KR102437522B1 - 면역요법을 위한 동종이형 및 면역억제제 저항성인 ｔ 세포의 조작 방법 - Google Patents

면역요법을 위한 동종이형 및 면역억제제 저항성인 ｔ 세포의 조작 방법 Download PDF

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Abstract

면역억제 약물들에 저항성이며 또한 비-동종반응성(non-alloreactive)인 면역요법을 위한 엔지니어링된 T-세포들의 개발 방법들. 본 발명은 면역억제제를 위한 표적을 코드하는 유전자들 및 T-세포 수용체 모두, 특히 CD52 및 TCR을 코드하는 유전자들을 불활성화시킴으로써 T-세포들을 변셩시키는 방법들에 대한 것이다. 이 방법은 도너들로부터 또는 초기(primary) 세포들의 배양으로부터 이용가능한 T-세포들 내 키(key) 유전자들의 선택을 정확하게 표적으로 하기 위한, 특이적 레어(rare) 커팅(cutting) 엔도뉴클레아제들, 특히 TALE-뉴클레아제들(TAL 작용인자 엔도뉴클레아제) 및 이러한 폴리펩타이드들을 코드하는 폴리뉴클레오타이드들,의 용도를 포함한다. 본 발명은 암 및 바이러스를 위한, 표준이며 알맞게 채택된(adoptive) 면역요법 전략들로의 길을 연다.

Description

면역요법을 위한 동종이형 및 면역억제제 저항성인 Ｔ 세포의 조작 방법{METHODS FOR ENGINEERING ALLOGENEIC AND IMMUNOSUPPRESSIVE RESISTANT T CELL FOR IMMUNOTHERAPY}
본 발명은 면역억제제에 대하여 동종반응성(alloreactive) 및 저항성(resistant)인 면역 요법을 위한 조작된(engineered) T-세포들을 개발하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 면역억제제와 T-세포 수용체에 대한 표적을 코드하는 유전자들을 불활성화시킴으로써 T-세포들을 변형시키는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 T-세포들 내의 키(key) 유전자들의 선택을 정확하게 표적으로 하는 상기 폴리펩타이드들을 코드하는 특이적 레어-커팅 엔도뉴클레아제들, 특히 TALE-뉴클레아제들(TAL effector endonuclease) 및 폴리뉴클레오타이드들의 용도에 관한 것이며, 공여체(donor)들 또는 초기 세포(primary cell)들의 배양(culture)으로부터 이용 가능하다. 또한 본 발명은 전구TCRα ("pTalpha") 및 이의 기능성 유도체들, 키메라 항원 수용체(CAR), 다연쇄(CAR) 및 면역 요법의 효율을 향상시키기 위한 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 암 및 바이러스 감염을 치료하기 위한 표준적 및 적합한 양자 면역 요법(adoptive immunotherapy)에 대한 방식을 가능하게 한다.
본 출원 청구항은 35 U.S.C. 119(e) 하에서 2012. 05. 25 일자로 출원된 미국 가출원번호 제61/651,933호; 및 2012. 09. 04 일자로 출원된 미국 가출원번호 제61/696,612호에 대하여 우선하며, 이들 전체는 본원에 참조 문헌으로서 병합된다.
엑스-비보(ex-vivo)에서 생성된 자가(autologous) 항원-특이적 T-세포들의 전달(transfer)을 포함하는 양자 면역 요법은 바이러스 감염들 및 암을 치료하기 위한 촉망되는 전략이다. 양자 면역 요법을 위해 사용되는 T-세포들은 유전적 조작을 통한 항원-특이적 T-세포들의 확장 또는 T-세포들의 전용(redirection)에 의해 생성될 수 있다(Park, Rosenberg et al. 2011). 바이러스 항원 특이적 T-세포들의 전달(transfer)은 이식 연관 바이러스 감염과 드문 바이러스-연관 악성 종양의 치료를 위해 사용되는 잘 확립된 과정이다. 유사하게, 종양 특이적 T-세포들의 분리 및 전달(transfer)은 흑색종(melanoma)의 치료에 성공적인 것으로 나타나고 있다.
T-세포들 내의 신규한 특이성은 형질 전환 T-세포 수용체들 또는 키메라 항원 수용체(CAR)들의 유전적 전달을 통해 성공적으로 생성되었다(Jena, Dotti et al. 2010). CAR들은 단일 융합 분자(single fusion molecule) 내에서 하나 이상(one or more)의 신호 전달(signaling) 도메인들과 연결된 표적화 부위(targeting moiety)로 이루어진다. 일반적으로, CAR의 결합 부위(binding moiety)는 유연성 링커(flexible linker)에 의해 연결된 단일클론항체(monoclonal antibody)의 작은 가변 단편(variable fragment)을 포함하는 단일사슬 항체(single-chain antibody; scFv)의 항원-결합 도메인으로 이루어진다. 또한 수용체 또는 리간드 도메인들에 기반한 결합 부위(binding moiety)들은 성공적으로 사용되었다. 제 1 생성 CAR들을 위한 신호 전달 도메인들은 CD3zeta 또는 Fc 수용체 감마 사슬의 세포질 영역(cytoplasmic region)으로부터 유래된다. 제 1 생성 CAR들은 T-세포 세포독성의 전용에 성공적인 것으로 나타나고 있으나, 인-비보에서 장기간 확장 및 항-종양 활성을 제공하는 것에 실패하였다. CD28, OX-40 (CD134) 및 4-1BB (CD137)를 포함하는 공동-자극 분자(co-stimulatory molecule)들로부터 신호 전달 도메인(signaling domain)은 CAR 변형 T-세포들의 생존을 향상시키고 증식을 증가시키기 위해 단독(제 2 생성) 또는 조합(제 3 생성)으로 추가되었다. CAR들은 림프종 및 고형 종양을 포함하는 다양한 흑색종들의 종양 세포의 표면에서 발현되는 항원들에 대하여 전용되기 위한 T-세포들을 성공적으로 허용하였다(Jena, Dotti et al. 2010).
현재 CAR 구조들은 모든 관련 도메인들이 단일 폴리펩타이드 내에 포함되는 디자인을 기반으로 한다. 상기 디자인은 신호 전달 도메인(signaling domain)들의 연속적인 추가를 필요로 하며, 이에 따라 이들의 정상적인 막근접 위치(juxtamembrane position)들로부터 동일한 도메인들을 움직이는 것을 필요로 한다. 따라서, 리간드들과 신호 전달 도메인(signaling domain)들이 분리된 구조는 원형질막(plasma membrane)으로부터 원위에 위치된 동일한 도메인들과 서로 추가되는 대신 이들의 정상적인 막 근접 위치(juxtamembrane position)들 내의 서로 다른 사슬들 상에 위치된 공동자극(costimulatory) 도메인들의 향상된 작용을 가능하도록 할 수 있다. IgE (FcεRI)를 위한 정상적인 수용체, 고친화성 수용체는 상기 구조를 제공할 것이다. 비만세포(mast cell)들과 호염구(basophil)들 상에 존재하는 FcεRI는 IgE에 고친화성으로 결합한다. FceRI는 리간드 결합 알파 서브유닛, 베타 서브유닛 및 두 개의 신호-전달 감마 서브유닛의 호모다이머(homodimer)로 구성된 4합체(tetrameric) 수용체 복합체이다(Metzger, Alcaraz et al. 1986). FcεRI 알파 도메인은 IgE에 결합하는 Ig-유사 도메인들, 막관통 도메인(transmembrane domain) 및 짧은 세포질 테일(cytoplasmic tail)을 포함하는 세포외 도메인(extracellular domain)으로 구성된다. 베타 서브유닛은 아미노와 카복시 말단 세포질 테일(cytoplasmic tail)들을 분리하는 네 개의 막관통 세그먼트(transmembrane segment)들을 포함한다. 감마 사슬은 막관통 영역(transmembrane region)과 하나의 면역수용체 타이로신-기반 활성화 모티프(immunoreceptor tyrosine-based activation motif; ITAM)를 포함하는 세포질 테일(cytoplasmic tail)로 필수적으로 이루어진다(Cambier 1995). TCR 복합체의 제타 사슬은 감마 사슬과 밀접하게 연관되며, FcεRI의 감마 사슬을 대체할 수 있다(Howard, Rodewald et al. 1990).
현재 양자 면역 요법을 사용하여 환자들을 치료하기 위한 프로토콜(protocol)은 자가(autologous) 세포 전달을 기반으로 한다. 상기 방식에 있어서, 환자들로부터 회수되며, 엑스-비보에서 유전적으로 변형되거나 선택되며, 세포의 수를 증폭시키기 위해 인 비트로에서 배양되며, 필요하다면 최종적으로 환자에게 주입된다. 림프구 주입에 더하여, 숙주는 예를 들어, (방사선 치료 또는 화학요법과 함께) 사전-조건화(pre-conditioning) 및 (IL-2와 같은) 림프구 생장 인자(lymphocyte growth factor)들의 투여와 같은 T-세포들의 생착 또는 면역 반응 내 이들의 참여를 지원하는 다른 방식들로 조작될 수 있다. 각 환자는 환자 자신의 림프구들을 사용(즉, 자가 요법)하여 개별적으로 제작된 치료를 받는다. 자가 요법들은 실제 적용하는데 상당한 기술적 및 병참학적 장애물들에 직면하며, 이들의 생성은 고가의 전용 시설과 전문 인력을 요구하며, 이들은 환자의 진단에 따라 단시간 내 생성되어야 하며, 대부분의 경우에 있어서 환자의 사전치료는 저하된 면역 기능을 야기하여 환자의 림프구들이 불충분하게 기능하며 매우 적은 수로 존재할 수 있다. 이러한 장애물들 때문에, 각 환자들의 자가 세포 제조는 실질적으로 새로운 제품으로, 효과 및 안정성에 상당한 변화들을 야기한다. 이상적으로, 동종이형 치료용 세포들이 사전-제조될 수 있으며, 상세하게는 환자들에게 즉시 투여를 위해 이용 가능한 것을 특징으로 하는 표준화된 요법을 사용하는 것이 요구된다. 동종이형은 동일한 종에 속하는 개체들로부터 얻어지나, 유전적으로는 유사하지 않은 세포를 의미한다. 다만, 현재 동종이형 세포(allogenic cell)들의 사용은 많은 문제점을 가진다. 면역-적격 숙주(immune-competent host)들에 있어서 동종이형 세포(allogenic cell)는 빠르게 거부되며, 숙주대이식거부(host versus graft rejection; HvG)로 지칭되는 과정, 이는 실질적으로 전달된 세포의 효과를 제한한다. 면역-적격 숙주들에 있어서, 동종이형 세포(allogenic cell)는 생착될 수 있으나, 이들의 내인성(endogenous) TCR 특이성들은 외래(foreign)의 숙주 조직을 인식하여, 이식편대숙주병(graft versus host disease; GvHD)을 야기하여, 심각한 조직 손상 및 사멸을 야기할 수 있다. 효과적으로 동종이형 세포(allogenic cell)를 사용하기 위해, 이들 문제점 모두가 극복되어야 한다.
면역-적격 숙주들에 있어서, 동종이형 세포(allogenic cell)들은 숙주 면역 시스템에 의해 신속하게 거부된다. 방사선 조사되지 않은 혈액 제품 내에 존재하는 동종이형 백혈구는 5 내지 6일 이하로 잔존할 것이라는 것이 증명되었다(Boni, Muranski et al. 2008). 따라서, 동종이형 세포(allogenic cell)들의 거부를 예방하기 위해, 숙주의 면역 시스템은 효과적으로 억제되어야 한다. 글루코코르티코이드스테로이드들은 면역억제를 위해 치료상으로 광범위하게 사용된다(Coutinho and Chapman 2011). 상기 부류의 스테로이드 호르몬들은 T-세포들의 세포기질(cytosol) 내에 존재하는 글루코코르티코이드 수용체(GR)에 결합하여 핵 내로 전좌(translocation)와 면역학적 과정 내에 포함된 다수의 유전자들의 발현을 조절하는 특이적 DNA 모티프들의 결합을 야기한다. 글루코코르티코이드 스테로이드들에 의한 T-세포들의 치료는 T-세포 아네르기(anergy)로 이어지고 T-세포 활성화를 저해하는 사이토카인(cytokine) 생성의 감소된 수준을 야기한다. CAMPATH1-H으로도 알려진 알렘투주맙(Alemtuzumab)은 CD52, 12 아미노산 글리코실포스파티딜-이노시톨-(GPI) 연결된 당단백질을 표적으로 하는 인간화 단일클론항체(monoclonal antibody)이다(Waldmann and Hale 2005). CD52는 T 및 B 림프구들 상에 높은 수준, 단핵구(monocyte)emf 상에 낮은 수준으로 발현되는 반면, 과립구(granulocyte)들 및 골수 전구체(bone marrow precursor)들 상에는 존재하지 않는다. CD52를 대상으로 하는 인간화 단일클론항체(monoclonal antibody), 알렘투주맙(Alemtuzumab)을 이용한 치료는 림프구들과 단핵구들의 순환의 신속한 고갈을 유도하는 것으로 나타났다. 이것은 T-세포 림프종(lymphoma)들과 어떤 경우에는 장기 이식을 위한 조절 요법의 일부로서 종종 사용된다. 다만, 양자 면역 요법에 있어서, 면역억제제의 사용은 도입된 치료용 T-세포들에 유해한 영향을 가질 수 있을 것이다. 따라서, 이러한 조건 내에서 양자 면역 요법 접근을 효과적으로 사용하기 위해서, 도입된 세포들은 면역억제 치료에 대하여 저항성이 요구될 것이다.
반면, T-세포 수용체(TCR)들은 세포 표면 수용체들이며, 항원의 존재에 반응하여 T-세포들의 활성화에 관여한다. TCR은 일반적으로 헤테로다이머(heterodimer)를 형성하기 위해 조립되는 두 개의 사슬, 알파 및 베타로 이루어지며, 세포 표면 상에 존재하는 T-세포 수용체 복합체를 형성하기 위해 CD3-전달 서브유닛과 연결된다. TCR의 각 알파 및 베타 사슬은 면역글로불린-유사 N-말단 가변(V) 및 불변(C) 영역. 소수성 막관통 도메인 및 짧은 세포질 영역으로 이루어진다. 면역글로불린 분자에 있어서, 알파 및 베타 사슬의 가변 영역은 V(D)J 재조합에 의해 생성되어, T-세포들의 집단 내에 항원 특이성의 큰 다양성을 생성한다. 다만, 온전한 항원을 인식하는 면역글로불린과 대조적으로, T-세포들은 MHC 분자와 연관된 처리된 펩타이드 단편에 의해 활성화되어, MHC 제한(MHC restriction)으로 알려진 T-세포들에 의한 항원 인식에 대한 추가적 차원(extra dimension)을 도입한다. T-세포 수용체를 통해 공여체(donor)와 수용체(recipient) 사이의 MHC 차이의 인식은 T-세포 증식과 GVHD의 잠재적 발달을 야기한다. TCR의 정상적인 표면 발현은 복합체의 모든 7개의 성분(component)들의 동조적 합성(coordinated synthesis)와 조립에 따른다는 것으로 나타났다(Ashwell and Klusner 1990). TCR알파 또는 TCR베타의 불활성화는 동종항원(alloantigen)의 인식과 이에 따른 GVHD를 예방하는 T-세포들의 표면으로부터 TCR의 제거를 야기할 수 있다. 다만, TCR 분열은 CD3 신호전달 성분(component)의 제거를 야기하며, 추가적인 T-세포 확장 수단을 변경한다.
정상적인 T-세포들에 있어서, T-세포 수용체들은 미숙한 흉선 세포(thymocyte)에 의해 발현되며, 이중-음성(CD4- CD8-)에서 이중-양성(CD4+ CD8+) 스테이지로 T-세포 발달에 결정적인 전구-T-세포 수용체(pTCR)들로부터 유래한다. TCR베타 좌위의 생산적 재배열에 성공한 전구-T-세포들은 전구-TCR 복합체를 형성하기 위해 불변의 전구T알파(preTalpha) 사슬과 CD3 신호 전달 성분(component)과 짝을 형성하는 기능성 TCR베타 사슬을 발현한다. 세포 표면에서 전구TCR의 발현은 베타-선택, TCR베타 좌위의 대립 유전자 배제(allelic exclusion)를 실시하여 TCR알파 좌위에서 재배열의 유도를 야기하는 발달하는 T-세포들의 확장을 유도하는 과정, 의 개시를 위해 필요하다(von Boehmer 2005). 성숙한 TCR을 형성하기 위한 생산적 TCR알파 재배열과 TCR알파에 의한 pT알파의 치환 이후에, 흉선 세포(thymocyte)들은 흉선 피질 세포(thymic epithelial cell)들 상에 발현되는 자가 펩타이드 MHC 복합체들이 결합할 때 양성 또는 TCR알파/베타 선택으로서 언급되는, 선택의 제 2 단계를 수행한다. 따라서, 성숙한 T-세포들은 이들의 TCR을 통해 항원/MHC 복합체를 인식하고 반응한다. TCR 활성화의 가장 즉각적인 결과는 T-세포들의 클론 확장(clonal expansion), 세포 표면 상에 활성화 마커들의 상향조절(upregulation) 및 세포독성 또는 사이토카인(cytokine) 분비의 유도를 포함하는 복수의 사건들을 야기하는 연결된 CD3 서브유닛들을 통한 신호 전달 경로의 시작이다.
흉선 발달(thymic development) 동안 전구T알파(preTalpha)와의 짝지음을 통한 TCR베타 사슬들의 선택의 특성 때문에, T-세포들 내에서 TCR알파는 불활성화되며, pT알파 전이유전자(transgene)의 이종 도입(heterologous introduction)은 전구TCR의 형성을 야기할 수 있다. 상기 pTCR은 MHC 비의존적인 방식으로 T-세포 활성화 또는 자극의 수단으로서 제공될 수 있으며, 이에 따라 예를 들어 TCR알파 불활성화 이후의 알파/베타 T-세포들의 지속적인 확장이 가능하도록 한다. 중요하게는, pTCR 복합체는 연결된 CD3 서브유닛들에 대하여 TCR으로서 유사한 생화학적 구성을 나타낸다(Carrasco, Ramiro et al. 2001). 게다가, TCR과는 다르게, 전구-TCR 신호 전달은 리간드 독립적 사건에 의해 부분적으로 발생할 수 있다. pTCR 세포외 도메인(extracellular domain)의 결정 구조는 pTCR 신호 전달의 가능한 리간드-독립성을 위한 구조적 기초를 제공하였다. pTCR은 두 개의 pT알파-TCR베타 헤테로다이머가 연결되는 곳에서 머리 꼬리(head to tail) 다이머를 형성하는 것으로 나타났다(Pang, Berry et al. 2010).
본 발명에 있어서, 발명자들은 현재 면역 요법 전략의 제한을 극복하여 면역억제제에 대하여 비-동종반응성(alloreactive) 및 저항성(resistant)이 될 수 있는 유전적으로 변형된 T-세포들의 제조를 달성하였다. 이것은 특히 CD52 및 GR인 서로 다른 면역억제제들에 대한 표적을 코드하는 유전자들의 불활성화와 연계된 TCR알파 또는 TCR베타를 대상으로 하는 특이적 TALE-뉴클레아제들을 사용하는 유전자 불활성화에 의해 가능해졌다.
특히, 동종이형 공여체(donor)로부터 유래된 T 림프구 내의 CD52 또는 글루코코르티코이드 수용체의 불활성화와 결부된 TCR알파 또는 TCR베타의 불활성화는 TCR을 제거함으로써 이들 세포들의 거부를 예방하는 알렘투주맙(Alemtuzumab) 또는 글루코코르티코이드 스테로이드들과 같은 면역억제제의 존재 하에서 도입된 림프구들의 증식과 활성을 허용하는 동안, MHC 차이(disparity)의 인식에 원인이 있는 GVHD의 위험을 유의적으로 감소시킨다. 따라서, 이들 변형된 동종이형 T-세포들은 종양 세포들 또는 감연된 세포들을 표적으로 할 수 있는 환자의 혈액 내에서 보다 효율적으로 확장할 것으로 기대된다.
비-동종반응성 및 면역억제 저항성일 수 있는 유전적으로 변형된 T-세포들의 상기 개념에 더하여, 본 발명자들은 특이적 TALE-뉴클레아제들의 용도 및 디자인에 의해 T-세포들 내의 서로 다른 유전자들을 부수적으로 불활성화되며, 이에 따라 이중 돌연변이들을 얻었다. 실제로, DSB에 의한 이중 유전자 표적화는 배양 시간에 걸쳐 T-세포들을 수득하고 유지하는 것의 어려움, 이들의 낮은 형질절환(transformation) 속도 및 선택 과정들 동안 상실 때문에 지금까지 달성되지 않았다. 이러한 어려움들은 상기 세포들을 얻기 위한 성공의 낮은 가능성을 야기한다.
따라서, 본 발명의 하나의 중요한 부분은 (특히 공동-트랜스펙션 시) 세포들에 의해 잘 감내될 수 있으며, T-세포 내에서 높은 속도의 DSB 사건들을 가능하게 하는 특이적 TALE-뉴클레아제들이 디자인되며, 본 발명에 따른 유전자들의 선택을 표적으로 하는 것이 가능하다는 것이다. 본원에 개시된 TALE-뉴클레아제들로서 레어-커팅 엔도뉴클레아제들을 사용함에 따라, 트랜스펙션된 T-세포들 내의 유전자들의 이중 불활성화를 얻을 가능성이 유의적으로 증가되었으며, 표준 절차를 사용하여 정기적으로 공여체로부터 이용 가능한 조작된(engineered) T-세포들을 생산하는 것이 가능한 것으로 나타났다.
게다가, 본 발명은 TCR알파가 불활성화될 때 T-세포들이 증식이 가능하도록 조작되는 실시예를 제안한다. TCR 서브유닛 불활성화가 수행되는 T-세포들과 함께 중요한 문제는 세포들이 더 이상 CD3 복합체를 통해 확장될 수 없다는 것이다. 상기 문제점을 해결하기 위해, 본 발명자들은 세포들 내에 전구T알파(preTalpha)의 발현에 의해 TCR알파가 CD3 복합체를 통해 불활성화되어 있는 실질적으로 T-세포들을 확장하기 위한 수단을 제공하며, 이에 따라 기능성 알파/베타 TCR의 부재 하에서 기능적 CD3 복합체를 회복시킨다.
최종적으로, T-세포들은 MHC의 독립적인 종양 관련 항원들을 향한 동종이형 세포들의 특이성을 전용하기 위해 CAR과 함께 추가적으로 형질전환된다. 특히, 본 발명은 다연쇄 CAR에 관한 것이며, 공동자극(costimulatory) 도메인들은 이들의 기능들을 개선하고, 생존율을 높이고, 조작된(engineered) T-세포들의 증식을 증가시키기 위해 이들의 정상적인 막근접 위치(juxtamembrane position)들 내에 위치된다. 그 결과, 본 발명은 양자 면역 요법을 위한 동종이형 T-세포들의 효과적인 형질전환과 CD3 복합체를 통한 이들의 용이한 확장을 가능하도록 하는 방법들, 폴리펩타이드들 및 폴리뉴클레오타이드들을 제공한다.
암 및 바이러스 감염을 치료하기 위한 표준적 및 적합한 양자 면역 요법(adoptive immunotherapy)에 대한 방식을 가능하게 한다.
일 측면에 있어서, 본 발명은 면역 요법 목적들에 적합하도록 만들기 위한 T-세포들, 특히 공여체들로부터 얻을 수 있는 동종이형 T-세포들을 조작하는 방법들을 개시한다. 보다 구체적으로 본 발명의 방법들은 MHC 인식 및/또는 암 및/또는 바이러스 감염들의 치료를 위한 면역억제제의 표적들과 연관된 유전자들을 불활성화 또는 대체함으로써 면역 요법과 관련된 세포들의 유전체의 정확한 변형을 가능하도록 한다. 특정 실시예들에 있어서, 면역 요법과 관련된 변형된 세포들은 추가적으로 특이적 세포 인식을 위한 CAR들을 코드하는 외인성 재조합 폴리뉴클레오타이드들을 포함한다. 현재 CAR들은 신호 전달 도메인의 연속적 추가(serial appending)을 필요로 하는 단일 융합 분자(single fusion molecule)이다. 이들의 정상적인 막근접 위치(juxtamembrane position)로부터 신호 전달 도메인(signaling domain)들의 이동은 이들의 기능을 방해할 수 있다. 따라서, 상기 문제점을 해결하기 위해, 본 발명자들은 모든 관련 신호 전달 도메인(signaling domain)들의 정상적인 막근접 위치(juxtamembrane position)가 가능하도록 하기 위해 FcεRI로부터 유래된 다연쇄 CAR을 디자인한다. FcεRI 알파 사슬의 고친화성 IgE 결합 도메인은 세포 표적에 대한 T-세포 특이성을 전용하기 위해 scFv와 같은 세포외 리간드-결합 도메인에 의해 대체되며, FcεRI 베타 사슬의 N 및/또는 C-말단 테일들은 정상적인 막근접 위치(juxtamembrane position)들 내에 공동자극 신호들을 위치시키기 위해 사용된다.
다른 측면에 있어서, TCR알파가 불활성화되는 T-세포들의 활성화 또는 자극을 촉진하기 위해, pT알파 또는 이의 기능성 변형체는 조작된(engineered) T-세포들 내로 도입된다. pT알파 또는 이의 기능성 변형체는 전체-길이 pT알파, 스플라이스 변형체(Saint-Ruf, Lechner et al. 1998) 또는 전구TCR 세포 표면 발현을 나타내는 C-말단 절단된 형태로 사용될 수 있다(Carrasco, Ramiro et al. 2001). 개시된 것보다 작거나 큰 다른 추가적인 절단들이 사용될 수 있다. 상이한 전구T알파(preTalpha) 형태들은 추가적으로 증식 및 생존을 증진시키기 위해 다른 분자들로부터 신호 전달 부위들(CD28, CD137, CD8, TCR알파 등)을 포함하거나 이전에 쥐에서 개시된 D22A, R24A, R102A 또는 R117A 돌연변이들(Yamasaki, Ishikawa et al. 2006)과 같이 이량화하기 위한 이의 능력에 영향을 주는 돌연변이들 또는 증식 잠재력을 감소시키기 위한 인간에서 개시된 W46R 돌연변이를 포함할 수 있다. 또한 CAR의 scFv 부분은 pT알파 또는 이의 기능성 변형체의 세포외 도메인(extracellular domain)에 융합될 수 있으며, 이에 따라 전구TCR의 증식 활성과 표적 항원들에 대한 특이성을 직접적으로 연결할 수 있다.
다른 측면에 있어서, 본 발명은 상기 목적 유전자들, 특히 TCR알파, TCR베타, GR 및 CD52를 정확하게 표적으로 하여 면역 요법을 위한 T-세포들을 유전적 변형이 가능하도록 하기 위한 폴리펩타이드들 및 레어-커팅 엔도뉴클레아제들을 코드하는 폴리뉴클레오타이드들에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 이들 유전자들 내의 특이적 표적 서열들과 이들 유전자들을 개별적으로 표적으로 하기 위해 디자인된 TALE-뉴클레아제들을 제공한다.
또한 본 발명은 본원에 개시된 임의의 단백질들, 폴리펩타이드들 또는 벡터들을 포함하는 분리된 세포들 또는 세포주(cell line)들에 관한 것이다. 특정 실시예에 있어서, 본 발명의 T-세포들은 면역 요법 내에서 이들의 용도를 위한 불활성화된 TCR알파, TCR베타, GR 또는 CD52 유전자들을 포함한다. 본 발명의 분리된 세포들 또는 세포주들은 추가적으로 외인성(exogenous) 재조합 폴리뉴클레오타이드들, 특히 pT알파 또는 이의 기능성 변형체, CAR들 또는 다연쇄 CAR들을 코드하는 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
바람직한 실시예에 있어서, 변형된 T-세포들은 치료제, 이상적으로는 "기성(off the shelf)" 제품으로서 사용된다.
다른 측면에 있어서, 본 발명은 상기 방법에 의해 얻을 수 있는 조작된(engineered) T-세포를 투여함으로써 환자의 암 또는 감염들을 치료 또는 예방하기 위한 방법에 관한 것이다.
본 발명은 암 및 바이러스 감염을 치료하기 위한 표준적 및 적합한 양자 면역 요법(adoptive immunotherapy)에 대한 방식을 가능하게 한다.
상술한 특징에 더하여, 본 발명은 추가적으로 하기의 설명과 첨부된 도면들로부터 확인될 수 있는 다른 특징들을 포함한다. 하기의 상세한 설명과 함께 하기의 도면들을 참조로 하여 이해할수록 본 발명의 보다 완전한 이해와 이의 다양한 부수적인 이점들은 용이하게 얻어질 것이다.
도 1: T-세포들과 항원 제시 세포(antigen presenting cell) 사이의 일반적인 관계의 개략도
도 2: 본 발명에 따라 유전적으로 변형된 치료용 T-세포들과 환자의 종양 세포들의 개략도
도 3: 다연쇄 CAR의 개략도
도 4: 다연쇄 CAR들의 서로 다른 형태의 개략도. A. FcεRI 수용체의 개략도. B-C scFv 및 FcεRI 알파 사슬의 막관통 도메인과 융합된 CD8 줄기 영역(stalk region)을 포함하는 다연쇄 CAR (csm1 내지 csm10)들의 서로 다른 형태. 적어도 하나의 41BB, CD28 및/또는 CD3 제타 도메인들은 FcεRI 알파, 베타 및/또는 감마 사슬에 융합될 수 있다.
도 5: 면역 요법을 위한 인간 동종이형 세포들을 조작하는 방법의 일 실시예의 개략도
도 6: 보체 또는 대조군(control)들과 함께 항-CD52 항체(CAMPATH1-H)로 치료 후 살아있는 CD52-양성 또는 CD52-음성 세포들의 밀리리터당 세포들의 농도
도 7: TCR-양성 및 TCR-음성 세포들 사이, 또는 CD52-양성 및 CD52-음성 세포들 사이, 및 대조군으로서 비활성화된 세포들의 전방 산란(FSC) 분포, 세포 크기의 지표의 비교
도 8: 표적된 CD52 및 TCR알파 불활성화된 T-세포들 상에서의 CD107a 발현(탈과립(degranulation)의 마커) 의 유세포분석(Flow cytometry analysis). CD107 발현은 Daudi 세포들과 배양하기 전(A) 및 후(B)의 CD52+TCRαβ+ 세포들(제 1 컬럼), CD52-TCRαβ- 세포들(제 2 컬럼), CD52-TCRαβ+ 세포들(제 3 컬럼) 및 CD52+TCRαβ- 세포들(제 4 컬럼) 상에서 분석되었다; C)는 추가적으로 CAR로 형질감염(transfect)되고, Daudi 세포들과 배양된 T-세포들의 유세포분석(Flow cytometry analysis)을 나타낸다; D)는 CAR로 트랜스펙트되었으나 Daudi 세포들과 배양되지 않은 T-세포들의 유세포분석(Flow cytometry analysis)을 나타내며, E)는 CAR로 트랜스펙트되고, PMA/이오노마이신(ionomycin)으로 처리된 T-세포들(양성 대조군)의 유세포분석(Flow cytometry analysis)을 나타낸다.
도 9: CD52와 TRAC TALE-뉴클레아제들의 잠재적인 오프-사이트(off-site) 표적들의 딥 시퀀싱(deep sequencing) 분석.
도 10: T7-엔도뉴클레아제 측정법에 의한 PDCD1 및 CTLA-4 유전체 좌위 분석.
