KR101341876B1 - 비가역 인히비터 디자인을 위한 알고리즘 - Google Patents

Abstract

본 발명은 표적 폴리펩타이드를 공유결합하는 인히비터를 디자인하는 알고리즘 및 방법에 관한 것이다. 상기 알고리즘 및 방법은 가역 인히비터를 비가역 인히비터로 신속하고 효율적으로 전환시키는데 사용될 수 있다.

Description

비가역 인히비터 디자인을 위한 알고리즘{ALGORITHM FOR DESIGNING IRREVERSIBLE INHIBITORS}

본 발명은 표적 폴리펩타이드의 비가역 인히비터를 디자인하기 위한 알고리즘 및 방법에 관한 것이다.

효소와 같은 폴리펩타이드의 활성을 억제하는 화합물은 중요한 치료제이다. 대부분의 인히비터는 이들의 표적 폴리펩타이드에 가역적으로 결합하고 이들의 표적 폴리펩타이드의 활성을 가역적으로 억제한다. 가역적 인히비터가 효과적인 치료제로서 개발되었으나, 가역적 인히비터는 일부 결점을 갖고 있다. 예를 들어, 다수의 가역적 키나아제의 인히비터는 ATP-바인딩 사이트와 상호작용한다. ATP-바인딩 사이트의 구조는 키나아제에서 고 보존적이기 때문에, 하나 이상의 원하는 키나아제를 선택적으로 억제하는 가역적 인히비터를 개발하는 것은 매우 도전적인 것이다. 또한, 가역적 인히비터는 이들의 표적 폴리펩타이드로부터 분리되기 때문에, 억제기간은 원하는 것보다 짧을 수 있다. 따라서, 가역적 인히비터가 치료제로 사용될 경우, 의도하고자 하는 생물학적 효과를 달성하기 위해 원하는 것보다 더 많은 양 및/또는 더 많은 빈도의 투여가 요구될 수 있다. 이는 독성을 생성하거나 다른 원하지 않는 영향을 초래할 수 있다.

이들의 표적 폴리펩타이드에 공유 결합하는 비가역 인히비터가 기술된다. 약물 표적의 공유 비가역 인히비터는 치료학적으로 이들의 가역적 인히비터에 비해 다수의 중요한 이점을 갖는다. 약물 표적의 지연된 억제는 최대 약물학적 효과에 필요할 수 있으며, 비가역 인히비터는 기존의 약물 표적 활성을 영구히 제거함으로써 이러한 이점을 제공할 수 있으며, 이는 새로운 표적 폴리펩타이드가 합성될 경우에만 되살아날 것이다. 비가역 인히비터가 투여될 경우, 비가역 인히비터의 치료적 혈장 농도는 표적 폴리펩타이드를 상기 인히비터에 간단히 노출시키기에 충분히 긴 경우에만 이루어지는 것이 필요할 수 있으며, 이는 표적의 활성을 비가역적으로 저해한다. 그다음에 혈장 수준은 신속히 감소하고, 표적 폴리펩타이드는 불활성인채로 남게된다. 이는 치료적 활성이 일어나는 최소 혈장 농도를 낮추며, 다중 투여 요건을 최소화하며, 그리고 효능을 손상시키지 않고 긴 혈장 반감기에 대한 요건을 생략하는 잠재적인 이점을 갖는다. 이러한 모든 고려사항은 고 혈장 수준 또는 연장된 혈장 수준에서 일어날 수 있는 어느 비특이적 표적을 벗어난 상호작용에 기인한 독성을 감소시킬 수 있다. 비가역 인히비터는 또한 약물 저항성에 있어 이점을 갖는 경향이 있다.

US 2007/0082884에는 소분자 인히비터에 의한 변형에 이용가능한 여러 키나아제의 바인딩 사이트에서 Cys를 확인하기 위한 구조적 생물정보학의 사용에 대해 기재되어 있다. 상기 문헌에는 또한 확인된 Cys와의 공유 결합을 형성하는 화합물의 제조에 대해 기재되어 있다. Pan et al., ChemMedChem 2(1):58-61(2007)에는 스크리닝 캠페인으로부터 브루톤 티로신 키나아제(BTK)를 억제할 수 있는 스캐폴드의 확인, 상기 스캐폴드에 기초한 일련의 화합물 제조, 및 BTK의 공유 인히비터의 확인에 대해 기재되어 있다. Wissner et al., J. Med. Chem. 48(24):7560-81(2005)에는 혈관 내피 성장 인자 리셉터-2(VEGFR2) 키나아제의 공유 비가역 인히비터인 일련의 화합물 제조에 대해 기재되어 있다. 상기 화합물은 퀴나졸린 코어 구조 및 고 반응성 퀴논을 함유한다. 이들 문헌 어디에도 비가역 인히비터를 디자인하거나 공지된 가역 인히비터의 비가역 유사체를 디자인하기 위한 일반화가능한 방법은 기재되어 있지 않다. 이러한 방법은 비가역 인히비터를 개발하는 시간과 비용을 실질적으로 줄일 수 있다.

본 발명은 표적 폴리펩타이드의 비가역 인히비터를 디자인하기 위한 알고리즘 및 방법에 관한 것이다. 본 발명의 알고리즘 및 방법에 의해 디자인되는 비가역 인히비터는 표적 폴리펩타이드에서 아미노산 측쇄와 공유 결합을 형성한다. 지금부터 본 발명을 사용하면 공지된 가역적 인히비터로부터 시작해서 비가역 인히비터를 효율적으로 디자인하는 것이 가능하다. 이러한 방법은 약물 발견 및 개발을 위한 전통적인 스크리닝 및 구조 활성 관련성 개발 방법과 관련된 시간 및 비용을 줄인다. 상기 알고리즘 및 방법은 후보 비가역 인히비터와 표적 폴리펩타이드 사이에 결합을 형성하는 것을 포함한다.

상기 알고리즘 및 방법은 A) 표적 폴리펩타이드내의 바인딩 사이트에 결합되며, 바인딩 사이트와 비공유 접촉을 형성하는 가역 인히비터의 구조 모델을 제공하는 단계; B) 상기 가역 인히비터가 상기 바인딩 사이트에 결합할 경우 상기 가역 인히비터에 인접한 표적 폴리펩타이드의 바인딩 사이트에서 Cys 잔기를 확인하는 단계; C) 상기 표적 폴리펩타이드에 공유 결합하는 후보 인히비터의 구조 모델을 생성하는 단계로서, 여기서 각 후보 인히비터는 상기 가역 인히비터의 치환가능한 위치에 결합되는 워헤드(warhead)를 함유하며, 상기 워헤드는 반응성 화학 작용기 및 임의로 상기 표적 폴리펩타이드의 바인딩 사이트내에서 Cys 잔기의 결합 거리내에 상기 반응성 화학 작용기를 배치하는 링커를 포함하는, 후보 인히비터의 구조 모델을 생성하는 단계; D) 상기 후보 인히비터가 상기 바인딩 사이트에 결합할 경우 상기 워헤드의 반응성 화학 작용기가 상기 표적 폴리펩타이드의 바인딩 사이트내에서 Cys 잔기의 결합 거리내에 존재하게 되는 가역 인히비터의 치환가능한 위치를 검출하는 단계; E) 상기 후보 인히비터가 바인딩 사이트에 결합할 경우 상기 표적 폴리펩타이드의 바인딩 사이트내에서 Cys 잔기의 결합 거리내에 존재하는 워헤드를 함유하는 후보 인히비터에 대해, 상기 후보 인히비터가 상기 바인딩 사이트에 결합할 경우 상기 바인딩 사이트내의 Cys 잔기의 황원자와 상기 워헤드의 반응성 화학 작용기 사이에 공유 결합을 형성하는 단계를 포함한다. 상기 바인딩 사이트내의 Cys 잔기의 황원자와 상기 워헤드의 반응성 화학 작용기 사이에 형성되는 결합에 대해 약 2옹스트롬 미만의 공유 결합 길이는 후보 인히비터가 표적 폴리펩타이드를 공유 결합시키는 인히비터임을 나타낸다.

도 1a-1q는 본 발명에 사용될 수 있는 114 개의 예시적인 워헤드의 구조 및 각 워헤드가 표적 폴리펩타이드내에서 Cys 잔기와 형성하는 티올 부가 생성물의 구조를 나타낸다. 티올 부가 생성물에서, Cys 측쇄의 황원자는 워헤드 및 Cys 잔기의 β 탄소에 결합하며, 그리고 Cys 잔기의 β 탄소는 R에 결합한다. R은 표적 폴리펩타이드의 나머지를 나타낸다.
도 2a는 c-KIT의 ATP-바인딩 사이트에서 화합물 1의 모델의 이미지이다. 표적 Cys 잔기, c-KIT의 Cys788을 또한 나타내었다.
도 2b는 c-KIT의 ATP-바인딩 사이트에서 화합물 1의 모델의 이미지이다. 이 이미지에서, 화합물 1은 c-KIT의 Cys788과 공유 결합을 형성하였다.
도 3a는 FLT3의 ATP-바인딩 사이트에서 화합물 4의 모델의 이미지이다. 표적 Cys 잔기, FLT3의 Cys828을 또한 나타내었다.
도 3b는 FLT3의 ATP-바인딩 사이트에서 화합물 4의 모델의 이미지이다. 이 이미지에서 화합물 4는 FLT3의 Cys828과 공유 결합을 형성하였다.
도 4a는 헤파타이티스 C 바이러스(HCV) 프로테아제, 보다 구체적으로 상기 바이러스의 NS3/4A HCV 프로테아제 성분의 바인딩 사이트에서 화합물 5의 모델의 이미지이다. 표적 Cys 잔기, HCV 프로테아제의 Cys를 또한 나타내었다.
도 4b는 HCV 프로테아제의 바인딩 사이트에서 화합물 5의 모델의 이미지이다. 이 이미지에서 화합물 5는 HCV 프로테아제의 Cys159와 공유 결합을 형성하였다.
도 5는 참고 화합물 및 화합물 2를 이용한 EOL-1 세포의 세포 증식의 투여량 반응 억제를 나타낸 것이다.
도 6은 EOL-1 세포를 사용한 "세척제거" 실험에서 참고 화합물 및 화합물 2를 이용한 PDGFR의 억제를 나타낸 것이다.
도 7은 화합물 3로 처리된 PDGFR의 트립신 분해의 질량 스펙트럼 분석 결과를 나타낸 것이다. 이 결과는 화합물 3이 Cys814와 결합을 형성하였음을 입증한다.
도 8은 화합물 5로 처리된 NS3/4A HCV 프로테아제의 질량 스펙트럼 분석 결과를 나타낸 것이다. 이 결과는 화합물 5-처리된 HCV 프로테아제가 질량을 증가시켰으며, 이는 상기 단백질과 화합물 5 사이의 부가 생성물의 형성과 일치한다. 부가 생성물은 Cys159가 Ser로 대체된 HCV 프로테아제의 변이 형태로 형성되지 않았다.
도 9는 화합물 6으로 처리된 HCV NS3/4A 프로테아제의 질량 스펙트럼 분석의 결과를 나타낸 것이다. 이 결과는 화합물 6-처리된 HCV 프로테아제가 질량을 증가시켰으며, 이는 상기 단백질과 화합물 6 사이의 부가 생성물의 형성과 일치한다. 부가 생성물은 Cys159가 Ser로 대체된 HCV 프로테아제의 변이 형태로 형성되지 않았다.
도 10a 및 10b는 cKIT 인산화 어세이(10A) 및 ERK 인산화를 측정한 다운스트림 신호전달 어세이(10B)에서 소라페닙(sorafenib)에 대한 비가역 인히비터 화합물 7에 의한 cKIT 활성의 연장된 억제를 보여주는 히스토그램이다.
도 11은 화합물 8로 처리된 HCV NS3/4A 프로테아제의 질량 스펙트럼 분석 결과를 나타낸 것이다. 그 결과는 화합물 8-처리된 HCV 프로테아제가 질량을 증가시켰으며, 이는 상기 단백질과 화합물 8 사이의 부가 생성물의 형성과 일치한다.

정의

본 명세서에 사용된 "인접한"이란 가역 인히비터가 표적 폴리펩타이드에 결합될 경우 가역 인히비터 근처에 존재하는 표적 폴리펩타이드내의 아미노산 잔기를 칭한다. 예를 들어, 아미노산 잔기의 어느 비-수소 원자는 가역 인히비터가 표적 폴리펩타이드에 결합시, 가역 인히비터의 어느 비-수소 원자의 약 20Å, 약 18Å, 약 16Å, 약 14Å, 약 12Å, 약 10Å, 약 8Å, 약 6Å, 약 4Å 또는 약 2Å이내인 경우에 가역 인히비터에 표적 폴리펩타이드내의 아미노산 잔기가 인접한다. 가역 인히비터가 표적 폴리펩타이드에 결합할 경우 가역 인히비터와 접촉하는 표적 폴리펩타이드내 아미노산 잔기는 상기 가역 인히비터와 인접한다.

본 명세서에 사용된 "치환가능한 위치"는 표적 폴리펩타이드에 대한 가역 인히비터의 바인딩에 영향을 주지않고 대체되거나 그리고/또는 제거될 수 있는 다른 원자 또는 화학기(예, 수소)에 결합하는 가역 인히비터내의 비-수소 원자를 칭한다.

본 명세서에, 표적 바인딩 사이트에서 가역 인히비터의 바인딩 방식 및 체류시간이 실질적으로 변하지 않는 경우, 가역 인히비터의 바인딩이 "영향을 받지 않는 것"으로 표현된다. 가역 인히비터의 바인딩은 예를 들어, 적절한 어세이(예, IC50, Ki)에서 인히비터의 효능이 1000 팩터미만, 100 팩터미만 또는 10 팩터미만으로 변하는 경우에 영향을 받지 않는다.

본 명세서에 사용된, "결합 거리"는 약 6Å이하, 약 4Å이하, 또는 약 2Å이하의 거리를 칭한다.

본 명세서에 사용된, "공유 결합" 및 "원자가 결합"은 결합된 원자에 의한 전자의 공유, 일반적으로 쌍으로 생성되는 두 원자간의 화학 결합을 칭한다.

본 명세서에 사용된, "비공유 결합"은 이들간에 공유 결합의 형성을 포함하지 않는 원자들 및/또는 분자들 사이의 상호작용을 칭한다.

본 명세서에 사용된, "비가역 인히비터"는 실질적으로 영구적인 공유 결합을 통해 표적 폴리펩타이드에 공유 결합하며, 상기 단백질의 작용 기간 보다 더 긴 기간동안 표적 폴리펩타이드의 활성을 억제하는 화합물이다. 비가역 인히비터는 일반적으로 시간 의존성, 즉, 활성이 근절될 때까지 표적 폴리펩타이드가 비가역 인히비터와 접촉하는 시간에 따라 표적 폴리펩타이드의 억제 정도가 증가하는 것을 특징으로 한다. 비가역 인히비터에 의해 억제되는 경우에 표적 폴리펩타이드 활성의 회복은 새로운 단백질 합성에 의존한다. 비가역 인히비터에 의해 억제되는 표적 폴리펩타이드 활성은 "세척제거" 시험에서 실질적으로 억제되는 것으로 잔존한다. 화합물이 비가역 억제제인지 여부를 측정하는 적절한 방법은 당 기술분야에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 비가역 억제는 표적 폴리펩타이드를 이용한 화합물의 억제 프로필의 역학 분석(예, 경합, 비경합), 억제제 화합물의 존재하에서 변형된 단백질 약물 표적의 질량 분광 분석법의 사용, "세척제거" 시험으로도 알려진 비연속 노출, 및 효소의 공유 변형을 나타내기 위한 방사능 표지 인히비터와 같은 라벨링의 사용, 또는 당 기술분야의 숙련자에게 알려진 다른 방법을 사용하여 검출 또는 확인될 수 있다. 특정 바람직한 구현으로, 상기 표적 폴리펩타이드는 촉매 활성을 가지며, 상기 비가역 인히비터는 촉매 잔기가 아닌 Cys 잔기와 공유 결합을 형성한다.

본 명세서에 사용된 "가역 인히비터"는 표적 폴리펩타이드에 가역적으로 결합하고, 표적 폴리펩타이드의 활성을 억제하는 화합물이다. 가역 인히비터는 이의 표적 폴리펩타이드에 비-공유적으로 결합하거나 일시적인 공유 결합을 포함하는 메카니즘을 통해 결합할 수 있다. 가역 인히비터에 의해 억제될 경우에 표적 폴리펩타이드 활성의 회복은 표적 폴리펩타이드로부터 가역 인히비터의 분리에 의해 일어날 수 있다. 표적 폴리펩타이드 활성은 가역 인히비터가 세정제거 시험시 "세정제거"되는 경우에 회복된다. 바람직한 가역 인히비터는 이의 표적 폴리펩타이드의 활성의 "강력한" 인히비터이다. "강력한" 가역 인히비터는 약 50μM 이하, 약 1μM 이하, 약 100nM 이하, 또는 약 1nM 이하의 IC₅₀으로 그리고/또는 약 50μM 이하, 약 1μM 이하, 약 100nM 이하, 또는 약 1nM 이하의 K_i로 이의 표적 폴리펩타이드의 활성을 억제한다.

용어 "IC₅₀" 및 "억제 농도 50"은 이에 한정하는 것은 아니나, 촉매 활성, 세포 생존성, 단백질 번역 활성 등을 포함하는 관심있는 생물학적 프로세스의 활성의 50%를 억제하는 분자의 농도를 의미하는 것을 잘 이해되는 기술 용어이다.

용어 "K_i" 및 "억제 상수"는 폴리펩타이드(예, 효소)-인히비터 복합체의 분리 상수인 것으로 잘 이해되는 기술 용어이다.

본 명세서에 사용된, "실질적으로 영구적인 공유 결합"이란 표적 폴리펩타이드의 작용 기간 보다 더 긴 기간 동안 생리학적 조건하에서 지속되는 인히비터와 표적 폴리펩타이드 사이의 공유 결합이다.

본 명세서에 사용된, "일시적 공유 결합"은 표적 폴리펩타이드의 작용 기간 보다 더 짧은 기간 동안 생리학적 조건하에서 지속되는 인히비터와 표적 폴리펩타이드 사이의 공유 결합이다.

본 명세서에 사용된, "워헤드"는 반응성 화학 작용성 또는 작용기를 포함하며, 그리고 임의로 링커부를 함유하는 화학 기이다. 상기 반응성 작용기는 시스테인(즉, 시스테인 측쇄내 -SH 기)과 같은 아미노산 잔기 또는 표적 단백질의 바인딩 포켓에 존재하는 공유적으로 변형될 수 있어 이에 따라 표적 폴리펩타이드를 비가역적으로 억제하는 다른 아미노산 잔기와 공유 결합을 형성할 수 있다. 하기에 정의 및 기술되는 -L-Y 기는 단백질을 공유적으로, 그리고 비가역적으로 억제하기 위한 이러한 워헤드 기를 제공하는 것으로 인식될 것이다.

용어 "인 실리코"는 예를 들어, 컴퓨터 모델링 프로그램, 컴퓨터 화학, 분자 그래픽, 분자 모델링 등을 사용하여 컴퓨터 시뮬레이션을 생성하는 컴퓨터에서 수행되는 방법 및 프로세스를 칭하는 것으로 이해되는 기술 용어이다.

본 명세서에 사용된, 용어 "컴퓨터 모델링 프로그램"은 이에 한정하는 것은 아니나 컴퓨터 화학, 화학정보학, 에너지 계산, 단백질 모델링 등을 포함하는 단백질 및 소분자의 시각화 및 공학기술을 다루는 컴퓨터 소프트웨어 프로그램을 칭한다. 이러한 프로그램의 예는 당 기술분야의 통상적인 기술을 가진 자에게 알려져 있으며, 여기서는 특정 예가 제공된다.

본 명세서에 사용된, 용어 "서열 정렬"은 둘 이상의 단백질 또는 핵산 서열의 배열을 칭하며, 이는 이들의 유사성(또는 차이)의 비교 및 하이라이팅이 가능하다. 서열 정렬에 대한 방법 및 컴퓨터 프로그램은 잘 알려져 있다(예, BLAST). 서열은 컬럼이 서열과 동일하거나 유사한 특성을 함유하는 경우에도 포함되도록 갭으로 채워질 수 있다(일반적으로 대쉬로 표기됨).

본 명세서에 사용된, 용어 "결정"은 X선을 회절시키는 어느 3차원 배향 배열을 칭한다.

본 명세서에 사용된, 용어 "원자 코디네이트" 및 "구조 코디네이트"는 단백질의 3차원 모델/구조 또는 실험적 구조로 원자의 위치를 나타내는 수학적 코디네이트("X", "Y" 및 "Z" 값으로 표기됨)를 칭한다.

본 명세서에 사용된, 용어 "호몰로지 모델링"은 이들의 호몰로지에 대한 기존의 3차원 구조로부터 거대분자의 3차원 구조에 대한 모델을 유도하는 실행을 칭한다. 호몰로지 모델은 관심있는 분자의 서열이 공지된 구조의 분자의 서열과 동일하지 않은 위치에서 잔기의 동일성을 변환시키는 것이 가능한 컴퓨터 프로그램을 사용하여 획득된다.

본 명세서에 사용된, "컴퓨터 화학"은 분자의 물리적 및 화학적 특성의 산출을 칭한다.

본 명세서에 사용된, "분자 그래픽"은 바람직하게 컴퓨터 스크린상에 원자의 2 또는 3 차원 묘사를 칭한다.

본 명세서에 사용된, "분자 모델링"은 컴퓨터를 사용하거나 사용하지 않고 하나 이상의 모델을 형성하며, 임의로 리간드의 구조 활성 관계에 대한 예측을 형성하는 것을 수행할 수 있는 방법 또는 절차를 칭한다. 분자 모델링에 사용되는 방법은 분자 그래픽 내지 컴퓨터 화학 범주내이다.

본 발명은 효소와 같은 표적 폴리펩타이드의 비가역 인히비터를 디자인하는 알고리즘 및 방법에 관한 것이다. 본 발명을 사용하여 디자인된 비가역 인히비터는 표적 폴리펩타이드의 강력하고 선택적인 억제를 할 수 있다. 일반적으로, 본 발명은 디자인 선택이 표적 폴리펩타이드의 구조, 표적 폴리펩타이드의 가역 인히비터의 구조 및 가역 인히비터와 표적 폴리펩타이드의 상호작용에 의해 가이드되는 래셔널 알고리즘 및 디자인 방법이다. 본 발명의 방법을 사용하여 디자인되는 비가역 인히비터, 또는 후보 비가역 인히비터는 하나 이상의 워헤드가 결합되는 템플레이트 또는 스캐폴드를 포함한다. 결과적으로 형성되는 화합물은 표적 폴리펩타이드에 대한 바인딩 친화력을 가지며, 한번 바인딩되면 워헤드는 표적 폴리펩타이드의 바인딩 사이트내의 Cys 잔기와 반응하여 공유 결합을 형성하며, 그 결과 표적 폴리펩타이드의 비가역 억제를 일으킨다.

본 발명은 표적 폴리펩타이드를 공유 결합시키는 인히비터를 디자인하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 표적 폴리펩타이드내의 바인딩 사이트에 바인딩되는 가역 인히비터의 구조 모델을 제공하는 것을 포함한다. 가역 인히비터는 바인딩 사이트와 비공유 접촉을 형성한다. 구조 모델을 이용하면, 가역 인히비터에 인접한 표적 폴리펩타이드의 바인딩 사이트내의 Cys 잔기는 가역 인히비터가 바인딩 사이트에 바인딩될 경우에 확인된다. 가역 인히비터에 인접한 단일 Cys 잔기, 모든 Cys 잔기 또는 원하는 수의 Cys 잔기는 가역 인히비터가 바인딩 사이트에 바인딩될 경우에 확인될 수 있다.

표적 폴리펩타이드를 공유 결합시키도록 디자인되는 하나 이상의 후보 인히비터의 구조 모델이 생성된다. 후보 인히비터는 가역 인히비터의 치환가능한 위치에 결합되는 워헤드를 함유한다. 워헤드는 Cys 잔기의 측쇄내의 티올기와 반응할 수 있으며 공유 결합을 형성할 수 있는 반응성 화학 작용기를 함유하며, 그리고 임의로 상기 반응성 화학 작용기를 표적 폴리펩타이드의 바인딩 사이트내의 확인된 Cys 잔기 중 하나의 결합 거리내에 배치하는 링커를 함유한다. 워헤드의 반응성 화학 작용기가 표적 폴리펩타이드의 바인딩 사이트내의 확인된 Cys 잔기의 결합 거리내에 존재하게 되는 것을 형성하는 가역 인히비터의 치환가능한 위치는 후보 인히비터가 바인딩 사이트에 바인딩될 경우에 확인된다.

확인된 치환가능한 위치에 부착되는 워헤드를 함유하며 표적 폴리펩타이드의 바인딩 사이트내의 확인된 Cys 잔기의 결합 거리내에 존재하는 후보 비가역 인히비터가, 바인딩 사이트에 후보 인히비터가 바인딩될 경우에 표적 폴리펩타이드를 공유 결합하는 인히비터일 가능성이 높은 것인지, 그리고 바람직하게는 표적 폴리펩타이드의 비가역 인히비터일 가능성이 높은 것인지를 검출하는 것은, 후보 인히비터가 바인딩 사이트에 바인딩될 경우에 바인딩 사이트내의 Cys 잔기의 황 원자와 워헤드의 반응성 화학 작용기 사이의 공유 결합을 형성함으로써 이루어진다. 바인딩 사이트내 Cys 잔기의 황 원자와 워헤드의 반응성 화학 작용기 사이에 형성되는 결합에 대해 약 2.1옹스트롬 내지 약 1.5옹스트롬, 또는 약 2옹스트롬 미만의 공유 결합 길이는 후보 인히비터가 표적 폴리펩타이드를 공유 결합시키는 인히비터임을 나타낸다.

본 발명의 방법은 물리적 모델 또는 바람직하게는 분자 그래픽과 같은 어느 적절한 구조 모델을 사용하여 수행될 수 있다. 상기 방법은 수동적으로 수행되거나 자동화될 수 있다. 바람직하게, 상기 방법은 인 실리코로 수행된다.

상기 설명 및 하기에 나타낸 보다 상세한 설명으로부터 본 발명의 알고리즘 및 방법은 개념적으로 A) 표적 및 가역 인히비터를 제공하는 단계, B) 표적 시스테인을 확인하는 단계, C) 워헤드를 함유하는 후보 인히비터의 구조 모델을 생성하는 단계, D) 표적 시스테인에 워헤드의 근접성을 측정하는 단계, 및 E) 공유 결합을 형성하는 단계를 포함한다는 것을 알 수 있을 것이다.

A) 표적 및 가역 인히비터 제공

본 발명은 표적 폴리펩타이드내 바인딩 사이트에 바인딩되는 가역 인히비터의 구조 모델을 제공하는 것을 포함하며, 여기서 상기 가역 인히비터는 바인딩 사이트와 비공유 접촉을 형성한다. 표적 폴리펩타이드내 바인딩 사이트에 바인딩되는 가역 인히비터의 어느 적절한 구조 모델이 제공 및 사용될 수 있다. 본 발명을 이용하여 표적 폴리펩타이드에 공유 결합하는 인히비터를 디자인하기 위한 출발점을 제공하기 위해, 일반적으로, 공지되거나 기존의 강한 표적 폴리펩타이드 가역 인히비터를 사용한다. 따라서, 예를 들어, 표적 단백질의 가역 인히비터가 이전에 확인된 경우(예, 문헌적으로 보고되었거나 당 기술분야의 숙련자에게 알려진 어느 방법에 의해 확인된 경우), 공지된 가역 인히비터는 인히비터와 복합된 표적 폴리펩타이드의 구조 모델을 생성하기 위해 사용될 수 있다. 그러나, 필요에 따라, 새로운 또는 기존에 알려지지 않은 가역 인히비터가 인히비터와 복합된 표적 폴리펩타이드의 구조 모델을 생성하기 위해 사용될 수 있다.

상기 알고리즘 및 방법은 강력한 가역 인히비터, 약한 가역 인히비터 또는 중간 정도의 효력을 지닌 가역 인히비터와 같은 어느 적절한 가역 인히비터를 사용하여 비가역 인히비터를 디자인하도록 사용될 수 있다. 예를 들어, 실시예 8에 기재된 바와 같이, 본 발명의 알고리즘 및 방법은 표적 단백질에 공유 결합하는 능력에 있어서 디자인함으로써 가역 인히비터의 효능을 증가시키도록 사용될 수 있다. 일부 구현에서, 상기 알고리즘 및 방법은 강한 가역 인히비터의 구조를 이용한다. 다른 구현에서, 상기 알고리즘 및 방법은 공유 결합에 있어서 디자인함으로써 효능을 향상시키도록 사용되며, 10nM 이상, 100nM 이상, 약 1-10nM, 약 1-100nM, 약 100μM 내지 1μM, 또는 약 1mM 내지 약 1μM의 IC₅₀ 또는 K_i를 갖는 인히비터와 같이 약하거나 중간 효능을 지닌 인히비터의 구조를 이용한다.

다수의 적절한 표적 폴리펩타이드의 3차원 구조가 알려져 있으며, 예를 들어, Research Collaboratory for Structural Bioinformatics Protein Data Bank(RCSB PDB, world wide web pdb.org에서 온라인으로 이용가능함; 참조 H.M. Berman et al., :Nucleic Acids Research, 28pp. 235-242(2000) 및 www.rcsb.org) 및 월드와이드 단배질 데이타 뱅크(wwPDB; Berman et al, Nature Structural Biology 10(12):980(2003))와 같은 공개 자료로부터 쉽게 이용가능하다. 적절한 표적 폴리펩타이드의 비제한적 리스트를 표 1에 나타내었으며, 이의 구조는 상기 단백질 데이타 뱅크에서 이용가능하다. 필요에 따라, 표적 단백질의 3차원 구조는 어느 적절한 방법을 이용하여 획득될 수 있다. 구조를 검출하는 적절한 방법은 예를 들어, 액상 핵 자기공명(NMR) 분광학, 고상 NMR 분광학, X-선 크리스탈로그래피 등(참조 예, Blow, D, Outline of Crystallography for Biologists. Oxford: Oxford University Press. ISBN 0-19-851051-9(2002).)과 같이 당 기술분야에 잘 알려져 있으며 통상적이다.

표적 폴리펩타이드의 구조 모델은 또한 예를 들어, 단백질의 1차 및 2차 구조에 기초한 호몰로지 모델링, 또는 폴딩 시험과 같은 컴퓨터 모델링의 잘 알려지고 통상적인 방법을 사용하여 생성될 수 있다. 호몰로지 모델을 생성하기 위한 적절한 방법은 당 기술분야에 잘 알려져 있다(참조 예, John, B. and Sali, A. Nucleic Acids Res 31(14):3982-92(2003)). 적절한 호몰로지 모델링 프로그램은 예를 들어, Modeler(Accelrys, Inc. San Diego) 및 Prime(Schrodinger Inc., Ner York)를 포함한다. 예를 들어, 본 명세서에서 실시예 3에 기재된 바와 같이, FLT3 키나아제의 호몰로지 모델이 오로라 키나아제의 공지 구조에 기초하여 생성되었다. 적절한 표적 폴리펩타이드의 비제한적인 리스트를 표 2에 나타내었으며, 호몰로지 모델을 생성하는데 사용될 수 있는 서열 정보가 이로부터 이용가능하다. 바람직한 구조 모델은 표적 폴리펩타이드에 대한, 또는 가역 인히비터와 복합시 적어도 표적 폴리펩타이드의 바인딩 사이트에 대한 원자 코디네이트를 사용하여 생성된다. 이러한 원자 코디네이트는 가역 인히비터와 복합되는 다수의 표적 폴리펩타이드에 대한 상기 단백질 데이타 뱅크에서 이용가능하며, X-선 결정학, 핵 자기 공명 분광학, 호몰로지 모델링 등을 사용하여 검출될 수 있다.

마찬가지로, 가역 인히비터 단독 또는 표적 폴리펩타이드와 복합된 가역 인히비터의 구조 모델은 공지 원자 코디네이트에 기초하여 생성되거나 다른 적절한 방법을 사용하여 생성될 수 있다. 표적 단백질상에 인히비터를 도킹하는 적절한 방법 및 프로그램은 당 기술분야에 잘 알려져 있다(참조 예, Perola et al., Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics 56:235-249(2004)). 일반적으로, 만일 표적 폴리펩타이드와 복합되는 가역 인히비터의 구조가 알려지지 않았다면, 복합체의 모델은 가역 인히비터의 가능하거나 있을 수 있는 바인딩 방식에 기초하여 제조될 수 있다. 가역 인히비터에 대해 가능하거나 있을 수 있는 바인딩 방식은 예를 들어, 공지된 바인딩 방식을 이용하여 상기 가역 인히비터의 다른 인히비터에 대한 구조 유사성에 기초하여 당 기술분야의 숙련자에게 쉽게 확인될 수 있다. 예를 들어, 실시예 5에 기재된 바와 같이, 10 이상의 다른 인히비터를 갖는 HCV 프로테아제의 복합체의 구조가 알려져 있으며, 이러한 인히비터 모두 상기 프로테아제에 대해 이들의 바인딩 방식에 있어 구조 유사성을 갖는다. 가역 인히비터 V-1의 가능한 바인딩 방식에 대한 이러한 지식에 기초하여, HCV와 복합된 V-1의 구조 모델이 생성되었으며, 이를 사용하여 HCV 프로테아제 Cys159가 공유 결합된 비가역 인히비터를 성공적으로 디자인하였다.

