CN102341411A - 抗-淋巴细胞毒素抗体 - Google Patents
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Abstract
本发明至少部分基于新类型抗体的鉴别，所述抗体例如导致改善的LT阻断性能。还提供制备本结合分子的方法和使用本发明的结合分子来拮抗LTβR信号传导的方法。
Description
相关申请
本专利申请要求于2008年12月31日提交的题为“抗-淋巴细胞毒素抗体”的第61/142,182号美国临时专利申请的优先权。上述引用的临时专利申请的全部内容通过引用并入本文。
背景技术
淋巴细胞毒素(LT)是涉及TNF的细胞因子，并且其以分泌和膜结合形式发现于人***中。分泌形式是单蛋白LT-α的三聚体，而LT的表面形式是两种相关分子LT-α和LT-β的络合物。主要形式是具有组成α1β2的异源三聚体，然而，α2β1异源三聚体也存在。
同源三聚体的仅有已知的细胞表面受体是两种TNF受体，p55，p75和HVEM。相反，LTα1β2异源三聚体不结合这些TNF受体，而是结合LTβ受体(LTβR)。LT与LTβR的结合在***生成和炎症中发挥重要作用。有效和特异性地阻断LT与LTβR的结合的抗体的开发在患者中调节LTβR-介导的应答方面是非常有益的。
发明概述
LTα1β2是TNF配体家族的独特成员，因为其是两种不同链LTα和LTβ的异源三聚体，而不是其他LT家族成员发现的单链的同源三聚体。该家族分子的受体发现结合在三聚体链之间的裂口中，如果配体是同源三聚体，所有三个裂口是相同的，并且结合在裂口中的单一抗体预计将同时阻断所有三个结合位点。相反，LTα1β2异源三聚体展现出三种不同裂口(其可表示为β-β，β-α和α-β)，并且直到本发明，并未清楚单一抗体可结合异源三聚体并且有效地阻断受体结合的所有位点，从而完全阻断生物活性。值得注意的是，本发明的抗体不结合LTα3(或结合LTα3，但和阻断TNFα受体结合的方式不同)并且和现有技术的抗-LTα1β2抗体相比具有改善的功能。
例如，在一个实施方案中，本发明的抗体和现有技术的抗体(如本文中使用的，术语LT是指除非另有说明)相比，更有效地阻断LT与LTβR的结合和/或通过LTβR更有效地阻断LT-信号传导的一种或多种生物效果。例如，在一个实施方案中，这些抗体导致阻断大于70％的
诱导的细胞因子产生。在另外的实施方案中，这些抗体导致阻断大于80％的诱导的细胞因子产生。在一个实施方案中，这些抗体导致阻断大于90％的
诱导的细胞因子产生。在一个实施方案中，这些抗体导致阻断大于95％的诱导的细胞因子产生。在另外的实施方案中，这种抗体抑制LT结合和/或LT-诱导的细胞因子产生的IC50小于约0.05ug/ml。在一个实施方案中，这种抗体抑制LT结合和/或LT-诱导的细胞因子产生的IC50小于约100nM。在一个实施方案中，这种抗体抑制LT结合和/或LT-诱导的细胞因子产生的IC50小于约30nM。在一个实施方案中，这种抗体抑制LT结合和/或LT-诱导的细胞因子产生的IC50小于约10nM。在一个实施方案中，这种抗体抑制LT结合和/或LT-诱导的细胞因子产生的IC50小于约3nM。一组这种抗体已经被开发并且这些抗体中的一些结合的抗原表位已经被映射。在优选的实施方案中，本发明的抗体还结合非人灵长类例如短尾猴的LT的抗原表位。还已经阐述这些抗体的可变区的结构。该组抗体的CDR(例如Chothia或KabatCDR)可用于产生结合LT并阻断LT-诱导的信号传导的结合分子(例如人源化抗体，修饰的抗体，单链结合分子)。因此，本发明涉及结合分子，包含特异于LT的一个或多个结合位点(例如可变重链区和可变轻链区)，其阻断LT与LTβR的结合，并且当和现有技术的抗体比较时具有改善的功能性能。
在一个方面中，本发明涉及一种分离的结合分子或包含其抗原结合区域的分子，其在这样的条件下在细胞中结合淋巴细胞毒素(LT)并且使LT-诱导的生物活性阻断至少约70％，在该条件下参照抗体B9(由以登录号HB11962保藏在ATCC的细胞系B9.C9.1产生)在细胞中使所述LT-诱导的生物活性阻断约50％。
在另外的方面中，本发明涉及一种分离的结合分子或包含其抗原结合区域的分子，其在细胞中以IC50小于100nM结合淋巴细胞毒素(LT)并且使LT-诱导的生物活性阻断。
在另外的方面中，本发明涉及一种分离的结合分子或包含其抗原结合区域的分子，其结合淋巴细胞毒素(LT)并且使LTβR-Ig与细胞的结合阻断至少85％。
在另外的方面中，本发明涉及分离的结合分子或包含其抗原结合区域的分子，其中LT-诱导的生物活性是IL-8释放。
在一个实施方案中，结合分子包含人氨基酸序列。
在一个实施方案中，结合分子包含其抗原结合区域，包含人氨基酸序列，所述人氨基酸序列包含抗体恒定区序列或其片段。
在一个实施方案中，本发明涉及结合分子，其中人恒定区是已经改变以降低与至少一种Fc受体结合的IgG1恒定区。
在一个实施方案中，本发明涉及结合分子，其中人恒定区是已经改变以增强与至少一种Fc受体结合的IgG1恒定区。
在一个实施方案中，本发明涉及结合分子，其是人源化的。
在一个实施方案中，LT-诱导的生物活性被阻断至少约80％。在一个实施方案中，LT-诱导的生物活性被阻断至少约90％。在一个实施方案中，LTBR-Ig-结合被阻断至少约90％。
在一个实施方案中，结合分子或包含其抗原结合区域的分子在细胞中以IC50小于30nM使LT-诱导的生物活性阻断。
在一个实施方案中，结合分子或包含其抗原结合区域的分子在细胞中以IC50小于10nM使LT-诱导的生物活性阻断。
在另外的实施方案中，本发明的结合分子或包含其抗原结合区域的分子在细胞中以IC50小于3nM使LT-诱导的生物活性阻断。
在一个实施方案中，结合分子结合LT上两个位点从而未残留用于LTβR结合的位点。
在一个实施方案中，结合分子是全长抗体。在一个实施方案中，结合分子是scFv分子。
在另外的实施方案中，本发明涉及特异性结合LT的抗原表位的结合分子，其中所述抗体与所述LT抗原表位的结合以剂量依赖性方式被102抗体竞争性阻断。
在一个实施方案中，LTβ的氨基酸193和194对于抗体结合是关键的。
在另外的实施方案中，本发明涉及特异性结合LT的抗原表位的结合分子，其中所述抗体与所述LT抗原表位的结合以剂量依赖性方式被AOD9抗体竞争性阻断。
在另外的实施方案中，本发明涉及特异性结合LT的抗原表位的结合分子，其中所述抗体与所述LT抗原表位的结合以剂量依赖性方式被101/103抗体竞争性阻断。
在另外的实施方案中，本发明涉及特异性结合LT的抗原表位的结合分子，其中所述抗体与所述LT抗原表位的结合以剂量依赖性方式被105抗体竞争性阻断。
在一个实施方案中，LTβ的氨基酸96，97，98，106，107和108对于抗体结合是关键的。
在另外的实施方案中，本发明涉及特异性结合LT的抗原表位的结合分子，其中所述抗体与所述LT抗原表位的结合以剂量依赖性方式被9B4抗体竞争性阻断。
在一个实施方案中，LTβ的氨基酸96，97和98对于抗体结合是关键的。
在另外的实施方案中，本发明涉及特异性结合LT的抗原表位的结合分子，其中所述抗体与所述LT抗原表位的结合以剂量依赖性方式被A1D5抗体竞争性阻断。
在一个实施方案中，LTβ的氨基酸172对于抗体结合是关键的。
在另外的实施方案中，本发明涉及特异性结合LT的抗原表位的结合分子，其中所述抗体与所述LT抗原表位的结合以剂量依赖性方式被107抗体竞争性阻断。
在另外的实施方案中，本发明涉及特异性结合LT的抗原表位的结合分子，LTβ的氨基酸151和153对于抗体结合是关键的。
在一个实施方案中，本发明涉及特异性结合LT的抗原表位的分离的抗体，其中所述抗体与所述LT抗原表位的结合以剂量依赖性方式被108抗体竞争性阻断。
在一个实施方案中，结合分子包含人氨基酸序列。
在一个实施方案中，人氨基酸序列是抗体恒定区序列。
在一个实施方案中，抗体是人源化的。
在另外的方面中，本发明涉及一种包含重链可变区和轻链可变区的淋巴细胞毒素结合分子，所述重链可变区包含重链CDR CDRH1、CDRH2和CDRH3，所述轻链可变区包含轻链CDR CDRL1、CDRL2和CDRL3，其中所述轻链和重链CDR衍生自选自AOD9，108，107，A1D5，102，101/103，9B4和105的抗体。
在另外的方面中，本发明涉及包含重链可变区和轻链可变区的淋巴细胞毒素结合分子，所述重链可变区包含重链CDR CDRH1、CDRH2和CDRH3，所述轻链可变区包含轻链CDR CDRL1、CDRL2和CDRL3，其中CDR衍生自所述AOD9抗体。
在另外的方面中，本发明涉及包含重链可变区和轻链可变区的淋巴细胞毒素结合分子，所述重链可变区包含重链CDR CDRH1、CDRH2和CDRH3，所述轻链可变区包含轻链CDR CDRL1、CDRL2和CDRL3，其中CDR衍生自108抗体。
在另外的方面中，本发明涉及包含重链可变区和轻链可变区的淋巴细胞毒素结合分子，所述重链可变区包含重链CDR CDRH1、CDRH2和CDRH3，所述轻链可变区包含轻链CDR CDRL1、CDRL2和CDRL3，其中CDR衍生自107抗体。
在另外的方面中，本发明涉及包含重链可变区和轻链可变区的淋巴细胞毒素结合分子，所述重链可变区包含重链CDR CDRH1、CDRH2和CDRH3，所述轻链可变区包含轻链CDR CDRL1、CDRL2和CDRL3，其中CDR衍生自A1D5抗体。
在另外的方面中，本发明涉及包含重链可变区和轻链可变区的淋巴细胞毒素结合分子，所述重链可变区包含重链CDR CDRH1、CDRH2和CDRH3，所述轻链可变区包含轻链CDR CDRL1、CDRL2和CDRL3，其中CDR衍生自102抗体。
在另外的方面中，本发明涉及包含重链可变区和轻链可变区的淋巴细胞毒素结合分子，所述重链可变区包含重链CDR CDRH1、CDRH2和CDRH3，所述轻链可变区包含轻链CDR CDRL1、CDRL2和CDRL3，其中CDR衍生自101/103抗体。
在另外的方面中，本发明涉及包含重链可变区和轻链可变区的淋巴细胞毒素结合分子，所述重链可变区包含重链CDR CDRH1、CDRH2和CDRH3，所述轻链可变区包含轻链CDR CDRL1、CDRL2和CDRL3，其中CDR衍生自105抗体。
在另外的方面中，本发明涉及包含重链可变区和轻链可变区的淋巴细胞毒素结合分子，所述重链可变区包含重链CDR CDRH1、CDRH2和CDRH3，所述轻链可变区包含轻链CDR CDRL1、CDRL2和CDRL3，其中CDR衍生自9B4抗体。
在另外的方面中，本发明涉及包含重链可变区和轻链可变区的淋巴细胞毒素结合分子，所述重链可变区包含重链CDR CDRH1、CDRH2和CDRH3，所述轻链可变区包含轻链CDR CDRL1、CDRL2和CDRL3，其中CDRH1包含序列GFSLX1X2Y/SGX3H其中X是任意氨基酸。
在另外的方面中，本发明涉及包含重链可变区和轻链可变区的淋巴细胞毒素结合分子，所述重链可变区包含重链CDR CDRH1、CDRH2和CDRH3，所述轻链可变区包含轻链CDR CDRL1、CDRL2和CDRL3，其中CDRH2包含序列VIWX1GGX2TX3X4NAX5FX6S其中X是任意氨基酸。
在另外的方面中，本发明涉及包含轻链可变区和轻链可变区的淋巴细胞毒素结合分子，所述重链可变区包含重链CDR CDRH1、CDRH2和CDRH3，所述轻链可变区包含轻链CDR CDRL1、CDRL2和CDRL3，其中CDRL1包含序列RASX1SVX2X3X4X5或X1ASQDX2X3X4X5LX6其中X是任意氨基酸。
在另外的方面中，本发明涉及包含轻链可变区和轻链可变区的淋巴细胞毒素结合分子，所述重链可变区包含重链CDR CDRH1、CDRH2和CDRH3，所述轻链可变区包含轻链CDR CDRL1、CDRL2和CDRL3，其中CDRL2包含序列RAX1RLX2D其中X是任意氨基酸。
在另外的方面中，本发明涉及包含轻链可变区和轻链可变区的淋巴细胞毒素结合分子，所述重链可变区包含重链CDR CDRH1、CDRH2和CDRH3，所述轻链可变区包含轻链CDR CDRL1、CDRL2和CDRL3，其中CDRL2包含序列X1X2SX3X4X5S其中X是任意氨基酸。
在另外的方面中，本发明涉及包含轻链可变区和轻链可变区的淋巴细胞毒素结合分子，所述重链可变区包含重链CDR CDRH1、CDRH2和CDRH3，所述轻链可变区包含轻链CDR CDRL1、CDRL2和CDRL3，其中CDRL3包含序列X1QX2X3X4X5PX6T其中X是任意氨基酸。
在另外的方面中，本发明涉及包含轻链可变区和轻链可变区的淋巴细胞毒素结合分子，所述重链可变区包含重链CDR CDRH1、CDRH2和CDRH3，所述轻链可变区包含轻链CDR CDRL1、CDRL2和CDRL3，其中CDRL3包含序列LX1X2DX4FPX6T其中X是任意氨基酸。
在另外的方面中，本发明涉及包含轻链可变区和轻链可变区的淋巴细胞毒素结合分子，所述重链可变区包含105抗体变体的重链CDR CDRH1、CDRH2和CDRH3，所述轻链可变区包含105变体的轻链CDR CDRL1、CDRL2和CDRL3。
在一个实施方案中，本发明涉及结合分子，其溶解度大于100或120mg/ml。
在一个实施方案中，结合分子包含105变体版本L10的轻链可变区。
在一个实施方案中，结合分子包含105变体版本H1的重链可变区。
在一个实施方案中，结合分子包含105变体版本H1的重链可变区或其CDR和105变体L10的轻链可变区或其CDR。
在一个实施方案中，本发明涉及组合物，包含本发明的结合分子和载体。
在一个实施方案中，本发明涉及一种治疗受试者的方法，所述受试者将受益于使用抗-LT结合分子的治疗，包括向所述受试者施用所述分子，使得所得进行所述治疗。
在一个实施方案中，所述受试者患有由炎症表征的疾患。
在一个实施方案中，炎性疾患选自：风湿性关节炎，多发性硬化，克罗恩病，溃疡性结肠炎，移植，狼疮，炎症性肝病，牛皮癣，干燥综合征，多发性硬化(例如SPMS)，病毒诱导的肝炎，自身免疫性肝炎，I型糖尿病，动脉硬化症和病毒休克综合征。
在一个实施方案中，炎性疾患是风湿性关节炎。
在一个实施方案中，受试者患有癌症。在一个实施方案中，癌症选自多发性骨髓瘤和顽性滤泡性淋巴瘤。
在一个方面中，本发明涉及编码本发明的结合分子的核酸分子。在一个实施方案中，核酸分子在载体中。
在一个实施方案中，本发明涉及宿主细胞，包含所述载体。
在一个实施方案中，本发明涉及制备抗体或结合分子的方法，包括：(i)培养权利要求66所述的宿主细胞，使得所述抗体或结合分子在宿主细胞培养基中分泌；(ii)将所述抗体或结合分子从所述培养基分离。
在另外的方面中，本发明涉及包含本发明的结合分子的组合物在制备药物中的用途。
在另外的实施方案中，所述药物用于治疗和炎症有关的疾患。
附图简要说明
图1A、1B和1C示出使用用于抗-LT抗体的IL-8释放测定的抑制曲线。在组A中，空心菱形表示102抗体，空心方形表示105抗体，实心三角形表示A0D9抗体，空心三角形表示B9抗体，实心圆形表示C37抗体，以及空心圆形表示B27抗体。在组B中，实心圆形表示105抗体以及空心三角形表示107抗体。组C表示9B4抗体的抑制曲线。
图2A-2G提供柱状图结果，其示出注射MOPC-21(鼠IgG1抗体用作同种型对照)的嵌合(huSCID)小鼠的MOMA-1+巨噬细胞的状态：图2B)，mLTBR-mIgG1(图2C)，抗体BBF6(mIgG1)(图2D)；抗体B9(mIgG1)(图2E)；抗体LT102(图2F)，抗体LT105(图2G)。野生型C57BL/6切片也示于图2A。
图3A-3G提供柱状图结果，其示出人LTα1β2的阻断的HEV的减少。MOPC-21(鼠IgG1抗体用作同种型对照)：图3B)，mLTBR-mIgG1(图3C)，抗体BBF6(mIgG1)(图3D)；抗体B9(mIgG1)(图3E)；抗体LT102(图3F)，抗体LT105(图3G)。野生型C57BL/6切片也示于图3A。
图4组A提供图，其示出抗体LT102和LT105在其中测量LTβRIg(或Fc)与表达LT的细胞的阻断的阻断测定中表现出优异的效力。在组A中实心方形表示LTβR-Ig，空心圆形表示102抗体，空心方形表示105抗体，空心三角形表示B9抗体，空心菱形表示C37抗体并且实心圆形表示B27抗体。组B显示出抗体9B4的LTβRIg(或Fc)的阻断的类似的优异的效力。
图5提供LTβRIg阻断测定(如图4中)的数据，其示出抗体102(空心三角形)，105(实心圆形)，A1D5(空心菱形)，107(实心三角形)，A0D9b(空心圆形)和103(实心菱形)都比B9(空心多边形)B27(空心反向三角)和C37(空心方形)更有效地阻断。LTbR显示为实心方形。
图6示出LTα1β2异源三聚体的图，包括三个不同裂口(αβ，βα和ββ)，包括两个B亚基和单一A亚基。
发明详述
I.定义
应当注意术语“一个”或“一种”实体指一个或多个该种实体；例如，“一种LT结合分子”应理解为代表一个或多个LT结合分子(如本文中使用的，术语LT是指LTα1β2，除非另有说明)。因此，术语“一个”(或“一种”)，“一个或多个”以及“至少一个”在本文中可进行互换。
本文中所用的术语“多肽”意欲同时包括了单数和复数的“多肽”，并指由酰胺键(也称作肽键)线性连接的单体(氨基酸)所构成的一种分子。术语“多肽”指两个或多个氨基酸的任何链，且不指定产物的具体长度。因此，肽、二肽、三肽、寡肽、“蛋白”、“氨基酸链”或任何其他用来指代两个或多个氨基酸链的术语都包含在“多肽”的定义之内，且术语“多肽”可用来取代任何上述术语或与之互换。术语“多肽”还意欲指多肽表达后修饰的产物，包括但不限于糖基化，乙酰化，磷酸化，酰胺化，通过已知的保护/阻断基团进行衍生化，蛋白水解裂解，或通过非天然存在的氨基酸进行修饰。多肽可衍生自天然的生物来源或通过重组技术生产，但不一定需要转译自指定的核酸序列。它可通过任何方式生成，包括化学合成。
本发明的多肽包含特异于本文更详细描述的LT的至少一个结合位点。因此，本多肽在本文也称为“结合分子”。在一个实施方案中，本发明的结合分子是抗-LT抗体或修饰的抗体。
在一个实施方案中，本发明的多肽是分离的。“分离的”多肽或其片段，变体或衍生物指一种不存在于其天然环境中的多肽。在一个实施方案中，不要求达到特定的纯化水平。例如，一种分离的多肽可取自其自然的或天然的环境中。在宿主细胞中表达的重组生产的多肽和蛋白被认为对于本发明的目的而言是分离的，因为它们是通过任何合适的技术分离、分割、或者部分或充分纯化的天然或重组多肽。
本文中所用的术语“衍生自”指定蛋白是指多肽的来源。在一个实施方案中，衍生自特定起始多肽的多肽或氨基酸序列是可变区序列(例如VH和/或VL)或其相关序列(例如CDR或衍生自其的框架区)。在一个实施方案中，衍生自特定起始多肽的氨基酸序列不是连续的。例如，在一个实施方案中，一个、二个、三个、四个、五个或六个CDR(例如Chothia或Kabat CDR)衍生自本发明的结合分子中使用的起始抗-LT抗体。在一个实施方案中，衍生自特定起始多肽或氨基酸序列的多肽或氨基酸序列所具有的氨基酸序列和所述起始序列或其部分基本上一致，其中所述部分由下列构成：至少3-5氨基酸、5-10个氨基酸、至少10-20个氨基酸、至少20-30个氨基酸、或至少30-50个氨基酸、或本领域普通技术人员鉴别为具有在起始序列中的来源的。
本发明的多肽还包括前述多肽的片段、衍生物、类似物或变体及其任意组合。术语“片段”、“变体”、“衍生物”和“类似物”在涉及本发明的结合分子时包括任何至少保留了一些相应分子的结合性能的多肽。除在本发明其他地方讨论的特定抗体片段之外，本发明的多肽片段包括蛋白水解片段以及缺失片段。本发明的结合分子的变体包括如上所述的片段，还包括具有由氨基酸替换、缺失或***所得的变更氨基酸序列的多肽。变体可以是天然存在的或是非天然存在的。非天然存在的变体可通过本领域已知的突变技术进行制备。变体多肽可包含保守或非保守氨基酸替换、缺失或添加。因此，多肽中的氨基酸残基可被来自相同侧链家族的另外氨基酸残基取代。在另外的实施方案中，氨基酸链可被侧链家族成员的顺序和/或组成不同的结构上类似的链取代。或者，在另外的实施方案中，可对多肽的全部或部分随机引入突变。
在一个实施方案中，本发明的多肽是抗体分子或修饰的抗体分子，包含含有六种CDR的至少一种抗-LT抗体结合位点(即，衍生自结合LT的抗体的三种轻链CDR和衍生自结合LT的相同或不同抗体的三种重链CDR)。在一个实施方案中，本发明的结合分子包含一个结合位点，包含衍生自结合LT的抗体的轻链可变区和衍生自结合LT的抗体的重链可变区。在一个实施方案中，本发明的结合分子包含至少两个结合位点。在一个实施方案中，结合分子包含两个结合位点。在一个实施方案中，结合分子包含多于两个的结合位点。在一个实施方案中，本发明涉及这些分离的LT结合分子或编码它们的核酸分子。
在一个实施方案中，本发明的结合分子是单体。在另外的实施方案中，本发明的结合分子是多聚体。例如，在一个实施方案中，本发明的结合分子是二聚体。在一个实施方案中，本发明的二聚体是同源二聚体，包含两个相同的单体亚基。在另外的实施方案中，本发明的二聚体是异源二聚体，包含两个不同的单体亚基。二聚体的亚基可包含一种或多种多肽链。例如，在一个实施方案中，二聚体包含至少两个多肽链。在一个实施方案中，二聚体包含两个多肽链。在另外的实施方案中，二聚体包含四个多肽链(例如抗体分子中的情况)。
在一个实施方案中，本发明的结合分子是单价的，即包含一个LT靶结合位点(例如scFv分子中的情况)。在一个实施方案中，本发明的结合分子是多价的，即包含多于一个的靶结合位点。在另外的实施方案中，结合分子包含至少两个结合位点。在一个实施方案中，结合分子包含两个结合位点(例如抗体的情况中)。在一个实施方案中，结合分子包含三个结合位点。在另外的实施方案中，结合分子包含四个结合位点。在另外的实施方案中，结合分子包含多于四个结合位点。
本文中所用的术语“化合价”指结合分子中的潜在结合位点的数量。结合分子可以是“单价的”并且具有单一结合位点，或者结合分子可以是“多价的”(例如二价、三价、四价或更多价)。各结合位点特异性结合一个靶分子或靶分子上的特定位点(例如抗原表位)。当结合分子包含多于一个靶结合位点(即多价的结合分子)时，各靶结合位点可特异性结合相同或不同分子(例如可结合不同LT分子或结合相同分子上的不同抗原表位)。
如本文中使用的术语“结合部分”、“结合位点”或“结合结构域”是指特异性结合LT的抗体可变区的部分。在一个实施方案中，结合位点包含衍生自结合LT的抗体的三种轻链CDR和衍生自结合LT的抗体的三种重链CDR。
术语“结合特异性”或“特异性”是指结合分子特异性结合给定靶分子或抗原表位(例如免疫反应)的能力。在某些实施方案中，本发明的结合分子包含两种或多种结合特异性(即，它们同时结合一种或多种不同抗原上存在的两种或多种不同抗原表位)。结合分子可以是“单特异性的”并且具有单一结合特异性，结合分子可以是“多特异性的”(例如双特异性或三特异性或更多的多特异性的)并且具有两种或多种结合特异性。在示例性实施方案中，本发明的结合分子是“双特异性”并且包含两种结合特异性。因此，无论LT结合分子是“单特异性的”还是“多特异性的”例如“双特异性”，是指结合分子反应的不同抗原表位的数量。在示例性实施方案中，本发明的多特异性结合分子可对于一种或多种LT分子上的不同抗原表位是特异性的。本发明的给定结合分子就特定结合特异性而言可以是单价或多价的。
本文中披露的结合分子可通过抗原的抗原表位或部分(例如可被它们识别或特异结合的LT靶多肽)进行描述或说明。靶多肽中与结合分子的结合位点或部分特异性相互作用的部分为″抗原表位″或″抗原决定簇″。根据抗原的大小、构型和类型，靶多肽可能包含单个抗原表位，但通常包含至少两个抗原表位，并可能包含任意数量的抗原表位。另外，应当注意靶多肽上的“抗原表位”可以是非多肽元件或包括非多肽元件，例如，“抗原表位”可包括碳水化合物侧链。抗体的肽或多肽抗原表位的最小大小约为4-5个氨基酸。肽或多肽抗原表位优选包含至少七个氨基酸，更优选至少包含九个氨基酸，最优选包含约15至约30个氨基酸。由于CDR可在其三级形态识别抗原性肽或多肽，因此包含抗原表位的氨基酸不需要连续的，并且在某些情况下，甚至可能不在同一肽链上。在本发明中，由本发明的抗-LT抗体识别的肽或多肽抗原表位包含LT的至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、更优选至少8个、至少9个、至少10、至少15个、至少20个、至少25个、或是约15至约30个连续或非连续的氨基酸的序列。在一个实施方案中，本发明的结合分子双价结合LT异源三聚体。在一个实施方案中，本发明的结合分子结合LT异源三聚体，使得LTβR配体与异源三聚体的结合被阻断，例如使得不保留LTβR配体的结合位点。
“特异性结合”通常指结合分子通过结合分子的结合位点(例如抗原结合结构域)与抗原表位结合，且该种结合需要结合位点和抗原表位之间的一些补体。根据该定义，当结合分子通过结合位点与抗原表位的结合比它与任意不相关的抗原表位的结合更为容易时，则称该结合分子据称“特异性结合”该抗原表位。如果结合分子是多特异性的，结合分子可通过结合分子的另外结合位点(例如抗原结合结构域)特异性结合第二抗原表位(即和第一抗原表位不相关)。
“优先结合”指结合分子通过结合位点与抗原表位的特异性结合比它与相关的、相似的、同源的或是类似的抗原表位的结合更为容易。因此，与给定抗原表位“优先结合”的抗体与该抗原表位的结合比与相关的抗原表位更为容易，即使该种结合分子可能与该相关抗原表位交叉反应。
本文中所用的术语“交叉反应性”指对某种抗原特异的结合分子或抗体与第二抗原反应的能力，并且是两种不同的抗原性物质之间相关性的衡量。因此，当抗体能与未包含在其构成中的抗原表位结合时该抗体具有交叉反应性。交叉反应性抗原表位通常含有与诱导抗原表位相同的多个互补结构特征。
例如，某些结合分子具有一定程度的交叉反应性，因此它们可以结合相关但并不相同的抗原表位，例如，与参考抗原表位具有至少95％、至少90％、至少85％、至少80％、至少75％、至少70％、至少65％、至少60％、至少55％、和至少50％的一致性(通过本领域已知的并在此处描述的方法进行计算)的抗原表位。如果抗体不结合与参考抗原表位具有小于95％、小于90％、小于85％、小于80％、小于75％、小于70％、小于65％、小于60％、小于55％和小于50％的一致性(通过本领域已知的并在此处描述的方法进行计算)的抗原表位，则认为该抗体不具有或具有极小的交叉反应性。如果抗体不与某种抗原表位的任何其他类似物、直系同源物或同源物相结合，则可认为该抗体对该抗原表位具有“高度特异性”。
本文中所用的术语“亲和性”指个体抗原表位与结合分子的结合位点结合强度的量度。例如参见Harlow et al.，Antibodies：A Laboratory Manual，(ColdSpring Harbor Laboratory Press，2nd ed.1988)，页码27-28。优选结合亲和性包括解离常数或Kd小于t的那些。在一个实施方案中，本发明的结合分子以亲和性小于下列数值而特异性结合LT：5x10-2M，10-2M，5x10-3M，10-3M，5x10-4M，10-4M，5x10-5M，10-5M，5x10-6M，10-6M，5x10-7M，10-7M，5x10-8M，10-8M，5x10-9M，10-9M，5x10-10M，10-10M，5x10-11M，10-11M，5x10-12M，10-12M，5x10-13M，10-13M，5x10-14M，10-14M，5x10-15M或10-15M。在一个实施方案中，本发明的结合分子以亲和性小于100x10-9结合LT异源三聚体上的高亲和性位点。
本文中所用的术语“亲和力”指一组结合分子(例如抗体)和抗原的复合物的整体稳定性，即结合分子混合物与抗原的功能性结合强度。例如参见Harlow，第29-34页。亲和力既与该组中的个体结合分子与特定抗原表位的亲和性相关，也与该结合分子和该抗原的效价相关。例如，二价单克隆抗体与聚合体等具有高度重复表位结构的抗原的相互作用将具有较高的亲和力。
如本文中使用的术语“效力”是指结合分子的浓度，其被发现在特定测定中产生某些水平的效果。例如，在一个实施方案中，本发明的结合分子使LTβR的生物活性阻断至少约70％，至少80％或至少90％；使LTbR结合阻断至少80％，至少90％，至少95％，和/或以IC50小于500nM，小于100nM，小于30nM，小于10nM，小于3nM在细胞中阻断LT-诱导的生物活性。
本发明的结合分子的结合位点包含抗体分子的抗原结合位点。抗原结合位点由从一种多肽变化至另一种多肽的可变区形成。在一个实施方案中，本发明的多肽包含至少两种抗原结合位点。如本文中使用的术语“抗原结合位点”包括特异性结合(免疫反应)抗原(例如抗原的细胞表面或可溶形式)的位点。抗原结合位点包括包括免疫球蛋白重链和轻链可变区，并且由这些可变区形成的结合位点决定抗体的特异性。在一个实施方案中，本发明的抗原结合位点包含抗-LT抗体分子的至少一种重链或轻链CDR。在另外的实施方案中，本发明的抗原结合位点包含一种或多种抗-LT抗体分子的至少两种CDR。在另外的实施方案中，本发明的抗原结合位点包含一种或多种抗-LT抗体分子的至少三种CDR。在另外的实施方案中，本发明的抗原结合位点包含一种或多种抗-LT抗体分子的至少四种CDR。在另外的实施方案中，本发明的抗原结合位点包含一种或多种抗-LT抗体分子的至少五种CDR。在另外的实施方案中，本发明的抗原结合位点包含结合LT的一种或多种抗体分子的至少六种CDR(三种重链和三种轻链)。
本发明的优选结合分子包含衍生自人氨基酸序列的框架和/或恒定区氨基酸序列。然而，结合多肽可包含衍生自其他哺乳动物物种的框架和/或恒定区序列。例如，包含鼠序列的结合分子对于某些应用可是合适的。在一个实施方案中，灵长动物框架区(例如非人灵长动物)、重链部分和/或铰链部分可包括在本发明的结合分子中。在一个实施方案中，一种或多种非人(例如鼠)氨基酸可存在于结合多肽的框架区，例如人或非人灵长动物框架氨基酸序列可包含一种或多种氨基酸回复突变，其中对应鼠氨基酸残基存在和/或可包含在初始鼠抗体中未发现的一种或突变至不同氨基酸残基(例如优化结合或生物物理性能的其他突变)。本发明的优选结合分子在人中的免疫原性低于包含相同CDR的鼠抗体。
术语″抗体″和″免疫球蛋白″在本文中互换使用。抗体或免疫球蛋白至少包含重链的可变结构域，并且通常至少包含重链和轻链的可变结构域。脊椎动物***中的基本免疫球蛋白结构已得到较为充分的了解。例如参见Harlowet al.，Antibodies：A Laboratory Manual，(Cold Spring Harbor Laboratory Press，2nd ed.1988)。
如将在下文具体讨论的那样，术语“免疫球蛋白”包含可以以生化方式区分的多种大类的多肽。本领域的技术人员均了解重链被分类为gamma、mu、alpha、delta或epsilon(γ、μ、α、δ、ε)，其中还有一些亚类(例如γ1-γ4)。由该链的性质决定了抗体的“类别”分别为IgG、IgM、IgA、IgG或IgE。免疫球蛋白小类(同种型)如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl等均得到了很好的区分并赋予了功能定位。熟练的技术人员考虑到本公开能够轻易辫别这些类别和同型的各修饰型，且它们均在本发明的范围之内。
轻链被分类为kappa或lambda(κ、λ)。各重链分类均能与kappa或lambda轻链的任意一种相结合。
轻链和重链均被划分为具有结构和功能同源性的区域。术语“恒定”和“可变”具有功能性含义。就此而言，将意识到轻(VL)和重(VH)链部分的可变结构域决定了抗原识别和特异性。相反地，轻链(CL)和重链(CH1、CH2或CH3)的恒定结构域则赋予了重要的生物功能，例如分泌、经胎盘活动性、Fc受体结合、补体结合等。根据惯例随恒定区域越为远离抗体的抗原结合位点或氨基酸末端，其数量有所上升。N末端区为可变区而C末端区为恒定区；CH3和CL区实际分别包含了重链和轻链的羧基末端。
如上文指出，可变区允许抗体选择性识别特异性结合抗原上的抗原表位。即，抗体(例如在一些情况下CH3结构域)的VL域和VH域、或决定簇互补区(CDR)的亚群结合形成定义三维抗原结合位点的可变区。该四级抗体结构形成了存在于各个Y臂末端的抗原结合位点。在一个实施方案中，该抗原结合位点可通过各VH和VL链上的三个CDR定义。在一些情况下，例如对于源自骆驼类或基于骆驼类免疫球蛋白工程改造的某些免疫球蛋白分子，完整的免疫球蛋白分子可能仅由重链组成，而不含轻链。例如参见Hamers-Casterman et al.，Nature 363：446-448(1993)。
如本文中使用的术语“可变区CDR氨基酸残基”包括CDR或互补决定区中的氨基酸，如使用序列或结构基方法所鉴定。如本文中使用的，术语″CDR″或″互补决定区″是指在重链和轻链多肽的可变区内发现的非连续的抗原联合位点。这些特定区域由下列文献描述：Kabat et al.，J.Biol.Chem.252，6609-6616(1977)和Kabat et al.，Sequences of protein of immunologicalinterest.(1991)以及Chothia et al.，J.Mol.Biol.196：901-917(1987)和MacCallumet al.，J.Mol.Biol.262：732-745(1996)，其中当彼此比较时所述定义包括氨基酸残基的重叠或亚组，并且本领域普通技术人员能容易地使用这些定义中的任一种来鉴别本文所述的抗-LT抗体的CDR。包括通过上述引用的文献中的各种所定义的CDR的氨基酸残基下面阐述用于比较。优选地，术语“CDR”是基于序列比较由Kabat定义的CDR。
CDR定义
1残基编号遵循Kabat et al.，上文的命名
2残基编号遵循Chothia et al.，上文的命名
3残基编号遵循MacCallum et al.，上文的命名
本文中使用的术语“可变区框架(FR)氨基酸残基”是指Ig链或其部分的框架区中的那些氨基酸。本文中使用的术语“框架区”或“FR区”包括为可变区一部分但不是CDR(例如使用Kabat定义CDR)一部分的氨基酸残基。因此，可变区框架长度为约100-120氨基酸，但是仅包括CDR外的那些氨基酸。对于重链可变区和由Kabat et al.定义的CDR的特定例子，框架区1对应于包括氨基酸1-30的可变区结构域；框架区2对应于包括氨基酸36-49的可变区结构域；框架区3对应于包括氨基酸66-94的可变区结构域；以及框架区4对应于包括氨基酸103至可变区末端的可变区结构域。轻链的框架区由各轻链可变区CDR类似地分隔开。类似地，使用由Chothia et al.或McCallum etal.定义的CDR，框架区边界由上述各自的CDR末端分隔开。在优选的实施方案中，CDR由Kabat定义。在另外的实施方案中，CDR由Chothia定义。
Kabat et al.还定义了适用于任何抗体的可变结构域序列的编号***。本领域技术人员可明白地分配该″Kabat编号″***至任何可变结构域序列，而不依赖于超出序列本身的任何试验数据。如本文中使用的，″Kabat编号″是指Kabat et al.，U.S.Dept.of Health and Human Services，″Sequence of Proteins ofImmunological Interest″(1983)所阐述的编号***。除非另有说明，涉及本发明的LTβR抗体的可变区或其抗原结合片段、变体或衍生物的编号是根据Kabat编号***的。
本文中使用的术语“Fc区”是指从铰链区木瓜蛋白酶切割位点(即IgG中的残基216，假设重链恒定区的第一残基在114)上游开始、并且在抗体的C-末端结束的免疫球蛋白重链的部分。因此，完整Fc区包含至少铰链区、CH2结构域和CH3结构域。抗体分子得到Fc区是二聚体的。本发明的结合分子可包含完整Fc区或一个或多个Fc部分。在一个实施方案中，结合分子的Fc区可以是嵌合的。例如，多肽的Fc结构域可包含衍生自IgG1分子的CH1结构域和衍生自IgG3分子的铰链区。在另外例子中，Fc区可包含部分衍生自IgG1分子并且部分衍生自IgG3分子的铰链区。在另外例子中，Fc区可包含部分衍生自IgG1分子并且部分衍生自IgG4分子的嵌合铰链。在一个实施方案中，本发明的二聚体Fc区可包含一个多肽链。在另外的实施方案中，本发明的二聚体Fc区可包含两个多肽链，例如抗体分子的情况中。
在一个实施方案中，本发明的结合分子包含至少一种恒定区，例如重链恒定区和/或轻链恒定区。在一个实施方案中，这种恒定区和野生型恒定区相比是修饰的。即，本文公开的本发明的多肽可包含对三种重链恒定结构域(CH1，CH2或CH3)和/或轻链恒定区结构域(CL)中的一种或多种的改变或修饰。示例性修饰包括在一种或多种结构域中添加、缺失或取代一个或多个氨基酸。可包括这种改变以优化效应子功能、半衰期等。
重链恒定区中的氨基酸位置，包括CH1，铰链，CH2和CH3结构域中的氨基酸位置，根据EU索引编号***在本文编号(参见Kabat et al.，“Sequencesof Proteins of Immunological Interest”，U.S.Dept.Health and Human Services，5th edition，1991)。相反，轻链恒定区(例如CL结构域)中的氨基酸位置根据Kabat索引编号***在本文编号(参见Kabat et al.，ibid)。
示例性结合分子包括或可包含例如多克隆、单克隆、多特异性、人的、人源化的、灵长动物源化的或嵌合抗体、单链抗体、抗原表位结合片段(如Fab、Fab′和F(ab′)2、Fd、Fvs)、单链Fvs(scFv)、单链抗体、二硫键连接Fvs(sdFv)、包含VL或VH区的片段、由Fab表达库制备的片段。ScFv分子已为本领域所知，其描述参见美国专利5,892,019。包含Ig重链的本发明的结合分子可以是免疫球蛋白分子的任何形式(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类别(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或小类。
结合分子可单独包含可变区或联合包含下列中的全部或一部分：铰链区，CH1，CH2和CH3结构域。本发明还包括抗原结合片段，包含可变区与铰链区，CH1，CH2和CH3结构域的组合。
术语“片段”是指多肽(例如抗体或抗体链)的一部分或组成部分，其包含的氨基酸残基比完整或整个多肽要少。术语“抗原结合片段”是指免疫球蛋白或抗体的多肽片段，该片段能结合抗原或与完整抗体(即它所来源的完整抗体)竞争结合抗原(即，特异性结合)。本文中使用的术语抗体分子的“抗原结合片段”包括抗体的抗原结合片段，例如抗体轻链(VL)，抗体重链(VH)，单链抗体(scFv)，F(ab’)2片段，Fab片段，Fd片段，Fv片段和单结构域抗体片段(DAb)。可以将完整抗体或抗体链通过例如化学或酶法处理来获得所述片段，或者通过重组手段。
如上所述，各种免疫球蛋白类别的恒定区的亚基结构和三种空间构象是熟知的。如本文中使用的，术语“VH结构域”包括免疫球蛋白重链的氨基末端可变结构域，并且术语“CH1结构域”包括免疫球蛋白重链的第一(大部分氨基末端)恒定区结构域。CH1结构域邻近VH结构域，并且是免疫球蛋白重链分子的铰链区的氨基末端。
如本文中使用的，术语“CH1结构域”包括从例如约EU位118-215延伸的免疫球蛋白重链的第一(大部分氨基末端)恒定区结构域。CH1结构域邻近VH结构域并且是免疫球蛋白重链分子的铰链区的氨基末端，其并不形成免疫球蛋白重链的Fc区的一部分。在一个实施方案中，本发明的结合分子包含衍生自免疫球蛋白重链分子(例如人IgG1或IgG4分子)的CH1结构域。
