CN114438179B - 用于检测慢性淋巴细胞白血病耐药相关基因突变的数字pcr试剂盒及引物和探针 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物检测领域，具体讲，涉及一种用于检测慢性淋巴细胞白血病(CLL)耐药相关基因突变的数字PCR试剂盒及引物和探针。本发明的试剂盒中含有用于检测BTK C481S位点、PLCG2 R655W位点、S707Y位点、BCL2 G101V位点和F104L位点的突变的引物和探针。本发明试剂盒采用数字PCR技术，对人类BTK C481S等突变位点进行定量检测，为临床医生对CLL患者靶向用药的疗效监测及临床用药提供参考。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测领域，具体讲，涉及一种用于检测慢性淋巴细胞白血病耐药相关基因突变的数字PCR试剂盒及引物和探针。
背景技术
慢性淋巴细胞白血病(CLL)是一种以成熟的、CD5阳性的B细胞在外周血、骨髓、肝脾和***中克隆性增殖积累为特征的血液***恶性疾病，是西方国家最常见的成人白血病。CLL患者的中位年龄为72岁，男性较女性更易感。我国CLL发病率虽然低于西方国家，但随着人口老龄化、生活方式西化以及诊断技术的提高，发病率呈现上升趋势。近30年来，CLL的治疗逐渐从免疫化疗走向靶向治疗时代，多种新型靶向药物投入临床应用，包括布鲁顿酪氨酸激酶(BTK)抑制剂伊布替尼(Ibrutinib)、PI3K抑制剂艾代拉里斯(Idelalisib)和Bcl-2抑制剂维奈克拉(Venetoclax)等。
B细胞受体(BCR)信号传导通路的持续活化在CLL细胞的增殖和生存中起到了重要的调控作用，阻断或抑制BCR通路是治疗CLL的新策略。BTK是BCR信号通路的重要组成部分之一，是B细胞成熟、分化、增殖及生存通路的重要调控因子。在CLL中，BTK可通过激活NF-κB、MAP激酶等下游信号通路，促进CLL细胞生存。抑制BTK活性能够下调BCR下游信号通路，使CLL细胞发生凋亡，产生明显的抗肿瘤效应。因此，靶向BTK的药物治疗策略已然成为血液***恶性肿瘤的研究热点。
伊布替尼是国际上第一个获批应用于治疗CLL患者的BTK抑制剂，它通过与BTK活性位点上的半胱氨酸-481(C481)高度特异性共价结合，不可逆地抑制BTK的活性，抑制B淋巴细胞的增殖、趋化和粘附，从而发挥良好的抗肿瘤作用，是一种高效、高选择性的口服小分子BTK抑制剂。伊布替尼在2017年获得我国药品监督管理局批准用于治疗复发或难治CLL。
然而，在伊布替尼的临床应用过程中，CLL患者对伊布替尼耐药的现象被发现并重视。多项研究发现，伊布替尼获得性耐药的产生与伊布替尼与BTK共价结合位点的基因突变(如C481S突变)、BTK下游通路调控因子突变(如PLCG2基因R665W突变、L846F突变和S707Y突变)有关。其中，BTK C481S突变对伊布替尼耐药性的产生起到最主要的作用。有研究发现，CLL患者外周血中BTK C481S突变的克隆扩增早于伊布替尼临床耐药表现9.3个月出现，定期监测、及时调整用药能使患者生存获益。目前，临床中多采用二代测序技术对CLL患者生物学样本进行靶向基因检测，以选择最适治疗方案、实现精准化治疗。但是，经济成本高、检测周期长成为二代测序技术服务于CLL患者临床用药指导的绊脚石。因此，低成本、高精度的快速检测技术对于采用伊布替尼治疗的CLL患者实现精准监测、指导临床用药有着非常重要的价值。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的首要发明目的在于提供一种用于检测慢性淋巴细胞白血病耐药相关基因突变的数字PCR试剂盒。
本发明的第二发明目的在于提供该试剂盒的使用方法。
本发明的第三发明目的在于提供用于检测慢性淋巴细胞白血病耐药相关基因突变的引物和探针。
为了完成本发明的发明目的，采用的技术方案为：
本发明提出一种用于检测慢性淋巴细胞白血病耐药相关基因突变的数字PCR试剂盒，所述试剂盒中含有核酸扩增试剂，所述核酸扩增试剂中含有用于检测BCL2 G101V和F104L位点、PLCG2 R655W位点、PLCG2 S707Y位点、BTK C481S位点的突变的引物和探针。
可选的，用于检测BCL2 G101V和F104L位点的上游引物的核苷酸序列如SEQ IDNO:1所示、下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示、探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:3～SEQ ID NO:5所示，用于检测PLCG2 R655W位点的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示、下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示、探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:8～SEQID NO:9所示，用于检测PLCG2 S707Y位点的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示、下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示、探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:12～SEQ IDNO:13所示，用于检测BTK C481S位点的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示、下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:15所示、探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:16～SEQ ID NO:17所示。
