PT979246E - Anticorpos monoclonais humanos contra o receptor do factor de crescimento epidérmico - Google Patents

Description

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ANTICORPOS MONOCLONAIS HUMANOS CONTRA 0 RECEPTOR DO FACTOR DE

CRESCIMENTO EPIDÉRMICO SNTECTONTgS m INVBNÇ&P I. Sumário da Invenção

De acordo com a presente invenção, são proporcionadas sequências de cadeias pesadas e leves contíguas totalmente humanas, abrangendo as regiões determinantes de complementaridade de anticorpos monoclonais contra o receptor do factor de crescimento epidérmico humano (EGF-r). São proporcionadas sequências nucleotídicas codificando e sequências de aminoácidos compreendendo moléculas de imunoglobulina de cadeias pesadas e leves, particularmente sequências correspondentes a (CDR), especificamente desde CDR1 até CDR3. São igualmente proporcionados hibridomas expressando tais moléculas de imunoglobulina e anticorpos rncnoclonais. pescoço, ovário e próstata. Modjtahedi e Dean Int'1 J, Qncology 4:277-296 « Demonstrou-se que tanto o factor de crescimento epidérmico (EGF) como o factor de crescimento transformador alfa se ligam ao EGF-r e conduzem a proliferação celular e crescimento tumoral.

Deste modo, determinados grupos propuseram que os anticorpos contra EGF, TGF-α e EGF-r podem ser úteis na terapia de tumores expressando ou sobre-expressando o EGF-r. Mendelsohn Câncer Cells 7:359 (1989), Mendelsohn Câncer Biology 1:339-344 (1990), Modjtahedi e Dean Int'l J. Oncology 4:277-296 (1994), Tosi et ai, Int'l J. Câncer 62:643-650 (1995). De facto, demonstrou-se que os anticorpos anti-EGF-r ao bloquearem a ligação de EGF e TGF-a ao receptor parecem inibir a proliferação celular tumoral. Simultaneamente, contudo, parece que os anticorpos anti-EGF-r não inibiram o crescimento celular independente de EGF e TGF-a. Modjtahedi e Dean Int'l j. Oncology 4:277-296 (1994) .

Em consideração destas conclusões, um combinação de anticorpcs monoclonais de murino e de rato contra EGF-r foram desenvolvidos e testados no que respeita a sua kapacidade para inibir o crescimento de células tumorais in vitro e in vivo.

Modjtahedi e Dean Int'l J. Oncology 4:277-296 (1994). O anticorpo que presumivelmente mais avançou clinicamente e um anticorpo quimérico, designado C225, que possui uma região variável murina e uma região constante IgGl humana. Modjtahedi e Dean Int'l . Oncology 4:277-296 (1994). O anticorpo murino, designado 225, sobre o qual se baseia c anticorpo C225, foi desenvolvido pela Universidade da Califórnia e Rorer. Ver Patente U.S. N° 4943533 e Patente Europeia N° 359282. Demonstrou-se que o anticorpo C225 inibe o crescimento celular mediado por EGF in Mtrc e inibe a formação de tumor humano ín vivo soo murganhos nude. Além disso, o anticorpo parecia agir em sinergia com determinados agentes quimioterapêuticos para erradicar tumores humanos in vivo em modelos de murganho aloenxertados. Modjtahedi e Dean lnt'l J. tttuoiopy 4:277-296 (1994). A ImClone tem conduzido ensaios clínicos humanos utilizando o anticorpo anti-EGF-r designado C225. Os ensaios clínicos ae Fase I e Fase 1/11 em doentes com carcinomas da cabeça e pescoço, próstata e pulmão foram presumivelmente, ou estão a ser actualmente, conduzidos com o C225. Nos ensaios clínicos de Fase I, não foi detectada toxicidade com múltiplas injecções e com doses de até, talvez, 400 ma./rn2, mesmo nos casos envolvendo doentes imunoccmprometidos. Tais estudos foram conduzidos como estudos de escalonamento de dose compreendendo 5 doses de desde cerca de 5 a cerca de 200 mg/m2 e foram realizados em combinação com quimioterapia (i. e., doxorubicina, adriamicina, taxol e cisplatina). Além dos aparentes dados de segurança que foram produzidos nestes estudos, os resultados preliminares dos estudos parecem indicar alguns indícios de retracção tumoral em 80% de doentes possuindo cancro da próstata.

Contudo, cada um destes anticorpos mencionadcs anteriormente possui regiões variáveis e/ou constantes de murino ou rato. A presença de tais proteínas derivadas de murino ou rato pode conduzir a eliminação rápida dos anticorpos ou pode conduzir a produção de uma resposta imune contra o anticorpo por ura doente. h fim de evitar a utilização de anticorpos derivados de murino ou rato, foi postulado que se poderia introduzir a função de anticorpo humano num roedor, de modo que o roedor produziria anticorpos totalmente humanos. A kapacidade para clonar e reconstruir loci humanos de megabases de tamanho em YAC e para os introduzir na linha germinal do nurganhc, proporciona uma poderosa abordagem na . dos componentes funcionais de loci muito grandes ou grosseiramente mapeados, bem como na produção de modelos úteis de doença humana. Além disso, a utilização de tal tecnologia para substituição de loci de murganho pelos seus equivalentes humanos poderia proporcionar conhecimentos únicos da expressão e regulação de produtos génicos humanos durante c desenvolvimento, sua comunicação com outros sistemas e o seu envolvimento na indução e progressão da doença.

Uma aplicação pratica importante dessa estratégia consiste na "humanização" do sistema imunitário humoral do murganho. A introdução de loci de imunoglobulina humana (Ig) em murganhos, em que os genes de Ig endógenos foram inactivados, oferece a oportunidade para estudar os mecanismos subjacentes a expressão e montagem programada de anticorpos, bem como o seu papel no desenvolvimento de células B. Além disso, uma estratégia poderia proporcionar uma fonte ideal de produção de anticorpos monoclonais totalmente humanos (Mab) - um importante marco com vista ao cumprimento da promessa da terapia de anticcrpos na doença humana. Espera-se que os anticorpos totalmente humanos minimizem as respostas imunoçenicas e alérgicas intrínsecas aos Mab de murganho ou derivados de murganho e, deste modo, aumentem a eficácia e segurança dos anticorpos administrados. Pode esperar-se que a utilização de anticorpos totalmente humanos proporcione uma vantagem substancial ao tratamento de doenças humanas crónicas e recorrentes, tais como inflamação, ií.ístb-iiÁiihiéèd·® e cancro, que requerem administrações repetidas de anticorpos.

Uma abordagem com vista a esta meta consistiu em manipular estirpes de murganhos deficientes na produção de anticorpos de murganho com fragmentos de grandes dimensões dos locí Ig humanos, prevendo que tais murganhos produziriam um vasto repertório de anticorpos humanos na ausência de anticorpos de murganho. Os fragmentos de Ig humano de grandes dimensões conservariam a vasta diversidade génica variável, bem como a correcta regulação da produção e expressão de anticorpos. Pela exploração da maquinaria do murganho em termos de diversificação e selecção de anticorpos e a ausência de tolerância imunológica a proteínas humanas, o repertório de anticorpos humanos reproduzido nestas estirpes de murganhos deveria produzir anticorpos de elevada afinidade contra qualquer antigénio de interesse, incluindo antigknios humanos. Utilizando a tecnologia de hibridoma, poderiam ser facilmente produzidos e seleccionados Mab humanos específicos de antigénio com a especificidade desejada.

Esta estratégia geral foi demonstrada com respeito à nossa geração das primeiras estirpes XenoMouse™ como publicado em 1994. Ver Green et ai. Nature Genetics 7:13-21 (1994). As adulto estirpes XenoMouse™ foram manipuladas com cromossomas artificiais de levedura (YAC) contendo fragmentos de configuração da linha germinal de 245 kb e 190 kb de tamanho do lócus da cadeia pesada humana e lócus da cadeia leve kapa, respectivamente, que continham sequências das regiões variáveis e constantes do núcleo. Id. A Ig humana contendo YAC provou ser com o sistema de murganho tanto para o rearranjc como para a expressão de anticorpos e foi. kapaz de substituir cs genes de Ig de murganho inactivados. O que foi demonstrado pela sua kapacidade para induzir o desenvolvimento de células E, para produzir um repertório humano de tipo adulto de anticorpos totalmente humanos e produzir Mab humanos específicos o® antigénio. Estes resultados sugeriram igualmente que a introdução de partes maiores dos locí de Ig humana contendo um maior número de genes V, elementos reguladores adicionais e regiões constantes de Ig humana, podia recapitular substancialmente o repertório completo que ê característico da resposta humoral humana a infecção e imunização. 0 trabalho de Green et ai. foi recentemente alargado a introdução de aproximadamente mais de 80% do repertório de anticorpos humanos através da introdução de fragmentos de configuração da linha germinal de YAC de megabases de tamanho dos loci das cadeias pesadas humanas e lóúí das cadeias leves kapa, respectivamente. Ver Mendez et al. Nature Genetícs 15:146-156 (1997) e documento WO-A-98/24853, reivindicando a prioridade de 3 de Dezembro de 1996.

Nestas publicações, anticorpos totalmente humanos específicos contra EGF-r, designados 1 . 1 E.2.5, E.2.11 e E.2.4, que são referidos nos presentes exemplos, são caracterizados e discutidos pormenorizadamente.

Tal abordagem é ainda discutida e delineada em Mendez et al. Nature Genetícs 15:146-156 (1997), Patente Europeia N° EP 0463151 Bl, concessão publicada a 12 de Junho de 1996, Pedido de Patente Internacional N° WO 94/02602, publicado a 3 de Fevereiro de 1394, Pedido de Patente Internacional N° WO 96/34096, publicado a 31 de Outubro de 1996, e Pedido PCT N° -K!?3S apresentado a 29 de Abril de 1996.

Numa abordagem alternativa, outros, incluindo a GenPharm International, Inc.., utilizaram uma abordagem, "mínilccas". Na abordagem mínílócus, um lócus de Ig exógeno I mímetizado através da IdPlyi&âft de partes (genes individuais) do lócus de Ig. Deste modo, Um ou mais genes ytf um ou ~ a i sjenes )¾ ou mais genes JH, uma região mu constante e urra segunda região constante (de um modo preferido uma região gama constante) são dispostos numa construção para inserção num animal. Esta abordagem é descrita na Patente U.S. N° 5545807 para Surani et ai. e Patentes U.S. N° 5545806 e 5625825, ambas para Lonberg e Kay. Ver Igualmente os Pedidos de Patente Internacional N° WO 94/25585, publicado a 10 de Novembro de 1994, WO 93/12227, publicado a 24 de Junho de 1993, WO 92/22645, publicado a 23 de Dezembro de 1992, WO 92/03918, publicado a 19 de Marco de 1992. Ver ainda Taylor et al., 1992, Chen et al., 1993, Tuaillon et al., 1993, Choi et al., 1993, Lonberg et al., (1994), Taylor et al., (1994) e Tuaillon et al., (1995).

Os inventores de Surani et al., citados anteriormente e atribuídos ao Medicai Research Counsel (o "MRC") produziram um murganho transgenico possuindo um lócus de Ig através da utilização da abordagem minilócus. Os inventores do trabalho da GenPharm International, citado anteriormente, Lonberg e Kay, seguindo o exemplo dos presentes requerentes, propuseram a inactivacão do lócus de Ig endógeno de murganho conjugada com duplicação substancial do trabalho de Surani et al.

Uma vantagem da abordagem minilócus consiste na rapidez com que as construções que incluem partes do lócus de Ig podem ser produzidas e introduzidas em animais. Proporcionadamente, contudo, uma desvantagem significativa da abordagem minilócus é e em teoria, é introduzida insuficiente diversidade através da inclusão do um pequeno número de genes V, D e J. De facto, o trabalho publicado parece apoiar esta questão. O desenvolvimento de cCldtM B e a produção de anticorpos de animais produzidos através da utilização da abordagem minilócus parecem definhar. Por ctctssstitt®* a investigação gue envolve a presente invenção foi consistentemente dirigida para a introdução ide partes de grandes dimensões do lócus de Ig, a fim de alcançar maior diversidade e num esforço de reconstituição do repertório imunitário dos animais.

As respostas de anticorpos humanos anti-murganho (HAMA) levaram a indústria a preparar anticorpos guiméricos ou humanizados de maneira diferente. Embora o anticorpo C225 seja um antieorpo quimérico, tendo uma região constante humana e uma região variável murina, espera-se que determinadas respostas de anticorpos humanos anti-quiméricos (HACA) sejam observadas, particularmente em utilizações crónicas ou multi-dose do anticorpo.

Deste modo, seria desejável proporcionar anticorpos totalmente humanos contra EGF-r que possuíssem actividades semelhantes ou melhoradas em comparação a C225, a fim de invalidar as questões e/ou efeitos da resposta HAMA ou HACA.

