CN104704129A - 与对布鲁顿酪氨酸激酶(btk)抑制剂的抗性相关的突变 - Google Patents

与对布鲁顿酪氨酸激酶(btk)抑制剂的抗性相关的突变 Download PDF

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Abstract

本文描述了赋予对BTK抑制剂治疗的抗性的突变。本文描述了表现出对共价和/或不可逆BTK抑制剂的抑制降低(即具有抗性)的修饰BTK多肽。本文还描述了PLCγ2和CARD11多肽的修饰，其赋予对BTK抑制剂治疗的抗性。本文描述了用于检测该修饰多肽和编码该修饰多肽的核酸的诊断方法及其方法的应用。本文描述了含有该修饰多肽的组合物、组合和试剂盒以及使用该修饰多肽的方法。本文还描述了使用修饰的BTK多肽作为筛选剂用于鉴别和设计第二代BTK抑制剂的方法。

Description

与对布鲁顿酪氨酸激酶(BTK)抑制剂的抗性相关的突变
交叉引用
本申请要求2012年7月24日提交的美国临时申请序列号61/675,303、2012年8月13日提交的61/682,688和2013年3月13日提交的61/780,652的权益，所有这些申请均通过引用其整体并入本文。
作为文本文件经由EFS-WEB提交的序列表的援引并入
本申请包含序列表，该序列表已作为ASCII格式的计算机可读文本文件经由EFS-Web提交，因此通过引用整体并入本文。该文本文件，创建日期为2013年7月22日，被命名为25922-865-601seqlist.txt，大小为130KB。
背景技术
布鲁顿酪氨酸激酶(BTK)是非受体酪氨酸激酶的Tec家族的成员，其对B细胞、髓系细胞和肥大细胞的生长、分化和活化都是至关重要的。BTK基因位于细胞发生条带Xq21.33-q22上，并包含19个外显子，横跨37kb，编码全长BTK蛋白质。BTK中的突变在人类中是已知的，并导致免疫病症——X连锁的丙种球蛋白缺乏血症(agammaglobulemia)。
BTK是通过由PIP3(磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸)生成和与BTK普列克底物蛋白(pleckstrin)同源(PH)结构域的键合所刺激的膜定位以及Src家族激酶对Tyr-551的转磷酸化而激活的。激活的BTK参与在PLCγ、JNK和p38MAPK途径中涉及的许多信号分子的磷酸化，导致Ca2+动员、mRNA稳定化以及NF-κB和AP-1转录因子的诱导。BTK活性被包括BTK抑制剂(IBTK)Sab和c-Cbl在内的许多蛋白质负调节。在抗原激发过程中，经典NF-κB途径通过由CARD11、MALT1和BCL10组成的“CBM”信号复合物的形成而被B细胞受体信号传导强烈激活。CBM位于BTK的PLCγ激活的下游。CBM途径在数种淋巴瘤亚型中发生病理性改变；已经发现CARD11中的突变组成性地激活下游NF-κB信号传导。
BTK对于B细胞受体(BCR)信号传导是必不可少的，并且在敲除小鼠模型中，其突变具有B细胞特异性表型。与正常B细胞相比，BTK蛋白质和mRNA在慢性淋巴细胞白血病(CLL)中显著过表达。尽管BTK在CLL细胞中并不总是组成性地具有活性，但B细胞受体(BCR)或CD40信号传导伴随着该途径的有效激活。BTK活性与B细胞恶性肿瘤的疾病进展相关，该B细胞恶性肿瘤例如是非霍金奇淋巴瘤，如慢性淋巴细胞白血病(CLL)、套细胞白血病(MCL)、滤泡淋巴瘤(FL)和弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)，以及多发性骨髓瘤(MM)。
发明内容
本文描述了对B细胞受体途径中的突变的鉴别，该突变赋予患者对使用布鲁顿酪氨酸激酶(BTK)抑制剂治疗患者的抗性。在一些实施方案中，该BTK抑制剂是与BTK共价地和/或不可逆地结合的BTK抑制剂。在一些实施方案中，该BTK抑制剂是与BTK的半胱氨酸481共价地和/或不可逆地结合的BTK抑制剂。在一些实施方案中，该BTK抑制剂是依鲁替尼(ibrutinib)。在一些实施方案中，该患者患有B细胞增殖性病症。在一些实施方案中，该患者患有B细胞恶性肿瘤。在一些实施方案中，该患者患有白血病或淋巴瘤。在一些实施方案中，该患者患有非霍金奇淋巴瘤。在一些实施方案中，该患者患有慢性淋巴细胞白血病(CLL)、套细胞白血病(MCL)、滤泡淋巴瘤(FL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)或多发性骨髓瘤(MM)。在一些实施方案中，该患者患有实体瘤，如癌或肉瘤。
本文描述了对布鲁顿酪氨酸激酶(BTK)中的突变的鉴别，该突变赋予激酶对由BTK抑制剂引起的抑制的抗性，该BTK抑制剂与BTK的半胱氨酸481共价地和/或不可逆地结合。本文描述了分离的突变BTK多肽和编码突变BTK多肽的分离的核酸。本文描述的突变的鉴别允许为BTK抑制剂疗法选择患者，监测接受BTK抑制剂疗法的患者，以及改变BTK抑制剂治疗方案。本文描述了用于检测突变BTK多肽和编码突变BTK多肽的核酸的诊断方法以及该方法的用途。本文还描述了用于鉴别抑制突变BTK多肽的第二代BTK抑制剂的方法。
在某些实施方案中，本文描述了确定受试者是否对使用共价和/或不可逆布鲁顿酪氨酸激酶(BTK)抑制剂的疗法具有较低反应性或可能成为有较低反应性的方法，其包括：(a)检测来自该受试者的含有编码BTK多肽的核酸分子的样品，以确定所编码的BTK多肽是否在与SEQID NO:1所示氨基酸序列的氨基酸位置481相对应的氨基酸位置处被修饰；以及(b)如果该受试者具有该修饰，则将该受试者表征为对使用共价和/或不可逆BTK抑制剂的疗法具有抗性或可能成为有抗性的。在一些实施方案中，该方法进一步包括从受试者获得样品的步骤。
在某些实施方案中，本文描述了将BTK表征为在受试者中对使用共价和/或不可逆BTK抑制剂的抑制具有抗性的方法，其包括：(a)检测来自该受试者的含有编码BTK多肽的核酸分子的样品，以确定所编码的BTK多肽是否在与SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的氨基酸位置481相对应的氨基酸位置处被修饰；以及(b)如果该受试者具有该修饰，则将该BTK表征为对使用共价和/或不可逆BTK抑制剂的抑制具有抗性。在一些实施方案中，该方法进一步包括从受试者获得样品的步骤。
在某些实施方案中，本文描述了监测为了治疗癌症而接受共价和/或不可逆BTK抑制剂的受试者是否已经发展或可能发展出对该疗法的抗性的方法，其包括：(a)检测来自该受试者的含有编码BTK多肽的核酸分子的样品，以确定所编码的BTK多肽是否在与SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的氨基酸位置481相对应的氨基酸位置处被修饰；以及(b)如果该受试者具有该修饰，则将该受试者表征为对使用共价和/或不可逆BTK抑制剂的疗法具有抗性或可能成为有抗性的。在一些实施方案中，该方法进一步包括如果该受试者具有该修饰则中断使用该BTK抑制剂的治疗。在一些实施方案中，该方法进一步包括如果该受试者不具有该修饰则继续使用BTK抑制剂的治疗。在一些实施方案中，该方法进一步包括如果该受试者具有该修饰则施用抑制该修饰激酶的第二代BTK抑制剂。在一些实施方案中，该方法进一步包括从受试者获得样品的步骤。在一些实施方案中，该方法进一步包括如果该受试者具有该修饰则施用LYN、SYK、JAK、PI3K、PLCγ、MAPK、MEK或NFκB的抑制剂。在一些实施方案中，该方法进一步包括如果该受试者具有该修饰则施用不与C481结合的BTK的共价抑制剂。在一些实施方案中，该方法进一步包括如果该受试者具有该修饰则施用BTK的可逆抑制剂。
在某些实施方案中，本文描述了优化受试者为了治疗癌症而接受共价和/或不可逆BTK抑制剂的疗法的方法，其包括：(a)检测来自该受试者的含有编码BTK多肽的核酸分子的样品，以确定所编码的BTK多肽是否在与SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的氨基酸位置481相对应的氨基酸位置处被修饰；以及(b)如果该受试者具有该修饰则中断使用不可逆BTK抑制剂的治疗，或者如果该受试者不具有该修饰则继续使用不可逆BTK抑制剂的治疗。在一些实施方案中，该方法进一步包括如果该受试者具有该修饰则施用抑制该修饰激酶的第二代BTK抑制剂。在一些实施方案中，该方法进一步包括从受试者获得样品的步骤。在一些实施方案中，该方法进一步包括如果该受试者具有该修饰则施用LYN、SYK、JAK、PI3K、PLCγ、MAPK、MEK或NFκB的抑制剂。在一些实施方案中，该方法进一步包括如果该受试者具有该修饰则施用不与C481结合的BTK的共价抑制剂。在一些实施方案中，该方法进一步包括如果该受试者具有该修饰则施用BTK的可逆抑制剂。
在某些实施方案中，本文描述了为使用第二代BTK抑制剂的疗法选择受试者的方法，其包括：(a)检测来自该受试者的含有编码BTK多肽的核酸分子的样品，以确定所编码的BTK多肽是否在与SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的氨基酸位置481相对应的氨基酸位置处被修饰；以及(b)如果该受试者具有该修饰，则将该受试者表征为使用第二代BTK抑制剂的疗法的候选者。在一些实施方案中，该方法进一步包括如果该受试者具有该修饰则施用抑制该修饰激酶的第二代BTK抑制剂。在一些实施方案中，该方法进一步包括从受试者获得样品的步骤。
在一些实施方案中，该修饰包括BTK多肽中氨基酸位置481处的氨基酸的置换或缺失。在一些实施方案中，该修饰是在BTK多肽的氨基酸位置481处半胱氨酸被置换为选自亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸、甘氨酸、甲硫氨酸、丝氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、脯氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸和谷氨酸的氨基酸。在一些实施方案中，该修饰是在BTK多肽的氨基酸位置481处半胱氨酸被置换为选自丝氨酸、甲硫氨酸或苏氨酸的氨基酸。在一些实施方案中，该修饰是在BTK多肽的氨基酸位置481处半胱氨酸至丝氨酸的置换。在一些实施方案中，该修饰包括编码BTK多肽的氨基酸位置481的核酸的缺失。
在该方法的一些实施方案中，用于该试验的核酸分子是RNA或DNA。在该方法的一些实施方案中，用于该试验的核酸分子是基因组DNA。在该方法的一些实施方案中，用于该试验的核酸分子是总RNA。在该方法的一些实施方案中，用于该试验的核酸分子是mRNA。在该方法的一些实施方案中，该方法进一步包括从RNA样品中分离mRNA。
在该方法的一些实施方案中，检测包括对编码BTK多肽的氨基酸位置481的核酸进行聚合酶链反应(PCR)扩增。在一些实施方案中，PCR扩增包括使用一对寡核苷酸引物，该引物位于编码BTK多肽的氨基酸位置481的区域的侧翼。在一些实施方案中，该方法包括对扩增的核酸进行测序。
在该方法的一些实施方案中，检测包括使核酸与序列特异性核酸探针接触，其中该序列特异性核酸探针：(a)与编码在氨基酸位置481处被修饰的修饰BTK的核酸结合；且(b)不与编码在氨基酸位置481处具有半胱氨酸的野生型BTK的核酸结合。在该方法的一些实施方案中，检测包括使用序列特异性核酸探针的PCR扩增。
在一些实施方案中，用于该方法的样品含有来自受试者的一种或多种肿瘤细胞。在一些实施方案中，用于该方法的样品含有循环肿瘤DNA(ctDNA)。
在该方法的一些实施方案中，在该方法中使用的核酸是从来自受试者的肿瘤细胞样品中分离的。在一些实施方案中，该样品是肿瘤活检样品、血液样品、血清样品、淋巴样品或骨髓抽吸物。
在该方法的一些实施方案中，该BTK抑制剂是与野生型BTK的半胱氨酸481共价结合的共价和/或不可逆BTK抑制剂。在一些实施方案中，该BTK抑制剂选自依鲁替尼(PCI-32765)、PCI-45292、PCI-45466、AVL-101、AVL-291、AVL-292或ONO-WG-37。在一些实施方案中，该BTK抑制剂是依鲁替尼。
在该方法的一些实施方案中，受试者患有癌症。在一些实施方案中，该癌症是血液***癌症。在一些实施方案中，癌症是B细胞恶性肿瘤。在一些实施方案中，癌症选自白血病、淋巴瘤或骨髓瘤。在一些实施方案中，该B细胞恶性肿瘤是慢性淋巴细胞白血病(CLL)、小淋巴细胞淋巴瘤(SLL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、活化B细胞弥漫性大B细胞淋巴瘤(ABC-DLBCL)、生发中心弥漫性大B细胞淋巴瘤(GCB DLBCL)、原发性纵隔B细胞淋巴瘤(PMBL)、非霍奇金淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、滤泡淋巴瘤、免疫母细胞大细胞淋巴瘤、前体B淋巴母细胞淋巴瘤、前体B细胞急性淋巴母细胞性白血病、多毛细胞白血病、套细胞淋巴瘤、B细胞幼淋巴细胞白血病、淋巴质浆细胞淋巴瘤/瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、脾边缘区淋巴瘤、浆细胞性骨髓瘤、浆细胞瘤、结外边缘区B细胞淋巴瘤、结边缘区B细胞淋巴瘤、纵隔(胸腺)大B细胞淋巴瘤、血管内大B细胞淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤或淋巴瘤样肉芽肿病。在一些实施方案中，受试者患有实体瘤。
在该方法的一些实施方案中，受试者在获得样品前用不可逆BTK抑制剂治疗。在一些实施方案中，该样品在首次施用不可逆BTK抑制剂后1周、2周、3周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月、14个月、16个月、18个月、20个月、22个月或24个月时获得。在一些实施方案中，该样品在使用不可逆BTK抑制剂治疗的过程中获得1、2、3、4、5、6、7、8、9、10次。在一些实施方案中，在首次施用时受试者对使用不可逆BTK抑制剂的治疗有反应。
在某些实施方案中，本文描述了筛选抑制修饰的BTK的化合物的方法，其包括：(a)提供修饰的BTK，其中该修饰的BTK在与SEQ IDNO:1所示氨基酸序列的氨基酸位置481相对应的氨基酸位置处被修饰；(b)使该修饰的BTK与测试化合物接触；以及(c)检测BTK活性的水平，其中活性的降低指示该化合物抑制该修饰的BTK。在一些实施方案中，该修饰是BTK多肽的第481位氨基酸的置换或缺失。在一些实施方案中，该修饰是在BTK多肽的氨基酸位置481处半胱氨酸被置换为选自亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸、甘氨酸、甲硫氨酸、丝氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、脯氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸和谷氨酸的氨基酸。在一些实施方案中，该修饰是在BTK多肽的氨基酸位置481处半胱氨酸被置换为选自丝氨酸、甲硫氨酸和苏氨酸的氨基酸。在一些实施方案中，该修饰是在BTK多肽的氨基酸位置481处半胱氨酸至丝氨酸的置换。在一些实施方案中，检测BTK活性的水平通过体外激酶试验来评估。在一些实施方案中，在该激酶试验中使用的底物是PLCγ、ERK1/2或AKT。在一些实施方案中，在该激酶试验中使用的底物是肽底物。在一些实施方案中，使用依鲁替尼作为阴性对照。
在一些实施方案中，在使BTK与测试化合物接触之前，将修饰的BTK多肽从表达该修饰的BTK多肽的宿主细胞中纯化。在一些实施方案中，该宿主细胞稳定地表达修饰的BTK多肽。在一些实施方案中，修饰的BTK多肽通过免疫亲和性或色谱法纯化。在一些实施方案中，该细胞是内源性野生型BTK表达缺陷的。在一些实施方案中，该细胞是鸡DT40BTK-/-B细胞或人BTK-/-B细胞。在一些实施方案中，该细胞是非B细胞。在一些实施方案中，该细胞是哺乳动物非B细胞。在一些实施方案中，该细胞是CHO细胞或Jurkat T细胞。在一些实施方案中，该细胞是非哺乳动物细胞。在一些实施方案中，该细胞是昆虫细胞、细菌细胞、酵母细胞或植物细胞。
在某些实施方案中，本文描述了分离的BTK多肽或其具有BTK活性的变体，其在与SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的氨基酸位置481相对应的氨基酸位置处包含修饰，其中该修饰赋予该修饰BTK多肽或变体对使用共价和/或不可逆BTK抑制剂的抑制的抗性。在一些实施方案中，该修饰赋予癌细胞对使用共价和/或不可逆BTK抑制剂的治疗的抗性。在一些实施方案中，该修饰包括与SEQ ID NO:1所示的野生型BTK相比第481位氨基酸的置换。在一些实施方案中，该置换是C481S。在一些实施方案中，该修饰包括氨基酸位置481的缺失。在一些实施方案中，该BTK多肽包含与SEQ ID NO:1所示的野生型BTK相比第481位氨基酸的置换和一个或多个额外的氨基酸置换。在一些实施方案中，该BTK多肽包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列或与具有SEQ ID NO:2所示序列的多肽具有至少或至少约60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的变体，其中第481位氨基酸不是半胱氨酸。在一些实施方案中，该分离的BTK多肽或其变体是重组蛋白。在一些实施方案中，该分离的BTK多肽或其变体是纯化的蛋白质。在一些实施方案中，该分离的BTK多肽或其变体是从细胞中纯化的。在一些实施方案中，该细胞是原核细胞或真核细胞。在一些实施方案中，该细胞是哺乳动物细胞、细菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞、植物细胞或两栖动物细胞。在一些实施方案中，该细胞是灵长类动物细胞。在一些实施方案中，该细胞是人细胞。在一些实施方案中，该修饰BTK多肽是重组多肽。
在某些实施方案中，本文描述了编码本文提供的修饰BTK多肽的分离的核酸分子。在一些实施方案中，该核酸是DNA或RNA分子。在一些实施方案中，该核酸是cDNA分子。在一些实施方案中，该核酸是PCR扩增产物。在一些实施方案中，该核酸是重组分子。在一些实施方案中，该核酸是合成分子。在一些实施方案中，该核酸包含SEQ ID NO:3所示的核酸序列，其中编码第481位氨基酸的核酸密码子被修饰，由此该密码子不编码半胱氨酸，或者该核酸包含与具有SEQ ID NO:3所示序列的多肽具有至少或至少约60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的变体，其中编码第481位氨基酸的核酸密码子不编码半胱氨酸。在一些实施方案中，该核酸包含SEQ ID NO:7所示的核酸序列或与具有SEQ ID NO:7所示序列的核酸具有至少或至少约60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的变体，其中编码第481位氨基酸的核酸密码子不编码半胱氨酸。在一些实施方案中，该核酸包含SEQ IDNO:8所示的核酸序列或与具有SEQ ID NO:8所示序列的核酸具有至少或至少约60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的变体，其中编码第481位氨基酸的核酸密码子不编码半胱氨酸。在一些实施方案中，该核酸包含SEQ ID NO:22所示的核酸序列或与具有SEQ ID NO:22所示序列的核酸具有至少或至少约60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的变体，其中编码第481位氨基酸的核酸密码子不编码半胱氨酸。在一些实施方案中，该核酸包含SEQ ID NO:23所示的核酸序列或与具有SEQ ID NO:23所示序列的核酸具有至少或至少约60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的变体，其中编码第481位氨基酸的核酸密码子不编码半胱氨酸。在一些实施方案中，该修饰BTK多肽是重组多肽。
在某些实施方案中，本文描述了载体，其包含编码本文提供的修饰BTK多肽的核酸分子。在一些实施方案中，该载体是病毒或质粒载体。在一些实施方案中，该核酸可操作地连接至启动子。在一些实施方案中，该启动子是组成型或诱导型启动子。在某些实施方案中，本文描述了一种宿主细胞，其包含编码本文提供的修饰BTK多肽的核酸分子或包含编码本文提供的修饰BTK多肽的核酸分子的载体。在一些实施方案中，该细胞是原核细胞或真核细胞。在一些实施方案中，该细胞是哺乳动物细胞、细菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞、植物细胞或两栖动物细胞。在一些实施方案中，该细胞是灵长类动物细胞。在一些实施方案中，该细胞是人细胞。在某些实施方案中，本文描述了由该宿主细胞表达的突变BTK多肽。
在某些实施方案中，本文描述了试剂盒，其包含突变BTK多肽或其具有BTK活性的变体，该突变BTK多肽或其变体在与SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的氨基酸位置481相对应的氨基酸位置处包含修饰。在一些实施方案中，该修饰是在BTK多肽的氨基酸位置481处半胱氨酸至丝氨酸的置换。
在某些实施方案中，本文描述了微芯片，该微芯片包含本文提供的突变BTK多肽或编码本文提供的修饰BTK多肽的核酸。在一些实施方案中，该修饰是在BTK多肽的氨基酸位置481处半胱氨酸至丝氨酸的置换。
在某些实施方案中，本文描述了试剂盒，其包含编码本文提供的修饰BTK多肽的任何分离的核酸或包含这样的核酸的载体。在一些实施方案中，该修饰是在BTK多肽的氨基酸位置481处半胱氨酸至丝氨酸的置换。
在某些实施方案中，本文描述了试剂盒，其包含一种或多种试剂，该试剂用于检测在氨基酸位置481处包含修饰的修饰BTK多肽。在一些实施方案中，该试剂盒包含微芯片，该微芯片包含具有修饰C481S的突变BTK多肽。
在某些实施方案中，本文描述了试剂盒，其包含一种或多种试剂，该试剂用于检测编码在氨基酸位置481处包含修饰的突变BTK多肽的核酸。在一些实施方案中，该试剂盒包含微芯片，该微芯片包含编码具有修饰C481S的突变BTK多肽的核酸。
在某些实施方案中，本文描述了与在氨基酸位置481处具有修饰的修饰BTK多肽结合的分离的抗体，其中该抗体不与具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的野生型BTK多肽结合或以低亲和力与之结合。在一些实施方案中，该修饰是在BTK多肽的氨基酸位置481处半胱氨酸至丝氨酸的置换。
在某些实施方案中，本文描述了用于检测在受试者中对使用共价和/或不可逆BTK抑制剂的抑制具有抗性的修饰BTK的***，其包含：(a)来自该受试者的含有编码BTK多肽的核酸分子的样品；以及(b)包含编码突变BTK多肽或其一部分的核酸的微阵列，该突变BTK多肽或其一部分在与SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的氨基酸位置481相对应的氨基酸位置处被修饰。在一些实施方案中，该微阵列包含在微芯片上。
在某些实施方案中，本文描述了用于检测在受试者中对使用共价和/或不可逆BTK抑制剂的抑制具有抗性的修饰BTK的***，其包含：(a)来自该受试者的含有编码BTK多肽的核酸分子的样品；以及(b)序列特异性核酸探针，其中该序列特异性核酸探针：(i)与编码在氨基酸位置481处被修饰的修饰BTK的核酸结合；且(ii)不与编码在氨基酸位置481处具有半胱氨酸的野生型BTK的核酸结合。
在某些实施方案中，本文描述了用于检测在受试者中对使用共价和/或不可逆BTK抑制剂的抑制具有抗性的修饰BTK的***，其包含：(a)来自该受试者的含有编码BTK多肽的核酸分子的样品；以及(b)一对寡核苷酸引物，其位于编码BTK多肽的氨基酸481的核酸区域的侧翼。
在某些实施方案中，本文描述了在患有血液***癌症的患者中进行维持疗法的方法，其包括：(a)向该患者施用维持疗法方案，该方案包括施用治疗有效剂量的共价和/或不可逆BTK抑制剂；以及(b)在所述维持疗法方案的过程中以预定的时间间隔监测该患者，以确定受试者是否在编码BTK的内源基因中具有突变，该突变导致与SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的氨基酸位置481相对应的氨基酸位置处的修饰。在一些实施方案中，监测包括：(a)检测来自所述受试者的含有编码BTK多肽的核酸分子的样品，以确定所编码的BTK多肽是否在与SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的氨基酸位置481相对应的氨基酸位置处被修饰。在一些实施方案中，该方法进一步包括如果该受试者具有该突变则中断维持疗法方案。在一些实施方案中，该方法进一步包括如果该受试者不具有该突变则继续维持疗法方案。在一些实施方案中，该方法进一步包括如果该受试者具有该突变则施用抑制该修饰BTK的第二代BTK抑制剂。在一些实施方案中，该方法进一步包括如果该受试者具有该修饰则施用LYN、SYK、JAK、PI3K、PLCγ、MAPK、MEK或NFκB的抑制剂。在一些实施方案中，该方法进一步包括如果该受试者具有该修饰则施用不与C481结合的BTK的共价抑制剂。在一些实施方案中，该方法进一步包括如果该受试者具有该修饰则施用BTK的可逆抑制剂。在一些实施方案中，BTK多肽中的修饰是C481S。在一些实施方案中，该核酸中的突变是在与SEQ ID NO:3所示核苷酸序列中的核酸位置1635相对应的核酸位置处鸟嘌呤至胞嘧啶的突变。在一些实施方案中，该核酸中的突变是在与SEQ ID NO:3所示核苷酸序列中的核酸位置1634相对应的核酸位置处胸腺嘧啶至腺嘌呤的突变。在一些实施方案中，该预定的时间间隔是每个月、每2个月、每3个月、每4个月、每5个月、每6个月、每7个月、每8个月、每9个月、每10个月、每11个月或每年。在一些实施方案中，该样品含有一种或多种癌细胞。在一些实施方案中，该样品含有ctDNA。在一些实施方案中，该方法进一步包括在用不可逆BTK抑制剂治疗前检测来自受试者的样品。在一些实施方案中，该血液***癌症是B细胞恶性肿瘤。在一些实施方案中，该癌症是白血病、淋巴瘤或骨髓瘤。在一些实施方案中，该癌症是慢性淋巴细胞白血病(CLL)、小淋巴细胞淋巴瘤(SLL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、活化B细胞弥漫性大B细胞淋巴瘤(ABC-DLBCL)、生发中心弥漫性大B细胞淋巴瘤(GCB DLBCL)、原发性纵隔B细胞淋巴瘤(PMBL)、非霍奇金淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、滤泡淋巴瘤、免疫母细胞大细胞淋巴瘤、前体B淋巴母细胞淋巴瘤、前体B细胞急性淋巴母细胞性白血病、多毛细胞白血病、套细胞淋巴瘤、B细胞幼淋巴细胞白血病、淋巴质浆细胞淋巴瘤/瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、脾边缘区淋巴瘤、浆细胞性骨髓瘤、浆细胞瘤、结外边缘区B细胞淋巴瘤、结边缘区B细胞淋巴瘤、纵隔(胸腺)大B细胞淋巴瘤、血管内大B细胞淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤或淋巴瘤样肉芽肿病。在一些实施方案中，该受试者患有实体瘤。在一些实施方案中，该B细胞恶性肿瘤是慢性淋巴细胞白血病(CLL)。在一些实施方案中，该不可逆BTK抑制剂选自依鲁替尼、PCI-45292、PCI-45466、AVL-101、AVL-291、AVL-292或ONO-WG-37。在一些实施方案中，该不可逆BTK抑制剂是依鲁替尼。在一些实施方案中，依鲁替尼以约10mg/天至约2000mg/天、约50mg/天至约1500mg/天、约100mg/天至约1000mg/天、约250mg/天至约850mg/天或约300mg/天至约600mg/天的每日剂量施用。在一些实施方案中，依鲁替尼以约140mg/天、420mg/天、560mg/天或840mg/天的每日剂量施用。
在某些实施方案中，本文描述了监测为了治疗癌症而接受BTK抑制剂的受试者是否已经发展或可能发展出对该疗法的抗性的方法，其包括：(a)检测来自该受试者的含有编码PLCγ2多肽的核酸分子的样品，以确定所编码的PLCγ2多肽是否在与SEQ ID NO:11所示氨基酸序列的氨基酸位置665或707相对应的氨基酸位置处被修饰；以及(b)如果该受试者具有该修饰，则将该受试者表征为对使用BTK抑制剂的疗法具有抗性或可能成为有抗性的。在一些实施方案中，该方法进一步包括如果该受试者具有该修饰则中断使用该BTK抑制剂的治疗。在一些实施方案中，该方法进一步包括如果该受试者不具有该修饰则继续使用BTK抑制剂的治疗。在一些实施方案中，该方法进一步包括从受试者获得样品的步骤。在一些实施方案中，该方法进一步包括如果该受试者具有该修饰则施用LYN、SYK、JAK、PI3K、MAPK、MEK或NFκB的抑制剂。在一些实施方案中，该修饰包括PLCγ2中的R665W或S707F置换。在一些实施方案中，该BTK抑制剂是共价或不可逆的抑制剂。
在某些实施方案中，本文描述了优化受试者为了治疗癌症而接受不可逆BTK抑制剂的疗法的方法，其包括：(a)检测来自该受试者的含有编码PLCγ2多肽的核酸分子的样品，以确定所编码的PLCγ2多肽是否在与SEQ ID NO:11所示氨基酸序列的氨基酸位置665相对应的氨基酸位置处被修饰；以及(b)如果该受试者具有该修饰则中断使用不可逆BTK抑制剂的治疗，或者如果该受试者不具有该修饰则继续使用不可逆BTK抑制剂的治疗。在一些实施方案中，该方法进一步包括如果该受试者具有该修饰则施用抑制该修饰激酶的第二代BTK抑制剂。在一些实施方案中，该方法进一步包括从受试者获得样品的步骤。在一些实施方案中，该方法进一步包括如果该受试者具有该修饰则施用LYN、SYK、JAK、PI3K、MAPK、MEK或NFκB的抑制剂。在一些实施方案中，该修饰包括PLCγ2中的R665W或S707F置换。在一些实施方案中，该BTK抑制剂是共价或不可逆的抑制剂。
在该方法的一些实施方案中，用于该试验的核酸分子是RNA或DNA。在该方法的一些实施方案中，该核酸分子是cDNA。在该方法的一些实施方案中，用于该试验的核酸分子是基因组DNA。在该方法的一些实施方案中，用于该试验的核酸分子是总RNA。在该方法的一些实施方案中，用于该试验的核酸分子是mRNA。在该方法的一些实施方案中，该方法进一步包括从RNA样品中分离mRNA。
在该方法的一些实施方案中，检测包括对编码PLCγ2多肽的氨基酸位置665或707的核酸进行聚合酶链反应(PCR)扩增。在一些实施方案中，PCR扩增包括使用一对寡核苷酸引物，该引物位于编码PLCγ2多肽的氨基酸位置665或707的区域的侧翼。在一些实施方案中，该方法包括对扩增的核酸进行测序。
在该方法的一些实施方案中，检测包括使核酸与序列特异性核酸探针接触，其中该序列特异性核酸探针：(a)与编码在氨基酸位置665处被修饰的修饰PLCγ2的核酸结合；且(b)不与编码在氨基酸位置665或707处具有精氨酸的野生型PLCγ2的核酸结合。在该方法的一些实施方案中，检测包括使用序列特异性核酸探针的PCR扩增。
在一些实施方案中，用于该方法的样品含有来自受试者的一种或多种肿瘤细胞。在一些实施方案中，用于该方法的样品含有循环肿瘤DNA(ctDNA)。
在该方法的一些实施方案中，在该方法中使用的核酸是从来自受试者的肿瘤细胞样品中分离的。在一些实施方案中，该样品是肿瘤活检样品、血液样品、血清样品、淋巴样品或骨髓抽吸物。
在一些实施方案中，该BTK抑制剂选自依鲁替尼(PCI-32765)、PCI-45292、PCI-45466、AVL-101、AVL-291、AVL-292或ONO-WG-37。在一些实施方案中，该PLCγ2抑制剂是依鲁替尼。
