JP5185624B2 - 血清アルブミンおよびglp−1またはpyyを標的とする二重特異性抗体 - Google Patents
血清アルブミンおよびglp−1またはpyyを標的とする二重特異性抗体 Download PDFInfo
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Description
体内または体循環における半減期の短い、そのような薬剤の種類の1つとして、グルカゴン様ペプチド1またはペプチドYY等のインクレチンホルモンがある。
a−(X)n1−b−(Y)n2−c−(Z)n3−dまたはa−(Z)n3−b−(Y)n2−c−(X)n1−d
(式中、
Xは、第1の標的に対して結合特異性を有するポリペプチド薬剤であり;
Yは、血清アルブミンに対して結合特異性を有する免疫グロブリン重鎖可変領域(VH)、または血清アルブミンに対して結合特異性を有する免疫グロブリン軽鎖可変領域(VL)であり;
Zは、第2の標的に対して結合特異性を有するポリペプチド薬剤であり;
a、b、cおよびdは、それぞれ独立に、存在しないか、または1〜約100個のアミノ酸残基であり;
n1は、1から約10であり;
n2は、1から約10であり;かつ
n3は、0から約10であるが、
n1およびn2が共に1であり、かつn3が0である場合には、Xは、抗体鎖または抗体鎖の断片を含まない)
を有する連続したポリペプチド鎖である。
X'が抗体鎖または抗体鎖の断片を含まない場合には、X'はポリペプチド薬剤であり、
Y'は、血清アルブミンに対して結合特異性を有する免疫グロブリン重鎖可変領域(VH)、または血清アルブミンに対して結合特異性を有する免疫グロブリン軽鎖可変領域(VL)である。いくつかの実施形態では、Y'は、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号24、配列番号25および配列番号26からなる群から選択されたアミノ酸配列、または配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22および配列番号23からなる群から選択されたアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、X'は、GLP−1またはGLP−1の類似体である。
、LysまたはArgであるポリペプチドが含まれる(同上)。これらのアイソフォームおよび変異体に広がる共通配列を、図14G(配列番号67)に示す。
いくつかの実施形態では、サポリンの機能性変異体が、成熟サポリン−6(配列番号65)に対して、少なくとも約80%、または少なくとも約85%、または少なくとも約90%、または少なくとも約91%、または少なくとも約92%、または少なくとも約93%、または少なくとも約94%、または少なくとも約95%、または少なくとも約96%、または少なくとも約97%、または少なくとも約98%、または少なくとも約99%のアミノ酸配列同一性を有する。
本発明の薬剤組成物は、in vivoにおける血清半減期を向上させるポリペプチドに対して結合特異性を有する結合部位(例えば、抗原結合部位)を含有するポリペプチド結合部分のいずれかを含むことができる。好ましくは、ポリペプチド結合部分は、少なくとも31個、少なくとも約40個、少なくとも約50個、少なくとも約60個、少なくとも約70個、少なくとも約80個、少なくとも約90個、少なくとも約100個、または少なくとも約110個のアミノ酸を、独立の実体として含む。好ましくは、ポリペプチド結合部分は、in vivoにおける血清半減期を向上させるポリペプチドに、少なくとも約5mMのKD(KD=Koff(kd)/Kon(ka))で結合する。いくつかの実施形態では、ポリペプチド結合部分は、in vivoにおける血清半減期を向上させるポリペプチドに、表面プラズモン共鳴法で(例えば、BIACORE製の装置を使用して)測定した場合、約10〜約100nM、または約100nM〜約500nM、または約500nM〜約5mMのKDで結合する。特定の実施形態では、ポリペプチド結合部分は、in vivoにおける血清半減期を向上させるポリペプチドに、約50nM、または約70nM、または約100nM、または約150nM、または約200nMのKDで結合する。
a−(P)n2−b−(X)n1−c−(Q)n3−dまたはa−(Q)n3−b−(X)n1−c−(P)n2−d
(式中、
Xは、ポリペプチド薬剤であり;
PおよびQは、それぞれ独立に、in vivoにおける血清半減期を向上させるポリペプチドに対して結合特異性を有する結合部位を含有するポリペプチド結合部分であり;
a、b、cおよびdは、それぞれ独立に、存在しないか、または1〜約100個のアミノ酸残基であり;
n1、n2およびn3は、存在するX、PまたはQの部分のそれぞれの数であり;
n1は、1から約10であり;
n2は、0から約10であり;かつ
n3は、0から約10であるが、
n2およびn3が共に0ではなく;かつ
n1およびn2が共に1であり、n3が0である場合には、Xは、抗体鎖または抗体鎖の断片を含まない)
を有する連続したポリペプチド鎖である。
本発明の薬剤複合体、非共有結合性の薬剤複合体および薬剤融合体は、所与の(すなわち、1個または複数の)、血清アルブミンに結合する、抗体の抗原結合断片を含む。抗原結合断片は、薬剤複合体または薬剤融合体が投与されることになる動物の血清アルブミンに対して結合特異性を有しうる。好ましくは、抗原結合断片は、ヒトの血清アルブミンに対して結合特異性を有する。しかし、獣医用も意図されており、抗原結合断片は、所望の動物由来の血清アルブミン、例えば、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ニワトリ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、シカ、ミンク等の血清アルブミンに対して結合特異性を有しうる。いくつかの実施形態では、抗原結合断片は、2つ以上の種由来の血清アルブミンに対して結合特異性を有する。例えば、本明細書に記載するように、ラットの血清アルブミンおよびマウスの血清アルブミンに対して結合特異性を有するヒトのdAb、ならびにラット、マウスおよびヒトの血清アルブミンに対して結合特異性を有するdAbが生成されている(表1および図7)。そのようなdAbは、同一の薬剤複合体または薬剤融合体を使用する前臨床および臨床試験を可能にし、適切な代用の薬剤複合体または薬剤融合体を用いた前臨床試験の実施を不必要にするという優位性をもたらす。
適切な、血清アルブミンに結合する抗体または抗体の抗原結合断片として、例えば、ヒトの抗体または抗体の抗原結合断片、ヒト化した抗体または抗体の抗原結合断片、キメラの抗体または抗体の抗原結合断片、げっ歯類(例えば、マウス、ラット)の抗体または抗体の抗原結合断片、およびラクダ科(Camelid)の抗体または抗体の抗原結合断片があげられる。特定の実施形態では、薬剤複合体、非共有結合性の薬剤複合体および薬剤融合体は、血清アルブミンに結合するラクダ科のVHHを含む。ラクダ科のVHHは、元々軽鎖がない、重鎖抗体に由来する免疫グロブリンの単一の可変領域のポリペプチドである。そのような抗体が、ラクダ、アルパカ、ヒトコブラクダおよびグアナコを含むラクダ科の種に存在する。VHH分子は、IgG分子に比べ約10分の1の大きさであり、単一のポリペプチドとして、安定性が非常に高く、極端なpHおよび温度の条件に抵抗性がある。適切な、血清アルブミンに結合するラクダ科のVHHとして、WO2004/041862(Ablynx N. V.)および本明細書(図15および配列番号77〜88)に開示されているものがあげられる。特定の実施形態では、ラクダ科のVHHは、ヒトの血清アルブミンに結合し、かつ配列番号72、配列番号73、配列番号74、配列番号75、配列番号76、配列番号77、配列番号78、配列番号79、配列番号80、配列番号81、配列番号82、配列番号83、配列番号84、配列番号85、配列番号86、配列番号87または配列番号88に対して、少なくとも約80%、または少なくとも約85%、または少なくとも約90%、または少なくとも約95%、または少なくとも約96%、または少なくとも約97%、または少なくとも約98%、または少なくとも約99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。アミノ酸配列同一性は、好ましくは、BLAST P等の適切なアラインメントアルゴリズムおよびデフォルトパラメーターを使用して決定する(KarlinおよびAltschul、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87(6): 2264-2268 (1990))。
薬剤複合体、非共有結合性の薬剤複合体または薬剤融合体が、ヒトに投与するためのものである場合、血清アルブミン(例えば、ヒトの血清アルブミン)に結合する抗体または抗体の抗原結合断片は、ヒトの、ヒト化したもしくはキメラの抗体、またはそのような抗体の抗原結合断片でありうる。このような種類の抗体および抗原結合断片は、ヒトにおいて、低免疫原性または無免疫原性であり、周知の優位性を提供する。例えば、ヒトの、ヒト化したもしくはキメラの抗体の抗原結合断片を含有する薬剤複合体、非共有結合性の薬剤複合体または薬剤融合体は、ヒトに繰り返し投与しても、(その他の完全に免疫原性である抗体に比較して)薬剤複合体または薬剤融合体に結合するヒト抗体の生成による効果の損失が少ないか、または効果の損失が全くない状態で投与できる。薬剤複合体、非共有結合性の薬剤複合体または薬剤融合体が、動物への投与を意図するものである場合、類似の抗体または抗原結合断片を使用できる。例えば、マウスまたはヒトの抗体由来のCDRを、ウマまたはウシ等の所望の動物由来のフレームワーク領域上にグラフトしうる。
ヒト抗体を作るトランスジェニック動物を、適切な抗原(例えば、ヒトの血清アルブミン)を用いて免疫でき、抗体産生細胞を単離し、従来法を使用して融合させて、ハイブリドーマを形成できる。所望の特徴(例えば、特異性、親和性)を有するヒトの抗体を産生するハイブリドーマを、任意の適切なアッセイ(例えば、ELISA法)を使用して同定し、所望により、選択し、適切な培養手法を使用してサブクローン化できる。
抗体、抗体の鎖(例えば、重鎖、軽鎖)またはそれらの断片もしくは一部の定常部が存在する場合には、それらを、任意の適切な起源から引き出すことができる。例えば、ヒトの、ヒト化したおよび特定のキメラの抗体、抗体の鎖(例えば、重鎖、軽鎖)またはそれらの断片もしくは一部の定常部が存在する場合には、それらは、ヒト由来であってもよく、それらを、任意の適切なヒトの抗体またはヒトの抗体の鎖から引き出すことができる。例えば、ヒト由来の定常部またはその一部を、対立遺伝子の変異体を含む、ヒトのκもしくはλ軽鎖および/またはヒトγ(例えば、γ1、γ2、γ3、γ4)、μ、α(例えば、α1、α2)、δもしくはε重鎖から引き出すことができる。特定の実施形態では、抗体または抗原結合断片(例えば、ヒト由来の抗体、ヒトの抗体)は、機能(例えば、エフェクター機能)を変化させる、または目的に合わせるアミノ酸の置換または交換を含むことができる。例えば、補体活性化および/またはFc受容体結合を低下させるように、ヒト由来の定常部(例えば、γ1定常部、γ2定常部)を設計できる。(例えば、教示全体が、参照によって本明細書に組み込むものとする、米国特許第5,648,260号(Winterら)、第5,624,821号(Winterら)および第5,834,597号(Tsoら)を参照)そのようなアミノ酸の置換または交換を含有するヒト由来の定常部のアミノ酸配列は、好ましくは、変化させていないヒト由来の定常部のアミノ酸配列の全長に対して少なくとも95%同一であり、より好ましくは、変化させていないヒト由来の定常部のアミノ酸配列の全長に対して少なくとも99%同一である。
変異体をコードする配列を(例えば、ファージライブラリーから;例えば、米国特許第5,514,548号(Krebberら)およびWO93/06213(Hoogenboomら)を参照)選択できる。