BREVE DISCRIÇÃO DAS FIGURAS DESENHADAS A Figura 1 é uma sequência de arninoácidos de uma molécula de imunoglobuiina de cadeia pesada que é segregada pelo híbrídoma Ei.l. As diferenças entre a sequência codificada pelo gene variável de cadeia pesada 4-31 e pela sequência da cadeia pesada segregada · El.l esiâo indicadas em negrito e letra aumentada. A Mitiá contíguo desde CDRl até CDR3 está indicada por sublinhado e cada uma das sequências CDR1, CDRS e CDR3 está indicada por sublinhado duplo. A Figura 2 é uma sequência nucleotídica do ADNc codificando a molécula de jpuhoglokud.Í.o:·; de cadeia pesada da Figura i que foi clonada a partir do hibridoma El.i. A Figura 3 é uma sequência de aminoácidos de uma molécula de imunoglobulina de cadeia leve kapa que é segregada pelo hibridoma El.l. As diferenças entre a sequência codificada pelo gene variável de cadeia leve 013 e pela sequência da cadeia leve segregada por El.l estão indicadas em negrito e letra aumentada. A sequência contígua desde CDR1 até CDR3 está indicada por sublinhado e cada uma das sequências CDR1, CDR2 e CDR3 está indicada por sublinhado duplo. A Figura 4 e uma sequência nucleotídica do ADNc codificando a molécula de imunoglobulina de cadeia leve kapa da Figura 3 que foi clonada a partir do hibridoma El.l. A Figura 5 é uma sequência de aminoácidos de uma molécula de imunoglobulina de cadeia pesada que é segregada pelo hibridoma E2.4. As diferenças entre a sequência codificada gene variável de cadeia pesada 4-31 e pela sequência da cadeia pesada segregada por E2.4 indicadas em negrito e Letra aumentada. A sequência contígua desde CDR1 até CDRS está indicada por sublinhado e cada a das sequências CDRl, CDR2 e CDR3 está indicada por sublinhado duplo. A Figura 6 é uma sequência nucleotídica do ADNc codificando a molécula de imunoglobulina de cadeia pesada da Figura 5 que foi cionada a partir do hibridoma E2.4. A Figura 7 d uma sequência de aminoácidos de uma molécula de imunoglobulina de cadeia leve kapa que e segregada pelo hibridoma E2.4. As diferenças entre a sequência codificada pelo gene variável de cadeia leve 018 e pela sequência da cadeia leve segregada por E2.4 sstvlf; indicadas em negrito e letra aumentada. A sequência contígua desde CDR1 até CDR3 está indicada por sublinhado e cada uma das sequências CDRl, CDR2 e CDR3 está indicada por sublinhado duplo. A Figura 8 é uma sequência nucleotídica do ADNc codificando a molécula de imunoglobulina de cadeia leve kapa da Figura 7 que foi cionada a partir do hibridoma E2.4. A Figura 9 é uma sequência de aminoácidos de uma molécula de imunoglobulina de cadeia pesada que é segregada pelo hibridoma E2.5. As diferenças entre a sequência codificada pelo gene variável de cadeia pesada 4-31 e pela sequência da cadeia pesada segregada por E2.5 estão indicadas em negrito e letra aumentada. A sequência contígua desde CDRl até CDR3 esta indicada por sublinhado e cada uma das sequências CDRl, CDR2 e CDR3 está indicada por sublinhado duplo. A Figura 10 é uma sequência núcleoLídica áo ADMm codificando a de imunoglobulina de cadeia pèbadvi da Figura 9 que foi cionada a partir dm bfb-rKkAA E2.5. A Figura 1 i i una sequência de arninoácidos de uma :soiécssIa de imunoglobulina de cadeia leve kapa que é segregada pelo hibridoma E2.5. As diferenças entre a sequência codificada pelo gene variável de cadeia leve 01S e pela sequência da cadeia leve segregada por E2.5 estão indicadas mi cegrito e letra aumentada. A sequência contígua desde CDR1 até CDR3 está .indicada por sublinhado e cada uma das sequências CDRÍ, CDR2 e CDR3 esta indicada por sublinhado auplo. A Figura 12 é uma sequência nucleotídica do ADNc codificando a molécula de imunoglcbulina de cadeia leve kapa da Figura 11 que foi clonada a partir do hibridoma E2.5. A Figura 13 é uma sequência de arninoácidos de uma molécula de imunoglobulina de cadeia pesada que é segregada pelo hibridoma E6.2. As diferenças entre a sequência codificada pelo gene variável de cadeia pesada 4-31 e pela sequência da cadeia pesada segregada por E6.2 estão indicadas em negrito e letra aumentada. A sequência contígua desde CDR1 até CDR3 está indicada por sublinhado e cada uma das sequências CDR1, CDR2 e CDR3 está indicada por sublinhado duplo. A Figura 14 é uma sequência nucleotídica dc ADNc codificando a molécula de imunoglobulina de cadeia pesada da Figura 13 que foi clonada a partir do hibridcma E6.2. h Figura i5 é uma sequência de arninoácidos de uma baléeaiá de imunoglobulina de cadeia leve kapa que é segregada pelo hibridcma E6.2. As diferenças entre a sequência codificada pelo gene variável de cadeia leve Cl8 e pela sequência da cadeia leve segregada por E6.2 estão indicadas em negrito e letra aumentada. A contígua desde CDR1 até CDR3 está indicada por SaidLlidiidc e cada uma das sequências CDRi, CDR2 e CDR3 esta indicada per sublinhado duplo. A Figura lo é uma sequência nucleotídíca do ADNc codificando a molécula de imunoglobulina de cadeia leve kapa da Figura 15 que foi clonada a partir do hibridoma E6.2. A Figura 17 é uma sequência de aminoácidos de uma molécula de imunoglobulina de cadeia pesada que é segregada pelo hibridoma E6.4. As diferenças entre a sequência codificada pelo gene variável de cadeia pesada 4-31 e pela sequência da cadeia pesada segregada por E6.4 estão indicadas em negrito e letra aumentada. A sequência contígua desde CDRI até CDR3 está indicada por sublinhado e cada uma das sequências CDRI, CDR2 e CDR3 está indicada por sublinhado duplo. A Figura 18 é uma sequência nucleotídíca do ADNc codificando a molécula de imunoglebulina de cadeia pesada da Figura 17 que foi clonada a partir do hibridoma E6.2. A Figura 19 é uma sequência de aminoácidos de uma molécula de imunoglobulina de cadeia Leve kapa que é segregada pelo hibridoma E6.4. As diferenças entre a sequência codificada pelo gene varíiilil de cadeia leve 018 e pela bs cadeia leve segregada por Z6.4 avião indicadas em negrito e letra aumentada. A sequência desde CDRI até CDR3 tító indicada por sublinhado e cada asis das sequências CDRI, CDR2 e CDR3 está indicada por sublinhado duplo. A Figura 20 é uma sequência nucleotídíca do ADNc codificando a molécula de imuncglobulina de cadeia leve kapa da Figura 19 que foi olooedu a partir do hibridoma L 6.4 . A Figura 2 1 é uma sequência de aminoácidos de uma molécula de imunoglcbulina de cadeia pesada que é segregada pelo hibridoma E2.ll. As diferenças entre a sequência codificada pelo gene variável de cadeia pesada 4-61 e pela sequência da cadeia pesada segregada por E2.ll estão indicadas em negrito e letra aumentada. A sequência contígua desde CDR1 até CDR3 está indicada por sublinhado e cada uma das sequências O&R!# CDR2 e CDR3 está indicada per sublinhado duplo. A Figura 22 é uma sequência nucleotídíca do ADNc codificando a molécula de imunoglobulina de cadeia pesada da Figura 21 que foi clonada a partir do hibridoma E2.ll. A Figura 2 3 é uma sequência de aminoácidos de uma molécula de imunoglobulina de cadeia leve kapa que é segregada pelo hibridoma E2.ll. As diferenças entre a sequência codificada pelo gene variável de cadeia leve 018 e pela sequência da cadeia leve segregada por L2.ll estão indicadas em negrito e letra aumentada. A sequência contígua desde CDRl até CDR3 está indicada por sublinhado e cada uma das sequências ς&$·.ι CDR2 e CDR3 está indicada por sublinhado duplo. A Figura 24 é uma sequência nucleotídíca do ADNc de imunoglobulina de cadeia leve codificando a molécula kapa da 23 que foi clonada a partir do hibridoma E2.1 1. A Figura 25 é uma sequência de aminoácidos de uma molécula de imunoglobulna de cadeia pesada que é segregada pelo hibridoma E6.3. As diferenças entre a sequência codificada pelo gene variável de cadeia pesada 4-61 e pela sequência da cadeia pesada segregada por E6.3 estão indicadas em negrito e letra aumentada. A sequência contígua desde CDR1 até CDR3 esta indicada por sublinhado e cada uma das sequências CDR1, CDR2 e CDR3 está indicada por sublinhado duplo. A Figura 26 é uma sequência nucleotídica do ADNc codificando a molécula de imunoglobulina de cadeia pesada da Figura 25 que foi clonada a partir do hibridoma E6.3. A Figura 27 é uma sequência de aminoácidos de uma molécula de imunoglobulina de cadeia leve kapa que é segregada pelo hibridoma E6.3. As diferenças entre a sequência codificada pelo gene variável de cadeia leve 018 e pela sequência da cadeia leve seqregada por E6.3 estão indicadas em negrito e letra aumentada. A sequência contígua desde CDR1 até CDR3 está indicada por sublinhado e cada uma aas sequências CDRl, CDR2 e CDR? está indicada por sublinhado duplo. & Figura 26 é uma sequência nucleotídica do ADNc codificando a molécula de imunoglobulina de cadeia leve kapa da Figura 27 que foi clonada a partir do hibridoma E6.3. A Figura 29 é uma sequência de aminoácidos de «w molécula de imunoglobulina de cadeia pesada que é segregada pela hibridoma E7.6.3. As diferenças entre a sequência codificada pelo gene de cadeia pesada 4-61 e pela sequência da cadeia pesada segregada por E7.6.3 estão indicadas em negrito e letra aumentada. A sequência contígua desde CDR1 ate CDR3 está indicada por sublinhado e cada uma das sequências CDR1, CDR2 e C3R3 está indicada per sublinhado duplo. A Figura 30 é uma sequência nucleotídica do ADNc codificando a molécula de imunoglobulina de cadeia pesada da Figura 29 que foi clonada a partir do hibridoma E7.6.3. A Figura 31 é uma sequência de aminoácidos de uma molécula de imunoglobulina de cadeia leve kapa que è segregada pelo hibridoma E7.6.3. As diferenças entre a sequência codificada pelo gene variável de cadeia leve 018 e pela sequência da cadeia leve segregada por E7.6.3 estão indicadas em negrito e letra aumentada. A sequência contígua desde CDR1 até CDR3 está indicada por sublinhado e cada uma das sequências CDR1, CDR2 e CDR3 está indicada por sublinhado duplo. A Figura 32 à uma sequência nucleotídica do ADNc codificando a molécula de imunoglobulina de cadeia leve kapa da Figura 31 que foi clonada a partir do hibridoma E7.6.3. A rigur* 3 proporciona uma comparação de comparações da sequência de aminoácidos da cadeia pesada do Md;ibcfPb especifico de anti-EGF-r com a sequência de aminoácidos do gene particular V, que codifica a cadeia pesada do anticorpo particular. A Figura 34 proporciona uma comparação de comparações da sequência de aminoácidos da cadeia leve do anticorpo especifico de anti-EGF-r com a sequência de aminoácidos do gene particular Vk que codifica a cadeia leve dc anticorpo particular. A Figura 35 apresenta o bloqueio da ligação de EGF a células do carcinoma epidermóide humano A431 por anticorpos humanos anti-EGF-r in vitro, onde (□) representa os resultados alcançados por um anticorpo anti-EGF-r de acordo com a invenção, representa os resultados alcançados pelo anticorpo monoclonal murino 225 e (▲) representa os resultados alcançados por um anticorpo IgG2 humano de controlo, não específico. A Figura 36 apresenta a inibição da ligação de EGF a células do carcinoma epidermóide humano A431 por anticorpos humanos anti-EGF-r in vitro, onde (□) representa os resultados alcançados pelo anticorpo monoclonal murino 225, (0) representa os resultados alcançados pelo anticorpo monoclonal murino 528, (?) representa os resultados alcançados utilizando o anticorpo El.l de acordo com o invenção, (A) representa os resultados alcançados utilizando o anticorpo E2.4 de acordo com a invenção, (►) representa os resultados alcançados utilizando o anticorpo E2.5 de acorde com a invenção, Hii representa os resultados alcançados utilizando o anticorpo EL.6 de acordo com a invenção, (♦) representa os resultados e utilizando o anticorpo E2.ll de acordo com a representa os resultados alcançados utilizando um anticorpo IgG2 humano de controlo, não especifico. A Figura 37 apresenta a inibição da ligação de TGF-ríx a células do carcinoma epidermóide humano A431 por anticorpos humanos anti-EGF-r in vitro, onde i;OS representa os resultados alcançados pelo anticorpo monoclonal murino 225, (♦) representa os resultados alcançados utilizando o anticorpo E6.2 de acordo com a invenção, (·) representa os resultados alcançados utilizando o anticorpo E6.3 de acordo com a invenção, (A) representa os resultados alcançados utilizando c anticorpo E7.1 de acordo com a invenção, () representa os resultados alcançados utilizando o anticorpo E7.10 de acordo com a invenção, (T) representa os resultados alcançados utilizando ο E7.6.3 e (®) representa os resultados alcançados utilizando um anticorpo IgG2 humano de controlo, não especifico. A Figura 38 apresenta a inibição da ligação de EGF a células do carcinoma do cólon humano SW948 por anticorpos humanos anti-EGF-r in vitro, onde (·) representa os resultados alcançados por um anticorpo anti-EGF-r de acordo com a invenção, O representa os resultados alcançados pelo anticorpo mcnoclonal murino 225 e (A) representa os resultados alcançados por um anticorpo IgG2 humano de controlo, nãc especifico. A ALgora 39 demonstra que anticorpos humanos anti-EGF-r derivados de estirpes XenoMouse II inibem o crescimento de células SW948 in vitro, onde (C) representa os resultados alcançados por um çsççiccrço anti-EGF-r de acordo com a invenção, 115 represento os resultados alcançados pslç anticorpo monoclonal murino 225 e (A) representa os resultados alcançados por um anticorpo IgG2 humane de controlo, não especifico. A Figura 40 apresecta a inibição do crescimento de células do carcinoma epidermóide humano A431 em murganhos atímicos através da utilização de anticorpos humanos anti-EGF-r de acordo com a invenção in vivo. Na Figura, (A) representa os resultados alcançados com uma dosagem de 1 mg de um anticorpo humano anti-EGF-r de acordo com a presente invenção, (▼) representa os resultados alcançados com uma dosagem de 0,2 mg de um anticorpo humano anti-EGF-r de acordo com a presente invenção, (□) representa os resultados alcançados por um anticorpo TgG2 humano de controlo, não especifico, e (O) representa os resultados alcançados utilizando solução salina tamponada com fosfatos como controlo. A Figura 41 apresenta dados relacionados com a inibição da formação do carcinoma epidermóide em murganhos atímicos através da utilização de anticorpos humanos anti-EGF-r de acordo com a invenção in vivo apresentando incidência tumoral no dia 19. A Figura 42 apresenta dados relacionados ccm a inibição da formação do carcinoma epidermóide em murganhos atímicos através da utilizarão de anticorpos humanos anti-EGF-r de acordo com a invenção in vivo apresentando incidência tumoral no dia 120. A Figura 43 apresenta dados relacionados com a erradicação de cn fuí::«r epidermóide humano estabelecido em murganhos stiimdmoe orrârég da utilização ae anticorpos humanos anti-EGF-r dê acordo com a invenção in vivo. Na Figura, (A) representa os resultadas alcançados com aoses múltiplas de 1 mg cada de um anticorpo humano anti-EGF-r de acordo com a presente invenção (E7.6.3), (*) representa os resultados alcançados com duas doses de 125 pg cada de doxorubicina, (*) representa os resultados alcançados com doses múltiplas de 1 mg cada de um anticorpo humano anti-EGF-r de acordo com a presente invenção (E7.6.3) em combinação com duas doses de 125 pg cada de doxorubicina, representa os resultados alcançados por um anticorpo IgG2 humano de controlo, não especifico, e (♦) representa os resultados alcançados utilizando solução salina tamponada com fosfatos como controlo. A Figura 44 apresenta dados relacionados com a erradicação de um tumor epidermóide humano estabelecido em murganhos atimicos através da utilização de anticorpos humanos anti-EGF-r de acordo com a invenção in vivo. Na Figura, (♦) representa os resultados alcançados com doses múltiplas de Qys mg cada de um anticorpo humano anti-EGF-r de acordo com a presente avença··.: (E2>5), () representa os resultados alcançados com duas doses de 125 pg cada de doxorubicina, (A) representa os resultados alcançados com doses múltiplas de 0,5 mg cada de u;?< anticorpo humano anti-EGF-r de acordo com a presente itwhçte (E2.5) em combinação com duas doses de 125 pg cada de doxorubicina, (*) representa os resultados alcançados utilizando solução salina tamponada com fosfatos como controlo e (--1 representa os m-Wtfltãiíc-s alcançados utilizando um anticorpo IgG2 hstn&arso de controlo, não especifico, a uma dose de 1 mg.

A presente invenção proporciona um anticorpo mc-noclonal totalmente humano contra o receptor do factor de crescimento epidérmico humano (EGF-r), compreendendo a) uma molécula de imunoglobulina de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos codificada por um ADNc como exposto na Fig. 30 (SEQ ID N°: 17), e b) uma molécula de imunoglobulina de cadeia leve kapa compreendendo uma sequência de aminoacidos codificada por um ADNc como exposto na Fig. 32 (SEQ ID N°: 18).

Numa forma de realização, o anticorpo da presente invenção compreende

a) a sequência de aminoácidos como exposto na Fig. 29 (SEQ ID N°: 37), e b) a sequência de aminoácidos como exposto na Fig. 31 (SEQ ID N°: 38) .

Numa forma de realização preferida, o anticorpo da presente invenção é um anticorpo IgG2 humano. A presente invenção proporciona igualmente uma linha celular de hibridoma, compreendendo a) uma sequência nucleotídica compreendendo uma sequência de ADNc como exposto na Fig. 30 (SEQ ID N°: 17), e b) í.wí.a sequência nucleotídica compreendendo uma sequência de ADNc ccmo expcsto na Fig. 32 (SEQ ID N°: 18).

Numa forma de realização, a linha celular de hibridoma da presente invenção segrega um anticorpo da presente invenção. A presente invenção proporciona ainda a utilização de um anticorpo da presente invenção para a preparação de uma composição farmacêutica para o tratamento de um tumor sólido.

As outras formas de realização referidas na descrição não constituem parte da invenção reivindicada mas servem para ilustrar a invenção.

Em primeiro lugar, descreve-se um anticorpo contra o receptor do factor de crescimento epidérmico compreendendo uma sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada, em que uma parte da sequência é codificada por um gene humano da família vQ 4 e qualquer uma das mutaçóes deste representadas pelas sequências nucleotídicas apresentadas nas Figuras 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26 e 30. Numa forma de realização preferida, a sequênciõ de aminoácidos da região variável da cadeia pesada compreende uma substituição do aminoácido Ácido Aspártíco no resíduo 10. segundo lugar, descreve-se ·.:;·· anioxvjapo cora i:.¾ receptor ¢1::- factor de crescimento epidérmico uaa sequência de aminoácidos da região variável da cadeia ao que uma parte da sequência é codificada por um gana haaado Vlpa-di e qualquer uma das mutações deste representadas pelas sequências nucleotídieas apresentadas nas Figuras 2, 6, 10, 14 e 18. Numa forma de realização preferida, a região variável da cadeia pesada compreende a sequência contígua desde CDR1 ate CDR3 como representado na SEQ lõ N°:23. Numa forma de realização preferida, o anticorpo compreende adicionalmente uma região variável da cadeia leve compreendendo a sequência representada por SEQ ID N5:24. Numa forma de realização preferida, a região variável da cadeia pesada compreende a sequência contígua desde CDR1 até CDR3 como representado na SEQ ID N°:25. Numa forma de realização preferida, o anticorpo compreende adicionalmente uma região variável da cadeia leve compreendendo a sequência representada por SEQ IDN5:26. Numa forma de realização preferida, a região variável da cadeia pesada compreende a sequência contígua desde CDR1 até CDR3 como representado na SEQ ID N°:27. Numa forma de realização preferida, o anticorpo compreende adicionalmente uma região variável da cadeia leve compreendendo a sequência representada por SEQ ID N°:28. Numa forma de realização preferida, a região variável da cadeia pesada compreende a sequência contígua desde CDRI até CDR3 como representado na SEQ ID N°:29. Numa forma de realização preferida, o anticorpo compreende adicionalmente uma região variável da cadeia leve compreendendo a sequência representada por SEQ ID N°:30. Numa forma de realização preferida, a região variável da cadeia pesada compreende a sequência contígua desde CDRI até CDR3 como representado na SEQ ID N°:31. Numa forma de realização preferida, o anticorpo compreende adicionalmente uma região variável da cadeia leve compreendendo a sequência representada por SEQ ID N°:32.

Em terceiro lugar, descreve-se um ao:;·::··: ::k; õõõitria: o receptor do factor de crescimento ír&iPérmlec: c.vr> >···>··;:' o··;: uma da cadeia pesada, em sequência de aminoácidos da região que uma parte da òàopfemia i codificada por um gene hairrrrKí VH 4-II e qualquer uma das mutações deste representadas pelas sequências nucleotidicas apresentadas nas Figuras 22, 26 e 30. forma de realização preferida, a região variável da cadeia pesada compreende a sequência contígua desde CDR1 até CDR3 como representado na SEQ ID N°:33. forma de realização preferida, o anticorpc compreende adicionalmente uma região variável da cadeia leve compreendendo a sequência representada por SEQ ID N°:34. Numa forma de realização preferida, a região variável da cadeia pesada compreende a sequência contígua desde CDR1 até CDR3 como representado na SEQ ID N°:35. Numa forma de realização preferida, a anticorpo compreende adicionalmente uma região variável da cadeia leve compreendendo a sequência representada por SEQ ID N°:36. Numa forma de realização preferida, a região variável da cadeia pesada compreende a sequência contígua desde CDR1 até CDR3 como representado na SEÇ ID N°:37. Numa forma de realização preferida, o anticorpo compreende adicionalmente uma região variável da cadeia leve compreendendo a sequência representada por SEQ ID N°:38.

Em quarto lugar, descreve-se um anticorpo contra o receptor do factor de crescimento epidérmico compreendendo uma sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve, em que uma parte da sequência é codificada por um gene humano da família Vk I e qualquer uma das mutações aeste representadas pelas sequências nucleotidicas apresentadas nas Figuras 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28 e 32. Numa forma de realização preferida, a região variável da cadeia compreende a sequência representada por SEQ ID N3:24. Numa forma de realização preferida, a região uatrlávei da cadeia leve compreende a sequência representada por a região SEQ ID N°:26. lamâ forma de realização preferida, variável da cadela leve compreende a sequência representada por SEQ ID N°:28. Numa forma de realização preferida, a região variável da cadeia leve compreende a sequência representada por SEQ 13 N°:30. Numa formo de realização preferida, a região variável da cadeia leve compreende a sequência representada por SEQ ID N°:32. Numa forma de realização preferida, a região variável da cadeia leve compreende a sequência representada por SEÇ ID N°:34. Numa forma de realização preferida, a região variável da cadeia leve compreende a sequência representada por SEQ 13 NG:36. Numa forma de realização preferida, a região variável da cadeia leve compreende a sequência representada por SEQ ID N°:38.

Em quinto lugar, descreve-se um anticorpo contra o receptor do factor de crescimento epidérmico compreendendo uma região variável da cadeia pesada compreendendo uma sequência contígua desde CDRI até CDR3 como representado na SEQ ID N°:23. Numa forma de realização preferida, o anticorpo compreende adicionalmente uma região variável da cadeia leve compreendendo a sequência representada por SEQ ID N°:24.

Em sexto lugar, descreve-se um anticorpo contra o receptor do factor de crescimento epidérmico compreendendo uma região variável da cadeia pesada compreendendo uma sequência contígua desde CDRI &tè CDR3 como representado na SEQ ID N°:25. Numa forma de realização preferida, o anticorpo compreende adicionalmente uma região variável da cadeia leve compreendendo a sequência representada por SEQ ID N°:26.

Em sèfi» lugar, descreve-se um anticorpo zirz;o o receptor do factor de crescimento epidérmico compreendendo ima região variávvl da cadeia pesada uma sequência contígua desde CDR1 atê CDR? como representado na SEQ ID N°:S7. Numa forma de realização preferida, o anticorpo compreende adicionalmente uma região variável da cadeia leve compreendendo a sequência representada por SEQ ID N°:28.

Em oitavo lugar, descreve-se um anticoipo contra o receptor do factor de crescimentc epidérmico compreendendo uma região variável da cadeia pesada compreendendo uma sequência contígua desde CDR1 até CDR.3 como representado na SEQ ID N°:29. Numa forma de realização preferida, o anticorpo compreende adicionalmente uma região variável da cadeia leve compreendendo a sequência representada por SEQ ID Nc:30.

Em nono lugar, descreve-se um anticorpo contra o receptor do factor de crescimento epidérmico compreendendo uma região variável da cadeia pesada compreendendo uma sequência contígua desde CDR1 até CDR3 como representado na SEQ ID N°:31. Numa forma de realização preferida, o anticorpo compreende adicionalmente uma região variavel da cadeia leve compreendendo a sequência representada por SEQ ID N°:32.

Em lugar, descreve-se um anticorpo contra o receptor do factor de crescimento epidérmico compreendendo uma região variavel da cadeia pesada compreendendo uma sequência contígua desde CDRl até CDR3 como representado na SEQ ID W°:33. Iludá. forma de realização preferida, o anticorpo compreende adicionalmente uma região variável da cadeia leve compreendendo a sequência representada por SEQ ID N°:34.

Em décimo primeiro lugar, descreve-se um anticoipo contra o receptor do factor de crescimento epidérmico compreendendo uma região variável da cadeia pesada compreendendo uma sequência contígua desde CDR1 àté CDR3 como representado na SEQ ID N°: 35. Numa forma de realização preferida, o anticorpo compreende adicionalmente uma região variável da cadeia leve compreendendo a sequência representada por SEQ 13 N°:36.

Em décimo segundo primeiro descreve-se um anticorpo contra o receptor dc factor de crescimento epidérmico compreendendo uma região variável da cadeia pesada compreendendo ;ms sequência contígua desde CDR1 até CDR3 como representado na SEQ ID Nc:37. Numa forma de realização preferida, o anticorpo compreende adicionalmente uma região variável da cadeia leve compreendendo a sequência representada por SsiQ ID N°:38.

Em décimo terceiro lugar, descreve-se, num método para tratar um tumor sólido com um anticorpo contra o receptor do factor de crescimento epidérmico, compreendendo o melhoramento a administração a um doente possuindo um tumor sólido de um dos anticorpos precedentes.

DESCRIÇÃO DETALHADA DAS FORMAS DE REALIZAÇÃO PREFERIDAS São proporcionados anticorpos monoclonais totalmente humanos contra o receptor do factor de crescimento epidérmico humano (EGF-r). São proporcionadas sequências nucleotidicas codificando e sequências de aminoácidos compreendendo moléculas de ímunoglobulína de cadeias pesadas e leves, particularmente sequências correspondentes a sequências de cadeias pesadas e leves contíguas desde CDRl até CDR3. São igualmente proporcionados hibridomas expressando tais moléculas de e anticorpos monoclonais.

Salvo definição em contrário, os termos científicos e técnicos utilizados com respeito à presente invenção deverão possuir os significados que são geralmente compreendidos pelos especialistas na técnica. Ainda, salvo disposição em contrário pelo contexto, os termos singulares deverão incluir piuralidades e os termos no plural deverão incluir o singular. Em geral, as nomenclaturas utilizadas com respeito a, e técnicas de, cultura de células e tecidos, biologia molecular e a química de proteína e oligo- ou polinucleotídica e hibridização aqui descritas são aquelas bem conhecidas e geralmente utilizadas na técnica. São utilizadas técnicas padrão para ADN recombinante, síntese oligonucleotídica e cultura de tecidos e transformação (e. g., electroporação, lipofecção). As reacções enzimáticas e técnicas de purificação são realizadas de acordo com as especificações dc fabricante ou como realizadas normalmente na técnica ou como aqui descritas. As técnicas e processos precedentes são geralmente realizados de acordo com métodos convencionais bem conhecidos na técnica e como descritos em diversas referências generalistas e mais especificas que são citadas e discutidas ao longo da presente memória descritiva. Ver, e. g., Sambrook et aí. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2" ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cola Spring Harbor, N.Y. ÊIM §*) I > que é aqui incorporado por referência. As nomenclaturas utilizadas com respeito a, e os processos laboratoriais e técnicas de, química analítica, química Pidâtica de síntese e química farmacêutica e medicinal aqui descritas são aquelas bem conhecidas e geralmente utilizadas na técnica. São utilizadas técnicas padrão para síntese química, análises químicas, preparação, distribuição e tratamento de doentes.

