CN112300279A - 针对抗cd73抗体和变体的方法和组合物 - Google Patents

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Abstract

提供了抗CD73抗体、变体、和其抗原结合片段，这些抗体、变体、和其抗原结合片段以高亲和力与人CD73结合并抑制CD73的酶活性，并且任选地诱导CD73内化。还提供了编码该抗CD73抗体、变体、和其抗原结合片段的分离的核酸分子，和相关的表达载体，和宿主细胞。提供了制备抗CD73抗体、变体、和其抗原结合片段的方法。还提供了相关的药物组合物和使用这些药物组合物治疗受试者的方法。

Description

针对抗CD73抗体和变体的方法和组合物
技术领域
本发明总体上涉及抗CD73抗体、它们的变体或突变体或其抗原结合片段，以及使用其治疗人癌症的方法。
背景技术
CD73(称为外-5’-核苷酸酶(NT5E，EC 3.1.3.5))是在大多数组织中发现的糖基-磷脂酰肌醇(GPI)-连接的70-kDa细胞表面酶(Zhang B.,Cancer Res.[癌症研究],70(16):6407-6411(2010))。CD73(最初被定义为淋巴细胞分化抗原)被认为在T淋巴细胞上起共同信号传导分子的作用，并且起黏附分子的作用，这对淋巴细胞与内皮结合是重要的。最近的研究表明CD73可以控制多种生理应答，包括上皮离子和液体转运、缺血预处理、组织损伤、血小板功能、缺氧和血管渗漏(Zhang B.,Cancer Res.[癌症研究],70(16):6407-6411(2010))。
已经证明了细胞外腺苷的免疫抑制作用(Stagg J.等人,Oncogene[癌基因],29(39):5346–5358(2010))。腺苷与其受体相互作用可以抑制大多数免疫细胞功能，包括自然杀伤(NK)细胞的细胞毒性、巨噬细胞吞噬作用、T细胞的细胞毒性和细胞因子释放(Goto T.等人,J.Immunol.[免疫学杂志],130(3):1350-1355(1983)；Ohta A.等人,J.Immunol.[免疫学杂志],183(9):5487-5493(2009))。阻断腺苷信号传导可以改善免疫疗法。CD73是参与腺苷信号传导的关键分子。CD73将腺苷一磷酸(AMP)(来自通过CD39进行的三磷酸腺苷(ATP)水解途径的产物)水解为腺苷以影响肿瘤微环境(Allard B.等人,Immunol.Rev.[免疫学综述],276(1):121-144(2017)；Resta R.等人,Immunol.Rev.[免疫学综述],161:95-109(1998))。CD73腺苷轴构成免疫肿瘤学中最有希望的途径之一。
研究报道了CD73参与细胞-细胞和细胞-基质相互作用，并表明CD73参与药物抗性和肿瘤促进(Spychala J.,Pharmacol.Ther.[药理学与治疗学],87(2-3):161–173(2000))。已证实CD73在若干种癌细胞中过表达(Gao ZW.等人,Biomed.Res.Int.[国际生物医学研究],2014:460654(2014))，并且该表达与一些癌症的预后不良或患者存活相关(LoiS.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊],110(27):11091-11096(2013)；Turcotte M.等人,Cancer Res.[癌症研究],75(21):4494-4503(2015)；Xiong L.等人,Cell Tissue Res.[细胞组织研究],355(2):365-374(2014))。在一些例子中，抗CD73单克隆抗体(mAb)治疗可以抑制转移和肿瘤血管发生(Allard B.等人,Int.J.Cancer[国际癌症杂志],134(6):1466-1473(2014)；Terp MG.等人,J.Immunol.[免疫学杂志],191(8):4165-4173(2013))。此外，研究人员已经证明了CD73-腺苷在癌症中的免疫抑制作用，并且认为靶向阻断CD73或腺苷受体可以有效地促进抗肿瘤免疫并增强第一代免疫检查点阻断剂的活性(Allard D.等人、Immunotherapy[免疫疗法]、8(2):145-163(2016))。
近年来，靶向CD73在临床前模型中产生了有利的抗肿瘤作用，并且CD73阻断连同其他免疫调节剂的组合治疗是特别有吸引力的治疗选择(Antonioli L.等人,TrendsCancer[癌症趋势],2(2):95-109(2016))。与抗CD73mAb的组合可以显著增强抗CTLA-4(细胞毒性T淋巴细胞抗原4)mAb和抗PD-1(程序性细胞死亡蛋白1)mAb的抗肿瘤活性(AllardB.等人,Clin.Cancer Res.[临床癌症研究],19(20):5626-5635(2013))。
然而，尽管针对CD73的研究取得进展并且利用该蛋白质得到临床益处，仍然需要开发针对CD73的有效、安全且强有力的抗体药剂。本发明满足了这些需求和其他需求。
发明内容
根据本发明的一个或多个目的，如本文所体现和广泛描述的，本发明在一个方面涉及抗CD73抗体、变体、突变体、和/或其抗原结合片段，制备它们的方法，包含它们的药物组合物，和使用它们治疗人受试者的方法。例如，所披露的抗CD73抗体及其亲和变体和/或突变体或抗原结合片段可以在治疗与CD73表达、CD73过表达、和/或异常CD73功能相关的疾病(如癌症或纤维化)中单独使用或与其他药剂组合使用。本文提供的抗体还可以用于通过向患者给予抗CD73抗体、和/或它们的亲和变体/突变体或其抗原结合片段并且在来自该患者的样品中(例如，体内或离体)检测与CD73蛋白结合的抗CD73抗体、和/或变体/突变体或其抗原结合片段，或通过将抗CD73抗体、和/或变体/突变体或其抗原结合片段与来自患者的样品进行接触并且定性地或定量地检测与CD73蛋白结合的抗CD73抗体、和/或亲和变体/突变体或其抗原结合片段，而在患者或患者样品中检测CD73蛋白。
本发明提供了抗CD73抗体和变体、和/或其抗原结合片段。在某些实施例中，本发明提供了至少十八(18)种抗CD73抗体、变体和/或其抗原结合片段，即抗CD73抗体、和/或变体N1及变体N1变体(N1#2、N1#2-P、N1#9和N1#9-PH)，N2，N4及N4变体(N4#1、N4#4、N4#4-3、N4#5、N4#6、N4#6-2、N4#6-3、N4#6-3-P、N4#6-4、N4#6-4-P和N4#6-5)。在下文序列表中提供了这些(18种)抗CD73抗体和/或其变体中每一种的轻链和重链的核酸和/或其编码氨基酸序列。下表1和2中分别提供了每种抗CD73抗体、和/或其变体的每条轻链(CDR-L1、CDR-L2、和CDR-L3)和每条重链(CDR-H1、CDR-H2、和CDR-H3)的CDR序列。
表1.抗CD73抗体、变体、和/或突变体轻链CDR序列
Figure BDA0002145498740000031
表2.抗CD73抗体、变体、和/或突变体重链CDR序列
Figure BDA0002145498740000032
在一些实施例中，根据(或如应用于)任何上述实施例，本发明的抗CD73抗体在其可变结构域的一个或多个CDR的N-糖基化位点处包含一个或多个突变。所得去糖基化的抗体保持与亲本非去糖基化抗体相同的功能。
在一些实施例中，根据(或如应用于)任何上述实施例，抗CD73抗体包含人IgG的Fc序列。在一些实施例中，根据(或如应用于)任何上述实施例，抗原结合片段选自下组，该组由以下组成：Fab、Fab’、F(ab')2、单链Fv(scFv)、Fv片段、双抗体、和线性抗体。在一些实施例中，根据(或如应用于)任何上述实施例，抗体是多特异性抗体。
在一些实施例中，根据(或如应用于)任何上述实施例，抗CD73抗体、变体或其抗原结合片段与治疗剂缀合。在一些实施例中，根据(或如应用于)任何上述实施例，抗CD73抗体、变体或其抗原结合片段与标记缀合。在一些实施例中，根据(或如应用于)任何上述实施例，标记选自下组，该组由以下组成：放射性同位素、荧光染料、和酶。
本发明提供了编码根据(或如应用于)任何上述实施例的抗CD73抗体、变体、突变体或其抗原结合片段的分离的核酸分子。还提供了编码根据(或如应用于)任何上述实施例的核酸分子的表达载体。还提供了包含根据(或如应用于)任何上述实施例的表达载体的细胞。本发明还提供了产生抗CD73抗体、变体或其抗原结合片段的方法，该方法包括培养根据(或如应用于)任何上述实施例的细胞和从细胞培养物回收抗体或其抗原结合片段。在一些实施例中，根据(或如应用于)任何上述实施例，细胞是哺乳动物细胞。在一些实施例中，根据(或如应用于)任何上述实施例，哺乳动物细胞是CHO细胞。在一些实施例中，根据(或如应用于)任何上述实施例，细胞是稳定的哺乳动物细胞系。在一些实施例中，根据(或如应用于)任何上述实施例，稳定的哺乳动物细胞系是CHO细胞系。
在某些实施例中，提供了在细胞表面与人CD73特异性结合并且能够中和可溶性或膜结合的人CD73蛋白的5'-胞外核苷酸酶活性的分离抗体。抗体可以诱导CD73的细胞内内化。
在某些实施例中，提供了一种与可溶性或膜结合的人CD73蛋白结合并能够抑制其酶活性的抗体，其中所述抗体不被内化到表达CD73的细胞中。
本发明提供了包含根据(或如应用于)任何上述实施例的抗CD73抗体、变体、突变体或其抗原结合片段和药学上可接受的载体的组合物。
本发明提供了通过使根据(或如应用于)任何上述实施例的抗CD73抗体、变体、突变体或其抗原结合片段与样品接触并且检测与CD73蛋白结合的抗CD73抗体而在来自患者的样品中检测CD73蛋白的方法。在一些实施例中，根据(或如应用于)任何上述实施例，抗CD73抗体、变体或其抗原结合片段在免疫组织化学测定(IHC)或在ELISA测定中使用。
还提供了在受试者中治疗癌症的方法，该方法包括向受试者给予有效量的根据(或如应用于)任何上述实施例的组合物。还提供了包含根据(或如应用于)任何上述实施例的抗CD73抗体、变体、突变体或其抗原结合片段的组合物，用于癌症治疗。提供了根据(或如应用于)任何上述实施例的抗CD73抗体、变体、突变体或其抗原结合片段在制造用于治疗癌症(如与CD73的表达相关的癌症)的药物中的用途。
在一些实施例中，根据(或如应用于)任何上述实施例，癌症选自黑色素瘤、头颈癌、尿路上皮癌、乳腺癌(例如，三阴性乳腺癌，TNBC)、胃癌、经典型霍奇金淋巴瘤(cHL)、非霍奇金淋巴瘤原发性纵隔B-细胞淋巴瘤(NHL PMBCL)、间皮瘤、卵巢癌、肺癌(例如，小细胞肺癌和非小细胞肺癌(NSCLC))、食管癌、鼻咽癌(NPC)、胆道癌、结肠直肠癌、***、甲状腺癌和唾液腺癌。在一些实施例中，根据(或如应用于)任何上述实施例，向受试者进一步给予选自下组的治疗剂，该组由以下组成：抗肿瘤剂、化学治疗剂、生长抑制剂和细胞毒性剂。在一些实施例中，根据(或如应用于)任何上述实施例，向受试者进一步给予放射疗法和/或手术。
通过研究以下附图和详细描述，本发明的其他***、方法、特征、和优点对于本领域技术人员将是显而易见的或将变得显而易见。旨在将所有这些另外的***、方法、特征和优点包括在本说明书内、本发明的范围内，并且由所附权利要求保护。此外，所描述的实施例的所有任选和优选特征和修改都可用于本文所教导的本发明的所有方面。此外，所附权利要求书的个体特征连同描述的实施例的所有任选的和优选的特征和修改都是彼此可组合的并且可互换的。
附图说明
参考以下附图可以更好地理解本发明的许多方面。
图1A-1B.从初始噬菌体淘选而选择的抗CD73先导克隆N1、N2和N4的轻链(图1A)(图1A分别按出现的顺序披露了SEQ ID NO 79-81)和重链可变区(图1B)(图1B分别按出现的顺序披露了SEQ ID NO 97-99)的氨基酸序列比对。通过用人CD73-ECD/His筛选人Fab初始噬菌体展示文库，鉴定了具有CD73酶结合和阻断活性的三个选择的抗体先导克隆。然后将这些选择的可变序列克隆到人IgG1Fc主链的L234F、L235E、P331S突变体中，以变成全长抗体。本文列出了抗体先导克隆的序列比对，并且将Kabat定义的CDR(互补决定区)加下划线并用粗体标记。
图2A-2C.选择的抗体的CD73结合。测试选择的抗体与重组人CD73蛋白(通过ELISA(图2A))、表达CD73的人肿瘤细胞MDA-MB-231(人乳腺癌)细胞(图2B)和NCI-H292(人黏液表皮样肺癌)细胞(图2C)(通过流式细胞术)的结合。将抗CD73 ref-1抗体和HLX01(抗CD20)分别用作阳性对照和阴性对照。
图3A-3B.抗CD73先导克隆对可溶性CD73酶活性和细胞CD73酶活性的作用。测试抗CD73抗体抑制人重组CD73蛋白和细胞表面CD73的酶活性的能力。将重组CD73蛋白(图3A)和NCI-H292细胞(图3B)与抗CD73抗体、ATP和AMP一起孵育。使用CellTiter-Glo测定来确定样品中的AMP浓度。冷光读数值指示CD73酶活性。将抗CD73 ref-1抗体和APCP用作阳性对照，而将HLX01(抗CD20)用作阴性对照。
图4.抗CD73先导克隆的抗体介导的CD73内化。在抗CD73抗体处理后，通过流式细胞术测量CD73的细胞表面表达。将抗CD73 ref-1抗体和HLX01(抗CD20)分别用作阳性对照和阴性对照。
图5A-5C.具有不同IgG Fc区的选择的抗体的CD73结合。还将N1、N2和N4的可变序列克隆到人野生型或C219S突变体IgG2Fc主链中。通过流式细胞术测试N1(图5A)、N2(图5B)、N4(图5C)的不同IgG同种型与表达CD73的人MDA-MB-231细胞的结合。将抗CD73 ref-1抗体和HLX01(抗CD20)分别用作阳性对照和阴性对照。
图6A-6C.具有不同的IgG Fc区的抗CD73先导克隆对细胞CD73酶活性的作用。测试具有不同IgG同种型的抗CD73先导克隆N1(图6A)、N2(图6B)、N4(图6C)抑制细胞CD73酶活性的能力。将MDA-MB-231细胞与抗CD73抗体一起孵育。添加ATP、AMP和CellTiter-Glo试剂并记录冷光。在酶活性测定中将APCP用作阳性对照。
图7A-7C.具有不同IgG Fc区的抗CD73抗体的抗体介导的CD73内化。在将细胞与具有N1(图7A)、N2(图7B)和N4(图7C)的不同IgG同种型的细胞孵育后，通过流式细胞术测量CD73的细胞表面表达。将抗CD73 ref-1抗体和HLX01(抗CD20)分别用作阳性对照和阴性对照。
图8A-8B.MDA-MB-231(人三阴性乳腺癌)异种移植小鼠模型中抗CD73先导克隆的肿瘤生长抑制活性。将小鼠(n＝5只小鼠/组)皮下移植MDA-MB-231细胞。在肿瘤接种后14天，当移植的肿瘤大小达到150-300mm3时，给予测试制品的第一剂量。在指定时间用5mg/kg抗体腹膜内处理小鼠。肿瘤生长曲线示于图8A中。第45天的个体肿瘤体积示于图8B中。所有数据点均为平均值±SEM。
图9.衍生自亲和力成熟的N1和N4变体的轻链可变区的氨基酸序列比对。从基于体外噬菌体展示的亲和力成熟实验鉴定具有更好CD73结合亲和力和可溶性CD73酶阻断活性的N1和N4变体。将Kabat定义的CDR(互补决定区)加下划线并用粗体标记。图9分别按出现的顺序披露了SEQ ID NO 82-85、88、86-87和89-92。
图10.衍生自亲和力成熟的N1和N4变体的重链可变区的氨基酸序列比对。从基于体外噬菌体展示的亲和力成熟实验鉴定具有更好CD73结合亲和力和可溶性CD73酶阻断活性的N1和N4变体。将Kabat定义的CDR(互补决定区)加下划线并用粗体标记。然后将这些选择的可变序列克隆到人IgG2Fc主链中，以变成全长抗体。图10分别按出现的顺序披露了SEQID NO 100-103、106、104-105和107-110。
图11A-11B.N1和N4变体的CD73结合。通过流式细胞术来测试选择的变体与表达CD73的MDA-MB-231(图11A)和NCI-H292细胞(图11B)的结合。将HLX01(抗CD20)用作阴性对照。
图12.N1和N4变体对固定化CD73酶活性的作用。测试N1和N4变体抑制固定化CD73酶活性的能力。孵育抗CD73抗体和CD73蛋白后，添加ATP、AMP和CellTiter-Glo试剂并记录冷光。将抗CD73 ref-1抗体、抗CD73 ref-2抗体用作阳性对照，而将HLX01(抗CD20)用作阴性对照。
图13.N1和N4变体的抗体介导的CD73内化。将NCI-H292细胞与N1和N4变体一起孵育，并通过流式细胞术测量CD73的细胞表面表达。将抗CD73 ref-1抗体和抗CD73 ref-2抗体用作阳性对照，而将HLX01(抗CD20)用作阴性对照。
图14.N1和N4靠前变体的轻链的氨基酸序列比对。将Kabat定义的CDR(互补决定区)加下划线并用粗体标记。图14分别按出现的顺序披露了SEQ ID NO 93-96。
图15.N1和N4靠前变体的重链可变区的氨基酸序列比对。将Kabat定义的CDR(互补决定区)加下划线并用粗体标记。然后将这些序列克隆到人IgG2 Fc主链中，以变成全长抗体。图15分别按出现的顺序披露了SEQ ID NO 111、101、和108-109。
图16A-16C.N1和N4靠前变体的CD73结合能力。通过ELISA测试抗CD73抗体与重组人CD73蛋白的结合(图16A)，以及通过流式细胞术测试CD73抗体与表达CD73的人肿瘤细胞MDA-MB-231(图16B)和NCI-H292(图16C)的结合。将抗CD73 ref-1抗体和抗CD73 ref-2抗体用作阳性对照，而将HLX01(抗CD20)用作阴性对照。
图17A-17C.N1和N4靠前变体对可溶性CD73酶活性(图17A)和细胞表面CD73酶活性(图17B，图17C)的作用。测试抗CD73抗体抑制人重组CD73蛋白和细胞表面CD73酶活性的能力。将重组CD73蛋白(图17A)、MDA-MB-231(图17B)和NCI-H292(图17C)细胞与抗CD73抗体一起孵育。添加ATP、AMP和CellTiter-Glo并记录冷光。将抗CD73 ref-1抗体、抗CD73 ref-2抗体和APCP用作阳性对照。将HLX01(抗CD20)用作阴性对照。
图18A-18B.N1和N4靠前变体的抗体介导的CD73内化。将MDA-MB-231(图18A)和NCI-H292(图18B)细胞与抗CD73N1和N4变体一起孵育。孵育后，通过流式细胞术测量CD73的细胞表面表达。将抗CD73 ref-1和抗CD73 ref-2抗体用作阳性对照，而将HLX01(抗CD20)用作阴性对照。
图19A-19B.通过N1和N4靠前变体逆转AMP对T细胞活性的抑制作用。将分离的人T细胞与CD3/CD28珠、AMP和连续稀释的抗体一起在37℃培养4天。CD3+T细胞的增殖之后进行CellTiter-Glo测定(图19A)，并使用人IFN-γELISA MAXTM Deluxe试剂盒(图19B)测量IFN-γ分泌。将抗CD73 ref-1和抗CD73 ref-2抗体用作阳性对照，而将HLX04(抗VEGF)用作阴性对照。
图20.MDA-MB-231(人三阴性乳腺癌)异种移植小鼠模型中N1和N4靠前变体的肿瘤生长抑制活性。将小鼠(n＝5只小鼠/组)皮下移植MDA-MB-231细胞。在肿瘤接种后7天，当移植的肿瘤大小达到约100mm3时，给予测试制品的第一剂量。每周两次用10mg/kg和2mg/kg的抗体腹膜内处理小鼠，持续5-6周。所有数据点均为平均值±SEM。
图21.NCI-H292(人黏液表皮样肺癌)异种移植小鼠模型中N1和N4靠前变体的肿瘤生长抑制活性。将小鼠(n＝5只小鼠/组)皮下移植NCI-H292细胞。肿瘤接种后3天给予测试制品的第一剂量。每周两次用50、10和2mg/kg的抗体腹膜内处理小鼠，持续3周。所有数据点均为平均值±SEM。
图22.NCI-H292异种移植肿瘤中N1和N4靠前变体对细胞CD73酶活性的作用。测试N1和N4靠前变体在NCI-H292异种移植模型中抑制CD73酶活性的能力。在抗体处理前4天，将小鼠(n＝4只小鼠/组)皮下移植NCI-H292细胞。在第0天腹膜内注射抗体、APCP和安慰剂。在抗体给予后第1、3和7天切除肿瘤。通过CellTiter-Glo测定来测量肿瘤中的CD73酶活性。
图23A-23B.MDA-MB-231异种移植肿瘤中N1和N4靠前变体对CD73表达和细胞CD73酶活性的作用。测试抗CD73抗体在MDA-MB-231异种移植模型中下调表面CD73表达和抑制CD73酶活性的能力。在抗体处理前7天，将小鼠(n＝4只小鼠/组)皮下移植MDA-MB-231细胞。在第0天注射抗体和安慰剂。在抗体给予后第1、3和7天收集肿瘤。通过染色的平均荧光强度(MFI)来测量CD73表达(图23A)，并通过CellTiter-Glo测定来测量肿瘤中的CD73酶活性(图23B)。
图24A-24B.N1和N4靠前变体与小鼠和猴的表达CD73的细胞的交叉结合。通过流式细胞术测试抗CD73抗体与表达CD73的小鼠乳腺癌4T1细胞(图24A)和猴肾上皮LLC-MK2细胞(图24B)的结合。将HLX01用作阴性对照。
本发明的另外的优点将部分地在下面的描述中列出，并且部分地将从该描述而显而易见，或者可以通过本发明的实践来了解。将借助于所附权利要求中具体指出的要素和组合来实现和获得本发明的优点。应当理解，前述一般描述和下面的详细描述都只是示例性和描述性的，并不是对要求保护的本发明的限制。
具体实施方式
在一个方面，本发明涉及抗CD73抗体、变体、突变体、和/或其抗原结合片段，制备它们的方法，包含它们的药物组合物，和使用它们治疗人受试者的方法。本发明进一步提供了抗CD73抗体与CD73特异性结合并且可以经由诱导巨噬细胞介导的吞噬作用而抑制肿瘤生长。所披露的抗体展示出与用于治疗临床病症(如癌症或纤维化)的常规的抗CD73单克隆抗体相比改善的功效和/或抗肿瘤活性。还提供了免疫缀合物，编码新颖的抗CD73抗体、它们的亲和变体或其抗原结合片段的核酸(如本文描述的)，和组合物(如药物组合物)。
在某些实施例中，本发明提供了至少十八(18)种抗CD73抗体、变体和/或其抗原结合片段，即表1和表2中指定的抗CD73抗体、变体、和/或突变体。在下文披露的序列-序列表部分中提供了这些抗CD73抗体、其变体和/或突变体中每一种的轻链和重链的核酸和/或其编码氨基酸序列。表1和2中分别提供了每种抗CD73抗体、其变体和/或突变体的每条轻链(CDR-L1、CDR-L2、和CDR-L3)和每条重链(CDR-H1、CDR-H2、和CDR-H3)的CDR序列。
本发明还提供了使用新颖的抗CD73抗体、其亲和变体和/或突变体或抗原结合片段以检测样品(如体内或离体样品)中CD73的方法，和/或包含此类抗体、变体和/或突变体或其抗原结合片段的组合物，所述组合物用于治疗与CD73表达、CD73过表达和/或异常CD73功能(如癌症或纤维化)相关的临床病症或疾病。在其他实施例中，所披露的抗CD73抗体及亲和变体和/或突变体或其抗原结合片段可以在治疗与CD73表达、CD73过表达、和/或异常CD73功能相关的疾病(如癌症或纤维化)中与其他药剂组合使用。本发明进一步提供了此类抗体、变体或其抗原结合片段在制造用于癌症治疗的药物中的用途。
本文提供的抗体还可以用于通过向患者给予抗CD73抗体、和/或它们的亲和变体/突变体或其抗原结合片段并且在来自该患者的样品中(例如，体内或离体)检测与CD73蛋白结合的抗CD73抗体、和/或变体/突变体或其抗原结合片段，或通过使抗CD73抗体、和/或变体/突变体或其抗原结合片段与来自患者的样品进行接触并且定性地或定量地检测与CD73蛋白结合的抗CD73抗体、和/或亲和变体/突变体或其抗原结合片段，而在患者或患者样品中检测CD73蛋白。
受益于前述描述和相关附图中呈现的教导，所披露的组合物和方法的所属领域的技术人员将想到本文披露的许多修改和其他实施例。因此，应当理解本发明不限于所披露的具体实施例，改进和其他实施例旨在包括于所附权利要求的范围内。技术人员将认识到本文描述的方面的许多变体和改编。这些变体和改编旨在包括在本发明的教导中并且涵盖于本文的权利要求中。
尽管本文采用了特定术语，但它们仅以一般性和描述性意义使用，而不是出于限制的目的。
如将对于本领域技术人员清楚的是，在阅读本发明说明书时，本文描述和展示的单独实施例的每一个具有离散的组分和特征，这些组分和特征可以在不偏离本发明的范围或精神的情况下易于与任何其他若干个实施例的特征分离或组合。
可以按照所叙述的事件的顺序或按照逻辑上可行的任何其他顺序来进行任何叙述的方法。也就是说，除非另外明确说明，否则决不旨在将本文阐述的任何方法或方面解释为要求以特定顺序执行其步骤。因此，在方法权利要求没有在权利要求或描述中具体陈述这些步骤将限于特定顺序的情况下，在任何方面都不旨在推断顺序。这适用于任何可能的用于解释的非表达基础，包括关于步骤或操作流程的安排的逻辑问题，从语法组织或标点符号衍生的明确含义，或说明书中描述的方面的数量或类型。
本文引用的所有参考文献，包括专利申请和出版物，均通过引用以其整体并入本文。仅提供本文讨论的这些出版物在本申请的提交日期之前的披露。本文不应被解释为承认本发明无权凭借先前的本发明而早于此类出版物。此外，本文提供的出版日期可能与实际出版日期不同，这可能需要独立确认。
虽然本发明的方面可以在具体的法定类别(例如***法定类别)中描述和要求保护，但这仅是出于方便的目的，并且本领域技术人员将理解可以在任何法定类别中描述和要求保护本发明的每个方面。
还应当理解，本文使用的术语仅是出于对具体的方面进行说明的目的，并不旨在进行限制。除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与所披露的组合物和方法所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。将进一步理解，术语(如在常用词典中定义的那些术语)应被解释为具有与其在说明书和相关领域的上下文中一致的含义，并且除非本文明确定义，否则不应被解释为理想化或过于正式的意义。
在描述本发明的各个方面之前，除非另外指示，否则提供以下定义并应当使用以下定义。另外的术语可以在本发明的其他地方定义。
定义
应当理解，本文描述的本发明的方面和实施例包括“包含”‘方面和实施例’、“由‘方面和实施例’组成”和“基本上由‘方面和实施例’组成”。
如本文使用的，“包含”应被解释为指定如提及的所声明的特征、整数、步骤或组件的存在，但不排除一个或多个特征、整数、步骤或组分或其组的存在或添加。此外，术语“通过”、“包含(comprising、comprises、comprised of)”、“包括(including、includes、included)”，“涉及(involving、involves、involved)”和“例如”中的每个以其开放的、非限制性的意义使用，并且可以互换使用。此外，术语“包含”旨在包括术语“基本上由……组成”和“由……组成”涵盖的实施例和方面。类似地，术语“基本上由......组成”旨在包括术语“由……组成”涵盖的实施例。
应当注意，比率、浓度、量和其他数值数据可以在本文中以范围格式表示。将进一步理解，每个范围的端点相对于其他端点都是重要的，并且独立于其他端点。还应当理解，本文披露了许多值，并且除了值本身之外，每个值在本文中也被披露为“约”该特定值。例如，如果披露了值“10”，则也披露了“约10”。在本文中范围可以表达为从“约”一个具体值，和/或至“约”其他具体值。类似地，当通过使用先行词“约”将值表示为近似值时，将理解该特定值形成一个另外的方面。例如，如果披露了值“约10”，则也披露了“10”。
当表达范围时，另外的方面包括从一个特定值和/或至其他特定值。例如，在所声明的范围包括一个或两个限制的情况下，排除那些包括的限制中的一个或两个的范围也包括于本发明中，例如短语‘x至y’包括从‘x’至‘y’的范围，以及大于‘x’且小于‘y’的范围。该范围也可以表示为上限，例如‘约x、y、z或更小’，并且应该被解释为包括‘约x’、‘约y’和‘约z’的特定范围，以及‘小于x’、‘小于y’和‘小于z’的范围。同样，短语‘约x，y，z或更大’应解释为包括‘约x’、‘约y’和‘约z’的特定范围以及‘大于x’、‘大于y’和‘大于z’的范围。此外，短语“约‘x’至‘y’”，其中‘x’和‘y’是数值，包括“约‘x’至约‘y’”。
应当理解，此范围格式出于方便和简洁的目的而被使用，并且因此应当被灵活地解释为不仅包括被明确叙述为范围界限的数值，而且包括该范围内所涵盖的所有单独数值或子范围，就像每个数值和子范围被明确叙述。为了说明，“约0.1％至5％”的数值范围应该被解释为不仅包括明确叙述的值：约0.1％至约5％，还包括在指定范围内的单独的值(例如，约1％、约2％、约3％、和约4％)，以及子范围(例如，约0.5％至约1.1％、约0.5％至约2.4％、约0.5％至约3.2％、和约0.5％至约4.4％，以及其他可能的子范围)。
如本文使用的，术语“约”、“大约”、“在或约”和“基本上”意指所讨论的量或值可以是精确值或提供如在本文权利要求或教导中叙述的等效结果或作用的值。本文对“约”值或参数的引用是指本技术领域的技术人员容易知道的相应值的通常误差范围。也就是说，应当理解，量、大小、配方、参数和其他数量和性质不是也不必是精确的，但可以(根据需要)是大约和/或更大或更小的，这反映公差、转换因子、四舍五入、测量误差等，以及本领域技术人员已知的其他因素，从而获得等效结果或作用。在一些情况下，无法合理确定提供等效结果或作用的值。在这种例子中，通常理解，如本文使用的，“约”和“在或约”意指标称值表示±10％变化，除非另外指示或推断。通常，量、大小、配方、参数或其他数量或特征是“约”、“大约”或“在或约”，无论是否明确地声明为此。应当理解，在定量值之前使用“约”、“大约”或“在或约”时，除非另外特别声明，否则参数还包括特定的定量值本身。也就是说，本文对“约”值或参数的引用包括(并描述)针对该值或参数本身的方面。例如，涉及“约X”的描述包括“X”的描述。
如本文使用的，术语“任选的”或“任选地”意指随后描述的事件或情况可以发生或可以不发生，并且该描述包括所述事件或情况发生的实施例和不发生的实施例。
如本文使用的，“CD73”和“CD-73”可以互换使用，并且是指由包含8个外显子的人基因编码的细胞表面酶，该人基因的细胞遗传学位置为3q13.12，并且碱基对的分子位置为在染色体6(智人注释发布(Homo sapiens Annotation Release)109，GRCh38.p12)上85,449,584-85,495,791。CD73蛋白是一种具有5’-核苷酸酶(利用Zn+2作为辅因子)的酶(EC分类：3.1.3.5)。该蛋白质能够将细胞外核苷酸水解成膜可渗透的核苷，并参与核碱基、核苷、核苷酸和核酸代谢的调节。其与经由GPI锚的主要在质膜上的细胞内位置相关。人CD73蛋白具有两种通过替代性剪接产生的同种型。典型同种型(UniProtKB标识符P21589)包含574个氨基酸并且具有约63kDa的分子量。CD73也被称为外-5’-核苷酸酶和5’-核苷酸酶。CD73基因的突变与关节和动脉的钙化相关，即遗传性动脉和关节多发性钙化综合征。
如本文使用的，“治疗(treatment或treating)”是用于获得有益的或所希望的结果(包括临床结果)的方法。出于本发明的目的，有益的或所希望的临床结果包括但不限于以下中的一种或多种：缓解由疾病引起的一种或多种症状、减少疾病的程度、稳定疾病(例如，预防或延迟疾病的恶化)、预防或延迟疾病的传播(例如，转移)、预防或延迟疾病的重现、延迟或减缓疾病的进展，改善疾病状态、提供疾病的缓解(部分或全部)、减少治疗疾病所需的一种或多种其他药物的剂量、延迟疾病的进展、增加或改善生活质量、增加体重增长和/或延长存活。“治疗”还涵盖减少癌症的病理后果(像例如，肿瘤体积)。本文提供的方法考虑了这些治疗方面中的任何一个或多个。
术语“重现”、“复发”或“复发的”是指在临床评估疾病消失后癌症或疾病的恢复。远处转移或局部重现的诊断可视为复发。
术语“难治性”或“抗性”是指对治疗没有应答的癌症或疾病。
术语“辅助疗法”是指在初次疗法后给予的疗法，通常是手术。针对癌症或疾病的辅助疗法可以包括免疫疗法、化学疗法、放射疗法、或激素疗法。
术语“维持疗法”是指预定的再治疗，其用于帮助维持先前治疗的效果。通常给予维持疗法以帮助保持癌症缓解或延长对特定疗法的应答，而不管疾病进展如何。
术语“侵袭性癌症”是指已经扩散到组织层(在其中癌症开始进入正常周围组织)之外的癌症。侵袭性癌症可能是也可能不是转移性的。
术语“非侵袭性癌症”是指非常早期的癌症或未扩散到起源组织之外的癌症。
肿瘤学中的术语“无进展存活”是指治疗期间和治疗之后癌症不生长的时间长度。无进展存活包括患者经历完全应答或部分应答的时间量，以及患者经历稳定疾病的时间量。
肿瘤学中的术语“进展性疾病”可以指自治疗开始以来由于肿块的质量增加或肿瘤扩散肿瘤生长超过20％。
“障碍”是受试者(例如，哺乳动物，如人)中与CD73表达、CD73过表达、和/或异常CD73功能相关的任何临床病症，使得受试者将受益于使用所披露的抗CD73抗体、其变体、突变体和/或片段，和/或本文提供的药物组合物的治疗或预防。例如，患有或需要预防CD73过表达的哺乳动物。这包括慢性和急性障碍或疾病,包括使哺乳动物易患所讨论的障碍的那些病理状况。本文中待治疗的障碍的非限制性实施例包括所披露的癌症(如头颈癌、咽喉癌、结肠直肠癌、肺癌等)或纤维化(包括特发性肺纤维化)。
如本文使用的，“肿瘤”是指无论恶性还是良性的所有赘生性细胞生长和增殖、以及所有癌前期与癌性细胞和组织。
术语“抗体”以最广泛的含义使用，并且具体涵盖例如单一单克隆抗体(包括激动剂、拮抗剂和中和抗体)，具有多表位特异性的抗体组合物，多克隆抗体，单链抗体和抗体片段(参见下文)，只要它们特异性结合天然多肽和/或表现出本发明的生物活性或免疫活性。根据一个实施例，抗体结合靶蛋白的寡聚形式，例如三聚体形式。根据另一个实施例，抗体特异性结合蛋白，该结合可以被本发明的单克隆抗体抑制(例如本发明的保藏抗体等)。短语抗体的“功能片段或类似物”是具有与其所参考的抗体相同的定性生物学活性的化合物。例如，本发明的抗体的功能片段或类似物可以是能够特异性结合CD73的抗体。在一个实施例中，抗体可以诱导对表达CD73的癌细胞的巨噬细胞介导的吞噬作用。
“分离的抗体”是已经从其天然环境的组分中鉴定和分离和/或回收的抗体。其天然环境的污染组分是会干扰抗体的诊断或治疗用途的物质，并且可包括酶、激素和其他蛋白质或非蛋白质溶质。在优选的实施例中，抗体将被纯化至(1)如通过Lowry法所确定的按抗体的重量计高于95％，并且最优选地按重量计高于99％，(2)通过使用旋转杯测序仪，足以获得N末端或内部氨基酸序列的至少15个残基的程度，或(3)在使用考马斯蓝或优选地银染色的还原或非还原条件下，通过SDS-PAGE所确定的均一性。分离的抗体包括重组细胞内的原位抗体，因为抗体的天然环境的至少一种组分将不存在。然而，通常，通过至少一个纯化步骤制备分离的抗体。
基本的4链抗体单元是由两条相同的轻(L)链和两条相同的重(H)链组成的异四聚体糖蛋白(IgM抗体由5个基本的异四聚体单元连同另外的称为J链的多肽组成，并且因此含有10个抗原结合位点，而分泌的IgA抗体可以聚合以形成包含2-5个基本的4链单元与J链的多价组合)。在IgG的情况下，4链单元通常为约150,000道尔顿。每条轻(L)链与重(H)链通过一个共价二硫键连接，而两条H链通过一个或多个二硫键(取决于H链同种型)相互连接。每条H和L链还具有规则间隔的链内二硫桥。每条H链在N末端具有可变结构域(VH)，随后是α和γ链中每一条的三个恒定结构域(CH)，以及μ和ε同种型的四个CH结构域。每条L链在N末端具有可变结构域(VL)，在其另一端具有恒定结构域(CL)。VL与VH对齐，并且CL与重链的第一恒定结构域(CH1)对齐。特定的氨基酸残基被认为在轻链和重链可变结构域之间形成界面。VH和VL的配对一起形成单个抗原结合位点。关于不同类别抗体的结构和特性，参见例如，Basic and Clinical Immunology[基础和临床免疫学],第8版,Daniel P.Stites等人,Appleton&Lange[阿普尔顿和兰格出版社],Norwalk[诺沃克],CT[康涅狄格州],1994,第71页和第6章。
来自任何脊椎动物物种的L链可以基于其恒定结构域的氨基酸序列被指定为两种明显不同的类型之一，称为κ和λ。取决于其重链(CH)的恒定结构域的氨基酸序列，可以将免疫球蛋白指定为不同类别或同种型。存在五类免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG、和IgM，具有分别被命名为α、δ、γ、ε、和μ的重链。基于CH序列和功能中的相对较小差异，γ和α类进一步被分为亚类，例如，人表达以下亚类：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、和IgA2。
术语“可变”是指可变结构域的某些区段在抗体之间的序列上差异很大的事实。V结构域介导抗原结合并定义特定抗体对其特定抗原的特异性。然而，在可变结构域的110个氨基酸跨度上变异性不是均匀分布的。相反，V区由15-30个氨基酸的称为框架区(FR)的相对不变的区段组成，这些区段由被称为“高变区”的较短区域(每个区域长9-12个氨基酸)分隔。天然重链和轻链的可变结构域各自包含主要采用β片层构型的四个FR，其通过三个高变区连接，这三个高变区连接形成连接β片层结构的环，并且在一些情况下形成β-片层结构的一部分。每条链中的高变区由FR维持密切接近地在一起，并且在高变区来自其他链的情况下，对形成抗体的抗原结合部位作出贡献(参见Sequences of Proteins ofImmunological Interest[免疫学关注的蛋白序列],第5版,Elvin A.Kabat等人,PublicHealth Service[公共卫生署],National Institutes of Health[国立卫生研究院],Bethesda[贝塞斯达],MD[马里兰州],1991)。恒定结构域不直接参与抗体与抗原的结合，但表现出各种效应子功能，例如抗体参与抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。
如本文使用的，术语“CDR”或“互补决定区”旨在意指在重链和轻链多肽的可变区内发现的非连续抗原结合位点。这些特定区已经描述于：Kabat EA.等人,J.Biol.Chem.[生物化学杂志],252(19):6609-6616(1977)；Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest[免疫学关注的蛋白序列],第5版,Elvin A.Kabat等人,Public Health Service[公共卫生署],National Institutes of Health[国立卫生研究院],Bethesda[贝塞斯达],MD[马里兰州],1991；Chothia C.等人,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志],196(4):901-917(1987)；以及MacCallum RM.等人,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志],262(5):732-745(1996)，其中定义包括当彼此比较时氨基酸残基的重叠或子集。然而，应用任一定义来指代抗体或移植的抗体或其变体的CDR旨在落入如本文定义和使用的术语的范围内。涵盖如上述每篇参考文献定义的CDR的氨基酸残基列于下表3中作为比较。
表3
Figure BDA0002145498740000151
如本文使用的，术语“单克隆抗体”是指从基本上均一的抗体群体中获得的抗体，即包含群体的个体的抗体是相同的，除了可以少量存在的可能天然存在的突变。单克隆抗体是高度特异性的，其针对单个抗原性位点。此外，与多克隆抗体制剂(其包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体)不同，每种单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。除了其特异性之外，单克隆抗体的优点还在于它们可以不被其他抗体污染地合成。修饰语“单克隆”不应解释为需要通过任何特定方法产生抗体。例如，可用于本发明的单克隆抗体可以通过首次描述于Kohler G.等人Nature[自然],256(5517):495-497(1975)的杂交瘤方法进行制备，或可以在细菌、真核动物或植物细胞中使用重组DNA方法进行制备(参见例如，美国专利号4,816,567)。还可以使用Clackson T.等人,Nature[自然],352(6336):624-628(1991)，MarksJD.等人,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志],222(3):581-597(1991)，以及例如下文实施例中描述的技术从噬菌体抗体文库中分离“单克隆抗体”。
本文的单克隆抗体包括“嵌合”抗体，其中重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而这个或这些链的剩余部分与衍生自另一物种或属于另一抗体类或亚类的抗体、以及此类抗体的片段中的相应序列相同或同源，只要它们表现出本发明的生物活性即可(参见美国专利号4,816,567；和Morrison SL.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]81(21):6851-6855(1984))。本文的目的嵌合抗体包括“灵长类化”抗体，其包含衍生自非人灵长类(例如，旧世界猴、猿等)的可变结构域抗原结合序列，和人恒定区序列。
“完整”抗体是包含抗原结合位点以及CL和至少重链恒定结构域CH1、CH2和CH3的抗体。恒定结构域可以是天然序列恒定结构域(例如人天然序列恒定结构域)或其氨基酸序列变体。优选地，完整抗体具有一种或多种效应子功能。
“抗体片段”包含完整抗体的一部分，优选完整抗体的抗原结合区或可变区。抗体片段的实施例包括Fab、Fab'、F(ab')2、和Fv片段；双抗体；线性抗体(参见美国专利号5,641,870，实施例2；Zapata G.等人,Protein Eng.[蛋白质工程化],8(10):1057-1062(1995))；单链抗体分子；和由抗体片段形成的多特异性抗体。表达“线性抗体”通常是指Zapata G.等人,Protein Eng.[蛋白质工程化]8(10):1057-1062(1995)中描述的抗体。简而言之，这些抗体包含一对串联Fd区段(VH-CH1-VH-CH1)，这些区段与互补的轻链多肽一起形成一对抗原结合区。线性抗体可以是双特异性的或单特异性的。
木瓜蛋白酶对抗体的消化产生了两个相同的抗原结合片段(称为“Fab”片段)和残留的“Fc”片段(此名称反映了易于结晶的能力)。Fab片段由整个L链连同H链的可变区结构域(VH)以及一条重链(CH1)的第一恒定结构域组成。每个Fab片段就抗原结合而言是单价的，即它具有单个抗原结合位点。胃蛋白酶对抗体的处理产生了单个大的F(ab’)2片段，其大致对应于具有二价抗原结合活性的两个二硫键连接的Fab片段，并且仍然能够交联抗原。Fab’片段与Fab片段的区别在于在包括来自抗体铰链区的一或多个半胱氨酸的CH1结构域的羧基末端具有另外的残基。Fab'-SH是本文对于Fab'的命名，其中恒定结构域的一个或多个半胱氨酸残基携带游离巯基。F(ab’)2抗体片段最初是作为Fab'片段对(在其之间有铰链半胱氨酸)生产的。抗体片段的其他化学偶联也是已知的。
Fc片段包含通过二硫键维持在一起的两条H链的羧基末端部分。抗体的效应子功能由Fc区中的序列确定，该区也是在某些类型的细胞上发现的Fc受体(FcR)识别的部分。
“变体Fc区”包含由于如本文定义的至少一个“氨基酸修饰”而不同于天然序列Fc区的氨基酸序列。优选地，与天然序列Fc区或亲本多肽的Fc区相比，变体Fc区具有至少一个氨基酸取代，例如在天然序列Fc区或亲本多肽的Fc区中从约一个至约十个氨基酸取代，并且优选从约一个至约五个氨基酸取代。在一个实施例中，本文变体Fc区将与天然序列Fc区具有至少约80％同源性、至少约85％同源性、至少约90％同源性、至少约95％同源性或至少约99％同源性。根据另一个实施例中，本文变体Fc区将与亲本多肽的Fc区具有至少约80％同源性、至少约85％同源性、至少约90％同源性、至少约95％同源性或至少约99％同源性。
术语“包含Fc区的多肽”是指一种包含Fc区的多肽，如抗体或免疫黏附蛋白(参见本文其他地方的定义)。可以例如在多肽的纯化期间或通过对编码多肽的核酸进行重组工程化来去除Fc区的C末端赖氨酸(根据EU编号***的残基447)。因此，根据本披露的包含具有Fc区的多肽(包括抗体)的组合物可以包含去除所有K447残基的多肽群体、没有去除K447残基的多肽群体、或具有和不具有K447残基的多肽混合物的多肽群体。