如本文中使用的，术语“CH2结构域”包括从例如约EU位231-340延伸的重链免疫球蛋白分子的一部分。CH2结构域是独特的，因为其不与另外的结构域紧密的配对。相反，两个N-连接的支化的烃链夹置在完整天然IgG分子的两个CH2结构域之间。在一个实施方案中，本发明的结合分子包含衍生自IgG1分子(例如人IgG1分子)的CH2结构域。在另外的实施方案中，本发明的改变的多肽包含衍生自IgG4分子(例如人IgG4分子)的CH2结构域。在示例性实施方案中，本发明的多肽包含CH2结构域(EU位231-340)或其部分。
如本文中使用的，术语“CH3结构域”包括从CH2结构域的N-末端延伸大约110残基例如从约位341-446b(EU编号***)的重链免疫球蛋白分子的一部分。CH3结构域典型地形成抗体的C-末端部分。然而，在一些免疫球蛋白中，另外的结构域可从CH3结构域延伸以形成分子的C-末端部分(例如IgM的μ链和IgE的ε链的CH4结构域)。在一个实施方案中，本发明的结合分子包含衍生自IgG1分子(例如人IgG1分子)的CH3结构域。在另外的实施方案中，本发明的结合分子包含衍生自IgG4分子(例如人IgG4分子)的CH3结构域。
本文中所用的术语“铰链区”包含将CH1区连接至CH2区的重链分子部分。该铰链区包含了约25个残基并且是柔性的，从而使得两个N末端抗原结合区可以独立移动。铰链区可以被细分为三个不同的区域：上、中、下铰链区(Roux et al.，J.Immunol.161：4083(1998))。
本文中所用的术语“嵌合抗体”是指这样的抗体，其中结合位点或部分(例如可变区)得自或衍生自第一物种，并且恒定区(根据本发明为完整的、部分的或修饰的)得自第二物种。在优选实施方案中，该靶结合区域或位点来自于非人类来源(例如鼠或灵长动物)而恒定区来自人类。
如本文中使用的术语“scFv分子”包括基本上由下列构成的结合分子：一种轻链可变结构域(VL)或其部分和一种重链可变结构域(VH)或其部分，其中各可变结构域(或其部分)衍生自相同或不同抗体。scFv分子优选包含夹置在VH结构域和VL结构域之间的scFv接头。scFv分子是本领域已知的，并且描述于例如美国专利5,892,019，Ho et al.1989.Gene 77：51；Bird et al.1988Science 242：423；Pantoliano et al.1991.Biochemistry 30：10117；Milenic et al.1991.Cancer Research 51：6363；Takkinen et al.1991.Protein Engineering4：837。scFv分子的VL和VH结构域衍生自一种或多种抗体分子。本领域技术人员还应该理解本发明的scFv分子的可变区可被修饰为使得它们的抗体分子(它们衍生自该抗体)的氨基酸序列改变。例如，在一个实施方案中，可进行核苷酸或氨基酸取代从而导致氨基酸残基的保守取代或改变(例如在CDR和/或框架残基中)。或者或另外，可使用本领域已知的技术对CDR氨基酸残基进行突变以优化抗原结合。本发明的结合分子保持结合LT抗原的能力。
如本文中使用的“scFv接头”是指夹置在scFv的VL和VH结构域之间的部分。scFv接头优选使scFv分子保持为抗原结合构象。在一个实施方案中，scFv接头包含scFv接头肽或由scFv接头肽构成。在某些实施方案中，scFv接头肽包含gly-ser连接肽或由gly-ser连接肽构成。在其他实施方案中，scFv接头包含二硫键。
如本文中使用的术语“gly-ser连接肽”是指由甘氨酸和丝氨酸残基构成的肽。示例性gly/ser连接肽包含氨基酸序列(Gly4Ser)n。在一个实施方案中，n＝1。在一个实施方案中，n＝2。在另外的实施方案中，n＝3。在优选的实施方案中，n＝4即(Gly4Ser)4。在另外的实施方案中，n＝5。在又一实施方案中，n＝6。另外示例性gly/ser连接肽包含氨基酸序列Ser(Gly4Ser)n。在一个实施方案中，n＝1。在一个实施方案中，n＝2。在优选的实施方案中，n＝3。在另外的实施方案中，n＝4。在另外的实施方案中，n＝5。在又一实施方案中，n＝6。
在一个实施方案中，本发明的结合分子是工程抗体分子。本文中所用的术语“工程抗体”或“修饰的抗体”是指结合分子包含抗-LT抗体结合位点，但是不是传统二价四链抗体分子。
在一个实施方案中，这种分子包含可变区，其中重链或轻链或两者中的可变结构域通过下列方式改变：用已知特异性的抗体至少部分取代一种或多种CDR(例如Kabat或Chothia CDR)，如果需要，通过部分框架区取代和序列变化进行。在一个实施方案中，CDR可衍生自相同类的抗体或者甚至抗体的亚类，其中框架区从其中衍生。在一个实施方案中，CDR衍生自不同类的抗体，优选衍生自不同物种的抗体。将一个或多个来自于已知特异性的非人类抗体的“供体”CDR嫁接至人重链或轻链框架区的工程抗体在此称为“人源化抗体”。无需将来自供体可变区的完整CDR替换所有的CDR以将一个可变区的抗原结合能力转换至另一个。事实上仅需要转移那些维持该目标结合位点活性所必需的残基。在一个实施方案中，这种“人源化”抗体可包含另外的改变，例如框架区氨基酸序列的突变(例如回复突变至供体氨基酸、突变至种系氨基酸或其他取代)。通过本文和现有技术(例如美国专利Nos.5,585,089，5,693,761，5,693,762和6,180,370)所给出的解释，本领域的技术人员应当能够通过常规试验或试错法试验获取功能性的工程或人源化抗体。
术语“多核苷酸”包括分离的核酸分子或构建体，例如，信使RNA(mRNA)或质粒DNA(pDNA)。多核苷酸可包括常规的磷酸二酯键或非常规的键(例如于肽核酸(PNA)中发现的酰胺键)。术语“核酸分子”包括指在多核苷酸中存在的一个或多个核酸片段，例如DNA或RNA片段。“分离的”核酸或多核苷酸指从其天然环境中分离的核酸分子、DNA或RNA。例如，包含在载体中的编码LT结合分子的重组多核苷酸被认为对于本发明的目的而言是分离的。分离的多核苷酸的进一步例子包括存在于外源宿主细胞中的重组多核苷酸或在溶液中(部分或完全)纯化的多核苷酸。分离的RNA分子包括对本发明多核苷酸的体内或体外RNA转录物。本发明包括的分离的多核苷酸或核酸进一步包括合成制备的该种分子。此外，多核苷酸或核酸可以是启动子、核糖体结合位点或转录终止子等调节元件或是包含该种调节元件。
本文中所用的“编码区”指由转译氨基酸的密码子组成的一部分核酸。尽管“终止密码子”(TAG、TGA或TAA)不翻译成氨基酸，它仍可被认为是编码区域的一部分，但如启动子、核糖体结合位点、转录终止子、内含子等侧翼序列不是编码区域的一部分。本发明的两个或多个编码序列可存在于一个单独的多核苷酸构建体(例如单独的载体)中或分离的多核苷酸构建体(例如分离的(不同)载体)中。此外，任何载体可包含一个单独的编码区或包含两个或多个编码区，例如，单独载体可分别编码免疫球蛋白的重链可变区和免疫球蛋白的轻链可变区。此外，本发明的载体、多核苷酸或核酸可编码与编码LT结合分子或其片段、变体或衍生物的核酸融合或未融合的外源编码区域。外源编码区包括但不限于专门的元件或基序，例如分泌腺信号肽或外源功能性区域。
本文中涉及核酸或多肽分子所用的术语“工程改造的”是指通过人工方法(例如，通过重组技术、体外肽合成、肽的酶催化或化学偶合或这些技术的组合)处理这些分子。
本文中所用的术语“连接的”、“融合的”或“融合”可相互替换。这些术语指通过化学连接或重组技术等任何方法连接两个或多个元件或成分。“框内融合”指以能够维持原始开放阅读框架(ORF)的正确翻译阅读框的方式连接两个或多个多核苷酸ORF以形成更长的连续ORF。因此，重组融合蛋白是含有两个或更多与原始ORF所编码的多肽相应的片段的单独蛋白(该片段一般在天然状态下不进行该种连接)。尽管该阅读框架在融合片段中彼此连续，但是该片段可被框内接头序列等序列物理或空间分隔。例如，编码免疫球蛋白可变区CDR的多核苷酸可框内融合，但只要该“融合的”CDR被共转译为连续多肽的一部分，它可被编码至少一个免疫球蛋白框架区或附加CDR区的多核苷酸所分隔。
在有关多肽的上下文中，“线性序列”或“序列”指多肽中的由氨基向羧基末端方向排列的氨基酸，其中序列内彼此相邻的残基在多肽的一级结构内连续。
本文中所用的术语“治疗”指治疗性或预防性措施，其目的为预防或延缓(减轻)有害的生理变化或病症，例如炎症的形成或扩散。有益或目标临床结果包括但不限于可测或不可测的症状的缓和、疾病程度的减轻、疾病状态的稳定(即不恶化)、疾病进展的延迟或减缓、疾病状态的改善或减轻、以及(部分或完全)消除。“治疗”还可指与未接受治疗的预计存活相比更长的存活时间。需要接受治疗的受试者包括已经患有疾病或病症以及容易患该疾病或病症的受试者或是需要预防该疾病或病症的受试者。
“受试者”或“个体”或“动物”或“患者”或“哺乳动物”指需要进行诊断、预后或治疗的任何受试者，特别是哺乳动物受试者。哺乳动物受试者包括人、驯养动物、畜牧动物以及动物园、运动或宠物动物，例如狗、猫、豚鼠、兔子、大鼠、小鼠、马、家畜、牛等。
本文中所用的短语如“可由结合分子的施用获益的受试者”和“需要治疗的动物”等包括了可从用于(例如)对结合分子识别的抗原的检测(例如用于诊断过程)和/或用于治疗(即通过特异性结合LT的结合分子对炎性疾病或癌症等疾病的减轻或预防)的结合分子的施用受益的受试者，包括哺乳动物受试者。如本文中更具体描述，该结合分子可在与药物、前药或同位素等物质相结合或不相结合的形式下进行使用。
本文中使用的术语“由炎症表征的疾患”是指在受试者中疾患由炎症应答引起或标准。炎性疾患可以是急性或慢性的。示例性炎性疾患包括风湿性关节炎，多发性硬化，克罗恩病，溃疡性结肠炎，移植，狼疮，炎症性肝病，牛皮癣，干燥综合征，多发性硬化(例如SPMS)，病毒诱导的肝炎，自身免疫性肝炎，I型糖尿病，动脉硬化症和病毒休克综合征，以及进行移植或已经进行移植的个体。
II.抗-LT结合分子
已经开发一组新型抗-LT结合分子。本发明的抗-LT结合分子和现有技术的抗体相比展示出改善的功能性能。在另外的实施方案中，本发明的抗-LT结合分子和现有技术的抗-LT抗体相比具有独特的结构性能。
在一个实施方案中，本发明涉及本文所述的抗体AOD9，108，107，105，9B4，A1D5，102或101/103抗体(本文中也称为LT抗体(例如LT105)；这些抗体的CDR；这些抗体的可变区序列；这些抗体的变体形式的CDR序列；这些抗体的变体形式的可变区序列；以及包含这些CDR和/或可变区的结合分子。还提供编码这些结合分子的核酸分子。在某些实施方案中，本发明涉及缺少信号序列的成熟形式的分子。下面更详细地阐述本发明的抗体的功能和结构特性以及本发明的其他方面。
A.增加LT-诱导的信号传导的抑制
LT-诱导的信号传导(在结合LTβR)时诱导炎性应答，并且也涉及淋巴组织的正常发育。本发明的结合分子和LTβR竞争结合淋巴细胞毒素，从而抑制LT-介导的信号传导并且在细胞中降低LT介导的生物应答。可使用多种测定来证实本发明的结合分子的阻断效果。
例如，在一个实施方案中，可以测量本发明的结合分子抑制LT(例如LT异源三聚体)与LTβR结合的能力。在一个实施方案中，可以使用生理学上单体LTβ受体(LTβR)。在优选的实施方案中，使用本领域或此处描述的方法在阻断研究中可以使用二聚体形式的LTβ受体，例如LTBR-Ig融合蛋白(例如现有技术中描述的Fc融合蛋白)。例如，生物素标记的LTβR将结合用佛波脂(PMA)处理的II-23细胞上的淋巴细胞毒素，佛波脂(PMA)在它们表面上表达LTα1β2。佛波脂处理的细胞和结合分子一起孵育以竞争生物素标记的LTβR-Ig，细胞被洗涤以除去未结合的LTβR-Ig，并且结合的LTβR-Ig使用抗生蛋白链菌素-PE检测。因此，可以使用例如FACS分析来测量结合分子阻断生物素标签的LTβR-Ig融合蛋白与表面LT(相比较于合适对照，例如不存在结合分子的情况)结合的能力。
在另外的实施方案中，测量结合分子抑制细胞因子(例如IL-8)由LTβR表达细胞(例如A375细胞)产生的能力。在该测定中LTβR表达细胞接触LTα1β2和结合分子，并且例如使用ELISA测定来测量结合分子抑制IL-8释放由细胞(相比较于合适对照，例如不存在结合分子的情况)产生的能力
在一个实施方案中，本发明的结合分子实现使LTβR-Ig结合的抑制和/或使一种或多种LT生物活性例如细胞因子(例如IL-8)产生的抑制大于70％。在一个实施方案中，本发明的结合分子实现使LTβR-Ig结合的抑制和/或使一种或多种LT生物活性的抑制大于80％。在一个实施方案中，本发明的结合分子实现使LTβR-Ig结合的抑制和/或使一种或多种LT生物活性的抑制大于90％。在一个实施方案中，本发明的结合分子实现使LTβR-Ig结合的抑制和/或使一种或多种LT生物活性的抑制大于95％。在一个实施方案中，本发明的结合分子实现使LTβR-Ig结合的完全抑制(即，100％)和/或使一种或多种LT生物活性的完全抑制(即，100％)。
在一个实施方案中，本发明涉及分离的结合分子或包含其抗原结合区域的分子，其在这样的条件下在细胞中结合淋巴细胞毒素α1β2并且使LTα1β2-诱导的生物活性抑制至少约70％，例如在该条件下参照抗体B9(由以登录号HB11962保藏在ATCC的细胞系B9.C9.1产生)在细胞中使LTα1β2-诱导的生物活性抑制约50％。在另外的实施方案中，本发明的分离的结合分子或包含其抗原结合区域的分子在细胞中使LTα1β2-诱导的生物活性阻断至少约80％，例如在该条件下参照抗体B9(由以登录号HB11962保藏在ATCC的细胞系B9.C9.1产生)在细胞中使LTα1β2-诱导的生物活性抑制约50％。在另外的实施方案中，本发明的分离的结合分子或包含其抗原结合区域的分子在细胞中使LTα1β2-诱导的生物活性阻断至少约85％，例如在该条件下参照抗体B9(由以登录号HB11962保藏在ATCC的细胞系B9.C9.1产生)在细胞中使LTα1β2-诱导的生物活性抑制约50％。在另外的实施方案中，本发明的分离的结合分子或包含其抗原结合区域的分子在细胞中使LTα1β2-诱导的生物活性阻断至少约90％，例如在该条件下参照抗体B9(由以登录号HB11962保藏在ATCC的细胞系B9.C9.1产生)在细胞中使LTα1β2-诱导的生物活性抑制约50％。在另外的实施方案中，本发明的分离的结合分子或包含其抗原结合区域的分子在细胞中使LTα1β2-诱导的生物活性阻断至少约95％，例如在该条件下参照抗体B9(由以登录号HB11962保藏在ATCC的细胞系B9.C9.1产生)在细胞中使LTα1β2-诱导的生物活性抑制约50％。在另外的实施方案中，本发明的分离的结合分子或包含其抗原结合区域的分子在细胞中使LTα1β2-诱导的生物活性阻断至少约98％，例如在该条件下参照抗体B9(由以登录号HB11962保藏在ATCC的细胞系B9.C9.1产生)在细胞中使LTα1β2-诱导的生物活性抑制约50％。在另外的实施方案中，本发明的分离的结合分子或包含其抗原结合区域的分子在细胞中使LTα1β2-诱导的生物活性阻断至少约100％，例如在该条件下参照抗体B9(由以登录号HB11962保藏在ATCC的细胞系B9.C9.1产生)在细胞中使LTα1β2-诱导的生物活性抑制约50％。在一个实施方案中，生物活性是IL-8释放。
在一个实施方案中，本发明涉及分离的结合分子，其结合淋巴细胞毒素β并且使LTβR与细胞的结合(或如上所述与二聚体LTBR-Ig结合)抑制至少约70％。在另外的实施方案中，本发明涉及分离的结合分子，其结合淋巴细胞毒素β并且使LTβR(或LTBR-Ig)与细胞的结合抑制至少80％。在另外的实施方案中，本发明涉及分离的结合分子，其结合淋巴细胞毒素β并且使LTβR(或LTBR-Ig)与细胞的结合抑制至少约90％。在另外的实施方案中，本发明涉及分离的结合分子，其结合淋巴细胞毒素β并且使LTβR(或LTBR-Ig)与细胞的结合抑制至少约95％。在另外的实施方案中，本发明涉及分离的结合分子，其结合淋巴细胞毒素β并且使LTβR(或LTBR-Ig)与细胞的结合抑制至少约98％。在另外的实施方案中，本发明涉及分离的结合分子，分离的结合分子结合淋巴细胞毒素β并且使LTβR(或LTBR-Ig)与细胞的结合抑制至少约100％。
B.增强的效力和/或亲和性
在一个实施方案中，本发明的结合分子以比现有技术抗体更低的浓度抑制LT与LTβR的结合和/或抑制LT-诱导的生物活性。当包含本发明的LT结合位点的抗体使LT-诱导的生物活性(例如IL-8释放)抑制50％的浓度(IC50)和包含现有技术LT结合位点的抗体比较时，这可容易地观察到。现有技术抗体需要3个级数量级的更多抗体来实现使LT与LTβR的结合抑制50％(参见图1，4和5)，并且一些根本未实现50％抑制。对于这些抗体，可以使用理论“理论IC50”来进行比较。在计算IC50值时，使用在使用抗原(LT)预孵育步骤的过程中存在的抗体浓度(而不是在加入细胞和缓冲液后的最终抗体浓度)。
在一个实施方案中，本发明的结合分子抑制LTβR或LTβR-Ig结合的IC50或抑制一种或多种LT生物活性的IC50小于约500nM。在另外的实施方案中，本发明的结合分子抑制LTβR或LTβR-Ig结合的IC50或抑制一种或多种LT生物活性的IC50小于约100nM。在另外的实施方案中，本发明的结合分子抑制LTβR或LTβR-Ig结合的IC50或抑制一种或多种LT生物活性的IC50小于约30nM。在另外的实施方案中，本发明的结合分子抑制LTβR或LTβR-Ig结合的IC50或抑制一种或多种LT生物活性的IC50小于约10nM。在另外的实施方案中，本发明的结合分子抑制LTβR或LTβR-Ig结合的IC50或抑制一种或多种LT生物活性的IC50小于约3nM。
在一个实施方案中，本发明的结合分子具有下列这些改善性能中的多于一种：即，实现使LTβR或LTβR-Ig结合的抑制或一种或多种LT生物活性的抑制大于70％，80％，90％，95％或98％，并且抑制的IC50小于约500nM，100nM，30nM，10nM或3nM。
在一个实施方案中，本发明的结合分子以EC50小于约0.3nM结合LTα1β2。在另外的实施方案中，本发明的结合分子以EC50小于约0.1nM结合LTα1β2。在另外的实施方案中，本发明的结合分子以EC50小于约0.03nM结合LTα1β2。
在一个实施方案中，本发明的结合分子以IC50为100nM或更低使一种或多种LT生物活性(例如IL-8释放)抑制至少90％。在一个实施方案中，本发明的结合分子以IC50为30nM或更低使一种或多种LT生物活性(例如IL-8释放)抑制至少90％。在一个实施方案中，本发明的结合分子以IC50为10nM或更低使一种或多种LT生物活性(例如IL-8释放)抑制至少90％。在一个实施方案中，本发明的结合分子以IC50为3nM或更低使一种或多种LT生物活性(例如IL-8释放)抑制至少90％。在一个实施方案中，本发明的结合分子或包含其抗原结合区域的分子还使LTβR或LTβR-Ig结合抑制至少70％，例如在该条件下参照抗体B9(由以登录号HB11962保藏在ATCC的细胞系B9.C9.1产生)在细胞中使LTα1β2-诱导的生物活性抑制约50％。在一个实施方案中，本发明的结合分子或包含其抗原结合区域的分子还使LTβR或LTβR-Ig结合抑制至少80％，例如在该条件下参照抗体B9(由以登录号HB11962保藏在ATCC的细胞系B9.C9.1产生)在细胞中使LTα1β2-诱导的生物活性抑制约50％。在一个实施方案中，本发明的结合分子或包含其抗原结合区域的分子还使LTβR或LTβR-Ig结合抑制至少90％，例如在该条件下参照抗体B9(由以登录号HB11962保藏在ATCC的细胞系B9.C9.1产生)在细胞中使LTα1β2-诱导的生物活性抑制约50％。在一个实施方案中，本发明的结合分子或包含其抗原结合区域的分子还使LTβR或LTβR-Ig结合抑制至少95％，例如在该条件下参照抗体B9(由以登录号HB11962保藏在ATCC的细胞系B9.C9.1产生)在细胞中使LTα1β2-诱导的生物活性抑制约50％。在一个实施方案中，本发明的结合分子或包含其抗原结合区域的分子还使LTβR或LTβR-Ig结合抑制至少100％，例如在该条件下参照抗体B9(由以登录号HB11962保藏在ATCC的细胞系B9.C9.1产生)在细胞中使LTα1β2-诱导的生物活性抑制约50％。
C.与LT的新区域的结合
本发明的结合分子不结合LTα3(或在103的情况中)，如果它们结合LTα3的话，并不以这样的方式来结合，该方式为阻断LTα3与TNFR的结合。另外，本发明的结合分子全都阻断LT与LTβR或LTβR-Ig的结合。在一个实施方案中，本发明的抗-LT结合分子和本发明的抗-LT抗体竞争结合LT。因此，在某些实施方案中，本发明的组合物中使用的结合部分可以和竞争测定中参照抗体结合相同的抗原表位，例如本文所述的AOD9，108，107，105，9B4，A1D5，102或101/103抗体。例如，结合部分可以衍生自交叉阻断(即竞争结合)本发明的抗-LT抗体或以其他方式干扰抗体结合的抗体。
结合分子据说″竞争抑制”或“竞争阻断”配体的结合，如果其在一定程度上特异性或优选结合抗原表位，该程度为配体(例如LT)与LTβR或LTβR-Ig的结合以依赖于配体浓度的方式抑制或阻断(例如空间阻断)。例如，当生物化学上测量时，给定浓度的结合分子的竞争抑制可通过增加配体浓度来克服，在该情况下配体将在与结合分子的结合靶分子(例如LTβR)的竞争中胜出。不希望束缚于任何特定理论，当结合分子结合的抗原表位位于或接近配体的结合位点从而抑制配体的结合时，认为竞争发生。竞争抑制可通过本领域熟知的方法和/或实施例中所述的方法来测定，包括例如竞争ELISA测定法。在一个实施方案中，本发明的结合分子使选自AOD9，108，107，105，9B4，A1D5，102或101/103的抗-LT抗体与LT(或竞争抗体能力中的一种以降低LT与LTβR的结合或下调LT-介导的信号传导)的结合竞争抑制至少90％、至少80％或至少70％。
在一个实施方案中，本发明的结合分子竞争抑制AOD9抗体与LT的结合。在一个实施方案中，本发明的结合分子竞争抑制108抗体与LT的结合。在一个实施方案中，本发明的结合分子竞争抑制107抗体与LT的结合。在一个实施方案中，本发明的结合分子竞争抑制105或9B4抗体与LT的结合。在一个实施方案中，本发明的结合分子竞争抑制A1D5抗体与LT的结合。在一个实施方案中，本发明的结合分子竞争抑制102抗体与LT的结合。在一个实施方案中，本发明的结合分子竞争抑制101/103抗体与LT的结合。
结合LT的竞争性抗原表位的其他抗体可使用现有技术已知的技术和它们的表征的可变区来鉴别。这些抗体可用作结合分子或它们的可变区可用作结合位点，并且引入本发明的结合分子。例如这种抗体的CDR可引入本发明的结合分子。例如，已经在各种片段或全长LT但没有信号序列的抗体产生后，可以使用本领域已知的抗原表位映射方案来确定LT的哪个氨基酸或抗原表位结合抗体或抗原结合片段(例如双抗体-夹心ELISA，描述于″Chapter11-Immunology，″Current Protocols in Molecular Biology，Ed.Ausubel et al.，v.2，John Wiley&Sons，Inc.(1996))。另外的抗原表位映射方案可发现于Morris，G.Epitope Mapping Protocols，New Jersey：Humana Press(1996)，其通过引用全部并入本文。抗原表位映射也可通过市售装置(即ProtoPROBE，Inc.(Milwaukee，Wisconsin))来进行。
在又一实施方案中，本发明的结合分子可包含结合LT的某些氨基酸残基的结合位点或者LT的某些氨基酸可对于其结合是关键的。下面公开的LT中的氨基酸位置是指成熟形式的蛋白中的氨基酸位置。对于成熟LTβ蛋白的序列，参见Genbank登陆GI：292277和4505035以及Browning J.et al.，Cell72：847-856(1993)，其通过引用全部并入本文。
在一个实施方案中，本发明涉及特异性结合LT的抗原表位的分离的结合分子，其中LT抗原表位与结合分子的结合以剂量依赖性方式被102抗体竞争性阻断。在另外的实施方案中，LTβ的氨基酸193(R)和194(R)(如下面SEQ ID NO：中所阐述)对于结合分子的结合是关键的。LTβ的序列如下：
1 MGALGLEGRG GRLQGRGSLL LAVAGATSLV TLLLAVPITV LAVLALVPQD
51 QGGLVTETAD PGAQAQQGLG FQKLPEEEPE TDLSPGLPAA HLIGAPLKGQ
101 GLGWETTKEQ AFLTSGTQFS DAEGLALPQD GLYYLYCLVG YRGRAPPGGG
151 DPQGRSVTLR SSLYRAGGAY GPGTPELLLE GAETVTPVLD PARRQGYGPL
201 WYTSVGFGGL VQLRRGERVY VNISHPDMVD FARGKTFFGA VMVG
在一个实施方案中，本发明涉及特异性结合LT的抗原表位的分离的结合分子，其中LT抗原表位与结合分子的结合以剂量依赖性方式被AOD9抗体竞争性阻断。在另外的实施方案中，LTβ的氨基酸151(D)和153(Q)(如SEQID NO：中所阐述)对于结合分子的结合是关键的。
在一个实施方案中，本发明涉及特异性结合LT的抗原表位的分离的结合分子，其中LT抗原表位与结合分子的结合以剂量依赖性方式被101/103抗体竞争性阻断。
在一个实施方案中，本发明涉及特异性结合LT的抗原表位的分离的结合分子，其中LT抗原表位与结合分子的结合以剂量依赖性方式被105或9B4抗体竞争性阻断。在一个实施方案中，LTβ的氨基酸96(P)，97(L)，98(K)对于结合分子的结合是关键的。
在一个实施方案中，本发明涉及特异性结合LT的抗原表位的分离的结合分子，其中LT抗原表位与结合分子的结合以剂量依赖性方式被105抗体竞争性阻断。在一个实施方案中，LTβ的氨基酸96(P)，97(L)，98(K)，106(T)，107(T)和108(K)(如SEQ ID NO：中所阐述)对于结合分子的结合是关键的。
在一个实施方案中，本发明涉及特异性结合LT的抗原表位的分离的结合分子，其中LT抗原表位与结合分子的结合以剂量依赖性方式被A1D5抗体竞争性阻断。在一个实施方案中，LTβ的氨基酸172(P)(如SEQ ID NO：中所阐述)对于结合分子的结合是关键的。
在一个实施方案中，本发明涉及特异性结合LT的抗原表位的分离的结合分子，其中LT抗原表位与结合分子的结合以剂量依赖性方式被107抗体竞争性阻断。在一个实施方案中，LTβ的氨基酸151(D)和153(Q)(如SEQ IDNO：中所阐述)对于结合分子的结合是关键的。
在一个实施方案中，本发明涉及特异性结合LT的抗原表位的分离的结合分子，其中LT抗原表位与结合分子的结合以剂量依赖性方式被108抗体竞争性阻断。
D.新型结构
在又一实施方案中，本发明的抗-LT结合分子包含和本文所述的抗-LT结合位点享有某些结构特征例如氨基酸序列同一性的抗-LT结合位点。
具有所要求的功能活性的一组抗体的CDR序列在下表1和2中有所阐述。
在一个实施方案中，本发明涉及包含重链可变区和轻链可变区的淋巴细胞毒素(LT)结合分子，所述重链可变区包含重链CDR CDRH1、CDRH2和CDRH3，所述轻链可变区包含轻链CDR CDRL1、CDRL2和CDRL3，其中所述轻链和重链CDR衍生自选自AOD9，108，107，A1D5，102，101/103，9B4和105的抗体。
在一个实施方案中，本发明涉及包含重链可变区和轻链可变区的LT结合分子，所述重链可变区包含重链CDR CDRH1、CDRH2和CDRH3，所述轻链可变区包含轻链CDR CDRL1、CDRL2和CDRL3，其中CDR衍生自AOD9抗体。
在一个实施方案中，本发明涉及包含重链可变区和轻链可变区的LT结合分子，所述重链可变区包含重链CDR CDRH1、CDRH2和CDRH3，所述轻链可变区包含轻链CDR CDRL1、CDRL2和CDRL3，其中CDR衍生自108抗体。
在一个实施方案中，本发明涉及包含重链可变区和轻链可变区的LT结合分子，所述重链可变区包含重链CDR CDRH1、CDRH2和CDRH3，所述轻链可变区包含轻链CDR CDRL1、CDRL2和CDRL3，其中CDR衍生自107抗体。
在一个实施方案中，本发明涉及包含重链可变区和轻链可变区的LT结合分子，所述重链可变区包含重链CDR CDRH1、CDRH2和CDRH3，所述轻链可变区包含轻链CDR CDRL1、CDRL2和CDRL3，其中CDR衍生自A1D5抗体。
在一个实施方案中，本发明涉及包含重链可变区和轻链可变区的LT结合分子，所述重链可变区包含重链CDR CDRH1、CDRH2和CDRH3，所述轻链可变区包含轻链CDR CDRL1、CDRL2和CDRL3，其中CDR衍生自102抗体。
在一个实施方案中，本发明涉及包含重链可变区和轻链可变区的LT结合分子，所述重链可变区包含重链CDR CDRH1、CDRH2和CDRH3，所述轻链可变区包含轻链CDR CDRL1、CDRL2和CDRL3，其中CDR衍生自101/103抗体。
在一个实施方案中，本发明涉及包含重链可变区和轻链可变区的LT结合分子，所述重链可变区包含重链CDR CDRH1、CDRH2和CDRH3，所述轻链可变区包含轻链CDR CDRL1、CDRL2和CDRL3，其中CDR衍生自105抗体。
在一个实施方案中，本发明涉及包含重链可变区和轻链可变区的LT结合分子，所述重链可变区包含重链CDR CDRH1、CDRH2和CDRH3，所述轻链可变区包含轻链CDR CDRL1、CDRL2和CDRL3，其中CDR衍生自9B4抗体。
根据本发明的例子的分离的抗体的CDR的分析促进开发共有CDR氨基酸序列。在一个实施方案中，本发明的结合分子包含本文所述的一种或多种共有CDR序列(参见例如表1和2)。例如，本发明的实施方案涉及包含重链可变区和轻链可变区的LT结合分子，所述重链可变区包含重链CDRCDRH1、CDRH2和CDRH3，所述轻链可变区包含轻链CDR CDRL1、CDRL2和CDRL3，其中CDRH1包含序列GFSLX1X2Y/SGX3H/GX4X5其中X是任意氨基酸。在另外的实施方案中，X1选自S或T；X2选自T，D或N。在另外的实施方案中，X3选自V，M或I，X4不存在或V，并且X5不存在或S。在一个实施方案中，CDRH1的氨基酸序列的7/10或7/12等同于共有序列中的那些。在一个实施方案中，残留5种CDR衍生自A0D9抗体、108抗体、9B4抗体或107抗体、或其组合。
在另外的实施方案中，本发明涉及包含重链可变区和轻链可变区的LT结合分子，所述重链可变区包含重链CDR CDRH1、CDRH2和CDRH3，所述轻链可变区包含轻链CDR CDRL1、CDRL2和CDRL3，其中CDRH1包含序列GX1X2X3X4X5X6X7X8X9X10其中X1选自Y或F；X2选自S，T或V；X3选自F或I；X4选自T或S；X5选自G，D或S；X6选自Y，S或G；X7选自F，Y或W；X8选自M或Y；X9选自N，Y或W；并且X10选自不存在或N。在一个实施方案中，残留5个CDR衍生自A1D5，A105，102或101/103抗体。
在另外的实施方案中，本发明涉及包含重链可变区和轻链可变区的LT结合分子，所述重链可变区包含重链CDR CDRH1、CDRH2和CDRH3，所述轻链可变区包含轻链CDR CDRL1、CDRL2和CDRL3，其中CDRH2包含序列VIWX1GGX2TX3X4NAX5FX6S。在一个实施方案中，X是任意氨基酸。在另外的实施方案中，X1选自R或S；X2选自N或S；X3选自N或D；X4选自Y或H；X5选自A或V；并且X6选自M，T或I。在一个实施方案中，结合分子的残留5个CDR衍生自A0D9抗体、108抗体或107抗体。
在另外的实施方案中，本发明涉及包含重链可变区和轻链可变区的LT结合分子，所述重链可变区包含重链CDR CDRH1、CDRH2和CDRH3，所述轻链可变区包含轻链CDR CDRL1、CDRL2和CDRL3，其中CDRH2包含序列X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10YX11X12X13X14X15X16其中X1选自R，T，G或不存在；X2选自I，H或Y；X3选自N，G，Y或I；X4选自P，D，Y或S；X5选自Y，W或G；X6选自N，T或D；X7选自G，D或S；X8选自D，Y或S；X9选自S，T，K或N；X10选自F，H，D，R或N；X11选自N，P或T；X12选自Q，D，G或P；X13选自K或S；X14选自F，V或L；X15选自K或Q；并且X16选自D，G或N。在一个实施方案中，残留5个CDR衍生自A1D5，102，9B4，105或101/103抗体或其组合。
在一个实施方案中，本发明涉及包含重链可变区和轻链可变区的LT结合分子，所述重链可变区包含重链CDR CDRH1、CDRH2和CDRH3，所述轻链可变区包含轻链CDR CDRL1、CDRL2和CDRL3，其中CDRH3包含序列G/AYYG/A。在一个实施方案中，残留5个CDR衍生自A0D9，107，108，9B4抗体或其组合。
在一个实施方案中，本发明涉及包含重链可变区和轻链可变区的LT结合分子，所述重链可变区包含重链CDR CDRH1、CDRH2和CDRH3，所述轻链可变区包含轻链CDR CDRL1、CDRL2和CDRL3，其中CDRL1包含序列或X1ASQDX2X3X4X5LX6其中X是任意氨基酸。在一个实施方案中，X1选自K或R；X2选自I或M；X3选自N或S；X4选自T或N；X5选自Y或F；X6选自N，T或R。在一个实施方案中，残留5个CDR衍生自A0D9抗体，108抗体，107抗体，A1D5抗体或101/103抗体。
在一个实施方案中，本发明涉及包含重链可变区和轻链可变区的LT结合分子，所述重链可变区包含重链CDR CDRH1、CDRH2和CDRH3，所述轻链可变区包含轻链CDR CDRL1、CDRL2和CDRL3，其中CDRL1包含序列或RASX1SV X2X3X4X5其中X是任意氨基酸。在一个实施方案中，X1选自E或S；X2选自D或S；X3选自N或Y；X4选自Y或M；X5选自G或I。在一个实施方案中，残留5个CDR衍生自105抗体或9B4抗体或其组合。
在一个实施方案中，本发明涉及包含重链可变区和轻链可变区的LT结合分子，所述重链可变区包含重链CDR CDRH1、CDRH2和CDRH3，所述轻链可变区包含轻链CDR CDRL1、CDRL2和CDRL3，其中CDRL2包含序列RAX1RLX2D其中X是任意氨基酸。在一个实施方案中，X1选自N或D；X2选自V或L。在一个实施方案中，残留5个CDR衍生自A0D9抗体，108抗体，107抗体，或101/103抗体或其组合。
在另外的实施方案中，CDRL2包含序列X1X2SX3X4X5S其中X1选自Y，R，A或K；X2选自T，A或V；X3选自K，S或N；X4选自L或R；X5选自H，E，A或F。在一个实施方案中，残留5个CDR衍生自A1D5抗体，102抗体，105抗体，105A抗体，105B抗体，105C抗体或9B4抗体。
在另外的实施方案中，本发明涉及包含重链可变区和轻链可变区的LT结合分子，所述重链可变区包含重链CDR CDRH1、CDRH2和CDRH3，所述轻链可变区包含轻链CDR CDRL1、CDRL2和CDRL3，其中CDRL3包含序列X1QX2X3X4X5PX6T其中X1选自Q或F；X2选自Y，V，G，W或S；X3选自D，S或N；X4＝D，H，Y或K；X5选自F，N或D；并且X6＝W，L或Y。在一个实施方案中，残留5个CDR衍生自108，107，A1D5，102，9B4或105抗体或其组合。
在另外的实施方案中，CDRL3包含序列LX1X2DX3FPX4T其中X1选自H或Q；X2选自H或Y；X3选自A或K；X4选自W或P。在一个实施方案中，残留5个CDR衍生自A0D9或101/103抗体或其组合。
在另外的实施方案中，本发明提供分离的多肽，包含、基本上由下列构成或由下列构成：免疫球蛋白重链可变区(VH)，其中VH-CDR1，VH-CDR2和VH-CDR3区具有的多肽序列等同于本文所述抗体的VH-CDR1，VH-CDR2和VH-CDR3序列(例如Kabat CDR或Chothia CDR(示例性取代位点示于表1)，不同之处在于在任意一种VH-CDR中有一个、两个、三个、四个、五个或六个氨基酸取代。在更大CDR例如VH-CDR-3中，在CDR中可进行另外的取代，只要包含VH-CDR的VH特异性或优选结合LT。在某些实施方案中氨基酸取代是保守的。
在另外的实施方案中，本发明提供分离的多肽，包含、基本上由下列构成或由下列构成：免疫球蛋白轻链可变区(VL)，其中VL-CDR1，VL-CDR2和VL-CDR3区具有的多肽序列等同于本文所述抗体的VL-CDR1，VL-CDR2和VL-CDR3序列(例如Kabat CDR或Chothia CDR(示例性取代位点示于表2)，不同之处在于在任意一种VL-CDR中有一个、两个、三个、四个、五个或六个氨基酸取代。在某些实施方案中氨基酸取代是保守的。
在一个实施方案中，可使结合分子的CDR改变以获得具有改善的性能的结合分子，例如结合性能或物理化学性能例如溶解度。例如，在一个实施方案中，可使重链或轻链的一个或多个CDR改变，这影响自缔合以改善分子的溶解度。在一个实施方案中，这些改变导致氨基酸被表1和2中阐述的基序提供的取代氨基酸所取代。在一个实施方案中，使CDRL2(例如105抗体)进行至少一种改变。在另外的实施方案中，使CDRL2(例如105抗体)进行两种改变。
例如，在一个实施方案中，可以制备：在Kabat位54至K在R的CDRL2具有突变的105抗体的轻链版本(版本A)；在Kabat位57位S在N的CDRL2具有突变的第二版本(版本B)；以及在CDRL2都具有突变的第三版本(比较于Kabat位54的K和Kabat位57的S；版本C)。如本发明的例子中所示，包含CDRL2的这些修饰的版本的抗体证实改善的溶解度。
本发明的LT结合分子可包含抗原识别位点、完整可变区或衍生自本发明的一种或多种初始或亲本抗-LT抗体的一种或多种CDR。
在一个实施方案中，考虑到A0D9，108，9B4和107重链CDR之间的同源性，可进行多种组合。例如，在一个实施方案中，A0D9重链CDRH1可取代108，9B4或107 CDRH1，并且联合来自这些抗体可变区中的任一种的CDRH2和CDRH3。
在另外的实施方案中，考虑到A0D9，108，9B4，101/103和107轻链CDR之间的同源性，可进行多种组合。例如，在一个实施方案中，A0D9轻链CDRL11可取代108，9B4，101/103或107 CDRL1，并且联合来自这些抗体可变区中的任一种的CDRL2和CDRL3。
在另外的实施方案中，本发明的第一抗-LT抗体的重链可联合本发明的第二抗-LT抗体的轻链。例如，考虑到A0D9，108和107重链CDR之间的同源性，A0D9重链可联合108或107轻链以产生抗-LT结合位点。在另外的实施方案中，108重链可联合A0D9或107轻链以产生抗-LT结合位点。在又一实施方案中，108重链可联合A0D9或107轻链以产生抗-LT结合位点。
在又一实施方案中，各种版本的抗-LT抗体轻链和重链可联合。例如，在一个实施方案中，本文所述的各种版本的105抗体轻链和重链可联合。如本文所阐述，这些版本中的一些证实和初始105抗体相比改善的溶解度。105轻链和重链的示例性组合包括：H1/L0(重链版本1和轻链版本0)；H1/L版本A；H1/L版本B；H1/L10；H1/L12；H1/L13；H11/L10；H11/L12；H11/L13；H14/L10和H14/L12。
本发明还涉及编码本发明的结合分子的多核苷酸序列。
在某些实施方案中，多核苷酸或核酸分子是DNA或RNA分子。在DNA的情况下，包含编码多肽的核酸的多核苷酸通常可包括启动子和/或可操作地和一个或多个编码区缔合的其他转录或翻译控制元件。在可操作的缔合基因产物例如多肽的编码区中，其和一个或多个调节序列以这样的方式进行缔合，该方式为在调节序列的影响或控制下进行基因产物的表达。
