KR102106821B1

KR102106821B1 - 이브루티닙을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물

Info

Publication number: KR102106821B1
Application number: KR1020190048689A
Authority: KR
Inventors: 허향숙; 김정연; 남혜연; 이주영; 남영표; 강리진; 이현주
Original assignee: 재단법인대구경북과학기술원
Priority date: 2018-04-27
Filing date: 2019-04-25
Publication date: 2020-05-06
Also published as: JP2021522277A; KR20190125214A; EP4331672A2; EP3785715A4; US20210322419A1; US11826368B2; EP3785715A1; JP7120553B2

Abstract

본 발명은 이브루티닙을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 이브루티닙은 미세아교세포(microglia) 또는 성상세포(astrocyte)의 활성을 억제하여 활성화된 미세아교세포 또는 활성화된 성상세포가 신경세포에 미치는 손상을 억제하는 효과가 있고, LPS(Lipopolysaccharides)에 의해 유도되는 미세아교세포의 세포이동을 억제하는 효과가 우수하며 아밀로이드 플라크 감소 및 타우 단백질의 인산화도 저해 활성을 가질 뿐만 아니라, 기억력 및 학습력을 향상시킬 수 있는 효과가 있어 퇴행성 뇌질환을 예방 또는 치료할 수 있는 치료제로 활용할 수 있다.

Description

이브루티닙을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물{Pharmaceutical composition for the prevention or treatment of neurodegenerative disease comprising ibrutinib an active ingredient}

본 발명은 이브루티닙을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

퇴행성 뇌질환은 나이가 들어감에 따라 발생하는 퇴행성 질환 중에서도 뇌에서 발생하는 질환을 뜻하며, 주요증상과 침범되는 뇌부위를 고려해 구분할 수 있는데, 대표적으로 알츠하이머 질환(Alzheimers disease)이나 파킨슨 질환 등이 포함된다. 퇴행성 뇌질환은 노화에 따른 신경퇴화와 유전적환경적 요인들로 인해 단백질이 응집돼 신경세포의 사멸로 야기되는 것으로 알려져 있다.

또한, 퇴행성 뇌질환은 특정 뇌세포의 사멸 또는 퇴화가 일시적 또는 오랜 기간에 걸쳐 진행하는 것이 있는데, 한번 죽은 뇌세포는 재생이 되지 않기 때문에 결국 치명적인 뇌기능의 손실로 이어져 발생하는 것으로 알려져 있고, 특히, 인지기능, 감각기능, 운동기능, 전신기능의 진행성 저하를 수반하는 뇌기능 부전은 결국 성격과 행동의 변화를 가져오고, 환자들이 스스로 자신을 돌볼 수 없는 지경에 이르게 한다. 이러한 뇌세포 사멸의 주요 경로로는 산화적 스트레스에 의한 산화적 독성, 흥분적 독성, 세포자멸사(apoptosis) 등이 제시되고 있으며, 각각은 특이한 신호전달과정을 통하여 세포사멸을 유발하게 된다. 구체적으로, 뇌졸증, 뇌손상, 알츠하이머병(Alzheimer's disease, AD), 파킨슨 병 환자에서 뇌세포 사멸의 주원인으로 활성 산소종(Reactive Oxygen Species)의 축적 후 단백질, 핵산, 지질의 산화적인 손상이 제시되었고, 특히 자유 라디칼(free radicals)에 의한 산화적 스트레스는 체내의 각 조직에서 일어나는 세포 사멸의 주원인으로 보고되고 있으며, 뇌신경질환에서 나타나는 세포사멸의 주기전의 하나로도 제시되어 왔다(Schapira, A.H., Curr. Opin. Neurol., 9(4):260-264, 1996).

또한, 미세아교세포(microglia)와 성상세포(astrocyte)의 활성은 퇴행성 뇌신경질환의 발병과 진행에 관련되어 있다고 보고되고 있으며, 미세아교세포(microglia)는 중추신경계(CNS)에 상주하는 면역세포로 외부의 자극에 의해 활성화되어 면역반응과 염증반응을 유발하는 것으로 알려져 있다. 미세아교세포(microglia)는 중추신경계에서 일차적인 면역 기능을 수행하는 세포로서, 가늘고 긴 가지와 얇은 세포체의 모양을 유지하고 있다가 외부에서 유입되거나 내부에서 발생되는 독소들이 존재하게 되면 이들 독소로부터 신경 세포를 보호하기 위해 굵고 짧은 가지와 뚱뚱한 세포체를 가지는 활성화된 모양으로 변화하게 된다.

그러나 박테리아의 내독소인 리포폴리사카라이드(lipopolysaccharide, LPS), 인터페론-γ, 베타아밀로이드 또는 갱글리오사이드와 같은 물질로 미세아교세포가 활성화가 되면 정상상태의 미세아교세포와는 달리 포식작용을 활발히 하고, 세포증식을 하며 TNF-α, IL-1β 및 IL-6 등과 같은 사이토카인, 케모카인, iNOS(inducible nitric oxide synthase), COX-2(cyclooxygenase-2) 등의 유전자를 발현시켜 염증매개물질들을 생성한다. 이러한 미세아교세포의 활성화는 손상된 세포를 제거하고 외부에서 침입하는 박테리아나 바이러스로부터 신경세포를 보호하는 일면이 있으나 iNOS에 의해 생성되는 일산화질소(NO)와 COX-2에 의해 생성되는 프로스타글란딘들, TNF-α 등은 신경세포에도 독성을 나타내기 때문에 결과적으로 미세아교세포의 활성화는 신경세포의 손상을 악화시키게 된다. 따라서 미세아교세포의 적절한 활성화 억제는 퇴행성 뇌질환을 치료할 수 있는 또 다른 방법이 될 수 있다.

또한, 성상세포(astrocyte)는 뇌의 발생과정 뿐만 아니라 정상적인 뇌활동을 유지하는데 중요한 역할을 한다. 뇌에서의 성상세포는 신경세포가 분비하는 신경전달물질을 적절하게 제거하거나 뇌에서의 이온농도를 조절하면서 신경세포 활성을 보조하는 역할을 하는 것으로 밝혀져 있고, 이 외에도 신경줄기세포가 신경세포로 분화하는데 결정적인 역할을 하는 것으로 밝혀진 바 있다.

그러나 성상세포는 뇌에 상해를 입었을 때, 증식이 활발해 지고 스웰링(swelling)이 일어나며 성상교세포증(astrogliosis)과 같은 반응성 성상세포로 활성화가 된다. 이러한 반응성 성상세포는 에이즈성 치매, 뇌 손상, 허혈성 뇌질환, 알츠하이머병 등에서 관찰되어지고 있다. 따라서 지속적인 성상세포의 활성화는 결국 신경세포의 사멸을 초래한다. 따라서 성상세포의 적절한 활성화 억제 역시 퇴행성 뇌질환을 치료할 수 있는 또 다른 방법이 될 수 있다.

현재 퇴행성 뇌질환을 치료하기 위해 사용되고 있는 치료법으로는 약물치료법, 수술치료법 및 물리치료법등이 있는데, 약물치료의 경우, 일반적으로 뇌에서 부족해진 도파민을 보충해주고, 도파민의 부족으로 인한 신경전달물질의 불균형을 맞춰주며, 신경세포의 파괴를 예방 또는 지연시키고자 하는 목적과 기타 우울증 등의 증상을 조절하기 위한 약물들이 사용되고 있다.

그러나 이러한 약물은 죽어버린 신경세포를 다시 살릴 수 없기 때문에 완치를 목적으로 하는 것이 아니라 증상의 조절을 목적으로 한다는 한계가 있어, 보다 효과적으로 퇴행성 뇌질환을 예방 또는 치료할 수 있는 새로운 치료제의 개발이 시급한 실정이다.

한편, 이브루티닙(Ibrutinib)은 B-세포 악성 종양을 표적으로 하는 항암제로 알려져 있으며, 악성 종양 B 세포가 제어 불가능하게 성장하고 분열하도록 자극하는 신호를 차단하는 작용을 하는 것으로 밝혀진 바 있다. 이러한 이브루티닙은 2013년 11월에 외투 세포 림프종의 치료에 대해, 2014년 2월에는 만성 림프구성 백혈병 치료에 대해 미국 FDA의 승인을 받았다.

그러나 아직까지 이브루티닙(Ibrutinib)이 퇴행성 뇌질환을 치료할 수 있는 치료제로서 사용 가능함을 규명한 예가 없다.

미국등록특허 7,514,444호

이에 본 발명자들은 종래 항암제로 알려진 이브루티닙(Ibrutinib)이 퇴행성 뇌질환을 예방 또는 치료할 수 있는 치료제로서 사용 가능함을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

그러므로 본 발명의 목적은 이브루티닙(ibrutinib) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

또한 본 발명의 다른 목적은 시험관 내에서 이브루티닙(ibrutinib) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 뇌신경 세포에 처리하는 단계를 포함하는, 미세아교세포(microglia) 또는 성상세포(astrocyte)의 활성 억제 방법을 제공하는 것이다.