可选的，所述探针的5’端连接有荧光基团，3’端连接有荧光淬灭基团；优选的，所述SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:16的荧光基团选自FAM、荧光淬灭基团选自MGB；所述SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:17的荧光基团选自VIC、荧光淬灭基团选自MGB。
可选的，所述上游引物的浓度为0.17～0.5μmol/L，优选0.35μmol/L；所述下游引物的浓度为0.17～0.5μmol/L，优选0.35μmol/L；所述探针的浓度为0.12～0.24μmol/L，优选0.18μmol/L。
可选的，所述试剂盒中还含有阴性对照和阳性对照，所述阴性对照为工艺用水，所述阳性对照为含有SEQ ID NO:18～SEQ ID NO:26所示的片段化质粒标准品。
可选的，所述试剂盒所适用的样本选血浆标本或石蜡标本。
本发明还涉及该数字PCR试剂盒的使用方法，至少包括以下步骤：
S1、样品处理：采用商业化提取试剂盒对样品进行提取，得到样品处理液；
S2、配制数字PCR反应混合液：将所述数字PCR反应液与所述样品处理液混合，得到数字PCR反应混合液；优选的，所述数字PCR反应液与所述样品处理液的体积比为6:14；
S3、将所述数字PCR反应混合液和微滴生成油加入微滴生成卡中，置于微滴生成仪中生成微滴，封膜，然后进行数字PCR扩增反应；
S4、读取荧光信号：将扩增后的96孔板置于微滴读取仪中，利用软件直接进行结果读取和分析；按照泊松分布原理自动计算获得ddPCR反应体系内BTK C481S位点、PLCG2R655W位点、S707Y位点、BCL2 G101V位点和F104L位点的突变的拷贝数。
可选的，所述数字PCR扩增反应的条件为：首先在95℃条件下保温9～11min；然后94℃保温13～16sec、58℃保温58～60sec，共进行39～41个循环；最后在98℃条件下保温10min，降温至4℃停止反应；优选的，首先在95℃条件下保温10min；然后94℃保温15sec、58℃保温60sec，共进行40个循环；最后在98℃条件下保温10min，降温至4℃停止反应；更优选的，升降温的速度≤2℃/s。
本发明涉及采用数字PCR检测慢性淋巴细胞白血病耐药相关基因突变的引物和探针，所述引物和探针用于检测BCL2 G101V和F104L位点、PLCG2 R655W位点、PLCG2 S707Y位点、BTK C481S位点的突变的引物和探针。
可选的，用于检测BCL2 G101V和F104L位点的上游引物的核苷酸序列如SEQ IDNO:1所示、下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示、探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:3～SEQ ID NO:5所示，用于检测PLCG2 R655W位点的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示、下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示、探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:8～SEQID NO:9所示，用于检测PLCG2 S707Y位点的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示、下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示、探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:12～SEQ IDNO:13所示，用于检测BTK C481S位点的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示、下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:15所示、探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:16～SEQ ID NO:17所示；优选的，所述SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:16的荧光基团选自FAM、荧光淬灭基团选自MGB；所述SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:9、SEQ IDNO:13、SEQ ID NO:17的荧光基团选自VIC、荧光淬灭基团选自MGB。
