CZ287551B6

CZ287551B6 - Derivatives of arylsulfonyl hydroxamic acid and pharmaceutical preparations based thereon

Info

Publication number: CZ287551B6
Application number: CZ19961130A
Authority: CZ
Inventors: Anthony D Piscopio; James P Rizzi
Original assignee: Pfizer
Priority date: 1995-04-20
Filing date: 1996-04-19
Publication date: 2000-12-13
Also published as: CZ113096A3; ES2153031T3; CA2218503A1; ATE198326T1; IL117868A; TW418197B; FI973974A0; NO961585L; BR9602001A; NO306253B1; WO1996033172A1; EP0821671A1; KR100219976B1; CN1123566C; ES2153031T4; JP3053222B2; DE69519751T2; RU2146671C1; PT821671E; DK0821671T3

Description

Deriváty arylsulfonylhydroxamové kyseliny a farmaceutické prostředky na jejich bázi

Oblast techniky

Vynález stýká derivátů arylsulfonylhydroxamové kyseliny, které jsou inhibitory matričních metalloproteináz nebo produkce faktoru nekrózy nádorů (dále „TNF“) a jako takové jsou užitečné při léčbě choroby zvolené ze souboru zahrnujícího artritis, rakovinu, ulcerace tkání, restenosu, periodontální chorobu, epidermolysis bullosa, scleritis a jiné choroby charakterizované aktivitou matriční metalloproteinázy, jakož i AIDS, sepsi, septický šok a jiné choroby zahrnující produkci TNF.

Vynález se také týká farmaceutických prostředků na bázi těchto sloučenin.

Dosavadní stav techniky

Existuje řada enzymů, které způsobují rozklad strukturních proteinů a které jsou strukturně příbuzné metalloproteasám. Metalloproteinázy degradující matrici, jako je želatinasa, stromelysin a kolagenáza, se podílejí na degradaci tkáňové matrice (například na zhroucení kolagenu) a jsou uváděny do souvislosti s mnoha patologickými stavy, které zahrnují abnormální metabolismus pojivové tkáně a základní membránové matrice, jako je artritis (například osteoartritis a rheumatoidní artritis), ulcerace tkáně (například komeální, epidermální a gastrická ulcerace), abnormální hojení ran, periodonální choroba, choroba kostí (například Pagetova choroba a osteoporosa), metastázy nebo invaze nádorů, jakož i infekce HIV (J. Leuk. Biol. 52(2): 244 až 248, 1992).

O faktoru nekrózy nádorů je známo, že se podílí na mnoha infekčních a autoimunitních chorobách (W. Friers, FEBS Letters, 1992, 285, 199). Kromě toho bylo ukázáno, že TNF je prvotním mediátorem inflamatomí odpovědi pozorované při sepsi a septickém šoku (C. E. Spooner et al., Clinical Immunology and Immunopathology, 1992 62 SI 1).

Podstata vynálezu

Předmětem vynálezu jsou deriváty arylsulfonylhydroxamové kyseliny obecného vzorce I

kde přerušovaná čára představuje případnou přídavnou vazbu;

-1 CZ 287551 B6 představuje atom uhlíku;

představuje atom uhlíku, kyslíku, nebo atom dusíku;

R³, R⁴, R⁵, R⁶, R⁷ a R⁸ nezávisle představuje vždy atom vodíku, alkylskupinu s 1 až 6 atomy uhlíku, popřípadě substituovanou zbytkem zvoleným ze souboru zahrnujícího alkylaminoskupinu s 1 až 6 atomy uhlíku, arylskupinu se 6 až 10 atomy uhlíku, pyridylskupinu, aryloxyskupinu se 6 až 10 atomy uhlíku, pyridyloxyskupinu, acylaminoskupin se 1 až 6 atomy uhlíku, acyloxyskupinu s 1 až 6 atomy uhlíku, aminoskupinu, alkylaminoskupinu s 1 až 6 atomy uhlíku a dialkylaminoskupinu s 1 až 6 atomy uhlíku v každé z alkylových částí; alkenylskupinu se 2 až 6 atomy uhlíku, arylalkenylskupinu se 6 až 10 atomy uhlíku v arylové a 2 až 6 atomy uhlíku v alkenylové části, alkinylskupinu se 2 až 6 atomy uhlíku, aiylalkinylskupinu se 6 až 10 atomy uhlíku v arylové a 2 až 6 atomy uhlíku v alkinylové části, pyridylalkinylskupinu s 2 až 6 atomy uhlíku v alkinylové části, alkylaminoskupinu s 1 až 6 atomy uhlíku, alkoxyskupinu s 1 až 6 atomy uhlíku, arylskupinu s 6 až 10 atomy uhlíku, aryloxyskupinu se 6 až 10 atomy uhlíku, cykloalkylskupinu se 3 až 6 atomy uhlíku, piperidylskupinu, alkylpiperidylskupinu s 1 až 6 atomy uhlíku v alkylové části, acylaminoskupinu s 1 až 6 atomy uhlíku, acylthioskupinu s 1 až 6 atomy uhlíku, acyloxyskupinu s 1 až 6 atomy uhlíku, skupinu vzorce R¹³ alkyl s 1 až 6 atomy uhlíku v alkylové části, kde R¹³představuje acylpiperazinoskupinu s 1 až 6 atomy uhlíku v acylové části, nebo acylpiperidylskupinu s 1 až 6 atomy uhlíku v acylové skupině nebo skupinu vzorce

kde n představuje číslo 0 až 6;

Z představuje hydroxyskupinu, alkoxyskupinu s 1 až 6 atomy uhlíku nebo skupinu obecného vzorce NR¹⁴R¹⁵, kde R¹⁴ a R¹⁵ představují nezávisle vždy atom vodíku, alkylskupinu s 1 až 6 atomy uhlíku popřípadě substituovanou zbytkem zvoleným ze souboru zahrnujícího alkylpiperidylskupinu s 1 až 6 atomy uhlíku v alkylové části, arylpiperidylskupinu se 6 až 10 atomy uhlíku v arylové části, arylskupinu se 6 až 10 atomy uhlíku, pyridylskupinu, arylarylskupinu s 6 až 10 atomy uhlíku v každé zarylových částí a cykloalkylskupinu se 3 až 6 atomy uhlíku; piperidylskupinu, alkylpiperidylskupinu s 1 až 6 atomy uhlíku v alkylové části, arylpiperidylskupinu s 6 až 10 atomy uhlíku v arylové části, acylpiperidylskupinu s 1 až 6 atomy uhlíku v acylové části, arylskupinu se 6 až 10 atomy uhlíku, pyridylskupinu, arylarylskupinu s 6 až 10 atomy uhlíku v každé z aiylových částí, cykloalkylskupinu se 3 až 6 atomy uhlíku, skupinu vzorce R¹⁶alkyl se 2 až 6 atomy uhlíku v alkylové části, alkyl(CHR¹⁶)alkyl s 1 až 6 atomy uhlíku v každé z alkylových částí, kde R¹⁶představuje hydroxyskupinu, acyloxyskupinu s 1 až 6 atomy uhlíku, alkoxyskupinu s 1 až 6 atomy uhlíku, piperazinoskupinu, acylaminoskupinu s 1 až 6 atomy uhlíku, aminoskupinu, alkylaminoskupinu s 1 až 6 atomy uhlíku, dialkylaminoskupinu s 1 až 6 atomy uhlíku v každé z alkylových částí, acylpiperazinoskupinu s 1 až 6 atomy uhlíku v acylové části, nebo skupinu CH(R¹⁸)COR¹⁹, kde R¹⁸ představuje vodík, alkylskupinu s 1 až 6 atomy uhlíku, arylalkylskupinu se 6 až 10 v arylové a 1 až 6 atomy uhlíku v alkylové části, hydroxyalkylskupinu s 1 až 6 atomy uhlíku, aminoalkylskupinu s 1 až 6 atomy uhlíku, alky lam inoalkylskupinu s 1 až 6 atomy uhlíku v každé z alkylových částí, bis(alkylamino)alkylskupinu s 1 až 6 atomy uhlíku v každé z alkylových částí,

-2CZ 287551 B6 skupinu vzorce R²⁰R^2lNCOalkyl s 1 až 6 atomy uhlíku v alkylové části nebo R²⁰OCOalkyl s 1 až 6 atomy uhlíku v alkylové části, kde R²⁰ a R²¹ představují nezávisle vždy vodík, alkylskupinu s 1 až 6 atomy uhlíku a arylalkylskupinu se 6 až 10 atomy uhlíku v arylové a 1 až 6 atomy uhlíku v alkylové části; a R ⁹ představuje skupinu vzorce R²²O nebo R²²R²³N, kde R²² a R²³ představuje nezávisle vždy vodík, alkylskupinu s 1 až 6 atomy uhlíku, arylalkylskupinu se 6 až 10 atomy uhlíku v arylové a 1 až 6 atomy uhlíku v alkylové části nebo pyridylaikylskupinu s 1 až 6 atomy uhlíku v alkylové části; nebo

15 20 21 22 23

R a R nebo R a R nebo R a R dohromady tvoří azetidinylový, pyrrolidinylový nebo morfolinylový zbytek; nebo

R³ a R⁴ nebo R⁵ a R⁶ dohromady tvoří oxoskupinu;

nebo

R³ a R⁴ nebo R⁵ a R⁶ nebo R⁷ a R⁸ dohromady tvoří cykloalkylový kruh se 3 až 6 atomy uhlíku nebo oxacyklohexylový, thiocyklohexylový, indanylový nebo tetralinylový kruh nebo skupinu obecného vzorce

kde

R²⁴ představuje vodík, acylskupinu s 1 až 6 atomy uhlíku nebo alkylskupinu s 1 až 6 atomy uhlíku; a

Ar představuje arylskupinu se 6 až 10 atomy uhlíku nebo pyridylskupinu, z nichž každá je popřípadě substituována alkylskupinou s 1 až 6 atomy uhlíku, alkoxyskupinou s 1 až 6 atomy uhlíku nebo aryloxyskupinou se 6 až 10 atomy uhlíku;

přičemž,

R⁷je odlišný od vodíku pouze v tom případě, když R⁸ je odlišný od vodíku;

R⁶je odlišný od vodíku pouze v tom případě, když R⁵ je odlišný od vodíku;

R³je odlišný od vodíku pouze v tom případě, když R⁴ je odlišný od vodíku;

když Y představuje atom kyslíku nebo atom dusíku a když jedna nebo více ze skupin R³, R⁴, R⁷ a R⁸ nezávisle představuje substituent obsahující heteroatom, nemůže být tento heteroatom přímo vázán od polohy 3 nebo 5;

když Y představuje atom dusíku, R⁴ chybí;

když Y představuje atom kyslíku, potom R⁵ a R⁶ chybějí;

když Y představuje atom dusíku, R⁶ chybí;

když přerušovaná čára představuje přídavnou vazbu, R⁴ a R⁶ chybějí;

-3CZ 287551 B6 když R³ a R⁵ nezávisle představuje vždy substituent obsahující heteroatom, pokud přerušovaná čára představuje přídavnou vazbu, potom tento heteroatom nemůže být přímo vázán k X a Y; a když R³, R⁴, R⁵, R⁶, R⁷ a R⁸ představuje vždy atom vodíku nebo alkylskupinu s 1 až 6 atomy uhlíku, potom buď Y představuje atom kyslíku, nebo atom dusíku, nebo přerušovaná čára představuje přídavnou vazbu;

a jejich farmaceuticky vhodné soli.

Pod pojmem „alkyl“, jak se ho používá v tomto textu, se rozumí, pokud není uvedeno jinak, nasycené jednovazné uhlovodíkové zbytky s řetězcem přímým, rozvětveným nebo cyklickým nebo jejich kombinace.

Pod pojmem „alkoxy“, jak se ho používá v tomto textu, se rozumí skupiny vzorce O-alkyl, kde alkyl má shora uvedený význam.

Pod pojmem „aryl, jak se ho používá v tomto textu, se rozumí, pokud není uvedeno jinak, organické zbytky odvozené od aromatických uhlovodíků odstraněním jednoho atomu vodíku. Jako příklady aiy lskupinu je možno uvést fenylskupinu nebo naftylskupinu.

Pod pojmem „acyl“, jak se ho používá v tomto textu, se rozumí, pokud není uvedeno jinak, zbytek obecného vzorce RCO, kde R představuje alkylskupinu, alkoxyskupinu nebo fenylskupinu.

