CN107530423B - 用抗lap单克隆抗体治疗癌症 - Google Patents

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Abstract

本文中描述了涉及LAP结合剂，包括例如抗LAP抗体的组合物和方法，及其在治疗癌症的方法中的用途。LAP结合剂影响***性和肿瘤内免疫两者，并且显示有效治疗广泛范围的癌症类型。

Description

用抗LAP单克隆抗体治疗癌症
对相关申请的交叉引用
本申请要求2015年1月14日提交的美国临时申请No.:62/103,401的35U.S.C.§119(e)下的权益，其内容通过引用完整并入本文。
发明领域
技术领域涉及抗LAP抗体和用于治疗癌症的方法。
发明背景
根据世界卫生组织的数据，2000年全球有1000万人被诊断出癌症，并且600万人死于癌症。此外，统计数据指示全球癌症发病率在上升。例如，在美国，预测指示目前活着的人中50％将在他们生命的某个时刻被诊断出某种形式的癌症。
癌症疗法包括放射、手术、细胞毒性化疗剂，旨在增加癌症特异性免疫应答的治疗、以及此类方法的组合。最近的癌症疗法方法主要集中于使用多种方法主动利用患者的免疫应答来靶向癌细胞，包括用肿瘤抗原进行免疫，抑制或去除抑制/调节免疫细胞群体，以及激活耗竭的免疫细胞群体。
发明概述
LAP或潜伏相关肽(latency-associated peptide)源自TGF-β的N端蛋白部分的分离。LAP是分泌性的，并且可以在细胞外基质中发现。此外，LAP也可以在血小板上表达。重要的是，如本文所述，在活化的调节性T细胞上发现LAP。本文描述的组合物和方法部分地基于下述的发现，即当用抗LAP抗体治疗时肿瘤生长较低，并且小鼠存活更长，并且本文所述的抗LAP抗体部分地通过阻止或抑制TGF-β信号传导(包括通过阻断TGF-β从LAP/TGF-b复合物的释放)和/或耗竭活化的CD4+和CD8+调节性T细胞群体两者起作用。更具体地，如本文所示，抗LAP抗体治疗如下影响***性和肿瘤内免疫两者：(1)肿瘤被增加数目的细胞毒性CD8+ T细胞浸润，并且肿瘤内Foxp3Treg减少。CD4+和CD8+肿瘤内T细胞具有降低的PD-1、LAG3和CD103表达。(2)在外周中，表达IFN-γ和颗粒酶B的CD4+和CD8+ T细胞分别增加，而CD103+ T细胞减少。最后，表达CD103和PD-L1的致耐受性树突细胞数目减少，而MHC II在脾脏髓样细胞上升高。抗LAP抗体在各种癌症模型，包括GBM模型、黑素瘤模型和结肠癌模型中显示效力，并观察到类似的肿瘤内和外周免疫作用，指示该方法对癌症治疗的广泛适用性。因此，如本文所证明，抗LAP抗体通过激活先天和适应性免疫强烈地影响***性和肿瘤内免疫应答，并克服了抑制肿瘤特异性免疫的机制。总之，作为单一疗法或与常规抗肿瘤模式组合的抗LAP抗体代表了用于癌症治疗的新型免疫治疗方法。
因而。本文中描述了特异性结合LAP的分离的抗LAP抗体或其抗原结合片段，其包含一个或多个选自下组的重链和轻链互补决定区(CDR)：a)具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的重链CDR1；b)具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的重链CDR2；c)具有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的重链CDR3；d)具有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的轻链CDR1；e)具有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的轻链CDR2；和f)具有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的轻链CDR3。
在一个实施方案中，分离的抗LAP抗体或其抗原结合片段包含重链互补决定区(CDRs):a)具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的重链CDR1；b)具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的重链CDR2；和c)具有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的重链CDR3。
在另一个实施方案中，分离的抗LAP抗体或其抗原结合片段包含轻链互补决定区(CDRs):a)具有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的轻链CDR1；b)具有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的轻链CDR2；和c)具有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的轻链CDR3。
在另一个实施方案中，分离的抗LAP抗体或其抗原结合片段包含互补决定区(CDRs)：a)具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的重链CDR1；b)具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的重链CDR2；c)具有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的重链CDR3；c)具有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的轻链CDR1；e)具有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的轻链CDR2；和f)具有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的轻链CDR3。
在另一个实施方案中，分离的抗LAP抗体或其抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的重链。
在另一个实施方案中，分离的抗LAP抗体或其抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的轻链。
在另一个实施方案中，分离的抗LAP抗体或其抗原结合片段包含a)具有SEQ IDNO:9的氨基酸序列的重链CDR1；b)具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的重链CDR2；c)具有SEQID NO:11的氨基酸序列的重链CDR3；d)具有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的轻链CDR1；e)具有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的轻链CDR2；和f)具有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的轻链CDR3。
在另一个实施方案中，分离的抗LAP抗体或抗原结合片段包含一个或多个选自下组的重链互补决定区(CDR)：a)具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的重链CDR1；b)具有SEQ IDNO:10的氨基酸序列的重链CDR2；和c)具有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的重链CDR3。
在另一个实施方案中，分离的抗LAP抗体或抗原结合片段包含一个或多个选自下组的轻链互补决定区(CDR)：a)具有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的轻链CDR1；b)具有SEQ IDNO:15的氨基酸序列的轻链CDR2；和c)具有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的轻链CDR3。
本文中所述的任何方面的抗体可以是单克隆抗体。在某些实施方案中，本文中所述的任何方面的抗体是嵌合的、CDR移植的、人源化的、复合人的或完全人的抗体或双重抗体或其抗原结合片段。在本文中所述的任何方面的其它实施方案中，抗体片段是Fab片段、Fab’片段、Fd片段、Fd’片段、Fv片段、dAb片段、F(ab’)2片段、单链片段、双抗体(diabody)、或线性抗体。在本文中所述的任何方面的另一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含人受体(acceptor)框架。这些实施方案之任一的基础的单克隆抗体可以包含例如由选自下组的杂交瘤克隆产生的单克隆抗体，所述组称为TW4-9E7,TW4-5A8,TW4-4E5,TW4-12B12,TW4-1G12,TW4-3G5,TW4-2F8,TW4-6H10,TW4-1G2,TW4-1E1,TW4-16F4,TW4-8F10,TW4-3H6,TW4-2C9,TW7-16B4,TW7-28G11,TW7-7H4,和TW7-20B9。
还描述了包含LAP结合剂和TGF-β信号传导抑制剂的组合物。
在一个实施方案中，LAP结合剂包含抗LAP抗体或其抗原结合片段。在另一个实施方案中，抗体是单克隆抗体。在另一个实施方案中，抗体是嵌合的、CDR移植的、人源化的或完全人的。在另一个实施方案中，抗体包含1个或更多个、2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、或5个或更多个、或所有6个重链和轻链互补决定区(CDR)，包括a)具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的重链CDR1；b)具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的重链CDR2；c)具有SEQ IDNO:11的氨基酸序列的重链CDR3；d)具有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的轻链CDR1；e)具有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的轻链CDR2；和f)具有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的轻链CDR3。
在另一个实施方案中，TGF-β信号传导抑制剂选自下组：结合TGF-β或其受体的抗体或其抗原结合片段、双链RNA或编码双链RNA的核酸、适体、和小分子。特异性结合TGF-β和TGF-β受体并且抑制由TGF-β和TGF-β受体的信号传导的抗体是本领域中已知的，并且包括商品化的抗体。经由R NA干扰特异性靶向TGF-β和/或TGF-β受体的双链RNA也是本领域中已知并且商品化的。TGF-b信号传导的小分子抑制剂是本领域中已知的，并且包括例如4-[4-(1,3-间二氧杂环戊烯-5-基)-5-吡啶-2-基-1H-咪唑-2-基]苯甲酰胺(4-[4-(1,3-benzodioxol-5-yl)-5-pyridin-2-yl-1H-imidazol-2-yl]benzamide)(SB431542)、N-(恶烷-4-基)-4-[4-(5-吡啶-2-基-1H-吡唑-4-基)吡啶-2-基]苯甲酰胺(N-(o xan-4-yl)-4-[4-(5-pyridin-2-yl-1H-pyrazol-4-yl)pyridin-2-yl]benzamide)(GW788388)、4-[3-(2-吡啶基)-1H-吡唑-4-基]-喹啉(LY364947)(4-[3-(2-Pyridinyl)-1H-pyrazol-4-yl]-quinoline(LY364947))、和2-(3-(6-甲基吡啶-2-基)-1H-吡唑-4-基)-1,5-萘啶(2-(3-(6-methylpyridin-2-yl)-1H-pyrazol-4-yl)-1,5-naphthyridine)(“ALK5抑制剂II”)。
还描述了包含LAP结合剂和免疫调节剂或化疗剂的组合物。
在一个实施方案中，LAP结合剂包含抗体或其抗原结合片段。在另一个实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段是单克隆抗体或其抗原结合片段。在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段是嵌合的、CDR移植的、人源化的或完全人的。在另一个实施方案中，抗体包含1个或更多个、2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、或5个或更多个、或所有6个重链和轻链互补决定区(CDR)，包括a)具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的重链CDR1；b)具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的重链CDR2；c)具有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的重链CDR3；d)具有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的轻链CDR1；e)具有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的轻链CDR2；和f)具有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的轻链CDR3。
在另一个实施方案中，免疫调节剂包含免疫检查点调节剂。免疫检查点蛋白受体及其配体(本文统称为检验点蛋白)介导T细胞介导的细胞毒性的抑制，并且通常由肿瘤或在肿瘤微环境中的无反应性T细胞上表达，并允许肿瘤逃避免疫攻击。免疫抑制检查点蛋白受体及其配体的活性的抑制剂可以克服免疫抑制性肿瘤环境，以允许肿瘤的细胞毒性T细胞攻击。免疫检查点蛋白质的实例包括但不限于PD-1、PD-L1、PDL2、CTLA4、LAG3、TIM3、TIGIT和CD103。此类蛋白质的活性的调节(包括抑制)可以通过免疫检查点调节剂完成，其可以包括例如靶向检查点蛋白质的抗体、适体、小分子和检测点受体蛋白质的可溶性形式，等等。PD-1靶向抑制剂包括经批准的药物试剂派姆单抗(pembrolizumab)和纳武单抗(nivolumab)，而易普利姆玛(ipilimumab)是经批准的CTLA-4抑制剂。对PD-L1、PD-L2、LAG3、TIM3、TIGIT和CD103特异性的抗体是已知的和/或商品化的，并且也可以由本领域技术人员产生。
除了免疫检查点调节剂之外免疫调节剂还包括促进或介导促进细胞介导的免疫应答的抗原呈递的试剂。此类免疫调节剂可以包括例如肿瘤抗原疫苗。肿瘤抗原疫苗可以包括包含特定肿瘤抗原或一组已知肿瘤抗原的制剂，其具有或不具有受试者自己的树突细胞或佐剂。或者，肿瘤抗原疫苗可以包含来自患者肿瘤的相对粗制的肿瘤细胞抗原制剂，当离体暴露于从患者细胞体外产生的树突细胞时，其可以在将树突细胞疫苗引入患者中时允许T细胞介导的肿瘤攻击。在一个实施方案中，免疫调节剂包括肿瘤抗原疫苗。在另一个实施方案中，肿瘤抗原疫苗包含树突细胞肿瘤抗原疫苗。
本文中还描述了抗体或其抗原结合片段，其结合在与TGF-β复合时的LAP，并且抑制TGF-β从所述LAP/TGF-β复合物释放。在一个实施方案中，抗体或抗原结合片段结合由LAP与TGF-β的结合形成的表位。在另一个实施方案中，抗体或抗原结合片段是单克隆抗体或其抗原结合片段，并且可以包括例如嵌合的、CDR移植的、人源化的或完全人的抗体或其抗原结合片段。在另一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含1个或更多个、2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、或5个或更多个、或所有6个重链和轻链互补决定区(CDR)，包括a)具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的重链CDR1；b)具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的重链CDR2；c)具有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的重链CDR3；d)具有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的轻链CDR1；e)具有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的轻链CDR2；和f)具有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的轻链CDR3。抗体或其抗原结合片段涵盖例如由杂交瘤克隆TW7-28G11产生的抗体。抗体或其抗原结合片段也可以涵盖例如由本文中描述的任何其它抗LAP杂交瘤克隆产生的抗体。
本文还描述了包含如本文所述的特异性结合LAP(包括例如人LAP)的LAP结合剂或抗体和药学上可接受的载体的药物组合物。对于在如本文所述的方法中施用于有此需要的个体的任何组合物，组合物的量将是“治疗有效量”，如该术语在本文中定义。
本文还描述了减少受试者中LAP+ T调节细胞群体的数目或活性的方法，所述方法包括对受试者施用LAP结合剂，由此LAP+ T调节细胞群体的数目或活性减少。
如本文所用，术语“调节性T细胞”或“T调节细胞”或“Tregs”是指CD4+或CD8+ T细胞的任何群体，其抑制或抑制其它免疫细胞，包括其它CD4+和CD8+ T细胞的活化、增殖和/或效应功能，并有助于维持自我耐受。在较旧的文献中Tregs有时也称为抑制T细胞。CD4+CD25+FoxP3+ Treg是源自胸腺的调节性T细胞群体，并且是相对同质的群体，直到它们迁移到外周，在那里亚群可以形成类似于常规记忆和效应T细胞的表型特征。该亚群的细胞可以迁移到淋巴样和非淋巴样组织，以维持适当的免疫稳态。外周衍生或所谓的诱导性Tregs是可以从外周中的常规CD4+CD25-FoxP3-T细胞形成的调节性T细胞群体。CD4+ Treg通常是CD4+和FoxP3+，尽管标志物谱可以随来源而变化-例如，胸腺衍生的Treg表达高水平的Helios标志物，而诱导的Tregs则不表达。并非所有诱导的Treg都表达CD25或FoxP3。与常规T细胞不同，一些Treg细胞在T细胞受体激活时，在其细胞表面上瞬时表达GARP和LAP/TGFβ两者。CD103+CD8+ Treg是通过产生细胞因子IL-10和/或TGF-β和/或通过对树突细胞的直接抑制作用介导抗原特异性抑制的调节性T细胞群体。用于鉴定和/或表征调节性T细胞群体的功能的示例性测定法是本领域已知的，并且描述于例如Collison和Vignali，In VitroTreg Suppression Assays，METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY(CLIFTON，NJ))2011年1月，其内容通过引用整体并入本文。通常，通过测量体外、离体或体内增殖的抑制来鉴定调节性T细胞功能。例如，体外Treg抑制测定法的示例性基本类型是在不存在抗原呈递细胞(APC)的情况下测量Treg功能的测定法。该测定法仅包括两种细胞类型，即Tconv和Tregs，其以各种比率混合在一起，通常以2:1比率开始，并使用抗CD3和抗CD28刺激，例如使用珠。通过使用例如胸苷掺入测定法或使用基于荧光染料的测定法，例如羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)稀释测定法，通过测量细胞增殖来测定Treg群体的抑制功能。
如本文中报道，特别感兴趣的Tregs群体是LAP+ Tregs，其可以特别在肿瘤组织中积累。如本文中报道，LAP结合剂可以减少LAP+ Tregs的数目或活性，包括肿瘤浸润性或肿瘤相关Treg的数目或活性。由LAP+ Tregs介导的免疫抑制的降低可以允许对肿瘤的有效免疫攻击。在一个实施方案中，LAP结合剂可以是抗体或其抗原结合片段。在一个实施方案中，抗体可以是单克隆抗体或其抗原结合片段。在另一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段可以是嵌合的、CDR移植的、人源化的或完全人的。在另一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含1个或更多个、2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、或5个或更多个、或所有6个重链和轻链互补决定区(CDR)，包括a)具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的重链CDR1；b)具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的重链CDR2；c)具有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的重链CDR3；d)具有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的轻链CDR1；e)具有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的轻链CDR2；和f)具有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的轻链CDR3。抗体或其抗原结合片段涵盖例如由杂交瘤克隆TW7-28G11产生的抗体。抗体或其抗原结合片段也可以涵盖例如由本文中描述的任何其它抗LAP杂交瘤克隆产生的抗体。虽然未缀合的抗体可以是有效的，在一个实施方案中，LAP结合剂可以与细胞毒剂或化疗剂或药物缀合。
通过施用LAP结合剂不仅减少LAP+ Tregs，而且还减少FoxP3+ Tregs。因此，本文中还描述了减少肿瘤中的FoxP3+调节T细胞数目的方法，所述方法包括对所述受试者施用LAP结合剂。关于本文中描述的其它方面，在一个实施方案中，LAP结合剂可以是抗体或其抗原结合片段。在一个实施方案中，抗体可以是单克隆抗体或其抗原结合片段。在另一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段可以是嵌合的、CDR移植的、人源化的或完全人的。在另一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含1个或更多个、2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、或5个或更多个、或所有6个重链和轻链互补决定区(CDR)，包括a)具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的重链CDR1；b)具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的重链CDR2；c)具有SEQ IDNO:11的氨基酸序列的重链CDR3；d)具有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的轻链CDR1；e)具有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的轻链CDR2；和f)具有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的轻链CDR3。抗体或其抗原结合片段涵盖例如由杂交瘤克隆TW7-28G11产生的抗体。抗体或其抗原结合片段也可以涵盖例如由本文中描述的任何其它抗LAP杂交瘤克隆产生的抗体。虽然未缀合的抗体可以是有效的，但是在一个实施方案中，LAP结合剂可以与细胞毒剂或化疗剂或药物缀合。
本文还描述了减少肿瘤中肿瘤浸润性免疫抑制T细胞的数目或活性的方法，所述方法包括对具有包含肿瘤浸润性免疫抑制T细胞的肿瘤的受试者施用LAP结合剂，从而减少此类细胞的数目或活性。在一个实施方案中，LAP结合剂可以是抗体或其抗原结合片段。在一个实施方案中，抗体可以是单克隆抗体或其抗原结合片段。在另一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段可以是嵌合的、CDR移植的、人源化的或完全人的。在另一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含1个或更多个、2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、或5个或更多个、或所有6个重链和轻链互补决定区(CDR)，包括a)具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的重链CDR1；b)具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的重链CDR2；c)具有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的重链CDR3；d)具有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的轻链CDR1；e)具有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的轻链CDR2；和f)具有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的轻链CDR3。抗体或其抗原结合片段涵盖例如由杂交瘤克隆TW7-28G11产生的抗体。抗体或其抗原结合片段也可以涵盖例如由本文中描述的任何其它抗LAP杂交瘤克隆产生的抗体。虽然未缀合的抗体可以是有效的，但是在一个实施方案中，LAP结合剂可以与细胞毒剂或化疗剂或药物缀合。
在在本文中证明LAP结合剂减少免疫抑制性T细胞群体，包括与肿瘤组织相关或肿瘤组织内浸润的免疫抑制性T细胞的情况下，得出结论可以使用如本文所述的LAP结合剂增加肿瘤特异性免疫。因此，这提供了增加肿瘤特异性免疫的方法，包括对有此需要的受试者施用治疗有效量的LAP结合剂。这还提供了治疗LAP表达和/或活性与癌症或肿瘤特异性免疫的抑制相关的癌症或肿瘤的方法，所述方法包括对有此需要的受试者施用治疗有效量的LAP结合剂。在这些方面，如在本文所述的其它方面一样，施用的LAP结合剂可以包括，例如，抗体或其抗原结合片段。在一个实施方案中，抗体可以是单克隆抗体或其抗原结合片段。在另一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段可以是嵌合的、CDR移植的、人源化的或完全人的。在另一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含1个或更多个、2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、或5个或更多个、或所有6个重链和轻链互补决定区(CDR)，包括a)具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的重链CDR1；b)具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的重链CDR2；c)具有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的重链CDR3；d)具有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的轻链CDR1；e)具有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的轻链CDR2；和f)具有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的轻链CDR3。抗体或其抗原结合片段涵盖例如由杂交瘤克隆TW7-28G11产生的抗体。抗体或其抗原结合片段也可以涵盖例如由本文中描述的任何其它抗LAP杂交瘤克隆产生的抗体。虽然未缀合的抗体可以是有效的，但是在一个实施方案中，LAP结合剂可以与细胞毒剂或化疗剂或药物缀合。
如本文中描述，发现了用LAP结合剂治疗不仅减少肿瘤中的LAP+和FoxP3+ Tregs数目，它还增加肿瘤中的CD8+细胞毒性T细胞数目。因此，本文中还描述了增加肿瘤中的CD8+细胞毒性T细胞数目的方法，所述方法包括对具有肿瘤的受试者施用LAP结合剂。在这些方面，如在本文所述的其它方面一样，施用的LAP结合剂可以包括，例如，抗体或其抗原结合片段。在一个实施方案中，抗体可以是单克隆抗体或其抗原结合片段。在另一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段可以是嵌合的、CDR移植的、人源化的或完全人的。在另一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含1个或更多个、2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、或5个或更多个、或所有6个重链和轻链互补决定区(CDR)，包括a)具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的重链CDR1；b)具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的重链CDR2；c)具有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的重链CDR3；d)具有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的轻链CDR1；e)具有SEQ IDNO:15的氨基酸序列的轻链CDR2；和f)具有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的轻链CDR3。抗体或其抗原结合片段涵盖例如由杂交瘤克隆TW7-28G11产生的抗体。抗体或其抗原结合片段也可以涵盖例如由本文中描述的任何其它抗LAP杂交瘤克隆产生的抗体。虽然未缀合的抗体可以是有效的，但是在一个实施方案中，LAP结合剂可以与细胞毒剂或化疗剂或药物缀合。
除了对CD8+细胞毒性T细胞的数目和/或活性的影响外，还发现了用LAP结合剂处理可以增加表达IFNγ的外周CD4+ T细胞的群体。因此，本文中还描述了增加有此需要的受试者中表达IFNγ的外周CD4+ T细胞的方法，所述方法包括对所述受试者施用LAP结合剂。测量由CD4+ T细胞的IFNγ产生或分泌是本领域技术人员已知的和/或在本文中别处描述。在此方面，如在本文中描述的其它方面一样，施用的LAP结合剂可以包括，例如，抗体或其抗原结合片段。在一个实施方案中，抗体可以是单克隆抗体或其抗原结合片段。在另一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段可以是嵌合的、CDR移植的、人源化的或完全人的。在另一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含1个或更多个、2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、或5个或更多个、或所有6个重链和轻链互补决定区(CDR)，包括a)具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的重链CDR1；b)具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的重链CDR2；c)具有SEQ IDNO:11的氨基酸序列的重链CDR3；d)具有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的轻链CDR1；e)具有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的轻链CDR2；和f)具有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的轻链CDR3。抗体或其抗原结合片段涵盖例如由杂交瘤克隆TW7-28G11产生的抗体。抗体或其抗原结合片段也可以涵盖例如由本文中描述的任何其它抗LAP杂交瘤克隆产生的抗体。虽然未缀合的抗体可以是有效的，但是在一个实施方案中，LAP结合剂可以与细胞毒剂或化疗剂或药物缀合。
本文中还描述了抑制肿瘤中由CD8+和/或CD4+ T细胞的免疫抑制因子或标志物表达的方法，所述方法包括对具有肿瘤的受试者施用LAP结合剂。肿瘤中由CD8+和/或CD4+ T细胞产生的免疫抑制因子或标志物包括例如PD-1、LAG3和CD103等等，并且抑制T细胞增殖或对刺激，包括例如T细胞受体刺激或抗原刺激的响应性。在此方面，如在本文中描述的其它方面一样，施用的LAP结合剂可以包括，例如，抗体或其抗原结合片段。在一个实施方案中，抗体可以是单克隆抗体或其抗原结合片段。在另一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段可以是嵌合的、CDR移植的、人源化的或完全人的。在另一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含1个或更多个、2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、或5个或更多个、或所有6个重链和轻链互补决定区(CDR)，包括a)具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的重链CDR1；b)具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的重链CDR2；c)具有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的重链CDR3；d)具有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的轻链CDR1；e)具有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的轻链CDR2；和f)具有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的轻链CDR3。抗体或其抗原结合片段涵盖例如由杂交瘤克隆TW7-28G11产生的抗体。抗体或其抗原结合片段也可以涵盖例如由本文中描述的任何其它抗LAP杂交瘤克隆产生的抗体。虽然未缀合的抗体可以是有效的，但是在一个实施方案中，LAP结合剂可以与细胞毒剂或化疗剂或药物缀合。
还发现与LAP结合剂联合施用肿瘤抗原或肿瘤抗原疫苗促进抗肿瘤免疫应答。这种方法可以补充例如肿瘤抗原疫苗治疗方法。因此，本文还描述了促进抗肿瘤免疫应答的方法，该方法包括用肿瘤抗原对需要***的受试者接种疫苗，并且对所述受试者施用LAP结合剂。肿瘤抗原和肿瘤抗原疫苗是本领域已知的并在本文其它地方描述。在此方面，如在本文中描述的其它方面一样，施用的LAP结合剂可以包括，例如，抗体或其抗原结合片段。在一个实施方案中，抗体可以是单克隆抗体或其抗原结合片段。在另一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段可以是嵌合的、CDR移植的、人源化的或完全人的。在另一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含1个或更多个、2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、或5个或更多个、或所有6个重链和轻链互补决定区(CDR)，包括a)具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的重链CDR1；b)具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的重链CDR2；c)具有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的重链CDR3；d)具有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的轻链CDR1；e)具有SEQ IDNO:15的氨基酸序列的轻链CDR2；和f)具有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的轻链CDR3。抗体或其抗原结合片段涵盖例如由杂交瘤克隆TW7-28G11产生的抗体。抗体或其抗原结合片段也可以涵盖例如由本文中描述的任何其它抗LAP杂交瘤克隆产生的抗体。虽然未缀合的抗体可以是有效的，但是在一个实施方案中，LAP结合剂可以与细胞毒剂或化疗剂或药物缀合。