本发明至少具有以下有益的效果：
本试剂盒采用数字PCR技术，对人类BTK C481S等突变进行定量检测，为临床医生对CLL患者疗效监测、制定个体化治疗方案提供参考。
附图说明
图1为BCL2 G101V突变位点示意图；
图2为检测过程中的界面示意图。
具体实施方式
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例经各资料结果的综合考虑，设计了BCL2 G101V、F104L、PLCG2R655W、S707Y和BTK C481S五个位点的数字PCR检测。
BCL2抑制剂-维奈克拉对慢性淋巴细胞性白血病患者具有强效而持久的缓解效果。但当BCL2 G101V发生突变时(NM_000633.2:c.302G>T,p.(Gly101Val))，能引起慢性淋巴细胞性白血病患者对维奈克拉的耐药性。基质中携带G101V突变的原代细胞随着浓度高于临床可达到的情况对维奈克拉的抗性显著提升。而在没有维奈克拉的情况下，G101V突变在保护细胞株免于凋亡和野生型BCL2一样有效。在结合实验中，维奈克拉与BIM竞争结合G101V的能力相比野生型BCL2急剧降低了180倍，这很可能是VAL中较大的异丙基占了结合维奈克拉的沟。在细胞实验中，维奈克拉能够轻易的从野生型BCL2上解离BAX和BAK，但是当这些促凋亡分子结合到G101V后就失效了。这些均提示BCL2 G101V突变导致CLL对维奈克拉耐药。因此检测该位点的突变情况能更好的为监测耐药克隆出现以及后续临床用药提供指导。BCL2 G101V突变位点示意图如图1所示。
BTK是非受体蛋白酪氨酸激酶Tec家族的成员，是B细胞抗原受体(BCR)信号通路中的关键激酶，能够调节正常B细胞的增殖、分化与凋亡，这也充分说明了BTK在B淋巴细胞的生成过程中起着不可替代的作用，是治疗血液肿瘤的理想靶点。人BTK基因的染色体编码了659个氨基酸。BTK基因包括了PH结构域、TH结构域、SH3结构域、SH2结构域和SH1结构域。其中PH结构域由大约120个氨基酸组成，包含转录因子BAP-135/TFH-I以及活性下调因子PIN1、IBTK的结合位点，同时也负责介导BTK与第2信使磷脂酰肌醇三磷酸(PIP3)的作用。TH结构域由大约80个氨基酸残基构成，由BTK蛋白质模体(motif)和富含脯氨酸区域两部分组成。SH3结构域能特异识别TH结构域中富含脯氨酸片段，诱发分子内折叠。SH1结构域包含活化环、ATP结合位点、催化器以及变构抑制片段。BTK的活化(磷酸化)最初发生在SH1结构域中的活化环中，进一步的活化发生在包含主要自磷酸化位点的SH2及SH3结构域中。SH2结构域的功能是特异性识别酪氨酸残基的磷酸化状态，从而使包含SH2结构域的蛋白质可以定位到其他蛋白的磷酸化酪氨酸位点上。
BTK的下游受体包括生长因子、B细胞抗原、趋化因子及非特异免疫受体等，因此BTK的活化能引发诸如：细胞增殖、存活、分化、血管新生、抗原表达和细胞因子合成等多种细胞过程。而BTK活化的重点在于BTK迁移到细胞膜上，当细胞膜上的一些受体接收到相应配体的刺激后，活化的受体会募集并磷酸化胞内的信号转导激酶PI3K，磷酸化的PI3K随后将膜上的PIP2转化为第2信使PIP3。PIP3结合到BTK的PH结构域，BTK随后会被募集到细胞膜，随后Tyr-551残基被Syk和Lyn激酶磷酸化。BTK接着在Tyr-223残基进行自磷酸化反应从而具备生理活性。
伊布替尼可以选择性的和靶蛋白BTK活性位点Cys481结合形成共价键，从而抑制BTK自身磷酸化，达到抑制BTK信号通路的效果，具有高效、不可逆的特点。突变导致的耐药性在对依鲁替尼存在耐药性的CLL患者(840mg/d)的血液RNA分析发现BTK的突变体C481S，从BTK结构和伊布替尼的对接(docking)结果可以看出，481位的半胱氨酸在药物结合中起到重要作用，因此从C突变为S大大降低了其结合的稳定性IC50。除此以外，还在CLL患者体内发现BTK的下游基因PLCG2的突变体，R665W，L845F和S707Y，这些突变均可导致伊布替尼的耐药。但仍出现出血、感染、骨髓抑制、肾毒性、继发第二个肿瘤等危及生命的不良事件。因此对这些位点进行检测有着重要的临床用药指导意义。
本发明实施例涉及一种用于检测慢性淋巴细胞白血病耐药相关基因突变的数字PCR试剂盒，试剂盒中含有核酸扩增试剂，核酸扩增试剂中含有用于检测BTK C481S位点、PLCG2 R655W位点、PLCG2 S707Y位点、BCL2 G101V位点和F104L位点的突变的引物和探针。具体的，引物和探针的核苷酸序列为如表1所示：
表1
| 引物探针名称 | 序列编号 | 核苷酸序列 | 修饰 |
| BCL2-G101V-F104L-F | SEQ ID NO:1 | ccacctgtggtccacctga | — |
| BCL2-G101V-F104L-R | SEQ ID NO:2 | caggtgcagctggctgga | — |
| BCL2-G101V-P | SEQ ID NO:3 | caggccgtcgacgact | 5’-FAM，3’-MGB |
