências de Aminoácidos de Framework
Hibridoma FR1 FR2 FR3 FR4 VH/VL (SEQ ID NO) (SEQ ID NO) (SEQ ID NO) (SEQ ID NO) M6 VH QVTLKESGP GVGWIRQPS KYYNSALKSRLTIS WGAGTTV GILQPSQTL GKGLDWLANI KDTSNNQVFLKIS TVSS (SEQ SLTCSFS (SEQ ID SVDTADTGTYYCA ID NO: 41) (SEQ ID NO: NO:39) Q (SEQ ID NO:40) 38) M11 VH QVTLKESGP GVGWIRQPS KYYNSALKSRLTIS WGAGTTV GILQPSQTL GKGLGWLANI KDTSNNQVFLKIS TVSS (SEQ SLTCSLS (SEQ ID SVDTADTGTYYCA ID NO:45) (SEQ ID NO:43) Q (SEQ ID NO:44) NO:42) M15 VH QVTLKESGP GVGWIRQPS KYYNSALKSRLTIS WGAGTTV GILQSSQTL GKGLDWLANI KDTSNNQVFLKIS TVSS (SEQ SLTCSFS (SEQ ID SVDTADTGTYYCA ID NO:49) (SEQ ID NO:47) Q (SEQ ID NO:48) NO:46) M6, M11, DVLMTQTPL YLQKPGQSPK GVPDRFSGSGSG FGAGTKLE M15 VL SLPVSLGDQ LLIY (SEQ ID TDFTLKISRVEAED LK (SEQ ID ASISC (SEQ NO: 51) LGVYYC (SEQ ID NO:53) ID NO: 50) NO:52)
[0126] Em certas modalidades, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, descrito neste documento, que se liga especificamente ao B7-H4 (por exemplo, B7-H4 humano), compreende regiões de estrutura VH (FRs) com pelo menos 70%, pelo menos 75%, em pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98% de identidade de sequência com as regiões de framework VH descritas neste documento na Tabela 7. Em certas modalidades, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, descrito neste documento, que se liga especificamente a B7-H4 (por exemplo, B7- H4 humano), compreende regiões de framework VL (FRs) com pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou pelo menos 98% de identidade de sequência com as regiões de framework VL, descritas neste documento na Tabela 7. Em algumas modalidades, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, descrito neste documento, que se liga especificamente a B7-H4 (por exemplo, B7 humano -H4), compreende regiões estruturais VH (FRs) tendo pelo menos 70%, pelo menos 75%,
pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98% de identidade de sequência com as regiões de framework VH, descritas neste documento na Tabela 7, supra, e regiões de framework VL (FRs) tendo pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, em pelo menos 95% ou pelo menos 98% de identidade de sequência com as regiões de framework VL, descritas neste documento na Tabela 7.
[0127] Em outro aspecto, são fornecidos neste documento anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos que se ligam ao mesmo epítopo de B7-H4 (por exemplo, um epítopo de B7-H4 humano) como um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo descrito neste documento (por exemplo, J511- J522).
[0128] Os ensaios de ligação de competição podem ser usados para determinar se dois anticorpos se ligam a epítopos sobrepostos. A ligação competitiva pode ser determinada em um ensaio no qual a imunoglobulina em teste inibe a ligação específica de um anticorpo de referência a um antígeno comum, como B7-H4. Numerosos tipos de ensaios de ligação competitiva são conhecidos, por exemplo: radioimunoensaio direto ou indireto em fase sólida (RIA), imunoensaio enzimático direto ou indireto em fase sólida (EIA), ensaio de competição em sanduíche (ver Stahli C et al., (1983) Methods Enzymol 9: 242-253); EIA de biotina- avidina direto em fase sólida (ver Kirkland TN et al., (1986) J Immunol 137: 3614- 9); ensaio de marcação direta em fase sólida, ensaio em sanduíche de marcação direta em fase sólida (ver Harlow E & Lane D, (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press); RIA de marcação direta em fase sólida usando marcação I-125 (ver Morel GA et al., (1988) Mol Immunol 25 (1): 7-15); EIA biotina- avidina direto em fase sólida (Cheung RC et al., (1990) Virology 176: 546-52); e RIA marcado direto. (Moldenhauer G et al., (1990) Scand J Immunol 32: 77-82). Normalmente, esse ensaio envolve o uso de antígeno purificado (por exemplo, B7- H4, como B7-H4 humano) ligado a uma superfície sólida ou células contendo qualquer um destes: uma imunoglobulina de teste não marcada e uma imunoglobulina de referência marcada. A inibição competitiva pode ser medida pela determinação da quantidade da marcação ligada à superfície sólida ou células na presença da imunoglobulina de teste. Geralmente, a imunoglobulina de teste está presente em excesso. Normalmente, quando um anticorpo competidor está presente em excesso, ele inibirá a ligação específica de um anticorpo de referência a um antígeno comum em pelo menos 50-55%, 55-60%, 60-65%, 65-70%, 70-75% ou mais. Um ensaio de ligação de competição pode ser configurado num grande número de diferentes formatos utilizando antígeno marcado ou anticorpo marcado. Em uma versão comum deste ensaio, o antígeno é imobilizado em uma placa de 96 poços. A capacidade de anticorpos não marcados de bloquear a ligação de anticorpos marcados ao antígeno é então medida usando marcadores radioativos ou enzimáticos. Para mais detalhes ver, por exemplo, Wagener C et al., (1983) J Immunol 130: 2308-2315; Wagener C et al., (1984) J Immunol Methods 68: 269- 274; Kuroki M et al., (1990) Cancer Res 50: 4872-4879; Kuroki M et al., (1992) Immunol Invest 21: 523-538; Kuroki M et al., (1992) Hybridoma 11: 391-407 e Antibodies: A Laboratory Manual, editores Ed Harlow E & Lane D supra, pp. 386-
389.
[0129] Em uma modalidade, um ensaio de competição é realizado usando ressonância plasmônica de superfície (BIAcore®), por exemplo, por uma "abordagem em tandem", tal como a descrita por Abdiche YN et al., (2009) Analytical Biochem 386: 172-180, em que o antígeno B7-H4 é imobilizado na superfície do chip, por exemplo, um chip sensor CM5 e os anticorpos anti-B7-H4 são então executados no chip. Para determinar se um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compete com um anticorpo anti-B7-H4 descrito neste documento, o anticorpo anti-B7-H4 é primeiro executado sobre a superfície do chip para atingir a saturação e, em seguida, o anticorpo potencial competidor é adicionado. A ligação do anticorpo competidor ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo pode, então, ser determinada e quantificada em relação a um controle não competidor.
[0130] Em uma modalidade, a ligação de competição do Fortebio Octet é usada para determinar que um anticorpo contra B7-H4 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo inibe competitivamente a ligação de outro anticorpo contra B7-H4 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo ao B7-H4.
[0131] Em outro aspecto, são fornecidos neste documento anticorpos que inibem competitivamente (por exemplo, de uma maneira dependente da dose) um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, descrito neste documento (por exemplo, J511-J522), a partir de ligação ao B7-H4 (por exemplo,
B7-H4 humano), conforme determinado através do uso de ensaios conhecidos por um versado na técnica ou descrito neste documento(por exemplo, ensaios competitivos de ELISA ou matriz de suspensão ou ensaio de ressonância de plasmon de superfície).
[0132] Em aspectos específicos, é fornecido neste documento um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno que inibe competitivamente (por exemplo, de uma maneira dependente da dose) a ligação ao B7-H4 (por exemplo, B7-H4 humano), de um anticorpo compreendendo um domínio VH tendo a sequência de aminoácido estabelecida na SEQ ID NO: 6, e um domínio VL tendo a sequência de aminoácidos definida para a SEQ ID NO: 9.
[0133] Em aspectos específicos, é fornecido neste documento um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno que inibe competitivamente (por exemplo, de uma maneira dependente da dose) a ligação ao B7-H4 (por exemplo, B7-H4 humano), de um anticorpo compreendendo um domínio VH tendo a sequência de aminoácido estabelecida na SEQ ID NO: 7 e um domínio VL tendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 9.
[0134] Em aspectos específicos, é fornecido neste documento um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno que inibe competitivamente (por exemplo, de uma maneira dependente da dose) a ligação ao B7-H4 (por exemplo, B7-H4 humano), de um anticorpo compreendendo um domínio VH tendo a sequência de aminoácido estabelecida na SEQ ID NO: 8, e um domínio VL tendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 9.
[0135] Em aspectos específicos, é fornecido neste documento um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno que inibe competitivamente (por exemplo<, de uma maneira dependente da dose) a ligação ao B7-H4 (por exemplo, B7-H4 humano), de um anticorpo compreendendo um domínio VH tendo a sequência de aminoácido estabelecida na SEQ ID NO:6 e um domínio VL tendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:10.
[0136] Em aspectos específicos, é fornecido neste documento um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno que inibe competitivamente (por exemplo, de uma maneira dependente da dose) a ligação ao B7-H4 (por exemplo, B7-H4 humano), de um anticorpo que compreende um domínio VH tendo a sequência de aminoácido estabelecida na SEQ ID NO: 7 e um domínio VL tendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 10.
[0137] Em aspectos específicos, é fornecido neste documento um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno que inibe competitivamente (por exemplo, de uma maneira dependente da dose) a ligação ao B7-H4 (por exemplo, B7-H4 humano), de um anticorpo que compreende um domínio VH tendo a sequência de aminoácido estabelecida na SEQ ID NO:8, e um domínio VL tendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:10.
[0138] Em aspectos específicos, é fornecido neste documento um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno que inibe competitivamente (por exemplo<, de uma maneira dependente da dose) a ligação ao B7-H4 (por exemplo, B7-H4 humano), de um anticorpo que compreende um domínio VH tendo a sequência de aminoácido estabelecida na SEQ ID NO:6 e um domínio VL tendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:11.
[0139] Em aspectos específicos, é fornecido neste documento um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno que inibe competitivamente (por exemplo, de uma maneira dependente da dose) a ligação ao B7-H4 (por exemplo, B7-H4 humano), de um anticorpo que compreende um domínio VH, tendo a sequência de aminoácido estabelecida na SEQ ID NO:7 e um domínio VL tendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:11.
[0140] Em aspectos específicos, é fornecido neste documento um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno que inibe competitivamente (por exemplo, de uma maneira dependente da dose) a ligação ao B7-H4 (por exemplo, B7-H4 humano), de um anticorpo que compreende um domínio VH tendo a sequência de aminoácido estabelecida na SEQ ID NO:8, e um domínio VL tendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:11.
[0141] Em aspectos específicos, é fornecido neste documento um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que se liga imunoespecificamente ao mesmo epítopo B7-H4 (por exemplo, B7-H4 humano) como aquele de qualquer um de J511-J522.
[0142] Em um aspecto específico, um fragmento de ligação ao antígeno, conforme descrito neste documento, que se liga imunoespecificamente ao B7-H4 (por exemplo, B7-H4 humano), é selecionado a partir do grupo que consiste em um Fab, Fab ', F (ab')2, e scFv, em que o Fab, Fab ', F (ab')2ou scFv compreende uma sequência da região variável da cadeia pesada e uma sequência da região variável da cadeia leve de um anticorpo anti-B7-H4 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, como descrito neste documento. Um Fab, Fab ', F (ab')2ou scFv pode ser produzido por qualquer técnica conhecida pelos versados na técnica, incluindo, mas não se limitando a, aqueles discutidos na Seção 5.3, infra.
[0143] Um anticorpo anti-B7-H4 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo pode ser fundido ou conjugado (por exemplo, ligado covalentemente ou não covalentemente) a um marcador ou substância detectável. Exemplos de marcadores ou substâncias detectáveis incluem marcadores de enzimas, tais como iodo (125I, 121I), carbono (14C), enxofre (35S), trítio (3H), índio (121In) e tecnécio (99Tc); etiquetas luminescentes, como luminol; e marcadores fluorescentes, como fluoresceína e rodamina, e biotina. Esses anticorpos marcados ou seus fragmentos de ligação ao antígeno do mesmo podem ser usados para detectar a proteína B7- H4 (por exemplo, B7-H4 humana). Ver, por exemplo, Seção 5.4.1, infra. Produção de Anticorpos
[0144] Anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos que se ligam imunoespecificamente a B7-H4 (por exemplo, B7-H4 humano) podem ser produzidos por qualquer método conhecido na técnica para a síntese de anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, por exemplo, por síntese química ou por técnicas de expressão recombinante. Os métodos descritos neste documento empregam, a menos que indicado de outra forma, técnicas convencionais em biologia molecular, microbiologia, análise genética , DNA recombinante, química orgânica, bioquímica, PCR, síntese e modificação de oligonucleotídeos, hibridização de ácido nucleico e campos relacionados dentro da habilidade da técnica. Essas técnicas são descritas, por exemplo, nas referências citadas neste documento e são totalmente explicadas na literatura. Ver, por exemplo, Sambrook J al., (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Ausubel FM et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987 e atualizações anuais); Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons (1987 e atualizações anuais) Gait (ed.) (1984) Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press; Eckstein (ed.) (1991) Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, IRL
Press; Birren B et al., (Eds.) (1999) Genome Analysis: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press.
[0145] Em um certo aspecto, é fornecido neste documento um método de produção de um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno que se liga imunoespecificamente ao B7-H4 (por exemplo, B7-H4 humano) compreendendo a cultura de uma célula ou célula hospedeira descrita neste documento. Em um determinado aspecto, é fornecido neste documento um método de produção de um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga imunoespecificamente ao B7-H4 (por exemplo, B7-H4 humano), que compreende a expressão (por exemplo, expressão recombinante) do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo usando uma célula ou célula hospedeira, descrito neste documento (por exemplo, uma célula ou uma célula hospedeira compreendendo polinucleotídeos que codificam um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, descrito neste documento). Em uma modalidade em particular, a célula é uma célula isolada. Em uma modalidade em particular, os polinucleotídeo exógenos foram introduzidos na célula. Em uma modalidade particular, o método compreende adicionalmente a etapa de purificação do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno obtido a partir da célula ou célula hospedeira.
[0146] Os métodos para a produção de anticorpos policlonais são conhecidos na técnica (ver, por exemplo, Capítulo 11 em: Short Protocols in Molecular Biology, (2002) 5th Ed., Ausubel FM et al., Eds., John Wiley and Sons, New York) .
[0147] Os anticorpos monoclonais ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos podem ser preparados usando uma ampla variedade de técnicas conhecidas na técnica, incluindo o uso de tecnologias de hibridoma, recombinante e de exibição de fago, tecnologias de apresentação à base de levedura ou uma combinação das mesmas. Por exemplo, anticorpos monoclonais ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos podem ser produzidos usando técnicas de hibridoma, incluindo aquelas conhecidas na técnica e ensinadas, por exemplo, em Harlow E & Lane D, Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988); Hammerling GJ et al., Em: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563 681 (Elsevier, NY, 1981), ou como descrito em Kohler G & Milstein C (1975) Nature 256: 495. Exemplos de métodos de apresentação à base de levedura que podem ser empregados para selecionar e gerar os anticorpos, descritos neste documento, incluem aqueles divulgados em, por exemplo, WO2009 / 036379A2; WO2010/105256; e WO2012/009568, cada um dos quais é incorporado neste documento por referência na sua totalidade.