도 11: 전구T알파(preTalpha) 구조체(construct)의 일부 예들의 개략도.
도 12: TCR 알파 불활성화된 JurkaT-세포들 내 형질도입(transduction) 효율(% BFP+ 세포들) 및 FL, Δ8, Δ8 pT알파 구조체들(% CD3 표면 발현)의 활성의 유세포분석(Flow cytometry analysis).
도 13: pT알파 단백질(preTCRα)에 대한 렌티바이러스 구조체(lentiviral construct) 코딩의 개략도.
도 14: A. 실험 프로토콜(protocol)의 도시. B. 정제 전 및 후 BFP-2A-pT알파Δ48 (KO/Δ48) 또는 대조군 BFP 렌티바이러스 벡터(KO/BFP)로 형질도입된 TCR알파 불활성화된 T-세포들(KO) 상의 TCR 알파/베타, CD3 발현 및 BFP 발현의 유세포분석(Flow cytometry analysis). C. BFP-2A-pT알파Δ48 렌티바이러스 벡터로 형질도입되거나(BFPpos) 그렇지 않은(BFPneg) 정제된 TCR 알파 불활성화된 세포들 상의 TCR 알파/베타 및 CD3 발현의 유세포분석(Flow cytometry analysis). NEP는 TRAC TALE-뉴클레아제들로 비전기청공된 세포들을 나타낸다.
도 15: A-B. BFP-2A-pTα-Δ48 렌티바이러스 벡터(pTα-Δ48), BFP-2A-pTα-Δ48.41BB 렌티바이러스 벡터(pTα-Δ48.BB) 또는 대조군 BFP 벡터(BFP)로 형질도입된 비전기청공된 세포들(NEP) 및 TCR알파 불활성화된 세포들(KO) 상에서 각각 항-CD3/CD28 비즈(beads)로 재-활성화 후 24 및 48 시간의 초기 활성화 마커 CD69 (A), 후기 활성화 마커 CD25 (B) 발현의 유세포분석(Flow cytometry analysis).
pTα-Δ48 히스토그램은 pTα-Δ48 (BFP+ 세포들)을 발현하는 TCR 불활성화된 세포들 내에서 발견된 신호에 해당하는 반면, KO 히스토그램은 pTα-Δ48 (BFP- 세포들)을 발현하지 않는 TCR 알파 불활성화된 세포들 내에서 발견된 신호에 해당하며, pTα-Δ48.41BB 히스토그램은 pTα-Δ48.41BB (BFP+ 세포들)을 발현하는 TCR 불활성화된 세포들 내에서 발견된 신호에 해당하는 반면, KO 히스토그램은 pTα-Δ48.41BB (BFP- 세포들)을 발현하지 않는 TCR 알파 불활성화된 세포들에 해당한다. NEP (비전기천공된) 히스토그램은 비조작된 세포들 내에서 발견된 신호에 해당한다. C. BFP-2A-pTα-Δ48 렌티바이러스 벡터(pTα-Δ48), BFP-2A-pTα-Δ48.41BB 렌티바이러스 벡터(pTα-Δ48.BB) 또는 대조군 BFP 벡터(BFP)로 형질도입된 비전기천공된 세포들(NEP) 및 TCR알파 불활성화된 세포들(KO) 상에서 항-CD3/CD28로 재-활성화 후 72 시간의 세포들의 크기의 유세포분석(Flow cytometry analysis). 각 그래프의 상부에 표시된 값은 각 집단의 형광의 기하평균에 해당한다.
도 16: 서로 다른 시간 지점들(x-축)에서 IL2 또는 항-CD3/CD28 비즈와 IL2 내에서 유지되는 pT알파-Δ48 (pTαΔ48) 또는 대조군 BFP 벡터(BFP)로 형질도입된 TCR 알파 불활성화된 세포들(KO)의 세포 생장 분석. BFP+ 세포들 수는 각 조건에 대하여 서로 다른 시간 지점들에서 측정되며, 상기 세포들의 배수 유도(fold induction)는 재-활성화 후 2번째 날에서 얻어진 값에 대하여 측정되었다. 상기 결과들은 두 개의 독립적인 공여체들로부터 얻어졌다. 두 번째 공여체에 있어서, 세포 생장은 pT알파-Δ48.41BB (pTa-Δ48.BB) 및 전장(full-length) pT알파- (pTa-FL)로 형질도입된 세포들에 대해서도 결정되었다.
도 17: 5개의 서로 다른 사이토펄스(Cytopulse) 프로그램들로 전기천공된 PBMC들 상에서 GFP 양성 세포들의 유세포분석(Flow cytometry analysis). 상부 라인은 큐벳 당 6x106 세포들의 형질감염(transfection)에 해당하며, 하부 라인은 큐벳 당 3x106 세포들의 형질감염(transfection)에 해당한다.
도 18: 생존도 염색약(eFluor-450)을 사용한 정제된 T-세포 사멸률(mortality)과 GFP mRNA, GFP DNA 및 대조군 pUC DNA과 함께 전기천공 후 생 집단(viable population) 사이의 GFP 양성 세포들의 유세포분석(Flow cytometry analysis). NEP는 전기천공 버퍼 내에 유지되었으나 전기천공되지 않은 세포들에 해당하며, NT는 배양 배지 내에 유지된 비전기천공된 세포들에 해당한다.
도 19: TRAC TALE-뉴클레아제 mRNA 전기천공 이후 인간 초기(primary) T-세포들 상에서 TCR 알파/베타 and CD3 발현의 유세포분석(Flow cytometry analysis) (상부). TRAC TALE-뉴클레아제 mRNA 전기천공 이후 인간 초기(primary) T-세포들로부터 추출된 유전체 DNA의 딥 시퀀싱(deep sequencing) 분석(하부).
도 20: A. 단일 사슬 CAR을 코드하는 mRNA의 유무 하에서 T-세포들의 전기천공 후 CAR 발현(항 F(ab')2)의 유세포분석(Flow cytometry analysis). B. daudi 세포들과 함께 공동배양된 전기천공된 T-세포들 상의 CD107a 발현(탈과립(degranulation)의 마커)의 유세포분석(Flow cytometry analysis).
도 21: 다연쇄 CAR을 코드하는 mRNA의 도시. B. 다연쇄 CAR을 코드하는 폴리시스트론성(polycistronic) mRNA의 유무 하에서 전기천공된 생 T-세포들 상의 CAR 발현(항 F(ab')2)의 유세포분석(Flow cytometry analysis). C. daudi 세포들과 함께 공동배양된 전기천공된 T-세포들 상의 CD107a 발현(탈과립(degranulation)의 마커)의 유세포분석(Flow cytometry analysis).
표 1: GR TALE-뉴클레아제들 및 인간 GR 유전자 내 TALE-뉴클레아제들 표적 위치(site)들의 서열들의 기술.
표 2: 효모 내 GR TALE-뉴클레아제들의 절단(cleavage) 활성. 값들은 0 및 1 사이로 포함된다. 최대 값은 1이다.
표 3: 293 세포들 내 내인성 TALE-뉴클레아제 표적 위치들(sites)에서의 표적된 돌연변이 발생의 퍼센트.
표 4: 초기(primary) T 림프구들 내 내인성 TALE-뉴클레아제 표적 위치들에서 표적된 돌연변이 발생 퍼센트.
표 5: 인간 상응하는 유전자들의 TALE-뉴클레아제들 표적의 CD52, TRAC 및 TRBC TALE-뉴클레아제들 및 서열들의 기재
표 6: TRAC 및 CD52 TALE-뉴클레아제들을 위한 추가적인 표적 서열들.
표 7: CD52 T02, TRAC_T01, TRBC_T01 및 TRBC_T02 표적들을 표적으로 하는 TALE-뉴클레아제를 위한 삽입-결실들(indels)의 퍼센트.
표 8: 상응하는 TALE-뉴클레아제-발현 폴리뉴클레오타이드들의 트랜스펙션 후 CD52-음성, TCR-음성 및 CD52/TCR-이중 음성 T 림프구들의 퍼센트들.
표 9: TRBC TALE-뉴클레아제-발현 폴리뉴클레오타이드들의 트랜스펙션 후 TCR-음성 T 림프구들의 퍼센트들.
표 10: CTLA4 및 PDCDl TALE-뉴클레아제들 및 인간 상응하는 유전자들 내 TALE-뉴클레아제들 표적 위치들의 서열들의 기재.
표 11: pT알파(pTalpha) 구조체들의 부분집합(subset)의 기술.
표 12: 주르카트(Jurkat) TCR 알파 불활성화된 세포들 내 서로 다른 pT알파 구조체들의 활성. 활성은 서로 다른 전구T알파(preTalpha) 구조체들로 트랜스펙트된 주르카트 TCR 알파 불활성화된 세포들 내 CD3 발현의 유동세포 분석에 의하여 측정되었다.
표 13: PBMC 유래된 T-세포들 내의 전기천공을 위해 요구되는 최소 전압을 결정하기 위하여 사용된 서로 다른 사이토펄스(cytopulse) 프로그램들.
표 14: 정제된 T 세포들을 전기천공하는데 사용되는 사이토펄스 프로그램.

[청구항 1]
하기 단계를 포함하는 면역 요법을 위한 T-세포들의 제조 방법:
(a) 적어도,
- 면역억제제를 위한 표적(target)을 발현하는 제 1 유전자, 및
-T-세포 수용체(TCR)의 성분(component)을 코드하는 제 2 유전자
를 불활성화시킴으로써 T-세포들을 변형시키는 단계;
(b) 선택적으로 상기 면역억제제의 존재 하, 상기 세포들을 팽창시키는 단계.
[청구항 2]
제 1항에 있어서,
하기 단계들을 포함하는, 면역 요법을 위한 T-세포들의 제조를 위한 방법:
(a) T-세포를 제공하는 단계;
(b) 면역억제제를 위한 표적을 발현하는 상기 T-세포 내에서 유전자를 선택하는 단계;
(c) DNA 절단(cleavage)에 의하여 각각 하기를 선택적으로 불활성화시킬 수 있는 레어-커팅(rare-cutting) 엔도뉴클레아제(endonuclease)들을 상기 T-세포 내로 도입하는 단계;
-상기 면역억제제를 위한 표적을 코드하는 상기 유전자 및
-T-세포 수용체(TCR)의 하나의 성분을 코드하는 적어도 하나의 유전자
(d) 선택적으로 상기 면역억제제의 존재 하, 상기 세포들을 팽창시키는 단계;
[청구항 3]
제 1항 또는 제 2항에 있어서,
면역억제제를 위한 상기 표적은 면역억제제에 대한 수용체인, 방법.
[청구항 4]
제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 형질전환된(transformed) T-세포들은 환자의 혈액 내에서 팽창되는, 방법.
[청구항 5]
제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 형질전환된 T-세포들은 인-비보에서 팽창되는, 방법.
[청구항 6]
제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 형질전환된 T-세포들은 상기 면역억제제의 존재 하 팽창되는 방법.
[청구항 7]
제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 유전자는 CD52인 면역억제제를 위한 표적을 발현시키고, 상기 면역억제제는 CD52 항원을 표적으로 하는 항체인, 방법.
[청구항 8]
제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 유전자는 글루코코르티코이드 수용체(GR)을 발현시키고 상기 면역억제제 특이적은 덱사메타손(dexamethasone)과 같은 코르티코스테로이드인, 방법.
[청구항 9]
제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서,
적어도 두 개의 불활성화된 유전자들이 CD52 및 TCR 알파, CD52 및 TCR 베타, GR 및 TCR 알파, GR 및 TCR 베타로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
[청구항 10]
제 2항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 레어-커팅 엔도뉴클레아제들은 단계 c)에서 상호-트랜스펙트되는(co-transfected), 방법.
[청구항 11]
제 2항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 레어-커팅 엔도뉴클레아제들은 mRNA에 의하여 코드되는, 방법.
[청구항 12]
제 2항 내지 제 11항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 레어-커팅 엔도뉴클레아제들은 RNA 전기천공법으로 단계 (c)에서 상기 세포 내로 도입(introduc)되는, 방법.
[청구항 13]
제 12항에 있어서,
단계 (c)에서, 상기 T 세포를 레어-커팅 엔도뉴클레아제를 코드하는 RNA와 접촉시키는 단계 및 하기로 구성되는 빠른 펄스(agile pulse) 서열을 적용하는 단계를 포함하는, 방법:
(a) 2250 센티미터 당 V부터 3000 센티미터당 V까지의 전압 범위, 0.1 ms의 펄스 폭 및 단계들 (a) 및 (b) 전기 펄스들 사이에 0.2 내지 10 ms의 펄스 간격을 갖는 하나의 전기 펄스;
(b) 100 ms의 펄스 폭 및 단계 (b)의 전기 펄스 및 단계 (c)의 제 1 전기 펄스 간에 100 ms의 펄스 간격을 갖고, 2250 V 부터 3000 V 까지의 전압 범위를 갖는 하나의 전기 펄스; 및
(c) 0.2 ms의 펄스 폭 및 4 개의 전기 펄스들의 각각들 간에 2 ms의 펄스 간격을 갖고, 325 V의 전압을 갖는 4개의 전기 펄스들.
[청구항 14]
제 2항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 레어-커팅 엔도뉴클레아제들은 TALE-뉴클레아제들인, 방법.
[청구항 15]
제 14항에 있어서,
이들 TALE-뉴클레아제 중 적어도 하나는 서열번호 37, 서열번호 57 내지 서열번호 60으로부터 선택되는 TCR알파(TCRalpha)의 유전자 표적 서열들 중 하나를 대상으로 하는(direct), 방법.
[청구항 16]
제 14항에 있어서,
이들 TALE-뉴클레아제 중 적어도 하나는 서열번호 38 및 서열번호 39로부터 선택되는 TCR 베타의 유전자 표적 서열들 중 하나를 대상으로 하는, 방법.
[청구항 17]
제 14항에 있어서, 이들 TALE-뉴클레아제들 중 적어도 하나는 서열번호 1 내지 서열번호 6으로부터 선택되는 GR의 유전자 표적 서열들 중 하나를 대상으로 하는, 방법.

[청구항 18]
제 14항에 있어서,
이들 TALE-뉴클레아제들 중 적어도 하나는 서열번호 40, 서열번호 61 내지 서열번호 65로부터 선택되는 CD52의 유전자 표적 서열들 중 하나를 대상으로 하는, 방법.
[청구항 19]
제 1항 내지 제 18항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 T-세포들 내로 키메라 항원 수용체(Chimeric Antigen Receptor)(CAR)를 도입하는 단계를 포함하는, 방법.
[청구항 20]
제 19항에 있어서,
상기 키메라 항원 수용체 서열은 서열번호 73인, 방법.
[청구항 21]
제 19항에 있어서,
상기 키메라 항원 수용체는 다연쇄(multi-chain) 키메라 항원 수용체인, 방법.
[청구항 22]
제 1항 내지 제 21항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 T-세포 내로 pT알파(pTalpha) 폴리펩타이드 또는 그것의 기능적 변형체를 도입하는 단계를 포함하는, 방법.
[청구항 23]
제 1항 내지 제 22항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 T-세포 내로 DNA 절단(cleavage)에 의하여 PDCD1 또는 CTLA-4 유전자를 선택적으로 불활성화시킬 수 있는 TALE-뉴클레아제를 도입하는 단계를 포함하는 방법.
[청구항 24]
제 1항 내지 제 23항 중 어느 한 항에 있어서,
단계 a)의 상기 T-세포들은 염증성 T-림프구들, 세포독성 T-림프구들, 조절 T-림프구들 또는 헬퍼 T-림프구들로부터 유래되는, 방법.
[청구항 25]
제 1항 내지 제 23항 중 어느 한 항에 있어서,
단계 a)의 상기 T-세포들은 CD4+ T-림프구들 및/또는 CD8+ T-림프구들로부터 유래되는, 방법.
[청구항 26]
제 1항 내지 제 25항 중 어느 한 항의 방법으로부터 수득가능한 분리된 T-세포 또는 세포주.
[청구항 27]
CD52 및 TCR 알파, CD52 및 TCR 베타, GR 및 TCR 알파, GR 및 TCR 베타로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 두 개의 유전자들이 불활성화된, 분리된 T-세포.
[청구항 28]
제 26항 또는 제 27항에 있어서,
키메라 항원 수용체를 코드하는 외인성 폴리뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함하는, 분리된 T-세포.
[청구항 29]
제 28항에 있어서,
상기 키메라 항원 수용체는 다연쇄 키메라 항원 수용체인, 분리된 T-세포.
[청구항 30]
제 26항 내지 제 29항 중 어느 한 항에 있어서,
CD3 표면 발현을 지지하기 위하여 pT알파(pTalpha) 이식유전자의 적어도 한 단편을 포함하는 외인성 핵산을 추가로 포함하는, 분리된 T-세포.
[청구항 31]
제 26항 내지 제 30항 중 어느 한 항에 있어서,
의약으로서 그것의 용도를 위한, 분리된 T-세포.
[청구항 32]
제 26항 내지 제 30항 중 어느 한 항에 있어서,
암 또는 바이러스 감염의 치료를 위한, 분리된 T-세포.
[청구항 33]
제 26항 내지 제 30항 중 어느 한 항에 있어서,
림프종의 치료를 위한, 분리된 T-세포.
[청구항 34]
적어도 하나의, 제 26항 내지 제 33항 중 어느 한 항의 분리된 T-세포를 포함하는 약학적 조성물.
[청구항 35]
(a) 제 1항 내지 제 25항 중 어느 한 항의 방법에 따라 T-세포들 집단(population)을 준비하는 단계;
(b) 상기 형질전환된 T- 세포들을 상기 환자에게 투여하는 단계를
포함하는, 그것을 필요로 하는 환자의 치료 방법.
[청구항 36]
제 35항에 있어서,
상기 환자는 제 1항 내지 제 25항의 방법에서 사용된 상기 면역억제제로 치료되는, 방법.
[청구항 37]
제 35항 또는 제 36항에 있어서,
상기 환자는 암, 바이러스 감염, 자가면역 질환 또는 이식편대숙주병(Graft versus Host Disease)(GvHD)으로 진단받은, 방법.
[청구항 38]
서열번호 37 및 서열번호 57 내지 서열번호 60으로부터 선택된 TCR 알파 유전자의 선택된 표적 서열들 중 하나를 대상으로 하는 TALE-뉴클레아제.
[청구항 39]
TCR 베타 유전자 서열번호 38 및 서열번호 39의 선택된 표적 서열들 중 하나를 대상으로 한 TALE-뉴클레아제.
[청구항 40]
서열번호 40 및 서열번호 61 내지 서열번호 65로부터 선택되는 CD52 유전자의 선택된 표적 서열들 중 하나를 대상으로 한 TALE-뉴클레아제.
[청구항 41]
서열번호 1 내지 서열번호 6으로부터 선택된 GR 유전자의 선택된 표적 서열들 중 하나를 대상으로 한 TALE-뉴클레아제.
[청구항 42]
제 28항 내지 제 41항 중 어느 한 항에 있어서,
서열번호 7 내지 서열번호 18 및 서열번호 41 내지 서열번호 48로부터 선택된 폴리펩타이드 서열 중 하나를 포함하는, TALE-뉴클레아제.
[청구항 43]
제 38항 내지 제 42항 중 어느 한 항에 따른 TALE-뉴클레아제를 코드하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드.
[청구항 44]
제 43항에 따른 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 분리된 T-세포.
[청구항 45]
적어도 두 개의 폴리펩타이드들을 포함하며, 상기 폴리펩타이드들은 적어도 제 1 및 제 2 TALEN들을 코드하고, 상기 제 1 TALEN은 TCR을 코드하는 유전자를 대상으로 하고, 상기 제 2는 면역억제제를 위한 표적을 코드하는 유전자를 대상으로 하는, 분리된 T-세포.
[청구항 46]
제 45항에 있어서,
상기 제 2 TALEN은 CD52 또는 GR을 코드하는 유전자를 대상으로 하는, 분리된 T-세포.
[청구항 47]
제 44항 내지 제 46항 중 어느 한 항에 있어서,
키메라 항원 수용체를 코드하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함하는, 분리된 T-세포.
[청구항 48]
제 44항 내지 제 47항 중 어느 한 항에 있어서,
CD3 표면 발현을 지지하기 위하여 pT알파(pTalpha)의 적어도 한 단편을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함하는, 분리된 T-세포.
본원에 구체적으로 정의되지 않는 한, 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어들은 유전자 요법, 생화학, 유전학 및 분자 생물학의 분야 내 통상의 기술자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다.
본원에 개시된 것과 유사 또는 동등한 모든 방법들과 물질들은 본원에 개시된 적합한 방법들 및 물질들과 함께 본 발명의 실시 또는 시험 내에 사용될 수 있다. 모든 간행물들, 특허 출원들, 특허들 및 본원에 언급된 다른 참조 문헌들은 이들 전체가 참조 문헌으로 병합된다. 상충하는 경우, 정의를 포함하는 본 명세서가 우선할 것이다. 추가적으로, 물질들, 방법들 및 실시예들은 예시적인 것이며 달리 명시되지 않는 한 제한하기 위한 것으로 의도되지 않는다.
달리 나타내지 않는 한, 본 발명의 실시는 기술 수준 범위 내의 세포 생물학, 세포 배양, 분자 생물학, 형질 전환 생물학, 미생물학, 재조합 DNA 및 면역학의 종래의 기술들에 적용될 것이다. 상기 기술들은 문헌 내에 상세히 설명되어 있다. 예를 들어, Current protocols in Molecular Biology (Frederick M. AUSUBEL, 2000, Wiley and son Inc, Library of Congress, USA); Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, (Sambrook et al, 2001, Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed., 1984); Mullis et al. U.S. Pat. No. 4,683,195; Nucleic Acid Hybridization (B. D. Harries & S. J. Higgins eds. 1984); Transcription And Translation (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984); Culture Of Animal Cells (R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); the series, Methods In ENZYMOLOGY (J. Abelson and M. Simon, eds.-in-chief, Academic Press, Inc., New York), specifically, Vols.154 and 155 (Wu et al. eds.) and Vol. 185, "Gene Expression Technology" (D. Goeddel, ed.); Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J. H. Miller and M. P. Calos eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer and Walker, eds., Academic Press, London, 1987); Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds., 1986); and Manipulating the Mouse Embryo, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986) 참조.
일반적인 측면에 있어서, 본 발명은 암 및 감염들을 치료하는데 있어서 새로운 양자 면역 요법 전략들을 위한 방법들에 관한 것이다.
비 동종반응성(alloreactive) 및 면역억제 저항성(immunosuppressive resistant) T-세포들:
특정 측면에 있어서, 본 발명은 특히 면역 요법을 위한 조작된 T-세포들의 방법에 관한 것이다. 특히 상기 방법은:
(a) 적어도,
- 면역억제제를 위한 표적을 발현하는 제 1 유전자, 및
- T-세포 수용체(TCR)의 성분(component)을 코드하는 제 2 유전자
를 불활성화시킴으로써 T-세포들을 변형시키는 단계;
(b) 선택적으로 상기 면역억제제의 존재 하, 상기 세포들을 확장시키는 단계를 포함한다.
면역억제제는 여러 작용 기작 중 하나에 의해 면역 기능을 억제하는 물질이다. 다시 말해, 면역억제제는 면역 반응의 정도 및/또는 탐욕(voracity)을 감소시기 위한 능력에 의해 나타나는 화합물에 의해 작용한다. 비제한적인 예로서, 면역억제제는 칼시뉴린 억제제(calcineurin inhibitor), 라파마이신(rapamycin)의 표적, 인터류킨-2 α-사슬 블록커(interleukin-2 α-chain blocker), 이노신 모노포스페이트 탈수소효소(inosine monophosphate dehydrogenase), 다이하이드로엽산 환원 효소(dihydrofolic acid reductase)의 억제제, 코르티코스테로이드(corticosteroid) 또는 면역억제 항대사물질(antimetabolite)일 수 있다. 일반적인 세포독성 면역억제제들은 DNA 합성을 억제함으로써 작용한다. 다른 것들은 T-세포들의 활성화 또는 도움 세포들의 활성화를 억제함으로써 작용할 수 있다. 본 발명에 따른 방법은 T-세포들 내의 면역억제제의 표적을 불활성화함으로써 면역 요법을 위한 T-세포들의 면역억제 저항성을 부여하는 것이 가능하다. 비제한적인 예로서, 면역억제제에 대한 표적은 CD52, 글루코코르티코이드 수용체(GR), FKBP 족 유전자 멤버 및 사이클로필린(cyclophilin) 족 유전자 멤버와 같은 면역억제제에 대한 수용체일 수 있다.
특정 실시예에 있어서, 상기 방법의 유전적 변형 단계는 CD52, GR, TCR 알파 및 TCR 베타로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나의 유전자의 불활성화를 필요로 한다. 다른 실시예에 있어서, 상기 방법의 유전적 변형 단계는 CD52 및 GR, CD52 및 TCR 알파, CDR52 및 TCR 베타, GR 및 TCR 알파, GR 및 TCR 베타, TCR 알파 및 TCR 베타로 이루어진 군으로부터 선택되는 두 개의 유전자들의 불활성화를 필요로 한다. 다른 실시예에 있어서, 상기 방법의 유전적 변형 단계는 두 개 이상의 유전자들의 불활성화를 필요로 한다. 유전적 변형은 바람직하게는 엑스-비보에서 수행된다.
유전자를 불활성화함으로써, 목적 유전자가 기능적 단백질 형태로 발현되지 않도록 할 수 있다. 특정 실시예에 있어서, 조작하기 위해 제공되는 세포들 내에서 상기 방법의 유전적 변형은 하나의 레어-커팅 엔도뉴클레아제의 발현에 의존하며, 상기 레어-커팅 엔도뉴클레아제는 특이적으로 하나의 표적된 유전자의 절단을 촉매하여 상기 표적된 유전자를 불활성화시킨다. 레어-커팅 엔도뉴클레아제에 의해 유발된 핵산 스트랜드 절단은 일반적으로 상동적 재조합(homologous recombination) 또는 비상동적 말단 결합(nonhomologous end joining; NHEJ)의 고유한 기작들을 통해 복구된다. 다만, NHEJ는 종종 절단 위치에서 DNA 서열의 변화를 야기하는 불완전한 복구 과정이다. 기작들은 직접적인 재-결찰(re-ligation) (Critchlow and Jackson 1998) 또는 소위 미세상동성(microhomology)-매개 말단 결합(Ma, Kim et al. 2003)을 통해 두 DNA 말단을 유지하는 것의 재결합을 포함한다. 비상동성 말단 결합(NHEJ)을 통한 복구는 종종 작은 삽입들 또는 결손들을 야기하며, 특정 유전자 녹아웃(knockout)들의 생성을 위해 사용될 수 있다. 상기 변형은 적어도 하나의 뉴클레오타이드의 치환, 결손 또는 추가일 수 있다. 세포 내에서 발생된 절단-유도된 돌연변이유발 사건, 즉 NHEJ 사건에 연속적인 돌연변이유발 사건은 기술 분야에서 잘 알려진 방법에 의해 식별 및/또는 선택될 수 있다. 특정 실시예에 있어서, 세포들을 조작하기 위한 상기 방법은 하기의 단계들 중 적어도 하나를 포함한다:
(a) 바람직하게는 세포 배양(cell culture) 또는 혈액 샘플로부터 T-세포를 제공하는 단계;
(b) 면역억제제를 위한 표적을 발현하는 상기 T-세포 내에서 유전자를 선택하는 단계;
(c) DNA 절단(cleavage), 바람직하게는 개별적인 이중-스트랜드 절단에 의하여 선택적으로 불활성화시킬 수 있는 레어-커팅 엔도뉴클레아제들을 상기 T-세포 내로 도입하는 단계:
- 상기 면역억제제를 위한 표적을 코드하는 상기 유전자 및
- T-세포 수용체(TCR)의 하나의 성분을 코드하는 적어도 하나의 유전자.
(d) 선택적으로 상기 면역억제제의 존재 하, 상기 세포들을 확장시키는 단계.
보다 바람직한 실시예에 있어서, 상기 방법은:
(a) 바람직하게는 세포 배양 또는 혈액 샘플로부터 T-세포를 제공하는 단계;
(b) 면역억제제를 위한 표적을 발현하는 상기 T-세포 내에서 유전자를 선택하는 단계;
(c) DNA 절단(cleavage), 바람직하게는 개별적인 이중-스트랜드 절단에 의하여 선택적으로 불활성화시킬 수 있는 레어-커팅 엔도뉴클레아제를 코드하는 핵산과 상기 T-세포를 형질전환하는 단계:
- 상기 면역억제제를 위한 표적을 코드하는 상기 유전자 및
- T-세포 수용체(TCR)의 하나의 성분을 코드하는 적어도 하나의 유전자;
(d) 상기 T-세포들 내에서 상기 레어-커팅 엔도뉴클레아제를 발현하는 단계;
(e) 세포 표면 상에 TCR을 발현하지 않는, 형질전환된 T-세포들을 분류하는 단계;
(f) 선택적으로 상기 면역억제제의 존재 하, 상기 세포들을 확장시키는 단계.
특정 실시예에 있어서, 상기 레어-커팅 엔도뉴클레아제는 CD52, GR, TCR 알파 및 TCR 베타로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나의 유전자를 특이적으로 표적으로 한다. 다른 실시예에 있어서, 조작하기 위해 제공되는 세포들 내에서 상기 방법의 유전적 변형은 두 개의 레어-커팅 엔도뉴클레아제들의 발현에 의존하며, 상기 두 개의 레어-커팅 엔도뉴클레아제들 각각은 CD52 및 GR, CD52 및 TCR 알파, CDR52 및 TCR 베타, GR 및 TCR 알파, GR 및 TCR 베타, TCR 알파 및 TCR 베타로 이루어진 군으로부터 선택되는 유전자들의 각각의 쌍 내의 절단은 특이적 및 개별적으로 촉매하여 상기 표적된 유전자들을 불활성화시킨다. 다른 실시예에 있어서, 두 개 이상의 레어-커팅 엔도뉴클레아제들은 두 개 이상의 유전자들을 표적화 및/또는 불활성화시키기 위해 조작하기 위한 세포들 내에서 발현될 수 있다.
다른 실시예에 있어서, 면역억제적 치료에 대하여 특이적인 상기 단계 (b)의 유전자는 CD52이며, 단계 (d) 또는 (e)의 면역억제적 치료는 CD52 항원을 표적으로 하는 인간화 항체를 포함한다.
다른 실시예에 있어서, 면역억제적 치료에 대하여 특이적인 상기 단계 (b)의 유전자는 글루코코르티코이드 수용체(GR)이며, 단계 (d) 또는 (e)의 면역억제적 치료는 덱사메타손(dexamethasone)과 같은 코르티코스테로이드를 포함한다.
다른 실시예에 있어서, 면역억제적 치료에 대하여 특이적인 상기 단계 (b)의 표적 유전자는 FKBP 족 유전자 멤버 또는 이의 변형체이며, 단계 (d) 또는 (e)의 면역억제적 치료는 타크로리무스(Tacrolimus) 또는 후지마이신(fujimycin)으로도 알려진 FK506을 포함한다. 다른 실시예에 있어서, 상기 FKBP 족 유전자 멤버는 FKBP12 또는 이의 변형체이다.
다른 실시예에 있어서, 면역억제적 치료에 대하여 특이적인 상기 단계 (b)의 유전자는 사이클로필린(cyclophilin) 족 유전자 멤버 또는 이의 변형체이며, 단계 (d) 또는 (e)의 면역억제적 치료는 사이클로스포린(cyclosporine)을 포함한다.