| BCL2-G101-F104-WT-P | SEQ ID NO:4 | cggcgacgacttctcc | 5’-VIC，3’-MGB |
| BCL2-F104L-P | SEQ ID NO:5 | acgacttgtcccgccg | 5’-FAM，3’-MGB |
| PLCG2-R655W-F | SEQ ID NO:6 | tactatgacagcctgagcc | — |
| PLCG2-R655W-R | SEQ ID NO:7 | tcgctcccctctcgcttc | — |
| PLCG2-R655W-P | SEQ ID NO:8 | aggattccctgggacg | 5’-FAM，3’-MGB |
| PLCG2-R655-WT-P | SEQ ID NO:9 | aggattccccgggac | 5’-VIC，3’-MGB |
| PLCG2-S707Y-F | SEQ ID NO:10 | agcattgtcgcatcaaccgg | — |
| PLCG2-S707Y-R | SEQ ID NO:11 | ctcgtagtaactgacgagct | — |
| PLCG2-S707Y-P | SEQ ID NO:12 | tggggacctacgcctat | 5’-FAM，3’-MGB |
| PLCG2-S707-WT-P | SEQ ID NO:13 | ctggggacctccgcct | 5’-VIC，3’-MGB |
| BTK-C481S-F | SEQ ID NO:14 | cgccccatcttcatcatcac | — |
| BTK-C481S-R | SEQ ID NO:15 | agcagctgctgagtctgg | — |
| BTK-C481S-P | SEQ ID NO:16 | aatggctccctcctgaa | 5’-FAM，3’-MGB |
| BTK-C481-WT-P | SEQ ID NO:17 | aatggctgcctcctgaa | 5’-VIC，3’-MGB |
可选的，在核酸扩增试剂中，上游引物的浓度为0.17～0.5μmol/L，优选0.35μmol/L；下游引物的浓度为0.17～0.5μmol/L，优选0.35μmol/L；探针的浓度为0.12～0.24μmol/L，优选0.18μmol/L。
可选的，试剂盒中还含有阴性对照和阳性对照，阴性对照为工艺用水。阳性对照为含有表2所示的片段化质粒标准品：
表2
可选的，试剂盒所适用的样本选血浆标本或石蜡标本。
本发明还涉及该数字PCR试剂盒的使用方法，至少包括以下步骤：
S1、样品处理：采用商业化提取试剂盒对样品进行提取，得到样品处理液；
S2、配制数字PCR反应混合液：将所述数字PCR反应液与所述样品处理液混合，得到数字PCR反应混合液；优选的，所述数字PCR反应液与所述样品处理液的体积比为6：14；
S3、将所述数字PCR反应混合液和微滴生成油加入微滴生成卡中，置于微滴生成仪中生成微滴，封膜，然后进行数字PCR扩增反应；
S4、读取荧光信号：将扩增后的96孔板置于微滴读取仪中，利用软件直接进行结果读取和分析；按照泊松分布原理自动计算获得ddPCR反应体系内BTK C481S位点、PLCG2R655W位点、S707Y位点、BCL2 G101V位点和F104L位点的突变的拷贝数。
其中，数字PCR扩增反应的条件为：首先在95℃条件下保温9～11min；然后94℃保温13～16sec、58℃保温58～60sec，共进行39～41个循环；最后在98℃条件下保温10min，降温至4℃停止反应；优选的，首先在95℃条件下保温10min；然后94℃保温15sec、58℃保温60sec，共进行40个循环；最后在98℃条件下保温10min，降温至4℃停止反应；更优选的，升降温的速度≤2℃/sec。
本发明实施例还涉及一种采用数字PCR检测慢性淋巴细胞白血病耐药相关基因突变的引物和探针，引物和探针用于检测BCL2 G101V和F104L位点、PLCG2 R655W位点、PLCG2S707Y位点、BTK C481S位点的突变的引物和探针，核苷酸序列具体如表1所示。
实施例1
试剂盒的组成如表3所示：
表3
适用仪器：QX200 Droplet Digital PCR***(美国BioRad公司)。
样本要求：适用于从血浆标本中提取的人类基因组游离DNA(cfDNA)或石蜡标本中提取的人类基因组DNA的检测。
阳性判断值或者参考区间：对10ng基因组DNA可测到2‰BCL2、PLCG2和BTK基因突变。
检验方法：
1.样本处理：
自行进行核酸提取(推荐使用商业化的试剂盒来提取DNA)，以此作为PCR反应模板。提取完的核酸建议立即进行检测，否则于-20℃以下保存。
2.扩增试剂准备及加样：
a.从试剂盒中取出相应的反应液，室温融化并混匀后，2000rpm离心10s，均按如下配制每个测试的PCR预混液：4μL混合液ddPCR+10μL 2×ddPCR MIX3，将上述配制好的PCR预混液，分别按每管14μL的量，分装于各PCR管内。
b.基因组DNA模板浓度测定(qubit测定)好后，用水稀释至2ng/μL，取模板6μL加至装有上述PCR预混液的PCR管中。
c.每个反应体系的总体积为20μL。
d.盖紧PCR管盖，振荡混匀20s以上，瞬时离心后进行微滴制备.