[0148] Em modalidades específicas, um anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo pode ser produzido usando o método de hibridoma primeiro descrito por Kohler et al., Nature, 256: 495 (1975), como mencionado acima. No método de hibridoma, um camundongo ou outro animal hospedeiro apropriado é imunizado, como descrito acima, para induzir linfócitos que produzem ou são capazes de produzir anticorpos que se ligarão especificamente à proteína usada para imunização, por exemplo, a proteína de domínio extracelular (ECD) B7-H4 proteína (SEQ ID NO: 20). Os linfócitos são então fundidos com células de mieloma usando um agente de fusão adequado, tal como polietilenoglicol, para formar uma célula de hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986)).
[0149] Em modalidades específicas, um anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno produzido por uma célula clonal (por exemplo, hibridoma ou célula hospedeira produzindo um anticorpo recombinante ou fragmento de ligação ao antígeno), em que o anticorpo ou antígeno o fragmento de ligação imunoespecificamente se liga ao B7-H4 (por exemplo, B7-H4 humano) conforme determinado , por exemplo, por ELISA ou outros ensaios de ligação ao antígeno conhecidos na técnica ou nos exemplos fornecidos neste documento. Em modalidades particulares, um anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo pode ser um anticorpo de roedor ou murino ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo. Em modalidades particulares, um anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo pode ser um anticorpo quimérico ou humanizado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo. Em certas modalidades, um anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo pode ser um fragmento Fab ou um fragmento F (ab ') 2. Os anticorpos monoclonais ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, descritos neste documento, podem, por exemplo, ser feitos pelo método de hibridoma como descrito em Kohler G & Milstein C (1975) Nature 256: 495 ou podem, por exemplo, ser isolados de bibliotecas de fago usando as técnicas conforme descrito neste documento, por exemplo. Outros métodos para a preparação de linhas celulares clonais e de anticorpos monoclonais e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos expressos, são desse modo bem conhecidos na técnica (ver, por exemplo, Capítulo 11 em: Short Protocols in Molecular Biology, (2002) 5ª Ed., Ausubel FM et al., Supra).
[0150] Fragmentos de ligação ao antígeno de anticorpos, descritos neste documento, podem ser gerados por qualquer técnica conhecida pelos versados na técnica. Por exemplo, os fragmentos Fab e F (ab') 2 descritos neste documento podem ser produzidos por clivagem proteolítica de moléculas de imunoglobulina, utilizando enzimas como papaína (para produzir fragmentos Fab) ou pepsina (para produzir fragmentos F (ab') 2). Um fragmento Fab corresponde a um dos dois braços idênticos de uma molécula de anticorpo tetramérico e contém a cadeia leve completa emparelhada com os domínios VH e CH1 da cadeia pesada. Um fragmento F (ab ')2 contém os dois braços de ligação ao antígeno de uma molécula de anticorpo tetramérica ligada por ligações dissulfeto na região de dobradiça.
[0151] Além disso, os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, descritos neste documento, também podem ser gerados usando vários métodos de exibição de fago e/ou de apresentação à base de levedura conhecidos na técnica. Em métodos de exibição de fagos, as proteínas são exibidas na superfície de partículas de fago que carregam as sequências de polinucleotídeo que as codificam. Em particular, as sequências de DNA que codificam os domínios VH e VL são amplificadas a partir de bibliotecas de cDNA de animais (por exemplo, bibliotecas de cDNA humano ou murino de tecidos afetados). O DNA que codifica os domínios VH ou VL são recombinados juntamente com um peptídeo de ligação de scFv por PCR e clonados em um vetor fagomídeo. O vetor é eletroporado em E. coli e a E. coli é infectada com o fago helper. Os fagos usados nestes métodos são tipicamente fagos filamentosos, incluindo fd e M13, e os domínios VH e VL são usualmente fundidos de forma recombinante com o gene III ou com o gene VIII do fago. O fago que expressa um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga especificamente a um antígeno particular pode ser selecionado ou identificado com o antígeno , por exemplo, usando antígeno marcado ou ligado ao antígeno ou capturado em uma superfície sólida ou grânulo. Exemplos de métodos de exibição de fago que podem ser usados para fazer os anticorpos ou fragmentos descritos neste documento incluem aqueles divulgados em Brinkman U et al., (1995) J Immunol Methods 182: 41-50; Ames RS et al., (1995) J Immunol Methods 184: 177-186; Kettleborough CA et al., (1994) Eur J Immunol 24: 952-958; Persic L et al., (1997) Gene 187: 9-18; Burton DR e Barbas CF (1994) Advan Immunol 57: 191-280; Pedido PCT No. PCT/GB91/001134; Publicações Internacionais WO 90/02809, WO 91/10737, WO 92/01047, WO 92/18619, WO 93/1 1236, WO 95/15982, WO 95/20401 e WO 97/13844; e Patentes US 5,698,426, 5,223,409, 5,403,484, 5,580,717, 5,427,908, 5,750,753, 5,821,047, 5,571,698, 5,427,908, 5,516,637, 5,780,225, 5,658,727, 5,733,743 e 5,969,108.
[0152] Um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo pode ser selecionado de qualquer classe de imunoglobulinas, incluindo IgM, IgG, IgD, IgA e IgE, e qualquer isotipo, incluindo IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. Polinucleotídeos
[0153] Em certos aspectos, são fornecidos, neste documento, polinucleotídeos compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, descrito neste documento, ou um domínio do mesmo (por exemplo, uma região de cadeia leve variável e/ou região de cadeia pesada variável) que imunoespecificamente se liga a um antígeno B7- H4 (por exemplo, B7-H4 humano) e vetores, por exemplo, vetores compreendendo tais polinucleotídeos para expressão recombinante em células hospedeiras (por exemplo, E. coli e células de mamíferos).
[0154] Em aspectos particulares, são fornecidos neste documento, os polinucleotídeos compreendendo sequências de nucleotídeos que codificam anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, que se ligam imunoespecificamente a um polipeptídeo B7-H4 (por exemplo, B7-H4 humano) e compreendem uma sequência de aminoácidos como descrito neste documento, bem como os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno que competem com esses anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno para a ligação a um polipeptídeo B7-H4 (por exemplo, de uma maneira dependente da dose), ou que se ligam ao mesmo epítopo, tal como os anticorpos ou antígeno fragmentos de ligação.
[0155] Também é fornecido neste documento um polinucleotídeo que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo que compreende uma sequência selecionada do grupo que consiste na SEQ ID NOs: 6-8. Em algumas modalidades, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreendendo o polipeptídeo se liga imunoespecificamente ao B7-H4.
[0156] Também é fornecido neste documento um polinucleotídeo compreendendo uma sequência de nucleotídeo, que codifica um polipeptídeo compreendendo uma sequência selecionada do grupo que consiste na SEQ ID NOs: 9-11. Em algumas modalidades, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreendendo o polipeptídeo se liga imunoespecificamente ao B7-H4.
[0157] Também é fornecido neste documento um polinucleotídeo compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo, que compreende uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 22-24, ou compreendendo os aminoácidos de todas as SEQ ID NOs: 22-
24. Em algumas modalidades, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreendendo o polipeptídeo se liga imunoespecificamente ao B7-H4. Também é fornecido neste documento um polinucleotídeo compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo compreendendo uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 25-29 ou compreendendo todas as SEQ ID NOs: 25, 26 e 29, todas as SEQ ID NOs: 25, 27 e 29, ou todas as SEQ ID NOs: 25, 28 e 29. Em algumas modalidades, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreendendo o polipeptídeo se liga imunoespecificamente ao B7-H4.
[0158] Também é fornecido neste documento um polinucleotídeo compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo, que compreende uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 16-18, 89, 90 e 91. Em algumas modalidades, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreendendo o polipeptídeo se liga imunoespecificamente ao B7-H4.
[0159] Também é fornecido neste documento um polinucleotídeo compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo compreendendo uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 19, 30 e 31. Em algumas modalidades, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreendendo o polipeptídeo se liga imunoespecificamente ao B7-H4.
[0160] Também são fornecidos neste documento polinucleotídeos que compreendem uma cadeia pesada e/ou uma sequência de nucleotídeos que codifica a cadeia leve mostrada na Tabela 8, por exemplo, em que um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreendendo a cadeia pesada codificada ou cadeia leve se liga especificamente ao B7-H4. Tabela 8: Sequências polinucleotídicas de codificação de cadeia pesada e leve Anticorpo Sequência polinucleotídica de codificação de cadeia pesada/leve (SEQ ID NO) J511 HC ATGGGCAGGCTTACTTCTTCATTCCTGCTACTGATTGTCCCTGC
ATATGTCCTGTCCCAGGTCACTCTGAAAGAGTCTGGCCCTGGG ATATTGCAGCCCTCCCAGACCCTCAGTCTGACTTGTTCTTTCTC TGGGTTTTCACTGAGCACTTATGGTCTGGGTGTAGGTTGGATT CGTCAGCCTTCAGGGAAGGGTCTGGACTGGCTGGCCAACATT TGGTGGAATGATGATAAATACTATAACTCAGCCCTGAAGAGCC GGCTCACAATCTCCAAGGATACCTCCAACAACCAGGTATTCCT CAAGATCTCCAGTGTGGACACTGCAGATACTGGCACATACTAC TGTGCTCAAGTTGATGGTTACTACTGGTACTTCGATGTCTGGG GCGCAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGCCAAAACGACAC CACCAAGTGTCTATCCACTGGCCCCTGGATCTGCTGCCCAAAC TAACTCCATGGTGACCCTGGGATGCCTGGTCAAGGGCTATTTC CCTGAGCCAGTGACAGTGACCTGGAACTCTGGATCCCTGTCCA GCGGTGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTGGAGTCTGACCTCTA CACTCTGAGCAGCTCAGTGACTGTCCCCTCCAGCCCTCGGCC CAGCGAGACCGTCACCTGCAACGTTGCCCACCCGGCCAGCAG CACCAAAGTGGACAAGAAAATTGTGCCCAGGGATTGTGGTTGT AAGCCTTGCATATGTACAGTCCCAGAAGTATCATCTGTCTTCAT
CTTCCCCCCAAAGCCCAAGGATGTGCTCACCATTACTCTGACT CcTAAGGTCACGTGTGTTGTGGTAGACATCAGCAAGGATGATC
CCGAGGTCCAGTTCAGCTGGTTTGTAGATGATGTGGAGGTGCA CACAGCTCAGACGCAACCCCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCAC TTTCCGCTCAGTCAGTGAACTTCCCATCATGCACCAGGACTGG CTCAATGGCAAGG AGTTCAAATGCAGGGTCAACAGTGCAGCTTTCCCTGCCCCCAT CGAGAAAACCATCTCCAAAACCAAAGGCAGACCGAAGGCTCCA CAGGTGTACACCATTCCACCTCCCAAGGAGCAGATGGCCAAG GATAAAGTCAGTCTGACCTGCATGATAACAGACTTCTTCCCTGA AGACATTACTGTGGAGTGGCAGTGGAATGGGCAGCCAGCGGA GAACTACAAGAACACTCAGCCCATCATGAACACGAATGGCTCT TACTTCGTCTACAGCAAGCTCAATGTGCAGAAGAGCAACTGGG AGGCAGGAAATACTTTCACCTGCTCTGTGTTACATGAGGGCCT
GCACAACCACCATACTGAGAAGAGCCTCTCCCACTCTCCTGGT AAATGA (SEQ ID NO: 93) J512, ATGGGCAGGCTTACTTCTTCATTCCTGCTACTGATTGTCCCTGC J517, ATATGTCCTGTCCCAGGTCACTCTGAAAGAGTCTGGCCCTGGG J518 HC ATATTGCAGCCCTCCCAGACCCTCAGTCTGACTTGTTCTTTCTC
