CN106474143A

CN106474143A - Toll样受体TLR7和TLR9抑制性寡核苷酸在制备用于治疗B细胞淋巴瘤的药物方面的应用

Info

Publication number: CN106474143A
Application number: CN201510531780.7A
Authority: CN
Inventors: 陈京涛; 安倍莹
Original assignee: Changchun Huapu Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Changchun Huapu Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2015-08-26
Filing date: 2015-08-26
Publication date: 2017-03-08

Abstract

本发明涉及Toll样受体TLR7和TLR9抑制性寡核苷酸在制备用于治疗B细胞淋巴瘤的药物中的应用，所述B细胞淋巴瘤具有MYD88L265P突变，所述寡核苷酸包含CCT重复序列[(CCT)n]，其中，C是胞嘧啶，T是胸腺嘧啶，n是8至12的整数，其中，所述寡核苷酸的序列选自：SEQ ID NO.1：5’-cctcctcctcctcctcctcctcct-3’；SEQ ID NO.2：5’-cctcctcctcctcctcctcctcctcct-3’；SEQ ID NO.3：5’-cctcctcctcctcctcctcctcctcctcct-3’；SEQ ID NO.4：5’-cctcctcctcctcctcctcctcctcctcctcct-3’；SEQ ID NO.5：5’-cctcctcctcctcctcctcctcctcctcctcctcct-3’；SEQ ID NO.6：5’-cctccTcctcctccTcctcctccTcctcctccTcct-3’；其中，小写字母t代表硫代修饰的碱基，大写字母T代表未修饰的碱基。本发明的寡核苷酸在具有MYD88L265P突变的B细胞淋巴瘤中可阻断TLR7和TLR9与MYD88L265P蛋白结合，阻断NF-κB信号通路的活化，从而抑制肿瘤细胞的增殖。

Description

Toll样受体TLR7和TLR9抑制性寡核苷酸在制备用于治疗B细胞淋巴瘤的药物方面的应用

技术领域

本发明总体上涉及一种Toll样受体TLR7和TLR9抑制性寡核苷酸及其应用，具体而言，本发明涉及包含CCT重复序列的TLR7和TLR9抑制性寡核苷酸在制备用于治疗B细胞淋巴瘤的药物方面的应用。

背景技术

B细胞淋巴瘤是B细胞产生的实体瘤，其包括霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤，其分型众多，霍奇金淋巴瘤包括经典霍奇金淋巴瘤和结节性淋巴细胞型霍奇金淋巴瘤，霍奇金淋巴瘤目前被认为是起源于B细胞的肿瘤。非霍奇金淋巴瘤主要包括弥漫性大B细胞淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL)、滤泡性淋巴瘤、黏膜相关淋巴组织淋巴瘤(MALT)、小淋巴细胞淋巴瘤/慢性淋巴细胞白血病、套细胞淋巴瘤(MCL)，以上5种B细胞非霍奇金淋巴瘤较为常见，占非霍奇金淋巴瘤的3/4。

弥漫性大B细胞淋巴瘤是最常见的一类淋巴瘤，约占非霍奇金淋巴瘤的30％左右。DLBCL的临床表现、形态学、免疫表型及遗传学特征极具异质性。根据基因表达谱将DLBCL分为生发中心来源B细胞样(germinal centreB-cell-like，GCB)和活化B细胞样(activated B-cell-like，ABC)两种亚型。生存分析显示GCB型的总生存期明显好于ABC型。就5年生存率来说，前者为76％，而后者仅为16％。近年来，越来越多的研究表明CD20分子靶向药物利妥昔单抗联合化疗方案可以明显提高CD20阳性DLBCL患者的完全缓解率和无病生存率，显著缩小GCB型与非-GCB型的预后差异。

华氏巨球蛋白血症(macroglobulinemia，WM)属于罕见的B细胞淋巴瘤，又叫淋巴浆细胞淋巴瘤，年发病率为0.3/10万，在所有的B系淋巴瘤中占1％～2％，其主要特征为骨髓淋巴样浆细胞浸润、单克隆IgM血症。WM为惰性淋巴瘤，有临床症状的患者中位生存时间为5～6年。Treon等(Treon SP.N Engl Med 2012；367(9):826-833)发现约90％的华氏巨球蛋白血症存在MYD88 L265P突变。MYD88 L265P突变可能是促进WM发生的早期致癌事件。近来研究表明，在多种B细胞肿瘤中发现MYD88的DNA序列因特定序位的碱基由T突变为C，导致蛋白编码区第265位氨基酸错义突变，即亮氨酸错变为脯氨酸(L→P)。此突变位点正好处于TIR(Toll-interleukin 1receptor，TIR)结构域，在没有TLR及IL-1R信号刺激的情况下MYD88也能发生二聚化，引发白介素-1受体相关激酶(interleukin-1receptor-associated kinase，IRAK)介导的NF-κB信号的激活，促进细胞增殖。在携带MYD88 L265P的AB型弥漫性大B细胞淋巴瘤细胞株中敲除IRAK4后，恶性细胞生长受限，而这种生长抑制可以通过引入野生型IRAK4纠正，对失活型IRAK4无效，IRAK4抑制剂可导致携带MYD88 L265P突变的ABC-DLBCL细胞株死亡，对携带野生型MYD88的GCB-DLBCL细胞株无致死作用。抑制MYD88/IRAK信号通路可以抑制NF-κB信号，并使具有MYD88 L265P突变的ABC-DLBCL肿瘤细胞生长受到抑制。Ngo等(Ngo VN.Nature 2011；470(7332):115-119)通过RNA干扰、高通量测序发现29％ABC-DLBCL存在MYD88 L265P突变，而在其他类型的弥漫性大B细胞淋巴瘤，如GCB-DLBCL和伯基特淋巴瘤中极少或者没有MYD88 L265P突变。NF-κB信号途径的持续激活是ABC-DLBCL的特征。基于此发现，本领域一直在致力于寻找能够靶向治疗具有MYD88 L265P突变的弥漫性大B细胞淋巴瘤。

发明内容

本发明总体上涉及Toll样受体TLR7和TLR9抑制性寡核苷酸在治疗B细胞淋巴瘤中的应用，具体而言，本发明涉及Toll样受体TLR7和TLR9抑制性寡核苷酸在制备用于治疗B细胞淋巴瘤的药物中的应用，其中，所述B细胞淋巴瘤具有MYD88 L265P突变，优选地，所述B细胞淋巴瘤是弥漫性大B细胞淋巴瘤，并且所述弥漫性大B细胞淋巴瘤是活化B细胞样亚型。

本发明的寡核苷酸包含CCT重复序列[(CCT)n]，其中，C是胞嘧啶，T是胸腺嘧啶，n是8至12的整数，其中，所述寡核苷酸的序列选自：

SEQ ID NO.1：5’-cctcctcctcctcctcctcctcct-3’；

SEQ ID NO.2：5’-cctcctcctcctcctcctcctcctcct-3’；

SEQ ID NO.3：5’-cctcctcctcctcctcctcctcctcctcct-3’；

SEQ ID NO.4：5’-cctcctcctcctcctcctcctcctcctcctcct-3’；

SEQ ID NO.5：5’-cctcctcctcctcctcctcctcctcctcctcctcct-3’；

SEQ ID NO.6：5’-cctccTcctcctccTcctcctccTcctcctccTcct-3’；

其中，小写字母t代表硫代修饰的碱基，大写字母T代表未修饰的碱基。

本发明的Toll样受体TLR7和TLR9抑制性寡核苷酸对具有MYD88 L265P突变的B细胞淋巴瘤产生剂量依赖性抑制作用。总体而言，所述Toll样受体TLR7和TLR9抑制性寡核苷酸以1.25mg/kg体重至500mg/kg体重的剂量对具有MYD88 L265P突变的B细胞淋巴瘤产生抑制作用。