编码抗-LT结合位点的核酸分子可操作地连接编码一个或多个恒定区部分的核苷酸序列、或可以或不可以衍生自抗体的其他期望核苷酸序列。如果启动子功能的诱导使mRNA的转录编码期望基因产物，并且如果两个DNA片段之间的接头的性质不干扰表达调节序列引导基因产物表达的能力或干扰DNA模板被转录的能力，则两个DNA片段(例如多肽编码区域和与之连接的启动子)被“可操作地连接”。因此，如果启动子能够影响核酸的转录，则该启动子区域将被可操作地连接至编码多肽的核酸。该启动子可以是仅能在预定细胞中引导DNA的充分转录的细胞特异性启动子。除启动子外的其他转录控制元件，如增强子、操作子、阻遏子以及转录终止信号可与多核苷酸进行可操作连接以引导细胞特异性转录。本文中披露了合适的启动子和其他转录控制区。
各种转录控制区域已为本领域技术人员所熟知。其包括但不限于在脊椎动物细胞中起作用的转录控制区域，例如但不限于来自细胞巨化病毒的启动子和增强子片段(立即早期启动子，与内含子-A相连接)、猿病毒40(早期启动子)以及逆转录酶病毒(例如禽劳斯肉瘤病毒)。其他的转录控制区域包括衍生自肌动蛋白、热休克蛋白、牛生长激素和兔β-球蛋白的脊椎动物基因的区域以及其他能够在真核细胞中控制基因表达的序列。其他合适的转录控制区域包括组织特异性启动子和增强子以及淋巴因子-诱导型启动子(例如受干扰素或白介素诱导的启动子)。
类似地，各种转译控制元件已为本领域普通技术人员所熟知。其包括但不限于核糖体结合位点、转译启动和终止密码子以及衍生自小核糖核酸病毒的元件(特别是内部核糖体进入位点或是IRES，也被称为CITE序列)。
在其他的实施方案中，本发明的核苷酸为RNA分子，例如以信使RNA(mRNA)的形式存在。
本发明的多核苷酸和核酸编码区可与编码分泌腺或信号肽的附加编码区(引导本发明的多核苷酸编码的多肽的分泌)相连接。根据信号假设，由哺乳动物细胞分泌的蛋白具有信号肽或分泌型前导序列，后者在生长蛋白链向粗面内质网的输出被启动时从成熟蛋白上被裂解。本领域普通技术人员均了解由脊椎动物细胞分泌的多肽通常具有融合到多肽N末端的信号肽，它从完整或“全长”多肽序列裂解以生产分泌或“成熟”型多肽。在某些实施方案中采用了如免疫球蛋白重链或轻链信号肽等天然信号肽，或保留了引导与之可操作连接的多肽分泌能力的该序列的功能性衍生物。可选择地，还可以使用外源哺乳动物信号肽或其功能性衍生物。例如，野生型前导序列可被人组织型纤溶酶原激活剂(TPA)或鼠β-葡萄糖醛酸酶的前导序列替换。在一个实施方案中，本发明的结合分子是缺少信号肽的成熟形式的分子。
此外，如本文中别处详细描述的，本发明包括组合物，包含上述一种或多种多核苷酸。
III.结合分子的示例性形式
A.抗-LT抗体
在某些实施方案中，本发明的LT结合分子是抗体。考虑到本申请中公开的数据，明显的是可以制备结合LT并且优于之前产生的那些抗体的抗体。在一个实施方案中，本发明涉及和本文披露的那些功能上相关的抗体。在一个实施方案中，本发明涉及和本文披露的那些结构上相关的抗体。在另外的实施方案中，本发明涉及和本文披露的那些功能上和结构上相关的抗体。本发明的抗体可通过本领域已知的用于合成抗体的方法来制备，特别是通过化学合成或优选通过本文所述的重组技术来制备。例如，本领域技术人员可使用熟知技术来筛选抗体-产生细胞系并培养。这些技术描述于多种多本试验手册和初级出版物中。就此而言，上述适用于本发明的技术描述于CurrentProtocols in Immunology，Coligan et al.，Eds.，Green Publishing Associates andWiley-Interscience，John Wiley and Sons，New York(1991)，其通过引用的方式全文(包括附录)并入本文中。
本发明的另一实施方案包含在不能生成内源免疫球蛋白的转基因动物(例如，鼠)体内生成人或实质人抗体(例如，参见美国专利No.6,075,181，5,939,598，5,591,669和5,589,369，均通过引用的方式并入本文中)。例如，据描述在嵌合和胚系突变小鼠中的抗体重链结合区的纯合子缺失可导致内源抗体生产的完全抑制。人免疫球蛋白基因阵列向该胚系突变小鼠的转移可导致在抗原攻击下的人抗体生产。另一使用SCID鼠生成人抗体的优选方法可参见美国专利No.5,811,524，该文献通过引用的方式并入本文中。应当可以理解与这些人抗体相关的遗传材料也可以依照此处所述进行分离和操作。
在另一个实施方案中，可通过显微操作选择淋巴细胞并分离可变基因。例如，可从免疫哺乳动物分离外周血单核细胞并在体外培养大约7天。筛选该培养物以获得达到筛选标准的特异性IgG。可对阳性孔的细胞进行分离。可通过FACS或补体介导的溶血空斑检测的鉴定分离得到生产Ig的单独B细胞。可通过显微操作将生成Ig的B细胞转移至试管，并可采用RT-PCR等方法扩增VH和VL基因。将VH和VL基因克隆至抗体表达载体并转染进入细胞(例如，真核或原核细胞)以进行表达。
在某些实施方案中，LT抗体的可变区和恒定区、或其抗原结合片段、变体或衍生物均为完全人源。完全人源抗体可通过本领域已知的以及本文中描述的技术进行制备。例如，针对特异性抗原的完全人源抗体可通过向经修饰在应答抗原性攻击时生产该种抗体同时其内源性基因座被灭活的转基因动物施用抗原进行制备。可用于制备该种抗体的示例性技术参见美国专利6,150,584、6,458,592、6,420,140。其他的技术已为本领域所知。如本文其他部分将作更具体讨论，完全人源抗体还可通过各种展示技术进行制备，例如噬菌体展示或其他病毒展示***。
目标抗原抗原的多克隆抗体可通过各种本领域公知的方法生产。例如，包含目标抗原抗原的抗原可施用至各种宿主动物，包括但不限于兔子、小鼠、大鼠、鸡、仓鼠、山羊、驴等，以诱导包含了对该抗原特异的多克隆抗体的血浆的生产。依据宿主种类不同，各种佐剂可用于提高免疫应答，其包括但不限于弗氏试剂(完全或不完全)，矿物凝胶(如氢氧化铝)，表面活性物质如溶血卵磷脂，pluronic多元醇，聚阴离子，肽，油乳剂，匙孔血蓝蛋白，二硝基酚以及潜在有用的人佐剂如BCG(卡介苗)和短小棒状杆菌。该类佐剂也是本领域熟知的。
单克隆
抗体可通过本领域已知的多种技术进行制备，包括杂交瘤，重组和噬菌体展示技术的应用及其组合。例如，单克隆抗体可通过本领域已知的杂交瘤技术进行生产，该技术还在许多文献中得到描述，例如Harlow etal.，Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，2nded.(1988)；Hammerling et al.，in：Monoclonal Antibodies and T-Cell HybridomasElsevier，N.Y.，563-681(1981)(所述参考文献以引用的方式全部并入)。本文中所用的术语“单克隆抗体”不限于通过杂交瘤技术生产的抗体。术语“单克隆抗体”指由单个克隆(包括真核、原核或噬菌体克隆)得到的抗体，而非它的生产方法。因此，术语“单克隆抗体”不限于通过杂交瘤技术生产的抗体。单克隆抗体可采用LT敲除小鼠生产以增加抗原表位识别的区域。单克隆抗体可通过本领域已知的多种技术进行制备，包括本文其他部分所述的杂交瘤和重组和噬菌体展示技术的应用。
在一个实施例中，采用本领域认可的方案，通过多次皮下或腹腔注射相关抗原(例如，纯化的LTα1β2或包含LTα1β2的细胞表达或细胞萃取物)和佐剂在哺乳动物体内产生抗体。该免疫作用通常可引发包含了从激活的脾细胞或淋巴细胞产生抗原反应抗体的免疫应答。尽管可从动物血浆获取所得的抗体以进行多克隆制备，通常期望可从脾脏、***或外周血分离单独的淋巴细胞以进行单克隆抗体(MAb)的均一制备。优选地，该淋巴细胞从脾脏中获取。在该种众所周知的方法中(Kohler et al.，Nature 256：495(1975))，该取自注射了抗原的哺乳动物的相对短命或终会死亡的淋巴细胞与一个永生肿瘤细胞系(例如，骨髓瘤细胞系)相融合，从而得到了永生的并能生产B细胞的转基因编码抗体的杂交细胞或“杂交瘤”。所得的杂交物通过对包含了能够形成单独抗体的特定基因的单独株系进行挑选，稀释和再生而分离得到单独遗传株系。它们可生产针对目标抗原的相似抗体，并由于其单纯的遗传亲缘而被称为“单克隆”。
将由此制备的杂交瘤细胞接种和培养至适当的培养基中，该培养基优选包含一种或多种抑制未融合的，亲代骨髓瘤细胞生长或存活的物质。本领域的技术人员均了解用于杂交瘤形成，挑选和培养的试剂，细胞系和培养基可从多个来源购买，且已充分建立了标准化的方案。通常对杂交瘤细胞生长的培养基进行分析以测定针对目标抗原的单克隆抗体的生产。优选地，由杂交瘤细胞生产的单克隆抗体的结合特异性通过免疫沉淀，放射性免疫测定(RIA)或酶联免疫吸收分析(ELISA)等体外分析进行测定。当杂交瘤经鉴定能够生产具有所需特异性，亲和性和/或活性的抗体后，该克隆可通过有限稀释法进行亚克隆并以标准方法培养(Goding，Monoclonal Antibodies：Principles andPractice，Academic Press，pp 59-103(1986))。进一步会了解，由亚克隆分泌的单克隆抗体可通过蛋白-A、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析等传统方法进行纯化，从培养基、腹水或血清中分离。
本领域技术人员还可理解编码抗体或抗体片段(例如，抗原结合位点)的DNA还可以从抗体库(例如噬菌体展示库)获得。特别地，该种噬菌体可特别用于展示由抗体库或组合抗体库(例如，人或鼠)表达的抗原结合结构域。表达结合目标抗原的抗原结合结构域的噬菌体可通过抗原(例如，采用标记抗原或者固体表面或珠子结合或捕获的抗原)进行选择或鉴别。在这些方法中使用的噬菌体通常为丝状噬菌体，包括fd和M13结合区，该结合区可由Fab，Fv OE DAB(单独轻或重链Fv区)或二硫键稳定的Fv抗体结构域融合至噬菌体基因III或基因VIII蛋白的噬菌体进行表达。示例性方法可参见例如EP 368684B1；美国专利5,969,108，Hoogenboom，H.R.和Chames，Immunol.Today21：371(2000)；Nagy et al.Nat.Med.8：801(2002)；Huie et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98：2682(2001)；Lui et al.，J.Mol.Biol.315：1063(2002)，其均通过引用的方式并入本文中。许多文献(例如Marks et al.，Bio/Technology10：779-783(1992))均已描述了通过链替换，以及作为构建大型噬菌体库的策略的组合感染和体内重组对高亲和性人抗体的生产。在另一实施方案中，可采用核糖体展示替代噬菌体作为展示平台(例如参见Hanes et al.，Nat.Biotechnol.18：1287(2000)；Wilson et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA98：3750(2001)；或Irving et al.，J.Immunol.Methods 248：31(2001))。在又一实施方案中，可通过细胞表面库筛选抗体(Boder et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA97：10701(2000)；Daugherty et al.，J.Immunol.Methods 243：211(2000))。在又一示例性实施方案中，高亲和性人Fab库有下列表示：联合衍生自人供体的免疫球蛋白序列和选择的互补决定区例如CDR H1和CDR H2中的合成多样性(参见例如Hoet et al.，Nature Biotechnol.，23：344-348(2005)，其均通过引用的方式并入本文中)。该类方法可为用于单克隆抗体的分离和后续克隆的传统杂交瘤技术提供替代方法。
在噬菌体展示方法中，功能性抗体区被展示在携带了对其编码的多聚核苷酸序列的噬菌体颗粒的表面上。例如，可从动物cDNA库(例如，人或鼠淋巴组织cDNA库)或合成cDNA库扩增或以其他方式分离编码VH和VL区的DNA序列。在某些实施方案中，该编码VH和VL区的DNA在PCR中通过scFv接头相连接并被克隆进入噬菌粒载体(例如，p CANTAB 6或pComb 3 HSS)。将该载体导入E.coli并以辅助噬菌体感染该E.coli。这些方法中所用的噬菌体通常为丝状噬菌体，包括fd和M13，通常将VH或VL区重组融合至噬菌体基因III或基因VIII。表达能够结合目标抗原(即，LT多肽或其片段)的抗原结合结构域的噬菌体可通过抗原(例如，采用标记抗原或者固体表面或珠子结合或捕获的抗原)进行选择或鉴别。
可用于制备该抗体的噬菌体展示方法的附加例子包括下列中披露的那些：Brinkman et al.，J.Immunol.Methods 182：41-50(1995)；Ames et al.，J.Immunol.Methods 184：177-186(1995)；Kettleborough et al.，Eur.J.Immunol.24：952-958(1994)；Persic et al.，Gene 187：9-18(1997)；Burton et al.，Advances inImmunology 57：191-280(1994)；PCT申请No.PCT/GB91/01134；PCT公开WO90/02809；WO 91/10737；WO 92/01047；WO 92/18619；WO 93/11236；WO95/15982；WO 95/20401；和美国专利No.5,698,426；5,223,409；5,403,484；5,580,717；5,427,908；5,750,753；5,821,047；5,571,698；5,427,908；5,516,637；5,780,225；5,658,727；5,733,743和5,969,108；其均以引用的方式全部并入本文中。
如上述参考文献所述，在噬菌体筛选后，可从该噬菌体分离该抗体编码区并用于生成包括人抗体或任何其他目标抗原结合片段的完整抗体，并在包括哺乳动物细胞，昆虫细胞，植物细胞，酵母和细菌的目标宿主中表达。例如，用于重组生产Fab、Fab′和F(ab′)2片段的技术也可采用本领域已知的技术，例如参见PCT公开WO 92/22324；Mullinax et al.，BioTechniques12(6)：864-869(1992)；和Sawai et al.，AJRI 34：26-34(1995)；和Better et al.，Science 240：1041-1043(1988)(所述参考文献以引用的方式全部并入)。
可用于生产单链Fvs和抗体的技术例子可参见美国专利No.4,946,778和5,258,498；Huston et al.，Methods in Enzymology 203：46-88(1991)；Shu et al.，PNAS 90：7995-7999(1993)；和Skerra et al.，Science 240：1038-1040(1988)。对于某些用途，包括抗体在人体的体内应用和体外检测分析，可优选使用嵌合，人源化或人源抗体。
完整人类抗体可特别用于人类患者的治疗。人类抗体可通过本领域已知的多种方法制备，包括上述采用来自人免疫球蛋白序列的抗体库进行的噬菌体展示方法。还可参见美国专利No.4,444,887和4,716,111；和PCT公开WO98/46645，WO 98/50433，WO 98/24893，WO 98/16654，WO 96/34096，WO96/33735，和WO 91/10741；其均以引用的方式全部并入本文中。
人类抗体还可采用不能表达功能性内源免疫球蛋白，但能表达人免疫球蛋白基因的转基因鼠进行生产。例如，人重链和轻链免疫球蛋白基因复合物可随机导入或通过同源重组进入鼠胚胎干细胞。可选择地，除人重链和轻链基因外，还可将人可变区，恒定区和多样区导入鼠胚胎干细胞。鼠重链和轻链免疫球蛋白基因可通过同源重组导入的人免疫球蛋白基因座进行单独或同时的非功能性修饰。特别地，JH区纯合子的删除防止了内源抗体的生产。扩增该修饰后的胚胎干细胞并注射进入胚泡以生产嵌合鼠。然后饲养该嵌合鼠以生产表达人抗体的纯合子型后代。该转基因鼠以选择抗原(例如所需靶多肽的全部或部分)通过常规方式进行免疫。针对该抗原的单克隆抗体可采用常规杂交瘤技术从免疫后的转基因鼠获取。转基因鼠包含的人免疫球蛋白转基因在B-细胞分化时重排，随后进行类型转换和体细胞突变。因此，通过该种技术可生产治疗有效的IgG、IgA、IgM和IgE抗体。该技术生产人类抗体的综述可参见Lonberg and Huszar Int.Rev.Immunol.13：65-93(1995)。对技术用于生产人类抗体和人类单克隆抗体以及生产该类抗体的方案的具体讨论可参见PCT公开WO 98/24893；WO 96/34096；WO 96/33735；美国专利No.5,413,923；5,625,126；5,633,425；5,569,825；5,661,016；5,545,806；5,814,318；和5,939,598，其以引用的方式全部并入本文中。此外，可委托Abgenix，Inc.(Freemont，Calif.)和GenPharm(San Jose，Calif.)等公司通过与上述类似的技术提供针对选定抗原的人类抗体。
识别选定抗原表位的完整人类抗体可通过称为“定向选择”的技术进行生产。在该方法中采用一种选定的非人类单克隆抗体(例如，鼠抗体)引导识别相同表位的完整人类抗体的筛选。(Jespers et al.，Bio/Technology12：899-903(1988)。还可参见美国专利No.5,565,332)。
″亲和性-成熟的″抗体是和未具有这些改变的父代抗体相比，在其一个或多种CDR中具有一个或多个改变从而导致抗体和抗原的亲和性改善的抗体。优选亲和性-成熟的抗体对于靶抗原具有纳摩尔或甚至皮摩尔的亲和性。亲和性-成熟的抗体通过本领域已知的方法来制备。Marks et alBio/Technology 10：779-783(1992)描述了通过VH和VL结构域的缓慢移动而引起亲和性成熟。CDR和/或框架残基的随机突变由下列文献描述：Barbas etal，ProcNat.Acad.Sci，USA 91：3809-3813(1994)；Schier et al.，Gene169：147-155(1995)；Yelton et al，J.Immunol.155：1994-2004(1995)；Jackson etal，J.Immunol.154.7)：3310-9(1995)；和Hawkins et al，J.MoI Biol.226：889-896(1992)。
B.单链结合分子
在其他实施方案中，本发明的结合分子可以是单链结合分子(例如单链可变区或scFv)。描述用于制备单链抗体的技术(美国专利No.4,694,778；Bird，Science 242：423-442(1988)；Huston et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA85：5879-5883(1988)；和Ward et al.，Nature 334：544-554(1989))可适于制备单链结合分子。可通过氨基酸桥连接Fv区的重链和轻链片段从而生成单链抗体来制备单链抗体。也可采用在大肠杆菌内组装功能性Fv片段的技术(Skerraet al.，Science 242：1038-1041(1988))。
在某些实施方案中，本发明的结合分子是scFv分子(例如连接scFv接头的来自本发明的抗-LT抗体的VH和VL结构域)或包含这些分子。scFv分子可以是常规scFv分子或稳定的scFv分子。稳定的scFv包含稳定突变、二硫键或赋予scFv或包含scFv的结合分子改善的稳定性(例如改善的热稳定性)的优化的接头，其详细描述于美国专利申请No.11/725,970，其以引用的方式全部并入本文中。
在其他实施方案中，本发明的结合分子是包含scFv分子的多肽。在某些实施方案中，多特异性结合分子可通过下列方式产生：使scFv分子(例如稳定的scFv分子)连接上文所述的抗-LT抗体、或包含一种抗-LT抗体的结合位点的单特异性结合分子，其中scFv分子和父代结合分子具有相同的结合特异性。在一个实施方案中，本发明的结合分子是scFv分子已经融合的天然存在的抗-LT抗体。
稳定的scFv分子具有改善的热稳定性(例如熔融温度(Tm)值大于54℃(例如55，56，57，58，59，60℃或更高)或者T50值大于39℃(例如40，41，42，43，44，45，46，47，48，50，51，52，53，54，55，56，57，58或59℃)。本发明的scFv分子或者包含它们的融合蛋白的稳定性可参照常规(非稳定的)scFv分子或包含常规scFv分子的结合分子的生物物理学性能(例如热稳定性)来评价。在一个实施方案中，本发明的结合分子的热稳定性为：比对照结合分子(例如常规scFv分子)高约0.1，约0.25，约0.5，约0.75，约1，约1.25，约1.5，约1.75，约2，约3，约4，约5，约6，约7，约8，约9或约10摄氏度。
在一个实施方案中，scFv接头由氨基酸序列(Gly4Ser)4构成或包含(Gly4Ser)4序列。其他示例性接头包含或由(Gly4Ser)3与(Gly4Ser)5序列构成。本发明的scFv接头的长度可改变。在一个实施方案中，本发明的scFv接头的长度为约5至约50个氨基酸。在另外的实施方案中，本发明的scFv接头的长度为约10至约40个氨基酸。在另外的实施方案中，本发明的scFv接头的长度为约15至约30个氨基酸。在另外的实施方案中，本发明的scFv接头的长度为约17至约28个氨基酸。在另外的实施方案中，本发明的scFv接头的长度为约19至约26个氨基酸。在另外的实施方案中，本发明的scFv接头的长度为约21至约24个氨基酸。
在某些实施方案中，本发明的稳定的scFv分子包含至少一种二硫键，其使VL结构域中的氨基酸连接VH结构域中的氨基酸。半胱氨酸残基对于提供二硫键是必须的。二硫键可引入本发明的scFv分子，例如以连接VL的FR4和VH的FR2或连接VL的FR2和VH的FR4。二硫键结合的示例性位置包括：VH的43，44，45，46，47，103，104，105和106以及VL的42，43，44，45，46，98，99，100和101，Kabat编号。半胱氨酸残基突变的氨基酸位置的示例性组合包括：VH44-VL100，VH105-VL43，VH105-VL42，VH44-VL101，VH106-VL43，VH104-VL43，VH44-VL99，VH45-VL98，VH46-VL98，VH103-VL43，VH103-VL44和VH103-VL45。在一个实施方案中，二硫键连接VH氨基酸44和VL氨基酸100。
在一个实施方案中，本发明的稳定的scFv分子包含具有夹置在VH结构域和VL结构域之间的氨基酸序列(Gly4Ser)4的scFv接头，其中VH和VL结构域通过氨基酸位44的VH中的氨基酸和氨基酸位100的VL中的氨基酸之间的二硫键连接。
在其他实施方案中，本发明的稳定的scFv分子包含scFv的可变结构域(VH或VL)内的一个或多个(例如2，3，4，5或更多)稳定突变。在一个实施方案中，稳定突变选自：a)在VL的Kabat位3氨基酸(例如谷氨酰胺)被例如丙氨酸，丝氨酸，缬氨酸，天冬氨酸或甘氨酸取代；(b)在VL的Kabat位46氨基酸(例如丝氨酸)被例如亮氨酸取代；(c)在VL的Kabat位49氨基酸(例如丝氨酸)被例如酪氨酸或丝氨酸取代；(d)在VL的Kabat位50氨基酸(例如丝氨酸或缬氨酸)被例如丝氨酸，苏氨酸和精氨酸，天冬氨酸，甘氨酸或赖氨酸取代；(e)在VL的Kabat位49氨基酸(例如丝氨酸)和Kabat位50(例如丝氨酸)分别被例如酪氨酸和丝氨酸；酪氨酸和苏氨酸；酪氨酸和精氨酸；酪氨酸和甘氨酸；丝氨酸和精氨酸；或丝氨酸和赖氨酸取代；(f)在VL的Kabat位75氨基酸(例如缬氨酸)被例如异亮氨酸取代；(g)在VL的Kabat位80氨基酸(例如脯氨酸)被例如丝氨酸或甘氨酸取代；(h)在VL的Kabat位83氨基酸(例如苯丙氨酸)被例如丝氨酸，丙氨酸，甘氨酸或苏氨酸取代；(i)在VH的Kabat位6氨基酸(例如谷氨酸)被例如谷氨酰胺取代；(j)在VH的Kabat位13氨基酸(例如赖氨酸)被例如谷氨酸盐取代；(k)在VH的Kabat位16氨基酸(例如丝氨酸)被例如谷氨酸盐或谷氨酰胺取代；(l)在VH的Kabat位20氨基酸(例如缬氨酸)被例如异亮氨酸取代；(m)在VH的Kabat位32氨基酸(例如天冬酰胺)被例如丝氨酸取代；(n)在VH的Kabat位43氨基酸(例如谷氨酰胺)被例如赖氨酸或精氨酸取代；(o)在VH的Kabat位48氨基酸(例如蛋氨酸)被例如异亮氨酸或甘氨酸取代；(p)在VH的Kabat位49氨基酸(例如丝氨酸)被例如甘氨酸或丙氨酸取代；(q)在VH的Kabat位55氨基酸(例如缬氨酸)被例如甘氨酸取代；(r)在VH的Kabat位67氨基酸(例如缬氨酸)被例如异亮氨酸或亮氨酸取代；(s)在VH的Kabat位72氨基酸(例如谷氨酸)被被例如天冬氨酸或天冬酰胺取代；(t)在VH的Kabat位79氨基酸(例如苯丙氨酸)被被例丝氨酸，缬氨酸或酪氨酸取代；以及(u)在VH的Kabat位101氨基酸(例如脯氨酸)被例如天冬氨酸取代。
C.单结构域结合分子
在某些实施方案中，结合分子是或包含单结构域结合分子(例如单结构域抗体)，也称为纳米抗体。示例性单结构域分子包括抗体的分离的重链可变结构域(VH)，即重链可变结构域并且没有轻链可变结构域；和抗体的分离的轻链可变结构域(VL)，即轻链可变结构域没有重链可变结构域。本发明的结合分子中使用的示例性单结构域抗体包括例如Camelid重链可变结构域(约118至136个氨基酸残基)，如Hamers-Casterman，et al.，Nature363：446-448(1993)和Dumoulin，et al.，Protein Science 11：500-515(2002)中所述。单结构域抗体的多聚体也在本发明的范围内。其他单结构域抗体包括shark抗体(例如shark Ig-NAR)。Shark Ig-NAR包含一个可变结构域(V-NAR)和五个C-样恒定结构域(C-NAR)的同源二聚体，其中多样性集中在长度从5至23个残基变化的延长的CDR3区域中。在camelid物种(例如骆驼)中，重链可变区，称为VHH，形成完整抗原结合结构域。camelid VHH可变区和衍生自常规抗体(VH)的那些之间的主要差异包括：(a)和VHH中的对应区域相比，VH的轻链接触表面中的氨基酸更具疏水性；(b)VHH中更长的CDR3；以及(c)VHH中CDR1和CDR3之间的二硫键频繁出现。制备单结构域结合分子的方法描述于美国专利Nos 6.005,079和6,765,087，其均以引用的方式全部并入本文中。
D.微抗体
在某些实施方案中，本发明的结合分子是微抗体或包含微抗体。微抗体可使用本领域所述的方法来制备(例如参见美国专利5,837,821或WO94/09817A1)。在某些实施方案中，微抗体是仅包含天然或天然(例如诱变)存在的重链可变结构域或轻链可变结构域、或其组合的2个互补决定区(CDR)的结合分子。这种微抗体的例子由Pessi et al.，Nature 362：367-369(1993)所述。另外示例性微抗体包含连接或融合CH3结构域或完整Fc区的scFv分子。微抗体的多聚体也在本发明的范围内。
E.结合分子片段
除非明确说明，本文中涉及结合分子使用的″片段″是指抗原结合片段，即特异性结合抗原的结合的一部分。在一个实施方案中，本发明的结合分子是抗体片段或包含这种片段。识别特异性抗原表位的抗体片段可通过已知的技术来产生。例如，可采用木瓜蛋白酶(生产Fab片段)或胃蛋白酶(生产F(ab′)2片段)等酶通过蛋白水解裂解免疫球蛋白分子或重组生产Fab和F(ab′)2片段。F(ab′)2片段包含了可变区，轻链恒定区和重链CH1区。
F.多价微抗体
在一个实施方案中，本发明的多特异性结合分子是具有至少一种scFv片段(第一结合位点)和具有第二结合位点的至少一种scFv的多价微抗体。两种scFv分子的结合位点可以相同或不同。在优选的实施方案中，至少一种scFv分子稳定化。示例性双特异性二价微抗体构建体包含CH3结构域，其在其N-末端融合连接肽，所述连接肽在其N-末端融合VH结构域，所述VH结构域在其N-末端融合(Gly4Ser)n柔性接头，所述接头在其N-末端融合VL结构域。在某些实施方案中，多价微抗体可以是二价、三价(例如三价抗体)，双特异性(例如二价抗体)或四价的(例如四价抗体)。
在另外的实施方案中，本发明的结合分子是scFv四价微抗体，scFv四价微抗体的各重链部分含有具有不同结合特异性的第一和第二scFv片段。在优选的实施方案中，至少一种scFv分子稳定化。所述第二scFv片段可连接第一scFv片段的N-末端(例如双特异性NH scFv四价微抗体或双特异性NL scFv四价微抗体)。或者，第二scFv片段可连接含有所述第一scFv片段的所述重链部分的C-末端(例如双特异性C-scFv四价微抗体)。尽管双特异性四价微抗体的第一重链部分的第一和第二scFv片段结合相同靶LT分子，双特异性四价微抗体的第二重链部分的第一和第二scFv片段中的至少一种可结合相同或不同的LT靶分子。
G.多特异性抗体
本发明的多特异性结合分子可包含至少两个结合位点，其中至少一种结合位点衍生自或包含上述单特异性结合分子中的一种的结合位点。在某些实施方案中，本发明的多特异性结合分子的至少一种结合位点是抗体的抗原结合区域或其抗原结合片段(例如上述抗体或抗原结合片段)。
在某些实施方案中，本发明的多特异性结合分子是双特异性的。双特异性结合分子可是双价的或更高价的(例如三价、四价、六价等)。双特异性二价抗体、它们的制备方法例如描述于美国专利No.5,731,168；5,807,706；5,821,333；和美国申请公开No.2003/020734和2002/0155537，公开内容均以引用的方式全部并入本文中。双特异性四价抗体、它们的制备方法例如描述于例如WO 02/096948和WO 00/44788，公开内容均以引用的方式全部并入本文中。通常参见PCT公开WO 93/17715；WO 92/08802；WO 91/00360；WO 92/05793；Tutt et al.，J.Immunol.147：60-69(1991)；美国专利No.4,474,893；4,714,681；4,925,648；5,573,920；5,601，819；Kostelny et al.，J.Immunol.148：1547-1553(1992)。
H.含scFv的多特异性结合分子
在一个实施方案中，本发明的多特异性结合分子是多特异性结合分子，包含至少一种scFv分子，例如上述scFv分子。在其他实施方案中，本发明的多特异性结合分子包含两种scFv分子，例如双特异性scFv(Bis-scFv)。在某些实施方案中，scFv分子是常规scFv分子。在其他实施方案中，scFv分子是上述稳定的scFv分子。在某些实施方案中，多特异性结合分子可通过下列方式来产生：连接scFv分子(例如稳定的scFv分子)和上述抗-LT抗体，或单特异性结合分子，包含一种抗-LT抗体的结合位点，其中scFv分子和父代结合分子结合LT的不同区域/具有不同关键的LT接触残基。在一个实施方案中，本发明的结合分子是天然存在的抗-LT抗体，其已经融合scFv分子。在一个实施方案中，这种scFv分子是稳定的。
当稳定的scFv连接父代结合分子时，稳定的scFv分子的连接优选使结合分子的热稳定性改善至少约2℃或3℃。在一个实施方案中，本发明的含scFv的结合分子和常规结合分子相比具有改善1℃的热稳定性。在另外的实施方案中，本发明的结合分子和常规结合分子相比具有改善2℃的热稳定性。在另外的实施方案中，本发明的结合分子和常规结合分子相比具有改善4，5，6℃的热稳定性。
在一个实施方案中，本发明的结合分子是稳定的“抗体”或“免疫球蛋白”分子，例如天然存在的抗体或免疫球蛋白分子(或其抗原结合片段)或基因工程改造的抗体分子，其以和抗体分子类似的方式结合抗原并且包含本发明的scFv分子。如本文中使用的，术语″免疫球蛋白″包括具有两个重链和两个轻链的组合的多肽，无论是否具有任何相关的特异性免疫反应性。
在一个实施方案中，本发明的多特异性结合分子包含连接抗体重链的C-末端的至少一种scFv(例如2，3或4scFvs，例如稳定的scFvs)，其中scFv和抗体具有不同的结合特异性。在另外的实施方案中，本发明的多特异性结合分子包含连接抗体重链的N-末端的至少一种scFv(例如2，3或4scFvs，例如稳定的scFvs)，其中scFv和抗体具有不同的结合特异性。在另外的实施方案中，本发明的多特异性结合分子包含连接抗体轻链的N-末端的至少一种scFv(例如2，3或4scFvs或稳定的scFvs)，其中scFv和抗体具有不同的结合特异性。在另外的实施方案中，本发明的多特异性结合分子包含连接抗体重链或轻链的N-末端的至少一种scFv(例如2，3或4scFvs或稳定的scFvs)和连接重链的C-末端的至少一种scFv(例如2，3或4scFvs或稳定的scFvs)，其中scFvs具有不同的结合特异性。
I.多特异性二价抗体
在其他实施方案中，本发明的结合分子是多特异性二价抗体。在一个实施方案中，本发明的多特异性结合分子是双特异性二价抗体，双特异抗体的各臂包含汇接scFv片段。在优选的实施方案中，至少一种scFv片段是稳定的。在一个实施方案中，双特异性双特异抗体可包含具有第一结合特异性的第一臂和具有第二结合特异性的第二臂。在另外的实施方案中，双特异抗体的各臂可包含具有第一结合特异性的第一scFv片段和具有第二结合特异性的第二scFv片段。在某些实施方案中，多特异性双特异抗体可直接融合完整Fc区或Fc部分(例如CH3结构域)。
J.多特异性结合分子片段
在某些实施方案中，本发明的结合分子片段可制成多特异性的。本发明的多特异性结合分子包括双特异性Fab2或多特异性(例如三特异性)Fab3分子。例如，多特异性结合分子片段可包含具有不同特异性的Fab或scFv分子的化学缀合的多聚体(例如二聚体、三聚体或四聚体)。
K.scFv2四价抗体
在其他实施方案中，本发明的多特异性结合分子是scFv2四价抗体，scFv2四价抗体的各重链部分含有scFv分子。在优选的实施方案中，至少一种scFv分子是稳定的。scFv片段可以连接重链部分的可变区的N-末端(例如NH scFv2四价抗体或NL scFv2四价抗体)。或者，scFv片段可连接scFv2四价抗体的重链部分的C-末端。scFv2四价抗体的各重链部分可具有结合相同或不同靶LT分子或抗原表位可变区和scFv片段。在多特异性分子的情况下，如果scFc2四价抗体的第一重链部分的scFv片段和可变区结合相同靶分子或抗原表位，双特异性四价微抗体的第二重链部分的第一和第二scFv片段中的至少一种结合不同靶分子或抗原表位。
L.汇接可变结构域结合分子
在其他实施方案中，本发明的多特异性结合分子可包含含有汇接抗原结合位点的结合分子。例如，可变结构域可包含：抗体重链，其工程化以包括直接串联融合或连接的至少两个(例如两个、三个、四个或更多)可变重链结构域(VH结构域)；以及抗体轻链，其工程化以包括直接串联融合或连接的至少两个(例如两个、三个、四个或更多)可变轻链结构域(VL结构域)。VH结构域和对应的VL结构域相互作用以形成一系列抗原结合位点，其中至少两个结合位点结合LT的相同或不同抗原表位。汇接可变结构域结合分子可包含两个或多个重链或轻链，并且具有高级价数(例如二价或四价)。汇接可变结构域结合分子的制备方法是本领域已知的，例如参见WO 2007/024715。
M.多特异性融合蛋白
在另外的实施方案中，本发明的多特异性结合分子是多特异性融合蛋白。如本文中使用的措词″多特异性融合蛋白″表示具有上述至少两种结合特异性的融合蛋白(如上面定义)。多特异性融合蛋白可装配为例如异源二聚体，异源三聚体或异源四聚体，其基本上公开于WO 89/02922(公开于Apr.6，1989)，EP 314,317(公开于May 3，1989)和美国专利No.5,116,964公布于May 2，1992。优选多特异性融合蛋白是双特异性的。在某些实施方案中，多特异性融合蛋白的至少结合特异性包含scFv例如稳定的scFv。
本领域技术人员使用常规重组DNA技术来开发多种其他多价抗体构建体，如公开于PCT国际申请No.PCT/US86/02269；欧洲专利申请No.184,187；欧洲专利申请No.171,496；欧洲专利申请No.173,494；PCT国际申请No.WO 86/01533；美国专利No.4,816,567；欧洲专利申请No.125,023；Better etal.(1988)Science 240：1041-1043；Liu et al.(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA84：3439-3443；Liu et al.(1987)J.Immunol.139：3521-3526；Sun et al.(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：214-218；Nishimura et al.(1987)Cancer Res.47：999-1005；Wood et al.(1985)Nature 314：446-449；Shaw et al.(1988)J.Natl.Cancer Inst.80：1553-1559)；Morrison(1985)Science 229：1202-1207；Oi etal.(1986)BioTechniques 4：214；美国专利No.5,225,539；Jones etal.(1986)Nature 321：552-525；Verhoeyan et al.(1988)Science 239：1534；Beidleret al.(1988)J.Immunol.141：4053-4060；以及Winter and Milstein，Nature，349，pp.293-99(1991))。优选非人抗体是连接非人抗原结合结构域和人恒定结构域而“人源化”的(例如Cabilly et al.，美国专利No.4,816,567；Morrison et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，81，pp.6851-55(1984))。
可用于制备多价抗体构建体的其他方法描述于下列公开文献：Ghetie，Maria-Ana et al.(2001)Blood 97：1392-1398；Wolff，Edith A.et al.(1993)CancerResearch 53：2560-2565；Ghetie，Maria-Ana et al.(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.94：7509-7514；Kim，J.C.et al.(2002)Int.J.Cancer 97(4)：542-547；Todorovska，Aneta et al.(2001)Journal of Immunological Methods 248：47-66；Coloma M.J.etal.(1997)Nature Biotechnology 15：159-163；Zuo，Zhuang et al.(2000)ProteinEngineering(Suppl.)13(5)：361-367；Santos A.D.，et al.(1999)Clinical CancerResearch 5：3118s-3123s；Presta，Leonard G.(2002)Current PharmaceuticalBiotechnology 3：237-256；van Spriel，Annemiek et al.，(2000)Review ImmunologyToday 21(8)391-397。