다른 실시예에 있어서, 상기 레어-커팅 엔도뉴클레아제는 메가뉴클레아제(meganuclease), 징크 핑거 뉴클레아제(Zinc finger nuclease) 또는 TALE-뉴클레아제일 수 있다. 바람직한 실시예에 있어서, 상기 레어-커팅 엔도뉴클레아제는 TALE-뉴클레아제이다. TALE-뉴클레아제에 의해 전사 활성화인자 유사 이펙터(Transcription Activator Like Effector; TALE)로부터 유래된 DNA-결합 도메인과 핵산 표적 서열을 절단하기 위한 하나의 뉴클레아제 촉매 도메인(catalytic domain)으로 이루어진 융합 단백질이 의도된다(Boch, Scholze et al. 2009; Moscou and Bogdanove 2009)(Deng, Yan et al. 2012; Mak, Bradley et al. 2012)(Christian, Cermak et al. 2010; Cermak, Doyle et al. 2011 ; Geissler, Scholze et al. 2011; Huang, Xiao et al. 2011 ; Li, Huang et al. 2011; Mahfouz, Li et al. 2011 ; Miller, Tan et al. 2011 ; Morbitzer, Romer et al. 2011; Mussolino, Morbitzer et al. 2011 ; Sander, Cade et al. 2011; Tesson, Usal et al. 2011; Weber, Gruetzner et al. 2011 ; Zhang, Cong et al. 2011; Li, Piatek et al. 2012; Mahfouz, Li et al. 2012) 본 발명에서 양자 면역 요법 전략들을 위한 관련 유전자들을 정확하게 표적으로 하기 위해 새로운 TALE-뉴클레아제들이 디자인되었다.
본 발명에 따른 바람직한 TALE-뉴클레아제들은:
- 서열번호 1 내지 6 (GR),
- 서열번호 37, 57 내지 60 (TCR알파),
- 서열번호 38 또는 39 (TCR베타), 및
- 서열번호 40, 61 내지 65 (CD52)
로 이루어진 군으로부터 선택되는 표적 서열을 인식 및 절단하는 것이다.
상기 TALE-뉴클레아제들은 바람직하게는 서열번호 1 내지 6 및 서열번호 37 내지 40인 각각의 표적 서열들을 절단하기 위해 서열번호 7 내지 서열번호 18 및 서열번호 41 내지 서열번호 48로부터 선택되는 폴리펩타이드 서열을 포함한다.
다른 실시예에 있어서, 추가적인 촉매 도메인(catalytic domain)은 표적된 유전자들을 불활성화시키기 위한 능력을 향상시키기 위한 돌연변이유발(mutagenesis)을 증가시키기 위해 상기 레어-커팅 엔도뉴클레아제와 함께 세포 내로 추가적으로 도입될 수 있다. 특히, 상기, 추가적인 촉매 도메인은 DNA 말단 공정 효소(DNA end processing enzyme)이다. DNA 말단 공정 효소의 비제한적인 예는 5-3' 엑소뉴클레아제(exonuclease)들, 3-5' 엑소뉴클레아제들, 5-3' 알칼리성 엑소뉴클레아제(alkaline exonuclease)들, 5' 플랩 엔도뉴클레아제(flap endonuclease)들, 헬리카제(helicase)들, 호스파타아제(hosphatase), 가수분해효소(hydrolase)들 및 주형-비의존성 DNA 폴리머라제(template-independent DNA polymerase)들이다. 상기 촉매 도메인의 비제한적인 예는 hExoI (EXO1_HUMAN), 효모 ExoI (EXO1_YEAST), E.coli ExoI, 인간 TREX2, 쥐 TREX1, 인간 TREX1, 소 TREX1, 래트(Rat) TREX1, TdT (terminal deoxynucleotidyl transferase) 인간 DNA2, 효모 DNA2 (DNA2 YEAST)로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질 도메인 또는 단백질 도메인의 촉매적으로 활성인 유도체를 포함한다. 바람직한 실시예에 있어서, 상기 추가적인 촉매 도메인은 3'-5'-엑소뉴클레아제 활성을 가지며, 보다 바람직한 실시예에 있어서, 상기 추가적인 촉매 도메인은 TREX, 보다 바람직하게는 TREX2 촉매 도메인(WO2012/058458)이다. 다른 바람직한 실시예에 있어서, 상기 촉매 도메인은 단일 사슬 TREX 폴리펩타이드에 의해 코드된다. 상기 추가적인 촉매 도메인은 선택적으로 펩타이드 링커에 의해 본 발명에 따른 뉴클레아제 융합 단백질 또는 키메라 단백질에 융합될 수 있다.
핵산내부분해 절단(Endonuclelytic break)들은 상동적 재조합의 속도를 자극하는 것으로 알려져 있다. 따라서, 다른 실시예에 있어서, 상기 방법의 유전적 변형 단계는 적어도 표적 핵산 서열의 일부에 대하여 상동인 서열을 포함하는 외인성 핵산(exogenous nucleic acid)을 세포 내로 도입하는 단계를 추가적으로 포함하여, 표적 핵산 서열과 외인성 핵산 사이에 상동적 재조합이 발생한다. 특정 실시예들에 있어서, 상기 외인성 핵산은 표적 핵산 서열의 5' 및 3' 영역들에 각각 상동인 제 1 및 제 2 부분들을 포함한다. 또한 이들 실시예들에 있어서 상기 외인성 핵산은 제 1 및 제 2 부분 사이에 표적 핵산 서열의 5' 및 3' 영역들과 비상동성을 포함하는 제3 부분을 포함한다. 표적 핵산 서열의 절단 이후, 상동적 재조합 사건은 표적 핵산 서열과 외인성 핵산 사이에 활성화된다. 바람직하게는, 적어도 50 bp, 바람직하게는 100 bp 이상, 보다 바람직하게는 200 bp 이상의 상동적 서열이 상기 공여체 매트릭스(donor matrix) 내에 사용된다. 따라서, 외언성 핵산은 바람직하게는 200 bp 내지 6000 bp, 보다 바람직하게는 1000 bp 내지 2000 bp이다. 실제로, 공유된 핵산 상동성들은 절단 위치의 상류(upstream) 및 하류(downstream)에 인접한 영역 내에 위치되며, 도입되는 핵산 서열은 두 팔(arm)들 사이에 위치된다.
특히, 상기 외인성 핵산은 상기 절단의 상류 서열에 대하여 상동인 제 1 영역, CD52, GR, TCR 알파 및 TCR 베타로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나의 표적된 유전자를 불활성화시키기 위한 서열, 절단의 하류 서열에 대하여 상동인 제 2 영역을 연속적으로 포함한다. 상기 폴리뉴클레오타이드 도입 단계는 상기 레어-커팅 엔도뉴클레아제의 도입 또는 발현과 동시, 이전 또는 이후일 수 있다. 절단 사건이 발생되는 표적 핵산 서열의 위치에 따라, 상기 외인성 핵산은 예를 들어, 외인성 핵산이 상기 유전자의 개방 번역틀(open reading frame) 내에 배치된 때, 유전자를 녹아웃하거나 새로운 서열들 또는 목적 유전자들을 도입하기 위해 사용될 수 있다. 상기 외인성 핵산을 사용함으로써 서열 삽입들은 상기 유전자의 정정 또는 치환(비제한적인 예로서 대립유전자 교환(swap))에 의해 표적된 기존 유전자를 변형하거나 상기 표적된 유전자의 정정 또는 치환에 의해 표적된 유전자의 발현을 상향- 또는 하향-조절(비제한적인 예로서 프로모터 교환)하기 위해 사용될 수 있다.
바람직한 실시예에 있어서, CD52, GR, TCR 알파 및 TCR 베타로 이루어진 군으로부터의 유전자들의 불활성화는 특이적 TALE-뉴클레아제에 의해 표적된 정확한 유전체 위치(genomic location)에서 이루어질 수 있으며, 여기서 상기 특이적 TALE-뉴클레아제는 절단을 촉매하며, 여기서 상기 외인성 핵산은 적어도 상동성 영역 및 상동적 재조합에 의해 삽입된 CD52, GR, TCR 알파 및 TCR 베타로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나의 표적된 유전자를 불활성화시키기 위한 서열을 연속적으로 포함한다. 다른 실시예에 있어서, 몇몇의 유전자들은 하나의 정의된 유전자 및 특정 유전자 불활성화를 위한 몇몇의 특정 폴리뉴클레오타이드들을 개별적 및 특이적으로 표적으로 하는 몇몇의 TALE-뉴클레아제들을 사용함으로써 연속적 또는 동시에 불활성화될 수 있으며,
추가적인 유전적 변형 단계에 의해, CD52, GR, TCR 알파 및 TCR 베타로 이루어진 군으로부터 선택되는 다른 유전자의 불활성화도 의도될 수 있다. 상기에 언급된 바와 같이, 상기 추가적인 유전적 변형 단계는:
(a) 적어도 하나의 레어-커팅 엔도뉴클레아제를 상기 세포들 내로 도입하여 상기 레어-커팅 엔도뉴클레아제가 상기 세포의 유전체의 하나의 표적된 서열 내에서 절단을 촉매하는 단계.
(b) 상기 절단의 상류의 서열에 상동성인 제 1 영역, 상기 세포의 유전체 내 삽입되기 위한 서열 및 상기 절단의 하류의 서열에 상동성인 제 2 영역을 연속적으로 포함하는 외인성 핵산을 상기 세포들 내로 선택적으로 도입하는 단계,
를 포함하는 불활성화 단계일 수 있으며,
여기서 상기 도입된 외인성 핵산은 유전자를 불활성화시키고, 적어도 하나의 재조합 목적 단백질을 코드하는 적어도 하나의 외인성 폴리뉴클레오타이드 서열을 삽입한다. 다른 실시예에 있어서, 상기 외인성 폴리뉴클레오타이드 서열은 CD52, GR, TCR 알파 및 TCR 베타로 이루어진 군으로부터 선택되는 유전자 내로 삽입된다.
특정 실시예에 있어서, 세포를 조작하기 위한 상기 방법은 추가적인 유전적 변형 단계를 더 포함한다. 추가적인 유전적 변형 단계에 의해, 조작하기 위한 세포들 내로 하나의 목적 단백질의 도입이 의도될 수 있다. 상기 목적 단백질은 비제한적인 예로서, 본원에 개시된 바에 따라 pT알파 또는 이의 기능적 변형체, 키메라 항원 수용체(CAR), 다연쇄 CAR, PDCD1 또는 CTLA-4를 표적으로 하는 이중특이성 항체 또는 레어-커팅 엔도뉴클레아제일 수 있다.
또한 본 발명은 TALE-뉴클레아제들에 관한 것이다. 일반적으로, 본 발명은:
(a) CD52, GR, TCR 알파 및 TCR 베타로 이루어진 군으로부터 선택되는 유전자들 내의 표적 서열과 결합하기 위해 조작된 전사 활성화인자-유사 이펙터(TALE) DNA 결합 도메인;
(b) 절단 도메인 또는 절단 절반-도메인(cleavage half-domain),
을 포함하는 TALE-뉴클레아제에 관한 것이다.
본 발명에 따른 바람직한 TALE-뉴클레아제들은:
- 서열번호 1 내지 6 (GR),
- 서열번호 37, 57 내지 60 (TCR알파),
- 서열번호 38 또는 39 (TCR베타) 및
- 서열번호 40, 61 내지 65 (CD52),
로 이루어진 군으로부터 선택되는 표적 서열을 인식 및 절단하는 것이다.
상기 TALE-뉴클레아제들은 바람직하게는 서열번호 1 내지 6 및 서열번호 37 내지 40의 각각의 표적 서열을 절단하기 위한 서열번호 7 내지 서열번호 18 및 서열번호 41 내지 서열번호 48로부터 선택되는 폴리펩타이드 서열을 포함한다.
일부 가변성은 이들 폴리펩타이드들을 유도하는 유전체 데이터로부터 발생할 수 있으며, 활성의 유의적 상실 없이(기능적 변형체들) 이들 폴리펩타이드들 내에 존재하는 아미노산들 중 일부가 치환될 가능성도 고려하면, 본 발명은 본 출원 내에 제공되는 서열과 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 가장 바람직하게는 적어도 95%의 동일성을 공유하는 상기 폴리펩타이드들의 폴리펩타이드 변형체들을 포함한다.
따라서 본 발명은 서열번호 7 내지 서열번호 18 및 서열번호 41 내지 서열번호 48로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 95%, 97% 또는 99%의 서열 동일성을 가지는 폴리펩타이드 서열을 포함하는 폴리펩타이드들을 도출한다.
또한 상기에 개시된 본 발명에 따른 레어-커팅 엔도뉴클레아제들을 코드하는 폴리뉴클레오타이드들, 벡터들은 본 발명의 범위 내에 포함된다.
또한 본 발명의 범위는 불활성화되는 CD52, GR, TCR 알파 및 TCR 베타로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 유전자 내에서, 세포들, 특히 t-세포들을 조작하기 위한 상기 방법에 의해 용이하게 얻어지는 분리된 세포들 또는 세포주들을 포함한다. 바람직하게는, CD52 및 GR, CD52 및 TCR 알파, CDR52 및 TCR 베타, GR 및 TCR 알파, GR 및 TCR 베타, TCR 알파 및 TCR 베타로 이루어진 군으로부터 선택되는 두 개의 유전자들이 불활성화된다.
본 발명에 따르면, 상기 유전자들은 바람직하게는 적어도 하나의 레어-커팅 엔도뉴클레아제에 의해 불활성화된다. 특히 TALE-뉴클레아제들이 T-세포들 내의 이중 불활성화를 달성하기 위해 유리하다는 것이 본 발명자들에 의해 밝혀졌다. 본 발명은 적어도 두 개의 폴리뉴클레오타이드들을 포함하는 분리된 T-세포를 포함하며, 상기 폴리뉴클레오타이드들은 적어도 제 1 및 제 2 TALE-뉴클레아제들, 바람직하게는 TCR을 코드하는 유전자를 대상으로 하는 제 1 TALE-뉴클레아제 및 CD52 또는 GR과 같은 면역억제제를 위한 수용체를 코드하는 유전자를 대상으로 하는 제 2 TALE-뉴클레아제를 코드한다.
다른 실시예에 있어서, 분리된 세포는 하나의 추가적인 유전체 변형을 더 포함한다. 다른 실시예에 있어서, 상기 추가적인 유전체 변형은 적어도 하나의 외인성 폴리뉴클레오타이드 서열의 삽입이다. 다른 실시예에 있어서, 상기 외인성 서열은 CD52, GR, TCR 알파 및 TCR 베타로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나의 유전자 내로 삽입된다.
전구T알파(PreTalpha)
다른 측면에 있어서, 본 발명은 상기 T-세포 pT알파(전구TCRα로도 지칭) 또는 이의 기능적 변형체 내로 도입되고 선택적으로 CD3 복합체의 자극을 통해 상기 세포들을 확장시키는 것을 포함하는 TCR 알파 결핍 T-세포를 확장시키는 방법에 관한 것이다.
바람직한 실시예에 있어서, 본 발명은:
a) CD3 표면 발현을 지지하기 위하여 pT알파의 적어도 한 단편을 코드하는 핵산으로 상기 세포들을 형질변환하는 단계
b) 상기 세포들 내에서 pT알파를 발현하는 단계
c) 선택적으로 CD3 복합체의 자극을 통해 상기 세포들을 선택적으로 확장시키는 단계,
를 포함한다.
또한 본 발명은 T-세포의 확장을 위한 방법의 단계들을 포함하는 면역 요법을 위한 T-세포들을 제조하는 방법에 관한 것이다.
특정 실시예에 있어서, pT알파 폴리뉴클레오타이드 서열은 무작위로 또는 상동적 재조합을 통해 도입될 수 있으며, 특히 삽입은 TCR알파 유전자의 불활성화와 연관될 수 있다.
본 발명에 따르면, pT알파의 서로 다른 기능적 변형체들이 사용된다. 펩타이드의 "기능적 변형체"는 전체 펩타이드 또는 이의 단편과 실질적으로 유사한 분자를 의미한다. 본 발명의 pT알파 또는 이의 기능적 변형체의 "단편"은 분자, 즉 짧은 펩타이드의 임의의 부분집합을 의미한다. 바람직한 pT알파 또는 기능적 변형체들은 전장 pT알파 또는 C-말단 절단된 pT알파 형태일 수 있다. C-말단 절단된 pT알파는 C-말단 내 하나 이상의 잔기들이 부족하다. 비제한적인 예로서, C-말단 절단된 pT알파 형태는 단백질의 C-말단(서열번호 107 내지 서열번호 114)으로부터 18, 48, 62, 78, 92, 110 또는 114개의 잔기들이 부족하다.
게다가, 펩타이드의 아미노산 서열 변형체들은 펩타이드를 코드하는 DNA 내 돌연변이들로 제조될 수 있다. 예를 들어, 상기 기능적 변형체들은 아미노산 서열 내의 잔기들의 결손들, 또는 삽입들 또는 치환들을 포함한다. 또한 결손, 삽입 및 치환의 임의의 조합은 원하는 활성, 특히 기능적 CD3 복합체의 복구를 보유하는 최종 구조체가 제공되는 최종 구조체에 도달하도록 이루어질 수 있다. 바람직한 실시예에 있어서, 적어도 하나의 돌연변이는 이량화(dimerization)에 영향을 주기 위해 상기에 개시된 바에 따른 서로 다른 pT알파 형태들 내에 도입된다. 비제한적인 예로서, 돌연변이 잔기는 적어도 인간 pT알파 단백질의 W46R, D22A, K24A, R102A 또는 R117A일 수 있거나, pT알파 족 또는 상동체 멤버 상에서 CLUSTALW 방법을 사용하여 정렬된 위치들일 수 있다. 상기에 개시된 바에 따른 pT알파 또는 이의 변형체는 바람직하게는 돌연변이 잔기 W46R (서열번호 123) 또는 돌연변이 잔기들 D22A, K24A, R102A 및 R117A (서열번호 124)을 포함한다. 특정 실시예에 있어서, 상기 pT알파 또는 변형체들은 비제한적인 예로서 CD28, OX40, ICOS, CD27, CD137 (4-1BB) 및 CD8 (서열번호 115 내지 서열번호 120)과 같은 신호-전달 도메인과 융합되기도 한다. 상기에 개시된 바에 따른 pT알파 또는 변형체들의 세포외 도메인은 TCR알파 단백질의 단편, 특히 TCR알파의 막관통 및 세포내 도메인(서열번호 122)과 융합될 수 있다. pT알파 변형체들은 TCR알파의 세포내 도메인(서열번호 121)과 융합될 수도 있다.
다른 실시예에 있어서, 상기 pT알파 형태들은 세포외 리간드-결합 도메인과 융합되며, 보다 바람직하게는 pT알파 또는 이의 기능적 변형체는 유연성 링커에 의해 연결되는 표적 항원 특이적 단일클론항체의 경(V L ) 및 중(V H ) 가변 단편을 포함하는 단일사슬 항체 단편(scFV)와 융합된다. 비제한적인 예로서, pT알파 또는 이의 기능적 변형체의 아미노산 서열은 서열번호 107 내지 서열번호 124로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 가변성은 이들 폴리펩타이드들을 유도하는 유전체 데이터로부터 발생할 수 있으며, 활성의 유의적 상실 없이(기능적 변형체들) 이들 폴리펩타이드들 내에 존재하는 아미노산들 중 일부가 치환될 가능성도 고려하면, 본 발명은 본 출원 내에 제공되는 서열과 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 가장 바람직하게는 적어도 95%의 동일성을 공유하는 상기 폴리펩타이드들의 폴리펩타이드 변형체들을 포함한다.
따라서 본 발명은 서열번호 107 내지 서열번호 124로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 95%, 97% 또는 99%의 서열 동일성을 가지는 폴리펩타이드 서열을 포함하는 폴리펩타이드들을 도출한다.
TCR 알파 결핍 T-세포에 의해 기능적 TCR 알파 사슬의 발현이 결핍된 분리된 T-세포가 의도된다. 이는 비제한적인 예로서, 이의 세포 표면 상에 임의의 기능적 TCR 알파를 발현하지 않도록 T-세포를 조작하거나 이의 표면 상에 매우 적은 기능적 TCR 알파 사슬이 생성되도록 T-세포를 조작하거나 돌연변이 또는 절단된 형태의 TCR 알파 사슬을 발현하기 위해 T-세포를 조작하는 다양한 수단을 통해 달성될 수 있다.
TCR 알파 결핍 세포들은 CD3 복합체를 통해 더 이상 확장될 수 없다. 다라서, 이러한 문제점을 해결하고 TCR 알파 결핍 세포들의 증식을 가능하게 하기 위해, pT알파 또는 이의 기능적 변형체는 상기 세포들 내로 도입됨에 따라 기능적 CD3 복합체를 복구한다. 바람직한 실시예에 있어서, 상기 방법은 DNA 절단에 의하여 T-세포 수용체(TCR)의 하나의 성분을 코드하는 하나의 유전자를 선택적으로 불활성화시킬 수 있는 레어-커팅 엔도뉴클레아제들을 상기 T-세포들 내로 도입하는 것을 더 포함한다. 특정 실시예에 있어서, 상기 레어-커팅 엔도뉴클레아제는 TALE-뉴클레아제들이다. 비제한적인 예로서, TALE-뉴클레아제는 서열번호 37 및 서열번호 57 내지 60으로 이루어진 군으로부터 선택되는 TCR알파의 유전자 표적 서열들 중 하나를 대상으로 한다. 바람직하게는, TALE-뉴클레아제들은 서열번호 41 및 서열번호 42로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 실시예에 있어서, TCR 알파 결핍 T-세포들의 확장을 위한 상기 방법은 추가적인 유전체 변형 단계를 포함한다. 추가적인 유전체 변형 단계에 의해, 조작하기 위한 세포들 내 하나의 목적 단백질의 도입이 의도될 수 있다. 상기 목적 단백질은 비제한적인 예로서, 키메라 항원 수용체(CAR), 특히 서열번호 73의 아미노산 서열을 포함하는 CAR, 다연쇄 CAR, 특히 서열번호 125의 아미노산 서열을 포함하는 다연쇄 CAR, PDCD1 또는 CTLA-4, 특히 서열번호 74 내지 서열번호 78의 핵산 서열을 표적으로 하는 이중특이적 항체, 레어-커닝 엔도뉴클레아제들 또는 본원에 개시된 바에 따른 면역억제제를 위한 표적을 표적으로 하는 레어-커팅 엔도뉴클레아제일 수 있다.
pT알파, 특히 상기에 개시된 기능적 변형체들을 코드하는 폴리펩타이드들 또한 본 발명 내에 포함된다. 바람직한 실시예에 있어서, 본 발명은 CD28, OX40, ICOS, CD137 및 CD8과 같은 신호 전달 도메인과 융합된 pT알파 또는 이의 기능적 변형체에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 서열번호 107 내지 서열번호 124로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 pT알파 기능적 변형체에 관한 것이다. 상기에 개시된 pT알파 또는 이의 기능적 변형체들을 코드하는 폴리뉴클레오타이드들, 벡터들 또한 본 발명 내에 포함된다.
상기 방법에 의해 용이하게 얻어지는 분리된 세포들 또는 세포주들 또한 본 발명의 범위 내에 포함된다. 특히 상기 분리된 세포들 또는 세포주들은 CD3 표면 발현을 지지하기 위해 상기 세포들 내로 pT알파 또는 이의 기능적 변형체를 도입하는 것에 의해 얻어진다. 바람직한 실시예에 있어서, 추가적으로 상기 분리된 세포 또는 세포주는 TCR알파 유전자를 불활성화시킴으로써 유전적으로 변형된다. 상기 유전자는 바람직하게는 적어도 하나의 레어-커팅 엔도뉴클레아제에 의해 불활성화된다. 바람직한 실시예에 있어서, 상기 레어-커팅 엔도뉴클레아제는 TALE-뉴클레아제이다.
다연쇄 키메라 항원 수용체(Multi-chain Chimeric Antigen Receptor, CAR)
다른 구현예에서, 상기 발명은 본 발명의 조작된(engineered) T-세포의 생산 및 팽창에 특히 적합한 다연쇄 키메라 항원 수용체(CAR)에 관한 것이다. 상기 다연쇄 CAR은 적어도 두 개의 하기 요소를 포함한다:
a) FcεRI 알파 사슬의 막관통 도메인(transmembrembrane domain) 및 세포 외 리간드-결합 도메인을 포함하는 하나의 폴리펩타이드,
b) FcεRI 베타 사슬의 N- 및C- 말단 세포질 꼬리 부분 및 막관통 도메인(transmembrane domain)을 포함하는 하나의 폴리펩타이드 및/또는
c) FcεRI 감마 사슬의 각 세포질내(intracytoplasmic) 꼬리 부분 및 막관통 도메인을 포함하는 두 개의 폴리펩타이드, 이에 의해 다른 폴리펩타이드가 함께 동시에 멀티머를 형성하여(multimerize), 이량체, 삼량체 또는 사량체 CAR을 형성한다.
사량체 CAR의 일 실시예가 도 3에 도시된다. 다연쇄 CARs의 다른 버전은 도 4에 나타난다. 다연쇄 CAR의 일 실시예는 아미노산 서열번호 125를 포함한다. 상기 용어 본원에서 사용된 "의 부분(a part of)" 은 짧은 펩티드인 분자의 임의의 서브세트(subset)를 의미한다. 대안적으로, 상기 폴리펩타이드의 아미노산 서열 기능적 변형체는 상기 폴리펩타이드를 코드하는 DNA에서 돌연변이에 의해 제조될 수 있다. 이러한 기능적 변형체는 아미노선 서열 내의 예를 들어, 결실, 삽입 또는 치환을 포함한다. 최종 구조가 특히, 특정 항-표적 세포 면역 활성을 나타내기 위한 바람직한 활성을 보유한다면 임의의 결실, 삽입 및 치환의 조합 또한 최종 구조에 도달하도록 만들어질 수 있다.
바람직한 구현예에서, 상기 세포 외 리간드-결합 도메인은 scFv이다. scFV이외의 다른 결합 도메인은 카멜리드(camelid) 단일-도메인 항체 단편 또는 혈관 내피 성장 인자 폴리펩타이드, 인테그린-결합 펩타이드, 헤레굴린(heregulin) 또는 IL-13 뮤테인, 항체 결합 도메인, 항체 가변(hypervariable) 루프 또는 CDRs 와 같은 제한되지 않은 예시로서 수용체 리간드와 같은 림프구의 사전정의된 표적으로 하는 데 또한 사용될 수 있다.
바람직한 구현예에서 상기 폴리펩타이드 a)상기 세포 외 리간드-결합 도메인 및 상기 막관통 도메인 사이의 스토크 영역(stalk region)을 포함한다. 상기 용어 "스토크 영역"은 본원에서 일반적으로 상기 막관통 도메인과 세포 외 리간드-결합 도메인을 연결하는 기능을 하는 임의의 올리고- 또는 폴리펩타이드를 의미한다. 특히, 스토크 영역은 세포 외 리간드-결합 영역을 위해 보다 가요성 및 접근성을 제공하기 위해 사용된다. 스토크 영역은 최대 300 아미노산, 바람직하게는 10 내지 100 아미노산 및 보다 바람직하게는 25 내지 50 아미노산을 포함할 수 있다. 스토크 영역은 CD8, CD4 또는 CD28의 세포 외 영역의 전부 또는 일부로부터 또는 항체 불변 영역의 전부 또는 일부로부터와 같이, 자연적으로 발생된 분자의 전부 또는 일부로부터 유래될 수 있다. 대안적으로, 상기 스토크 영역은 자연적으로 발생된 스토크 서열에 대응하는 합성 서열일 수 있고, 또는 완전히 합성 스토크 서열일 수 있다.
바람직한 구현예에서, 상기 a), b) 및/또는 c)의 폴리펩타이드는 적어도 하나의 신호-변환 도메인을 추가로 포함한다. 보다 바람직한 구현예에서, 상기 신호-전달 도메인은 CD28, OX40, ICOS, CD137 및 CD8로 구성된 군으로부터 선택된다.
바람직한 구현예에서, FcεRI 의 알파, 베타 및/또는 감마 사슬 단편의 상기 C-말단 세포질 꼬리는 TNFR-관련 인자2 (TRAF2) 결합 부위를 추가로 포함한다. 보다 바람직한 구현예에서, FcεRI 의 알파, 베타 및/또는 감마 사슬의 C-말단 세포질 꼬리는 상호자극(costimulatory)TNFR 멤버 족의 세포질내 꼬리로 대체된다. 상호자극 TNFR 족 멤버의 세포질 꼬리는 메인 보존 부위(P/S/A)X(Q/E)E) 또는 마이너 보존 부위(PXQXXD)로 구성된 TRAF2 결합 부위를 포함하고, 상기 X는 임의의 아미노산이다. TRAF 단백질은 수용체 삼량체에 대한 반응에서 많은 TNFRs의 세포 내 꼬리로 구성된다.
또 다른 바람직한 구현예에서, FcεRI 의 알파, 베타 및/또는 감마 사슬의 상기 세포질내 도메인은 TCR 제타 사슬(또한 CD3제타로 명명된다)의 세포질내 도메인으로 대체된다. 또 다른 바람직한 구현예에서, FcεRI 의 알파, 베타 및/또는 감마 사슬의 상기 세포질내 도메인은 적어도 하나의 추가적 면역수용체 티로신계 활성화 부위(immunoreceptor tyrosine-based activation motif, ITAM)를 포함한다. ITAM은 syk/zap70 fb 티로신 키나아제의 결합 부위와 같이 기여하는 다양한 수용체의 세포질내 꼬리에서 발견되는 신호 부위로 잘 정의된다. 본 발명에서 사용된 ITAM의 예들은 TCR제타, FCR감마, FCR베타, CD3감마, CD3델타, CD3입실론, CD5, CD22, CD79a, CD79b, 및 CD66d로부터 유래된 것들을 포함한다.
비제한적 예시로서, 다연쇄 CAR의 다른 버전디 도 4에 도시된다.
바람직한 구현예에서, 상기 다연쇄 CAR은 아미노산 서열번호 125를 포함한다. 본 발명은 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 90 %, 95 % 97 % 또는 99 %의 서열번호 125로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖은 서열 동일성(identity)을 갖은 폴리펩타이드 서열을 포함하는 폴리펩타이드에 관한 것이다.
또한, 본 발명의 범위에 상기 설명된 본 발명에 따른 다연쇄 CAR를 코드하는 벡터, 폴리뉴클레오타이드가 포함된다.
포괄하는 특정 구현예에서, 본 발명은 상기 T-세포 내로 상기 다연쇄 CAR 및 확장되는 상기 세포를 포함하는 다른 폴리펩타이드를 도입하는 단계를 포함하는 면역 요법을 위한 T-세포들의 제조를 위한 방법에 관한 것이다.
또 다른 구현예에서, 상기 방법은 상기 TCR의 일 요소 및/또는 면역억제제를 위한 표적을 발현하는 적어도 하나의 유전자를 불활성화시킴으로써 상기 세포를 유전적으로 변형시키는 단계를 포함한다. 바람직한 구현예에서, 상기 유전자는 TCR알파, TCR베타, CD52 및 GR로 구성된 군으로부터 선택된다. 바람직한 구현예에서, 상기 방법은 추가로 포함한다. DNA 절단(cleavage)에 의하여 상기 유전자를 선택적으로 불활성화시킬 수 있는 레어-커팅(rare-cutting) 엔도뉴클레아제(endonuclease)들을 상기 T-세포 내로 도입하는 단계를 포함할 수 있다. 보다 바람직한 구현예에서, 상기 레어-커팅 엔도뉴클라아제는 TALE-뉴클라아제이다. 본 발명에 따른 바람직한 TALE-뉴클라아제는 서열번호 1 내지 6(GR), 서열번호 37, 57 내지 60(TCR알파), 서열번호 38 내지 39(TCR베타) 및 서열번호 40, 서열번호 61 내지 65(CD52)로 구성된 군으로부터 선택된 표적 서열을 인식하고 절단하는 것들이다.