TGGGTTTTCACTGAGCACTTATGGTCTGGGTGTAGGTTGGATT CGTCAGCCTTCAGGGAAGGGTCTGGACTGGCTGGCCAACATT TGGTGGAATGATGATAAATACTATAACTCAGCCCTGAAGAGCC GGCTCACAATCTCCAAGGATACCTCCAACAACCAGGTATTCCT CAAGATCTCCAGTGTGGACACTGCAGATACTGGCACATACTAC TGTGCTCAAGTTGATGGTTACTACTGGTACTTCGATGTCTGGG GCGCAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGCCAAAACGACAC CACCAAGTGTCTATCCACTGGCCCCTGGATCTGCTGCCCAAAC TAACTCCATGGTGACCCTGGGATGCCTGGTCAAGGGCTATTTC CCTGAGCCAGTGACAGTGACCTGGAACTCTGGATCCCTGTCCA GCGGTGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTGGAGTCTGACCTCTA CACTCTGAGCAGCTCAGTGACTGTCCCCTCCAGCCCTCGGCC CAGCGAGACCGTCACCTGCAACGTTGCCCACCCGGCCAGCAG CACCAAAGTGGACAAGAAAATTGTGCCCAGGGATTGTGGTTGT AAGCCTTGCATATGTACAGTCCCAGAAGTATCATCTGTCTTCAT CTTCCCCCCAAAGATCAAGGATGTACTCATGATCTCCCTGAGC CCCATAGTCACATGTGTGGTGGTGGATGTGAGCGAGGATGAC CCAGATGTCCAGATCAGCTGGTTTGTGAACAACGTGGAAGTAC ACACAGCTCAGACACAAACCCATAGAGAGGATTACAACAGTAC TCTCCGGGTGGTCAGTGCCCTCCCCATCCAGCACCAGGACTG GATGAGTGGCAAGG AGTTCAAATGCAAGGTCAACAACAAAGACCTCCCAGCGCCCAT CGAGAGAACCATCTCAAAACCCAAAGGGTCAGTAAGAGCTCCA CAGGTATATGTCTTGCCTCCACCAGAAGAAGAGATGACTAAGA AACAGGTCACTCTGACCTGCATGGTCACAGACTTCATGCCTGA AGACATTTACGTGGAGTGGACCAACAACGGGAAAACAGAGCTA AACTACAAGAACACTGAACCAGTCCTGGACTCTGATGGTTCTTA CTTCATGTACAGCAAGCTGAGAGTGGAAAAGAAGAACTGGGTG GAAAGAAATAGCTACTCCTGTTCAGTGGTCCACGAGGGTCTGC
ACAATCACCACACGACTAAGAGCTTCTCCCGGACTCCGGGTAA ATAGTAA (SEQ ID NO: 12) J513 HC ATGGGCAGGCTTACTTCTTCATTCCTGCTACTGATTGTCCCTGC
ATATGTCCTGTCCCAGGTCACTCTGAAAGAGTCTGGCCCTGGG ATATTGCAGCCCTCCCAGACCCTCAGTCTGACTTGTTCTCTCTC TGGGTTTTCACTGAGCACTTATGGTCTGGGTGTAGGTTGGATT CGTCAGCCTTCAGGGAAGGGTCTGGGCTGGCTGGCCAACATT TGGTGGAATGATGATAAATACTATAACTCAGCCCTGAAGAGCC GGCTCACAATCTCCAAGGATACCTCCAACAACCAGGTATTCCT CAAGATCTCCAGTGTGGACACTGCAGATACTGGCACATACTAC TGTGCTCAAGTTGATGGTTACTACTGGTACTTCGATGTCTGGG GCGCAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGCCAAAACGACAC CACCAAGTGTCTATCCACTGGCCCCTGGATCTGCTGCCCAAAC TAACTCCATGGTGACCCTGGGATGCCTGGTCAAGGGCTATTTC CCTGAGCCAGTGACAGTGACCTGGAACTCTGGATCCCTGTCCA GCGGTGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTGGAGTCTGACCTCTA CACTCTGAGCAGCTCAGTGACTGTCCCCTCCAGCCCTCGGCC CAGCGAGACCGTCACCTGCAACGTTGCCCACCCGGCCAGCAG CACCAAGGTGGACAAGAAAATTGTGCCCAGGGATTGTGGTTGT AAGCCTTGCATATGTACAGTCCCAGAAGTATCATCTGTCTTCAT
CTTCCCCCCAAAGCCCAAGGATGTGCTCACCATTACTCTGACT CcTAAGGTCACGTGTGTTGTGGTAGACATCAGCAAGGATGATC
CCGAGGTCCAGTTCAGCTGGTTTGTAGATGATGTGGAGGTGCA CACAGCTCAGACGCAACCCCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCAC TTTCCGCTCAGTCAGTGAACTTCCCATCATGCACCAGGACTGG CTCAATGGCAAGGAGTTCAAATGCAGGGTCAACAGTGCAGCTT TCCCTGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAACCAAAGGCAG ACCGAAGGCTCCACAGGTGTACACCATTCCACCTCCCAAGGAG CAGATGGCCAAGGATAAAGTCAGTCTGACCTGCATGATAACAG ACTTCTTCCCTGAAGACATTACTGTGGAGTGGCAGTGGAATGG GCAGCCAGCGGAGAACTACAAGAACACTCAGCCCATCATGAA CACGAATGGCTCTTACTTCGTCTACAGCAAGCTCAATGTGCAG AAGAGCAACTGGGAGGCAGGAAATACTTTCACCTGCTCTGTGT
TACATGAGGGCCTGCACAACCACCATACTGAGAAGAGCCTCTC CCACTCTCCTGGTAAATGA (SEQ ID NO:94) J514, ATGGGCAGGCTTACTTCTTCATTCCTGCTACTGATTGTCCCTGC J519, ATATGTCCTGTCCCAGGTCACTCTGAAAGAGTCTGGCCCTGGG J520 HC ATATTGCAGCCCTCCCAGACCCTCAGTCTGACTTGTTCTCTCTC
TGGGTTTTCACTGAGCACTTATGGTCTGGGTGTAGGTTGGATT CGTCAGCCTTCAGGGAAGGGTCTGGGCTGGCTGGCCAACATT TGGTGGAATGATGATAAATACTATAACTCAGCCCTGAAGAGCC GGCTCACAATCTCCAAGGATACCTCCAACAACCAGGTATTCCT CAAGATCTCCAGTGTGGACACTGCAGATACTGGCACATACTAC TGTGCTCAAGTTGATGGTTACTACTGGTACTTCGATGTCTGGG GCGCAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGCCAAAACGACAC CACCAAGTGTCTATCCACTGGCCCCTGGATCTGCTGCCCAAAC TAACTCCATGGTGACCCTGGGATGCCTGGTCAAGGGCTATTTC CCTGAGCCAGTGACAGTGACCTGGAACTCTGGATCCCTGTCCA GCGGTGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTGGAGTCTGACCTCTA CACTCTGAGCAGCTCAGTGACTGTCCCCTCCAGCCCTCGGCC CAGCGAGACCGTCACCTGCAACGTTGCCCACCCGGCCAGCAG CACCAAGGTGGACAAGAAAATTGTGCCCAGGGATTGTGGTTGT AAGCCTTGCATATGTACAGTCCCAGAAGTATCATCTGTCTTCAT CTTCCCCCCAAAGATCAAGGATGTACTCATGATCTCCCTGAGC CCCATAGTCACATGTGTGGTGGTGGATGTGAGCGAGGATGAC CCAGATGTCCAGATCAGCTGGTTTGTGAACAACGTGGAAGTAC ACACAGCTCAGACACAAACCCATAGAGAGGATTACAACAGTAC TCTCCGGGTGGTCAGTGCCCTCCCCATCCAGCACCAGGACTG GATGAGTGGCAAGGAGTTCAAATGCAAGGTCAACAACAAAGAC CTCCCAGCGCCCATCGAGAGAACCATCTCAAAACCCAAAGGGT CAGTAAGAGCTCCACAGGTATATGTCTTGCCTCCACCAGAAGA AGAGATGACTAAGAAACAGGTCACTCTGACCTGCATGGTCACA GACTTCATGCCTGAAGACATTTACGTGGAGTGGACCAACAACG GGAAAACAGAGCTAAACTACAAGAACACTGAACCAGTCCTGGA CTCTGATGGTTCTTACTTCATGTACAGCAAGCTGAGAGTGGAA AAGAAGAACTGGGTGGAAAGAAATAGCTACTCCTGTTCAGTGG
TCCACGAGGGTCTGCACAATCACCACACGACTAAGAGCTTCTC CCGGACTCCGGGTAAATAGTAA (SEQ ID NO:13) J515 HC ATGGGCAGGCTTACTTCTTCATTCCTGCTACTGATTGTCCCTGC
ATATGTCCTGTCCCAGGTCACTCTGAAAGAGTCTGGCCCTGGG ATATTGCAGTCCTCCCAGACCCTCAGTCTGACTTGTTCTTTCTC TGGGTTTTCACTGAGCACTTATGGTCTGGGTGTAGGTTGGATT CGTCAGCCTTCAGGGAAGGGTCTGGACTGGCTGGCCAACATT TGGTGGAATGATGATAAATACTATAACTCAGCCCTGAAGAGCC GGCTCACAATCTCCAAGGATACCTCCAACAACCAGGTATTCCT CAAGATCTCCAGTGTGGACACTGCAGATACTGGCACATACTAC TGTGCTCAAGTTGATGGTTACTACTGGTACTTCGATGTCTGGG GCGCAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGCCAAAACGACAC CACCAAGTGTCTATCCACTGGCCCCTGGATCTGCTGCCCAAAC TAACTCCATGGTGACCCTGGGATGCCTGGTCAAGGGCTATTTC CCTGAGCCAGTGACAGTGACCTGGAACTCTGGATCCCTGTCCA GCGGTGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTGGAGTCTGACCTCTA CACTCTGAGCAGCTCAGTGACTGTCCCCTCCAGCCCTCGGCC CAGCGAGACCGTCACCTGCAACGTTGCCCACCCGGCCAGCAG CACCAAGGTGGACAAGAAAATTGTGCCCAGGGATTGTGGTTGT AAGCCTTGCATATGTACAGTCCCAGAAGTATCATCTGTCTTCAT
CTTCCCCCCAAAGCCCAAGGATGTGCTCACCATTACTCTGACT CcTAAGGTCACGTGTGTTGTGGTAGACATCAGCAAGGATGATC
CCGAGGTCCAGTTCAGCTGGTTTGTAGATGATGTGGAGGTGCA CACAGCTCAGACGCAACCCCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCAC TTTCCGCTCAGTCAGTGAACTTCCCATCATGCACCAGGACTGG CTCAATGGCAAGGAGTTCAAATGCAGGGTCAACAGTGCAGCTT TCCCTGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAACCAAAGGCAG ACCGAAGGCTCCACAGGTGTACACCATTCCACCTCCCAAGGAG CAGATGGCCAAGGATAAAGTCAGTCTGACCTGCATGATAACAG ACTTCTTCCCTGAAGACATTACTGTGGAGTGGCAGTGGAATGG GCAGCCAGCGGAGAACTACAAGAACACTCAGCCCATCATGAA CACGAATGGCTCTTACTTCGTCTACAGCAAGCTCAATGTGCAG AAGAGCAACTGGGAGGCAGGAAATACTTTCACCTGCTCTGTGT
TACATGAGGGCCTGCACAACCACCATACTGAGAAGAGCCTCTC CCACTCTCCTGGTAAATGA (SEQ ID NO:95) J516, ATGGGCAGGCTTACTTCTTCATTCCTGCTACTGATTGTCCCTGC J521, ATATGTCCTGTCCCAGGTCACTCTGAAAGAGTCTGGCCCTGGG J522 HC ATATTGCAGTCCTCCCAGACCCTCAGTCTGACTTGTTCTTTCTC
TGGGTTTTCACTGAGCACTTATGGTCTGGGTGTAGGTTGGATT CGTCAGCCTTCAGGGAAGGGTCTGGACTGGCTGGCCAACATT TGGTGGAATGATGATAAATACTATAACTCAGCCCTGAAGAGCC GGCTCACAATCTCCAAGGATACCTCCAACAACCAGGTATTCCT CAAGATCTCCAGTGTGGACACTGCAGATACTGGCACATACTAC TGTGCTCAAGTTGATGGTTACTACTGGTACTTCGATGTCTGGG GCGCAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGCCAAAACGACAC CACCAAGTGTCTATCCACTGGCCCCTGGATCTGCTGCCCAAAC TAACTCCATGGTGACCCTGGGATGCCTGGTCAAGGGCTATTTC CCTGAGCCAGTGACAGTGACCTGGAACTCTGGATCCCTGTCCA GCGGTGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTGGAGTCTGACCTCTA CACTCTGAGCAGCTCAGTGACTGTCCCCTCCAGCCCTCGGCC CAGCGAGACCGTCACCTGCAACGTTGCCCACCCGGCCAGCAG CACCAAGGTGGACAAGAAAATTGTGCCCAGGGATTGTGGTTGT AAGCCTTGCATATGTACAGTCCCAGAAGTATCATCTGTCTTCAT CTTCCCCCCAAAGATCAAGGATGTACTCATGATCTCCCTGAGC CCCATAGTCACATGTGTGGTGGTGGATGTGAGCGAGGATGAC CCAGATGTCCAGATCAGCTGGTTTGTGAACAACGTGGAAGTAC ACACAGCTCAGACACAAACCCATAGAGAGGATTACAACAGTAC TCTCCGGGTGGTCAGTGCCCTCCCCATCCAGCACCAGGACTG GATGAGTGGCAAGG AGTTCAAATGCAAGGTCAACAACAAAGACCTCCCAGCGCCCAT CGAGAGAACCATCTCAAAACCCAAAGGGTCAGTAAGAGCTCCA CAGGTATATGTCTTGCCTCCACCAGAAGAAGAGATGACTAAGA AACAGGTCACTCTGACCTGCATGGTCACAGACTTCATGCCTGA AGACATTTACGTGGAGTGGACCAACAACGGGAAAACAGAGCTA AACTACAAGAACACTGAACCAGTCCTGGACTCTGATGGTTCTTA CTTCATGTACAGCAAGCTGAGAGTGGAAAAGAAGAACTGGGTG GAAAGAAATAGCTACTCCTGTTCAGTGGTCCACGAGGGTCTGC
ACAATCACCACACGACTAAGAGCTTCTCCCGGACTCCGGGTAA ATAGTAA (SEQ ID NO: 14) J511 a ATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTGGTGCTGATGTTCTGGATTC J516 LC CTGCTTCCGGCAGTGATGTTTTGATGACCCAAACTCCACTCTC
CCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCATCTCTTGCAGA TCTAGTCAGAGCATTGTACATAGTAATAGAAACACCTATTTAGA ATGGTACCTGCAGAAACCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATC TACAACGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCA GTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAGATCAGCAG AGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAGTTTATTACTGCTTTCAAGGT TCACATGTTCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAG CTGAAACGGGCTGATGCTGCACCAACTGTATCCATCTTCCCAC CATCCAGTGAGCAGTTGACATCTGGAGGTGCCTCAGTCGTGTG CTTCTTGAACAACTTCTACCCCAAAGACATCAATGTCAAGTGGA AGATTGATGGCAGTGAACGACAAAATGGCGTCCTGAACAGTTG GACTGATCAGGACAGCAAAGACAGCACCTACAGCATGAGCAG CACCCTCACGTTGACCAAGGACGAGTATGAACGACATAACAGC
TATACCTGTGAGGCCACTCACAAGACATCAACTTCACCCATTGT CAAGAGCTTCAACAGGAATGAGTGTTAG (SEQ ID NO: 15) J517, ATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTGGTGCTGATGTTCTGGATTC J519 e CTGCTTCCGGCAGTGATGTTTTGATGACCCAAACTCCACTCTC J521 LC CCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCATCTCTTGCAGA
TCTAGTCAGAGCATTGTACATAGTAATAGAAACACCTATTTAGA ATGGTACCTGCAGAAACCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATC TACAACGTTGCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCA GTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAGATCAGCAG AGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAGTTTATTACTGCTTTCAAGGT TCACATGTTCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAG CTGAAACGGGCTGATGCTGCACCAACTGTATCCATCTTCCCAC CATCCAGTGAGCAGTTGACATCTGGAGGTGCCTCAGTCGTGTG CTTCTTGAACAACTTCTACCCCAAAGACATCAATGTCAAGTGGA AGATTGATGGCAGTGAACGACAAAATGGCGTCCTGAACAGTTG GACTGATCAGGACAGCAAAGACAGCACCTACAGCATGAGCAG CACCCTCACGTTGACCAAGGACGAGTATGAACGACATAACAGC
TATACCTGTGAGGCCACTCACAAGACATCAACTTCACCCATTGT CAAGAGCTTCAACAGGAATGAGTGTTAG (SEQ ID NO: 96) J518, ATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTGGTGCTGATGTTCTGGATTC J520 e CTGCTTCCGGCAGTGATGTTTTGATGACCCAAACTCCACTCTC J522 LC CCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCATCTCTTGCAGA
TCTAGTCAGAGCATTGTACATAGTAATAGAAACACCTATTTAGA ATGGTACCTGCAGAAACCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATC TACCAGGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCA GTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAGATCAGCAG AGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAGTTTATTACTGCTTTCAAGGT TCACATGTTCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAG CTGAAACGGGCTGATGCTGCACCAACTGTATCCATCTTCCCAC CATCCAGTGAGCAGTTGACATCTGGAGGTGCCTCAGTCGTGTG CTTCTTGAACAACTTCTACCCCAAAGACATCAATGTCAAGTGGA AGATTGATGGCAGTGAACGACAAAATGGCGTCCTGAACAGTTG GACTGATCAGGACAGCAAAGACAGCACCTACAGCATGAGCAG CACCCTCACGTTGACCAAGGACGAGTATGAACGACATAACAGC
TATACCTGTGAGGCCACTCACAAGACATCAACTTCACCCATTGT CAAGAGCTTCAACAGGAATGAGTGTTAG (SEQ ID NO: 97)
[0161] Também é fornecido neste documento um polinucleotídeo que compreende um ácido nucleico que codifica um domínio variável da cadeia pesada, em que o ácido nucleico que codifica o domínio variável da cadeia pesada compreende as três sequências de codificação de CDR da SEQ ID NO: 12. Também é fornecido neste documento um polinucleotídeo que compreende um ácido nucleico que codifica um domínio variável da cadeia pesada, em que o ácido nucleico que codifica o domínio variável da cadeia pesada compreende as três sequências de codificação de CDR da SEQ ID NO:13. Também é fornecido neste documento um polinucleotídeo que compreende um ácido nucleico que codifica um domínio variável da cadeia pesada, em que o ácido nucleico que codifica o domínio variável da cadeia pesada compreende as três sequências de codificação de CDR da SEQ ID NO:14. Também é fornecido neste documento um polinucleotídeo que compreende um ácido nucleico que codifica um domínio variável da cadeia pesada, em que o ácido nucleico que codifica o domínio variável da cadeia pesada compreende as três sequências de codificação de CDR da SEQ ID NO:93. Também é fornecido neste documento um polinucleotídeo que compreende um ácido nucleico que codifica um domínio variável da cadeia pesada, em que o ácido nucleico que codifica o domínio variável da cadeia pesada compreende as três sequências de codificação de CDR da SEQ ID NO:94. Também é fornecido neste documento um polinucleotídeo que compreende um ácido nucleico que codifica um domínio variável da cadeia pesada, em que o ácido nucleico que codifica o domínio variável da cadeia pesada compreende as três sequências de codificação de CDR da SEQ ID NO:95.