Como utilizado de acordo -::-::-¾ a presente divulgação, deve-se considerar que os termos seguintes, salvo indicação em contrário, possuem os seguintes significados: 0 termo "polinucleotídeo isolado" asssa aqui utilizado devera significar um polinucleotídeo de origem genómica, ADNc, ou sintética ou alguma combinação destas que, em virtude da sua origem, o "polinucleotídeo isolado" (1) não está associado a totalidade ou a uma parte de um polinucleotídeo na qual o "polinucleotídeo isolado" se encontra na natureza, (2) esta ligado operacionalmente a um polinucleotídeo ao qual não está ligado na natureza ou (3) não ocorre na natureza como parte de uma sequência maior. 0 termo "proteína isolada" aqui referido significa uma proteína de origem de ADNc, ARN recombinante ou sintética ou alguma combinação destas que, em virtude da sua origem, ou fonte de derivação, a "proteína isolada" (1) não está associada a proteínas encontradas na natureza, (2) está isenta de outras proteínas da mesma fonte, e. g., isenta de proteínas murinas, (3) é expressa por uma célula de uma espécie diferente ou (4) não ocorre na natureza. 0 termo "polipéptido" é aqui utilizado como um termo genérico para se referir a proteína nativa, fragmentos ou análogos de urra sequência polipeptídiea. Deste modo, proteína nativa, fragmentes e análogos são espécies do género polipéptido. Os polipéptidos preferidos de acordo com a inys-oyâ* compreendem as moléculas de imunoglobulina de cadeias pesadas humanas representadas pelas Figuras 1, 5, 9, 13, 17, 21, 25 e 29 e as 1 -vc:,2.,-:,-, de imunoglobulina de cadeias leves kapa hyfsmás representadas pelas c: 3, 7, 11, 15, 19, 23, 27 e 31, bem ccmo moléculas de anticorpos í^mÉMãim por combinações as moléculas de imunoglobulina de vadeias pesadas com moléculas de imunoglobulina de cadeias leves, tais ccmo as moléculas de imunoglobulina de cadeias leves kapa, e vice-versa, bem como cs S0U3 fragmentos e análogos. 0 termo "de ocorrência natural" comc aqui utilizado enquanto aplicado a um cbjecto refere-se ao facto de um objecto se poder eneontrar na natureza. Por exemplo, uma sequência polipeptídica ou polinucleotídica que está presente num organismo (incluindo vírus) que pode ser isolada a partir de uma fonte na natureza e que não tenha sido intencionalmente modificada pelo homem no laboratório cu de maneira diferente e de ocorrência natural. 0 termo "ligado operacionalmente" como aqui utilizado refere-se a posições de componentes descritos como tais que estejam numa relação que lhes permite funcionar no seu modo pretendido. Uma sequência de controlo "ligada operacionalmente" a uma sequência codificante d ligada de tal modo que a expressão da sequência codificante é alcançada sob condiqões compatíveis com as sequências de controle. 0 termo "sequência de controlo" como aqui utilizado refere-se a sequências polinucleotídicas que são necessárias para efectuar a expressão e processamento de sequências codificantes às quais estão ligadas. A natureza de Lais sequências de controlo difere, dependendo do organismo hospedeiro; nos procariotas, tais sequências de controlo incluem geralmente promotor, dltbo de ligação ríbossómico e sequência de terminação de nos eucaríotas, geralmente, tais sequências de controlo incluem promotores e sequência de terminação de transcrição. 0 termo "sequências de controlo" pretende incluir, no minímo, todos cu; componentes cuja presença seja essencial para a όίφοοοοΰο e processamento e pode iguaimente incluir componentes adicionais cuja presença seja vantajosa, por exemplo, sequências condutoras e sequências agentes de fusáo. 0 termo "polinucleotídeo" como aqui referido significa uma forma polimérica de nucleotideos de, pelo menos, 10 bases de comprimento, ribonucleotídeos ou desoxinucleotídeos ou uma forma modificada de um ou outro tipo de nucleotídeo. O termo inclui formas de cadeia simples e dupla de ADN. O termo "oligonucleotideo" aqui referido inclui nucleotideos de ocorrência natural e modificados ligados entre si por ligações oligonucleotídicas de ocorrência natural e de ocorrência não natural. Os oligonucleotídeos são um subcombinação polinucleotídico compreendendo geralmente um comprimento de 200 bases ou menos. De um modo preferido, os oligonucleotídeos têm 10 a 60 bases de comprimento e, de um modo muito preferido 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 a 40 bases de comprimento. Os oligonucleotídeos são normalmente de cadeia simples, e. g., para sondas; embora os oligonucleotídeos possam ser dupla, e. g., para utilizar na construção de um mutante génico. Os oligonucleotídeos da invenção podem ser oligonucleotídeos sentido ou anti-sentido. O termo "nucleotideos de ocorrência natural" aqui referido inclui desoxirribonucleotídecs ou ribonucleotídeos. O termo «nucleotideos modificados" aqui referido inclui nucleotideos com fosforotioatc, grupos de isçúosr modificados cu substituídos e semelhantes. O termo "ligações oligonucleotídicas" aqui referido inclui llgmçOè-í de oligonucleotídeos Cars como fcsfcrodisselenoato, fosforoamidato e Nucl. Acíds Res. t :y β f λ ç ,:v ? % % 4-.0, fosforosselenoato, to Mo t v:¾ 'ú 1 I M- r;? S- ·:; ot fosforaniladato, semelhantes. Ver, e. g., LaPlanche et : 19 8 4) ; (1986); Stec et al. J. Am. Chem. Çoc.

Nu c ;em

Acíds Res. 16:3209 (1188); Zon et al.

Drug Design 6:539 (1991); Zon et al.

Oliqonucleotides and Analogues: A Practical Approach, pp. 87-108 (F. Eckstein, Ed. Oxford University Press, Gxford, Inglaterra (1991)); Stec et aí. Patente U.S. Nc 5151510; Uhlmann and Peyman Chemical Reviews 90:543 (1990), cujas divulgações são por este meio incorporadas por referência. Se desejado, um oligonucleotideo pode incluir um marcador para detecção. 0 termo "hibridizar selectivamente" aqui referido significa ligar detectável e especificamente. Os polinucleotídeos, oligonucleotídeos e os seus fragmentos de acordo com a invenção hibridizam-se selectivamente a cadeias de ácidos nucleicos sob condições de hibridização e lavagem que minimizam quantidades apreciáveis de ligação detectável a ácidos nucleicos não específicos. Podem utilizar-se condições de elevada restringência para alcançar condições de hibridização selectiva como conhecidas na técnica e aqui discutidas. Geralmente, a homologia de sequência de ácidos nucleicos entre os polinucleotídeos, oligonucleotídeos e fragmentos da invenção e uma sequência de ácidos nucleicos de interesse será, pelo menos, de 80% e mais tipicamente com homologias crescentes preferidas de, pelo menos, 85%, 90%, 95%, 99% e 100%. M;d:s sequências de amínoácídos são homólogas se existir uma identidade parcial ou completa entre as suas sequências. Por exemplo, 85% de homologia significa que 85% dos aminoácidcs são idênticos quando as duas sáo alinhadas para máxima coincidência. São permitidas j crus (em qu-;.;.:,quú;: uma das duas sequências a tòiyíeidi r) para maximizar a coincidência; são preferidos í3-0£K.p:S' 1 .¾¾Γ5:'£·ο^ dis Lacuna de 5 ou menos, sendo ma.i.s pieferiaos cucj 2 ou menos. De um modo alternativo e preferido, duas sequências proteicas (ou sequências polipeptídicas deri adas daquelas de, pelo menos, 30 aminoácidos de comprimento) são homólogas, como este termo é aqui qt: ilidddw * se tiverem uma pontuação de alinhamento superior a 5 (em unidades de desvio-padrão) utilizando o programa ALIGN com a matriz de dados de mutação e uma penalidade de lacuna de 6 ou maior. Ver Dayhoff, M.O., in Atlas of Protein Sequence and Structure, pp. 101-110 (Volume 5, National Biomedical Research Foundation (1972)) e o Suplemento 2 deste volume, pp. 1-10. As duas sequências ou partes destas são, de um modo mais preferido homólogas se os seus aminoacidos forem maiores que ou iguais a 50% idênticos ífuando optimamente alinhados utilizando o programa ALIGN. O termo "corresponde a" é aqui utilizado para significar uma sequência polinucleotídica é homóloga (i. e., é idêntica, não estritamente evolucionariamente aparentada) em relação a toda ou a uma parte de uma sequência polinucleotídica de referência, ou que uma sequência polipeptidica é idêntica a uma sequência polipeptídira de referência. Em oposição, o termo "complementar a" é aqui utilizado para significar que a sequência complementar é homóloga em relação a tcda ou ã uma parte de uma sequência polinucleotídica de referência. Para ilustração, a sequência nucleotídica "TATAC" corresponde a uma sequência de referência "TATAC" e é complementar a uma sequência de referência "GTATA".

Os termos seguintes são utilizados para descrever as de sequência entre duas ou mais sequências polinucleotídicas ou de aminoácidos: "sequência de referência", "janela de comparação", "identidade de sequência", "percentagem de identidade de sequência" e "identidade substanciai". Uma "sequência de referência" é «.& sequência definida utilizada como base para uma comparação de sequências; a sequência de referência pude ser um. subcombinação de uma sequência maior, por exemplo, como segmento de uma sequência de comprimento completo de ADNc ou de ms gene dada numa listagem de sequências ou pode compreender uma sequência completa de ADNc ou de um gene. Geralmente, uma sequência de referência tem, pelo menos, 18 nucleotídeos ou o aminoácidos de comprimento, frequentemente, pelo menos, 24 nucleotídeos ou 8 aminoacidos de comprimento e muitas vezes, pelo menos, 48 nucleotídeos ou 16 aminoacidos de comprimento. Visto que duas sequências polinucleotídicas ou de aminoácidos podem compreender cada uma (1) aa sequência (i.e., uma parte da sequência completa polinucleotidica ou de aminoácidos) que é semelhante entre as duas moléculas e (2) pode compreender ainaa uma sequência que e divergente entre as duas sequências polinucleotídicas ou de aminoácidos, comparações de sequências entre duas (ou mais) moléculas são tipicamente realizadas pela comparação de sequências das duas moléculas sobre uma "janela de comparação" para identificar e comparar regiões locais de semelhança de sequência. Uma "janela de comparação", como aqui utilizado, refere-se a um segmento coneeptual de, pelo menos, 18 posições nucleotídicas ou 6 aminoácidos contíguas, em que uma sequência polinucleotidica ou sequência de aminoacidos pode ser comparada a uma sequência de referência de, pelo menos, 18 sequências nucleotídicas ou 6 aminoácidos contíguas e em que a parte da sequência polinucleotidica na janela de comparação pode compreender adições, deleções, substituições e semelhantes (i. e., iecaãursd de 20 porcento ou menos relativamente à sequência de referência (que não compreende adpçp&s ou . para alinhamento ideal das duas sequências. 0 alinhamento ideal de sequências para alinhar x xma janela de comparação pode ser conduzido ou 1 ::· algoritmo de dgmaX&giii local de Smith e Waterman Adv, Appl. * 2:482 U » peio algoritmo de alinhamento de hcmología de Needleman e Wunsch J. Mol. Biol. 48:443 (1970), pelo método de busca de semelhança de Pearson e Lipman Broc. úárjú Acad.

Scí. (E.U.A.) 85:2444 (1988), por implementações informatizadas destes algoritmos (GAP, BEÇSFIT, FASTA e TFASTA do Wisconsin Genetics Çoftware Fackage Release 7.0, (Genetics Computer Group, 575 Dr., Madison, Wis.), pacotes de software Geneworks ou MacVector) ou per inspecção, e o melhor alinhamento (ie., que resulta na percentagem mais elevada de homologia sobre a janela de comparação) produzido pelos diversos métodos é seleccionado. O termo "identidade de sequência" significa que as duas sequências polinucleotidicas ou de aminoácidos são idênticas _e., numa base de nucleotídeo-a-nucleotídeo ou resíduo-a-resíduo) sobre a janela de comparação. O termo "percentagem de identidade de sequência" é calculado pela comparação de duas sequências idealmente alinhadas sobre a janela de comparação, determinando o número de posições em que a base de ácido nucleico (e. g., A, T, C, G, U, ou I) ou resíduo idêntico ocorre em ambas as sequências para produzir o número de posições coincidentes, dividindo o número de posições coincidentes pelo número total de posições na janela de comparação (i. e., o tamanho de janela) e multiplicando o resultado por 100 para produzir a percentagem de identidade de sequência. C termo "identidade asbat ator s.· ^ como aqui utilizado denota uma característica de uma sequência polinucleotídica ou de aminoácidos, em que c polinucleotideo ou aminoácido compreende uma que tem, pelo menos, 85 porcento de identidade de sequência, de um modo preferido, pele menos, 90 a 95 de identidade de éo·::ia, de os ' f- mais usual, pelo menos, 99 porcento de identidade de sequência relativamente a uma sequência de referência sobre uma janela de comparação de, peio menos, 18 posições nucieotidicas (6 aminoácidos) , frequentemente sobre uma janela de, pelo menos, 24-48 posições nucieotidicas (8-16 aminoácidos), em que a percentagem de identidade de sequência é calculada pela comparação da sequência de referência à sequência que pode incluir deleções ou adições que totalizam 20 porcento, ou menos, da sequência de referência sobre a janela de comparação. A sequência de referência pode ser um subcombinação de uma sequência maior.

Gomo aqui utilizado, os vinte aminoácidos convencionais e suas abreviações seguem a utilização convencional. Ver Immunology - A Synthesis ta* Edição, E.S. Golub e D.R. Gren, Ed., Sinauer Associates, Sunderland, Mass. (1991)), que é aqui incorporado por referência. Os estereoisómeros (e. g., D-aminoácidos) dos vinte aminoácidos convencionais, aminoácidos não naturais tais como aminoácidos a-, a-disubstituídos, aminoácidos N-alquilo, ácido láctico e outros aminoácidos não convencionais podem constituir igualmente componentes adequados para polipéptidos da presente invenção. Exemplos de aminoácidos não convencionais incluem: 4-hidroxiprolina, y-carboxiglutamato, ε-Ν, N,N-trimetilisina, e-N-acetilisina, O-fosfoserina, N-acetilserina, N-formilmetionina, 3-metil-histídina, 5-hidroxiliçina, o-N-rnetilarginina e outros aminoácidos e iminoácidos (e. g., 4-hidroxiprolina) semelhantes. Na notação polipeptidica aqui utilizada, a direcção esquerda é a direcção terminal «ah* e a direcção direita è a direcção carboxíterminal, de acordo com a utilização e convenção padrão.

Analogamente, salvo especificação em contrário, a extremidade esquerda de sequências polinucleotídicas de cadeia simples é a extremidade 5'; a direcção esquerda de sequências polmucleotídicas duplas é referida como a direcção 5' . A direcção de adição 00 5' para 3' de transcritos nascentes de ARN é referida como a direcção ae transcrição; as regiões de sequência na cadeia de ADN tendo a mesma sequência que c ARN e que estão em 5' em relação a extremidade 5' do transcrito de ARN são referidas como "sequências a montante"; as regiões de sequência na cadeia de ADN tendo a mesma sequência que o ARN e que estão em 3' em relação a extremidade 3' do transcrito de ARN são referidas como "sequências a jusante".

Como aplicado aos polipéptidos, o termo "identidade substancial" significa que duas sequências peptídicas, quando idealmente alinhadas, tal como pelos programas GAP ou BESTFIT utilizando ponderações de lacuna pré-definidas partilham, pelo menos, 80 porcento de identidade de sequência, de um modo preferido, pelo menos, 95 porcento de identidade de sequência e de um modo muito preferido, pelo menos, 99 porcento de identidade de sequência. De um modo preferido, posições de resíduos que não são idênticas diferem por substituições conservativas de aminoácidos. As substituições conservativas de arninoácidos referem-se à permutabilidade de resíduos tendo cadeias laterais semelhantes. Por exemplo, um grupo de aminoacidos possuindo cadeias laterais alifáticas é glicina, alanina, valina, leucina e isoieucina; um grupo de aminoácidoç tendo cadeias laterais hidróxilo-alifáticas é serina e treonina; um grupo de aminoácidos possuindo cadeias laterais contendo amida é asparagina e glutamina; um grupo de aminoácidos possuindo cadeias laterais aromáticas é fenilalanina, tirosina e triptofano; um qrqpç de aminoácidos possuindo cadeias laterais básicas é lisína, arginina e histidína; e um grupo de aminoácidos possuindo cadeias laterais ccsccscoi?:: enxofre é cisteína e metíonina. São grupos preferidos de substituições conservativas da amínoácidos: valina-leucir.a-isoleucina, fenilalanina-tirosina, i lô i íus - aogi sisa, alanina-valina, glutâmico-aspártico e asparagina-giutamina. 0 termo "fragmento polipeptídico" como aqui utilizado refere-se a um pod ;.pòp· ; ao que tem uma deleção ammo-terminal e/ou carboxiterminal, mas onde a sequência de amínoácidos remanescente é idêntica as posições correspondentes na sequência de ocorrência natural deduzida, por exemplo, a partir de uma sequência de ADNc de comprimento completo. Os fragmentos têm tipicamente, pelo menos, 5, 6, 8 ou iO amínoácidos de comprimento, de um modo preferido, pelo menos, 14 amínoácidos de comprimento, de um modo mais preferido, pelo menos, 20 amínoácidos de comprimento, de um modo usual, pelo menos, 50 amínoácidos de comprimento e, de um modo ainda mais preferido, pelo menos, 70 amínoácidos de comprimento. O termo "análogo" como aqui utilizado refere-se a polipéptidos que são constituídos por um segmento de, pelo menos, 25 amínoácidos que possui identidade substancial em relação a uma parte de uma sequência de amínoácidos deduzida e que possui, pelo menos, uma das seguintes propriedades: (1) ligação especifica a um EGF-r, em condições de ligação adequadas, (2) kapacidade de ligação de EGF ao seu receptor ou (3) kapacidade para inibir o EGF-r da expressão do crescimento celular in vitro ou in vivo. Tipicamente, os análogos polipeptídicos compreendem uma ddbotiiuiçib conservativa de amínoácidos (ou adição ou deleção) coa respeito a sequência de ocorrência natural. Os análogos possuem tipicamente, pelo menos, 20 aMirútãosdbíí de comprimento, de um modo pTOÍor:Uk>P pelo menos, 50 amínoácidos ou mais de comprimento e podem ser, frequentemente, tão compridos quanta um polipéptído de comprimento completo de ocorrência natural.