尽管用免疫检查点抑制剂进行癌症治疗可有效地克服肿瘤利用的免疫抑制以避免免疫攻击，但是某些类型的癌症是或可以变成对于用检查点抑制剂治疗难治的。例如，某些癌症，包括某些胶质母细胞瘤、黑素瘤和结肠直肠癌等趋向于对PD-1及其受体抑制剂治疗难治的。用LAP结合剂的治疗可以有效促进这些癌症中的抗肿瘤免疫应答，并且预期此类治疗也可以恢复或建立此类癌症对检查点抑制剂的敏感性。因此，本文描述了治疗对免疫检查点抑制剂治疗难治的癌症的方法，该方法包括对具有此类癌症的受试者施用LAP结合剂。在此方面，如在本文中描述的其它方面一样，施用的LAP结合剂可以包括，例如，抗体或其抗原结合片段。在一个实施方案中，抗体可以是单克隆抗体或其抗原结合片段。在另一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段可以是嵌合的、CDR移植的、人源化的或完全人的。在另一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含1个或更多个、2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、或5个或更多个、或所有6个重链和轻链互补决定区(CDR)，包括a)具有SEQ IDNO:9的氨基酸序列的重链CDR1；b)具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的重链CDR2；c)具有SEQID NO:11的氨基酸序列的重链CDR3；d)具有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的轻链CDR1；e)具有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的轻链CDR2；和f)具有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的轻链CDR3。抗体或其抗原结合片段涵盖例如由杂交瘤克隆TW7-28G11产生的抗体。抗体或其抗原结合片段也可以涵盖例如由本文中描述的任何其它抗LAP杂交瘤克隆产生的抗体。虽然未缀合的抗体可以是有效的，但是在一个实施方案中，LAP结合剂可以与细胞毒剂或化疗剂或药物缀合。在一个实施方案中，方法进一步包括施用免疫检查点抑制剂，其可以包括但不限于癌症抗拒(refractory)的检查点抑制剂。在一个实施方案中，癌症是胶质母细胞瘤,结肠直肠癌或黑素瘤。在一个实施方案中，在用LAP结合剂治疗前，癌症是PD-1或PD-L1抑制剂难治的。
在本文中证明用LAP结合剂的治疗可有效克服肿瘤免疫抑制的情况下，本文还描述了基于患者肿瘤中存在的LAP+ Treg的存在(检测)和/或量(定量检测)对治疗和/或预期或预测的治疗功效选择患者的方法。得出结论，如果LAP+ Treg存在和/或相对于参照以相当大的数目存在，则患者将更可能响应用如本文所述的LAP结合剂的治疗。因此，本文还描述了用于鉴定或选择具有可能响应用LAP结合剂的疗法的肿瘤的患者的方法，所述方法包括分析来自受试者的肿瘤样品以确定LAP+ T调节细胞的存在，和LAP+ T调节细胞是否存在或相对于参照是否以相当大的数目存在。如果患者的肿瘤具有LAP+ Treg或例如相对于参照具有相当大的数目，则患者被鉴定为具有可能响应用LAP结合剂治疗的肿瘤。对于此类患者，该方法可以进一步包括治疗，包括对受试者施用LAP结合剂，从而促进抗肿瘤免疫应答。作为一个实例，参照可以是已知用LAP结合剂有效治疗的肿瘤中存在的LAP+ Treg细胞的数目。在该实施方案中，如果患者肿瘤中的LAP+ Treg细胞的数目例如为此类参照的至少20％或更多(即，相对于参照的相当大的数目，如该术语在本文中使用)，患者会比当患者肿瘤中的数目低于所述水平时更可能响应用LAP结合剂的治疗。如果发现患者的肿瘤没有LAP+Treg或发现相对于参照具有低得多的水平的LAP+ Treg，则用LAP结合剂进行治疗，其仍然可以有可能的是用LAP结合剂的治疗将促进治疗，但是可能性小于水平较高的情况。在此类情况下，将患者鉴定为不太可能响应LAP结合剂，并且可以考虑或实施其它治疗方法，如对患者施用除了LAP结合剂以外的免疫调节剂或抗肿瘤剂。此类治疗方法的非限制性实例可包括例如施用免疫检查点抑制剂、化疗剂和/或γ辐射。
在此方面，如在本文中描述的其它方面一样，施用的LAP结合剂可以包括，例如，抗体或其抗原结合片段。在一个实施方案中，抗体可以是单克隆抗体或其抗原结合片段。在另一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段可以是嵌合的、CDR移植的、人源化的或完全人的。在另一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含1个或更多个、2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、或5个或更多个、或所有6个重链和轻链互补决定区(CDR)，包括a)具有SEQID NO:9的氨基酸序列的重链CDR1；b)具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的重链CDR2；c)具有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的重链CDR3；d)具有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的轻链CDR1；e)具有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的轻链CDR2；和f)具有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的轻链CDR3。抗体或其抗原结合片段涵盖例如由杂交瘤克隆TW7-28G11产生的抗体。抗体或其抗原结合片段也可以涵盖例如由本文中描述的任何其它抗LAP杂交瘤克隆产生的抗体。虽然未缀合的抗体可以是有效的，但是在一个实施方案中，LAP结合剂可以与细胞毒剂或化疗剂或药物缀合。
还发现了记忆T细胞的标志物在使用LAP结合剂***后上调。因此，本文中还描述了在有此需要的受试者中促进对感兴趣的抗原特异性的记忆T细胞的形成的方法，所述方法包括对所述受试者施用LAP结合剂和所述感兴趣的抗原。在一个实施方案中，用LAP结合剂的治疗导致增加的CD44+和/或增加的IL7R+ T细胞。涵盖的是，此方法不仅在促进和维持响应肿瘤抗原的记忆中，而且还对促进和维持响应传染性病原体的记忆提供益处。感兴趣的抗原(其可以纯化的抗原或更粗制的抗原制剂，如全肿瘤抗原制剂)可以单独、与佐剂一起、或以树突细胞疫苗的形式施用。在此方面，如在本文中描述的其它方面一样，施用的LAP结合剂可以包括，例如，抗体或其抗原结合片段。在一个实施方案中，抗体可以是单克隆抗体或其抗原结合片段。在另一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段可以是嵌合的、CDR移植的、人源化的或完全人的。在另一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含1个或更多个、2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、或5个或更多个、或所有6个重链和轻链互补决定区(CDR)，包括a)具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的重链CDR1；b)具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的重链CDR2；c)具有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的重链CDR3；d)具有SEQID NO:14的氨基酸序列的轻链CDR1；e)具有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的轻链CDR2；和f)具有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的轻链CDR3。抗体或其抗原结合片段涵盖例如由杂交瘤克隆TW7-28G11产生的抗体。抗体或其抗原结合片段也可以涵盖例如由本文中描述的任何其它抗LAP杂交瘤克隆产生的抗体。虽然未缀合的抗体可以是有效的，但是在一个实施方案中，LAP结合剂可以与细胞毒剂或化疗剂或药物缀合。
本文还描述了LAP结合剂用于下列各项的用途：
·治疗特征为或涉及LAP+ T调节细胞的不想要的数目或活动的疾病或病症；
·通过降低肿瘤浸润性免疫抑制性T细胞的数目或活性来治疗癌症，所述用途包括对具有包含肿瘤浸润性免疫抑制性T细胞的肿瘤的受试者施用LAP结合剂，从而减少此类细胞的数目或活性；
·通过提高肿瘤特异性免疫治疗癌症，所述用途包括对有此需要的受试者施用治疗有效量的LAP结合剂；
·治疗LAP表达和/或活性与抑制癌症或肿瘤特异性免疫有关的癌症或肿瘤，所述用途包括对有此需要的受试者施用治疗有效量的LAP结合剂；
·通过增加肿瘤中的CD8+细胞毒性T细胞的数目来治疗癌症或肿瘤，所述用途包括对具有肿瘤的受试者施用LAP结合剂；
·通过在有此需要的受试者中增加表达IFNγ的外周CD4+ T细胞来治疗癌症或肿瘤，所述用途包括对受试者施用LAP结合剂；
·通过在有此需要的受试者中增加表达颗粒酶B的外周CD8+ T细胞来治疗癌症或肿瘤，所述用途包括对受试者施用LAP结合剂；
·通过减少肿瘤中FoxP3+调节性T细胞的数目来治疗癌症或肿瘤，所述用途包括对受试者施用LAP结合剂；
·通过抑制肿瘤中由CD8+和/或CD4+ T细胞的免疫抑制因子表达来治疗癌症或肿瘤，所述用途包括对具有肿瘤的受试者施用LAP结合剂；
·促进抗肿瘤免疫应答，所述用途包括用肿瘤抗原对需要***的受试者接种疫苗并对所述受试者施用LAP结合剂；
·治疗对用免疫检查点抑制剂的治疗难治的癌症，所述用途包括对具有此类癌症的受试者施用LAP结合剂；
·治疗癌症，所述用途包括分析来自受试者的肿瘤样品以确定LAP+ T调节细胞的存在，并且如果存在LAP+ T调节细胞，则对受试者施用LAP结合剂，从而促进抗肿瘤免疫应答；
·促进对感兴趣的抗原特异性的记忆T细胞的形成以治疗受试者中的癌症或感染，所述用途包括对所述受试者施用LAP结合剂和感兴趣的抗原。
在本文中描述的每个方面，LAP结合剂可以是例如特异性结合具有SEQ ID NO:1-3中任一项中列出的序列的LAP分子的LAP结合剂。
在本文中描述的每个方面的一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段可以是例如结合LAP配体相互作用位点的抗体或其抗原结合片段。LAP配体相互作用位点可以是例如与成熟TGFβ相互作用的位点、与整联蛋白相互作用的位点、和/或与潜伏TGFβ结合蛋白(LTBP)相互作用的位点。
在本文中描述的每个方面的一个实施方案中，LAP结合剂结合与TGF-β复合的LAP，并且抑制TGF-β从所述复合物释放。
在本文中描述的每个方面的一个实施方案中，单克隆抗体是由选自以下的任一种杂交瘤克隆生成的单克隆抗体：TW4-9E7,TW4-5A8,TW4-3E5,TW4-4E5,TW4-12B12,TW4-13B12,TW4-1G12,TW4-3G5,TW4-2F8,TW4-6H10,TW4-1G2,TW4-1E1,TW4-16F4,TW4-8F10,TW4-3H6,TW4-2C9,TW7-16B4,TW7-28G11,TW7-7H4,和TW7-20B9。
在本文中描述的每个方面的一个实施方案中，LAP结合剂是小分子抑制剂、试剂或化合物。
在本文中描述的每个方面的一个实施方案中，LAP结合剂是结合LAP或与LAP物理相互作用的RNA或DNA适体。
在本文中描述的每个方法的一个实施方案中，受试者具有或已经诊断为具有癌症。
在本文中描述的每个方法的一个实施方案中，受试者具有或已经诊断为具有脑肿瘤、黑素瘤或结肠直肠癌。在一个实施方案中，脑肿瘤是胶质母细胞瘤。
在本文中描述的每个治疗方法的一个实施方案中，所述方法进一步包括对所述受试者施用抗癌疗法、化疗剂或免疫调节剂。在一个实施方案中，所述免疫调节剂包含免疫检查点抑制剂。在一个实施方案中，免疫检查点抑制剂结合下列一项或多项：PD1、PDL1、PDL2、CTLA4、LAG3、TIM3、TIGIT和/或CD103。在一个实施方案中，免疫检查点抑制剂是PD1、PDL1、和/或PDL2抑制剂，其选自派姆单抗(pembrolizumab)；纳武单抗(nivolumab)；MK-3475；MPDL3280A；MEDI0680；MEDI4736；AMP-224；和MSB0010718C。
在本文中描述的每个治疗方法的一个实施方案中，方法进一步包括对受试者施用化疗剂。
在本文中描述的每个治疗方法的一个实施方案中，方法进一步包括对所述受试者施用肿瘤或癌症抗原。在一个实施方案中，方法包括与树突细胞(DC)疫苗接种同时或组合施用LAP结合剂。
在本文中描述的每个治疗方法的一个实施方案中，LAP结合剂是如本文中描述的分离的抗体或其抗原结合片段或包含此类抗体或其抗原结合片段的药物组合物。
定义
除非本文另有定义，与本申请结合使用的科学和技术术语应具有本公开所属领域的普通技术人员通常理解的含义。应当理解，本发明不限于本文所述的特定方法、方案和试剂等，并且因此可以变化。本文使用的术语仅用于描述具体实施方案的目的，并不意图限制仅由权利要求书限定的本发明的范围。免疫学和分子生物学常用术语的定义见The MerckManual of Diagnosis and Therapy,第18版,Merck Research Laboratories出版,2006(ISBN0-911910-18-2)；Robert S.Porter et al.(编),The Encyclopedia of MolecularBiology,Blackwell Science Ltd.出版,1994(ISBN 0-632-02182-9)；以及RobertA.Meyers(编),Molecular Biology and Biotechnology:a Comprehensive DeskReference,VCH Publishers,Inc.出版,1995(ISBN 1-56081-569-8)；Immunology byWerner Luttmann,Elsevier出版,2006。分子生物学中的常用术语的定义参见BenjaminLewin,Genes IX,Jones&Bartlett Publishing出版,2007(ISBN-13:9780763740634)；Kendrew et al.(编),The Encyclopedia of Molecular Biology,由Blackwell ScienceLtd.出版,1994(ISBN0-632-02182-9)；以及Robert A.Meyers(编),Maniatis et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,USA(1982)；Sambrook et al.,Molecular Cloning:ALaboratory Manual(第2版),Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold SpringHarbor,N.Y.,USA(1989)；Davis et al.,Basic Methods in Molecular Biology,Elsevier Science Publishing,Inc.,New York,USA(1986)；或Methods in Enzymology:Guide to Molecular Cloning Techniques Vol.152,S.L.Berger and A.R.Kimmerl编,Academic Press Inc.,San Diego,USA(1987)；Current Protocols in MolecularBiology(CPMB)(Fred M.Ausubel,et al.编,John Wiley and Sons,Inc.),CurrentProtocols in Protein Science(CPPS)(John E.Coligan,et.al.编,John Wiley andSons,Inc.)和Current Protocols in Immunology(CPI)(John E.Coligan,et.al.编JohnWiley and Sons,Inc.)，其全部通过引用完整并入本文。
如本文所用，术语“LAP结合剂”是指特异性结合LAP并显著调节LAP与任何与LAP相互作用的其配体或分子之间的相互作用并因此在体外、原位和/或体内调节其产生的生物学或功能活性(包括由LAP信号传导介导的下游途径的活性，诸如例如从小潜伏复合物或潜伏复合物中的TGF-β释放、LAP介导的免疫应答抑制和LAP介导的抗肿瘤免疫应答的抑制)的分子或试剂。考虑用于本文描述的各个方面和实施方案的示例性LAP结合剂包括但不限于抗体或其抗原结合片段，其特异性结合LAP上涉及LAP和TGF-β、LAP和整联蛋白、和/或LAP和LTBP的结合和/或相互作用，和/或调节LAP同二聚化和/或结合的一个或多个氨基酸残基或表位(包括当TGF-β与LAP结合时形成的表位)；小分子试剂，其靶向或特异性结合LAP上涉及LAP和TGF-β、LAP和整联蛋白、和/或LAP和LTBP、和/或LAP和GARP的结合和/或相互作用，和/或调节LAP同二聚化和/或结合的一个或多个氨基酸残基或表位；和RNA或DNA适体，其结合LAP上涉及LAP和TGF-β、LAP和整联蛋白、和/或LAP和LTBP的结合和/或相互作用，和/或调节LAP同二聚化和/或结合的一个或多个氨基酸残基或表位。在本文所述方面的优选实施方案中，LAP结合剂特异性结合LAP并抑制或阻断自小潜伏复合物或潜伏复合物的TGF-β释放。
如本文所用，相对于在不存在LAP结合剂的情况下的相互作用和/或活性，LAP结合剂具有在体外、原位和/或体内调节LAP和TGF-β、LAP和整联蛋白、和/或LAP和LTBP之间的相互作用和/或调节LAP同二聚化和/或其所得生物或功能活性达至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％，至少99％或更多的能力。至少如本文所述的LAP结合剂在癌症模型如皮下小鼠胶质瘤模型中阻断肿瘤诱导的免疫抑制，并在所述模型中导致在CD4+ T细胞上较高的IFNγ表达、减少的调节CD4+ T细胞的数目和/或活性、增加的细胞毒性CD8+ T细胞数目和/或减少的对肿瘤的浸润、肿瘤大小、和/或增加的存活。
“调节LAP和TGF-β/整联蛋白/潜伏性TGF-β结合蛋白/LAP之间的相互作用”或“影响LAP和TGF-β/整联蛋白/潜伏性TGF-β结合蛋白/LAP之间的相互作用”在本文中可互换使用，通常是指与在相同条件下但不存在LAP结合剂的情况下LAP和TGF-β/整联蛋白/潜伏性TGF-β结合蛋白/LAP之间的相互作用相比调节(即增加或减少)LAP和TGF-β/整联蛋白/潜在TGF-β结合蛋白/LAP之间的相互作用或结合达至少5％、至少10％、至少25％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或更多。在本文描述的方面的优选实施方案中，LAP结合剂调节LAP和TGF-β之间的相互作用，使得自小潜伏复合物的TGF-β的释放被抑制或阻断，和/或减少调节性CD4+和/或CD8+ T细胞的数目和/或活性。
如本文所用，“增加肿瘤特异性免疫”是指直接增加或扩大针对癌症或肿瘤的免疫应答和/或除去对癌症或肿瘤的免疫应答的抑制，并且包括但是不限于例如增加癌症特异性抗原的识别；和/或增加到肿瘤部位的肿瘤浸润性淋巴细胞(例如CD4和CD8 T细胞)和/或肿瘤浸润性先天免疫细胞(如天然杀伤细胞、天然杀伤T细胞、巨噬细胞和树突细胞)；在肿瘤/癌症部位增加或扩大细胞因子和/或趋化因子产生，如IFNγ、CXCL10、CXCL9和CXCL11、IL-17、IL-12；降低/抑制免疫抑制分子，如LAG3和PD1；减少/抑制调节细胞群体，如T调节细胞，包括Foxp3+CD4 T细胞和CD103+CD8T细胞等。在此上下文和本文中的其它上下文中，“增加”指相对于参照，最小至统计学上显著的增加，优选至少10％或更多。
如本文所用，短语“LAP表达和/或活性与抑制癌症或肿瘤特异性免疫相关的癌症或肿瘤”是指其中LAP的表达和/或活性已经被确定为与抑制癌症或肿瘤特异性免疫相关的那些癌症/肿瘤。换言之，LAP的表达和/或活性与癌症特异性抗原的识别降低相关的癌症或肿瘤；到肿瘤部位的肿瘤浸润性淋巴细胞(例如CD4和CD8 T细胞)和/或肿瘤浸润的先天免疫细胞(如天然杀伤细胞、天然杀伤T细胞、巨噬细胞和树突细胞)的数目和/或活性的缺乏或减少；在肿瘤/癌症部位的减少或缺乏的细胞因子和/或趋化因子产生如IFNγ、CXCL10、CXCL9和CXCL11、IL-17、IL-12；增加的免疫抑制分子表达，如LAG3和PD1；调节细胞群体，如T调节细胞的存在增加，包括例如Foxp3+CD4T细胞和CD103+CD8T细胞。
如本文所用，抗体或其抗原结合片段包括单克隆抗体、人抗体、人源化抗体或嵌合抗体、单链抗体、Fab片段，F(ab')片段、由Fab表达文库产生的片段、和/或上述任何物质的抗原结合片段。抗体还指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即含有抗原或靶结合位点或“抗原结合片段”的分子。本文所述的免疫球蛋白分子可以是免疫球蛋白分子的任何类型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类，如本领域技术人员所理解的。
术语“抗体片段”或“抗原结合片段”包括但不限于：(i)Fab片段，其具有VL、CL、VH和CH1域；(ii)Fab'片段，其是在CH1域的C端具有一个或多个半胱氨酸残基的Fab片段；(iii)具有VH和CH1域的Fd片段；(iv)Fd'片段，其具有VH和CH1域和在CH1域的C端的一个或多个半胱氨酸残基；(v)Fv片段，其具有抗体的单一臂的VL和VH域；(vi)dAb片段(Ward et al.,Nature341,544-546(1989))，其由VH域或VL域组成；(vii)分离的CDR区；(viii)F(ab')2片段，一种包含由铰链区处的二硫桥连接的两个Fab'片段的二价片段；(ix)单链抗体分子(例如单链Fv；scFv)(Bird et al.,Science 242:423-426(1988)；和Huston et al.,PNAS(USA)85:5879-5883(1988))；(x)具有两个抗原结合位点的"双抗体"，其包含同一多肽链中与轻链可变域(VL)连接的重链可变域(VH)(参见例如EP 404,097；WO 93/11161；以及Hollinger etal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993))；(xi)"线性抗体"，其包含一对串联Fd区段(VH-CH1-VH-CH1)，该区段与互补的轻链多肽一起形成一对抗原结合区(Zapata etal.Protein Eng.8(10):1057-1062(1995)；和美国专利No.5,641,870)；和任何前述物质的修饰的形式(例如通过共价附着聚亚烷基二醇(例如聚乙二醇、聚丙二醇、聚丁二醇)或其它合适的聚合物修饰)，其保留了抗原结合活性。
如本文所用，“表位”可以由连续氨基酸或通过蛋白质的三级折叠而并置的非连续氨基酸形成。由连续氨基酸形成的表位通常在暴露于变性溶剂时保留，而通过三级折叠形成的表位通常在用变性溶剂处理时丧失。表位通常包括以独特的空间构象中的至少3个，更通常至少5个，约9个，或约8-10个氨基酸。“表位”包括通常由免疫球蛋白VH/VL对结合的结构单元。表位定义抗体的最小结合位点，因此代表抗体特异性的靶物。在单域抗体的情况下，表位表示由分离的可变域结合的结构单元。术语“抗原决定簇”和“表位”也可在本文中互换使用。
术语“特异性”、“特异性结合”或“对…特异性”是指特定抗体或其抗原结合片段可以结合的不同类型的抗原或抗原决定簇的数目。因此，与第二靶物或抗原相比，如本文所定义的抗体或其抗原结合片段在其以下述亲和力(如本文中所述并且适当地例如以KD值表示)结合第一抗原时被说成对第一靶物或抗原是“特异性的”，所述亲和力比所述氨基酸序列或多肽结合另一种靶物或多肽的亲和力好至少50倍，如至少100倍，优选至少1000倍，并且高达10,000倍或更高。优选的，当抗体或其抗原结合片段对靶标或抗原“特异性”时，与另一靶标或抗原相比，其能够结合所述靶标或抗原，但不结合其他靶标或抗原。
如本文所用，“小分子抑制剂”包括但不限于小肽或肽样分子、可溶性肽和合成的非肽基有机或无机化合物。小分子抑制剂或拮抗剂可以具有下列任一项的分子量：约100至约20,000道尔顿(Da)、约500至约15,000Da、约1000至约10,000Da。
附图简述
图1A-1E表明了GBM中免疫细胞上的LAP表达。从颅内GBM的percoll梯度分离后分离单核细胞。在髓样细胞(图1A)、γδT细胞(图1B)和CD4 T细胞(图1C)上测定表面LAP表达的水平。在GBM中的CD4T细胞上检查LAP和FoxP3的共表达(图1D)。图1E。在GBM小鼠脾脏中γδT细胞上的LAP的表达。*P<0.05
图2A-2D表明了LAP+γδT细胞表现出免疫抑制特性。通过qRT-PCR(图2A)和流式细胞术(图2B)，在幼稚小鼠(
Figure GDA0003423274920000211
mice)中的LAP-和LAP+γδT细胞上分析炎性细胞因子的表达。LAP+γδT细胞抑制T细胞增殖(图2C)并在幼稚小鼠中诱导FoxP3表达(图2D)。
图3A-3B表明了胶质瘤对γδT细胞的LAP表达的诱导。将LAP-γδT细胞单独培养或与GL261胶质瘤细胞共培养。两天和三天后，对γδT细胞分析LAP表达。显示了这两个时间点的代表性结果(图3A)和三天温育的统计分析(图3B)。*P<0.05
图4A-4B表明了抗LAP处理使免疫***偏向促炎应答。用抗LAP或IC抗体处理幼稚小鼠。从脾和肠系膜***(MLN)中分离T细胞，并且测量T细胞增殖(图4A)。激活分离的T细胞，并且通过ELISA估算细胞因子分泌以确定细胞产生IFN-γ、IL17和IL-2的潜力(图4B)。
图5A-5K表明了抗LAP处理消除皮下胶质瘤的生长并激活免疫***。将GL261胶质瘤细胞植入C57BL/6小鼠的体侧，并且用抗LAP或同种型匹配对照(IC)抗体进行处理。在抗LAP处理后，肿瘤收缩(图5A和5B)，外周Th1应答增加(图5C)，调节性T细胞减少(图5D-5F，5K)，CTL应答上调(图5G-5J)。*p<0.05，**p<0.01，****p<0.0001
图6表明了LAP表达在抗LAP处理的携带黑素瘤的小鼠中的T细胞亚组上减少。
图7表明了CD4+ T细胞在抗LAP处理的携带黑素瘤的小鼠中表现出促炎性表型。
图8表明了CD8+ T细胞在抗LAP处理的携带黑素瘤的小鼠中表现出促炎性表型。
图9表明了NK细胞在抗LAP处理的携带黑素瘤的小鼠中表现出促炎性表型。
图10表明了从抗LAP处理的小鼠的LN中分离的免疫细胞增殖得更好。在用100μg/ml OVA体外刺激3天后，OVA--携带黑素瘤的小鼠的腹股沟***细胞的增殖。
图11表明了从抗LAP处理的小鼠的LN分离的免疫细胞具有促炎性谱。在用100μg/ml OVA体外刺激3天后，OVA--携带黑素瘤的小鼠的腹股沟***细胞的细胞因子生成(通过ELISA)。
图12表明了CD4+ T细胞上的LAP表达。
图13表明了CD16+CD14+上的LAP表达。
图14表明了CD11b+CD14+CD16--(经典单核细胞，类似Ly6C--hi)上的LAP表达。
图15表明了CD11b+CD14+CD16-(经典单核细胞，类似Ly6C--hi)上的LAP表达。
图16表明了Lin-CD11c+(mDC)上的LAP表达。
图17表明了Lin-CD11c-CD123+(pDC)的门控。
图18表明了Lin-CD11c-CD123+(pDC)上的LAP表达。
图19描绘了脾脏中CD4+ T细胞上的LAP表达。
图20表明了在抗LAP处理后的脾脏中CD4+ T细胞上的IFN-γ表达较高。
图21表明了在抗LAP处理后的脾脏中调节CD4+ T细胞的数目减少。
图22表明了在抗LAP处理后在脾脏中CD4+ T细胞上的CD103表达减少。
图23表明了在抗LAP处理后在脾脏中的CD8+ T细胞上的LAP表达。
图24表明了在抗LAP处理后在脾脏中CD8+ T细胞的细胞毒性表型增加。
图25表明了在抗LAP处理后在脾脏中CD8+ T细胞上的IFN-γ表达较高。
图26表明了在抗LAP处理后在脾脏中CD8+ T细胞的CD103表达上较低。
图27表明了抗LAP处理后引流***(LN)中T细胞亚组的比例。
图28表明了在抗LAP处理后在LN中的CD8+ T细胞上CD103表达较低。
图29表明了在抗LAP处理后在脾脏中CD11c和CD11b细胞上MHC II类表达增加。
图30表明了脾脏中髓样细胞上的LAP表达(幼稚小鼠)。
图31表明了CD103主要由CD11b-Hi/CD11c-Lo(幼稚小鼠)表达。
图32表明了在皮下GL261 GBM模型中，抗LAP(16B4)处理导致脾脏中CD11c-Lo和CD11c-Hi亚组比率的变化。
图33表明了在皮下GL261 GBM模型中脾脏中的CD11b-Hi/CD11c-Lo细胞上CD103表达被抗LAP降低。
图34表明了在皮下GL261 GBM模型中脾脏中的CD11b-Hi/CD11c-Lo细胞中CD103表达被抗LAP降低。
图35表明了在皮下GL261 GBM模型中脾脏中的CD11b-Hi/CD11c-Lo细胞上的PD-L1表达被抗LAP降低。
图36表明了在皮下GL261 GBM模型中在GBM小鼠中的脾脏中的髓样细胞上的LAP表达。
图37表明了在皮下GL261 GBM模型的肿瘤中CD4+和CD8+ T细胞上的LAP表达。
图38表明了体内CD4+ T细胞上的LAP表达。
图39表明了CD4+LAP+ T细胞在脾脏抗LAP处理后下调。
图40A-40B表明了抗LAP抗体介导ADCP和CDC。
图41表明了抗LAP处理后GBM中CD8+ T淋巴细胞的积累。
图42表明了抗-LAP处理后GBM中CD4+FoxP3+ T细胞减少。
图43表明了抗LAP处理后GBM中的LAG+CD4+ T细胞减少。
图44表明了抗LAP处理后GBM中的LAG+CD8+ T细胞减少。
图45表明了抗LAP处理后GBM中PD1+ T细胞的减少。
图46表明了抗LAP处理后GBM中PD-L1+ T细胞的减少。
图47表明了抗LAP处理后GBM中CD103+ T细胞减少。
图48表明了脾脏中CD4+ T细胞上CD103数目减少。
图49表明了脾脏和LN中CD8+ T细胞上CD103数目减少。
图50表明了携带B16-OVA的小鼠中用抗LAP处理导致对OVA刺激更好的T细胞应答。
图51描绘了所有人和小鼠LAP同种型之间的序列比对和比较。
图52描绘了所有人LAP同种型之间的序列比对和比较。
图53描绘了所有小鼠LAP同种型之间的序列比对和比较。
图54描绘了所有人和小鼠proTGF-β同种型之间的序列比对和比较。SEQ ID NO:25-30以其出现的顺序公开。
图55a-55n描绘了癌症模型中抗LAP抗体的治疗效果。图55a，55b：黑素瘤，B16；图55c-55f：颅内GBM，图55g，55h：皮下胶质母细胞瘤，GL261；图55i-55n结肠直肠癌(CRC)(图55i-55k：AOM/DSS CRC，图55l-55n：皮下CRC)。用TW7-28G11处理小鼠：图55a，55b，55g，55i-55n；和16B4：图55c-55f，55h。
图56a-56b描绘了使用黑素瘤肿瘤模型的抗LAP抗体对适应性免疫应答的效果。显示肿瘤内(图56a)和外周(图56b)免疫应答的效果。用TW7-28G11处理小鼠。
图57a-57j描绘了在脾脏中抗LAP抗体对先天免疫应答的作用。图57a，57b显示抗LAP处理后脾脏中CD11b-int/CD11c-hi细胞的积累和CD11b-hi/CD11c-int的减少。用抗LAP处理降低CD103和PD-L1的表达(图57c)。LAP主要在CD11b-hi细胞上表达(图57d)。与CD11b-int相比，CD11b-hi细胞表达增加的免疫抑制细胞因子、TGF-b和IL-10的水平，和减少促炎细胞因子IL-12的表达(图57e)。CD11b-int与CD8+ T细胞的共培养促进促炎细胞因子的表达(图57f)。CD11b-int上抗原呈递标志物MHCII(图57g)和CD86(图57h)的表达高于CD11b-hi。CD11b-hi细胞不能体外支持CD8+ T细胞生长(图57i)。抗LAP处理导致表达IFN-g的NK细胞的积累(图57j)。用TW7-16B4处理小鼠。
图58a-58d表明了抗LAP抗体消耗了抑制性CD4+ T细胞。图58a显示抗LAP处理在体内减少LAP+CD4+ T细胞的数目。用抗LAP的TW7-28G11克隆处理携带黑素瘤(B16)的小鼠，并用非竞争性TW7-16B4克隆进行计数。用TW7-28G11处理小鼠。图58b显示LAP+CD4+ T细胞表达增加的抑制标志物水平。图58c表明LAP+CD4+ T细胞拥有抑制能力。图58d显示抗LAP降低LAP+CD4+ T细胞的抑制能力。
图59a-59e表明了抗LAP抗体减少了脾脏和引流***(dLNs，图59a)中抑制性CD103+CD8+ T细胞的数目。CD8+但不是CD4+ T细胞是抗LAP的治疗效果所必需的(图59b)。抗LAP抗体在体外降低CD103+CD8+ T细胞的抑制能力(图59c)。将CD103+CD8+ T细胞过继性转移到CD8KO小鼠消除抗LAP的治疗作用，从而表明其在体内的抑制作用(图59d)。在其过继转移后CD8+ T细胞上的CD103表达得到保留，并且CD103+CD8+ T表达降低的活化标志物水平(图59e)。用TW7-28G11处理小鼠。
图60a-60c表明了与树突细胞(DC)疫苗接种组合的抗LAP处理保护小鼠免于GBM。用加载有卵清蛋白的DC预先接种小鼠并用抗LAP处理。一周后，颅内对小鼠植入GL261-OVA胶质瘤细胞，然后追踪小鼠存活和肿瘤生长。图60d-60f表明在抗LAP处理后肿瘤特异性CD8+记忆细胞的积累增加。用TW7-16B4抗LAP克隆处理小鼠。
图61表明了与树突细胞疫苗接种组合的抗LAP处理改善了B16黑素瘤的处理。用加载有卵清蛋白的DC预先接种小鼠并用TW7-28G11处理。一周后，对小鼠植入B16-OVA黑素瘤，并测量肿瘤生长。幼稚(未接种疫苗的小鼠)用作接种疫苗的对照。
图62表明了TGF-β1/LAP和其它LAP相关mRNA的高表达与较好的GBM、黑素瘤和CRC患者存活相关。基于肿瘤癌症基因组图谱(Tumor Cancer Genome Atlas，TCGA)数据，癌症患者存活和肿瘤中mRNA表达之间的关系。
图63描绘了表达低水平的LAP相关基因(TCGA)的其它癌症患者(AML、膀胱癌、胃腺癌)的存活。
图64描绘了通过其对TGF-β释放的抑制的抗LAP抗体的示例性筛选。通过处理表达人TGF-β的P3U1细胞并通过ELISA测量培养基中分泌的活性/游离TGF-β(非酸化条件)的水平来测试抗LAP的不同克隆。
图65表明了抗LAP处理不影响血小板计数和活性。用抗LAP的TW7-28G11克隆(250ug/小鼠)处理小鼠，并且在3天后分析(n＝3)。
图66描绘了小鼠和人proTGF-β蛋白序列之间的相似性。
图67表明了在抗LAP处理后，GBM中的记忆T细胞的标志物上调。
发明详述
提供了涉及本文中所述的下述发现的组合物和方法，即当用抗LAP抗体处理时肿瘤生长较低并且小鼠存活更长，并且本文所述的抗LAP抗体阻断TGF-β释放并消耗抑制性调节性T细胞群体，包括CD4+LAP+ T细胞和CD8+CD103+ T细胞。在各种癌症模型中测试抗LAP抗体，包括胶质母细胞瘤模型、黑素瘤模型和结肠直肠癌模型，并观察到类似的肿瘤内和外周免疫作用，如本文所述。因此，如本文所证明，用抗LAP抗体的治疗，其部分通过阻断TGF-β释放和消耗抑制性CD4+ T细胞起作用，强烈地影响***性和肿瘤内免疫应答，其通过激活先天和适应性免疫两者并克服抑制肿瘤特异性免疫的机制。
LAP和LAP结合剂
LAP和TGF-β以一种前体多肽翻译，所述前体多肽经弗林蛋白酶细胞内切割，导致N端LAP蛋白部分与TGF-β分离。TGF-β通过形成小的潜伏复合物(SLC)与LAP立即非共价再装配，所述潜伏复合物将TGF-β以其无活性形式保持，与GARP受体结合沉积在细胞表面上或者在SLC结合潜伏TGF-β结合蛋白1(LTBP-1)后包埋于胞外基质中。TGF-β必须通过特定信号从其潜伏形式释放以启动信号转导。认为这种机制在需要时允许活性细胞因子的立即可用性和快速释放，并且解释为何不同于其它细胞因子，TGF-β组成性表达但在许多组织中是沉默的。
转化生长因子β(TGFβ)蛋白家族由哺乳动物中发现的三种不同的同等型(TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3)组成。TGFβ蛋白激活和调节多种影响疾病状态的基因应答，所述疾病状态包括细胞增殖、炎症和心血管疾病。TGFβ是一种多功能细胞因子，最初以其将正常成纤维细胞转化为能够进行不依赖于贴壁的生长的细胞的能力而命名。TGFβ分子主要由造血细胞和肿瘤细胞产生，并且可以调节(即刺激或抑制)来自多种正常和新生性组织起源的细胞的生长和分化(Sporn et al.,Science,233:532(1986))，并刺激各种基质细胞的形成和扩增。
已知TGFβ参与许多增殖和非增殖细胞过程，如细胞增殖和分化、胚胎发育、细胞外基质形成、骨发育、创伤愈合、造血和免疫和炎性应答。参见例如，Pircher et al,Biochem.Biophys.Res.Commun.,136:30-37(1986)；Wakefield et al.,Growth Factors,1:203-218(1989)；Roberts and Sporn,第419-472页于Handbook of ExperimentalPharmacology cds M.B.Sporn&A.B.Roberts(Springer,Heidelberg,1990)；Massague etal.,Annual Rev.Cell Biol.,6:597-646(1990)；Singer and Clark,New Eng.J.Med.,341:738-745(1999)。此外，TGFβ用于治疗和预防肠粘膜疾病(WO 2001/24813)。还已知TGFβ对各种免疫细胞类型具有强的免疫抑制作用，包括细胞毒性T淋巴细胞(CTL)抑制(Rangeset al.,J.Exp.Med.,166:991,1987),Espevik et al.,J.Immunol.,140:2312,1988)、受抑制的B细胞淋巴细胞生成和κ轻链表达(Lee et al.,J.Exp.Med.,166:1290,1987)、造血负调节(Sing et al.,Blood,72:1504,1988)、肿瘤细胞上HLA-DR表达的下调(Czarniecki etal.,J.Immunol.,140:4217,1988)、以及抑制响应B细胞生长因子的抗原激活的B淋巴细胞的增殖(Petit-Koskas et al.,Eur.J.Immunol.,18:111,1988)。另见美国专利No.7,527,791。