또한 본 발명의 다른 목적은 시험관 내에서 이브루티닙(ibrutinib) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 뇌신경 세포에 처리하는 단계를 포함하는, LPS로 유도되는 미세아교세포(microglia)의 세포 이동을 억제하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 이브루티닙(ibrutinib) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 조성물은 미세아교세포(microglia) 또는 성상세포(astrocyte)의 활성을 억제하여 활성화된 미세아교세포 또는 활성화된 성상세포가 신경세포에 미치는 손상을 억제하는 효과를 갖는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 조성물은 미세아교세포의 세포이동을 억제하는 활성을 갖는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 미세아교세포 또는 성상세포의 활성; 또는 미세아교세포의 세포이동은 LPS(Lipopolysaccharides)에 의해 유도되는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 조성물은 아밀로이드 플라크 억제 또는 타우 단백질의 인산화 억제 활성을 갖는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 조성물은 신경세포에서 기억력과 학습력에 관여하는 수상돌기가지(dendritic spine)의 수 및 시냅토파이신(synaptophysin) 및 PSD-95의 풍타 수(puncta number)를 증가시켜 기능적 시냅스를 증가시키는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 조성물은 알츠하이머 질병 모델에서 장기 기억력을 향상시키는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 퇴행성 뇌질환은 알츠하이머, 파킨슨병, 헌팅톤병, 다발성 경화증, 다발성 신경위축, 간질, 뇌질환(encephalopathy), 뇌졸중, 기억장애, 인지장애 및 학습장애로 이루어진 군 중에서 선택되는 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 시험관 내에서 이브루티닙(ibrutinib) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 뇌신경 세포에 처리하는 단계를 포함하는, 미세아교세포(microglia) 또는 성상세포(astrocyte)의 활성을 억제하는 방법을 제공한다.

또한 본 발명은 시험관 내에서 이브루티닙(ibrutinib) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 뇌신경 세포에 처리하는 단계를 포함하는, LPS로 유도되는 미세아교세포(microglia)의 세포 이동을 억제하는 방법을 제공한다.

본 발명은 이브루티닙의 퇴행성 뇌질환에 대한 치료제 용도에 관한 것으로, 미세아교세포 및 성상세포의 활성을 효과적으로 억제함으로써 염증성 사이토카인의 생산을 감소시켜 염증을 억제하고, 활성화된 미세아교세포 및 성상세포가 신경세포에 미치는 손상에 대한 보호 효과가 우수할 뿐만 아니라, 퇴행성 뇌질환의 원인인 아밀로이드 플라크 및 타우(Tau) 인산화를 억제하는 효과가 있고, 아밀로이드 베타 분해 효소인 IDE의 발현수준을 증가시켜 아밀로이드 플라크의 생성을 억제 및 알츠하이머 질병 동물 모델에서 장기기억을 향상시키는 효과가 있고, 더불어 기억력 및 학습력과 연관된 수상돌기가지(dendritic spine)의 수를 증가시켜 기억력 및 학습력 증진을 통해 퇴행성 뇌신경질환을 예방, 개선 및 치료할 수 있는 바, 이브루티닙을 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료제로 유용하게 사용할 수 있다.

도 1은 미세아교세포에 대한 이브루티닙의 세포독성 여부를 확인한 결과를 나타낸 것으로, 1a는 이브루티닙을 100, 250, 500, 750, 1000nM 농도별로 처리한 후 세포 생존도를 분석한 것이고, 1b는 이브루티닙을 1, 5, 10, 25, 50μM 농도별로 처리한 후 세포 생존도를 분석한 것이며, 1c는 LPS로 자극된 BV2 미세아교세포 및 이브루티닙를 전처리한 후 LPS로 자극된 BV2 미세아교세포의 세포형태를 현미경으로 관찰한 사진을 나타낸 것이다.
도 2는 BV2 미세아교세포에 이브루티닙을 전처리한 후, 각 전염증성 사이토카인의 발현수준을 RT-PCR을 통해 확인한 결과를 나타낸 것이고(도 2a~2f), 도 2g는 분석 세포를 항-CD11b 항체, COX-2 항체 또는 항-CD11b 및 IL-1β 항체를 사용하여 염색된 세포를 현미경으로 관찰한 것이며, 2h 및 2i는 이브루티닙 처리에 따른 IL-1β, COX-2의 발현수준을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 BV2 미세아교세포에 이브루티닙 전처리에 따른 LPS로 유도된 전염증성 사이토카인의 수준을 RT-PCR을 통해 확인한 결과를 나타낸 것이다(도 3a~3f).
도 4는 초대배양 미세아교세포에 이브루티닙을 전처리한 후, LPS로 유도된 전염증성 사이토카인들의 발현 수준을 RT-PCR을 통해 확인한 결과를 나타낸 것이다(도 4a~4f).
도 5는 초대배양 성상세포에 이브루티닙을 전처리한 후, LPS로 유도된 전염증성 사이토카인들의 발현 수준을 RT-PCR을 통해 확인한 결과를 나타낸 것이다(도 5a~5f).
도 6은 BV2 미세아교세포에 TLR4 억제제인 TAK242, 이브루티닙 및 LPS를 각 조건별로 처리하고, 세포 내에서 발현되는 L-1β 및 COX-2의 mRNA 수준을 RT-PCR을 이용하여 분석하였다.
도 7은 ERK / AKT 신호전달에 미치는 Ibrutinib의 역할을 분석한 결과로서, BV2 미세아교세포에 이브루티닙을 전처리한 후, ERK / AKT 신호 전달 항체를 이용하여 이들 단백질의 인산화 정도를 분석한 것으로, 7a~7c는 ERK의 인산화 정도를 확인한 것이다.
도 8a~8c는 BV2 미세아교세포에 이브루티닙을 전처리한 후(1시간) AKT의 인산화 정도를 확인한 것이며, 8d~8f는 Ibrutinib의 처리 시간을 더 장시간 처리한 후(5시간), AKT 의 인산화 정도를 확인한 결과를 나타낸 것이다. 8g~8i는 Ibrutinib를 전처리하고 LPS를 처리한 군에서의 COX-2 및 IL-1beta mRNA 수준을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 BV2 미세아교세포를 Ibrutinib (1μM)로 전처리 한 후, 세포 내 subcellular 분획화를 수행하여 핵과 사이토졸 분획에서는 p-STAT3 수준을 웨스턴블럿으로 확인한 결과를 나타낸 것이고(도 9c-9d), 항-p-STAT3(s727) 및 항-CD11b 항체들을 사용하여 면역세포화학 염색을 통한 현미경 관찰결과(도 9e) 및 p-STAT3의 수준을 확인한 결과를 나타낸 것이다(도 9f).
도 10은 이브루티닙이 LPS- 자극된 미세아교세포의 이동을 조절할 수 있는지 확인한 결과를 나타낸 것으로, 배양된 미세아교세포에 이브루티닙을 전처리한 후, 세포 스크래치를 준 다음 이브루티닙 처리에 의한 세포 이동 정도를 현미경으로 확인한 결과(10a) 및 이동된 세포수를 확인한 결과(10b)를 나타낸 것이다.
도 11은 마우스 동물모델의 cortex 및 hippocampus에서 LPS에 의한 미세아교세포의 활성화 및 이브루티닙에 의한 미세아교세포 활성화 억제효과를 미세아교세포 표지자인 IBa-1 발현수준 확인으로 수행한 것으로, 항-IBa-1 항체를 사용한 면역조직화학 염색 결과를 나타낸 것이다(도 11a~11c).
도 12는 마우스 동물모델의 cortex 및 hippocampus에서 LPS에 의한 성상세포의 활성화 및 이브루티닙에 의한 성상세포 활성화 억제효과를 성상세포 표지자인 GFAP 발현수준 확인으로 수행한 것으로, 항-GFAP 항체를 사용한 면역조직화학 염색 결과를 나타낸 것이다(도 12a~12c).
도 13은 알츠하이머 유발 질병 모델 (5x FAD mice)에서 이브루티닙 처리에 따른 기억력 및 학습력 행동 분석을 위해, Y 미로실험과 신규물질탐색 시험을 수행한 결과를 나타낸 것이다(도 13A~13B).
도 14은 알츠하이머 유발 질병 모델 (Tau를 과발현 시킨 PS19 mice)에서 이브루티닙 처리에 따른 기억력 및 학습력 행동 분석을 위해, Y 미로실험과 신규물질탐색 시험을 수행한 결과를 나타낸 것이다 (도 14A~14B).
도 15는 이브루티닙 (1 μM)의 인지행동 향상 기전 중 dendritic spine 수 에 대한 변화를 분석하기 위해, 초대배양 해마신경세포(primary hippocampal neurons)에 GFP를 형질전환 한 후 이브루티닙 (1 μM) 또는 비히클을 24시간 처리한후, 면역조직화학 염색을 수행하여 dendrtiic spine 수의 변화 결과를 나타낸 것이다 (도 15A~15B).
도 16은 이브루티닙 (5 μM)의 인지행동 향상 기전 중 dendritic spine 수 증가를 분석하기 위해, 초대배양 해마신경세포(primary hippocampal neurons)에 GFP를 형질전환 한 후 이브루티닙 (5 μM) 또는 비히클을 24시간 처리한후, 면역조직화학 염색을 수행하여 dendrtiic spine 수의 변화 결과를 나타낸 것이다 (도 16A~16B).
도 17은 이브루티닙이 functional synapse에 영향을 주는지를 확인하기 위해, 초대배양 해마신경세포(primary hippocampal neurons)에서 GFP를 형질전환 한 후 항-ynaptophysin 항체와 항-PSD-95 항체를 이용하여 면역조직화학 염색을 수행하여 puncta number 변화를 확인한 결과를 나타낸 것이다 (도 17A~17D).
도 18은 이브루티닙의 인지행동 향상 분자기전 연구를 실험한 연구결과로, 초대배양 해마신경세포(primary hippocampal neurons)에 GFP를 형질전환 한 후, 항-p-FAK 항체를 이용하여 면역조직화학 염색을 수행한 결과를 나타낸 것이다 (도 18A~18B).
도 19는 이브루티닙에 의한 dendritic spine numebr 변화를 확인하기 위해, 정상 마우스 뇌에 이브루티님 (10 mg/kg, I.P) 또는 비히클을 매일 2주간 복강투여후, hippocampus CA1부위에서 Golgi 염색을 수행하여 dendrtic spine number 결과를 나타낸 것이다 (도 19A~19D).
도 20은 알츠하이머 질병 동물 모델에서 이브루티닙에 의한 dendritic spine numebr 변화를 확인하기 위해, 알츠하이머 동물 모델 (PS 19 mice) 뇌에 이브루티님 (10 mg/kg, I.P) 또는 비히클을 매일 2주간 복강투여후, hippocampus CA1 및 cortical layer V 부위에서 Golgi 염색을 수행하여 dendritic spine number 결과를 나타낸 것이다 (도 20A~20H).
도 21은 알츠하이머 질병 동물모델 (5xFAD)의 cortex 및 hippocampus에서 이브루티닙 처리에 따른 아밀로이드 플라크 억제 효과를 확인한 것으로, 항-4G8항체를 사용한 면역조직화학 염색 결과를 나타낸 것이다(도 21A~21E).
도 22는 알츠하이머 질병 동물모델 (5xFAD)의 cortex 및 hippocampus에서 이브루티닙 처리에 따른 아밀로이드 플라크의 감소에 대한 분자기전을 확인하기 위해 항-IDE 항체를 사용하여 면역조직화학 염색을 수행한 결과를 나타낸 것이다(도 22A~22E).
도 23은 알츠하이머 질병 동물모델 (5xFAD)의 cortex 및 hippocampus에서 이브루티닙 처리에 따른 Total Tau 단백질의 발현 변화를 확인하기 위해 항-Tau-5 항체를 사용하여 면역조직화학 염색을 수행한 결과를 나타낸 것이다(도 23A~23E).
도 24는 알츠하이머 질병 동물모델 (5xFAD)의 cortex 및 hippocampus에서 이브루티닙 처리에 따른 타우(Tau) 인산화 변화 효과를 확인하기 위해 항-AT8 항체를 사용하여 면역조직화학 염색을 수행한 결과를 나타낸 것이다(도 24A~24E).
도 25는 알츠하이머 질병 동물모델 (5xFAD)의 cortex 및 hippocampus에서 이브루티닙 처리에 따른 타우(Tau) 인산화 변화를 확인하기 위해 항-AT100 항체를 사용하여 면역조직화학 염색을 수행한 결과를 나타낸 것이다(도 25A~25E).
도 26은 알츠하이머 질병 동물모델 (5xFAD)의 cortex 및 hippocampus에서 이브루티닙 처리에 따른 타우(Tau) 인산화 변화 효과를 확인하기 위해 항-AT180 항체를 사용하여 면역조직화학 염색을 수행한 결과를 나타낸 것이다(도 26A~26E).
도 27은 알츠하이머 질병 동물모델 (5xFAD)의 cortex 및 hippocampus에서 이브루티닙 처리에 따른 타우(Tau) 단백질의 인산화를 조절하는 유전자인 p-CDK의 변화를 확인하기 위해 항-p-CDK5 항체를 사용하여 면역조직화학 염색을 수행한 결과를 나타낸 것이다(도 27A~27E).

