MX2011002252A - Composiciones de antagonistas del pd-1 y metodos de uso. - Google Patents

Abstract

Se describen métodos para tratar el cáncer y enfermedades infecciosas usando un régimen de tratamiento el cual comprende la administración de un compuesto el cual reduce la transducción de señales inhibitorias en linfocitos T, en combinación con un agente potenciador, tal como la ciclofosfamida, para producir potentes respuestas mediadas por linfocitos T. También están divulgadas aquellas composiciones que comprenden tos antagonistas del PD-1 y agentes potenciadores útiles en los métodos de la invención.

Description

COMPOSICIONES DE ANTAGONISTAS DEL PD-1 Y MÉTODOS DE USO i CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con composiciones terapéuticas que contienen un compuesto que previene la transduccion de señales inhibidoras en células T en combinación con agentes potencjadores y el uso de tales compuestos juntos o de manera separada para la inducción de respuestas de células T, las cuales son de gran valor en terapias para enfermedades.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION La respuesta de linfocitos T a estados patológicos, tales como la infección y enfermedades crónicas como el cáncer, es complicada e involucra interacciones intercelulares y la producción de mediadores solubles (llamados citoquinas o linfoquinas). La activación de células T depende normalmente de una señal con especificidad de algún antígeno después de con acto del receptor de células T (TCR) con un péptido antigénico presentado vía el complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) mientras la medida de esta reacción se controla mediante señales positivas y negativas independientes del antigeno que surgen a partir de una variedad de moléculas co-estimuladoras. Las últimas son miembros comunes de la familia CD28/B7. A la inversa, Muerte Celular Programada-1 (Programemed Death-1, P -1) es un miembro de la familia CD28 de receptores que liberan una respuesta inmune negativa cuando son inducidos sobre células T. El contacto entre PD-1 y uno de sus ligandos (B7-H1 o B7-DC) induce una respuesta inhibidora que disminuye la multiplicación de células T y/o la fuerza y/o duracióiji de una respuesta de células T. ¡ Así, la respuesta de los linfocitos T es regulada por varios factores, incluyendo moléculas de superficie celular que actúan como receptores, donde los últimos incluyen tanto el complejo TCR como otras moléculas de superficie. 1 En resumen, una respuesta celular T con especificidad por algún antígeno es mediada por dos señales: 1) acoplamiento del TCR con un péptido antigénico presentado en el contexto de HC (señal 1), y 2) una segunda señal antígeno-independiente liberada por contacto entre diferentes pares receptor/ligando (señal 2). Esta "segunda señal" es crí ica para determinar el tipo de respuesta celular T (activación vs tolerancia) así como la fuerza y duración de esa respuesta, y es regulada mediante señales tanto j positivas como negativas a partir de moléculas coestimuladoras, tales como la familia de proteínas B7.

La ruta co-estimulante celular T más ampliamente caracterizada es B7-CD28, en la cual B7-1 (CD80) y B7-2 (CD86) cada una pueden acoplar el receptor estimulador CD28 y el receptor inhibidor CTLA-4 (CD152). En I conexión con la señalización a través del receptor celular T, la ligación de j ' CD28 aumenta la proliferación antígeno-específica de células T, aumenta la producción de citoquinas, estimula la diferenciación y función efectora, y promueve la supervivencia de células T (Lenshow, ., Annu. Rev. Immunol., 14:233-258 (1996); Chambers y Allison, Curr. Opin. Immunol., 9:396-404 i (1997); y Rathmell y Thompson, Annu. Rev. Immunol., 17:781-828 (1999)). En i contraste, se considera que la señalización a través de CTLA-4 libera una señal negativa que inhibe la proliferación de células T, producción de IL-2, y progresión del ciclo celular (Krummel y Allison, J. Exp. Med., 183:2533-2540 (1996); y Walunas, J. Exp. Med., 183:2541-2550 (1996)). Otros mie bros de la familia B7 de moléculas coestimuladoras incluyen B7-H1 (Dong, Nature Med., 5:1365-1369 (1999); y Freeman, J. Exp. Med., 192:1-9 (2000)), B7-DC (Tseng, J. Exp. Med., 193:839-846 (2001 ); y Latchman, Nature Immunol., 2:261 -268 (2001)), B7-H2 (Wang, Blood, 96:2808-2813 (2000); j Swallow, Immunity, 11 :423432 (1999); y Yoshinaga, Nature, 402:827-832 (I999)), B7-H3 (Chapoval, Nature Immunol., 2:269-274 (2001 )) y B7-H4 (Choi, J. Immunol., 171 :4650-4654 (2003); Sica, Immunity, 18:849-861 (2003); Prasad, mmunity, 18:863-873 (2003); y Zang, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A., 100:10388-10392 (2003)). B7-H5 (descrito en la WO 2006/012232) es un miembro recientemente descubierto de la familia B7.

Las moléculas de la familia B7 tienen un dominio de membrana próxima IgC (constante) y un domino de membrana distal IgV (variable). La familia tipo CD28 de receptores para estos ligandos comparten un dominio tipo IgV extracelular común. Las interacciones de pares receptoreslligandos I son mediadas predominantemente a través de residuos en los dominios IgV de los ligandos y receptores (Schwartz, Nature Immunol., 3.427-434! (2002)).

En general, los dominios IgV son descritos por tener dos láminas c-ue cada una contiene una capa de hebras-ß (Williams y Barclay, Annu. Rev. Immunol., 6:381-405 (1988)). Las láminas frontal y posterior de CTLA-4 contienen hebras A'GFC'C y ABEDC, respectivamente (Ostrov, Science, 290¡:816-819 I (2000) ), mientras las láminas frontal y posterior de los dominios B7 IgV están i compuestas de las hebras AGFCC'C" y BED, respectivamente (Schwartz, Nature, 410:604-608 (2001); Stamper, Nature, 410:608-61 1 (2001); y Ikemizu, Immunity, 12:51-60 (2000)). El análisis cristalográfico reveló que la interface fijadora de CTLA-4/B7 es dominada por la interacción del bucle CDR3- análogo desde CTLA-4, compuesto por un motivo MYPPPY, |con una superficie sobre B7 formada predominantemente por las hebras G, F, C, C y C" (Schwartz, Nature, 410:604-608 (2001); y Stamper, Nature, 410:608-61 1 I I (2001) ). Datos a partir de homologías aminoácidas, mutaciones, y modelación computarizada proporcionan soporte para el concepto que este motivo es también un sitio de fijación de B7 principal para CD28 (Bajorath.j J. Mol.

Graph. Model., 15:135-139 (1997)). Aunque el motivo MYPPP\ no es conservado en ICOS, el receptor para B7-H2, los estudios han indicado que un motivo relacionado que tiene la secuencia FDPPPF y se localiza en la posición análoga es un determinante principal para fijación de ICOS a B7-H2 (Wand, J. Exp. Med., 195:1033-1041 (2002)).

B7-DC (también llamada PD-L2 o CD273) es un miembro relativamente nuevo de la familia B7, y tiene una secuencia aminoácida que es aproximadamente 34% idéntica a B7-H1 (también llamada i PD-L1 ). Ortólogos B7-DC humanos y de ratón comparten aproximadamente e¡l 70% de identidad aminoácida. Aunque transcriptos B7-H1 y B7-DC son hallados en varios tejidos (Dong, Nature Med., 5:1365-1369 (1999); Latchmari, Nature Immunol., 2:261-268 (2001); y Tamura, Blood, 97:1809-1816 (20¡01)), los perfiles de expresión de las proteínas son bastante diferentes. B7-H1 es j ampliamente expresado sobre una amplia variedad de tipos tisulares y celulares, mientras que la expresión de B7-DC predominantemente está i restringida a células dendríticas activadas (DC) y macrófagos. j Se ha mostrado que ambos B7-H1 y B7-DC se fijan a PD-1 (Freeman, J. Exp. Med., 192:1027-1034 (2000)), un miembro distante de la familia CD28 con un motivo inhibidor basado en tirosina inmunoreceptora i (ITIM) en su dominio citoplásmico (Ishida, EMBO J., 1 :3887-3895 (1992)). PD-1 , un miembro de la familia CD28 de receptores, es expresado de manera inducible sobre células T activadas, células B, células asesinas ¡naturales señal supresora o inhibitoria a las células T que resulta en proliferación celular disminuida de células T u otra reducción en activación de células T. B7-H1 es el ligando PD1 predominante que causa transducción inhibitoria de sejñales en células T. La presente invención resuelve el problema de inhibición de células T indeseadas al proporcionar agentes que se fijan a PD-1 y asi prevenir la transducción de señales inhibitorias, o en su lugar se fijan a ligandos del PD-1 tal como B7-H1 , evitando así la fijación del ligando a PD-1 para liberar una señal inhibitoria. En cualquier caso, se estimulan las respuestas de células T, j tal como la proliferación o activación de células T.

! B7-H1 es el ligando PD1 predominante, probablemente Jdebido a su distribución más amplia y niveles mayores de expresión. La inhibición del PD-1 ocurre solamente cuando PD-1 y TCR son ligados en ¡estrecha proximidad entre si, en el contexto de la sinapsis inmune. PD-1 y susj ligandos han sido el tema de varias publicaciones. ! i B7-H1 también es sobre expresado en muchos ^cánceres (incluyendo cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer esofágico, cáncer gástrico, glioma, leucemia, cáncer pulmonar, melanoma, mieloma ¡ múltiple, cáncer ovárico, cáncer pancreático, carcinoma de células renales, |y cáncer ¡ urotelial), y se ha relacionado con un pobre pronóstico. B7-H1 se ¡expresa i mediante muchas líneas celulares tumorales, especialmente después de una estimulación con ¡nterferón gamma (IFN-?), también es regulado de manera positiva sobre células supresoras de origen mieloide que infiltran (tumores (MDSC). Por ejemplo, PD-1 es positivamente regulado sobre células T CD8 específicas tumorales y se asocia con un deterioro funcional, [anergia, agotamiento, y apoptosis. La regulación positiva del PD-1 también está j asociada con fenotipos disfuncionales y/o supresores sobre tipos celulares adicionales, tal como células T reguladoras (Treg) y células T asesinas naturales (NK).

La presente invención hace uso de tales funciones moleculares al proporcionar regímenes de tratamiento para tratar enfermedades a través de una actividad aumentada de células T, especialmente con respecto al cáncer y a enfermedades infecciosas. i BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN En un aspecto, La presente invención se relaciona con un método para aumentar respuestas de células T, por ejemplo, con respecto a un antígeno, en un mamífero en necesidad de tal aumento, el cual comprende administrar a dicho mamífero un compuesto que reduce la transdijicción de señales inhibitorias en células inmunes, especialmente células T, y un agente potenciador, en donde dicho régimen de tratamiento es efectivo para i aumentar la respuesta de células T de dicho mamífero. ¡ I Compuestos útiles en el régimen de tratamiento de la irjivención incluyen aquellos que se fijan a, y bloquean los receptores del PD-1 en células T sin disparar transducción de señales inhibitorias, compuestos que se fijan a ligandos PD-1 para prevenir su fijación a PD-1 , compuestos que realizan ambas acciones, y compuestos para prevenir la expresión de genes que codifican bien sea PD-1 o ligandos naturales del PD-1. Tales compuestos son conocidos en la presente como "Antagonistas del PD-1." Compuestos que se fijan a ligandos naturales del PD-1 incluyen el PD-1 mismo, así comoj también fragmentos activos del PD-1 , y en el caso del ligando B7-H1 , proteínas y fragmentos B7.1. Tales antagonistas incluyen proteínas, anticuerpos, moléculas anti-sentido y orgánicos pequeños.

En una realización preferida, dicha respuesta de células T es mayor que aquella producida mediante dicho antagonista del PD- o dicho agente potenciador cuando cualquiera se administra sin el otro. ! En otra realización, los compuestos útiles en los métodos de la invención son aquellos que se fijan a moléculas de superficie de células T tal i como CTLA4 para prevenir señales inhibitorias activadas mediante fijación de ligandos naturales de los mismos o que se fijan a dicho ligandos rjiaturales.

Tales antagonistas incluyen proteínas, anticuerpos, moléculas anti-sentido y i orgánicos pequeños.

En una realización general, compuestos útiles en regímenes de tratamiento y composiciones dLa presente invención incluyen aquellos que se fijan a PD-1 sin disparar, inducir, aumentar, facilitar y/o permitir igación del PD-1 con TCR.

Compuestos preferidos que previenen la transd ucción de señales inhibitorias a través del PD-1 y por lo tanto actúan como antagonistas del PD-1 incluyen, pero no están limitados a, polipéptidos B7-DC, especialmente porciones solubles de estos, incluyendo fragmentos activos de estos, variantes y homólogos de estos, así como también proteínas de fusión que incorporan cualquiera de los anteriores, que se fijan a PD-1 sin disparar la transducción de señales inhibitorias. En realizaciones preferidas, B7-DC comprende la secuencia aminoácida de SEQ ID NO: 1 , 2, 3 o 4. Tales compuestos preferidos son aquellos que incorporan el dominio soluble de B7-DC (es decir, sin secuencia de transmembrana). Fragmentos apropiados de polipéptidos B7-DC incluyen fragmentos que contienen los dominios IgV y/o IgC o fragmentos que contienen solamente el dominio IgV, con el último siendo una realización preferida, con aminoácidos 20-121 de SEQ ID NO: 1 como un ejemplo preferido de un dominio IgV.

Antagonistas PD-1 preferidos también incluyen, peijo no están limitados a, fragmentos activos de ligandos naturales del PD-1 , ¡tales como polipéptidos B7-H1 (divulgados en la Patente estadounidense No. 6,803,192, incorporada en la presente como referencia en su totalidad), especialmente porciones solubles de estos, incluyendo variantes y homólogos de estos, así como también proteínas de fusión que incorporan cualquiera de los anteriores, que se fijan a PD-1 sin disparar la transducción de señales inhibitorias.

Compuestos preferidos de la invención también inc uyen, pero no están limitados a, compuestos, incluyendo fragmentos activos, variantes y homólogos, que se fijan a ligandos naturales del PD-1 , tales como los fragmentos de B7-1 que se fijan a B7-H1 , así como también proteínas de fusión que incorporan cualquiera de los anteriores, que se fijan a ligandos del PD-1 para evitar la fijación del último a PD-1 para disparar la transducción de señales inhibitorias.

En otra realización, las composiciones y métodos de uso de las mismas, incluyen una combinación de un antagonista receptor del PD-1 que se fija a, y bloquea el receptor del PD-1 , y un antagonista receptor del PD-1 separado que se fija a, y bloquea ligandos receptores del PD-1. Otra realización dl_a presente invención proporciona antagonistas receptores del PD-1 que se fijan al receptor del PD-1 sin disparar (inducir) la transducción de señales inhibitorias a través del receptor del PD-1 y también tienen la capacidad de fijar y antagonizar ligandos receptores del PD-1 , tal como B7-H1 , que de otra manera dispararían la transducción de señales inhibitorias a través del receptor del PD-1. Otros antagonistas receptores del PD-1 contemplados en la presente incluyen anticuerpos bi-específicos que pueden fijar tanto el receptor del PD-1 como los ligandos de receptores del|PD-1.

Realizaciones preferidas de compuestos útiles en La presente invención también incluyen anticuerpos que se fijan a PD-1 o C1LA4, por lo tanto reduciendo o aboliendo, la transducción de señales inhibitorias mediadas por estas fuentes.

Compuestos preferidos para utilizar en los métodos de la invención también incluyen, pero no están limitados a, fragmentos activos de ligandos de CTLA4 (tal como B7-1 y B7-2) que se fijan a CTLA4 para reducir señales inhibitorias subsiguientes pero que no se fijan a CD28 o de otra forma inhiben la transducción de señales positivas mediante CD28.

Compuestos preferidos que previenen la transducción de señales inhibitorias a través de PD-1 y por lo tanto actúan como antagonistas PD-1 incluyen, pero no están limitados a, antagonistas B7-DC, especialmente porciones solubles de estos, incluyendo fragmentos activos de estos, variantes y homólogos de estos, así como también proteínas de fusión que incorporan cualquiera de los anteriores, que se fijan a B7-DC.

En una realización, los polipéptidos B7-DC, fragmentos o variantes de los mismos son acoplados a otros polipéptidos para formar proteínas de fusión que antagonizan el receptor del PD-1 mediante fijación al receptor del PD-1 sin causar transducción de señales inhibitorias a través PD-1 , reduciendo así, o interfiriendo con, fijación de ligados a PD-1 , particularmente fijación de B7-H1 , e interferir así con la transducción de señales inhibitorias a través del receptor del PD-1. Ejemplos de tales proteínas de fusión son polipéptidos que comprenden la secuencia aminoácida de SEQ ID NO: 9, 10, 12 o 13, así como también homólogos de los mismos. En una realización preferida, todo o una parte del dominio extracelular (ECD) de B7-DC es parte de una proteína de fusión en donde este está ligado a un segundo polipéptido que contiene una parte Fe de una inmunoglobulina. Un ejemplo preferido de esto es B7-DC-lg, especialmente donde esta estructura es parte de un homodímero en donde dos moléculas de B7-DC-lg están ligadas entre si, como por ejemplo mediante un ¡enlace de disulfuro.

En realizaciones específicas, los fragmentos útiles en los compuestos de la invención constan de al menos 10, 15, 25, 50, 75, 100, 150, 200 o más aminoácidos contiguos de un polipéptido que tiene la actividad antagonista deseada. Tales fragmentos comúnmente también son parte de las proteínas de fusión para utilizar en la invención.

En otro aspecto, la presente invención se relaciona con un método para aumentar respuestas de las células T en un mamífero en necesidad del mismo, que comprende administrar a dicho mamífero un régimen de tratamiento efectivo que comprende un anticuerpo anti-PD-1 y un agente potenciador, en donde dicho régimen de tratamiento es efectivo para aumentar la respuesta de células T de dicho mamífero.

En otro aspecto, la presente invención se relaciona con un método de aumentar respuestas de células T en un mamífero en necesidad del mismo, que comprende administrar a dicho mamífero un régimen de tratamiento efectivo que comprende un inmunomodulador, y un agente potenciador, en donde dicho régimen de tratamiento es efectivo para aumentar la respuesta de células T de dicho mamífero. Tales inmunomoduladores incluyen moléculas que antagonizan otros receptores de la familia CD28 (tal como CTLA4) que inhiben respuestas de células T. Una realización preferida utiliza un anticuerpo anti-CTLA4 y un agente potenciador. Inmunomoduladores adicionales incluyen: moléculas que agonizan receptores de la familia CD28 (tales como CD28 e ICOS) que activan respuestas de células T; las moléculas que antagonizan ligandos de la familia B7 (tal como B7-H1 , B7-DC, B7-H4) que inhiben respuestas de células T; y moléculas que agonizan ligandos de la familia B7 (tal como B7.1 y B7.2) que activan respuestas de células T.

En realizaciones adicionales de cualquiera de los métodos de la invención, el régimen de tratamiento de un compuesto antagonista del PD-1 y un agente potenciador además comprende al menos un agente terapéutico adicional. Agentes terapéuticos adicionales contemplados incluyen agentes inmunomoduladores. Los agentes inmunomoduladores de ejemplq para tales métodos incluyen anticuerpos anti-PD-1 y anti-CTLA4.

En una realización, el agente potenciador es seleccionado a partir de la ciclofosfamida y análogos de la ciclofosfamida, Sunitinib (Sutent), anti-TGF8 y Imatinib (Gleevac), un inhibidor de la mitosis, tal como paclitaxel, un inhibidor de aromatasa, tal como el letrozol, un receptor A2a de adenosina (A2AR), un inhibidor de la angiogénesis, antraciclinas, ixaliplatino, doxorubicina, antagonistas TLR4, y antagonistas IL-18. Algunos de estos agentes reducen el número de Tregs (es decir, linfocitos T reguladores o T regs) dentro del microambiente tumoral.

En otra realización, los métodos y/o composiciones de la invención específicamente contemplan el uso de cualquier adyuvante apropiado como parte de dicho método y/o composición.

Según la invención, las células T pueden colocarse en contacto con el antagonista receptor del PD-1 y/o composiciones del mismo que contienen un agente potenciador en vitro, ex vivo o en vivo. El contacto de células T que utilizan antagonistas receptores del PD-1 y/o composiciones del mismo que contienen un agente potenciador puede ocurrir antes, durante o después de activación de la célula T.

En una realización específica, una molécula que evita o reduce la transducción de señales inhibitorias a través del PD-1 y el agente potenciador se administran en momentos distintos, como por ejemplo cuando el agente potenciador se administra antes de administrar el antagonista del PD-1. Tal administración puede ser en conjunto con un agente terapéutico adicional.

En realizaciones específicas de cualquiera de los métodos de la invención, el régimen de tratamiento incluye la administración del agente potenciador al menos 1 hora, o al menos 2 horas, o al menos 3 horas, o al menos 5 horas, o al menos 10 horas, o al menos 15 horas, o al menos 20 horas, o al menos 24 horas, o al menos 30 horas o aún más antes de administrarse cualquiera o todos entre los antagonistas del PD-1 , el anticuerpo anti-PD- , el anticuerpo anti-CTLA4, y/o agentes terapéuticos adicionales. La administración del agente potenciador también puede ocurrir después de administrarse cualquiera o todos entre el antagonista del PD-1 , el anticuerpo anti-PD-1 , el anticuerpo anti-CTLA4 y/o agentes terapéuticos adicionales, tal como a no más de 1 hora, 2 horas, 3 horas, 5 horas, 10 horas, 15 horas, 20 horas, 24 horas, o aún hasta 30 horas después de administrarse un antagonista del PD-1 , o puede ocurrir en conjunto con la administración del antagonista del PD-1 .

La respuesta aumentada de células T lograda como un resultado de los métodos de la invención es suficiente para tratar una enfermedad, incluyendo una o más entre cáncer, infección viral, infección bacteriana e infección parasitaria. Donde la enfermedad es el cáncer, tal cáncer puede ser cualquiera o más entre cáncer de vejiga, cerebral, de mama, cervical, colo-rectal, esofágico, renal, hepático, pulmonar, nasofaríngeo, pancreático, prostético, de piel, de estómago, uterino, ovárico, testicular, o hematológico.

En otro aspecto, La presente invención incluye composiciones de los antagonistas utilizados en los métodos de la invención, en un vehículo farmacéuticamente aceptable y en donde dicha molécula fijadora del PD-1 y dicho agente potenciador están cada uno presentes en una cantidad efectiva para producir estimulación aumentada de células T.

En una realización preferida, la invención incluye kits médicos que comprenden recipientes que contienen uno o más de los agentes para utilizar en la invención junto con vehículos farmacéuticos para dilución de los mismos e instrucciones para administración. Además, ambos antagonista del receptor del PD-1 como agente potenciador pueden estar presentes como componentes en un único recipiente, en un vehículo farmacéuticamente aceptable, cuando dichos componentes se van a administrar al mismo tiempo.

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS La Figura 1 muestra que B7-DC-lg se fija a PD-1. B7-DC-lg rotulado fue incubado en varias concentraciones con una línea celular CHO que expresa constitutivamente PD-1 o células CHO precursoras que no expresan PD-1. La fijación se analizó mediante citometría de flujo. La intensidad de fluorescencia media (MFI) de B7-DC-lg (eje-y) se muestra como una función de la concentración de sonda (eje-x). B7-DC-lg se fija a células CHO. PD-1 (círculo sólido) pero no a células CHO no transfectadas (triángulo gris).

La Figura 2 muestra que B7-DC-lg compite con B7-H1 por fijación a PD-1. B7-DC-lg sin rotular en varias concentraciones primero se incubó con una línea celular CHO que expresa constitutivamente PD-1 antes de la adición de B7-H1-lg rotulado a la mezcla celular. La intensidad de fluorescencia media (MFI) de B7-H1-lg (eje-y) se muestra como una función de la concentración del competidor B7-DC-lg sin rotular (eje-x) agregado. A medida que aumenta la concentración de B7-DC-lg sin rotular, disminuye la cantidad de B7-H1-lg rotulado fijado a células CHO, demostrando que B7-DC-Ig compite con B7-H1 por fijación a PD-1.