抗体“效应子功能”是指可归因于抗体的Fc区(天然序列Fc区或氨基酸序列变体Fc区)的那些生物学活性，并且随抗体同种型而变化。抗体效应子功能的实施例包括：C1q结合和补体依赖的细胞毒性；Fc受体结合；抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体的下调；和B细胞活化。“天然序列Fc区”包含与天然存在的Fc区的氨基酸序列相同的氨基酸序列。Fc序列的实施例描述于例如但不限于：Sequences of Proteins ofImmunological Interest[免疫学关注的蛋白序列],第5版,Elvin A.Kabat等人,PublicHealth Service[公共卫生署],National Institutes of Health[国立卫生研究院],Bethesda[贝塞斯达],MD.[马里兰州],1991。
“Fv”是最小抗体片段，其含有完整抗原识别位点和抗原结合位点。该片段由紧密非共价缔合的一个重链可变区结构域和一个轻链可变区结构域的二聚体组成。从这两个结构域的折叠中发出六个高变环(各自来自H链和L链的3个环)，这些高变环贡献氨基酸残基以用于抗原结合并赋予抗体与抗原结合特异性。
然而，甚至单个可变结构域(或仅包含三个对抗原有特异性的CDR的半个Fv)具有识别并结合抗原的能力，虽然通常以比完整结合位点更低的亲和力进行。
“单链Fv”(也缩写为“sFv”或“scFv”)是包含连接成单个多肽链的VH和VL抗体结构域的抗体片段。优选地，sFv多肽进一步包含在VH与VL结构域之间的多肽接头，该多肽接头使得sFv能够形成用于抗原结合的所希望的结构。关于scFv的综述，参见A.Pluckthun,ThePharmacology of Monoclonal Antibodies[单克隆抗体的药理学]第113卷,Rosenburg和Moore编辑,Springer-Verlag[施普林格出版社],纽约,1994,第269-315页中的“Antibodies from Escherichia coli[来自大肠杆菌的抗体]”；或Ahmad ZA.等人,Clin.Dev.Immunol.[临床与发育免疫学],2012:980250(2012)。
术语“双抗体”是指通过构建在VH和VL结构域之间具有短接头(约5-10个残基)的sFv片段(参见前述段落)制备的小抗体片段，这样实现V结构域的链间而不是链内配对，产生二价片段，即具有两个抗原结合位点的片段。双特异性双抗体是两个“交叉”sFv片段的异二聚体，其中两个抗体的VH和VL结构域存在于不同的多肽链上。双抗体更全面地描述于，例如，EP 404,097；WO 93/11161；和Hollinger P.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,[美国国家科学院院刊]90(14):6444-6448(1993)。
“人源化”形式的非人(例如啮齿动物)抗体是嵌合抗体，其含有衍生自非人抗体的最小序列。大多数情况下，人源化抗体是人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体高变区的残基被来自非人物种(例如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类)的具有所希望的抗原特异性、亲和力和容量的高变区(供体抗体)的残基替换。在一些实施例中，人免疫球蛋白的框架区(FR)残基被相应的非人残基替换。
另外，人源化抗体可以包括未在受体抗体或供体抗体中发现的残基。进行这些修饰以进一步改善抗体性能。通常，人源化抗体将包括至少一个、并且典型地两个可变结构域中的基本上全部，其中全部或基本上全部的高变环对应于非人类免疫球蛋白的那些，并且全部或基本上全部的FR是人类免疫球蛋白序列的那些。人源化抗体还将任选地包括免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，典型地是人免疫球蛋白的至少一部分。关于另外的细节，参见Jones PT.等人,Nature[自然],321(6069):522-525(1986)；Riechmann L.等人,Nature[自然],332(6162):323-329(1988)；以及Presta LG,Curr.Opin.Biotechnol.[生物技术当前述评],3(4):394-398(1992)。
将“关于本文鉴定的多肽和抗体序列的氨基酸序列同一性百分比(％)”或“同源性”定义为在对齐序列(考虑任何保守取代作为序列同一性的一部分)后，候选序列中与所比较多肽中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。出于确定氨基酸序列同一性百分比的目的，可以用本领域技术中的多种方式来实现比对，例如使用公众可得的计算机软件，如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以确定用于测量比对的适当参数，包括需要在被比较序列的全长范围实现最大比对的任何算法。然而，出于本文的目的，使用序列比较计算机程序ALIGN-2生成氨基酸序列同一性％值。ALIGN-2序列比较计算机程序由基因泰克公司(Genentech,Inc.)编写，并且源代码已经与美国版权局(U.S.Copyright Office)(华盛顿特区(Washington D.C.)，20559)中的用户文档一起提交，其在美国版权登记号TXU510087下注册。ALIGN-2程序可通过加利福尼亚州南旧金山的基因泰克公司(Genentech,Inc.)公开获得。应编译ALIGN-2程序以在UNIX操作***(优选数字UNIX V4.0D)上使用。所有序列比较参数均由ALIGN-2程序设置并且不变。
术语“Fc受体”或“FcR”用于描述结合抗体Fc区的受体。在一个实施例中，本发明的FcR是结合IgG抗体的FcR(γ受体)，并且包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII亚类的受体，包括这些受体的等位基因变体和可替代地剪接形式。FcγRII受体包括FcγRIIA(“活化受体”)和FcγRIIB(“抑制受体”)，FcγRIIA和FcγRIIB具有类似的氨基酸序列(这些序列主要在其细胞质结构域中不同)。活化受体FcγRIIA在其细胞质结构域中含有基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)。抑制受体FcγRIIB在其细胞质结构域中含有基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)(参见
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M,Annu.Rev.Immunol.[免疫学年度评论],15:203-234(1997))。该术语包括同种异型，如FcγRIIIA同种异型：FcγRIIIA-Phe158、FcγRIIIA-Val158、FcγRIIA-R131和/或FcγRIIA-H131。FcRs综述于Ravetch JV.等人,Annu.Rev.Immunol.[免疫学年度评论],9:457-492(1991)；Capel PJ.等人,Immunomethods[免疫方法],4(1):25-34(1994)；和de Haas M.等人,J.Lab.Clin.Med.[实验与临床医学杂志],126(4):330-341(1995)中。本文的术语“FcR”涵盖其他FcR，包括将来鉴定的FcR。该术语还包括新生儿受体FcRn，其负责将母体IgG转移至胎儿(Guyer RL.等人,J.Immunol.[免疫学杂志],117(2):587-593(1976)和Kim JK.等人,Eur.J.Immunol.[欧洲免疫学杂志],24(10):2429-2434(1994))。
术语“FcRn”是指新生儿Fc受体(FcRn)。FcRn在结构上与主要组织相容性复合体(MHC)类似，并且由与β2-微球蛋白非共价结合的α链组成。新生儿Fc受体FcRn的多种功能综述于Ghetie V.等人,Annu.Rev.Immunol.[免疫学年度评论],18:739-766(2000)中。FcRn在从母亲到后代的被动递送免疫球蛋白IgG和调节血清IgG水平中起作用。FcRn可以作为补救受体，以完整形式结合和运输(两者都在细胞内或跨细胞)胞饮化的IgG，并从默认的降解途径中拯救它们。
人IgG Fc区的“CH1结构域”(也称为“H1”的“C1”)“结构域”通常从约氨基酸118延伸至约氨基酸215(EU编号***)。
“铰链区”通常定义为从人IgG1的Glu216延伸至Pro230(Burton DR.,Mol.Immunol.[分子免疫学],22(3):161-206(1985))。其他IgG同种型的铰链区可以通过将第一个和最后一个形成重链间S-S键的半胱氨酸残基置于相同位置而与IgG1序列比对。
Fc区的“下铰链区”通常定义为紧邻铰链区C末端的残基区，即Fc区的残基233至239。在先前的报道中，FcR结合通常归因于IgG Fc区的下铰链区中的氨基酸残基。
人IgG Fc区的“CH2结构域”(也称为“H2”的“C2”)“结构域”通常从约氨基酸231延伸至约氨基酸340。CH2结构域是独特的，因为其不与另一个结构域紧密配对。而是，两个N连接的支链碳水化合物链***完整天然IgG分子的两个CH2结构域之间。据推测，碳水化合物可以提供结构域-结构域配对的替代物并有助于稳定CH2结构域(Burton DR.,Mol.Immunol.[分子免疫学],22(3):161-206(1985))。
“CH3结构域”(也称为“C2”或“H3”结构域)包含Fc区中靠CH2结构域C末端的残基区域(即从约氨基酸残基341至抗体序列的C末端(典型地在IgG的氨基酸残基446或447处))。
“功能Fc区”具有天然序列Fc区的“效应子功能”。示例性“效应子功能”包括C1q结合；补体依赖的细胞毒性；Fc受体结合；抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如B细胞受体；BCR)的下调等。此类效应子功能通常需要Fc区与结合结构域(例如抗体可变结构域)组合，并且可以使用例如本文披露的各种测定法进行评估。
“C1q”是包含免疫球蛋白Fc区的结合位点的多肽。C1q与两种丝氨酸蛋白酶C1r和C1s一起形成复合物C1(补体依赖的细胞毒性(CDC)途径的第一组分)。人C1q可以从例如加利福尼亚州(CA)圣地亚哥(San Diego)的基代尔公司(Quidel)商业购买。
术语“结合结构域”是指与另一分子结合的多肽的区域。在FcR的情况下，结合结构域可以包含其负责结合Fc区的多肽链部分(例如，其α链)。一个有用的结合结构域是FcRα链的细胞外结构域。
具有变体IgG Fc(该变体具有“改变的”FcR结合亲和力或ADCC活性)的抗体是与亲本多肽或包含天然序列Fc区的多肽相比具有增强或减弱的FcR结合活性(例如，FcγR或FcRn)和/或ADCC活性的抗体。针对FcR“表现出增加的结合”的变体Fc结合至少一个比亲本多肽或天然序列IgG Fc具有更高的亲和力(例如，更低的表观Kd或IC50值)的FcR。根据一些实施例，与亲本多肽相比，结合的改善为约3倍，优选地约5倍、10倍、25倍、50倍、60倍、100倍、150倍、200倍、高达500倍、或约25％至1000％的结合的改善。针对FcR“表现出减少的结合”的多肽变体结合至少一个比亲本多肽具有更低的亲和力(例如，更高的表观Kd或更高的IC50值)的FcR。与亲本多肽相比结合的减少可以为约40％或更多的结合减少。
“抗体依赖的细胞介导的细胞毒性”或“ADCC”是指一种细胞毒性形式，其中分泌的Ig与某些细胞毒性细胞(例如自然杀伤(NK)细胞、中性粒细胞和巨噬细胞)上存在的Fc受体(FcR)结合使得这些细胞毒性效应细胞特异性结合携带抗原的靶细胞，并随后用细胞毒素杀伤该靶细胞。抗体“武装”细胞毒性细胞并且对于这种杀伤是绝对必需的。用于介导ADCC的原代细胞NK细胞仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。造血细胞上的FcR表达总结于Ravetch JV.等人,Annu.Rev.Immunol.[免疫学年度评论]9:457-492(1991)的第464页的表3中。为了评估目的分子的ADCC活性，可以进行体外ADCC测定(如美国专利号5,500,362或5,821,337或下文实施例中描述的)。用于此类测定的有用的效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和自然杀伤(NK)细胞。可替代地或另外地，可以在体内评估目的分子的ADCC活性，例如在动物模型中，如Clynes R.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,[美国国家科学院院刊]95(2):652-656(1998)中披露的。
包含变体Fc区(“表现出增加的ADCC”或在人效应细胞的存在下比具有野生型IgGFc的多肽或亲本多肽更有效地介导抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC))的多肽是当在测定中具有变体Fc区的多肽和具有野生型Fc区的多肽(或亲本多肽)的量基本上相同时，在体外或体内基本上更有效地介导ADCC的多肽。通常，使用本领域已知的任何体外ADCC测定鉴定此类变体，如用于确定ADCC活性的测定或方法(例如在动物模型中等)。在一个实施例中，优选的变体是比野生型Fc(或亲本多肽)从约5倍至约100倍(例如从约25至约50倍)更有效地介导ADCC。
“补体依赖的细胞毒性”或“CDC”是指在补体存在下靶细胞的裂解。经典补体途径的活化由补体***的第一组分(C1q)与(合适的亚类的)抗体(该抗体与其同源抗原结合)的结合而引发。为了评估补体活化，可以进行CDC测定(例如，如Gazzano-Santoro H.等人,J.Immunol.Methods[免疫学方法杂志],202(2):163-171(1997)中描述的)。具有改变的Fc区氨基酸序列、和增加的或减少的C1q结合能力的多肽变体描述于美国专利号6,194,551B1和WO 99/51642。这些专利公开物的内容通过引用明确地并入本文(还参见Idusogie EE.等人,J.Immunol.[免疫学杂志],164(8):4178-4184(2000))。
如本文披露的抗CD73抗体(或其片段)或组合物的“有效量”是足以实现特定声明的目的的量。“有效量”可以凭经验和通过与所声明的目的相关的已知方法确定。术语“治疗有效量”是指如本文披露的抗CD73抗体(或变体或其抗原结合片段)或组合物在哺乳动物(亦称患者)中有效“治疗”疾病或障碍的量。在癌症的情况下，如本文披露的抗CD73抗体(或变体或其抗原结合片段)或组合物的治疗有效量能减少癌细胞的数量；减小肿瘤大小或重量；抑制(即，在一定程度上减慢并且优选地停止)癌细胞浸润到外周器官中；抑制(即，在一定程度上减慢并且优选地停止)肿瘤转移；在一定程度上抑制肿瘤生长；和/或在一定程度上缓解与癌症相关的一种或多种症状。在一定程度上，如本文披露的抗CD73抗体(或变体或其抗原结合片段)或组合物可以防止现有癌细胞生长和/或杀死现有癌细胞，该抗体(或其变体或抗原结合片段)或组合物可以是细胞抑制性的和/或细胞毒性的。在一个实施例中，治疗有效量是生长抑制量。在另一个实施例中，治疗有效量是延长患者存活的量。在另一个实施例中，治疗有效量是改善患者无进展存活的量。
本发明的抗CD73抗体(或变体或其抗原结合片段)或如本文披露的组合物的“生长抑制量”是能够在体外或体内抑制细胞(尤其是肿瘤，例如癌细胞)生长的量。出于抑制赘生性细胞生长的目的的本披露的多肽、抗体、拮抗剂或组合物的“生长抑制量”可以凭经验和通过已知的方法或通过本文提供的实施例确定。
本发明的抗CD73抗体(或变体或其抗原结合片段)或组合物的“细胞毒性量”是能够在体外或体内破坏细胞(尤其是肿瘤，例如癌细胞)的量。出于抑制赘生性细胞生长的目的的本发明的抗CD73抗体(或变体或其抗原结合片段)或组合物的“细胞毒性量”可以凭经验和通过本领域已知的方法确定。
本发明的抗CD73抗体(或变体或其抗原结合片段)或组合物的“生长抑制量”是能够在体外或体内抑制细胞(尤其是肿瘤，例如癌细胞)生长的量。出于抑制赘生性细胞生长的目的的本披露的抗CD73抗体(或变体或其抗原结合片段)或组合物的“生长抑制量”可以凭经验和通过已知的方法或通过本文提供的实施例确定。
如本文使用的，“药学上可接受的”或“药理学上相容的”是指不具有生物学或其他方面不希望的材料，例如，该材料可以掺入给予患者的药物组合物中，而不会与包含该材料的该组合物的任何其他组分以有害的方式引起任何显著的不希望的生物学作用或相互作用。药学上可接受的载体或赋形剂优选满足毒理学和制造测试的所需标准和/或包含在由美国食品和药物管理局(U.S.Food and Drug administration)编制的非活性成分指南中。
术语“检测”旨在包括确定物质的存在或不存在，或量化物质(如CD73)的量。因此，该术语是指本发明的材料、组合物和方法用于定性和定量确定的用途。通常，用于检测的特定技术对于本发明的实践并不重要。
例如，根据本发明的“检测”可以包括：观察CD73基因产物、mRNA分子、或CD73多肽的存在或不存在；CD73多肽水平或与靶标结合的量的变化；CD73多肽的生物学功能/活性的变化。在一些实施例中，“检测”可以包括检测野生型CD73水平(例如，mRNA或多肽水平)。检测可以包括与对照相比量化在10％和90％之间的任何值，或在30％和60％之间或100％以上的任何值的变化(增加或减少)。检测可以包括量化在2倍至10倍之间的任何值(包括端值)或更多(例如100倍)的变化。
当在本文中使用时，术语“标记”是指可直接或间接与抗体缀合的可检测的化合物或组合物。标记本身可以是可检测的(例如，放射性同位素标记或荧光标记)，或者在酶标记的情况下可以催化可检测的底物化合物或组合物的化学改变。抗CD73抗体和亲和变体/突变体
本发明涉及结合如本文披露的CD73受体的抗体。所披露的抗CD73抗体、及它们的亲和变体和/或突变体、或其抗原结合片段可以用于各种治疗性和诊断性方法。抗CD73抗体是以具有足够的亲和力和特异性与CD73结合的抗体。在一些实施例中，所披露的抗CD73抗体(或其变体或突变体或抗原结合片段)可以在靶向和干扰与CD73的表达相关的疾病或病症中用作治疗剂。在各个方面，所披露的抗CD73抗体(或变体/突变体或其抗原结合片段)显示与其他蛋白质的最小结合。在一些实施例中，优选所披露的抗CD73抗体(或变体/突变体或其抗原结合片段)是人或重组人源化抗CD73单克隆抗体。
不希望受特定理论的束缚，据信所披露的抗CD73抗体、及它们的亲和变体和/或突变体、或其抗原结合片段可以增加表达CD73的细胞中CD73的内化，从而导致减少在所披露的抗CD73抗体、及它们的亲和变体和/或突变体、或其抗原结合片段结合的细胞上的质膜上CD73蛋白的量。因此，质膜上CD73蛋白量的减少与和CD73相关的5’-核苷酸酶活性的降低是相关的。在一些方面，再次不希望受特定理论的束缚，据信由于5’-核苷酸酶活性降低，与CD73相关的5'-核苷酸酶活性的降低(经由增加的内化)可以经由肿瘤位点处增强的免疫细胞功能来减少肿瘤细胞增殖。
如本文披露的，所披露的抗CD73抗体、及它们的亲和变体和/或突变体或抗原结合片段被认为在与CD73表达相关的其他临床病症(例如纤维化，包括特发性肺纤维化)中具有有益作用。不希望受特定理论的束缚，据信在其他此类临床病症中，由于表达CD73的适当细胞的CD73蛋白减少(和相应的，5’-核苷酸酶活性降低)，所披露的抗CD73抗体及它们的亲和变体和/或突变体或抗原结合片段可以对患者(例如纤维化(包括特发性肺纤维化))具有积极的临床益处。
根据某些实施例中，抗CD73抗体包含本文披露的抗体中的任一个的CDR、可变重链区、和/或可变轻链区。
本发明提供了抗CD73抗体、它们的亲和变体/突变体、和/或其抗原结合片段。在某些实施例中，本发明的特定抗CD73抗体、它的一种或多种亲和变体/一种或多种突变体，和/或其一种或多种抗原结合片段包含轻链(LC)可变结构域序列(包含如上表1中列出的特异性CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列)和重链(HC)可变结构域序列(包含如上表2中列出的特异性CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列)。本发明的每个特定抗CD73抗体、它的一种或多种亲和变体/一种或多种突变体、和/或其一种或多种抗原结合片段的每条轻链和重链的核酸和它的氨基酸序列也在下文序列表中提供。本发明提供了重链和轻链可变结构域，并且本文提到的CDR以所有可能的成对方式组合，以生成大量抗CD73抗体、及它们的一种或多种亲和变体/一种或多种突变体、和/或其一种或多种抗原结合片段。
在某些实施例中，一个或多个氨基酸取代是一个或多个保守氨基酸取代。在某些实施例中，氨基酸取代基本上不降低抗体与抗原结合的能力。例如，可以进行基本上不降低所披露的抗体与靶CD73的结合亲和力的保守的改变(例如，如本文提供的保守取代)。可以使用下文实施例中描述的方法来评估抗CD73抗体变体的结合亲和力。
保守取代示于“保守取代”的标题下表4中。“示例性取代”的标题下的表4提供了更实质的变化，并且如下文参考氨基酸侧链类别进一步描述的。氨基酸取代可以引入目的抗体中，并针对所希望的活性(例如保留/改善的CD73结合、降低的免疫原性、或改善的ADCC或CDC)筛选产物。
表4：保守取代
Figure BDA0002145498740000241
Figure BDA0002145498740000251
非保守取代将需要将这些类别中的一个的成员交换为另一个类别。示例性取代变体是亲和力成熟的抗体，该抗体可以方便地生成，例如使用基于噬菌体展示的亲和力成熟技术(例如本文披露的那些)。简而言之，对一个或多个CDR残基进行突变，并且将变体抗体在噬菌体上展示并针对特定生物学活性(例如结合亲和力)进行筛选。可以在HVR中进行改变(例如，取代)，例如以改善抗体亲和力。此类改变可以在HVR“热点”(即由在体细胞成熟过程期间以高频率经历突变的密码子编码的残基)中进行(参见例如，Chowdhury,MethodsMol.Biol.[分子生物学方法]207:179-196(2008))和/或在SDR(a-CDR)中进行，测试所得变体VH或VL的结合亲和力。通过构建二级文库和从二级文库重选进行的亲和力成熟已经描述于例如Hoogenboom HR,Methods in Mol.Biol.[分子生物学方法]178:1-37(2002)；Antibody Phage Display[抗体噬菌体展示],Philippa O'Brien,R.A.,Humana Press[哈门那出版社],Totowa[托托瓦],NJ[新泽西州],2001。
在亲和力成熟的一些实施例中，通过多种方法(例如，易错PCR，链改组，或寡核苷酸定向诱变)中的任一种，将多样性引入经选择用于成熟的可变基因中。然后产生二级文库。然后筛选文库以鉴别具有所希望的亲和力的任何抗体变体。引入多样性的另一种方法涉及HVR定向方法，其中使若干HVR残基(例如一次4-6个残基)随机化。可例如使用丙氨酸扫描诱变或模型化来特异性地鉴别抗原结合中涉及的HVR残基。
在某些实施例中，抗CD73抗体、变体或突变体或其抗原结合片段可能在重链或轻链可变区中缺乏N糖基化基序，这可能导致一批抗体内的差异，造成功能、免疫原性或稳定性改变。分析抗体糖基化的方法包括但不限于例如色谱法(例如阳离子交换色谱法(CEX)或液相色谱法)、质谱法(例如电喷雾电离质谱法)和毛细管电泳-十二烷基硫酸钠。此类方法描述于例如，Jung ST.等人,Curr.Opin.Biotechnol.[生物技术当前述评],22(6):858-67(2011)；Cummings RD,Etzler ME.Antibodies and Lectins in Glycan Analysis.[多糖分析中的抗体和凝集素].于:Varki A,Cummings RD,Esko JD等人编辑.Essentials ofGlycobiology[糖生物学的本质].第2版.Cold Spring Harbor[冷泉港](纽约):ColdSpring Harbor Laboratory Press[冷泉港实验室出版社]；2009.第45章；Mulloy B,HartGW,Stanley P.Structural Analysis of Glycans.[聚糖的结构分析]于:Varki A,Cummings RD,Esko JD等人编辑.Essentials of Glycobiology.[糖生物学的本质]第2版.Cold Spring Harbor[冷泉港](纽约):Cold Spring Harbor Laboratory Press[冷泉港实验室出版社]；2009.第47章；Leymarie N.等人,Anal.Chem.[分析化学],84(7):3040-3048(2012)；Fernandez DD.,European Biopharmaceutical Review[欧洲生物制药评论]第106-110页(2005)；以及Raju TS,Methods Mol.Biol.[分子生物学方法],988:169-180(2013)。
在某些实施例中，特定抗CD73抗体突变体的突变体在一个或多个CDR区中的N糖基化位点处包含一个或多个突变，例如序列子N-X-S/T。在N糖基化位点具有一个或多个突变体的抗CD73抗体突变体消除了N糖基化位点但仍保留了等同的功能。
在某些实施例中，抗CD73抗体、变体和/或突变体或其抗原结合片段对CD73的结合亲和力高于对CD73同源物的结合亲和力。通常，抗CD73抗体、和/或变体或其抗原结合片段“特异性结合”CD73(即，具有不超过约1x 10-7M，优选地不超过约1x 10-8和最优选地不超过约1x 10-9M的结合亲和力(Kd)值)，但对非CD73具有比其对CD73的结合亲和力弱至少约50倍、或至少约500倍、或至少约1000倍的结合亲和力。特异性结合CD73的抗CD73抗体可以是如上定义的任何各种类型的抗体，但优选是人源化或人抗体。
在一些实施例中，如通过本领域已知的方法(如ELISA、荧光活化细胞分选(FACS)分析、或放射免疫沉淀(RIA))确定的，抗CD73抗体与非靶蛋白的结合程度小于抗体与CD73的结合的约10％。可以例如通过确定与对照分子(通常是不具有结合活性的具有类似结构的分子)的结合相比的分子的结合来测量特异性结合。例如，可以通过与靶标(例如，过量的未标记靶标)类似的对照分子竞争来确定特异性结合。在这种情况下，如果标记的靶标与探针的结合被过量的未标记的靶标竞争性地抑制，则指示特异性结合。如本文使用的，术语“特异性结合”特定多肽或特定多肽靶上的表位或“与特定多肽或特定多肽靶上的表位特异性结合”或对特定多肽或特定多肽靶上的表位具有“特异性”可以通过以下表现：例如，对靶标具有至少约10-4M、可替代地至少约10-5M、可替代地至少约10-6M、可替代地至少约10-7M、可替代地至少约10-8M、可替代地至少约10-9M、可替代地至少约10-10M、可替代地至少约10-11M、可替代地至少约10-12M、或更大的Kd的分子。在一个实施例中，术语“特异性结合”是指以下结合：
其中分子与特定多肽或特定多肽上的表位结合而基本上不结合任何其他多肽或多肽表位。
抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)是针对肿瘤细胞的治疗性抗体的作用机制。ADCC是细胞介导的免疫防御，免疫***的效应细胞借此主动裂解靶细胞(例如，癌细胞)，这些靶细胞的膜表面抗原被特异性抗体(例如，如本文描述的抗CD73抗体和/或亲和变体)结合。在一些实施例中，抗CD73抗体和/或亲和变体表现出与参照抗CD73单克隆抗体类似的抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)效应子功能，如例如通过实施例中描述的测定所证明的。
例如，在某些实施例中，本文描述的抗CD73抗体和/或其亲和变体或突变体的ADCC效应子功能活性是参照抗CD73抗体的ADCC效应子功能活性的至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、至少约100％、或多于100％(例如，约105％、约106％、约107％、约108％、约109％、约110％、约111％、约112％、约113％、约114％、约115％、约116％、约117％、约118％、约119％、约120％、约121％、约122％、约123％、约124％、约125％、或约130％)，包括这些值之间的任何范围。
在某些实施例中，抗CD73抗体、和/或其亲和变体或其突变体表现出与参照抗CD73抗体类似的对CD73的结合亲和力。在某些实施例中，与CD73结合是通过ELISA证明的，如实施例中描述的。例如，抗CD73和/或其亲和变体或其突变体对CD73的结合亲和力比参照抗CD73抗体对CD73的结合亲和力高约1％、约5％、约10％、约15％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％、约100％、或多于100％(例如，约105％、约106％、约107％、约108％、约109％、约110％、约111％、约112％、约113％、约114％、约115％、约116％、约117％、约118％、约119％、约120％、约121％、约122％、约123％、约124％、约125％、或多于约125％)。
在某些实施例中，抗CD73抗体、和/或其亲和变体或其突变体以在约0.1pM至200pM(0.2nM)之间(例如约0.1pM、约0.25pM、约0.5pM、约0.75pM、约1pM、约5pM、约10pM、约20pM、约30pM、约40pM、约50pM、约60pM、约70pM、约80pM、约90pM、约100pM、约110pM、约120pM、约130pM、约140pM、约150pM、约160pM、约170pM、约180pM、约190pM、或多于约190pM，包括这些值之间的任何范围)的Kd结合人CD73。在某些实施例中，抗CD73抗体、和/或其亲和变体或其突变体与CD73的结合亲和力比参照抗CD73抗体与CD73的结合亲和力高约1％、约5％、约10％、约15％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％、约100％、或多于约100％(例如，约105％、约110％、约120％、或约130％)。在某些实施例中，抗CD73、和/或其变体或其突变体与CD73的结合亲和力比参照抗CD73抗体与CD73的结合亲和力高约1.1倍、约1.2倍、约1.3倍、约1.4倍、约1.5倍、约1.6倍、约1.7倍、约1.8倍、约1.9倍、约2倍、约2.25倍、约2.5倍、约2.75倍、约3倍、约3.25倍、约3.5倍、约3.75倍、约4倍、约4.25倍、约4.5倍、约4.75倍、或多于约4.75倍，包括这些值之间的任何范围。
在某些实施例中，与参照抗CD73抗体相比，本文提供的抗CD73抗体、和/或其变体或其突变体具有延长的体内半衰期。在某些实施例中，本文描述的抗CD73抗体、和/或其变体或其突变体的体内半衰期不短于参照抗CD73抗体的体内半衰期。
在某些实施例中，本文提供的抗CD73抗体、和/或其变体或其突变体表现出与参照抗CD73抗体类似的药代动力学特性。在某些实施例中，本文提供的抗CD73抗体、和/或其变体或其突变表现出参照抗CD73抗体的血清浓度-时间曲线的约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、或高于95％(如约96％、约97％、约98％、约99％、或多于约99％)(包括这些值之间的任何范围)的AUC(曲线下面积)。
在某些实施例中，本发明的抗CD73抗体、和/或其变体或其突变体包含人IgG(例如，人IgG1或人IgG4)的Fc序列。在某些实施例中，Fc序列已经被改变或以其他方式被改变，使得其缺乏抗体依赖的细胞毒性(ADCC)效应子功能，这通常和其与Fc受体(FcR)的结合相关。有许多可以改变效应子功能的Fc序列的变化或突变的实施例。例如，WO00/42072，以及Shields等人J Biol.Chem.[生物化学杂志]9(2):6591-6604(2001)描述了具有改善或减弱的与FcR的结合的抗体变体。这些出版物的内容通过引用明确地并入本文。本披露的抗CD73抗体、和/或其变体或其突变体可以处于以下形式：Fab、Fab'、F(ab')2、单链Fv(scFv)、Fv片段；双抗体和线性抗体。此外，本披露的抗CD73抗体、和/或其变体或其突变体可以是与CD73结合但也与一个或多个其他其突变体结合并抑制其一种或多种功能的多特异性抗体、和/或其变体或突变体。本披露的抗CD73抗体、和/或其变体或其突变体可以与治疗剂(例如，细胞毒性剂、放射性同位素和化学治疗剂)或用于通过成像在患者样品中或体内检测CD73的标记(例如，放射性同位素、荧光染料和酶)进行缀合。本文还提供了其他修饰，包括毒素与抗CD73抗体、和/或其变体或突变体的缀合。
本文还考虑了编码抗CD73抗体、和/或其变体和/或其突变体的核酸分子，和包含编码CDR和/或重链可变结构域和/或轻链可变结构域的核酸分子的表达载体，并且还考虑了包含这些核酸分子的细胞。本发明的抗CD73抗体、和/或其变体或其突变体可以在本文描述的疗法中使用并且可以用于在患者样品(例如，经由FACS、免疫组织化学(IHC)、ELISA测定)或患者中检测CD73蛋白。
单克隆抗体
单克隆抗体可以例如使用杂交瘤方法(如描述于Kohler G.等人,Nature[自然],174(5):2453-2455(2005))制备或可以通过重组DNA方法(美国专利号4,816,567)制作或可以通过下文实施例中本文描述的方法产生。在杂交瘤方法中，典型地用免疫剂使仓鼠、小鼠或其他适当的宿主动物免疫，以引发产生或能够产生与免疫剂特异性结合的抗体的淋巴细胞。可替代地，可使淋巴细胞体外免疫。
免疫剂将典型地包括多肽或目的蛋白的融合蛋白或包含蛋白质的组合物。通常，如果希望是人源细胞，则使用外周血淋巴细胞(“PBL”)，或者如果希望是非人哺乳动物来源，则使用脾细胞或***细胞。然后使用合适的融合剂(例如聚乙二醇)将淋巴细胞与永生化细胞系融合以形成杂交瘤细胞(Monoclonal Antibodies:principles and practice[单克隆抗体：原理和实践],James W.Goding,纽约:Academic Press[学术出版社公司],1986,第59-103页)。永生化细胞系通常是转化的哺乳动物细胞，特别是啮齿动物、牛和人来源的骨髓瘤细胞。通常，采用大鼠或小鼠骨髓瘤细胞系。杂交瘤细胞可以在合适的培养基中培养，该培养基优选地含有一种或多种抑制未融合的永生化细胞的生长或存活的物质。例如，如果亲代细胞缺少酶次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT或HPRT)，杂交瘤的培养基典型地包含次黄嘌呤、氨蝶呤和胸苷(HAT培养基)，这些物质阻止HGPRT缺陷型细胞的生长。
优选的永生化细胞系是有效融合、支持经选择的产生抗体的细胞稳定高水平表达抗体、并且对培养基(如HAT培养基)敏感的那些。更优选的永生化细胞系是鼠骨髓瘤细胞系，其可以获得自：例如Salk Institute[索尔克研究所]Cell Distribution Center[细胞分布中心],San Diego[圣地亚哥],California[加利福尼亚州]和American Type CultureCollection[美国典型培养物保藏中心],Manassas[马纳萨斯],Virginia[弗尼吉亚州]。还描述了人骨髓瘤及小鼠-人杂合骨髓瘤细胞系用于产生人单克隆抗体(Kozbor D.等人,J.Immunol.[免疫学杂志],133(6):3001-3005(1984)；Monoclonal Antibody ProductionTechniques and Applications[单克隆抗体生产技术及应用],Brodeur等人,MarcelDekker,Inc.[马塞尔德克尔公司]:纽约,1987,第51-63页)。
然后可以测定培养杂交瘤细胞的培养基中是否存在针对多肽的单克隆抗体。由杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性可以通过免疫沉淀或通过体外结合测定来确定，例如放射免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA)。此类技术和测定在本领域中是已知的。单克隆抗体的结合亲和力可以例如通过Munson PJ.等人,Anal.Biochem.[分析生物化学],107(1):220-239(1980)的斯卡查德(Scatchard)分析来确定。
在鉴定出所希望的杂交瘤细胞后，可以将克隆通过有限稀释程序进行亚克隆并通过标准方法生长(Monoclonal Antibodies:principles and practice[单克隆抗体：原理和实践],James W.Goding,纽约:Academic Press[学术出版社公司],1986,第59-103页)。用于此目的的合适培养基包括例如杜氏改良培养基(Dulbecco's Modified Eagle'sMedium)和RPMI-1640培养基。可替代地，杂交瘤细胞可以在哺乳动物体内作为腹水生长。
亚克隆分泌的单克隆抗体可以通过常规的免疫球蛋白纯化程序(例如蛋白A-琼脂糖、羟基磷灰石色谱法、凝胶电泳、透析或亲和色谱法)从培养基或腹水液中分离或纯化。
单克隆抗体也可以通过本领域已知的和/或后来开发的重组DNA方法制备。使用常规的程序(例如，通过使用能够与编码鼠类抗体的重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)，可以容易地对编码本文提供的单克隆抗体的DNA进行分离和测序。本文提供的杂交瘤细胞用作这种DNA的优选来源。一旦被分离，DNA被置于表达载体中，然后将这些载体转染到不另外产生免疫球蛋白的宿主细胞(如猿COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞)中，以便在重组宿主细胞中获得单克隆抗体的合成。还可以例如通过以同源鼠类序列取代人重链和轻链恒定域的编码序列(例如，Morrison等人，同上)，或通过将非免疫球蛋白多肽全部或部分的编码序列共价结合至免疫球蛋白编码序列来修饰DNA。这种非免疫球蛋白多肽可以取代本文提供的抗体的恒定结构域，或者可以取代本文提供的抗体的一个抗原结合位点的可变结构域以产生嵌合二价抗体。
在某些实施例中，本发明提供的抗CD73抗体和/或其变体或其突变体由稳定的哺乳动物细胞系表达。在某些实施例中，本发明提供的抗CD73抗体和/或其变体或其突变体以约2.0克/升、约2.5克/升、约3.0克/升、约3.5克/升、约4.0克/升、约4.5克/升、约5.0克/升、约5.5克/升、约6.0克/升、约6.5克/升、约7.0克/升、或多于约7.0克/升(包括这些值之间的任何范围)的滴度从稳定的哺乳动物细胞系表达。在某些实施例中，表达本发明提供的抗CD73抗体和/或其变体或其突变体的稳定的哺乳动物细胞系是CHO细胞系。
在某些实施例中，抗体是单价抗体。用于制备单价抗体的方法是本领域已知的。例如，一种方法涉及免疫球蛋白轻链和修饰的重链的重组表达。通常在Fc区中的任何点截短重链以防止重链交联。可替代地，相关的半胱氨酸残基被另一个氨基酸残基取代或被删除以防止交联。
体外方法也适于制备单价抗体。可以使用但不限于本领域已知的技术来完成消化抗体以产生其片段(特别是Fab片段)。
人抗体和人源化抗体
本发明的抗CD73抗体、和/或其变体或其突变体是人抗体。它们也可以是人源化抗体。非人(例如鼠类)抗体的人源化形式是嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其典型地含有衍生自非人免疫球蛋白的最小序列的片段(例如Fv、Fab、Fab’、F(ab’)2或抗体的其他抗原结合子序列)。人源化抗体包括人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体CDR的残基被来自非人物种(供体抗体)(如具有所希望的特异性、亲和力和能力的小鼠、大鼠或兔)的CDR的残基替代。在一些实施例中，人免疫球蛋白的Fv框架残基可以被相应的非人残基替代。人源化抗体还可以包含既不在受体抗体中也不在导入的CDR或框架序列中发现的残基。通常，人源化抗体可包含至少一个、典型地两个可变结构域中的基本上全部，其中全部或基本上全部的CDR区对应于非人免疫球蛋白的那些区，以及全部或基本上全部的FR区是人免疫球蛋白共有序列的那些区。人源化抗体还优选地包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，典型地是人免疫球蛋白恒定区的至少一部分(例如，Jones PT.等人,Nature[自然],321(6069):522-525(1986)；Riechmann L.等人,Nature[自然],332(6162):323-327(1988)；PrestaLG,Curr.Opin.Biotechnol.[生物技术当前述评],3(4):394-398(1992))。
通常，人源化抗体具有从非人来源引入的一个或多个氨基酸残基。这些非人氨基酸残基通常被称为“输入”残基，它们典型地取自一种“输入”可变结构域。根据一个实施例中，基本上按照Winter和同事的方法，通过用啮齿动物CDR或CDR序列取代人抗体的相应序列来进行人源化(Jones PT.等人,Nature[自然],321(6069):522-525(1986)；RiechmannL.等人,Nature[自然],332(6162):323-327(1988)；Verhoeyen M.等人.,Science[科学],239(4847):1534-1536(1988))。因此，在此所述的“人源化”抗体是指如下的抗体：其中基本上小于一个完整的人可变结构域的区域被来自非人物种的相应序列取代。在实践中，典型地，人源化抗体是如下抗体：其中一些CDR残基和可能的一些FR残基被来自啮齿动物抗体中类似位点的残基取代。
作为人源化的替代，可以生成人抗体。例如，现在有可能产生转基因动物(例如小鼠)，这些转基因动物能够在免疫后在不存在内源性免疫球蛋白产生的情况下产生完整的人抗体库。例如，已经描述了在嵌合和种系突变小鼠中的抗体重链连接区(JH)基因的纯合性缺失导致内源性抗体产生的完全抑制。将人种系免疫球蛋白基因排列转移到此类种系突变小鼠中将导致在抗原激发后人抗体的产生，参见例如Jakobovits A.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊],90(6):2551-2555(1993)；JakobovitsA.等人,Nature[自然],362(6417):255-258(1993)；Bruggemann M.等人,Year Immunol.[免疫学年报],7:33-40(1993)；美国专利号5,545,806、5,569,825、5,591,669；5,545,807；和WO 97/17852。
可替代地，可以通过将人免疫球蛋白基因座引入转基因动物中来制备人抗体，这些转基因动物例如是已经使内源性免疫球蛋白基因部分地或完全地失活的小鼠。在激发后，观察到人抗体的产生，这在所有方面都紧密地类似于在人中所见，包括基因重排、组装及抗体库。该方法在本领域中是已知的，例如参见Marks JD.等人,Biotechnology[生物技术],10(7):779-783(1992)；Lonberg N.等人,Nature[自然],368(6474):856-859(1994)；Morrison SL.,Nature[自然],368(6474):812-813(1994)；Fishwild DM.等人,Nat.Biotechnol.[自然生物技术],14(7):845-851(1996)；Neuberger M.,Nat.Biotechnol.[自然生物技术],14(7):826(1996)；Lonberg N.等人,Int.Rev.Immunol.[国际免疫学综述],13(1):65-93(1995)。
