JP2023551113A - 二重特異性抗体及びその応用 - Google Patents

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Abstract

本発明は、二重特異性抗体及びその応用を提供する。本発明に係る二重特異性抗体又は抗原結合断片は、２つ以上の抗原又は同一抗原の２つ以上のエピトープに結合することができる。本発明の抗体又は抗原結合断片は、炎症性疾患、自己免疫性疾患、がん又は脊髄損傷など、様々な疾患の治療に用いることができ、関連疾患の診断及び予後に用いることもできる。

Description

本発明は、生物医薬分野に属し、特に二重特異性抗体及びその応用に関する。
がん免疫療法は、近年のがん治療における革命的なブレークスルーであり、生命科学分野の研究で多くの注目を集めた。また、より多くの新規抗体薬の承認に伴い、免疫療法は、従来の治療法を補完するものから、中心的且つ標準的ながん治療法へと変化している。免疫チェックポイント（Ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ）を標的として、Ｔ細胞機能を活性化させ、それによって獲得免疫能力を高めがんを克服する方法において、ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１経路を中心とした抗体療法の開発は、すでにこの分野のホットトピックとなっている。生体に炎症又は感染が発生した場合、プログラム細胞死リガンド１（Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｄｅａｔｈ－ｌｉｇａｎｄ １、ＰＤ－Ｌ１）は誘導されて、造血細胞、内皮細胞又は上皮細胞に発現し、Ｔ細胞、Ｂ細胞及び単核細胞に発現されるプログラム細胞死受容体１（Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｄｅａｔｈ １、ＰＤ－１）と結合することにより免疫応答を抑制することができる。ＰＤ－１細胞質領域は、２つのチロシンベースのシグナル伝達ドメインであるＩＴＩＭ（免疫受容体チロシン阻害性モチーフ）とＩＴＳＭ（免疫受容体チロシンスイッチモチーフ）を含む。ＰＤ－Ｌ１は、膀胱がん、乳がん、結腸がん、肺がん、メラノーマ、卵巣がん、胃がん、甲状腺がん、原発性縦隔大細胞型Ｂ細胞リンパ腫及び古典的ホジキンリンパ腫などの様々な固形腫瘍及び血液腫瘍を含む多くのがんにおいて過剰発現される。腫瘍細胞に過剰発現されるＰＤ－Ｌ１は、Ｔ細胞上のＰＤ－１と結合し、ＰＤ－１のＩＴＩＭドメインを活性化させ、Ｔ細胞の機能障害と不全を引き起こし、細胞傷害性Ｔ細胞が腫瘍細胞を効果的に標的するのを阻止し、免疫系に「ｄｏｎ’ｔ ｆｉｎｄ ｍｅ（私を見つけないで）」というシグナルを送り、腫瘍細胞に適応免疫耐性を獲得させ、それによって腫瘍の浸潤を促進し、予後不良をもたらす。
自然免疫系は、感染と細胞悪性転化を防ぐ最初の非特異的防衛線である。自然免疫系に、単核細胞、マクロファージ及び樹状細胞は、貪食作用（ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ）により、抗原提示細胞（ａｎｔｉｇｅｎ ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ ｃｅｌｌｓ、ＡＰＣｓ）の役割を果たす。一方、貪食作用を通じて腫瘍細胞を飲み込むＡＰＣｓの能力は、自然免疫と適応免疫をつなぐ不可欠な架け橋である。食作用チェックポイント（Ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔｓ、例えばＣＤ４７－ＳＩＲＰα）を標的として調節とすることは、がん免疫療法の開発に新たな方法を提供した。ＣＤ４７（ｉｎｔｅｇｒｉｎ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ、ＩＡＰ、ＣＤ４７）は、正常細胞の表面で広く発現され、マクロファージの表面のＳＩＲＰα（Ｓｉｇｎａｌ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｐｒｏｔｅｉｎ α、ＳＩＲＰα）と結合することで、健康細胞がマクロファージに「食べられる」ことがないように、「ｄｏｎ’ｔ ｅａｔ ｍｅ（私を食べないで）」というシグナルを送る。がん細胞は、この機序を利用して、その表面でＣＤ４７を過剰発現させ、マクロファージにそれらを「正常細胞」として扱うように仕掛けて、自然免疫の監視及びマクロファージによって媒介される貪食攻撃から逃れる。研究によって、甲状腺がん、卵巣がん、前立腺がん、子宮頸がん、膀胱がん、頭頸がん、胃がん、急性骨髄性白血病、Ｂ細胞とＴ細胞急性白血病、非ホジキンリンパ腫などのほとんどの腫瘍細胞は、ＣＤ４７を高発現し、且つＣＤ４７の過剰発現は、臨床予後の差に関わることが証明されている。
モノクローナル抗体免疫療法は、一部の患者に持続的な延命効果をもたらし、患者の治癒への希望を実現してくれた。がんや他の多種の疾患に対する鋭意検討に従って、疾患の発生と発症には複数のシグナル伝達経路と機序が関与していることが認識されており、モノクローナル抗体の単一の刺激又は阻害では腫瘍を徹底的に殺す効果が達成できず、更に単剤療法の応答率が限られていることが分かった。二重特異性抗体（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ、ＢｓＡｂ）は、２つの抗原又は１つの抗原の２つの異なるエピトープに同時に結合し、異なるシグナル伝達経路を遮断又は活性化させることができ、免疫細胞が腫瘍細胞を殺すことをより効果的に媒介するため、モノクローナル抗体薬ひいては併用薬よりも優れた治療効果が得られる可能性がある。抗体薬の研究開発技術の急速な発展に伴い、二重特異性抗体も研究開発のブームを迎え、複数の二重特異性抗体が既に臨床開発段階にあり、３つの二重特異性抗体が承認されている。２００９年、欧州連合は、がん性腹水の治療用Ｔｒｉｏｍａｂという構造を持つ最初の治療性二重特異性抗体であるＣａｔｕｍａｘｏｍａｂ（ＣＤ３とＥｐＣＡＭを標的とする）を承認した。モノクローナル抗体に比べて、二重特異性抗体は、特異性が高く、標的性が強く、投与量が少ないなどの利点があり、腫瘍の臨床治療において非常に有意義であるだけでなく、炎症性疾患の治療においても重大な突破だと言え、応用の見通しが非常に広い。
既知の知識によると、ＰＤ－Ｌ１とＣＤ４７タンパク質は、腫瘍細胞に同時に過剰発現され、ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ１とＣＤ４７／ＳＩＲＰα経路を介して、自然免疫系の監視から逃れ、適応免疫耐性を得ることが分かっている。従って、ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ１とＣＤ４７／ＳＩＲＰα経路を同時に抵抗し、自然免疫系及び適応免疫系を活性化させると、より優れた腫瘍抑制効果を発揮する可能性がある。
本発明は、多価と多重特異性抗体又は抗原結合断片及びその応用を提供する。本発明は、ＰＤ－Ｌ１へのより良好な結合性及び良好なドラッグアビリティを有する新規抗ＰＤ－Ｌ１抗体を提供する。また、本発明は、ヒト赤血球と結合せず、ヒト赤血球の凝集を引き起こさず、良好な標的特異性を有し、且つ副作用が小さい新規抗ＣＤ４７抗体を提供する。また、本発明は、共通の軽鎖を有する「ノブ・イントゥ・ホール」（Ｋｎｏｂｓ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅｓ）対称ＩｇＧ様二重特異性抗体構造を採用し、異なる重鎖及び軽鎖の正確な組み立てを実現し、二重特異性抗体の生産率を増加させ、体外の培養細胞で安定的に発現しやすく、複雑な生産工程を必要としない。また、本発明で採用される二重特異性抗体構造は、各抗原結合部位とそれらに対応する異なるエピトープとの結合親和性を確保でき、且つ、異なるエピトープに結合した場合、互いに結合に干渉することがなく、良好なドラッガビリティーを有する。更に、本発明の二重特異性抗体は、安定的な物理的・生物学的性質を有するため、該抗体にはより良好な生産性と開発性が期待できる。
いくつかの実施形態において、本発明は、二重特異性抗体又は抗原結合断片を提供する。本発明で提供される抗体又は抗原結合断片は、２つ以上の抗原、又は同じ抗原の２つ以上のエピトープ、又は同じエピトープの２つ以上のコピーに結合することができる。
いくつかの実施形態において、本発明は、二重特異性抗体又は抗原結合断片を提供し、上記抗体又は抗原結合断片は、ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する可変領域ａを含み、そのうち、上記可変領域ａは、
（ａ） 配列番号４～８の何れか１項で示されるアミノ酸配列、又は配列番号４～８の何れか１項で示されるアミノ酸配列と比べて１つ又は複数の保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含むＶＨａ ＣＤＲ１と、
（ｂ） 配列番号９～１８の何れか１項で示されるアミノ酸配列、又は配列番号９～１４の何れか１項で示されるアミノ酸配列と比べて１つ又は複数の保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含むＶＨａ ＣＤＲ２と、
（ｃ） 配列番号１９又は２０で示されるアミノ酸配列、又は配列番号１９又は２０で示されるアミノ酸配列と比べて１つ又は複数の保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含むＶＨａ ＣＤＲ３と、
（ｄ） 配列番号３６～４０の何れか１項で示されるアミノ酸配列、又は配列番号３６～４０の何れか１項で示されるアミノ酸配列と比べて１つ又は複数の保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含むＶＬａ ＣＤＲ１と、
（ｅ） 配列番号４１～４４の何れか１項で示されるアミノ酸配列、又は配列番号４１～４４の何れか１項で示されるアミノ酸配列と比べて１つ又は複数の保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含むＶＬａ ＣＤＲ２と、
（ｆ） 配列番号４５～４８の何れか１項で示されるアミノ酸配列、又は配列番号４５～４８の何れか１項で示されるアミノ酸配列と比べて１つ又は複数の保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含むＶＬａ ＣＤＲ３と、
のうちの１種又は複数種のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、上記可変領域ａは、重鎖可変領域ａ（ＶＨａ）を含み、上記重鎖可変領域ａは、配列番号４～８の何れか１項で示されるアミノ酸配列を含むＶＨａ ＣＤＲ１と、配列番号９～１８の何れか１項で示されるアミノ酸配列を含むＶＨａ ＣＤＲ２と、配列番号１９又は２０で示されるアミノ酸配列を含むＶＨａ ＣＤＲ３と、を含む。
いくつかの実施形態において、上記可変領域ａは、軽鎖可変領域ａ（ＶＬａ）を含み、上記軽鎖可変領域ａは、配列番号３６～４０の何れか１項で示されるアミノ酸配列を含むＶＬａ ＣＤＲ１と、配列番号４１～４４の何れか１項で示されるアミノ酸配列を含むＶＬａ ＣＤＲ２と、配列番号４５～４８の何れか１項で示されるアミノ酸配列を含むＶＬａ ＣＤＲ３と、を含む。
いくつかの実施形態において、上記可変領域ａは、ＶＨａ ＣＤＲ１、ＶＨａ ＣＤＲ２及びＶＨａ ＣＤＲ３を含むＶＨａと、ＶＬａ ＣＤＲ１、ＶＬａ ＣＤＲ２及びＶＬａ ＣＤＲ３を含むＶＬａと、を含む。そのうち、ＶＨａ ＣＤＲ１は、配列番号４～８の何れか１項で示されるアミノ酸配列を含み、ＶＨａ ＣＤＲ２は、配列番号９～１８の何れか１項で示されるアミノ酸配列を含み、ＶＨａ ＣＤＲ３は、配列番号１９又は２０で示されるアミノ酸配列を含み、ＶＬａ ＣＤＲ１は、配列番号３６～４０の何れか１項で示されるアミノ酸配列を含み、ＶＬａ ＣＤＲ２は、配列番号４１～４４の何れか１項で示されるアミノ酸配列を含み、ＶＬａ ＣＤＲ３は、配列番号４５～４８の何れか１項で示されるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、上記ＶＨａ ＣＤＲ１は、配列番号４で示されるアミノ酸配列、又は配列番号４で示されるアミノ酸配列と比べて１つ又は複数の保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含み、上記ＶＨａ ＣＤＲ２は、配列番号９～１４の何れか１項で示されるアミノ酸配列、又は配列番号９～１４の何れか１項で示されるアミノ酸配列と比べて１つ又は複数の保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含み、上記ＶＨａ ＣＤＲ３は、配列番号１９で示されるアミノ酸配列、又は配列番号１９で示されるアミノ酸配列と比べて１つ又は複数の保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、上記ＶＨａ ＣＤＲ１は、配列番号４で示されるアミノ酸配列、又は配列番号４で示されるアミノ酸配列と比べて１つ又は複数の保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含み、上記ＶＨａ ＣＤＲ２は、配列番号１４で示されるアミノ酸配列、又は配列番号１４で示されるアミノ酸配列と比べて１つ又は複数の保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含み、上記ＶＨａ ＣＤＲ３は、配列番号１９で示されるアミノ酸配列、又は配列番号１９で示されるアミノ酸配列と比べて１つ又は複数の保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、上記ＶＬａ ＣＤＲ１は、配列番号３６で示されるアミノ酸配列、又は配列番号３６で示されるアミノ酸配列と比べて１つ又は複数の保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含み、上記ＶＬａ ＣＤＲ２は、配列番号４１で示されるアミノ酸配列、又は配列番号４１で示されるアミノ酸配列と比べて１つ又は複数の保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含み、上記ＶＬａ ＣＤＲ３は、配列番号４５で示されるアミノ酸配列、又は配列番号４５で示されるアミノ酸配列と比べて１つ又は複数の保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、上記ＶＨａ ＣＤＲ１は、配列番号４で示されるアミノ酸配列、又は配列番号４で示されるアミノ酸配列と比べて１つ又は複数の保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含み、上記ＶＨａ ＣＤＲ２は、配列番号１４で示されるアミノ酸配列、又は配列番号１４で示されるアミノ酸配列と比べて１つ又は複数の保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含み、上記ＶＨａ ＣＤＲ３は、配列番号１９で示されるアミノ酸配列、又は配列番号１９で示されるアミノ酸配列と比べて１つ又は複数の保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含み、上記ＶＬａ ＣＤＲ１は、配列番号３６で示されるアミノ酸配列、又は配列番号３６で示されるアミノ酸配列と比べて１つ又は複数の保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含み、上記ＶＬａ ＣＤＲ２は、配列番号４１で示されるアミノ酸配列、又は配列番号４１で示されるアミノ酸配列と比べて１つ又は複数の保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含み、上記ＶＬａ ＣＤＲ３は、配列番号４５で示されるアミノ酸配列、又は配列番号４５で示されるアミノ酸配列と比べて１つ又は複数の保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、上記ＶＨａは、配列番号４９～６３の何れか１項で示されるアミノ酸配列、又は配列番号４９～６３の何れか１項で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列、又は配列番号４９～６３の何れか１項で示されるアミノ酸配列と比べて１つ又は複数の保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、上記ＶＨａは、配列番号５４で示されるアミノ酸配列、又は配列番号５４で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列、又は配列番号５４で示されるアミノ酸配列と比べて１つ又は複数の保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、上記ＶＬａは、配列番号７５～８０の何れか１項で示されるアミノ酸配列、又は配列番号７５～８０の何れか１項で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列、又は配列番号７５～８０の何れか１項で示されるアミノ酸配列と比べて１つ又は複数の保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、上記ＶＬａは、配列番号７５で示されるアミノ酸配列、又は配列番号７５で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列、又は配列番号７５で示されるアミノ酸配列と比べて１つ又は複数の保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、上記可変領域ａは、ＶＨａ及びＶＬａを含む。上記ＶＨａは、配列番号５４で示されるアミノ酸配列、又は配列番号５４で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列、又は配列番号５４で示されるアミノ酸配列と比べて１つ又は複数の保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含み、上記ＶＬａは、配列番号７５で示されるアミノ酸配列、又は配列番号７５で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列、又は配列番号７５で示されるアミノ酸配列と比べて１つ又は複数の保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、本発明は、二重特異性抗体又は抗原結合断片を提供し、上記抗体又は抗原結合断片は、軽鎖定常領域ａ（ＣＬａ）、及び重鎖定常領域ａ（ＣＨａ）を更に含む。
いくつかの実施形態において、上記ＣＨａは、配列番号８１、８３～８６の何れか１項で示されるアミノ酸配列、又は配列番号８１、８３～８６の何れか１項で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列、又は配列番号８１、８３～８６の何れか１項で示されるアミノ酸配列と比べて１つ又は複数の保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、上記ＣＬａは、配列番号８２で示されるアミノ酸配列、又は配列番号８２で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列、又は配列番号８２で示されるアミノ酸配列と比べて１つ又は複数の保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、本発明は、二重特異性抗体又は抗原結合断片を提供し、上記抗体又は抗原結合断片は、１本の本明細書に記載の重鎖ａ、１本の重鎖ｘ及び１本の軽鎖ａと１本の軽鎖ｘを含み、上記重鎖ａと上記軽鎖ａは、ペアリングしてＰＤ－Ｌ１抗原結合部位を形成し、上記重鎖ｘと上記軽鎖ｘは、ペアリングして他の抗原結合部位を形成する。いくつかの実施形態において、上記重鎖ａは、本明細書に記載のＶＨａ ＣＤＲ１、ＶＨａ ＣＤＲ２及びＶＨａ ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態において、上記重鎖ａは、本明細書に記載のＶＨａを含む。いくつかの実施形態において、上記重鎖ａは、本明細書に記載のＶＨａ及びＣＨａを含む。いくつかの実施形態において、上記軽鎖ａは、本明細書に記載のＶＬａ ＣＤＲ１、ＶＬａ ＣＤＲ２及びＶＬａ ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態において、上記軽鎖ａは、本明細書に記載のＶＬａを含む。いくつかの実施形態において、上記軽鎖ａは、本明細書に記載のＶＬａ及びＣＬａを含む。いくつかの実施形態において、上記重鎖ｘは、本明細書に記載の重鎖ｂと同じである。いくつかの実施形態において、上記軽鎖ｘは、上記軽鎖ａと同じである。
いくつかの実施形態において、上記他の抗原は、ＣＤ４７、ＬＡＧ３、ＴＧＦβ、ＣＴＬＡ－４、４－１ＢＢ、ＰＤ１、ＴＩＧＩＴ、ＫＩＲ、ｃ－Ｍｅｔ、ＶＩＳＴＡ又はＢＣＭＡである。いくつかの実施形態において、上記他の抗原は、ＣＤ４７である。
いくつかの実施形態において、上記重鎖ｘのＣＤＲは、Ｍａｇｒｏｌｉｍａｂ、ＡＯ－１７６（Ａｒｃｈ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ）、ＴＪＣ４（天境生物）、ＡＫ１１７（康方生物）又はＩＢＩ１８８（信達生物）などの重鎖ＣＤＲから選ばれる。いくつかの実施形態において、上記重鎖ｘの可変領域は、Ｍａｇｒｏｌｉｍａｂ、ＡＯ－１７６（Ａｒｃｈ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ）、ＴＪＣ４（天境生物）、ＡＫ１１７（康方生物）又はＩＢＩ１８８（信達生物）などの重鎖可変領域から選ばれる。いくつかの実施形態において、上記軽鎖ｘのＣＤＲは、Ｍａｇｒｏｌｉｍａｂ、ＡＯ－１７６（Ａｒｃｈ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ）、ＴＪＣ４（天境生物）、ＡＫ１１７（康方生物）又はＩＢＩ１８８（信達生物）などの軽鎖ＣＤＲから選ばれる。いくつかの実施形態において、上記軽鎖ｘの可変領域は、Ｍａｇｒｏｌｉｍａｂ、ＡＯ－１７６（Ａｒｃｈ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ）、ＴＪＣ４（天境生物）、ＡＫ１１７（康方生物）又はＩＢＩ１８８（信達生物）などの軽鎖可変領域から選ばれる。いくつかの実施形態において、上記軽鎖ｘは、上記軽鎖ａと同じである。
いくつかの実施形態において、上記重鎖ａは、配列番号９２又は９４で示されるアミノ酸配列、又は配列番号９２又は９４で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列、又は配列番号９２又は９４で示されるアミノ酸配列と比べて１つ又は複数の保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、本発明に提供される二重特異性抗体又は抗原結合断片とＰＤ－Ｌ１との親和性指数は、ＫＤ≦１０ｎＭである。いくつかの実施形態において、本発明に提供される二重特異性抗体又は抗原結合断片とＰＤ－Ｌ１との親和性指数は、ＫＤ≦１ｎＭである。いくつかの実施形態において、本発明に提供される二重特異性抗体又は抗原結合断片とＰＤ－Ｌ１との親和性指数は、ＫＤ≦０．５ｎＭである。
別の態様において、本発明は、二重特異性抗体又は抗原結合断片を提供し、上記抗体又は抗原結合断片は、ＣＤ４７に特異的に結合する可変領域ｂを含み、そのうち、上記可変領域ｂは、
（ｇ） 配列番号２１～２３の何れか１項で示されるアミノ酸配列、又は配列番号２１～２３の何れか１項で示されるアミノ酸配列と比べて１つ又は複数の保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含むＶＨｂ ＣＤＲ１と、
（ｈ） 配列番号２４～２８の何れか１項で示されるアミノ酸配列、又は配列番号２４～２８の何れか１項で示されるアミノ酸配列と比べて１つ又は複数の保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含むＶＨｂ ＣＤＲ２と、
（ｉ） 配列番号２９～３５の何れか１項で示されるアミノ酸配列、又は配列番号２９～３５の何れか１項で示されるアミノ酸配列と比べて１つ又は複数の保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含むＶＨｂ ＣＤＲ３と、
（ｊ） 配列番号３６～４０の何れか１項で示されるアミノ酸配列、又は配列番号３６～４０の何れか１項で示されるアミノ酸配列と比べて１つ又は複数の保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含むＶＬｂ ＣＤＲ１と、
（ｋ） 配列番号４１～４４の何れか１項で示されるアミノ酸配列、又は配列番号４１～４４の何れか１項で示されるアミノ酸配列と比べて１つ又は複数の保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含むＶＬｂ ＣＤＲ２と、
（ｌ） 配列番号４５～４８の何れか１項で示されるアミノ酸配列、又は配列番号４５～４８の何れか１項で示されるアミノ酸配列と比べて１つ又は複数の保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含むＶＬｂ ＣＤＲ３と、
のうちの１種又は複数種のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、上記可変領域ｂは、重鎖可変領域ｂ（ＶＨｂ）を含み、上記重鎖可変領域ｂは、配列番号２１～２３の何れか１項で示されるアミノ酸配列を含むＶＨｂ ＣＤＲ１と、配列番号２４～２８の何れか１項で示されるアミノ酸配列を含むＶＨｂ ＣＤＲ２と、配列番号２９～３５の何れか１項で示されるアミノ酸配列を含むＶＨｂ ＣＤＲ３と、を含む。
いくつかの実施形態において、上記可変領域ｂは、軽鎖可変領域ｂ（ＶＬｂ）を含み、上記軽鎖可変領域ｂは、配列番号３６～４０の何れか１項で示されるアミノ酸配列を含むＶＬｂ ＣＤＲ１と、配列番号４１～４４の何れか１項で示されるアミノ酸配列を含むＶＬｂ ＣＤＲ２と、配列番号４５～４８の何れか１項で示されるアミノ酸配列を含むＶＬｂ ＣＤＲ３と、を含む。
いくつかの実施形態において、上記可変領域ｂは、ＶＨｂ ＣＤＲ１、ＶＨｂ ＣＤＲ２及びＶＨｂ ＣＤＲ３を含むＶＨｂと、ＶＬｂ ＣＤＲ１、ＶＬｂ ＣＤＲ２及びＶＬｂ ＣＤＲ３を含むＶＬｂと、を含む。そのうち、ＶＨｂ ＣＤＲ１は、配列番号２１～２３の何れか１項で示されるアミノ酸配列を含み、ＶＨｂ ＣＤＲ２は、配列番号２４～２８の何れか１項で示されるアミノ酸配列を含み、ＶＨｂ ＣＤＲ３は、配列番号２９～３５の何れか１項で示されるアミノ酸配列を含み、ＶＬｂ ＣＤＲ１は、配列番号３６～４０の何れか１項で示されるアミノ酸配列を含み、ＶＬｂ ＣＤＲ２は、配列番号４１～４４の何れか１項で示されるアミノ酸配列を含み、ＶＬｂ ＣＤＲ３は、配列番号４５～４８の何れか１項で示されるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、上記ＶＨｂ ＣＤＲ１は、配列番号２１で示されるアミノ酸配列、又は配列番号２１で示されるアミノ酸配列と比べて１つ又は複数の保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含み、上記ＶＨｂ ＣＤＲ２は、配列番号２４で示されるアミノ酸配列、又は配列番号２４で示されるアミノ酸配列と比べて１つ又は複数の保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含み、上記ＶＨｂ ＣＤＲ３は、配列番号２９で示されるアミノ酸配列、又は配列番号２９で示されるアミノ酸配列と比べて１つ又は複数の保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、上記ＶＬｂ ＣＤＲ１は、配列番号３６で示されるアミノ酸配列、又は配列番号３６で示されるアミノ酸配列と比べて１つ又は複数の保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含み、上記ＶＬｂ ＣＤＲ２は、配列番号４１で示されるアミノ酸配列、又は配列番号４１で示されるアミノ酸配列と比べて１つ又は複数の保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含み、上記ＶＬｂ ＣＤＲ３は、配列番号４５で示されるアミノ酸配列、又は配列番号４５で示されるアミノ酸配列と比べて１つ又は複数の保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、上記ＶＨｂ ＣＤＲ１は、配列番号２１で示されるアミノ酸配列、又は配列番号２１で示されるアミノ酸配列と比べて１つ又は複数の保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含み、上記ＶＨｂ ＣＤＲ２は、配列番号２４で示されるアミノ酸配列、又は配列番号２４で示されるアミノ酸配列と比べて１つ又は複数の保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含み、上記ＶＨｂ ＣＤＲ３は、配列番号２９で示されるアミノ酸配列、又は配列番号２９で示されるアミノ酸配列と比べて１つ又は複数の保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含み、上記ＶＬｂ ＣＤＲ１は、配列番号３６で示されるアミノ酸配列、又は配列番号３６で示されるアミノ酸配列と比べて１つ又は複数の保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含み、上記ＶＬｂ ＣＤＲ２は、配列番号４１で示されるアミノ酸配列、又は配列番号４１で示されるアミノ酸配列と比べて１つ又は複数の保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含み、上記ＶＬｂ ＣＤＲ３は、配列番号４５で示されるアミノ酸配列、又は配列番号４５で示されるアミノ酸配列と比べて１つ又は複数の保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、上記ＶＨｂは、配列番号６４～７４の何れか１項で示されるアミノ酸配列、又は配列番号６４～７４の何れか１項で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列、又は配列番号６４～７４の何れか１項で示されるアミノ酸配列と比べて１つ又は複数の保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、上記ＶＨｂは、配列番号６４で示されるアミノ酸配列、又は配列番号６４で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列、又は配列番号６４で示されるアミノ酸配列と比べて１つ又は複数の保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、上記ＶＬｂは、配列番号７５～８０の何れか１項で示されるアミノ酸配列、又は配列番号７５～８０の何れか１項で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列、又は配列番号７５～８０の何れか１項で示されるアミノ酸配列と比べて１つ又は複数の保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、上記ＶＬｂは、配列番号７５で示されるアミノ酸配列、又は配列番号７５で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列、又は配列番号７５で示されるアミノ酸配列と比べて１つ又は複数の保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、上記可変領域ｂは、ＶＨｂ及びＶＬｂを含む。上記ＶＨｂは、配列番号６４で示されるアミノ酸配列、又は配列番号６４で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列、又は配列番号６４で示されるアミノ酸配列と比べて１つ又は複数の保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含み、上記ＶＬｂは、配列番号７５で示されるアミノ酸配列、又は配列番号７５で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列、又は配列番号７５で示されるアミノ酸配列と比べて１つ又は複数の保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、本発明は、二重特異性抗体又は抗原結合断片を提供し、上記抗体又は抗原結合断片は、軽鎖定常領域ｂ（ＣＬｂ）、及び重鎖定常領域ｂ（ＣＨｂ）を更に含む。