Pod pojmem „acyloxy“, jak se ho používá v tomto textu, se rozumí O-acylskupina, kde „acyl“ má význam uvedený výše.

Polohy v kruhu sloučenin obecného vzorce I jsou číslovány následujícím způsobem:

U sloučenin obecného vzorce I se dává přednost konformaci, kdy zbytek hydroxamové kyseliny je uspořádán axiálně v poloze 2.

Sloučeniny obecného vzorce I mohou obsahovat centra chirality, a proto se vyskytují v různých enantiomerických formách. Do rozsahu tohoto vynálezu spadají všechny optické isomery a stereoisomery sloučenin obecného vzorce I a jejich směsi.

Přednost se dává sloučeninám obecného vzorce I, kde Y představuje kyslík nebo dusík.

Dalšími přednostními sloučeninami jsou sloučeniny obecného vzorce I, kde Ar představuje 4methoxyfenylskupinu nebo 4—fenoxyfenylskupinu.

Dalšími přednostními sloučeninami jsou sloučeniny obecného vzorce I, kde R⁸ představuje arylskupinu se 6 až 10 atomy uhlíku, pyridylskupinu, arylalkylskupinu se 6 až 10 atomy uhlíku v arylové a 1 až 6 atomy uhlíku v alkylové části, pyridylalkylskupinu s 1 až 6 atomy uhlíku

-4CZ 287551 B6 v alkylové části, karboxyskupinu nebo skupinu karboxyalkylskupinu s 1 až 6 atomy uhlíku v alkylové části.

Dalšími přednostními sloučeninami jsou deriváty arylsulfonylhydroxamové kyseliny obecného vzorce I definované výše a jejich farmaceuticky vhodné soli, kde R³, R⁶, R⁷ a R⁹ představují atomy vodíku.

Větší přednost se dává sloučeninám obecného vzorce I, kde Y představuje uhlík, Ar představuje 4-methoxyfenylskupinu nebo 4-fenoxyfenylskupinu a R⁸ představuje aiylakinylskupinu se 6 až 10 atomy uhlíku v arylové části nebo pyridylalkinylskupinu se 2 až 6 atomy uhlíku v alkinylové části.

Větší přednost se dává sloučeninám obecného vzorce I, kde Y představuje kyslík, Ar představuje 4-methoxyfenylskupinu nebo 4-fenoxyfenylskupinu a R⁸ představuje arylakinylskupinu se 6 až 10 atomy uhlíku v arylové části nebo pyridylalkinylskupinu se 2 až 6 atomy uhlíku v alkinylové části.

Větší přednost se dává sloučeninám obecného vzorce I, kde Y představuje uhlík, Ar představuje 4—methoxyfenylskupinu nebo 4-fenoxyfenylskupinu a R⁸ představuje karboxyskupinu nebo karboxyalkylskupinu s 1 až 6 atomy uhlíku v alkylové části.

Větší přednost se dává sloučeninám obecného vzorce I, kde Y představuje kyslík, Ar představuje 4-methoxyfenylskupinu nebo 4-fenoxyfenylskupinu a R⁸ představuje karboxyskupinu nebo karboxyalkylskupinu s 1 až 6 atomy uhlíku v alkylové části.

Y představuje kyslík, Ar představuje 4-methoxyfenylskupinu nebo 4-fenoxyfenylskupinu a R⁸představuje skupinu karboxylové kyseliny nebo skupinu (karboxylová kyselina)alkyl s 1 až 6 atomy uhlíku v alkylové části.

Větší přednost se dává sloučeninám obecného vzorce I, kde Y představuje uhlík, Ar představuje 4-methoxyfenylskupinu nebo 4-fenoxyfenylskupinu a R⁵ představuje arylakinylskupinu se 6 až 10 atomy uhlíku v arylové části nebo pyridylalkinylskupinu se 2 až 6 atomy uhlíku v alkinylové části.

Větší přednost se dává sloučeninám obecného vzorce I, kde Y představuje kyslík, Ar představuje 4-methoxyfenylskupinu nebo 4-fenoxyfenylskupinu a R⁵ představuje arylakinylskupinu se 6 až 10 atomy uhlíku v arylové části nebo pyridylalkinylskupinu se 2 až 6 atomy uhlíku v alkinylové části.

Větší přednost se dává sloučeninám obecného vzorce I, kde Y představuje uhlík, Ar představuje 4-methoxyfenylskupinu nebo 4-fenoxyfenylskupinu a R⁵ představuje karboxyskupinu nebo karboxyalkylskupinu s 1 až 6 atomy uhlíku v alkylové části.

Větší přednost se dává sloučeninám obecného vzorce I, kde Y představuje uhlík, Ar představuje 4-methoxyfenylskupinu nebo 4-fenoxyfenylskupinu a R⁵ představuje alkylaminoskupinu s 1 až 6 atomy uhlíku.

Větší přednost se dává sloučeninám obecného vzorce I, kde Y představuje kyslík, Ar představuje 4-methoxyfenylskupinu nebo 4-fenoxyfenylskupinu a R⁸ představuje alkylaminoskupinu s 1 až 6 atomy uhlíku.

-5CZ 287551 B6

Specifickými přednostními sloučeninami obecného vzorce I jsou:

(2R,3S)-N-hydroxy-3-ethinyl-l-(4-methoxybenzensulfonyl)piperidin-2-karboxamid;

(2R,3S)-N-hydroxy-l-(4-methoxybenzensulfonyl)-3-(5-methoxythiofen-2-ylethinyl)piperidin-2-karboxamid;

(2R,3R)-N-hydroxy-l-(4-methoxybenzensulfonyl)-3-(3-pyridin-3-ylprop-2-inyl)piperidin2-karboxamid;

(2S,3R)-N-hydroxy-4-(4-methoxybenzensulfonyl)-2-pyridin-3-ylmorfolin-3-karboxamid;

(2S,3R)-N-hydroxy-2-hydroxykarbamoyM-(4-methoxybenzensulfonyl)morfolin-3-karboxamid;

(2R,3R)-N-hydroxy-2-hydroxykarbamoyl-4-(4-methoxybenzensulfonyl)piperidin-2karboxamid;

(2R,3S)-N-hydroxy-l-(4—methoxybenzensulfonyl)-3-(4-fenyl-pyridin-2-yl)piperidin-2karboxamid;

(2S,3R)-N-hydroxy-l-(4-methoxybenzensulfonyi)-2-(4-fenyl-pyridin-2-yl)morfolin-2karboxamid;

(2R,3S)-N-hydroxy-N-hydroxy-3-(2-chlor—4-fluorfenyl)-l-(4-methoxybenzensulfonyl)piperidin-2-karboxamid a (2S,3R)-N-hydroxy-2-(2-chlor-4-fluorfenyl)-l-(4-methoxybenzensulfonyl)piperidin-3karboxamid.

Předmětem vynálezu je dále také farmaceutický prostředek a) pro léčbu choroby zvolené ze souboru zahrnujícího artritis, rakovinu, ulcerace tkání, restenosu, periodonální chorobu, epidermolysis bullosa, scleritis a jiné choroby charakterizované aktivitou matriční metalloproteinázy, jakož i AIDS, sepsi, septický šok a jiné choroby zahrnující produkci faktoru nekrózy nádorů (TNF) nebo b) pro inhibici matričních metalloproteináz nebo produkce faktoru nekrózy nádorů (TNF) u savců, včetně člověka, jehož podstata spočívá v tom, že obsahuje derivát arylsulfonylhydroxamové kyseliny obecného vzorce I nebo jeho farmaceuticky vhodnou sůl v množství, které je účinné pro takovou léčbu nebo inhibici a farmaceuticky vhodný nosič.

Předmětem vynálezu jsou dále také deriváty arylsulfonylhydroxamové kyseliny nebo jejich farmaceuticky vhodné soli pro použití pro inhibici a) matričních metalloproteináz nebo b) produkce faktoru nekrózy nádorů (TNF) u savců, včetně člověka.

Předmětem vynálezu jsou dále také deriváty aiylsulfonylhydroxamové kyseliny nebo jejich farmaceuticky vhodné soli pro použití pro léčbu choroby zvolené ze souboru zahrnujícího artritis, rakovinu, ulcerace tkání, restenosu, periodonální chorobu, epidermolysis bullosa, scleritis a jiné choroby charakterizované aktivitou matriční metalloproteinázy, jakož i AIDS, sepsi, septický šok a jiné choroby zahrnující produkci faktoru nekrózy nádorů (TNF) u savců, včetně člověka.

Následuje podrobný popis tohoto vynálezu.

Výroba sloučenin podle vynálezu je ilustrována v následujících reakčních schématech. Pokud není uvedeno jinak, mají symboly R, R³, R⁴, R⁵, R⁶, R⁷, R⁸, n a Ar v těchto reakčních schématech a v připojené diskusi výše uvedený význam a R¹, R² a R⁹ představují atomy vodíku.

-6CZ 287551 B6

Preparace 1

XVI

Preparace 2

-7CZ 287551 B6

Schéma 1

III

-8CZ 287551 B6

Schéma 2

vJOgfit' IX

VIII

VII

-9CZ 287551 B6

Schéma 3

XI

NHOH

-10CZ 287551 B6

Schéma 4

XXI

-11CZ 287551 B6

Schéma 4 - pokračování

XX

XIX

XIII

-12CZ 287551 B6

Schéma 5

XXVI

XXIV

-13CZ 287551 B6

Schéma 5 - pokračování

XXIV

XIV

-14CZ 287551 B6

Při reakci podle preparace 1 se sloučenina obecného vzorce XVI převede na odpovídající hydroxyesterovou sloučeninu obecného vzorce VI tak, že se sloučenina obecného vzorce XVI nejprve nechá reagovat s arylsulfonylhalogenidem za přítomnosti triethylaminu a aprotického rozpouštědla, jako je methylenchlorid, tetrahydrofuran nebo dioxan, při teplotě v rozmezí od asi 20 do asi 30 °C, přednostně při teplotě místnosti. Takto vzniklá sloučenina se potom nechá reagovat se sloučeninou obecného vzorce

kde R²⁵ představuje benzyloxykarbonylskupinu, alkylskupinu s 1 až 6 atomy, benzylskupinu, allylskupinu nebo terc.butylskupinu, za přítomnosti natriumhexamethyldisilazanu a rozpouštědlové směsi tetrahydrofuran/trimethylformamid při teplotě v rozmezí od asi -20 do asi 20 °C, přednostně při asi 0 °C, za vzniku hydroxyesterové sloučeniny obecného vzorce VI.

Při reakci 2 v preparaci 2 se aminosloučenina obecného vzorce XVIII, kde R²⁵ má výše uvedený význam, převede na odpovídající arylsulfonylaminovou sloučeninu obecného vzorce XVII tak, že se 1) sloučenina obecného vzorce XVIII nechá reagovat s arylsulfonylhalogenidem za přítomnosti triethylaminu a aprotického rozpouštědla, jako je methylenchlorid, tetrahydrofuran nebo dioxan, při teplotě v rozmezí od asi 20 do asi 30 °C, přednostně při teplotě místnosti a potom se 2) takto získaná sloučenina nechá reagovat se sloučeninou vzorce

za přítomnosti natriumhexamethyldisilazanu a v rozpouštědlové směsi tetrahydrofuran/dimethylformamid při teplotě v rozmezí od asi -20 do asi 20 °C, přednostně při asi 0 °C a potom se 3) takto vzniklá sloučenina nechá reagovat s ozonem v roztoku v methylenchloridu a methanolu při teplotě v rozmezí od asi -90 do asi -70, přednostně při asi -78 °C. Takto vzniklá nestálá ozonidová sloučenina se potom nechá reagovat s trifenylfosfmem, a tak se získá arylsulfonylaminová sloučenina obecného vzorce XVII. Při reakci 2 v preparaci 2 se arylsulfonylaminová sloučenina vzorce XVII převádí na odpovídající hydroxyesterovou sloučeninu vzorce VI postupem, při němž se na sloučeninu vzorce XVII působí sloučeninou obecného vzorce

kde W představuje lithium, hořčík, měď nebo chrom.