3.制备微滴：
a.将8个20μL反应体系加入到DG8 cartridge中间一排的8个孔内。
注意：1)必须先在DG8 cartridge中间1排加样品(若样品不足8个时，空孔请加入20μL BX ddPCR Buffer Control；加样前将移液枪调制20μL示数，取样时吸取管中所有液体)。
2)加样本时，避免产生气泡，如有肉眼可见气泡，可用一洁净枪头戳破气泡。
b.在DG8 cartridge最底一排8个孔中各加入70μL Droplet Generation oil，盖上胶垫(gasket)，将DG8 cartridge轻轻地平稳放置于微滴生成仪中，开始生成微滴，注意仪器上指示灯状态，一般2min之内完成。
c.微滴生成于cartridge最上面一排孔内，将生成的微滴(大约为35～45μL)转移到96孔板中。
5.封膜
微滴转入96孔板内后，用预热好的PX1热封仪对其进行封膜，推荐的运行程序为：180℃，5s，无需颠倒方向二次封膜；封好膜之后应该在30min内进行PCR反应，或者放于4℃冰箱4小时之内进行PCR。
6.PCR扩增：
95℃，10min；(94℃，15sec；58℃，60sec)40个循环；98℃，10min；4℃，5min，反应体系设为40μL，注意升降温速度≤2℃/s。
7.微滴读取：
a.先打开电脑，再打开Droplet Reader电源，在使用前需预热至少30min；
b.将之前完成PCR的96孔板放入plate holder，平稳放入微滴读取仪中。
c.打开QuantaSoft软件，对96孔板中样品信息进行Setup，完成后即可进行Run。
注意：1)Supermix选择“ddPCR Supermix for probes”
2)Dye Set选择“FAM/VIC”
8.结果分析：
检测完成后，点击“2D Amplitude”查看通道1和通道2聚类图。此图允许手工或自动调节阈值用以对每个检测通道进行阳性和阴性微滴指定。
点击“Auto Analyze”重设阈值；
手工指定阈值：
使用阈值十字线指定整个点图的分类区域(仅在热图模式下可选)；
使用椭圆，矩形或套索阈值调节工具来分类点图区域：点击相应工具按钮，然后在“Working cluster selector”点击区域类型，使用工具选择相应区域。界面示意图如图2所示：
注意：荧光阈值线的设置参照阴性对照和阳性对照：在2D Amplitude中，荧光阈值线的位置应该使阴性对照的微滴簇在“ch1-ch2-”区间内，阳性对照的4种微滴簇分别位于四个区间内。
检验结果的解释：
1.有效性判定：
阴性对照有效性判定：“ch1+”区的点＜4个点且落在“ch2+”区的点＜4个点。
阳性对照有效性判定：落在“ch1+ch2-”区的点≥4个点且突变比例≥2‰。
无效结果的判定：每个反应管的total微滴数应≥8000，若total微滴数＜8000，该反应孔的微滴生成则不理想，需重新进行微滴生成。
2.结果判定：
2.1定性判定
(1)若样本落在“ch1+ch2-”区的点≥4个且突变比例≥2‰，则判定BCL2和BTK位点突变。
(2)如不符合(1)，
若样本DNA≥50拷贝
若样本落在“ch1+ch2-”区的点为<3个或突变比例＜2‰，则判定BCL2和BTK位点无突变或突变低于最低检测限值。
若样本落在“ch1+ch2-”区的点为3个，且突变比例≥2‰，则判定BCL2和BTK位点突变疑似阳性，需重新检测。重新检测的结果，若样本落在“ch1+ch2-”区的点≥4个且突变比例≥2‰，则判定BCL2和BTK位点突变。反之，判定BCL2和BTK位点无突变或突变低于最低检测限值。
若样本DNA＜50拷贝，则提示加入的DNA质量不佳或者含有PCR抑制剂，需要重新提取DNA后或重新取样后再做。重新检测后，样本DNA<50拷贝且不符合(1)，则判定DNA质量不符合要求。反之，按上述条件进行相应判定。
2.2定量判定
若样本BTK位点突变，可按Ch1/(Ch1+Ch2)公式进行突变百分比计算。
实验例1引物筛选试验
按一般原则配制引物探针反应液，在每一需要检测的位点上先配制20人份小样进行预实验。
1、根据BCL2 G101V-F104L位点配制表4内的组分。再将引物F1/R2，F2/R1，F2/R2进行替换表3中的F1/R1进行实验，使用通过其他检测方法如NGS测序获得的已知突变频率的标准品进行微滴反应试验来比较各引物搭配之间的好坏，选择最优搭配方案。
表4：BCL2反应液
| 名称 | 浓度 | 1人份 | 20人份 |
| BCL2-F1 | 50μmol/L | 0.36μL； | 7.2μL |
| BCL2-R1 | 50μmol/L | 0.36μL | 7.2μL |
| Probe G101V | 100μmol/L | 0.03μL | 0.6μL |
| Probe F104L | 100μmol/L | 0.03μL | 0.6μL |
| Probe BCL2-WT | 100μmol/L | 0.05μL | 1μL |
| TE | 3.17μL | 63.4μL | |
| TOTAL | 4μL | 80μL |
引物序列如表5所示：
表5
| 引物名称 | 序列编号 | 核苷酸序列 |
| BCL2-F1 | SEQ ID NO:27 | ccggtgccacctgtggtc |
| BCL2-R1 | SEQ ID NO:28 | gcggtgaagggcgtcagg |
| BCL2-F2 | SEQ ID NO:1 | ccacctgtggtccacctga |
| BCL2-R2 | SEQ ID NO:2 | caggtgcagctggctgga |
| PLCG2-R655W-F1 | SEQ ID NO:6 | tactatgacagcctgagcc |
| PLCG2-R655W-R1 | SEQ ID NO:29 | cgctcccctctcgcttcc |
| PLCG2-R655W-F2 | SEQ ID NO:30 | caagccgtggtactatgacagc |
| PLCG2-R655W-R2 | SEQ ID NO:7 | tcgctcccctctcgcttc |
| PLCG2-S707Y-F1 | SEQ ID NO:31 | tcagggctaggggcaagg |
| PLCG2-S707Y-R1 | SEQ ID NO:32 | aatgcttctcgtagtaactgacg |
| PLCG2-S707Y-F2 | SEQ ID NO:10 | agcattgtcgcatcaaccgg |
| PLCG2-S707Y-R2 | SEQ ID NO:11 | ctcgtagtaactgacgagct |
| BTK-C481S-F1 | SEQ ID NO:14 | cgccccatcttcatcatcac |
| BTK-C481S-R1 | SEQ ID NO:15 | agcagctgctgagtctgg |
| BTK-C481S-F2 | SEQ ID NO:33 | cccatcttcatcatcactgagtac |
| BTK-C481S-R2 | SEQ ID NO:34 | catccttgcacatctctagcag |
BCL2引物筛选试验结果如表6-表9所示：
表6：BCL2 F2/R2引物筛选试验结果
表7：BCL2 F1/R1引物筛选试验结果
表8：BCL2 F2/R1引物筛选试验结果
表9：BCL2 F1/R2引物筛选试验结果
通过表6至表9所示微滴读取结果可以看出，BCL2F2/R2引物混合的反应液对于阳性标准品突变率检测出的准确性最高，且在阴性样本中有着较好的检测特异性，同时未发现非特异性的突变点数(ch1+ch2-点数)。
根据相同的方法，分别对检测位点PLCG2R655W、PLG2 S707Y和BTK C481S位点根据表10、11、12所示的常规反应液配比进行了20人份小样试剂的配制，再将引物F1/R2，F2/R1，F2/R2进行替换表中的F1/R1进行实验，比较各引物之间的好坏，根据相同的标准选择最优搭配。