在一种实施方式中，对具有MYD88 L265P突变的B细胞淋巴瘤产生抑制作用的Toll样受体TLR7和TLR9抑制性寡核苷酸的剂量为1.25mg/kg体重至12.5mg/kg体重，或12.5mg/kg体重至25mg/kg体重，或25mg/kg体重至50mg/kg体重，或50mg/kg体重至125mg/kg体重，或125mg/kg体重至250mg/kg体重，或250mg/kg体重至500mg/kg体重。

在优选的实施方式中，对具有MYD88 L265P突变的B细胞淋巴瘤产生抑制作用的Toll样受体TLR7和TLR9抑制性寡核苷酸的剂量为5mg/kg体重，或12.5mg/kg体重，或25mg/kg体重，或50mg/kg体重。

在本发明的一种实施方式中，所述药物还包括药学上可接受的载体，其选自：溶液、稀释剂、溶剂、分散剂、脂质体、乳剂、糖衣、抗菌剂、抗真菌剂、等渗的和延缓吸收的试剂。

在本发明的优选实施方式中，所述药物被配制成口服给药剂型、静脉注射剂型、肌肉注射剂型、吸入给药剂型、局部施用剂型。

本发明的寡核苷酸表现出Toll样受体TLR7和TLR9抑制性，其对于治疗具有MYD88 L265P突变的ABC型DLBCL尤其有效，将本发明的寡核苷酸作用于具有MYD88 L265P突变的ABC型DLBCL，其可阻断TLR7和TLR9与MYD88L265P蛋白结合，从而阻断NF-κB信号通路的活化，抑制ABC-DLBCL细胞生存，进而有效抑制淋巴瘤细胞增殖。由此，本发明的具有Toll样受体TLR7和TLR9抑制性的寡核苷酸可用于靶向治疗具有MYD88 L265P突变的B细胞淋巴瘤并可用于制备治疗具有MYD88 L265P突变的B细胞淋巴瘤的药物。

附图说明

图1A至图1C显示了本发明的不同序列的寡核苷酸(SEQ ID NO.1,SEQ IDNO.5,SEQ ID NO.6)对咪喹莫特(Imiquimod，IMQ)和CpG685诱导的人外周血单个核细胞(PBMC)增殖的抑制作用。X轴代表CFSE，y轴代表CD19+B细胞，在PBMC的增殖实验中，CFSE染色，培养6天，流式细胞仪检测细胞的增殖。

图1A显示了培养基组、SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6的寡核苷酸组对PBMC的增殖情况的影响。培养基组细胞增殖率3.78％，SEQ IDNO.1、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6的寡核苷酸组的细胞增殖率分别为1.21％、0.823％和1.08％，寡核苷酸组和培养基组的细胞增殖率没有差别，作为实验对照组。

图1B显示了本发明的不同序列的寡核苷酸(SEQ ID NO.1,SEQ ID NO.5,SEQ ID NO.6)对IMQ(5μM)刺激人外周血单个核细胞增殖的抑制情况。本发明的寡核苷酸与IMQ按照1:1、1:3、1:9、1:27的比例加入到PBMC中，流式细胞仪检测CD19+B细胞增殖。本发明的寡核苷酸的浓度从0μM增加至27μM，本发明的不同序列的寡核苷酸均可抑制IMQ诱导的B细胞增殖，SEQ ID NO.1的寡核苷酸抑制CD19+B细胞增殖由30.60％降低至0.031％，SEQ ID NO.5的寡核苷酸抑制CD19+B细胞增殖由30.60％降低至0.059％，SEQ ID NO.6的寡核苷酸抑制CD19+B细胞增殖由30.60％降低至0.159％。

图1C显示了本发明的不同序列的寡核苷酸(SEQ ID NO.1,SEQ ID NO.5,SEQ ID NO.6)对CpG685(1μM)刺激人外周血单个核细胞增殖的抑制情况。寡核苷酸的浓度从0μM增加至27μM，不同序列的寡核苷酸均可抑制CpG685诱导的B细胞增殖，SEQ ID NO.1的寡核苷酸抑制CD19+B细胞增殖由28.50％降低至1.03％，SEQ ID NO.5的寡核苷酸抑制CD19+B细胞增殖由28.50％降低至0.027％，SEQ ID NO.6的寡核苷酸抑制CD19+B细胞增殖由28.50％降低至1.08％。该实验重复3次均得到类似的结果。

图2A至图2D分别显示了CBA法检测本发明的不同序列的寡核苷酸(SEQID NO.1,SEQ ID NO.5,SEQ ID NO.6)对IMQ或CpG685刺激人外周血单个核细胞(PBMC)分泌的细胞因子IL-6和IL-10的抑制情况。X轴代表经过不同处理的人PBMC组，y轴代表细胞因子的含量。对照组为培养基组和NOG组。

图2A显示了本发明的不同浓度的寡核苷酸(SEQ ID NO.1,SEQ ID NO.5,SEQ ID NO.6)对IMQ刺激PBMC分泌IL-6的影响。IMQ(5μM)和不同序列、不同浓度的寡核苷酸(分别为0、0.3、1.5、7.5和37.5μM)加入到PBMC中培养36h，CBA(BD)测定IL-6的含量；

图2B显示了本发明的不同浓度的寡核苷酸(SEQ ID NO.1,SEQ ID NO.5,SEQ ID NO.6)对IMQ刺激PBMC分泌IL-10的影响。IMQ(5μM)和不同序列的寡核苷酸(浓度分别为0、0.1、0.5、2.5和12.5μM)加入到PBMC中培养36h，CBA(BD)测定IL-10的含量；图2A和图2B说明本发明的寡核苷酸对IMQ诱导人PBMC分泌细胞因子IL-6和IL-10具有抑制作用，且呈剂量相关性。

图2C显示了本发明的不同浓度的寡核苷酸(SEQ ID NO.1,SEQ ID NO.5,SEQ ID NO.6)对CpG685刺激PBMC分泌IL-6的影响。CpG685(1μM)和本发明的寡核苷酸(浓度分别为0、1、3、9和27μM)加入到PBMC中培养36h，CBA法测定IL-6的含量；

图2D显示了本发明的寡核苷酸(SEQ ID NO.1,SEQ ID NO.5,SEQ ID NO.6)在不同浓度条件下对CpG685刺激PBMC分泌IL-10的影响。CpG685(1μM)和本发明的寡核苷酸(浓度分别为0、1、3、9和27μM)加入到PBMC中培养36h，CBA测定IL-10的含量。图2C和图2D表明本发明的寡核苷酸对CpG685诱导人PBMC分泌细胞因子IL-6和IL-10具有抑制作用，且呈剂量相关性。以上实验重复3次均得到类似的结果，表示为平均值±SD。

图3显示了Sanger法DNA测序检测细胞系OCI-Ly19和OCI-Ly3.3的MYD88突变位点。Sanger法DNA测序结果显示，OCI-Ly19细胞的MYD88 PCR产物测序，该序列和NCBI数据库中的MYD88序列一致，不存在突变位点，OCI-Ly19属于MYD88野生型的细胞株。OCI-Ly3.3细胞的MYD88 PCR产物测序，该序列和NCBI数据库中的MYD88序列存在一个碱基的突变位点即T突变为C，故OCI-Ly3.3属于MYD88 L265P突变的细胞株。每株细胞测定2个克隆。