在该方法的一些实施方案中，受试者患有癌症。在一些实施方案中，该癌症是血液***癌症。在一些实施方案中，癌症是B细胞恶性肿瘤。在一些实施方案中，癌症选自白血病、淋巴瘤或骨髓瘤。在一些实施方案中，该B细胞恶性肿瘤是慢性淋巴细胞白血病(CLL)、小淋巴细胞淋巴瘤(SLL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、活化B细胞弥漫性大B细胞淋巴瘤(ABC-DLBCL)、生发中心弥漫性大B细胞淋巴瘤(GCB DLBCL)、原发性纵隔B细胞淋巴瘤(PMBL)、非霍奇金淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、滤泡淋巴瘤、免疫母细胞大细胞淋巴瘤、前体B淋巴母细胞淋巴瘤、前体B细胞急性淋巴母细胞性白血病、多毛细胞白血病、套细胞淋巴瘤、B细胞幼淋巴细胞白血病、淋巴质浆细胞淋巴瘤/瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、脾边缘区淋巴瘤、浆细胞性骨髓瘤、浆细胞瘤、结外边缘区B细胞淋巴瘤、结边缘区B细胞淋巴瘤、纵隔(胸腺)大B细胞淋巴瘤、血管内大B细胞淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤或淋巴瘤样肉芽肿病。在一些实施方案中，受试者患有实体瘤。
在该方法的一些实施方案中，受试者在获得样品前用BTK抑制剂治疗。在一些实施方案中，该样品在首次施用不可逆BTK抑制剂后1周、2周、3周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月、14个月、16个月、18个月、20个月、22个月或24个月时获得。在一些实施方案中，该样品在使用BTK抑制剂治疗的过程中获得1、2、3、4、5、6、7、8、9、10次。在一些实施方案中，在首次施用时受试者对使用BTK抑制剂的治疗有反应。
在某些实施方案中，本文描述了一种试剂盒，其包含一种或多种试剂，该试剂用于检测在氨基酸位置665处包含修饰的修饰PLCγ2多肽。在一些实施方案中，该试剂盒包含微芯片，该微芯片包含具有修饰R665W或S707F的突变PLCγ2多肽。
在某些实施方案中，本文描述了一种试剂盒，其包含一种或多种试剂，该试剂用于检测编码在氨基酸位置665或707处包含修饰的突变PLCγ2多肽的核酸。在一些实施方案中，该试剂盒包含微芯片，该微芯片包含编码具有修饰R665W或S707F的突变PLCγ2多肽的核酸。
在某些实施方案中，本文描述了一种用于检测修饰的PLCγ2的***，该修饰PLCγ2赋予受试者中对使用不可逆BTK抑制剂的抑制的抗性，该***包含：(a)来自该受试者的含有编码PLCγ2多肽的核酸分子的样品；以及(b)包含编码突变PLCγ2多肽或其一部分的核酸的微阵列，该突变PLCγ2多肽或其一部分在与SEQ ID NO:11所示氨基酸序列的氨基酸位置665或707相对应的氨基酸位置处被修饰。在一些实施方案中，该微阵列包含在微芯片上。
在某些实施方案中，本文描述了一种用于检测修饰的PLCγ2的***，该修饰PLCγ2赋予受试者中对使用BTK抑制剂的抑制的抗性，该***包含：(a)来自该受试者的含有编码PLCγ2多肽的核酸分子的样品；以及(b)序列特异性核酸探针，其中该序列特异性核酸探针：(i)与编码在氨基酸位置665或707处被修饰的修饰PLCγ2的核酸结合；且(ii)不与编码在氨基酸位置665处具有精氨酸或在位置707处具有丝氨酸的野生型PLCγ2的核酸结合。
在某些实施方案中，本文描述了一种用于检测修饰的PLCγ2的***，该修饰PLCγ2赋予受试者中对使用BTK抑制剂的抑制的抗性，该***包含：(a)来自该受试者的含有编码PLCγ2多肽的核酸分子的样品；和(b)一对寡核苷酸引物，其位于编码PLCγ2多肽的氨基酸665或707的核酸区域的侧翼。
在某些实施方案中，本文描述了一种在患有血液***癌症的患者中进行维持疗法的方法，其包括：(a)向该患者施用维持疗法方案，该方案包括施用治疗有效剂量的BTK抑制剂；以及(b)在所述维持疗法方案的过程中以预定的时间间隔监测该患者，以确定受试者是否在编码PLCγ2的内源基因中具有突变，该突变导致与SEQ ID NO:11所示氨基酸序列的氨基酸位置665或707相对应的氨基酸位置处的修饰。在一些实施方案中，监测包括：(a)检测来自该受试者的含有编码PLCγ2多肽的核酸分子的样品，以确定所编码的PLCγ2多肽是否在与SEQ ID NO:11所示氨基酸序列的氨基酸位置665或707相对应的氨基酸位置处被修饰。在一些实施方案中，该方法进一步包括如果该受试者具有该突变则中断使用该BTK抑制剂的治疗。在一些实施方案中，该方法进一步包括如果该受试者不具有该突变则继续使用BTK抑制剂的治疗。在一些实施方案中，该方法进一步包括如果该受试者具有该修饰则施用LYN、SYK、JAK、PI3K、MAPK、MEK或NFκB的抑制剂。在一些实施方案中，PLCγ2多肽中的修饰是R665W或S707F。在一些实施方案中，该预定的时间间隔是每个月、每2个月、每3个月、每4个月、每5个月、每6个月、每7个月、每8个月
在一些实施方案中，该BTK抑制剂以约10mg/天至约2000mg/天、约50mg/天至约1500mg/天、约100mg/天至约1000mg/天、约250mg/天至约850mg/天或约300mg/天至约600mg/天的每日剂量施用。在一些实施方案中，依鲁替尼以约140mg/天、420mg/天、560mg/天或840mg/天的每日剂量施用。在一些实施方案中，该BTK抑制剂是共价和/或不可逆BTK抑制剂。在一些实施方案中，该BTK抑制剂选自依鲁替尼(PCI-32765)、PCI-45292、PCI-45466、AVL-101、AVL-291、AVL-292或ONO-WG-37。在一些实施方案中，该BTK抑制剂是依鲁替尼。
在某些实施方案中，本文描述了监测为了治疗癌症而接受BTK抑制剂的受试者是否已经发展或可能发展出对该疗法的抗性的方法，其包括：(a)检测来自该受试者的含有编码CARD11多肽的核酸分子的样品，以确定所编码的CARD11多肽是否在与SEQ ID NO:19所示氨基酸序列的氨基酸位置232相对应的氨基酸位置处被修饰；以及(b)如果该受试者具有该修饰，则将该受试者表征为对使用BTK抑制剂的疗法具有抗性或可能成为有抗性的。在一些实施方案中，该方法进一步包括如果受试者具有该修饰则中断使用BTK抑制剂的治疗。在一些实施方案中，该方法进一步包括如果受试者不具有该修饰则继续使用BTK抑制剂的治疗。在一些实施方案中，该方法进一步包括从受试者获得样品的步骤。在一些实施方案中，该方法进一步包括如果受试者具有该修饰则施用LYN、SYK、JAK、PI3K、MAPK、MEK或NFκB的抑制剂。在一些实施方案中，该修饰包括CARD11中的L232LL***。在一些实施方案中，该BTK抑制剂是共价或不可逆抑制剂。
在某些实施方案中，本文描述了优化受试者为了治疗癌症而接受不可逆BTK抑制剂的疗法的方法，其包括：(a)检测来自该受试者的含有编码CARD11多肽的核酸分子的样品，以确定所编码的CARD11多肽是否在与SEQ ID NO:19所示氨基酸序列的氨基酸位置232相对应的氨基酸位置处被修饰；以及(b)如果该受试者具有该修饰则中断使用该不可逆BTK抑制剂的治疗，或者如果该受试者不具有该修饰则继续使用该不可逆BTK抑制剂的治疗。在一些实施方案中，该方法进一步包括如果受试者具有该修饰则施用抑制该修饰激酶的第二代BTK抑制剂。在一些实施方案中，该方法进一步包括从受试者获得样品的步骤。在一些实施方案中，该方法进一步包括如果受试者具有该修饰则施用LYN、SYK、JAK、PI3K、MAPK、MEK或NFκB的抑制剂。在一些实施方案中，该修饰包括CARD11中的L232LL***。在一些实施方案中，该BTK抑制剂是共价或不可逆抑制剂。
在该方法的一些实施方案中，用于该试验的核酸分子是RNA或DNA。在该方法的一些实施方案中，该核酸分子是cDNA。在该方法的一些实施方案中，用于该试验的核酸分子是基因组DNA。在该方法的一些实施方案中，用于该试验的核酸分子是总RNA。在该方法的一些实施方案中，用于该试验的核酸分子是mRNA。在该方法的一些实施方案中，该方法进一步包括从RNA样品中分离mRNA。
在该方法的一些实施方案中，检测包括对编码CARD11多肽的氨基酸位置232的核酸进行聚合酶链反应(PCR)扩增。在一些实施方案中，PCR扩增包括使用一对寡核苷酸引物，该引物位于编码CARD11多肽的氨基酸位置232的区域的侧翼。在一些实施方案中，该方法包括对扩增的核酸进行测序。
在该方法的一些实施方案中，检测包括使核酸与序列特异性核酸探针接触，其中该序列特异性核酸探针：(a)与编码在氨基酸位置232处被修饰的修饰CARD11的核酸结合；且(b)不与编码野生型CARD11的核酸结合。在该方法的一些实施方案中，检测包括使用序列特异性核酸探针的PCR扩增。
在一些实施方案中，用于该方法的样品含有来自受试者的一种或多种肿瘤细胞。在一些实施方案中，用于该方法的样品含有循环肿瘤DNA(ctDNA)。
在该方法的一些实施方案中，在该方法中使用的核酸从来自受试者的肿瘤细胞样品中分离。在一些实施方案中，该样品是肿瘤活检样品、血液样品、血清样品、淋巴样品或骨髓抽吸物。
在一些实施方案中，该BTK抑制剂选自依鲁替尼(PCI-32765)、PCI-45292、PCI-45466、AVL-101、AVL-291、AVL-292或ONO-WG-37。在一些实施方案中，该CARD11抑制剂是依鲁替尼。
在该方法的一些实施方案中，受试者患有癌症。在一些实施方案中，该癌症是血液***癌症。在一些实施方案中，癌症是B细胞恶性肿瘤。在一些实施方案中，癌症选自白血病、淋巴瘤或骨髓瘤。在一些实施方案中，该B细胞恶性肿瘤是慢性淋巴细胞白血病(CLL)、小淋巴细胞淋巴瘤(SLL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、活化B细胞弥漫性大B细胞淋巴瘤(ABC-DLBCL)、生发中心弥漫性大B细胞淋巴瘤(GCB DLBCL)、原发性纵隔B细胞淋巴瘤(PMBL)、非霍奇金淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、滤泡淋巴瘤、免疫母细胞大细胞淋巴瘤、前体B淋巴母细胞淋巴瘤、前体B细胞急性淋巴母细胞性白血病、多毛细胞白血病、套细胞淋巴瘤、B细胞幼淋巴细胞白血病、淋巴质浆细胞淋巴瘤/瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、脾边缘区淋巴瘤、浆细胞性骨髓瘤、浆细胞瘤、结外边缘区B细胞淋巴瘤、结边缘区B细胞淋巴瘤、纵隔(胸腺)大B细胞淋巴瘤、血管内大B细胞淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤或淋巴瘤样肉芽肿病。在一些实施方案中，受试者患有实体瘤。
在该方法的一些实施方案中，受试者在获得样品前用BTK抑制剂治疗。在一些实施方案中，该样品在首次施用不可逆BTK抑制剂后1周、2周、3周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月、14个月、16个月、18个月、20个月、22个月或24个月时获得。在一些实施方案中，该样品在使用BTK抑制剂治疗的过程中获得1、2、3、4、5、6、7、8、9、10次。在一些实施方案中，在首次施用时受试者对使用BTK抑制剂的治疗有反应。
在某些实施方案中，本文描述了一种试剂盒，其包含一种或多种试剂，该试剂用于检测在氨基酸位置232处包含修饰的修饰CARD11多肽。在一些实施方案中，该试剂盒包含微芯片，该微芯片包含具有修饰L232LL的突变CARD11多肽。
在某些实施方案中，本文描述了一种试剂盒，其包含一种或多种试剂，该试剂用于检测编码在氨基酸位置232处包含修饰的突变CARD11多肽的核酸。在一些实施方案中，该试剂盒包含微芯片，该微芯片包含编码具有修饰L232LL的突变CARD11多肽的核酸。
在某些实施方案中，本文描述了一种用于检测修饰的CARD11的***，该修饰CARD11赋予受试者中对使用不可逆BTK抑制剂的抑制的抗性，该***包含：(a)来自该受试者的含有编码CARD11多肽的核酸分子的样品；以及(b)包含编码突变CARD11多肽或其一部分的核酸的微阵列，该突变CARD11多肽或其一部分在与SEQ ID NO:19所示氨基酸序列的氨基酸位置232相对应的氨基酸位置处被修饰。在一些实施方案中，该微阵列包含在微芯片上。
在某些实施方案中，本文描述了一种用于检测修饰的CARD11的***，该修饰CARD11赋予受试者中对使用BTK抑制剂的抑制的抗性，该***包含：(a)来自该受试者的含有编码CARD11多肽的核酸分子的样品；以及(b)序列特异性核酸探针，其中该序列特异性核酸探针：(i)与编码在氨基酸位置232处被修饰的修饰CARD11的核酸结合；且(ii)不与编码野生型CARD11的核酸结合。
在某些实施方案中，本文描述了一种用于检测修饰的CARD11的***，该修饰CARD11赋予受试者中对使用BTK抑制剂的抑制的抗性，该***包含：(a)来自该受试者的含有编码CARD11多肽的核酸分子的样品；和(b)一对寡核苷酸引物，其位于编码CARD11多肽的氨基酸232的核酸区域的侧翼。
在某些实施方案中，本文描述了一种在患有血液***癌症的患者中进行维持疗法的方法，其包括：(a)向该患者施用维持疗法方案，该方案包括施用治疗有效剂量的BTK抑制剂；以及(b)在所述维持疗法方案的过程中以预定的时间间隔监测该患者，以确定受试者是否在编码CARD11的内源基因中具有突变，该突变导致与SEQ ID NO:19所示氨基酸序列的氨基酸位置232相对应的氨基酸位置处的修饰。在一些实施方案中，监测包括：(a)检测来自该受试者的含有编码CARD11多肽的核酸分子的样品，以确定所编码的CARD11多肽是否在与SEQ ID NO:19所示氨基酸序列的氨基酸位置232相对应的氨基酸位置处被修饰。在一些实施方案中，该方法进一步包括如果该受试者具有该突变则中断使用该BTK抑制剂的治疗。在一些实施方案中，该方法进一步包括如果该受试者不具有该突变则继续使用BTK抑制剂的治疗。在一些实施方案中，该方法进一步包括如果该受试者具有该修饰则施用LYN、SYK、JAK、PI3K、MAPK、MEK或NFκB的抑制剂。在一些实施方案中，CARD11多肽中的修饰是L232LL。在一些实施方案中，该预定的时间间隔是每个月、每2个月、每3个月、每4个月、每5个月、每6个月、每7个月、每8个月
在一些实施方案中，该BTK抑制剂以约10mg/天至约2000mg/天、约50mg/天至约1500mg/天、约100mg/天至约1000mg/天、约250mg/天至约850mg/天或约300mg/天至约600mg/天的每日剂量施用。在一些实施方案中，依鲁替尼以约140mg/天、420mg/天、560mg/天或840mg/天的每日剂量施用。在一些实施方案中，该BTK抑制剂是共价和/或不可逆BTK抑制剂。在一些实施方案中，该BTK抑制剂选自依鲁替尼(PCI-32765)、PCI-45292、PCI-45466、AVL-101、AVL-291、AVL-292或ONO-WG-37。在一些实施方案中，该BTK抑制剂是依鲁替尼。
附图说明
图1描绘了使用依鲁替尼的野生型和突变BTK的结构建模。红色箭头指向断裂的共价键。
图2A-C证明BTK突变导致BCR信号途径的再激活和基因表达的改变。图2A描绘了在四个系列样品中BTK磷酸化和下游BCR信号传导的免疫印迹。GAPDH作为加载对照而包括在内。图2B显示了全部4个系列样品的图示热图与27-基因BCR特征(signature)的表达谱。RPKM-标准化的表达计数使用如下所示的颜色参考值范围以颜色代表。图2C：针对BCR特征簇中每个单独的基因对RPKM-标准化的表达计数进行作图。四个标本之间的差异通过单向方差分析法(ANOVA)进行分析。*P<0.05，***P<0.001。
图3A-C：BTK突变导致增加的离体细胞增殖，其对其它BCR抑制剂仍然敏感。图3A：患者临床过程中Ki67+CLL细胞的纵向变化。图3B：在治疗前(Pre-Rx)和反应(responding)样品中，依鲁替尼消除了体外基质诱导的增殖，但是在复发样品中未消除。依鲁替尼的浓度在每列的顶部示出。BrdU+细胞的百分比在每个图块中示出。Iso：同种型对照。图3C：其它激酶抑制剂对CLL增殖的影响。示出了实验中使用的浓度。未经处理的细胞(+NK)充当对照。PRT060318：SYK抑制剂；PRT062070：SYK/JAK双重抑制剂；CAL101：PI3Kδ抑制剂；托法替尼：JAK抑制剂；达沙替尼：多激酶抑制剂。
图4：细胞大小的变化，反映了经依鲁替尼治疗又复发后增加的增殖。
具体实施方式
某些术语
除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语都与所请求保护的主题所属领域的技术人员所一般了解的意义相同。除非另外指出，否则在本文完整公开内容中提到的所有专利、专利申请、公开的申请和出版物、GENBANK序列、网站和其它发表的材料均通过引用而整体并入。如果本文中的术语有多个定义，则以本章节中的定义为准。当提到URL或其它此类标识符或地址时，应当理解，此类标识符可能改变，并且因特网上的特定信息可能时有时无，但是等同的信息是已知的，并且可以通过例如搜索因特网和/或适当的数据库而容易地找到。对其之提及证明了此信息的可获得性和公开发布。通常，用于细胞培养、细胞感染、抗体产生和分子生物学方法的程序是本领域中常用的方法。这类标准技术可见于例如参考手册，例如Sambrook等人(2000)和Ausubel等人(1994)。
如本文所用的，单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数形式的指示物，除非上下文另有明确说明。在本申请中，除非另有特别说明，单数形式的使用包括复数形式。如本文所用的，“或”的使用意为“和/或”，除非另有说明。此外，术语“包括”以及其它形式(例如，“包含”、“含有”和“具有”)的使用不是限制性的。
如本文所用的，范围和量可表示为“约”特定值或范围。“约”也包括确切的量。因此，“约5μg”意思是“约5μg”以及“5μg”。通常，术语“约”包括预计将在实验误差内的量。
如本文所用的，布鲁顿酪氨酸激酶(BTK)多肽是指任何BTK蛋白质或多肽，包括但不限于重组产生的蛋白质、合成产生的蛋白质、天然的BTK蛋白质以及从细胞或组织中提取的BTK蛋白质。BTK多肽包括来自不同物种的相关多肽，该物种包括但不限于人和非人来源的动物。非人来源的BTK多肽包括但不限于非人灵长类动物(例如，黑猩猩和猿)、鼠类(例如，小鼠和大鼠)、犬类(狗)、猫类(猫)、兔类(兔)、禽类(鸟)、牛类(牛)、羊类(绵羊)、猪类(猪)、马类(马)、鱼类(鱼)、蛙类(青蛙)以及其它哺乳动物或非哺乳动物BTK多肽。示例性的BTK多肽包括，例如，来自小鼠(GenBank登录号AAB47246)、狗(GenBank登录号XP_549139.)、大鼠(GenBank登录号NP_001007799)、鸡(GenBank登录号NP_989564)或斑马鱼(GenBank登录号XP_698117)的直向同源物，以及上述任何一种的融合蛋白，其对布鲁顿酪氨酸激酶的一种或多种底物(例如，具有氨基酸序列“AVLESEEELYSSARQ”的肽底物)表现出激酶活性。示例性的BTK多肽包括但不限于SEQ ID NO:1、2和4-6。BTK多肽包括野生型BTK、等位基因变异同种型、包括在肿瘤或血液***恶性肿瘤中发现的体细胞突变在内的体细胞突变、来自核酸的合成分子、分离自人类组织和细胞的蛋白质，以及它们的修饰形式。本文提供的BTK多肽可通过经由一个或多个氨基酸的缺失、添加或置换对一级氨基酸序列的修饰来进一步修饰。BTK多肽包括任何BTK多肽或其具有BTK活性如激酶活性的一部分。
如本文所用的，突变BTK多肽、突变BTK蛋白质和修饰的BTK多肽或修饰的BTK蛋白质在本文中可互换使用，并指在一个或多个氨基酸位置处被修饰的BTK多肽。示例性的修饰包括但不限于氨基酸的置换、缺失或添加。
如本文所用的，术语“BTK抑制剂”或“BTK拮抗剂”是指抑制或降低BTK多肽的至少一种活性的试剂。BTK活性包括直接的和间接的活性。示例性的直接活性包括但不限于与靶分子的缔合或靶底物的磷酸化(即，激酶活性)。示例性的间接活性包括但不限于下游生物事件的激活或抑制，例如NF-κB介导的基因转录的激活。
如本文所用的，术语“不可逆抑制剂”是指这样的化合物，当其与靶蛋白(例如激酶)接触时，导致与该蛋白质形成或在该蛋白质内形成新的共价键，由此减弱或消除了靶蛋白的一种或多种生物活性(例如磷酸转移酶活性)，而不管该不可逆抑制剂随后是存在还是不存在。
如本文所用的，术语“不可逆BTK抑制剂”是指BTK的抑制剂，其可以与BTK的氨基酸残基形成共价键。在一个实施方案中，BTK的不可逆抑制剂可以与BTK的半胱氨酸残基形成共价键；在特定的实施方案中，不可逆抑制剂可以与BTK的半胱氨酸481残基(或其同源物)或另一种酪氨酸激酶的同源对应位置的半胱氨酸残基形成共价键。
如本文所用的，BTK活性的抑制是指，与不存在抑制剂时的相同活性相比，在该抑制剂的存在下BTK活性的下降。
如本文所用的，短语“赋予对共价和/或不可逆BTK抑制剂的抗性”是指BTK对由共价和/或不可逆BTK抑制剂引起的抑制的敏感性的任何降低。在本文提供的一些实施方案中，BTK在半胱氨酸481处的修饰赋予对共价和/或不可逆BTK抑制剂的抗性。在一些实施方案中，该修饰阻止抑制剂与BTK的结合。在一些实施方案中，抑制剂可逆地与BTK结合。在一些实施方案中，相对于与野生型BTK的结合，抑制剂对与修饰BTK的结合的亲和力降低。
如本文所用的，术语“第二代BTK抑制剂”是指抑制在半胱氨酸481处含有氨基酸修饰的BTK多肽的至少一种活性的试剂。在一些实施方案中，第二代BTK抑制剂也抑制野生型BTK多肽的活性。在一些实施方案中，第二代BTK抑制剂不抑制野生型BTK多肽的活性。
如本文所用的，术语“第一代BTK抑制剂”是指抑制野生型BTK多肽的活性，但对在半胱氨酸481处含有氨基酸修饰的BTK多肽显示出抑制下降的试剂。在一些实施方案中，第一代BTK抑制剂是共价和/或不可逆BTK抑制剂。
术语“癌症”和“癌性的”是指或描述哺乳动物中的生理状况，该状况的特征典型地是不受调控的细胞生长。癌症的实例包括但不限于B细胞淋巴增生性疾病(BCLD)，诸如淋巴瘤和白血病，以及实体瘤。所谓“B细胞相关的癌症”或“B细胞谱系的癌症”是指其中失调的或不受调控的细胞生长与B细胞相关的任何类型的癌症。
在癌症背景下所谓的“难治性”意指特定的癌症对使用特定治疗剂的疗法有抗性或无反应。癌症对使用特定治疗剂的疗法具难治性的可能是始于用该特定治疗剂开始治疗时(即，对初始治疗剂暴露就是无反应的)，或者是由于在使用该治疗剂的首次治疗期的过程中或在使用该治疗剂的后续治疗期的过程中发展出对该治疗剂的抗性。
如本文所用的，“维持疗法”意指化学疗法或其它治疗的持续使用，以帮助降低对初始治疗有有益反应(例如缓解)后复发(癌症的卷土重来)的风险。维持疗法也可用于患有晚期癌症(例如，不能被治愈的癌症)的患者，以帮助防止其进一步生长和扩散。
所谓“BTK介导的信号传导”指的是任何直接或间接依赖于BTK活性的生物活性。BTK介导的信号传导的实例是导致BTK表达细胞的增殖和存活的信号，以及对BTK表达细胞内一种或多种BTK信号传导途径的刺激。
BTK“信号途径“或“信号转导途径”意指由BTK的活性所导致的至少一个生化反应或一组生化反应，其产生一种信号，当该信号通过该信号途径传送时，该信号会导致信号级联中一种或多种下游分子的激活。信号转导途径涉及若干信号转导分子，这些信号转导分子会导致信号从细胞表面跨过细胞质膜传递，并通过一系列信号转导分子中的一种或多种，通过该细胞的细胞质，且在一些情况下，进入细胞核中。本发明特别有意义的是BTK信号转导途径，其经由NF-κB信号途径最终调节(增强或者抑制)NF-κB的激活。
术语“核酸”是指单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸及其聚合物。除非特别限定，否则该术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，其具有与参考核酸相似的结合性质并以与天然存在的核苷酸类似的方式被代谢。除非特别限定，否则该术语也指寡核苷酸类似物，包括PNA(肽核酸)，在反义技术中使用的DNA的类似物(例如，硫代磷酸、磷酰胺(phosphoroamidate))。除非另有说明，否则特定核酸序列也隐含保守修饰的其变体(包括但不限于简并密码子置换)和互补序列以及明确指定的序列。特别地，通过生成其中一个或多个选定的(或全部)密码子的第三位置被置换为混合碱基和/或脱氧肌苷残基的序列来实现简并密码子置换(Batzer等人(1991)Nucleic Acid Res.19:5081；Ohtsuka等人(1985)J.Biol.Chem.260:2605-2608；和Cassol等人(1992)Mol.Cell.Probes 6,327-331；以及Rossolini等人(1994)Mol.Cell.Probes 8:91-98)。
术语“氨基酸”是指天然存在和非天然存在的氨基酸，以及以与天然存在的氨基酸相似的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然编码的氨基酸是20种常见氨基酸(丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸)和吡咯赖氨酸(pyrolysine)及硒代半胱氨酸。氨基酸类似物是指与天然存在的氨基酸具有相同的基本化学结构(即，与氢结合的α碳、羧基、氨基和R基团)的试剂，例如，高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。这样的类似物具有修饰的R基团(例如，正亮氨酸)或修饰的肽骨架，但保留与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。
本文中氨基酸用其公知的三字母符号或用IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的单字母符号来表示。同样地，核苷酸用其普遍接受的单字母代码来表示。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，是指氨基酸残基的聚合物。该术语适用于天然存在的氨基酸聚合物以及其中一个或多个氨基酸残基是非天然存在的氨基酸(例如氨基酸类似物)的氨基酸聚合物。该术语涵盖任何长度的氨基酸链，包括全长蛋白质，其中氨基酸残基通过共价肽键连接。
如本文所用的，关于多肽的氨基酸序列或核酸分子中核苷酸序列的修饰，其修饰分别包括氨基酸和核苷酸的缺失、***和取代。
为了确定两个氨基酸序列或两个核酸的同源性百分比，所述序列可以为了最佳比较目的而比对(例如，为了与第二氨基酸或核酸序列进行最佳比对，在第一氨基酸或核酸序列的序列中引入缺口)。然后可比较相应的氨基酸位置或核苷酸位置处的氨基酸残基或核苷酸。当第一序列中的位置被与第二序列中的相应位置相同的氨基酸残基或核苷酸占据时，则该分子在该位置上是相同的。两个序列之间的同源性百分比是序列共有的相同位置的数目的函数(即，％同一性＝相同位置数/位置总数(例如，重叠位置)x 100)。在一些实施方案中，两个序列长度相同。
为了确定两个序列之间的同源性百分比，使用如Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-5877修改的Karlin和Altschul(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:2264-2268的算法。将这样的算法并入至Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215:403-410的NBLAST和XBLAST程序中。BLAST核苷酸检索使用NBLAST程序进行，得分＝100，字长＝12，以获得与本文描述或公开的核酸分子同源的核苷酸序列。BLAST蛋白质检索使用XBLAST程序进行，得分＝50，字长＝3。为了获得用于比较目的的缺口比对(gapped alignments)，使用如Altschul等人(1997)Nucleic Acids Res.25:3389-3402所述的缺口BLAST。当使用BLAST和缺口BLAST程序时，使用各自程序(例如，XBLAST和NBLAST)的缺省参数。更多细节参见国家生物技术信息中心网站(在万维网地址ncbi.nlm.nih.gov上)。适合于在本文描述的方法中使用的蛋白质还包括与本文所述的任何蛋白质的氨基酸序列相比具有1至15个氨基酸改变，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸置换、缺失或添加的蛋白质。在其它实施方案中，改变的氨基酸序列与本文所述的任何蛋白质的氨基酸序列至少75％相同，例如，77％、80％、82％、85％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。只要改变的氨基酸序列保留足以在本文所述的组合物和方法中具有功能性的生物活性，则这样的序列变异蛋白质适合于本文所述的方法。在进行氨基酸置换时，该置换应当是保守的氨基酸置换。在常见的氨基酸之间，例如，“保守的氨基酸置换”由下列每个组内的氨基酸之间的置换来说明：(1)甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸，(2)苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸，(3)丝氨酸和苏氨酸，(4)天冬氨酸和谷氨酸，(5)谷氨酰胺和天冬酰胺，以及(6)赖氨酸、精氨酸和组氨酸。本领域技术人员将会认识到，通常，在多肽的非必需区域中的单氨基酸置换基本上不改变生物活性(参见，例如，Watson等人.Molecular Biology of the Gene,第4版,1987,TheBenjamin/Cummings Pub.co.,p.224)。BLOSUM62表是由蛋白质序列区段的约2000个局部多重比对衍生的氨基酸置换矩阵，代表超过500组相关蛋白质的高度保守的区域(Henikoff等人(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:10915-10919)。因此，BLOSUM62置换频率用于定义在一些实施方案中引入本文所述或公开的氨基酸序列内的保守氨基酸置换。尽管仅基于化学性质来设计氨基酸置换是可能的(如上面所讨论)，但短语“保守氨基酸置换”优选地指由大于-1的BLOSUM62值所表示的置换。例如，如果置换的特征是BLOSUM62值为0、1、2或3，则氨基酸置换是保守的。根据该***，优选的保守氨基酸置换的特征是BLOSUM62值至少为1(例如，1、2或3)，而更优选的保守氨基酸置换的特征是BLOSUM62值至少为2(例如，2或3)。
如本文所用的，相应的残基是指在比对的基因座处出现的残基。相关的或变异的多肽通过本领域技术人员已知的任何方法进行比对。这样的方法通常使匹配最大化，并且包括诸如使用手工比对和使用大量可用的比对程序(例如，BLASTP)的方法以及本领域技术人员已知的其它方法。通过比对多肽的序列，本领域技术人员可以使用保守的和相同的氨基酸残基作为指导来鉴别相应的残基。相应的位置也可基于结构比对，例如通过使用蛋白质结构的计算机模拟比对。在其它情况下，可以鉴别相应的区域。
如本文所用的，等位基因变体或等位基因变异参考由不同于基因的参考形式的基因所编码(即，由等位基因编码)的多肽。通常，基因的参考形式编码来自物种的群体或单个参考成员的多肽的野生型形式和/或优势形式。通常，等位基因变体(其包括物种之间的变体)与来自相同物种的野生型和/或优势形式一般具有至少80％、90％或更高的氨基酸同一性；同一性程度取决于该基因以及比较是种间的还是种内的。通常，种内等位基因变体与野生型和/或优势形式具有至少约80％、85％、90％或95％或更高的同一性，包括与多肽的野生型和/或优势形式具有96％、97％、98％、99％或更高的同一性。