표적 폴리펩타이드내 바인딩 사이트에 바인딩된 가역 인히비터의 구조 모델은 바람직하게 컴퓨터 모델이다. 컴퓨터 모델은 VIDA^TM, 시각화 소프트웨어(OpenEye Scientific Software, New Mexico), Insight II^® 또는 Discovery Studio^®, 그래픽 분자 모델링 소프트웨어(Accelrys Software Inc., San Diego, CA)와 같은 어느 적절한 소프트웨어를 이용하여 생성 및 시각화될 수 있다.

단백질 데이타 뱅크(Protein Data Bank)에서 이용가능한 구조를 가진 예시적인 표적 폴리펩타이드

표적 폴리펩타이드	PDB 코드
프로테아제
휴먼 사이토메갈로바이러스 프로테아제	2WPO
헤파타이티스 바이러스 NS3/4A 프로테아제	2OC8
헤르페스 프로테아제	1AT3
KSHV 프로테아제	1FL1
바리셀라-조스터 바이러스 프로테아제	1VZV
엡스테인 바 바이러스 프로테아제	106E
프로테아솜	1JD2
카스파아제-1	1RWK
단백질 키나아제
MEK	1S9J
BTK	1K2P
CKIT	1T46
FLT3	1RJB
VEGFR2	1YWN
ZAP70	1U59
C-SRC	2SRC
JAK3	1YVJ
FAK	1MP8
EGFR	1M17
FGFR	2FG1
GSK3B	1R0E
JNK3	1PMQ
리피드 키나아제
PI-3 키나아제	2CHW
포스포디에스테라아제
PDE5	1TBF
디아세틸라아제
HDAC8	1VKG
히트 쇼크 단백질
HSP70	1S3X
G 단백질-결합 리셉터
베타 아드레날 리셉터	2VT4
트랜스퍼라아제
파네실 트랜스퍼라아제	1JCQ
메탈로엔자임
카보닉 안하이드라아제	1A42
뉴클리어 호르몬 리셉터
안드로겐 리셉터	2AMB
에스트로겐 리셉터 알파	1R5K
PPAR DELTA	1Y0S

예시적인 표적 폴리펩타이드 및 서열 어세션 번호

표적 폴리펩타이드	서열 어세션 번호
ZAP70	P43403
C-SRC	P12931
ITK	NM_005546
BTK	SWS:BTK_HUMAN
RON	Q04912
JNK3	SWS:MK10_HUMAN
FGFR1	NM_000604
FGFR2	NM_000141
FGFR3	M58051
FGFR4	L03840
KDR(FLK, VEGFR, VEGFR2)	NM_002253
FLT1	AF063657
FLT3	NM_004119
C-KIT	X06182
EGFR	SWS:EGRF_HUMAN
PDFGR-A	M21574
PDGFR-B	J03278
GSK3A	NM_019884
GSK3B	P49841
RON	NM_002447
C-YES	M15990
Iuka	AF012890
Icky	AF080158
ALK	NM_004304
JAK1	P23458
JAK2	NM_004972
JAK3	AF513860
TYK2	P29597
JNK1	L26318
JNK3	P45984
FAK	Q05397
LIMK	NM_002314
MEK1	Q02750
MEK2	P36507
MELK	NM_014791
PBK	Q96KB5
PDK2	NM_016457
PKR	P19525
PLK	NM_004073
PI3-KINASE	Q9BZC8
헤파타이티스 C 바이러스 NS3/4A 프로테아제	SWS:POLG_HCVJA
헤르페스 심플렉스 바이러스 프로테아제	GB:AAA92139
KSHV 프로테아제	GB:AAC05223
바리셀라-조스터 바이러스 프로테아제	SWS:VP40_VZVD
엡스테인-바 바이러스 프로테아제	SWS:VP40 EBV
휴먼 사이토메갈로바이러스 프로테아제	SWS:VP40_HCMVA

B) 표적 시스테인 확인

본 발명은 가역 인히비터가 바인딩 사이트에 바인딩되는 경우에 가역 인히비터에 인접한 표적 폴리펩타이드의 바인딩 사이트내 Cys 잔기를 확인하는 단계를 포함한다. 가역 인히비터와 복합되는 표적 폴리펩타이드의 구조 모델을 이용하여, 워헤드와의 공유 결합 형성을 위한 표적에 적절한 표적 폴리펩타이드의 Cys 잔기가 확인된다. 워헤드와의 공유 결합 형성을 위한 표적에 적절한 Cys 잔기는 구조 모델내 가역 인히비터에 인접한다. 구조 모델내 가역 인히비터에 인접한 Cys 잔기는 분자간 거리를 측정하는 어느 적절한 방법을 이용하여 확인될 수 있다. 컴퓨터 모델에서 분자간 거리를 계산하는 여러 프로그램은 예를 들어, VIDA^TM, 시각화 소프트웨어(OpenEye Scientific Software, New Mexico), Discovery Studio, 시각화 소프트웨어(Accelrys, Inc., San Diego) 등과 같이 당 기술분야에 잘 알려져 있다.

일 예로, 분자간 거리(예, 옹스트롬)는 표적 폴리펩타이드 바인딩 사이트내 모든 Cys 잔기의 모든 비수소 원자와 가역 인히비터의 모든 비수소 원자 사이에 측정된다. 가역 인히비터에 인접한 Cys 잔기는 이러한 분자간 거리로부터 쉽게 확인된다. 인접한 Cys 잔기가 가역 인히비터의 약 10옹스트롬, 약 8옹스트롬 또는 약 6옹스트롬내에 존재하는 것이 일반적으로 바람직하다.

필요에 따라, 가역 인히비터에 인접한 Cys 잔기는 표적 폴리펩타이드내 Cys 잔기의 접근가능한 표면에서의 변화를 분석함으로써 확인될 수 있다. 이는 예를 들어, 표적 폴리펩타이드가 가역 인히비터와 복합될 경우, 그리고 표적 폴리펩타이드가 가역 인히비터와 복합되지 않을 경우에 표적 폴리펩타이드내 Cys 잔기의 접근가능한 표면적(예, 표적 폴리펩타이드의 인히비터 바인딩 사이트)을 검출함으로써 이루어질 수 있다. 가역 인히비터가 표적 폴리펩타이드에 복합될 경우 접근가능한 표면적내 변화를 갖는 Cys 잔기는 가역 인히비터에 인접하기 쉽다. 표면 접근성과 관련하여 Lee, B. and Richared, F.M., J. Mol. Biol. 55:379-400(1971)을 참조바란다. 이는 필요에 따라 분자간 거리를 측정함으로써 확인될 수 있다.

C) 워헤드를 함유하는 후보 인히비터의 구조 모델 형성

본 발명은 표적 폴리펩타이드에 공유결합하도록 디자인되는 후보 인히비터의 구조 모델을 형성하는 것을 포함하며, 여기서 각 후보 인히비터는 가역 인히비터의 치환가능한 위치에 결합하는 워헤드를 함유한다. 인접 Cys 잔기와 공유 결합을 형성할 수 있는 후보 인히비터는 워헤드기를 가역 인히비터상의 치환가능한 위치에 첨가함으로써 디지인된다. 예를 들어, 워헤드는 표적 폴리펩타이드내 Cys 잔기에 인접한 불포화 탄소원자에 결합될 수 있다. 다른 예로, 가역 인히비터 표적 폴리펩타이드 복합체에서 Cys 잔기는 가역 인히비터의 일부에 의해 가려지거나 부분적으로 가려진다. 이러한 상황에서, 가역 인히비터의 일부가 제거될 수 있으며 적절한 워헤드로 대체되어 가역 인히비터에 의해 가려지거나 부분적으로 가려지는 Cys 잔기를 공유결합하는 인히비터가 생성된다. 이러한 접근법은 워헤드로 제거되거나 대체되는 가역 인히비터의 일부가 가역 인히비터의 바인딩에 영향을 주지않고 제거될 수 있는 경우에 적절하다. 바인딩에 영향을 주지않고 제거될 수 있는 가역 인히비터 부분은 쉽게 확인될 수 있다. 예를 들어 표적 폴리펩타이드와의 수소 결합, 반데르 발스 상호작용 및/또는 소수성 상호작용과 관련되지 않은 부분을 포함한다.

상기 워헤드는 반응성 화학 작용기와 Cys 측쇄의 황원자 사이에 공유결합을 형성하기 위해 Cys 측쇄와 반응할 수 있는 반응성 화학 작용기를 포함한다. 상기 워헤드는 표적 폴리펩타이드 바인딩 사이트내 Cys 측쇄의 결합 거리내에 반응성 화학 작용기를 위치시키는 링커를 임의로 함유한다. 상기 워헤드는 Cys 측쇄내 원하는 정도의 반응성에 기초하여 선택될 수 있다. 링커가 존재하는 경우, 링커는 표적 Cys 잔기의 결합 거리내에 반응성 화학 작용기를 위치시키도록 제공된다. 예를 들어, 인접 Cys 잔기가 가역 인히비터의 치환가능한 위치에 직접적으로 결합되는 반응성 화학 작용기에 대해 가역 인히비터로부터 너무 멀리 떨어진 경우, 반응성 화학 작용기가 2가 C₁-C₁₈ 포화 또는 불포화, 선형 또는 분지형 탄화수소 사슬과 같은 적절한 링커를 통해 가역 인히비터의 치환가능한 위치에 결합될 수 있다.

워헤드의 적절한 예는 예를 들어, 도 1에 나타낸 바와 같은 것들을 포함한다. 일부 적절한 워헤드는 화학식 *-X-L-Y를 가지며, 여기서 *는 가역 인히비터의 치환가능한 위치에 대한 부착 지점을 나타낸다.

X는 결합이거나 2가 C₁-C₆ 포화 또는 불포화, 선형 또는 분지형 탄화수소 사슬이며, 여기서 임의로 탄화수소 사슬의 한 개, 두 개 또는 세 개의 메틸렌 유니트가 독립적으로 -NR-, -O-, -C(O)-, -OC(O)-, -C(O)O-, -S-, -SO-, -SO₂-, -C(=NR)-, -N=N- 또는 -C(=N₂)-로 치환되며;

L은 공유 결합 또는 2가 C_1-8 포화 또는 불포화, 선형 또는 분지형, 탄화수소 사슬이며, 여기서 L의 한 개, 두 개 또는 세 개의 메틸렌 유니트는 임의로 그리고 독립적으로 시클로프로필렌, -NR-, -N(R)C(O)-, -C(O)N(R)-, -N(R)SO₂-, -SO₂N(R)-, -O-, -C(O)-, -OC(O)-, -C(O)O-, -S-, -SO-, -SO2-, -C(=S)-, -C(=NR)-, -N=N-, 또는 -C(=N₂)-로 치환되며;

Y는 수소, 옥소, 할로겐, NO₂ 또는 CN으로 임의로 치환된 C_1-6 지방족, 또는 3-10 멤버드 모노시클릭 또는 비시클릭, 포화, 부분 포화 또는 질소, 산소 또는 황으로부터 독립적으로 선택된 0-3 헤테로원자를 갖는 아릴 고리이며, 그리고 여기서 상기 고리는 1-4 R^e 기로 치환되며; 그리고

각 R^e는 -Q-Z, 옥소, NO₂, 할로겐, CN, 적절한 이탈기, 또는 옥소, 할로겐, NO2 또는 CN으로 임의로 치환된 C_1-6 지방족으로부터 독립적으로 선택되며, 여기서;

Q는 공유 결합이거나 2가 C_1-6 포화 또는 불포화, 선형 또는 분지형 탄화수소 사슬이며, 여기서 Q의 둘 이상의 메틸렌 유니트는 임의로 그리고 독립적으로 -N(R)-, -S-, -O-, -C(O)-, -OC(O)-, -C(O)O-, -SO-, 또는 -SO₂-, N(R)C(O)-, -C(O)N(R)-, -N(R)SO₂- 또는 -SO₂N(R)-으로 치환되며; 그리고

Z는 수소이거나 옥소, 할로겐, NO₂, 또는 CN으로 임의로 치환된 C_1-6 지방족이다.

일부 구현으로 X는 결합, -O-, -NH-, -S-, -O-CH₂-C≡C-, -NH-CH₂-C≡C-, -S-CH₂-C≡C-, -O-CH₂-CH₂-O-, -O-(CH₂)₃-, 또는 -O-(CH₂)₂-C(CH₃)₂-이다.

특정 구현으로, L은 공유 결합이다.

특정 구현으로, L은 2가 C_1-8 포화 또는 불포화, 선형 또는 분지형, 탄화수소 사슬이다. 특정 구현으로, L은 -CH₂-이다.

특정 구현으로, L은 공유 결합, -CH₂-, -NH-, -CH₂NH-, -NHCH₂-, -NHC(O)-, -NHC(O)CH₂OC(O)-, -CH₂NHC(O)-, -NHSO₂-, -NHSO₂CH₂-, -NHC(O)CH₂OC(O)- 또는 -SO₂NH-이다.

일부 구현으로, L은 2가 C_2-8 선형 또는 분지형, 탄화수소 사슬이며, 여기서 L은 적어도 하나의 이중결합을 가지며, 그리고 L의 한 개 또는 두 개의 부가적 메틸렌 유니트는 -NRC(O)-, -C(O)NR-, -N(R)SO₂-, -SO₂N(R)-, -S-, -S(O)-, -SO₂-, -OC(O)-, -C(O)O-, 시클로프로필렌, -O-, -N(R)-, 또는 -C(O)-로 임의로 그리고 독립적으로 치환된다.

특정 구현으로, L은 2가 C_2-8 선형 또는 분지형, 탄화수소 사슬이며, 여기서 L은 적어도 하나의 이중 결합을 가지며, 그리고 L의 적어도 하나의 메틸렌 유니트는 -C(O)-, -NRC(O)-, -C(O)NR-, -N(R)SO₂-, -SO₂N(R)-, -S-, -S(O)-, -SO₂-, -OC(O)-, 또는 -C(O)O-로 치환되며, 그리고 L의 한 개 또는 두 개의 부가적인 메틸렌 유니트는 시클로프로필렌, -O-, -N(R)- 또는 -C(O)-로 임의로 그리고 독립적으로 치환된다.

일부 구현으로, L은 2가 C_2-8 선형 또는 분지형, 탄화수소 사슬이며, 여기서 L은 적어도 하나의 이중 결합을 가지며, 그리고 L의 적어도 하나의 메틸렌 유니트는 -C(O)-로 치환되며, 그리고 L의 한 개 또는 두 개의 부가적인 메틸렌 유니트는 시클로프로필렌, -O-, -N(R)-, 또는 -C(O)-로 임의로 그리고 독립적으로 치환된다.

상기한 바와 같이, 특정 구현으로, L은 2가 C_2-8 선형 또는 분지형, 탄화수소 사슬이며, 여기서 L은 적어도 하나의 이중 결합을 갖는다. 이 기술분야의 통상의 기술을 가진 자는 이러한 이중 결합이 탄화수소 사슬 백본내에 존재하거나, 백본 사슬의 "외부"에 존재하여 이에 따라 알킬리덴 기를 형성할 수 있음을 인식할 수 있을 것이다. 예를 들어, 알킬리덴 분지형 사슬을 갖는 이러한 L기는 -CH₂C(=CH₂)CH₂-을 포함한다. 따라서, 일부 구현으로, L은 2가 C_2-8 선형 또는 분지형, 탄화수소 사슬이며, 여기서 L은 적어도 하나의 알킬리데닐 이중 결합을 갖는다. 예시적인 L기는 -NHC(O)C(=CH₂)CH₂-를 포함한다.

특정 구현으로, L은 2가 C_2-8 선형 또는 분지형, 탄화수소 사슬이며, 여기서 L은 적어도 하나의 이중 결합을 가지며, L의 적어도 하나의 메틸렌 유니트는 -C(O)-으로 치환된다. 특정 구현으로, L은 -C(O)CH=CH(CH₃)-, -C(O)CH=CHCH₂NH(CH₃)-, -C(O)CH=CH(CH₃)-, -C(O)CH=CH-, -CH₂C(O)CH=CH-, -CH₂C(O)CH=CH(CH₃)-, -CH₂CH₂C(O)CH=CH-, -CH₂CH₂C(O)CH=CHCH₂-, -CH₂CH₂C(O)CH=CHCH₂NH(CH₃)-, 또는 -CH₂CH₂C(O)CH=CH(CH₃)-, 또는 -CH(CH₃)OC(O)CH=CH- 이다.

특정 구현으로, L은 2가 C_2-8 선형 또는 분지형, 탄화수소 사슬이며, 여기서 L은 적어도 하나의 이중 결합이며, 그리고 L의 적어도 하나의 메틸렌 유니트는 -OC(O)-로 치환된다.

일부 구현으로, L은 2가 C_2-8 선형 또는 분지형, 탄화수소 사슬이며, 여기서 L은 적어도 하나의 이중 결합을 가지며, 그리고 L의 적어도 하나의 메틸렌 유니트는 -NRC(O)-, -C(O)NR-, -N(R)SO₂-, -SO₂N(R)-, -S-, -S(O)-, -SO₂-, -OC(O)-, 또는 -C(O)O-, 및 L의 한 개 또는 두 개의 부가적인 메틸렌 유니트가 시클로프로필렌, -O-, -N(R)-, 또는 -C(O)-로 임의로 그리고 독립적으로 대체된다. 일부 구현으로, L은 -CH₂OC(O)CH=CHCH₂-, -CH₂-OC(O)CH=CH-, 또는 -CH(CH=CH₂)OC(O)CH=CH- 이다.

특정 구현으로, L은 -NRC(O)CH=CH-, -NRC(O)CH=CHCH₂N(CH₃)-, -NRC(O)CH=CHCH₂O-, -CH₂NRC(O)CH=CH-, -NRSO₂CH=CH-, -NRSO₂CH=CHCH₂-, -NRC(O)(C=N₂)C(O)-, -NRC(O)CH=CHCH₂N(CH₃)-, -NRSO₂CH=CH-, -NRSO₂CH=CHCH₂-, -NRC(O)CH=CHCH₂O-, -NRC(O)C(=CH₂)CH₂-, -CH₂NRC(O)-, -CH₂NRC(O)CH=CH-, -CH₂CH₂NRC(O)-, 또는 -CH₂NRC(O)시클로프로필렌-이며, 여기서 각 R은 독립적으로 수소이거나 임의로 치환된 C_1-6 지방족이다.

특정 구현으로, L은 -NHC(O)CH=CH-, -NHC(O)CH=CHCH₂N(CH₃)-, -NHC(O)CH=CHCH₂O-, -CH₂NHC(O)CH=CH-, -NHSO₂CH=CH-, -NHSO₂CH=CHCH₂-, -NHC(O)(C=N₂)C(O)-, -NHC(O)CH=CHCH₂N(CH₃)-, -NHSO₂CH=CH-, -NHSO₂CH=CHCH₂-, -NHC(O)CH=CHCH₂O-, -NHC(O)C(=CH₂)CH₂-, -CH₂NHC(O)-, -CH₂NHC(O)CH=CH=CH-, -CH₂CH₂NHC(O)-, 또는 -CH₂NHC(O)시클로프로필렌-이다.

일부 구현으로, L은 2가 C_2-8 선형 또는 분지형, 탄화수소 사슬이며, 여기서 L은 적어도 하나의 삼중 결합이다. 특정 구현으로, L은 2가 C-8 선형 또는 분지형, 탄화수소 사슬이며, 여기서 L은 적어도 하나의 삼중 결합이며, 그리고 L의 한 개 또는 두 개의 부가적인 메틸렌 유니트가 임의로 그리고 독립적으로 -NRC(O)-, -C(O)NR-, -S-, -S(O)-, -SO₂-, -C(=S)-, -C(=NR)-, -O-, -N(R)-, 또는 -C(O)-로 치환된다. 일부 구현으로, L은 적어도 하나의 삼중 결합이며, 그리고 L의 적어도 하나의 메틸렌 유니트는 -N(R)-, -N(R)C(O)-, -C(O)-, -C(O)O-, 또는 -OC(O)-, 또는 -O-로 치환된다.

예시적인 L기는 -C≡C-, -C≡CCH₂N(이소프로필)-, -NHC(O)≡CCH₂CH₂-, -CH₂-C≡C-CH₂-, -C≡CCH₂O-, -CH₂C(O)C≡C, -C(O)C≡C-, 또는 -CH₂OC(=O)C≡C-를 포함한다.

특정 구현으로, L은 이가 C_2-8 선형 또는 분지형, 탄화수소 사슬이며, 여기서 L의 한 개의 메틸렌 유니트는 시클로프로필렌으로 대체되며, 그리고 L의 한 개 또는 두 개의 부가적인 메틸렌 유니트는 독립적으로 C(O)-, -NRC(O)-, -C(O)NR-, -N(R)SO₂-, 또는 -SO₂N(R)-로 치환된다. 예시적인 L기는 -NHC(O)-시클로프로필렌-SO₂- 및 -NHC(O)-시클로프로필렌-을 포함한다.

상기 일반적으로 정의한 바와 같이, Y는 수소, 옥소, 할로겐, NO₂ 또는 CN으로 임의로 치환된 C_1-6 지방족, 또는 3-10 멤버드 모노시클릭 또는 비시클릭, 포화, 부분 포화 또는 질소, 산소 또는 황으로부터 독립적으로 선택된 0-3 헤테로원자를 갖는 아릴 고리이며, 그리고 여기서 상기 고리는 1-4 R^e 기로 치환되며; 그리고 각 R^e는 -Q-Z, 옥소, NO2, 할로겐, CN 또는 C_1-6 지방족으로부터 독립적으로 선택되며, 여기서 Q는 공유 결합이거나 2가 C_1-6 포화 또는 불포화, 선형 또는 분지형 탄화수소 사슬이며, 여기서 Q의 한 개 또는 두 개의 메틸렌 유니트는 임의로 그리고 독립적으로 -N(R)-, -S-, -O-, -C(O)-, -OC(O)-, -C(O)O-, -SO-, 또는 -SO₂-, N(R)C(O)-, -C(O)N(R)-, -N(R)SO₂- 또는 -SO₂N(R)-으로 치환되며; 그리고 Z는 수소이거나 옥소, 할로겐, NO₂, 또는 CN으로 임의로 치환된 C_1-6 지방족이다.

특정 구현으로, Y는 수소이다.

특정 구현으로, Y는 옥소, 할로겐, NO₂ 또는 CN으로 임의로 치환된 C_1-6 지방족이다. 일부 구현으로, Y는 옥소, 할로겐, NO₂ 또는 CN으로 임의로 치환된 C_2-6 알케닐이다. 다른 구현으로, Y는 옥소, 할로겐, NO₂ 또는 CN으로 임의로 치환된 C_1-6 알키닐이다. 일부 구현으로, Y는 C_2-6 알케닐이다. 다른 구현으로, Y는 C_2-4 알키닐이다.

다른 구현으로, Y는 옥소, 할로겐, NO₂ 또는 CN으로 치환된 C_1-6 알킬이다. 이러한 Y기는 -CH₂F, -CH₂Cl, -CH₂CN 및 -CH₂NO₂를 포함한다. 특정 구현으로, Y는 질소, 산소 또는 황으로부터 독립적으로 선택된 0-3 헤테로원자를 갖는 포화 3-6 멤버드 모노시클릭 고리이며, 여기서 Y는 1-4 R^e 기로 치환되며, 여기서 각 R^e는 본 명세서에 상기 정의하고 기술한 바와 같다.

일부 구현으로, Y는 산소 또는 질소로부터 선택된 1 헤테로원자를 갖는 포화 3-4 멤버드 헤테로시클릭 고리이며, 여기서 상기 고리는 1-2 R^e 기로 치환되며, 여기서 각 R^e는 본 명세서에서 상기 정의하고 기술한 바와 같다. 예시적으로 이러한 고리는 에폭시드 및 옥세탄 고리이며, 여기서 각 고리는 1-2 R^e기로 치환되며, 여기서 각 R^e는 본 명세서에 상기 정의하고 기술한 바와 같다.

다른 구현으로, Y는 산소 또는 질소로부터 선택된 1-2 헤테로원자를 갖는 포화 5-6 멤버드 헤테로시클릭 고리이며, 여기서 상기 고리는 1-4 R^e 기로 치환되며, 여기서 각 R^e는 본 명세서에 상기 정의하고 기술한 바와 같다. 이러한 고리는 피페리딘 및 피롤리돈을 포함하며, 여기서 각 고리는 -4 R^e 기로 치환되며, 여기서 각 R^e는 본 명세서에 상기 정의하고 기술한 바와 같다. 특정 구현으로, Y는

이며, 여기서 각 R, Q, Z 및 R^e는 본 명세서에 상기 정의하고 기술한 바와 같다.

일부 구현으로, Y는 포화 3-6 멤버드 카르복실릭 고리이며, 여기서 상기 고리는 1-4 R^e 기로 치환되며, 여기서 R^e는 본 명세서에 상기 정의하고 기술한 바와 같다. 특정 구현으로, Y는 시클로프로필, 시클로부틸, 시클로펜틸 또는 시클로헥실이며, 여기서 각 고리는 1-4 R^e 기로 치환되며, 여기서 각 R^e는 본 명세서에 상기 정의하고 기술한 바와 같다. 특정 구현으로, Y는

이며, 여기서 각 R^e는 본 명세서에 상기 정의하고 기술한 바와 같다. 특정 구현으로, Y는 할로겐, CN 또는 NO₂로 임의로 치환된 시클로프로필이다.

특정 구현으로, Y는 질소, 산소 또는 황으로부터 독립적으로 선택된 0-3 헤테로원자를 갖는 부분 불포화 3-6 멤버드 모노시클릭 고리이며, 여기서 상기 고리는 1-4 R^e 기로 치환되며, 여기서 각 R^e는 본 명세서에 상기 정의하고 기술한 바와 같다.

일부 구현으로, Y는 부분 불포화 3-6 멤버드 카르보시클릭 고리이며, 여기서 상기 고리는 1-4 R^e 기로 치환되며, 여기서 각 R^e는 본 명세서에 상기 정의하고 기술한 바와 같다. 일부 구현으로, Y는 시클로프로페닐, 시클로부테닐, 시클로펜테닐 또는 시클로헥세닐이며, 여기서 각 고리는 1-4 R^e 기로 치환되며, 여기서 R^e는 본 명세서에 상기 정의하고 기술한 바와 같다. 특정 구현으로, Y는

이며, 여기서 각 R^e는 본 명세서에 상기 정의하고 기술한 바와 같다.

특정 구현으로, Y는 질소, 산소 또는 황으로부터 독립적으로 선택된 1-2 헤테로원자를 갖는 부분 불포화 4-6 멤버 헤테로시클릭 고리이며, 여기서 상기 고리는 1-4 R^e 기로 치환되며, 여기서 각 R^e는 본 명세서에 상기 정의하고 기술한 바와 같다. 특정 구현으로, Y는

로부터 선택되며, 여기서 R 및 R^e는 본 명세서에 상기 정의하고 기술한 바와 같다.

특정 구현으로, Y는 0-2 질소를 갖는 6-멤버드 방향족 고리이며, 여기서 상기 고리는 1-4 R^e 기로 치환되며, 여기서 각 R^e는 본 명세서에 상기 정의하고 기술한 바와 같다. 특정 구현으로, Y는 페닐, 피리딜 또는 피리미디닐이며, 여기서 각 고리는 1-4 R^e 기로 치환되며, 여기서 각 R^e는 본 명세서에 상기 정의하고 기술한 바와 같다.

일부 구현으로, Y는

로부터 선택되며, 여기서 R^e는 본 명세서에 상기 정의하고 기술한 바와 같다.

다른 구현으로, Y는 5-멤버드 질소, 산소 또는 황으로부터 독립적으로 선택된 1-3 헤테로원자를 갖는 헤테로아릴 고리이며, 여기서 상기 고리는 1-3 R^e 기로 치환되며, 여기서 R^e는 본 명세서에 상기 정의하고 기술한 바와 같다. 일부 구현으로, Y는 질소, 산소 및 황으로부터 독립적으로 선택된 1-3 헤테로원자를 갖는 5 멤버드 부분 불포화 또는 아릴 고리이며, 여기서 상기 고리는 1-4 R^e 기로 치환되며, 여기서 각 R^e는 본 명세서에 상기 정의하고 기술한 바와 같다. 예시적인 이러한 고리는 이속사졸릴, 옥사졸릴, 티아졸릴, 이미다졸릴, 피라졸릴, 피롤릴, 퓨라닐, 티에닐, 트리아졸, 티아디아졸, 및 옥사디아졸이며, 여기서 각 고리는 1-R^e 기로 치환되며, 여기서 각 R^e는 본 명세서에 상기 정의하고 기술한 바와 같다. 특정 구현으로, Y는

로부터 선택되며, 여기서 각 R 및 R^e는 본 명세서에 상기 정의하고 기술한 바와 같다.

특정 구현으로, Y는 8-10 멤버드 비시클릭, 포화, 부분 불포화 또는 질소, 산소 또는 황으로부터 독립적으로 선택된 0-3 헤테로원자를 갖는 아릴 고리이며, 여기서 상기 고리는 1-4 R^e 기로 치환되며, 여기서 각 R^e는 본 명세서에 상기 정의하고 기술한 바와 같다. 또 다른 견지에 따르면, Y는 질소, 산소 또는 황으로부터 독립적으로 선택된 1-3 헤테로원자를 갖는 9-10 멤버드 비시클릭, 부분 불포화, 또는 아릴 고리이며, 여기서 상기 고리는 1-4 R^e 기로 치환되며, 여기서 각 R^e는 본 명세서에 상기 정의하고 기술한 바와 같다. 예시적인 이러한 비시클릭 고리는 2,3-디하이드로벤조[d]이소티아졸을 포함하며, 여기서 상기 고리는 1-4R^e 기로 치환되며, 여기서 각 R^e는 본 명세서에 상기 정의하고 기술한 바와 같다.

상기 일반적으로 정의된 바와 같이, 각 R^e는 -Q-Z, 옥소, NO₂, 할로겐, CN, 적절한 이탈기, 또는 옥소, 할로겐, NO₂ 또는 CN으로 임의로 치환된 C_1-6 지방족이며, 여기서 Q는 공유 결합이거나 2가 C_1-6 포화 또는 불포화, 선형 또는 분지형, 탄화수소 사슬이며, 여기서 Q의 한 개 또는 두 개의 메틸렌 유니트는 임의로 그리고 독립적으로 -N(R)-, -S-, -O-, -C(O)-, -OC(O)-, -SO-, 또는 -SO₂-, -N(R)C(O)-, -C(O)N(R)-, -N(R)SO₂-, 또는 -SO₂N(R)-로 치환되며; 그리고 Z는 수소 또는 옥소, 할로겐, NO₂ 또는 CN으로 임의로 치환된 C_1-6 지방족이다.

특정 구현으로, R^e는 옥소, 할로겐, NO₂ 또는 CN으로 임의로 치환된 C_1-6 지방족이다. 다른 구현으로, R^e는 옥소, NO₂, 할로겐 또는 CN이다. 일부 구현으로, R^e는 -Q-Z이며, 여기서 Q는 공유 결합이며, 그리고 Z는 수소(즉, R^e는 수소)이다. 다른 구현으로, R^e는 -Q-Z이며, 여기서 Q는 2가 C_1-6 포화 또는 불포화, 선형 또는 분지형, 탄화수소 사슬이며, 여기서 Q의 한 개 또는 두 개의 메틸렌 유니트는 임의로 그리고 독립적으로 -NR-, -NRC(O)-, -C(O)NR-, -S-, -O-, -C(O)-, -SO-, 또는 -SO₂-로 치환된다. 다른 구현으로, Q는 적어도 하나의 이중 결합을 갖는 2가 C_2-6 선형 또는 분지형, 탄화수소 사슬이며, 여기서 Q의 한 개 또는 두 개의 메틸렌 유니트는 임의로 그리고 독립적으로 -NR-, -NRC(O)-, -C(O)NR-, -S-, -O-, -C(O)- 또는 -SO₂-로 치환된다. 특정 구현으로, R^e 기의 Z부는 수소이다. 일부 구현으로, -Q-Z는 -NHC(O)CH=CH₂ 또는 -C(O)CH=CH₂이다.

특정 구현으로, 각 R^e는 옥소, NO₂, CN, 플루오로, 클로로, -NHC(O)CH=CH₂, -C(O)CH=CH₂, -CH₂CH=CH₂, -C≡CH, -C(O)OCH₂Cl, -C(O)OCH₂F, -C(O)OCH₂CN, -C(O)CH₂Cl, -C(O)CH₂F, -C(O)CH₂CN 또는 -CH₂C(O)CH₃로부터 독립적으로 선택된다.