图4A和图4B显示了流式细胞仪检测OCI-Ly19细胞和OCI-Ly3.3细胞内TLR7和TLR9的表达。X轴代表TLR7-PE或TLR9-APC，Y轴代表细胞数。检测OCI-Ly19或OCI-Ly3.3的TLR7-PE和TLR9-APC的平均荧光强度(MIF)。从图4A中可以看出，在OCI-Ly19细胞组，TLR7-PE和TLR9-APC较同型对照明显右移，平均荧光强度(MIF)明显高于同型对照组的MIF，说明OCI-Ly19细胞内表达TLR7和TLR9蛋白。从图4B中可以看出，在OCI-Ly3.3细胞组，TLR7-PE和TLR9-APC较同型对照明显右移，平均荧光强度(MIF)明显高于同型对照组的MIF，说明OCI-Ly3.3细胞内表达TLR7和TLR9蛋白。

图5显示了WST-1测定本发明的不同序列的寡核苷酸(SEQ ID NO.1,SEQID NO.5,SEQ ID NO.6)对OCI-Ly19细胞增殖无抑制作用，但明显抑制OCI-Ly3.3细胞增殖。X轴代表寡核苷酸的浓度，Y轴代表细胞活率。SEQ IDNO.1,SEQ ID NO.5,SEQ ID NO.6的寡核苷酸分别以0、5、10、20和40μM浓度作用OCI-Ly19或OCI-Ly3.3细胞72小时，通过WST-1测定细胞活力，数值表示为平均值±SD。图5表明随着寡核苷酸浓度的增加，OCI-Ly19的细胞活力在100％左右，OCI-Ly3.3的细胞活力由100％逐渐下降，但当本发明的寡核苷酸的浓度为40μM时，其细胞活力为20％左右。该实验重复3次均得到类似的结果。寡核苷酸浓度的增加对OCI-Ly19的细胞活力无影响；但是抑制OCI-Ly3.3的细胞活力，这种抑制作用具有浓度依赖性。

图6显示了CBA方法检测本发明的不同序列的寡核苷酸(SEQ ID NO.1,SEQ ID NO.5,SEQ ID NO.6)对GCB-DLBCL细胞系OCI-Ly19分泌IL-10无抑制作用，但可以抑制ABC-DLBCL细胞系OCI-Ly3.3细胞分泌细胞因子IL-10。X轴代表不同序列的寡核苷酸的浓度，Y轴代表IL-10的含量。CBA方法检测细胞因子IL-10的含量。将本发明的不同序列的寡核苷酸以0、2、4、8、10和20μM的浓度与OCI-Ly19或OCI-Ly3.3共培养36小时，结果显示OCI-Ly19细胞分泌的IL-10较少，随着寡核苷酸浓度的增加，OCI-Ly19分泌IL-10的量不发生改变。对于OCI-Ly3.3细胞而言，在寡核苷酸的浓度为10μM时，IL-10几乎接近0,。随着寡核苷酸的浓度的增加，OCI-Ly3.3细胞分泌IL-10的量逐渐减少，这种抑制作用呈剂量相关性，且三种不同序列的寡核苷酸表现出相似的抑制作用。该实验重复3次均得到类似的结果。

图7A和图7B显示了PI染色流式细胞仪检测本发明的寡核苷酸(SEQ IDNO.6)对细胞系OCI-Ly19和OCI-Ly3.3细胞周期的影响。X轴代表寡核苷酸的浓度，Y轴代表细胞百分比。图7A中SEQ ID NO.6的寡核苷酸在浓度分别为0、15和30μM的条件下和细胞OCI-Ly19一同培养72h，细胞周期结果显示，不同浓度的SEQ ID NO.6的寡核苷酸对OCI-Ly19的细胞周期各期均没有影响。图7B中SEQ ID NO.6的寡核苷酸在浓度分别为0、15和30μM的条件下与细胞OCI-Ly3.3培养72h，细胞周期结果显示，SEQ ID NO.6在浓度为30μM时，与浓度为0μM时相比(与对照组相比)，OCI-Ly3.3细胞周期G1期细胞比例明显增加，S期和G2,M期细胞比例明显减少，SEQ ID NO.6的寡核苷酸阻止OCI-Ly3.3细胞由G1期向S期和G2,M期转变，使得细胞停留在G1期，导致细胞增殖减慢。

具体实施方式

以下将结合实施例对本发明涉及的多个方面进行详细说明，这些实施例仅用于举例说明。本领域普通技术人员可理解的是，本发明不受实施例中所描述的具体操作步骤的限制。

除非另有说明，本文使用的所有技术术语和科学术语通常具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。

本发明总体上提供Toll样受体TLR7和TLR9抑制性寡核苷酸在制备用于治疗B细胞淋巴瘤的药物中的应用，其中，所述B细胞淋巴瘤具有MYD88L265P突变，所述寡核苷酸包含CCT重复序列[(CCT)n]，其中，C是胞嘧啶，T是胸腺嘧啶，n是8至12的整数。

Toll样受体TLR7和TLR9抑制性寡核苷酸

一方面，本发明提供一种包含CCT重复序列[(CCT)n]的寡核苷酸，其中，C是胞嘧啶，T是胸腺嘧啶，n是8至12的整数。

本文中的术语“寡核苷酸”是指由糖(如脱氧核糖)，磷酸基团和碱基组成的分子，其中糖分子和碱基连接成核苷，核苷由磷酸基团连接形成核苷酸，形成核苷的碱基有嘧啶和嘌呤，嘧啶有胸腺嘧啶(缩写为T或t)和胞嘧啶(缩写为C或c)，嘌呤有腺嘌呤(adenine，缩写为A或a)和鸟嘌呤(guanine，缩写为G或g)。本发明中的寡核苷酸是指寡脱氧核苷酸，其是由自动核酸合成仪器合成，因此这些寡核苷酸是人工合成的寡核苷酸。本发明的寡核苷酸包含CCT重复序列[(CCT)n]，其中，C是胞嘧啶或其衍生物，T是胸腺嘧啶或其衍生物，n表示重复单位的个数，其可以是8-12的整数。

在本发明的一些实施方式中，本发明的寡核苷酸中的磷酸骨架可为未修饰的。

本发明的寡核苷酸中的磷酸骨架还可为部分修饰的或全部修饰的。所述修饰可包括多种化学修饰，例如，使用硫代磷酸酯部分修饰或全部修饰本发明的寡核苷酸中的碱基。所述修饰可在寡核苷酸的合成过程中进行或者在合成之后进行，并且所述修饰可发生在核苷之间的磷酸二酯桥键上、核糖单元上和/或天然核苷碱基(腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶)上。当在合成寡核苷酸的过程中进行修饰时，被修饰的碱基可被并入寡核苷酸内部或位于寡核苷酸末端。当在合成寡核苷酸之后进行修饰时，所述修饰可通过使用活性基团进行，例如，通过氨基修饰成分进行，通过3’或5’羟基进行，或通过磷酸酯基团进行。

本发明所述的化学修饰可包括对本发明的寡核苷酸的骨架进行修饰，包括但不限于，用硫代磷酸酯对骨架进行修饰，得到硫代磷酸酯骨架，这种骨架是一种稳定的核酸分子的糖磷酸酯骨架，在该骨架中，至少一个核苷酸之间的键上，硫取代了未桥接的磷酸酯的氧，或者，在每个或每隔一个核苷酸之间的键上，硫取代了未桥接的磷酸酯的氧。还可对寡核苷酸骨架进行其他修饰，例如，使用非离子型DNA类似物，例如，烷基磷酸酯和芳基磷酸酯，对骨架进行修饰，其中，由烷基或芳基取代带电荷的磷酸酯中的氧，或者使用磷酸二酯和烷基磷酸三酯对骨架进行修饰，其中，将带电荷的氧烷基化。