如本文所用的，术语“基本纯化的”是指可能基本上或实质上不含在纯化前通常与目标成分相伴或与之相互作用的其它成分的目标成分。仅举例来说，当目标成分的制品含有低于约30％、低于约25％、低于约20％、低于约15％、低于约10％、低于约5％、低于约4％、低于约3％、低于约2％或低于约1％(以干重计)的掺杂成分时，目标成分可以是“基本纯化的”。因此，“基本纯化的”目标成分可以具有约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或更高的纯度水平。
如本文所用的，物种变体是指同一多肽在物种之间的变体。通常，种间变体与来自另一物种的野生型和/或优势形式具有至少约60％、70％、80％、85％、90％或95％或更高的同一性，包括与多肽的野生型和/或优势形式具有96％、97％、98％、99％或更高的同一性。
如本文所用的术语“受试者”是指作为治疗、观察或实验对象的动物。仅举例来说，受试者可以是但不限于哺乳动物，包括但不限于人。
如本文所用的IC50是指特定测试化合物的量、浓度或剂量，其在测量这样的反应的试验中，达到最大反应的50％抑制，例如BTK的抑制。
如本文所用的EC50是指特定测试化合物的剂量、浓度或量，其引起的剂量依赖性反应为由特定测试化合物诱导、引起或加强的特定反应的最大表达的50％。
如本文所用的，术语“治疗”和其它语法等效词包括减轻、缓解或改善疾病或病况的一种或多种症状，改善、阻止或减少疾病或病况的一种或多种额外症状的出现、严重程度或频率，改善或阻止疾病或病况的一种或多种症状的潜在代谢病因，抑制疾病或病况，例如，阻止疾病或病况的发展，减轻疾病或病况，引起疾病或病况的消退，减轻由疾病或病况引起的状况，或预防性地和/或治疗性地抑制疾病或病况的症状。在非限制性实例中，为获得预防性益处，将本文公开的第三代BTK抑制剂化合物施用于处于发展特定病症的风险中、易于发展特定病症的个体，或施用于报告了病症的一种或多种生理学症状的个体。在一些实施方案中，在使用一种或多种治疗剂治疗后，将本文公开的第三代BTK抑制剂化合物施用于受试者。在一些实施方案中，本文公开的第三代BTK抑制剂化合物与使用一种或多种治疗剂的治疗联合施用于受试者。
如本文所用的，防止或预防是指降低发展疾病或病况的风险。
如本文所用的术语“有效量”、“治疗有效量”或“药学有效量”是指足以治疗病症的BTK抑制剂化合物的量。在一些实施方案中，结果是病症的指征、症状或病因的减少和/或缓解，或生物***的任何其它需要的改变。例如，用于治疗用途的“有效量”是提供病症在临床上显著减轻所需的、包含本文公开的BTK抑制剂化合物的组合物的量。在任何个别情况中，合适的“有效”量使用任何合适的技术(例如，剂量递增研究)来确定。
如本文所用的，术语“药学上可接受的”是指一种物质(例如，载体或稀释剂)，其不消除本文所述的BTK抑制剂化合物的生物活性或性质，并且相对地无毒(即，将该物质施用于个体不会引起不希望的生物效应，或者不会以有害的方式与包含它的组合物的任何组分相互作用)。
如本文所用的，对照是指除了没有使用测试参数进行处理外基本上与测试样品相同的样品，或者如果是血浆样品，则其可以来自没有受目标病况影响的正常志愿者。对照也可以是内部对照。
如本文所用的，术语“受试者”、“个体”和“患者”可互换使用。这些术语均不应解释为需要医疗专业人员(例如，医生、护士、医生助手、护理员、临终关怀工作者(hospice workder))的监督。如本文所用的，受试者可以是任何动物，包括哺乳动物(例如，人或非人类动物)和非哺乳动物。在本文提供的方法和组合物的一个实施方案中，该哺乳动物是人。
如本文所用的，“接触”是指触摸、进行接触或使物质邻近的动作。“接触”可通过在流体或半流体混合物中混合组分来实现。
概述：癌症中的BTK功能和抗药性
抗药性是影响到医学的数个领域(包括传染病和癌症)的问题。在癌症治疗过程中，自发的随机突变随着癌细胞群体通过反复***扩大而发生，其中一些赋予抗性并因此具有生存优势。本文描述了BTK基因中的突变，它是在使用不可逆BTK抑制剂依鲁替尼治疗CLL患者的过程中出现的。在使用依鲁替尼治疗大约18个月后，在单独的研究中有三名患者表现出绝对淋巴细胞计数(ALC)的增加以及增大的***大小。在一名患者中即使当依鲁替尼剂量从560mg/天逐渐升高至840mg/天时疾病进展也在继续。从该患者中分离血液样品，并从包含在样品中的细胞中分析编码BTK的mRNA。在两名患者中发现已经出现BTK蛋白质中的突变。在一名患者中，编码BTK的核酸具有鸟嘌呤(g)-1635至胞嘧啶(c)-1635的错义突变，导致半胱氨酸-481密码子TGC至TCC(丝氨酸)的置换。在第二名患者中，编码BTK的核酸具有胸腺嘧啶(t)-1634至腺嘌呤(a)-1634的错义突变，导致半胱氨酸-481密码子TGC至AGC(丝氨酸)的置换。在使用依鲁替尼治疗早期取自相同患者的样品未包含这些突变。Cys-481密码子的突变提示肿瘤对由依鲁替尼治疗提供的选择压力的适应性反应。
对于肿瘤学中所有主要的酪氨酸激酶抑制剂，包括伊马替尼(格列卫(Gleevec))，和EGFR抑制剂吉非替尼和埃罗替尼，已经描述了抗性突变的获得。在晚期CML中，66％的患者在使用伊马替尼治疗后复发，并且5％的慢性CML患者在前几年内复发。30-50％的这些复发患者已经获得了靶激酶(ABL)中的抗性突变。这样的患者继续进行包括达沙替尼、尼洛替尼等的其它治疗，但其中许多最终复发，具有新的抗性突变。在肺癌中，埃罗替尼和吉非替尼已经产生了令人印象深刻的和持久的临床效果，但几乎所有人都在12-18个月内由于抗性而变为无效。这些抗性患者中约有50％在靶激酶(EGFR)中具有被称为T790M的突变，该突变改变单个氨基酸。
本文描述了修饰的BTK多肽和编码该多肽的核酸，该多肽含有野生型BTK的第481位半胱氨酸至丝氨酸的氨基酸置换(C481S)。本文还描述了产生本文所述的修饰BTK核酸和多肽的方法。本文还描述了包含本文所述的修饰BTK核酸和多肽的组合物、组合和试剂盒，以及用于检测本文所述的修饰BTK核酸和多肽的试剂。还提供了使用该修饰BTK多肽来鉴别突变BTK相互作用分子(包括BTK抑制剂，包括第二代BTK抑制剂)的方法。本文还描述了作为合成核酸的修饰BTK核酸。本文还描述了作为cDNA分子的修饰BTK核酸。本文还描述了由作为合成核酸的修饰BTK核酸产生的修饰BTK多肽。本文还描述了由作为cDNA分子的修饰BTK核酸产生的修饰BTK多肽。本文还描述了不含BTK基因组DNA的修饰BTK核酸。本文还描述了未甲基化的修饰BTK核酸。本文还描述了不含BTK内含子序列的修饰BTK核酸。本文还描述了包含来自BTK基因组序列的两个或更多个外显子的核苷酸序列的修饰BTK核酸。在一些实施方案中，该修饰BTK核酸包含在与野生型BTK多肽的位置481相对应的位置处编码丝氨酸的核苷酸序列。
如本文所述，对BTK中氨基酸位置481处的突变如C481S的鉴别允许设计和筛选对具有一个或多个抗性突变的突变BTK的抑制有效的抑制剂。这样的抑制剂在临床和治疗性应用中是有用的。在一些实施方案中，该抑制剂可用于治疗癌症，例如血液***癌症，如B细胞恶性肿瘤。
如本文所述，在一些实施方案中，筛选受试者，以用于鉴别在BTK中氨基酸位置481处的突变，例如C481S。在一些实施方案中，对这样的突变的鉴别允许癌症治疗的处方或癌症治疗的改进。在一些实施方案中，对这样的突变的鉴别用来将受试者分类以用于特定疗法，例如，使用抑制突变C481S活性的抑制剂(即，第二代BTK抑制剂)的疗法。在一些实施方案中，对这样的突变的鉴别用来将受试者表征为具有BTK介导的疾病或病况(例如，血液***癌症，如B细胞癌症)的复发高风险。在一些实施方案中，对这样的突变的鉴别用来将受试者表征为缺乏对特定BTK抑制剂(例如共价和/或不可逆BTK抑制剂，如依鲁替尼)的反应性。
如本文实施例中所述，在接受使用BTK抑制剂的疗法的患者中，也鉴别了BCR途径的下游蛋白质中单独的突变。例如，鉴别了PLCγ2和CARD11中的突变。对于PLCγ2，发现了导致在R665和S707处的氨基酸置换(例如，R665W和S707F)的错义突变。对于CARD11，观察到亮氨酸在位置L232处的***(即L232LL)。预测这类突变将导致每种蛋白质的组成型活性。因此，本文提供了筛选此类突变以便为疗法选择患者、监测接受BTK抑制剂疗法的患者以及优化治疗方案如维持疗法的方法。
突变BTK多肽
本文提供了突变BTK多肽。在一些实施方案中，该突变BTK多肽是分离的突变BTK多肽。在一些实施方案中，该分离的突变BTK多肽是非天然的突变BTK多肽。在一些实施方案中，该分离的突变BTK多肽是重组突变BTK多肽。通常，本文提供的突变BTK多肽显示出至少一种BTK活性。例如，该突变BTK多肽通常保留BTK活性，例如，与靶分子的缔合或靶底物的磷酸化(即，激酶活性)。在一些实施方案中，本文提供的突变BTK多肽相对于野生型BTK多肽具有降低的激酶活性。在一些实施方案中，本文提供的突变BTK多肽相对于野生型BTK多肽具有增加的激酶活性。在一些实施方案中，本文提供的突变BTK多肽相对于野生型BTK多肽具有等同的激酶活性。在一些实施方案中，该突变BTK多肽是重组蛋白。在一些实施方案中，该突变BTK多肽是从宿主细胞中纯化的。
在一些实施方案中，该突变BTK多肽含有一个或多个氨基酸置换，该置换赋予对由共价和/或不可逆BTK抑制剂引起的抑制的抗性。在一些实施方案中，该不可逆BTK抑制剂抑制野生型BTK多肽的激酶活性。在一些实施方案中，该突变BTK多肽含有一个或多个氨基酸置换，该置换赋予对由共价和/或不可逆BTK抑制剂引起的抑制的抗性，该BTK抑制剂与SEQ ID NO:1所示野生型BTK的氨基酸位置481处的半胱氨酸共价结合。在一些实施方案中，该突变BTK多肽含有一个或多个氨基酸置换，该置换赋予对由共价和/或不可逆BTK抑制剂引起的抑制的抗性，该BTK抑制剂是依鲁替尼、PCI-45292、PCI-45466、AVL-101、AVL-291、AVL-292或ONO-WG-37。在一些实施方案中，该突变BTK多肽含有一个或多个氨基酸置换，该置换赋予对由共价和/或不可逆BTK抑制剂引起的抑制的抗性，该BTK抑制剂是依鲁替尼。
本文提供了分离的BTK多肽或其具有BTK活性的变体，其在与SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的氨基酸位置481相对应的氨基酸位置处包含修饰，其中该修饰赋予该修饰BTK多肽或变体对使用共价和/或不可逆BTK抑制剂的抑制的抗性。
在一些实施方案中，该修饰包含与SEQ ID NO:1所示的野生型BTK相比在氨基酸位置481处氨基酸的置换或缺失。在一些实施方案中，该修饰包含与SEQ ID NO:1所示的野生型BTK相比第481位氨基酸的置换。在一些实施方案中，该修饰是在BTK多肽的氨基酸位置481处半胱氨酸被置换为选自亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸、甘氨酸、甲硫氨酸、丝氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、脯氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸和谷氨酸的氨基酸。在一些实施方案中，该修饰是在BTK多肽的氨基酸位置481处半胱氨酸被置换为选自丝氨酸、甲硫氨酸或苏氨酸的氨基酸。在一些实施方案中，该修饰是在BTK多肽的氨基酸位置481处半胱氨酸至丝氨酸的置换。在一些实施方案中，该置换是C481S。在一些实施方案中，该修饰包含SEQ ID NO:1所示野生型BTK多肽的氨基酸位置481的缺失。
在一些实施方案中，该突变BTK多肽包含与SEQ ID NO:1所示的野生型BTK相比第481位氨基酸的置换和一个或多个额外的氨基酸置换。在一些实施方案中，该突变BTK多肽包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列或与具有SEQ ID NO:2所示序列的多肽具有至少或至少约60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的变体，其中第481位氨基酸不是半胱氨酸。在一些实施方案中，该突变BTK多肽包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，该突变BTK多肽包括这样一种多肽：其与氨基酸位置481相对应的位置处具有丝氨酸，并且与具有SEQ ID NO:2所示序列的多肽具有65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列同一性。
在一些实施方案中，该突变BTK多肽包含在氨基酸位置481处的修饰和在一个或多个额外氨基酸位置处的修饰。在一些实施方案中，该突变BTK多肽包含在氨基酸位置481处的修饰和在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或更多个氨基酸位置处的修饰。在一些实施方案中，该突变BTK多肽包含在位置481处的修饰和在一个额外的氨基酸位置处的修饰。在一些实施方案中，该突变BTK多肽包含在氨基酸位置481处的丝氨酸和在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或更多个氨基酸位置处的修饰。在一些实施方案中，该突变BTK多肽包含在位置481处的丝氨酸和在一个额外的氨基酸位置处的修饰。在一些实施方案中，在氨基酸位置481处的修饰是置换C481S。
在一些实施方案中，该突变BTK多肽包含SEQ ID NO:2所示的突变BTK多肽的一部分。在一些实施方案中，该部分显示出BTK多肽的活性。在一些实施方案中，该突变BTK多肽包含BTK多肽的激酶结构域，其在SEQ ID NO:2所示的突变BTK多肽的氨基酸位置481处包含修饰。
在一些实施方案中，该突变BTK多肽包含在位置481处的修饰以及选自在例如下列文献中描述的BTK修饰的修饰：Vihinen等人(1999)Hum.Mutat.13:280-285，de Weer等人Hum.Mol.Genet.(1994)3(1):161-166；Pérez de Diego等人(2008)Clin Exp Immunol.152(1):33-8；Kenegane等人(2000)Clin Exp Immunol.120(3):512–517，Li等人(1995)Immunity 2:451-460和Baraldi等人(1999)Structure 7:449-460。在一些实施方案中，氨基酸位置481处的修饰是置换C481S。在一些实施方案中，所述一个或多个额外的修饰选自以下氨基酸位置处的置换：L11、K12、S14、K19、F25、K27、R28、R33、Y39、Y40、E41、I61、V64、R82、Q103、V113、S115、T117、Q127、C154、C155、T184、P189、P190、Y223、W251、R288、L295、G302、R307、D308、V319、Y334、L358、Y361、H362、H364、N365、S366、L369、I370M、R372、L408、G414、Y418、I429、K430、E445、G462、Y476、M477、C502、C506、A508、M509、L512、L518、R520、D521、A523、R525、N526、V535、L542、R544、Y551、F559、R562、W563、E567、S578、W581、A582、F583、M587、E589、S592、G594、Y598、A607、G613、Y617、P619、A622、V626、M630、C633、R641、F644、L647、L652、V1065和A1185。在一些实施方案中，所述一个或多个额外的修饰选自L11P、K12R、S14F、K19E、F25S、K27R、R28H、R28C、R28P、T33P、Y39S、Y40C、Y40N、E41K、I61N、V64F、V64D、R82K、Q103QSFSSVR、V113D、S115F、T117P、Q127H、C154S、C155G、T184P、P189A、Y223F、W251L、R288W、R288Q、L295P、G302E、R307K、R307G、R307T、D308E、V319A、Y334S、L358F、Y361C、H362Q、H364P、N365Y、S366F、L369F、I370M、R372G、L408P、G414R、Y418H、I429N、K430E、E445D、G462D、G462V、Y476D、M477R、C502F、C502W、C506Y、C506R、A508D、M509I、M509V、L512P、L512Q、L518R、R520Q、D521G、D521H、D521N、A523E、R525G、R525P、R525Q、N526K、V535F、L542P、R544G、R544K、Y551F、F559S、R562W、R562P、W563L、E567K、S578Y、W581R、A582V、F583S、M587L、E589D、E589K、E589G、S592P、G594E、Y598C、A607D、G613D、Y617E、P619A、P619S、A622P、V626G、M630I、M630K、M630T、C633Y、R641C、F644L、F644S、L647P、L652P、V1065I和A1185V。
在一些实施方案中，该突变BTK多肽包含SEQ ID NO:2所示的突变BTK多肽的一部分。在一些实施方案中，该部分显示出BTK多肽的活性。例如，在一些实施方案中，该部分显示出激酶活性。在一些实施方案中，该突变BTK多肽包含BTK多肽的激酶结构域，其在SEQ IDNO:2所示的突变BTK多肽的氨基酸位置481处包含修饰。在一些实施方案中，该突变BTK多肽基本上由BTK多肽的激酶结构域组成，其在SEQ ID NO:2所示的突变BTK多肽的氨基酸位置481处包含修饰。在一些实施方案中，该突变BTK多肽包含SEQ ID NO:2所示的突变BTK多肽从大约氨基酸位置397至大约氨基酸位置652的氨基酸序列。在一些实施方案中，该突变BTK多肽包含SEQ ID NO:2所示的突变BTK多肽从大约氨基酸位置402至大约氨基酸位置652的氨基酸序列。
在一些实施方案中，BTK多肽是包含连接的BTK多肽的激酶结构域和异源多肽的融合蛋白，该BTK多肽在SEQ ID NO:1所示的野生型BTK多肽的氨基酸位置481处包含修饰。在一些实施方案中，在氨基酸位置481处的修饰是氨基酸置换C481S。产生融合蛋白的方法是本领域中已知的，并且包括标准重组DNA技术。例如，在一些实施方案中，按照常规技术将编码不同多肽序列的DNA片段符合读框地连接在一起，该技术例如是通过使用平端或交错末端进行连接，限制酶消化以提供合适的末端，根据情况对粘端的补平，碱性磷酸酶处理以避免不希望的连接，以及酶促连接。在一些实施方案中，融合基因可通过包括自动化DNA合成仪在内的常规技术合成。在一些实施方案中，基因片段的PCR扩增可使用锚定引物来进行，该引物在两个连续基因片段之间产生互补的突出端，其随后可退火并再扩增以产生嵌合基因序列(参见，例如，CurrentProtocols in Molecular Biology,Ausubel等人编.John Wiley&Sons:1992)。在一些实施方案中，编码融合部分(例如，GST多肽)的表达载体是可商购获得的。可将编码修饰BTK多肽的核酸克隆至这样的表达载体内，以使得该融合部分与该修饰BTK多肽符合读框地连接。
在一些实施方案中，在SEQ ID NO:1所示的野生型BTK多肽的氨基酸位置481处包含修饰的BTK多肽连接至肽标签。在一些实施方案中，该肽标签是被标签特异性抗体识别的表位标签。在一些实施方案中，该标签是表位标签，例如但不限于c-myc、V-5、血凝素(HA)、FLAG标签。在一些实施方案中，该标签是亲和标签，例如但不限于生物素、strep-标签、壳多糖结合蛋白质(CBP)、麦芽糖结合蛋白质(MBP)、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)或聚(His)标签。在一些实施方案中，在SEQ ID NO:1所示的野生型BTK多肽的氨基酸位置481处包含修饰的BTK多肽连接至可检测蛋白质或部分，例如发光、化学发光、生物发光或荧光蛋白或部分。在一些实施方案中，该荧光蛋白是绿色(GFP)、红色(RFP)、青色(CFP)、黄色(YFP)或蓝色(BFP)荧光蛋白。在一些实施方案中，在SEQ ID NO:1所示的野生型BTK多肽的氨基酸位置481处包含修饰的BTK多肽连接至酶，例如，萤光素酶或β-半乳糖苷酶。
在一些实施方案中，本文提供了包含本文提供的突变BTK多肽的阵列。在一些实施方案中，该突变BTK多肽与微芯片结合。在一些实施方案中，该突变BTK多肽直接与微芯片结合。在一些实施方案中，该突变BTK多肽通过连接体间接地与微芯片结合。在一些实施方案中，本文提供了包含本文提供的突变BTK多肽的阵列。
编码突变BTK多肽的核酸
本文提供了编码突变BTK多肽的核酸。本文提供了编码本文所述的任何突变BTK多肽的核酸。推断编码特定多肽的核酸的方法是本领域已知的，并且包括标准分子生物学技术。提供了编码本文提供的突变BTK多肽的示例性核酸。应当理解，由于遗传密码的简并性，存在编码同一多肽的多个变异核酸。编码本文提供的突变BTK多肽的核酸涵盖这类变体。在一些实施方案中，该突变BTK核酸是合成的核酸。在一些实施方案中，该突变BTK核酸是cDNA分子。在一些实施方案中，该突变BTK核酸不包含基因组DNA。在一些实施方案中，该突变BTK核酸是未甲基化的。在一些实施方案中，该突变BTK核酸不包含BTK基因组内含子序列。在一些实施方案中，该突变BTK核酸包含来自BTK基因组序列的两个或更多个外显子的核苷酸序列，包括包含编码BTK多肽的位置481的密码子序列的核酸。在一些实施方案中，该突变BTK核酸包含在与野生型BTK多肽的位置481相对应的位置处编码丝氨酸的核苷酸序列。
在一些实施方案中，编码本文提供的修饰BTK多肽的核酸是DNA或RNA分子。在一些实施方案中，编码突变BTK多肽的核酸包含修饰，其中所编码的多肽在与SEQ ID NO:1所示的野生型BTK多肽的氨基酸位置481相对应的位置处包含氨基酸半胱氨酸的置换。在一些实施方案中，该核酸包含SEQ ID NO:3所示的核酸序列，其中编码第481位氨基酸的核酸密码子被修饰，由此该密码子不编码半胱氨酸，或者该核酸包含与具有SEQ ID NO:3所示序列的多肽具有至少或至少约60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的变体，其中编码第481位氨基酸的核酸密码子不编码半胱氨酸。
在一些实施方案中，该核酸修饰是编码BTK多肽的一个或多个密码子的错义突变或缺失。在一些实施方案中，该修饰是改变在BTK多肽的氨基酸位置481处编码半胱氨酸的核酸密码子的错义突变。在一些实施方案中，在BTK多肽的氨基酸位置481处编码半胱氨酸的核酸密码子是TGC或TGT。在一些实施方案中，在BTK多肽的氨基酸位置481处编码半胱氨酸的核酸密码子是TGC。在一些实施方案中，在BTK多肽的氨基酸位置481处编码半胱氨酸的核酸密码子是TGT。在一些实施方案中，该修饰将在BTK多肽的氨基酸位置481处编码半胱氨酸的核酸密码子从TGC改变为编码丝氨酸的核酸密码子。在一些实施方案中，该修饰将在BTK多肽的氨基酸位置481处编码半胱氨酸的核酸密码子从TGT改变为编码丝氨酸的核酸密码子。在一些实施方案中，编码丝氨酸的核酸密码子选自TCT、TCC、TCA、TCG、AGT或AGC。
在一些实施方案中，该修饰是在SEQ ID NO:3所示核酸中的核酸位置1634处包含胸腺嘧啶(t)至腺嘌呤(a)的置换的错义突变。在一些实施方案中，该修饰将在BTK多肽的氨基酸位置481处编码半胱氨酸的核酸密码子从TGC改变为AGC(丝氨酸)。在一些实施方案中，编码突变BTK多肽的核酸包含SEQ ID NO:7或22所示的核苷酸序列。
在一些实施方案中，该修饰是在SEQ ID NO:3所示核酸中的核酸位置1635处包含鸟嘌呤(g)至胞嘧啶(c)的置换的错义突变。在一些实施方案中，该修饰将在BTK多肽的氨基酸位置481处编码半胱氨酸的核酸密码子从TGC改变为TCC(丝氨酸)。在一些实施方案中，编码突变BTK多肽的核酸包含SEQ ID NO:8或23所示的核苷酸序列。
在一些实施方案中，编码突变BTK多肽的核酸包含与具有SEQ IDNO:7或22所示核苷酸序列的核酸具有65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％核苷酸序列同一性的核酸，其中编码的突变BTK多肽相对于野生型BTK多肽在与氨基酸位置481相对应的位置处包含修饰。在一些实施方案中，编码突变BTK多肽的核酸包含与具有SEQ ID NO:8或23所示核苷酸序列的核酸具有65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％核苷酸序列同一性的核酸，其中编码的突变BTK多肽相对于野生型BTK多肽在与氨基酸位置481相对应的位置处包含修饰。在一些实施方案中，编码突变BTK多肽的核酸包含与具有SEQ ID NO:7或22所示核苷酸序列的核酸具有65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％核苷酸序列同一性的核酸，其中编码的突变BTK多肽在与氨基酸位置481相对应的位置处不包含半胱氨酸。在一些实施方案中，编码突变BTK多肽的核酸包含与具有SEQ ID NO:8或23所示核苷酸序列的核酸具有65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％核苷酸序列同一性的核酸，其中编码的突变BTK多肽在与氨基酸位置481相对应的位置处不包含半胱氨酸。在一些实施方案中，编码突变BTK多肽的核酸包含与具有SEQ ID NO:7或22所示核苷酸序列的核酸具有65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％核苷酸序列同一性的核酸，其中编码的突变BTK在与氨基酸位置481相对应的位置处包含丝氨酸。在一些实施方案中，编码突变BTK多肽的核酸包含与具有SEQ ID NO:8或23所示核苷酸序列的核酸具有65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％核苷酸序列同一性的核酸，其中编码的突变BTK在与氨基酸位置481相对应的位置处包含丝氨酸。
在一些实施方案中，本文提供的编码突变BTK多肽的核酸是分离的核酸。在一些实施方案中，本文提供的编码突变BTK多肽的核酸是DNA分子。在一些实施方案中，本文提供的编码突变BTK多肽的核酸是cDNA分子。在一些实施方案中，本文提供的编码突变BTK多肽的核酸是RNA分子。在一些实施方案中，本文提供的编码突变BTK多肽的核酸是抑制性RNA分子(即RNAi)。在一些实施方案中，本文提供的核酸是与编码突变BTK多肽的核酸互补或结合的核酸分子。
在一些实施方案中，本文提供的编码突变BTK多肽的核酸编码包含氨基酸位置481的本文提供的突变BTK多肽的一部分。在一些实施方案中，该密码子编码不是半胱氨酸的氨基酸。在一些实施方案中，该密码子编码是丝氨酸的氨基酸。在一些实施方案中，本文提供的编码突变BTK多肽的核酸编码本文提供的突变BTK多肽的一个或多个结构域。在一些实施方案中，本文提供的编码突变BTK多肽的核酸编码本文提供的突变BTK多肽的激酶结构域。
在一些实施方案中，本文提供的编码突变BTK多肽或其一部分的核酸含有编码不是半胱氨酸的第481位氨基酸的核酸。在一些实施方案中，本文提供的编码突变BTK多肽或其一部分的核酸含有在氨基酸位置481处编码丝氨酸的核酸。
在一些实施方案中，本文提供的核酸是编码突变BTK多肽的一部分的寡核苷酸。在一些实施方案中，本文提供的核酸是编码突变BTK多肽的一部分的寡核苷酸，该部分包含编码与氨基酸位置481相对应的氨基酸的核苷酸密码子。在一些实施方案中，该密码子编码不是半胱氨酸的氨基酸。在一些实施方案中，该密码子编码是丝氨酸的氨基酸。
在一些实施方案中，本文提供的核酸是包含编码本文提供的修饰BTK多肽的核酸分子的载体。在一些实施方案中，本文提供的核酸是包含编码本文提供的突变BTK多肽的核酸的载体，它是一种表达载体。在一些实施方案中，编码本文提供的突变BTK多肽的核酸可操作地连接至启动子。在一些实施方案中，该启动子是组成型或诱导型启动子。在一些实施方案中，本文提供了一种宿主细胞，其包含编码本文提供的修饰BTK多肽的载体或核酸分子。在一些实施方案中，该细胞是原核细胞或真核细胞。本文还提供了由该宿主细胞表达的突变BTK多肽。
在一些实施方案中，该载体是病毒载体或质粒载体。在一些实施方案中，该病毒载体是DNA或RNA病毒载体。示例性的病毒载体包括但不限于痘苗、腺病毒、腺伴随病毒(AAV)、逆转录病毒或疱疹病毒载体。
在一些实施方案中，本文提供了一种阵列，其包含编码本文提供的任何突变BTK多肽的核酸。在一些实施方案中，该突变BTK核酸与微芯片结合。在一些实施方案中，该突变BTK多肽直接与微芯片结合。在一些实施方案中，该突变BTK多肽通过连接体间接地与微芯片结合。在一些实施方案中，本文提供了一种微芯片阵列，其包含编码本文提供的任何突变BTK多肽的核酸。
核酸和多肽的产生
在一些实施方案中，编码本文提供的突变BTK多肽的分离的核酸分子是通过标准重组方法产生的。在一些实施方案中，编码本文提供的突变BTK多肽的分离的核酸分子是通过从基因组DNA扩增突变BTK序列而产生的。在一些实施方案中，编码本文提供的突变BTK多肽的分离的核酸分子使用BTK序列特异性引物通过聚合酶链反应产生。在一些实施方案中，编码突变BTK多肽的分离的核酸分子
在一些实施方案中，将编码本文提供的突变BTK多肽的分离的核酸分子***表达载体中，并在宿主细胞或非细胞提取物中表达。在一些实施方案中，编码本文提供的突变BTK多肽的分离的核酸分子可操作地连接至用于在细胞或非细胞提取物中表达编码多肽的启动子。在一些实施方案中，该启动子是组成型启动子。在一些实施方案中，该启动子是诱导型启动子。
在一些实施方案中，编码本文提供的突变BTK多肽的核酸分子对细胞而言是“外源的”，这意味着其对于导入载体的细胞而言是外来的，或者该序列与细胞中的序列是同源的，但在宿主细胞核酸内通常未发现该序列的位置处。载体包括质粒、粘粒、病毒(噬菌体、动物病毒和植物病毒)以及人工染色体(例如，YAC)。本领域技术人员将会很好地装备以通过标准重组技术构建载体，这描述于Sambrook等人,1989和Ausubel等人,1996中，二者均通过引用并入本文。
在细胞中表达蛋白质的方法是本领域中公知的，并且包括，例如，在诸如动物和植物细胞的细胞中的表达。用于表达本文提供的突变BTK多肽的示例性的动物细胞包括但不限于细菌、酵母、昆虫细胞、两栖动物和哺乳动物细胞，例如，人、灵长类动物、啮齿类动物、牛和绵羊细胞。在一些实施方案中，将编码突变BTK的核酸整合到宿主细胞的基因组中。
在一些实施方案中，用于表达本文提供的突变BTK多肽的方法包括培养包含编码突变BTK多肽的表达载体的宿主细胞，使得由细胞产生该突变BTK多肽。在一些方法中，将编码突变多肽的核酸连接至编码信号序列的核酸，使得该信号序列被表达为与突变BTK多肽的融合肽。在一些实施方案中，该信号序列允许由宿主细胞分泌突变BTK多肽。
在一些实施方案中，突变BTK多肽分离自表达突变多肽的宿主细胞。在一些实施方案中，从宿主细胞制备提取物，并且通过纯化方法分离突变BTK多肽，该方法例如是但不限于色谱法或使用BTK多肽特异性的或尤其是突变BTK多肽特异性的抗体的免疫亲和性。
抗体
本文提供了分离的抗体，它与在氨基酸位置481处具有修饰的修饰BTK多肽结合，其中该抗体不与具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的野生型BTK多肽结合或以较低亲和力与之结合。在一些实施方案中，该修饰是在BTK多肽的氨基酸位置481处半胱氨酸至丝氨酸的置换。