[0162] Também é fornecido neste documento um polinucleotídeo que compreende um ácido nucleico que codifica um domínio variável da cadeia leve, em que o ácido nucleico que codifica o domínio variável da cadeia leve compreende as três sequências de codificação de CDR da SEQ ID NO:15. Também é fornecido neste documento um polinucleotídeo que compreende um ácido nucleico que codifica um domínio variável da cadeia leve, em que o ácido nucleico que codifica o domínio variável da cadeia leve compreende as três sequências de codificação de CDR da SEQ ID NO:96. Também é fornecido neste documento um polinucleotídeo que compreende um ácido nucleico que codifica um domínio variável da cadeia leve, em que o ácido nucleico que codifica o domínio variável da cadeia leve compreende as três sequências de codificação de CDR da SEQ ID NO:97.
[0163] Também é fornecida neste documento uma composição que compreende (i) um polinucleotídeo compreendendo um ácido nucleico que codifica um domínio variável de cadeia pesada, em que o ácido nucleico que codifica o domínio variável de cadeia pesada compreende a sequência de três codificação de CDR de SEQ ID NO: 12 ou 93 e (ii) um polinucleotídeo compreendendo um ácido nucleico que codifica um domínio variável de cadeia leve, em que o ácido nucleico que codifica o domínio variável de cadeia leve compreende as três sequências de codificação de CDR das SEQ ID NO: 15, 96 ou 97. O ácido nucleico que codifica o domínio variável da cadeia pesada e o ácido nucleico que codifica o domínio variável da cadeia leve podem estar no mesmo polinucleotídeo ou em polinucleotídeos diferentes. O ácido nucleico que codifica o domínio variável da cadeia pesada e o ácido nucleico que codifica o domínio variável da cadeia leve podem estar no mesmo vetor ou em vetores diferentes.
[0164] Também é fornecida neste documento uma composição que compreende (i) um polinucleotídeo compreendendo um ácido nucleico que codifica um domínio variável de cadeia pesada, em que o ácido nucleico que codifica o domínio variável de cadeia pesada compreende as três sequências de codificação de CDR das SEQ ID NO:13 ou 94 e (ii) um polinucleotídeo compreendendo um ácido nucleico que codifica um domínio variável de cadeia leve, em que o ácido nucleico que codifica o domínio variável de cadeia leve compreende as três sequências de codificação de CDR das SEQ ID NO: 15, 96 ou 97. O ácido nucleico que codifica o domínio variável da cadeia pesada e o ácido nucleico que codifica o domínio variável da cadeia leve podem estar no mesmo polinucleotídeo ou em polinucleotídeos diferentes. O ácido nucleico que codifica o domínio variável da cadeia pesada e o ácido nucleico que codifica o domínio variável da cadeia leve podem estar no mesmo vetor ou em vetores diferentes.
[0165] Também é fornecida neste documento uma composição que compreende (i) um polinucleotídeo compreendendo um ácido nucleico que codifica um domínio variável de cadeia pesada, em que o ácido nucleico que codifica o domínio variável de cadeia pesada compreende três sequências de codificação de CDR das SEQ ID NO: 14 ou 95 e (ii) um polinucleotídeo compreendendo um ácido nucleico que codifica um domínio variável de cadeia leve, em que o ácido nucleico que codifica o domínio variável de cadeia leve compreende as três sequências de codificação de CDR das SEQ ID NO: 15, 96 ou 97. O ácido nucleico que codifica o domínio variável da cadeia pesada e o ácido nucleico que codifica o domínio variável da cadeia leve podem estar no mesmo polinucleotídeo ou em polinucleotídeos diferentes. O ácido nucleico que codifica o domínio variável da cadeia pesada e o ácido nucleico que codifica o domínio variável da cadeia leve podem estar no mesmo vetor ou em vetores diferentes.
[0166] Também é fornecido neste documento um polinucleotídeo que compreende um ácido nucleico que codifica um domínio variável da cadeia pesada, em que o ácido nucleico que codifica o domínio variável da cadeia pesada compreende a sequência de codificação de domínio variável da SEQ ID NO: 12. Também é fornecido neste documento um polinucleotídeo compreendendo um ácido nucleico que codifica um domínio variável da cadeia pesada, em que o ácido nucleico que codifica o domínio variável da cadeia pesada compreende a sequência de codificação do domínio variável da SEQ ID NO: 13. Também é fornecido neste documento um polinucleotídeo que compreende um ácido nucleico que codifica um domínio variável de cadeia pesada, em que o ácido nucleico que codifica o domínio variável de cadeia pesada compreende a sequência de codificação de domínio variável da SEQ ID NO:14. Também é fornecido neste documento um polinucleotídeo que compreende um ácido nucleico que codifica um domínio variável da cadeia pesada, em que o ácido nucleico que codifica o domínio variável da cadeia pesada compreende a sequência de codificação do domínio variável da SEQ ID NO: 93. Também é fornecido neste documento um polinucleotídeo que compreende um ácido nucleico que codifica um domínio variável de cadeia pesada, em que o ácido nucleico que codifica o domínio variável de cadeia pesada compreende a sequência de codificação de domínio variável da SEQ ID NO:94. Também é fornecido neste documento um polinucleotídeo que compreende um ácido nucleico que codifica um domínio variável da cadeia pesada, em que o ácido nucleico que codifica o domínio variável da cadeia pesada compreende a sequência de codificação do domínio variável da SEQ ID NO: 95.
[0167] Também é fornecido neste documento um polinucleotídeo que compreende um ácido nucleico que codifica um domínio variável da cadeia leve, em que o ácido nucleico que codifica o domínio variável da cadeia leve compreende a sequência de codificação de domínio variável da SEQ ID NO:15. Também é fornecido, neste documento, um polinucleotídeo que compreende um ácido nucleico que codifica um domínio variável de cadeia leve, em que o ácido nucleico que codifica o domínio variável da cadeia leve compreende a sequência de codificação de domínio variável da SEQ ID NO:96. Também é fornecido neste documento um polinucleotídeo que compreende um ácido nucleico que codifica um domínio variável da cadeia leve, em que o ácido nucleico que codifica o domínio variável da cadeia leve compreende a sequência de codificação de domínio variável da SEQ ID NO:97.
[0168] Também é fornecida neste documento uma composição que compreende (i) um polinucleotídeo compreendendo um ácido nucleico que codifica um domínio variável de cadeia pesada, em que o ácido nucleico que codifica o domínio variável de cadeia pesada compreende a sequência de codificação de domínio variável das SEQ ID NO: 12 ou 93 e (ii) um polinucleotídeo compreendendo um ácido nucleico que codifica um domínio variável de cadeia leve, em que o ácido nucleico que codifica o domínio variável de cadeia leve compreende a sequência de codificação de domínio variável das SEQ ID NO: 15, 96 ou 97. O ácido nucleico que codifica o domínio variável da cadeia pesada e o ácido nucleico que codifica o domínio variável da cadeia leve podem estar no mesmo polinucleotídeo ou em polinucleotídeos diferentes. O ácido nucleico que codifica o domínio variável da cadeia pesada e o ácido nucleico que codifica o domínio variável da cadeia leve podem estar no mesmo vetor ou em vetores diferentes.
[0169] Também é fornecida neste documento uma composição que compreende (i) um polinucleotídeo compreendendo um ácido nucleico que codifica um domínio variável de cadeia pesada, em que o ácido nucleico que codifica o domínio variável de cadeia pesada compreende a sequência de codificação de domínio variável das SEQ ID NO:13 ou 94 e (ii) um polinucleotídeo compreendendo um ácido nucleico que codifica um domínio variável de cadeia leve, em que o ácido nucleico que codifica o domínio variável de cadeia leve compreende a sequência de codificação de domínio variável das SEQ ID NO: 15, 96 ou 97. O ácido nucleico que codifica o domínio variável da cadeia pesada e o ácido nucleico que codifica o domínio variável da cadeia leve podem estar no mesmo polinucleotídeo ou em polinucleotídeos diferentes. O ácido nucleico que codifica o domínio variável da cadeia pesada e o ácido nucleico que codifica o domínio variável da cadeia leve podem estar no mesmo vetor ou em vetores diferentes.
[0170] Também é fornecida neste documento uma composição que compreende (i) um polinucleotídeo compreendendo um ácido nucleico que codifica um domínio variável de cadeia pesada, em que o ácido nucleico que codifica o domínio variável de cadeia pesada compreende a sequência de codificação de domínio variável das SEQ ID NO: 14 ou 95 e (ii) um polinucleotídeo compreendendo um ácido nucleico que codifica um domínio variável de cadeia leve, em que o ácido nucleico que codifica o domínio variável de cadeia leve compreende a sequência de codificação de domínio variável das SEQ ID NO: 15, 96 ou 97. O ácido nucleico que codifica o domínio variável da cadeia pesada e o ácido nucleico que codifica o domínio variável da cadeia leve podem estar no mesmo polinucleotídeo ou em polinucleotídeos diferentes. O ácido nucleico que codifica o domínio variável da cadeia pesada e o ácido nucleico que codifica o domínio variável da cadeia leve podem estar no mesmo vetor ou em vetores diferentes.
[0171] Também são fornecidos neste documento polinucleotídeos que compreendem uma sequência de nucleotídeos que codifica a SEQ ID NO: 6, 7, 8, 9, 10, 11, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 ou 29, respectivamente.
[0172] Também são fornecidos neste documento polinucleotídeos que são pelo menos cerca de 80%, 85% ou 90% idênticos a uma sequência de nucleotídeos que codifica a SEQ ID NO: 6, 7, 8, 9, 10, 11, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 ou 29, respectivamente.
[0173] Também são fornecidos neste documento polinucleotídeos compreendendo uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos cerca de 95% idêntica a uma sequência de nucleotídeos que codifica a SEQ ID NO: 6, 7, 8, 9, 10, 11, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 ou 29, respectivamente. Também são fornecidos neste documento polinucleotídeos compreendendo uma sequência de nucleotídeos que é de pelo menos cerca de 96% idêntica a uma sequência de nucleotídeos que codifica a SEQ ID NO: 6, 7, 8, 9, 10, 11, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 ou 29, respectivamente. Também são fornecidos neste documento polinucleotídeos compreendendo uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos cerca de 97% idêntica a uma sequência de nucleotídeos que codifica a SEQ ID NO: 6, 7, 8, 9, 10, 11, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 ou 29, respectivamente. Também são fornecidos neste documento polinucleotídeos compreendendo uma sequência de nucleotídeos que é de pelo menos cerca de 98% idêntica a uma sequência de nucleotídeos que codifica a SEQ ID NO: 6, 7, 8, 9, 10, 11, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 ou 29, respectivamente. Também são fornecidos neste documento polinucleotídeos compreendendo uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos cerca de 99% idêntica a uma sequência de nucleotídeos que codifica a SEQ ID NO: 6, 7, 8, 9, 10, 11, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 ou 29, respectivamente.
[0174] Em uma modalidade particular, um polinucleotídeo ou combinação de polinucleotídeos fornecidos neste documento compreende uma sequência de nucleotídeos ou combinação de sequências de nucleotídeos que codificam um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que, imunoespecificamente, se liga ao B7-H4 (por exemplo, B7-H4 humano), em que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma cadeia pesada, em que a cadeia pesada compreende um domínio variável da cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos estabelecida na Tabela 3 (por exemplo, SEQ ID NOs: 6-8) e uma região constante que compreende a sequência de aminoácido de uma região constante de cadeia pesada gama (γ) murina (por exemplo, IgG1 ou IgG2a).
[0175] Em uma modalidade particular, um polinucleotídeo ou combinação de polinucleotídeos fornecidos neste documento compreende uma sequência de nucleotídeos ou combinação de sequências de nucleotídeos que codificam um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que imunoespecificamente se liga ao B7-H4 (por exemplo, B7-H4 humano), em que o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreende uma cadeia leve, em que a cadeia leve compreende um domínio variável da cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos estabelecida na Tabela 4 (por exemplo, SEQ ID NOs: 9-11) e uma região constante que compreende a sequência de aminoácido de uma região constante de cadeia leve kappa murina.
[0176] Em uma modalidade específica, são fornecidos neste documento polinucleotídeos compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica um anticorpo anti-B7-H4 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo ou um domínio do mesmo, designado neste documento, ver, por exemplo, Tabela
1.
[0177] Também são fornecidos neste documento polinucleotídeos que codificam um anticorpo anti-B7-H4 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo descrito neste documento, ou um domínio do mesmo que são otimizados, por exemplo, por otimização de códon/RNA, substituição com sequências de sinal heterólogas e eliminação de elementos de instabilidade de mRNA. Métodos para gerar ácidos nucleicos otimizados que codificam um anticorpo anti-B7-H4 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, ou um domínio do mesmo (por exemplo, cadeia pesada, cadeia leve, domínio VH ou domínio VL) para expressão recombinante através por meio da introdução de alterações de códon (por exemplo, uma alteração de códon que codifica o mesmo aminoácido devido à degenerescência do código genético) e/ou eliminação de regiões inibidoras no mRNA pode ser realizada adaptando os métodos de otimização descritos em, por exemplo, Patentes US 5,965,726; 6,174,666; 6,291,664; 6,414,132; e 6,794,498, em conformidade.