可替代地，噬菌体展示技术(McCafferty J.等人,Nature[自然],348(6301):552-554(1990))可以用于从来自未免疫供体的免疫球蛋白可变(V)结构域基因库体外产生人抗体和抗体片段。根据该技术的一个实施例，将抗体V结构域序列框内克隆到丝状细菌噬菌体的主要或次要外壳蛋白基因中(例如M13或fd)，并在噬菌体颗粒的表面上展示为功能性抗体片段。噬菌体展示能以多种形式进行，例如，如下文实施例部分中描述的或如例如Johnson KS.等人,Curr.Opin.Struct.Biol.[结构生物学观点],3(4):564-571(1993)中综述的。若干个来源的V基因区段可用于噬菌体展示。Clackson T.等人,Nature[自然],352(6336):624-628(1991)从衍生自经免疫的小鼠的脾脏的V基因的小随机组合文库中分离出多种抗噁唑酮抗体。可以构建来自未免疫的人供体的V基因的库，并且可以基本上按照以下描述的技术分离针对多种抗原(包括自身抗原)的抗体：Marks JD.等人,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志],222(3):581-597(1991)，或Griffith AD.等人,EMBO J.[欧洲分子生物学学会杂志]12(2):725-734(1993)。还参见，美国专利号5,565,332和5,573,905。
如上讨论的，还可以使用本领域已知的方法通过体外活化的B细胞生成人抗体。
还可以使用本领域已知的各种技术(包括噬菌体展示文库)产生人抗体。Hoogenboom HR.等人,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志],227(2):381-388(1991)；Marks JD.等人,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志],222(3):581-597(1991)。Cole等人和Boerner等人的技术也可用于制备人单克隆抗体(Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy[单克隆抗体与癌症疗法],Cole等人,Alan Liss,Inc.[艾伦利斯有限公司],1985,第77页，以及Boerner P.等人,J.Immunol.[免疫学杂志],147(1):86-95(1991))。
多特异性抗体
多特异性抗体是对两种或更多种不同抗原具有结合特异性的单克隆抗体，优选人抗体或人源化抗体(例如，对至少两种抗原具有结合特异性的双特异性抗体)。例如，结合特异性中的一种可以是针对a5～1蛋白质，另一种可以是针对任何其他抗原。根据一个优选的实施例，其他抗原是细胞表面蛋白或受体或受体亚基。例如，细胞表面蛋白可以是自然杀伤(NK)细胞受体。因此，根据一个实施例，本发明的双特异性抗体可以结合CD73和例如第二细胞表面受体两者。
用于制备双特异性抗体的合适的方法是本领域已知的。例如，双特异性抗体的重组产生是基于两个免疫球蛋白重链/轻链对的共表达，其中这两条重链具有不同的特异性(Milstein C等人,Nature[自然],305(5934):537-540(1983))。由于免疫球蛋白重链和轻链的随机分类，这些杂交瘤(quadromas)产生十种不同抗体分子的潜在混合物，其中只有一种具有正确的双特异性结构。通常通过亲和色谱法步骤完成正确分子的纯化。本领域披露了类似的方法，例如在WO93/08829中和Traunecker A.等人,EMBO J.[欧洲分子生物学学会杂志],10(12):3655-3659(1991)中。
具有所希望的结合特异性的抗体可变结构域(抗体-抗原结合位点)可以与免疫球蛋白恒定结构域序列融合。融合优选是与包含至少部分铰链、CH2和CH3区的免疫球蛋白重链恒定结构域一起。优选是在这些融合体的至少一种中存在含有轻链结合所需位点的第一重链恒定区(CH1)。将编码免疫球蛋白重链融合体和(如果需要)免疫球蛋白轻链的DNA***单独的表达载体中，并共转染到合适的宿主生物体中。关于生成双特异性抗体的进一步细节，参见例如Suresh MR.等人,Methods Enzymol.[酶学方法],121:210-228(1986)。
还描述了直接从重组细胞培养物制备和分离双特异性抗体片段的各种技术。例如，使用亮氨酸拉链产生双特异性抗体(Kostelny SA.等人,J.Immunol.[免疫学杂志],148(5):1547-1553(1992))。将来自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉链肽通过基因融合与两种不同抗体的Fab'部分连接。将抗体同源二聚体在铰链区还原以形成单体，然后再氧化以形成抗体异源二聚体。该方法也可用于产生抗体同源二聚体。描述于Hollinger P.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊],90(14):6444-6448(1993)的“双抗体”技术提供了制备双特异性抗体片段的替代机制。片段包含通过接头与VL连接的VH，该接头太短而不允许同一链上的两个结构域之间配对。因此，迫使一个片段的VH和VL结构域与另一个片段的互补VL和VH结构域配对，从而形成两个抗原结合位点。还报道了通过使用单链Fv(sFv)二聚体制备双特异性抗体片段的另一种策略。参见Gruber M.等人,J.Immunol.[免疫学杂志],152(11):5368-5374(1994)。
考虑了具有多于两个化合价的抗体。例如，可以制备三特异性抗体(Tutt A.等人,J.Immunol.[免疫学杂志],147(1)60-69(1991))。
异源缀合抗体
异源缀合抗体由两个共价连接的抗体组成。例如，已经提出此类抗体将免疫***细胞靶向不需要的细胞，并用于治疗HIV感染。考虑了可以使用合成蛋白化学中的已知方法(包括涉及交联剂的那些方法)在体外制备这些抗体。例如，可以使用二硫键交换反应或通过形成硫醚键来构建免疫毒素。用于该目的的合适的试剂的实施例包括亚氨基硫醇酯(iminothiolate)和4-巯基丁亚氨酸甲酯(methyl-4-mercaptobutyrimidate)和本领域已知的那些。
效应子功能工程化
可以希望的是在效应子功能方面修饰本文提供的抗体，以增强例如抗体在治疗癌症中的有效性。例如，可以将一个或多个半胱氨酸残基引入Fc区，从而允许在该区域中形成链间二硫键。由此生成的同二聚体抗体可以具有改善的内化能力和/或增加的补体介导的细胞杀伤和抗体依赖的细胞毒性(ADCC)。参见Caron PC.等人,J.Exp.Med.[实验医学杂志],176(4):1191-1195(1992)和Shopes B.,J.Immunol.[免疫学杂志],148(9):2918-2922(1992)。还可以使用本领域已知的异源双功能交联剂制备具有增强的抗肿瘤活性的同源二聚体抗体。可替代地，可以工程化抗体使得具有双Fc区，从而可以具有增强的补体裂解和ADCC能力。参见，例如Stevenson GT.等人,Anticancer Drug Des.[抗癌药物设计],3(4):219-230(1989)。
可以进行Fc区序列中的突变或改变以改善FcR结合(例如，FcγR，FcRn)。根据一个实施例，与天然IgG或亲本抗体相比，本发明的抗体具有选自下组的至少一个改变的效应子功能，该组由以下组成：ADCC、CDC、和改善的FcRn结合。若干个有用的特异性突变的实施例描述于，例如，Shields RL.等人,J.Biol.Chem.[生物化学杂志],276(6):6591-6604(2001)；Presta,LG.等人,Biochem.Soc.Trans.[生物化学学会汇报]30(4):487-490(2002)；以及WO00/42072。
根据一个实施例，Fc受体突变是在选自下组的至少一个位置处的取代，该组由以下组成：Fc区的238、239、246、248、249、252、254、255、256、258、265、267、268、269、270、272、276、278、280、283、285、286、289、290、292、293、294、295、296、298、301、303、305、307、309、312、315、320、322、324、326、327、329、330、331、332、333、334、335、337、338、340、360、373、376、378、382、388、389、398、414、416、419、430、434、435、437、438或439，其中Fc区中残基的编号是根据EU编号***进行的。在一些实施例中，Fc受体突变是D265A取代。在一些实施例中，Fc受体突变是N297 A取代。另外的合适的突变是本领域已知的，例如，如美国专利号7,332,581中列出的。
免疫缀合物
本发明还涉及包含与细胞毒性剂(如化学治疗剂)、毒素(例如，细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素或其片段)、或放射性同位素(即放射缀合物)缀合的抗体、或其变体或突变体的免疫缀合物。
可以使用的酶活性毒素及其片段包括白喉A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、蓖麻毒蛋白A链、相思豆毒蛋白A链、蒴莲根毒蛋白A链、α-帚曲毒蛋白、油桐蛋白、香石竹毒蛋白、美洲商陆(Phytolacaamericana)蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(momordicacharantia)抑制剂、麻疯树毒蛋白、巴豆毒蛋白、肥阜草(sapaonaria officinalis)抑制剂、多花白树毒蛋白、丝林霉素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酿霉素(phenomycin)、依诺霉素(enomycin)和单端抱菌素(tricothecenes)。多种放射性核素可用于产生放射缀合的抗体。实施例包括212Bi、131I、131In、90Y和186Re。有用于生成此类免疫缀合物的示例性化学治疗剂包括本文其他地方描述的那些。
在某些实施例中，本发明的抗CD73抗体、和/或其变体或其突变体与美登素(maytansine)、美登木素生物碱(maytansinoid)或卡里奇霉素(calicheamicin)缀合。在某些实施例中，本发明的抗CD73抗体、和/或其变体或其突变体与美登木素生物碱DM1缀合。
使用多种双功能蛋白偶联剂(例如，N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶二巯基)丙酸酯(SPDP)、亚氨基硫烷(IT)、亚氨酸酯的双功能衍生物(如二甲基己二亚氨酸酯HCl)、活性酯(如辛二酸二琥珀酰亚胺酯)、醛类(如戊二醛)、双叠氮化合物(如双(对叠氮苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(如双-(对重氮苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(如甲代亚苯基2,6-二异氰酸酯)、和双活性氟化合物(如1,5-二氟-2,4-二硝基苯))制备抗体和细胞毒性剂的缀合物。例如，可以如Vitetta ES.等人,Science[科学],238(4830):1098-1104(1987)描述的制备蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14-标记的1-异硫氰酸基苄基-3-甲基二亚乙基三胺-五乙酸(MX-DTPA)是用于将放射性核苷酸与抗体缀合的示例性螯合剂。参见，WO 94/11026。
在某些实施例中，本发明的抗CD73抗体、和/或其变体或其突变体可以与“受体”(如链霉抗生物素蛋白)缀合，用于肿瘤预靶向，其中向患者给予抗体-受体缀合物，随后使用清除剂从循环中除去未结合的缀合物，然后给予与细胞毒性剂(例如，放射性核苷酸)缀合的“配体”(例如，抗生物素蛋白)。
共价修饰
抗CD73抗体、其变体、突变体、和片段的共价修饰包括在本披露的范围内。一种类型的共价修饰包括使多肽的靶氨基酸残基与能够和多肽的选择的侧链或N末端或C末端残基反应的有机衍生剂反应。用双功能剂进行衍生化是有用的，例如，用于将多肽与水不溶性支持基质或表面交联以用于纯化抗体的方法，反之亦然。常用的交联剂包括，例如，1,1-双(重氮乙酰基)-2-苯基乙烷、戊二醛、N-羟基琥珀酰亚胺酯(例如，与4-叠氮水杨酸的酯)、同双功能亚氨酸酯(包括二琥珀酰亚胺酯如3,3'-二硫代双(琥珀酰亚胺基-丙酸酯))、双功能马来酰亚胺(如双-N-马来酰亚胺基-1,8-辛烷)和药剂(如甲基-3-[(对叠氮苯基)-二硫代]丙酰亚氨酸酯)。
其他修饰包括谷氨酰胺酰和天冬酰胺酰残基分别脱酰胺为相应的谷氨酰和天冬氨酰残基，脯氨酸和赖氨酸的羟基化、丝氨酰或苏氨酰残基的羟基磷酸化，赖氨酸、精氨酸和组氨酸侧链的α-氨基基团的甲基化(Proteins:Structure and Molecular Properties[蛋白质：结构和分子特性],Thomas E.Creighton,W.H.Freeman&Co.[W.H.弗里曼公司],San Francisco[旧金山],1983,第79-86页)，N末端胺的乙酰化和任何C末端羧基的酰胺化。
对多肽的另一种类型的共价修饰的包括以本领域已知的方式(例如，在美国专利号4,640,835；4,496,689；4,301,144；4,670,417；4,791,192或4,179,337中列出的)将多肽连接到多种非蛋白质聚合物中的一种，例如聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇或聚氧化烯。
嵌合分子
如果有利于形成包含与另一种异源多肽或氨基酸序列融合的多肽(例如，免疫黏附蛋白或肽体)的嵌合分子，本发明的抗CD73抗体、和/或其变体或其突变体也可以被修饰。
在一个实施例中，这种嵌合分子包含多肽与蛋白质转导结构域的融合体，该蛋白质转导结构域将多肽靶向递送至各种组织，并且更具体为穿过脑血屏障，其中使用例如人免疫缺陷病毒TAT蛋白的蛋白质转导结构域(Schwarze SR.等人,Science[科学]285(5433):1569-1572(1999))。
在某些实施例中，此类嵌合分子包含带有标签多肽的多肽的融合体，该标签多肽提供了抗标签抗体可选择性结合的表位。表位标签通常位于多肽的氨基或羧基末端。此类带表位标签形式的多肽的存在可使用针对该标签多肽的抗体来检测。此外，表位标签的提供使多肽易于使用抗标签抗体或另一类型结合该表位标签的亲和基质通过亲和纯化来纯化。多种标签多肽及其各自抗体是本领域已知的。实施例包括多组氨酸(poly-His)或多组氨酸-甘氨酸(poly-His-gly)标签；流感HA标签多肽及其抗体12CA5(Field J.等人,Mol.Cell.Biol.[分子细胞生物学杂志],8(5):2159-2165(1988))；c-myc标签及其8F9、3C7、6E10、G4、B7和9E10抗体(Evan GI.等人,Mol.Cell.Biol.[分子细胞生物学杂志],5(12):3610-3616(1985))；及单纯疱疹病毒糖蛋白D(gD)标签及其抗体(Paborsky LR.等人,Protein Eng.[蛋白质工程],3(6):547-553(1990))。其他标签多肽包括Flag肽(Hopp TP.等人,Bio/Technology[生物技术],6:1204-1210(1988))；KT3表位肽(Martin GA.等人,Science[科学],255(5041):192-194(1992))；α-微管蛋白表位肽(Skinner MP.等人,J.Biol.Chem.[生物化学杂志],266(9):15163-15166(1991))；和T7基因10蛋白肽标签(Lutz-Freyermuth C.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊],87(16):6393-6397(1990))。
在替代性实施例中，嵌合分子可以包含多肽与免疫球蛋白或免疫球蛋白特定区域的融合体。对于二价形式的嵌合分子(例如“免疫黏附蛋白”)，此类融合体可以是与IgG分子Fc区的融合。本发明的Ig融合体包括大约包含或只包含人的残基94-243、残基33-53或残基33-52以取代Ig分子内的至少一个可变区的多肽。在一个特别优选的实施例中，免疫球蛋白融合体包含IgG1分子的铰链、CH2和CH3，或者铰链、CH1、CH2和CH3区。免疫球蛋白融合体的产生是本领域已知的，参见例如美国专利号5,428,130。
免疫脂质体
还可以将本发明的抗CD73抗体、和/或其变体或其突变体配制为免疫脂质体。通过本领域已知的方法制备含有抗体的脂质体，如以下描述的：Epstein DA.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊],82(11):3688-3692(1985)；和Hwang KJ.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊],77(7):4030-4034(1980)；和美国专利号4,485,045和4,544,545。美国专利号5,013,556披露了具有增强的循环时间的脂质体。
特别有用的脂质体可以通过反相蒸发法用包含磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG衍生的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂质组合物生成。将脂质体挤出通过具有限定孔径的过滤器以产生具有所希望的直径的脂质体。本披露的抗体的Fab’片段可以经由二硫键交换反应与脂质体缀合，如Martin FJ.等人,J.Biol.Chem.[生物化学杂志],257(1):286-288(1982)中描述的。脂质体内还任选地含有抗肿瘤剂、生长抑制剂或化学治疗剂(如多柔比星(doxorubicin))。参见，Gabizon A.等人,J.Natl.Cancer Inst.[国家癌症研究所杂志],81(19):1484-1488(1989)。
使用抗CD73抗体、其变体或突变体进行治疗
可以向受试者(例如，哺乳动物如人)给予所披露的抗CD73抗体、变体、突变体和/或其片段，和/或本文提供的药物组合物，以治疗与CD73表达、CD73过表达或异常CD73功能相关的疾病、障碍、或临床病症。例如，与CD73的表达相关的癌症可以是但不限于：如淋巴瘤、肾癌、肺癌、结肠癌、肝癌、胃癌、原发性渗出性淋巴瘤、骨肉瘤和非霍奇金淋巴瘤。与CD73表达相关的疾病、障碍或临床病症的另外的实施例可以是纤维化，包括特发性肺纤维化。在某些实施例中，本发明提供了本文描述的抗CD73抗体和/或变体/突变体(或其片段)，用于制造用于在受试者中治疗癌症或纤维化的药物。在某些实施例中，待治疗的受试者是哺乳动物(例如，人，非人灵长类、大鼠、小鼠、牛、马、猪、绵羊、山羊、狗、猫等)。在某些实施例中，受试者是人。在某些实施例中，受试者是临床患者、临床试验志愿者、实验动物等。在某些实施例中，怀疑受试者患有癌症或纤维化或有此风险。
在一些实施例中，可以向受试者(例如，哺乳动物如人)给予所披露的抗CD73抗体、变体、突变体和/或其片段，和/或本文提供的药物组合物，以治疗与CD73表达相关的癌症的癌症重现或复发。
在一些实施例中，可以向受试者(例如，哺乳动物如人)给予所披露的抗CD73抗体、变体、突变体和/或其片段，和/或本文提供的药物组合物，以治疗与CD73表达相关的难治性或抗性癌症。
在一些实施例中，可以向受试者(例如，哺乳动物如人)给予所披露的抗CD73抗体、变体、突变体和/或其片段，和/或本文提供的药物组合物，以提供用于与CD73表达相关的癌症的辅助疗法。
在一些实施例中，可以向受试者(例如，哺乳动物如人)给予所披露的抗CD73抗体、变体、突变体和/或其片段，和/或本文提供的药物组合物，以提供用于与CD73表达相关的癌症的维持疗法。
在一些实施例中，可以向受试者(例如，哺乳动物如人)给予所披露的抗CD73抗体、变体、突变体和/或其片段，和/或本文提供的药物组合物，以治疗与CD73表达相关的侵袭性癌症。
在一些实施例中，可以向受试者(例如，哺乳动物如人)给予所披露的抗CD73抗体、变体、突变体和/或其片段，和/或本文提供的药物组合物，以治疗与CD73表达相关的非侵袭性癌症。
在一些实施例中，可以向受试者(例如，哺乳动物如人)给予所披露的抗CD73抗体、变体、突变体和/或其片段，和/或本文提供的药物组合物，以增加诊断为与CD73表达相关的癌症的受试者的无进展存活。
在一些实施例中，可以使用所披露的抗CD73抗体、变体、突变体和/或其片段治疗的与CD73表达相关的癌症可以是多药抗性(MDR)或药物敏感的。癌症的实施例包括但不限于癌、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤、血液学癌症和白血病。在一些实施例中，可以使用所披露的抗CD73抗体、变体、突变体和/或其片段治疗的与CD73表达相关的癌症包括但不限于：结肠直肠癌、卵巢癌、胃癌、胆囊癌、白血病、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、***癌、黑色素瘤、乳腺癌、三阴性乳腺癌(TNBC)、膀胱癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、胰腺癌、胶质瘤、头颈癌、甲状腺癌、B-细胞急性淋巴细胞白血病、髓母细胞瘤、非典型畸胎样/横纹肌样瘤和口腔鳞状细胞癌。在另外的实施例中，可以使用所披露的抗CD73抗体、变体、突变体和/或其片段治疗的与CD73表达相关的癌症包括但不限于：血液(或造血组织)癌、膀胱癌、脑癌、乳腺癌(例如，三阴性乳腺癌，TNBC)、中枢和周围神经***癌、***、结肠癌、头颈癌、肾癌、肝癌、肺癌(包括小细胞肺癌)、食管癌、胆囊癌、胃肠道癌、泌尿生殖道的癌症、淋巴谱系淋巴***造血肿瘤、骨髓谱系造血肿瘤、卵巢癌、胰腺癌、直肠癌、胃癌、***癌、皮肤癌(包括鳞状细胞癌)和甲状腺癌。
在一些实施例中，可以使用所披露的抗CD73抗体、变体、突变体和/或其片段治疗的与CD73表达相关的癌症可以是血液学癌症。在仍另外的方面，血液学癌症选自白血病、骨髓瘤、或淋巴瘤，包括但不限于：急性髓细胞性白血病(AML)、急性淋巴母细胞白血病(ALL)、慢性髓细胞性白血病(CML)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、毛细胞白血病、慢性粒-单核细胞白血病(CMML)、幼年型粒-单核细胞白血病(JMML)、霍奇金淋巴瘤、经典型霍奇金淋巴瘤(cHL)、非霍奇金淋巴瘤原发性纵隔B细胞淋巴瘤(NHL PMBCL)、非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、单发性骨髓瘤、局限性骨髓瘤、髓外骨髓瘤、小淋巴细胞淋巴瘤、B细胞非霍奇金淋巴瘤、和大B细胞淋巴瘤。淋巴谱系的示例性造血肿瘤包括但不限于：白血病、急性淋巴细胞白血病、急性淋巴母细胞白血病、B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、毛细胞淋巴瘤和伯基特淋巴瘤。髓细胞谱系的造血肿瘤包括但不限于：急性和慢性髓细胞性白血病，骨髓增生异常综合征和早幼粒细胞白血病；间充质来源的肿瘤，包括纤维肉瘤和横纹肌肉瘤。
在其他实施例中，可以使用所披露的抗CD73抗体、变体、突变体和/或其片段治疗的与CD73表达相关的癌症可以是脑或中枢神经***的癌症。中枢和周围神经***肿瘤包括但不限于：星形细胞瘤、成神经细胞瘤、胶质瘤和神经鞘瘤。另外的示例性脑癌或中枢神经***癌包括：胶质瘤、髓母细胞瘤、原始神经外胚瘤(PNET)、听神经瘤、胶质瘤、脑膜瘤、垂体腺瘤、神经鞘瘤、CNS淋巴瘤、原始神经外胚瘤、颅咽管瘤、脊索瘤、髓母细胞瘤、中枢成神经细胞瘤、中枢神经细胞瘤、成松果体细胞瘤、松果体母细胞瘤(pineoblastoma)、非典型畸胎样横纹肌样瘤、软骨肉瘤、软骨瘤、脉络丛癌(choroid plexus carcinoma)、脉络丛***状瘤、颅咽管瘤、胚胎发育不良性神经上皮瘤、神经节细胞瘤、生殖细胞瘤、血管母细胞瘤、血管周细胞瘤和转移性脑肿瘤。在又另外的方面，胶质瘤选自室管膜细胞瘤、星形细胞瘤、少突神经胶质瘤、和少突星形细胞瘤。在甚至另外的方面，胶质瘤选自幼年型毛细胞型星形细胞瘤、室管膜下巨细胞星形细胞瘤、神经节神经胶质瘤、室管膜下瘤、多形性黄色瘤形星形细胞瘤(pleomorphic xanthoastrocytoma)、间变性星形细胞瘤、多形性胶质母细胞瘤、脑干胶质瘤、少突神经胶质瘤、室管膜细胞瘤、少突星形细胞瘤、小脑星形细胞瘤、***增生性小儿星形细胞瘤、室管膜下巨细胞星形细胞瘤、弥散型星形细胞瘤、混合型胶质瘤、视神经胶质瘤、大脑胶质瘤病(gliomatosis cerebri)、多灶性神经胶质瘤(multifocalgliomatous tumor)、多中心多形性胶质母细胞瘤(multicentric glioblastomamultiforme tumor)、神经节细胞瘤和神经节神经胶质瘤。
可以使用所披露的抗CD73抗体、变体、突变体和/或其片段治疗的与CD73表达相关的其他示例性肿瘤包括但不限于：鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、***状癌、***状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管肺癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌、绒毛膜癌、***瘤、胚胎癌、肾母细胞瘤、***、睾丸肿瘤、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、骨肉瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜细胞瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤、黑色素瘤、成神经细胞瘤、视网膜母细胞瘤、黑色素瘤、畸胎癌、异皮着色性干皮病(xenoderoma pigmentosum)、角质棘皮瘤(keratoctanthoma)、滤泡性甲状腺癌和卡波西肉瘤。
针对癌症(如黑色素瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)、头颈癌、尿路上皮癌、乳腺癌(例如，三阴性乳腺癌，TNBC)、胃癌、经典型霍奇金淋巴瘤(cHL)、非霍奇金淋巴瘤原发性纵隔B细胞淋巴瘤(NHL PMBCL)、间皮瘤、卵巢癌、肺癌(例如，小-细胞肺癌)、食管癌、鼻咽癌(NPC)、胆道癌、结肠直肠癌、***、甲状腺癌)或任何其他表现出异常CD73功能和这些疾病的临床描述的疾病的许多诊断方法是本领域已知的。此类方法包括但不限于例如免疫组织化学、PCR、荧光原位杂交(FISH)。关于异常CD活性或表达的诊断方法的其他细节在本领域中描述。
所披露的抗CD73抗体和/或变体或突变体(或其片段)和/或本文提供的药物组合物可以通过任何合适的途径给予，包括，例如静脉内、肌肉内、或皮下。在一些实施例中，所披露的抗CD73抗体和/或变体或突变体(或其片段)和/或本文提供的药物组合物可以通过肠胃外给予来进行给予。“肠胃外”是指静脉内、皮下和肌肉内给予。
在一些实施例中，所披露的抗CD73抗体和/或变体或突变体(或其片段)和/或本文提供的药物组合物可以与至少一种药剂(如第二、第三或第四药剂)组合给予。该至少一种药剂可以是已知治疗癌症或纤维化(包括特发性肺纤维化)的任何合适的药剂。
在各种实施例中，所披露的抗CD73抗体和/或变体或突变体(或其片段)和/或本文提供的药物组合物可以与用于癌症治疗的至少一种药剂组合给予。在具体的实施例中，所披露的抗CD73抗体和/或变体或突变体(或其片段)和/或本文提供的药物组合物可以与用于癌症治疗的至少一种药剂(如奥沙利铂、甲酰四氢叶酸、氟尿嘧啶(5-FU)、吉西他滨、紫杉醇(包括蛋白质结合型紫杉醇(例如但不限于纳米颗粒白蛋白结合型紫杉醇，其有时被称为“白蛋白结合型紫杉醇(nab-paclitaxel)”)、或其组合)组合给予。
用于癌症治疗的至少一种药剂的另外的实施例包括但不限于：化学治疗剂、免疫治疗剂、癌症疫苗、抗血管生成剂、细胞因子、激素疗法、基因疗法、生物疗法和放射疗法。例如，已知治疗癌症的至少一种药剂可以是已知的细胞抑制性或细胞毒性或抗癌剂(如抗肿瘤剂)、生长抑制剂、细胞毒性剂或化学治疗剂(如多西他赛(docetaxel)、吉非替尼(gefitinib)、FOLFIRI(伊立替康(irinotecan)、5-氟脲嘧啶、和亚叶酸(leucovorin))、伊立替康、顺铂、卡铂、紫杉醇、贝伐单抗(bevacizumab)(抗VEGF抗体)、FOLFOX-4、输注的氟脲嘧啶、甲酰四氢叶酸(leucovorin)、和奥沙利铂(oxaliplatin)、阿法替尼(afatinib)、吉西他滨(gemcitabine)、卡培他滨(capecitabine)、培美曲塞(pemetrexed)、替万替尼(tivantinib)、依维莫司(everolimus)、CpG-ODN、雷帕霉素(rapamycin)、来那度胺(lenalidomide)、维莫非尼(vemurafenib)、内皮抑制蛋白、拉帕替尼(lapatinib)、PX-866、Imprime PGG和irlotinibm。
在一些实施例中，抗CD73抗体和/或变体/突变体(或其片段)与另外的药剂缀合。例如，该至少一种药剂包括乌拉莫司汀(uracil mustard)、氮芥、环磷酰胺、异环磷酰胺、美法仑(melphalan)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、哌泊溴烷(pipobroman)、曲他胺(triethylenemelamine)、三亚乙基硫代磷酰胺(triethylenethiophosphoramine)、白消安、卡莫司汀、环己亚硝脲(lomustine)、链脲菌素(链脲菌素)、达卡巴嗪(dacarbazine)、替莫唑胺(temozolomide)、噻替派(thiotepa)、六甲蜜胺(altretamine)、甲氨蝶呤(methotrexate)、5-氟脲嘧啶、氟尿苷、阿糖孢苷、6-巯嘌呤、6-硫鸟嘌呤、磷酸氟达拉滨(fludarabine phosphate)、喷司他丁(pentostatin)、硼替佐米(bortezomib)、长春花碱、长春新碱、长春瑞滨、长春地辛、博莱霉素(bleomycin)、放线菌素D、道诺霉素(daunorubicin)、多柔比星、表柔比星(epirubicin)、***、氯法拉滨、克拉屈滨、pemextresed、伊达比星(idarubicin)、紫杉醇、多西他赛、伊沙匹隆(ixabepilone)、光神霉素(mithramycin)、拓扑替康(topotecan)、伊立替康、脱氧助间型霉素(deoxycoformycin)、丝裂霉素-C、L-天冬酰胺酶、干扰素、依托泊苷(etoposide)、替尼泊苷17α-炔雌醇(ethinylestradiol)、己烯雌酚(diethylstilbestrol)、睾酮、强的松、氟***、屈他雄酮丙酸酯(dromostanolone propionate)、睾内酯、醋酸甲地孕酮、三苯氧胺(tamoxifen)、甲基强的松龙、甲基睾酮、***龙、曲安奈德(triamcinolone)、氯烯雌醚(chlorotrianisene)、羟孕酮、氨鲁米特、雌莫司汀(estramustine)、醋酸甲羟孕酮(medroxyprogesteroneacetate)、亮丙瑞林、氟他胺(flutamide)、托瑞米芬、戈舍瑞林、顺铂、卡铂、羟基脲(hydroxyurea)、安吖啶、丙卡巴肼(procarbazine)、米托坦(mitotane)、米托蒽醌(mitoxantrone)、左旋咪唑(levamisole)、诺维本(navelbene)、阿那曲唑(anastrazole)、来曲唑(letrazole)、卡培他滨、雷罗色分(reloxafine)、卓罗沙吩(droloxafine)、六甲嘧胺(hexamethylmelamine)、奥沙利铂
Figure BDA0002145498740000421
易瑞沙(iressa)(吉非替尼(gefinitib)、Zd1839)、
Figure BDA0002145498740000422
(卡培他滨)、
Figure BDA0002145498740000423
(埃罗替尼(erlotinib)、阿扎胞苷(5-氮胞啶；5-AzaC)、替莫唑胺
Figure BDA0002145498740000424
吉西他滨(例如、
Figure BDA0002145498740000425
(吉西他滨HCl))和血管抑制因子(vasostatin)。
在各种实施例中，所披露的抗CD73抗体和/或变体或突变体(或其片段)和/或本文提供的药物组合物可以与至少一种药剂组合给予，该至少一种药剂为例如烷化剂，如噻替派和CYTOXAN(R)环磷酰胺；烷基磺酸盐，如白消安、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶类(aziridines)，如苯并多巴(benzodopa)、卡巴醌(carboquone)、美妥替哌(meturedopa)和脲多巴(uredopa)；乙烯亚胺和甲基蜜胺类(methylamelamines)，包括六甲蜜胺、曲他胺、三亚乙基磷酰胺(trietylenephosphoramide)、三亚乙基硫代磷酰胺(triethiylenethiophosphoramide)和三羟甲蜜胺(trimethylolomelamine)；多聚乙酰类(acetogenins)(尤其是布拉它辛(bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone)；δ-9-四氢***酚(屈***酚，MARINOL(R))；β-拉帕醌；拉帕醇；秋水仙碱；桦木酸；喜树碱(包括合成类似物拓扑替康(HYCAMTIN(R))、CPT-Il(伊立替康，CAMPTOSAR(R))、乙酰基喜树碱(acetylcamptothecin)、莨菪亭(scopolectin)和9-氨基喜树碱(aminocamptothecin))；苔藓虫素；callystatin；CC-1065(包括其阿多来新(adozelesin)、卡折来新(carzelesin)和比折来新(bizelesin)合成类似物)；鬼臼毒素(podophyllotoxin)；鬼臼酸(podophyllinicacid)；替尼泊苷；念珠藻素类(cryptophycins)(具体是念珠藻素1和念珠藻素8)；尾海兔素(dolastatin)；倍癌霉素(duocarmycin)(包括合成类似物，KW-2189和CBl-TML)；五加素(eleutherobin)；水鬼蕉碱(pancratistatin)；匍枝珊瑚醇(sarcodictyin)；海绵抑制素(spongistatin)；氮芥类，如苯丁酸氮芥、萘氮芥、胆怜酸胺(cholophosphamide)、雌莫司汀、异环磷酰胺、氮芥、盐酸氧氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法仑、新恩比兴(novembichin)、苯芥胆甾醇(phenesterine)、泼尼氮芥(prednimustine)、曲磷胺(trofosf amide)、乌拉莫司汀；亚硝基脲类(nitrosureas)，如卡莫司汀、氯脲霉素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、环己亚硝脲、尼莫司汀(nimustine)、和雷莫司汀(ranimnustine)；抗生素类，如烯二炔抗生素(例如，卡里奇霉素，尤其是卡里奇霉素γll和卡里奇霉素ωll(参见，例如，Nicolaou KC.等人,Angew.Chem.Int.Ed.Engl.[应用化学英文国际版],33:183-186(1994))；dynemicin，包括dynemicin A；埃斯佩拉霉素(esperamicin)；以及新制癌菌素发色团(neocarzinostatin chromophore)和相关的色蛋白烯二炔抗生素发色团)、阿克拉霉素类(aclacinomysins)、放线菌素、氨茴霉素(authramycin)、重氮丝氨酸(azaserine)、博莱霉素、放线菌素C、卡柔比星(carabicin)、洋红霉素、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycinis)、放线菌素D、道诺霉素、地托比星(detorubicin)、6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸、多柔比星(包括ADRIAMYCIN(R)、吗啉代-多柔比星、氰基吗啉代-多柔比星、2-吡咯啉代-多柔比星、多柔比星HCl脂质体注射(DOXIL(R))和去氧多柔比星)、表柔比星、依索比星(esorubicin)、伊达比星、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素如丝裂霉素C、霉酚酸、诺加霉素、橄榄霉素类(olivomycins)、培洛霉素(peplomycin)、泊非霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑菌素(streptonigrin)、链脲菌素(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、新制癌菌素(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代谢物，如甲氨蝶呤、吉西他滨(GEMZAR(R))、喃氟啶(tegafur)(UFTORAL(R))、卡培他滨(XELODA(R))、埃博霉素和5-氟脲嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，如二甲叶酸、甲氨蝶呤、蝶罗呤(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物，如氟达拉滨，6-巯嘌呤、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，如环胞苷(ancitabine)、阿扎胞苷、6-氮尿苷(azauridine)、卡莫氟(carmofur)、阿糖孢苷、二脱氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依诺他滨、氟尿苷；雄激素，如卡普睾酮(calusterone)、屈他雄酮丙酸酯、环硫雄醇、美雄烷、睾内酯；抗肾上腺类，如氨鲁米特、米托坦、曲洛司坦；叶酸补充剂，如亚叶酸；醋葡醛内酯(aceglatone)；醒磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；氨基乙酰丙酸；恩尿嘧啶(eniluracil)；安吖啶；bestrabucil；比生群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；地佛法明(defofamine)；地美可辛(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；依洛尼塞(elfornithine)；依利醋铵(elliptinium acetate)；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；洛尼代宁(lonidainine)；美登木素生物碱，如美登素和安丝菌素(ansamitocins)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌；莫匹丹莫(mopidanmol)；二胺硝吖啶(nitraerine)；喷司他丁；苯来美特(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；2-乙基酰肼(ethylhydrazide)；丙卡巴肼；PSK(R)多糖复合物(JHS自然产品公司(JHS NaturalProducts)，尤金市(Eugene)，俄勒冈州(OR))；丙亚胺(razoxane)；根霉素；西佐喃；锗螺胺(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亚胺醌；2,2',2"-三氯三乙胺；单端孢霉烯(trichothecenes)(尤其是T-2毒素、维拉库林(verracurin)A、杆孢菌素(roridin)A和蛇形菌素(anguidine)；乌拉坦(urethane)；长春地辛(ELDISEME(R)、FILDESIN(R))；达卡巴嗪；甘露醇氮芥(mannomustine)；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；加西托新(gacytosine)；***糖苷("Ara-C")；噻替派；紫杉烷类，例如紫杉醇(TAXOL(R))、紫杉醇(ABRAXANE(TM))的白蛋白工程化的纳米颗粒配制品、和多西他赛(doxetaxel)(TAXOTERE(R))；苯丁酸氮芥(chloranbucil)；6-硫鸟嘌呤；巯嘌呤；甲氨蝶呤；铂类似物，如顺铂和卡铂；长春花碱(VELBAN(R))；铂；依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺(ifosf amide)；米托蒽醌；长春新碱(ONCOVIN(R))；奥沙利铂；甲酰四氢叶酸；长春瑞滨(NAVELBINE(R))；能灭瘤(novantrone)；依达曲沙(edatrexate)；道诺霉素(daunomycin)；氨基蝶呤；伊班膦酸钠(ibandronate)；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟胺酸(DMFO)；类视黄醇，如视黄酸；任何上述的药学上可接受的盐、酸或衍生物；以及上述两种或多种的组合，如CHOP(环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和***龙组合疗法的缩写)，以及FOLFOX(奥沙利铂(ELOXATIN(TM))组合5-FU和甲酰四氢叶酸的治疗方案的缩写)。
在各种实施例中，所披露的抗CD73抗体和/或变体或突变体(或其片段)和/或本文提供的药物组合物可以与至少一种药剂组合给予，该至少一种药剂为血管发生抑制剂，例如但不限于：血管抑素(纤溶酶原片段)；抗血管生成抗凝血酶III；Angiozyme；ABT-627；Bay12-9566；氟草胺(Benefin)；贝伐单抗；BMS-275291；软骨衍生的抑制剂(CDI)；CAI；CD59补体片段；CEP-7055；Col 3；康普瑞汀(combretastatin)A-4；内皮抑制蛋白(胶原蛋白XVIII片段)；纤连蛋白片段；gro-β；常山酮(halofuginone)；肝素酶(heparinases)；肝素多聚己糖片段；HMV833；人绒毛膜促性腺素(hCG)；IM-862；干扰素α/β/γ；干扰素诱导蛋白(IP-10)；白介素-12；Kringle 5(纤溶酶原片段)；马立马司他(Marimastat)；金属蛋白酶抑制剂(TIMP)；2-甲氧***(2-methoxyestradiol)；MMI 270(CGS 27023A)；MoAb IMC-1C11；癌立消(Neovastat)；NM-3；panzem；PI-88；胎盘核糖核酸酶抑制剂；纤溶酶原激活物抑制剂；血小板因子-4(PF4)；普马司他(prinomastat)；催乳素16kD片段；增殖蛋白相关的蛋白(PRP)；PTK 787/ZK 222594；类视黄醇；索利司他(solimastat)；角鲨胺；SS 3304；SU 5416；SU6668；SU11248；四氢可的松-S；四硫钼酸盐；沙利度胺；血小板应答蛋白-1(TSP-1)；TNP-470；转化生长因子-β(TGF-b)；血管抑制素(vasculostatin)；血管抑制因子(钙网蛋白片段)；ZD6126；ZD 6474；法尼基转移酶抑制剂(FTI)；和双膦酸盐。