Las Figuras 3A-3C muestran los resultados de los experimentos en donde la combinación de cic ofosfamida (CTX o Cytoxan®) y B7-DC-lg murino dimérico resultó en la erradicación de tumores CT26 establecidos (carcinoma de colon) en ratones. La figura 3A muestra volumen tumoral (mm3) versus días post exposición a tumor en ratones tratados con 100 mg/kg de CTX en el Día 10 mientras la figura 3B muestra volumen tumoral (mm3) versus días pos exposición al tumor en ratones tratados con CTX el Día 10 seguido un día después por la primera administración de B7-DC-lg. Cada línea en cada gráfica representa un ratón. La fecha negra representa administración B7-DC-lg. La figura 3C muestra volumen tumoral medio.

Figura 4 muestra los resultados de experimentos en donde la combinación de CTX y B7-DC-lg murino dimérico erradicó tumores CT26 establecidos (carcinoma de colon) en ratones y protegió contra re-exposición con CT26. Los ratones que fueron tratados con CTX y B7-DC-lg y se encontraron libres de crecimiento tumoral el día 44 después de inoculación tumoral fueron re-expuestos a tumores. Los ratones luego fueron re-expuestos nuevamente el Día 70. Ninguno de los ratones presentó crecimiento tumoral a la altura del día 100.

La Figura 5 muestra que el tratamiento de CTX y B7-DC-lg resultó en generación de CTL (linfocitos T citotóxicos) de memoria específicos de tumores. Los ratones a los cuales se erradicó tumores subcutáneos CT26 establecidos después de tratamiento de CTX y B7-DC-lg fueron re-expuestos con células CT26. Siete días después, los esplenocitos fueron aislados y pulsados bien sea con ovalbúmina, un péptido irrelevante, o AH1 , un péptido específico para CT26. Las células fueron teñidas con primero anticuerpo anti-CD8 seguido por teñido intracelular con anticuerpo anti-IFNy antes de análisis FACS.

Las Figuras 6A-6D muestran los efectos de diferentes dosis de B7-DC-lg en combinación con CTX sobre la erradicación de tumores CT26 establecidos en ratones. Ratones Balb/C de 9 a 1 1 semanas de edad fueron implantados subcutáneamente con células 1 E05 CT26. El día 9, los ratones fueron inyectados intraperitonealmente con 100 mg/kg de CTX. Veinticuatro horas después, el día 10, los ratones fueron tratados con 30, 100, o 300 ug de B7-DC-lg seguido por 2 inyecciones cada semana hasta 8 tratamientos en total. El crecimiento tumoral se midió dos veces por semana.

Las Figuras 7A-7C muestran los resultados de los experimentos en donde la combinación de CTX y anticuerpo anti-PD-1 resultó en erradicación de tumores CT26 establecidos (carcinoma de colon) en ratones. La figura 7A muestra el volumen tumoral (mm3) versus días pos exposición tumoral en ratones no tratados (es decir, ratones tratados con vehículo solo), la figura 7B muestra el volumen tumoral (mm3) versus días pos exposición tumoral en ratones tratados solo con anti-PD-1 comenzando el día 11 en 300 g por inyección, 3 veces por semana, hasta 12 inyecciones y la figura 7C muestra volumen tumoral (mm3) versus días pos exposición tumoral en ratones tratados con CTX el Día 1 1 y la primera administración de anti-PD-1 el Día 12 a 300µg por inyección, 3 veces por semana, hasta 12 inyecciones. Cada línea en cada gráfica representa un ratón. La fecha negra representa administración de anti-PD-1.

Las Figuras 8A y 8B muestran los resultados de experimentos en donde la combinación de CTX y anticuerpo anti-CTLA4 resultó en erradicación de tumores CT26 establecidos (carcinoma de colon) en ratones. Aquí, la figura 8A muestra el volumen tumoral (mm3) versus días pos exposición tumoral en ratones tratados con 100 mg/kg de CTX el Día 1 1 mientras la figura 8B muestra el volumen tumoral (mm3) versus días pos exposición tumoral en ratones tratados con CTX el Día 1 1 y anti-CTLA4 el Día 12 a 100µg por inyección, 2 veces por semana, hasta 8 inyecciones. Cada línea en cada gráfica representa un ratón. La fecha negra representa administración anti-CTLA-4.

Las Figuras 9A y 9B muestran los resultados de los experimentos en donde ratones Balb/C de 9 a 11 semanas de edad fueron implantados con 1 X 105 células CT26 subcutáneamente. El día 9, los ratones fueron inyectados con 100 mg/kg de CTX, intraperitonealmente.

Veinticuatro horas después, el Día 10, ratones fueron tratados con 100 g de B7-DC-lg. Hubo 5 grupos: ratones que no recibieron ninguna célula tumoral, vehículo inyectado, CTX solo, CTX + B7-DC-lg o B7-DC-lg solo. Dos ratones no expuestos anteriormente a ningún experimento (naive) y 4 ratones de otros grupos fueron retirados del estudio el Día 1 1 (2 días después de CTX) y el Día 16 (7 días después de CTX) para análisis de células T. El panel izquierdo muestra que en el Día 1 1 , 2 días después de inyección CTX, Treg en el bazo del ratones con tratamiento CTX fue significativamente menor que aquel en los ratones con implantación tumoral e inyectados con vehículo. El panel derecho muestra que en el Día 16, 7 días después de CTX y 6 días después de tratamiento B7-DC-lg, B7-DC-lg significativamente redujo las células T CD4+ que expresan PD-1 alto. Esto se observó tanto en ratones tratados con B7-DC-lg como en ratones tratados con CTX + B7-DC-lg. Los ratones implantados con células tumorales prometieron tener más células T PD-1+/CD4+ en el nodulo linfático en drenaje en comparación con ratones no expuestos a ningún tipo de experimento.

La Figura 10 muestra los resultados de experimentos en donde la combinación de CTX y B7-DC-lg resultó en supervivencia aumentada en ratones con inyección en la vena de la cola de una linea celular turmoral de próstata de ratón. Las células SP-1 fueron aisladas desde pulmones de ratón que hicieron metástasis a partir de inyección de células tumorales de TRAMP (adenocarcinoma transgénico de próstata murina). Ratones B10.D2 fueron primero inyectados con 3x105 células SP-1 vía inyección en la vena de la cola. Los Días 5, 12 y 19, los ratones fueron inyectados con 50 mg/kg de CTX donde se indicó. El Día 6, 13 y 20, los ratones fueron administrados con 5 mg/kg de B7-DC-lg donde se indicó. Aquí, "NT" se refiere a "no tratados".

La Figura 11. A ratones Balb/C con edad de 1 1-13 semanas se les proporcionó metástasis hepática utilizando una técnica de inyección hemiesplénica. Los bazos de ratones anestesiados se dividieron en dos mitades y las mitades fueron recortadas. Las células CT26 (1 E05) fueron inyectadas en un hemibazo, y después de 30 segundos, este hemibazo fue resecado y la vena esplénica en drenaje fue cortada. El Día 10, los ratones recibieron 1 inyección de CTX a 50 mg/kg, intraperitonealmente. Veinticuatro horas después, el Día 1 1 , ratones fueron tratados con Listeria recombinante que lleva péptido AH1 , un epítopo de CT26, a 0.1 x LD50 (1 x107 CFU), luego el Día 14 y 17. Los ratones también fueron tratados con B7-DC-lg el Día 11 y luego el Día 18. La supervivencia general de ratones fue monitoreada.

Definiciones A menos que se defina de otra manera, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente tienen los mismos significados como comúnmente se entienden por alguien con experiencia en el estado de la técnica al cual la invención divulgado pertenece. En particular, los siguientes términos y frases tienen el siguiente significado.

La término "transducción de señales inhibitorias" se utiliza para referirse cualquier transducción de señales que tiene el efecto de abolir o de otra manera reducir las respuestas de células T contra un antígeno, ya sea mediante reducción de proliferación de células T o mediante cualquier otro mecanismo inhibitorio, mediante lo cual la extensión o duración de una respuesta inmunogénica de células T es disminuida. Tal transducción de señales inhibitorias puede deberse a fijación del PD-1 a un ligando natural, tal como fijación del PD-1 mediante B7-H1 o algún otro miembro de esta clase de ligandos, B7-DC, o puede deberse a fijación de CTLA4 a ligandos, tal como B7-1 o B7-2. En general, los compuestos de la invención reducen tal transducción de señales inhibitorias e incluyen, pero no están limitados a, antagonistas del PD-1 y antagonistas del CTLA4.

El término "antagonista del PD-1 " se refiere a una molécula que atenúa la transduccion de señales inhibitorias mediada por PD-1 , encontrada sobre la superficie de células T, células B, células asesinas naturales (NK), monocitos, DC, y macrófagos. Tal antagonista incluye a molécula qué altera cualquier señal inhibitoria generada por una molécula del PD-1 sobre una célula T. En ejemplos específicos de la invención, un antagonista del PD-1 es una molécula que inhibe, reduce, suprime o de otra manera reducen la transduccion de señales inhibitorias a través de la ruta de señalización de receptores del PD-1. Tal disminución puede resultar donde: (i) el antagonista del PD-1 de la invención se fija a un receptor del PD-1 sin disparar la transducción de señales, para reducir o bloquear transduccion de señales inhibitorias,; (ii) el antagonista del PD-1 se fija a un ligando (ej., un agonista) del receptor del PD-1 , evitando su fijación al mismo (por ejemplo, donde dicho agonista es B7-H1); (¡ii) el antagonista del PD-1 se fija a, o de otra manera inhibe la actividad de una molécula que es parte de una cadena reguladora que, cuando no es inhibida, tiene el resultado de estimular u de otra manera facilitar transducción de señales inhibitorias del PD-1 ; o (iv) el antagonista del PD-1 inhibe la expresión de un receptor del PD-1 o ligando de expresión mismo, especialmente al reducir o abolir la expresión de uno o más genes que codifican PD-1 o uno o más de su ligandos naturales. Así, un antagonista del PD-1 de la invención es un molécula que realiza una disminución en transducción de señales inhibitorias del PD-1 , aumentando así respuesta de células T a uno o más antígenos.

Como se utiliza en la presente, el término " antagonista de CTLA4 " significa un compuesto que reduce inhibición CTLA4- mediada de reacciones de células T. Por ejemplo, en una célula T, CTLA4 libera un impulso inhibitorio ante fijación de ligandos B7, tales como B7-1 y B7-2. Un antagonista de CTLA4 es aquel que altera fijación de dichos ligandos a CTLA4 sobre células T activadas. En una realización, el antagonista es un anticuerpo anti-CTLA4 que fija CTLA4 para prevenir fijación de ligandos.

Como se utiliza en la presente, el término "fragmento activo" se refiere a una parte de un polipéptido natural, o un polipéptido con alta homología de secuencia (por ejemplo, al menos 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, o 99% de identidad de secuencia aminoácida) a un polipéptido natural y que exhibe actividad antagonista del PD-1 , por ejemplo, mediante fijación del PD-1 o mediante fijación a un ligando del PD-1. En realizaciones preferidas, tal fragmento consistiría del dominio extracelular (ECD) de una proteína B7-DC que se fija a PD-1 , tal como SEQ ID NO: 3, preferiblemente los aminoácidos 20 a 221 de la misma. En el caso de polipéptido del PD-1 , un fragmento activo sería parte de dicho polipéptido que comprende un dominio de fijación que se fija a un ligando natural del PD-1 para prevenir estimulación de transducción de señales inhibitorias mediada por PD-1 mediante dicho ligando. Los fragmentos activos pueden identificarse por su capacidad para competir con la molécula de la cual se derivan por fijación a un sitio de fijación natural. Por ejemplo, los fragmentos activos competirán con B7-DC tipo silvestre por fijación a PD-1.

Con respecto a un anticuerpo, el término "fragmento activo" significa una porción fijadora de antígenos de un anticuerpo que es menor que una inmunoglobulina entera. Tales fragmentos incluyen fragmentos Fab y F(ab2)\ capaces de reaccionar y fijarse a cualquiera de los polipéptidos divulgados en la presente como receptores o ligandos. Estos fragmentos Fab y F(ab')2 carecen de la porción Fe de un anticuerpo intacto, se eliminan más rápidamente de la circulación, y pueden tener menos fijación tisular no específica que un anticuerpo intacto (Wahl ., J. Nuc. Med. 24:316-325 (1983)). También incluidos están los fragmentos Fv (Hochman, J. . (1973) Biochemistry 12:1130-1 135; Sharon, J. .(1976) Biochemistry 15:1591-1594). Estos diferentes fragmentos se producen utilizando técnicas convencionales tales como escisión con proteasas o escisión química (ver, ej.,, Rousseaux ., Meth. Enzymol., 121 :663-69 (1986)).

Como se utiliza en la presente, el término "parte soluble" de un antagonista del PD-1 se refiere a aquella parte polipéptido de longitud completa que no incluye ninguna parte de la porción o segmento de transmembrana. Por ejemplo, con respecto a B7-DC, una parte soluble incluiría la parte extracelular (con o sin la secuencia señal N-terminal) pero no incluiría ninguna parte de la porción de transmembrana (o, al menos, no suficiente para reducir solubilidad). Así, la ECD de B7-DC humano se muestra como SEQ ID NO: 3 y consta de ambos dominios tipo IgV- y tipo IgC de la molécula de longitud completa (es decir, los aminoácidos 20-221 de la secuencia de longitud completa (SEQ ID NO: 1).

Como se utiliza en la presente, un "polipéptido co-estimulador" es un polipéptido que, al interactuar con una molécula de superficie celular sobre células T, modula la actividad de la célula T. Así, la respuesta de la célula T puede ser una respuesta efectora (ej.,, CTL o célula B productora de anticuerpos), una respuesta ayudadora (7 helper) que proporciona ayuda para una o más respuestas efectoras (ej.,, CTL o célula B productora de anticuerpos), o una respuesta supresora.

Como se utiliza en la presente, el término "régimen de tratamiento" se refiere a un tratamiento de una enfermedad o un método para lograr un cambio fisiológico deseado, tal como respuesta aumentada o disminuida del sistema inmune a un antígeno o immunógeno, tal como un aumento o disminución en el número o actividad de una o más células, o tipos celulares, que están involucrados en tal respuesta, en donde dicho tratamiento o método comprende administrar a un animal, tal como un mamífero, especialmente un ser humano, una cantidad suficiente de dos o más agentes o componentes químicos de dicho régimen para tratar efectivamente una enfermedad o para producir dicho cambio fisiológico, en donde dichos agentes o componentes químicos son administrados juntos, como parte de la misma composición, o administrados de manera separada e independientemente al mismo tiempo o en momentos diferentes (es decir, la administración de cada agente o componente está separada por un periodo de tiempo fijo a partir de uno o más de los agentes o componentes) y donde administración de dicho uno o más agentes o componentes logra un resultado mayor que cuando cualquiera de dichos agentes o componentes se administran solos o por separado.

Como se utiliza en la presente el término "aislado" se utiliza para describir un compuesto de interés (ej., bien sea un polinucleótido o un polipéptido) que está en un ambiente diferente del cual el compuesto se encuentra en la naturaleza ej., separado de su ambiente natural mediante por ejemplo concentrar un péptido a una concentración a la cual éste no se encuentra en la naturaleza. "Aislado" se utiliza para incluir compuestos que están dentro de muestras que son sustancialmente enriquecidas para el compuesto de interés y/o en las cuales el compuesto de interés es parcial o sustancialmente purificado.

Como se utiliza en la presente, el término "polipéptido" se refiere a una cadena de aminoácidos de cualquier longitud, sin considerar modificación (ej., fosforilación o glicosilación). Un polipéptido dl_a presente invención puede ser un polipéptido recombinante, un polipéptido natural o un polipéptido sintético, preferiblemente un polipéptido recombinante.

Como se utiliza en la presente, un polipéptido "variante" contiene al menos una alteración de secuencia aminoácida comparada con la secuencia aminoácida del polipéptido tipo silvestre correspondiente.

Como se utiliza en la presente, una "alteración de secuencia aminoácida" puede ser, por ejemplo, una sustitución, una supresión, o una inserción de uno o más aminoácidos.

Como se utiliza en la presente, los términos "parte," "segmento," y "fragmentos," cuando se utilizan en relación con polipéptidos, se refieren a una secuencia continua de residuos, tal como residuos aminoácidos, cuya secuencia forma un subgrupo de una secuencia mayor. Por ejemplo, si un polipéptido fuera sometido a tratamiento con cualquiera de las endopeptidasas comunes, tales como tripsina o quimiotripsina, los oligopéptidos que resultan de tal tratamiento representarían porciones, segmentos o fragmentos del polipéptido inicial. Un "fragmento" de un polipéptido por lo tanto se refiere a cualquier subgrupo del polipéptido que es un polipéptido más corto de la proteína de longitud completa. Generalmente, los fragmentos tendrán cinco o más aminoácidos de longitud.

Un derivado, análogo u homólogo, de un polipéptido (o fragmento del mismo) de la invención puede ser (i) uno en el cual uno o más de los residuos aminoácidos son sustituidos con un residuos aminoácido conservado o no conservado (preferiblemente un residuos aminoácido conservado) y tal residuo aminoácido sustituido puede o no ser uno codificado por el código genético, o (ii) uno en el cual uno o más de los residuos aminoácidos incluye un grupo sustituyente, o (iii) uno en el cual el polipéptido maduro es fusionado con otro compuesto, tal como un compuesto para aumentar la vida media del polipéptido (por ejemplo, glicol de polietileno), o (iv) uno en el cual los aminoácidos adicionales son fusionados al polipéptido maduro, tal como una secuencia líder o secretoria o una secuencia la cual se emplea para purificación del polipéptido maduro o una secuencia de una pro-proteína. Tales derivados y análogos se consideran dentro del alcance de la invención por aquellos con experiencia en el estado de la técnica a partir de las enseñanzas en la presente.

Como se utiliza en la presente, "valencia" se refiere al número de sitios de fijación disponibles por molécula.

Según La presente invención, el término "identidad porcentual" o "idéntico %," cuando en referencia a una secuencia, significa que una secuencia es comparada con una secuencia reivindicada o descrita después de alinear la secuencia a ser comparada (la "secuencia comparada") con la secuencia descrita o reivindicada (la "secuencia de referencia"). El identidad porcentual luego se determina según la siguiente fórmula: Identidad porcentual = 100Í1-(C/R)1 en donde C es el número de diferencias entre la Secuencia de Referencia y la Secuencia comparada sobre la longitud de alineación entre la Secuencia de referencia y la Secuencia comparada en donde (i) cada base o aminoácido en la Secuencia de referencia que no tiene una base o aminoácido alineado correspondiente en la Secuencia comparada y (ii) cada brecha en la Secuencia de referencia y (iii) cada base o aminoácido alineado en la Secuencia de referencia que es diferente de una base o aminoácido alineado en la Secuencia comparada, constituye una diferencia; y R es el número de bases o aminoácidos en la Secuencia de referencia sobre la longitud de la alineación con la Secuencia comparada con cualquiera brecha creada en la Secuencia de referencia también es contada como una base o aminoácido. Si existe una alineación entre la Secuencia comparada y la Secuencia de referencia para la cual el identidad porcentual como se calculó anteriormente es aproximadamente igual o mayor que un Identidad porcentual mínimo especificado entonces la Secuencia comparada tiene el Identidad porcentual mínimo especificado a la Secuencia de referencia aún cuando puedan existir alineaciones en las cuales el identidad porcentual calculado anteriormente sea menor que el identidad porcentual especificado.

Como se utiliza en la presente, el término "sustitución aminoácida conservadora" se refiere a una sustitución en donde el aminoácido sustituido tiene propiedades estructurales o químicas similares, y sustituciones aminoácidas "no-conservadoras" son aquellas en las cuales la carga, hidrofobicidad, o el grueso del aminoácido sustituido se alteran de manera significativa. Las Sustituciones no conservadoras diferirán más significativamente en su efecto sobre mantener (a) la estructura del esqueleto peptídico en el área de la sustitución, por ejemplo, como una conformación en lámina o helicoidal, (b) la carga o hidrofobicidad de la molécula en el sitio objetivo, o (c) el grueso de la cadena lateral. Ejemplos de sustituciones aminoácidas conservadoras incluyen aquellas en las cuales la sustitución está dentro de uno de los siguientes cinco grupos: 1) residuos alifáticos pequeños, no polares o levemente polares (Ala, Ser, Thr, Pro, Gly); 2) residuos polares y cargados negativamente y sus amidas (Asp, Asn, Glu, Gin); residuos polares y cargados de manera positiva (His, Arg, Lys); residuos alifáticos grandes, no polares (Met, Leu, lie, Val, Cys); y residuos aromáticos grandes (Phe, Tyr, Trp). Ejemplos de sustituciones aminoácidas no conservadoras son aquellas donde 1) un residuo hidrofílico, ej., serilo o treonilo, es sustituido por (o mediante) un residuo hidrofóbico, ej., leucilo, isoleucilo, fenilalanilo, valilo, o alanilo; 2) una cisteína o prolina es sustituido por (o mediante) cualquier otro residuo; 3) un residuo que tiene una cadena lateral electropositiva, ej., lisilo, arginilo, o histidilo, es sustituido por (o mediante) un residuo electronegativo, ej., glutamilo o aspartilo; o 4) un residuo que tiene una cadena lateral abultada, ej., fenilalanina, es sustituido por (o mediante) un residuo que no tiene una cadena lateral, ej., glicina.

Los términos "individuo", "huésped", "sujeto", y "paciente" se utilizan intercambiablemente en la presente, y se refieren a un mamífero, incluyendo, pero sin limitar a, primates, por ejemplo, seres humanos, así como también roedores, tales como ratones y ratas, y otros animales de laboratorio.

Como se utiliza en la presente el término "cantidad efectiva" o "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a una dosificación suficiente para tratar, inhibir, o aliviar uno o más síntomas de una estado patológico tratados o de otra manera proporcionar un efecto farmacológico y/o fisiológico deseado, especialmente aumentar la respuesta de células T a un antígeno seleccionado. La dosificación exacta variará según una variedad de factores tales como variables dependientes del sujeto (ej., edad, estado del sistema inmune, etc.), la enfermedad, y el tratamiento administrado.

Como se utiliza en la presente "vehículo farmacéuticamente aceptable" incluye cualquiera y todos los solventes, medios de dispersión, revestimientos, agentes antibacterianos y antimicóticos, agentes isotónicos y retardantes de absorción, y similares. El uso de tales medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas es bien conocido en el estado de la técnica. Excepto que cualquier medio o agente convencional sea incompatible con el compuesto activo, se contempla el uso del mismo en las composiciones terapéuticas. Compuestos activos suplementarios también pueden incorporarse en las composiciones.

El término "anticuerpo" se utiliza para incluir moléculas intactas así como también fragmentos de las mismas incluyendo el sitio de fijación de antígenos. La estructura entera del anticuerpo a menudo es dada como H2L2 y se refiere al hecho que los anticuerpos comúnmente comprenden 2 cadenas aminoácidas livianas (L) y 2 cadenas aminoácidas pesadas (H). Ambas cadenas tienen regiones capaces de interactuar con un blanco antigénico estructuralmente complementario. Las regiones que interactúan con el blanco son conocidas como regiones "variables" o "V" y se caracterizan por las diferencias en secuencia aminoácida a partir de anticuerpos de diferente especificidad antigénica. Las regiones variables de bien sea Cadenas livianas o pesadas contienen las secuencias aminoácidas capaces de fijación específica a blancos antigénicos. Dentro de estas secuencias están otras secuencias más pequeñas llamadas "hipervariables" por su extrema variabilidad entre anticuerpos de diferente especificidad. Tales regiones hipervariables también se conocen como "regiones determinantes de complementariedad" o regiones "CDR". Estas regiones CDR explican la especificad básica del anticuerpo para una estructura determinante antigénica particular. Las CDRs representan tramos no adyacentes de aminoácidos dentro de las regiones variables pero, sin importar la especie, se ha encontrado que las ubicaciones posicionales de estas secuencias aminoácidas críticas dentro de las regiones variables de cadena pesada y liviana tienen locaciones similares dentro de las secuencias aminoácidas de las cadenas variables. Las cadenas pesadas y livianas variables de todos los anticuerpos tienen cada una 3 regiones CDR, cada una adyacente con las otras (denominadas L1 , L2, L3, H1 , H2, H3) para las cadenas livianas (L) y pesadas (H) respectivas. Las regiones CDR aceptadas se han descrito por Kabat, J. Biol. Chem. 252:6609-6616 (1977). La anticuerpos divulgados según la invención también pueden ser completamente sintéticos, en donde las cadenas polipéptidas de los anticuerpos son sintetizadas y, posiblemente, optimizadas para fijación a los polipéptidos divulgados en la presente como receptores. Tales anticuerpos pueden ser anticuerpos quiméricos o humanizados y pueden tener estructura completamente tetrámera, o pueden ser diméricos y comprender solamente una cadena pesada y una cadena liviana.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona un régimen de tratamiento, o terapia de combinación, para tratar enfermedad en mamíferos que comprende un compuesto que reduce o elimina transducción de señales inhibitorias en células T, preferiblemente células T humanas, administrado en conjunto con un agente potenciador para aumentar una respuesta inmune.