[0178] Um polinucleotídeo que codifica um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, descrito neste documento, ou um domínio do mesmo pode ser gerado a partir do ácido nucleico de uma fonte adequada (por exemplo, um hibridoma) usando métodos bem conhecidos na técnica (por exemplo, PCR e outros métodos de clonagem molecular). Por exemplo, a amplificação por PCR utilizando primers sintéticos hibridizáveis com as extremidades 3' e 5' de uma sequência conhecida, pode ser realizada utilizando DNA genômico obtido a partir de células de hibridoma que produzem o anticorpo de interesse. Tais métodos de amplificação por PCR podem ser usados para obter ácidos nucleicos compreendendo a sequência que codifica a cadeia leve e/ou cadeia pesada de um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo. Tais métodos de amplificação por PCR podem ser usados para obter ácidos nucleicos compreendendo a sequência que codifica a região da cadeia leve variável e/ou a região da cadeia pesada variável de um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo. Os ácidos nucleicos amplificados podem ser clonados em vetores para expressão em células hospedeiras e para clonagem adicional, por exemplo, para gerar anticorpos quiméricos e humanizados ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos.
[0179] Os polinucleotídeos fornecidos neste documento podem estar, por exemplo, na forma de RNA ou na forma de DNA. O DNA inclui cDNA, DNA genômico e DNA sintético, e o DNA pode ser de fita dupla ou de fita simples. Se for de fita simples, o DNA pode ser a fita codificadora ou a fita não codificadora (anti- sense). Em certas modalidades, o polinucleotídeo é um cDNA ou um DNA sem um ou mais íntrons endógenos. Em certas modalidades, um polinucleotídeo é um polinucleotídeo que não ocorre naturalmente. Em certas modalidades, um polinucleotídeo é produzido de forma recombinante. Em certas modalidades, os polinucleotídeos são isolados. Em certas modalidades, os polinucleotídeos são substancialmente puros. Em certas modalidades, um polinucleotídeo é purificado a partir de componentes naturais. Células e vetores
[0180] Em certos aspectos, são fornecidos neste documento vetores (por exemplo, vetores de expressão) compreendendo polinucleotídeos que compreendem sequências de nucleotídeos que codificam anticorpos anti-B7-H4 e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, ou um domínio dos mesmos, para expressão recombinante em células hospedeiras, de preferência em células de mamíferos. Também são fornecidas neste documento células, por exemplo, células hospedeiras, que compreendem tais vetores para a expressão recombinante de anticorpos anti-B7-H4 ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, descritos neste documento. Em um aspecto particular, são fornecidos neste documento métodos para a produção de um anticorpo ou fragmentos de ligação ao antígeno do mesmo, descritos neste documento, que compreende a expressão de desse anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo em uma célula hospedeira.
[0181] Em certas modalidades, a expressão recombinante de um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, ou domínio do mesmo descrito neste documento (por exemplo, uma cadeia pesada ou leve descrita neste documento) que se liga especificamente ao B7-H4 (por exemplo, B7-H4 humano) envolve a construção de um vetor de expressão contendo um polinucleotídeo que codifica o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, ou domínio do mesmo. Uma vez que um polinucleotídeo que codifica um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo ou domínio do mesmo (por exemplo, domínio variável da cadeia pesada ou leve), descrito neste documento foi obtido, o vetor para a produção do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo pode ser produzido por Tecnologia de DNA recombinante através do uso de técnicas bem conhecidas na técnica. Assim, os métodos para preparar uma proteína por expressão de um polinucleotídeo contendo um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, ou domínio do mesmo (por exemplo, cadeia leve ou cadeia pesada), que codifica a sequência de nucleotídeos são descritos neste documento. Os métodos que são bem conhecidos pelos especialistas na técnica podem ser usados para construir vetores de expressão que contém anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, ou domínio do mesmo (por exemplo, cadeia leve ou cadeia pesada), sequências de codificação e sinais de controle de transcrição e tradução apropriados. Esses métodos incluem, por exemplo, técnicas de DNA recombinante in vitro, técnicas sintéticas e recombinação genética in vivo. Também são fornecidos vetores replicáveis que compreendem uma sequência de nucleotídeos que codifica um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, descrito neste documento, uma cadeia pesada ou leve, um domínio variável de cadeia pesada ou leve ou um CDR de cadeia pesada ou leve, operacionalmente ligado a um promotor. Tais vetores podem, por exemplo, incluir a sequência de nucleotídeos que codifica a região constante do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo (ver , por exemplo, Publicação Internacional WO 86/05807 e WO 89/01036; e Patente US 5,122,464) , e os domínios variáveis do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo podem ser clonados em tal vetor para a expressão de toda a cadeia pesada, toda a cadeia leve ou ambas as cadeias pesadas e leves inteiras.
[0182] Um vetor de expressão pode ser transferido para uma célula (por exemplo, célula hospedeira) por técnicas convencionais, e as células resultantes podem então ser cultivadas por técnicas convencionais para produzir um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, descrito neste documento (por exemplo, um anticorpo ou antígeno fragmento de ligação do mesmo compreendendo as seis CDRs das SEQ ID NOs:22-25, 26, 27, ou 28, e 29, a VH da SEQ ID NOs:6-8, a VL das SEQ ID NOs:9-11, a VH das SEQ ID NOs:6-8 e a VL da SEQ ID NOs:9-11, a cadeia pesada das SEQ ID NO:16-18, 89, 90 ou 91, a cadeia leve das SEQ ID NO:19, 30 31 ou a cadeia pesada das SEQ ID NOs16- 18, 89, 90 ou 91 e a cadeia leve das SEQ ID NO:19, 30 ou 31). Assim, são fornecidas neste documento células hospedeiras contendo um polinucleotídeo que codifica um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, descrito neste documento, por exemplo, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreendendo as seis CDRs da SEQ ID NOs: 22-25, 26, 27 ou 28 e 29, a VH da SEQ ID NOs: 6-8, a VL da SEQ ID NOs: 9-11, a VH da SEQ ID NOs: 6-8 e a VL da SEQ ID NOs: 9-11, a cadeia pesada das SEQ ID NO: 16-18, 89, 90 ou 91, a cadeia leve das SEQ ID NO: 19, 30 ou 31, ou a cadeia pesada das SEQ ID NO: 16-18, 89, 90 ou 91 e a cadeia leve das SEQ ID NO: 19, 30 ou 31), operacionalmente ligada a um promotor para a expressão de tais sequências na célula hospedeira. Em certas modalidades, para a expressão de anticorpos de cadeia dupla ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, os vetores que codificam tanto as cadeias pesada quanto as cadeias leve, individualmente, podem ser co-expressos na célula hospedeira para expressão da imunoglobulina inteira, conforme detalhado abaixo. Em certas modalidades, uma célula hospedeira contém um vetor que compreende um polinucleotídeo que codifica a cadeia pesada e a cadeia leve de um anticorpo, descrito neste documento, ou um domínio do mesmo. Em modalidades específicas, uma célula hospedeira contém dois vetores diferentes, um primeiro vetor que compreende um polinucleotídeo que codifica uma cadeia pesada ou uma região variável da cadeia pesada de um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, descrito neste documento, e um segundo vetor que compreende um polinucleotídeo que codifica uma cadeia leve ou uma região variável de cadeia leve de um anticorpo descrito neste documento (por exemplo, um anticorpo compreendendo as seis CDRs das SEQ ID NOs: 22- 25, 26, 27 ou 28 e 29), ou um domínio do mesmo. Em outras modalidades, uma primeira célula hospedeira compreende um primeiro vetor compreendendo um polinucleotídeo que codifica uma cadeia pesada ou uma região variável de cadeia pesada de um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, descrito neste documento, e uma segunda célula hospedeira compreende um segundo vetor compreendendo um polinucleotídeo que codifica uma cadeia leve ou uma região variável de cadeia leve de um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, descrito neste documento (por exemplo, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que compreende as seis CDRs das SEQ ID NOs: 22-25, 26, 27 ou 28, e 29). Em modalidades específicas, uma região variável de cadeia pesada/cadeia pesada expressa por uma primeira célula associada a uma região variável de cadeia leve/cadeia leve de uma segunda célula para formar um anticorpo anti-B7-H4 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, descrito neste documento (por exemplo, anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que compreende as seis CDRs das SEQ ID NOs: 22-25, 26, 27 ou 28 e 29). Em certas modalidades, é fornecida neste documento uma população de células hospedeiras que compreende essa primeira célula hospedeira e essa segunda célula hospedeira.
[0183] Em uma modalidade particular, é fornecida neste documento uma população de vetores que compreende um primeiro vetor compreendendo um polinucleotídeo que codifica uma região variável de cadeia leve/cadeia leve de um anticorpo anti-B7-H4 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, descrito neste documento, e um segundo vetor que compreende um polinucleotídeo que codifica uma região variável de cadeia pesada/cadeia pesada de um anticorpo anti-
B7-H4 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, descrito neste documento (por exemplo, anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que compreende as CDRs das SEQ ID NOs: 22-25, 26 , 27 ou 28 e 29). Alternativamente, pode ser usado um único vetor o qual codifica e é capaz de expressar os polipeptídeos da cadeia pesada e leve.
[0184] Uma variedade de sistemas de vetor de expressão de hospedeiro pode ser utilizada para expressar anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, descritos neste documento (por exemplo, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreendendo as CDRs das SEQ ID NOs: 22-25, 26, 27 ou 28 e 29) (ver, por exemplo, Patente US 5,807,715). Esses sistemas de expressão de hospedeiro representam veículos pelos quais as sequências de codificação de interesse podem ser produzidas e subsequentemente purificadas, mas também representam células que podem, quando transformadas ou transfectadas com as sequências de codificação de nucleotídeos apropriadas, expressar um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo descrito neste documento in situ. Estes incluem, mas não estão limitados a micro-organismos tais como bactérias (por exemplo, E. coli e B. subtilis) transformados com DNA de bacteriófago recombinante, DNA de plasmídeo ou vetores de expressão de DNA de cosmídeo contendo sequências de codificação de anticorpos; levedura (por exemplo, Saccharomyces Pichia) transformada com vetores de expressão de levedura recombinantes contendo sequências de codificação de anticorpos; sistemas de células de insetos infectados com vetores de expressão de vírus recombinantes (por exemplo, baculovírus) contendo sequências de codificação de anticorpos; sistemas de células vegetais (por exemplo, algas verdes, como Chlamydomonas reinhardtii) infectados com vetores de expressão de vírus recombinantes (por exemplo, vírus do mosaico da couve- flor, CaMV; vírus do mosaico do tabaco, TMV) ou transformados com vetores de expressão de plasmídeo recombinante (por exemplo, plasmídeo Ti) contendo sequências de codificação anticorpos; ou sistemas de células de mamíferos (por exemplo, COS (por exemplo, COS1 ou COS), CHO, BHK, MDCK, HEK 293, NS0, PER.C6, VERO, CRL7O3O, HsS78Bst, HeLa e NIH 3T3, HEK-293T, HepG2, SP210, R1.1, B-W, L-M, BSC1, BSC40, YB/20 e células BMT10) abrigando construtos de expressão recombinante contendo promotores derivados do genoma de células de mamíferos (por exemplo, promotor de metalotioneína) ou de vírus de mamíferos (por exemplo, o promotor tardio de adenovírus; o promotor 7.5K do vírus vaccinia). Em uma modalidade específica, as células para expressar anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, descritos neste documento (por exemplo, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreendendo as CDRs das SEQ ID NOs: 22-25, 26, 27, ou 28 e 29) são células CHO, por exemplo células CHO do CHO GS System ™ (Lonza). Em uma modalidade particular, as células para expressar anticorpos descritos neste documento são células humanas, por exemplo, linhas de células humanas. Em uma modalidade específica, um vetor de expressão de mamífero é pOptiVEC ™ ou pcDNA3.3. Em uma modalidade particular, células bacterianas, como Escherichia coli, ou células eucarióticas (por exemplo, células de mamíferos), especialmente para a expressão de uma molécula de anticorpo recombinante inteira, são usadas para a expressão de uma molécula de anticorpo recombinante. Por exemplo, células de mamíferos, como células de ovário de hamster chinês (CHO) em conjunto com um vetor, como o principal elemento promotor de gene inicial intermediário de citomegalovírus humano, é um sistema de expressão eficaz para anticorpos (Foecking MK & Hofstetter H (1986) Gene 45: 101-105 e Cockett MI et al., (1990) Biotechnology 8: 662-667). Em certas modalidades, os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, descritos neste documento, são produzidos por células CHO ou células NS0.
[0185] Em algumas modalidades, um peptídeo sinal é usado na construção de um vetor contendo a VH ou VL de um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo fornecido neste documento. Em uma modalidade específica, a sequência de nucleotídeos e a sequência de aminoácidos de um peptídeo sinal usado para construir um vetor de expressão para a sequência VH são fornecidas na SEQ ID NO: 2 e 4, respectivamente. Em outra modalidade específica, a sequência de nucleotídeos e a sequência de aminoácidos de um peptídeo sinal usado para construir um vetor de expressão para a sequência da VL são fornecidas nas SEQ ID NO: 3 e 5, respectivamente.
[0186] Em uma modalidade específica, a sequência de nucleotídeos do peptídeo sinal VH é fornecida como ATGGGC AGGCTT ACTTCT TCATTC CTGCTA CTGATT GTCCCT GCATAT GTCCTG TCC (SEQ ID NO: 2). Em outra modalidade específica, a sequência de aminoácidos do peptídeo sinal VH é fornecida como MGRLTSSFLLLIVPAYVLS (SEQ ID NO: 4).
[0187] Em uma modalidade específica, a sequência de nucleotídeos do peptídeo sinal VL é fornecida como ATGAAG TTGCCT GTTAGG CTGTTG GTGCTG ATGTTC TGGATT CCTGCT TCCGGC AGT (SEQ ID NO: 3). Em outra modalidade específica, a sequência de aminoácidos do peptídeo sinal de VL é fornecida como MKLPVRLLVLMFWIPASGS (SEQ ID NO: 5).
[0188] Além disso, uma cepa de célula hospedeira pode ser escolhida, a qual modula a expressão das sequências inseridas, ou modifica e processa o produto do gene da forma específica desejada. Essas modificações (por exemplo, glicosilação) e processamento (por exemplo, clivagem) de produtos proteicos podem contribuir para a função da proteína. Para este fim, podem ser usadas células hospedeiras eucarióticas que possuem a maquinaria celular para o processamento apropriado do transcrito primário, glicosilação e fosforilação do produto do gene. Essas células hospedeiras de mamífero incluem, mas não estão limitadas a CHO, VERO, BHK, HeLa, MDCK, HEK 293, NIH 3T3, W138, BT483, Hs578T, HTB2, BT2O e T47D, NS0 (uma linha celular de mieloma murino que não produz endogenamente quaisquer cadeias de imunoglobulina), CRL7O3O, COS (por exemplo, COS1 ou COS), PER.C6, VERO, HsS78Bst, HEK-293T, HepG2, SP210, R1.1, B-W, L-M, BSC1, BSC40, YB / 20, BMT10 e Células HsS78Bst. Em certas modalidades, os anticorpos anti-B7-H4 descritos neste documento (por exemplo, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreendendo as CDRs das SEQ ID NOs: 22-25, 26, 27 ou 28 e 29) são produzidos em células de mamíferos, como células CHO.