특별한 구현예에서, 상기 방법은 추가적 유전적 변형 단계를 추가로 포함한다. 추가적 유전적 변형 단계에 의해, 하나의 관심 단백질을 조작하기 위해 세포 내로 도입을 의도할 수 있다. 상기 관심 단백질의 비제한적 예시로서, 이중특이 항체, PDCDl 또는 CTLA-4 을 표적으로 하는 레어-커팅 엔도뉴클레아제, pT알파(pTalpha) 또는 본 명세서에 설명된 것과 같이 이의 기능적 변형체일 수 있다.
본 발명은 또한 상기 방법에 의해 세포를 조작하기 위해 수득하기 쉬운 분리된 세포 또는 세포주에 관한 것이다. 특히, 상기 분리된 세포는 상기 다연쇄CAR을 포함하는 폴리펩타이드를 코드하는 외인성 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
불활성화된 PDCDI 또는 CTLA4 T-세포
치료적(therapeutic) 항종양 면역을 활성화시키는 또 다른 방법은 면역 체크포인트의 차단이다. 면역 반응은 자극과 억제 신호의 균형을 잡음으로써 조절된다. 면역-체크포인트 단백질의 발현은 종양에 의해 조절이 곤란할 수 있고 중요한 면역 저항 메커니즘일 수 있다. T-세포 기능의 네거티브 조절인자는 CTLA-4 및 PDCD1로 또한 알려진 예정 사멸(programmed death)-1 (PD1)과 같은 분자를 포함하고, 상기 CTLA-4는 T-세포 활성의 경로를 하향-조절하는 중요 네거티브 조절 분자이고, 상기 PD1은 그것의 리간드(예정 사멸 리간드-1, PD-L1)에 결합되어 T-세포의 사이토킨 생성 및 증식을 감소시키는 경우(Pardoll 2012) 활성화된 T-세포를 상향-조절하는 막관통 수용체이다. 따라서, 억제 신호의 대항제는 항원-특이 T-세포 반응의 증폭을 야기한다.
따라서 본 발명은 특히 PDCD1 및/또는 CTLA-4에서, 면역 체크포인트와 관련있는 적어도 하나의 단백질을 불활성화시킴으로써 일반적으로 T-세포를 변형시키는 단계를 포함하는, 특히 면역 요법을 위한 T-세포를 조작하는 방법에 관한 것이다.
특별한 구현예에서, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:
(a) T-세포를 제공하는 단계;
(b) 상기 T-세포 내로 DNA 절단에 의하여 PDCD1 유전자 또는 CTLA-4 유전자를 선택적으로 불활성화시킬 수 있는 레어-커팅 엔도뉴클레아제를 도입하는 단계; 및
(c) 상기 세포가 확장되는 단계.
바람직한 구현예에서, 상기 레어-커팅 엔도뉴클레아제는 TALE-뉴클레아제이다. 본 발명에서 새로운 TALE-뉴클레아제는 선택적 면역 요법 전략을 위해 정확히 관계가 있는 유전자를 표적으로 하도록 설계되었다. 본 발명에 따른 바람직한 TALE-뉴클레아제는 서열번호 77 및 서열번호 78(PDCD-1), 서열번호 74 내지 서열번호 76(CTLA-4)로 구성된 군으로부터 선택된 표적 서열을 인식하고 절단하는 것들이다. 본 발명은 또한 서열번호 79 내지 서열번호 88로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 TALE- 뉴클레아제 폴리펩타이드에 관한 것이다.
본 발명은 또한 서열번호 79 내지 서열번호 88로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖은, 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 90 %, 95 % 97 % 또는 99 %의 서열번호 동일성을 갖은 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드에 관한 것이다. 또한, 본 발명의 범위에 상기 설명된 본 발명에 따른 레어-커팅 엔도뉴클레아제를 코드하는 벡터, 폴리뉴클레오타이드가 포함된다. 이러한 방법은 본 명세서에서 설명된 다른 방법들 중 임의의 하나와 관련될 수 있다.
이중특이 항체
추가적 구현예에 따르면, 전술한 바와 같이 다른 방법에 의해 수득된 조작된 T-세포는 이중특이 항체에 추가로 노출될 수 있다. 상기 T-세포는 환자에 투여 전에 엑스 비보(ex vivo) 또는 환자에 투여 후 인 비보(in vivo)에서 이중특이 항체에 노출시킬 수 있다. 상기 이중특이 항체는 표적 항원 근방 내로 상기 조작된 세포를 가져오는 것을 허락하는 별개의 항원 특성을 갖는 두 개의 가변 영역을 포함한다. 비제한적 예시로서, 상기 이중 특이 항체는 CD 와 같은 림프구 항원 및 종양 마커를 대상으로 하고, 다시 보내는 포텐셜을 가지고 종양에 대하여 임의의 순환하는 T-세포를 활성화시킨다.
전달 방법
상기 설명된 다른 방법들은, pT알파 또는 그것의 기능적 변형체, 레어 커팅 엔도뉴클레아제, TALE-뉴클레아제, 선택적으로DNA- 말단 처리 효소 또는 외인성 핵산을 갖는 다연쇄 CAR 또는 CAR을 세포 내로 도입하는 단계와 관련이 있다.
비제한적 예시로서, 상기 pT알파 또는 그것의 기능적 변형체, 레어 커팅 엔도뉴클레아제, TALE-뉴클레아제, 선택적으로DNA- 말단 처리 효소 또는 외인성 핵산을 갖는 다연쇄 CAR 또는 CAR은 하나에 의해 코드된 이식 유전자 또는 다른 플라스미드(plasmidic) 벡터로서 도입될 수 있다. 다른 이식 유전자는 2A 펩타이드를 코드하는 서열과 같이 리보솜 스킵 서열(ribosomal skip sequence)을 코드하는 핵산 서열을 포함하는 하나의 벡터에서 포함될 수 있다. 피코마바이러스들(picomaviruses)의 아프타(Aphtho) 바이러스 하위 그룹에서 확인된 2A 펩타이드는 코돈에 의해 코드된 두 개의 아미노산 사이에서 펩타이드 결합의 형성 없이 한 코돈에서 다음 코돈으로의 리보솜 "스킵"을 야기한다(도넬리 (Donnelly) 외, J. 일반 바이러스학 82: 1013-1025 (2001); 도넬리 (Donnelly) 외, J. 일반 바이러스학 78: 13-21 (1997); 도로니나(Doronina) 외, 분자 및 세포 생물학 28(13): 4227-4239 (2008); 앳킨스(Atkins) 외, RNA 13: 803-810 (2007) 참조). "코돈"은 mRNA 상의(또는 DNA 분자의 전사 가닥 상의), 리보솜에 의해 하나의 아미노산 잔기로 번역되는 세 개의 뉴클레오타이드를 의미한다. 따라서, 두 개의 폴리펩타이드는 상기 폴리 펩타이드가 틀에 있는 2A 올리고펩타이드 서열에 의해 분리되는 경우, 단일, mRNA 내의 근접한 해독틀(open reading frame)로부터 합성될 수 있다. 이러한 리보솜 스킵 메커니즘은 당 분야에 잘 알려져 있으며, 하나의 전령 RNA에 의해 코드되는 여러 단백질의 발현을 위한 여러가지 벡터에 의해 사용되는 것이 알려져 있다. 비제한적 예시로서, 본 발명에서, 2A 펩타이드는 레어-커팅 엔도뉴클레아제 및 DNA-말단 처리 효소 또는 다연쇄 CAR의 다른 폴리펩타이드들로 발현되기 위해 사용된다.
상기 플라스미드 벡터는 상기 벡터를 받은 세포의 식별 및/또는 선택을 위해 제공되는 선택 마커를 포함할 수 있다.
폴리펩타이드는 상기 폴리펩타이드를 코드하는 폴리뉴클레오타이드를 세포 내로 도입하는 결과로서 세포 내 정 위치에서(in situ) 합성될 수 있다. 대안적으로, 상기 폴리펩타이드는 세포 외부에서 생성될 수 있고 그 후 여기에 도입될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드 구조를 동물 세포에 도입하는 방법은 당 분야에서 알려져 있으며 비제한적 예시로서, 폴리 펩타이드 구조가 세포의 지놈 내로 통합되는 안정적 형질전환 방법, 폴리 펩타이드 구조가 세포의 지놈 내로 통합되지 않는 일시적 형질전환 방법 및 바이러스 매개 방법을 포함한다. 상기 폴리뉴클레오타이드는 셀 내에 도입될 수 있고, 예시로서 재조합 바이러스 벡터(예, 레트로 바이러스, 아데노바이러스), 리포좀 및 이와 동일한 종류의 것이 있다. 예를 들어, 일시적 형질전환 방법은 예를 들어 미세주입법(microinjection), 전기천공법 또는 입자분사법(particle bombardment)을 포함한다. 상기 폴리뉴클레오타이드는 벡터, 세포에서 발현되는 관점에서 보다 구체적으로 플라스미드 또는 바이러스에서 포함될 수 있다.
- 전기천공법
본 발명의 보다 바람직한 구현예는, 본 발명에 따라 폴리펩타이드를 코드하는 폴리뉴클레오타이드들은 예를 들어 전기천공법에 의해 세포 내로 직접 도입되는 mRNA일 수 있다. 본 발명자들은 T-세포 내 mRNA 전기천공법을 위한 최적의 조건을 결정했다.
본 발명자는 펄스 전기장의 사용에 의해, 세포 내로 물질의 전달을 위해 일시적으로 살아있는 세포를 투과성있게 하는 사이토펄스(cytoPulse) 기술을 사용했다. 펄스에자일(PulseAgile, (셀렉티스 소유)) 전기천공법 파형의 사용을 기반으로 하는 이 기술은 펄스 사이 간격뿐만 아니라 펄스 지속, 강도의 정밀한 제어를 가능하게 한다(US특허6,010,613 및 PCT출원WO2004083379). 이들 모든 파라미터는 최소 치사율을 갖는 높은 형질감염(transfection) 효율을 위한 최상의 조건에 도달하기 위해 변형된다. 기본적으로, 후속적 낮은 전기장 펄스가 세포 내로 상기 폴리뉴클레오타이드를 이동시키는 동안, 제1 높은 전기장 펄스는 구멍 형성을 가능하게 한다. 본 발명의 한 양태에서, 본 발명자는 T-세포에서 mRNA의 95%> 형질감염(transfection) 효율의 달성을 이끄는 단계 및 T-세포 내에 다른 단백질의 종류를 일시적으로 발현시키기 위해 상기 전기천공법 프로토콜의 사용을 설명한다. 특히 본 발명은, 상기 T 세포를 RNA와 접촉시키는 단계 및 하기로 구성되는 빠른 펄스(agile pulse) 서열을 T-세포에 적용하는 단계를 포함하는 형질 전환 T-세포의 방법에 관한 것이다:
(a) 2250 센티미터 당 V부터 3000 센티미터당 V까지의 범위의 전압, 0.1 ms의 펄스 폭 및 단계 (a) 및 (b) 전기 펄스들 사이에 0.2 내지 10 ms의 펄스 간격을 갖는 전기 펄스;
(b) 100 ms의 펄스 폭 및 단계 (b)의 전기 펄스와 단계 (c)의 제 1 전기 펄스 사이에 100 ms의 펄스 간격을 갖고, 2250 V 부터 3000 V 까지의 전압 범위를 갖는 전기 펄스; 및
(c) 0.2 ms의 펄스 폭 및 4 개의 전기 펄스들의 각각들 사이에 2 ms의 펄스 간격을 갖고, 325 V의 전압을 갖는 4개의 전기 펄스들.
특별한 구현예에서, T-세포를 형질전환 방법은RNA를 상기 T-세포에 접촉시키는 단계 및 하기로 구성되는 빠른 펄스 서열을 T-세포에 적용하는 단계를 포함한다:
(a) 2250, 2300, 2350, 2400, 2450, 2500, 2550, 2400, 2450, 2500, 2600, 2700, 2800, 2900 또는 3000센티미터당 V의 전압, 0.1ms의 펄스 폭 및 단계 (a) 및 (b) 전기 펄스들 사이에 0.2, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 ms의 펄스 간격을 갖는 전기 펄스;
(b) 2250, 2250, 2300, 2350, 2400, 2450, 2500, 2550, 2400, 2450, 2500, 2600, 2700, 2800, 2900 또는 3000V 범위의 전압, 100 ms의 펄스 폭 및 단계 (b)의 전기 펄스 및 단계 (c)의 제1 전기 펄스 사이에100 ms의 펄스 간격을 갖는 전기 펄스; 및
(c) 0.2 ms의 펄스 폭 및 4 개의 전기 펄스들의 각각들 간에 2 ms의 펄스 간격을 갖고, 325 V의 전압을 갖는 4개의 전기 펄스들.
상기 설명된 값의 범위에 포함되는 모든 값은 본원에 개시되어 있다. 전기천공법 매질(medium)은 당해 분야에 공지된 임의의 적합한 매질일 수 있다. 바람직하게는, 상기 전기천공법 매질은 0.01 내지 1.0 밀리지멘스(milliSiemens)에 걸친 범위의 전도성을 갖는다.
특별한 구현예에서, 비제한적 예시로서, 상기 RNA는 레어-커팅 엔도뉴클레아제, 하프(Half)-TALE-뉴클레아제와 같은 레어-커팅 엔도뉴클레아제의 한 모노머, 키메라 항원 수용체, 적어도 하나의 다연쇄 키메라 항원 수용체의 요소, pT알파 또는 그것의 기능적 변형체, 외인성 핵산, 하나의 추가적 촉매 도메인이 있다.
T-세포의 활성 및 확장
T-세포의 유전적 변형 전 또는 후이든, 상기 T-세포는 US특허6,352,694; 6,534,055; 6,905,680; 6,692,964; 5,858,358; 6,887,466; 6,905,681; 7,144,575; 7,067,318; 7,172,869; 7,232,566; 7,175,843; 5,883,223; 6,905,874; 6,797,514; 6,867,041 ; 및U.S. 특허 출원 명세서 20060121005에 설명된 바와 같은 방법을 사용하여 일반적으로 활성화되고 확장될 수 있다. T-세포는 시험관 내(in vitro) 또는 인 비보에서 확장될 수 있다.
일반적으로, 본 발명의 상기 T-세포는 신호와 관련된CD3 TCR 복합체를 자극하는 제제 및 T-세포의 표면 상의 공동 자극 분자를 자극하는 리간드에 부착되는 표면과의 접촉에 의해 팽창된다.
특히, T-세포 집단은 시험관 내에서 항-CD3 항체, 또는 그것의 항원-결합 단편, 또는 표면 상에 고정된 항-CD2 항체와의 접촉에 의해 또는 칼슘 이온통로와 결합된 단백질 카이네이즈(protein kinase) C 활성인자(예를 들어, 브리오스타틴(bryostatin))와 접촉에 의해서와 같이 자극될 수 있다. T-세포의 표면 상의 보조 분자의 상호-자극을 위해, 상기 보조 분자와 결합하는 리간드가 사용된다. 예를 들어, 상기 T-세포의 증식을 자극하는 적합한 조건 하 T-세포의 집단은 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체와 접촉된다. CD4+ T-세포 또는 CD8+ T-세포, 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체 중 하나의 증식을 자극한다. 예를 들어, 각각의 신호를 제공하는 제제는 용액 내 또는 표면에 결합될 수 있다. 당업자가 용이하ㅔ 이해할 수 있는 바와 같이, 세포와 입자의 비율은 표적 세포에 대한 입자 크기에 따라 달라질 수 있다. 본 발명의 추가적 실시예에서, T-세포와 같은 세포는 상기 비드(bead) 코팅된 제제와 결합되고, 비드와 세포는 후속적으로 분리되고, 그 후 세포는 배양된다. 대안적 구현예에서, 배양 전에, 상기 비드 코팅 제제 및 세포는 분리되지 않으나 함께 배양된다. 세포 표면 단백질은 항-CD3 및 항-CD28이 부착되는(3x28 비드) 상자기성 비드가 T-세포에 접촉되도록 허용함에 의해 결찰(ligate)될 수 있다. 일 구현예에서, 상기 세포(예를 들어, 4 내지 10 T-세포) 및 비드(예를 들어, 1:1 비율의 DYNABEADS® M-450 CD3/CD28 T 상자기성 비드)는 완충액, 바람직하게는 (칼슘, 마그네슘 등의 2가 양이온이 없는)PBS와 결합된다. 다시, 당업자는 사용될 수 있는 어떤 세포 농도를 용이하게 이해할 수 있다. 상기 혼합물은 몇 시간(약 3시간) 에서 약 14일까지 또는 이 사이의 임의의 시간적 정수 값 동안 배양될 수 있다. 다른 구현예에서, 상기 혼합물은 21일 동안 배양될 수 있다. T-세포 배양에 적합한 조건은, 혈청(예를 들어, 소 태아 또는 인간 혈청), 인터루킨-2(IL-2), 인슐린, IFN-g , 1L- 4, 1L-7, GM-CSF, -10, - 2, 1L- 15, TGFp, 및 TNF- 또는 당업자에게 공지된 세포의 성장을 위한 다른 첨가제들을 포함하는, 증식 및 생존력에 필요한 인자를 포함할 수 있는 적절한 매질들(예를 들어, Minimal Essential Media 또는 RPMI Media 1640 또는, X-vivo 5, (Lonza))을 포함한다. 세포의 성장을 위한 다른 첨가제는 이에 제한되지는 않으나, 계면활성제, 플라즈마네이트(plasmanate) 및 N-아세틸-시스테인 및 2-머캅토에타노이(2-mercaptoethanoi)와 같은 환원제를 포함한다. 매질은 RPMI 1640, A1M-V, DMEM, MEM, a-MEM, F-12, X-Vivo 1, 및 X-Vivo 20, 첨가된 아미노산, 소듐 피루브산, 및 비타민, 어느 혈청-프리 또는 혈청(또는 플라즈마)의 적절한 양과 함께 보충된 또는 호르몬의 정의된 세트, 및/또는 T-세포의 성장 및 팽창을 위한 사이토카인(들)의 양을 갖는 최적화제를 포함한다. 항생제, 예를 들어 페니실린 및 스트렙토마이신은 환자에 주입되는 세포 내 배양이 아닌, 단지 실험적인 배양에에서 포함된다. 상기 표적 세포는 예를 들어, 적절한 온도(예, 37?C) 및 대기(예, 공기에 5%의 CO2 를 더 포함)인 성장을 지지하는데 필요한 조건 하에서 유지된다. 다양한 자극 시간에 노출된 T-세포는 다른 특성을 나타낼 수 있다.
다른 특별한 구현예에서, 상기 세포는 조직 또는 세포와 상호-배양됨에 의해 팽창될 수 있다. 상기 세포는 예를 들어 상기 세포를 환자에 투여한 후 환자의 피에서인 인 비보에서 또한 팽창될 수 있다.
변형된 T-세포
본 발명의 범위에서 상기 설명된 방법 중 임의의 하나에 따라 수득된 분리된 T-세포를 또한 포괄한다. 본 발명에 따른 상기 T-세포는 줄기 세포로부터 유리될 수 있다. 상기 줄기 세포는 성인 줄기 세포, 태아 줄기 세포, 보다 구체적으로 는 비-인간 줄기 세포, 제대혈 줄기 세포, 전구 세포, 골수 줄기 세포, 유도 만능 (induced pluripotent) 줄기 세포, 분화전능(totipotent) 줄기 세포 또는 조혈(hematopoietic) 줄기 세포일 수 있다. 대표적 인간 세포는 CD34+ 세포이다. 상기 분리된 세포는 또한 수지상 세포(dendritic cell), NK-세포, B-세포 또는 염증성 T-림프구들, 세포독성 T-림프구들, 조절 T-림프구들 또는 헬퍼 T-림프구로 구성된 군으로부터 선택된 T-세포일 수 있다. 다른 구현예에서, 상기 세포는 CD4+ T- 림프구들 및 CD8+ T-림프구들로 구성된 군으로부터 유래될 수 있다. 본 발명의 세포들의 확장 및 유전적 변형 전에, 세포의 공급원은 다양한 비-제한적 방법을 통해 환자로부터 수득할 수 있다. T-세포는 말초 혈액 단핵 세포(peripheral blood mononuclear cells), 골수, 림프절 조직, 제대혈, 흉선 조직, 감염, 복수, 흉수, 비장 조직 및 종양 부위로부터의 조직을 포함하는 다수의 비-제한적 공급원으로부터 수득될 수 있다. 본 발명의 특정 구현예에서, 당업자에게 사용가능하고 공지된 임의의 수의 T-세포주가 사용될 수 있다. 다른 구현예에서, 상기 세포는 건강한 기증자, 암 진단받은 환자 또는 감염으로 진단된 환자로부터 유래될 수 있다. 다른 구현예에서, 상기 세포는 상이한 표현형을 나타내는 세포들의 혼합된 집단의 일부이다. 본 발명의 범위에서 상기 설명된 방법에 따른 형질전환된 T-세포로부터 수득된 세포주도 또한 포괄된다. 면역 억제 치료에 저항성 있고 이전의 방법에 의해 수득되기 쉬운 변형된 세포는 본 발명의 범위에서 포괄된다.
다른 구현예에서, 본 발명에 따른 상기 분리된 세포는 CD52, GR, TCR 알파 및 TCR 베타로 구성된 군으로부터 선택된 불활성화된 유전자를 포함하고 및/또는 CAR, 다연쇄 CAR 및/또는 pT알파 이식 유전자를 나타낸다. 다른 구현예에서, 본 발명에 따라 상기 분리된 세포는 CD52 및 GR, CD52 및 TCR 알파, CDR52 및 TCR 베타, GR 및 TCR 알파, GR 및 TCR 베타, TCR 알파 및 TCR 베타로 구성된 군으로부터 선택된 두 개의 불활성화된 유전자를 포함하고 및/또는 CAR, 다연쇄 CAR 및/또는 pT알파 이식 유전자를 나타낸다.
다른 구현예에서, 본 발명에 따른 세포들에서 TCR은 TCR 알파 유전자 및/또는 TCR 베타 유전자(들)을 불활성화시킴으로써 기능하지 않도록 나타난다. 상기 전략은 보다 구체적으로 GvHD를 피하기 위해 사용된다. 본 발명의 특별한 양태에서 개별(individual)부터 유래된 변형된 세포를 얻는 방법은, 상기 세포는 주요 조직 적합 복합적 신호 경로(Major Histocompatibility Complex signaling pathway)와 별개로 증식될 수 있다. 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:
(a) 상기 개별로부터 세포를 회복하는 단계;
(b)TCR 알파 또는 TCR 베타 유전자를 불활성화시킴으로써 엑스-비보에서 상기 세포를 유전적으로 면형시키는 단계;
(c) 상기 세포를 증폭시키기 위해 적절한 조건에서 시험관 내 유전적으로 변형된 T-세포를 배양하는 단계.
주요 조직 적합 복합적 신호 경로와 별개로 증식될 수 있는 변형된 세포는, 본 발명의 범위에 포괄되는 이러한 방법에 의해 수득되기 쉽다. 상기 변형된 세포는 숙주편대이식(Host versus Graft, HvG) 거부 반응 및 이식편대숙주 질환(Graft versus Host Disease, GvHD)에 대항하는 그것이 필요한 환자를 치료하기 위한 본 발명의 특별한 양태에서 사용될 수 있다; 따라서 본 발명의 범위에서 숙주편대이식(HvG) 거부 반응 및 이식편대숙주 질환(GvHD)에 대항하는 그것이 필요한 환자를 치료하는 방법은 상기 환자에 불활성화된 TCR 알파 및/또는 TCR 베타 유전자를 포함하는 변형된 세포의 효과적인 양을 투여함으로써 상기 환자를 치료하는 단계를 포함한다.
치료적 적용
다른 구현예에서, 다른 방법에 의해 수득되는 분리된 세포 또는 전술한 바와 같은 상기 분리된 세포로부터 유래된 세포주는 약제로써 사용될 수 있다. 다른 구현예에서, 상기 약제는 이들 약제를 필요로한 환자에서 암 또는 감염을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 다른 구현예에서, 본 발명에 따른 상기 분리된 세포 또는 상기 분리된 세포로부터 유래된 세포주는 이를 필요로하는 환자에서 암 또는 바이러스 감염의 치료를 위한 약제의 제조에 사용될 수 있다.
다른 양태에서, 본 발명은 이를 필요로하는 환자를 치료하기 위한 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 적어도 하나의 하기 단계를 포함한다:
(a)전술한 방법 중 임의의 하나에 의해 수득 가능한 T-세포를 제공하는 단계;
(b)상기 형질전환 T-세포를 상기 환자에 투여하는 단계,
일 구현예상에서, 본 발명의 상기 T-세포는 인 비보에서 강력한 T-세포 팽창을 거칠 수 있고 장시간 동안 지속될 수 있다.
상기 치료는 개선(ameliorating), 치료 또는 예방할 수 있다. 이는 자가(autologous) 면역요법의 일부 또는 동종이형(allogenic) 면역요법 치료의 일부일 수 있다. 자가 조직에 의함은 환자를 치료하기 위해 사용되는 세포, 세포주 또는 세포의 집단이 상기 환자 또는 인간 백혈구 항원(Human Leucocyte Antigen, HLA) 호환성 기증자로부터 발생되는 것을 의미한다. 동종 이형에 의함은, 환자를 치료하기 위해 사용되는 세포 또는 세포의 집단은 상기 환자로부터는 발생하지 않고 기증자로부터 발생되는 것을 의미한다.
본 발명은 특히, 일반적으로 기증자로부터 수득되는, 비-동종반응성 세포 내 T-세포의 형질전환이 가능한 한에 있어서는, 동종이형 면역 요법에 적합하다. 이는 표준 프로토콜 하에서 수행될 수 있고 필요한 만큼 여러 번 재생될 수 있다. 상기 결과적 변형된 T-세포는 하나 또는 여러 환자들에게 모아지고 투여될 수 있고, 치료적 생산물로 "규격품"으로서 제조할 수 있다.
개시된 방법이 사용될 수 있는 세포들은 이전 섹션에서 설명된다. 상기 치료는 암, 바이러스 감염, 자가면역질환 또는 이식편대숙주질환(GvHD)로 진단받은 환자를 치료하기 위해 사용될 수 있다. 치료될 수 있는 암은 혈관이 분포된 종양뿐만 아니라 혈관이 분포되지 않은, 또는 아직 충분히 혈관이 분포되지 않은 종양을 포함한다. 상기 암은 비-고형(nonsolid) 종양(예를 들어, 백혈병(leukemia) 및 림프종(lymphoid)과 같은 혈액학적 종양) 또는 고형 종양을 포함할 수 있다. 본 발명의 CAR로 치료되는 암의 유형은 이에 제한되지 않으나, 암(carcinoma), 모세포종(blastoma), 및 육종(sarcoma), 및 특정 백혈병 또는 림프 악성 종양, 양성(benign) 및 악성(malignant) 종양, 및 예를들어 육종, 암종 및 흑색종(melanomas)인 악성 종양들을 포함한다. 성인 종양/암 및 소아 종양/암도 또한 포함된다.
이는 항체 요법, 화학 요법, 사이토킨 요법, 수지상 세포 요법, 유전자 요법, 호르몬 요법, 레이저 광 요법 및 방사선 요법의 군으로부터 선택된 하나 이상의 암에 대한 요법의 조합의 치료일 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 치료는 면역 억제 치료를 받고 있는 환자에게 투여될 수 있다. 실제로, 본 발명은 바람직하게는 이러한 면역 억제제에 대한 수용체를 코드하는 유전자의 불활성화에 기인한 적어도 하나의 면역 억제제에 저항하도록 제조되는 세포 또는 세포의 집단을 필요로 한다. 이러한 양태에서, 상기 면역억제 치료는 환자 내에서 본 발명에 따른 T-세포의 선택 및 확장을 도와야 한다.
본 발명에 따른 세포 또는 세포 집단의 투여는 에어로졸 흡입, 주사, 섭취, 수혈, 이식(implantation) 또는 이식(transplantation)에 의하는 것을 포함하는 임의의 편리한 방식으로 수행될 수 있다. 본원에 기재된 조성물은 환자에게 피하의(subcutaneously), 피내의(intradermaliy), 종양 내(intratumorally), 골수 내(intramedullary), 근육 내(intramuscularly), 정맥 내 또는 림프 내(intralymphatic) 주사, 또는 복막 내로 투여될 수 있다. 일 구현예에서, 상기 본 발명의 세포 조성물은 바람직하게는 정맥 내 주사에 의해 투여될 수 있다.
세포 또는 세포 집단의 투여는 kg 체중 당 104-109　세포, 바람직하게는 105　 내지 106세포/kg 체중의, 그 범위 내의 세포 수의 모든 정수 값을 포함하는 투여량으로 구성될 수 있다. 상기 세포 또는 세포 집단은 하나 이상의 용량(dose)으로 투여될 수 있다. 다른 구현예에서, 상기 세포의 유효량은 단일 용량으로서 투여된다. 다른 구현예에서, 상기 세포의 유효량은 주기에 걸쳐 하나 이상의 용량으로 투여된다. 투여 시기는 관리하는 의사의 판단 내에 그리고 환자의 임상 상태에 따라 달라진다. 상기 세포 또는 세포의 집단은 혈액 은행 또는 기증자와 같은 임의의 공급원으로부터 수득될 수 있다. 개개인의 요구가 다양하지만, 당해 분야의 기술 내에 특정 질환 또는 상태에 대한 소정의 세포 유형의 유효량의 최적 범위를 결정한다. 유효량은 치료적 또는 예방적 이익을 제공하는 함량을 의미한다. 투여된 용량은 치료 받는 사람의 나이, 건강 및 체중, 동시 치료의 종류(있는 경우), 치료의 빈도 및 바람직한 효과의 특성에 따라 달라질 것이다.
다른 구현예에서, 상기 세포의 유효량 또는 이러한 세포를 포함하는 조성물은 비경구적으로 투여된다. 상기 투여는 정맥 내 투여일 수 있다. 상기 투여는 종양 내 주사에 의해 직접적으로 수행될 수 있다.