Los métodos de la invención también se relacionan con el uso de inmunomoduladores de amplio espectro y composiciones de estos. En general, la respuesta aumentada de células T que resulta a partir de estos métodos es mayor que cualquier respuesta aumentada de células T que resulta de administrar la misma dosis de bien sea dicho antagonista del PD-1 o dicho agente potenciador solo.

La composiciones y regímenes divulgados son útiles para estimular o aumentar respuestas inmunes que involucran células T. Por lo tanto, los métodos de la invención son más útiles en tratar una condición patológica que se beneficiaría de un aumento en actividad de células T y donde la respuesta aumentada de células T es necesaria o suficiente para tratar dicha enfermedad, aún cuando la enfermedad no sea específicamente causada o empeorada por una respuesta reducida de células T. En una realización preferida, el tipo de enfermedad a tratar o prevenir es un tumor maligno o una enfermedad infecciosa crónica causada por un patógeno bacteriano, viral, protozoario, helminto u otro patógeno intracelular microbiano que es atacado, es decir, mediante linfocitos T citotóxicos. La activación de células T que utiliza las composiciones divulgadas también es ventajosa en tratar o prevenir condiciones caracterizadas por ¡nmunosupresión.

Según La presente invención, la respuesta de células T puede regularse por moléculas que se fijan a receptores sobre la superficie de células T y moléculas que se fijan a ligandos de tales receptores. En el caso de PD-1 , las moléculas que fijan PD-1 para reducir su efecto inhibidor y/o moléculas que fijan uno o más ligandos del PD-1 para reducir su capacidad de fijar PD-1 tienen el efecto de reducir la capacidad de PD-1 para inhibir respuesta de células T, aumentando así está repuesta y el efecto inmunológico de la misma.

A. Antagonistas de receptores del PD-1 Se proveen composiciones que contienen antagonistas de receptores del PD-1 e incluyen compuestos o agentes que bien sea se fijan a y bloquean un ligando del PD-1 para interferir o inhibir la fijación del ligando al receptor del PD-1 , o fijarse directamente al receptor del PD-1 y bloquearlo sin inducir transducción de señales inhibitorias a través del receptor del PD-1. En otra realización, el antagonista de receptores del PD-1 se fija directamente al receptor del PD-1 sin disparar transducción de señales inhibidoras y también se fija a un ligando del receptor del PD-1 para reducir o inhibir el ligando evitando que active la transducción de señales a través del receptor del PD-1. Al reducir el número y/o cantidad de ligandos que se fijan a receptores del PD-1 y disparan la transducción de una señal inhibidora, menos células son atenuadas por la señal negativa liberada por la transducción de señales de PD-1 y una respuesta inmune más robusta puede lograrse.

Según La presente invención, la señalización del PD-1 requiere fijación a un ligando del PD-1 (tal como B7-H1 o B7-DC) en proximidad estrecha con un antígeno peptídico presentado por el complejo mayor de histocompatibilidad ( HC) (ver, por ejemplo, Freeman Proc. Nati. Acad. Sci. U. S. A 105:10275-10276 (2008)). Por lo tanto, proteínas, anticuerpos o pequeñas moléculas que previenen co-l¡gación del PD-1 y TCR sobre la membrana de células T son antagonistas del PD-1 útiles contemplados por esta invención.

Antagonistas de receptores del PD-1 de ejemplo incluyen, pero no están limitados a polipéptidos B7-DC, incluyendo homólogos y variantes de éstos, así como también fragmentos activos de cualquiera de los anteriores, y proteínas de fusión que incorporan cualquiera de estos. En una realización preferida, la proteína de fusión comprende la parte soluble de B7-DC acoplada a la porción Fe de un anticuerpo, tal como IgG humano, y no incorpora toda o parte de la porción de transmembrana de B7-DC humano. Los antagonistas de receptores del PD-1 también pueden ser antagonistas o anticuerpos de moléculas pequeñas que reducen o interfieren con la transduccion de señales de receptores del PD-1 mediante fijación a ligandos del PD-1 o al PD-1 mismo, especialmente donde la co-ligación del PD-1 con TCR no sigue tal fijación, por lo cual no se dispara la transducción de señales inhibidoras a través del receptor del PD-1.

Los antagonistas de receptores del PD-1 proporcionados en la presente generalmente son útiles in vivo y ex vivo como terapéuticos estimuladores de respuestas inmunes. En general, las composiciones antagonistas divulgadas son útiles para tratar un sujeto que tiene o está predispuesto a cualquier enfermedad o trastorno al cual el sistema inmune del sujeto prepara una respuesta inmune. 1. Polipéptidos B7-DC En ciertas realizaciones, las proteínas B7-DC pueden utilizarse como antagonistas de receptores del PD-1. B7-DC es un ligando natural del PD-1 y se fija a PD-1 con afinidad más alta que B7-H1 , y puede así inhibir interacciones B7-H1 :PD-1. Polipéptidos apropiados de B7-DC, incluyendo variantes, homólogos y fragmentos de los mismos, pueden obtenerse a partir de los siguientes polipéptidos B7-DC humanos de longitud completa con (SEQ ID NO:1) o sin (SEQ ID NO:2) el péptido señal endógeno.

MIFLLLMLSL ELQLHQIAAL FTVTVPKELY IIEHGSNVTL EC FDTGSHV NLGAITASLQ 60 KVENDTSPH E ATLLEEQL PLGKASFHIP QVQVRDEGQY QCIIIYGVAW DYKYLTLKVK 120 ASYRKINTHI LKVPETDEVE LTCQATGYPL AEVSWPNVSV PA TSHSRTP EGLYQVTSVL 180 RLKPPPGRNF SCVFW THVR ELTLASIDLQ SQMEPRTHPT WLLHIFIPFC IIAFIFIATV 240 IALRKQLCQK LYSS DTTKR PVTTTKREVN SAI 273 (SEQ ID NO: 1) LFTVTVPKEL YIIEHGS VT LECNFDTGSH VNLGAITASL Q VENDTSPH RERATLLEEQ 60 LPLGKASFHI PQVQVRDEGQ YQCIIIYGVA WDYKYLTLKV KASYRKINTH ILKVPETDEV 120 ELTCQATGYP LAEVSWPNVS VPANTSHSRT PEGLYQVTSV LRLKPPPGRN FSCVFW THV 180 RELTLASIDL QSQMEPRTHP TWLLHIFIPF CIIAFIFIAT VIALRKQLCQ KLYSSKDTTK 240 RPVTTTKREV NSAI 254 (SEQ ID NO: 2) La familia B7 de moléculas, incluyendo B7-DC, se expresan en la superficie celular con un dominio IgC constante próximo de membrana y un dominio IgV distal de membrana. Los receptores para estos ligandos comparten un dominio tipo IgV extracelular común. Las interacciones de pares receptor/ligando son mediadas predominantemente a través de residuos en los dominios IgV de los ligandos y receptores. En general, los dominios IgV son descritos teniendo dos láminas que contienen una capa de hebras ß. Estas hebras ß se conocen como A', B, C, C\ C", D, E, F y G. La estructura de tales polipéptidos ha sido descrita en la literatura (Ver Molnar, Estructura de cristal del complejo entre Muerte Programada-1 (PD-1) y su ligando PD-L2, PNAS, Vol. 105, pp. 10483-10488 (Julio 29, 2008)).

B7-DC, una proteína de transmembrana, en su forma monomérica, comprende dominios IgV y IgC que componen la porción extracelular de la molécula (el dominio extracelular, o ECD), con el dominio tipo IgV como responsable, totalmente o en parte, por fijación del PD-1 así como también de otras funciones citadas en los métodos de la invención. Para la proteína humana, el dominio IgV se caracteriza por poseer un enlace disulfuro que une las hebras B y F (citadas anteriormente), lo cual parece ser característico de muchos dominios IgV y posee una estructura tridimensional similar con los dominios IgV de B7-1 y B7-2 (ver Molnar (2008), supra).

En una realización los polipéptidos variantes B7-DC contienen alteraciones aminoácidas (es decir, sustituciones, supresiones o inserciones) dentro de una o más de estas hebras ß en cualquier combinación posible. En otra realización, las variantes B7-DC contienen una o más alteraciones aminoácidas (es decir, sustituciones, supresiones o inserciones) dentro de las hebras ß ?', C, C C", D, E, F o G. En una realización preferida las variantes B7-DC contienen una o más alteraciones aminoácidas en la hebra ß G. En otra realización, los fragmentos de polipéptidos variantes B7-DC incluyen los dominios IgC y IgV de B7-DC. En otra realización, los fragmentos de polipéptidos B7-DC variantes incluyen el dominio IgV de B7-DC.

Proteínas humanas y murinas B7-DC contienen un dominio intracitoplásmico corto, un dominio de transmembrana único y un dominio extracelular. El dominio extracelular contiene dos dominios Ig; un dominio IgC próximo de membrana y un dominio IgV distal de membrana. Fragmentos útiles de polipéptidos B7-DC variantes incluyen fragmentos solubles. Fragmentos B7-DC solubles son fragmentos de B7-DC que pueden desprenderse, secretarse o de otra manera extraerse desde células productoras. En una realización, los fragmentos polipeptídicos B7-DC variantes incluyen el dominio extracelular entero de B7-DC. El dominio extracelular de B7-DC incluye aminoácidos desde aproximadamente 20 hasta aproximadamente 221 aminoácidos de B7-DC murino o humano o fragmentos activos del mismo. En otra realización, los fragmentos polipeptídicos B7-DC variantes incluyen los dominios IgC y IgV de B7-DC. En otra realización, los fragmentos polipeptídicos B7-DC variantes incluyen el dominio IgV de B7-DC.

Se considera que la señalización del PD-1 requiere fijación a un ligando PD-1 (típicamente B7-H1) en proximidad estrecha con un antígeno peptídico presentado por el complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) (Freeman Proc. Nati. Acad. Sci. U. S. A 105:10275-10276 (2008)). Por lo tanto, las proteínas, anticuerpos o pequeñas moléculas que previenen coligación del PD-1 y TCR sobre la membrana de células T son antagonistas PD-1 útiles contemplados por esta invención.

Los antagonistas del PD-1 útiles en los métodos y composiciones de la invención incluyen fragmentos de la proteína B7-DC que incorporan el ECD. Alternativamente, los fragmentos de B7-DC incluyen parte del dominio extracelular que comprende el dominio tipo IgV o IgV, preferiblemente aminoácidos 20-221 , más preferiblemente 20-121 , que son suficientes para fijar al receptor del PD-1 para interferir, o prevenir, u de otra manera reducir transducción de señales inhibidoras a través del receptor del PD-1. En una realización preferida el fragmento B7-DC compite con B7-H1 por fijación a los receptores del PD-1.

En una realización, los fragmentos polipeptídicos B7-DC variantes puede contener una región del polipéptido que es importante para fijación a PD-1. Estos fragmentos polipeptídicos pueden ser útiles para competir por fijación a PD-1 y prevenir la fijación de B7-DC nativo a PD-1. Al competir por la fijación a PD-1 , estos fragmentos pueden ser útiles para aumentar una respuesta inmune, puesto que inhibir de B7-H1 y B7-DC con PD-1 inhibe la supresión de respuestas inmunes que de otra manera ocurrirán. Un fragmento polipeptídico de B7-DC murino o humano que podría fijarse competitivamente a PD-1 puede contener, por ejemplo, aminoácidos 101-108 o 110-1 14. La fijación de B7-DC tipo silvestre a PD-1 típicamente es inhibida en al menos 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95%, o más de 95 % en comparación con el nivel de fijación de B7-DC tipo silvestre a PD-1 en ausencia de un fragmento de dicho B7-DC tipo silvestre. Fragmentos B7-DC útiles de ejemplo en los métodos y/o composiciones de la invención incluyen, pero no están limitados en ninguna forma a, los siguientes dominios extracelulares B7-DC: Dominio extracelular de B7-DC humano (ECD): LFTVTVPKEL YIIEHGSNVT LECNFDTGSH VNLGAITASL Q VE DTSPH RERATLLEEQ 60 LPLGKASFHI PQVQVRDEGQ YQCIIIYGVA DYKYLTLKV KASYR INTH ILKVPETDEV 120 ELTCQATGYP LAEVSWP VS VPANTSHSRT PEGLYQV SV LRLKPPPGRN FSCVFWNTHV 180 RELTLASIDL QSQMEPRTHP TW 202 (SEQ ID NO:3) y ECD de B7-DC murino: LFTVTAPKEV YTVDVGSSVS LECDFDRREC TELEGIRASL QKVENDTSLQ SERATLLEEQ 60 LPLG ALFHI PSVQVRDSGQ YRCLVICGAA WDYKYLTVKV KASYMR1DTR ILEVPGTGEV 120 QLTCQARGYP LAEVSWQ VS VPANTSHIRT PEGLYQVTSV LRLKPQPSRN FSCMFW AH 180 ELTSAIIDP LSRMEPKVPR TW 202 (SEQ ID NO:4> ECD de B7-DC de Mono Cinomolgus LFTVTVPKEL YIIEHGSNVT LECNFDTGSH VNLGAITASL QKVENDTSPH RERATLLEEQ 60 LPLGKASFHI PQVQVRDEGQ YQCIIIYGVA WDYKYLTLKV KASYRKINTH ILKVPETDEV 120 ELTCQATGYP LAEVSWPNVS VPANTSHSRT PEGLYQVTSV LRLKPPPGRN FSCVFWNTHV 180 RELTLASIDL QSQMEPRTHP TW 202 (Seq ID NO: 15) Otras numerosas secuencias de primate útiles en los métodos y composiciones de la invención se proporcionan en Onlamoon, Inmunología, Vol. 124, pp. 277-293 (2008).

Un antagonista del PD-1 útil en las composiciones y métodos de la invención también incluye una proteína de fusión (como se describe a continuación) que comprende primera y segunda porciones polipeptídicas, en donde dicha proteína de fusión, o al menos la primera porción polipeptídica de la misma, posee actividad antagonista del PD-1 , especialmente donde dicha proteína de fusión se fija a PD-1 y lo bloquea o se fija a un ligando del PD-1 y lo bloquea. La primera porción polipeptídica de tal proteína de fusión puede comprender, o constar de, cualquiera de los polipéptidos antagonistas del PD- , o fragmentos fijadores del PD-1 de los mismos, de otra manera citados en la presente para utilizar como antagonistas del PD-1 en los métodos de la invención. En una realización preferida de tal proteína de fusión, la primera porción polipeptídica citada es N-terminal a la segunda porción polipeptídica citada. En una realización separada, la primera porción polipeptídica citada es enlazada a la segunda porción polipeptídica citada mediante un oligopéptido además de los aminoácidos que componen la primera y segunda porciones polipéptidas citadas, donde dichos aminoácidos enlazados no disminuyen sustancialmente la actividad antagonista del PD-1 de dicha proteína de fusión.

En una proteína de fusión dimérica preferida, el dímero resulta de la fijación covalente de residuos Cys en las regiones CH de dos de las cadenas Ig pesadas que son los mismos residuos Cys que son enlazados por disulfuro en cadenas pesadas Ig normales dimerizadas.

Un gran número de secuencias polipeptídicas que se utilizan comúnmente como socios de fijación de proteínas de fusión son bien conocidas en el estado de la técnica. Ejemplos de socios de fijación polipeptídica útiles incluyen, pero no están limitados a, proteína verde fluorescente (GFP), glutación S-transferasa (GST), polihistidina, myc, hemaglutinina, Flag™ tag (u octapéptido FLAG) (Kodak, New Haven, CT), proteína de fijación de maltosa E y proteína A.

Aún otra realización proporciona un constructo tetrámero que tiene un sustrato BirA fusionado al dominio extracelular del polipéptido B7-DC variante. Métodos para preparar constructos tetrámeros son conocidos en el estado de la técnica (ver Pertovas, J. Exp. Med., 203:2281 (2006)).

Proteínas de fusión de B7-DC murinas de ejemplo contienen los aminoácidos 20-221 de B7-DC murino fusionados a aminoácidos 237-469 de lgG2a murino (CAA49868). En un ejemplo no limitante, las proteínas de fusión de B7-DC humano contienen los aminoácidos 20-221 de B7-DC humano fusionados a los aminoácidos 245-476 de lgG1 humano (AAA02914). Los péptidos señal para proteínas B7-DC de fusión incluyen el péptido señal endógeno o cualquier otro péptido señal que facilita secreción de las proteínas de fusión a partir de un huésped. En otra realización, el primer polipéptido incluiría solamente el dominio IgV. Otras realizaciones pueden comprender el dominio de bisagra y Fe de un anticuerpo IgC, tal lgG1 , con ninguna de las regiones variables presentes. Otras realizaciones incluyen uso de la región de bisagra y Fe de lgG2 o lgG4, especialmente que tiene un N297Q u otra mutación que reduce la función efectora.

Según los métodos y composiciones de la invención, el polipéptido útil como un antagonista del PD-1 , o la primera porción polipeptídica de una proteína de fusión útil como un antagonista PD-1 , comprende una secuencia aminoácida que tiene al menos 60%, o al menos 65%, o al menos 70%, o al menos 75%, o al menos 80%, o al menos 85%, o al menos 90%, o al menos 95%, o al menos 99% de identidad con los aminoácidos 1-221 de SEQ ID NO: 1 , preferiblemente los aminoácidos 20-221 de SEQ ID NO: 1 , o los aminoácidos 26-221 de SEQ ID NO: 1 , o los aminoácidos 1-202 de SEQ ID NO: 3 o 4, más preferiblemente los aminoácidos 20-121 de SEQ ID NO: 1 o los aminoácidos 1 -102 de SEQ ID NO: 3 o 4.

En una realización, un polipéptido útil como un antagonista del PD-1 , o la primera porción polipeptídica de una proteína de fusión útil como un antagonista del PD-1 , consta de los aminoácidos 1-221 de SEQ ID NO: 1 , o consta de los aminoácidos 20-221 de SEQ ID NO: 1 , o consta de los aminoácidos 26-221 de SEQ ID NO: 1 , o consta de los aminoácidos 1-202 de SEQ ID NO: 3 o 4. En una realización (SEQ ID NO: 2), no comprende aminoácidos 1 -19 de SEQ ID NO: 1.

En otros ejemplos específicos, un polipéptido antagonista del PD-1 , o primera porción polipeptídica de una proteína de fusión antagonista del PD-1 , comprende la secuencia aminoácida 20-121 de SEQ ID NO: 1 , preferiblemente donde comprende la secuencia aminoácida WDYKY en residuos 1 10-114 de la misma, o donde comprende los aminoácidos 1-102 de SEQ ID NO: 3, preferiblemente donde comprende la secuencia aminoácida WDYKY en los residuos 91-95 de la misma.

En una realización preferida, tales identidades porcentuales se logran mediante una dependencia sobre sustituciones aminoácidas conservadoras como se definió en otra parte en la presente.

En tal realización, el polipéptido antagonista del PD-1 , o primera porción polipéptida de una proteína de fusión antagonista del PD-1 , no comprende los aminoácidos 1-19 de SEQ ID NO: 1 , o no comprende ninguna porción un dominio de transmembrana, especialmente no la totalidad de tal dominio, o no comprende ninguna porción del dominio intracelular (o soluble), especialmente no la totalidad de tal dominio, de un ligando del PD-1 u otra proteína antagonista del PD-1. En una realización preferida, tal antagonista, o primera porción polipeptidica, comprende solamente el dominio extracelular (ECD) de SEQ ID NO:1 y por lo tanto está compuesta solamente de una porción soluble del polipéptido de dicha secuencia, o un fragmento de dicha porción soluble.

En otra de tales realizaciones, el polipéptido antagonista del PD-1 , o primera porción polipeptidica de una proteína de fusión antagonista del PD-1, comprende el dominio IgV, o dominio tipo IgV, o fragmento de fijación del PD-1 del mismo, de un ligando del PD-1 o consta del dominio IgV, o dominio tipo IgV, o fragmento fijador del PD-1 del mismo, de un ligando del PD-1. En ejemplos específicos, tal ligando del PD-1 es un B7-DC tipo silvestre o molécula de B7-H1 , preferiblemente B7-DC tipo silvestre o molécula de B7-H1 de ratón o primate, preferiblemente humano.

En otra de tales realizaciones, el polipéptido antagonista del PD-1 , o primera porción polipeptidica de una proteína de fusión antagonista del PD-1 , un fragmento de fijación del PD-1 del dominio IgV, o dominio tipo IgV, de un ligando del PD-1 , especialmente donde el dominio IgV, o dominio tipo IgV, consta de los aminoácidos 20-121 de la SEQ ID NO: 1 o aminoácidos 1 - 102 de la SEQ ID NO: 3.

Un antagonista del PD-1 de la invención también incluye un fragmento fijador del PD-1 fijación de los aminoácidos 20-121 de SEQ ID NO: 1 (longitud completa humana), o aminoácidos 1-102 de SEQ ID NO: 3 (dominio extracelular o ECD).

En realizaciones específicas del mismo, el polipéptido o fragmento fijador del PD-1 también incorpora los aminoácidos WDYKY en los residuos 110-114 de SEQ ID NO: 1 o WDYKY en los residuos 91-95 de SEQ ID NO: 3. A manera de ejemplos no limitantes, tal fragmento fijador del PD-1 comprende al menos 10, o al menos 20, o al menos 30, o al menos 40, o al menos 50, o al menos 60, o al menos 70, o al menos 75, o al menos 80, o al menos 85, o al menos 90, o al menos 95, o al menos 100 aminoácidos adyacentes de la secuencia de aminoácidos 20-121 de SEQ ID NO: 1 , en donde una realización preferida de cada fragmento fijador del PD-1 comprendería como un sub-fragmento los aminoácidos WDYKY encontrados en los residuos 110-114 de SEQ ID NO: 1 o WDYKY en los residuos 91-95 de SEQ ID NO: 3.

Otros polipéptidos preferidos y fragmentos fijadores del PD-1 específicamente contemplados por la invención incluyen la secuencia polipeptídica de aminoácidos 20-121 de SEQ ID NO: 1 (longitud completa humana) y fragmentos fijadores del PD-1 del mismo, en donde, en tal polipéptido o fragmento fijador del PD-1 , está presente una cisteína en los residuos 42 y/o 102, con una cisteína en ambas posiciones siendo preferida, y/o en donde una fenilalanina está presente en el residuo 21 , y/o en donde un ácido glutámico está presente en el residuo 28, y/o en donde una treonina, y/o en donde una glutamina está presente en el residuo 60, y/o en donde un ácido glutámico está presente en el residuo 101 , y/o en donde isoleucina está presente en el residuo 103, y/o en donde una isoleucina está presente en el residuo 105, y/o en donde una glicina está presente en el residuo 107, y/o en donde valina está presente en el residuo 108, y/o en donde un triptófano está presente en el residuo 1 10, y/o en donde ácido aspártico está presente en el residuo 1 11 , y/o en donde una tirosina está presente en el residuo 1 12, y/o en donde una lisina está presente en el residuo 113, y/o en donde una tirosina está presente en residuo 1 14, siempre y cuando, en el caso de fragmentos fijadores del PD-1 , dicho fragmento es suficientemente grande para incluir tales posiciones aminoácidas.

Polipéptidos adicionales preferidos y fragmentos fijadores del PD-1 específicamente contemplados por la invención incluyen la secuencia polipeptidica de aminoácidos 1-102 de SEQ ID NO: 3 (ECD humano) o SEQ ID NO: 4 (ECD murino) y fragmentos fijadores de los mismos, en donde, en tal polipéptido o fragmento fijador del PD-1 , una cisteína está presente en los residuos 23 y/o 83, con una cisteína en ambas posiciones preferida, y/o en donde una fenilalanina está presente en el residuo 2, y/o en donde un ácido glutámico está presente en el residuo 9, y/o en donde una treonina o arginina está presente en el residuo 37, con treonina preferida, y/o en donde una glutamina está presente en el residuo 41 , y/o en donde arginina está presente en el residuo 82, y/o en donde una leucina está presente en el residuo 84, y/o en donde una isoleucina está presente en el residuo 86, y/o en donde una glicina está presente en el residuo 88, y/o en donde una alanina está presente en el residuo 89, y/o en donde un triptófano está presente en el residuo 91 , y/o en donde un ácido aspártico está presente en el residuo 92, y/o en donde una tirosina está presente en el residuo 93, y/o en donde una lisina está presente en el residuo 94, y/o en donde una tirosina está presente en el residuo 95, siempre y cuando, en el caso de fragmentos fijadores del PD-1 , dicho fragmento sea suficientemente grande para incluir tales posiciones aminoácidas.