血清アルブミンに結合する抗体の抗原結合断片を得るための好ましい方法は、抗原結合断片のレパートリーから所望の血清アルブミンに対して結合特異性を有する抗原結合断片(例えば、scFv、dAb)を選択することを含む。例えば、本明細書に記載するように、血清アルブミンに結合するdAbを、適切なファージディスプレイライブラリーから選択できる。多くの適切なバクテリオファージディスプレイライブラリーおよび選択方法(例えば、一価のディスプレイ系および多価のディスプレイ系)が記載されている。(例えば、Griffithsら、米国特許第6,555,313 B1号(参照によって本明細書に組み込むものとする);Johnsonら、米国特許第5,733,743号(参照によって本明細書に組み込むものとする);McCaffertyら、米国特許第5,969,108号(参照によって本明細書に組み込むものとする);Mulligan-Kehoe、米国特許第5,702,892号参照によって本明細書に組み込むものとする);Winter, G.ら、Annu. Rev. Immunol. 12: 433-455 (1994);Soumillion, P.ら、Appl. Biochem, Biotechnol. 47(2-3): 175-189 (1994);Castagnoli, L.ら、Comb. Chem. High Throughput Screen,4(2): 121-133 (2001);WO99/20749(TomlinsonおよびWinter);WO03/002609 A2(Winterら);WO2004/003019 A2(Winterら)を参照)バクテリオファージライブラリーに提示されるポリペプチドは、例えば、繊維状ファージ(具体的には、fd、M13、F1)、溶菌ファージ(具体的には、T4、T7、λ)またはRNAファージ(具体的には、MS2)等の任意の適切なバクテリオファージ上に提示させ、血清アルブミン(例えば、ヒトの血清アルブミン)への結合に関して選択できる。
本発明の特定の薬剤組成物(例えば、薬剤複合体、非共有結合性の薬剤複合体、薬剤融合体)は、個体に投与して、例えば、個体中の生物学的標的分子に結合する、および/またはその機能を変化させることによって、治療または診断に有益な効果をもたらすことができる、任意の薬剤(例えば、有機小分子、核酸、ポリペプチド)を含むことができる。本発明のその他の薬剤組成物(例えば、薬剤融合体)は、ポリペプチドまたはポリペプチド薬剤を含むことができる。薬剤融合体の好ましい実施形態では、薬剤は、抗体の鎖および抗体の鎖の断片(例えば、VH、Vκ、Vλ)を含まない。特定の実施例では、薬剤は、インスリン分泌促進性の薬剤、インクレチン、グルカゴン様1ペプチド、GLP−1ペプチド、GLP−1類似体、GLP−1誘導体、PYY、PYYペプチド、PYY類似体、PYY誘導体、エキセンディン−3、エキセンディン−3ペプチド、エキセンディン−3類似体、エキセンディン−3誘導体、エキセンディン−4、エキセンディン−4ペプチド、エキセンディン−4類似体、エキセンディン−4誘導体、またはこれらの2種以上の組合せ(例えば、GLP−1ペプチドとPYYペプチド)から選択される。
本発明の薬剤融合体は、連続したポリペプチド鎖を含む融合タンパク質であり、前記鎖は、血清アルブミンに結合する抗体の抗原結合断片を第1の部分として含み、これはポリペプチド薬剤である第2の部分に連結している。第1および第2の部分は、ペプチド結合を介して互いに直接的に結合している、あるいは適切なアミノ酸またはペプチドもしくはポリペプチドのリンカーを介して連結することができる。追加の(例えば、第3の、第4の)部分および/またはリンカー配列が、適切であれば、存在してもよい。第1の部分は、N末端の位置、C末端の位置、または第2の部分(すなわち、ポリペプチド薬剤)に関する内部に存在しうる。特定の実施形態では、各部分が、2個以上の複製物で存在しうる。例えば、薬剤融合体は、第1の部分を2個以上含むことができ、そのそれぞれが血清アルブミンに結合する抗体の抗原結合断片を含む(例えば、ヒトの血清アルブミンに結合するVHとヒトの血清アルブミンに結合するVL、または2個以上のヒトの血清アルブミンに結合するVHまたはVL)。
a−(X)n1−b−(Y)n2−c−(Z)n3−dまたはa−(Z)n3−b−(Y)n2−c−(X)n1−d
(式中、
Xは、第1の標的に対して結合特異性を有するポリペプチド薬剤であり;
Yは、血清アルブミンに対して結合特異性を有する抗体の単一の鎖である抗原結合断片
であり;
Zは、第2の標的に対して結合特異性を有するポリペプチド薬剤であり;
a、b、cおよびdは、それぞれ独立に、存在しないか、または1〜約100個のアミノ酸残基であり;
n1は、1から約10であり;
n2は、1から約10であり;かつ
n3は、0から約10であるが、
n1およびn2が共に1であり、かつn3が0である場合には、Xは、抗体鎖または抗体鎖の断片を含まない)
を有する連続したポリペプチド鎖である。
His7−Xaa8−Xaa9−Gly10−Xaa11−Phe12−Thr13−Xaa14−Asp15−Xaa16−Xaa17−Xaa18−Xaa19−Xaa20−Xaa21−Xaa22−Xaa23−Xaa24−Xaa25−Xaa26−Xaa27−Phe28−Ile29−Xaa30−Xaa31−Xaa32−Xaa33−Xaa34−Xaa35−Xaa36−Xaa37−Xaa38−Xaa39−Xaa40−Xaa41−Xaa42−Xaa43−Xaa44−Xaa45
式I−配列番号172
(ただし、
8位のXaaは、Ala、Gly、Ser、Thr、Leu、Ile、Val、Glu、AspまたはLysであり;
9位のXaaは、GluまたはAspであり;
11位のXaaは、Thr、Ala、Gly、Ser、Leu、Ile、Val、Glu、AspまたはLysであり;
14位のXaaは、Ser、Ala、Gly、Thr、Leu、Ile、Val、Glu、AspまたはLysであり;
16位のXaaは、Val、Ala、Gly、Ser、Thr、Leu、Ile、Tyr、Glu、Asp、TrpまたはLysであり;
17位のXaaは、Ser、Ala、Gly、Thr、Leu、Ile、Val、Glu、AspまたはLysであり;
18位のXaaは、Ser、Ala、Gly、Thr、Leu、Ile、Val、Glu、Asp、Trp、TyrまたはLysであり;
19位のXaaは、Tyr、Phe、Trp、Glu、Asp、GlnまたはLysであり;
20位のXaaは、Leu、Ala、Gly、Ser、Thr、Ile、Val、Glu、Asp、Met、Trp、TyrまたはLysであり;
21位のXaaは、Glu、AspまたはLysであり;
22位のXaaは、Gly、Ala、Ser、Thr、Leu、Ile、Val、Glu、AspまたはLysであり;
23位のXaaは、Gln、Asn、Arg、Glu、AspまたはLysであり;
24位のXaaは、Ala、Gly、Ser、Thr、Leu、Ile、Val、Arg、Glu、AspまたはLysであり;
25位のXaaは、Ala、Gly、Ser、Thr、Leu、Ile、Val、Glu、AspまたはLysであり;
26位のXaaは、Lys、Arg、Gln、Glu、AspまたはHisであり;
27位のXaaは、Leu、Glu、AspまたはLysであり;
30位のXaaは、Ala、Gly、Ser、Thr、Leu、Ile、Val、Glu、AspまたはLysであり;
31位のXaaは、Trp、Phe、Tyr、Glu、AspまたはLysであり;
32位のXaaは、Leu、Gly、Ala、Ser、Thr、Ile、Val、Glu、AspまたはLysであり、
33位のXaaは、Val、Gly、Ala、Ser、Thr、Leu、Ile、Glu、AspまたはLysであり;
34位のXaaは、Asn、Lys、Arg、Glu、AspまたはHisであり;
35位のXaaは、Gly、Ala、Ser、Thr、Leu、Ile、Val、Glu、AspまたはLysであり;
36位のXaaは、Gly、Arg、Lys、Glu、AspまたはHisであり;
37位のXaaは、Pro、Gly、Ala、Ser、Thr、Leu、Ile、Val、Glu、AspまたはLysである、あるいは欠失しており;
38位のXaaは、Ser、Arg、Lys、Glu、AspまたはHisである、あるいは欠失しており;
39位のXaaは、Ser、Arg、Lys、Glu、AspまたはHisである、あるいは欠失しており;
40位のXaaは、Gly、Asp、GluまたはLysである、あるいは欠失しており;
41位のXaaは、Ala、Phe、Trp、Tyr、Glu、AspまたはLysである、あるいは欠失しており;
42位のXaaは、Ser、Pro、Lys、GluまたはAspである、あるいは欠失しており;
43位のXaaは、Ser、Pro、Glu、AspまたはLysである、あるいは欠失しており;
44位のXaaは、Gly、Pro、Glu、AspまたはLysである、あるいは欠失しており;
および45位のXaaは、Ala、Ser、Val、Glu、AspまたはLysである、あるいは欠失しているが;
37、38、39、40、41、42、43または44位のアミノ酸が欠失している場合には、そのアミノ酸の下流の各アミノ酸も欠失している)
の配列を含むGLP−1類似体を含む。
Xaa7−Xaa8−Glu−Gly−Thr−Phe−Thr−Ser−Asp−Xaa16−Ser−Xaa18−Xaa19−Xaa20−Glu−Xaa22−Xaa23−Ala−Xaa25−Xaa26−Xaa27−Phe−Ile−Xaa30−Trp−Leu−Xaa33−Xaa34−Xaa35−Xaa36−Xaa37−Xaa38−Xaa39−Xaa40−Xaa41−Xaa42−Xaa43−Xaa44−Xaa45−Xaa46
式(II)−配列番号173
(ただし、
Xaa7は、L−ヒスチジン、D−ヒスチジン、脱アミノ−ヒスチジン、2−アミノ−ヒスチジン、(3−ヒドロキシ−ヒスチジン、ホモヒスチジン、Nα−アセチル−ヒスチジン、α−フルオロメチル−ヒスチジン、α−メチル−ヒスチジン、3−ピリジルアラニン、2−ピリジルアラニンまたは4−ピリジルアラニンであり;
Xaa8は、Ala、Gly、Val、Leu、Ile、Lys、Aib、(1−アミノシクロプロピル)カルボン酸、(1−アミノシクロブチル)カルボン酸、(1−アミノシクロペンチル)カルボン酸、(1−アミノシクロへキシル)カルボン酸、(1−アミノシクロへプチル)カルボン酸または(1−アミノシクロオクチル)カルボン酸であり;
Xaa16は、ValまたはLeuであり;
Xaa18は、Ser、LysまたはArgであり;
Xaa19は、TyrまたはGlnであり;
Xaa20は、LeuまたはMetであり;
Xaa22は、Gly、GluまたはAibであり;
Xaa23は、Gln、Glu、LysまたはArgであり;
Xaa25は、AlaまたはValであり;
Xaa26は、Lys、GluまたはArgであり;
Xaa27は、GluまたはLeuであり;
Xaa30は、Ala、GluまたはArgであり;
Xaa33は、ValまたはLysであり;
Xaa34は、Lys、Glu、AsnまたはArgであり;
Xaa35は、GlyまたはAibであり;
Xaa36は、Arg、GlyまたはLysであり;
Xaa37は、Gly、Ala、Glu、Pro、Lys、アミドであるか、または存在せず;
Xaa38は、Lys、Ser、アミドであるか、または存在せず;
Xaa39は、Ser、Lys、アミドであるか、または存在せず;
Xaa40は、Gly、アミドであるか、または存在せず;
Xaa41は、Ala、アミドであるか、または存在せず;
Xaa42は、Pro、アミドであるか、または存在せず;
Xaa43は、Pro、アミドであるか、または存在せず;
Xaa44は、Pro、アミドであるか、または存在せず;
Xaa45は、Ser、アミドであるか、または存在せず;
Xaa46は、アミドであるか、または存在しないが;Xaa38、Xaa39、Xaa40、Xaa41、Xaa42、Xaa43、Xaa44、Xaa45またはXaa46が存在しない場合には、下流の各アミノ酸残基も存在しない)
のアミノ酸配列を含むGLP−1類似体を含む。
Xaa7−Xaa8−Glu−Gly−Thr−Phe−Thr−Ser−Asp−Val−Ser−Xaa18−Tyr−Leu−Glu−Xaa22−Xaa23−Ala−Ala−Xaa26−Glu−Phe−lle−Xaa30−Trp−Leu−Val−Xaa34−Xaa35−Xaa36−Xaa37−Xaa38
式(III)−配列番号174
(ただし、
Xaa7は、L−ヒスチジン、D−ヒスチジン、脱アミノ−ヒスチジン、2−アミノ−ヒスチジン、β−ヒドロキシ−ヒスチジン、ホモヒスチジン、N’1−アセチル−ヒスチジン、α−フルオロメチル−ヒスチジン、α−メチル−ヒスチジン、3−ピリジルアラニン、2−ピリジルアラニンまたは4−ピリジルアラニンであり;
Xaa8は、Ala、Gly、Val、Leu、Ile、Lys、α−アミノイソ酪酸(Aib)、(1−アミノシクロプロピル)カルボン酸、(1−アミノシクロブチル)カルボン酸、(1−アミノシクロペンチル)カルボン酸、(1−アミノシクロへキシル)カルボン酸、(1−アミノシクロへプチル)カルボン酸または(1−アミノシクロオクチル)カルボン酸であり;
Xaa18は、Ser、LysまたはArgであり;
Xaa22は、Gly、GluまたはAibであり;