在本发明的一些实施方式中，本发明的寡核苷酸的序列选自：

SEQ ID NO.1：5’-cctcctcctcctcctcctcctcct-3’；

SEQ ID NO.2：5’-cctcctcctcctcctcctcctcctcct-3’；

SEQ ID NO.3：5’-cctcctcctcctcctcctcctcctcctcct-3’；

SEQ ID NO.4：5’-cctcctcctcctcctcctcctcctcctcctcct-3’；

SEQ ID NO.5：5’-cctcctcctcctcctcctcctcctcctcctcctcct-3’；

SEQ ID NO.6：5’-cctccTcctcctccTcctcctccTcctcctccTcct-3’；

本发明提供的寡核苷酸具有Toll样受体TLR7和TLR9抑制性，也被称为Toll样受体TLR7和TLR9抑制性寡核苷酸。在本发明中，“Toll样受体(TLR)”是人TLR家族成员，该家族成员有11个受体，是哺乳动物进化中比较保守的一个受体家族。TLR能特异性识别病原相关的分子模式(PAMP)，不仅在激活天然免疫中发挥重要作用，而且还调节获得性免疫，是连接天然免疫和获得性免疫的桥梁。TLR是Ⅰ型跨膜蛋白，可分为胞外区，胞内区和跨膜区三部分，其中胞外区可以识别特定的配体即能识别微生物的PAMP，胞内区的结构与IL-1的Ⅰ型受体同源，称为Toll/白介素1受体同源结构域(Toll/IL-1Rhomology domain,TIR)，主要负责细胞内的信号传导。TLR在多种免疫细胞都有表达，如B细胞、树突细胞(DC)、巨噬细胞和特定类型的T细胞等。TLR在细胞中的定位不同，其中TLR1、TLR2、TLR4、TLR5和TLR6存在于细胞膜表面，而TLR3、TLR7、TLR8和TLR9则只存在于细胞内的内质网、内体和溶酶体上。TLR各自识别特定的PAMP，其中TLR1和TLR6分别识别三酰脂肽；TLR2可以识别肽聚糖、脂蛋白和酵母多糖；TLR3识别病毒双链RNA(dsRNA)和Poly I:C；TLR4识别细菌细胞壁的脂多糖；TLR5识别鞭毛素；TLR7和TLR8识别病毒单链RNA(ssRNA)和人工合成的小分子抗病毒化合物，例如咪喹莫特类化合物(Imiquimod(S26308)，其是TLR7/8的配体于1988年由美国学者Man Chen等首先报道。随后陆续发现了系列的类似化合物，如R837、R848等；咪喹莫特家族被证实可以通过TLR7/8-MYD88信号依赖通路产生IFN，具有抗病毒和抗肿瘤活性，可用作为B淋巴细胞活化剂；TLR9识别细菌和病毒的未甲基化的CpG DNA。

TLR/IL1-R与相应病原体相关分子模式(pathogen associated molecularpattern，PAMP)结合后，直接通过TIR结构域或间接通过带有TIR结构域的衔接蛋白(TIR domain-containing adaptor protein，TIRAP)和Bruton酪氨酸激酶(Bruton's tyrosine kinase，BTK)激活MYD88，活化后MYD88通过DD结构域间的同型互作招募IRAK4，后者使IRAK1发生磷酸化，并结合肿瘤坏死因子相关因子6(tumor necrosis factor receptor-asssociatd factor 6，TRAF6)，形成与胞膜相连的TLR-MYD88-IRAK4-IRAK1-TRAF6复合物；随后，IRAK1-TRAF6与复合物分离，结合蛋白激酶复合体TAK1-TAB1-TAB4，活化的TAK1与IRAK1解离，使复合物TRAF6-TAK1-TAB1-TAB4进入胞质，在泛素化连接酶作用下，TRAF6泛素化而降解，活化的TAK1-TAB1-TAB4复合物分别通过磷酸化启动两条信号转导途径。第1条途径：TAK1磷酸化异源三聚体，即IKK复合体(NEMO/IKKγ-IKKα-IKKβ)，后者再使IκBα磷酸化后发生泛素化降解，释放由P65和P50两份亚单位组成的NF-κB转位至胞核，激活促进细胞生长的NF-κB依赖性基因。第2条途径：TAK1使丝裂原活化蛋白激酶信号(mitogen-activated protein kinase，MAPK)途径成分磷酸化后激活转录因子c-Jun和c-Fos，c-Jun和c-Fos转位至胞核，形成转录因子AP-1，激活MAPK依赖性基因。

Kian-Huat Lim等(Kian-Huat Lim.Cancer Research:April 15,2013；Volume73,Issue 8,Supplement 1)发现在MYD88 L265P突变后，TLR7或TLR9可以结合MYD88 L265P蛋白，使MYD88发生二聚化，导致下游NF-κB信号的激活。在ABC-DLBCL的细胞系中敲除TLR7和TLR9之后可以明显抑制NF-κB活化，促进细胞凋亡。在敲除了内源TLR7或TLR9的ABC-DLBCL细胞系中，癌细胞增殖受到明显抑制。在B细胞淋巴瘤中约90％的淋巴浆细胞淋巴瘤/华氏巨球蛋白血症(WM)、29％的活化型弥漫大B细胞淋巴瘤，33％的中枢神经***淋巴瘤(所有检测标本病理均为弥漫大B细胞淋巴瘤)、9％的粘膜相关淋巴瘤(MALT)、2.9％的慢性淋巴细胞白血病中均检测出MYD88 L265P突变。本发明的寡核苷酸具有Toll样受体TLR7和TLR9抑制性，其在作用于具有MYD88L265P突变的B细胞淋巴瘤(例如，弥漫性大B细胞淋巴瘤，例如，ABC型弥漫性大B细胞淋巴瘤)中可以通过阻断TLR7和TLR9与MYD88 L265P蛋白结合，阻断NF-κB信号通路的活化，从而抑制肿瘤细胞的增殖。由此，本发明的具有Toll样受体TLR7和TLR9抑制性的寡核苷酸可用于靶向治疗具有MYD88L265P突变的B细胞淋巴瘤并可用于制备治疗具有MYD88 L265P突变的B细胞淋巴瘤的药物。

医药用途

另一方面，本发明提供一种使用本发明的具有Toll样受体TLR7和TLR9抑制性的寡核苷酸治疗个体体内的B细胞淋巴瘤的方法以及使用本发明的具有Toll样受体TLR7和TLR9抑制性的寡核苷酸在制备用于治疗B细胞淋巴瘤的药物中的应用，其中，所述B细胞淋巴瘤具有MYD88 L265P突变，例如：弥漫性大B细胞淋巴瘤，包括，活化B细胞样亚型弥漫性大B细胞淋巴瘤(ABC-DLBCL)。

在一些实施方式中，本发明的上述寡核苷酸(SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.6)可与药学上可接受的载体一同配制成用于治疗弥漫性大B细胞淋巴瘤的药物制剂，其中，该药物制剂可以根据临床需要而配制成口服给药剂型，静脉注射剂型，肌肉注射剂型，吸入给药剂型，局部施用剂型，等等。

进一步而言，该药物制剂还可包含额外的活性成分，其选自：CHOP(环磷酰胺、阿霉素、长春新碱、***)、Btk抑制剂(Ibrutinib)、PI3Kδ抑制剂(Idelalisib)、mTOR抑制剂(Everolimus)、STAT3抑制剂(OPB-51602)、抗-CD20单克隆抗体(Rituximab)、SYK抑制剂(Fostamatinib)、Bcl-2抑制剂(Navitoclax)、蛋白酶抑制剂(Bortezomib)和免疫调节剂(Lenalidomide)，上述额外的活性成分中的一种或几种可与本发明的具有Toll样受体TLR7和TLR9抑制性的寡核苷酸一同联合治疗弥漫性大B细胞淋巴瘤。