在一些实施方案中，使用特异性识别突变BTK多肽但不识别野生型BTK多肽的抗体检测本文提供的突变BTK多肽。在一些实施方案中，用特异性识别在氨基酸位置481处具有丝氨酸的突变BTK多肽但不识别野生型BTK多肽的抗体检测本文提供的突变BTK多肽。在一些实施方案中，抗体针对于本文提供的突变BTK多肽的一个或多个等位基因形式。使用特异性蛋白质或寡肽作为抗原来产生特异性识别肽或蛋白质上表位的抗体的技术是公知的。在一个实施方案中，靶基因的所需等位基因形式的DNA序列通过***克隆到适当的表达载体中，并在原核或真核宿主细胞中翻译为蛋白质。回收该蛋白质，并用作抗原来引发特异性抗体的产生。在另一个实施方案中，靶基因的所需等位基因形式的DNA通过PCR技术扩增，随后在体外翻译为蛋白质，该蛋白质将用作抗原来引发特异性抗体的产生。在另一个实施方案中，使用替代等位基因的DNA序列作为基础用于生成代表等位基因的氨基酸序列的合成肽，该合成肽用作抗原来引发特异性抗体的产生。
在一些实施方案中，抗体通过标准单克隆抗体技术生成，或者通过基于重组的表达***生成。总的参见，Abbas,Lichtman和Pober,Cellular and Molecular Immunology,W.B.Saunders Co.(1991)。术语“抗体”意在包括完整抗体分子以及抗体片段或衍生物，如Fab和F(ab')2，它们能够特异性结合抗原。这样产生的抗体仅优先结合以等位基因形式产生的突变蛋白，其用作抗原来产生抗体。生成等位基因特异性抗体的方法也在美国专利号6,200,754和美国专利号6,054,273中描述，其完整内容通过引用而并入。
在一些实施方案中，本文提供的抗体是人源化抗体。“人源化抗体”是指一种类型的工程抗体，其具有来源于非人供体免疫球蛋白的CDR，以及来源于一种或多种人免疫球蛋白的该分子的其余免疫球蛋白衍生部分。在一些实施方案中，改变构架支持残基以保持结合亲和力(参见，例如，Queen等人Proc.Natl.Acad Sci USA,86:10029-10032(1989)，Hodgson等人Bio/Technology,9:421(1991))。在一些实施方案中，根据与供体抗体的核苷酸和氨基酸的同源性，合适的人接受体抗体选自常规的数据库，例如，数据库、Los Alamos数据库和Swiss Protein数据库。在一些实施方案中，以与供体抗体的构架区的同源性(基于氨基酸)为特征的人抗体适合于提供重链恒定区和/或用于***供体CDR的重链可变构架区。在一些实施方案中，能够提供轻链恒定或可变构架区的合适的接受体抗体以类似的方式选择。在一些实施方案中，接受体抗体重链和轻链起源于同一接受体抗体。在一些实施方案中，接受体抗体重链和轻链起源于不同的接受体抗体。现有技术描述了数种产生这样的人源化抗体的方式—参见，例如，EP-A-0239400和EP-A-054951。
在一些实施方案中，利用本领域已知的技术，使用对本文提供的突变BTK多肽具有特异性的抗体来检测本文提供的突变BTK多肽在样品中的存在，该样品例如是测定样品、细胞样品、细胞提取物、生物样品或患者样品。这些技术包括，例如，Western印迹法、免疫组织化学、间接免疫荧光和抗体微阵列。在一些实施方案中，特异性识别突变BTK多肽的抗体是第二代BTK抑制剂。在一些实施方案中，特异性识别突变BTK多肽的抗体抑制该突变BTK多肽的生物活性的能力可使用本文描述的用于鉴别第二代BTK抑制剂的方法来确定。
用于检测突变BTK多肽和编码突变BTK多肽的核酸的诊断试验
本文提供了涉及检测受试者中的突变BTK多肽或受试者中的编码突变BTK多肽的核酸的诊断方法。在一些实施方案中，受试者患有BTK介导的疾病或病症。在一些实施方案中，受试者患有的BTK介导的疾病或病症是B细胞癌症。在一些实施方案中，该诊断方法用于筛选患有对使用共价和/或不可逆BTK抑制剂的疗法具有抗性的B细胞癌症的受试者，鉴别用于使用共价和/或不可逆BTK抑制剂的治疗的受试者，鉴别可能或不可能对使用共价和/或不可逆BTK抑制剂的治疗有反应的受试者，预测受试者是否可能发展出对使用共价和/或不可逆BTK抑制剂的治疗的抗性，监测接受使用共价和/或不可逆BTK抑制剂的疗法的受试者的疗法，优化接受共价和/或不可逆BTK抑制剂疗法的受试者的疗法，以及它们的组合。在一些实施方案中，该方法包括为使用第二代BTK抑制剂的疗法选择受试者。在一些实施方案中，该方法进一步包括向受试者施用抑制突变BTK的第二代BTK抑制剂。在一些实施方案中，该BTK修饰赋予癌细胞对使用共价和/或不可逆BTK抑制剂的治疗的抗性。
在一些实施方案中，所检测的突变BTK多肽在与SEQ ID NO:1所示的野生型BTK多肽的氨基酸位置481相对应的位置处包含修饰。在一些实施方案中，所检测的突变BTK多肽在与SEQ ID NO:1所示的野生型BTK多肽的氨基酸位置481相对应的位置处包含氨基酸半胱氨酸至丝氨酸的氨基酸置换。在一些实施方案中，具有在氨基酸位置481处包含修饰的突变BTK多肽的受试者对使用共价和/或不可逆BTK抑制剂的抑制具有抗性。在一些实施方案中，具有在氨基酸位置481处包含修饰的突变BTK多肽的受试者对使用共价和/或不可逆BTK抑制剂的抑制具有抗性，该BTK抑制剂是依鲁替尼。在一些实施方案中，具有在氨基酸位置481处包含修饰的突变BTK多肽的受试者对使用共价和/或不可逆BTK抑制剂的抑制具有抗性，该BTK抑制剂与野生型BTK的半胱氨酸481共价结合。在一些实施方案中，具有在氨基酸位置481处包含修饰的突变BTK多肽的受试者对使用共价和/或不可逆BTK抑制剂的抑制具有抗性，该BTK抑制剂是依鲁替尼、PCI-45292、PCI-45466、AVL-101、AVL-291、AVL-292或ONO-WG-37。在一些实施方案中，具有在氨基酸位置481处包含修饰的突变BTK多肽的受试者对使用共价和/或不可逆BTK抑制剂的抑制具有抗性，该BTK抑制剂是依鲁替尼。
在一些实施方案中，提供了确定受试者是否对使用共价和/或不可逆BTK抑制剂的疗法具有较低反应性或可能成为有较低反应性的方法，其包括：(a)检测来自该受试者的含有编码BTK多肽的核酸分子的样品，以确定所编码的BTK多肽是否在与SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的氨基酸位置481相对应的氨基酸位置处被修饰；以及(b)如果该受试者具有该修饰，则将该受试者表征为对使用共价和/或不可逆BTK抑制剂的疗法具有抗性或可能成为有抗性的。在一些实施方案中，步骤(a)离体进行。在一些实施方案中，该方法进一步包括如果该受试者不具有该修饰则继续使用BTK抑制剂的治疗。在一些实施方案中，该方法进一步包括如果该受试者具有该修饰则施用抑制该修饰激酶的第二代BTK抑制剂。在一些实施方案中，该方法进一步包括如果该受试者具有该修饰则施用LYN、SYK、JAK、PI3K、PLCγ、MAPK、MEK或NFκB的抑制剂。在一些实施方案中，该方法进一步包括如果该受试者具有该修饰则施用不与C481结合的BTK的共价抑制剂。在一些实施方案中，该方法进一步包括如果该受试者具有该修饰则施用BTK的可逆抑制剂。在该方法的一些实施方案中，受试者患有癌症。在一些实施方案中，该癌症是血液***癌症。在一些实施方案中，癌症是B细胞恶性肿瘤。本文中提供了示例性的B细胞恶性肿瘤。在一些实施方案中，癌症选自白血病、淋巴瘤或骨髓瘤。在一些实施方案中，该方法进一步包括从受试者获得样品。
在一些实施方案中，提供了将BTK表征为在受试者中对使用共价和/或不可逆BTK抑制剂的抑制具有抗性的方法，其包括：(a)检测来自该受试者的含有编码BTK多肽的核酸分子的样品，以确定所编码的BTK多肽是否在与SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的氨基酸位置481相对应的氨基酸位置处被修饰；以及(b)如果该受试者具有该修饰，则将该BTK表征为对使用共价和/或不可逆BTK抑制剂的抑制具有抗性。在一些实施方案中，步骤(a)离体进行。在一些实施方案中，该方法进一步包括如果该受试者不具有该修饰则继续使用BTK抑制剂的治疗。在一些实施方案中，该方法进一步包括如果该受试者具有该修饰则施用抑制该修饰激酶的第二代BTK抑制剂。在一些实施方案中，该方法进一步包括如果该受试者具有该修饰则施用LYN、SYK、JAK、PI3K、PLCγ、MAPK、MEK或NFκB的抑制剂。在一些实施方案中，该方法进一步包括如果该受试者具有该修饰则施用不与C481结合的BTK的共价抑制剂。在一些实施方案中，该方法进一步包括如果该受试者具有该修饰则施用BTK的可逆抑制剂。在该方法的一些实施方案中，受试者患有癌症。在一些实施方案中，该癌症是血液***癌症。在一些实施方案中，癌症是B细胞恶性肿瘤。本文中提供了示例性的B细胞恶性肿瘤。在一些实施方案中，癌症选自白血病、淋巴瘤或骨髓瘤。在一些实施方案中，该方法进一步包括从受试者获得样品。
在一些实施方案中，提供了监测为了治疗癌症而接受共价和/或不可逆BTK抑制剂的受试者是否已经发展或可能发展出对该疗法的抗性的方法，其包括：(a)检测来自该受试者的含有编码BTK多肽的核酸分子的样品，以确定所编码的BTK多肽是否在与SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的氨基酸位置481相对应的氨基酸位置处被修饰；以及(b)如果该受试者具有该修饰，则将该受试者表征为对使用共价和/或不可逆BTK抑制剂的疗法具有抗性或可能成为有抗性的。在一些实施方案中，步骤(a)离体进行。在一些实施方案中，该方法进一步包括如果该受试者具有该修饰则中断使用该BTK抑制剂的治疗。在一些实施方案中，该方法进一步包括如果该受试者不具有该修饰则继续使用BTK抑制剂的治疗。在一些实施方案中，该方法进一步包括如果该受试者具有该修饰则施用抑制该修饰激酶的第二代BTK抑制剂。在一些实施方案中，该方法进一步包括如果该受试者具有该修饰则施用LYN、SYK、JAK、PI3K、PLCγ、MAPK、MEK或NFκB的抑制剂。在一些实施方案中，该方法进一步包括如果该受试者具有该修饰则施用不与C481结合的BTK的共价抑制剂。在一些实施方案中，该方法进一步包括如果该受试者具有该修饰则施用BTK的可逆抑制剂。在该方法的一些实施方案中，受试者患有癌症。在一些实施方案中，该癌症是血液***癌症。在一些实施方案中，癌症是B细胞恶性肿瘤。本文中提供了示例性的B细胞恶性肿瘤。在一些实施方案中，癌症选自白血病、淋巴瘤或骨髓瘤。在一些实施方案中，该方法进一步包括从受试者获得样品。
在一些实施方案中，提供了优化为了治疗癌症而接受共价和/或不可逆BTK抑制剂的受试者的疗法的方法，其包括：(a)检测来自该受试者的含有编码BTK多肽的核酸分子的样品，以确定所编码的BTK多肽是否在与SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的氨基酸位置481相对应的氨基酸位置处被修饰；以及(b)如果该受试者具有该修饰则中断使用不可逆BTK抑制剂的治疗，或者如果该受试者不具有该修饰则继续使用不可逆BTK抑制剂的治疗。在一些实施方案中，该方法进一步包括如果该受试者具有该修饰则施用抑制该修饰激酶的第二代BTK抑制剂。在一些实施方案中，步骤(a)离体进行。在一些实施方案中，该方法进一步包括如果该受试者具有该修饰则施用LYN、SYK、JAK、PI3K、PLCγ、MAPK、MEK或NFκB的抑制剂。在一些实施方案中，该方法进一步包括如果该受试者具有该修饰则施用不与C481结合的BTK的共价抑制剂。在一些实施方案中，该方法进一步包括如果该受试者具有该修饰则施用BTK的可逆抑制剂。在该方法的一些实施方案中，受试者患有癌症。在一些实施方案中，该癌症是血液***癌症。在一些实施方案中，癌症是B细胞恶性肿瘤。本文中提供了示例性的B细胞恶性肿瘤。在一些实施方案中，癌症选自白血病、淋巴瘤或骨髓瘤。在一些实施方案中，该方法进一步包括从受试者获得样品。
在一些实施方案中，提供了为使用第二代BTK抑制剂的疗法选择受试者的方法，其包括：(a)检测来自该受试者的含有编码BTK多肽的核酸分子的样品，以确定所编码的BTK多肽是否在与SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的氨基酸位置481相对应的氨基酸位置处被修饰；以及(b)如果该受试者具有该修饰，则将该受试者表征为使用第二代BTK抑制剂的疗法的候选者。在一些实施方案中，该方法进一步包括如果该受试者具有该修饰则施用抑制该修饰激酶的第二代BTK抑制剂。在一些实施方案中，步骤(a)离体进行。在该方法的一些实施方案中，受试者患有癌症。在一些实施方案中，该癌症是血液***癌症。在一些实施方案中，癌症是B细胞恶性肿瘤。本文中提供了示例性的B细胞恶性肿瘤。在一些实施方案中，癌症选自白血病、淋巴瘤或骨髓瘤。在一些实施方案中，该方法进一步包括从受试者获得样品。
在一些实施方案中，该修饰包括BTK多肽中氨基酸位置481处的氨基酸的置换或缺失。在一些实施方案中，该修饰是在BTK多肽的氨基酸位置481处半胱氨酸被置换为选自亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸、甘氨酸、甲硫氨酸、丝氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、脯氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸和谷氨酸的氨基酸。在一些实施方案中，该修饰是在BTK多肽的氨基酸位置481处半胱氨酸被置换为选自丝氨酸、甲硫氨酸或苏氨酸的氨基酸。在一些实施方案中，该修饰是在BTK多肽的氨基酸位置481处半胱氨酸至丝氨酸的置换。在一些实施方案中，该修饰包括编码BTK多肽的氨基酸位置481的核酸的缺失。
在该方法的一些实施方案中，用于该试验的核酸分子是RNA或DNA。在该方法的一些实施方案中，用于该试验的核酸分子是基因组DNA。在该方法的一些实施方案中，用于该试验的核酸分子是总RNA。在该方法的一些实施方案中，用于该试验的核酸分子是mRNA。在该方法的一些实施方案中，该方法进一步包括从RNA样品中分离mRNA。在该方法的一些实施方案中，用于该试验的核酸分子是cDNA。在该方法的一些实施方案中，该方法进一步包括将RNA样品逆转录为cDNA。在该方法的一些实施方案中，该方法包括分析cDNA。在一些实施方案中，该样品是含有循环肿瘤DNA(ctDNA)、RNA(ctRNA)或微小RNA的血浆或血清样品(参见，例如Chan等人(2007)Br J Cancer.96(5):681-5)。
在一些实施方案中，通过核酸扩增方法扩增基因组核酸样品。在一些实施方案中，该核酸扩增方法是聚合酶链反应(PCR)。在一些实施方案中，使用一组BTK基因特异性核苷酸引物扩增基因组核酸样品。在一些实施方案中，这组核苷酸引物位于编码BTK多肽的氨基酸位置481的核酸序列的侧翼。在一些实施方案中，扩增产物是编码BTK多肽的氨基酸位置481的核酸。在一些实施方案中，序列特异性引物偶联至可检测分子，诸如荧光标记、生物发光标记、化学发光标记、放射性标记、酶标记、可检测底物或与第二可检测分子结合的肽或分子。
在本领域中有多种方法可用于检测编码突变BTK多肽的核酸中的单点突变和样品中的BTK多肽的氨基酸改变。检测核酸突变和突变多肽的以下方法意为示例性的，而不是排他性的。
在该方法的一些实施方案中，检测样品包括对编码BTK多肽的氨基酸位置481的核酸进行聚合酶链反应(PCR)扩增。在一些实施方案中，PCR扩增包括使用位于编码BTK多肽的氨基酸位置481的区域侧翼的一对寡核苷酸引物，以及扩增编码含有氨基酸位置481的BTK多肽或其部分的核酸序列。在一些实施方案中，该方法包括对扩增的核酸进行测序。在一些实施方案中，该方法包括使用序列特异性引物对扩增的核酸进行测序。在一些实施方案中，该方法包括将扩增的PCR片段连接到载体内，然后对编码含有氨基酸位置481的BTK多肽或其部分的核酸进行测序。在一些实施方案中，该方法包括使用载体序列特异性引物对载体中的扩增的核酸进行测序。
用于本文提供的方法中的示例性的测序方法是本领域公知的，包括但不限于双脱氧或链终止法、Maxam-Gilbert测序、大规模平行特征测序(或MPSS)、聚合酶群落(polony)测序、焦磷酸测序、Illumina染料测序、SOLiD(或连接测序)测序、离子半导体测序、DNA纳米球测序、HeliScope测序和单分子实时(SMRT)测序。
在该方法的一些实施方案中，检测样品包括焦磷酸测序。焦磷酸测序基于合成测序。其不同于Sanger测序，因为其依赖于核苷酸掺入时焦磷酸释放的检测，而非依赖于使用双脱氧核苷酸的链终止。“合成测序”包括取得待测序的DNA的单链，然后酶促合成其互补链。焦磷酸测序法基于使用另一种化学发光酶检测DNA聚合酶(一种DNA合成酶)的活性。该方法允许通过沿DNA单链合成互补链、一次一个碱基对地对DNA单链进行测序，并且检测在每一步中实际加入哪种碱基。模板DNA是固定的，并且连续加入A、C、G和T核苷酸的溶液，并从反应中除去。仅当核苷酸溶液与模板的第一个非配对碱基互补时才产生光。产生化学发光信号的溶液的顺序允许对模板序列的测定。该方法能够测量混合群体中的多等位基因突变，能够在白血病细胞的异质群体中检测突变。
在该方法的一些实施方案中，检测样品包括使核酸与序列特异性核酸探针接触，其中该序列特异性核酸探针：(a)与编码在氨基酸位置481处被修饰的修饰BTK的核酸结合；且(b)不与编码在氨基酸位置481处具有半胱氨酸的野生型BTK的核酸结合。在一些实施方案中，检测样品包括(a)使样品与突变BTK核酸序列特异性寡核苷酸探针接触，由此如果该突变核酸序列存在于样品中，则形成探针-DNA复合物，以及(b)检测该探针-DNA复合物。在一些实施方案中，寡核苷酸探针对在与BTK多肽的氨基酸位置481相对应的位置处编码丝氨酸的核酸是特异性的。在一些实施方案中，将序列特异性探针偶联至可检测分子，诸如荧光标记、生物发光标记、化学发光标记、放射性标记、酶标记、可检测底物或与第二可检测分子结合的肽或分子。
在该方法的一些实施方案中，检测包括使用等位基因特异性PCR。在一些实施方案中，单核苷酸改变是可以通过使用基于PCR的切割扩增多态性序列(CAPS)标记物的PCR检测的，该标记物在突变序列中创建限制性位点(Michaels等人(1998)Plant J.14(3):381-5)或附接于可检测部分(诸如但不限于荧光团)的序列特异性发夹探针(Mhlanga和Malmberg(2001)Methods 25:463-471)。在一些实施方案中，序列特异性探针偶联至可检测分子，诸如荧光标记、生物发光标记、化学发光标记、放射性标记、酶标记、可检测底物或与第二可检测分子结合的肽或分子。在一些实施方案中，寡核苷酸探针对在与BTK多肽的氨基酸481相对应的位置处编码丝氨酸的核酸是特异性的。
在一些实施方案中，通过BEAMing(珠子、扩增、乳液、磁性)PCR测序法评估编码突变BTK的DNA(参见，例如Li等人(2006)NatMethods.3(2):95-7；Li等人(2006)Nat Methods.3(7):551-9；和Diehl等人(2008)Nat Med.14(9):985–990)。BEAMing是这样一种技术：其中单个DNA分子附接于油包水型乳液中的磁珠上，然后经历区室化的PCR扩增。随后通过与针对突变或野生型BTK的荧光等位基因特异性探针的杂交来确定与珠子结合的DNA的突变状态。然后使用流式细胞术定量存在于血浆或血清中的突变DNA的水平(参见例如Higgins等人(2012)ClinCancer Res 18:3462-3469)。
在一些实施方案中，检测样品包括变性高效液相色谱法(D-HPLC)。D-HPLC依赖于柱基质内异源双链/同源双链DNA种类的差异保留动力学，该柱基质被设计用于根据针对电解质梯度的电荷密度来分离DNA片段。(参见例如Frueh等人(2003)Clin Chem Lab Med.41(4):452-61)。
在一些实施方案中，检测样品包括纳米流体力学，包括使用NanoPro来确定在氨基酸位置半胱氨酸481处与不可逆BTK抑制剂共价结合的野生型BTK多肽和不与不可逆BTK抑制剂共价结合的突变C481S BTK多肽的pI差异。NanoPro是一种能够基于等电点的小差异来分离蛋白质的仪器。与未偶联的突变BTK相比，具有不可逆BTK抑制剂的半胱氨酸481的共价修饰将改变其等电点，这用于检测与BTK结合的药物。
在一些实施方案中，检测样品包括使用微阵列。在一些实施方案中，使用寡核苷酸阵列评估编码突变BTK的DNA的存在(参见例如Hastia等人(1999)J Med Genet.36(10):730-6)。在一些实施方案中，寡核苷酸阵列包含于微芯片上。在一些实施方案中，单核苷酸改变可使用微芯片检测。在一些实施方案中，编码本文提供的突变BTK多肽或其部分的核酸含有编码不是半胱氨酸的第481位氨基酸的核酸。在一些实施方案中，编码本文所提供的突变BTK多肽或其部分的核酸含有在氨基酸位置481处编码半胱氨酸的核酸。
在该方法的一些实施方案中，用于检测突变BTK的样品是含有BTK多肽的蛋白质样品。在这样的实例中，检测包括使用突变BTK多肽特异性的抗体检测该突变。在一些实施方案中，检测突变BTK多肽的方法包括从受试者提供样品，其中该样品包含BTK多肽，并且通过使样品与对突变BTK多肽结合具有特异性、且不与野生型BTK多肽结合或以降低的亲和力与之结合的抗体接触，来检测样品中突变BTK多肽的存在，其中突变BTK多肽的存在产生抗体-突变BTK多肽复合物。在一些实施方案中，该方法进一步包括检测该抗体-突变BTK多肽复合物。在一些实施方案中，该方法进一步包括使用检测试剂检测该抗体-突变BTK多肽复合物。在一些实施方案中，将突变BTK特异性抗体偶联到可检测分子，如荧光标记、生物发光标记、化学发光标记、放射性标记、酶标记、可检测底物或者与第二可检测蛋白质(例如第二抗体)结合的肽或分子。在一些实施方案中，通过测定可检测分子来检测突变BTK特异性抗体的结合。在一些实施方案中，通过使用第二(例如抗-IgG)抗体来检测突变BTK特异性抗体的结合。
在该方法的一些实施方案中，受试者患有BTK-介导的疾病或病症。在该方法的一些实施方案中，受试者患有B细胞增生性病症。在该方法的一些实施方案中，受试者患有癌症。在一些实施方案中，癌症是血液***癌症。在一些实施方案中，该癌症是B细胞恶性肿瘤。在一些实施方案中，癌症选自白血病、淋巴瘤或骨髓瘤。在一些实施方案中，该B细胞恶性肿瘤是慢性淋巴细胞白血病(CLL)、小淋巴细胞淋巴瘤(SLL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、活化B细胞弥漫性大B细胞淋巴瘤(ABC-DLBCL)、生发中心弥漫性大B细胞淋巴瘤(GCB DLBCL)、原发性纵隔B细胞淋巴瘤(PMBL)、非霍奇金淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、滤泡淋巴瘤、免疫母细胞大细胞淋巴瘤、前体B淋巴母细胞淋巴瘤、前体B细胞急性淋巴母细胞性白血病、多毛细胞白血病、套细胞淋巴瘤、B细胞幼淋巴细胞白血病、淋巴质浆细胞淋巴瘤/瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、脾边缘区淋巴瘤、浆细胞性骨髓瘤、浆细胞瘤、结外边缘区B细胞淋巴瘤、结边缘区B细胞淋巴瘤、纵隔(胸腺)大B细胞淋巴瘤、血管内大B细胞淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤或淋巴瘤样肉芽肿病。在一些实施方案中，受试者患有实体瘤。
在一些实施方案中，受试者患有实体瘤。在一些实施方案中，受试者患有肉瘤、癌、神经纤维瘤(neurofibromatoma)或淋巴瘤。
在一些实施方案中，受试者患有肺癌、乳腺癌、结肠癌、脑癌、***癌、肝癌、胰腺癌、食道癌、肾癌、胃癌、甲状腺癌、膀胱癌、子宫癌、***或卵巢癌。在一些实施方案中，受试者患有转移性癌症。在一些实施方案中，受试者患有以下癌症：急性成淋巴细胞性白血病、急性淋巴母细胞性白血病、急性髓样白血病、急性早幼粒细胞白血病、腺癌、腺瘤、肾上腺癌、肾上腺皮质癌、AIDS相关的癌症、AIDS相关的淋巴瘤、***癌、阑尾癌、星形细胞瘤、基底细胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、骨肉瘤/恶性纤维组织细胞瘤、脑干胶质瘤、脑癌、癌、小脑星形细胞瘤、大脑星形细胞瘤/恶性神经胶质瘤、室管膜瘤、髓母细胞瘤、幕上原发性神经外胚层瘤、视途径或下丘脑神经胶质瘤、乳腺癌、支气管腺瘤/类癌、伯基特淋巴瘤、类癌瘤、癌、中枢神经***淋巴瘤、***、慢性淋巴细胞白血病、慢性髓性白血病、慢性脊髓增生性病症、结肠癌、皮肤T细胞淋巴瘤、***增生性小圆细胞肿瘤、子宫内膜癌、室管膜瘤、表皮样癌、食道癌、尤因肉瘤(Ewing's sarcoma)、颅外生殖细胞肿瘤、性腺外生殖细胞肿瘤、肝外胆管癌、眼癌/眼内黑色素瘤、眼癌/视网膜母细胞瘤、胆囊癌、胆结石肿瘤、胃癌、胃肠道类癌瘤、胃肠道间质瘤、巨细胞瘤、多形性胶质母细胞瘤、神经胶质瘤、毛细胞瘤、头颈癌、心脏癌、肝细胞/肝癌、霍奇金淋巴瘤、增生、增生性角膜神经肿瘤、原位癌、下咽癌、肠神经节瘤、胰岛细胞瘤、卡波西肉瘤、肾/肾细胞癌、喉癌、平滑肌瘤肿瘤、唇及口腔癌、脂肪肉瘤、肝癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、淋巴瘤、巨球蛋白血症、恶性类癌、骨的恶性纤维组织细胞瘤、恶性高钙血症、恶性黑色素瘤、马方习性瘤(marfanoidhabitus tumor)、髓样癌、黑色素瘤、梅克尔细胞癌(merkel cell carcinoma)、间皮瘤、转移性皮肤癌、转移性鳞状颈癌、口腔癌、粘膜神经瘤、多发性骨髓瘤、蕈样真菌病、骨髓增生异常综合征、骨髓瘤、骨髓增生性疾病、鼻腔及副鼻窦癌、鼻咽癌、颈癌、神经组织癌、神经母细胞瘤、口癌、口咽癌、骨肉瘤、卵巢癌、卵巢上皮肿瘤、卵巢生殖细胞肿瘤、胰腺癌、甲状旁腺癌、***癌、咽癌、嗜铬细胞瘤、松果体星形细胞瘤、松果体生殖细胞瘤、松果体母细胞瘤、垂体腺瘤、胸膜肺母细胞瘤、真性红细胞增多症、原发性脑肿瘤、***癌、直肠癌、肾细胞瘤、网状细胞肉瘤、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、***瘤、塞扎莱综合征(Sezary syndrome)、皮肤癌、小肠癌、软组织肉瘤、鳞状细胞癌、鳞状颈癌、胃癌、幕上原发性神经外胚层瘤、睾丸癌、喉癌、胸腺瘤、甲状腺癌、局部皮肤损伤、滋养细胞瘤、尿道癌、子宫/子宫内膜癌、子宫肉瘤、***癌、外阴癌、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症或肾母细胞瘤(Wilm's tumor)。
在一些实施方案中，受试者患有复发性癌症。在一些实施方案中，受试者患有难治性癌症。在一些实施方案中，受试者患有难治性癌症，其中该癌症对使用共价和/或不可逆BTK抑制剂的治疗是难治性的。在一些实施方案中，受试者患有难治性癌症，其中该受试者表现出对使用共价和/或不可逆BTK抑制剂的治疗的敏感性降低。在一些实施方案中，受试者患有难治性癌症，其中该受试者表现出对使用共价和/或不可逆BTK抑制剂的特定剂量的敏感性降低。在一些实施方案中，受试者患有难治性癌症，其中该受试者表现出癌症的一种或多种症状的严重程度或出现增加(即，疾病进展)。在一些实施方案中，受试者表现出癌症的消退降低。在一些实施方案中，癌症的消退停止。在一些实施方案中，受试者患有复发性或难治性血液***癌症。在一些实施方案中，受试者患有复发性或难治性B细胞恶性肿瘤。
在一些实施方案中，受试者被怀疑患有血液***癌症或处于患血液***癌症的高风险中。在一些实施方案中，受试者被怀疑患有B细胞恶性肿瘤或处于患B细胞恶性肿瘤的高风险中。在一些实施方案中，受试者被怀疑患有白血病、淋巴瘤或骨髓瘤或处于患白血病、淋巴瘤或骨髓瘤的高风险中。
在一些实施方案中，受试者表现出血液***癌症的一种或多种症状。在一些实施方案中，受试者表现出B细胞恶性肿瘤的一种或多种症状。在一些实施方案中，受试者表现出白血病、淋巴瘤或骨髓瘤的一种或多种症状。在一些实施方案中，受试者表现出一种或多种症状，例如但不限于异常B细胞功能、异常B细胞大小或形状、异常B细胞计数、疲劳、发热、盗汗、频发感染、***增大、苍白、贫血、易出血或挫伤、食欲缺乏、体重减轻、骨或关节痛、头痛和瘀斑。
在一些实施方案中，受试者罹患自身免疫性疾病，例如，炎性肠病、关节炎、狼疮、类风湿性关节炎、银屑病性关节炎、骨关节炎、斯蒂尔病、青少年关节炎、糖尿病、重症肌无力、桥本氏甲状腺炎、Ord甲状腺炎、格雷夫斯氏病、舍格伦综合征、多发性硬化、格林-巴利综合征、急性播散性脑脊髓炎、阿狄森病、斜视眼阵挛-肌阵挛综合征、强直性脊柱炎、抗磷脂抗体综合征、再生障碍性贫血、自身免疫性肝炎、腹腔病、肺出血肾炎综合征、特发性血小板减少性紫癜、视神经炎、硬皮病、原发性胆汁性肝硬化、莱特尔综合征、高安氏动脉炎、颞动脉炎、温型自身免疫性溶血性贫血、韦格纳肉芽肿、银屑病、普秃、贝赛特氏症、慢性疲劳、自主神经机能异常、子宫内膜异位症、间质性膀胱炎、神经性肌强直、硬皮病或外阴痛。
在其它实施方案中，受试者罹患异种免疫病况或疾病，例如，移植物抗宿主病、移植、输血、过敏性反应、***反应、I型超敏反应、变应性结膜炎、变应性鼻炎或特应性皮炎。
在一些实施方案中，受试者患有炎性疾病，例如，哮喘、阑尾炎、睑炎、细支气管炎、支气管炎、滑囊炎、***、胆管炎、胆囊炎、结肠炎、结膜炎、膀胱炎、泪腺炎、皮炎、皮肌炎、脑炎、心内膜炎、子***、肠炎、小肠结肠炎、上髁炎、***、筋膜炎、纤维织炎、胃炎、胃肠炎、肝炎、化脓性汗腺炎、喉炎、乳腺炎、脑膜炎、脊髓炎、心肌炎、肌炎、肾炎、***、***、骨炎、耳炎、胰腺炎、腮腺炎、心包炎、腹膜炎、咽炎、胸膜炎、静脉炎、局限性肺炎、肺炎、直肠炎、***炎、肾盂肾炎、鼻炎、输卵管炎、鼻窦炎、口炎、滑膜炎、肌腱炎、扁桃体炎、葡萄膜炎、***炎、血管炎或外阴炎。
在进一步的实施方案中，受试者罹患血栓栓塞性病症，例如，心肌梗死、心绞痛、血管成形术后再闭塞、血管成形术后再狭窄、主动脉冠状动脉旁路术后再闭塞、主动脉冠状动脉旁路术后再狭窄、中风、短暂缺血、外周动脉闭塞性病症、肺栓塞或深静脉血栓形成。
在一些实施方案中，受试者被施用或已经施用一种或多种用于治疗疾病或病况的治疗剂。在一些实施方案中，受试者被施用或已经施用用于治疗疾病或病况的BTK抑制剂。在一些实施方案中，受试者除了BTK抑制剂外还施用或已经施用一种或多种治疗剂以用于治疗疾病或病况。
在一些实施方案中，受试者被施用或已经施用一种或多种用于治疗癌症的化疗剂。在一些实施方案中，受试者被施用或已经施用一种或多种用于治疗癌症的BTK抑制剂。在一些实施方案中，受试者除了BTK抑制剂外还施用或已经施用一种或多种化疗剂以用于治疗癌症。
在一些实施方案中，用于该方法中的样品获自来自生物体的任何组织或流体。样品包括但不限于全血、分离的骨髓、骨髓抽吸物、胸膜液、腹膜液、中央脊髓液、腹液、胰液、脑脊髓液、脑液、腹水、心包液、尿液、唾液、支气管灌洗液、汗液、泪液、耳流出物、痰、鞘膜液、***、***流出物、乳汁、羊水以及呼吸道、肠道或泌尿生殖道的分泌物。在具体的实施方案中，该样品是肿瘤活检样品。在具体的实施方案中，样品是来自于作为淋巴***或循环***的一部分或与之相关的流体或组织。在一些实施方案中，该样品是血液样品，其为是静脉、动脉、外周、组织、脐带血样品。在具体的实施方案中，该样品是含有一种或多种外周血单核细胞(PBMC)的血细胞样品。在一些实施方案中，该样品含有一种或多种循环肿瘤细胞(CTC)。在一些实施方案中，该样品含有一种或多种散布的肿瘤细胞(DTC，例如在骨髓抽吸物样品中)。
用于从包含在组织和流体样品内的细胞中分离核酸和蛋白质的方法是本领域公知的。在具体的实施方案中，从受试者获得的样品是从来自受试者的肿瘤活检物中所含的细胞分离的。在具体的实施方案中，从受试者获得的样品是从骨髓抽吸物中的细胞分离的。在具体的实施方案中，从受试者获得的样品是从血清样品中所含的细胞中分离的。在具体的实施方案中，从受试者获得的样品是从淋巴样品中所含的细胞中分离的。在具体的实施方案中，该样品含有不包含在细胞中的循环肿瘤核酸。
在一些实施方案中，使用公知的、常规的临床方法，通过任何合适的获取样品的手段从受试者获得样品。用于从受试者获取流体样品的程序是公知的。例如，用于抽取和处理全血和淋巴的程序是公知的，并且可用于获得用于所提供的方法的样品。通常，为了采集血液样品，向样品中添加抗凝剂(例如EDTA，或柠檬酸盐和肝素或CPD(柠檬酸盐、磷酸盐、右旋糖)或类似的物质)以防止血液凝结。在一些实例中，将血液样品采集到含有足以防止血液样品凝结的量的EDTA的采集管中。