Xaa23は、Gln、Glu、LysまたはArgであり;
Xaa26は、Lys、GluまたはArgであり;
Xaa30は、Ala、GluまたはArgであり;
Xaa34は、Lys、GluまたはArgであり;
Xaa35は、GlyまたはAibであり;
Xaa36は、ArgまたはLysであり;
Xaa37は、Gly、Ala、GluまたはLysであり;
Xaa38は、Lys、アミドであるか、または存在しない)
のアミノ酸配列を含むGLP−1ペプチドを含む。
別の態様では、本発明は、薬剤に結合している、血清アルブミンに結合する抗体の抗原結合断片を含む複合体を提供する。そのような複合体には、「薬剤複合体」が含まれ、これは、薬剤が共有結合している、血清アルブミンに結合する抗体の抗原結合断片を含んでおり、さらに「非共有結合性の薬剤複合体」も含まれ、これは、薬剤が非共有結合している、血清アルブミンに結合する抗体の抗原結合断片を含んでいる。好ましくは、複合体は、十分に安定であり、したがって、in vivoの条件下(例えば、ヒトに投与した場合)で、血清アルブミンに結合する抗体の抗原結合断片と薬剤とが、実質的に互いに結合している状態を維持する。好ましくは、in vivoの条件下で、複合体の約20%以下、約15%以下、約10%以下、約9%以下、約8%以下、約7%以下、約6%以下、約5%以下、約4%以下、約3%以下、約2%以下、約1%以下が解離または分解して、薬剤と抗原結合断片とを放出する、あるいは複合体の解離または分解は、実質的に起こらない。例えば、「in vivo」の条件下での安定性を、薬剤複合体または非共有結合性の薬剤複合体を、血清(例えば、ヒトの血清)中で、37℃にて、24時間インキュベートすることによって、好都合に評価できる。そのような方法の一実施例では、等量の薬剤複合体と複合体を形成していない薬剤とを血清の2本の異なるバイアルに希釈する。各バイアルの内容物の半分を、直ちに−20℃にて凍結し、残りの半分を37℃にて、24時間インキュベートする。その後、SDS−PAGE法および/またはウエスタンブロット法等の任意の適切な方法を使用して、4個の試料全部を分析できる。ウエスタンブロットを、薬剤に結合する抗体を使用して探索できる。薬剤複合体のレーンにある薬剤はいずれも、解離していなければ、薬剤複合体の大きさへ移動するであろう。多くのその他の適切な方法を使用して、例えば、上記のように調製した試料を、クロマトグラフィー(例えば、ゲルろ過、イオン交換および逆相)、ELISA法、質量分析等の適切な分析方法を使用して分析することによって、「in vivo」の条件下での安定性を評価できる。
別の態様では、本発明は、薬剤複合体が単一の連続したペプチド鎖ではない場合に、血清アルブミンに対して結合特異性を有する抗体の抗原結合断片と、前記抗原結合断片に共有結合している薬剤とを含む薬剤複合体を提供する。
一部の非共有結合(例えば、水素結合、ファンデルワールス相互作用)は、安定で、特異性の高い分子間結合を形成できる。例えば、相補的な結合相手間の複数の非共有結合によって達成される分子認識反応は、酵素の基質への結合、抗体の抗原認識、リガンドの受容体への結合等の多くの重要な生物学的相互作用、ならびにタンパク質およびペプチドの三次元構造の安定化の基礎をなす。したがって、そのような弱い非共有結合性の相互作用(例えば、水素結合、ファンデルワールス相互作用、静電気的な相互作用、親水性相互作用等)を利用して、薬剤を血清アルブミンに対して結合特異性を有する抗体の抗原結合断片に結合させることができる。
本発明の薬剤組成物(例えば、薬剤複合体、非共有結合性の薬剤複合体、薬剤融合体)を含む組成物を提供し、これには、(例えば、ヒトおよび/または動物に投与するための)薬学的または生理学的組成物が含まれる。薬学的または生理学的組成物は、1種または複数の薬剤組成物(例えば、薬剤複合体、非共有結合性の薬剤複合体、薬剤融合体)と、薬学的または生理学的に許容される担体とを含む。通常、これらの担体として、食塩水および/または緩衝溶媒をはじめとする、水溶液またはアルコール/水溶液、乳濁液または懸濁液があげられる。非経口溶媒として、塩化ナトリウム溶液、リンゲルのデキストロース、デキストロース、ならびに塩化ナトリウムおよび乳酸添加リンゲル液があげられる。適切な生理学的に許容されるアジュバントを、懸濁液中にポリペプチドの複合物を維持するために必要であれば、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ゼラチンおよびアルギン酸等の増粘剤から選ぶことができる。静脈内溶媒として、リンゲルのデキストロースを基剤としたもの等、体液および栄養分の補充物、ならびに電解質の補充物があげられる。抗菌剤、抗酸化剤、キレート化剤および不活性ガス等、保存剤およびその他の添加剤も存在しうる(Mark. (1982) Remington's Pharmaceutical Science, 16th Edition)。
実施例
この実施例では、血清アルブミンに対する単一ドメイン抗体(dAb)を作製する方法を説明する。マウス血清アルブミン(MSA)、ヒト血清アルブミン(HSA)およびラット血清アルブミン(RSA)に対するdAbの選択を記載する。
多様性位置:H30、H31、H33、H35、H50、H52、H52a、H53、H55、H56、H58、H95、H97、H98。
ライブラリー2(VH):
多様性位置:H30、H31、H33、H35、H50、H52、H52a、H53、H55、H56、H58、H95、H97、H98、H99、H100、H100A、H100B。
ライブラリー3(Vκ):
多様性位置:L30、L31、L32、L34、L50、L53、L91、L92、L93、L94、L96
ライブラリーサイズ:2×109
VHおよびVκライブラリーは、選択されるライブラリー中のクローンの大部分が機能的であるよう、一般的なリガンドプロテインAおよびプロテインLそれぞれとの結合について予備選択しておいた。上記で示されるライブラリーのサイズは、予備選択サイズに相当している。
この実施例では、IL−Iraと、血清アルブミンと結合するdAbとを含む融合タンパク質を作製する方法を説明する。1種はIL−1raのdAb N末端を含み(MSA16IL1−ra)、1種はIL−1raのdAb C末端を含む(IL1−raMSA 16)、2種の融合体を作製した。融合体およびベクターの配列は図2Cおよび2Dに示されている。MSAと結合しなかった対照融合体も製造し、その配列は図2Eに示されている。
手短に言えば、2つの多重クローニング部位(MCS)を以下に詳述するように設計し、T7プロモーターを含む発現ベクターに挿入した。制限部位を、IL1−ra、dAb、GASリーダーおよびリンカーを挿入するために設計した。一方(MCS1+3)は、IL−1raのdAb N末端を含むタンパク質をコードし、もう一方(MCS2+4)は、IL−1raのdAb C末端を含むタンパク質をコードする。
NdeI、スタッファー、SalI、NotI、スタッファー、XhoI、BamHI
gcgcatatgttagtgcgtcgacgtcaaaaggccatagcgggcggccgctgcaggtctcgagtgcgatggatcc
(配列番号35)
IL1−radAb融合体のクローニング部位2+4
NdeI、スタッファー、StUI、SacI、スタッファー、SalI、NotI、TAA TAA BamHI
gcgcatatgttaagcgaggccttctggagagagctcaggagtgtcgacggacatccagatgacccaggcggccgctaataaggatccaatgc
(配列番号36)
次いで、MCSを適当な制限酵素を用いて消化することと、アニーリングしている、リーダーをコードするプライマーをライゲーションすることとによってGASリーダーを各ベクター中に挿入した。次いで、リンカーをコードするリンカーDNAを同様の方法で挿入した。IL−1raをコードするDNAは、cDNAクローンからPCR(必要とされる制限部位を加えるよう設計されたプライマーを用いる)によって得、TOPOクローニングベクターに挿入した。核酸配列決定によって正確な配列を確認した後、IL−1raをコードするDNAをTOPOベクターから切り出し、リーダーおよびリンカーを含むベクターにライゲーションした。最後に、dAbをコードするDNAを、dAb発現ベクターから切り出し、インサート(ゲル精製によって精製した)およびベクターのSalI/NotI消化によってベクターに挿入した。
MSA16IL1−ra、IL1−raMSA16およびダミーIL−1raは、大腸菌のペリプラズムにおいて発現され、プロテインLアガロース親和性樹脂(Affitech,Norway)に対するバッチ吸収と、それに続くグリシンpH2.2での溶出を用いて上清から精製した。次いで、精製したdAbを、SDS−PAGEゲル電気泳動とそれに続くクマシー染色とによって分析した。1種のタンパク質(IL−1raMSA 16)については、>90%のタンパク質が期待された大きさであったので、さらなる精製は行なわずに活性について分析した。その他のタンパク質(MSA16IL1−raおよびダミーIL−1ra)はより小さいバンドが混入していたので、pH9のRESOURSEQイオン交換カラムでのFPLCイオン交換クロマトグラフィーによってさらに精製した。タンパク質は、0〜500mM NaClの直線塩勾配を用いて溶出した。SDS−PAGEゲル電気泳動によって分析した後、期待された大きさのタンパク質を含む画分を合わせて、純度>90%の混合画分を得た。このタンパク質をさらなる分析に用いた。
MSA16IL−1ra融合体を、MRC−5細胞(ATCC受託番号CCL−171;American Type Culture Collection,Manassas,VA)におけるIL−1によるIL−8分泌の誘導を中和する能力について試験した。この方法は、HUVECにおけるIL−1によるIL−8の誘導を記載するAkeson, L. et al (1996) Journal of Biological Chemistry 271, 30517-30523から適応させ、MRC−5細胞をHUVEC細胞株の代わりに用いた。手短に言えば、マイクロタイタープレートにプレーティングされたMRC−5細胞を、dAbIL−1ra融合タンパク質またはIL−1ra対照およびIL−1(100pg/mL)とともに一晩インキュベートした。インキュベートした後、上清を細胞から吸引除去し、IL−8濃度を、サンドイッチELISA(R&D Systems)によって測定した。
3種のdAb/IL−1ra融合体を、血清アルブミンと結合し、モノクローナル抗IL1ra抗体によって同時に検出される能力について試験した。試験した融合体はMSA16IL−1ra、IL−1raMSA16およびダミーIL−1raであった。手短に言えば、ELISAプレートを、10μg/mlのマウス血清アルブミンで一晩コーティングし、0.05%Tween PBSで5回洗浄し、次いで、4% Marvel PBSで1時間ブロッキングした。ブロッキングした後、プレートを0.05%Tween PBSで5回洗浄し、次いで、4% MPBSで希釈した各dAb、IL−1ra融合体とともに1時間インキュベートした。各融合体は1μM濃度および7連続4倍希釈物(すなわち、60pMまで低下させた)でインキュベートした。インキュベートした後、プレートを0.05%Tween PBSで5回洗浄し、次いで、4%MPBSで希釈した、ヒトIL−1受容体アンタゴニストに対するウサギポリクローナル抗体(ab−2573)(Abcam,UK)の製造業者推奨希釈物とともに1時間インキュベートした。このインキュベーションの後、プレートを0.05%Tween PBSで5回洗浄し、次いで、4%MPBSで希釈した、二次抗体(抗ウサギIgG−HRP)の1/2000希釈物とともに1時間インキュベートした。二次抗体とともにインキュベートした後、プレートを0.05%Tween PBSで3回、PBSで2回洗浄し、次いで、ウェルあたり50μlのTMBマイクロウェルペルオキシダーゼ基質(KPL,MA)を用いて発現させ、この反応を、ウェルあたり50μlのHCLで停止させた。吸収は450nMで読み取った。
A.MSA結合性dAb/HAエピトープタグ融合タンパク質のマウスにおける血清半減期の測定