특정 구현으로, R^e는 적절한 이탈기, 즉, 친핵성 배위가 일어나는 기이다. "적절한 이탈기"는 관심있는 시스테인의 티올 부와 같이 원하는 도입되는 화학부에 의해 쉽게 이동되는 화학기이다. 적절한 이탈기는 당 기술분야에 잘 알려져 있다(참조 예, "Advanced Organic Chemistry", Jerry March, 5th Ed., pp. 351-357, John Wiley and Sons, N.Y.). 이러한 이탈기는 이에 한정하는 것은 아니나, 할로겐, 알콕시, 설포닐옥시, 임의로 치환된 알킬설포닐옥시, 임의로 치환된 알케닐설포닐옥시, 임의로 치환된 아릴설포닐옥시, 아실 및 디아조늄 부를 포함한다. 적절한 이탈기의 예는 클로로, 요오드, 브로모, 플루오로, 아세틸, 메탄설포닐옥시(메실옥시), 토실옥시, 트리플릴옥시, 니트로-페틸설포닐옥시(노실옥시), 및 브로모-페닐설포닐옥시(브로실옥시)를 포함한다.

특정 구현으로, 하기 구현 및 조합의 L-Y가 적용된다:

(a) L은 2가 C_2-8 선형 또는 분지형, 탄화수소 사슬이며, 여기서 L은 적어도 하나의 이중 결합을 가지며, 그리고 L의 한 개 또는 두 개의 부가적인 메틸렌 유니트는 임의로 그리고 독립적으로 -NRC(O)-, -C(O)NR-, -N(R)SO₂-, -SO₂N(R)-, -S-, -S(O)-, -SO₂-, -OC(O)-, -C(O)O-, 시클로프로필렌, -O-, -N(R)-, 또는 -C(O)-으로 치환되며; 그리고 Y는 수소이거나 옥소, 할로겐, NO2 또는 CN으로 임의로 치환되며; 또는

(b) L은 2가 C_2-8 선형 또는 분지형, 탄화수소 사슬이며, 여기서 L은 적어도 하나의 이중 결합을 가지며, 그리고 L의 적어도 하나의 메틸렌 유니트는 C(O)-, -NRC(O)-, -C(O)NR-, -N(R)SO₂-, -SO₂N(R)-, -S-, -S(O)-, -SO₂-, -OC(O)-, 또는 -C(O)O-로 치환되며, 그리고 L의 한 개 또는 두 개의 부가적인 메틸렌 유니트는 임의로 그리고 독립적으로 시클로프로필렌, -O-, -N(R)- 또는 -C(O)-으로 치환되며; 그리고 Y는 수소이거나 옥소, 할로겐, NO2 또는 CN으로 임의로 치환된 C1-6 지방족이며; 또는

(c) L은 2가 C_2-8 선형 또는 분지형, 탄화수소 사슬이며, 여기서 L은 적어도 하나의 이중 결합을 가지며, 그리고 L의 적어도 하나의 메틸렌 유니트는 C(O)-로 치환되며, 그리고 L의 한 개 또는 두 개의 부가적인 메틸렌 유니트는 임의로 그리고 독립적으로 시클로프로필렌, -O-, -N(R)- 또는 -C(O)-으로 치환되며; 그리고 Y는 수소이거나 옥소, 할로겐, NO₂ 또는 CN으로 임의로 치환된 C_1-6 지방족이며; 또는

(d) L은 2가 C_2-8 선형 또는 분지형, 탄화수소 사슬이며, 여기서 L은 적어도 하나의 이중 결합을 가지며, 그리고 L의 적어도 하나의 메틸렌 유니트는 C(O)-으로 치환되며; 그리고 Y는 수소이거나 옥소, 할로겐, NO₂ 또는 CN으로 임의로 치환된 C_1-6 지방족이며; 또는

(e) L은 2가 C_2-8 선형 또는 분지형, 탄화수소 사슬이며, 여기서 L은 적어도 하나의 이중 결합을 가지며, 그리고 L의 적어도 하나의 메틸렌 유니트는 -OC(O)-으로 치환되며; 그리고 Y는 수소이거나 옥소, 할로겐, NO₂ 또는 CN으로 임의로 치환된 C_1-6 지방족이며; 또는

(f) L은 -NRC(O)CH=CH-, -NRC(O)CH=CHCH₂N(CH₃)-, -NRC(O)CH=CHCH₂O-, -CH₂NRC(O)CH=CH-, -NRSO₂CH=CH-, -NRSO₂CH=CHCH₂-, -NRC(O)(C=N₂)-, -NRC(O)(C=N₂)C(O)-, -NRC(O)CH=CHCH₂N(CH₃)-, -NRSO₂CH=CH-, -NRSO₂CH=CHCH₂-, -NRC(O)CH=CHCH₂O-, -NRC(O)C(=CH₂)CH₂-, -CH₂NRC(O)-, -CH₂NRC(O)CH=CH-, -CH₂CH₂NRC(O)-, 또는 -CH₂NRC(O)시클로프로필렌-이며; 여기서 R은 H이거나 임의로 치환된 C_1-6 지방족이며; 그리고 Y는 수소이거나 옥소, 할로겐, NO₂ 또는 CN으로 임의로 치환된 C_1-6 지방족이며; 또는

(g) L은 -NHC(O)CH=CH-, -NHC(O)CH=CHCH₂(CH₃-), -NHC(O)CH=CHCH₂O-, -CH₂NHC(O)CH=CH-, -NHSO₂CH=CH-, -NHSO₂CH=CHCH₂-, -NHC(O)(C=N₂)-, -NHC(O)(C=N₂)C(O)-, -NHC(O)CH=CHCH₂N(CH₃)-, -NHSO₂CH=CH-, -NHSO₂CH=CHCH₂-, -NHC(O)CH=CHCH₂O-, -NHC(O)C(=CH₂)-, -CH₂NHC(O)-, -CH₂NHC(O)CH=CH-, -CH₂CH₂NHC(O)-, 또는 -CH₂NHC(O)시클로프로필렌-이며; 그리고 Y는 수소이거나, 옥소, 할로겐, NO₂ 또는 CN으로 임의로 치환된 C_1-6 지방족이며; 또는

(h) L은 2가 C_2-8 선형 또는 분지형, 탄화수소 사슬이며, 여기서 L은 적어도 하나의 알킬리데닐 이중 결합이며, 그리고 L의 적어도 하나의 메틸렌 유니트는 -C(O)-, -NRC(O)-, -C(O)NR-, -N(R)SO₂-, -SO₂N(R)-, -S-, -S(O)-, -SO₂-, -OC(O)-, 또는 -C(O)O-로 치환되며, 그리고 L의 하나 또는 두 개의 부가적인 메틸렌 유니트는 임의로 그리고 독립적으로 시클로프로필렌, -O-, -N(R)-, 또는 -C(O)-으로 치환되며; 그리고 Y는 수소이거나 옥소, 할로겐, NO₂ 또는 CN으로 임의로 치환되며; 또는

(i) L은 2가 C_2-8 선형 또는 분지형, 탄화수소 사슬이며, 여기서 L은 적어도 하나의 삼중 결합이며, 그리고 L의 한 개 또는 두 개의 부가적인 메틸렌 유니트는 임의로 그리고 독립적으로 -NRC(O)-, -C(O)NR-, -N(R)SO₂-, -SO₂N(R)-, -S-, -S(O)-, -SO₂-, -OC(O)-, 또는 -C(O)O-으로 치환되며, 그리고 Y는 수소이거나 옥소, 할로겐, NO₂ 또는 CN으로 임의로 치환되며;

(j) L은 -C≡C-, -C≡CCH₂N(이소프로필)-, -NHC(O)C≡CCH₂CH₂-, -CH₂-C≡C-CH₂-, -C≡CCH₂O-, -CH₂C(O)C≡C-, -C(O)C=C-, 또는 -CH₂OC(=O)C≡C이며; 그리고 Y는 수소이거나 옥소, 할로겐, NO₂ 또는 CN으로 임의로 치환되며; 또는

(k) L은 2가 C_2-8 선형 또는 분지형, 탄화수소 사슬이며, 여기서 L의 하나의 메틸렌 유니트는 시클로프로필렌으로 치환되며, 그리고 L의 한 개 또는 두 개의 부가적인 메틸렌 유니트는 -NRC(O)-, -C(O)NR-, -N(R)SO₂-, -SO₂N(R)-, -S-, -S(O)-, -SO₂-, -OC(O)-, 또는 -C(O)O-으로 독립적으로 치환되며; 그리고 Y는 수소이거나 옥소, 할로겐, NO₂, 또는 CN으로 임의로 치환된 C_1-6 지방족이며; 또는

(l) L은 공유 결합이며, Y는 하기로부터 선택되며;

(i) 옥소, 할로겐, NO₂ 또는 CN으로 치환된 C_1-6 알킬; 또는

(ii) 옥소, 할로겐, NO₂ 또는 CN으로 임의로 치환된 C_2-6 알케닐; 또는

(iii) 옥소, 할로겐, NO₂ 또는 CN으로 임의로 치환된 C_2-6 알키닐; 또는

(iv) 산소 또는 질소로부터 선택된 1 헤테로원자를 갖는 포화 3-4 멤버드 헤테로시클릭 고리, 여기서 상기 고리는 1-2 R^e 기로 치환되며, 여기서 각 R^e는 본 명세서에 상기 정의하고 기술한 바와 같음; 또는

(v) 산소 또는 질소로부터 선택된 1-2 헤테로원자를 갖는 포화 5-6 멤버드 헤테로시클릭 고리, 여기서 상기 고리는 1-4 Re 기로 치환되며, 여기서 각 R^e는 본 명세서에 상기 정의하고 기술한 바와 같음; 또는

(vi)

이며, 여기서 각 R, Q, Z 및 R^e는 본 명세서에 상기 정의하고 기술한 바와 같음; 또는

(vii) 포화 3-6 멤버드 카보시클릭 고리이며, 여기서 상기 고리는 1-4 R^e는 본 명세서에 상기 정의하고 기술한 바와 같으며; 또는

(viii) 질소, 산소 또는 황으로부터 독립적으로 선택된 0-3 헤테로원자를 갖는 부분 불포화 3-6 멤버드 모노시클릭 고리, 여기서 상기 고리는 1-4 R^e로 치환되며, 여기서 각 R^e는 본 명세서에 상기 정의하고 기술한 바와 같음; 또는

(ix) 부분 불포화 3-6 멤버드 카르복시클릭 고리, 여기서 상기 고리는 1-4 R^e로 치환되며, 여기서 각 R^e는 본 명세서에 상기 정의하고 기술한 바와 같음; 또는

(x)

여기서 각 R^e는 본 명세서에 상기 정의하고 기술한 바와 같음; 또는

(xi) 질소, 산소 또는 황으로부터 독립적으로 선택된 1-2 헤테로원자를 갖는 부분 불포화 4-6 멤버드 헤테로시클릭 고리, 여기서 상기 고리는 1-4 R^e 기로 치환되며, 여기서 각 R^e는 본 명세서에 상기 정의하고 기술한 바와 같음; 또는

(xii)

여기서 각 R 및 R^e는 본 명세서에 상기 정의하고 기술한 바와 같음; 또는

(xiii) 0-2 질소를 갖는 6-멤버드 방향족 고리, 여기서 상기 고리는 1-4 R^e 기로 치환되며, 여기서 각 R^e는 본 명세서에 상기 정의하고 기술한 바와 같음; 또는

(xiv)

여기서 각 R^e는 본 명세서에 상기 정의하고 기술한 바와 같으며; 또는

(xv) 질소, 산소 또는 황으로부터 독립적으로 선택된 1-3 헤테로원자를 갖는 5-멤버드 헤테로아릴 고리, 여기서 상기 고리는 1-3 R^e 기로 치환되며, 여기서 각 R^e는 본 명세서에 상기 정의하고 기술한 바와 같음; 또는

(xvi)

여기서 각 R 및 R^e는 본 명세서에 상기 정의하고 기술한 바와 같으며; 또는

(xvii) 질소, 산소, 또는 황으로부터 독립적으로 선택된 0-3 헤테로원자를 갖는 8-10 멤버드 비시클릭, 포화, 부분 포화 또는 아릴 고리, 여기서 상기 고리는 1-4 R^e 기로 치환되며, 여기서 각 R^e는 본 명세서에 상기 정의하고 기술한 바와 같음;

(m) L은 -C(O)-이며, 그리고 Y는 하기로부터 선택되며;

(i) 옥소, 할로겐, NO₂ 또는 CN으로 치환된 C_1-6 알킬; 또는

(ii) 옥소, 할로겐, NO₂ 또는 CN으로 임의로 치환된 C_2-6 알케닐; 또는

(iii) 옥소, 할로겐, NO₂ 또는 CN으로 임의로 치환된 C_2-6 알키닐; 또는

(iv) 산소 또는 질소로부터 선택된 1 헤테로원자를 갖는 포화 3-4 멤버드 헤테로시클릭 고리, 여기서 상기 고리는 1-2 R^e 기로 치환되며, 여기서 각 R^e는 본 명세서에 상기 정의하고 기술한 바와 같음; 또는

(v) 산소 또는 질소로부터 선택된 1-2 헤테로원자를 갖는 포화 5-6 멤버드 헤테로시클릭 고리, 여기서 상기 고리는 1-4 Re 기로 치환되며, 여기서 각 R^e는 본 명세서에 상기 정의하고 기술한 바와 같음; 또는

(vi)

이며, 여기서 각 R, Q, Z 및 R^e는 본 명세서에 상기 정의하고 기술한 바와 같음; 또는

(vii) 포화 3-6 멤버드 카보시클릭 고리이며, 여기서 상기 고리는 1-4 R^e는 본 명세서에 상기 정의하고 기술한 바와 같으며; 또는

(viii) 질소, 산소 또는 황으로부터 독립적으로 선택된 0-3 헤테로원자를 갖는 부분 불포화 3-6 멤버드 모노시클릭 고리, 여기서 상기 고리는 1-4 R^e로 치환되며, 여기서 각 R^e는 본 명세서에 상기 정의하고 기술한 바와 같음; 또는

(ix) 부분 불포화 3-6 멤버드 카르복시클릭 고리, 여기서 상기 고리는 1-4 R^e로 치환되며, 여기서 각 R^e는 본 명세서에 상기 정의하고 기술한 바와 같음; 또는

(x)

여기서 각 R^e는 본 명세서에 상기 정의하고 기술한 바와 같음; 또는

(xi) 질소, 산소 또는 황으로부터 독립적으로 선택된 1-2 헤테로원자를 갖는 부분 불포화 4-6 멤버드 헤테로시클릭 고리, 여기서 상기 고리는 1-4 R^e 기로 치환되며, 여기서 각 R^e는 본 명세서에 상기 정의하고 기술한 바와 같음; 또는

(xii)

여기서 각 R 및 R^e는 본 명세서에 상기 정의하고 기술한 바와 같음; 또는

(xiii) 0-2 질소를 갖는 6-멤버드 방향족 고리, 여기서 상기 고리는 1-4 R^e 기로 치환되며, 여기서 각 R^e는 본 명세서에 상기 정의하고 기술한 바와 같음; 또는

(xiv)

여기서 각 R^e는 본 명세서에 상기 정의하고 기술한 바와 같으며; 또는

(xv) 질소, 산소 또는 황으로부터 독립적으로 선택된 1-3 헤테로원자를 갖는 5-멤버드 헤테로아릴 고리, 여기서 상기 고리는 1-3 R^e 기로 치환되며, 여기서 각 R^e는 본 명세서에 상기 정의하고 기술한 바와 같음; 또는

(xvi)

여기서 각 R 및 R^e는 본 명세서에 상기 정의하고 기술한 바와 같으며; 또는

(xvii) 질소, 산소, 또는 황으로부터 독립적으로 선택된 0-3 헤테로원자를 갖는 8-10 멤버드 비시클릭, 포화, 부분 포화 또는 아릴 고리, 여기서 상기 고리는 1-4 R^e 기로 치환되며, 여기서 각 R^e는 본 명세서에 상기 정의하고 기술한 바와 같음;

(n) L은 -N(R)C(O)-이며, Y는 하기로부터 선택되며;

(i) 옥소, 할로겐, NO₂ 또는 CN으로 치환된 C_1-6 알킬; 또는

(ii) 옥소, 할로겐, NO₂ 또는 CN으로 임의로 치환된 C_2-6 알케닐; 또는

(iii) 옥소, 할로겐, NO₂ 또는 CN으로 임의로 치환된 C_2-6 알키닐; 또는

(iv) 산소 또는 질소로부터 선택된 1 헤테로원자를 갖는 포화 3-4 멤버드 헤테로시클릭 고리, 여기서 상기 고리는 1-2 R^e 기로 치환되며, 여기서 각 R^e는 본 명세서에 상기 정의하고 기술한 바와 같음; 또는

(v) 산소 또는 질소로부터 선택된 1-2 헤테로원자를 갖는 포화 5-6 멤버드 헤테로시클릭 고리, 여기서 상기 고리는 1-4 Re 기로 치환되며, 여기서 각 R^e는 본 명세서에 상기 정의하고 기술한 바와 같음; 또는

(vi)

이며, 여기서 각 R, Q, Z 및 R^e는 본 명세서에 상기 정의하고 기술한 바와 같음; 또는

(vii) 포화 3-6 멤버드 카보시클릭 고리이며, 여기서 상기 고리는 1-4 R^e는 본 명세서에 상기 정의하고 기술한 바와 같으며; 또는

(viii) 질소, 산소 또는 황으로부터 독립적으로 선택된 0-3 헤테로원자를 갖는 부분 불포화 3-6 멤버드 모노시클릭 고리, 여기서 상기 고리는 1-4 R^e로 치환되며, 여기서 각 R^e는 본 명세서에 상기 정의하고 기술한 바와 같음; 또는

(ix) 부분 불포화 3-6 멤버드 카르복시클릭 고리, 여기서 상기 고리는 1-4 R^e로 치환되며, 여기서 각 R^e는 본 명세서에 상기 정의하고 기술한 바와 같음; 또는

(x)

여기서 각 R^e는 본 명세서에 상기 정의하고 기술한 바와 같음; 또는

(xi) 질소, 산소 또는 황으로부터 독립적으로 선택된 1-2 헤테로원자를 갖는 부분 불포화 4-6 멤버드 헤테로시클릭 고리, 여기서 상기 고리는 1-4 R^e 기로 치환되며, 여기서 각 R^e는 본 명세서에 상기 정의하고 기술한 바와 같음; 또는

(xii)

여기서 각 R 및 R^e는 본 명세서에 상기 정의하고 기술한 바와 같음; 또는

(xiii) 0-2 질소를 갖는 6-멤버드 방향족 고리, 여기서 상기 고리는 1-4 R^e 기로 치환되며, 여기서 각 R^e는 본 명세서에 상기 정의하고 기술한 바와 같음; 또는

(xiv)

여기서 각 R^e는 본 명세서에 상기 정의하고 기술한 바와 같으며; 또는

(xv) 질소, 산소 또는 황으로부터 독립적으로 선택된 1-3 헤테로원자를 갖는 5-멤버드 헤테로아릴 고리, 여기서 상기 고리는 1-3 R^e 기로 치환되며, 여기서 각 R^e는 본 명세서에 상기 정의하고 기술한 바와 같음; 또는

(xvi)

여기서 각 R 및 R^e는 본 명세서에 상기 정의하고 기술한 바와 같으며; 또는

(xvii) 질소, 산소, 또는 황으로부터 독립적으로 선택된 0-3 헤테로원자를 갖는 8-10 멤버드 비시클릭, 포화, 부분 포화 또는 아릴 고리, 여기서 상기 고리는 1-4 R^e 기로 치환되며, 여기서 각 R^e는 본 명세서에 상기 정의하고 기술한 바와 같음;

(o) L은 2가 C_1-8 포화 또는 불포화, 선형 또는 분지형, 탄화수소 사슬이며; 그리고 Y는 하기로부터 선택되며;

(i) 옥소, 할로겐, NO₂ 또는 CN으로 치환된 C_1-6 알킬; 또는

(ii) 옥소, 할로겐, NO₂ 또는 CN으로 임의로 치환된 C_2-6 알케닐; 또는

(iii) 옥소, 할로겐, NO₂ 또는 CN으로 임의로 치환된 C_2-6 알키닐; 또는

(iv) 산소 또는 질소로부터 선택된 1 헤테로원자를 갖는 포화 3-4 멤버드 헤테로시클릭 고리, 여기서 상기 고리는 1-2 R^e 기로 치환되며, 여기서 각 R^e는 본 명세서에 상기 정의하고 기술한 바와 같음; 또는

(v) 산소 또는 질소로부터 선택된 1-2 헤테로원자를 갖는 포화 5-6 멤버드 헤테로시클릭 고리, 여기서 상기 고리는 1-4 R^e 기로 치환되며, 여기서 각 R^e는 본 명세서에 상기 정의하고 기술한 바와 같음; 또는

(vi)

이며, 여기서 각 R, Q, Z 및 R^e는 본 명세서에 상기 정의하고 기술한 바와 같음; 또는

(vii) 포화 3-6 멤버드 카보시클릭 고리이며, 여기서 상기 고리는 1-4 R^e는 본 명세서에 상기 정의하고 기술한 바와 같으며; 또는

(viii) 질소, 산소 또는 황으로부터 독립적으로 선택된 0-3 헤테로원자를 갖는 부분 불포화 3-6 멤버드 모노시클릭 고리, 여기서 상기 고리는 1-4 R^e로 치환되며, 여기서 각 R^e는 본 명세서에 상기 정의하고 기술한 바와 같음; 또는

(ix) 부분 불포화 3-6 멤버드 카르복시클릭 고리, 여기서 상기 고리는 1-4 R^e로 치환되며, 여기서 각 R^e는 본 명세서에 상기 정의하고 기술한 바와 같음; 또는

(x)

여기서 각 R^e는 본 명세서에 상기 정의하고 기술한 바와 같음; 또는

(xi) 질소, 산소 또는 황으로부터 독립적으로 선택된 1-2 헤테로원자를 갖는 부분 불포화 4-6 멤버드 헤테로시클릭 고리, 여기서 상기 고리는 1-4 R^e 기로 치환되며, 여기서 각 R^e는 본 명세서에 상기 정의하고 기술한 바와 같음; 또는

(xii)

여기서 각 R 및 R^e는 본 명세서에 상기 정의하고 기술한 바와 같음; 또는

(xiii) 0-2 질소를 갖는 6-멤버드 방향족 고리, 여기서 상기 고리는 1-4 R^e 기로 치환되며, 여기서 각 R^e는 본 명세서에 상기 정의하고 기술한 바와 같음; 또는

(xiv)

여기서 각 R^e는 본 명세서에 상기 정의하고 기술한 바와 같으며; 또는

(xv) 질소, 산소 또는 황으로부터 독립적으로 선택된 1-3 헤테로원자를 갖는 5-멤버드 헤테로아릴 고리, 여기서 상기 고리는 1-3 R^e 기로 치환되며, 여기서 각 R^e는 본 명세서에 상기 정의하고 기술한 바와 같음; 또는

(xvi)

여기서 각 R 및 R^e는 본 명세서에 상기 정의하고 기술한 바와 같으며; 또는

(xvii) 질소, 산소, 또는 황으로부터 독립적으로 선택된 0-3 헤테로원자를 갖는 8-10 멤버드 비시클릭, 포화, 부분 포화 또는 아릴 고리, 여기서 상기 고리는 1-4 R^e 기로 치환되며, 여기서 각 R^e는 본 명세서에 상기 정의하고 기술한 바와 같음;

(p) L은 공유 결합, -CH₂-, -NH-, -C(O)-, -CH₂NH-, -NHCH₂-, -NHC(O)-, -NHC(O)CH₂OC(O)-, -CH₂NHC(O)-, -NHSO₂-, -NHSO₂CH₂-, -NHC(O)CH₂OC(O)-, 또는 -SO₂NH-이며; 그리고 Y는 하기로부터 선택되며;

(i) 옥소, 할로겐, NO₂ 또는 CN으로 치환된 C_1-6 알킬; 또는

(ii) 옥소, 할로겐, NO₂ 또는 CN으로 임의로 치환된 C_2-6 알케닐; 또는

(iii) 옥소, 할로겐, NO₂ 또는 CN으로 임의로 치환된 C_2-6 알키닐; 또는

(iv) 산소 또는 질소로부터 선택된 1 헤테로원자를 갖는 포화 3-4 멤버드 헤테로시클릭 고리, 여기서 상기 고리는 1-2 R^e 기로 치환되며, 여기서 각 R^e는 본 명세서에 상기 정의하고 기술한 바와 같음; 또는

(v) 산소 또는 질소로부터 선택된 1-2 헤테로원자를 갖는 포화 5-6 멤버드 헤테로시클릭 고리, 여기서 상기 고리는 1-4 R^e 기로 치환되며, 여기서 각 R^e는 본 명세서에 상기 정의하고 기술한 바와 같음; 또는

(vi)

이며, 여기서 각 R, Q, Z 및 R^e는 본 명세서에 상기 정의하고 기술한 바와 같음; 또는

(vii) 포화 3-6 멤버드 카보시클릭 고리이며, 여기서 상기 고리는 1-4 R^e는 본 명세서에 상기 정의하고 기술한 바와 같으며; 또는

(viii) 질소, 산소 또는 황으로부터 독립적으로 선택된 0-3 헤테로원자를 갖는 부분 불포화 3-6 멤버드 모노시클릭 고리, 여기서 상기 고리는 1-4 R^e로 치환되며, 여기서 각 R^e는 본 명세서에 상기 정의하고 기술한 바와 같음; 또는

(ix) 부분 불포화 3-6 멤버드 카르복시클릭 고리, 여기서 상기 고리는 1-4 R^e로 치환되며, 여기서 각 R^e는 본 명세서에 상기 정의하고 기술한 바와 같음; 또는

(x)

여기서 각 R^e는 본 명세서에 상기 정의하고 기술한 바와 같음; 또는

(xi) 질소, 산소 또는 황으로부터 독립적으로 선택된 1-2 헤테로원자를 갖는 부분 불포화 4-6 멤버드 헤테로시클릭 고리, 여기서 상기 고리는 1-4 R^e 기로 치환되며, 여기서 각 R^e는 본 명세서에 상기 정의하고 기술한 바와 같음; 또는

(xii)

여기서 각 R 및 R^e는 본 명세서에 상기 정의하고 기술한 바와 같음; 또는

(xiii) 0-2 질소를 갖는 6-멤버드 방향족 고리, 여기서 상기 고리는 1-4 R^e 기로 치환되며, 여기서 각 R^e는 본 명세서에 상기 정의하고 기술한 바와 같음; 또는

(xiv)

여기서 각 R^e는 본 명세서에 상기 정의하고 기술한 바와 같으며; 또는

(xv) 질소, 산소 또는 황으로부터 독립적으로 선택된 1-3 헤테로원자를 갖는 5-멤버드 헤테로아릴 고리, 여기서 상기 고리는 1-3 R^e 기로 치환되며, 여기서 각 R^e는 본 명세서에 상기 정의하고 기술한 바와 같음; 또는

(xvi)

여기서 각 R 및 R^e는 본 명세서에 상기 정의하고 기술한 바와 같으며; 또는

(xvii) 질소, 산소, 또는 황으로부터 독립적으로 선택된 0-3 헤테로원자를 갖는 8-10 멤버드 비시클릭, 포화, 부분 포화 또는 아릴 고리, 여기서 상기 고리는 1-4 R^e 기로 치환되며, 여기서 각 R^e는 본 명세서에 상기 정의하고 기술한 바와 같다.

특정 구현으로, 화학식 I의 Y기는 하기 표 3에 나타낸 것들로부터 선택되며, 여기서 각 물결선은 분자의 나머지에 대한 결합 지점을 나타낸다. 표 2에 나타낸 각 Re 기는 독립적으로 할로겐으로부터 선택된다.

표 3. 예시적인 Y 기들:

특정 구현으로, R₁은 -C≡CH, -C≡CCH₂NH(이소프로필), -NHC(O)C≡CCH₂CH₃, -CH₂-C≡C-CH₃, -C≡CCH₂OH, -CH₂C(O)C≡CH, -C(O)C≡CH 또는 -CH₂OC(=O)C≡CH이다. 일부 구현으로, R₁은 NHC(O)CH=CH₂, -NHC(O)CH=CHCH₂N(CH₃)₂ 또는 -CH₂NHC(O)CH=CH₂로부터 선택된다.

특정 구현으로, R₁은 하기 표 4에 나타낸 것들로부터 선택되며, 여기서 각 물결선은 분자의 나머지에 대한 결합 지점을 나타낸다.

표 4: 예시적인 R ₁ 기들

여기서 각 R^e는 독립적으로 적절한 이탈기, NO₂, CN 또는 옥소이다.

워헤드를 함유하는 후보 인히비터의 구조 모델은 어느 적절한 방법을 이용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에 나타내고 예시된 바오 같이 워헤드는 적절한 분자 모델링 프로그램을 이용하여 가역 인히비터 주역상에 삼차원으로 형성될 수 있다. 적절한 모델링 프로그램은 Discovery Studio® 및 Pipeline Pilot^TM(분자 모델링 소프트웨어, Accelrys Inc., San Diego, CA), Combibuild, Combilibmaker 3D(화합물 라이브러리를 생성하는 소프트웨어, Tripos L.P., St. Louis, MO), SMOG(소분자 컴퓨터 조합 디자인 프로그램; DeWitte and Shakhnovich, J. Am. Chem. Soc. 118:11733-11744(1996); DeWitte et al., J. Am. Chem. Soc. 119:4608-4617(1997); Shimada et al., Protein Sci. 9:765-775(2000); Maestro^TM, CombiGlide^TM, Glide^TM 및 Jaguar^TM(모델링 소프트웨어 패키지, Schrodinger, LLC. 120 West 45th Street, New York, NY 10036-4041))을 포함한다. 워헤드는 표적 폴리펩타이드내 Cys 잔기에 인접한 각 치환가능한 위치에 부착될 수 있으며, 또는 선택된 치환가능한 위치에 또는 필요에 따라 단일 치환가능한 위치에 부착될 수 있다. 워헤드는 FROG(3D 형태 제네레에터; Bohme et al., Nucleic Acids Res. 35(web server issue): W568-W572(2007).), Discovery Studio® 또는 Pipline Pilot^TM(Accelrys, Inc., San Diego), Combilibmaker 3D(Tripos, St. Louis), SMOG(DeWitte and Shakhnovich, J. Am. Chem. Soc. 118:11733-11744(1996); DeWitte et al., J. Am. Chem. Soc. 119:4608-4617(1997); Shimada et al., Protein Sci. 9:765-775(2000))등과 같이, 어느 적절한 방법 또는 프로그램을 이용하여 화합물에 부착될 수 있다. 워헤드는 예를 들어, Discovery Studio®을 이용하여 수동적으로 부착될 수 있으며, 또는 예를 들어, Pipline Pilot^TM(Accelrys, Inc., San Diego)을 이용하여 자동화 형식으로 부착될 수 있다.

일부 바람직한 구현으로, 복수의 후보 인히비터의 구조 모델이 생성된다. 워헤드가 다른 치환가능한 위치에 부착되는 화합물을 포함하는 구조 모델 및 각 가능한 치환가능 위치에 대한 부착은 적어도 하나의 화합물에 의해 나타내어진다.

D) 표적 시스테인에 대한 워헤드의 근접성 검출

본 발명은 후보 인히비터가 바인딩 사이트에 결합될 경우 표적 폴리펩타이드의 바인딩 사이트내 Cys 잔기의 결합 거리내에 워헤드의 반응성 화학 작용기가 존재하게 되는 가역 인히비터의 치환가능한 위치를 검출하는 것을 포함한다. 후보 인히비터의 구조 모델은 가역 인히비터내의 어느 치환가능한 위치가 워헤드의 반응성 화학 작용기가 표적 폴리펩타이드의 바인딩 사이트에서 Cys 잔기의 결합 거리내에 존재하도록 하는지 분석된다. 반응성 화학 작용기가 구조 모델에서 Cys 잔기의 결합 거리내에 존재하게 되는 Cys 잔기 - 치환가능 위치 조합은 통제하제 또는 통제없이 분자가 거리를 측정하는 어느 적절한 방법을 이용하여 확인될 수 있다. 예를 들어, 반응성 화학 작용기가 Cys 잔기의 결합 거리내에 존재하도록 하는 Cys 잔기 - 치환가능 위치 조합은 적절한 컴퓨터를 사용한 방법을 이용하여 확인될 수 있으며, 이는 1) 표적 폴리펩타이드가 고정되고, 다만 Cys 측쇄만이 유동적이도록 하며, 그리고 후보 인히비터가 고정되고, 다만 워헤드만이 유동적이도록 하는 방법, 2) 표적 폴리펩타이드가 유동적이도록 하고, 후보 인히비터가 유동적이도록 하는 방법, 3) 표적 폴리펩타이드가 유동적이도록 하고, 후보 인히비터가 고정되도록 하며, 다만 워헤드만 유동적이도록 하는 방법, 또는 4) 표적 폴리펩타이드가 고정되도록 하고, 다만 Cys 측쇄만이 유동적이도록 하고, 그리고 후보 인히비터를 유동적이도록 하는 방법을 포함한다. 바람직하게, 표적 폴리펩타이드는 고정되고 다만, Cys 측쇄는 유동적이도록 하고, 그리고 후보 인히비터는 고정되고 다만, 워헤드는 유동적이도록 한다.