[0189] Em certas modalidades, os anticorpos anti-B7-H4 descritos neste documento (por exemplo, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreendendo as CDRs das SEQ ID NOs: 22-25, 26, 27 ou 28 e 29) são produzidos em Células Potelligent® CHOK1SV.
[0190] Uma vez que um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, descrito neste documento, tenha sido produzido por expressão recombinante, ele pode ser purificado por qualquer método conhecido na técnica para purificação de uma molécula de imunoglobulina, por exemplo, por cromatografia (por exemplo, troca iônica, afinidade, particularmente por afinidade para o antígeno específico após a Proteína A, e cromatografia em coluna de dimensionamento), centrifugação, solubilidade diferencial, ou por qualquer outra técnica padrão para a purificação de proteínas. Adicionalmente, os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, descrito neste documento, podem ser fundidos com sequências polipeptídicas heterólogas, descritas neste documento, ou de outro modo conhecidas na técnica para facilitar a purificação.
[0191] Em modalidades específicas, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, descrito neste documento, é isolado ou purificado. Geralmente, um anticorpo isolado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é substancialmente isento de outros anticorpos, ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos com especificidades antigênicas diferentes do anticorpo isolado ou de um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo. Por exemplo, em uma modalidade particular, uma preparação de um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, descrito neste documento, é substancialmente isenta de material celular e/ou precursores químicos. Usos e Métodos Usos de detecção e diagnóstico
[0192] Um anticorpo anti-B7-H4 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, descrito neste documento (ver, por exemplo, Seção 5.2) pode ser usado para testar os níveis de proteína B7-H4 em uma amostra biológica usando métodos conhecidos pelos versados na técnica, incluindo imunoensaios, tal como o ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA), separação de células ativadas por fluorescência (FACS), imuno-histoquímica (IHC), imunoprecipitação e Western blotting.
[0193] Os marcadores de ensaio de anticorpo adequados são conhecidos na técnica e incluem marcadores de enzima, tais como peroxidase de rábano (HRP) e glicose oxidase; radioisótopos, tais como iodo (125I, 121I), carbono (14C), enxofre (35S), trítio (3H), índio (121In) e tecnécio (99Tc); haptenos, marcadores fluorescentes, moléculas fosforescentes, moléculas quimioluminescentes, cromóforos, moléculas luminescentes, moléculas de fotoafinidade, partículas coloridas e/ou ligantes, como a biotina. Em algumas modalidades, uma enzima (um marcador enzimático) irá gerar um produto colorido em contato com um substrato cromogênico. São exemplos de enzimas adequadas urease, fosfatase alcalina,
peroxidase de hidrogênio (rábano) e/ou oxidase de glicose.
[0194] Esses marcadores podem ser usados para marcação de um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, descrito neste documento. Alternativamente, um segundo anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que reconhece um anticorpo anti-B7-H4 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, descrito neste documento, pode ser marcado e usado em combinação com um anticorpo anti-B7-H4 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo para detectar os níveis de proteína B7-H4. Em algumas modalidades, tal anticorpo secundário ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo , por exemplo, um anticorpo anti-camundongo ou anti-roedor, é marcado com uma enzima (por exemplo, peroxidase de rábano) e detectado com um substrato da enzima (por exemplo, 3, 3'-diaminobenzidina (DAB)).
[0195] Vários métodos são conhecidos na técnica para a ligação ou a conjugação de um anticorpo para sua fração conjugada. Alguns métodos de ligação envolvem o uso de um complexo de quelato de metal empregando, por exemplo, um agente quelante orgânico, tal como anidrido de ácido dietilenotriaminopentacético (DTPA); ácido etilenotriaminotetracético; N-cloro-p- toluenossulfonamida; e/ou tetracloro-3α-6α-difenilglicouril-3 ligado ao anticorpo (Patentes US 4,472,509 e 4,938,948, cada uma incorporada neste documento por referência). Os anticorpos monoclonais também podem ser reagidos com uma enzima na presença de um agente de acoplamento, como glutaraldeído ou periodato. Conjugados com marcadores de fluoresceína são preparados na presença desses agentes de acoplamento ou por reação com um isotiocianato. Na Patente US 4,938,948, o imageamento de tumores de mama, por exemplo, é alcançado usando anticorpos monoclonais e as frações de imageamento detectáveis são vinculadas ao anticorpo usando peptídeos de ligação como metil- p-hidroxibenzimidato ou N-succinimidil-3-(4-hidroxifenil)propionato.
[0196] Em outras modalidades, a derivatização de imunoglobulinas introduzindo seletivamente grupos de sulfidrila na região Fc de uma imunoglobulina, é contemplada usando condições de reação que não alteram o sítio de combinação de anticorpo. Os conjugados de anticorpos produzidos de acordo com esta metodologia são divulgados para exibir longevidade, especificidade e sensibilidade aperfeiçoadas (Patente US 5,196,066, incorporada neste documento por referência). A ligação específica ao sítio de moléculas efetoras ou repórter, em que o repórter ou molécula efetora é conjugada com um resíduo de carboidrato na região Fc, também foi divulgada na literatura (O'Shannessy et al., Biotechnol Appl Biochem. 1987 dezembro; 9 (6): 488-96).
[0197] O ensaio para o nível de expressão da proteína B7-H4 se destina a incluir a medição qualitativa ou quantitativa ou a estimativa do nível de uma proteína B7-H4 em uma primeira amostra biológica, seja diretamente (por exemplo, determinando ou estimando o nível de proteína absoluto) ou relativamente (por exemplo, comparando com o nível de proteína B7-H4 em uma segunda amostra biológica ou padrão). O nível de expressão do polipeptídeo B7- H4 na primeira amostra biológica pode ser medido ou estimado e comparado com um nível padrão de proteína B7-H4, sendo o padrão determinado a partir de uma segunda amostra biológica que não está doente ou determinada pelos níveis médios de uma população de amostras que não estão doentes. Como será apreciado na técnica, uma vez conhecido o nível de polipeptídeo B7-H4 "padrão", ele pode ser usado repetidamente como padrão para comparação.
[0198] Tal como utilizado neste documento, o termo "amostra biológica" refere-se a qualquer amostra biológica obtida de um sujeito, linha celular, tecido ou outra fonte de células que potencialmente expressam o B7-H4. Fontes não limitativas de uma amostra para uso na presente invenção incluem tecido sólido, biópsia, ascite, aspirados, extratos fluidos, sangue (incluindo células tumorais circulantes), plasma, soro, fluido espinhal, fluido linfático, as seções externas da pele, tratos respiratório, intestinal e geniturinário, lágrimas, saliva, leite, tumores, órgãos, culturas de células e/ou constituintes de cultura de células, por exemplo. Os métodos para a obtenção de biópsias de tecido e fluidos corporais de animais (por exemplo, humanos) são bem conhecidos na técnica. Métodos exemplares de obtenção de células tumorais circulantes (CTCs) são divulgados em Ferreira et al., Molecular Oncology 10: 374-394, que é incorporado neste documento por referência na sua totalidade. Por exemplo, as CTCs podem ser enriquecidas a partir de uma amostra de sangue usando estratégias baseadas em imunoafinidade ou biofisicamente. As CTCs também podem ser obtidas usando modalidades de imageamento direto. Métodos exemplares de obtenção e processamento de biópsias, que podem ser usados em ensaios de imuno-
histoquímica (IHC), são fornecidos neste documento no Exemplo 4.
[0199] Um anticorpo anti-B7-H4, descrito neste documento, pode ser usado para aplicações de diagnóstico, incluindo aplicações in vitro bem conhecidas e padrão para os especialistas na técnica e com base na presente descrição. Ensaios de diagnóstico e kits para avaliação in vitro do B7-H4 podem ser utilizados para avaliar amostras de pacientes, incluindo aqueles com câncer conhecido ou suspeito de ter câncer. Este tipo de monitoramento e avaliação prognóstica e diagnóstica está na prática, por exemplo, utilizando anticorpos contra a proteína HER2 no câncer de mama (HercepTestTM, Dako) em que o ensaio é usado para avaliar pacientes para terapia de anticorpos usando Herceptin®.
[0200] Os anticorpos anti-B7-H4 e fragmentos de ligação ao antígeno do mesmo, descritos neste documento, podem transportar um marcador detectável ou funcional. Quando são utilizados marcadores de fluorescência, podem ser utilizados análise de separação de células e microscopia ativada por fluorescência (FACS) ou combinação de ambos os processos de procedimentos conhecidos na técnica e para identificar e quantificar os membros de ligação específicos. Os anticorpos anti-B7-H4 ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos descritos neste documento podem transportar um marcador de fluorescência. Marcadores de fluorescência exemplificativos incluem, por exemplo, sondas reativas e conjugadas, por exemplo, Aminocumarina, Fluoresceína e vermelho do Texas, corantes Alexa Fluor, corantes Cy e corantes DyLight. Um anticorpo anti-B7-H4 pode transportar um marcador radioativo, como os isótopos 3H, 14C, 32P, 35S, 36Cl, 51Cr, 57Co, 58Co, 59Fe, 67Cu, 90Y, 99Tc, 111In, 117Lu, 121I, 124I, 125I, 131I, 198Au, 211At, 213Bi, 225Ac e 186Re. Quando os marcadores radioativos são usados, os procedimentos de contagem atualmente disponíveis conhecidos na técnica podem ser utilizados para identificar e quantificar a ligação específica do anticorpo anti-B7-H4 ou fragmento de ligação ao antígeno ao B7-H4 (por exemplo, B7-H4 humano). No caso em que o marcador é uma enzima, a detecção pode ser realizada por qualquer uma das técnicas colorimétricas, espectrofotométricas, fluorospectrofotométricas, amperométricas ou gasométricas atualmente utilizadas, como conhecidas na técnica. Isto pode ser alcançado através do contato com uma amostra ou uma amostra de controle com um anticorpo anti-B7-H4, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo sob condições que permitem a formação de um complexo entre o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo e o B7-H4. Quaisquer complexos formados entre o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo e o B7- H4 são detectados e comparados na amostra e no controle. À luz da ligação específica dos anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, descritos neste documento para B7-H4, os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos podem ser usados para detectar especificamente a expressão do B7-H4, por exemplo, em células inteiras, em membranas celulares ou no citoplasma. Os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, descritos neste documento, também podem ser usados para purificar o B7-H4 via purificação de imunoafinidade.
[0201] Também está incluído neste documento um sistema de ensaio que pode ser preparado na forma de um kit de teste para a análise quantitativa da extensão da presença de, por exemplo, B7-H4. O sistema ou kit de teste pode compreender um componente marcado, por exemplo, um anticorpo marcado ou fragmento de ligação ao antígeno e um ou mais reagentes imunoquímicos adicionais. Ver, por exemplo, a Seção 5.4.3 abaixo para obter mais informações sobre kits.
[0202] Em alguns aspectos, os métodos para detectar o B7-H4 em uma amostra in vitro, compreendem o contato da amostra com um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, conforme fornecido neste documento. Em alguns aspectos, é fornecido neste documento o uso de um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, conforme fornecido neste documento, para detectar o B7-H4 em uma amostra in vitro. Em um aspecto, é fornecido neste documento um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, fornecido neste documento, para uso na detecção do B7-H4 em um sujeito ou uma amostra obtida de um sujeito. Em um aspecto, é fornecido neste documento um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, fornecido neste documento, para uso como um diagnóstico. Em uma modalidade, o anticorpo compreende um marcador detectável. Em uma modalidade preferida, o B7-H4 é B7-H4 humano. Em uma modalidade preferida, o sujeito é um ser humano. Em uma modalidade adicional, o sujeito, por exemplo, um sujeito humano tem câncer.
[0203] Em alguns aspectos, a presente invenção contempla métodos de imunodetecção para ligação e detecção do B7-H4. Os anticorpos preparados,
de acordo com a presente invenção, podem ser empregados para detectar o B7- H4. Alguns métodos de imunodetecção incluem imuno-histoquímica, citometria de fluxo, ensaio imunoabsorvente ligado a enzima (ELISA), radioimunoensaio (RIA), ensaio imunorradiométrico, fluoroimunoensaio, ensaio quimioluminescente, ensaio bioluminescente, transferência de Western blot, apenas para mencionar alguns. A etapas de vários métodos de imunodetecção úteis foram descritos na literatura científica, tais como, por exemplo, Doolittle MH e Ben-Zeev O, Methods Mol Biol. 1999; 109: 215-37; Gulbis B e Galand P, Hum Pathol. Dezembro de 1993; 24 (12): 1271-85; e De Jager R et al., Semin Nucl Med. Chem. Abril de 1993; 23 (2): 165- 79, cada um incorporado neste documento por referência.
[0204] Em geral, os métodos de ligação imunológica incluem a obtenção de uma amostra, por exemplo, uma amostra suspeita de compreender o B7-H4 e o contato da amostra com um primeiro anticorpo anti-B7-H4, de acordo com a presente invenção sob condições eficazes para permitir a formação de imunocomplexos.
[0205] O contato da amostra biológica escolhida com o anticorpo sob condições eficazes e por um período de tempo suficiente para permitir a formação de imunocomplexos (imunocomplexos primários), geralmente, compreende adicionar a composição de anticorpo à amostra e incubar a mistura por um período de tempo suficiente para que os anticorpos formem complexos imunes com, isto é, para se ligar especificamente a qualquer B7-H4 presente. Após este tempo, a composição da amostra-anticorpo, tal como uma seção de tecido, Placa ELISA, dot blot ou western blot, geralmente será lavada para remover qualquer espécie de anticorpo não-especificamente ligado, permitindo que somente os anticorpos especificamente ligados dentro os imunocomplexos primários sejam detectados.
[0206] Em geral, a detecção da formação de imunocomplexo é bem conhecida na técnica e pode ser alcançada através da aplicação de abordagens diversas. Estes métodos baseiam-se, geralmente, mediante a detecção de uma marcação ou marcador, como qualquer desses marcadores radioativos, fluorescentes, biológicos e enzimáticos. As patentes dos EUA relativas ao uso de tais marcações incluem as Patentes US 3,817,837; 3,850,752; 3,939,350; 3,996,345; 4,277,437; 4,275,149 e 4,366,241, cada um incorporado neste documento por referência. Em algumas modalidades, um agente de ligação secundário, como um segundo anticorpo e/ou um arranjo de ligação de ligante de biotina/avidina, pode ser usado de acordo com metodologias conhecidas na técnica.
[0207] Em algumas modalidades, o primeiro anticorpo que se liga aos complexos imunes primários pode ser detectado por meio de um segundo agente de ligação que tem afinidade de ligação com o anticorpo. Nestes casos, o segundo agente de ligação pode estar ligado a um marcador detectável. O segundo agente de ligação em si é muitas vezes um anticorpo, que pode, desse modo, ser denominado um anticorpo "secundário". Os complexos imunes primários são contatados com o agente de ligação rotulada, secundário, marcado ou anticorpo, sob condições eficazes e por um período de tempo suficiente para permitir a formação de complexos imunes secundários. Os complexos imunes secundários geralmente são lavados, então, para remover quaisquer anticorpos secundários marcados não especìficamente ligados ou ligantes, e a marcação restante nos imunocomplexos secundários é então detectada.