본 발명의 특정 구현예어서, 세포는 많은 관련 치료 양상과 결합하여(예를 들어, 이전에, 동시 또는 이후에) 환자에게 투여된고, 상기 관련 치료 양상은 항바이러스 요법, 시도포비어(cidofovir) 및 인터루킨-2(interleukin-2), 사이타라빈(Cytarabine, ARA-C로도 알려짐) 또는 MS 환자를 위한 나탈리주마브(nataliziimab) 치료 또는 건선(psoriasis) 환자를 위한 에팔리주마브(efaliztimab) 치료 또는PML 환자를 위한 다른 치료들과 같은 제제를 통한 치료를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 추가적 구현예에서, 본 발명의 상기 T-세포는 화학 요법, 방사선, 시클로스포린(cyclosporine), 아자티오프린(azathioprine), 메토트렉세이트(methotrexate), 미코페놀레이트(mycophenolate), 및 FK506, 항체와 같은 면역 억제제 또는 CAM PATH 와 같은 다른 면역 제거제(immunoablative agents), 항-CD3 항체 또는 다른 항체 요법, 사이톡신, 플루다라정(fludaribine), 시클로스포린(cyclosporine), FK506, 라파마이신(rapamycin), 미코프리놀릭 산(mycoplienolic acid), 스테로이드(steroids), FR901228, 사이토카인 및 광선 조사의 조합이 사용될 수 있다. 포스피타아제 칼시뉴린(phosphatase calcineurin)(시클로스포린 및 FK506) 또는 p70S6 키나아제를 억제하는 이러한 약물은 신호를 유도하는 성장 인자(라파마이신)에 중요하다(류(Liu) 외, 세포 66:807-815, 1 1 ; 핸더슨(Henderson) 외, 면역. 73:316-321, 1991 ; 비에르(Bierer) 외, Citrr. Opin. mm n. 5:763-773, 93). 추가적 구현예에서, 본 발명의 세포 조성물은 골수 이식, 플루다라정, 외부-빔 방사 요법(XRT), 시클로포스파미드(cyclophosphamide)와 같은 화학 요법 제제 또는 OKT3 또는 CAMPATH와 같은 항체를 이용한 T-세포 탈격(ablative) 요법과 결합하여(예를 들어, 이전에, 동시 또는 이후에) 환자에게 투여된다. 다른 구현예에서, 본 발명의 세포 조성물은 예를 들어, 리툭산(Rituxan)인 CD20과 반응하는 제제와 같은 B-탈격 요법에 따라 투여된다. 예를 들어, 일 구현예에서, 환자는 말초 혈액 출기 세포 이식이 따르는 고용량 화학 요법의 표준 치료를 받을 수 있다. 특정 구현예에서, 이식 다음으로, 환자는 본 발명의 확장된 면역 세포의 주입을 받는다. 추가적 구현예에서, 확장된 세포는 수술(surgeiy) 전후로 투여된다. 여기에 설명된 방법 중 임의의 하나에 의해 수득되는 상기 변형된 세포는 숙주편대이식(Host versus Graft, HvG) 거부 반응 및 이식편대숙주 질환(Graft versus Host Disease, GvHD)에 대항하는 그것이 필요한 환자를 치료하기 위한 본 발명의 특별한 양태에서 사용될 수 있다; 따라서 본 발명의 범위에서 숙주편대이식(HvG) 거부 반응 및 이식편대숙주 질환(GvHD)에 대항하는 그것이 필요한 환자를 치료하는 방법은 상기 환자에 불활성화된 TCR 알파 및/또는 TCR 베타 유전자를 포함하는 변형된 세포의 효과적인 양을 투여함으로써 상기 환자를 치효하는 단계를 포함한다.
면역 요법을 위한 인간 동종이형(allogeneic) 세포를 조작하는 방법의 실시예
본 발명을 보다 잘 이해하기 위해, 면역 요법을 위한 인간 동종이형(allogenic) 세포를 조작하는 방법의 일 실시예가 도 5에 도시된다. 상기 방법은 하나 또는 여러 하기 단계들의 조합을 포함한다:
1. 세포 배양 또는 한 개인 환자 또는 혈액 은행으로부터 T-세포를 제공받고, 항- CD3/C28 활성인자 비드를 사용하여 상기 T-세포를 활성화 시키는 단계. 상기 비드는 T-세포의 활성 및 확장에 요구되는 일차 및 상호-자극 신호 모두를 제공한다.
2. a) CD3 표면 발현을 지지하고 CD3 복합체의 자극을 통해 세포 확장을 허용하기 위해 pT알파 또는 그것의 기능적 변형체 이식 유전자로 상기 세포에 형질 도입하는(Transducing) 단계. TCR 파열은 TCR 복합체의 제거를 기대하고 동종이형반응성(GvHD)을 제거하나 CD3 신호 요소의 손실에 기인한 동종이형(allogenic) 세포 확장을 변하게 할 수 있다. 형질 도입된 세포는 pT알파 사슬 또는 그것의 기능적 변형체를 발현하도록 기대된다. 사전TCR 복합체를 형성하기 위해 TCR베타 사슬 및 CD3 신호 요소를 갖는 이 pT알파 사슬 쌍은, 따라서 기능적 CD3 복합체를 복원하고 불활성화된 TCR알파 세포의 활성 또는 자극을 지지한다. pT알파 렌티바이러스(lentiviral) 벡터를 갖는 T-세포의 형질 도입은 TCR알파 불활성화 전후에 실현될 수 있다.
b)상기 세포에, 림프종(lymphomas) 및 고형 종양을 포함하는 다양한 악성 종양으로부터 표적 T-세포의 표면에서 발현되는 항원에 대해 T-세포를 다시 보내는(redirect) 것을 허용하는 다연쇄 CARs을 형질 도입하는 단계. 공동-자극 도메인의 기능을 향상시키기 위해, 본 발명자들은 전술한 바와 같이 FCERI로부터 유래된 다연쇄 CAR을 고안했다. 형질 도입은 TCR알파 및 CD52유전자의 불활성화 전후에 실현될 수 있다.
3. 비 동종반응성 및 면역 억제성 저항 T-세포를 조작하는 단계:
a) 동종이형(allogenic)의 TCR 에 의해 외부로서 숙주 조직의 인식을 막고 세포의 표면으로부터 TCR을 제거하고 따라서 GvHD를 피하기 위해, 상기 세포에서 TCR알파를 불활성화시키는 것이 가능하다.
b)또한 T-세포 이식에 영향을 주지 않고 거부 반응을 방지하기 위해 면역 억제 치료에 상기 세포를 저항성 있도록 하기 위해, 면역 억제제는 표적을 코드하는 한 유전자를 불활성화시키는 것이 가능하다. 이 예시에서, 면역 억제제의 표적은 CD52이고 면역 억제제는 인간화 단일 클론성 항-CD52 항체이다.
본 발명자들에 의해 T-세포 내에서 DSB이벤트의 높은 비율을 허용함으로써TALE-뉴클레아제의 사용은 T-세포에서 상기 이중 불활성화를 달성하는 것이 특히 유리한 것이 밝혀졌다. 바람직하게는, TCR알파 및 CD52유전자는 상기 유전자를 표적으로 하는 TALE-뉴클레아제를 코드하는 mRNA를 갖는 T-세포를 전기천공함에 의해 불활성화된다. 본 발명자들에 의해 높은 형질전환율을 일으키는 mRNA를 사용하는 것은 T-세포들에 덜 해롭고 따라서, T- 세포 조작의 처리에서 중요한 것이 밝혀졌다. 그 후, 불활성화된 T-세포는 자기성 비드를 사용하여 분려된다. 예를 들어, CD52를 발현하는 T-세포는 고형 표면 상에 정착에 의해 제거되고 불활성화된 세포는 컬럼을 통해 통과되는 스트레스에 노출되지 않는다. 이 온화한 방법은 적절히 조작된 T-세포의 농도를 증가시킨다.
4. 환자에 투여 전 조작된 T-세포의 시험관 내 또는 CD3 복합체의 자극을 통한 환자에게 투여에 따르라 인 비보에서 확장. 투여 단계 전에, 환자는 CAMPATH1-H, 인간화 단일 클론성 항-CD52 항체와 같은 면역 억제 치료에 영향을 받는다.
5. 표적 항원 근방에 조작된 세포를 가져오기 위해 환자에 투여 전에 엑스 비보에서 또는 환자에 투여 후에 인 비보에서 이중 특이 항체에 선택적으로 노출된 상기 세포.
다른 정의들
- 폴리펩타이드 서열에서 아미노산 잔기는 예를 들어, Q는 Gln 또는 글루타민 잔기를 의미하고, R은 Arg 또는 아르기닌 잔기를 의미하며, D는 Asp 또는 아스파르트산 잔기를 의미하는, 단일-문자 코드(one-letter code)에 따라 본원에서 표시된다.
- 아미노산 치환은 다른 잔기로 하나의 잔기의 대체를 의미하고, 예를 들어, 펩타이드 서열에서 글루타민 잔기로 아르기닌 잔기의 대체가 아미노산 치환이다.
- 뉴클레오타이드는 하기와 같이 표시된다; 단일-문자 코드는 뉴클레오타이드의 염기를 표시하기 위해 사용된다: a는 아데닌, t는 티민, c는 시토신, 및 g는 구아닌이다. 변성된 뉴클레오타이드는, r 은 g 또는 a (퓨린 뉴클레오타이드)를 나타내고, k 는 g 또는 t를 나타내고, s는 g 또는 c를 나타내고, w는 a 또는 t를 나타내고, m은 a 또는 c를 나타내고, y는 t 또는 c (피리미딘 뉴클레오타이드)를 나타내고, d는 g, a 또는 t를 나타내고, v는 g, a 또는 c를 나타내고, b는 g, t 또는 c를 나타내고, h는 a, t 또는 c를 나타내고, n은 g, a, t 또는 c를 나타낸다.
- 본원에서 사용된"핵산" 또는 "폴리뉴클레오타이드"은 데옥시리보핵산(DNA) 또는 리보핵산(RNA), 올리고뉴클레오타이드, 중합 효소 연쇄 반응(PCR) 및 결찰(ligation), 절단, 엔도뉴클레아제 작용 및 엑소뉴클레아제 작용에 의해 발생된 단편과 같은 뉴클레오타이드 및/또는 폴리뉴클레오타이드를 지칭한다. 핵산 분자는 (DNA 및 RNA 와 같은)자연 발생 뉴클레오타이드의 단량체, (예를 들어 자연 발생 뉴클레오타이드의 거울상 이성질체 형태인)자연 발생 뉴클레오타이드의 유사체, 또는 이들의 조합으로 구성될 수 있다. 예를 들어, 할로젠, 알킬기, 아민 및 아지도기로 하나 이상의 하이드록시기를 대체하는 당 변형은 에테르 또는 에스테르로서 기능할 수 있다. 또한, 상기 전체 당 모이어티(moiety)는 아자-당 및 카르복실릭 당 유사체와 같은 입체적 및 전자적 유사 구조로 대체될 수 있다. 염기 모이어티에서 변형의 예시는 알킬화된 퓨린 및 피리미딘, 아실화된 퓨린 및 피리미딘 또는 다른 잘 알려진 헤테로 대체물을 포함한다. 핵산 단량체는 포스포디에스테르 결합 또는 이러한 이러한 연결의 유사체에 의해 연결될 수 있다. 핵산은 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다.
-"상기 이중-가닥 손상의 서열 상부에 상동의 제1 영역, 상기 세포의 지놈에서 삽입되는 서열 및 상기 이중-가닥 손상의 서열 하부에 상동의 제2 영역을 연속적으로 포함하는 폴리뉴클레오타이드"는, 정 위치에서 DNA 표적의 5' 내지 3' 영역에 상동인 제1 및 제2 영역을 포함하는 매트릭스 또는 DNA 구조를 의미하는 것이다. 상기 DNA 구조는 또한 정 위치에서 대응되는 DNA 서열과 일부 상동을 포함하는 제1 및 제2 영역 사이에서 위치되는 제3 부분 또는 대안적으로 정 위치에서 상기 DNA 표적의 표적의 5' 내지 3' 영역과 상동이 아닌 것을 포함한다. DNA 표적의 절단에 따라, 상동 재조합 이벤트는 관심(interest) 좌(locus)에서 포함되는 표적 유전자를 포함하는 지놈 사이에서 자극되고, 상기 DNA 표적을 포함하는 지놈 서열은 상기 매트릭스의 제2 부분 및 상기 매트릭스의 제1 및 제2 부분의 변이성 부분으로 대체된다.
-"DNA 표적", "DNA 표적 서열", "표적 DNA 서열", "핵산 표적 서열", "표적 서열", 또는 "처리 부위(processing site)"은 본 발명에 따른 레어-커팅 엔도뉴클레아제에 의해 처리되고 표적이될 수 있는 것을 의미한다. 이러한 용어들은 특정 DNA 위치, 바람직하게는 세포에서 지놈 위치뿐만 아니라, 이에 제한되지는 않으나 플라스미드, 에피솜, 바이러스, 트랜스포존, 또는 미토콘드리아와 같은 소기관과 같은 유전적 물질의 주 본체와 별도로 존재할 수 있는 유전적 물질의 일부를 지칭한다. TALE-뉴클라아제 표적의 비제한적 예시로서, 표적이되는 지놈 서열은 일반적으로 15-bp 스페이서로 분리된 두 개의 17 b- 장 서열(하프(half) 표적이라 지칭)으로 이루어진다. 각 하프-표적은 EF1-알파 프로모터 또는 T7 프로모터의 조절 하에 플라스미드에서 코드되는 비제한적 예시로서 표 1, 5, 6 및 10에 열거된 TALE-뉴클레아제들의 반복에 의해 인식된다. 상기 핵산 표적 서열은 1, 5, 6 및 10에 지시된, 상기 표적의 한 가닥의 5' 내지 3' 서열에 의해 정의된다.
- 키메라 항원 수용체(CAR)는 예를 들어, 특정 항-표적 세포의 활동을 나타내는 키메라 단백질을 발생시키기 위해, T-세포 수용체-활성 세포 내 도메인을 갖는 바람직한 항원(예, 종양 항원)에 대해 항체-기반 특이성인 표적 T-세포에 존재하는 성분에 대한 결합 도메인과 결합한 분자를 의미한다. 일반적으로, CAR은 T-세포 항원 수용채 복합체 제타 사슬(scFvFc^)의 세포 내 신호 도메인에 융합되는 세포 외 단일 사슬 항체(scFvFc)로 구성되고, T-세포에서 발현시, 단일 클론 항체의 특이성에 따라 항원 인식을 다시 보내는(redirect), 상기 능력을 갖는다. 본 발명에서 사용되는 CAR의 일 실시예는 CD19항원을 대상으로 하는 CAR이고, 비제한적 예시로서 아미노산 서열번호 73을 포함할 수 있다.
- "전달 벡터" 또는 "전달 벡터들"은, 세포 접촉(즉, "접촉") 또는 세포 내 전달 또는 서브 세포 내 구획(compartments)(즉, "도입") 제제/화학제 및 본 발명에서 필요로 하는 분자(단백질 또는 핵산)에 놓기 위하여 본 발명에 사용될 수 있는 임의의 전달 벡터를 의도한다. 이는 리포좀 전달 벡터, 바이러스 전달 벡터, 약물 전달 벡터, 화학성 운반체, 중합성 운반체, 리포플렉스, 폴리플렉스, 덴드리머, 미세기포(microbubbles)(초음파 조영제), 나노입자, 유화제 또는 다른 적절한 전달 벡터를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 이들 전달 벡터는 분자, 화학제, 거대 분자(유전자, 단백질), 또는 플라스미드와 같은 다른 벡터, 디아토스(Diatos)에 의해 개발된 펩타이드의 전달을 허용한다. 이러한 경우에, 전달 벡터는 분자 운반체이다. "전달 벡터" 또는 "전달 벡터들"은 또한, 트랜스펙션(형질감염)을 수행하기 위해 고안된 전달 방법이다.
- 상기 용어 "벡터" 또는 "벡터들"은 연결된 또 다른 핵산을 운반할 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 본 발명에서 "벡터"은 이에 제한되지는 않으나, 염색체, 비염색체, 세미-합성 또는 합성 핵산으로 이루어질 수 있는 선형 또는 원형 DNA 또는 RNA 분자, 바이러스 벡터, 플라스미드, RNA 벡터를 포함한다. 바람직한 벡터는 이들이 연결된 핵산의 발현(발현 벡터) 및/또는 자율 복제 (autonomous replication)(에피솜 벡터)를 할 수 있는 것들이다. 다수의 적절한 벡터는 당업자에게 알려져 있고 상업적으로 시판된다.
바이러스 벡터는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 파르보바이러스(예를 들어, 아데노-관련 바이러스), 코로나바이러스, 오르토믹소바이러스(orthomyxovirus)(예를 들어, 인플루엔자 바이러스)와 같은 네거티브 가닥 RNA 바이러스, 라브도바이러스(rhabdovirus) (예를 들어, 광견병 (rabies) 및 수포성 구내염 바이러스(vesicular stoma-titis virus)), 파라믹소바이러스(예를 들어, 홍역(measles) 및 센다이(Sendai)), 피코르나바이러스 (picornavirus) 및 알파바이러스와 같은 포지티브 가닥 RNA 바이러스, 및 아데노바이러스, 헤르페스바이러스 (예를 들어, 단순포진 바이러스 (Herpes Simplex virus) 타입 1 및 2, 엡스테인-바 바이러스(Epstein-Barr virus), 사이토메갈로바이러스(cytomegalovirus)), 및 폭스바이러스(poxvirus)(예를 들어, 종두(vaccinia), 계두(fowlpox), 카나리아 두창(canarypox))를 포함한다. 다른 바이러스는 예를 들어, 노로(Norwalk) 바이러스,토가바이러스(togavirus), 플라비바이러스(flavivirus), 레오바이러스(reoviruses), 파포바바이러스(papovavirus), 헤파드나바이러스 (hepadnavirus), 및 헤파티티스 바이러스(hepatitis virus)를 포함한다. 레트로바이러스의 예시는: 에비안 백혈병-육종(avian leukosis-sarcoma), 포유류 C-타입, B-타입 바이러스, D 타입 바이러스, HTLV-BLV 군, 렌티-바이러스 (lenti-virus), 스푸마바이러스 (spumavirus)(커핀(Coffin), J. M., (레트로바이러스과: 기본적 바이러스학에서 바이러스 및 그들의 복제(Retroviridae: The viruses and their replication, In Fundamental Virology), 3판, B. N. Fields, et al., Eds., Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, 1996)를 포함한다.
- "렌티바이러스 벡터(lentiviral vector)"은, 상대적으로 큰 패킹 능력(packaging capacity), 감소된 면역원성(immunogenicity) 및 큰 범위의 다른 세포 유형을 높은 효율로 안정하게 형질 도입(transduce)시키는 이들의 능력 때문에 유전자 전달에 대해 매우 유망한 HIV-계 렌티바이러스 벡터를 의미한다. 렌티바이러스 벡터는 보통 생산자(producer) 세포에 세 개(팩킹, 진화 및 전달) 이상의 플라스미드의 일시적인 트랜스펙션 후에 발생한다. HIV과 같이, 렌티바이러스 벡터는 상기 세포 표면 상에 수용체를 갖는 바이러스 표면 글리코단백질의 상호작용을 통해 표적 세포로 진입한다. 엔트리(entry)에서, 상기 바이러스 RNA는 이것은 바이러스 역 전사효소복합체 (reverse transcriptase complex)에 의해 매개되는 역 전사를 수행한다. 역 전사의 생성물은 이중-가닥 선형 바이러스 DNA이고, 이는 감염된 세포의 DNA에서 바이러스 통합을 위한 기질이다. "통합적인 렌티바이러스 벡터(또는 LV)"은, 비-제한 예시로서 표적 세포의 지놈을 통합할 수 있는 이러한 벡터를 의미한다. 반대 측면에서, "비 통합적 렌티바이러스 벡터(또는 NILV)"은, 상기 바이러스 인테그라제(integrase)의 작용을 통해 표적 세포의 지놈을 통합시키지 않는 효율적인 유전자 전달 벡터를 의미한다.
- 전달 벡터 및 벡터는 소노포레이션(sonoporation) 또는 전기천공법(electroporation) 또는 이들 기술의 파생과 같은 어떤 세포의 삼투(permeabilization) 기술과 조합되거나 관련이 있을 수 있다.
- 세포 또는 세포들은, 임의의 진핵 생물 세포, 일차 세포 (primary cell) 및 시험관 내 배양을 위한 이들 유기체로부터 유래된 세포주를 의미한다.
- "일차 세포" 또는 "일차 세포들"은, 매우 작은 집단 더블링(doubling)을 겪고 따라서 연속적 종양형성성(tumorigenic) 또는 인위적으로 불멸화된 세포주와 비교하여, 이들이 유래된 조직의 특징 및 주 기능적 성분을 보다 대표하는, 생물 조직(즉, 생검 재료 (biopsy material))로부터 직접 가져오고 시험관 내에서 자리를 잡은 세포를 의미한다.
비제한적 예시로서, 세포주는 CHO-K1 세포; HEK293 세포; Caco2 세포; U2-OS 세포; NIH 3T3 세포; NSO 세포; SP2 세포; CHO-S 세포; DG44 세포; K-562 세포, U-937 세포; MRC5 세포; IMR90 세포; JurkaT-세포; HepG2 세포; HeLa 세포; HT-1080 세포; HCT-116 세포; Hu-h7 세포; Huvec 세포; Molt 4 세포로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
이러한 모든 세포주는 관심의 유전자 또는 단백질을 생산, 발현, 정량화, 검출, 연구하기 위해, 본 발명의 방법에 의해 변형되어 세포주 모델을 제공할 수 있고, 이러한 모델들은 또한 비제한적 예시로서 화학제, 생물연료, 치료학 및 작물학과 같은 다양한 분야 및 생산, 연구에서 관심의 생물학적 활성 분자를 스크린(screen)하기 위해 사용될 수 있다.
- "돌연변이"는, 폴리뉴클레오타이드(cDNA,유전자) 또는 폴리펩타이드 서열에서 하나, 둘, 셋, 넷, 다섯, 여섯, 일곱, 여덟, 아홉, 열, 열하나, 열둘, 열셋, 열넷, 열다섯, 스물, 스물다섯, 서른, 마흔, 쉰 또는 이상의 뉴클레오타이드/아미노산의 치환, 결실, 삽입을 의미한다. 상기 돌연변이는 유전자의 코딩 서열 또는 이의 조절 서열(regulatory sequence)에 영향을 미칠 수 있다. 이는 또한 지놈 서열의 구조 또는 상기 코드된 mRNA의 구조/안전성에 영향을 미칠 수 있다.
- "변이체(들)"는 반복 변이체, 변이체, DNA 반복 변이체, TALE-뉴클레아제 변이체, 폴리펩타이드 변이체 돌연변이 또는 모 분자의 아미노선 서열에서 적어도 하나의 잔기의 대체에 의해 얻어진 폴리펩타이드 변이체를 의미한다.
- "기능적 변이체"는, 단백질 또는 단백질 도메인의 촉매적 활성 돌연변이를 의미한다; 이러한 돌연변이는, 모 단백질 또는 단백질 도메인 또는 추가적 특성 또는 높거나 낮은 활성과 비교하여 동일한 활성을 가질 수 있다.
- "유전자"는, 염색체에 따라 선형 방식으로 배열된 DNA 배열의 분절(segment)으로 구성되는, 형질(heredity)의 염기 단위를 의미하고, 이는 특정 단백질 또는 단백질 분절에 대한 코드이다. 유전자는 통상적으로 프로모터, 5' 미번역 영역, 하나 이상의 코딩 서열(엑손), 선택적 인트론(introns), 3' 미번역 영역을 포함한다. 상기 유전자는 종결 인자(terminator), 인핸서(enhancers) 및/또는 사일렌서(silencers)를 추가로 포함한다.
- 본 발명에 사용된 바와 같은, 용어 "좌(locus)"는 염색체상에 DNA 서열(예를 들어, 유전자)의 특정 물리적 위치이다. 상기 용어 "좌"은 염색체 상에 레어-커팅 엔도뉴클레아제 표적 서열의 특정 물리적 위치를 지칭할 수 있다. 이러한 좌는 본 발명에 따른 레어-커팅 엔도뉴클레아제에 의해 인식 및/또는 절단되는 표적 서열을 포함할 수 있다. 본 발명의 관심의 좌는 세포의 유전적 물질의 주 몸체 (즉, 염색체)에 존재하는 핵산 서열뿐만 아니라, 비제한적 예시로서, 미토콘드리아와 같은 세포 소기관(organelle)에서 또는 플라스미드, 에피좀, 바이러스, 트랜스포존과 같은 유전적 물질의 상기 주 몸체와 별개로 존재할 수 있는 유전적 물질의 부분을 한정할(qualify) 수 있는 것으로 이해된다.
- 상기 용어 "엔도뉴클레아제"은 DNA 또는 RNA 분자, 바람직하게는 DNA 분자 내의 핵산들 사이에 결합의 가수분해(절단)를 촉매할 수 있는 임의의 야생형 또는 변성 효소를 지칭한다. 엔도뉴클레아제는 그의 서열에 관계없이 DNA또는 RNA분자를 절단하지 않으나, "표적 서열" 또는 "표적 부위"으로서 추가로 지칭되는 특정 폴리뉴클레오타이드 서열에서 DNA 또는 RNA를 인식하고 절단한다. 엔도뉴클레아제는 12 염기 쌍(bp) 길이, 보다 바람직하게는 14-55 bp를 초과하는 폴리뉴클레오타이드 인식 부위를 일반적으로 갖는 경우, 레어-커팅 엔도뉴클레아제로서 분류될 수 있다. 레어-커팅 엔도뉴클레아제는 한정된 좌에서 DNA 이중-가닥 손상(DSBs)을 유도시킴으로써 HR을 상당히 증가시킨다 (Rouet, Smih et al. 1994; Rouet, Smih et al. 1994; Choulika, Perrin et al. 1995; Pingoud and Silva 2007). 레어-커팅 엔도뉴클레아제는 예를 들어, 호밍(homing) 엔도뉴클레아제(Paques 및 Duchateau 2007), FokI과 같은 제한 효소의 촉매 도메인을 갖는 조작된 징크-핑거(zinc-finger) 도메인의 융합으로부터 야기되는 키메라 징크-핑거 뉴클레아제(ZFN)(Porteus 및 Carroll 2005) 또는 화학적 엔도뉴클레아제(Eisenschmidt, Lanio et al. 2005 ; Arimondo, Thomas et al. 2006; Simon, Cannata et al. 2008)일 수 있다. 화학적 엔도뉴클레아제에 있어서, 화학적 또는 펩타이드 절단인자(cleaver)는 핵산의 중합체 또는 특정 표적 서열을 인식하는 다른 DNA에 접합되고, 그에 의해 특정 서열에 대한 절단 활성을 표적으로 한다. 또한 화학적 엔도뉴클레아제는 특정 DNA 서열과 결합하는 것으로 알려진(Kalish 및 Glazer 2005), DNA 절단 분자, 트리플렉스-형성 올리고뉴클레오타이드 (TFOs) 및 오르소페난트롤린(orthophenanthroline)의 접합과 같은 합성 뉴클레아제를 포괄한다. 이러한 화학적 엔도뉴클레아제는 본 발명에 따른 용어 "엔도뉴클레아제"에 포함된다.
레어-커팅 엔도뉴클레아제는, 예를 들어, 상기 크산토모나스(Xanthomonas) 속의 식물 병원균에 의해 감염 처리에서 사용된 단백질의 과(family)인, 전사 활성인자 유사 작동자(TALE)로부터 유래된 DNA 결합 도메인 및 FokI 촉매 도메인을 사용하는 키메라 뉴클레아제의 새로운 분류인, TALE-뉴클라아제일 수 있다 (Boch, Scholze et al. 2009; Moscou and Bogdanove 2009; Christian, Cermak et al. 2010; Li, Huang et al.). FokI-기반 TALE-뉴클레아제(TALE-뉴클레아제)의 기능적 설계는 필수적으로 상기 TALE 도메인에 의해 대체될 징크-핑거 DNA 결합 도메인을 갖는, ZFN의 것(that of a ZFN)이다. 그로서, TALE-뉴클레아제에 의한 DNA 절단은 비특이적 중심 영역의 측면의 두 개 의DNA 인식 영역을 요구한다. 본 발명에서 포괄되는 레어-커팅 엔도뉴클레아제는 또한 TALE-뉴클레아제로부터 유래될 수 있다.
레어-커팅 엔도뉴클레아제는 메가뉴클레아제의 명칭으로 알려진, 호밍 엔도뉴클레아제일 수 있다. 이러한 호밍 엔도뉴클레아제는 당 기술분야에서 잘 알려져 있다(Stoddard 2005). 호밍 엔도뉴클레아제는 DNA 표적 서열을 인식하고, 단일- 또는 이중-가닥 손상을 발생시킨다. 호밍 엔도뉴클레아제는 12 내지 45 염기쌍 (bp) 길이, 보통 14 내지 40 bp 길이의 범위에서 DNA 표적 부위를 매우 특이적으로, 인식한다. 본 발명에 따른 호밍 엔도뉴클레아제는, 예를 들어, LAGLIDADG 엔도뉴클레아제, HNH 엔도뉴클레아제, 또는 GIY-YIG 엔도뉴클레아제에 대응할 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 호밍 엔도뉴클라아제는 l-Crel 변성일 수 있다.
-용어 "TALE-뉴클레아제"(TALEN)은 전사 활성인자 유사 작동자(TALE) 및 핵산 표적 서열을 절단하는 하나의 뉴클레아제 촉매 도메인으로부터 일반적으로 유래된 핵산-결합 도메인으로 구성되는 융합 단백질을 의미한다. 상기 촉매적 도메인은 바람직하게는 뉴클레아제 도메인이고 보다 바람직하게는 예를 들어, I-Tevl, ColE7, NucA 및 Fok-I와 같은 엔도뉴클레아제 활성을 갖는 도메인이다. 특별한 구현예에서, 상기 TALE 도메인은 예를 들어, I-Crel 및 I-Onul 또는 이들의 기능적 변형체와 같은 메가뉴클레아제로 융합될 수 있다. 보다 바람직한 구현예에서, 상기 뉴클레아제는 단량체 TALE-뉴클레아제이다. 단량체 TALE-뉴클레아제는 WO2012138927에 개시된 I-Tevl 의 촉매적 도메인으로 반복되는 조작된 TAL의 융합과 같은, 특정 인식 및 절단에 대한 이합체를 필요로하지 않는 TALE-뉴클레아제이다. 전사 활성인자 유사 작동자(TALE)는 다수의 반복되는 서열을 포함하는 박테리아 종 크산토모나스로부터의 단백질이고, 각 반복은 서열을 표적으로 하는 핵산의 각 뉴클레오타이드 염기에 특이적인 12 및 13(RVD)의 위치에서 디-잔기(di-residues)를 포함한다. 유사 모듈 염기-퍼-염기(base-per-base) 핵산 결합 특성(MBBBD)을 갖는 결합 도메인은 또한 다른 박테리아 종에서 어플리케이션에 의해 최근 발견된 새로운 모듈 단백질로부터 유래될 수 있다. 상기 새로운 모듈 단백질은 TAL 반복보다 더 서열 변이성을 나타내는 이점을 갖는다. 바람직하게는, 다른 뉴클레오타이드의 인식과 관련있는 RVDs는 C 인식을 위한HD, T인식을 위한 NG, A 인식을 위한NI, G 또는 A 인식을 위한 NN, A, C, G 또는 T 인식을 위한 NS, T인식을 위한HG, T인식을 위한 IG, G 인식을 위한 NK, C 인식을 위한 HA, C 인식을 위한 ND, C 인식을 위한HI, G 인식을 위한HN, G 인식을 위한NA, G 또는 A 인식을 위한SN 및 T 인식을 위한 YG, A인식을 위한 TL, A 또는 G 인식을 위한 VT 및 A 인식을 위한SW이다. 다른 구현예에서, 중요한 아미노산 12 및 13은 뉴클레오타이드 A, T, C 및 G를 향한 그들의 특이성을 향상시키기 위해 특히 이 특이성을 향상시키기 위해 다른 아미노산 잔기를 향해 변이될 수 있다. TALE-뉴클레아제는 이미 개시되었고 유전자 표적화 및 유전자 변형을 자극하는데 사용되고 있다(Boch, Scholze et al. 2009; Moscou and Bogdanove 2009; Christian, Cermak et al. 2010; Li, Huang et al.). 조작된 TAL-뉴클레아제는 상표명 TALEN™ 상업적으로 사용 가능하다(셀렉티스(Cellectis), 8 rue de la Croix Jarry, 75013 Paris, France).