반응성 화학 작용기가 Cys 잔기의 결합 거리내에 존재하게 되도록 하는 Cys 잔기 - 치환가능 위치 조합을 확인하는 적절한 여러가지 컴퓨터를 사용하는 방법은 당 기술분야에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 분자간 거리, 분자 역학, 에너지 최소화, 시스테마틱 배좌 조사 및 매뉴얼 모델링을 계산하는 적절한 프로그램이 당 기술분야에 잘 알려져 있다. 적절한 프로그램은 예를 들어, Discovery Studio® 및 Charmm(Accelrys, Inc. San Diego), Amber(Amber Software Administrator, USSF, 600 16th Street, Room 552, San Fransisco, CA 94158 and ambermd.org/) 등을 포함한다. 화합물 변형 에너지 및 정전기 상호작용을 평가할 수 있는 컴퓨터 프로그램이 당 기술분야에 이용가능하며, 예를 들어, Gaussian 92, revision C(M. J. Frisch, Gaussian, Inc., Pittsburgh, Pa.); AMBER, version 4.0(P.A. Kollman, University of California at San Francisco, Calif.); QUANTA/CHARMM(Accelrys, Inc., Burlington, Mass.)를 포함한다. 이러한 프로그램은 예를 들어, 컴퓨터 워크스테이션을 이용하여 시행될 수 있다. 다른 적절한 하드웨어 시스템 및 소프트웨어 패키지는 당 기술분야의 숙련자에게 알려져 있다. 후보 인히비터의 도킹은 Flexx(Tripos, St. Louis, Missouri), Glide(Schrodinger, New York), ICM-Pro(Molsoft, California) 등과 같은 적절한 소프트웨어를 이용하고, 그 다음 OPLS-AA, CHARMM 또는 AMBER과 같은 표준 분자 역학 포스필드를 이용한 에너지 최소화 및 분자 역학에 의해 완수될 수 있다.

E) 공유 결합 형성

본 발명은 바인딩 사이트내 Cys 잔기의 황 원자와 워헤드의 반응성 화학 작용기 사이의 공유 결합을 형성하는 것을 포함한다. 반응성 화학 작용기가 Cys 잔기의 결합 거리내에 존재하도록 하는 Cys 잔기 - 치환가능한 위치 조합을 확인하는 것은 Cys 잔기를 공유결합으로 변형하기 쉬운 후보 인히비터를 확인한다. 그러나, 이러한 모델 단독에서 반응 화학 작용기와 Cys 측쇄의 구형 근접성은 반응성 화학 작용기와 Cys 측쇄간에 공유결합이 형성될 것이라는 충분한 지표가 아니다. 따라서, 본 발명의 알고리즘 및 방법에서, 결합은 반응성 화학 작용기와 Cys 측쇄 사이에 형성되며, 그리고 형성된 결합의 길이가 분석된다. 바인딩 사이트내 Cys 잔기의 황 원자와 워헤드의 반응성 화학 작용기 사이에 형성되는 결합에 대해 약 2.1옹스트롬 내지 약 1.5옹스트롬, 또는 바람직하게 약 2옹스트롬미만의 공유 결합 길이는 후보 인히비터가 표적 폴리펩타이드를 공유적으로 결합하게 되는 인히비터임을 나타낸다. 바람직하게, 반응성 화학 작용기와 Cys 측쇄 사이에 형성되는 결합의 길이는 약 2옹스트롬, 약 1.9옹스트롬, 약 1.8옹스트롬, 약 1.7옹스트롬, 약 1.6옹스트롬 또는 약 1.5옹스트롬이다. 결합을 형성하고 결합 길이를 측정하는 적절한 방법 및 프로그램은 당 기술분야에 잘 알려져 있으며, Discovery Studio? 및 Charmm(Accelrys, Inc. San Diego), Amber(Amber Software Administrator, USSF, 600 16th Street, Room 552, San Fransisco, CA 94158 and ambermd.org/), Guassian(340 Quinnipiac St. Bldg 40, Wallingford CT 06292 USA and www.gaussian.com/), Qsite(Schrodinger Inc., New York), 및 공유 도킹 프로그램(BioSolvlT GmbH, Germany www.biosolvwit.de), Maestro^TM, MacroModel^TM 및 Jaguar^TM(Modeling softwar packages, Schrodinger, LLC. 120 West 45th Street, New York, NY 10036-4041)을 포함한다.

필요에 따라, 상기 방법을 이용하여 디자인되는 화합물은 추가 분석되며 그리고/또는 구조적으로 정제될 수 있다. 예를 들어, 필요에 따라, 본 발명은 바인딩 사이트내 Cys 잔기의 황 원자와 워헤드의 반응성 화학 작용기간에 공유 결합이 형성될 경우 표적 폴리펩타이드의 바인딩 사이트가 블로킹되는지(즉, 리간드, 기질 또는 보조인자가 바인딩 사이트에 바인딩될 수 없는) 검출하는 추가 단계를 포함할 수 있다. 이 단계는 Cys 잔기 복합체를 공유 결합하는 표적 폴리펩타이드 - 비가역 인히비터의 구조 모델을 사용하여 수행될 수 있다. 표적 폴리펩타이드에 대한 인히비터의 바인딩은 반응성 화학 작용기와 Cys 잔기간에 공유 결합의 형성시 변환되는 것이 가능하다. 그러나, 대부분의 경우에 화합물은 여전히 표적 폴리펩타이드의 바인딩 사이트를 블로킹하고 리간드, 기질 또는 보조인자가 바인딩 사이트에 바인딩되는 것을 방해할 것이다. 공유 결합의 형성시 인히비터의 바인딩 모드의 변환 및 바인딩 사이트가 블로킹된 채로 남아있는지 여부는 본 명세서에 기재된 적절한 방법 및 프로그램을 이용하여 공유결합 형성 후 표적 폴리펩타이드에 복합된 인히비터의 구조 모델을 분석함으로써 검출될 수 있다.

다른 예로, 본 발명을 사용하여 디자인되는 화합물은 형성된 공유 결합의 형태와 같이 우호적이거나 바람직한 특성에 대해 추가 분석된다. 실시예 1 및 6에 나타낸 바와 같이, Cys와 아크릴아미드 워헤드간에 형성된 공유결합은 아미드의 시스-형태 또는 트랜스-형태를 가질 수 있으며, 트랜스-형태가 바람직하다. 다른 예로, 바람직한 화합물은 워헤드와 Cys 잔기의 반응에 의해 형성된 산물의 에너지에 기초하여 유사한 구조를 갖는 화합물들로부터 선택되며, 보다 낮은 에너지 산물이 바람직하다. 산물의 에너지는 양자 역학 또는 분자 역학을 이용하는 것과 같이 어느 적절한 방법을 이용하여 측정될 수 있다.

본 발명은 표적 폴리펩타이드의 바인딩 사이트내 Cys 잔기와 공유결합을 형성함으로써 어느 원하는 표적 폴리펩타이드를 공유결합하는 인히비터를 디자인하는데 사용될 수 있다. 본 발명에 따라 디자인되는 인히비터와 공유결합을 형성하는 Cys 잔기는 표적 폴리펩타이드를 함유하는 단백질과에서 보존적이지 않은 것이 바람직하다. Cys 잔기가 보존적이지 않음으로써, 단백질과의 여러 멤버를 저해하는 난잡한 가역 인히비터가 단백질과의 보다 적은 멤버 또는 심지어 단일 멤버를 저해하는 보다 선택적인 비가역 인히비터로 전환되는 것이 가능하다.

본 발명의 일부 적용으로, 표적 폴리펩타이드는 촉매 활성을 갖는다. 예를 들어, 표적 폴리펩타이드는 키나아제, 바이러스 프로테아제와 같은 프로테아제, 포스파타아제 또는 다른 효소일 수 있다. 표적 폴리펩타이드가 촉매 활성을 갖는 경우, 본 발명에 따라 디자인된 인히비터와 공유결합을 형성하는 Cys 잔기는 촉매 잔기가 아닌 것이 바람직하다. 특정 바람직한 구현으로, 본 발명을 사용하여 디자인된 비가역 인히비터는 슈사이드 또는 메카니즘-베이즈드 인히비터가 아니며, 이러한 것들은 촉매 프로세스도중에 기질을 공유 불활성화물질로 전환시키는 효소의 프로세스로부터 기인한 인히비터이다.

바람직하게, 가역 인히비터는 리간드, 보조인자 또는 기질에 대한 바인딩 사이트인 표적 폴리펩타이드상의 한 사이트에 바인딩한다. 표적 폴리펩타이드가 키나아제인 경우, 가역 인히비터는 키나아제의 ATP-바인딩 사이트와 바인딩하거나 상호작용하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 가역 인히비터는 ATP 바인딩 사이트의 힌지 리전과 상호작용할 수 있다.

본 명세서에 기술된 알고리즘 및 방법은 표적 폴리펩타이드의 바인딩 사이트의 전체 구조 및 가역 인히비터의 구조를 사용하여 수행될 수 있다. 임의로, 가역 인히비터 및 단지 표적 폴리펩타이드의 바인딩 사이트의 Cys의 구조는 알고리즘이 수행되는 경우에 고려된다. 이러한 경우에, Cys 잔기 및 가역 인히비터의 삼차원 배향은 이들이 표적 폴리펩타이드의 바인딩 사이트의 구조의 나머지에 존재하는 것과 동일하다. 비가역 인히비터 또는 후보 비가역 인히비터가 단지 바인딩 사이트의 Cys만을 고려하여 디자인된 경우, 바인딩 사이트의 전체 모델이 고려될 수 있으며, 필요에 따라, 워헤드가 바인딩 사이트내 Cys의 결합 거리내에 존재하도록 하는 치환가능한 위치의 수가 감소하는 입체 충돌을 확인할 수 있는 부가적인 정보 및 통제를 제공한다. 본 명세서에 나타낸 실시예에서, 알고리즘은 가역 인히비터 및 표적 폴리펩타이드의 바인딩 사이트의 Cys의 구조를 고려하여 수행되었다. 이러한 방법은 여러 표적 폴리펩타이드의 비가역 인히비터를 성공적으로 생성하였다. 실시예에 기재된 수행에서 확인된 비가역 인히비터에 대한 치환가능한 위치의 수는 적었으며, 따라서 바인딩 사이트의 전체 모델에 의해 도입될 수 있는 부가적인 통제는 필요하지 않았지만, 사용될 수도 있었다.

편의상 상기 알고리즘 및 방법의 단계는 본 발명의 명확하고 간결한 설명이 이루어지도록 본 명세서에서 기술된다. 하지만, 상기 방법은 기재된 순서로 연속적으로 수행하는 것이 바람직하며, 이는 어느 적절한 순서로도 수행될 수 있다. 예를 들어, 상기 방법은 워헤드와 Cys 잔기간에 결합을 형성하여 부가물을 형성한 다음, 가역 인히비터상의 치환가능한 위치에 워헤드를 결합함으로써, 임의로 링커를 통해 결합함으로써 수행될 수 있다.

에논-함유 워헤드, 비가역 인히비터 및 컨쥬게이트

본 발명은 또한 컨쥬게이티드 에논, α,β 불포화 카보닐을 함유하는 워헤드를 갖는 비가역 인히비터에 관한 것이다. 본 발명은 또한 컨쥬게이티드 워헤드와 폴리펩타이드내 시스테인 잔기의 -SH를 반응시킴으로써 형성되는 폴리펩타이드 컨쥬게이트에 관한 것이다. 에논은 구조 -C(O)-CH=CH-를 함유하는 반응성 작용기의 한 부류이다. 이러한 구조는 선형, 분지형 또는 고리형 화학부의 일부일 수 있다. 에논은 이들이 일반적으로 용액내에서 저 반응성이며 시스테인의 -SH와 반응하지 않는 잇점을 제공한다. 그러나, 폴리펩타이드내 Cys의 결합 거리내에 위치할 경우, 에논은 선택적으로 시스테인 잔기의 -SH와 반응할 수 있다. 따라서, 컨쥬게이티드 에논은 고 선택성 워헤드 및 비가역 인히비터를 제공하는데 사용될 수 있다.

일 견지로, 컨쥬게이티드 에논을 포함하는 워헤드는 하기 화학식을 가지며,

상기 식에서, R₁, R₂ 및 R₃는 독립적으로 수소, C₁-C₆ 알킬, 또는 -NRxRy와 치환된 C₁-C₆ 알킬이며; Rx 및 Ry는 독립적으로 수소이거나 C₁-C₆ 알킬이다.

컨쥬게이티드 에논을 포함하는 예시적인 워헤드는 I-a 내지 I-h를 포함한다.

본 발명은 본 발명의 알고리즘을 이용하여 디자인되는 비가역 인히비터와 같이 표적 폴리펩타이드의 시스테인 잔기와 공유결합을 형성하는 컨쥬게이티드 에논 워헤드를 포함하는 비가역 인히비터에 관한 것이다. 일부 구현으로, 상기 컨쥬게이티드 에논 워헤드는 화학식 I의 것이다. 특정 구현으로, 상기 컨쥬게이티드 에논 워헤드는 I-a, I-b, I-c, I-d, I-e, I-f 및 I-g로부터 선택된다.

본 발명은 또한 본 발명의 알고리즘을 사용하여 디자인된 비가역 인히비터와 같은 표적 폴리펩타이드의 시스테인 잔기와 공유 결합을 형성하는 컨쥬게이티드 에논 워헤드를 포함하는 비가역 인히비터와, 시스테인 잔기를 갖는 바인딩 사이트를 함유하는 폴리펩타이드를 접촉시킴으로써 표적 폴리펩타이드를 비가역적으로 억제하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 또한 컨쥬게이티드 에논-함유 워헤드를 Cys 잔기의 -SH기와 반응시킴으로써 형성되는 폴리펩타이드 컨쥬게이트에 관한 것이다. 이러한 컨쥬게이트는 다양한 용도를 갖는다. 예를 들어, 컨쥬게이티드 에논 워헤드를 함유하는 비가역 인히비터로 치료받고자 하는 환자로부터 얻어진 생물학적 시료내의 비컨쥬게이티드 표적 폴리펩타이드에 대해 상대적인 컨쥬게이트 표적 폴리펩타이드의 양이 맞춤 투여량으로 사용될 수 있다(예, 투여받는 양 및/또는 투여간의 시간 간격). 일 견지로, 상기 컨쥬게이트는 하기 화학식을 갖는다:

X-M-S-CH₂-R

상기 식에서, X는 표적 폴리펩타이드의 바인딩 사이트에 바인딩하는 화학부이며, 여기서 바인딩 사이트는 시스테인 잔기를 함유하며,

M은 상기 시스테인 잔기의 황 원자와 컨쥬게이티드 에논-함유 워헤드기의 공유결합에 의해 형성되는 변형부이며;

S-CH₂는 상기 시스테인 잔기의 측쇄 황-메틸렌이며; 그리고

R은 표적 폴리펩타이드의 잔부이다.

일부 구현으로, 상기 컨쥬게이티드 에논-함유 워헤드는 화학식 I의 것이며, 상기 컨쥬게이트는 화학식 II의 것이다:

상기 식에서, X는 표적 폴리펩타이드의 바인딩 사이트에 바인딩하는 화학부이며, 여기서 바인딩 사이트는 시스테인 잔기를 함유하며;

S-CH₂는 상기 시스테인 잔기의 측쇄 황-메틸렌이며; 그리고

R은 표적 폴리펩타이드의 잔부이며;

R₁, R₂ 및 R₃는 독립적으로 수소, C₁-C₆ 알킬, 또는 -NRxRy와 치환된 C₁-C₆ 알킬이며; 그리고 Rx 및 Ry는 독립적으로 수소이거나 C₁-C₆ 알킬이다.

특정 구현으로, 상기 컨쥬게이트는 II-a, II-b, II-c, II-d, II-e, II-f, II-g 및 II-h로부터 선택되며, 여기서 X 및 R은 화학식 II에 정의된 바와 같다.

실시예

실시예 1. 비가역 이매티닙(imatinib)

이매티닙은 cKIT, PDGFR, ABL 및 CSFIR 키나아제의 강한 가역 인히비터이다. 본 명세서에 기술된 디자인 알고리즘을 이용하여 이러한 인히비터들은 신속하고 효율적으로 cKIT, PDGFR, ABL 및 CSFIR 키나아제의 비가역 인히비터로 전환되었다. 또한, 이는 본 발명의 방법이 표적의 가역 인히비터를 그 표적의 비가역 인히비터로 쉽게 전환시키기가 불가능한 경우를 확인하는 것을 보여주며, 후속하는 실시예는 이매티닙 및 표적 ABL에 대한 경우이다.

A. cKIT

디자인 방법

이매티닙에 바인딩된 cKIT의 x-선 복합체의 코디네이트는 단백질 데이타뱅크(world wide web rcsb.org)로부터 획득되었다. 이매티닙의 코디네이트를 추출하고, cKIT에 바인딩되었을 때 이매티닙의 20옹스트롬내의 모든 단백질 Cys 잔기는 Discovery Studio(v2.0.1.7347; Accelrys Inc., CA)를 이용하여 확인되었다. 이는 7 잔기 Cys660, Cys673, Cys674, Cys788, Cys809, Cys884, 및 Cys906를 확인하였다. 그 다음, 15 개의 치환가능한 위치가 상기 이매티닙 템플레이트(화학식 I-1)상에서 3차원으로 탐색되어 워헤드로 치환되어 워헤드가 상기 Cys 잔기(Cys660, Cys673, Cys674, Cys788, Cys809, Cys884, 또는 Cys906)중 하나와 공유결합을 형성할 수 있는지 조사하였다.

디자인 방법 1.1

본 방법에서, 워헤드는 상기 이매티닙 템플레이트상에 수동적으로 형성되었으며, 그 다음 분자 역학을 사용하여 cKit의 바인딩 사이트내 Cys와 결합을 형성하는 워헤드의 능력을 평가하였다. 아크릴아미드 워헤드는 Discovery Studio를 이용하여 상기 이매티닙 템플레이트상에 3차원으로 형성되었다. 상기 이매티닙 템플레이트는 화학식 I-1에 나타낸 것이다. 그 결과 형성된 화합물들의 구조를 체크하여 워헤드의 위치를 측정하고, 워헤드가 바인딩 사이트내 확인된 어느 Cys 잔기에 도달할 수 있는지 측정하였다.

화학식 I-1

워헤드 및 측쇄 위치의 유연성을 샘플링하기 위해, 워헤드 및 측쇄 위치의 분자 역학 시뮬레이션을 수행하고, 워헤드가 바인딩 사이트내 어느 Cys 잔기의 6옹스트롬내에 존재하였는지, 그리고 워헤드와 잔기사이에 입체 충돌이 있었는지 검출하기 위해 분석하였다. 분자 역학 시뮬레이션을 위한 Discovery Studio의 Standard Dynsmics Cascade Simulations 프로토콜에서 스탠다드 셋팅이 이용되었다. 4ps 시뮬레이션으로 Discovery Studio에서 MMFF 포스필드가 사용되었다. 비-워헤드 위치의 코디네이트 및 Cys 주쇄 원자들은 분자 역학 시뮬레이션 도중에 고정으로 유지되었다.

이 시뮬레이션으로 cKIT의 하나의 근접 Cys788 및 두 근접 Cys809로서 세 개의 템플레이트 위치를 확인하였다(표 5).

위치	장소	CYS788 또는 CYS809에 대한 거리	결합이 형성될 수 있는지 여부
			CYS788	CYS809
R1		OK	예	아니오
R2		OK	예	아니오
R3	입체 충돌
R4		OK	예	아니오
R5	입체 충돌
R6	입체 충돌
R7		너무 떨어져 있음
R8		너무 떨어져 있음
R9		너무 떨어져 있음
R10		OK	아니오	아니오
R11		OK	아니오	아니오
R12	입체 충돌
R13		너무 떨어져 있음
R14	입체 충돌
R15	입체 충돌

그 다음, 이러한 5개의 템플레이트 위치는 아크릴아미드 반응산물이 후보 인히비터와 Cys 잔기(Cys788 또는 Cys809) 사이에 형성되는데 필요한 최종 필터에 적용되었으며, 이는 스탠다드 분자 역학 시뮬레이션을 이용하여 2옹스트롬미만의 결합을 형성하는 것을 포함하였다. 이러한 통제는 3개의 템플레이트 위치, R₁, R₂ 및 R₄와 그리고, 단지 하나의 Cys 잔기, Cys788을 남겼다. 이러한 템플레이트 위치 중에서, 위치 R2 및 R4에 워헤드를 포함한 결합은 워헤드의 아미드기의 시스-형태를 포함하였으며, 이는 덜 바람직한 것이다. 위치 R₁에 워헤드를 포함한 결합은 워헤드의 아미드기의 트랜스-형태를 포함하였으며, 이는 바람직한 것이다.

디자인 방법 1.2

본 방법에서, 워헤드는 이매티닙 템플레이트상에 자동적으로 모델링되었으며, 그 다음 분자 도킹을 이용하여 cKit의 바인딩 사이트내 Cys와 결합을 형성하는 이들의 능력을 평가하였다.

워헤드는 Accelryes SciTegic Pipeline 컴퓨터 프로토콜을 이용하여 이매티닙 템플레이트상에서 형성되었으며, 이는 15개의 가능한 가상 화합물들로부터 13개의 가상 화합물을 형성하였다. 이는 대칭에 기인하여 등가인 R₂ 및 R₄ 뿐만 아니라 R₃ 및 R₅(화학식 I-1)에 기인하였으며, 이에 따라 R₂ 및 R₃만이 추가로 평가되었다. 그 다음, 이들 화합물은 Discovery Studio에서 리간드 제조 프로토콜을 이용하여 3D로 전환되었다. 그 다음, 이러한 3D 가상 화합물은 Discovery Studio의 CDOCKER 프로토콜을 사용하여 cKit x-선 구조로 도킹되었다. 통제 도킹 알고리즘이 사용되었으며, 여기서 x-선 구조로 정의된 바와 같은(화학식 I-1) 이매티닙의 코어가 도킹 공정에서 통제로 사용되었다. 10개 형태의 각 가상 화합물이 생성되었으며, 각 화합물의 상부 형태는 cKit의 바인딩 사이트내 Cys에 대한 거리에 의해 이의 근접성에 대해 평가되었다. 디스턴스 필터(<6옹스트롬)를 적용한 후, R₁ 및 R₂에 워헤드를 갖는 2개의 화합물만이 바인딩 사이트내 Cys에 대해 근접된 것으로 발견되었다. 이러한 두 화합물은 모두 Cys788에 근접하였으며, 이들은 그 다음 결합 형성 능력에 대해 평가되었다. 단백질 및 화합물은 고정으로 유지하고, Cys788의 측쇄 및 워헤드는 통제되지 않았다. 최소화가 완료된 후, 새로 형성된 공유 결합 및 포텐셜 에너지를 조사하였다. R₁ 위치에 워헤드를 갖는 가상 화합물이 가장 바람직한 것으로 랭크되었다.

아래에서 상세히 나타낸 바와 같이, R₁ 위치에 아크릴아미드를 갖는 두 화합물, 화합물 1 및 화합물 2가 합성되었으며 cKit를 저해하는 것으로 나타났다.

화합물의 합성

중간물 A의 합성

단계 1: 3-디메틸아미노-1-피리딘-3-일-프로페논: 3-아세틸피리딘(2.5g, 20.64mmol) 및 N,N-디메틸-포름아미드 디메틸아세탈(3.20ml, 24mmol)을 에탄올(10mL)에서 밤새 환류하였다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각하고 감소된 압력하에서 증발시켰다. 디에틸 에테르(20mL)를 나머지에 첨가하고, 그 혼합물을 0℃로 냉각하였다. 그 혼합물을 여과하여 노란 결정으로서 3-디메틸아미노-1-피리딘-3-일-프로페논(1.9g, 10.78mmol)이 생성되었다(수율: 52%). 이 물질을 추가 정제없이 후속 단계에 사용하였다.

단계 2: N-(2-메틸-5-니트로-페닐)-구아니디늄 니트레이트: 2-메틸-5-니트로 아닐린(10g, 65mmol)을 에탄올(25mL)에 용해하고, 농축 HNO₃(4.6mL)를 그 용액에 적가한 후 시안아미드 50% 수용액(99mmol)을 적가하였다. 그 반응 혼합물을 밤새 환류한 다음, 0℃로 냉각하였다. 그 혼합물을 여과하고, 잔존물을 에틸 아세테이트 및 디에틸 에테르로 세정하고, 건조하여 N-(2-메틸-5-니트로-페닐)-구아니디움 니트레이트(4.25g, 수율: 34%)가 수득되었다.

단계 3: 2-메틸-5-니트로페닐-(4-피리딘-3-일-피리미딘-2-일)-아민: 2-프로판올(20mL)에 담긴 3-디메틸아미노-1-피리딘-3-일-프로페논(1.70g, 9.6mmol) 및 N-(2-메틸-5-니트로-페닐)-구아니디늄 니트레이트(2.47g, 9.6mmol)의 서스펜션에 NaOH(430mg, 10.75mmol)을 첨가하였으며, 그 결과 형성된 혼합물을 24시간동안 환류하였다. 그 반응 혼합물을 0℃로 냉각시키고, 그 결과 형성된 침전물을 여과하였다. 고형 잔존물을 물에 현탁시키고, 여과한 다음 2-프로판올 및 디에틸 에테르로 세정하고 건조하였다. 2-메틸-5-니트로페닐-(4-피리딘-3-일-피리미딘-2-일)-아민 0.87g(2.83mmol)이 분리되었다(수율: 30%).

단계 4: 4-메틸-N-3-(4-피리딘-3-일-피리미딘-2-일)-벤젠-1,3-디아민(중간물 A): 농축 염산(8mL)에 용해된 SnCl₂.2H₂O(2.14g, 9.48mmol)의 용액을 2-메틸-5-니트로-페닐-(4-피리딘-3-일-피리미딘-2-일)-아민(0.61g, 1.98mmol)에 격렬히 교반하면서 첨가하였다. 30분 교반 후, 혼합물을 파쇄된 얼음상에 붓고, K₂CO₃로 알칼리를 제조하고, 에틸 아세테이트(50ml)로 3회 추출하였다. 유기상들은 혼합되고, MgSO₄에 걸쳐 건조되고 증발되어 건조상태로 만들었다. 디클로로메탄으로부터의 재결정화는 오프화이트 고형물로서 4-메틸-N-3-(4-피리딘-3-일-피리미딘-2-일)-벤젠-1,3-디아민의 252.6mg(0.91mmol)이 수득되었다(수율: 46%).

화합물 1의 합성

단계 1: DMF(10mL) 및 피리딘(0.5ml)내에 용해된 4-아미도벤조산(1.40g, 10mmol)의 4-(아크릴아미도)벤조산 A 용액을 0℃로 냉각하였다. 이 용액에 아크릴로일 클로라이드(0.94g, 10mmol)를 첨가하고, 그 결과 형성된 혼합물을 3시간동안 교반하였다. 그 혼합물을 물 200ml에 붓고, 얻어진 백색 고형물을 여과하고, 물 및 에테르로 세정하였다. 고 진공하에서 건조하여 1.8g의 원하는 산물을 수득하였으며, 이는 다음 단계에 추가 정제없이 사용되었다.

단계 2: 4-(아크릴아미도)벤조산(82mg, 0.43mmol) 및 중간물 A(100mg, 0.36mmol)를 질소하에 피리딘(4ml)에 용해하고 교반하였다. 이 용액에 1-프로판 포스포닉산 시클릭 안하이드리드(0.28g, 0.43mmol)를 첨가하고, 그 결과 형성된 용액을 실온에서 밤새 교반하였다. 용매를 증발시켜 소 체적으로 만들었으며, 그 다음 이를 냉수 50ml에 부었다. 형성된 고형물을 여과하여 노란색 분말이 획득되었다. 컬럼 크로마토그래피(95:5 CHCl₂:MeOH)에 의한 조 생성물의 정제는 4-아크릴아미도-N-(4-메틸-3-(4-(피리딘-3-일)피리미딘-2-일아미노)페닐)벤즈아미드(화합물 1) 30mg을 백색 분말로 생성하였다. MS(M+ H⁺): 251.2; ¹H NMR(DMSO-D6, 300MHz)δ(ppm): 10.42(s, 1H), 9.26(d, 1H), J=2.2Hz), 8.99(s, 1H), 8.68(dd, 1H, J=3.0 및 1.7Hz), 8.51(d, 1H, J=5.2Hz), 8.48(m, 1H), 8.07(d, 1H, J=1.7Hz), 7.95(d, 2H, J=8.8Hz), 7.79(d, 2H, J=8.8Hz), 7.45(m, 3H), 7.19(d, 1H, J=8.5Hz), 6.30(dd,H,J=16.7 및 1.9Hz), 5.81(dd, 1H, J=9.9 및 2.2Hz), 2.22(s, 3H).

화합물 2의 합성

4-아크릴아미도-N-(4-메틸-3-(4-피리딘-3-일)피리미딘-2-일아미노)페닐-3-(트리플루오로메틸)벤즈아미드

1) 메틸 4-아크릴아미도-3-니트로벤조에이트

요오드화 메틸(1.4g, 9.86mmol)을 30mL DMF에 용해된 4-니트로-3-(트리플루오로메틸)벤조산(1.0g, 4.25mmol) 및 포타슘 카보네이트(1.5g, 10.85mmol)의 교반 용액에 실온에서 적가하였다. 그 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 디에틸 에테르(120mL)를 적가하고, 그 혼합물을 물로 세정하고, Na₂SO₄에 걸쳐 건조하고, 여과하고 감소된 압력하에서 농축하여 1.0g의 조 메틸 4-니트로-3-(트리플루오로메틸)벤조에이트를 수득하였다. 30mL 메탄올에 용해된 0.87g(3.49mmol)의 메틸 4-니트로-3-(트리플루오로메틸)벤조에이트 및 0.2g 10% Pd/C의 용액을 수소(40psi)하에서 실온에서 밤새 교반하였다. 그 혼합물을 여과하고 감소된 압력하에서 농축하여 백색 고형물로서 0.8g의 조 메틸 4-아미노-3-(트리플루오로메틸)벤조에이트를 수득하였다. 아크릴로일 클로라이드(0.35mL, 3.65mmol)를 0℃에서 40mL의 디클로로메탄에 용해된 0.8g의 메틸 4-아미노-3-(트리플루오로메틸)벤조에이트 및 트리에틸아민(0.9g, 8.9mmol)의 용액에 첨가하였다. 이 용액을 실온에서 3시간동안 교반한 후 연속적으로 포화 수성 NaHCO₃ 및 포화 수성 NaCl로 세정하였다. 디클로로메탄 용액을 Na₂SO₄에 걸쳐 건조하고, 진공하에서 농축하여 조 생성물을 수득하였으며, 이는 1% CH₃OH-CH₂Cl₂를 사용하여 실리카 겔에 걸친 크로마토그래피에 의해 추가 정제되어 백색 고형물로서 상기 명칭의 화합물 0.818mg을 수득하였다.

2) 4-아크릴아미도-3-니트로벤조산

20mL THF에 용해된 메틸 4-아크릴아미도-3-니트로벤조에이트(0.8g, 2.93mmol)의 교반 용액에 20mL의 1N LiOH 용액을 첨가하였다. 그 결과 형성된 용액은 10% 수성 HCl로 pH 1로 산성화되었으며, 그 다음 3 개의 40mL 부의 에틸 아세테이트로 추출되었다. 합쳐진 에틸 아세테이트 추출물을 포화 수성 NaCl로 세정하고, Na₂SO₄에 걸쳐 건조하고, 여과하고, 진공하에 건조되도록 농축시켜 백색 고형물로서 상기 명칭의 화합물 0.75g을 수득하였다.