表10：PLCG2 R655W反应液
| 名称 | 浓度 | 1人份 | 20人份 |
| PLCG2-R655F1 | 50μmol/L | 0.36 | 7.2 |
| PLCG2-R655R1 | 50μmol/L | 0.36 | 7.2 |
| Probe PLCG2 R655W | 100μmol/L | 0.03 | 0.6 |
| Probe PLCG2 R655-WT | 100μmol/L | 0.05 | 1 |
| TE | 3.2 | 64 | |
| TOTAL | 4 | 80 |
表11：PLCG2 S707Y反应液
| 名称 | 浓度 | 1人份 | 20人份 |
| PLCG2-S707F1 | 50μmol/L | 0.36 | 7.2 |
| PLCG2-S707R1 | 50μmol/L | 0.36 | 7.2 |
| Probe PLCG2 S707Y | 100μmol/L | 0.03 | 0.6 |
| Probe PLCG2 S707-WT | 100μmol/L | 0.05 | 1 |
| TE | 3.2 | 64 | |
| TOTAL | 4 | 80 |
表12：BTK C481S反应液
| 名称 | 浓度 | 1人份 | 20人份 |
| BTK C481F1 | 50μmol/L | 0.36 | 7.2 |
| BTK C481F1 | 50μmol/L | 0.36 | 7.2 |
| Probe BTK C481S | 100μmol/L | 0.03 | 0.6 |
| Probe BTK C481-WT | 100μmol/L | 0.05 | 1 |
| TE | 3.2 | 64 | |
| TOTAL | 4 | 80 |
PLCG2 R655W引物筛选试验结果如表13～16所示：
表13：PLCG2 R655W-F1/PLCG2 R655W-R2引物筛选试验结果
表14：PLCG2 R655W-F2/PLCG2 R655W-R2引物筛选试验结果
表15：PLCG2 R655W-F2/PLCG2 R655W-R1引物筛选试验结果
表16：PLCG2 R655W-F1/PLCG2 R655W-R1引物筛选试验结果
PLCG2 S707Y引物筛选试验结果表17～20所示：
表17：PLCG2 S707Y-F2PLCG2 S707Y-R2引物筛选试验结果
表18：PLCG2 S707Y-F1/PLCG2 S707Y-R1引物筛选试验结果
表19：PLCG2 S707Y-F2/PLCG2 S707Y-R1引物筛选试验结果
表20:PLCG2 S707Y-F1/PLCG2 S707Y-R2引物筛选试验结果
BTK C481S引物筛选试验结果如表21～24所示:
表21：BTK C481S-F1/BTK C481S-R1引物筛选试验结果
表22：BTK C481S-F2/BTK C481S-R2引物筛选试验结果
表23：BTK C481S-F2/BTK C481S-R1引物筛选试验结果
表24：BTK C481S-F1/BTK C481S-R2引物筛选试验结果
通过观察微滴读取结果可以看出(表13至24)，PLCG2 R655W F1/R2、PLCG2S707YF2/R2、BTK C481S-F1/R1引物混合的反应液对于阳性标准品突变率检测出的准确性最高，且在阴性样本中有着较好的检测特异性，同时未发现非特异性的突变点数(ch1+ch2-点数)，并作为选择进行预实验的配制方案。
引物浓度和探针浓度在整个PCR反应中是相互关联的，因此选用了这两种因素对稀释至10％的质粒参考品进行交叉实验对PCR反应体系进行优化。
表25：BTK C481S引物浓度和探针浓度试验结果
以上实验结果表明，在节约原材料及保证检测准确性的前提下引物浓度0.35μM，探针浓度为0.18μM的组合为最有效的检测搭配。表明了在拷贝数不受影响的前提检测出的突变率与参考品一致。同理对其他四个位点也进行了相应的实验，结果一致。根据此配制方案进行灵敏度、准确性、稳定性等试验。
实验例2检测限实验
检测灵敏度的确定和依据选取含有突变的质粒参考品按一定比例与野生的质粒混合后进行梯度稀释，以确定反应液突变率的参考值。以BTK C481S位点为例，其检测结果如下：
表26：BTK C481S检测限设定试验结果
通过观察微滴读取结果可以看出，BTK C481S反应液对于突变率大于等于0.1％的样本仍然可以检出。但是在0.1％～0.2％的范围内，定量结果与预期突变率出现了较大偏差；当突变率降到0.1％以下时，检测结果容易出现漏检(如阴性被检测出)。因此将定性检测范围定为≥0.2％。以此相同的方法分别对其他的PLCG2 R655W、S707Y、BCL2 G101V和G104L位点进行了相同检测灵敏度确定试验，所有位点的突变检测范围都定为≥0.2％。
检测限的检测结果：根据以上实验结果，采用BTK C481S突变比例为确定的检测限，重复20次，检测结果如下：
表27：BTK C481S检测限结果
由以上结果可以看出，在95％的置信区间的条件下，使用BTK C481S检出限参考品(突变率＝0.2％)进行实验，重复20次的实验结果的阳性符合率为100％，，显示为有效的检测灵敏度。以此相同的方法分别对其他的PLCG2 R655W、S707Y、BCL2 G101V和G104L位点进行了相同确定实验，所有位点的阳性符合率都为100％。
实验例3准确度实验及结果
选用3例临床检测BTK C481S为阳性的慢性淋巴细胞白血患者的DNA样本，进行检测实验并与经过高通量测序方法检测为阳性的突变率进行比较。
表28：BTK C481S临床样本准确性实验结果
根据结果可知，9047、4915、和4672的样本呈现BTK C481S阳性，突变率分别为24.1％、44.7％、和43.3％，结果与经过NGS检测计算出的频率相一致。为了进一步确认其突变比率的正确性，进行了二次相同重复实验，结果与第一次结果相一致，排除了操作误差会给结果带来不准确性的可能。
同理，分别选用了临床检测PLCG2 R655W、S707Y、BCL2 G101V和G104L阳性的样本共5例进行了检测(见表29)，结果与经过NGS检测计算出的频率相一致，每组实验重复了三次以确保实验误差对结果的影响。
表29：临床样本准确性实验结果
实验例4:特异性实验及结果
选取BTK C481S、BCL2 G101V、BCL2 G104L、PLCG2 R655W和PLCG2 S707Y经高通量测序检测为阴性的临床样本两例和弥漫性组织淋巴瘤细胞系SU-DHL2的DNA样本分别使用上述5个位点的试剂盒进行检测。BTK C481S试剂盒实验结果如表30所示。
表30：BTK C481S试剂盒特异性结果
以上结果显示：BTK C481S试剂盒检测阴性和细胞系样本结果均为阴性，提示试剂盒特异性好。以此相同的方法分别对其他的PLCG2 R655W、S707Y、BCL2 G101V和G104L位点进行了相同确定实验，所有位点的检测结果都为阴性。
本申请虽然以较佳实施例公开如上，但并不是用来限定权利要求，任何本领域技术人员在不脱离本申请构思的前提下，都可以做出若干可能的变动和修改，因此本申请的保护范围应当以本申请权利要求所界定的范围为准。
序列表
<110> 江苏省人民医院
苏州云泰生物医药科技有限公司
<120> 用于检测慢性淋巴细胞白血病耐药相关基因突变的数字PCR试剂盒及引物和探针
<160> 34
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ccacctgtgg tccacctga 19
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
caggtgcagc tggctgga 18
<210> 3
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
caggccgtcg acgact 16
<210> 4
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cggcgacgac ttctcc 16