IV.修饰的结合分子
在某些实施方案中，本发明的结合分子的至少一种可包含一种或多种修饰。修饰形式的本发明的LT结合分子可使用本领域已知的技术从全前体或父代抗体来制备。
在某些实施方案中，本发明的修饰的LT结合分子是多肽，其已经被改变以显示出天然多肽未发现的特征(例如修饰导致功能的降低或功能的增强，例如效应功能)。在一个实施方案中，结合分子的一个或多个残基可通过官能性侧基的反应而化学上衍生化。在一个实施方案中，结合分子可修饰以包括二十个标准氨基酸的一种或多种天然存在的氨基酸衍生物。例如，4-羟基脯氨酸可替换脯氨酸；5-羟基赖氨酸可替换赖氨酸；3-甲基组氨酸可替换组氨酸；高丝氨酸可替换丝氨酸；以及鸟氨酸可替换赖氨酸。
在一个实施方案中，本发明的LT结合分子包含了其中一个或多个结构域被部分或全部删除的合成恒定区(“结构域删除结合分子”)。在某些实施方案中的相容性修饰结合分子包含了整个CH2结构域被去除的结构域删除构建体或变体(ΔCH2构建体)。在其他实施方案中可采用短连接肽替换缺失区域以提供可变区的灵活性和自由移动性。本领域的技术人员将可以理解由于CH2结构域对抗体分解率的调节性能，因而特别优选该构建体。结构域删除构建体可由编码IgG1人恒定区的载体获得(例如参见WO 02/060955A2和WO02/096948A2)。该载体经工程改造缺失了CH2结构域并提供了表达区域缺失IgG1恒定区的合成载体。
在一个实施方案中，本发明的LT结合分子包含数个或者甚至单个氨基酸缺失或替换的免疫球蛋白重链，只要其允许单体亚基间结合。例如，在某些情况下，在CH2区选定部位的单个氨基酸突变可足以基本上降低Fc结合。类似地，可能仅需要删除控制带调节效应功能(例如，补体结合)的一个或多个恒定区。该恒定区的部分缺失可能提高该抗体的选定特性(血清半衰期)，同时保留其他与对象恒定区相关的所需功能的完整性。此外，如上文指出，结合分子的恒定区可通过对增强所得构建体性能的一个或多个氨基酸的突变或替换进行改变。就此而言，可以在破坏保守结合位点(例如，Fc结合)的活性的同时充分保留修饰抗体的构型和免疫原性作用。另一实施方案包含了向恒定区添加一个或多个氨基酸以增强所需的特性(例如效应功能)或者提供更多细胞毒素或糖附着。在该实施方案中可能需要***或复制来自选定恒定区结构域的特定序列。
本发明还提供包含、主要包含、或由此处所述的结合部分(例如，抗体分子的VH区和或VL区)的变体(包括衍生物)组成的结合分子，该结合部分免疫特异性结LT多肽。本领域技术人员已知的标准技术可用于在编码LT结合分子的核苷酸序列引入突变，包括但不限于可导致氨基酸替换的定点突变和PCR-介导的突变。优选地，该变体(包括衍生物)相对参考VH区、VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3、VL区、VL-CDR1、VL-CDR2或VL-CDR3编码少于50个氨基酸替换，少于40个氨基酸替换，少于30个氨基酸替换，少于25个氨基酸替换，少于20个氨基酸替换，少于15个氨基酸替换，少于10个氨基酸替换，少于5个氨基酸替换，少于4个氨基酸替换，少于3个氨基酸替换，或少于2个氨基酸替换。“保守氨基酸替换”是以具有类似电荷侧链的氨基酸残基替换其中一个氨基酸残基。本领域内已经定义了有类似电荷侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸，精氨酸，组氨酸)，酸性侧链(例如，天冬氨酸，谷氨酸)，未带电极性侧链(例如，甘氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，丝氨酸，苏氨酸，酪氨酸，半胱氨酸)，无极性侧链(例如，丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，蛋氨酸，色氨酸)，β-分支侧链(例如，苏氨酸，缬氨酸，异亮氨酸)和芳香侧链(例如，酪氨酸，苯丙氨酸，色氨酸，组氨酸)的氨基酸。可选择地，该突变可沿全部或部分编码序列进行(例如饱和突变)，对所得的突变进行生物活性筛选以鉴定保留活性(例如，结合LT多肽的能力)的突变体。
例如，可以仅在本发明的结合分子(例如抗体分子)的框架区或CDR区引入突变。所引入的突变可以是同义或中性错义突变，即对抗体结合抗原的能力没有或具有很少的影响，事实上该种突变有些不改变任何氨基酸序列。这些类型的突变可能对优化密码子用途或提高杂交瘤的抗体生产非常有用。可选择地，非中性错义突变可改变结合分子结合抗原的能力。例如，多数同义或中性错义突变的位点可能在框架区中，而多数非中性错义突变的位点可能在CDR中，尽管这并非绝对要求。本领域的技术人员均能设计和测试具有所需性能(例如未改变抗原结合活性或改变了结合活性(例如，提高了抗原结合活性或改变了抗体特异性)的突变分子。突变后可对编码蛋白进行常规表达，编码蛋白的功能性和/或生物活性(例如，免疫特异性结合LT多肽的至少一个抗原表位的能力)可通过此处所述的技术或本领域已知的常规修饰技术进行测定。
A.共价连接
本发明的LT结合分子可是修饰的，即，将分子共价连接至该结合分子，并使该共价连接不阻碍结合分子特异性结合其同源抗原表位。例如但非限制，本发明的结合分子可通过糖基化，乙酰化，聚乙二醇化，磷酰化，酰胺化(包括或除去)、经过已知的保护/阻断基团进行衍生化，蛋白水解裂解，与细胞配体或其他蛋白连接等方法修饰。各种化学修饰中的任意一种均可通过已知技术实现，包括但不限于特异性化学裂解，乙酰化，甲酰化，衣霉素代谢合成等。此外，该衍生物可能包含一个或多个非传统氨基酸。
如本文别处更为具体的描述，本发明的结合分子还可在N或C末端重组融合至外源多肽或者化学结合(包括共价和非共价结合)至多肽或其他组合物。例如，LT-特异性结合分子可重组融合或结合至可用于检测测定标记的分子或外源多肽，药物，放射性核，或毒素等效应分子。例如，参见PCT公开WO 92/08495、WO 91/14438、WO 89/12624、美国专利No.5,314,995和EP 396,3870。
本发明的LT结合分子可由通过肽键或修饰肽键(即，肽异构体)彼此连接的氨基酸所组成，并可包含20个基因编码氨基酸以外的氨基酸。LT-特异性结合分子可通过转译后作用等自然作用，或通过本领域公知的化学修饰技术进行修饰。该修饰在基本文本和更具体的专著，以及大量的研究文献中得到了具体的描述。LT-特异性结合分子的任何部位均可进行修饰，包括肽骨架，氨基酸侧链以及氨基或羧基末端，或在碳水化合物等部分上。应当可以理解在给定LT-特异性结合分子的多个位点可出现相同或不同程度的相同类型的修饰。此外，给定LT-特异性结合分子可包含多种类型的修饰。LT-特异性结合分子可因为泛素化等原因而带有分支，它们也可呈带或不带分支的环状。环状，分支和带分支的环状LT-特异性结合分子可通过转译后自然作用或合成方法形成。修饰包括乙酰化，酰化，ADP-核糖基化，酰胺化，黄素的共价结合，亚铁血红素部分的共价结合，核苷酸或核苷酸衍生物的共价结合，脂质或脂质衍生物的共价结合，磷脂酰肌醇的共价结合，交联，环化，形成二硫键，脱甲基，共价交联的形成，半胱氨酸的形成，焦谷氨酸的形成，甲酰化，γ-羧化，糖基化，GPI锚形成，羟基化，碘处理，甲基化，豆蔻酰化，氧化，聚乙二醇化，蛋白水解作用，磷酸化，异戊烯化，外消旋，硒化，硫酸盐化，如精胺酰化等经转移RNA介导向蛋白添加氨基酸，泛素化。(例如参见Proteins-Structure And Molecular Properties，T.E.Creighton，W.H.Freeman and Company，New York 2nd Ed.，(1993)；Posttranslational CovalentModification Of Proteins，B.C.Johnson，Ed.，Academic Press，New York，pgs.1-12(1983)；Seifter et al.，Meth Enzymol 182：626-646(1990)；Rattan et al.，AnnNY Acad Sci 663：48-62(1992))。
本发明还包括包含LT结合分子以及外源多肽的融合蛋白。该抗体融合的外源多肽可具有功能性或可用于靶向LT多肽表达细胞。在一个实施方案中，本发明的融合蛋白包括具有本发明的结合分子的结合位点中的任意一种或多种的氨基酸序列、以及外源多肽序列的多肽，主要由其组成、或由其组成的。在另一个实施方案中，用于此处披露的诊断和治疗方法的融合蛋白包括具有LT-特异性结合分子的任意一个，两个，三个VH-CDR氨基酸序列，或一种LT-特异性结合分子的任意一个，两个，三个VL-CDR氨基酸序列，以及外源多肽序列的多肽，主要由其组成、或由其组成。在一个实施方案中，该融合蛋白包含了本发明LT-特异性结合分子的VH-CDR3氨基酸序列，以及外源多肽序列的多肽，该融合蛋白特异性结合LT的至少一种抗原表位。在另一实施方案中，融合蛋白包含具有本发明LT-特异性结合分子的至少一个VH区氨基酸序列和本发明LT-特异性结合分子的至少一个VL区氨基酸序列，以及外源多肽序列的多肽。在一个实施方案中，该融合蛋白的VH和VL区对应特异性结合LT的至少一种抗原表位的的单独来源抗体。在另一实施方案中，用于此处披露的诊断和治疗方法的融合蛋白包括具有LT-特异性结合分子的任意一个，两个，三个或更多VH CDR氨基酸序列以及LT-特异性结合分子的任意一个，两个，三个或更多VL CDR氨基酸序列，以及外源多肽序列的多肽，主要由其组成、或由其组成。优选对应本发明单独来源结合分子的两个，三个，四个，五个，六个，或更多VH-CDR或VL-CDR。本发明还包括编码这些融合蛋白的核酸分子。
文献报导的示例性融合蛋白包括与T细胞受体(Gascoigne et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：2936-2940(1987))；CD4(Capon et al.，Nature337：525-531(1989)；Traunecker et al.，Nature 339：68-70(1989)；Zettmeissl et al.，DNA Cell Biol.USA 9：347-353(1990)；和Byrn et al.，Nature344：667-670(1990))；L-选择素(归巢受体)(Watson et al.，J.Cell.Biol.110：2221-2229(1990)；和Watson et al.，Nature 349：164-167(1991))；CD44(Aruffo et al.，Cell 61：1303-1313(1990))；CD28和B7(Linsley et al.，J.Exp.Med.173：721-730(1991))；CTLA-4(Lisley et al.，J.Exp.Med.174：561-569(1991))；CD22(Stamenkovic et al.，Cell 66：1133-1144(1991))；TNF受体(Ashkenazi et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：10535-10539(1991)；Lesslauer et al.，Eur.J.Immunol.27：2883-2886(1991)；和Peppel et al.，J.Exp.Med.174：1483-1489(1991))；和IgE受体a(Ridgway and Gorman，J.Cell.Biol.Vol.115，Abstract No.1448(1991))相融合。
如本文别处讨论，本发明的LT抗体、或其抗原结合片段、变体、或衍生物可通过本领域已知方法融合至外源多肽以提高该多肽的体内半衰期或用于免疫测定。例如，在一个实施方案中，可将PEG连接至本发明的LT结合分子以提高其体内半衰期。Leong，S.R.，et al.，Cytokine 16：106(2001)；Adv.in Drug Deliv.Rev.54：531(2002)；或Weir et al.，Biochem.Soc.Transactions30：512(2002)。
此外，本发明的LT结合分子可融合至标记序列(如肽)以促进其纯化或检测。在优选实施方案中，该标记氨基酸序列为六组氨酸肽，例如pQE载体中所提供的标签(QIAGEN，Inc.，9259 Eton Avenue，Chatsworth，Calif.，91311)，其中多数已上市销售。如Gentz et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86：821-824(1989)所述，例如，用于融合蛋白快速纯化的六组氨酸。其他可用于纯化的肽标签包括但不限于对应来自流感血凝集素蛋白的抗原表位的“HA”标签(Wilson et al.，Cell 37：767(1984))以及“flag”标签。
融合蛋白可通过本领域公知的方法进行制备(例如，参见美国专利No.5,116,964和5,225,538)。可根据经验选择进行融合的精确位点以优化该融合蛋白的分泌或结合特性。然后将编码该融合蛋白的DNA转染进入表达宿主细胞。
本发明的LT结合分子可以非结合形式使用或与多种分子中的至少一种相结合，例如，可提高该分子的治疗性能，促进靶标检测，或患者的显像或治疗。本发明的LT结合分子可在纯化前或纯化后、纯化进行时进行标记或连接。
特别地，本发明的LT结合分子可连接至治疗剂，前药，肽，蛋白，酶，病毒，脂质，生物应答调节剂，药剂或PEG。
本领域的技术人员应能理解根据待连接的选定试剂的不同，可通过多种技术实现该连接。例如，与生物素的连接物可通过结合多肽与生物素的活化酯N-羟基琥珀酰亚胺酯)反应得到。类似地，与荧光标记的结合物可在偶合剂(例如，此处所列举的偶合剂)的存在下，或通过与异硫氰酸(优选荧光素-硫氰酸)的反应进行制备。本发明的LT结合分子的结合物可以类似方式进行制备。
本发明还包括与诊断或治疗剂相结合的本发明的LT结合分子。该LT结合分子可例如在作为检测特定治疗和/或预防方案的有效性的临床测试步骤中，用于检测神经疾病的发展或进展。可通过将该LT结合分子与可测物质偶合以促进检测。可测物质的例子包括各种酶，辅基，荧光材料，发光材料，生物发光材料，放射性材料，使用各种正电子发射断层的正电子发射金属，以及非放射性顺磁性金属离子。例如，可连接至抗体并用于本发明所述诊断的金属离子可参见美国专利No.4,741,900。适用酶的例子包括辣根过氧化酶，碱性磷酸酶，β-半乳糖苷酶，或是乙酰胆碱酯酶；适用辅基的例子包括抗生蛋白链菌素-生物素和亲和素-生物素；适用荧光材料的例子包括伞形酮，荧光素，异硫氰酸萤光素，丹磺酰，二氯三嗪野芝麻碱荧光素，丹磺酰氯或藻红素；发光材料的例子包括发光氨；生物发光材料的例子包括荧光素酶，虫荧光素和发光蛋白质；以及适用放射性物质的例子包括125I、131I、111In或99Tc。
LT结合分子还可通过与化学发光化合物偶合进行可测标记。然后可通过检测化学反应过程中产生的发光以测定化学发光标记LT结合分子的存在。特别有用的化学发光标记化合物的例子为发光氨，异鲁米诺，theromatic吖啶酯，咪唑，吖啶盐和草酸酯。
对LT结合分子进行可测标记的方法之一为将其连接至酶并将连接产物用于酶免疫测定(EIA)(Voller，A.，″The Enzyme Linked ImmunosorbentAssay(ELISA)″Microbiological Associates Quarterly Publication，Walkersville，Md.，Diagnostic Horizons 2：1-7(1978))；Voller et al.，J.Clin.Pathol.31：507-520(1978)；Butler，J.E.，Meth.Enzymol.73：482-523(1981)；Maggio，E.(ed.)，Enzyme Immunoassay，CRC Press，Boca Raton，Fla.，(1980)；Ishikawa，E.et al.，(eds.)，Enzyme Immunoassay，Kgaku Shoin，Tokyo(1981)。该种与LT结合分子连接的酶将以特定方式适当的底物(优选发色底物)反应从而生成可通过例如分光光度计，荧光计或视觉方法检测的化学部分。可用于可测标记该抗体的酶包括但不限于，苹果酸脱氢酶，葡萄球菌核酸酶，delta-5-类固醇异构酶，酵母乙醇脱氢酶，alpha-甘油磷酸脱氢酶，丙糖磷酸盐异构酶，辣根过氧化酶，碱性磷酸酶，天冬酰胺酶，葡萄糖氧化酶，beta-半乳糖苷酶，核糖核酸酶，脲酶，过氧化氢酶，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，葡萄糖淀粉酶和乙酰胆碱酯酶。此外，可通过采用针对该酶的发色底物的比色法实现该检测。还可通过对底物的酶反应程度与类似建立的标准的视觉比较实现该检测。
还可通过多种其他免疫测定方法实现该检测。例如，在放射性标记该LT结合分子后，可采用放射性免疫测定(RIA)检测该抗体(例如参见Weintraub，B.，Principles of Radioimmunoassays，Seventh Training Course on RadioligandAssay Techniques，The Endocrine Society，(March，1986)，其通过引用的方式并入本文中)。该放射性同位素的检测手段包括但不限于伽马计数器，闪烁计数器或自动射线摄影。
LT结合分子还可采用152Eu或其他镧系元素等荧光发射金属进行可测标记。这些金属可通过二乙烯三胺五乙酸((DTPA)或乙二胺四乙酸(EDTA)等金属鳌合基团连接该结合分子。
将各种部分连接至结合分子的技术已熟知，例如参见Arnon et al.，″Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy″，inMonoclonal Antibodies And Cancer Therapy，Reisfeld et al.(eds.)，pp.243-56(Alan R.Liss，Inc.(1985)；Hellstrom et al.，″Antibodies For DrugDelivery″，in Controlled Drug Delivery(2nd Ed.)，Robinson et al.(eds.)，MarcelDekker，Inc.，pp.623-53(1987)；Thorpe，″Antibody Carriers Of Cytotoxic AgentsIn Cancer Therapy：A Review″，in Monoclonal Antibodies′84：Biological AndClinical Applications，Pinchera et al.(eds.)，pp.475-506(1985)；″Analysis，Results，And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of RadiolabeledAntibody In Cancer Therapy″，in Monoclonal Antibodies For Cancer DetectionAnd Therapy，Baldwin et al.(eds.)，Academic Press pp.303-16(1985)和Thorpe etal.，″The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates″，Immunol.Rev.62：119-58(1982)。
特别地，用于此处披露的诊断和治疗方法的结合分子可结合至细胞毒性(例如放射性同位素，细胞毒性药物，或毒素)治疗剂，细胞抑制剂，生物毒素，前药，肽，蛋白，酶，病毒，脂质，生物应答调节剂，药剂，免疫活性配体(例如，淋巴因子或其他抗体，其中所得的分子同时结合肿瘤细胞和效应细胞(如T细胞))，或PEG。在另一实施方案中，用于此处披露的诊断和治疗方法的结合分子可结合至降低肿瘤血管形成的分子。在其他实施方案中，所披露的组合物可包含偶联药物或前药的结合分子。本发明的其他实施方案包含了结合分子的用途，例如，与特异性生物毒素或其细胞毒性片段(例如，蓖麻毒素，白树毒素，假单胞菌外毒素或白喉毒素)结合的结合分子的用途。结合或未结合的结合分子的使用选择将依赖于癌症的类型和阶段，辅助治疗的使用(例如，化疗或外部辐射)以及患者的状态。可以理解本领域的技术人员将能够根据此处的教导容易地作出选择。
可以理解，在过去的研究中，带有同位素标记的抗肿瘤抗体曾成功地被用于破坏动物模型、部分情况下在人体内的实体肿瘤和淋巴瘤/白血病中的细胞。示例性放射性同位素包括：90Y、125I、131I、123I、111In、105Rh、153Sm、67Cu、67Ga、166Ho、177Lu、186Re。188Re。该放射性核通过生成致电离辐射，在核DNA中引起多条链的断裂，从而导致细胞死亡。用于生成治疗性结合物的同位素通常可产生具有短光程长的高能量α-或β-粒子。该种放射性核可以杀死它们极为接近的细胞，例如该结合物吸附或进入的肿瘤细胞。它们对于非定域细胞作用很小或没有作用。放射性核基本上为非免疫原性。
对于在本发明中使用放射标记结合物，结合分子可直接标记(例如通过碘化)或可以通过使用鳌合剂间接标记。本文中所用的短语“间接标记”和“间接标记方法”均指鳌合剂被共价连接至结合分子，且至少一个放射核与该鳌合剂结合。该种鳌合剂通常指双功能鳌合剂，因为它们同时结合多肽和放射性同位素。特别优选的鳌合剂包括1-异硫氰酸苯甲基-3-甲基二乙烯三胺五乙酸(“MX-DTPA”)和环己基二乙烯三胺五乙酸(“CHX-DTPA”)衍生物。其他的鳌合剂包括P-DOTA和EDTA衍生物。特别优选的用于间接标记的放射性核包括111In和90Y。
本文中所用的短语“直接标记”和“间接标记方法”同时指放射性核被共价直接吸附至多肽(通常通过氨基酸残基)。更具体地，这些连接技术包括随机标记和定点标记。对于后者，该标记发生在多肽上的特定位点，例如仅在该结合物的Fc部分存在的N-连接的糖残基。此外，各种直接标记技术和方案在本发明适用。例如，碍-99标记的多肽可通过配体交换过程制备，其中通过锡粒子溶液还原高得酸(TcO4 -)，将还原的得鳌合至Sephadex柱，并向该柱应用结合多肽，或者也可采用批量标记技术，例如，孵育高锝酸，还原剂(例如SnCl2)，缓冲溶液(例如邻苯二甲酸钠-钾溶液)以及结合分子。在任何情况下，优选用于直接标记多肽的放射性核已为本领域公知，并特别优选的用于直接标记的放射性核为通过酪氨酸残基共价吸附的131I。用于此处披露的方法的结合分子可例如通过过放射活性碘化钠或钾以及化学氧化剂(例如，次氯酸钠，氯胺T等)，或是酶氧化剂(例如乳过氧化酶，葡萄糖氧化酶和葡萄糖)进行衍生。
有关鳌合剂和鳌合剂结合物的专利已为本领域所知。例如，Gansow的美国专利No.4,831,175涉及多取代二乙烯三胺五乙酸鳌合剂以及包含它的蛋白结合物，以及它们的制备方法。Gansow的美国专利No.5,099,069、5,246,692、5,286,850、5,434,287和5,124,471同样涉及多取代DTPA鳌合剂。这些专利均通过引用的方式并入本文中。适用金属鳌合剂的其他例子为乙二胺四乙酸(EDTA)、二乙烯三胺五乙酸(DPTA)、1，4，8，11-四氮杂十四烷、1，4，8，11-四氮杂十四烷-1，4，8，11-四乙酸，或特别优选并在下文多次体现的类似物环己基-DTPA或CHX-DTPA。其他的适用鳌合剂包括尚待发现的鳌合剂，这些鳌合剂可由技术人员简单地辨别，且明确包含在本发明的范围之内。
其他优选的针对结合分子(例如结合多肽)的结合制剂为细胞毒性药物，特别是用于癌症治疗的细胞毒性药物。本文中所用的“细胞毒素或细胞毒性剂”指对细胞的生长和增殖不利且能减少，抑制或破坏细胞或恶性肿瘤的任意制剂。示例性细胞毒素包括但不限于，放射性核，生物毒素，酶活毒素，细胞抑制或细胞毒性治疗剂，前药，免疫活性配体和生物应答调节剂如细胞因子。延迟或减缓免疫活性细胞或恶性细胞生长的任何细胞毒素均在本发明的范围之内。
将各种部分连接至结合分子的技术已熟知，例如参见Arnon et al.，″Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy″，inMonoclonal Antibodies And Cancer Therapy，Reisfeld et al.(eds.)，pp.243-56(Alan R.Liss，Inc.(1985)；Hellstrom et al.，″Antibodies For DrugDelivery″，in Controlled Drug Delivery(2nd Ed.)，Robinson et al.(eds.)，MarcelDekker，Inc.，pp.623-53(1987)；Thorpe，″Antibody Carriers Of Cytotoxic AgentsIn Cancer Therapy：A Review″，in Monoclonal Antibodies′84：Biological AndClinical Applications，Pinchera et al.(eds.)，pp.475-506(1985)；″Analysis，Results，And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of RadiolabeledAntibody In Cancer Therapy″，in Monoclonal Antibodies For Cancer DetectionAnd Therapy，Baldwin et al.(eds.)，Academic Press pp.303-16(1985)，and Thorpeet al.，″The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-ToxinConjugates″，Immunol.Rev.62：119-58(1982)。
B.降低免疫原性
在某些实施方案中，本发明的LT结合分子或其部分可通过本领域认可的技术进行修饰以降低其免疫原性。例如，结合分子或其部分可进行人源化，灵长源化或去免疫化。在一个实施方案中，可制备嵌合结合分子或结合分子可包含至少一部分的嵌合抗体分子。在这样的情况下，非人LT结合分子、通常鼠或灵长动物结合分子保留或充分保留了父代结合分子的抗原结合功能，但在人体内具有更低免疫原性。这可通过多种方法实现，包括(a)将完整非人类可变区嫁接至人恒定区以生成嵌合结合分子；(b)将一个或多个非人类决定簇互补区(CDR)的至少一部分嫁接至保留或未保留关键框架残基的人框架和恒定区；或(c)移植整个非人类可变结构域，但通过替换表面残基以类人切片将其“包覆”。该类方法参见Morrison et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.81：6851-6855(1984)；Morrison et al.，Adv.Immunol.44：65-92(1988)；Verhoeyenet al.，Science 239：1534-1536(1988)；Padlan，Molec.Immun.28：489-498(1991)；Padlan，Molec.Immun.31：169-217(1994)，和美国专利No.5,585,089，5,693,761，5,693,762和6,190,370，所有文献都通过引用的方式全部并入本文中。
在一个实施方案中，本发明的结合分子(例如抗体)或其部分可以是嵌合的。嵌合结合分子是结合分子，其中结合分子的不同部分衍生自不同动物物种，例如抗体具有衍生自鼠单克隆抗体的可变区和人免疫球蛋白恒定区。嵌合结合分子的制备方法是本领域已知的。参见例如Morrison，Science229：1202(1985)；Oi et al.，BioTechniques 4：214(1986)；Gillies et al.，J.Immunol.Methods 125：191-202(1989)；美国专利No.5,807,715；4,816,567；和4,816397，其均以引用的方式全部并入本文中。开发″嵌合抗体″的制备的技术(Morrisonet al.，Proc.Natl.Acad.Sci.81：851-855(1984)；Neuberger et al.，Nature312：604-608(1984)；Takeda et al.，Nature 314：452-454(1985))可用于合成所述分子。例如，编码鼠LT抗体分子的结合特异性的基因序列可和具有合适生物活性的人抗体分子的序列融合在一起。如本文中使用的，嵌合结合分子是分子，其中不同部分衍生自不同动物物种，例如具有衍生自鼠单克隆抗体的可变区和人免疫球蛋白恒定区的那些，例如人源化抗体。
在另外的实施方案中，本发明的结合分子或其部分是灵长动物源化。灵长动物源化抗体的方法由Newman，Biotechnology 10：1455-1460(1992)披露。具体而言，该技术导致产生包含了猴可变结构域和人恒定区的抗体。该文献通过引用的方式并入本文中。此外，该技术还可参见共同受让的美国专利No.5,658,570，5,693,780和5,756,096，该文献通过引用的方式并入本文中。
在另外的实施方案中，本发明的结合分子(例如抗体)或其部分是人源化的。人源化结合分子是结合分子，其具有来自非人类的结合特异性，即具有一个或多个来自非人类抗体的互补决定区(CDR)，以及来自人免疫球蛋白分子的框架区。人框架区的框架残基通常可被CDR供体抗体的相应残基所替代以突变而改变，优选提高抗原结合。这些框架替换可通过本领域公知的方法进行鉴定，例如，可通过对CDR和框架残基的相互作用建模以鉴定对抗原结合重要的框架残基，可通过序列比较鉴定在特定位点的反常框架残基。(例如参见Queen et al.，美国专利No.5,585,089；Riechmann et al.，Nature332：323(1988)，其以引用的方式全部并入本文中。抗体可通过多种本领域已知的技术进行人源化，例如，CDR-嫁接(EP 239,400；PCT公开WO 91/09967；美国专利No.5,225,539；5,530,101；和5,585,089)，镶饰或重塑(EP 592,106；EP519,596；Padlan，Molecular Immunology 28(4/5)：489-498(1991)；Studnicka et al.，Protein Engineering 7(6)：805-814(1994)；Roguska.et al.，PNAS91：969-973(1994))，以及链替换(美国专利No.5,565,332)。抗体人源化的其他参考文献包括：Kabat，E.A.，Wu，T.T.，Perry，H.M.，Gottesman，K.S.and Foeller，C.(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest.5th Edition，U.S.Dept.Health and Human Services.U.S.Govt.Printing Office.Chothia，C.，Lesk，A.M.，Tramontano，A.，Levitt，M.，Smith-Gill，S.J.，Air，G.，Sheriff，S.，Padlan，E.A.，Davies，D.，Tulip，W.R.，Colman，P.M.，Spinelli，S.，Alzari，P.M.and Poljak，R.J.(1989)Nature 342：877-883.Chothia，C.，Novotny，J.，Bruccoleri，R.andKarplus，M.(1985)J.Mol.Biol.186：651Brensing-Kuppers J，ZocherI，Thiebe R，Zachau HG.(1997).Gene.191(2)：173-81.Matsuda F，Ishii K，Bourvagnet P，KumaK，Hayashida H，Miyata T，Honjo T.(1998)J Exp Med.188(11)：2151-62.CarterP.J.and Presta L.J.(2000)“Humanized antibodies and methods for making them”US Patent 6,407,213 Johnson，T.A.，Rassenti，LZ.，and Kipps，T.J.(1997)J.Immunol.158：235-246，其以引用的方式全部并入本文中。本申请包括的示例性人源化可变区在实施例中阐述。
去免疫化还可用于降低结合分子的免疫原性。本文中所用的术语“去免疫化”包括对结合分子进行改造以修饰T细胞抗原表位(例如，参见WO9852976A1，WO0034317A2)。例如，可对来自起始抗体的VH和VL序列进行分析，由各V区“定位”的人T细胞抗原表位显示了与序列内的决定簇互补区(CDR)和其他关键残基相关的抗原表位的定位。对来自于T细胞表位图谱的单独T细胞表位进行分析，以在不轻易改变终抗体活性的情况下鉴定选择性的氨基酸替代物。经设计得到了一系列包括氨基酸替代物组合物的替代VH和VL序列，随后这些序列被整合进入一系列的结合多肽(例如，LT-特异性抗体或其免疫特异性片段)以用于本文中所述的诊断和治疗方法，并对功能进行测验。通常可生成和测验12-24个变体抗体。然后将包含修饰后的V区和人C区的完整重链和轻链基因克隆进入表达载体，将该后续质粒导入细胞系进行全抗体生产。对该类抗体通过适当的生化和生物侧定进行比较，鉴定得到最佳变体。
在一个实施方案中，本发明的结合分子是人源化抗体或包含具有受体人框架或基本上人受体框架的人源化抗体可变区。为了本文的目的，″受体人框架″是包含衍生自人免疫球蛋白框架或人共有框架的VL或VH框架的氨基酸序列的框架。″衍生自″人免疫球蛋白框架或人共有框架的受体人框架可包含其相同氨基酸序列，或可含有某些氨基酸序列改变。在一个实施方案中，VL受体人框架和VL人免疫球蛋白框架序列或人共有框架序列的序列相同。
″人共有框架″是表示在人免疫球蛋白VL或VH框架序列的选择中最通常存在的氨基酸残基的框架。通常，人免疫球蛋白VL或VH序列的选择来自可变结构域序列的亚基。也可考虑人种系序列或具有一些共有序列的种系序列(例如FR4)。
在一个实施方案中，轻链和重链的受体框架序列是相同的，在规范、界面和镶饰区残基具有和鼠初始抗体序列的高度类似性。当测定类似于种系序列时排除CDR序列。在一个实施方案中，受体序列具有相同长度的CDR如果(除了CDR-H3)的话；并且要求最少数量的回复突变。
在一个实施方案中，和稳定共有种类最为不同的受体框架被选择以改善人源化设计的物理化学性能。
在一个实施方案中，对于105抗体，人种系huL6(具有共有人KV3FR4)和人gi|3004688可分别用作轻链和重链的受体框架。
在一个实施方案中，人源化105轻链被制成在氨基酸位1包含回复突变(E→D；即E至D)。在一个实施方案中，制成在氨基酸位21包含回复突变(L→I)。在另外的实施方案中，制成在氨基酸位68包含回复突变(G→R)。在又一实施方案中，制成在氨基酸位86包含回复突变(Y→F)。
在一个实施方案中，制成人源化轻链的第一版本，包含在位1的回复突变。在另外的实施方案中，制成105轻链的第二版本，包含在位1、21和86的回复突变。在另外的实施方案中，制成105轻链的第三版本，包含在位1、21、68和86的回复突变。
人源化LT105轻链的三种不同版本如下所示。LT105的人源化轻链包括：种系huL6框架//共有人KV4 FR4//LT105 L CDR。下面在L1、L2和L3所述的回复突变为小写字体、粗字体。包括Chothia定义的CDR有下划线。
＞L0＝嫁接
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASESVDNYGISFMHWYQQKPGQAPRLLIYRASNLESGIPARFSGSGSGTDFT
LTISSLEPEDFAVYYCQQSNKDPYTFGQGTKVEIK(SEQ ID NO：)
＞L1
LTISSLEPEDFAVYYCQQSNKDPYTFGQGTKVEIK(SEQ ID NO：)
＞L2
LTISSLEPEDFAVYCQQSNKDPYTFGQGTKVEIK(SEQ ID NO：)
＞L3
LTISSLEPEDFAV
YCQQSNKDPYTFGQGTKVEIK(SEQ ID NO：)
在一个实施方案中，制成人源化105重链，包含在氨基酸位1的回复突变(E→D)。在一个实施方案中，制成包含在氨基酸位2r的回复突变(A→V)。在另外的实施方案中，制成包含在氨基酸位25的回复突变(S→T)。在又一实施方案中，制成包含在氨基酸位37的回复突变(V→I)。在又一实施方案中，制成包含在氨基酸位47的回复突变(W→G)。在又一实施方案中，制成包含在氨基酸位48的回复突变(I→M)。在又一实施方案中，制成包含在氨基酸位49的回复突变(S→G)。在又一实施方案中，制成包含在氨基酸位67的回复突变(F→I)。在又一实施方案中，制成包含在氨基酸位78的回复突变(L→F)。在又一实施方案中，制成包含在氨基酸位82的回复突变(M→L)。
在一个实施方案中，制成人源化105重链的第一版本，包含在位24和47的回复突变。在另外的实施方案中，制成105重链的第二版本，包含在位24，37，49，67和78的回复突变。在另外的实施方案中，制成105重链的第三版本，包含在位1，24，25，37，47，49，67和78的回复突变。在另外的实施方案中，制成105重链的第四版本，包含在位1，24，25，37，47，48，49，67，78和82的回复突变。
下面示出人源化LT105重链的四种不同版本。LT105的人源化重链包括gi|3004688框架//LT105 H CDR。下面在H1，H2，H3和H4所述的回复突变为小写字体、粗字体。包括Chothia定义的CDR有下划线。
＞H0＝嫁接
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSITSGYYWNWVRQAPGKGLEWISYISYDGSNNYNPSLKNRFTISRDSAK
NSLYLHMHSLRAEDTAVYYCARDAYSYGMDYWGQGTTVTVSS
(SEQ ID NO：)
＞H1
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCA
SGYSITSGYYWNWVRQAPGKGLE
ISYISYDGSNNYNPSLKNRFTISRDSAK
NS
YLHMHSLRAEDTAVYYCARDAYSYGMDYWGQGTTVTVSS
(SEQ ID NO：)
＞H2
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCA
SGYSITSGYYWNW
RQAPGKGLEI
YISYDGSNNYNPSLKNR
TISRDSAK
NS
YLHMHSLRAEDTAVYYCARDAYSYGMDYWGQGTTVTVSS
(SEQ ID NO：)
＞H3
NS
YLHMHSLRAEDTAVYYCARDAYSYGMDYWGQGTTVTVSS
(SEQ ID NO：)
＞H4
NS
YLHHSLRAEDTAVYYCARDAYSYGMDYWGQGTTVTVSS
(SEQ ID NO：)