- 상이 용어 "절단"은 폴리뉴클레오타이드의 공유 골격의 손상을 의미한다. 절단은 이에 제한되는 않으나, 포스포디에스테르 결합의 효소적 또는 화학적 가수분해를 포함하는 다양한 방법에 의해 개시될 수 있다. 단일-가닥 절단 및 이중-가닥 절단이 모두 가능하고, 이중-가닥 절단은 두 개의 별개 단일-가닥으로 절단 사건을 초래할 수 있다. 이중 가닥 DNA, RNA, 또는 DNA/RNA 하이브리드 절단은 무딘(blunt) 말단 또는 비틀린(staggered) 말단의 생산을 초래할 수 있다.
-"융합 단백질"은, 별도의 단백질 또는 이들의 부분에 대해 본래적으로 코드하는, 두 가지 이상의 유전자의 결합으로 이루어진 기술 분야에서 잘 알려진 처리의 결과를 의미하고, 상기 "융합 유전자"의 번역은 각각의 본래 단백질로부터 유래된 기능적 특성을 갖는 단일 폴리펩타이드를 초래한다.
- "동일성"은 두 개의 핵산 분자 또는 폴리펩타이드 사이에 서열 동일성을 의미한다. 동일성은 비교를 목적으로 정렬될 수 있는 각 서열에서 위치를 비교하여 결정될 수 있다. 상기 비교된 서열에서 위치가 동일한 염기에 의해 점유되는 경우, 상기 분자는 그 위치에서 동일한 것이다. 핵산 또는 아미노산 서열 사이에 유사성 또는 동일성의 정도는 상기 핵산 서열에 의해 공유된 위치에서 동일하거나 일치하는 뉴클레오타이드의 수의 함수이다. 다양한 정렬 알고리즘(alignment algorithm) 및/또는 프로그램은 상기 GCG 서열 분석 패킹의 일부로서 가능한 FASTA 또는 BLAST를 포함하는(University of Wisconsin, Madison, Wis.), 두 서열 사이에서 동일성을 계산하기 위해 사용될 수 있고, 예를 들어, 디폴트 설정 (default setting)으로 사용될 수 있다. 예를 들어, 본원에서 설명된 특정 폴리펩타이드에 적어도 70%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 고, 바람직하게는 이러한 폴리펩타이드를 코드하는 폴리뉴클레오타이드뿐만 아니라 상당히 동일한 기능을 나타내는 폴리펩타이드가 고려된다.
-"유사성"은 두 개 이상의 폴리펩타이드의 아미노산 서열 사이의 관계를 설명한다. BLASTP는 BLOSUM45, BLOSUM62 또는 BLOSUM80와 같은 유사성 매트릭스를 사용하여 아미노산 서열을 참고하여 이에 대하여 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 87.5%, 90%, 92.5%, 95%, 97.5%, 98%, 99% 서열 유사성을 갖는 아미노산 서열을 식별하기 위해 또한 사용될 수 있다. 달리 명시되지 않는 한, 유사성 스코어(score)는 BLOSUM62의 사용을 기반으로 할 것이다. BLASTP를 사용하는 경우, 퍼센트 유사성은 BLASTP 포지티브 스코어를 기반으로 하고, 상기 퍼센트 서열 동일성은 BLASTP 동일성 스코어를 기반으로 한다. BLASTP "동일성"은 동일한 서열 쌍을 높게 스코어링하는 전체 잔기의 수 및 분수(fraction)를 나타내고; BLASTP"포지티브"은 정렬 점수가 포지티브 값을 가지고 서로 유사한 잔기의 수 및 분수를 나타낸다. 본원에서 개시된 아미노산 서열의 유사성의 동일성의 동이럿ㅇ 또는 유사성 또는 임의의 중간 정도의 이러한 정도를 가지는 아미노산 서열이 고려되고 본 명세서에서 포괄된다. 유사한 폴리펩타이드의 상기 폴리뉴클레오타이드 서열은 유전적 코드를 사용하여 추론되고 통상적인 수단에 의해 얻어질 수 있다. 예를 들어, pT알파의 기능적 변형체는 아미노산 서열번호 107에 대하여70%, 75%, 80%, 85%, 87.5%, 90%, 92.5%, 95%, 97.5%, 98%, 99% 서열 유사성을 갖는다. 기능적 변형체와 같은 코드하는 폴리뉴클레오타이드는 유전적 코드를 사용하여 그의 아미노산 서열을 역전사함으로써 생산될 수 있다.
-"신호-형질도입 도메인" 또는 "공동-자극 리간드"은 T-세포 상의 동족의 공동-자극 분자와 특이적으로 결합하는 세포를 나타내는 항원 상의 분자를 지칭하고, 그에 의해 예를 들어, 펩타이드를 운반하는 MHC 분자를 갖는TCR/CD3 복합체에 결합에 의해 제공되는 일차 신호에 부가적인 신호를 제공하고, T-세포 반응을 매개하고, 이에 제한되지는 않응나 증식, 활성화, 분화 및 이와 같은 것을 포함한다. 상호-자극 리간드는 이에 제한되지는 않으나, CD7, B7-1 (CD80), B7-2 (CD86), PD-LI, PD-L2, 4-1BBL, OX40L, 유도적 상호자극 리간드(igand) (ICOS-L), 세포 내 부착 분자(ICAM, CD30L, CD40, CD70, CD83, HLA-G, MICA, M1CB, HVEM, 림포톡신 베타 수용체, 3/TR6, ILT3, ILT4, Toll 리간드 수용체에 결합하는 작용약 또는 항체 및 B7-H3와 특이적으로 결합하는 리간드를 포함한다. 상호-자극 리간드는 또한 그 중에서도 특히, T-세포 상에 존재하는 상호-자극 분자와 특이적으로 결합하는 항체를 포괄하고, 상기 항체는 이에 제한되지는 않으나, CD27, CD28, 4-IBB, OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, 림프구 기능-관련 항원-1(LFA-1), CD2, CD7, LTGHT, NKG2C, B7-H3, CD83과 특이적으로 결합하는 리간드 등이 있다.
"상호-자극 분자"은 상호-자극 리간드와 특이적으로 결합하는 T-세포 상의 동족의 결합 파트너를 지칭하고, 그리하여, 증식에 제한되지는 않으나, 이와 같은 세포의 상호-반응을 매개한다. 상호-자극 분자는 이에 제한되지는 않으나, MHC 분류 I 분자, BTLA 및Toll 리간드 수용체를 포함한다.
본원에서 사용된 "상호-자극 신호"은 TCR/CD3 결찰(ligation)과 같은, 일차 신호와 조합인 신호를 지칭하고, T-세포 증식 및/또는 중요 분자의 상향조절 또는 하향조절을 이끈다.
-"이중특이 항체"은 단일 항체 분자 내의 두 다른 항원을 위한 결합 부위를 갖는 항체를 지칭한다. 당업자는 정규(canonical) 항체 구조이외에 다른 분자가 두 결합 특이성으로 구성될 수 있는 것을 이해할 것이다. 추가적으로, 이중특이 항체에 의한 항원 결합은 동시 또는 순차적일 수 있는 것을 이해할 것이다. 이중특이 항체는 "폴리도마(polydoma) " 기술(U.S. Pat. No. 4,474,893 참조)에 의해 화학적 기술(예를 들어,Kranz et al. (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 5807 참조) 또는 그 자체가 알려진 DNA 재조합 기술에 의해 제조될 수 있다. 비제한적 예시로서, 각 결합 도메인은 항체 헤비(heavy) 사슬("VH 또는 H region")로부터 적어도 하나의 가변 영역을 포함하고, 상기 제1 결합 도메인의 VH영역은 CD3와 같은 림프구 마커에 특이적으로 결합하고 제2 결합 도메인의 VH 영역은 종양 항원에 특이적으로 결합한다.
-본원에서 사용되는 상기 용어 "세포 외 리간드-결합 도메인"은 리간드를 결합할 수 있는 올리고- 또는 폴리펩타이드로서 정의된다. 바람직하게는. 상기 도메인은 세포 표면 분자와 상호작용할 수 있다. 예를 들어, 상기 세포 외 리간드-결합 도메인은 특정 질환 상태와 관련된 표적 세포 상의 세포 표면 마커로서 행동하는 리간드를 인식하기 위해 선택될 수 있다. 따라서 리간드로서 행동할 수 있는 세포 표면 마커의 예시는 바이러스, 박테리아 및 기생 감염, 자가 면역 질환 및 암세포와 관련된 것들을 포함한다.
상기 용어"환자(subject)" 또는 환자"(patient)"은 인간이 아닌 영장류와 인간을 포함한 동물계의 모든 구성원을 포함한다.
본 발명의 상기 기재된 설명은 임의의 당업자가 상기 동일한 것을 제조하고 사용할 수 있게 하는 것과 같은 제조 및 사용의 방식 및 공정을 제공하고, 이러한 권한 부여(enablement)는 본래의 설명의 일부를 구성하는 첨부된 청구항의 주제를 위해 특히 제공된다.
수치적 제한 또는 범위가 본원에서 기재된 경우, 종점들은 포함된다. 또한, 수치적 제한 또는 범위 내의 모든 값 및 서브 범위는 만약 명시적으로 기재되지 않아도 구체적으로 포함된다.
상기 설명은 당업자가 본 발명을 제조 및 사용이 가능하도록 제시되고, 특정 어플리케이션 및 이의 요건들의 맥락에서 제공된다. 바람직한 구현예의 다양한 변형은 당업자에게 용이하게 명백할 것이며, 본원에서 정의된 유전적 원리는 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않고 다른 구현 예 및 어플리케이션에 적용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 나타낸 구현예에 제한되는 것을 의도하지 않으나, 본원에 개시된 원리 및 특성과 일치하는 전반적 범위를 따른다.
본 발명에서 일반적으로 기재된 것을 가지고, 어떤 특별한 실시예를 참조하여 추가적 이해가 얻어질 수 있고, 상기 실시예는 단지 설명을 목적으로 본원에서 제공되며, 달리 명시되지 않는 한, 본 발명은 이에 제한되는 않는다.
실시예들
실시예 1: 인간 GR 유전자를 절단하는 TALE-뉴클레아제
인간 GR 유전자의 6개의 헤테로다이머(heterodimeric) TALE-뉴클레아제들(nucleases)이 설계되고 생산되었다. 하기 표 1은 각각의 TALE-뉴클레아제에 의하여 절단(cleave)된 표적 서열들을 가리킨다. GR TALE-뉴클레아제는 (반(half) TALE-뉴클레아제들이라 불리는) 두 개의 독립적인 개체들(entities)로 구성되며(composed), 그 각각은 15-bp 스페이서에 의하여 분리된 (반(half) 표적들이라고 불리는) 2개의 17-bp 길이 서열들로 구성된 GR 표적 서열들을 절단(cleave)하고 결합하도록 조작된 반복 서열을 포함한다.
Figure 112021049142782-pat00001
Figure 112021049142782-pat00002
표 1: GR TALE-뉴클레아제들 및 인간 GR 유전자 내 TALE-뉴클레아제들 표적 위치(site)들의 서열들의 기술
N-말단, C-말단 도메인들 및 반복의 아미노산 서열들은 AvrBs3 TALE (참조: GenBank: X16130.1)에 기초한다. 상기 C-말단 및 N-말단 도메인들은 2개의 BsmBI 제한 부위(restriction site)들에 의하여 분리된다. 바람직한 서열들(서열번호 1 내지 6)을 표적으로 하는 반복 어레이들(arrays)(서열번호 7 내지 18)이 연이은 제한(restriction)/연결(ligation)/세척 단계들로 구성된(composed) 고형 지지체(solid support) 방법을 이용하여 합성되었다. 간단히 말해서, (이(di)-반복을 코드하는) 첫 번째 블록(block)이 비오틴/스트렙타비딘(streptavidin) 상호작용을 통하여 고형 지지체 상에 고정화되었고, 두 번째 블록(삼(tri)-반복)은 그 다음에 상기 첫 번째에 연결되었고, SfaNI 절단(digestin) 후 세 번째 블록(삼-반복)이 커플링된다. 상기 공정은 바람직한 반복 어레이를 얻자마자 삼- 또는 이- 반복 블록들을 이용하여 반복되었다. 그 산물은 그 후 대장균 내 증폭을 위하여 전통적인 pAPGlO 클로닝 플라스미드 내로 클로닝되고 시퀀싱되었다(sequenced). 이와 같이 수득된 반복 어레이 서열들은 플라스미드를 받기 위한 타입 IIS 제한 효소들 BsmB 및 삽입된 반복 서열을 위한 Bbvl 및 SfaNI를 이용하는 효모 ㅂ발현 TALE 벡터 내로 서브클로닝되었다(subcloned). FokI 제한 효소의 촉매 영역(domain)에 융합되기 위한(fuse) TALE 유래 DNA 결합 영역을 포함하는, 반 TALE-뉴클레아제를 코드하는 DNA가 대장균에서 증폭되었으며, 표준 미니프레프(standard miniprep) 기술들을 이용하여 회수되고 삽입물(insert)의 온전한 상태를 평가하기 위하여 시퀀싱되었다.
효모 내 GR TALE-뉴클레아제들의 활성:
서열번호 1 내지 6을 야기한 15 bp들의 스페이서에 의하여 분리된 DNA 가닥 상에서 서로 마주보는 두 개의 TALE 표적 서열들을 포함하는 표적들에 대한, 6개의 GR-TALE-뉴클레아제들의 뉴클레아제 활성이 전에 기재한 우리의 효모 SSA 어세이에서 37 ℃ 및 30 ℃에서 시험되었다(국제 PCT 출원들 WO 2004/067736 및 (Epinat, Arnould et al. 2003; Chames, Epinat et al. 2005; Arnould, Chames et al. 2006; Smith, Grizot et al. 2006) 내). 상기 TALE-뉴클레아제 DNA 표적 서열들을 포함하는 모든 효모 표적 리포터 플라스미드들이 전에 기재한 바와 같이 만들어졌다(국제 PCT 출원들 WO 2004/067736 및 (Epinat, Arnould et al. 2003; Chames, Epinat et al. 2005; Arnould, Chames et al. 2006; Smith, Grizot et al. 2006 내). 효모에서, 표적들에 대한 각각의 클론들의 TALE-뉴클레아제 절단(cleavage) 활성 레벨들은 표 2에 나타내었다.
Figure 112021049142782-pat00003
표 2: 효모 내 GR TALE-뉴클레아제들의 절단(cleavage) 활성
값들은 0 및 1 사이로 포함된다. 최대 값은 1이다.
HEK293 세포들 내에서 GR TALE-뉴클레아제들의 활성:
각각의 TALE-뉴클레아제 구조체(construct)가 pEF1알파 긴(long) 프로모터의 통제 하 포유류 발현 벡터 내 제한 효소 절단(digestion)을 이용하여 서브클론되었다.
100 만개의 HEK293 세포들이 트랜스펙션(transfection) 하루 전 접종되었다.제조업자의 지시에 따라 리포펙타민(lipofectamine)(Invitrogen) 25 ㎕를 이용하여 EF1알파 프로모터의 통제 하 GR 유전자 내 관심있는 두 개의 반 표적들 게놈 서열들을 인식하는, GRex2, GRex3T2, GRex3T4, GRex5Tl , GRex5T2 또는 GRex5T3 TALE-뉴클레아제의 왼쪽 및 오른쪽 반(half)을 코드하는 두 개의 플라스미드들을 각각 2.5 ㎍으로, 세포들이 상호-트랜스펙션되었다. 대조군으로, EF1 알파 프로모터의 통제 하 T-세포 수용체 알파 불변 사슬 영역(constant chain region) (TRAC_T01) 표적 위치((TRAC_T01-L 및 -R TALE-뉴클레아제 (서열번호 41 및 서열번호 42, TRAC_T01 표적 위치 (서열번호 37))를 표적으로 하는 TALE-뉴클레아제들의 왼쪽 및 오른쪽 반을 코드하는 두 개의 플라스미드들 각각 2.5 ㎍으로, 세포들이 상호-트랜스펙션되었다. GR 코드 서열 내 TALE-뉴클레아제들에 의하여 일어나는 이중 가닥 파손(break)은 비상동성 말단 연결(non homologous end joining)(NHEJ)을 야기하는데, 이는 오류유발(error-prone) 메커니즘이다.
TALE-뉴클레아제들의 활성이 표적으로 한 게놈 자리(genomic locus)에서 삽입들 또는 결실들의 빈도에 의하여 측정된다.
트랜스펙션 2 또는 7일 후 세포들이 수확되었으며, 자리(locus) 특이적 PCR들이 하기 프라이머들을 이용하여 추출된 게놈 DNA 상에 수행되었다: 5'-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAG-3' (포워드(forward) 어댑터(daptator) 서열)- 1ON (TAG)- GR 엑손 2를 위한 자리 특이적 포워드 서열: 5 ' -GGTTC ATTTAAC AAGCTGCC-3' (서열번호 31), GR 엑손 3을 위함: 5 ' -GC ATTCTGACTATGAAGTGA-3 ' (서열번호 32) 및 GR 엑손 5를 위함: 5 ' -TC AGC AGGCC ACTAC AGGAGTCTC AC AAG-3 ' (서열번호 33) 및 역(reverse) 프라이머 5 ' -CCTATCCCCTGTGTGCCTTGGC AGTCTC AG-3 ' (역(reverse) 어댑터 서열)- GR 엑손 2를 위한 자리 특이적 역 서열 : 5'-AGCCAGTGAGGGTGAAGACG-3' (서열번호 34), GR 엑손 3을 위함 : 5'-GGGCTTTGCATATAATGGAA-3 ' (서열번호 35) 및 GR 엑손 5를 위함 : 5'-CTGACTCTCCCCTTC ATAGTCCCCAGAAC-3 ' (서열번호 36).
PCR 산물들은 454 시퀀싱 시스템(454 Life Sciences)에 의하여 시퀀싱되었다. PCR 산물 당 대략 10,000 개의 서열들이 수득되었고, 그 후 위치(site)- 특이적 삽입 또는 결실 이벤트(event)들의 존재를 위하여 분석되었다. 표 3은 샘플 내 서열들의 총 개수들 중 TALE-뉴클레아제 위치에서 삽입들 또는 결실들을 보인 서열들의 퍼센트를 나타낸다. 표 3에서 대표 시험의 결과인 GRex2, GRex3T2 및 GRex3T4가 리스트되어 있다.
시험한 모든 케이스들에서, 돌연변이 발생(mutagenesis)의 %는 트랜스펙션 2일 후 샘플의 것과 비교했을 때 7일에서 유사하였다. 돌연변이 발생을 높이는 이벤트들의 특성 또한 분석되었는데, 삽입들에 비교하여 모든 케이스들에서 다수의 결실들이 밝혀졌다.
Figure 112021049142782-pat00004
표 3: HEK293 세포들 내 내인성 TALE-뉴클레아제 표적 위치들(sites)에서의 표적된 돌연변이 발생의 퍼센트.
초기(primary) T 림프구들 내 GR TALE-뉴클레아제들의 활성:
각각의 TALE-뉴클레아제 구조체가 T7 프로모터의 통제 하 발현 벡터 내 제한 효소 절단(digestion)을 이용하여 서브클론되었다.
GR 게놈 서열들을 절단하는(cleaving) TALE-뉴클레아제들을 코드하는 mRNA들이 T7로부터 코드 서열들 다운스트림(downstream)을 나르는 각각의 플라스미드로부터 합성되었다. 말초혈액으로부터 분리된 T 림프구들은 항-CD3/CD28 활성화제 비드들(activator beads)(Life technologies)을 이용하여 5일 간 활성화되었으며, 5 백만 세포들이 CytoLVT-P 기구(BTX-Harvard apparatus)를 이용하여 반 TALE-뉴클레아제들 둘 다를 코드하는 2 mRNA들 각각 10 ㎍으로 전기천공법에 의하여 트랜스펙션되었다. CD52 유전자(CD52_T02-L 및 -R TALEN (서열번호 55 및 56), 표적 서열 CD52_T02 서열번호 40)를 표적으로 하는 반 TALE-뉴클레아제들 둘 다를 코드하는 2 mRNA들 각각 10 ㎍으로 트랜스펙트된 T 세포들이 대조군으로 이용된다.
트랜스팩션 3 및 7일 후, 게놈 DNA가 트랜스펙션된(transfected) 세포들로부터 분리되었으며 자리 특이적 PCR들이 전술한 프라이머들을 이용하여 수행되었다. PCR 산물들은 454 시퀀싱 시스템(454 Life Sciences)에 의하여 시퀀싱되었다. PCR 산물 당 대략 10,000 개의 서열들이 수득되었으며, 그 후 위치-특이적 삽입 또는 결실 이벤트들의 존재를 위하여 분석되었다; 결과는 표 4에 있다.
Figure 112021049142782-pat00005
표 4: 초기(primary) T 림프구들 내 내인성 TALE-뉴클레아제 표적 위치들에서 표적된 돌연변이 발생 퍼센트.
실시예 2: 인간 CD52 유전자, 인간 T 세포 수용체 알파 불변 사슬(T-cell receptor alpha constant chain) (TRAC) 및 인간 T-세포 수용체 베타 불변 사슬들 1 및 2 (T-cell receptor beta constant chains 1 and 2) (TRBC)를 절단하는(cleaving) TALE-뉴클레아제들
실시예 1에서 전술한 바와 같이, 각각 CD52, TRAC 및 TRBC 유전자들을 표적으로 하는 헤테로다이머 TALE-뉴클레아제들이 설계되고 생산되었다. 표적이 된 게놈 서열들은 11 또는 15-bp 스페이서에 의하여 분리된 (반(half) 표적들이라고 불리는) 2개의 17-bp 길이의 서열들을 구성한다.
각각의 반-표적은 표 5에 리스트된 반 TALE-뉴클레아제들의 반복들에 의하여 인식된다. 인간 게놈은 2개의 기능적 T-세포 수용체 베타 사슬들(T-cell receptor beta chains)(TRBC1 및 TRBC2)을 포함한다. 알파/베타 T 림프구들의 발달 동안, 이들 두 개의 불변 사슬들 중 하나가 각각의 세포에서 선택되어 TCR-베타의 다양한 영역으로 슬라이스되고 기능적인 전장 베타 사슬로 형성된다. 2 TRBC 표적들이 TRBC1 및 TRBC2 간에 보존된 서열들 내에서 선택되어, 상응하는 TALE-뉴클레아제가 동시에 TRBC1 및 TRBC2 둘 다를 절단(cleave)하였을 것이다.
Figure 112021049142782-pat00006
표 5: 인간 상응하는 유전자들의 TALE-뉴클레아제들 표적의 CD52, TRAC 및 TRBC TALE-뉴클레아제들 및 서열들의 기재
TRAC 및 CD52 유전자들 내 다른 표적 서열들이 설계되었으며, 이는 표 6에 나타나 있다.
Figure 112021049142782-pat00007
표 6: TRAC 및 CD52 TALE-뉴클레아제들을 위한 추가적인 표적 서열들.
HEK293 세포들 내 CD52-TALE-뉴클레아제, TRAC-TALE-뉴클레아제 및 TRBC-TALE-뉴클레아제의 활성
TALE-뉴클레아제 구조체 각각이 pEF1 알파 긴(long) 프로모터의 통제 하 포유류 발현 벡터 내 제한 효소 절단(digestion)을 이용하여 서브클로닝되었다. 백만 개의 HEK293 세포들이 트랜스펙션 하루 전에 접종되었다. 세포들은 EF1-알파 프로모터의 통제 하 CD52 유전자, T-세포 수용체 알파 불변 사슬 영역(TRAC) 또는 T-세포 수용체 베타 불변 사슬 영역(TRBC) 내 관심있는 게놈 서열 내 두 개의 반(half) 표적들을 인식하는 TALE-뉴클레아제들을 코드하는 두 개의 플라스미드들을 각각 2.5 ㎍으로, 또는 제조업자의 지시에 따라 리포펙타민(lipofectamine) (Invitrogen) 25 ㎕를 이용하여 대조군 pUC 벡터 (pCLS0003) 5 ㎍으로, 상호-트랜스펙션되었다. CD52 또는 TRAC 코드 서열들 내 TALE-뉴클레아제들에 의하여 일어나는 이중 가닥 절단(cleavage)은 오류유발(error-prone)메커니즘인, 비상동성 말단 연결(non homologous end joining)(NHEJ)에 의하여 살아있는 세포들 내에서 수선(repair)된다. 살아 있는 세포들 내 TALE-뉴클레아제들의 활성은 표적이 된 게놈 자리에서의 삽입들 또는 결실들의 빈도에 의하여 측정된다. 트랜스펙션 48 시간 후, 게놈 DNA가 트랜스펙트(transfected)된 세포들로부터 분리되었으며, 자리(locus) 특이적 PCR들이 하기 프라이머들을 이용하여 수행되었다: 5 ' -CC ATCTC ATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAG (포워드(forward) 어댑터(adaptor) 서열)-10N (TAG)-CD52를 위한 자리 특이적 포워드 서열: 5'-CAGATCTGCAGAAAGGAAGC-3 ' (서열번호 66), TRAC를 위함: 5'-ATC ACTGGC ATCTGGACTCCA-3 ' (서열번호 67), TRBC1을 위함 : 5'-AGAGCCCCTACCAGAACCAGAC-3 ' (서열번호 68), 또는 TRBC2를 위함 : 5'-GGACCTAGTAACATAATTGTGC-3 ' (서열번호 69), 및 역(reverse) 프라이머 5'-CCTATCCCCTGTGTGCCTTGGCAGTCTCAG (역(reverse) 어댑터(adaptor) 서열)- CD52를 위한 내인성 자리 특이적 역(reverse) 서열 : 5 ' -CCTGTTGGAGTCC ATCTGCTG-3 ' (서열번호 70), TRAC를 위함: 5 ' -CCTC ATGTCTAGC AC AGTTT-3 ' (서열번호 71), TRBC1 및 TRBC2를 위함: 5'- ACC AGCTC AGCTCC ACGTGGT-3 ' (서열번호 72). PCR 산물들은 454 시퀀싱 시스템(454 Life Sciences)에 의하여 시퀀싱되었다. PCR 산물 당 대략 10,000 개의 서열들이 수득되었으며, 그 후 위치-특이적 삽입 또는 결실 이벤트들의 존재를 분석하였다; 결과는 표 7에 있다.
Figure 112021049142782-pat00008
표 7: CD52 T02, TRAC_T01, TRBC_T01 및 TRBC_T02 표적들을 표적으로 하는 TALE-뉴클레아제를 위한 삽입-결실들(indels)의 퍼센트.
초기(primary) T 림프구들 내 CD52-TALE-뉴클레아제, TRBC-TALE-뉴클레아제 및 TRAC-TALE-뉴클레아제의 활성
TALE-뉴클레아제 구조체 각각은 T7 프로모터의 통제 하 포유류 발현 벡터 내 제한 효소 절단(digestion)을 이용하여 서브클로닝되었다.
CD52 TRAC 및 TRBC 게놈 서열을 절단(cleaving)하는 TALE-뉴클레아제를 코드하는 mRNA가 T7 프로모터로부터 코딩 서열들 다운스트림(coding sequences downstream)을 나르는 플라스미드로부터 합성되었다. 말초혈액으로부터 분리된 T 림프구들은 항-CD3/CD28 활성화제 비드들(activator beads) (Life technologies)을 이용하여 5일 동안 활성화되었으며, 그 후 5 백만개 세포들을 CytoLVT-P 기구를 이용하여 반(half) TALE-뉴클레아제 양쪽 모두를 코딩하는 2개의 mRNA들 각각 (또는 대조군들로서 코딩하지 않는(non coding) RNA)으로 10 ㎍으로 전기천공법으로 트랜스펙션시켰다. NHEJ에 의하여 유도된 삽입들 및 결실들의 결과로서, CD52 및/또는 TRAC의 코딩 서열이 세포들의 일부(fraction)에서 프레임을 벗어나게(out of frame) 되어, 비-기능적 유전자들을 야기할 것이다. 전기천공법 5일 후, CD52 또는 TCR의 존재를 위하여, 그것들의 세포 표면에서, 유동세포 분석법(flow cytometry)을 위하여 플루오로크롬-콘쥬게이트된 항-CD52 또는 항-TCR 항체로 표지되었다. 말초혈액으로부터 팽창된 모든 T 림프구들이 정상적으로 CD52 및 TCR을 발현하기 때문에, CD52-음성(negative) 또는 TCR-음성(negative) 세포들의 비율(proportion)은 TALE-뉴클레아제 활성의 직접적인 척도이다. 표 8에 대표 실시예의 결과들이 리스트되어 있다. 표 9는 TRBC TALE-뉴클레아제들의 효율을 시험한 대표 실시예의 결과들은 보여준다.
Figure 112021049142782-pat00009
표 8: 상응하는 TALE-뉴클레아제-발현 폴리뉴클레오타이드들의 트랜스펙tus 후 CD52-음성, TCR-음성 및 CD52/TCR-이중 음성 T 림프구들의 퍼센트들.
Figure 112021049142782-pat00010
표 9: TRBC TALE-뉴클레아제-발현 폴리뉴클레오타이드들의 트랜스펙션 후 TCR-음성 T 림프구들의 퍼센트들.
표적이 된 CD52 유전자로 T 세포들의 기능적 분석들
CD52 유전자 불활성화의 목표는 T 림프구들을 면역 억제(immunosuppression)에 의하여 매개된 항-CD52 항체에 저항성이 있게 만드는 것이다. 전술한 바와 같이, T 림프구들은 CD52를 절단하는(cleaving) TALE-뉴클레아제를 코드하는 mRNA로 트랜스펙션되었다. 트랜스펙션 7일 후, 세포들은 30% 토끼 보체(complement)(Cedarlane)와 함께 또는 그것 없이 50 ㎍/ml 항-CD52 단일클론 항체 (또는 대조군으로 래트 IgG)로 처리되었다. 37 ℃에서 배양 2 시간 후, 세포들은 형광 생존력 염료(fluorescent viability dye)(eBioscience)와 함께 플루오로크롬(fluorochrome)-콘쥬게이트된 항-CD52 항체로 표지되었고, 살아 있는 세포들 중 CD52-음성 및 CD52-음성 세포들의 빈도를 측정하기 위하여 유동세포 분석법에 의하여 분석되었다. 도 6은 대표 실시예의 결과를 보여주는데, 이는 CD52-음성 세포들이 보체-매게된 항-CD52 항체 독성에 완전히 저항성을 갖는다는 것을 입증하는 것이다.
표적이 된 TRAC 유전자로 T 세포들의 기능적 분석
TRAC 유전자 불활성화의 목표는 T 림프구들을 T-세포 수용체 자극에 무반응으로 만드는 것이다. 전술한 바와 같이, T 림프구들은 TRAC 또는 CD52를 절단하는(cleaving) TALE-뉴클레아제를 코드하는 mRNA로 트랜스펙션되었다. 트랜스펙션 16일 후, 세포들은 T 세포 수용체를 통하여 기능하는 T-세포 마이토겐(mitogen)인, 피토헤마글루티닌(phytohemagglutinin)(PHA, Sigma-Aldrich) 5 ㎍/ml까지로 처리되었다. 기능적 T-세포 수용체를 갖는 세포들은 다음의 PHA 처리를 따라 크기가 증가되어야 한다. 배양 3일 후, 세포들은 플루오로크롬-콘쥬게이트된 항-CD52 또는 항-TCR 항체로 표지되었으며, TCR-양성(positive) 및 TCR-음성 세포들 간, 또는 CD52-양성 및 CD52 음성 세포들 간의 세포 크기 분포를 비교하기 위하여 유동세포 분석법에 의하여 분석되었다. 도 7은 TCR-양성 세포들이 PHA 처리 후 상당히 크기가 증가한 반면, TCR-음성 세포들은 처리되지 않은 세포들과 동일한 크기를 갖는다는 것을 보여주는데, 이는 TRAC 불활성화가 그것들을 TCR-시그널링(signaling)에 무반응성으로 만든다는 것을 가리킨다. 반면, CD52-양성 및 CD52-음성은 동일한 정도로 크기가 증가한다.