En realizaciones adicionales, cualquiera de los anteriores polipéptidos también puede incorporar porciones o fragmentos, por ejemplo, desde 1 a 10 aminoácidos adyacentes, obtenidos a partir de los dominios de señal, transmembrana o C-terminal de los polipéptidos B7-DC o B7-H1 , tal como aquel de ratón o primate, preferiblemente humano.

Tales polipéptidos y/o fragmentos fijadores del PD-1 también pueden estar presentes en cualquiera de las proteínas de fusión de la invención, por ejemplo, donde tal polipéptido o fragmento fijador del PD-1 representa el "primer polipéptido" de tal proteína de fusión.

En ejemplos específicos, la molécula, combinada con un agente potenciador para utilizar en un régimen de tratamiento de la invención, comprende un fragmento fijador del PD-1 de los aminoácidos 20-221 de SEQ ID NO: 1. En tal realización, el fragmento es a partir de los aminoácidos 20- 121 de SEQ ID NO: 1 , preferiblemente donde el fragmento contiene los aminoácidos 1 10-114 de SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, más de un fragmento está presente (como se describió en otra parte en la presente) y la molécula comprende al menos 2, 3, 4, 5 o más fragmentos de una proteína B7-DC, especialmente donde el fragmento es parte, o contiene parte de los aminoácidos 20-221 de SEQ ID NO: 1. En una realización preferida del mismo, al menos dicho fragmento es a partir de los aminoácidos 20 - 121 de SEQ ID NO: 1 , más preferiblemente en donde al menos dicho fragmento incluye los aminoácidos 1 10-1 14 de SEQ ID NO: 1 (es decir, la secuencia WDYKY (SEQ ID NO: 14)). En realizaciones preferidas, el fragmento fijador del PD-1 tiene al menos 10, o al menos 25, o al menos 50, o al menos 75, o al menos 100 aminoácidos adyacentes de longitud.

El péptido señal humano endógeno tiene la siguiente secuencia IFLLLMLSL ELQLHQIAA (SEQ ID NO: 5) y representa los primeros 19 aminoácidos de SEQ ID NO: 1. En ciertas realizaciones, fragmentos polipeptídicos de B7-DC pueden incluir 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 aminoácidos adyacentes del péptido señal endógeno o heterólogo (el cual puede utilizarse para producir un polipéptido B7-DC recombinante mediante expresión en y secreción a partir de una célula transformada). También se apreciara que un polipéptido B7-DC útil puede incluir 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 aminoácidos adyacentes del dominio de transmembrana de B7-DC, y/o 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 aminoácidos adyacentes del dominio citoplásmico, o combinaciones de los mismos siempre y cuando el fragmento B7-DC retenga la capacidad de antagonizar el receptor del PD-1.

Los fenotipos de ratones PD-1-/- proporcionan evidencia directa para PD-1 como un regulador negativo de respuestas inmunes in vivo. En la ausencia de PD-1 , los ratones en el ambiente C57BL/6 lentamente desarrollan una glomerulonefritis tipo lupus y artritis progresiva (Nishimura, Immunity, 11 : 141-151 (1999)). Los ratones PD-1-/- en el ambiente BALB/c rápidamente desarrollan una cardiomiopatía dilatada autoinmune fatal (Nishimura, Science. 291 :319-322 (2001 )). Sin embargo, evidencia substancial indica que B7-DC puede funcionar para co-estimular, respuestas de células T activas. En presencia de señales TCR subóptimas, B7-DC produce proliferación y producción aumentada de citoquinas in vitro (Tseng, J. Exp. Med. 193:839-846 (2001 )). Por otra parte, estudios in vitro indican un papel regulador negativo para B7-DC en respuestas de células T. Estos datos aparentemente contradictorios se interpretan mejor mediante expresión de receptores adicionales para B7-DC en células T diferentes de PD-1.

Por lo tanto, proteínas B7-DC, variantes, fragmentos y fusiones de las mismas, pueden tener la ventaja de aumentar directamente respuestas de células T al fijarse a un receptor no conocido que activa la célula T, además de aumentar las respuestas de células T al evitar la transducción de señales inhibitorias mediada por PD-1. 2. Polipéptidos B7-H1 En otra realización, el compuesto para utilizar en combinación con un agente potenciador en el régimen de tratamiento de la invención, es, o comprende, un fragmento de un B7-H1 mamífero, preferiblemente a partir de ratón o primate, preferiblemente humano, en donde dicho fragmento se fija a PD-1 y bloquea el mismo pero no resulta en transducción de señales inhibitorias a través de PD-1 y dicho fragmento tiene al menos 10, o al menos 20, o al menos 30, o al menos 40, o al menos 50, o al menos 60, o al menos 70, o al menos 80, o al menos 90, o al menos 100 aminoácidos adyacentes de longitud. En otras realizaciones, el fragmento puede ser de longitud variable siempre y cuando tenga la función de fijación a PD-1 pero no produzca transducción de señales inhibitorias que resulte en proliferación reducida de células T. Tales fragmentos B7-H1 también encuentran uso como parte de la primera porción polipeptídica de proteínas de fusión de la invención.

Secuencias B7- Polipéptido B7-H1 humano (SEQ ID NO. 16): MRIFAVFIFM TYWHLLNAFT VTVPKDLYW EYGSNMTIEC KFPVEKQLDL AALIVYWEME 60 DKNIIQFVHG EEDLKVQHSS YRQRARLLKD QLSLGNAALQ ITDV LQDAG VYRCMISYGG 120 ADYKRITVKV NAPY KINQR ILWDPVTSE HELTCQAEGY PKAEVIWTSS DHQVLSGKTT 180 TT SKREEKL FNVTSTLRIN TTT EIFYCT FRRLDPEE H TAELVIPELP LAHPPNERTH 240 LVILGAILLC LGVALTFIFR LR GR MDVK KCGIQDTNSK KQSDTHLEET 290 B7-H1 Murino (SEQ ID NO: 17) RIFAGIIFT ACCHLLRAFT ITAPKDLYW EYGSNVTMEC RFPVERELDL LALWYWEKE 60 DEQVIQFVAG EEDLKPQHSN FRGRASLPKD QLLKGNAALQ ITDVKLQDAG VYCCIISYGG 120 ADYKRIT CV NAPYRKINQR ISVDPATSEH ELICQAEGYP EAEVIWT SD HQPVSGKRSV 280 TTSRTEG LL NVTSSLRVNA TA DVFYCTF WRSQPGQNHT AELIIPELPA THPPQNRTHW 240 VLLGSILLFL IWSTVLLFL R QVRMLDVE CGVEDTSSK NR DTQFEET 290 PD-L1 Macaca mulata (SEQ ID NO: 18) MRIFAVFIFT IYWHLLNAFT VTVP DLYW EYGSNMTIEC RFPVEKQLGL 60 TSLIVYWE E DKNIIQFVHG EEDLKVQHSN YRQRAQLLKD QLSLGNAALR 120 ITDVKLQDAG VYRCMISYGG ADYKRITVKV NAPYNKINQR ILWDPVTSE 180 HELTCQAEGY PKAEVIWTSS DHQVLSGKTT TTNSKREEKL L VTSTLRIN 240 TTANEIFYCI FRRLGPEENH TAELVIPELP LALPPNERTH LVILGAIFLL 300 LGVALTFIFY LRKGR MDMK KSGIRVTNSK KQRDTQLEET 340 Proteínas B7-H1-lg son descritas en WO/2001/014557 (pub. 1 Marzo de 2001) y en WO/2002/079499 (pub. 10 Octubre de 2002). 3. PD-1 y Otros Polipéptidos Otros polipéptidos útiles de la invención incluyen aquellos que se fijan a los ligandos del receptor del PD-1. Estos incluyen la proteína de receptores del PD-1 , o fragmentos solubles de la misma, los cuales pueden fijarse a los ligandos del PD-1 , tales como B7-H1 o B7-DC, y prevenir fijación al receptor del PD-1 endógeno, evitando así la transduccion de señales inhibitorias. También se ha mostrado que B7-H1 fija la proteína B7.1 (Butte, Immunity, Vol. 27, pp. 111-122, (2007)). Tales fragmentos también incluyen la parte ECD soluble de la proteína PD-1 que incluye mutaciones, tal como la mutación A99L, que aumenta la fijación a los ligandos naturales (Molnar, La estructura de cristal del complejo entre (PD-1) y su ligando PD-L2, PNAS, Vol. 105, pp. 10483-10488 (29 Julio de 2008)). B7-1 o fragmentos solubles del mismo, los cuales pueden fijarse al ligando B7-H1 y prevenir fijación al receptor del PD-1 endógeno, evitando así transducción de señales inhibitorias, también son útiles.

Los polipéptidos del PD-1 útiles en los métodos de la invención son como siguen: PD-1 Humano (SEQ ID NO: 19) MQIPQAPWPV VWAVLQLGWR PGWFLDSPDR PW PPTFFPA LLWTEGDNA TFTCSFSNTS 60 ESFVLNWYRM SPSNQTDKLA AFPEDRSQPG QDCRFRVTQL PNGRDFHMSV VRARRNDSGT 120 YLCGAISLAP KAQIKESLRA ELRVTERRAE VPTAHPSPSP RPAGQFQTLV VGWGGLLGS 180 LVLLVWVLAV ICSRAARGTI GARRTGQPLK EDPSAVPVFS VDYGELDFQW RE TPEPPVP 240 CVPEQTEYAT IVFPSGMGTS SPARRGSADG PRSAQPLRPE DGHCSWPL 288 PD-1 de Mono Cinomolgus (SEQ ID NO: 20) MQIPQAPWPV VWAVLQLGWR PGWFLESPDR PW APTFSPA LLLVTEGDNA TFTCSFSNAS 60 ESFVLNWYRM SPSNQTDKLA AFPEDRSQPG QDCRFRVTRL PNGRDFHMSV VRARRNDSGT 120 YLCGAISLAP KAQIKESLRA ELRVTERRAE VPTAHPSPSP RPAGQFQTLV VGWGGLLGS 180 LVLLVWVLAV ICSRAARGTI GARRTGQPLK EDPSAVPVFS VDYGELDFQW REKTPEPPVP 240 CVPEQTEYAT IVFPSGMGTS SPARRGSADG PRSAQPLRPE DGHCSWPL 288 Según la invención, puesto que B7-1 y fragmentos del mismo también pueden fijarse a B7-H1 y enviar transducción inhibitoria a células T a través de B7-H1 , bloquear esta interacción también puede reducir la transducción de señales inhibitorias que ocurre a través B7-H1. Los compuestos para utilizar en la invención incluyen aquellas moléculas que bloquean este tipo de interacción. Tales moléculas han sido divulgadas en Butte (2007), supra, e incluyen anticuerpos anti-B7-H1 con especificidad dual que bloquean bien sea la interacción B7-H1 : B7-1 y B7-H1 :PD-1 así como también anticuerpos que exhiben mono-especificidad que bloquean la interacción PD-L1 :B7-1. Compuestos que bloquean esta interacción al bloquear B7-1 también son útiles, e incluyen anticuerpos anti-B7-1. 4. Polipéptidos variantes Polipéptidos útiles en la invención, como se describen, incluyen aquellos que son mutados para contener una o más sustituciones, supresiones, o inserciones aminoácidas. Métodos para mutagénesis son conocidos en el estado de la técnica. Los polipéptidos mutados o variantes inhiben o reducen la transducción de señales inhibitorias a través de receptores del PD-1 mediante fijación a ligandos del PD-1. Alternativamente, las variantes (ej., polipéptidos B7-DC) pueden fijarse al receptor del PD-1 e inhibir, reducir, o bloquear transducción de señales inhibitorias a través del receptor del PD-1. Los polipéptidos variantes pueden ser de cualquier especie de origen. En una realización, el polipéptido variante es a partir de una especie de mamífero. En una realización preferida, el polipéptido variante es de origen murino o primate, preferiblemente humano.

En una realización el polipéptido variante es un polipéptido B7-DC que tiene la misma afinidad de fijación a PD-1 que un B7-DC tipo silvestre o no variante pero no tiene o tiene menos del 10% de capacidad para disparar transducción de señales inhibitorias a través del receptor del PD-1 relativo a un polipéptido B7-DC no mutado. En otras realizaciones, el polipéptido B7-DC variante tiene 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, o 60% más de afinidad de fijación con PD-1 que B7-DC de tipo silvestre sin disparar transducción de señales inhibitorias del PD-1.

Un polipéptido variante (ej., un polipéptido variante B7-DC) incluye aquellos que tienen cualquier combinación de sustituciones, supresiones o inserciones aminoácidas siempre y cuando la actividad antagonizante del PD-1 no sea sustancialmente reducida versus el tipo silvestre. Sin embargo, donde exista tal reducción, esta debe ser no más de la mitad de aquella del tipo silvestre de manera que dicha variante tiene al menos 50% de la actividad antagonista del PD-1 de la proteína del tipo silvestre, preferiblemente al menos 60%, más preferiblemente al menos 80%, lo mas preferiblemente al menos 90% o 95%, con al menos 100% especialmente preferido. Aumentos en tal actividad que resultan a partir de dicha variante son aún más deseables. En una realización, los polipéptidos variantes de B7-DC aislados tienen alteraciones aminoácidas tal que su secuencia aminoácida comparte al menos 60, 70, 80, 85, 90, 95, 97, 98, 99, 99.5 o 100% de identidad con una secuencia aminoácida de un polipéptido B7-DC de tipo silvestre, especialmente aquel a partir de un mamífero, preferiblemente polipéptido B7-DC tipo silvestre murino o tipo silvestre primate, preferiblemente humano.

La identidad de secuencia polipeptídica puede calcularse utilizando la definición de identidad porcentual proporcionada en la presente anteriormente.

Las sustituciones aminoácidas en polipéptidos pueden ser "conservadoras" o "no conservadoras".

Las moléculas de la familia B7, incluyendo B7-DC, son expresadas en la superficie celular con un dominio IgC constante próximo de membrana y un dominio IgV distal de membrana. Los receptores para estos ligandos comparten un dominio tipo IgV extracelular común. Las interacciones de pares receptor/ligando son mediadas predominantemente a través de residuos en los dominios IgV de los ligandos y receptores. En general, los dominios IgV se describen como teniendo dos laminas donde cada una contiene una capa de hebras ß. Estas hebras ß son citadas como A', B, C, C\ C", D, E, F y G. En una realización los polipéptidos variantes de B7-DC contienen alteraciones aminoácidas (es decir, sustituciones, supresiones o inserciones) dentro de una o más de estas hebras ß en cualquier combinación posible. En otra realización, las variantes B7-DC contienen una o más alteraciones aminoácidas (es decir, sustituciones, supresiones o inserciones) dentro de las hebras ß ?', C, C\ C", D, E, F o G. En una realización, variantes B7-DC contienen una o más alteraciones aminoácidas en la hebra ß G.

Con respecto a B7-DC murino o primate, preferiblemente humano, un polipéptido B7-DC variante puede contener, sin limitación, sustituciones, supresiones o inserciones en posiciones que no reducen substancialmente la fijación a PD-1 relativo a B7-DC no mutado.

Sin embargo se entiende, que sustituciones en las posiciones aminoácidas citadas pueden hacerse utilizando cualquier aminoácido o análogo de aminoácido. Por ejemplo, las sustituciones en las posiciones citadas pueden hacerse con cualquiera de los aminoácidos naturales (ej.,, alanina, ácido aspártico, asparagina, arginina, cisteína, glicina, ácido glutámico, glutamina, histidina, leucina, valina, isoleucina, lisina, metionina, prolina, treonina, serina, fenilalanina, triptófano, o tirosina).

Mientras las sustituciones descritas en la presente son con respecto B7-DC murino y primate, especialmente humano, se nota que alguien con experiencia común en el estado de la técnica podría fácilmente hacer alteraciones equivalentes en los polipéptidos correspondientes a partir de otras especies (ej.,, rata, hámster, conejillo de Indias, gerbo, conejo, perro, gato, caballo, cerdo, oveja, vaca o primate no humano).

Fragmentos preferidos incluyen todo o parte del dominio extracelular de B7-DC efectivo para fijarse a PD-1.

En una realización, fragmentos de polipéptidos B7-DC variantes son aquellos que retienen la capacidad para fijarse a PD-1 sin disparar transducción de señales inhibitorias del PD-1. Una realización proporciona un polipéptido B7-DC variante que es un fragmento de B7-DC de longitud completa y típicamente tiene al menos el 20 por ciento, 30 por ciento, 40 por ciento, 50 por ciento, 60 por ciento, 70 por ciento, 80 por ciento, 90 por ciento, 95 por ciento, 98 por ciento, 99 por ciento, 100 por ciento, o aún más del 100 por ciento de la actividad antagonista del polipéptido B7-DC variante de longitud completa.

Fragmentos útiles de polipéptidos B7-DC variantes incluyen fragmentos solubles. Fragmentos B7-DC solubles son fragmentos de B7-DC que pueden desprenderse, secretarse o de otra manera extraerse a partir de las células productoras. En una realización, fragmentos polipeptídicos B7-DC variantes incluyen el dominio extracelular entero de B7-DC. El dominio extracelular de B7-DC incluye aminoácidos desde 20 a 221 aminoácidos aproximadamente de B7-DC murino o primate, preferiblemente humano. En otra realización, fragmentos polipeptídicos B7-DC variantes incluyen los dominios IgC y IgV de B7-DC. En otra realización, los fragmentos polipeptídicos B7-DC variantes incluyen el dominio IgV de B7-DC.

En una realización, los fragmentos polipeptídicos B7-DC variantes contienen una región del polipéptido que es importante para la afinidad de fijación para PD-1. Estos fragmentos polipeptídicos son útiles para fijar y bloquear el receptor del PD-1 para evitar que ligandos nativos se fijen al receptor del PD-1 , aumentando así una respuesta inmune. Inhibir interacciones de B7-H1 nativo o B7-DC con PD-1 inhibe la supresión de respuestas inmune que de otra manera ocurrirían. Un fragmento polipeptídico B7-DC murino o primate, preferiblemente humano, que se fija a PD-1 contiene, a manera de ejemplo no limitante, aminoácidos 101-105, o 1 1 1-1 13. La fijación de B7-H1 al receptor del PD-1 típicamente es inhibida en al menos el 50 por ciento, o al menos 60 por ciento, o al menos 70 por ciento, o al menos 75 por ciento, o al menos 80 por ciento, o al menos 90 por ciento, o al menos 95 por ciento, o más en comparación con él nivel de fijación de B7-H1 a PD-1 en ausencia del fragmento.

El mutante del PD-1 humano A99L fija B7-DC y B7-H1 con mayor afinidad que PD-1 humano no mutado (Lazar Molnar PNAS 105 p. 10483-10488 (2008)). En una realización de la invención, el compuesto que actúa para reducir la transducción de señales inhibitorias es una proteína soluble, tal como el ECD del PD-1 que incorpora esta mutación. 5. Polipéptidos Modificados Polipéptidos útiles en la invención, como se describió, incluyendo variantes, homólogos y fragmentos de los mismos, pueden ser modificados mediante fracciones químicas encontradas asociadas con polipéptidos en el ambiente celular normal, por ejemplo, mediante fosforilación, metilación, amidación, sulfatación, acilación, glicosilación, sumoilación y ubiquitilación del polipéptido.

Tales polipéptidos también pueden modificarse mediante fracciones químicas que no son normalmente parte de polipéptidos en un ambiente celular. Tales modificaciones pueden introducirse en la molécula al reaccionar residuos aminoácidos dirigidos del polipéptido con un agente derivatizante orgánico que es capaz de reaccionar con cadenas laterales seleccionadas o residuos terminales. Otra modificación útil es la ciclación de la proteína. Tales modificaciones también incluyen introducción de un rótulo capaz de proporcionar una señal detectable, bien sea directamente o indirectamente, incluyendo, pero sin limitar a, radioisótopos y compuestos fluorescentes.

Ejemplos de derivados químicos de los polipéptidos incluyen lisinilo y residuos terminales amino derivatizados con anhídridos de ácido succínico u otros anhídridos de ácido carboxílico. La derivatización con un anhídrido carboxílico cíclico tiene el efecto de invertir la carga de los residuos de lisinilo. Otros reactivos apropiados para derivatizar residuos que contienen amino incluyen imidoésteres tales como picolinimidato de metilo; fosfato de piridoxal; piridoxal; cloroborohidruro; ácido trinitrobenzensulfónico; O-metilisourea; 2,4 pentanodiona; y reacción catalizada por transaminasa con glioxilato. Grupos secundarios carboxilo, aspartilo o glutamilo, pueden ser selectivamente modificados mediante reacción con carbodiimidas (R— N=C=N-R') tales como 1-ciclohexil-3-(2-morfolinil-(4-etil)carbodiimida o 1-etil-3-(4-azonia-4,4-dimetilpentil)-carbodiimida. Además, residuos de aspartilo y glutamilo pueden convertirse en residuos de asparaginilo y glutaminilo mediante reacción con amoniaco. Polipéptidos de la invención también pueden incluir uno o más aminoácidos D que son sustituidos por uno o más aminoácidos L.

En otras realizaciones, el agente potenciador, tal como CTX, puede ser parte del compuesto que reduce la transducción de señales inhibitorias, tal como donde el agente potenciador es químicamente enlazado a un antagonista del PD-1 de la invención. 6. Proteínas de fusión También se proporcionan polipéptidos de fusión que tienen un primer socio de fusión, o porción polipeptídica, que comprenden toda o una parte de una proteína antagonista del PD-1 , un polipéptído de B7-DC por ejemplo, (incluyendo variantes, homólogos y fragmentos del mismo) fusionados (i) directamente a un segundo polipéptido o, (ii) opcionalmente, fusionados a una secuencia peptídica enlazadora que se fusiona al segundo polipéptido. La presencia del socio de fusión puede alterar, por ejemplo, la solubilidad, afinidad y/o valencia del polipéptido antagonista del PD-1. Las proteínas de fusión divulgadas incluyen cualquier combinación de alteración aminoácida (es decir, sustitución, supresión o inserción), fragmento, y/o modificación de un polipéptido antagonista del PD-1 como se describe anteriormente. En una realización, proteínas de fusión de B7-DC incluyen el dominio extracelular de una proteína B7-DC como el primer socio de fijación. En otra realización, tales las proteínas de fusión de B7-DC incluyen el dominio IgV y IgC de una proteína B7-DC como el primer socio de fijación. En otra realización, las proteínas de fusión B7-DC variantes incluyen el dominio IgV de una proteína B7-DC como el primer socio de fijación.

Primeros socios de fusión representativos incluyen polipéptido de B7-DC primate, preferiblemente humano, o murino, fragmentos del mismo, y variantes del mismo divulgados en la presente anteriormente. Fragmentos preferidos incluyen el dominio extracelular de B7-DC. Como se citó, el dominio extracelular puede incluir 1-10 aminoácidos adyacentes de un péptido de señal, dominio de transmembrana de B7-DC, o ambos.

En una realización, las composiciones y/o productos y/o métodos de la invención utilizan antagonista de receptor del PD-1 , especialmente polipéptidos, incluyendo variantes, homólogos y fragmentos de los mismos, que son acoplados a otros polipéptidos para formar proteínas de fusión que antagonizan el receptor del PD-1 al fijar un ligando del PD-1 , tal como B7-H1 , inhibiendo así el ligando para que no interactúe con PD-1. En otra realización, los polipéptidos antagonistas de receptores del PD-1 , o variantes de los mismos, son acoplados a otros polipéptidos para formar proteínas de fusión que antagonizan el receptor del PD-1 al fijar y bloquear el receptor del PD-1 e inhibir o reducir transducción de señales inhibitorias a través del PD-1.

El segundo socio fijador polipeptídico, o segunda porción polipeptídica, puede ser N-terminal o C-terminal con relación al polipéptido antagonista del PD-1. En una realización preferida, el segundo polipéptido es C-terminal al polipéptido antagonista del PD-1.

