CN111344305B - 抗pd-l1的抗体及其用途 - Google Patents

抗pd-l1的抗体及其用途 Download PDF

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Abstract

涉及一种抗PD‑L1的抗体及其用途。具体而言，涉及一种抗PD‑L1的抗体及其抗原结合片段以及其用于诊断和治疗癌症及预测预后的用途。

Description

抗PD-L1的抗体及其用途
技术领域
本发明涉及一种抗PD-L1的抗体及其用途。具体而言，本发明涉及一种抗PD-L1的抗体及其抗原结合片段以及其用于诊断和治疗炎性疾病、自身免疫性疾病和癌症及预测预后的用途。
背景技术
免疫***必须在有效应答以清除致病体与保持耐受以防止自身免疫疾病之间实现平衡。T细胞对于保持这种平衡是关键的，它们的适当的调节主要是通过B7-CD28家族的分子协调进行。B7家族成员(其行使配体的功能)和CD28家族成员(其行使受体的功能)之间的相互作用不仅提供了关键的正信号，可发起、提高和维持T细胞应答，而且在适当时还提供促进限制、终止和/或消弱T细胞应答的关键负信号。CD28家族的一个成员，称为PD-1(也称为程序化细胞死亡-1)在活化的T细胞、B细胞和单核细胞上被增量调节；B7家族中的配体，PD-L1(也称为B7H1或程序化细胞死亡-1配体1)与T细胞上的受体PD-1相互作用，在免疫应答的负性调控方面发挥着重要作用。
PD-L1(B7-H1)是40kDa的细胞表面糖蛋白，属于B7家族，具有IgV和IgC样区、跨膜区及胞浆区尾部。该基因于1999年首次被发现并克隆(Doμg H et al.，Nat Med 5：1365-1369，1999)，它与T细胞上的受体PD-1相互作用，在免疫应答的负性调控方面发挥着重要作用。PD-L1除了在免疫细胞上表达外，在人类正常的组织中表达量较低，但是在一些肿瘤细胞系上却有着较高的表达，例如，肺癌、卵巢癌、结肠癌和黑色素瘤(Iwai et al.，PNAS 99：12293-7，2002；和Ohigashi et al.，Clin Cancer Res 11：2947-53，2005)。
已有的结果显示，肿瘤细胞中高表达的PD-L1是通过增加T细胞的凋亡从而在肿瘤的免疫逃逸中起着重要的作用。例如，在卵巢癌、肾脏癌、结肠直肠癌、胰脏癌、肝癌和黑色素瘤的大量样品中，在不考虑后续治疗的情况下，PD-L1的表达与不良预后和总存活期短有关。敲除PD-1基因的小鼠，因PD-L1/PD-1通路被阻断，则接种肿瘤细胞后不能形成肿瘤(Doμg H et al.，Nat Med 8：793-800，2002)。
考虑到PD-L1在癌症发展和免疫***调节中的重要作用，持续需要检测PD-L1的存在情况以及阻断PD-L1/PD-1通路的有效抗体。
发明内容
本发明涉及一种抗PD-L1的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体的轻链区包含：
1)序列KSSQX1VLYSSNNKNYLX2W(SEQ ID NO：14)所示的LCDR1序列，其中X1为S或N，并且X2为A或P；
2)序列WASTRES(SEQ ID NO：15)所示的LCDR2序列；和
3)序列QQYYSTPLT(SEQ ID NO：16)所示的LCDR3序列；并且
其中所述抗体的重链区包含：
1)序列GFTFSSY(SEQ ID NO：17)所示的HCDR1序列；
2)序列SX3DGSNK(SEQ ID NO：18)所示的HCDR2序列，其中X3为F或Y；和
3)序列DRIYLDY(SEQ ID NO：19)所示的HCDR3序列。
在本发明的一个方面中，所述抗体为抗PD-L1的抗体。
在本发明的一个方面中，所述抗体的轻链区的序列为SEQ ID NO：1，并且所述抗体的重链区的序列为SEQ ID NO：2。
在本发明的一个方面中，所述抗体的轻链区的序列为SEQ ID NO：3，并且所述抗体的重链区的序列为SEQ ID NO：4。
在本发明的一个方面中，所述抗体的轻链区的序列为SEQ ID NO：5，并且所述抗体的重链区的序列为SEQ ID NO：6。
在本发明的一个方面中，所述抗体的轻链区的序列为SEQ ID NO：7，并且所述抗体的重链区的序列为SEQ ID NO：8。
在本发明的一个方面中，所述抗体的轻链区的序列为SEQ ID NO：9，并且所述抗体的重链区的序列为SEQ ID NO：10。
在本发明的一个方面中，所述抗体的轻链区的序列为SEQ ID NO：11，并且所述抗体的重链区的序列为SEQ ID NO：12。
在本发明的一个方面中，所述抗体的轻链区的序列包含一个或多个选自以下的突变：第1位氨基酸从E至D的突变、第2位氨基酸从L至I的突变、第4位氨基酸从L至M的突变和第105位氨基酸从D至E的突变，并且
所述抗体的重链区序列包含一个或多个选自以下的突变：第1位氨基酸从E至Q的突变、第6位氨基酸从Q至E的突变和第16位氨基酸从K至R的突变。
在本发明的一个方面中，所述抗体的轻链区的序列为SEQ ID NO：20，并且所述抗体的重链区的序列为SEQ ID NO：21。
在本发明的一个方面中，所述抗体的轻链区的序列为SEQ ID NO：22，并且所述抗体的重链区的序列为SEQ ID NO：23。
在本发明的一个方面中，所述抗体的轻链区的序列为SEQ ID NO：24，并且所述抗体的重链区的序列为SEQ ID NO：25。
在本发明的一个方面中，所述抗体的轻链区的序列为SEQ ID NO：26，并且所述抗体的重链区的序列为SEQ ID NO：27。
在本发明的一个方面中，所述抗体的轻链区的序列为SEQ ID NO：28，并且所述抗体的重链区的序列为SEQ ID NO：29。
在本发明的一个方面中，所述抗体的轻链区的序列为SEQ ID NO：30，并且所述抗体的重链区的序列为SEQ ID NO：31。
在本发明的一个方面中，所述抗体的轻链区的序列为SEQ ID NO：32，并且所述抗体的重链区的序列为SEQ ID NO：33。
在本发明的一个方面中，所述抗原结合片段为Fab、Fab′、F(ab′)2、scFv或dsFv片段。
在本发明的一个方面中，本发明涉及使用本发明的抗体或其抗原结合片段治疗癌症的方法，包括将本发明的抗体或其抗原结合片段给予有需要的受试者。优选地，所述癌症选自肺癌、结肠癌、卵巢癌、肾脏癌、结肠直肠癌、胰脏癌、肝癌、黑色素瘤、乳腺癌、骨髓瘤、神经胶质瘤、白血病和淋巴瘤。
在本发明的一个方面中，本发明涉及本发明的抗体或其抗原结合片段用于制备治疗癌症的药剂的用途，优选地，所述癌症选自肺癌、结肠癌、卵巢癌、肾脏癌、结肠直肠癌、胰脏癌、肝癌、黑色素瘤、乳腺癌、骨髓瘤、神经胶质瘤、白血病和淋巴瘤。
在本发明的一个方面中，本发明涉及使用本发明的抗体或其抗原结合片段诊断癌症的方法，包括将本发明的抗体或其抗原结合片段与来自受试者样品接触，并且确定所述抗体与PD-L1的结合情况，由此确定受试者样品的PD-L1表达水平，从而诊断受试者中的癌症。优选地，所述癌症选自肺癌、结肠癌、卵巢癌、肾脏癌、结肠直肠癌、胰脏癌、肝癌、黑色素瘤、乳腺癌、骨髓瘤、神经胶质瘤、白血病和淋巴瘤。