CD52 및 TRAC 유전자들로 처리된 T 세포들의 기능적 분석
게놈 엔지니어링(engineering)이 키메라 항원 수용체(chimeric antigen receptor)(CAR)로 제공될 때 현재 항-종양(anti-tumor)활성에 대한 T 세포들의 능력에 영향을 미치지 않는다는 것을 입증하기 위하여, 우리는 항-CD19 CAR (서열번호 73)을 코드하는 RNA l0 ㎍으로 CD52-TALE-뉴클레아제 및 TRAC-TALE-뉴클레아제와 표적으로 된 T 세포들을 트랜스펙트(transfect)하였다. 24시간 후, T 세포들이 4시간 동안 CD19 발현 다우디(Daudi) 세포들과 배양되었다. CD107a의 세포 표면 상향조절(upregulation), T 림프구들에 의한 세포독성 과립(cytotoxic granule) 방출의 마커(marker)는 유동세포 분석법 분석에 의하여 측정되었다(Betts, Brenchley et al. 2003). 그 결과들은 도 8에 포함되었으며, CD52-음성/TCRap-음성 세포들 및 CD52-양성/TCRaP-양성이 PMA /이오노마이신(ionomycin) (양성 대조군) 또는 CD 19+ 다우디(Daudi) 세포들에 대응하여 탈과립시키는(degranulate) 동일한 능력을 갖고 있다는 것을 보여준다. CD 107 상향조절은 CD19+의 존재에 의존적이다. 이러한 데이터들은 게놈 엔지니어링이 통제된 항-종양 반응을 증가시키는(mount) T 세포들의 능력에 부정적 영향을 갖지 않는다는 것을 제안한다.
초기(primary) T 림프구들 내 CD52-TALE-뉴클레아제 및 TRAC-TALE-뉴클레아제의 게놈 안전성
우리의 구조체들이 뉴클레아제 소단위체들을 포함하기 때문에, 복수의(multiple) TALE-뉴클레아제 트랜스펙션이 '아슬아슬한 승부(close match)' 표적 서열들에서 또는 반(half)-TALE-뉴클레아제들의 페어링 오류(mispairing)에 의하여, 유전독성(genotoxicity) 및 표적을 벗어난(off-target) 절단(cleavage)를 야기할 수 있는지 여부에 대한 중요한 질문이 있다. TRAC-TALE-뉴클레아제 및 CD52-TALE-뉴클레아제의 세포 게놈들의 온전성(integrity)에 대한 영향을 추정하기 위하여, 우리는 위치를 벗어난(off-site) 절단(cleavage)의 가능성을 나타낸는 인간 게놈 내 서열들을 리스트로 만들었다. 이 리스트를 만들어내기 위하여, 우리는 원래의 반(half) 표적들에 비교하여 4개 까지의 대체들(substitutions)을 갖는 게놈 내 모든 서열들을 확인하였으며, 그 후 서로 9 내지 30 bp의 스페이서를 갖는 머리를 맞춘(a head to head) 방향의 잠재적 반 표적들의 쌍들을 확인하였다. 이 분석은 하나의 CD52 반(half) TALE-뉴클레아제 및 하나의 TRAC 반(half)-TALE-뉴클레아제에 의하여 형성된 헤테로다이머들 또는 하나의 반(half)--TALE-뉴클레아제 분자의 호모다이머들에 의하여 잠재적으로 표적이 된 위치들을 포함하였다. 우리는 개개의 대체(substitution)들의 비용 및 대체들의 위치를 고려한 특이성(specificity) 데이터에 기초하여, 잠재적인 위치를 벗어난(off-site) 표적들의 점수를 매겼다(이 때, 미스매치들(mismatches)은 반(half) 표적의 3' 말단에서 염기들에 대하여 더 잘 견뎌내어진다(better tolerated)). 우리는 절단(cleavage) 가능성의 추정을 반영하는 점수를 갖는 173 개의 특유의 서열들을 수득하였다. 우리는 15개의 높은 점수들(top scores)을 선택하였고, CD52 및 TRAC TALE-뉴클레아제로 동시에 트랜스펙트된 T 세포들 내 이들 자리들(loci)에서 돌연변이들의 빈도를 대단히 시퀀싱함으로서(deep sequencing) 분석하였으며, CD52-음성, TCRaP-음성으로 자기 분리(magnetic separation)에 의하여 정제하였다(purify). 결과들은 도 9에 있다. 삽입/결실의 가장 높은 빈도는 7×10-4이었다. 이러한 결과들은 의도된 표적들보다 적어도 600 배 덜 돌연변이될 것 같은 추정상의 위치를 벗어난(offsite) 표적을 만든다. 그러므로 본 연구에서 사용된 TALE-뉴클레아제 시약들은 극히 특이적인 것으로 보인다.
실시예 3: 인간 CTLA4 유전자 및 인간 PDCDl 유전자를 절단하는(cleaving) TALE-뉴클레아제들
실시예 1에서 기재한 바와 같이, 각각 PDCDl 및 CTLA4 유전자들을 표적으로 하는 헤테로다이머 TALE-뉴클레아제들을 설계하고 생산하였다. 표적이 된 게놈 서열들은 11 또는 15-bp 스페이서에 의하여 분리된 두 개의 17-bp 길이 서열들(반(half) 표적들이라 불림)로 구성된다. 각각의 반(half)-표적은 표 10에 리스트로 된 반(half) TALE-뉴클레아제들의 반복들에 의하여 인식된다.
Figure 112021049142782-pat00011
Figure 112021049142782-pat00012
표 10: CTLA4 및 PDCDl TALE-뉴클레아제들 및 인간 상응하는 유전자들 내 TALE-뉴클레아제들 표적 위치들의 서열들의 기재.
HEK293 세포들 내 CTLA4-TALE-뉴클레아제 및 PDCDl -TALE-뉴클레아제의 활성
TALE-뉴클레아제 구조체 각각은 pEF1알파 긴(long) 프로모터의 통제 하 포유류 발현 벡터 내 제한 효소 절단(digestion)을 이용하여 서브클로닝되었다. 백만 개의 HEK293 세포들이 트랜스펙션 하루 전에 접종되었다. 세포들은 EFl-알파 프로모터의 통제 하 PDCDl 및 CTLA-4 유전자 내 관심있는 게놈 서열 내 두 개의 반(half) 표적들을 인식하는 TALE-뉴클레아제들을 코드하는 두 개 플라스미드들 각각을 2.5 ㎍으로 또는 제조업자의 지시에 따라 리포펙타민(lipofectamine) (Invitrogen) 25 ㎕를 이용하여 대조군 pUC 벡터 (pCLS0003) 5 ㎍으로 상호-트랜스펙트시켰다(co-transfected). PDCDl 또는 CTLA-4 코딩 서열들 내 TALE-뉴클레아제들에 의하여 만들어지는 이중 가닥 절단은 비상동성 말단 연결(non homologous end joining)(NHEJ)에 의하여 살아 있는 세포들 내에서 수선(repair)되는데, 이는 오류유발(error-prone) 메커니즘이다. 살아 있는 세포들 내 TALE-뉴클레아제들의 활성은 표적이 된 게놈 자리들에서 삽입들 또는 결실들의 빈도에 의하여 측정된다. 트랜스펙션 48 시간 후, 게놈 DNA는 트랜스펙트된 세포들로부터 분리되었고, 자리 특이적 PCR들이 하기 프라이머들을 이용하여 수행되었다: 5 '-CCATCTC ATCCCTGCGTGTCTCCGACTC AG (포워드 어댑터 서열)-1ON (TAG)-CTLA4_T01을 위한 자리 특이적 포워드 서열 : 5'-CTCTACTTCCTGAAGACCTG-3 ' (서열번호 99) , CTLA4_ T03/T04를 위함: 5'-AC AGTTGAGAGATGGAGGGG-3 ' (서열번호 100), PDCD1_T01를 위함 : 5'-CCACAGAGGTAGGTGCCGC-3 ' (서열번호 101) 또는 PDCD1_T03를 위함: 5'-GAC AGAGATGCCGGTCACCA-3' (서열번호 102) 및 역(reverse) 프라이머 5'-CCTATCCCCTGTGTGCCTTGGCAGTCTCAG (역(reverse) 어댑터 서열)- CTLA4_T01을 위한 내인성 자리 특이적 역(reverse) 서열 : 5'-TGGAATACAGAGCCAGCCAA-3' (서열번호 103), CTLA4_T03/T04을 위함: 5'-GGTGCCCGTGCAGATGGAAT-3 ' (서열번호 104), PDCD1_T01을 위함 : 5'-GGCTCTGCAGTGGAGGCCAG-3 ' (서열번호 105) 또는 PDCDl_T03을 위함: 5'-GGACAACGCCACCTTCACCT-3' (서열번호 106).
PCR 산물들은 T7-엔도뉴클레아제(endonuclease) 어세이(assay)에 의하여 분석되었다: 간단하게, PCR 산물의 변성(denaturation) 및 재-어닐링(reannealing) 후, T7 엔도뉴클레아제는 야생형 및 돌연변이된 가닥들로 구성된(composed) 미스매치된(mismatched) DNA를 특이적으로 절단할 것이다(digest). 상기 절단(digestion) 산물은 그 다음에, 폴리아크릴아마이드(polyacrylamide) 겔 전기영동(electrophoresis)에 의하여 분해(resolve)된다. 절단된(digested) 산물의 존재는 TALE-뉴클레아제 활성에 의하여 유도된 돌연변이된 서열들을 보여준다. 결과들은 도 10에 나타나 있는데, 화살표는 절단된(digested) PCR 산물들을 가리킨다. 그것들은 PDCD1_T1, PDCD1_T3, CTLA4_T1, CTLA4_T3 및 CTLA4_T4 TALE-뉴클레아제들 모두가 그것들의 표적 위치들에서 돌연변이 유발(mutagenic) 뉴클레아제 활성을 보인다는 것을 입증한다.
실시예 4: pT알파(pTalpha)는 불활성화된 TCR 알파 T 림프구들 내 CD3 표면 발현을 허용한다:
서로 다른 전구T알파(preTalpha) 버젼들(versions)의 기술:
인간 pT알파(pTalpha) 유전자는 세포외(extracellular) Ig-유사(like) 도메인, 소수성 막관통(transmembrane) 도메인 및 큰 C-말단 세포질내(intracytoplasmic) 꼬리(tail)를 포함하는 막관통 당단백질(glycoprotein)을 코드한다. 인간 pT알파(pTalpha) 당단백질로부터 유래한 서로 다른 버젼들(versions)이 설계되었으며, 표 11에 기재되어 있고, 도 11에 나타나 있다.
Figure 112021049142782-pat00013
Figure 112021049142782-pat00014
표 11: pT알파(pTalpha) 구조체들의 부분집합(subset)의 기술.
시험한 서로 다른 전구T알파(preTalpha) 구조체들은 하기를 포함한다:
1) pT알파(pTalpha) 결실 돌연변이들: 서로 다른 결실들이 인간 pT알파 단백질(114 아미노산들을 포함함)의 세포내(intracellular) 세포질(cytoplasmic) 꼬리에서 만들어졌다. 시험된 구조체들은 단백질의 전장 (full length) 버젼들(FL) 및 단백질의 C-말단(terminus)으로부터 18, 48, 62, 78, 92, 110 및 114 아미노산들이 결실된 돌연변이들을 포함한다(서열번호 108 내지 서열번호 114).
2) 세포내 활성 도메일들을 포함하는 pT알파 돌연변이들: FL 및 그것들의 C-말단에서 CD8, CD28 또는 41BB 세포내 활성 도메인들에 융합된(fused) △48 변이체들(variant)(서열번호 115 내지 서열번호 120).
3) pT알파(pTalpha)/TCRα 키메라 돌연변이들: 구조체들 중 하나에서, TCRα 세포내 도메일(intracellular domain)(IC)가 pT알파의 꼬리-없는(tail-less) 버젼(△114)에 융합되었다. 두 번째 구조체는 또한 pT알파 세포외 도메인이 막관통(transmembrane)(TM) 및 TCRα의 IC 도메인들에 융합된 것에서 만들어졌다(서열번호 122).
4) pT알파 다이머화(dimerization) 돌연변이들: 일부 돌연변이들은 문헌에 전구TCR(preTCR) 복합체의 올리고머화/다이머화(dimerisation) 능력을 변화시킬 수 있는 것으로 기재되어 있다. 이들 돌연변이들은, 구성요소인(constitutive) 시그널링을 포함하지 않고(전구TCR(preTCR) 올리고머화에 유도된 것으로 추정됨), 세포 표면에서 전구TCR(preTCR) 발현을 허용하는 것으로 제안된다. 돌연변이들은 pT알파△48(pTalpha△48) 변이체 내 도입되었으며, 이는 하기이다:
-1xMUT:W46R (서열번호 123)
-4xMUT: D22A, K24A, R102A, Rl17A (서열번호 124)
TRAC 불활성화된 주르카트(Jurkat) 세포들 내 서로 다른 전구T알파 구조체들의 활성:
서로 다른 pT알파(pTalpha) 변이체들을 TCR알파(TCRalpha) 불활성화된 세포들에서 CD3 표면 발현을 회복시키는(restore) 그것들의 능력을 스크리닝하기 위하여, TALEN을 표적으로 하는 TRAC를 이용하여 TCR알파(TCRalpha) 유전자가 파괴된(disrupt) 것에서 세포주가 만들어졌다. 주르카트 세포들(T-세포 백혈병 세포주)들이 사이토펄스(CytoPulse) 전기천공법을 이용하여 TRAC를 절단(cleaving)하는 TALEN를 코드하는 플라스미드들로 트랜스펙트되었으며, KO 세포들 (TCRα/β NEG; CD3NEG)이 그 다음에 CD3 자성(magnetic) 비드들(beads)을 이용하여 자성 선택에 의하여 정제되었다. KO 개체군(population)(JKT_KOx3 세포들)은 증폭되었으며, 서로 다른 pT알파(pTalpha) 변이체들의 스크리닝에 사용되었다. 스크리닝은 EF1α 프로모터의 통제 하 서로 다른 pT알파 변이체들을 코드하는 플라스미드 15 ㎍으로 JKT_KOx3 세포들 1만 개의 트랜스펙션에 의하여 수행되었고, 뒤이어 트랜스펙션 48 시간 후 CD3 세포 표면 발현의 유동세포 분석법에 의하여 분석이 이루어졌다. 도 12는 트랜스펙션 효율들(BFP+ 세포들의 %) 및 JKT_KOx3 세포들 내 FL, △18 및 △48 pT알파(pTalpha) 구조체들의 활성의 대표 실시예로, 이는 CD3+ 세포들의 %에 기초하며, 유동세포 분석법으로 결정하였다. 서로 다른 구조체들로부터의 결과들은 표 12에 그룹으로 되어 있다.
Figure 112021049142782-pat00015
표 12: 주르카트(Jurkat) TCR 알파 불활성화된 세포들 내 서로 다른 pT알파 구조체들의 활성. 활성은 서로 다른 전구T알파(preTalpha) 구조체들로 트랜스펙트된 주르카트 TCR 알파 불활성화된 세포들 내 CD3 발현의 유동세포 분석에 의하여 측정되었다.
TCR 알파 불활성화된 초기 T 림프구들 내 pT알파-FL(pTalpha-FL) 및 pT알파-△48(pTalpha-△48)의 활성:
TCR 알파 불활성화된 T 리프구들 내 CD3 표면 발현을 유도하는 pT알파-FL(pTalpha-FL) 및 pT알파-△48(pTalpha-△48)의 활성을 시험하기 위하여, pT알파-FL(pTalpha-FL) 및 pT알파-△48(pTalpha-A48) 코딩 서열들이 SFFV 프로모터 하 푸른 형광성 단백질(Blue Fluorescent protein)(BFP)을 코드하는 자가-불활성화시키는(self-inactivating) pLV-SFFV-BFP-2A-PCTRA 렌티바이러스(lentiviral) 벡터 내로 클로닝하였고, 뒤이어 T2A 펩타이드의 자가-절단(self-cleaving)이 이루어졌다(도 13).
말초 혈액으로부터 분리된 T 림프구들은 항-CD3/CD28 활성화제 비드들(Life technologies)을 이용하여 72 시간 동안 활성화되었으며, 4.5 백만 세포들이 CytoLVT-S 기구(BTX-Harvard Harbour)를 이용하여 TCR 알파 불변 사슬 영역(TCR alpha constant chain region)(TRAC)을 표적으로 하는 TALE-뉴클레아제를 코드하는 mRNA 10 ㎍으로 전기천공법에 의하여 트랜스펙트되었다. 전기천공 2일 후, T 세포들이 LV-SFFV-BFP-2A-pTalpha-△48 또는 LV-SFFV-BFP-2A-대조군 렌티바이러스(lentiviral) 벡터들 중 하나로 형질도입(transduce)되었다. CD3 음성 및 CD3low T 세포들은 그 다음 항-CD3 자성 비드들(Miltenyi Biotech)을 이용하여 정제되었다. 이 실험 프로토콜은 도 14A에 나타나 있다.
도 14B는 CD3 비드들로 정제되기 전 및 후에 BFP-2A-pTalpha△48 (KO/△48) 또는 대조군 BFP 렌티바이러스 벡터 (KO/BFP) 중 하나로 형질도입(transduce)된 TCR알파(TCRalpha) 불활성화된 T 세포들 상 BFP 발현, TCRalpha/beta, CD3 세포 표면 발현의 유동세포 분석을 나타낸다. BFP-T2A-pTalpha-△48 벡터 (BFP+ 세포들)에 의하여 형질도입(transduce)된 TCR알파(TCRalpha) 불활성화된 세포들은 비-형질도입된 세포들(BFP- 세포들)에 비하여 더 높은 CD3 레벨을 보인다. 대조군 BFP 벡터로 형질도입된(transduced) 세포들 사이에는 차이가 관찰되지 않았다. 이러한 결과들은 pT알파(pTalpha)가 TCR알파(TCRalpha) 불활성화된 세포들의 세포 표면에서 CD3 발현의 회복을 매개한다는 것을 가리킨다. 반면, 예상한대로, TCR알파(alpha)/베타(beta) 염색(staining)은 pTalpha-△48 발현 벡터로 형질도입(transduced)되거나 그렇지 않은 세포들에서 계속 변화가 없다.
pT알파-매개된 CD3 발현은 TCR-결핍(deficient) T-세포들의 활성화를 뒷받침한다:
pT알파(pTalpha)의 세포 활성화 시그날들을 형질도입(transduce)하는 용량을 밝히기 위하여, 초기(early) 및 후기(later) 발현 마커들의 발현이, pTalpha-△48 및 pTalpha-△48.41BB로 형질도입(transdece)된 TCR 알파 불활성화된 T 세포들에서 분석되었다. pTalpha-△48 및 pTalpha-△48.41BB로 형질도입(transduce)된 TCR 알파 불활성화된 T 세포들이, 도 14A 및 전술한 바와 같이, 초기(primary) 인간 T-세포들로부터 만들어졌다.
CD3를 경유한 시그널링을 검출하기 위하여, 세포들은 CD3 비드들로 TCR 알파 불활성화된 T 세포들의 정제 3일 후 항-CD3/CD28-코팅된 비드들을 이용하여 재-활성화되었다(도 14A). 세포들은 각각 재-활성화 24 및 48 시간 후, 플루오로크롬-콘쥬게이트된 항-CD69 (초기(early) 활성화 마커) 및 항-CD25(후기(late) 활성화 마커)로 염색되었고, 그리고 유동세포 분석법에 의하여 분석되었다(도 15A-B). 도 15A-B에 나타난 바와 같이, pTalpha-△48 (KO/pTα-△48) 또는 pTalpha-△48.41BB (KO/pTα-△48.BB)을 발현하는 TCR 알파 불활성화된 세포들은 TCR알파/베타 발현 세포들 내 관찰되는 그것들에 유사한 레벨들까지 활성화 마커들의 상향조절을 보인다(NEP: 전기천공되지 않은 세포들(non electroporated cells)).
T 세포 활성화의 또다른 지표는 가끔 "블라스팅(blasting)"이라고 언급되는, 세포 크기의 증가이다. 전구TCR(preTCR) 복합체들의 "블라스팅"을 유도하는 용량은 항--CD3/CD28-비드들을 이용한 재-활성화 72 시간 후 세포 크기의 유동세포 분석(flow cytometry analysis)에 의하여 측정되었다(도 15C). 항-CD3/CD28 비드들로의 자극은 pTalpha-△48 또는 pTalpha-△48.41BB를 발현하는 세포들에 비해(vs.) TCR알파/베타 복합체들을 발현하는 세포들에서 세포 크기의 비교할만한 증가를 유도하였다. 이들을 종합할 때, 이러한 결과들은 전구TCR(preTCR) 복합체들이 활성화 마커 상향조절을 매개하는 메커니즘과 효율적으로 연결된 시그널들을 형질도입(transduce)할 만하다(competent).
pT알파-매개된 CD3 발현은 자극성(stimulatory) 항-CD3/CD28 항체들을 이용하여 TCR-결핍(deficient) 초기(primary) T-세포들의 팽창을 뒷받침한다.
장기(long term) 세포 증식(proliferation)을 뒤받침하기 위한 전구TCR(preTCR) 복합체들의 용량을 평가하기 위하여, 전술한 바와 같이 만들어진 세포들의 증식이 측정되었다. 초기(initial) 활성화 10일 후, 세포들은 IL2(비-재-작용(non-Re-act)) 또는 항-CD3/CD28 비드들을 갖는 IL2(재-작용(Re-act)) 내에서 유지되었다. 각각의 조건을 위하여, 세포들은 수가 세어졌으며, BFP+ 세포들의 수를 추산하기 위하여 서로 다른 시점들에서 유동세포 분석법에 의하여 분석되었다. BFP 또는 BFP-T2A-preTCRα-△48 벡터들로 형질도입된(transduced) TCR알파 불활성화된 세포들(KO)의 성장이 비교되었으며, 이들 세포들의 폴드 유도(fold induction)가 재-활성화 2일 후 수득된 값에 대하여 추산되었다. 도 16은 두 개의 독립적인 도너들(donors)로 수득된 결과들을 보여준다. 두 케이스 모두에서, pTalpha-△48를 발현하는 TCR알파 불활성화된 세포들은 BFP 대조군 벡터만을 발현하는 TCR 알파 불활성화된 세포들보다 더 크게 확장을 보여준다. 두 번째 도너들을 위하여, pTalpha-△48.41BB 또는 전장 pTalpha을 발현하는 TCR알파 불활성화된 세포들 또한 포함되었고, 역시 BFP 대조군 벡터만을 발현하는 TCR알파 불활성화된 세포들에 비하여 더 큰 팽창을 보여주었다.
실시예 5: 사이토펄스(Cytopulse) 기술을 이용한 T 세포들에서의 mRNA 트랜스펙션의 최적화.
최적화된 사이토펄스 프로그램의 결정
세포들이 트랜스펙트될 수 있는 전압 범위를 결정하기 위하여, 비활성화된 PBMC들 상에서 실험들의 첫 번째 세트가 수행되었다. 5개의 서로 다른 프로그램들이 표 13에 기재된 대로 시험되었다.
Figure 112021049142782-pat00016
표 13: PBMC 유래된 T-세포들에 요구되는 최소 전압을 결정하기 위하여 사용된 서로 다른 사이토펄스(cytopulse) 프로그램들.
3 또는 6 백만개의 세포들을 서로 다른 사이토펄스 프로그램들을 이용하여 대조군 플라스미드들 pUC 및 GFP를 코드하는 플라스미드들 20 ㎍으로 0.4 cm 갭(gap) 큐벳(cuvette) (30 또는 15×l06 세포들/ml)에서 전기천공하였다. 전기천공법 24 시간 후, 트랜스펙션의 효율을 결정하기 위하여 유동세포 분석법(flow cytometry)에 의하여 전기천공된 세포들에서 GFP 발현이 분석되었다. 도 17에 나타난 데이터는 T 세포들 유래의 PBMC에서 플라스미드 전기천공에 요구되는 최소 전압을 가리킨다. 이들 결과들은 사이토펄스(cytopulse) 프로그램 3 및 4는 T 세포들의 효율적인 형질전환(transformation)을 가능하게 한다(EP#3 및 #4).
활성화된 정제된 T 세포들의 mRNA의 전기천공법
T 세포들의 효율적인 DNA 전기천공을 허용하는 최고의 사이토펄스(cytopulse) 프로그램을 확인한 후, 우리는 이 방법이 mRAN 전기천공에 적용한지 여부를 시험하였다.
PHA/IL2로 6일 전-활성화된(preactivated) 5×l06 정제된 T 세포들이 사이토포레이션(cytoporation) 버퍼 T(BTX-Harvard apparatus) 내 재부유(resupend)시키고, GFP를 코딩하는 mRNA l0㎍ 또는 앞서 결정한 바와 같이 선호되는 사이토펄스 프로그램을 이용하여 pUC 또는 GFP를 코딩하는 플라스미드들 20 ㎍으로 0.4 cm 큐벳들 내에 전기천공하였다(표 14).
Figure 112021049142782-pat00017
표 14: 정제된 T 세포들을 전기천공하는데 사용되는 사이토펄스 프로그램.
트랜스펙션 48시간 후, 세포들은 생존력 염료(viability dye)(eFluor-450)로 염색되었으며, 세포 생존력(viability) 및 생존 가능한(viable) GFP+ 세포들이 유동세포 분석법에 의하여 결정되었다(도 18).
도 18에 나타난 데이터들은 여기에서 결정된 최적의 조건으로의 RNA의 전기천공법이 독성이 없다고 확인이 되고, 생존가능한(viable) 세포들의 95%를 초과하는 트랜스펙션을 허용한다는 것을 가리킨다.
합성에서, 전체 데이터세트(dataset)는 T-세포들이 효율적으로 DNA 또는 RNA 중 하나로 트랜스펙트될 수 있다는 것을 보여준다. 특히, RNA 트랜스펙션은 세포 생존력(viability)에 영향을 미치지 않고, 세포 개체군(population) 내 관심있는 트랜스펙트된 유전자의 균일한 발현 레벨들을 허용한다.
효율적인 트랜스펙션은 사용된 활성화 방법에 독립적으로, 세포 활성화 후 초기에 달성될 수 있다(PHA/IL-2 또는 CD3/CD28-코팅된-비드들). 본 발명자들은 >95%의 효율로 활성화 72 시간 후부터 세포를 트랜스펙트(transfect)하는 것에 성공하였다. 게다가, 해동(thawing) 및 활성화 후 T 세포들의 효율적인 트랜스펙션은 또한 동일한 전기천공법 프로토콜을 이용하여 수득될 수 있다.
TALE-뉴클레아제 기능적 발현을 위한 초기(primary) 인간 T 세포들 내 mRAN 전기천공법
mRAN 전기천공이 초기(primary) 인간 T 세포들에서 GFP의 효율적 발현을 하게 한다는 것을 입증한 후, 우리는 이 방법이 관심있는 다른 단백질들의 발현에도 적용가능한지 여부를 시험하였다. 전사 활성화제-유사 작용인자 뉴클레아제들(transcription activator-like effector nucleases)(TALE-nuclease)은 TAL DNA 결합(binding) 도메인의 DNA 절단(cleavage) 도메인으로의 융합에 의하여 만들어지는 위치(site)-특이적 뉴클레아제들이다. 그것들이 특히 임의의 원하는 DNA 서열에서 이중-가닥 파손(breaks)들을 유도하기 때문에 그것들은 강력한 게놈 편집(editing) 도구들이다. 이들 이중-가닥 파손들은 비상동성 말단 연결(Non-homologous end-joining (NHEJ))을 활성화시키는데, 이는 오류유발(error-prone) DNA 수선(repair) 메커니즘이고, 잠재적으로 관심있는 임의의 원하는 유전자의 불활성화를 이끈다. 대체적으로, 만약 적절한 수선(repair) 주형이 동시에 세포 내로 도입된다면(introduce), TALE-뉴클레아제-유도된 DNA 파손들은 상동성(homologous) 재조합(recombination)에 의하여 수선될 수 있고, 따라서 유전자 서열을 변형시킬 가능성을 제공할 것이다.
우리는 T 세포 항원 수용체(T cell antigen receptor)(TRAC)의 알파 사슬을 코드하는 인간 유전자에서 서열을 특이적으로 절단(cleave)하기 위하여 설계된 TALE-뉴클레아제를 발현하기 위하여 mRNA 전기천공법(electroporation)을 사용하였다. 이 서열에서 유도된 돌연변이들은 세포 표면으로부터 TCRαβ 복합체(complex)의 상실(loss) 및 유전자불활성화를 야기할 것으로 예상된다. TRAC TALE-뉴클레아제 RNA 또는 대조군으로서 코딩하지 않는(non coding) RNA는 사이토펄스 기술을 이용하여 활성화된 초기(primary) 인간 T 림프구들에 트랜스펙트되었다. 전기천공 서열은 1200 V의 2 개 펄스들(pulses)에 있고, 표 14에 기재된 대로, 뒤이어 130 V 의 4개 펄스들이 있다.
전기천공 7일 후 TCR 표면 발현의 유동세포 분석(flow cytometry analysis)에 의하여(도 19, 위쪽 패널), 우리는 T 세포들 중 44%가 TCRαβ의 발현을 상실했다는 것을 관찰하였다. 우리는 TRAC 자리(locus)의 PCR 증폭 및 뒤이어 454 고속 대량(high throughput) 시퀀싱에에 의하여 트랜스펙트된 세포들의 게놈 DNA를 분석하였였다. 시퀀싱된 대립형질들(alleles) 중 33%(2153 중 727)가 TALE-뉴클레아제 절단(cleavage)의 위치에서 삽입 또는 결실을 포함하였다. 도 19(아래 패널)는 돌연변이된 대립형질들(alleles)의 실시예들을 보여준다.
이들 데이터들은 사이토펄스 기술을 이용한 mRNA의 전기천공이 TRAC TALE-뉴클레아제의 기능적 발현을 야기한다는 것을 가리킨다.
항-CD19 단일 사슬 키메라 항원 수용체(chimeric antigen receptor) (CAR)를 코드하는 단일시스트론(monocistronic) mRNA로 T 세포들의 전기천공:
항-CD3/CD28 코팅된 비드들 및 IL2로 며칠간(3-5) 전활성화된(preactivated) 5×106 T 세포들이 사이토포레이션(cytoporation) 버퍼 T 내 재부유되었고(resuspended), 그리고 표 14에 기재된 프로그램을 이용하여 단일 사슬 CAR(서열번호 73)을 코드하는 mRNA 10 ㎍과 함께 또는 mRNA 없이 0.4 cm 큐벳들 내에서 전기천공되었다.