Při reakci 1 podle schématu 1 se sloučenina vzorce VI, kde chránící skupinou R²⁵ je benzyloxykarbonylskupinu, alkylskupina s 1 až 6 atomy uhlíku, benzylskupina, allylskupina nebo terc.butylskupina, převádí na odpovídající morfolinonovou sloučeninu vzorce V laktonizací a následujícím Claisenovým přesmykem sloučeniny obecného vzorce VI. Tato reakce se usnadní odštěpením chránící skupiny R²⁵ ze sloučeniny obecného vzorce VI, což se provádí za podmínek, které jsou vhodné pro konkrétně přítomné chránící skupiny R²⁵. Tyto podmínky zahrnují: a) zpracování vodíkem za přítomnosti hydrogenačního katalyzátoru, jako je 10% palladium na

-15CZ 287551 B6 uhlíku, v případě že R²⁵ představuje benzyloxykarbonylskupinu; b) zmýdelnění, pokud R²⁵představuje nižší alkylskupinu; c) hydrogenolýzu, pokud R²⁵ představuje benzylskupinu; d) zpracování silnou kyselinou, jako je kyselina trifluoroctová nebo kyselina chlorovodíková, pokud R²⁵ představuje terc.butylskupinu nebo e) zpracování tributylstannihydridem a kyselinou octovou za přítomnosti katalytického chloridu bis(trifenylfosfin)palladnatého, pokud R²⁵představuje allylskupinu.

Při reakci 2 podle schématu 1 se morfolinová sloučenina obecného vzorce V převede na derivát karboxylové kyseliny obecného vzorce IV reakcí sloučeniny vzorce V s lithiumhexamethyldisilazanem v aprotickém rozpouštědle, jako je tetrahydrofuran, při teplotě v rozmezí od asi -90 do asi -70, přednostně při asi -78 °C. Ke vzniklé reakční směsi se potom přidá trimethylsilylchlorid a rozpouštědlo (tetrahydrofuran) se odpaří za sníženého tlaku a nahradí toluenem. Vzniklá reakční směs se zahřeje na teplotu v rozmezí od asi 100 do asi 120 °C, přednostně na asi 110°C a působí se na ni kyselinou chlorovodíkovou za vzniku derivátu karboxylové kyseliny obecného vzorce IV.

Při reakci 3 podle schématu 1 se derivát karboxylové kyseliny obecného vzorce IV převede na odpovídající sloučeninu hydroxamové kyseliny obecného vzorce III tak, že se na sloučeninu vzorce IV působí l-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylkarbodiimidem a 1-hydroxybenztriazolem v polárním rozpouštědle, jako je dimethylformamid a ke vzniklé reakční směsi se po uplynutí přibližně 15 minut až 1 hodiny, přednostně asi 30 minut přidá hydroxylamin. Tento hydroxylamin se přednostně vytváří in šitu ze své solné formy, jako je hydroxylaminhydrochlorid, za přítomnosti báze, jako je N-methylmorfolin. Alternativně se může použít chráněného derivátu hydroxy lam inu nebo jeho solné formy, v němž je hydroxy lová skupina chráněna vytvořením terc.butyl-, benzyl- nebo allyletheru, za přítomnosti (benzotriazol-1yloxy)tris(dimethylamino)fosfoniumhexafluorfosfátu a báze, jako je N-methylmorfolin. Odštěpení chránící skupiny hydroxylaminu se provádí hydrogenolýzou benzylové chránící skupiny nebo - v případě terc.butylové chránící skupiny - působením silné kyseliny, jako je kyselina trifluoroctová. Allylovou chránící skupinu je možno odstranit působením dibutylstannihydridu a kyseliny octové za přítomnosti chloridu bis(trifenylfosfin)palladnatého. Jako chráněného derivátu hydroxylaminu se také může použít N,O-bis(4-methoxybenzyl)hydroxylaminu, a v tomto případě se deprotekce provádí za použití směsi kyseliny methansulfonové a kyseliny trifluoroctové.

Při reakci 4 podle schématu 1 se sloučenina hydroxamové kyseliny obecného vzorce III popřípadě převede na odpovídající piperidinovou sloučeninu obecného vzorce II tak, že se sloučenina vzorce III nechá reagovat s vodíkem za přítomnosti hydrogenačního katalyzátoru, jako je 10% palladium na uhlíku.

Při reakci 1 podle schématu 2 se arylsulfonylpiperazinová sloučenina obecného vzorce IX, kde R²⁶ představuje benzyloxykarbonylskupinu, benzylskupinu nebo terc.-butoxykarbonylskupinu, převádí na sloučeninu obecného vzorce VIII. Při tom se sloučenina obecného vzorce IX uvádí do reakce s chráněným derivátem hydroxylaminu obecného vzorce

R²⁷ONH₂.HC1 kde R²⁷ představuje terc.butylskupinu, benzylskupinu nebo allylskupinu, za přítomnosti dicyklohexylkarbodiimidu, dimethylaminopyridinu a aprotického rozpouštědla, jako je methylenchlorid. Chrániči skupina R²⁶ se volí tak, aby ji bylo možno snadno odštěpit za přítomnosti chránící skupiny R²⁷, aniž by došlo také k odštěpení skupiny R²⁷. Proto nemůže být skupina R²⁶ shodná se skupinou R²⁷. Odštěpování chránící skupiny R²⁶ ze sloučeniny obecného vzorce IX se provádí za podmínek vhodných pro konkrétně použitou skupinu R²⁶. Tyto podmínky zahrnují: a) zpracování vodíkem za přítomnosti hydrogenačního katalyzátoru, jako je 10% palladium na uhlíku, v případě že R²⁶ představuje benzyloxykarbonylskupinu; b) hydrogenolýzu, pokud R²⁶ představuje

-16CZ 287551 B6 benzylskupinu; nebo c) zpracování silnou kyselinou, jako je kyselina trifluoroctová nebo kyselina chlorovodíková, pokud R²⁶ představuje terc.butoxykarbonylskupinu.

Při reakci 2 podle schématu 2 se sloučenina obecného vzorce VIII převádí na odpovídající sloučeninu hydroxamové kyseliny obecného vzorce VII, kde R⁵ představuje atom vodíku nebo alkylskupinu s 1 až 6 atomy uhlíku. Pokud R⁵ představuje alkylskupinu s 1 až 6 atomy uhlíku, může se sloučenina obecného vzorce VIII uvést do reakce s příslušným alkylhalogenidem. Následující odštěpení hydroxylaminové chránící skupiny R²⁷ se provádí hydrogenolýzou (v případě benzylové chránící skupiny) nebo působením silné kyseliny, jako je kyselina trifluoroctová (v případě terc.butylové chránící skupiny). Allylovou chránící skupinu je možno odštěpit působením tributylcínhydridu a kyseliny octové za přítomnosti chloridu bis(trifenylfosfin)palladnaného, jako katalyzátoru.

Při reakci 1 podle schématu 3 se arylsulfonylaminová sloučenina obecného vzorce XII, kde R²⁵má výše uvedený význam, převádí na odpovídající piperazinovou sloučeninu obecného vzorce XI. Při tom se na sloučeninu obecného vzorce XII působí karbodiimidem a bází, jako je triethylamin. Získaná sloučenina obecného vzorce XI se potom dále zpracovává na požadovanou sloučeninu hydroxamové kyseliny obecného vzorce X způsobem popsaným výše, v souvislosti s reakcí 3 podle schématu 1.

Při reakci 1 podle schématu 4 se provádí odštěpování chránící skupiny 28 a následující reduktivní aminace sloučeniny obecného vzorce XXII, kde Y představuje kyslík, síru nebo uhlík, za vzniku odpovídající iminové sloučeniny obecného vzorce XXI. Přitom se pracuje za podmínek vhodných pro konkrétně použitou chránící skupinu R²⁸. Tyto podmínky jsou stejné jako podmínky uvedené výše v souvislosti s odštěpováním chránící skupiny R²⁶ při reakci 1 podle schématu 2.

Při reakci 2 podle schématu 4 se iminová sloučenina obecného vzorce XXI převádí na odpovídající piperidinovou sloučeninu obecného vzorce XX. Přitom se na sloučeninu obecného vzorce XXI působí nukleofilním činidlem obecného vzorce R²M, kde M představuje lithium, mangesiumhalogenidový zbytek nebo ceriumhalogenidový zbytek. Reakce se provádí v etherových rozpouštědlech, jako je diethylether nebo tetrahydrofuran, při teplotě přibližně v rozmezí od -78 do 0 °C. Přednostně se pracuje při asi -70 °C.

Při reakci 3 podle schématu 4 se piperidinová sloučenina obecného vzorce XX sulfonuje na odpovídající arylsulfonylpiperidinovou sloučeninu obecného vzorce XIX. Přitom se sloučenina obecného vzorce XX nechá reagovat s arylsulfonylhalogenidem za přítomnosti triethylaminu a aprotického rozpouštědla, jako je metheronchlorid, tetrahydrofuran nebo dioxan, při teplotě přibližně v rozmezí od 20 do 30 °C, přednostně při teplotě místnosti.

Při reakci 4 podle schématu 4 se arylsulfonylpiperidinová sloučenina obecného vzorce XIX převádí na sloučeninu hydroxamové kyseliny obecného vzorce XIX způsobem popsaným výše v souvislosti s reakcí 3 podle schématu 1.

Při reakci 1 podle schématu 5 se sloučenina obecného vzorce XXVI, kde každá z chránících skupin R²⁹ a R³¹ je nezávisle zvolena ze souboru zahrnujícího benzyloxykarbonylskupinu, benzylskupinu a terc.butoxykarbonylskupinu a R³⁰ představuje benzyloxykarbonylskupinu, alkylskupinu s 1 až 6 atomy uhlíku, benzylskupinu, allylskupinu nebo terc.butylskupinu, převádí na odpovídající iminovou sloučeninu obecného vzorce XXV odštěpením chránící skupiny R²⁹ a následující reduktivní aminací sloučeniny obecného vzorce XXVI. Chrániči skupina R²⁹ se volí tak, aby ji bylo možno selektivně odštěpit za přítomnosti chránící skupiny R³¹, aniž by došlo také k odštěpení skupiny R³¹. Odštěpování chránící skupiny R²⁹ ze sloučeniny obecného vzorce XXVI se provádí za podmínek vhodných pro konkrétně použitou chránící skupinu R²⁹, při nichž nedochází k ovlivnění chránící skupiny R³¹. Tyto podmínky zahrnují: a) zpracování vodíkem za přítomnosti hydrogenačního katalyzátoru, jako je 10% palladium na uhlíku, v případě že R²⁹

-17CZ 287551 B6 představuje benzyloxykarbonylskupinu a R³¹ představuje terc.butylskupinu; b) zmýdelnění, v případě, že R²⁹ představuje alkylskupinu s 1 až 6 atomy uhlíku a R³¹ představuje terc.butylskupinu; c) hydrogenolýzu, pokud R²⁹ představuje benzylskupinu a R³¹ představuje alkylskupinu s 1 až 6 atomy uhlíku nebo terc.butylskupinu; nebo d) zpracování silnou kyselinou, jako je 5 kyselina trifluoroctová nebo kyselina chlorovodíková, pokud R²⁹ představuje terc.butylskupinu a

R³¹ představuje alkylskupinu s 1 až 6 atomy uhlíku, benzylskupinu nebo allylskupinu; nebo e) zpracování s tributylcínhydridem a kyselinou octovou za přítomnosti chloridu bis(trifenylfosfin)palladnatého, jako katalyzátoru, pokud R²⁹ představuje allylskupinu a R³¹ představuje alkylskupinu s 1 až 6 atomy uhlíku, benzylskupinu nebo terc.butylskupinu. Chránící skupinu R³⁰ío je možno volit tak, že také dochází k jejímu odštěpení v reakčním stupni, v němž se odštěpuje chránící skupina R²⁹.

Při reakci 2 podle schématu 5 se iminová sloučenina obecného vzorce XXV převádí na odpovídající sloučeninu obecného vzorce XXIV. Přitom se na sloučeninu obecného vzorce XXV 15 působí nukleofilním činidlem obecného vzorce R²M, kde M představuje lithium, mangesiumhalogenidový zbytek nebo kalciumhalogenidový zbytek. Reakce se provádí v etherových rozpouštědlech, jako je diethylether nebo tetrahydrofuran, při teplotě přibližně v rozmezí od -78 do 0 °C. Přednostně se pracuje při asi -70 °C.

Při reakci 3 podle schématu 5 se piperidinová sloučenina obecného vzorce XXIV sulfonuje na odpovídající arylsulfonylpiperidinovou sloučeninu obecného vzorce III. Tato reakce se provádí postupem popsaným výše v souvislosti s reakcí 3 podle schématu 4.