본 발명은 이브루티닙(ibrutinib) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공함에 특징이 있다.

이브루티닙(Ibrutinib)은 앞서 종래기술에서도 언급한 바와 같이, B-세포 악성 종양을 표적으로 하는 항암제로 알려져 있으며 면역질환의 치료 가능성에 대한 연구가 보고된 바 있다. 그러나 아직까지 이브루티닙이 뇌질환의 치료 가능성에 대해 연구된 바가 없다.

이에 본 발명에서는 이브루티닙(ibrutinib) 퇴행성 뇌질환의 치료제로 사용가능함을 최초로 규명하였다.

본 발명의 일실시예에 의하면, 이브루티닙(ibrutinib)이 미세아교세포(microglia) 또는 성상세포(astrocyte)의 활성을 억제하여 활성화된 미세아교세포 또는 활성화된 성상세포가 신경세포에 미치는 손상을 억제하는 효과가 있음을 확인하였다. 뿐만 아니라 본 발명에서는 활성화된 미세아교세포의 세포 이동을 이브루티닙 처리 시, 효과적으로 억제함에 따라 활성화된 미세아교세포의 세포 이동에 의한 퇴행성 뇌질환의 발병을 억제할 수 있음을 알 수 있었다.

뇌에서 대식세포의 역할을 하는 미세아교세포(microglial cell)는 중추신경계(central nervous system, CNS) 내 면역반응을 조절하는 중요한 효과세포 (effector cell)이다. 이들의 활성화는 약물이나 독소에 의한 이물질을 제거하고 신경 성장 인자를 분비하여 CNS의 항상성을 유지하는데 중요한 역할을 한다. 그러나 손상된 뉴런으로부터 발생하는 신호, 외부 자극에 의해 변형된 비정상적인 형태의 단백질의 축적, 병원체의 침투와 같은 유해한 스트레스에 노출되면 미세아교세포의 활성이 지나치게 증가되어 신경세포의 손상을 유발함으로써 알츠하이머질환, 파킨슨질환, 다발성 경화증, 뇌경색 등과 같은 퇴행성 뇌질환들을 일으킬 수 있다. 따라서 미세아교세포의 과도한 활성 억제 방법은 퇴행성 뇌질환의 새로운 치료 방법이 될 수 있다.

구체적으로 과도하게 활성화된 미세아교세포는 정상 상태의 미세아교세포와는 달리 포식작용을 활발히 하고, 세포증식을 하며, TNF-α, IL-1β 및 IL-6 등과 같은 사이토카인, 케모카인, iNOS(inducible nitric oxide synthase), COX-2(cyclooxygenase-2) 등의 유전자를 발현시켜 염증매개물질들을 생성한다. 미세아교세포의 활성화는 손상된 세포를 제거하고 외부에서 침입하는 박테리아나 바이러스로부터 신경세포를 보호하는 일면이 있으나 iNOS에 의해 생성되는 일산화질소(NO)와 COX-2에 의해 생성되는 프로스타글란딘들, TNF-α 등은 신경세포에도 독성을 나타내기 때문에 결과적으로 미세아교세포의 활성화는 신경세포의 손상을 악화시키게 되며, 퇴행성 뇌질환의 원인으로 작용한다.

또한, 성상세포(astrocyte) 역시 정상적인 뇌활동을 유지하는데 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있는데, 특히 신경세포의 시냅스 형성, 시냅스 숫자 조절, 시냅스 기능, 신경줄기세포의 신경으로의 분화에 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 그러나 이러한 성상세포가 과도하게 반응성을 가지게 되면, 즉 과도한 활성화 상태를 유지하게 되면 신경세포의 사멸을 초래하고 이웃한 신경세포의 사멸도 유도하는 등, 퇴행성 뇌질환의 원인으로 작용하게 된다. 따라서 과도한 성상세포의 활성화 억제 역시 퇴행성 뇌질환의 새로운 치료 방법에 될 수 있다.

상기 미세아교세포 및 성상세포의 과도한 활성화 원인물질로는 박테리아의 내독소인 리포폴리사카라이드(lipopolysaccharide, LPS), 인터페론-γ, 베타아밀로이드 및 갱글리오사이드 등이 포함될 수 있으나, 본 발명의 일실시예에서 바람직하게는 리포폴리사카라이드(lipopolysaccharide, LPS)일 수 있다.

또한, 본 발명의 다른 일실시예에서는 이브루티닙(ibrutinib)이 BV2 미세아교세포에서 LPS로 유되되는 전염증성 사이토카인의 발현 수준을 유의적으로 억제시킬 수 있음을 확인하였고, 특히 이브루티닙(ibrutinib) 처리에 따른 전염증성 사이토카인 억제효과는 신경세포 타입별 특이적인 결과도 확인하였는데, 초대배양 성상세포에서는 이브루티닙에 의한 전염증성 사이토카인 억제 효과를 보이지 않은 반면, 미세아교세포에서는 COX-2 및 IL-6의 전염증성 사이토카인의 수준을 효과적으로 억제시키는 것으로 나타났다.

또한, 본 발명자들은 이브루티닙의 뇌신경세포 보호 효과에 작용하는 기작을 확인한 결과, 이브루티닙이 TRL4와 LPS 사이의 상호 작용을 방지하여 LPS- 자극된 전염증성 반응을 억제할 수 있는 것으로 확인되었고, Ibrutinib의 전염증 반응 조절은 AKT 신호 전달에 의존적인 것을 확인할 수 있었다.

특히 퇴행성 뇌질환의 한 종류인 파킨슨 병의 경우, 활성화된 미세아교세포에서 TRL4와 LPS 사이의 활발한 상호작용이 관찰되는 것으로 알려져 있으며, 뇌염증 반응에 AKT가 관여하고 있는 것으로 알려져 있다.