癌症中TGF-β同等型表达是复杂且可变的，TGFβ同种型的不同组合在特定的癌症中具有不同的作用。参见例如美国专利No.7,927,593。例如，在卵巢癌及其进展中TGF-β1和TGF-β3可以比TGFβ2发挥更大的作用；而在较高级的软骨肉瘤肿瘤中TGF-β1和TGF-β2表达比TGF-β3更高。在人乳腺癌中，TGF-β1和TGF-β3高度表达，TGF-β3表达似乎与总体存活相关--具有***转移和TGFβ3阳性表达的患者具有较差的预后结果。然而，在结肠癌中，TGF-β1和TGF-β2比TGF-β3更高度表达，并且比无癌症个体中以更大的循环水平存在。在胶质瘤中，TGF-β2对于细胞迁移是重要的。
如本文所用，“潜伏相关肽”或“LAP”指具有以下氨基酸序列的人TGF-β1前体肽的氨基端域：LSTCKTIDMELVKRKRIEAIRGQILSKLRLASPPSQG EVPPGPLPEAVLALYNSTRDRVAGESAEPEPEPEADYYAKEVTRVLMVETHNEIYDKFKQSTHSIYMFFNTSELREAVPEPVLLSRAELRLLRLKLKVEQHVELYQKYSNNSWRYLSNRLLAPSDSPEWLSFDVTGVVRQWLSRGGEIEGFRLSAHCSCDSRDNTLQVDINGFTTGRRGDLATIHGMNRPFLLLMATPLERAQHLQSSRHRR(SEQ ID NO:1)，如由例如NP_000651.3的氨基酸30-278所述；指具有以下氨基酸序列的人TGF-β2前体肽的氨基端域：LSTCSTLDMDQFMRKRIEAIRGQILSKLKLTSPPEDYPEPEEVPPEVISIYNSTRDLLQEKASRRAAACERERSDEEYYAKEVYKIDMPPFFPSENAIPPTFYRPYFRIVRFDVSAMEKNASNLVKAEFRVFRLQNPKARVPEQRIELYQILKSKDLTSPTQRYIDSKVVKTRAEGEWLSFDVTDAVHEWLHHKDRNLGFKISLHCPCCTFVPSNNYIIPNKSEELEARFAGIDGTSTYTSGDQKTIKSTRKKNSGKTPHLLLMLLPSYRLESQQTNRRKKR(SEQ ID NO:2)，如由例如NP_001129071.1的氨基酸21-302所述；指具有以下氨基酸序列的人TGF-β3前体肽的氨基端域：LSTCTTLDFGHIKKKRVEAIRGQILSKLRLTSPPEPTVMTHVPYQVLALYNSTRELLEEMHGEREEGCTQENTESEYYAKEIHKFDMIQGLAEHNELAVCPKGITSKVFRFNVSSVEKNRTNLFRAEFRVLRVPNPSSKRNEQRIELFQILRPDEHIAKQRYIGGKNLPTRGTAEWLSFDVTDTVREWLLRRESNLGLEISIHCPCHTFQPNGDILENIHEVMEIKFKGVDNEDDHGRGDLGRLKKQKDHHNPHLILMMIPPHRLDNPGQGGQRKKR(SEQ ID NO:3)，如由例如NP_003230.1的氨基酸24-300所述；指具有以下氨基酸序列的小鼠TGF-β1前体肽的氨基端域：LSTCKTIDMELVKRKRIEAIRGQILSKLRLASPPSQGEVPPGPLPEAVLALYNSTRDRVAGESADPEPEPEADYYAKEVTRVLMVDRNNAIYEKTKDISHSIYMFFNTSDIREAVPEPPLLSRAELRLQRLKSSVEQHVELYQKYSNNSWRYLGNRLLTPTDTPEWLSFDVTGVVRQWLNQGDGIQGFRFSAHCSCDSKDNKLHVEINGISPKRRGDLGTIHDMNRPFLLLMATPLERAQHLHSSRHRR(SEQ ID NO:4)，如由例如NP_035707.1的氨基酸序列30-278所述；指具有以下氨基酸序列的小鼠TGF-β2前体肽的氨基端域：LSTCSTLDMDQFMRKRIEAIRGQILSKLKLTSPPEDYPEPDEVPPEVISIYNSTRDLLQEKASRRAAACERERSDEEYYAKEVYKIDMPSHLPSENAIPPTFYRPYFRIVRFDVSTMEKNASNLVKAEFRVFRLQNPKARVAEQRIELYQILKSKDLTSPTQRYIDSKVVKTRAEGEWLSFDVTDAVQEWLHHKDRNLGFKISLHCPCCTFVPSNNYIIPNKSEELEARFAGIDGTSTYASGDQKTIKSTRKKTSGKTPHLLLMLLPSYRLESQQSSRRKKR(SEQ ID NO:5)，如由NP_033393.2的氨基酸21-302所述；指具有以下氨基酸序列的小鼠TGF-β3前体肽的氨基端域：LSTCTTLDFGHIKKKRVEAIRGQILSKLRLTSPPEPSVMTHVPYQVLALYNSTRELLEEMHGEREEGCTQETSESEYYAKEIHKFDMIQGLAEHNELAVCPKGITSKVFRFNVSSVEKNGTNLFRAEFRVLRVPNPSSKRTEQRIELFQILRPDEHIAKQRYIGGKNLPTRGTAEWLSFDVTDTVREWLLRRESNLGLEISIHCPCHTFQPNGDILENVHEVMEIKFKGVDNEDDHGRGDLGRLKKQKDHHNPHLILMMIPPHRLDSPGQGSQRKKR(SEQ ID NO:6)，如由例如NP_033394.2的氨基酸24-298所述；以及其任何其它天然存在的等位、剪接变体及加工形式。在一些实施方案中，术语“LAP”也用于指LAP多肽的截短形式或片段。例如，在本申请中可以通过“LAP(215-217)”确定对LAP的任何此类形式的提及。LAP的特定残基可以例如称为“LAP(194)”、“SEQ ID NO:1的氨基酸194”、或“SEQ ID NO:1的LAP的Cys 194”。
在一些实施方案中，LAP可以作为LAP分子的同二聚体存在。对于许多物种LAP多肽的序列是已知的，例如，人和小鼠LAP。与其相互作用位点物理相互作用、结合或空间阻塞配体与其相互作用位点的结合的试剂可用于抑制LAP活性。
LAP含有与结合配偶体(例如TGFβ)相互作用所必需的重要残基。SEQ ID NO:1和4的位置194和196、SEQ ID NO:2和5的位置206和208、以及SEQ ID NO:3和6的位置204和206处的半胱氨酸在两个LAP之间的分子间二硫键中是重要的。它们至丝氨酸的突变使分子“有活性”(Sanderson et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,92,2572-2576(1995)；Brunneretal,Mol.Endocrinol.6,1691-1700(1992)；Brunner et al,J.Biol.Chem,264,13660-13664(1989)；其通过引用整体并入本文)。SEQ ID NO:1和4的位置215-217、SEQ ID NO:2和5的位置241-243、以及SEQ ID NO:3和6的位置238-240的RGD/SGD基序有助于与整联蛋白的相互作用(Munger et al,Mol Biol Cell,9:2627-2638(1998；DerynckR,TIBS,19,548-553(1994)；其通过引用整体并入本文)。SEQ ID NO:1-6的位置4处的半胱氨酸对于与LTBP的第三个富含半胱氨酸的重复的二硫桥是重要的(Saharinen et al.The EMBO Journal,15,245-253(1996))。编码TGFβ的核酸描述于美国专利No.5,801,231中。上述参考文献通过引用整体并入本文。
本文提供了部分地基于下述发现的组合物和方法，即当用抗LAP抗体处理时，肿瘤生长较低，并且小鼠存活更长，并且本文所述的抗LAP抗体的作用部分地基于它们抑制TGF-β从保持TGF-β为其无活性形式的包含LAP的小潜伏复合物(SLC)释放，和/或减少调节性CD4+ T细胞的数目的能力。如本文所示，抗LAP抗体处理还如下影响***性和肿瘤内的免疫力两者。肿瘤由增加数目的细胞毒性CD8+ T细胞浸润，并且肿瘤内Foxp3 Treg减少。CD4+和CD8+肿瘤内T细胞具有降低的PD-1、LAG3和CD103表达。在外周中，表达IFN-γ和颗粒酶B的CD4+和CD8+ T细胞分别增加，而CD103+T细胞减少。最后，表达CD103和PD-L1的致耐受性树突细胞数目减少，而MHC II在脾脏髓样细胞上升高。本文描述的抗LAP抗体通过激活先天和适应性免疫力两者来强烈地影响***性和肿瘤内免疫应答并克服抑制肿瘤特异性免疫的机制。不希望被理论束缚或限制，该活性可以牵涉隔绝活性TGF-β，通过阻止其从SLC释放和/或减少调节性CD4+ T细胞的数目。鉴于其针对一批肿瘤类型的证明了的活性，如本文所述的抗LAP抗体可以用作单一疗法或与其它抗肿瘤模式，如例如抗PD1抗体、靶向肿瘤免疫抑制的其它试剂和/或其它抗癌疗法组合使用，并且代表了用于肿瘤治疗的新型免疫治疗方法。
因此，在一些方面，本文中提供了治疗LAP表达和/或活性与癌症或肿瘤特异性免疫的抑制相关的癌症和肿瘤的组合物和方法，包括对有此需要的受试者施用治疗有效量的LAP结合剂。此类结合剂可用于调节LAP和TGFβ之间的相互作用，使得TGFβ不从小潜伏复合物释放，和/或抑制/阻断LAP与另一LAP分子之间的相互作用，即抑制/阻断同二聚化。特别地，在本文所述方面的优选实施方案中，此类LAP结合剂可用于抑制或阻断TGFβ从包含LAP和成熟TGFβ的小潜伏复合物释放，从而隔绝成熟TGFβ。
在本文描述的方法的一些实施方案中，LAP结合剂可以结合具有SEQ ID NO:1-6中任一项中列出的序列的LAP分子。在本文描述的方法的一些实施方案中，LAP结合剂可以结合具有SEQ ID NO:1-3中任一中列出的序列的LAP分子。在本文描述的方法的一些实施方案中，LAP结合试剂可以结合在SEQ ID NO:1-3中任一中列出的序列之间共享的保守区域。在一些实施方案中，LAP结合剂可以结合源自SEQ ID NO:1-6中任一项的表位和LAP相互作用蛋白，如TGFβ。在一些此类实施方案中，在LAP结合剂结合源自SEQ ID NO:1-6中任一项的表位和TGFβ的情况下，LAP结合剂与表位的结合抑制或阻断TGFβ从小潜伏复合物的释放。
在一些实施方案中，用于本文所述的组合物和方法的LAP结合剂可以与LAP配体相互作用位点(例如，与成熟TGFβ相互作用的位点、与整联蛋白相互作用的位点、和/或与LTBP相互作用的位点)结合或物理相互作用。此类位点的非限制性实例包括SEQ ID NO:1和4的R189、SEQ ID NO:2和5的R196、和SEQ ID NO:3和6的R192(参见例如McGowan et al.TheJournal of Clinical Endocrinology and Metabolism 2003 88:3321-6；其通过引用整体并入本文)。因此，在本文所述的组合物和方法的一些实施方案中，LAP结合剂与SEQ IDNO:1和4的R189、SEQ ID NO:2和5的R196、和/或SEQ ID NO:3和6的R192结合或物理相互作用。在本文描述的组合物和方法的一些实施方案中，LAP结合剂与SEQ ID NO:1和4的氨基酸215-217、SEQ ID NO:2和5的氨基酸241-243、和/或SEQ ID NO:3和6的氨基酸238-240结合或物理相互作用。在本文所述方法的一些实施方案中，LAP结合剂与SEQ ID NO:1-6中任一项的Cys4结合或物理相互作用。
在本文描述的方面的一些实施方案中，用于本文所述组合物和方法的LAP结合剂可以与LAP同二聚化位点，即与另一LAP分子相互作用的位点结合或相互作用。因此，在本文描述的方面的一些实施方案中，LAP结合剂与SEQ ID NO:1和4的Cys194和/或Cys196，SEQID NO:2和5的Cys206和/或Cys208，和/或SEQ ID NO:3和6的Cys204和/或Cys206结合或物理相互作用。
如本文所用，术语“LAP结合剂”是指特异性结合LAP并显著调节LAP与其与LAP相互作用的任何其配体或分子之间的相互作用，并且因此在体外、原位和/或体内调节其所得生物学或功能活性(包括由LAP信号传导介导的下游途径的活性，如例如来自小潜伏复合物或潜伏复合物的TGF-β释放、LAP介导的免疫应答抑制和LAP介导的抗肿瘤免疫应答的抑制)的分子或试剂。考虑用于本文描述的各个方面和实施方案的示例性LAP结合剂包括但不限于抗体或其抗原结合片段，其特异性结合LAP上涉及LAP和TGF-β、LAP和整联蛋白、和/或LAP和LTBP的结合和/或相互作用的一个或多个氨基酸残基或表位，和/或调节LAP同二聚化和/或结合；小分子试剂，其靶向或特异性结合LAP上涉及LAP和TGF-β、LAP和整联蛋白、和/或LAP和LTBP相互作用，和/或调节LAP同二聚化和/或结合的一个或多个氨基酸残基或表位；和RNA或DNA适体，其结合LAP上涉及LAP和TGF-β、LAP和整联蛋白、和/或LAP和LTBP的结合和/或相互作用，和/或调节LAP同二聚化和/或结合的一个或多个氨基酸残基或表位。在本文所述方面的优选实施方案中，LAP结合剂特异性结合LAP并抑制或阻断自小潜伏复合物或潜伏复合物的TGF-β释放。
如本文所用，相对于在不存在LAP结合剂的情况下的相互作用和/或活性，LAP结合剂具有在体外、原位和/或体内调节LAP和TGF-β、LAP和整联蛋白、和/或LAP和LTBP之间的相互作用和/或调节LAP同二聚化和/或其所得生物或功能活性达至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％，至少99％或更多的能力。至少如本文所述的LAP结合剂在小鼠癌症模型如皮下小鼠胶质瘤模型中阻断肿瘤诱导的免疫抑制。此活性在小鼠皮下胶质瘤模型中导致CD4+ T细胞上较高的IFNγ表达、减少的调节CD4+ T细胞的数目和/或活性、增加的细胞毒性CD8+ T细胞数目和/或对肿瘤的浸润、肿瘤大小减小、和/或增加的存活。
“调节LAP和TGF-β/整联蛋白/潜伏性TGF-β结合蛋白/LAP之间的相互作用”或“影响LAP和TGF-β/整联蛋白/潜伏性TGF-β结合蛋白/LAP之间的相互作用”在本文中可互换使用，通常是指与在相同条件下但不存在LAP结合剂的情况下LAP和TGF-β/整联蛋白/潜伏性TGF-β结合蛋白/LAP之间的相互作用相比调节(即增加或减少)LAP和TGF-β/整联蛋白/潜在TGF-β结合蛋白/LAP之间的相互作用或结合达至少5％、至少10％、至少25％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或更多，如本文中所述。在本文描述的方面的优选实施方案中，LAP结合剂调节LAP和TGF-β之间的相互作用，使得自小潜伏复合物的TGF-β的释放被抑制或阻断，和/或减少调节性CD4+ T细胞的数目和/或活性。
一些LAP结合试剂，如抗LAP抗体是本领域中已知的。参见例如Ali et al.PLOSONE 2008:e1914；其通过引用整体并入本文。抗LAP抗体试剂的其它实例描述于美国专利号8,198,412和美国专利公开号2008/0206219；其通过引用整体并入本文。
在本文所述方面的一些实施方案中，用于本文所述组合物和方法的抗LAP抗体或其抗原结合片段可以与LAP配体相互作用位点，例如与成熟的TGF-β相互作用的位点、与整联蛋白相互作用的位点、和/或与LTBP相互作用的位点结合或物理相互作用。在本文所述方面的一些实施方案中，用于本文所述组合物和方法的抗-LAP抗体或其抗原结合片段与LAP结合潜伏性TGF-β时存在的LAP表位结合或物理相互作用。在本文所述方面的一些实施方案中，用于本文所述的组合物和方法的抗LAP抗体或其抗原结合片段结合小鼠和人LAP两者。
在本文描述的方面的一些实施方案中，抗LAP抗体或其抗原结合片段与SEQ IDNO:1和4的R189、SEQ ID NO:2和5的R196、和/或SEQ ID NO:3和6的R192结合或物理相互作用。在本文所述方面的一些实施方案中，抗LAP抗体或其抗原结合片段与SEQ ID NO:1和4的氨基酸215-217、SEQ ID NO:2和5的氨基酸241-243、和/或SEQ ID NO:3和6的氨基酸238-240结合或物理相互作用。在本文所述方面的一些实施方案中，抗LAP抗体或其抗原结合片段与SEQ ID NO:1-6中任一项的Cys4结合或物理相互作用。
在本文描述的方面的一些实施方案中，用于本文所述组合物和方法的抗LAP抗体或其抗原结合片段可与LAP同二聚化位点(即，与另一个LAP分子相互作用的位点)结合或物理相互作用。因此，在本文所述方面的一些实施方案中，抗LAP抗体或其抗原结合片段与SEQID NO:1和4的Cys194和/或Cys196、SEQ ID NO:2和5的Cys206和/或Cys208、和/或SEQ IDNO:3和6结的Cys204和/或Cys206合或物理相互作用。
适合于用于组合物和用于实施本文所述方法的LAP特异性或选择性结合LAP的抗体或其抗原结合片段优选为单克隆抗体，并且可包括但不限于人抗体、人源化抗体、CDR移植的抗体或嵌合抗体，包括单链抗体、Fab片段、F(ab')片段、由Fab表达文库产生的片段、和/或上述任一种的结合片段。抗体还指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即含有抗原或靶结合位点或“抗原结合片段”的分子。本文所述的免疫球蛋白分子可以是免疫球蛋白分子的的任何类型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类的，如本领域技术人员所理解的。术语“抗体”是指由4条多肽链，即两条重(H)链和两条轻链(L)链组成的免疫球蛋白分子。链通常通过二硫键彼此连接。每个重链由所述重链的可变区(本文缩写为HCVR或VH)和所述重链的恒定区组成。重链恒定区由三个域CH1、CH2和CH3组成。每个轻链由所述轻链的可变区(本文中简称为LCVR或VL)和所述轻链的恒定区组成。轻链恒定区由CL域组成。VH和VL区可以进一步分为称为互补决定区(CDR)并且散布有称为框架区(FR)的保守区的高变区。因此，每个VH和VL区由以下顺序从N末端到C末端排列的三个CDR和四个FR组成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。这种结构是本领域技术人员所熟知的。
如本文所用，术语“CDR”是指抗体可变序列内的互补决定区。对于每个可变区，在重链和轻链的每个可变区中有三个CDR，其称为CDR1、CDR2和CDR3。如本文所用，术语“CDR组”是指发生在能够结合抗原的单个可变区中的三个CDR的组。这些CDR的确切边界根据不同的***而不同定义。Kabat(Kabat et al,Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest(National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1987)和(1991))描述的***不仅提供了适用于抗体的任何可变区的明确的残基编号***，而且还提供了限定三个CDR的精确残基边界。这些CDR可以称为Kabat CDR。每个互补决定区可以包含来自如由Kabat定义的“互补决定区”的氨基酸残基(即，轻链可变域中的约残基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)和重链可变域中的31-35(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)；Kabat et al.,Sequencesof Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,NationalInstitutes of Health,Bethesda,Md.(1991))和/或来自“高变环”的那些残基(即轻链可变域中的约残基26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)和重链可变域中的26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)；Chothia and Lesk J.Mol.Biol.196:901-917(1987))。在一些情况下，互补决定区可包括来自根据Kabat定义的CDR区和高变环的氨基酸。例如，抗体4D5的人重链CDRH1包括氨基酸26至35。Chothia和同事(Chothia&Lesk,J.Mol.Biol,196:901-917(1987)和Chothia et al.,Nature 342:877-883(-1989))发现，Kabat CDR内的某些子部分采用几乎相同的肽骨架构象，尽管在氨基酸序列水平上具有大的多样性。这些子部分分别称为L1、L2和L3或H1、H2和H3，其中“L”和“H”分别表示轻链和重链区。这些区域可以称为ChothiaCDR，其具有与Kabat CDR重叠的边界。定义与Kabat CDR重叠的CDR的其它边界已经由Padlan(FASEB).9:133-139(1995))和MacCallum(J Mol Biol 262(5):732-45(1996))描述。还有其它CDR边界定义可以不严格遵循上述***之一，但是仍将与Kabat CDR重叠，尽管它们可以根据下述预测或实验发现缩短或延长：特定的残基或残基组或甚至完整的CDR不显著影响抗原结合。本文使用的方法可以利用根据任何这些***定义的CDR，尽管优选实施方案使用Kabat或Chothia定义的CDR。如本文所用，“抗体可变域”是指抗体分子的轻链和重链中包括互补决定区(CDR，即CDR1、CDR2和CDR3)和框架区(FR)的氨基酸序列的部分。VH是指重链的可变域。VL是指轻链的可变域。根据本发明中使用的方法，归入CDR和FR的氨基酸位置可以根据Kabat(Sequences of Proteins of Immunological Interest(NationalInstitutes of Health,Bethesda,Md.,1987和1991))定义。抗体或抗原结合片段的氨基酸编号也与根据Kabat的氨基酸编号。
如本文所述，术语抗原结合片段或“抗原结合部分”所涵盖的抗体片段的实例包括：(i)具有VL，CL，VH和CH1域的Fab片段；(ii)Fab'片段，其是在CH1域的C末端具有一个或多个半胱氨酸残基的Fab片段；(iii)具有VH和CH1域的Fd片段；(iv)在CH1域的C末端具有VH和CH1域和一个或多个半胱氨酸残基的Fd'片段；(v)具有抗体单臂的VL和VH域的Fv片段；(vi)由VH域或VL域或VH，CH1，CH2，DH3或VH，CH2，CH3组成的dAb片段(Ward等人，Nature341,544-546(1989))；(vii)分离的CDR区；(viii)F(ab')2片段，包含在铰链区通过二硫桥连接的两个Fab'片段的二价片段；(ix)单链抗体分子(例如单链Fv；scFv)(Bird等人，Science 242：423-426(1988)；和Huston等人，PNAS(USA)85：5879-5883(1988))；(x)具有两个抗原结合位点的“双抗体”，其包含与相同多肽链中的轻链可变域(VL)连接的重链可变区(VH)(参见例如EP 404,097；WO 93/11161；和Hollinger et al。Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：6444-6448(1993))；(xi)包含一对串联Fd区段(VH-CH1-VH-CH1)的“线性抗体”，其与互补轻链多肽一起形成一对抗原结合区(Zapata等人Protein Eng.8(10)：1057-1062(1995)；和美国专利号5,641,870)；和任何前述的修饰形式(例如通过聚亚烷基二醇(例如聚乙二醇，聚丙二醇，聚丁二醇)或其它合适的聚合物的共价连接来修饰)。
如本文所用，“表位”可以由连续氨基酸或通过蛋白质的三级折叠并置的非连续氨基酸形成。由连续氨基酸形成的表位通常在暴露于变性溶剂时保留，而通过三级折叠形成的表位通常在用变性溶剂处理时丧失。表位也可以由在两种不同蛋白质上发现的不连续氨基酸形成，这仅当它们彼此结合时发生，例如当LAP结合TGF-β时。因此，在本文所述的组合物和方法的一些实施方案中，抗LAP抗体或其抗原结合片段结合当LAP与TGF-β结合时发现的非连续氨基酸形成的表位。表位通常在独特的空间构象中包括至少3个，更通常至少5个、约9个、或约8-10个氨基酸。“表位”包括通常由免疫球蛋白VH/VL对结合的结构单元。表位定义抗体的最小结合位点，因此代表抗体或其抗原结合片段特异性的靶物。在单域抗体的情况下，表位表示由分离的可变域结合的结构单元。术语“抗原决定簇”和“表位”也可在本文中互换使用。
关于靶物或抗原，靶物或抗原上的术语“配体相互作用位点”是指靶物或抗原上作为用于结合配体、受体或其它结合配偶体的位点、催化位点、切割位点、变构相互作用的位点、涉及靶物或抗原的多聚化(如同二聚化或异二聚化)的位点的位点、表位、抗原决定簇、部分、域或氨基酸残基的区段；或靶物或抗原上参与靶物或抗原的生物作用或机制的任何其它位点、表位、抗原决定簇、部分、域或氨基酸残基的区段。例如，在一些实施方案中，LAP上的配体相互作用位点可以是TGF-β结合或相互作用的任何位点，或整联蛋白结合或相互作用的任何位点，或LTBP结合或相互作用的任何位点。更一般地，“配体相互作用位点”可以是靶物或抗原上的下述任何位点、表位、抗原决定簇、部分、域或氨基酸残基的区段，其可以与本文所述的LAP结合剂的结合位点结合，使得LAP和配体之间的相互作用或结合(和/或涉及由LAP与配体结合介导的任何途径、相互作用、信号传导、生物学机制或生物学效应)被调节。参见例如Mittl et al.,Protein Sci.5:1261-1271(1996),“The crystal structureof TGFβ3and comparison to TGFβ2:implications for receptor binding”，其内容通过引用整体并入本文。
在抗体或其抗原结合片段的上下文中，术语“特异性”或“特异性”是指特定抗体或其抗原结合片段可以结合的不同类型的抗原或抗原决定簇的数目。抗体或其抗原结合片段或部分的特异性可以基于亲和力和/或亲合力来确定。用抗原结合蛋白的抗原的解离平衡常数(KD)表示的亲和力是抗原决定簇与抗原结合蛋白上的抗原结合位点之间的结合强度的量度：KD的值越小，抗原决定簇与抗原结合分子之间的结合强度越强。或者，亲和力也可以表示为亲和常数(KA)，其是1/KD。如本领域技术人员将清楚的，亲和力可以以本身已知的方式确定，这取决于感兴趣的具体抗原。因此，与第二靶物或抗原相比，如本文所定义的抗体或其抗原结合片段在其以下述亲和力(如本文中所述并且适当地例如以KD值表示)结合第一抗原时被说成对第一靶物或抗原是“特异性的”，所述亲和力比所述氨基酸序列或多肽结合另一种靶物或多肽的亲和力好至少50倍，如至少100倍，优选至少1000倍，并且高达10,000倍或更高。优选地，当抗体或其抗原结合片段对靶物或抗原是“特异性”时，与另一靶物或抗原相比，其可以结合靶物或抗原，但不结合其它靶物或抗原。
然而，如本领域普通技术人员所理解的，在一些实施方案中，在靶物上的结合位点被多个不同配体共享或部分共享的情况下，抗体或其抗原结合片段可以特异性结合靶物，如LAP，并具有抑制/预防多种不同配体结合的功能效应。
亲合力是抗原结合分子与相关抗原之间的结合强度的量度。亲合力与抗原决定簇与其抗原结合分子上的抗原结合位点之间的亲和力以及存在于抗原结合分子上的相关结合位点的数目有关。通常，抗原结合蛋白将以解离常数(KD为10-5至10-12摩尔/升或更低，优选10-7至10-12摩尔/升或更低，且更优选10-8至10-12摩尔/升(即以缔合常数(KA)105至1012升/摩尔或更高，优选为107至1012升/摩尔或更高，更优选为108至1012升/摩尔))结合其关联或特定抗原。通常认为大于10-4mol/升(或任何低于104M-1的KA值)的任何KD值指示非特异性结合。认为有意义(例如特异性)的生物相互作用的KD通常是在10-10M(0.1nM)至10-5M(10000nM)的范围内、相互作用越强，其KD越低。优选地，本文所述的抗LAP抗体或其抗原结合片段上的结合位点将以小于500nM，优选小于200nM，更优选小于10nM，如小于500pM的亲和力结合。抗原结合蛋白与抗原或抗原决定簇的特异性结合可以以本身已知的任何合适的方式测定，包括例如Scatchard分析和/或竞争结合测定，例如放射免疫测定(RIA)、酶免疫测定(EIA)和三明治式竞争测定，以及本领域本身已知的其不同变型；以及本文提及的其它技术。
在本文所述方法的一些实施方案中，LAP结合剂是抗LAP单克隆抗体。
如本文所用，术语“单克隆抗体”是指从基本均质的抗体群体获得的抗体，即构成群体的各抗体是相同的，除了可以少量存在的可能的天然存在的突变外。单克隆抗体是高度特异性的，针对单一抗原。此外，与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，单克隆制剂中的每种抗体针对抗原上相同的单一决定簇。应当理解，术语“单克隆抗体”是指源自单个克隆的抗体，包括任何真核、原核或噬菌体克隆，而不是指产生它的方法。如本文使用，术语“单克隆抗体”不限于通过杂交瘤技术产生的抗体，并且修饰语“单克隆抗体”不应被解释为需要通过任何特定方法生产抗体。例如，根据本发明使用的单克隆抗体可以通过首先由Kohler et al.,Nature 256:495(1975)描述的杂交瘤方法或其随后的改编制备，或者可以通过重组DNA方法(参见例如美国专利号4,816,567)制备。例如，也可以使用Clackson et al.,Nature 352:624-628(1991)or Marks et al.,J.Mol.Biol.222:581-597(1991)中描述的技术从噬菌体抗体文库中分离出“单克隆抗体”。
在本文所述的组合物和方法的一些实施方案中，LAP结合剂是由下列杂交瘤克隆之任一种生成的抗-LAP单克隆抗体：TW4-9E7,TW4-5A8,TW4-3E5,TW4-4E5,TW4-12B12,TW4-13B12,TW4-1G12,TW4-3G5,TW4-2F8,TW4-6H10,TW4-1G2,TW4-1E1,TW4-16F4,TW4-8F10,TW4-3H6,TW4-2C9,TW7-16B4,TW7-28G11,TW7-7H4,和TW7-20B9。
在本文所述的组合物和方法的一些实施方案中，LAP结合剂是具有由以下杂交瘤克隆中任一种产生的抗体的一种或多种生物学特性的抗-LAP单克隆抗体：TW4-9E7,TW4-5A8,TW4-4E5,TW4-12B12,TW4-13B12,TW4-1G12,TW4-3E5,TW4-3G5,TW4-2F8,TW4-6H10,TW4-1G2,TW4-1E1,TW4-16F4,TW4-8F10,TW4-3H6,TW4-2C9,TW7-16B4,TW7-28G11,TW7-7H4,和TW7-20B9。
如本文所用，具有指定抗体(如TW7-28G11抗体或TW7-16B4)的“生物学特性”的抗体是具有该抗体的一种或多种生物学特性的抗体，所述生物学特性区分它与结合相同抗原的其它抗体。例如，TW7-28G11单克隆抗体的生物学特征包括对于给定群体具有TW7-28G11抗体的ED50值处或左右的ED50值(即在50％群体中治疗有效的剂量)；对于给定参数或表型具有TW7-28G11抗体的ED50值处或左右的ED50值(即实现给定参数或表型的半最大抑制的剂量)。任何特定剂量的效果都可以通过合适的生物测定来监测。例如，在这些方面的一些实施方案中，由特异性结合LAP并且具有TW7-28G11抗体的一个或多个生物学特征的抗LAP抗体抑制的给定参数或表型可以包括但不限于特异性结合人和小鼠LAP两者和/或预防或抑制TGF-β从小潜伏复合物释放，和/或选择性地消耗调节性T细胞群体，如表达LAP的CD4+调节性T细胞和/或CD103+CD8 T细胞的能力。
在本文描述的方面的一些实施方案中，用于本文所述组合物和方法的抗LAP抗体包括与由以下任一种杂交瘤克隆产生的单克隆抗体结合LAP的一个或多个相同表位的单克隆抗体：TW4-9E7,TW4-5A8,TW4-3E5,TW4-4E5,TW4-12B12,TW4-13B12,TW4-1G12,TW4-3G5,TW4-2F8,TW4-6H10,TW4-1G2,TW4-1E1,TW4-16F4,TW4-8F10,TW4-3H6,TW4-2C9,TW7-16B4,TW7-28G11,TW7-7H4,和TW7-20B9。
在一些方面，抗LAP单克隆抗体是由本文所述的杂交瘤TW7-28G11产生或表达并且称为“TW7-28G11抗体”或“TW7-28G11抗-LAP抗体”的单克隆抗LAP抗体TW7-28G11及其衍生物或抗原结合片段，包括例如“TW7-28G11可变重链”或“TW7-28G11可变轻链”。
如本文所述，TW7-28G11杂交瘤产生本文称为“TW7-28G11抗-LAP抗体”或“TW7-28G11抗体”或“变体TW7-28G11抗LAP单克隆抗体”的单克隆抗体，其对LAP是高特异性的，并且可以有力地抑制LAP生物活性，并在治疗癌症中提供高度治疗效果。如本文所示，TW7-28G11抗LAP抗体结合人和小鼠LAP两者并防止或抑制TGF-β从小潜伏复合物的释放，并且当在体内施用时选择性地消耗调节性T细胞群体，如表达LAP的CD4+调节T细胞和/或CD103+CD8 T细胞。TW7-28G11抗LAP抗体以及由其衍生或产生的任何抗原结合片段的生物学特性使其特别可用于本文所述的组合物和方法，包括治疗和诊断应用。因此，如本文所述进行TW7-28G11抗体的序列分析，以鉴定用于本文所述的组合物和方法的TW7-28G11抗体的重链和轻链可变域序列和互补决定区(CDR)序列。
在本说明书和权利要求书中，免疫球蛋白重链中残基的编号方式是如Kabat etal.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public HealthService,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991)中的EU索引的编号方式，其也可以在万维网上获得，并且通过引用明确地完整并入本文。“如Kabat中的EU索引”是指人IgG1 EU抗体的残基编号方式。如本文所用，“Kabat序列编号方式”或“Kabat标记”是指如Kabat中的EU索引编号编码可变区的序列。对于重链可变区，根据Kabat编号，高变区范围为CDR1的氨基酸位置31至35，CDR2的氨基酸位置50至65，以及CDR3的氨基酸位置95至102。对于轻链可变区，根据Kabat编号，高变区范围为CDR1的氨基酸位置24至34，CDR2的氨基酸位置50至56，CDR3的氨基酸位置89至97。在一些实施方案中，也可以使用可变区的IMGT(国际免疫学信息***)编号方式，其是根据IIMGT的方法在免疫球蛋白可变重链或轻链中的残基的编号方式，如Lefranc,M.-P.,"The IMGT unique numbering for immunoglobulins,Tcell Receptors and Ig-like domains",The Immunologist,7,132-136(1999)中所述，并且通过引用明确地完整并入本文。如本文所用，“IMGT序列编号方式”是指根据IMGT编号编码可变区的序列。
如通过分析从TW7-28G11杂交瘤获得的序列获得的编码TW7-28G11抗体重链的VH或可变域的核苷酸序列是：
ATGAAGTTGTGGCTGAACTGGATTTTCCTTGTAACACTTTTAAATGATATCCAGTGTGAGGTGAAGCTGGTGGAGTCTGGAGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGTTCTCTGAGTCTCTCCTGTGCAGCTTCTGGATTCACCTTCACTGATTACTACATGAGCTGGGTCCGCCAGCCTCCAGGGAAGGCACTTGAGTGGTTGGGTTTTATTAGAAACAAACCTAATGGTTACACAACAGAGTACAGTGCATCTGTGAAGGGTCGGTTCACCATCTCCAGAGATAATTCCCAAAGCATCCTCTATCTTCAAATGAATGTCCTGAGAGCTGAGGACAGTGCCACTTATTACTGTGCAAGATATACGGGGGGGGGTTACTTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA(SEQ ID NO:7)。
与SEQ ID NO:7对应的TW7-28G11抗体的VH域的氨基酸序列是：
MKLWLNWIFLVTLLNDIQCEVKLVESGGGLVQPGGSLSLSCAASGFTFTDYYMSWVRQPPGKALEWLGFIRNKPNGYTTEYSASVKGRFTISRDNSQSILYLQMNVLRAEDSATYYCARYTGGGYFDYWGQGTTLTVSS(SEQID NO:8)。