いくつかの実施形態において、上記ＣＨｂは、配列番号８１、８３～８６の何れか１項で示されるアミノ酸配列、又は配列番号８１、８３～８６の何れか１項で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列、又は配列番号８１、８３～８６の何れか１項で示されるアミノ酸配列と比べて１つ又は複数の保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、上記ＣＬｂは、配列番号８２で示されるアミノ酸配列、又は配列番号８２で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列、又は配列番号８２で示されるアミノ酸配列と比べて１つ又は複数の保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、本発明は、二重特異性抗体又は抗原結合断片を提供し、上記抗体又は抗原結合断片は、１本の本明細書に記載の重鎖ｂ、１本の重鎖ｙ及び１本の本明細書に記載の軽鎖ｂと１本の軽鎖ｙを含み、上記重鎖ｂと上記軽鎖ｂは、ペアリングしてＣＤ４７抗原結合部位を形成し、上記重鎖ｙと上記軽鎖ｙは、ペアリングして他の抗原結合部位を形成する。いくつかの実施形態において、上記重鎖ｂは、本明細書に記載のＶＨｂ ＣＤＲ１、ＶＨｂ ＣＤＲ２及びＶＨｂ ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態において、上記重鎖ｂは、本明細書に記載のＶＨｂを含む。いくつかの実施形態において、上記重鎖ｂは、本明細書に記載のＶＨｂ及びＣＨｂを含む。いくつかの実施形態において、上記軽鎖ｂは、本明細書に記載のＶＬｂ ＣＤＲ１、ＶＬｂ CDR２及びＶＬｂ ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態において、上記軽鎖ｂは、本明細書に記載のＶＬｂを含む。いくつかの実施形態において、上記軽鎖ｂは、本明細書に記載のＶＬｂ及びＣＬｂを含む。いくつかの実施形態において、上記軽鎖ｙは、上記軽鎖ｂと同じである。
いくつかの実施形態において、上記他の抗原は、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－１、ＢＣＭＡ、ＭＳＬＮ、ＣＤ１９、ＣＤ２０又はＶＥＧＦである。いくつかの実施形態において、上記他の抗原は、ＰＤ－Ｌ１である。
いくつかの実施形態において、上記重鎖ｙのＣＤＲは、Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ、Ａｖｅｌｕｍａｂ、Ｄｕｒｖａｌｕｍａｂ、Ｅｎｖａｆｏｌｉｍａｂ又はＣｏｓｉｂｅｌｉｍａｂなどの重鎖ＣＤＲから選ばれる。いくつかの実施形態において、上記重鎖ｙの可変領域は、Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ、Ａｖｅｌｕｍａｂ、Ｄｕｒｖａｌｕｍａｂ、Ｅｎｖａｆｏｌｉｍａｂ又はＣｏｓｉｂｅｌｉｍａｂなどの重鎖可変領域から選ばれる。いくつかの実施形態において、上記軽鎖ｙのＣＤＲは、Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ、Ａｖｅｌｕｍａｂ、Ｄｕｒｖａｌｕｍａｂ、Ｅｎｖａｆｏｌｉｍａｂ又はＣｏｓｉｂｅｌｉｍａｂなどの軽鎖ＣＤＲから選ばれる。いくつかの実施形態において、上記軽鎖の可変領域は、Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ、Ａｖｅｌｕｍａｂ、Ｄｕｒｖａｌｕｍａｂ、Ｅｎｖａｆｏｌｉｍａｂ又はＣｏｓｉｂｅｌｉｍａｂなどの軽鎖可変領域から選ばれる。いくつかの実施形態において、上記重鎖ｙは、本明細書に記載の重鎖ａと同じである。いくつかの実施形態において、上記軽鎖ｙは、上記軽鎖ｂと同じである。
いくつかの実施形態において、上記重鎖ｂは、配列番号９３又は９５で示されるアミノ酸配列、又は配列番号９３又は９５で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列、又は配列番号９３又は９５で示されるアミノ酸配列と比べて１つ又は複数の保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、本発明に提供される二重特異性抗体又は抗原結合断片とＣＤ４７との親和性指数は、ＫＤ≦３０ｎＭである。いくつかの実施形態において、本発明に提供される二重特異性抗体又は抗原結合断片とＣＤ４７との親和性指数は、ＫＤ≦１０ｎＭである。いくつかの実施形態において、本発明に提供される二重特異性抗体又は抗原結合断片とＣＤ４７との親和性指数は、ＫＤ≦５ｎＭである。
いくつかの実施形態において、本発明に提供される二重特異性抗体又は抗原結合断片は、赤血球の凝集を引き起こさない。
別の態様において、本発明は、二重特異性抗体又は抗原結合断片を提供し、上記抗体又は抗原結合断片は、ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する可変領域ａ、及びＣＤ４７に特異的に結合する可変領域ｂを含む。
そのうち、上記可変領域ａは、
（ａ） 配列番号４～８の何れか１項で示されるアミノ酸配列、又は配列番号４～８の何れか１項で示されるアミノ酸配列と比べて１つ又は複数の保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含むＶＨａ ＣＤＲ１と、
（ｂ） 配列番号９～１８の何れか１項で示されるアミノ酸配列、又は配列番号９～１８の何れか１項で示されるアミノ酸配列と比べて１つ又は複数の保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含むＶＨａ ＣＤＲ２と、
（ｃ） 配列番号１９又は２０で示されるアミノ酸配列、又は配列番号１９又は２０で示されるアミノ酸配列と比べて１つ又は複数の保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含むＶＨａ ＣＤＲ３と、
（ｄ） 配列番号３６～４０の何れか１項で示されるアミノ酸配列、又は配列番号３６～４０の何れか１項で示されるアミノ酸配列と比べて１つ又は複数の保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含むＶＬａ ＣＤＲ１と、
（ｅ） 配列番号４１～４４の何れか１項で示されるアミノ酸配列、又は配列番号４１～４４の何れか１項で示されるアミノ酸配列と比べて１つ又は複数の保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含むＶＬａ ＣＤＲ２と、
（ｆ） 配列番号４５～４８の何れか１項で示されるアミノ酸配列、又は配列番号４５～４８の何れか１項で示されるアミノ酸配列と比べて１つ又は複数の保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含むＶＬａ ＣＤＲ３と、
のうちの１種又は複数種のアミノ酸配列を含む。
上記可変領域ｂは、
（ｇ） 配列番号２１～２３の何れか１項で示されるアミノ酸配列、又は配列番号２１～２３の何れか１項で示されるアミノ酸配列と比べて１つ又は複数の保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含むＶＨｂ ＣＤＲ１と、
（ｈ） 配列番号２４～２８の何れか１項で示されるアミノ酸配列、又は配列番号２４～２８の何れか１項で示されるアミノ酸配列と比べて１つ又は複数の保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含むＶＨｂ ＣＤＲ２と、
（ｉ） 配列番号２９～３５の何れか１項で示されるアミノ酸配列、又は配列番号２９～３５の何れか１項で示されるアミノ酸配列と比べて１つ又は複数の保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含むＶＨｂ ＣＤＲ３と、
（ｊ） 配列番号３６～４０の何れか１項で示されるアミノ酸配列、又は配列番号３６～４０の何れか１項で示されるアミノ酸配列と比べて１つ又は複数の保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含むＶＬｂ ＣＤＲ１と、
（ｋ） 配列番号４１～４４の何れか１項で示されるアミノ酸配列、又は配列番号４１～４４の何れか１項で示されるアミノ酸配列と比べて１つ又は複数の保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含むＶＬｂ ＣＤＲ２と、
（ｌ） 配列番号４５～４８の何れか１項で示されるアミノ酸配列、又は配列番号４５～４８の何れか１項で示されるアミノ酸配列と比べて１つ又は複数の保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含むＶＬｂ ＣＤＲ３と、
のうちの１種又は複数種のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、上記可変領域ａは、重鎖可変領域ａ（ＶＨａ）を含み、上記重鎖可変領域ａは、配列番号４～８の何れか１項で示されるアミノ酸配列を含むＶＨａ ＣＤＲ１と、配列番号９～１８の何れか１項で示されるアミノ酸配列を含むＶＨａ ＣＤＲ２と、配列番号１９又は２０で示されるアミノ酸配列を含むＶＨａ ＣＤＲ３と、を含み、上記可変領域ｂは、重鎖可変領域ｂ（ＶＨｂ）を含み、上記重鎖可変領域ｂは、配列番号２１～２３の何れか１項で示されるアミノ酸配列を含むＶＨｂ ＣＤＲ１と、配列番号２４～２８の何れか１項で示されるアミノ酸配列を含むＶＨｂ ＣＤＲ２と、配列番号２９～３５の何れか１項で示されるアミノ酸配列を含むＶＨｂ ＣＤＲ３と、を含む。
いくつかの実施形態において、上記可変領域ａは、軽鎖可変領域ａ（ＶＬａ）を含み、上記軽鎖可変領域ａは、配列番号３６～４０の何れか１項で示されるアミノ酸配列を含むＶＬａ ＣＤＲ１と、配列番号４１～４４の何れか１項で示されるアミノ酸配列を含むＶＬａ ＣＤＲ２と、配列番号４５～４８の何れか１項で示されるアミノ酸配列を含むＶＬａ ＣＤＲ３と、を含み、上記可変領域ｂは、軽鎖可変領域ｂ（ＶＬｂ）を含み、上記軽鎖可変領域ｂは、配列番号３６～４０の何れか１項で示されるアミノ酸配列を含むＶＬｂ ＣＤＲ１と、配列番号４１～４４の何れか１項で示されるアミノ酸配列を含むＶＬｂ ＣＤＲ２と、配列番号４５～４８の何れか１項で示されるアミノ酸配列を含むＶＬｂ ＣＤＲ３と、を含む。
いくつかの実施形態において、上記可変領域ａは、ＶＨａ及びＶＬａを含み、上記可変領域ｂは、ＶＨｂ及びＶＬｂを含む。上記ＶＨａは、ＶＨａ ＣＤＲ１、ＶＨａ ＣＤＲ２及びＶＨａ ＣＤＲ３を含み、上記ＶＬａは、ＶＬａ ＣＤＲ１、ＶＬａ ＣＤＲ２及びＶＬａ ＣＤＲ３を含む。そのうち、ＶＨａ ＣＤＲ１は、配列番号４～８の何れか１項で示されるアミノ酸配列を含み、ＶＨａ ＣＤＲ２は、配列番号９～１８の何れか１項で示されるアミノ酸配列を含み、ＶＨａ ＣＤＲ３は、配列番号１９又は２０で示されるアミノ酸配列を含む。上記ＶＨｂは、ＶＨｂ ＣＤＲ１、ＶＨｂ ＣＤＲ２及びＶＨｂ ＣＤＲ３を含み、上記ＶＬｂは、ＶＬｂ ＣＤＲ１、ＶＬｂ ＣＤＲ２及びＶＬｂ ＣＤＲ３を含む。そのうち、ＶＨｂ ＣＤＲ１は、配列番号２１～２３の何れか１項で示されるアミノ酸配列を含み、ＶＨｂ ＣＤＲ２は、配列番号２４～２８の何れか１項で示されるアミノ酸配列を含み、ＶＨｂ ＣＤＲ３は、配列番号２９～３５の何れか１項で示されるアミノ酸配列を含み、ＶＬｂ ＣＤＲ１は、配列番号３６～４０の何れか１項で示されるアミノ酸配列を含み、ＶＬｂ ＣＤＲ２は、配列番号４１～４４の何れか１項で示されるアミノ酸配列を含み、ＶＬｂ ＣＤＲ３は、配列番号４５～４８の何れか１項で示されるアミノ酸配列を含む。ＶＬａ ＣＤＲ１及びＶＬｂ ＣＤＲ１は、独立的に配列番号３６～４０の何れか１項で示されるアミノ酸配列から選ばれるアミノ酸配列を含み、ＶＬａ ＣＤＲ２及びＶＬｂ ＣＤＲ２は、独立的に配列番号４１～４４の何れか１項で示されるアミノ酸配列から選ばれるアミノ酸配列を含み、ＶＬａ ＣＤＲ３及びＶＬｂ ＣＤＲ３は、独立的に配列番号４５～４８の何れか１項で示されるアミノ酸配列から選ばれるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、上記ＶＨａ ＣＤＲ１は、配列番号４で示されるアミノ酸配列、又は配列番号４で示されるアミノ酸配列と比べて１つ又は複数の保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含み、上記ＶＨａ ＣＤＲ２は、配列番号９～１４の何れか１項で示されるアミノ酸配列、又は配列番号９～１４の何れか１項で示されるアミノ酸配列と比べて１つ又は複数の保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含み、上記ＶＨａ ＣＤＲ３は、配列番号１９で示されるアミノ酸配列、又は配列番号１９で示されるアミノ酸配列と比べて１つ又は複数の保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含み、上記ＶＨｂ ＣＤＲ１は、配列番号２１で示されるアミノ酸配列、又は配列番号２１で示されるアミノ酸配列と比べて１つ又は複数の保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含み、上記ＶＨｂ ＣＤＲ２は、配列番号２４で示されるアミノ酸配列、又は配列番号２４で示されるアミノ酸配列と比べて１つ又は複数の保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含み、上記ＶＨｂ ＣＤＲ３は、配列番号２９で示されるアミノ酸配列、又は配列番号２９で示されるアミノ酸配列と比べて１つ又は複数の保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、上記ＶＨａ ＣＤＲ１は、配列番号４で示されるアミノ酸配列、又は配列番号４で示されるアミノ酸配列と比べて１つ又は複数の保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含み、上記ＶＨａ ＣＤＲ２は、配列番号１４で示されるアミノ酸配列、又は配列番号１４で示されるアミノ酸配列と比べて１つ又は複数の保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含み、上記ＶＨａ ＣＤＲ３は、配列番号１９で示されるアミノ酸配列、又は配列番号１９で示されるアミノ酸配列と比べて１つ又は複数の保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含み、上記ＶＨｂ ＣＤＲ１は、配列番号２１で示されるアミノ酸配列、又は配列番号２１で示されるアミノ酸配列と比べて１つ又は複数の保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含み、上記ＶＨｂ ＣＤＲ２は、配列番号２４で示されるアミノ酸配列、又は配列番号２４で示されるアミノ酸配列と比べて１つ又は複数の保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含み、上記ＶＨｂ ＣＤＲ３は、配列番号２９で示されるアミノ酸配列、又は配列番号２９で示されるアミノ酸配列と比べて１つ又は複数の保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、上記ＶＬａ ＣＤＲ１又はＶＬｂ ＣＤＲ１は、配列番号３６で示されるアミノ酸配列、又は配列番号３６で示されるアミノ酸配列と比べて１つ又は複数の保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含み、上記ＶＬａ ＣＤＲ２又はＶＬｂ ＣＤＲ２は、配列番号４１で示されるアミノ酸配列、又は配列番号４１で示されるアミノ酸配列と比べて１つ又は複数の保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含み、上記ＶＬａ ＣＤＲ３又はＶＬｂ ＣＤＲ３は、配列番号４５で示されるアミノ酸配列、又は配列番号４５で示されるアミノ酸配列と比べて１つ又は複数の保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、上記ＶＨａ ＣＤＲ１は、配列番号４で示されるアミノ酸配列、又は配列番号４で示されるアミノ酸配列と比べて１つ又は複数の保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含み、上記ＶＨａ ＣＤＲ２は、配列番号１４で示されるアミノ酸配列、又は配列番号１４で示されるアミノ酸配列と比べて１つ又は複数の保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含み、上記ＶＨａ ＣＤＲ３は、配列番号１９で示されるアミノ酸配列、又は配列番号１９で示されるアミノ酸配列と比べて１つ又は複数の保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含み、上記ＶＨｂ ＣＤＲ１は、配列番号２１で示されるアミノ酸配列、又は配列番号２１で示されるアミノ酸配列と比べて１つ又は複数の保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含み、上記ＶＨｂ ＣＤＲ２は、配列番号２４で示されるアミノ酸配列、又は配列番号２４で示されるアミノ酸配列と比べて１つ又は複数の保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含み、上記ＶＨｂ ＣＤＲ３は、配列番号２９で示されるアミノ酸配列、又は配列番号２９で示されるアミノ酸配列と比べて１つ又は複数の保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む。上記ＶＬａ ＣＤＲ１又はＶＬｂ ＣＤＲ１は、配列番号３６で示されるアミノ酸配列、又は配列番号３６で示されるアミノ酸配列と比べて１つ又は複数の保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含み、上記ＶＬａ ＣＤＲ２又はＶＬｂ ＣＤＲ２は、配列番号４１で示されるアミノ酸配列、又は配列番号４１で示されるアミノ酸配列と比べて１つ又は複数の保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含み、上記ＶＬａ ＣＤＲ３又はＶＬｂ ＣＤＲ３は、配列番号４５で示されるアミノ酸配列、又は配列番号４５で示されるアミノ酸配列と比べて１つ又は複数の保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、上記ＶＬａ ＣＤＲ１は、上記ＶＬｂ ＣＤＲ１と同じアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、上記ＶＬａ ＣＤＲ２は、上記ＶＬｂ ＣＤＲ２と同じアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、上記ＶＬａ ＣＤＲ３は、上記ＶＬｂ ＣＤＲ３と同じアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、上記ＶＬａ ＣＤＲ１は、上記ＶＬｂ ＣＤＲ１と同じアミノ酸配列を含み、上記ＶＬａ ＣＤＲ２は、上記ＶＬｂ ＣＤＲ２と同じアミノ酸配列を含み、上記ＶＬａ ＣＤＲ３は、上記ＶＬｂ ＣＤＲ３と同じアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、上記可変領域ａは、重鎖可変領域ＶＨａ及び軽鎖可変領域ＶＬａを含み、そのうち、上記ＶＨａは、配列番号４９～６３の何れか１項で示されるアミノ酸配列、又は配列番号４９～６３の何れか１項で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列を含み、且つ／又は上記ＶＬａは、配列番号７５～８０の何れか１項で示されるアミノ酸配列、又は配列番号７５～８０の何れか１項で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、上記可変領域ａは、重鎖可変領域ＶＨａ及び軽鎖可変領域ＶＬａを含み、そのうち、上記ＶＨａは、配列番号５４で示されるアミノ酸配列、又は配列番号５４で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列を含み、且つ／又は上記ＶＬａは、配列番号７５で示されるアミノ酸配列、又は配列番号７５で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、上記可変領域ｂは、重鎖可変領域ＶＨｂ及び軽鎖可変領域ＶＬｂを含み、そのうち、上記ＶＨｂは、配列番号６４～７４の何れか１項で示されるアミノ酸配列、又は配列番号６４～７４の何れか１項で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列を含み、且つ／又は上記ＶＬｂは、配列番号７５～８０の何れか１項で示されるアミノ酸配列、又は配列番号７５～８０の何れか１項で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、上記可変領域ｂは、重鎖可変領域ＶＨｂ及び軽鎖可変領域ＶＬｂを含み、そのうち、上記ＶＨｂは、配列番号６４で示されるアミノ酸配列、又は配列番号６４で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列を含み、且つ／又は上記ＶＬｂは配列番号７５で示されるアミノ酸配列、又は配列番号７５で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、上記ＶＨａは、配列番号４９～６３の何れか１項で示されるアミノ酸配列、又は配列番号４９～６３の何れか１項で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列、又は配列番号４９～６３の何れか１項で示されるアミノ酸配列と比べて１つ又は複数の保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含み、上記ＶＨｂは、配列番号６４～７４の何れか１項で示されるアミノ酸配列、又は配列番号６４～７４の何れか１項で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列、又は配列番号６４～７４の何れか１項で示されるアミノ酸配列と比べて１つ又は複数の保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、上記ＶＨａは、配列番号５４で示されるアミノ酸配列、又は配列番号５４で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列、又は配列番号５４で示されるアミノ酸配列と比べて１つ又は複数の保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含み、上記ＶＨｂは、配列番号６４で示されるアミノ酸配列、又は配列番号６４で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列、又は配列番号６４で示されるアミノ酸配列と比べて１つ又は複数の保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、上記ＶＬａ及びＶＬｂは、独立的に配列番号７５～８０の何れか１項で示されるアミノ酸配列から選ばれるアミノ酸配列、又は配列番号７５～８０の何れか１項で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列、又は配列番号７５～８０の何れか１項で示されるアミノ酸配列と比べて１つ又は複数の保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、上記ＶＬａ及びＶＬｂは、独立的に配列番号７５で示されるアミノ酸配列から選ばれるアミノ酸配列、又は配列番号７５で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列、又は配列番号７５で示されるアミノ酸配列と比べて１つ又は複数の保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、上記可変領域ａは、ＶＨａ及びＶＬａを含み、上記可変領域ｂは、ＶＨｂ及びＶＬｂを含む。上記ＶＨａは、配列番号５４で示されるアミノ酸配列、又は配列番号５４で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列、又は配列番号５４で示されるアミノ酸配列と比べて１つ又は複数の保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む。上記ＶＨｂは、配列番号６４で示されるアミノ酸配列、又は配列番号６４で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列、又は配列番号６４で示されるアミノ酸配列と比べて１つ又は複数の保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む。上記ＶＬａ又はＶＬｂは、配列番号７５で示されるアミノ酸配列、又は配列番号７５で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列、又は配列番号７５で示されるアミノ酸配列と比べて１つ又は複数の保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、上記ＶＬａは、上記ＶＬｂと同じアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗体又は抗原結合断片は、軽鎖定常領域ａ（ＣＬａ）、重鎖定常領域ａ（ＣＨａ）、軽鎖定常領域ｂ（ＣＬｂ）、及び重鎖定常領域ｂ（ＣＨｂ）を更に含む。
いくつかの実施形態において、上記ＣＨａは、ＩｇＧ１サブタイプである。いくつかの実施形態において、上記ＣＨｂは、ＩｇＧ１サブタイプである。
いくつかの実施形態において、上記ＣＨａ及び／又はＣＨｂは、Ｙ３４９Ｃ、Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖのうちの１種又は複数種のアミノ酸変異を含むＩｇＧ１サブタイプであり、ここで、アミノ酸位置は、Ｅｕ番号によるものである。
いくつかの実施形態において、上記ＣＨａ及び／又はＣＨｂは、Ｎ２９７Ａアミノ酸変異を含むＩｇＧ１サブタイプであり、ここで、アミノ酸位置は、Ｅｕ番号によるものである。
いくつかの実施形態において、上記ＣＨａ及びＣＨｂの１つの重鎖定常領域は、Ｎ２９７Ａ、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖなどの１種又は複数種のアミノ酸変異を含む。
いくつかの実施形態において、上記ＣＨａ及びＣＨｂの別の重鎖定常領域は、Ｎ２９７Ａ、Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗなどの１種又は複数種のアミノ酸変異を含む。
いくつかの実施形態において、上記ＣＨａは、配列番号８１、８３～８６の何れか１項で示されるアミノ酸配列、又は配列番号８１、８３～８６の何れか１項で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列、又は配列番号８１、８３～８６の何れか１項で示されるアミノ酸配列と比べて１つ又は複数の保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、上記ＣＨｂは、配列番号８１、８３～８６の何れか１項で示されるアミノ酸配列、又は配列番号８１、８３～８６の何れか１項で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列、又は配列番号８１、８３～８６の何れか１項で示されるアミノ酸配列と比べて１つ又は複数の保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、上記ＣＨａは、配列番号８１、８３又は８５で示されるアミノ酸配列、又は配列番号８１、８３又は８５で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列、又は配列番号８１、８３又は８５で示されるアミノ酸配列と比べて１つ又は複数の保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、上記ＣＨｂは、配列番号８１、８４又は８６で示されるアミノ酸配列、又は配列番号８１、８４又は８６で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列、又は配列番号８１、８４又は８６で示されるアミノ酸配列と比べて１つ又は複数の保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、上記ＣＨａは、配列番号８３で示されるアミノ酸配列を含み、上記ＣＨｂは、配列番号８４で示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、上記ＣＨａは、配列番号８５で示されるアミノ酸配列を含み、上記ＣＨｂは、配列番号８６で示されるアミノ酸配列を含む。 いくつかの実施形態において、上記ＣＨａは、配列番号８４で示されるアミノ酸配列を含み、上記ＣＨｂは、配列番号８３で示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、上記ＣＨａは、配列番号８６で示されるアミノ酸配列を含み、上記ＣＨｂは、配列番号８５で示されるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、上記ＣＬａは、配列番号８２で示されるアミノ酸配列、又は配列番号８２で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列、又は配列番号８２で示されるアミノ酸配列と比べて１つ又は複数の保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、上記ＣＬｂは、配列番号８２で示されるアミノ酸配列、又は配列番号８２で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列、又は配列番号８２で示されるアミノ酸配列と比べて１つ又は複数の保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、上記重鎖ａは、配列番号９２又は９４で示されるアミノ酸配列、又は配列番号９２又は９４で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列、又は配列番号９２又は９４で示されるアミノ酸配列と比べて１つ又は複数の保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含み、上記重鎖ｂは、配列番号９３又は９５で示されるアミノ酸配列、又は配列番号９３又は９５で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列、又は配列番号９３又は９５で示されるアミノ酸配列と比べて１つ又は複数の保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、上記軽鎖ａ及び軽鎖ｂは、何れも配列番号９６で示されるアミノ酸配列、又は配列番号９６で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、本発明に提供される二重特異性抗体又は抗原結合断片とＰＤ－Ｌ１との親和性指数は、ＫＤ≦１０ｎＭである。いくつかの実施形態において、本発明に提供される二重特異性抗体又は抗原結合断片とＰＤ－Ｌ１との親和性指数は、ＫＤ≦１ｎＭである。いくつかの実施形態において、本発明に提供される二重特異性抗体又は抗原結合断片とＣＤ４７との親和性指数は、ＫＤ≦３０ｎＭである。いくつかの実施形態において、本発明に提供される二重特異性抗体又は抗原結合断片とＣＤ４７との親和性指数は、ＫＤ≦１０ｎＭである。いくつかの実施形態において、本発明に提供される二重特異性抗体又は抗原結合断片とＣＤ４７との親和性指数は、ＫＤ≦５ｎＭである。