따라서 본 발명의 실험결과에 의하면, 이브루티닙은 미세아교세포 표면에 존재하는 TRL4 수용체와 LPS의 반응을 효과적으로 억제할 수 있음을 확인하였고, 미세아교세포에서 LPS에 의해 유도되는 p-AKT(활성형 AKT)의 수준을 효과적으로 억제함으로써, 퇴행성 뇌질환의 발병에 관여하는 세포 내 신호 전달을 감소 또는 억제할 수 있다는 것을 확인하였다.

또한, 본 발명의 다른 실험 결과에 의하면, 알츠하이머가 유발된 마우스 동물모델을 대상으로 이브루티닙 처리에 따른 알츠하이머 치료 효과 분석을 수행하였는데, 이브루티닙 처리 시, 아밀로이드 분해효소인 IDE의 발현이 증가하는 것으로 나타났고, 이로 인해 알츠하이머 원인이 되는 아밀로이드 플라크 수가 현저히 감소되는 것을 확인할 수 있었다. 뿐만 아니라 이브루티닙을 처리한 군은 이브루티닙을 처리하지 않은 군에 비해 알츠하이머의 원인이 되는 타우(Tau) 단백질의 인산화가 현저히 감소하는 것을 확인하였다. 나아가, 본 발명의 일실시예에서 이브루티닙을 처리한 군은 이브루티닙을 처리하지 않은 군에 비해 dendritic spine number가 증가하고, synaptophysin 또는 PSD-95 puncta number가 증가(즉, 기능적 시냅스(functional synaspe)의 증가)되며, 장기 기억력이 향상됨을 확인하였다.

그러므로 본 발명의 이브루티닙(ibrutinib) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 퇴행성 뇌질환의 치료제로서 사용 가능하며, 이브루티닙(ibrutinib) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 퇴행성 뇌질환의 치료방법을 제공할 수 있다.

본 발명에 따른 상기 퇴행성 뇌질환은 이에 제한되지는 않으나, 알츠하이머, 파킨슨병, 헌팅톤병, 다발성 경화증, 다발성 신경위축, 간질, 뇌질환(encephalopathy), 뇌졸중, 기억장애, 인지장애 및 학습장애로 이루어진 군 중에서 선택되는 것일 수 있다.

본 발명의 퇴행성 뇌신경질환의 예방 또는 치료용 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 상기 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.

경구투여를 위한 고형제제에는 정제환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용된다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테로 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

상기 약학적 조성물은 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제 및 좌제로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형을 가질 수 있다.

또한, 이들 약학적 조성물은 상기 기술된 바와 같이, 신경퇴행 및/또는 이와 연관된 증상을 비롯한 다양한 질환을 치료하기 위하여 본 발명의 약학적 조성물을 투여할 수 있다.

상기 본 발명의 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 용어 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.

본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하다. 본 발명의 약제학적 조성물의 일반적인 투여량은 성인 기준으로 0.001-100 ㎎/kg 범위 내이다.

상기 약학적 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 본 발명의 조성물은 목적하는 바에 따라 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내투여, 경구 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 또한, 상기조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.

본 발명의 조성물은 퇴행성 뇌질환의 예방 및 치료를 위하여 단독으로, 수술, 호로몬 치료, 약물 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.

나아가 본 발명은 시험관 내에서 이브루티닙(ibrutinib) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 뇌신경 세포에 처리하는 단계를 포함하는, 미세아교세포(microglia) 또는 성상세포(astrocyte)의 활성을 억제하는 방법을 제공할 수 있다.

또한 본 발명은 시험관 내에서 이브루티닙(ibrutinib) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 뇌신경 세포에 처리하는 단계를 포함하는, LPS로 유도되는 미세아교세포(microglia)의 세포 이동을 억제하는 방법을 제공할 수 있다.

또한 본 발명은 시험관 내에서 이브루티닙(ibrutinib) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 뇌신경 세포에 처리하는 단계를 포함하는, 아밀로이드 플라크 억제, 타우 인산화 저해 또는 장기기억력 향상 방법을 제공할 수 있다.

이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

<준비예 및 실험방법>

세포주 및 배양조건

BV2 미세아교세포(BV2 microglial cells; Dr. Kyung-Ho Suk 박사로부터 입수))를 5 % 태아 소 혈청(FBS, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)이 함유된 DMEM / 고함량 글루코스(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) 배지를 이용하여 5 % CO2 배양기에서 배양하였다.

야생형 마우스(wild type mice)

모든 실험은 한국 뇌 연구원(IACUC-2016-0013)이 승인된 동물 실험 및 지침에 따라 수행하였다. C57BL6 / N 마우스는 OrientBio Company로부터 구입 하여 사용하였으며, 수컷 C57BL6 / N (8 주, 25-30g) 마우수는 병원균이 없는 시설에서 22 ℃의 주위 온도에서 12 시간의 명암주기 하에 사육하였다. 사육한 마우스로의 약물 주입은 이브루티닙(10mg / kg) 또는 비히클(DMSO)을 복강 내 (i.p) 3 일 동안 투여하고 LPS (10mg / kg, i.p)를 3 시간 동안 연속적으로 주사하였다. 3 시간 후, 4 % 파라포름 알데히드(PFA) 용액을 사용하여 야생형 마우스를 관류 및 고정시키고, 뇌 조직을 플래시 동결시킨 후, 크라이오스탯(cryostat)으로 40 mm두께가 되도록 절편화 시켰다. 각 뇌 절편은 면역조직 화학염색에 사용되었다. 뇌 절편을 PBS로 세정하고, 실온에서 0.2 % 트리톤 X-100 및 1 % BSA를 함유하는 PBS 에서 1 시간 동안 항온 배양하여 투과성을 갖도록 하였고, 1 시간 후 1차 항체를 4 ℃에서 밤새 반응시키고, 조직을 0.5 % BSA로 3 회 세척한 후, 실온에서 1 시간 동안 2차 항체를 반응시켰다(비오틴 - 결합된 항 토끼 항체(1 : 400, Vector 실험실). 이후 뇌 절편을 0.5 % BSA로 세척하고 상온에서 avidin-biotin 복합용액(Vector Laboratories, Burlingame, CA)에서 1 시간 동안 배양하였다. 0.1M PB 완충액으로 3 회 세척한 절편은 0.003 % H2O2를 함유하는 0.1M PB에서 0.5mg/ml 3,3'- 디아 미노 벤지딘(DAB, Sigma-Aldrich)을 이용하여 반응 결과의 신호를 검출하였다. 절편은 0.1M PB로 헹구고 젤라틴 코팅 슬라이드에 올려놓은 후 밝은 필드 현미경 (Leica)을 이용하여 이미지 분석을 수행하였다.

알츠하이머 유발 마우스 동물모델 제작(5x FAD mice)

5xFAD 마우스 (스톡번호. 008730, B6SJL-Tg APPSwFlLon,PSEN1*M146L*L286V6799Vas/Mmjax) F1세대를 Jacson 연구실로부터 입수하고, 형질전환 수컷 마우스 (5xFAD)를 Jacson 연구실로부터 구매한 암컷 C57BL/6J와 함께 두었다. 5xFAD는 K670N, M671L (Swedish), I716V (Florida), 및 V717I (London)를 지닌 돌연변이 사람 APP (695)와 2개의 FAD 변이 (M146L 및 L286V)를 갖는 사람 PS1에 수반하는 사람 가족성 알츠하이머병 (Familial Alzheimers Disease, FAD) 변이를 과발현하는 것으로 알려져 있다. 상기 형질전환은 마우스 Thy1 프로모터에 의해 조절되어 뇌에서 과발현되도록 하였고, 5xFAD 형질전환에 대한 지노타이핑은 Jackson Lab의 지노타이핑 프로토콜에 의해 제공되는 PCR 방법으로 수행하였다.

5xFAD 마우스에 대한 지노타이핑

4주령 마우스로부터 꼬리를 잘라내고, 이로부터 유전체 DNA를 추출하였다. 꼬리를 염기성 용해 용액에서 95℃, 2시간 인큐베이션 한 후, 중성화 용액으로 반응을 종료했다. Prime Taq Premix (GeNetBio, Korea)를 사용하여 PCR 반응을 수행했하고, PCR 생성물을 1.5% 아가로스겔에서 전기영동으로 분리하였다. 본 발명에서 사용된 프라이머 서열을 다음과 같다:

전위 프라이머: 5-AATAGAGAACGGCAGGACCA-3

역위 프라이머: 5-GCCATGAGGGCACTAATCAT-3

PCR 증폭은 94℃에서 30초간 변성, 60℃에서 30초간 어닐링 및 72℃에서 90초간 연장의 사이클을 35회 반복 수행하였고, PCR 생성물을 Eco Dye (1:5000, Korea)와 함께 1.5% 아가로스겔 상에서 전기영동으로 분리하였다.