在一些实施方案中，样品是组织活检物，并且通过例如针刺活检、CT引导的针刺活检、抽吸活检、内窥镜活检、支气管镜检活检、支气管灌洗、切开活检、切除活检、钻取活检、刮取活检、皮肤活检、骨髓活检以及袢电外科切除术(LEEP)而获得。通常，获得非坏死、无菌活检物或标本，其大于100mg，但可以更小，例如小于100mg，50mg或更少，10mg或更少，或者5mg或更少；或者更大，例如大于100mg，200mg或更多，或者500mg或更多，1g或更多，2g或更多，3g或更多，4g或更多，或者5g或更多。用于试验的待提取的样品大小取决于许多因素，包括但不限于待进行的试验的次数、组织样品的健康状况、癌症的类型以及患者的状况。在一些实施方案中，将组织放置在无菌容器如无菌管或培养板中，并且任选地浸于适当的介质中。通常，用本领域公知的机械手段和/或酶处理将细胞解离成细胞悬浮液。通常，收集细胞，然后进行用于分离核酸的标准程序以供测定。
在一些实施方案中，以固定的间隔从受试者中采集样品，例如，一天、两天、三天、四天、五天、六天、一周、两周、三周、四周、一个月、两个月、三个月、四个月、五个月、六个月、一年、每天、每周、每两个月、每季度、每半年或每年。
在一些实施方案中，在预定的时间或相对于使用一种或多种抗癌剂的治疗以固定的间隔进行样品的采集。在一些实施方案中，施用抗癌剂以用于白血病、淋巴瘤或骨髓瘤的治疗。用于治疗白血病、淋巴瘤或骨髓瘤的示例性的抗癌剂包括但不限于阿霉素(多柔比星)、百克沙(bexxar)、苯达莫司汀、博来霉素、硫酸博来霉素、硼替佐米、达卡巴嗪、德耳塔松(deltasone)、顺铂、环磷酰胺、癌得星(cytoxan)、DTIC达卡巴嗪、达沙替尼、多柔比星、依托泊苷、氟达拉滨、格拉司琼、凯特瑞、来那度胺、甲苯肼(matulane)、双氯乙基甲胺、氮芥(mustargen)、莫司汀、纳治良(natulan)、美罗华(Rituxan)(利妥昔单抗，抗CD20抗体)、VCR、环磷酰胺(neosar)、氮芥(nitrogen mustard)、安可平、昂丹司琼、强体松(orasone)、***、丙卡巴肼、沙利度胺、VP-16、硫酸长春碱(velban)、癌备(velbe)、velsar、凡毕士(VePesid)、长春碱、长春新碱、 、枢复宁(zofran)、干细胞移植、放射疗法或组合疗法，例如，ABVD(阿霉素、博来霉素、长春碱和达卡巴嗪)、ChlvPP(苯丁酸氮芥、长春碱、丙卡巴肼和***龙)、Stanford V(莫司汀、多柔比星、长春碱、长春新碱、博来霉素、依托泊苷和类固醇)、BEACOPP(博来霉素、依托泊苷、多柔比星、环磷酰胺、长春新碱、丙卡巴肼和***龙)、BEAM(卡莫司汀(BiCNU)依托泊苷、阿糖胞苷(Ara-C，胞嘧啶阿糖胞苷)和美法仑)、CHOP(环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和***)、R-CHOP(利妥昔单抗、多柔比星、环磷酰胺、长春新碱和***)、EPOCH(依托泊苷、长春新碱、多柔比星、环磷酰胺和***)、CVP(环磷酰胺、长春新碱和***)、ICE(异环磷酰胺-卡铂-依托泊苷)、R-ACVBP(利妥昔单抗、多柔比星、环磷酰胺、长春地辛、博来霉素和***)、DHAP(***、高剂量阿糖胞苷、(Ara C)、顺铂)、R-DHAP(利妥昔单抗、***、高剂量阿糖胞苷、(Ara C)、顺铂)、ESHAP(依托泊苷(VP-16)、甲基***龙和高剂量阿糖胞苷(Ara C)、顺铂)、CDE(环磷酰胺、多柔比星和依托泊苷)、 (硼替佐米)加(脂质体多柔比星)、(来那度胺)加***以及硼替佐米加***。在一些实施方案中，抗癌剂是氟达拉滨。在一些实施方案中，抗癌剂是苯达莫司汀。在一些实施方案中，抗癌剂是美罗华。在一些实施方案中，抗癌剂是达沙替尼。在一些实施方案中，在治疗之前、期间或之后或在使用抗癌剂的连续治疗之间，在预定的时间或以固定的间隔采集样品。在具体的实例中，在施用抗癌疗法之前从受试者获得样品，然后在治疗进行后以固定的间隔再次获得样品。
在一些实施方案中，在预定的时间或相对于使用共价和/或不可逆BTK抑制剂的治疗以固定的间隔进行样品的采集。例如，在治疗之前、期间或之后或在连续治疗之间，在预定的时间或以固定的间隔采集样品。在具体的实例中，在施用共价和/或不可逆BTK抑制剂之前从受试者获得样品，然后在使用不可逆BTK抑制剂的治疗进行后以固定的间隔再次获得样品。在一些实施方案中，向受试者施用共价和/或不可逆BTK抑制剂和一种或多种额外的抗癌剂。在一些实施方案中，向受试者施用共价和/或不可逆BTK抑制剂和不是不可逆BTK抑制剂的一种或多种额外的抗癌剂。在一些实施方案中，向受试者施用一种或多种不可逆BTK抑制剂。在一些实施方案中，向受试者施用一种或多种与野生型BTK的半胱氨酸481共价结合的不可逆BTK抑制剂。在一些实施方案中，该不可逆BTK抑制剂是依鲁替尼、PCI-45292、PCI-45466、AVL-101、AVL-291、AVL-292或ONO-WG-37。在一些实施方案中，该不可逆BTK抑制剂是依鲁替尼。
在本文所提供的任何方法中使用的额外的BTK抑制剂可见于，例如，美国专利号7,547,689、7,960,396和美国专利公开号US 2009-0197853A1和US 2012-0065201A1，以上全部通过引用整体并入本文。在本文所提供的任何方法中使用的额外的BTK抑制剂也可见于，例如US20100029610、WO09051822、WO10123870、WO09158571、WO11034907、WO12021444、WO11029046、WO08110624、WO10080481、WO10144647、WO10056875、WO05047290、WO06053121、WO06099075、WO08033834、WO08033857、WO08033858、WO09137596、WO10056875、WO10068788、WO10068806、WO10068810、WO11140488、WO12030990、WO12031004、WO2010056875、WO05066156、WO10056875、US20120316148、WO09048307、WO09147190、WO11162515、WO11162515、WO06036941、WO10126960、WO07136790、WO12025186、WO2013010380、WO2013010868、WO2013010869、WO2013008095、WO11152351、WO2013060098、WO2013060098、WO07002325、WO07002433、WO07013896、WO09143024、WO10065898、WO2012158764、WO2012158785、WO2012158795、WO2012158810、WO09053269、WO09156284、WO2012020008、WO2012156334、WO2013024078、WO08057252、WO03081210、WO03087051、US20130059847A1、WO06065946、WO07027594和WO08092199，以上全部通过引用整体并入本文。
在一些实施方案中，将与野生型BTK的半胱氨酸481共价结合的共价和/或不可逆BTK抑制剂与一种或多种可逆BTK抑制剂联合施用给受试者。例如，在一些实施方案中，将与野生型BTK的半胱氨酸481共价结合的共价和/或不可逆BTK抑制剂与不依赖于半胱氨酸481结合的一种或多种可逆BTK抑制剂联合施用给受试者。可逆BTK抑制剂是本领域已知的，并且包括但不限于达沙替尼、PC-005、RN486、PCI-29732或土曲霉酸。在具体的实施方案中，不可逆BTK抑制剂依鲁替尼与可逆BTK抑制剂达沙替尼联合施用。
在一些实施方案中，在第一次施用不可逆BTK抑制剂后1周、2周、3周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月、14个月、16个月、18个月、20个月、22个月、24个月、26个月、28个月、30个月、32个月、34个月、36个月或更长的时间获得样品。在一些实施方案中，在第一次将不可逆BTK抑制剂施用给未曾暴露于不可逆BTK抑制剂的受试者之后1周、2周、3周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月、14个月、16个月、18个月、20个月、22个月、24个月、26个月、28个月、30个月、32个月、34个月、36个月或更长的时间获得样品。在一些实施方案中，在第一次将不可逆BTK抑制剂施用给患有复发性或难治性癌症的受试者之后1周、2周、3周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月、14个月、16个月、18个月、20个月、22个月、24个月、26个月、28个月、30个月、32个月、34个月、36个月或更长的时间获得样品。在一些实施方案中，在使用不可逆BTK抑制剂治疗过程中1、2、3、4、5、6、7、8、9、10次或更多次获得样品。在一些实施方案中，当首次施用时，受试者对使用不可逆BTK抑制剂的治疗有反应。
维持疗法
本文提供了用于患有B细胞增殖性病症的受试者的维持疗法的方法。在一些实施方案中，B细胞增殖性病症是癌症。在一些实施方案中，该癌症是血液***癌症。在一些实施方案中，用于维持疗法的方法包括在初始治疗期使用共价和/或不可逆BTK抑制剂治疗血液***癌症，随后进行维持疗法方案。在一些实施方案中，用于维持疗法的方法包括使用共价和/或不可逆BTK抑制剂治疗血液***癌症为期六个月或更长的一段时间，例如，6个月、7个月、8个月、9个月内、10个月、11个月、12个月、13个月、14个月、15个月、16个月、17个月、18个月、19个月、20个月、21个月、22个月、23个月、24个月、25个月、26个月、27个月、28个月、29个月、30个月、31个月、32个月、33个月、34个月、35个月、3年、4年、5年、6年、7年、8年、9年、10年或更长的时间。在一些实施方案中，不可逆BTK抑制剂与野生型BTK的半胱氨酸481共价结合。在一些实施方案中，不可逆BTK抑制剂选自依鲁替尼、PCI-45292、PCI-45466、AVL-101、AVL-291、AVL-292或ONO-WG-37。在一些实施方案中，不可逆BTK抑制剂是依鲁替尼。
在示例性的方法中，使用治疗有效量的共价和/或不可逆BTK抑制剂治疗患有血液***癌症的受试者，并且以预定的时间间隔监测受试者，以确定受试者是否在编码BTK的内源基因中获得导致在BTK的半胱氨酸481处的修饰的突变。在一些实施方案中，监测包括检测来自受试者的含有编码BTK多肽的核酸分子的样品，以确定所编码的BTK多肽是否在与SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的氨基酸位置481相对应的氨基酸位置处被修饰。在一些实施方案中，该修饰是C481S。在一些实施方案中，样品含有一种或多种癌细胞或ctDNA。在一些实施方案中，在使用不可逆BTK抑制剂治疗之前或在使用不可逆BTK抑制剂治疗早期(例如，约1周至约2个月之后)，从受试者获得含有一种或多种癌细胞或ctDNA的样品，以确定受试者在使用共价和/或不可逆BTK抑制剂治疗之前或早期是否表达野生型BTK。
在一些实施方案中，提供了在患有血液***癌症的患者中进行维持疗法的方法，其包括：(a)向该患者施用维持疗法方案，该方案包括施用治疗有效剂量的共价和/或不可逆BTK抑制剂；以及(b)在所述维持疗法方案的过程中以预定的时间间隔监测该患者，以确定受试者是否在编码BTK的内源基因中具有突变，该突变导致与SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的氨基酸位置481相对应的氨基酸位置处的修饰。在一些实施方案中，监测包括检测来自该受试者的含有编码BTK多肽的核酸分子的样品，以确定所编码的BTK多肽是否在与SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的氨基酸位置481相对应的氨基酸位置处被修饰。在一些实施方案中，该修饰是C481S。在一些实施方案中，该样品含有一种或多种癌细胞或ctDNA。在一些实施方案中，在使用不可逆BTK抑制剂治疗之前或在使用不可逆BTK抑制剂治疗早期(例如，约1周至约2个月之后)从受试者获得含有一种或多种癌细胞或ctDNA的样品，以确定该受试者是否表达野生型BTK。
在一些实施方案中，该方法进一步包括如果该受试者具有该修饰则中断使用该BTK抑制剂的治疗。在一些实施方案中，该方法进一步包括如果该受试者不具有该修饰则继续使用BTK抑制剂的治疗。在一些实施方案中，该方法进一步包括如果该受试者具有该修饰则施用抑制该修饰激酶的第二代BTK抑制剂。在一些实施方案中，该方法进一步包括如果该受试者具有该修饰则施用LYN、SYK、JAK、PI3K、PLCγ、MAPK、MEK或NFκB的抑制剂。在一些实施方案中，该方法进一步包括如果该受试者具有该修饰则施用不与C481结合的BTK的共价抑制剂。在一些实施方案中，该方法进一步包括如果该受试者具有该修饰则施用BTK的可逆抑制剂。
在一些实施方案中，该突变是编码BTK的半胱氨酸481的密码子中的错义突变。在一些实施方案中，该突变是导致在氨基酸位置481处半胱氨酸被置换为另一种氨基酸的错义突变。在一些实施方案中，该突变是导致在氨基酸位置481处半胱氨酸被置换为丝氨酸的错义突变。在一些实施方案中，该突变是导致半胱氨酸-481密码子TGC被置换为TCC(丝氨酸)的鸟嘌呤-1635至胞嘧啶-1635的错义突变。在一些实施方案中，该突变是导致半胱氨酸-481密码子TGC被置换为AGC(丝氨酸)的胸腺嘧啶(t)-1634至腺嘌呤(a)-1634的错义突变。
在一些实施方案中，每个月、每2个月、每3个月、每4个月、每5个月、每6个月、每7个月、每8个月、每9个月、每10个月、每11个月或每年监测受试者，以确定受试者是否在编码BTK的内源基因中获得导致在BTK多肽的半胱氨酸481处的修饰的突变。
在一些实施方案中，血液***癌症是B细胞恶性肿瘤。在一些实施方案中，癌症选自白血病、淋巴瘤或骨髓瘤。在一些实施方案中，该B细胞恶性肿瘤是慢性淋巴细胞白血病(CLL)、小淋巴细胞淋巴瘤(SLL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、活化B细胞弥漫性大B细胞淋巴瘤(ABC-DLBCL)、生发中心弥漫性大B细胞淋巴瘤(GCB DLBCL)、原发性纵隔B细胞淋巴瘤(PMBL)、非霍奇金淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、滤泡淋巴瘤、免疫母细胞大细胞淋巴瘤、前体B淋巴母细胞淋巴瘤、前体B细胞急性淋巴母细胞性白血病、多毛细胞白血病、套细胞淋巴瘤、B细胞幼淋巴细胞白血病、淋巴质浆细胞淋巴瘤/瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、脾边缘区淋巴瘤、浆细胞性骨髓瘤、浆细胞瘤、结外边缘区B细胞淋巴瘤、结边缘区B细胞淋巴瘤、纵隔(胸腺)大B细胞淋巴瘤、血管内大B细胞淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤或淋巴瘤样肉芽肿病。在一些实施方案中，受试者患有实体瘤。在一些实施方案中，该B细胞恶性肿瘤是慢性淋巴细胞白血病(CLL)。
在一些实施方案中，维持疗法包括多个给药周期。在一些实施方案中，给药周期为1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月或更长的时间。在一些实施方案中，给药周期包括在整个周期中施用单一治疗剂量的不可逆BTK抑制剂。在一些实施方案中，给药周期包括在整个周期中两个或更多个不同剂量的不可逆BTK抑制剂。在一些实施方案中，不可逆BTK抑制剂的剂量在连续周期中不同。在一些实施方案中，不可逆BTK抑制剂的剂量在连续周期中增加。在一些实施方案中，不可逆BTK抑制剂的剂量在连续周期中相同。
在一些实施方案中，维持疗法包括施用不可逆BTK抑制剂的每日剂量。在一些实施方案中，所施用的不可逆BTK抑制剂的每日剂量是或大约是约10mg/天至约2000mg/天，例如，约50mg/天至约1500mg/天，例如约100mg/天至约1000mg/天，例如约250mg/天至约850mg/天，例如约300mg/天至约600mg/天。在具体实施方案中，不可逆BTK抑制剂的维持剂量是约840mg/天。在不可逆抑制剂为依鲁替尼的具体实施方案中，维持剂量为约840mg依鲁替尼/天。在具体实施方案中，不可逆BTK抑制剂的维持剂量为约560mg/天。在不可逆抑制剂为依鲁替尼的具体实施方案中，维持剂量为约560mg依鲁替尼/天。在具体实施方案中，维持剂量为约420mg/天。在不可逆抑制剂为依鲁替尼的具体实施方案中，维持剂量为约420mg依鲁替尼/天。在具体实施方案中，不可逆BTK抑制剂的维持剂量为约140mg/天。在不可逆抑制剂为依鲁替尼的具体实施方案中，维持剂量为约140mg依鲁替尼/天。
在一些实施方案中，每天一次、每天两次、每天三次或更频繁地施用不可逆BTK抑制剂。在具体的实施方案中，每天一次施用不可逆BTK抑制剂。在一些实施方案中，每天一次、每天两次、每天三次或更频繁地施用不可逆BTK抑制剂，该不可逆BTK抑制剂是依鲁替尼。在具体的实施方案中，每天一次施用不可逆BTK抑制剂，该不可逆BTK抑制剂是依鲁替尼。
在一些实施方案中，不可逆BTK抑制剂的剂量随时间而逐渐升高。在一些实施方案中，不可逆BTK抑制剂的剂量随时间而逐渐升高，该不可逆BTK抑制剂是依鲁替尼。在一些实施方案中，不可逆BTK抑制剂的剂量在预定的一段时间内从等于或约为1.25mg/kg/天的剂量逐渐升高到等于或约为12.5mg/kg/天的剂量。在一些实施方案中，不可逆BTK抑制剂的剂量在预定的一段时间内从等于或约为1.25mg/kg/天的剂量逐渐升高到等于或约为12.5mg/kg/天的剂量，该不可逆BTK抑制剂是依鲁替尼。在一些实施方案中，预定的时间段是经历1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月、18个月、24个月或更长。
在一些实施方案中，给药周期包括不可逆BTK抑制剂与额外的治疗剂联合施用。在一些实施方案中，额外的治疗剂同时、顺序或间歇地与不可逆BTK抑制剂施用。在一些实施方案中，额外的治疗剂是抗癌剂。在一些实施方案中，额外的治疗剂是用于治疗白血病、淋巴瘤或骨髓瘤的抗癌剂。在本文其它地方提供了与共价和/或不可逆BTK抑制剂联合施用的示例性抗癌剂。在具体的实施方案中，抗癌剂是抗-CD 20抗体(例如美罗华)。在具体的实施方案中，抗癌剂是苯达莫司汀。在一些实施方案中，额外的抗癌剂是可逆BTK抑制剂。在一些实施方案中，额外的抗癌剂是与BTK的结合不依赖于半胱氨酸481的可逆BTK抑制剂。在一些实施方案中，额外的抗癌剂是达沙替尼。
在一些实施方案中，提供了监测为了治疗血液***癌症而接受使用共价和/或不可逆BTK抑制剂的维持疗法的受试者是否已经发展或可能发展出对该疗法的抗性的方法，其包括：(a)检测来自该受试者的含有编码BTK多肽的核酸分子的样品，以确定所编码的BTK多肽是否在与SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的氨基酸位置481相对应的氨基酸位置处被修饰；以及(b)如果该受试者具有该修饰，则将该受试者表征为对使用共价和/或不可逆BTK抑制剂的疗法具有抗性或可能成为有抗性的。在一些实施方案中，步骤(a)离体进行。在一些实施方案中，该方法进一步包括如果该受试者具有该修饰则中断使用该BTK抑制剂的治疗。在一些实施方案中，该方法进一步包括如果该受试者不具有该修饰则继续使用BTK抑制剂的治疗。在一些实施方案中，该方法进一步包括如果该受试者具有该修饰则施用抑制该修饰激酶的第二代BTK抑制剂。在一些实施方案中，该方法进一步包括如果该受试者具有该修饰则施用LYN、SYK、JAK、PI3K、PLCγ、MAPK、MEK或NFκB的抑制剂。在一些实施方案中，该方法进一步包括如果该受试者具有该修饰则施用不与C481结合的BTK的共价抑制剂。在一些实施方案中，该方法进一步包括如果该受试者具有该修饰则施用BTK的可逆抑制剂。在该方法的一些实施方案中，受试者患有癌症。在一些实施方案中，血液***癌症是B细胞恶性肿瘤。本文中提供了示例性的B细胞恶性肿瘤。在一些实施方案中，癌症选自白血病、淋巴瘤或骨髓瘤。在一些实施方案中，该方法进一步包括从受试者获得样品。
在一些实施方案中，提供了优化为了治疗血液***癌症而接受使用共价和/或不可逆BTK抑制剂的维持疗法的受试者的疗法的方法，其包括：(a)检测来自该受试者的含有编码BTK多肽的核酸分子的样品，以确定所编码的BTK多肽是否在与SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的氨基酸位置481相对应的氨基酸位置处被修饰；以及(b)如果该受试者具有该修饰则中断使用共价和/或不可逆BTK抑制剂的治疗，或者如果该受试者不具有该修饰则继续使用共价和/或不可逆BTK抑制剂的治疗。在一些实施方案中，该方法进一步包括如果该受试者具有该修饰则施用抑制该修饰激酶的第二代BTK抑制剂。在一些实施方案中，该方法进一步包括如果该受试者具有该修饰则施用LYN、SYK、JAK、PI3K、PLCγ、MAPK、MEK或NFκB的抑制剂。在一些实施方案中，该方法进一步包括如果该受试者具有该修饰则施用不与C481结合的BTK的共价抑制剂。在一些实施方案中，该方法进一步包括如果该受试者具有该修饰则施用BTK的可逆抑制剂。在一些实施方案中，步骤(a)离体进行。在一些实施方案中，血液***癌症是B细胞恶性肿瘤。本文中提供了示例性的B细胞恶性肿瘤。在一些实施方案中，癌症选自白血病、淋巴瘤或骨髓瘤。在一些实施方案中，该方法进一步包括从受试者获得样品的步骤。
与突变BTK相互作用的分子的鉴别
本文提供了使用突变BTK多肽筛选与突变BTK多肽相互作用的药剂的方法。在一些实施方案中，与突变BTK多肽相互作用的药剂也抑制突变BTK。因此，本文提供了利用突变BTK多肽筛选抑制突变BTK的药剂(即第二代BTK抑制剂)的方法。在一些实施方案中，该方法用于鉴别用于B细胞癌症的治疗的第二代BTK抑制剂。在一些实施方案中，该方法用于鉴别用于治疗抗性癌症(诸如，对使用共价和/或不可逆BTK抑制剂如依鲁替尼的治疗具有抗性的B细胞癌症)的第二代BTK抑制剂。在一些实施方案中，使用提供的方法鉴别的第二代BTK抑制剂还抑制野生型BTK多肽。因此，在一些实施方案中，使用所提供的方法鉴别的第二代BTK抑制剂抑制突变BTK多肽和野生型BTK多肽。在一些实施方案中，第二代BTK抑制剂不抑制野生型BTK多肽的活性。
在一些实施方案中，用于鉴别第二代BTK抑制剂的方法包括(a)提供修饰的BTK，其中修饰的BTK在与SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的氨基酸位置481相对应的氨基酸位置处被修饰；(b)使修饰的BTK与测试化合物接触；以及(c)检测BTK活性的水平，其中活性的降低指示该化合物抑制修饰的BTK。在一些实施方案中，在检测BTK活性水平之前使细胞与测试化合物接触约1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、8小时、10小时、12小时、14个小时、16小时、18小时、20小时、22小时、24小时或更长。
在一些实施方案中，BTK中的修饰是BTK多肽的氨基酸位置481处的氨基酸的置换或缺失。在一些实施方案中，该修饰是在BTK多肽的氨基酸位置481处半胱氨酸被置换为选自亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸、甘氨酸、甲硫氨酸、丝氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、脯氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸和谷氨酸的氨基酸。在一些实施方案中，该修饰是在BTK多肽的氨基酸位置481处半胱氨酸被置换为选自丝氨酸、甲硫氨酸和苏氨酸的氨基酸。在一些实施方案中，该修饰是在BTK多肽的氨基酸位置481处半胱氨酸至丝氨酸的置换。因此，在一些实施方案中，使用所提供的方法鉴别的第二代BTK抑制剂抑制在BTK多肽的氨基酸位置481处具有修饰的突变BTK多肽。在一些实施方案中，使用所提供的方法鉴别的第二代BTK抑制剂抑制在BTK多肽的氨基酸位置481处具有丝氨酸的突变BTK多肽。在一些实施方案中，使用所提供的方法鉴别的第二代BTK抑制剂还抑制野生型BTK多肽。
在一些实施方案中，通过体外激酶试验评估检测BTK活性水平。在一些实施方案中，在激酶试验中使用的底物是PLCγ。在一些实施方案中，在激酶试验中使用的底物是肽底物。在一些实施方案中，当修饰的BTK对使用特定不可逆抑制剂如依鲁替尼的抑制具有抗性时，采用该抑制剂作为比较对照。在一些实施方案中，采用野生型BTK多肽进行比较。
在一些实施方案中，通过测定细胞内的BTK的直接底物的磷酸化水平或BTK激酶级联中磷酸化的靶标而评估BTK活性水平。在一些实施方案中，该细胞是B淋巴细胞、单核细胞或巨噬细胞。在一些实施方案中，该细胞是癌细胞系，诸如淋巴瘤、白血病或骨髓瘤细胞系。在一些实施方案中，该细胞系是MCL、DBCL或滤泡淋巴瘤细胞系。在一些实施方案中，该细胞系是BTK敲除B细胞淋巴瘤细胞系，如DT40BTK敲除细胞系。在一些实施方案中，在测试化合物的存在或不存在下，使用磷特异性抗体检测细胞中特定BTK靶标(如PLCγ、ERK1/2(MAPK)和AKT)的磷酸化水平。在一些实施方案中，在暴露于测试化合物之前、期间或之后，首先刺激细胞以激活BCR信号途径。在一些实施方案中，在暴露于测试化合物之前、期间或之后，将细胞首先用抗-IgM或抗-IgG刺激以激活BCR信号途径。检测磷酸化蛋白质的方法是本领域已知的，并且包括，例如，Western印迹分析或免疫组织化学。
在一些实施方案中，从表达修饰BTK多肽的宿主细胞中纯化修饰BTK多肽。在一些实施方案中，修饰BTK多肽是重组蛋白。在一些实施方案中，纯化的BTK用于测定BTK活性的水平。在一些实施方案中，通过免疫亲和性或色谱法纯化修饰BTK多肽。
在一些实施方案中，在该方法中使用能够用编码修饰BTK多肽的核酸转染且在其中可以监测BTK活性的宿主细胞系。在一些实施方案中，宿主细胞不表达野生型BTK。在一些实施方案中，宿主细胞是内源性野生型BTK表达缺陷的。在一些实施方案中，表达修饰BTK多肽的宿主细胞稳定地表达该修饰BTK多肽。在一些实施方案中，将编码修饰BTK多肽的核酸整合到细胞的基因组中。
在一些实施方案中，宿主细胞是鸡DT40BTK-/-B细胞或人BTK-/-B细胞。在一些实施方案中，该细胞是非B细胞。在一些实施方案中，该细胞是哺乳动物非B细胞。在一些实施方案中，该细胞是CHO细胞或Jurkat T细胞。在一些实施方案中，该细胞是非哺乳动物细胞。在一些实施方案中，该细胞是昆虫细胞、细菌细胞、酵母细胞或植物细胞。
一些实施方案中，使用对使用共价和/或不可逆BTK抑制剂的治疗具有抗性的细胞系评估BTK活性的水平。在一些实施方案中，该细胞系是抗性MCL(例如Mino或Jeko)、DLBCL(例如OCI-Ly1、OCI-Ly2、OCI-Ly3、OCI-Ly4、OCI-Ly6、OCI-Ly7、OCI-Ly10、OCI-Ly18、OCI-Ly19、U2932、HBL-1、RIVA或TMD8)或滤泡淋巴瘤(例如DoHH2、Granta519或HF-1)细胞系，其已通过长期暴露于共价和/或不可逆BTK抑制剂而被选择为抗性。在一些实施方案中，在体外进行选择。在一些实施方案中，在体内、在已经施加癌细胞的动物模型中进行选择。在一些实施方案中，抗性MCL或DLBCL细胞系在氨基酸位置C481处含有BTK的修饰。在一些实施方案中，该修饰是C481S。
针对BTK抑制的细胞功能试验包括在存在或不存在一定浓度范围的候选BTK抑制剂化合物的情况下，测定响应于在细胞系中刺激BTK介导的途径(例如，Ramos细胞中的BCR激活)的一个或多个细胞终点。用于确定对BCR激活的响应的有用终点包括，例如，BTK的自身磷酸化、BTK靶蛋白(例如，PLC-γ)的磷酸化和胞质钙通量。
在一些实施方案中，采用下游转录靶标试验来确定在存在或不存在测试化合物的情况下的BTK活性。在一些实施方案中，该下游转录靶标试验是基于NF-κB的试验。在一些实例中，编码报道蛋白的基因可操作地连接至NF-κB响应性启动子，该启动子对BCR途径信号传导是敏感的并且当BTK受到抑制时被抑制。在一些实施方案中，报道基因编码选自萤光素酶、荧光蛋白、生物发光蛋白或酶的蛋白质。在一些实施方案中，该试验包括含有报道子和突变BTK的宿主细胞。在存在或不存在测试化合物的情况下检测基因表达的水平指示该测试化合物在突变BTK的存在下是否抑制BCR途径。在一些实施方案中，测试化合物直接抑制突变BTK。
用于许多无细胞生化试验(例如激酶试验)和细胞功能试验(例如钙通量)的高通量试验是本领域普通技术人员所熟知的。另外，高通量筛选***是可商购获得的(参见，例如Zymark Corp.,Hopkinton,MA；Air Technical Industries,Mentor,OH；Beckman Instruments,Inc.Fullerton,CA；Precision Systems,Inc.,Natick,MA等)。这些***一般使全部程序自动化，包括所有样品和试剂的吸移、液体分配、计时孵育和在适合该试验的检测器中对微量板的最终读取。自动化***因此允许对大量BTK化合物进行鉴别和表征，而无需过多的劳动。
在一些实施方案中，通过体内试验评估检测BTK活性的水平。在一些实施方案中，在动物模型中评估检测BTK活性的水平。在一些实施方案中，该动物模型是白血病的小鼠模型。这样的动物模型是本领域已知的，并且包括，例如，AML和CLL小鼠模型(参见，例如，Zuber,(2009)Genes and Development 23(7):877-89和Pekarsky等人(2007)J CellBiochem.100(5):1109-18)。在一些实施方案中，该动物模型是表达在Cys 481处被修饰的修饰BTK的转基因动物。在一些实施方案中，将测试化合物施用于表达在Cys 481处被修饰的修饰BTK的转基因动物，并且通过本文所述的一种或多种试验评估BTK的活性。在一些实施方案中，该试验是使用突变BTK多肽进行的激酶试验，该突变BTK多肽分离自施用了测试化合物的转基因动物并且与对照进行比较。在一些实施方案中，在B细胞样品中评估一个或多个BTK靶标的磷酸化水平，该B细胞样品来自施用了测试化合物的转基因动物并且与对照进行比较。在一些实施方案中，该对照是来自未施用测试化合物的动物的样品。在一些实施方案中，该对照是来自施用了共价和/或不可逆BTK抑制剂的动物的样品。
试剂盒/制品
为了在本文描述的诊断和治疗应用中使用，本文还描述了试剂盒和制品。该试剂盒可包括载体、包装或容器，该容器被区室化为接纳一个或多个诸如小瓶、管等容器，每个容器包含一个将在本文描述的方法中使用的单独元件。合适的容器包括，例如，瓶子、小瓶、注射器和试管。该容器由包括例如玻璃或塑料的任何可接受的材料形成。
在一些实施方案中，本文提供的试剂盒用于检测受试者中编码修饰BTK多肽的核酸或用于检测受试者中的修饰BTK多肽。在一些实施方案中，本文提供的试剂盒作为伴随诊断工具与一种或多种共价和/或不可逆BTK抑制剂一起使用。在一些实施方案中，该试剂盒用于为使用第二代BTK拮抗剂的治疗选择患者，用于将受试者鉴别为对共价和/或不可逆BTK抑制剂具有抗性或可能成为有抗性的，用于监测对共价和/或不可逆BTK抑制剂的抗性的发展，或它们的组合。本文提供的试剂盒包含一种或多种试剂，该试剂用于检测编码修饰BTK多肽的核酸，用于检测修饰BTK多肽，用于检测来自受试者的细胞中的BTK活性，用于在体外或体内检测BTK活性，或它们的组合。示例性试剂包括但不限于寡核苷酸、PCR试剂、缓冲液、抗体、用于测定激酶活性的BTK底物、用于酶染色的底物、发色团或其它材料，如载玻片、容器、微量滴定板，以及任选的用于实施该方法的说明。本领域技术人员将会认识到可以用于接触各种材料的许多其它可能的容器和板和试剂。试剂盒还可包含对照样品，例如，核酸或蛋白质，例如本文提供的突变BTK多肽或编码本文提供的修饰BTK多肽的核酸。在一些实施方案中，试剂盒包含一组或多组用于检测突变BTK表达的寡核苷酸引物。