3) 4-아크릴아미도-N-(4-메틸-3-(4-피리딘-3-일)피리미딘-2-일아미노)페닐-3-(트리플루오로메틸)벤즈아미드

10mL 피리딘에 용해된 N-(4-메틸-3-(4-피리딘-3-일)피리미딘-2-일아미노)페닐아민(87mg, 0.31mmol) 및 4-아크릴아미도-3-(트리플루오로메틸)벤조산(95mg, 0.37mmol)의 교반된 용액에 프로필포스포닉 안하이드리드 250mg(0.39mmol)를 첨가하였다. 그 결과 형성된 용액을 72시간동안 실온에서 교반하였다. 용매를 진공하에서 제거하고 잔존물을 50mL 물로 교반하여 여과에 의해 분리된 노란 고형물을 수득하였다. 5% CH₃OH-CH₂Cl₂를 사용하여 실리카 겔 크로마토그래피에 의해 조 생성물을 정제하여 상기 명칭의 화합물 101mg을 수득하였다. ₁H NMR(DMSO-d6, 300MHz)δ(ppm): 10.41(s, 1H), 9.90(s, 1H), 9.28(d, 1H),, 8.98(s, 1H), 8.69(d, 1H), 8.68(dd, 1H), 8.49(m, 1H), 8.29(s, 1H), 8.24(d, 1H), 8.08(d, 1H), 7.79, (m, 3H), 7.23(d, 1H), 6.59(dd, 1H), 6.28(dd, 1H), 5.81(dd, 1H), 2.24(s, 3H).

cKIT 저해 어세이

휴먼 재조합 c-KIT(Millipore, catalog number 14-559)를 이용하여 c-KIT의 인히비터로서 화합물들을 시험하고, 플루오레세인-표지 펩타이드 기질(1.5μM)의 인산화를 모니터하였다. 반응은 100mM HEPES(pH 7.5), 10mM MnCl₂, 1mM DDT, 0.015% Brij-35, 및 300μM ATP에서 시험 화합물과 함께 또는 시험 화합물 없이 수행하였다. 반응은 ATP를 첨가하고 실온에서 1시간동안 배양함으로써 시작되었다. 반응은 100mM HEPES(pH 7.5), 30mM EDTA, 0.015% Brij-35, 및 5% DMSO를 함유하는 정지 버퍼를 첨가하여 종료되었다. 인산화 및 비인산화 기질은 전기영동상 변화 분석법을 이용하여 전하에 의해 분리되었다. 형성된 산물은 효소 활성의 저해 또는 증가를 검출하기 위해 컨트롤 웰과 비교하였다. 화합물 1 및 화합물 2에 대한 c-KIT 저해 데이타를 표 6에 나타내었다.

c- KIT 저해 데이타

화합물 #	% 저해	농축(μM)
1	82	1
2	88	1

B. PDGFR

디자인 방법

상기한 바와 같이 이매티닙(pdbcode 1T46)에 바인딩된 cKIT의 x-선 복합체에 대한 코디네이트를 이용하여, PDGFR-알파 키나아제(Uniprot code: P16234)의 호몰로지 모델을 생성하였다. 호몰로지 모델은 나타낸 cKIT-PDGFRα 정렬을 이용하여 Discovery Studio에서 Build Homology 모듈을 사용하여 형성되었다. 그 다음, 이매티닙 템플레이트상의 15 치환가능 위치를 3차원으로 탐색하여 워헤드로 치환되어 워헤드가 바인딩 사이트내 Cys와 공유결합을 형성할 수 있는지 검출하였다. 상기 방법은 3 템플레이트 위치, R₁, R₂ 및 R₄와 그리고 아크릴아미드 워헤드와 공유결합을 형성할 수 있는 Cys814를 확인하였다. 이러한 템플레이트 위치 중에서, 위치 R₂ 및 R₄에 워헤드를 포함한 결합은 워헤드의 아미드기의 시스-형태를 포함하였으며, 이는 덜 바람직한 것이다. 위치 R₁에 워헤드를 포함한 결합은 아미드기의 트랜스-형태를 포함하였으며, 이는 바람직한 것이다.

CKIT: 휴먼 CKIT(SWQ ID NO:1)

PDGFRALPHA: 휴먼 PDGF 리셉터 알파(SEQ ID NO:2)

PDGFR 저해 어세이

방법 A:

Z'-LYTE^TM 생화학 시험법 또는 유사한 생화학 시험법을 이용하여 Invitrogen Corp(Invitrogen Corporation, 1600 Faraday Avenue, Carlsbad, Calofornia, CA; world wide web invitrogen.com/downloads/Z-LYTE_Brochure_1205.pdf)에 의해 기재된 방법과 실질적으로 동일한 방식으로 PDGFR의 인히비터로서 화합물들을 시험하였다. Z'-LYTE^TM 생화학 시험법은 플루오레센계, 결합-효소 포맷을 사용하여, 단백질 분해 분할에 대한 인산화 및 비인산화 펩타이드의 다른 민감도에 기초한다.

화합물 1은 0.1μM 및 1μM에서 2회 시험되었다. 화합물 1은 1μM에서 76% 및 0.1μM에서 29%의 PDGFR-α의 평균 저해율을 나타내었다.

방법 B

간략히, 10X 스톡의 PDGFRα(PV3811) 효소, 1.13X ATP(AS001A) 및 Y12-Sox 펩타이드 기질(KCZ1001)을 20mM Tris, pH 7.5, 5mM MgCl2, 1mM EGTA, 5mM β-글리세로포스페이트, 5% 글리세롤(10X 스톡, KB002A) 및 0.2mM DTT(DS001A)로 구성된 1X 키나아제 반응 버퍼에 제조하였다. 5μL의 효소를 Corning(#3574) 384-웰, 화이트, 논바인딩 표면 마이크로타이터 플래이트(Corning, NY)에서 0.5μL 체적의 50% DMSO 및 50% DMSO에 제조된 연속 희석 화합물로 27℃에서 30분간 예비배양하였다. 키나아제 반응은 45μL의 ATP/Y9 또는 Y12-Sox 펩타이드 기질 혼합물을 첨가하여 시작하였으며, Synergy⁴ 플래이트 리더(BioTek(Winooski, VT))에서 λex360/λem485에서 60분간 매 30-90초마다 모니터하였다. 각 어세이의 마지막에서, 각 웰로부터 얻어진 진행 곡선은 선형 반응 속도론 및 적합도 통계(R², 95% 신뢰구간, 제곱의 절대합)에 대해 조사되었다. 각 반응으로부터 초기 속도(0분 내지 20+ 분)는 상대적 형광 유니트 대 시간(분)의 플롯의 기울기로부터 측정되었다. 그 다음, log[인히비터] 대 반응으로부터 IC₅₀을 추정하기 위해 GraphPad Prism(GraphPad Software(San Diego))에서 Variable Slope 모델을 이용하여 인히비터 농도에 대해 도시하였다. [PDGFRα]=2-5nM, [ATP]=60μM 및 [Y9-Sox 펩타이드] = 10μM(ATP K_Mapp=61μM)

화합물 1 및 화합물 2에 대한 PDGFR 저해 데이타를 표 7에 나타내었다.

PDGFR 저해 데이타

화합물 #	% 저해	농도(μM)	IC50(nM)
1	76	1	172.94
2	91	1	2.2

화합물 1의 PDGF 질량 스펙트럼 분석

화합물 1의 존재하에서 PDGFR-α의 질량 스펙트럼 분석을 수행하였다. PDGFR-α 단백질(Invitrogen: PV3811)은 1μM, 10μM alc 100μM 화합물 1으로 60분간 배양되었다. 특히, 1μL의 0.4μg/μL PDGFR-α(Invitrogen PV3811) 스톡 용액(50mM Tris HCl pH 7.5, 150mM NaCl, 0.5mM EDTA, 0.02% Triton X-100, 2mM DTT, 50% 글리세롤)을 10% DMSO에 용해된 9μL의 화합물 1에 첨가하였다(1μM, 10μM 및 100μM의 최종 농도). 60분후, 9μL의 50mM 암모늄 비카보네이트, 50mM 암모늄 비카보에니트에 용해돈 3.3μL의 6mM 요오드아세트아미드, 및 1μL의 35ng/μL 트립신을 첨가하여 반응을 정지시켰다.

트립신 분해는 10μM에서 질량 스펙트로미터(MALDI-TOF)에 의해 분석되었다. PDGFR-α 단백질에서 발견된 5 시스테인 잔기 중에서, 4 시스테인 잔기가 요오드아세트아미드에 의해 변형된 것으로 확인되었으며, 5번째 시스테인 잔기는 화합물 1에 의해 변형된 것으로 확인되었다. 트립신 분해의 질량 스펙트럼 분석은 Cys814에서 PDGFR-α 단백질에 공유결합되는 화합물 1과 일치하였다. 트립신 분해의 MS/MS 분석은 Cys814에서 화합물 1의 존재를 확인하였다.

EOL-1 세포 증식 어세이

DSMZ(ACC 386)으로부터 구입한 EOL-1 세포를 RPMI(Invitrogen #21870) + 10% FBS + 1% 페니실린/스트렙토마이신(Invitrogen #15140-122)에서 유지하였다. 세포 증식 어세이를 위해, 완전 배지내에 담긴 세포들을 2 x 10⁴cells/웰의 밀도로 96웰 플래이트에 플래이팅하고 500nM 내지 10pM의 범위의 화합물로 72시간동안 2개씩 배양되었다. 세포 증식은 Alamar Blue 시약(Invitrogen cat#DAL1100)으로 대사 활성을 측정함으로써 시험되었다. Alamar Blue로 37℃에서 8시간 배양한 후, 흡광도를 590nm에서 읽고, 세포 증식의 IC₅₀을 GraphPad를 이용하여 계산하였다. 기준 화합물 및 화합물 2를 이용한 EOL-1 세포들의 세포 증식의 투여량 반응 저해를 도 5에 나타내었다.

EOL-1 세포 세정제거 시험

EOL 세포를 완전 배지에서 서스펜션으로 증식시키고, 화합물을 1시간동안 시료당 2 x 10⁶ 세포로 첨가하였다. 1시간 후, 세포들을 펠렛팅하고, 배지를 제거하고, 화합물-프리 배지로 대체하였다. 세포를 특정 시점에서 수집하고, 세포 추출 버퍼에서 용해하고, 15μg 총 단백질 용해물을 각 래인에 로딩하였다. PDGFR 인산화는 Santa Cruz 항체 sc-12910을 이용해 웨스턴 블롯에 의해 분석되었다. 이 실험 결과를 도 6에 나타내었으며, 이는 DMSO 컨트롤 및 가역 기준 화합물에 비해, 화합물 2는 0시간 및 4시간 후 "세정제거" 후에 EOL-1 세포에서 PDGFR의 효소 저해를 유지한 것으로 나타났다.

C. CSF1R

디자인 방법

상기한 바와 같이 이매티닙(pdbcode 1T46)에 바인딩된 cKIT의 x-선 복합체에 대한 코디네이트를 이용하여, CSF1R 키나아제(Uniprot code: P07333)의 호몰로지 모델을 생성하였다. 호몰로지 모델은 나타낸 cKIT-CSF1R 정렬을 이용하여 Discovery Studio에서 Build Homology 모듈을 사용하여 형성되었다. 그 다음, 이매티닙 템플레이트상의 15 치환가능 위치를 3차원으로 탐색하여 워헤드로 치환되어 워헤드가 바인딩 사이트내 Cys와 공유결합을 형성할 수 있는지 검출하였다. 상기 방법은 2 템플레이트 위치(R₁ 및 R₂)와 그리고 아크릴아미드 워헤드와 결합을 형성할 수 있는 Cys774를 확인하였다.

CKIT: 휴먼 CKIT(SWQ ID NO:1)

CSF1R: 휴먼 SCF1R(SEQ ID NO:3)

CSF1R 저해 어세이

Z'-LYTE^TM 생화학 시험법 또는 유사한 생화학 시험법을 이용하여 Invitrogen Corp(Invitrogen Corporation, 1600 Faraday Avenue, Carlsbad, Calofornia, CA)에 의해 기재된 방법과 실질적으로 동일한 방식으로 PDGFR의 인히비터로서 화합물들을 시험하였다. 2X CSF1R(FMS)/Tyr01 펩타이드 혼합물은 50mM HEPES pH 7.5, 0.01% BRIJ-35, 10mM MgCl₂, 1mM EGTA에서 제조되었다. 최종 10μL 키나아제 반응은 50mM HEPES pH 7.5, 0.01% BRIJ-35, 10mM MgCl₂, 1mM EGTA에 용해된 0.2-67.3ng CSF1R(FMS) 및 2μM Tyr01 펩타이드로 구성되었다. 1시간 키나아제 반응 배양 후, 5μL의 1:128 희석의 디벨롭먼트 시약 B를 첨가하였다.

화합물 1은 10μM에서 CSF1R에 대해 72% 저해율을 나타내었으며, 화합물 2는 10μM에서 CSF1R에 대해 89% 저해율을 나타내었다.

질량 스펙트럼 분석 데이타

질량 스펙트럼 분석은 화합물 2가 CSF1R의 공유결합 변경제이었는지 측정하기 위해 사용되었다. CSF1R(0.09μg/μl)를 트립신 분해전에 10X 초과액으로 3시간동안 화합물 2(Mw 518.17)와 함께 배양되었다. 요오드아세트아미드는 화합물 배양 후 알킬레이팅제로 사용되었다. 트립신 분해를 위해, 2μl 분액을 10μl의 0.1% TFA로 희석한 후에, 매트릭스로서 알파 시아노-4-히드록시 신남산(0.1% TFA:아세토니트릴 50:50내에 5mg/ml)을 이용하여 MALDI 표적상에서 직접적으로 마이크로 C18 Zip Tipping에 올려놓았다.

트립신 분해를 위해, 상기 기구를 1800의 펄스 추출 설정으로 리플렉션 모드로 설정하였다. 캘리브레이션은 Laser Biolabs Pep Mix 스탠다드(1046.54, 1296.69, 1672.92, 2093.09, 2465.20)를 사용하여 수행되었다. CID/PSD 분석을 위해, 펩타이드는 이온 게이트 타이밍을 설정하도록 커서를 이용하여 선택되었으며, 프레그먼트화는 약 20% 더 높은 레이저 파워에서 일어났으며, He가 CID에 대한 충돌 가스로서 사용되었다. 프레그먼트에 대한 캘리브레이션은 커브 필드 리플렉션에 대한 P14R 프레그먼트화를 이용하여 수행되었다. 화합물 2 변형(518.17) 편입은 또한 표적 펩타이드가 NCIHR(SEQ ID NO: 8)(MH+ 642.31+518.17=1160.48)를 단지 변형된 펩타이드가 존재하는 것으로 예측함을 확인하였다. 이 펩타이드 신호(1160.50)의 PSD 분석은 이 펩타이드의 서열을 입증한 데이타베이스 MS/MS 이온 서치를 가능케 하기에 충분한 프레그먼트를 제공하였다.

D. ABL

디바인 방법

상기한 바와 같이, 이매티닙(pdbcode 1T46)에 바인딩된 cKIT의 x-선 복합체에 대한 코디네이트를 이용하여, ABL 키나아제(Uniprot code: P00519)의 호몰로지 모델을 생성하였다. 호몰로지 모델은 나타낸 cKIT-ABL 정렬을 이용하여 Discovery Studio에서 Build Homology 모듈을 사용하여 형성되었다. 그 다음, 아크릴아미드 워헤드를 배치하여 바인딩 사이트내 Cys와 공유결합을 형성하기 위해 3차원으로, 이매티닙 템플레이트상의 15 치환가능 위치가 탐색되었다. 상기 방법은 변형될 수 있는 템플레이트 위치나 적절한 Cys가 없는 것으로 확인하였다.

CKIT: 휴먼 CKIT(SEQ ID NO:1)

ABL: 휴먼 ABL(SEQ ID NO:4)

실시예 2. 비가역 니로티닙

니로티닙은 ABL, cKIT, PDGFR 및 CSF1R 키나아제의 강한 가역 인히비터이다. 본 명세서에 나타낸 구조에 기초한 디자인 알고리즘을 이용하여 니로티닙은 신속하고 효과적으로 비가역 인히비터롤 전환되었으며, 이는 cKIT 및 PDGFR을 저해하는 것으로 나타났다.

A. ABL

Abl(pdbcode 3CS9)에 바인딩된 니로티닙의 x-선 복합체에 대한 코디네이트는 단백질 데이타뱅크(world wide web rcsb.org)로부터 획득되었다. 니로티닙의 코디네이트를 추출하고, ABL에 바인딩된 경우 니로티닙의 20옹스트롬내의 모든 단백질 Cys 잔기가 확인되었다. 그 다음, 니로티닙 템플레이트(II-1)상의 14 치환가능한 위치를 3차원으로 탐색하여 클로로아세트아미드로 치환되어 바인딩 사이트내 Cys와 공유 결합을 형성할 수 있는 있는지 조사하였다. 상기 방법은 변형될 수 있는 템플레이트 위치 또는 적절한 Cys가 없는 것으로 확인하였다.

B. PDGFRa

PDGFR 알파 키나아제(Uniprot code: P16234)의 호몰로지 모델은 템플레이트로서 ABL(pdbcode 3CS9)에 바인딩된 니로티닙의 x-선 구조를 사용하여 생성되었다. 호몰로지 모델은 나타낸 ABL-PDGFRa 정렬을 이용하여 Discovery Studio에서 Build Homology 모듈을 사용하여 형성되었다. 그 다음, 워헤드로 치환되어 바인딩 사이트내 Cys와 공유결합을 형성할 수 있는지 조사하기 위해 3차원으로, 니로티닙 템플레이트(II-1)상의 14 치환가능 위치가 탐색되었다. 상기 방법은 클로로아세트아미드 워헤드와 공유결합을 형성할 수 있는 하나의 템플레이트 위치(R₁₁) 및 하나의 Cys(Cys814)를 확인하였다. R₁₁에 클로로아세트아미드를 함유하는 화합물 3이 합성되었다.

PDGFRALPHA: 휴먼 PDGF 리셉터 알파(SEQ ID NO:2)

ABL: 휴먼 ABL(SEQ ID NO:4)

C. CSF1R

CSF1R 키나아제(Uniprot code: P07333)의 호몰로지 모델은 템플레이트로서 ABL(pdbcode 3CS9)에 바인딩된 니로티닙의 x-선 구조를 사용하여 생성되었다. 호몰로지 모델은 나타낸 ABL-CSF1R 정렬을 이용하여 Discovery Studio에서 Build Homology 모듈을 사용하여 형성되었다. 그 다음, 워헤드로 치환되어 바인딩 사이트내 Cys와 공유결합을 형성할 수 있는지 조사하기 위해 3차원으로, 니로티닙 템플레이트(II-1)상의 14 치환가능 위치가 탐색되었다. 상기 방법은 클로로아세트아미드 워헤드와 공유결합을 형성할 수 있는 하나의 템플레이트 위치(R₁₁) 및 하나의 Cys(Cys774)를 확인하였다.

CSF1R: 휴먼 SCF1R(SEQ ID NO:3)

ABL: 휴먼 ABL(SEQ ID NO:4)

D. cKIT

cKIT 키나아제(Uniprot code: P10721)의 호몰로지 모델은 템플레이트로서 ABL(pdbcode 3CS9)에 바인딩된 니로티닙의 x-선 구조를 사용하여 생성되었다. 호몰로지 모델은 나타낸 ABL-cKIT 정렬을 이용하여 Discovery Studio에서 Build Homology 모듈을 사용하여 형성되었다. 그 다음, 클로로아세트아미드 워헤드로 치환되어 바인딩 사이트내 Cys와 공유결합을 형성할 수 있는지 조사하기 위해 3차원으로, 니로티닙 템플레이트(II-1)상의 14 치환가능 위치가 탐색되었다. 이러한 통제는 하나의 템플레이트 위치(R₁₁) 및 하나의 Cys(Cys788)를 남겼다.

CKIT: 휴먼 CKIT(SEQ ID NO:1)

ABL: 휴먼 ABL(SEQ ID NO:4)

화합물 3의 합성

스킴 3-A

a) NH₂CN, EtOH/HCl, 90℃, 15h, b) DMF-DMA, 에탄올, 환류, 16h, c) NaOH/EtOH, 환류, 16h

단계-1: 에탄올(12.5mL)에 용해된 아닐린 에스테르(5g, 30.27mmol)의 교반 용액에 실온에서 농축 HNO₃(3mL)를 첨가하고, 그 다음 50% 수용액의 시안아미드(1.9g, 46.0mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 90℃에서 16시간 가열한 다음, 0℃로 냉각하였다. 고형물을 침전시키고 여과하여 제거하고, 에틸 아세테이트(10mL), 디에틸 에테르(10mL)로 세정하고, 건조하여 연분홍의 고형물로서 이에 상응하는 구아니딘(4.8g, 76.5%)을 수득하였으며, 이는 추가 정제없이 사용되었다.

단계-2: 에탄올(40mL)에 용해된 3-아세틸 피리딘(10.0g, 82.56mmol) 및 N,N-디메틸포름아미드 디메틸 아세탈(12.8g, 96.00mmol)의 교반 용액을 16시간동안 환류하였다. 그 다음, 실온에서 냉각하고 감압하에 농축하여 조 물질을 얻었다. 나머지는 에테르(10mL)에 취하고, 0℃로 냉각하고 여과하여 노란 결정질의 고형물로서 이에 상응하는 에나미드(7.4g, 50.8%)를 수득하였다.

단계-3: 에탄올(27mL)에 용해된 상기 구아니딘 유도체(2g, 9.6mmol), 상기 에나미드 유도체(1.88g, 10.7mmol) 및 NaOH(0.44g, 11.0mmol)의 교반 용액을 90℃에서 48시간동안 환류하였다. 반응 혼합물을 그 다음 냉각하고 감압하에 농축하여 잔류물을 얻었다. 이 잔류물을 에틸 아세테이트(20mL)에 취하고 물(5mL)로 세정하였다. 유기층 및 수성층을 분리하고, 개별적으로 처리하여 이에 상응하는 에스테르 및 중간물 C를 각각 얻었다. 상기 수성층을 냉각하고 백색 고형물이 침전되는 1.5N HCl로 산성화하였다(pH 3-4). 침전물을 여과하고, 건조하고 과잉의 물은 톨루엔(2x10mL)을 통해 공비 증류에 의해 제거하여 엷은 노란 고형물로서 중간물 C(0.5g)을 얻었다. ¹H NMR(DMSO-d6, 400MHz) δ(ppm): 2.32(s, 3H), 7.36(d, J=10.44Hz, 1H), 7.53(d, J=6.84Hz, 1H), 760-7.72(m, 2H), 8.26(s, 1H), 8.57(d, J=6.84Hz, 1H), 8.64(d, J=10.28Hz, 1H), 8.70-8.78(bs, 1H), 9.15(s, 1H), 9.35(s, 1H). 유기 추출물을 염수(3mL)로 세정하고, 건조하고(Na₂SO₄), 그리고 감압하에 농축하여 조 고형물로서 중간물 C의 에스테르를 얻었다. 이는 컬럼 크로마토그래피에 의해 추가 정제되어(SiO₂, 60-120메쉬, MeOH/CHCl₃: 10/90) 노란 고형물로서 중간물 C의 에스테르(0.54g)를 수득하였다.

스킴 3-B

a) (BOC)₂O, DMAP, Et₃N, THF, b) H₂, Pd/C, CH₃OH

단계-1: THF(0.3mL)에 용해된 상기 니트로아닐린(0.15g, 0.7mmol)의 교반 용액에 Et₃N(0.11mL, 0.73mmol) 및 DMAP(0.05g, 0.44mmol)을 첨가하였다. 이에 BOC 안하이드리드(0.33mL, 1.52mmol)를 첨가하고, 반응은 5시간동안 환류되도록 하였다. 그 다음, 반응 혼합물을 냉각하고, THF(15mL)로 희석하고, 염수(5mL)로 세정하였다. 유기상을 분리하고, Na₂SO₄를 통해 건조하고, 여과하고 감압하에 농축하여 조 생성물을 얻었다. 이 조 생성물은 크로마토그래피에 의해 추가 정제되어(SiO₂, 60-120메쉬, MeOH/CHCl₃: 10/90) 백색 결정 고형물로서 이에 상응하는 di-Boc 프로텍티드 아닐린(0.25g, 88%)을 수득하였으며, 이는 추가 정제없이 다음 단계를 위해 취해졌다.

단계-2: MeOH(4mL)에 용해된 Boc 프로텍티드 아닐린 용액(0.25g, 0.13mmol)을 10% Pd/C(0.14g, 0.13mmol)을 통해 20℃에서 12시간동안 수소화하였다(H₂, 3Kg). 그 반응 혼합물을 Celite®의 쇼트 패드를 통해 통과시키고, 감압하에 농축하여 오프-화이트 고형물로서 이에 상응하는 아닐린(0.18g, 77.6%)을 수득하였다. ¹H NMR(CD₃OD, 400MHz) δ(ppm): 1.36(s, 18H), 6.84-6.87(m, 1H), 6.95-6.97(m, 2H).

스킴 3-C

a) HATU, DIEA, CH₃CN, 85℃, 16h, b) TFA/CH₂Cl₂, 0℃ 내지 실온, 3h

단계 1: 아세토니트릴에 용해된 HATU, DIEA의 존재하에서 di-Boc 프로텍티드 아닐린과 중간물 C의 커플링은 이에 상응하는 아미드를 제공할 수 있다.

단계 2: 중간물 D를 제공하기 위한 Boc 기의 탈보호화는 메틸렌 클로라이드에서 0℃에서 TFA로 상기 아미드를 처리한 다음 실온으로 가온함으로써 수행될 수 있다.

0℃에서 THF(10mL)에 용해된 중간물 D(0.1g, 0.22mmol)의 교반 용액에 N2 하에 Et₃N(0.033g, 0.32mmol)을 첨가하였다. 클로로아세틸 클로라이드(0.029g, 0.26mmol)을 교반하면서 적가하고, 그 반응 혼합물을 실온으로 되도록 하게 하고 12시간동안 교반하였다. 그 반응 혼합물을 감압하에 농축하여 잔류물을 얻고, 이를 EtOAc(10mL)에 취하였다. 이 용액을 물(2mL)로 세정하고, 수성층은 다시 EtOAc(2x10mL)로 추출되었다. EtOAc 분획들을 합치고, 염수(2mL)로 세정하였다. Na₂SO₄에 걸쳐 건조하고, EtOAc 용액을 여과하고, 감압하에 농축하여 조 잔류물을 수득하였으며, 이는 그 다음 컬럼 크로마토그래피로 정제되었다(SiO₂, 60-120메쉬, CHCl₃/MeOH: 9/1) 연한 노란 고형물로서 III-14(50mg, 43%)를 수득하였다. ¹H NMR (DMSO-d₆) δ(ppm): 2.34(s, 3H), 4.30(s, 2H), 7.42-7.48(m, 4H), 7.73-7.75(m, 1H), 8.05-8.10(m, 1H), 8.24(d, J=2.2Hz, 1H), 8.29(s, 1H), 8.43(d, J=8.04Hz, 1H), 8.54(d, J=5.16Hz, 1H), 8.67(dd, J=1.6 & 4.76Hz, 1H), 9.16(s, 1H), 9.26(d, J=2.2Hz, 1H), 9.89(s, 1H), 10.50(s, 1H); LCMS: m/e 541.2(M+1)

표적 저해

cKIT 또는 PDGFR를 저해하는 화합물 3의 성능은 실시예 1에 기재된 cKIT 저해 어세이 또는 PDGFR 저해 어세이를 사용하여 평가되었다. 실험 데이타는 화합물 3가 cKIT(IC₅₀=0.7nM) 및 PDGFR(IC₅₀=9nM)의 강한 인히비터이었음을 나타내었다(표 8).

화합물 3 저해 데이타

표적	IC50(nM)
cKIT	0.7
PDGFR	9

PDGFR 질량 스펙트럼 분석

화합물 3의 존재하에서 PDGFR-α의 질량 스펙트럼 분석을 수행하였다. PDGFR-α(43pmols)는 10X 초과량에서 3시간동안 화합물 3(434pmols)과 함께 배양된 후 트립산 분해되었다. 트립신 분해를 위해 5μl 분액(7pmols)을 10μl의 0.1% TFA로 희석한 후에, 매트릭스로서 알파 시아노-4-히드록시 신남산(0.1% TFA:아세토니트릴 50:50내에 5mg/ml)을 이용하여 MALDI 표적상에서 직접적으로 마이크로 C18 Zip Tipping에 올려놓았다.

트립신 분해는 질량 스펙트로미터(MALDI_TOF)에 의해 분석되었다. 트립신 분해의 질량 스펙트럼 분석은 Cys814에서 PDGFR-α와 공유결합되는 화합물 3와 일치하였다(도 7). 트립신 분해의 MS/MS 분석은 Cys814에서 화합물 3의 존재를 확인하였다.

c-KIT 질량 스펙트럼 분석

화합물 3의 존재하에서 c-KIT의 질량 스펙트럼 분석을 수행하였다. 특히, c-KIT 키나아제(86pmols)는 트립신 분해전에 10X 과량으로 3시간동안 화합물 3(863pmols)와 함께 배양되었다. 요오드아세트아미드는 화합물 배양 후 알킬레이팅제로 사용되었다. 트립신 분해를 위해 5μl 분액(14pmols)을 10μl의 0.1% TFA로 희석한 후에, 매트릭스로서 알파 시아노-4-히드록시 신남산(0.1% TFA:아세토니트릴 50:50내에 5mg/ml)을 이용하여 MALDI 표적상에서 직접적으로 마이크로 C18 Zip Tipping에 올려놓았다.

트립신 분해는 질량 스펙트로미터(MALDI-TOF)에 의해 분석되었다. 트립신 분해의 질량 스펙트럼 분석은 두 표적 시스테인 잔기 Cys788(메이저) 및 Cys808(마이너)에서 c-KIT 단백질에 공유결합되는 화합물 3와 일치되었다.

cKIT 세정제거 어세이

GIST430 세포(참조, Bauer et al., Cancer Research, 66(18):9153-9161(2006))를 8x10⁵cells/well의 밀도로 6웰 플래이트에 시딩하고, 다음 날 완전 배지에 희석된 1μM 화합물로 처리하였다. 90분 후, 배지를 제거하고 세포를 화합물이 없는 배지로 세정하였다. 세포를 매 2시간마다 세정하고, 새로운 화합물-프리 배지에 재현탁하였다. 세포를 특정 시점에서 수집하고, Roche 완전 프로테아제 인히비터 정제(Roche 11697498001) 및 포스파타아제 인히비터(Roche 04 906 837 001)이 보충된 세포 추출 버퍼(Invitrogen FNN0011)에 용해하고, 10μg 총 단백질 용해물을 각 래인에 로딩하였다. c-KIT 인산화는 pTyr(4G10) 항체 및 토탈 키트 항체(Cell Signaling Technology)를 이용하여 웨스턴 블롯에 의해 조사되었다. 그 결과를 표 9에 나타내었으며, 이는 화합물 3이 0시간 및 6시간에 "세정제거"후 GIST430 세포에서 c-KIT 효소 저해를 유지하는 것으로 나타났다.

cKIT 세정제거 시험

처리	상대 cKIT 인산화(%)
DMSO 컨트롤	100
화합물 3 0시간 세정제거	11
화합물 3 6시간 세정제거	15

실시예 3. 비가역 VX -680

VX-680은 FLT3 키나아제의 강한 가역 인히비터이다. 본 명세서에 기재된 구조-기초 디자인 알고리즘을 이용하여, VX-680은 신속하고 효율적으로 FLT-3의 비가역 인히비터로 전환되었다.

VX-680

Flt3에 대한 VX-680의 바인딩 모드는 관련 오로라 키나아제(Aurora Kinase)를 이용한 VX-680의 바인딩 모드에서의 저해에 의해 검출되었으며, 이에 따라, VX-680을 갖는 오로라 키나아제 복합체의 결정 구조가 검출되었다. FLT3의 호몰로지 모델은 Accelrys Discovery Studio(Discovery Studio v2.0.1.7347, Accelrys Inc)에서 단백질 모델링 성분을 이용하여 오로라 키나아제(pdbcode 2F4J)의 x-선 구조를 이용하여 형성되었다. 모델 형성에 사용된 정렬은 FLT3 및 오오라 키나아제의 x-선 복합체의 구조 정렬에 기초하였다. 이러한 두 단백질간의 높은 구조 유사성 및 바인딩 사이트 위치의 높은 유사성은 호몰로지 모델링 전략을 더욱 뒷받침하였다.

3Å의 RMSD와 함께 256 개의 구조적으로 동등한 위치를 갖는 FLT3(1RJB)와 오로라 키나아제/VX-680 복합체(2FB4)간의 구조 정렬.

사슬 1: 휴먼 오로라 키나아제(Aurora Kinase)(SEQ ID NO:5)

사슬 2: 휴먼 RAF(SEQ ID NO:6)

VX680을 이용한 Flt3의 호몰로지 모델은 바인딩된 VX680의 20옹스트롬내에 존재하는 Flt3내에 6 개의 Cys 잔기(Cys694, Cys695, Cys681, Cys828, Cys807 및 Cys790)를 확인하였다. 그 다음, VX-680 템플레이트(화학식 III-1)상의 7 치환가능한 위치를 3차원으로 탐색하여 FLT3 바인딩 사이트내에서 확인된 Cys 잔기 중 하나와 공유결합을 위해 워헤드로 치환될 수 있는지 조사하였다. 워헤드는 Discovery Studio를 이용하여 VX-680 상에서 3차원으로 형성되었으며, 그 결과 화합물들의 구조는 워헤드가 바인딩 사이트내 Cys에 이를 수 있는지 조사하기 위해 체크되었다.

화학식 III-1

워헤드 및 측쇄 위치의 유연성을 샘플링하기 위해, 워헤드 및 측쇄 위치의 스탠다드 분자 역학 시뮬레이션을 수행하고, 워헤드가 바인딩 사이트내 상기 확인된 어느 Cys 잔기의 6옹스트롬내에 존재하였는지 검출하기 위해 분석하였다. 분자 역학 시뮬레이션을 위한 Accelrys Discovery Studio v2.0.1.7347(Accelrys Inc)의 Standard Dynsmics Cascade Simulations 프로토콜에서 스탠다드 셋팅이 이용되었다. 비-워헤드 위치의 코디네이트 및 Cys 주쇄 원자들의 코디네이트는 분자 역학 시뮬레이션 도중에 고정으로 유지되었다.

이 시뮬레이션으로 Cys828에 근접한 세 개의 템플레이트 위치(R₄, R₆ 및 R₇)를 확인하였다(표 10). 이러한 템플레이트 위치는 아크릴아미드 반응산물이 후보 인히비터와 Cys828 사이에 형성되는데 필요한 최종 필터에 적용되었으며, 이는 스탠다드 분자 역학 시뮬레이션을 이용하여 2옹스트롬미만의 결합을 형성하는 것을 포함하였다. 이러한 통제는 3개의 모든 템플레이트 위치에 대해 성공적으로 만족되었다. R₇ 위치에 아크릴아미드를 함유한 화합물 4가 합성되었다.