<210> 5
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
acgacttgtc ccgccg 16
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tactatgaca gcctgagcc 19
<210> 7
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tcgctcccct ctcgcttc 18
<210> 8
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
aggattccct gggacg 16
<210> 9
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
aggattcccc gggac 15
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
agcattgtcg catcaaccgg 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ctcgtagtaa ctgacgagct 20
<210> 12
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
tggggaccta cgcctat 17
<210> 13
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
ctggggacct ccgcct 16
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
cgccccatct tcatcatcac 20
<210> 15
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
agcagctgct gagtctgg 18
<210> 16
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
aatggctccc tcctgaa 17
<210> 17
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
aatggctgcc tcctgaa 17
<210> 18
<211> 96
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
ccacctgtgg tccacctgac cctccgccag gccggcgacg acttctcccg ccgctaccgc 60
cgcgacttcg ccgagatgtc cagccagctg cacctg 96
<210> 19
<211> 96
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
ccacctgtgg tccacctgac cctccgccag gccgtcgacg acttctcccg ccgctaccgc 60
cgcgacttcg ccgagatgtc cagccagctg cacctg 96
<210> 20
<211> 96
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
ccacctgtgg tccacctgac cctccgccag gccggcgacg acttgtcccg ccgctaccgc 60
cgcgacttcg ccgagatgtc cagccagctg cacctg 96
<210> 21
<211> 95
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
tactatgaca gcctgagccg cggagaggca gaggacatgc tgatgaggat tccccgggac 60
ggggccttcc tgatccggaa gcgagagggg agcga 95
<210> 22
<211> 95
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
tactatgaca gcctgagccg cggagaggca gaggacatgc tgatgaggat tccctgggac 60
ggggccttcc tgatccggaa gcgagagggg agcga 95
<210> 23
<211> 92
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
agcattgtcg catcaaccgg gacggccggc actttgtgct ggggacctcc gcctattttg 60
agagtctggt ggagctcgtc agttactacg ag 92
<210> 24
<211> 92
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
agcattgtcg catcaaccgg gacggccggc actttgtgct ggggacctac gcctattttg 60
agagtctggt ggagctcgtc agttactacg ag 92
<210> 25
<211> 95
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
cgccccatct tcatcatcac tgagtacatg gccaatggct gcctcctgaa ctacctgagg 60
gagatgcgcc accgcttcca gactcagcag ctgct 95
<210> 26
<211> 95
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
cgccccatct tcatcatcac tgagtacatg gccaatggct ccctcctgaa ctacctgagg 60
gagatgcgcc accgcttcca gactcagcag ctgct 95
<210> 27
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
ccggtgccac ctgtggtc 18
<210> 28
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
gcggtgaagg gcgtcagg 18
<210> 29
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
cgctcccctc tcgcttcc 18
<210> 30
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
caagccgtgg tactatgaca gc 22
<210> 31
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
tcagggctag gggcaagg 18
<210> 32
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
aatgcttctc gtagtaactg acg 23
<210> 33
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
cccatcttca tcatcactga gtac 24
<210> 34
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
catccttgca catctctagc ag 22
Claims (6)