在一些实施方案中，容器可包含一种或多种共价和/或不可逆BTK抑制剂或者一种或多种通过本文所述的方法鉴别的第二代BTK抑制剂，其任选地在组合物中或与本文公开的另一种药剂组合。容器任选地具有用于给药的诸如注射器、针、配量杯或小瓶的材料。这样的试剂盒任选地包含带有鉴别性描述或标签或关于其在本文所述方法中的应用的说明的化合物。
在一些实施方案中，试剂盒包含具有BTK活性的修饰BTK多肽或其变体，其在与SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的氨基酸位置481相对应的氨基酸位置处包含修饰。在一些实施方案中，该修饰是在BTK多肽的氨基酸位置481处半胱氨酸至丝氨酸的置换。在一些实施方案中，试剂盒包含任何编码本文提供的修饰BTK多肽的分离的核酸或者包含这样的核酸的载体。在一些实施方案中，该修饰是在BTK多肽的氨基酸位置481处半胱氨酸至丝氨酸的置换。
在一些实施方案中，试剂盒包含微芯片，该微芯片包含本文提供的修饰BTK多肽或编码本文提供的修饰BTK多肽的核酸。在一些实施方案中，该修饰是在BTK多肽的氨基酸位置481处半胱氨酸至丝氨酸的置换。
对使用共价和/或不可逆BTK抑制剂的治疗具有抗性的细胞系的产生
本文提供了用于产生对使用共价和/或不可逆BTK抑制剂的治疗具有抗性的B细胞癌细胞系的方法。在一些实施方案中，该B细胞癌细胞系对使用共价和/或不可逆BTK抑制剂的治疗具有抗性，该共价和/或不可逆BTK抑制剂与野生型BTK的半胱氨酸481共价结合。在一些实施方案中，该B细胞癌细胞系对使用依鲁替尼、PCI-45292、PCI-45466、AVL-101、AVL-291、AVL-292或ONO-WG-37的治疗具有抗性。在一些实施方案中，该B细胞癌细胞系对使用依鲁替尼的治疗具有抗性。在一些实施方案中，通过所提供的方法产生的抗性细胞系表达修饰BTK蛋白质。在一些实施方案中，该BTK蛋白质在与SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的氨基酸位置481相对应的氨基酸位置处被修饰。
在一些实施方案中，该方法包括使B细胞癌细胞系(即亲本细胞系)与共价和/或不可逆BTK抑制剂接触，并将该细胞培养预定的一段时间。在一些实施方案中，该方法包括在提高的不可逆BTK抑制剂浓度下将细胞培养预定的一段时间。在一些实施方案中，不可逆BTK抑制剂的浓度范围为约0.01μM至约100μM，例如，0.1μM至约10μM。在一些实施方案中，在约0.05μM、0.1μM、0.5μM和1μM的不可逆BTK抑制剂下培养细胞。在一些实施方案中，不可逆BTK抑制剂的浓度增加2、3、4、5、6、7、8、9、10倍或更多倍。在一些实施方案中，不可逆BTK抑制剂的浓度增加3倍。在一些实施方案中，在不可逆BTK抑制剂的存在下培养细胞1天、2天、3天、4天、5天、6天、1周、2周、3周、4周、1个月、1.5个月、2个月、2.5个月、3个月或更长。在一些实施方案中，每2天、每3天、每4天、每5天、每6天、每周或更长时间将细胞分开并重新铺板。在一些实施方案中，每天、每2天、每3天、每4天、每5天、每6天、每周或更长时间更新含有不可逆BTK抑制剂的培养基。在一些实施方案中，该不可逆BTK抑制剂与野生型BTK的Cys 481共价结合。在一些实施方案中，该不可逆BTK抑制剂是依鲁替尼、PCI-45292、PCI-45466、AVL-101、AVL-291、AVL-292或ONO-WG-37。在一些实施方案中，该不可逆BTK抑制剂是依鲁替尼。
在一些实例中，亲本B细胞癌细胞系是白血病、淋巴瘤或骨髓瘤细胞系。在一些实例中，亲本B细胞癌细胞系是DLBCL细胞系。示例性的DLBCL细胞系包括ABC-DLBCL细胞系，包括但不限于OCI-LY10、OCI-Ly3、U2932、RIVA、HBL-1或TMD8细胞系，以及GCB-DLBCL细胞系，包括但不限于于OCI-Ly19或OCI-Ly7。在一些实例中，亲本B细胞癌细胞系是MCL细胞系。示例性的MCL细胞系包括但不限于Mino和Jeko细胞系。在一些实例中，亲本B细胞癌细胞系是滤泡淋巴瘤细胞系。示例性的滤泡淋巴瘤细胞系包括但不限于DoHH2、Granta 519和HF-1细胞系。
在一些实施方案中，根据B细胞受体途径激活的增加来鉴别抗性细胞系。在一些实施方案中，通过检测所处理的细胞系中的下游靶标在依鲁替尼的存在下是否比在依鲁替尼存在下的亲本细胞系表现出增加的磷酸化来鉴别B细胞受体途径激活的增加。在一些实例中，磷酸化的下游靶标是磷酸化的RAF或磷酸化的MEK。在一些实施方案中，抗性细胞系对单独的依鲁替尼治疗具有抗性，但是对MEK抑制剂与依鲁替尼的治疗敏感。
依鲁替尼抗性患者中的非BTK突变——检测、组合物及其用途
如本文所述，在某些情况下，在非BTK的蛋白质中的突变导致患者对使用BTK抑制剂(例如，共价和/或不可逆抑制剂)的治疗具有抗性。在一些实施方案中，该突变位于BTK途径的下游效应蛋白质中。在一些实施方案中，该突变是功能获得性突变。在一些实施方案中，该突变导致BTK途径的下游效应蛋白质的组成型激活。
PLCγ2
在一些实施方案中，下游效应蛋白质是磷脂酶Cγ2(PLCγ2)。PLC将磷脂磷脂酰肌醇4,5-二磷酸(PIP2)切割成二酰基甘油(DAG)和肌醇1,4,5-三磷酸(IP3)。DAG依然与膜结合，并且IP3作为可溶性结构释放到胞质溶胶中。然后IP3扩散通过胞质溶胶以与IP3受体结合，IP3受体是光滑内质网(ER)中的特定钙离子通道。这引起钙的胞质溶胶浓度增加，从而引发一连串的细胞内变化和活性。此外，钙和DAG一起作用以激活蛋白激酶C，蛋白激酶C继续将其它分子BTK激酶途径磷酸化，从而导致改变的细胞活性。在一些实施方案中，突变PLCγ2多肽具有组成型活性(即不需要通过BTK的磷酸化)。
在一些实施方案中，PLCγ2中的突变导致患者对使用BTK抑制剂的治疗的抗性。在一些实施方案中，该突变是PLCγ2中的功能获得性突变。在一些实施方案中，该突变导致PLCγ2的组成型激活。在一些实施方案中，PLCγ2的组成型激活导致细胞内钙的动员、细胞外信号调节的激酶(ERK)和c-Jun NH2-末端激酶(JNK)促***原激活的蛋白激酶(MAPK)途径的激活。在一些实施方案中，PLCγ2中的突变导致PLCγ2中的氨基酸对应位置R665的氨基酸置换。在一些实施方案中，PLCγ2中的突变导致精氨酸被置换为色氨酸(R665W)。在一些实施方案中，PLCγ2中的突变导致PLCγ2中的氨基酸对应位置S707的氨基酸置换。在一些实施方案中，PLCγ2中的突变导致丝氨酸被置换为苯丙氨酸(S707F)。
本文提供的用于检测修饰BTK多肽的任何方法还可应用于PLCγ2多肽的检测。例如，可以通过PCR方法检测突变PLCγ2多肽，该PCR方法使用突变体特异性核酸来检测基因组中的体细胞突变，或者使用PLCγ2突变体特异性抗体来检测突变PLCγ2多肽。
在一些实施方案中，提供了编码突变PLCγ2多肽的核酸。在一些实施方案中，提供了编码突变PLCγ2多肽的核酸载体。在一些实施方案中，该载体是病毒载体。在一些实施方案中，提供了包含编码突变PLCγ2多肽的核酸的宿主细胞。在一些实施方案中，提供了包含表达的PLCγ2多肽的宿主细胞。
本文提供的且本领域已知的用于产生本文提供的修饰BTK多肽和核酸的任何方法，包括核酸表达载体和宿主细胞的使用，也可应用于本文提供的突变PLCγ2多肽和核酸的产生。
本文提供了突变PLCγ2多肽。在一些实施方案中，该突变PLCγ2多肽是重组蛋白质。在一些实施方案中，从宿主细胞中纯化该突变PLCγ2多肽。
在一些实施方案中，该突变PLCγ2多肽包含一个或多个氨基酸置换，该置换赋予对由BTK抑制剂引起的抑制的抗性。在一些实施方案中，该突变PLCγ2多肽包含一个或多个氨基酸置换，该置换赋予对由共价和/或不可逆BTK抑制剂引起的抑制的抗性，该抑制剂为依鲁替尼、PCI-45292、PCI-45466、AVL-101、AVL-291、AVL-292或ONO-WG-37。在一些实施方案中，该突变PLCγ2多肽包含一个或多个氨基酸置换，该置换赋予对由BTK抑制剂引起的抑制的抗性。
本文提供了具有PLCγ2活性的分离的PLCγ2多肽或其变体，其中该PLCγ2多肽或其变体在与SEQ ID NO:11所示氨基酸序列的氨基酸位置665或707相对应的氨基酸位置处包含修饰。
在一些实施方案中，该修饰包括与SEQ ID NO:11所示的野生型PLCγ2相比在氨基酸位置665或707处的氨基酸的置换或缺失。在一些实施方案中，该修饰包括与SEQ ID NO:11所示的野生型PLCγ2相比在氨基酸位置665或707处的氨基酸的置换。在一些实施方案中，该修饰是在PLCγ2多肽的氨基酸位置665处第665位精氨酸被置换为选自亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸、甘氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、赖氨酸、丝氨酸、组氨酸、脯氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸和谷氨酸的氨基酸。在一些实施方案中，该修饰是在PLCγ2多肽的氨基酸位置665处精氨酸至色氨酸的置换。在一些实施方案中，该置换是R665W。在一些实施方案中，该修饰是在PLCγ2多肽的氨基酸位置707处第707位精氨酸被置换为选自亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸、甘氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、脯氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸和谷氨酸的氨基酸。在一些实施方案中，该修饰是在PLCγ2多肽的氨基酸位置707处丝氨酸至苯丙氨酸的置换。在一些实施方案中，该置换是S707W。
在一些实施方案中，该突变PLCγ2多肽包含与SEQ ID NO:11所示的野生型PLCγ2相比第665或707位氨基酸的置换和一个或多个额外的氨基酸置换。在一些实施方案中，该突变PLCγ2多肽包含在氨基酸位置665或707处的修饰和在一个或多个额外的氨基酸位置处的修饰。在一些实施方案中，该突变PLCγ2多肽包含在氨基酸位置665或707处的修饰和在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或更多个氨基酸位置处的修饰。在一些实施方案中，氨基酸位置665处的修饰是置换R665W。在一些实施方案中，氨基酸位置707处的修饰是置换S707F。
在一些实施方案中，在SEQ ID NO:11所示野生型PLCγ2多肽的氨基酸位置665或707处包含修饰的PLCγ2多肽连接至肽标签。在一些实施方案中，该肽标签是被标签特异性抗体识别的表位标签。在一些实施方案中，该标签是表位标签，例如但不限于c-myc、V-5、血凝素(HA)、FLAG标签。在一些实施方案中，该标签是亲和标签，例如但不限于生物素、strep-标签、壳多糖结合蛋白质(CBP)、麦芽糖结合蛋白质(MBP)、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)或聚(His)标签。在一些实施方案中，在SEQ ID NO:11所示野生型PLCγ2多肽的氨基酸位置665或707处包含修饰的PLCγ2多肽连接至可检测蛋白质或部分，例如发光、化学发光、生物发光或荧光蛋白或部分。在一些实施方案中，该荧光蛋白是绿色(GFP)、红色(RFP)、青色(CFP)、黄色(YFP)或蓝色(BFP)荧光蛋白。在一些实施方案中，在SEQ ID NO:11所示野生型PLCγ2多肽的氨基酸位置665或707处包含修饰的PLCγ2多肽连接至酶，例如，萤光素酶或β-半乳糖苷酶。
本文提供了编码突变PLCγ2多肽的核酸。本文提供了编码本文描述的任何突变PLCγ2多肽的核酸。推断编码特定多肽的核酸的方法是本领域已知的，并且包括标准分子生物学技术。提供了编码本文所提供的突变PLCγ2多肽的示例性核酸。可以理解，由于遗传密码的简并性，存在编码同一多肽的多个变异核酸。编码本文所提供的突变PLCγ2多肽的核酸包括这样的变体。
在一些实施方案中，编码本文所提供的修饰PLCγ2多肽的核酸是DNA或RNA分子。在一些实施方案中，编码突变PLCγ2多肽的核酸包含修饰，其中所编码的多肽在与SEQ ID NO:11所示野生型PLCγ2多肽的氨基酸位置665或707相对应的位置处包含氨基酸精氨酸的置换。在一些实施方案中，该核酸包含SEQ ID NO:12所示的核酸序列，其中编码第665位氨基酸的核酸密码子被修饰，由此该密码子不编码精氨酸，或者该核酸包含与具有SEQ ID NO:12所示序列的多肽具有至少或至少约60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的变体，其中编码第665位氨基酸的核酸密码子不编码精氨酸或者编码第707位氨基酸的核酸密码子不编码丝氨酸。
在一些实施方案中，该核酸修饰是一个或多个编码PLCγ2多肽的密码子的错义突变或缺失。在一些实施方案中，该修饰是改变在PLCγ2多肽的氨基酸位置665处编码精氨酸的核酸密码子的错义突变。在一些实施方案中，该修饰是改变在PLCγ2多肽的氨基酸位置707处编码丝氨酸的核酸密码子的错义突变。
在一些实施方案中，在PLCγ2多肽的氨基酸位置665处编码丝氨酸的核酸密码子是CGT、CGC、CGA、CGG、AGA或AGG。在一些实施方案中，该修饰将在PLCγ2多肽的氨基酸位置665处编码精氨酸的核酸密码子改变为编码色氨酸的核酸密码子。在一些实施方案中，编码苯色氨酸的核酸密码子是TGG。
在一些实施方案中，在PLCγ2多肽的氨基酸位置707处编码丝氨酸的核酸密码子是TCT、TCC、TCA、TCG、AGT或AGC。在一些实施方案中，该修饰将在PLCγ2多肽的氨基酸位置707处编码丝氨酸的核酸密码子改变为编码苯丙氨酸的核酸密码子。在一些实施方案中，编码苯丙氨酸的核酸密码子是TTT或TTC。
在一些实施方案中，提供了确定受试者是否对使用BTK抑制剂的疗法具有较低反应性或可能成为有较低反应性的方法，其包括：(a)检测来自该受试者的含有编码PLCγ2多肽的核酸分子的样品，以确定所编码的PLCγ2多肽是否在与SEQ ID NO:11所示氨基酸序列的氨基酸位置665或707相对应的氨基酸位置处被修饰；以及(b)如果该受试者具有该修饰，则将该受试者表征为对使用BTK抑制剂的疗法具有抗性或可能成为有抗性的。在一些实施方案中，该方法进一步包括从受试者获得样品的步骤。在一些实施方案中，该修饰包括PLCγ2中的R665W或S707F置换。在一些实施方案中，该BTK抑制剂是共价或不可逆抑制剂。
在某些实施方案中，本文描述了监测为了治疗癌症而接受BTK抑制剂的受试者是否已经发展或可能发展出对该疗法的抗性的方法，其包括：(a)检测来自该受试者的含有编码PLCγ2多肽的核酸分子的样品，以确定所编码的PLCγ2多肽是否在与SEQ ID NO:11所示氨基酸序列的氨基酸位置665或707相对应的氨基酸位置处被修饰；以及(b)如果该受试者具有该修饰，则将该受试者表征为对使用BTK抑制剂的疗法具有抗性或可能成为有抗性的。在一些实施方案中，该方法进一步包括如果该受试者具有该修饰则中断使用该BTK抑制剂的治疗。在一些实施方案中，该方法进一步包括如果该受试者不具有该修饰则继续使用BTK抑制剂的治疗。在一些实施方案中，该方法进一步包括从受试者获得样品的步骤。在一些实施方案中，该方法进一步包括如果该受试者具有该修饰则施用LYN、SYK、JAK、PI3K、MAPK、MEK或NFκB的抑制剂。在一些实施方案中，该修饰包括PLCγ2中的R665W或S707F置换。在一些实施方案中，该BTK抑制剂是共价或不可逆抑制剂。
在某些实施方案中，本文描述了优化为了治疗癌症而接受不可逆BTK抑制剂的受试者的疗法的方法，其包括：(a)检测来自该受试者的含有编码PLCγ2多肽的核酸分子的样品，以确定所编码的PLCγ2多肽在与SEQ ID NO:11所示氨基酸序列的氨基酸位置665相对应的氨基酸位置处是否被修饰；以及(b)如果该受试者具有该修饰则中断使用不可逆BTK抑制剂的治疗，或者如果该受试者不具有该修饰则继续使用不可逆BTK抑制剂的治疗。在一些实施方案中，该方法进一步包括如果该受试者具有该修饰则施用抑制该修饰激酶的第二代BTK抑制剂。在一些实施方案中，该方法进一步包括从受试者获得样品的步骤。在一些实施方案中，该方法进一步包括如果该受试者具有该修饰则施用LYN、SYK、JAK、PI3K、MAPK、MEK或NFκB的抑制剂。在一些实施方案中，该修饰包括PLCγ2中的R665W或S707F置换。在一些实施方案中，该BTK抑制剂是共价或不可逆抑制剂。
在该方法的一些实施方案中，用于该试验的核酸分子是RNA或DNA。在该方法的一些实施方案中，该核酸分子是cDNA。在该方法的一些实施方案中，用于该试验的核酸分子是基因组DNA。在该方法的一些实施方案中，用于该试验的核酸分子是总RNA。在该方法的一些实施方案中，用于该试验的核酸分子是mRNA。在该方法的一些实施方案中，该方法进一步包括从RNA样品中分离mRNA。
在该方法的一些实施方案中，检测包括对编码PLCγ2多肽的氨基酸位置665或707的核酸进行聚合酶链反应(PCR)扩增。在一些实施方案中，PCR扩增包括使用一对寡核苷酸引物，该引物位于编码PLCγ2多肽的氨基酸位置665或707的区域的侧翼。在一些实施方案中，该方法包括对扩增的核酸进行测序。
在该方法的一些实施方案中，检测包括使核酸与序列特异性核酸探针接触，其中该序列特异性核酸探针：(a)与编码在氨基酸位置665处被修饰的修饰PLCγ2的核酸结合；且(b)不与编码在氨基酸位置665或707处具有精氨酸的野生型PLCγ2的核酸结合。在该方法的一些实施方案中，检测包括使用序列特异性核酸探针的PCR扩增。
在一些实施方案中，用于该方法的样品含有来自受试者的一种或多种肿瘤细胞。在一些实施方案中，用于该方法的样品含有循环肿瘤DNA(ctDNA)。
在该方法的一些实施方案中，在该方法中使用的核酸是从来自受试者的肿瘤细胞样品中分离的。在一些实施方案中，该样品是肿瘤活检样品、血液样品、血清样品、淋巴样品或骨髓抽吸物。
在一些实施方案中，该BTK抑制剂选自依鲁替尼(PCI-32765)、PCI-45292、PCI-45466、AVL-101、AVL-291、AVL-292或ONO-WG-37。在一些实施方案中，该PLCγ2抑制剂是依鲁替尼。
在该方法的一些实施方案中，受试者患有癌症。在一些实施方案中，该癌症是血液***癌症。在一些实施方案中，癌症是B细胞恶性肿瘤。在一些实施方案中，癌症选自白血病、淋巴瘤或骨髓瘤。在一些实施方案中，该B细胞恶性肿瘤是慢性淋巴细胞白血病(CLL)、小淋巴细胞淋巴瘤(SLL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、活化B细胞弥漫性大B细胞淋巴瘤(ABC-DLBCL)、生发中心弥漫性大B细胞淋巴瘤(GCB DLBCL)、原发性纵隔B细胞淋巴瘤(PMBL)、非霍奇金淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、滤泡淋巴瘤、免疫母细胞大细胞淋巴瘤、前体B淋巴母细胞淋巴瘤、前体B细胞急性淋巴母细胞性白血病、多毛细胞白血病、套细胞淋巴瘤、B细胞幼淋巴细胞白血病、淋巴质浆细胞淋巴瘤/瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、脾边缘区淋巴瘤、浆细胞性骨髓瘤、浆细胞瘤、结外边缘区B细胞淋巴瘤、结边缘区B细胞淋巴瘤、纵隔(胸腺)大B细胞淋巴瘤、血管内大B细胞淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤或淋巴瘤样肉芽肿病。在一些实施方案中，受试者患有实体瘤。
在该方法的一些实施方案中，受试者在获得样品前用BTK抑制剂治疗。在一些实施方案中，该样品在首次施用不可逆BTK抑制剂后1周、2周、3周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月、14个月、16个月、18个月、20个月、22个月或24个月时获得。在一些实施方案中，该样品在使用BTK抑制剂治疗的过程中获得1、2、3、4、5、6、7、8、9、10次。在一些实施方案中，在首次施用时，受试者对使用BTK抑制剂的治疗有反应。
在某些实施方案中，本文描述了一种试剂盒，其包含一种或多种试剂，该试剂用于检测在氨基酸位置665处包含修饰的修饰PLCγ2多肽。在一些实施方案中，该试剂盒包含微芯片，该微芯片包含具有修饰R665W或S707F的突变PLCγ2多肽。
在某些实施方案中，本文描述了一种试剂盒，其包含一种或多种试剂，该试剂用于检测编码在氨基酸位置665或707处包含修饰的突变PLCγ2多肽的核酸。在一些实施方案中，该试剂盒包含微芯片，该微芯片包含编码具有修饰R665W或S707F的突变PLCγ2多肽的核酸。
在某些实施方案中，本文描述了一种用于检测修饰的PLCγ2的***，该修饰PLCγ2赋予受试者中对使用不可逆BTK抑制剂的抑制的抗性，该***包含：(a)来自该受试者的含有编码PLCγ2多肽的核酸分子的样品；以及(b)包含编码突变PLCγ2多肽或其一部分的核酸的微阵列，该突变PLCγ2多肽或其一部分在与SEQ ID NO:11所示氨基酸序列的氨基酸位置665或707相对应的氨基酸位置处被修饰。在一些实施方案中，该微阵列包含在微芯片上。
在某些实施方案中，本文描述了一种用于检测修饰的PLCγ2的***，该修饰PLCγ2赋予受试者中对使用BTK抑制剂的抑制的抗性，该***包含：(a)来自该受试者的含有编码PLCγ2多肽的核酸分子的样品；以及(b)序列特异性核酸探针，其中该序列特异性核酸探针：(i)与编码在氨基酸位置665或707处被修饰的修饰PLCγ2的核酸结合；且(ii)不与编码在氨基酸位置665处具有精氨酸或在位置707处具有丝氨酸的野生型PLCγ2的核酸结合。
在某些实施方案中，本文描述了一种用于检测修饰的PLCγ2的***，该修饰PLCγ2赋予受试者中对使用BTK抑制剂的抑制的抗性，该***包含：(a)来自该受试者的含有编码PLCγ2多肽的核酸分子的样品；和(b)一对寡核苷酸引物，其位于编码PLCγ2多肽的氨基酸665或707的核酸区域的侧翼。
在某些实施方案中，本文描述了一种在患有血液***癌症的患者中进行维持疗法的方法，其包括：(a)向该患者施用维持疗法方案，该方案包括施用治疗有效剂量的BTK抑制剂；以及(b)在所述维持疗法方案的过程中以预定的时间间隔监测该患者，以确定受试者是否在编码PLCγ2的内源基因中具有突变，该突变导致与SEQ ID NO:11所示氨基酸序列的氨基酸位置665或707相对应的氨基酸位置处的修饰。在一些实施方案中，监测包括：(a)检测来自该受试者的含有编码PLCγ2多肽的核酸分子的样品，以确定所编码的PLCγ2多肽是否在与SEQ ID NO:11所示氨基酸序列的氨基酸位置665或707相对应的氨基酸位置处被修饰。在一些实施方案中，该方法进一步包括如果该受试者具有该突变则中断使用该BTK抑制剂的治疗。在一些实施方案中，该方法进一步包括如果该受试者不具有该突变则继续使用BTK抑制剂的治疗。在一些实施方案中，该方法进一步包括如果该受试者具有该修饰则施用LYN、SYK、JAK、PI3K、MAPK、MEK或NFκB的抑制剂。在一些实施方案中，PLCγ2多肽中的修饰是R665W或S707F。在一些实施方案中，该预定的时间间隔是每个月、每2个月、每3个月、每4个月、每5个月、每6个月、每7个月、每8个月
在一些实施方案中，该BTK抑制剂以约10mg/天至约2000mg/天、约50mg/天至约1500mg/天、约100mg/天至约1000mg/天、约250mg/天至约850mg/天或约300mg/天至约600mg/天的每日剂量施用。在一些实施方案中，依鲁替尼以约140mg/天、420mg/天、560mg/天或840mg/天的每日剂量施用。在一些实施方案中，该BTK抑制剂是共价和/或不可逆BTK抑制剂。在一些实施方案中，该BTK抑制剂选自依鲁替尼(PCI-32765)、PCI-45292、PCI-45466、AVL-101、AVL-291、AVL-292或ONO-WG-37。在一些实施方案中，该BTK抑制剂是依鲁替尼。
CARD11
在一些实施方案中，下游效应蛋白质是含胱天蛋白酶募集结构域的蛋白11(CARD11)，也称为含CARD的MAGUK蛋白1(Carma 1)。CARD11属于MAGUK(膜相关鸟苷酸激酶)家族，其通常作为分子支架在多蛋白复合物的装配中发挥作用。MAGUK家族成员包含SH3结构域、PDZ结构域以及与鸟苷酸激酶同源的GuK结构域。此外，CARD11包含氨基末端CARD结构域(胱天蛋白酶募集结构域)。该结构域在与许多包含参与调节细胞凋亡和NF-κB激活的CARD结构域的蛋白质形成相互作用中发挥重要作用。CARD11主要在淋巴细胞中表达并且与Bcl10的CARD结构域相关联。当过表达时，CARD11导致Bcl10的磷酸化和NF-κB的激活。
在一些实施方案中，CARD11中的突变导致患者对使用BTK抑制剂的治疗的抗性。在一些实施方案中，该突变是CARD11中的功能获得性突变。在一些实施方案中，该突变导致NF-κB介导的转录的组成型激活。在一些实施方案中，CARD11中的突变导致CARD11中氨基酸位置232处的氨基酸***。在一些实施方案中，CARD11中的突变导致在氨基酸位置L232处的亮氨酸***。在一些实施方案中，该修饰是L232LL。在一些实施方案中，CARD11中的突变导致在氨基酸位置L232处的异亮氨酸***。在一些实施方案中，该修饰是L232IL或L232LI。
本文提供的用于检测修饰BTK多肽的任何方法还可应用于CARD11多肽的检测。例如，可以通过PCR方法检测突变CARD11多肽，该PCR方法使用突变体特异性核酸来检测基因组中的体细胞突变，或者使用CARD11突变体特异性抗体来检测突变CARD11多肽。
在一些实施方案中，提供了编码突变CARD11多肽的核酸。在一些实施方案中，提供了编码突变CARD11多肽的核酸载体。在一些实施方案中，该载体是病毒载体。在一些实施方案中，提供了包含编码突变CARD11多肽的核酸的宿主细胞。在一些实施方案中，提供了包含表达的CARD11多肽的宿主细胞。
本文提供的和本领域已知的用于产生本文提供的修饰BTK多肽和核酸的任何方法，包括核酸表达载体和宿主细胞的使用，也可应用于本文提供的突变CARD11多肽和核酸的产生。
本文提供了突变CARD11多肽。在一些实施方案中，突变CARD11多肽是重组蛋白。在一些实施方案中，从宿主细胞中纯化突变CARD11多肽。
在一些实施方案中，突变CARD11多肽包含一个或多个氨基酸置换，该置换赋予对由BTK抑制剂导致的抑制的抗性。在一些实施方案中，突变CARD11多肽包含一个或多个氨基酸置换，该置换赋予对由共价和/或不可逆BTK抑制剂导致的抑制的抗性。在一些实施方案中，突变CARD11多肽含有一个或多个氨基酸置换，该置换赋予对由共价和/或不可逆BTK抑制剂导致的抑制的抗性，其中该共价和/或不可逆BTK抑制剂是依鲁替尼、PCI-45292、PCI-45466、AVL-101、AVL-291、AVL-292或ONO-WG-37。在一些实施方案中，突变CARD11多肽包含一个或多个氨基酸置换，该置换赋予对由BTK抑制剂导致的抑制的抗性。
本文提供了分离的CARD11多肽或其具有CARD11活性的变体，其中该CARD11多肽或其变体在与SEQ ID NO:19所示氨基酸序列的氨基酸位置L232相对应的氨基酸位置处包含修饰。
在一些实施方案中，该修饰包含与SEQ ID NO:19所示的野生型CARD11相比在氨基酸位置L232处的氨基酸的置换或缺失。在一些实施方案中，该修饰包含与SEQ ID NO:19所示的野生型CARD11相比在位置L232处的氨基酸置换。在一些实施方案中，该修饰是在CARD11多肽的氨基酸232处的亮氨酸***(例如L232LL)。
在一些实施方案中，突变CARD11多肽包含与SEQ ID NO:19所示的野生型CARD11相比在CARD11多肽的氨基酸232处的亮氨酸***和一个或多个额外的氨基酸置换。在一些实施方案中，突变CARD11多肽包含氨基酸232处的亮氨酸***和在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或更多个氨基酸位置处的修饰。在一些实施方案中，氨基酸232处的修饰是L232LL。
在一些实施方案中，在SEQ ID NO:19所示的野生型CARD11多肽的氨基酸位置232处包含修饰的CARD11多肽连接至肽标签。在一些实施方案中，该肽标签是被标签特异性抗体识别的表位标签。在一些实施方案中，该标签是表位标签，例如但不限于c-myc、V-5、血凝素(HA)、FLAG标签。在一些实施方案中，该标签是亲和标签，例如但不限于生物素、strep-标签、壳多糖结合蛋白质(CBP)、麦芽糖结合蛋白质(MBP)、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)或聚(His)标签。在一些实施方案中，在SEQ ID NO:19所示的野生型CARD11多肽的氨基酸位置232处包含修饰的CARD11多肽连接至可检测蛋白质或部分，例如发光、化学发光、生物发光或荧光蛋白或部分。在一些实施方案中，该荧光蛋白是绿色(GFP)、红色(RFP)、青色(CFP)、黄色(YFP)或蓝色(BFP)荧光蛋白。在一些实施方案中，在SEQ ID NO:19所示的野生型CARD11多肽的氨基酸位置232处包含修饰的CARD11多肽连接至酶，例如，萤光素酶或β-半乳糖苷酶。
本文提供了编码突变CARD11多肽的核酸。本文提供了编码本文所述的任何突变CARD11多肽的核酸。推断编码特定多肽的核酸的方法是本领域已知的，并且包括标准分子生物学技术。提供了编码本文所提供的突变CARD11多肽的示例性核酸。可以理解，由于遗传密码的简并性，存在编码同一多肽的多个变异核酸。编码本文所提供的突变CARD11多肽的核酸包括这样的变体。
在一些实施方案中，编码本文所提供的修饰CARD11多肽的核酸是DNA或RNA分子。在一些实施方案中，编码突变CARD11多肽的核酸包含修饰，其中所编码的多肽在与SEQ ID NO:19所示的野生型CARD11多肽的氨基酸位置232相对应的位置处包含氨基酸的***。在一些实施方案中，该核酸包含SEQ ID NO:20所示的核酸序列，或者与具有SEQ ID NO:20所示序列的多肽具有至少或至少约60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的变体。
在一些实施方案中，提供了确定受试者是否对使用BTK抑制剂的疗法具有较低反应性或可能成为有较低反应性的方法，其包括：(a)检测来自该受试者的含有编码CARD11多肽的核酸分子的样品，以确定所编码的CARD11多肽是否在与SEQ ID NO:19所示氨基酸序列的氨基酸位置232相对应的氨基酸位置处被修饰；以及(b)如果该受试者具有该修饰，则将该受试者表征为对使用BTK抑制剂的疗法具有抗性或可能成为有抗性的。在一些实施方案中，该方法进一步包括从受试者获得样品的步骤。在一些实施方案中，该修饰包括CARD11中的L232LL***。在一些实施方案中，该BTK抑制剂是共价或不可逆抑制剂。