別の態様において、本発明は、二重特異性抗体又は抗原結合断片を提供し、上記抗体又は抗原結合断片は、ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する可変領域ａ、ＣＤ４７に特異的に結合する可変領域ｂ、軽鎖定常領域、及び重鎖定常領域を含み、上記重鎖定常領域は、ＩｇＧ１サブタイプであり、又はＹ３４９Ｃ、Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖのうちの１種又は複数種のアミノ酸変異を含むＩｇＧ１サブタイプであり、ここで、アミノ酸位置は、Ｅｕ番号によるものである。
いくつかの実施形態において、上記重鎖定常領域は、Ｎ２９７Ａアミノ酸変異を更に含むＩｇＧ１サブタイプであり、ここで、アミノ酸位置は、Ｅｕ番号によるものである。
いくつかの実施形態において、上記重鎖定常領域は、第１重鎖定常領域及び第２重鎖定常領域を含み、上記第１重鎖定常領域は、
Ｎ２９７Ａ、Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗのうちの１種又は複数種のアミノ酸変異を含み、且つ／又は
上記第２重鎖定常領域は、
Ｎ２９７Ａ、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖのうちの１種又は複数種のアミノ酸変異を含む。
いくつかの実施形態において、上記第１重鎖定常領域は、配列番号８１、８３又は８５で示されるアミノ酸配列、又は配列番号８１、８３又は８５で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列を含み、且つ／又は上記第２重鎖定常領域は、配列番号８１、８４又は８６で示されるアミノ酸配列、又は配列番号８１、８４又は８６で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、上記可変領域ａのＶＨａは、上記第１重鎖定常領域に連結され、上記可変領域ｂのＶＨｂは、上記第２重鎖定常領域に連結され、又は、上記可変領域ａのＶＨａは、上記第２重鎖定常領域に連結され、上記可変領域ｂのＶＨｂは、上記第１重鎖定常領域に連結される。
いくつかの実施形態において、上記軽鎖定常領域は、配列番号８２で示されるアミノ酸配列、又は配列番号８２で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、上記抗体又は抗原結合断片は、本明細書に記載の可変領域ａ、及び本明細書に記載の可変領域ｂを含む。
別の態様において、本発明は、二重特異性抗体又は抗原結合断片を提供し、上記抗体又は抗原結合断片は、１つの重鎖ａ、１つの重鎖ｂ及び２つの同じ軽鎖を含む。
いくつかの実施形態において、上記軽鎖の可変領域（ＶＬ）は、配列番号３６～４０の何れか１項で示されるアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ１と、配列番号４１～４４の何れか１項で示されるアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ２と、配列番号４５～４８の何れか１項で示されるアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ３と、を含む。
いくつかの実施形態において、上記ＶＬ ＣＤＲ１は、配列番号３６で示されるアミノ酸配列、又は配列番号３６で示されるアミノ酸配列と比べて１つ又は複数の保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含み、上記ＶＬ ＣＤＲ２は、配列番号４１で示されるアミノ酸配列、又は配列番号４１で示されるアミノ酸配列と比べて１つ又は複数の保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含み、上記ＶＬ ＣＤＲ３は、配列番号４５で示されるアミノ酸配列、又は配列番号４５で示されるアミノ酸配列と比べて１つ又は複数の保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、上記ＶＬは、配列番号７５～８０の何れか１項で示されるアミノ酸配列、又は配列番号７５～８０の何れか１項で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列、又は配列番号７５～８０の何れか１項で示されるアミノ酸配列と比べて１つ又は複数の保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、上記ＶＬは、配列番号７５で示されるアミノ酸配列、又は配列番号７５で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列、又は配列番号７５で示されるアミノ酸配列と比べて１つ又は複数の保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、上記軽鎖は、配列番号９６で示されるアミノ酸配列、又は配列番号９６で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列、又は配列番号９６で示されるアミノ酸配列と比べて１つ又は複数の保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、上記重鎖ａと１本の上記軽鎖は、ペアリングしてＰＤ－Ｌ１抗原結合部位を形成し、上記重鎖ｂと別の上記軽鎖は、ペアリングしてＣＤ４７、ＬＡＧ３、ＴＧＦβ、ＣＴＬＡ－４、４－１ＢＢ、ＰＤ－１、ＴＩＧＩＴ、ＫＩＲ、ｃ－Ｍｅｔ、ＶＩＳＴＡ又はＢＣＭＡ抗原結合部位を形成する。いくつかの実施形態において、上記重鎖ａと１本の上記軽鎖は、ペアリングしてＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－１、ＢＣＭＡ、ＭＳＬＮ、ＣＤ１９、ＣＤ２０又はＶＥＧＦ抗原結合部位を形成し、上記重鎖ｂと別の上記軽鎖は、ペアリングしてＣＤ４７抗原結合部位を形成する。
いくつかの実施形態において、上記重鎖ａと１本の上記軽鎖は、ペアリングしてＰＤ－Ｌ１抗原結合部位を形成し、上記重鎖ｂと別の上記軽鎖は、ペアリングしてＣＤ４７抗原結合部位を形成する。
いくつかの実施形態において、上記重鎖ａは、配列番号９２又は９４で示されるアミノ酸配列、又は配列番号９２又は９４で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列を含み、上記重鎖ｂは、配列番号９３又は９５で示されるアミノ酸配列、又は配列番号９３又は９５で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列を含み、上記軽鎖は、配列番号９６で示されるアミノ酸配列、又は配列番号９６で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、上記抗体又は抗原結合断片とＰＤ－Ｌ１との親和性指数は、ＫＤ≦１ｎＭである。
いくつかの実施形態において、上記抗体又は抗原結合断片とＣＤ４７との親和性指数は、ＫＤ≦１０ｎＭである。
いくつかの実施形態において、上記抗体又は抗原結合断片とＣＤ４７との親和性指数は、ＫＤ≦３０ｎＭである。
別の態様において、本発明は、上記抗体又は抗原結合断片をコードするポリヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態において、上記ポリヌクレオチドは、単離されたポリヌクレオチドである。
別の態様において、本発明は、上記ポリヌクレオチドを含む発現ベクターを提供する。いくつかの実施形態において、上記発現ベクターは、単離された発現ベクターである。
別の態様において、本発明は、上記ポリヌクレオチド、又は上記発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。いくつかの実施形態において、上記宿主細胞は、単離された宿主細胞である。いくつかの実施形態において、上記細胞は、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ細胞（例えば、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞）、ＢＨＫ細胞、Ｃｏｓ１細胞、Ｃｏｓ７細胞、ＣＶ１細胞又はマウスＬ細胞である。
別の態様において、本発明は、抗体又は抗原結合断片を産生するために、培地で上記宿主細胞を培養することを含む、本明細書に記載の抗体又は抗原結合断片を製造する方法を提供する。いくつかの実施形態において、上記方法は、上記宿主細胞又は上記培地から上記抗体又は抗原結合断片を回収することを更に含む。
別の態様において、本発明は、上記抗体又は抗原結合断片、上記ポリヌクレオチド、又は上記発現ベクター、又は上記細胞、及び薬学的に許容されるベクターを含む組成物を提供する。
別の態様において、本発明は、上記抗体又は抗原結合断片、上記ポリヌクレオチド、又は上記発現ベクター、上記細胞又は上記組成物の、疾患を治療する薬剤の調製における応用を提供する。
いくつかの実施形態において、上記疾患は、自己免疫疾患、急性又は慢性炎症性疾患、感染性疾患（例えば、慢性感染症又は敗血症）、がんである。いくつかの実施形態において、上記疾患は、ＰＤ－Ｌ１及びＣＤ４７に関連する疾患である。いくつかの実施形態において、上記疾患は、ＰＤ－Ｌ１及びＣＤ４７に関連する疾患であり、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）、リンパ腫、乳がん、胃がん、肺がん、食道がん、腸がん、卵巣がん、子宮頸がん、腎臓がん、膵臓がん、膀胱がん、神経膠腫、黒色腫や他の固形腫瘍などの各種の血液疾患や固形腫瘍を含むが、これらには限られない。１つの実施形態において、上記がんは、結腸がんなどの胃腸管がんである。
別の態様において、本発明は、治療と必要とする患者に有効量の上記二重特異性抗体又は抗原結合断片、上記ポリヌクレオチド、又は上記発現ベクター、上記細胞又は上記組成物を投与することを含む疾患を治療する方法を提供する。
いくつかの実施形態において、上記疾患は、自己免疫疾患、急性又は慢性炎症性疾患、感染性疾患（例えば、慢性感染症又は敗血症）、がんである。いくつかの実施形態において、上記疾患は、ＰＤ－Ｌ１及びＣＤ４７に関連する疾患である。いくつかの実施形態において、上記疾患は、ＰＤ－Ｌ１及びＣＤ４７に関連する疾患であり、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）、リンパ腫、乳がん、胃がん、肺がん、食道がん、腸がん、卵巣がん、子宮頸がん、腎臓がん、膵臓がん、膀胱がん、神経膠腫、黒色腫や他の固形腫瘍などの各種の血液疾患や固形腫瘍を含むが、これらには限られない。１つの実施形態において、上記がんは、結腸がんなどの胃腸管がんである。
いくつかの実施形態において、本発明は、上記二重特異性抗体又は抗原結合断片、上記ポリヌクレオチド、又は上記発現ベクターを含む試薬キット又は製品に関する。
本発明は、二重特異性抗体又は抗原結合断片及びその応用を提供し、本発明の二重特異性抗体又は抗原結合断片は、２つ以上の抗原、又は同じ抗原の２つ以上のエピトープに結合することができる。本発明の抗体又は抗原結合断片は、自己免疫疾患、急性又は慢性炎症性疾患、感染性疾患、がんなどの各種の疾患の治療又は予防に用いることができ、関連疾患の診断及び予後に用いることもできる。
本発明の二重特異性抗体の構造を例示する。 一連のグラフであり、図２Ａと図２Ｂはそれぞれ、ＳＥＣによって検出された２種類の抗ＰＤ－Ｌ１／ＣＤ４７二重特異性抗体ＢｓＡｂ－４６とＢｓＡｂ－７１の純度を示す。 抗ＰＤ－Ｌ１ ｓｃＦｖとＰＤ－Ｌ１－Ｈｉｓ－Ｂｉｏｔｉｎ抗原タンパク質との結合力であり、ここで、クローン番号は、対応する抗ＰＤ－Ｌ１ ｓｃＦｖを発現する陽性酵母クローンを示す。 ＭＯＡ法により検出された、Ｒ２－４を軽鎖として、異なる抗ＰＤ－Ｌ１のＶＨとからなる抗ＰＤ－Ｌ１抗体、及び陰性対照となるＩｇＧ１抗体（ＩｇＧ－Ｉｓｏｔｙｐｅ）による、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１シグナル伝達経路に対する影響を示す。 ＭＯＡ法により検出された、異なる軽鎖の抗ＰＤ－Ｌ１抗体、及び陰性対照となるＩｇＧ１抗体（ＩｇＧ－Ｉｓｏｔｙｐｅ）による、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１シグナル伝達経路に対する影響を示す。 異なる軽鎖の抗ＣＤ４７抗体、陽性対照となる抗体Ｈｕ５Ｆ９－Ｇ４とＩｇＧ１対照抗体（ＩｇＧ－Ｉｓｏｔｙｐｅ）による、赤血球の凝集に対する影響を示し、ここで、Ｈｕ５Ｆ９は、Ｈｕ５Ｆ９－Ｇ４を表す。外観によると、線状に流れる赤血球塊は、血球凝集反応を起こさないもの、点状になるのは、わずかに凝集しているもの、穴全体がぼやけるのは、明らかに凝集しているものである。 抗ＣＤ４７抗体及び陽性対照となる抗体Ｈｕ５Ｆ９－Ｇ４の、マクロファージによる腫瘍細胞の貪食を促進する能力を示し、ここで、Ｈｕ５Ｆ９は、Ｈｕ５Ｆ９－Ｇ４を表す。 一連のグラフであり、それぞれ抗ＰＤ－Ｌ１／ＣＤ４７二重特異性抗体とＰＤ－Ｌ１及びＣＤ４７との結合能力を示す。図８Ａは、まずＰＤ－Ｌ１－Ｈｉｓに結合し、後にＣＤ４７－Ｈｉｓに結合するものであり、図８Ｂは、まずＣＤ４７－Ｈｉｓに結合し、後にＰＤ－Ｌ１－Ｈｉｓに結合するものであり、図８Ｃは、抗ＰＤ－Ｌ１／ＣＤ４７二重特異性抗体ＢｓＡｂ－７１－Ｎ２９７Ａの結合能力を示し、上の部分がまずＰＤ－Ｌ１－Ｈｉｓに結合し、後にＣＤ４７－Ｈｉｓに結合するものであり、下の部分がまずＣＤ４７－Ｈｉｓに結合し、後にＰＤ－Ｌ１－Ｈｉｓに結合するものであり、図中のｈＰＤＬ１－Ｈｉｓは、ＰＤ－Ｌ１－Ｈｉｓを表し、ｈＣＤ４７－Ｈｉｓは、ＣＤ４７－Ｈｉｓを表す。 一連のグラフであり、図９Ａと図９Ｃは、ＦＡＣＳにより検出された、例示的な抗ＰＤ－Ｌ１／ＣＤ４７二重特異性抗体、親としての抗ＰＤ－Ｌ１抗体、及び陰性対照となる抗ＣＤ４７抗体４７－Ｒ２－４とＰＤ－Ｌ１を過剰発現するＣＨＯ細胞との結合を示す。図９Ｂと図９Ｄは、ＦＡＣＳにより検出された、例示的な抗ＰＤ－Ｌ１／ＣＤ４７二重特異性抗体、親としての抗ＣＤ４７抗体４７－Ｒ２－４、及び陰性対照となる抗ＰＤ－Ｌ１抗体Ｌ１－Ｒ２－４－７１とＣＤ４７を過剰発現するＣＨＯ細胞との結合を示す。図中、横軸は抗体濃度を示し、縦軸は平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示す。 一連のグラフであり、ＭＯＡ法により検出された、本発明の例示的な抗ＰＤ－Ｌ１／ＣＤ４７二重特異性抗体、親としての抗ＰＤ－Ｌ１抗体Ｌ１－Ｒ２－４－７１、及び陰性対照となるＩｇＧ１抗体（ＩｇＧ－Ｉｓｏｔｙｐｅ）による、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１シグナル伝達経路に対する影響を示す。図１０Ａは、抗ＰＤ－Ｌ１／ＣＤ４７二重特異性抗体ＢｓＡｂ－３６、ＢｓＡｂ－４６、ＢｓＡｂ－４７、ＢｓＡｂ－７１の結果であり、図１０Ｂは、抗ＰＤ－Ｌ１／ＣＤ４７二重特異性抗体ＢｓＡｂ－７１－Ｎ２９７Ａの結果である。 例示的な抗ＰＤ－Ｌ１／ＣＤ４７二重特異性抗体、抗ＣＤ４７の陽性抗体Ｈｕ５Ｆ９－Ｇ４、抗ＣＤ４７の親抗体４７－Ｒ２－４及びＩｇＧ１対照抗体（ＩｇＧ－Ｉｓｏｔｙｐｅ）による、赤血球の凝集に対する影響を示し、ここで、Ｈｕ５Ｆ９は、Ｈｕ５Ｆ９－Ｇ４を表す。 例示的な抗ＰＤ－Ｌ１／ＣＤ４７二重特異性抗体、抗ＣＤ４７の親抗体４７－Ｒ２－４及びＩｇＧ１対照抗体（ＩｇＧ－Ｉｓｏｔｙｐｅ）の、マクロファージによる腫瘍細胞の貪食を促進する能力を示す。 一連のグラフであり、図１３Ａは、ＦＡＣＳにより検出された、例示的な抗ＰＤ－Ｌ１／ＣＤ４７二重特異性抗体、抗ＣＤ４７の陽性抗体Ｈｕ５Ｆ９－Ｇ４、親としての抗ＣＤ４７抗体４７－Ｒ２－４、及び陰性対照となる抗ＰＤ－Ｌ１抗体Ｌ１－Ｒ２－４－７１とヒト赤血球細胞との結合を示す。図１３Ｂは、ＦＡＣＳにより検出された、例示的な抗ＰＤ－Ｌ１／ＣＤ４７二重特異性抗体、抗ＣＤ４７の陽性抗体Ｈｕ５Ｆ９－Ｇ４、親としての抗ＣＤ４７抗体４７－Ｒ２－４、及び陰性対照となる抗ＰＤ－Ｌ１抗体Ｌ１－Ｒ２－４－７１とヒトＴリンパ性白血病Ｊｕｒｋａｔ細胞との結合を示す。図中、横軸は抗体濃度を示し、縦軸は平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示す。 抗ＰＤ－Ｌ１／ＣＤ４７二重特異性抗体による、外因性刺激下でのＰＢＭＣからのＩＬ２サイトカインの放出に対する影響を示す。 ＭＣ３８－ｈＣＤ４７（Ｔｇ）／Ｃ５７ＢＬ／６－ｈＳＩＲＰαマウスモデルにおいて、抗ＰＤ－Ｌ１抗体Ｌ１－Ｒ２－４－７１、抗ＣＤ４７抗体４７－Ｒ２－４、抗ＰＤ－Ｌ１抗体Ｌ１－Ｒ２－４－７１と抗ＣＤ４７抗体４７－Ｒ２－４との併用薬、抗ＰＤ－Ｌ１／ＣＤ４７二重特異性抗体ＢｓＡｂ－７１－Ｎ２９７Ａによる腫瘍抑制活性をＩｇＧ１対照抗体と比較した図である。
別段の説明のない限り、下記のそれぞれの用語は、後述するような意味を持つべきである。本明細書において別段の説明のない限り、定常領域におけるアミノ酸残基の番号は、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓ、５ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ、１９９１に記述されたＥＵ番号付けシステムによるものである。
定義
注意すべきであることは、「１種」の実体という用語は、１種又は複数種の当該実体を指し、例えば、「１種の抗体」は、１種又は複数種の抗体と理解されるべきであるため、「１種」（又は「１つ」）、「１種又は複数種」及び「少なくとも１種」という用語は、本明細書で互換的に使用されてもよい。
「約」又は「おおよそ」は、当業者に容易に知られる対応する数値の通常の誤差範囲を指す。幾つかの実施形態において、本明細書で言及される「約」又は「おおよそ」は、記載された数値及びその±１０％、±５％、±１％又は±０．１％の範囲を指す。
「ポリペプチド」という用語は、単数の「ポリペプチド」及び複数の「ポリペプチド」を包含することを意図しており、また、アミド結合（ペプチド結合とも呼ばれる）によって線形的に結合したアミノ酸モノマーからなる分子を意味する。「ポリペプチド」という用語は、２つ又はそれ以上のアミノ酸の任意の単鎖又は複数の鎖を意味し、また、生成物の特定の長さに関与しない。従って、「ポリペプチド」の定義は、ペプチド、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」、又は、２つ若しくは複数のアミノ酸鎖を示すための任意の他の用語を含み、「ポリペプチド」という用語は、上記何れか１つの用語の代わりに用いられ、又は上記何れか１つの用語と交互に用いられることができる。「ポリペプチド」という用語は、ポリペプチドの発現後に修飾された生成物も指し、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、既知の保護／ブロッキング基による誘導化、タンパク質加水分解切断又は非天然存在アミノ酸による修飾を含むが、これらに限定されない。ポリペプチドは、天然の生物源に由来にするか、又は組換え技術によって産生され得るが、指定された核酸配列から翻訳される必要はなく、化学合成を含む任意の方法によって産生され得る。
「アミノ酸」とは、α－アミノ酸のような、アミノ基とカルボキシル基を同時に含む有機化合物であり、そのまま又は前駆体の形態で核酸によりコードすることができる。単一のアミノ酸は、３つのヌクレオチド（いわゆるコドン又は塩基トリプレット）から構成される核酸によりコードされる。各々のアミノ酸は、少なくとも１つのコドンによってコードされる。同じアミノ酸を異なるコドンによってコードすることは、「遺伝子コードの縮重性」と呼ばれる。アミノ酸は、天然アミノ酸と非天然アミノ酸とを含む。天然アミノ酸は、アラニン（３文字符号：Ａｌａ、１文字符号：Ａ）、アルギニン（Ａｒｇ、Ｒ）、アスパラギン（Ａｓｎ、Ｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ、Ｄ）、システイン（Ｃｙｓ、Ｃ）、グルタミン（Ｇｌｎ、Ｑ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ、Ｅ）、グリシン（Ｇｌｙ、Ｇ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ、Ｈ）、イソロイシン（Ｉｌｅ、Ｉ）、ロイシン（Ｌｅｕ、Ｌ）、リシン（Ｌｙｓ、Ｋ）、メチオニン（Ｍｅｔ、Ｍ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ、Ｆ）、プロリン（Ｐｒｏ、Ｐ）、セリン（Ｓｅｒ、Ｓ）、トレオニン（Ｔｈｒ、Ｔ）、トリプトファン（Ｔｒｐ、Ｗ）、チロシン（Ｔｙｒ、Ｙ）及びバリン（Ｖａｌ、Ｖ）を含む。
「保存的アミノ酸置換」とは、１つのアミノ酸残基が、化学的特性（例えば、電荷又は疎水性）が類似した側鎖（Ｒ基）を含む別のアミノ酸残基で置換されることを意味する。一般的に、保存的アミノ酸置換は、タンパク質の機能的特性を実質的に変えることはあまりない。化学的特性が類似した側鎖を含むアミノ酸の種類の実例は、１）グリシン、アラニン、バリン、ロイシン及びイソロイシンのような脂肪族側鎖、２）セリン及びトレオニンような脂肪族ヒドロキシ基側鎖、３）アスパラギン及びグルタミンのようなアミドを含む側鎖、４）フェニルアラニン、チロシン及びトリプトファンのような芳香族側鎖、５）リシン、アルギニン及びヒスチジンのような塩基性側鎖、６）アスパラギン酸及びグルタミン酸のような酸性側鎖を含む。
本発明において、細胞、核酸、ポリペプチド、抗体などに関して使用される、「単離された」ＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリペプチド、抗体などの「単離された」という用語は、ＤＮＡ又はＲＮＡなど、細胞の自然環境の他の成分の１種又は複数種からそれぞれ単離された分子を指す。本発明で使用される「単離された」という用語は、組換えＤＮＡ技術により産生された場合には細胞材料、ウイルス材料若しくは細胞培地を実質的な含まない核酸又はペプチド、或いは、化学合成された場合は化学的前駆体又は他の化学物質を実質的に含まない核酸又はペプチドを更に指す。更に、「単離された核酸」は、天然状態で存在しない核酸断片を含み、天然状態で存在することはないことを意味する。本発明において、「単離された」という用語は、他の細胞タンパク質又は組織から単離された細胞又はポリペプチドを意味するためにも用いられる。単離されたポリペプチドは、精製されたポリペプチド及び組換えポリペプチドを含むことを意味する。単離されたポリペプチド、抗体などは、一般的には、少なくとも１つの精製ステップによって調製される。幾つかの実施形態において、単離された核酸、ポリペプチド、抗体などの純度は、少なくとも約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９９％、又はこれらの数値のうちの何れか２つの値の間の範囲（端点を含む）又はそのうちの任意の値である。
「組換え」という用語は、ポリペプチド又はポリヌクレオチドに関するもので、天然に存在しないポリペプチド又はポリヌクレオチドの形態を指し、非制限的な実施例は、組み合わせにより通常存在していないポリヌクレオチド又はポリペプチドを産生することができる。
「相同性」又は「同一性」又は「類似性」とは、２つのペプチド間又は２つの核酸分子間の配列類似性を指す。それぞれの配列におけるアラインメント可能な位置を比較することにより、相同性を特定することができる。比較された配列における位置が同じ塩基又はアミノ酸で占められている場合、分子は、この位置上で相同である。配列間の相同性の程度は、配列の共有するマッチング位置又は相同位置の数からなる関数である。
「少なくとも８０％の同一性」は、約８０％の同一性、約８１％の同一性、約８２％の同一性、約８３％の同一性、約８５％の同一性、約８６％の同一性、約８７％の同一性、約８８％の同一性、約９０％の同一性、約９１％の同一性、約９２％の同一性、約９４％の同一性、約９５％の同一性、約９８％の同一性、約９９％の同一性、又はこれらの数値のうちの何れか２つの値の間の範囲（端点を含む）又はそのうちの任意の値である。
「少なくとも９０％の同一性」は、約９０％の同一性、約９１％の同一性、約９２％の同一性、約９３％の同一性、約９５％の同一性、約９６％の同一性、約９７％の同一性、約９８％の同一性、約９９％の同一性、又はこれらの数値のうちの何れか２つの値の間の範囲（端点を含む）又はそのうちの任意の値である。
ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド配列（又はポリペプチド又は抗体配列）が別の配列と特定の百分率（例えば９０％、９５％、９８％又は９９％）の「同一性又は配列同一性」を有することは、配列アラインメント時に、比較される２つの配列において当該百分率の塩基（又はアミノ酸）が同じであることを意味する。目視検査又は本分野で知られているソフトウェアプログラム、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．（２００７）がＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙに記載されたソフトウェアプログラムにより、当該アラインメント及び同一性百分率又は配列同一性を決定することができる。好ましくは、デフォルトパラメータを用いてアラインメントを行う。アラインメントプログラムの１つは、ＢＬＡＳＴＮとＢＬＡＳＴＰなどのデフォルトパラメータを使用したＢＬＡＳＴであり、両方とも次のデフォルトパラメータが使用される：Ｇｅｎｅｔｉｃｃｏｄｅ＝ｓｔａｎｄａｒｄ；ｆｉｌｔｅｒ＝ｎｏｎｅ；ｓｔｒａｎｄ＝ｂｏｔｈ；ｃｕｔｏｆｆ＝６０；ｅｘｐｅｃｔ＝１０；Ｍａｔｒｉｘ＝ＢＬＯＳＵＭ６２；Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎｓ＝５０ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ；ｓｏｒｔｂｙ＝ＨＩＧＨＳＣＯＲＥ；Ｄａｔａｂａｓｅｓ＝ｎｏｎ－ｒｅｄｕｎｄａｎｔ；ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋＣＤＳｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｓ＋ＳｗｉｓｓＰｒｏｔｅｉｎ＋ＳＰｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲ。生物学的に同等のポリヌクレオチドは、上記に指定された百分率の同一性を有し、同一又は類似の生物学活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを意味する。
ポリヌクレオチドは、４つのヌクレオチド塩基の特定の配列、即ち、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）とチミン（Ｔ）からなり、ポリヌクレオチドがＲＮＡである場合に、チミンはウラシル（Ｕ）に取り替えられる。「ポリヌクレオチド配列」は、ポリヌクレオチド分子の文字によって表すことができる。当該文字は、中央処理ユニットを有するコンピュータにおけるデータベースに入力され、生物情報学的応用、例えば、機能ゲノミクスと相同性検索に用いられることができることを示す。
「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」という用語は、交換可能に使用され、デオキシリボヌクレオチドであるかリボヌクレオチド又はその類似体であるかに関わらず、任意の長さのヌクレオチドの重合形態を意味する。ポリヌクレオチドは、任意の３次元構造を有してもよく、また、既知又は未知の任意の機能を実行することができる。非制限的なポリヌクレオチドの実施例は、遺伝子又は遺伝子断片（例えば、プローブ、プライマー、ＥＳＴ又はＳＡＧＥラベル）、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、転移ＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分岐したポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたＤＮＡ、任意の配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブ及びプライマーである。ポリヌクレオチドは、例えばメチル化されたヌクレオチド及びヌクレオチド類似体などの修飾されたヌクレオチドを含んでもよい。当該修飾があると、ヌクレオチドの構造への修飾は、ポリヌクレオチドを組み立てる前でも後でも行うことができる。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分によって中断されてもよい。重合後に、標識成分との複合などによりポリヌクレオチドを更に修飾してもよい。この用語は、二重鎖と単鎖分子も指す。特に説明や要求のない限り、本開示の何れのポリヌクレオチドの実施例は、二重鎖形態、及び二重鎖形態を構成する知られている又は予測される２つの相補可能な単鎖形態のうちのそれぞれの形式を含む。
「コード」という用語は、ポリヌクレオチドに適用される場合に、ポリペプチドを「コード」すると言われるポリヌクレオチドを指し、その天然状態にあるか、又は、当業者に公知の方法により操作される場合、転写及び／又は翻訳によって当該ポリペプチド及び／又はその断片を産生することができる。
「抗体」又は「抗原結合断片」とは、抗原を特異的に認識して結合するポリペプチド又はポリペプチド複合体を意味する。抗体は、完全な抗体及びその任意の抗原結合断片又はその単鎖であってもよい。従って、「抗体」という用語は、分子中に、抗原に結合する生物学的活性を有する免疫グロブリン分子の少なくとも一部を含む任意のタンパク質又はペプチドを含む。抗体と抗原結合断片は、重鎖又は軽鎖又はそのリガンド結合部分の相補性決定領域（ＣＤＲ）、重鎖可変領域（ＶＨ）、軽鎖可変領域（ＶＬ）、重鎖定常領域（ＣＨ）、軽鎖定常領域（ＣＬ）、フレーム領域（ＦＲ）又はその任意の部分、或いは結合タンパク質の少なくとも一部を含むが、これらに限定されない。ＣＤＲ領域は、軽鎖のＣＤＲ領域（ＶＬ ＣＤＲ１～３）と重鎖のＣＤＲ領域（ＶＨ ＣＤＲ１～３）を含む。本発明に記載の抗体又は抗原結合断片は、抗原ａ、抗原ｂに特異的に結合する抗体断片を含む二重特異性抗体である。幾つかの実施形態において、第１ポリペプチド鎖は構造ＶＨａ－ＣＨａを含み、第２ポリペプチド鎖は構造ＶＬａ－ＣＬａを含み、第３ポリペプチド鎖は構造ＶＨｂ－ＣＨｂを含み、第４ポリペプチド鎖は構造ＶＬｂ－ＣＬｂを含む。幾つかの実施形態において、第２ポリペプチド鎖と第４ポリペプチド鎖のアミノ酸配列は同じである。
「抗体断片」又は「抗原結合断片」という用語は、抗体の一部を指し、本発明の抗体断片の構成形態は、単一特異的抗体断片におけるＦ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖなどと類似することができる。その構造に関わらず、抗体断片は、完全抗体で認識された同一の抗原に結合する。「抗体断片」という用語は、アプタマー、鏡像異性体及び２価抗体を含む。「抗原結合断片」という用語は、特定の抗原に結合して複合体を形成することによって抗体として機能する任意の合成又は遺伝子操作されたタンパク質を更に含む。
「単鎖可変断片」又は「ｓｃＦｖ」とは、免疫グロブリンの重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）の可変領域の融合タンパク質である。幾つかの態様において、これらの領域は、１０個～約２５個のアミノ酸の短いリンカーペプチドに結合している。リンカーは、柔軟性を増加させるためにグリシンを豊富に含んでもよく、溶解性を増加させるためにセリン又はスレオニンを豊富に含んでもよく、且つ、ＶＨのＮ末端とＶＬのＣ末端に結合してもよく、その逆でもよい。このタンパク質には定常領域が除去され、リンカーが導入されたことにも関わらず、原始免疫グロブリンの特異性を保持している。ＳｃＦｖ分子は、例えば米国特許第５，８９２，０１９号に記載されているように、本分野で一般的に知られている。