在各种实施例中，所披露的抗CD73抗体和/或变体或突变体(或其片段)和/或本文提供的药物组合物可以与至少一种药剂组合给予，该至少一种药剂选自DNA相互作用剂，如顺铂或多柔比星；拓扑异构酶II抑制剂，如依托泊苷；拓扑异构酶I抑制剂，如CPT-11或拓扑替康；微管蛋白相互作用剂，如天然存在的或合成的紫杉醇、多西他赛或埃博霉素(例如伊沙匹隆)；激素剂，如三苯氧胺；胸苷酸合酶抑制剂(thymidilate synthase inhibitor)，如5-氟脲嘧啶；和抗代谢物，如甲氨蝶呤，其他酪氨酸激酶抑制剂，如易瑞沙和OSI-774；血管发生抑制剂；BTK抑制剂、SYK抑制剂、ITK抑制剂、PI3-激酶抑制剂、FLT3抑制剂、EGF抑制剂；PAK抑制剂、VEGF抑制剂；CDK抑制剂；SRC抑制剂；c-Kit抑制剂；Her1/2抑制剂和针对生长因子受体的单克隆抗体，如爱必妥(erbitux)(EGF)和赫塞汀(herceptin)(Her2)以及其他蛋白激酶调节剂。这些药剂可以与分化剂如ATRA、EZH2抑制剂、DNMT抑制剂、皮质类固醇、IDH1抑制剂、IDH2抑制剂和维生素C组合使用。
在各种实施例中，所披露的抗CD73抗体和/或变体或突变体(或其片段)和/或本文提供的药物组合物可以与在癌细胞中增强DNA损伤杀伤的小分子(包括PARP抑制剂、MDM2抑制剂、NAMPT抑制剂和HSP90抑制剂)组合给予。
在各种实施例中，所披露的抗CD73抗体和/或变体或突变体(或其片段)和/或本文提供的药物组合物可以与一种或多种免疫治疗剂(包括拮抗剂、抗体和免疫调节剂，包括但不限于：HERCEPTINS、RITUXANS、OVAREXTM、PANOREX@、BEC2、IMC-C225、VITAMIN、CAMPATH@I/H、Smart MI95、LYMPHOCIDETM、Smart I D10和ONCOLYMTM、利妥昔单抗、吉妥单抗(gemtuzumab)或曲妥单抗(trastuzumab))组合给予。在其他实施例中，免疫治疗剂可以是靶向PD-1、PD-L1、PD-L2、CTLA4、LAG3、TIGIT、TIM3、CEACAM-1、半乳凝素-1、半乳凝素-9、BLTA、CD69、CD113、GPR56、2B4、CD48、PD1H、LAIR1、TIM-1、TIM-4、VISTA、GARP、CD73、CD39、A2AR、B7-1、B7-2、4-1BBL、CD137、CD28、CD28H、GITR、GITRL、ICOS、ICOS-L、OX40、OX40L、CD70、CD27、CD40、DR3的抗体，或针对此类靶标的抗体的组合。在一些实施例中，免疫治疗剂可以是靶向PD-1、PD-L1、PD-L2、CTLA4、LAG3、TIGIT、TIM3、CEACAM-1、半乳凝素-1、半乳凝素-9、BLTA、CD69、CD113、GPR56、2B4、CD48、PD1H、LAIR1、TIM-1、TIM-4、VISTA、GARP、CD73、CD39、A2AR、或其组合的拮抗剂；靶向B7-1、B7-2、4-1BBL、CD137、CD28、CD28H、GITR、GITRL、ICOS、ICOS-L、OX40、OX40L、CD70、CD27、CD40、DR3、或其组合的激动剂；或前述拮抗剂和激动剂的组合。
在各种实施例中，所披露的抗CD73抗体和/或变体或突变体(或其片段)和/或本文提供的药物组合物可以与靶向免疫细胞或癌细胞上的细胞表面分子(包括但不限于：EGFR、HER2、CD38、间皮素、CD33、CD37、CD19、CD20、CD3、CD123、CD70、BAFFR、CD4、CD8、CD56、CD38)的抗体或此类抗体的组合进行组合给予。在一些实施例中，所披露的抗CD73抗体和/或变体或突变体(或其片段)和/或本文提供的药物组合物可以与靶向免疫细胞或癌细胞上的细胞表面分子(包括但不限于：EGFR、HER2)的抗体或此类抗体的组合进行组合给予。
在各种实施例中，所披露的抗CD73抗体和/或变体或突变体(或其片段)和/或本文提供的药物组合物可以与至少一种化学治疗剂(如烷化剂、抗代谢物、铂酸盐剂、紫杉醇、抗激素剂、拓扑异构酶抑制剂、微管蛋白药剂、信号传导抑制剂(例如，激酶抑制剂)和其他化学治疗剂)组合给予。“化学治疗剂”是在癌症治疗中有用的化学化合物。化学治疗剂的实施例包括：烷化剂，如噻替派和环磷酰胺
Figure BDA0002145498740000464
烷基磺酸盐，如白消安、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶类(aziridines)，如苯并多巴(benzodopa)、卡巴醌(carboquone)、美妥替哌(meturedopa)和脲多巴(uredopa)；乙烯亚胺和甲基蜜胺类(methylamelamines)，包括六甲蜜胺、曲他胺、三亚乙基磷酰胺(trietylenephosphoramide)、三亚乙基硫代磷酰胺(triethiylenethiophosphoramide)和三羟甲蜜胺(trimethylolomelamine)；多聚乙酰类(acetogenins)(尤其是布拉它辛(bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone)；δ-9-四氢***酚(屈***酚，
Figure BDA0002145498740000461
)；β-拉帕醌；拉帕醇；秋水仙碱；桦木酸；喜树碱(包括合成类似物拓扑替康
Figure BDA0002145498740000462
CPT-11(伊立替康、
Figure BDA0002145498740000463
)、乙酰基喜树碱(acetylcamptothecin)、莨菪亭(scopolectin)和9-氨基喜树碱(aminocamptothecin))；苔藓虫素；callystatin；CC-1065(包括其阿多来新(adozelesin)、卡折来新(carzelesin)和比折来新(bizelesin)合成类似物)；鬼臼毒素(podophyllotoxin)；鬼臼酸(podophyllinicacid)；替尼泊苷；念珠藻素类(cryptophycins)(具体是念珠藻素1和念珠藻素8)；尾海兔素(dolastatin)；倍癌霉素(duocarmycin)(包括合成类似物，KW-2189和CB1-TM1)；五加素(eleutherobin)；水鬼蕉碱(pancratistatin)；匍枝珊瑚醇(sarcodictyin)；海绵抑制素(spongistatin)；氮芥类，如苯丁酸氮芥、萘氮芥、胆怜酸胺(cholophosphamide)、雌莫司汀、异环磷酰胺、氮芥、盐酸氧氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法仑、新恩比兴(novembichin)、苯芥胆甾醇(phenesterine)、泼尼氮芥(prednimustine)、曲磷胺(trofosf amide)、乌拉莫司汀；亚硝基脲类(nitrosureas)，如卡莫司汀、氯脲霉素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、环己亚硝脲、尼莫司汀(nimustine)、和雷莫司汀(ranimnustine)；抗生素类，如烯二炔抗生素(例如，卡里奇霉素，尤其是卡里奇霉素γ1I和卡里奇霉素ωI1(参见，例如，Nicolaou KC.等人,Angew.Chem.Int.Ed.Engl.[应用化学英文国际版],33:183-186(1994))；dynemicin，包括dynemicin A；埃斯佩拉霉素(esperamicin)；以及新制癌菌素发色团(neocarzinostatin chromophore)和相关的色蛋白烯二炔抗生素发色团)、阿克拉霉素类(aclacinomysins)、放线菌素、氨茴霉素(authramycin)、重氮丝氨酸(azaserine)、博莱霉素、放线菌素C、卡柔比星(carabicin)、洋红霉素、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycinis)、放线菌素D、道诺霉素、地托比星(detorubicin)、6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸、多柔比星(包括
Figure BDA0002145498740000471
吗啉代-多柔比星、氰基吗啉代-多柔比星、2-吡咯啉代-多柔比星、多柔比星HCl脂质体注射
Figure BDA0002145498740000472
多柔比星脂质体TLC D-99
Figure BDA0002145498740000473
聚乙二醇化脂质体多柔比星
Figure BDA0002145498740000474
和去氧多柔比星)、表柔比星、依索比星(esorubicin)、伊达比星、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素如丝裂霉素C、霉酚酸、诺加霉素、橄榄霉素类(olivomycins)、培洛霉素(peplomycin)、泊非霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑菌素(streptonigrin)、链脲菌素(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、新制癌菌素(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代谢物，如甲氨蝶呤、吉西他滨
Figure BDA0002145498740000475
喃氟啶(tegafur)
Figure BDA0002145498740000476
卡培他滨
Figure BDA0002145498740000477
埃博霉素和5-氟脲嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，如二甲叶酸、甲氨蝶呤、蝶罗呤(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物，如氟达拉滨，6-巯嘌呤、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，如环胞苷(ancitabine)、阿扎胞苷、6-氮尿苷(azauridine)、卡莫氟(carmofur)、阿糖孢苷、二脱氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依诺他滨、氟尿苷；抗肾上腺类，如氨鲁米特、米托坦、曲洛司坦；叶酸补充剂，如亚叶酸；醋葡醛内酯(aceglatone)；醒磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；氨基乙酰丙酸；恩尿嘧啶(eniluracil)；安吖啶；bestrabucil；比生群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；地佛法明(defofamine)；地美可辛(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；依洛尼塞(elfornithine)；依利醋铵(elliptinium acetate)；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；洛尼代宁(lonidainine)；美登木素生物碱，如美登素和安丝菌素(ansamitocins)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌；莫匹丹莫(mopidanmol)；二胺硝吖啶(nitraerine)；喷司他丁；苯来美特(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；2-乙基酰肼(ethylhydrazide)；丙卡巴肼；
Figure BDA0002145498740000478
多糖复合物(JHS自然产品公司(JHS Natural Products)，尤金市(Eugene)，俄勒冈州(Oreg))；丙亚胺(razoxane)；根霉素；西佐喃；锗螺胺(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亚胺醌；2,2′,2″-三氯三乙胺；单端孢霉烯(trichothecenes)(尤其是T-2毒素、维拉库林(verracurin)A、杆孢菌素(roridin)A和蛇形菌素(anguidine)；乌拉坦(urethan)；达卡巴嗪；甘露醇氮芥(mannomustine)；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；加西托新(gacytosine)；***糖苷(“Ara-C”)；噻替派；紫杉烷类，例如紫杉醇
Figure BDA0002145498740000481
紫杉醇(ABRAXANETM)的白蛋白工程化的纳米颗粒配制品、和多西他赛
Figure BDA0002145498740000482
苯丁酸氮芥(chloranbucil)；6-硫鸟嘌呤；巯嘌呤；甲氨蝶呤；铂剂，如顺铂、奥沙利铂和卡铂；预防微管蛋白聚合形成微管的长春花类(vincas)，包括长春花碱
Figure BDA0002145498740000483
长春新碱
Figure BDA0002145498740000484
长春地辛
Figure BDA0002145498740000485
和长春瑞滨
Figure BDA0002145498740000486
依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺；米托蒽醌；甲酰四氢叶酸；能灭瘤(novantrone)；依达曲沙(edatrexate)；道诺霉素(daunomycin)；氨基蝶呤；伊班膦酸钠(ibandronate)；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟胺酸(DMFO)；类视黄醇，如视黄酸，包括蓓萨罗丁(bexarotene)
Figure BDA0002145498740000487
双膦酸盐，如氯膦酸盐(例如，
Figure BDA0002145498740000488
或
Figure BDA0002145498740000489
)、依替膦酸钠(etidronate)
Figure BDA00021454987400004810
NE-58095、唑来膦酸/唑来膦酸盐
Figure BDA00021454987400004811
阿仑膦酸盐
Figure BDA00021454987400004812
帕米膦酸二钠(pamidronate)
Figure BDA00021454987400004813
替鲁膦酸盐(tiludronate)
Figure BDA00021454987400004814
或利塞膦酸盐
Figure BDA00021454987400004815
曲沙他滨(troxacitabine)(1,3-二氧杂环戊烷核苷胞嘧啶类似物)；反义寡核苷酸，特别是那些抑制与异常细胞增殖有关的信号传导途径中基因(例如PKC-α、Raf、H-Ras和表皮生长因子受体(EGF-R))表达的反义寡核苷酸；疫苗，如
Figure BDA00021454987400004816
疫苗和基因疗法疫苗，例如
Figure BDA00021454987400004817
疫苗、
Figure BDA00021454987400004818
疫苗和
Figure BDA00021454987400004819
疫苗；拓扑异构酶1抑制剂(例如，
Figure BDA00021454987400004820
)；rmRH(例如，
Figure BDA00021454987400004821
)；BAY439006(索拉非尼；拜耳公司(Bayer))；SU-11248(辉瑞公司(Pfizer))；哌立福辛(perifosine)、COX-2抑制剂(例如，塞来昔布(celecoxib)或依托考昔(etoricoxib))、蛋白酶体抑制剂(例如，PS341)；硼替佐米
Figure BDA00021454987400004822
CCI-779；替吡法尼(ipifarnib)(R11577)；orafenib、ABT510；Bcl-2抑制剂，如奥利默森钠(blimersen sodium)
Figure BDA00021454987400004823
匹克生琼(pixantrone)；EGFR抑制剂(参见下文定义)；酪氨酸激酶抑制剂(参见下文定义)；以及任何上述的药学上可接受的盐、酸或衍生物；以及上述两种或多种的组合，如CHOP(环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和***龙组合疗法的缩写)，以及FOLFOX(奥沙利铂(ELOXATINTM)组合5-FU和甲酰四氢叶酸的治疗方案的缩写)。
本文中，化学治疗剂包括用于调节、减少、阻断或抑制可促进癌症生长的激素的作用的“抗激素剂”或“内分泌治疗剂”。它们本身可能是激素，包括但不限于：具有混合激动剂/拮抗剂谱的抗***，包括三苯氧胺
Figure BDA00021454987400004824
4-羟基三苯氧胺，托瑞米芬
Figure BDA00021454987400004825
艾多昔芬(idoxifene)、屈洛昔芬(droloxifene)、雷洛昔芬
Figure BDA0002145498740000491
曲沃昔芬、雷洛西芬(keoxifene)和选择性***受体调节剂(SERM)如SERM3；不具有激动剂特性的纯抗***，如氟维司群(fulvestrant)
Figure BDA0002145498740000492
和EM800(此类药剂可以封闭***受体(ER)二聚化、抑制DNA结合、增加ER周转和/或抑制ER水平)；芳香酶抑制剂，包括甾体芳香酶抑制剂如福美斯坦(formestane)和依西美坦
Figure BDA0002145498740000493
和非甾体芳香酶抑制剂如阿那曲唑
Figure BDA0002145498740000494
来曲唑
Figure BDA0002145498740000495
和氨鲁米特，以及其他芳香酶抑制剂包括伏氯唑(vorozole)
Figure BDA0002145498740000496
醋酸甲地孕酮
Figure BDA0002145498740000497
法倔唑(fadrozole)和4(5)-咪唑；促黄体激素释放激素激动剂，包括亮丙瑞林(
Figure BDA0002145498740000498
和
Figure BDA0002145498740000499
)、戈舍瑞林、布舍瑞林(buserelin)和曲普瑞林(tripterelin)；性类固醇，包括孕激素如醋酸甲地孕酮和醋酸甲羟孕酮，***如己烯雌酚和结合***(premarin)，以及雄激素/类视黄醇如氟***，全反视黄酸(和芬维A胺；奥那司酮(onapristone)；抗孕酮；***受体下调剂(ERD)；抗雄激素，如氟他胺、尼鲁米特(nilutamide)和比卡鲁胺(bicalutamide)；以及任何上述的药学上可接受的盐、酸或衍生物；以及上述两种或更多种的组合。
本文中，“紫杉烷”是具有抑制微管解聚功能的化学治疗剂。实施例包括紫杉醇
Figure BDA00021454987400004910
紫杉醇(ABRAXANETM)的白蛋白工程化的纳米颗粒配制品、和多西他赛
Figure BDA00021454987400004911
优选的紫杉烷是紫杉醇。
如本文使用的，术语“EGFR抑制剂”是指与EGFR结合或以其他方式直接与EGFR相互作用并防止或降低其信号传导活性的化合物，并且可替代地称为“EGFR拮抗剂”。此类药剂的实施例包括与EGFR结合的抗体和小分子。与EGFR结合的抗体的实施例包括MAb 579(ATCCCRL HB 8506)、MAb 455(ATCC CRL HB8507)、MAb 225(ATCC CRL 8508)、MAb 528(ATCC CRL8509)(参见，美国专利号4,943,533，Mendelsohn等人)及其变体，如嵌合的225(C225或西妥昔单抗(Cetuximab)；
Figure BDA00021454987400004912
)和重新成形的人225(H225)(参见，WO96/40210，埃克隆***公司(Imclone Systems Inc.))；IMC-11F8(完全人EGFR靶向抗体(埃克隆公司(Imclone)))结合II型突变体EGFR的抗体(美国专利号5,212,290)；如美国专利号5,891,996中描述的，结合EGFR的人源化和嵌合抗体；以及结合EGFR的人抗体，如ABX-EGF或帕尼单抗(参见WO 98/50433，(安根尼克斯公司(Abgenix)/安进公司(Amgen)))；EMD 55900(Stragliotto G.等人,Eur.J.Cancer[欧洲癌症杂志]32A(4):636-640(1996))；针对EGFR且与EGF和TGF-α两者竞争EGFR结合的EMD7200(马妥珠单抗(matuzumab))人源化EGFR抗体(EMD公司/默克公司(Merck))；人EGFR抗体，HuMax-EGFR(GenMab公司)；称作E1.1、E2.4、E2.5、E6.2、E6.4、E2.11、E6.3和E7.6.3并且在美国专利号6,235,883中描述的完全人抗体；MDX-447(梅达雷克斯公司(Medarex Inc))；和mAb 806或人源化mAb 806(Johns TG.等人,J.Biol.Chem.[生物化学杂志]279(29):30375-30384(2004))。抗EGFR抗体可以与细胞毒性剂缀合，由此生成免疫缀合物(参见，例如，EP659,439A2，默克专利有限公司(Merck PatentGmbH))。EGFR拮抗剂包括小分子，例如在以下中描述的化合物：美国专利号：5,616,582、5,457,105、5,475,001、5,654,307、5,679,683、6,084,095、6,265,410、6,455,534、6,521,620、6,596,726、6,713,484、5,770,599、6,140,332、5,866,572、6,399,602、6,344,459、6,602,863、6,391,874、6,344,455、5,760,041、6,002,008和5,747,498，以及以下PCT出版物：WO 98/14451、WO 98/50038、WO 99/09016和WO 99/24037。特定小分子EGFR拮抗剂包括OSI-774(CP-358774、埃罗替尼、
Figure BDA0002145498740000501
基因泰克公司(Genentech)/OSI制药公司(OSIPharmaceuticals))；PD 183805(CI 1033、2-丙烯酰胺，N-[4-[(3-氯-4--氟苯基)氨基]-7-[3-(4-吗啉基)丙氧基]-6-喹唑啉基]-，二盐酸盐，辉瑞有限公司(Pfizer Inc.))；ZD1839，吉非替尼(易瑞沙(IRESSA)J)4-(3′-氯-4′-氟苯胺基)-7-甲氧基-6-(3-吗啉代丙氧基)喹唑啉，阿斯利康公司(AstraZeneca))；ZM 105180((6-氨基-4-(3-甲基苯基-氨基)-喹唑啉，捷利康公司(Zeneca))；BIBX-1382(N8-(3-氯-4-氟-苯基)-N2-(1-甲基-哌啶-4-基)-嘧啶并[5,4-d]嘧啶-2,8-二胺，勃林格殷格翰公司(Boehringer Ingelheim))；PKI-166((R)-4-[4-[(1-苯乙基)氨基]-1H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基]-苯酚)；(R)-6-(4-羟基苯基)-4-[(1-苯乙基)氨基]-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶)；CL-387785(N-[4-[(3-溴苯基)氨基]-6-喹唑啉基]-2-丁炔酰胺)；EKB-569(N-[4-[(3-氯-4-氟苯基)氨基]-3-氰基-7-乙氧基-6-喹啉基]-4-(二甲基氨基)-2-丁酰胺)(惠氏公司(Wyeth))；AG1478(苏根公司(Sugen))；AG1571(SU 5271；苏根公司(Sugen))；双重EGFR/HER2酪氨酸激酶抑制剂，如拉帕替尼(GW 572016或N-[3-氯-4-[(3氟苯基)甲氧基]苯基]6[5[[[2甲磺酰基)乙基]氨基]甲基]-2-呋喃基]-4-氨基喹唑啉；葛兰素史克公司(Glaxo-SmithKline))。
“酪氨酸激酶抑制剂”是抑制酪氨酸激酶如HER受体的酪氨酸激酶活性的分子。此类抑制剂的实施例包括前述段落中提到的EGFR-靶向药物；小分子HER2酪氨酸激酶抑制剂，例如TAK165(可获得自武田药品公司(Takeda))；CP-724,714(ErbB2受体酪氨酸激酶的口服选择性抑制剂(辉瑞公司(Pfizer)和OSI公司)；双重HER抑制剂，如优先结合EGFR但抑制过表达HER2和EGFR两者的细胞的EKB-569(可获得自惠氏公司(Wyeth))；拉帕替尼(GW572016；可获得自葛兰素史克公司(Glaxo-SmithKline))，一种口服HER2和EGFR酪氨酸激酶抑制剂；PKI-166(可获得自诺华公司(Novartis))；泛HER抑制剂，如卡奈替尼(canertinib)(CI-1033；法玛西亚公司(Pharmacia))；Raf-1抑制剂，如抑制Raf-1信号传导的反义试剂ISIS-5132(可获得自ISIS制药公司(ISIS Pharmaceuticals))；非HER靶向TK抑制剂，如甲磺酸伊马替尼(Imatinib mesylate)(格列卫(GLEEVAC)J)，可获得自葛兰素公司(Glaxo)；MAPK细胞外调节激酶I抑制剂CI-1040(可获得自法玛西亚公司(Pharmacia))；喹唑啉类，如PD153035、4-(3-氯苯胺基)喹唑啉；吡啶并嘧啶类；嘧啶并嘧啶类；吡咯并嘧啶类，如CGP59326、CGP 60261和CGP 62706；吡唑并嘧啶类，4-(苯基氨基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶；姜黄素(二阿魏酰甲烷，4,5-双(4-氟苯胺基)邻苯二甲酰亚胺)；含有硝基噻吩部分的酪氨酸磷酸化抑制剂(tyrphostines)；PD-0183805(华纳兰勃特公司(Warner-Lamber))；反义分子(例如，与HER-编码核酸结合的那些反义分子)；喹喔啉类(美国专利号5,804,396)；酪氨酸磷酸化抑制剂(tryphostins)(美国专利号5,804,396)；ZD6474(阿斯利康公司(AstraZeneca))；PTK-787(诺华公司(Novartis)/先灵公司(Schering AG))；泛HER抑制剂，如CI-1033(辉瑞公司(Pfizer))；Affinitac(ISIS 3521；Isis公司/礼来公司(Lilly))；甲磺酸伊马替尼(格列卫(Gleevac)；诺华公司(Novartis))；PKI 166(诺华公司(Novartis))；GW2016(葛兰素史克公司(Glaxo SmithKline))；CI-1033(辉瑞公司(Pfizer))；EKB-569(惠氏公司(Wyeth))；Semaxinib(苏根公司(Sugen))；ZD6474(阿斯利康公司(AstraZeneca))；PTK-787(诺华公司(Novartis)/先灵公司(Schering AG))；INC-1C11(埃克隆公司(Imclone))；或如以下专利出版物中任一个所述：美国专利号5,804,396；WO 99/09016(美国氰胺公司(American Cyanamid))；WO 98/43960(美国氰胺公司(American Cyanamid))；WO 97/38983(华纳兰勃特公司(Warner Lambert))；WO 99/06378(华纳兰勃特公司(Warner Lambert))；WO 99/06396(华纳兰勃特公司(Warner Lambert))；WO 96/30347(辉瑞有限公司(PfizerInc.))；WO 96/33978(捷利康公司(Zeneca))；WO 96/3397(捷利康公司(Zeneca))；和WO96/33980(捷利康公司(Zeneca))。
在各种实施例中，所披露的抗CD73抗体和/或变体或突变体(或其片段)和/或本文提供的药物组合物可以与放线菌素D、卡培他滨、卡铂、顺铂、秋水仙碱、道诺霉素、多西他赛、多柔比星、表柔比星、依托泊苷、5-氟脲嘧啶、吉西他滨、美法仑、甲氨蝶呤、丝裂霉素C、米托蒽醌、紫杉醇、萨力多胺、拓扑替康、长春花碱、和长春新碱组合给予。
在各种实施例中，所披露的抗CD73抗体和/或变体或突变体(或其片段)和/或本文提供的药物组合物可以与一种或多种另外的疗法或临床干预(如放射疗法、手术、化学疗法和/或靶向疗法)组合给予。在某些实施例中，所披露的抗CD73抗体和/或变体(或其片段)和/或本文提供的药物组合物与针对所披露的癌症的放射疗法组合给予。
在一些实施例中，所披露的抗CD73抗体和/或变体或突变体(或其片段)和/或本文提供的药物组合物可以与手术(例如，可以在给予所披露的抗CD73抗体之前进行手术、可以在给予所披露的抗CD73抗体之后进行手术、和/或可以与给予所披露的抗CD73抗体同时进行或几乎同时进行手术)联合给予。
取决于待治疗的适应症和本领域技术人员熟悉的与给药相关的因素，本文提供的抗CD73抗体、变体、突变体或其片段将以有效剂量给予，例如在最小化毒性和副作用的同时有效治疗该适应症的剂量。通常优选使用最大剂量的本披露的药理学药剂(单独或与其他治疗剂组合)，即根据合理的医学判断的最高安全剂量。然而，本领域的普通技术人员将理解，出于医学原因、心理原因或几乎任何其他原因，患者可坚持较低剂量或可耐受剂量。在一些实施例中，有效剂量可以使得所希望的应答是抑制疾病或病症的进展，例如癌症的进展。这可能仅涉及暂时减缓疾病的进展，但更优选地，这涉及永久地停止疾病的进展。这可以通过本领域的普通技术人员已知的针对任何特定疾病的常规诊断方法来监测。对疾病或病症的治疗的所希望的应答也可以是延迟发作或甚至预防疾病或病症的发作。
可以通过细胞培养物或实验动物中的标准药物程序确定所披露的抗CD73抗体和/或变体或突变体(或其片段)和/或本文提供的药物组合物的毒性和治疗功效，例如确定LD50(使50％的群体致死的剂量)和ED50(在50％的患者群体中治疗有效的剂量)。在毒性和治疗效果之间的剂量比率为治疗指数，并且它可以表示为比率LD50/ED50。可以希望表现出大治疗指数的化合物。尽管可以使用表现出毒副作用的所披露的抗CD73抗体和/或变体或突变体(或其片段)和/或本文提供的药物组合物，但是应该小心设计将此类化合物靶向至受影响的组织的部位的递送***，从而将对未感染的细胞的潜在损伤最小化，并且由此减少副作用。
从细胞培养测定和动物研究获得的数据可以用于配制一系列的用于在人中使用的剂量。所披露的抗CD73抗体和/或变体或突变体(或其片段)和/或本文提供的药物组合物的剂量优选地在包括ED50且具有很小毒性或无毒性的循环浓度范围内。剂量可根据所采用的剂型和所使用的给予途径在该范围内变化。对于任何所披露的抗CD73抗体和/或变体或突变体(或其片段)和/或本文提供的药物组合物，最初可以从细胞培养测定来评估治疗有效量。可以在动物模型中配制剂量以达到包括如细胞培养实验中确定的IC50的循环血浆浓度范围。该信息可用于更精确地确定在人中有用的剂量。可以例如通过高效液相色谱法来测量血浆中的水平。
可以通过使用本领域已知的或在Yamanaka K.等人,Microbiol.Immunol.[微生物免疫]45(7):507-514(2001)中描述的各种实验动物模型(例如SCID小鼠模型或具有人肿瘤移植物的裸鼠)确定所披露的抗CD73抗体和/或变体或突变体(或其片段)和/或本文提供的药物组合物的抗癌活性。
在用于人之前，可以在体外测试、然后在体内测试所披露的抗CD73抗体和/或变体或突变体(或其片段)和/或本文提供的药物组合物的所希望的治疗或预防活性。例如，可以用于确定是否指示给予特定治疗方案的体外测定包括体外细胞培养测定，其中患者组织样品在培养中生长、并暴露于方案或以其他方式给予方案，且观察这种方案对该组织样品的作用。
接触的细胞的较低水平的增殖或存活可以指示所披露的抗CD73抗体和/或变体或突变体(或其片段)和/或本文提供的药物组合物可在受试者中有效治疗选择的障碍。可替代地，可以使用肿瘤细胞系或恶性细胞系(而不是从患者培养细胞)来筛选方案。可以使用本领域已知的许多测定来评估这种存活和/或生长；例如，可以通过测量3H-胸苷掺入、通过直接细胞计数、通过检测已知基因如原癌基因或细胞周期标志物的转录活性的变化来测定细胞增殖；可以通过台盼蓝染色来评估细胞活力，同时可以基于形态学等的变化来目测评估分化。
在人中测试之前，可以在合适的动物模型***(括但不限于大鼠、小鼠、鸡、牛、猴、兔等)中测试用于疗法的所披露的抗CD73抗体和/或变体或突变体(或其片段)和/或本文提供的药物组合物。本领域已知并广泛使用的癌症的主要动物模型包括小鼠，如Hann B.等人,Curr.Opin.Cell Biol.[细胞生物学新观点]13(6):778-784(2001)中描述的，其全部内容通过引用并入本文。
此外，本领域技术人员已知的任何测定可用于评估所披露的抗CD73抗体和/或变体或突变体(或其片段)和/或本文提供的药物组合物用于治疗、预防、管理或改善一种或多种与如上所述的疾病或障碍相关的症状的预防和/或治疗效用。
本领域技术人员可以容易地确定用于治疗或预防本文描述的障碍的合适的日剂量。对于所披露的癌症的治疗，典型的剂量可以是例如在0.001μg至1000μg的范围内；然而，低于或高于该示例性范围的剂量在本披露的范围内。日剂量可以是约0.1μg/kg总体重至约100mg/kg总体重(例如，约5μg/kg、约10μg/kg、约100μg/kg、约500μg/kg、约1mg/kg、约50mg/kg，或由前述值中的任两个所定义的范围)，优选地从约0.3μg/kg总体重至约10mg/kg总体重(例如，约0.5μg/kg、约1μg/kg、约50μg/kg、约150μg/kg、约300μg/kg、约750μg/kg、约1.5mg/kg、约5mg/kg，或由前述值中的任两个所定义的范围)，更优选地从约1μg/kg总体重至1mg/kg总体重(例如，约3μg/kg、约15μg/kg、约75μg/kg、约300μg/kg、约900μg/kg，或由前述值中的任两个所定义的范围)，并且甚至更优选地从约0.5mg/kg总体重/天至10mg/kg总体重/天(例如，约2mg/kg、约4mg/kg、约7mg/kg、约9mg/kg，或由前述值中的任两个所定义的范围，包括前述值之间的任何范围)。如上提到的，可以通过定期评估治疗的患者来监测治疗或预防功效。对于经若干天或更长时间的重复给予，取决于病症，重复进行治疗直至发生所希望的疾病症状抑制。然而，其他剂量方案可能是有用的并且在本披露的范围内。所希望的剂量可通过单次推注给予组合物、通过多次推注给予组合物、或通过连续输注给予组合物来递送。
包含抗CD73抗体、变体、突变体或其片段的药物组合物可以每天给予一次、两次、三次或四次。组合物也能以低于每日给予的频率进行给予，例如，每周六次、每周五次、每周四次、每周三次、每周两次、每周一次、每两周一次、每三周一次、每月一次、每两个月一次、每三个月一次或每六个月一次。组合物也可以例如在植入物中以缓释配制品给予，该植入物逐渐释放该组合物以在一段时间内使用，并且允许该组合物以较低频率给予，例如每月一次、每2-6个月一次、每年一次、或甚至单次给予。缓释装置(例如圆粒剂型(pellets)、纳米颗粒、微粒、纳米球、微球等)可以通过注射进行给予。
抗体和/或变体或突变体(或其片段)能以单次日剂量给予，或者总日剂量能以每日两次、三次或四次的分剂量给予。组合物也能以低于每日给予的频率进行给予，例如，每周六次、每周五次、每周四次、每周三次、每周两次、每周一次、每两周一次、每三周一次、每月一次、每两个月一次、每三个月一次或每六个月一次。抗体(或其片段)也可以例如在植入物中以缓释配制品给予，该植入物逐渐释放该组合物以在一段时间内使用，并且允许该组合物以较低频率给予，例如每月一次、每2-6个月一次、每年一次、或甚至单次给予。缓释装置(例如圆粒剂型(pellets)、纳米颗粒、微粒、纳米球、微球等)可以通过注射或手术植入各种位置进行给予。
可以通过例如但不限于肿瘤消退、肿瘤重量或尺寸缩小、进展时间、存活持续时间、无进展存活、总体反应率、应答持续时间、生活质量、蛋白质表达和/或活性来评估癌症治疗。可以采用确定疗法功效的方法，包括例如通过放射成像测量反应。
在一些实施例中，将治疗功效测量为肿瘤生长抑制百分比(％TGI)，使用等式100-(T/C x 100)进行计算，其中T是治疗的肿瘤的平均相对肿瘤体积，并且C是未治疗的肿瘤的平均相对肿瘤体积。在某些实施例中，％TGI是约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、或多于95％。在某些实施例中，抗CD73和/或其变体或突变体的％TGI与参照抗CD73抗体的％TGI相同或比其高例如约1.1倍、约1.2倍、约1.3倍、约1.4倍、约1.5倍、约1.6倍、约1.7倍、约1.8倍、约1.9倍、约2倍、约2.1倍、约2.2倍、约2.3倍、约2.4倍、约2.5倍、约2.6倍、约2.7倍(包括这些值之间的任何范围)，或比参照抗CD73抗体的％TGI高约2.7倍。
药物组合物
可以将本发明的所披露的抗CD73抗体和/或变体或突变体(或其片段)制备成包含合适的载体或赋形剂的药物组合物，使得它们适于给予。通过将具有所希望的纯度的抗体(或其片段)与任选的药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂(Remington'sPharmaceutical Sciences[雷明顿药物科学]第16版,Osol,A.编辑(1980))混合，以冻干的配制品或水溶液的形式获得抗体的合适的药物组合物。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所采用的剂量和浓度下对受体无毒，并且包括缓冲液(如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和蛋氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；六甲基氯化铵；苯扎氯铵、苄索氯铵；苯酚、丁基或苄醇；烷基对羟基苯甲酸酯，如甲基对羟基苯甲酸酯或丙基对羟基苯甲酸酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基的)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸、或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖、或糊精；螯合剂，如EDTA；糖类，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐反离子，如钠；金属络合物(例如锌-蛋白质络合物)；和/或非离子表面活性剂，如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。示例性抗体配制品描述于WO 98/56418中，其通过引用明确地并入本文。适于皮下给予的冻干的药物组合物描述于WO 97/04801中。此类冻干的药物组合物可以用合适的稀释剂重构成高蛋白质浓度，并且重构的配制品可以皮下给予至本文中待治疗的哺乳动物。
在一些实施例中，所披露的药物组合物是适于肠胃外或静脉内给予。在一些实施例中，所披露的适于肠胃外给予的药物组合物可以是与预期受试者的血液等渗的水性和非水性配制品；水性和非水性无菌悬浮液可包括悬浮***，其设计用于将化合物靶向一个或多个器官的血液组分。配制品可以存在于单位剂量或多剂量密封容器(例如安瓿或小瓶)中。临时注射溶液和悬浮液可以由先前描述类型的无菌粉末、颗粒和片剂制备。肠胃外和静脉内配制品可以包括矿物质和其他材料，以使它们与选择的注射或递送***类型相容。
用于肠胃外给予的常用的药学上可接受的载体包括水、合适的油、盐水、右旋糖(葡萄糖)水溶液或相关的糖溶液和二醇如丙二醇或聚乙二醇。用于肠胃外给予的溶液优选地含有活性成分的水溶性盐、合适的稳定剂和(如果必要)缓冲物质，单独或组合的抗氧化剂(如亚硫酸氢钠、亚硫酸钠或抗坏血酸)是合适的稳定剂。柠檬酸盐和EDTA钠也可用作载体。此外，肠胃外溶液可以含有防腐剂，例如苯扎氯铵、甲基对羟基苯甲酸酯或丙基对羟基苯甲酸酯、或氯丁醇。合适的药物载体描述于上文引用的Remington[雷明顿]中。
可注射配制品能以常规形式来制备，或者作为液体溶液或悬浮液；作为适于在注射前溶解或悬浮在液体中的固体形式；或作为乳液。优选地，根据本领域已知的技术，使用合适的药学上可接受的载体和如上所述的其他任选的组分配制无菌可注射悬浮液。
肠胃外给予能以许多方式进行，但优选使用注射器、导管或类似装置来实现本文描述的配制品的肠胃外给予。可以全身注射配制品，使得活性剂传播基本上遍布整个血流。
此外，还可以将配制品局部注射到靶位点，例如，注射到身体的特定部分以治疗癌症或纤维化是希望的。经由注射的局部给予的优点是其限制或避免整个身体暴露于一种或多种活性剂(例如，抑制剂和/或其他治疗剂)。必须注意的是，在本发明的上下文中，术语局部给予包括区域给予，例如，通过递送至服务于该身体区域的血管来给予针对身体的一部分的配制品。局部递送可以是直接的，例如，瘤内递送。局部递送也可以是几乎直接的，即病灶内或腹膜内，也就是说，递送至足够接近肿瘤或感染部位的区域，使得抑制剂表现出所希望的药理学活性。因此，当希望局部递送时，药物配制品优选地在病灶内、瘤内或腹膜内递送。
在某些实施例中，药物组合物处于单位剂型。在这种形式中，将组合物分成含有适量活性组分的单位剂量。单位剂型可以是包装的制剂，该包装含有离散量的制剂，例如小瓶或安瓿中的冻干的粉末。
本文的药物组合物还可含有所治疗的具体适应症所必需的一种以上的活性化合物，优选那些具有互补活性而不会相互产生不利影响的活性化合物。例如，可以希望的是进一步提供抗肿瘤剂、生长抑制剂、细胞毒性剂或化学治疗剂。此类分子合适地以对预期目的有效的量组合存在。此类其他药剂的有效量取决于配制品中存在的抗体的量、疾病或障碍或治疗的类型、以及上文讨论的其他因素。这些通常以与本文描述相同的剂量和给予途径使用，或者以迄今采用的剂量的从约1％至99％使用。活性成分也可以包埋在例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊中，例如分别在胶体药物递送***中(例如，脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米颗粒和纳米胶囊)或在粗乳液中的羟甲基纤维素或明胶-微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊。此类技术披露于Remington's Pharmaceutical Sciences[雷明顿药物科学],第16版,Osol,A.编辑(1980)中。
可以制备缓释制剂。缓释制剂的合适的实施例包括含有拮抗剂的固体疏水聚合物的半透性基质，这些基质处于成型制品的形式，例如薄膜或微胶囊。缓释基质的实施例包括聚酯，水凝胶(例如，聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)、或聚(乙烯醇))，聚丙交酯(美国专利号3,773,919)，L-谷氨酸和乙基-L-谷氨酸的共聚物，不可降解的乙烯-乙烯基，可降解的乳酸-乙醇酸共聚物(如LUPRON DEPOTTM(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林组成的可注射微球))以及聚-D-(-)-3-羟基丁酸。虽然聚合物(如乙烯-乙酸乙烯酯和乳酸-乙醇酸)的能够释放分子超过100天，但某些水凝胶在更短的时间段内释放蛋白质。当包封的抗体长时间保留在体内时，它们会因暴露于37℃的湿气而变性或聚集，导致生物活性的丧失和免疫原性的可能变化。可以根据所涉及的机制设计合理的策略以实现稳定。例如，如果发现聚集机理是通过硫代-二硫键交换形成分子间S-S键，则可以通过修饰巯基残基、从酸性溶液中冻干、控制水分含量、使用适当的添加剂并且开发特定的聚合物基质组合物来实现稳定化。
脂质转染体(lipofectin)或脂质体可用于将本发明的多肽和抗体(或其片段)或组合物递送到细胞中。在使用抗体片段的情况下，优选特异性结合靶蛋白结合域的最小抑制片段。例如，基于抗体的可变区序列，可以设计肽分子使其保留结合靶蛋白序列的能力。此类肽可以是化学合成地和/或通过重组DNA技术产生。参见，例如，Marasco WA.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]90(16):7889-7893(1993)。