如所阐述的可进行上面另外的改变以阐述105抗体的可替换的版本，并且可制成多种轻链和重链组合。例如，在一个实施方案中，本发明的结合分子包含105抗体版本0的轻链或其CDR。在另外的实施方案中，本发明的结合分子包含105抗体版本1的重链或其CDR。在另外的实施方案中，本发明的结合分子包含105抗体版本0的轻链或其CDR并且联合105抗体版本1的重链或其CDR
L0
1 EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASESVD NYGISFMHWY QQKPGQAPRL
51 LIYRASNLES GIPARFSGSG SGTDFTLTIS SLEPEDFAVY YCQQSNKDPY
101 TFGQGTKVEI KRTVAAPSVF IFPPSDEQLK SGTASVVCLL NNFYPREAKV
151 QWKVDNALQS GNSQESVTEQ DSKDSTYSLS STLTLSKADY EKHKVYACEV
201 THQGLSSPVT KSFNRGEC
(SEQ ID NO：)
H1
1 EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAVSGYSIT SGYYWNWVRQ APGKGLEGIS
51 YISYDGSNNY NPSLKNRFTI SRDSAKNSFY LHMHSLRAED TAVYYCARDA
101 YSYGMDYWGQ GTTVTVSSAS TKGPSVFPLA PSSKSTSGGT AALGCLVKDY
151 FPEPVTVSWN SGALTSGVHT FPAVLQSSGL YSLSSVVTVP SSSLGTQTYI
201 CNVNHKPSNT KVDKKVEPKS CDKTHTCPPC PAPELLGGPS VFLFPPKPKD
251 TLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST
301 YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY
351 TLPPSRDELT KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD
401 SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPG
(SEQ ID NO：)
在另外的实施方案中，本发明的结合分子包含105抗体的版本A的轻链或其CDR。在另外的实施方案中，本发明的结合分子包含105抗体的版本B的轻链或其CDR。在另外的实施方案中，本发明的结合分子包含105抗体的版本C的轻链或其CDR。例如，在一个实施方案中，这种轻链可以和105抗体的重链版本配对。
1 EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASESVD NYGISFMHWY QQKPGQAPRL
51 LIYKASNLES GIPARFSGSG SGTDFTLTIS SLEPEDFAVY YCQQSNKDPY
101 TFGQGTKVEI KRTVAAPSVF IFPPSDEQLK SGTASVVCLL NNFYPREAKV
151 QWKVDNALQS GNSQESVTEQ DSKDSTYSLS STLTLSKADY EKHKVYACEV
201 THQGLSSPVT KSFNRGEC
版本B
1 EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASESVD NYGISFMHWY QQKPGQAPRL
51 LIYRASSLES GIPARFSGSG SGTDFTLTIS SLEPEDFAVY YCQQSNKDPY
101 TFGQGTKVEI KRTVAAPSVF IFPPSDEQLK SGTASVVCLL NNFYPREAKV
151 QWKVDNALQS GNSQESVTEQ DSKDSTYSLS STLTLSKADY EKHKVYACEV
201 THQGLSSPVT KSFNRGEC
版本C
1 EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASESVD NYGISFMHWY QQKPGQAPRL
51 LIYKASSLES GIPARFSGSG SGTDFTLTIS SLEPEDFAVY YCQQSNKDPY
101 TFGQGTKVEI KRTVAAPSVF IFPPSDEQLK SGTASVVCLL NNFYPREAKV
151 QWKVDNALQS GNSQESVTEQ DSKDSTYSLS STLTLSKADY EKHKVYACEV
201 THQGLSSPVT KSFNRGEC
在另外的实施方案中，本发明的结合分子包含105抗体版本10的轻链或其CDR。在另外的实施方案中，本发明的结合分子包含105抗体版本1的重链或其CDR。在另外的实施方案中，本发明的结合分子包含105抗体版本10的轻链或其CDR并且联合105抗体版本1的重链或其CDR：
L10
1 AIQLTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASESVD NYGISFMHWY QQKPGKAPKL
51 LIYKASSLES GVPSRFSGSG SGTDFTLTIS SLQPEDFATY YCQQSNKDPY
101 TFGQGTKVEI KRTVAAPSVF IFPPSDEQLK SGTASVVCLL NNFYPREAKV
151 QWKVDNALQS GNSQESVTEQ DSKDSTYSLS STLTLSKADY EKHKVYACEV
201 THQGLSSPVT KSFNRGEC
在另外的实施方案中，本发明的结合分子包含105抗体版本12或13的轻链或其CDR。在另外的实施方案中，本发明的结合分子包含105抗体版本1的重链或其CDR。在另外的实施方案中，本发明的结合分子包含105抗体版本12或13的轻链或其CDR并且联合105抗体版本1的重链或其
CDR：
L12
1 DIQLTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASESVD NYGISFMHWY RQKPGKAPKL
51 LIYKASSLES GVPSRFSGRG SGTDFTLTIS SLQPEDFATY YCQQSNKDPY
101 TFGQGTKVEI KRTVAAPSVF IFPPSDEQLK SGTASVVCLL NNFYPREAKV
151 QWKVDNALQS GNSQESVTEQ DSKDSTYSLS STLTLSKADY EKHKVYACEV
201 THQGLSSPVT KSFNRGEC
L13
1 DIRLTQSPSS LSASVGQRVT ISCRASESVD NYGISFMHWY RQKPGKAPKL
51 LIYKASSLES GVPSRFSGRG SGTDFTLTIS SLQPEDFATY YCQQSNKDPY
101 TFGQGTKVEI KRTVAAPSVF IFPPSDEQLK SGTASVVCLL NNFYPREAKV
151 QWKVDNALQS GNSQESVTEQ DSKDSTYSLS STLTLSKADY EKHKVYACEV
201 THQGLSSPVT KSFNRGEC
在另外的实施方案中，本发明的结合分子包含105抗体的版本11或14的重链或其CDR(例如)联合105抗体的轻链版本。
H11
1 EVQLVESGGG LVQPRGSLRL SCAVSGYSIT SGYYWNWIRQ APGKGLEWVS
51 YISYDGSNNY NPSLKNRFTI SRDNSKNTFY LQMNNLRAED TAAYYCARDA
101 YSYGMDYWGQ GTTVTVSSAS TKGPSVFPLA PSSKSTSGGT AALGCLVKDY
151 FPEPVTVSWN SGALTSGVHT FPAVLQSSGL YSLSSVVTVP SSSLGTQTYI
201 CNVNHKPSNT KVDKKVEPKS CDKTHTCPPC PAPELLGGPS VFLFPPKPKD
251 TLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST
301 YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY
351 TLPPSRDELT KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD
401 SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPG
H14
1 EVQLQESGGG LVKPRGSLRL SCAVSGYSIT SGYYWNWIRQ APGKGLEWVS
51 YISYDGSNNY NPSLKNRFSI SRDNSKNTFY LKMNRLRAED SAAYYCARDA
101 YSYGMDYWGQ GTTVTVSSAS TKGPSVFPLA PSSKSTSGGT AALGCLVKDY
151 FPEPVTVSWN SGALTSGVHT FPAVLQSSGL YSLSSVVTVP SSSLGTQTYI
201 CNVNHKPSNT KVDKKVEPKS CDKTHTCPPC PAPELLGGPS VFLFPPKPKD
251 TLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST
301 YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY
351 TLPPSRDELT KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD
401 SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPG
在一个实施方案中，对于102抗体，使用人种系序列huA3(具有共有HUMKV2 FR4)和人种系序列huVH3-11(具有共有HUMHV3 FR4)。
设计一种版本的可变重链的整形链，并且设计四种版本的可变重链的整形链，除了轻链和重链CDR嫁接序列。对于重链，第一版本含有最少的回复突变并且随后版本含有更多的回复突变(即它们是至少″人源化″)。鼠A113被所有版本的重链中的S113(存在于人HV FR4)取代，并且不作为回复突变进行分析。根据Kabat路线进行编号。
在一个实施方案中，人源化LT102(huLT102)的整形的轻链包括种系huA3框架、共有人KV2 FR4和LT102 L CDR。hu102的轻链中的回复突变包括I2V。V2是支持CDR-L1的规范残基。
下面示出示例性人源化LT102轻链序列(关于回复突变的细节参见上面所述)。LT102的人源化轻链包括：种系huA3框架//共有人KV2 FR4//LT102 L CDR。回复突变为小写字体、粗字体。包括Chothia定义的CDR有下划线。
＞L0＝嫁接
DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQNIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDF
TLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHFPWTFGQGTKVEIK
＞L1
DVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQNIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDF
TLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHFPWTFGQGTKVEIK
下面描述四种不同版本的人源化LT102重链。LT102的人源化重链包括：种系huVH3-11框架//共有人HV3 FR4//LT102 H CDR。下面在H1，H2，H3和H4所述的回复突变为小写字体、粗字体。包括Chothia定义的CDR有下划线。
＞H0＝嫁接
QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMYWIRQAPGKGLEWVSTIGDGTSYTHYPDSVQGRFTISRDNAK
NSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDLGTGPFAYWGQGTLVTVSS
＞H1
QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCASGFTFSDYYMYWIRQAPGKGLEWVSTIGDGTSYTHYPDSVQGRFTISRDNAK
NSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDLGTGPFAYWGQGTLVTVSS
＞H2
NSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDLGTGPFAYWGQGTLVTVSS
＞H3
NSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDLGTGPFAYWGQGTLVTVSS
＞H4
V
LVESGGGLVKPGGSLRLSCA
SGFTFSDYYMYWIRQAPGKGLEWVSTIGDGTSYTHYPDSVQGRFTISRDA
N
LYLQMNSLRAEDTAVYYCARDLGTGPFAYWGQGTLVTVSS
在一个实施方案中，制成人源化102轻链，包含在氨基酸位2的回复突变(I→V)。
在一个实施方案中，制成人源化102重链，包含在氨基酸位24的回复突变(A→V)。在一个实施方案中，制成人源化102重链，包含在氨基酸位73的回复突变(N→Y)。在一个实施方案中，制成人源化102重链，包含在氨基酸位3的回复突变(Q→K)。在一个实施方案中，制成人源化102重链，包含在氨基酸位K→T)的回复突变。在一个实施方案中，制成人源化102重链，包含在氨基酸位77的回复突变(S→N)。
在一个实施方案中，制成人源化102重链的第一版本，包含在位24的回复突变。在另外的实施方案中，制成102重链的第二版本，包含在位24，1和73的回复突变。在另外的实施方案中，制成102重链的第三版本，包含在位24，1，73和3的回复突变。在另外的实施方案中，制成102重链的第四版本，包含在位24，1，73，3，75和77的回复突变。
C.效应功能和Fc修饰
本发明的LT结合分子可包含介导一种或多种效应功能的恒定区。例如，补体的Cl成分与抗体恒定区的结合可激活补体***，从而引起靶细胞的补体依赖性细胞毒性。补体的激活对于细胞病原体的调理和溶解非常重要。补体的激活还刺激炎症应答，并且还可参与自身免疫超敏性。此外，抗体通过Fc区结合各种细胞上的受体，其中抗体Fc区上的Fc受体结合位点结合细胞上的Fc受体(FcR)。有多种Fc受体对不同类别的抗体具有特异性，包括IgG(gamma受体)、IgE(epsilon受体)、IgA(alpha受体)和IgM(mu受体)。抗体与细胞表面上Fc受体的结合可引发一系列重要的和多样的生物应答，包括抗体包裹粒子吞没和破坏，免疫复合物的清除，杀伤细胞对抗体包裹的目标细胞的溶解(称为抗体依赖性细胞介导的细胞毒，或ADCC)，炎症介质的释放，胎盘转移和免疫球蛋白生产的控制。
本发明的某些实施方案包括LT结合分子，其中一个或多个恒定区域的至少一种氨基酸被删除或以其他方式改造从而提供所需的生化性质，例如下降的效应功能，增加的效应功能，非共价二聚化的改善的能力，提高的肿瘤位点定位能力，下降的血清半衰期，或是与具有大致相同免疫原性的完整、未改造的抗体相比具有提高的血清半衰期。例如，本文中所述的诊断和治疗方法中采用的某些结合分子为包含了与免疫球蛋白重链类似的多肽链，但缺失了一个或多个重链区的至少一部分的区域缺失抗体。例如，在某些抗体中，修饰抗体的恒定区中的一个完整区域将被删除，例如，CH2区的全部或部分将被删除。
在某些LT结合分子中，抗-LT结合位点可融合Fc部分。在一个实施方案中Fc部分可以是衍生自抗体分子的野生型Fc部分。在另外的实施方案中，Fc部分可以使用本领域已知的技术来突变以改变(例如增加或降低)效应功能。例如，(通过点突变或其他方法)对恒定区域的删除或灭活可降低循环修饰结合分子的Fc受体结合从而提高肿瘤定位。在其他情况下恒定区修饰与本发明的适度互补结合相一致从而减少了血清半衰期以及与结合细胞毒素的非特异性结合。恒定区的另一种修饰可用于修饰二硫键或寡糖部分从而通过提高抗原特异性或抗体灵活性来增强定位。通过修饰得到的生理功能，生物相容性以及其他生化作用(例如肿瘤定位、生物分布以及血清半衰期)可通过公知的免疫技术在不采取附加试验的情况下轻易地进行检测和定量。
在某些实施方案中，本发明的结合多肽中使用的Fc结构域是Fc变体。如本文中使用的，术语“Fc变体”是指相对于所述Fc结构域衍生的野生型Fc结构域，具有至少一种氨基酸取代的Fc结构域。例如，其中Fc结构域衍生自人IgG1抗体，所述人IgG1 Fc结构域的Fc变体包含相对于野生型Fc结构域(例如设计以改变的结合分子的效应功能或半衰期)的至少一种氨基酸取代。
Fc变体的氨基酸取代可定位在Fc结构域内的任何位置(即任何EU常规氨基酸位置)。在一个实施方案中，Fc变体包含定位在铰链结构域或其部分中的氨基酸位置处的取代。在另外的实施方案中，Fc变体包含定位在CH2结构域或其部分中的氨基酸位置处的取代。在另外的实施方案中，Fc变体包含定位在CH3结构域或其部分中的氨基酸位置处的取代。在另外的实施方案中，Fc变体定位在CH4结构域或其部分中的氨基酸位置处的取代。
本发明的结合多肽可使用任何本领域识别的Fc变体，其已知赋予效应功能和/或FcR结合的改善(例如降低或增强)。所述Fc变体可包括例如下列国际PCT公开披露的氨基酸取代中的任一种：WO88/07089A1，WO96/14339A1，WO98/05787A1，WO98/23289A1，WO99/51642A1，WO99/58572A1，WO00/09560A2，WO00/32767A1，WO00/42072A2，WO02/44215A2，WO02/060919A2，WO03/074569A2，WO04/016750A2，WO04/029207A2，WO04/035752A2，WO04/063351A2，WO04/074455A2，WO04/099249A2，WO05/040217A2，WO05/070963A1，WO05/077981A2，WO05/092925A2，WO05/123780A2，WO06/019447A1，WO06/047350A2，和WO06/085967A2或美国专利5,648,260；5,739,277；5,834,250；5,869,046；6,096,871；6,121,022；6,194,551；6,242,195；6,277,375；6,528,624；6,538,124；6,737,056；6,821,505；6,998,253；和7,083,784，其均通过引用的方式并入本文中。
在某些实施方案中，本发明的结合多肽包含Fc变体多肽，所述Fc变体多肽包含改变抗体的抗原非依赖性效应功能、特别是抗体的循环半衰期的氨基酸取代。和缺少这些取代的结合多肽相比，这些结合多肽显示出与FcRn结合的增强或降低，因此分别在血清中具有增加或降低的半衰期。对FcRn具有改善的亲和性的Fc变体预期具有更长的血清半衰期，并且这些分子在治疗哺乳动物的方法中具有有用的应用，其中期望施用的多肽具有延长的半衰期，例如以治疗慢性疾病或疾患。相反，和FcRn具有降低的结合亲和性的Fc变体预期具有更短的半衰期，并且这些分子也有用于例如施用至哺乳动物，其中缩短的循环时间可是有利的，例如对于体内诊断成像或在这样的情况其中当存在于延长期间的循环中时初始多肽具有毒性副作用。和FcRn具有降低的结合亲和性的Fc变体也较少可能穿过胎盘，因此也有用于治疗孕妇中的疾病或疾患。另外，FcRn结合亲和性降低的其他应用可以是期望的，包括期望脑、肾脏和/或肝脏定位的那些应用。在一个示例性实施方案中，本发明的改变的多肽表现出穿过脉管***的肾脏的肾小球的上皮细胞的降低的运输。在另外的实施方案中，本发明的改变的多肽表现出穿过脑的血脑屏障(BBB)至血管空间中的降低的运输。在一个实施方案中，FcRn结合改变的结合多肽包含在Fc结构域的“FcRn结合环”内具有一个或多个氨基酸取代的Fc结构域。FcRn结合环包含氨基酸残基280-299(根据EU编号)。在其他实施方案中，FcRn结合亲和性改变的本发明的结合多肽包含在15
FcRn“接触区域”内具有一个或多个氨基酸取代的Fc结构域。如本文中使用的，术语15
FcRn“接触区域”包括下列位置处的残基：243-261，275-280，282-293，302-319，336-348，367，369，372-389，391，393，408，424，425-440(EU编号)。在优选的实施方案中，FcRn结合亲和性改变的本发明的结合多肽包含在下列位置中的任一种处具有一个或多个氨基酸取代的Fc结构域：256，277-281，283-288，303-309，313，338，342，376，381，384，385，387，434和438。FcRn结合活性改变的示例性氨基酸取代披露于国际PCT公开No.WO05/047327，其通过引用的方式并入本文中。
在其他实施方案中，本文所述的诊断和治疗方法中使用的某些结合分子具有恒定区例如IgG4重链恒定区，其被改变以减少或消除糖基化。例如，本发明的结合多肽还可包含Fc变体，所述Fc变体包含改变结合多肽的糖基化的氨基酸取代。例如，所述Fc变体可具有减少的糖基化(例如N-或O-连接的糖基化)或可包含野生型Fc结构域的改变的糖形(例如低岩藻糖或无岩藻糖聚糖)。分子的这些低岩藻糖或非岩藻糖形式可使用本领域已知的可替换的细胞系来准备以产生这些改变的形式。在一个实施方案中，Fc变体是非岩藻糖化的。
在示例性实施方案中，Fc变体包含通常在氨基酸位297(EU编号)发现的N-连接的聚糖的减少的糖基化。在另外的实施方案中，结合多肽具有糖基化基序附近或之内的氨基酸取代，例如，含有氨基酸序列NXT或NXS的N-连接糖基化基序。在特定实施方案中，结合多肽包含在氨基酸位228或299(EU编号)具有氨基酸取代的Fc变体。在更特定的实施方案中，结合分子包含含有S228P和T299A突变(EU编号)的IgG4恒定区。
赋予减少或改变的糖基化的示例性氨基酸取代公开于PCT公开No.WO05/018572，其通过引用并入本文。在优选的实施方案中，本发明的结合分子被修饰以消除糖基化。这些结合分子可称为″agly″结合分子(例如“agly”抗体)。尽管未受到理论的束缚，但是据信″agly″结合分子在体内可具有改善的安全性和稳定性特性。示例性agly结合分子包含IgG4抗体的无糖基化Fc区(“IgG4.P”)，其没有Fc-效应功能从而消除对于表达LT的正常重要器官的潜在的Fc介导的毒性。在特定实施方案中，本发明的agly结合分子可包含本领域已知的IgG4.P或IgG4PE恒定区。
V.结合分子的制备方法
众所周知，RNA可通过标准技术(例如在异硫氰酸胍萃取和沉淀后进行离心或层析)从原始杂交瘤细胞或其他转化细胞分离。在需要时可通过oligodT纤维素层析等标准技术从总RNA分离mRNA。适用的技术已为本领域熟知。
在一个实施方案中，编码本发明的结合分子的单独链(例如该抗体轻链和重链)的cDNA可参照公知的方法采用逆转录酶和DNA聚合酶同时或单独制备。例如，可通过共有恒定区引物或基于公开的重链和轻链DNA和氨基酸序列的更具特异性的引物启动PCR。如上文讨论，PCR还可用于分离编码该结合分子的单独链的DNA克隆。在该情况下可用共有引物或更具同源性探针如鼠恒定区探针来筛选该库。DNA，通常是质粒DNA，可采用本领域已知技术从细胞分离，并参考标准的，公知技术(例如，其具体内容可参见前述有关重组DNA技术的参考文献)获得限制性酶图谱和测序。当然，该DNA可在分离过程或后续分析中参照本发明在任意点进行合成。在对分离的遗传物质进行操作以提供本发明的结合分子后，编码该LT结合分子的多核苷酸通常被***表达载体并引导进入可用于生产所需数量LT结合分子的宿主细胞。
结合分子，例如结合此处所述的目标分子(例如LT)的抗体的重链或轻链的重组表达需要构建包含了编码该结合分子的多核苷酸的表达载体。在获得编码本发明结合分子(或其链或部分)的多核苷酸后，可通过本领域公知的重组DNA技术制备生产该结合分子的载体。因此，此处描述了通过表达包含结合分子编码核苷酸序列的多核苷酸制备蛋白的方法。可采用本领域技术人员公知的方法构建包含结合分子编码序列和适当的转录和转译控制信号的表达载体。这些方法包括例如体内重组DNA技术，合成技术，以及体内遗传重组。因此，本发明提供了包含可操作地连接至启动子的编码本发明结合分子或其链或结构域的核苷酸序列的可复制载体。该类载体可包含编码该抗体分子恒定区的核苷酸序列(例如，参见PCT公开WO 86/05807；PCT公开WO 89/01036以及美国专利No.5,122,464)，且编码结合分子(或其链或结构域)的核苷酸可被克隆进入该种载体以表达完整的结合分子。
如果本发明的结合分子是二聚体，宿主细胞可以共转染本发明的表达载体、编码第一多肽单体的第一载体和编码第二多肽单体的第二载体。两种载体可含有相同的可选择的标记，其能够使单体进行平等的表达。或者，可以使用编码两种载体的单一载体。在单体是抗体轻链和重链的实施方案中，轻链有利地置于重链之前以避免过多毒性游离的重链(Proudfoot，Nature322：52(1986)；Kohler，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：2197(1980))。结合分子的单体的编码序列可包含cDNA或基因组DNA。本文使用的术语“载体”或“表达载体”是指根据本发明所用的作为导入和在宿主细胞表达目标基因的工具的载体。如本领域技术人员所知，该种载体可简单选自质粒，噬菌体，病毒和逆转录病毒。一般而言，适用本发明的载体将包含选择性标记，帮助目标基因进行克隆的适当限制性酶切位点以及进入真核或原核细胞和/或在其中复制的能力。
可采用多种表达载体***实现本发明目的。例如，一类利用来自动物病毒(例如牛***瘤病毒，多瘤病毒，腺病毒，痘苗病毒，杆状病毒，逆转录病毒(RSV、MMTV或MOMLV)或SV40病毒)的DNA元件的载体。其他包括了具有内部核糖体结合位点的多顺反子***的应用。此外，将该DNA整合至其染色体的细胞可通过导入一个或多个支持转染宿主细胞选择的标记进行选择。该标记可向营养缺陷型宿主提供原营养，耐受抗微生物剂(例如，抗生素)或耐受铜等重金属。该选择性标记基因既可直接连接至待表达的DNA序列，也可通过共转化导入相同的细胞。为优化mRNA的合成可能还需要附加的元件。这些元件可包括信号序列，剪接信号，以及转录启动子，增强子，以及终止信号。
在特别优选的实施方案中，该克隆可变区基因与上述方法合成的(优选人)重和轻链恒定区一起***表达载体。在一个实施方案中，这可通过称为NEOSPLA(披露于美国专利6,159,730)的Biogen IDEC，Inc.的专有表达载体作用。该载体包含了细胞巨化病毒启动子/增强子，小鼠β球蛋白主启动子，SV40复制起始区，牛生长激素多聚腺苷酸化序列，新霉素磷酸转移酶外显子1和外显子2，二氢叶酸还原酶基因和前导序列。据发现通过结合可变和恒定区基因，在CHO细胞内转染，在含G418培养基筛选并通过氨甲喋呤扩增时，该载体可导致极高水平的抗体表达。当然，任何能在真核细胞引发表达的表达载体均可用于本发明。适用载体的范例包括但不限于质粒pcDNA3，pHCMV/Zeo，pCR3.1，pEF1/His，pIND/GS，pRc/HCMV2，pSV40/Zeo2，pTRACER-HCMV，pUB6/V5-His，pVAX1和pZeoSV2(可从Invitrogen，San Diego，CA购买)，以及质粒pCI(可从Promega，Madison，WI购买)。一般而言，对大量的转染细胞进行筛选以确定其是否表达了适当高水平免疫球蛋白重链和轻链是常规实验，其可通过机器人***等形式开展。载体***的描述还可参见美国专利No.5,736,137和5,658,570，其通过引用的方式全文并入本文中。该***提供了很高的表达水平，例如，＞30pg/细胞/天。其他示例性载体***披露于美国专利6,413,777。
在其他优选实施方案中，本发明的结合分子可采用多顺反子构建体进行表达，例如可参见2002年11月18日提交的美国专利申请公开No.2003-0157641A1，其通过引用的方式全文并入本文中。在这些新型表达***中，多个目的基因产物例如抗体的重和轻链可通过单个多顺反子构建体生产。这些***有利地利用了内部核糖体进入位点(IRES)以在真核宿主细胞内提供相对高水平的LT结合分子。适用IRES序列可参见在此引用的美国专利No.6,193,980。本领域技术人员应当可以理解该种表达***可被用于有效生产本发明披露的全系列的LT结合分子。
更普遍而言，一旦制备得到编码LT结合分子的单体亚基的载体或DNA序列，该表达载体可被导入合适的宿主细胞。质粒相宿主细胞的导入可采用本领域技术人员公知的多种技术实现。这些技术包括但不限于，转染(包括电泳和电穿孔)，原生质体融合，磷酸钙沉淀，带有套膜DNA的细胞融合，显微注射以及用完整病毒感染。参见Ridgway，A.A.G.″MammalianExpression Vectors″Vectors，Rodriguez and Denhardt，Eds.，Butterworths，Boston，Mass.，Chapter 24.2，pp.470-472(1988)。典型地，质粒通常通过电穿孔导入宿主细胞。在适于结合分子生产的条件下培养带有表达构建体的宿主细胞，并对结合分子合成进行测定。示例性检测技术包括酶联免疫吸附分析(ELISA)，放射性免疫测定(RIA)，或荧光激活细胞分类分析(FACS)，免疫组化等。
该表达载体通过常规技术转入宿主细胞，然后以常规技术培养该转染细胞以生产用于此处所述方法的抗体。因此，本发明包括了包含可操作地连接至外源启动子的编码本发明结合分子或其单体或链的多核苷酸的宿主细胞。在针对表达双链抗体或二聚体结合分子的优选实施例中，如下文详述，单独编码结合分子链的载体可在宿主细胞中共表达以表达完整结合分子。
此处所述的“宿主细胞”指能够接受使用重组DNA技术构建并至少编码一种外源基因的载体的细胞。在对从重组宿主分离结合分子的方法的描述中所用的术语“细胞”和“细胞培养物”可相互替换地说明结合分子的来源(除非另行清楚指明)。换言之，可回收多肽的“细胞”即可指离心得到的全细胞，也可指包含了培养基和悬浮细胞的细胞培养。
可采用多种宿主表达载体***来表达用于此处所述方法的结合分子。该种宿主表达***代表了可生产和后续纯化目标编码序列的载体，还代表了在以适当核苷酸编码序列进行转化或转染后原位表达本发明抗体分子的细胞。其包括但不限于微生物，如以包含了抗体编码序列的重组噬菌体DNA，质粒DNA或粘粒DNA表达载体转染的细菌(例如，大肠杆菌，枯草芽袍杆菌)；以包含抗体编码序列的重组酵母表达载体转染的酵母(例如，毕赤酵母)；以包含抗体编码序列的重组病毒表达载体(杆状病毒)感染的昆虫细胞***；以包含抗体编码序列的重组病毒表达载体(例如，花椰菜花叶病毒，CaMV；烟草花叶病毒，TMV)感染或重组质粒表达载体(例如，Ti质粒)转染的植物细胞***；或包含了带有哺乳动物细胞基因组启动子(例如，金属硫蛋白启动子)或哺乳动物病毒启动子(例如，腺病毒晚期启动子；牛痘病毒7.5k启动子)的重组表达构建体的哺乳动物细胞***(例如，COS，CHO，BLK，293，3T3细胞)。优选地，可使用细菌细胞如大肠杆菌，更优选使用真核细胞表达重组结合分子，特别是完整重组结合分子。例如，结合来自人细胞巨化病毒的中间早期基因启动子元件等载体的哺乳动物细胞如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)是一种有效的抗体和其他结合分子的表达***(Foecking et al.，Gene45：101(1986)；Cockett et al.，Bio/Technology 8：2(1990))。
该用于蛋白表达的宿主细胞系通常来源于哺乳动物；本领域技术人员应当具有优选适用于表达目标基因产物的特定宿主细胞系的能力。示例性宿主细胞系包括但不限于，CHO(中国仓鼠卵巢细胞)，DG44和DUXB11(中国仓鼠卵巢细胞系，DHFR缺陷型)，HELA(人子***)，CVI猴肾细胞系)，COS(带有SV40T抗原的CVI衍生物)，VERY，BHK(幼仓鼠肾)，MDCK，293，WI38，81610(中国仓鼠纤维原细胞)，BALBC/3T3(鼠成纤维)，HAK(仓鼠肾细胞系)，SP2/O(小鼠骨髓瘤)，P3x63-Ag3.653(小鼠骨髓瘤)，BFA-1c1BPT(牛内皮细胞)，RAJI(人淋巴细胞)以及293(人肾)。特别优选CHO细胞。通常可从商业服务机构，美国组织培养物保藏中心或公开文献获取。
此外，还可选择以特定形式调节***序列表达，或修饰和处理基因产物的宿主细胞株。对该蛋白产物的该种修饰(例如，糖基化)和处理(例如，裂解)可对该蛋白的功能非常重要。不同的宿主细胞可对蛋白和基因产物的转译后处理和修饰均有不同的特性和特殊的机制。可选择适当的细胞系或宿主***以确保表达的外源蛋白的正确修饰和处理。为此，可使用具有正确处理基因产物的初级转录，糖基化和磷酸化的细胞机制的真核宿主细胞。
优选稳定表达以进行重组蛋白的长期高产量生产。例如，可通过工程改造得到稳定表达该结合分子的细胞系。宿主细胞可通过由适当表达控制元件(例如，启动子，增强子，序列，转录终止子，聚腺苷酸化位点等)和选择性标记控制的进行转化，而非使用包含病毒复制起始区的表达载体。在导入外源DNA后，将工程细胞在富集培养基中培养1-2天，然后转入选择性培养基。重组质粒中的选择性标记可带来对选择因素的耐受并使细胞将该质粒稳定整合进入其染色体，然后生长得到可进行后续克隆并扩展入细胞系的病灶。该方法可用于工程改造可稳定表达结合分子的细胞系。
多种选择***可供使用，包括但不限于可分别应用于tk-、hgprt-或aprt-细胞的单纯疱疹病毒胸苷激酶(Wigler et al.，Cell 11：223(1977))，次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Szybalska&Szybalski，Proc.Natl.Acad.Sci.USA48：202(1992))，以及腺喋呤磷酸核糖转移酶(Lowy et al.，Cell 22：8171980)基因。此外，抗代谢物抗性可用作下列基因选择的基础：具有对氨甲喋呤的抗性的dhfr(Wigler et al.，Natl.Acad.Sci.USA 77：357(1980)；O′Hare et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78：1527(1981))；具有对麦考酚酸的抗性的gpt(Mulligan&Berg，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78：2072(1981))；具有对氨基糖苷G-418的抗性的neo(Clinical Pharmacy 12：488-505；Wu and Wu，Biotherapy 3：87-95(1991)；Tolstoshev，Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32：573-596(1993)；Mulligan，Science260：926-932(1993)；和Morgan and Anderson，Ann.Rev.Biochem.62：191-217(1993)；TIB TECH 11(5)：155-215(1993年5月)；具有对潮霉素的抗性的hygro(Santerre et al.，Gene 30：147(1984))。本领域公知的可供使用的重组DNA技术可参见Ausubel et al.(eds.)，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，NY(1993)；Kriegler，Gene Transfer and Expression，ALaboratory Manual，Stockton Press，NY(1990)；以及Chapters 12和13，Dracopoli et al.(eds)，Current Protocols in Human Genetics，John Wiley&Sons，NY(1994)；Colberre-Garapin et al.，J.Mol.Biol.150：1(1981)，其通过引用的方式全文并入本文中。
结合分子的表达水平可通过载体扩增得到提高(其综述参见Bebbingtonand Hentschel，The use of vectors based on gene amplification for the expressionof cloned genes in mammalian cells in DNA cloning，Academic Press，New York，Vol.3.(1987))。当表达结合分子的载体***中的标记可进行扩增时，宿主细胞培养中抑制剂水平的提升可提高标记基因拷贝数。由于扩增区与结合分子关联，因而结合分子的产量也会得到提高(Crouse et al.，Mol.Cell.Biol.3：257(1983))。
体外生产可以放大，以获得大量的所需多肽。在组织培养条件下培养哺乳动物细胞的技术已为本领域所知并包括均匀悬浮培养(例如，在气升式反应器或连续搅拌反应器中)，或是固定化或包埋细胞培养(例如，在中空纤维，微胶囊中，在琼脂糖微珠或陶瓷芯上)。在必须和/或需要时，例如，在合成铰链区多肽的生物合成后，或在此处所述的HIC层析步骤前后，该多肽溶液可通过常规层析方法进行纯化，例如凝胶过滤，离子交换层析，DEAE-纤维素层析或(免疫-)亲和层析。
编码本发明LT结合分子的基因还可通过非哺乳动物细胞(例如细菌或昆虫或酵母或植物细胞)进行表达。较容易接受核酸的细菌包括肠杆菌成员，例如大肠杆菌或沙门氏菌菌株；芽孢杆菌，例如枯草芽孢杆菌；肺炎球菌；链球菌，以及流感嗜血杆菌。应当进一步指出，在细菌中表达时该外源多肽通常作为包含体的一部分。该外源多肽可进行分离，纯化然后组装入功能性分子。在需要结合分子的四价形式时，该亚基将自动装配进入四价结合分子(例如四价抗体(WO02/096948A2))。
在细菌***中，根据被表达的结合分子的目标用途，可选择使用多种表达载体。例如，当需要生产大量该种蛋白，以得到结合分子的药物组合物时，可采用能够引导高水平表达易纯化融合蛋白产物的载体。该类载体包括但不限于，大肠杆菌表达载体pUR278(Ruther et al.，EMBO J.2：1791(1983))，其中该抗体克隆序列可在与lacZ编码区同框的情况下单独连接至该载体从而生产融合蛋白；pIN载体(Inouye&Inouye，Nucleic Acids Res.13：3101-3109(1985)；Van Heeke&Schuster，J.Biol.Chem.24：5503-5509(1989))等。pGEX载体也可用于将外源多肽以谷胱甘肽S转移酶(GST)融合蛋白的形式进行表达。一般而言，该种融合蛋白具有可溶性，并能通过吸附，结合至基质谷胱甘肽-琼脂糖珠，然后在自由谷胱甘肽存在下洗脱进行简单的纯化。通过设计该pGEX载体包括了凝血酶或Xa因子蛋白酶裂解位点，从而使该克隆的目标基因产物可以从GST部分释放。