면역조직화학 및 면역형광분석

실험에 사용한 마우스 동물을 관류용액 (0.9% NaCl, Sigma) 및 4% 파라포름알데히드 용액 (Millipore)을 사용하여 관류하고 고정하였으며, 뇌조직을 동결조직절편기 (Leica)로 절단하고 (40 ㎜ 두께), 면역형광 및 면역조직화학염색을 수행하였다. 면역형광염색을 위해, 박편을 PBS로 세척한 다음, 다음의 일차 항체와 인큐베이션 하였다: 아밀로이드 플라크를 검출할 수 있는 안티-4G8 항체, 아밀로이드 분해 효소인 안티-IDE 항체, Tau 인산화 검출을 위한 항체 안티-AT8를 사용하였다. 항체는 0.5% BSA을 함유하는 PBS로 희석하였고, 천천히 세이킹하면서 4℃에서 하룻밤 인큐베이션 하였다. 다음 날, 조직을 0.5% BSA를 함유하는 PBS로 세척하고, 555-컨쥬게이션-안티-래빗 IgG (1:200, Molecular Probe)와 함께 실온에서 1시간 동안 인큐베이션 하였다. 조직을 젤라틴 코팅된 커버글래스 위에 올리고 DAPI-함유 마운팅 용액 (Vector Laboratories)을 위에 가하였다. 염색된 조직을 공초점현미경 (TI-RCP, Nikon)으로 촬영하였다. 면역조직화학을 위해, 박편을 PBS로 세척하고 인큐베이션 하였으며, 실온에서 0.2% Triton X-100 및 1% BSA와 함께 PBS 내에서 1시간 동안 처리하여 투과성을 갖도록 하였다. 다음, 일차 항체를 천천히 세이킹하면서 4℃, 하룻밤 인큐베이션하였다. 다음 날, 상기 조직을 0.5% BSA와 함께 PBS로 3회 세척하고 다음의 이차 항체와 함께 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다: 비오틴-컨쥬게이션된 안티 래빗 항체 (1:400, Vector Laboratories). 박편을 0.5% BSA와 함께 PBS로 다시 세척하고, 아비딘-비오틴 복합체 (avidin-biotin complex) 용액에서 1시간 동안 실온으로 인큐베이션 하였다. 0.1 M PB (phosphate buffer) 내에서 3회 세척한 후, 0.003% H₂O₂을 함유하는 0.1 M PB 내의 0.5 ㎎/㎖ 3,3-디아미노벤즈이딘 (3,3-diaminobenzidine) (DAB, Sigma)으로 박편을 인큐베이션하여 시그널을 검출하였다. 다음, 박편을 0.1M PB로 세척한 다음, 젤라틴 코팅된 슬라이드 상에 올리고, 명시야 현미경 (Leica)으로 관찰하였다.

항체 및 억제제

1차 항체들로는 rat-anti-mouse CD11b (1:400, abcam), rabbit-anti-COX2 (1:1000, abcam), rabbit-anti-IL-1b (1:200, abcam), rabbit-anti-GFAP (1:5000, neuromics), rabbit-anti-Iba1 (1:1000, Wako), goat-anti-IbaI (1:500, Wako), rabbit-anti-AKT(1:1000, Santa Cruz), p-AKT(Ser473, Thr308) (1:1000, Cell Signaling), rabbit-anti-ERK (1:1000, Santa Cruz), rabbit-anti-p-ERK (Thr42/44) (1:1000, Cell Signaling), rabbit-anti-STAT3 (1;1000, Cell Signaling), rabbit-anti-p-STAT3 (Ser727, abcam), mouse-anti-synaptophysin (1:200, Sigma), mouse-anti-PSD95 (1:200, Neuromab), rabbit-anti-pFAK (1:500, Cell signaling), mouse-anti-4G8 (1:500, Biolegend), rabbit-anti-IDE (1:200, Abcam), rabbit-anti-NEP (1:200, Millippore), mouse-anti-Tau5 (1:200, Invitrogen), mouse-anti-AT8 (1:200, Invitrogen), mouse-anti-AT100 (1:200, Invitrogen), mouse-anti-180 (1:200, Invitrogen), rabbit-anti-pCDK5 (1:200, Biosource)를 사용하였다. 또한 억제제들로는 TLR4 inhibitor (TAK-242, 500 nM), AKT inhibitor (MK2206, 10 mM)을 사용하였다.

MTT 어세이

세포 생존력은 3- (4,5- 디메틸티아졸 -2- 일) -2,5- 디페닐테트라졸륨 브로마이드 (MTT) 분석법을 사용하였다. 세포를 96- 웰 플레이트에 분주하고 FBS의 존재 또는 부재하에 24 시간 동안 다양한 농도의 이브루티닙(100nM~1μM, 1 Mm-50 μM)을 처리하였다. 그런 다음 세포를 0.5 mg/ml MTT로 처리하고 37 ℃에서 3 시간 동안 5 % CO2 배양기에서 배양한 다음, 580 nm에서 흡광도를 측정하였다.

초대배양 미세아교세포 및 성상세포

일차 혼합된 글리아(glia) 세포는 1일 된 Sprague Dawley 마우스의 대뇌 피질로부터 분리하여 배양하였는데, 즉, 마우스 피질을 10 % FBS 및 페니실린 - 스트렙토마이신 용액(5000 단위 / ml 페니실린, 5 mg / ml 스트렙토마이신, Corning, USA)을 함유하는 고포도당 DMEM 배지에서 단일세포로 분주하고, 75-cm² T 플라스크 (0.5 반구 / 플라스크)에 2 주간 담가두었다. 미세아교세포를 수확하기 위해, 플레이트를 120rpm에서 2 시간 동안 일정하게 흔들어준 뒤, 배지를 수집하고 15 분 동안 1500 rpm에서 원심 분리한 다음, 세포 펠릿을 플레이트에 1x10⁵ 세포 / 24웰 이 되도록 재현탁시켰다. 일단 미세아교세포가 수집되면 플라스크의 나머지 세포를 0.1 % 트립신을 사용하여 수확하여 성상세포 개체군을 얻었다. 성상세포와 미세아교세포를 Poly-D-Lysine (Sigma)으로 미리 코팅된 12- 웰 플레이트(35mm)에서 배양 한 후, 이를 실험에 사용하였다.

RT-PCR

전체 RNA는 TriZol (Invitrogene)을 사용하여 세포로부터 추출하였다. oligoDT (GeNetBio, Korea)가 포함된 Superscript cDNA Premix Kit II를 사용하여 총 RNA를 cDNA로 역전사 시켰고, Prime Taq Premix (GeNetBio, 한국)를 사용하여 수행된 RT-PCR 산물은 Eco Dye (1 : 5000, Korea)를 포함한 1.5 % 아가로즈 겔에서 전기영동에 의해 분리되었다. 전기영동된 RT-PCR은 Image J(NIH)와 Fusion (Korea)을 사용하여 이미지 분석을 수행하였다.

면역세포화학법

BV2 미세아교세포를 4 % 파라포름 알데히드로 10 분간 고정하고, PBS로 3 회 세척 한 후, 항-CD11b 및 항-IL-1β 또는 항-CD11b 및 항-COX2 항체를 GOB 버퍼(0.1% 젤라틴, 0.3 % Triton X-100, 16 mM 인산나트륨 pH 7.4 및 450 mM NaCl)로 4 ℃에서 밤새 반응시켰다. 다음날, 세포를 PBS로 3회 세척하고 실온에서 1 시간 동안 이차 항체와 반응시켰다. 이차 항체는 마우스 AlexaFluor 488 및 토끼 AlexaFluor 555 (1 : 200, Molecular Probes, USA)를 사용하였다. 이후 공초점 현미경(니콘, 일본)을 사용하여 이미지를 단일평면에서 촬영하였고 Image J 소프트웨어를 사용하여 분석하였다.

웨스턴블롯팅

Ibrutinib이 ERR / AKT 신호전달에 영향을 주어 신경염증을 변화시킬 수 있는지 알아보기 위해, BV2 미세아교세포를 Ibrutinib (1μM) 또는 비히클로 1 시간 처리 한 후, LPS (1μg / ml) 또는 PBS로 45 분간 처리하였다. 45분 후, 프로테아제 및 포스파타아제 억제제를 (Roche, USA) 함유하는 RIPA 완충액을 사용하여 세포를 용해시켰다. 웨스턴 블럿은 종래 일반적인 웨스턴블롯 방법에 의해 수행하였고, 이미지는 Fusion 소프트웨어 또는 Image J 소프트웨어를 사용하여 분석하였다.

운드 힐링 어세이(Wound healiing assay)

BV2 미세아교세포를 12- 웰 플레이트에 접종하고, 세포가 80-90%가 되도록 배양한 후, 세포 스크래쳐 (SPL, Korea)로 긁어 상처를 만들었다. 스크래처 직후 이미지는 촬영하고, 이후 Ibrutinib (500nM) 또는 비히클로 1시간 동안 세포에 처리한 다음, LPS 또는 PBS로 24 시간 동안 처리하였다. 24 시간 후, 이미지를 다시 촬영하여 운드 힐링 정도를 분석하였다(Nam et al., 2017).

세포질 및 핵 분획(Cytosol and nuclear fractionation)

BV2 미세아교세포를 세포질 분획용 완충액(10 mM HEPES pH 8.0, 1.5 mM MgCl2, 10 mM KCl, 0.5 mM DTT, 300 mM 슈 크로스, 0.1 % NP-40 및 0.5 mM PMSF)을 사용하여 용해시켰다. 용액을 첨가하고 5 분 후, 세포 용해물을 10,000rpm, 4 ℃에서 1 분간 원심 분리하여 상등액을 세포질 분획으로 분리하여 보관하였다. 펠릿은 얼음 상에서 15 분 동안 핵 분획용 완충액(10 mM HEPES pH 8.0, 20 % 글리세롤, 100 mM KCl, 100 mM NaCl, 0.2 mM EDTA, 0.5 mM DTT 및 0.5 mM PMSF)으로 용해시켰다. 이후 4 ℃에서 10,000 rpm으로 15 분간 원심분리 하였고, Western blot 분석은 anti-STAT3 (s727), PCNA 및 β-actin 항체를 이용하였으며 Fusion 소프트웨어를 사용하여 분석하였다.