[0208] Outros métodos incluem a detecção de imunocomplexos primários por uma abordagem de duas etapas. Um segundo agente de ligação, como um anticorpo, que tem afinidade de ligação com o anticorpo é usado para formar complexos imunes secundários, como descrito acima. Após a lavagem, os complexos imunes secundários são contatados com um terceiro agente de ligação ou anticorpo que tem afinidade de ligação com o segundo anticorpo, novamente sob condições eficazes e por um período de tempo suficiente para permitir a formação de complexos imunes (imunocomplexos terciários). O terceiro ligante ou anticorpo está ligado a uma marcação detectável, permitindo a detecção dos complexos imunes terciárias formados desta forma. Este sistema pode prover amplificação de sinal, se isto for desejado.
[0209] Em outra modalidade, um anticorpo monoclonal ou policlonal biotinilado é usado para detectar o(s) antígeno(s) alvo e uma segunda etapa de anticorpo é usada para detectar, então, a biotina anexada para a biotina complexada. Nesse método, a amostra a ser testada é primeiro incubada em uma solução que inclui a primeira etapa de anticorpo. Se o antígeno alvo estiver presente, alguns dos anticorpo ligam-se especificamente ao antígeno para formar um complexo biotinilado anticorpo/antígeno. O complexo de anticorpo/antígeno é então amplificado por incubação em sucessivas soluções de biotinilado estreptavidina (ou avidina), DNA, e/ou DNA complementar biotinilado, com cada etapa adicionando sítios de biotina adicionais ao complexo de anticorpo/antígeno. As etapas de amplificação são repetidas até que um nível adequado de amplificação seja alcançado, no ponto em que a amostra é incubada em uma solução que compreende a segunda etapa de anticorpo contra a biotina. Este anticorpo da segunda etapa é marcado, como por exemplo com uma enzima que pode ser usada para detectar a presença do complexo de anticorpo/antígeno por histoenzimologia usando um substrato cromogênio. Com a amplificação adequada, um conjugado pode ser produzido, ou seja, macroscopicamente visível.
[0210] Em uma modalidade, imuno-histoquímica (IHC) é utilizado para detecção imunológica. Usando IHC, a detecção de B7-H4 em uma amostra pode ser alcançada direcionando uma amostra com um agente de ligação, por exemplo, um anticorpo anti-B7-H4 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo. O agente de ligação pode ser ligado, direta ou indiretamente, a um marcador detectável ou pode ser detectado por outro agente de ligação que está ligado, direta ou indiretamente, a um marcador detectável. Em uma modalidade, 3,3'- diaminobenzidina (DAB) é usada no ensaio de IHC para detectar o anticorpo primário ligado ao B7-H4. Em uma modalidade, a concentração do anticorpo anti- B7-H4 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, no ensaio de IHC, é de cerca de 1 μg/ml a cerca de 50 μg/ml. Em uma modalidade, a concentração do anticorpo anti-B7-H4 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, no ensaio de IHC, é de cerca de 1 μg/ml a cerca de 20 μg/ml. Em uma modalidade, a concentração do anticorpo anti-B7-H4 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo no ensaio de IHC é de cerca de 10 μg/ml.
[0211] A IHC pode ser realizada em células, péletes celulares, tecidos, preparações de sangue, plasma, soro ou fluido linfático, etc. Em algumas modalidades, as amostras são amostras fixas. Em algumas modalidades, as amostras são amostras incorporadas em parafina. Em algumas modalidades, as amostras são amostras fixadas em formol e incorporadas em parafina.
[0212] Em uma modalidade, a citometria de fluxo é utilizada para detecção imunológica. Assim, por exemplo, o número de anticorpos ligados por célula (ABC) pode ser avaliado usando citometria de fluxo.
Usos e Métodos Terapêuticos
[0213] Em um aspecto, são apresentados neste documento métodos para o tratamento de um câncer que expressa o B7-H4 em um sujeito, compreendendo a administração de um anticorpo anti-B7-H4 terapêutico ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo ao sujeito, em que a expressão do B7- H4 foi detectada em um amostra obtida do sujeito usando um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo fornecido neste documento. Em algumas modalidades, o método compreende adicionalmente detectar o B7-H4 na amostra obtida do sujeito.
[0214] Em uma determinada modalidade, fornecida neste documento, o câncer é selecionado do grupo que consiste em: câncer de mama (por exemplo, câncer de mama triplo negativo, câncer de mama positivo para receptor de hormônio (HR), carcinoma ductal), carcinoma endometrial, câncer de ovário, células não pequenas de câncer de pulmão (por exemplo, carcinoma de células escamosas), câncer pancreático, câncer de tireoide, câncer de rim (por exemplo, carcinoma de células renais) e câncer de bexiga (por exemplo, carcinoma de células uroteliais).
[0215] Os anticorpos anti-B7-H4 terapêuticos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos incluem, por exemplo, 20502 e 22213 e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos. As sequências de aminoácidos e nucleotídeos para os anticorpos 20502 e 22213 são fornecidas nas Tabelas 9 e 10. Tabela 9: Sequências de aminoácidos e nucleotídeos de anticorpo 20502 Domínio do Sequência (SEQ ID NO) anticorpo (AA/N) VH CDR1 (AA) GSIKSGSYYWG (SEQ ID NO: 58) VH CDR2 (AA) NIYYSGSTYYNPSLRS (SEQ ID NO: 59) VH CDR3 (AA) AREGSYPNQFDP (SEQ ID NO: 60) VL CDR1 (AA) RASQSVSSNLA (SEQ ID NO: 61) VL CDR2 (AA) GASTRAT (SEQ ID NO: 62) VL CDR3 (AA) QQYHSFPFT (SEQ ID NO: 63) VH (AA) QLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSIKSGSYY
WGWIRQPPGKGLEWIGNIYYSGSTYYNPSLRSRVT
ISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAREGSYPNQ FDPWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 64) VL (AA) EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVSSNLAW
YQQKPGQAPRLLIYGASTRATGIPARFSGSGSGTE
FTLTISSLQSEDFAVYYCQQYHSFPFTFGGGTKVEI K (SEQ ID NO: 65) VH FR1 (AA) QLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSG (SEQ ID NO: 66) VH FR2 (AA) WIRQPPGKGLEWIG (SEQ ID NO: 67) VH FR3 (AA) RVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYC (SEQ ID NO: 68) VH FR4 (AA) WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 69) VL FR1 (AA) EIVMTQSPATLSVSPGERATLSC (SEQ ID NO: 70) VL FR2 (AA) WYQQKPGQAPRLLIY (SEQ ID NO: 71) VL FR3 (AA) GIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYC (SEQ ID NO:72) VL FR4 (AA) FGGGTKVEIK (SEQ ID NO:73) Cadeia pesada QLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSIKSGSYY (AA) WGWIRQPPGKGLEWIGNIYYSGSTYYNPSLRSRVT
ISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAREGSYPNQ FDPWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGG TAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAV LQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNT KVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFP PKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYV DGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDW LNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVY TLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESN
GQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQ QGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 74) Cadeia leve EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVSSNLAW (AA) YQQKPGQAPRLLIYGASTRATGIPARFSGSGSGTE
FTLTISSLQSEDFAVYYCQQYHSFPFTFGGGTKVEI KRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPR EAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLS
STLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNR GEC (SEQ ID NO: 75) VH (N) CAGCTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTG
GTGAAGCCTTCGGAGACCCTGTCCCTCACCTGC ACTGTCTCTGGTGGCTCCATCAAAAGTGGTAGTT ACTACTGGGGCTGGATCCGCCAGCCCCCAGGGA AGGGGCTGGAGTGGATTGGGAACATCTATTATAG TGGGAGCACCTACTACAACCCGTCCCTCAGAAGT CGAGTCACCATATCCGTAGACACGTCCAAGAACC AGTTCTCCCTGAAGCTGAGTTCTGTGACCGCCGC AGACACGGCGGTGTACTACTGCGCCAGAGAAGG
ATCTTACCCCAATCAGTTTGATCCATGGGGACAG GGTACATTGGTCACCGTCTCCTCA (SEQ ID NO: 76) VL(N) GAAATAGTGATGACGCAGTCTCCAGCCACCCTGT
CTGTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCT GCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCAACTTAG CCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCA GGCTCCTCATCTATGGTGCATCCACCAGGGCCA CTGGTATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGT CTGGGACAGAGTTCACTCTCACCATCAGCAGCCT GCAGTCTGAAGATTTTGCAGTTTATTACTGTCAGC
AGTACCACTCCTTCCCTTTCACTTTTGGCGGAGG GACCAAGGTTGAGATCAAA (SEQ ID NO: 77) Tabela 10: Sequências de aminoácidos e nucleotídeos de anticorpo 22213 Domínio do Sequência (SEQ ID NO) anticorpo (AA/N) VH CDR1 (AA) GSIGRGSYYWG (SEQ ID NO: 32) VH CDR2 (AA) NIYYSGSTYYNPSLKS (SEQ ID NO: 33) VH CDR3 (AA) AREGSYTTVLNV (SEQ ID NO:34) VL CDR1 (AA) RASQSVASSHLA (SEQ ID NO:35) VL CDR2 (AA) DAVSRAT (SEQ ID NO:36) VL CDR3 (AA) QQAASYPLT (SEQ ID NO:37)
QLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSIGRGSYY WGWIRQPPGKGLEWIGNIYYSGSTYYNPSLKSRVTI VH (AA)
SVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAREGSYTTVL NVWGQGTMVTVSS (SEQ ID NO: 54)
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVASSHLAW YQQKPGQAPRLLIYDAVSRATGIPDRFSGSGSGTD VL (AA)
FTLTISRLEPEDFAVYYCQQAASYPLTFGGGTKVEI K (SEQ ID NO:55) QLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSG (SEQ ID VH FR1 (AA) NO:78) VH FR2 (AA) WIRQPPGKGLEWIG (SEQ ID NO:79) RVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYC (SEQ ID VH FR3 (AA) NO:80) VH FR4 (AA) WGQGTMVTVSS (SEQ ID NO:81) VL FR1 (AA) EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSC (SEQ ID NO:82) VL FR2 (AA) WYQQKPGQAPRLLIY (SEQ ID NO:83) GIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYC (SEQ VL FR3 (AA) ID NO:84) VL FR4 (AA) FGGGTKVEIK (SEQ ID NO:98)
QLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSIGRGSYY WGWIRQPPGKGLEWIGNIYYSGSTYYNPSLKSRVTI
SVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAREGSYTTVL Cadeia pesada NVWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGG (AA) TAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAV
LQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNT KVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFP PKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYV DGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDW LNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVY TLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESN
GQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQ QGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 56)
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVASSHLAW YQQKPGQAPRLLIYDAVSRATGIPDRFSGSGSGTD
FTLTISRLEPEDFAVYYCQQAASYPLTFGGGTKVEI Cadeia leve
KRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPR (AA) EAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLS
STLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNR GEC (SEQ ID NO: 57)
CAGCTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTG GTGAAGCCTTCGGAGACCCTGTCCCTCACCTGC ACTGTCTCTGGTGGCTCCATCGGGAGGGGGAGT TACTACTGGGGCTGGATCCGCCAGCCCCCAGGG AAGGGGCTGGAGTGGATTGGGAACATCTATTATA GTGGGAGCACCTACTACAACCCGTCCCTCAAGA VH (N) GTCGAGTCACCATATCCGTAGACACGTCCAAGAA CCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGTTCTGTGACCGCC GCAGACACGGCGGTGTACTACTGCGCCAGAGAA
GGATCTTACACAACCGTGTTAAACGTATGGGGTC AGGGTACAATGGTCACCGTCTCCTCA (SEQ ID NO: 85)
GAAATTGTGTTGACGCAGTCTCCAGGCACCCTGT CTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTG CAGGGCCAGTCAGAGTGTTGCCAGCAGCCACTT AGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCC CAGGCTCCTCATCTATGACGCAGTCAGCAGGGC VL (N) CACTGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGG GTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGA CTGGAGCCTGAAGATTTTGCAGTGTATTACTGTC
AGCAGGCCGCCAGTTACCCTCTCACTTTTGGCG GAGGGACCAAGGTTGAGATCAAA (SEQ ID NO: 86)
[0216] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-B7-H4 terapêutico ou fragmento de ligação ao antígeno compreende as VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2 e VL CDR3 de 20502. As CDRs podem ser as CDRs definidas por Kabat, as CDRs definidas por Chothia ou as CDRs definidas por AbM.
[0217] Em algumas modalidades, o anticorpo terapêutico anti-B7-H4 ou fragmento de ligação ao antígeno compreende as VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2 e VL CDR3 de 22213. As CDRs podem ser as CDRs definidas por Kabat, as CDRs definidas por Chothia ou as CDRs definidas por AbM.
[0218] Em algumas modalidades, o anticorpo terapêutico anti-B7-H4 ou fragmento de ligação ao antígeno compreende as VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2 e VL CDR3 compreendem as sequências de aminoácidos da SEQ ID NOs: 32-37, respectivamente. Em algumas modalidades, o anticorpo terapêutico anti-B7-H4 ou fragmento de ligação ao antígeno compreende as VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2 e VL CDR3 compreendem as sequências de aminoácidos da SEQ ID NOs: 58-63, respectivamente.
[0219] Em algumas modalidades, o anticorpo terapêutico anti-B7-H4 ou fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável da cadeia pesada e uma região variável da cadeia leve, em que a região variável da cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 54. Em algumas modalidades, o anticorpo terapêutico anti-B7-H4 ou fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável da cadeia pesada e uma região variável da cadeia leve, em que a região variável da cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:64.
[0220] Em algumas modalidades, o anticorpo terapêutico anti-B7-H4 ou fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável da cadeia pesada e uma região variável da cadeia leve, em que a região variável da cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:55. Em algumas modalidades, o anticorpo terapêutico anti-B7-H4 ou fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável da cadeia pesada e uma região variável da cadeia leve, em que a região variável da cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:65.
[0221] Em algumas modalidades, o anticorpo terapêutico anti-B7-H4 ou fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:54 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:55. Em algumas modalidades, o anticorpo terapêutico anti-B7-H4 ou fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:64 e uma região variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:65.
[0222] Em algumas modalidades, o anticorpo terapêutico anti-B7-H4 ou fragmento de ligação ao antígeno compreende uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:56. Em algumas modalidades, o anticorpo terapêutico anti-B7-H4 ou fragmento de ligação ao antígeno compreende uma cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:74.
[0223] Em algumas modalidades, o anticorpo terapêutico anti-B7-H4 ou fragmento de ligação ao antígeno compreende uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:57. Em algumas modalidades, o anticorpo terapêutico anti-B7-H4 ou fragmento de ligação ao antígeno compreende uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:75.