Při reakci 4 podle schématu 5 se arylsulfonylpiperidinová sloučenina obecného vzorce XXIII 25 převádí na sloučeninu hydroxamové kyseliny obecného vzorce XIV tak, že se 1) odštěpí chránící skupina R³¹ a popřípadě R³⁰ ze sloučeniny obecného vzorce XXIII a potom se 2) sloučenina obecného vzorce XXIII podrobí reakci popsané výše v souvislosti s reakcí 3 podle schématu 1.

Odštěpování chránících skupin R³⁰ a R³¹ ze sloučeniny obecného vzorce XXIII se provádí za podmínek, které jsou vhodné pro konkrétně použité chránící skupiny R³⁰ a R³¹. Tyto podmínky 30 zahrnují podmínky uvedené výše v souvislosti s odštěpováním chránící skupiny R²⁵ při reakci 1 podle schématu 1.

Farmaceuticky vhodné soli kyselých sloučenin podle vynálezu jsou soli utvořené s bázemi, tj. soli s kationty alkalických kovů a kovů alkalických zemin, jako je sodík, lithium, draslík, vápník, 35 hořčík, dále též soli amonia, jako amoniové, trimethylamoniové, diethylamoniové a tris(hydroxymethyl)methylamoniové soli.

Pokud je součástí struktury sloučenin podle vynálezu také bazická skupina, jako například pyridylskupina, jsou také možné adiční soli s kyselinami, jako s minerálními kyselinami, 40 organickými karboxylovými kyselinami a organickými sulfonovými kyselinami, například s kyselinou chlorovodíkovou, methansulfonovou a maleinovou.

Schopnost sloučenin obecného vzorce I nebo jejich farmaceuticky vhodných solí (tyto látky jsou v tomto popisu souhrnně označovány názvem „sloučeniny podle vynálezu“) inhibovat matriční 45 metalloproteinázy nebo produkci faktoru nekrózy nádorů (TNF), a tedy účinnost sloučenin podle vynálezu při léčbě chorob, které jsou charakteristické uplatňováním matriční metalloproteinázy nebo produkcí faktoru nekrózy nádorů, je demonstrována v následujících in vitro zkušebních postupech.

Biologické zkoušky

Inhibice humánní kolagenázy (MMP-1)

Humánní rekombinantní kolagenáza se aktivuje trypsinem při poměru 10 mg trypsinu na 100 mg 55 kolagenázy. Trypsin a kolagenáza se inkubují při teplotě místnosti po dobu 10 minut a potom se

-18CZ 287551 B6 k inkubační směsi přidá pětinásobný nadbytek (50pg/10pg trypsinu) sojového inhibitoru trypsinu.

Za použití dimethylsulfoxidu se vyrobí zásobní roztoky inhibitorů o 10 mM koncentraci a potom se provede jejich ředění podle následujícího schématu:

mM -> 120 μΜ -> 12 μΜ -> 1,2 μΜ -» 0,12 μΜ

Vždy 25 μΐ roztoku ο každé koncentraci se potom přidá (3 replikace) do příslušných jamek 96jamkové misky microfluor. Konečná koncentrace inhibitoru po přidání enzymu a substrátu je snížena v poměru 1 : 4. V jamkách Dl až D6 jsou umístěny pozitivní kontrolní vzorky (enzym, ale žádný inhibitor) a v jamkách D7 až D12 jsou umístěny slepé pokusy (žádný enzym, žádný inhibitor).

Kolagenáza se zředí na koncentraci 4 ng/ml a do příslušných jamek misky microfluor se přidá vždy 25 μΐ zředěného přípravku. Konečná koncentrace kolagenázy při této zkoušce je 100 ng/ml.

Substrát (DNP-Pro-Ch-Gly-Cys(Me)-His-Ala-Lys(NMA)-NH2) se vyrobí jako 5 mM zásobní roztok dimethylsulfoxidu a potom zředí zkouškovým pufrem na 20 μΜ koncentraci. Zkouška se zahájí přídavkem 50 μΐ substrátu do jamky misky microfluor, čímž se dosáhne 10 μΜ koncové koncentrace.

V čase 0 a potom ve 20-minutových intervalech se odečítají hodnoty fluorescence (excitace 360 nm a emise 460 nm). Zkouška se provádí při teplotě místnosti, přičemž její obvyklé trvání je 3 hodiny.

Jak pro slepé pokusy, tak pro pokusy zahrnující vzorky s kolagenázou se potom vynese do grafu závislost fluorescence na čase (data z třech replikací se zprůměrují). Pro stanovení hodnot IC50 se zvolí časový bod, který poskytuje dobrý signál (slepý pokus) a který se nalézá v lineární části křivky (obvykle okolo asi 120 minut). Hodnoty v čase 0 se používá v případě všech koncentrací všech sloučenin jako referenční hodnoty, která se odečítá od dat v čase 120 minut. Data se vynášejí do grafu jako koncentrace inhibitoru proti procentickému potlačení (podíl fluorescence inhibitoru a fluorescence samotné kolagenázy vynásobený číslem 100). Hodnoty IC₅₀ se určí z koncentrace inhibitoru, která poskytuje signál představující 50% potlačení.

Pokud jsou uvedené hodnoty IC50 nižší než 0,03 μΜ, potom se inhibitory zkoušejí v koncentracích 0,3 μΜ, 0,03 μΜ, 0,003 μΜ a 0,0003 μΜ.

Průměrné hodnoty IC50 pro některé reprezentativní sloučeniny podle vynálezu jsou uvedeny dále:

	IC₅₀ (nM)
(±)-(2R,3R)-(N-hydroxy)-l-(4-methoxybenzensulfonyl)-3-methyl- l,2,3,6-tetrahydropyridin-2-karboxamid (příklad 1)	12
N-hydroxy-l-(4-methoxybenzensulfonyl)-3-fenyl-l,2,3,6-tetrahydropyridin-2-karboxamid (příklad 2)	12
(±)-(2R,3R)-N-hydroxy-l-(4-methoxybenzensulfonyl}-3-fenylpiperidin-2-karboxamid (příklad 3)	6
(±)-N-hydroxy-l-(4-methoxybenzensulfonyl)-2-piperazinkarboxamid (příklad 4)	350
N-hydroxy-l-(4-methoxybenzen sulfonyl)-5-oxopiperazin-2-karboxamid (příklad 5)	140
N-hydroxy-l-(4-methoxybenzensulfonyl)morfolin-2-karboxamid (příklad 6)	29

-19CZ 287551 B6

Tabulka - pokračování

	IC₅₀ (nM)
N-hydroxy-3-benzyl-l-(4-methoxybenzensulfonyl)-l,2,3,6-tetrahydropyridin-2-karboxamid	7
N-hydroxy-3-(2-chlor-4-fluor fenyl)-l-(4-methoxybenzensulfonyl)-l ,2,- 3,6-tetrahydropyridin-2-karboxamid	4
N-hydroxy-1 -(4-methoxybenzensulfony 1)-1,2,3,4,5,6-hexahydro[3,3'b]pyridyl-2-karboxamid	9
N-hydroxy-3-benzyloxymethyl-l-(4-methoxybenzensulfonyl)-l, 2,3,6tetrahydropyridin-2-karboxamid	4
N-hydroxy-4-(4-methoxybenzensulfonyl)-2-fenyl)morfolin-3-karboxamid	120
N-hydroxy-4-(4-methoxybenzensulfonyl)-2-fenylmorfolin-3-karboxamid	1200
N-hydroxy-l-(4-fenoxybenzensulfonyl)piperidin-2-karboxamid	2
N-hydroxy-3-ethinyl-l-(4-methoxybenzensulfonyl)-l,2,3,6-tetrahydropyridin-2-karboxamid	10
ethylester (2R,3S)-2-hydroxykarbamoyl-l-(4-methoxybenzensulfonyl)piperidin-3-karboxylové kyseliny	1500
methylester (2R,4R)-2-hydroxykarbamoyl-l-(4-methoxybenzensulfonyl)piperidin-4-karboxylové kyseliny	19
(2R,4R)-2-hydroxykarbamoyl-l-(4-methoxybenzensulfonyl)piperidin- 4-karboxylová kyselina	32
ethylester (2R,4R)-2-hydroxykarbamoyl-l-(4-methoxybenzensulfonyl)piperidin-4-karboxylové kyseliny	12
N-hydroxy-(2R,4R)-4-am ino-1 -(4-methoxy benzensulfony l)p iperi d in— 2-karboxamid	20
isopropylester (2R,3 S)-[ 1 -(4-butoxybenzensulfonyl)-2-hydroxykarbamoylpiperidin-3-yl]karbamové kyseliny	9
isopropylester (2R,3 S)-{ l-[4-(4-fluorfenoxy)benzensulfonyl]-2-hydroxykarbamoylpiperidin-3-yl} karbamové kyseliny	2
methylester (2R,4R)-1 -(4-butoxybenzensulfonyl)-2-hydroxykarbamoyl- piperidin-4-karboxylové kyseliny	95
(2R,4R)-l-(4-butoxybenzensulfonyl)-2-hydroxykarbamoylpiperidin- 4-karboxylová kyselina	119

Inhibice želatinasy (MMP-2)

Inhibice aktivity želatinasy se provádí za použití substrátu Dnp-Pro-Cha-Gly-Cys(Me)-HisAla-Lys(NMA)-NH2 (10 μΜ) za stejných podmínek, jaké jsou popsány výše v souvislosti se zkouškou inhibice humánní kolagenázy (MMP-1).

Zelatinasa (72 kD) se aktivuje 1 mM ΑΡΜΑ (p-aminofenylmerkuriacetát) 15 hodin při 4 °C a potom se zředí na koncovou zkouškovou koncentraci 100 mg/ml. Inhibitory se zředí stejným způsobem jako při zkoušce inhibice humánní kolagenázy (MMP-1), takže se dosáhne koncových zkouškových koncentrací 30 μΜ, 3 μΜ, 0,3 μΜ a 0,03 μΜ. Každá koncentrace se zkouší se třemi replikacemi. Fluorescence (excitace 360 nm, emise 460 nm) se odečítá v čase 0 a potom ve 20-minutových intervalech po dobu 4 hodin.

Hodnoty IC50 se stanoví tak, jako při zkoušce inhibice humánní kolagenázy (MMP-1). Pokud se uvádí koncentrace IC50 nižší než 0,03 μΜ, zkoušejí se inhibitory při konečné koncentraci 0,3 μΜ, 0,03 μΜ, 0,003 μΜ a 0,0003 μΜ.

Inhibice aktivity stromelysinu (MMP-3)

-20CZ 287551 B6

Zkouška inhibice aktivity stromelysinu představuje modifikovanou spektrofotometrickou zkoušku, kterou popsali Weingarten a Feder (Weingarten H. a Fader J., Spectrophotometric Assay for Vertebrate Collagenase, Anal. Biochem., 147, 437 až 440 (1985)). Hydrolýza thipeptolidového substrátu [Ac-Pro-Leu-Gly-SCH[CH₂CH(CH₃)2]CO-Leu-Gly-OC2H2] poskytuje merkaptanový fragment, který lze monitorovat za přítomnosti Ellmanova činidla.

Humánní rekombinantní prostromelysin se aktivuje trypsinem při poměru 1 μΐ trypsinového zásobního roztoku o koncentraci 10 mg/ml na 26 pg stromelysinu. Trypsin a stromelysin se inkubují při teplotě 37 °C po dobu 15 minut a potom se na inkubační směs působí po dobu 10 minut při 37 °C 10 μΐ sojového inhibitoru trypsinu o koncentraci 10 mg/ml, za účelem eliminace trypsinové aktivity.

Zkoušky se provádějí v celkovém objemu zkouškového pufru (200 mM chlorid sodný, 50 mM MES a lOmM chlorid vápenatý, pH6,0) 250 μΐ v 96-jamkových mikrotitrových miskách. Aktivovaný stromelysin se zředí zkouškovým pufrem na koncentraci 25 pg/ml. Ellmanovo činidlo (3-karboxy—4-nitrofenyldisulfid) se vyrobí jako 1 M zásobní roztok v dimethylformamidu a potom zředí na 1 M zásobní roztok v dimethylformamidu a potom zředí na 5 mM koncentraci zkouškovým pufrem. Do každé jamky se takto získaný zředěný roztok přidá v množství 50 μΐ, takže koncová koncentrace je lmM.

Za použití dimethylsulfoxidu se vyrobí zásobní roztoky inhibitorů o lOmM koncentraci a potom se provede jejich sériově ředění zkouškovým pufrem tak, aby se při přídavku 50 μΐ příslušného zředěného roztoku do vhodné jamky dosáhlo konečné koncentrace 3 μΜ, 0,3 μΜ, 0,003 μΜ a 0,0003 μΜ. Při všech podmínkách se zkoušky provádějí vždy se třemi replikacemi.