在某些实施方案中，本文描述了监测为了治疗癌症而接受BTK抑制剂的受试者是否已经发展或可能发展出对该疗法的抗性的方法，其包括：(a)检测来自该受试者的含有编码CARD11多肽的核酸分子的样品，以确定所编码的CARD11多肽是否在与SEQ ID NO:19所示氨基酸序列的氨基酸位置232相对应的氨基酸位置处被修饰；以及(b)如果该受试者具有该修饰，则将该受试者表征为对使用BTK抑制剂的疗法具有抗性或可能成为有抗性的。在一些实施方案中，该方法进一步包括如果受试者具有该修饰则中断使用BTK抑制剂的治疗。在一些实施方案中，该方法进一步包括如果受试者不具有该修饰则继续使用BTK抑制剂的治疗。在一些实施方案中，该方法进一步包括从受试者获得样品的步骤。在一些实施方案中，该方法进一步包括如果受试者具有该修饰则施用LYN、SYK、JAK、PI3K、MAPK、MEK或NFκB的抑制剂。在一些实施方案中，该修饰包括CARD11中的L232LL***。在一些实施方案中，该BTK抑制剂是共价或不可逆抑制剂。
在某些实施方案中，本文描述了优化为了治疗癌症而接受不可逆BTK抑制剂的受试者的疗法的方法，其包括：(a)检测来自该受试者的含有编码CARD11多肽的核酸分子的样品，以确定所编码的CARD11多肽是否在与SEQ ID NO:19所示氨基酸序列的氨基酸位置232相对应的氨基酸位置处被修饰；以及(b)如果该受试者具有该修饰则中断使用该不可逆BTK抑制剂的治疗，或者如果该受试者不具有该修饰则继续使用该不可逆BTK抑制剂的治疗。在一些实施方案中，该方法进一步包括如果受试者具有该修饰则施用抑制该修饰激酶的第二代BTK抑制剂。在一些实施方案中，该方法进一步包括从受试者获得样品的步骤。在一些实施方案中，该方法进一步包括如果受试者具有该修饰则施用LYN、SYK、JAK、PI3K、MAPK、MEK或NFκB的抑制剂。在一些实施方案中，该修饰包括CARD11中的L232LL***。在一些实施方案中，该BTK抑制剂是共价或不可逆抑制剂。
在该方法的一些实施方案中，用于该试验的核酸分子是RNA或DNA。在该方法的一些实施方案中，该核酸分子是cDNA。在该方法的一些实施方案中，用于该试验的核酸分子是基因组DNA。在该方法的一些实施方案中，用于该试验的核酸分子是总RNA。在该方法的一些实施方案中，用于该试验的核酸分子是mRNA。在该方法的一些实施方案中，该方法进一步包括从RNA样品中分离mRNA。
在该方法的一些实施方案中，检测包括对编码CARD11多肽的氨基酸位置232的核酸进行聚合酶链反应(PCR)扩增。在一些实施方案中，PCR扩增包括使用一对寡核苷酸引物，该引物位于编码CARD11多肽的氨基酸位置232的区域的侧翼。在一些实施方案中，该方法包括对扩增的核酸进行测序。
在该方法的一些实施方案中，检测包括使核酸与序列特异性核酸探针接触，其中该序列特异性核酸探针：(a)与编码在氨基酸位置232处被修饰的修饰CARD11的核酸结合；且(b)不与编码野生型CARD11的核酸结合。在该方法的一些实施方案中，检测包括使用序列特异性核酸探针的PCR扩增。
在一些实施方案中，用于该方法的样品含有来自受试者的一种或多种肿瘤细胞。在一些实施方案中，用于该方法的样品含有循环肿瘤DNA(ctDNA)。
在该方法的一些实施方案中，在该方法中使用的核酸从来自受试者的肿瘤细胞样品中分离。在一些实施方案中，该样品是肿瘤活检样品、血液样品、血清样品、淋巴样品或骨髓抽吸物。
在一些实施方案中，该BTK抑制剂选自依鲁替尼(PCI-32765)、PCI-45292、PCI-45466、AVL-101、AVL-291、AVL-292或ONO-WG-37。在一些实施方案中，该CARD11抑制剂是依鲁替尼。
在该方法的一些实施方案中，受试者患有癌症。在一些实施方案中，该癌症是血液***癌症。在一些实施方案中，癌症是B细胞恶性肿瘤。在一些实施方案中，癌症选自白血病、淋巴瘤或骨髓瘤。在一些实施方案中，该B细胞恶性肿瘤是慢性淋巴细胞白血病(CLL)、小淋巴细胞淋巴瘤(SLL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、活化B细胞弥漫性大B细胞淋巴瘤(ABC-DLBCL)、生发中心弥漫性大B细胞淋巴瘤(GCB DLBCL)、原发性纵隔B细胞淋巴瘤(PMBL)、非霍奇金淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、滤泡淋巴瘤、免疫母细胞大细胞淋巴瘤、前体B淋巴母细胞淋巴瘤、前体B细胞急性淋巴母细胞性白血病、多毛细胞白血病、套细胞淋巴瘤、B细胞幼淋巴细胞白血病、淋巴质浆细胞淋巴瘤/瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、脾边缘区淋巴瘤、浆细胞性骨髓瘤、浆细胞瘤、结外边缘区B细胞淋巴瘤、结边缘区B细胞淋巴瘤、纵隔(胸腺)大B细胞淋巴瘤、血管内大B细胞淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤或淋巴瘤样肉芽肿病。在一些实施方案中，受试者患有实体瘤。
在该方法的一些实施方案中，受试者在获得样品之前用BTK抑制剂治疗。在一些实施方案中，该样品在首次施用不可逆BTK抑制剂后1周、2周、3周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月、14个月、16个月、18个月、20个月、22个月或24个月时获得。在一些实施方案中，该样品在使用BTK抑制剂治疗的过程中获得1、2、3、4、5、6、7、8、9、10次。在一些实施方案中，在首次施用时，受试者对使用BTK抑制剂的治疗有反应。
在某些实施方案中，本文描述了一种试剂盒，其包含一种或多种试剂，该试剂用于检测在氨基酸位置232处包含修饰的修饰CARD11多肽。在一些实施方案中，该试剂盒包含微芯片，该微芯片包含具有修饰L232LL的突变CARD11多肽。
在某些实施方案中，本文描述了一种试剂盒，其包含一种或多种试剂，该试剂用于检测编码在氨基酸位置232处包含修饰的突变CARD11多肽的核酸。在一些实施方案中，该试剂盒包含微芯片，该微芯片包含编码具有修饰L232LL的突变CARD11多肽的核酸。
在某些实施方案中，本文描述了一种用于检测修饰的CARD11的***，该修饰CARD11赋予受试者中对使用不可逆BTK抑制剂的抑制的抗性，该***包含：(a)来自该受试者的含有编码CARD11多肽的核酸分子的样品；和(b)包含编码突变CARD11多肽或其一部分的核酸的微阵列，该突变CARD11多肽或其一部分在与SEQ ID NO:19所示氨基酸序列的氨基酸位置232相对应的氨基酸位置处被修饰。在一些实施方案中，该微阵列包含在微芯片上。
在某些实施方案中，本文描述了一种用于检测修饰的CARD11的***，该修饰CARD11赋予受试者中对使用BTK抑制剂的抑制的抗性，该***包含：(a)来自该受试者的含有编码CARD11多肽的核酸分子的样品；和(b)序列特异性核酸探针，其中该序列特异性核酸探针：(i)与编码在氨基酸位置232处被修饰的修饰CARD11的核酸结合；且(ii)不与编码野生型CARD11的核酸结合。
在某些实施方案中，本文描述了一种用于检测修饰的CARD11的***，该修饰CARD11赋予受试者中对使用BTK抑制剂的抑制的抗性，该***包含：(a)来自该受试者的含有编码CARD11多肽的核酸分子的样品；和(b)一对寡核苷酸引物，其位于编码CARD11多肽的氨基酸232的核酸区域的侧翼。
在某些实施方案中，本文描述了在患有血液***癌症的患者中进行维持疗法的方法，其包括：(a)向该患者施用维持疗法方案，该方案包括施用治疗有效剂量的BTK抑制剂；以及(b)在该维持疗法方案的过程中以预定的时间间隔监测该患者，以确定受试者是否在编码CARD11的内源基因中具有突变，该突变导致与SEQ ID NO:19所示氨基酸序列的氨基酸位置232相对应的氨基酸位置处的修饰。在一些实施方案中，监测包括：(a)检测来自受试者的含有编码CARD11多肽的核酸分子的样品，以确定所编码的CARD11多肽是否在与SEQ ID NO:19所示氨基酸序列的氨基酸位置232相对应的氨基酸位置处被修饰。在一些实施方案中，该方法进一步包括如果受试者具有该突变则中断使用该BTK抑制剂的治疗。在一些实施方案中，该方法进一步包括如果受试者不具有该突变则继续使用BTK抑制剂的治疗。在一些实施方案中，该方法进一步包括如果受试者具有该修饰则施用LYN、SYK、JAK、PI3K、MAPK、MEK或NFκB的抑制剂。在一些实施方案中，CARD11多肽中的修饰是L232LL。在一些实施方案中，预定的时间间隔是每个月、每2个月、每3个月、每4个月、每5个月、每6个月、每7个月、每8个月
在一些实施方案中，该BTK抑制剂以约10mg/天至约2000mg/天、约50mg/天至约1500mg/天、约100mg/天至约1000mg/天、约250mg/天至约850mg/天或约300mg/天至约600mg/天的每日剂量施用。在一些实施方案中，依鲁替尼以约140mg/天、420mg/天、560mg/天或840mg/天的每日剂量施用。在一些实施方案中，该BTK抑制剂是共价和/或不可逆BTK抑制剂。在一些实施方案中，该BTK抑制剂选自依鲁替尼(PCI-32765)、PCI-45292、PCI-45466、AVL-101、AVL-291、AVL-292或ONO-WG-37。在一些实施方案中，该BTK抑制剂是依鲁替尼。
实施例
提供这些实施例仅仅是为了说明性目的，而并非限制本文提供的权利要求的范围。
实施例1
在该实施例中，在接受使用共价BTK抑制剂依鲁替尼的疗法的白血病患者中鉴别布鲁顿酪氨酸激酶(BTK)中的突变。
以560mg/天的剂量经多周期依鲁替尼疗法治疗罹患慢性淋巴细胞白血病(CLL)的患者。大约18个月的治疗后，一名患者表现出临床疾病进展。进展的特征是绝对淋巴细胞计数(ALC)升高和***大小增大。依鲁替尼的剂量然后从560mg/天增加到840mg/天。然而，这种增加的剂量没有抑制疾病进展。另一名患者在后续研究中用420mg依鲁替尼联合苯达莫司汀和美罗华进行周期治疗。该患者也在大约12个月的治疗后表现出临床疾病进展。
在研究前、治疗期间以及当根据所设置的IWCLL评价标准认为患者的病情进展时，从患者采集全血。将全血收集到含有柠檬酸钠作为抗凝剂的BD Vacutainer细胞制备管(BD Vacutainer Cell Preparation Tubes)(CPT)中。在抽血后48小时内将收集的全血运送到分析地点，在那里立即将CPT收集管在水平转子离心机中以1800RCF于室温下离心20分钟。在吸出上方血浆成分后，用移液管仔细收集血浆层下方的外周血单核细胞(PBMC)层。将收集的细胞重悬浮于Sigma红细胞(RBC)裂解缓冲液(目录号R 7757)中5分钟，以除去残余的RBC，随后用PBS洗涤两次以终止裂解，并进行离心以收集细胞沉淀物。在一些情况下，此时用磁珠分选PBMC沉淀物，以便富集B细胞、T细胞或单核细胞。对于以下描述的RNA分析，将PBMC细胞沉淀物重悬浮于QiagenRLT裂解缓冲液中，并置于-80℃冰箱中直到进行分析。对于储存及在后续分析中的使用，细胞沉淀物作为活细胞冷冻，并重悬浮于90％FBS中，轻柔并缓慢地向该沉淀物中滴加10％DMSO溶液。将这些小瓶在Mister Frosty容器中预冷，并置于-80℃冰箱中24小时，然后永久储存于液氮罐中。
使用Qiagen All Prep试剂盒从PBMC中分离总DNA、RNA和蛋白质。使用下列反向BTK引物(称为BTK#2R)：5’–aagtgaaattggggcttgtg–3’(SEQ ID NO.:9)，采用购自Agilent Technologies的试剂盒(目录号600184)，经逆转录合成BTK mRNA的第一链cDNA。该反应遵照生产商的说明。将模板RNA、基因特异性引物、dNTP混合物和缓冲液在微管中混合。将该混合物在65℃下变性5分钟，在25℃下引物退火5分钟。然后加入DTT和AccuScript High Fidelity逆转录酶，并使DNA在42℃下延伸30至90分钟，冷却至4℃，然后在-20℃下保持。
然后使用来自Agilent Technologies的PfuUltra II HS聚合酶，经聚合酶链反应(PCR)扩增来自逆转录反应的mRNA-cDNA杂合体。在PCR反应中使用1至3微升的逆转录反应。使用相同的反向引物BTK#2R以及正向引物：(称为BTK#2F)5’–agtcccaccttccaagtcct–3’(SEQ ID NO.:10)。使用热循环仪的扩增采用下列PCR方案：步骤1–在95℃下变性2分钟；步骤2–在95℃下变性30秒，在55℃下退火30秒，在68℃下延伸1.25分钟；步骤3–重复步骤2三十九次；步骤4–在68℃下延伸5分钟，冷却至4℃，然后在-20℃下保持。通过溴化乙锭琼脂糖凝胶电泳分析10％的PCR产物。样品的剩余部分然后使用QiaQuick PCR产物纯化试剂盒纯化。
对完整BTK开放阅读框的两条链的测序在Sequetech Corporation(Mountain View,CA)进行，其使用由Sequetech设计并合成的引物。BTK的野生型mRNA序列(登录号NM_000061.2)在SEQ ID NO.:3中示出。抗性患者#1(200-004/200-007)的DNA序列在SEQ ID NO.:7中示出。抗性患者#2(350-105)的DNA序列在SEQ ID NO.:8中示出。测序显示，在接受依鲁替尼前/治疗早期从两名患者中收集的细胞中的mRNA序列是野生型，即，该RNA在BTK的氨基酸蛋白质序列中的第481位编码正常的半胱氨酸。在研究结束时(EOS)/治疗后期来自抗性患者的细胞中，mRNA的序列改变，使得该mRNA现在于BTK的第481位编码丝氨酸而不是半胱氨酸。抗性患者#1具有胸腺嘧啶(t)-1634至腺嘌呤(a)-1634的错义突变(即t1634a)。该突变将半胱氨酸-481密码子TGC改变为AGC(丝氨酸)。抗性患者#2具有鸟嘌呤(g)-1635至胞嘧啶(c)-1635的错义突变(即g1635c)。该突变也将半胱氨酸-481密码子TGC改变为TCC(丝氨酸)。
高度灵敏的等位基因特异性PCR分析(1％分析灵敏度)进一步证实了复发样品的基因组DNA中该突变的独特存在，提示该突变在患者治疗期间获得。对于基因组BTK DNA的PCR，使用下列4种引物：BTKg-F1：TGATGGGCTCCAAATCCCTG(SEQ ID NO:13)；BTKg-R1：AATGATGGCACCAGCAGC(SEQ ID NO:14)；BTKg-F2：AATCCCTGCTTGCTTCCACA(SEQ ID NO:15)；BTKg-R2：TTGATGGGCTCAGCACTGG(SEQ ID NO:16)。
在用于制备供测序的样品的单独方法中，在治疗前以及疾病进展后，使用QIAamp RNA Blood Mini试剂盒从患者的PBMC中分离总RNA。首先利用polyA选择对mRNA进行纯化，清除珠蛋白RNA(表达分析(Expression Analysis))，然后进行化学片段化。使用随机六聚体逆转录引物将mRNA片段转化为单链cDNA。接着，生成第二链以创建双链cDNA，随后进行末端修复及在分子的每个末端添加单A碱基。然后将允许附接到流动池表面上的衔接子连接到片段的每个末端。该衔接子含有独特的索引序列(表达分析(Expression Analysis))，该序列允许文库在多重化(multiplexing)过程中合并。然后进行PCR以扩增并富集所连接的物质，以创建cDNA文库，随后进行聚簇生成和使用TruSeq SBS试剂盒的直接Illumina(Illumina HiSeq 2000)合成测序。进行配对末端测序，每个样品在单独的测序泳道中运行。产生超过1亿个读取值，平均88x覆盖度/样品。
实施例2
在该实施例中，生成表达BTK C481S突变体的细胞系。将编码BTK C481S突变体的核酸***到表达载体构建体中，由此该核酸与启动子有效连接以供表达该突变蛋白质。将BTK C481S构建体稳定转染到诸如昆虫细胞的细胞系中用于重组蛋白产生，或者转染到诸如CHO细胞或Jurkat T细胞或鸡DT40BTK-/-B细胞系或人BTK敲除B细胞系的BTK缺陷细胞系中。
这些细胞系用于筛选第二代化合物或用于产生纯化的蛋白质以供体外试验如激酶试验使用。
对于体外试验，C481S BTK重组蛋白在诸如昆虫细胞的细胞中产生，纯化为均质，并评估其对包括通用肽或特异性下游底物(如PLCγ)在内的各种底物的酪氨酸激酶特异性活性，并进行体外激酶试验(C481S、ATP、辅因子Mg/Mn、肽底物)。PCi-32765(依鲁替尼)用作阴性对照。
鸡DT40BTK-/-或人BTK-/-用野生型BTK或C481S BTK稳定地转染，并用于HTS型功能试验中。在一个实例中，该细胞用抗-IgM/G刺激，以连接并激活B细胞受体(BCR)，因而激活这些细胞系中的下游BTK。刺激18小时后，使用以及不使用系列稀释的化合物评估这些细胞中的表面CD69激活。与C481S共价结合的BTK抑制剂预期在细胞洗出实验后会抑制并减少CD69。
实施例3
通过活性部位中C481的巯基的迈克尔添加，依鲁替尼与BCR信号传导的重要组成部分BTK共价结合，导致激酶活性的强而不可逆的抑制(Honigberg等人,PNAS 107(29):13075–13080)。结构建模证实，C481S突变将会破坏这种共价结合，但不会破坏依鲁替尼适配到酶活性部位中的能力(图1)。响应于BCR信号传导，LYN和SYK将BTK在Y551处磷酸化，诱导BTK在Y223处的自身磷酸化，从而导致激酶激活。因此，Y223的磷酸化反映了BTK酶活性。免疫印迹分析证实，当患者对依鲁替尼有反应时，p-BTK(Y223)相对于基线降低，并且随着疾病复发而升高(图2A，泳道3和4)。p-ERK的变化显示类似于p-BTK的趋势，在患者的临床反应过程中降低，随后在疾病复发时升高到基线以上，当4周后再评价时进一步升高。另一方面，p-AKT随依鲁替尼治疗而升高，并且不根据临床过程而改变。总之，p-BTK和p-ERK水平的变化彼此相关，并且提示该突变允许在依鲁替尼的存在下的BCR信号传导。
在示例性的方法中，也使用培养的、用编码人BTK的质粒转染的细胞(例如HEK293T细胞)，通过流式细胞分析来监测BTK在位点Y551处的磷酸化和某些相关的信号事件。HEK293T细胞中的表达导致BTK中Y551位点的组成型磷酸化，并且这可通过使用荧光偶联的抗体(BD Biosciences目录号558134)的流式细胞术来检测。HEK293T细胞中BTK的表达也导致Erk在T202/Y204处的磷酸化，并且这可通过使用BD Biosciences目录号612566的流式细胞术来检测。BTK中的Y551和Erk中的T202/Y204的磷酸化均被使用依鲁替尼(和达沙替尼)的治疗以剂量依赖性的方式抑制，并且当表达BTK的无激酶活性突变体而不是野生型或C481S BTK时，不发生组成型磷酸化，这表明BTK激酶活性是发生这些磷酸化事件所需要的。总BTK的表达水平通过使用BDBiosciences目录号558527的流式细胞术来监测。
用于制备细胞的一个示例性的程序如下：将HEK293T细胞接种到10cm板中，并且使之附着过夜。使用磷酸钙法，用含有在CMV启动子控制下的人野生型或C481S突变BTK或C481A突变BTK或K430A突变BTK(羧基末端6His融合体)的质粒转染细胞。转染后大约16小时，使细胞脱附并接种到多孔板中。大约24小时后，将细胞用依鲁替尼或其它抑制剂处理，并且或者使用低聚甲醛原位固定；或者机械脱附，洗涤到新鲜的无药物培养基中，并孵育1.5小时，然后固定。通透化处理的细胞用示出的BD Biosciences荧光标记的抗体染色，并在BD CantoII流式细胞仪上分析。FlowJo软件和荧光-1(fluorescence-minus-one)对照用来对阳性细胞群体进行门控(gate)，并且同样对每个样品应用门控。总阳性细胞计数表示为表达BTK的细胞的比例。
实施例4
在该实施例中，分析患者中的基因表达数据。使用建立的27-基因BCR表达特征(signature)(Blood.2011年1月13；117(2):563-74)获得的基因表达的RNA-Seq数据表明，反应性(responding)患者的BCR特征相对于治疗前基线下调(图2B)。然而，该基因簇的表达在初始评估和四周后这两个复发阶段均升高。
为了进行RNA-Seq，在治疗前以及疾病进展后使用QIAamp RNABlood Mini试剂盒从患者的PBMC中分离总RNA。首先利用polyA选择对mRNA进行纯化，清除珠蛋白RNA(表达分析(ExpressionAnalysis))，然后进行化学片段化。使用随机六聚体逆转录引物将mRNA片段转化为单链cDNA。接着，生成第二链以创建双链cDNA，随后进行末端修复及在分子的每个末端添加单A碱基。然后将允许附接到流动池表面上的衔接子连接到片段的每个末端。该衔接子含有独特的索引序列(表达分析(Expression Analysis))，该序列允许文库在多重化过程中合并。然后进行PCR以扩增并富集所连接的物质，以创建cDNA文库，随后进行聚簇生成和使用TruSeq SBS试剂盒的直接Illumina(IlluminaHiSeq 2000)合成测序。进行配对末端测序，每个样品在单独的测序泳道中运行。产生超过1亿个读取值，平均88x覆盖度/样品。使用具有Bowtie2对齐工具(aligner)的TopHat软件包，将这些读取值与HG19基因组装配体对齐。用samtools排除未定位到基因组的读取值或可能的PCR复制物。使用Cufflinks和cuffmerge定量转录物表达的水平。计算每百万个定位的读取值每千碱基的读取值(RPKM)：将定位到每个转录物序列的读取值的数目用以kb为单位的模板长度进行标准化，并除以定位到整个转录组的读取值的数目。使用Cluster 3.0软件进行BCR特征基因的层序聚类分析，并使用树视图(TreeView)生成热图。
值得注意的是，基因表达的变化趋势类似于p-BTK和p-ERK的变化趋势。总之，来自突变分析、信号转导和基因表达概况分析的数据强烈提示，1)BTK C481S突变的获得允许在依鲁替尼的存在下CLL细胞中的BCR信号传导，以及2)治疗过程中的BCR信号活性与患者的疾病状态相关。
实施例5
该实施例证实，依鲁替尼抑制来自反应性患者外周血的CLL细胞的增殖，但对来自已复发、具有BTK C481S突变的患者的细胞则不抑制。在反应性患者中，Ki-67+细胞的数目和细胞大小在依鲁替尼治疗过程中降低，但复发且具有突变的患者则不然。对来自这些患者的系列样品的分析也证实，在反应样品中，Ki-67+阳性CLL细胞的百分比从4.5％下降到0.53％。在复发1中，Ki-67+细胞的数目增加到5.3％，然后在复发2中增加到8.0％(图3A)。作为依鲁替尼对增殖的影响的进一步的证据，也显示了反映复发后增殖增加的细胞大小的变化(图4)。在本研究中，在复发样品中，增殖性CLL群体的大小从19-20％增加到35-36％(图3B，第二列)。使用依鲁替尼(250或500nM)对患者CLL细胞的处理完成阻断了治疗前(pre-Rx)和反应样品中的BrdU掺入(图3B，上两行，第3和第4列对比第2列)。然而，在两个复发样品中，留下了一些增殖性CLL细胞(图3B，下两行，第2、第3和第4列对比第1列)。因此，CLL对依鲁替尼的体外增殖反应符合患者的临床过程，并且获得对依鲁替尼治疗的抗性。
在流式细胞术中使用的抗体购自BD(San Jose,CA)并根据说明进行使用：CD3-V500、CD19-APCCy7、CD19-APC、CD5-PerCPCy5.5、CD5-FITC、CXCR4-PECy7、CXCR4-PE、CD38-PE、CD62L-PE、CCR7-V450、CXCR3-Alexa488、CXCR5-Alexa647、CD49d-APC、CD29-PE、CD44-V450、CD54-PE、CD11a-APC、CD11c-V450、CD18-FITC、CD40-PECy7、Ki67-Alexa488、Igκ轻链-APC、Ig l轻链-FITC。用于Western印迹法的抗体：针对ERK1和2的磷酸-p44/42MAP激酶[T202/Y204]、针对PKB/AKT的磷酸-AKT[Ser473](New England Biolabs,Ipswich,MA)、针对BTK的磷酸-BTK[Y551](BD Biosciences)、针对BTK的磷酸-BTK[Y223](Epitomics,Burlingame,CA)和针对PLCγ2的磷酸-PLCγ2[Y759](BD Biosciences)；抗-ERK2(C-14；Santa CruzBiotechnology,Santa Cruz,CA)、抗-AKT(H-136；Santa CruzBiotechnology)、抗-BTK(克隆53；BD Biosciences)、山羊F(ab)’2抗-人IgM(LE/AF；Southern Biotech,Birmingham,AL)、辣根过氧化物酶(HRP)-偶联的兔抗小鼠和HRP-偶联的山羊抗兔(DAKO,Houston,TX)。
实施例6
该实施例证实，BCR或替代途径的其它抑制剂可抑制CLL增殖并克服由C481S突变引起的抗性。使用体外CLL增殖模型，除依鲁替尼外，还用GS-1101(CAL-101，一种PI3Kdelta抑制剂)、达沙替尼(下游BCR靶标LYN和BTK)、PRT062070(一种SYK/JAK双重抑制剂)、PRT060318(高度特异性SYK抑制剂，ref)和托法替尼(一种JAK抑制剂)处理细胞。图3C显示，依鲁替尼和GS-1101使增殖从31％降至12和14％，而托法替尼只将增殖降低到21％。达沙替尼和两种具有针对SYK的活性的抑制剂(PRT062070和PRT060318)导致增殖的完全抑制。这些结果提示，BTK突变的CLL细胞保持对BCR抑制敏感。因此，LYN、SYK、JAK、PI3K、PLCγ、MAPK、MEK、NFκB的额外或替代抑制剂，BTK的其它共价抑制剂或BTK的其它可逆抑制剂，预计也对具有C481S突变的患者有效。
实施例7
依鲁替尼单一或联合疗法的早期试验选入了246名CLL患者，他们接受中值为14个月的依鲁替尼。在基线时和复发或病情进展(PD)后进行RNAseq和全外显子组测序(WES)及随后的比较基因组分析，并通过对3名获得依鲁替尼抗性的患者的Sanger测序来证实。使用TopHat和BWA软件比对RNAseq和WES数据。使用SAMtools mpileup鉴别单核苷酸变异(SNV)。与常规化学疗法后复发的患者相比，在依鲁替尼抗性患者中获得最小的基因组变化，反映了相对的基因组稳定性。在针对于复发样品的3名患者中发现了SNV。3名患者中的2名具有独特的SNV，这些SNV各自在BTK的第481位编码半胱氨酸至丝氨酸的置换(C481S)。BMX、ITK、TEC和BLK中的同源半胱氨酸残基是野生型(WT)。依鲁替尼对重组C481S的抑制强度比对野生型的抑制强度低25倍，并且不能共价结合在细胞中表达的C481S。第三名患者具有WT BTK，但是获得潜在的功能获得性突变，在PLCγ2的外显子19中的c1993t，其编码R665W置换，BTK的一种底物，与组成型PLCγ2激活一致。
在最初对依鲁替尼有反应但后来变为抗药性的患者的后续研究中，鉴别了两个额外的突变。核酸测序显示，在治疗开始时采集的患者血液样品为野生型，而在医生指定的疾病进展时采集的样品在下列位点处突变：1)发现一名患者已经获得PLCγ2中的突变。该突变是框内单核苷酸点突变：c2120t(即，在PLCγ2编码区的第2120位为胸腺嘧啶而不是胞嘧啶)。该突变导致在密码子707处丝氨酸被置换为苯丙氨酸的PLCγ2蛋白质(S707F)。2)发现一名患者已获得CARD11中的突变。该突变是三个胸腺嘧啶核苷酸在CARD11编码区的核苷酸位置694与695之间的***。该突变被命名为694_695insTTT。该突变导致在亮氨酸-232与赖氨酸-233之间***亮氨酸密码子的CARD11蛋白质。该突变体被称为L232_K233insL或L232LL。(注意，CARD11mRNA的翻译存在替代起始位点。在一些情况下，注意到该位点的CARD11突变是第225位而不是第232位)。
预计S707F突变是导致PLCγ2蛋白质的组成型活性的功能获得性突变。Zhou等人在American Journal of Human Genetics(2012)91；713-720中描述了PLCγ2中的一个类似的突变(S707Y)，其赋予对PLCγ2蛋白质的组成型活性，并导致自身炎性和免疫缺陷疾病。像R665W突变一样，S707F位于自身抑制性羧基末端SH2结构域中。鉴于PLCγ2位于BTK的下游，赋予功能获得性组成型PLCγ2活性的效果支持了对依鲁替尼的抗药性。
CARD11L232LL突变蛋白预期也具有组成型活性。如Lenz等人在Science(2008)319；1676-1679中所述，在B细胞淋巴瘤患者样品中发现了类似的突变(232与233之间的异亮氨酸***)。如Lenz等人所述，该突变赋予下游NF-kB途径的组成型活性和增强的细胞存活率。像PLCγ2一样，CARD11是一种在Btk下游激活的蛋白质。CARD11被PKCbeta磷酸化并激活，PKCbeta是Btk和PLCg2的下游效应物。因此，CARD11中赋予组成型活性的功能获得性突变可以绕开Btk，并使细胞在Btk抑制剂如依鲁替尼的存在下激活生长和抗凋亡信号途径。L232LL突变位于氨基末端卷曲螺旋结构域中，该结构域对CARD11寡聚化和NF-kB激活而言是至关重要的，并且其中CARD11中几个不同的突变已在B细胞淋巴瘤患者标本中发现。
本文仅为说明性目的描述了实施例和实施方案，并且对本领域技术人员提示的各种修改或改变将包括在本申请的精神和范围以及所附权利要求的范围内。

Claims (158)

1.一种确定受试者是否对使用共价和/或不可逆布鲁顿酪氨酸激酶(BTK)抑制剂的疗法具有较低反应性或可能成为有较低反应性的方法，其包括：
(a)检测来自该受试者的含有编码BTK多肽的核酸分子的样品，以确定所编码的BTK多肽是否在与SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的氨基酸位置481相对应的氨基酸位置处被修饰；以及
(b)如果该受试者具有该修饰，则将该受试者表征为对使用共价和/或不可逆BTK抑制剂的疗法具有抗性或可能成为有抗性的。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述受试者已施用共价和/或不可逆BTK抑制剂以用于治疗癌症。
3.一种优化受试者为了治疗癌症而接受共价和/或不可逆BTK抑制剂的疗法的方法，其包括：
(a)检测来自该受试者的含有编码BTK多肽的核酸分子的样品，以确定所编码的BTK多肽是否在与SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的氨基酸位置481相对应的氨基酸位置处被修饰；以及
(b)如果该受试者具有该修饰则中断使用该共价和/或不可逆BTK抑制剂的治疗，或者如果该受试者不具有该修饰则继续使用该共价和/或不可逆BTK抑制剂的治疗。
4.一种为使用第二代BTK抑制剂的疗法选择受试者的方法，其包括：
(a)检测来自该受试者的含有编码BTK多肽的核酸分子的样品，以确定所编码的BTK多肽是否在与SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的氨基酸位置481相对应的氨基酸位置处被修饰；以及
(b)如果该受试者具有该修饰，则将该受试者表征为使用第二代BTK抑制剂的疗法的候选者。
5.如权利要求2所述的方法，其进一步包括如果所述受试者具有所述修饰则中断使用共价和/或不可逆BTK抑制剂的治疗，或者如果所述受试者不具有所述修饰则继续使用共价和/或不可逆BTK抑制剂的治疗。
6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其进一步包括如果所述受试者具有所述修饰则施用抑制所述修饰BTK的第二代BTK抑制剂。
7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其进一步包括如果所述受试者具有所述修饰则施用LYN、SYK、JAK、PI3K、PLCγ、MAPK、MEK或NFκB的抑制剂。
8.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其进一步包括施用不与C481结合的BTK的共价抑制剂。