活性成分也可以包埋在例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊中，例如分别在胶体药物递送***中(例如，脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米颗粒和纳米胶囊)或在粗乳液中的羟甲基纤维素或明胶-微胶囊和聚-(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊。此类技术披露于Remington's PHARMACEUTICAL SCIENCES[雷明顿药物科学]，同上。
可以制备缓释制剂。缓释制剂的合适的实施例包括含有抗体(或其片段)的固体疏水聚合物的半透性基质，这些基质处于成型制品的形式，例如薄膜或微胶囊。缓释基质的实施例包括聚酯，水凝胶(例如，聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)、或聚(乙烯醇))，聚丙交酯(美国专利号3,773,919)，L-谷氨酸和乙基-L-谷氨酸的共聚物，不可降解的乙烯-乙酸乙烯酯，可降解的乳酸-乙醇酸共聚物(如LUPRON DEPOT TM(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林组成的可注射微球))以及聚-D-(-)-3-羟基丁酸。虽然聚合物(如乙烯-乙酸乙烯酯和乳酸-乙醇酸)的能够释放分子超过100天，但某些水凝胶在更短的时间段内释放蛋白质。当包封的抗体长时间保留在体内时，它们会因暴露于37℃的湿气而变性或聚集，导致生物活性的丧失和免疫原性的可能变化。可以根据所涉及的机制设计合理的策略以实现稳定。例如，如果发现聚集机理是通过硫代-二硫键交换形成分子间S-S键，则可以通过修饰巯基残基、从酸性溶液中冻干、控制水分含量、使用适当的添加剂并且开发特定的聚合物基质组合物来实现稳定化。
在某些实施例中，配制品包含高于约0.5mg/mL、高于约1mg/mL、高于约2mg/mL、高于约3mg/mL、高于约4mg/mL、高于约5mg/mL、高于约6mg/mL、高于约7mg/mL、高于约8mg/mL、高于约9mg/mL、高于约10mg/mL、高于约11mg/mL、高于约12mg/mL、高于约13mg/mL、高于约14mg/mL、高于约15mg/mL、高于约16mg/mL、高于约17mg/mL、高于约18mg/mL、高于约19mg/mL、高于约20mg/mL、高于约21mg/mL、高于约22mg/mL、高于约23mg/mL、高于约24mg/mL、高于约25mg/mL、高于约26mg/mL、高于约27mg/mL、高于约28mg/mL、高于约29mg/mL、或高于约30mg/mL(包括这些值之间的任何范围)浓度的本文描述的抗CD73抗体和/或其变体或突变体。
包含所披露的抗体的配制品应该具有与该抗体或片段的等电点值不相似的pH(在最终配制品中)，例如，如果配制品的pH为7，则pI为从8至9或更高可能是适当的。尽管不希望受理论的束缚，但据认为这可能最终提供具有改善的稳定性的最终配制品，例如抗体或片段保持在溶液中。例如，在某些实施例中，pH在4.0至7.0的范围内的所披露的药物配制品可以包含：1mg/mL至200mg/mL的根据本披露的抗体和1至100mM的缓冲液，以及任选地以下中的一种或多种：(a)0.001％至1％的表面活性剂，(b)10mM至500mM的稳定剂，(c)10mM至500mM的稳定剂和5mM至500mM的张度剂，和/或(d)5mM至500mM的张度剂。合适的缓冲液包括但不限于柠檬酸盐、甘氨酸、磷酸盐、乙酸盐、琥珀酸盐和碳酸氢盐。例如，大约pH 6的配制品可以包含1至50mg/mL的抗体、20mM的L-组氨酸HCl、240mM的海藻糖和0.02％的聚山梨醇酯20。可替代地，大约pH 5.5的配制品可以包含1至50mg/mL的抗体、20mM柠檬酸盐缓冲液、240mM蔗糖、20mM精氨酸和0.02％聚山梨醇酯20。
在某些实施例中，抗CD73抗体和/或其变体或突变体(例如，以高于约0.5mg/mL、高于约1mg/mL、高于约5mg/mL、高于约10mg/mL、高于约15mg/mL、高于约20mg/mL、或高于约25mg/mL(包括这些值之间的任何范围)的浓度)配制于包含柠檬酸盐、NaCl、乙酸盐、琥珀酸盐、甘氨酸、聚山梨醇酯80(Tween80)或前述的任何组合的缓冲液中。在某些实施例中，抗CD73抗体和/或其变体(例如，以高于约0.5mg/mL、高于约1mg/mL、高于约5mg/mL、高于约10mg/mL、高于约15mg/mL、高于约20mg/mL、或高于约25mg/mL(包括这些值之间的任何范围)的浓度)配制于包含约100mM至约150mM甘氨酸的缓冲液中。在某些实施例中，将抗CD73抗体和/或其变体配制于包含约50mM至约100mM NaCl的缓冲液中。在某些实施例中，将抗CD73抗体和/或其变体或突变体(例如，以高于约0.5mg/mL、高于约1mg/mL、高于约5mg/mL、高于约10mg/mL、高于约15mg/mL、高于约20mg/mL、或高于约25mg/mL(包括这些值之间的任何范围)的浓度)配制于包含约10mM至约50mM乙酸盐的缓冲液中。在某些实施例中，将抗CD73抗体和/或其变体配制于包含约10mM至约50mM琥珀酸盐的缓冲液中。在某些实施例中，将抗CD73抗体和/或其变体或突变体(例如，以高于约0.5mg/mL、高于约1mg/mL、高于约5mg/mL、高于约10mg/mL、高于约15mg/mL、高于约20mg/mL、或高于约25mg/mL(包括这些值之间的任何范围)的浓度)配制于包含约0.005％至约0.02％聚山梨醇酯80的缓冲液中。在某些实施例中，将抗CD73抗体和/或其变体或突变体配制于合适的缓冲液中，以提供在约5.1至5.6之间的缓冲pH。例如，可以将抗CD73抗体和/或其变体或突变体配制于包含10mM柠檬酸盐、100mMNaCl、100mM甘氨酸和0.01％聚山梨醇酯80的缓冲液中，其中该配制品处于pH＝5.5。
在某些实施例中，包含本文描述的抗CD73抗体和/或其变体或突变体(例如，以高于约0.5mg/mL、高于约1mg/mL、高于约5mg/mL、高于约10mg/mL、高于约15mg/mL、高于约20mg/mL、或高于约25mg/mL(包括这些值之间的任何范围)的浓度)的配制品(如包含缓冲液(该缓冲液包含10mM柠檬酸盐、100mM NaCl、100mM甘氨酸和0.01％聚山梨醇酯80)的配制品，其中该配制品处于pH＝5.5)在室温(如在约20℃-25℃)稳定持续约0.5周、1.0周、1.5周、2.0周、2.5周、3.5周、4.0周、4.5周、或5.0周(包括这些值之间的任何范围)。在某些实施例中，包含本文描述的抗CD73抗体和/或其变体或突变体(例如，以高于约0.5mg/mL、高于约1mg/mL、高于约5mg/mL、高于约10mg/mL、高于约15mg/mL、高于约20mg/mL、或高于约25mg/mL(包括这些值之间的任何范围)的浓度)的配制品(如包含缓冲液(该缓冲液包含10mM柠檬酸盐、100mM NaCl、100mM甘氨酸和0.01％聚山梨醇酯80)的配制品，其中该配制品处于pH＝5.5)在加速条件下(如在约37℃储存)稳定持续约0.5周、1.0周、1.5周、2.0周、2.5周、3.5周、4.0周、4.5周、或5.0周(包括这些值之间的任何范围)。
尺寸排阻色谱法(SEC)是用于蛋白质稳定性研究的熟知且广泛使用的方法，以检测对应于物理和化学不稳定性的潜在片段化和聚集。在某些实施例中，如使用SEC测量的，在37℃下1周后，相对于初始高分子量种类的％，包含5mg/mL、10mg/mL、15mg/mL、20mg/mL、或25mg/mL的本文描述的抗CD73抗体和/或其变体或突变体的配制品显示小于约1.6％、1.4％、1.2％、1.0％、0.8％、0.6％、0.4％、0.2％、或0.1％(包括这些值之间的任何范围)的高分子量种类(HMWS)的增加。在某些实施例中，如使用SEC测量的，在37℃下2周后，相对于初始高分子量种类的％，包含5mg/mL、10mg/mL、15mg/mL、20mg/mL、或25mg/mL的本文描述的抗CD73抗体的配制品显示小于约2.0％、1.8％1.6％、1.4％、1.2％、1.0％、0.8％、0.6％、0.4％、0.2％、或0.1％(包括这些值之间的任何范围)的高分子量种类的增加。在某些实施例中，如使用SEC测量的，在37℃下4周后，相对于初始高分子量种类的％，包含5mg/mL、10mg/mL、15mg/mL、20mg/mL、或25mg/mL的本文描述的抗CD73抗体和/或其变体或突变体的配制品显示小于约3.3％、3.2％、3.1％、3.0％、2.9％、2.8％、2.7％、2.6％、2.5％、2.4％、2.2％、2.0％、1.8％、1.6％、1.4％、1.2％、1.0％、0.8％、0.6％、0.4％、0.2％、或0.1％(包括这些值之间的任何范围)的高分子量种类的增加。
在某些实施例中，如使用SEC测量的，在37℃下1周后，相对于初始低分子量种类的％，包含5mg/mL、10mg/mL、15mg/mL、20mg/mL、或25mg/mL的本文描述的抗CD73抗体和/或其变体或突变体的配制品显示小于约1.6％、1.4％、1.2％、1.0％、0.8％、0.6％、0.4％、0.2％、或0.1％(包括这些值之间的任何范围)的低分子量种类(LMWS)的增加。在某些实施例中，如使用SEC测量的，在37℃下2周后，相对于初始低分子量种类的％，包含5mg/mL、10mg/mL、15mg/mL、20mg/mL、或25mg/mL的本文描述的抗CD73抗体和/或其变体或突变体的配制品显示小于约2.0％、1.8％、1.6％、1.4％、1.2％、1.0％、0.8％、0.6％、0.4％、0.2％、或0.1％(包括这些值之间的任何范围)的低分子量种类的增加。在某些实施例中，如使用SEC测量的，在37℃下4周后，相对于初始低分子量种类的％，包含5mg/mL、10mg/mL、15mg/mL、20mg/mL、或25mg/mL的本文描述的抗CD73抗体和/或其变体或突变体的配制品显示小于约2.4％、2.2％、2.0％、1.8％、1.6％、1.4％、1.2％、1.0％、0.8％、0.6％、0.4％、0.2％、或0.1％(包括这些值之间的任何范围)的低分子量种类的增加。
在某些实施例中，如使用SEC测量的，在37℃下1周后，相对于初始单体的％，包含5mg/mL、10mg/mL、15mg/mL、20mg/mL、或25mg/mL的本文描述的抗CD73抗体和/或其变体或其突变体的配制品显示不超过约0.2％、0.4％、0.6％、0.8％、0.9％、1.0％、1.1％、1.2％、1.3％、1.4％、1.6％、1.7％、1.8％、1.9％、2.0％、2.1％、2.2％、2.3％、2.4％、2.5％、2.6％、2.7％、2.8％、2.9％、3.0％、3.1％、3.2％、3.3％、3.4％、或3.5％(包括这些值之间的任何范围)的单体的减少。在某些实施例中，如使用SEC测量的，在37℃下2周后，相对于初始单体的％，包含5mg/mL、10mg/mL、15mg/mL、20mg/mL、或25mg/mL的本文描述的抗CD73抗体和/或其变体或其突变体的配制品显示不超过约0.2％、0.4％、0.6％、0.8％、0.9％、1.0％、1.1％、1.2％、1.3％、1.4％、1.6％、1.7％、1.8％、1.9％、2.0％、2.1％、2.2％、2.3％、2.4％、2.5％、2.6％、2.7％、2.8％、2.9％、3.0％、3.1％、3.2％、3.3％、3.4％、或3.5％(包括这些值之间的任何范围)的单体的减少。在某些实施例中，如使用SEC测量的，在37℃下2周后，相对于初始单体的％，包含5mg/mL、10mg/mL、15mg/mL、20mg/mL、或25mg/mL的本文描述的抗CD73抗体和/或其变体或其突变体的配制品显示不超过约0.2％、0.4％、0.6％、0.8％、0.9％、1.0％、1.1％、1.2％、1.3％、1.4％、1.6％、1.7％、1.8％、1.9％、2.0％、2.1％、2.2％、2.3％、2.4％、2.5％、2.6％、2.7％、2.8％、2.9％、3.0％、3.1％、3.2％、3.3％、3.4％、或3.5％(包括这些值之间的任何范围)的单体的减少。
阳离子交换色谱法(CEX)是熟知且广泛使用的工具，以检测蛋白质降解事件，例如脱酰胺或氧化(Moorhouse KG.等人,J.Pharm.Biomed.Anal.[药学和生物医学分析杂志]16(4):593-603(1997))。降解产物典型地称为酸性或碱性物质。酸性物质是早于CEX的主峰洗脱出来的变体，而碱性种类是晚于CEX的主峰洗脱出来的变体。在某些实施例中，如使用CEX测量的，在37℃下1周后，包含5mg/mL、10mg/mL、15mg/mL、20mg/mL、或25mg/mL的本文描述的抗CD73抗体和/或其变体或其突变体的配制品的酸性峰部分不超过总蛋白的约7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、或15％(包括这些值之间的任何范围)。在某些实施例中，如使用CEX测量的，在37℃下2周后，包含5mg/mL、10mg/mL、15mg/mL、20mg/mL、或25mg/mL的本文描述的抗CD73抗体和/或其变体或其突变体的配制品的酸性峰部分不超过总蛋白的约8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、或18％(包括这些值之间的任何范围)。在某些实施例中，如使用CEX测量的，在37℃下2周后，包含5mg/mL、10mg/mL、15mg/mL、20mg/mL、或25mg/mL的本文描述的抗CD73抗体和/或其变体或突变体(或片段)的配制品的酸性峰部分不超过总蛋白的约8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、或27％(包括这些值之间的任何范围)。
在某些实施例中，如使用CEX测量的，在37℃下1周后，包含5mg/mL、10mg/mL、15mg/mL、20mg/mL、或25mg/mL的本文描述的抗CD73抗体和/或其变体或突变体(或片段)的配制品的碱性峰部分不超过总蛋白的约39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、或46％(包括这些值之间的任何范围)。在某些实施例中，如使用CEX测量的，在37℃下2周后，包含5mg/mL、10mg/mL、15mg/mL、20mg/mL、或25mg/mL的本文描述的抗CD73抗体和/或其变体或突变体(或片段)的配制品的碱性峰部分不超过总蛋白的约39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、或46％(包括这些值之间的任何范围)。在某些实施例中，如使用CEX测量的，在37℃下4周后，包含5mg/mL、10mg/mL、15mg/mL、20mg/mL、或25mg/mL的本文描述的抗CD73抗体和/或其变体或突变体(或片段)的配制品的碱性峰部分不超过总蛋白的约39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、或46％(包括这些值之间的任何范围)。
在某些实施例中，如使用CEX测量的，在37℃下1周后，包含5mg/mL、10mg/mL、15mg/mL、20mg/mL、或25mg/mL的本文描述的抗CD73抗体和/或其变体或突变体(或片段)的配制品的主峰部分不小于总蛋白的约32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、或46％(包括这些值之间的任何范围)。在某些实施例中，如使用CEX测量的，在37℃下2周后，包含5mg/mL、10mg/mL、15mg/mL、20mg/mL、或25mg/mL的本文描述的抗CD73抗体和/或其变体或突变体(或片段)的配制品的碱性峰部分不小于总蛋白的约32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、或46％(包括这些值之间的任何范围)。在某些实施例中，如使用CEX测量的，在37℃下4周后，包含5mg/mL、10mg/mL、15mg/mL、20mg/mL、或25mg/mL的本文描述的抗CD73抗体和/或其变体或突变体(或片段)的配制品的碱性峰部分不小于总蛋白的约32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、或46％(包括这些值之间的任何范围)。
用于体内给予的配制品必须是无菌的。这可以通过例如穿过无菌过滤膜过滤而容易地实现。
使用抗CD73抗体及其变体/突变体的诊断和成像方法
与CD73特异性结合的经标记的抗CD73抗体、变体、突变体、其片段，以及其衍生物和类似物可用于诊断目的，以检测、诊断或监测与CD73的表达、异常表达和/或活性相关的疾病和/或障碍。例如，本文提供的所披露的抗CD73抗体和/或变体或突变体(或其片段)可以用于原位、体内、离体和体外诊断测定或成像测定。用于检测CD73表达的方法，包括(a)使用本披露的一种或多种抗体测定多肽在个体的细胞(例如组织)或体液中的表达，和(b)比较该基因表达水平和标准基因表达水平，其中与标准表达水平相比，测定的基因表达水平的增加或减少指示异常表达。
本文提供的另外的实施例包括在动物(例如哺乳动物，如人)中诊断与CD73的表达或异常表达相关的疾病或障碍的方法。这些方法包含在哺乳动物中检测CD73分子。在某些实施例中，诊断包括：(a)向哺乳动物给予有效量的经标记的抗CD73抗体和/或其变体或突变体(或片段)；(b)在给予后等待一段时间间隔，以允许经标记的抗CD73抗体和/或其变体或突变体(或片段)优先浓缩在受试者的表达CD73的部位(并且将未结合的经标记的分子清除至背景水平)；(c)确定背景水平；和(d)检测受试者中经标记的分子，使得检测到高于背景水平的经标记的分子指示受试者患有与CD73表达或异常表达相关的特定疾病或障碍。背景水平可以通过不同方法确定，这些方法包括将所检测到的标记的分子的量与先前针对一个具体***确定的标准值进行对比。
本文提供的抗CD73抗体和/或其变体或突变体(或片段)可以用于使用本领域技术人员已知的经典免疫组织学方法来测定生物样品中蛋白质水平(例如，参见Jalkanen等人,J.Cell.Biol.[细胞生物学杂志]101:976-985(1985)；Jalkanen等人,J.Cell.Biol.[细胞生物学杂志]105:3087-3096(1987))。有用于检测蛋白质基因表达的其他基于抗体的方法包括免疫测定，例如酶联免疫吸附测定(ELISA)和放射免疫测定(RIA)。合适的抗体测定标记是本领域中已知的并且包括酶标记(如，葡萄糖氧化酶)；放射性同位素，如碘(131I、125I、123I、121I)、碳(14C)、硫(35S)、氚(3H)、铟(115mIn、113mIn、112In、111In)、锝(99Tc、99mTc)、铊(201Ti)、镓(68Ga、67Ga)、钯(103Pd)、钼(99Mo)、氙(133Xe)、氟(18F)、钐(153Sm)、镥(177Lu)、钆(159Gd)、钷(149Pm)、镧(140La)、镱(175Yb)、钬(166Ho)、钇(90Y)、钪(47Sc)、铼(186Re、188Re)、镨(142Pr)、铑(105Rh)、钌(97Ru)；鲁米诺；以及荧光标记(如荧光素及罗丹明及生物素)。
本领域已知的技术可以应用于本文提供的经标记的抗体(或其片段)。此类技术包括但不限于使用双功能缀合剂(参见例如，美国专利号5,756,065；5,714,631；5,696,239；5,652,361；5,505,931；5,489,425；5,435,990；5,428,139；5,342,604；5,274,119；4,994,560；和5,808,003)。
可替代地，或另外地，可以测量细胞中编码CD73的核酸或mRNA的水平，例如经由使用对应于编码CD73的核酸或其互补序列的基于核酸的探针的荧光原位杂交；(FISH；参见1998年10月公布的WO 98/45479)，DNA印迹法、RNA印迹法或聚合酶链反应(PCR)技术，例如实时定量PCR(RT-PCR)。还可以通过测量生物流体(如血清)中的脱落抗原来研究CD73过表达，例如使用基于抗体的测定(还参见，例如，1990年6月12日发布的美国专利号4,933,294；1991年4月18日发布的WO 91/05264；1995年3月28日发布的美国专利号5,401,638；以及Sias等人,J.Immunol.Methods[免疫方法杂志]132:73-80(1990))。除了上述测定之外，本领域技术人员可获得各种体内和离体测定。例如，可以将哺乳动物体内的细胞暴露于抗体，该抗体任选地用可检测标记(例如放射性同位素)进行标记，并且可以例如通过外部扫描放射性或者通过分析取自先前暴露于该抗体的哺乳动物的样品(例如，活体标本检查或其他生物样品)来评估抗体与细胞的结合。
制品和试剂盒
在各种实施例中，本发明涉及如下试剂盒，该试剂盒包含所披露的抗CD73抗体、变体、突变体和/或其片段，和/或本文提供的药物组合物，以及以下中的一个或多个：(a)已知治疗癌症的至少一种药剂；或(b)治疗癌症的说明书。
在另外的实施例中，将所披露的抗CD73抗体、其变体、突变体和/或片段，和/或本文提供的药物组合物，以及已知治疗癌症的至少一种药剂进行共同配制。
在仍另外的实施例中，将所披露的抗CD73抗体、其变体、突变体和/或片段，和/或本文提供的药物组合物，以及已知治疗癌症的至少一种药剂进行共同包装。
在另外的实施例中，已知治疗癌症的一种药剂是激素治疗剂。在仍另外的实施例中，激素治疗剂选自下组中的一个或多个，该组由以下组成：亮丙瑞林、三苯氧胺、雷洛昔芬、甲地孕酮、氟维司群、曲普瑞林(triptorelin)、甲羟孕酮、来曲唑、阿那曲唑(anastrozole)、依西美坦、比卡鲁胺、戈舍瑞林、组氨瑞林(histrelin)、氟***、雌莫司汀、氟他胺、托瑞米芬、地加瑞克(degarelix)、尼鲁米特、阿巴瑞克(abarelix)和睾内酯，或其药学上可接受的盐、水合物、溶剂合物或多晶型物。
在另外的实施例中，已知治疗癌症的至少一种药剂是化学治疗剂。在仍另外的实施例中，该化学治疗剂选自下组中的一个或多个，该组由以下组成：烷化剂、抗代谢物剂、抗肿瘤抗生素剂、有丝***抑制剂、mTOR抑制剂或其他化学治疗剂。
在另外的实施例中，该抗肿瘤抗生素剂选自下组中的一个或多个，该组由以下组成：多柔比星、米托蒽醌、博莱霉素、道诺霉素、放线菌素D、表柔比星、伊达比星、普卡霉素、丝裂霉素、喷司他丁和戊柔比星(valrubicin)，或其药学上可接受的盐、水合物、溶剂合物或多晶型物。
在另外的实施例中，该抗代谢物剂选自下组中的一个或多个，该组由以下组成：吉西他滨、5-氟脲嘧啶、卡培他滨、羟基脲、巯嘌呤、培美曲塞、氟达拉滨、奈拉滨(nelarabine)、克拉屈滨、氯法拉滨、阿糖孢苷、地西他滨(decitabine)、普拉曲沙(pralatrexate)、氟尿苷、甲氨蝶呤和硫鸟嘌呤，或其药学上可接受的盐、水合物、溶剂合物或多晶型物。
在另外的实施例中，该烷化剂选自下组中的一个或多个，该组由以下组成：卡铂、顺铂、环磷酰胺、苯丁酸氮芥、美法仑、卡莫司汀、白消安、环己亚硝脲、达卡巴嗪、奥沙利铂、异环磷酰胺、氮芥、替莫唑胺、噻替派、苯达莫司汀(bendamustine)和链脲菌素，或其药学上可接受的盐、水合物、溶剂合物或多晶型物。
在另外的实施例中，该有丝***抑制剂选自下组中的一个或多个，该组由以下组成：伊立替康、拓扑替康、鲁比替康(rubitecan)、卡巴他赛(cabazitaxel)、多西他赛、紫杉醇、依托泊甙(etopside)、长春新碱、伊沙匹隆、长春瑞滨、长春花碱和替尼泊苷，或其药学上可接受的盐、水合物、溶剂合物或多晶型物。
在另外的实施例中，该mTOR抑制剂选自下组中的一个或多个，该组由以下组成：依维莫司、西罗莫司(siroliumus)和替西罗莫司(temsirolimus)，或其药学上可接受的盐、水合物、溶剂合物或多晶型物。
在另外的实施例中，试剂盒进一步包含提供所披露的抗CD73抗体、其变体、突变体和/或片段，和/或本文提供的药物组合物与手术联合的说明书。在仍另外的实施例中，试剂盒进一步包含提供所披露的抗CD73抗体、其变体、突变体和/或片段，和/或本文提供的药物组合物与手术联合的说明书，其中这些说明书提供了在给予至少一种化合物之前进行手术。在又另外的实施例中，试剂盒进一步包含提供所披露的抗CD73抗体、其变体、突变体和/或片段，和/或本文提供的药物组合物与手术联合的说明书，其中这些说明书提供了在给予所披露的抗CD73抗体、其变体、突变体和/或片段，和/或本文提供的药物组合物之后进行手术。在甚至另外的实施例中，试剂盒进一步包含提供所披露的抗CD73抗体、其变体、突变体和/或片段，和/或本文提供的药物组合物与手术联合的说明书，其中这些说明书提供了在给予所披露的抗CD73抗体、其变体、突变体和/或片段，和/或本文提供的药物组合物之后进行手术，并且其中这些说明书提供了给予所披露的抗CD73抗体、其变体、突变体和/或片段，和/或本文提供的药物组合物是用于实现肿瘤的术前减积。在仍另外的实施例中，试剂盒进一步包含提供化合物与手术联合的说明书，其中这些说明书提供了在给予所披露的抗CD73抗体、其变体、突变体和/或片段，和/或本文提供的药物组合物之后进行手术，并且其中这些说明书提供了与给予所披露的抗CD73抗体、其变体、突变体和/或片段，和/或本文提供的药物组合物几乎同时进行手术。
在另外的实施例中，试剂盒进一步包含提供所披露的抗CD73抗体、变体、突变体和/或其片段，和/或药物组合物与放射治疗联合的说明书。在仍另外的实施例中，试剂盒进一步包含提供所披露的抗CD73抗体、变体、突变体和/或其片段，和/或药物组合物与放射治疗联合的说明书，其中这些说明书提供了在给予所披露的抗CD73抗体、变体、突变体和/或其片段，和/或药物组合物之前进行放射治疗。在又另外的实施例中，试剂盒进一步包含提供所披露的抗CD73抗体、变体、突变体和/或其片段，和/或药物组合物与放射治疗联合的说明书，其中这些说明书提供了在给予所披露的抗CD73抗体、变体、突变体和/或其片段，和/或药物组合物的步骤之后进行放射治疗。在甚至另外的实施例中，试剂盒进一步包含提供所披露的抗CD73抗体、变体、突变体和/或其片段，和/或药物组合物与放射治疗联合的说明书，其中这些说明书提供了与给予所披露的抗CD73抗体、变体、突变体和/或其片段，和/或药物组合物的步骤几乎同时进行放射治疗。
在另外的实施例中，试剂盒进一步包含多个剂型，该多个包含一个或多个剂量；其中每个剂量包含治疗有效量的所披露的抗CD73抗体、变体、突变体和/或其片段，和/或药物组合物和至少一种药剂。在仍另外的实施例中，试剂盒进一步包含多个剂型，该多个包含一个或多个剂量；其中每个剂量包含治疗有效量的所披露的抗CD73抗体、变体、突变体和/或其片段，和/或药物组合物和至少一种药剂，并且其中将所披露的抗CD73抗体、变体、突变体和/或其片段，和/或药物组合物的每个剂量和已知治疗癌症的至少一种药剂共同配制。在又另外的实施例中，试剂盒进一步包含多个剂型，该多个包含一个或多个剂量；其中每个剂量包含治疗有效量的所披露的抗CD73抗体、变体、突变体和/或其片段，和/或药物组合物和至少一种药剂，并且其中将所披露的抗CD73抗体、变体、突变体和/或其片段，和/或药物组合物的每个剂量和已知治疗癌症的至少一种药剂共同包装。
在另外的实施例中，试剂盒进一步包含多个剂型，该多个包含一个或多个剂量；其中每个剂量包含治疗有效量的所披露的抗CD73抗体、变体、突变体和/或其片段，和/或药物组合物(配制用于静脉内给予)，和至少一种药剂(配制用于口服给予和/或静脉内给予)。在仍另外的实施例中，试剂盒进一步包含多个剂型，该多个包含一个或多个剂量；其中每个剂量包含治疗有效量的所披露的抗CD73抗体、变体、突变体和/或其片段，和/或药物组合物(配制用于静脉内给予)，和至少一种药剂(配制用于口服给予)。在又另外的实施例中，试剂盒进一步包含多个剂型，该多个包含一个或多个剂量；其中每个剂量包含治疗有效量的所披露的抗CD73抗体、变体、突变体和/或其片段，和/或药物组合物(配制用于静脉内给予)，和至少一种药剂(配制用于静脉内给予)。
所披露的抗CD73抗体、变体、突变体和/或其片段，和/或药物组合物可以方便地作为试剂盒提供，其中提供了两种或更多种组分(可以是活性或非活性成分、载体、稀释剂等)与用于使患者或将药物给予至患者的人制备实际剂型的说明书。此类试剂盒可以具有包含在其中的所有必需的材料和成分，或者这些试剂盒可以含有用于使用或制造必须由患者或将药物给予至患者的人独立获得的材料或组分的说明书。在另外的实施例中，试剂盒可以包括有助于向患者给予单位剂量的任选的组分，如用于重构粉末形式的小瓶、用于注射的注射器、定制的IV递送***、吸入器等。另外地，试剂盒可以包含用于制备和给予组合物的说明书。该试剂盒可以作为用于一个受试者的单一使用单位剂量，用于特定受试者的多次使用(以恒定剂量或者其中随疗法进展单一化合物的效力可以变化)而制造；或者该试剂盒可以含有适于给予至多个患者的多个剂量(“散装包装”)。试剂盒组分可以装在纸箱、泡罩包装、瓶、管等中。
在另外的实施例中，所披露的试剂盒能以每日给药方案包装(例如，卡片包装(packaged on cards)、给药卡片包装(packaged with dosing cards)、泡罩包装或吹塑塑料包装等)。此类包装促销产品并增加患者对药物方案的依从性。此类包装还可以减少患者的困惑。本披露的特征在于进一步包含使用说明书的试剂盒。
在另外的实施例中，本发明还提供了药物包装或试剂盒，该药物包装或试剂盒包含填充有本发明的药物组合物的一种或多种成分的一个或多个容器。与这种容器或此类容器相关的可以是处于管理药物或生物制品制造、使用或销售的政府机构所规足的形式的标识，该标识反映制造、使用或销售机构批准用于人给予。
在各种实施例中，所披露的试剂盒还可以包含与其他组分共同包装、共同配制、和/或共同递送的化合物和/或产品。例如，药物制造商、药物经销商、医师、配药店(compounding shop)或药剂师可以提供如下试剂盒，该试剂盒包含所披露的化合物和/或产品、以及另一种组分用于递送至患者。
考虑了所披露的试剂盒可以与所披露的制备方法、所披露的使用或治疗方法和/或所披露的组合物一起使用。
还提供了可用于各种目的的试剂盒，例如任选地与制品组合的用于在患者中分离或检测CD73的试剂盒。为了分离和纯化CD73，试剂盒可以含有与珠(例如，SEPHAROSETM珠)偶联的本文提供的抗CD73抗体和/或其变体或突变体(或片段)。可以提供含有抗体(或其片段)的试剂盒，用于例如在ELISA或蛋白质印迹法中体外检测和定量CD73。与制品一样，试剂盒包含容器和在容器上或与容器相关的标记或包装***物。例如，容器容纳包含至少一种本文提供的抗CD73抗体和/或其变体或突变体(或片段)的组合物。可以包括的另外的容器含有，例如，稀释剂和缓冲液、对照抗体。标记或包装***物可以提供对组合物的描述以及用于预期的体外或诊断用途的说明书。
本文提供的另一个实施例是含有用于治疗所披露的癌症的材料的制品。制品可以包含容器和该容器上或与该容器相关的标记或包装***物。适合的容器包括例如，瓶子、小瓶、注射器等。容器可以由多种材料制成，例如玻璃或塑料。通常，容器容纳有效治疗病症的组合物，并且可具有无菌进入口(例如，容器可以是静脉内溶液袋或具有可由皮下注射针刺穿的塞子的小瓶)。组合物中的至少一种活性剂是本文提供的抗CD73抗体和/或其变体或突变体(或片段)。标记或包装***物指示组合物用于治疗特定病症。标记或包装***物将进一步包含向患者给予抗体组合物的说明书。还考虑了包含本文描述的组合疗法的制品和试剂盒。
包装***物是指通常包括在治疗产品的商业包装中的说明书，这些说明书含有关于使用此类治疗产品的适应症、用法、剂量、给予、禁忌症和/或警告的信息。在一个实施例中，包装***物指示组合物用于治疗癌症(如头颈癌、肺癌或结肠直肠癌)。
另外地，制品可以进一步包含第二容器，该容器包含药学上可接受的缓冲液，如抑菌性注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液和右旋糖溶液。其可以进一步包括从商业和用户角度所希望的其他材料，包括其他缓冲液、稀释剂、过滤器、针头和注射器。
现在已经总体上描述了本发明的方面，以下实施例描述了本发明的一些另外的方面。虽然结合以下实施例和相应的文本和附图描述了本发明的方面，但是并不旨在将本发明的方面限制于此描述。相反，旨在涵盖包括于本发明的精神和范围内的所有替代物、修改和等效物。
实施例
提出以下实施例以向本领域的普通技术人员提供如何制备和评估本文要求保护的化合物、组合物、制品、装置和/或方法的完整披露和描述，并且旨在纯粹是本发明的示例，而并非旨在限制诸位发明人认为的本发明的范围。虽然已尽力确保数字(例如量、温度等)的准确性，但仍应考虑一些误差和偏差。除非另外指示，否则份数是重量份数，温度是℃或环境温度，并且压力是大气压或接近大气压。
Figure BDA0002145498740000681
实施例1.抗CD73抗体和变体的制备。
用人CD73-ECD/His淘选人Fab初始噬菌体展示文库。用与链霉抗生物素蛋白包衣的磁性
Figure BDA0002145498740000682
M-280(赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific)#11205D)偶联的生物素化的huCD73-ECD/His进行四轮淘选后，选择了具有CD73结合活性和固定化的CD73酶阻断活性的五十二个可能克隆并确定四种序列(N1至N4)。然后将选择的可变序列克隆到人IgG1Fc主链的L234F、L235E、P331S突变体中，以成为用于体外功能分析(CD73结合、CD73酶活性阻断、抗体介导的CD73内化)的全长抗体。还将N1、N2和N4先导克隆到人野生型或C219S突变体IgG2Fc主链中。根据体外功效和体内功效测试(MDA-MB-231异种移植模型)，选择N1和N4用于以下亲和力成熟并确定wtIgG2主链。
将抗体先导克隆N1和先导克隆N4用于基于体外噬菌体展示的亲和力成熟实验，以生成具有改善的CD73结合活性性能和CD73酶阻断活性性能的另外的克隆。经由PCR生成N1先导克隆的CDR-L1/CDR-L3/CDR-H3(集中于3个CDR)核酸文库，将其克隆到噬菌体展示载体中并转化到大肠杆菌TG1细胞中，以产生噬菌体文库。用生物素化的huCD73-ECD/His进行三轮淘选后，经由结合测定和酶阻断测定筛选出具有不同序列的十五个Fab克隆，并且发现两个Fab(N1#2和N1#9)具有更好的功效。关于N4先导克隆的亲和力成熟，首先生成CDR-L3/CDR-H1/CDR-H3核酸文库以产生噬菌体文库。经过三轮淘选后，经由结合测定和酶阻断测定筛选出具有不同序列的六个Fab克隆(N4#1至N4#6)。然后，生成N4#1、N4#4、N4#5和N4#6克隆的CDR-L1/CDR-L2/CDR-H2核酸文库以产生噬菌体文库。经过三轮淘选后，选择具有更好的结合活性和酶阻断活性的N4#4-3、N4#6-2、N4#6-3、N4#6-4、N4#6-5克隆。
亲和力成熟后，将N1#2、N1#9、N4#5、N4#6、N4#4-3、N4#6-2、N4#6-3、N4#6-4、N4#6-5克隆到IgG2Fc主链中，以成为全长抗体并进行体外功效测试(包括CD73蛋白结合ELISA、表达CD73的肿瘤细胞结合、固定化和细胞CD73酶阻断、抗体介导的CD73内化)和体内功效测试(NCI-H292异种移植模型)，并选择N1#2、N1#9、N4#6-3、N4#6-4克隆。根据序列比对和CMC稳定性，修饰这四个克隆以产生N1#2-P、N1#9-PH、N4#6-3-P、N4#6-4-P。N1#9-PH具有更好的可溶性CD73酶阻断功效，并且N4#6-3-P、N4#6-4-P可以诱导表面CD73内化。N1#9-PH、N4#6-3-P、N4#6-4-P可以减轻AMP介导的T细胞抑制并且在体内具有针对MDA-MB-231异种移植的抗肿瘤活性。此外，N4#6-4-P可在异种移植肿瘤中诱导CD73下调并阻断CD73酶活性，并且在NCI-H292异种移植模型中具有比其他抗CD73抗体更好的抗肿瘤活性。
从初始噬菌体淘选中选择的抗CD73先导克隆N1、N2和N4的轻链和重链可变区的氨基酸序列比对分别示于图1A和图1B中。衍生自亲和力成熟的N1和N4变体的轻链可变区的氨基酸序列比对示于图9中，其中将Kabat定义的CDR(互补决定区)加下划线并用粗体标记，并且将衍生自亲和力成熟的N1和N4变体的重链可变区的氨基酸序列比对示于图10中，其中将Kabat定义的CDR(互补决定区)加下划线并用粗体标记。然后将这些选择的可变序列克隆到人IgG2Fc主链中，以变成全长抗体。
图14显示N1和N4靠前变体的轻链的氨基酸序列比对，其中将Kabat定义的CDR(互补决定区)加下划线并用粗体标记，并且图15显示了N1和N4靠前变体的重链可变区的氨基酸序列比对，其中将Kabat定义的CDR(互补决定区)加下划线并用粗体标记。然后将这些序列克隆到人IgG2Fc主链中，以变成全长抗体。
实施例2.选择的抗体的CD73结合能力。
进行ELISA测定以评估选择的抗体与重组人CD73-ECD/His蛋白的结合。将山羊抗人IgG Fd(或Fc)抗体以每孔三十纳克在4℃在96孔EIA微孔板上涂覆过夜。用(在PBS中的)5％脱脂乳阻断后，添加连续稀释的抗体并将其在室温孵育1小时。除去未结合的抗体，将孔用含有0.05％Tween20的1×PBST洗涤三次。将生物素标记的CD73-ECD/His蛋白以每孔三十纳克添加到孔中，并在室温再孵育1小时。将未结合的生物素标记的CD73-ECD/His用含有0.05％Tween20的1×PBST洗涤三次。然后将抗生物素蛋白-HRP添加到孔中并在室温孵育30分钟。通过用含有0.05％Tween20的1×PBST洗涤三次而来除去过量的第二抗体。洗涤后，将板使用TMB进行显色。通过酶标仪读取450nm的波长处的吸光度。
通过ELISA测试选择的抗CD73抗体与重组人CD73蛋白的结合，并且结合数据示于图2A中。
通过将MDA-MB-231或NCI-H292细胞与连续稀释的抗体在FACS缓冲液(含有2％FBS的PBS)中在4℃一起孵育30分钟来测试抗CD73抗体的全细胞结合能力。将细胞用FACS缓冲液洗涤，并在4℃用FITC标记的山羊抗人IgG(H+L)抗体(或PE标记的山羊抗人IgG Fcγ)对结合再进行30分钟检测。通过染色的平均荧光强度(MFI)测量抗体与细胞表面的结合。使用Cytomics FC500或CytoFLEX流式细胞仪(贝克曼库尔特公司(Beckman Coulter Inc.))进行流式细胞术分析。图2B和2C显示选择的抗CD73抗体结合表达CD73的人肿瘤细胞MDA-MB-231(人乳腺癌)细胞(图2B)和NCI-H292(人黏液表皮样肺癌)细胞(图2C)。
在这些研究中，将抗CD73 ref-1抗体和HLX01(抗CD20)分别用作阳性对照和阴性对照。这些数据表明，所有选择的抗CD73抗体都可以与人CD73重组蛋白和表达CD73的人肿瘤细胞结合。
图11A-11B还显示了N1和N4变体的CD73结合。通过流式细胞术来测试选择的变体与表达CD73的MDA-MB-231(图11A)和NCI-H292(图11B)细胞的结合。将HLX01(抗CD20)用作阴性对照。这些数据指示，在亲和力成熟后，所有N1和N4变体都可以与表达CD73的人肿瘤细胞结合。在这两种细胞系中，N4变体具有比N1变体更好的CD73结合能力。全细胞结合能力的排序是：N4#5、N4#6-4、N4#6-5>N4#6-2>N4#4-3、N4#6、N4#6-3、N1#9>N1#2。
图16A-16C显示N1和N4靠前变体的CD73结合能力。通过ELISA测试抗CD73抗体与重组人CD73蛋白的结合(图16A)、通过流式细胞术测试抗CD73抗体与表达CD73的人肿瘤细胞MDA-MB-231(图16B)和NCI-H292(图16C)的结合。将抗CD73 ref-1抗体和抗CD73 ref-2抗体用作阳性对照，而将HLX01(抗CD20)用作阴性对照。这些数据指示，N4#6-3-P、N4#6-4-P和N1#9-PH以可比的亲和力与重组CD73和MDA-MB-231细胞上的表面CD73结合。N1#9-PH与表达CD73的NCI-H292细胞的结合略好于N4#6-3-P和N4#6-4-P与该细胞的结合。
实施例3.抗CD73先导克隆对可溶性CD73酶活性和细胞CD73酶活性的作用。
测试抗CD73抗体抑制人重组CD73蛋白和细胞表面CD73的酶活性的能力。通过测量AMP抑制的荧光素的ATP依赖性氧化(CellTiter-Glo测定；普洛麦格公司(Promega))，分析CD73催化AMP水解成腺苷和无机磷酸盐。将十五纳克的重组人CD73-ECD/His蛋白与连续稀释的抗CD73抗体、ATP(终浓度100μM)和AMP(终浓度300μM)在测定缓冲液(25mM Tris，5mMMgCl2，pH 7.46)中在37℃孵育。将相同体积的CellTiter-Glo试剂添加到反应中并在白色96孔微孔板中混合2min。孵育10min后，测量冷光。
将表达CD73的细胞(5E3-1E4细胞/孔)重悬于培养基中，并置于96孔微孔板中(或预接种24小时)。向每种培养物中添加三倍(或五倍)连续稀释的抗体。在37℃孵育15分钟后，添加AMP(终浓度225μM)并孵育4-20小时。离心后，收集培养上清液，置于96孔微孔板中，并添加ATP至终浓度为100μM，用于孵育2min。将相同体积的CellTiter-Glo试剂添加到每个孔中并混合2min。孵育10min后，测量冷光。
显示抗CD73先导克隆对可溶性CD73酶活性和细胞CD73酶活性的作用的数据分别示于图3A和3B中。这些数据表明，所有选择的抗体都可以抑制人可溶性CD73和表面CD73两者的酶活性。在可溶性CD73酶活性测定中，当IgG相对于sCD73处于化学计量过量时，观察到抑制丧失。这种所谓的“钩状效应(hook effect)”可以产生自相同IgG分子上的Fab臂为竞争靶抗原上有限的结合位点而驱动的单价抗体结合。
测试具有不同IgG同种型的抗CD73先导克隆N1、N2、N4抑制细胞CD73酶活性的能力。将MDA-MB-231细胞与抗CD73抗体一起孵育。添加ATP、AMP和CellTiter-Glo试剂并记录冷光。在酶活性测定中将APCP用作阳性对照。具有不同IgG Fc区的这些抗CD73先导克隆对细胞CD73酶活性的作用显示于图6A(先导克隆N1)、6B(先导克隆N2)和6C(先导克隆N4)中。
这些数据指示，N1克隆的wtIgG2同种型具有比tmtIgG1和mtIgG2同种型更好的阻断活性。N2克隆的tmtIgG1同种型具有比wtIgG2和mtIgG2同种型更好的阻断活性。具有wtIgG2同种型的N4显示出比tmtIgG1和mtIgG2同种型最佳的阻断活性。tmtIgG1同种型具有以下Fc位点特异性变化：L234F、L235E和P331S。
图17A-17C还显示N1和N4靠前变体对可溶性CD73酶活性(图17A)和细胞表面CD73酶活性(图17B和图17C)的作用。测试抗CD73抗体抑制人重组CD73蛋白和细胞表面CD73酶活性的能力。将重组CD73蛋白(图17A)、MDA-MB-231(图17B)和NCI-H292(图17C)细胞与抗CD73抗体一起孵育。添加ATP、AMP和CellTiter-Glo并记录冷光。将抗CD73 ref-1抗体、抗CD73ref-2抗体和APCP用作阳性对照。将HLX01(抗CD20)用作阴性对照。
图17A-17C中展示的数据显示N1#9-PH抑制可溶性CD73酶活性的能力优于N4#6-3-P和N4#6-4P。然而，N1#9-PH和N4#6-4-P对细胞表面CD73酶活性显示出可比的阻断活性。
实施例4.抗CD73先导克隆的抗体介导的CD73内化。
将肿瘤细胞(5E4至1E5细胞/孔)悬浮于培养基中，并与不同浓度的抗CD73抗体一起孵育4小时。除去培养基后，将细胞悬浮于FACS缓冲液(含有2％FBS的PBS)中，并与小鼠抗人CD73抗体(4G4)在4℃一起孵育30分钟。将细胞用FACS缓冲液洗涤，并与FITC标记的山羊抗小鼠IgG(H+L)抗体或Alexa488标记的山羊抗小鼠IgG Fcγ抗体一起孵育。使用CytomicsFC500或CytoFLEX流式细胞仪(贝克曼库尔特公司(Beckman Coulter Inc.))进行流式细胞术分析。将抗CD73 ref-1抗体和HLX01(抗CD20)分别用作阳性对照和阴性对照。
图4中展示的数据指示仅N4-tmtIgG1可以诱导CD73内化。N1-tmtIgG1和N2-tmtIgG1不能诱导CD73内化。