[0224] Em algumas modalidades, o anticorpo terapêutico anti-B7-H4 ou fragmento de ligação ao antígeno compreende uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:56 e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 57. Em algumas modalidades, o anticorpo terapêutico anti-B7-H4 ou fragmento de ligação ao antígeno compreende) uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:74 e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 75. Kits
[0225] São fornecidos neste documento kits que compreendem um ou mais anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, descritos neste documento, ou conjugados (por exemplo, conjugados de detecção) dos mesmos. Conforme fornecido neste documento, os kits podem ser usados em métodos de diagnóstico. Em uma modalidade, um kit compreende um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, descrito neste documento, de preferência um anticorpo purificado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, em um ou mais recipientes.
[0226] Em uma modalidade específica, os kits descritos neste documento contêm um antígeno B7-H4 substancialmente isolado (por exemplo, B7- H4 humano) que pode ser usado como um controle. Em modalidades específicas, um kit fornecido neste documento pode incluir um antígeno B7-H4 produzido de forma recombinante ou sintetizado quimicamente. O antígeno B7-H4 fornecido no kit também pode ser anexado a um suporte sólido.
[0227] Em outra modalidade específica, os kits descritos neste documento compreendem adicionalmente um anticorpo de controle ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que não reage com um antígeno B7-H4. Em outra modalidade específica, os kits descritos neste documento contêm um ou mais elementos para detectar a ligação específica de um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo a um antígeno B7-H4 (por exemplo, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo pode ser conjugado a um substrato detectável, tal como um composto fluorescente, uma enzima, um substrato de enzimático, um composto radioativo ou um composto luminescente, ou um segundo anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que reconhece o primeiro anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, pode ser conjugado com um substrato detectável). Em uma modalidade mais específica, os elementos de detecção do kit descrito acima incluem um suporte sólido ao qual um antígeno B7-H4 está ligado. Tal kit também pode incluir um anticorpo anti- camundongo/roedor marcado por repórter ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo. Nesta modalidade, a ligação do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo ao antígeno B7-H4 pode ser detectada pela ligação do referido anticorpo marcado por repórter ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.
[0228] Em outra modalidade específica, os kits descritos neste documento compreendem adicionalmente um anticorpo anti-B7-H4 terapêutico ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, e/ou informação de que um anticorpo anti-B7-H4 terapêutico ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo deve ser administrado quando o B7- H4 é detectado em uma amostra usando um anticorpo anti-B7-H4, ou fragmento de ligação ao antígeno, fornecido neste documento.
[0229] Os seguintes exemplos são oferecidos a título de ilustração e não a título de limitação.
EXEMPLOS
[0230] Os exemplos nesta Seção (ou seja, na Seção 6) são oferecidos a título de ilustração, e não como limitação. Exemplo 1: Geração de hibridoma
[0231] Um painel de anticorpos que se ligam seletivamente ao B7-H4 foi gerado usando uma versão solúvel recombinante da proteína do domínio extracelular (ECD) B7-H4:
MASLGQILFWSIISIIIILAGAIALIIGFGISGRHSITVTTVASAGNIGEDGILSCT FEPDIKLSDIVIQWLKEGVLGLVHEFKEGKDELSEQDEMFRGRTAVFADQVIVGN ASLRLKNVQLTDAGTYKCYIITSKGKGNANLEYKTGAFSMPEVNVDYNASSETLR CEAPRWFPQPTVVWASQVDQGANFSEVSNTSFELNSENVTMKVVSVLYNVTIN NTYSCMIENDIAKATGDIKVTESEIKRRSHLQLLNSKASGSEPKSSDKTHTCPPCP APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEV HNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKT
TPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG K (SEQ ID NO: 20).
[0232] Cada planta do pé da pata de um camundongo NZB/W foi injetada com a proteína B7-H4 ECD ressuspensa em Sigma Adjuvant System® (Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO). O soro foi colhido 21 dias após o primeiro reforço e titulado por ensaio imunoenzimático (ELISA) e separação de células ativadas por fluorescência (FACS) e citometria de fluxo para garantir que o camundongo tivesse uma boa resposta imune. As triagens por ELISA e FACS são descritas em detalhe nos Exemplos 2 e 3, respectivamente. Três dias após o reforço final, células de nódulos poplíteos de camundongos com título positivo foram fundidas com uma linha de células de mieloma de camundongo (ver, por exemplo, Chuntharapai et al., 1997, Methods Enzymol. 288:15-27). Foram gerados cerca de 2880 clones de hibridoma de rato.
[0233] Os clones de hibridoma gerados por este processo foram então triados quanto à produção de anticorpos monoclonais ligados à proteína B7-H4 ECD (SEQ ID NO: 20), o domínio IgV do N-Terminal B7-H4 (aminoácidos 1-151) proteína de fusão -huIgG Fc (SEQ ID NO: 21), e para células HEK 293 que expressam de forma estável o B7-H4 humana de comprimento completo (SEQ ID NO:1) em sua superfície.
MASLGQILFWSIISIIIILAGAIALIIGFGISGRHSITVTTVASAGNIGEDGILSCT FEPDIKLSDIVIQWLKEGVLGLVHEFKEGKDELSEQDEMFRGRTAVFADQVIVGN ASLRLKNVQLTDAGTYKCYIITSKGKGNANLEYKTGAFSGSEPKSSDKTHTCPPC PAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVE VHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYK
TTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP GK (SEQ ID NO:21). Exemplo 2: Triagem por ELISA
[0234] Para triar os clones de hibridoma gerados no Exemplo 1, foi realizado o ELISA geralmente como descrito em Baker et al., 2002, Trends Biotechnol, 20: 149-156.
[0235] Resumidamente, as placas de 96 poços foram revestidas com 50 μl da proteína B7-H4 ECD (SEQ ID NO: 20) ou a proteína de fusão Fc do B7-H4 N-Terminal (SEQ ID NO: 21) a uma concentração de 2 μg/ml em tampão de revestimento (tampão de carbonato a 0,05 M, pH 9,6), vedado e armazenado durante a noite a 40°C. Depois de remover a solução de revestimento, 200 μl da solução de ensaio/bloqueio contendo 0,5% de albumina de soro bovino (BSA) e de Tween®-20 a 0,05% em PBS (pH 7,4) (diluente de ELISA) foram adicionados a cada poço de uma placa de 96 poços. As placas foram incubadas à temperatura ambiente durante uma hora com agitação. Os poços foram então lavados três vezes com 300 μl de Tween®-20 a 0,05% em PBS (tampão de lavagem). Após a lavagem, 100 μl do sobrenadante do hibridoma em diluente de ELISA foram adicionados a cada poço, e as placas foram incubadas em temperatura ambiente por uma hora com agitação. Os poços foram lavados três vezes com tampão de lavagem conforme descrito anteriormente. Após a lavagem, 100 μl de uma diluição 1:1000 de IgG anti-camundongo de ovelha acoplado a peroxidase de rábano silvestre em diluente de ELISA foram adicionados a cada poço. As placas foram incubadas à temperatura ambiente durante uma hora com agitação, lavadas três vezes com tampão de lavagem como descrito anteriormente e secas com batidinhas. Os poços foram desenvolvidos adicionando 100 μl de substrato de peroxidase de micropoços de tetrametilbenzidina (TMB) a cada poço e incubando em temperatura ambiente por 5-10 minutos ou até que uma boa mudança de cor fosse observada. O desenvolvimento foi interrompido adicionando 100 μl de solução de parada de TMB a cada poço. As placas foram analisadas a 650 nm.
[0236] Pré-sangria e polissoro foram usados como controles. As amostras pré-sangria continham soros de camundongo antes da imunização e as amostras de polissoro continham anti-soros de camundongo obtidos após as imunizações. Os anticorpos que deram um sinal ELISA positivo foram selecionados para triagem adicional por separação de células ativadas por fluorescência (FACS). Exemplo 3: Triagem por FACS
[0237] Para triar ainda mais os clones de hibridoma gerados no Exemplo 1, a separação de células ativadas por fluorescência (FACS) foi realizada usando células HEK 293 que expressam de forma estável o B7-H4 humano de comprimento total (SEQ ID NO: 1). Linhas celulares HEK 293 padrão serviram como controles negativos. As células foram ressuspensas e centrifugadas a 500g durante 5 minutos a 40°C. O meio foi aspirado e as células foram ressuspensas em tampão de coloração BD FACSFlowTM (BD Biosciences, San Jose, CA) com 1% de soro fetal bovino (FBS) (tampão de coloração de células) a 40°C. As células foram centrifugadas como descrito anteriormente, os meios foram aspirados e as células foram ressuspensas em tampão de coloração de células a 40°C para uma concentração final de 2x106 células/ml. As células foram então adicionadas a placas de fundo redondo de 96 poços a 50 μl/poço. 100 μl de sobrenadante de cada clone de hibridoma foram adicionados a cada poço, de modo que cada sobrenadante de hibridoma foi incubado com um poço contendo a linha de células HEK 293 que expressa de forma estável B7-H4 ou a linha de células de controle negativo. As placas foram incubadas em gelo por 30 minutos e centrifugadas conforme descrito anteriormente. Em seguida, os sobrenadantes foram aspirados. Cada poço foi ressuspenso em 200 μl de tampão de coloração de células a 40°C. Posteriormente, as placas foram centrifugadas conforme descrito anteriormente, e o tampão de coloração celular foi aspirado. Após a etapa de lavagem, as células em cada poço foram ressuspensas em 100 μl de uma diluição a 1:1000 de Fc de IgG anti-camundongo de cabra acoplado a R-ficoeritrina (Jackson Immunoresearch, West Grove, PA) em tampão de coloração de células a 40°C, e as placas foram incubadas no escuro em gelo durante 30 minutos. As placas foram centrifugadas conforme descrito anteriormente e os sobrenadantes aspirados. Cada poço foi ressuspenso em 200 μl de tampão de coloração de células a 40°C, e as placas foram centrifugadas conforme descrito anteriormente. O tampão de coloração de células foi aspirado. As células em cada poço foram ressuspensas em 200 μl de tampão de coloração de células a 40°C e transferidas para microtubos de 1,2 ml. FACS foi realizado em um FACScanTM ou FACSCaliburTM (BD Biosciences,
San Jose, CA). Os anticorpos que mostraram ligação celular no ensaio FACS foram selecionados para triagem adicional por imuno-histoquímica (IHC). Exemplo 4: Triagem por IHC
[0238] Para triar ainda mais os clones de hibridoma gerados no Exemplo 1, a coloração imuno-histoquímica (IHC) foi realizada em seções obtidas de um sujeito com um tumor de mama de carcinoma ductal invasivo. Seções fixadas em formalina e embutidas em parafina (FFPE) foram cortadas a 5 micra, secas ao ar em lâminas carregadas Superfrost Plus e cozidas por uma hora a 60°C.As seções foram desparafinizadas e coradas em um autocorador Discovery Ultra (Ventana Medical Systems, Tucson, AZ).Após 1 hora de recuperação do antígeno com Ultra CC1 a 95°C, o B7-H4 foi detectado com anticorpos primários de camundongo anti-B7-H4 por 1 hora em temperatura ambiente seguido por Omni- Map anti-HRP de camundongo, sistema de detecção de ChromoMap 3,3'- diaminobenzidina (DAB) e contracoloração com hematoxilina, de acordo com as instruções do fabricante.
[0239] Sete anticorpos primários anti-B7-H4 foram usados: seis anticorpos recombinantes gerados no Exemplo 1 (a 10 µg / mL) juntamente com A57.1 (ver Patente US 7,619,068) (a 1,25 µg/mL), que foi usado como um controle. Os dois anticorpos recombinantes (J516 e J512) detectaram o B7-H4 nas membranas celulares e citoplasma em um padrão semelhante ao A57.1, com uma maioria de células B7-H4-positivas observadas no compartimento do tumor, como mostrado nas Figuras 1 e 2 . Os anticorpos recombinantes detectaram menos células que expressam B7-H4 com intensidade de sinal 1+ do que A57.1 (35% por J512 vs 35% por J516% vs 58% por A57.1), como mostrado pelas Figuras 3 e 4. Quando a expressão de B7-H4 foi medida por análise de imageamento computacional (Definiens, Cambridge, MA), J516 e J512 demonstraram uma distribuição semelhante de sinal B7-H4 através dos compartimentos celulares para A57.1, como mostrado nas Figuras 5A-5C. Exemplo 5: Determinação de Sequência
[0240] A sequência dos anticorpos anti-B7-H4 de cadeia pesada (HC) e cadeia leve (LC) M6, M11 e M15, todos os quais mostraram coloração IHC, foram determinados de acordo com o seguinte procedimento.
[0241] O RNA foi colhido de hibridomas usando reagente Trizol
(Thermofisher Scientific, Carlsbad, CA) e o cDNA foi preparado usando transcriptase reversa Smartscribe (Clontech, Mountain View, CA) e polimerase Advantage 2 (Clontech, Mountain View, CA). A PCR foi realizada utilizando a polimerase Phusion Taq (NEB, Ipswich, MA) em condições de PCR padrão. Os produtos de PCR foram então clonados usando o kit de clonagem Zero Blunt ® TOPO® (Thermofisher Scientific, Carlsbad, CA). Os clones foram triados quanto as inserções e múltiplos clones foram sequenciados para verificar as sequências do gene da cadeia pesada e da cadeia leve originais. As sequências polinucleotídicas que codificam a cadeia pesada e a cadeia leve são fornecidas na Tabela 8 acima.
[0242] Os domínios variáveis do anticorpo anti-B7-H4 foram então subclonados em vetores de expressão com diferentes regiões Fc para gerar anticorpos com IgG2a de camundongo e regiões constantes de IgG1 de camundongo. Os domínios variáveis de cadeia pesada anti-B7-H4 foram então clonados em vetores de expressão com diferentes regiões Fc para gerar anticorpos com IgG2a de camundongo e regiões constantes de IgG1 de camundongo. Domínios variáveis de cadeia leve anti-B7-H4 foram clonados em vetores de expressão com região constante de IgK de camundongo. Após a verificação da sequência, os anticorpos isolados foram atribuídos aos IDs J511-J516, conforme especificado na Tabela 1 acima. * * *
[0243] A presente invenção não deve ser limitada em escopo pelas modalidades específicas descritas neste documento. De fato, várias modificações da invenção além daquelas mostradas e descritas se tornarão evidentes para os versados na técnica a partir da descrição anterior e das figuras anexas. Tais modificações se destinam a permanecer dentro do escopo das reivindicações anexas.
[0244] Todas as referências (por exemplo, publicações ou patentes ou pedidos de patentes) citadas neste documento são incorporadas neste documento por referência nas suas totalidades e para todos os fins na mesma extensão, como se cada referência individual (por exemplo, publicação ou patente ou pedido de patente) fosse específica e individualmente indicada para ser incorporada por referência na sua totalidade para todos os fins.
[0245] Outras modalidades estão no escopo das seguintes

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  1. reivindicações.
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