在本发明的一个方面中，本发明涉及本发明的抗体或其抗原结合片段用于制备诊断癌症的试剂的用途，优选地，所述癌症选自肺癌、结肠癌、卵巢癌、肾脏癌、结肠直肠癌、胰脏癌、肝癌、黑色素瘤、乳腺癌、骨髓瘤、神经胶质瘤、白血病和淋巴瘤。
在本发明的一个方面中，本发明涉及使用本发明的抗体或其抗原结合片段用于制备确定癌症患者预后或总存活期的方法，包括将本发明的抗体或其抗原结合片段与来自受试者样品接触，并且确定所述抗体与PD-L1的结合情况，由此诊断受试者样品的PD-L1表达水平，从而确定癌症患者预后或总存活期。优选地，所述癌症选自肺癌、结肠癌、卵巢癌、肾脏癌、结肠直肠癌、胰脏癌、肝癌、黑色素瘤、乳腺癌、骨髓瘤、神经胶质瘤、白血病和淋巴瘤。结果表明，相对于不具有PD-L1表达的存在的患者，在使用药物进行治疗(例如本发明的抗癌疗法的治疗)时，具有PD-L1表达的存在的患者具有更好的预后或更长的总存活期。
在本发明的一个方面中，本发明涉及本发明的抗体或其抗原结合片段用于制备确定癌症患者预后或总存活期的试剂的用途，优选地，所述癌症选自肺癌、结肠癌、卵巢癌、肾脏癌、结肠直肠癌、胰脏癌、肝癌、黑色素瘤、乳腺癌、骨髓瘤、神经胶质瘤、白血病和淋巴瘤。
本发明的抗体或其抗原结合片段可以有效地结合PD-L1并阻断PD-L1/PD-1通路，从而有效地诊断和治疗癌症，其效果明显优于本领域中已知的常用抗PD-L1的特异性抗体。
在本发明的一个方面中，本发明涉及使用本发明的抗体或其抗原结合片段治疗炎性疾病或自身免疫性疾病的方法，包括将本发明的抗体或其抗原结合片段给予有需要的受试者。优选地，所述炎性疾病或自身免疫性疾病选自病毒感染、类风湿性关节炎、骨关节炎、银屑病、红斑狼疮、克罗恩病、多发性硬化症和炎症性肠病。
在本发明的一个方面中，本发明涉及本发明的抗体或其抗原结合片段用于制备治疗炎性疾病或自身免疫性疾病的药剂的用途，优选地，所述炎性疾病或自身免疫性疾病选自病毒感染、类风湿性关节炎、骨关节炎、银屑病、红斑狼疮、克罗恩病、多发性硬化症和炎症性肠病。
在本发明的一个方面中，本发明涉及使用本发明的抗体或其抗原结合片段诊断炎性疾病或自身免疫性疾病的方法，包括将本发明的抗体或其抗原结合片段与来自受试者样品接触，并且确定所述抗体与PD-L1的结合情况，由此确定受试者样品的PD-L1表达水平，从而诊断炎性疾病或自身免疫性疾病。优选地，所述炎性疾病或自身免疫性疾病选自病毒感染、类风湿性关节炎、骨关节炎、银屑病、红斑狼疮、克罗恩病、多发性硬化症和炎症性肠病。
在本发明的一个方面中，本发明涉及本发明的抗体或其抗原结合片段用于制备诊断炎性疾病或自身免疫性疾病的试剂的用途，优选地，所述炎性疾病或自身免疫性疾病选自病毒感染、类风湿性关节炎、骨关节炎、银屑病、红斑狼疮、克罗恩病、多发性硬化症和炎症性肠病。
本发明的抗体或其抗原结合片段可以有效地检测PD-L1的存在情况以及阻断PD-L1/PD-1通路，其效果优于现有技术中已知的抗PD-L1抗体，例如市售的阿特珠单抗。
附图说明
图1示出了6只转基因小鼠中抗PD-L1的抗体的血清滴度。
图2示出了单克隆原核表达ScFv阻断PD-1与PD-L1的结合的活性。
图3示出了利用ELISA测定检测候选抗体与PD-L1之间的结合的灵敏度。
图4A示出了利用BiAcore检测候选抗体PLH03-BT613-hIgG1的结合动力学的结果。
图4B示出了利用BiAcore检测候选抗体PLH06-CA782-hIgG1的结合动力学的结果。
图4C示出了利用BiAcore检测候选抗体PLH06-CA783-hIgG1的结合动力学的结果。
图4D示出了利用BiAcore检测候选抗体PLH01-CA785-hIgG1的结合动力学的结果。
图4E示出了利用BiAcore检测候选抗体PLH01-CA786-hIgG1的结合动力学的结果。
图4F示出了利用BiAcore检测候选抗体PLH01-CA787-hIgG1的结合动力学的结果。
图5示出了不同候选抗体阻断PD-L1与PD-1之间的结合的结果。
图6示出了抗体BT613和抗体PL-GEN-IgG1对PD-L1的结合亲和力的比较结果。
图7示出了抗体BT613和抗体PL-GEN-IgG1阻断PD-L1与PD-1之间的结合的活性的比较结果。
图8示出了抗体BT613和抗体PL-GEN-IgG1阻断PD-L1与B7-1之间的结合的活性的比较结果。
图9示出了抗体BT613和抗体PL-GEN-IgG1对小鼠PD-L1的结合亲和力的比较结果。
图10示出了抗体BT613和抗体PL-GEN-IgG1对PD-L1相关蛋白的结合亲和力的比较结果。
图11示出了在GS-C2/PD-L1/GS-J2/PD-1细胞系中，抗体BT613和抗体PL-GEN-IgG1(Atezolizumab)阻断PD-L1与PD-1之间的结合的活性的比较结果。
图12示出了MLR体外检测抗体BT613和抗体PL-GEN-IgG1(Atezolizumab)对IL-2产生的作用。
图13示出了C57BL/6小鼠静脉注射10.0mg/kg抗体BT613和抗体阿特珠单抗(Atezolizumab)后的药时曲线。
图14A示出了3.0mg/kg抗体BT613和阿特珠单抗对肿瘤体积增长的抑制作用。
图14B示出了小鼠肿瘤的照片，其中TS1503-A为抗体BT613，且TS1503-D为阿特珠单抗。
图15示出了溶剂、抗体BT613和阿特珠单抗组中的肿瘤重量。
图16示出了溶剂、抗体BT613和阿特珠单抗组中的小鼠体重。
图17A示出了利用BiAcore检测BT613突变体BT613(HM\LM)的结合动力学的结果。
图17B示出了利用BiAcore检测BT613突变体BT613(H/LM)的结合动力学的结果。
图17C示出了利用BiAcore检测BT613突变体BT613(HM/L)的结合动力学的结果。
图17D示出了利用BiAcore检测BT613突变体BT613(HM/LM-1)的结合动力学的结果。
图17E示出了利用BiAcore检测BT613突变体BT613(HM/LM-2)的结合动力学的结果。
图17F示出了利用BiAcore检测BT613突变体BT613(HM/LM-3)的结合动力学的结果。
图17G示出了利用BiAcore检测BT613突变体BT613(HM/LM-4)的结合动力学的结果。
图18A示出了3.0mg/kg抗体BT613和阿特珠单抗对肿瘤体积增长的抑制作用。
图18B示出了小鼠肿瘤的照片，其中TS1503-1为BT613，且TS1503-4为阿特珠单抗。
图19示出了溶剂、抗体BT613和阿特珠单抗组中的肿瘤重量。
图20示出了溶剂、抗体BT613和阿特珠单抗组中的小鼠体重。
具体实施方式
参照以下实施例可以更好地理解本发明。但是，应理解，以下实施例仅用于举例说明目的，而不应被理解为以任何方式限制本发明的保护范围。
实施例1.抗PD-L1的单链抗体的产生