本发明所述的“药学上可接受的载体”包括一种或多种固体或液体填充剂、稀释剂或包封物质，所述载体适合将本发明中的寡核苷酸应用于个体体内。该载体可以是有机的、无机的、天然的或合成的。该载体包括各种溶液、稀释剂、溶剂、分散剂、脂质体、乳剂、糖衣、抗菌剂、抗真菌剂、等渗的和延缓吸收的试剂、和其他的适合本发明中的寡核苷酸应用的载体。药物学上可接受的载体的选择决定于本发明中寡核苷酸应用方式。可注射用的载体包括水、生理盐水、平衡盐溶液、葡萄糖溶液、甘油等。对于固体混合物(如粉末、丸、片剂、胶囊形式)而言，常用的非毒性固体载体包括：具有药理学纯度的甘露醇、乳糖、淀粉和硬脂酸镁等。另外，作为生物学上中性的载体，应用的药理学组分中可以含有非毒性的辅助物质，包括湿化或乳化剂、防腐剂、PH缓冲试剂，醋酸钠和单月桂酸酯等。上述药学上可接受的载体是本领域普通技术人员所熟知的(参见，例如，Remington's PharmaceuticalSciences,第18版，Mack Printing Company，1990，第1289-1329页，该参考文献通过引用并入本文)。

举例而言，填充剂的实例为乳糖一水合物、无水乳糖和各种淀粉。粘合剂的实例为各种纤维素和交联聚乙烯吡咯烷酮、微晶纤维素以及硅化微晶纤维素。合适的润滑剂的实例，包括作用于被压缩粉末的流动性的药剂，例如，胶态二氧化硅、硬脂酸、硬脂酸镁、硬脂酸钙和硅胶。增甜剂的实例是天然或人造增甜剂，例如蔗糖、木糖醇、糖精钠、甜蜜素和天冬甜素。防腐剂的实例为山梨酸钾、羟苯甲酸甲酯、羟苯甲酸丙酯、苯甲酸及其盐、诸如对羟基苯甲酸丁酯之类的对羟基苯甲酸的酯、诸如乙醇或苯甲醇之类的醇、诸如苯酚之类的酚化合物，或者四元化合物，例如，苯扎氯铵。合适的稀释剂的实例包括药物可接受的惰性填料，例如，微晶纤维素、乳糖、磷酸氢钙和糖类。稀释剂的实例包括微晶纤维素，诸如乳糖一水合物和无水乳糖之类的乳糖，磷酸氢钙，甘露糖醇，淀粉，山梨糖醇，蔗糖和葡萄糖。合适的崩解剂包括轻度交联聚乙烯吡咯烷酮、玉米淀粉、马铃薯淀粉、玉米淀粉和改性淀粉、交联聚乙烯吡咯烷酮、羟基乙酸淀粉钠及其混合物。

本发明的药物制剂可为水溶液形式、盐水溶液形式、颗粒、气溶胶、粉末、片剂、糖衣片剂、微胶囊、栓剂、糖浆、乳液、悬浮剂、霜剂、滴剂或其他适于多种药物递送***的形式。

本发明的药物制剂可通过如下方式给药：口服给药、肠胃外给药、舌下给药、跨粘膜给药、透皮给药、直肠给药、腹腔内注射给药、皮下给药、肌肉内给药、静脉内给药、动脉内给药、鞘内给药、局部给药(以粉末、软膏、凝胶、滴剂或透皮贴剂的形式局部给药)、含服给药，通过导管给药、通过植入物给药，等等。在任何给药形式的情况下，本发明的药物制剂必须是无菌的且在生产和存储条件下为稳定的，并且不会受到细菌或微生物污染。

本发明的药物制剂还可被配制为通过注射(例如，快速注射或连续输注)方式肠胃外给药的剂型。可以单位剂量形式提供用于注射给药的剂型，例如，以安瓶或多剂量容器的形式提供。本发明的药物制剂可采用诸如油性载体或水性载体中的悬浮液、溶液或乳液之类的形式并且可含有诸如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂之类的调节剂，并且可加入例如交联的聚乙烯吡咯烷酮、琼脂或海藻酸或其盐(例如，海藻酸钠)。

本发明的药物制剂的悬浮液可制备成合适的油性注射悬浮液或水性注射悬浮液，其中，合适的亲脂性溶剂或载体包括脂肪油(例如，芝麻油)或合成的脂肪酸酯(例如，油酸乙酯或甘油三酯)或脂质体；水性注射悬浮液可包含能够增加悬浮液的粘度的物质，例如，羧甲基纤维素钠、山梨糖醇或葡聚糖。任选地，悬浮液还可含有合适的能够增加化合物的溶解度的稳定剂或试剂，从而可制备高度浓缩的溶液。对于注射而言，本发明的药物制剂可被配制成水性溶液，优选地配制成生理相容性缓冲液(例如，Hanks溶液、林格氏溶液或生理盐水缓冲液)。

优选地，本发明的药物制剂可为使用前溶解于合适的载体中的粉末形式，所述合适的载体例如，无菌无热原水。

对于透过粘膜给药而言，在该制剂中使用适于待穿透的屏障的渗透剂。这些渗透剂通常为本领域已知的。

对于口腔给药而言，本发明的药物制剂可以通过常规方式配制的片剂或含片的形式给药。

对于吸入给药而言，本发明的药物制剂可被配制成便于通过使用合适的推进剂(例如，二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他合适的气体)以由加压包或喷雾器提供的喷雾的形式递送。在使用加压喷雾的情况下，剂量单位可通过提供递送计量的量的阀来确定。在吸入器或吹入器中使用的胶囊和药筒(例如，明胶胶囊和药筒)可被配制为含有本发明的药物组合物和合适的粉末基体(例如，乳糖或淀粉)的粉末混合物的剂型。

本发明的药物制剂还可包含合适的固体或凝胶相载体或赋形剂。这些载体或赋形剂的实例包括碳酸钙、磷酸钙、各种糖类、淀粉、纤维素衍生物、明胶和诸如聚乙二醇之类的聚合物。

在本发明的优选的实施方式中，本发明的药物制剂在用于治疗弥漫性大B细胞淋巴瘤的过程中还可与其他活性剂联合给药，所述其他活性剂选自：CHOP(环磷酰胺、阿霉素、长春新碱、***)、Btk抑制剂(Ibrutinib)、PI3Kδ抑制剂(Idelalisib)、mTOR抑制剂(Everolimus)、STAT3抑制剂(OPB-51602)、抗-CD20单克隆抗体(Rituximab)、SYK抑制剂(Fostamatinib)、Bcl-2抑制剂(Navitoclax)、蛋白酶抑制剂(Bortezomib)和免疫调节剂(Lenalidomide)。