Dimethylsulfoxidový zásobní roztok peptidového substrátu o koncentraci 300 mM se zkouškovým pufrem zředí n a 15mM koncentraci. Zkouška se zahájí přídavkem 50 μΐ takto získaného zředěného roztoku do každé jamky (dosažená koncová koncentrace substrátu je tedy 3mM). Jamky se slepými pokusy obsahují peptidový substrát a Ellmanovo činidlo bez enzymu. Tvorba produktu se monitoruje při 405 nm za použití zařízení Molecular Devices UVmax Plate Reader.

Hodnoty IC50 se stanoví stejným způsobem jako při zkoušce inhibice kolagenázy.

Inhibice MMP-13

Humánní rekombinantní MMP-13 se aktivuje 2 mM ΑΡΜΑ (p-aminofenylmerkuriacetát) po dobu 1,5 hodiny při 37 °C a potom se zředí zkouškovým pufrem (50 mM Tris, pH 7,5, 200 mM chlorid sodný, 5mM chlorid vápenatý, 20 μΜ chlorid zinečnatý, 0,02 % povrchově aktivní látka Brij) na koncentraci 400 mg/ml. Do každé jamky v 96-jamkové misce microfluor se přidá 25 μΐ zředěného enzymu. V jamce se enzym při zkoušce ještě zředí v poměru 1 : 4 přídavkem inhibitoru a substrátu, takže jeho konečná koncentrace při zkoušce je 100 mg/ml.

Vyrobí se dimethylsulfoxidové zásobní roztoky inhibitorů o koncentraci lOmM, které se pak zředí zkouškovým pufrem za použití systému ředění inhibitoru, který je uveden ve zkoušce inhibice humánní kolagenázy (MMP-1). Do jamek misky microfluor se přidá vždy 25 μΐ roztoku o každé koncentraci (3 replikace). Konečná koncentrace při zkoušce je 30 μΜ, 3 μΜ, 0,3 μΜ a 0,03 μΜ.

Substrát (Dnp-Pro-Cha-Gly-Cys(Me)-His-Ala-Lys(NMA)-NH2) se zpracuje tak, jako při zkoušce inhibice humánní kolagenázy (MMP-1) a do každé jamky se přidá vždy 50 μΐ vzniklého roztoku, čímž se dosáhne koncové zkouškové koncentrace 10 μΜ. Fluorescence (excitace 360 nm, emise 450 nm) se odečítá v čase 0 a potom každých 5 minut po dobu 1 hodiny.

-21CZ 287551 B6

Pozitivní kontrolní vzorky obsahují enzym a substrát bez inhibitoru, zatímco slepé vzorky obsahují samotný substrát.

Hodnoty IC₅₀ se stanoví stejným způsobem jako při zkoušce inhibice humánní kolagenázy (MMP-1). Pokud jsou uvedené hodnoty IC₅₀ nižší než 0,03 μΜ, potom se inhibitory zkoušejí v konečných koncentracích 0,3 μΜ, 0,03 μΜ, 0,003 μΜ a 0,0003 μΜ.

Inhibice produkce TNF

Schopnost sloučenin podle vynálezu a jejich farmaceuticky vhodných solí inhibovat produkci TNF, a tedy jejich použitelnost pro léčbu chorob, při nichž dochází k produkci TNF, je demonstrována následující zkouškou in vitro.

Z anti-koagulované humánní krve se izolují humánní jednojademé buňky za použití jednostupňového separačního postupu Ficoll-hypaque. Jednojademé buňky se třikrát promyjí v Hanksově vyváženém solném roztoku (HBSS) s dvojmocnými kationty a resuspendují na hustotu 2xl0⁶/ml v HBSS s obsahem 1% BSA. Diferenciální počty stanovené za použití analyzátoru Abbott Cell Dyn 3500 ukazují, že v těchto přípravcích monocyty tvoří 17 až 24 % celkového počtu buněk.

Do 96-jamkových misek s plochým dnem (Costar) se umístí vždy 180 μΐ vzniklé suspenze buněk. Přídavkem zkoušené sloučeniny a LPS (koncová koncentrace 100 ng/ml) se objem v každé jamce upraví na hodnotu 200 μΐ. Zkoušky se za všech podmínek provádějí se třemi replikacemi. Po čtyřhodinové inkubaci při 37 °C v inkubátoru se zvlhčenou atmosférou obsahující oxid uhličitý se misky vyjmou a provede se centrifugace (10 minut při asi 250 x g). Supematanty se oddělí a analyzují na TNF-α za použití soupravy R&D ELISA.

Pro podávání člověku za účelem inhibice matričních metalloproteináz nebo produkce faktoru nekrózy nádorů (TNF) se může použít různých konvenčních cest, jako například orálního, parenterálního a topického podávání. Obvykle se bude účinná sloučenina podávat orálně nebo parenterálně v dávce v rozmezí od asi 0,1 do asi 25 mg/kg tělesné hmotnosti léčebného subjektu za den, přičemž přednostní denní dávka bude ležet přibližně v rozmezí od 0,3 do 5 mg/kg. V závislosti na stavu léčeného subjektu bude nutně docházet k určitým variacím dávkování. Vhodnou dávku pro individuálního pacienta stanoví v každém případě ošetřující lékař.

Sloučeniny podle vynálezu je možno podávat v podobě široké palety různých dávkovačích forem, v nichž budou terapeuticky účinné sloučeniny podle vynálezu přítomny v koncentraci v rozmezí od asi 5,0 do asi 70 % hmotnostních.

Pro orální podávání je možno použít tablet obsahujících různé excipienty, jako je mikrokrystalická celulosa, citrát sodný, uhličitan vápenatý, dikalciumfosfát a glycin spolu s různými bubřidly, jako je škrob (přednostně kukuřičný, bramborový nebo tapiokový škrob), kyselina alginová a určité komplexní křemičitany a také granulačními pojivý, jako je polyvinylpyrrolidon, sacharosa, želatina a klovatina. Často jsou pro tabletování také velmi užitečná lubrikační činidla, jako je stearan hořečnatý, laurylsulfát sodný a mastek. Pevných směsí podobného typu je také možno použít jako náplně pro želatinové kapsle; jako přednostní látky je v této souvislosti možno uvést také laktosu a vysokomolekulámí polyethylenglykoly. Když se má pro orální podávání použít vodných suspenzí a/nebo elixírů, mísí se účinná přísada s různými sladidly nebo ochucovadly, pigmenty nebo barvivý a je-li to zapotřebí, emulgátory a/nebo suspenzními činidly, jakož i s takovými ředidly, jako je voda, ethanol, propylenglykol, glycerol a jejich různé směsi.

Pro parenterální podávání (intramuskulámí, intraperitoneální, subkutánní a intravenosní podávání) se obvykle používá sterilních injekčních roztoků účinných přísad. Při tom se může použít roztoků terapeuticky účinné sloučeniny podle vynálezu buď v sezamovém, nebo arašídovém oleji nebo také ve vodném propylenglykolu. Hodnota pH vodných roztoků by měla

-22CZ 287551 B6 být, pokud je to zapotřebí, vhodným způsobem nastavena a pufrována, přednostně na hodnotu vyšší než je 8 a kapalné ředidlo by mělo být nejprve isotonizováno. Takové vodné roztoky se hodí pro podávání ve formě intravenosních injekcí. Olejové roztoky se hodí pro intraartikulámí, intramuskulámí a subkutánní injekční podávání. Všechny tyto roztoky se vyrábějí za sterilních podmínek v souladu se standardními farmaceutickými technologiemi, které jsou odborníkům v tomto oboru dobře známé.

Sloučeniny podle vynálezu je dále také možno podávat topicky, například při léčbě inflamatomích chorob kůže. Ktomu se hodí krémy, želé, gely, pasty a masti, které se také vyrábějí standardními farmaceutickými postupy.

Vynález je blíže objasněn v následujících příkladech provedení. Tyto příklady mají výhradně ilustrativní charakter a rozsah vynálezu v žádném ohledu neomezují.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1 (±)-(2R*,3R*)-(N-Hydroxy)-l-(4-methoxybenzensulfonyl)-3-methyl-l,2,3,6-tetrahydropyridin-2-karboxamid (a) K roztoku (E)-l-amino-3-penten-2-olu (2,0 g, 10,0 mmol) v methylenchloridu (50 ml) se přidá triethylamin (160 μΐ, 11,0 mmol) a poté 4-methoxybenzensulfonylchlorid (2,07 g, 10,0 mmol). Získaná směs se míchá 12 hodin při teplotě místnosti a zředí ethylacetátem. Zředěná směs se promyje vodou, 10% kyselinou citrónovou, vysuší síranem sodným, přefiltruje a zkoncentruje. Surový produkt se přečistí chromatografii na silikagelu za použití směsi ethylacetátu a hexanů v poměru 2:1, jako elučního činidla. Získá se N-(2-hydroxypent-3enyl)-4-methoxybenzensulfonamid.

(b) K roztoku (±)-(E)-N-(2-hydroxypent-3-enyl)-4-methoxybenzensulfonamidu (1,2 g, 4,42 mmol) ve směsi tetrahydrofuranu a dimethylformamidu (10 ml, asi 3 : 1) se při 0 °C přidá natriumbis(trimethylsilyl)amid (4,9 ml, 1,0 M roztok v tetrahydrofuranu). Ke vzniklé směsi se po 10 minutách přidá terc.butylbromacetát (786 ml, 4,83 mmol). Získaná směs se zahřeje na teplotu místnosti, míchá 1 hodinu a rozloží nasyceným roztokem chloridu amonného. Zředěná směs se extrahuje ethylacetátem. Spojené extrakty se vysuší síranem sodným, přefiltrují a zkoncentrují. Surový produkt se přečistí chromatografii na silikagelu za použití směsi ethylacetátu a hexanů v poměru 1 : 1, jako elučního činidla. Získá se terc.butylester [(2-hydroxypent-3-enyl)-(4methoxybenzensulfonyl)amino]octové kyseliny.

(c) K roztoku terc.butylesteru (±)-(E)-(2-hydroxypent-3-enyl)-4-methoxybenzensulfonyl)aminojoctové kyseliny (900 mg, 2,43 mmol) v benzenu (10 ml) se přidá trifluoroctová kyselina (56 μΐ, 0,73 mmol). Získaný roztok se 3 hodiny zahřívá na 80 °C, ochladí na teplotu místnosti a zkoncentruje. Získá se (±)-4-(4-methoxybenzensulfonyl)-6-propenylmorfolin-2-on, kterého se použije bez dalšího přečištění.

(d) K roztoku lithiumbis(trimethylsilyl)amidu (2,67 mmol, 1,0 M v tetrahydrofuranu) v tetrahydrofuranu (5,0 ml) se při -78 °C přidá roztok surového (±)-(E)-4-(4—methoxybenzensulfonyl)-6-propenylmorfolin-2-onu získaného podle předchozího stupně. Ke směsi se po 15 minutách přidá trimethylsilylchlorid (1,53 ml, 12,15 mmol) a získaná směs se zahřeje na teplotu místnosti. Rozpouštědlo se odstraní za sníženého tlaku a nahradí toluenem (10 ml). Získaná směs se 3 hodiny zahřívá na 110 °C, ochladí na teplotu místnosti a smísí s 1 N roztokem kyseliny chlorovodíkové. Získaná směs se míchá 10 minut a extrahuje ethylacetátem. Spojené extrakty se vysuší síranem sodným, přefiltrují a zkoncentrují. Surový produkt se přečistí

-23CZ 287551 B6 chromatografií na silikagelu za použití směsi ethylacetátu a hexanů v poměru 2 : 1 s 1 % kyseliny octové, jako elučního činidla. Získá se (±)-(2R*,3R*)-l-(4-methoxybenzensulfonyl)-3-methyl1,2,3,6-tetrahydropyridin-2-karboxylová kyselina.