위치	장소	CYS로부터의 거리	결합이 형성될 수 있는지 여부
R1		너무 떨어져 있음
R2	입체 충돌	충돌
R3	입체 충돌
R4		OK	예
R5		OK	아니오
R6		OK	예
R7		OK	예

화합물 4의 합성

단계 1. 4,6-디클로로-2-메틸설포닐 피리미딘

4,6-디클로로-2-(메틸티오)피리딘(24g, 0.123mol)을 교반 및 얼음조하에서 500ml의 CH₂Cl₂에 용해하였다. 메타-클로로페옥시벤조산(약 0.29mol)을 40분내에 서서히 첨가하였다. 그 반응 혼합물을 4시간동안 교반하고, CH₂Cl₂로 희석하고, 그 다음 50% Na₂S₂O₃/NaHCO₃ 용액으로 처리하였다. 유기상은 포화 수성 NaCl로 세정하고, MgSO₄에 걸쳐 건조한 다음 여과하였다. 진공하에서 용매를 제거하여 약 24g의 상기 명칭의 화합물을 연한 자주색 고형물로서 얻었다.

단계 2. 테르트-부틸 N-(4-머캅토페닐)카바메이트

4-아미노티오페놀(25g, 0.2mol)을 250ml의 EtOAc에 용해하였다. 그 용액을 얼음 조로 냉각하고, 디-t-부틸디카보네이트(48g, 0.22mol)을 교반하면서 적가하였다. 1시간 교반 후, 물에 용해된 포화 NaHCO₃를 첨가하였다. 그 반응 혼합물을 밤새 교반하였다. 유기상을 물 및 포화 NaCl 용액으로 세정하고, MgSO₄에 걸쳐 건조한 다음 여과하였다. 진공 하에서 유기 용매를 제거하여 약 68g의 노란 오일을 얻었으며, 이는 헥산으로 처리되어 노란 고형물로서 약 50g의 상기 명칭의 화합물을 얻었다.

단계 3. 테르트-부틸 4-(4,6-디클로로피리미딘-2-일티오)페닐카바메이트

t-BuOH 150ml내에 용해된 테르트-부틸 N-(4-머캅토페닐)카바메이트(5g, 0.022mol) 및 4,6-디클로로-2-메틸설포닐피리미딘(5g, 0.026mol)의 혼합물을 1시간동안 환류에서 가열한 다음, NaOAc(0.5g)를 첨가하였다. 그 반응물을 추가 14시간동안 환류에서 가열하였다. 진공하에 용매를 제거하고 잔류물을 에틸 아세테이트에 용해하였다. 유기상을 K₂CO₃ 용액 및 포화 수성 NaCl로 성공적으로 세정하고, MgSO₄에 걸쳐 건조한 다음, 여과하였다. 용매를 제거하여 노란 고형물로서 약 5g의 상기 명칭의 화합물을 얻었다.

단계 4. 테르트-부틸 4-(4-클로로-6-(3-메틸-1H-피라졸-5-일아미노)피리미딘-2-일티오)페닐카바메이트

1ml의 DMF에 용해된 테르트-부틸 4-(4,6-디클로로피리미딘-2-일티오)페닐카바메이트(100mg, 0.27mmol), 3-메틸-5-아미노-1H-피라졸(28.7mg, 0.3mmol), 디이소프로필에틸아민(41.87mg) 및 NaI(48.6mg, 0.324mmol)의 용액을 85℃에서 4시간동안 가열하였다. 20mL의 에틸 아세테이트로 냉각 및 희석한 후, 유기상을 물 및 포화 수성 NaCl로 연속적으로 세정하고, MgSO₄를 통해 건조한 다음, 여과하였다. 진공하에서 용매를 제거하여 약 120mg의 조 생성물을 수득하였으며, 이는 실리카 겔(30% EtOAc/헥산)로 정제되어 상기 명칭의 화합물 64mg을 얻었다.

단계 5. 테르트-부틸 4-(4-(3-메틸-1-H-피라졸-5-일아미노)-6-(4-메틸피페라진-1-일)피리미딘-2-일티오)페닐카바메이트

테르트-부틸 4-(4-클로로-6-(3-메틸-1H-피라졸-5-일아미노)피리미딘-2-일티오)페닐카바메이트(61mg, 0.14mmol)과 1ml의 메틸피페라진의 혼합물을 110℃에서 2시간동안 가열하였다. 반응 혼합물을 20mL 에틸 아세테이트로 희석하였다. 유기상을 물로 세정하고, MgSO₄를 통해 건조한 다음, 여과하였다. 진공하에서 용매를 제거하여 연한 각색 고형물로서 약 68.2mg의 조 생성물을 수득하였으며, 이는 실리카 겔(30% EtOAc/헥산)로 정제되어 상기 명칭의 화합물 49.5mg을 얻었다. MS(M+H⁺): 497.36.

단계 6. 2-(4-아미노페닐티오)-N-(3-메틸-1H-피라졸-5-일아미노)-6-(4-메틸피페라진-1-일)피리미딘-4-아민

5ml의 MeOH에 용해된 테르트-부틸 4-(4-(3-메틸-1H-피라졸-5-일아미노)-6-(4-메틸피페라진-1-일)피리미딘-2-일티오)페닐카바메이트(44.5mg)의 용액을 2ml의 5N HCl로 처리하였다. TLC가 출발 물질이 잔류하지 않은 것으로 나타난 경우에 반응 혼합물은 에틸 아세테이트로 희석되었다. 유기상은 NaHCO₃ 및 포화 NaCl로 세정되고, MgSO₄를 통해 건조한 다음, 여과하였다. 진공하에서 용매를 제거하여 상기 명칭의 화합물 약 32.1mg을 얻었다. ¹H NMR (300MHz, DMSO-d₆): δ 11.68(s, 1H), 9.65(s, 1H), 9.25(s, 1H), 7.60(d, 2H), 7.45(d, 2H), 6.00(s, 1H), 5.43(s, 1H), 2.38(m, 4H), 2.20(m, 2H), 2.05(m, 2H), 1.52(s, 6H), MS(M+H⁺):397.18.

단계 7. N-(4-(4-(3-메틸-1H-피라졸-5-일아미노)-6-(4-메틸피페라진-1-일)피리미딘-2일티오)페닐)아크릴아미드

아크릴로일 클로라이드(6.85mL, 7.33mg, 0.081mmol)를 3ml의 CH₂Cl₂에 용해된 2-(4-아미노페닐티오)-N-(3-메틸-1H-피라졸-5-일)-6-(4-메틸피페라진-1-일)피리미딘-4-아민(32.1mg, 0.081mmol)의 용액에 0℃에 첨가하였다. 30분 후, 반응 혼합물을 에틸 아세테이트로 희석하였다. 유기상은 NaHCO₃ 및 포화 NaCl로 세정되고, MgSO₄를 통해 건조한 다음, 여과하였다. 용매를 제거하여 조 생성물을 수득하였으며, 이는 실리카겔로 정제되어 20mg의 산물을 얻었다. MS(M+H⁺):451.36.

생화학 시험

화합물 4는 FLT3 생화학 어세이에서 FLT3 인산화 저해에 대한 2.2nM의 IC₅₀을 가졌다. VX-680은 이 어세이에서 10.7nM의 IC₅₀을 가졌다.

FLT3 생화학 어세이

연속-해독 키나아제 어세이를 사용하여 활성 FLT-3 효소에 대한 화합물의 활성을 측정하였다. 이 어세이는 vendor(Invitrogen, Carlsbad, CA, world wide web invitrogen.com/content.cfm?pageid=11338)에 의해 기술된 방법과 실질적으로 동일한 방법으로 수행되었다. 간략히, 10X 스톡의 KDR(Invitrogen 또는 BPS Bioscience(PV3660 또는 40301)) 또는 FLT-3(PV3182) 효소, 1.13X ATP(AS001A) 및 Y9-Sox 또는 Y12-Sox 펩타이드 기질(KCZ1001)을 20mM Tris, pH 7.5, 5mM MgCl₂, 1mM EGTA, 5mM β-글리세로포스페이트, 5% 글리세롤(10X 스톡, KB002A) 및 0.2mM DTT(DS001A)로 구성된 1X 키나아제 반응 버퍼에 제조하였다. 5μL의 효소를 Corning(#3574) 384-웰, 화이트, 논바인딩 표면 마이크로타이터 플래이트(Corning, NY)에서 30분간 27℃에서 0.5μL 체적의 50% DMSO 및 50% DMSO에 제조된 연속 희석 화합물과 함께 예비 배양되었다. 키나아제 반응은 45μL의 ATP/Y9 또는 Y5-Sox 펩타이드 기질 혼합물을 첨가함으로써 시작되었으며, Synergy⁴ 플래이트 리더(BioTek(Winooski, VT))에서 λex360/λem485에서 60분간 매 30초마다 모니터하였다. 각 어세이의 마지막에, 각 웰로부터 얻어진 진행 곡선은 선형 반응 속도론 및 적합도 통계(R², 95% 신뢰구간, 제곱의 절대합)에 대해 조사되었다. 각 반응으로부터 초기 속도(0분 내지 20+ 분)는 상대적 형광 유니트 대 시간(분)의 플롯의 기울기로부터 측정되었다. 그 다음, log[인히비터] 대 반응으로부터 IC₅₀을 추정하기 위해 GraphPad Prism(GraphPad Software(San Diego))에서 Variable Slope 모델을 이용하여 인히비터 농도에 대해 도시하였다.

최적 프로토콜에 사용된 [시약]

[PDGFRα]=2-5nM, [ATP]=60μM 및 [Y9-Sox 펩타이드] = 10μM(ATP K_Mapp=61μM)

[FLT-3]=15nM, [ATP]=500μM 및 [Y5-Sox 펩타이드]=10μM(ATP K_Mapp=470μM)

질량 스펙트럼 분석

Flt3는 트립신 분해전에 100X 초과로 화합물 4와 함께 3시간동안 배양되었다. 요오드아세트아미드가 화합물 배양 후 알킬화제로 사용되었다. 트립신 분해를 위해 5μl 분액(7pmols)을 10μl의 0.1% TFA로 희석한 다음, 매트릭스로서 알파 시아노-4-히드록시 신남산(0.1% TFA:아세토니트릴 50:50내에 5mg/ml)을 이용하여 MALDI 표적상에서 직접적으로 마이크로 C18 Zip Tipping에 올려놓았다.

질량 스펙트럼 측정 기구를 1800의 펄스 추출 설정으로 리플렉션 모드로 설정하였다. 캘리브레이션은 Laser Biolabs Pep Mix 스탠다드(1046.54, 1296.69, 1672.92, 2093.09, 2465.20)를 사용하여 수행되었다. CID/PSD 분석을 위해, 펩타이드는 이온 게이트 타이밍을 설정하도록 커서를 이용하여 선택되었으며, 프레그먼트화는 약 20% 더 높은 레이저 파워에서 일어났으며, He가 CID에 대한 충돌 가스로서 사용되었다. 프레그먼트에 대한 캘리브레이션은 커브 필드 리플렉션에 대한 P14R 프레그먼트화를 이용하여 수행되었다.

부착된 화합물 4와 함께 서열 ICDFGLAR(SEQ ID NO: 9)을 갖는 트립신 펩타이드의 변형 형태는 1344.73에서 피크를 형성하였다. 컨트롤 다이제스트는 1344 피크의 증거를 보이지 않았으며 이는 화합물 4가 변형 펩타이드임을 나타낸다.

실시예 4. 비가역 보세프레비어(boceprevir)

보세프레비어(boceprevir)는 헤파타이티스 C 바이러스(HCV) 프로테아제의 강력한 가역 인히비터이다. 본 명세서에 나타낸 구조-기초 디자인 알고리즘을 이용하여 보세프레비어는 신속하고 효율적으로 HCV 프로테아제의 가역 인히비터로부터 비가역 인히비터로 전환되었다.

HCV 프로테아제(pdbcode 2OC8)에 바인딩된 보세프레비어의 x-선 복합체에 대한 코디네이트를 단백질 데이타 뱅크로부터 얻었다. 보세프레비어의 코디네이트를 추출하고, 보세프레비어의 20옹스트롬내의 모든 단백질 Cys 잔기가 확인되었다. 이는 5개의 잔기 Cys16, Cys47, Cys52, Cys145 및 Cys159를 확인하였다. 그 다음, 워헤드가 보세프레비어 바인딩 사이트내 Cys와 공유결합을 형성할 수 있도록 워헤드와 치환될 수 있는지 조사하기 위해 보세프레비어 템플레이트상의 4치환가능한 위치(화학식 IV-1)를 3차원으로 탐색하였다. 아크릴아미드 워헤드는 Accelrys Discovery Studio v2.0.1.7347(Accelrys Inc, CA)를 이용하여 보세프레비어 템플레이트(화학식 IV-1)상에서 3차원으로 형성되었으며, 그리고 워헤드가 HCV 프로테아제 바인딩 사이트내에 확인된 Cys 잔기 중 하나에 이를 수 있는지 알아보기 위해, 그 결과 형성된 화합물들의 구조를 체크하였다.

워헤드 및 측쇄 위치의 유연성을 샘플링하기 위해, 워헤드 및 측쇄 위치의 분자 역학 시뮬레이션을 수행하고, 워헤드가 바인딩 사이트내 어느 Cys 잔기의 6옹스트롬내에 존재하였는지, 그리고 워헤드와 잔기사이에 입체 충돌이 있었는지 검출하기 위해 분석하였다. 이는 Cys159에 근접한 2 템플레이트 위치(R₁ 및 R₃)를 확인하였다(표 11). 이러한 2 템플레이트 위치는 그 다음, 후보 비가역 인히비터와 Cys159간에 형성되는 반응 산물을 필요로 하는 최종 필터에 적용되었으며, 이는 표준 분자 역학 시뮬레이션을 이용하여 2옹스트롬미만의 결합을 형성하는 것을 포함하였다. 이러한 통제는 하나의 템플레이트 위치, R₃를 남기었다. 화합물 5가 합성되었으며, 이는 생화학 어세이(HCV 프로테아제 FRET 어세이)에서 1.3μM의 IC_{50_ATP}를 갖는 것으로 나타났으며, 그리고 레플리콘 세포 어세이에서 HCV 복제를 저해하고 230nM의 EC50을 갖는 것으로 나타났다.

위치	장소	CYS에 대한 거리	결합이 형성될 수 있는지 여부
R1		OK	아니오
R2	입체 충돌	충돌
R3		OK	예
R4		충돌

화합물 5의 합성

화합물 5는 하기와 같은 단계 및 중간물에 따라 제조되었다.

스킴 4-A

단계 1: 중간물 4a

4mL THF/MeOH(1:1)에 용해된 (1R,2S,5S)-3-테르트-부틸 2-메틸 6,6-디메틸-3-아자비시클로[3.1.0]헥산-2,3-디카르복실레이트(0.30g, 1.1mmol)의 용액에 1N 수성 LiOH 용액(2.0mL)을 첨가하였다. 실온에서 10시간동안 교반한 후, 반응 혼합물을 1.0N HCl로 중화하였다. 유기 용매를 진공하에 증발시키고, 잔류 수성 상은 1.0N HCl을 이용하여 pH~3으로 산성화하고, EtOAc로 추출하였다. 유기층은 염수로 세정되고 무수 마그네슘 설페이트를 통해 건조하였다. 용매 제거 후, 0.28g의 중간물 1a가 얻어졌다: MS m/z: 254.2(ES-).

단계 2: 중간물 4b

10.0ml의 무수 아세토니트릴에 용해된 단계 1의 산물(0.28g, 1.0mmol) 및 3-아미노-4-시클로부틸-2-히드록시부탄아미드(0.27g, 1.3mmol)에 HATU(0.45g, 1.2mmol) 및 DIEA(0.5ml, 3.0mmol)를 실온에서 교반하에 첨가하였다. TLC 분석 결과 커플링 반응의 완료는 10시간 후에 일어난 것으로 나타났다. EtOAc의 50ml 부를 첨가하고, 그 혼합물을 수성 NaHCO₃ 및 염수로 세정하였다. 유기층은 분리되고 Na₂SO₄를 통해 건조되었다. 용매 제거 후, 조 생성물은 실리카 겔(용리액: EtOAc/헥산)상에서 크로마토그래피에 적용되었다. 총 0.4g의 상기 명칭의 화합물을 얻었다(88%). MS m/z: 432.2(ES+, M+Na).

단계 3: 중간물 4c

단계 2의 생성물(0.40g, 1.0mmol)을 디옥산에 용해된 5mL 4N HCl에 용해하였다. 그 혼합물을 실온에서 1시간동안 교반하였다. 용매 제거 후, 10mL 부의 DCM을 붓고 증발시켜 건조하였다. 이러한 DCM 첨가 후 증발 공정을 4회 반복하여 잔류 고형물을 얻었으며, 이는 직접 다음 단계에 사용되었다: MS m/z: 310.1(M+H⁺).

단계 4: 중간물 4d

3.0mL의 무수 아세토니트릴에 용해된 단계 3의 생성물(0.10g, 0.28mmol) 및 (S)-3-(테르트-부톡시카보닐아미노)-2-(3-테르트-부틸우레이도)프로파노익 산(0.10g, 0.33mmol)의 용액에 HATU(125g, 0.33mmol) 및 DIEA(0.17ml, 1.0mmol)를 실온에서 교반하에 첨가하였다. 1시간 후, EtOAc 15ml를 첨가하고, 그 혼합물을 수성 NaHCO₃ 및 염수로 세정하였다. 유기층은 분리되고 Na₂SO₄를 통해 건조되었다. 용매 제거 후, 조 생성물은 실리카 겔(용리액: EtOAc/헥산)상에서 크로마토그래피에 적용되어, 103mg의 상기 명칭의 화합물을 얻었다(60%). MS m/z: 595.2(M+H⁺).

단계 5: 중간물 4e

단계 4의 생성물(75mg, 0.12mmol)을 디옥산에 용해된 3mL 4N HCl에 용해하고, 그 반응물을 실온에서 1시간동안 교반하였다. 용매 제거 후, 3mL 부의 DCM을 붓고 증발시켜 건조하였다. 이러한 DCM 첨가 후 증발 공정을 3회 반복하여 연한 갈색 고형물을 얻었으며, 이는 직접 다음 단계에 사용되었다: MS m/z: 495.2(M+H⁺).

단계 6: 중간물 4f

단계 2에 기재된 방법에 따라 아크릴산(13.6mg, 0.19mmol)을 HATU(65mg, 0.17mmol)을 이용하여 단계 5의 생성물과 커플링하여 상기 명칭의 화합물을 얻었다(60mg, 조 생성물). MS m/z: 549.3(M+H⁺).

단계 7: 단계 6의 조 생성물(60mg, 0.11mmol)을 5ml의 디클로로메탄에 용해한 후, Dess-Martin 페리오디난(60mg, 0.15mmol)을 첨가하였다. 그 결과 형성된 용액을 실온에서 1시간동안 교반하였다. 그 다음, 용매를 제거하고, 잔류물을 실리카 겔(용리액: EtOAc/헥산)상에서 크로마토그래피에 적용하여, 13mg의 상기 명칭의 화합물을 얻었다. MS m/z: 547.2(M+H⁺).

질량 스펙트럼 분석

화합물 5의 존재하에서 HCV의 질량 스펙트럼 분석은 하기 프로토콜을 사용하여 수행되었다: HCV NS3/4A 와일드 타입(wt)을 단백질에 대해 10X 초과의 화합물 5로 1시간동안 배양하였다. 2μl 시료 분액을 10μl의 0.1% TFA로 희석한 후에, 탈착 매트릭스로서 시나피닉 산(0.1% TFA:아세토니트릴 50:50내에 10mg/ml)을 이용하여 MALDI 표적상에서 직접적으로 마이크로 C18 Zip Tipping에 올려놓았다. 상기 기구를 24,500의 펄스 추출 설정을 사용하여 선형 모드로 설정하였으며, 상기 기구의 캘리브레이션은 표준으로서 아포미오글로빈으로 설정하였다. 화합물 5가 없는 단백질에 비해, 화합물 5와 함께 배양된 단백질은 현저히 반응하여 HCV 프로테아제보다 더 무거운 약 547 Da의 새로운 종을 생성하였으며, 이는 547 Da의 화합물 5의 질량과 일치하는 것이었다.

Cys159가 Ser로 변이된 HCV 프로테아제의 돌연변이형을 사용하여 화합물 5의 추가적인 분석을 수행한 결과, 화합물 5는 돌연변이 HCV 프로테아제를 변형시키지 않은 것으로 나타났다.

단쇄 HCV 프로테아제(wt) 펩타이드 발현 및 정제

단쇄 단백질 가수분해 도메인(NS4A_21-32-GSGS-NS_33-631)("GSGS"는 SEQ ID NO: 10에 나타낸 바와 같음)을 pET-14b(Novagen, Madison, WI)내로 클로닝하고, DH10B 세포(Invitrogen)내로 트랜스포밍하였다. 그 결과 형성된 플라스미드를 단백질 발현 및 정제를 위해 앞서 기재된 바와 같이(1, 2) 에스케리차 콜라이 BL21(Escherichia coli BL21)(Novagen)내로 트랜스퍼하였다. 간략히, 배양물을 100μg/mL의 앰피실린을 함유하는 LB 배지에서 37℃에서 흡광도가 600nm(OD600)에 이를 때 까지 배양하고, 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노시드(IPTG)를 1mM로 첨가하여 유도하였다. 18℃에서 20시간동안 추가 배양한 후, 박테리아를 6,000 x g에서 10분간 원심분리하여 수거하고, 50mM Na3PO4, pH 8.0, 300mM NaCl, 5mM 2-머캅토에탄올, 10% 글리세롤, 0.5% Igepal CA630 및 1mM 페닐메틸설포닐 플루오라이드, 0.5μg/mL 루펩틴, 펩스태틴 및 2mM 벤즈아미딘으로 구성된 프로테아제 인히비터 칵테일을 함유하는 라이시스 버퍼에 재부유하였다. 세포들을 동결 및 해동한 후 초음파분해하여 용해(lyse)하였다. 세포 잔해물을 12,000 x g에서 30분간 원심분리하여 제거하였다. 상층액을 0.45-μm 필터(Corning)를 통해 통과시킴으로써 더욱 정제한 다음, NiSO₄로 하전된 HiTrap 킬레이팅 컬럼(Amersham Pharmacia Biotech)상에 적재하였다. 바인딩된 단백질을 100 내지 500mM 선형 구배로 이미다졸 용액으로 용출하였다. 선택된 분획은 Ni²⁺ 컬럼 크로마토그래피를 통해 런닝되고 10% 소디움 도데실 설페이트(SDS)-폴리아크릴아미드 겔상에서 분석되었다. 정제된 단백질은 12% SDS-PAGE 겔에서 전기영동에 의해 분해된 다음, 니트로셀룰로즈 멤브레인상에 트랜스퍼되었다. 단백질은 NS3에 대한 모노클로날 항체를 이용하여 웨스턴 블롯 분석에 의해 분석되었다. 단백질은 2차 항체로서 호스래디쉬 퍼옥시다아제-접합 고트 항마우스 항체(Pierce)와 함께 케미루미네센스 키트(Roche)를 이용하여 가시화되었다. 단백질은 분액화되고 -80℃에 보관되었다.

HCV 프로테아제 및 C159S 변이체의 클로닝 및 발현

NS4A/NS3의 돌연변이 DNA 프레그먼트는 PCR에 의해 생성되고, pET 발현 벡터내로 클로닝되었다. BL21 컴피턴트 세포내로 트랜스포밍한 후, 발현은 IPTG로 2시간동안 유도되었다. His-태깅된 융합 단백질은 친화 컬럼 및 크기 배제 크로마토그래피에 의해 정제되었다.

생화학 어세이

HCV NS3/4A 1b 효소에 대해 HCV 프로테아제 FRET 어세이(IC50_APP)가 사용되었다. 하기 프로토콜을 사용하여 "어패런트" IC50(IC50_APP) 값을 생성하였다. 어느 특정 이론으로 한정하는 것은 아니나, IC50 값으로 대비된 IC50_APP는 시간에 따른 저해의 보다 유용한 지표를 제공할 수 있으며, 따라서 결합 친화도를 보다 더 잘 나타낸다. 프로토콜은 화합물 효능, 순위 및 HCV NS3/4A 1b 프로테아제 효소의 와일드 타입 및 C159S, A156S, A156T, D168A, D168V, R155K 돌연변이들에 대한 저항성 프로필을 평가하도록 다음과 같이 개발된 변형 FRET-베이즈드 어세이(v_03)이다: Bioenza(Mountain View, CA)의 NS3/4A 프로테아제 효소의 10X 스톡 및 1.13X 5-FAM/QXL^TM520 FRET 펩타이드 기질(Anaspec(San Jose, CA))을 50mM Tris-HCl, pH 7.5, 5mM DTT, 2% CHAPS 및 20% 글리세롤에 제조하였다. 0.5μL 체적의 50% DMSO 및 50% DMSO에 연속적으로 희석된 화합물 스포팅한 후, 5μL의 각 효소를 코닝(#3575) 384-웰, 블랙, 마이크로타이터 플래이트(Corning, NY)에 첨가하였다. 프로테아제 반응은 45μL의 FRET 기질을 첨가하여 효소를 첨가한 후 즉시 시작되었으며, Synergy4 플래이트 리더(BioTek(Winooski, VT)에서 λex485/λem520에서 60-90분간 모니터되었다. 각 어세이의 마지막에, 각 웰로부터 얻어진 진행 곡선은 선형 반응 속도론 및 적합도 통계(R², 95% 신뢰구간, 제곱의 절대합)에 대해 조사되었다. 각 반응으로부터 초기 속도(0분 내지 15+ 분)는 상대적 형광 유니트 대 시간(분)의 플롯의 기울기로부터 측정되었다. 그 다음, log[인히비터] 대 반응으로부터 IC₅₀을 추정하기 위해 GraphPad Prism(GraphPad Software(San Diego))에서 Variable Slope 모델을 이용하여 인히비터 농도에 대해 도시하였다.

화합물 5는 본 어세이에서 1.3μM의 IC50으로 HCV 프로테아제를 저해하였다.

리플리콘 어세이

상기 화합물들은 리플리콘-유도 루시페라아제 활성을 사용하여 화합물들의 항바이러스 활성 및 세포독성을 평가하기위해 시험되었다. 본 어세이는 세포주 ET(luc-ubi-neo/ET)를 사용하였으며, 이는 안정한 루시페라아제(Luc) 리포터 및 3 세포 배양-적응 돌연변이를 갖는 HCV RNA 리플리콘을 함유하는 휴먼 Huh7 헤파토마 세포주이다.

상기 ET 세포주는 Dulbecco's 변형 필수 배지(DMEM), 10% FBS(fetal bovine serum), 1% 페니실린-스트렙토마이신(pen-strep), 1% 글루타민, 1% 비필수 아미노산, 400μg/mL G418에서 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 배양되었다. 모든 세포 배양 시약들은 Invitrogen(Carlsbad)로부터 획득되었다. 세포들은 트립신처리되고(1% 트립신:EDTA), 화이트 96-웰 어세이 플래이트(Costar)에 5x10³ cells/well로 플래이팅되어 세포수(세포독성) 또는 항바이러스 활성 평가에 이용되었다. 화합물들은 6개의 3-배 농도로 각각 첨가되고, 어세이는 DMEM, 5% FBS, 1% pen-strep, 1% 글루타민, 1% 비필수 아미노산에서 런닝되었다. 휴먼 인터페론 알파-2b(PBL Biolabs, New Brunswick, NJ)가 각 런닝에 양성 컨트롤 화합물로서 포함되었다. 세포들은 화합물 첨가 후 72시간까지 프로세싱되었으며, 이때 세포들은 여전히 서브컨플루언트한 상태이었다. 항바이러스 활성은 제조자의 지시에 따라 Steady-Glo Luciferase Assay System(Promega, Madison, WI)을 이용하여 리플리콘-유도 루시페라아제 활성을 분석함으로써 측정되었다. 각 웰에서 세포수는 Cell Titer Blue Assay(Promega)에 의해 측정되었다. 화합물 프로필은 적용가능한 EC₅₀(바이러스 복제를 50% 저해하는 유효 농도), EC₉₀(바이러스 복제를 90% 저해하는 유효 농도), IC₅₀(세포 생존율을 50% 감소시키는 농도) 및 SI₅₀(선택 지수: EC₅₀/IC₅₀) 값을 산출함으로써 유도되었다.

화합물 5는 본 어세이에서 230nM의 EC₅₀__APP로 활성을 저해하였다.

실시예 5. 헤파타이티스 C 바이러스 프로테아제의 비가역 인히비터

화합물 V-1은 HCV 프로테아제의 강력한 가역 인히비터이다(실시예 4에 기재된 생화학 어세이에서 0.4nM의 IC₅₀__APP).

HCV 프로테아제(pdbcode 2OC8)에 바인딩된 보세프레비어의 x-선 복합체에 대한 코디네이트를 단백질 데이타 뱅크(world wide web rcsb.org)로부터 얻었다. HCV 프로테아제의 결정 구조는 이에 바인딩된 10이상의 소분자 펩타이드-베이즈드 인히비터를 이용하여 측정되었으며, 이들의 바인딩 모드에서 유의한 구조적 유사성이 있었다. 보세프레비어의 구조는 Discovery Studio를 사용하여 HCV 프로테아제에서 V-1의 구조를 모델-형성하는데 사용되었다.

모델에서 V-1의 20옹스트롬내의 모든 단백질 Cys 잔기가 확인되었다. 이는 5개의 잔기 Cys16, Cys47, Cys52, Cys145 및 Cys159를 확인하였다. 그 다음, 워헤드가 HCV 프로테아제 바인딩 사이트내 확인된 Cys 잔기와 공유결합을 형성할 수 있도록 워헤드와 치환될 수 있는지 조사하기 위해 V-1상의 4치환가능한 위치(V-2 템플레이트 사용)를 3차원으로 탐색하였다. 워헤드는 Accelrys Discovery Studio(Accelrys Inc, CA)를 이용하여 템플레이트(화학식 V-2)상에서 3차원으로 형성되었으며, 그리고 워헤드가 확인된 Cys 잔기 중 하나에 이를 수 있는지 알아보기 위해, 그 결과 형성된 화합물들의 구조를 체크하였다.

화학식 V-2

워헤드 및 측쇄 위치의 유연성을 샘플링하기 위해, 워헤드 및 측쇄 위치의 표준 분자 역학 시뮬레이션을 수행하고, 워헤드가 바인딩 사이트내 확인된 어느 Cys 잔기의 6옹스트롬내에 존재하였는지 체크하였다. 이는 Cys159에 근접한 2개의 템플레이트 위치(R₁ 및 R₃)를 확인하였다. 이러한 2 템플레이트 위치는 그 다음, 아크릴아미드 반응산물이 후보 인히비터와 Cys159 사이에 형성되는데 필요한 최종 필터에 적용되었으며, 이는 스탠다드 분자 역학 시뮬레이션을 이용하여 2옹스트롬미만의 결합을 형성하는 것을 포함하였다. 이러한 통제는 하나의 템플레이트 위치, R₃를 남겼다.

화합물 6이 합성되었으며, HCV 프로테아제(IC50 0.4nM)의 강한 인히비터인 것으로 나타났으며, Cys159상에서 HCV 프로테아제를 변형시키는 것으로 나타났다(도 4).

화합물 6의 합성

N-[(1,1-디메틸에톡시)카보닐]-3-[(2-프로페노일)아미노]-L-알라닐-(4R)-4-[(7-메톡시-2-페닐-4-퀴놀리닐)옥시]-L-프롤릴-1-아미노-2-에테닐-N-(페닐설포닐)-(1R,2S)-시클로프로판카르복스아미드: 상기 명칭의 화합물은 하기와 같은 단계 및 중간물에 따라 제조되었다.

중간물 5-1

에틸-1-[[[(2S,4R)-1-[(1,1-디메틸에톡시)카보닐]-4-[(7-메톡시-2-페닐-4-퀴놀리닐)옥시]-2-피롤리디닐]카보닐]아미노]-2-에테닐-(1R,2S)-시클로프로판카르복실레이트: 100ml의 DCM에 용해된 (1R, 2S)-1-아미노-2-비닐시클로프로판 카르복실산 에틸 에스테르 톨루엔설폰산(2.29g, 7.0mmol) 및 N-Boc(2S, 4R)-(2-페닐-7-메톡시 퀴놀린-4-옥소)프롤린(3.4g, 7.3mmol)의 용액에 HATU(3.44g, 9.05mmol) 및, 그 다음 DIEA(3.81ml, 21.9mmol)을 교반하에 첨가하였다. 그 혼합물을 실온에서 2시간동안 교반하였다. 출발물질의 완전한 소비 후, 반응 혼합물을 염수로 2회 세정하고 MgSO4를 통해 건조하였다. 용매 제거 후, 조 생성물은 실리카 겔(헥산:EtOAc=2:1)상에서 크로마토그래피에 적용되었다. 총 3.45g의 상기 명칭의 화합물을 얻었다: Rf 0.3(EtOAc:헥산=2:1); MS m/z: 602.36(M+H⁺).