MSA結合性dAb/HAエピトープタグ融合タンパク質は、大腸菌のペリプラズムにおいて発現され、プロテインLアガロース親和性樹脂(Affitech,Norway)に対するバッチ吸収と、それに続くグリシンpH2.2での溶出を用いて精製した。融合タンパク質の血清半減期を、マウスにおいて、CD1系統雄動物への約1.5mg/kgでの単回静脈内(i.v.)注射後に測定した。血清レベルの分析は、4%Marvelでブロッキングされた、ヤギ抗HA(Abcam,UK)捕捉およびプロテインL−HRP(Invitrogen,USA)検出を用いるELISAによって行なった。洗浄は0.05%Tween−20、PBSを用いて行なった。既知濃度のMSA結合性dAb/HA融合体の標準曲線は、1×マウス血清の存在下で設定し、試験サンプルとの比較性を確実にした。1コンパートメントモデルでのモデリング(WinNonlin Software,Pharsight Corp.,USA)により、MSA結合性dAb/HAエピトープタグ融合タンパク質は、最終相tl/2 29.1時間および曲線下面積559時間・μg/m1を有するとわかった。このことは、わずか数分ほどの短いものであり得るHAエピトープタグペプチド単独の予測半減期を上回る大きな改善を実証する。
MSA結合性dAb/IL−1ra融合タンパク質(MSA16IL−1ra)は、大腸菌のペリプラズムにおいて発現され、プロテインLアガロース親和性樹脂(Affitech,Norway)に対するバッチ吸収と、それに続くグリシンpH2.2での溶出を用いて精製した。MSA16IL−1ra(DOM7m−16/IL−1ra)、MSAと結合しないdAbとのIL−Ira融合体(ダミーdAb/IL−1ra)およびHAエピトープタグと融合している抗MSA dAb(DOM7m−16HAタグ)の血清半減期を、マウスにおいてCD1系統雄動物への約1.5mg/kgでの単回i.v.注射後に調べた。
抗ラット血清アルブミンdAbは、C末端HAタグとともに大腸菌のペリプラズムにおいて発現され、Vk dAbについてのプロテインLアガロース親和性樹脂(Affitech,Norway)に対するバッチ吸収およびVH dAbについてのプロテインA親和性樹脂に対するバッチ吸収と、それに続くグリシンpH2.2での溶出を用いて精製した。血清半減期を調べるために、4匹のラットからなる群に、1.5mg/KgのDOM7r−27、DOM7r−31、DOM7r−16、DOM7r−3または無関係の抗原と結合する対照dAb(HEL4)で単回i.v.注射を行なった。7日間にわたる尾静脈からの連続出血によって血清サンプルを得、ELISAプレート上にコーティングされたヤギ抗HA(Abcam,Cambridge UK)と、それに続く、プロテインA−HRP(VH dAbに対して)またはプロテインL−HRP(Vκ dAbに対して)を用いる検出とを用いるサンドイッチELISAによって分析した。既知濃度のdAbの標準曲線は1×ラット血清の存在下で設定し、試験サンプルとの比較性を確実にした。2コンパートメントモデルでのモデリング(WinNonlin薬物動退学ソフトウェア(Pharsight Corp.,USA)を用いる)を用いてt1/2βおよび曲線下面積(AUC)を算出した(表4)。
ヒトにおけるdAb、薬剤融合体または薬剤複合体のin vivo半減期は、動物において得られた半減期データから相対スケーリングを用いて推定できる。3匹の動物において求めたin vivo半減期のlogを、動物の体重のlogに対してプロットする。プロットした点を通って直線を引き、直線の傾きおよびy切片を用い、式logY=log(a)+b log(W){式中、Yはヒトにおけるin vivo半減期であり、log(a)はy切片であり、bは傾きであり、Wはヒトの体重である}を用いてヒトにおけるin vivo半減期を算出する。直線は、約35グラム(例えば、マウス)、約260グラム(例えば、ラット)および約2,710グラムの重さの動物において得られたin vivo半減期データを用いて作成できる。この算出には、ヒトの体重は70,000グラムであると考えることができる。
関節リウマチの認識されたマウスモデル(DBA/1マウスにおけるII型コラーゲン誘導関節炎(CIA))における融合体DOM7m−16/IL−1raの有効性およびIL−1raの有効性を評価した。研究を通じて、マウスは、20〜24℃、12時間明、12時間暗サイクルで、HEPAフィルター処理したスカンテイナー(Scantainer)中に収納された標準2型ケージ中の試験設備中に維持した。食餌(Harlan−Teklad普通食2016)およびUV滅菌水を無制限に与えた。マウスは、適当な順化を確実にするために研究の開始の少なくとも7日前に試験設備に運び入れた。
リボソーム不活性化タンパク質サポリン(抗癌剤)は、変性剤およびプロテアーゼに対して高度に安定であり、Tリンパ球を標的とする毒素として用いられている。ビオチン−ストレプトアビジン結合を介してサポリンとDOM7h−8をカップリングさせることによって非共有結合性薬剤複合体を調製した。この非共有結合性薬剤複合体を用いて得られた結果は、DOM7h−8は、薬剤とカップリングされた場合に、その血清アルブミン結合特徴を保持するということを実証する。
フルオレセインイソチオシアネート(FITC)は、タンパク質上のアミノ、スルフヒドリル、イミダゾリル、チロシルまたはカルボニル基と架橋できる。分子量は389Daであり、大きさは多数の小分子薬と同程度である。この複合体を用いて得られた結果は、抗sa dAbは、小さな化学物質とカップリングした場合に、その血清アルブミン結合特徴を維持するということを実証し、このことは、小分子薬を抗SA dAbと複合体を形成させることができるということを示す。
多数のペプチドが治療効果を有する。NまたはC末端システインを含むモデルペプチドは抗血清アルブミンdAbとカップリングできる。
インスリン分泌促進性薬剤の効力は、用量反応曲線からEC50値を算出することによって調べることができる。ヒトGLP−1受容体を発現する、安定にトランスフェクトされた細胞株、BHK467−12A(tk−ts13)に由来する精製した原形質膜を、GLP−1およびペプチド類似体で刺激し、Perkin Elmer Life Sciences製のAlphaScreen(商標)cAMPアッセイキットを用いてcAMP産生の効力を測定する。
BRIN−BD11細胞を、24ウェルプレートに播種し(3×105個/ウェル)、48時間培養し、次いで、トリチウム化アデニン(2mCi)を補給した培地で16時間プレインキュベートする。細胞を冷ハンクス緩衝塩類溶液(HBS)で2回洗浄し、試験溶液(400μl、37℃)を加える。次いで、細胞を、1mM IBMXおよび5.6mMグルコースの存在下、HBSバッファー中、種々の濃度の(10−10〜10−5M)GLP−1化合物に曝露する(20分、37℃)。インキュベートした後、試験溶液を除去し、300mlの溶解溶液(5% TFA、3% SDS、未標識ATP5mMおよび未標識cAMP300μM)を加える。ダウエックスおよびアルミナ交換樹脂を用い、記載されるとおりに(Miguel JC, et al. Biochem. Pharmacol. 2003, 65:283)、細胞用溶解物中のトリチウム化アデニンおよびATPからトリチウム化cAMPを分離する。
GLP−1化合物のin vivo生物活性は、12〜16週齢の肥満の糖尿病(ob/ob)マウスにおいて評価できる。動物を、22±2℃、12時間明:12時間暗サイクルの空調管理された室内で個別に飼育する。動物には無制限に水を飲ませ、標準齧歯類維持食に連続アクセスさせる。マウスは18時間絶食させ、生理食塩水(9g/L NaCl)、グルコース(18mM/体重1kg)を単独で、またはGLP−1化合物(25nM/体重1kg)と組み合わせて、8ml/体重1kgを腹膜内投与する。血液サンプルを、注射の直前、注射の15分後、30分後および60分後に冷却したフッ化物/ヘパリン微量遠心管に採取し、得られた血漿を−20℃で保存する。
血漿グルコースレベルは、Analoxグルコースアナライザー(Hammersmith,London,UK)を用いて測定でき、これではグルコースオキシダーゼ法を用いる(Stevens JF, Clin. Chim. Acta 1971, 32:199)。インスリンレベルは、デキストランコーティングしたチャコールラジオイムノアッセイ(Flatt PR and Bailey CJ, Diabetologia 1981,20:573)によってアッセイできる。血漿グルコースおよびインスリン曲線下の増加面積(AUC)は、GraphPad PRISMバージョン3.0(Graphpad Software,San Diego,CA,USA)を用いて算出できる。
GLP−1類似体の半減期延長は、健常なブタにsc投与した後の血漿中のその濃度をモニターすることによって測定できる。比較のために、sc.投与後のGLP−1(7−37)(GLP−1の天然活性型、対照として用いる)の血漿中の濃度を追跡できる。
ブタ(50%デュロック、25%ヨークシャー、25%デンマーク・ランドレス、約40kg)を実験の開始から絶食させる。各ブタに、50pM等張液(5mMリン酸塩、pH7.4、0.02%Tween(登録商標)−20(Merck)、45mg/mlマンニトール(発熱物質不含、Novo Nordisk))中、体重1kgあたり0.5nmolの試験組成物を投与する。血液サンプルは頸静脈中のカテーテルから採取する。5mlの血液サンプルを、175μlの以下の溶液を入れた冷却したガラス中に注ぎ入れる:0.18M EDTA、15000KIE/mlアプロチニン(Novo Nordisk)および0.30mM バリン−ピロリジド(Novo Nordisk)、pH7.4。30分以内に、サンプルを5〜6000*gで10分間遠心分離する。温度は4℃で維持する。上清を異なるガラスにピペットで入れ、使用まで−20℃で維持する。
コーティングバッファー(PBS):リン酸緩衝生理食塩水、pH7.2
洗浄バッファー(PBS−洗浄):リン酸緩衝生理食塩水、0.05%v/v Tween20、pH7.2
アッセイバッファー(BSA−バッファー):リン酸緩衝生理食塩水、10g/l ウシ血清アルブミン(Fluka05477)、0.05%v/v Tween20、pH7.2
ストレプトアビジンバッファー:リン酸緩衝生理食塩水、0.5M NaCl、0.05%v/v Tween 20、pH7.2
標準:血漿マトリックス中の個々の化合物
A−TNP:ナンセンス抗体
AMDEX:ストレプトアビン(Streptavin)−セイヨウワサビペルオキシダーゼ(Amersham RPN4401V)
TMB基質:3,3’,5,5’テトラメチルベンジジン(<0.02%)、過酸化水素
アッセイは以下のとおりに実施できる(容量/ウェル):
1)100μlの、PBSバッファー中5μg/mlの捕捉抗体を用いてコーティングし、4℃で一晩インキュベートし、5回PBS洗浄し、最後の洗浄液で最小30分間ブロッキングし、次いで、プレートを空にする◎
2)20μlのサンプル+100μlの、10ug/mlのA−TNPを含むBSAバッファー中、1μg/mlのビオチン化検出抗体を、振盪機上で、室温で2時間インキュベートし、5回のPBS洗浄を行ない、次いで、プレートを空にする◎
3)100μlの、ストレプトアビジンバッファー中、AMDEX1:8000を、振盪機上、室温で45〜60分インキュベートし、5回のPBS洗浄を行ない、次いで、プレートを空にする◎
4)100μlのTMB基質を、振盪機上で、室温でインキュベートし、100μlの4M H3PO4を用いて反応を停止する。450nmの吸光度を読み取り、参照として620nmを用いる。サンプルの濃度は、標準曲線から算出できる。
DBバッファー:80mMリン酸塩バッファー、0.1%ヒト血清アルブミン、10mM EDTA、0.6mM チオマーサル、pH7.5
FAMバッファー:40mMリン酸塩バッファー、0.1%ヒト血清アルブミン、0.6mMチオマーサル、pH7.5
チャコール:40mMリン酸塩バッファー、0.6mMチオマーサル、16.7%ウシ血漿、15g/l活性炭、pH7.5(懸濁液を最小1時間混合し、その後4℃で使用する)
標準:血漿マトリックス中の個々の化合物
アッセイはミニソープチューブ12×75mm(容量/チューブ)において以下のとおりに実施する:
GLP−1ラジオレセプターアッセイとは、LEADseekerイメージング粒子を用いる放射測定リガンド結合アッセイである。アッセイは、GLP−1受容体、未標識GLP−1類似体、125Iで標識したヒトGLP−1およびコムギ胚芽凝集素(WGA)でコーティングしたPS LEADseeker粒子を含有する膜断片からなる。非放射性および125I−標識GLP−1は、受容体との結合について競合する。LEADseeker粒子を添加すると、それらはWGA−残基を介して膜断片上の炭水化物残基と結合する。125I−分子とLEADseeker粒子間の近接が、粒子からの光の放射を引き起こす。LEADseekerは放射された光をイメージングし、サンプル中に存在するGLP−1類似体の量と可逆的に相関がある。