根据Kabat序列编号方式，TW7-28G11抗体的SEQ ID NO:8的VH域的互补决定区1或CDR1的氨基酸序列是：DYYMS(SEQ ID NO:9)。根据Kabat序列编号方式，TW7-28G11抗体的SEQ ID NO:8的VH域的CDR2的氨基酸序列是：FIRNKPNGYTTEYSASVKG(SEQ ID NO:10)。根据Kabat序列编号，TW7-28G11抗体的SEQ ID NO:8的VH域的CDR3的氨基酸序列是：YTGGGYFDY(SEQ ID NO:11)。
如通过分析从TW7-28G11杂交瘤获得的序列获得的编码TW7-28G11抗体的轻链的VL或可变域的核苷酸序列是：
ATGATGTCCTCTGCTCAGTTCCTTGGTCTCCTGTTGCTCTGTTTTCAAGGTACCAGATGTGATATCCAGATGACACAGACTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGACAGACTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGCAATTATTTAAACTGGTATCAGCAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACTACACATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAAGCAGATATTGCCACTTACTTTTGCCAACAGGGTGATACACTTCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAA(SEQ ID NO:12)。
与SEQ ID NO:12对应的TW7-28G11抗体的VL域的氨基酸序列是：
MMSSAQFLGLLLLCFQGTRCDIQMTQTTSSLSASLGDRLTISCRASQDISNYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQADIATYFCQQGDTLPWTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO:13)。
根据Kabat序列编号方式，TW7-28G11抗体的SEQ ID NO:13的VL域的互补决定区1或CDR1的氨基酸序列是：RASQDISNYLN(SEQ ID NO:14)。根据Kabat序列编号方式，TW7-28G11抗体的SEQ ID NO:13的VL域的CDR2的氨基酸序列是：YTSRLHS(SEQ ID NO:15)。根据Kabat序列编号方式，TW7-28G11抗体的SEQ ID NO:13的VL域的CDR3的氨基酸序列是：QQGDTLPWT(SEQ ID NO:16)。
根据Kabat序列编号方式，TW7-28G11抗体的SEQ ID NO:8的VH域的框架1或FR1区氨基酸序列是：EVKLVESGGGLVQPGGSLSLSCAASGFTFT(SEQ ID NO:17)。根据Kabat序列编号方式，TW7-28G11抗体的SEQ ID NO:8的VH域的框架2或FR2区氨基酸序列是：WVRQPPGKALEWLG(SEQ ID NO:18)。根据Kabat序列编号方式，TW7-28G11抗体的SEQ ID NO:8的VH域的框架3或FR3区氨基酸序列是：RFTISRDNSQSILYLQMNVLRAEDSATYYCAR(SEQ ID NO:19)。根据Kabat序列编号方式，TW7-28G11抗体的SEQ ID NO:8的VH域的框架4或FR4区氨基酸序列是：WGQGTTLTVSS(SEQ ID NO:20)。
根据Kabat序列编号方式，TW7-28G11抗体的SEQ ID NO:13的VL域的框架1或FR1区氨基酸序列是：DIQMTQTTSSLSASLGDRLTISC(SEQ ID NO:21)。根据Kabat序列编号方式，TW7-28G11抗体的SEQ ID NO:13的VL域的框架2或FR2区氨基酸序列是：WYQQKPDGTVKLLIY(SEQID NO:22)。根据Kabat序列编号方式，TW7-28G11抗体的SEQ ID NO:13的VL域的框架3或FR3区氨基酸序列是：GVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQADIATYFC(SEQ ID NO:23)。根据Kabat序列编号方式，TW7-28G11抗体的SEQ ID NO:13的VL域的框架2或FR2区氨基酸序列是：FGGGTKLEIK(SEQ ID NO:24)。
因此，在本文中提供的方面的一些实施方案中，TW7-28G11抗体的重链和/或轻链可变域序列，即SEQ ID NO:8和/或SEQ ID NO:13及其相应的CDR序列SEQ ID NO:9-11和SEQID NO:14-16可以用于产生例如CDR移植的、嵌合的、人源化的、或复合人的抗体或抗原结合片段，如本文中别处描述。如本领域普通技术人员理解，可用于本文中所述的组合物和方法的源自TW7-28G11抗体或由杂交瘤TW4-9E7,TW4-5A8,TW4-3E5,TW4-4E5,TW4-12B12,TW4-13B12,TW4-1G12,TW4-3G5,TW4-2F8,TW4-6H10,TW4-1G2,TW4-1E1,TW4-16F4,TW4-8F10,TW4-3H6,TW4-2C9,TW7-16B4,TW7-28G11,TW7-7H4,和TW7-20B9生成的任何抗体的任何变体、CDR移植的、嵌合的、人源化的、或复合的抗体或抗原结合片段将维持免疫特异性结合LAP的能力，使得相对于其来源的初始抗体，所述变体、CDR移植的、嵌合的、人源化的、或复合的抗体或抗原结合片段具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或更多的对LAP的结合。
在本文中提供的方面的一些实施方案中，本文中所述的特异性结合LAP(例如人LAP)的抗LAP抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO:14的VLCDR1、SEQ ID NO:15的VL CDR2、和SEQ ID NO:14的VL CDR3，或由杂交瘤TW4-9E7,TW4-5A8,TW4-3E5,TW4-4E5,TW4-12B12,TW4-13B12,TW4-1G12,TW4-3G5,TW4-2F8,TW4-6H10,TW4-1G2,TW4-1E1,TW4-16F4,TW4-8F10,TW4-3H6,TW4-2C9,TW7-16B4,TW7-28G11,TW7-7H4,和TW7-20B9生成的任一种抗体的VL CDR1、VL CDR2、和VL CDR3。在一些实施方案中，抗LAP抗体或其抗原结合片段包含TW7-28G11抗体的VL框架区。在本文所述的方面的一些实施方案中，抗LAP抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区序列，其包含SEQ ID NO:13的轻链可变区序列的一个、两个、三个或四个框架区。在本文所述的方面的一些实施方案中，抗LAP抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区序列的框架区中的一个、两个、三个或四个，其与SEQ ID NO:13的轻链可变区序列的一个、两个、三个或四个框架区是至少75％、80％、85％、90％、95％、或100％相同的。在本文所述的方面的一些实施方案中，除了多至10个氨基酸取代、缺失、和/或***，优选多至10个氨基酸取代的存在外源自所述氨基酸序列的轻链可变框架区由所述氨基酸序列组成。在本文所述的方面的一些实施方案中，源自所述氨基酸序列的轻链可变框架区由所述氨基酸序列组成，其中1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸残基被取代为相应的非人、灵长类或人的轻链可变框架区中类似位置中找到的氨基酸。
在本文描述的方面的一些实施方案中，本文所述的特异性结合LAP的抗LAP抗体或其抗原结合片段包含分别为SEQ ID NO:14、15、和16的VL CDR1、VL CDR2、和VL CDR3。在本文所述的方面的一些实施方案中，抗体或抗原结合片段还包含源自人或灵长类抗体的VL的一个、两个、三个或全部四个VL框架区。选择与本文所述的轻链CDR序列一起使用的灵长类或人抗体的轻链框架区可以具有例如与非人亲本抗体的轻链框架区，例如，SEQ ID NO:21-24至少70％的同一性。选择的灵长类或人抗体可以在其轻链互补决定区中具有与TW7-28G11抗体的轻链互补决定区的氨基酸，即SEQ ID NO:14-16相同或基本相同数目的氨基酸。在本文所述方面的一些实施方案中，灵长类或人轻链框架区氨基酸残基来自与TW7-28G11抗体的轻链框架区，即SEQ ID NO:20-24具有至少75％同一性、至少80％同一性、至少85％同一性(或更多)的天然灵长类或人抗体轻链框架区。在一些实施方案中，抗LAP抗体或抗原结合片段还包含源自人轻链可变κ亚家族的一个、两个、三个或全部四个VL框架区。在一些实施方案中，抗LAP抗体或抗原结合片段还包含源自人轻链可变λ亚家族的一个、两个、三个或全部四个VL框架区。
在本文描述的方面的一些实施方案中，本文所述的特异性结合LAP的抗LAP抗体或其片段包含重链可变区(VH)，其包含分别为SEQ ID NO:9、10、和11的VH CDR1、VH CDR2、和VHCDR3，或由杂交瘤TW4-9E7,TW4-5A8,TW4-3E5,TW4-4E5,TW4-12B12,TW4-13B12,TW4-1G12,TW4-3G5,TW4-2F8,TW4-6H10,TW4-1G2,TW4-1E1,TW4-16F4,TW4-8F10,TW4-3H6,TW4-2C9,TW7-16B4,TW7-28G11,TW7-7H4,和TW7-20B9生成的任一种抗体的VH CDR1、VH CDR2、和VHCDR3。在本文描述的方面的一些实施方案中，抗-LAP抗体或其抗原结合片段包含SEQ IDNO:8的重链可变区序列的一个、两个、三个或全部四个框架区。在本文描述的方面的一些实施方案中，抗LAP抗体或其抗原结合片段包含重链可变区序列的一个、两个、三个或四个框架区，其与SEQ ID NO:8的重链可变区序列的一个、两个、三个或四个框架区是至少75％、80％、85％、90％、95％或100％相同的。在本文所述的方面的一些实施方案中，除了多至10个氨基酸取代、缺失和/或***，优选多至10个氨基酸取代的存在外源自所述氨基酸序列的重链可变框架区由所述氨基酸序列组成。在本文所述的方面的一些实施方案中，源自所述氨基酸序列的重链可变框架区由所述氨基酸序列组成，其中1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸残基被取代为相应的非人、灵长类或人的重链可变框架区中类似位置中找到的氨基酸。
在本文描述的方面的一些实施方案中，本文所述的特异性结合LAP的抗LAP抗体或其片段包含分别为SEQ ID NO:9、10和11的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3。在本文描述的方面的一些实施方案中，抗LAP抗体或抗原结合片段还包含源自人或灵长类抗体的VH的一个、两个、三个或全部四个VH框架区。选择与本文所述的重链CDR序列一起使用的灵长类或人抗体的重链框架区可以具有例如与非人亲本抗体的重链框架区，例如SEQ ID NO:17-20至少70％的同一性。优选地，选择的灵长类或人抗体可以在其重链互补决定区中与TW7-28G11抗体的轻链互补决定区的氨基酸，即SEQ ID NO:9-11具有相同或基本相同数目的氨基酸。在本文描述的方面的一些实施方案中，灵长类或人重链框架区氨基酸残基来自与TW7-28G11抗体的重链框架区，即SEQ ID NO:17-20具有至少75％同一性、至少80％同一性、至少85％同一性(或更多)的天然灵长类或人抗体重链框架区。在具体实施方案中，抗体或抗原结合片段还包含源自人重链可变亚家族(例如，亚家族1至7之一)的一个、两个、三个或全部四个VH框架区。
在本文所述的方面的一些实施方案中，本文所述的特异性结合LAP的抗LAP抗体或其片段包含(i)包含分别为SEQ ID NO:9、10和11的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3的重链可变区(VH)，和(ii)包含分别为SEQ ID NO:14、15和16的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3的轻链可变区(VL)。在本文描述的方面的一些实施方案中，本文所述的抗LAP抗体或其抗原结合片段包含重链可变区序列的一个、两个、三个或四个框架区，其与SEQ ID NO:8的重链可变区序列的一个、两个、三个或四个框架区是至少75％、80％、85％、90％、95％或100％相同的。在本文所述的方面的一些实施方案中，除了多至10个氨基酸取代、缺失和/或***，优选多至10个氨基酸取代的存在外，源自所述氨基酸序列的重链可变框架区由所述氨基酸序列组成。在本文所述的方面的一些实施方案中，源自所述氨基酸序列的重链可变框架区由所述氨基酸序列组成，其中1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸残基被取代为相应的非人、灵长类或人的重链可变框架区中类似位置中找到的氨基酸。在本文所述方面的一些实施方案中，抗LAP抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区序列，其包含SEQ ID NO:13的轻链可变区序列的一个、两个、三个或四个框架区。在本文描述的方面的一些实施方案中，抗LAP抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区序列的一个、两个、三个或四个框架区，其SEQ ID NO:13的轻链可变区的一个、两个、三个或四个框架区是至少75％、80％、85％、90％、95％或100％相同的。在本文所述的方面的一些实施方案中，源自所述氨基酸序列的轻链可变框架区由除了多至10个氨基酸取代、缺失和/或***，优选多至10个氨基酸取代的存在外的所述氨基酸序列组成。在本文所述的方面的一些实施方案中，源自所述氨基酸序列的轻链可变框架区由所述氨基酸序列组成，其中1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸残基被取代为相应的非人、灵长类或人的轻链可变框架区中类似位置中找到的氨基酸。选择与本文所述的轻链CDR序列一起使用的灵长类或人抗体的轻链框架区可以具有例如与非人亲本抗体的轻链框架区，例如SEQ ID NO:21-24至少70％的同一性。选择的灵长类或人抗体可以在其轻链互补决定区中具有与TW7-28G11抗体的轻链互补决定区，即SEQ ID NO:14-16的氨基酸相同或基本相同数目的氨基酸。在本文所述方面的一些实施方案中，灵长类或人轻链框架区氨基酸残基来自与TW7-28G11抗体的轻链框架区，即SEQ ID NO:20-24具有至少75％同一性、至少80％同一性、至少85％同一性(或更多)的天然灵长类或人抗体轻链框架区。选择与本文所述的重链CDR序列一起使用的灵长类或人抗体的重链框架区可以具有例如与非人亲本抗体的重链框架区，例如SEQ ID NO:17-20至少70％的同一性。优选地，选择的灵长类或人抗体可以在其重链互补决定区中与TW7-28G11抗体的轻链互补决定区，即SEQ ID NO:9-11的氨基酸具有相同或基本相同数目的氨基酸。在本文描述的方面的一些实施方案中，灵长类或人重链框架区氨基酸残基来自与TW7-28G11抗体的重链框架区，即SEQ ID NO:17-20具有至少75％同一性，至少80％同一性，至少85％同一性(或更多)的天然灵长类或人抗体重链框架区。在具体实施方案中，抗体或抗原结合片段还包含源自人重链可变亚家族(例如，亚家族1至7之一)的一个、两个、三个或全部四个VH框架区。
在本文描述的方面的一些实施方案中，特异性结合LAP的抗LAP抗体或其片段包含分别为SEQ ID NOS:14,15,16,9,10和11的VL CDR1,VL CDR2,VL CDR3,VH CDR1,VH CDR2,和VH CDR3。在某些实施方案中，抗LAP抗体或抗原结合片段还包含源自人或灵长类抗体的VL的一个、两个、三个或全部四个VL框架区，以及源自人或灵长类抗体的VH的的一个、两个、三个或全部四个VH框架区。选择与本文所述的轻链CDR序列一起使用的灵长类或人抗体的轻链框架区可以具有例如与非人亲本抗体的轻链框架区，例如SEQ ID NO:21-24至少70％的同一性。选择的灵长类或人抗体可以在其轻链互补决定区中具有与TW7-28G11抗体的轻链互补决定区，即SEQ ID NO:14-16的氨基酸相同或基本相同数目的氨基酸。在本文所述的方面的一些实施方案中，灵长类或人轻链框架区氨基酸残基来自与TW7-28G11抗体的轻链框架区，即SEQ ID NO:20-24具有至少75％同一性，至少80％同一性，至少85％同一性(或更多)的天然灵长类或人抗体轻链框架区。选择与本文所述的重链CDR序列一起使用的抗体的灵长类或人重链框架区可以具有例如与非人亲本抗体的重链框架区，例如SEQ ID NO:17-20至少70％的同一性。优选地，选择的灵长类或人抗体可以在其重链互补决定区中与TW7-28G11抗体的轻链互补决定区，即SEQ ID NO:9-11的氨基酸具有相同或基本相同数目的氨基酸。在本文描述的方面的一些实施方案中，灵长类或人重链框架区氨基酸残基来自与TW7-28G11抗体的重链框架区，即SEQ ID NO:17-20具有至少75％同一性，至少80％同一性，至少85％同一性(或更多)的天然灵长类或人抗体重链框架区。在具体实施方案中，抗LAP抗体或抗原结合片段还包含源自人重链可变亚家族(例如，亚家族1至7之一)的一个、两个、三个或全部四个VH框架区。
在本文描述的方面的一些实施方案中，特异性结合LAP的抗体或其片段包含SEQID NO:13的VL域的氨基酸序列。在本文所述方面的一些实施方案中，特异性结合LAP的抗体或其片段包含由SEQ ID NO:13的氨基酸序列组成或基本上由SEQ ID NO:13的氨基酸序列组成的VL域。
在本文描述的方面的一些实施方案中，特异性结合LAP的抗LAP抗体或其片段包含VH域的氨基酸序列，其包含SEQ ID NO:8的VH域的氨基酸序列。在本文描述的方面的一些实施方案中，特异性结合LAP的抗LAP抗体或其片段包含由SEQ ID NO:8的氨基酸序列组成或基本上由SEQ ID NO:8的氨基酸序列组成的VH域。
在本文描述的方面的一些实施方案中，特异性结合LAP的抗LAP抗体或其片段含有包含SEQ ID NO:8的VH域的氨基酸序列的VH域和包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的VL域。在本文描述的方面的一些实施方案中，特异性结合LAP的抗LAP抗体或其片段包含由SEQ IDNO:8的氨基酸序列组成或基本上由SEQ ID NO:8的氨基酸序列组成的VH域和由SEQ ID NO:13的氨基酸序列组成或基本上由SEQ ID NO:13的氨基酸序列组成的VL域。
本文描述的抗体或抗原结合片段可以通过其单独的VL域或其单独的VH域或其单独的3个VL CDR或其单独的3个VH CDR描述。参见例如Rader C et al.,(1998)PNAS 95:8910-8915(其通过引用整体并入本文)，其描述通过分别从人轻链或重链文库鉴定互补的轻链或重链使小鼠抗αvβ3抗体人源化，产生具有与初始抗体的亲和力一样或更高的亲和力的人源化抗体变体。另见Clackson T et al.,(1991)Nature 352:624-628(其通过引用整体并入本文)，描述了通过使用特定的VL域(或VH域)并且对文库筛选互补可变域产生结合特定抗原的抗体的方法。
在本文描述的方面的一些实施方案中，沿着本文中所述的抗体的VH(例如，CDR1、CDR2或CDR3)和/或VL(例如，CDR1、CDR2或CDR3)区的一个或多个CDR的位置可以改变一个，两个，三个，四个，五个或六个氨基酸位置，只要维持与LAP(例如，人LAP)的免疫特异性结合(例如，基本维持，例如，至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％，至少95％的其来源的初始抗体的结合)。例如，在一些实施方案中，限定本文所述任何抗体(例如，由杂交瘤TW4-9E7,TW4-5A8,TW4-3E5,TW4-4E5,TW4-12B12,TW4-13B12,TW4-1G12,TW4-3G5,TW4-2F8,TW4-6H10,TW4-1G2,TW4-1E1,TW4-16F4,TW4-8F10,TW4-3H6,TW4-2C9,TW7-16B4,TW7-28G11,TW7-7H4,和TW7-20B9生成的任一种抗体)的CDR的位置可以通过将CDR的N末端和/或C末端边界相对于本文所述的任一种抗体的CDR的CDR位置移位一个，两个，三个，四个，五个或六个氨基酸而变化，只要维持与LAP(例如，人LAP)的免疫特异性结合(例如，基本维持，例如至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％，至少95％的其来源的初始抗体的结合)。在另一个实施方案中，本文所述的抗体的VH(例如CDR1、CDR2或CDR3)和/或VL(例如，CDR1、CDR2或CDR3)区的一个或多个CDR的长度可以变化(例如，更短或更长)一个，两个，三个，四个，五个或更多个氨基酸，只要维持与LAP(例如，人LAP)的免疫特异性结合(例如，基本维持，例如至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％，至少95％的其来源的初始抗体的结合)。
因此，在本文描述的方面的一些实施方案中，本文所述的VL CDR1,VL CDR2,VLCDR3,VH CDR1,VH CDR2,和/或VH CDR3可以比本文所述的一个或多个CDR(例如，SEQ ID NO:14-16和9-11)短一个，两个，三个，四个，五个或更多个氨基酸，只要维持与LAP(例如，人LAP)的免疫特异性结合(例如，基本维持，例如相对于其来源的初始抗体的结合，至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％，至少95％)。在本文描述的方面的一些实施方案中，本文所述的VL CDR1,VL CDR2,VL CDR3,VH CDR1,VH CDR2,和/或VH CDR3可以比本文所述的一个或多个CDR(例如，SEQ ID NO:14-16和9-11)长一个，两个，三个，四个，五个或更多个氨基酸，只要维持与LAP(例如，人LAP)的免疫特异性结合(例如，基本维持，例如相对于其来源的初始抗体的结合，至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％，至少95％)。在本文描述的方面的一些实施方案中，与本文所述的一个或多个CDR(例如，SEQ ID NO:14-16和9-11)相比，本文所述的VL CDR1,VL CDR2,VL CDR3,VH CDR1,VH CDR2,和/或VH CDR3的氨基末端可以延长一个，两个，三个，四个，五个或更多个氨基酸，只要维持与LAP(例如，人LAP)的免疫特异性结合(例如，基本维持，例如相对于其来源的初始抗体的结合，至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％，至少95％)。在本文描述的方面的一些实施方案中，与本文所述的一个或多个CDR(例如，SEQ ID NO:14-16和9-11)相比，本文所述的VLCDR1,VL CDR2,VL CDR3,VH CDR1,VH CDR2,和/或VH CDR3的羧基末端可以延长一个，两个，三个，四个，五个或更多个氨基酸，只要维持与LAP(例如，人LAP)的免疫特异性结合(例如，基本维持，例如相对于其来源的初始抗体的结合，至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％，至少95％)。在本文描述的方面的一些实施方案中，与本文所述的一种或多种CDR(例如，SEQ ID NO:14-16和9-11)相比，本文所述的VL CDR1,VL CDR2,VL CDR3,VH CDR1,VHCDR2,和/或VH CDR3的氨基末端可以缩短一个，两个，三个，四个，五个或更多个的氨基酸，只要维持与LAP(例如，人LAP)的免疫特异性结合(例如，基本维持，例如相对于其来源的初始抗体的结合，至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％，至少95％)。在本文描述的方面的一些实施方案中，与本文所述的一种或多种CDR(例如，SEQ ID NO:14-16和9-11)相比，本文所述的VL CDR1,VL CDR2,VL CDR3,VH CDR1,VH CDR2,和/或VH CDR3的羧基末端可以缩短一个，两个，三个，四个，五个或更多个的氨基酸，只要维持与LAP(例如，人LAP)的免疫特异性结合(例如，基本维持，例如相对于其来源的初始抗体的结合，至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％，至少95％)。可以使用本领域已知的任何方法来确定是否维持与LAP(例如人LAP)的免疫特异性结合，例如本文提供的“实施例”部分中描述的结合测定和条件。
关于重链，在本文所述方面的一些实施方案中，本文所述的抗体的重链可以是alpha(α)、delta(Δ)、epsilon(ε)、gamma(γ)或mu(μ)重链。在本文所述方面的一些实施方案中，所述抗体的重链可以包含人alpha(α)、delta(Δ)、epsilon(ε)、gamma(γ)或mu(μ)重链。在一个具体实施方案中，本文所述的抗体包含重链，其中VH域的氨基酸序列包含SEQ IDNO:8，其中重链的恒定区包含人gamma(γ)重链恒定区的氨基酸序列，如本领域已知的任一种。人恒定区序列的非限制性实例已经在本领域中描述，例如参见美国专利No.5,693,780和Kabat E A et al.,(1991)同上。
在本文描述的方面的一些实施方案中，抗LAP抗体包含VL域和VH域，其包含SEQ IDNO:13和/或SEQ ID NO:8，其中恒定区包含IgG，IgE，IgM，IgD，IgA或IgY免疫球蛋白分子，或人IgG，IgE，IgM，IgD，IgA或IgY免疫球蛋白分子的恒定区的氨基酸序列。在本文描述的方面的一些实施方案中，抗LAP抗体包含VL域和VH域，其包含SEQ ID NO:13和/或SEQ ID NO:8，其中恒定区包含IgG，IgE，IgM，IgD，IgA或IgY免疫球蛋白分子，任何类(例如IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA1和IgA2)或任何亚类(例如IgG2a和IgG2b)的免疫球蛋白分子的恒定区的氨基酸序列。人恒定区的非限制性实例在本领域中描述，例如参见Kabat E A等人(1991)同上。
在本文描述的方面的一些实施方案中，将一个，两个或更多个突变(例如，氨基酸取代)引入本文所述的抗LAP抗体或其片段的Fc区(例如，CH2域(人IgG1残基231-340)和/或CH3域(人IgG1的残基341-447)和/或铰链区，根据Kabat编号***(例如，Kabat中的EU索引)编号)以改变抗体的一个或多个功能性质，如血清半衰期、补体结合、Fc受体结合和/或抗原依赖性细胞性细胞毒性。
在本文描述的方面的一些实施方案中，将一个，两个或更多个突变(例如，氨基酸取代)引入Fc区的铰链区(CH1域)，使得铰链区中半胱氨酸残基的数目被改变(例如，增加或减少)，如例如美国专利No.5,677,425所述。可以改变CH1域铰链区中半胱氨酸残基的数目，以例如促进轻链和重链的装配，或改变(例如增加或减少)抗体的稳定性。
在本文描述的方面的一些实施方案中，将一个，两个或更多个突变(例如，氨基酸取代)引入本文所述的抗LAP抗体或其片段的Fc区(例如，CH2域(人IgG1的残基231-340)和/或CH3域(人IgG1的残基341-447)和/或铰链区，根据Kabat编号***(例如，Kabat的EU索引)编号)以增加或减少抗体对效应细胞表面上的Fc受体(例如活化的Fc受体)的亲和力。降低或增加抗体对Fc受体的亲和力的抗体或其片段的Fc区中的突变以及将此类突变引入Fc受体或其片段的技术是本领域技术人员已知的。可以产生以改变抗体对Fc受体的亲和力的抗体Fc受体中的突变的实例描述于例如Smith P et al.,(2012)PNAS109:6181-6186,美国专利No.6,737,056,和国际公开No.WO 02/060919；WO 98/23289；和WO 97/34631，其通过引用并入本文。
在本文描述的方面的一些实施方案中，将一个，两个或更多个氨基酸突变(即，取代，***或缺失)引入IgG恒定域或其FcRn结合片段(优选Fc或铰链-Fc域片段)以改变(例如，降低或增加)抗体的体内半衰期。关于将改变(例如，降低或增加)抗体的体内半衰期的突变的实例，参见例如国际公开号WO 02/060919；WO 98/23289；和WO 97/34631；和美国专利No.5,869,046,6,121,022,6,277,375和6,165,745。
在本文描述的方面的一些实施方案中，将一个，两个或更多个氨基酸突变(即，取代，***或缺失)引入IgG恒定域或其FcRn结合片段(优选Fc或铰链-Fc区片段)，以降低抗LAP抗体的体内半衰期。在本文描述的方面的一些实施方案中，将一个，两个或更多个氨基酸突变(即，取代，***或缺失)引入IgG恒定域或其FcRn结合片段(优选Fc或铰链-Fc域片段)以增加抗体的体内半衰期。在本文所述方面的一些实施方案中，抗体可以在第二恒定(CH2)域(人IgG1的残基231-340)和/或第三恒定(CH3)域(人IgG1的残基341-447)中具有一个或多个氨基酸突变(例如，取代)，根据Kabat中的EU索引(Kabat EA等，(1991)，同上))编号。在本文所述方面的一些实施方案中，本文所述的抗体或其抗原结合片段的IgG1的恒定区包含位置252处的甲硫氨酸(M)至酪氨酸(Y)取代，位置254处的丝氨酸(S)至苏氨酸(T)取代，以及位置256处的苏氨酸(T)至谷氨酸(E)取代(根据如Kabat中的EU索引编号)。参见美国专利No.7,658,921，其通过引用并入本文。与相同抗体的野生型形式相比，已经显示此类突变体IgG(称为“YTE突变体”)表现出四倍增加的半衰期(参见Dall'Acqua W F et al.,(2006)J Biol Chem 281:23514-24)。在本文所述方面的一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含IgG恒定域，其包含根据如Kabat中的EU索引编号的位置251-257、285-290、308-314、385-389和428-436处的氨基酸残基的1、2、3或更多个氨基酸取代。
在本文描述的方面的一些实施方案中，将一个，两个或更多个氨基酸取代引入IgG恒定域Fc区中以改变抗LAP抗体的效应功能。例如，可以用不同的氨基酸残基替代一个或多个选自根据如Kabat中的EU索引编号的氨基酸残基234、235、236、237、297、318、320和322的氨基酸，使得抗体对效应配体具有改变的亲和力，但保留亲本抗体的抗原结合能力。改变了亲和力的效应配体可以是例如Fc受体或补体的C1成分。在美国专利No.5,624,821和5,648,260中更详细地描述了这种方法。在本文所述方面的一些实施方案中，恒定区域的缺失或失活(通过点突变或其它手段)可以降低循环抗体的Fc受体结合，从而增加肿瘤定位。关于缺失或失活恒定域并因此增加肿瘤定位的突变的描述，参见例如美国专利No.5,585,097和8,591,886。在本文描述的方面的一些实施方案中，可以将一个或多个氨基酸取代引入本文所述抗体的Fc区，以除去Fc区上潜在的糖基化位点，这可以降低Fc受体结合(参见例如Shields R L et al.,(2001)J Biol Chem 276:6591-604)。在本文描述的方面的一些实施方案中，可以制备本文所述抗体的恒定区中的一个或多个以下突变：N297A取代；N297Q取代；L235A取代和L237A取代；L234A取代和L235A取代；E233P取代；L234V取代；L235A取代；C236缺失；P238A取代；D265A取代；A327Q取代；或P329A取代(根据Kabat中的EU索引编号)。在本文描述的方面的一些实施方案中，本文所述的抗体或其抗原结合片段包含具有N297Q或N297A氨基酸取代的IgG1的恒定域。
在本文描述的方面的一些实施方案中，可以用不同的氨基酸残基替代在本文所述的抗LAP抗体的恒定区中选自氨基酸残基329、331和322(根据Kabat中的EU索引编号)的一个或多个氨基酸，使得抗体具有改变的Clq结合和/或减少或消除的补体依赖性细胞毒性(CDC)。在美国专利No.6,194,551(Idusogie等人)中更详细地描述了这种方法。在本文描述的方面的一些实施方案中，改变本文所述抗体的CH2域的N末端区域中的氨基酸位置231至238内的一个或多个氨基酸残基，从而改变抗体固定补体的能力。该方法在国际公开号WO94/29351中进一步描述。在本文所述方面的一些实施方案中，修饰本文所述抗体的Fc区以增加抗体介导抗体依赖性细胞性细胞毒性(ADCC)的能力和/或增加抗体对Fcγ受体的亲和力的能力，其通过突变在以下位置处的一个或多个氨基酸(例如，引入氨基酸取代)进行：238,239,248,249,252,254,255,256,258,265,267,268,269,270,272,276,278,280,283,285,286,289,290,292,293,294,295,296,298,301,303,305,307,309,312,315,320,322,324,326,327,329,330,331,333,334,335,337,338,340,360,373,376,378,382,388,389,398,414,416,419,430,434,435,437,438或439(根据Kabat中的EU索引编号)。该方法在国际公开号WO 00/42072中进一步描述。
在本文描述的方面的一些实施方案中，本文所述的抗LAP抗体包含IgG4抗体的恒定区，并且重链氨基酸残基228(根据Kabat中的EU索引编号)的丝氨酸替换为脯氨酸。
据报道具有降低的岩藻糖含量的抗体对Fc受体(如例如FcγRIIIa)具有增加的亲和力。因此，在某些实施方案中，本文所述的抗LAP抗体或其抗原结合片段具有降低的岩藻糖含量或没有岩藻糖含量。可以使用本领域技术人员已知的技术来产生此类抗体。例如，抗体可以在缺陷的或缺乏岩藻糖基化能力的细胞中表达。在具体实例中，具有敲除α1,6-岩藻糖基转移酶的两个等位基因的细胞系可用于产生具有降低的岩藻糖含量的抗体。POTELLIGENTRTM***(Lonza)是可用于产生具有降低的岩藻糖含量的抗体的这种***的实例。或者，可以产生具有降低的岩藻糖含量或无岩藻糖含量的抗体或抗原结合片段，其通过例如：(i)在阻止或减少岩藻糖基化的条件下培养细胞；(ii)翻译后除去岩藻糖(例如，用岩藻糖苷酶)；(iii)期望碳水化合物的翻译后添加，例如重组表达非糖基化糖蛋白后；或(iv)糖蛋白的纯化，以选择不被岩藻糖基化的抗体或其抗原结合片段。关于生产无岩藻糖含量或降低的岩藻糖含量的抗体或其抗原结合片段的方法，参见例如Longmore G D&SchachterH(1982)Carbohydr Res 100:365-92和Imai-Nishiya H et al.,(2007)BMCBiotechnol.7:84。
在本文所述的方面的一些实施方案中，本文所述的抗LAP抗体或其抗原结合片段对CD32B(也称为FcγRIIB或FCGR2B)具有增加的亲和力，例如与具有野生型Fc区，例如IgG1Fc的抗体相比。在本文所述方面的一些实施方案中，本文所述的抗LAP抗体或其抗原结合片段相对于CD32A(FcγRIIA)和CD16(FcγRIIIA)两者对CD32B(FcγRIIB)具有选择性增加的亲和力。提供了导致对CD32B增加的亲和力的序列改变，例如在Mimoto et al.,ProteinEngineering,Design&Selection 10:589-598(2013),Chu et al.,Molecular Immunology45:3926-3933(2008),以及Strohl,Current Opinion in Biology 20:685-691(2009)(其各自的全部内容通过引用并入本文)中。在本文所描述的方面的一些实施方案中，具有对CD32B增加的亲和力的抗体或抗原结合片段包含重链恒定区，例如IgG1恒定区或其片段，其包含选自以下的突变：G236D，P238D，S239D，S267E，L328F，L328E，位置236后***的精氨酸及其组合，根据EU索引(Kabat et al.,Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,U.S.Department of Health and Human Services,Bethesda(1991))编号。在本文所述方面的一些实施方案中，具有对CD32B增加的亲和力的抗体或抗原结合片段包含重链恒定区，例如IgG1恒定区或其片段，其包含S267E和L328F取代。在本文描述的方面的一些实施方案中，对CD32B具有增加的亲和力的抗体或抗原结合片段包含重链恒定区，例如IgG1恒定区或其片段，其包含P238D和L328E取代。在本文所描述的方面的一些实施方案中，对CD32B具有增加的亲和力的抗体或抗原结合片段包含重链恒定区，例如IgG1恒定区或其片段，其包含P238D取代和选自下组的取代：E233D，G237D，H268D，P271G，A330R及其组合。在本文所述方面的一些实施方案中，对CD32B具有增加的亲和力的抗体或抗原结合片段包含重链恒定区，例如IgG1恒定区或其片段，其包含P238D，E233D，G237D，H268D，P271G和A330R替代。在本文所描述的方面的一些实施方案中，对CD32B具有增加的亲和力的抗体或抗原结合片段包含重链恒定区，例如IgG1恒定区或其片段，其包含G236D和S267E。在本文描述的方面的一些实施方案中，对CD32B具有增加的亲和力的抗体或抗原结合片段包含重链恒定区，例如IgG1恒定区或其片段，其包含S239D和S267E。在本文所述方面的一些实施方案中，对CD32B具有增加的亲和力的抗体或抗原结合片段包含重链恒定区，例如IgG1恒定区或其片段，其包含S267E和L328F。在本文所描述的方面的一些实施方案中，对CD32B具有增加的亲和力的抗体或抗原结合片段包含重链恒定区，例如IgG1恒定区，或其片段，其包含在位置236之后***的精氨酸和L328R。