图7还显示具有不同IgG Fc区的抗CD73抗体的抗体介导的CD73内化。在将细胞与N1(图7A)、N2(图7B)和N4(图7C)的不同IgG同种型孵育后，通过流式细胞术测量CD73的细胞表面表达。将抗CD73 ref-1抗体和HLX01(抗CD20)分别用作阳性对照和阴性对照。数据显示N4(而不是N1和N2)可以诱导CD73内化。不同IgG同种型之间没有明显差异。
图13还显示N1和N4变体的抗体介导的CD73内化。将NCI-H292细胞与N1和N4变体一起孵育，并通过流式细胞术测量CD73的细胞表面表达。将抗CD73 ref-1抗体和抗CD73 ref-2抗体用作阳性对照，而将HLX01(抗CD20)用作阴性对照。数据指示，在亲和力成熟后，N4变体可以诱导CD73内化，并且N1变体仍然不能诱导CD73内化。
图18A和18B还显示N1和N4靠前变体的抗体介导的CD73内化。将MDA-MB-231(图18A)和NCI-H292(图18B)细胞与抗CD73N1和N4变体一起孵育。孵育后，通过流式细胞术测量CD73的细胞表面表达。将抗CD73 ref-1和抗CD73 ref-2抗体用作阳性对照，而将HLX01(抗CD20)用作阴性对照。这些数据指示，N4#6-3-P和N4#6-4-P可在两种表达CD73的癌细胞中诱导CD73内化。
实施例5.具有不同IGG FC区的选择的抗体的CD73结合。
通过将MDA-MB-231细胞与连续稀释的生物素标记的抗CD73抗体在FACS缓冲液(含2％FBS的PBS)中在4℃一起孵育30分钟来测试抗CD73抗体与细胞表面CD73的结合。将细胞用FACS缓冲液洗涤，并用链霉抗生物素蛋白-FITC在4℃对结合进行30分钟检测。使用Cytomics FC500(贝克曼库尔特公司(Beckman Coulter Inc.))进行流式细胞术分析。
将N1、N2和N4的可变序列克隆到人野生型或C219S突变体IgG2Fc主链中。通过流式细胞术测试N1(图5A)、N2(图5B)、N4(图5C)的不同IgG同种型与表达CD73的人MDA-MB-231细胞的结合。将抗CD73 ref-1抗体和HLX01(抗CD20)分别用作阳性对照和阴性对照。
示于图5A-5C中的数据指示在CD73结合能力方面N1的不同IgG同种型之间不存在差异。数据还显示N2克隆(tmtIgG1同种型)具有比wtIgG2和mtIgG2同种型更好的CD73结合活性，并且N4克隆(tmtIgG1同种型)具有比wtIgG2和mtIgG2同种型更好的CD73结合活性。
实施例6.MDA-MB-231(人三阴性乳腺癌)异种移植小鼠模型中抗CD73先导克隆的 肿瘤生长抑制活性。
使用免疫受损的NOD/SCID(非肥胖糖尿病/严重联合免疫缺陷)小鼠，在异种移植小鼠模型中研究抗人CD73抗体的体内活性。将100μL的PBS中总共1E7个表达CD73的人三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞与100μL的人工基膜(Matrigel)(科宁公司(Corning)，加利福尼亚州(CA)，美国)(以1:1比率)混合，并皮下植入雌性NOD/SCID小鼠(乐斯科公司(Biolasco)，台北，台湾)的两侧胁腹。当肿瘤大小达到150-300mm3(肿瘤接种后第14天)时，每周两次或在指定时间腹膜内给予5mg/kg抗CD73抗体或10mL/kg安慰剂。观察肿瘤并进行测量，直至第45天。将肿瘤体积定义为TV(肿瘤体积)＝(长度x宽度2)/2。
肿瘤生长曲线示于图8A中。第45天的个体肿瘤体积示于图8B中。所有数据点均为平均值±SEM。数据证明，除了N1、N2和N4克隆的tmtIgG1同种型外，所有抗CD73抗体在MDA-MB-231异种移植模型中具有抗肿瘤活性(TGI≥50％)。N1-wtIgG2、N1-mtIgG2、N2-wtIgG2和N2-mtIgG2几乎完全抑制肿瘤生长。
图20还显示MDA-MB-231(人三阴性乳腺癌)异种移植小鼠模型中N1和N4靠前变体的肿瘤生长抑制活性。将小鼠(n＝5只小鼠/组)皮下移植MDA-MB-231细胞。在肿瘤接种后7天，当移植的肿瘤大小达到约100mm3时，给予测试制品的第一剂量。每周两次用10mg/kg和2mg/kg的抗体腹膜内处理小鼠，持续5-6周。所有数据点均为平均值±SEM。这些数据证明，所有N1和N4靠前变体针对体内MDA-MB-231异种移植具有抗肿瘤活性。N4#6-3-P、N4#6-4-P和N1#9-PH具有比抗CD73参考抗体更好的抗肿瘤活性。
实施例7.N1和N4变体对固定化CD73酶活性的作用。
测试N1和N4变体抑制固定化CD73酶活性的能力。将山羊抗人IgG Fd抗体以每孔三百纳克在4℃在白色高亲和力96孔微孔板上涂覆过夜。用(在PBS中的)5％脱脂乳阻断后，添加连续稀释的抗体并将其在室温孵育1小时。除去未结合的抗体，将孔用含有0.05％Tween20的1×PBST洗涤三次。将在测定缓冲液(25mM Tris，5mM MgCl2，pH 7.46)中的二十五微升的100ng/mLCD73-ECD/His蛋白添加到孔中，并在室温再孵育1小时。添加二十五微升的66μMATP和200μM AMP混合物，并在37℃孵育9分钟。将相同体积的CellTiter-Glo试剂添加到反应混合物中并(在白色96孔微孔板中)混合内容物2min。孵育10min后，测量冷光。将抗CD73ref-1抗体、抗CD73 ref-2抗体用作阳性对照，而将HLX01(抗CD20)用作阴性对照。
N1和N4变体对固定化CD73酶活性的作用示于图12中。这些数据指示，在亲和力成熟后，所有N1和N4变体都可以抑制CD73酶活性。N1变体的CD73酶阻断活性优于N4变体和抗CD73 ref-2抗体，但与抗CD73 ref-1抗体是可比的。阻断固定化CD73酶活性：N1#2、N1#9>N4#6-4、N4#6-5>N4#4-3、N4#6-2>N4#6-3、N4#5>N4#6。
实施例8.通过N1和N4靠前变体逆转AMP对T细胞活性的抑制作用。
CD73催化腺苷一磷酸(AMP)胞外产生腺苷。腺苷通过激活A2aR和A2bR受体抑制免疫应答(包括T细胞、NK细胞和树突细胞的免疫应答)。除了CD73酶抑制和内化之外，还检测了抗CD73抗体的CD73抑制对T细胞增殖的功能性作用。
将人T细胞使用MagniSort人T细胞富集试剂盒(eBioscience公司(eBioscience,Inc.))从外周血单核细胞(PBMC)分离，并悬浮于含有50IU/mL的重组人IL-2(eBioscience公司(eBioscience,Inc.))的完全培养基(含有10％FBS的RPMI-1640)中。将体积为100μL的T细胞(5E4细胞/反应)与DynabeadsTM人T-活化因子CD3/CD28(赛默飞世尔科技公司(ThermoFisher Scientific))以1:0.5的细胞比珠的比率进行混合。将AMP(1mM)和连续稀释的抗体以100μL的体积添加到每个反应中。将不含活化珠(未刺激组)、仅含有CD3/CD28珠(刺激组)、或含有CD3/CD28珠和AMP(AMP介导的抑制组)的反应用作测定对照。将抗CD73 ref-1抗体、抗CD73 ref-2抗体和APCP用作阳性对照。将HLX04(抗VEGF)用作阴性对照。将细胞在37℃培养4天。在第4天，收集细胞、洗涤并重悬于新鲜的RPMI-1640培养基中。通过CellTiter-Glo测定来分析T细胞增殖。收集培养物上清液用于细胞因子测量。使用人IFN-γELISAMAXTM Deluxe试剂盒(Biolegend有限公司(BioLegend,Inc.))测量IFN-γ的水平。
通过N1和N4靠前变体逆转AMP对T细胞活性的抑制作用显示于图19A和19B中。CD3+T细胞的增殖之后进行CellTiter-Glo测定(图19A)，并使用人IFN-γELISA MAXTM Deluxe试剂盒(图19B)测量IFN-γ分泌。将抗CD73 ref-1抗体、抗CD73 ref-2抗体和APCP用作阳性对照。将HLX04(抗VEGF)用作阴性对照。图19A和19B中显示的数据表明N1和N4靠前变体能够以剂量依赖性方式增强T细胞增殖和IFN-γ分泌。数据进一步指示N4#6-3-P、N4#6-4-P和N1#9-PH可以减轻AMP介导的T细胞抑制。
实施例9.NCI-H292(人黏液表皮样肺癌)异种移植小鼠模型中N1和N4靠前变体的 肿瘤生长抑制活性。
使用免疫受损的BALB/c裸鼠，在异种移植小鼠模型中研究抗人CD73抗体的体内活性。将100μL的PBS中的总共5E6NCI-H292细胞与100μL的人工基膜(Matrigel)(科宁公司(Corning)，加利福尼亚州(CA)，美国)(以1:1比率)混合，并皮下植入雄性BALB/c裸鼠(乐斯科公司(Biolasco)，台北，台湾)的两侧胁腹。当肿瘤大小达到150-300mm3，每周两次腹膜内给抗予CD73抗体或安慰剂，持续3周。观察肿瘤并每周测量两次。将肿瘤体积定义为TV(肿瘤体积)＝(长度x宽度2)/2。
图21显示NCI-H292(人黏液表皮样肺癌)异种移植小鼠模型中N1和N4靠前变体的肿瘤生长抑制活性。将小鼠(n＝5只小鼠/组)皮下移植NCI-H292细胞。肿瘤接种后3天给予测试制品的第一剂量。每周两次用50、10和2mg/kg的抗体腹膜内处理小鼠，持续3周。所有数据点均为平均值±SEM。数据证明，N4#6-4-P在NCI-H292异种移植模型中具有比其他抗CD73抗体更好的抗肿瘤活性。
实施例10.NCI-H292异种移植肿瘤中N1和N4靠前变体对细胞CD73酶活性的作用。
将100μL的PBS中的总共5E6NCI-H292细胞与100μL的人工基膜(Matrigel)(科宁公司(Corning)，加利福尼亚州(CA)，美国)(以1:1比率)混合，并在给予抗体前4天，皮下植入雄性BALB/c裸鼠(乐斯科公司(Biolasco)，台北，台湾)的两侧胁腹。在第0天用30mg/kg抗体、APCP和安慰剂腹膜内处理小鼠，并在第1、3和7天收集肿瘤。将肿瘤细胞(2E4)重悬于测定缓冲液(25mM Tris，5mM MgCl2，pH 7.46)中，并用ATP(终浓度100μM)和AMP(终浓度300μM)在37℃处理45分钟。将相同体积的CellTiter-Glo试剂添加到反应混合物中并(在白色96孔微孔板中)混合内容物2min。孵育10min后，测量冷光。
图22显示NCI-H292异种移植肿瘤中N1和N4靠前变体对细胞CD73酶活性的作用。测试N1和N4靠前变体在NCI-H292异种移植模型中抑制CD73酶活性的能力。在抗体处理前4天，将小鼠(n＝4只小鼠/组)皮下移植NCI-H292细胞。在第0天腹膜内注射抗体、APCP和安慰剂。在抗体给予后第1、3和7天切除肿瘤。通过CellTiter-Glo测定来测量肿瘤中的CD73酶活性。
数据证明，N1和N4靠前变体可以抑制NCI-H292异种移植模型中的CD73酶活性。N4#6-3-P和N4#6-4-P在肿瘤中阻断CD73酶活性优于N1#9-PH和抗CD73参照抗体。
实施例11.MDA-MB-231异种移植肿瘤中N1和N4靠前变体对CD73表达和细胞CD73酶 活性的作用。
将100μL的PBS中的总共1E7MDA-MB-231细胞与100μL的人工基膜(Matrigel)(科宁公司(Corning)，加利福尼亚州(CA)，美国)(以1:1比率)混合，并在给予抗体前7天，皮下植入雌性NOD/SCID小鼠(乐斯科公司(Biolasco)，台北，台湾)的两侧胁腹。在第0天用2mg/kg抗体和10mL/kg安慰剂腹膜内处理小鼠。在第1、3和7天收集肿瘤。为了测量表面CD73表达水平，将5E4肿瘤细胞重悬于FACS缓冲液(含2％FBS的PBS)中，并用抗人和抗小鼠FcR阻断试剂在4℃处理30分钟。离心后，然后将细胞与小鼠抗人CD73抗体(4G4)在4℃孵育30分钟。将细胞用FACS缓冲液洗涤，并与Alexa 488标记的山羊抗小鼠IgG Fcγ抗体一起在4℃再孵育30分钟。使用CytoFLEX流式细胞仪(贝克曼库尔特公司(Beckman Coulter Inc.))进行流式细胞术分析。将总共2E4肿瘤细胞重悬于测定缓冲液(25mM Tris，5mM MgCl2，pH 7.46)中用于CD73酶活性测量。将细胞悬浮液用ATP(终浓度100μM)和AMP(终浓度300μM)在37℃处理45分钟。将相同体积的CellTiter-Glo试剂添加到反应混合物中并混合2min(在白色96孔微孔板中)。孵育10min后，测量冷光。
图23A和23B显示MDA-MB-231异种移植肿瘤中N1和N4靠前变体对CD73表达和细胞CD73酶活性的作用。通过染色的平均荧光强度(MFI)来测量CD73表达(图23A)，并通过CellTiter-Glo测定来测量肿瘤中的CD73酶活性(图23B)。数据证明，与安慰剂组相比，N4#6-4-P可以下调MDA-MB-231异种移植小鼠模型中表面CD73表达并抑制CD73酶活性。
实施例12.N1和N4靠前变体与小鼠和猴的表达CD73的细胞的交叉结合。
通过将4T1或LLC-MK2细胞(1E5细胞/测试)与连续稀释的抗体在FACS缓冲液(含有2％FBS的PBS)中在4℃孵育30分钟来评估抗CD73抗体的结合。将细胞用FACS缓冲液洗涤，并在4℃用FITC标记的山羊抗人IgG(H+L)抗体对结合再进行30分钟检测。通过染色的平均荧光强度(MFI)测量抗体与细胞表面的结合。使用Cytomics FC500或CytoFLEX流式细胞仪(贝克曼库尔特公司(Beckman Coulter Inc.))进行流式细胞术分析。
图24A和24B显示N1和N4靠前变体与小鼠和猴的表达CD73的细胞的交叉结合。通过流式细胞术测试抗CD73抗体与表达CD73的小鼠乳腺癌4T1细胞(图24A)和猴肾上皮LLC-MK2细胞(图24B)的结合。将HLX01用作阴性对照。这些数据指示，N1和N4靠前变体与猴的表达CD73的细胞具有交叉反应性。N1和N4靠前变体不能与小鼠的CD73交叉结合。
提供前述实施例仅用于说明目的，并且仅是为了清楚理解本发明的原理而提出的实施方式的可能实施例，并且不旨在以任何方式限制本发明的范围。在基本上不背离本发明的精神和原理的情况下，可以对上述的一个或多个实施例进行许多变化和修改。所有此类修改和变化旨在包括在本发明的范围内并且由所附权利要求保护。
SEQUENCE LISTING
<110> 上海复宏汉霖生物技术股份有限公司
上海复宏汉霖生物制药有限公司
上海复宏汉霖生物医药有限公司
<120>针对抗CD73抗体和变体的方法和组合物
<130> SH1903-19P122506
<140>
<141>
<160> 111
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 13
<212> PRT
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<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<212> PRT
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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Thr Gly Thr Ser Ser Asn Ile Gly Thr Gly Tyr Asp Ile His
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 15
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Asn Gly Arg Val
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<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 19
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<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 20
Ala Ala Trp Asp Ile Ser Leu Asn Gly Arg Val
1 5 10
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<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 21
Gln Ser Tyr Asp Ser Gly Leu Arg Gly Trp Tyr
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<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 22
Gln Ser Tyr Asp Ser Gly Leu Arg Gly Trp Ala
1 5 10
<210> 23
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 23
Gln Ser Tyr Asp Ser Gly Leu Arg Gly Leu Val
1 5 10
<210> 24
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 24
Gln Ser Tyr Asp Ser Gly Gln Arg Gly Trp Val
1 5 10
<210> 25
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 25
Asp Tyr Ala Met His
1 5
<210> 26
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 26
Gly Tyr Tyr Trp Ser
1 5
<210> 27
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 27
Ser Tyr Ala Ile Ser
1 5
<210> 28
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 28
Ser Tyr Ala Ile Thr
1 5
<210> 29
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 29
Ser Tyr Ala Ile Ala
1 5
<210> 30
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 30
Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val Arg
1 5 10 15
Gly
<210> 31
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 31
Glu Ile Asn His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210> 32
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 32
Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 33
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 33
Gly Ile Ser Trp Asn Ser Asn Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Pro Val Arg
1 5 10 15
Gly
<210> 34
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 34
Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 35
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 35
Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Val Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 36
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 36
Arg Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 37
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 37
Met Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 38
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 38
Gly Ile Ser Trp Asn Ser Asn Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val Arg
1 5 10 15
Gly
<210> 39
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 39
Asp Met Gly Trp Glu Leu Leu Lys Thr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val
1 5 10 15
<210> 40
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 40
Gly Arg Tyr Asp Phe Trp Ser Gly Tyr Tyr Ala Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10 15
<210> 41
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 41
Asp Gly Ala Val Ala Ala Tyr Asp Ala Phe Asp Ile
1 5 10
<210> 42
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 42
Asp Met Gly Trp Glu Leu Leu Lys Thr Ser Tyr Tyr Gly Met Asp Val
1 5 10 15
<210> 43
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 43
Asp Met Gly Trp Ser Leu Leu Lys Thr Asn Tyr Tyr Gly Met Asp Val
1 5 10 15
<210> 44
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 44
Asp Gly Ala Val Ala Ala Tyr Asp Ala Phe Ser Ile
1 5 10
<210> 45
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 45
Asp Gly Ala Val Ala Ala Tyr Asp Ala Phe Leu Ile
1 5 10
<210> 46
<211> 651
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 46
cagactgtgg tgactcagga gccctcagcg tctgggaccc ccgggcagag ggtcaccatc 60
tcttgttctg gaagcagctc caacatcgga agtaatactg taaactggta ccagcagctc 120
ccaggaacgg cccccaaact cctcatctat agtaataatc agcggccctc aggggtccct 180
gaccgattct ctggctccaa gtctggcatc tcagcctccc tggccatcag tgggctccag 240
tctgaggatg aggctgatta ttactgtgca gcatgggatg acagcctgaa tggtcgggtg 300
ttcggcggag ggaccaagct gaccgtccta ggtcagccca aggctgcccc ctcggtcact 360
ctgttcccgc cctcctctga ggagcttcaa gccaacaagg ccacactggt gtgtctcata 420
agtgacttct acccgggagc cgtgacagtg gcctggaagg cagatagcag ccccgtcaag 480
gcgggagtgg agaccaccac accctccaaa caaagcaaca acaagtacgc ggccagcagc 540
tacctgagcc tgacgcctga gcagtggaag tcccacaaaa gctacagctg ccaggtcacg 600
catgaaggga gcaccgtgga gaagacagtt gcccttacag aatgttcata a 651
<210> 47
<211> 657
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 47
cttaatttta tgctgactca gccccactct gtgtcggagt ctccggggaa gacggtgacc 60
atctcctgca catgcagcgg tggcagaatt gccaacaact atgtgcagtg gtaccagcag 120
cgcccgggca cttcccccac cactgtgatc tatgaggata acctaagacc ctctggggtc 180
cctgatcgct tctctggctc gatcgacagg gcctccaatt ctgcctccct caccatctct 240
gacctgagga ctgaggacga ggctcactat tattgccagt cttatgattc caacgatggg 300
gtggctttcg gcggcgggac caaactgacc gtcctgggtc agcccaaggc tgccccctcg 360
gtcactctgt tcccgccctc ctctgaggag cttcaagcca acaaggccac actggtgtgt 420
ctcataagtg acttctaccc gggagccgtg acagtggcct ggaaggcaga tagcagcccc 480
gtcaaggcgg gagtggagac caccacaccc tccaaacaaa gcaacaacaa gtacgcggcc 540
agcagctatc tgagcctgac gcctgagcag tggaagtccc acagaagcta cagctgccag 600
gtcacgcatg gagggagcac cgtggagaag acagtggccc ttacagaatg ttcataa 657
<210> 48
<211> 654
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 48
caggctgtgc tgactcagcc gtcctcagtg tctggggccc cagggcaaag ggtcaccatc 60
tcctgcaccg ggaccagttc caacatcggg gcaggttatg atatccactg gtatcaacaa 120
cttccaggaa cagcccccaa gctcctcatg taccgtttca ccagacggcc ctcaggggtc 180
cctgaccgat tctctggctc caagtctggc acttctgcct ccctgaccat cactggcctc 240
caggtagagg atgaagctga ttattactgc cagtcctatg acagcggcct gcgtggttgg 300
gtgttcggcg gagggaccaa gctggccgtc ctaggtcagc ccaaggctgc cccctcggtc 360
actctgttcc caccctcctc tgaggagctt caagccaaca aggccacact ggtgtgtctc 420
ataagtgact tctacccggg agccgtgaca gtggcctgga aggcagatag cagccccgtc 480
aaggcgggag tggagaccac cacaccctcc aaacaaagca acagcaagta cgcggccagc 540
agctacctga gcctgacgcc tgagcagtgg aagtcccaca gaagctacag ctgccaggtc 600
acgcatgaag ggagcaccgt ggagaagaca gttgccctta cagaatgttc ataa 654
<210> 49
<211> 330
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 49
cagactgtgg tgactcagga gccctcagcg tctgggaccc ccgggcagag ggtcaccatc 60
tcttgttctg gaagcagctc caacatcgga ggtaatactg taaattggta ccagcagctc 120
ccaggaacgg cccccaaact cctcatctat agtaataatc agcggccctc aggggtccct 180
gaccgattct ctggctccaa gtctggcatc tcagcctccc tggccatcag tgggctccag 240
tctgaggatg aggctgatta ttactgtgca gcttgggatg acagcctgaa tggtcgggtg 300
ttcggcggag ggaccaagct gaccgtccta 330
<210> 50
<211> 330
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 50
cagactgtgg tgactcagga gccctcagcg tctgggaccc ccgggcagag ggtcaccatc 60
tcttgttctg gaagcagctc caacatcgga agtaataagg taaattggta ccagcagctc 120
ccaggaacgg cccccaaact cctcatctat agtaataatc agcggccctc aggggtccct 180
gaccgattct ctggctccaa gtctggcatc tcagcctccc tggccatcag tgggctccag 240
tctgaggatg aggctgatta ttactgtgca gcatgggata ttagcctgaa tggtcgggtg 300
ttcggcggag ggaccaagct gaccgtccta 330
<210> 51
<211> 333
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 51
caggctgtgc tgactcagcc gtcctcagtg tctggggccc cagggcaaag ggtcaccatc 60
tcctgcaccg ggaccagttc caacatcggg gcaggttatg atatccactg gtatcaacaa 120
cttccaggaa cagcccccaa gctcctcatg taccgtttca ccagacggcc ctcaggggtc 180
cctgaccgat tctctggctc caagtctggc acttctgcct ccctgaccat cactggcctc 240
caggtagagg atgaagctga ttattactgc cagtcctatg acagcggcct gcgtggttgg 300
tacttcggcg gagggaccaa gctgaccgtc cta 333
<210> 52
<211> 333
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 52
caggctgtgc tgactcagcc gtcctcagtg tctggggccc cagggcaaag ggtcaccatc 60
tcctgcaccg ggaccagttc caacatcggg gcaggttatg atatccactg gtatcaacaa 120
cttccaggaa cagcccccaa gctcctcatg taccgtttca ccagacggcc ctcaggggtc 180
cctgaccgat tctctggctc caagtctggc acttctgcct ccctgaccat cactggcctc 240
caggtagagg atgaagctga ttattactgc cagtcctatg acagcggcct acgtggttgg 300
gcgttcggcg gagggaccaa gctgaccgtc cta 333
<210> 53
<211> 333
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 53
caggctgtgc tgactcagcc gtcctcagtg tctggggccc cagggcaaag ggtcaccatc 60
tcctgcaccg ggaccagttc caacatcggg gcaggttatg atatccactg gtatcaacaa 120
cttccaggaa cagcccccaa gctcctcatg taccgtttca ccagacggcc ctcaggggtc 180
cctgaccgat tctctggttc caagtctggc acttctgcct ccctgaccat cactggcctc 240
caggtagagg atgaagctga ttattactgc cagtcctatg acagcggcct gcgtggtctt 300
gtgttcggcg gagggaccaa gctgaccgtc cta 333
<210> 54
<211> 333
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 54
caggctgtgc tgactcagcc gtcctcagtg tctggggccc cagggcaaag ggtcaccatc 60
tcctgcaccg ggaccagttc caacatcggg gcaggttatg atatccactg gtatcaacaa 120
cttccaggaa cagcccccaa gctcctcatg taccgtttca ccagacggcc ctcaggggtc 180
cctgaccgat tctctggctc caagtctggc acttctgcct ccctgaccat cactggcctc 240
caggtagagg atgaagctga ttattactgc cagtcctatg acagcggcca gcgtggttgg 300
gtgttcggcg gggggaccaa gctgaccgtc cta 333
<210> 55
<211> 333
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 55
caggctgtgc tgactcagcc gtcctcagtg tctggggccc cagggcaaag ggtcaccatc 60
tcctgcaccg ggaccagttc caacatcggg cagggttatg atatccactg gtatcaacaa 120
cttccaggaa cagcccccaa gctcctcatg taccgtttca cccggcggcc ctcaggggtc 180
cctgaccgat tctctggctc caagtctggc acttctgcct ccctgaccat cactggcctc 240
caggtagagg atgaagctga ttattactgc cagtcctatg acagcggcct acgtggttgg 300
gcgttcggcg gagggaccaa gctgaccgtc cta 333
<210> 56
<211> 333
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 56
caggctgtgc tgactcagcc gtcctcagtg tctggggccc cagggcaaag ggtcaccatc 60
tcctgcaccg ggaccagttc caacatcggg catggttatg atatccactg gtatcaacat 120
cttccaggaa cagcccccaa gctcctcatg taccgtttcg ttagacggcc ctcaggggtc 180
cctgaccgat tctctggctc caagtctggc acttctgcct ccctgaccat cactggcctc 240
caggtagagg atgaagctga ttattactgc cagtcctatg acagcggcca gcgtggttgg 300
gtgttcggcg gagggaccaa gctgaccgtc cta 333
<210> 57
<211> 333
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 57
caggctgtgc tgactcagcc gtcctcagtg tctggggccc cagggcaaag ggtcaccatc 60
tcctgcaccg ggaccagttc caacatcggg ctgggttatg atatccactg gtatcaacat 120
cttccaggaa cagcccccaa gctcctcatg taccgtttcg atagacggcc ctcaggggtc 180
cctgaccgat tctctggctc caagtctggc acttctgcct ccctgaccat cactggcctc 240
caggtagagg atgaagctga ttattactgc cagtcctatg acagcggcca gcgtggttgg 300
gtgttcggcg gagggaccaa gctgaccgtc cta 333
<210> 58
<211> 333
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 58
caggctgtgc tgactcagcc gtcctcagtg tctggggccc cagggcaaag ggtcaccatc 60
tcctgcaccg ggaccagttc caacatcggg gcaggttttg atattcactg gtatcaacaa 120
cttccaggaa cagcccccaa gctcctcatg taccgtttca gtagacggcc ctcaggggtc 180
cctgaccgat tctctggctc caagtctggc acttctgcct ccctgaccat cactggcctc 240
caggtagagg atgaagctga ttattactgc cagtcctatg acagcggcca gcgtggttgg 300
gtgttcggcg gagggaccaa gctgaccgtc cta 333
<210> 59
<211> 333
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 59
caggctgtgc tgactcagcc gtcctcagtg tctggggccc cagggcaaag ggtcaccatc 60
tcctgcaccg ggaccagttc caacatcggg actggttatg atatccactg gtatcaacaa 120
cttccaggaa cagcccccaa gctcctcatg taccggttca ccagacggcc ctcaggggtc 180
cctgaccgat tctctggctc caagtctggc acttctgcct ccctgaccat cactggcctc 240
caggtagagg atgaagctga ttattactgc cagtcctatg acagcggcca gcgtggttgg 300
gtgttcggcg gagggaccaa gctgaccgtc cta 333
<210> 60
<211> 651
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 60
cagactgtgg tgactcagga gccctcagcg tctgggaccc ccgggcagag ggtcaccatc 60
tcttgttctg gaagcagctc caacatcgga ggtaatactg taaattggta ccagcagctc 120
ccaggaacgg cccccaaact cctcatctat agtaataatc agcggccctc aggggtccct 180
gaccgattct ctggctccaa gtctggcatc tcagcctccc tggccatcag tgggctccag 240
tctgaggatg aggctgatta ttactgtgca gcttgggatg acagcctgaa tggtcgggtg 300
ttcggcggag ggaccaagct gaccgtccta ggtcagccca aggctgcccc ctcggtcact 360
ctgttcccgc cctcctctga ggagcttcaa gccaacaagg ccacactggt gtgcctcata 420
agtgacttct acccgggagc cgtgacagtg gcctggaagg cagatagcag ccccgtcaag 480
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tacctgagcc tgacgcctga gcagtggaag tcccacaaaa gctacagctg ccaggtcacg 600
catgaaggga gcaccgtgga gaagacagtt gcccctacag aatgttcata a 651
<210> 61
<211> 651
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 61
cagactgtgg tgactcagga gccctcagcg tctgggaccc ccgggcagag ggtcaccatc 60
tcttgttctg gaagcagctc caacatcgga agtaataagg taaattggta ccagcagctc 120
ccaggaacgg cccccaaact cctcatctat agtaataatc agcggccctc aggggtccct 180
gaccgattct ctggctccaa gtctggcatc tcagcctccc tggccatcag tgggctccag 240
tctgaggatg aggctgatta ttactgtgca gcatgggata ttagcctgaa tggtcgggtg 300
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ctgttcccgc cctcctctga ggagcttcaa gccaacaagg ccacactggt gtgtctcata 420
agtgacttct acccgggagc cgtgacagtg gcctggaagg cagatagcag ccccgtcaag 480