動物血漿の前処理:動物血漿を56℃で4時間熱処理し、10,000rpmで10分間遠心分離する。その後、Val−Pyr(10μM)およびアプロテニン(aprotenin)(500KIE/ml)を加え、使用まで−18℃で保存する。
GLP−1類似体標準:GLP−1類似体を熱処理血漿にスパイクして約1μM〜1pMの範囲の希釈系列を製造する。
GLP−1 RRAアッセイバッファー:25mM Na−HEPES(pH7.5)、2.5mM CaCl2、1mM MgCl2、50mM NaCl、0.1%オボアルブミン、0.003%Tween 20、0.005%バシトラシン、0.05% NaN3。
GLP−1受容体懸濁液:GLP−1受容体膜断片は、ヒト膵臓GLP−1受容体を発現する新生児ハムスター腎臓(BHK)細胞から精製する。使用まで−80℃で保存する。
WGAがカップリングしているポリスチレンLEADseekerイメージングビーズ(RPNQ0260,Amersham):ビーズは、GLP−1 RRAアッセイバッファーで13.3mg/mlという濃度に再構成する。次いで、GLP−1受容体膜懸濁液を加え、使用前に少なくとも1時間低温(2〜8℃)でインキュベートする。
125I−GLP−1(7−36)アミド(Novo Nordisk A/S)。使用まで−18℃で保存する。エタノール99.9容積%(De Dansk Sprotfabrikker A/S)。使用まで−18℃で保存する。MultiScreen(登録商標)Solvinert0.45μm疎水性PTFEプレート(MSRPN0450、Millipore Corp.)
ポリプロピレン384ウェルプレート(カタログ番号781075、Greiner Bio−One)。
水平プレート混合
標準スインギングバケット型マイクロタイタープレートローターアセンブリーを備える遠心機
UltrVap,ドライダウンサンプル濃縮機(Provair)。
手順:
サンプル調製:MultiScreen(登録商標)Solvinertフィルタープレートを、化学的に適合するレシーバープレート(すなわち、ポリプロピレンプレート)に乗せて濾過液を回収する。
150μlの氷冷エタノール99.9%を、MultiScreen Solvinertフィルタープレートの空のウェルに加え、続いて50μlの標準物質または血漿サンプルを加える。フィルタープレート上に保存蓋を置き、水平プレートミキサー上で、18〜22℃で15分間インキュベートする。
蓋をつけた、組み立てたフィルターおよびレシーバープレートを標準スインギングバケット型マイクロタイタープレートローターアセンブリーに入れる。1500rpmで2分間、濾過液をレシーバープレートの空のウェルに回収する。加熱N2(40℃)を用いるUltraVapを用いて濾過液を15分間ドライダウンする。各ウェルに100μlのGLP−1 RRAアッセイバッファーを加えて乾燥材料を再構成する。これを水平ミキサー上で5分間インキュベートする。
1.35μlのGLP−1 RRAアッセイバッファー
2.5μlの再構成された濾過液
3.10μlの125I−GLP−1(7−36)アミド。保存用液は、使用前にGLP−1 RRAアッセイバッファーで20,000cpm/ウェルに希釈した。
4.15μlの、WGAポリスチレンLEADseekerイメージングビーズ(0.2mg/ウェル)にプレコーティングされるGLP−1受容体膜断片(0.5μg/ウェル)
プレートを密閉し、18〜22℃で一晩インキュベートする。各ウェルからの光の放射を、LEADseeker多様式イメージングシステムを10分間用いることによって検出する。
ヒトGLP−1受容体を発現する、安定にトランスフェクトされた細胞株、BHK467−12A(tk−ts13)に由来する精製した原形質膜を、GLP−1およびペプチド類似体を用いて刺激し、cAMP産生の効力を、Perkin Elmer Life Sciences 製のAlphaScreen(商標)cAMPアッセイキットを用いて測定する。
位置9のグルタミン酸がプロリンで置換されたGLP−1(7−37)([Pro9]GLP−1(7−37))を、iDOM7h−8(CDR3におけるKabatナンバリングによるP96E突然変異)を含む融合体として、GASリーダー(WO05/093074参照のこと)とともにpET 12aベクターにクローニングした。GLP−1グルタミン酸のプロリン9への置換は、融合体のGLP−1部分に、ジペプチジルペプチダーゼIV(DPPIV)切断による分解に対する耐性を付与するために行なわれた(Brian D. Green et al. (2003) Metabolic Stability, Receptor Binding, cAMP Generation, Insulin secretion and Antihyperglycaemic Activity of Novel N-terminal Glu9-substituted Analogues of Glucagon-like-peptide-1: Biol. Chem. (384) 1543-1555)。全部で、3種の構築物を作製した。1種はリンカーのないもの、1種は[Pro9]GLP−1(7−37)とiDOM7h−8の間にPSSアミノ酸を含むもの、1種は[Pro9]GLP−1(7−37)とiDOM7h−8の間にPSSGAPアミノ酸を含むものである(Dom7h−8アルブミン結合形として図16に示される)。発現は、オーバーナイトの発現自己誘導TBレディミックス(Novagen)を用い、30℃で48時間、BL21 DE3 Plys S細胞において行ない、その後、遠心分離によって上清を回収した。プロテインL−アガロースでの親和性捕捉を用いて上清から[Pro9]GLP−1(7−37)iDom7h−8融合体を精製した。次いで、10カラム容積のPBSで樹脂を洗浄し、0.1MグリシンpH2を用いて、結合しているタンパク質を溶出した。次いで、グリシンバッファー中の[Pro9]GLP−1(7−37)−iDom7h−8融合体を、20mMのクエン酸バッファー、pH6.2を用いて予備平衡させた陽イオン交換カラム(1ml S−カラム、GE healthcare)上に載せた。溶出は、1M NaClを補給した同バッファーの0〜50%勾配を用いて行なった。ピーク
を回収し、SDS PAGE電気泳動によってタンパク質の大きさを調べた。予想される大きさのタンパク質のピークをプールし、PBSにバッファー交換した。質量分析およびN末端配列決定によってタンパク質の同一性を確認した。
[Pro9]GLP−1(7−37)−PSSGAP−iDOM7h−8融合体がGLP−1活性を示すことを確認するために、融合体を2種の異なる生物学的アッセイに付した。第1のアッセイでは、RINm5fラットインスリノーマ細胞株(Gadzarらによって、ラットのX線誘導移植可能インスリノーマから1980年に開発された)を、種々の濃度(10pM〜0.1μM)のGLP−1および[Pro9]GLP−l(7−37)−PSSGAP−iDOM7h−8融合体とともに60分間インキュベートした。さらに、エキセンディン−4、ジペプチジルペプチダーゼIVによる分解に対して耐性のGLP−1類似体の単一点アッセイと、対照としての単一点バッファーのみのアッセイを加えた。RINm5fラット細胞はグルコースに対してあまり反応しなかったが、栄養素または非分泌促進物質に曝露された場合にはそれらはβ細胞と同様の分泌反応を示す。したがって、細胞増殖に対する化合物の作用は、細胞増殖ELISAシステム(Amersham,Little Chalfont,UK)を用いて増殖細胞におけるDNA合成の間の5−ブロモ−2’−デオキシウリジン(BrdU)の組み込みレベルを測定することによって評価した、図17参照のこと。DNAレベルを測定するためにOD450を用いたところ、最大100nMという濃度の融合体まで[Pro9]GLP−1(7−37)−PSSGAP−iDOM7h−8融合体のレベルが増大するにつれ、DNAレベルの用量依存性増加があった。GLP−1はまた、予測された用量依存性反応を示した。
実施例11において記載したものと同様の3種の構築物(1種はリンカーのないもの、1種は[Pro9]GLP−1(7−37)とiDOM7h−8の間にPSSアミノ酸を含むもの、1種は[Pro9]GLP−1(7−37)とiDOM7h−8の間にPSSGAPアミノ酸を含むもの)を、OMP−Tリーダーを用いて再度作製した。明確にするために、構築物中の要素の順序は、OMP−Tリーダー、[Pro9]GLP−1、リンカー(適切な場合には)およびiDom7h−8とした。発現は、OD16で0.5mM IPTGで誘導されたTB培地中、25℃で4時間、BL21 DE3 Plys S細胞において行い、その後、遠心分離によって細胞ペレットを回収した。次いで、分泌されたタンパク質をペリプラズム調製によって回収した。プロテインL−アガロースでの親和性捕捉を用いて、ペリプラズム画分からGLP−1 iDom7h−8融合体を精製した。次いで、10カラム容積のPBSで樹脂を洗浄し、結合しているタンパク質を0.1MグリシンpH2で溶出した。次いで、グリシンバッファー中の[Pro9]GLP−1(7−37)融合体を、20mMのクエン酸バッファー、pH6.2を用いて予め平衡化した陽イオン交換カラム(1ml S−カラム、GE healthcare)上に載せた。溶出は、1M NaClを補給した同バッファーの0〜50%勾配を用いて行った。この場合には、20mMクエン酸バッファー、pH6.2(0%NaCl)でカラムを洗浄した結果、予測されるサイズのバンドが流れてしまったので、5K ビバスピンカラム(Vivascience)を用いてこれを濃縮した。
[Pro9]GLP−I−PSS−iDOM7h−8融合構築物(図16bに記載されるとおりであるがiDom7h−8を用いるもの)を、単独およびN末端EAEA延長部分とともに、の双方でpPlCzαベクターにクローニングし、ピキア・パストリスKM71hに形質転換する。(i)30℃で4日かけてメタノール誘導を用いて、および(ii)25℃で2日かけてメタノール誘導を用いてタンパク質を発現させる。上清を遠心分離によって回収し、タンパク質をSDS PAGEゲル上での大きさについて調べる。
実施例11に記載されるものと同様の融合体を、細胞質におけるタンパク質発現のために設計されたpET21発現ベクター(Novagen)にクローニングする。場合により、プロテアーゼ切断部位を構築物中、[Pro9]GLP−1(7−37)の犠牲的N末端とHAP...の間に含める。これにより、タンパク質が、完全に天然のN末端を確実に消化されるようにすることが可能となる。これに使用できる酵素としては、第Xa因子、トロンビンまたはDPPIがあげられる。次いで、タンパク質は、IPTG誘導された際にBL21(DE3)細胞において高レベルで発現され、細胞内封入体に蓄積する。BL21細胞から封入体を単離し、グアニジンHClに可溶化する。還元した後、封入体を酸化還元シャッフリングバッファーシステム中で再フォールディングさせる(Buchner, J., Pastan, I. and Brinkmann, U. (1992). A method for increasing the yield of properly folded recombinant fusion proteins. Anal. Biochem. 205, 263-270。再フォールディング後、タンパク質を透析し、5K ビバスピンカラム(Vivascience)において濃縮し、S−カラム(GE healthcare)によって精製する。
[Pro9]GLP−1−PSS−DOM7h−8融合構築物(図16bに記載されるとおり)を、翻訳されたタンパク質の培地への分泌を促進するためのマウス分泌シグナルペプチドを用いてPcDNA(−)ベクターにクローニングする。アルカリ溶解(mega prep kit,qiagen,CA)を用い、大腸菌において1mgのDNAを調製し、一過性のタンパク質発現のために、ダルベッコ改変イーグル培地(Gibco)
で増殖させた1.5LのHEK293細胞にトランスフェクトする。37℃で5日間培養物をインキュベートすることによってタンパク質を発現させ、遠心分離によって上清(発現されたタンパク質を含む)を回収する。プロテインL−アガロースでの親和性捕捉を用いて、ペリプラズム画分から[Pro9]GLP−1−PSS−DOM7h−8融合体を精製する。次いで、10カラム容積のPBSで樹脂を洗浄し、0.1MグリシンpH2を用いて結合しているタンパク質を溶出する。次いで、グリシンバッファー中のタンパク質を、20mMのクエン酸バッファー、pH6.2を用いて予備平衡させた陽イオン交換カラム(1ml S−カラム、GE healthcare)上に載せた。溶出は、1M NaClを補給した同バッファーの0〜50%勾配を用いて行なった。次いで、SDS−PAGEゲルで正しい大きさのタンパク質を、5Kビバスピンカラム(Vivascience)を用いて濃縮し、生物学的アッセイのためにバッファーをPBSに交換する。