Os análogos peptídicos são geralmente utilizados na indústria farmacêutica como fármacos não peptídicos com propriedades análogas àquelas do péptidc-molde. Estes tipos de compostos não peptídicos são designados "miméticos de péptido" ou '"i Fauchere, J. Adv. Drug Res. 15:29 (1986);

Veber e Freidinger TINS p.392 (1985); e Evans et ai. J. Med. Chem. 30: 1229 (1387), que são aqui incorporados por referência. Tais compcstos são frequentemente desenvolvidos com o auxílio de modelação molecular computorizada. Os miméticos peptídicos que são estruturalmente semelhantes a péptidos terapeuticamente úteis podem ser utilizados para produzir um efeito terapêutico ou profiláctico equivalente. Geralmente, os peptidomiméticos são estruturalmente semelhantes a um polipéptido de paradigma (i. e., um polipéptido que possui uma propriedade bioquímica ou actividade farmacológica), tal como o anticorpo humano, mas têm uma ou mais ligações peptídicas facultativamente substituídas por uma ligação seleccionada a partir do grupo consistindo em: —CH2MH--, --CH2S--, —CH2-CH2—, -CH=CH— (cis e trans), --COCH2- ---CH(OH)CH2— e -CH2SO—, por métodos bem conhecidos na técnica. A substituição sistemática de um ou mais aminoácidos de uma região de consenso por %m D-aminoácido do mesmo tipo (e. g., 0-lisina em vez de L-Lisina) pode ser utilizada para produzir péptidos mais estáveis. Ainda, péptidos constrangidos compreendendo uma sequência de consenso ou uma variação de sequência de consenso substancialmente idêntica podem ser produzidos por métodos conhecidos na técnica (Rizo e Gierasch Ann. Rev. Bíonhem. 61:387 (1992), aqui incorporado por referência); por exemplo, pela adição de resíduos internos de eisteína kapazes de formar pontes intramolecuiares dissulfanetil que ciclizam o péptido. Μ::&?ΐEiδθΓ|?0·ν ou "péptído (s) de anticorpo" refere-se ã um anticorpo intacto, ou a um seu fragmento de que compete com o anticorpo intacto peia li-g&çã® especifica. Os fragmentos de ligação são produzidos por técnicos de ADN recombinante ou por clivagem enzimãtica ou química de anticorpos intactos. Fragmentos de ligação incluem Fab, Fab', Fv e ariticorpos de cadeia simples. Um anticorpo, exceptuando um anticorpo "bi-específico" ou "bifuncional", é entendido como tendo cada um dos seus sítios de ligação idênticos. Um anticorpo inibe substancialmente a adesão de um receptor a um contra-receptor quando um excesso de anticorpo reduz a quantidade de receptor ligado ao contra-receptor por, pelo menos, cerca de 20%, 40%, 60% ou 80% e, mais usualmente superior a cerca de 85% (como medido num ensaio de ligação competitivo in vitro). O termo "epitopo" inclui qualquer determinante proteico kapaz de se ligar especificamente a um receptor de imunoglobulina ou de células T. Determinantes epitópicos consistem usualmente em agrupamentos de superfície quimicamente activos de moléculas, tais como cadeias laterais de aminoácidos ou de açúcares e possuem usualmente características estruturais tridimensionais específicas, bem como características de carga especificas. Diz-se que um anticorpo liga especificamente um antigénio quando a constante de dissociação é d 1 çFL de um modo preferido ú 100 nM e de um modo muitc preferido 1 10 nM. O termo "agente" à aqui utilizado para denotar um ccmposto químico, uma mistura de compostos qulsigioí?> uma macromolécnla preparado bi:çld(çíca ;>o mm cai sdc ::,0 preparado a plftir de materiais biológicos. referem-se a incorporação de um marcador e. g., por incorporação de um aminoácido marcado radioactivamente oa ligação a um poiipéptido de grupos biotinxlo que podem ser detectados por avidina marcada (e. g., estreptavidina contendo u;··: marcador fluorescente ou actividade enzimática que pode ser detectada por métodos ópticos ou colorimétricos). um determinadas situações, a marca ou marcador também podem ser terapêuticos. Diversos métodos de marcação de polipéptidos e glicoproteínas são conhecidos na técnica e podem ser utilizados. Exemplos de marcadores de polipéptidos incluem, entre outros, os seguintes: radioisótopos ou radionuclídeos (e. g., 'H, 14C, ''lí* S, 9GY, ^Tc, " líq ϊ , "1) , marcadores fluorescentes (e. g., FITC, rodamina, lantanideos fosforescentes), marcadores enzimáticos (e. g., peroxidase de rábano, β-galactosidase, luciferase, fosfatase alcalina), quimioluminescentes, grupos biotinilo, epitopos polipeptídicos pré-determinados reconhecidos por um repórter secundário (e. g., sequências de pares de fechos de correr de leucina, sítios de ligação de anticorpos secundários, domínios de ligação metálicos, marcas de epitopos). Em algumas formas de realização, os marcadores são ligados por braços espaçadores de diversos comprimentos para reduzir um potencial impedimento esterioquimico. 0 termo "agente farmacêutico ou fármaco" como aqui utilizado refere-se a um composto ou composição química Rapaz de induzir um desejado efeito terapêutico quando correctamente administrado a um doente. Outros termos de química são aqui utilizados de acordo aom a utilização convencional ri2 tlcdi/osp como exemplificado pcct The McGraw-Hill Dictionary of Chemical {Herms (Parker, S., Ed., McGraw-Hill, São Francisco úddfi aqui incorporado per referência). 0 termo "agente antineoplasico" é aqui utilizado para se referir a agentes que têm a propriedade funcional dê inibir um desenvolvimento ou progressão de neoplaçma num humano, particularmente uma lesão maligna (cancerosa), tal como um carcinoma, sarcoma, linforna ou leucemia. A inibição de metástases é frequentemente uma propriedade de agentes antineoplásicos.

Como aqui utilizado "substancialmente puro" significa que uma espécie objecto e a espécie dominante presente (i. e., numa base molar é mais abundante do que qualquer outra espécie individual na composição) e, de um modo preferidc uma fracção substancialmente purificada é uma composição em que a espécie objecto compreende, pelo menos, cerca de 50 porcento (numa base molar) de todas as espécies macromoleculares presentes. Geralmente, uma composição substancialmente pura compreenderá mais de cerca de 80 porcento de todas as espécies macromoleculares presentes na composição, de um modo mais preferido mais de cerca de 85%, 90%, 95% e 99%. De um modo muito preferido, a espécie objecto é purificada essencialmente ate a homogeneidade (espécies contaminantes dád se conseguem detectar na ccmposicão por métodos de deteccão convencionais) em que a composição consiste essencialmente numa única espécie macromolecular. 0 termo doente inclui indivíduos humanos e veterinários. Sâbe-se que a unidade estrutural básica de anticorpo compreende um tetrâmero. Cada tetrâmero i composto por dois pares idênticcs de cadeias poiipeptidicas, tendo cada a $3» cadeia "leve" (cerca de 25 kDa) e uma "pesada" (cerca de 50-70 kCa) . A parte amino-terminal de cada cadeia inclui uma região variável de cerca de 100 a 110 ou mais amincacidos responsável, principalmente, pelo reconhecimento de antigénio. A parte carbcxiterminal de cada cadeia define uma região constante responsável, principalmente, pela função efectora. As cadeias leves humanas são classificadas como cadeias leves kapa e lambda. As cadeias pesadas são classificadas como mu, delta, gama, alfa ou épsilon e definem o isótipo do anticorpo como IgM, IgD, IgA e IgE, respectivamente. No seio das cadeias leves e pesadas, as regiões variáveis e constantes estão unidas por uma região "J" de cerca de 12 ou mais aminoácidos, com a região pesada incluindo igualmente uma região "D" de cerca de mais iO aminoácidos. Ver, duma maneira geral, Fundamental Immunology Cap. 7 (Paul, W., ed., 2a ed. Raven Press, N.Y. (1989)) (para todos os fins incorporado por referência na sua totalidade). As regiões variáveis de cada par de cadeia leve/pesada formam o sítio de ligação do anticorpo.

Deste modo, um anticorpo intacto possui dois sítios de iigaçãc. Excepto nos anticorpos bifuncionais ou %i-específicos, os dois sítios de ligação sáo os mesmos.

Todas as cadeias exibem a mesma estrutural geral de regiões de estrutura (FR) relativamente conservadas unidas por três regiões também denominadas regiões determinantes de complementaridade ou CDR. As CDR das duas cadeias de cada par estão alinhadas pelas regiões de escrutura, permitindo a ii/p-çi-cs a um epitopo especifico. Desde N-fermir.al a C-terminal, ambas as cadeias leves e pesadas compreendem os domínios FRi, CDR1, FR2, CDRS, FR3, CDR3 e FR4. A atribuição de aminoácidos a cada domínio está de acordo com as definições de Kabat Sequences of Proteins of Immunoloqical Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 e 1991)), ou Chothia & Lesk J. Moi. lis.L 196:901-917 (1987); Chothia et ai. Nature 342:878-883 ·; 1 ;'Ç 1 ! Λ

Um anticorpo bi-específico ou bifuncional é um anticorpo híbrido artificial possuindo dois pares de cadeias pesadas/leves diferentes e dois sítios de ligação diferentes. Os anticorpos bi-específicos podem ser produzidos por uma variedade de métodos incluindo fusão de hibridomas ou ligação de fragmentos Fab' . Ver, e. g., Songsivilai & Lachmann Clin. Exp. Iimunol. 79: 315-321 (1990), Kostelny et al. J. Immunol. 148:1547-1553 (1992). A produção de anticorpos bi-específicos pode ser um processo relativamente intensivo em mão-de-obra comparado com a produção de anticorpos convencionais e os rendimentos e grau de pureza são geralmente mais baixos para os anticorpos bi-específicos. Os anticorpos bi-específicos não existem na forma de fragmentos possuindo um único sítio de ligação (e. g., Lab, Fab' e Fv).

Preparação de Anticorpos Q anticorpo de acordo com a invenção é preparado, de um modo preferido, através da olílde um murganho transgénico que possuí uma parte substancial dc genoma produtor de anticorpo humano inserido, mas que é tornado deficiente na pttáuÇa.b de anticorpos murinos endógenos. Per conseguinte, tais murganhos são kapazes de produzir moléculas de imunogiobulína e anticorpos humanas e são deficientes na pzms&çàs de moléculas de imunogiobulína e anticorpos murinas. As tecnologias utilizadas para alcançar o mesmo são divulgadas nas patentes, pedidos e referências aqui divulgadas nos Antecedentes. Contudo, em particular, uma forma de realização preferida de produção transgénica de murganhos e anticorpos destes é divulgada no documento WO-A-98/24893, reivindicando a prioridade apresentada a 3 de Dezembro de 1996, ver igualmente Mendez et al. Nature Genetics 15:146-156 (1997).

Através da utilização de tal tecnologia, produziram-se anticorpos monoclonais totalmente humanos contra uma variedade de antigénios. Essencialmente, imunizam-se linhas XenoMouseT" de murganhos com um antigénio de interesse, recuperam-se as células linfáticas (tais como células B) dos murganhos que expressam os anticorpos, fundem-se essas células recuperadas com uma linha celular de tipo mielóide para preparar linhas celulares de hibridoma imortais e estas linhas celulares de hibridoma são pesquisadas e seleccionadas para identificar linhas celulares de hibridoma que produzem anticorpos específicos contra o antigénio de interesse. Estas técnicas foram utilizadas de acordo com a presente invenção para a preparação de anticorpos específicos contra EGF-r. Descreve-se, aqui, a produção de oito linhas celulares de hibridoma que produzem anticorpos específicos contra CGF-r. Para ^ ·.:' disso, proporciona-se uma caracterização dos íhtlibgrbhh produzidos por tais linhas celulares, incluindo análises de sequências nucleotídieas e de aminoácidos das cadeias pesadas e leves de tais anticorpos.

As linhas celulares de hibridona aqui discutidas são designadas EI.l, E2,i? E2.5, E6.2, Εβ.4, E2.ll, E6.3 e E7.6.3. Apenas a E7.6.3 faz parte da invenção reivindicada. Cada a:·:·:·, dos anticorpos produzidos pelas linhas celulares supramencionadas são cadeias pesadas IgG2 totalmente humanas com cadeias leves kapa humanas. Em geral, os anticorpos de acordo com a invenção possuem afinidades muito elevadas, possuindo tipicamente Kd de desde cerca de iíf f ate cerca de 11 ' M, quando medidas quer pela fase sólida quer pela fase de solução.

Como será entendido, os anticorpcs de acordo com a presente invenção podem ser expressos em linhas celulares excluindo linhas celulares de hibridoma. As sequências codificando anticorpos particulares podem ser utilizadas para transformação de uma célula hospedeira de mamífero adequada. A transformação pode ser por qualquer método conhecido de introdução de polinucleotídeos numa céiulá hospedeira incluindo, por exemplo, o empacotamento do polinucleotídeo num vírus (ou num vector virai) e transformando uma célula hospedeira com o vírus (ou vector) ou por processos de transfeccão conhecidos na técnica, como exemplificado pelas Patentes U.S. N° 4399216, 4912040, 4740461 e 4959455. O processo de transformação utilizado depende do hospedeiro a transformar. Os métodos de introdução de polinucleotídeos heterólogos em células de mamífero são bem conhecidos na técnica e incluem a transfecção mediada por dextranc, precipitação por fosfato de cálcio, transfecção mediada por políbreno, fusão de protopiastos, encapsulamento dois) polinucleotídeo(s) em lipossomas e micro-jihjçççâo directa do ADN nos núcleos.

As linhas celulares de mamífero disponíveis como hospedeiros de expressão são bem conhecidas na técnica e incluem muitas linhas celulares imortalizadas disponíveis a partir da American Type Culture Collection tòiCCh· incluindo, não limitada a células de ovário de hamster Chinês {CHO) , células HeLa, células de rim de hamster bebé íEtdç f células de rim de macaco {COS), células do carcinoma hepatocelular humano (e. g., Hep G2) e um combinação de outras linhas celulares. As linhas celulares de um modo preferido particular são seleccionadas através da determinação de que linhas celulares têm elevados níveis de expressão e produzem anticorpos com prcpriedades de ligação de EGF-r constitutivas.

Cs anticorpos de acordo com a presente invenção são inibidores potentes da ligação de EGF e AI?·-··;:< ao seu receptor, EGF-r. Tais resultados são discutidos nos Exemplos 5 e 6 e apresentados nas Figuras 35 até 38. Coerente com tais resultados, e como apresentado na figura 39 e discutido com respeito ao Exemplo 7, o anticorpo de acordo com a presente invenção inibe igualmente o crescimento de determinadas linhas celulares de carcinoma humano in vitro e previne igualmente o crescimento de determinados carcinomas humanos in vivo. Tais resultados são apresentados nas Figuras 40 até 42 e discutidos com respeito ao Exemplo 8. No Exemplo 9, demonstra-se que um anticorpo de acordo com a presente invenção, pelo menos em combinação com um agente antineoplásicc, erradicará um tumor existente num animal. Além disso, a terapia de anticorpo, enquanto monoterapia (i. e., não em combinação com um agente antineoplásico) parece possível de acordo com os anticorpos de acordo com a presente invenção, caso que não parece possível na técnica anterior, por exemplo através da utilização do anticorpo 225. Tais resultados são discutidos com respeito ao Exemplo 9 e apresentados nas Figuras 43-44.

Os resultados demonstrados de acordo com a presente Invenção indicam que os anticorpos de acordo com a presente invenção possuem determinadas qualidades que podem tornar as presentes anticorpos mais eficazes do que a terapêutica actual de anticorpos contra EGF-I, e. g., 225. 0 anticorpo 225 em desenvolvimento clinico pela Imclone >'· um anticorpo IgGl quimérico com uma afinidade de 2 X ΗΓ'^ 1¾ que, embora pareça eficaz na terapia de combinação com um agente antineoplásico, não parece muito eficaz na monoterapia. Em contrapartida, os anticorpos de acordo com a invenção, i. e., o anticorpo E7.6.3 da invenção, possuem afinidades significativamente superiores (E2.5: 1,6 X 11 1 Μ; E7.6.3: 5,7 X IO'11 M) e parecem eficazes em moncterapia alem da terapia de combinação com um agente antineoplásico e a doses mais baixas do que com o anticorpo C225.

EXEMPLOS

Os exemplos seguintes, incluindo as experiências conduzidas e resultados alcançados são proporcionados apenas para fins de ilustração e não podem ser interpretados como restritivos da presente invenção.

Exemplo 1

Produção Hibridomas Produtores de Anticorpos Anti-EGF-r seieecionados e

Os anticorpos dã invenção foram preparados, ensaiados de acorda com o presente Exemplo.

Imunização e produção de hibridoma: XencMurganhos íS a 13 semanas de idade! foram imunizadas intraperitonealmente com 2x10 células A431 (ATCC CRL-7907) ressuspenssas em solução salina tamponada com fosfatos (PBS). Esta dose foi repetida três vezes. Quatro dias antes da fuçtih:;, os murganhos receberam uma injecção final de células em PBS. Linfócitos do baça e do nodo linfático de murganhos imunizados foram fundidos com a linha de mieicma não secretora NSO-bcl2 (Ray e Diamond, 1994) e foram submetidos a selecção HAT como descrito anteriormente (Galfre e Milstein, 1981) . Foi recuperado um extenso painel de hibridornas segregando, todos eles, anticorpos humanos Igvícs: específicos de EGF-r (como a seguir detectado). Como descrito no Exemplo 2, alguns dos anticorpos anticorpos seleccionados a partir do painel foram seleccicnados peia sua kapacidade para competir com o anticorpo 225.

Ensaio ELISA: O ELISA para determinação de anticorpos específicos de antigénio no soro de murganho e nos sobrenadantes de hibridornas foi efectuado como descrito (Coligan et ál.c,· 1994) utilizando EGF-r purificado por afinidade a partir de células A431 (Sigma, E-3641) para capturar os anticorpos. As concentrações de imunoglobulinas humanas e de murganho foram determinadas utilizando os seguintes anticorpos de captura: IgG de coelho anti-humano (Southern Biotechnology, 6145-01), Igx de cabra ãnti-humano (Vector Laboiatories, AI-3060), IgM de murganho anti-humano (CGI/ATCC, HB-57), para Ig gama, kapa e mu humano, respectivamente, e IgG de cabra anti-murganho (Caltag, 1050-01),

Igr de cabra anti-murganhc (Southern Biotechnology, Igm de cabra anti-murganho (Southern Biotechnology, h de cabra anti-murganho (Southern Biotechnology,

KhlDKíli para capturar Ig gana, kapa, mu e lambda de murganho, respectivamente. Os anticorpos de detecção utilizadas

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Ensaios de ligação de receptor: O ensaio de ligação do receptor de EGF foi efectuado com células A421 ou células SW948 (0,4 x 1 §: téiúivSt por poço) que foram incubadas com concentrações variáveis de anticorpos em tampão de ligação PES durante 30 minutos a 4 °C. 0,1 nM [ ?5I] de EGF (Amersham, IM-196) ou [U'I] LCir-* (Amersham) foi adicionado a cada poço e as placas foram incubadas durante 90 min a 3 °C. As placas foram lavadas cinco vezes, secas ao ar e contadas num contador de cintilação. Os anticorpos de murganho anti-EGF-r 225 e 528 (Calbiochem) foram utilizados somo controlos.

Co-Selecção de Anticorpos Anti-EGF-r com o Anticorpo m225

Como anteriormente discutido, foi demonstrado que o anticorpo 225 possui uma elevada afinidade para, e inibição eficaz da ligação de EGF e TGF-a a EGF-r. Deste modo, espera-se que se forem seleccionados anticorpos humanos contra EGF-r que sejam preparados de acordo com a presente invenção com o anticorpo 225 num ensaio de competição, seriam seleccionados os anticorpos contra o mesmo ou epitopo semelhante a que se liga o anticorpo 225.

Consequentemente, conduziram-se ensaios BIAcore em que o EGF-r solúvel purificado a partir de membranas de células A431 (Sigma, E—3641) foi pré-tratado com o anticorpo 225 e tratado a seguir com anticorpos da invenção. Quando os anticorpos da invenção não se ligaram, esses anticorpos da invenção foram analisados quanto à afinidade de ligação como anteriormente descrito.

Na seguinte Tabela, são proporcionadas as medições de afinidade para alguns dos anticorpos seleccionados deste modo:

Tabela I

Como será observado, os antieorpos seleccionados deste modo possuem afinidades e constantes de ligação excepcionalmente elevadas. EXEMPLO 3

Estruturas de Anticorpos Anti-EGF-r Preparados de acordo com a Invenção

Na discussão seguinte, ê proporcionada a informação estrutural relacionada com anticorpos preparados de acordo com a invenção. A fim de analisar as estruturas de anticorpos produzidos de acordo com 3 invenção, foram clonados genes codificando os fragmentos de cadeias pesadas e leves ;ls hibridoma particular. A clonagem e sequenciação génica foram realizadas como se segue: liRfe poli (A) ' foi isolado a partir de, aprcximadamefite, 2 X iír bdldlsb de hibridoma derivadas de XenoMurganhos imunizados utilizando um kit Fast-Track (Invitrogen). A produção de ADNc iniciado aleatoriamente foi seguida de PGR. Os iniciadores específicos da região variável da família VK humana ou VK humana (Marks et al., 1991) ou um iniciador % humano universal, MG-30 (CAGGTGCAGCTGGAGCAGTCIGG)(SEQ ID N°:l) foi utilizado em combinação com iniciadores específicos da região constante Cy2 humana (MG-40d; 5'-GCTGAGGGAGTAGAGTCCTGAGGA-3') (SEQ ID N°:2) ou região constante Ck (h:<P2; como anteriormente descrito em Green et al., 1994). As sequências de transcritos das cadeias pesadas e kapa derivadas de Mab humanos de hibridomas foram obtidas por sequenciação directa de produtos de PCR produzidos a partir de ARN poli(AT) utilizando os iniciadores anteriormente descritos. Os produtos de PCR foram igualmente clonados no pCRII utilizando um kit de clonagem TA (Invitrogen) e ambas as cadeias foram sequenciadas utilizando kíts de sequenciação de terminação de corante da Prism e uma máquina de sequenciação ABI 377. Todas as sequências foram analisadas por alinhamentos contra o "directório de sequências V BASE" (Tomlinson et al., MRC Centre for Protein Engineering, Gambridge, UK) utilizando os programas de software MacVector e Geneworks. ãÊJhrMemtk Ml -1 C anticorpo segregado peio hibridoma El.l compreende um anticorpo IgG2 humano possuindo uma cadeia lebb kapa humana. Os anticorpos foram anaiisados quanto à r estrutural relacionada com a utilização géníca da sua cadeia pesada e cadeia leve, bem como as suas sequências de amxnoácidos. Deste modo, a utilização génica da cadeia pesada VK, D e JH e da cadeia leve Vk e Jk foi analisada e as diferenças entre o produto codificado e a utilização génica particular foram igualmente analisadas. Consequentemente, o anticorpo segregado pelo hibridoma El.l demonstrou a seguinte utilização génica:

% - 4-M

Como indicado no directório de sequências V BASE, a sequência de aminoacidos codificada pelo gene VH 4-31 corresponde a:

VSGGSISSGGYYWSWIRQHPOKCLBWIGYI YYSGSTYYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAAtrrAVYYCAS SEQ ID N°:19

Como indicado no directório de sequências V BASE, a sequência de arninoácidos codificada pelo gene Vk iSitd corresponde a:

SEÇ ID >í';::2G A informação das sequências de arninoácidos e nucleotídicas respeitantes às cadeias pesadas e leves 4 proporcionada a seguir c respeito às Figuras 1-4. A figura i ê uma sequência de aminoáeidos de una molécula de imunoglobulina de cadeia pesada que é segregada pelo hibridoma El.l. As diferenças entre a sequência codificada pelo gene variável de cadeia pesada 4-31 e pela sequência da cadeia pesada segregada por El.l estão indicadas em negrito e Letra aumentada. A sequência contígua desde CDR1 até CDR3 está indicada per sublinhado e cada uma das sequências CDR1, CDR2 e CDR3 está indicada per sublinhado duplo. A Figura 2 ê uma sequência nucleotídica do ADNc codificando a molécula de imunoglobulina de cadeia pesada da Figura 1 que foi clonada a partir do hibridoma El.l. A Figura 3 é uma sequência de arninoácidos de uma molécula de imunoglobulina de cadeia leve kapa que é segregada pelo hibridoma El.l. As diferenças entre a sequência codificada pelo gene variável de cadeia leve 018 e pela sequência da cadeia leve segregada por Ei.l estão indicadas em negrito e letra aumentada. A sequência contígua desde CDRl até CER3 está indicada por sublinhado e cada uma das sequências CDRl, CDR2 e CDR3 está indicada por sublinhado duplo. A Figura 4 à uma sequência nucleotídica do ADNc codificando a molécula de imunoglobulina de cadeia leve kapa da Figura 3 que foi clonada a partir do hibridoma El.l. O anticorpo segregado pelo hibridoma E2.4 compreende um anticorpo IgG2 humano possuindo uma cadeia leve kapa humana. Os anticorpos tmous analisados quanto é informação estrutural relacionada com a utilização génica da sua cadeia pesada e cadeia leve, bem como as suas sequências de aninoácidos. Deste modo, a utilização génica da cadeia pesada D e JK e da cadeia leve Vk e Jk foi anaiisada e as diferenças entre o produto codificado e a utilização génica particular foram igualmente analisadas. Consequentemente, o anticorpo segregado pelo hibridoma E2.4 demonstrou a seguinte utilização génica: VC - Í":ÍÍ d - píitm '»v ' «i

% - UlB jk « ··< A informação das sequências de aminoácidos e nucleotídicas respeitantes as cadeias pesadas e leves é proporcionada a seguir com respeito as Figuras 5-8. A Figura 5 é uma sequência de aminoacidos de uma molécula de imunoglobulina de cadeia pesada que é segregada pelo hibridoma E2.4. As diferenças entre a sequência codificada pelo gene variável de cadeia pesada 4-31 e pela sequência da cadeia pesada segregada por E2.4 estão indicadas em negrito e letra aumentada. A sequência contígua desde CDR1 até CDR3 está indicada por sublinhado e cada uma das sequências CDR1, CDR2 e CDR3 está indicada por sublinhado duplo. A Figura 5 é uma sequência nucleotídica do ADNc codificando a molécula de imunoglobulina de cadeia pesada da Figura 5 que foi clonada a partir do hibridoma E2.4. A riditt 7 é imo s:s;íptm:;;:i.i de aminoácidos de uma. molécula de imunoglobulina de cadeia leve kapa quê é segregada pelo hibridoma E2.4. As diferenças entre a sequência codificada gene variável de cadeia leve 018 e pela sequência da cadeia leve segregada, por E2.f estão indicadas em negrito e letra aumentada. A sequência contígua desde CDRl até CDR3 está indicada por sublinhado e cada uma das sequências CDRl, CDR2 e CDR3 está inaicada por sublinhado duplo. A Figura 8 e uma sequência nucleotídica do ADNc codificando a molécula de imunoglobulina de cadeia leve kapa da Figura 7 que foi cionada a partir do hibridoma E2.4.

Hibridoma E2.5 O anticorpo segregado pelo hibridoma E2.5 compreende um anticorpo IgG2 humano possuindo uma cadeia leve kapa humana. Os anticorpos foram analisados quanto a informação estrutural relacionada com a utilização génica da sua cadeia pesada e cadeia leve, bem como as suas sequências de aminoácidos. Deste modo, a utilização génica da cadeia pesada VH, D e JK e da cadeia leve Vk e Jk foi analisada e as diferenças entre o produto codificado e a utilização génica particular foram igualmente analisadas. Consequentemente, o anticorpo segregado pelo hibridoma E2.5 demcnstrou a seguinte utilização génica: A informação das cfr--1 oc de aminoácidos e qyclslÇR.:b:ilSrS:s respeitantes às cadeias pesadas e leves é proporcionada a seguir com respeito as Figuras 9-12. A Figura 9 é aua sequência de aminoácidos ae uma molécula de la'mll n& de cadeia pesada que é segregada pelo hibridoma E2.5. As diferenças entre a sequência codificada pelo gene variável de cadeia pesada 4-31 e pela sequência da cadeia pesada segregada por E2.5 estão indicadas em negrito e letra aumentada. A sequência contígua desde CDR1 até CDR3 está indicada por sublinhado e cada uma das sequências CDRÍ, CDR2 e CDR3 está indicada por sublinhado duplo. A Figura 10 é uma sequência nucleotidica do ADNc codificando a molécula de imunogiobulina de cadeia pesada da Figura 9 que foi clonada a partir do hibridoma E2.5. A Figura 11 é uma sequência de aminoácidos de uma molécula de imunogiobulina de cadeia leve kapa que é segregada pelo hibridoma E2.5. As diferenças entre a sequência codificada pelo gene variável de cadeia leve 018 e pela sequência da cadeia leve segregada por E2.5 estão indicadas em negrito e letra aumentada. A sequência contígua desde CDR1 até CDR? está indicada por sublinhado e cada uma das sequências CDR1, CDR2 e CDR3 está indicada por sublinhado duplo. A Figura 12 é uma sequência nucleotidica do ADNc codificando a molécula de imunogiobulina de cadeia leve kapa da Figura 11 que foi clonada a partir do hibridoma E2.5.

Mtztdúmã E§\ 2 C anticorpo segregado pelo hibridoma E6.2 compreende um anticorpo IgG2 humano possuindo uma cadeia leve kapa humana. Os anticorpos foram analisados quanto à informação estrutural relacionada com a utilização génica da sua cadeia pesada e cadeia leve, bem como as suas sequências de aminoácidos. Deste modo, a utilização génica da cadeia pesada 11, D e Jh e da cadeia leve Vk e Jk foi analisada e as diferenças entre o produto codificado e a utilização génica particular fcram igualmente analisadas. Consequentemente, o anticorpo segregado pelo hibridorna E6.2 demonstrou a seguinte utilização génica: VH - 4-31 D - ? (CNTCCCTT) - 6

Vk- 018

Jk - 1 A informação das sequências de aminoácidos e nucleotidicas respeitantes as cadeias pesadas e leves é proporcionada a seguir com respeito as Figuras 13-16. A Figura 13 é uma sequência de aminoácidos de uma molécula de imunoglobulina de cadeia pesada que é segregada pelo hibridorna E6.2. As diferenças entre a sequência codificada pelo gene variável de cadeia pesada 4-31 e pela sequência da cadeia pesada segregada por E6.2 fôirbto indicadas em negrito e letra aumentada. A sequência contígua desde CDR1 até CDR3 esta indicada por sublinhado e cada uma das sequências CDR1, CDR2 e CDR3 Aotâ indicada por sublinhado duplo. A Figura 14 é uma sequência nucleotídica do ADNc codificando a molécula de imunoglobulina de cadeia pesada da Figura 13 que foi clonada a partir do hibridorna E6.2. A Figura 15 é umA sequência de aminoácidos de uma sqiéqulé ae de cadeia leve kapa que i segregada pelo hibridorna E6.2. As diferenças entre a ;s*Ípl5çpi;& codificada pelo gene variável de cadeia leve 018 e pela sequência da cadeia leve segregada por E6.2 estão indicadas em negritc e letra aumentada. A sequência contígua desde CDR1 até C333 estâ indicada por áubliKSiiidd e cada sarna das sequências CDR1, CDR2 e CDR3 estâ indicada por sublinhado duplo. A Figura 16 e uma sequência nucleotídica do ADNc codificando a molécula de imunoglobulina de cadeia leve kapa da Figura 15 que fci clonada a partir do hibridoma E6.2.

Hibridoma E6.4 O anticorpo segregado pelo hibridoma E6.4 compreende um anticorpo IgG2 humano possuindo uma cadeia leve kapa humana. Os anticorpos foram analisados quanto à informação estrutural relacionada com a utilização génica da sua cadeia pesada e cadeia leve, bem como as suas sequências de aminoacidos. Deste modo, a utilização genica da cadeia pesada VH, D e JH e da cadeia leve Vk e Jk foi analisada e as diferenças entre o produto codificado e a utilização génica particular foram igualmente analisadas. Consequentemente, o anticorpo segregado pelo hibridoma E6.4 demonstrou a seguinte utilização génica:

Como indicado no directório de sequências V BASE, a sequência de aminoácidos codificada peio gene Vk 012 corresponde a:

T;;-m«^ftSÍ:?.SSnXWYQ<JKPGKAPKLL:YAASSLQSGVPSRrSGSGSGtDETLTISSLQPD0?ATTYCQQ3YSTE SEQ ID N° : 21 A informação das sequências de aminoácidos e nudeotídícas respeitantes as cadeias pesadas e leves é proporcionada a seguir com respeito às Figuras 17-20. A Figura 17 é uma sequência de aminoacidos de uma molécula de imunoglobulina de cadeia pesada que é segregada pelo hibridoma E6.4. As diferenças entre a sequência codificada pelo gene variável de cadeia pesada 4-31 e peia sequência da cadeia pesada segregada por E6.4 estão indicadas em negrito e letra aumentada. A sequência contígua desde CDR1 até CDR3 esta indicada por sublinhado e cada uma das sequências CDR1, CDR2 e CDR3 está indicada por sublinhado duplo. A Figura 18 é uma sequência nucleotídica do ADNc codificando a molécuia de imunoglobulina de cadeia pesada da Figura 17 que foi clonada a partir do hibridoma E6.4. A Figura 19 é uma sequência de aminoácidos de uma molécula de imunogiobulina de cadeia leve kapa qae é segregada pelo hibridoma E6.4. As diferenças entre a sequência codificada pelo gene variável de cadeia leve 012 e pela sequência da cadeia leve segregada por E6.4 estão indicadas em negrito e letra aumentada. & sequência contígua desde CDR1 até CDR3 está indicada por e cada uma das sequências CDR1, CDR2 e CDR3 está indicada por sublinhado duplo. A Figura 20 é uma sequência do ADNc cod:ficando a molécula de imunoglobulina de cadeia leve kapa da Figura 19 que foi clonada a partir do hibridoma E6.4.

Hibridoma E2.ll O anticorpo segregado pelo hibridoma E2.ll compreende um anticorpo IgG2 humano possuindo uma cadeia leve Kapa humana. Os anticorpos foram analisados quanto a informação estrutural relacionada com a utilização génica da sua cadeia pesada e cadeia leve, bem como as suas sequências de aminoacidos. Deste modo, a utilização génica da cadeia pesada VK, D e Jh e da cadeia leve Vk e Jk foi analisada e as diferenças entre o produto codificado e a utilização génica particular foram igualmente analisadas. Consequentemente, o anticorpo segregado pelo hibridoma E2.ll demonstrou a seguinte utilização génica: w 4-Cl ; 4? · < SV A .· Λ ·· % 4 Vt " VÍK - •'Ί·.

Como indicado ht sequência de aminoácidos directório de sequências V BASE, a codificada pelo gene V':: 4-61 sorresponde a: v*X:S*(aVÍ «nvs*: A informação das sequências de aminoácidos e nucleotídicas respeitantes às cadeias pesadas e leves é proporcionada a seguir com respeito às , \; 21-24. A Figura 2i é uma sequência de aminoácidos de uma molécula de imunoglobulina de cadeia pesada que é segregada pele hibridoma E2.ll. fe diferenças entre a sequência codificada peio gene variável de cadeia pesada 1-61 e pela sequência da cadeia pesada segregada por E2.ll estão indicadas em negrito e letra aumentada. A sequência contígua desde CDR1 até CDR3 está indicada por sublinhado e cada uma das sequências CDR1, CDR2 e CDR3 esta indicada por sublinhado duplo. A Figura 22 é uma sequência nucleotidica do MIt codificando a molécula de imunogiobulina de cadeia pesada da Figura 21 que foi clonada a partir do hibridoma E2.ll. A Figura 2 3 é uma sequência de aminoácidos de uma molécula de imunoglobulina de cadeia leve kapa que é segregada pelo hibridoma E2.ll. As diferenças entre a sequência codificada pelo gene variável de cadeia leve 018 e pela sequência da cadeia leve segregada por E2.ll estão indicadas em negrito e letra aumentada. A sequência contígua desde CDR1 até CDR3 está indicada por sublinhado e cada uma das sequências CDR1, CDR2 e CDR3 está indicada por sublinhado duplo. A Figura 24 é uma sequência nucleotidica do ADNc codificando a molécula de imunoglobulina de cadeia leve kapa da Figura 23 que foi clonada a partir do hibridoma E2.ll.

Hibridoma E6.3 0 anticorpo segregado pelo hibridoma E5.3 compreende um anticorpo IgG2 humano possuindo uma leve kapa humana. 3s anticorpos foram analisados quantc a informação estrutural relacionada com o utilização génica da sua cadeia pesada e cadeia leve, bem como as suas sequências de aminoacidos. Deste modo, a utilização génica da cadeia pesada VH, c e JK e da cadeia leve Vk e Jk foi analisada e as diferenças entre c produto codificado e a utilização génica particular foram igualmente analisadas. Ccnsequentemente, o anticorpo segregado pelo hibridoma E6.3 demonstrou a seguinte utilização génica:

A informação das sequências de aminoacidos e nucleotídicas respeitantes às cadeias pesadas e leves é proporcionada a seguir com respeito as Figuras 25-28. A Figura 25 é urra sequência de aminoácidos de uma molécula de imunoglobulina de cadeia pesada que é segregada pelo bibridoma E6.3. As diferenças entre a sequência codificada pelo gene variável de cadeia pesada 4-61 e pela sequência da cadeia pesada segregada por E6.3 estão indicadas em negrito e letra aumentada. A seguencia contígua desde CDR1 &tá CDR3 está indicada por sublinhado e cada uma das sequências CDR1, CDRL e CDR3 está indicada por sublinhado duplo. k Figura 26 á ns sequência nucleotídica do ADMc codificando a molécula de imunoglobulina de cadeia pesada da Fistgxcg 25 que foi clonada a partir dc hibridoma E6.3. A Figura 27 é uma sequência de aminoácidos de uma molécula de imunoglobulina de cadeia leve kapa que é segregada pelo hibridoma E6.3. As diferenças entre a sequência codificada pelo gene variável de cadeia leve 018 e pela sequência da cadeia leve segregada por E6.3 estão indicadas em negrito e letra aumentada. A sequência contígua desde CDR1 ate CDR3 esta indicada por sublinhado e cada uma das sequências CDR1, CDR2 e CDR3 está indicada por sublinhado duplo, A Figura 28 é uma sequência nucleotídica do ADNc codificando a molécula de imunoglobulina de cadeia leve kapa da Figura 27 que foi clonada a partir do hibridoma E6.3. O anticorpo segregado pelo hibridoma E7.6.3 compreende um anticorpo IgG2 humano possuindo uma cadeia leve kapa humana. Os anticorpos foram analisados quanto à informayão estrutural relacionada com a utilização génica da sua cadeia pesada e cadeia leve, bem como as suas sequências de aminoácidos. Deste modo, a utilização génica da cadeia pesada D e .¾ e da cadeia leve Vk e Jk foi analisada e as diferenças entre o produto codificado e a utilização génica particular foram igualmente analisadas. Consequentemente, o anticorpo segregado pelo hibridoma E7.6.3 demonstrou a seguinte utilização génica: A informação das sequências de aminoácidos e nucleotídicas respeitantes as cadeias pesadas e leves é proporcionada a seguir com respeito as Figuras 29-32. A Figura 29 é uma sequência de aminoácidos de uma molécula de imunoglobulina de cadeia pesada que é segregada pelo hibridoma E7.6.3. As diferenças entre a sequência codificada pelo gene variável de cadeia pesada 4-61 e pela sequência da cadeia pesada segregada por E7.6. estão indicadas em negrito e letra aumentada. A sequência contígua desde CDR1 até CDR3 está indicada por sublinhado e cada uma das sequências CDR1, CDR2 e CDR3 está indicada por sublinhado duplo. A Figura 30 e uma sequência nucleotídica do ADNc codificando a molécula de imunoglobulina de cadeia pesada da Figura 29 que foi clonada a partir do bibridoma E7.6.3. A Figura 31 é uma sequência de aminoácidos de uma molécula de imunoglobulina de cadeia leve kapa que é segregada pelo hibridoma E7.6.3. As diferenças entre a sequência codificada pelo gene variável de cadeia leve 018 e pela sequência da cadeia leve segregaaa por E7.6.3 estão indicadas em negrito e letra aumentada. A sequência contígua desde CDR1 &l:.é CDR3 êêts indicada por sublinhado e cada uma das sequências CDR1, CDR2 e CDR3 está indicada por sublinhado duplo. A Figura 32 é uma sequência nucleotídica do ADNc codificando a molécula de imunoglobulina de cadeia 1.¾¾¾ kapa da

Figura 31 que foi clonada a partir do hibridoma E7.6.3.

Análise de Substituições de Aminoácidos das Cadeias Pesadas e Leves A Figura 33 proporciona uma comparação de comparações da sequência de aminoácidos da cadeia pesada do anticorpo especifico de anti-EGF-r com a sequência de aminoácidos do gene particular VH que codifica a cadeia pesada do anticorpo particular. A Figura 34 proporciona uma comparação semelhante de comparações da sequência de aminoácidos da cadeia leve do anticorpo especifico de anti-EGF-r com a sequência de aminoácidos do gene particular Vk que codifica a cadeia leve do anticorpo particular. Como será observado, existem diversas substituições de aminoácidos notavelmente conservadas entre as sequências das cadeias pesadas e leves. Em particular, nas cadeias pesadas dos anticorpos, todas as moléculas das cadeias pesadas são codificadas por genes da família VH 4 e têm uma Glicina na posição 11 em anticorpos codificados por vi 4-31 e Serina na posição 10 em anticorpos codificados por VK 4-61 que é cada uma substituída por um Ácido Aspártico. Igualmente nas cadeias pesadas V* 4-31, todos excepto uss dos anticorpos inclui uma substituição de Serina na posição 7 poç Asparagina. Uma substituição semelhante, embora não tão predominante é observada na pxsiçkú 35, onde uma Serina em dois dos codificados por V:. 4-31 e dois dos anticorpos codificados por Vk 4-61 é substituída por orna 1 :>{,···>a r. .·; * Igualmente, em dois dos 4-31 e dois dos anticorpos codificados por codificados por ¥!: 4-01 existem substituições na posição 28 onde, em cada caso, uma tírosina é substituída por uma Serina (E2.4) ou uma Histidina (E6.4, E2.ll e E7.6 .. Cinco dos anticorpos, três aos anticorpos codificados por 4-31 e dois dos anticorpos codificados por % 4-61, possuem Valina em vez de Leucina (E2.4 e E2.ll) ou Jsoleucina (E2.5, Eó.2 e E7.6.3) na posição 50.

Com respeito as sequências de aminoácidos das cadeias leves kapa, todas as sequências são codificadas por genes da família Vk I, com sete das moléculas sendo codificadas pelos genes 018 e uma (E6.4) sendo codificada por um gene 012. Existe um elevado grau de homologia entre os produtos génicos 012 e 018, como demonstrado quando a molécula E6.4 è comparada com o produto génico 018, juntamente com as outras moléculas, na Figura 34. A molécula E6.4 possui apenas duas substituições relativamente ao produto genico 012, como apresentado na Figura 19 e apenas 13 substituições relativamente ao produto génico 018. Todos os anticorpos possuem uma substituição na posição 74 em CDR3, onde uma Asparagina é substituída por uma Serina (El.l, E2.5, E2.ll e E6.3), Histidina (E2.4, E6.2 e E7.6.3) ou Arglaltia E . ) . As restantes substituições são menos altamente conservadas.

Contudo, um certo número de anticorpos parece possuir substituições no seio das CDR. Contudo, é interessante notar que E7.6.3, que é um anticorpo com afinidades muito elevadas, não possui nenhumas substituições de aminoácidos na sequência de aminoácidos da cadeia leve até quase proximal a CDR3 e no seio de CDR3.

Será entendido que cada uma das substituições de aminoácidos identificadas anteriormente existe ítaibí? peito ou no seio de una CDR. Tais pareciam imimtençer algum efeito sobre a ligação do anticorpo à molécula do receptor de EGF. Para além aissc, tais substituições podiam ter um efeito significativo sobre a afinidade dos anticorpos.

Como anteriormente discutido, demonstrou-se que os anticorpos anti-EGF-r possuem determinadas actividades anti-tumorais. As experiências seguintes foram efectuadas a fim de determinar se os anticorpos de acordo com a presente invenção possuíam tais actividades anti-tumorais. EXEMPLO 5

Bloqueio da Ligação de EGF e TGF-a a Células do Carcinoma Epidermóide Humano A431 por Anticorpos Humanos Anti-EGF-r in vitro

Foi conduzido um ensaio in vitro para determinar se os anticorpos de acordo com a presente invenção eram kapazes de bloquear a ligação de EGF a uma linha celular do carcinoma humano. A experiência foi conduzida para comparar a ligação de anticorpos de acordo com a invenção com o anticorpo monoclonal murino 225 que, como anteriormente discutido, demonstrou previamente actividade anticancerosa.