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tacctgagcc tgacgcctga gcagtggaag tcccacaaaa gctacagctg ccaggtcacg 600
catgaaggga gcaccgtgga gaagacagtt gcccctacag aatgttcata a 651
<210> 62
<211> 654
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 62
caggctgtgc tgactcagcc gtcctcagtg tctggggccc cagggcaaag ggtcaccatc 60
tcctgcaccg ggaccagttc caacatcggg ctgggttatg atatccactg gtatcaacaa 120
cttccaggaa cagcccccaa gctcctcatg taccgtttcg atagacggcc ctcaggggtc 180
cctgaccgat tctctggctc caagtctggc acttctgcct ccctgaccat cactggcctc 240
caggtagagg atgaagctga ttattactgc cagtcctatg acagcggcca gcgtggttgg 300
gtgttcggcg gagggaccaa gctgaccgtc ctaggtcagc ccaaggctgc cccctcggtc 360
actctgttcc cgccctcctc tgaggagctt caagccaaca aggccacact ggtgtgtctc 420
ataagtgact tctacccggg agccgtgaca gtggcctgga aggcagatag cagccccgtc 480
aaggcgggag tggagaccac cacaccctcc aaacaaagca acaacaagta cgcggccagc 540
agctacctga gcctgacgcc tgagcagtgg aagtcccaca aaagctacag ctgccaggtc 600
acgcatgaag ggagcaccgt ggagaagaca gttgccccta cagaatgttc ataa 654
<210> 63
<211> 654
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 63
caggctgtgc tgactcagcc gtcctcagtg tctggggccc cagggcaaag ggtcaccatc 60
tcctgcaccg ggaccagttc caacatcggg gcaggttttg atattcactg gtatcaacaa 120
cttccaggaa cagcccccaa gctcctcatg taccgtttca gtagacggcc ctcaggggtc 180
cctgaccgat tctctggctc caagtctggc acttctgcct ccctgaccat cactggcctc 240
caggtagagg atgaagctga ttattactgc cagtcctatg acagcggcca gcgtggttgg 300
gtgttcggcg gagggaccaa gctgaccgtc ctaggtcagc ccaaggctgc cccctcggtc 360
actctgttcc cgccctcctc tgaggagctt caagccaaca aggccacact ggtgtgtctc 420
ataagtgact tctacccggg agccgtgaca gtggcctgga aggcagatag cagccccgtc 480
aaggcgggag tggagaccac cacaccctcc aaacaaagca acaacaagta cgcggccagc 540
agctacctga gcctgacgcc tgagcagtgg aagtcccaca aaagctacag ctgccaggtc 600
acgcatgaag ggagcaccgt ggagaagaca gttgccccta cagaatgttc ataa 654
<210> 64
<211> 375
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 64
gaggtgcagc tggtggagtc cgggggaggc ttggtacagc ctggcaggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cacctttgat gattatgcca tgcactgggt ccggcaagct 120
ccagggaagg gcctggagtg ggtctcaggt attagttgga atagtggtag cataggctat 180
gcggactctg tgaggggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctccctgtat 240
ctgcaaatga acagtctgag agctgaggac acggccttgt attactgtgc aaaagatatg 300
gggtgggagc tactaaaaac ctactactac ggtatggacg tctggggcca agggaccacg 360
gtcaccgtct caagc 375
<210> 65
<211> 369
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 65
caggtgcagc tacagcagtg gggcgcagga ctgttgaagc cttcggagac cctgtccctc 60
acctgcgctg tctatggtgg gtccttcagt ggttactact ggagctggat ccgccagccc 120
ccagggaagg ggctggagtg gattggggaa atcaatcata gtggaagcac caactacaac 180
ccgtccctca agagtcgagt caccatatca gtagacacgt ccaagaacca gttctccctg 240
aagctgagct ctgtgaccgc cgcggacacg gctgtgtatt actgtgcgag aggccggtac 300
gatttttgga gtggttatta tgcgtacttt gactactggg gccagggcac cctggtcacc 360
gtctcaagc 369
<210> 66
<211> 363
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 66
caggtccagc tggtacaatc tggggctgag gtgaagaagt ctgggtcctc ggtgaaggtc 60
tcctgcaagg cttctggagg caccttcagc agctatgcta tcagctgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggaggg atcatcccta tctttggtac agcaaactac 180
gcacagaagt tccagggcag agtcacgatt accgcggacg aatccacgag catagcctac 240
atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagtgatgga 300
gcagtggctg cttatgatgc ttttgatatc tggggccaag ggacaatggt caccgtctca 360
agc 363
<210> 67
<211> 375
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 67
gaggtgcagc tggtggagtc cgggggaggc ttggtacagc ctggcaggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggact cacctttgat gattatgcca tgcactgggt ccggcaagct 120
ccagggaagg gcctggagtg ggtctcaggt attagttgga atagtaatag cataggctat 180
gcggaccctg tgaggggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctccctgtat 240
ctgcaaatga acagtctgag agctgaggac acggccttgt attactgtgc aaaagatatg 300
gggtgggagc tactaaaaac ctcttactac ggtatggacg tctggggcca agggaccacg 360
gtcaccgtct caagc 375
<210> 68
<211> 375
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 68
gaggtgcagc tggtggagtc cgggggaggc ttggtacagc ctggcaggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cacctttgat gattatgcca tgcactgggt ccggctagct 120
ccagggaagg gcctggagtg ggtctcaggt attagttgga atagtggtag cataggctat 180
gcggactctg tgaggggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctccctgtat 240
ctgcaaatga acagtctgag agctgaggac acggccttgt attactgtgc aaaagatatg 300
gggtggagtc tactaaaaac caactactac ggtatggacg tctggggcca agggaccacg 360
gtcaccgtct caagc 375
<210> 69
<211> 363
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 69
caggtccagc tggtacaatc tggggctgag gtgaagaagt ctgggtcctc ggtgaaggtc 60
tcctgcaagg cctctggata taccttcagc agctatgcta tcacttgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggaggg atcatcccta tctttggtac agcaaactac 180
gcacagaagt tccagggcag agtcacgatt accgcggacg aatccacgag catagcctac 240
atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagtgatgga 300
gcagtggctg cttatgatgc ttttgatatt tggggccaag ggacaatggt caccgtctca 360
agc 363
<210> 70
<211> 363
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 70
caggtccagc tggtacaatc tggggctgag gtgaagaagt ctgggtcctc ggtgaaggtc 60
tcctgcaagg cttctggagg caccttcgct agctatgcta ttagttgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggaggg atcatcccta tctttggtac aacaaactac 180
gcacagaagt tccagggcag agtcacgatt accgcggacg aatccacgag catagcctac 240
atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagtgatgga 300
gcagtggctg cttatgatgc ttttgatatt tggggccaag ggacaatggt caccgtctca 360
agc 363
<210> 71
<211> 363
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 71
caggtccagc tggtacaatc tggggctgag gtgaagaagt ctgggtcctc ggtgaaggtc 60
tcctgcaagg cttctggagg caccttcagc agctatgcta tcgcttgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggaggg atcatcccta tctttggtac agtaaactac 180
gcacagaagt tccagggcag agtcacgatt accgcggacg aatccacgag catagcctac 240
atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagtgatgga 300
gcagtggctg cttatgatgc ttttagtata tggggccaag ggacaatggt caccgtctca 360
agc 363
<210> 72
<211> 363
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 72
caggtccagc tggtacaatc tggggctgag gtgaagaagt ctgggtcctc ggtgaaggtc 60
tcctgcaagg cttctggagg cacgttcagc agctatgcta tcagttgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggaggg atcatcccta tctttggtac aacaaactac 180
gcacagaagt tccagggcag agtcacgatt accgcggacg aatccacgag catagcctac 240
atggagctga gtagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagtgatgga 300
gcagtggctg cttatgatgc ttttctgatc tggggccaag ggacaatggt caccgtctca 360
agc 363
<210> 73
<211> 363
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 73
caggtccagc tggtacaatc tggggctgag gtgaagaagt ctgggtcctc ggtgaaggtc 60
tcctgcaagg cttctggagg caccttcgct agctatgcta ttagttgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggaggg atcatcccta tctttggtac agttaactac 180
gcacagaagt tccagggcag agtcacgatt accgcggacg aatccacgag catagcctac 240
atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagtgatgga 300
gcagtggctg cttatgatgc ttttgatatt tggggccaag ggacaatggt caccgtctca 360
agc 363
<210> 74
<211> 363
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 74
caggtccagc tggtacaatc tggggctgag gtgaagaagt ctgggtcctc ggtgaaggtc 60
tcctgcaagg cttctggagg cacgttcagc agctatgcta tcagttgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggaagg atcatcccta tctttggtac aacaaactac 180
gcacagaagt tccagggcag agtcacgatt accgcggacg aatccacgag catagcctac 240
atggagctga gtagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagtgatgga 300
gcagtggctg cttatgatgc ttttctgatc tggggccaag ggacaatggt caccgtctca 360
agc 363
<210> 75
<211> 363
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 75
caggtccagc tggtacaatc tggggctgag gtgaagaagt ctgggtcctc ggtgaaggtc 60
tcctgcaagg cttctggagg cacgttcagc agctatgcta tcagttgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggaggg atcatcccta tctttggtac agcaaactac 180
gcacagaagt tccagggcag agtcacgatt accgcggacg aatccacgag catagcctac 240
atggagctga gtagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagtgatgga 300
gcagtggctg cttatgatgc ttttctgatc tggggccaag ggacaatggt caccgtctca 360
agc 363
<210> 76
<211> 363
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 76
caggtccagc tggtacaatc tggggctgag gtgaagaagt ctgggtcctc ggtgaaggtc 60
tcctgcaagg cttctggagg cacgttcagc agctatgcta tcagttgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggaatg atcatcccta tctttggtac agcaaactac 180
gcacagaagt tccagggcag agtcacgatt accgcggacg aatccacgag catagcctac 240
atggagctga gtagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagtgatggg 300
gcagtggctg cttatgatgc ttttctgatc tggggccaag ggacaatggt caccgtctca 360
agc 363
<210> 77
<211> 363
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 77
caggtccagc tggtacaatc tggggctgag gtgaagaagt ctgggtcctc ggtgaaggtc 60
tcctgcaagg cttctggagg cacgttcagc agctatgcta tcagttgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggaagg atcatcccta tctttggtac aacaaactac 180
gcacagaagt tccagggcag agtcacgatt accgcggacg aatccacgag catagcctac 240
atggagctga gtagcctgag atctgaggac acggccatgt attactgtgc gagtgatgga 300
gcagtggctg cttatgatgc ttttctgatc tggggccaag ggacaatggt caccgtctcg 360
agc 363
<210> 78
<211> 375
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 78
gaggtgcagc tggtggagtc cgggggaggc ttggtacagc ctggcaggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cacctttgat gattatgcca tgcactgggt ccggcaagct 120
ccagggaagg gcctggagtg ggtctcaggt attagttgga atagtaatag cataggctat 180
gcggactctg tgaggggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctccctgtat 240
ctgcaaatga acagtctgag agctgaggac acggccttgt attactgtgc aaaagatatg 300
gggtgggagc tactaaaaac ctcttactac ggtatggacg tctggggcca agggaccacg 360
gtcaccgtct caagc 375
<210> 79
<211> 216
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 79
Gln Thr Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn
20 25 30
Thr Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Ser Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Ile Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu
85 90 95
Asn Gly Arg Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln
100 105 110
Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu
115 120 125
Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr
130 135 140
Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys
145 150 155 160
Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr
165 170 175
Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His
180 185 190
Lys Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys
195 200 205
Thr Val Ala Leu Thr Glu Cys Ser
210 215
<210> 80
<211> 218
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 80
Leu Asn Phe Met Leu Thr Gln Pro His Ser Val Ser Glu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Lys Thr Val Thr Ile Ser Cys Thr Cys Ser Gly Gly Arg Ile Ala Asn
20 25 30
Asn Tyr Val Gln Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Thr Ser Pro Thr Thr
35 40 45
Val Ile Tyr Glu Asp Asn Leu Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Ile Asp Arg Ala Ser Asn Ser Ala Ser Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Asp Leu Arg Thr Glu Asp Glu Ala His Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp
85 90 95
Ser Asn Asp Gly Val Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser
115 120 125
Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp
130 135 140
Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro
145 150 155 160
Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn
165 170 175
Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys
180 185 190
Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Gly Gly Ser Thr Val
195 200 205
Glu Lys Thr Val Ala Leu Thr Glu Cys Ser
210 215
<210> 81
<211> 217
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 81
Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly
20 25 30
Tyr Asp Ile His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Met Tyr Arg Phe Thr Arg Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Leu
65 70 75 80
Gln Val Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Gly
85 90 95
Leu Arg Gly Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Ala Val Leu Gly
100 105 110
Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu
115 120 125
Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe
130 135 140
Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val
145 150 155 160
Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Ser Lys
165 170 175
Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser
180 185 190
His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu
195 200 205
Lys Thr Val Ala Leu Thr Glu Cys Ser
210 215
<210> 82
<211> 110
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 82
Gln Thr Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Gly Asn
20 25 30
Thr Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Ser Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Ile Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu
85 90 95
Asn Gly Arg Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 83
<211> 110
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 83
Gln Thr Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn
20 25 30
Lys Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Ser Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Ile Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Ile Ser Leu
85 90 95
Asn Gly Arg Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 84
<211> 111
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 84
Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly
20 25 30
Tyr Asp Ile His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Met Tyr Arg Phe Thr Arg Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Leu
65 70 75 80
Gln Val Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Gly
85 90 95
Leu Arg Gly Trp Tyr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 85
<211> 111
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 85
Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly
20 25 30
Tyr Asp Ile His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Met Tyr Arg Phe Thr Arg Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Leu
65 70 75 80
Gln Val Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Gly
85 90 95
Leu Arg Gly Trp Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 86
<211> 111
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 86
Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly
20 25 30
Tyr Asp Ile His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Met Tyr Arg Phe Thr Arg Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Leu
65 70 75 80
Gln Val Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Gly
85 90 95
Leu Arg Gly Leu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 87
<211> 111
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 87
Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly
20 25 30
Tyr Asp Ile His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Met Tyr Arg Phe Thr Arg Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Leu
65 70 75 80
Gln Val Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Gly
85 90 95
Gln Arg Gly Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 88
<211> 111
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 88
Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asn Ile Gly Gln Gly
20 25 30
Tyr Asp Ile His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Met Tyr Arg Phe Thr Arg Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Leu
65 70 75 80
Gln Val Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Gly
85 90 95
Leu Arg Gly Trp Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 89
<211> 111
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 89
Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asn Ile Gly His Gly
20 25 30
Tyr Asp Ile His Trp Tyr Gln His Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Met Tyr Arg Phe Val Arg Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Leu
65 70 75 80
Gln Val Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Gly
85 90 95
Gln Arg Gly Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 90
<211> 111
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 90
Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asn Ile Gly Leu Gly
20 25 30
Tyr Asp Ile His Trp Tyr Gln His Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Met Tyr Arg Phe Asp Arg Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Leu
65 70 75 80
Gln Val Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Gly
85 90 95
Gln Arg Gly Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 91
<211> 111
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 91
Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly
20 25 30
Phe Asp Ile His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Met Tyr Arg Phe Ser Arg Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Leu
65 70 75 80
Gln Val Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Gly
85 90 95
Gln Arg Gly Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 92
<211> 111
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 92
Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asn Ile Gly Thr Gly
20 25 30
Tyr Asp Ile His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Met Tyr Arg Phe Thr Arg Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Leu
65 70 75 80
Gln Val Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Gly
85 90 95
Gln Arg Gly Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 93
<211> 216
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 93
Gln Thr Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Gly Asn
20 25 30
Thr Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Ser Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Ile Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu
85 90 95
Asn Gly Arg Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln
100 105 110
Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu
115 120 125
Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr
130 135 140
Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys
145 150 155 160
Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr
165 170 175
Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His
180 185 190
Lys Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys
195 200 205
Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
210 215
<210> 94
<211> 216
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 94
Gln Thr Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn
20 25 30
Lys Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Ser Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Ile Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Ile Ser Leu
85 90 95
Asn Gly Arg Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln
100 105 110
Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu
115 120 125
Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr
130 135 140
Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys
145 150 155 160
Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr
165 170 175
Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His
180 185 190
Lys Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys
195 200 205
Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
210 215
<210> 95
<211> 217
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 95
Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asn Ile Gly Leu Gly
20 25 30