除了原核生物外，还可采用真核微生物。尽管许多其他的菌株(例如，毕赤酵母)已上市销售，酿酒酵母，或普通面包酵母在真和微生物中最为常用。
通常可使用质粒YRp7(Stinchcomb et al.，Nature 282：39(1979)；Kingsmanet al.，Gene 7：141(1979)；Tschemper et al.，Gene 10：157(1980))等在酵母中进行表达。该质粒已包含了可为缺乏在色氨酸中生长能力的酵母突变菌株(例如ATCC No.44076或PEP4-1(Jones，Genetics 85：12(1977))提供选择性标记的TRP1基因。然后作为酵母宿主细胞基因组特征的Trp1病斑的存在为色氨酸缺失生长下转化的检测提供了有效的环境。
在昆虫***中，通常使用蓿苜尺蠖核多角体病毒(AcNP V)作为表达外源基因的载体。该病毒生长于草地夜蛾细胞。该抗体编码序列可单独克隆进入该病毒的非必须区(例如多角体蛋白基因)并位于AcNPV启动子(例如该多角体蛋白启动子)的控制下。
当本发明的结合分子被重组表达后，可通过本领域已知的任意免疫球蛋白分子纯化方法对其进行纯化，例如，层析(例如，离子交换层析，亲和层析，特别是对蛋白A特异性抗原的亲和层析，筛分柱层析)，离心，微分溶出，或通过任何其他蛋白纯化标准技术。可选择地，提高本发明结合分子(例如抗体)亲和性的优选方法参见US 20020123057A1。
VI.使用包含结合LT的结合分子的组合物的治疗方法
本发明的一种实施方案提供受益于施用抗-LT结合分子的受试者的治疗方法，该方法包括、主要包括、或由向该动物施用有效量的本文所述的本发明的结合分子或组合物。
在一个实施方案中，本发明的结合分子施用至患有和炎症或自身免疫应答有关的疾患的受试者。在一个实施方案中，本发明的结合分子施用至患有癌症的受试者。
示例性炎症或自身免疫疾患包括器官特异性疾病(即，免疫应答特异性针对于器官***例如内分泌***，造血***，皮肤，心肺***，肠胃及肝脏***，肾脏***，甲状腺，耳，神经肌***，中枢神经***等)或可影响多种器官***的***性疾病(例如，全身性红斑狼疮(SLE)，风湿性关节炎，多肌炎等)。在一个实施方案中，使用本发明的结合分子治疗的自身免疫或炎性疾患是具有异位淋巴表现的疾患。
示例性自身免疫或炎性疾病包括例如：风湿性关节炎，干燥综合征，硬皮病，狼疮例如SLE和狼疮肾炎，多肌炎/皮肌炎，冷球蛋白血症，抗-磷脂抗体综合征和牛皮癣关节炎)，自身免疫肠胃及肝脏疾患(如例如炎性肠疾病(例如溃疡性结肠炎和克罗恩病)，自身免疫胃炎和恶性贫血，自身免疫性肝炎，原发性胆汁性肝硬化，原性性硬化性胆管炎和腹腔疾病)，血管炎(如例如ANCA-阴性血管炎和ANCA-相关血管炎，包括丘-施二氏血管炎，韦格内氏肉芽肿症和显微镜下多血管炎)，自身免疫神经***疾患(如例如多发性硬化(MS)，RRMS，SPMS，眼肌阵挛性肌阵挛综合征，重症肌无力，视神经脊髓炎，帕金森氏症，阿耳茨海默氏病和自身免疫多发性神经病)，肾脏喜欢(如例如，血管球性肾炎，古德帕斯彻氏综合征和贝格尔氏病)，自身免疫皮肤病(如例如，牛皮癣，荨麻疹，假膜性喉头炎，慢性天疱疮，大疱性类天疱疮和皮肤全身性红斑狼疮)，血液性疾病(如例如，血小板减少性紫癜，血栓性血小板减少性紫癜，输血后紫癜和自身免疫溶血性贫血)，动脉硬化症，葡萄膜炎，自身免疫听力疾病(如例如，内耳病和听力损失)，***，雷诺氏综合征，皮肌炎，器官移植和自身免疫内分泌障碍(如例如，糖尿病相关自身免疫疾病例如胰岛素-依赖性糖尿病(IDDM)，爱迪生氏病和自身免疫甲状腺疾病(例如格雷夫斯氏病和甲状腺炎))。更优选的这些疾病包括例如RA，IBD，包括克罗恩病和溃疡性结肠炎，ANCA-相关的血管炎，狼疮，MS，干燥综合征，格雷夫斯氏病，IDDM，恶性贫血，甲状腺炎和血管球性肾炎。甚至更优选的是RA，IBD，狼疮和MS，并且更优选RA和IBD，最优选RA。
示例性非自身免疫适应症包括滤泡性淋巴瘤，动脉硬化症，病毒诱导的肝炎，支气管哮喘和病毒休克综合征。
在一个实施方案中，本结合分子用于治疗风湿性关节炎。如本文中使用的，″风湿性关节炎″或″RA″是指识别的疾病状态，其可根据2000修订的American Rheumatoid Association的RA分类标准或任何类似的标准来诊断，并且包括主动早期和初期RA，如下面定义的。RA的生理指标包括对称关节肿胀，其是特征性的，尽管在风湿性关节炎中不是不变的。手的近侧指间(PIP)关节以及掌骨指骨(MCP)，腕关节，肘，膝，踝关节和跖趾(MTP)关节的梭形肿胀通常受到影响，并且肿胀容易被检测。被动运动中的疼痛是关节炎症的最敏感的测试，并且炎症和结构变形通常限制受到影响的关节的活动范围。典型的可见的变化包括MCP关节处手指的尺骨偏差、伸直过度、或MCP和PIP关节的屈曲过度、肘的屈曲性挛缩和腕骨和趾部的半脱位。患有RA的受试者可耐DMARD，因为DMARD在治疗症状中不是有效的或不是完全有效的。
在一个实施方案中，根据本发明的疗法的候选物包括对于之前或目前使用TNF抑制剂的治疗经历不充分的应答的那些。
在一个实施方案中，本发明的结合分子用于治疗主动风湿性关节炎。″主动风湿性关节炎″的患者是指患者具有主动但非潜伏性的RA症状。″早期主动风湿性关节炎″的受试者是那样的受试者，其根据RA分类的1987修改的ACR标准诊断患有主动RA至少8周但是不长于4年。″早期风湿性关节炎″的受试者是那样的受试者，其根据RA分类的1987修改的ACR标准诊断患有RA至少8周但是不长于4年。早期RA包括例如青少年型RA，幼年特发性关节炎(JIA)或少年RA(JRA)。
在一个实施方案中，本发明的结合分子用于治疗初期风湿性关节炎。″初期RA″患者具有早期多发性关节炎，其并未完全满足诊断RA的ACR标准，但是相关于存在RA-特异性前兆生物标记，例如抗-CCP和共享的抗原表位。它们包括阳性抗-CCP抗体患者，其患有多发性关节炎，但是并未诊断RA，其处于发展bonafide ACR标准RA的高风险中(95％可能性)。
″关节损伤″以最广泛的意义使用，并且是指一个或多个关节的任意部分损坏或者部分或全部破坏，包括***和软骨，其中损坏包括任何原因的结构和/或功能损害，并且可以或不可以引起关节疼痛/关节痛。其包括但不限于相关于或源自炎性关节病以及非炎性关节病的关节损伤。该损害可由任何病症引起，例如自身免疫疾病，特别是关节炎，最特别是RA。示例性这种病症包括急性和慢性关节炎，RA包括青少年型RA，幼年特发性关节炎(JIA)或少年RA(JRA)，以及阶段例如类风湿性滑膜炎，痛风或痛风性关节炎，急性免疫关节炎，慢性炎症性关节炎，退化性关节炎，II型胶原质-诱导的关节炎，感染性关节炎，脓毒性关节炎，莱姆关节炎，增生性关节炎，牛皮癣性关节炎，斯提耳病，脊椎关节炎，骨关节炎，关节炎慢性progrediente，变形性关节炎，多发性关节炎慢性primaria，反应性关节炎，更年期关节炎，***耗尽关节炎和强直性脊椎炎/类风湿性脊椎炎)，除了RA的风湿性自身免疫疾病，和RA的次级明显***性发展(包括但不限于血管炎，肺纤维化或费耳提氏综合征)。为了本文目的，关节是骨骼元件之间(脊椎动物例如动物)和围绕并支持其的部分的接触点，包括但不限于例如髋关节，脊柱的椎骨之间的关节，脊柱和骨盆(骶髂关节)之间的关节，附接骨骼的腱和韧带中的关节，肋骨和脊柱，肩部，膝盖，脚，肘，手，指，踝，和趾部之间的关节，但特别是手和脚中的关节。
在一个实施方案中，受试者之前从未使用药物进行治疗，例如未使用免疫抑制剂治疗疾患，但在特定实施方案中，之前从未使用TNF拮抗剂进行治疗。在可选择的实施方案中，受试者之前使用药物进行治疗以治疗疾患，包括TNF拮抗剂。
在又一方面中，患者复发疾患。在可选择的实施方案中，患者并未复发疾患。
在另外的方面中，本发明的抗体是施用至受试者以治疗疾患的仅有的药物。在可选择的方面中，本文的结合分子是用于治疗疾患的仅有的药物。
在又一方面中，受试者仅患有RA作为自身免疫疾患。
或者，受试者仅患有MS作为自身免疫疾患。甚至或者，受试者仅患有狼疮或ANCA-相关的血管炎或干燥综合征作为自身免疫疾患。
VIII.药物组合物和施用方法
LT-特异性结合分子的制备以及向需要的受试者进行施用的方法已为本领域技术人员熟知或容易确定。结合分子的施用途径可以是(例如)口服，肠胃外，通过吸入或局部施用。此处所用的术语肠胃外施用包括(例如)静脉内，动脉内，腹膜内，肌肉内，皮下，直肠或***施用。尽管所有这些施用的形式均明确在本发明的范围内，但是其中一种施用形式是供注射，特别是供静脉或动脉注射或者滴注的溶液。注射用的合适的药物组合物通常可包含缓冲液(例如，醋酸盐，磷酸盐或柠檬酸盐缓冲液)，表面活性剂(例如，聚山梨醇酯)，任选的稳定剂(例如，人白蛋白)等。然而，在另一种与此技术一致的方法中，结合分子可直接传递至有害细胞群的位点，从而提高该疾病组织对该治疗剂的暴露。
肠胃外施用的制剂包括无菌水溶液或非水溶液，悬浮液和乳剂。非水溶剂的例子为丙二醇，聚乙二醇，植物油(例如橄榄油)，以及可注射的有机酯(例如油酸乙酯)。水溶液载体包括水，酒精/水溶液，乳剂或悬浮液，包括盐水和缓冲介质。本发明中药学上可接受的载体包括但不限于0.01-0.1M，优选0.05M磷酸盐缓冲液或0.8％盐水。其他常用的肠胃外载体包括磷酸钠溶液，Ringer右旋糖，右旋糖和氯化钠，Ringer乳酸盐，或固定油。静脉内载体包括液体和营养补充剂，电解质补充剂，例如基于Ringer右旋糖的电解质补充剂等。还可包括防腐剂和其他添加剂，例如抗菌剂，抗氧化剂，鳌合剂，以及惰性气体等。
更具体地，适于注射用途的药物组合物包括无菌水溶液(溶于水时)或分散液以及用作可无菌注射溶液或分散液的临时制剂的无菌粉末。此时，该组合物应当无菌且具有足够的流动性以进行注射。它应在生产和贮存条件下保持稳定，并优选可耐受微生物(例如细菌和真菌)的污染。该载体可以是溶剂或分散介质，其包含，例如水，乙醇，多元醇(丙三醇，丙二醇，以及液体聚乙二醇等)，及其适当的混合物。适当的流动性可通过多种方式维持，例如，通过适用卵磷脂等包覆，对于分散剂通过保持所需的颗粒尺寸以及通过表面活性剂的使用。用于此处披露的治疗方法的合适制剂披露于Remington′sPharmaceutical Sciences，Mack Publishing Co.，16th ed.(1980)。
微生物作用的预防可通过各种抗菌和抗真菌剂(例如，防腐剂，氯丁醇，苯酚，抗坏血酸，硫柳汞等)实现。在许多情况下该组合物中优选包含等张剂，例如，糖，多元醇(例如甘露醇，山梨糖醇)，或氯化钠。可注射组合物的长期吸收可通过在组合物中包含一种延缓吸收的试剂(例如，单硬脂酸铝和明胶)来实现。
在任意情况下，无菌可注射溶液可通过将所需量的活性化合物(例如本发明的结合分子)与此处所列成份的一种或组合溶于适当的溶剂中，并根据要求过滤灭菌而制备得到。一般而言，分散剂可通过将活性化合物与包含了基础分散介质和所需其他上述成分的无菌载体结合得到。对于可用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末，其优选制备方法为真空干燥和冷冻干燥，通过制备得到的粉末包含活性成分和从其无菌过滤溶液得到的任何附加所需成分。该注射制剂经处理后将根据本领域已知方法填充入容器(例如安瓶，袋，瓶，注射器或小瓶)，并在无菌条件下密封。此外，该制剂可经过包装以试剂盒的形式出售，如共同未决申请U.S.S.N.09/259,337(US-2002-0102208 A1)所述，其通过引用的方式全文并入本文中。该产品优选包含标签或说明书以指示该相关组合物可用于治疗患有或易患自体免疫或肿瘤性病症的受试者。
用于治疗高度增殖紊乱的本发明组合物的有效剂量取决于多种因素，包括施用方法，靶标位点，患者的生理状态，该患者是人或动物，施用的其他药物，以及用于治疗还是预防。该患者通常为人，但也可治疗包括转基因动物在内的非人类哺乳动物。可采用本领域技术人员已知的常规方法对治疗剂量进行滴定测量以获得最佳的安全性和有效性。
采用抗体或其片段对高度增殖紊乱进行治疗时，该剂量相对宿主体重可以为，例如，从约0.0001至100mg/kg，更通常为0.01至5mg/kg(例如，0.02mg/kg，0.25mg/kg，0.5mg/kg，0.75mg/kg，1mg/kg，2mg/kg等)。例如该剂量可以是1mg/kg体重或10mg/kg体重或在1-10mg/kg范围内，优选至少1mg/kg。上述范围的中间剂量在本发明的范围之内。受试者给药可采取每天施用，隔日施用，每周施用或根据任何其他通过实证分析得到的进度施用。一种示例性治疗需要在较长的期限内(例如，至少六个月)进行多剂量施用。一种示例性治疗方案需要每两周或每月一次或是每3至6个月一次施用。示例性剂量给法包括连续每天1-10mg/kg或15mg/kg，隔日30mg/kg或每周60mg/kg。在一些方法中同时给用两种或多种具有不同结合特异性的单克隆抗体或其他治疗剂，其中各抗体或治疗剂的施用剂量均在指示的范围之内。
此处披露的LT-特异性结合分子可在多种时间施用。单独剂量之间的间隔可以为数周，数月或数年。根据对患者体内靶多肽或靶分子血液水平的测量所示，该间隔也可是不规律的。在一些方法中可对剂量进行调整以使血浆多肽浓度在1-1000μg/ml，在一些方法中该浓度为25-300μg/ml。可选择地，结合分子可作为缓释制剂施用，此时可减少给药频率。剂量和频率的变化取决于抗体在患者体内的半衰期。结合分子还可通过与稳定多肽或部分(例如，白蛋白或PEG)相融合来延长半衰期。一般而言，人源化抗体显示了最长的半衰期，其次是嵌合抗体和非人源抗体。在一个实施方案中，本发明的结合分子可以未结合形式施用。在另一实施方案中，本文公开的方法中使用的该结合分子可以结合形式多次施用。在另一实施方案中，本发明的结合分子可先以不结合方式，再以结合方式施用，或以相反的顺序施用。
施用剂量和频率可依据该治疗为预防性或治疗性而发生变化。在预防性应用中，包含抗体或其混合物的组合物被施用至未处于疾病状态或在疾病前状态的患者以增强该患者的抵抗力。该种数量被定义为“预防有效剂量”。对于该用途，其确切的数量在以依赖于患者的健康和总体免疫力状态，但通常在每个剂量约0.1至25mg的范围内，特别在每个剂量0.5至2.5mg的范围内。可以相对低的剂量在较长的一段时间内以相对较低的频率施用。部分患者将接受终生持续治疗。
在治疗性应用中，有时需要以相对高的剂量(例如，从约1至400mg/kg的结合分子，例如，每个剂量的抗体，放射免疫结合物通常采用从5至25mg的剂量，细胞毒素药物结合的分子将采用更高的剂量)在相对短的间隔内施用直至疾病的进展被减缓或终止，并优选直至该患者显示部分或完全改善疾病症状。此后，该患者可以预防方案进行施用。
在一个实施方案中，可采用包含编码LT-特异性抗体或其免疫特异性片段的核酸分子(例如，包含在载体中)的核酸分子治疗受试者。编码多肽的核酸的剂量范围为每个患者约10ng至1g、100ng至100mg、1μg至10mg或30-300μg DNA。传染性病毒载体的剂量在每剂10-100或更多病毒体。
用于预防性和/或治疗性治疗的治疗剂可通过肠胃外，局部，静脉内，口服，皮下，动脉内，头颅内，腹膜内，鼻内或肌肉内的方式施用。在部分方法中，药剂被直接注射进入特定的LTbR-表达细胞被积聚的组织，例如头颅内注射。抗体施用优选采用肌肉注射或静脉输注。在部分方法中，特定的治疗性抗体被直接注射入颅内。在一些方法中，该抗体作为缓释组合物或仪器(例如MedipadTM仪)进行给药。
LT结合分子可任选与其他对病症或症状的治疗(例如，预防或治疗)有效的试剂联合施用。
在本公开披露的范围内，本发明的LT-特异性结合分子可通过上述治疗方法在足以产生治疗或预防效果的数量下施用于人或其他动物。本发明的LT-特异性抗体结合分子可以常规剂型施用于人或其他动物，该剂型可参照已知技术将本发明抗体结合常规药学上可接受载体或稀释液进行制备。本领域技术人员均可理解该药学上可接受的载体或稀释液的形式和特征由其结合的活性成分的量，给药途径和其他公知变量所决定。本领域技术人员将进一步理解包含一种或多种如本发明所述的结合分子的混合剂可能会特别有效。
本发明的实施将采用(除非另行指出)细胞生物学，细胞培养，分子生物学，转基因生物学，微生物学，重组DNA以及免疫学的常规技术，其均在本领域的技术范围之内。该类技术在文献中得到了充分的解释。例如，参见Molecular Cloning A Laboratory Manual，2nd Ed.，Sambrook et al.，ed.，ColdSpring Harbor Laboratory Press：(1989)；Molecular Cloning：A LaboratoryManual，Sambrook et al.，ed.，Cold Springs Harbor Laboratory，New York(1992)，DNA Cloning，D.N.Glover ed.，Volumes I and II(1985)；OligonucleotideSynthesis，M.J.Gait ed.，(1984)；Mullis et al.U.S.Pat.No：4，683，195；NucleicAcid Hybridization，B.D.Hames&S.J.Higgins eds.(1984)；Transcription AndTranslation，B.D.Hames&S.J.Higgins eds.(1984)；Culture Of Animal Cells，R.I.Freshney，Alan R.Liss，Inc.，(1987)；Immobilized Cells And Enzymes，IRLPress，(1986)；B.Perbal，A Practical Guide To Molecular Cloning(1984)；thetreatise，Methods In Enzymology，Academic Press，Inc.，N.Y.；Gene TransferVectors For Mammalian Cells，J.H.Miller and M.P.Calos eds.，Cold SpringHarbor Laboratory(1987)；Methods In Enzymology，Vols.154 and 155(Wu et al.eds.)；Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology，Mayer andWalker，eds.，Academic Press，London(1987)；Handbook Of ExperimentalImmunology，Volumes I-IV，D.M.Weir and C.C.Blackwell，eds.，(1986)；Manipulating the Mouse Embryo，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，N.Y.，(1986)；和Ausubel et al.，Current Protocols in MolecularBiology，John Wiley and Sons，Baltimore，Maryland(1989)。
抗体工程的一般原则可参见Antibody Engineering，2nd edition，C.A.K.Borrebaeck，Ed.，Oxford Univ.Press(1995)。蛋白工程的一般原则可参见Protein Engineering，A Practical Approach，Rickwood，D.，et al.，Eds.，IRL Pressat Oxford Univ.Press，Oxford，Eng.(1995)。抗体和抗体一半抗原结合的一般原则可参见Nisonoff，A.，Molecular Immunology，2nd ed.，Sinauer Associates，Sunderland，MA(1984)和Steward，M.W.，Antibodies，Their Structure andFunction，Chapman and Hall，New York，NY(1984)。此外，本领域已知且未具体描述的免疫学标准方法可参照Current Protocols in Immunology，John Wiley&Sons，New York；Stites et al.(eds)，Basic and Clinical-Immunology(8th ed.)，Appleton&Lange，Norwalk，CT(1994)and Mishell and Shiigi(eds)，SelectedMethods in Cellular Immunology，W.H.Freeman and Co.，New York(1980)。
阐述了免疫学基本原理的标准参考著作包括Current Protocols inImmunology，John Wiley&Sons，New York；Klein，J.，Immunology：The Scienceof Self-Nonself Discrimination，John Wiley&Sons，New York(1982)；Kennett，R.，et al.，eds.，Monoclonal Antibodies，Hybridoma：A New Dimension inBiological Analyses，Plenum Press，New York(1980)；Campbell，A.，“MonoclonalAntibody Technology”in Burden，R.，et al.，eds.，Laboratory Techniques inBiochemistry and Molecular Biology，Vol.13，Elsevere，Amsterdam(1984)，KubyImmunology 4th ed.Ed.Richard A.Goldsby，Thomas J.Kindt and Barbara A.Osborne，H.Freemand&Co.(2000)；Roitt，I.，Brostoff，J.and Male D.，Immunology 6th ed.London：Mosby(2001)；Abbas A.，Abul，A.and Lichtman，A.，Cellular and Molecular Immunology Ed.5，Elsevier Health SciencesDivision(2005)；Kontermann and Dubel，Antibody Engineering，SpringerVerlan(2001)；Sambrook and Russell，Molecular Cloning：A Laboratory Manual.Cold Spring Harbor Press(2001)；Lewin，Genes VIII，Prentice Hall(2003)；Harlow and Lane，Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring HarborPress(1988)；Dieffenbach and Dveksler，PCR Primer Cold Spring HarborPress(2003)。
前文及本文中引用的所有参考文献均以引用的方式全文并入本文中。
实施例
实施例1.抗-淋巴细胞毒素抗体的克隆
通过珠上存在的LTα1β2注射小鼠来制备针对人淋巴细胞毒素(LT)的小鼠单克隆抗体(mAbs)。LTα1β2使用本领域识别的技术(使用抗-myc抗体或通过CnBr固定至珠表面)连接至珠。
来自鼠杂交瘤细胞的全细胞RNA使用Qiagen RNeasy mini试剂盒按照生产商推荐的方案来制备。编码重链和轻链的可变区的cDNA由来自全细胞RNA的RT-PCR使用第一链cDNA的引物的随机六聚体来克隆。对于具有完整信号序列的鼠免疫球蛋白可变结构域的PCR扩增，杂交至多鼠免疫球蛋白基因家族信号序列的降解正向引物和特异于鼠恒定结构域的5’端的单一反向引物的混合体(cocktail)。按照生产商推荐的方案，PCR使用ClontechAdvantage 2聚合酶混合物。PCR产物经凝胶纯化，并且使用它们的TOPO克隆试剂盒按照生产商推荐的方案亚克隆到Invitrogen’s pCR2.1TOPO载体。来自多个独立亚克隆的***物被测序以建立共有序列。降低成熟的免疫球蛋白N-末端和通过杂交瘤的Edman降解所测定的那些一致。
特异性亚基的分配基于BLAST分析使用来自Kabat数据库的共有免疫球蛋白可变结构域序列(Kabat et al.(1991)Sequences of Proteins ofImmunological Interest.5th Edition，U.S.Dept.of Health and Human Services.U.S.Govt.Printing Office.)来进行。使用Kabat定义来表示下面的CDR。
mAb A0D9
下面示出A0D9成熟重链可变结构域蛋白序列，CDR有下划线：
1 QVQLKQSGPG LVQPSQSLSI TCTVSGFSLS TYGVHWVRQF PGKGLEWLGV
51 IWRGGNTNYN AAFMSRLTIS KDNSKSQVFF KMNSLQAKDT AIYYCVRNQI
101 YDGYYDYAMD YWGQGTSVTV SS(SEQ ID NO：)
A0D9重链是鼠亚基I(B)重链
下面示出A0D9重链可变结构域的DNA序列(来自pYL460)，其信号序列有下划线(重链编码的信号是MAVLGLLFCLVTFPSCVLS(SEQ IDNO：))：
1 ATGGCTGTCC TGGGGCTGCT CTTCTGCCTG GTGACATTCC CAAGCTGTGT
51 CCTGTCCCAG GTGCAGCTGA AGCAGTCAGG ACCTGGCCTA GTGCAGCCCT
101 CACAGAGCCT GTCCATCACC TGCACAGTCT CTGGTTTCTC ATTATCTACC
151 TATGGTGTCC ACTGGGTTCG CCAGTTTCCA GGAAAGGGTC TGGAGTGGCT
201 GGGAGTGATA TGGAGAGGTG GAAACACAAA CTATAATGCA GCTTTCATGT
251 CCAGACTGAC CATCAGCAAG GACAATTCCA AGAGTCAAGT TTTCTTTAAA
301 ATGAACAGTC TGCAAGCTAA AGACACAGCC ATATATTATT GTGTCAGAAA
351 CCAGATCTAT GATGGTTACT ACGACTATGC TATGGACTAC TGGGGTCAGG
401 GAACCTCAGT CACCGTCTCC TCA(SEQ ID NO：)
下面示出A0D9成熟轻链可变结构域蛋白序列，CDR有下划线：
1 DIKMTQSPSS MYASLGERVT ITCKASQDIN TYLNWLQQKP GKSPKTLIYR
51 ANRLVDGVPS RFSGRGSGQD YSLTISSLEY EDVGIYYCLH YDAFPWTFGG
101 GTKLEIK
A0D9轻链是鼠亚基V kappa轻链
下面示出成熟轻链可变结构域的DNA序列(来自pYL463)，其信号序列有下划线(轻链编码的信号MRAPAQFFGFLLLWFPGIKC(SEQ ID NO：))：
1 ATGAGGGCCC CTGCTCAGTT TTTTGGCTTC TTGTTGCTCT GGTTTCCAGG
51 TATCAAATGT GACATCAAGA TGACCCAGTC TCCATCTTCC ATGTATGCAT
101 CTCTAGGAGA GAGAGTCACT ATCACTTGCA AGGCGAGTCA GGACATTAAT
151 ACCTATTTAA ACTGGCTCCA GCAGAAACCA GGGAAATCTC CTAAGACCCT
201 GATCTATCGT GCAAACAGAT TGGTAGATGG GGTCCCATCA AGGTTCAGTG
251 GCCGTGGATC TGGGCAAGAT TATTCTCTCA CCATCAGCAG CCTGGAATAT
301 GAAGATGTGG GAATTTATTA TTGTCTACAC TATGATGCAT TTCCGTGGAC
351 GTTCGGCGGA GGCACCAAGC TGGAAATCAA A(SEQ ID NO：)
mAb A1D5
下面示出A1D5成熟重链可变结构域蛋白序列，CDR有下划线：
1 EVQLQQSGPE LVKPGASVKI SCKASGYSFT GYFMNWMRQS HGKSLEWIGR
51 INPYNGDSFY NQKFKDKATL TVDKSSTTAH MELLSLTSED SAVYYCGRGY
101 DAMDYWGQGT SVTVSS(SEQ ID NO：)
A1D5重链是鼠亚基I(B)重链
下面示出A1D5重链可变结构域的DNA序列(来自pYL338)，其信号序列有下划线(重链编码的信号MGWSCVMLFLL SVTVGVFS(SEQ IDNO：))：
1 ATGGGATGGA GCTGTGTAAT GCTCTTTCTC CTGTCAGTAA CTGTAGGTGT
51 GTTTTCTGAG GTTCAGCTGC AGCAGTCTGG ACCTGAGCTG GTGAAGCCTG
101 GGGCTTCAGT GAAGATATCC TGCAAGGCTT CTGGTTACTC ATTTACTGGC
151 TACTTTATGA ACTGGATGAG GCAGAGCCAT GGAAAGAGCC TTGAGTGGAT
201 TGGACGTATT AATCCTTACA ATGGTGATTC TTTCTACAAC CAGAAGTTCA
251 AGGACAAGGC CACATTGACT GTAGACAAAT CCTCTACCAC AGCCCACATG
301 GAGCTCCTGA GCCTGACATC TGAGGACTCT GCAGTCTATT ATTGTGGAAG
351 AGGATACGAC GCTATGGACT ACTGGGGTCA AGGAACCTCA GTCACCGTCT
401 CCTCA(SEQ ID NO：)
下面示出A1D5成熟轻链可变结构域蛋白序列，CDR有下划线：
1 DIQMTQTTSS LSASLGDRVT ISCRASQDIS NFLTWYQQKP DGTVKLLIYY
51 TSKLHSGVPS RFSGSGSGTD YSLTISNLEP GDIATYYCQQ VSKFPWTFGG
101 GAKLEIK(SEQ ID NO)
A1D5轻链是鼠亚基V kappa轻链
下面示出成熟轻链可变结构域的DNA序列(来自pYL352)，其信号序列有下划线(轻链编码的信号MVSTAQFLGLLLLCFQGTRC(SEQ ID NO：))：
1 ATGGTGTCCA CAGCTCAGTT CCTTGGTCTC CTGTTGCTCT GTTTTCAAGG
51 TACCAGATGT GATATCCAGA TGACACAGAC TACATCCTCC CTGTCTGCCT
101 CTCTGGGAGA CAGAGTCACC ATTAGTTGCA GGGCAAGTCA GGACATTAGC
151 AATTTTTTAA CCTGGTATCA GCAGAAACCA GATGGAACTG TTAAACTCCT
201 GATCTACTAC ACATCAAAAT TACACTCAGG AGTCCCATCA AGGTTCAGTG
251 GCAGTGGGTC TGGGACAGAT TATTCTCTCA CCATTAGCAA CCTGGAACCG
301 GGTGATATTG CCACTTACTA TTGCCAACAG GTTAGTAAGT TTCCGTGGAC
351 GTTCGGTGGA GGCGCCAAGC TGGAAATCAA A(SEQ ID NO：)
mAbs LT101和LT103
发现抗体LT101(P1G4.4)和LT103(P1G9.1)是相同的。下面示出LT101和LT103成熟重链可变结构域蛋白序列，CDR有下划线：
1 QVQLQQSGPE LVKPGASVQI SCKASGYVFS SSWMNWVKQR PGRGLEWIGR
51 IYPGDGDTDY TGKFKGKATL TADKSSNTAY MQLSSLTSVD SAVYFCASGY
101 FDFWGQGTPL TVSS(SEQ ID NO)
抗体LT101和LT103的重链是鼠亚基II(B)重链
下面示出LT101重链可变结构域的DNA序列(来自pYL458或pYL459)，其信号序列有下划线(重链编码的信号MGWSCIMFFLLSITAGVHC(SEQ IDNO：))：
1 ATGGGATGGA GCTGTATCAT GTTCTTCCTC CTGTCAATAA CTGCAGGTGT
51 CCATTGCCAG GTCCAGCTGC AGCAGTCTGG ACCTGAGCTG GTGAAGCCTG
101 GGGCCTCAGT GCAGATTTCC TGCAAAGCTT CTGGCTACGT TTTCAGTAGT
151 TCTTGGATGA ACTGGGTGAA GCAGAGGCCT GGACGGGGTC TTGAGTGGAT
201 TGGGCGGATT TATCCTGGAG ATGGAGATAC TGACTACACT GGGAAGTTCA
251 AGGGCAAGGC CACACTGACT GCAGACAAAT CCTCCAACAC AGCCTACATG
301 CAGCTCAGCA GCCTGACCTC TGTGGACTCT GCGGTCTATT TCTGTGCAAG
351 TGGGTACTTT GACTTCTGGG GCCAAGGCAC CCCTCTCACC GTCTCCTCA
(SEQ ID NO)
下面示出LT101和LT103成熟轻链可变结构域蛋白序列，CDR有下划线：
1 DITMTQSPSS MYASLGERVT ITCKASQDMN NYLRWFQQKP GKSPQTLIFR
51 ANRLVDGVPS RFSGSGSGQD YSLTISSLEF EDMGIYYCLQ HDKFPPTFGG
101 GTKLEIK(SEQ ID NO：)
LT101和LT103的轻链是鼠亚基V kappa轻链
下面示出成熟轻链可变结构域的DNA序列(来自pYL461或pYL4622)，其信号序列有下划线(轻链编码的信号MRAPAQFLGILLLWFPGIKC(SEQ IDNO：))：
1 ATGAGGGCCC CTGCTCAGTT TCTTGGCATC TTGTTGCTCT GGTTTCCAGG
51 TATCAAATGT GACATCACGA TGACCCAGTC TCCATCTTCC ATGTATGCAT
101 CTCTAGGAGA GAGAGTCACT ATCACTTGCA AGGCGAGTCA GGACATGAAT
151 AACTATTTAA GGTGGTTCCA GCAGAAACCA GGGAAGTCTC CTCAGACCCT
201 GATCTTTCGT GCAAACAGAT TGGTCGATGG GGTCCCATCA AGGTTCAGTG
251 GCAGTGGATC TGGGCAAGAT TATTCTCTCA CCATCAGCAG CCTGGAATTT
301 GAAGATATGG GAATTTATTA TTGTCTACAG CATGATAAAT TTCCTCCGAC
351 GTTCGGTGGA GGCACCAAGC TGGAAATCAA A(SEQ ID NO：)
mAb LT102
下面示出LT102(P1G8.2)成熟重链可变结构域蛋白序列，CDR有下划线：
1 EVKLVESGGG LVKPGGSLKL SCAVSGFTFS DYYMYWIRQT PEKRLEWVAT
51 IGDGTSYTHY PDSVQGRFTI SRDYATNNLY LQMTSLRSED TALYYCARDL
101 GTGPFAYWGQ GTLVTVSA(SEQ ID NO)
LT102重链是鼠亚基III(D)重链
下面示出LT102重链可变结构域的DNA序列(来自pYL375)，其信号序列有下划线(重链编码的信号MDFGLSWVFLVLVLKGVQC(SEQ IDNO：))：
1 ATGGACTTCG GGTTGAGCTG GGTTTTCCTT GTCCTTGTTT TAAAAGGTGT
51 CCAGTGTGAA GTGAAGCTGG TGGAGTCTGG AGGAGGCTTA GTGAAGCCTG
101 GAGGGTCCCT GAAACTCTCC TGTGCAGTCT CTGGATTCAC TTTCAGTGAC
151 TATTATATGT ATTGGATTCG CCAGACTCCG GAAAAGCGGC TGGAGTGGGT
201 CGCAACCATT GGTGATGGTA CTAGTTACAC CCACTATCCA GACAGTGTGC
251 AGGGGCGATT CACCATCTCC AGAGACTATG CCACGAACAA CCTGTACCTG
301 CAAATGACTA GTCTGAGGTC TGAAGACACA GCCTTATATT ACTGTGCAAG
351 AGATCTTGGA ACCGGGCCTT TTGCTTACTG GGGCCAGGGG ACTCTGGTCA
401 CTGTCTCTGC A(SEQ ID NO：)
下面示出LT102成熟轻链可变结构域蛋白序列，CDR有下划线：
1 DVLMTQTPRS LPVSLGDQAS ISCRSSQNIV HSNGNTYLEW YLQKPGQSPK
51 LLIYKVSNRF SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDLGV YYCFQGSHFP
101 WTFGGGTKLE IK(SEQ ID NO：)
LT102轻链是鼠亚基II kappa轻链
下面示出成熟轻链可变结构域的DNA序列(来自pYL378)，其信号序列有下划线(轻链编码的信号MKLPVRLLVLMFWIPASSS(SEQ ID NO：))：
1 ATGAAGTTGC CTGTTAGGCT GTTGGTGCTG ATGTTCTGGA TTCCTGCTTC
51 CAGCAGTGAC GTTTTGATGA CCCAAACTCC ACGCTCCCTG CCTGTCAGTC
101 TTGGAGATCA AGCCTCCATC TCTTGCAGAT CTAGTCAGAA CATTGTTCAT
151 AGTAATGGAA ACACCTATTT AGAATGGTAC CTGCAGAAAC CAGGCCAGTC
201 TCCAAAGCTC CTGATCTACA AAGTTTCCAA CCGATTTTCT GGGGTCCCAG
251 ACAGGTTCAG TGGCAGTGGA TCAGGGACAG ATTTCACACT CAAGATCAGC
301 AGAGTGGAGG CTGAGGATCT GGGAGTTTAT TACTGCTTTC AAGGTTCACA
351 TTTTCCTTGG ACATTCGGTG GAGGCACCAA GCTGGAGATC AAA
(SEQ ID NO：)
mAb LT105
下面示出LT105(P2E9.7)成熟重链可变结构域蛋白序列，CDR有下划线：
1 DVQLQESGPG LVKPSQSLSL TCSVTGYSIT SGYYWNWIRQ FPGNKLEGMG
51 YISYDGSNNY NPSLKNRISI TRDSSKNQFF LKLNSVTAED SGTYYCARDA
101 YSYGMDYWGQ GTSVTVSS(SEQ ID NO：)
LT105重链是鼠亚基I(A)重链