本发明所述的B细胞淋巴瘤是弥漫性大B淋巴瘤(diffuse large B-celllymphoma，DLBCL)，是最常见的一类淋巴瘤，约占非霍奇金淋巴瘤的30％左右。DLBCL的临床表现、形态学、免疫表型及遗传学特征极具异质性。DLBCL可发生于任何年龄，但以老年人多见，中位发病年龄为60～65岁，男性稍多于女性。临床上以迅速增大的无痛性肿块为典型表现，约1/3的患者伴有发热、盗汗、体重减轻等症状。DLBCL可发生于***内或结外，约40％DLBCL原发于结外，主要是胃肠道，其他常见结外部位包括骨、睾丸、唾液腺、甲状腺、皮肤等。2000年Alizadeh等首先将cDNA微阵列技术应用于DLBCL基因表达谱的研究。根据基因表达谱将DLBCL分为生发中心B细胞样(germinal centre B-cell-like，GCB)和活化B细胞样(activated B-cell-like，ABC)两种亚型，生存分析显示GCB型的总生存期明显好于ABC型。就5年生存率来说，前者为76％，而后者仅为16％。近年来，越来越多的研究表明CD20分子靶向药物利妥昔单抗联合化疗方案可以明显提高CD20阳性DLBCL患者的完全缓解率和无病生存率，显著缩小GCB型与非-GCB型的预后差异。Ngo等通过RNA干扰、高通量测序发现29％ABC型弥漫大B细胞淋巴瘤存在MYD88 L265P，而在其他类型的弥漫大B细胞淋巴瘤如GCB型和伯基特淋巴瘤中极少或者没有。MYD88 L265P突变使得MYD88发生二聚化，引起NF-κB信号通路的持续激活，60％的ABC型DLBCL有核内NF-κB表达，而仅有小部分(约30％)GCB型DLBCL有核内NF-κB表达，研究证实，持续性的NF-κB的激活是部分ABC型DLBC细胞存活所必需的。本文所述的MYD88本质上是一种胞质内可溶性的衔接蛋白，是Toll样受体和IL-1受体信号通路的调节分子，参与人体固有免疫。相对分子量35kDa，包含2个特殊的结构域。C端带有与TLR分子胞内段相同的TIR结构域，通过同型相互作用与TLR/IL-1R相接，启动信号转导。N端是死亡结构域(death domain，DD)，带有死亡结构域的信号分子，参与凋亡相关的信号通路。

本发明的寡核苷酸表现出Toll样受体TLR7和TLR9抑制性，其对于治疗具有MYD88 L265P突变的ABC型DLBCL尤其有效，将本发明的寡核苷酸作用于具有MYD88 L265P突变的ABC型DLBCL，其可阻断TLR7和TLR9与MYD88L265P蛋白结合，从而阻断NF-κB信号通路的活化，抑制ABC-DLBCL细胞生存，进而有效抑制淋巴瘤细胞增殖。在本发明的一些实施方式中，将本发明的寡核苷酸或包含本发明的寡核苷酸的药物制剂给药于受治者可缓解或治疗ABC-DLBCL，对于具有MYD88 L265P的ABC-DLBCL型个体上发生的严重病理现象而言，将本发明的寡核苷酸或包含本发明的寡核苷酸的药物制剂给药于受治者可减轻ABC-DLBCL疾病的症状、抑制由MYD88 L265P介导的NF-κB信号活化导致肿瘤细胞的增殖。

本发明所述的受治者是指应用本发明寡核苷酸的人类个体和非人类脊椎动物个体。非人类脊椎动物包括非人类灵长类动物，畜牧动物和宠物动物等。

治疗有效量

在本发明的Toll样受体TLR7和TLR9抑制性寡核苷酸用于制备治疗B细胞淋巴瘤的药物方面，由本发明的寡核苷酸制成的用于治疗B细胞淋巴瘤的药物制剂中包含治疗有效量的本发明的寡核苷酸，所述治疗有效量即为有效实现期望目的的量。对特定应用有效的实际量将(尤其)取决于治疗中的病症。有效量的确定恰好在本领域技术人员的能力范围内(尤其是根据本文具体公开的内容)。

对于本文所述的寡核苷酸而言，治疗有效量可最先通过细胞培养检测法确定。目标血药浓度为能够抑制细胞生长或***的活性化合物的浓度。在优选的实施方式中，细胞活性的至少25％被抑制。能够诱导至少约30％、50％、75％或甚至90％或者更高的细胞活性抑制的活性化合物的目标血药浓度为目前优选的。可监测患者体内的细胞活性抑制的百分数，从而评估所达到的血药浓度的适当性，并且可上调或下调剂量以实现期望的抑制百分数。

如本领域已知的，用于人体的治疗有效量还可通过动物模型来确定。例如，用于人体的剂量可被配制成实现已在动物体内发现的有效循环浓度。如上所述，人体内的剂量可通过监测细胞抑制和上调或下调剂量来调节。

治疗有效剂量还可通过已知的表现出类似药理学活性的化合物的动物体内或人体试验数据来确定。所使用的剂量可基于与已知化合物进行比较的所给药的化合物的效力来调节(例如，Lakshmi Bhagat et al.,IMO-8400,a selectiveantagonist of TLRs 7,8and 9,inhibits MYD88 L265P mutation-driven signalingand cell survival:A potential novel approach for treatment of B-cell lymphomasharboring MYD88 L265P mutation,CANCER RESEARCH,October 1,2014 74:2574以及中国发明专利申请公开CN102171235A)。

实施例

结合下面的非限定性实施例举例说明本发明的TLR7和TLR9抑制性寡核苷酸可用于缓解和治疗具有MYD88 L265P突变的ABC型弥漫大B淋巴瘤。

在本发明的实施例中，应用人PBMC、ABC-DLBCL细胞株OCI-Ly3.3细胞、GCB-DLBCL细胞株OCI-Ly19细胞，因为人PBMC含有TLR7和TLR9受体，故利用TLR7的配体IMQ和TLR9的配体CpG685刺激人PBMC后，免疫细胞增殖，本发明的TLR7和TLR9抑制性寡核苷酸可以明显抑制IMQ或CpG 685刺激的人PBMC增殖和炎性细胞因子IL-6、IL-10的分泌。

对于DLBCL细胞系的研究，OCI-Ly19细胞属于MYD88野生型，作为对照组，OCI-Ly3.3细胞属于MYD88 L265P突变型，作为实验组。本发明的TLR7和TLR9抑制性寡核苷酸可以抑制具有MYD88 L265P突变的ABC-DLBCL型OCI-Ly3.3细胞增殖和细胞因子IL-10的分泌，而对于MYD88野生型的GCB-DLBCL型OCI-Ly19细胞无类似作用。

实施例中的咪喹莫特(Imiquimod(R-837)，C₁₄H₁₆N₄,HCl)购自Invivogen。本发明的实施例中使用的寡核苷酸是由长春华普生物技术有限公司合成，均经无热源处理。寡核苷酸中的内毒素应用鲎变形细胞溶解法检测(Associates ofCape Cod,Inc)。以下显示的是在实施例中应用的寡核苷酸的序列和名称：

NOG1；5’-cctcctcctcctcctcctcctcct-3’(SEQ ID NO.1)；

NOG2:5’-cctcctcctcctcctcctcctcctcctcctcctcct-3’(SEQ ID NO.5)；

NOG3:5'-cctccTcctcctccTcctcctccTcctcctccTcct-3’(SEQ ID NO.6)；

CpG 685：5’-tcgtcgacgtcgttcgttctc-3’(SEQ ID NO.7)。

实施例1.本发明的不同序列的NOG1-3寡核苷酸(SEQ ID NO.1,SEQ ID NO.5, SEQ ID NO.6)对IMQ或CpG 685刺激人外周血单个核细胞(PBMC)增殖的影响

用Ficoll–Hypaque密度梯度离心法从人外周血分离单个核细胞(Ficoll试剂购自Pharmacia公司，血液样品由吉林省血液中心提供)。用台酚兰染色法确定人外周血单个核细胞的成活率为95％-99％。采用CFSE(Invivogen公司)进行标记，采用LSR Fortessa(BD公司)流式细胞仪检测人外周血单个核细胞的增殖情况。

“CFSE(carboxyfluorescein succinimidyl ester)”：是一种化学染料，全称为羧基荧光素琥珀酰亚胺酯，是由羧基荧光素二乙酸盐琥珀酰亚胺酯自由通过细胞膜进入细胞内后被非特异性酯酶切除乙酰基后形成的，能够与细胞内的多肽和蛋白质发生非特异性的、不可逆性的、稳定的共价结合。CFSE对细胞没有毒性，化学性质稳定，与蛋白质结合后不会再分离，CFSE本身带有绿色荧光基团，能够被488nm的激光激发，荧光信号一般被FITC通道接收。在细胞增殖时，细胞内的CFSE才会被平均分配到两个子细胞中，第二代子细胞的CFSE浓度为原始浓度的一半，第三代子细胞只有1/4，***子细胞只有1/8，以此类推，所以通过分析增殖后细胞的荧光强度来计算细胞增殖的活性。