「抗体」という用語は、生化学的に区分可能な種々の広範なクラスのポリペプチドを含む。当業者であれば、重鎖のクラスは、ｇａｍｍａ、ｍｕ、ａｌｐｈａ、ｄｅｌｔａ又はｅｐｓｉｌｏｎ（γ、μ、α、δ、ε）を含み、更に幾つかのサブクラス（例えば、γ１－γ４）を含むことが理解される。この鎖の性質は、抗体の「種類」がそれぞれＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＧ又はＩｇＥであることを決定している。例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４などの免疫グロブリンサブクラス（アイソタイプ）は、既に十分に特徴づけられ、付与された機能特異性も知られている。何れの免疫グロブリンの種類も、本発明に開示された請求範囲に保護されている。幾つかの実施形態において、免疫グロブリン分子の種類はＩｇＧである。この４本の鎖は、ジスルフィド結合により「Ｙ」配置で連結され、そのうち軽鎖は「Ｙ」の口部から始まり、可変領域を通って連続して重鎖を取り囲む。
本発明に開示された抗体、抗原結合断片又は誘導体は、ポリクローナル、モノクローナル、多重特異性、完全ヒト、ヒト化、霊長類化、キメラ抗体、単鎖抗体、エピトープ結合断片（例えば、クラスＦａｂ、クラスＦａｂ’及びクラスＦ（ａｂ’）２）、クラス単鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）を含むが、これらに限定されない。
軽鎖は、ｋａｐｐａ（κ）又はｌａｍｂｄａ（λ）に分けることができる。各重鎖は、κ又はλ軽鎖に結合することができる。一般に、ハイブリドーマ、Ｂ細胞又は遺伝子操作された宿主細胞から免疫グロブリンを産生する場合、その軽鎖と重鎖は、共有結合を介して結合し、２本の重鎖の「尾」部分は、共有ジスルフィド結合又は非共有結合を介して結合する。重鎖において、アミノ酸配列は、Ｙ配置の分岐した末端のＮ末端から各本の鎖の底部のＣ末端まで延びている。免疫グロブリンのκ軽鎖可変領域はＶκであり、免疫グロブリンのλ軽鎖可変領域はＶλである。
軽鎖及び重鎖は何れも、構造及び機能相同性の領域に分けられる。用語「定常の」及び「可変の」は、機能によって使用される。軽鎖（ＶＬ）及び重鎖（ＶＨ）の部分の可変領域は、抗原の認識と特異性を決定する。軽鎖及び重鎖の定常領域は、分泌、経胎盤移動、Ｆｃ受容体結合、補体結合などの重要な生物学的性質を付与する。慣例に従って、定常領域の番号は、抗体の抗原結合部位又はアミノ基末端からより遠くなるにつれて増加する。Ｎ末端部分は可変領域で、Ｃ末端部分は定常領域であり、ＣＨ３及びＣＬ構造ドメインは、それぞれ重鎖及び軽鎖のカルボキシ末端を含む。
天然に存在する抗体において、抗体が含水環境でその３次元配置を示すと仮定すると、それぞれの抗原結合ドメインに存在する６つの「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」は、抗原結合ドメインが形成される短くて非連続的な、抗原に特異的に結合するアミノ酸配列である。抗原結合ドメインにおいて「フレームワーク」領域と呼ばれる残りの他のアミノ酸は、小さい分子間可変性を示す。フレームワーク領域のほとんどはβ－折り畳み配座を採用し、ＣＤＲがそれに連結される環状構造を形成し、又は場合によっては、β折り畳み構造の一部を形成する。従って、フレーム領域は、ステントを形成することにより、鎖間の非共有相互作用でＣＤＲを正確な方位に位置決めする。特定の位置にＣＤＲを有する抗原結合ドメインは、抗原エピトープへの抗体の非共有結合を促進する抗原エピトープに相補的な表面を形成する。所定の重鎖又は軽鎖可変領域について、当業者は、既知の方法によってＣＤＲ及びフレーム領域を含むアミノ酸を同定することができる（Ｋａｂａｔ、Ｅ．ｅｔ ａｌ．、Ｕ．Ｓ． Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（１９８３）及びＣｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９６：９０１－９１７（１９８７）を参照）。
同じ抗体の可変領域のＣＤＲの境界は、異なる割り当てシステムに応じて、異なる場合がある。従って、本発明で定義された具体的なＣＤＲ配列で抗体を限定することに言及する場合、上記抗体の範囲は、可変領域配列が本発明のＣＤＲ配列を含むが、異なる方法の適用により、声明されたＣＤＲ境界が本発明で定義された具体的なＣＤＲ境界とは異なる抗体も包含する。Ｋａｂａｔ及びＣｈｏｔｈｉａによって定義されたＣＤＲは、互いに比較する時のアミノ酸残基の重複又はサブセットを含む。それにもかかわらず、任意の定義を使用して抗体又はその変異体のＣＤＲを指すことは何れも、本発明の範囲内である。
Ｋａｂａｔらはまた、任意の抗体の可変領域配列に適用される番号付けシステムを定義した。当業者は、配列自体以外の他の実験データとは無関係にこの「Ｋａｂａｔ番号付け」システムを任意の可変領域配列に適用することができる。「Ｋａｂａｔ番号」とは、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ． ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓが「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」（１９８３）において提案された番号付けシステムを指す。抗体は、ＥＵ又はＣｈｏｔｈｉａ番号付けシステムを使用することもできる。
本発明に開示された抗体は、鳥類と哺乳動物とを含む任意の動物に由来してもよい。好ましくは、抗体は、ヒト由来、マウス由来、ロバ由来、ウサギ由来、ヤギ由来、ラクダ由来、ラマ由来、ウマ由来又はニワトリ由来の抗体である。他の実施形態において、可変領域は、軟骨魚綱（ｃｏｎｄｒｉｃｔｈｏｉｄ）由来（例えば、サメ由来）であってもよい。
重鎖定常領域は、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ（例えば上、中及び／又は下ヒンジ領域）ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、又は変異体又は断片のうちの少なくとも１種を含む。抗体の重鎖定常領域は、異なる免疫グロブリン分子に由来してもよい。例えば、ポリペプチドの重鎖定常領域は、ＩｇＧ１分子に由来するＣＨ１構造ドメインとＩｇＧ３分子に由来するヒンジ領域とを含んでもよい。他の実施形態において、重鎖定常領域は、部分的にＩｇＧ１分子に由来するヒンジ領域と部分的にＩｇＧ３分子に由来するヒンジ領域を含んでもよい。他の実施形態において、重鎖の一部は、部分的にＩｇＧ１分子に由来するキメラヒンジ領域と部分的にＩｇＧ４分子に由来するキメラヒンジ領域を含んでもよい。
「軽鎖定常領域」は、抗体軽鎖に由来する一部のアミノ酸配列を含む。好ましくは、軽鎖定常領域は、定常κドメイン又は定常λドメインのうちの少なくとも１つを含む。「軽鎖－重鎖対」とは、軽鎖のＣＬドメインと重鎖のＣＨ１ドメインとの間のジスルフィド結合によって二量体を形成することができる軽鎖と重鎖の集合体を指す。
「ＶＨドメイン」は、免疫グロブリン重鎖のアミノ基末端可変ドメインを含み、「ＣＨ１ドメイン」は、免疫グロブリン重鎖の第１定常領域を含む。ＣＨ２ドメインは、他のドメインと密接に対を形成するものではなく、完全な天然ＩｇＧ分子の２つのＣＨ２ドメイン間に、２つのＮ－で連結した分岐炭水化物鎖を挿入する。ＣＨ３ドメインは、ＣＨ２ドメインからＩｇＧ分子のＣ－末端まで延び、約１０８個の残基を含む。「ヒンジ領域」は、ＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインとを連結する一部の重鎖領域を含む。上記ヒンジ領域は、約２５個の残基を含み、且つ柔軟であることで、２つのＮ末端抗原結合領域を個別に移動させることができる。ヒンジ領域は、上・中・下ヒンジドメインという３つの異なるドメインに細かく分けることができる（Ｒｏｕｘ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ １６１：４０８３（１９９８））。
「ジスルフィド結合」とは、２つの硫黄原子間に形成される共有子結合を指す。システインのチオール基は、第２のチオール基と共にジスルフィド結合を形成するか、又は架橋することができる。天然に存在する大部分のＩｇＧ分子において、ＣＨ１とＣＬ領域は、ジスルフィド結合によって結合される。
「キメラ抗体」とは、その可変領域が第１の種から得られるか又は由来し、その定常領域（完全なもの、部分的なもの又は修飾されたものであってもよい）が第２の種に由来する任意の抗体を指す。幾つかの実施形態において、可変領域は非ヒト（例えばマウス又は霊長類動物）に由来し、定常領域はヒトに由来する。
「特異的結合」とは、通常、抗体又は抗原結合断片がその抗原結合ドメイン及びエピトープを介して特定の抗原に相補的に結合し、比較的安定した複合体を形成することを指す。「特異的」は、抗体又は抗原結合断片が特定の抗原又はエピトープに結合する相対的親和性で表すことができる。例えば、抗体「Ａ」が抗体「Ｂ」よりも同じ抗原に対してより高い相対的親和性を有する場合、抗体「Ａ」が抗体「Ｂ」よりもこの抗原に対してより高い特異性を有すると考えられる。特異的結合は、平衡解離定数（ＫＤ）で示すことができ、ＫＤが小さいほど、結合がより緊密であることを意味する。２つの分子が特異的結合であるか否かを決定する方法は、例えば、平衡透析、表面プラズモン共鳴、バイオレイヤー光干渉計測法などを含み、本分野でよく知られるものである。抗原ａに「特異的結合」する抗体は、抗原ａとの平衡解離定数ＫＤが約１００ｎＭ以下、約１０ｎＭ以下、約５ｎＭ以下、約１ｎＭ以下、又は０．５ｎＭ以下の抗体を含む。
「ＥＣ５０」即ち半数最大効果濃度（ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｆｏｒ ５０％ ｏｆ ｍａｘｉｍａｌ ｅｆｆｅｃｔ、ＥＣ５０）とは、最大効果の５０％を引き起こす濃度を指す。
「二重特異性」抗体とは、同じ抗原上の異なるエピトープであってもよいが、異なる抗原上の異なるエピトープであってもよい、２つの抗原結合部位を有する抗体を指す。
「共通軽鎖」という用語は、当該軽鎖が異なる重鎖と同時に組み立てられて、対応する機能を備えた完全な抗体を形成できることを意味し、当該軽鎖は二重特異性抗体の発現に使用でき、２つの抗体を含む混合物の発現にも使用できる。
「エフェクター機能」という用語は、免疫グロブリンＦｃ領域に起因する生物学的活性を指す。免疫グロブリンのエフェクター機能の例には、Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、抗体依存性細胞仲介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞貪食作用（ＡＤＣＰ）、サイトカインの分泌、Ｆｃ受容体の結合作用、抗原提示細胞による免疫複合体仲介性抗原の取り込み、細胞表面受容体のダウンレギュレーション（例えば、Ｂ細胞受容体）及びＢ細胞の活性化が含まれる。
「治療」とは、治療的処置及び予防的又は防止的処置を意味し、その目的は、疾患の進行などの望ましくない生理学的変化又は障害を予防、軽減、改善又は停止することであり、症状の緩和、疾患程度の軽減、疾患状態の安定化（即ち、悪化せず）、疾患進行の遅延又は緩和、疾患状態の改善、緩和、軽減又は消失（部分的又は完全）、治療を受けない場合に予想される生存期限の延長などの検出可能かどうかにかかわらない結果を含むが、これらに限定されない。治療を必要とする患者には、すでに病状又は障害にかかった患者、病状又は障害にかかりやすい患者、又はこの病症又は障害の予防を必要とする患者、検出、診断プロセス及び／又は治療のために、本発明により開示される抗体又は医薬組成物を投与することから利益を得ることができる、又は利益が期待される患者が含まれる。
「患者」とは、ヒト、イヌ、ネコ、ウサギ、マウス、ウマ、ウシなどを含む、診断、予防、予後又は治療を必要とする任意の哺乳動物を指す。
二重特異性抗体
二重特異性抗体は、モノクローナル抗体と比較して、より強い特異性、腫瘍細胞への標的化及びオフターゲット毒性の低減などの顕著な利点がある。二重特異性抗体は、モノクローナル抗体と比較して、１つの特異性抗原結合部位が追加されるため、治療において次のような利点がある。（１）２つの抗原結合部位がそれぞれ腫瘍細胞と免疫細胞に結合でき、Ｔ免疫細胞が腫瘍細胞の周囲に集まり、腫瘍への殺傷力を強化する。（２）２つの異なる媒体経路を同時に遮断して、独自又は重複の機能を発揮し、様々な免疫シグナル伝達経路を仲介して、細胞殺傷毒性を強化することができる。（３）２つの異なる細胞表面抗原が結合した後、相対的に言えば、潜在的に結合特異性を高め、オフターゲットなどの副作用を減らす可能性がある。従って、二重特異性抗体は、腫瘍免疫の治療及び炎症の治療において、幅広い応用の見通しが示されている。
腫瘍免疫では、複数の標的を標的とする治療計画は互いに協力できるため、腫瘍の免疫逃避を防止するのに役立ち、現在、腫瘍免疫の異なる標的を標的とする抗体の同時投与も臨床試験に入っている。しかし、同時投与には、２つの独立した抗体製品の注射、又は２つの異なる抗体の複合製剤の１回の注射が必要である。２回の注射により、投与量とスケジュールを柔軟に設定できるが、患者のコンプライアンス不便と痛みが生じる。また、複合製剤は投与量にある程度の柔軟性を提供できるが、２つの抗体の分子特性が異なるため、通常、溶液中の２つの抗体の化学的及び物理的安定性を可能にする調製条件を見つけることは困難である。まして、２つの異なる抗体の同時投与及び複合製剤の療法は、患者及び／又は支払者の追加費用を増やす可能性があるため、腫瘍を治療するための代替免疫療法が必要であり、好ましくは、このような代替免疫療法は二重特異性抗体に関する。
1） ＰＤ－Ｌ１に結合する二重特異性抗体の部分
幾つかの実施形態において、本発明に係る二重特異性抗体又は抗原結合断片は、ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合することができる。幾つかの実施形態において、本発明に係る二重特異性抗体又は抗原結合断片は、哺乳動物のＰＤ－Ｌ１に特異的に結合することができる。幾つかの実施形態において、ＰＤ－Ｌ１は、ヒトＰＤ－Ｌ１である。幾つかの実施形態において、抗体分子は、ＰＤ－Ｌ１の１つ又は複数の細胞外ドメインに結合する。
幾つかの実施形態において、抗体結合親和性は、表面プラズモン共鳴技術（例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ親和性測定）を使用して測定される。
幾つかの実施形態において、本発明に係る二重特異性抗体又は抗原結合断片は、以下の１種又は複数種の性質を有する。
（ａ） 本発明に係る二重特異性抗体又は抗原結合断片は、高親和性でＰＤ－Ｌ１（例えばヒトＰＤ－Ｌ１）に結合すし、例えば、以下の平衡解離定数（ＫＤ）でＰＤ－Ｌ１に結合する。上記ＫＤは約１２ｎＭよりも小さく、例えば、約１０ｎＭ以下、約５ｎＭ以下、約４ｎＭ、３ｎＭ、２ｎＭ又は１ｎＭ以下である。幾つかの実施形態において、上記ＫＤは、約０．９ｎＭ、又は０．５ｎＭ以下である。
（ｂ） 本発明に係る二重特異性抗体又は抗原結合断片は、ヒトＰＤ－Ｌ１を発現する細胞に結合する。幾つかの実施形態において、例えば、そのＥＣ５０は、約２ｎＭ、１ｎＭ、０．９ｎＭ、０．８ｎＭ、０．７ｎＭ、０．６ｎＭ、又は０．５ｎＭ以下である。幾つかの実施形態において、上記結合は、フローサイトメトリー（例えばＦＡＣＳ）を使用して測定される。幾つかの実施形態において、ヒトＰＤ－Ｌ１を発現する細胞は、ヒトＰＤ－Ｌ１を発現するＣＨＯ細胞である。
（ｃ） 幾つかの実施形態において、本発明に係る二重特異性抗体又は抗原結合断片は、ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１の関連する活性を遮断する。例えばそのＥＣ５０は、約６μｇ／ｍＬ、５μｇ／ｍＬ、４μｇ／ｍＬ、３μｇ／ｍＬ、２μｇ／ｍＬ、又は１μｇ／ｍＬ以下である。幾つかの実施形態において、ＰＤ－Ｌ１の関連する活性は、ＰＤ－Ｌ１とＰＤ－１との結合である。幾つかの実施形態において、本発明に係る抗体又はその断片は、ＭＯＡ測定において、約６μｇ／ｍＬ、５μｇ／ｍＬ、４μｇ／ｍＬ、３μｇ／ｍＬ、２μｇ／ｍＬ、又は１μｇ／ｍＬ以下又はそれらの約以下のＥＣ５０、又は約０．１～３μｇ／ｍＬ、０．１～０．４μｇ／ｍＬ又は０．１～０．３μｇ／ｍＬのＥＣ５０でＰＤ－Ｌ１とＰＤ－１との結合を阻害する。幾つかの実施形態において、細胞は、ヒトＰＤ－Ｌ１を過剰発現するＣＨＯ細胞である。
（ｄ） 本発明に係る二重特異性抗体又は抗原結合断片は、抗体依存性細胞仲介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を誘導することができる。
（ｅ） 本発明に係る二重特異性抗体又は抗原結合断片は、ＰＤ－Ｌ１の１種又は複数種の活性を阻害する。例えば、腫瘍浸潤リンパ球の増加、Ｔ細胞受容体仲介性増殖の増加、又はがん細胞の免疫逃避の減少の１つ又は複数をもたらす。幾つかの実施形態において、二重特異性抗体又は抗原結合断片は、腫瘍の増殖を阻害することができ、腫瘍は腫瘍の免疫逃避である。幾つかの実施形態において、腫瘍は、結腸がんなど、胃腸管腫瘍（例えば、がん）である。
幾つかの実施形態において、本発明に係る二重特異性抗体又は抗原結合断片は、ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する重鎖可変領域ａ（ＶＨａ）と軽鎖可変領域ａ（ＶＬａ）を含む。そのうち、ＶＨａは、３つのＣＤＲ（ＶＨａ ＣＤＲ１、ＶＨａ ＣＤＲ２、ＶＨａ ＣＤＲ３）を含み、ＶＬａは、３つのＣＤＲ（ＶＬａ ＣＤＲ１、ＶＬａ ＣＤＲ２、ＶＬａ ＣＤＲ３）を含む。幾つかの実施形態において、ＶＨａのＣＤＲは、Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ、Ａｖｅｌｕｍａｂ、Ｄｕｒｖａｌｕｍａｂ、Ｅｎｖａｆｏｌｉｍａｂ又はＣｏｓｉｂｅｌｉｍａｂにおける重鎖ＣＤＲから選ばれる。幾つかの実施形態において、ＶＨａは、Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ、Ａｖｅｌｕｍａｂ、Ｄｕｒｖａｌｕｍａｂ、Ｅｎｖａｆｏｌｉｍａｂ又はＣｏｓｉｂｅｌｉｍａｂにおける重鎖可変領域から選ばれる。幾つかの実施形態において、ＶＬａのＣＤＲは、Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ、Ａｖｅｌｕｍａｂ、Ｄｕｒｖａｌｕｍａｂ、Ｅｎｖａｆｏｌｉｍａｂ又はＣｏｓｉｂｅｌｉｍａｂにおける軽鎖ＣＤＲから選ばれる。幾つかの実施形態において、ＶＬａは、Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ、Ａｖｅｌｕｍａｂ、Ｄｕｒｖａｌｕｍａｂ、Ｅｎｖａｆｏｌｉｍａｂ又はＣｏｓｉｂｅｌｉｍａｂにおける軽鎖可変領域から選ばれる。
幾つかの実施形態において、ＶＨａ ＣＤＲ１は、配列番号４～８の何れか一項で示されるアミノ酸配列を含み、ＶＨａ ＣＤＲ２は、配列番号９～１８の何れか一項で示されるアミノ酸配列を含み、ＶＨａ ＣＤＲ３は、配列番号１９又は２０で示されるアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態において、ＶＨａ ＣＤＲ１は、配列番号４で示されるアミノ酸配列を含み、ＶＨａ ＣＤＲ２は、配列番号９～１４の何れか一項で示されるアミノ酸配列を含み、ＶＨａ ＣＤＲ３は、配列番号１９で示されるアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態において、ＶＨａ ＣＤＲ１は、配列番号４で示されるアミノ酸配列を含み、ＶＨａ ＣＤＲ２は、配列番号１４で示されるアミノ酸配列を含み、ＶＨａ ＣＤＲ３は、配列番号１９で示されるアミノ酸配列を含む。
幾つかの実施形態において、ＶＬａ ＣＤＲ１は、配列番号３６～４０の何れか一項で示されるアミノ酸配列を含み、ＶＬａ ＣＤＲ２は、配列番号４１～４４の何れか一項で示されるアミノ酸配列を含み、ＶＬａ ＣＤＲ３は、配列番号４５～４８の何れか一項で示されるアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態において、ＶＬａ ＣＤＲ１は、配列番号３６で示されるアミノ酸配列を含み、ＶＬａ ＣＤＲ２は、配列番号４１で示されるアミノ酸配列を含み、ＶＬａ ＣＤＲ３は、配列番号４５で示されるアミノ酸配列を含む。
幾つかの実施形態において、ＶＨａ ＣＤＲ１は、配列番号４で示されるアミノ酸配列を含み、ＶＨａ ＣＤＲ２は、配列番号１４で示されるアミノ酸配列を含み、ＶＨａ ＣＤＲ３は、配列番号１９で示されるアミノ酸配列を含み、ＶＬａ ＣＤＲ１は、配列番号３６で示されるアミノ酸配列を含み、ＶＬａ ＣＤＲ２は、配列番号４１で示されるアミノ酸配列を含み、ＶＬａ ＣＤＲ３は、配列番号４５で示されるアミノ酸配列を含む。
幾つかの実施形態において、ＶＨａは、配列番号４９～６３の何れか一項で示されるアミノ酸配列を含み、幾つかの実施形態において、ＶＬａは、配列番号７５～８０の何れか一項で示されるアミノ酸配列を含む。
幾つかの実施形態において、本発明に係る二重特異性抗体又は抗原結合断片は、配列番号５０で示されるアミノ酸配列を有するＶＨａ及び配列番号７５で示されるアミノ酸配列を有するＶＬａからなる可変領域ａを含む。
幾つかの実施形態において、本発明に係る二重特異性抗体又は抗原結合断片は、配列番号５１で示されるアミノ酸配列を有するＶＨａ及び配列番号７５で示されるアミノ酸配列を有するＶＬａからなる可変領域ａを含む。
幾つかの実施形態において、本発明に係る二重特異性抗体又は抗原結合断片は、配列番号５２で示されるアミノ酸配列を有するＶＨａ及び配列番号７５で示されるアミノ酸配列を有するＶＬａからなる可変領域ａを含む。
幾つかの実施形態において、本発明に係る二重特異性抗体又は抗原結合断片は、配列番号５４で示されるアミノ酸配列を有するＶＨａ及び配列番号７５で示されるアミノ酸配列を有するＶＬａからなる可変領域ａを含む。
2） ＣＤ４７に結合する二重特異性抗体の部分
幾つかの実施形態において、本発明に係る二重特異性抗体又は抗原結合断片は、ＣＤ４７に特異的に結合することができる。幾つかの実施形態において、本発明に係る二重特異性抗体又は抗原結合断片は、哺乳動物のＣＤ４７に特異的に結合することができる。幾つかの実施形態において、ＣＤ４７は、ヒトＣＤ４７である。幾つかの実施形態において、抗体分子は、ＣＤ４７の１つ又は複数の細胞外ドメインに結合する。
幾つかの実施形態において、本発明に係る二重特異性抗体又は抗原結合断片は、以下の１種又は複数種の性質を有する。
（ａ） 本発明に係る二重特異性抗体又は抗原結合断片は、高親和性でＣＤ４７（例えばヒトＣＤ４７）に結合し、例えば、以下の平衡解離定数（ＫＤ）でＣＤ４７に結合する。上記ＫＤは約７００ｎＭより小さく、例えば、約３０ｎＭ以下、約１０ｎＭ以下、約５ｎＭ以下である。
（ｂ） 本発明に係る二重特異性抗体又は抗原結合断片は、顕著な細胞凝集を引き起こさず、例えば、本発明に係る二重特異性抗体又は抗原結合断片は、赤血球の顕著な血球凝集反応を引き起すことがない。幾つかの実施形態において、抗ＣＤ４７陽性対照抗体Ｈｕ５Ｆ９－Ｇ４が存在する時の凝集レベルと比較すると、本発明に係る二重特異性抗体又は抗原結合断片が存在する時の凝集レベルは、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％又は少なくとも９９％低下する場合、本発明に係る二重特異性抗体又は抗原結合断片は顕著な凝集レベルを引き起こさなかったことを示す。抗体の濃度が４００ｐＭ～８００ｎＭにある時、本発明に係る二重特異性抗体又は抗原結合断片は、顕著な細胞凝集を引き起すことがない。
（ｃ） 本発明に係る二重特異性抗体又は抗原結合断片は、ヒト赤血球に結合しない。一実施形態において、抗ＣＤ４７陽性対照抗体Ｈｕ５Ｆ９－Ｇ４が存在する時のヒト赤血球結合レベルと比較すると、本発明に係る二重特異性抗体又は抗原結合断片が存在する時のヒト赤血球結合レベルは、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％又は少なくとも９９％低下する場合、本発明に係る二重特異性抗体又は抗原結合断片は顕著にヒト赤血球に結合しなかったことを示す。好ましくは、抗体の濃度が２００ｐＭ～１００ｎＭにある時、本発明に係る二重特異性抗体又は抗原結合断片は、顕著にヒト赤血球に結合しない。
（ｄ） 幾つかの実施形態において、本発明に係る二重特異性抗体又は抗原結合断片は、ＣＤ４７とＳＩＲＰαとの結合を遮断する遮断抗体である。幾つかの実施形態において、本発明のＣＤ４７抗体が存在する場合、腫瘍細胞に対するマクロファージの貪食能力は、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％又は少なくとも９９％向上する。
（ｅ） 本発明に係る二重特異性抗体又は抗原結合断片は、抗体依存性細胞仲介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を誘導することができる。
（ｆ） 本発明に係る二重特異性抗体又は抗原結合断片は、ＣＤ４７の１種又は複数種の活性を阻害し、例えば、腫瘍浸潤マクロファージの貪食能力の増加及び／又はがん細胞の免疫逃避の減少をもたらす。幾つかの実施形態において、二重特異性抗体又は抗原結合断片は、腫瘍の増殖を阻害することができ、腫瘍は腫瘍の免疫逃避である。幾つかの実施形態において、腫瘍は、結腸がんなど、胃腸管腫瘍（例えば、がん）である。
幾つかの実施形態において、本発明に係る二重特異性抗体又は抗原結合断片は、ＣＤ４７に特異的に結合する重鎖可変領域ｂ（ＶＨｂ）と軽鎖可変領域ｂ（ＶＬｂ）を含む。そのうち、ＶＨｂは、３つのＣＤＲ（ＶＨｂ ＣＤＲ１、ＶＨｂ ＣＤＲ２、ＶＨｂ ＣＤＲ３）を含み、ＶＬｂは、３つのＣＤＲ（ＶＬｂ ＣＤＲ１、ＶＬｂ ＣＤＲ２、ＶＬｂ ＣＤＲ３）を含む。幾つかの実施形態において、ＶＨｂのＣＤＲは、Ｍａｇｒｏｌｉｍａｂ、ＡＯ－１７６（Ａｒｃｈ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ）、ＴＪＣ４（天境生物）、ＡＫ１１７（康方生物）又はＩＢＩ１８８（信達生物）などにおける重鎖ＣＤＲから選ばれる。幾つかの実施形態において、ＶＨｂは、Ｍａｇｒｏｌｉｍａｂ、ＡＯ－１７６（Ａｒｃｈ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ）、ＴＪＣ４（天境生物）、ＡＫ１１７（康方生物）又はＩＢＩ１８８（信達生物）などにおける重鎖可変領域から選ばれる。幾つかの実施形態において、ＶＬｂのＣＤＲは、Ｍａｇｒｏｌｉｍａｂ、ＡＯ－１７６（Ａｒｃｈ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ）、ＴＪＣ４（天境生物）、ＡＫ１１７（康方生物）又はＩＢＩ１８８（信達生物）などにおける軽鎖ＣＤＲから選ばれる。幾つかの実施形態において、ＶＬｂは、Ｍａｇｒｏｌｉｍａｂ、ＡＯ－１７６（Ａｒｃｈ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ）、ＴＪＣ４（天境生物）、ＡＫ１１７（康方生物）又はＩＢＩ１８８（信達生物）などにおける軽鎖可変領域から選ばれる。
幾つかの実施形態において、ＶＨｂ ＣＤＲ１は、配列番号２１～２３の何れか一項で示されるアミノ酸配列を含み、ＶＨｂ ＣＤＲ２は、配列番号２４～２８の何れか一項で示されるアミノ酸配列を含み、ＶＨｂ ＣＤＲ３は、配列番号２９～３５の何れか一項で示されるアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態において、ＶＨｂ ＣＤＲ１は、配列番号２１で示されるアミノ酸配列を含み、ＶＨｂ ＣＤＲ２は、配列番号２４で示されるアミノ酸配列を含み、ＶＨｂ ＣＤＲ３は、配列番号２９で示されるアミノ酸配列を含む。
幾つかの実施形態において、ＶＬｂ ＣＤＲ１は、配列番号３６～４０の何れか一項で示されるアミノ酸配列を含み、ＶＬｂ ＣＤＲ２は、配列番号４１～４４の何れか一項で示されるアミノ酸配列を含み、ＶＬｂ ＣＤＲ３は、配列番号４５～４８の何れか一項で示されるアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態において、ＶＬｂ ＣＤＲ１は、配列番号３６で示されるアミノ酸配列を含み、ＶＬｂ ＣＤＲ２は、配列番号４１で示されるアミノ酸配列を含み、ＶＬｂ ＣＤＲ３は、配列番号４５で示されるアミノ酸配列を含む。
幾つかの実施形態において、ＶＨｂ ＣＤＲ１は、配列番号２１で示されるアミノ酸配列を含み、ＶＨｂ ＣＤＲ２は、配列番号２４で示されるアミノ酸配列を含み、ＶＨｂ ＣＤＲ３は、配列番号２９で示されるアミノ酸配列を含み、ＶＬｂ ＣＤＲ１は、配列番号３６で示されるアミノ酸配列を含み、ＶＬｂ ＣＤＲ２は、配列番号４１で示されるアミノ酸配列を含み、ＶＬｂ ＣＤＲ３は、配列番号４５で示されるアミノ酸配列を含む。
幾つかの実施形態において、ＶＨｂは、配列番号６４～７４の何れか一項で示されるアミノ酸配列を含み、幾つかの実施形態において、ＶＬｂは、配列番号７５～８０の何れか一項で示されるアミノ酸配列を含む。
幾つかの実施形態において、本発明に係る二重特異性抗体又は抗原結合断片は、配列番号６４で示されるアミノ酸配列を有するＶＨｂ及び配列番号７５で示されるアミノ酸配列を有するＶＬｂからなる可変領域ｂを含む。
3） 抗ＰＤ－Ｌ１／ＣＤ４７二重特異性抗体
自然免疫系は、感染と細胞悪性転化を防ぐ最初の非特異的防衛線である。自然免疫系において、単球、マクロファージ及び樹状細胞は、貪食作用を通じて抗原提示細胞（ＡＰＣｓ）として機能する。一方、貪食作用を通じて腫瘍細胞を飲み込むＡＰＣｓの能力は、自然免疫と適応免疫をつなぐ不可欠な架け橋である。ＡＰＣｓによる腫瘍細胞の摂取の減少のため、Ｔ細胞活性の低下を間接的に引き起こす。例えば、Ａｖｉｃｅ ＭＮ ｅｔ ａｌ．、Ｒｏｌｅ ｏｆ ＣＤ４７ ｉｎ ｔｈｅ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｎａｉｖｅ Ｔ ｃｅｌｌ ａｎｅｒｇｙ、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１６７（５）：２４５９～２４６８（２００１）を参照する。研究により、ＰＤ－Ｌ１及びＣＤ４７タンパク質の発現は、両方とも転写因子ＭＹＣによって調節され、同時に腫瘍細胞で過剰発現されることが確認されている。例えば、Ｓｔｅｐｈａｎｉｅ Ｃ ｅｔ ａｌ．、ＭＹＣ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｔｈｅ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｈｒｏｕｇｈ ＣＤ４７ ａｎｄ ＰＤ－Ｌ１、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３５２（６２８２）：２２７～３１（２０１６）を参照する。腫瘍細胞は、ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ１とＣＤ４７／ＳＩＲＰα伝達経路を通じて、自然免疫系の監視から逃れ、適応免疫寛容を獲得する。
幾つかの実施形態において、本発明は、ＰＤ－Ｌ１及びＣＤ４７に特異的に結合できる抗ＰＤ－Ｌ１／ＣＤ４７二重特異性抗体又は抗原結合断片を提供する。幾つかの実施形態において、本発明に係る抗体又はその断片は、ヒトＰＤ－Ｌ１及びＣＤ４７などの哺乳動物のＰＤ－Ｌ１及びＣＤ４７に結合する。例えば、抗体分子は、ＰＤ－Ｌ１及びＣＤ４７上のエピトープ（例えば、線状又は立体配座エピトープ）に特異的に結合する。幾つかの実施形態において、抗体分子は、ＰＤ－Ｌ１及びＣＤ４７の１つ又は複数の細胞外ドメインに結合する。
幾つかの実施形態において、本発明の抗ＰＤ－Ｌ１／ＣＤ４７二重特異性抗体又は抗原結合断片は、以下の１種又は複数種の性質を有する。