Y 미로 시험 (Y maze)

정상 동물 (wild type mice) 혹은 알츠하이머 유발 동물모델 (5xFAD mice, PS19 mice)에 이브루티닙 투여 시 단기 기억력 향상 능력을 검증하기 위해, 각 팔의 길이가 42cm, 너비가 3cm, 높이가 12cm이고, 세 팔의 각도가 120도로 이루어진 Y 모양의 maze의 한 쪽 팔 끝에 동물을 위치하게 하고, 5분간 방문한 팔을 기록 하였다. 그 후에 Percent alteration= (alteration 횟수 / triads 횟수) x 100을 구하여 단기기억력의 척도로 사용하였다.

alteration: 세 개의 서로 다른 팔에 차례로 들어간 경우에 1점 부여함

triads: 전체 방문 횟수-2

신규 물질 탐색 시험 (Novel object recognition test)

정상 동물 (wild type mice) 혹은 알츠하이머 유발 동물모델 (5xFAD mice, PS19 mice)에 이브루티닙 투여 시 장기 기억력 향상 능력을 검증하기 위해, 42 x 42x 25cm 크기의 상자에서 모양과 크기가 동일한 두 개의 물체를 구석에 위치시킨 후 동물을 상자 가운데서 출발시키고, 동물이 물체에 관심을 보이는 시간을 5분간 기록 하였다. 24시간 후 두 물체 중 하나를 새로운 것으로 교체한 후 기존 물체와 새로운 물체로 접근한 시간을 각각 측정하고, 새로운 물체에 대한 선호도를 분석하여 장기 기억 분석 지표로 사용 하였다.

통계처리

Graphpad Prism 4 소프트웨어를 사용하여 양측 T- 검정 또는 ANOVA를 사용하여 모든 데이터를 분석하였다. post-hoc 분석은 Tukey의 Multiple Comparison 테스트로 수행하였고 유의성은 p <0.05로 설정하였다. 데이터는 평균 ± S.E.M로 나타내었다(* p <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001).

<실시예 1>

이브루티닙의 BV2 미세아교세포에 대한 세포독성 여부 확인

Ibrutinib이 BV2 미세아교세포에 대한 세포 독성이 있는지 확인하기 위해, BV2 미세아교세포에 비히클 또는 Ibrutinib(100, 250, 500, 750, 1000nM)을 각각 24 시간 동안 처리하고, MTT 분석을 수행하였다. 또한, BV2 미세아교세포에 비히클 또는 Ibrutinib를 더 높은 농도인 1, 5, 10, 25, 50μM로 24 시간 동안 각각 처리하고 MTT 분석을 수행하였다.

분석 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, 이브루티닙이 BV2 미세아교세포에 대해 25μM 농도까지는 세포 독성을 유발하지 않는 것으로 나타났다. 반면, 50μM의 농도에서는 세포 사멸이 발생되는 것으로 나타나, 25μM 농도까지는 세포에 대해 비교적 독성을 유발하지 않음을 알 수 있었다(도 1a~1b 참조).

또한, 본 발명자들은 Ibrutinib이 LPS- 유도 BV2 미세아교세포에서 세포 형태를 변형시킬 수 있는지 여부를 시험하기 위해, BV2 미세아교 세포를 Ibrutinib (1μM) 또는 비히클로 30 분 동안 전처리하고 LPS (1μg / ml) 또는 PBS로 5 시간 30 분 동안 처리하였다. 이후 세포를 고정시키고 항-CD11b 항체로 면역염색시켰다.

분석 결과, 도 1c에 나타낸 바와 같이, LPS로 자극된 BV2 미세아교세포는 비히클 처리와 비교하여 얇은 긴 형태의 세포바디 형태를 보이는 것으로 나타났다. 한편, Ibrutinib을 전처리한 군은 LPS 처리에 의한 얇은 긴 형태의 세포바디 형태 변화를 감소시키는 것으로 나타났다(도 1c 참조).

<실시예 2>

이브루티닙 처리에 따른 LPS로 유도된 전염증성 사이토카인의 수준 감소효과 분석

이브루티닙을 BV2 미세아교세포에 1μM의 농도로 30 분간 전처리 한 후, LPS (1μg/ml) 또는 PBS로 5시간 30분 동안 처리하였다. 이후 RNA를 분리하고 염증성 사이토카인 수준을 RT-PCR을 사용하여 측정하였다. 이때 mRNA 수준 분석은 염증성 사이토카인 IL-1β, COX-2, IL-6, TNF-α의 수준을 측정하였다.

분석 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 이브루티닙의 전처리 결과 LPS로 발현이 증가된 IL-1β, COX-2, IL-6, TNF-α의 발현이 이브루티닙 처리에 의해 감소된 것으로 나타난 반면, iNOS는 발현 감소 정도가 IL-1β, COX-2, IL-6, TNF-α의 감소에 비해 덜 감소된 것으로 나타났다(도 2a~2f 참조).

또한, 본 발명자들은 상기와 같은 RT-PCR의 결과를 면역세포화학 분석을 통해 재검증하였는데, 상기 실험에 사용된 세포를 항-CD11b 항체 및 COX-2 항체 또는 항-CD11b 및 IL-1β 항체로 면역염색 후 확인하였다. 또한 여기서 대조군으로는 이브루티닙 대신 비히클을 처리한 군을 사용하였다.

그 결과, 도 2의 g~i에 나타낸 바와 같이, 미세아교세포에서 LPS에 의해 증가된 COX-2와 IL-1의 농도를 이브루티닙 처리 시 감소되는 것을 확인할 수 있었다.

따라서 이러한 결과를 통해 본 발명자들은 본 발명의 이브루티닙이 BV2 미세아교세포에서 발생하는 염증 반응을 억제할 수 있음을 알 수 있었다.

나아가 본 발명자들은 상기 방법과 달리 미세아교세포에 이브루티닙를 후처리한 경우에도 염증성 사이토카인의 발현 감소를 상기 결과와 같이 유도할 수 있는지 확인하기 위해, 미세아교세포에 LPS (1 mg/ml) 또는 PBS를 30 min 동안 전처리한 후, 이후에 이브루티닙(1 mM) 을 5시간 30분 동안 처리한 다음, RT-PCR을 수행하였다.

그 결과, 상기 도 2의 결과와 달리, 이브루티닙을 후처리한 경우에는 IL-6의 발현수준만을 유의적으로 억제하는 것으로 나타났다(도 3 참조).

<실시예 3>

초대배양 미세아교세포(primary microglial cells)에서 이브루티닙 처리에 따른 전염증성 사이토카인의 억제효과 분석

초대배양 미세아교세포와 성상세포에서 이브루티닙 처리가 염증 반응을 조절할 수 있는지 확인하기 위해, 미세아교세포에 비히클 또는 이브루티닙(1 uM)을 30 분간 처리하고, LPS (1 ㎍/ml) 또는 PBS로 5시간 30 분간 처리 한 다음, 염증성 사이토카인 수준을 RT- PCR로 분석하였다.

그 결과, 미세아교세포에서 이브루티닙을 전처리한 경우, COX-2 및 IL-6의 전염증성 사이토카인의 수준을 다른 사이토카인에 비해 유의적으로 감소시키는 것으로 나타났다(도 4a~4f 참조).

또한, 본 발명자들은 이브루티닙이 초대배양 성상세포에서도 전염증성 사이토카인의 발현수준에 영향을 줄 수 있는지 확인하기 위해, 초대배양 성상세포에 비히클 또는 이브루티닙(1μM)을 30 분간 전처리하고, LPS (1μg/ml) 또는 PBS로 5 시간 30 분간 처리 한 후, 염증성 사이토카인 수치를 RT-PCR을 사용하여 측정하였다.

분석 결과, 특이하게도 초대배양 성상세포에서는 이브루티닙이 전염증성 사이토카인의 발현 수준에 영향을 주지 못하는 것으로 나타났다(도 5 참조). 이러한 결과는 이브루티닙의 전염증성 사이토카인에 대한 영향이 세포 타입에 의해 반응한다는 것을 의미한다.

<실시예 4>

이브루티닙의 TLR4 수용체 억제활성에 의한 LPS로 유도된 전염증성 사이토카인의 수준 억제효과 분석

LPS가 미세아교세포의 세포 표면에 있는 TLR4 수용체와 상호 작용한다는 것이 알려져 있다. 이에 이브루티닙이 세포 표면에서 LPS/TLR4 수용체 상호 작용을 억제하여 뇌신경의 염증을 조절할 수 있는지 분석하였다. 이를 확인하기 위해, BV2 미세아교 세포에 TAK242 (TLR4 억제제, 500nM) 또는 비히클로 30 분간 전처리하고, Ibrutinib (1μM) 또는 비히클로 30 분간 처리한 다음, LPS (1㎍ / ml) 또는 PBS로 5 시간 동안 처리하였다. 이후 총 RNA를 분리하고 RT-PCR을 이용하여 IL-1β 및 COX-2의 mRNA 수준을 측정하였다.

분석 결과, Ibrutinib는 LPS- 유도된 BV2 미세아교세포에서 COX-2 및 IL-1의 mRNA 수준을 유의적으로 감소시키는 것으로 나타났다(도 6a-6c 참조). 또한, TLR4의 억제는 LPS- 유도된 BV2 미세아교세포에서 Ibrutinib의 존재 하에 IL-1β 및 COX-2 mRNA 수준을 더 감소시키는 것으로 나타났다(도 6a-6c 참조).