ペプチドYY(3−36)(PYY:アミノ酸配列番号167および核酸配列番号168IKPEAPGEDASPEELNRYYASLRHYLNLVTRQRY)は、ヒトにおいて食物摂取を阻害し、血漿において短い半減期を有する(10〜30分)。食事に応答して放出され、弓状核においてY2Rを介して作用し、食物摂取を生理学的に調節する。PYYを、DOM7h−8に隣接してpET GASベクター(WO05093074)にクローニングする(DOM7h−8のペプチドC末端およびN末端をそれぞれ示す、図20aおよび20bを参照のこと)。発現は、0.5mM IPTGで誘導されたTB培地中、25℃で4時間、BL21 DE3 Plys S細胞において行ない、その後、遠心分離によって細胞ペレットを回収する。次いで、分泌されたタンパク質をペリプラズム調製によって回収する。プロテインL−アガロースでの親和性捕捉を用いて、ペリプラズム画分からPYY DOM7h−8融合体を精製する。次いで、10カラム容積のPBSで樹脂を洗浄し、結合しているタンパク質を0.1MグリシンpH2で溶出し、イオン交換によってさらに精製する。次いで、精製タンパク質を、透析によってPBSにバッファー交換し、5K ビバスピンカラム(Vivascience)において濃縮し、生物学的アッセイに付して、記載されるようにcAMP放出の刺激を測定する(Goumain et al. (2001) The Peptide YY-Preferring Receptor Mediating Inhibition of Small Intestinal Secretion Is a Peripheral Y2 Receptor: Pharmacological Evidence and Molecular Cloning: Molecular Pharmacology: 60 124-134)。手短に言えば、記載されるように(Servin et al. (1989): Peptide-YY and neuropeptide-Y inhibit vasoactive intestinal peptide-stimulated adenosine 3',5'-monophosphate production in rat small intestine: structural requirements of peptides for interacting with PYY-preferring receptors. Endocrinology 124: 692-700)、200μgタンパク質/mlの単離された腸の腺窩細胞を、連続攪拌下、1.4%(w/v)ウシ血清アルブミン、0.1%バシトラシンおよび0.2mM 3−イソブチル−l−メチルキサンチン(IBMX)を含有するリン酸緩衝生理食塩水、pH7.0 0.5ml中15℃で45分間インキュベートする。腸細胞(例えば、VIP)に、PYY単独またはPYY−Dom7h−8融合体を、cAMP産生の強力な生理学的刺激薬とともに加える。反応は細胞を加えることによって開始し、50μlの11M過塩素酸を添加することによって45分後に停止する。4,000gで10分間遠心分離した後、上清中に存在するcAMPをコハク酸化し、記載されるように(Laburthe et al., (1982) Alpha-adrenergic inhibition of cyclic AMP accumulation in epithelial cells isolated from rat small intestine. Biochim Biophys Acta 721:101-108)ラジオイムノアッセイによってその濃度を測定する。
[Pro9]GLP−1(7−37)−DOM7h−8−PYY(図19c参照のこと)融合体を、pET GASベクターにクローニングし、次いで、実施例17に記載されるDom7h−8 PYYについて記載したように発現させる。精製した後、それぞれ実施例17および実施例12に記載されるアッセイに従って、融合体をPYYとGLP−1双方の生物活性についてアッセイする。
Claims (31)
- インスリン分泌促進性の薬剤(IA)またはペプチドYY (PYY)、および血清アルブミンである抗原に結合する免疫グロブリン単一可変ドメインである抗体の断片を含む薬剤複合体または融合体であって、
該抗原はin vivoにおける該薬剤複合体または融合体の半減期を向上させるよう作用し、
該インスリン分泌促進性の薬剤は、グルカゴン様ペプチド-1 (GLP-1)、エキセンディン−3、エキセンディン−4、胃酸分泌抑制ペプチド(GIP)、またはオキシントモジュリン(OXM)から選択されるペプチドである、前記薬剤複合体または融合体。 - 該抗体の断片と融合しているインスリン分泌促進剤ペプチドを含む融合タンパク質である、請求項1に記載の薬剤複合体または融合体。
- インスリン分泌促進性の薬剤が、ペプチドリンカー部分を介して該抗体の断片に融合している、請求項2に記載の薬剤複合体または融合体。
- 免疫グロブリン単一可変ドメインがVH、VLまたはVHHドメインから選択される、請求項1〜3のいずれか1項に記載の薬剤複合体または融合体。
- 前記ペプチドがGLP-1であり、配列番号157および159からなる群より選択される配列と比較して、交換、付加または欠失している、1個以下のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列を有し、かつ前記ペプチドがインスリン分泌促進性である、請求項1〜4のいずれか1項に記載の薬剤複合体または融合体。
- GLP-1がGly10、Thr12、Asp14、Phe27およびIle29を含む、請求項1〜5のいずれか1項に記載の薬剤複合体または融合体。
- GLP-1が、配列番号157または配列番号159と、アミノ酸が1個以下異なり、かつ前記GLP-1がインスリン分泌促進性である、請求項5または6に記載の薬剤複合体または融合体。
- 表面プラズモン共鳴で測定した場合、血清アルブミン(SA)に対して、1nMから500μMの解離定数(Kd)を有する、SAに対して特異的である単一の可変ドメインを有する、請求項1〜7のいずれか1項に記載の薬剤複合体または融合体。
- 該SA特異的ドメインがSAに、標準的なリガンド結合アッセイにおいて1nMから500μMのIC50で結合する、請求項8に記載の薬剤複合体または融合体。
- 2個、3個または4個のインスリン分泌促進性の薬剤(IA)部分を有する、請求項1に記載の薬剤複合体または融合体。
- IA-IA’-AFまたはIA-(AF)n-IA’を含み、IAおよびIA’は同一または異なるインスリン分泌促進性の薬剤であり、AFは請求項1で詳述した抗体の断片であり、nは1、2、3、4、または5に等しい、請求項10に記載の薬剤複合体または融合体。
- [GLP-1]-[AF]-[GLP-1]または[GLP-1]-[GLP-1]-[AF]を含む、請求項11に記載の薬剤複合体または融合体。
- 抗満腹感剤を含み、該抗満腹感剤がPYYおよびPYY (3-36)からなる群より選択される、請求項1〜12のいずれか1項に記載の薬剤複合体または融合体。
- IA-(AF)n-(IA’)x-[抗満腹感剤]または[抗満腹感剤]-(IA’)x-(AF)n-IAを含み、nは1、2、3、4、または5に等しく、xは0、1、2、3、4、または5に等しい、請求項13に記載の薬剤複合体または融合体。
- 1から6時間の間のt 1/2 αを有する、請求項1〜14のいずれか1項に記載の薬剤複合体または融合体。
- 12から60時間の間のt 1/2 βを有する、請求項1〜15のいずれか1項に記載の薬剤複合体または融合体。
- インスリン、エキセンディン−4、エキセンディン−3、PYY(3−36)、レジスチン、レプチン、メラノコルチン3受容体/メラノコルチン4受容体アンタゴニスト、アグーチ関連ペプチド(AgRP)アンタゴニスト、アポリポタンパク質A−IV、エンテロスタチン、ガストリン放出ペプチド(GRP)、インスリン様増殖因子(IGF1)、骨形成タンパク質9(BMP−9)、IL−22、RegIV、インターフェロンα、INGAPペプチド、ソマトスタチン、アミリン、ニュールリン(neurulin)、インターフェロンβ、インターフェロンハイブリッド、アディポネクチン、内在性カンナビノイド、Cペプチド、WNT10b、オレキシン−A、副腎皮質刺激ホルモン、エンテロスタチン、コレシストキニン、オキシントモジュリン、メラニン細胞刺激ホルモン、メラノコルチン、メラニン凝集ホルモン、BB−2、ニューロペプチドy (NPY) Y2アゴニスト、NPY Y5/Y1アンタゴニスト、OXM、ガラニン1R (Gal−1R)アンタゴニスト、メラニン凝集ホルモン1R (MCH−1R)アンタゴニスト、MC−3/4アゴニスト、ボンベシン様受容体3(BRS−3)アゴニスト、膵臓ポリペプチド、抗グレリン抗体断片、脳由来の向神経因子、ヒト成長ホルモン、副甲状腺ホルモン、卵胞刺激ホルモン、または胃酸分泌抑制ペプチドからなる群から選択された薬剤をさらに含む、請求項1に記載の薬剤複合体または融合体。
- GLPがGLP-1(7-37)、GLP-1(7-36)アミド、[Ser8]GLP-1(7-36)アミド、[Pro9]GLP-1(7-36)、または[Pro9]GLP-1(7-37)である、請求項1に記載の薬剤複合体または融合体。
- GLPが、PSS、PSSGAPおよびPSSGAPPPSからなる群より選択されるC末端ペプチドを有する、請求項18に記載の薬剤複合体または融合体。
- 請求項1〜19のいずれか1項に記載の薬剤複合体または融合体をコードする組換え核酸。
- 請求項20に記載の組換え核酸を含む宿主細胞。
- 請求項21に記載の宿主細胞を、前記組換え核酸の発現に適した条件下で維持し、それによって、薬剤融合体を生成することを含む、薬剤融合体を生体外で生成する方法。
- 請求項1〜19のいずれか1項に記載の薬剤複合体または融合体と、生理学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
- 患者における症状を治療および/または予防するために用いる請求項1〜19のいずれか1項に記載の薬剤であって、該症状が、高血糖、2型糖尿病、耐糖能障害、1型糖尿病、肥満、高血圧、シンドロームX、脂質代謝異常、認知障害、アテローム性動脈硬化症、心筋梗塞、冠状心疾患およびその他の心血管障害、脳卒中、炎症性腸疾患、消化不良、ならびに胃潰瘍からなる群より選択される、請求項1〜19のいずれか1項に記載の薬剤複合体または融合体。
- 患者の2型糖尿病において、疾患の進行を遅らせる、または予防するために用いる、請求項1〜19のいずれか1項に記載の薬剤複合体または融合体。
- 患者による食物摂取を減少させる、患者のβ細胞アポトーシスを減少させる、β細胞の機能を改善しβ細胞の質量の増大を増加させる、および/または患者のβ細胞のグルコース感受性を修復するために用いる、請求項1〜19のいずれか1項に記載の薬剤複合体または融合体。
- 患者による食物摂取を減少させる、患者のβ細胞アポトーシスを減少させる、患者のβ細胞の機能を改善しβ細胞の質量を増加させる、および/または患者のβ細胞のグルコース感受性を修復するために用いる、請求項1〜19のいずれか1項に記載の薬剤複合体または融合体。
- 患者において、高血糖、1型糖尿病、2型糖尿病またはβ細胞欠損症を治療および/または予防するために用いる、請求項1〜19のいずれか1項に記載の薬剤複合体または融合体。
- 糖尿病の治療および/または予防に用いるための、請求項1〜19のいずれか1項に記載の薬剤複合体または融合体。
- 肥満の治療および/または予防に用いるための、請求項1〜20のいずれか1項に記載の薬剤複合体または融合体。
- 患者による食物摂取を減少させるために用いる、請求項1〜20のいずれか1項に記載の薬剤複合体または融合体。
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BR112013007388B1 (pt) | 2010-09-28 | 2022-01-04 | Amylin Pharmaceuticals, Llc | Polipeptídeo tendo domínio de ligação de albumina e leptina, seu uso no tratamento de doenças, bem como composição farmacêutica que o compreende |
US20130266567A1 (en) | 2010-12-01 | 2013-10-10 | Haren Arulanantham | Anti-serum albumin binding single variable domains |