（ａ） 幾つかの実施形態において、本発明の抗ＰＤ－Ｌ１／ＣＤ４７二重特異性抗体は、ＰＤ－Ｌ１及びＣＤ４７に同時に結合することができ、且つ親抗体の親和定数を維持し、それにより、ＰＤ１／ＰＤ－Ｌ１シグナル伝達経路を遮断し、ＳＩＲＰα／ＣＤ４７シグナル伝達経路を遮断することができる。
（ｂ） 幾つかの実施形態において、本発明の抗ＰＤ－Ｌ１／ＣＤ４７二重特異性抗体は、超高親和性（例えば、ＫＤ＝０．１７４ｎＭ）でＰＤ－Ｌ１に結合し、高親和性（例えば、ＫＤ＝３．７８ｎＭ）又は中程度の親和性（例えば、ＫＤ＝２７．８ｎＭ）でＣＤ４７に結合することができる。腫瘍細胞のＰＤ－Ｌ１との特異的結合によって、本発明の抗ＰＤ－Ｌ１／ＣＤ４７二重特異性抗体の腫瘍細胞への選択的結合を促進し、多くの正常な組織で発現するＣＤ４７との結合を回避し、副作用を減少させる。ＣＤ４７との親和性がＰＤ－Ｌ１との親和性よりもはるかに低い場合、本発明の抗ＰＤ－Ｌ１／ＣＤ４７二重特異性抗体の有効用量の範囲を大幅に拡張することができる。
（ｃ） 幾つかの実施形態において、本発明の抗ＰＤ－Ｌ１／ＣＤ４７二重特異性抗体は、無関係な重鎖と軽鎖のペアリングを避けることができる共通軽鎖で設計される。
（ｄ） 幾つかの実施形態において、本発明の抗ＰＤ－Ｌ１／ＣＤ４７二重特異性抗体は、４本鎖抗体の構造を安定化し、各鎖間の正しいカップリング又はペアリングを容易にするアミノ酸残基で設計される。幾つかの実施形態において、本発明に係る二重特異性抗体のそれぞれのＦｃドメインには、それぞれＹ３４９Ｃ及びＳ３５４Ｃが含まれるか、又は、それぞれＳ３５４Ｃ及びＹ３４９Ｃが含まれる。本発明に係る二重特異性抗体のそれぞれのＦｃドメインには、それぞれ突起（「ノブ（ｋｎｏｂ）」）又は空洞（「ホール（ｈｏｌｅ）」）が含まれ、また、第１ポリペプチド鎖のＦｃドメインの上記突起又は空洞は、第３ポリペプチド鎖のＦｃドメインの上記空洞又は突起内にそれぞれ設置することができる。このようにして、上記第１ポリペプチド鎖と第３ポリペプチド鎖は、互いに「ノブイントゥーホール（ｋｎｏｂ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅ）」の安定な会合を形成する。そのうち、第１ポリペプチド鎖は、ＰＤ－Ｌ１を特異的に認識して結合できるＶＨａ－ＣＨａ構造を含み、第３ポリペプチド鎖は、ＣＤ４７を特異的に認識して結合できるＶＨｂ－ＣＨｂ構造を含む。
（ｅ） 幾つかの実施形態において、本発明の抗ＰＤ－Ｌ１／ＣＤ４７二重特異性抗体は、体外の培養細胞で安定的に発現し、熱安定性が良好で、抗体の収率及び純度が高く、複雑な製造プロセスを必要としないなどの利点を有する。
（ｆ） 本発明の抗ＰＤ－Ｌ１／ＣＤ４７二重特異性抗体又はその断片は、ヒトＰＤ－Ｌ１を発現する細胞に結合する。幾つかの実施形態において、例えば、約２ｎＭ、１ｎＭ、０．９ｎＭ、０．８ｎＭ、０．７ｎＭ、０．６ｎＭ、０．５ｎＭ以下のＥＣ５０でヒトＰＤ－Ｌ１を発現する細胞を結合する。幾つかの実施形態において、上記結合は、フローサイトメトリー（例えばＦＡＣＳ）を使用して測定される。幾つかの実施形態において、ヒトＰＤ－Ｌ１を発現する細胞は、ヒトＰＤ－Ｌ１を発現するＣＨＯ－Ｓ細胞である。
（ｇ） 幾つかの実施形態において、本発明の抗ＰＤ－Ｌ１／ＣＤ４７二重特異性抗体又はその断片は、ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１の関連する活性を遮断する。例えば、約０．３μｇ／ｍＬ以下のＥＣ５０、又は約０．１～３μｇ／ｍＬのＥＣ５０でＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１の関連する活性を遮断する。幾つかの実施形態において、ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１の関連する活性とは、ＰＤ－Ｌ１とＰＤ－１との結合後、ＰＤ１細胞内ドメインの阻害シグナルの活性化を指す。幾つかの実施形態において、本発明の抗ＰＤ－Ｌ１／ＣＤ４７二重特異性抗体又はその断片は、ＭＯＡ測定において、約０．３μｇ／ｍＬ以下又は約０．１～３μｇ／ｍＬ以下のＥＣ５０でＰＤ－Ｌ１とＰＤ－１との結合を阻害する。幾つかの実施形態において、細胞は、ヒトＰＤ－Ｌ１を過剰発現するＣＨＯ細胞である。
（ｈ） 本発明の抗ＰＤ－Ｌ１／ＣＤ４７二重特異性抗体は、顕著な細胞凝集を引き起こすことがなく、例えば、本発明の抗ＰＤ－Ｌ１／ＣＤ４７二重特異性抗体は、赤血球の顕著な血球凝集反応を引き起こすことがない。幾つかの実施形態において、抗ＣＤ４７陽性対照抗体Ｈｕ５Ｆ９－Ｇ４が存在する時の凝集レベルと比較すると、本発明の抗ＰＤ－Ｌ１／ＣＤ４７二重特異が存在する時の凝集レベルは、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％又は少なくとも９９％低下する場合、本発明の抗ＰＤ－Ｌ１／ＣＤ４７二重特異性抗体は顕著な凝集レベルを引き起こさなかったことを示す。好ましくは、抗体の濃度が４００ｐＭ～８００ｎＭにある時、本発明の抗ＰＤ－Ｌ１／ＣＤ４７二重特異性抗体は、顕著な細胞凝集を引き起こすことがない。
（ｉ） 本発明の抗ＰＤ－Ｌ１／ＣＤ４７二重特異性抗体は、ヒト赤血球と結合することがない。一実施形態において、抗ＣＤ４７陽性対照抗体Ｈｕ５Ｆ９－Ｇ４が存在する時のヒト赤血球結合レベルと比較すると、本発明の抗ＰＤ－Ｌ１／ＣＤ４７二重特異性抗体が存在する時のヒト赤血球結合レベルは、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％又は少なくとも９９％低下する場合、本発明の抗ＰＤ－Ｌ１／ＣＤ４７二重特異性抗体はヒト赤血球と明らかに結合しかなったことを示す。好ましくは、抗体の濃度が２００ｐＭ～１００ｎＭにある時、本発明の抗ＰＤ－Ｌ１／ＣＤ４７二重特異性抗体は、ヒト赤血球と明らかに結合することがない。
（ｊ） 幾つかの実施形態において、本発明の抗ＰＤ－Ｌ１／ＣＤ４７二重特異性抗体は、ＣＤ４７とＳＩＲＰαとの結合を遮断する遮断抗体である。幾つかの実施形態において、本発明の抗ＰＤ－Ｌ１／ＣＤ４７二重特異性抗体が存在する時、腫瘍細胞に対するマクロファージの貪食能力は、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％又は少なくとも９９％向上する。
（ｋ） 幾つかの実施形態において、本発明の抗ＰＤ－Ｌ１／ＣＤ４７二重特異性抗体又はその断片は、抗体依存性細胞仲介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を誘導することができる。一実施形態において、本発明の抗ＰＤ－Ｌ１／ＣＤ４７二重特異性抗体又はその断片は、抗体依存性細胞仲介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を誘導する能力が減少する。一実施形態において、本発明の抗ＰＤ－Ｌ１／ＣＤ４７二重特異性抗体又はその断片は、抗体依存性細胞仲介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を誘導することができない。
（ｌ） 本発明の抗ＰＤ－Ｌ１／ＣＤ４７二重特異性抗体又はその断片は、ＰＤ－Ｌ１及びＣＤ４７の１種又は複数種の活性を共同で阻害する。幾つかの実施形態において、抗ＰＤ－Ｌ１／ＣＤ４７二重特異性抗体は、腫瘍の増殖を阻害することができ、腫瘍は腫瘍の免疫逃避である。幾つかの実施形態において、腫瘍は、結腸がんなど、胃腸管腫瘍（例えば、がん）である。
幾つかの実施形態において、本発明の抗ＰＤ－Ｌ１／ＣＤ４７二重特異性抗体は、それぞれ２本の重鎖と２本の軽鎖である４本のペプチド鎖を有する。１本の重鎖はＶＨａを含み、別の重鎖はＶＨｂを含み、１本の軽鎖はＶＬａを含み、別の軽鎖はＶＬｂを含み、そのうち、ＶＨａ、ＶＬａで構成された可変領域ａはＰＤ－Ｌ１に特異的に結合し、ＶＨｂ、ＶＬｂで構成された可変領域ｂはＣＤ４７に特異的に結合する。幾つかの実施形態において、２本の軽鎖は同じ軽鎖である。
幾つかの実施形態において、本発明に係る二重特異性抗体は、「ノブイントゥーホール」（Ｋｎｏｂｓ－ｉｎｔｏ－Ｈｏｌｅｓ）技術を使用する（例えば、Ｊｏｈｎ Ｂ．Ｂ．Ｒｉｄｇｗａｙ ｅｔ ａｌ．、「Ｋｎｏｂｓ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅｓ」ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ ＣＨ３ｄｏｍａｉｎｓ ｆｏｒ ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、９（７）：ｐ．６１７－２１（１９９６）；Ｓｈａｎｅ Ａｔｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．、Ｓｔａｂｌｅ ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｓ ｆｏｒｍ ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ ｔｈｅ ｄｏｍａｉｎ ｉｎｔｅｒｆａｃｅ ｏｆ ａ ｈｏｍｏｄｉｍｅｒ ｕｓｉｎｇ ａ ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ ｌｉｂｒａｒｙ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ、２７０：ｐ．２６－３５（１９９７）；Ｐａｕｌ Ｃａｒｔｅｒ、Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ｈｕｍａｎ ＩｇＧ ｂｙ ｄｅｓｉｇｎ、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ、２４８、７～１５（２００１）；特許ＵＳ８２１６８０５Ｂ２を参照）。当該技術は、本発明の二重特異性抗体の各鎖の正しい会合を促進するために、本発明の二重特異性抗体の異なる鎖間で界面を改進することができる。通常、当該技術は、１本鎖の界面に「突起」（「ノブ（ｋｎｏｂｓ）」）を導入し、それとペアリングされる別の鎖の界面に対応する「空洞」（「ホール（ｈｏｌｅｓ）」）を導入することで、突起を空洞内に設置可能にすることに関する。１本鎖からの重鎖定常ドメインのＣＨ３ドメイン界面のアミノ酸側鎖を大きな側鎖（アミノ酸置換Ｔ３６６Ｗ（Ｅｕ番号）など）で置き換えることによって突起を構築することができる。大きなアミノ酸側鎖を小さな側鎖（アミノ酸置換Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖ（Ｅｕ番号））で置き換えることで、ペアリングされる別の鎖の重鎖定常ドメインのＣＨ３ドメイン界面で、突起と同じ又は類似するサイズの補償空洞を構築する。幾つかの実施形態において、１本の重鎖ＦｃドメインにはＹ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖが含まれ、別の重鎖ＦｃドメインにはＳ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗが含まれ、「ノブイントゥーホール（ｋｎｏｂ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅ）」の安定な会合が形成される。
幾つかの実施形態において、本発明の二重特異性抗体のＦｃ領域は、Ｆｃ受容体の結合親和性に対する修飾を含む。幾つかの実施形態において、上記Ｆｃ受容体はＦｃγ受容体であり、特にヒトＦｃγ受容体である。一実施形態において、上記Ｆｃ受容体は活性化されたＦｃ受容体である。幾つかの実施形態において、上記修飾は、本発明の二重特異性抗体のエフェクター機能を低減させる。幾つかの実施形態において、上記エフェクター機能は、抗体依存性細胞仲介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）である。幾つかの実施形態において、上記修飾は、上記免疫グロブリン分子Ｆｃ領域内にあり、特にそのＣＨ２領域内にある。幾つかの実施形態において、上記免疫グロブリン分子は、免疫グロブリン重鎖第２９７位（Ｅｕ番号）でのアミノ酸置換を含む。一具体的な実施形態において、上記アミノ酸置換はＮ２９７Ａである（例えば、Ｊ．Ｌｕｎｄ ｅｔ ａｌ．、Ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ－ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｉｎ ＩｇＧ ｃａｎ ｍｏｄｕｌａｔｅ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｂｙ Ｆｃ ｇａｍｍａ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ、ＦＡＳＥＢ．Ｊ．９、１１５－１１９（１９９５）を参照）。
幾つかの実施形態において、本発明の抗ＰＤ－Ｌ１／ＣＤ４７二重特異性抗体の重鎖は、ＭＥＦＧＬＳＷＶＦＬＶＡＩＬＫＧＶＱＣ（配列番号９０）などのシグナルペプチド配列を更に含む。幾つかの実施形態において、本発明の抗ＰＤ－Ｌ１／ＣＤ４７二重特異性抗体の軽鎖は、ＭＤＭＲＶＬＡＱＬＬＧＬＬＬＬＣＦＰＧＡＲＣ（配列番号９１）などのシグナルペプチド配列を更に含む。
幾つかの実施形態において、抗ＰＤ－Ｌ１／ＣＤ４７二重特異性抗体は、配列番号４９～６３の何れか一項で示されるＶＨａ、配列番号６４～７４の何れか一項で示されるＶＨｂ、及び配列番号７５～８０の何れか一項で示されるＶＬａとＶＬｂを含む。
幾つかの実施形態において、抗ＰＤ－Ｌ１／ＣＤ４７二重特異性抗体は、配列番号４９で示されるＶＨａ、配列番号６４で示されるＶＨｂ、及び配列番号７５で示されるＶＬａとＶＬｂを含む。
幾つかの実施形態において、抗ＰＤ－Ｌ１／ＣＤ４７二重特異性抗体は、配列番号４９で示されるＶＨａ、配列番号６４で示されるＶＨｂ、及び配列番号７６で示されるＶＬａとＶＬｂを含む。
幾つかの実施形態において、抗ＰＤ－Ｌ１／ＣＤ４７二重特異性抗体は、配列番号４９で示されるＶＨａ、配列番号６４で示されるＶＨｂ、及び配列番号７７で示されるＶＬａとＶＬｂを含む。
幾つかの実施形態において、抗ＰＤ－Ｌ１／ＣＤ４７二重特異性抗体は、配列番号４９で示されるＶＨａ、配列番号６４で示されるＶＨｂ、及び配列番号７８で示されるＶＬａとＶＬｂを含む。
幾つかの実施形態において、抗ＰＤ－Ｌ１／ＣＤ４７二重特異性抗体は、配列番号４９で示されるＶＨａ、配列番号６４で示されるＶＨｂ、及び配列番号７９で示されるＶＬａとＶＬｂを含む。
幾つかの実施形態において、抗ＰＤ－Ｌ１／ＣＤ４７二重特異性抗体は、配列番号４９で示されるＶＨａ、配列番号６４で示されるＶＨｂ、及び配列番号８０で示されるＶＬａとＶＬｂを含む。
幾つかの実施形態において、抗ＰＤ－Ｌ１／ＣＤ４７二重特異性抗体は、配列番号５０で示されるＶＨａ、配列番号６４で示されるＶＨｂ、及び配列番号７５で示されるＶＬａとＶＬｂを含む。
幾つかの実施形態において、抗ＰＤ－Ｌ１／ＣＤ４７二重特異性抗体は、配列番号５０で示されるＶＨａ、配列番号６４で示されるＶＨｂ、及び配列番号７６で示されるＶＬａとＶＬｂを含む。
幾つかの実施形態において、抗ＰＤ－Ｌ１／ＣＤ４７二重特異性抗体は、配列番号５０で示されるＶＨａ、配列番号６４で示されるＶＨｂ、及び配列番号７７で示されるＶＬａとＶＬｂを含む。
幾つかの実施形態において、抗ＰＤ－Ｌ１／ＣＤ４７二重特異性抗体は、配列番号５０で示されるＶＨａ、配列番号６４で示されるＶＨｂ、及び配列番号７８で示されるＶＬａとＶＬｂを含む。
幾つかの実施形態において、抗ＰＤ－Ｌ１／ＣＤ４７二重特異性抗体は、配列番号５０で示されるＶＨａ、配列番号６４で示されるＶＨｂ、及び配列番号７９で示されるＶＬａとＶＬｂを含む。
幾つかの実施形態において、抗ＰＤ－Ｌ１／ＣＤ４７二重特異性抗体は、配列番号５０で示されるＶＨａ、配列番号６４で示されるＶＨｂ、及び配列番号８０で示されるＶＬａとＶＬｂを含む。
幾つかの実施形態において、抗ＰＤ－Ｌ１／ＣＤ４７二重特異性抗体は、配列番号５１で示されるＶＨａ、配列番号６４で示されるＶＨｂ、及び配列番号７５で示されるＶＬａとＶＬｂを含む。
幾つかの実施形態において、抗ＰＤ－Ｌ１／ＣＤ４７二重特異性抗体は、配列番号５１で示されるＶＨａ、配列番号６４で示されるＶＨｂ、及び配列番号７６で示されるＶＬａとＶＬｂを含む。
幾つかの実施形態において、抗ＰＤ－Ｌ１／ＣＤ４７二重特異性抗体は、配列番号５１で示されるＶＨａ、配列番号６４で示されるＶＨｂ、及び配列番号７７で示されるＶＬａとＶＬｂを含む。
幾つかの実施形態において、抗ＰＤ－Ｌ１／ＣＤ４７二重特異性抗体は、配列番号５１で示されるＶＨａ、配列番号６４で示されるＶＨｂ、及び配列番号７８で示されるＶＬａとＶＬｂを含む。
幾つかの実施形態において、抗ＰＤ－Ｌ１／ＣＤ４７二重特異性抗体は、配列番号５１で示されるＶＨａ、配列番号６４で示されるＶＨｂ、及び配列番号７９で示されるＶＬａとＶＬｂを含む。
幾つかの実施形態において、抗ＰＤ－Ｌ１／ＣＤ４７二重特異性抗体は、配列番号５１で示されるＶＨａ、配列番号６４で示されるＶＨｂ、及び配列番号８０で示されるＶＬａとＶＬｂを含む。
幾つかの実施形態において、抗ＰＤ－Ｌ１／ＣＤ４７二重特異性抗体は、配列番号５２で示されるＶＨａ、配列番号６４で示されるＶＨｂ、及び配列番号７５で示されるＶＬａとＶＬｂを含む。
幾つかの実施形態において、抗ＰＤ－Ｌ１／ＣＤ４７二重特異性抗体は、配列番号５２で示されるＶＨａ、配列番号６４で示されるＶＨｂ、及び配列番号７６で示されるＶＬａとＶＬｂを含む。
幾つかの実施形態において、抗ＰＤ－Ｌ１／ＣＤ４７二重特異性抗体は、配列番号５２で示されるＶＨａ、配列番号６４で示されるＶＨｂ、及び配列番号７７で示されるＶＬａとＶＬｂを含む。
幾つかの実施形態において、抗ＰＤ－Ｌ１／ＣＤ４７二重特異性抗体は、配列番号５２で示されるＶＨａ、配列番号６４で示されるＶＨｂ、及び配列番号７８で示されるＶＬａとＶＬｂを含む。
幾つかの実施形態において、抗ＰＤ－Ｌ１／ＣＤ４７二重特異性抗体は、配列番号５２で示されるＶＨａ、配列番号６４で示されるＶＨｂ、及び配列番号７９で示されるＶＬａとＶＬｂを含む。
幾つかの実施形態において、抗ＰＤ－Ｌ１／ＣＤ４７二重特異性抗体は、配列番号５２で示されるＶＨａ、配列番号６４で示されるＶＨｂ、及び配列番号８０で示されるＶＬａとＶＬｂを含む。
幾つかの実施形態において、抗ＰＤ－Ｌ１／ＣＤ４７二重特異性抗体は、配列番号５３で示されるＶＨａ、配列番号６４で示されるＶＨｂ、及び配列番号７５で示されるＶＬａとＶＬｂを含む。
幾つかの実施形態において、抗ＰＤ－Ｌ１／ＣＤ４７二重特異性抗体は、配列番号５３で示されるＶＨａ、配列番号６４で示されるＶＨｂ、及び配列番号７６で示されるＶＬａとＶＬｂを含む。
幾つかの実施形態において、抗ＰＤ－Ｌ１／ＣＤ４７二重特異性抗体は、配列番号５３で示されるＶＨａ、配列番号６４で示されるＶＨｂ、及び配列番号７７で示されるＶＬａとＶＬｂを含む。
幾つかの実施形態において、抗ＰＤ－Ｌ１／ＣＤ４７二重特異性抗体は、配列番号５３で示されるＶＨａ、配列番号６４で示されるＶＨｂ、及び配列番号７８で示されるＶＬａとＶＬｂを含む。
幾つかの実施形態において、抗ＰＤ－Ｌ１／ＣＤ４７二重特異性抗体は、配列番号５３で示されるＶＨａ、配列番号６４で示されるＶＨｂ、及び配列番号７９で示されるＶＬａとＶＬｂを含む。
幾つかの実施形態において、抗ＰＤ－Ｌ１／ＣＤ４７二重特異性抗体は、配列番号５３で示されるＶＨａ、配列番号６４で示されるＶＨｂ、及び配列番号８０で示されるＶＬａとＶＬｂを含む。
幾つかの実施形態において、抗ＰＤ－Ｌ１／ＣＤ４７二重特異性抗体は、配列番号５４で示されるＶＨａ、配列番号６４で示されるＶＨｂ、及び配列番号７５で示されるＶＬａとＶＬｂを含む。
幾つかの実施形態において、抗ＰＤ－Ｌ１／ＣＤ４７二重特異性抗体は、配列番号５４で示されるＶＨａ、配列番号６４で示されるＶＨｂ、及び配列番号７６で示されるＶＬａとＶＬｂを含む。
幾つかの実施形態において、抗ＰＤ－Ｌ１／ＣＤ４７二重特異性抗体は、配列番号５４で示されるＶＨａ、配列番号６４で示されるＶＨｂ、及び配列番号７７で示されるＶＬａとＶＬｂを含む。
幾つかの実施形態において、抗ＰＤ－Ｌ１／ＣＤ４７二重特異性抗体は、配列番号５４で示されるＶＨａ、配列番号６４で示されるＶＨｂ、及び配列番号７８で示されるＶＬａとＶＬｂを含む。
幾つかの実施形態において、抗ＰＤ－Ｌ１／ＣＤ４７二重特異性抗体は、配列番号５４で示されるＶＨａ、配列番号６４で示されるＶＨｂ、及び配列番号７９で示されるＶＬａとＶＬｂを含む。
幾つかの実施形態において、抗ＰＤ－Ｌ１／ＣＤ４７二重特異性抗体は、配列番号５４で示されるＶＨａ、配列番号６４で示されるＶＨｂ、及び配列番号８０で示されるＶＬａとＶＬｂを含む。
幾つかの実施形態において、重鎖定常領域は、ＩｇＧ１サブタイプ（配列番号８１）である。幾つかの実施形態において、重鎖定常領域は、Ｎ２９７Ａ、Ｙ３４９Ｃ、Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖの１種又は複数種のアミノ酸変異を含む。
幾つかの実施形態において、抗ＰＤ－Ｌ１／ＣＤ４７二重特異性抗体は、配列番号８３で示されるＣＨａ、配列番号８４で示されるＣＨｂ、及び配列番号８２で示されるＣＬａとＣＬｂを含む。
幾つかの実施形態において、抗ＰＤ－Ｌ１／ＣＤ４７二重特異性抗体は、配列番号８４で示されるＣＨａ、配列番号８３で示されるＣＨｂ、及び配列番号８２で示されるＣＬａとＣＬｂを含む。
幾つかの実施形態において、抗ＰＤ－Ｌ１／ＣＤ４７二重特異性抗体は、配列番号８５で示されるＣＨａ、配列番号８６で示されるＣＨｂ、及び配列番号８２で示されるＣＬａとＣＬｂを含む。
幾つかの実施形態において、抗ＰＤ－Ｌ１／ＣＤ４７二重特異性抗体は、配列番号８６で示されるＣＨａ、配列番号８５で示されるＣＨｂ、及び配列番号８２で示されるＣＬａとＣＬｂを含む。
幾つかの実施形態において、抗ＰＤ－Ｌ１／ＣＤ４７二重特異性抗体は、２つの異なる重鎖と２つの同じ軽鎖を含み、重鎖ａは配列番号９２で示され、重鎖ｂは配列番号９３で示され、軽鎖は配列番号９６で示される。
幾つかの実施形態において、抗ＰＤ－Ｌ１／ＣＤ４７二重特異性抗体は、２つの異なる重鎖と２つの同じ軽鎖を含み、重鎖ａは配列番号９４で示され、重鎖ｂは配列番号９５で示され、軽鎖は配列番号９６で示される。
定常領域及び全長配列は次の通りである。
当業者はまた、本発明に開示された抗体又は抗原結合断片の配列が置換されてもよく、置換後のアミノ酸配列が当該抗体の天然に存在するアミノ酸配列とは異なることを理解すべきである。例えば、置換後のアミノ酸配列は、開始配列と類似してもよく、例えば、開始配列と一定の比率の同一性を有し、例えば、開始配列と約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９８％又は約９９％、又はこれらの数値のうちの何れか２つの値の間の範囲（端点を含む）又はそのうちの任意の値の同一性を有する。
幾つかの実施形態において、抗体に含まれているアミノ酸配列は、１つ又は複数の修飾基を有する。例えば、本発明により開示される二重特異性抗体は、修飾されて官能基（例えば、ＰＥＧ、薬物、毒素又はラベル）を付加することができる。
本発明に開示された抗体、抗原結合断片は修飾された誘導体を含み、即ち任意の種類の分子の抗体への共有結合によって修飾され、共有結合は、抗体のエピトープへの結合を阻止することがない。下記の実例を含むが、これらに限定されず、抗体は、グリコシル化、アセチル化、ポリエチレングリコール化、リン酸化、アミド化、既知の保護／封鎖基による誘導体化、タンパク質加水分解切断、細胞リガンド又は他のタンパク質への結合などによって修飾されてもよい。多くの化学修飾のうちの何れか１つの修飾は、特異的化学分解、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝合成などを含むが、これらに限定されない従来技術によって行われてもよい。
幾つかの実施形態において、抗体は、治療剤、薬物前駆体、ペプチド、タンパク質、酵素、ウイルス、脂質、生物学的反応調節剤、薬剤又はＰＥＧと複合することができる。
抗体は、治療剤に複合又は融合することができ、上記治療剤は、検出可能な標識（例えば、放射性標識）、免疫調節剤、ホルモン、酵素、オリゴヌクレオチド、光感受性治療剤又は診断剤、薬物又は毒素の細胞傷害剤、超音波増強剤、非放射性標識及びその組成物、並びに本分野で既知の他のこのような試薬を含んでもよい。
抗体は、化学発光化合物にカップリングすることによって、検出可能に標識されることができる。そして、化学反応過程において現れた発光を検出することにより、化学発光標識された抗体の存在を確定する。化学発光標識化合物の実例は、ルミノール、イソルミノール、芳香族アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジン塩及びシュウ酸エステルを含む。
抗体及び抗体をコードするポリヌクレオチドの調製方法
本発明は、本発明に記載の抗体、抗原結合断片、及びその誘導体をコードするポリヌクレオチド又は核酸分子を更に開示する。本発明に開示されたポリヌクレオチドは、ＶＨａ、ＶＨｂ、ＶＬａ、ＶＬｂ、ＣＨａ、ＣＨｂ、ＣＬａ、ＣＬｂ、Ｆｃ領域、重鎖ａ、重鎖ｂ、軽鎖などをコードすることができる。抗体を調製する方法は、本分野で既知であり、且つ本発明に記載されたものである。幾つかの実施形態において、本発明により開示された抗体、抗原結合断片に含まれている可変領域及び定常領域は、何れも完全ヒトのものである。完全ヒト抗体及び抗原結合断片は、本分野で開示された技術及び本発明に記載されている技術により調製することができる。例えば、特定の抗原に対する完全ヒト抗体は、抗原をトランスジェニック動物に投与することにより調製することができ、上記トランスジェニック動物は、抗原の攻撃に応答して完全ヒト抗体を産生するために改良されている。このような抗体を調製することができる例示的技術は、米国特許６，４５８，５９２と６，４２０，１４０が参照され、その内容の全てが参照により本明細書に組み込まれる。本発明に記載の二重特異性抗体は、抗原ａ、抗原ｂに特異的に結合する断片を融合し、二重特異性抗体の一部の断片は、前述の単一抗原に結合する抗体の調製方法を参照することができる。
幾つかの実施形態において、調製された抗体は、治療すべき動物（ヒトなど）に、有害な免疫応答を引き起こすことがない。幾つかの実施形態において、本発明に開示された抗体、抗原結合断片、又は誘導体は、その免疫原性を低減させるために、本分野で認められている技術で修飾される。例えば、抗体は、ヒト化、霊長類化、脱免疫化されてもよく、又はキメラ抗体として調製されてもよい。これらの種類の抗体は非ヒト抗体、通常、マウス類又は霊長類抗体に由来し、親抗体の抗原結合特性を保持又は基本的に保持しているが、ヒトにおいて免疫原性が低い。それは、（ａ）キメラ抗体を産生するために、非ヒトの可変領域全体をヒトの定常領域に移植すること、（ｂ）重要なフレーム残基を保持し、又は保持せずに、１つ又は複数の非ヒト相補性決定領域（ＣＤＲ）の少なくとも一部をヒトのフレーム及び定常領域に移植すること、又は（ｃ）非ヒトの可変領域全体を移植するが、ヒト類似の部分で表面残基を置換することによりそれらを「隠す」ことを含む様々な方法により実現される。通常、ヒトフレーム領域におけるフレーム残基は、ＣＤＲドナー抗体からの対応する残基、抗原結合を改善可能な残基などで置換される。これらのフレームの置換は、本分野で既知の方法で同定することができ、例えば、ＣＤＲとフレーム残基の相互作用をシミュレーションすることで、抗原結合に重要な役割を果たすフレーム残基が同定され、且つ配列アラインメントによって特定の位置での異常なフレーム残基が同定される。（米国特許５，５８５，０８９を参照し、その内容の全てが参照により本明細書に組み込まれる）。抗体は、本分野で既知の様々な技術を使用してヒト化することができ、例えば、ＣＤＲ移植（ＥＰ２３９，４００、ＷＯ９１／０９９６７、米国特許５，２２５，５３９、５，５３０，１０１及び５，５８５，０８９）、修復又は表面再構成（ＥＰ５９２，１０６、ＥＰ５１９，５９６）及び鎖の再構成（米国特許５，５６５，３３２）、その内容の全てが参照により本明細書に組み込まれる。
脱免疫化は、抗体の免疫原性の低減に用いることもできる。本発明において、「脱免疫化」という用語は、Ｔ細胞エピトープを修飾するために抗体を変化させることを含む（例えば、ＷＯ／９８５２９７６ Ａ１及びＷＯ／００３４３１７ Ａ２を参照）。例えば、開始抗体からの重鎖可変領域配列及び軽鎖可変領域配列を分析し、各可変領域からのヒトＴ細胞エピトープ「マップ」を生成し、相補性決定領域（ＣＤＲｓ）及び配列内の他の重要な残基に対するエピトープの位置を示す。Ｔ細胞エピトープマップからの単一のＴ細胞エピトープを分析することにより、抗体活性を変えるリスクが低い選択可能なアミノ酸置換を同定する。アミノ酸置換の組み合わせを含む一連の選択可能な重鎖可変領域配列及び軽鎖可変領域配列を設計し、続いてこれらの配列を一連の結合ポリペプチドに組み込む。その後、修飾された可変領域及びヒト定常領域を含む完全な重鎖と軽鎖の遺伝子を発現ベクターにクローンし、続いてプラスミドを細胞株に導入することで完全な抗体を産生する。その後、適当な生物化学及び生物学実験にて抗体を比較し、最適な抗体を同定する。
本発明に開示された二重特異性抗体又は抗原結合断片の結合特異性は、免疫共沈降、放射免疫実験（ＲＩＡ）や酵素結合免疫吸着実験（ＥＬＩＳＡ）などの体外実験により、検出することができる。
又は、本発明の二重特異性抗体におけるｓｃＦｖは、単鎖ユニットの製造技術を参照することができる（米国特許４，６９４，７７８）。Ｆｖ領域の重鎖と軽鎖断片へのアミノ酸架橋によって単鎖ユニットを形成し、単鎖融合ペプチドを形成する。大腸菌で機能的なＦｖ断片を組み立てる技術も使用できる（Ｓｋｅｒｒａ ｅｔ ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：１０３８～１０４１（１９８８））。酵母でディスプレイされたｓｃＦｖを使用することができ、酵母でディスプレイされたベクターはｐＹＤ１ベクター（Ａｄｄｇｅｎｅ）であってもよく、宿主サッカロミセスセレビシエはサッカロミセスセレビシエＥＢＹ１００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）であってもよい。
単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）及び抗体の製造に使用できる技術の実例は、米国特許４，９４６，７７８及び５，２５８，４９８に記載のものを含む。ヒトの体内での抗体の利用及び体外検出実験を含む幾つかの使用には、キメラ抗体、ヒト化抗体又は全ヒト抗体が使用できる。キメラ抗体は、抗体の異なる部分が異なる動物種から由来するような分子であり、例えば、マウスモノクローナル抗体の可変領域及びヒト免疫グロブリン定常領域を有する抗体である。キメラ抗体の製造方法は、本分野で既知のものであり、米国特許５，８０７，７１５、４，８１６，５６７及び４，８１６，３９７を参照し、その内容の全てが参照により本明細書に組み込まれる。
更に、Ｎｅｗｍａｎ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：１４５５～１４６０（１９９２）には、組換え抗体を製造する他の効率的方法が開示されており、特に、当該技術は、サル可変領域及びヒト定常領域配列を含む霊長類抗体を産生することができ、当該参照文献の内容のすべてが参照により本明細書に組み込まれる。更に、当該技術は、共に譲渡される米国特許５，６５８，５７０、５，６９３，７８０及び５，７５６，０９６にも言及されており、それぞれの特許の内容の全てが参照により本明細書に組み込まれる。
抗体は、免疫グロブリン配列からの抗体ライブラリーを利用して行われるファージディスプレイ法を含む本分野で知られている種々の方法により、調製することができる。米国特許４，４４４，８８７及び４，７１６，１１１、及びＰＣＴ公開文書ＷＯ９８／４６６４５、ＷＯ９８／５０４３３、ＷＯ９８／２４８９３、ＷＯ９８／１６６５４、ＷＯ９６／３４０９６、ＷＯ９６／３３７３５及びＷＯ９１／１０７４１を参照してもよく、それぞれの特許の内容のすべてが参照により本明細書に組み込まれる。
選択的エピトープを認識する完全ヒト抗体は、「誘導選択」として呼ばれる技術により製造することができる。この方法において、選択された非ヒトモノクローナル抗体（例えば、マウス抗体）を使用して、同じエピトープを認識する完全ヒト抗体のスクリーニングを誘導する（米国特許５，５６５，３３２を参照し、その内容の全てが参照により本明細書に組み込まれる）。