따라서 이러한 결과를 통해 본 발명자들은 이브루티닙이 TRL4와 LPS 사이의 상호 작용을 방지하여 LPS- 자극된 전염증성 반응을 억제할 수 있음을 알 수 있었다.

<실시예 5>

이브루티닙의 AKT 신호전달을 통한 LPS로 유도된 전염증성 반응 변화 분석

최근의 연구결과에 의하면 AKT 및 ERK 신호 전달이 glia 세포(REF)에서 전 염증성 사이토카인 조절에 중요한 역할을 한다고 보고되고 있다. 이에 본 발명자들은 LPS 매개 뇌염증 반응 조절에 Ibrutinib가 역할을 하는지 확인하기 위해, ERK / AKT 신호전달에 미치는 Ibrutinib의 작용을 분석하였다. 이를 위해 BV2 미세아교세포에 Ibrutinib (1μM) 또는 비히클을 1 시간 동안 전처리하고 LPS (1μg / ml) 또는 PBS로 45 분간 처리 한 후, ERK / AKT 신호 전달 항체를 이용하여 신호 전달에 관여하는 인자들의 발현변화를 웨스턴 블랏을 통해 확인하였다.

그 결과, 예기치 않게 Ibrutinib는 LPS로 유도된 BV2 세포에서 p-ERK를 변화시키지 않는 것으로 나타났다(도 7a-7c 참조). 그러나, Ibrutinib이 BV2 미세아교세포에서 LPS로 유도된 p-AKT 수준을 현저하게 감소시키는 것을 확인할 수 있었다(도 8a-8c 참조).

상기와 같은 결과에 의해, Ibrutinib이 LPS에 의한 AKT 신호전달을 조절할 수 있는지를 조사했다. 이를 위해 BV2 미세아교세포를 Ibrutinib (1μM) 또는 비히클로 5 시간 동안 전처리하고 LPS (1μg / ml) 또는 PBS로 45 분간 처리 한 후 항 p-AKT를 이용한 웨스턴블랏을 수행하였다.

그 결과, 더 장시간 Ibrutinib을 처리한 경우, LPS에 의해 유발된 p-AKT 수준을 유의하게 감소시키는 것을 확인할 수 있었다(도 8d-8f 참조).

또한, 본 발명자들은 Ibrutinib이 AKT 신호 전달을 통해 염증 반응을 조절하는지를 확인하였는데, 이를 위해 BV2 미세아교세포를 MK2206 (AKT 억제제, 10μM) 또는 비히클로 30분 동안 전처리하고, Ibrutinib (1μM) 또는 비히클로 30 분간 처리한 뒤, LPS (1μg / ml) 또는 PBS로 5 시간 동안 처리하고 RT-PCR을 이용하여 COX-2와 IL-1의 mRNA 수준을 측정하였다.

그 결과, 상기 결과와 동일하게 Ibrutinib를 전처리하고 LPS를 처리한 군에서 COX-2와 IL-1의 mRNA 수준이 감소되는 것으로 나타났고(도 8g-8i 참조), 또한 MK2206, Ibrutinib 및 LPS로 처리한 군은 LPS 및 MK2206을 처리한 군과 비교하여 COX-2 및 IL-1beta mRNA 수준이 감소되는 것으로 나타났다(도 8g-8i 참조). 이러한 결과를 통해 Ibrutinib의 전염증 반응 조절은 AKT 신호 전달에 의존적이라는 것을 알 수 있었다.

<실시예 6>

이브루티닙의 핵 내에서 LPS로 유도된 p-STAT3의 수준 감소 효과분석

전사인자인 STAT3은 LPS에 의한 염증 유발 사이토카인 수준 조절에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 이에 Ibrutinib가 염증 반응을 변화시키기 위해 STAT3을 필요로 하는지를 확인하였는데, 이를 위해 BV2 미세아교세포를 Ibrutinib (1μM) 또는 비히클로 30 분간 전처리하고 LPS (1μg / ml) 또는 PBS로 5 시간 30 분간 처리한 다음, 세포 내 subcellular 분획을 수행하였다.

분석 결과, Ibrutinib은 LPS-자극된 핵의 p-STAT3 수준을 감소시켰고(도 9a-9b), 사이토졸의 p-STAT3 수준도 감소 경향을 보였다(도 9c-9d 참조).

위의 결과를 검증하기 위해, 항-p-STAT3(s727) 및 항-CD11b 항체들을 사용하여 면역세포화학법을 실시하였는데, 그 결과, BV2 미세아교 세포에서 Ibrutinib이 LPS- 유도된 핵 내의 p-STAT3 수준을 하향 조절하는 것으로 나타났다(도 9e-9f 참조). 이러한 결과는 Ibrutinib이 뇌신경 염증 반응을 변형시키는 STAT3 신호전달에 의존적임을 나타낸다.

<실시예 7>

이브루티닙의 미세아교세포의 세포 이동 억제 효과분석

이브루티닙이 LPS- 자극된 미세아교세포의 이동을 조절할 수 있는지 확인하는 실험을 수행하였는데, 이를 위해 Ibrutinib (500 nM) 또는 비히클로 23 시간 30 분 동안 미세아교세포에 전처리하고 LPS (100 ng / ml) 또는 PBS로 30 분간 처리한 후, 상처 치유분석법을 수행하였다. 즉, 세포가 배양된 플레이트에 스트래치를 내어 스크레치가 된 부분으로 세포들의 이동이 이브루티닙에 의해 이뤄지는 분석하였다.

그 결과, LPS 단독 처리 군에 비해 이브루티닙을 전처리한 군의 경우, LPS 자극에 의한 미세아교세포의 이동이 유의적으로 감소되는 것으로 나타났다(도 10a-10b 참조).

즉, 이러한 결과는 Ibrutinib이 LPS에 의한 신경세포의 이동을 억제할 수 있으므로, 신경세포 이동에 의한 퇴행성 뇌질환의 발병을 억제 또는 퇴행성 뇌질환을 치료할 수 있음을 시사한다.

<실시예 8>

마우스 동물모델에서 이브루티닙의 LPS로 자극된 미세아교세포 및 성상세포의 활성 억제 효과 분석

최근 연구결과에 의하면 활성화된 미세아교세포 및 성상세포는 퇴행성 뇌질환의 발병에 관련이 있는 것으로 알려지고 있다. 이에 본 발명자들은 이브루티닙이 퇴행성 뇌질환의 치료제로서 사용 가능함을 확인하기 위해, 동물 모델을 대상으로 LPS로 유도된 미세아교세포 및 성상세포의 활성화에 대한 이브루티닙의 효과를 분석하였다. 이를 확인하기 위해, 야생형 마우스에게 이브루티닙(10 mg / kg, i.p)을 3 일간 주사하고 이때 복강 내 주사(10 mg / kg / 일)를 i.p. 3 시간 동안 수행한 후, 항 IBa-1(도 11a~11c) 및 항-GFAP 항체(도 12a~12c)로 면역조직화학 염색을 수행하였다.

그 결과, LPS로 주사된 야생형 마우스는 미세아교세포 및 성상세포의 활성화가 상향 조절되는 것으로 나타난 반면, 이브루티닙 투여에 의해 미세아교세포 및 성상세포의 활성화는 유의적으로 억제되는 것으로 나타났다. 따라서 본 발명자들은 이러한 결과를 통해 Ibrutinib가 야생형 마우스에서 LPS로 유도된 미세아교세포 및 성상세포의 활성화를 조절할 수 있음을 알 수 있었고, 특히 이들 세포의 활성화를 억제함으로써 퇴행성 뇌질환을 예방 또는 치료할 수 있음을 알 수 있었다.

<실시예 9>

알츠하이머 유발 동물모델에서 이브루티닙 처리에 따른 기억력과 학습력 관련 행동 변화 분석

이브루티닙이 기억력 및 학습력에 어떠한 영향을 미치는지 확인하기 위하여, 알츠하이머 유발 동물모델 (5xFAD, PS19 mice)에 이브루티닙 (10 mg / kg, i.p.) 혹은 비히클을 14일간 처치한 후 단기기억 행동 평가를 위해 Y-미로시험 (Y-maze)을, 장기기억 행동 평가를 위해 신규물질탐색 시험 (Novel object recognition test, NOR)을 수행하였다.

그 결과, 알츠하이머 질병 유발 동물 모델 중 5xFAD 마우스에 이브루티닙을 처치한 경우, 장기기억이 현저하게 증가함을 행동학적으로 확인하였다(도13 A~13B). 또한, 알츠하이머 질병 유발 모델 중 PS19 마우스에 이브루티닙을 처치한 군의 경우 장기기억이 향상되는 경향을 보였다(도 14A~14B 참조).

따라서 본 발명자들은 이러한 결과를 통해 이브루티닙이 알츠하이머 동물모델쥐에서 학습 및 기억력을 향상시킴을 확인할 수 있었다.

<실시예 10>

초대배양 해마신경세포(primary hippocampal neurons)에서 이브루티닙 처리에 따른 dendritic spine의 수 증가 및 형성 관련 유전자들의 발현 촉진 효과 분석

이브루티닙의 인지 행동 향상 기전을 분석하기 위해, 초대배양 해마신경세포(primary hippocampal neurons)에 GFP를 형질도입(transfection) 후, 이브루티닙 1 또는 5 μM을 24 시간 동안 처리하였다. 그 후, dendritic spine 수 변화를 관찰하고, pre synaptic 지표인 synaptophysin 항체와 post-synaptic 마커인자인 PSD-95 항체를 이용하여 염색을 한 후 puncta number 및 그에 따른 발현 정도를 확인하였다.