下面示出LT105重链可变结构域的DNA序列(来自pYL382)，其信号序列有下划线(重链编码的信号MMVLSLLYLLTAIPGILS(SEQ ID NO：))：
1 ATGGACTTCG GGTTGAGCTG GGTTTTCCTT GTCCTTGTTT TAAAAGGTGT
51 CCAGTGTGAA GTGAAGCTGG TGGAGTCTGG AGGAGGCTTA GTGAAGCCTG
101 GAGGGTCCCT GAAACTCTCC TGTGCAGTCT CTGGATTCAC TTTCAGTGAC
151 TATTATATGT ATTGGATTCG CCAGACTCCG GAAAAGCGGC TGGAGTGGGT
201 CGCAACCATT GGTGATGGTA CTAGTTACAC CCACTATCCA GACAGTGTGC
251 AGGGGCGATT CACCATCTCC AGAGACTATG CCACGAACAA CCTGTACCTG
301 CAAATGACTA GTCTGAGGTC TGAAGACACA GCCTTATATT ACTGTGCAAG
351 AGATCTTGGA ACCGGGCCTT TTGCTTACTG GGGCCAGGGG ACTCTGGTCA
401 CTGTCTCTGC A(SEQ ID NO：)
下面示出LT105成熟轻链可变结构域蛋白序列，CDR有下划线：
1 DIVLTQSPAS LAVSLGQRAT ISCRASESVD NYGISFMHWY QQKPGQPPKL
51 LIYRASNLES GIPARFSGSG SRTDFTLTIN PVETDDVATF YCQQSNKDPY
101 TFGGGTKLEI K(SEQ ID NO：)
LT105轻链是鼠亚基III kappa轻链
下面示出成熟轻链可变结构域的DNA序列(来自pYL383)，其信号序列有下划线(轻链编码的信号METDTLLLWVLLLWVPGSTG(SEQ ID NO：))：
1 ATGGAGACAG ACACACTCCT GCTATGGGTG CTGCTGCTCT GGGTTCCAGG
51 TTCCACAGGT GACATTGTGC TGACCCAATC TCCAGCTTCT TTGGCTGTGT
101 CTCTAGGGCA GAGGGCCACC ATCTCCTGCA GAGCCAGCGA AAGTGTTGAT
151 AATTATGGCA TTAGTTTTAT GCACTGGTAC CAGCAGAAAC CAGGACAGCC
201 ACCCAAACTC CTCATCTATC GTGCATCCAA CCTAGAATCT GGGATCCCTG
251 CCAGGTTCAG TGGCAGTGGG TCTAGGACAG ACTTCACCCT CACCATTAAT
301 CCTGTGGAGA CTGATGATGT TGCAACCTTT TACTGTCAGC AAAGTAATAA
351 GGATCCGTAC ACGTTCGGAG GGGGGACCAA GCTGGAAATA AAA
(SEQ ID NO：)
mAb LT107
下面示出LT107(P5C4.1)成熟重链可变结构域蛋白序列，CDR有下划线：
1 QVQLKQSGPG LVQPSQI TCTVSGFSLT NYGIHWIRQP PGKGLEWLGV
51 IWSGGSTDHN AAFISRLSIS KDNSKSQVFF TMNSLEVDDT AIYYCARNRA
101 YYRYEGGMDY WGQGTSVTVS S
LT107鼠亚基I(B)重链.注意FR1中潜在的N-连接的糖基化位点上面粗体示出。
下面示出LT107重链可变结构域的DNA序列(来自pYL382)，其信号序列有下划线(重链编码的信号MAVLGLLFCLVTFPSCVLS(SEQ ID NO：))：
1 ATGGCTGTCC TGGGGCTGCT CTTCTGCCTG GTGACATTCC CAAGCTGTGT
51 CCTATCCCAG GTGCAGCTGA AACAGTCAGG ACCTGGCCTC GTGCAGCCCT
101 CACAGAACCT GTCCATCACC TGCACAGTCT CTGGTTTCTC ATTAACTAAC
151 TATGGTATAC ACTGGATTCG CCAGCCTCCA GGAAAGGGTC TGGAGTGGCT
201 GGGAGTGATA TGGAGTGGTG GAAGCACAGA CCATAATGCT GCTTTCATAT
251 CCAGACTGAG CATCAGCAAG GACAACTCCA AGAGCCAAGT TTTCTTTACA
301 ATGAACAGTC TGGAAGTTGA TGACACAGCC ATATACTACT GTGCCAGAAA
351 TAGAGCCTAC TATAGGTACG AGGGGGGTAT GGACTATTGG GGTCAAGGAA
401 CCTCAGTCAC CGTCTCCTCA(SEQ ID NO：)
下面示出LT107成熟轻链可变结构域蛋白序列，CDR有下划线：
1 DIKMTQSPSS MYASLGERVT ITCKASQDIN TYLNWFQQKP GKSPMTLIYR
51 ADRLLDGVPS RFSGSGSGQD YSLTISSLED EDMGIYYCQQ YDDFPLTFGA
101 GTKLELK(SEQ ID NO：)
这是鼠亚基V kappa轻链。下面示出成熟轻链可变结构域的DNA序列(来自pYL448)，其信号序列有下划线(轻链编码的信号MVSSAQFLGILLLWFPGIKC(SEQ ID NO：))：
1 ATGGTATCCT CAGCTCAGTT CCTTGGAATC TTGTTGCTCT GGTTTCCAGG
51 TATCAAATGT GACATCAAGA TGACCCAGTC TCCATCTTCC ATGTATGCAT
101 CTCTAGGAGA GAGAGTCACT ATCACTTGCA AGGCGAGTCA GGACATTAAT
151 ACCTATTTAA ACTGGTTCCA GCAGAAACCA GGGAAATCTC CTATGACCCT
201 GATCTATCGT GCAGACAGAT TGTTAGATGG GGTCCCATCA AGGTTCAGTG
251 GCAGTGGATC TGGGCAAGAT TATTCTCTCA CCATCAGCAG CCTGGAGGAT
301 GAGGATATGG GAATTTACTA TTGTCAACAG TATGATGACT TTCCTCTCAC
351 GTTCGGTGCT GGGACCAAGC TGGAGCTGAA A(SEQ ID NO：)
mAb LT108
下面示出LT108(P4F2.2)成熟重链可变结构域蛋白序列，CDR有下划线：
1 QVQLKQSGPG LVQPSQSLSI TCTVSGFSLT DYGIHWIRQP PGKGLEWLGV
51 IWSGGSTDHN AVFTSRL
KDNSKSQVFF KMNSLEPDDT AMYYCARNRA
101 YYRYEGGMDY WGQGTSVTVS S(SEQ ID NO：)
这是鼠亚基I(B)重链。注意FR3中潜在的N-连接的糖基化位点上面粗体示出。下面示出LT107重链可变结构域的DNA序列(来自pYL449)，其信号序列有下划线(重链编码的信号MAVLALLFCLVTFPSCVLS(SEQ IDNO：))：
1 ATGGCTGTCT TAGCGCTGCT CTTCTGCCTG GTGACATTCC CAAGCTGTGT
51 CCTATCCCAG GTGCAGCTGA AGCAGTCAGG ACCTGGCCTC GTGCAGCCCT
101 CACAGAGCCT GTCCATCACC TGCACAGTCT CTGGTTTCTC ATTAACTGAC
151 TATGGTATAC ACTGGATTCG CCAGCCTCCA GGAAAGGGTC TGGAGTGGCT
201 GGGAGTGATA TGGAGTGGTG GAAGCACAGA CCATAATGCT GTCTTCACAT
251 CCAGACTGAA TATCAGCAAG GACAACTCCA AGAGTCAAGT TTTCTTTAAA
301 ATGAACAGTC TGGAACCTGA TGACACAGCC ATGTACTACT GTGCCAGAAA
351 TAGAGCCTAC TATAGGTACG AGGGGGGTAT GGACTACTGG GGTCAAGGAA
401 CCTCAGTCAC CGTCTCCTCA(SEQ ID NO：)
LT107和LT108的重链的蛋白水平93.4％相同，并且IgBLAST分析表示它们衍生自类似的V-D-J重组事件。下面示出LT107(上)和LT108(下)重链可变结构域之间的比对：
. . . .
1 QVQLKQSGPGLVQPSQ
ITCTVSGFSLTNYGIHWIRQPPGKGLEWLGV 50
||||||||||||||||.|||||||||||||.|||||||||||||||||||
1 QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTDYGIHWIRQPPGKGLEWLGV 50
. . . . .
51 IWSGGSTDHNAAFISRLSISKDNSKSQVFFTMNSLEVDDTAIYYCARNRA 100
||||||||||| | |||.|||||||||||| ||||| ||||.||||||||
51 IWSGGSTDHNAVFTSRL
KDNSKSQVFFKMNSLEPDDTAMYYCARNRA 100
. .
101 YYRYEGGMDYWGQGTSVTVSS 121
|||||||||||||||||||||
101 YYRYEGGMDYWGQGTSVTVSS 121
下面示出LT108成熟轻链可变结构域蛋白序列，CDR有下划线：
1 DIKMTQSPSS MYASLGERVT ITCKASQDIN TYLNWFQQKP GKSPMTLIYR
51 ADRLLDGVPS RFSGSGSGQD YSLTISSLED EDMGIYYCQQ YDDFPLTFGA
101 GTKLELK(SEQ ID NO：)
这是鼠亚基V kappa轻链。在蛋白水平，其和LT107轻链100％相同。下面示出成熟轻链可变结构域的DNA序列(来自pYL450)，其信号序列有下划线(轻链编码的信号MVSSAQFLGILLLWFPGIKC(SEQ ID NO：))：
1 ATGGTATCCT CAGCTCAGTT CCTTGGAATC TTGTTGCTCT GGTTTCCAGG
51 TATCAAATGT GACATCAAGA TGACCCAGTC TCCATCTTCC ATGTATGCAT
101 CTCTAGGAGA GAGAGTCACT ATCACTTGCA AGGCGAGTCA GGACATTAAT
151 ACCTATTTAA ACTGGTTCCA GCAGAAACCA GGGAAATCTC CTATGACCCT
201 GATCTATCGT GCAGACAGAT TGTTAGATGG GGTCCCATCA AGGTTCAGTG
251 GCAGTGGATC TGGGCAAGAT TATTCTCTCA CCATCAGCAG CCTGGAGGAT
301 GAAGATATGG GAATTTACTA TTGTCAACAG TATGATGACT TTCCTCTCAC
351 GTTCGGTGCT GGGACCAAGC TGGAGCTGAA A(SEQ ID NO：)
其在单核苷酸处和LT107的轻链有区别：残基E81的密码子中沉默摇摆位置的改变。
下面是9B4成熟重链可变结构域蛋白序列，CDR有下划线：
1 QVTLKESGPG ILQPSQTLSL TCSFSGFSLS TSGMGVSWIR QPSGKGLEWL
51 AHIYWDDDKR YNPSLRSRLT ISKDTSRNQV FLKITSVDTA DTATYYCARR
101 EGYYGSSFDF DVWGAGTTVT VSS
抗体9B4的重链是鼠亚基I(B)重链
下面示出9B4重链可变结构域的DNA序列(来自pYL573)，其信号序列有下划线(重链编码的信号MGRLTFSFLL LIVPAYVLS(SEQ ID NO：))：
1 ATGGGCAGAC TTACATTCTC ATTCCTGCTG CTGATTGTCC CTGCATATGT
51 CCTTTCCCAG GTTACCCTGA AAGAGTCTGG CCCTGGGATA TTGCAGCCCT
101 CCCAGACCCT CAGTCTGACT TGTTCTTTCT CTGGGTTTTC ACTGAGCACT
151 TCTGGGATGG GTGTGAGCTG GATTCGTCAG CCTTCAGGAA AGGGTCTGGA
201 GTGGCTGGCA CACATTTACT GGGATGATGA CAAGCGCTAT AACCCATCCC
251 TGAGGAGCCG GCTCACAATC TCCAAGGATA CCTCCAGAAA CCAGGTATTC
301 CTCAAGATCA CCAGTGTGGA CACTGCAGAT ACTGCCACAT ACTACTGTGC
351 TCGAAGAGAG GGTTACTACG GTAGTAGCTT CGACTTCGAT GTCTGGGGCG
401 CAGGGACCAC GGTCACCGTC TCCTCT
下面示出LT 9B4成熟轻链可变结构域蛋白序列，CDR有下划线：
1 QIVLSQSPAI LSASPGEKVT MTCRASSSVS YMIWYQQKPG SSPKPWIYAT
51 SSLASGVPTR FSGSGSGTSY SLTISRVEAA DAATYYCQQW SYNPLTFGAG
101 TKLELK
这是鼠亚基kappa VI kappa轻链。下面示出成熟轻链可变结构域的DNA序列(来自pYL9B4)，其信号序列有下划线(轻链编码的信号MDLQVQIFSFLLISASVKMSRG(SEQ ID NO：))：
1 ATGGATTTAC AGGTGCAGAT TTTCAGCTTC CTGCTAATCA GTGCTTCAGT
51 CAAAATGTCC AGAGGACAAA TTGTTCTCTC CCAGTCTCCA GCAATCCTGT
101 CTGCATCTCC AGGGGAGAAG GTCACAATGA CTTGCAGGGC CAGCTCAAGT
151 GTGAGTTACA TGATCTGGTA CCAACAGAAG CCAGGATCCT CCCCCAAACC
201 CTGGATTTAT GCCACATCCA GCCTGGCTTC TGGAGTCCCT ACTCGCTTCA
251 GTGGCAGTGG GTCTGGGACC TCTTACTCTC TCACAATCAG CAGAGTGGAG
301 GCTGCAGATG CTGCCACTTA TTACTGCCAG CAGTGGAGTT ATAACCCGCT
351 CACGTTCGGT GCTGGGACCA AGCTGGAGCT GAAA
CDR共有序列
各种抗-LTα1β2抗体的序列分析鉴定CDR内的许多共有序列。表1描述了鉴定用于重链序列的共有序列，并且表2描述了鉴定用于轻链序列的共有序列。
实施例2：抗-淋巴细胞毒
(LT)抗体的体外活性
IL-8释放测定
IL-8释放测定用于确定实施例1中所述的抗-LT抗体的功能活性。IL-8释放测定基于IL-8的分泌，其在可溶性重组人淋巴细胞毒素α1β2结合A375细胞(人黑素瘤细胞系)上的细胞表面淋巴细胞毒素β受体后观察到。IL-8释放测定测量通过结合可溶性淋巴细胞毒素α1β2从而抑制结合淋巴细胞毒素β受体，抗体阻断该IL-8分泌的能力。然后使用ELISA测定来测量分泌到培养基上清中的IL-8。
将抗体稀释至合适的浓度，并且和可溶性重组人淋巴细胞毒素α1β2(170ng/ml)在室温下在96-孔微量滴定板中孵育1小时淋巴细胞毒素α1β2的浓度通过确定IL-8释放最大量的滴定试验来优化。
然后将15,000至20,000个A375细胞加入各孔，并且将板在37℃5％CO2孵育17小时。在孵育结束时，将板离心并且收获上清。使用标准夹心ELISA测定来测试上清的IL-8浓度。IL-8浓度针对抗体浓度作图，并且从数据的4-参数曲线拟合(参见图1A和1B的抑制曲线)来确定IC50。表3描述了各抗体的计算的IC50值。在计算IC50值中，使用LTα1β2预孵育的过程中存在抗体浓度(而不是在加入细胞和缓冲液后的抗体浓度，其小4x)。
表3：测定IL-8释放抑制的IC50和IL-8释放抑制百分率的概述
| 抗体 | IC50nM | 最大抑制％ |
| 9B4 | 0.6 | 95 |
| 102 | 0.406；0.991 | 92 |
| 103 | 1.11 | 90 |
| 105 | 0.52；1.056 | 100 |
| 107 | 0.53 | 95 |
| 108 | 1.3 | 100 |
| A1D5 | 2.5 | 94 |
| A0D9 | 1.67 | 94 |
| C37 | - | 未抑制 |
| B27 | - | 未抑制 |
| B9 | 约500nM(估计) | 53％667nM |
LTα3 ELISA
另外，结合试验揭示出在实施例1所述的抗-LT抗体中，只有mAbLT101/LT103结合LTα3(可溶性同源三聚体)，而其他并未结合。MAbLT101/LT103能够阻断LTα1β2-LTBR相互作用(最大阻断约70％)，这使用下列测定来测量。然而，LT101/103不能阻断LTα3和TNFR-Ig(p55)之间的相互作用(以阻断elisa格式来评价)。
对于LTa3 ELISA，微量滴定板包覆LTα3(1或5ug/ml，在PBS中)，然后非特异性结合位点被1％酪蛋白缓冲液阻断。将样品(抗体，受体-Ig)加入并且使用HRP-缀合的抗-鼠Ig抗体检测结合。为了评价mAbs阻断LTα3和TNFR-hIg(p55)之间的相互作用的能力，将板包覆LTα3并且如上所述进行阻断。在加入TNFR-Ig之前30分钟，将序列稀释的抗体加入板。TNFR-hIg与板结合的LTα3的结合使用HPR缀合的抗-人Ig抗体来检测。
LTBR-Ig阻断测定(II-23测定)
将II-23细胞和50ng/ml PMA在37℃5％CO2孵育4小时。将细胞洗涤，并且将500,000细胞加入96孔板的各孔中。将抗体稀释至合适的浓度，并且加入II-23细胞。在4℃下30分钟的孵育时间后，将生物素标记的LTβR-Ig加入各孔至最终浓度为1ug/ml。将细胞在4℃孵育另外30分钟，然后洗涤3次。将抗生蛋白链菌素-PE稀释至1/500，并且加入各孔，在4℃下孵育1小时。将细胞洗涤一次，并且通过FACS分析来读取。将平均荧光强度针对抗体浓度作图，并且从数据的4-参数曲线拟合来确定IC50。
多种鉴定的mAb在II-23测定中具有大于90％的效力，包括LT105，9B4LT102，A1.D5和AOD9。mAb LT102和LT105在II-23测定中具有大于98％的阻断。如图4中所示，LT102和LT105在II-23阻断测定中相对于抗-LT抗体B9(参加美国专利No.5,925,351)，C37和B27(C37和B27都描述于Browning et al.(1995)J Immunol 154：33)表现出优异的效力。数据的概述示于表4。
表4.LTβR与LT结合的最大抑制百分率
| 抗体 | 最大抑制％ |
| A0D9 | 92 |
| 105 | 97 |
| 9B4 | 99 |
| 103 | 77 |
| 102 | 98 |
| 107 | 80 |
| 108 | 81 |
| A1D5 | 92 |
| B9 | 44 |
交叉反应性
LT105，9B4和A1D5也结合食蟹猴(Macaca fascicularis)的LT，如LT102在低的稳定状态下所进行的那样。一些抗-LT mAb的交叉反应性评价的概述下面描述于表5。值得注意的是某些现有技术的抗体不结合Cyno LT(例如B9)。
表5
抗原表位分析
进行交叉阻断试验以确定实施例1中所述的新型抗-LT抗体结合的抗原表位。还测定本领域已知的抗-LT抗体的交叉反应性。表6提供交叉阻断研究的综述。
表6：交叉阻断结果
| LT012 | LT105 | 9B4 | LT107 | A1D5 | A0D9 | B9 | C37 | B27 | |
| LT102 | - | - | - | - | - | - | - | - | |
| LT105 | - | + | - | - | - | - | - | - | |
| 9B4 | + | ||||||||
| LT107 | - | - | - | - | + | - | - | - | |
| A1D5 | - | - | - | - | - | - | - | - | |
| A0D9 | - | - | - | + | - | - | - | - | |
| B9 | - | - | - | - | - | - | - | - | |
| C37 | - | - | - | - | - | - | - | + | |
| B27 | - | - | - | - | - | - | - | + |
如表6中所述，在新抗-LT抗体中存在有限的交叉反应性。另外，LT102，LT105，9B4，LT9B4，LT107，A1D5，A0D9都结合的抗原表位不同于抗-LT抗体B9，C37和B27结合的抗原表位。
相对于人LT，LT102以更低稳定状态来结合cyno LT。该结果显示LT102的关键的接触点可能在cyno和人LT之间非同源区域。这样，基于分子建模包括下列氨基酸取代在该区域中设计人LTβ的变体形式：D151R/Q153R；R193A/R194A；D151R/Q153R/R193A/R194A；PLK(96，97，98)WMS；TTK(106，107，108)ASQ；TTK(106，107，108)AWQ；FA(231，232)YR；T114R；DAE(121，122，123)PTH；和P172R。
结果显示浓度为100ng/ml和10ng/ml的LTBR-Fc(阳性对照)结合突变LT组的所有成员。然而，抗体LT102结合突变LT组的所有成员(以和LTBR-Fc阳性对照相同的浓度)，除了突变体R193A/R194A和D151R/Q153R/R193A/R194A。因此，残基R193和R194对于LT102与人LT的结合是关键的。
发现抗体LT105结合cyno LT而不是鼠LT。该结果显示LT105关键的接触点可能在cyno和鼠LT之间非同源区域。在该区域(基于和LTBR相互作用的可能性)内设计人LT的突变形式。基于分子建模包括下列氨基酸取代设计人LT的变体形式：D151R/Q153R；R193A/R194A；D151R/Q153R/R193A/R194A；PLK(96，97，98)WMS；TTK(106，107，108)ASQ；TTK(106，107，108)AWQ；FA(231，232)YR；T114R；DAE(121，122，123)PTH；和P172R。
这些结果显示浓度为100ng/ml和10ng/ml的LTBR-Fc(阳性对照)结合突变LT组的所有成员。然而，抗体LT105不结合突变体PLK(96，97，98)WMS；TTK(106，107，108)ASQ；和TTK(106，107，108)AWQ。因此，发现P96/L97/K98和T106/T107/K108对于LT与LT105的结合是关键的。发现9B4交叉竞争LT105，并且其结合受到P96/L97/K98突变至LT的影响，但在位106，107或108并不突变。
总之，使用人LTβ的突变形式的LT102，LT105，9B4和A1D5的抗原表位映射显示出R193/R194对于LT102结合是关键的，并且P96/L97/K98和T106/T107/K108对于LT105和9B4结合是关键的残基。类似的突变研究揭示出残基P172对于A1D5与人LT的结合是关键的，并且残基D151/Q153对于LT107和A0D9的结合是关键的。
LT异源三聚体的图示于图6。在亚基LTα上，D50N和Y108F突变限定了αβ/βα裂口的侧面。另外，阻断LT105结合的LTB突变紧密地对齐Y108F位点。
实施例3：抗-淋巴细胞毒
(LT)抗体的体内活性
下列材料和方法用于该实施例：
小鼠：NOD-scid IL2rgnull pups(＜72hrs龄)被辐射(100rads)并且通过RO窦注射立即接受3x104人CD34+脐带血细胞。对于另外的细节，参见Pearson et al.(2008)Curr Top Microbiol Immunol 324：25。
试剂：LT102，LT105和B9是鼠抗-人LTa1b2(mIgG1)抗体(BIIB，不交叉鼠LT)。BBF6是仓鼠抗-鼠LTa1b2抗体(BIIB，不交叉人LT)。鼠LTBR-mIgG1用作阻断LT-LTBR相互租用的阳性对照(显示比鼠LT低～2X的亲和性结合人LT)。MOPC-21是用作同种型对照抗体的鼠IgG1抗体。
给药：在约4月龄，将重构的小鼠随机分组(n＝5只小鼠/组)。以50ug/小鼠/周(图2)或200ug/小鼠/周(图3)(腹膜内施用，总共5次注射，n＝5小鼠/组)给小鼠注射同种型对照(MOPC-21)，阳性对照(mLTBR-mIgG1)，BBF6，B9，LT102或LT105。在最后注射7天后，收集组织用于分析。
组织学分析：PNAd/MECA79(HEV)：将***组织固定在10％中性缓冲的***24小时，并且储存在石蜡切片中。切出3um切片，去石蜡并且进行抗原回取(Dako)。进行内源性过氧化物酶切片(Dako)和Fc切片(兔的血清)，之后施加大鼠抗-小鼠PNAd初级抗体(1∶300)(BD)。使用生物素化的兔抗-大鼠IgG(H+L)次级抗体(Vector)和ABC标准试剂盒(Vectastain)，之后使DAB底物(Vector)显像。苏木精-明矾染剂(Sigma)核染液是最后的步骤，之后将载玻片在95％和100％乙醇中依次脱水并且使用Permount盖玻片储存。
唾液酸粘附素/MOMA-1：将10um切片从在OCT中用甲基丁烷冰冻的脾脏组织中切除，并且储存在-80℃。将切片固定在丙酮中，在lx TBS中重新水合，并且进行内源过氧化酶阻断和Fc阻断(BSA)。将切片用大鼠抗-小鼠MOMA-1 FITC初级抗体(1∶100)(Serotec)染色。使用抗-FITC-AP次级抗体(Roche)，之后使用AP Substrate Kit(Vector)显像。将切片用CrystalMount覆盖，并且允许在室温下空气干燥过夜。
为了研究抗-人LTα1β2 mAbs的功能活性，相对于嫁接CD34+人脐带血细胞的组织学mAb，B9，NOD-scid IL2rynull小鼠，使用LT102和LT105。这些小鼠支持开发功能人免疫***的多种组分。特别地，嵌合小鼠已经成功地重构，并且证实MECA-79+HEV在外周***，并且唾液酸粘附素/MOMA-1+巨噬细胞环在脾脏。这些结构是LT-LTβR依赖性的，并且因此可用作施用的抗-LT抗体的活性的读出。
注射MOPC-21的嵌合(huSCID)小鼠具有类似于野生型C57BL/6小鼠中观察到的脾脏唾液酸粘附素/MOMA-1+嗜金属巨噬细胞环，这由阳性MOMA-1染色证实(参见图2A和2B)。组织学分析显示人LTα1β2的阻断导致脾脏MOMA-1+嗜金属巨噬细胞的损失。通过使用mLTβR-mIg注射huSCID小鼠而抑制LTβR，这导致MOMA-1+嗜金属巨噬细胞的消失(参见图2C)。这并未用注射抗体BBF6(鼠LTα1β2的阻断mAb)的huSCID小鼠来概述(参见图2D)，从而证实L Tα1β2源是人。注射人LTα1β2的新抗体(LT102和LT105)的HuSCID小鼠也显示MOMA-1染色的类似的损失(参见图2F和2G)。明显地，用现有技术抗-人LT抗体B9处理并会导致MOMA-1+巨噬细胞结构的损失(图2E)。
高内皮微静脉(HEV)是特殊结构，其辅助细胞进入***。这些结构的开发和保持已经显示依赖于LTβR表达。组织学分析显示HEV能够使用人LTα1β2的阻断来降低。在嵌合模型中，HEV类似地证实存在于野生型小鼠(C57BL/6)和注射MOPC-21的huSCID小鼠(图3A，B)，尽管频率减少，但类似地依赖于LTBR信号传导，因为它们使用LTβR-Ig处理(注射mLTBR-mIgG1的huSCID小鼠)时未损失(图3C)。如所预计的，将抗-鼠LTα1β2 mAb(BBF6)施用至huSCID小鼠没有效果(图3D)。huLTα1β2在注射LT102或LT105的huSCID小鼠中的阻断明显地降低HEV(图3F和3G)，而使用现有技术抗体B9的处理对于HEV结构具有最小的效果(图3E)。
总之，显示新抗-人LT抗体，LT102和LT105的功能性体内活性优于现有技术mAb，B9，包括在可能对于人疾病的治疗关键的靶上。这由CD169+(唾液酸粘附素/MOMA-1/Siglec-1)巨噬细胞的密度降低来证实。该结论还由HEV和功能性PNAd/MAdCAM的密度的降低来支持(中断运输至***)。
实施例4：抗-淋巴细胞毒(LT)抗体LT105的人源化
鼠LT105轻链和重链的序列如下所示：
轻链：
1 D
VLTQSPAS LAVSLGQRAT ISCR 
SES 
DNYGI SF 
HWYQQKP GQPPKLLYR 50
51
NLESGIPA RFS
SGSRTD
TLTINP VET DDVATFYCQ 
SNKD 
YTFGG 100
101 GTKLEIK(SEQ ID NO：)
重链：
1 DVQLQESGPG LVKPSQSLSL TCS
T SGY Y NWIRQF PGNKLEGMGY 50
51 ISYD 
SNNYN PSLKNRISITDSSKNQFFL K LNSVTAEDSGTY YCA
DAYSYGM 100a
101 DYWGQGTSVT VSS(SEQ ID NO：)
-
下划线：Kabat CDR残基
在该实施例中根据Kabat图表来进行编号。
鼠可变区的分析
互补决定区(CDR)含有最可能结合抗原的残基，并且必须保留在改造的抗体中。CDR根据Kabat et al(1991)由序列定义。CDR落入规范类别(Chothia et al，1989)，其中关键残基在较大程度上确定CDR环的结构构象。这些残基几乎一直保留在改造的抗体中。重链和轻链的CDR如下所示分类为规范类别：
对于这些CDR类别重要的规范残基示于表4中。
表4：规范残基mAb LT105
对于鼠和人亚基，使用BLAST程序和编译的共有与种系blast蛋白序列数据库，可变轻链和重链比较于共有(Kabat et al，1991)和种系序列(Matsuda et al，1998，Brensing-Kuppers et al，1997)。
可变轻链是鼠亚基Kappa 3(111氨基酸重叠中89％的一致性；CDR-L3比通常的情况短1个残基)的成员，并且可能源自鼠mu21-5种系(在99氨基酸重叠的94％一致性)，如下所示。
mu21-5
LT105：1 DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVDNYGISFMHWYQQKPGQPPKLLIYRASNLES 60
DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVD+YG SFMHWYQQKPGQPPKLLIYRASNLES
Mu21-5：1 DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVDSYGNSFMHWYQQKPGQPPKLLIYRASNLES 60
LT015：61 GIPARFSGSGSRTDFTLTINPVETDDVATFYCQQSNKDP 99
GIPARFSGSGSRTDFTLTINPVE DDVAT+YCQQSN+DP
Mu21-5：61 GIPARFSGSGSRTDFTLTINPVEADDVATYYCQQSNEDP 99
可变重链是鼠亚基重链1A(117氨基酸中81％的一致性；CDR-H1和CDR-H2均比通常的情况短1个残基)的成员，并且可能源自鼠VH36-60种系(在97氨基酸重叠的81％一致性)，如下所示。
muVH36-60
LT105：1 DVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCSVTGYSITSGYYWNWIRQFPGNKLEGMGYISYDGSNNY 60
+VQLQESGP LVKPSQ+LSLTCSVTG SITS Y WNWIR+FPGNKLE MGYISY GS Y
muVH3-60：1 EVQLQESGPSLVKPSQTLSLTCSVTGDSITSDY-WNWIRKFPGNKLEYMGYISYSGSTYY 59
LT105：61 NPSLKNRISITRDSSKNQFFLKLNSVTAEDSGTYYCAR 98
NPSLK+RISITRD+SKNQ++L+LNSVT+ED+ TYYCAR
muVH3-60：60 NPSLKSRISITRDTSKNQYYLQLNSVTSEDTATYYCAR 97
可变轻链对应于人亚基Kappa 4(111氨基酸中67％的一致性；CDR-L1比通常的情况短2个残基)并且最接近人B3种系(在99氨基酸重叠的66％一致性)，如下所示。
huB3
LT105：1 DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESV--DNYGISFMHWYQQKPGQPPKLLIYRASNL 58
DIV+TQSP SLAVSLG+RATI+C++S+SV + +++ WYQQKPGQPPKLLIY AS
huB3：1 DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLYSSNNKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTR 60
LT105：59 ESGIPARFSGSGSRTDFTLTINPVETDDVATFYCQQSNKDP 99
ESG+P RFSGSGS TDFTLTI+ ++ +DVA +YCQQ P
huB3：61 ESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYSTP 101
可变重链对应于人亚基重链2(114氨基酸中69％的一致性；CDR-H1比通常的情况短1个残基；CDR-H2比通常的情况短3个残基)并且最接近人VH4-28种系(在98氨基酸重叠的68％一致性)，如下所示。
huVH4-28
LT105：2 VQLQESGPGLVKPSQSLSLTCSVTGYSITSGYYWNWIRQFPGNKLEGMGYISYDGSNNYN 61
VQLQESGPGLVKPS +LSLTC+V+GYSI+S +W WIRQ PG LE +GYI Y GS YN
huVH4-28：2 VQLQESGPGLVKPSDTLSLTCAVSGYSISSSNWWGWIRQPPGKGLEWIGYIYYSGSTYYN 61
LT105：62 PSLKNRISITRDSSKNQFFLKLNSVTAEDSGTYYCAR 98
PSLK+R++++ D+SKNQF LKL+SVTA D+ YYCAR
huVH4-28：62PSLKSRVTMSVDTSKNQFSLKLSSVTAVDTAVYYCAR 98
可变区结构的建模
为了该人源化，基于轻链和重链的晶体结构PDB ID 2F58、使用Modeler、SCWRL侧链取代、和使用Gromos96 43b1参数测定真空简单最小化，构建LT105可变区的模型。2F58和LT105具有CDR和相等长度的框架区。
改造的可变区的分析
为了选择轻链和重链的抗体受体框架序列，在规范、界面和镶饰区残基鉴定的候选物具有和鼠LT105序列的高度类似性；如果可能相同长度的CDR(除了CDR-H3)；最少数量的回复突变(即，人受体的框架残基类型改变至LT105成熟鼠抗体)。还考虑。人种系序列填充在FR4框架区中的人共有残基。
选择的框架：人种系序列huL6(共有人KV3 FR4)和人gi|3004688分别选自作为轻链和重链的受体框架的多种候选物(参见下述序列)。和稳定的KV3和HV3共有类别差异最大的受体框架被选择以改善人源化设计的物理化学性能。
＞LT105L
DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVDNYGISFMHWYQQKPGQPPKLLIYRASNLESGIPARFSGSG
SRTDFTLTINPVETDDVATFYCQQSNKDPYTFGGGTKLEIK
＞huL6
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSG
SGTDFTLTISSLEPEDFAVYYC
＞共有人KV3FR4区
----------------------------------------------------------------------
-------------------------------FGQGTKVEIK
＞LT105H
DVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCSVTGYSITSGYYWNWIRQFPGNKLEGMGYIS YDGSNNYNPSLKNRISI
TRDSSKNQFFLKLNSVTAEDSGTYYCARDAYSYGMDYWGQGTSVTVSS
＞gi|3004688
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYEMNWVRQAPGKGLEWISYISNGDNTIYYADSVKGRFTI
SRDSAKNSLYLHMHSLRAEDTAVYYCARGDYGGNGYFYYYAMDVWGQGTTVTVSS
CDR包括Chothia定义具有下划线。
LT105的人源化设计
人源化LT105轻链的三种不同版本如下所示。LT105的人源化轻链包括：种系huL6框架//共有人KV4 FR4//LT105L CDR。下面在L1、L2和L3所述的回复突变为小写字体、粗字体。包括Chothia定义的CDR有下划线。
＞L0＝嫁接
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASESVDNVGISFMHWVQQKPGQAPRLLIVRASNLESGIPARFSGSGSGTD
FTLTISSLEPEDFAVYYCQQSNKDPYTFGQGTKVEIK(SEQ ID NO：)
＞L1
FTLTISSLEPEDFAVYYCQQSNKDPYTFGQGTKVEIK(SEQID NO：)
＞L2
FTLTISSLEPEDFAV
YCQQSNKDPYTFGQGTKVEIK(SEQ ID NO：)
＞L3
FTLTISSLEPEDFAV
YCQQSNKDPYTFGQGTKVEIK(SEQ ID NO：)
下面示出人源化LT105重链的四种不同版本。LT105的人源化重链包括gi|3004688框架//LT105H CDR。下面在H1，H2，H3和H4所述的回复突变为小写字体、粗字体。包括Chothia定义的CDR有下划线。
＞H0＝嫁接
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSITSGYYWNWVRQAPGKGLEWISYISYDGSNNYNPSLKNRFTISRDS
AKNSLYLHMHSLRAEDTAVYYCARDAYSYGMDYWGQGTTVTVSS
(SEQ ID NO：)
＞H1