他の実施形態において、通常の方法（例えば、マウス抗体重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子と特異的に結合可能なオリゴヌクレオチドプローブを使用すること）により、所望のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡを単離し、配列決定することができる。単離され及びサブクローニングされたハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡの由来にすることができる。単離されると、ＤＮＡは、発現ベクターに置かれ、その後、例えば、大腸菌細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞又は他の免疫グロブリンを産生しない骨髄腫細胞などの原核又は真核宿主細胞にトランスフェクトされることができる。単離されたＤＮＡ（本明細書に記載のように合成であってもよい）は、抗体の定常領域及び可変領域の配列を調製するために使用されてもよく、例えば、米国特許５，６５８，５７０に記載されているように、その内容のすべてが参照により本明細書に組み込まれる。この方法は、選択された細胞からＲＮＡを抽出してｃＤＮＡに形質転換してから、Ｉｇ特異的プライマーを利用してＰＣＲ技術により増幅する。この目的に適用される適当なプローブは、米国特許５，６５８，５７０において言及されたこともある。
更に、従来の組換えＤＮＡ技術を用いて、本発明に係る抗体の１つ又は複数のＣＤＲをフレームワーク領域に挿入することができ、例えば、ヒトフレームワーク領域に挿入してヒト化非完全ヒト抗体を構築する。フレーム領域は、天然に存在するか又は共通のフレーム領域であってもよいが、ヒトフレーム領域が好ましい（Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７８：４５７～４７９（１９９８）が参照され、その中に一連のヒトフレーム領域が挙げられている）。幾つかのポリヌクレオチドは、フレーム領域とＣＤＲとの組み合わせによって産生される標的抗原の少なくとも１つのエピトープに特異的に結合する抗体をコードすることができる。フレーム領域内で１つ又は複数のアミノ酸置換を行うことができ、抗体のその抗原への結合を改善できるアミノ酸置換を選択することができる。また、この方法で鎖間ジスルフィド結合の形成に関与する１つ又は複数の可変領域におけるシステイン残基の置換又は欠失を行うことにより、１つ又は複数の鎖間ジスルフィド結合が欠失した抗体分子を産生することができる。本分野の技術的範囲でポリヌクレオチドに対して行われた他の変更も、本発明に含まれる。
抗体は、通常の組換えＤＮＡ技術により調製することができる。当業者に知られている技術により、抗体を製造するベクター及び細胞株などを選択し、構築し、培養することができる。これらの技術は何れも、Ｒｅｃｏｍｂｉａｎｔ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｆｏｒ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ｉｎ Ｃｕｌｔｕｒｅｄ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ、Ｄ．Ｌ．Ｈａｃｋｅｒ、Ｆ．Ｍ．Ｗｕｒｍ、ｉｎ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｍｏｄｕｌｅ ｉｎ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、２０１７などの種々のラボマニュアル及び主な出版物に記載されており、その内容のすべてが参照により全文に組み込まれる。
幾つかの実施形態において、従来の方法により本明細書に記載の抗体アミノ酸配列に従って抗体をコードするＤＮＡを合成することができ、それらを発現ベクターに配置し、次いで宿主細胞にトランスフェクトし、トランスフェクトされた宿主細胞を培地で培養して抗体を産生する。抗体の重鎖と軽鎖を発現するＤＮＡは、同じベクターに配置してもよく、異なるベクターに配置してもよい。異なるベクターに配置すると、抗体の重鎖を発現するベクターと軽鎖を発現するベクターは、適切な比率で宿主細胞にトランスフェクトすることができる（例えば、Ｔｉｈｏｍｉｒ Ｓ．Ｄｏｄｅｖ ｅｔ ａｌ．、Ａ ｔｏｏｌ ｋｉｔ ｆｏｒ ｒａｐｉｄ ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ ｖｏｌｕｍｅ ４、Ａｒｔｉｃｌｅ ｎｕｍｂｅｒ：５８８５（２０１４）；Ｓｔｅｆａｎ Ｓｃｈｌａｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｏｎ ｔｈｅ Ｏｐｔｉｍａｌ Ｒａｔｉｏ ｏｆ Ｈｅａｖｙ ｔｏ Ｌｉｇｈｔ Ｃｈａｉｎ Ｇｅｎｅｓ ｆｏｒ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ ＣＨＯ Ｃｅｌｌｓ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｐｒｏｇｒｅｓｓ、２１：１２２－１３３（２００５）；Ｈａｄｉ Ｂａｙａｔ ｅｔ ａｌ．、Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｖｅｃｔｏｒ ｄｅｓｉｇｎ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｉｎ ＣＨＯ ｃｅｌｌｓ、Ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、４８（８）：８２２－８２９（２０１８））。幾つかの実施形態において、発現抗体ベクターは、少なくとも１つのプロモータエレメント、抗体コード配列、転写終了シグナル及びｐｏｌｙＡ尾部を含む。他のエレメントは、エンハンサー、Ｋｏｚａｋ配列及び挿入配列の両側のＲＮＡスプライシングのドナーと受容体部位を含む。ＳＶ４０の前期と後期プロモーター、レトロウイルス由来の長い末端反復配列、例えばＲＳＶ、ＨＴＬＶ１、ＨＩＶＩ及びサイトメガロウイルスの早期プロモーターによって、高効率な転写を得ることができ、アクチンプロモーターのような他の幾つかの細胞のプロモーターを適用することもできる。適切な発現ベクターは、ｐＩＲＥＳ１ｎｅｏ、ｐＲｅｔｒｏ－Ｏｆｆ、ｐＲｅｔｒｏ－Ｏｎ、ＰＬＸＳＮ、又はＰｌｎｃｘ、ｐｃＤＮＡ３．１（＋／－）、ｐｃＤＮＡ／Ｚｅｏ（＋／－）、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｙｇｒｏ（＋／－）、ＰＳＶＬ、ＰＭＳＧ、ｐＲＳＶｃａｔ、ｐＳＶ２ｄｈｆｒ、ｐＢＣ１２ＭＩとｐＣＳ２などを含んでもよい。一般的に用いられる哺乳動物細胞は、２９３細胞、Ｃｏｓ１細胞、Ｃｏｓ７細胞、ＣＶ１細胞、マウスＬ細胞とＣＨＯ細胞などを含む。
幾つかの実施形態において、挿入遺伝子断片は、スクリーニング標識を含有する必要があり、よく見られるスクリーニング標識は、トランスフェクションに成功した細胞のスクリーニングと単離を容易にするように、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、グルタミン合成酵素、ネオマイシン耐性、ハイグロマイシン耐性などのスクリーニング遺伝子を含む。構築されたプラスミドを上記遺伝子無しの宿主細胞にトランスフェクトし、選択培地で培養し、トランスフェクションに成功した細胞が大量増殖し、所望の目的タンパク質を産生する。
二重特異性抗体の調製方法は文献に広く記載されている。例えば、Ｑｉｏｎｇ Ｗａｎｇ、ｅｔ ａｌ．、Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、８、４３（２０１９）；Ｚｈｕａｎｇ Ｚｕｏ、ｅｔ ａｌ．、Ａｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｒｏｕｔｅ ｔｏ ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ＩｇＧ－ｌｉｋｅ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ、１３（５）：３６１－３６７（２０００）；Ｍａｔｔｈｉａｓ Ｍａｃｋ、ｅｔ ａｌ．、Ａ ｓｍａｌｌ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ａｓ ａ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｓｉｎｇｌｅ－ｃｈａｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、９２：７０２１－７０２５（１９９５）；Ｒｏｄｒｉｇｏ Ｖａｚｑｕｅｚ－Ｌｏｍｂａｒｄｉ、ｅｔ ａｌ．、Ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ、Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ １３（１）：９９－１１７（２０１８）；Ｅｌｉｓａ Ｃｏｒｓｉｅｒｏ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ａ Ｂａｓｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｍａｔｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ、６：１４８１（２０１６）。
更に、当業者に知られている標準的技術により、本発明に記載の抗体をコードするヌクレオチド配列に、アミノ酸置換を引き起こす部位特異的突然変異及びＰＣＲ仲介突然変異を含むが、これらに限定されない突然変異が導入されてもよい。変異体（誘導体を含む）は、元の重鎖可変領域ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３及び軽鎖可変領域ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２又はＶＬ ＣＤＲ３に対して５０個よりも少ないアミノ酸の置換、４０個よりも少ないアミノ酸の置換、３０個よりも少ないアミノ酸の置換、２５個よりも少ないアミノ酸の置換、２０個よりも少ないアミノ酸の置換、１５個よりも少ないアミノ酸の置換、１０個よりも少ないアミノ酸の置換、５個よりも少ないアミノ酸の置換、４個よりも少ないアミノ酸の置換、３個よりも少ないアミノ酸の置換又は２個よりも少ないアミノ酸の置換をコードするものである。又は、例えば、飽和突然変異によって、すべて又は一部に沿って配列をコードする時に無作為に突然変異を導入してもよく、得られた突然変異体の生物活性をスクリーニングすることにより、活性を保持した突然変異体を同定してもよい。
幾つかの実施形態において、本明細書に記載の置換は、保存的アミノ酸置換である。
治療方法
本発明は、治療方法及び用途を更に提供する。幾つかの実施形態において、患者へ有効用量の上記二重特異性抗体を投与することを含む、様々なタイプのがん、腫瘍又は感染症などの関連疾患を治療又は改善するための方法を提供する。幾つかの実施形態において、がん、腫瘍又は感染症などの関連疾患を治療又は改善するための上記二重特異性抗体の応用を提供する。幾つかの実施形態において、がん、腫瘍又は感染症などの関連疾患を治療又は改善するための薬物の調製における上記二重特異性抗体の応用を提供する。
本発明は、ＰＤ－Ｌ１及び／又はＣＤ４７を治療標的とする関連疾患を治療する方法に関し、ＰＤ－Ｌ１とＰＤ１との結合及び／又はＣＤ４７とＳＩＲＰαとの結合を排除、阻害又は低減することによって任意の疾患又は病状を改善、緩和、阻害又は予防できる方法に関し、有効量の本明細書に記載の任意の抗ＰＤ－Ｌ１／ＣＤ４７二重特異性抗体又はその断片を被験者に投与することを含む、被験者のがん又は腫瘍を治療する方法、被験者のがん又は腫瘍症状を軽減する方法、被験者の腫瘍又はがんの再発を回避する方法を提供することに関する。
本発明に提供される抗体及びその抗原結合断片、並びにそれらを含む医薬組成物は、被験者における異常なＰＤ－Ｌ１及び／又はＣＤ４７の発現、活性及び／又はシグナル伝達に関連する疾患及び病状の診断、予後、監視、治療、緩和及び／又は予防に用いられる治療薬として使用することができる。標準方法を使用することによって被験者における異常なＰＤ－Ｌ１又はＣＤ４７の発現、活性及び／又はシグナル伝達に関連する疾患及び病状を同定する場合、本発明に開示されたモノクローナル抗体、二重特異性抗体及びその抗原結合断片、並びにそれらを含む医薬組成物を投与することができる。
従来技術に開示されたＣＤ４７抗体の大部がヒト赤血球の血球凝集反応を誘導できることを鑑み、現在、マクロファージの貪食作用を効果的に促進できるだけでなく、細胞凝集を引き起こさない新しい抗ＣＤ４７抗体を取得することも依然として緊迫である。本願に開示された抗ＰＤ－Ｌ１／ＣＤ４７二重特異性抗体は、このようなニーズを満たし、貪食作用を効果的に促進するだけでなく、顕著な赤血球凝集を引き起すことがなく、より好ましくは、ヒト赤血球に明らかに結合することがない。
幾つかの実施形態において、本発明の抗ＰＤ－Ｌ１／ＣＤ４７二重特異性抗体は、超高親和性でＰＤ－Ｌ１に結合し、高親和性又は中程度の親和性でＣＤ４７に結合することができる。腫瘍細胞のＰＤ－Ｌ１との特異的結合によって、本発明の抗ＰＤ－Ｌ１／ＣＤ４７二重特異性抗体の腫瘍細胞への選択的結合を促進し、多くの正常な組織で発現するＣＤ４７への結合を回避し、副作用を減少させる。ＣＤ４７との親和性がＰＤ－Ｌ１との親和性よりもはるかに低い場合、本発明の抗ＰＤ－Ｌ１／ＣＤ４７二重特異性抗体の有効用量の範囲を大幅に拡張することができる。
幾つかの実施形態において、本発明に記載の抗体で治療及び／又は予防するがんは、固形腫瘍、血液学がん（例えば、白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫などの骨髄腫）及び転移性病変を含むが、これらに限定されない。一実施形態において、がんは、固形腫瘍である。固形腫瘍の例には、悪性腫瘍、例えば、肺、***、卵巣、リンパ、胃腸管（結腸など）、肛門、生殖器及び泌尿生殖器（腎、膀胱上皮、膀胱細胞、前立腺）、咽頭、ＣＮＳ（脳、神経細胞又は神経膠細胞など）、頭部と頸部、皮膚（黒色腫など）、鼻咽頭（分化又は未分化の移転性又は局所再発性鼻咽頭がん）及び膵臓を侵襲するがんなど、複数の臓器系の肉腫及びがんが含まれる。がんは、早期、中期、進行性又は転移性がんである可能性がある。一実施形態において、腫瘍は、腫瘍免疫逃避である。幾つかの実施形態において、腫瘍は、結腸がんなど、胃腸管腫瘍（例えば、がん）である。
任意の特定の患者の具体的な用量及び治療レジメンは、使用される特定の抗体又は誘導体、患者の年齢と体重、一般的健康状態、性別と飲食、及び投与時間、***頻度、薬物の組み合わせ、並びに治療される特定の疾患の重症度を含む様々な要因によって決められる。当業者の範囲に含まれる医療関係者により、これらの要因を判断する。上記用量は、更に、治療すべき個体患者、投与経路、製剤種類、使用される化合物の特性、疾患の重症度及び所望の効果によって決められる。使用される用量は、本分野でよく知られている薬理学及び薬物動態学的原理によって決定することができる。幾つかの実施形態において、有効用量の範囲は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約１００ｍｇ／ｋｇであり、例えば週に２回（ＢＩＷ）又は月に１回であってもよい。
抗体又は誘導体の投与方法は、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、経鼻、硬膜外及び経口注射を含むが、これらに限定されない。医薬組成物は、注入やボーラス注射などの任意の好都合な経路により投与され、上皮又は皮膚粘膜（例えば、口腔粘膜、直腸と腸粘膜など）を介して吸収されてもよく、他の生物活性剤と共に投与されてもよい。従って、本発明の抗体を含む医薬組成物は、経口投与、直腸投与、腸胃外投与、大脳内投与、経膣投与、腹腔内投与、外用（例えば、粉末、軟膏、ドロップ剤又は経皮パッチ剤による）、口腔投与、又は経口や鼻内噴霧投与が可能である。
本発明に使用される「腸胃外」という用語は、静脈内、筋肉内、腹腔内、胸骨内、皮下と関節内注射及び輸注を含む投与形態である。
投与形態は、全身投与又は局所投与であってもよい。更に、脳室内注射及び髄腔内注射を含む任意の適当な経路により、本発明の抗体を中枢神経系に導入する必要があり得るが、脳室内注射は、脳室内カテーテルを介してリザーバーのようなもの（Ｏｍｍａｙａリザーバーであってもよい）に連結されることで、注射を補助することができる。肺部投与によってもよく、例えば、吸入器又は噴霧器を使用すること、及び霧化された製剤を使用することによってもよい。
本発明の抗体は、治療すべき領域に局所投与することができ、手術期間の局所注入、例えば、手術後の創傷被覆材と併用する局所応用により、注射により、カテーテルにより、坐剤又はインプラント体で実現されることができるが、これらの方式に限定されず、上記インプラントは、多孔質、無孔又はゲル状の材料であり、膜（例えば、シリコンゴム膜）又は繊維を含む。好ましくは、本発明のタンパク質（抗体を含む）を投与する場合に、タンパク質を吸収しない材料を使用するように注意しなければならない。
通常、疾患を治療するために体外検査を行う方法には、本発明に記載の抗体又は誘導体を投与し、そして許容可能な動物モデルにおいて所望の治療的又は予防的活性を体内検査し、最後にヒトに投与することが含まれる。好適な動物モデル（トランスジェニック動物を含む）は、当業者に知られているものである。例えば、本発明に記載の抗体、抗原結合断片の治療的使用を確認するための体外測定は、抗体による細胞株又は患者組織試料への影響を含む。抗体による細胞株及び／又は組織試料への作用は、当業者に知られている技術、例えば、本発明の他の部分で開示される技術により検出することができる。本発明の内容により、特異的抗体を投与するか否かを決定することに利用可能な体外測定実験は、体外細胞培養実験を含み、そのうち、患者組織試料は培養物において培養され、且つ化合物に暴露され、又は他の方式で投与され、このような化合物による組織試料への影響を観察する。
種々の既知の輸送システムは、本発明の抗体又は誘導体又はそれらをコードするポリヌクレオチドの投与、例えばリポソーム体、微粒子、マイクロカプセルに封入され、上記化合物を発現可能な組換え細胞、受容体仲介性エンドサイトーシス作用（例えば、Ｗｕ ａｎｄ Ｗｕ、１９８７、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９～４４３２を参照）、レトロウイルス又は他のベクターの一部としての核酸の構築などに用いることができる。
併用療法
幾つかの実施形態において、本発明の抗体は、１種又は複数種の本発明の抗体の投与及び１種又は複数種の他の治療剤又は方法との併用又は組み合わせ使用を含む、他の治療又は予防レジメンと組み合わせることができる。併用療法の場合、抗体は、他の治療剤と同時に又は別々に投与することができる。別々に投与する場合、別の他の治療剤を投与する前又は後に、本発明の抗体を投与することができる。
幾つかの実施形態において、本発明の二重特異性抗体を患者に投与する場合、本明細書により開示される抗体分子又は医薬組成物又は免疫複合体、及び治療方法及び／又は他の治療剤（例えば、化学療法薬、放射線療法薬又は生物高分子薬）などの１種又は複数種の他の療法と組み合わせて患者に投与することもできる。
このような組み合わせ療法は、組み合わせ投与（そのうち、２種類以上の治療薬が同じ調製物又は別々の調製物に含まれる）及び別々の投与を包含し、この場合、別の療法、例えば治療方法及び／又は治療薬の投与前、投与中、及び／又は投与後に本発明の抗体を投与することができる。抗体分子及び／又は他の療法、例えば治療薬又は治療方法は、活動性疾患中又は緩和中又は活動性がより低い疾患中に投与することができる。抗体分子は、他の治療前、他の治療中、治療後又は疾患の緩和中に投与することができる。
幾つかの実施形態において、本発明の二重特異性抗体は、化学療法剤と組み合わせて投与される。幾つかの実施形態において、本発明の抗ＰＤ－Ｌ１／ＣＤ４７二重特異性抗体と併用投与可能な化学療法剤は、抗生物質誘導体（例えば、ドキソルビシン、ブレオマイシン、ダウノルビシン及びアクチノマイシンＤ）、抗エストロゲン剤（例えば、タモキシフェン）、代謝拮抗物質（例えば、フルオロウラシル、５－ＦＵ、メトトレキサート、フルオロウリジン、インターフェロンα－２ｂ、グルタミン酸、ミトラマイシン、メルカプトプリン及び６－チオグアニン）、細胞傷害剤（例えば、カルムスチン、ＢＣＮＵ、ロムスチン、ＣＣＮＵ、シタラビン、シクロホスファミド、エストラムスチン、ヒドロキシ尿素、プロカルバジン、マイトマイシン、ブスルファン、シスプラチン及び硫酸ビンクリスチン）、ホルモン（例えば、メドロキシプロゲステロン、リン酸エストラムスチンナトリウム、エチニルエストラジオール、エストラジオール、酢酸メゲストロール、メチルテストステロン、ジエチルスチルベストロール二リン酸、クロロトリアニセン及びテストラクトン）、ナイトロジェンマスタード誘導体（例えば、メルファラン、クロラムブシル、ジクロロメチルジエチルアミン（メクロレタミン）及びチオテパ）、ステロイドとその組み合わせ（例えば、ベタメタゾンリン酸ナトリウム）、及び他の化合物（例えば、ダカルバジン、アスパラギナーゼ、ミトタン、硫酸ビンクリスチン、硫酸ビンブラスチン及びエトポシド）を含むが、これらに限定されない。
幾つかの実施形態において、本発明の抗体はサイトカインと併用投与される。本発明の抗体と共に投与可能なサイトカインは、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１３、及びＩＬ－１５などを含むが、これらに限定されない。
幾つかの実施形態において、本発明の二重特異性抗体は、生物高分子薬と組み合わせて投与される。生物大分子薬の実例には、患者の治療に適用される治療用抗体を含むがこれに限定されない免疫治療薬が含まれる。治療用抗体の幾つかの実例には、シムツズマブ、アバボルマブ、アデカツムマブ、アフツズマブ、アレムツズマブ、アトモマブ、アマツキシマブ、アナツムマブ、アシピモマブ、バビツキシマブ、ベルトムマブ、ベバシズマブ、ビバリズマブ、ブリナツムマブ、ブレンツキシマブ、カンツズマブ、カトマゾマブ、セツキシマブ、セツズマブ、セツムマブ、クリバスツズマブ、キナツムマブ、ダラツムマブ、チョチツズマブ、デュリゴツズマブ、デュシツズマブ、デモマブ、ダセツズマブ、ダロツズマブ、エクロモキシマブ、エロツズマブ、エンシツキシマブ、エルトマソマブ、イタラキシズマブ、ファレルツズマブ、フィコラツズマブ、フィジツムマブ、フランボルツズマブ、フツキシマブ、ガニツマブ、ゲムツズマブ、ジレンツキシマブ、グランバルツムマブ、イブリツムマブ、イゴボズマブ、イムガルツズマブ、インダルキシマブ、イノツズマブ、インテツムマブ、イピリムマブ、イラツムマブ、ラベツズマブ、リサツムマブ、リンツズマブ、ロボツズマブ、ルカツムマブ、マペルツムマブ、マツズマブ、ミラツズマブ、ミンレリムマブ、ミツムマブ、モシツムマブ、ナツズマブ、ナツムマブ、ネジツムマブ、ニモツズマブ、ノフェツズマブ、オカツズマブ、オファツムマブ、オラツズマブ、オナツズマブ、オペルツズマブ、オルゲボズマブ、パニツムマブ、パサツズマブ、パトリツズマブ、ペンツムマブ、ペルツズマブ、ピトロリムマブ、プラツムマブ、ラコトムマブ、ラジツムマブ、リロツムマブ、リツキシマブ、ロバツムマブ、サツコムマブ、シブツズマブ、スツキシマブ、ソリツムマブ、タカツズマブ、タプリツズマブ、テナツムマブ、テプロツムマブ、チカルツズマブ、トキシコムマブ、トシリズマブ、クスツズマブ、ウルブツキシマブ、ベルツズマブ、ボルストリズマブ、ボルツズマブ及びザルツムマブなどが含まれる。
幾つかの実施例において、本発明の抗体は、免疫チェックポイント阻害剤と共に使用することができる。幾つかの実施形態において、本発明の抗体は、放射線療法などの他の治療又は予防計画と組み合わせて投与される。
医薬組成物
本発明は、医薬組成物を更に提供する。このような組成物は、有効用量の抗体又は抗原結合断片及び薬学的に許容されるベクターを含む。幾つかの実施形態において、医薬組成物は、抗がん剤（例えば、免疫チェックポイント阻害剤）を更に含む。
幾つかの実施形態において、「薬学的に許容される」という用語は、政府の規制機関により承認された、又は他の一般に認められている薬局方に挙げられた動物用、特にヒト用の物質を指す。更に、「薬学的に許容されるベクター」は、通常、任意種類の無毒な固体、半固体又は液体充填剤、希釈剤、封入材料又は製剤添加物などを指す。
「ベクター」という用語は、活性成分と共に患者へ投与可能な希釈剤、アジュバント、賦形剤又はベクターを指す。このような薬物ベクターは、滅菌液体であってもよく、例えば、水、及び石油、落花生油、大豆油、鉱油、ごま油などの動植物又は合成由来の油を含む油である。医薬組成物が静脈内投与される場合に、水は、好ましいベクターである。生理食塩水溶液とグルコース水溶液とグリセリン溶液は、液体ベクターとして用いられてもよく、特に注射用溶液に用いられる。好適な薬用賦形剤は、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセリン、タルク、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセリン、プロピレン、エチレングリコール、水、エタノールなどを含む。必要に応じて、組成物は湿潤剤若しくは乳化剤、又は酢酸塩、クエン酸塩又はリン酸塩のようなｐＨ緩衝剤を更に少量に含んでもよい。ベンジルアルコールやｐ－ヒドロキシ安息香酸メチルなどの抗菌剤、アスコルビン酸や亜硫酸水素ナトリウムなどの酸化防止剤、エチレンジアミン四酢酸などのキレート剤、及び塩化ナトリウムやデキストロースなどの張力を調節する試薬も予測可能である。これらの組成物は、溶液、懸濁液、乳剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、散薬、徐放性製剤などの形態を採用してもよい。当該組成物は、従来の接着剤及びトリグリセリドなどのベクターで坐剤として調製されてもよい。経口製剤は、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどの標準的なベクターを含んでもよい。好適な薬物ベクターの実例は、Ｅ．Ｗ．ＭａｒｔｉｎのＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓにおいて記載されており、ここで参照により本発明に組み込まれる。このような組成物は、臨床的有効用量の抗体又は抗原結合断片を含み、好ましくは精製された形態で、適当な数量のベクターと組み合わせることにより、患者に適する投与形態を提供する。当該製剤は、投与モードに適用すべきである。非経口製剤は、アンプル、使い捨て注射器又はガラスやプラスチックで作製される多用量のバイアルに封入されてもよい。
幾つかの実施形態において、通常のステップによって、組成物を、ヒトへの静脈内注射に適する医薬組成物に調製する。静脈内投与用の組成物は、一般的に、滅菌などの透水性緩衝液における溶液である。組成物は、更に可溶化剤と、リドカインのような局所麻酔薬を含んでもよく、これにより、注射部位の痛みが緩和される。一般的に、有効成分は、単位用量の形態で単独で供給され、又は混合して供給され、例えば、乾燥した凍結乾燥粉末又は無水濃縮物の形態で活性剤の量を指示可能な密封容器（例えば、アンプル又は小袋）に入れられる。注入で組成物を投与する場合に、医薬等級滅菌水又は生理食塩水を含有する点滴ボトルで組成物を分注してもよい。注射で組成物を投与する場合に、投与する前に有効成分を混合できるように、注射用の滅菌水又は生理食塩水のアンプルを使用してもよい。
本発明の化合物は、中性又は塩の形態に調製されてもよい。薬学的に許容される塩は、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などに由来するものとアニオンとで形成される塩と、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２－エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどに由来するものとカチオンと形成される塩と、を含む。
実施例
以下、具体的な実施例によって本発明の技術的解決手段について更に説明するが、具体的な実施例は本発明の保護範囲を限定するものではない。他の当業者が本発明の趣旨を基に行われる本質的でない修正や調整は依然として、本発明の保護範囲に属する。
実施例１：抗原の調製
ＣＤ４７－Ｈｉｓ抗原調製：ヒトＣＤ４７細胞外ドメイン（ＥＣＤ）タンパク質（配列番号１）のＣ末端に８×ＨＩＳラベル（配列番号３）を付加してＣＤ４７組換えタンパク質を構築した。ヒトＣＤ４７のＥＣＤ領域は、遺伝子合成によって哺乳動物の発現ベクター（例えば、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）発現ベクター）にサブクローニングされた。ＨＥＫ２９３Ｆ細胞を一過性にトランスフェクトした後、ニッケルベースの固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）により精製されたＣＤ４７－Ｈｉｓ抗原が得られた。
ＰＤ－Ｌ１－Ｈｉｓ抗原調製：ヒトＰＤ－Ｌ１細胞外ドメイン（ＥＣＤ）タンパク質（配列番号２）のＣ末端に８×ＨＩＳラベル（配列番号３）を付加してＰＤ－Ｌ１組換えタンパク質を構築した。ヒトＰＤ－Ｌ１のＥＣＤ領域は、遺伝子合成によって哺乳動物の発現ベクター（例えば、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）発現ベクター）にサブクローニングされた。ＨＥＫ２９３Ｆ細胞を一過性にトランスフェクトした後、ニッケルベースの固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）により精製されたＰＤ－Ｌ１－Ｈｉｓ抗原が得られた。
ＣＤ４７－ＥＣＤ（配列番号１）：
ＭＷＰＬＶＡＡＬＬＬＧＳＡＣＣＧＳＡＱＬＬＦＮＫＴＫＳＶＥＦＴＦＣＮＤＴＶＶＩＰＣＦＶＴＮＭＥＡＱＮＴＴＥＶＹＶＫＷＫＦＫＧＲＤＩＹＴＦＤＧＡＬＮＫＳＴＶＰＴＤＦＳＳＡＫＩＥＶＳＱＬＬＫＧＤＡＳＬＫＭＤＫＳＤＡＶＳＨＴＧＮＹＴＣＥＶＴＥＬＴＲＥＧＥＴＩＩＥＬＫＹＲＶＶＳＷＦＳＰ
ＰＤ－Ｌ１－ＥＣＤ（配列番号２）：
ＭＲＩＦＡＶＦＩＦＭＴＹＷＨＬＬＮＡＦＴＶＴＶＰＫＤＬＹＶＶＥＹＧＳＮＭＴＩＥＣＫＦＰＶＥＫＱＬＤＬＡＡＬＩＶＹＷＥＭＥＤＫＮＩＩＱＦＶＨＧＥＥＤＬＫＶＱＨＳＳＹＲＱＲＡＲＬＬＫＤＱＬＳＬＧＮＡＡＬＱＩＴＤＶＫＬＱＤＡＧＶＹＲＣＭＩＳＹＧＧＡＤＹＫＲＩＴＶＫＶＮＡＰＹＮＫＩＮＱＲＩＬＶＶＤＰＶＴＳＥＨＥＬＴＣＱＡＥＧＹＰＫＡＥＶＩＷＴＳＳＤＨＱＶＬＳＧＫＴＴＴＴＮＳＫＲＥＥＫＬＦＮＶＴＳＴＬＲＩＮＴＴＴＮＥＩＦＹＣＴＦＲＲＬＤＰＥＥＮＨＴＡＥＬＶＩＰＥＬＰＬＡＨＰＰＮＥＲ
８×ＨＩＳ（配列番号３）：
ＨＨＨＨＨＨＨＨ
実施例２：抗体の調製
２．１酵母でディスプレイされた抗ＰＤ－Ｌ１ ｓｃＦｖ
抗ＰＤ－Ｌ１抗体のｓｃＦｖ断片（重鎖可変領域、軽鎖可変領域及び重軽鎖可変領域のリンカー（Ｇ４Ｓ）３）をコードする核酸配列を合成し、ベクターに挿入され、エレクトロポレーターによって宿主サッカロミセスセレビシエに移されて陽性酵母クローンが得られた。上記で得られた陽性酵母クローンを選び出し、モノクローナルとして培養した。そのうち、ＡＴＥ陽性酵母クローン表面で発現するｓｃＦｖの重鎖可変領域、軽鎖可変領域はＡｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂと一致し、他の陽性酵母クローン表面で発現するｓｃＦｖは表１に示され、各ＶＨ配列番号に対応する配列は表２に示され、対応するＣＤＲは表３に示された。リンカーのアミノ酸配列はＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ、その核酸配列はｇｇｔｇｇａｇｇｃｇｇｔｔｃａｇｇｃｇｇａｇｇｔｇｇｃｔｃｔｇｇｃｇｇｔｇｇｃｇｇａｔｃｇであった。
２．２抗ＣＤ４７抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体及びその調製
２．２．１抗ＣＤ４７抗体
１１種類のＩｇＧ１完全抗体のＶＨとＶＬの組み合わせは、表４に示され、ＶＨとＣＨは、抗体の重鎖を構成し、ＶＬとＣＬは、抗体の軽鎖を構成し、ＣＨの配列は、配列番号８１で示され、ＣＬ配列は配列番号８２で示され、「抗体」＋抗体番号で示され、例えば抗体１７（抗体重鎖は配列番号６５で示されるＶＨと配列番号８１で示されるＣＨで構成され、抗体軽鎖は配列番号９８で示されるＶＬと配列番号８２で示されるＣＬで構成される）。