(e) K roztoku (±)-(2R*,3R*)-l-(4-methoxybenzensulfonyl)-3-methyl-l,2,3,6-tetrahydropyridin-2-karboxylové kyseliny (100 mg, 0,36 mmol) v dimethylformamidu (5 ml) se přidá hydroxybenztriazol (53 mg, 0,39 mmol) a hydrochlorid l-(3-dimethylaminopropyl)-3ethylkarbodiimidu (75 mg, 0,39 mmol). K získané směsi se po 1 hodině přidá hydrochlorid hydroxylaminu (75 mg, 1,08 mmol) a poté triethylamin (150 μΐ, 1,08 mmol). Získaná směs se míchá přes noc, zředí vodou a extrahuje ethylacetátem. Spojené extrakty se vysuší, přefiltrují a zkoncentrují. Surový produkt se přečistí chromatografií na silikagelu za použití směsi ethylacetátu a hexanů v poměru 2 : 1 s 1 % kyseliny octové, jako elučního činidla. Získá se (±)~ (2R*,3R*)-(N-hydroxy)-l-(4-methoxybenzensulfonyl)-3-methyl-l,2,3,6-tetrahydropyridin2-karboxamid ve formě bílé pevné látky o teplotě tání 173 °C (za rozkladu).

Hmotnostní spektrum (termosprej): m/Z 326 (m-C(0)N(H)0H, 100%, (m, 7%), (m+H, 30%), (m+NHLt, 10%).

*H NMR (CDCh, 250 MHz, ppm): δ 7,72 (d, J = 8,9 Hz, 2H), 7,03 (d, J = 8,9 Hz, 2H), 5,66 (dq, J = 13,0, 2,7 Hz, 1H), 5,45 (dd, 13,0, 1,9 Hz), 4,37 (d, 7,0 Hz, 1H), 4,06 - 3,82 (m, 2H), 3,82 (s, 3H), 3,43 - 3,30 (m, 1H), 2,62 - 2,31 (m, 1H), 0,97 (d, 7,5 Hz, 3H).

Příklad 2

N-Hydroxy-1 -(4-methoxybenzensulfony l)-3-feny 1-1,2,3,6-tetrahydropyridin-2-karboxam id (a) K roztoku terc.butylesteru glycinu (5,0 g, 29,82 mmol) v methylenchloridu (50 ml) se přidá triethylamin (6,65 ml, 62,63 mmol) a poté 4-methoxybenzensulfonylchlorid (29,82 mmol, 6,2 g). Získaný roztok se míchá 24 hodin, zředí vodou a extrahuje ethylacetátem. Spojené extrakty se vysuší síranem sodným, přefiltrují a zkoncentrují. Surový produkt se přečistí chromatografií na silikagelu za použití směsi hexanu a ethylacetátu v poměru 6 : 2, jako elučního činidla. Získá se terc.butylester (4-methoxybenzensulfonylamino)-octové kyseliny.

(b) K roztoku terc.butylesteru (4-methoxybenzensulfonylamino)octové kyseliny (3,0 g, 10 mmol) ve směsi tetrahydrofuranu a dimethylformamidu (ml, asi 3 : 1) se při 0 °C přidá natriumbis(trimethylsilyl)amid (10,0 ml, 1,0 M roztok v tetrahydrofuranu). Po 10 minutách se ke směsi přidá 4-brom-2-methyl-2-buten (1,27 μΐ, 11,0 mmol). Získaná směs se zahřeje na teplotu místnosti, míchá 1 hodinu, rozloží nasyceným roztokem chloridu amonného a extrahuje ethylacetátem. Spojené extrakty se vysuší síranem sodným, přefiltrují a zkoncentrují. Surový produkt se přečistí chromatografií na silikagelu za použití směsi ethylacetátu a hexanů v poměru 1 : 1, jako elučního činidla. Získá se terc.butylester [(4-methoxybenzensulfonyl)-(3-methylbut2-enyl)amino]octové kyseliny.

(c) Směsí terc.butylesteru [(4-methoxybenzensulfonyl)-(3-methylbut-2-enyl)amino]octové kyseliny (2,0 g, 5,4 mmol) ve směsi methylenchloridu a methanolu (50 ml, asi 1 : 1) se při 78 °C vede proud ozonu až do stálého modrého zabarvení. Ke směsi se přidá trifenylfosfín (4,24 g, 16,2 mmol), získaný roztok se míchá 3 hodiny při teplotě místnosti a zkoncentruje. Surový produkt se přečistí chromatografií na silikagelu za použití směsi ethylacetátu a hexanů v poměru 1 : 1, jako elučního činidla. Získá se terc.butylester [(4-methoxybenzensulfonyl)-(2oxoethyl)amino]octové kyseliny.

(d) K suspenzi chloridu chromnatého (1,3 g, 10,49 mmol) v dimethylformamidu (20 ml) se přidá suspenze chloridu nikelnatého (0,026 mmol, 1 mg) v dimethylformamidu (1 ml) a poté směs (trans)~p-jodstyrenu (1,20 g, 5,24 mmol) a terc.butylesteru [(4-methoxybenzensulfonyl)-(2

-24CZ 287551 B6 oxoethyl)amino]octové kyseliny (900 mg, 2,62 mmol) v dimethylformamidu (5 ml). Získaný roztok se míchá 3 hodiny, zředí vodou a extrahuje ethylacetátem. Spojené extrakty se promyjí roztokem chloridu sodného, vysuší síranem sodným, přefiltrují a zkoncentrují. Surový produkt se přečistí chromatografií na silikagelu za použití směsi hexanu a ethylacetátu v poměru 3 : 2, jako elučního činidla. Získá se terc.butylester (±)-(E)-[(2-hydroxy-4-fenylbut-3-enyl)-(4methoxybenzensulfonyl)amino]octové kyseliny.

(e) Terc.butylester (±)-(E)-[(2-hydroxy-4-fenylbut-3-enyl)-(4-methoxybenzensulfonyl)aminojoctové kyseliny se podrobí postupu za podmínek popsaných v příkladu lc. Surový produkt se překrystaluje z chloroformu. Získá se (±)-(E)-4-(4-methoxybenzensulfonyl)-6styrylmorfolin-2-on.

(f) (±)-(E)-4-(4-Methoxybenzensulfonyl)-6-styrylmorfolin-2-on se podrobí postupu za podmínek popsaných v příkladu ld. Surový produkt se přečistí chromatografií na silikagelu za použití směsi hexanu a ethylacetátu v poměru 2 : 1 s 1 % kyseliny octové. Získá se (±)-(2R*,3R*)-l-(4-methoxybenzensulfonyl)-3-fenyl-l,2,3,6-tetrahydropyridin-2-karboxylová kyselina.

(g) (±)~(2R*,3R*)-l-(E-methoxybenzensulfonyl)-3-fenyl-l,2,3,6-tetrahydropyridin-2-karboxylová kyselina se podrobí reakci za podmínek popsaných v příkladu le. Surový produkt se přečistí chromatografií na silikagelu za použití směsi hexanu a ethylacetátu v poměru 1 : 1 s 1 % kyseliny octové, jako elučního činidla. Získá se N-hydroxy-l-(4-methoxybenzensulfonyl)-3fenyl-l,2,3,6-tetrahydropyridin-2-karboxamid ve formě bílé pevné látky o teplotě tání 151 až 154 °C (za rozkladu).

Hmotnostní spektrum [PBMS w/C.I. (NH₃)j: m/Z 388 (M+NH4, 100%).

'H NMR (CD₃OD): δ 7,75 (d, J = 8,5 Hz, 2H), 7,38 - 7,12 (m, 5H), 7,04 (d, J = 8,5 Hz, 2H), 5,91 (d, J = 8,9 Hz, 1H), 5,28 (d, J = 9,9 Hz, 1H), 4,89 (s, H₂O), 4,57 (d, 6,8 Hz, 1H), 4,07 (ABq, JAB = 18,0 Hz, delta v AB = 39,1 Hz, 2H), 3,85 (o, 3H), 3,39 (bs, CD₃OD).

Příklad 3 (±)-(2R*,3R*)-N-Hydroxy-l-(4-methoxybenzensulfonyl)-3-fenylpiperidin-2-karboxamid (a) K roztoku (±)-(2R*,3R*)-l-(4-methoxybenzensulfonyl)-3-fenyl-l,2,3,6-tetrahydropyridin-2-karboxylové kyseliny (65 mg, 0,17 mmol, z příkladu 2) se přidá hydrochlorid benzylhydroxylaminu (32 mg, 0,20 mmol), dicyklohexylkarbodiimid (41 mg, 0,20 mmol) a dimethylaminopyridin (27 mg, 0,22 mmol). Získaná směs se míchá přes noc, zředí ethylacetátem, přefiltruje přes Celíte® a odpaří. Surový produkt se přečisti chromatografií za použití směsi hexanu a ethylacetátu v poměru 1:1, jako elučního činidla. Získá se (±)-(2R*,3R*)-Nbenzyloxy-l-(4-methoxybenzensulfonyl)-3-fenyl-l,2,3,6-tetrahydropyridin-2-karboxamid.

(b) K roztoku (±)-(2R*,3R*)-N-benzyloxy-l-(4-methoxybenzensulfonyl)-3-fenyl-l,2,3,6tetrahydropyridin-2-karboxamidu (35 mg, 0,073 mmol) v ethanolu (5 ml) se přidá 10% palladium na uhlíku (10 mg, 5 mmol). Baňka se evakuuje a znovu naplní vodíkem (tento postup se dvakrát opakuje). Reakční směs se poté 1 hodinu míchá, přefiltruje přes Celíte® a filtrát se zkoncentruje. Shromáždí se produkt, (±)-(2R*,3R*}-N-hydroxy-l-(4-methoxybenzensulfonyl)-3-fenyl-piperidin-2-karboxamid, ve formě bílé pevné látky o teplotě tání 163 °C (za rozkladu).

Hmotnostní spektrum [PBMS w/C.I. (NH₃)]: m/Z 390 (m+H₂, (m+NH₄).

-25CZ 287551 B6 'H NMR (CD3OD): δ 7,73 (d, J = 8,9 Hz, 2H), 7,31 - 7,37 (m, 9H), 7,04 (d, 8,9 Hz, 2H), 4,89 (s, H₂O), 4,34 (d, J = 5,4 Hz, 1H), 3,86 (s, 3H), 3,74 - 3,63 (m, 2H), 3,31 (bs, CD₃OD), 2,99 - 2,90 (m, 1H), 2,58-2,52 (m, 1H), 1,94- 188 (m, 1H), 1,67- 16,0 (m, 2H).

Příklad 4

Hydrochlorid (±)-N-hydroxy-l-(4-methoxybenzensulfonyl)-2-piperazinkarboxamidu (a) K roztoku (±)-4-benzyloxykarbonyl-2-piperazinkarboxylové kyseliny (1,90 g, 7,2 mmol) ve směsi dioxanu a vody (10 ml, asi 1 : 1) se přidá 1 N roztok hydroxidu sodného (15 ml, 15 mmol) a poté 4-methoxybenzensulfonylchlorid. Získaný roztok se míchá 1 hodinu, okyselí 1 N kyselinou chlorovodíkovou a extrahuje ethylacetátem. Spojené extrakty se vysuší síranem sodným, přefiltrují a zkoncentrují. Surový produkt se přečistí chromatografií na silikagelu za použití směsi ethylacetátu a hexanů v poměru 2 : 1 s 1 % kyseliny octové, jako elučního činidla. Získá se (±)-l-(4-methoxybenzensulfonyl)-4-benzyloxykarbonyl-2-piperazinkarboxylová kyselina.

(b) K roztoku (±)-l-(4-methoxybenzensulfonyl)-4-benzyloxykarbonyl-2-piperazinkarboxylové kyseliny (100 mg, 0,23 mmol) v methylenchloridu (5 ml) se přidá hydrochlorid Oterc.butylhydroxylaminu (35 mg, 0,28 mmol), dimethylaminopyridin (37 mg, 0,30 mmol) a dicyklohexylkarbodiimid (57 mg, 0,28 mmol). Získaná směs se míchá přes noc, zředí hexany a vysrážená pevná látka se odfiltruje. Získaný roztok se zkoncentruje a surový produkt se přečistí chromatografií na silikagelu za použití směsi ethylacetátu a hexanů v poměru 2 : 1 s 1 % kyseliny octové, jako elučního činidla. Získá se (±)-N-(terc.butyloxy)-l-(4-methoxybenzensulfonyl)-4benzyloxykarbonyl-2-piperazinkarboxamid.

(c) K roztoku (±)-N-terc.butyloxy)-l-(4-methoxybenzensulfonyl)-4-benzyloxykarbonyl-2piperazinkarboxamidu (68 mg, 0,134 mmol) v methanolu (6 ml) se přidá 10% palladium na uhlí (7 mg). Baňka se evakuuje a znovu naplní vodíkem (tento postup se dvakrát opakuje). Reakční směs se poté míchá 1 hodinu, přefiltruje přes Celíte® a filtrát se zkoncentruje. Získaného produktu, (±)-N-(terc.butyloxy)-l-(4-methoxybenzensulfonyl)-2-piperazinkarboxamidu, se použije dále bez dalšího přečištění.