在本文描述的方面的一些实施方案中，特异性结合LAP(例如人LAP)的抗LAP抗体或其抗原结合片段包含与本文中描述为SEQ ID NO:21-24的一个、两个、三个或四个VL框架区具有至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，或至少98％的序列同一性的VL框架区(FR)。在本文所描述的方面的一些实施方案中，特异性结合LAP(例如，人LAP)的抗LAP抗体或其抗原结合片段包含与本文中描述为SEQ ID NO:17-20的一个、两个、三个或四个VH框架区具有至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，或至少98％的序列同一性的VH框架区(FR)。在本文描述的方面的一些实施方案中，特异性结合LAP(例如，人LAP)的抗体或其抗原结合片段包含(i)与本文中描述为SEQ ID NO:17-20的一个、两个、三个或四个VH框架区具有至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，或至少98％的序列同一性的VH框架区(FR)，和(ii)与本文中描述为SEQ ID NO:21-24的一个、两个、三个或四个VL框架区具有至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，或至少98％的序列同一性的VL框架区(FR)。
也可以使用数学算法实现两个序列(例如，氨基酸序列或核酸序列)之间的百分比同一性的测定。用于比较两个序列的数学算法的具体的非限制性实例是Karlin S&Altschul S F(1990)PNAS 87:2264-2268的算法，如Karlin S&Altschul S F(1993)PNAS90:5873-5877中修改的。此类算法并入Altschul S F et al.,(1990)J Mol Biol 215:403的NBLAST和XBLAST程序中。可以用设置为例如得分＝100，字长＝12的NBLAST核苷酸程序参数进行BLAST核苷酸搜索，以获得与本文所述的核酸分子同源的核苷酸序列。可以使用设置为例如得分50，字长＝3的XBLAST程序参数进行BLAST蛋白质搜索，以获得与本文所述的蛋白质分子同源的氨基酸序列。为了获得缺口比对用于比较目的，可以如Altschul S F etal.,(1997)Nuc Acids Res 25:3389 3402中所述，使用缺口BLAST。或者，PSI BLAST可用于进行迭代搜索，其检测分子之间疏远的关系(同上)。当使用BLAST，缺口BLAST和PSI Blast程序时，可以使用相应程序(例如，XBLAST和NBLAST)的默认参数(例如，参见国家生物技术信息中心(NCBI)，在万维网ncbi.nlm.nih.gov)。用于比较序列的数学算法的另一个具体的非限制性实例是Myers and Miller,1988,CABIOS 4:1117的算法。此类算法并入ALIGN程序(第2.0版)中，其是GCG序列比对软件包的一部分。当使用ALIGN程序比较氨基酸序列时，可以使用PAM120权重残基表、缺口长度罚分12、和缺口罚分4。可以在允许或不允许缺口的情况下使用与上述技术类似的技术来确定两个序列之间的百分比同一性。在计算百分比同一性中，通常只计算完全匹配。
在一些方面，本文提供了抗LAP抗体或其抗原结合片段，其与由杂交瘤TW4-9E7,TW4-5A8,TW4-3E5,TW4-4E5,TW4-12B12,TW4-13B12,TW4-1G12,TW4-3G5,TW4-2F8,TW4-6H10,TW4-1G2,TW4-1E1,TW4-16F4,TW4-8F10,TW4-3H6,TW4-2C9,TW7-16B4,TW7-28G11,TW7-7H4,和TW7-20B9产生的任一种抗体结合相同或重叠的LAP表位(例如，人LAP的表位)。在这些方面的一些实施方案中，抗LAP抗体或其抗原结合片段与具有SEQ ID NO:8的VH域和SEQ ID NO:13的VL域的由杂交瘤TW7-28G11产生的抗体结合相同或重叠的LAP表位。如本领域普通技术人员所知，抗体的表位可以通过例如NMR光谱学、X射线衍射晶体学研究、ELISA测定、与质谱(例如，液相色谱电喷雾质谱)联用的氢/氘交换，基于阵列的寡肽扫描测定和/或诱变作图(例如，定点诱变作图)来测定。对于X射线晶体学，可以使用本领域中任何已知方法(例如Giege R et al.,(1994)Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 50(Pt 4):339-350；McPherson A(1990)Eur J Biochem 189:1-23；Chayen N E(1997)Structure 5:1269-1274；McPherson A(1976)J Biol Chem251:6300-6303)实现接近。可以使用公知的X射线衍射技术研究抗体:抗原晶体，并且可以使用诸如X-PLOR(Yale University,1992,由Molecular Simulations,Inc.销售；见例如Meth Enzymol(1985)第114&115卷，Wyckoff HW et al.编,美国专利申请No.2004/0014194)，以及BUSTER(Bricogne G(1993)ActaCrystallogr D Biol Crystallogr 49(Pt 1):37-60；Bricogne G(1997)Meth Enzymol276A:361-423,Carter C W编；Roversi P et al.,(2000)Acta Crystallogr D BiolCrystallogr 56(Pt 10):1316-1323)的计算机软件改进。诱变作图研究可以使用本领域技术人员已知的任何方法来完成。关于诱变技术的描述，包括丙氨酸扫描诱变技术，参见例如Champe M et al.,(1995)同上和Cunningham B C&Wells J A(1989)同上。此外，可以使用常规技术例如免疫测定来鉴定识别和结合相同或重叠的LAP(例如人LAP)表位的抗体，例如通过显示一种抗体阻断另一种抗体结合靶抗原的能力，即竞争性结合测定法。竞争结合测定法也可用于确定两种抗体对表位具有相似的结合特异性。竞争结合可以在测试法中测定，其中所测试的免疫球蛋白抑制参考抗体与共同抗原如LAP的特异性结合。许多类型的竞争性结合测定法是已知的，例如：固相直接或间接放射免疫测定(RIA)，固相直接或间接酶免疫测定(EIA)，三明治式竞争测定(参见Stahli C et al.,(1983)Methods Enzymol 9:242-253)；固相直接生物素-亲合素EIA(参见Kirkland T N et al.,(1986)J Immunol137:3614-9)；固相直接标记测定，固相直接标记三明治式测定(参见Harlow E&Lane D,(1988)Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press)；使用1-125标记物的固相直接标记RIA(参见Morel G A et al.,(1988)Mol Immunol 25(1):7-15)；固相直接生物素-亲合素EIA(Cheung R C et al.,(1990)Virology 176:546-52)；和直接标记RIA(Moldenhauer G et al.,(1990)Scand J Immunol 32:77-82)。通常，这种测定涉及使用与固体表面结合的纯化抗原(例如，LAP)或携带这些(未标记的测试免疫球蛋白和标记的参考免疫球蛋白)的任一种的细胞。可以通过测定在测试免疫球蛋白存在下与固体表面或细胞结合的标记物的量来测量竞争性抑制。通常，测试免疫球蛋白过量存在。通常，当竞争抗体过量存在时，它将抑制参考抗体与共同抗原的特异性结合达至少50-55％、55-60％、60-65％、65-70％、70-75％或者更多。竞争结合测定可以使用标记的抗原或标记的抗体以大量不同的形式配置。在该测定的常见形式中，将抗原固定在96孔板上。然后，使用放射性或酶标记物测量未标记的抗体阻断标记的抗体与抗原结合的能力。关于进一步的细节，参见例如Wagener C et al.,(1983)J Immunol 130:2308-2315；Wagener C et al.,(1984)JImmunol Methods 68:269-274；Kuroki M et al.,(1990)Cancer Res 50:4872-4879；Kuroki M et al.,(1992)Immunol Invest 21:523-538；Kuroki M et al.,(1992)Hybridoma 11:391-407和Antibodies:A Laboratory Manual,Harlow E&Lane D编同上,第386-389页。可以例如使用表面等离振子共振(BIACORE)进行竞争测定法，例如通过串联方法，如由Abdiche Y N et al.,(2009)Analytical Biochem 386:172-180描述的“串联方法”进行，其中将LAP抗原固定在芯片表面上，例如，CM5传感器芯片，然后将抗LAP抗体在芯片上运行。为了确定抗体是否与本文所述的抗LAP抗体或其抗原结合片段竞争，首先将抗LAP抗体在芯片表面上运行以实现饱和，然后添加潜在的竞争性抗体。然后，可以相对于非竞争对照来确定和定量竞争抗体的结合。
当两种抗体在竞争结合测定，如ELISA测定(其可以使用标记的抗原或标记的抗体以所有数目的不同形式配置)中识别相同或空间重叠的表位时，竞争结合测定法可以用于确定抗体是否例如以剂量依赖的方式被另一种抗体(例如，与参照抗体结合基本上相同的表位或重叠的表位的抗体)竞争性阻断。
因此，在本文描述的方面的一些实施方案中，可以在竞争结合测定中用由本文所述的杂交瘤TW4-9E7,TW4-5A8,TW4-3E5,TW4-4E5,TW4-12B12,TW4-13B12,TW4-1G12,TW4-3G5,TW4-2F8,TW4-6H10,TW4-1G2,TW4-1E1,TW4-16F4,TW4-8F10,TW4-3H6,TW4-2C9,TW7-16B4,TW7-28G11,TW7-7H4,和TW7-20B9产生的任一种抗体，或其嵌合或Fab抗体，或包含由本文所述的杂交瘤TW4-9E7,TW4-5A8,TW4-3E5,TW4-4E5,TW4-12B12,TW4-13B12,TW4-1G12,TW4-3G5,TW4-2F8,TW4-6H10,TW4-1G2,TW4-1E1,TW4-16F4,TW4-8F10,TW4-3H6,TW4-2C9,TW7-16B4,TW7-28G11,TW7-7H4,和TW7-20B9产生的任一种抗体的一个或多个VH CDR和一个或多个VL CDR的抗LAP抗体测试抗LAP抗体。
在本文描述的方法的一些实施方案中，LAP结合剂是特异性结合LAP的抗LAP抗体或其抗原结合片段的嵌合抗体衍生物。
如本文所用，术语“嵌合抗体”是指其中重链和/或轻链的一部分与源自特定物种或属于特定抗体类或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的剩余部分与源自另一种物种或属于另一抗体类或亚类的抗体中的相应序列相同或同源的抗体分子，以及此类抗体的片段，只要它们表现出期望的生物活性(美国专利号4,816,567；和Morrison et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA81:6851-6855(1984))。嵌合抗体分子可以包括例如来自小鼠、大鼠或其它物种的抗体的一个或多个VH和/或VL抗原结合域与人恒定区。已经描述了用于制备嵌合抗体的各种方法，并且可以用于制备含有识别期望抗原(例如LAP)的免疫球蛋白可变区的嵌合抗体。参见，例如Takeda et al.,1985,Nature 314:452；Cabilly et al.,美国专利No.4,816,567；Boss et al.；Tanaguchi et al.,欧洲专利公开EP171496；欧洲专利公开0173494,英国专利GB 2177096B)。
在本文描述的方法的一些实施方案中，LAP结合剂是特异性结合LAP的抗LAP抗体或其抗原结合片段的CDR移植的抗体衍生物。
术语“CDR移植的抗体”是指包含来自一个物种的重链和轻链可变区序列但其中VH和/或VL的一个或多个CDR区的序列被另一物种的CDR序列替代的抗体，如具有人重链和轻链可变区的抗体，其中一个或多个人CDR(例如，CDR3)已被小鼠CDR序列替代。本文描述的CDR移植的抗体包含来自人抗体的重链和轻链可变区序列，其中VH和/或VL的一个或多个CDR区域替换为本文所述的鼠抗体的CDR序列，如SEQ ID NO:9-11和14-16或由杂交瘤TW4-9E7,TW4-5A8,TW4-3E5,TW4-4E5,TW4-12B12,TW4-13B12,TW4-1G12,TW4-3G5,TW4-2F8,TW4-6H10,TW4-1G2,TW4-1E1,TW4-16F4,TW4-8F10,TW4-3H6,TW4-2C9,TW7-16B4,TW7-28G11,TW7-7H4,和TW7-20B9产生的任一种抗体的CDR序列。来自任何人抗体的框架序列可以充当CDR植入的模板。然而，在此类框架上的直接链置换常常导致对抗原的结合亲和力的一些损失。人抗原与初始非人或鼠抗体的同源性越多，将非人CDR与人框架组合会在CDR中引起可降低亲和力的畸变的可能性越不太可能。因此，除了CDR之外选择用于替代鼠可变框架的人可变框架例如与鼠抗体可变区框架具有至少65％的序列同一性。除CDR之外的人和鼠可变区具有例如至少70％的序列同一性，至少75％的序列同一性，至少80％的序列同一性或至少85％的序列同一性。用于制备嵌合抗体的方法是本领域已知的。(参见例如EP 239,400；PCT公开文本WO 91/09967；美国专利号5,225,539；5,530,101和5,585,089)，镶面(veneering)或表面重修(resurfacing)(EP 592,106；EP 519,596；Padlan,MolecularImmunology28(4/5):489-498(1991)；Studnicka et al.,Protein Engineering 7(6):805-814(1994)；Roguska et al.,PNAS 91:969-973(1994))和链改组(美国专利No5,565,352)，其各自的内容通过引用整体并入本文。
在本文所述方法的一些实施方案中，LAP结合剂是特异性结合LAP的抗LAP抗体或其抗原结合片段的人源化抗体衍生物。
非人(例如，鼠)抗体的人源化形式是含有源自非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合抗体。一般地，人源化抗体是人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自接受者的CDR或高变区的残基被来自具有期望的特异性、亲和力和容量的非人物种(供体抗体)(例如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类)的CDR或高变区的残基替换。在一些情况下，人免疫球蛋白的Fv框架区(FR)残基被相应的非人残基替换。此外，人源化抗体可以包含在受体抗体或供体抗体中未发现的残基。进行这些修饰以进一步改善抗体性能。通常，人源化抗体将包含至少一个且通常两个基本上整个可变域，其中所有或基本上所有的高变环对应于非人免疫球蛋白的，并且全部或基本上全部的FR区是人免疫球蛋白共有序列的那些。人源化抗体任选地还包含免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常为人免疫球蛋白的恒定区的至少一部分。更多细节见Jones et al.,Nature321:522-525(1986)；Riechmann et al.,Nature 332:323-329(1988)；以及Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992)。
人源化抗体可以选自免疫球蛋白的任何类别，包括IgM，IgG，IgD，IgA和IgE，以及任何亚类，包括但不限于IgG1，IgG2，IgG3和IgG4。
人源化抗体的框架和CDR区域不需要与亲本序列精确对应，例如，供体抗体CDR或共有框架可以通过至少一个氨基酸残基的取代，***和/或缺失来诱变，因此该位点的CDR或框架残基不完全对应于供体抗体或共有框架。然而，在优选的实施方案中，此类突变将不是广泛的。通常，至少80％，优选至少85％，更优选至少90％，最优选至少95％的人源化抗体残基将对应于亲本FR和CDR序列的那些。如本文所用，术语“共有框架”是指共有免疫球蛋白序列中的框架区。如本文所用，术语“共有免疫球蛋白序列”是指由相关免疫球蛋白序列家族中最常发生的氨基酸(或核苷酸)形成的序列(参见例如，Winnaker,From Genes toClones(Veriagsgesellschaft,Weinheim,Germany 1987)。在免疫球蛋白家族中，共有序列中的每个位置被家族中该位置最频繁出现的氨基酸占据。在两个氨基酸同样频繁地出现的情况下，任一者可以包括在共有序列中。
如本文所使用，“游标区(Vernier zone)”是指框架残基的亚组，其可以调节CDR结构并微调与抗原的配合，如Foote和Winter(1992,J.Mol.Biol.224:487-499，其通过引用并入本文)所描述。游标区残基形成CDR下面的层并且可以影响CDR的结构和抗体的亲和力。
可以与本文所述的CDR序列一起使用的已知的人免疫球蛋白(Ig)序列例如在万维网上公开于www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez-/query.fcgi；www.atcc.org/phage/hdb.html；www.sciquest.com/；www.abcam.com/；www.antibodyresource.com/onlinecomp.html；www.public.iastate.eduLabout.pedro/research_tools.html；www.mgen.uniheidelberg.de/SD/IT/IT.html；www.whfreeman.com/immunology/CH-05/kuby05.htm；www.library.thinkquest.org/12429/Immune/Antibody.html；www.hhmi.org/grants/lectures/1996/vlab/；www.path.cam.ac.uk/.about.mrc7/m-ikei-mages.html；www.antibodyresource.com/；mcb.harvard.edu/BioLinks/Immunology.html.www.immunologylink.com/；pathbox.wustl.edu/.about.hcenter/index.-html；www.biotech.ufl.edu/.about.hcl/；www.pebio.com/pa/340913/340913.html-；www.nal.usda.gov/awic/pubs/antibody/；www.m.ehime-u.acjp/.about.yasuhito-/Elisa.html；www.biodesign.com/table.asp；www.icnet.uk/axp/facs/davies/lin-ks.html；www.biotech.ufl.edu/.about.fccl/protocol.html；www.isac-net.org/sites_geo.html；aximtl.imt.uni-marburg.de/.about.rek/AEP-Start.html；baserv.uci.kun.nl/.about.jraats/linksl.html；www.recab.uni-hd.de/immuno.bme.nwu.edu/；www.mrc-cpe.cam.ac.uk/imt-doc/pu-blic/INTRO.html；www.ibt.unam.mx/virN_mice.html；imgt.cnusc.fr:8104/；www.biochem.ucl.ac.uk/.about.martin/abs/index.html；anti-body.bath.ac.uk/；abgen.cvm.tamu.edu/lab/wwwabgen.html；www.unizh.ch/.about.honegger/AHOsem-inar/Slide01.html；www.cryst.bbk.ac.uk/.about.ubcg07s/；www.nimr.mrc.ac.uk/CC/ccaewg/ccaewg.htm；www.path.cam.ac.ukhabout.mrc7/h-umanisation/TAHHP.html；www.ibt.unam.na/vir/structure/stat_aim.html；www.biosci.missouri.edu/smithgp/index.html；www.cryst.bioc.cam.ac.uk/.abo-utimolina/Web-pages/Pept/spottech.html；www.jerini.de/fr roducts.htm；www.patents.ibm.com/ibm.html.Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,U.S.Dept.Health(1983)，每项通过引用整体并入本文。此类输入序列可用于降低免疫原性或降低，增强或修改结合、亲和力、结合速率、解离速率、亲合力、特异性、半衰期或任何其它合适的特征，如本领域中已知的。
人框架区中的框架残基可被来自CDR供体抗体的相应残基取代以改变，优选地改善抗原结合。这些框架取代通过本领域熟知的方法来鉴定，例如通过CDR和框架残基的相互作用的建模来鉴定对于抗原结合重要的框架残基，以及序列比较来鉴定在特定位置处的不常见的框架残基。(参见例如Queen et al.,U.S.Pat.No.5,585,089；Riechmann et al.,Nature 332:323(1988)，其通过引用整体并入本文)。三维免疫球蛋白模型通常可用，并且是本领域技术人员熟悉的。计算机程序是可用的，其例示并且展示所选择的候选免疫球蛋白序列的可能的三维构象结构。这些展示的检查允许分析残基在候选免疫球蛋白序列的功能发挥中的可能作用，即影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基的分析。以这种方式，可以从共有序列和导入序列中选择和组合FR残基，从而实现期望的抗体特征，如增加的对靶抗原的亲和力。通常，CDR残基直接且最实质性牵涉影响抗原结合。抗体可以使用本领域已知的各种技术进行人源化，包括但不限于那些记载于Jones et al.,Nature 321:522(1986)；Verhoeyen et al.,Science 239:1534(1988),Sims et al.,J.Immunol.151:2296(1993)；Chothia and Lesk,J.Mol.Biol.196:901(1987),Carter et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89:4285(1992)；Presta et al.,J.Immunol.151:2623(1993),Padlan,Molecular Immunology 28(4/5):489-498(1991)；Studnicka et al.,Protein Engineering 7(6):805-814(1994)；Roguska.et al.,PNAS 91:969-973(1994)；PCT publication WO 91/09967,PCT/:US98/16280,US96/18978,US91/09630,US91/05939,US94/01234,GB89/01334,GB91/01134,GB92/01755；WO90/14443,WO90/14424,WO90/14430,EP 229246,EP 592,106；EP 519,596,EP 239,400,美国专利No.5,565,332,5,723,323,5,976,862,5,824,514,5,817,483,5,814,476,5,763,192,5,723,323,5,766,886,5,714,352,6,204,023,6,180,370,5,693,762,5,530,101,5,585,089,5,225,539；4,816,567的，每篇通过引用完整并入本文。
如本文所用，术语“接受体”和“接受体抗体”是指提供或编码一个或多个框架区的氨基酸序列的至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或100％的抗体或核酸序列。在一些实施方案中，术语“接受体”是指提供或编码恒定区的抗体氨基酸或核酸序列。在另一个实施方案中，术语“接受体”是指提供或编码一个或多个框架区和恒定区的抗体氨基酸或核酸序列。在一个具体的实施方案中，术语“接受体”是指提供或编码一个或多个框架区的氨基酸序列的至少80％，优选至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或100％的人抗体氨基酸或核酸序列。根据该实施方案，接受体可以含有不存在于人抗体的一个或多个特定位置的至少1个，至少2个，至少3个，至少4个，至少5个，或至少10个氨基酸残基。接受体框架区和/或受体恒定区可以例如从种系抗体基因，成熟抗体基因，功能抗体(例如，本领域公知的抗体，开发中的抗体，或商品化抗体)衍生或获得。
如本文所用，术语“规范”残基是指限定由Chothia等人(J.Mol.Biol.196:901-907(1987)；Chothia et al.,J.Mol.Biol,227:799(1992),两者都通过引用并入本文)定义的特定的规范CDR结构的CDR或框架中的残基。根据Chothia等人，许多抗体的CDR的关键部分具有几乎相同的肽主链确认，尽管在氨基酸序列水平上有大的多样性。每个规范结构主要规定形成环的氨基酸残基的连续区段的一组肽主链扭转角。
如本文所用，术语“供体”和“供体抗体”是指提供一个或多个CDR的抗体。在本文所述的组合物和方法的一些实施方案中，供体抗体是来自与获得或衍生框架区的抗体不同的物种的抗体。在人源化抗体的情况下，术语“供体抗体”是指提供一个或多个CDR的非人抗体。
如本文所用，术语“关键”残基是指可变区内对抗体，特别是人源化抗体的结合特异性和/或亲和力具有更大影响的某些残基。关键残基包括但不限于以下一个或多个：与CDR相邻的残基、潜在的糖基化位点(其可以是N-或O-糖基化位点)、罕见的残基、能够与抗原相互作用的残基、能够与CDR相互作用的残基、规范残基、重链可变区和轻链可变区之间的接触残基、游离区内的残基、以及重链可变CDR1的Chothia定义和第一个重链框架的Kabat定义之间重叠的区域中的残基。
在包含本文所述的任何抗LAP抗体或其抗原结合片段的组合物和方法的一些实施方案中，抗LAP抗体或抗原结合片段是抗体衍生物。例如但不限于，抗体衍生物包括已被修饰的抗体，例如通过糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、酰胺化、通过已知保护/封闭基团的衍生化、蛋白水解切割、连接到细胞配体或其它蛋白质等。许多化学修饰中的任一种可以通过已知技术进行，包括但不限于特定的化学切割、乙酰化、甲酰化等。此外，该衍生物可含有一种或多种非经典氨基酸。
本文所述的抗LAP抗体和抗原结合片段可以通过本领域已知的任何合适的方法产生。针对例如LAP的单克隆和多克隆抗体是本领域已知的。在对于例如产生具有特定特征或表位特异性的抗体必要的程度上，本领域技术人员可以产生新的单克隆抗体或多克隆抗LAP抗体，如本文中简要讨论或如本领域中已知。
多克隆抗体可以通过本领域熟知的各种方法产生。例如，LAP或其包含一个或多个LAP配体相互作用位点的片段可以施用于各种宿主动物，包括但不限于兔，小鼠，大鼠等，以诱导含有对蛋白质特异性的多克隆抗体的血清的产生。多克隆抗体优选通过多次皮下(sc)或腹膜内(ip)注射相关抗原和佐剂在动物中制备。可以有用的是将抗原与待免疫的物种中免疫原性的蛋白质(例如钥孔虫戚血蓝蛋白，血清白蛋白，牛甲状腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制剂)缀合，使用双功能或衍生化试剂，例如马来酰亚胺苯甲酰磺基琥珀酰亚胺酯(通过半胱氨酸残基的缀合)，N-羟基-琥珀酰亚胺(通过赖氨酸残基)，戊二醛，琥珀酸酐，SOCl2或R1N＝C＝NR，其中R和R1是不同的烷基基团。可以使用各种其它佐剂来增加免疫应答，这取决于宿主物种，并且包括但不限于：弗氏(完全和不完全)，矿物凝胶如氢氧化铝，表面活性物质如溶血卵磷脂，pluronic多元醇，聚阴离子，肽，油乳剂，钥孔虫戚血蓝蛋白，二硝基苯酚和潜在有用的人佐剂如BCG(卡介苗)和小棒杆菌(corynebacterium parvum)。合适的佐剂也是本领域技术人员所熟知的。
单克隆抗体可以使用本领域已知的多种技术制备，包括使用杂交瘤，重组和噬菌体展示技术或其组合。本文描述的用于制备单克隆抗体的各种方法在本领域是可获得的。例如，单克隆抗体可以使用首先由Kohler et al.,Nature,256:495(1975)描述的杂交瘤方法或其任何后续发展，或通过重组DNA方法(美国专利号4,816,567)制备。例如，可以使用杂交瘤技术产生单克隆抗体，包括本领域已知的并且例如在Harlow et al.,Antibodies:ALaboratory Manual,(Cold Spring Harbor Laboratory Press,第2版,1988)；Hammer-ling,et al.,in:Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681(Elsevier,N.Y.,1981)(所述参考文献通过引用整体并入)中教导的。使用杂交瘤技术生产和筛选特异性抗体的方法是本领域常规和熟知的。在另一个实例中，也可以使用本领域已知的各种噬菌体展示方法产生本文所述的方法和组合物中有用的抗体，如使用McCafferty et al.,Nature,348:552-554(1990)中描述的技术产生的抗体噬菌体文库的分离。Clackson etal.,Nature,352:624-628(1991)和Marks et al.,J.Mol.Biol.,222:581-597(1991)分别描述了使用噬菌体文库分离鼠和人抗体。随后的出版物描述了通过链改组产生高亲和力(nM范围)的人抗体(Marks et al.,Bio/Technology,10:779-783(1992))，以及组合感染和体内重组作为构建非常大的噬菌体文库的策略(Waterhouse et al.,Nuc.Acids.Res.,21:2265-2266(1993))。因此，这些技术是用于分离单克隆抗体的传统单克隆抗体杂交瘤技术的可行备选方案。
在本文所述的组合物，方法和用途的一些实施方案中，将完全人抗体用作LAP结合剂，其对于人患者的治疗性处理是特别期望的。
人抗体可以通过本领域已知的多种方法制备，包括使用源自人免疫球蛋白序列的抗体文库的上文描述的噬菌体展示方法。另见美国专利No.4,444,887和4,716,111；和PCT公开WO 98/46645,WO 98/50433,WO98/24893,WO 98/16654,WO 96/34096,WO 96/33735,和WO 91/10741，其内容通过引用整体并入本文。
也可以使用表达人免疫球蛋白基因的转基因小鼠制备人抗体，并且在免疫后能够在不存在内源性免疫球蛋白产生的情况下产生人抗体的完全库。关于生产人抗体的这种技术的概述，参见Lonberg and Huszar,1995,Int.Rev.Immunol.13:65-93。关于用于生产人抗体和人单克隆抗体的此技术以及用于产生此类抗体的方案的详细讨论，参见例如PCT公开WO 98/24893；WO 92/01047；WO 96/34096；WO 96/33735；欧洲专利No.0 598 877；美国专利No.5,413,923；5,625,126；5,633,425；5,569,825；5,661,016；5,545,806；5,814,318；5,885,793；5,916,771；和5,939,598，其内容通过引用完整并入本文。另外，诸如Abgenix,Inc.(Freemont,Calif.)和Medarex(Princeton,N.J.)等公司可以允诺提供针对选定的抗原的人抗体，其使用与上文描述的技术相似的技术进行。还见例如Jakobovits et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:2551(1993)；Jakobovits et al.,Nature,362:255-258(1993)；Bruggermann et al.,Year in Immuno.,7:33(1993)；以及Duchosal etal.Nature355:258(1992)，其内容通过引用整体并入本文。或者，可以使用噬菌体展示技术(McCafferty et al.,Nature 348:552-553(1990))从来自未免疫供体的免疫球蛋白可变(V)域基因全集在体外产生人抗体和抗体片段。人抗体也可以由体外活化的B细胞产生(参见美国专利号5,567,610和5,229,275，其内容通过引用完整并入本文)。可以使用称为“引导选择”的技术来产生识别所选表位的完全人抗体。在该方法中，选择的非人单克隆抗体，例如小鼠抗体用于指导识别相同表位的完全人抗体的选择(Jespers et al.,1994,Bio/technology12:899-903)。
“Fv”片段是含有完整的抗原识别和结合位点的抗体片段。该区域由紧密缔合的一个重链可变域和一个轻链可变域的二聚体组成，其本质上可以是共价的，例如在scFv中。用于在这种配置中，每个可变域的三个CDR相互作用以限定VH-VL二聚体表面上的抗原结合位点。总共，六个CDR或其亚组赋予抗体的抗原结合特异性然而，即使通常以比整个结合位点低的亲和力，单个可变域(或仅包含针对抗原特异性的三个CDR的一半的Fv)具有识别和结合抗原的能力。
“框架区域”(以下称为FR)是除CDR残基之外的那些可变域残基。每个可变域通常具有标识为FR1，FR2，FR3和FR4的四个FR。如果根据Kabat定义CDR，则轻链FR残基位于大约残基1-23(LCFR1)，35-49(LCFR2)，57-88(LCFR3)和98-107(LCFR4)，并且重链FR残基大约位于重链残基中的残基1-30(HCFR1)，36-49(HCFR2)，66-94(HCFR3)和103-113(HCFR4)处。如果CDR包含来自高变环的氨基酸残基，则轻链FR残基位于轻链中的大约残基1-25(LCFR1)，33-49(LCFR2)，53-90(LCFR3)和97-107(LCFR4)，并且重链FR残基大约位于重链残基中的残基1-25(HCFR1)，33-52(HCFR2)，56-95(HCFR3)和102-113(HCFR4)处。在一些情况下，当CDR包含来自如由Kabat定义的CDR和高变环的CDR两者的氨基酸时，FR残基将相应地调整。例如，当CDRH1包括氨基酸H26-H35时，重链FR1残基位于1-25位，并且FR2残基位于36-49位。每个互补决定区可以包含如由Kabat定义的“互补决定区”的氨基酸残基(即在轻链可变域中的大约残基24-34(L1)，50-56(L2)和89-97(L3)和重链可变域中的31-35(H1)，50-65(H2)和95-102(H3)；Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5thEd.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991))和/或来自“高变环”的那些残基(即轻链可变域中的大约残基26-32(L1)，50-52(L2)和91-96(L3)和重链可变域中的26-32(H1)，53-55(H2)和96-101(H3)；Chothia and LeskJ.Mol.Biol.196:901-917(1987))。在一些情况下，互补决定区可包括来自根据Kabat定义的CDR区和高变环两者的氨基酸。