En una realización preferida, la proteína de fusión contemplada para utilizar en los métodos y composiciones y/o productos de la invención comprende al menos una porción de un anticuerpo. Con la llegada de métodos de biología molecular y tecnología recombinante, ahora es posible producir moléculas de anticuerpos mediante medios recombinantes y así generar secuencias génicas que codifican secuencias aminoácidas especificas encontradas en la estructura polipeptídica de los anticuerpos.

Tales anticuerpos pueden producirse mediante bien sea clonación de las secuencias génicas que codifican las cadenas polipeptídicas de dichos anticuerpos o mediante síntesis directa de dichas cadenas polipeptídicas, con ensamble in vitro de las cadenas sintetizadas para formar estructuras tetrámeras activas (H2L2) con afinidad para epítopos específicos y determinantes antigénicos. Esto ha permitido la producción fácil de anticuerpos que tienen secuencias características de anticuerpos neutralizantes a partir de diferentes especies y fuentes.

Sin importar la fuente de los anticuerpos, o cómo están recombinantemente construidos, o como están sintetizados, in vitro o in vivo, utilizando animales transgénicos, tales como vacas, cabras y ovejas, utilizando grandes cultivos celulares de tamaño comercial o de laboratorio, en bioreactores o mediante síntesis química directa empleando organismos no vivos en cualquier etapa del proceso, todos los anticuerpos tienen una estructura tridimensional general similar. Esta estructura a menudo es dada como H2L2 y se refiere al hecho que anticuerpos comúnmente comprenden 2 cadenas aminoácidas livianas (L) y 2 cadenas aminoácidas pesadas (H). Ambas cadenas tienen regiones capaces de interactuar con un blanco antigénico estructuralmente complementario. Las regiones que interactúan con el blanco son referidas como regiones "variables" o regiones "V" y son caracterizadas por diferencias en la secuencia aminoácidas desde anticuerpos de diferente especificidad antigénica.

En realizaciones preferidas, los polipéptidos antagonistas de receptores del PD-1 , incluyendo fragmentos, mutantes y otras variantes, tienen un primer socio de fusión que tiene toda o una parte de una proteína B7-DC o variante de la misma fusionada (i) directamente a un segundo polipéptido o, (ii) opcionalmente, fusionada a una secuencia peptídica enlazadora que es fusionada al segundo polipéptido. La presencia del socio de fusión puede alterar la solubilidad, afinidad y/o valencia del polipéptido de B7-DC. En realizaciones más preferidas, los polipéptidos de B7-DC son fusionados a uno o más dominios de una región constante de cadena pesada Ig, más preferiblemente una secuencia aminoácida que corresponde a las regiones de bisagra, CH2 y CH3 de una cadena Cy2a de inmunoglobulina humana a las regiones de bisagra, CH2 y CH3 de una cadena Cy2a de inmunoglobulina murina. En una realización preferida, la región constante preferiblemente incluye una mutación (por ejemplo N297Q) para eliminar o reducir fijación de receptores Fe.

Las regiones de bisagra, CH2 y CH3 de una cadena Cylde inmunoglobulina humana tiene la siguiente secuencia aminoácida: EPKSCDKTHT CPPCPAPELL GGPSVFLFPP PKDTLMISR TPEVTCWVD VSHEDPEV F 60 NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ Y STYRWSV LTVLHQDWLN GKEYKCKVSN KALPAPIEKT 120 ISKAKGQPRE PQVYTLPPSR DELTKNQVSL TCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP 180 PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS RWQQGNVFSC SVMHEALH H YTQKSLSLSP GK 232 (SEQ ID NO:6).

Las regiones de bisagra, CH2 y CH3 de una cadena Cy2a de inmunoglobulina de murina tiene la siguiente secuencia aminoácida: EPRGPTIKPC PPCKCPAPNL LGGPSVFIFP PKIKDVLMIS LSPIVTCWV DVSEDDPDVQ 60 ISWFVNNVEV HTAQTQTHRE DY STLRWS ALPIQHQDWM SGKEFKCKV N DLPAPIER 120 TISKPKGSVR APQVYVLPPP EEEMTK QVT LTCMVTDFMP EDIYVEWT GKTEL YKNT 180 EPVLDSDGSY FMYS LRVEK VERNSYS CSWHEGLHN HHTT SFSRT PGK 233 (SEQ ID NO:7) Las proteínas de fusión de B7-DC murino de ejemplo contienen aminoácidos 20-221 de B7-DC murino fusionados a aminoácidos 237-469 de lgG2a murino (CAA49868). Las proteínas de fusión de B7-DC humano pueden contener los aminoácidos 20-221 de B7-DC humano fusionados a los aminoácidos 245-476 de lgG1 humano (AAA02914). Los péptidos señal para proteínas de fusión B7-DC pueden ser los péptidos señal endógenos o cualquier otro péptido señal que facilite la secreción del proteína de fusión desde un huésped.

Una proteína de de fusión B7-DC-lg murina representativa es codificada mediante la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO:8.

Se apreciará que las secuencias de ácidos nucleicos divulgadas pueden ser optimizadas con codones para aumentar los niveles de expresión para sintetizar las proteínas de fusión útiles en los métodos y composiciones dLa presente invención. Métodos para optimización por codones son conocidos en el estado de la técnica.

La proteína de fusión B7-DC-lg murina codificada mediante la SEQ ID NO:8 tiene la siquiente secuencia aminoácida: MLLLLPIL L SLQLHPVAAL FTVTAP EVY TVDVGSSVSL ECDFDRRECT ELEGIRASLO 60 KVENDTSLQS ERATLLEEQL PLGKALFHIP SVQVRDSGQY RCLVICGAAW DYKYLTVKVK 120 ASYMRIDTRI LEVPGTGEVQ LTCQARGYPL AEVSWQNVSV PA TSHIRTP EGLYQVTSVL 180 RLKPQPSRNF SCMFW AHMK ELTSAIIDPL SRMEPKVPRT WEPRGPTIKP CPPCKCPAPN 240 LLGGPSVFIF PPKIKDVLMI SLSPIVTCW VDVSEDDPDV QISWFVNNVE VHTAQTQTHR 300 EDYNSTLRW SALPIQHQDW MSGKEFKC V NNKDLPAPIE RTIS PKGSV RAPQVYVLPP 360 PEEEMTK QV TLTCMVTDFM PEDIYVEWTN NGKTELNY TEPVLDSDGS YF YSKL E 420 KK WVERNSY SCSWHEGLH NHHTTKSFSR TPGK 454 (SEQ ID NO: 9) La SEQ ID NO: 10 proporciona la secuencia aminoácida para proteína de fusión B7-DC-lg murina sin la secuencia señal.

LFTVTAPKEV YTVDVGSSVS LECDFDRREC TELEGIRASL QKVENDTSLQ SERATLLEEQ 60 LPLGKALFHI PSVQVRDSGQ YRCLVICGAA WDYKYLTVKV KASYMRIDTR ILEVPGTGEV 120 QLTCQARGYP LAEVSWQNVS VPANTSHIRT PEGLYQVTSV LRLKPQPSRN FSCMFWNAHM 180 KELTSAI IDP LSRMEPKVPR TWEPRGPTIK PCPPCKCPAP NLLGGPSVFI FPPKIKDVLM 240 ISLSPIVTCV WDVSEDDPD VQISWFVNNV EVHTAQTQTH REDYNSTLRV VSALPIQHQD 300 WMSGKEFKCK VNNKDLPAPI ERTISKPKGS VRAPQVYVLP PPEEEMTKKQ VTLTCMVTDF 360 MPEDIYVEWT NNGKTELNYK NTEPVLDSDG SYFMYSKLRV EKKNWVERNS YSCSWHEGL 420 HNHHTTKSFS RTPGK 435 (SEQ ID NO: 10) En una realización B7-DC-lg humana es codificada por la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO:11 , que codifica la secuencia aminoácida para B7-DC-lg humana: IFLLLMLSL ELQLHQ1AAL FTVTVPKELY IIEHGSNVTL ECNFDTGSHV NLGAITASLQ 60 KVENDTSPHR ERATLLEEQL PLGKASFHI QVQVRDEGQY QCIIIYGVAW DYKYLTLKVK 120 ASYRKINTHI LKVPETDEVE LTCQATGYPL AEVSWPNVSV PANTSHSRTP EGLYQVTSVL 180 RLKPPPGRNF SCVFWNTHVR ELTLASIDLQ SQMEPRTHPT WEPKSCDKTH TCPPCPAPEL 240 LGGPSVFLFP P PKDTLMIS RTPEVTC W DVSHEDPEVK FNWYVDGVEV HNAKTKPREE 300 QYNSTYRWS VLTVLHQDWL NGKEYKCKVS NKALPAPIEK TISKAKGQPR EPQVYTLPPS 360 RDELTKNQVS LTCLVKGFYP SDIAVEWESN GQPENNYKTT PPVLDSDGSF FLYSKLTVDK 420 SRWQQGNVFS CSVMHEALH HYTQKSLSLS PGK 453 (SEQ ID NO:12) La presente invención específicamente contempla realizaciones donde la proteína de fusión madura útil en los métodos y composiciones de la invención tiene la secuencia señal removida. En una realización preferida, la secuencia señal es completamente removida. 5 SEQ ID NO: 13 proporciona la secuencia aminoácida para B7- DC-lg humano sin la secuencia señal.

LFTVTVPKEL YIIEHGS VT LECNFDTGSH VNLGAITASL QKVENDTSPH RERATLLEEQ 60 LPLGKASFHI PQVQVRDEGQ YQCIIIYGVA WDYKYLTLKV KASYRKINTH ILKVPETDEV 120 ELTCQATGYP LAEVSWPNVS VPANTSHSRT PEGLYQVTSV LRLKPPPGRN FSCVFWNTHV 180 RELTLASIDL QSQMEPRTHP TWEPKSCDKT HTCPPCPAPE LLGGPSVFLF PPKPKDTLMI 240 SRTPEVTCW VDVSHEDPEV KF WYVDGVE VHNAKTKPRE EQYNSTYRW SVLTVLHQDW 300 -|Q LNGKEYKCKV SN ALPAPIE KTISKAKGQP REPQVYTLPP SRDELTK QV SLTCLVKGFY 360 PSDIAVEWES NGQPE YKT TPPVLDSDGS FFLYSKLTVD KSRWQQGNVF SCSVMHEALH 420 NHYTQ SLSL SPGK 434 (SEQ ID NO:13).

La presente invención específicamente contempla realizaciones donde las proteínas de fusión B7-DC-lg divulgadas utilizadas en los métodos y 5 composiciones divulgadas en la presente tienen al menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 99% o 100% identidad de secuencia con SEQ ID NO: 9, 10, 12, o 13.

En otra realización de la invención, el polipéptido de fusión puede tener una función bi-específica mediante la cual el primer socio de 20 fusión se fija a un ligando del PD-1 , tal como B7-H1 , y el segundo socio de fusión se fija al receptor del PD-1 sin disparar transduccion de señales inhibitorias a través del receptor del PD-1.

Mientras un polipéptido útil en la invención puede ser monomérico o dimérico, las proteínas de fusión mismas pueden estar presentes en una forma monomérica u oligomérica, preferiblemente como un dímero. En realizaciones específicas, las proteínas de fusión útiles como antagonistas del PD-1 en los métodos y composiciones de la invención pueden ensamblarse espontáneamente en formas oligoméricas, especialmente diméricas, o pueden enlazarse químicamente para formar tales oligómeros mediante medios bien conocidos en el estado de la técnica. Por ejemplo, una proteína de fusión útil en practicar la invención puede ella misma comprender una parte de un polipéptido B7-DC fusionada a una parte de un anticuerpo y estas pueden además ensamblarse en un dímero. En tal ejemplo, un polipéptido para utilizar en la invención es fusionado como una cadena aminoácida sencilla a la región Fe de un anticuerpo (tal como donde este constructo se expresa a partir de un polinucleótido recombinante sencillo), después de lo cual dos de tales productos de fusión son ligados entre sí para formar un homodímero, mediante por ejemplo un enlace de disulfuro entre las regiones Fe respectivas.

Tales productos dímerícos pueden ser homodímeros (donde ambas proteínas de fusión monoméricas son idénticas) o pueden ser heterodímeros (donde dos proteínas de fusión diferentes están ligadas entre si). Los monómeros individuales de tales dímeros pueden ser enlazados mediante cualquier medio conocido en el estado de la técnica, tal como un enlace covalente (ej., un enlace de disulfuro) o mediante un enlace no covalente (tal como una interacción iónica). El B7-DC-lg utilizado en los ejemplos de la invención estuvo presente en la forma de un homodímero teniendo 2 copias de SEQ ID NO: 10 enlazadas juntas mediante un enlace de disulfuro. Además, los heterod ¡meros de la invención incluyen proteínas b¡-específicas y proteínas de fusión en donde una parte monomérica se fija a PD-1 y la otra se fija a un ligando natural del PD-1. Tales heterodímeros son formados mediante acoplamiento de polipéptidos y proteínas de fusión completamente descritas en otra parte en la presente.

En otra realización útil de la invención, el antagonista del PD-1 es un heterodímero, tal como donde dos proteínas de fusión están ligadas juntas pero estas no son de secuencia aminoácida idéntica. En un ejemplo específico, cada monómero puede comprender una parte Fe de un anticuerpo enlazado a un fragmento activo de un polipéptido B7-DC donde estos fragmentos activos son a partir de partes diferentes del polipéptido B7-DC o donde una proteína de fusión que comprende una parte Fe de un anticuerpo fusionado a un polipéptido B7-DC de longitud completa nativa es enlazado (por ejemplo, entrecruzados) a una proteína de fusión que comprende una parte Fe de un anticuerpo y un fragmento activo de un polipéptido B7-DC nativo de longitud completa. En cada caso, la porción del anticuerpo utilizado en formar cada proteína de fusión monomérica puede ser diferente entre las dos unidades monoméricas. Cualquier combinación dímérica es específicamente contemplada por los métodos y composiciones de la invención.

En una proteína de fusión dimérica preferida, los resultados el dímero resulta de la unión covalente del resido Cys en las regiones CH de dos de las cadenas pesadas Ig que son los mismos residuos Cys que son enlazados por disulfuro en cadenas pesadas Ig normales dimerizadas.

Aún otra realización proporciona un constructo tetrámero que tiene un sustrato BirA fusionado al dominio extracelular de un polipéptido B7-DC variante. Métodos para preparar constructos tetrámeros son conocidos en el estado de la técnica (ver Pertovas, J. Exp. Meó., 203:2281 (2006)). 7. Anticuerpos Anti-PD-1 y Otros Anticuerpos Otros antagonistas PD-1 contemplados por los métodos de esta invención incluyen anticuerpos que se fijan a PD-1 o ligandos del PD-1 , y otros anticuerpos.

En un aspecto, La presente invención se relaciona con un método de aumentar una respuesta de células T en un mamífero en necesidad de la misma, que comprende administrar a dicho mamífero un régimen de tratamiento efectivo que comprende un anticuerpo anti-PD-1 y un agente potenciador, en donde dicho régimen de tratamiento es efectivo para aumentar la respuesta de células T de dicho mamífero a dicho antígeno.

Los anticuerpos anti-PD-1 útiles en los regímenes de tratamiento de la invención incluyen, pero no están limitados a, aquellos descritos en las siguientes publicaciones: PCT/IL03/00425 (Hardy, WO/2003/099196) PCT/JP2006/309606 (Korman, WO/2006/121168) PCT/US2008/008925 (L¡, WO/2009/01 708) PCT/JP03/08420 (Honjo, WO/2004/004771 ) PCT/JP04/00549 (Honjo, WO/2004/072286) PCT/IB2003/006304 (Collins, WO/2004/056875) PCT/US2007/088851 (Ahmed, WO/2008/083174) PCT/US2006/026046 (Korman, WO/2007/005874) PCT/US2008/084923 (Terrett, WO/2009/073533) Berger, Clin. Cáncer Res., Vol. 14, pp. 30443051 (2008).

Un ejemplo específico de un anticuerpo anti-PD-1 útil en los métodos de la invención es MDX-1 106 (ver Kosak, US 20070166281 (pub. 19 Julio de 2007) en par. 42), un anticuerpo anti-PD-1 humano, preferiblemente administrado a una dosis de 3 mg/kg.

En otro aspecto, La presente invención se relaciona con un método de aumentar una respuesta de células T en un mamífero en necesidad del mismo, que comprende administrar a dicho mamífero un régimen de tratamiento efectivo que comprende un anticuerpo de ligando anti-PD-1 , un anticuerpo anti-B7-H1 por ejemplo, y un agente potenciador, en donde dicho régimen de tratamiento es efectivo para aumentar la respuesta de células T de dicho mamífero a dicho antígeno.

Anticuerpos anti-B7-H1 útiles en los regímenes de tratamiento de la invención incluyen, pero no están limitados a, aquellos descritos en las siguientes publicaciones: PCT/US06/022423 (WO/2006/133396, pub. 14 Diciembre de 2006) PCT/US07/088851 (WO/2008/083174, pub. 10 Julio de 2008) US 2006/0110383 (pub. 25 Mayo de 2006) Un ejemplo específico de un anticuerpo anti-B7-H1 útil en los métodos de la invención es MDX-1 105 (WO/2007/005874, publicado 11 enero de 2007)), un anticuerpo anti-B7-H1 humano.

Para anticuerpos anti-B7-DC ver 7,411 ,051 , 7,052,694, 7,390,888, 20060099203 Otra realización de la invención incluye un anticuerpo bi-específico que comprende un anticuerpo que se fija al receptor del PD-1 unido a un anticuerpo que se fija a un ligando del PD-1 , tal como B7-H1. En una realización preferida, la porción fijadora del PD-1 reduce o inhibe la transducción de señales a través del receptor del PD-1.

El anticuerpo para utilizar en la invención no necesita ser un anticuerpo anti-PD-1 o anticuerpo de ligando anti-PD-1 pero puede ser otro anticuerpo útil en mediar los efectos de células T en una respuesta inmune. En este aspecto, La presente invención se relaciona con un método de aumentar una respuesta de células T a un antígeno en un mamífero en necesidad del mismo, que comprende administrar un dicho mamífero un régimen de tratamiento efectivo que comprende un anticuerpo anti-CTLA4 y un agente potenciador, en donde dicho régimen de tratamiento es efectivo para aumentar la respuesta de células T de dicho mamífero a dicho antígeno. Un ejemplo de un anticuerpo anti-CTLA4 contemplado para utilizar en los métodos de la invención incluye un anticuerpo como se describió en PCT/US2006/043690 (Fischkoff, WO/2007/056539).

Ejemplos específicos de un anticuerpo anti-CTLA4 útil en los métodos de la invención son Ipilimumab, también conocido como MDX-010 o MDX-101 , un anticuerpo anti-CTLA4 humano, preferiblemente administrado a un dosis de 10 mg/kg, y Tremelimumab un anticuerpo anti-CTLA4 humano, preferiblemente administrado a una dosis de 15 mg/kg. 8. Antagonistas PD-1 de Moléculas Pequeñas Los antagonistas de receptores del PD-1 también pueden ser antagonistas de moléculas pequeñas. El término "molécula pequeña" se refiere a compuestos orgánicos pequeños que tienen un peso molecular de más de 100 y menos de 2,500 Daltons aproximadamente, preferiblemente entre 100 y 2000, más preferiblemente entre 100 y 1250 aproximadamente, más preferiblemente entre 100 y 1000 aproximadamente, más preferiblemente entre 100 y 750 aproximadamente, más preferiblemente entre 200 y 500 Daltons aproximadamente. Las moléculas pequeñas a menudo incluyen estructuras de carbono cíclico o estructuras heterocíclicas y/o estructuras aromáticas o poliaromáticas sustituidas con uno o más grupos funcionales. El antagonistas de moléculas pequeñas reducen o interfieren con la transducción de señales de receptores del PD-1 al fijarse a ligandos del PD-1 tales como B7-H1 y B7-DC y prevenir que ligando interactúe con PD-1 o al fijarse directamente al receptor del PD-1 y bloquearlo sin disparar la transducción de señales a través del receptor del PD-1.

En una realización, tal molécula pequeña puede ser administrada en combinación con otro antagonista del PD-1 o antagonista de CTLA4, tal como un anticuerpo específico para PD-1 o uno de sus ligandos o un anticuerpo específico para CTLA4 o uno de sus ligandos. Así, tales moléculas pequeñas pueden ser administradas como compuestos en uno o más de los métodos de la invención o pueden ser administradas en combinación con otros compuestos útiles en los métodos de la invención. Por ejemplo, se ha mostrado que una series de compuestos orgánicos pequeños se fijan al ligando B7-1 para prevenir fijación a CTLA4 (ver Erbe, J. Biol. Chem., Vol. 277, pp. 7363-7368 (2002). Tales orgánicos pequeños podrían administrarse solos o junto con un anticuerpo anti-CTLA4, en combinación con administración de CTX, para reducir la transducción de señales inhibitorias de células T.

En una realización, antagonistas PD-1 o antagonistas de CTLA4 contemplados para utilizar en los métodos de la invención incluyen ácidos nucleicos anti-sentido, ambos ADN y ARN, así como también moléculas de ARNsi. Tales moléculas anti-sentido previenen la expresión de PD-1 sobre células T así como también la producción de ligandos de células T, tales como B7-H1 , PD-L1 y PD-L2. Por ejemplo, ARNsi (por ejemplo, de aproximadamente 21 nucleótidos de longitud, lo cual es específico para el gen que codifica PD-1 , o que codifica un ligando del PD-1 , y tales oligonucleótidos pueden ser fácilmente adquiridos comercialmente) forma complejos con vehículos, tal como polietilenimina (ver Cubillos-Ruiz, J. Clin. Invest. 119(8): 2231-2244 (2009), son fácilmente absorbidos por células que expresan PD-1 así como también ligandos del PD-1 y reducen la expresión de estos receptores y ligandos para lograr una disminución en la transducción de señales inhibitorias en células T, activando así las células T.

B. Agentes potenciadores Según la invención, la actividad del antagonista del PD-1 es aumentada, preferiblemente sinergísticamente, mediante la presencia de un agente potenciador. El agente potenciador actúa para aumentar la eficacia del antagonista de receptor del PD-1 , posiblemente en más que un mecanismo, aunque el mecanismo preciso de acción no es esencial para la práctica amplia dl_a presente invención.

En la realización preferida, el agente potenciador es ciclofosfamida. Ciclofosfamida (CTX, Cytoxan®, o Neosar®) es un fármaco de oxazahosforina y análogos incluyen ifosfamida (IFO, Ifex), perfosfamida, trofosfamida (trofosfamida; Ixoten), y sales, solvatos, profármacos y metabolitos farmacéuticamente aceptables del mismo (Solicitud de patente estadounidense 20070202077 la cual es incorporada en su totalidad). Ifosfamida (MITOXANA®) es un análogo estructural de ciclofosfamida y su mecanismo de acción se considera idéntico o substancialmente similar a aquel de ciclofosfamida. Perfosfamida (4-hidroperoxiciclofosfamida) y trofosfamida son también agentes alquilantes, los cuales son estructuralmente relacionados a ciclofosfamida. Por ejemplo, perfosfamida alquila ADN, inhibiendo así la replicación de ADN y síntesis de ARN y proteínas. Nuevos derivados de oxazafosforinas han sido diseñados y evaluados en un intento por mejorar la selectividad y respuesta con toxicidad reducida en el huésped (Liang J, Huang M, Duan W, Yu XQ, Zhou S. Diseño de los nuevos fármacos anti-cáncer de oxazafosforina. Curr Pharm Des. 2007;13(9):963-78. Publicación). Estos incluyen mafosfamida (NSC 345842), glufosfamida (D19575, mostaza de beta-D-glucosilisofosforamida), S-(-)-bromofosfamida (CBM-1 1), NSC 612567 (perhidrotiazina de aldofosfamida) y NSC 613060 (tiazolidina de aldofosfamida). Mafosfamida es un análogo de oxazafosforina que es una sal del ácido 4-tioetano sulfónico químicamente estable de 4-hidroxi-CPA. Glufosfamida es derivada de IFO en el cual la mostaza isofosforamida, el metabolito alquilante de IFO, es glicosidicalmente enlazado a una molécula de beta-D-glucosa. Análogos de ciclofosfamida adicionales se describen en la patente estadounidense 5,190,929 titulada " análogos de ciclofosfamida útiles como agentes anti-tumorales " la cual se incorpora en la presente como referencia en su totalidad.