9.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其进一步包括如果所述受试者具有所述修饰则施用BTK的可逆抑制剂。
10.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其中该方法进一步包括从受试者获得样品。
11.如权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述修饰包括BTK多肽中氨基酸位置481处的氨基酸的置换或缺失。
12.如权利要求11所述的方法，其中所述修饰是在BTK多肽的氨基酸位置481处半胱氨酸被置换为选自亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸、甘氨酸、甲硫氨酸、丝氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、脯氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸和谷氨酸的氨基酸。
13.如权利要求12所述的方法，其中所述修饰是在BTK多肽的氨基酸位置481处半胱氨酸被置换为选自丝氨酸、甲硫氨酸或苏氨酸的氨基酸。
14.如权利要求13所述的方法，其中所述修饰是在BTK多肽的氨基酸位置481处半胱氨酸至丝氨酸的置换。
15.如权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述修饰包括编码所述BTK多肽的氨基酸位置481的核酸的缺失。
16.如权利要求1-10中任一项所述的方法，其中编码所述修饰BTK多肽的核酸在与SEQ ID NO:3所示核苷酸序列中的核酸位置1635相对应的核酸位置处具有鸟嘌呤至胞嘧啶的突变，或在与SEQ ID NO:3所示核苷酸序列中的核酸位置1634相对应的核酸位置处具有胸腺嘧啶至腺嘌呤的突变。
17.如权利要求1-16中任一项所述的方法，其中所述核酸分子是RNA或DNA。
18.如权利要求17所述的方法，其中所述DNA是基因组DNA。
19.如权利要求1-17中任一项所述的方法，其中该方法进一步包括从样品中分离mRNA。
20.如权利要求1-19中任一项所述的方法，其中检测包括扩增编码所述BTK多肽的氨基酸位置481的核酸。
21.如权利要求20所述的方法，其中扩增是通过聚合酶链反应(PCR)。
22.如权利要求21所述的方法，其中PCR扩增包括使用一对寡核苷酸引物，该引物位于编码所述BTK多肽的氨基酸位置481的区域的侧翼。
23.如权利要求22所述的方法，其中检测包括对所扩增的核酸进行测序。
24.如权利要求1-19中任一项所述的方法，其中检测包括使所述核酸与序列特异性核酸探针接触，其中该序列特异性核酸探针：
(a)与编码在氨基酸位置481处被修饰的修饰BTK的核酸结合；且
(b)不与编码在氨基酸位置481处具有半胱氨酸的野生型BTK的核酸结合。
25.如权利要求24所述的方法，其中检测包括使用所述序列特异性核酸探针的PCR扩增。
26.如权利要求1-25中任一项所述的方法，其中所述样品含有来自受试者的一种或多种肿瘤细胞。
27.如权利要求1-26中任一项所述的方法，其中所述样品含有循环肿瘤DNA(ctDNA)。
28.如权利要求1-27中任一项所述的方法，其中所述样品是肿瘤活检样品、血液样品、血清样品、淋巴样品或骨髓抽吸物。
29.如权利要求1-28中任一项所述的方法，其中所述共价或不可逆BTK抑制剂与野生型BTK的半胱氨酸481共价结合。
30.如权利要求1-29中任一项所述的方法，其中所述共价或不可逆BTK抑制剂选自依鲁替尼、PCI-45292、PCI-45466、AVL-101、AVL-291、AVL-292或ONO-WG-37。
31.如权利要求30所述的方法，其中所述BTK抑制剂是依鲁替尼。
32.如权利要求1-31中任一项所述的方法，其中所述受试者患有癌症。
33.如权利要求32所述的方法，其中所述癌症是血液***癌症。
34.如权利要求33所述的方法，其中所述癌症是B细胞恶性肿瘤。
35.如权利要求33或34所述的方法，其中所述癌症选自白血病、骨髓瘤或淋巴瘤。
36.如权利要求34或权利要求35所述的方法，其中所述B细胞恶性肿瘤是慢性淋巴细胞白血病(CLL)、小淋巴细胞淋巴瘤(SLL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、活化B细胞弥漫性大B细胞淋巴瘤(ABC-DLBCL)、生发中心弥漫性大B细胞淋巴瘤(GCB DLBCL)、原发性纵隔B细胞淋巴瘤(PMBL)、非霍奇金淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、滤泡淋巴瘤、免疫母细胞大细胞淋巴瘤、前体B淋巴母细胞淋巴瘤、前体B细胞急性淋巴母细胞性白血病、多毛细胞白血病、套细胞淋巴瘤、B细胞幼淋巴细胞白血病、淋巴质浆细胞淋巴瘤/瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、脾边缘区淋巴瘤、浆细胞性骨髓瘤、浆细胞瘤、结外边缘区B细胞淋巴瘤、结边缘区B细胞淋巴瘤、纵隔(胸腺)大B细胞淋巴瘤、血管内大B细胞淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤或淋巴瘤样肉芽肿病。
37.如权利要求1-36中任一项所述的方法，其中所述受试者患有实体瘤。
38.如权利要求2、3或5-37中任一项所述的方法，其中所述样品是在首次施用共价和/或不可逆BTK抑制剂后1周、2周、3周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月、14个月、16个月、18个月、20个月、22个月或24个月时获得的样品。
39.如权利要求2、3或5-38中任一项所述的方法，其中所述样品在使用不可逆BTK抑制剂治疗的过程中获得1、2、3、4、5、6、7、8、9、10次。
40.如权利要求38或39所述的方法，其中在首次施用时，所述受试者对使用不可逆BTK抑制剂的治疗有反应。
41.一种筛选抑制修饰BTK的化合物的方法，其包括：
(a)提供修饰BTK，其中该修饰BTK在与SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的氨基酸位置481相对应的氨基酸位置处被修饰；
(b)使该修饰BTK与测试化合物接触；以及
(c)检测BTK活性的水平，其中活性的降低指示该化合物抑制该修饰BTK。
42.如权利要求41所述的方法，其中所述修饰是BTK多肽的第481位氨基酸的置换或缺失。
43.如权利要求42所述的方法，其中所述修饰是在BTK多肽的氨基酸位置481处半胱氨酸被置换为选自亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸、甘氨酸、甲硫氨酸、丝氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、脯氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸和谷氨酸的氨基酸。
44.如权利要求43所述的方法，其中所述修饰是在BTK多肽的氨基酸位置481处半胱氨酸被置换为选自丝氨酸、甲硫氨酸和苏氨酸的氨基酸。
45.如权利要求44所述的方法，其中所述修饰是在BTK多肽的氨基酸位置481处半胱氨酸至丝氨酸的置换。
46.如权利要求41-45中任一项所述的方法，其中检测BTK活性的水平通过体外激酶试验来评估。
47.如权利要求46所述的方法，其中在所述激酶试验中使用的底物是PLCγ、ERK1/2或AKT。
48.如权利要求41-47中任一项所述的方法，其中在使BTK与测试化合物接触之前，将所述修饰BTK多肽从表达该修饰BTK多肽的宿主细胞中纯化。
49.如权利要求48所述的方法，其中所述宿主细胞稳定地表达所述修饰BTK多肽。
50.如权利要求48或权利要求49所述的方法，其中所述细胞是内源性野生型BTK表达缺陷的。
51.如权利要求50所述的方法，其中所述细胞是哺乳动物细胞、非哺乳动物细胞、禽类细胞、昆虫细胞、细菌细胞、酵母细胞或植物细胞。
52.如权利要求50所述的方法，其中所述细胞是鸡DT40BTK-/-B细胞或人BTK-/-B细胞。
53.一种分离的BTK多肽或其具有BTK活性的变体，其在与SEQID NO:1所示氨基酸序列的氨基酸位置481相对应的氨基酸位置处包含修饰，其中该修饰赋予所述修饰BTK多肽或变体对使用不可逆BTK抑制剂的抑制的抗性。
54.如权利要求53所述的分离的BTK多肽，其中所述修饰包括与SEQ ID NO:1所示的野生型BTK相比第481位氨基酸的置换。
55.如权利要求53或权利要求54所述的分离的BTK多肽，其中所述置换是C481S。
56.如权利要求53所述的分离的BTK多肽，其中所述修饰包括氨基酸位置481的缺失。
57.如权利要求53-56中任一项所述的分离的BTK多肽，其中该多肽包含与SEQ ID NO:1所示的野生型BTK相比第481位氨基酸的置换和一个或多个额外的氨基酸置换。
58.如权利要求53-57中任一项所述的分离的BTK多肽，其中该多肽包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列或与具有SEQ ID NO:2所示序列的多肽具有至少或至少约60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的变体，其中第481位氨基酸不是半胱氨酸。
59.如权利要求53-58中任一项所述的分离的BTK多肽，其中该多肽是纯化的蛋白质。
60.如权利要求59所述的分离的BTK多肽，其中该多肽是从细胞中纯化的。
61.如权利要求60所述的分离的BTK多肽，所述细胞是哺乳动物细胞、人细胞、细菌细胞、酵母细胞、禽类细胞、昆虫细胞、植物细胞或两栖动物细胞。
62.一种分离的核酸分子，其编码如权利要求53-61中任一项所述的分离的BTK多肽。
63.如权利要求62所述的分离的核酸，其中该核酸是DNA或RNA分子。
64.如权利要求62所述的分离的核酸，其中该核酸是cDNA分子。
65.如权利要求62-64中任一项所述的分离的核酸，其中该核酸包含SEQ ID NO:3所示的核酸序列，其中编码第481位氨基酸的核酸密码子被修饰，由此该密码子不编码半胱氨酸，或者该核酸包含与具有SEQID NO:3所示序列的核酸具有至少或至少约60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的变体，其中编码第481位氨基酸的核酸密码子不编码半胱氨酸。
66.如权利要求62或权利要求63所述的分离的核酸，其中该核酸包含SEQ ID NO:7、8、22或23所示的核酸序列或与具有SEQ ID NO:7、8、22或23所示序列的核酸具有至少或至少约60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的变体，其中编码第481位氨基酸的核酸密码子不编码半胱氨酸。
67.一种载体，其包含如权利要求62-66中任一项所述的核酸分子。
68.如权利要求67所述的载体，其中该载体是病毒或质粒载体。
69.如权利要求67或权利要求68所述的载体，其中所述核酸可操作地连接至启动子。
70.一种宿主细胞，其包含如权利要求62-66中任一项所述的核酸分子或如权利要求67-69中任一项所述的载体。
71.如权利要求70所述的宿主细胞，其中该细胞是原核细胞或真核细胞。
72.如权利要求71所述的宿主细胞，其中该细胞是哺乳动物细胞、细菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞、植物细胞或两栖动物细胞。
73.如权利要求72所述的宿主细胞，其中该细胞是灵长类动物细胞。
74.如权利要求73所述的宿主细胞，其中该细胞是人细胞。
75.一种突变BTK多肽，其由权利要求70-74中任一项的宿主细胞表达。
76.一种微芯片，其包含如权利要求53-58中任一项所述的突变BTK多肽或如权利要求62-66中任一项所述的核酸。
77.一种试剂盒，其包含一种或多种试剂，该试剂用于检测在氨基酸位置481处包含修饰的突变BTK多肽或编码在氨基酸位置481处包含修饰的突变BTK多肽的核酸。
78.如权利要求77所述的试剂盒，其包含一对寡核苷酸引物，该引物位于编码BTK多肽的氨基酸481的核酸区域的侧翼。
79.如权利要求77所述的试剂盒，其包含寡核苷酸引物，该引物
(a)与编码在氨基酸位置481处被修饰的修饰BTK的核酸结合；且
(b)不与编码在氨基酸位置481处具有半胱氨酸的野生型BTK的核酸结合。
80.如权利要求77所述的试剂盒，其包含微芯片，该微芯片包含
(a)具有修饰C481S的修饰BTK多肽，或其包含修饰C481S的一部分；或
(b)编码具有修饰C481S的突变BTK多肽的核酸分子，或其包含修饰C481S的一部分。
81.一种用于检测在受试者中对使用不可逆BTK抑制剂的抑制具有抗性的修饰BTK的***，其包含：
(a)来自该受试者的含有编码BTK多肽的核酸分子的样品；以及
(b)包含编码突变BTK多肽或其一部分的核酸的微阵列，该突变BTK多肽或其一部分在与SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的氨基酸位置481相对应的氨基酸位置处被修饰。
82.如权利要求81所述的***，其中所述微阵列包含在微芯片上。
83.一种用于检测在受试者中对使用不可逆BTK抑制剂的抑制具有抗性的修饰BTK的***，其包含：
(a)来自该受试者的含有编码BTK多肽的核酸分子的样品；以及
(b)序列特异性核酸探针，其中该序列特异性核酸探针：
(i)与编码在氨基酸位置481处被修饰的修饰BTK的核酸结合；且
(ii)不与编码在氨基酸位置481处具有半胱氨酸的野生型BTK的核酸结合。
84.一种用于检测在受试者中对使用不可逆BTK抑制剂的抑制具有抗性的修饰BTK的***，其包含：
(a)来自该受试者的含有编码BTK多肽的核酸分子的样品；以及
(b)一对寡核苷酸引物，其位于编码BTK多肽的氨基酸481的核酸区域的侧翼。
85.一种在患有血液***癌症的患者中进行维持疗法的方法，其包括：
(a)向该患者施用维持疗法方案，该方案包括施用治疗有效剂量的共价和/或不可逆BTK抑制剂；以及
(b)在所述维持疗法方案的过程中以预定的时间间隔监测该患者，以确定受试者是否在编码BTK的内源基因中具有突变，该突变导致与SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的氨基酸位置481相对应的氨基酸位置处的修饰。
86.如权利要求85所述的方法，其中监测包括：
检测来自所述受试者的含有编码BTK多肽的核酸分子的样品，以确定所述编码的BTK多肽是否在与SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的氨基酸位置481相对应的氨基酸位置处被修饰。
87.如权利要求85或86所述的方法，其中该方法进一步包括如果所述受试者具有所述突变则中断维持疗法方案，或者如果所述受试者不具有所述突变则继续维持疗法方案。
88.如权利要求85或86所述的方法，其中该方法进一步包括如果所述受试者具有所述突变则施用抑制所述修饰BTK的第二代BTK抑制剂。
89.如权利要求85-88中任一项所述的方法，其进一步包括如果所述受试者具有所述修饰则施用LYN、SYK、JAK、PI3K、PLCγ、MAPK、MEK或NFκB的抑制剂。
90.如权利要求85-88中任一项所述的方法，其进一步包括施用不与C481结合的BTK的共价抑制剂。
91.如权利要求85-88中任一项所述的方法，其进一步包括如果所述受试者具有所述修饰则施用BTK的可逆抑制剂。
92.如权利要求85-91中任一项所述的方法，其中所述BTK多肽中的修饰是C481S。
93.如权利要求85-92中任一项所述的方法，其中所述核酸中的突变是在与SEQ ID NO:3所示核苷酸序列中的核酸位置1635相对应的核酸位置处鸟嘌呤至胞嘧啶的突变，或在与SEQ ID NO:3所示核苷酸序列中的核酸位置1634相对应的核酸位置处胸腺嘧啶至腺嘌呤的突变。
94.如权利要求85-93中任一项所述的方法，其中所述预定的时间间隔是每周、每个月、每2个月、每3个月、每4个月、每5个月、每6个月、每7个月、每8个月、每9个月、每10个月、每11个月或每年。
95.如权利要求85-94中任一项所述的方法，其中所述样品含有一种或多种癌细胞。
96.如权利要求85-94中任一项所述的方法，其中所述样品含有ctDNA。
97.如权利要求85-96中任一项所述的方法，其中该方法进一步包括在用不可逆BTK抑制剂治疗前检测来自所述受试者的样品。
98.如权利要求85-97中任一项所述的方法，其中所述血液***癌症是B细胞恶性肿瘤。
99.如权利要求85-98中任一项所述的方法，其中所述癌症是白血病、淋巴瘤或骨髓瘤。
100.如权利要求85-99中任一项所述的方法，其中所述癌症是慢性淋巴细胞白血病(CLL)、小淋巴细胞淋巴瘤(SLL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、活化B细胞弥漫性大B细胞淋巴瘤(ABC-DLBCL)、生发中心弥漫性大B细胞淋巴瘤(GCB DLBCL)、原发性纵隔B细胞淋巴瘤(PMBL)、非霍奇金淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、滤泡淋巴瘤、免疫母细胞大细胞淋巴瘤、前体B淋巴母细胞淋巴瘤、前体B细胞急性淋巴母细胞性白血病、多毛细胞白血病、套细胞淋巴瘤、B细胞幼淋巴细胞白血病、淋巴质浆细胞淋巴瘤/瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、脾边缘区淋巴瘤、浆细胞性骨髓瘤、浆细胞瘤、结外边缘区B细胞淋巴瘤、结边缘区B细胞淋巴瘤、纵隔(胸腺)大B细胞淋巴瘤、血管内大B细胞淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤或淋巴瘤样肉芽肿病。
101.如权利要求100所述的方法，其中所述B细胞恶性肿瘤是CLL。
102.如权利要求85-101中任一项所述的方法，其中所述共价和/或不可逆BTK抑制剂选自依鲁替尼、PCI-45292、PCI-45466、AVL-101、AVL-291、AVL-292或ONO-WG-37。
103.如权利要求102所述的方法，其中所述共价和/或不可逆BTK抑制剂是依鲁替尼。
104.如权利要求103所述的方法，其中所述维持疗法方案包括以约10mg/天至约2000mg/天、约50mg/天至约1500mg/天、约100mg/天至约1000mg/天、约250mg/天至约850mg/天或约300mg/天至约600mg/天的每日剂量施用所述BTK抑制剂。
105.一种确定受试者是否对使用BTK抑制剂的疗法具有较低反应性或可能成为有较低反应性的方法，其包括：
(a)检测来自该受试者的含有编码PLCγ2多肽的核酸分子的样品，以确定所编码的PLCγ2多肽是否在与SEQ ID NO:11所示氨基酸序列的氨基酸位置665或707相对应的氨基酸位置处被修饰；以及
(b)如果该受试者在氨基酸位置665或707处具有修饰，则将该受试者表征为对使用BTK抑制剂的疗法具有抗性或可能成为有抗性的。
106.一种监测为了治疗癌症而接受BTK抑制剂的受试者是否已经发展或可能发展出对该疗法的抗性的方法，其包括：
(a)检测来自该受试者的含有编码PLCγ2多肽的核酸分子的样品，以确定所编码的PLCγ2多肽是否在与SEQ ID NO:11所示氨基酸序列的氨基酸位置665或707相对应的氨基酸位置处被修饰；以及
(b)如果该受试者在氨基酸位置665或707处具有修饰，则将该受试者表征为对使用BTK抑制剂的疗法具有抗性或可能成为有抗性的。
107.一种优化为了治疗癌症而接受BTK抑制剂的受试者的疗法的方法，其包括：
(a)检测来自该受试者的含有编码PLCγ2多肽的核酸分子的样品，以确定所编码的PLCγ2多肽是否在与SEQ ID NO:11所示氨基酸序列的氨基酸位置665或707相对应的氨基酸位置处被修饰；以及
(b)如果该受试者在氨基酸位置665或707处具有修饰则中断使用该BTK抑制剂的治疗，或者如果该受试者不具有该修饰则继续使用该BTK抑制剂的治疗。
108.如权利要求105-107中任一项所述的方法，其中所述PLCγ2多肽中的修饰是R665W或S707F。
109.如权利要求105-108中任一项所述的方法，其中编码所述修饰PLCγ2多肽的核酸在与SEQ ID NO:26所示核苷酸序列中的核酸位置1993相对应的核酸位置处具有胞嘧啶至胸苷的突变，或在与SEQ ID NO:26所示核苷酸序列中的核酸位置2120相对应的核酸位置处具有胞嘧啶至胸苷的突变。
110.如权利要求105-109中任一项所述的方法，其中所述BTK抑制剂是可逆或不可逆BTK抑制剂。
111.如权利要求105-108中任一项所述的方法，其中所述BTK抑制剂是共价BTK抑制剂。
112.如权利要求105-108中任一项所述的方法，其中所述BTK抑制剂与BTK的半胱氨酸481共价结合。
113.如权利要求105-108中任一项所述的方法，其中所述BTK抑制剂选自依鲁替尼、PCI-45292、PCI-45466、AVL-101、AVL-291、AVL-292或ONO-WG-37。
114.如权利要求105-108中任一项所述的方法，其中所述BTK抑制剂是依鲁替尼。
115.一种分离的PLCγ2多肽或其具有PLCγ2活性的变体，其在与SEQ ID NO:11所示氨基酸序列的氨基酸位置665或707相对应的氨基酸位置处包含修饰，其中该修饰赋予癌细胞对使用BTK抑制剂的抑制的抗性。
116.如权利要求115所述的分离的PLCγ2多肽，其中所述BTK抑制剂是依鲁替尼。
117.如权利要求115或116所述的分离的PLCγ2多肽，其中该分离的PLCγ2多肽包含SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列或与具有SEQID NO:17所示序列的多肽具有至少或至少约60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的变体，其中第665位氨基酸不是精氨酸。
118.如权利要求117所述的分离的PLCγ2多肽，其中第665位氨基酸是色氨酸。
119.如权利要求115或116所述的分离的PLCγ2多肽，其中该分离的PLCγ2多肽包含SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列或与具有SEQID NO:18所示序列的多肽具有至少或至少约60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的变体，其中第707位氨基酸不是丝氨酸。
120.如权利要求119所述的分离的PLCγ2多肽，其中第707位氨基酸是苯丙氨酸。
121.一种分离的核酸分子，其编码如权利要求115-120中任一项所述的分离的PLCγ2多肽。
122.如权利要求121所述的分离的核酸，其中该核酸是DNA或RNA分子。
123.如权利要求121所述的分离的核酸，其中该核酸是cDNA分子。
124.如权利要求121-123中任一项所述的分离的核酸，其中该核酸包含SEQ ID NO:26或27所示的核酸序列，或与具有SEQ ID NO:26或27所示序列的核酸具有至少或至少约60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的变体，其中编码第665位氨基酸的核酸密码子不编码精氨酸，或者编码第707位氨基酸的核酸密码子不编码丝氨酸。
125.一种用于检测修饰PLCγ2的***，该修饰PLCγ2赋予受试者中对使用不可逆BTK抑制剂的抑制的抗性，该***包含：
(a)来自该受试者的含有编码PLCγ2多肽的核酸分子的样品；以及
(b)包含编码修饰PLCγ2多肽或其一部分的核酸的微阵列，该修饰PLCγ2多肽或其一部分在与SEQ ID NO:11所示氨基酸序列的氨基酸位置665或707相对应的氨基酸位置处被修饰。
126.如权利要求125所述的***，其中所述微阵列包含在微芯片上。
127.一种用于检测修饰PLCγ2的***，该修饰PLCγ2赋予受试者中对使用不可逆BTK抑制剂的抑制的抗性，该***包含：
(a)来自该受试者的含有编码PLCγ2多肽的核酸分子的样品；以及
(b)序列特异性核酸探针，其中该序列特异性核酸探针：
(i)与编码在氨基酸位置665或707处被修饰的修饰PLCγ2的核酸结合；且
(ii)不与编码在氨基酸位置665处具有精氨酸或在氨基酸位置707处具有丝氨酸的野生型PLCγ2的核酸结合。
128.一种用于检测修饰PLCγ2的***，该修饰PLCγ2赋予受试者中对使用不可逆BTK抑制剂的抑制的抗性，该***包含：
(a)来自该受试者的含有编码PLCγ2多肽的核酸分子的样品；以及
(b)一对寡核苷酸引物，其位于编码PLCγ2多肽的氨基酸665或氨基酸707的核酸区域的侧翼。
129.如权利要求125-128中任一项所述的***，其中所述PLCγ2多肽中的修饰是R665W或S707F。
130.一种在患有血液***癌症的患者中进行维持疗法的方法，其包括：
(a)向该患者施用维持疗法方案，该方案包括施用治疗有效剂量的BTK抑制剂；以及
(b)在所述维持疗法方案的过程中以预定的时间间隔监测该患者，以确定受试者是否在编码PLCγ2的内源基因中具有突变，该突变导致与SEQ ID NO:11所示氨基酸序列的氨基酸位置665或707相对应的氨基酸位置处的修饰。
131.如权利要求129所述的方法，其中所述PLCγ2多肽中的修饰是R665W或S707F。
132.一种确定受试者是否对使用BTK抑制剂的疗法具有较低反应性或可能成为有较低反应性的方法，其包括：
(a)检测来自该受试者的含有编码CARD11多肽的核酸分子的样品，以确定所编码的CARD11多肽是否在与SEQ ID NO:19所示氨基酸序列的氨基酸位置232相对应的氨基酸位置处被修饰；以及
(b)如果该受试者在氨基酸位置232处具有修饰，则将该受试者表征为对使用BTK抑制剂的疗法具有抗性或可能成为有抗性的。
133.一种监测为了治疗癌症而接受BTK抑制剂的受试者是否已经发展或可能发展出对该疗法的抗性的方法，其包括：
(a)检测来自该受试者的含有编码CARD11多肽的核酸分子的样品，以确定所编码的CARD11多肽是否在与SEQ ID NO:19所示氨基酸序列的氨基酸位置232相对应的氨基酸位置处被修饰；以及
(b)如果该受试者在氨基酸位置232处具有修饰，则将该受试者表征为对使用BTK抑制剂的疗法具有抗性或可能成为有抗性的。
134.一种优化受试者为了治疗癌症而接受BTK抑制剂的疗法的方法，其包括：
(a)检测来自该受试者的含有编码CARD11多肽的核酸分子的样品，以确定所编码的CARD11多肽是否在与SEQ ID NO:19所示氨基酸序列的氨基酸位置232相对应的氨基酸位置处被修饰；以及
(b)如果该受试者在氨基酸位置232处具有修饰则中断使用该BTK抑制剂的治疗，或者如果该受试者不具有该修饰则继续使用该BTK抑制剂的治疗。
135.如权利要求132-134中任一项所述的方法，其中所述CARD11多肽中的修饰是SEQ ID NO:19所示氨基酸序列的氨基酸232后的氨基酸***。
136.如权利要求132-135中任一项所述的方法，其中所述CARD11多肽中的修饰是L232LL。
137.如权利要求132-136中任一项所述的方法，其中编码所述修饰CARD11多肽的核酸在与SEQ ID NO:24所示核苷酸序列中的核酸位置694相对应的核酸位置处具有三个胸苷核苷酸的***。
138.如权利要求132-137中任一项所述的方法，其中所述BTK抑制剂是可逆或不可逆BTK抑制剂。
139.如权利要求132-137中任一项所述的方法，其中所述BTK抑制剂是共价BTK抑制剂。
140.如权利要求132-137中任一项所述的方法，其中所述BTK抑制剂与BTK的半胱氨酸481共价结合。
141.如权利要求132-137中任一项所述的方法，其中所述BTK抑制剂选自依鲁替尼、PCI-45292、PCI-45466、AVL-101、AVL-291、AVL-292或ONO-WG-37。
142.如权利要求132-137中任一项所述的方法，其中所述BTK抑制剂是依鲁替尼。
143.一种分离的CARD11多肽或其具有CARD11活性的变体，其在与SEQ ID NO:19所示氨基酸序列的氨基酸位置232相对应的氨基酸位置处包含修饰，其中该修饰赋予癌细胞对使用BTK抑制剂的抑制的抗性。
144.如权利要求143所述的分离的CARD11多肽，其中所述BTK抑制剂是依鲁替尼。
145.如权利要求143或144所述的分离的CARD11多肽，其中该分离的CARD11多肽包含SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列或与具有SEQ ID NO:20所示序列的多肽具有至少或至少约60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的变体。
146.如权利要求145所述的分离的CARD11多肽，其中该CARD11多肽相对于SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列在氨基酸232后具有氨基酸的***。
147.如权利要求146所述的分离的CARD11多肽，其中所述氨基酸是亮氨酸。
148.一种分离的核酸分子，其编码如权利要求143-147中任一项所述的分离的CARD11多肽。
149.如权利要求148所述的分离的核酸，其中该核酸是DNA或RNA分子。
150.如权利要求148所述的分离的核酸，其中该核酸是cDNA分子。
151.如权利要求148-150中任一项所述的分离的核酸，其中该核酸包含SEQ ID NO:25所示的核酸序列或与具有SEQ ID NO:25所示序列的核酸具有至少或至少约60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的变体。
152.一种用于检测修饰CARD11的***，该修饰CARD11赋予受试者中对使用不可逆BTK抑制剂的抑制的抗性，该***包含：
(a)来自该受试者的含有编码CARD11多肽的核酸分子的样品；以及
(b)包含编码修饰CARD11多肽或其一部分的核酸的微阵列，该修饰CARD11多肽或其一部分在与SEQ ID NO:19所示氨基酸序列的氨基酸位置232相对应的氨基酸位置处被修饰。
153.如权利要求152所述的***，其中所述微阵列包含在微芯片上。
154.一种用于检测修饰CARD11的***，该修饰CARD11赋予受试者中对使用不可逆BTK抑制剂的抑制的抗性，该***包含：
(a)来自该受试者的含有编码CARD11多肽的核酸分子的样品；以及
(b)序列特异性核酸探针，其中该序列特异性核酸探针：
(i)与编码在氨基酸位置232处被修饰的修饰CARD11的核酸结合；且
(ii)不与编码SEQ ID NO:19所示野生型CARD11的核酸结合。
155.一种用于检测修饰CARD11的***，该修饰CARD11赋予受试者中对使用不可逆BTK抑制剂的抑制的抗性，该***包含：
(a)来自该受试者的含有编码CARD11多肽的核酸分子的样品；和
(b)一对寡核苷酸引物，其位于编码CARD11多肽的氨基酸232的核酸区域的侧翼。
156.如权利要求152-155中任一项所述的***，其中所述CARD11多肽中的修饰是L232LL。
157.一种在患有血液***癌症的患者中进行维持疗法的方法，其包括：
(a)向该患者施用维持疗法方案，该方案包括施用治疗有效剂量的BTK抑制剂；以及
(b)在所述维持疗法方案的过程中以预定的时间间隔监测该患者，以确定受试者是否在编码CARD11的内源基因中具有突变，该突变导致与SEQ ID NO:19所示氨基酸序列的氨基酸位置232相对应的氨基酸位置处的修饰。
158.如权利要求157所述的方法，其中所述CARD11多肽中的修饰是L232LL。
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