1.一种用于检测慢性淋巴细胞白血病耐药相关基因突变的数字PCR试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中含有核酸扩增试剂，所述核酸扩增试剂中含有用于检测BCL2 G101V和F104L位点、PLCG2 R655W位点、PLCG2 S707Y 位点、BTK C481S位点的突变的引物和探针；
用于检测BCL2 G101V和F104L位点的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示、下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示、探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:3~ SEQ ID NO:5所示，
用于检测PLCG2 R655W位点的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示、下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示、探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:8~ SEQ ID NO:9所示，
用于检测PLCG2 S707Y位点的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示、下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示、探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:12~ SEQ ID NO:13所示，
用于检测BTK C481S位点的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示、下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:15所示、探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:16~ SEQ ID NO:17所示。
2.根据权利要求1所述的数字PCR试剂盒，其特征在于，所述探针的 5’端连接有荧光基团，3’端连接有荧光淬灭基团；
所述SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:16的荧光基团为 FAM、荧光淬灭基团为MGB；所述SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:13、SEQ IDNO:17的荧光基团为VIC、荧光淬灭基团为MGB。
3.根据权利要求1所述的数字PCR试剂盒，其特征在于，所述上游引物的浓度为0.35 μmol/L；所述下游引物的浓度为0.35 μmol/L；所述探针的浓度为0.18 μmol/L。
4.根据权利要求1所述的数字PCR试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还含有阴性对照和阳性对照，所述阴性对照为工艺用水，所述阳性对照为含有SEQ ID NO:18~ SEQ ID NO:26所示的片段化质粒标准品。
5.根据权利要求1所述的数字PCR试剂盒，其特征在于，所述试剂盒所适用的样本选自血浆标本或石蜡标本。
6.一种采用数字PCR检测慢性淋巴细胞白血病耐药相关基因突变的引物和探针，其特征在于，所述引物和探针为用于检测BCL2 G101V和F104L位点、PLCG2 R655W位点、PLCG2S707Y 位点、BTK C481S位点的突变的引物和探针；
用于检测BCL2 G101V和F104L位点的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示、下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示、探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:3~ SEQ ID NO:5所示，
用于检测PLCG2 R655W位点的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示、下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示、探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:8~SEQ ID NO:9所示，
用于检测PLCG2 S707Y位点的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示、下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示、探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:12~ SEQ ID NO:13所示，
用于检测BTK C481S位点的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示、下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:15所示、探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:16~ SEQ ID NO:17所示；
所述SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:16的荧光基团为 FAM、荧光淬灭基团为MGB；所述SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:13、SEQ IDNO:17的荧光基团为VIC、荧光淬灭基团为MGB。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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Applications Claiming Priority (1)
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|---|---|---|---|
| CN202011186910.5A CN114438179B (zh) | 2020-10-30 | 2020-10-30 | 用于检测慢性淋巴细胞白血病耐药相关基因突变的数字pcr试剂盒及引物和探针 |
Publications (2)
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|---|---|---|---|---|
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-
2020
- 2020-10-30 CN CN202011186910.5A patent/CN114438179B/zh active Active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Resistance Mechanisms to Targeted Agents in Chronic Lymphocytic Leukemia;Kittai等;The Cancer Journal;第25卷(第6期);428-435 * |
| 慢性淋巴细胞白血病的分子异常及其临床价值;徐卫等;内科理论与实践;第12卷(第5期);303-308 * |
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