En otras realizaciones, el agente potenciador es un agente que reduce actividad y/o numero de linfocitos T reguladores (T-regs), preferiblemente Sunitinib (SUTENT®), anti-TGFp o Imatinib (GLEEVAC®). El régimen de tratamiento citado también puede incluir administrar un adyuvante.

Agentes potenciadores útiles también incluyen inhibidores de mitosis, tal como paclitaxol, inhibidores de aromatasas (ej., Letrozole) e inhibidores de angiogénesis (inhibidores VEGF ej., Avastin, VEGF-Trap) (ver, por ejemplo, L¡, Bloqueo de factor de crecimiento endotelial vascular reduce células T reguladoras intratumorales y aumenta la eficacia de una inmunoterapia de cáncer secretora de GM-CSF. Clin Cáncer Res. 2006 Nov 15;12(22):6808-16.), antraciclinas, oxaliplatino, doxorubicina, antagonistas de TLR4, y antagonistas de IL-18.

C. Composiciones famaceuticas En un aspecto, la invención se relaciona con una composición terapéutica, que comprende una molécula que previene la transducción de señales inhibidoras a través de PD-1 , o un antagonista de CTLA4, y un agente potenciador en un vehículo farmacéuticamente aceptable. Los componentes de dicha composición están presentes en una cantidad efectiva para aumentar una respuesta de células T en un mamífero. En realizaciones específicas, el agente potenciador es ciclofosfamida o un análogo de ciclofosfamida, ejemplos de tales análogos han sido citados anteriormente.

En otros ejemplos específicos, el agente potenciador es un agente que reduce la actividad de linfocitos T reguladores (T-regs), preferiblemente donde la actividad es reducida debido a una disminución en el número de dichos T-regs. En realizaciones no limitantes preferidas, el agente es Sunitinib (SUTENT®), anti-TGF o Imatinib (GLEEVAC®).

El agente potenciador útil en formular composiciones de la invención también incluye inhibidores de mitosis, tales como paclitaxol, inhibidores de aromatasa (ej., Letrozole), inhibidores de angiogénesis (inhibidores de VEGF ej., Avastin, VEGF-Trap), antraciclinas, oxaliplatino, doxorubicina, antagonistas de TLR4, y antagonistas de IL-18.

Una composición terapéutica de la invención opcionalmente también comprende al menos un agente adicional que puede ser uno o más de un anticuerpo anti-PD-1 , un anticuerpo anti-CTLA4, un inhibidor de mitosis, un inhibidor de aromatasa, un antagonista de receptores A2a de adenosina (A2AR), o un inhibidor de angiogénesis.

Cualquiera de las composiciones terapéuticas de la invención también puede contener uno o más adyuvantes como se describió en la presente.

Un antagonista del PD-1 útil como un componente de una composición terapéutica de la invención incluye cualquiera de los antagonistas del PD-1 citados en la presente para utilizar en cualquiera de los métodos de la invención. Por ejemplo, tal antagonista del PD-1 incluye cualquiera de las proteínas de fusión citadas en la presente. Tal antagonista también puede ser cualquiera de los polipéptidos o fragmentos fijadores del PD-1 citados en la presente para utilizar como la primera porción polipeptídica de cualquiera de las proteínas de fusión descritas para utilizar en cualquiera de los métodos de la invención. Tal antagonista además puede ser un anticuerpo, tal como cualquiera de los anticuerpos anti-PD-1 , -B7-DC o -B7-H1 conocidos mencionados en la presente.

Una composición terapéutica de la invención también incluye, además de o en lugar del antagonista del PD-1 anteriormente mencionado, un anticuerpo anti-CTLA4. Tal composición por lo tanto contendría tal anticuerpo anti-CTLA4 y un agente potenciador de la clase ya descrita en la presente.

Una composición terapéutica de la invención encuentra uso en cualquiera de los métodos de la invención divulgados en la presente. Tal composición, mientras se pretenda utilizar como un tratamiento activo de una condición patológica, también puede encontrar uso como composiciones profilácticas para prevenir cualquiera de las enfermedades citadas en la presente.

En un aspecto, La presente invención contempla una composición terapéutica que comprende un antagonista del PD-1 y un agente potenciador en un vehículo farmacéuticamente aceptable, en donde el antagonista del PD-1 y el agente potenciador están presentes juntos en una cantidad efectiva para aumentar una respuesta de células T en un mamífero.

Composiciones terapéuticas dentro del alcance de la invención incluyen composiciones que comprenden cualquiera y todas las combinaciones de los antagonistas del PD-1 y/o anticuerpos divulgados en la presente con cualquiera de los agentes potenciadores citados. A manera de ejemplos no limitantes, una composición terapéutica de la invención incluye una composición que comprende una cantidad efectiva de uno o más antagonistas del PD-1 , tal como una combinación de cualquiera o todos los polipéptidos de longitud completa enumerados en la presente como SEQ ID Nos específicos u homólogos de los mismos junto con uno o más fragmentos de cualquiera de dichos polipéptidos, incluyendo donde cualquiera o todos de estos son fusionados a otras proteínas, tales como fusionados a una o más inmunoglobuNnas citadas en la presente, o no fusionados así, y que comprenden uno o más agentes potenciadores, tales como ciclofosfamida sola, o ciclofosfamida mas uno o más análogos de la misma, de solo uno o más análogos de ciclofosfamida, o el agente potenciador puede constar de ciclofosfamida y un agente que reduce el número de T reg en un mamífero que recibe la composición, o puede constar de un análogo de ciclofosfamida más un agente que reduce el número de T reg o el agente potenciador puede constar solamente de uno o más agentes que reducen el numero de T reg u otra actividad Treg. Todas estas combinaciones son contempladas por la invención siempre y cuando la composición comprenda al menos un antagonista del PD-1 y/o anticuerpo mediador en la actividad de células T y al menos un agente potenciador.

Las composiciones de la invención también pueden incluir agentes activos adicionales. En realizaciones preferidas de cualquiera de las composiciones de la invención, la composición farmacéutica o terapéutica comprende además al menos un agente adicional seleccionado a partir del grupo que consta de un anticuerpo anti-PD- , un anticuerpo anti-CTLA4, un inhibidor de mitosis, tal como paclitaxel, un inhibidor de aromatasa, tal como letrozol, un antagonista A2AR, un inhibidor de angiogénesis, antraciclinas, oxaliplatino, doxorubicina, antagonistas de TLR4, y antagonistas de IL-18.

El antagonista del PD-1 y/o agente potenciador pueden administrarse mediante cualquier medio apropiado. En una realización preferida, el antagonista del PD-1 y/o agente potenciador se administra en una solución acuosa, mediante inyección parenteral. La formulación también puede ser en la forma de una suspensión o emulsión. En general, composiciones farmacéuticas son proporcionadas incluyendo cantidades efectivas de un péptido o polipéptido, y opcionalmente incluyen diluyentes, preservativos, solubilizantes, emulsificadores, adyuvantes y/o vehículos farmacéuticamente aceptables. Tales composiciones incluyen diluyentes tales como agua estéril, solución salina amortiguada con varios contenidos de buffer (como por ejemplo, Tris-HCI, acetato, fosfato), pHs y fuerza iónica; y opcionalmente, aditivos tales como detergentes y agentes solubilizantes (ej., TWEEN 20, TWEEN 80, Polisorbato 80), antioxidantes (ej.„ ácido ascórbico, metabisulfito de sodio), y preservativos (ej.,, Thimersol, alcohol bencílico) y sustancias de carga (volumen) (ej.,, lactosa, manitol). Ejemplos de solventes no acuosos o vehículos son glicol de propileno, glicol de polietileno, aceites vegetales, tales como aceite de oliva y aceite de maíz, gelatina, y ésteres orgánicos inyectables tal como oleato de etilo. Las formulaciones pueden ser liofilizadas y residueltas/resuspendidas inmediatamente antes de utilizar. La formulación puede ser esterilizada mediante, por ejemplo, filtración a través de un filtro retenedor de bacterias, al incorporar agentes esterilizantes en las composiciones, al irradiar las composiciones, o al calentar las composiciones.

Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden administrarse mediante rutas de administración parenteral (intramuscular, intraperitoneal, intravenosa (IV) o inyección subcutánea), transdérmica (bien sea pasivamente o utilizando iontoforesis o electroporación), o transmucosal (nasal, vaginal, rectal, o sublingual). Los métodos de la invención no excluyen administrar el antagonista del PD-1 y el agente potenciador mediante rutas separadas y diferentes (ej., tópicamente).

El antagonista del PD-1 y el agente potenciador pueden ser administrados al mismo tiempo, o en momentos diferentes, con el agente potenciador siendo administrado antes o después del antagonista del PD-1. En una realización, un agente potenciador se administra antes y después del antagonista del PD-1. En tal realización, el mismo agente potenciador se administra antes y después del antagonista del PD-1. En otra realización, el agente potenciador se administra antes del antagonista del PD-1.

Como se utiliza en la presente el término "cantidad efectiva" o "cantidad terapéuticamente efectiva " se refiere a una dosificación suficiente para tratar, inhibir, o aliviar uno o más síntomas del trastorno tratado o de otra manera proporcionar un efecto farmacológico y/o fisiológico deseado. La dosificación precisa variará según una variedad de factores tales como variables dependientes del sujeto (ej. edad, salud del sistema inmune, etc.), la enfermedad, y el tratamiento efectuado. Cantidades terapéuticamente efectivas de antagonistas de receptores del PD-1 y/o anticuerpos junto con agentes potenciadores hacen que una respuesta inmune sea activada o sostenida.

La dosificación seleccionada depende del efecto terapéutico deseado, sobre la ruta de administración, y sobre la duración del tratamiento deseado. Generalmente niveles de dosificación de 0.001 a 50 mg/kg de peso corporal se administran a mamíferos diariamente. Preferiblemente, dicha dosis es de 1 a 50 mg/kg, más preferiblemente de 1 a 40 mg/kg, o incluso de 1 a 30 mg/kg, con una dosis de 2 a 20 mg/kg siendo también una dosis preferida. Ejemplos de otras dosificaciones incluyen de 2 a 15 mg/kg, o de 2 a 10 mg/kg o incluso de 3 a 5 mg/kg, con una dosis de aproximadamente 4 mg/kg siendo un ejemplo específico.

Para regímenes de tratamiento que utilizan un agente potenciador y un anticuerpo, tal como un anticuerpo anti-PD-1 o un anticuerpo anti-CTLA4, las dosificaciones están comúnmente en el rango de 0.1 a 100 mg/kg, con rangos más cortos de 1 a 50 mg/kg preferidos y rangos de 10 a 20 mg/kg más preferidos. Una dosis apropiada para un sujeto humano está entre 5 y 15 mg/kg, con 10 mg/kg de anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano anti-PD-1 , como MDX-1 106) más preferido (más una dosis apropiada de ciclofosfamida u otro agente potenciador dada hasta aproximadamente 24 horas antes del anticuerpo).

En general, a manera de ejemplo solamente, formas de dosificación basadas en el peso corporal para cualquiera de los antagonistas de transducción de señales útiles en los métodos de la invención incluyen dosis en el rango de 5-300 mg/kg, o 5-290 mg/kg, o 5-280 mg/kg, o 5-270 mg/kg, o 5-260 mg/kg, o 5-250 mg/kg, o 5-240 mg/kg, o 5-230 mg/kg, o 5-220 mg/kg, o 5-210 mg/kg, o 20 a 180 mg/kg, o 30 a 170 mg/kg, o 40 a 160 mg/kg, o 50 a 150 mg/kg, o 60 a 140 mg/kg, o 70 a 130 mg/kg, o 80 a 120 mg/kg, o 90 a 110 mg/kg, o 95 a 105 mg/kg, con dosis de 3 mg/kg, 5 mg/kg, 7 mg/kg, 10 mg/kg, 15 mg/kg, 20 mg/kg, 25 mg/kg, 30 mg/kg, 50 mg/kg y 100 mg/kg siendo ejemplos específicos de dosis preferidas. Tales dosis pueden, naturalmente, repetirse. La dosis estará, naturalmente, correlacionada con la identidad del mamífero que recibe dicha dosis. Las dosis en los rangos mg/kg anteriormente citados son convenientes para mamíferos, incluyendo roedores, tales como ratones y ratas, y primates, especialmente humanos, con dosis de aproximadamente 5 mg/kg, aproximadamente 10 mg/kg y aproximadamente 15 mg/kg siendo especialmente preferidas para tratar humanos.

Según el régimen de tratamiento de la invención, el agente potenciador, por ejemplo ciclofosfamida, se administra en una dosis no toxicas que varían dependiendo del animal. En realizaciones específicas, el agente potenciador es administrado mediante cualquier medio apropiado de administración, incluyendo parenteral u oral, el primero incluyendo administración sistémica, tal como intravenosa. Por ejemplo, un agente potenciador como ciclofosfamida es normalmente administrado oralmente. Tal administración puede ser en cualquier dosificación conveniente, dependiendo del agente potenciador. La dosificación en cada caso puede basarse en el peso corporal o puede administrarse como una dosificación unitaria.

Mientras CTX por sí mismo no es tóxico, algunos de sus metabolitos son agentes citotóxicos alquilantes que inducen eslabonamiento de ADN y, en dosis más altas, rompimiento de hebras. Muchas células son resistentes a CTX puesto que expresan altos niveles de la enzima destoxificante, la aldehido deshidrogenasa (ALDH). CTX direcciona proliferación de linfocitos, a medida que los linfocitos (pero no células madre hematopoyéticas) expresan solamente bajos niveles de ALDH, y células en reproducción son las más sensibles a agentes de alquilación de ADN.

Dosis bajas de CTX (< 200 mg/kg) pueden tener efectos estimuladores inmunes, incluyendo estimulación de respuestas inmunes anti-tumorales en humanos y modelos murinos de cáncer (Brode & Cooke Crit Rev. Immunol. 28:109-126 (2008)). Estas dosis bajas son sub-terapéuticas y no tienen una actividad anti-tumoral directa. En contraste, altas dosis de CTX inhiben la respuesta anti-tumoral. Varios mecanismos pueden explicar el papel de CTX en potenciación de respuesta inmune anti-tumoral: (a) reducción de CD4+CD25+FoxP3+ Treg (y específicamente Treg proliferante, el cual puede ser especialmente supresivo), (b) reducción de linfocitos B; (c) inducción de óxido nítrico (NO), que resulta en supresión de crecimiento de células tumorales; (d) movilización y expansión de CD1 1b+Gr-1+ MDSC. Estos efectos primarios tienen numerosos efectos secundarios; por ejemplo después de disminución de Treg los macrófagos producen más IFN-y y menos IL-10. También se ha mostrado que CTX induce expresión de IFN tipo I y promueve proliferación homeostática de linfocitos.

La reducción de Treg es más a menudo citada como el mecanismo mediante el cual CTX potencia la respuesta inmune anti-tumoral. Esta conclusión se basa en parte en los resultados de experimentos de transferencia adoptiva. En el modelo tumoral AB1-HA, el tratamiento con CTX en el día 9 proporciona una tasa de cura de 75%. La transferencia de Treg purificado en el Día 12 casi completamente inhibió la respuesta de CTX (van der Most Cáncer Immunol. Immunolar. 58:1219-1228 (2009). Un resultado similar fue observado en el modelo tumoral HHD2: la transferencia adoptiva de CD4+CD25+ Treg después de pre-tratamiento CTX eliminó la respuesta terapéutica a la vacuna (Taieb.J. J. Immunol. 176:2722-2729 (2006)).

Numerosos ensayos clínicos humanos han demostrado que CTX de baja dosis es un agente seguro, bien tolerado, y efectivo para promover respuestas inmunes anti-tumorales (Bas, & Mastrangelo Cáncer Immunol. Immunolar. 47:1-12 (1998)).

La dosis óptima para CTX para potenciar una respuesta inmune anti-tumoral, es aquella que reduce los conteos totales de células T al reducir niveles Treg por debajo del rango normal pero es subterapéutica (ver Machiels Cáncer Res. 61 :3689-3697 (2001 )).

En ensayos clínicos humanos donde CTX ha sido utilizado como un agente inmunopotenciador, una dosis de 300 mg/m2 ha sido usualmente utilizada. Para un hombre promedio (6 pies, 170 libras (78 kg) con un área de superficie corporal de 1.98 m2), 300 mg/m2 es 8 mg/kg, o 624 mg de proteína total. En modelos murinos de cáncer, la eficacia se ha observado en rangos de dosificación desde 15 - 150 mg/kg, la cuales se relaciona con 0.45 - 4.5 mg de proteína total en un ratón de 30g (Machiels Cáncer Res. 61 :3689-3697 (2001), Hengst Cáncer Res. 41 :2163-2167 (1981 ), Hengst Cáncer Res. 40:2135-2141 (1980)).

Para mamíferos más grandes, tales como un primate, preferiblemente un paciente humano, tales dosis mg/m2 pueden ser utilizadas pero dosis unitarias administradas sobre un intervalo de tiempo finito pueden ser preferidas. Tales dosis unitarias pueden ser administradas sobre una base diaria durante un periodo de tiempo finito, tal como hasta 3 días, o hasta 5 días, o hasta 7 días, o hasta 10 días, o hasta 15 días o hasta 20 días o hasta 25 días, todos específicamente contemplados por la invención. El mismo régimen puede ser aplicado para otros agentes potenciadores citados en la presente.

Todas estas administraciones pueden ocurrir antes o después de administración de una molécula fijadora del PD-1 de la invención. Alternativamente, la administración de una o más dosis de una molécula fijadora del PD-1 de la invención puede ser temporalmente escalonada con la administración del agente potenciador para formar un curso uniforme o no uniforme de tratamiento mediante el cual una o más dosis de agente potenciador son administradas, seguido por una o más dosis de un compuesto fijador del PD-1 , seguido por una o más dosis de agente potenciador, todas según cualquier esquema seleccionado o deseado por el investigador o médico que administra dichos agentes.

En otras realizaciones específicas, el régimen de tratamiento incluye administraciones múltiples de uno o más antagonistas del PD-1. En algunas realizaciones, tales administraciones múltiples de antagonistas del PD-1 están en conexión con administraciones múltiples de los mismos o diferentes agentes potenciadores.

Como en otras realizaciones de la invención, aquí el agente potenciador se administra al menos 1 , 2, 3, 5, 10, 15, 20, 24 o 30 horas antes de o después de administrar el antagonista del PD-1.

Las composiciones farmacéuticas útiles en la presente también contienen un vehículo farmacéuticamente aceptable, incluyendo cualquier diluyente o excipiente apropiado, el cual incluye cualquier agente farmacéutico que no induce por sí mismo la producción de anticuerpos perjudiciales para el individual que recibe la composición, y el cual puede administrarse sin toxicidad indebida. Vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen, pero no están limitados a, líquidos tales como agua, solución salina, glicerol y etanol, y similares, incluyendo vehículos útiles en la formación de atomizaciones para distribución nasal u otro tipo de distribución en el tracto respiratorio o para distribución al sistema oftálmico. Una discusión completa de vehículos, diluentes y otros excipientes farmacéuticamente aceptables, se encuentra en REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES (Mack Pub. Co., N.J. edición actual).

Las composiciones de vacuna (como se discuten a continuación) pueden además incorporar sustancias adicionales para estabilizar pH, o para funcionar como adyuvantes, agentes humectantes, o agentes emulsificantes, los cuales pueden servir para mejorar la efectividad de la vacuna.

Generalmente las vacunas son formuladas para administración parenteral y son inyectadas bien sea subcutáneamente o intramuscularmente.

Tales vacunas también pueden formularse como supositorios o para administración oral, utilizando métodos conocidos en el estado de la técnica, o para administración a través de rutas nasales o respiratorias.

D. Métodos de fabricación Polipéptidos antagonistas del PD-1 aislados, incluyendo variantes, homólogos y fragmentos de los mismo, bien sea tipo silvestre o mutados, y proteínas de fusión que comprenden cualquiera de estos, todos contemplados para utilizar en la invención, pueden obtenerse mediante, por ejemplo, síntesis química o mediante producción recombinante en una célula huésped. Para producir recombinantemente un polipéptido coestimulador, puede utilizarse un ácido nucleico que contiene una secuencia nucleótida que codifica el polipéptido para transformar, transducir, o transfectar una célula hospedera bacteriana o eucariótica (ej., una célula de insecto, levadura, o mamífera. Se apreciará que las secuencias nucleótidas pueden ser optimizadas con codones para aumentar los niveles de expresión proteica en una clase particular de célula hospedera. Métodos para optimización por codones son bien conocidos en el estado de la técnica. En general, los constructos de ácido nucleico incluyen una secuencia reguladora operablemente unida a una secuencia nucleótida que codifica un polipéptido coestimulador. Las secuencias reguladoras (también conocidas en la presente como secuencias de control de expresión) típicamente no codifican un producto génico, pero en cambio afectan la expresión de la secuencia de ácido nucleico a la cual están operablemente unidas. Los péptidos señal utilizados para secretar proteínas desde una célula pueden ser los péptidos señal endógenos o cualquier otro péptido señal que facilite la secreción de la proteína de fusión desde un huésped.

Para procedimientos generales de biología molecular útiles para realizar La presente invención, están disponibles un número de referencias estándares que contienen procedimientos bien conocidos en el estado de la técnica de biología molecular e ingeniería genética y tales procedimientos no necesitan ser descritos adicionalmente en la presente. Referencias útiles incluyen Sambrook, Clonación Molecular: Un Manual de Laboratorio, Segunda Edición, Cold Spring Harbor, N.Y., (1989), Wu , Methods en Gene Biotechnology (CRC Press, New York, NY, 1997), y Recombinant Gene Expression Protocols, en Methods en Molecular Biology, Vol. 62, (Tuan, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 1997), las divulgaciones de los mismos se incorporan aquí como referencia E. Tratamiento de enfermedades Las enfermedades a ser tratadas o prevenidas mediante la administración de una combinación terapéutica proporcionada por La presente invención incluyen un tumor maligno o una enfermedad infecciosa crónica producida por una bacteria, virus, protozoario, helminto, u otro patógeno microbiano que entra de manera intracelular. Tales enfermedades a menudo son combatidas por ataque mediante linfocitos T citotóxicos. Puesto que La presente invención proporciona terapias de combinación útiles para aumentar respuestas de células T, a través actividad aumentada de células T, proliferación reducida de células T y señales inhibitorias reducidas de células T, las terapias de combinación de la invención tienen ventaja única en tratar (o aún prevenir) tales enfermedades.

En una realización, puesto que las infecciones virales son principalmente eliminadas mediante células T, un aumento en actividad de células T es terapéuticamente útil en aumentar eliminación de un agente viral infeccioso desde un animal o primate, preferiblemente humano. Así, los compuestos divulgados de la invención, con actividad antagonista de receptores del PD-1 , junto con un agente potenciador trabajan en combinación para el tratamiento de infecciones virales locales o sistémicas. Las infecciones a ser tratadas mediante los compuestos de la invención incluyen, pero no están limitadas a, infecciones virales de inmunodeficiencia (ej., VIH), papiloma (ej., VPH), herpes (ej., HSV), encefalitis, influenza (ej., virus de la influenza humana A), hepatitis (ej., VHC, VHB), y gripe común (ej., rinovirus humano. Las formulaciones farmacéuticas de composiciones de antagonistas receptores del PD-1 también pueden administrarse para tratar enfermedades virales sistémicas, incluyendo, pero sin limitar a, SIDA, influenza, gripe común, o encefalitis.

Infecciones no virales tratables mediante los compuestos de la invención incluyen, pero no están limitadas a, infecciones producidas por microorganismos incluyendo, pero sin limitar a, Actinomyces, Anabaena, Bacillus, Bacteroides, Bdellovibrio, Bordetella, Borrelia, Campylobacter, Caulobacter, Chlamydia, Chlorobium, Chromatium, Clostridium, Corynebacterium, Cytophaga, Deinococcus, Escherichia, Francisella, Halobacterium, Heliobacter, Haemophilus, Hemophilus influenza tipo B (HIB), Hyphomicrobium, Legionella, Leptspirosis, Listeria, Meningococcus A, B y C, Methanobacterium, Micrococcus, Myobacterium, Mycoplasma, Myxococcus, Neisseria, Nitrobacter, Oscillatoria, Prochloron, Proteus, Pseudomonas, Phodospirillum, Rickettsia, Salmonella, Shigella, Spirillum, Spirochaeta, Staphylococcus, Streptococcus, Streptomyces, Sulfolobus, Larmoplasma, Thiobacillus, Treponema, Vibrio, Yersinia, Cryptococcus neoformans, Histoplasma sp. (tal como Histoplasma capsulatum), Candida albicans, Candida tropicalis, Nocardia asteroides, Rickettsia ricketsii, Rickettsia typhi, Leishmania, Mycoplasma pneumoniae, Chlamydial psittaci, Chlamydial trachomatis, Plasmodium sp. (tal como Plasmodium falciparum), Trypanosoma brucei, Entamoeba histolítica, Toxoplasma gondii, Tnchomonas vaginalis y Schistosoma mansoni.