Neste exemplo, foi utilizada a linha celular do carcinoma epidermóide humano A431. A Linha celular M3I é conhecida pelo seu elevado nível de expressão ae EGF-r (cerca de 2 X 10b moléculas ikí EGF-r por célula). Por conseguinte, são necessárias concentrações superiores de anticorpos anti-EGF-r poro saturar a é demonstrado o totalidade dos sítios de ligação. Cs resultados deste exemplo •Mó apresentados na Figura 35. Na Figura, bloqueio da ligação de EGF marcado com I^3 a células do carcinoma epidermóide humano Mol por um anticorpo humano anti-EGF-r in vitro. Na Figura, (C) representa os resultados alcançados pelo anticorpo anti-EGF-r de acordo com a invenção (E7.6.3), (0) representa os resultados alcançados anticorpo monoclonal murino 225 e (s) representa os resultados alcançados por um anticorpo IgG2 humane de controlo, nãc especifico. A Figura 36 apresenta a inibição da ligação de EGF a células do carcinoma epidermóide humano A411 por um painel de anticorpos humanos anti-EGF-r in vitro quando comparada a 225, 528 e aos controlos IgG2 humanos não específicos. Na Figura, (□) representa os resultados alcançados pelo anticorpo monoclonal murino 225, (o) representa os resultados alcançados pelo anticorpo monoclonal murino 528, (t) representa os resultados alcançados utilizando o anticorpo El.l, (s) representa os resultados alcançados utilizando o anticorpo E2.4, (4) representa os resultados alcançados utilizando o anticorpo E2.5, (3) representa os resultados alcançados utilizando o anticorpo E2.6, (u) representa os resultados alcançados utilizando o anticorpo E2.ll e ΐ ) representa os resultados alcançados utilizando um anticorpo IgG2 humano de controlo, não especifico.

Os resultados indicam que os anticorpos de acordo com a invenção podem bloyuear melhor a ligação de EGF a EGF-r expresso à superfície em íGUalaís A431 do que os anticorpos 225 e 528. Os anticorpos de acordo com a invenção parecem iniciar a inibição da ligação a uma concentração de 8 nM, em a uma concentração de F! nM para o anticorpo 225.

Com respeito á inibição da ligação de TOF-çq é observada oíoa fôtlõá-ciâL semelhante através da atiiiMgéò de anticorpos de acordo com a òoí&ççiiç quando comparada ao anticorpo 225. d Figura 37 apresenta a inibição da ligação do TGF-a a eiloias do carcinoma epidermóide dcm-ãos A431 por anticorpos humanos anli-EGF-r in vítro, onde >;Ci| representa os resultados alcançados pelo anticorpo monoclonal murino 225, (u) representa os resultados alcançados utilizando o anticorpo E6.2, (i) representa os resultados alcançados utilizando o anticorpo E6.3, (s) representa os resultados alcançados utilizando o anticorpo E7.2, (n) representa os resultados alcançados utilizando o anticorpo E7.10, (t) representa os resultados alcançados utilizando ο E7.6.3 e C:’i representa os resultados alcançados utilizando um anticorpo IgG2 humano de controlo, não específico.

Os resultados indicam que os anticorpos de acordo com a invenção podem bloquear melhor a ligação de TGF-α a EGF-r expresso a superfície em ceiulas A431 do que o anticorpo 225. Os anticorpos de acordo com a invenção parecem iniciar a inibição da ligação a uma concentração de 0,1 r,M, em comparação a uma concentracão de 1 nM para o anticorpo 225.

Bloqueio da Ligação de EGF a Células do Adenocarcinoma do Cólon Humano SW948 por Anticorpos Humanos Anti-EGF-r in vitro

Foi conduzido outro ensaio in vitro para determinar se os anticorpos de acordo com a presente invenção eram kapazes de bloquear a ligação de EGF a ainda outra linha celular do ccrcincmí:: humano. ··. experiência foi conduzida para a :om o anticorpo ligação de anticorpos de acordo com a c monoclonal murino 225 que, como anteriormente discutida, demonstrou previamente actividade anticancerosa.

Neste exemplo, foi utilizada a linha celular do adenocarcinoma do cólon humano SW948. Contrastando com a linha celular Ά431, a linha celular SW948 possui expressão relativamente baixa de EGF-r à sua superfície (cerca de 40000 moléculas per célula) . Por conseguinte, são necessários menos dos anticorpos anti-EGF-r para saturar a totalidade dos sítios de ligação dos receptores nas células. Os resultados deste exemplo são apresentados na Figura 38. Na Figura, é demonstrado o bloqueio da ligação de EGF marcado com ϊ“···; a células do adenocarcinoma do cólon humano SW948 por um anticorpo humano anti-EGF-r iri vitro. Na Figura, (m) representa os resultados alcançados por um anticorpo anti-EGF-r de acordo com a invenção (E7.6.3), (ti) representa os resultados alcançados pelo anticorpo monoclonal murino 225 e (s) representa os resultados alcançados por um anticorpo lgG2 humano de controlo, não específico.

Os resultados indicam que o anticorpo de acordo com a invenção bloqueia a ligação de EGF a células SW948, pelo menos tão bem como o anticorpo 225. De facto, a curva está ligeiramente melhorada com respeito ao anticorpo de acordo com a invenção, demonstrando irtibldib a concentrações mais baixas do que o anticorpo 225. EXEMPLO 7

Inibição do Crescimento de Células do Adenoearcinoma do Cólon Humano SW948 por Anticorpos Humanos Anti-EGF-r in vitro

Foi igualmente conduzido um ensaio in vitro para determinar se, e em que medida, em comparação ao anticorpc 225, os anticorpos de acordo com a invenção eram kapazes de inibição do crescimento de células cancerosas. A experiência foi conduzida para comparar a inibição por anticorpos de acordo com a invenção com a inibição pelo anticorpo monoclonal murino 225 que, como anteriormente discutido, demonstrou previamente actividade anticancerosa.

Neste exemplo, foi utilizada a linha celular do adenoearcinoma do cólon humano SW948. Nas nossas mãos, apenas a linha celular SW948 apresentou crescimento celular dependente de EGF. Em contrapartida, a linha celular A431 apresentou inibição de crescimento na presença de EGF in vitro. Os resultados são apresentados na Figura 39 onde se demonstra que os anticorpos humanos anti-EGF-r de acordo com a presente invenção inibem o crescimento de células SW948 in vitro. Na Figura, (m) representa os resultados alcançados por um anticorpo anti-EGF-r de acordo com a invenção (E7.6.3), ÍOj representa os resultados alcançados pelo anticorpo rnonoclonal murino 225 e (s) representa os resultados $&$&»££$$$ por um anticorpo IgG2 humano de controlo, não especifico.

Os resultados indicam que o anticorpo de acordo com a invenção inibe o crescimento de células SW948, peio menos tâo bem como o anticorpo 225. ias facto, a curva está ligeiramente melhorada com rèoporlUs ao anticorpo do acordo com a invenção, demonstrando uma aparente inibição no crescimento celular de 100% a, aproximadamente, 10C pg/rnL, ao passo que o anticorpo 225 parece estabilizar a um nível de inibição entre 80 a 90% na mesma gama de dosagem. EXEMPLO 8

Inibição do Crescimento do Carcinoma Epidermóide Humano em Murganhos Atímicos por Anticorpos Humanos Anti-EGF-r in vivo

Na presente experiência, procurou determinar-se se os anticorpos de acordo com a presente invenção eram Xzp.mm·, de inibir o crescimento celular tumoral in vivo. lia experiência, murganhos atímicos com 8 semanas de idade foram inoculados subcutaneamente com a linha celular do carcinoma epidermóide humano Ά431. Injectaram-se os murganhos com 5 X HP tblulã.8 de A431. Uma das duas dosagens de um anticorpo de acordo com a invenção ou um de dois controlos foi ínjectado intraperitonealmente no mesmo dia em que as células A431 foram inoculadas. Seguiram-se três administrações do anticorpo ou controlo e os murganhos foram seguidos quanto a formação subcutânea e tamanho do tumor. As dosagens de anticorpo utilizadas foram 1,0 mg ou 0,2 mg. Os contrclas foram solução salina tamponada com fosfatos cu um anticorpo IgG2 humano não específico.

Os resultados desta experiência Pio apresentados na Figura 40. Na Figura, a inibição do crescimento de células ao carcinoma epidermóide humano em murganhos atímicos através da ·.. roç-uu do anticorpos humanos anti-EGF-r de acordo com a invenção in vivo á evidente. Na Figura, (s) representa os resultados alcançados 0:0:0 uma dosagem de 1,0 mg de um sctlcíítp-v haaoood anti-EGF-r de acordo com a presente loosood-a (E7.6.3) òn-Sò , (t) representa os resultados alcançados com uma dosagem de 0,2 mg ao anticorpo E.7.6.3 (·?!*»&? # O representa os resultados alcançados por um anticorpo IgG2 humano de controlo, não especifico, ίη··-δ5 e (m) representa os resultados alcançados utilizando solução salina tamponada com fosfatos como controlo (n=6) . Não foi observado crescimento tumoral em animais tratados ccm o anticorpo E .6.3, ao passo que os animais de controlo desenvolveram tumores significativos no espaço de 25 dias a contar da inoculação de células tumorais.

Na mesma experiência, foram comparados três anticorpos de acordo com a invenção. Os resultados são apresentados na Figura 41. Cada um dos anticorpos, E7.6.1 a 1 mg em 5 murganhos e 0,2 mg em 4 murganhos, E2.5 a 1 mg em 3 murganhos e 0,2 mg em 3 murganhos, e El.l a 1 mg em 3 murganhos, demonstrou inibição da formação do carcinoma epidermóide humano nos murganhos em comparação a controlas. A totalidade des animais de cont rolo (incluindo 6 animais tratados com PBS e 6 animais tratados com

IgG2 humano) desenvolveu tumores significativos no espaço de 19 dias a contar da inoculação, ao passo que áiri.huM dos animais trátados com os anticorpos humanos anti-EGF-r de acordo com a invenção desenvolveu tumores no espaço de 19 aias a contar da inoculação. A Figura 42 apresenta os resultados do seguimento dos animais desta mesma experiência mencionada anteriormente durante 03 dias após inoculação com c carcinoma epidermeide humano. Os resultados desca experiência são ca Figura 42. Na

Figura, observar-se-á que a totalidade dos murganhos de itoprxol :· r ío:;, desenvolvido tumores nu espaço de 20 dias a contar da inoculação de células tumorais. Em contrapartida, o primeiro murganno tratado com um anticorpo de acordo com a presente invenção a desenvolver um tumor foi no dia 70. Mé ao dia 130, apenas 4 de 15 dos animais experimentais tinha desenvolvido tumores. Interessantemente, nenhum dos animais experimentais tratado com a dosagem de 0,2 mg do anticorpo E2.5 desenvoiveu tumores dentro do período de teste. A experiencia anterior com respeito a este Exemplo 8 demonstra que os anticorpos de acordo com a presente invenção, se administrados contemporaneamente com a inoculação de uma linha celular tumoral, parecem prevenir quase totalmente a iniciação do crescimento celular tumoral e a iniciação do tumor. Além disso, observar-se-á que o efeito inibidor sobre o crescimento celular tumoral parece de longa duração. EXEMPLO 9

Erradicação do Crescimento do Carcinoma Epidermóide Humano em Murganhos Atimicos por Anticorpos Humanos Anti-EGF-r in vivo

Embora a prevenção do crescimento celular tumoral e/ou estabelecimento de um tumor, como anteriormente discutido com respeito ao exemplo precedente, seja uma descoberta positiva, de um ponto de vista terapêutico, a erradicação de um tumor estabelecido também é altamente desejável. nas experiências seguintes examinou-se se os anticorpos de acordo com a eram kapazes de erradicar um tumor estabelecido num Dados anteriores produzidos com respeito ao anticorpc; 225 indicaram que, a fim de erradicar eficazmente um tumor estabelecido âtiàçél da utilização do anticorpo 225, foi necessário complementar c tratamento com um agente antineoplásico. Deste modo, com respeito as nossas experiências, olhou-se para o tratamento com anticorpos, tanto iscladamente, como em combinação com o tratamento com um agente antineoplásico.

Na experiência, murganhos atimicos foram inoculados subcutaneamente com 5 X HN idfiuios do carcinoma epidermóide humano A431 no dia 0. Os murganhos foram tratados com anticorpos, agentes quimioterapêuticos e/ou controlos após o tumor ter tido uma oportunidade para se estabelecer (tamanho 1 0, 4 cm3) . Os tratament-os foram iniciados e continuaram nos dias 5, 8, 10, 14, 16 e 21, sendo as quimioterapias administradas apenas nos dias 5 e 6. As terapias consistiram em um anticorpo de acordo com a invenção (E7.6.3), o agente antineoplásico doxorubicina e uma combinação de anticorpo e doxorubicina. Os controlos foram solução salina tamponada com fosfatos ou um anticorpo IgG2 humano não específico. Cada grupo de tratamento consistiu em 5 animais. Os dados produzidos a partir das experiências são apresentados na Figura 43, onde (s) representa os resultados alcançados com uma dosagem de 1 mg de um anticorpo humano anti-EGF-r de acordo com a presente invenção (E7.6.3) (n=5), (5) representa os resultados alcanqados com uma dosagem de 125 pg de doxorubicina, (Vi representa os resultados alcançados com uma dosagem de 1 mg de um anticorpc humano anti-EGF-r de acordo com a presente invenção (E7.6.3) em combinação com uma Ροοοορρ de i25 uq de doxorubicina, <n) representa os resultados alcançados por um anticorpo IgG2 humano de controlo, não específico, e (u) representa os resultados alcançados utilizando scdruqqç salina tamponada com fosfatos como controlo. ίνΰί-Κί será observado, a administração do anticorpo E7.6.3 em combinação com a doxorubicina resultou na completa erradicação do crescimento tumoral. Para sife disso, o crescimento tunoral foi completamente detido através da administração apenas do anticorpo E7.6.3.

Numa experiência semelhante, cujos resultados são apresentados na Figura 44, no seguimento da inoculação do tumor, cinco murganhos foram tratados com 0,5 mg do anticorpo E2.5 nos dias 5, 8, 10, 14, 16 e 21 e cinco murganhos foram tratados com uma combinação do anticorpo E2.5 administrado nos dias 5, 8, 10, 14, 16 e 21 e doxorubicina administrada nos dias 5 e 6. Na Figura, (u) representa os resultados alcançados com uma dosagem de 0,5 mg do anticorpo humano anti-ESF-r E2.5, (n) representa os resultados alcançados com uma dosagem de 125 pg de doxorubicina, (s) representa os resultados alcançados com uma dosagem de 0,5 mg de um anticorpo humano anti-EGF-r de acordo com a presente invenção (E2.5) em combinação com uma dosagem de 125 ug de doxorubicina, (5) representa os resultados alcançados utilizando solução salina tamponada com fosfatos como controlo e (V) representa os resultados alcançados utilizando um anticorpo IgG2 humano de controlo, não especifico.

Como será observado, a administração do anticorpo E2.5, por si só ou em combinação com doxorubicina, resultou na quase completa erradicução de tumores nos murganhos.

Ensaios Clínicos Humanos para o Tratamento e Diagnóstico de Carcinomas Humanos através da utilização de Anticorpos Humanos

Anti-EGF-r in vivo

Introdução

Os anticorpos de acordo com a presente invenção estão indicados no tratamento de determinados tumores sólidos. Com base num combinação de factores, incluindo níveis de expressão de EGF-r, entre outros, os seguintes tipos de tumores parecem apresentar indicações preferidas: cancrc da mama, ovário, cólon, próstata, bexiga e de células não-pequenas do pulmão. Com respeito a cada uma destas indicações, três vias clínicas parecem oferecer potenciais distintos para o sucesso clínico:

Terapia adjuvante: Na terapia adjuvante, os doentes seriam tratados com anticorpos de acordo com a presente invenção em combinação com um agente quimioterapêutico ou antineoplásico e/ou terapia de radiação. Os alvos primários listados anteriormente serão tratados sob protocolo pela adição de anticorpos da invenção a terapia padrão de primeira e segunda linha. A concepção de protocolos abordará a eficácia tal como avaliado pela redução na massa turnoral, bem comc pela kapacidade para reduzir as doses habituais da quimioterapia padrãc. Estas reduções da dosagem permitirão uma terapia adicional e/ou prolongada pela redução da toxicidade associada à dcse do agente quimioterapêutico. Os anticorpos anti-EGF-r da técnica anterior o sou ou estão a Keoç utilizados em diversos ensaios clínicos em combinação com os agentes quimioterapêuticos ou antineoplásícos sdi iamictoo ÍC225: carcinoma da próstata avançado), císplatina (C 2 2 5: carcinomas da cabeça e pescoço e pubmâm avançados), taxol (C225: cancro da mama) e doxorubicina (C225: pré-clínico).

Monoterapia: Em combinação οοκ a utilização dcs anticorpos de acordo com a presente invenção na monoterapia de tumores, os anticorpos serão administrados a dcentes sem um agente quimioterapêutico ou antineoplásieo. Resultados pré-clinicos produzidos através da , . * de anticorpos de aceras com a presente invenção e aqui discutidos têm demonstrado resultados semelhantes, tanto com a terapia adjuvante como/ou com a terapia autónoma. Além disso, a monoterapia tem aparentemente sido conduzida clinicamente em doentes com cancro na fase terminal com extensa doença metastática. Os doentes pareceram apresentar alguma estab ílíZdÇâO da doença. Id. Os ensaios serão concebidos para demonstrar um efeito em doentes refractários com (cancro) tumor.

Agente de Imagiologia: Através da ligação de um radionuclídeo e . g., ítrio C°Y)) a anticorpos de acordo com a presente invenção, espera-se que os anticorpos marcados radioactivamente de acordo com a presente invenção possam ser utilizados como agentes de imagiologia de diagnóstico. Num tal papel, os anticorpos da invenção localizar-se-ão, tanto nos tumores sólidos, bem como nas lesões metastáticas de células expressando o receptor d& EGF. Em combinação com a utilização dos anticorpos da invenção como agentes de imagiologia, os anticorpos podem ser utilizados no auxilio do tratamento uiròmaióó Se tumores visto que tanto um rastreio pré- cxrúrgico bem como um se seguem para determinar que tumor persiste e/ou regressa, um anticorpo ξχχΗη)·«ύ·2ζ$ foi oi::tltuá·'::": como agan;:* de imagiologia num ensaio clínico humano de Fase 1 em doentes tendo carcinomas epidermóides do pulmão não Divgí et al. >11 -Marli Claocsn:·: l;S;:?t. vil :97-104 (1991). Os doentes foram seguidos com uma câmara de raios gama padrão anterior e posterior. Dados preliminares indicaram que todas as lesões primárias e lesões metastáticas de grandes dimensões foram identificadas, ao passo que apenas foram detectadas metade das lesões metastáticas de pequenas dimensões (inferiores a 1 cm).

Dose e Via de Administração

Embora não tenha ainda sido determinada a dosagem especifica para os anticorpos de acordo com a invenção, certas considerações de dosagem podem ser determinadas através de comparação com o produto semelhante (ImClone C225) que está na clínica. O anticorpo C225 esta a ser administrado tipicamente com doses na gama de 5 a 400 com as doses inferiores utilizadas apenas em combinação com os estudos de segurança. Os anticorpos de acordo com a invenção têm uma afinidade de um log mais elevada do que o anticorpo C225. Para além disso, os anticorpos de acordo com a presente invenção são anticorpos totalmente humanos, em comparação a natureza quimérica do anticorpo C225 e, deste modo, esperar-se-ia que o eiiminaçãc de anticorpo fosse mais lenta. Consequentemente, poder-se-á esperar que a dosagem em doentes com anticorpos de acordo com a invenyão pode ser inferior, talvez na gama de 50 a 300 mg/m2, e ainda permanecerem eficazes. A dosagem em em opoCvtçãv; à convencional da dose em mg/kg, é «s medida baseada na área de superfície e é uma medição de dosagem ccettcíctón te que é para incluir doentes de todos os tamanhos, desde bebés a adultos.

Espera-se que três abordagens de distribuição distintas ogóvm ãtoíc: para a distribuição dos anticorpos da acordo com a Iguíiíggdau d inrravenosa convencional será presumivelmente a técnica de distribuição padrão para a maioria doa tumores. Contudo, com respeita aos tumores na cavidade peritoneal, tais como tumores dos ovários, canal biiiar, outros canais e semelhantes, a administração intraperitoneal pode ser favorável para a obtenção de uma dose elevada de anticorpo no tumor e para minimizar a eliminação do anticorpo. De modo semelhante, determinados tumores sólidos possuem vasculatura que e apropriada para a perfusão regional. A perfusáo regional permitira a obtenção de uma dose elevada do anticorpo no sitio de um tumor e minimizará a eliminação de curto prazo do anticorpo.