1.1小鼠免疫
用PD-L1蛋白PD-L1-His(Sinobiological，目录号10084-H08H)与佐剂一起免疫绿叶制药的全人抗体转基因小鼠LuyeMab(转基因小鼠制备方法记载于中国专利CN201210281415中)，首免的佐剂为完全弗氏佐剂，二免和三免的佐剂为非完全弗氏佐剂(incomplete freund’s adjuvant，Sigma)。共免疫17只小鼠，3次免疫后选取抗体血清滴度较高的6只小鼠用不含佐剂的抗原进行加强免疫(参见图1)，4天后杀死小鼠并取出脾脏，并冷冻保存备用。
1.2噬菌体库的建立
通过Trizol(Thermo Scientific，目录货号15596-026)从冻存的小鼠脾脏中按照常规的方案进行RNA提取，使用罗氏反转录试剂盒Transcriptor First Strand cDNASynthesis Kit(Roche Applied Science，目录货号4897030001)按照其说明书将RNA反转录成cDNA。噬菌体库的建立步骤参照Tim Clackson编辑的《Phage display》中记载的方法进行，首先用PCR的方法从cDNA中获得重链和轻链的可变区，再将重链和轻链的可变区通过重叠延伸PCR的方法获得ScFv，对ScFv进行SfiI酶切50℃(持续5h)，将酶切后的ScFv(单链Fv)与质粒pCOMB3x连接，然后将连接产物电转染至大肠杆菌XL1-Blue感受态细胞中。以编号为LYQ013的小鼠建立的噬菌体库PD-L1-H3-1，库容4.2＊108；以编号为LYQ024的小鼠建立的噬菌体库PD-L1-H6-1，库容4.0＊108。
1.3克隆筛选
平板筛选：用PD-L1-His蛋白以0.2μg/孔包被平板(高吸附微孔板，Costar)，4℃下放置过夜，第二天通过3％脱脂奶粉封闭平板1h，加入噬菌体库PD-L1-H3-1/PD-L1-H6-1(集落形成单位：2＊1012)并孵育2h，用PBST(0.01M，DH 7.4，0.05％tween-20)洗涤4-10次后用洗脱缓冲液(pH 2.2，0.1M HCl-Gly)洗脱PD-L1特异性结合的噬菌体。
磁珠筛选：将PD-L1-Fc蛋白按照Thermo的生物素标记说明书步骤进行生物素化(投入的PD-L1蛋白与生物素的摩尔比1∶2)，再与Thermo的磁珠(Invitrogen Dynabeads M-280 Streptavidin，00355871)结合，然后与噬菌体库PD-L1-H3-1/PD-L1-H6-1(集落形成单位：2＊1012)孵育，从而获得PD-L1特异性结合的克隆。
平板筛选获得克隆PLH6-CA782\CA783\CA785\CA786\CA787，磁珠筛选获得克隆PLH3-BT613，其中PLH3代表小鼠LYO013建立的库PD-L1-H3-1，PLH6代表小鼠LYO024建立的库PD-L1-H6-1。
1.4单克隆原核表达ScFv阻断PD-1与PD-L1的结合
将通过噬菌体酶联免疫(ELISA)法检测为阳性的库涂布2YT(Amp 100μg/ml)平板，挑取单克隆直接并用商业可获得的ZYM培养基进行诱导表达，表达后的纯化产物用于检测阻断活性，结果如图2中所示。
实施例2.抗PD-L1的抗体的分子构建与生产
将克隆PLH3-BT613、PLH6-CA782\CA783\CA785\CA786\CA787送至Invitrogen生物技术有限公司测序。每个克隆的氨基酸序列记载于下表1中。
表1.具有阻断活性的克隆的氨基酸序列
Figure GPA0000285170710000111
Figure GPA0000285170710000121
将抗体基因与Fc序列(N297A)SEQ NO ID：13融合后，抗体基因通过5’的Xba I(NEB目录货号#R0145S)与3’的EcoRV(NEB目录货号#R3195S)酶切，纯化后的抗体基因通过T4DNA连接酶(NEB目录货号#M0202S)连接入载体pCDNA3.4(Life Technology)，然后转染进入HEK293细胞中，在37℃\8％CO2\125rpm的摇床中DMEM培养基培养，6天后，取瞬时表达上清通过Protein A(GE Healthcare)按照常规亲和层析流程纯化，获得抗PD-L1的抗体，并通过UV280结合消光系数确定抗体浓度。
SEQ ID NO：13
Figure GPA0000285170710000122
对照抗体的生产：通过IMGT数据及专利US 8217149B2确定罗氏PD-L1抗体阿特珠单抗的氨基酸序列，全基因合成并测序后***载体pCDNA3.4通过HEK293细胞表达，生产的抗体命名为PL-GEN-IgG1。
实施例3.候选抗体的表征
3.1 ELISA检测候选抗体与PD-L1蛋白的结合
将96孔ELISA板(BEVER，40301)用不同浓度(0.4μg/ml、0.2μg/ml、0.1μg/ml、0.05μg/ml、0.025μg/ml、0.0125μg/ml、0.00625μg/ml、0μg/ml)的抗原PD-L1-His以100μl/孔包被，4℃下孵育过夜；用3％脱脂奶粉37℃封闭1h；每孔加入2μg/ml候选抗体各100μl，37℃下孵育1h；然后加入山羊抗人IgG/HRP(中杉金桥)，37℃孵育1h，显色10min后，酶标仪上读取OD450。结果见图3，6株抗体具有相似的对PD-L1蛋白的结合灵敏度。
3.2 SPR检测候选抗体与PD-L1蛋白的结合
抗体结合动力学使用基于表面等离子共振(surface plasmon resonance，SRP)技术的BIAcoreX100仪器测量。通过GE anti Human IgG FC氨基偶联试剂盒(GE，cat#BR-1008-39)，将抗人IgG抗体氨基偶联到CM5生物传感器芯片(GE，BR-1000-12)上以获得大约1000应答单位(response units，RU)。对于动力学测量，将抗体用HBS-EP+1×(GE，cat#BR-1006-69)缓冲液2倍连续稀释，从50mM起始，2倍稀释4个浓度梯度，并设置0浓度。测定条件如下：抗体：1μg/ml，进样时间60s，流速5μl/min，稳定5s；PD-L1蛋白(50mM，25mM，12.5mM，6.25mM，3.125mM，0mM)：结合60s，流速30μl/min，解离300s；再生：用3M MgCl2缓冲液再生30s，启动2次。使用简单一对一Languir结合模型(BIAcore Evaluation Software version3.2)计算结合常数(ka)和解离常数(kd)，平衡解离常数(kD)以比率kd/ka计算。
表2 BiAcore检测候选抗体结合动力学
Figure GPA0000285170710000131
Figure GPA0000285170710000141
3.3候选抗体阻断PD-L1蛋白与PD-1蛋白的结合