중간물 5-2

1-[[[(2S,4R)-1-[(1,1-디메틸에톡시)카보닐]-4-[(7-메톡시-2-페닐-4-퀴놀리닐)옥시]-2-피롤리디닐]카보닐]아미노]-2-에테닐-(1R,2S)-시클로프로판카르복실산: 140ml의 THF/H₂O/MeOH(9.5:1.5)의 140ml에 용해된 중간물 5-1의 생성물(1.70g, 2.83mmol) 용액에 리튬 히드록시드 모노하이드레이트(0.95gm 22.6mmol)을 첨가하였다. 그 혼합물을 실온에서 24시간동안 교반한 후, 반응 혼합물을 1.0N HCl로 중화하였다. 유기 용매는 진공하에 증발시키고, 잔류 수성상은 1.0N HCl을 이용하여 pH~3으로 산성화하고, EtOAc로 추출하였다. 유기층은 염수로 세정하고 무수 마그네슘 설페이트를 통해 건조하였다. 용매 제거 후, 1.6g의 상기 명칭의 화합물을 얻었다: R_f 0.2(EtOAc:MeOH=10:1); MS m/z: 574.36(M+H⁺).

중간물 5-3

N-(1,1-디메틸에톡시)카보닐)-(4R)-4-[(7-메톡시-2-페닐-4-퀴놀리닐)옥시]-L-프롤릴-1-아미노-2-에테닐-N-(페닐설포닐)-(1R, 2S)-시클로프로판카르복스아미드: 20ml의 DMF에 용해된 중간물 5-2의 생성물(1.24g, 2.16mmol) 용액에 HATU(0.98g, 2.58mmol) 및 DIEA(1.43ml, 8.24mmol)를 첨가하고, 그 혼합물을 1시간동안 교반한 다음, 15ml의 DMF에 용해된 벤젠설폰아미드(1.30g, 8.24mmol), DMAP(1.0g, 8.24mmol) 및 DBU(1.29g, 8.4mmol)의 용액을 첨가하였다. 추가 4시간동안 교반을 계속하였다. 반응 혼합물을 EtOAc로 희석하고, 수성 NaOAc 버퍼(pH~5, 2x10ml), NaHCO₃ 용액 및 염수로 세정하였다. MgSO₄를 통해 건조하고 용매를 제거한 후, 일부의 DCM을 첨가하여 순수 생성물이 침전되었다. 여과물을 농축하고, 잔류물을 헥산/EtOAc(1:1~1:2)을 이용한 실리카 겔상의 크로마토그래피에 적용하였다. 총 0.76g의 상기 명칭의 화합물을 얻었다: R_f 0.3(EtOAc:헥산=3:1); MS m/z: 713.45(M+H⁺), 735.36(M+Na⁺).

중간물 5-4

(4R)-4-[(7-메톡시-2-페닐-4-퀴놀리닐)옥시]-L-프롤릴-1-아미노-2-에테닐-N-(페닐설포닐)-(1R, 2S)-시클로프로판카르복스아미드: 30ml의 DCM에 용해된 중간물 5-3의 생성물 용액에 15ml의 TFA를 적가하였다. 그 혼합물을 2시간동안 교반하였다. 용매를 제거한 후, 20ml의 DCM을 붓고, 증발시켜 건조하였다. 이러한 DCM 첨가 후 증발 공정을 4회 반복하였다. 톨루엔(20ml)을 첨가한 다음 증발하여 건조하였다. 이러한 사이클을 2회 반복하여 잔류물을 얻었으며, 이는 상기 명칭의 화합물의 TFA 염으로서 0.9g 백색 분말로 고형화되었다. 상기 TFA 염의 소 시료를 NaHCO₃로 중화하여 상기 명칭의 화합물을 얻었다: R_f 0.4(DCM:MeOH=10:1); MS m/z: 613.65(M+H⁺).

중간물 5-5

N-[(1,1-디메틸에톡시)카보닐)-3-[[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카보닐]아미노]-L-알라닐-(4R)-4-[(7-메톡시-2-페닐-4-퀴놀리닐)옥시]-L-프롤릴-1-아미노-2-에테닐-N-(페닐설포닐)-(1R, 2S)-시클로프로판카르복스아미드: 3.0ml의 DMF에 용해된 중간물 5-4의 생성물(0.15g, 0.178mmol) 및 N-Boc-3-(Fmoc)아미노-L-알라닌 용액에 HATU(85.1mg, 0.224mmol) 및 NMM(90.5mg, 0.895mmol)을 교반하에 실온에서 첨가하였다. TLC 분석 결과, 커플링 반응의 종료는 1시간 후에 일어난 것으로 나타났다. 20ml부의 EtOAc를 붓고, 그 혼합물을 버퍼(pH~4, AcONa/AcOH), NaHCO₃ 및 염수로 세정하고, MgSO₄를 통해 건조하였다. 용매 제거 후, 조 오일 생성물을 실리카 겔(용리액:EtOAc/헥산)상의 크로마토그래피에 적용하였다. 총 0.12g의 상기 명칭의 화합물을 얻었다: R_f 0.4(EtOAc:헥산=1:1); MS m/z: 1021.56(M+H⁺).

중간물 5-6

N-[(1,1-디메틸에톡시)카보닐)-3-아미노-L-알라닐-(4R)-4-[(7-메톡시-2-페닐-4-퀴놀리닐)옥시]-L-프롤릴-1-아미노-2-에테닐-N-(페닐설포닐)-(1R, 2S)-시클로프로판카르복스아미드: 12% 피페리딘을 함유한 1ml의 DMF에 용해된 중간물 5-5의 생성물 110mg의 용액을 실온에서 1.5시간동안 교반한 다음, 고진공하에 증발시켜 건조하였다. 그 잔류물을 헥산/에테르(4:1)로 트리츄에이팅하여 70mg의 상기 명칭의 화합물을 얻었다: R_f 0.25(EtOAc:MeOH=10:1); MS m/z: 798.9(M+H⁺).

화합물 6

N-[(1,1-디메틸에톡시)카보닐)-3-[(2-프로페노일)아미노]-L-알라닐-(4R)-4-[(7-메톡시-2-페닐-4-퀴놀리닐)옥시]-L-프롤릴-1-아미노-2-에테닐-N-(페닐설포닐)-(1R, 2S)-시클로프로판카르복스아미드: 3eq.의 트리에틸아민을 함유하는 3ml의 DCM에 용해된 중간물 5-6의 생성물 69mg의 교반 용액에 아크릴로일 클로라이드(11μL, 0.132mmol)를 0℃에서 적가하였다. 그 반응 혼합물을 실온에서 1.5시간동안 교반한 다음, 10ml의 DCM으로 희석하였다. 그 결과 형성된 용액을 염수로 2회 세정하고, 마그네슘 설페이트를 통해 건조하였다. 용매를 제거하여 조 생성물을 얻었으며, 이는 헥산/EtOAc(1:3~1:5)으로 일차로, 그 다음 DCM-메탄올(50:1~25:1)로 실리카겔상에서 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 총 36mg의 상기 명칭의 화합물을 얻었다: R_f 0.25(DCM:MeOH=25:1); MS m/z: 892.55(M+H⁺).

질량 스펙트럼 분석

질량 스펙트럼 분석은 C159S 변이가 아닌 WT 프로테아제의 변형을 나타내었으며, 이는 화합물 6에 의한 표적 Cys의 특정 변형을 뒷받침한다.

시험 화합물의 존재하에서 HCV 와일드 타입 또는 HCV 변이체 C159S의 질량 스펙트럼 분석을 수행하였다. 100pmols의 HCV 와일드 타입(Bioenza CA)을 화합물과 함께 1시간동안 배양하고, 단백질에 대해 10배 초과의 화합물 6으로 3시간동안 배양하였다. 1μl 분액의 시료(총 4.24μl의 체적)를 10μl의 0.1% TFA로 희석한 후에, 탈착 매트릭스로서 시나피닉 산(0.1% TFA:아세토니트릴 50:50내에 10mg/ml)을 이용하여 MALDI 표적상에서 직접적으로 마이크로 C18 Zip Tipping에 올려놓았다. 분석은 Shimadzu Biotech Axima TOF²(Shimadzu Instruments) 매트릭스-어시스트-레이저 탈착/이온화 타임 오브 플라이트(MALDI_TOF) 질량 스펙트로미터상에서 수행되었다. 동일한 공정을 HCV 프로테아제의 HCV C159S 변이체 100pmols 상에서 단백질에 대해 10배 초과의 화합물 6에서 3시간동안 수행되었다.

불활성 HCV 단백질은 24465의 MH+에서 나타났으며, 이에 상응하는 시나피닉(매트릭스) 부가물은 약 200 Da 이상에서 발생하였다. 화합물 6의 화학량론적 편입(852Da의 MW)이 일어났으며, 이는 약 850-860 Da(25320-25329의 MH+) 이상인 새로운 질량 피크를 생성하였다(도 9). 이는 화합물 6의 단일 분자의 편입과 일치한다. 유의한 반응이 10x 농도의 화합물에서 1시간 후에도 일어났으며, 10x 농도에서 3시간 후에 거의 완전한 전환이 일어났다. 상기 효소의 C159s 변이체 형태는 어느 변형 증거를 보이지 않았으며, 이는 상기 화합물이 Cys 159를 변형하였음을 확인시켜 주는 것이다.

상기 질량 스펙트럼 분석은 화합물 6을 HCV 프로테아제에 첨가함으로써 853 달톤의 질량 변환이 일어났음을 확인시켜 주었으며, 이는 상기 화합물을 함유하는 HCF 프로테아제의 부가물이 형성되었음을 입증하는 것이다. 또한, 화합물 6은 Cys 159가 세린으로 변한 HCV 프로테아제의 변이형태를 갖는 부가물을 형성하지 않았으며, 이는 아크릴아미드 워헤드와 Cys 및 Ser의 다른 반응성에 기초하여 예상된 바와 같다. 이러한 데이타는 본 발명의 방법이 HCV 프로테아제의 특정 비가역 인히비터를 디자인하는데 사용되었음을 입증한다.

생화학 및 세포학적 데이타

화합물 6은 실시예 4에 기재된 생화학 및 리플리콘 어세이로 시험되었다. 화합물 6은 생화학 어세이에서 2.8nM의 IC₅₀__APP 및 리플리콘 어세이에서 174nM의 EC50을 나타내었다.

실시예 6. 비가역 소라페닙

소라페닙은 cKIT 키나아제 도메인의 강력한 가역 인히비터이다. 본 발명의 디자인 알고리즘을 이용하여, 소라페닙은 신속하고 효율적으로 cKIT의 비가역 인히비터로 전환되었다.

cKIT 키나아제(Uniprot code: P10721)의 호몰로지 모델은 템플레이트로서 B-Raf(pdbcode 1UWH)에 바인딩된 소라페닙의 x-선 구조를 이용하여 생성되었다. 상기 호몰로지 모델은 하기에 나타낸 cKIT ― B-RAF 정렬을 이용하여 Discovery Studio에서 Build Homology 모듈을 사용하여 형성되었다. 그 다음, 소라페닙 템플레이트상의 15 치환가능 위치(화학식 VI-1)를 3차원으로 탐색하여 워헤드로 치환되어 워헤드가 바인딩 사이트내 Cys와 공유결합을 형성할 수 있는지 조사하였다. 상기 방법은 2 템플레이트 위치(R₉ 및 R₁₀)와 그리고 아크릴아미드 워헤드와 공유결합을 형성할 수 있는 하나의 Cys(Cys788)를 확인하였다. 그러나 R₉ 위치를 포함한 결합은 덜 바람직한 시스-아미드의 채택을 포함하였으며, 한편 R₁₀ 위치를 포함한 결합은 보다 바람직한 트랜스 아미드를 형성할 수 있었다. 화합물 7이 합성되었으며, 이는 R₁₀ 위치에서 워헤드를 갖는 중요성에 대해 시험되었다.

RAF: 휴먼 RAF(SEQ ID NO:7)

CKIT: 휴먼 CKIT(SEQ ID NO:11)

화합물 7의 합성

4-(4-(3-(4-아크릴아미도-3-(트리플루오로메틸)페닐)우레이도)페녹시)-N-메틸피콜린아미드

단계 1. C,C'-비스-테르트-부틸 N-4-아미노-2-트리플루오로메틸페닐)이미노디카보네이트

1,4-디옥산(50mL)에 용해된 4-니트로-2-트리플루오로메틸아닐린(4.12g, 20mmol)이 교반 용액에 4-DMAP(1.22g, 10mmol) 및 Boc 안하이드리드(13.13g, 50mmol)을 실온에서 첨가하였다. 그 반응 혼합물을 110℃에서 2시간동안 가열하였다. 그 반응 혼합물을 냉각하고, 감압하에 농축하고, 잔류물을 EtOAc(25mL)에 용해하였다. 이를 10% 시트르산 용액(5mL), 물(5mL) 및 포화 수성 NaCl(2mL)로 세정하였다. Na₂SO₄를 통해 건조한 다음 감압하에 농축하여 잔류물을 얻었으며, 이는 컬럼 크로마토그래피(SiO₂, 60-120, 페트 에테르/에틸 아세테이트, 6/4)에 의해 정제되어 5.3g(13mmol)의 연노란 고형물로서 비스-Boc 중간물을 얻었다. 이 물질을 50mL 메탄올에 용해하였다. 이 용액에 질소 분위기하에 아세트산(3mL)을 첨가하고, 철 분말(1.71g, 19.4g-atom)을 첨가하였다. 그 반응 혼합물을 70℃에서 2시간동안 가열하고, 실온으로 냉각하고, celite® bed를 통해 여과하였다. 여과물을 감압하에 농축하고, 잔류물을 EtOAc(30mL)로 희석하였다. 이를 물(2mL) 및 포화 수성 NaCl(2mL)로 세정하고, Na₂SO₄를 통해 건조하였다. 감압하에서의 농축으로 잔류물이 얻어졌으며, 이는 컬럼 크로마토그래피(SiO₂, 60-120, 페트 에테르/에틸 아세테이트, 6/4)에 의해 정제되어 3.19g(13mmol)의 오프-화이트 고형물로서 상기 명칭의 화합물을 얻었다.

단계 2. 4-(4-(3-(4-아미노-3-(트리플루오로메틸)페닐)우레이도)페녹시)-N-메틸피콜린아미드

톨루엔(5mL)에 용해된 C,C'-비스-테르트-부틸 N-4-아미노-2-트리플루오로메틸페닐)이미노디카보네이트(0.5g, 1.32mmol) 및 Et₃N(0.6mL, 5.97mmol)의 교반 용액에 포스겐(톨루엔에 용해된 20% 용액, 0.91mL, 1.85mmol)을 첨가하였다. 그 반응 혼합물을 환류에서 16시간동안 가열한 다음, 실온으로 냉각하였다. 4-(4-아미노페녹시)-N-메틸-2-피리딘카르복스아미드(0.32g, 1.32mmol)를 첨가하고, 그 반응 혼합물을 환류에서 2시간동안 가열하였다. 그 반응 혼합물을 퓸 후드에서 물(5mL)로 퀀칭하고, EtOAc(2x20mL)로 추출하였다. 에틸 아세테이트 추출물을 포화 수성 NaCl(15mL)로 세정하고, Na2SO4를 통해 건조하고, 감압하에 농축하여 0.62g의 상기 명칭의 화합물을 얻었다.

단계 3. 4-(4-(3-(4-아크릴아미도-3-(트리플루오로메틸)페닐)우레이도)페녹시)-N-메틸피콜린아미드

DMF(5mL)에 용해된 4-(4-(3-(4-아미노-3-(트리플루오로메틸)페닐)우레이도)페녹시)-N-메틸피콜린아미드(0.1g, 0.22mmol) 및 피리딘(0.0.5g, 0.45mmol)의 교반 용액에 아크릴로일 클로라이드(0.03g, 0.33mmol)을 0℃에서 첨가하였다. 그 반응 혼합물을 실온으로 냉각하고, 12시간동안 더 교반하고, 얼음 냉수(10mL)로 퀀칭하고, EtOAc(2x20mL)로 추출하였다. 에틸 아세테이트 추출물을 포화 수성 NaCl(5mL)로 세정하고, Na₂SO₄를 통해 건조하고, 감압하에 농축하여 조 생성물 CNX-43을 얻었다. 이 조 생성물을 중성 알루미나 컬럼 크로마토그래피에 의해 먼저 정제한 다음 프렙(prep)에 의해 정제하였다. HPLC를 수행하여 백색 고형물로서 18mg의 상기 명칭의 화합물을 얻었다. ¹H NMR(MeOD) δppm: 2.94(s, 3H), 5.82(d, J=10.0Hz, 1H), 6.37(dd, J=1.76 & 17.16Hz, 1H), 6.50(dd, J=10.28 & 17.16Hz, 1H), 7.06(dd, J=2.6 & 5.94Hz, 1H), 7.11-7.15(m, 2H), 7.45(d, J=8.64Hz, 1H), 7.56-7.61(m, 3H), 7.67(dd, J=2.24 & 8.48Hz, 1H), 8.0(s, 1H), 8.45-8.55(m, 1H); LCMS: m/e 501(M+2)

생화학 시험

소라페닙은 cKIT 인산화의 저해에 대해 50.5nM의 IC50을 가졌으며, 한편 화합물 7은 cKIT 인산화의 저해에 대해 31nM의 IC50을 가졌다. 생화학 시험은 cKIT에 대해 실시예 1에 기재된 어세이를 이용하여 수행되었다.

GIST882 세포성 어세이

GIST882 세포를 완전 배지에 8x105 cells/well의 밀도로 6웰 플래이트에 시딩하였다. 다음 날, 완전 배지로 희석된 1μM 화합물로 세포를 90분간 처리하였다. 90분 후, 배지를 제거하고, 세포를 화합물-프리 배지로 세정하였다. 세포를 매 2시간마다 세정하고 새로운 화합물-프리 배지에 재부유하였다. 세포를 특정 시점에서 수거하고, Roche 완전 프로테아제 인히비터 정제(Roche 11697498001) 및 포스파타아제 인히비터(Roche 04 906 837 001)이 함유된 Cell Extraction Buffer(Invitrogen FNN0011)에서 용해한 다음, 용해물을 28.5 게이지 주사기를 통해 각 10회 통과시킴으로써 전단시켰다. 단백질 농도를 측정하고, 10μg 총 단백질 용해물을 각 래인에 로딩하였다. cKIT 인산화는 pTyr(4G10) 항체 및 총 키트 항체(Cell Signaling Technology)를 이용하여 웨스턴 블롯에 의해 분석되었다.

소라페닙 및 화합물 7은 1마이크로몰에서 GIST882 세포주에서 세포 활성에 대해 시험되었다. 두 화합물은 cKIT 자가인산화를 저해하였으며, 또한 ERK의 다운스트림 신호전달을 저해하였다. 비가역 인히비터로 지연된 저해가 있었는지 알아보기 위해, 세포를 화합물없이 세정하였다. 가역 인히비터, 소라페닙에 대해, cKIT 및 다운스트림 신호전달의 저해 활성은 해소되었으나, 화합물 7의 비가역 저해는 적어도 8시간동안 계속되었다. 이 데이타는 비가역 인히비터 소라페닙에 비해 비가역 인히비터 화합물 7의 활성기간이 우수함을 뒷받침한다.

질량 스펙트럼 분석

c-KIT(15pmols)를 화합물 7(150pmols)로 3시간동안 10X 초과량으로 배양한 후 트립신 분해하였다. 화합물 배양 후 알킬화제로 요오드아세트아미드가 사용되었다. 화합물 7이 첨가되지 않은 컨트롤 시료를 또한 제조하였다. 트립신 분해를 위해, 2μl 분액(3.3pmols)을 10μl의 0.1% TFA로 희석한 후에, 매트릭스로서 알파 시아노-4-히드록시 신남산(0.1% TFA:아세토니트릴 50:50내에 5mg/ml)을 이용하여 MALDI 표적상에서 직접적으로 마이크로 C18 Zip Tipping에 올려놓았다.

기구:

트립신 분해를 위해, 상기 기구를 2200의 펄스 추출 설정으로 리플렉션 모드로 설정하였다. 캘리브레이션은 Laser Biolabs Pep Mix 스탠다드(1046.54, 1296.69, 1672.92, 2093.09, 2465.20)를 사용하여 수행되었다. CID/PSD 분석을 위해, 펩타이드는 이온 게이트 타이밍을 설정하도록 커서를 이용하여 선택되었으며, 프레그먼트화는 약 20% 더 높은 레이저 파워에서 일어났으며, He가 CID에 대한 충돌 가스로서 사용되었다. 프레그먼트에 대한 캘리브레이션은 커브 필드 리플렉션에 대한 P14R 프레그먼트화를 이용하여 수행되었다.

화합물 7에 의해 변형되는 것으로 예측된 펩타이드는 서열 NCIHR(SEQ ID NO: 8)을 가지며, 1141.5의 MH+에서 관찰되었다.(화합물 7의 모노아이소토프 질량은 499.15이었음) 비교시, 화합물 7을 포함하지 않은 cKIT의 컨트롤 분해는 이러한 질량 피크의 완전한 부재를 나타내었다. 이 데이타는 또한 서열 ICDFGLAR(SEQ ID NO: 9)을 갖는 펩타이드의 변형이 있었음을 제시한다.

실시예 7. 헤파타이티스 C 바이러스 프로테아제의 비가역 인히비터

실시예 5에 기재된 바와 같이, 화합물 V-1은 HCV 프로테아제의 강력한 가역 인히비터이다. HCV 프로테아제에서 V-1의 모델-형성 구조를 이용하여(참조, 실시예 5), 상기 모델에서 V-1의 20옹스트롬내의 모든 단백질 Cys 잔기가 확인되었다. 이는 5 잔기들, Cys16, Cys47, Cys52, Cys145 및 Cys159를 확인하였다. 그 다음, 에논 워헤드로 치환되어 HCV 바인딩 사이트내 확인된 Cys 잔기와 공유결합을 형성할 수 있는 4 치환가능 위치를 3차원으로 탐색하였다. 워헤드는 Discovery Studio(Accelrys Inc, CA)를 이용하여 템플레이트(화학식 V-2)상에서 3차원으로 형성되었으며, 그 결과 형성된 화합물의 구조는 상기 워헤드가 바인딩 사이트내 확인된 Cys 잔기중 하나에 이를 수 있는지 체크하였다.

워헤드 및 측쇄 위치의 유연성을 샘플링하기 위해, 워헤드 및 측쇄 위치의 표준 분자 역학 시뮬레이션을 수행하고, 워헤드가 바인딩 사이트내 어느 Cys 잔기의 6옹스트롬내에 존재하였는지 체크하였다. 이는 Cys159에 근접한 두 템플레이트 위치(R₁ 및 R₃)를 확인하였다. 이러한 두 템플레이트 위치는 그 다음, 에논 반응 생성물이 후보 인히비터와 Cys159 사이에 형성되는데 필요한 최종 필터에 적용되었으며, 이는 스탠다드 분자 역학 시뮬레이션을 이용하여 2옹스트롬미만의 결합을 형성하는 것을 포함하였다. 이러한 통제는 하나의 템플레이트 위치, R₃를 남겼다.

화합물 8이 합성되었으며, 이는 HCV 프로테아제의 강력한 인히비터인 것으로 나타났으며(IC₅₀__APP<0.5nM), Cys159상의 HCV 프로테아제를 변형하는 것으로 나타났다.

화합물 8의 합성

화합물 8

테르트-부틸-(S)-1-(2S,4R)-2-(1R,2S)-1-(시클로프로필설포닐카바모일)-2-비닐시클로프로필카바모일)-4-(7-메톡시-2-페닐퀴놀린-4-일옥시)피롤리딘-1-일)-7-메틸-1,5-디옥소옥트-6-엔-2-일카바메이트: 상기 명칭의 화합물은 하기와 같은 단계 및 중간물에 따라 제조되었다.

중간물 8-1:

6ml의 DMF에 용해된 중간물 5-2(0.9g, 1.57mmol)의 용액에 CDI(0.28g, 1.7mmol)을 첨가하였다. 그 혼합물을 1시간 동안 교반한 후, 2ml의 DMF에 용해된 시클로프로필설폰아미드(0.25g, 2.0mmol), DBU(0.26ml, 1.8mmol) 및 DIEA(0.9ml, 5mmol)의 용액에 첨가하였다. 그 혼합물을 60℃에서 10시간동안 교반하였다. 그 반응 혼합물을 EtOAc로 희석하고, 수성 NaOAc 버퍼(pH~5, 2x10ml), NaHCO3 용액 및 염수로 세정하였다. Na₂SO₄를 통해 건조하고, 용매를 제거한 후, 잔류물을 헥산/EtOAc(1:1~1:2)을 이용한 실리카겔상에서의 크로마토그래피에 적용하였다. 총 0.8g의 중간물 8-1을 얻었다: R_f 0.3(EtOAc:헥산=3:1), MS m/z: 677.2(M+H⁺).

중간물 8-2:

중간물 8-1(0.8g, 1.18mmol)을 디옥산에 용해된 5ml의 4N HCl에 용해하고, 그 반응물을 실온에서 1시간동안 교반하였다. 용매 제거 후, 20-ml 부의 DCM을 붓고, 증발하여 건조하였다. 이러한 DCM 첨가 후 증발 공정을 3회 반복하여 중간물 8-2을 이의 HCl 염으로서 수득하였다. MS m/z:577.2(M+H⁺).

중간물 8-3:

10ml의 무수 THF에 용해된 N-Boc-피로글루타믹산(0.23g, 1.0mmol)의 용액에 2-메틸프로프-1-에닐)마그네슘 브로마이드(THF, 5ml, 2.5mmol에 0.5M)를 -78℃에서 서서히 첨가하였다. 그 반응 혼합물을 1시간동안 -78℃에서 교반하였다. 1N HCl(2.5ml) 수성 용액을 첨가하고, 그 혼합물을 서서히 실온으로 데웠다. 1N HCl로 pH를 ~3으로 조절하였다. 그 다음, THF를 진공하에서 제거하고, 잔류 수용액을 DCM(3X 20mL)로 추출하였다. 유기층을 Na₂SO₄를 통해 건조하고, 여과하고, 용매를 제거하여 조 생성물을 얻었다.

화합물 8:

테르트-부틸-(S)-1-(2S,4R)-2-(1R,2S)-1-(시클로프로필설포닐카바모일)-2-비닐시클로프로필카바모일)-4-(7-메톡시-2-페닐퀴놀린-4-일옥시)피롤리딘-1-일)-7-메틸-1,5-디옥소옥트-6-엔-2-일카바메이트: 상기 명칭의 화합물은 HATU를 이용하여 화합물 6의 합성시 중간물 5-5에 대해 기재된 커플링 반응에 따라 중간물 8-2와 중간물 8-3을 커플링하여 제조되었다.

총 70mg의 상기 명칭의 화합물을 얻었다(65%): R_f 0.5(EtOAc); MS m/z: 844.2(M+H⁺).

생화학 데이타

화합물 8은 실시예 4에 기재된 생화학 어세이로 시험되었으며, HCV 프로테아제의 강력한 인히비터인 것으로 나타났다(IC₅₀__APP<0.5nM)

질량 스펙트럼 분석

질량 스펙트럼 분석은 실시예 5에 기재된 바와 같이 수행되었다. 분석 결과, 화합물 8을 HCV 프로테아제에 첨가함으로써 약 844달톤의 질량 변환을 일으킨 것으로 확인되었으며, 이는 상기 화합물을 함유한 HCV 프로테아제의 부가물이 형성되었음을 입증하는 것이다(도 11).

실시예 8. 공유원자가를 통한 향상된 효능

본 실시예는 중간정도의 또는 약한 효능을 갖는 가역 인히비터로부터 출발하여 강력한 비가역 인히비터를 디자인하는 디자인 알고리즘 및 방법의 적용을 나타낸다.

8.A. Btk 키나아제의 인히비터

화합물 9는 Btk 키나아제의 약한 가역 인히비터이다(생화학 어세이에서 IC₅₀ 8.6μM). 본 발명의 구조-기초 디자인 알고리즘을 이용하여 화합물 9는 신속하고 효율적으로 Btk의 비가역 인히비터로 전환되었다.

Btk에서 화합물 9의 바인딩 모드는 Discovery Studio(v2.0.1.7347; Accelrys Inc.)에서 단백질 모델링 컴포넌트로 Btk 아포 구조(pdb code: 1K2P) 및 EGFR 인히비터의 코-크리스털 구조(pdb code: 2RGP)를 이용하여 도킹 방법을 통해 획득되었다.

Btk를 이용한 화합물 9의 바인딩 모델은 화합물 9의 20옹스트롬내에 존재하는 5 Cys 잔기들(Cys464, Cys481, Cys502, Cys506, 및 Cys527)을 확인하였다. 그러나, 3차원 구조에서, 상기 5 잔기중 4 잔기(Cys464, Cys502, Cys506 및 Cys527)은 측쇄 또는 단백질 백본에 의해 블로킹되었다. 이러한 시스테인들은 입체 충돌에 기인하여 쉽게 접근가능하지 않다. 따라서, 단지 하나의 시스테인(Cys481)만이 도달가능하며, 바람직한 거리내에 존재한다. 화합물 9 템플레이트상의 일 치환가능한 위치는 3차원으로 탐색되었다(화학식 VIII-1에서 R₁). 워헤드(아크릴아미드)는 Discovery Studio를 사용하여 화합물 9 템플레이트상에 형성되었으며, 그 결과 형성된 화합물의 구조는 Discovery Studio(v2.0.1.7347; Accelrys Inc.)를 사용하여 Btk내로 도킹되었다. 최종 3차원 구조는 상기 워헤드가 바인딩 사이트내 Cys에 이들 수 있는지 검출하도록 체크되었다(Cys로부터 6옹스트롬 이하이었음).

이러한 방법은 화합물 9 템플레이트상의 상기 선택된 R₁ 위치가 Cys481에 근접하며, 그 거리는 6옹스트롬미만이었음을 확인하였다. 아크릴아미드 반응 생성물은 후보 인히비터와 Cys481 사이에 형성되었으며, 이는 표준 분자 역학 시뮬레이션을 이용하여 2옹스트롬미만의 결합을 형성하는 것을 포함하였다. 이러한 통제는 이러한 위치에 대해 성공적으로 만족되었다.

하기 방법 및 어세이를 사용하여, R₁ 위치에 아크릴아미드를 함유하는 화합물 10을 합성하였으며, 이는 생화학 어세이에서 IC₅₀ 1.8nM을 갖는 Btk 키나아제의 강한 인히비터인 것으로 나타났다. 이는 화합물 9(IC₅₀ 8.6μM)에 비해 효능이 현저히 향상된 것이다. 화합물 10의 활성은 또한 Ramos 세포 어세이로 평가되었다. 화합물 9는 생화학 어세이에서 이와 같이 Btk의 약한 인히비터이었기 때문에, 세포 어세이에서 어느 저해 활성을 가질 것이라고 예측되지 않았다. 그러나, 1μM의 농도로 사용된 경우, 화합물 10은 Ramos 세포에서 Btk 신호전달의 85% 저해를 나타내었다. 이러한 데이타는 본 발명의 알고리즘 및 방법이 약한 가역 인히비터(화합물 9)의 효능을 향상시키는데 사용되었으며, 강력한 비가역 인히비터(화합물 10)가 세포에서 활성을 가졌음을 보여준다.

화합물 10의 합성

N-{3-[6-(4-페녹시페닐아미노)-피리미딘-4-일아미노]페닐}-2 프로펜아미드

5mL의 THF에 용해된 3-[6-(4-페녹시페닐아미노)-피리미딘-4-일아미노]페닐아민(250mg, 0.7mmol) 및 트리에틸아민(180mg, 1.75mmol)의 용액을 실온에서 교반하였다. 아크릴로일 클로라이드(80mg, 0.9mmol)를 반응 혼합물에 첨가하고, 이를 실온에서 1시간동안 교반하였다. 용매를 진공 증발에 의해 제거하고, 그 조 생성물을 EtOAc/DCM 용매 시스템을 이용한 실리카 겔상에서 플래쉬 크로마토그래피에 의해 정제하여 연한 색상의 고형물로서 115mg(40% 수율)의 상기 명칭의 화합물을 얻었다. MS(m/z):MH⁺=424. ¹H NMR(DMSO):9.14(s, 1H), 9.10(s, 1H), 8.22(s, 1H), 7.89(s, 1H), 7.52(d, 2H, J=9.0Hz), 7.35-6.92(m, 11H), 6.42(dd, 1H, J1=10.1Hz, J2=16.9Hz), 6.22(dd, 1H, J1=1.9Hz, J2=16.9Hz), 6.12(s, 1H), 5.70(dd, 1H, J1=1.9Hz, J2=10.1Hz)ppm.