人外周血单个核细胞以5×10⁵个/孔的密度接种到U型底96孔板，加入CFSE，终浓度为5μM。IMQ(5μM)或CpG685(1μnol/L)与不同序列的NOG1-3寡核苷酸按照摩尔浓度比例1:1、1:3、1:9、1:27加入PBMC中，孵育6天。CD19-APC-H7(BD公司)、CD3-APC(BD公司)、LSR Fortessa(BD公司)流式细胞术检测FITC-CFSE，该指标反映细胞增殖情况。该实验重复3次均得到类似的结果。

实验结果如图1A～图1C所示，与对照组相比，寡核苷酸NOG1-3的浓度从0μM增加至27μM，寡核苷酸NOG1-3抑制IMQ诱导的CD19+B细胞增殖，使细胞成活率由30.60％降低至近乎0％；寡核苷酸NOG1-3抑制CpG685诱导的CD19+B细胞增殖，使细胞成活率由28.50％降低至近乎0％。以上结果说明本发明的含有CCT重复序列[(CCT)n]的寡核苷酸可以明显抑制IMQ或CpG685诱导的人外周血CD19+B细胞的增殖。

实施例2.本发明的不同序列的寡核苷酸NOG1-3(SEQ ID NO.1,SEQ ID NO.5, SEQ ID NO.6)对IMQ和CpG685刺激的人外周血单个核细胞(PBMC)分泌的细胞因子IL6和IL-10的抑制作用

用Ficoll–Hypaque密度梯度离心法从人外周血分离人外周血单个核细胞(Ficoll试剂购自Pharmacia公司，血液样品由吉林省血液中心提供)。用台酚兰染色法确定人外周血单个核细胞的成活率为95％-99％。用CBA(BD)检测人外周血单个核细胞分泌的情况。

“CBA(cytometric bead array)”：即微量样本多重蛋白定量技术，是基于流式细胞检测***的多重蛋白定量检测方法。利用人工微球代替细胞，在该微球上包被细胞因子抗体，当待测样本中含有相应的细胞因子时，人工微球上的抗体能够与细胞因子结合，再加上PE偶联的抗细胞因子抗体，形成“三明治夹心”结构，通过激发PE荧光素，根据荧光信号的强弱来定量细胞因子。

人外周血单个核细胞以5×10⁵个/孔的密度接种到U型底96孔板。测定寡核苷酸NOG1-3抑制IMQ刺激PBMC分泌IL-6和IL-10：IMQ(5μM)和NOG1、NOG2和NOG3(浓度分别为0、0.3、1.5、7.5和37.5μM)按照不同比例，与人PBMC一同培养36h，收集上清，CBA(BD)测定IL-6的含量；IMQ(5μM)和NOG1、NOG2和NOG3(浓度分别为0、0.1、0.5、2.5和12.5μM)按照不同比例，与人PBMC一同培养36h，收集上清，CBA测定IL-10的含量。

NOG1-3抑制CpG685刺激人PBMC分泌IL-6和IL-10：CpG685(1μM)和NOG1、NOG2和NOG3(浓度分别为0、1、3、9和27μM)按照不同比例，与人PBMC一同培养36h，收集上清，CBA法测定IL-6的含量；CpG685(1μM)和NOG1、NOG2和NOG3(浓度分别为0、1、3、9和27μM)按照不同比例，与人PBMC一同培养36h，收集上清，CBA法测定IL-10的含量。以上实验重复3次，结果显示为平均值±SD。

如图2A和图2B所示，将培养基组和寡核苷酸组进行比较，随着寡核苷酸NOG1-3的浓度的增加，不同序列的寡核苷酸NOG1-3对IMQ刺激人PBMC分泌IL-6和IL-10的抑制作用增强；如图2C和图2D所示，将培养基组和寡核苷酸组进行比较，随着寡核苷酸NOG1-3浓度的增加，不同序列的寡核苷酸NOG1-3对CpG685刺激人PBMC分泌IL-6和IL-10的抑制作用增强。以上结果说明本发明的包含CCT重复序列[(CCT)n]的寡核苷酸可以明显抑制IMQ或CpG685诱导人外周血单个核细胞分泌IL-6和IL-10，随着寡核苷酸的浓度增加，抑制效果增强，表现出剂量依赖性。

实施例3.对GCB-DLBCL细胞株OCI-Ly19和ABC-DLBCL细胞株OCI-Ly3.3的 DNA序列中MYD88突变位点的测定

为了确定OCI-Ly19或OCI-Ly3.3细胞中MYD88 L265P突变位点，采用Sanger法DNA测序的方法。在37℃，5％(体积分数)CO2培养箱中，用补充有10％胎牛血清(GIBCO)和1％青霉素/链霉素(Hyclone)的IMDM培养基(GIBCO)培养OCI-Ly19和OCI-Ly3.3细胞。用台酚兰染色法确定细胞的成活率为95％-99％。OCI-Ly19或OCI-Ly3.3细胞数为(2～3)×10⁶提取基因组DNA，DNA提取试剂盒(购自全氏金生物试剂公司)，PCR扩增MYD88片段，DNA聚酶(Takara)，上游引物为5’-gttgaagactgggcttgtcc-3’，下游引物为5’-aggaggcagggcagaagta-3’。每株细胞测定2个克隆，委托金唯智生物技术(北京)有限公司测序。

Sanger法DNA测序结果如图3显示，细胞OCI-Ly19的MYD88序列和NCBI数据库中的MYD88序列一致，不存在突变位点，属于MYD88野生型。细胞OCI-Ly3.3的MYD88序列和NCBI数据库中的MYD88序列存在一个碱基的突变位点即T突变为C，属于MYD88 L265P突变。

实施例4.细胞株OCI-Ly19和OCI-Ly3.3的TLR7和TLR9的表达

在37℃，5％(体积分数)CO2培养箱中，用补充有10％胎牛血清(GIBCO)和1％青霉素/链霉素(Hyclone)的IMDM培养基(GIBCO)培养OCI-Ly19和OCI-Ly3.3细胞。用台酚兰染色法确定细胞的成活率为95％-99％。每种细胞按细胞密度为5×10⁵个/孔接种于96孔U型板中，进行胞内染色。细胞内染色试剂购自BD公司，200μl Fixation Perm Buffer悬浮细胞,4℃，孵育20min，用200ulPerm Wash Buffer洗涤1遍，以2700rpm进行离心，持续5min，丢弃上清液，加入TLR7-PE和TLR9-APC抗体染色，室温避光孵育30min,用Perm WashBuffer洗涤2遍，用400μl Perm Wash Buffer重悬细胞，LSR Fortessa(BD公司)流式细胞仪检测OCI-Ly19或OCI-Ly3.3的TLR7-PE和TLR9-APC的平均荧光强度(MIF)。

如图4A和图4B所示，OCI-Ly19和OCI-Ly3.3的TLR7-PE和TLR9-APC的平均荧光强度(MIF)明显高于同型对照组，这表明OCI-Ly19或OCI-Ly3.3细胞内均表达TLR7和TLR9。

实施例5.本发明的不同序列的寡核苷酸NOG1-3(SEQ ID NO.1,SEQ ID NO.5, SEQ ID NO.6)对于GCB-DLBCL细胞系OCI-Ly19细胞增殖无抑制作用，但抑制ABC-DLBCL细胞系OCI-Ly3.3细胞的增殖