将ELISA板用浓度为0.25μg/ml的PD-1-Fc以100μl/孔包被，在4℃下孵育过夜；用3％脱脂奶粉封闭1h；同时将PD-L1-Fc-生物素(0.5μg/ml)(制备步骤同1.3)和不同浓度(4μg/mL、2μg/mL、1μg/mL、0.5μg/mL、0.25μg/mL、0.125μg/mL、0.0625μg/mL、0μg/mL)候选抗体在37℃共孵育1h，然后加入到封闭过的ELISA板上，在37℃再孵育1h；继而加入链霉素/HRP，在37℃下孵育1h；显色10min后，在酶标仪上读取OD450。结果见图5，6株抗体都能够有效阻断PD-1与PD-L1的结合，且具有相似的阻断活性。
实施例4 BT613与罗氏PD-L1抗体的比较
4.1 PL-BT613-IgG1(以下或简称为BT613)与罗氏PD-L1抗体的比较实验。首先在高表达PD-L1的细胞系上进行结合亲和力比较，将GS-C2/PD-L1细胞(购自南京金斯瑞)用FACS缓冲液(PBS，含0.2％BSA)调节细胞数至5E5个，100μl/w，加入100μgBT613(样品A)或PL-GEN-IgG1(样品D)抗体，混匀后在4℃下静置1h。用FACS缓冲液洗涤细胞2次后，用100μlFACS缓冲液重悬细胞，加入1μg羊抗人IgG荧光二抗(Life，A21445)混匀后在4℃下静置1h。FACS缓冲液洗涤细胞2次，用100μl FACS缓冲液重悬后进行流式检测(BD AccuriTM C6)。BT613抗体显示在GS-C2/PD-L1细胞上与罗氏PD-L1抗体有相似的结合亲和力(参见图6)。
4.2 BT613与PL-GEN-IgG1在阻断PD-1与PD-L1结合的活性上的比较，ELISA的操作步骤与3.3中相同，结果见图7，可见BT613相对于罗氏的PL-GEN-IgG1在阻断PD-L1与PD-1的结合上具有更好的活性。
4.3 BT613与PL-GEN-IgG1在阻断B7-1与PD-L1的结合的活性上的比较
将96孔酶标板用B7-1-Fc(购自义翘神州)(浓度为0.5μg/ml)以100μl/孔包被，4度下包被过夜，第二天用3％脱脂奶粉封闭1h；同时将PD-L1-Fc-生物(0.8μg/ml)与梯度稀释的PLH03-BT613-hIgG1或PL-GEN-IgG1(8μg/ml、4μg/ml、2μg/ml、1μg/ml、0.5μg/ml、0.25μg/ml、0.125μg/ml、0μg/ml)在37℃下共孵育1h，然后加入到已经包被B7-1的酶标板上，在37℃下再孵育1h；再加入链霉素/HRP，37℃下孵育1h，显色10min后，酶标仪上读取OD450。结果见图8，BT613和罗氏的PL-GEN-IgG1在阻断PD-L1与B7-1的结合上具有相似的活性。
4.4 BT613与PL-GEN-IgG1与不同种属的PD-L1的结合：通过ELISA法检测的结果表明BT613和PL-GEN-IgG1与人和食蟹猴PD-L1都表现出相似的结合(结果未列出)，而在小鼠PD-L1蛋白上具有不一样的结合表现(参见图9)。
4.5 BT613与PL-GEN-IgG1与PD-L1相关蛋白的结合：通过ELISA法检测的结果表明BT613和PL-GEN-IgG1与人PD-L1\PDL2\PDL3蛋白的结合的差异，结果见图10，显示两者都特异性与人PD-L1结合。
4.6 BT613与罗氏PD-L1抗体在体外细胞功能上的比较
4.6.1基于功能细胞系的活性检测：GS-C2/PD-L1细胞/GS-J2/PD-1细胞(购自南京金斯瑞)为金斯瑞公司建立的功能细胞系。在这两种细胞中，PD-1\PD-L1的结合会抑制细胞内荧光素酶的表达，当加入PD-L1/PD-1抗体阻断这种结合时，会增强荧光素酶的表达，抗体加入的浓度与荧光素酶的表达正相关。结果见图11，BT613抗体和阿特珠单抗(从国外按照正规流程购买)都可以在细胞水平阻断PD-1与PD-L1的结合，并增强萤光素酶的表达，两者具有相似的IC50值。
4.6.2混合淋巴反应(MLR)检测抗体的细胞活性
从健康人中分离外周血单核细胞，通过树突状细胞(DC)分化培养液促进DC细胞的分化和成熟，然后与从另一健康人血液中纯化的CD4+T细胞按照DC细胞：CD4+T细胞＝1：10的比例混合。同时，RPMI 1640完全培养基梯度稀释抗PD-L1抗体(8μg/mL，0.8μg/mL，0.08μg/mL，0.008μg/mL，0.0008μg/mL)。将上述混合好的细胞与稀释的抗体一起加入到96孔细胞培养板中，放于37℃和5％CO2的细胞培养箱中培养5天后，收集100μl细胞上清液，测定IL2的浓度。具体结果参见图12，在混合淋巴反应(MLR)测定中，BT613具有优于阿特珠单抗的功能活性，尤其在200μg/mL和2μg/mL下，BT613更好的刺激CD4+T细胞产生IL2。
实施例5 BT613与阿特珠单抗在小鼠中的药代动力学的研究
每个抗体选4只C57BL/6小鼠静脉给药，剂量为10.0mg/kg，给药前0h、给药后0.5h、1h、8h及1d、2d、4d、7d、10d、12d、14d、17d、21d、28d时采血清检测抗体浓度，具体结果参见图13及表3，给药后BT613在小鼠血清中更加持久。
表3 BT613/阿特珠单抗(10.0mg/kg)在小鼠中的药代研究
Figure GPA0000285170710000161
实施例6 BT613/阿特珠单抗在B-hPD-1人源化小鼠MC38-hPD-L1结肠癌皮下移植瘤模型中的药效学研究
利用购自北京百奥赛图公司的具有人源PD-1的B-hPD-1小鼠与具有人源PD-L1的MC38-hPD-L1结肠癌细胞建立结肠癌肿瘤模型进行PD-L1抗体的功能研究。
MC38-hPD-L1结肠癌进行皮下建模，将MC38-hPD-L1结肠癌细胞5×105个/0.1mL接种于雌性B-hPD-1人源化小鼠右侧前胁肋部皮下，待肿瘤生长到约150mm3时按肿瘤体积随机分组，每组6只，共3组，分别为：溶剂对照组、PLH03-BT613-IgG1(3mg/kg，Q2Dx8)组，以及阿特珠单抗(3mg/kg，Q2Dx8)组。给药途径为腹腔注射，分组给药后第21天结束实验。每周测量肿瘤体积及体重2次，记录小鼠体重和肿瘤体积。抗体对小鼠肿瘤体积增长的抑制结果参见图14A和14B，BT613在3mg/kg的剂量上具有比阿特珠单抗更好的抑制效果。小鼠体重的结果参见图16，结果表明施用BT613后小鼠体重略有增长，结合肿瘤增长抑制的结果分析，增长体积大致相当于肿瘤体积，说明BT613安全性较好。
分组后第21天实验结束时，将动物安乐死，移除肿瘤称重，计算相对瘤重抑制率(IRTW)。从肿瘤重量上看，在3mg/kg剂量下，BT613具有比阿特珠单抗更强的肿瘤抑制活性，具体结果参见图15。
CA782、CA783、CA785、CA786和CA787也得到了与BT613相类似的上述实验的结果。
实施例7 BT613/阿特珠单抗在B-hPD-1人源化小鼠MC38-hPD-L1皮下移植瘤模型中的药效学研究
利用购自北京百奥赛图公司的具有人源PD-1的B-hPD-1小鼠与具有人源PD-L1的MC38-hPD-L1结肠癌细胞建立结肠癌肿瘤模型进行PD-L1抗体的功能研究。