“人源化抗体”在该术语在本文中使用时是指来自非人物种的抗体分子，其中结合期望抗原(即LAP或与配体结合的LAP)的抗体具有来自非人物种的一个或多个CDR，以及来自人免疫球蛋白分子的框架和恒定区。通常，人框架区中的框架残基将被来自CDR供体抗体的相应残基取代，以改变，优选地改善抗原结合。这些框架取代通过本领域熟知的方法来鉴定，例如通过CDR和框架残基的相互作用的建模来鉴定对于抗原结合重要的框架残基，以及序列比较来鉴定在特定位置处的不寻常的框架残基。(参见例如Queen et al.,美国专利No.5,585,089；Riechmann et al.,1988,Nature332:323)。可以使用本领域中已知的多种技术使抗体人源化，包括例如CDR移植(EP 239,400；PCT公开WO 91/09967；美国专利No.5,225,539；5,530,101；和5,585,089),镶面(veneering)或表面重构(EP 592,106；EP519,596；Padlan,Molecular Immunology,1991,28(4/5):489-498；Studnicka et al.,1994,Protein Engineering 7(6):805-814；Roguska.et al,1994,PNAS91:969-973)，和链改组(美国专利No.5,565,332)，其内容通过引用完整并入本文。人源化抗体具有从非人来源引入其中的一个或多个氨基酸残基。这些非人氨基酸残基通常被称为“输入”残基，其通常取自“输入”可变域。人源化可以基本上按照Winter和同事的方法(Jones et al.,Nature,321:522-525(1986)；Riechmann et al.,Nature,332:323-327(1988)；Verhoeyen et al.,Science,239:1534-1536(1988))(其内容通过引用整体并入本文)进行，通过用啮齿动物CDR或CDR序列替换人抗体的相应序列进行。因此，此类“人源化”抗体是嵌合抗体(美国专利号4,816,567，其内容通过引用整体并入本文)，其中实质上少于完整的人可变域已被来自非人物种的相应序列替换。实际上，人源化抗体通常是人抗体，其中一些CDR残基和可能一些FR残基被啮齿类抗体中的类似位点的残基取代。
“Fab”片段含有轻链的可变和恒定域和可变域和重链的第一恒定域(CH1)的可变域。F(ab')2抗体片段包含一对Fab片段，它们通过它们之间的铰链半胱氨酸在其羧基末端附近共价连接。抗体片段的其它化学偶联也是本领域已知的。
“单链Fv”或“scFv”抗体片段包含抗体的VH和VL域，其中这些域存在于单个多肽链中。通常，Fv多肽还包含VH和VL域之间的多肽接头，其使scFv能够形成抗原结合期望的结构。关于scFv的综述，参见Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,第113卷,Rosenburg and Moore编Springer-Verlag,New York,第269-315页(1994)。
术语“双抗体”是指具有两个抗原结合位点的小抗体片段，其片段包含与同一多肽链(VH和VL)中与轻链可变域(VL)连接的重链可变域(VH)。通过使用太短以致于不允许同一链上的两个域之间配对的接头，迫使域与另一条链的互补域配对并创建两个抗原结合位点。双抗体在例如EP 404,097；WO93/11161；以及Hollinger et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993)中更完整描述。
表述“线性抗体”是指Zapata等人，Protein Eng.,8(10):1057-1062(1995)中描述的抗体。简言之，这些抗体包含一对串联Fd区段(VH-CH1-VH-CH1)，其与互补轻链多肽一起形成一对抗原结合区。线性抗体可以是双特异性或单特异性的。
已经开发出用于产生抗体或抗原结合片段的各种技术。本文描述的抗体可以使用常规技术进行片段化，并且以与上文对全抗体所述相同的方式对片段筛选效用。传统上，这些片段是通过完整抗体的蛋白水解消化衍生的(参见例如Morimoto et al.,Journal ofBiochemical and Biophysical Methods24:107-117(1992)和Brennan et al.,Science,229:81(1985))。例如，可以通过使用酶例如木瓜蛋白酶(以产生Fab片段)或胃蛋白酶(以产生F(ab')2片段)蛋白水解切割免疫球蛋白分子来产生本文所述的双特异性和多特异性抗体的Fab和F(ab')2片段。F(ab')2片段包含可变区，轻链恒定区和重链的CH1域。然而，这些片段现在可以由重组宿主细胞直接产生。例如，抗体片段可以从上文讨论的抗体噬菌体文库中分离出来。或者，Fab'-SH片段可以直接从大肠杆菌(E.coli)中回收并化学偶联形成F(ab')2片段(Carter et al.,Bio/Technology 10:163-167(1992))。根据另一种方法，可以从重组宿主细胞培养物中直接分离F(ab')2片段。用于制备抗体片段的其它技术对于熟练从业人员将是显而易见的。在其它实施方案中，所选择的抗体是单链Fv片段(scFv)。参见WO93/16185。
可以用于产生单链Fv和抗体的技术的实例包括美国专利No.4,946,778和5,258,498；Huston et al.,1991,Methods in Enzymology 203:46-88；Shu et al.,1993,PNAS90:7995-7999；以及Skerra et al.,1988,Science 240:1038-1040中描述的。对于一些用途，包括如本文所述的人中的抗体体内用途以及体外增殖或细胞毒性测定，优选使用嵌合，人源化或人抗体。
“亲和力成熟”抗体是在其一个或多个CDR中具有一个或多个改变的抗体，所述改变导致与不拥有那些改变的亲本抗体相比抗体对抗原的亲和力的改善。优选的亲和力成熟抗体对靶抗原会具有纳摩尔或甚至皮摩尔亲和力。通过本领域已知的方法产生亲和力成熟的抗体。Marks et al.Bio/Technology 10:779-783(1992)描述了通过VH和VL域改组的亲和力成熟。CDR和/或框架残基的随机诱变由以下描述：Barbas et al.Proc Nat.Acad.Sci,USA 91:3809-3813(1994)；Schier et al.Gene 169:147-155(1995)；Yelton etal.J.Immunol.155:1994-2004(1995)；Jackson et al.,J.Immunol.154(7):3310-9(1995)；以及Hawkins et al.,J.Mol.Biol.226:889-896(1992)。
如本文所用，“互补”是指此时两个免疫球蛋白域属于形成关联对或组的结构家族或源自此类家族并且保留该特征。例如，天然抗体的VH域和VL域是互补的；两个VH域不互补，并且两个VL域不互补。互补域可以在免疫球蛋白超家族的其它成员中发现，如T细胞受体的Vα和Vβ(或γ和δ)域。人工的域，如基于不结合表位的蛋白质支架的域是不互补的(除非工程化改造为如此)。同样，基于例如免疫球蛋白域和纤连蛋白域的两个域不是互补的。
在本文所述的组合物，方法和用途的一些实施方案中，LAP结合剂是小分子抑制剂，试剂或化合物。
在本文描述的方法的一些实施方案中，用于本文所述方法的LAP小分子结合剂可以与LAP配体相互作用位点，例如与成熟TGF-β相互作用的位点，与整联蛋白相互作用的站点，和/或与LTBP相互作用的位点结合或物理相互作用。
在本文描述的方法的一些实施方案中，LAP小分子结合剂与SEQ ID NO:1和4的R189、SEQ ID NO:2和5的R196，和/或SEQ ID NO:3和6的R192结合或物理相互作用。在本文描述的方法的一些实施方案中，LAP小分子结合剂与SEQ ID NO:1和4的氨基酸215-217，SEQID NO:2和5的氨基酸241-243和/或SEQ ID NO:3和6的氨基酸238-240结合或物理相互作用。在本文所述方法的一些实施方案中，LAP小分子结合剂与SEQ ID NO:1-6中任一个的Cys4结合或物理相互作用。
在本文所述的方法的一些实施方案中，用于本文所述方法的LAP小分子结合剂可以与LAP同二聚化位点(即与另一LAP分子相互作用的位点)结合或物理相互作用。因此，在本文描述的方法的一些实施方案中，LAP小分子结合剂与SEQ ID NO:1和4的Cys194和/或Cys196和SEQ ID NO:2和5的Cys206和/或Cys208和/或SEQ ID NO:3和6的Cys204和/或Cys206结合或物理相互作用。
此类小分子抑制剂包括但不限于小肽或肽样分子，可溶性肽和合成的非肽基有机或无机化合物。小分子抑制剂或拮抗剂可以具有约100至约20,000道尔顿(Da)，约500至约15,000Da，约1000至约10,000Da中任一种的分子量。
在本文所述的组合物，方法和用途的一些实施方案中，LAP结合剂是与LAP结合或物理相互作用并调节LAP与其任何配体之间的相互作用的RNA或DNA适体。
在本文所述的方法的一些实施方案中，用于本文所述方法的LAP RNA或DNA适体可以结合LAP配体相互作用位点，即与成熟TGFβ相互作用的位点，与整联蛋白相互作用的位点，和/或与LTBP相互作用的位点。
在本文描述的方法的一些实施方案中，LAP RNA或DNA适体结合SEQ ID NO:1和4的R189、SEQ ID NO:2和5的R196、和/或SEQ ID NO:3和6的R192。在本文描述的方法的一些实施方案中，LAP RNA或DNA适体与SEQ ID NO:1和4的氨基酸215-217、SEQ ID NO:2和5的氨基酸241-243、和/或SEQ ID NO:3和6的氨基酸238-240结合或物理相互作用。在本文所述的方法的一些实施方案中，RNA或DNA适体与SEQ ID NO:1-6中任一个的Cys4结合或物理相互作用。
在本文所述的方法的一些实施方案中，用于本文所述方法的LAP RNA或DNA适体可以与LAP同二聚化位点，即与另一LAP分子相互作用的位点结合或物理相互作用。因此，在本文描述的方法的一些实施方案中，LAP RNA或DNA适体与SEQ ID NO:1和4的Cys194和/或Cys196，SEQ ID NO:2和5的Cys206和/或Cys208，和/或SEQ ID NO:3和6的Cys204和/或Cys206结合或物理相互作用。
用于本文描述的组合物和方法的LAP结合剂可以使用本领域已知的方法来鉴定或表征，例如蛋白质-蛋白质结合测定，生物化学筛选测定，免疫测定和基于细胞的测定，其是本领域中公知的，包括但不限于实施例和附图中所述的那些。
对于本文所述的方法和用途的临床应用，施用包含LAP结合剂的组合物可以包括配制成用于胃肠外施用，例如静脉内；粘膜，例如鼻内；眼或其它施用模式的药物组合物或药物制剂。在一些实施方案中，本文所述的LAP结合剂可以与在受试者中导致有效治疗的任何药学上可接受的载体化合物，材料或组合物一起施用。因此，用于本文所述的方法的药物配制剂可以含有与一种或多种药学上可接受的成分组合的如本文所述的LAP结合剂。
短语“药学上可接受的”是指在合理的医学判断的范围内适合用于与人和动物的组织接触而没有过度毒性、刺激性、变应性应答或其它问题或并发症，与合理的益处/风险比相称的那些化合物、材料、组合物和/或剂型。如本文中所用，短语“药学上可接受的载体”是指药学上可接受的材料、组合物或媒介物，如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂、介质、包封材料、制造助剂(例如润滑剂、滑石镁、硬脂酸钙或锌或硬脂酸)或溶剂包封材料，其涉及维持LAP结合剂的稳定性、溶解度或活性。在与配制剂的其它成分相容并且不对患者有害的意义上，每种载体必须是“可接受的”。可充当药学上可接受的载体的材料的一些实例包括：(1)糖，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；(2)淀粉，如玉米淀粉和马铃薯淀粉；(3)纤维素及其衍生物，如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、乙基纤维素、微晶纤维素和乙酸纤维素；(4)粉状黄蓍胶；(5)麦芽；(6)明胶；(7)赋形剂，如可可脂和栓剂蜡；(8)油，如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；(9)二醇，如丙二醇；(10)多元醇，如甘油、山梨糖醇、甘露醇和聚乙二醇(PEG)；(11)酯，如油酸乙酯和月桂酸乙酯；(12)琼脂；(13)缓冲剂，如氢氧化镁和氢氧化铝；(14)海藻酸；(15)无热原水；(16)等张盐水；(17)林格氏溶液；(19)pH缓冲溶液；(20)聚酯、聚碳酸酯和/或聚酐；(21)填充剂，如多肽和氨基酸(22)血清组分，如血清白蛋白、HDL和LDL；(23)C2-C12醇，如乙醇；和(24)药物配制剂中使用的其它无毒相容物质。释放剂、包衣剂、防腐剂和抗氧化剂也可以存在于药物配制剂中。诸如“赋形剂”、“载体”、“药学上可接受的载体”等的术语在本文中可互换使用。
本文所述的LAP结合剂可以特别配制用于以固体、液体或凝胶形式向受试者施用化合物，包括适用于以下的那些：(1)肠胃外施用，例如通过皮下、肌肉内、静脉内或硬膜外注射，作为例如无菌溶液或悬浮液或持续释放配制剂；(2)表面应用，例如作为施用于皮肤的霜剂、软膏剂或受控释放贴片或喷雾剂；(3)***内或直肠内，例如作为子宫托、乳膏或泡沫；(4)眼；(5)经皮；(6)经粘膜；或(79)鼻。另外，可以将LAP结合剂植入患者或使用药物递送***注射。参见，例如Urquhart,et al.,Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.24:199-236(1984)；Lewis编"Controlled Release of Pesticides and Pharmaceuticals"(PlenumPress,New York,1981)；美国专利No.3,773,919；以及美国专利No.35 3,270,960。
下文描述了可以用于本文所述方法的包含LAP结合剂的组合物的配制剂和施用模式的其它实施方案。
肠胃外用剂型。LAP结合剂的肠胃外剂型也可以通过各种途径施用于受试者，包括但不限于皮下、静脉内(包括推注)、肌肉内和动脉内。由于肠胃外剂型的施用通常绕过患者对污染物的天然防御，胃肠外剂型优选是无菌的或能够在对患者施用前灭菌。肠胃外剂型的实例包括但不限于准备注射的溶液、准备要溶解或悬浮在药学上可接受的注射用媒介物中的干产品、准备注射的悬浮液、受控释放肠胃外剂型、和乳剂。
可以用于提供本公开的肠胃外剂型的合适媒介物是本领域技术人员公知的。实例包括但不限于：无菌水；注射用水USP；生理盐水；葡萄糖溶液水性媒介物，如但不限于氯化钠注射液、林格注射液、右旋糖注射液，右旋糖和氯化钠注射液、以及乳酸林格注射液；水混溶性媒介物，如但不限于乙醇、聚乙二醇、和丙二醇；和非水性媒介物，如但不限于玉米油、棉籽油、花生油、芝麻油、油酸乙酯、肉豆蔻酸异丙酯和苯甲酸苄酯。
气溶胶制剂。LAP粘合剂可以与合适的推进剂(例如烃推进剂，如丙烷、丁烷或异丁烷与常规佐剂)一起包装在加压气溶胶容器中。本文所述的LAP结合剂也可以以非加压形式施用，如在雾化器或喷雾器中。本文所述的LAP结合剂也可以例如通过使用吸入器以干粉形式直接施用于气道。
作为说明，合适的粉末组合物包括与乳糖或者对于支气管内施用可接受的其它惰性粉末彻底混合的本文所述的LAP结合剂的粉末制剂。粉末组合物可以通过气溶胶分配器施用或装入可被受试者***装置中的可破裂胶囊中，该装置刺穿胶囊并以适于吸入的稳定流吹出粉末。组合物可以包括推进剂、表面活性剂和共溶剂，并且可以填充到由合适的计量阀密封的常规气溶胶容器中。
用于对呼吸道递送的气溶胶是本领域中已知的。参见例如Adjei,A.and Garren,J.Pharm.Res.,1:565-569(1990)；Zanen,P.and Lamm,J.-W.J.Int.J.Pharm.,114:111-115(1995)；Gonda,I."Aerosols for delivery of therapeutic and diagnostic agents tothe respiratory tract,"于Critical Reviews in Therapeutic Drug CarrierSystems,6:273-313(1990)；Anderson et al.,Am.Rev.Respir.Dis.,140:1317-1324(1989))，并且也具有用于***性递送肽和蛋白质的潜力(Patton and Platz,AdvancedDrug Delivery Reviews,8:179-196(1992))；Timsina et.al.,Int.J.Pharm.,101:1-13(1995)；和Tansey,I.P.,Spray Technol.Market,4:26-29(1994)；French,D.L.,Edwards,D.A.and Niven,R.W.,Aerosol Sci.,27:769-783(1996)；Visser,J.,Powder Technology58:1-10(1989))；Rudt,S.and R.H.Muller,J.Controlled Release,22:263-272(1992)；Tabata,Y,and Y.Ikada,Biomed.Mater.Res.,22:837-858(1988)；Wall,D.A.,DrugDelivery,2:10 1-20 1995)；Patton,J.and Platz,R.,Adv.Drug Del.Rev.,8:179-196(1992)；Bryon,P.,Adv.Drug.Del.Rev.,5:107-132(1990)；Patton,J.S.,et al.,Controlled Release,28:15 79-85(1994)；Damms,B.and Bains,W.,NatureBiotechnology(1996)；Niven,R.W.,et al.,Pharm.Res.,12(9)；1343-1349(1995)；和Kobayashi,S.,et al.,Pharm.Res.,13(1):80-83(1996)，所有这些的内容通过引用完整并入本文。
本文所述的LAP结合剂的配制剂还涵盖包含所公开的化合物作为活性成分的无水药物组合物和剂型，因为水可以促进一些化合物的降解。例如，在制药领域中广泛接受水的添加(例如5％)作为模拟长期储存的手段，以便确定诸如架存期或制剂随时间的稳定性的特征。参见例如Jens T.Carstensen,Drug Stability:Principles&Practice,379-80(2nded.,Marcel Dekker,NY,N.Y.:1995)。本公开的无水药物组合物和剂型可以使用无水或低含水成分和低水分或低湿度条件来制备。如果预期在制造、包装和/或储存期间与水分和/或湿度实质性接触，则包含乳糖和至少一种包含伯胺或仲胺的活性成分的药物组合物和剂型优选是无水的。优选使用已知防止暴露于水的材料包装无水组合物，使得它们可以包含在合适的配方试剂盒中。合适的包装的实例包括但不限于气密密封箔、塑料、具有或不具有干燥剂的单位剂量容器(例如小瓶)、泡罩包装和带状包装(strip pack)。
受控和延迟释放剂量形式。在本文描述的方面的一些实施方案中，LAP结合剂可以通过受控或延迟释放手段施用于受试者。理想地，在医学治疗中使用最佳设计的受控释放制剂的特征在于用于在最小量的时间中治愈或控制状况的药物物质的最小值。受控释放配制剂的优点包括：1)药物的延长活性；2)减少剂量频率；3)增加的患者顺从性；4)较小的总剂量的使用；5)局部或***性副作用的降低；6)药物积累的最小化；7)血液水平波动的减少；8)治疗功效的改善；9)药物活性的增强或丧失的减少；10)疾病或状况的控制速度的改善。(Kim,Cherng-ju,Controlled Release Dosage Form Design,2(TechnomicPublishing,Lancaster,Pa.:2000))。受控释放配制剂可用于控制式(I)化合物的作用开始、作用持续时间、治疗窗内的血浆水平和峰值血液水平。特别地，可以使用受控或延长释放剂型或配制剂来确保实现式(I)化合物的最大有效性，同时使潜在的不利影响和安全性问题(其可以由于药物给药不足(即，低于最小治疗水平)以及超过药物的毒性水平两者而发生)最小化。
多种已知的受控或延长释放剂型、配制剂和装置可适用于与本文所述的LAP结合剂一起使用。实例包括但不限于美国专利No.:3,845,770；3,916,899；3,536,809；3,598,123；4,008,719；5674,533；5,059,595；5,591,767；5,120,548；5,073,543；5,639,476；5,354,556；5,733,566；以及6,365,185B1中描述的，其各自的全部内容通过引用并入本文。这些剂型可用于提供一种或多种活性成分的缓慢或受控释放，使用例如羟丙基甲基纤维素、其它聚合物基质、凝胶、可渗透膜、渗透***(如
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(Alza Corporation,MountainView,Calif.USA))、多层涂层材料、微粒、脂质体或微球或其组合以在不同比例中提供期望的释放概貌。此外，离子交换材料可用于制备所公开化合物的固定化、吸附的盐形式，从而实现药物的受控递送。具体的阴离子交换剂的实例包括但不限于：
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A568和
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AP143(Rohm&Haas,Spring House,Pa.USA)。
在本文描述的方法的一些实施方案中，用于本文所述方法的LAP结合剂通过持续释放或以脉冲施用于受试者。脉冲疗法不是随时间不连续施用相同量的组合物的形式，而是包括以降低的频率施用相同剂量的组合物或施用减少的剂量。当病症在受试者中连续发生时，例如在受试者具有病毒感染的连续或慢性症状的情况下，持续释放或脉冲施用是特别优选的。可以减少每个脉冲剂量，并且使在治疗过程中对受试者或患者施用的本文所述的LAP结合剂的总量最小化。
必要时，脉冲之间的间隔可由本领域普通技术人员确定。通常，当组合物或组合物的活性组分在递送下一个脉冲之前在受试者中不再可检测到时，可以通过施用另一剂的组合物来计算脉冲之间的间隔。间隔也可以从组合物的体内半衰期计算。间隔可以计算为大于体内半衰期，或比组合物半衰期大2倍，3倍，4倍，5倍和甚至10倍。用于通过输注或其它形式的递送给患者脉冲组合物的各种方法和装置公开在美国专利No.4,747,825；4723958；4948592；4,965,251和5,403,590。
治疗方法和LAP结合剂的用途
如本文中证明，当用抗LAP抗体处理时，颅内和皮下的GBM肿瘤生长较低，并且小鼠存活较长。抗LAP抗体治疗也如下影响***性和肿瘤内免疫：(1)肿瘤被增加数目的细胞毒性CD8+ T细胞浸润，并且肿瘤内Foxp3Treg减少。CD4+和CD8+肿瘤内T细胞具有降低的PD-1、LAG3和CD103表达。(2)在外周中，表达IFN-γ和颗粒酶B的CD4+和CD8+ T细胞分别增加，而CD103+ T细胞减少。最后，表达CD103和PD-L1的耐受性树突细胞数目减少，而MHC II在脾脏髓样细胞上升高。还在黑素瘤模型和结肠直肠癌模型中测试了抗LAP抗体，并观察到类似的肿瘤内和外周免疫作用。因此，如本文中证明，LAP的抑制通过激活先天和适应性免疫两者来强烈地影响***性和肿瘤内免疫应答，并且克服了抑制肿瘤特异性免疫的机制。总之，LAP结合剂作为单一疗法或与常规抗肿瘤模式组合代表了治疗各种癌症的新型免疫治疗方法，包括但不限于脑瘤、黑素瘤和结肠直肠癌。
在一些方面，在本文中提供了治疗癌症和肿瘤的方法，其中LAP表达和/或活性与癌症或肿瘤特异性免疫的抑制相关，包括对有此需要的受试者施用治疗有效量的LAP结合剂。
在一些方面，本文提供了增加肿瘤特异性免疫的方法，包括对有此需要的受试者施用治疗有效量的LAP结合剂。
在本文所述的这些方面和所有此类方面的一些实施方案中，受试者具有或已经诊断为具有癌症。
如本文所用，“癌症”或“肿瘤”是指干扰身体器官和***的正常功能发挥的细胞的不受控制的生长。具有癌症或肿瘤的受试者是具有存在于受试者体内的客观可测量的癌细胞的受试者。该定义中包括良性和恶性癌症，以及休眠性肿瘤或微转移。从其初始位置迁移并且接种重要器官的癌症最终可以通过受影响的器官的功能恶化而导致受试者的死亡。诸如白血病的造血癌症能够在与受试者中的正常造血区室的竞争中胜出，从而导致造血衰竭(以贫血、血小板减少和嗜中性粒细胞减少症(neutropenia)的形式)，最终导致死亡。
“转移”是指癌症从其主要部位扩散到身体其它位置。癌细胞可以脱离原发性肿瘤，穿透***和血管，通过血流循环，并在身体其它地方的正常组织中的远距离病灶中生长(转移)。转移可以是局部的或远端的。转移是一个连续的过程，取决于肿瘤细胞从原发性肿瘤中脱离，经由血流行进，并在远端部位处停止。在新的部位处，细胞建立血液供应，并可以生长以形成危及生命的块。肿瘤细胞内的刺激和抑制性分子途径两者调节此行为，并且远端部位中的肿瘤细胞和宿主细胞之间的相互作用也是重大的。
除了监测特定的症状外，最通常通过单独或组合使用磁共振成像(MRI)扫描、计算机断层摄影(CT)扫描、血液和血小板计数、肝功能研究、胸部X射线和骨扫描检测转移。
癌症的实例包括但不限于癌、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤和白血病。此类癌症的更具体的实例包括但不限于：基底细胞癌、胆道癌；膀胱癌；骨癌；脑和CNS癌；乳腺癌；腹膜癌；***；胆管癌；绒毛膜癌；结肠和直肠癌；***癌；消化***癌症；子宫内膜癌；食道癌；眼癌；头颈癌；胃癌(包括胃肠癌)；胶质母细胞瘤；肝癌；肝癌；上皮内新生物；肾癌；喉癌；白血病；肝癌；肺癌(例如，小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞状细胞癌)；淋巴瘤，包括霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤；黑素瘤；骨髓瘤；神经母细胞瘤；口腔癌(例如唇、舌、口、和咽)；卵巢癌；胰腺癌；***癌；视网膜母细胞瘤；横纹肌肉瘤；直肠癌；呼吸***癌；唾液腺癌；肉瘤；皮肤癌；鳞状细胞癌；胃癌；畸胎癌；睾丸癌；甲状腺癌；子宫或子宫内膜癌；泌尿***癌症；外阴癌；以及其它癌和肉瘤；以及B细胞淋巴瘤(包括低级别/滤泡型非霍奇金淋巴瘤(NHL)；小淋巴细胞性(SL)NHL；中级/滤泡型NHL；中等级弥漫性NHL；高级免疫母细胞性NHL；高级免疫母细胞性NHL；高等级小非裂解细胞NHL；大体积疾病NHL(bulky diseaseNHL)；套细胞淋巴瘤；AIDS相关淋巴瘤；和沃尔登斯特伦(Waldenstrom)巨球蛋白血症)；慢性淋巴细胞性白血病(CLL)；急性成淋巴细胞性白血病(ALL)；毛细胞白血病；慢性成髓细胞性白血病；和移植后淋巴增生性疾病(PTLD)，以及与斑痣性错构瘤病相关的异常血管增生，水肿(如与脑肿瘤相关的水肿)、原始起源肿瘤和梅格斯(Meigs)氏综合征。
在本文所述的这些方法和所有此类方法的一些实施方案中，有此需要的受试者具有或已经诊断为具有脑肿瘤。在一些此类实施方案中，脑肿瘤是胶质母细胞瘤。
在本文所述的这些方法和所有此类方法的一些实施方案中，有此需要的受试者具有或已经诊断为具有黑素瘤。
在本文所述的这些方法和所有此类方法的一些实施方案中，有此需要的受试者具有或已经诊断为具有结肠直肠癌。
在本文所述的这些方法和所有此类方法的一些实施方案中，有此需要的受试者具有或已经诊断为具有脑肿瘤、黑素瘤或结肠直肠癌。在一些此类实施方案中，脑肿瘤是胶质母细胞瘤。
在本文所述的这些方法和所有此类方法的一些实施方案中，除了本文所述的LAP结合剂之外，所述方法还包括对受试者施用抗癌疗法或试剂。
术语“抗癌疗法”是指可用于治疗癌症的疗法。抗癌治疗剂的实例包括但不限于例如手术、化疗剂、生长抑制剂、细胞毒性剂、放射疗法和用于放射疗法的试剂、抗血管生成剂、凋亡剂、抗微管蛋白剂、和其它治疗癌症的试剂，如抗HER-2抗体(例如
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)、抗CD20抗体、表皮生长因子受体(EGFR)拮抗剂(例如酪氨酸激酶抑制剂)、HER1/EGFR抑制剂(例如厄洛替尼
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)、血小板衍生生长因子抑制剂(例如，GLEEVECTM(伊马替尼甲磺酸盐(Imatinib Mesylate)))、COX-2抑制剂(例如塞来考昔(celecoxib))、干扰素、细胞因子、拮抗剂(例如中和抗体)，其结合一种或多种以下靶物PD1、PDL1、PDL2(例如，派姆单抗(pembrolizumab)；nivolumab；MK-3475；AMP-224；MPDL3280A；MEDI0680；MSB0010718C；和/或MEDI4736)；CTLA4(例如，tremelimumab(PFIZER)和ipilimumab))；LAG3(例如BMS-986016)；CD103；TIM-3和/或其它TIM系列成员；CEACAM-1和/或其它CEACAM家族成员、ErbB2、ErbB3、ErbB4、PDGFR-β、BlyS、APRIL、BCMA或VEGF受体、TRAIL/Apo2和其它生物活性和有机化学剂等。本文所述的方法也特别考虑其组合。
在本文描述的方法的一些实施方案中，与本文所述的LAP结合剂一起施用的抗癌疗法包含PD1、PDL1和/或PDL2抑制剂，如抗体。此类PD1、PDL1和PDL2抑制剂的非限制性实例包括派姆单抗(KEYTRUDA，MERCK)；nivolumab(BRISTOL-MYERS SQUIBB)；MK-3475；MPDL3280A(GENENTECH)；MEDI0680和MEDI4736(MEDIMMUNE/ASTRAZENECA)；AMP-224；和MSB0010718C。抗PD1抗体试剂的其它非限制性实例可以包括来自对人PD1特异性的单克隆抗体的PD1结合位点序列，如MDX-1106(ONO-4538)、完全人IgG4抗PD1阻断抗体(Journal ofClinical CT-011(Journal of ClinicalOncology,2008Vol 26,No 15S)；CT-011(CureTech,LTD,以前为CT-AcTibody或BAT)，人源化单克隆IgG1抗体(Benson DM et al,Blood.2010May 11)，或从克隆NAT(Abcam)，克隆EH12.2H7(Biolegend)，克隆J166(eBioscience)，克隆MIH4(eBioscience)，克隆J105(eBioscience)或克隆192106(R&Dsystems)获得的那些。
在一些实施方案中，抗癌疗法包括诸如过继性细胞转移的免疫治疗。本文所用，“过继性细胞转移”是指涉及遗传工程化受试者或患者自身的T细胞以在其表面上产生称为嵌合抗原受体(CAR)的特殊受体的免疫疗法。CAR是允许T细胞识别肿瘤细胞上的特定蛋白质(抗原)的蛋白质。然后，将这些工程化的CAR T细胞在实验室中培养直至它们以数十亿计数。然后，将CART细胞的扩大群体输注入患者中。输注后，T细胞在受试者的身体中繁殖，并在其工程受体的指导下识别并杀死其表面上携带抗原的癌细胞。
如本文所用，术语“细胞毒剂”是指抑制或阻止细胞功能和/或引起细胞破坏的物质。该术语旨在包括放射性同位素(例如At211,I131,I125,Y90,Re186,Re188,Sm153,Bi212,P32和Lu的放射性同位素)、化疗剂、和毒素如小分子毒素或细菌、真菌、植物或动物起源的酶活性毒素，包括其活性片段和/或变体。
在这些方法和本文所述的所有此类方法的一些实施方案中，所述方法还包括对施用了本文所述的LAP结合剂的受试者施用化疗剂，例如替莫唑胺。
化疗剂的非限制性实例可以包括烷化剂类(alkylating agents)，诸如塞替派(thiotepa)和
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环磷酰胺(cyclophosphamide)、替莫唑胺(temozolomide)；磺酸烷基酯类(alkyl sulfonates)，诸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶类(aziridines)，诸如苯佐替派(benzodepa)、卡波醌(carboquone)、美妥替派(meturedepa)和乌瑞替派(uredepa)；乙撑亚胺类(ethylenimines)和甲基蜜胺类(methylamelamines)，包括六甲蜜胺(altretamine)、三乙撑蜜胺(triethylenemelamine)、三乙撑磷酰胺(trietylenephosphoramide,triethylenephosphoramide)、三乙撑硫代磷酰胺(triethiylenethiophosphoramide,triethylenethiophosphoramide)和三羟甲蜜胺(trimethylolomelamine)；番荔枝内酯类(acetogenin)(尤其是布拉他辛(bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone))；喜树碱(camptothecin)(包括合成类似物托泊替康(topotecan)；苔藓抑素(bryostatin)；callystatin；CC-1065(包括其阿多来新(adozelesin)、卡折来新(carzelesin)和比折来新(bizelesin)合成类似物)；隐藻素类(cryptophycins)(特别是隐藻素1和隐藻素8)；多拉司他汀(dolastatin)；duocarmycin(包括合成类似物，KW-2189和CB1-TM1)；艾榴塞洛素(eleutherobin)；pancratistatin；sarcodictyin；海绵抑素(spongistatin)；氮芥类(nitrogen mustards)，诸如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、胆磷酰胺(cholophosphamide)、雌莫司汀(estramustine)、异环磷酰胺(ifosfamide)、双氯乙基甲胺(mechlorethamine)、盐酸氧氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法仑(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥胆甾醇(phenesterine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥(uracil mustard)；亚硝脲类(nitrosoureas)，诸如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimustine)；抗生素类，诸如烯二炔类抗生素(enediyne)(如加利车霉素(calicheamicin)，尤其是加利车霉素γ1I和加利车霉素ωI1(参见例如Agnew.Chem Intl.Ed.Engl.,33:183-186(1994))；蒽环类抗生素(dynemicin)，包括dynemicin A；埃斯波霉素(esperamicin)；以及新制癌素(neocarzinostatin)发色团和相关色蛋白烯二炔类抗生素发色团)、阿克拉霉素(aclacinomycin)、放线菌素(actinomycin)、氨茴霉素(anthramycin)、偶氮丝氨酸(azaserine)、博来霉素(bleomycin)、放线菌素C(cactinomycin)、carabicin、洋红霉素(caminomycin,carminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycinis,chromomycin)、放线菌素D(dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-二氮-5-氧-L-正亮氨酸、
Figure GDA0003423274920000781