(d) K roztoku (±)-N-(terc.butyloxy)-l-(4-methoxybenzensulfonyl)-2-piperazinkarboxamidu (30 mg, v dichlormethanu) se přidá ethanol (1 kapka). Získaný roztok se ochladí na -10 °C a nechá se jím 5 minut probublávat plynný chlorovodík. Reakční nádoba se uzavře a směs se míchá 24 hodin, načež se odpařením její objem sníží na 1/3. Vysrážená pevná látka se odfiltruje a vysuší za vakua. Získá se hydrochlorid (±)-N-hydroxy-l-(4-methoxybenzensulfonyl)-2-piperazinkarboxamidu ve formě bílé pevné látky o teplotě tání 167 °C (za rozkladu).

Hmotnostní spektrum (termosprej): m/z 343 (m + 1,100%).

'H NMR (CD3OD, 250 MHz, ppm): δ 7,76 (d, J = 8,9 Hz, 2H), 7,07 (d, J = 8,9 Hz, 2H), 3,87 (bs, H₂O), 4,19 (d, J = 3,3 Hz, 1H), 3,87 (s, 3H), 5,58 (bd, J = 6,2 Hz, 1H), 3,42 (bd, J = 6,1 Hz, 1H), 3,30 (bs, CD3OD), 3,16 (d, J = 13,5 Hz, 1H), 2,87 (bd, J = 13,3 Hz, 1H), 2,69 (dd, J = 13,3, 3,0 Hz, 1H), 2,51 (dt, J = 12,5, 3,8 Hz, 1H).

Příklad 5

N-Hydroxy-l-(4-methoxybenzensulfonyl)-5-oxopiperazin-2-karboxamid (a) K roztoku (±)-benzyloxykarbonylamino-2-terc.butoxykarbonylaminopropionátu (2,8 g, 7,9 mmol) v methylenchloridu (25 ml) se při 0 °C přidá roztok plynného chlorovodíku v dioxanu

-26CZ 287551 B6 (25 ml). Získaný roztok se míchá 4 hodiny při 0 °C a poté zkoncentruje. Surového produktu, hydrochloridu methylesteru 3-benzyloxykarbonylamino-2-aminopropionové kyseliny, se použije bez dalšího přečištění.

(b) Hydrochlorid methylesteru 3-benzyloxykarbonylamino-2-aminopropionové kyseliny se podrobí reakci za podmínek popsaných v příkladu la. Surový produkt se přečistí chromatografií na silikagelu za použití směsi hexanu a ethylacetátu v poměru 1 : 1, jako elučního činidla. Získá se methylester (±)-3-benzyloxykarbonylamino-2-(4-methoxybenzensulfonylamino)propionové kyseliny.

(c) Methylester (±)-3-benzyloxykarbonylamino-2-(4-methoxybenzensulfonylamino)propionové kyseliny se podrobí reakci za podmínek popsaných v příkladu 1. Surový produkt se přečistí chromatografií na silikagelu za použití směsi ethylacetátu a hexanu v poměru 3 : 2, jako elučního činidla. Získá se methylester (±)-3-benzyloxykarbonylamino-2-[terc.-butoxykarbonylmethyl(4-methoxybenzensulfonyl)amino]propionové kyseliny.

(d) Methylester (±)-3-benzyloxykarbonylamino-2-[terc.-butoxykarbonylmethyl-(4-methoxybenzensulfonyl)amino]propionové kyseliny se podrobí reakci za podmínek popsaných v příkladu 4c. Získaného produktu, methylesteru 3-amino-2-[terc.butoxykarbonylmethyl-(4-methoxybenzensulfonyl)amino]-propionové kyseliny, se použije bez dalšího přečištění.

(e) K roztoku methylesteru 3-amino-2-[terc.butoxykarbonylmethyl-(4-methoxybenzensulfonyl)amino]propionové kyseliny (2,46 g, 6,1 mmol) v methylenchloridu (20 ml) se při 0 °C přidá trifluoroctová kyselina (5 ml). Získaný roztok se míchá 12 hodin při 0 °C a poté zkoncentruje. Surového produktu, methylesteru 3-amino-2-[karboxymethyl-(4-methoxybenzensulfonyl)amino]propionové kyseliny ve formě soli s trifluoroctovou kyselinou, se použije bez dalšího přečištění.

(f) K roztoku methylesteru 3-amino-2-[karboxymethyl-(4-methoxybenzensulfonyl)amino]propionové kyseliny ve formě soli s trifluoroctovou kyselinou (2,11 g, 6,1 mmol) v methylenchloridu (5 ml) se přidá hydrochlorid l-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylkarbodiimidu (1,76 g, 9,2 mmol) a triethylamin (3,4 ml, 24,4 mmol). Získaná směs se míchá přes noc, zředí ethylacetátem a promyje 1 N kyselinou chlorovodíkovou. Organická vrstva se vysuší síranem sodným, přefiltruje a zkoncentruje. Surový produkt se přečistí chromatografií na silikagelu za použití ethylacetátu, jako elučního činidla. Získá se methylester l-(4-methoxybenzensulfonyl)5-oxopiperazin-2-karboxylové kyseliny.

(g) K roztoku methylesteru l-(4-methoxybenzensulfonyl)-5-oxopiperazin-2-karboxylové kyseliny (200 mg, 0,61 mmol) ve směsi methanolu, tetrahydrofuranu a vody (5 ml, asi 6 : 2 : 1) se při 0 °C přidá hydroxid lithný (64 mg, 1,53 mmol). Získaná směs se míchá 30 minut, okyselí 1 N kyselinou chlorovodíkovou a extrahuje ethylacetátem. Spojené extrakty se vysuší síranem sodným, přefiltrují a zkoncentrují. Surového produktu, l-(4-methoxybenzensulfonyl)-5oxopiperazin-2-karboxylové kyseliny, se použije bez dalšího přečištění.

(h) K roztoku l-(4-methoxybenzensulfonyl)-5-oxopiperazin-2-karboxylové kyseliny (166 mg, 0,53 mmol) v methylenchloridu (5 ml) se přidá hydrochlorid O-benzylhydroxylaminu (255 mg, 1,6 mmol), hydrochlorid l-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylkarbodiimidu (153 mg, 0,8 mmol) a triethylamin (370 μΐ, 2,65 mmol). Získaná směs se míchá přes noc, zředí ethylacetátem a promyje IN kyselinou chlorovodíkovou. Organická vrstva se vysuší síranem sodným, přefiltruje a zkoncentruje. Surový produkt se přečistí chromatografií na silikagelu za použití 5% methanolu v methylenchloridu, jako elučního činidla. Získá se N-(benzyloxy)-l-(4-methoxybenzensulfonyl)-5-oxopiperazin-2-karboxamid.

-27CZ 287551 B6 (i) N-(benzyloxy)-l-(4-methoxybenzensulfonyl)-5-oxopiperazin-2-karboxamid se podrobí reakci za podmínek popsaných v příkladu 4c, čímž se získá N-hydroxy-l-(4-methoxybenzensulfonyl)-5-oxopiperazin-2-karboxamid ve formě bílé pevné látky.

Hmotnostní spektrum (termosprej): m/Z 343 (M+H, 60%), (m+NH», 17%).

*H NMR (CD₃OD), 250 MHz, ppm: δ 7,79 (d, J = 8,9 Hz, 2H), 4,90 (s, H₂O), 4,47 (dd, J = 5,0, 3,2 Hz, 1H), (4,03, s, 2H), 3,88 (s, 3H), 3,47 (dd, J = 13,4, 3,2 Hz, 1H), 3,35 - 3,30 (m, 1H), 3,30 (s, CD₃OD).

Příklad 6

N-Hydroxy-l-(4-methoxybenzensulfonyl)morfolin-2-karboxamid (a) Morfolin-2-karboxylová kyselina se podrobí reakci za podmínek popsaných v příkladu 4a, čímž se získá l-(4-methoxybenzensulfonyl)morfolin-2-karboxylová kyselina.

(b) l-(4-methoxybenzensulfonyl)morfolin-2-karboxylová kyselina se podrobí reakci za podmínek popsaných v příkladu 5h, čímž se získá N-benzyloxy-l-(4-methoxybenzensulfonyl)morfolin-2-karboxamid.

(c) N-benzyloxy-l-(4-methoxybenzensulfonyl)morfolin-2-karboxamid se podrobí reakci za podmínek popsaných v příkladu 4c, čímž se získá N-hydroxy-l-(4-methoxybenzensulfonyl)morfolin-2-karboxamid ve formě bílé pěny.

Hmotnostní spektrum (termosprej): m/Z 343 (m+H, 100%) [a]_D: +57° (c = 0,60, CHC₃) 'HNMR (CDC1₃), 250 MHz, ppm: δ 7,78 (bd, J= 8,0 Hz, 2H), 7,38 (bs, 1H), 7,01 (bd, J = 8,0 Hz, 2H), 4,34 (bs, J = 2H), 3,87 (s, 3H), 3,85 - 3,30 (m, 3H), 3,30 - 3,15 (m, 2H).

Claims

1. Deriváty arylsulfonylhydroxamové kyseliny obecného vzorce I (I),

-28CZ 287551 B6 kde přerušovaná čára představuje případnou přídavnou vazbu;

X představuje atom uhlíku;

Y představuje atom uhlíku, kyslíku, nebo atom dusíku;

R³, R⁴, R⁵, R⁶, R⁷ a R⁸ nezávisle představuje vždy atom vodíku, alkylskupinu s 1 až 6 atomy uhlíku, popřípadě substituovanou zbytkem zvoleným ze souboru zahrnujícího alkylaminoskupinu s 1 až 6 atomy uhlíku, arylskupinu se 6 až 10 atomy uhlíku, pyridylskupinu, aryloxyskupinu se 6 až 10 atomy uhlíku, pyridyloxyskupinu, acylaminoskupinu s 1 až 6 atomy uhlíku, acyloxyskupinu s 1 až 6 atomy uhlíku, aminoskupinu, alkylaminoskupinu s 1 až 6 atomy uhlíku a dialkylaminoskupinu s 1 až 6 atomy uhlíku v každé z alkylových částí; alkenylskupinu se 2 až 6 atomy uhlíku, aiylalkenylskupinu se 6 až 10 atomy uhlíku v arylové a 2 až 6 atomy uhlíku v alkenylové části, alkinylskupinu se 2 až 6 atomy uhlíku, arylalkinylskupinu se 6 až 10 atomy uhlíku v arylové a 2 až 6 atomy uhlíku v alkinylové části, pyridylalkinylskupinu s 2 až 6 atomy uhlíku v alkinylové části, alkylaminoskupinu s 1 až 6 atomy uhlíku, alkoxyskupinu s 1 až 6 atomy uhlíku, arylskupinu s 6 až 10 atomy uhlíku, aryloxyskupinu se 6 až 10 atomy uhlíku, cykloalkylskupinu se 3 až 6 atomy uhlíku, piperidylskupinu, alkylpiperidylskupinu s 1 až 6 atomy uhlíku v alkylové části, acylaminoskupinu s 1 až 6 atomy uhlíku, acylthioskupinu s 1 až 6 atomy uhlíku, acyloxyskupinu s 1 až 6 atomy uhlíku, skupinu vzorce R¹³alkyl s 1 až 6 atomy uhlíku v alkylové části, kde R¹³ představuje acylpiperazinoskupinu s 1 až 6 atomy uhlíku v acylové části, nebo acylpiperidylskupinu s 1 až 6 atomy uhlíku v acylové skupině nebo skupinu vzorce kde n představuje číslo 0 až 6;