MC38-hPD-L1结肠癌进行皮下建模，将MC38-hPD-L1结肠癌细胞5×105个/0.1mL接种于雌性B-hPD-1人源化小鼠右侧前胁肋部皮下，待肿瘤生长到约111mm3时按肿瘤体积随机分组，每组6只，共3组，分别为：溶剂对照组、PLH03-BT613-IgG1(3mg/kg，Q2Dx8)组，以及阿特珠单抗(3mg/kg，Q2Dx8)组。给药途径为腹腔注射，每两天给药1次，共给药8次，分组给药后第17天结束实验。每周测量肿瘤体积及体重2次，记录小鼠体重和肿瘤体积。抗体对小鼠肿瘤体积增长的抑制结果参见图18A和18B，BT613在3mg/kg的剂量上具有比阿特珠单抗更好的抑制效果。小鼠体重的结果参见图20，结果表明施用BT613后小鼠体重略有增长，结合肿瘤增长抑制的结果分析，增长体积大致相当于肿瘤体积，说明BT613安全性较好。
分组后第17天实验结束时，将动物安乐死，移除肿瘤称重，计算相对瘤重抑制率(IRTW)。从肿瘤重量上看，在3mg/kg剂量下，BT613具有比阿特珠单抗更强的肿瘤抑制活性，具体结果参见图19。
CA782、CA783、CA785、CA786和CA787也得到了与BT613相类似的上述实验的结果。
实施例8 BT613序列继续向胚系基因优化
对抗体BT613序列两端的非胚系氨基酸继续进行优化，使之更接近种系(germline)，从而降低免疫原性风险。下表4列出了具体的氨基酸突变位置，氨基酸编号按照Kabat规则进行编号，BT613不同突变体的亲和力检测值见表4，具体结合动力学曲线见图17A至17G，BT613不同突变体的氨基酸序列见表5。
表4 BT613不同突变体氨基酸变化及相应亲和力
Figure GPA0000285170710000181
表5 BT613不同变体氨基酸序列
Figure GPA0000285170710000182
Figure GPA0000285170710000191
序列表
<110> 山东博安生物技术有限公司
<120> 抗PD-L1抗体及其用途
<130> FP1170597P
<141> 2017-10-30
<160> 33
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 113
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
Glu Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser
20 25 30
Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Ser Thr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Asp Ile
100 105 110
Lys
<210> 2
<211> 116
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Lys
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ser Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Leu Ile Ser Phe Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Thr Ser Leu Arg Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Arg Ile Tyr Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 3
<211> 113
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 3
Glu Leu Gln Leu Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser
20 25 30
Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Ser Thr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 4
<211> 116
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 4
Gln Ile Thr Leu Lys Glu Ser Gly Gly Gly Val Leu Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Leu Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Thr Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Arg Ile Tyr Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Leu
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 5
<211> 113
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 5
Glu Leu Arg Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser
20 25 30
Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Ser Thr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 6
<211> 116
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 6
Gln Ile Thr Leu Lys Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Leu Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Arg Ile Tyr Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 7
<211> 113
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 7
Glu Leu Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Asn Val Leu Tyr Ser
20 25 30
Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Ser Thr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 8
<211> 116
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 8
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Lys
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ser Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Leu Ile Ser Phe Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Thr Ser Leu Arg Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Arg Ile Tyr Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 9
<211> 113
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 9
Glu Leu Gln Leu Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser
20 25 30
Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Ser Thr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 10
<211> 116
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 10
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Lys
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ser Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Leu Ile Ser Phe Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Thr Ser Leu Arg Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Arg Ile Tyr Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 11
<211> 113
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 11
Glu Leu Gln Leu Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser
20 25 30
Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Ser Thr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 12
<211> 116
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 12
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Lys
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ser Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Leu Ile Ser Phe Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Thr Ser Leu Arg Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Arg Ile Tyr Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 13
<211> 330
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 13
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Met Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Met Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 14
<211> 18
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 14
Lys Ser Ser Gln Xaa Val Leu Tyr Ser Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu
1 5 10 15
Xaa Trp
<210> 15
<211> 7
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 15
Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser
1 5
<210> 16
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 16
Gln Gln Tyr Tyr Ser Thr Pro Leu Thr
1 5
<210> 17
<211> 7
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 17
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
1 5
<210> 18
<211> 7
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 18
Ser Xaa Asp Gly Ser Asn Lys
1 5
<210> 19
<211> 7
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 19
Asp Arg Ile Tyr Leu Asp Tyr
1 5
<210> 20
<211> 113
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 20