그 결과, 초대배양 해마신경세포에서 이브루티닙 1μM 또는 5 μM 처치군 모두에서 비히클 처치군에 비해 dendritic spine 수가 유의미하게 증가하였고(도15A-15B, 도16A~16B), 이브루티닙 5 μM 처치군에서 비히클 처치군에 비해 synaptophysin 및 PSD-95 pnuca number가 현저하게 증가한 것을 확인하였다 (도17A~17D. 따라서 이브루티닙은 해마에서 functional synapses 증가를 통해 인지 행동 향상 효과를 나타냄을 확인할 수 있었다.

<실시예 11>

초대배양 해마신경세포(primary hippocampal neurons)에서 이브루티닙의 dendritic spine 수 증가에 따른 분자기전 연구

이브루티닙의 기억 행동 향상 기전을 분석하기 위해, primary hippocampal neurons에 GFP를 형질도입(transfection) 후 이브루티닙 5 μM 또는 비히클을 24 시간 동안 처리 하였다. 그 후, dendritic spine number를 조절하는데에 관여하는 p-FAK 항체를 이용하여 염색을 한 후 발현 정도를 확인하였다.

그 결과, 이브루티닙 5 μM 처치군에서 비히클 처치군에 비해 p-FAK 발현이 현저하게 감소한 것을 확인하였다(도 18a~18b). 따라서, 이브루티닙은 해마에서 FAK signaling을 저해하므로, dendritic spine number를 조절함을 확인하였다.

<실시예 12>

정상쥐 및 알츠하이머 유발 동물모델에서 이브루티닙 처리에 따른 dendritic spine의 수 증가 효과 분석

이브루티닙의 인지 행동 향상 기전을 분석하기 위해, 정상쥐 및 알츠하이머 유발 동물모델인 PS19 mice (3개월령)에 이브루티닙을 (10 mg / kg, i.p)을 14 일간 주사하고, 마우스의 뇌를 적출하여 Golgi 염색을 수행 후, cortex 및 hippocampus 부위 신경세포 (AO 부위, BS 위치)의 spine 수를 분석하였다.

그 결과, 정상쥐에서 이브루티닙 처치군의 hippocampus CA1 신경세포의 spine 수가 비히클 처치군에 비해 증가한 것을 확인하였다(도 19A-19D). 또한, 알츠하이머 동물모델 (PS19 mice) 이브루티닙 처치군의 hippocampus 신경세포의 spine 수가 비히클 처치군에 비해 현저하게 증가한 것을 확인하였으며(도 20A~20D), 반면에 알츠하이머 동물모델 이브루티닙 처치군의 cortical lyaer V 신경세포의 spine 수는 비히클 처치군에 비해 별다르게 변화가 없음을 확인하였다 (도 20E~20H). 따라서, 이브루티닙이 dendritic spine 밀도 증가를 통해 인지 기능을 향상시킴을 in vivo에서도 확인하였다.

<실시예 13>

알츠하이머 동물 마우스에서 이브루티닙에 의한 아밀로이드 플라크 억제 효과 분석

본 발명자들은 이브루티닙이 퇴행성 뇌질환의 치료제로서 사용 가능함을 확인하기 위해, 알츠하이머가 유발된 마우스 동물모델을 대상으로 이브루티닙 처리 시, 아밀로이드 플라크의 수, 아밀로이드 분해효소인 IDE, NEP의 발현양을 분석하였다.

이를 확인하기 위해, 알츠하이머 동물 마우스 (5xFAD mice) 에게 이브루티닙(10 mg / kg, i.p) 또는 비히클을 14 일간 주사하고, 항-4G8 항체, 항-IDE 항체 를 이용하여 면역조직화학 염색 및 현미경 관찰을 수행하였다.

그 결과, 도 21에 나타낸 바와 같이, 아밀로이드를 검출할 수 있는 항-4G8 항체를 통한 면역조직화학 염색에 의하면, cortex 및 hippocampus 모두에서 이브루티닙을 처리한 군이 처리하지 않은 군에 비해 아밀로이드 플라크가 현저하게 감소된 것으로 나타났다 (도21A~21E). 이와 더불어 이브루티닙이 어떻게 아밀로이드 플락을 감소시키는지에 대한 분자기전 실험으로, 먼저 아밀로이드 분해효소인 IDE의 발현 수준을 확인한 결과, 도 21에 나타낸 바와 같이 cortex 및 hippocampus 모두에서 이브루티닙을 처리한 군이 처리하지 않은 군에 비해 아밀로이드 분해효소인 IDE의 발현이 증가된 것을 확인할 수 있었다 (도 22A~22E). 즉, 이브루티닙은 IDE의 발현증가를 통해 알츠하이머의 유발원인이 되는 아밀로이드 플락을 억제할 수 있음을 시사한다.

<실시예 14>

알츠하이머 동물 마우스 에서 이브루티닙에 의한 타우 인산화 조절 효과 분석

본 발명자들은 이브루티닙이 퇴행성 뇌질환의 치료제로서 사용 가능함을 확인하기 위해, 이브루티닙이 타우 인산화 또한 조절할수 있는지를 확인하기 위하여알츠하이머 동물모델인 5xFAD (3개월령) 생쥐를 대상으로 이브루티닙 처리 시, Tau 발현 변화 및 Tau 인산화 변화여부를 분석하였다. 이를 확인하기 위해, 알츠하이머 유발 마우스에게 이브루티닙(10 mg / kg, i.p) 또는 비히클을 14 일간 주사하고, 항-Tau5 항체, 항-CDK 항체, 항-AT8 항체, 항-AT100 항체 및 항-AT180 항체를 이용하여 면역조직화학 염색 및 현미경 관찰을 수행하였다.

그 결과, 도 23에 나타낸 바와 같이, Total Tau를 검출할 수 있는 항-Tau5 항체를 통한 면역조직화학 염색에 의하면, 5xFAD 생쥐의 cortex 및 hippocampus에서 이브루티닙을 처리한 군이 처리하지 않은 군에 비해 Tau-5 발현에는 유의미한 차이를 보이지 않았다 (도23A~23E). 그러나, 도24부터 도26에 나타낸 바와 같이, Tau 인산화 여부를 검출 할 수 있는 항-AT8 항체, 항-AT100 항체 및 항-AT180 항체, Tau 인산화에 관여하는 단백질을 검출 할 수 있는 항-pCDK5 항체를 통한 면역조직화학 염색 결과에 따르면, 항-AT8 항체를 이용하여 면역조직화학 염색을 한 결과, 5xFAD 생쥐의 cortex에서만 이브루티닙 처리시 Tau 인산화가 유의미하게 감소한 것을 확인 할 수 있었다 (도24A~24E). 그리고, 항-AT100 항체를 이용하여 면역조직화학 염색을 한 결과, 5xFAD 생쥐의 cortex와 hippocampus 둘다 이브루티닙 처리시 Tau 인산화가 유의미하게 감소한 것을 확인 할 수 있었다 (도25A~25E).항-AT180 항체를 이용하여 면역조직화학 염색을 한 결과, 5xFAD 생쥐의 cortex에서는 이브루티닙 처리시 Tau 인산화가 유의미하게 감소한 것을 확인 할 수 있었고, hippocampus에서는 이브루티닙 처리시 Tau 인산화가 감소하는 경향을 확인하였다 (도26A~26E). 이와 더불어, 타우 인산화를 유도하는 유전자인, 항-CDK 항체를 이용하여 면역조직화학 염색을 한 결과, 5xFAD 생쥐의 cortex 와 hippocampus 둘다에서이브루티닙 처리시 CDK 인산화가 유의미하게 감소한 것을 확인 할 수 있었다 (도27A~27B).

결론적으로 본 발명자들은 이브루티닙이 아밀로이드 플라크, 타우 인산화, 뇌염증 억제 및 기억력 향상을 모두 조절할 수 있음을 확인함으로써 이브루티닙을 퇴행성 뇌질환을 예방, 개선 또는 치료할 수 있는 새로운 치료제로서 사용할 수 있음을 알 수 있었다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims

이브루티닙(ibrutinib) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 알츠하이머 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 조성물은 미세아교세포(microglia) 또는 성상세포(astrocyte)의 활성을 억제하여 활성화된 미세아교세포 또는 활성화된 성상세포가 신경세포에 미치는 손상을 억제하는 효과를 갖는 것을 특징으로 하는, 알츠하이머 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 조성물은 미세아교세포의 세포이동을 억제하는 활성을 갖는 것을 특징으로 하는, 알츠하이머 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제2항 또는 제3항에 있어서,
미세아교세포 또는 성상세포의 활성; 또는 미세아교세포의 세포이동은 LPS(Lipopolysaccharides)에 의해 유도되는 것을 특징으로 하는, 알츠하이머 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 조성물은 아밀로이드 플라크 억제 또는 타우 단백질의 인산화 억제 활성을 갖는 것을 특징으로 하는, 알츠하이머 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 조성물은 신경세포에서 수상돌기가지(dendritic spine)의 수, 시냅토파이신(synaptophysin)의 수 및 PSD-95의 풍타(puncta) 수를 증가시키는 것을 특징으로 하는, 알츠하이머 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 조성물은 알츠하이머 질병 동물 모델에서 장기 기억을 향상시키는 것을 특징으로 하는, 알츠하이머 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
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