Tyr Asp Ile His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Met Tyr Arg Phe Asp Arg Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Leu
65 70 75 80
Gln Val Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Gly
85 90 95
Gln Arg Gly Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
100 105 110
Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu
115 120 125
Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe
130 135 140
Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val
145 150 155 160
Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys
165 170 175
Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser
180 185 190
His Lys Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu
195 200 205
Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
210 215
<210> 96
<211> 217
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 96
Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly
20 25 30
Phe Asp Ile His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Met Tyr Arg Phe Ser Arg Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Leu
65 70 75 80
Gln Val Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Gly
85 90 95
Gln Arg Gly Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
100 105 110
Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu
115 120 125
Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe
130 135 140
Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val
145 150 155 160
Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys
165 170 175
Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser
180 185 190
His Lys Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu
195 200 205
Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
210 215
<210> 97
<211> 125
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 97
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Asp Met Gly Trp Glu Leu Leu Lys Thr Tyr Tyr Tyr Gly Met
100 105 110
Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 98
<211> 123
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 98
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asn His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Gly Arg Tyr Asp Phe Trp Ser Gly Tyr Tyr Ala Tyr Phe Asp Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 99
<211> 121
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 99
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Ser Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Ile Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ser Asp Gly Ala Val Ala Ala Tyr Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 100
<211> 125
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 100
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Leu Thr Phe Asp Asp Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Asn Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Pro Val
50 55 60
Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Asp Met Gly Trp Glu Leu Leu Lys Thr Ser Tyr Tyr Gly Met
100 105 110
Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 101
<211> 125
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 101
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Leu Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Asp Met Gly Trp Ser Leu Leu Lys Thr Asn Tyr Tyr Gly Met
100 105 110
Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 102
<211> 121
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 102
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Ser Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Ile Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ser Asp Gly Ala Val Ala Ala Tyr Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 103
<211> 121
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 103
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Ser Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ala Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Ile Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ser Asp Gly Ala Val Ala Ala Tyr Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 104
<211> 121
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 104
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Ser Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Val Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Ile Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ser Asp Gly Ala Val Ala Ala Tyr Asp Ala Phe Ser Ile Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 105
<211> 121
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 105
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Ser Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Ile Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ser Asp Gly Ala Val Ala Ala Tyr Asp Ala Phe Leu Ile Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 106
<211> 121
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 106
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Ser Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ala Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Val Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Ile Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ser Asp Gly Ala Val Ala Ala Tyr Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 107
<211> 121
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 107
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Ser Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Ile Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ser Asp Gly Ala Val Ala Ala Tyr Asp Ala Phe Leu Ile Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
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<211> 121
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 108
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Ser Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Ile Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ser Asp Gly Ala Val Ala Ala Tyr Asp Ala Phe Leu Ile Trp Gly
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Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 109
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Ser Gly Ser
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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
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Gly Met Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Ile Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 110
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Ser Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Ile Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
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100 105 110
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115 120
<210> 111
<211> 125
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 111
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
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50 55 60
Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Asp Met Gly Trp Glu Leu Leu Lys Thr Ser Tyr Tyr Gly Met
100 105 110
Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120 125

Claims (54)

1.一种抗CD73抗体(N1)，该抗体包含基本上由以下组成的轻链(LC)可变结构域序列：a)包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的CDR-L1，b)包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的CDR-L2，和c)包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的CDR-L3，和基本上由以下组成的重链可变结构域(VH)序列：a)包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的CDR-H1，b)包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的CDR-H2，和c)包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列的CDR-H3。
2.如权利要求1所述的抗CD73抗体，其中该抗CD73抗体N1的该LC包含SEQ ID NO:46的核酸序列编码的SEQ ID NO:79的氨基酸序列，并且其中该抗CD73抗体N1的该VH包含SEQ IDNO:64的核酸序列编码的SEQ ID NO:97的氨基酸序列。
3.一种抗CD73抗体(N2)，该抗体包含基本上由以下组成的轻链(LC)可变结构域序列：a)包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的CDR-L1，b)包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CDR-L2，和c)包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的CDR-L3，和基本上由以下组成的重链可变结构域(VH)序列：a)包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列的CDR-H1，b)包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列的CDR-H2，和c)包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列的CDR-H3。
4.如权利要求3所述的抗CD73抗体，其中该抗CD73抗体N2的该LC包含SEQ ID NO:47的核酸序列编码的SEQ ID NO:80的氨基酸序列，并且其中该抗CD73抗体N2的该VH包含SEQ IDNO:65的核酸序列编码的SEQ ID NO:98的氨基酸序列。
5.一种抗CD73抗体(N4)，该抗体包含基本上由以下组成的轻链(LC)可变结构域序列：a)包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR-L1，b)包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR-L2，和c)包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的CDR-L3，和基本上由以下组成的重链可变结构域(VH)序列：a)包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列的CDR-H1，b)包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列的CDR-H2，和c)包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列的CDR-H3。
6.如权利要求5所述的抗CD73抗体，其中该抗CD73抗体N4的该LC包含SEQ ID NO:48的核酸序列编码的SEQ ID NO:81的氨基酸序列，并且其中该抗CD73抗体N4的该VH包含SEQ IDNO:66的核酸序列编码的SEQ ID NO:99的氨基酸序列。
7.一种抗CD73抗体变体(N1#2)，该抗体变体包含基本上由以下组成的轻链可变结构域(VL)序列：a)包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的CDR-L1，b)包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的CDR-L2，和c)包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的CDR-L3，和基本上由以下组成的重链可变结构域(VH)序列：a)包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的CDR-H1，b)包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的CDR-H2，和c)包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列的CDR-H3。
8.如权利要求7所述的抗CD73抗体变体，其中该抗CD73抗体变体N1#2的该VL包含SEQID NO:49的核酸序列编码的SEQ ID NO:82的氨基酸序列，并且其中该抗CD73抗体变体N1#2的该VH包含SEQ ID NO:67的核酸序列编码的SEQ ID NO:100的氨基酸序列。
9.一种抗CD73抗体变体(N1#9)，该抗体变体包含基本上由以下组成的轻链可变结构域(VL)序列：a)包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的CDR-L1，b)包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的CDR-L2，和c)包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的CDR-L3，和基本上由以下组成的重链可变结构域(VH)序列：a)包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的CDR-H1，b)包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的CDR-H2，和c)包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列的CDR-H3。
10.如权利要求9所述的抗CD73抗体变体，其中该抗CD73抗体变体N1#9的该VL包含SEQID NO:50的核酸序列编码的SEQ ID NO:83的氨基酸序列，并且其中该抗CD73抗体变体N1#9的该VH包含SEQ ID NO:68的核酸序列编码的SEQ ID NO:101的氨基酸序列。
11.一种抗CD73抗体变体(N4#1)，该抗体变体包含基本上由以下组成的轻链可变结构域(VL)序列：a)包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR-L1，b)包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR-L2，和c)包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的CDR-L3，和基本上由以下组成的重链可变结构域(VH)序列：a)包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列的CDR-H1，b)包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列的CDR-H2，和c)包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列的CDR-H3。
12.如权利要求11所述的抗CD73抗体变体，其中该抗CD73抗体变体N4#1的该VL包含SEQID NO:51的核酸序列编码的SEQ ID NO:84的氨基酸序列，并且其中该抗CD73抗体变体N4#1的该VH包含SEQ ID NO:69的核酸序列编码的SEQ ID NO:102的氨基酸序列。
13.一种抗CD73抗体变体(N4#4)，该抗体变体包含基本上由以下组成的轻链可变结构域(VL)序列：a)包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR-L1，b)包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR-L2，和c)包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的CDR-L3，和基本上由以下组成的重链可变结构域(VH)序列：a)包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列的CDR-H1，b)包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列的CDR-H2，和c)包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列的CDR-H3。
14.如权利要求13所述的抗CD73抗体变体，其中该抗CD73抗体变体N4#4的该VL包含SEQID NO:52的核酸序列编码的SEQ ID NO:85的氨基酸序列，
并且其中该抗CD73抗体变体N4#4的该VH包含SEQ ID NO:70的核酸序列编码的SEQ IDNO:103的氨基酸序列。
15.一种抗CD73抗体变体(N4#5)，该抗体变体包含基本上由以下组成的轻链可变结构域(VL)序列：a)包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR-L1，b)包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR-L2，和c)包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的CDR-L3，和基本上由以下组成的重链可变结构域(VH)序列：a)包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的CDR-H1，b)包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列的CDR-H2，和c)包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列的CDR-H3。
16.如权利要求15所述的抗CD73抗体变体，其中该抗CD73抗体变体N4#5的该VL包含SEQID NO:53的核酸序列编码的SEQ ID NO:86的氨基酸序列，并且其中该抗CD73抗体变体N4#5的该VH包含SEQ ID NO:71的核酸序列编码的SEQ ID NO:104的氨基酸序列。
17.一种抗CD73抗体变体(N4#6)，该抗体变体包含基本上由以下组成的轻链可变结构域(VL)序列：a)包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR-L1，b)包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR-L2，和c)包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列的CDR-L3，和基本上由以下组成的重链可变结构域(VH)序列：a)包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列的CDR-H1，b)包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列的CDR-H2，和c)包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列的CDR-H3。
18.如权利要求17所述的抗CD73抗体变体，其中该抗CD73抗体变体N4#6的该VL包含SEQID NO:54的核酸序列编码的SEQ ID NO:87的氨基酸序列，并且其中该抗CD73抗体变体N4#6的该VH包含SEQ ID NO:72的核酸序列编码的SEQ ID NO:105的氨基酸序列。
19.一种抗CD73抗体变体(N4#4-3)，该抗体变体包含基本上由以下组成的轻链可变结构域(VL)序列：a)包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDR-L1，b)包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR-L2，和c)包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的CDR-L3，和基本上由以下组成的重链可变结构域(VH)序列：a)包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列的CDR-H1，b)包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列的CDR-H2，和c)包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列的CDR-H3。
20.如权利要求19所述的抗CD73抗体变体，其中该抗CD73抗体变体N4#4-3的该VL包含SEQ ID NO:55的核酸编码的SEQ ID NO:88的氨基酸序列，并且其中该抗CD73抗体变体N4#4-3的该VH包含SEQ ID NO:73的核酸编码的SEQ ID NO:106的氨基酸序列。
21.一种抗CD73抗体变体(N4#6-2)，该抗体变体包含基本上由以下组成的轻链可变结构域(VL)序列：a)包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的CDR-L1，b)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CDR-L2，和c)包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列的CDR-L3，和基本上由以下组成的重链可变结构域(VH)序列：a)包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列的CDR-H1，b)包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列的CDR-H2，和c)包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列的CDR-H3。
22.如权利要求21所述的抗CD73抗体变体，其中该抗CD73抗体变体N4#6-2的该VL包含SEQ ID NO:56的核酸序列编码的SEQ ID NO:89的氨基酸序列，并且其中该抗CD73抗体变体N4#6-2的该VH包含SEQ ID NO:74的核酸序列编码的SEQ ID NO:107的氨基酸序列。
23.一种抗CD73抗体变体(N4#6-3)，该抗体变体包含基本上由以下组成的轻链可变结构域(VL)序列：a)包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的CDR-L1，b)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR-L2，和c)包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列的CDR-L3，和基本上由以下组成的重链可变结构域(VH)序列：a)包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列的CDR-H1，b)包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列的CDR-H2，和c)包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列的CDR-H3。
24.如权利要求23所述的抗CD73抗体变体，其中该抗CD73抗体变体N4#6-3的该VL包含SEQ ID NO:57的核酸序列编码的SEQ ID NO:90的氨基酸序列，并且其中该抗CD73抗体变体N4#6-3的该VH包含SEQ ID NO:75的核酸序列编码的SEQ ID NO:108的氨基酸序列。
25.一种抗CD73抗体变体(N4#6-4)，该抗体变体包含基本上由以下组成的轻链可变结构域(VL)序列：a)包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的CDR-L1，b)包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR-L2，和c)包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列的CDR-L3，和基本上由以下组成的重链可变结构域(VH)序列：a)包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列的CDR-H1，b)包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的CDR-H2，和c)包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列的CDR-H3。
26.如权利要求25所述的抗CD73抗体变体，其中该抗CD73抗体变体N4#6-4的该VL包含SEQ ID NO:58的核酸序列编码的SEQ ID NO:91的氨基酸序列，并且其中该抗CD73抗体变体N4#6-4的该VH包含SEQ ID NO:76的核酸序列编码的SEQ ID NO:109的氨基酸序列。
27.一种抗CD73抗体变体(N4#6-5)，该抗体变体包含基本上由以下组成的轻链可变结构域(VL)序列：a)包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的CDR-L1，b)包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR-L2，和c)包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列的CDR-L3，和基本上由以下组成的重链可变结构域(VH)序列：a)包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列的CDR-H1，b)包含SEQ IDNO:36的氨基酸序列的CDR-H2，和c)包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列的CDR-H3。
28.如权利要求27所述的抗CD73抗体变体，其中该抗CD73抗体变体N4#6-5的该VL包含SEQ ID NO:59的核酸序列编码的92的氨基酸序列，并且其中该抗CD73抗体变体N4#6-5的该VH包含SEQ ID NO:77的核酸序列编码的SEQ ID NO:110的氨基酸序列。
29.一种抗CD73抗体变体(N1#2-P)，该抗体变体包含基本上由以下组成的轻链(LC)可变结构域序列：a)包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的CDR-L1，b)包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的CDR-L2，和c)包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的CDR-L3，和基本上由以下组成的重链可变结构域(VH)序列：a)包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的CDR-H1，b)包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列的CDR-H2，和c)包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列的CDR-H3。
30.如权利要求29所述的抗CD73抗体变体，其中该抗CD73抗体变体N1#2-P的该LC包含SEQ ID NO:60的核酸序列编码的SEQ ID NO:93的氨基酸序列，并且其中该抗CD73抗体变体N1#2-P的该VH包含SEQ ID NO:78的核酸序列编码的SEQ ID NO:111的氨基酸序列。
31.一种抗CD73抗体变体(N1#9-PH)，该抗体变体包含基本上由以下组成的轻链(LC)可变结构域序列：a)包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的CDR-L1，b)包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的CDR-L2，和c)包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的CDR-L3，和基本上由以下组成的重链可变结构域(VH)序列：a)包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的CDR-H1，b)包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的CDR-H2，和c)包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列的CDR-H3。
32.如权利要求31所述的抗CD73抗体变体，其中该抗CD73抗体变体N1#9-PH的该LC包含SEQ ID NO:61的核酸序列编码的SEQ ID NO:94的氨基酸序列，并且其中该抗CD73抗体变体N1#9-PH的该VH包含SEQ ID NO:68的核酸序列编码的SEQ ID NO:101的氨基酸序列。
33.一种抗CD73抗体变体(N4#6-3-P)，该抗体变体包含基本上由以下组成的轻链(LC)可变结构域序列：a)包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的CDR-L1，b)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR-L2，和c)包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列的CDR-L3，和基本上由以下组成的重链可变结构域(VH)序列：a)包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列的CDR-H1，b)包含SEQ IDNO:32的氨基酸序列的CDR-H2，和c)包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列的CDR-H3。
34.如权利要求33所述的抗CD73抗体变体，其中该抗CD73抗体变体N4#6-3-P的该LC包含SEQ ID NO:62的核酸序列编码的SEQ ID NO:95的氨基酸序列，并且其中该抗CD73抗体变体N4#6-3-P的该VH包含SEQ ID NO:75的核酸序列编码的SEQ ID NO:108的氨基酸序列。
35.一种抗CD73抗体变体(N4#6-4-P)，该抗体变体包含基本上由以下组成的轻链(LC)可变结构域序列：a)包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的CDR-L1，b)包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR-L2，和c)包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列的CDR-L3，和基本上由以下组成的重链可变结构域(VH)序列：a)包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列的CDR-H1，b)包含SEQ IDNO:37的氨基酸序列的CDR-H2，和c)包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列的CDR-H3。
36.如权利要求35所述的抗CD73抗体变体，其中该抗CD73抗体变体N4#6-4-P的该LC包含SEQ ID NO:63的核酸序列编码的SEQ ID NO:96的氨基酸序列，并且其中该抗CD73抗体变体N4#6-4-P的该VH包含SEQ ID NO:76的核酸序列编码的SEQ ID NO:109的氨基酸序列。
37.根据权利要求1-36中任一项所述的抗CD73抗体或变体，其中所述抗CD73抗体或变体在N-糖基化位点处包含一个或多个突变。
38.根据权利要求1-37中任一项所述的抗CD73抗体或变体的抗原结合片段，其中该抗原结合片段选自下组，该组由以下组成：Fab、Fab’、F(ab')2、单链Fv(scFv)、Fv片段、双抗体、和线性抗体。
39.根据权利要求1-38中任一项所述的抗CD73抗体、变体或其抗原结合片段，其中该抗CD73抗体、变体、或抗原结合片段是多特异性抗体、变体、或抗原结合片段。
40.根据权利要求1-39中任一项所述的抗CD73抗体、变体、或其抗原结合片段，该抗CD73抗体、变体、或其抗原结合片段与治疗剂缀合。
41.根据权利要求1-39中任一项所述的抗CD73抗体、变体、或其抗原结合片段，该抗CD73抗体、变体、或其抗原结合片段与标记缀合。
42.根据权利要求41所述的抗CD73抗体、变体、或其抗原结合片段，其中该标记选自下组，该组由以下组成：放射性同位素、荧光染料和酶。
43.一种分离的核酸分子，该分离的核酸分子编码根据权利要求1-38中任一项所述的抗CD73抗体、变体、或其抗原结合片段。
44.一种表达载体，该表达载体包含根据权利要求43所述的核酸分子。
45.一种细胞，该细胞包含根据权利要求44所述的表达载体。
46.一种产生根据权利要求1-38中任一项所述的抗CD73抗体、变体、或其抗原结合片段的方法，该方法包括培养根据权利要求45所述的细胞和从该细胞培养物回收该抗CD73抗体、变体、或其抗原结合片段。
47.一种组合物，该组合物包含根据权利要求1-38中任一项所述的抗CD73抗体、变体、或其抗原结合片段和药学上可接受的载体。
48.根据权利要求1-38中任一项所述的抗CD73抗体、变体、或其抗原结合片段在制备如下药物中的用途，该药物用于通过检测与CD73蛋白结合的抗CD73抗体、变体、或其抗原结合片段而在来自患者的样品中检测CD73蛋白。
49.根据权利要求48所述的用途，其中该抗CD73抗体、变体、或其抗原结合片段在免疫组织化学测定(IHC)或在ELISA测定中使用。
50.根据权利要求1-38中任一项所述的抗CD73抗体、变体、或其抗原结合片段或根据权利要求47所述的组合物在制造用于在受试者中治疗癌症的药物中的用途。
51.根据权利要求50所述的用途，其中该癌症选自下组，该组由以下组成：黑色素瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)、头颈癌、尿路上皮癌、三阴性乳腺癌(TNBC)、胃癌、经典型霍奇金淋巴瘤(cHL)、非霍奇金淋巴瘤原发性纵隔B-细胞淋巴瘤(NHL PMBCL)、间皮瘤、卵巢癌、肺癌、食管癌、鼻咽癌(NPC)、胆道癌、结肠直肠癌、乳腺癌、***、甲状腺癌、***癌、膀胱癌、胰腺癌、唾液腺癌和表达CD73的恶性肿瘤。
52.根据权利要求1-38中任一项所述的抗CD73抗体、变体、或其抗原结合片段或根据权利要求47所述的组合物在制造用于在受试者中治疗纤维化的药物中的用途。
53.根据权利要求50-52中任一项所述的用途，其中向该受试者进一步给予选自下组的治疗剂，该组由以下组成：抗肿瘤剂、化学治疗剂、生长抑制剂、细胞毒性剂、和免疫治疗剂。
54.根据权利要求50-52中任一项所述的用途，其中向该受试者进一步给予放射疗法或外科手术。
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