Plano de Desenvolvimento Clínico (CDP)

Visão Geral: C CDP seguirá e desenvolvera tratamentos de anticorpos anti-EGF-r de acordo com a invenção com respeito â terapia adjuvante, monoterapia e como agente de imagiologia. Os ensaios serão utilizados inicialmente para demonstrar a segurança e serão, a seguir, utilizados para abordar a eficácia em doses repetidas. Os ensaios serão abertos comparando a quimioterapia padrão som a terapia padrão mais anticorpos de acordo com a invenção. Corno será entendido, critérios que podem ser utilizados com respeito ao recrutamento de doentes podem sei os níveis de expressão de ESF-r de tumores de doentes como determinado em biopsia.

Tal Doíio com Jotousy terapêutica na i:rnboo:*b de proteína ou anticorpo, as íiov:ttod.s ds r: iàii principalmente com íld síndroma de de citocina, i. ·::., !iLí>oo:í;rosdvp id-síirítí tremores, arrepios, (ii) 3 desenvolvimento de una resposta imunogénica contra o material (i. e., desenvolvimento de anticorpos humanos pelo dcente contra a terapêutica de anticorpos humanos ou resposta ΗΑΗΆ) e (iii) toxicidade contra células normais que expressam o receptor de EGF, e. g., hepatócitos que expressam EGF-r. Serão utilizados testes padrão e seguimento para monitorizar cada uma destas questões de segurança. Em particular, a função hepática será frequentemente monitorizada durante os ensaios clínicos a fim de avaliar lesões para o fígado, se existirem.

Ensaio Clínico Humano: Terapia Adjuvante com Anticorpo Humano Anti-EGF-r e Agente Quimioterapêutico

Será iniciado um ensaio clínico humano de Fase I para avaliar a segurança de seis doses intravenosas de um anticorpo humano anti-EGE-r de acordo com a invenção com respeito ao tratamento de um tumor sólido, e. g., cancro da mama. No estudo, será avaliada a segurança de doses únicas de anticorpos de acordo com a invenção quando utilizadas como terapia adjuvante contra um agente antineoplásico ou quimioterapêutico, tal como cisplatina, topotecano, doxorubicina, adriamicina, taxol ou similar. A concepção do ensaio incluirá a distribuição de seis doses únicas de um anticorpo de acordo com a invenção com a dosagem de anticorpo ascendendo desde, aproximadamente, cerca de 25 mg/rrú ai! cerca de 27 5 £*# decorrer do tratamento de acordo com o seguinte horário:

Os doentes serão seguidos de perto durante uma semana no seguimento de cada administração de anticorpo e quimioterapia. Em particular, os doentes serão avaliados quanto ás questões de segurança anteriormente mencionadas: (i) síndroma de libertação de citocina, i. e., hipotensão, febre, tremores, arrepios, (ii) o desenvolvimento de uma resposta imunogénica contra o material (i. e., desenvolvimento de anticorpos humanos pelo doente contra a terapêutica de anticorpo ou resposta HAHA) e (iii) toxicidade contra células normais que expressam o receptor de EGF, e. g., hepatócitos que expressam EGF-r. Serão utilizados testes padrão e seguimento para monitorizar cada uma destas questões de segurança. Em particular, a função hepática será frequentemente monitorizada durante os ensaios clínicos a fim de avaliar lesões para o fígado, se existirem.

Os doentes serão igualmente avaliados quanto ao resultado clinico e, em particular, quanto à reduçãc da massa tumoral como demonstrado por MRL ou outra imagiologia.

Assumindo a demonstração de segurança e ttta indicação de eficácia, os ensaios de Fase LI seriam §?:s:iniciados para explorar ainda a eficácia e determinar & dosagem óptima.

Ensaio Clínico Humano: Monoterapia com Anticoxpo Humano Anti-EGF-z

Assumindo que os anticorpos de acordo com a presente invenção parecem seguros com respeito ao ensaio adjuvante anteriormente discutido, um ensaio clinico humano para avaliar a eficácia e dosagem Cptima para monoterapia. Tal ensaio poderia ser realizado, e implicaria as mesmas analises de segurança e resultados, para o ensaio adjuvante anteriormente descrito, sendo a excepção que os doentes não receberão a quimioterapia concorrentemente com a receita de doses de anticorpos de acordo com a invenção.

Ensaio Clínico Humano: Imagiologia de Diagnóstico com Anticoxpo Anti-EGF-z

Uma vez mais, assumindo que a terapia adjuvante anteriormente discutida parece segura dentro dos critérios de segurança anteriormente discutidos, pode conduzir-se um ensaio clinico humano relativamente a utilização de anticorpos de acordo com a presente invenção enquanto agente de imagiologia de diagnóstico. Espera-se que o protocolo seja concebido numa forma substancialmente semelhante àquela descrita em Divgi et ai. J. Natl. Câncer Inst. 83:97-104 (1991) .

INCORPORAÇÃO REFERÊNCIA fodaa as referências aqui citadas, incluindo patentes, pedidos de patente, artigos, livros e semelhantes, e as referências ali citadas, na medida que que nàú estejam já, são psc: este meio incorporadas por referência na sua totalidade. Moirq as referências seguintes são igualmente aqui incorporadas por referência na sua totalidade, incluindo as referências citadas nessas referências:

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CRESCIMENTO

(ii) TÍTULO DA MOffiMCÂO: ANTICORPOS IRbmMkS CONTRA 0 RECEPTOR DO FACTOR DE EPIDÉRMICO (iii) NÚMERO DE SEQUÊNCIAS: 38 (iv) MORADA PARA CORRESPONDÊNCIA: (A) DESTINATÁRIO: Abgenix, Inc. (B) RUA: 7601,Dumbarton Circle (C) CIDADE: Fremont

(D) ESTADO: CA

(E) PAÍS: EUA (F) CÓDIGO POSTAL: 30555 (v) SUPORTE ííáfDRMÁTICO: SILO DE MEIO: Disquete (B) COMPUTADOR: IBM CcROAtreel 1.5 06/851362 (B) CATA DO PEDIDO: 05 DE MAIO SE 1997 (C) CLASSIFICACÃO: (vií) DADOS DE PEDIDCÇ ANTERIORES: (A) NÚMERO DE PEDIDO: (B) DATA DO PEDIDO:

ív:U.i,; r/oOlR/O/çIO DE EADRErM; lO/iólHTEB

(A) NOME: Hare, Christophe A (B) NÚMERO DE REGISTO: 37637 (C) REFERÊNCIA/NÚMERO DO REGISTO: Cell 4.20 (ix) INFORMAÇÃO DE TELECOMUNICAÇÃO: (A) TELEFONE: 510-608-6533 (B) FAX: 510-608-6511 (C) TELEX: (2) INFORMAÇÃO RELATIVA A SEQ ID N°:1:

:ERD:DlO m ( —--L : 22 pares de bases

(B) iliROàcixiò DaolaiQB (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) 000¾ DE IÇOROlOiA: ÃOFa D;::di HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: (vi) FONTE ORIGINAL: (xi) DESCRIÇÃO DE SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:1: CAGGTGCAGC TGGAGGAGTC IGG 23 (2) INFORMAÇÃO RELATIVA A SEQ ID N°:2: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: (vi) FONTE ORIGINAL: (xi) DESCRIÇÃO DE SEQUÊNCIA: SEÇ ID N°:2: GCTGAGGGAG TAGAGTCSTG AGGA 24

SV 294 jjâí

0 S bases ίΒí TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) ii (li) TIPO DE MOLÉCULA: AOH;:: híu wm ζίν} (v) TIPO DE FRAGMENTO: (vi) FONTE ORIGINAL: OO:'! TíESCkíÇAq $.:¾ ;ÇR0·,:ϊΟίνΙ,Α J OaQ CU D' : ::

GTCTCTGGTG GCTCCATCAA CAGTGGTGAT TACTACTGGA GCTGGATCCG CCAGCACCCA GGGAAGGGCC TGGACTGCAT TGGGTACATC TATTACAGTG GGAGCACCTA CTACAACCCG TCCCTCAAGA GTCGAGTTAC CATATCAGTA GACACGTCTA AGAATCAGTT CTTCCTGAAG CTGACCTCTG TGACTGCCGC GGACACGGCC GTGTATTACT GTGCGAGATC TACGGTWTA AATCCGGGGT GGTTCGACCC CTGGGGCCAR GGAACCCTGG TCACCGTCTC CTCA (2) INFORMAÇÃO RELATIVA A SEQ ID N°:4: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 264 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPCLOGIA: linear (ii> TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (iií) HIPOTÉTICA: NÃO ξίΐό ΑΝΤΙ-SENTIDO: NÃO í'.0 TIPO DE DDIaRCFUT:··; ív.i) FONTE CôCIOlNÂL: SEQ ID N°:4: 60 120 180 240 294 (x i) Da,ACiÇ pr S.ó DE ΤΕςτυΝΟ (ΐ A.: TAAATTGGTT TCAGCAGAAR 60 ATTTGGAAAC AGGGGGCCCA 120 TCACCATCAG CGGCCTGCAG 180 GTCTCCCACT CACTTTCGGC 240 264

ACCATCACTT GCCAGGCGAG TCAGGACATT AACAACTATT CCAGGGAAAG CCCCTAAGGT CCTGATCCAC GATGCATCCA TCAAGGTTCA GTGGAAGTGG ATCTGGGACA GATTTTACIT CCTGAAGACA TTGCAACATA TTATTGTCAA CAGTATGAAA GGAGGGACCA AGGTGGAGAT CAAA (2) .....RELATIVA A SEQ ID N°:5: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 291 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: (vi) FONTE ORIGINAL: (xi) DESCRIÇÃO DE SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:5: GTCTCTGGTG GCTCCATCAA CAGTGGTGAT TACTACTGGA GCTGGATCCG CCAGCACCCA 60 GGGAAGGGCC TGGAGTGGAT TGGGTCCATC TATTACAGTG GGAACACCTT CTACAACCCG 120 TCCCTCAAGA GTCGAGTTAC CATATCACTA GACACGTCTA AGAACCAGTT CTCCCTGAAG 180 CTGAGTTCTG TGACTGCCGC GGACACGGCC GTGTGTTACT GTGCGAGAAA TATAGTGACT 240 ACGGGTGCTT TTGATATCTG GGGCCAAGGG ACRATGGTCA CCGTCTCTTC A 291 IR. < r Ê :· o:·

TIPO DE simples (C) TOPOLOGIA: linear (li) TIFO DE MOLÉCULA: ADNc i i? ·ί·ΛϊϋτΡ';·::όΛ: Νλν 1V W Λ : ''V VxirVl' ívU TIPO DE FRAGMENTO: (vi) FONTE ORIGINAL: (xi) DESCRIÇÃO DE SEQUÊNCIA: SEQ ID Nc: 6: 60 120 180 240 264

ACCATCACTT GTCAGGCGAG TCAGGACATT ACCATTTATT TAAATTGGTA TCAACAGAAA CCAGGGAAAG CCCCTAAGCT CCTGATCAAC GACGCATCCA GTTTGGAAAC AGGGGTCCCA TTAAGGTTCA GTGGAAGTGG ATCTGGGACA GATTTTACTT TCACCATCAG CAGCCTGCAG CCTGAAGATA TTGCAACATA TTACTGTCAA CAGTATGATC ATCTCCCGCT CACTTTCGGC GGCGGGACCA AGGTGGCGAT CAAA (2) INFORMAÇÃO RELATIVA A SEQ ID N°:7: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 288 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPC DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO (iv) ANTI-SENTIDO: NÃO ?» TIPO DE FRAGMENTO: ·:·.·.·: · vv:\ :·· ··:··*.··« :·: --· i A .· ;ç 2..000 LÃQ L./v·*...iCAvA; · (xi) DROCIICÃC OH HEOOfiiÇLA; SEQ 10 1 :7: 60 120 180 240 288

GTCTCTGGTG GCTCCATCAG CAGTGGTGAT TACTACTGGA CCTGGATCCG CCAGCACCCA GGGAAGGGCC TGGAGTGGAT TGGGTACATC TATTACAGTG GGAACACCTA CTACAACCCG TCCCTCAAGA GTCGAGTTTC CATGTCAATA GACACGTCTG AGAACCAGTT CTCCCTGAAG CTGAGCTCTG TGACTGCCGC GGACACGGCC GTGTATTACT GTGCGAGAAA ACCAGTGACT GGGGGGGAGG ACTACTGGGG CCAGGGAACC CTGGTCACCG TCTCCTCA (2) RELATIVA A ÇEQ ID N°:8: 5 i ( CliJOOCf iTitTTKVTSi PT TTyOÊOC TA: (A) COMPRIMENTO: 262 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (lií) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO (v) TIPC DE FRAGMENTO: (vi) FONTE ORIGINAL: (xi) DTTCT:ÍÇÃO DE SEQUÊNCIA: SEÇ ID Nc:8: 60 120 180 240 262

ACCATCACTT GCCAGGCGAG TCAGGACATT AGTAACTATT TAAATTGGTA TCAGCAGAAA CCAGGGAAAG CCCTAAGCTC CTGATCTACG ATGCTTCCAA TTTGGAAACA GGGGTCCCAT CAAGGTTCAG TGGAGTGGAT CTGGGACAGA TTTTACTTTC ACCATCAGCA GCCTGCAGCC TGAAGATGTT GGAACATATG TCTGTCAACA GTATGAGAGT CTCCCGTGCG GTTTTGGCCA GGGGACCAAA CTGGAGATCA RA i ΟΑκΑΙίΤίΤκ m COMPRIMENTO: 291 pares de Cases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (C) 'ril:\·;.··:>'.· 1A2 linear í :I i > T i Γ: : pi PPLEP.: L: 1: APPc illiU il .Avll> : «AC pi vi AU Ti. ·· SENTI PC: 0¾ (v) TIPO DF FRAGMENTO: ΓθΠ FONTE ORIGINAL: (xi) DESCRIÇÃO DE SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:9:

GTCTCTGGTG GCTCCATCAA CAGTGGTGAT TTCTACTGGA GCTGGATCCG CCAACACCCA GGGAAGGGCC TGGAGTGGAT TGGGTACATC TATTACAGTG GGAGCACCTA CTACAACCCG TCCCTCAAGA GTCGAGTTAC CATGTCAATA GACCCGTCTA AGAACCAGTT CTCCCTGAAA CTGATCTCTG TGACTGCCGC GGACACGGCC GTTTATTACT GTGCGACNTC CCTTTACTRT GGCGGGGGTA TGGACGTCTG GGGCCAAGGG ACCACGGTCR CCGTCTCCTC A 60 120 180 240 291 (2) INFORMAÇÃO RELATIVA A SEQ ID N°:1G: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 264 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleíco (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLGGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO ·: pç piccpípítt pqi pão (v) TIPO DE FRAGMENTO: Q::;U FONTE ORIGINAL: SEQ ID N0:10: (xi) íUiillilPAO DE iPQiPilPA: 60 120 180 240 264

ACCATCACTT GCCAGGCGAG TCAGGACATT AACAACTATT TGAATTGGTA TCAGCAGAGG CCNGGGAACG CCCCTAAACT CCTGATCTAC GATGCATCCA ATTTGGAAAC AGGGGTCCCA TCAAGGTTCA GXGGAAGTGG ATCTGGGACA GATTTTACTT TCACCATCAA CAGCCTGCAG CCTGAAGATA TTGCGACATA TTATTGTCAA CACTATGATC ATCTCCCGTG GACGTTC5GC CAAGGGACCA AGGTGGAANT CAAA (2) RELATIVA A SEQ ID N°:ll: (i) CAmCTSRÍÉr.TC&S DE SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 291 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear

í lid ΤΤΡβ Dg iiçtdiCllíLÂ í Alfe í '01 5 dl EOlsil odo: odO

(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: (vi) FONTE ORIGINAL: (xi) DESCRIÇÃO DE SEQUÊNCIA: SEQ ID No:11: 60 120 180 240 291

GTCTCTGGTG GCTCCATCAA CAATGGTGAT TACTACTGGA GCTGGATCCG CCAGCACCCA GGGAAGGGCC TGGAGTGGAT TGGGCACATC TATTACAGTG GGAGCACCTA CTACATCCCG TCCCTCAAGA GTCGAACTAC CATATCAGTA GACACGTCTA AGAACCAGTT CTCCCTGAAG CTGAACTCTG TGACTGCCGC GGACACGGCC GTGTATTACT GTGCGAGAGG GACAGTAACT ACGTACTACT TTGACTACTG GGGCCAGGGA ACCCTGGTCA CCGTCTCCTC A >: d.V^UVVs.-.J:,í'.-A\Â ·;ΐ: λ ;,·ο:· diòl, qíí p.ã·: (A) COMPRIMENTO: 270 pares de bases t-B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO SE CADELA: simples (D) TOPCÃOCILAí linear

(íi) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (iii) HIPOTÉTICA: NÃO (ív) ANTI-SENTIDO: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: (vi) FONTE ORIGINAL: (xi) OOliOPlÇÃO DE SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 12: ACCATCACTT GCCGGGCAAG TCAGAGCATT AGCAGCTATT TAAATTGGTA TCAGCAGAAA 60 CCAGGGAAAG CCCCTAAGCT CCTGATCTAT GCTGCATCCA GTTTGCAAAG TGGGGTCCCA 120 TCAAGGTTCA GTGGCAGTGG ATCTGGGACA GATTTCACTC TCACCATCAG CAGTCTGCAA 180 CCTGAAGATT TTGCAACTTA CTACTGTCAA CAGGGTTACA GAACCCCTCC GGAGTGCAGT 240 TTTGGCCAGG GGACCAAGCT GGAGATCAAA 270 (2) INFORMAÇÃO RELATIVA A SEQ ID No:13: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 291 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO (iv) ANTI-SENTIDO: NÃO O-O TIFO DE FRAGMENTO: U::'D FONTE ORIGINAL: (xi) DESCRIÇÃO DE SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:13: 60 120 180 240 291

GTCTCTGGTG GCTCCGTCAG CAGTGGTGAT TACTACTGGA GCTGGATCCG GCAGCCCCCA GGGAAGGGAC TCGAGTGGAT TGGACATCTC TATTACAGTG GGAACACCAA CTACAACCCC TCCCTCAAGA GTCGAGTCAC CATATCATTA GACACGTCCA AGAACCAGTT CTCCCTGAAG CTGAGCTCTG TGACCGCTGC GGACACGGCC GTGTATTACT GTGCGAGAGA TTTTTTGACT GGTTCCTTCT TTGACTACTG GGGCCAGGGA ACCCTGGTCA CCGTCTCCTC A (2) RELATIVA A SEQ ID N°:14: (A) COMPRIMENTO: 264 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (C) TDPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: (vi) FONTE ORIGINAL: (xi) DESCRIÇÃO DE SEQUÊNCIA: CEQ ID N°:14: 60 120 180 240 264

ACCATCACTT 5CCAGGCGAG TCAGGACATA AGCAACTATT TAAATTGGTA TCAGCAGAAA CCAGGGAAAG CCCCTAAGCT CCTGATCAAC GAIGCATCCG ATTTGGAAAC AGGGGTCCCA TCAAGGATCA GTGGAAGTGG A1CTGGGACA GATTTTACTT TCACCATCAG CAACCTGCAG CCTGAAGATA TTGCAACATA TTACTGTCAA CAATATGATA GTCTCCCGCT CACTTTCGGC GGAGGGACCA AGGTGGAGAT CAGA (2) '{NÊOiVVVÃ:; RELATIVA A SEQ ID N°:15: ÍM COMPRIMENTO: 288 pares de bases (B) TI PC: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear ÍÍ:U TIPO DE ΟϋΟΟΓΤΠ A:

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO OLvÇ ANTI-SENTIDO: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: (vi) FONTE ORIGINAL: (xi) DESCRIÇÃO DE SEOOtÇÃTiA;; SEQ ID N°:15: 60 120 180 240 288

GTCTCTGGTG GCTCCGTCTA CAGTGGTGAT TACTACTGGA GCTGGATCCG GCAGCCCCCC GGGAAGGGAC TGGAGTGGAT TGGGTATATC TATTACAGTG GGAGCACCAA TTACAATCCC TCCCTCAAGA GTCGAGTCAC CATATCAGTA GACACGTCCA AGAACCAGTT CTCCCTGAAG CTGAGCTCTG TGACCGCTGC GGACACGGCC GTGTATTRCT GTGCGAGAGA CTCCATACTG GGAGCTACCA ACTACTGGGG CCAGGGAACC CTGGTCACCG TCTCCTCA (2) INFORMAÇÃO RELATIVA A SEQ ID N°:16: (A) COMPRIMENTO: 264 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleicc (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (Ui) SIFOTÉTICA; NÃO

(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO (v) TIPO DE FRMíSÍtOo (vi) FONTE ORIGINAL: 60 60 120 180 240 264

ACCATCACTT GCCAGGCGAG TCNGGACATT AATAACTATT TANATTGGTN TCAGCAGAAA CCAGGGAAAG CCCCTAAAST CCTGATCTCC GATGCATCCA ATTTAGAAAC RGGGGTCCCA TCGAGGTTCA GTGGAAGTGG ATCTGGGACA GANTNTACTT TCACCATCAG CAGCCTGCAG CCTGAAGATA TTGCNACATA TCACTGTCNA CAGTATNATA GTCTCCCGCT CACTTTCGGC GGAGGGACCA AGGTAGAGAT CAAA (2) INFORMAÇÃO RELATIVA A SEQ ID N°:17: (i) CARACTERÍSTICA3 DE SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 288 pares de bases (B) TIPO: acido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: (vi) FONTE ORIGINAL: 60 120 180 240 :