En una realización, La presente invención proporciona métodos y composiciones para inducir o aumentar una respuesta inmune en un huésped para tratar cáncer. Los tipos de cáncer que pueden tratarse con las composiciones y métodos proporcionados incluyen, pero no están limitados a, la siguiente: cáncer de vejiga, cerebral, de mama, cervical, colo-rectal, esofágico, renal, hepático, pulmonar, nasofaríngeo, pancreático, prostático, dérmico, estomacal, uterino, ovárico, testicular, y hematológico.

Tumores malignos los cuales pueden tratarse están clasificados en la presente según el origen embriónico del tejido desde el cual se deriva el tumor. Los carcinomas son tumores que se originan a partir de tejidos endodérmicos o ectodérmicos tales como piel o el revestimiento epitelial de glándulas u órganos internos. Sarcomas, los cuales se originan con menor frecuencia, se derivan a partir de tejidos conectivos mesodérmicos tales como hueso, grasa, y cartílago. Las leucemias y linfomas son tumores malignos de células hematopoyéticas de la medula ósea. Las leucemias proliferan como células únicas, mientras los linfomas tienden a crecer como masas tumorales. Los tumores malignos pueden aparecer en numerosos órganos o tejidos del cuerpo para establecer un cáncer.

Como una demostración del valor de los regímenes de tratamiento de la invención, el análogo murino de B7-DC-lg (en el cual el B7-DC ECD de ratón, el cual comparte identidad de secuencia del 72% con la proteína humana, es fusionado al dominio Fe de lgG2a de ratón) probado en modelos tumorales murinos singeneicos para cáncer de colon, mastocitoma, y otros tipos tumorales que incorporan un pre-tratamiento de ciclofosfamida (CTX) como se describió en la presente.

Los resultados mostraron que tratamiento con una dosis subterapéutica de CTX, la cual actúa como un agente inmunopotenciador, seguido por B7-DC-IG murino erradica tumores de carcinoma de colon CT26 establecidos en hasta 80% de los animales. Además, en estudios de reexposición a tumor de carcinoma de colon CT26, no se detectó ningún re- crecimiento tumoral en ratones a los cuales se había erradicado previamente el tumor siguiendo el tratamiento con CTX + B7-DC-lg murino. Estos ratones también mostraron tener una aumentada población de linfocitos T citotóxicos específicos de tumores con relación a ratones no expuestos a ningún tipo de experimento.

En una realización, La presente invención contempla el uso de un compuesto que reduce transducción de señales inhibitorias en una célula T, como se describió en otra parte en la presente, en la fabricación de un medicamento para aumentar una respuesta de células T mediante terapia de combinación en donde dicho compuesto se administra en conjunto con un agente potenciador. Además, el compuesto que reduce la transducción de señales inhibitorias en a célula T y dicho agente potenciador son proporcionados como medicamentos separados para administración en momentos diferentes, preferiblemente donde el agente potenciador se administra antes del compuesto que reduce la transducción de señales inhibitorias, por ejemplo, hasta 24 horas antes del compuesto inhibitorio (u otros intervalos de tiempo citados en la presente). Preferiblemente, el compuesto y agente potenciador son para utilizar en el tratamiento de una enfermedad infecciosa o cáncer, incluyendo enfermedades causadas por cualquiera de los agentes infecciosos o cánceres citados en otra parte en la presente.

En un realización preferida, un compuesto útil en estos métodos es una proteína recombinante compuesta del ECD de B7-DC humano fusionado al dominio Fe de IgG^ conocido en la presente como B7-DC-lg.

En una realización, La presente invención se relaciona con un kit médico para administrar un compuesto que reduce transducción de señales inhibitorias en una célula T, como se divulga en la presente, en combinación con un agente potenciador, dicho kit comprendiendo: (a) una provisión de dosificación de un compuesto que reduce transducción de señales inhibitorias en una célula T, (b) una provisión de un agente potenciador; (c) una provisión de vehículo farmacéuticamente aceptable; y (d) instrucciones impresas para administrar el compuesto como se describió anteriormente.

F. Terapias de combinación Las vacunas requieren respuesta fuerte de las células T para eliminar células cancerígenas y células infectadas o agentes infecciosos. Los antagonistas receptores del PD-1 descritos en la presente pueden administrarse como un componente de una vacuna, junto con un agente potenciador, para proporcionar una señal co-estimuladora a células T. Las vacunas divulgadas en la presente incluyen antígenos, un antagonista receptor del PD-1 y opcionalmente adyuvantes y moléculas diana.

Los antígenos contra los cuales la respuesta de células T es aumentada mediante los métodos y composición de la invención incluyen péptidos, proteínas, polisacáridos, sacáridos, lípidos, ácidos nucleicos, o combinaciones de los mismos. Los antígenos, en el caso de enfermedad, están presentes debido al proceso patológico.

Las composiciones de antagonistas receptores del PD-1 divulgadas pueden administrarse en conexión con vacunas profilácticas, lo cual confiere resistencia en un sujeto para exposición subsecuente a agentes infecciosos, o en conjunto con vacunas terapéuticas, las cuales pueden utilizarse para iniciar o aumentar una respuesta inmune de un sujeto a un antígeno pre-existente, tal como una antigeno tumoral en un sujeto con cáncer, o un antígeno viral en un sujeto infectado con un virus.

El resultado deseado de una respuesta inmune profiláctica, terapéutica o desensibilizada puede variar según la enfermedad, con base en principios bien conocidos en el estado de la técnica. Por ejemplo, una respuesta inmune contra un agente infeccioso puede prevenir completamente colonización y replicación de un agente infeccioso, afectando "inmunidad estéril" y la ausencia de cualquiera de los síntomas de la enfermedad. Sin embargo, una vacuna contra agentes infecciosos puede considerarse efectiva si reduce el número, severidad o duración de síntomas; si reduce el número de individuos en una población con síntomas; o reduce la transmisión de un agente infeccioso. De manera similar, las respuestas inmunes contra cáncer, alérgenos o agentes infecciosos pueden tratar completamente una enfermedad, pueden aliviar síntomas, o pueden ser una faceta en una intervención terapéutica general contra una enfermedad. Por ejemplo, la estimulación de una respuesta inmune contra un cáncer puede ser acoplada con enfoques quirúrgicos, quimioterapéuticos, radiológicos, hormonales y otros enfoques inmunológicos con el objeto de realizar tratamiento.

Los métodos y productos de la invención no excluyen el uso de un adyuvante además del agente potenciador. Tal adyuvante puede administrarse, por ejemplo, junto con la antagonista del PD-1. Los adyuvantes útiles en las composiciones y métodos de la invención incluyen, pero no están limitados a, uno o más de los siguientes: emulsiones en aceite (ej., adyuvante Freund); formulaciones de saponina; virosomas y partículas tipo viral; derivados bacterianos y microbianos; oligonucleótidos inmunoestimuladores; toxinas ADP-ribosilantes y derivados destoxificados; alumbre; BCG; composiciones que contienen minerales (ej., sales minerales, tal como sales de aluminio y sales de calcio, hidroxidos, fosfatos, sulfatos, etc.); bioadhesivos y/o mucoadhesivos; micropartículas; liposomas; formulaciones de éter de polioxietileno y éster de polioxietileno; péptidos de muramilo; polifosfaceno; compuestos de imidazoquinilona; y sustancias tensoactivas (ej., lisolecitina, polioles plurónicos, polianiones, péptidos, emulsiones en aceite, la hemocianina extraída del molusco lapa californiana, y dinitrofenol). Adyuvantes útiles también incluyen inmunomoduladores tales como citoquinas, interleuquinas (ej., IL-1 , IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12, etc.), interferonas (ej., interferona-?), factor estimulador de colonias de macrófagos, y factor de necrosis tumoral.

Nada en la presente excluye el antagonista de receptores del PD-1 divulgado, incluyendo cualquiera de los polipéptidos, fragmentos, vanantes, homólogos y proteínas de fusión divulgadas en la presente, de ser administrados a un sujeto en necesidad de los mismos en combinación con uno o más agentes terapéuticos adicionales (además del agente potenciador). Los agentes terapéuticos adicionales son seleccionados con base en la condición, trastorno o enfermedad a ser tratada. Por ejemplo, los antagonistas de receptores del PD-1 pueden ser co-administrados con uno o más agentes adicionales que funcionan para aumentar o promover una respuesta inmune, y los cuales son considerados en la presente como agentes activos.

Tales agentes incluyen, pero no están limitados a, amsacrina, bleomicina, busulfan, capecitabina, carboplatino, carmustina, clorambucilo, cisplatino, cladribina, clofarabina, crisantaspasa, citarabina, dacarbazina, dactinomicina, daunorubicina, docetaxel, doxorubicina, epirubicina, etoposida, fludarabina, fluorouracilo, gemcitabina, hidroxlcarbamida, idarubicina, ifosfamida, irinotecan, leucovorin, doxorubicina liposomal, daunorubicina liposomal, lomustina, melfalan, mercaptopurina, mesna, metotrexato, mitomicina, mitoxantrona, oxaliplatino, paclitaxel, pemetrexed, pentostatino, procarbazina, raltitrexed, satraplatlno, estreptozocina, tegafur-uracilo, temozolomida, teniposida, tiotepa, tioguanina, topotecan, treosulfan, vinblastina, vincristina, vindesina, vinorelbina, o una combinación de los mismos. Agentes pro-apoptóticos representativos incluyen, pero no están limitados a fludarabinataurosporina, cicloheximida, actinomicina D, lactosilceramida, 15d-PGJ 2) y combinaciones de los mismos.

Las terapias proporcionadas por los métodos y composiciones dl_a presente invención también pueden utilizarse en conexión con otros tipos de terapias, tales como tratamientos de radiación, cirugía, y similares.

G. Ensayos para actividad antagonista La presente invención cita un número de estructuras específicas útiles para realizar los métodos de la invención. Otros compuestos que poseen actividad antagonista y son útiles en los métodos de la invención también pueden identificarse por referencia a procedimientos de ensayo bien conocidos para identificar estructuras químicas que se fijan a PD-1 , CTLA4, y ligandos de cualquiera de estos y que también poseen la habilidad para reducir la transducción de señales inhibitorias en células T. Algunos de tales ensayos son ensayos de fijación útiles en determinar si una estructura química seleccionada se fija a receptores; estos son bien conocidos en el estado de la técnica y no necesitan ser divulgados en detalle en la presente (ver, por ejemplo, Patente estadounidense No. 2008/0274490, (pub. 6 Noviembre de 2008) y Patente estadounidense No. 7,105,328 (publicada el 12 de septiembre de 2006), cada una mostrando ensayos para moduladores de señalización del PD-1 que utilizan células T) las divulgaciones de las cuales se incorporan como referencia en su totalidad. Otros ensayos son utilizados para determinar los efectos de agentes de la invención, tales como fragmentos activos, para activar células T al aumentar proliferación y/o producción de citoquinas. Tales ensayos son también bien conocidos en el estado de la técnica. Por ejemplo, la proliferación de células puede demostrarse mediante incorporación aumentada de de 3H-timidina (debido a síntesis aumentada de ADN necesaria para multiplicación celular) o ELISA y/o RIA para detectar producción aumentada de citoquinas mediante células T en cultivo.

En uno de tales experimentos, se evaluó la actividad de fijación del PD-1 de B7-DC-lg humano mediante ELISA. Placas ELISA de 96-pozos fueron recubiertas con 100 µL· 0.75 ug/mL de PD-1/Fc humano recombinante (R&D Systems) diluido en un buffer de BupH carbonato/bicarbonato de pH 9.4 (Pierce) durante 2 horas y luego bloqueado con solución BSA (Jackson ImmunoResearch) durante 90-120 minutos. B7-DC-lg humano serialmente diluido (tipo silvestre, así como también muteína D1 11S, y mutantes K1 13S que fueron seleccionados para fijación reducida a PD-1) así como también un control de isotipo lgG1 humano fueron dejados fijarse durante 90 minutos. B7-DC-lg fijado se detectó utilizando 100 uL de clon MIH18 B7-DC anti-humano conjugado a biotina a 0.5 ug/mL seguido de HRP-Streptavidin (BD Bioscience) y sustrato TMB (BioFX) diluido 1 :1000. La absorbancia a 450 nm fue leída utilizando un lector de placas (Molecular Devices) y los datos fueron analizados en SoftMax utilizando un ajuste logístico 4 parámetros. Los datos mostraron que B7-DC-lg humano (tipo silvestre) se fijo a PD-1 pero los mutantes K1 13S y D11 1 S no se fijaron a PD-1.

Para realizar los procedimientos dLa presente invención naturalmente se entiende que las referencias a buffers, medios, reactivos, células, condiciones de cultivo particulares y similares no pretenden ser limitantes, pero están para ser leídas para incluir todos los materiales relacionados que alguien con experiencia común en el estado de la técnica reconocería como de interés o valor en el contexto particular en el cual la discusión es presentada. Por ejemplo, a menudo es posible sustituir un sistema buffer o medio de cultivo por otro y aún lograr resultados similares, si no idénticos. Aquellos con experiencia en el estado de técnica tendrán suficiente conocimiento de tales sistemas y metodologías para ser capaces, sin experimentación indebida, de hacer tales sustituciones que óptimamente servirán a los propósitos en utilizar los métodos y procedimientos divulgados en la presente.

La invención se describe en detalle en los siguientes ejemplos no limitantes. Se debe entender que estos métodos y ejemplos en ninguna forma limitan la invención a las realizaciones descritas en la presente y que otras realizaciones y usos no sugerirán duda a aquellos con experiencia en el estado de técnica.

EJEMPLOS EJEMPLO 1 B7-DC-lg se fija a PD01 que expresa células CHO B7-DC-lg fue primero conjugado con aloficocianina (APC) y luego encubado a varias concentraciones con una línea celular CHO expresando constitutivamente PD-1 o células CHO precursoras que no expresan PD-1. La fijación se analizó mediante citometría de flujo. La figura 1 muestra la intensidad de fluorescencia media (MFI) de B7-DC-lg-APC como una función de la concentración de sonda (eje-x). B7-DC-lg-APC se fija a células CHO.PD-1 (círculo sólido) pero no a células CHO no transfectadas (triángulo gris).

EJEMPLO 2 B7-DC-lg compite con B7-H1 por fijación a PD-1.

B7-H1-lg fue primero conjugado con aloficocianina (APC). B7-DC-lg sin rotular en varias concentraciones fue primero incubado con una línea celular CHO expresando constitutivamente PD-1 antes de la adición de B7-H1-lg-APC a la sonda y mezcla celular. La figura 2 muestra que la intensidad de fluorescencia media (MFI) de B7-H1-Fc-APC se muestra como una función de la concentración del competidor B7-DC-lg sin rotular (eje-x) agregado. A medida que la concentración de B7-DC-lg sin rotular es aumentada, la cantidad de B7-H1-lg-APC fijado a células CHO disminuye, demostrando que B7-DC-lg compite con B7-H1 por fijación a PD-1.

EJEMPLO 3 Modelo Tumoral CT26 La línea celular tumoral colorectal de ratón, CT26, se obtuvo a partir de ATCC. Un banco celular maestro en el pasaje 4 se generó siguiendo las pautas ATCC. Las células fueron probadas y no se confirmó micoplasma y otra contaminación patógena. Un tubo con células tumorales fue descongelado a partir de los concentrados criopreservados y sembrado por dos pasajes antes de ser inoculado..

Células CT26 fueron divididas en dilución 1 :5 con 30 mL de medio completo (RPMI + FBS 10%, 2 mM L-Glu, y 1x P/S) para cultivo de dos días o en dilución 1 :10 con 30 mi de medio completo para cultivo de 3 días. Células CT26 fueron cosechadas al aspirar medio, enjuagando el matraz con 5 mL PBS, agregando 5 mL de tripsina, incubando a 37 °C durante 2 min, y luego neutralizado con 10 mL de medio completo. Después de centrifugar a 600 x g (-1000 rpm) durante 5 min, el medio fue aspirado y el pellet celular fue resuspendido al pipetiar con 10 mi de medio RPMI normal. Este paso de lavado se repitió tres veces.

El número celular y la viabilidad de las células inoculadas se analizaron mediante tinción con azul triptano con dilución adecuada (ej., dilución 1 :5, 10 uL de células + 40 uL de azul triptano) y se confirmaron mediante el conteo celular NOVA durante el último paso lavado. La viabilidad celular es generalmente mayor del 95% para inoculación.

Las células CT26 fueron diluidas a células 6.7x105 /mL para inoculación inicial con medio RPMI normal y almacenadas sobre hielo. Típicamente cada ratón fue inoculado con 150 uL(células 1x105).

El día 9, todos los ratones con tumor fueron primero agrupados en una jaula y fueron aletoriamente divididos en grupos experimentales. La solución CTX fue reconstituida mediante 1x PBS a 4 mg/mL Los ratones fueron intraperitonealmente inyectados (IP) con 0.5 mL de solución CTX resultando en 2 mg para un ratón de 20gram, es decir 100 mg/kg.

El día 10, los ratones fueron inyectados intraperitonealmente con 0.5 mL de B7-DC-lg (0.2 mg/mL) resultando en 0.1 mg para un ratón de 20 gram, es decir 5 mg/kg. La misma dosis fue dada 2 veces por semana durante 4 semanas, 8 dosis totales. Crecimiento tumoral fue monitoreado al medir el tumor dos veces por semana vía un calibrador digital, comenzando en el día cuando B7-DC-lg fue dado. Volumen tumoral fue calculado como sigue: Volumen tumoral = 7t(Dshort)2 * (D|ong)/6= -0.52 x (DShort)2 *(D|0ng) Los ratones fueron sacrificados y retirados del estudio si volumen tumoral alcanzó 2000 mm3 o si hubo úlceras en piel e infecciones el sitio de inoculación tumoral.

EJEMPLO 4 La combinación de ciclofosfamida y B7-DC-lg puede erradicar tumores establecidos.

Ratones Balb/C con 9 a 11 semanas de edad fueron implantados con células tumorales colorectales 1.0 x 105 CT26 subcutáneamente como se describió anteriormente. El día 10 después de la implantación tumoral, los ratones recibieron 100 mg/kg de ciclofosfamida. El tratamiento con B7-DC-lg comenzó 1 día después, el día 11. Los ratones fueron tratados con 100 ug de B7-DC-lg, 2 dosis por semana, durante 4 semanas y dosis totales 8. El 75% de los ratones que recibieron el CTX + el régimen de tratamiento B7-DC-lg erradicaron los tumores establecidos en el Día 44, mientras todos los ratones en el grupo CTX murieron como un resultado de crecimiento tumoral o fueron sacrificados porque los tumores excedieron los tamaños aprobados por IACUC (los resultados se muestran en las Figuras 3A-3C). Estos resultados demuestran la efectividad del régimen de tratamiento sobre tumores establecidos y no simple profilaxis.

EJEMPLO 5 La combinación de ciclofosfamida y B7-DC-lg puede erradicar tumores establecidos y proteger contra re-exposición al tumor.

Los ratones con tumores colorectales CT26 establecidos erradicados del experimento descrito anteriormente fueron re-expuestos a células CT26 1x105 el día 44 y el día 70. No crecieron tumores a partir de la re-exposición indicando que los ratones habían desarrollado inmunidad anti-tumoral a largo plazo a partir del tratamiento de combinación de ciclofosfamida y B7-DC-lg. Todos ratones en el grupo de control de vehículo desarrollaron tumores (los resultados se muestran en la Figura 4). Estos resultados mostraron la efectividad del régimen de tratamiento sobre tumores establecidos y que el tratamiento de combinación de ciclofosfamida y B7- DCIg resultó en respuestas de memoria a antígenos tumorales.

EJEMPLO 6 La combinación de ciclofosfamida y B7-DC-lg puede generar CTL (linfocitos T citotóxicos) de memoria específicos de tumores Los ratones con tumores colorectales establecidos CT26 erradicados del experimento descrito anteriormente fueron re-expuestos a células CT26 2.5x105 el día 44. Siete días después, se aislaron los bazos de los ratones. Los esplenocitos de ratón fueron pulsados con 5 o 50 ug/mL de ovalbúmina (OVA) o péptidos de AH1 durante 6 horas en la presencia de un boqueador Golgi (BD Bioscience). Se analizaron las células T efectoras de memoria mediante la evaluación de las células CD8+/IFNy+ T. Los resultados en la Figura 5 muestran que hubo cantidad significativa de células T efectoras CT26 específicas en los ratones con tumor CT26 erradicado.

EJEMPLO 7 El efecto de dosis de B7-DC-lg dependiente de erradicación tumoral Ratones Balb/C de 9 a 11 semanas de edad fueron implantados subcutáneamente con 1.0 x 105células tumorales colorectales CT26. El día 9 después de la implantación tumoral, los ratones recibieron una única dosis de ciclofosfamida (100 mg/kg) y comenzaron el tratamiento el día 10 con 30, 100 o 300 ug de B7-DC-lg, 2 dosis por semana durante 4 semanas, dosis 8 totales. Las figuras 6A-6D muestra que 70% de los ratones erradicaron los tumores a 300 µg, 40% de erradicación tumoral con 100 g, y la dosis de 30 g dio origen a erradicación tumoral de 10%.

EJEMPLO 8 La combinación de ciclofosfamida y anti-PD-1 puede erradicar tumores establecidos.

Ratones Balb/C de 9 a 11 semanas de edad fueron expuestos subcutáneamente a 1.0 x 105 células tumorales coloréeteles CT26. El día 11 después de la exposición tumoral, los ratones recibieron una dosis única de ciclofosfamida (100 mg/kg) y comenzaron un tratamiento con anticuerpo anti-PD-1 (250 µg, G4 Clon, Hirano F., 2005 Cáncer Research) el cual se administro 3 veces por semana durante cuatro semanas. El 70% de los ratones que recibieron el CTX + el régimen anti-PD-1 erradicó tumores CT26 establecidos en el día 50 después exposición tumoral, mientras todos ratones en los grupos de control y anti-PD-1 solo murieron como resultado de crecimiento tumoral o fueron sacrificados puesto que los tumores excedieron los tamaños aprobados por IACUC. Estos resultados muestran la efectividad del régimen de tratamiento sobre tumores establecidos y no simple profilaxis. Los resultados se muestran en las figuras 7A-7C.

EJEMPLO 9 La combinación de ciclofosfamida y anti-CTLA4 puede erradicar tumores establecidos.

Los ratones Balb/C de 9 a 1 1 semanas de edad fueron expuestos subcutáneamente a 1.0 x 105 células tumorales colorectales CT26. El día 11 después de la exposición tumoral, los ratones recibieron 100 mg/kg de ciclofosfamida. El tratamiento con Anti-CTLA4 (un CTLA4 anti-ratón a partir de hámster hibridoma - ATCC deposito UC10-4F10-1 ) comenzó un 1 día después, el día 12. Los ratones fueron tratados con 100 µg de anti-CTLA4, 2 dosis por semana, durante 4 semanas. El 56% de los ratones que recibieron el CTX + el régimen anti-CTLA4 estuvieron libres de tumores en el día 50 después de exposición tumoral, mientras todos los ratones en el grupo de control murieron como un resultado de crecimiento tumoral o fueron sacrificados puesto que los tumores excedieron los tamaños aprobados por IACUC. Resultados son mostrados en las figuras 8A y 8B. Estos resultados muestran la efectividad del régimen de tratamiento sobre tumores establecidos y no simple profilaxis.