多柔比星(doxorubicin)(包括吗啉代多柔比星、氰基吗啉代多柔比星、2-吡咯代多柔比星、和脱氧多柔比星)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊达比星(idarubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素类(mitomycins)诸如丝裂霉素C、霉酚酸(mycophenolicacid)、诺拉霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycin)、培洛霉素(peplomycin)、泊非霉素(potfiromycin,potfiromycin)、嘌呤霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑菌素(streptonigrin)、链佐星(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代谢物类，诸如甲氨蝶呤、和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，诸如二甲叶酸(denopterin)、甲氨蝶呤、蝶酰三谷氨酸(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物，诸如氟达拉滨(fludarabine)、6-巯基嘌呤(mercaptopurine)、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鸟嘌呤(thioguanine)；嘧啶类似物，诸如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、双脱氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)；雄激素类，诸如卡鲁睾酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)、表硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾内酯(testolactone)；抗肾上腺类，诸如氨鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂，诸如亚叶酸(folinic acid)；醋葡醛内酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamideglycoside)；氨基乙酰丙酸(aminolevulinic acid)；恩尿嘧啶(eniluracil)；安吖啶(amsacrine)；bestrabucil；比生群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；地磷酰胺(defosfamide)；地美可辛(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；elformithine；依利醋铵(elliptinium acetate)；epothilone；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟脲(hydroxyurea)；香菇多糖(lentinan)；氯尼达明(lonidamine)；美登木素生物碱类(maytansinoids)，诸如美登素(maytansine)和安丝菌素(ansamitocin)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌达醇(mopidamol)；二胺硝吖啶(nitracrine)；喷司他丁(pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；2-乙基酰肼(ethylhydrazide)；丙卡巴肼(procarbazine)；
Figure GDA0003423274920000791
多糖复合物(JHS Natural Products,Eugene,Oreg.)；雷佐生(razoxane)；根霉素(rhizoxin)；西索菲兰(sizofuran,sizofiran)；螺旋锗(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亚胺醌(triaziquone)；2,2',2”-三氯三乙胺；单端孢菌素类(trichothecenes)(尤其是T-2毒素、疣孢菌素(verrucarin)A、杆孢菌素(roridin)A和蛇行菌素(anguidin))；乌拉坦(urethan)；长春地辛(vindesine)；达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露醇氮芥(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；gacytosine；阿糖胞苷(arabinoside)(“Ara-C”)；环磷酰胺；塞替派(thiotepa)；类紫杉醇(taxoids)，例如
Figure GDA0003423274920000801
帕利他塞(paclitaxel)(Bristol-Myers Squibb Oncology,Princeton,N.J.)、
Figure GDA0003423274920000802
无克列莫佛(Cremophor-free)、清蛋白改造的纳米颗粒剂型帕利他塞(American Pharmaceutical Partners,Schaumberg,Ill.)和
Figure GDA0003423274920000803
多西他塞(doxetaxel)(Rhone-Poulenc Rorer,Antony,France)；苯丁酸氮芥(chlorambucil)；
Figure GDA0003423274920000804
吉西他滨；6-硫鸟嘌呤(thioguanine)；巯基嘌呤(mercaptopurine)；甲氨蝶呤(methotrexate)；铂类似物，诸如顺铂(cisplatin)、奥沙利铂(oxaliplatin)和卡铂(carboplatin)；长春碱(vinblastine)；铂；依托泊苷(etoposide)(VP-16)；异环磷酰胺(ifosfamide)；米托蒽醌(mitoxantrone)；长春新碱；NAVELBINE,长春瑞滨(vinorelbine)；能灭瘤(novantrone)；替尼泊苷(teniposide)；依达曲沙(edatrexate)；道诺霉素(daunomycin)；氨基蝶呤(aminopterin)；希罗达(xeloda)；伊本膦酸盐(ibandronate)；伊立替康(irinotecan)(Camptosar,CPT-11)(包括伊立替康与5-FU和甲酰四氢叶酸(leucovorin)的治疗方案)；拓扑异构酶抑制剂RFS2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；类维A酸(retinoids)，诸如维A酸(retinoic acid)，卡培他滨(capecitabine)；考布他汀(combretastatin)；甲酰四氢叶酸(LV)；奥沙利铂(oxaliplatin)，包括奥沙利铂治疗方案(FOLFOX)；lapatinib(TYKERB.)；PKC-alpha、Raf、H-Ras、EGFR(例如厄洛替尼(erlotinib)
Figure GDA0003423274920000805
和VEGF-A的抑制剂，其降低细胞增殖；和上述任何物质的药学上可接受的盐、酸或衍生物。另外，治疗方法可以进一步包括使用放射、放射疗法或放射治疗。
如本文所用，术语“化学疗法”或“化疗剂”是指具有在治疗以异常细胞生长为特征的疾病中的治疗有用性的任何化学试剂。此类疾病包括肿瘤、新生物和癌症以及以增生性生长为特征的疾病。如本文所用的化学治疗剂包括化学剂和生物剂。这些试剂发挥功能以抑制癌细胞实现持续存活所依赖的细胞活性。化疗剂的类别包括烷化/生物碱剂、抗代谢物、激素或激素类似物，以及各种各样的抗新生物药物。大多数(如果不是全部)这些试剂对癌细胞是直接毒性的，并且不需要免疫刺激。在一个实施方案中，化疗剂是用于治疗新生物如实体瘤的试剂。在一个实施方案中，化疗剂是放射性分子。本领域技术人员可以容易地鉴定使用的化学治疗剂(例如参见Slapak and Kufe,Principles of Cancer Therapy,于Harrison's Principles of Internal Medicine,第14版的第86章；Perry et al.,Chemotherapy,于Abeloff,Clinical Oncology 2,2000Churchill Livingstone,Inc的第17章；Baltzer L,Berkery R(编):Oncology Pocket Guide to Chemotherapy,第2版St.Louis,Mosby-Year Book,1995；Fischer D S,Knobf M F,Durivage H J(编):TheCancer Chemotherapy Handbook,第4版St.Louis,Mosby-Year Book,1993)。
“放射疗法”是指使用定向性γ射线或β射线来诱导对细胞的足够损伤，以限制其正常发挥功能或完全破坏细胞的能力。应当理解，本领域中将存在许多已知的方法来确定治疗的剂量和持续时间。典型的治疗以一次施用给予，并且典型剂量范围为每天10至200单位(Grays)。
在本文所述的这些方法和所有此类方法的一些实施方案中，所述方法进一步包括对施用了本文所述的LAP结合剂的受试者施用肿瘤或癌抗原。抗原可作为肿瘤抗原疫苗施用。除了由受试者的肿瘤表达的已知肿瘤抗原之外，还考虑了全肿瘤抗原疫苗接种。参见例如Chiang et al,Vaccines 3:344-372(2015)。
已经鉴定出与特定癌症相关的许多肿瘤抗原。如本文所用，术语“肿瘤抗原”和“癌症抗原”可互换使用，是指由癌细胞差异表达，因此可以利用以靶向癌细胞的抗原。癌症抗原是可以潜在地刺激明显的肿瘤特异性免疫应答的抗原。这些抗原中的一些由正常细胞编码，但不一定由正常细胞表达。这些抗原可以表征为在正常细胞中通常是沉默(即不表达)的那些抗原、仅在某些分化阶段表达的那些抗原和那些在时间上表达的那些抗原，如胚胎和胎儿抗原。其它癌症抗原由突变细胞基因如癌基因(例如激活的ras癌基因)、抑制基因(例如突变型p53)和由内部缺失或染色体易位产生的融合蛋白编码。其它癌症抗原可以由病毒基因编码，如RNA和DNA肿瘤病毒上携带的基因。许多肿瘤抗原已经根据多种实体瘤定义：MAGE 1、2和3，由免疫定义；MART-1/Melan-A、gp100、癌胚抗原(CEA)、HER-2、粘蛋白(即MUC-1)、***特异性抗原(PSA)和***酸性磷酸酶(PAP)。此外，已经显示了乙肝(HBV)、埃巴(EBV)和人***瘤(HPV)等病毒蛋白分别在肝细胞癌、淋巴瘤和子***的发展中起重要作用。然而，肿瘤使用或受益于一系列不同的免疫逃避机制，使得癌症患者的免疫***通常不能对肿瘤抗原响应。通常与睾丸、胎盘和卵巢的***细胞或***相关的癌抗原的一些实例包括癌症-睾丸(CT)抗原BAGE、GAGE、MAGE-1和MAGE-3、NY-ESO-1、SSX。这些抗原存在于黑素瘤、淋巴瘤、肺癌、膀胱癌、结肠癌和乳腺癌中(例如，如Butterfield et al.,J.Immunotherapy 2008；31:294-309；Markowicz et al.,J Clin Oncol 27:15s,2009(增刊；摘要9039)中所述)。通常在黑素细胞、上皮组织、***和结肠中发现的癌症抗原还包括分化抗原Gp100、Melan-A/Mart-1、酪氨酸酶、PSA、CEA和Mammaglobin-A。这些抗原存在于黑素瘤、***癌和结肠癌和乳腺癌中。一些癌症抗原是以低水平普遍表达但在癌症中过表达的共享抗原。过表达的癌症抗原的实例包括在食道、肝脏、胰腺、结肠、乳腺、卵巢、膀胱和***癌中发现的p53、HER-2/neu、livin和存活蛋白。其它癌症抗原是独特的，如与黑素瘤、非小细胞肺癌和肾癌的一种或多种相关的β-连环蛋白-m、β-肌动蛋白/4/m、肌球蛋白/m、HSP70-2/m和HLA-A2-R170J。其它癌症抗原是通常在上皮组织如肾、肠和结肠直肠组织中发现的肿瘤相关的碳水化合物抗原。这些癌症抗原包括可以在黑素瘤、成神经细胞瘤、结肠直肠癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌和***癌中发现的GM2、GD2、GD3、MUC-1、sTn、abd globo-H。另外的肿瘤抗原、肽表位及其描述描述于美国专利No.7,906,620；7,910,692；8,097,242；7,935,531；8,012,468；8,097,256；8,003,773；Tartour et al.,Immunol Lett 2000；74(1):1-3，其内容通过引用整体并入本文。在一些实施方案中，使用完整的癌抗原，而在其它实施方案中，使用癌抗原的肽表位(通过蛋白水解消化或重组制备)。因此，与本文所述的组合物和方法一起使用的肿瘤或癌症抗原的非限制性实例包括但不限于Her2、***干细胞抗原(PSCA)、PSMA(***特异性膜抗原)、β-连环蛋白-m、B细胞成熟抗原(BCMA)、甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、癌抗原-125(CA-125)、CA19-9、钙网膜蛋白(calretinin)、MUC-1，上皮膜蛋白(EMA)、上皮肿瘤抗原(ETA)、酪氨酸酶、Mammaglobin-A、黑素瘤相关抗原(MAGE)、CD34、CD45、CD99、CD117、嗜铬粒蛋白、细胞角蛋白、结蛋白、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、巨囊性病的液状蛋白(gross cystic disease fluid protein)(GCDFP-15)、EBV、gp100、HMB-45抗原、蛋白melan-A(被T淋巴细胞识别的黑素瘤抗原；MART-1)、livin、存活蛋白、myo-D1、肌肉特异性肌动蛋白(MSA)、神经丝、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、胎盘碱性磷酸酶、突触囊泡蛋白、甲状腺球蛋白、甲状腺转录因子-1、丙酮酸激酶同工酶M2型的二聚体形式(肿瘤M2-PK)，CD19，CD22，CD27，CD30，CD70，GD2(神经节苷脂G2)EphA2,CSPG4,CD138,FAP(成纤维细胞活化蛋白),CD171,kappa,lambda,5T4,αvβ6整联蛋白,B7-H3,B7-H6,CAIX,CD19,CD20,CD22,CD30,CD33,CD44,CD44v6,CD44v7/8,CD70,CD123,EGFR,EGP2,EGP40,EpCAM,fetalAchR,FRα,GAGE,GD3,HLA-A1+MAGE1,MAGE-3,HLA-A1+NY-ESO-1,IL-11Rα,IL-13Rα2,Lewis-Y,Muc16,NCAM,NKG2D Ligands,NY-ESO-1,PRAME,ROR1,SSX,存活蛋白,TAG72,TEMs,VEGFR2,EGFRvIII(表皮生长因子变体III)，***蛋白17(Sp17)，间皮蛋白(mesothelin)，PAP(***酸性磷酸酶)，prostein，TARP(T细胞受体γ交替读码框蛋白)，Trp-p8，STEAP1(***六跨膜上皮抗原1(six-transmembrane epithelial antigen of the prostate1))，HSP70-2/m和HLA-A2-R170J，酪氨酸酶，异常ras蛋白或异常p53蛋白。
在本文所述的这些方法和所有此类方法的一些实施方案中，所述方法还包括与本文所述的LAP结合剂同时或组合施用树突细胞(DC)疫苗接种。
如本文所用，“树突细胞疫苗接种”或“DC疫苗”是指设计用于诱导T细胞依赖性免疫，如癌症特异性T细胞依赖性抗肿瘤免疫的免疫疗法的形式，其可使用DC导致持久的完全响应。如本文所用，“树突细胞(DC)免疫疗法”或“树突细胞疫苗”的实例包括修饰的树突细胞和任何其它抗原呈递细胞、(自体或异种)，无论是由多种抗原、完全癌细胞、单一抗原、由mRNA、噬菌体展示或任何其它修饰来修饰，包括但不限于例如离体产生的抗原加载的树突细胞(DC)以诱导抗原特异性T细胞免疫、离体基因加载的DC以诱导体液免疫、离体产生的抗原加载的DC以诱导肿瘤特异性免疫、离体产生的未成熟DC以诱导耐受性。
就本文所述的数值和癌症治疗方法而言，“减少”、“抑制”或“降低”是指对于给定的参数或症状，引起优选20％或更大、30％或更大、40％或更大、45％或更大、更优选50％或更大、55％或更大、60％或更大、65％或更大、70％或更大、最优选75％或更大、80％或更大、85％或更大、90％或更大、或95％或更大的总体降低的能力。减少、抑制或降低可以指例如待治疗的病症的症状、转移或微转移的存在或大小、原发性肿瘤的大小、某个细胞群体的数目或活性等。
如本文所用，“缓解癌症或肿瘤的症状”是改善与癌症相关的任何状况或症状，如所治疗的癌症的症状、转移或微转移的存在或大小、原发性肿瘤的大小、休眠肿瘤的存在或大小等。与相当的未处理对照(如施用LAP结合剂前的受试者)相比，此类降低或预防程度为至少5％、10％、20％、40％、50％、60％、80％、90％、95％或更多，如通过本领域普通技术人员已知的任何标准技术测量。正在治疗癌症或肿瘤的患者或受试者是医学从业人员已经诊断为患有此类状况的患者或受试者。诊断可以通过任何合适的手段进行。
如本文所用，就包含本文中所述的LAP结合剂的任何组合物、方法和用途而言，术语“治疗”、“处理”或“改善”是指治疗性处理，其中目的是反转、减轻、改善、抑制、减缓或停止与疾病或病症相关的状况的进展或严重性。术语“治疗/处理”包括减少或减轻疾病或病症的至少一种副作用或症状。如果减少一种或多种症状或临床标志物，则治疗通常是“有效的”。或者，如果疾病的进展减少或停止，则治疗是“有效的”，也就是说，“治疗”不仅包括症状或标志物的改善，而且还包括在缺乏治疗的情况下预期的症状的进展或恶化的停止，至少减慢。有益或期望的临床结果包括但不限于减轻一种或多种症状、减少疾病程度，稳定(即不恶化)疾病状态、延迟或减缓疾病进展、改善或缓解疾病状态、和缓解(不管是部分还是全部)，无论是可检测的还是检测不到的。疾病的术语“治疗”还包括缓解疾病的症状或副作用(包括姑息治疗)。
如就本文所述的任何方法而言使用，术语“受试者”、“患者”和“个体”在本文中可互换使用，并且是指动物，例如本文所述的抑制剂的人类受体。为了治疗对于特定动物如人受试者特定的疾病状态，术语“受试者”是指特定动物。术语“非人动物”和“非人哺乳动物”在本文中可互换使用，并且包括哺乳动物如大鼠、小鼠、兔、绵羊、猫、狗、牛、猪和非人灵长类动物。术语“受试者”还包括任何脊椎动物，包括但不限于哺乳动物、爬行动物、两栖动物和鱼。然而，有利地，受试者是哺乳动物如人或其它哺乳动物，例如驯养的哺乳动物，例如狗、猫、马等。生产哺乳动物，如牛、绵羊、猪等也包括在术语受试者中。
如本文所用，术语“有效量”是指减轻所治疗的疾病或病症的至少一种或多种症状所需要的本文所述的LAP结合剂的量，并且指足以提供期望效果，例如降低或抑制LAP介导的肿瘤免疫抑制的药理学组合物量。因此，术语“治疗有效量”是指使用如本文所公开的方法的本文所述的抑制剂或增效剂的量，其在对典型受试者施用时足以提供所述效果。如本文所用的有效量还包括下述的量，其足以延缓疾病症状发展，改变症状疾病的过程(例如但不限于减缓疾病症状的进展)，或反转疾病的症状。因此，不可能规定确切的“有效量”。然而，对于任何给定的情况，本领域普通技术人员仅使用常规实验可以确定适当的“有效量”。
可以通过细胞培养物或实验动物中的标准药物程序来确定有效量、毒性和治疗功效，例如用于确定LD 50(对群体的50％致死的剂量)和ED 50(在50％群体中治疗有效的剂量)。剂量可以根据使用的剂型和使用的施用途径而变化。毒性和治疗效果之间的剂量比是治疗指数，并且可以表示为LD50/ED50的比率。表现出大的治疗指数的组合物、方法和用途是优选的。最初可以从细胞培养测定法估算治疗有效剂量。此外，剂量可以在动物模型中制定，以实现循环血浆浓度范围，其包括在细胞培养物中或在合适的动物模型中测定的IC50，其实现测量的功能或活性的最大限度的抑制。血浆中的水平可以通过例如高效液相层析来测量。任何特定剂量的效果都可以通过合适的生物测定来监测。剂量可以由内科医生确定，并根据需要调整以适应观察到的治疗效果。
本文所述的LAP结合剂可以通过导致受试者中有效治疗的任何适当途径施用于有需要的受试者。如本文所用，术语“施用”和“引入”可互换使用，并且是指通过使所述试剂至少部分定位在期望部位，如肿瘤部位或炎症部位，从而产生期望的效果的方法或途径将LAP结合剂置于受试者中。
在一些实施方案中，本文所述的LAP结合剂可以通过任何施用模式施用于受试者，所述施用模式***性或者对期望的表面或靶物递送试剂，并且可以包括但不限于注射、输注、滴注和吸入施用。在可以保护多肽试剂免于在肠道中失活的程度上，也考虑口服施用形式。“注射”包括但不限于静脉内，肌内，动脉内，鞘内，心室内，囊内，眶内，心内，皮内，腹膜内，经气管，皮下，表皮下，关节内，囊下，蛛网膜下，脊柱内，脑脊柱内和胸骨内注射输注。
如本文中使用，短语“肠胃外施用”是指通常通过注射进行的肠内和局部施用以外的施用方式，短语“***性施用”和“外周施用”是指除了直接对靶位点，组织或器官外施用LAP结合剂，使得其进入受试者的循环***，因此进行代谢和其它类似过程。
本发明的一些实施方案可以在以下任何编号段落中定义：
1.特异性结合LAP的分离的抗LAP(潜伏相关肽)抗体或其抗原结合片段，其包含选自下组的一个或多个重链和轻链互补决定区(CDR)：
a.具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的重链CDR1；
b.具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的重链CDR2；
c.具有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的重链CDR3；
d.具有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的轻链CDR1；
e.具有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的轻链CDR2；和
f.具有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的轻链CDR3。
2.段落1的分离的抗LAP抗体或其抗原结合片段，其包含以下重链互补决定区(CDR)：
a.具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的重链CDR1；
b.具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的重链CDR2；和
c.具有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的重链CDR3。
3.段落1-2中任一项的分离的抗LAP抗体或其抗原结合片段，其包含以下轻链互补决定区(CDR)：
a.具有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的轻链CDR1；
b.具有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的轻链CDR2；和
c.具有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的轻链CDR3。
4.段落1-2中任一项的分离的抗LAP抗体或其抗原结合片段，其包含以下互补决定区(CDR)：
a.具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的重链CDR1；
b.具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的重链CDR2；
c.具有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的重链CDR3；
d.具有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的轻链CDR1；
e.具有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的轻链CDR2；和
f.具有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的轻链CDR3。
5.段落1-4中任一项的分离的抗LAP抗体或其抗原结合片段，其包含具有SEQ IDNO:8的氨基酸序列的重链。
6.段落1-5中任一项的分离的抗LAP抗体或其抗原结合片段，其包含具有SEQ IDNO:13的序列的轻链。
7.特异性结合LAP的分离的抗LAP抗体或其抗原结合片段，其包含：
a.具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的重链CDR1；
b.具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的重链CDR2；
c.具有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的重链CDR3；
d.具有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的轻链CDR1；
e.具有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的轻链CDR2；和
f.具有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的轻链CDR3。
8.特异性结合LAP的分离的抗LAP抗体或其抗原结合片段，其包含选自下组的一个或多个重链互补决定区(CDR)：
a.具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的重链CDR1；
b.具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的重链CDR2；和
c.具有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的重链CDR3。
9.特异性结合LAP的分离的抗LAP抗体或其抗原结合片段，其包含选自下组的一个或多个轻链互补决定区(CDR)：
a.具有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的轻链CDR1；
b.具有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的轻链CDR2；和
c.具有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的轻链CDR3。
10.段落1-9中任一项的分离的抗LAP抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体是嵌合的、CDR移植的、人源化的、复合人的或完全人的抗体或双重抗体或其抗原结合片段。
11.段落1-10中任一项的分离的抗LAP抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体片段是Fab片段、Fab’片段、Fd片段、Fd’片段、Fv片段、dAb片段、F(ab’)2片段、单链片段、双抗体(diabody)、或线性抗体。
12.段落1-11中任一项的分离的抗LAP抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗体片段包含人接受体框架。
13.组合物，其包含LAP结合剂和TGF-β信号传导抑制剂。
14.段落13的组合物，其中所述LAP结合剂包含抗LAP抗体或其抗原结合片段。
15.段落14的组合物，其中所述抗体是单克隆抗体。
16.段落14的组合物，其中所述抗体是嵌合的、CDR移植的、人源化的或完全人的。
17.段落14的组合物，其中所述抗LAP抗体或其抗原结合片段选自段落1-12的抗LAP抗体或其抗原结合片段。
18.段落13的组合物，其中所述TGF-β信号传导抑制剂选自下组：结合TGF-β或其受体的抗体或其抗原结合片段、双链RNA或编码双链RNA的核酸、适体、和小分子。
19.段落18的组合物，其中所述小分子选自下组：4-[4-(1,3-间二氧杂环戊烯-5-基)-5-吡啶-2-基-1H-咪唑-2-基]苯甲酰胺(SB431542)、N-(恶烷-4-基)-4-[4-(5-吡啶-2-基-1H-吡唑-4-基)吡啶-2-基]苯甲酰胺(GW788388)、4-[3-(2-吡啶基)-1H-吡唑-4-基]-喹啉(LY364947)、和2-(3-(6-甲基吡啶-2-基)-1H-吡唑-4-基)-1,5-萘啶(“ALK5抑制剂II”)。
20.组合物，其包含LAP结合剂和免疫调节剂或化疗剂。
21.段落20的组合物，其中所述LAP结合剂包含抗体或其抗原结合片段。
22.段落21的组合物，其中所述抗体或其抗原结合片段是单克隆抗体或其抗原结合片段。
23.段落21的组合物，其中所述抗体或其抗原结合片段是嵌合的、CDR移植的、人源化的或完全人的。
24.段落21的组合物，其中所述抗体或其抗原结合片段包含段落1-12中任一项的抗体组成。
25.段落20的组合物，其中所述免疫调节剂包含免疫检查点调节剂。
26.段落25的组合物，其中所述免疫检查点调节剂调节选自下组的多肽的效应：PD-1、PD-L1、PDL2、CTLA4、LAG3、TIM3、TIGIT、和/或CD103。
27.段落20的组合物，其中所述免疫调节剂包含肿瘤抗原疫苗。
28.段落27的组合物，其中所述肿瘤抗原疫苗包含树突细胞肿瘤抗原疫苗。
29.抗体或其抗原结合片段，其结合在与TGF-β复合时的LAP，并且抑制TGF-β从所述LAP/TGF-β复合物释放。
30.段落29的组合物，其中所述抗体或其抗原结合片段是单克隆抗体或其抗原结合片段.
31.段落29的组合物，其中所述抗体或其抗原结合片段是嵌合的、CDR移植的、人源化的或完全人的。
32.段落29的组合物，其中所述抗体或其抗原结合片段包含段落1-12中任一项的抗体组成。
33.段落29的抗体或抗原结合片段，其结合由LAP与TGF-β的结合形成的表位。
34.段落29的抗体或抗原结合片段，其包含段落7的抗体的CDR。
35.药物组合物，其包含段落1-34中任一项的组成和药学可接受载体。
36.减少受试者中LAP+ T调节细胞群体的数目或活性的方法，所述方法包括对所述受试者施用LAP结合剂，从而减少所述群体的数目或活性。
37.段落36的方法，其中所述LAP结合剂包含抗体或其抗原结合片段。
38.段落37的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段是单克隆抗体或其抗原结合片段.
39.段落37的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段是嵌合的、CDR移植的、人源化的或完全人的。
40.段落37的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段包含段落1-12中任一项的抗体组成。
41.段落36的方法，其中所述LAP结合剂与细胞毒性药物缀合。
42.减少肿瘤中肿瘤浸润性免疫抑制T细胞的数目或活性的方法，所述方法包括对具有包含肿瘤浸润性免疫抑制T细胞的肿瘤的受试者施用LAP结合剂，从而减少此类细胞的数目或活性。
43.段落42的方法，其中所述LAP结合剂包含抗体或其抗原结合片段。
44.段落43的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段是单克隆抗体或其抗原结合片段。
45.段落43的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段是嵌合的、CDR移植的、人源化的或完全人的。
46.段落43的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段包含段落1-12中任一项的抗体组成。
47.段落42的方法，其中所述LAP结合剂与细胞毒性药物缀合。
48.增加肿瘤特异性免疫的方法，其包括对有此需要的受试者施用治疗有效量的LAP结合剂。
49.段落48的方法，其中所述LAP结合剂包含抗体或其抗原结合片段。
50.段落49的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段是单克隆抗体或其抗原结合片段。
51.段落49的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段是嵌合的、CDR移植的、人源化的或完全人的。
52.段落49的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段包含段落1-12中任一项的抗体组成。
53.治疗LAP表达和/或活性与癌症或肿瘤特异性免疫的抑制相关的癌症或肿瘤的方法，其包括对有此需要的受试者施用治疗有效量的LAP结合剂。
54.段落53的方法，其中所述LAP结合剂包含抗体或其抗原结合片段。
55.段落54的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段是单克隆抗体或其抗原结合片段。
56.段落54的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段是嵌合的、CDR移植的、人源化的或完全人的。
57.段落54的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段包含段落1-12中任一项的抗体组成。
58.增加肿瘤中的CD8+细胞毒性T细胞的数目的方法，所述方法包括对具有肿瘤的受试者施用LAP结合剂。
59.段落58的方法，其中所述LAP结合剂包含抗体或其抗原结合片段。
60.段落59的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段是单克隆抗体或其抗原结合片段。
61.段落59的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段是嵌合的、CDR移植的、人源化的或完全人的。
62.段落59的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段包含段落1-12中任一项的抗体组成。
63.增加有此需要的受试者中表达IFNγ的外周CD4+ T细胞的方法，所述方法包括对所述受试者施用LAP结合剂。
64.段落63的方法，其中所述LAP结合剂包含抗体或其抗原结合片段。
65.段落64的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段是单克隆抗体或其抗原结合片段。
66.段落64的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段是嵌合的、CDR移植的、人源化的或完全人的。
67.段落64的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段包含段落1-12中任一项的抗体组成。
68.增加有此需要的受试者中表达颗粒酶B的外周CD8+ T细胞的方法，所述方法包括对所述受试者施用LAP结合剂。
69.段落68的方法，其中所述LAP结合剂包含抗体或其抗原结合片段。
70.段落69的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段是单克隆抗体或其抗原结合片段。
71.段落69的方法，其中其中所述抗体或其抗原结合片段是嵌合的、CDR移植的、人源化的或完全人的。
72.段落69的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段包含段落1-12中任一项的抗体组成。
73.减少肿瘤中FoxP3+调节T细胞的数目的方法，所述方法包括对所述受试者施用LAP结合剂。
74.段落73的方法，其中所述LAP结合剂包含抗体或其抗原结合片段。
75.段落74的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段是单克隆抗体或其抗原结合片段。
76.段落74的方法，其中其中所述抗体或其抗原结合片段是嵌合的、CDR移植的、人源化的或完全人的。
77.段落74的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段包含段落1-12中任一项的抗体组成。
78.抑制肿瘤中由CD8+和/或CD4+ T细胞表达免疫抑制因子或标志物的方法，所述方法包括对具有肿瘤的受试者施用LAP结合剂。
79.段落78的方法，其中所述LAP结合剂包含抗体或其抗原结合片段。
80.段落79的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段是单克隆抗体或其抗原结合片段。
81.段落79的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段是嵌合的、CDR移植的、人源化的或完全人的。
82.段落79的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段包含段落1-12中任一项的抗体组成。
83.段落78的方法，其中所述免疫抑制因子或标志物包含PD-1、LAG-3和CD103中的一种或多种。
84.促进抗肿瘤免疫应答的方法，所述方法包括用肿瘤抗原对需要***的受试者接种疫苗，并且对所述受试者施用LAP结合剂。
85.段落84的方法，其中所述LAP结合剂包含抗体或其抗原结合片段。
86.段落85的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段是单克隆抗体或其抗原结合片段。
87.段落85的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段是嵌合的、CDR移植的、人源化的或完全人的。
88.段落85的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段包含段落1-12中任一项的抗体组成。
89.治疗对于用免疫检查点抑制剂的治疗是难治性的癌症的方法，所述方法包括对具有此类癌症的受试者施用LAP结合剂。
90.段落89的方法，其中所述LAP结合剂包含抗体或其抗原结合片段。
91.段落90的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段是单克隆抗体或其抗原结合片段。
92.段落90的方法，其中其中所述抗体或其抗原结合片段是嵌合的、CDR移植的、人源化的或完全人的。
93.段落90的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段包含段落1-12中任一项的抗体组成。