Btk에 대한 효능 평가를 위한 옴니아 어세이

하기 프로토콜은 Btk 효소의 활성 형태에 대한 화합물의 고유 효능을 측정하기 위한 연속-리드 키나아제 어세에를 나타낸다. 본 어세이 플랫폼의 기법은 vendor(Invitrogen, Carlsbad, CA)에 의해 가장 잘 기술되어 있다(the world wide web at invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-Services/Applications/Drug-Discovery/Target-and-Identification-and-Validation/KinaseBiology/KB-Misc/Biochemical-Assays/Omnia-Kinase-Assays.html). 간략히, 10X 스톡의 5nM Btk(Invitrogen), 1.13X 40μM ATP(AS001A) 및 10μM(ATP KMapp~36mM) Tyr-Sox 접합 펩타이드 기질(KCZ1001)을 20mM Tris, pH 7.5, 5mM MgCl2, 1mm EGTA, 5mM β-글리세로포스페이트, 5% 글리세롤(10X 스톡, KB002A) 및 0.2mM DTT(DS001A)로 구성된 1X 키나아제 반응 버퍼에 준비하였다. 5μL의 효소를 Corning(#3574) 384-웰, 화이트, 논-바인딩 표면 마이크로타이터 플래이트(Corning, NY)에서 0.5μL 체적의 50% DMSO 및 50% DMSO에 준비된 연속 희석 화합물과 함께 27℃에서 30분간 예비배양하였다. 키나아제 반응은 45μL의 ATP/Tyr-Sox 펩타이드 기질 혼합물을 첨가하여 시작되었으며, Synergy⁴ 플래이트 리더(BioTek(Winooski, VT))에서 λex360/λem485에서 60분간 매 30-90초마다 모니터하였다. 각 어세이의 마지막에서, 각 웰로부터 얻어진 진행 곡선은 선형 반응 속도론 및 적합도 통계(R², 95% 신뢰구간, 제곱의 절대합)에 대해 조사되었다. 각 반응으로부터 초기 속도(0분 내지 ~30분)는 상대적 형광 유니트 대 시간(분)의 플롯의 기울기로부터 측정되었다. 그 다음, log[인히비터] 대 반응으로부터 IC₅₀을 추정하기 위해 GraphPad Prism(GraphPad Software(San Diego))에서 Variable Slope 모델을 이용하여 인히비터 농도에 대해 도시하였다.

Btk Ramos 세포 어세이

화합물 CNX-85는 Ramos 휴먼 Burkitt 림프종 세포에서 시험되었다. Ramos 세포를 T225 플라스크에서 서스펜션으로 성장시키고, 스핀다운한 다음, 50ml의 혈청-프리 배지에 재부유하고 1시간동안 배양하였다. 화합물은 혈청 프리 배지내에 Ramos 세포에 1, 0.1, 0.01 또는 0.001μM의 최종 농도로 첨가되었다. Ramos 세포는 화합물과 함께 1시간동안 배양되고, 혈청 프리 배지로 다시 세정되고, 100μl의 혈청 프리 배지로 재부유되었다. 그 다음, 세포들은 1μg의 고트 F(ab')2 Anti-Human IgM으로 자극되고, 10분간 얼음상에서 배양되어 B 세포 리셉터 신호전달 경로가 활성화되었다. 10분 후, 세포들을 PBS로 1회 세정한 다음, Invitrogen Cell Extraction 버퍼로 얼음상에서 용해되었다. 용해물로부터 얻은 16μg 총 단백질을 겔상에 로딩하고, 블롯은 Btk 기질 PLCγ2의 인산화에 대해 탐침되었다.

8.B. HCV 프로테아제의 인히비터

화합물 11은 HCV 프포테아제의 약한 가역 인히비터이다(생화학 어세이에서 165nM의 IC₅₀). 본 명세서에 나타낸 구조-기초 디자인 알고리즘을 이용하여, 화합물 11은 신속하고 효율적으로 HCV 프로테아제의 비가역 인히비터로 전환되었다.

10 이상의 소분자 펩타이드-기초 인히비터를 갖는 복합체에서 HCV 프로테아제의 결정 구조가 조사되었으며, 이러한 인히비터들의 바인딩 모드에서 유의한 구조적 유사성이 있었다. 보세프레비어(pdbcode 2OC8)를 갖는 복합체의 x-선 구조는 단백질 데이타뱅크(world wide web rcsb.org)로부터 얻어졌으며, Discovery Studio를 사용하여 HCV 프로테아제에서 화합물 11의 구조를 모델-형성하는데 사용되었다.

모델에서 도킹된 화합물의 20옹스트롬내의 HCV 프로테아제의 모든 Cys 잔기가 확인되었다. 이는 5개의 잔기 Cys16, Cys47, Cys52, Cys145 및 Cys159를 확인하였다. 그 다음, 워헤드가 HCV 프로테아제 바인딩 사이트내 확인된 Cys 잔기와 공유결합을 형성할 수 있도록 워헤드와 치환될 수 있는지 조사하기 위해 화합물 11 템플레이트상의 일 치환가능한 위치(화학식 VIIIB-1에서 R₁)를 3차원으로 탐색하였다. 워헤드(아크릴아미드)는 템플레이트(화학식 VIIIB-1)상에서 3차원으로 형성되었으며, 가역 인히비터의 나머지는 변화시키지 않고 유지하였다. 워헤드가 바인딩 사이트내 확인된 Cys 잔기 중 하나에 이를 수 있는지 알아보기 위해, 그 결과 형성된 화합물들의 구조를 체크하였다.

워헤드 및 측쇄 위치의 유연성을 샘플링하기 위해, 워헤드 및 측쇄 위치의 분자 역학 시뮬레이션을 수행하고, 워헤드가 바인딩 사이트내 확인된 어느 Cys 잔기의 6옹스트롬내에 존재하였는지 분석하였다. 이 방법은 상기 템플레이트상의 R₁ 위치가 Cys159에 근접하였음을 확인하였다. 그 다음, 이 위치는 아크릴아미드 반응산물이 후보 인히비터와 Cys159 사이에 형성되는데 필요한 최종 필터에 적용되었으며, 이는 스탠다드 분자 역학 시뮬레이션을 이용하여 2옹스트롬미만의 결합을 형성하는 것을 포함하였다. 이러한 통제는 화합물 12와 부합하였다.

하기와 같이, 화합물 12가 합성되었으며, HCV 프로테아제의 강한 인히비터인 것으로 나타났다.

화합물 12의 합성

(2S,4R)-1-(2-아크릴아미도아세틸)-4-(7-메톡시-2-페닐퀴놀린-4-일옥시)-N-((1R,2S)-1-(페닐설포닐카바모일)-2-비닐시클로프로필)피롤리딘-2-카르복스아미드:

상기 명칭의 화합물은 하기와 같은 단계 및 중간물에 따라 제조되었다.

에틸-1-[[[(2S,4R)-1-[(1,1-디메틸에톡시)카보닐]-4-[(7-메톡시-2-페닐-4-퀴놀리닐)옥시]-2-피롤리디닐]카보닐]아미노]-2-에테닐-(1R,2S)-시클로프로판카르복실레이트: 100ml의 DCM에 용해된 (1R, 2S)-1-아미노-2-비닐시클로프로판 카르복실산 에틸 에스테르 톨루엔설폰산(2.29g, 7.0mmol) 및 N-Boc(2S, 4R)-(2-페닐-7-메톡시 퀴놀린-4-옥소)프롤린(3.4g, 7.3mmol)의 용액에 교반하에 HATU(3.44g, 9.05mmol)을 첨가한 다음, DIEA(3.81ml, 21.9mmol)를 첨가하였다. 그 혼합물을 실온에서 2시간동안 교반하였다. 출발 물질의 완전 소비 후, 그 반응 혼합물을 염수로 2회 세정하고, MgSO₄를 통해 건조하였다. 용매 제거 후, 조 생성물을 실리카 겔(헥산:EtOAc=2:1)상에서의 크로마토그래피에 적용하였다. 3.45g의 상기 명칭의 화합물을 얻었다: R_f 0.3(EtOAc:헥산=2:1), MS m/z: 602.36(M+H⁺).

1-[[[(2S,4R)-1-[(1,1-디메틸에톡시)카보닐]-4-[(7-메톡시-2-페닐-4-퀴놀리닐)옥시]-2-피롤리디닐]카보닐]아미노]-2-에테닐-(1R,2S)-시클로프로판카르복실산: 140ml의 THF/H₂O/MeOH(9:5:1.5)에 용해된 중간물 8.B-1의 생성물(1.70g, 2.83mmol)의 용액에 리튬 히드록시드 모노하이드레이트(0.95g, 22.6mmol)을 첨가하였다. 실온에서 24시간동안 교반한 후, 그 반응 혼합물을 1.0N HCl로 중화하였다. 유기 용매를 진공하에 증발시키고, 잔류 수성 상을 1.0N HCl을 이용하여 pH~3으로 산성화하고 EtOAc로 추출하였다. 유기층을 염수로 세정하고, 무수 마그네슘 설페이트를 통해 건조하였다. 용매 제거 후, 1.6g의 상기 명칭의 화합물을 얻었다: R_f 0.2(EtOAc:MeOH=10:1); MS m/z:574.36(M+H⁺).

N-(1,1-디메틸에톡시)카보닐)-(4R)-4-[(7-메톡시-2-페닐-4-퀴놀리닐)옥시]-L-프롤릴-1-아미노-2-에테닐-N-(페닐설포닐)-(1R,2S)-시클로프로판카르복스아미드: 20ml의 DMF에 용해된 중간물 8.B-2의 생성물(1.24g, 2.16mmol)의 용액에, HATU(0.98g, 2.58mmol) 및 DIEA(1.43ml, 8.24mmol)를 첨가하였다. 그 혼합물을 실온에서 1시간동안 교반한 후, 15ml의 DMF에 용해된 벤젠설폰아미드(1.30g, 8.24mmol), DMAP(1.0g, 8.24mmol) 및 DBU(1.29g, 8.4mmol)의 용액을 첨가하였다. 추가 4시간 동안 교반을 계속하였다. 그 반응 혼합물을 EtOAc로 희석하고, 수성 NaOAc 버퍼(pH~5, 2x10ml), NaHCO₃ 용액 및 염수로 세정하였다. MgSO₄를 통해 건조하고, 용매를 제거한 후, 일부의 DCM을 첨가하여 순수 생성물이 침전되었다. 그 여과물을 농축하고, 잔류물을 헥산:EtOAc(1:1~1:2)을 이용한 실리카 겔상에서의 크로마토그래피에 적용하였다. 총 0.76g의 상기 명칭의 화합물을 얻었다: R_f 0.3(EtOAc:헥산=3:1), MS m/z: 713.45(M+H⁺), 735.36(M+Na⁺).

(4R)-4-[(7-메톡시-2-페닐-4-퀴놀리닐)옥시]-L-프롤릴-1-아미노-2-에테닐-N-(페닐설포닐)-(1R,2S)-시클로프로판칼복스아미드: 30ml의 DCM에 용해된 중간물 8.B-3으로부터 얻어진 생성물의 용액에 15ml의 TFA를 적가하였다. 그 혼합물을 실온에서 2시간동안 교반하였다. 용매 제거 후, 20ml부의 DCM을 붓고, 증발에 의해 건조하였다. 이러한 DCM 첨가 후 증발 공정을 4회 반복하였다. 톨루엔(20ml)을 첨가한 다음, 증발하여 건조하였다. 이러한 사이클을 2회 반복하여 잔류물을 얻었으며, 이는 고형화되어 상기 명칭의 화합물의 TFA 염으로서 백색 분말 0.9g을 얻었다. 상기 TFA 염의 소 시료를 NaHCO₃로 중화하여 상기 명칭의 화합물을 얻었다: R_f 0.4(DCM:MeOH=10:1); MS m/z: 613.65(M+H⁺).

(2S,4R)-1-(2-t-부톡시카보닐아미노아세틸)-4-(7-메톡시-2-페닐퀴놀린-4-일옥시)-N-((1R,2S)-1-(페닐설포닐카바모일)-2-비닐시클로프로필)피롤리딘-2-카르복스아미드: 3.0mL의 아세토니트릴에 용해된 중간물 8.B-4의 생성물(0.10g, 0.15mmol) 및 N-Boc-글리신(0.035g, 0.20mmol)의 용액에 HATU(85.1mg, 0.22mmol) 및 DIEA(0.09mL, 0.5mmol)을 교반하에 실온에서 첨가하였다. 그 반응 혼합물을 2시간동안 교반하였다. LC-MS 및 TLC 분석 결과, 커플링 반응의 완료를 나타내었다. 20mL의 EtOAc를 붓고, 그 혼합물을 버퍼(pH~4, AcONa/AcOH), NaHCO₃ 및 염수로 세정하고, Na₂SO₄를 통해 건조하였다. 용매 제거 후, 조 생성물을 실리카 겔(용리액:EtOAc/헥산)상에서 크로마토그래피에 적용하였다. 총 0.11g의 상기 명칭의 화합물을 얻었다: R_f 0.2(EtOAc:헥산=2:1); MS m/z: 770.3(M+H⁺).

(2S,4R)-1-(2-아미노아세틸)-4-(7-메톡시-2-페닐퀴놀린-4-일옥시)-N-((1R,2S)-1-(페닐설포닐카바모일)-2-비닐시클로프로필)피롤리딘-2-카르복스아미드: 중간물 8.B-5의 생성물(0.11g, 0.13mmol)을 디옥산에 용해된 2mL의 4N HCl에 용해하고, 그 반응물을 실온에서 1시간동안 교반하였다. 용매 제거 후, 3mL 부의 DCM을 붓고, 증발하여 건조하였다. 이러한 DCM 첨가 후 증발 공정을 3회 반복하여 상기 화합물의 HCl 염으로서 중간물 6을 얻었다(0.10g). MS m/z: 670.2(M+H⁺).

(2S,4R)-1-(2-아크릴아미도아세틸)-4-(7-메톡시-2-페닐퀴놀린-4-일옥시)-N-((1R,2S)-1-(페닐설포닐카바모일)-2-비닐시클로프로필)피롤리딘-2-카르복스아미드(I-27): 상기 명칭의 화합물은 중간물 8.B-5에 대해 기재된 커플링 반응에 따라 HATU를 이용하여 중간물 8.B-6와 아크릴산을 커플링함으로써 제조되었다. 총 0.10g의 상기 명칭의 화합물을 얻었다(87%): R_f 0.5(DCM에 용해된 5% MeOH); MS m/z:724.3(M+H⁺).

생화학 및 세포 시험 데이타

화합물 12는 실시예 4에 기재된 리플리콘 어세이에서 시험되었다. 화합물 12는 어세이에서 204nM의 EC50을 가졌으며, 가역 화합물 11은 어세이에서 3000nM 이상의 ED50을 가졌다.

와일드 타입 및 변이 NS3/4A 1b 효소에 대한 HCV 프로테아제 FRET 어세이(IC ₅₀ )

프로토콜은 In Vitro Resistance Studies of HCV Serine Protease Inhibitors, 2004, JBC, vol. 279, No. 17, pp17508-17514로부터 변형된 FRET-베이즈드 어세이이다. 화합물들의 고유 효능은 HCV NS3/4A 1b 프로테아제 효소의 A156S, A156T, D168A 및 D168V 변이체들에 대해 다음과 같이 평가되었다: 10X 스톡의 NS3/4A 프로테아제 효소(Bioenza, Mountain View, CA) 및 1.13X 5-FAM/QXLTM520 FRET 펩타이드 기질(Anaspec, San Jose, CA)을 50mM HEPES, pH 7.8, 100mM NaCl, 5mM DTT 및 20% 글리세롤에 준비하였다. 5μL의 각 효소를 Corning(#3573) 384-웰, 블랙, 비처리 마이크로타이터 플래이트(Corning, NY)에서 0.5μL 체적의 50% DMSO 및 50% DMSO에 제조된 연속 희석 화합물로 25℃에서 30분간 예비배양하였다. 프로테아제 반응은 45μL의 FRET 기질을 첨가하여 시작하였으며, Synergy⁴ 플래이트 리더(BioTek(Winooski, VT))에서 λex487/λem514에서 120분간 모니터하였다. 각 어세이의 마지막에서, 각 웰로부터 얻어진 진행 곡선은 선형 반응 속도론 및 적합도 통계(R², 제곱의 절대합)에 대해 조사되었다. 각 반응으로부터 초기 속도(0분 내지 30+ 분)는 상대적 형광 유니트 대 시간(분)의 플롯의 기울기로부터 측정되었다. 그 다음, log[인히비터] 대 반응으로부터 IC₅₀을 추정하기 위해 GraphPad Prism(GraphPad Software(San Diego))에서 Variable Slope 모델을 이용하여 인히비터 농도에 대해 도시하였다. 결과를 표 12에 나타내었다.

시험 화합물	효소/어세이	IC50(nM)
화합물 12	WT	0.30
	HCV D168A	17
가역 화합물 11	WT	165
	HCV D168A	3000 이상

상기 데이타는 HCV 프로테아제를 공유결합하는 워헤드를 함유하는 화합물 12가 강력한 인히비터이거나 와일드 타입 및 변이 HCV 프로테아제임에 반하여, 가역 화합물 11은 그렇지 않음을 보여준다.

본 명세서에 나타낸 모든 특허문헌, 공개된 출원 및 참고문헌들의 가르침은 모두 본 명세서에 참고문헌으로 편입된다. 본 발명은 이의 구현을 예시하기 위해 레퍼런스와 함께 특정적으로 나타내고 설명되었으나, 첨부된 청구범위에 의해 포함되는 본 발명의 범위를 벗어나지 않고 다양한 형태 변화가 있을 수 있으며, 세부 사항들이 이루어질 수 있음이 당업자에 의해 이해될 것이다.

서열목록
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Claims (45)

1. A) 표적 폴리펩타이드내의 바인딩 사이트에 결합되며, 바인딩 사이트와 비공유 접촉을 형성하는 가역 인히비터의 구조 모델을 제공하는 단계;
   B) 상기 가역 인히비터가 상기 바인딩 사이트에 결합할 경우 상기 가역 인히비터에 인접한 표적 폴리펩타이드의 바인딩 사이트에서 Cys 잔기를 확인하는 단계;
   C) 상기 표적 폴리펩타이드에 공유 결합하는 후보 인히비터의 구조 모델을 생성하는 단계로서, 여기서 각 후보 인히비터는 상기 가역 인히비터의 치환가능한 위치에 결합되는 워헤드(warhead)를 함유하며, 상기 워헤드는 반응성 화학 작용기 및 임의로 상기 표적 폴리펩타이드의 바인딩 사이트내에서 Cys 잔기의 결합 거리내에 상기 반응성 화학 작용기를 배치하는 링커를 포함하는, 후보 인히비터의 구조 모델을 생성하는 단계;
   D) 상기 후보 인히비터가 상기 바인딩 사이트에 결합할 경우 상기 워헤드의 반응성 화학 작용기가 상기 표적 폴리펩타이드의 바인딩 사이트내에서 Cys 잔기의 결합 거리내에 존재하게 되는 가역 인히비터의 치환가능한 위치를 검출하는 단계;
   E) 상기 후보 인히비터가 바인딩 사이트에 결합할 경우 상기 표적 폴리펩타이드의 바인딩 사이트내에서 Cys 잔기의 결합 거리내에 존재하는 워헤드를 함유하는 후보 인히비터에 대해, 상기 후보 인히비터가 상기 바인딩 사이트에 결합할 경우 상기 바인딩 사이트내의 Cys 잔기의 황원자와 상기 워헤드의 반응성 화학 작용기 사이에 공유 결합을 형성하며, 여기서 2.1옹스트롬 미만의 공유 결합 길이는 후보 인히비터가 표적 폴리펩타이드를 공유 결합시키는 인히비터임을 나타내는, 상기 바인딩 사이트내의 Cys 잔기의 황원자와 상기 워헤드의 반응성 화학 작용기 사이에 공유 결합을 형성하는 단계
   를 포함하는 표적 폴리펩타이드를 공유결합하는 인히비터를 디자인하는 방법.
   
2. 제 1항에 있어서, 상기 Cys 잔기는 표적 폴리펩타이드를 포함하는 단백질과에서 보존적이지 않은 것을 특징으로 하는 방법.
   
3. 제 1항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 촉매 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
   
4. 제 3항에 있어서, 상기 바인딩 사이트는 기질 또는 보조인자에 대한 바인딩 사이트인 것을 특징으로 하는 방법.
   
5. 제 3항에 있어서, 상기 Cys 잔기는 촉매 잔기가 아닌 것을 특징으로 하는 방법.
   
6. 제 1항에 있어서,
   F) 상기 바인딩 사이트는 공유 결합이 상기 바인딩 사이트내 Cys 잔기의 황 원자와 상기 워헤드의 반응성 화학 작용기 사이에 형성될 경우에 블로킹되는지 검출하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
   
7. 제 1항에 있어서, 상기 E) 단계에서 형성된 공유 결합은 워헤드 및 Cys의 측쇄는 유동적이고, 후보 인히비터와 바인딩 사이트의 나머지 구조들은 고정되는 계산(computational) 방법을 이용하여 형성되는 것을 특징으로 하는 방법.
   
8. 제 1항에 있어서, 상기 B) 단계에서 가역 인히비터가 바인딩 사이트에 결합될 경우 가역 인히비터에 인접한 표적 폴리펩타이드의 바인딩 사이트내 각 Cys 잔기가 확인되는 것을 특징으로 하는 방법.
   
9. 제 1항에 있어서, 상기 C) 단계에서 후보 인히비터의 구조 모델은 복수의 후보 인히비터를 포함하며, 여기서 워헤드는 복수의 후보 인히비터 모델의 각 모델에서 다른 치환가능한 위치에 결합되는 것을 특징으로 하는 방법.
   
10. 제 1항에 있어서, 상기 워헤드는 화학식 -X-L-Y를 가지며, 여기서
    X는 결합이거나 2가 C₁-C₆ 포화 또는 불포화, 선형 또는 분지형 탄화수소 사슬이며, 여기서 탄화수소 사슬의 0 개, 한 개, 두 개 또는 세 개의 메틸렌 유니트가 독립적으로 -NR-, -O-, -C(O)-, -OC(O)-, -C(O)O-, -S-, -SO-, -SO₂-, -C(=NR)-, -N=N- 또는 -C(=N₂)-로 치환되며;
    L은 공유 결합 또는 2가 C_1-8 포화 또는 불포화, 선형 또는 분지형, 탄화수소 사슬이며, 여기서 L의 한 개, 두 개 또는 세 개의 메틸렌 유니트는 독립적으로 시클로프로필렌, -NR-, -N(R)C(O)-, -C(O)N(R)-, -N(R)SO₂-, -SO₂N(R)-, -O-, -C(O)-, -OC(O)-, -C(O)O-, -S-, -SO-, -SO₂-, -C(=S)-, -C(=NR)-, -N=N-, 또는 -C(=N₂)-로 치환되며;
    Y는 수소, 옥소, 할로겐, NO₂ 또는 CN으로 치환되거나 비치환된 C_1-6 지방족, 또는 3-10 멤버드 모노시클릭 또는 비시클릭, 포화, 부분 포화 또는 질소, 산소 또는 황으로부터 독립적으로 선택된 0-3 헤테로원자를 갖는 아릴 고리이며, 그리고 여기서 상기 고리는 -Q-Z, 옥소, NO₂, 할로겐, CN, 또는 C_1-6 지방족으로부터 독립적으로 선택된 1-4기로 치환되며, 여기서:
    Q는 공유결합 또는 2가 C_1-6 포화 또는 불포화, 선형 또는 분지형 탄화수소 사슬이며, 여기서 Q의 0, 하나 또는 둘의 메틸렌 유니트는 독립적으로 -NR-, -S-, -O-, -C(O)-, -SO-, 또는 -SO₂-로 치환되며; 그리고
    Z는 수소이거나 옥소, 할로겐 또는 CN으로 치환되거나 비치환된 C_1-6 지방족이며;
    각 R은 독립적으로 수소이거나 C_1-6 지방족, 페닐, 질소, 산소 또는 황으로부터 독립적으로 선택된 1-2 헤테로원자를 갖는 4-7 멤버드 헤테로시클릭 고리, 또는 질소, 산소 또는 황으로부터 독립적으로 선택된 1-4 헤테로원자를 갖는 5-6 멤버드 모노시클릭 헤테로아릴 고리로 치환되거나 비치환된 기인 것을 특징으로 하는 방법.
    
11. 제 1항에 있어서, 상기 표적 폴리펩타이드는 키나아제인 것을 특징으로 하는 방법.
    
12. 제 11항에 있어서, 상기 가역 인히비터는 ATP 바인딩 사이트와 상호작용하는 것을 특징으로 하는 방법.
    
13. 제 12항에 있어서, 상기 가역 인히비터는 ATP 바인딩 사이트의 힌지 리전과 상호작용하는 것을 특징으로 하는 방법.
    
14. 제 11항에 있어서, 상기 키나아제는 단백질 키나아제인 것을 특징으로 하는 방법.
    
15. 제 11항에 있어서, 상기 키나아제는 리피드 키나아제인 것을 특징으로 하는 방법.
    
16. 제 1항에 있어서, 상기 표적 폴리펩타이드는 프로테아제인 것을 특징으로 하는 방법.
    
17. 제 16항에 있어서, 상기 프로테아제는 바이러스 프로테아제인 것을 특징으로 하는 방법.
    
18. 제 17항에 있어서, 상기 바이러스 프로테아제는 HCV 프로테아제인 것을 특징으로 하는 방법.
    
19. 제 16항에 있어서, 상기 프로테아제는 카스파아제인 것을 특징으로 하는 방법.
    
20. 제 16항에 있어서, 상기 프로테아제는 프로테아솜 또는 프로테아솜의 성분인 것을 특징으로 하는 방법.
    
21. 제 1항에 있어서, 상기 표적 폴리펩타이드는 포스포디에스테라아제인 것을 특징으로 하는 방법.
    
22. 제 1항에 있어서, 상기 표적 폴리펩타이드는 디아세틸라아제인 것을 특징으로 하는 방법.
    
23. 제 1항에 있어서, 상기 표적 폴리펩타이드는 히트 쇼크 단백질인 것을 특징으로 하는 방법.
    
24. 제 1항에 있어서, 상기 표적 폴리펩타이드는 G 단백질-결합 리셉터인 것을 특징으로 하는 방법.
    
25. 제 1항에 있어서, 상기 표적 폴리펩타이드는 트랜스퍼라아제인 것을 특징으로 하는 방법.
    
26. 제 1항에 있어서, 상기 표적 폴리펩타이드는 메탈로엔자임(metalloenzyme)인 것을 특징으로 하는 방법.
    
27. 제 1항에 있어서, 상기 표적 폴리펩타이드는 뉴클리어 호르몬 리셉터인 것을 특징으로 하는 방법.
    
28. 제 1항에 있어서, Cys 잔기의 -SH 기와의 반응성을 맞추기 위해 화합물의 구조를 정제하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
    
29. 제 1항에 있어서, 표적 폴리펩타이드내 바인딩 사이트에 결합되는 가역 인히비터의 구조 모델은 3차원 구조 모델인 것을 특징으로 하는 방법.
    
30. 제 29항에 있어서, 상기 3차원 구조 모델은 결정 구조 또는 용액 구조로부터 얻어진 구조 정보를 이용하여 생성되는 것을 특징으로 하는 방법.
    
31. 제 30항에 있어서, 상기 3차원 구조 모델은 호몰로지 모델인 것을 특징으로 하는 방법.
    
32. 제 30항에 있어서, 상기 3차원 구조 모델은 계산(computational) 방법을 이용하여 생성되는 것을 특징으로 하는 방법.
    
33. 제 1항에 있어서, 상기 방법은 인 실리코(in silico)로 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
    
34. 제 1항에 있어서, 상기 방법은 컴퓨터에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
    
35. 제 1항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 촉매 활성을 가지며, 상기 가역 인히비터는 50μM이하의 IC50으로 상기 폴리펩타이드의 활성을 저해하는 것을 특징으로 하는 방법.
    
36. 제 1항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 촉매 활성을 가지며, 상기 가역 인히비터는 50μM이하의 Ki로 상기 폴리펩타이드의 활성을 저해하는 것을 특징으로 하는 방법.
    
37. 제 1항에 있어서, 상기 표적 폴리펩타이드는 돌연변이 또는 약물-내성 단백질인 것을 특징으로 하는 방법.
    
38. 제 1항에 있어서, 상기 가역 인히비터는 1μM 이하의 IC₅₀으로 또는 1μM 이하의 K_i로 이의 표적 폴리펩타이드의 활성을 억제하는 것을 특징으로 하는 방법.
    
39. 제 1항에 있어서, 상기 가역 인히비터는 1mM 내지 1μM의 IC₅₀ 또는 K_i로 상기 표적 폴리펩타이드를 저해하는 것을 특징으로 하는 방법.
    
40. 제 39항에 있어서, 표적 폴리펩타이드를 공유결합하는 인히비터는 상기 가역 인히비터 보다 더 작은 IC₅₀ 또는 K_i 값으로 상기 표적 폴리펩타이드를 저해하는 것을 특징으로 하는 방법.
    
41. A) 표적 폴리펩타이드내의 바인딩 사이트에 결합되며, 바인딩 사이트와 비공유 접촉을 형성하는 가역 인히비터의 구조 모델을 제공하는 단계;
    B) 상기 가역 인히비터가 상기 바인딩 사이트에 결합할 경우 상기 가역 인히비터에 인접한 표적 폴리펩타이드의 바인딩 사이트에서 Cys 잔기를 확인하는 단계;
    C) 워헤드 기의 구조 모델을 제공하는 단계로서, 여기서 상기 워헤드는 상기 Cys 잔기와 반응할 수 있으며 상기 바인딩 사이트내 Cys 잔기의 황 원자와 상기 워헤드 기의 반응성 화학 작용기 사이에 공유 결합을 형성할 수 있는 반응성 화학 작용기를 포함하는 워헤드 기의 구조 모델을 제공하는 단계;
    D) 상기 가역 인히비터에 워헤드가 결합될 수 있는 치환가능한 위치를 확인하는 단계로서, 상기 바인딩 사이트내 Cys 잔기의 황 원자와 상기 워헤드 기의 반응성 화학 작용기 사이에 결합이 형성되도록 임의로 링커를 통해 상기 가역 인히비터에 워헤드 기가 2.1Å미만의 결합 길이를 갖도록 워헤드가 결합될 수 있는 치환가능한 위치를 확인하는 단계;
    E) 상기 워헤드 기를 임의로 상기 링커를 통해 상기 가역 인히비터의 치환가능한 위치에 결합시키는 단계
    를 포함하는 표적 폴리펩타이드를 공유결합하는 인히비터를 디자인하는 방법.
    
42. 표적 폴리펩타이드상의 바인딩 사이트에 바인딩하는 화학 부 및 워헤드를 포함하며, 상기 워헤드는 하기 화학식을 갖는 것을 특징으로 하는 비가역 인히비터:
    

    

    
    상기 식에서, R₁, R₂ 및 R₃는 독립적으로 수소, C₁-C₆ 알킬, 또는 -NRxRy와 치환되는 C₁-C₆ 알킬이며; 그리고
    Rx 및 Ry는 독립적으로 수소 또는 C₁-C₆ 알킬임.
    
43. 컨쥬게이티드 에논 워헤드를 함유하는 비가역 인히비터와 시스테인을 포함하는 폴리펩타이드의 반응 생성물이며, 하기 화학식을 갖는 폴리펩타이드 컨쥬게이트:
    X-M-S-CH₂-R
    상기 식에서, X는 표적 폴리펩타이드의 바인딩 사이트에 바인딩하는 화학부이며, 여기서 바인딩 사이트는 시스테인 잔기를 함유하며,
    M은 상기 시스테인 잔기의 황 원자와 컨쥬게이티드 에논-함유 워헤드기의 공유결합에 의해 형성되는 변형부이며;
    S-CH₂는 상기 시스테인 잔기의 측쇄 황-메틸렌이며; 그리고
    R은 표적 폴리펩타이드의 잔부이며,
    상기 컨쥬게이티드 에논 워헤드는 하기 화학식을 가지며,
    

    

    
    상기 식에서, R₁, R₂ 및 R₃는 독립적으로 수소, C₁-C₆ 알킬, 또는 -NRxRy와 치환되는 C₁-C₆ 알킬이며; 그리고
    Rx 및 Ry는 독립적으로 수소 또는 C₁-C₆ 알킬임.
    
44. 컨쥬게이티드 에논 워헤드를 함유하는 비가역 인히비터와 시스테인을 포함하는 폴리펩타이드의 반응 생성물이며, 하기 화학식을 갖는 폴리펩타이드 컨쥬게이트:
    X-M-S-CH₂-R
    상기 식에서, X는 표적 폴리펩타이드의 바인딩 사이트에 바인딩하는 화학부이며, 여기서 상기 표적 폴리펩타이드의 바인딩 사이트는 시스테인 잔기를 함유하며; M은 상기 시스테인 잔기의 황 원자와 에논-함유 워헤드의 공유결합에 의해 형성되는 변형부이며;
    S-CH₂는 상기 시스테인 잔기의 측쇄 황-메틸렌이며; 그리고
    R은 표적 폴리펩타이드의 잔부이며, 상기 표적 폴리펩타이드는 브루톤 티로신 키나아제(BTK), BTK 동족체, 또는 BTK 티로신 키나아제 시스테인 동족체가 아님.
    
45. 제 43항 또는 제 44항에 있어서, 상기 컨쥬게이트는 하기 화학식을 갖는 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드 컨쥬게이트:
    

    

    
    상기 식에서, X는 표적 폴리펩타이드의 바인딩 사이트에 바인딩하는 화학부이며, 여기서 바인딩 사이트는 시스테인 잔기를 함유하며;
    S-CH₂는 상기 시스테인 잔기의 측쇄이며;
    R은 표적 폴리펩타이드의 잔부이며;
    R₁, R₂ 및 R₃는 독립적으로 수소, C₁-C₆ 알킬, 또는 -NRxRy와 치환된 C₁-C₆ 알킬이며; 그리고
    Rx 및 Ry는 독립적으로 수소이거나 C₁-C₆ 알킬임.

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