EJEMPLO 10 La combinación de ciclofosfamida y el régimen B7-DC-lq lleva a una Reducción de Tregs en el Microambiente tumoral Las figuras 9A y 9B muestran los resultados de los experimentos en donde ratones Balb/C de 9 a 11 semanas de edad fueron implantados subcutáneamente con 1 X 105 células CT26. El día 9, los ratones fueron inyectados con 100 mg/kg de CTX, intraperitonealmente. Veinticuatro horas después, el día 10, los ratones fueron tratados con 100 pg de B7-DC-lg. Hubo 5 grupos: los ratones que no recibieron ninguna célula tumoral, vehículo inyectado, CTX solo, CTX + B7-DC-lg o B7-DC-lg solo. Dos ratones no expuestos a ningún tipo de experimento y 4 ratones de otros grupos fueron retirados del estudio el día 1 1 (2 días después de CTX) y Día 16 (7 días después CTX) para análisis de células T. El panel izquierdo muestra el día 1 1 , 2 días después de la inyección de CTX, el Treg en el bazo de los ratones con tratamiento CTX fue significativamente menor que aquel en los ratones con implantación tumoral y inyectados con vehículos. El panel derecho muestra que el día 16, 7 días después de administración de CTX y 6 días después del tratamiento con B7-DC-lg, B7-DC-lg significativamente redujo las células T CD4+ que expresan PD-1 alto. Esto se observó tanto en ratones tratados con B7-DC-lg como en ratones tratados con CTX + B7-DC-lg. Los ratones implantados con células tumores pretendían tener más células PD-1 +/CD4+ T en el nodulo linfático en drenaje en comparación con ratones no expuestos a ningún tipo de experimento.

EJEMPLO 11 La combinación de ciclofosfamida y B7-DC-lq puede promover supervivencia en ratones en un modelo de tumor de próstata metastásico Ratones B10.D2 de 9 a 1 semanas de edad fueron inyectados intravenosamente con 3.0 x 105 células SP-1 , las cuales fueron aisladas a partir de metástasis pulmonar después de inyección de células TRAMP precursoras. Los ratones CTX recibieron 3 dosis de CTX, 50 mg/kg, el día 5, 12 y 19. Los ratones tratados con B7-DC-lg recibieron 3 dosis de B7-DC-lg, 5 mg/kg, el día 6, 13 y 20. El día 100, el 17% de ratones en los grupos de control, no tratados, CTX solo, B7-DC-lg solo sobrevivieron mientras el 43% de los ratones que recibieron combinación de CTX y B7-DC-lg sobrevivieron. Los resultados son mostrados en la figura 10.

EJEMPLO 12 La combinación de vacuna de Listeria contra el cáncer y B7-DC-lq puede aumentar la supervivencia en el ratón pos implantación hepática de CT26 Ratones Balb/C de 1 1-13 semanas de edad fueron implantados con células CT26 utilizando una técnica de inyección hemiesplénica (Yoshimura K. 2007, Cáncer Research). El día 10, los ratones recibieron 1 inyección de CTX con 50 mg/kg, intraperitonealmente. Veinticuatro horas después, el día 1 , los ratones fueron tratados con Listeria recombinante que llevara el péptido AH1 , un epítopo de CT26, en 0.1 LD50 (1x107 CFU), luego el día 14 y 17. Los ratones también fueron tratados con B7-DC-lg el día 11 y luego el día 18. La figura 1 1 muestra que los ratones sin ningún tratamiento o tratados con CTX y vacuna de Listeria contra el cáncer murieron todos antes del día 45. El 60% de los ratones que recibieron la combinación triple, CTX + vacuna Listeria cáncer y B7-DC-lg sobrevivieron.

Lista de referencias 1. Brode S, Cooke A. Immune-potentiating effects of the chemotherapeutic drug cyclophosphamide. Crit Rev.lmmunol. 2008;28(2): 109-26 2. van der Most RG, Currie AJ, Mahendran S, Prosser A, Darabi A, Robinson BW, Nowak AK, Lake RA. Tumor eradication after cyclophosphamide depends on concurrent depletion of regulatory T cells: a role for cycling TNFR2-expressing effector-suppressor T cells in limiting effective chemotherapy. Cáncer Immunol.lmmunother. 2009 Aug;58(8):1219-28 3. Taieb J, Chaput N, Schartz N, Roux S, Novault S, Menard C, Ghiringhelli F, Terme M, Carpentier AF, Darrasse-Jeze G, et al. Chemoimmunotherapy of tumors: cyclophosphamide synergizes with exosome based vaccines. J.lmmunol. 2006 Mar 1 ;176(5):2722-9 4. Machiels JP, Reilly RT, Emens LA, Ercolini AM, Lei RY, Weintraub D, Okoye Fl, Jaffee EM. Cyclophosphamide, doxorubicin, and paclitaxel enhance the antitumor immune response of granulocyte/macrophage-colony stimulating factor-secreting whole-cell vaccines in HER-2/neu tolerized mice. Cáncer Res. 2001 May 1 ;61(9):3689-97 5. Bass KK, Mastrangelo MJ. Immunopotentiation with low-dose cyclophosphamide in the active specific immunotherapy of cáncer. Cáncer Immunol.lmmunother. 1998 Sep;47(1):1-12 6. Hengst JC, Mokyr MB, Dray S. Cooperation between cyclophosphamide tumoricidal activity and host antitumor immunity in the cure of mice bearíng large MOPC-315 tumors. Cáncer Res. 1981 Jun;41 (6):2163-7 7. Hengst JC, Mokyr MB, Dray S. Importance of timing in cyclophosphamide therapy of MOPC-315 tumor-bearing mice. Cáncer Res. 1980 Jul;40(7):2135-41 8. Tsung K, Meko JB, Tsung YL, Peplinski GR, Norton JA. Immune response against large tumors eradicated by treatment with cyclophosphamide and IL-12. J.lmmunol. 1998 Feb 1 ;160(3):1369-77 9. Honeychurch J, Glennie MJ, lllidge TM. Cyclophosphamide inhibition of anti-CD40 monoclonal antibody-based therapy of B cell lymphoma is dependent on CD11 b+ cells. Cáncer Res. 2005 Aug 15;65(16):7493-501 10. Wada S, Yoshimura K, Hipkiss EL, Harris TJ, Yen HR, Goldberg MV, Grosso JF, Getnet D, Demarzo AM, Netto GJ, Anders R, Pardoll DM, Drake CG. Cyclophosphamide augmente antitumor immunity: studies in an autochthonous prostate cáncer model. Cáncer Res. 2009 May 15;69(10):4309-18. 11. Freeman.G.J. Structures of PD-1 with its ligands: sideways and dancing cheek to cheek. Proc. Nati. Acad. Sci. U. S. A 105, 10275-10276 (2008). 12. Brode.S. & Cooke.A. Immune-potentiating effects of the chemotherapeutic drug cyclophosphamide. Crit Rev. Immunol. 28, 109-126(2008). 13. van der Most.R.G. et al. Tumor eradication after cyclophosphamide depends on concurrent depletion of regulatory T cells: a role for cycling TNFR2-expressing effector-suppressor T cells in limiting effective chemotherapy. Cáncer Immunol. Immunother. 58, 1219-1228 (2009). 14. Taieb.J. et al. Chemoimmunotherapy of tumors: cyclophosphamide synergizes with exosome based vaccines. J. Immunol. 176, 2722-2729 (2006). 15. Bass.K.K. & Mastrangelo.M.J. Immunopotentiation with low-dose cyclophosphamide in the active specific immunotherapy of cáncer. Cáncer Immunol. Immunother. 47, 1-12 (1998). 16. Machiels.J.P. et al. Cyclophosphamide, doxorubicin, and paclitaxel enhance the antitumor immune response of granulocyte/macrophage-colony stimulating factor-secreting whole-cell vaccines in HER-2/neu tolerized mice. Cáncer Res. 61 , 3689-3697 (2001 ). 17. Hengst, J. C, Mokyr.M.B., & Dray.S. Cooperation between cyclophosphamide tumoricidal activity and host antitumor immunity in the cure of mice bearing large MOPC-315 tumors. Cáncer Res. 41 , 2163-2167 (1981). 18. Hengst.J.C, Mokyr.M.B., & Dray.S. Importance of timing in cyclophosphamide therapy of MOPC-315 tumor-bearing mice. Cáncer Res. 40, 2135-2141 (1980). 19. Tsung.K., Meko.J.B., Tsung.Y.L, Peplinski.G.R., & Norton, J.A. Immune response against large tumors eradicated by treatment with cyclophosphamide and IL-12. J. Immunol. 160, 1369-1377 (1998). 20. Honeychurch.J., Glennie.M.J., & lllidge.T.M.

Cyclophosphamide inhibition of anti-CD40 monoclonal antibody-based therapy of B cell lymphoma is dependent on CD1 1 b+ cells. Cáncer Res. 65, 7493-7501 (2005). 21. Wada S, Yoshimura K, Hipkiss EL, Harris TJ, Yen HR, Goldberg MV, Grosso JF, Getnet D, Demarzo AM, Netto GJ, Anders R, Pardoll DM, Drake CG. Cyclophosphamide augments antitumor immunity: studies in autochthonous prostate cáncer model. Cáncer Res. 2009 May ;69(10):4309-18.

Claims (67)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1. El uso de un compuesto que reduce la transducción de señales inhibitorias en una célula T, y un agente potenciador en la preparación de un medicamento para aumentar una respuesta de células T en un mamífero.

2. El uso como el que se reclama en la reivindicación 1 , en donde dicho compuesto es una proteína de fusión que comprende una primera y segunda porción péptida, en donde dicha primera parte péptida comprende un fragmento activo de un polipéptido antagonista del PD-1 y dicha segunda parte péptida comprende una porción de una inmunoglobulina (ig).

3 . El uso como el que se reclama en la reivindicación 2, en donde dicho antagonista del polipéptido del PD-1 es un polipéptido B7-DC tipo silvestre.

4. El uso como el que se reclama en la reivindicación 3, en donde dicho B7-DC es un B7-DC humano.

5. El uso como el que se reclama en la reivindicación 4, en donde dicho fragmento activo no comprende ninguna porción sustancial de la porción de transmembrana de dicho polipéptido B7-DC.

6. El uso como el que se reclama en la reivindicación 5, en donde dicho fragmento activo comprende la parte soluble de dicho polipéptido B7-DC y dicha segunda porción péptida comprende la región Fe de un anticuerpo pero no comprende ninguna región variable de dicho anticuerpo.

7. El uso como el que se reclama en la reivindicación 5, en donde dicho fragmento activo comprende la secuencia aminoácida SEQ ID NO: 3 y dicha segunda porción polipéptidica comprende la región Fe de un anticuerpo pero no comprende ninguna región variable de dicho anticuerpo.

8. El uso como el que se reclama en la reivindicación 4, en donde dicha primera porción péptida consta de una secuencia aminoácida que tiene al menos un 80% de identidad con aminoácidos 20-221 ó 20-121 de la SEQ ID NO: 1.

9. El uso como el que se reclama en la reivindicación 4, en donde dicha primera porción péptida consta de la secuencia aminoácida de aminoácidos 20-221 ó 20-121 de la SEQ ID NO: 1.

10. El uso como el que se reclama en la reivindicación 5, en donde dichos fragmentos fijadores del PD-1 comprenden al menos 10 aminoácidos adyacentes, o al menos 25 aminoácidos adyacentes, o al menos 50 aminoácidos adyacentes, o al menos 75 aminoácidos adyacentes, o al menos 90 aminoácidos adyacentes, o al menos 100 aminoácidos adyacentes de la SEQ ID NO: 1.

11. El uso como el que se reclama en la reivindicación 2, en donde dicha proteína de fusión comprende una secuencia aminoácida que tiene al menos un 80% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 9, 10, 12 ó 13.

12. El uso como el que se reclama en la reivindicación 2, en donde dicha proteína de fusión comprende la secuencia aminoácida SEQ ID 9, 10, 12, ó 13.

13. El uso como el que se reclama en la reivindicación 2, en donde dicha proteína de fusión es un monómero.

14. El uso como el que se reclama en la reivindicación 2, en donde dicha proteína de fusión es parte de un dímero.

15. El uso como el que se reclama en la reivindicación 14, en donde dicho dímero es un homodímero.

16. El uso como el que se reclama en la reivindicación 14, en donde dicho dímero es un heterodímero.

17. El método de la reivindicación 1 , en donde dicho agente potenciador es la ciclofosfamida o un análogo de la ciclofosfamida.

18. El uso como el que se reclama en la reivindicación 1 , en donde dicho agente potenciador es un agente que reduce la actividad de linfocitos T reguladores (T-regs).

19. El uso como el que se reclama en la reivindicación 1 , en donde dicho agente potenciador está adaptado para ser administrable antes de dicho compuesto.

20. El uso como el que se reclama en la reivindicación 19, en donde dicho agente potenciador está adaptado para ser administrable al menos X horas antes de dicho compuesto, en donde X es seleccionado a partir de 1 , 2, 3, 5, 10, 15, 20, 24 y 30.

21. El uso como el que se reclama en la reivindicación 1 , en donde el medicamento está además adaptado para ser administrable con al menos un agente adicional seleccionado del grupo que consta de un anticuerpo anti-PD-1 , un anticuerpo anti-CTLA4, un inhibidor de la mitosis, un inhibidor de la aromatasa, un antagonista A2AR, y un inhibidor de la angiogénesis.

22. El uso como el que se reclama en la reivindicación 1 , en donde dicho compuesto es un polipéptido que comprende un fragmento activo de un polipéptido B7-DC tipo silvestre.

23. El uso como el que se reclama en la reivindicación 22, en donde dicho fragmento activo no comprende ninguna porción de la porción de transmembrana de tal polipéptido.

24. El uso como el que se reclama en la reivindicación 22, en donde dicho polipéptido B7-DC es un polipéptido B7-DC humano.

25. El uso como el que se reclama en la reivindicación 24, en donde dicho fragmento activo comprende una secuencia aminoácida que tiene al menos un 80% de identidad con aminoácidos 20-221 ó 20-121 de la SEQ ID NO: 1.

26. El uso como el que se reclama en la reivindicación 24, en donde dicho fragmento activo consta de la secuencia aminoácida de aminoácidos 20-221 ó 20-121 de SEQ ID NO: 1.

27. El uso como el que se reclama en la reivindicación 23, en donde dicho fragmento fijador del PD-1 comprende al menos 10 aminoácidos adyacentes, o al menos 25 aminoácidos adyacentes, o al menos 50 aminoácidos adyacentes, o al menos 75 aminoácidos adyacentes, o al menos 90 aminoácidos adyacentes, o al menos 100 aminoácidos adyacentes de la SEQ ID NO: 1 ó 19.

28. El uso como el que se reclama en la reivindicación 1 , en donde dicho compuesto es un polipéptido que comprende un fragmento activo de un polipéptido B7-H1 tipo silvestre.

29. El uso como el que se reclama en la reivindicación 28, en donde dicho fragmento activo no comprende ninguna porción de la porción de transmembrana de tal polipéptido.

30. El uso como el que se reclama en la reivindicación 28, en donde dicho polipéptido B7-H1 es un polipéptido B7-H1 humano.

31. El uso como el que se reclama en la reivindicación 28, en donde dicho fragmento activo comprende al menos 10 aminoácidos adyacentes, o al menos 25 aminoácidos adyacentes, o al menos 50 aminoácidos adyacentes, o al menos 75 aminoácidos adyacentes, o al menos 90 aminoácidos adyacentes, o al menos 100 aminoácidos adyacentes de la SEQ ID NO: 16.

32. El uso como el que se reclama en la reivindicación 1 , en donde dicho compuesto es un polipéptido que comprende un fragmento activo de un polipéptido PD-1 tipo silvestre.

33. El uso como el que se reclama en la reivindicación 32, en donde dicho fragmento activo no comprende ninguna porción de la porción de transmembrana de tal polipéptido.

34. El uso como el que se reclama en la reivindicación 32, en donde dicho polipéptido del PD-1 es un polipéptido humano del PD-1.

35. El uso como el que se reclama en la reivindicación 32, en donde dicho fragmento activo comprende al menos 10 aminoácidos adyacentes, o al menos 25 aminoácidos adyacentes, o al menos 50 aminoácidos adyacentes, o al menos 75 aminoácidos adyacentes, o al menos 90 aminoácidos adyacentes, o al menos 100 aminoácidos adyacentes de la SEQ ID NO: 17 ó 18.

36. El uso como el que se reclama en la reivindicación 1 , en donde dicho compuesto es un anticuerpo anti-PD-1 o un fragmento activo del mismo.

37. El uso como el que se reclama en la reivindicación 36, en donde dicho agente potenciador es la ciclofosfamida o un análogo de la ciclofosfamida.

38. El uso como el que se reclama en la reivindicación 36, en donde dicho agente potenciador está adaptado para ser administrable antes de dicho compuesto.

39. El uso como el que se reclama en la reivindicación 38, en donde dicho agente potenciador está adaptado para ser administrable al menos X horas antes de dicho compuesto, en donde X se selecciona de 1 , 2, 3, 5, 10, 15, 20, 24 y 30.

40. El uso como el que se reclama en la reivindicación 1 , en donde dicho compuesto es un anticuerpo anti-CTI_A4 o un fragmento activo del mismo.

41. El uso como el que se reclama en la reivindicación 40, en donde dicho agente potenciador es la ciclofosfamida o un análogo de la ciclofosfamida.

42. El uso como el que se reclama en la reivindicación 40, en donde dicho agente potenciador está adaptado para ser administrable antes de dicho compuesto.

43. El uso como el que se reclama en la reivindicación 42, en donde dicho agente potenciador está adaptado para ser administrable al menos X horas antes de dicho compuesto, en donde X se selecciona de 1 , 2, 3, 5, 10, 15, 20, 24 y 30.

44. El uso como el que se reclama en la reivindicación 1 , en donde dicho compuesto consta del dominio extracelular de B7-DC, B7-H1 , PD- , B7.1 , o un fragmento activo de cualquiera de estos.

45. El uso como el que se reclama en la reivindicación 44, en donde dicho fragmento activo comprende al menos 10 aminoácidos adyacentes, o al menos 25 aminoácidos adyacentes, o al menos 50 aminoácidos adyacentes, o al menos 75 aminoácidos adyacentes, o al menos 90 aminoácidos adyacentes, o al menos 100 aminoácidos adyacentes.

46. El uso como el que se reclama en la reivindicación 1 , en donde dicho compuesto está presente en una cantidad suficiente para tratar una enfermedad susceptible de tratamiento mediante una respuesta inmune aumentada mediada por células T.

47. El uso como el que se reclama en la reivindicación 46, en donde dicho compuesto se selecciona del grupo que consta de: (a) una proteína de fusión que comprende dichas primera y segunda porciones péptidas, en donde dicha primera porción péptida comprende un fragmento activo de un polipéptido antagonista del PD-1 y dicha segunda porción péptida comprende una porción de una inmunoglobulina (Ig); (b) un anticuerpo anti-PD-1 , incluyendo fragmentos activos del mismo; (c) un anticuerpo anti-CTLA4, incluyendo fragmentos activos del mismo; (d) un polipéptido fijador del PD-1- o polipéptido fijador de ligandos del PD-1 ; y (e) una combinación de cualquier 2 o más entre (a), (b), (c) y (d).

48. El uso como el que se reclama en la reivindicación 47, en donde dicho agente potenciador es la ciclofosfamida o un análogo de la ciclofosfamida.

49. El uso como el que se reclama en la reivindicación 47, en donde dicho agente potenciador es un agente que reduce la actividad de linfocitos T reguladores (T-regs).

50. El uso como el que se reclama en la reivindicación 47, en donde dicho agente potenciador es Sunitinib (SUTENT®), anti-TGNFB o Imatinib (GLEEVAC®), antraciclinas, oxaliplatino, doxorubicina, antagonistas de TLR4, y antagonistas de IL-18.

51. El uso como el que se reclama en la reivindicación 47, en donde el medicamento está además adaptado para ser administrable con al menos un agente adicional seleccionado del grupo que consta de un anticuerpo anti-PD-1 , un anticuerpo anti-CTLA4, un inhibidor de la mitosis, un inhibidor de la aromatasa, un antagonista A2AR, y un inhibidor de la angiogénesis.

52. El uso como el que se reclama en la reivindicación 46, en donde dicha enfermedad es una enfermedad infecciosa.

53. El uso como el que se reclama en la reivindicación 46, en donde dicha enfermedad es el cáncer.

54. El uso como el que se reclama en la reivindicación 53, en donde dicho cáncer es cáncer de vejiga, cáncer cerebral, cáncer de mama, cáncer cervical, cáncer colo-rectal, cáncer esofágico, cáncer renal, cáncer hepático, cáncer pulmonar, cáncer nasofaríngeo, cáncer pancreático, cáncer de próstata, cáncer de piel, cáncer de estómago, cáncer uterino, cáncer ovárico, cáncer testicular, o cáncer hématológico.

55. Una composición terapéutica, que comprende un compuesto que previene la transducción de señales inhibidoras a través del Muerte Celular Programada-1 (PD- ) en células T y un agente potenciador en un vehículo farmacéuticamente aceptable, en donde dicho compuesto y dicho agente potenciador están juntos presentes en una cantidad efectiva para aumentar una respuesta de células T en un mamífero.

56. La composición de conformidad con la reivindicación 55, caracterizada además porque dicho compuesto se selecciona del grupo que consta de: (a) una proteína de fusión que comprende una primera y una segunda porción péptida, en donde dicha primera porción péptida comprende un fragmento activo de un polipéptido antagonista del PD-1 y dicha segunda porción péptida comprende una porción de una inmunoglobulina (Ig); (b) un anticuerpo anti-PD-1 , incluyendo fragmentos activos del mismo; (c) un anticuerpo anti-CTLA4, incluyendo fragmentos activos del mismo; (d) un polipéptido de fijación al PD-1-, polipéptido de fijación a ligandos del PD-1 , un polipéptido del PD-1 , o un fragmento activo de los mismos; y (e) una combinación de cualquier 2 o más entre (a), (b), (c) y (d).

57. La composición de conformidad con la reivindicación 55, caracterizada además porque dicho agente potenciador es la ciclofosfamida o un análogo de la ciclofosfamida.

58. La composición de conformidad con la reivindicación 55, caracterizada además porque dicho agente potenciador es Sunitinib (SUTENT®), anti-TGNFS o Imatinib (GLEEVAC®), antraciclinas, oxaliplatino, doxorubicina, antagonistas de TLR4, y antagonistas de IL-18.

59. La composición de conformidad con la reivindicación 47, ^ caracterizada además porque comprende adicionalmente al menos un agente adicional seleccionado del grupo que consta de un anticuerpo anti-PD-1 , un anticuerpo anti-CTLA4, un inhibidor de la mitosis, un inhibidor de la aromatasa, un antagonista A2AR, y un inhibidor de la angiogénesis.

60. El uso de un compuesto que reduce la transducción de señales inhibitorias en una célula T en la fabricación de un medicamento para aumentar una respuesta de células T mediante terapia de combinación, en donde dicho compuesto está adaptado para ser administrable en conjunto con un agente potenciador.

61. El uso del compuesto de la reivindicación 60, en donde dicho compuesto que reduce la transducción de señales inhibitorias en una célula T y dicho agente potenciador están adaptados para ser administrables como medicamentos separados en momentos distintos.

62. El uso como el que se reclama en la reivindicación 61 , en donde el agente potenciador está adaptado para ser administrable hasta 24 horas antes del compuesto inhibitorio.

63. El uso del compuesto y agente potenciador de la reivindicación 60 en el tratamiento de una enfermedad infecciosa.

64. El uso del compuesto y agente potenciador de la reivindicación 60 en el tratamiento del cáncer.

65. El uso como el que se reclama en la reivindicación 64, en donde dicho cáncer es cáncer de vejiga, cáncer cerebral, cáncer de mama, cáncer cervical, cáncer colo-rectal, cáncer esofágico, cáncer renal, cáncer hepático, cáncer pulmonar, cáncer nasofaríngeo, cáncer pancreático, cáncer prostético, cáncer de piel, cáncer estomacal, cáncer uterino, cáncer ovárico, cáncer testicular, o cáncer hematológico.

66. Un kit médico para administrar un compuesto que reduce la transducción de señales inhibitorias en una célula T en combinación con un agente potenciador, dicho kit comprende: (a) una provisión de dosificación de un compuesto que reduce la transducción de señales inhibitorias en una célula T, (b) una provisión de un agente potenciador; (c) una provisión de un vehículo farmacéuticamente aceptable; y (d) instrucciones impresas para administrar el compuesto en un uso de acuerdo con las reivindicaciones 60-65.

67. El uso como el que se reclama en la reivindicación 1 , en donde dicho compuesto consta de un dominio extracelular de B7-DC, B7-H1 , PD-1 , o B7-1 , o un polipéptido que difiere de aquellos mediante solamente sustituciones aminoácidas conservadoras, y fragmentos de éstas.