表４に対応するＶＨとＶＬ配列は、表５に示され、そのうち、重鎖ＣＤＲは、表６に示された。
抗ＣＤ４７抗体の陽性対照Ｈｕ５Ｆ９－Ｇ４（Ｍａｇｒｏｌｉｍａｂ）は、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞で一過性に発現したヒトＣＤ４７抗体であり、その配列は、米国特許ＵＳ２０１５／０１８３８７４Ａ１の抗体「Ｈｕ５Ｆ９」の配列と同じである。
２．２．２抗ＰＤ－Ｌ１抗体
ＣＰ１１－３６、ＣＰ１１－４６、ＣＰ１１－４７、ＣＰ１１－５５、ＣＰ１１－７１を選択してＩｇＧ１完全抗体を調製した。そのうち、ＶＨ及びＶＬは、表１に示され、ＣＨ配列は、配列番号８１で示され、ＣＬ配列は、配列番号８２で示され、上記の５個の抗ＰＤ－Ｌ１抗体を、Ｌ１－Ｒ２－４－３６、Ｌ１－Ｒ２－４－４６、Ｌ１－Ｒ２－４－４７、Ｌ１－Ｒ２－４－５５及びＬ１－Ｒ２－４－７１にそれぞれ命名した。
２．２．３共通軽鎖を有する抗ＣＤ４７抗体及び抗ＰＤ－Ｌ１抗体
抗体の組立方法は、表７に示された。可変領域の組立方法は、「ＶＨ＋ＶＬ」であり、ＣＨ配列は、配列番号８１で示され、ＣＬ配列は、配列番号８２で示された。軽鎖可変領域配列は、表８に示され、軽鎖可変領域ＣＤＲは、表９に示された。
２．２．４抗体の調製
抗体重鎖をコードする遺伝子及び抗体軽鎖をコードする遺伝子を発現ベクターにそれぞれクローニングして、重鎖発現ベクター及び軽鎖発現ベクターが得られた。更に、重鎖発現ベクター及び軽鎖発現ベクターをＨＥＫ２９３Ｆ細胞に一過性にトランスフェクトし、細胞発現後の培養液はＰｒｏｔｅｉｎＡカラムを使用した固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）により精製されて抗体が得られ、配列決定後に予想された配列と一致する。
２．３抗ＰＤ－Ｌ１／ＣＤ４７二重特異性抗体及びその調製
２．３．１抗ＰＤ－Ｌ１／ＣＤ４７二重特異性抗体
抗ＰＤ－Ｌ１／ＣＤ４７二重特異性抗体の構成図は、図１に示され、５種類の抗体可変領域のアミノ酸配列は、表１０に示された。図１の構成図から、抗ＰＤ－Ｌ１／ＣＤ４７二重特異性抗体が４本のポリペプチド鎖で構成されることが分かった。
抗体ＢｓＡｂ－３６、ＢｓＡｂ－４６、ＢｓＡｂ－４７、ＢｓＡｂ－７１において、抗ＰＤ－Ｌ１のＶＨのＣ末端は、ヒトＩｇＧ１に誘導された定常領域（配列番号８３）のＮ末端に連結され、そのＦｃ領域は、抗ＣＤ４７の重鎖と安定的に会合するために「ノブイントゥーホール」変異を含み、軽鎖は、Ｒ２－４（配列番号７５）とヒトκ軽鎖定常領域（配列番号８２）によって連結されて共通軽鎖が構成され、抗ＣＤ４７のＶＨのＣ末端は、ヒトＩｇＧ１に誘導された定常領域（配列番号８４）のＮ末端に連結され、そのＦｃ領域は、抗ＰＤ－Ｌ１の重鎖と安定的に会合するために「ノブイントゥーホール」変異を含む。
抗体ＢｓＡｂ－７１－Ｎ２９７Ａは、ＢｓＡｂ－７１にあり、抗体のＡＤＣＣ効果を弱めるためにＦｃ領域がＮ２９７Ａに変異された。即ち、ＢｓＡｂ－７１－Ｎ２９７Ａの抗ＰＤ－Ｌ１重鎖は、配列番号９２で示され、抗ＣＤ４７重鎖は、配列番号９３で示され、軽鎖は、配列番号９６で示された。
２．３．２抗ＰＤ－Ｌ１／ＣＤ４７二重特異性抗体の調製
ステップ２．３．１で構築された抗ＰＤ－Ｌ１／ＣＤ４７二重特異性抗体をコードするヌクレオチド配列を発現ベクターに構築し、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞で発現及び精製して抗ＰＤ－Ｌ１／ＣＤ４７抗体を得た。具体的には、次の通りである。
抗ＰＤ－Ｌ１の重鎖をコードする遺伝子（ＢｓＡｂ－７１－Ｎ２９７Ａを例にとると、遺伝子配列は配列番号９９で示される）及び抗ＣＤ４７の重鎖をコードする遺伝子（ＢｓＡｂ－７１－Ｎ２９７Ａを例にとると、遺伝子配列は配列番号１００で示される）を発現ベクターにそれぞれクローニングし、抗ＰＤ－Ｌ１重鎖プラスミド及び抗ＣＤ４７重鎖プラスミドをそれぞれ得た。抗ＰＤ－Ｌ１／ＣＤ４７抗体の軽鎖をコードする遺伝子（ＢｓＡｂ－７１－Ｎ２９７Ａを例にとると、遺伝子配列は配列番号１０１で示される）を発現ベクターにクローニングし、軽鎖プラスミドを得た。上記で正しく構築された抗ＰＤ－Ｌ１重鎖プラスミド、抗ＣＤ４７重鎖プラスミド及び軽鎖プラスミドは、モル比１：１：２の比率でＨＥＫ２９３Ｆ細胞を一過性にトランスフェクトした。細胞発現後、培養液は、アフィニティークロマトグラフィー及びイオン交換クロマトグラフィーにより、抗ＰＤ－Ｌ１／ＣＤ４７抗体（例えばＢｓＡｂ－７１－Ｎ２９７Ａ）を得た。配列決定後に抗体配列を確認した。
サイズ排除クロマトグラフィー（ｓｉｚｅ ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、ＳＥＣ）を使用して収集された試料の純度を検出した。一部の例示的抗体のＳＥＣ結果は図２Ａと図２Ｂに示され、二重特異性抗体ＢｓＡｂ－４６の純度は９６．３０％、ＢｓＡｂ－７１の純度は９７．０５％であった。
抗ＰＤ－Ｌ１重鎖ヌクレオチド配列（配列番号９９）は次の通りである。
ＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＡＴＣＣＧＧＣＧＧＡＧＧＧＣＴＧＧＴＧＣＡＧＣＣＡＧＧＴＧＧＣＴＣＴＣＴＧＡＧＡＣＴＧＡＧＴＴＧＣＧＣＣＧＣＴＴＣＡＧＧＡＴＴＣＡＣＣＴＴＴＴＣＣＧＡＣＴＣＴＴＧＧＡＴＴＣＡＣＴＧＧＧＴＧＣＧＣＣＡＧＧＣＣＣＣＣＧＧＡＡＡＧＧＧＡＣＴＧＧＡＧＴＧＧＧＴＣＧＧＴＴＧＧＡＴＴＴＣＴＣＣＴＴＡＣＧＧＡＧＧＧＡＧＴＡＣＡＴＡＣＴＡＴＧＣＣＧＡＣＴＣＴＴＡＴＡＧＧＴＣＧＣＧＡＴＴＣＡＣＴＡＴＣＴＣＣＧＣＴＧＡＴＡＣＴＡＧＣＡＡＡＡＡＣＡＣＣＧＣＡＴＡＴＣＴＧＣＡＧＡＴＧＡＡＣＴＣＣＣＴＧＡＧＧＧＣＡＧＡＡＧＡＣＡＣＡＧＣＣＧＴＣＴＡＣＴＡＴＴＧＴＧＣＡＡＧＧＣＧＧＣＡＴＴＧＧＣＣＣＧＧＴＧＧＣＴＴＴＧＡＴＴＡＣＴＧＧＧＧＴＣＡＧＧＧＴＡＣＣＣＴＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＴＣＣＴＣＣＧＣＣＴＣＣＡＣＣＡＡＧＧＧＣＣＣＣＴＣＣＧＴＧＴＴＣＣＣＴＣＴＧＧＣＣＣＣＣＴＣＴＴＣＣＡＡＧＡＧＣＡＣＣＡＧＣＧＧＣＧＧＣＡＣＣＧＣＣＧＣＴＣＴＧＧＧＡＴＧＴＣＴＧＧＴＧＡＡＧＧＡＴＴＡＣＴＴＴＣＣＣＧＡＧＣＣＴＧＴＧＡＣＣＧＴＧＡＧＣＴＧＧＡＡＣＴＣＣＧＧＣＧＣＣＣＴＧＡＣＣＴＣＣＧＧＣＧＴＧＣＡＣＡＣＡＴＴＣＣＣＴＧＣＣＧＴＧＣＴＧＣＡＧＡＧＣＡＧＣＧＧＣＣＴＧＴＡＣＴＣＣＣＴＧＡＧＣＡＧＣＧＴＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＣＣＴＡＧＣＴＣＣＡＧＣＣＴＧＧＧＣＡＣＣＣＡＧＡＣＣＴＡＣＡＴＣＴＧＴＡＡＣＧＴＧＡＡＣＣＡＣＡＡＧＣＣＴＴＣＣＡＡＣＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＡＧＧＴＧＧＡＧＣＣＴＡＡＧＡＧＣＴＧＴＧＡＣＡＡＧＡＣＣＣＡＣＡＣＣＴＧＣＣＣＴＣＣＴＴＧＴＣＣＴＧＣＣＣＣＴＧＡＧＣＴＧＣＴＧＧＧＣＧＧＣＣＣＡＴＣＴＧＴＧＴＴＣＣＴＧＴＴＣＣＣＴＣＣＣＡＡＧＣＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＣＴＧＡＴＧＡＴＣＡＧＣＡＧＡＡＣＣＣＣＣＧＡＧＧＴＧＡＣＣＴＧＴＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＴＧＴＧＴＣＣＣＡＣＧＡＧＧＡＣＣＣＴＧＡＧＧＴＧＡＡＧＴＴＴＡＡＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＴＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＣＡＡＴＧＣＣＡＡＧＡＣＣＡＡＧＣＣＣＡＧＡＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＡＣｇｃｃＴＣＣＡＣＣＴＡＣＡＧａＧＴＧＧＴＧＴＣＣＧＴＧＣＴＧＡＣＣＧＴＧＣＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＴＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＴＡＡＧＧＴＧＡＧＣＡＡＣＡＡＧＧＣＣＣＴＧＣＣＣＧＣＣＣＣＴＡＴＣＧＡＧＡＡＧＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＡＧＧＣＣＡＡＧＧＧＣＣＡＧＣＣＴＡＧＧＧＡＧＣＣＴＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＣＴＧＣＡＧＡＧＡＣＧＡＧＣＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＴＣＡＧＧＴＧＡＧＣＣＴＧＴＧＧＴＧＣＣＴＧＧＴＧＡＡＧＧＧＣＴＴＣＴＡＣＣＣＣＡＧＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＴＣＣＡＡＴＧＧＣＣＡＧＣＣＴＧＡＧＡＡＣＡＡＴＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＣＣＣＣＣＣＴＧＴＧＣＴＧＧＡＴＡＧＣＧＡＴＧＧＣＡＧＣＴＴＣＴＴＴＣＴＧＴＡＣＡＧＣＡＡＧＣＴＧＡＣＣＧＴＧＧＡＴＡＡＧＴＣＣＡＧＧＴＧＧＣＡＧＣＡＧＧＧＣＡＡＴＧＴＧＴＴＴＡＧＣＴＧＴＡＧＣＧＴＧＡＴＧＣＡＣＧＡＧＧＣＣＣＴＧＣＡＣＡＡＴＣＡＣＴＡＣＡＣＣＣＡＧＡＡＧＡＧＣＣＴＧＡＧＣＣＴＧＴＣＣＣＣＣＧＧＣＡＡＧ
そのＦｃの核酸配列（配列番号８７）は次の通りである。
ＧＣＣＴＣＣＡＣＣＡＡＧＧＧＣＣＣＣＴＣＣＧＴＧＴＴＣＣＣＴＣＴＧＧＣＣＣＣＣＴＣＴＴＣＣＡＡＧＡＧＣＡＣＣＡＧＣＧＧＣＧＧＣＡＣＣＧＣＣＧＣＴＣＴＧＧＧＡＴＧＴＣＴＧＧＴＧＡＡＧＧＡＴＴＡＣＴＴＴＣＣＣＧＡＧＣＣＴＧＴＧＡＣＣＧＴＧＡＧＣＴＧＧＡＡＣＴＣＣＧＧＣＧＣＣＣＴＧＡＣＣＴＣＣＧＧＣＧＴＧＣＡＣＡＣＡＴＴＣＣＣＴＧＣＣＧＴＧＣＴＧＣＡＧＡＧＣＡＧＣＧＧＣＣＴＧＴＡＣＴＣＣＣＴＧＡＧＣＡＧＣＧＴＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＣＣＴＡＧＣＴＣＣＡＧＣＣＴＧＧＧＣＡＣＣＣＡＧＡＣＣＴＡＣＡＴＣＴＧＴＡＡＣＧＴＧＡＡＣＣＡＣＡＡＧＣＣＴＴＣＣＡＡＣＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＡＧＧＴＧＧＡＧＣＣＴＡＡＧＡＧＣＴＧＴＧＡＣＡＡＧＡＣＣＣＡＣＡＣＣＴＧＣＣＣＴＣＣＴＴＧＴＣＣＴＧＣＣＣＣＴＧＡＧＣＴＧＣＴＧＧＧＣＧＧＣＣＣＡＴＣＴＧＴＧＴＴＣＣＴＧＴＴＣＣＣＴＣＣＣＡＡＧＣＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＣＴＧＡＴＧＡＴＣＡＧＣＡＧＡＡＣＣＣＣＣＧＡＧＧＴＧＡＣＣＴＧＴＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＴＧＴＧＴＣＣＣＡＣＧＡＧＧＡＣＣＣＴＧＡＧＧＴＧＡＡＧＴＴＴＡＡＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＴＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＣＡＡＴＧＣＣＡＡＧＡＣＣＡＡＧＣＣＣＡＧＡＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＡＣｇｃｃＴＣＣＡＣＣＴＡＣＡＧａＧＴＧＧＴＧＴＣＣＧＴＧＣＴＧＡＣＣＧＴＧＣＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＴＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＴＡＡＧＧＴＧＡＧＣＡＡＣＡＡＧＧＣＣＣＴＧＣＣＣＧＣＣＣＣＴＡＴＣＧＡＧＡＡＧＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＡＧＧＣＣＡＡＧＧＧＣＣＡＧＣＣＴＡＧＧＧＡＧＣＣＴＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＣＴＧＣＡＧＡＧＡＣＧＡＧＣＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＴＣＡＧＧＴＧＡＧＣＣＴＧＴＧＧＴＧＣＣＴＧＧＴＧＡＡＧＧＧＣＴＴＣＴＡＣＣＣＣＡＧＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＴＣＣＡＡＴＧＧＣＣＡＧＣＣＴＧＡＧＡＡＣＡＡＴＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＣＣＣＣＣＣＴＧＴＧＣＴＧＧＡＴＡＧＣＧＡＴＧＧＣＡＧＣＴＴＣＴＴＴＣＴＧＴＡＣＡＧＣＡＡＧＣＴＧＡＣＣＧＴＧＧＡＴＡＡＧＴＣＣＡＧＧＴＧＧＣＡＧＣＡＧＧＧＣＡＡＴＧＴＧＴＴＴＡＧＣＴＧＴＡＧＣＧＴＧＡＴＧＣＡＣＧＡＧＧＣＣＣＴＧＣＡＣＡＡＴＣＡＣＴＡＣＡＣＣＣＡＧＡＡＧＡＧＣＣＴＧＡＧＣＣＴＧＴＣＣＣＣＣＧＧＣＡＡＧ
抗ＣＤ４７重鎖ヌクレオチド配列（配列番号１００）は次の通りである。
ＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＣＡＧＧＡＧＴＣＣＧＧＣＣＣＴＧＧＣＣＴＧＧＴＧＡＡＧＣＣＴＴＣＣＧＡＧＡＣＣＣＴＧＴＣＣＣＴＧＡＣＣＴＧＴＡＣＣＧＴＧＡＧＣＧＧＣＧＧＣＡＧＣＣＴＧＧＡＴＡＡＣＴＡＴＴＡＣＴＧＧＡＧＣＴＧＧＡＴＣＣＧＧＣＡＧＣＣＴＣＣＴＧＧＣＡＡＧＧＧＣＣＴＧＧＡＧＴＧＧＡＴＣＧＧＣＴＡＣＡＴＣＴＡＣＴＡＴＴＣＣＧＧＣＡＡＣＡＣＣＡＡＴＴＡＣＡＡＣＣＣＴＴＣＣＣＴＧＡＡＧＡＧＣＣＧＧＧＴＧＡＣＣＡＴＣＴＣＣＧＴＧＧＡＣＡＣＣＡＧＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＴＴＴＡＧＣＣＴＧＡＡＧＣＴＧＴＣＣＴＣＣＧＴＧＡＣＣＧＣＣＧＣＴＧＡＴＡＣＣＧＣＣＧＴＧＴＡＣＴＡＣＴＧＴＧＣＣＡＧＧＧＧＣＧＧＣＣＧＧＴＴＣＣＴＧＧＡＧＡＧＡＴＡＴＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＴＡＣＣＣＴＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＡＧＣＡＧＣＧＣＣＡＧＣＡＣＣＡＡＧＧＧＣＣＣＣＴＣＣＧＴＧＴＴＣＣＣＴＣＴＧＧＣＣＣＣＴＡＧＣＡＧＣＡＡＧＴＣＣＡＣＣＡＧＣＧＧＣＧＧＣＡＣＣＧＣＣＧＣＴＣＴＧＧＧＡＴＧＴＣＴＧＧＴＧＡＡＧＧＡＣＴＡＣＴＴＴＣＣＴＧＡＧＣＣＣＧＴＧＡＣＣＧＴＧＴＣＣＴＧＧＡＡＣＴＣＣＧＧＣＧＣＣＣＴＧＡＣＣＴＣＣＧＧＣＧＴＧＣＡＣＡＣＡＴＴＣＣＣＣＧＣＣＧＴＧＣＴＧＣＡＧＴＣＣＴＣＣＧＧＣＣＴＧＴＡＣＴＣＣＣＴＧＴＣＣＡＧＣＧＴＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＣＣＴＡＧＣＴＣＣＡＧＣＣＴＧＧＧＣＡＣＣＣＡＧＡＣＣＴＡＣＡＴＣＴＧＴＡＡＣＧＴＧＡＡＣＣＡＣＡＡＧＣＣＣＴＣＣＡＡＴＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＴＡＡＧＡＡＧＧＴＧＧＡＧＣＣＣＡＡＧＴＣＣＴＧＣＧＡＣＡＡＧＡＣＣＣＡＣＡＣＣＴＧＴＣＣＴＣＣＴＴＧＣＣＣＣＧＣＣＣＣＣＧＡＧＣＴＧＣＴＧＧＧＡＧＧＡＣＣＴＴＣＴＧＴＧＴＴＣＣＴＧＴＴＣＣＣＴＣＣＣＡＡＧＣＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＣＴＧＡＴＧＡＴＣＡＧＣＡＧＡＡＣＣＣＣＴＧＡＧＧＴＧＡＣＣＴＧＴＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＣＧＴＧＡＧＣＣＡＣＧＡＧＧＡＣＣＣＴＧＡＧＧＴＧＡＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＣＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＣＡＡＴＧＣＣＡＡＧＡＣＣＡＡＧＣＣＣＡＧＡＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＡＣｇｃＣｔｃＣＡＣＣＴＡＣＡＧＡＧＴＧＧＴＧＴＣＣＧＴＧＣＴＧＡＣＣＧＴＧＣＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＴＴＧＧＣＴＧＡＡＣＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＧＴＧＴＣＣＡＡＴＡＡＧＧＣＣＣＴＧＣＣＣＧＣＣＣＣＣＡＴＣＧＡＧＡＡＧＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＧＧＣＣＡＡＧＧＧＣＣＡＧＣＣＣＡＧＡＧＡＧＣＣＴＣＡＧＧＴＧＴＧＴＡＣＣＣＴＧＣＣＴＣＣＣＴＣＣＡＧＧＧＡＴＧＡＧＣＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＧＴＣＣＣＴＧＡＧＣＴＧＣＧＣＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＴＴＣＴＡＣＣＣＣＡＧＣＧＡＴＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＴＣＣＡＡＣＧＧＣＣＡＧＣＣＣＧＡＧＡＡＴＡＡＴＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＣＣＣＣＣＣＣＧＴＧＣＴＧＧＡＣＡＧＣＧＡＣＧＧＡＴＣＴＴＴＣＴＴＴＣＴＧＧＴＧＴＣＣＡＡＧＣＴＧＡＣＣＧＴＧＧＡＴＡＡＧＴＣＣＡＧＧＴＧＧＣＡＧＣＡＧＧＧＣＡＡＣＧＴＧＴＴＴＡＧＣＴＧＴＡＧＣＧＴＧＡＴＧＣＡＣＧＡＧＧＣＣＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＣＣＡＧＡＡＧＴＣＣＣＴＧＴＣＣＣＴＧＡＧＣＣＣＣＧＧＣＡＡＧ
そのＦｃの核酸配列（配列番号８８）は次の通りである。
ＧＣＣＡＧＣＡＣＣＡＡＧＧＧＣＣＣＣＴＣＣＧＴＧＴＴＣＣＣＴＣＴＧＧＣＣＣＣＴＡＧＣＡＧＣＡＡＧＴＣＣＡＣＣＡＧＣＧＧＣＧＧＣＡＣＣＧＣＣＧＣＴＣＴＧＧＧＡＴＧＴＣＴＧＧＴＧＡＡＧＧＡＣＴＡＣＴＴＴＣＣＴＧＡＧＣＣＣＧＴＧＡＣＣＧＴＧＴＣＣＴＧＧＡＡＣＴＣＣＧＧＣＧＣＣＣＴＧＡＣＣＴＣＣＧＧＣＧＴＧＣＡＣＡＣＡＴＴＣＣＣＣＧＣＣＧＴＧＣＴＧＣＡＧＴＣＣＴＣＣＧＧＣＣＴＧＴＡＣＴＣＣＣＴＧＴＣＣＡＧＣＧＴＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＣＣＴＡＧＣＴＣＣＡＧＣＣＴＧＧＧＣＡＣＣＣＡＧＡＣＣＴＡＣＡＴＣＴＧＴＡＡＣＧＴＧＡＡＣＣＡＣＡＡＧＣＣＣＴＣＣＡＡＴＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＴＡＡＧＡＡＧＧＴＧＧＡＧＣＣＣＡＡＧＴＣＣＴＧＣＧＡＣＡＡＧＡＣＣＣＡＣＡＣＣＴＧＴＣＣＴＣＣＴＴＧＣＣＣＣＧＣＣＣＣＣＧＡＧＣＴＧＣＴＧＧＧＡＧＧＡＣＣＴＴＣＴＧＴＧＴＴＣＣＴＧＴＴＣＣＣＴＣＣＣＡＡＧＣＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＣＴＧＡＴＧＡＴＣＡＧＣＡＧＡＡＣＣＣＣＴＧＡＧＧＴＧＡＣＣＴＧＴＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＣＧＴＧＡＧＣＣＡＣＧＡＧＧＡＣＣＣＴＧＡＧＧＴＧＡＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＣＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＣＡＡＴＧＣＣＡＡＧＡＣＣＡＡＧＣＣＣＡＧＡＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＡＣｇｃＣｔｃＣＡＣＣＴＡＣＡＧＡＧＴＧＧＴＧＴＣＣＧＴＧＣＴＧＡＣＣＧＴＧＣＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＴＴＧＧＣＴＧＡＡＣＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＧＴＧＴＣＣＡＡＴＡＡＧＧＣＣＣＴＧＣＣＣＧＣＣＣＣＣＡＴＣＧＡＧＡＡＧＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＧＧＣＣＡＡＧＧＧＣＣＡＧＣＣＣＡＧＡＧＡＧＣＣＴＣＡＧＧＴＧＴＧＴＡＣＣＣＴＧＣＣＴＣＣＣＴＣＣＡＧＧＧＡＴＧＡＧＣＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＧＴＣＣＣＴＧＡＧＣＴＧＣＧＣＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＴＴＣＴＡＣＣＣＣＡＧＣＧＡＴＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＴＣＣＡＡＣＧＧＣＣＡＧＣＣＣＧＡＧＡＡＴＡＡＴＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＣＣＣＣＣＣＣＧＴＧＣＴＧＧＡＣＡＧＣＧＡＣＧＧＡＴＣＴＴＴＣＴＴＴＣＴＧＧＴＧＴＣＣＡＡＧＣＴＧＡＣＣＧＴＧＧＡＴＡＡＧＴＣＣＡＧＧＴＧＧＣＡＧＣＡＧＧＧＣＡＡＣＧＴＧＴＴＴＡＧＣＴＧＴＡＧＣＧＴＧＡＴＧＣＡＣＧＡＧＧＣＣＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＣＣＡＧＡＡＧＴＣＣＣＴＧＴＣＣＣＴＧＡＧＣＣＣＣＧＧＣＡＡＧ
軽鎖ヌクレオチド配列（配列番号１０１）は次の通りである。
ＧＡＡＡＴＴＧＴＧＣＴＧＡＣＴＣＡＧＴＣＴＣＣＡＴＣＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＧＣＡＴＣＴＧＴＡＧＧＡＧＡＣＡＧＡＧＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＴＴＧＣＣＴＧＧＣＡＡＧＴＣＡＧＡＣＣＡＴＴＧＧＴＡＣＡＴＧＧＴＴＡＧＣＡＴＧＧＴＡＴＣＡＧＣＡＧＡＡＡＣＣＡＧＧＧＡＡＡＴＣＴＣＣＴＣＡＧＣＴＣＣＴＧＡＴＣＴＡＴＧＣＴＧＣＡＴＣＣＡＣＴＴＴＧＣＡＡＴＣＡＧＧＧＧＴＣＣＣＡＴＣＴＣＧＧＴＴＣＡＧＴＧＧＣＡＧＴＧＧＡＴＣＴＧＧＧＡＣＡＧＡＴＴＴＣＡＣＴＣＴＣＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＣＡＧＣＣＴＧＡＡＧＡＴＧＴＴＧＣＡＡＣＴＴＡＴＴＡＣＴＧＴＣＡＧＣＡＡＴＡＴＴＡＴＡＧＴＡＣＴＣＣＴＣＧＧＡＣＧＴＴＣＧＧＣＣＡＡＧＧＧＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＧＡＴＴＡＡＡＣＧＴＡＣＧＧＴＧＧＣＴＧＣＡＣＣＡＴＣＴＧＴＣＴＴＣＡＴＣＴＴＣＣＣＧＣＣＡＴＣＴＧＡＴＧＡＧＣＡＧＴＴＧＡＡＡＴＣＴＧＧＡＡＣＴＧＣＣＴＣＴＧＴＴＧＴＧＴＧＣＣＴＧＣＴＧＡＡＴＡＡＣＴＴＣＴＡＴＣＣＣＡＧＡＧＡＧＧＣＣＡＡＡＧＴＡＣＡＧＴＧＧＡＡＧＧＴＧＧＡＴＡＡＣＧＣＣＣＴＣＣＡＡＴＣＧＧＧＴＡＡＣＴＣＣＣＡＧＧＡＧＡＧＴＧＴＣＡＣＡＧＡＧＣＡＧＧＡＣＡＧＣＡＡＧＧＡＣＡＧＣＡＣＣＴＡＣＡＧＣＣＴＣＡＧＣＡＧＣＡＣＣＣＴＧＡＣＧＣＴＧＡＧＣＡＡＡＧＣＡＧＡＣＴＡＣＧＡＧＡＡＡＣＡＣＡＡＡＧＴＣＴＡＣＧＣＣＴＧＣＧＡＡＧＴＣＡＣＣＣＡＴＣＡＧＧＧＣＣＴＧＡＧＣＴＣＧＣＣＣＧＴＣＡＣＡＡＡＧＡＧＣＴＴＣＡＡＣＡＧＧＧＧＡＧＡＧＴＧＴ
そのＣＬの核酸配列（配列番号８９）は次の通りである。
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実施例３：抗ＰＤ－Ｌ１ ｓｃＦｖの抗原タンパク質ＰＤ－Ｌ１－Ｈｉｓ－Ｂｉｏｔｉｎへの結合能
フローサイトメトリーにより、酵母によってディスプレイされた抗ＰＤ－Ｌ１ ｓｃＦｖの抗原タンパク質ＰＤ－Ｌ１－Ｈｉｓ－Ｂｉｏｔｉｎへの結合能を検出した。実施例２のステップ２．１の陽性酵母のクローニングをそれぞれ、１ｎＭのＰＤ－Ｌ１－Ｈｉｓ－Ｂｉｏｔｉｎ抗原タンパク質と共に室温で１ｈインキュベートし、更にｐＨ７．４のＰＢＳで３回洗浄した後、次にＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ－ＰＥ蛍光二次抗体と共に室温で３０ｍｉｎインキュベートし、更にｐＨ７．４のＰＢＳで３回洗浄した後、新しいＰＢＳを加え、フローサイトメーターでの検出を準備した。
ＰＤ－Ｌ１－Ｈｉｓ－Ｂｉｏｔｉｎの調製：精製されたＰＤ－Ｌ１－Ｈｉｓ抗原タンパク質に、１ｍｇのタンパク質あたり２６．６μＬの１０ｎＭのＤＭＳＯで調製したｂｉｏｔｉｎ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｂ４５０１－１Ｇ）を加え、室温で２ｈインキュベートした後、ｐＨ７．４のＰＢＳで透析した。
図３に示されるように、本発明の抗ＰＤ－Ｌ１ ｓｃＦｖ（ＣＰ１１－３６、ＣＰ１１－４６、ＣＰ１１－７１、ＣＰ１４－１６及びＣＰ１４－８０）の、ＰＤ－Ｌ１－Ｈｉｓ－Ｂｉｏｔｉｎ抗原タンパク質への結合能は、陽性対照ＡＴＥ ｓｃＦＶよりも明らかに優れ、陽性対照ＡＴＥ ｓｃＦＶと比較して、本発明の抗ＰＤ－Ｌ１ ｓｃＦＶ（ＣＰ－１１－４７、ＣＰ－１１－５５、ＣＰ２１－８、ＣＰ２１－４７及びＣＰ２２－３４）の、ＰＤ－Ｌ１－Ｈｉｓ－Ｂｉｏｔｉｎ抗原タンパク質への結合能は実質的に同じであった。
実施例４：抗ＣＤ４７抗体のＳＩＲＰα遮断活性
ＥＬＩＳＡ競合法により、１１種類の抗体（抗体Ｌ１２－６、抗体１７、抗体３、抗体３－３、抗体３－６、抗体６、抗体１０、抗体１６、抗体１８、抗体２４、抗体２５）と陽性対照（抗体Ｈｕ５Ｆ９－Ｇ４）を様々な濃度（１２、６、３、２、１．５、１．２、０．７５、０．３７５、０．１８８、０．０９４μｇ／ｍＬ）に希釈し、ＥＬＩＳＡプレートにコーティングしたＣＤ４７－Ｈｉｓ（２μｇ／ｍＬ）抗原と共に室温で１時間インキュベートし、ＰＢＳＴで４回洗浄し、更にＳＩＲＰα－Ｆｃ－Ｂｉｏ（０．１μｇ／ｍＬ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＥＺ－Ｌｉｎｋ（登録商標）ＮＨＳ－Ｂｉｏｔｉｎ Ｒｅａｇｅｎｔｓ試薬キットで調製）リガンドを加えてＣＤ４７－Ｈｉｓ抗原と共に室温で１時間インキュベートし、ＰＢＳＴで４回洗浄した。結合したＳＩＲＰα－Ｆｃ－ＢｉｏとＨＲＰ－複合ストレプトアビジン二次抗体が化学発光反応を起こし、プレートリーダーによりＯＤ４５０値を検出し、ＯＤ４５０値に基づいて抗体のＩＣ５０を換算して抗体のＳＩＲＰα遮断活性を判定した。結果は、表１１に示された。結果によって、上記の抗ＣＤ４７抗体が何れも細胞表面ＣＤ４７へのＳＩＲＰａの結合を阻害できることが示された。
実施例５：抗ＰＤ－Ｌ１抗体の親和性及びＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１への遮断活性
Ｂｉａｃｏｒｅによる親和性解離定数（ＫＤ）の検出
Ｂｉａｃｏｒｅシステム（ＧＥ社）を用い、動力学的結合アッセイによって、対応する抗原に結合する本発明の実施例２のステップ２．２．２の抗体の平衡解離定数（ＫＤ）を決定した。マニュアルの方法に従って、５μｇの抗原タンパク質ＰＤ－Ｌ１－Ｈｉｓをチップに固定し、最高濃度が１００ｎＭ（１：２で希釈し、５つの勾配）の抗ＰＤ－Ｌ１抗体を流動相として、親和性を測定し、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅにより結果を分析した。ここで、陽性対照は、ＡＴＥ抗体であった（ＡＴＥ抗体のアミノ酸配列は、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞によって発現されたＡｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂと一致した）。表１２は、例示的抗体のＫＤデータを示しており、ＡＴＥ抗体と比較して、本発明の抗体Ｌ１－Ｒ２－４－３６、Ｌ１－Ｒ２－４－４６、Ｌ１－Ｒ２－４－４７、Ｌ１－Ｒ２－４－５５及びＬ１－Ｒ２－４－７１は、ＰＤ－Ｌ１抗原に対してより高い親和性を有することが分かった。
抗ＰＤ－Ｌ１抗体の生物活性検出方法は、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１の結合への上記構築した抗ＰＤ－Ｌ１抗体の阻害作用を検出した。
ＭＯＡ法による抗ＰＤ－Ｌ１抗体のＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１への遮断活性の検出
抗ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１抗体は、ＰＤ－１のＰＤ－Ｌ１への結合を遮断することによって、下流のＮＦＡＴシグナル伝達経路に対する阻害作用を解除することができる。Ｐｒｏｍｅｇａ社により提供されたＭＯＡ（Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ Ａｃｔｉｏｎ、ＭＯＡ）検出システム（ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１ Ｂｌｏｃｋａｄｅ Ｂｉｏａｓｓａｙ、Ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ Ｍｏｄｅｌ、Ｃａｔａｌｏｇ Ｊ１２５２）を用いて、マニュアルに記載された方法に従って、蛍光レポーター遺伝子の発現を検出することによって、ＮＦＡＴシグナルの活性化状態を反映し、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１に結合する実施例２のステップ２．２．２の抗体の阻害作用を検出した。そのうち、陰性対照抗体ＩｇＧ－Ｉｓｏｔｙｐｅは、北京義翹神州科技股分有限公司（カタログ番号：ＨＧ１Ｋ）から購入された。
活性検出の前日にＣＨＯ－ＰＤ－Ｌ１細胞（上記ＭＯＡ検出システムから）を播種した：ＣＨＯ－ＰＤ－Ｌ１を播種する１～２日前に継代し、培養上清を捨て、滅菌ＰＢＳで細胞を１回洗浄した。適量のＴｒｙｐｓｉｎ（Ｇｉｂｃｏ）を加えて３７℃、５％のＣＯ２のインキュベータで３～５ｍｉｎ消化した。新鮮な培地を加えて消化を停止させ、細胞を５０ｍＬの遠心分離チューブに移してカウントした。必要な体積の細胞を採取し、９００ｒｐｍで５ｍｉｎ遠心分離した。ＤＭＥＭ－Ｆ１２培地（Ｇｉｂｃｏ）を加え、細胞を４×１０５細胞／ｍＬに再懸濁させた。細胞を９６ウェルの白色細胞培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に１００μＬ／ウェルで加えた。細胞を３７℃、５％のＣＯ２のインキュベータで一晩培養した。
検出当日に、Ｊｕｒｋａｔ－ＰＤ１細胞（上記のＭＯＡ検出システムから）を処理した：カウント後に必要な体積の細胞を採取し、９００ｒｐｍで５ｍｉｎ遠心分離した。測定緩衝液（１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ）＋１％ＦＢＳ）で細胞を１．２５×１０６細胞／ｍＬに再懸濁させておいた。ＣＨＯ－ＰＤ－Ｌ１細胞培養プレートの培地上清を９５μＬ／ウェル吸引除去し、４０μＬ／ウェルの試験試料（上記の抗ＰＤ－Ｌ１抗体、ＡＴＥ抗体及び陰性対照ＨＧ１Ｋ抗体、最高濃度は２０μｇ／ｍＬであり、測定緩衝液において２倍、合計９勾配で希釈した）を加え、４０μＬのＪｕｒｋａｔ－ＰＤ１細胞を更に加え、軽く振とうして均一に混合し、３７℃、５％のＣＯ２のインキュベータにおいて６時間培養した。検出：ＯＮＥ－ＧｌｏＴＭ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａから購入し、Ｅ６１２０）を事前に融解した。６時間後、ＯＮＥ－ＧｌｏＴＭを５０μＬ／ウェルで添加した。室温で５～１０ｍｉｎ放置し、値を読み取った。実験結果は図４に示されるように、本発明の抗体Ｌ１－Ｒ２－４－３６、Ｌ１－Ｒ２－４－４６、Ｌ１－Ｒ２－４－４７、Ｌ１－Ｒ２－４－５５及びＬ１－Ｒ２－４－７１は何れも、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１の相互作用を効果的に遮断することができ、対照抗体ＡＴＥと比較して、抗体（Ｌ１－Ｒ２－４－３６及びＬ１－Ｒ２－４－４６）はより強い遮断活性を有する。
実施例６：共通軽鎖抗体の親和性及び活性
Ｂｉａｃｏｒｅによる親和性解離定数（ＫＤ）の検出