在37℃，5％(体积分数)CO2培养箱中，在补充有10％胎牛血清(GIBCO)和1％青霉素/链霉素(Hyclone)的PRIM-1640(GIBCO)培养基中培养OCI-Ly19。在补充有10％胎牛血清(GIBCO)和1％青霉素/链霉素(Hyclone)的IMDM(GIBCO)培养基中培养OCI-Ly3.3细胞。用台酚兰染色法确定细胞的成活率为95％-99％，细胞处于对数生长期时方可做细胞活力实验。OCI-Ly19细胞以8×10³/孔的密度接种到平底96孔板，OCI-Ly3.3细胞以3×10³/孔的密度接种到平底96孔板，100uL/孔，将浓度分别为0、5、10、20和40μM的寡核苷酸NOG1、NOG2和NOG3与OCI-Ly19或OCI-Ly3.3共培养72小时，加入WST-1试剂(中国碧云天生物技术研究所)10ul，孵育3h，测定OD450，计算细胞活力，该实验设置5个复孔，重复进行3次独立实验，结果表示为平均值±SD。

图5表明随着寡核苷酸NOG1-3浓度的增加，OCI-Ly19的细胞活力在100％左右，而OCI-Ly3.3的细胞活力由100％逐渐下降，但寡核苷酸NOG1-3的浓度在40μM时，OCI-Ly3.3细胞活力在20％左右。

细胞增殖实验说明了本发明的包含CCT重复序列[(CCT)n]的寡核苷酸对于MYD88野生型的GCB-DLBCL的细胞株OCI-Ly19细胞增殖无抑制作用，但明显抑制具有MYD88 L265P突变的ABC-DLBCL细胞株OCI-Ly3.3细胞的增殖，这种抑制作用呈剂量相关性。由此可见，本发明的包含CCT重复序列[(CCT)n]的寡核苷酸可有效用于治疗具有MYD88 L265P突变的ABC型弥漫性大B细胞淋巴瘤。

实施例6.本发明的不同序列的寡核苷酸NOG1-3(SEQ ID NO.1,SEQ ID NO.5, SEQ ID NO.6)对OCI-Ly19和OCI-Ly3.3分泌的细胞因子IL-10的影响

在37℃，5％(体积分数)CO2培养箱中，用补充有10％胎牛血清(GIBCO)和1％青霉素/链霉素(Hyclone)的IMDM培养基(GIBCO)培养OCI-Ly19和OCI-Ly3.3细胞。用台酚兰染色法确定细胞的成活率为95％-99％。OCI-Ly19和OCI-Ly3.3细胞均以2×10⁵/孔密度接种到96孔板，将浓度分别为0、2、4、8、10和20μM的寡核苷酸NOG1、NOG2和NOG3与OCI-Ly19或OCI-Ly3.3共培养36小时。CBA法检测细胞因子IL-10。该实验重复3次均得到类似的结果。

如图6所示，本发明的寡核苷酸NOG1-3对OCI-Ly19细胞分泌的IL-10无抑制作用，但NOG1-3可以明显抑制OCI-Ly3.3细胞分泌的细胞因子IL-10，并且这种抑制作用呈剂量相关性。

实施例7.NOG3(SEQ ID NO.6)对OCI-Ly19和OCI-Ly3.3细胞周期的影响

在37℃，5％(体积分数)CO2培养箱中，用补充有10％胎牛血清(GIBCO)和1％青霉素/链霉素(Hyclone)的IMDM培养基(GIBCO)培养OCI-Ly19和OCI-Ly3.3细胞。用台酚兰染色法确定细胞的成活率为95％-99％。细胞处于对数生长期时方可做细胞周期实验。OCI-Ly19和OCI-Ly3.3细胞均以1.25×10⁵/孔密度接种到96孔板，浓度分别为0、15和30μM寡核苷酸NOG3分别与OCI-Ly19或OCI-Ly3.3共培养72小时，碘化丙啶PI(北京鼎国昌盛生物技术有限公司)染色，LSR Fortessa(BD公司)流式细胞仪检测细胞周期。该实验重复3次均得到类似的结果。

如图7A和图7B所示，本发明的寡核苷酸NOG3对于OCI-Ly19细胞周期无影响作用；但影响OCI-Ly3.3的细胞周期，与对照组相比，OCI-Ly3.3细胞周期G1期细胞比例明显增加，S期和G2,M期明显减少，这说明本发明的寡核苷酸NOG3阻止OCI-Ly3.3细胞由G1期向S期和G2,M期转变，使得细胞停留在G1期，导致细胞增殖减慢。

上文对本发明的优选的实施例进行了描述，但是，这些实施例仅仅用于举例说明。本领域技术人员可在不背离本发明的实质的前提下对这些实施例作出多种改变、修改和替换。本发明的范围由所附的权利要求来限定，并且本发明权利要求范围内的组合物及其应用以及它们的等同物也被所附的权利要求涵盖。

Claims

1.Toll样受体TLR7和TLR9抑制性寡核苷酸在制备用于治疗B细胞淋巴瘤的药物中的应用，所述B细胞淋巴瘤具有MYD88 L265P突变，所述寡核苷酸包含CCT重复序列[(CCT)n]，其中，C是胞嘧啶，T是胸腺嘧啶，n是8至12的整数，其中，所述寡核苷酸的序列选自：

SEQ ID NO.1：5’-cctcctcctcctcctcctcctcct-3’；

SEQ ID NO.2：5’-cctcctcctcctcctcctcctcctcct-3’；

SEQ ID NO.3：5’-cctcctcctcctcctcctcctcctcctcct-3’；

SEQ ID NO.4：5’-cctcctcctcctcctcctcctcctcctcctcct-3’；

SEQ ID NO.5：5’-cctcctcctcctcctcctcctcctcctcctcctcct-3’；

SEQ ID NO.6：5’-cctccTcctcctccTcctcctccTcctcctccTcct-3’；

2.如权利要求1所述的应用，其中，所述B细胞淋巴瘤是弥漫性大B细胞淋巴瘤。

3.如权利要求2所述的应用，其中，所述弥漫性大B细胞淋巴瘤是活化B细胞样亚型。

4.如权利要求1至3中任一项所述的应用，其中，所述Toll样受体TLR7和TLR9抑制性寡核苷酸对具有MYD88 L265P突变的B细胞淋巴瘤产生剂量依赖性抑制作用。

5.如权利要求1至3中任一项所述的应用，其中，所述Toll样受体TLR7和TLR9抑制性寡核苷酸以1.25mg/kg体重至500mg/kg体重的剂量对具有MYD88L265P突变的B细胞淋巴瘤产生抑制作用。

6.如权利要求5所述的应用，其中，对具有MYD88 L265P突变的B细胞淋巴瘤产生抑制作用的Toll样受体TLR7和TLR9抑制性寡核苷酸的剂量为1.25mg/kg体重至12.5mg/kg体重，或12.5mg/kg体重至25mg/kg体重，或25mg/kg体重至50mg/kg体重，或50mg/kg体重至125mg/kg体重，或125mg/kg体重至250mg/kg体重，或250mg/kg体重至500mg/kg体重。

7.如权利要求6所述的应用，其中，所述剂量为5mg/kg体重，或12.5mg/kg体重，或25mg/kg体重，或50mg/kg体重。

8.如权利要求1至7中任一项所述的应用，其中，所述药物还包括药学上可接受的载体。

9.如权利要求8所述的应用，其中，所述药学上可接受的载体选自：溶液、稀释剂、溶剂、分散剂、脂质体、乳剂、糖衣、抗菌剂、抗真菌剂、等渗的和延缓吸收的试剂。

10.如权利要求1所述的应用，其中，所述药物被配制成口服给药剂型、静脉注射剂型、肌肉注射剂型、吸入给药剂型、局部施用剂型。