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCA
SGYSITSGYYWNWVRQAPGKGLE
ISYISYDGSNNYNPSLKNRFTISRDS
AKNS
YLHMHSLRAEDTAVYYCARDAYSYGMDYWGQGTTVTVSS
(SEQ ID NO：)
＞H2
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCA
SGYSITSGYYWNW
RQAPGKGLE
I
YISYDGSNNYNPSLKNR
TISRDS
AKNS
YLHMHSLRAEDTAVYYCARDAYSYGMDYWGQGTTVTVSS
(SEQ ID NO：)
＞H3
VQLVESGGGLVQPGGSLRLSCA
GYSITSGYYWNW
RQAPGKGLE
I
YISYDGSNNYNPSLKNR
TISRDS
AKNS
YLHMHSLRAEDTAVYYCARDAYSYGMDYWGQGTTVTVSS
(SEQ ID NO：)
＞H4
VQLVESGGGLVQPGGSLRLSCA
GYSITSGYYWNWRQAPGKGLE
YISYDGSNNYNPSLKNR
TISRDS
AKNS
YLH
HSLRAEDTAVYYCARDAYSYGMDYWGQGTTVTVSS
(SEQ ID NO：)
实施例5：抗-淋巴细胞毒
(LT)抗体LT102的人源化
鼠LT102轻链和重链的序列如下所示：
轻链：
1 D
LMTQTPRS LPVSLGDQAS ISCR 
SQN 
VHSNGN TY 
EWYLQKP GQSPKLL
YK 50
51 NRFSGVPD RFS
SGSGTD
TLKISR VEA EDLGVYYCF 
GSHF 
WTFGG 100
101 GTKLEIK(SEQ ID NO：)
重链：
1 EV KLVESGGG LVKPGGSLKL SCA S 
DY Y 
YWIRQT PEKRLEWVAT 50
51 IGDG 
SYTHYP DSVQGRFTIS
DYATNNLYL QMTSLRSEDTALY YCA
DLGTGPF 100a
101 AY WGQGTLVT VSA(SEQ ID NO：)
下划线：Kabat CDR残基
在该实施例中根据Kabat图表来进行编号。
鼠可变区的分析
互补决定区(CDR)含有最可能结合抗原的残基，并且必须保留在改造的抗体中。CDR根据Kabat et al(1991)由序列定义。CDR落入规范类别(Chothia et al，1989)，其中关键残基在较大程度上确定CDR环的结构构象。这些残基几乎一直保留在改造的抗体中。重链和轻链的CDR如下所示分类为规范类别：
对于这些CDR类别重要的规范残基示于表1中。
表5
对于鼠和人亚基，使用BLAST程序和查询包含共有与种系序列的数据库，可变轻链和重链比较于共有(Kabat et al，1991)和种系序列(Matsuda etal，1998，Brensing-Kuppers et al，1997)。CDR排除于和种系比较的序列。
LT102的可变轻链是鼠亚基Kappa 2(112氨基酸重叠中94％的一致性)的成员，并且可能源自鼠mucr1种系(在100氨基酸重叠的97％一致性)。LT102的VL和mucr1之间的比较如下所示。
mucr1
查询：1 DVLMTQTPRSLPVSLGDQASISCRSSQNIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRF 60
DVLMTQTP SLPVSLGDQASISCRSSQ+IVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRF
Sbjct：1 DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRF 60
查询：61 SGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHFP 100
SGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSH P
Sbjct：61 SGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVP 100
可变重链是鼠亚基重链3D(118氨基酸中80％的一致性)的成员，并且可能源自鼠VH37.1种系(在98氨基酸重叠的86％一致性)。LT102的VH和VH37.1之间的比较如下所示。
muVH37.1
查询：1 EVKLVESGGGLVKPGGSLKLSCAVSGFTFSDYYMYWIRQTPEKRLEWVATIGDGTSYTHY 60
EVKLVESGGGLVKPGGSLKLSCA SGFTFS Y M W+RQTPEKRLEWVATI G SYT+Y
Sbjct：1 EVKLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYGMSWVRQTPEKRLEWVATISGGGSYTYY 60
查询：61 PDSVQGRFTISRDYATNNLYLQMTSLRSEDTALYYCAR 98
PDSV+GRFTISRD A NNLYLQM+SLRSEDTALYYCAR
Sbjct：61 PDSVKGRFTISRDNAKNNLYLQMSSLRSEDTALYYCAR 98
可变轻链对应于人亚基Kappa 2(112氨基酸中77％的一致性)并且最接近人A3种系(在100氨基酸重叠的76％一致性)。LT102的VL和huA3之间的比较如下所示。
＞huA3
查询：1 DVLMTQTPRSLPVSLGDQASISCRSSQNIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRF 60
D++MTQ+P SLPV+ G+ ASISCRSSQ+++HSNG YL+WYLQKPGQSP+LLIY SNR
Sbjct：1 DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRA 60
查询：61 SGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHFP 100
SGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAED+GVYYC Q P
Sbjct：61 SGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQALQTP 100
可变重链对应于人亚基重链3(117氨基酸中72％的一致性)并且最接近人VH3-21种系(在98氨基酸重叠的73％一致性)。LT102的VH和huVH3-21之间的比较如下所示。
＞huVH3-21
查询：1 EVKLVESGGGLVKPGGSLKLSCAVSGFTFSDYYMYWIRQTPEKRLEWVATIGDGTSYTHY 60
EV+LVESGGGLVKPGGSL+LSCA SGFTFS Y M W+RQ P K LEWV++I +SY +Y
Sbjct：1 EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYSMNWVRQAPGKGLEWVSSISSSSSYIYY 60
查询：61 PDSVQGRFTISRDYATNNLYLQMTSLRSEDTALYYCAR 98
DSV+GRFTISRD A N+LYLQM SLR+EDTA+YYCAR
Sbjct：61 ADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR 98
可变区结构的建模
为了LT102的人源化，基于轻链和重链的晶体结构PDB ID 1CLZ、使用Modeler、SCWRL侧链取代、和使用Gromos96 43b1参数测定真空简单最小化，构建LT102可变区的模型。1CLZ在CDR-H3中具有1个特别残基。
改造的可变区的分析
方法：为了选择轻链和重链的抗体受体框架序列，我们使用抗体序列数据库和查询工具以鉴定合适的模板，其最类似于在规范、界面和镶饰区残基中的鼠LT102；相同长度的CDR(除了CDR-H3)；最少数量的回复突变(即，人受体的框架残基类型改变至LT102成熟鼠抗体)；以及在所有位置(L 4，38，43，44，58，62，65-69，73，85，98和H 2，4，36，39，43，45，69，70，74，92)没有根本没有回复突变(参见Carter and Presta，2000)。还考虑人种系序列填充在FR4框架区中的人共有残基。
选择的框架：人种系序列huA3(共有HUMKV2 FR4)和人种系序列huVH3-11(共有HUMHV3 FR4)分别选自作为轻链和重链的受体框架的多种候选物。序列如下所示。
＞LT102L
DVLMTQTPRSLPVSLGDQASISCRSSQNIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGT
DFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHFPWTFGGGTKLEIK
＞huA3
DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGT
DFTLKISRVEAEDVGVYYC
＞共有人KV2FR4区
--------------------------------------------------------------------------
----------------------------FGQGTKVEIK
＞LT102H
EVKLVESGGGLVKPGGSLKLSCAVSGFTFSDYYMYWIRQTPEKRLEWVATIGDGTSYTHYPDSVQGRFTISRDY
ATNNLYLQMTSLRSEDTALYYCARDLGTGPFAYWGQGTLVTVSA
＞huVH3-11
QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMSWIRQAPGKGLEWVSYISSSGSTIYYADSVKGRFTISRDN
AKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR
＞共有人HV3 FR4区
--------------------------------------------------------------------------
---------------------------------WGQGTLVTVSS
CDR包括Chothia定义具有下划线。
对于该抗体，并非所有规范残基回复突变可避免：种系huA3在3规范残基(L 2，27b，51)区别于LT102 L，并且种系huVH3-11在1规范残基(H24)区别于LT102 H。
设计可变轻链改造链的一种版本，并且设计可变重链改造链的四种版本，除了轻链和重链CDR嫁接序列。对于重链，第一版本含有最少的回复突变，后续版本含有更多回复突变(即它们至少是″人源化″的)。在所有版本的重链中鼠A113被S113(存在于人HV FR4)取代，并且不作为回复突变来进行分析。根据Kabat图表进行编号。
改造的VL中的回复突变
人源化LT102(huLT102)的改造的轻链包括种系huA3框架、共有人KV2FR4和LT102 L CDR。hu102的轻链中的回复突变包括：I2V。V2是支持CDR-L1的规范残基。
改造的VH中的回复突变
人源化LT102(huLT012)的改造的重链的四种版本均包括种系huVH3-11框架、共有人HV3 FR4和LT102 H CDR。
LT102的人源化设计
下面示出人源化LT102轻链序列(有关回复突变的细节参见上面)。LT102的人源化轻链包括：种系huA3框架//共有人KV2 FR4//LT102 LCDR。回复突变为小写粗体字。包括Chothia定义的CDR有下划线。
＞L0＝嫁接
DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQNIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGT
DFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHFPWTFGQGTKVEIK
＞L1
D
VMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQNIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHFPWTFGQGTKVEIK
下面示出人源化LT102重链的四种不同版本。LT102的人源化重链包括：人种系huVH3-11框架//共有人HV3 FR4//LT102 H CDR。下面在H1，H2，H3和H4所述的回复突变为小写字体、粗字体。包括Chothia定义的CDR有下划线。
＞H0＝嫁接
QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMYWIRQAPGKGLEWVSTIGDGTSYTHYPDSVQGRFTISRDN
AKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDLGTGPFAYWGQGTLVTVSS
＞H1
QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCA
SGFTFSDYYMYWIRQAPGKGLEWVSTIGDGTSYTHYPDSVQGRFTISRDN
AKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDLGTGPFAYWGQGTLVTVSS
＞H2
AKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDLGTGPFAYWGQGTLVTVSS
＞H3
AKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDLGTGPFAYWGQGTLVTVSS
＞H4
V
LVESGGGLVKPGGSLRLSCA
SGFTFSDYYMYWIRQAPGKGLEWVSTIGDGTSYTHYPDSVQGRFTISRD
A
NLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDLGTGPFAYWGQGTLVTVSS
实施例6.改变以改善溶解度
L0 H1(105抗体版本0的轻链/105抗体版本1的重链)联合人源化105轻链和重链被选择用于表达和稳定性研究：
L0
1 EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASESVD NYGISFMHWY QQKPGQAPRL
51 LIYRASNLES GIPARFSGSG SGTDFTLTIS SLEPEDFAVY YCQQSNKDPY
101 TFGQGTKVEI KRTVAAPSVF IFPPSDEQLK SGTASVVCLL NNFYPREAKV
151 QWKVDNALQS GNSQESVTEQ DSKDSTYSLS STLTLSKADY EKHKVYACEV
201 THQGLSSPVT KSFNRGEC
(SEQ ID NO：)
H1
1 EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAVSGYSIT SGYYWNWVRQ APGKGLEGIS
51 YISYDGSNNY NPSLKNRFTI SRDSAKNSFY LHMHSLRAED TAVYYCARDA
101 YSYGMDYWGQ GTTVTVSSAS TKGPSVFPLA PSSKSTSGGT AALGCLVKDY
151 FPEPVTVSWN SGALTSGVHT FPAVLQSSGL YSLSSVVTVP SSSLGTQTYI
201 CNVNHKPSNT KVDKKVEPKS CDKTHTCPPC PAPELLGGPS VFLFPPKPKD
251 TLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST
301 YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY
351 TLPPSRDELT KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD
402 SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPG
(SEQ ID NO：)
人源化105的H1/L0版本的溶解度测定为9.9mg/ml。对数个轻链CDR残基进行突变，认为负责于分子的自身缔合(并因此不溶)。制备：具有在CDRL2中Kabat位54的R突变为K的轻链的第一版本(版本A)、具有在CDRL2中Kabat位57的N突变为S的第二版本(版本B)、以及在CDRL2具有两种突变的第三版本(包含在Kabat位54的K和在Kabat位57的S；版本C)。版本A显示在28.6mg/ml时析出，版本B显示在34.9mg/ml时析出。
版本A
1 EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASESVD NYGISFMHWY QQKPGQAPRL
51 LIY
ASNLES GIPARFSGSG SGTDFTLTIS SLEPEDFAVY YCQQSNKDPY
101 TFGQGTKVEI KRTVAAPSVF IFPPSDEQLK SGTASVVCLL NNFYPREAKV
151 QWKVDNALQS GNSQESVTEQ DSKDSTYSLS STLTLSKADY EKHKVYACEV
201 THQGLSSPVT KSFNRGEC
版本B
1 EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASESVD NYGISFMHWY QQKPGQAPRL
51 LIYRASLES GIPARFSGSG SGTDFTLTIS SLEPEDFAVY YCQQSNKDPY
101 TFGQGTKVEI KRTVAAPSVF IFPPSDEQLK SGTASVVCLL NNFYPREAKV
151 QWKVDNALQS GNSQESVTEQ DSKDSTYSLS STLTLSKADY EKHKVYACEV
201 THQGLSSPVT KSFNRGEC
版本C
1 EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASESVD NYGISFMHWY QQKPGQAPRL
51 LIY
LES GIPARFSGSG SGTDFTLTIS SLEPEDFAVY YCQQSNKDPY
101 TFGQGTKVEI KRTVAAPSVF IFPPSDEQLK SGTASVVCLL NNFYPREAKV
151 QWKVDNALQS GNSQESVTEQ DSKDSTYSLS STLTLSKADY EKHKVYACEV
201 THQGLSSPVT KSFNRGEC
在试图进一步改善溶解度时，制备新版本的轻链，其包括轻链的版本C中发现的R54K和N57S CDRL2突变，并且还包括新框架，所述新框架被选择以提供增加的总电荷，从而达到所得序列L10：
L10
1 AIQLTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASESVD NYGISFMHWY QQKPGKAPKL
51 LIYKASSLES GVPSRFSGSG SGTDFTLTIS SLQPEDFATY YCQQSNKDPY
101 TFGQGTKVEI KRTVAAPSVF IFPPSDEQLK SGTASVVCLL NNFYPREAKV
151 QWKVDNALQS GNSQESVTEQ DSKDSTYSLS STLTLSKADY EKHKVYACEV
201 THQGLSSPVT KSFNRGEC
当联合H1时轻链的L10版本显示溶解度大于100mg/ml。
还制备轻链的另外的版本，包括L12和L13：
L12
1 DIQLTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASESVD NYGISFMHWY RQKPGKAPKL
51 LIYKASSLES GVPSRFSGRG SGTDFTLTIS SLQPEDFATY YCQQSNKDPY
101 TFGQGTKVEI KRTVAAPSVF IFPPSDEQLK SGTASVVCLL NNFYPREAKV
151 QWKVDNALQS GNSQESVTEQ DSKDSTYSLS STLTLSKADY EKHKVYACEV
201 THQGLSSPVT KSFNRGEC
L13
1 DIRLTQSPSS LSASVGQRVT ISCRASESVD NYGISFMHWY RQKPGKAPKL
51 LIYKASSLES GVPSRFSGRG SGTDFTLTIS SLQPEDFATY YCQQSNKDPY
101 TFGQGTKVEI KRTVAAPSVF IFPPSDEQLK SGTASVVCLL NNFYPREAKV
151 QWKVDNALQS GNSQESVTEQ DSKDSTYSLS STLTLSKADY EKHKVYACEV
201 THQGLSSPVT KSFNRGEC
当联合H1时轻链的L12还显示在100mg/ml时未析出，L13联合H1显示在48mg/ml时未析出。
还制备重链的另外的版本，包括H11和H14。
H11
1 EVQLVESGGG LVQPRGSLRL SCAVSGYSIT SGYYWNWIRQ APGKGLEWVS
51 YISYDGSNNY NPSLKNRFTI SRDNSKNTFY LQMNNLRAED TAAYYCARDA
101 YSYGMDYWGQ GTTVTVSSAS TKGPSVFPLA PSSKSTSGGT AALGCLVKDY
151 FPEPVTVSWN SGALTSGVHT FPAVLQSSGL YSLSSVVTVP SSSLGTQTYI
201 CNVNHKPSNT KVDKKVEPKS CDKTHTCPPC PAPELLGGPS VFLFPPKPKD
251 TLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST
301 YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY
351 TLPPSRDELT KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD
401 SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPG
H14
1 EVQLQESGGG LVKPRGSLRL SCAVSGYSIT SGYYWNWIRQ APGKGLEWVS
51 YISYDGSNNY NPSLKNRFSI SRDNSKNTFY LKMNRLRAED SAAYYCARDA
101 YSYGMDYWGQ GTTVTVSSAS TKGPSVFPLA PSSKSTSGGT AALGCLVKDY
151 FPEPVTVSWN SGALTSGVHT FPAVLQSSGL YSLSSVVTVP SSSLGTQTYI
201 CNVNHKPSNT KVDKKVEPKS CDKTHTCPPC PAPELLGGPS VFLFPPKPKD
251 TLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST
301 YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY
351 TLPPSRDELT KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD
401 SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPG
L10联合H11或H14显示的溶解度分别比联合H1时低3.7，并且大于28mg/ml。还测试另外的联合，并且数据展示于下表中：
实施例7.抗体与LT的结合
使用下列方法测定存在竞争剂时LTbR结合位点的适用性。
Biacore芯片制备.使用Biacore 3000装置进行所有试验。根据生产商的说明，使用Biacore Amine Coupling试剂盒抗-Flag抗体M2固定在CM5传感芯片上。简言之，抗体在10mM乙酸盐，pH 5.0中稀释至50μg/ml，并且将30μl注射在芯片表面，该表面已经使用注射30μl的1∶1N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)∶1-乙基-3(3-二甲基氨基丙基)-碳化二亚胺盐酸盐(EDC)来活化。然后将过量的游离胺基团用注射50μl的1M乙醇胺来捕获。典型的固定水平是4000-6000RU。所有样品都在测定缓冲液(10mM HEPES pH7.0+150mM NaCl+0.05％去污剂p-20+0.05％BSA)中制备。该相同的缓冲液用作样品分析过程中的运行缓冲液。为了固定，使用相同的缓冲液但是没有BSA。
Biacore结合测定.可溶性Flag-标签的LTα1β2在测定缓冲液中稀释至200nM，并且以流速25μl/min注射在M2衍生的表面上或作为背景对照的未衍生的表面上。该表面允许稳定2分钟，同时缓冲液以25μl/min流过表面。以25μl/min注射饱和浓度的竞争剂(基8μM LTβR-Ig，2μM抗体LT105，4μM抗体B9，4μM抗体LT102或2μM抗体9B4；在单独试验中测定)3分钟。再次该表面允许在缓冲液流动下稳定3分钟。在稳定后，将在测定缓冲液中的20μM单体LTβR以25μl/min注射在表面上4分钟。然后将表面注射两次在0.5M KCl中的3M盐酸胍来再生。
如下所示测定各组分与亲和捕获的LTα1β2的结合的化学计量的量。
(1)可得竞争剂位点＝[(竞争剂分子量)/(配体分子量)]x(配体应答)
(2)结合的竞争剂＝(净竞争剂应答)/(可得竞争剂位点)
(3)可得LTβR位点＝[(LTβR分子量)/(配体分子量)]x(净配体应答)
(4)结合的LTβR＝(净LTβR应答)/(可得LTβR位点)
使用这些方法，2LTβR结合位点在LTα1β2上鉴定，由它们对于LTbR的亲和性来区别(位点1显示出亲和性约50nM并且位点2显示出亲和性约为1500nM)。
相比于完整抗体，测试的抗体以该表观亲和性(0.3nM或更高)结合，而测试的Fab片段(LT105和B9)以较低亲和性(2nM或更弱)结合。因此，各测试的抗体以较高亲和性二价结合单LTα1β2三聚体。
如下表所示，在存在结合的LTβR-Ig，LT105，LT102或9B4时，不可得到LTβR结合位点，而在存在B9时，一个LTβR结合位点保持可得。因此，尽管现有技术B9抗体能够以二价高亲和性和LTα1β2相互作用，但是其仅可阻断一个受体结合位点。相反，在存在结合的LT105，LT102和9B4抗体(本文已经证实更加完全阻断LT与LTβR的结合)时，不可得到LTβR结合位点。
等同形式
本领域技术人员使用不超过常规的试验将认识到或能够识别本文所述发明的特定实施方案的多种等同形式。这些等同形式旨在包括在所附权利要求书内。
Claims (70)
1.一种分离的抗体或包含其抗原结合区域的分子，其在这样的条件下在细胞中结合淋巴细胞毒素(LT)并且使LT-诱导的生物活性阻断至少约70％，在该条件下参照抗体B9(由以登录号HB11962保藏在ATCC的细胞系B9.C9.1产生)在细胞中使所述LT-诱导的生物活性阻断约50％。
2.一种分离的抗体或包含其抗原结合区域的分子，其在细胞中以IC50小于100nM结合淋巴细胞毒素(LT)并且使LT-诱导的生物活性阻断。
3.一种分离的抗体或包含其抗原结合区域的分子，其结合淋巴细胞毒素(LT)并且使LTβR-Ig与细胞的结合阻断至少85％。
4.权利要求1或2所述的分离的抗体或包含其抗原结合区域的分子，其中所述LT-诱导的生物活性是IL-8释放。
5.权利要求1、2或3所述的分离的抗体或包含其抗原结合区域的分子，其包含人氨基酸序列。
6.权利要求1或2所述的分离的抗体或包含其抗原结合区域的分子，其中所述人氨基酸序列包含抗体恒定区序列或其片段。
7.权利要求6所述的分离的抗体或包含其抗原结合区域的分子，其中所述人恒定区是已经改变以降低与至少一种Fc受体结合的IgG1恒定区。
8.权利要求6所述的分离的抗体或包含其抗原结合区域的分子，其中所述人恒定区是已经改变以增强与至少一种Fc受体结合的IgG1恒定区。
9.权利要求1、2或3所述的分离的抗体或其抗原结合区，其是人源化的。
10.权利要求1或2所述的分离的抗体或其抗原结合区，其中所述LT-诱导的生物活性被阻断至少约80％。
11.权利要求1或2所述的分离的抗体或其抗原结合区，其中所述LT-诱导的生物活性被阻断至少约90％。
12.权利要求3所述的分离的抗体或其抗原结合区，其中LTBR-Ig-结合被阻断至少约90％。
13.权利要求2所述的分离的抗体或包含其抗原结合区域的分子，其在细胞中以IC50小于30nM使LT-诱导的生物活性阻断。
14.权利要求2所述的分离的抗体或包含其抗原结合区域的分子，其在细胞中以IC50小于10nM使LT-诱导的生物活性阻断。
15.权利要求2所述的分离的抗体或包含其抗原结合区域的分子，其在细胞中以IC50小于3nM使LT-诱导的生物活性阻断。
16.权利要求3所述的分离的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段结合LT上两个位点从而未残留用于LTβR结合的位点。
17.权利要求1、2或3所述的分离的抗体或其抗原结合区，其是全长抗体。
18.权利要求1、2或3所述的分离的抗体或其抗原结合区，其是scFv分子。
19.一种特异性结合LT的抗原表位的分离的抗体，其中所述抗体与所述LT抗原表位的结合以剂量依赖性方式被102抗体竞争性阻断。
20.权利要求19所述的分离的抗体，其中LTβ的氨基酸193和194对于抗体结合是关键的。
21.一种特异性结合LT的抗原表位的分离的抗体，其中所述抗体与所述LT抗原表位的结合以剂量依赖性方式被AOD9抗体竞争性阻断。
22.一种特异性结合LT的抗原表位的分离的抗体，其中所述抗体与所述LT抗原表位的结合以剂量依赖性方式被101/103抗体竞争性阻断。
23.一种特异性结合LT的抗原表位的分离的抗体，其中所述抗体与所述LT抗原表位的结合以剂量依赖性方式被105抗体竞争性阻断。
24.权利要求23所述的分离的抗体，其中LTβ的氨基酸96，97，98，106，107和108对于抗体结合是关键的。
25.一种特异性结合LT的抗原表位的分离的抗体，其中所述抗体与所述LT抗原表位的结合以剂量依赖性方式被9B4抗体竞争性阻断。
26.权利要求25所述的分离的抗体，其中LTβ的氨基酸96，97和98对于抗体结合是关键的。
27.一种特异性结合LT的抗原表位的分离的抗体，其中所述抗体与所述LT抗原表位的结合以剂量依赖性方式被A1D5抗体竞争性阻断。
28.权利要求27所述的分离的抗体，其中LTβ的氨基酸172对于抗体结合是关键的。
29.一种特异性结合LT的抗原表位的分离的抗体，其中所述抗体与所述LT抗原表位的结合以剂量依赖性方式被107抗体竞争性阻断。
30.权利要求29所述的分离的抗体，其中LTβ的氨基酸151和153对于抗体结合是关键的。
31.一种特异性结合LT的抗原表位的分离的抗体，其中所述抗体与所述LT抗原表位的结合以剂量依赖性方式被108抗体竞争性阻断。
32.权利要求19-31中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合区，其包含人氨基酸序列。
33.权利要求32所述的分离的抗体或其抗原结合区，其中所述人氨基酸序列是抗体恒定区序列。
34.权利要求19-31中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合区，其中所述抗体是人源化的。
35.一种包含重链可变区和轻链可变区的淋巴细胞毒素结合分子，所述重链可变区包含重链CDR CDRH1、CDRH2和CDRH3，所述轻链可变区包含轻链CDR CDRL1、CDRL2和CDRL3，其中所述轻链和重链CDR衍生自选自AOD9，108，107，A1D5，102，101/103，9B4和105的抗体。
36.一种包含重链可变区和轻链可变区的淋巴细胞毒素结合分子，所述重链可变区包含重链CDR CDRH1、CDRH2和CDRH3，所述轻链可变区包含轻链CDR CDRL1、CDRL2和CDRL3，其中所述CDR衍生自所述AOD9抗体。
37.一种包含重链可变区和轻链可变区的淋巴细胞毒素结合分子，所述重链可变区包含重链CDR CDRH1、CDRH2和CDRH3，所述轻链可变区包含轻链CDR CDRL1、CDRL2和CDRL3，其中所述CDR衍生自所述108抗体。
38.一种包含重链可变区和轻链可变区的淋巴细胞毒素结合分子，所述重链可变区包含重链CDR CDRH1、CDRH2和CDRH3，所述轻链可变区包含轻链CDR CDRL1、CDRL2和CDRL3，其中所述CDR衍生自所述107抗体。
39.一种包含重链可变区和轻链可变区的淋巴细胞毒素结合分子，所述重链可变区包含重链CDR CDRH1、CDRH2和CDRH3，所述轻链可变区包含轻链CDR CDRL1、CDRL2和CDRL3，其中所述CDR衍生自所述A1D5抗体。
40.一种包含重链可变区和轻链可变区的淋巴细胞毒素结合分子，所述重链可变区包含重链CDR CDRH1、CDRH2和CDRH3，所述轻链可变区包含轻链CDR CDRL1、CDRL2和CDRL3，其中所述CDR衍生自所述102抗体。
41.一种包含重链可变区和轻链可变区的淋巴细胞毒素结合分子，所述重链可变区包含重链CDR CDRH1、CDRH2和CDRH3，所述轻链可变区包含轻链CDR CDRL1、CDRL2和CDRL3，其中所述CDR衍生自所述101/103抗体。
42.一种包含重链可变区和轻链可变区的淋巴细胞毒素结合分子，所述重链可变区包含重链CDR CDRH1、CDRH2和CDRH3，所述轻链可变区包含轻链CDR CDRL1、CDRL2和CDRL3，其中所述CDR衍生自所述105抗体。
43.一种包含重链可变区和轻链可变区的淋巴细胞毒素结合分子，所述重链可变区包含重链CDR CDRH1、CDRH2和CDRH3，所述轻链可变区包含轻链CDR CDRL1、CDRL2和CDRL3，其中所述CDR衍生自所述9B4抗体。
44.一种包含重链可变区和轻链可变区的淋巴细胞毒素结合分子，所述重链可变区包含重链CDR CDRH1、CDRH2和CDRH3，所述轻链可变区包含轻链CDR CDRL1、CDRL2和CDRL3，其中CDRH1包含序列GFSLX1X2Y/SGX3H其中X是任意氨基酸。
45.一种包含重链可变区和轻链可变区的淋巴细胞毒素结合分子，所述重链可变区包含重链CDR CDRH1、CDRH2和CDRH3，所述轻链可变区包含轻链CDR CDRL1、CDRL2和CDRL3，其中CDRH2包含序列VIWX1GGX2TX3X4NAX5FX6S其中X是任意氨基酸。
46.一种包含轻链可变区和轻链可变区的淋巴细胞毒素结合分子，所述重链可变区包含重链CDR CDRH1、CDRH2和CDRH3，所述轻链可变区包含轻链CDR CDRL1、CDRL2和CDRL3，其中CDRL1包含序列RASX1SVX2X3X4X5或X1ASQDX2X3X4X5LX6其中X是任意氨基酸。
47.一种包含轻链可变区和轻链可变区的淋巴细胞毒素结合分子，所述重链可变区包含重链CDR CDRH1、CDRH2和CDRH3，所述轻链可变区包含轻链CDR CDRL1、CDRL2和CDRL3，其中CDRL2包含序列RAX1RLX2D其中X是任意氨基酸。
48.一种包含轻链可变区和轻链可变区的淋巴细胞毒素结合分子，所述重链可变区包含重链CDR CDRH1、CDRH2和CDRH3，所述轻链可变区包含轻链CDR CDRL1、CDRL2和CDRL3，其中CDRL2包含序列X1X2SX3X4X5S其中X是任意氨基酸。
49.一种包含轻链可变区和轻链可变区的淋巴细胞毒素结合分子，所述重链可变区包含重链CDR CDRH1、CDRH2和CDRH3，所述轻链可变区包含轻链CDR CDRL1、CDRL2和CDRL3，其中CDRL3包含序列X1QX2X3X4X5PX6T其中X是任意氨基酸。
50.一种包含轻链可变区和轻链可变区的淋巴细胞毒素结合分子，所述重链可变区包含重链CDR CDRH1、CDRH2和CDRH3，所述轻链可变区包含轻链CDR CDRL1、CDRL2和CDRL3，其中CDRL3包含序列LX1X2DX4FPX6T其中X是任意氨基酸。
51.一种包含轻链可变区和轻链可变区的淋巴细胞毒素结合分子，所述重链可变区包含105抗体变体的重链CDR CDRH1、CDRH2和CDRH3，所述轻链可变区包含105变体的轻链CDR CDRL1、CDRL2和CDRL3。
52.权利要求51所述的结合分子，其中所述结合分子的溶解度大于120mg/ml。
53.权利要求51所述的淋巴细胞毒素结合分子，其中所述结合分子包含105变体版本L10的轻链可变区。
54.权利要求51所述的淋巴细胞毒素结合分子，其中所述结合分子包含105变体版本H1的重链可变区。
55.权利要求51所述的淋巴细胞毒素结合分子，其中所述结合分子包含105变体版本L10的轻链可变区和105变体版本H1的重链可变区。
56.一种组合物，包含权利要求1-34中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合区和载体。
57.一种组合物，包含权利要求35-55中任一项所述的结合分子和载体。
58.一种治疗受试者的方法，所述受试者将受益于使用抗-LT结合分子的治疗，包括向所述受试者施用权利要求56或57中任一项所述的组合物，使得所得进行所述治疗。
59.权利要求58所述的方法，其中所述受试者患有由炎症表征的疾患。
60.权利要求59所述的方法，其中所述炎性疾患选自：风湿性关节炎，多发性硬化，克罗恩病，溃疡性结肠炎，移植，狼疮，炎症性肝病，牛皮癣，干燥综合征，多发性硬化(例如SPMS)，病毒诱导的肝炎，自身免疫性肝炎，I型糖尿病，动脉硬化症和病毒休克综合征。
61.权利要求60所述的方法，其中所述炎性疾患是风湿性关节炎。
62.权利要求58所述的方法，其中所述受试者患有癌症。
63.权利要求62所述的方法，其中所述癌症选自多发性骨髓瘤和顽性滤泡性淋巴瘤。
64.一种核酸分子，编码权利要求1-35中任一项所述的抗体。
65.一种核酸分子，编码权利要求36-55中任一项所述的结合分子。
66.权利要求64或65所述的核酸分子，其在载体中。
67.一种宿主细胞，包含权利要求66所述的载体。
68.一种制备抗体或结合分子的方法，包括：
(i)培养权利要求67所述的宿主细胞，使得所述抗体或结合分子在宿主细胞培养基中分泌；(ii)将所述抗体或结合分子从所述培养基分离。
69.权利要求56或57所述的组合物在制备药物中的用途。
70.权利要求69所述的用途，其中所述药物用于治疗和炎症有关的疾患。
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