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SG10201604564XA (en) | 2011-06-10 | 2016-07-28 | Hanmi Science Co Ltd | Novel oxyntomodulin derivatives and pharmaceutical composition for treating obesity comprising the same |
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US20140256621A1 (en) * | 2011-07-08 | 2014-09-11 | Astrazeneca Pharmaceuticals Lp | Engineered poypeptides having enhanced duration of action and reduced immunogenicity |
CA2772180A1 (en) * | 2011-12-02 | 2013-06-02 | Garvan Institute Of Medical Research | Anti-npy and pyy antibodies and uses thereof |
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CN112409480A (zh) * | 2019-08-20 | 2021-02-26 | 四川科伦博泰生物医药股份有限公司 | 结合血清白蛋白的蛋白及其用途 |
US11877988B2 (en) * | 2019-10-15 | 2024-01-23 | Diverse Biotech, Inc. | Conjugate molecules |
CN111116752B (zh) * | 2019-12-24 | 2021-09-03 | 北京纽安博生物技术有限公司 | 结合免疫球蛋白的单域抗体、抗禽流感单域抗体、双功能抗体及其应用 |
US20230293647A1 (en) | 2020-04-09 | 2023-09-21 | Autolus Limited | Polypeptide |
KR102367488B1 (ko) * | 2020-06-29 | 2022-02-25 | 주식회사 프로테인웍스 | 단일사슬항체-알부민 약물 복합체의 분석방법 |
WO2024018036A1 (en) * | 2022-07-20 | 2024-01-25 | Bioinnova S.R.L.S. | Microalgae expressing biologically active products |
CN117327200B (zh) * | 2023-11-28 | 2024-02-09 | 西宝生物科技(上海)股份有限公司 | 一种调控糖脂代谢和抗衰老的双功能重组蛋白gik及其制备方法 |
Family Cites Families (81)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4172124A (en) | 1978-04-28 | 1979-10-23 | The Wistar Institute | Method of producing tumor antibodies |
US4816567A (en) | 1983-04-08 | 1989-03-28 | Genentech, Inc. | Recombinant immunoglobin preparations |
US5225539A (en) | 1986-03-27 | 1993-07-06 | Medical Research Council | Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies |
US5120712A (en) * | 1986-05-05 | 1992-06-09 | The General Hospital Corporation | Insulinotropic hormone |
JP2583257B2 (ja) | 1986-05-05 | 1997-02-19 | ザ・ジェネラル・ホスピタル・コーポレーション | インシュリン向性ホルモン |
NZ222907A (en) | 1986-12-16 | 1990-08-28 | Novo Industri As | Preparation for intranasal administration containing a phospholipid absorption enhancing system |
EP0307434B2 (en) | 1987-03-18 | 1998-07-29 | Scotgen Biopharmaceuticals, Inc. | Altered antibodies |
US5116946A (en) | 1988-06-08 | 1992-05-26 | Eniricerche S.P.A. | Synthetic, immunologically active peptides useful for the preparation of antimalarial vaccines |
GB8823869D0 (en) | 1988-10-12 | 1988-11-16 | Medical Res Council | Production of antibodies |
US5530101A (en) | 1988-12-28 | 1996-06-25 | Protein Design Labs, Inc. | Humanized immunoglobulins |
EP0464022B1 (en) * | 1989-03-20 | 2000-05-31 | The General Hospital Corporation | Insulinotropic hormone |
US6267964B1 (en) | 1989-08-01 | 2001-07-31 | Affibody Technology Sweden Ab | Stabilized protein or peptide conjugates able to bond albumin having extended biological half-lives |
SE509359C2 (sv) * | 1989-08-01 | 1999-01-18 | Cemu Bioteknik Ab | Användning av stabiliserade protein- eller peptidkonjugat för framställning av ett läkemedel |
US5977307A (en) | 1989-09-07 | 1999-11-02 | Alkermes, Inc. | Transferrin receptor specific ligand-neuropharmaceutical agent fusion proteins |
US5859205A (en) | 1989-12-21 | 1999-01-12 | Celltech Limited | Humanised antibodies |
SG48759A1 (en) | 1990-01-12 | 2002-07-23 | Abgenix Inc | Generation of xenogenic antibodies |
US6075181A (en) | 1990-01-12 | 2000-06-13 | Abgenix, Inc. | Human antibodies derived from immunized xenomice |
JP3262329B2 (ja) | 1990-01-24 | 2002-03-04 | アイ. バックレイ,ダグラス | 糖尿病治療に有用なglp―1アナログ |
GB9015198D0 (en) | 1990-07-10 | 1990-08-29 | Brien Caroline J O | Binding substance |
CA2090126C (en) | 1990-08-02 | 2002-10-22 | John W. Schrader | Methods for the production of proteins with a desired function |
US5789650A (en) | 1990-08-29 | 1998-08-04 | Genpharm International, Inc. | Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies |
US5545806A (en) | 1990-08-29 | 1996-08-13 | Genpharm International, Inc. | Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies |
US5770429A (en) | 1990-08-29 | 1998-06-23 | Genpharm International, Inc. | Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies |
EP0814159B1 (en) | 1990-08-29 | 2005-07-27 | GenPharm International, Inc. | Transgenic mice capable of producing heterologous antibodies |
US6300129B1 (en) | 1990-08-29 | 2001-10-09 | Genpharm International | Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies |
US5633425A (en) | 1990-08-29 | 1997-05-27 | Genpharm International, Inc. | Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies |
US5661016A (en) | 1990-08-29 | 1997-08-26 | Genpharm International Inc. | Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes |
US5625126A (en) | 1990-08-29 | 1997-04-29 | Genpharm International, Inc. | Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies |
AU2228292A (en) | 1991-06-14 | 1993-01-12 | Research Corporation Technologies, Inc. | Peptide derivatives of collagenase inhibitor |
WO1994004679A1 (en) | 1991-06-14 | 1994-03-03 | Genentech, Inc. | Method for making humanized antibodies |
EP0605522B1 (en) | 1991-09-23 | 1999-06-23 | Medical Research Council | Methods for the production of humanized antibodies |
ATE408012T1 (de) | 1991-12-02 | 2008-09-15 | Medical Res Council | Herstellung von autoantikörpern auf phagenoberflächen ausgehend von antikörpersegmentbibliotheken |
DK36492D0 (da) | 1992-03-19 | 1992-03-19 | Novo Nordisk As | Praeparat |
US5733743A (en) | 1992-03-24 | 1998-03-31 | Cambridge Antibody Technology Limited | Methods for producing members of specific binding pairs |
CA2115811A1 (en) | 1993-02-17 | 1994-08-18 | Claus Krebber | A method for in vivo selection of ligand-binding proteins |