94.段落89的方法，其进一步包括施用免疫检查点抑制剂。
95.段落89的方法，其中所述癌症是胶质母细胞瘤、结肠直肠癌或黑素瘤。
96.段落89的方法，其中所述癌症在用所述LAP结合剂的治疗前对于PD-1或PD-L1抑制剂是难治性的。
97.用于治疗癌症的方法，所述方法包括分析来自受试者的肿瘤样品以测定LAP+T调节细胞的存在，并且若LAP+ T调节细胞是存在的，则对所述受试者施用LAP结合剂，从而促进抗肿瘤免疫应答。
98.段落97的方法，其中所述LAP结合剂包含抗体或其抗原结合片段。
99.段落97的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段是单克隆抗体或其抗原结合片段。
100.段落97的方法，其中其中所述抗体或其抗原结合片段是嵌合的、CDR移植的、人源化的或完全人的。
101.段落97的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段包含段落1-12中任一项的抗体组成。
102.从癌症患者群体中选择患者的方法，所述患者的癌症可能响应用LAP结合剂的疗法，所述方法包括对来自患者的肿瘤样品分析LAP+ T调节细胞的存在，其中若发现LAP+ T调节细胞存在于所述患者的肿瘤中，则将所述患者的肿瘤鉴定为可能响应用LAP结合剂的疗法。
103.段落102的方法，其进一步包括当在所述肿瘤中发现LAP+ T调节细胞时，对所述患者施用LAP结合剂，并且当在所述肿瘤中未发现LAP+ T调节细胞时，对所述患者施用除了LAP结合剂外的免疫调节剂或抗肿瘤剂。
104.段落102或103的方法，其中所述LAP结合剂包含抗体或其抗原结合片段。
105.段落104的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段是单克隆抗体或其抗原结合片段。
106.段落104的方法，其中其中所述抗体或其抗原结合片段是嵌合的、CDR移植的、人源化的或完全人的。
107.段落104的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段包含段落1-12中任一项的抗体组成。
108.段落102的方法，其中对来自所述患者的肿瘤样品分析LAP+ T调节细胞的存在包括定量测量存在的LAP+ T调节细胞的量，并且在发现LAP+ T调节细胞存在时，将它们的量与参照比较，其中将具有较高的LAP+ T调节细胞相对水平的肿瘤鉴定为更可能响应用LAP结合剂的疗法。
109.段落103的方法，其中所述免疫调节剂包含免疫检查点抑制剂。
110.段落103的方法，其中所述抗肿瘤剂包含γ放射或化疗剂。
111.在有此需要的受试者中促进对感兴趣的抗原特异性的记忆T细胞的形成的方法，所述方法包括对所述受试者施用LAP结合剂和所述感兴趣的抗原。
112.段落111的方法，其中在施用所述LAP结合剂后CD44+和/或IL7R+ T细胞增加。
113.段落111的方法，其中所述感兴趣的抗原包含肿瘤抗原或由传染性病原体表达的抗原。
114.段落113的方法，其中所述肿瘤抗原作为树突细胞疫苗施用。
115.段落111的方法，其中所述LAP结合剂包含抗体或其抗原结合片段。
116.段落115的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段是单克隆抗体或其抗原结合片段。
117.段落115的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段是嵌合的、人源化的或完全人的。
118.段落115的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段包含段落1-12中任一项的抗体组成。
119.LAP结合剂治疗疾病或病症的用途，所述疾病或病症特征在于或牵涉LAP+ T调节细胞的不想要的数目或活性。
120.LAP结合剂减少肿瘤中的肿瘤浸润性免疫抑制T细胞的数目或活性的用途，所述用途包括对具有包含肿瘤浸润性免疫抑制T细胞的肿瘤的受试者施用LAP结合剂，从而减少此类细胞的数目或活性。
121.LAP结合剂提高肿瘤特异性免疫的用途，所述用途包括对有此需要的受试者施用治疗有效量的LAP结合剂。
122.LAP结合剂用于治疗LAP表达和/或活性与癌症或肿瘤特异性免疫的抑制有关的癌症或肿瘤的用途，所述用途包括对有此需要的受试者施用治疗有效量的LAP结合剂。
123.LAP结合剂用于通过增加肿瘤中CD8+细胞毒性T细胞的数目来治疗癌症或肿瘤的用途，所述用途包括对具有肿瘤的受试者施用LAP结合剂。
124.LAP结合剂用于通过在有此需要的受试者中增加表达IFNγ的外周CD4+ T细胞来治疗癌症或肿瘤的用途，所述用途包括对所述受试者施用LAP结合剂。
125.LAP结合剂用于通过增加有此需要的受试者中表达颗粒酶B的外周CD8+ T细胞来治疗癌症或肿瘤的用途，所述用途包括对所述受试者施用LAP结合剂。
126.LAP结合剂用于通过减少肿瘤中FoxP3+调节T细胞的数目来治疗癌症或肿瘤的用途，所述用途包括对所述受试者施用LAP结合剂。
127.LAP结合剂用于通过抑制肿瘤中由CD8+和/或CD4+ T细胞表达免疫抑制因子来治疗癌症或肿瘤的用途，所述用途包括对具有肿瘤的受试者施用LAP结合剂。
128.LAP结合剂用于促进抗肿瘤免疫应答的用途，所述用途包括用肿瘤抗原对需要***的受试者接种疫苗，并且对所述受试者施用LAP结合剂。
129.LAP结合剂用于治疗对于用免疫检查点抑制剂的治疗难治性的癌症的用途，所述用途包括对具有此类癌症的受试者施用LAP结合剂。
130.LAP结合剂用于治疗癌症的用途，所述用途包括分析来自受试者的肿瘤样品以测定LAP+ T调节细胞的存在，并且若LAP+ T调节细胞是存在的，则对所述受试者施用LAP结合剂，从而促进抗肿瘤免疫应答。
131.LAP结合剂促进对感兴趣的抗原特异性的记忆T细胞的形成以治疗受试者中的癌症或感染的用途，所述用途包括对所述受试者施用LAP结合剂和所述感兴趣的抗原。
132.段落13-32中任一项的组合物或段落36-118中任一项的方法或段落119-131中任一项的用途，其中所述LAP结合剂特异性结合具有SEQ ID NO:1-3中任一项列出的序列的LAP分子。
133.段落13-28中任一项的组合物或段落37、43、49、54、59、64、69、74、79、85、90、98、104或115中任一项的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段结合LAP配体相互作用位点。
134.段落133的组合物或方法，其中所述LAP配体相互作用位点是与成熟TGFβ相互作用的位点、与整联蛋白相互作用的位点、和/或与潜伏TGFβ结合蛋白(LTBP)相互作用的位点。
135.段落1-28中任一项的组合物或段落36、42、48、53、58、63、68、73、78、84、89、97、102、111中任一项的方法或段落119-131中任一项的用途，其中所述LAP结合剂结合与TGF-β复合的LAP，并且抑制TGF-β从所述复合物释放。
136.段落15、22、30中任一项的组合或段落38、44、50、55、60、65、70、75、80、86、91、99、105或116中任一项的方法，其中所述单克隆抗体由选自以下的任一种杂交瘤克隆生成：TW4-9E7、TW4-5A8、TW4-3E5、TW4-4E5、TW4-12B12、TW4-13B12、TW4-1G12、TW4-3G5、TW4-2F8、TW4-6H10、TW4-1G2、TW4-1E1、TW4-16F4、TW4-8F10、TW4-3H6、TW4-2C9、TW7-16B4、TW7-28G11、TW7-7H4、和TW7-20B9。
137.段落13、20或35中任一项的组合物，或段落36、42、48、53、58、63、68、73、78、84、89、97、102、111中任一项的方法，或段落119-131中任一项的用途，其中所述LAP结合剂是小分子抑制剂、试剂或化合物。
138.段落13、20或35中任一项的组合物，或段落36、42、48、53、58、63、68、73、78、84、89、97、102、111中任一项的方法，或段落119-131中任一项的用途，其中所述LAP结合剂是结合LAP或与LAP物理相互作用的RNA或DNA适体。
139.段落36-101、111-118中任一项的方法或段落120-131中任一项的用途，其中所述受试者具有或已经诊断为具有癌症。
140.段落139的方法或用途，其中所述受试者具有或已经诊断为具有脑肿瘤、黑素瘤或结肠直肠癌。
141.段落140的方法或用途，其中所述脑肿瘤是胶质母细胞瘤。
142.段落36、42、48、53、58、63、68、73、78、84、89、97、111中任一项的方法或段落119-131中任一项的用途，其中所述方法进一步包括对所述受试者施用抗癌疗法、化疗剂或免疫调节剂。
143.段落142的方法或用途，其中所述免疫调节剂包含免疫检查点抑制剂。
144.段落143的方法或用途，其中所述免疫检查点抑制剂结合下列一项或多项：PD1、PDL1、PDL2、CTLA4、LAG3、TIM3、TIGIT和/或CD103。
145.段落143的方法或用途，其中所述免疫检查点抑制剂是PD1、PDL1、和/或PDL2抑制剂，其选自派姆单抗(pembrolizumab)；纳武单抗(nivolumab)；MK-3475；MPDL3280A；MEDI0680；MEDI4736；AMP-224；和MSB0010718C。
146.段落142的方法或用途，其中所述方法进一步包括对所述受试者施用肿瘤或癌症抗原。
147.段落146的方法或用途，其中所述方法包括与树突细胞(DC)疫苗接种同时或组合施用所述LAP结合剂。
148.段落24的方法，其中所述LAP结合剂是段落1-11中任一项的分离的抗体或其抗原结合片段或段落12的药物组合物。
149.段落13、20或35中任一项的组合物，或段落36、42、48、53、58、63、68、73、78、84、89、97、102、111中任一项的方法，或段落119-131中任一项的用途，其中所述LAP结合剂是段落1-11中任一项的分离的抗体或其抗原结合片段或段落12的药物组合物。
应当理解，前述描述和以下实施例仅是说明性的，而不应被认为是对本发明范围的限制。在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以对所公开的实施方案进行各种改变和修改，这对本领域技术人员将是显而易见的。此外，标识的所有专利、专利申请和出版物为了描述和公开例如可以与本发明结合使用的此类出版物中描述的方法通过引用明确地并入本文。这些出版物仅提供其在本申请的提交日期之前的公开内容。这方面的任何内容都不应被解释为承认凭借先前的发明或出于任何其它原因，发明人没有资格早于此类公开。关于这些文件内容的日期的所有声明或关于这些文件的内容的说明基于申请人可获得的信息，并不构成对这些文件的日期或内容的正确性的任何承认。
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实施例
实施例1
在来自头颈癌患者肿瘤的FOXP3+CD4+淋巴细胞上膜结合LAP表达是上调的。发现结肠直肠癌(CRC)患者血液和肿瘤中LAP+CD4+淋巴细胞作为增强的抑制性T细胞。血液来源的LAP+CD4+亚组以TGF-β依赖性方式抑制幼稚T细胞增殖。在结肠直肠癌中，30％的肿瘤内CD4+FOXP3调节性T细胞是LAP和LAG阳性。它们分泌IL-10并产生膜结合的TGF-β。虽然IFN-γ在血液中的LAP阳性细胞比LAP阴性T细胞中略高，肿瘤浸润性LAP阳性T淋巴细胞(LAP+TIL)与LAP-TIL相比分泌显著更低量的IFN-γ和更高的IL-10。令人感兴趣的是，发现这些CD4+LAP+ TIL比CD4+LAP-细胞的50倍更具攻击性，并且这部分依赖于TGF-β。
不依赖于TGF-β，LAP具有可以促进癌症恶性的生物功能。显示了可溶性LAP通过充当化学引诱剂来调节人单核细胞的运输。因此，脑肿瘤中高水平的LAP可以从周围吸引单核细胞，所述单核细胞在肿瘤环境中成为肿瘤相关的巨噬细胞，从而有助于免疫抑制。此外，固定化的LAP可以诱导MMP-9的表达，并通过整联蛋白信号传导促进肿瘤细胞的迁移和侵入，而可溶性LAP具有相反的作用。
抗LAP的治疗作用
鉴于CD4+LAP+ T细胞的重要调节作用，我们开发了识别在细胞表面上表达的LAP的单克隆抗LAP抗体。我们产生鼠和人特异性单克隆抗LAP抗体两者，其在体内消耗CD4+LAP+ T细胞并阻断TGF-β释放。本文描述的结果显示小鼠抗体的在同基因模型中降低黑素瘤、GBM和CRC肿瘤生长的功效(图55a-55n)。具体地，用抗LAP(28G11克隆，图55a，55b)处理B16原位肿瘤模型。此外，我们在GBM/GL261模型中测试了抗LAP：原位/颅内和皮下模型。用16B4(图55c-55f)处理颅内模型，并且用16B4(图55g)或28G11(图55h)处理皮下模型。最后，用28G11(图55i-55n)或16B4(未显示)处理结肠直肠癌(CRC)模型。用抗LAP处理AOM/DSS诱导的原位(图55I-55K)和皮下MC38(图55l)和CT26(图55m，55n)CRC模型。在所有肿瘤模型中，抗LAP处理产生治疗效果。因此，抗LAP抗体可用于阻断黑素瘤、GBM和CRC模型中由LAP介导的免疫抑制。
我们还获得并测试了基于GL261原始胶质瘤细胞、B16黑素瘤细胞和组成性表达卵白蛋白(GL261-OVA和B16-OVA)的细胞的同基因癌模型，以研究颅内和皮下小鼠模型两者中的抗原特异性免疫应答。
我们鉴定了一种新的LAP+γδT细胞调控亚组，其表现出免疫抑制表型，抑制幼稚T细胞的增殖并诱导FoxP3表达，进一步支持免疫抑制。(Rezende et al.,NatureComminications)。此外，我们发现这种细胞群体积累在携带GBM的小鼠的脾脏中(图1E)，表明这些细胞参与胶质瘤诱导的免疫抑制。
为了研究LAP在GBM中免疫应答调节中的作用，我们首先分析了不同浸润GBM的免疫细胞上和外周中的LAP表达。我们发现GBM浸润性淋巴细胞和髓样细胞在其表面上表达高水平的LAP(图1A-1D)，表明它可以在GBM中的免疫抑制中发挥作用。
为了研究在GBM介导的免疫抑制中哪些LAP+免疫细胞群是重要的，我们比较了携带GBM的小鼠中不同LAP+免疫细胞的频率。令人感兴趣的是，我们发现γδ+LAP+ T细胞在携带GBM的小鼠的脾脏中强烈积累(图1E)。由于文献中尚未描述该亚组，我们研究了其表型和功能。我们发现与从幼稚小鼠分离的γδ+LAP-T细胞相比，所述γδ+LAP+ T淋巴细胞拥有抑制表型(图2A，2B)。通过qRT-PCR和流式细胞术得到的细胞因子表达谱显示，促炎细胞因子如IFN-γ下调，而免疫抑制性细胞因子(例如TGF-β和IL-10)上调。然后，我们测试了γδ+LAP+ T亚组的功能，并且发现这些细胞表现出强的抑制能力，并且能够在体外测定中诱导FoxP3的表达(图2C)。
由于我们发现LAP对从肿瘤分离的γδT淋巴细胞的高表达，我们检查了胶质瘤细胞是否可以诱导LAP在这些细胞上表达。如图3A-3B显示，与胶质瘤GL261细胞共培养γδ+LAP-T淋巴细胞在体外导致LAP表达增加，表明胶质瘤可通过诱导γδT细胞上的LAP表达而引起免疫抑制。为了消除抑制性LAP对免疫***的影响，我们使用抗LAP抗体在体内阻断LAP活性。
为了分析抗LAP抗体对免疫***的影响，我们用抗LAP抗体处理幼稚小鼠。我们发现与用同种型匹配的对照处理的小鼠相比，抗LAP处理的动物中的T细胞增殖和促炎细胞因子的产生更高(图4A-4B)，表明抗LAP具有诱导促炎性免疫应答的能力。(da Cunha,International Immunology,2014)
为了评估针对肿瘤的抗LAP抗体的治疗价值，我们使用通过在C57BL/6小鼠的体侧中植入GL261细胞得到的小鼠胶质瘤的皮下模型。肿瘤植入后，用抗LAP抗体腹膜内(i.p.)处理小鼠，并且每隔一天给予重复治疗。使用同种型匹配的非特异性抗体(IC)作为阴性对照。肿瘤在植入后约10天出现，并且最初在两个处理组中生长，之后，当免疫力完全形成时，从植入起14天后，在抗LAP处理组中显著收缩(图55h，5B)。当我们调查免疫应答时，我们发现抗LAP阻断了干扰促炎性免疫应答的肿瘤诱导的免疫抑制(图5C-5K)。抗LAP处理导致在CD4+ T细胞上较高的IFN-γ表达，和在CD4+ T细胞上降低FoxP3(相应地，图5C和5D)。此外，处理导致CD8+ T细胞数目增加(图5G)及其细胞毒性表型(图5H-5I)。
令人感兴趣的是，抗LAP处理导致CD11b-Hi髓样细胞亚组的频率降低而CD11b-Int细胞增加(图57a，57b)。抗LAP处理后CD11b-hi上的耐受性相关标志物PD-L1和CD103水平降低(图57c)。LAP蛋白主要在CD11b-hi细胞上表达，另外地表明该亚组的抑制表型(图57d)。我们检查了这两个亚群的免疫谱。从幼稚小鼠分选亚组，用抗CD40抗体或脂多糖(LPS)刺激，然后进行基因表达分析。激活后，CD11b-Hi群体表达较高水平的免疫抑制细胞因子IL-10和TGF-βb和较低水平的促炎细胞因子IL-12，表明该亚组可以具有调节作用；抗LAP处理消除了这些细胞。(图57e)。与CD11b-int亚组相比，与CD11b-hi共同培养的CD8细胞表达较低水平的支持抗肿瘤免疫应答(IFN-γ和TNF-α)的促炎细胞因子(图57f)。此外，CD11b-Hi亚组表达低水平的抗原呈递标志物(图57g，57h)，表明这些细胞具有较低的支持抗原特异性免疫应答的能力。最后，CD11b-hi细胞在体外培养时不支持CD8+ T细胞生长(图57i)。因此，我们发现抗LAP处理减少了具有抑制性质的髓样细胞的数目，这有利于更强的免疫应答和肿瘤消除。
由于抗LAP抗体治疗在消除外周肿瘤中非常有效，我们进行实验以评估其在颅内GBM的原位小鼠模型中的潜力。在使用立体定向手术将GL261胶质瘤细胞植入纹状体后，从肿瘤植入后的第五天开始每隔一天用抗LAP处理小鼠。如图55c-55f中所示，尽管攻击性肿瘤进展，但用抗LAP处理的小鼠存活更长，并且这与CD8+ T细胞对脑肿瘤的浸润增加有关。考虑到颅内GBM的强的恶性性质，该结果表明抗LAP抗体对脑肿瘤的治疗潜力，并表明抗LAP的治疗作用的潜力。
为了研究LAP和TGF-β在人GBM中的作用，我们分析了TCGA(The Cancer GenomeAtlas)数据，以确定信使RNA(两种蛋白质共有)的表达是否与患者存活相关。我们发现高水平的mRNA表达(标记为TGF-β)与GBM患者的存活之间存在负相关(图62)，表明编码LAP/TGF-β的基因参与GBM发病机制。对具有其它癌症的患者观察到相似的结果，证明了LAP表达机制与恶性肿瘤相关的广泛现象(图62,63)。
研究LAP在癌症中的免疫抑制作用。
我们发现使用抗LAP抗体，TW7-28G11(图58a)或TW7-16B4(图39)的处理导致小鼠中CD4+LAP+ T细胞的积累减少，如通过使用非竞争的抗LAP克隆检测这些细胞所指示(图58a)。这些结果表明抗LAP处理导致体内CD4+LAP+ T细胞的消耗。最近的研究表明，由各种免疫细胞表达的LAP可以介导免疫抑制。使用流式细胞术分析，我们发现从B16黑素瘤分离的LAP+CD4+ T细胞表达较高水平的免疫抑制标志物FoxP3，LAG3，PD1，PD-L1，Tim3，CD103(图58b)，表明这些细胞的抑制能力。为了评估癌症中LAP+CD4+ T细胞的抑制性质，我们从携带B16肿瘤的小鼠的脾脏分选了LAP+CD4+ T细胞(为测定提供了足够量的LAP+细胞)，并在DC的存在下与幼稚CD4+ T细胞共培养它。我们观察到与没有添加抑制细胞的条件相比，在LAP+CD4+ T细胞存在下幼稚T细胞的增殖几乎减少了2倍(图58c)。作为阴性对照，我们使用LAP-CD4+ T细胞，其仅由于FoxP3+ T细胞的存在而略微降低T细胞增殖。令人感兴趣的是，从携带B16黑素瘤的小鼠的脾脏或引流***(dLN)分离的CD4+LAP+ T细胞在抗LAP处理后具有降低的抑制特性(图58d)。用TW7-28G11处理小鼠，并且通过TW7-16B4克隆分选CD4+LAP+ T细胞。
我们还发现抗LAP处理导致携带肿瘤的小鼠中CD8+CD103+ T细胞的累积减少(皮下GBM：图23，28)；颅内GBM：图47，49；黑素瘤：图59a)，表明这些细胞在肿瘤模型中可以具有抑制能力。实际上，虽然CD8+T细胞是介导抗LAP的治疗效果必需的(图59b)，但是从携带黑素瘤的小鼠的脾脏或dLN分离的CD103+CD8+ T细胞表现出抑制能力，其在体外测定法中在抗LAP处理的情况下降低(图59c)。此外，这些细胞过继性转移到植入有黑素瘤的CD8KO小鼠导致肿瘤生长恶化(图59d)，表明CD103+CD8+ T细胞在体内抑制肿瘤特异性免疫。这些细胞的表型分析表明CD103+CD8+ T细胞比CD103细胞表达更低的促炎标志物(图59e)。因此，抗LAP能够靶向肿瘤中新的调节性CD8+ T细胞群体。
为了确定小鼠中不同免疫细胞上的LAP表达水平，在同基因小鼠模型(GL261)中诱导颅内GBM。检查外周和脑两者中以下免疫亚组上的LAP表达水平：αβT淋巴细胞(CD4+和CD8+)，γδT淋巴细胞，巨噬细胞(CD11b+)和树突细胞(DCs，CD11c+)。
使用percoll梯度从GBM分离单核细胞，并且用各自与抗LAP抗体组合的抗-CD4、-CD8、-γδTCR、-CD11b、-CD11c抗体进行染色，用于多参数流式细胞术分析。比较了自携带GBM的小鼠和幼稚小鼠脾脏分离的肿瘤浸润和外周免疫细胞上的LAP表达水平。
我们之前已经证明了在正常条件下在人T淋巴细胞和树突细胞上LAP表达。为了分析GBM相关人免疫细胞上的LAP表达，用人特异性抗LAP抗体，根据我们发表的方法针对活T淋巴细胞(CD4+)，单核细胞(CD11b+)和树突细胞(mDC，CD11c+Lin-and pDCs，CD11c-Lin-CD123+)将来自健康供体和GBM受试者的分离的外周血单核细胞(PBMC)染色。
在小鼠和人中的疾病进展的不同阶段分离的LAP+免疫细胞浸润性颅内GBM的表 型。
为了检查LAP+免疫细胞(αβ+和γδ+ T淋巴细胞；CD11b+和CD11c+髓样细胞)的表型，通过采用基于Nanostring的炎性阵列进行LAP+对LAP-免疫细胞的基因序型分析，如我们较早证明，然后通过qRT-PCR验证特定基因的表达(例如，TGF-β，TNF-α，IL-10和IL-12)。在静息和刺激条件下通过流式细胞术和ELISA测定炎症相关和调节基因(例如T细胞上的IFN-γ，GRZB，CD107a，IL-10，FoxP3和髓样细胞上的PD-L1，CD39，CD103)的蛋白水平。为了评估髓样细胞的抗原呈递潜力，测量MHCI，MHCII，CD80，CD86和CD40的水平。这些研究在不同的疾病阶段进行，以确定LAP表达和细胞表型如何与疾病进展相关。
与我们的小鼠研究互补，检查了与健康供体血液相比从胶质瘤患者的血液(PBMC)和肿瘤分离的LAP+免疫细胞的表型。通过Nanostring和qRT-PCR测定炎症基因(例如，TGF-β，TNF-α和IL-10)的表达。通过流式细胞术在静息和刺激条件下检查免疫相关基因(例如，T细胞上的IFN-γ，GRZB，IL-10，FoxP3和髓样细胞上的PD-L1，CD39，CD103)的蛋白质水平。
从肿瘤分离的LAP+调节免疫细胞的功能分析
为了研究表达膜结合LAP的免疫细胞的功能，确定其影响T细胞功能的能力。检查T淋巴细胞和髓样细胞。测试以下参数以分析相应的LAP+和LAP-细胞的抑制能力：a)淋巴细胞的功能：离体检查在LAP+对LAP-T细胞(αβ+和γδ+ T淋巴细胞两者)存在下的T细胞增殖。使用OT-II小鼠(OVA-TCR Tg)使用非特异性应答者T细胞活化(用抗CD3)和抗原特异性活化(用卵清蛋白)进行两种类型的测定。
为了研究αβ+LAP+和γδ+LAP+ T细胞在体内的功能作用，将这些细胞过继转移到携带GBM的小鼠中，进行GBM进展，然后监测肿瘤生长(通过MRI)，评估存活并且检查局部和***适应性和先天免疫应答。
使用巨噬细胞CytoSelect吞噬测定(使用zymozan底物)检查CD11b+LAP+细胞的吞噬作用。通过与幼稚T细胞共培养巨噬细胞(CD11b+LAP+)和树突细胞(CD11c+LAP+)并通过T细胞增殖测定监测其生长来测量对T细胞的影响。这些实验研究了在GBM中抗原呈递能力和髓样细胞的抑制效果。
检查从GBM患者和健康供体的PBMC分离的人淋巴细胞和髓样细胞的功能(通过FACS分选)，并且使用T细胞增殖/抑制测定评估其免疫抑制潜力。
鉴于LAP的免疫抑制性质，表达该蛋白质的免疫细胞表达其它抑制性标志物(图58b)，并在功能测定中证明调节作用(图58c，58d)。迄今为止描述的LAP的大多数生物学作用归因于αβ+ T细胞功能。如本文所证明的，我们发现γδ+LAP+ T细胞也具有抑制能力(图2A-2D)，并且在携带GBM的小鼠中强烈***性上调(图1E)。我们的实验在GBM的背景下评估其病理功能。此外，我们的研究探索了LAP+髓样细胞在免疫抑制中的以前未研究的作用。评 估抗LAP抗体在治疗GBM颅内小鼠模型中的治疗潜力。
我们的结果表明，抗LAP抗体消除了外周胶质瘤模型中的肿瘤生长，并且表明它们可以增加颅内GBM模型的存活(图55c-55h)。***性评估了我们的实验室中开发的抗LAP抗体对免疫***的影响以及这种调节在颅内GBM模型中是否具有治疗作用。
抗LAP抗体处理对携带肿瘤的小鼠中的免疫应答的影响。
为了研究抗LAP如何影响免疫***，用抗LAP和IC抗体i.p.处理幼稚和携带颅内肿瘤的GBM小鼠，每隔一天处理三周。收获脾脏和肿瘤，并检查适应性和先天性免疫应答。测定抗LAP抗体对适应和先天免疫应答两者的影响。
1)适应性免疫应答。通过分析肿瘤和脾脏中T淋巴细胞亚组(CD4+和CD8+)的频率来评估Th1/Th2和细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答。通过流式细胞术检查这两个亚组上表面膜结合和细胞内免疫调节子(如IFN-γ)的表达；CD4+ T细胞上LAP，LAG，CD103，PD1，Tim3，IL-10，FoxP3，IL-17和TGF-β；CD8+ T淋巴细胞上CD107，GRZB和穿孔蛋白。在GL261胶质瘤(图27和41，通过16B4处理)和B16黑素瘤(图56a，通过28G11处理)模型中，我们发现用抗LAP处理的小鼠的肿瘤被增加数目的CD8+ T细胞浸润。在黑素瘤模型中，在抗LAP处理后，基于Ki67的表达，CD8+肿瘤浸润性T细胞具有更好的增殖能力，并表达较高水平的促炎介质(图56a)。此外，抗LAP处理后，CD8+ T细胞/Tregs的比率也较高。在外周中，CD8+ T细胞数及其促炎表型也较高(图56b)。
2)先天免疫应答。通过流式细胞术检查其频率和抑制标志物(PD-L1，CD39，CD103)，抗原呈递标志物(MHCI，MHCII)和共刺激分子(CD40，CD80，CD86)的表达，研究包括树突细胞(CD11c+)和巨噬细胞(CD11b+)的肿瘤浸润性抗原呈递细胞。图57a-57j。
评估这些髓样细胞亚组产生不同细胞因子(IL-1β，IL-6，IL10，IL-12，IL-23和TGF-β)的能力。分选巨噬细胞和DC，用抗CD40抗体或脂多糖(LPS)刺激，然后进行基因表达分析。
为了分析GBM中抗LAP之后的功能性免疫应答，将表达卵白蛋白(GL261-OVA)的GL261胶质瘤细胞颅内注射并用抗LAP抗体处理小鼠。在这些小鼠中测量OVA特异性CD4+和CD8+ T细胞免疫应答。
抗LAP抗体在实验GBM模型中的治疗价值。
靶向GBM相关免疫抑制的抗体可用作治疗。我们实验室产生的抗LAP抗体用于测试其在GBM中的治疗潜力。
将GL261细胞颅内植入C57BL/6小鼠中，然后从肿瘤植入后第二天开始每隔一天用抗LAP(100μg/小鼠)处理。通过磁共振成像(MRI)和存活监测GBM生长(图55a-55n)。通过苏木精和曙红(H&E)和免疫组织化学抗CD31染色分析GBM侵入和血管发生，3)通过Nanostring进行募集到GBM的巨噬细胞的转录和功能谱及其对体外T细胞增殖的影响；和4)通过分析细胞毒性和调节性T细胞的频率及其功能来评估局部和外周免疫应答。由于LAP可以诱导细胞侵入，因此体外(Boyden室)和体内(组织病理学)分析是否通过抗LAP处理减少GBM侵入。
如本文所述，使用攻击性颅内GBM模型，我们观察到用抗LAP处理后小鼠的存活增加。在本文描述的方面的一些实施方案中，可以使用较高剂量的抗LAP抗体和早期开始治疗来增强针对GBM的抗LAP抗体的治疗效果。另外，鉴于LAP是由颅内GBM中的不同免疫细胞产生的并且可以吸引单核细胞，抗LAP处理可以导致巨噬细胞的较低的肿瘤浸润。考虑到髓样细胞对GBM的病理学贡献，抗LAP处理可导致降低的浸入和局部肿瘤免疫抑制，其是巨噬细胞显著贡献的特征。
增强的针对肿瘤相关抗原的免疫T细胞记忆。
我们发现携带颅内GBM并用抗LAP处理的小鼠中的肿瘤浸润性T细胞表达较高水平的记忆标志物(IL7R和CD44，图67)。基于这些结果，我们假设抗LAP可以增强免疫记忆，并从用表达肿瘤相关抗原的DC疫苗预先疫苗接种获益。我们通过用卵白蛋白加载的树突细胞预疫苗接种小鼠，用抗LAP(16B4克隆)处理小鼠并在一周后注射颅内肿瘤(GL261-OVA)来测试此假设(图60a)。我们通过MRI成像和存活追踪疾病发展。用抗LAP处理的所有小鼠均未形成肿瘤，而五只IC处理的小鼠中的四只形成GBM，因此必须处死，从而支持我们的假设(图60b，60c)。为了测试长期免疫，三个月后用皮下GL261-OVA再攻击剩余的小鼠。这些小鼠没有形成肿瘤，表明它们保留了针对该肿瘤的免疫记忆。与幼稚小鼠或用IC处理的小鼠相比，抗LAP处理的小鼠表达更高水平的IL7R(图60d，60e)，并且四聚体信号在CD8+ T细胞上更高(图60f)，表明抗LAP增加CD8+肿瘤抗原特异性T细胞。在用抗-LAP的28G11克隆处理的黑素瘤模型中，通过类似的观察支持这些观察(图61)。因此，抗LAP可以增强免疫记忆，并且将潜在受益于与肿瘤相关抗原的并发疫苗接种。
实施例2
抗LAP抗体构建体的制备
使用
Figure GDA0003423274920001051
试剂(Thermo Fisher Scientific)，根据TRIZOL试剂的技术手册，从TW7-28G11杂交瘤细胞中分离总RNA。通过琼脂糖凝胶电泳分析总RNA。
遵循PRIMESCRIPTTM第1链cDNA合成试剂盒的技术手册，使用同种型特异性反义引物或通用引物将总RNA逆转录成cDNA。根据GenScript的RACE的标准操作程序扩增来自TW7-28G11杂交瘤细胞的VH和VL的抗体片段。
使用标准分子克隆程序将扩增的抗体片段分别克隆到标准克隆载体中。
进行菌落PCR筛选以鉴定具有正确大小的***物的克隆。对每个抗体片段测序不少于5个具有正确大小***片段的单菌落。
发送具有正确的VH和VL***物大小的TW7-28G11杂交瘤细胞的5个单菌落用于测序。发现五个不同克隆的VH和VL基因几乎相同。本文列为SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:12的共有核苷酸序列认为是由杂交瘤TW7-28G11产生的抗体的序列。
本文中以SEQ ID NO:9-11提供TW7-28G11抗体的VH CDR1-CDR3氨基酸序列。TW7-28G11抗体的VL CDR1-CDR3氨基酸序列在本文中作为SEQ ID NO:14-16提供。使用TW7-28G11抗体的VH和/或VL CDR序列产生人源化抗体，植入CDR的抗体和/或嵌合抗体和/或其抗原结合片段的合适的框架序列可以使用本领域技术人员已知并且如本文别处所描述的技术鉴定和选择。
使用例如
Figure GDA0003423274920001061
试剂从TW7-16B4杂交瘤细胞中分离总RNA。使用例如琼脂糖凝胶电泳分析总RNA。
遵循PRIMESCRIPTTM第1链cDNA合成试剂盒的技术手册，使用例如同种型特异性反义引物或通用引物将总RNA逆转录成cDNA。使用例如GenScript的RACE标准操作程序扩增来自TW7-16B4杂交瘤细胞的VH和VL的抗体片段。
使用标准分子克隆程序将扩增的抗体片段分别克隆到标准克隆载体中。
进行菌落PCR筛选以鉴定具有正确大小的***物的克隆。例如，对每个抗体片段测序至少三个或至少五个具有正确大小***物的单菌落。
发送具有正确的VH和VL***物大小的TW7-16B4杂交瘤细胞的单菌落用于测序，并鉴定从其鉴定VH和VL的氨基酸序列以及相应的CDR1-CDR3区域的共有核苷酸序列。
使用TW7-16B4抗体的VH和/或VL CDR序列产生人源化抗体，CDR移植的抗体和/或嵌合抗体和/或其抗原结合片段的合适的框架序列可以使用本领域技术人员已知并且如本文别处所描述的技术鉴定和选择。
Figure IDA0001406465300000011
Figure IDA0001406465300000021
Figure IDA0001406465300000031
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Figure IDA0001406465300000051
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Figure IDA0001406465300000071
Figure IDA0001406465300000081
Figure IDA0001406465300000091
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Figure IDA0001406465300000111
Figure IDA0001406465300000121
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Figure IDA0001406465300000141
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Figure IDA0001406465300000181
Figure IDA0001406465300000191
Figure IDA0001406465300000201
Figure IDA0001406465300000211

Claims (18)

1.抗LAP抗体或其抗原结合片段在制备用于治疗癌症的药物中的用途，其中所述癌症是胶质母细胞瘤、黑素瘤和结肠直肠癌，所述抗LAP抗体或其抗原结合片段包含分别在SEQID NO:9、10和11中列出的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别在SEQ ID NO:14、15和16中列出的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列。
2.权利要求1的用途，其中所述抗LAP抗体或其抗原结合片段包含含有四个框架区的重链可变区，所述框架区各自与SEQ ID NO:8的重链可变区的框架区中的1、2、3或4个是至少75％相同的；并且包含含有四个框架区的轻链可变区序列，所述框架区各自与SEQ ID NO:13的轻链可变区的框架区中的1、2、3或4个是至少75％相同的。
3.权利要求2的用途，其中所述重链可变区序列由SEQ ID NO:8组成。
4.权利要求2的用途，其中所述轻链可变区序列由SEQ ID NO:13组成。
5.权利要求2的用途，其中所述重链可变区序列由SEQ ID NO:8组成，并且其中所述轻链可变区序列由SEQ ID NO:13组成。
6.权利要求1-5中任一项的用途，其中所述抗LAP抗体或其抗原结合片段是Fab片段、Fab’片段、Fd片段、Fd’片段、Fv片段、dAb片段、F(ab’)2片段、单链片段、双抗体、或线性抗体。
7.权利要求1-6中任一项的用途，其中所述抗LAP抗体或其抗原结合片段结合包含LAP和TGF-β的复合物。
8.权利要求7的用途，其中所述抗LAP抗体或其抗原结合片段结合所述复合物的表位，其中所述表位由与TGF-β复合的LAP形成。
9.权利要求7的用途，其中所述抗LAP抗体或其抗原结合片段与所述复合物的结合抑制TGF-β从所述复合物释放。
10.权利要求1-9中任一项的用途，当施用于人时所述抗LAP抗体或其抗原结合片段能够消耗表达LAP的T细胞。
11.权利要求1-10中任一项的用途，其中所述抗LAP抗体是双特异性抗体。
12.药物组合物在制备用于治疗癌症的药物中的用途，其中所述癌症是胶质母细胞瘤、黑素瘤和结肠直肠癌，其中所述药物组合物包含权利要求1-11中任一项的抗LAP抗体或其抗原结合片段和药学上可接受的载体。
13.权利要求1-12中任一项的用途，其中所述抗LAP抗体或其抗原结合片段，或药物组合物以有效量施用，以降低免疫抑制T细胞的数目或活性。
14.权利要求1-13中任一项的用途，其中所述抗LAP抗体或其抗原结合片段，或药物组合物以有效量施用，以降低LAP+T调节细胞的数目或活性。
15.权利要求1-14中任一项的用途，其中所述抗LAP抗体或其抗原结合片段，或药物组合物以有效量施用，以降低免疫抑制T细胞的数目或活性，其中所述免疫抑制T细胞浸润与所述癌症相关的肿瘤。
16.权利要求1-15中任一项的用途，其中所述抗LAP抗体或其抗原结合片段，或药物组合物与化疗剂或免疫调节剂组合使用。
17.权利要求1-16中任一项的用途，其中所述抗LAP抗体或其抗原结合片段，或所述药物组合物与免疫调节剂组合使用，其中所述免疫调节剂包含免疫检查点调节剂，任选其中所述免疫检查点调节剂调节选自下组的多肽的效应：PD-1，PD-L1，PDL2，CTLA4，LAG3，TIM3，TIGIT和CD103。
18.权利要求1-17中任一项的用途，其中所述癌症对于用免疫检查点抑制剂的治疗是难治性的。
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