実施例５のＢｉａｃｏｒｅによる親和性解離定数（ＫＤ）の検出方法により、実施例２のステップ２．２．３の抗ＰＤ－Ｌ１抗体及び抗ＣＤ４７抗体の解離定数を測定した。結果は、表１３に示された。
上記のデータから、本発明の様々な軽鎖は、それぞれ抗ＰＤ－Ｌ１及び抗ＣＤ４７の重鎖と共にモノクローナル抗体を同時に形成し、且つ溶液中のヒトＰＤ－Ｌ１及びヒトＣＤ４７タンパク質にそれぞれ結合できることが分かった。
ＭＯＡ法による抗ＰＤ－Ｌ１抗体のＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１への遮断活性の検出
実施例５のＭＯＡ法により、実施例２のステップ２．２．３の抗ＰＤ－Ｌ１抗体のＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１への遮断活性が検出された。実験結果は図５に示され、本発明の様々な軽鎖の抗ＰＤ－Ｌ１抗体は何れも、ＰＤ１／ＰＤ－Ｌ１の相互作用を効果的に遮断することができる。
抗ＣＤ４７抗体の赤血球凝集実験
大部分の抗ＣＤ４７抗体は、赤血球凝集を促進する副作用を有することが知られているため、これらの抗ＣＤ４７抗体の治療への応用は限られている。従って、本発明の実施例２のステップ２．２．３の抗ＣＤ４７抗体の赤血球凝集作用を更に検出した。具体的な検出方法：新鮮なヒト血液を採取し、生理食塩水で３回洗浄した後、２％のヒト赤血球懸濁液を調製し、２％のヒト赤血球懸濁液と試験抗体（最高最終濃度が８００ｎＭ、２倍シリーズで希釈し、合計１１個の希釈後濃度を取得した）を等体積で混合し、３７℃で４時間インキュベートし、次に抗体の赤血球凝集を評価し、９６ウェルＵ字型プレートを４５°傾斜し、赤血球塊の流れ方向を観察し、「一字型」を呈する場合は、赤血球が凝集していないことが示された。上記のアッセイに記載された実験において、赤血球凝集反応の結果は図６に示された。高濃度の場合、４７－Ｒ２－８９及び対照抗体Ｈｕ５Ｆ９－Ｇ４は、赤血球凝集を引き起こしたが、他の例示的抗体は赤血球凝集を引き起こさなかった。本発明の大部分の抗ＣＤ４７抗体は、赤血球凝集作用を大幅に低減できるため、臨床治療において副作用を大幅に低減し、様々ながんの治療に広く適用できることが分かった。
抗ＣＤ４７抗体の貪食作用への促進の実験
体外貪食作用の測定によって、実施例２のステップ２．２．３の抗ＣＤ４７抗体がＣＤ４７を発現する標的細胞へのマクロファージの貪食を増強するか否かを評価した。簡単に言えば、抗ＣＤ４７抗体（０．７ｎＭ）の存在下で、ＲＡＷ２６４．７マクロファージ（２×１０５個／ｍＬ）とＣＦＳＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号：Ｃ３４５５４）で標識されたＲａｊｉ細胞（４×１０５個／ｍＬ）を、１：２の比率で２４ウェルボトムプレートに播種し、３７℃で暗所で２時間インキュベートした。インキュベートが完了すると、ＰＢＳで細胞を２回洗浄した後、１００μＬのＡＰＣ－Ｆ４／８０蛍光抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を更に加え、氷上（暗所）で３０分間インキュベートし、ＰＢＳ緩衝液で２回洗浄し、フローサイトメトリーにより分析した。貪食指数を分析し、貪食指数の計算方法は以下の通りである：貪食指数＝ＣＦＳＥ－Ｆ４／８０二重陽性のマクロファージ数（即ち、腫瘍細胞を貪食したマクロファージ数）／マクロファージ５０００個あたり。図７に示されるように、本発明の抗ＣＤ４７抗体とＨｕ５Ｆ９－Ｇ４の両方とも、標的細胞へのマクロファージの貪食作用を効果的に誘導することができる。
実施例７：抗ＰＤ－Ｌ１／ＣＤ４７二重特異性抗体のＴｍ値の測定
ＤＳＣ（示差走査熱量計、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ、ＭｉｃｒｏＣａｌ ＶＰ－Ｃａｐｉｌｌａｒｙ）の方法を使用して例示的二重特異性抗体及び参照抗体（ここでは、Ｌ１－Ｒ２－４－７１を参照として使用する）のＴｍ値を測定し、これに基づいて例示的二重特異性抗体の熱安定性を予備的に判断した。
試料タンパク質は、１×ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）において濃度２ｍｇ／ｍＬの溶液に調製された。４０℃から始めて、１８０℃／ｈｒの速度で試料又は空白緩衝液の比熱容量（Ｃｐ）を走査した。対応する緩衝液の結果から試料走査の結果をそれぞれ差し引き、得られたＣｐ値を使用して温度をプロットし、その中でＣｐ値が大幅に増加したピーク値に対応する温度を試料のＴｍ値とした。
表１４から分かるように、従来の抗体と類似し、例示的二重特異性抗体及びＬ１－Ｒ２－４－７１参照試料の両方とも、約７０℃のＣＨ２溶解温度及び約８５℃のＣＨ３溶解温度を含む明らかなＴｍ値が示された。同時に、Ｌ１－Ｒ２－４－７１と比較して、二重特異性抗体のＴｍ値はわずかに低いが、違いが明らかではないことが分かり、二重特異性抗体はモノクローナル抗体と類似しており、良好な熱安定性を有すると予備判断できた。
実施例８：抗ＰＤ－Ｌ１／ＣＤ４７抗体の２種類の抗原への結合活性
Ｏｃｔｅｔシステム（ＦｏｒｔｅＢｉｏ社）を使用して動力学的結合アッセイによって、例示的二重特異性抗体のＰＤ－Ｌ１及びＣＤ４７への結合能力を決定した。実験の開始時に、ＰｒｏＡバイオセンサＡＨＣセンサ（Ｐａｌｌ、１５０６０９１）をＰＢＳ緩衝液に浸漬し、室温で１０分間平衡化した。９６ウェルの黒色ポリスチレンハーフエリアマイクロプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ）のウェルに１００μＬの二重特異性抗体溶液（ＢｓＡｂ－３６、ＢｓＡｂ－４６、ＢｓＡｂ－４７又はＢｓＡｂ－７１（２０μｇ／ｍＬ））、１００μＬのＰＤ－Ｌ１－Ｈｉｓ抗原溶液（２００ｎＭ、４０ｎＭ、８ｎＭ、１．６ｎＭ、０．３２ｎＭ及び０）及び１００μＬのＣＤ４７－Ｈｉｓ抗原溶液（２００ｎＭ、４０ｎＭ、８ｎＭ、１．６ｎＭ、０．３２ｎＭ及び０）をそれぞれ加えた。上記抗体溶液をそれぞれ含むウェルにＰｒｏＡバイオセンサＡＨＣを浸漬し、室温で１２０秒浸漬してサンプリングした。続いて、ベースラインに達するまでＰＢＳ緩衝液においてセンサを洗浄し、次に１００μＬのＰＤ－Ｌ１－Ｈｉｓ抗原溶液を含むウェルに浸漬し、続いて、ベースラインに達するまでＰＢＳ緩衝液においてセンサを洗浄し、次に１００μＬのＣＤ４７－Ｈｉｓ抗原溶液を含むウェルに浸漬し、抗体と抗原との会合を監視した。回転速度を１０００回転／分間とし、温度を３０℃とした。結果は、図８Ａに示された。
別の実験では、実験方法は上記と同じであるが、抗体の２種類の抗原への結合順序が上記の実験とは逆になり、上記抗体溶液をそれぞれ含むウェルにＰｒｏＡバイオセンサＡＨＣを浸漬し、室温で１２０秒浸漬してサンプリングした。続いて、ベースラインに達するまでＰＢＳ緩衝液においてセンサを洗浄し、次に１００μＬのＣＤ４７－Ｈｉｓ抗原溶液を含むウェルに浸漬し、その後、ベースラインに達するまでＰＢＳ緩衝液においてセンサを洗浄し、更に１００μＬのＰＤ－Ｌ１－Ｈｉｓ抗原溶液を含むウェルに浸漬し、抗体と抗原との会合を監視した。結果は、図８Ｂに示された。
別の実験では、実験方法は上記と同じであるが、二重特異性抗体はＢｓＡｂ－７１－Ｎ２９７Ａであり、二重特異性抗体ＢｓＡｂ－７１－Ｎ２９７Ａの２種類の抗原への結合活性を検出した。結果は、図８Ｃに示されるように、ＢｓＡｂ－７１－Ｎ２９７Ａが溶液のＰＤ－Ｌ１及びＣＤ４７タンパク質と同時に結合できることが示された。
上記の結果から、本発明の例示的二重特異性抗体は、溶液中のＰＤ－Ｌ１及びＣＤ４７タンパク質と同時に結合し、且つ異なるエピトープに結合する時に互いに干渉することなく結合できることが分かった。
実施例９：抗ＰＤ－Ｌ１／ＣＤ４７二重特異性抗体の解離定数の測定
実施例５のＢｉａｃｏｒｅによる親和性解離定数（ＫＤ）の検出方法により、上記のように構築された抗ＰＤ－Ｌ１／ＣＤ４７二重特異性抗体のヒトＰＤ－Ｌ１－Ｈｉｓ又はヒトＣＤ４７－Ｈｉｓ抗原への結合の平衡解離定数（ＫＤ）を測定し、異なるフィッティング方法によって結果を分析した。表１５には、例示的抗体のＫＤデータが示された。
上記のデータから、１：１Ｂｉｎｄｉｎｇのフィッティング方法により、本発明の例示的二重特異性抗体は、溶液中のヒトＰＤ－Ｌ１－Ｈｉｓに結合することができ、且つ親抗体の親和性定数を維持し、本発明の例示的二重特異性抗体は、溶液中のヒトＣＤ４７－Ｈｉｓタンパク質に結合することができ、抗体の親和性定数が親抗体よりも弱く、中程度の抗ＣＤ４７親和性を有することが分かった。
実施例１０：抗ＰＤ－Ｌ１／ＣＤ４７二重特異性抗体のＰＤ－Ｌ１又はＣＤ４７を過剰発現するＣＨＯ細胞への結合の分析
フローサイトメトリーにより、本発明の例示的抗ＰＤ－Ｌ１／ＣＤ４７二重特異性抗体のヒトＰＤ－Ｌ１又はヒトＣＤ４７を過剰発現するＣＨＯ細胞への結合を測定した。簡単に言えば、ヒトＰＤ－Ｌ１又はヒトＣＤ４７のｃＤＮＡを発現ベクターに挿入し、チャイニーズハムスターの卵巣がん細胞（ＣＨＯ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にトランスフェクトし、ヒトＰＤ－Ｌ１又はヒトＣＤ４７を過剰発現するＣＨＯ細胞（ＰＤ－Ｌ１－ＣＨＯ細胞又はＣＤ４７－ＣＨＯ細胞）を産生した。ＰＤ－Ｌ１－ＣＨＯ細胞又はＣＤ４７－ＣＨＯ細胞を、異なるシリーズで希釈した例示的二重特異性抗体とそれぞれ均一に混合し、氷上で１ｈインキュベートし、ＰＢＳで細胞を２回洗浄し、ＰＥで標識された抗ヒトＦｃ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１２－４９９８－８２）蛍光二次抗体を更に加え、氷上、暗所で３０分間インキュベートし、ＰＢＳで細胞を２回洗浄した後にＰＢＳで細胞を再懸濁し、ＦＡＣＳにより抗体の細胞への結合を検出した。結果は、図９Ａ及び図９Ｂに示された。図９Ａから、本発明の例示的二重特異性抗体は、何れも細胞表面で発現するＰＤ－Ｌ１に結合することができ、親抗体の結合ＥＣ５０が維持されることが分かった。同時に、図９Ｂから、本発明の例示的二重特異性抗体は、何れも細胞表面で発現するＣＤ４７に結合することができることが分かった。
別の実施例において、上記の方法により抗ＰＤ－Ｌ１／ＣＤ４７二重特異性抗体ＢｓＡｂ－７１－Ｎ２９７ＡのＰＤ－Ｌ１又はＣＤ４７を過剰発現するＣＨＯ細胞への結合を分析した。結果は、図９Ｃ及び図９Ｄに示された。図９Ｃから、ＢｓＡｂ－７１－Ｎ２９７Ａは、細胞表面で発現するＰＤ－Ｌ１に結合することができ、親抗体の結合ＥＣ５０が維持されることが分かった。同時に、図９Ｄから、ＢｓＡｂ－７１－Ｎ２９７Ａは、細胞表面で発現するＣＤ４７に結合することができることが分かった。
既存の報告によると、ＣＤ４７タンパク質は様々な正常のヒト組織で、様々な程度に発現されることが知られているため、抗ＣＤ４７抗体の治療への応用に一定の障害をもたらした。本発明において、二重特異性抗体のヒトＣＤ４７に対する親和性及び結合能を戦略的に低下させることにより、臨床治療において抗体によって引き起こされる副作用を低減することができ、様々ながんの治療に広く適用できると予測された。
実施例１１：ＭＯＡ法に基づいた本発明の例示的二重特異性抗体の抗ＰＤ－Ｌ１活性の検出
実施例５のＭＯＡ検出方法によって、本発明の例示的二重特異性抗体（ＢｓＡｂ－３６、ＢｓＡｂ－４６、ＢｓＡｂ－４７、ＢｓＡｂ－７１及びＢｓＡｂ－７１－Ｎ２９７Ａ）の抗ＰＤ－Ｌ１活性を検出した。結果は、図１０Ａ及び図１０Ｂに示されるように、本発明の二重特異性抗体がＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１の相互作用によるＮＦＡＴシグナル伝達経路への阻害作用を排除することができ、且つ抗ＰＤ－Ｌ１抗体として単独で使用したＬ１－Ｒ２－４－７１抗体よりも活性が高かった。
実施例１２：抗ＰＤ－Ｌ１／ＣＤ４７二重特異性抗体の赤血球凝集への促進活性の検出
実施例６に記載の赤血球凝集実験の検出方法によれば、本発明は、抗ＰＤ－Ｌ１／ＣＤ４７二重特異性抗体の赤血球凝集作用を更に研究した。結果は、図１１に示されるように、本発明の例示的二重特異性抗体は、赤血球凝集を引き起こさず、赤血球凝集を促進する活性が対照群Ｈｕ５Ｆ９－Ｇ４よりも明らかに低く、親抗体４７－Ｒ２－４と一致するように維持された。
実施例１３：二重特異性抗体の腫瘍細胞に対するマクロファージの貪食能力への促進の検出（ファゴサイトグラム）
フローサイトメトリーによるアッセイにおいて、本発明の例示的二重特異性抗体の腫瘍細胞に対するマクロファージの貪食能力への促進を測定した。実施例６に記載の抗ＣＤ４７抗体の貪食作用への促進の実験方法によれば、体外で本発明の例示的二重特異性抗体の標的細胞に対するマクロファージの貪食能力への促進を評価した。図１２から、抗ＰＤ－Ｌ１／ＣＤ４７二重特異性抗体は、標的細胞に対するマクロファージの貪食作用を効果的に誘導することができ、その誘導活性が抗ＣＤ４７モノクローナル抗体と類似することが分かった。
実施例１４：二重特異性抗体のヒト赤血球への結合の分析（ＲＢＣ ｂｉｎｄｉｎｇ）
腫瘍細胞及び赤血球でのみ、ＣＤ４７－ＳＩＲＰα相互作用の遮断が貪食作用を誘発することは、従来技術で知られている。この機序は、抗ＣＤ４７抗体の作用機序を決定するため、治療による赤血球の減少が重度の貧血を引き起こし、抗ＣＤ４７抗体の治療への応用が制限された。赤血球の差別的な特性を持つ抗ＣＤ４７抗体への結合によって、正常な赤血球への結合を効果的に回避し、臨床治療における副作用を低減することができる。本実施例において、フローサイトメトリーにより、例示的二重特異性抗体の腫瘍細胞及びヒト赤血球への選択的結合の性質を検出した。具体的な方法：新鮮なヒト血液を採取し、生理食塩水で３回洗浄した後、２％のヒト赤血球懸濁液を調製し、２％のヒト赤血球懸濁液と試験抗体（最高最終濃度が２００ｎＭ、２倍シリーズで希釈し、合計１１個の希釈後濃度）を等体積で混合し、氷上で１ｈインキュベートし、ＰＢＳで細胞を２回洗浄し、ＰＥで標識された抗ヒトＦｃ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１２－４９９８－８２）蛍光二次抗体を更に加え、氷上、暗所で３０分間インキュベートし、ＰＢＳで細胞を２回洗浄した後にＰＢＳで細胞を再懸濁し、ＦＡＣＳにより抗体の細胞への結合を検出した。上記と同様に、例示的二重特異性抗体及びヒトリンパ球性白血病Ｊｕｒｋａｔ細胞の検出試料を調製した。実験結果は、図１３Ａ及び図１３Ｂに示されるように、２００ｎＭの抗体濃度で、本発明の二重特異性抗体がヒト赤血球に弱く結合するだけであり、親抗体４７－Ｒ２－４及び陽性対照抗体Ｈｕ５Ｆ９－Ｇ４のヒト赤血球への結合よりも明らかに弱く、異なった赤血球結合特性は、二重特異性抗体及び親抗体の腫瘍細胞への結合に影響を与えなかった。従って、本発明の二重特異性抗体は、臨床応用の安全性がより高く、治療への適応性がより広かった。
実施例１５：抗ＰＤ－Ｌ１／ＣＤ４７二重特異性抗体の、外因性刺激下でのヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からのＩＬ２サイトカインの放出に与える影響
この研究では、例示的抗体を、体外で培養し異なる供与体に由来するＰＢＭＣと共にインキュベートし、システム内のＩＬ２の発現量を検出することによって、Ｔ細胞に対する異なる抗体の活性化作用を反映した。
ＰＢＭＣ分離：ドナー（Ｄｏｎｏｒ１及びＤｏｎｏｒ２）から新鮮な抗凝固全血を採取し、等体積のＰＢＳで１：１の比率で全血を希釈し、１５ｍＬの遠心分離チューブに７ｍＬのヒト末梢血リンパ球分離液（達優、７９１２０１１）を加え、希釈後の７ｍＬの血液サンプルをヒト末梢血リンパ球分離液（達優、７９１２０１１）の液面の上に徐々に加え、２つの液面間の界面をクリアに保持し、血液サンプルは分離液の上に浮かんで界面を突き破ることができず、室温下で、水平回転子を使用して８００ｇで３０ｍｉｎ遠心分離し、加速するための加速度を１に設定し、減速するための加速度を０に設定し、遠心分離後、チューブの底は赤血球、中間層は分離液、最上層は血漿／組織ホモジネート層であり、血漿層と分離液層との間は薄くて緻密な白い膜、即ちＰＢＭＣ細胞層であった。白い膜層を新しい遠心分離チューブに慎重に吸引し、吸引したＰＢＭＣをＰＢＳで一定の体積に希釈し、反転して均一に混合した。室温で、水平回転子を使用して２５０ｇで１０ｍｉｎ遠心分離し、上清を捨て、２回繰り返し洗浄し、ＰＢＳで細胞を再懸濁し、カウントしておいた。
抗体の準備：ＰＢＭＣ培養液で抗体ＢｓＡｂ－７１－Ｎ２９７Ａ（５μｇ／ｍＬ）、４７－Ｒ２－４（５μｇ／ｍＬ）、Ｌ１－Ｒ２－４－７１（５μｇ／ｍＬ）、４７－Ｒ２－４（５μｇ／ｍＬ）＋Ｌ１－Ｒ２－４－７１（５μｇ／ｍＬ）を調製した。
ＰＢＭＣ刺激：適量のＰＢＭＣを取り、細胞の密度が１×１０６個／ｍＬになるようにＰＢＭＣ培養液で再懸濁し、ＳＥＥの濃度を１００ｎｇ／ｍＬにするように、上記の細胞懸濁液にＳＥＥ（Ｔｏｘｉｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＥＴ４０４）を加えた。９６ウェルの細胞培養プレートを取り、ＳＥＥが加えられたＰＢＭＣ細胞を１ウェルあたり１００μＬでウェルに均一に配分した。準備が整った抗体溶液を１ウェルあたり１００μＬでプレートに加え、均一に混合し、この時、ＳＥＥの最終濃度は５０ｎｇ／ｍＬ、抗体の最終濃度は２．５μｇ／ｍＬであり、各ウェルに合計１０万個のＰＢＭＣ細胞があった。抗体と細胞を３７℃の二酸化炭素インキュベータで４日間共培養した。
ＩＬ－２検出：準備が整った抗ＩＬ－２抗体を９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ（登録商標） Ａｓｓａｙ Ｐｌａｔｅ）にコーティングし、各ウェルに抗ＩＬ－２抗体１００μＬを加え、４℃で一晩インキュベートし、マイクロウェルプレートウォッシャーを使用して毎回３００μＬの洗浄液でプレートを２回洗浄した。清潔な紙の上で軽く叩いて乾かし、各ウェルに２００μＬのブロッキング溶液を加え、３７℃の電気恒温インキュベータで２時間インキュベートし、各ウェルに実験用希釈液７５μＬ及び抗体と共に４日間共同インキュベートしたＰＢＭＣ上清液２５μＬを加え、希釈したＩＬ－２標準品（Ｈｕｍａｎ ＩＬ－２ ＥＬＩＳＡ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｋｉｔ（ＨＲＰ）、Ｍａｂｔｅｃｈ）を加え、３７℃で２時間インキュベートし、マイクロウェルプレートウォッシャーを使用して毎回３００μＬの洗浄液でプレートを５回洗浄した。清潔な紙の上で軽く叩いて乾かし、各ウェルに１００μＬの抗ＩＬ－２ビオチン化抗体を加え、３７℃の電気恒温インキュベータで１時間インキュベートし、各ウェルに１００μＬの二次抗体溶液を加え、３７℃の電気恒温インキュベータで１時間インキュベートし、マイクロウェルプレートウォッシャーを使用して毎回３００μＬの洗浄液でプレートを８回洗浄した。清潔な紙の上で軽く叩いて乾かし、各ウェルに１００μＬのＴＭＢ単一成分発色液を加え、３７℃、暗所で１０～１５ｍｉｎインキュベートし、各ウェルに５０μＬの停止液を加えて発色反応を停止させ、次に多機能プレートリーダーでデータを読み取って分析し、吸光値を４５０ｎｍに設定した。
実験結果は、図１４に示されるように、本発明の例示的抗ＰＤ－Ｌ１／ＣＤ４７二重特異性抗体ＢｓＡｂ－７１－Ｎ２９７Ａが体外でＴ細胞を効果的に活性化することができる。
実施例１６：本発明の抗ＰＤ－Ｌ１／ＣＤ４７二重特異性抗体の体内抗腫瘍作用
ヒトＣＤ４７を発現するＭＣ３８細胞（ＭＣ３８－ｈＣＤ４７（Ｔｇ）、江蘇集萃薬康生物科技有限公司）を使用し、ｈＳＩＲＰα遺伝子組換えのＣ５７ＢＬ／６－ｈＳＩＲＰαマウスにおいて本発明の抗ＰＤ－Ｌ１／ＣＤ４７二重特異性抗体の抗腫瘍作用を測定した。
ヒトＳＩＲＰα遺伝子組換えマウス：雌Ｃ５７ＢＬ／６－ｈＳＩＲＰαマウス（５～８週齢）（江蘇集萃薬康生物科技有限公司）。
実験細胞：対数増殖期のマウス結腸がん細胞ＭＣ３８ーｈＣＤ４７（Ｔｇ）を採取し、培養液を除去し、ＰＢＳで２回洗浄した後に、１×１０６／１００μＬ／匹の接種量で接種位置とする右側腹部領域に接種した。
群分けによる投与：平均腫瘍体積が約５０～１００ｍｍ３の場合、担癌マウスを無作為に群分けにした。群分けの基準：腫瘍体積ＣＶ値が３０％未満である。接種の当日をＤ０日と定義し、群分けの当日に実験プロトコルの設計に従って投与を開始した。投与量と投与方法は、表１６に示された。細胞接種後、動物の正常な行動に対する腫瘍の影響を定期的に毎週監視した。具体的な内容：実験動物の活動、摂食と飲水状態、体重の増減状況、目、被毛及び他の異常状態。試験中に観察された臨床症状は何れも、生データに記録された。投与開始後、体重を週２回測定した。腫瘍体積を週２回測定した。腫瘍体積の計算式：腫瘍体積（ｍｍ３）＝０．５×ａ×ｂ２、ａは腫瘍長径、ｂは腫瘍短径である。監視は３３日後に終了した。接種後の３３日目に相対腫瘍阻害率（ＴＧＩ％）を計算した。計算式：ＴＧＩ％＝（１－治療群の平均相対腫瘍体積／溶媒群の平均相対腫瘍体積）×１００％。
腫瘍阻害率の結果は、図１５及び表１７に示された。接種後の３３日目にＩｓｏｔｙｐｅ ＩｇＧ１群と比較して、５ｍｇ／ｋｇのＬ１－Ｒ２－４－７１単剤の腫瘍阻害率は３２．２５％、５ｍｇ／ｋｇの４７－Ｒ２－４単剤の腫瘍阻害率は１８．９０％、５ｍｇ／ｋｇのＬ１－Ｒ２－４－７１と５ｍｇ／ｋｇの４７－Ｒ２－４との併用投与の腫瘍阻害率は７６．７３％、１０ｍｇ／ｋｇの抗ＰＤ－Ｌ１／ＣＤ４７二重特異性抗体ＢｓＡｂ－７１－Ｎ２９７Ａの腫瘍阻害率は６８．７０％であり、単剤の腫瘍阻害効果より明らかに優れており、併用投与群と比較して統計的な差は認められなかった（ｐ＞０．０５）。マウスの体重を検出した結果は、各群のマウスの体重に有意差が認められなかった。
本発明を説明する目的で幾つかの代表的な実施形態及び詳細を示しているが、本発明の範囲から逸脱することなく様々な変更や修正を行うことができることは、当業者にとって明らかである。

Claims (20)

  1. 二重特異性抗体又は抗原結合断片であって、前記抗体又は抗原結合断片は、ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する可変領域ａを含み、そのうち、前記可変領域ａは、
    （ａ） 配列番号４～８の何れか一項で示されるアミノ酸配列を含むＶＨａ ＣＤＲ１と、
    （ｂ） 配列番号９～１８の何れか一項で示されるアミノ酸配列を含むＶＨａ ＣＤＲ２と、
    （ｃ） 配列番号１９又は２０で示されるアミノ酸配列を含むＶＨａ ＣＤＲ３と、
    （ｄ） 配列番号３６～４０の何れか一項で示されるアミノ酸配列を含むＶＬａ ＣＤＲ１と、
    （ｅ） 配列番号４１～４４の何れか一項で示されるアミノ酸配列を含むＶＬａ ＣＤＲ２と、
    （ｆ） 配列番号４５～４８の何れか一項で示されるアミノ酸配列を含むＶＬａ ＣＤＲ３と、のうちの１種又は複数種のアミノ酸配列を含む、
    ことを特徴とする二重特異性抗体又は抗原結合断片。
  2. 前記可変領域ａは、前記ＶＨａ ＣＤＲ１、ＶＨａ ＣＤＲ２、ＶＨａ ＣＤＲ３、ＶＬａ ＣＤＲ１、ＶＬａ ＣＤＲ２及びＶＬａ ＣＤＲ３を含む、
    ことを特徴とする請求項１に記載の抗体又は抗原結合断片。
  3. 前記ＶＨａ ＣＤＲ１は、配列番号４で示されるアミノ酸配列を含み、前記ＶＨａ ＣＤＲ２は、配列番号９～１４の何れか一項で示されるアミノ酸配列を含み、前記ＶＨａ ＣＤＲ３は、配列番号１９で示されるアミノ酸配列を含み、又は
    前記ＶＨａ ＣＤＲ１は、配列番号４で示されるアミノ酸配列を含み、前記ＶＨａ ＣＤＲ２は、配列番号１４で示されるアミノ酸配列を含み、前記ＶＨａ ＣＤＲ３は、配列番号１９で示されるアミノ酸配列を含み、前記ＶＬａ ＣＤＲ１は、配列番号３６で示されるアミノ酸配列を含み、前記ＶＬａ ＣＤＲ２は、配列番号４１で示されるアミノ酸配列を含み、前記ＶＬａ ＣＤＲ３は、配列番号４５で示されるアミノ酸配列を含む、
    ことを特徴とする請求項１に記載の抗体又は抗原結合断片。
  4. 前記抗体又は抗原結合断片は、ＣＤ４７に特異的に結合する可変領域ｂを更に含み、そのうち、前記可変領域ｂは、
    （ｇ） 配列番号２１～２３の何れか一項で示されるアミノ酸配列を含むＶＨｂ ＣＤＲ１と、
    （ｈ） 配列番号２４～２８の何れか一項で示されるアミノ酸配列を含むＶＨｂ ＣＤＲ２と、
    （ｉ） 配列番号２９～３５の何れか一項で示されるアミノ酸配列を含むＶＨｂ ＣＤＲ３と、
    （ｊ） 配列番号３６～４０の何れか一項で示されるアミノ酸配列を含むＶＬｂ ＣＤＲ１と、
    （ｋ） 配列番号４１～４４の何れか一項で示されるアミノ酸配列を含むＶＬｂ ＣＤＲ２と、
    （ｌ） 配列番号４５～４８の何れか一項で示されるアミノ酸配列を含むＶＬｂ ＣＤＲ３と、のうちの１種又は複数種のアミノ酸配列を含む、
    ことを特徴とする請求項１～３の何れか一項に記載の抗体又は抗原結合断片。
  5. 前記可変領域ｂは、前記ＶＨｂ ＣＤＲ１、ＶＨｂ ＣＤＲ２、ＶＨｂ ＣＤＲ３、ＶＬｂ ＣＤＲ１、ＶＬｂ ＣＤＲ２及びＶＬｂ ＣＤＲ３を含む、
    ことを特徴とする請求項４に記載の抗体又は抗原結合断片。
  6. 前記ＶＨｂ ＣＤＲ１は、配列番号２１で示されるアミノ酸配列を含み、前記ＶＨｂ ＣＤＲ２は、配列番号２４で示されるアミノ酸配列を含み、前記ＶＨｂ ＣＤＲ３は、配列番号２９で示されるアミノ酸配列を含み、前記ＶＬｂ ＣＤＲ１は、配列番号３６で示されるアミノ酸配列を含み、前記ＶＬｂ ＣＤＲ２は、配列番号４１で示されるアミノ酸配列を含み、前記ＶＬｂ ＣＤＲ３は、配列番号４５で示されるアミノ酸配列を含む、
    ことを特徴とする請求項４に記載の抗体又は抗原結合断片。
  7. 前記ＶＬａ ＣＤＲ１と前記ＶＬｂ ＣＤＲ１は、同じアミノ酸配列を含み、前記ＶＬａ ＣＤＲ２と前記ＶＬｂ ＣＤＲ２は、同じアミノ酸配列を含み、且つ／又は前記ＶＬａ ＣＤＲ３と前記ＶＬｂ ＣＤＲ３は、同じアミノ酸配列を含む、
    ことを特徴とする請求項１～６の何れか一項に記載の抗体又は抗原結合断片。
  8. 前記可変領域ａは、重鎖可変領域ＶＨａと軽鎖可変領域ＶＬａを含み、そのうち、
    前記ＶＨａは、配列番号４９～６３の何れか一項で示されるアミノ酸配列、又は配列番号４９～６３の何れか一項で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列を含み、且つ／又は
    前記ＶＬａは、配列番号７５～８０の何れか一項で示されるアミノ酸配列、又は配列番号７５～８０の何れか一項で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列を含む、
    ことを特徴とする請求項１～７の何れか一項に記載の抗体又は抗原結合断片。
  9. 前記ＶＨａは、配列番号５４で示されるアミノ酸配列、又は配列番号５４で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列を含み、且つ／又は
    前記ＶＬａは、配列番号７５で示されるアミノ酸配列、又は配列番号７５で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列を含む、
    ことを特徴とする請求項１～８の何れか一項に記載の抗体又は抗原結合断片。
  10. 前記可変領域ｂは、重鎖可変領域ＶＨｂと軽鎖可変領域ＶＬｂを含み、そのうち、
    前記ＶＨｂは、配列番号６４～７４の何れか一項で示されるアミノ酸配列、又は配列番号６４～７４の何れか一項で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列を含み、且つ／又は
    前記ＶＬｂは、配列番号７５～８０の何れか一項で示されるアミノ酸配列、又は配列番号７５～８０の何れか一項で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列を含む、
    ことを特徴とする請求項１～９の何れか一項に記載の抗体又は抗原結合断片。
  11. 前記ＶＨｂは、配列番号６４で示されるアミノ酸配列、又は配列番号６４で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列を含み、且つ／又は
    前記ＶＬｂは、配列番号７５で示されるアミノ酸配列、又は配列番号７５で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列を含む、
    ことを特徴とする請求項１～９の何れか一項に記載の抗体又は抗原結合断片。
  12. 前記ＶＬａと前記ＶＬｂは、同じアミノ酸配列を含む、
    ことを特徴とする請求項１～１１の何れか一項に記載の抗体又は抗原結合断片。
  13. 前記抗体又は抗原結合断片は、重鎖定常領域ａと重鎖定常領域ｂを更に含み、前記重鎖定常領域ａと前記重鎖定常領域ｂは、重鎖可変領域ａと重鎖可変領域ｂにそれぞれ連結され、前記重鎖定常領域ａ及び／又は前記重鎖定常領域ｂは、アミノ酸位置がＥｕ番号付けられている
    Ｙ３４９Ｃ、Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖの１種又は複数種のアミノ酸変異を含み、
    任意にＮ２９７Ａというアミノ酸変異を更に含む、
    ことを特徴とする請求項１～１２の何れか一項に記載の抗体又は抗原結合断片。
  14. 前記重鎖定常領域ａと重鎖定常領域ｂのうちの１つは、
    Ｎ２９７Ａ、Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗのうちの１種又は複数種のアミノ酸変異を含み、且つ／又は
    別の重鎖定常領域は、
    Ｎ２９７Ａ、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖのうちの１種又は複数種のアミノ酸変異を含む、
    ことを特徴とする請求項１３に記載の抗体又は抗原結合断片。
  15. 前記１つの重鎖定常領域は、配列番号８１、８３又は８５で示されるアミノ酸配列、又は配列番号８１、８３又は８５で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列を含み、且つ／又は別の重鎖定常領域は、配列番号８１、８４又は８６で示されるアミノ酸配列、又は配列番号８１、８４又は８６で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列を含む、
    ことを特徴とする請求項１３に記載の抗体又は抗原結合断片。
  16. 二重特異性抗体又は抗原結合断片であって、前記抗体又は抗原結合断片は、１つの重鎖ａ、１つの重鎖ｂ及び２つの同じ軽鎖を含み、前記重鎖ａと１つの前記軽鎖は、ペアリングしてＰＤ－Ｌ１抗原結合部位を形成し、前記重鎖ｂと別の前記軽鎖は、ペアリングしてＣＤ４７抗原結合部位を形成する、
    ことを特徴とする二重特異性抗体又は抗原結合断片。
  17. 前記重鎖ａは、配列番号９２又は９４で示されるアミノ酸配列、又は配列番号９２又は９４で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列を含み、前記重鎖ｂは、配列番号９３又は９５で示されるアミノ酸配列、又は配列番号９３又は９５で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列を含み、前記軽鎖は、配列番号９６で示されるアミノ酸配列、又は配列番号９６で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列を含む、
    ことを特徴とする請求項１６に記載の抗体又は抗原結合断片。
  18. 請求項１～１５の何れか一項に記載の抗体又は抗原結合断片をコードすることを特徴とするポリヌクレオチド、又は
    請求項１～１７の何れか一項に記載の抗体又は抗原結合断片をコードするポリヌクレオチドを含むことを特徴とする発現ベクター、又は
    請求項１～１７の何れか一項に記載の抗体又は抗原結合断片をコードするポリヌクレオチドを含むことを特徴とする細胞。
  19. 請求項１～１７の何れか一項に記載の抗体又は抗原結合断片、請求項１８に記載のポリヌクレオチド、発現ベクター又は細胞、及び薬学的に許容されるベクターを含む、
    ことを特徴とする組成物。
  20. 請求項１～１７の何れか一項に記載の抗体又は抗原結合断片、請求項１８に記載のポリヌクレオチド、発現ベクター又は細胞、或いは請求項１９に記載の組成物の、疾患を治療する薬剤の調製における
    応用。
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