Z představuje hydroxyskupinu, alkoxyskupinu s 1 až 6 atomy uhlíku nebo skupinu obecného vzorce NR^I4R¹⁵, kde R¹⁴ a R¹⁵ představují nezávisle vždy atom vodíku, alkylskupinu s 1 až 6 atomy uhlíku popřípadě substituovanou zbytkem zvoleným ze souboru zahrnujícího alkylpiperidylskupinu s 1 až 6 atomy uhlíku v alkylové části, arylpiperidylskupinu se 6 až 10 atomy uhlíku v aiylové části, arylskupinu se 6 až 10 atomy uhlíku, pyridylskupinu, arylaiylskupinu s 6 až 10 atomy uhlíku v každé z arylových částí a cykloalkylskupinu se 3 až 6 atomy uhlíku; piperidylskupinu, alkylpiperidylskupinu s 1 až 6 atomy uhlíku v alkylové části, arylpiperidylskupinu s 6 až 10 atomy uhlíku v arylové části, acylpiperidylskupinu s 1 až 6 atomy uhlíku v acylové části, arylskupinu se 6 až 10 atomy uhlíku, pyridylskupinu, arylarylskupinu s 6 až 10 atomy uhlíku v každé z arylových částí, cykloalkylskupinu se 3 až 6 atomy uhlíku, skupinu vzorce R^l6alkyl se 2 až 6 atomy uhlíku v alkylové části, alkyl(CHR¹⁶)alkyl s 1 až 6 atomy uhlíku v každé z alkylových částí, kde R¹⁶ představuje hydroxyskupinu, acyloxyskupinu s 1 až 6 atomy uhlíku, alkoxyskupinu s 1 až 6 atomy uhlíku, piperazinoskupinu, acylaminoskupinu s 1 až 6 atomy uhlíku, aminoskupinu, alkylaminoskupinu s 1 až 6 atomy uhlíku, dialkylaminoskupinu s 1 až 6 atomy uhlíku v každé z alkylových částí, acylpiperazinoskupinu s 1 až 6 atomy uhlíku v acylové

-29CZ 287551 B6 části, nebo skupinu CH(R¹⁸)COR¹⁹, kde R¹⁸ představuje vodík, alkylskupinu s 1 až 6 atomy uhlíku, arylalkylskupinu se 6 až 10 v arylové a 1 až 6 atomy uhlíku v alkylové části, hydroxyalkylskupinu s 1 až 6 atomy uhlíku, aminoalkylskupinu s 1 až 6 atomy uhlíku, alky lam inoalkylskupinu s 1 až 6 atomy uhlíku v každé z alkylových částí, bis(alkylamino)alkylskupinu s 1 až 6 atomy uhlíku v každé z alkylových částí, skupinu vzorce R²⁰R²¹NCOalkyl s 1 až 6 atomy uhlíku v alkylové části nebo R²⁰OCOalkyl s 1 až 6 atomy uhlíku v alkylové části, kde R²⁰ a R²¹ představují nezávisle vždy vodík, alkylskupinu s 1 až 6 atomy uhlíku a arylalkylskupinu se 6 až 10 atomy uhlíku v arylové a 1 až 6 atomy uhlíku v alkylové části; a R¹⁹ představuje skupinu vzorce R²²O nebo R²²R²³N, kde R²² a R²³ představuje nezávisle vždy vodík, alkylskupinu s 1 až 6 atomy uhlíku, arylalkylskupinu se 6 až 10 atomy uhlíku v arylové a 1 až 6 atomy uhlíku v alkylové části nebo pyridylalkylskupinu s 1 až 6 atomy uhlíku v alkylové části; nebo

R¹⁴ a R¹⁵ nebo R²⁰ a R²¹ nebo R²² a R²³ dohromady tvoří azetidinylový, pyrrolidinylový nebo morfolinylový zbytek; nebo

R³ a R⁴ nebo R⁵ a R⁶ dohromady tvoří oxoskupinu;

nebo

R³ a R⁴ nebo R⁵ a R⁶ nebo R⁷ a R⁸ dohromady tvoří cykloalkylový kruh se 3 až 6 atomy uhlíku nebo oxacyklohexylový, thiocyklohexylový, indanylový nebo tetralinylový kruh nebo skupinu obecného vzorce kde

přičemž,

R⁷ je odlišný od vodíku pouze v tom případě, když R⁸ je odlišný od vodíku;

R⁶ je odlišný od vodíku pouze v tom případě, když R⁵ je odlišný od vodíku;

R³ je odlišný od vodíku pouze v tom případě, když R⁴ je odlišný od vodíku;

když Y představuje atom kyslíku nebo atom dusíku a když jedna nebo více ze skupin R³, R⁴, R⁷ a R⁸ nezávisle představuje substituent obsahující heteroatom, nemůže být tento heteroatom přímo vázán do polohy 3 nebo 5;

když Y představuje atom dusíku, R⁴ chybí;

když Y představuje atom kyslíku, potom R⁵ a R⁶ chybějí;

-30CZ 287551 B6 když Y představuje atom dusíku, R⁶ chybí;

když R³ a R⁵ nezávisle představuje vždy substituent obsahující heteroatom, pokud přerušovaná čára představuje přídavnou vazbu, potom tento heteroatom nemůže být přímo vázán k X a Y; a když R³, R⁴, R⁵, R⁶, R⁷ a R⁸ představuje vždy atom vodíku nebo alkylskupinu s 1 až 6 atomy uhlíku, potom buď Y představuje atom kyslíku, nebo atom dusíku, nebo přerušovaná čára představuje přídavnou vazbu;

a jejich farmaceuticky vhodné soli.

2. Deriváty arylsulfonylhydroxamové kyseliny podle nároku 1 obecného vzorce I a jejich farmaceuticky vhodné soli, kde Y představuje kyslík nebo dusík.

3. Deriváty arylsulfonylhydroxamové kyseliny podle nároku 1 obecného vzorce I a jejich farmaceuticky vhodné soli, kde Ar představuje 4-methoxyfenylskupinu nebo 4-fenoxyfenylskupinu.

4. Deriváty arylsulfonylhydroxamové kyseliny podle nároku 1 obecného vzorce I a jejich farmaceuticky vhodné soli, kde R⁸ představuje arylskupinu se 6 až 10 atomy uhlíku, pyridylskupinu, arylalkylskupinu se 6 až 10 atomy uhlíku v arylové a 1 až 6 atomy uhlíku v alkylové části, pyridylalkylskupinu s 1 až 6 atomy uhlíku v alkylové části, karboxyskupinu nebo skupinu karboxyalkylskupinu s 1 až 6 atomy uhlíku v alkylové části.

5. Deriváty arylsulfonylhydroxamové kyseliny podle nároku 1 obecného vzorce I a jejich farmaceuticky vhodné soli, kde R³, R⁶, R⁷ a R⁹ představují atomy vodíku.

6. Deriváty arylsulfonylhydroxamové kyseliny podle nároku 1 obecného vzorce I a jejich farmaceuticky vhodné soli, kde Y představuje uhlík, Ar představuje 4-methoxyfenylskupinu nebo 4-fenoxyfenylskupinu a R⁸ představuje arylakinylskupinu se 6 až 10 atomy uhlíku v arylové části nebo pyridylalkinylskupinu se 2 až 6 atomy uhlíku v alkinylové části.

7. Deriváty arylsulfonylhydroxamové kyseliny podle nároku 1 obecného vzorce I a jejich farmaceuticky vhodné soli, kde Y představuje kyslík, Ar představuje 4-methoxyfenylskupinu nebo 4-fenoxyfenylskupinu a R⁸ představuje arylakinylskupinu se 6 až 10 atomy uhlíku v arylové části nebo pyridylalkinylskupinu se 2 až 6 atomy uhlíku v alkinylové části.

8. Deriváty arylsulfonylhydroxamové kyseliny podle nároku 1 obecného vzorce I a jejich farmaceuticky vhodné soli, kde Y představuje uhlík, Ar představuje 4-methoxyfenylskupinu nebo 4-fenoxyfenylskupinu a R⁸ představuje karboxyskupinu nebo karboxyalkylskupinu s 1 až 6 atomy uhlíku v alkylové části.

9. Deriváty arylsulfonylhydroxamové kyseliny podle nároku 1 obecného vzorce I a jejich farmaceuticky vhodné soli, kde Y představuje kyslík, Ar představuje 4-methoxyfenylskupinu nebo 4-fenoxyfenylskupinu a R⁸ představuje karboxyskupinu nebo karboxyalkylskupinu s 1 až 6 atomy uhlíku v alkylové části.

10. Deriváty arylsulfonylhydroxamové kyseliny podle nároku 1 obecného vzorce I a jejich farmaceuticky vhodné soli, kde Y představuje uhlík, Ar představuje 4-methoxyfenylskupinu nebo 4-fenoxyfenylskupinu a R⁵ představuje arylakinylskupinu se 6 až 10 atomy uhlíku v arylové části nebo pyridylalkinylskupinu se 2 až 6 atomy uhlíku v alkinylové části.

-31CZ 287551 B6

11. Deriváty arylsulfonylhydroxamové kyseliny podle nároku 1 obecného vzorce I a jejich farmaceuticky vhodné soli, kde Y představuje kyslík, Ar představuje 4-methoxyfenylskupinu nebo 4-fenoxyfenylskupinu a R⁵ představuje arylakinylskupinu se 6 až 10 atomy uhlíku v arylové části nebo pyridylalkinylskupinu se 2 až 6 atomy uhlíku v alkinylové části.

12. Deriváty arylsulfonylhydroxamové kyseliny podle nároku 1 obecného vzorce I a jejich farmaceuticky vhodné soli, kde Y představuje uhlík, Ar představuje 4-methoxyfenylskupinu nebo 4-fenoxyfenylskupinu a R⁵ představuje karboxyskupinu nebo karboxyalkylskupinu s 1 až 6 atomy uhlíku v alkylové části.

13. Deriváty arylsulfonylhydroxamové kyseliny podle nároku 1 obecného vzorce I a jejich farmaceuticky vhodné soli, kde Y představuje kyslík, Ar představuje 4-methoxyfenylskupinu nebo 4-fenoxyfenylskupinu a R⁵ představuje karboxyskupinu nebo karboxyalkylskupinu s 1 až 6 atomy uhlíku v alkylové části.

14. Deriváty arylsulfonylhydroxamové kyseliny podle nároku 1 obecného vzorce I a jejich farmaceuticky vhodné soli, kde Y představuje uhlík, Ar představuje 4-methoxyfenylskupinu nebo 4-fenoxyfenylskupinu a R⁵ představuje alkylaminoskupinu s 1 až 6 atomy uhlíku.

15. Deriváty arylsulfonylhydroxamové kyseliny podle nároku 1 obecného vzorce I a jejich farmaceuticky vhodné soli, kde Y představuje kyslík, Ar představuje 4-methoxyfenylskupinu nebo 4-fenoxyfenylskupinu a R⁸ představuje alkylaminoskupinu s 1 až 6 atomy uhlíku.

16. Deriváty arylsulfonylhydroxamové kyseliny podle nároku 1, zvolené ze souboru zahrnujícího (2S,3R)-N-hydroxy-2-hydroxykarbamoyl-4-(4-methoxybenzensulfonyl)morfolin-3karboxamid a (2R,3R)-N-hydroxy-2-hydroxykarbamoyl—4-(4-methoxybenzensulfonyl)piperidin-2karboxamid.

17. Farmaceutický prostředek pro léčbu choroby zvolené ze souboru zahrnujícího artritis, rakovinu, ulcerace tkání, restenosu, periodontální chorobu, epidermolysis bullosa, scleritis a jiné choroby charakterizované aktivitou matriční metalloproteinázy, jakož i AIDS, sepsi, septický šok a jiné choroby zahrnující produkci faktoru nekrózy nádorů (TNF) nebo pro inhibici matričních metalloproteináz nebo produkce faktoru nekrózy nádorů (TNF) u savců, včetně člověka, vyznačující se tím, že obsahuje derivát arylsulfonylhydroxamové kyseliny obecného vzorce I nebo jeho farmaceuticky vhodnou sůl podle nároku 1 v množství, které je účinné pro takovou léčbu nebo inhibici a farmaceuticky vhodný nosič.

18. Deriváty arylsulfonylhydroxamové kyseliny obecného vzorce I nebo jejich farmaceuticky vhodné soli podle nároku 1 pro použití pro inhibici a) matričních metalloproteináz nebo b) produkce faktoru nekrózy nádorů (TNF) u savců, včetně člověka.

19. Deriváty arylsulfonylhydroxamové kyseliny obecného vzorce I nebo jejich farmaceuticky vhodné soli podle nároku 1 pro použití pro léčbu choroby zvolené ze souboru zahrnujícího artritis, rakovinu, ulcerace tkání, restenosu, periodontální chorobu, epidermolysis bullosa, scleritis a jiné choroby charakterizované aktivitou matriční metalloproteinázy, jakož i AIDS, sepsi, septický šok a jiné choroby zahrnující produkci faktoru nekrózy nádorů (TNF) u savců, včetně člověka.