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser
20 25 30
Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Ser Thr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 21
<211> 116
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 21
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ser Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Leu Ile Ser Phe Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Thr Ser Leu Arg Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Arg Ile Tyr Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 22
<211> 113
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 22
Glu Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser
20 25 30
Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Ser Thr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Asp Ile
100 105 110
Lys
<210> 23
<211> 116
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 23
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ser Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Leu Ile Ser Phe Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Thr Ser Leu Arg Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Arg Ile Tyr Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 24
<211> 113
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 24
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser
20 25 30
Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Ser Thr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 25
<211> 116
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 25
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Lys
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ser Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Leu Ile Ser Phe Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Thr Ser Leu Arg Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Arg Ile Tyr Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 26
<211> 113
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 26
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser
20 25 30
Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Ser Thr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 27
<211> 116
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 27
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ser Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Leu Ile Ser Phe Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Thr Ser Leu Arg Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Arg Ile Tyr Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 28
<211> 113
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 28
Asp Leu Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser
20 25 30
Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Ser Thr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 29
<211> 116
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 29
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ser Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Leu Ile Ser Phe Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Thr Ser Leu Arg Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Arg Ile Tyr Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 30
<211> 113
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 30
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser
20 25 30
Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Ser Thr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 31
<211> 116
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 31
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ser Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Leu Ile Ser Phe Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Thr Ser Leu Arg Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Arg Ile Tyr Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 32
<211> 113
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 32
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser
20 25 30
Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Ser Thr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Asp Ile
100 105 110
Lys
<210> 33
<211> 116
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 33
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ser Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Leu Ile Ser Phe Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Thr Ser Leu Arg Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Arg Ile Tyr Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115

Claims (10)

1.一种抗PD-L1的抗体或其抗原结合片段，包括轻链可变区和重链可变区，其特征在于：
所述轻链可变区包含：
1）序列KSSQX1VLYSSNNKNYLX2W（SEQ ID NO: 14）所示的LCDR1序列，其中X1为S，并且X2为A；
2）序列WASTRES（SEQ ID NO: 15）所示的LCDR2序列；和
3）序列QQYYSTPLT（SEQ ID NO: 16）所示的LCDR3序列；并且
所述重链可变区包含：
1）序列GFTFSSY（SEQ ID NO: 17）所示的HCDR1序列；
2）序列SX3DGSNK（SEQ ID NO: 18）所示的HCDR2序列，其中X3为F；和
3）序列DRIYLDY（SEQ ID NO: 19）所示的HCDR3序列。
2.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于：所述轻链可变区的序列为SEQ ID NO: 1，重链可变区的序列为SEQ ID NO: 2。
3.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于：
所述轻链可变区的序列为SEQ ID NO: 20，重链可变区的序列为SEQ ID NO: 21；或者
所述轻链可变区的序列为SEQ ID NO: 22，重链可变区的序列为SEQ ID NO: 23；或者
所述轻链可变区的序列为SEQ ID NO: 24，重链可变区的序列为SEQ ID NO: 25；或者
所述轻链可变区的序列为SEQ ID NO: 26，重链可变区的序列为SEQ ID NO: 27；或者
所述轻链可变区的序列为SEQ ID NO: 28，重链可变区的序列为SEQ ID NO: 29；或者
所述轻链可变区的序列为SEQ ID NO: 30，重链可变区的序列为SEQ ID NO: 31；或者
所述轻链可变区的序列为SEQ ID NO: 32，重链可变区的序列为SEQ ID NO: 33。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于：所述抗原结合片段为Fab、Fab'、F(ab')2、scFv或dsFv片段。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的抗体或其抗原结合片段在制备治疗癌症的药剂中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述癌症选自肺癌、结肠癌、卵巢癌、肾脏癌、结肠直肠癌、胰脏癌、肝癌、黑色素瘤、乳腺癌、骨髓瘤、神经胶质瘤、白血病和淋巴瘤。
7.根据权利要求1-4中任一项所述的抗体或其抗原结合片段在制备诊断癌症的试剂中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述癌症选自肺癌、结肠癌、卵巢癌、肾脏癌、结肠直肠癌、胰脏癌、肝癌、黑色素瘤、乳腺癌、骨髓瘤、神经胶质瘤、白血病和淋巴瘤。
9.根据权利要求1-4中任一项所述的抗体或其抗原结合片段在制备确定癌症患者预后或总存活期的试剂中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述癌症选自肺癌、结肠癌、卵巢癌、肾脏癌、结肠直肠癌、胰脏癌、肝癌、黑色素瘤、乳腺癌、骨髓瘤、神经胶质瘤、白血病和淋巴瘤。
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