(xi) DESCRIÇÃO DE SEQUÊNCIA: SEÇ ID U:;' :17: GTCTCTGGTG GCTCCGTCAG CAGTGGTGAT TACTACTGGA CCTGGATCCG GCAGTCCCCA gggaagggac tggagtggat tggacacatc tattacagtg ggaacaccaa ttataacccc TCCCTCAAGA GTCGACTCAC CATATCAATT GACACGTCCA AGACTCAGTT CTCCCTGAAG CTGAGTTCTG TGACCGCTGC GGACACGGCC ATTTATTACT GTGTGCGAGA TCGAGTGACT GGTGCTTTTG ATATCTGGGG CCAAGGGACA atggtcaccg tctcttca (A) COMPRIMENTO: 264 pares de bases (R) TIPO: ácido nucleico (C) Tim de CADELA: simples i SJ S;í 1Ί.íms íii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(iii) RÍPOÇtlOiCÃ; SÃO (iv) 0]1ϊϊ'"0:Β|ίΤΙ00ί NÃO (V) TIFO DE FRAGMENTO: (vi) FONTE ORIGINAL: (xi) DESCRIÇÃO DE SEQUÊNCIA: SEQ ID 00:18: 60 120 180 240 264

ACCATCACTT GCCAGGCGAG TCAGGACATC AGCAACTATT TAAATTGGTA TCAGCAGAAA CCAGGGAAAG CCCCTAAACT CCTGATCTAC GATGCATCCA ATTTGGAAAC AGGGGTCCCA TCAAGGTTCA GTGGAAGTGG ATCTGGGACA GATTTTACTT TCACCATCAG CAGCCTGCAG CCTGAAGATA TTGCAACATA TTTCTGTCAA CACTTTGATC ATCTCCCGCT CGCTTTCGGC GGAGGGACCA AGGTGGAGAT CAAA (2) INFORMAÇÃO RELATIVA A SEÇ ID N°:19: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 76 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (íi) TIPO DE peptido

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO ivi TIPO CE FRAGMENTO: interno (vi) JvNtE ORIGINAL: (xi) DEOCRIÇÃÒ 00 ::0.ο:;0;0:ίΛ: OSQ OS 0:;v ;1;

Vai Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile 15 10 15

Arg Gin His Pr o Gly Lys Gly Le« Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr 20 25 30

Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Vai Thr Ile 35 40 45

Ser Vai Asp Thr Ser Lys Asn Gin Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Vai 50 55 60

Thr Ala Ala Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys Ala Axg 65 70 75 (2) rfLLDimAÇaO RELATIVA A SEÇ ID N°:20: (í )CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 76 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TLPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(iv) ΑΝΤΙ-SENTIDO: NÃO (v) TLPO DE FRAGMENTO: interno (vi) FONTE ORIGINAL:

Thr Ile Thr Cys Gin Ala Ser Gin Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn Trp 15 10 15

Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ata 20 25 30

Ser Açn Leu Glu Thr Gly Vai Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser 35 40 45

Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp He 50 55 60

Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Asp Asn Leu Pro 65 70 75 (A) COMPRIMENTO: 76 mimàz (E) TIPO: ammoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (Ui) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: interno (vi) FONTE ORIGINAL: (xr) DESCRIÇÃO DE SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:21:

Thr Ile Thr Cys Axg Ala Ser Gin Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp 15 10 15

Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala 20 25 30

Ser Ser Leu Gin Ser Gly Vai Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser 35 40 45

Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe 50 55 60

Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Ser Tyr ser Thr Pro 65 70 75 (2) INFORMAÇÃO RELATIVA A SEQ ID N°:22: (A) CLiOLPitMOlTG:; pg aminoácidos (E) TIPO: aminoácido TJWJ DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPC DE MOLÉCULA: péptído avo aaoaavaíQO: não (v) TIPO DE FRAGMENTO: interno (ví) FONTE ORIGINAL: aa DESCRIÇÃO DE SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:22:

Vai Ser Gly Gly Ser Vai Ser Ser Gly Ser Tyr Tyr Trp Ser Trp 11 e 15 10 15

Arg Gin Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr He Tyr Tyr 20 25 30

Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Vai Thr Ile 35 40 45

Ser Vai Asp Thr Ser Lys Asn Gin Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Vai 50 55 60

Thr Ala M* Asp Thr Ai st Vai Tyr Tyr Cys Ala Arg 65 70 75 (2) INFORMAÇÃO RELATIVA A SEQ ID Nc:23: (i) CARACIERÍSIICAS DE SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 98 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptído

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO aj TIPC DE FRAGMENTO: interno

Lta FONTE ORIGINAL: (xi) DESCRIÇÃO SE úS:QU#aIÃ: SEQ IS Sa EU:

Ser Trp Ile 15 Ile fyr Tyr 30 Vai Thr Ile

Thr Ser Vai Thr Vai Vai 80 Vai Thr Vai 95

Vai Ser Gly Gly Ser Ile Asn Ser Gly Asp Tyr Tyr Trp 15 10

Arg Gin His Pro Gly Lys Gly Leu Asp Cys Ile Gly Tyr 20 25

Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro LííÇi Lys Ser Axg 35 40 45

Ser Vai Asp Thr Ser Lys Asn Gin Phe Phe Leu Lys Leu 50 55 60

Thr Ala Ala Asp Thr Vai Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser 65 70 75

Asn Pro Gly Trp Phe Asp Pro Trp Gly Gin'Gly Thr Leu 85 90

Ser Ser (2) Iíílí-ORíMÇAíÍ RELATIVA a SEQ TD K°:24: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 105 arninoácidos (B) TIPO: arninoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (li) TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: interno (vi) FOHIE ORIGINAL: (xi) DESCRICÃO DE SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:24:

Thr Ile Thr Cys Gin Al.iS Gin Asp Ile Asn Asn Tyr Leu Asn Trp 15 10 15

Phe Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Vai Leu Ile HiS Asp Ala 20 25 30

Ser Asn Leu Glu Thr Gly Gly Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser 35 40 45

Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Gly Leu Gin Pro Glu Asp Ile 50 55 60

Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Glu Ser Leu Pro Leu Thr Phe Gly 65 70 75 80

Gly Gly Thr Lys Vai Glu Ile Lys Arg Thr Vai Ala Aia Pro Ser Vai 85 90 95

Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin 100 105 (A) COMPRIMENTO: 97 amínoácidos (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPGLOGIA: linear {ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: interno (vi) FONTE ORIGINAL: (xi) DESCRIÇÃO DE SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:25:

Vai Ser Gly Gly Ser Ile Asn Ser Gly Asp Tyr Tyr Trp Ser Trp Xle 1 5 10 15 Arg Gin His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp lie Gly Ser Ile Tyr Tyr 20 25 30 Ser Giy Asn Thr Phe Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Vai Thr Ile 35 40 45 Ser Leu Asp Thr Ser Lys Asn Gin Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Vai 50 55 60 Thr Ala Ala Asp Thr Ala vai Cys Tyr Cys Ala Arg Asn Ile Vai Thr 65 70 75 80 Thr Gly Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gin Gly Thr M e t Vai Thr Vai Ser 85 90 95 ser (2) 'OílCORMAClO: RELATIVA A SEQ ID N°:26: 105 MrifUii (B) ΨΙΚ'ϊΐ aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples ·- í '> ·ϊ·;τ Ίν: ^:· ϊ':;Α Μγ'-Υ SV^rr?' ,· 0.:-0-.. -: '.<· «:· -ί . · · '.·' >·· < ·'-· ·'>·'·>···· . « ί·' ···λ- ,ν·;·,νν: í:UM HlS^ÉífliÇAí ffiD (iv) ΑΝΤΙ-SENTI DO: Mó

ÍM TIPO DE FRAGMENTO: interno ÍWl) FONTE ORIGINAL ÍDij OEíIORíÇÀCí DE DEIIitNÇIA? D10 IP l* ; DE ;

Thr Ile Thr Cys Gin Ala Ser Gin Asp Ile Thr Ile Tyr Leu Asn Trp 15 10 15

Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Asn Asp Ala - 20 25 30

Ser Ser Leu Glu Thr Gly Vai Pro Leu Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser 35 40 45

Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Leu Gin Pro Glu Asp Ile 50 55 60

Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Asp His Leu Pro Leu Thr Phe Gly 65 70 75 80

Gly Gly Thr Lys Vai Ala Ile Lys Arg Thr Vai Ala Ala Pro Ser Vai 85 90 §'$

Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin 100 105 (2) INFORMAÇÃO RELATIVA A SEQ ID N°:27: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA: (A) CGMPRIMENTO: 96 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO CE CADELA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii)

(iii) HIPOTÉTICA: BM (iv) A.LL I - ΕΚΕΙ' I iXJ s tò:0 (v) TIPO DE FRAGMENTO: interno i v 5 FONTE ORIGINAL:

Vai ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly Asp Tyr Tyr Trp Thr Trp Ile 15 10 15

Axg Gin His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr 20 25 30

Ser Gly Asn Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Axg Vai Ser Met 35 40 45

Ser Ile Asp Thr Ser Glu Asn Gin Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Vai 50 55 60

Thr Ala Ala Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys Ala Axg Lys Pro Vai Thr 65 70 75 80

Gly Sly Glu Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser 85 90 95 (2) INFORMAÇÃO RELATIVA A ÇEQ ID N°:28: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 105 arninoácidos (B) TIPO: arninoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (Ui) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ΑΝΤΙ-SENTIDO: NÃO (v) TIPO DE F GMENTO: interno (vi) FONTE ORIGINAL: (xi) DESCRIÇÃO DE SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:28:

Thr Ile Thr Cys Gin Aia Ser Gin Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn Trp 15 10 .1.5

Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys )..>ία Leu lie Tyr Asp Ala 20 25 30

Ser Asn Leu Gfu Thr Gly Vai Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser 35 40 45

Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gin P;í'í? Glu Asp Ile 50 55 60

Vai Gly Tyr Tyr Vai Gin Gin Tyr Glu Ser Leu Pro Cys Gly Phe Gfy 65 70 75 8®

Gin Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Axg Thr Vai Ala Aia Pro Ser Vai 85 90 95

Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin 100 105 ν'.*;· ' ίΐ V Ο·'·:0 Ιόν ; γ:\ :··:::;··· ç νί/'νΐ:; (Β) TIPC: aminoácido {C) TIEG DE LADEIA: simples (D) TOPCLOGIA: linear

(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: interno (vi) FONTE ORIGINAL: (xi) DESCRIÇÃO DE SlCptNcIÃ: SEQ ID N°:29:

Trp Ile is T-μ Tyr Thr Met Ser Vai Tyr Tyr 30 Vai $s>£ 95 V&I Ser Gly Gly Ser Ile Asn Ser Gly Asp Phe Tyr Trp Ser 15 10

Arg Gin His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile 20 25 30

Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys &»'* Arg Vai 35 40 45

Ser Ile Asp Pro Ser Lys Asn Gin Phe Ser Leu Lys Leu Ile 50 55 60

Thr Ala Ala Asp Thr Aia Vai Tyr Tyr Cys Ala Thr Ser Leu 65 70 75

Gly Gly Gly Met Asp Vai Trp Gly Gin Gly Thr Thr Vai Thr 85 90

Ser (2) iÇRtlGMÃÇÃg RELATIVA A SEQ ID N°:30: iA;i COMPRIMENTO: 105 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: Linear íivi &%3 Γνΐ TIPO DE FRAGMENTO: interno (vi) FONTE ORIGINAL: (xi) DESCRICÃO DE SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:30:

Thr Ile Thr Cys Gin Ala ser Gin Asp Ile Ser Asn Asn Leu Asn Trp 1 s 10 15

Tyr Gin Gin Lys Arg Gly Asn Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala • 20 25 30

Ser Asn Leu Glu Thr Gly Vai Pro Ser Asf Phe Ser Gly Ser Gly Ser 35 40 ' 45

Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Asn Leu Gin Pro Glu Ile 50 55 60

Ala Thr Τρτ Tft Cys Gin His Tyr Asp H is Leu Pro Trp Thr Phe Gly 65 70 75 80

Gin Gly Thr Lys Vai Glu Xaa Lys Thr Vai Ala Ala Pro ser Vai 85 90 95

Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin 100 105 (2) INFORMAÇÃO RELATIVA A SEQ ID N°:31: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA: (A) CCMFRLMENTO: 97 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: edllpius (Di TOPOLOGIA: linear

Vai Ser Gly Gly Ser Ile Asn Asn Gly Asp Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile 15 10 15

Arg Gin HÍS ΡΓΟ Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly His Ile Tyr Tyr 20 25 30

Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ile Pro Ser Leu Lys Ser Axg Thr Thr Ile 35 40 45

Ser Vai Asp Thr Ser Lys Asn Gin Phe Ser Leu Lys Leu Asn Ser Vai 50 55 60

Thr Ala Ala Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Thr Vai Thr 65 70 75 30

Thr Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Thr Vai Thr Vai Ser 85 90 95

Ser (2) RELATIVA A ÇEQ ID N°:32; (1) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 107 aminoácidos (B) TIPO: arninoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (II) TIPO DE MOLÉCULA: péptldc

(III) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: interno (vi) FONTE ORIGINAL: (xi) m&CWXÇlú DE SEQUÊNCIA: SEQ ID Nc:32:

Thr Ile Thr Cys Arg Ria Ser Gin Sè:í' Ile Ser ser T^r Leu Asn Ttp 15 10 15

Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr A ia Ai a 20 25 30

Ser Ser Leu Gin Ser Gly Vai Pro Ser Axg Phe Ser Gly Ser Gly Ser 35 40 45

Glv Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe 50 55 60

Ala Thr Tyr Tyr cys Gin Gin Gly Tyr Axg Thr Pro Pro Glu Cys Ser 65 70 75 80

Phe Gly Gin Gly Thr Lys Glu Ile Lys Arg Thr Vai Ala Aia Pro 85 90 95

Sei: Vai Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin it>5 (2) RELATIVA A SEQ ID N°:33: (A) COMPRIMENTO: 97 arninoácidos (E) TIPO: aminoácído (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (íí)TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ΑΝΤΙ-SENTIDO: NÃO (v) TIPC DE FRAGMENTC: interno (vi) FONTE ORIGINAL: (xi) DESCRIÇÃO DE SEQUÊNCIA: SEQ ID ;írc33:

Vai Ser Gly Gly Ser Vai Ser Ser 1 5 .Arg Gin Pro Pra Gly Lys Gly Leu 20 Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Pro 35 40 Ser Leu Asp Thr Ser Lys Asn Gin 50 55 Thr Ala Ala Asp Thr Aia Vai Tyr 65 7 0 Gly Ser Phe Phe Asp Tyr Trp Gly 85 Ser

Gly Asp Tyr Tyr 10

Glu Trp Ile Gly 25

Ser Leu Lys Ser

Phe Ser Leu Lys 60

Tyr Cys Ala Arg 75

Gin Gly Thr Leu 90

Trp Ser Trp lie 15

His Leu Tyr Tyr 30

Arg Vai Thr Ile 45

Leu Ser Ser V a 1

Asp Phe Leu Thr 80

Vai Thr Vai Ser 95 (2) RELATIVA A SEQ ID N°:34: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 105 aminoácidos (E) TIPO: aminoacido (C) TIFO DE CADEIA: simples (D) TOPGLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ΑΝΤΙ-SENTIDO: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: interno (vi) FGNTE ORIGINAL: (xi) DESCRIÇÃO DE SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:34:

Thr Ile Thr Cys Gin Ser Gin Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn Trp 1 5 10 15 '

Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Asn Asp Ala 20 25 30 S-er Asp Leu Glu Thr Gly Vai Pro Ssc Arg SI* Ser Gly Ser Gly Ser 35 40 45

Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Asn Leu Gin Pro Glu Asp Ile 50 55 60

Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Asp Ser Leu Pro Leu Thr Phe Gly 65 7 0 75 80

Gly Gly Thr Lys Vai Glu Ile Arg Arg Thr Vai Ais Ala Pro Ser Vai 85 90 95

Phe Tle Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin 100 105 (A) COMPRIMENTO: 96 aminoácidcs (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear <11) TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: interno (vi) FONTE ORIGINAL: (xi) DESCRIÇÃO DE SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:35:

Vai ser Gly Gly Ser Vai Tyr Ser Gly Asp Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile 15 10 15

Arg Gin Pro PCO Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr 20 25 30

Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Vai ThX Ile 35 40 45 $*£ Vai Asp Thr Ser Lys Asn Gin Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Vai 50 55 60

Thr Ala Bã Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Ser Ile Leu 65 70 75 80

Gly Ala Thr Asn Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser 85 90 95 (A) CDMFRIMEMTO: 105 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (1i) TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(iv) ΑΝΤΙ-SENTIDO: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: interno (vi) FONTE ORIGINAL: (xi) DESCRIÇÃO DE SEQUÊNCIA: SEQ ID N°:36:

Thr Ile Thr C y s Gin Ala Ser Gin Xaa Ile Ser A s n Tyr I .eu Xaa T rp 1 5 10 15 Ty r Gin Gin Ly s P r o Gly Ly s Ala Pro Lys Xaa* Leu Ile Ser Asp Ala 20 25 3.0 Ser A s n Leu GlU Thr Gly Vai P r o Ser Arg Phe Ser Gly Gly Ser 35 40 45 Gly Thr Xaa Xaa Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Ile 50 55 60 Ala Thr Ty r Hi s Cys Xaa Gin Ty r Xaa Ser Leu Pro Leu Thr Phe Gly 65 70 75 80 Gly Gly Thr L y s Vai Glu Ile Lys Arg Thr Vai Ala Ala Pro Ser Vai 85 90 95 Phe Ile Phe P r o P r o Ser Asp Glu Gin

!§§ UB (2) RELATIVA A SEQ ID N°:37: (A) COMPRIMENTO: 96 (B) TIFO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples UX· TIPO DE MOLÉCULA: pèptPú*

(iv) ΑΝΤΙ-SENTIDO: NÃO (v) TIPO DE FRAGMENTO: interno Oriu FONTE ORIGINAL: (xi) DESCRIÇÃO DE SEQUÊNCIA: SEÇ ID N°:37:

Val ser Gly Gly Ser Vai Ser Ser Gly Asp Tyr Tyr Trp Thr Trp IIe 15 10 15

Arg Gin Ser Pr o Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly His Ile Tyr Tyr 20 25 30

Ser PÀy As* Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile 35 40 45

Ser Ile Asp Thr Ser Lys Thr Gin Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val 50 55 60

Thr Ala Ala Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Val Arg Asp Arg Val Thr 65 70 75 80

Gly Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gin Gly Thr Val Thr Val Ser Ser 85 90 95 (2) INFORMAÇÃO RELATIVA A SEQ ID N°:38: (i) CARACTERíSTICAS DE SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 105 aminoácidos (B) TIPO: amínoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO SE TULECULA: péptido Uí.IO ANII-Sd : (v) TIPO DE >- knoimCRTOInterno FONTE ORIGINAL:

Thr Ile Thr cys Gin Ala Ser Gin Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn Trp 1 5 10 15 Ty £ Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys l-SSi Leu Ile Tyr Asp Ala 20 25 30 Ser Asn Leu GlU Thr Gly Vai Pro Ser Arg Phe Ser Gly S er Gly Ser 35 40 45 Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Ile 50 55 60 Aia Thr Tyr Phe Cys Gin His Phe Asp H i s Leu Pro Leu Ala Phe Gly 65 30 75 80 Gly Gly Thr Lys Vai Glu Ile Lys Arg Thr Vai Ala Aia Pro Ser Vai 8 5 90 95 Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin 100 105

Lisboa, 3 de Agosto de 2007

Claims (4)

1.

Anticorpo mo-nv. ·.·'·r; = X totalmente humano contra o receptor do factor de crescimento epidérmico humano (EGF-r), compreendendo a) uma í$e>iéteíla de imuncglobulina de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos codificada por um ADNc como exposto na Fig. 30 (SEQ ID N°: 17), e b) uma molécula de imunoglobulina de cadeia leve kapa compreendendo uma sequência de aminoácidos codificada por um ADNc como exposto na Fig. 32 (SEÇ ID N°: 18).

2. Anticorpo da reivindicação 1, compreendendo a) a sequência de aminoácidos como exposto na Fig. 29 (SEQ ID N°: 37), e b) a sequência de aminoácidos como exposto na Fig. 31 (SEQ ID Nc: 38) .

3. Anticorpo da reivindicação 1 ou 2, em que o referidc anticorpo é um anticorpo IgG2 humano.

4. Linha celular de hibridoma, compreendendo a) uma sequência nucleotidíca ·ν:η: . ο ο ή??': st uma sequência de ADNc como exposto na Fig. 30 (SEQ ID N° : l"n t e b) una sãusoóãcia nucleot ídica ;:u;:::s:::pLc«gr:deudn uma sequência de ADNc corno exposto na Fig. 32 (SEQ ID N° : U) Linha celular de hibridoma da reivindicação 4, segregando um anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3. Utilização de um anticorpo de qualquer uma das reivindicações 1 a 3 para a preparação de uma composição farmacêutica para o tratamento de um tumor sólido. Lisboa, 3 de Agosto de 2007