NZ250844A (en) * | 1993-04-07 | 1996-03-26 | Pfizer | Treatment of non-insulin dependant diabetes with peptides; composition |
AU6819494A (en) | 1993-04-26 | 1994-11-21 | Genpharm International, Inc. | Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies |
WO1994026087A2 (en) | 1993-05-14 | 1994-11-24 | Connor Kim C O | Recombinant protein production and insect cell culture and process |
SE9400088D0 (sv) | 1994-01-14 | 1994-01-14 | Kabi Pharmacia Ab | Bacterial receptor structures |
ZA957192B (en) * | 1994-09-06 | 1996-03-15 | Scapa Group Plc | Pintle wire |
AU2466895A (en) | 1995-04-28 | 1996-11-18 | Abgenix, Inc. | Human antibodies derived from immunized xenomice |
US5702892A (en) | 1995-05-09 | 1997-12-30 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Phage-display of immunoglobulin heavy chain libraries |
JP4436457B2 (ja) | 1995-08-18 | 2010-03-24 | モルフォシス アイピー ゲーエムベーハー | 蛋白質/(ポリ)ペプチドライブラリー |
US5834597A (en) | 1996-05-20 | 1998-11-10 | Protein Design Labs, Inc. | Mutated nonactivating IgG2 domains and anti CD3 antibodies incorporating the same |
DE19624387C2 (de) | 1996-06-19 | 1999-08-19 | Hatz Motoren | Kaltstartvorrichtung |
CA2262647C (en) | 1996-08-08 | 2007-12-04 | Amylin Pharmaceuticals, Inc. | Methods for regulating gastrointestinal motility |
KR100942002B1 (ko) | 1996-12-03 | 2010-02-12 | 암젠 프레몬트 인코포레이티드 | 복수의 vh 및 vk 부위를 함유하는 사람 면역글로불린 유전자좌를 갖는 형질전환된 포유류 및 이로부터 생성된 항체 |
US6235883B1 (en) | 1997-05-05 | 2001-05-22 | Abgenix, Inc. | Human monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor |
CA2292415A1 (en) | 1997-06-20 | 1998-12-30 | Innogenetics N.V. | B7-binding molecules for treating immune diseases |
DK1019077T4 (da) | 1997-08-08 | 2011-03-07 | Amylin Pharmaceuticals Inc | Hidtil ukendte exendinagonistforbindelser |
GB9722131D0 (en) | 1997-10-20 | 1997-12-17 | Medical Res Council | Method |
EP1066314B1 (en) | 1997-11-14 | 2007-12-26 | Amylin Pharmaceuticals, Inc. | Novel exendin agonist compounds |
EP1032587B2 (en) * | 1997-11-14 | 2013-03-13 | Amylin Pharmaceuticals, Inc. | Novel exendin agonist compounds |
WO1999040788A1 (en) | 1998-02-13 | 1999-08-19 | Amylin Pharmaceuticals, Inc. | Inotropic and diuretic effects of exendin and glp-1 |
EP1056775B1 (en) | 1998-02-27 | 2010-04-28 | Novo Nordisk A/S | Glp-1 derivatives of glp-1 and exendin with protracted profile of action |
US6197582B1 (en) | 1998-03-18 | 2001-03-06 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Development of human monoclonal antibodies and uses thereof |
JP2003502024A (ja) | 1999-05-14 | 2003-01-21 | メディカル リサーチ カウンシル | タンパク質骨格および単量体ポリペプチドを多量体化するためのその使用 |
ATE422369T1 (de) * | 1999-12-24 | 2009-02-15 | Genentech Inc | Verfahren und zusammensetzungen zur verlängerung der entsorgungshalbwertszeit von biowirksamen verbindungen |
AU2002226897B2 (en) * | 2000-12-07 | 2007-10-25 | Eli Lilly And Company | GLP-1 fusion proteins |
US7211395B2 (en) | 2001-03-09 | 2007-05-01 | Dyax Corp. | Serum albumin binding moieties |
CN1294148C (zh) * | 2001-04-11 | 2007-01-10 | 中国科学院遗传与发育生物学研究所 | 环状单链三特异抗体 |
ES2298378T3 (es) | 2001-06-28 | 2008-05-16 | Novo Nordisk A/S | Formulacion estable de glp-1 modificado. |
DK1399484T3 (da) * | 2001-06-28 | 2010-11-08 | Domantis Ltd | Dobbelt-specifik ligand og anvendelse af denne |
JP2005508324A (ja) * | 2001-09-24 | 2005-03-31 | インペリアル カレッジ イノベーションズ リミテッド | 摂食行動の修正 |
ES2500918T3 (es) | 2001-12-21 | 2014-10-01 | Human Genome Sciences, Inc. | Proteínas de fusión de albúmina e interferón beta |
CA2484556A1 (en) | 2001-12-21 | 2003-07-24 | Human Genome Sciences, Inc. | Albumin fusion proteins |
AU2003201998C1 (en) * | 2002-01-10 | 2012-10-25 | Imperial Innovations Limited | Modification of feeding behavior |
AU2003245664A1 (en) | 2002-06-21 | 2004-01-06 | Dyax Corporation | Serum protein-associated target-specific ligands and identification method therefor |
EP1517921B1 (en) * | 2002-06-28 | 2006-06-07 | Domantis Limited | Dual specific ligands with increased serum half-life |
MXPA05004955A (es) * | 2002-11-08 | 2005-11-17 | Ablynx Nv | Anticuerpos de region unica dirigidos contra el factor-alfa de necrosis de tumor y usos de estos. |
EP1558646A2 (en) * | 2002-11-08 | 2005-08-03 | Ablynx N.V. | Single domain antibodies directed against interferon- gamma and uses thereof |
CA2513213C (en) | 2003-01-22 | 2013-07-30 | Human Genome Sciences, Inc. | Albumin fusion proteins |
CA2525120C (en) | 2003-05-14 | 2013-04-30 | Domantis Limited | A process for recovering polypeptides that unfold reversibly from a polypeptide repertoire |
ES2315664T3 (es) * | 2003-06-30 | 2009-04-01 | Domantis Limited | Anticuerpos de dominio unico (dab) pegilados. |
SI2932981T1 (sl) | 2003-09-19 | 2021-11-30 | Novo Nordisk A/S | Albumin-vezavni derivati GLP-1 |
PT1737962E (pt) | 2004-03-24 | 2010-12-03 | Domantis Ltd | Sequência líder universal gas1 |
BRPI0511755A (pt) * | 2004-06-01 | 2008-01-02 | Domantis Ltd | composições, fusões e conjugados de drogas e métodos de produção, tratamento e utilização |
US20060052301A1 (en) * | 2004-06-03 | 2006-03-09 | Ronen Shemesh | Splice variants of peptide YY, neuropeptide Y, pancreatic peptide Y and Amylin, and uses thereof |
US7563443B2 (en) * | 2004-09-17 | 2009-07-21 | Domantis Limited | Monovalent anti-CD40L antibody polypeptides and compositions thereof |
WO2006049983A2 (en) * | 2004-10-27 | 2006-05-11 | Biorexis Pharmaceutical Corporation | Peptide yy modified transferrin fusion proteins |
KR20070115947A (ko) * | 2005-02-11 | 2007-12-06 | 아밀린 파마슈티칼스, 인크. | 선택가능한 특성들을 가지는 gip 유사체 및 하이브리드폴리펩타이드 |
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