전기천공 24시간 후, 세포들은 고정시킬 수 있는(fixable) 생존력 염료(viability dye) eFluor-780로 염색되고 특이적 PE-콘쥬게이트된 염소 항-마우스 IgG F(ab')2 단편이 살아 있는 세포들 상 CAR의 세포 표면 발현을 평가하였다. 데이터는 도 20에 나타나 있다. A는 전술한 단일시스트론(monocitronic) mRNA로 전기천공된 살아 있는 T 세포들의 방대한 수가 그것들의 표면에서 CAR를 발현한다는 것을 가리킨다. 전기천공 24시간 후, T 세포들이 6 시간 동안 다우디(Daudi) (CD19+) 세포들과 공배양되었고(coculture), 그것들의 표면에서 탈과립(degranulation) 마커 CD107a의 발현을 검출하기 위하여 유동세포 분석법에 의하여 분석되었다(Betts, Brenchley et al. 2003).
도 20에 나타낸 데이터들은 전술한 단일시스트론 mRNA로 전기천공된 세포들의 다수가 CD19를 발현하는 표적 세포들의 존재 하 탈과립된다는 것을 가리킨다. 이들 결과들은 전기천공된 T 세포들의 표면에서 발현된 CAR이 활성(active)이라는 것을 명백히 입증한다.
항-CD19 다중소단위체(multisubunit) 키메라 항원 수용체(CAR)을 코드하는 다시스트론성(polycistronic) mRNA로 T 세포들의 전기천공:
항 CD3/CD28 코팅된 비드들 및 IL2로 며칠 간(3-5) 전활성화(preactivate)된 5×106 T 세포들이 사이토포레이션(cytoporation) 버퍼 T 내에서 전기천공되었고, 표 14에 기재된 바와 같이 프로그램을 이용하여 복수-사슬(multi-chain) CAR(서열번호 125, 서열번호 126에 의하여 코딩됨, 도 21 A 및 도 4B (csm4))을 코드하는 mRNA 45 ㎍과 함께 또는 mRNA 없이 0.4cm 큐벳들에서 전기천공되었다.
전기천공 24시간 후 세포들은 고정시킬 수 있는(fixable) 생존력 염료(viability dye) eFluor-780로 염색되고 특이적 PE-콘쥬게이트된 염소 항-마우스 IgG F(ab')2 단편이 살아 있는 세포들 상 CAR의 세포 표면 발현을 평가하였다. 도 21에 나타낸 데이터들은 전술한 다시스트론 mRNA로 전기천공된 살아 있는 T 세포들의 방대한 다수가 그것들의 표면에서 CAR을 발현한다는 것을 가리킨다.
전기천공 24시간 후 T 세포들이 6시간 동안 Daudi (CD19+)와 공배양되었고, 그것들의 표면에서 탈과립 마커 CD107a의 발현을 검출하기 위하여 유동세포 분석법에 의하여 분석하였다. 도 21에 나타낸 데이터는 전술한 다시스트론(polycistronic) mRNA로 전기천공된 세포들의 다수가 CD19를 발현하는 표적 세포들의 존재에서 탈과립된다(degranulate)는 것을 가리킨다. 이들 결과들은 전기천공된 T 세포들의 표면에서 발현된 CAR이 활성이라는(active) 것을 명백히 입증한다.
본 명세서 내 인용된 문헌들의 리스트
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cggctacaac ctgcccatcg gccaggccga cgaaatgcag 2520 aggtacgtgg aggagaacca gaccaggaac aagcacatca accccaacga gtggtggaag 2580 gtgtacccct ccagcgtgac cgagttcaag ttcctgttcg tgtccggcca cttcaagggc 2640 aactacaagg cccagctgac caggctgaac cacatcacca actgcaacgg cgccgtgctg 2700 tccgtggagg agctcctgat cggcggcgag atgatcaagg ccggcaccct gaccctggag 2760 gaggtgagga ggaagttcaa caacggcgag atcaacttcg cggccgactg ataa 2814 <210> 92 <211> 2832 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CTLA4_T03-RTALEN <400> 92 atgggcgatc ctaaaaagaa acgtaaggtc atcgataagg agaccgccgc tgccaagttc 60 gagagacagc acatggacag catcgatatc gccgatctac gcacgctcgg ctacagccag 120 cagcaacagg agaagatcaa accgaaggtt cgttcgacag tggcgcagca ccacgaggca 180 ctggtcggcc acgggtttac acacgcgcac atcgttgcgt taagccaaca cccggcagcg 240 ttagggaccg tcgctgtcaa gtatcaggac atgatcgcag cgttgccaga ggcgacacac 300 gaagcgatcg ttggcgtcgg caaacagtgg tccggcgcac gcgctctgga ggccttgctc 360 acggtggcgg gagagttgag aggtccaccg ttacagttgg acacaggcca acttctcaag 420 attgcaaaac 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Leu Arg Ala Pro Ser Ser Ser Leu Gly Ala Phe Phe Arg Gly Asp Leu 260 265 270 Pro Pro Pro Leu Gln Ala Gly Ala Ala Ala Ser His Arg Asn Arg Arg 275 280 285 Arg Val Cys Lys Cys Pro Arg Pro Val Val Lys Ser Gly Asp Lys Pro 290 295 300 Ser Leu Ser Ala Arg Tyr Val 305 310 <210> 117 <211> 325 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> pTalpha-FL-41BB <400> 117 Met Ala Gly Thr Trp Leu Leu Leu Leu Leu Ala Leu Gly Cys Pro Ala 1 5 10 15 Leu Pro Thr Gly Val Gly Gly Thr Pro Phe Pro Ser Leu Ala Pro Pro 20 25 30 Ile Met Leu Leu Val Asp Gly Lys Gln Gln Met Val Val Val Cys Leu 35 40 45 Val Leu Asp Val Ala Pro Pro Gly Leu Asp Ser Pro Ile Trp Phe Ser 50 55 60 Ala Gly Asn Gly Ser Ala Leu Asp Ala Phe Thr Tyr Gly Pro Ser Pro 65 70 75 80 Ala Thr Asp Gly Thr Trp Thr Asn Leu Ala His Leu Ser Leu Pro Ser 85 90 95 Glu Glu Leu Ala Ser Trp Glu Pro Leu Val Cys His Thr Gly Pro Gly 100 105 110 Ala Glu Gly His Ser Arg Ser Thr Gln Pro Met His Leu Ser Gly Glu 115 120 125 Ala Ser Thr Ala Arg Thr Cys Pro Gln Glu Pro Leu 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Met Ala Gly Thr Trp Leu Leu Leu Leu Leu Ala Leu Gly Cys Pro Ala 1 5 10 15 Leu Pro Thr Gly Val Gly Gly Thr Pro Phe Pro Ser Leu Ala Pro Pro 20 25 30 Ile Met Leu Leu Val Asp Gly Lys Gln Gln Met Val Val Val Cys Leu 35 40 45 Val Leu Asp Val Ala Pro Pro Gly Leu Asp Ser Pro Ile Trp Phe Ser 50 55 60 Ala Gly Asn Gly Ser Ala Leu Asp Ala Phe Thr Tyr Gly Pro Ser Pro 65 70 75 80 Ala Thr Asp Gly Thr Trp Thr Asn Leu Ala His Leu Ser Leu Pro Ser 85 90 95 Glu Glu Leu Ala Ser Trp Glu Pro Leu Val Cys His Thr Gly Pro Gly 100 105 110 Ala Glu Gly His Ser Arg Ser Thr Gln Pro Met His Leu Ser Gly Glu 115 120 125 Ala Ser Thr Ala Arg Thr Cys Pro Gln Glu Pro Leu Arg Gly Thr Pro 130 135 140 Gly Gly Ala Leu Trp Leu Gly Val Leu Arg Leu Leu Leu Phe Lys Leu 145 150 155 160 Leu Leu Phe Asp Leu Leu Leu Thr Cys Ser Cys Leu Cys Asp Pro Ala 165 170 175 Gly Pro Leu Pro Ser Pro Ala Thr Thr Thr Arg Leu Arg Ala Leu Gly 180 185 190 Ser His Arg Leu His Pro Ala Thr Glu Thr Gly Gly Arg Glu Ala Thr 195 200 205 Ser Ser Pro Arg Pro Gln Pro Arg Asp Arg Arg Trp Gly Asp Thr Pro 210 215 220 Pro Gly Arg Lys Pro Gly Ser Pro Val Ala Ser Gly Gly Val Leu Ala 225 230 235 240 Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg 245 250 255 Ser Lys Arg Ser Arg Gly Gly His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro 260 265 270 Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro 275 280 285 Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser 290 295 <210> 119 <211> 263 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> pTalpha-Delta48-CD8 <400> 119 Met Ala Gly Thr Trp Leu Leu Leu Leu Leu Ala Leu Gly Cys Pro Ala 1 5 10 15 Leu Pro Thr Gly Val Gly Gly Thr Pro Phe Pro Ser Leu Ala Pro Pro 20 25 30 Ile Met Leu Leu Val Asp Gly Lys Gln Gln Met Val Val Val Cys Leu 35 40 45 Val Leu Asp Val Ala Pro Pro Gly Leu Asp Ser Pro Ile Trp Phe Ser 50 55 60 Ala Gly Asn Gly Ser Ala Leu Asp Ala Phe Thr Tyr Gly Pro Ser Pro 65 70 75 80 Ala Thr Asp Gly Thr Trp Thr Asn Leu Ala His Leu Ser Leu Pro Ser 85 90 95 Glu Glu Leu Ala Ser Trp Glu Pro Leu Val Cys His Thr Gly 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Leu Leu Val Asp Gly Lys Gln Gln Met Val Val Val Cys Leu 35 40 45 Val Leu Asp Val Ala Pro Pro Gly Leu Asp Ser Pro Ile Trp Phe Ser 50 55 60 Ala Gly Asn Gly Ser Ala Leu Asp Ala Phe Thr Tyr Gly Pro Ser Pro 65 70 75 80 Ala Thr Asp Gly Thr Trp Thr Asn Leu Ala His Leu Ser Leu Pro Ser 85 90 95 Glu Glu Leu Ala Ser Trp Glu Pro Leu Val Cys His Thr Gly Pro Gly 100 105 110 Ala Glu Gly His Ser Arg Ser Thr Gln Pro Met His Leu Ser Gly Glu 115 120 125 Ala Ser Thr Ala Arg Thr Cys Pro Gln Glu Pro Leu Arg Gly Thr Pro 130 135 140 Gly Gly Ala Leu Trp Leu Gly Val Leu Arg Leu Leu Leu Phe Lys Leu 145 150 155 160 Leu Leu Phe Asp Leu Leu Leu Thr Cys Ser Cys Leu Cys Asp Pro Ala 165 170 175 Gly Pro Leu Pro Ser Pro Ala Thr Thr Thr Arg Leu Arg Ala Leu Gly 180 185 190 Ser His Arg Leu His Pro Ala Thr Glu Thr Gly Gly Arg Glu Ala Thr 195 200 205 Ser Ser Pro Arg Pro Gln Pro Arg Asp Arg Arg Trp Gly Asp Thr Pro 210 215 220 Pro Gly Arg Lys Pro Gly Ser Pro Val Gly Ser Lys Arg Gly Arg Lys 225 230 235 240 Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr 245 250 255 Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu 260 265 270 Gly Gly Cys Glu Leu 275 <210> 121 <211> 172 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> pTalpha-Delta114-TCRalpha.IC <400> 121 Met Ala Gly Thr Trp Leu Leu Leu Leu Leu Ala Leu Gly Cys Pro Ala 1 5 10 15 Leu Pro Thr Gly Val Gly Gly Thr Pro Phe Pro Ser Leu Ala Pro Pro 20 25 30 Ile Met Leu Leu Val Asp Gly Lys Gln Gln Met Val Val Val Cys Leu 35 40 45 Val Leu Asp Val Ala Pro Pro Gly Leu Asp Ser Pro Ile Trp Phe Ser 50 55 60 Ala Gly Asn Gly Ser Ala Leu Asp Ala Phe Thr Tyr Gly Pro Ser Pro 65 70 75 80 Ala Thr Asp Gly Thr Trp Thr Asn Leu Ala His Leu Ser Leu Pro Ser 85 90 95 Glu Glu Leu Ala Ser Trp Glu Pro Leu Val Cys His Thr Gly Pro Gly 100 105 110 Ala Glu Gly His Ser Arg Ser Thr Gln Pro Met His Leu Ser Gly Glu 115 120 125 Ala Ser Thr Ala Arg Thr Cys Pro Gln Glu Pro Leu Arg Gly Thr Pro 130 135 140 Gly Gly Ala Leu Trp Leu Gly Val Leu Arg Leu Leu Leu Phe Lys Leu 145 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TM. IC <400> 122 Met Ala Gly Thr Trp Leu Leu Leu Leu Leu Ala Leu Gly Cys Pro Ala 1 5 10 15 Leu Pro Thr Gly Val Gly Gly Thr Pro Phe Pro Ser Leu Ala Pro Pro 20 25 30 Ile Met Leu Leu Val Asp Gly Lys Gln Gln Met Val Val Val Cys Leu 35 40 45 Val Leu Asp Val Ala Pro Pro Gly Leu Asp Ser Pro Ile Trp Phe Ser 50 55 60 Ala Gly Asn Gly Ser Ala Leu Asp Ala Phe Thr Tyr Gly Pro Ser Pro 65 70 75 80 Ala Thr Asp Gly Thr Trp Thr Asn Leu Ala His Leu Ser Leu Pro Ser 85 90 95 Glu Glu Leu Ala Ser Trp Glu Pro Leu Val Cys His Thr Gly Pro Gly 100 105 110 Ala Glu Gly His Ser Arg Ser Thr Gln Pro Met His Leu Ser Gly Glu 115 120 125 Ala Ser Thr Ala Arg Thr Cys Pro Gln Glu Pro Leu Arg Gly Thr Pro 130 135 140 Gly Gly Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala 145 150 155 160 Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser 165 170 <210> 123 <211> 233 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> pTalpha.EC-Delta48-1xMUT <400> 123 Met Ala Gly Thr Trp Leu Leu Leu Leu Leu Ala Leu Gly Cys Pro Ala 1 5 10 15 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Gly Ser Pro Val 225 230 <210> 124 <211> 233 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> pTalpha.EC-Delta48-4xMUT <400> 124 Met Ala Gly Thr Trp Leu Leu Leu Leu Leu Ala Leu Gly Cys Pro Ala 1 5 10 15 Leu Pro Thr Gly Val Gly Gly Thr Pro Phe Pro Ser Leu Ala Pro Pro 20 25 30 Ile Met Leu Leu Val Ala Gly Ala Gln Gln Met Val Val Val Cys Leu 35 40 45 Val Leu Asp Val Ala Pro Pro Gly Leu Asp Ser Pro Ile Trp Phe Ser 50 55 60 Ala Gly Asn Gly Ser Ala Leu Asp Ala Phe Thr Tyr Gly Pro Ser Pro 65 70 75 80 Ala Thr Asp Gly Thr Trp Thr Asn Leu Ala His Leu Ser Leu Pro Ser 85 90 95 Glu Glu Leu Ala Ser Trp Glu Pro Leu Val Cys His Thr Gly Pro Gly 100 105 110 Ala Glu Gly His Ser Ala Ser Thr Gln Pro Met His Leu Ser Gly Glu 115 120 125 Ala Ser Thr Ala Ala Thr Cys Pro Gln Glu Pro Leu Arg Gly Thr Pro 130 135 140 Gly Gly Ala Leu Trp Leu Gly Val Leu Arg Leu Leu Leu Phe Lys Leu 145 150 155 160 Leu Leu Phe Asp Leu Leu Leu Thr Cys Ser Cys Leu Cys Asp Pro Ala 165 170 175 Gly Pro Leu Pro Ser Pro Ala Thr Thr Thr Arg Leu Arg Ala Leu Gly 180 185 190 Ser His Arg Leu His Pro Ala Thr Glu Thr Gly Gly Arg Glu Ala Thr 195 200 205 Ser Ser Pro Arg Pro Gln Pro Arg Asp Arg Arg Trp Gly Asp Thr Pro 210 215 220 Pro Gly Arg Lys Pro Gly Ser Pro Val 225 230 <210> 125 <211> 848 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Multi-chain CAR <400> 125 Met Ala Pro Ala Met Glu Ser Pro Thr Leu Leu Cys Val Ala Leu Leu 1 5 10 15 Phe Phe Ala Pro Asp Gly Val Leu Ala Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser 20 25 30 Gly Pro Glu Leu Ile Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys 35 40 45 Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Val Met His Trp Val Lys Gln 50 55 60 Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn 65 70 75 80 Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr 85 90 95 Ser Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr 100 105 110 Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Thr Tyr Tyr Tyr 115 120 125 Gly Ser Arg Val Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val 130 135 140 Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 145 150 155 160 Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Ala Pro Ser Ile Pro Val Thr Pro 165 170 175 Gly Glu Ser Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu Asn 180 185 190 Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Leu Gln Arg Pro Gly Gln 195 200 205 Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val 210 215 220 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala Phe Thr Leu Arg 225 230 235 240 Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln 245 250 255 His Leu Glu Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu 260 265 270 Lys Arg Ala Asp Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala 275 280 285 Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg 290 295 300 Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys 305 310 315 320 Asp Phe Phe Ile Pro Leu Leu Val Val Ile Leu Phe Ala Val Asp Thr 325 330 335 Gly Leu Phe Ile Ser Thr Gln Gln Gln Val Thr Phe Leu Leu Lys Ile 340 345 350 Lys Arg Thr Arg Lys Gly Phe Arg Leu Leu Asn Pro His Pro Lys Pro 355 360 365 Asn Pro Lys Asn Asn Arg Ala Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys 370 375 380 Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Asp Thr Glu Ser Asn Arg 385 390 395 400 Arg Ala Asn Leu Ala Leu Pro Gln Glu Pro Ser Ser Val Pro Ala Phe 405 410 415 Glu Val Leu Glu Ile Ser Pro Gln Glu Val Ser Ser Gly Arg Leu Leu 420 425 430 Lys Ser Ala Ser Ser Pro Pro Leu His Thr Trp Leu Thr Val Leu Lys 435 440 445 Lys Glu Gln Glu Phe Leu Gly Val Thr Gln Ile Leu Thr Ala Met Ile 450 455 460 Cys Leu Cys Phe Gly Thr Val Val Cys Ser Val Leu Asp Ile Ser His 465 470 475 480 Ile Glu Gly Asp Ile Phe Ser Ser Phe Lys Ala Gly Tyr Pro Phe Trp 485 490 495 Gly Ala Ile Phe Phe Ser Ile Ser Gly Met Leu Ser Ile Ile Ser Glu 500 505 510 Arg Arg Asn Ala Thr Tyr Leu Val Arg Gly Ser Leu Gly Ala Asn Thr 515 520 525 Ala Ser Ser Ile Ala Gly Gly Thr Gly Ile Thr Ile Leu Ile Ile Asn 530 535 540 Leu Lys Lys Ser Leu Ala Tyr Ile His Ile His Ser Cys Gln Lys Phe 545 550 555 560 Phe Glu Thr Lys Cys Phe Met Ala Ser Phe Ser Thr Glu Ile Val Val 565 570 575 Met Met Leu Phe Leu Thr Ile Leu Gly Leu Gly Ser Ala Val Ser Leu 580 585 590 Thr Ile Cys Gly Ala Gly Glu Glu Leu Lys Gly Asn Lys Val Pro Glu 595 600 605 Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met 610 615 620 Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe 625 630 635 640 Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Gly Ser Gly Val Lys Gln 645 650 655 Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn 660 665 670 Pro Gly Pro Met Ile Pro Ala Val Val Leu Leu Leu Leu Leu Leu Val 675 680 685 Glu Gln Ala Ala Ala Leu Gly Glu Pro Gln Leu Cys Tyr Ile Leu Asp 690 695 700 Ala Ile Leu Phe Leu Tyr Gly Ile Val Leu Thr Leu Leu Tyr Cys Arg 705 710 715 720 Leu Lys Ile Gln Val Arg Lys Ala Ala Ile Thr Ser Tyr Glu Lys Ser 725 730 735 Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly 740 745 750 Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr 755 760 765 Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys 770 775 780 Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys 785 790 795 800 Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg 805 810 815 Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala 820 825 830 Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 835 840 845 <210> 126 <211> 2547 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Multi-chain CAR <400> 126 atggctcctg ccatggaatc ccctactcta ctgtgtgtag ccttactgtt cttcgctcca 60 gatggcgtgt tagcagaggt gcagttgcag cagtcagggc cagagttgat taagcccgga 120 gcctccgtca agatgtcctg caaggccagc gggtacactt tcaccagcta cgtcatgcat 180 tgggtgaagc agaagccagg ccaggggctt gagtggattg ggtacatcaa cccctacaac 240 gacgggacca aatacaacga gaaattcaag ggcaaagcca cactcacctc cgataagtcc 300 tcctctaccg cctacatgga gctcagctcc ctgacctccg aggatagcgc tgtgtattac 360 tgcgcaaggg gcacatacta ctatggctct agggtgttcg actactgggg gcagggcact 420 actctcacag tgagctcagg cggaggaggc agtggcggag ggggaagtgg gggcggcggc 480 agcgatattg tcatgaccca ggcagcccct agtatccctg tgactccagg cgagagcgtg 540 agcatcagct gccggtccag caagagcctg ctgaacagta acggaaacac atacctctac 600 tggtttctgc agaggcccgg ccagagccct cagctgctga tttaccgcat gtcaaatctt 660 gcctctgggg tgcccgatag atttagtggg agcggatccg gcacagcttt tacattgcgg 720 atctccagag tcgaggccga agacgtgggg gtctattact gtatgcaaca cctggaatac 780 ccctttacct tcggagccgg cacaaagctg gagctgaagc gggctgacac cacaaccccc 840 gctccaaggc cccctacccc cgcaccaact attgcctccc agccactctc actgcggcct 900 gaggcctgtc ggcccgctgc tggaggcgca gtgcatacaa ggggcctcga tttcgcctgc 960 gattttttta tcccattgtt ggtggtgatt ctgtttgctg tggacacagg attatttatc 1020 tcaactcagc agcaggtcac atttctcttg aagattaaga gaaccaggaa aggcttcaga 1080 cttctgaacc cacatcctaa gccaaacccc aaaaacaaca gagccgaggg cagaggcagc 1140 ctgctgacct gcggcgacgt ggaggagaac ccaggcccca tggacacaga aagtaatagg 1200 agagcaaatc ttgctctccc acaggagcct tccagtgtgc ctgcatttga agtcttggaa 1260 atatctcccc aggaagtatc ttcaggcaga ctattgaagt cggcctcatc cccaccactg 1320 catacatggc tgacagtttt gaaaaaagag caggagttcc tgggggtaac acaaattctg 1380 actgctatga tatgcctttg ttttggaaca gttgtctgct ctgtacttga tatttcacac 1440 attgagggag acattttttc atcatttaaa gcaggttatc cattctgggg agccatattt 1500 ttttctattt ctggaatgtt gtcaattata tctgaaagga gaaatgcaac atatctggtg 1560 agaggaagcc tgggagcaaa cactgccagc agcatagctg ggggaacggg aattaccatc 1620 ctgatcatca acctgaagaa gagcttggcc tatatccaca tccacagttg ccagaaattt 1680 tttgagacca agtgctttat ggcttccttt tccactgaaa ttgtagtgat gatgctgttt 1740 ctcaccattc tgggacttgg tagtgctgtg tcactcacaa tctgtggagc tggggaagaa 1800 ctcaaaggaa acaaggttcc agagaaacgg ggccggaaga agctcctcta catttttaag 1860 cagcctttca tgcggccagt gcagacaacc caagaggagg atgggtgttc ctgcagattc 1920 cctgaggaag aggaaggcgg gtgcgagctg ggttctggcg tgaaacagac tttgaatttt 1980 gaccttctca agttggcggg agacgtggag tccaacccag ggcccatgat tccagcagtg 2040 gtcttgctct tactcctttt ggttgaacaa gcagcggccc tgggagagcc tcagctctgc 2100 tatatcctgg atgccatcct gtttctgtat ggaattgtcc tcaccctcct ctactgtcga 2160 ctgaagatcc aagtgcgaaa ggcagctata accagctatg agaaatcaag agtgaagttc 2220 tccaggagcg cagatgcccc cgcctatcaa cagggccaga accagctcta caacgagctt 2280 aacctcggga ggcgcgaaga atacgacgtg ttggataaga gaagggggcg ggaccccgag 2340 atgggaggaa agccccggag gaagaaccct caggagggcc tgtacaacga gctgcagaag 2400 gataagatgg ccgaggccta ctcagagatc gggatgaagg gggagcggcg ccgcgggaag 2460 gggcacgatg ggctctacca ggggctgagc acagccacaa aggacacata cgacgccttg 2520 cacatgcagg cccttccacc ccggtga 2547

Claims (48)

  1. 하기를 포함하는, 면역 요법을 위하여 엑스 비보(ex vivo)에서 T-세포들을 조작하는(engineering) 방법:
    (a) 레어-커팅 엔도뉴클레아제(rare-cutting endonuclease)를 이용함으로써 면역억제제에 대한 표적을 코드하는 적어도 하나의 유전자의 발현을 불활성화시킴으로써 T-세포들을 변형시키는 단계이며, 이때 레어-커팅 엔도뉴클레아제는 상기 유전자를 선택적으로 불활성화시킬 수 있고, 그리고 이때 상기 유전자는 글루코코르티코이드 수용체 (GR) 또는 CD52를 코드하는 단계, 및
    (b) 상기 세포들을 확장시키는 단계,
    이때 상기 면역억제제는 GR 또는 CD52를 표적으로 하는 면역억제제이다.
  2. 제 1항에 있어서,
    단계 (a) 전에 하기 단계들을 포함하는 방법:
    (i) T-세포를 제공하는 단계;
    (ii) 글루코코르티코이드 수용체 (GR) 또는 CD52를 발현하는 상기 T-세포에서 유전자를 선택하는 단계; 및
    (iii) DNA 절단(cleavage)에 의하여, GR 또는 CD52를 코드하는 상기 유전자를 선택적으로 불활성화시킬 수 있는 적어도 하나의 레어-커팅 엔도뉴클레아제를 상기 T-세포 내로 엑스 비보로 도입하는 단계.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서,
    T-세포들은 상기 면역억제제의 존재 하 단계 (b)에서 확장되는, 방법.
  4. 제 1항 또는 제 2항에 있어서,
    상기 면역억제제에 대한 상기 표적은 CD52이고 상기 면역억제제는 CD52 항원을 표적으로 하는 항체인, 방법.
  5. 제 4항에 있어서,
    상기 CD52 항원을 표적으로 하는 항체는 알렘투주맙(Alemtuzumab)인, 방법.
  6. 제 1항 또는 제 2항에 있어서,
    상기 면역억제제에 대한 상기 표적은 글루코코르티코이드 수용체 (GR)이고 상기 면역억제제는 코르티코스테로이드인, 방법.
  7. 제 6항에 있어서,
    상기 코르티코스테로이드는 덱사메타손(dexamethasone)인, 방법.
  8. 제 2항에 있어서,
    상기 레어-커팅 엔도뉴클레아제는 RNA 전기천공법으로 단계 (iii)에서 상기 세포 내로 도입되는, 방법.
  9. 제 2항에 있어서,
    상기 레어-커팅 엔도뉴클레아제는 메가뉴클레아제(meganuclease), 징크 핑거 뉴클레아제 또는 TALE-뉴클레아제인, 방법.
  10. 제 9항에 있어서,
    이때 상기 TALE-뉴클레아제는 메가뉴클레아제에 융합된 TALE 도메인을 포함하는, 방법.
  11. 제 2항에 있어서,
    상기 레어-커팅 엔도뉴클레아제는 GR 유전자에서, 서열번호: 1 내지 서열번호: 6 으로부터 선택되는 표적 서열들 중 하나에 대하여 향해지는(direct), 방법.
  12. 제 2항에 있어서,
    상기 레어-커팅 엔도뉴클레아제는 CD52 유전자에서, 서열번호: 40 및 서열번호: 61 내지 서열번호: 65 로부터 선택되는 표적 서열들 중 하나에 대하여 향해지는, 방법.
  13. 제 1항 또는 제 2항에 있어서,
    이때 상기 방법은 면역 체크-포인트에 관련되는 적어도 하나의 단백질을 불활성화시킴으로써 상기 T-세포를 유전적으로 변형시키는 것을 더 포함하고, 이때 상기 면역 체크-포인트 단백질은 PDCD1 또는 CTLA-4인, 방법.
  14. 제 1항 또는 제 2항에 있어서,
    키메라 항원 수용체 (CAR)를 상기 T-세포 내로 도입하는 것을 포함하는, 방법.
  15. 제 1항 또는 제 2항에 있어서,
    단계 a)에서 상기 T-세포들은 염증성 T-림프구들, 세포독성 T-림프구들, 조절 T-림프구들, 헬퍼 T-림프구들로부터 유래되거나 또는 줄기 세포로부터 유래되는, 방법.
  16. 제 1항 또는 제 2항에 있어서,
    단계 a)에서 상기 T-세포들은 CD4+ T-림프구들 또는 CD8+ T-림프구들로부터 유래되는, 방법.
  17. 제 1항 또는 제 2항에 있어서,
    상기 T-세포들은 일차 세포들(primary cells)인, 방법.
  18. 적어도 CD52 유전자가 적어도 하나의 레어-커팅 엔도뉴클레아제로 불활성화된 분리된 T-세포.
  19. 적어도 GR 유전자가 적어도 하나의 레어-커팅 엔도뉴클레아제로 불활성화된 분리된 T-세포.
  20. 제 18항 또는 제 19항에 있어서,
    상기 세포가 제 1항 또는 제 2항의 방법에 의하여 수득가능한, 분리된 T-세포.
  21. 글루코코르티코이드 수용체 (GR)를 코드하는 유전자 또는 CD52를 코드하는 유전자에 대하여 향해지는 적어도 하나의 레어-커팅 엔도뉴클레아제 또는 이러한 레어-커팅 엔도뉴클레아제를 코드하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 분리된 T-세포.
  22. 제 21항에 있어서,
    CD52를 코드하는 유전자에 대하여 향해지는 상기 레어-커팅 엔도뉴클레아제는: 서열번호: 40 및 서열번호: 61 내지 서열번호: 65로부터 선택되는 폴리뉴클레오타이드 서열에 대하여 향해지는, 분리된 T-세포.
  23. 제 21항에 있어서,
    GR을 코드하는 유전자에 대하여 향해지는 상기 레어-커팅 엔도뉴클레아제는: 서열번호: 1 내지 서열번호: 6으로부터 선택되는 폴리뉴클레오타이드 서열 유전자에 대하여 향해지는, 분리된 T-세포.
  24. 제 21항 내지 제 23항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 레어-커팅 엔도뉴클레아제는 메가뉴클레아제, 징크 핑거 뉴클레아제 또는 TALE-뉴클레아제인, 분리된 T-세포.
  25. 제 24항에 있어서,
    이때 상기 레어-커팅 엔도뉴클레아제는 TALE-뉴클레아제이고 그리고 메가뉴클레아제에 융합된 TALE 도메인을 포함하는, 분리된 T-세포.
  26. 제 24항에 있어서,
    상기 레어-커팅 엔도뉴클레아제는 TALE-뉴클레아제이고 그리고 서열번호: 41 내지 서열번호: 48 로부터 선택되는 폴리펩타이드 서열들 중 하나를 포함하는, 분리된 T-세포.
  27. pT알파(pTalpha) 또는 그것의 기능적 변형체, 키메라 항원 수용체 (CAR), 복수-사슬(multi-chain) CAR 또는 외인성 재조합 T-세포 수용체 (TCR)를 코드하는 외인성 재조합 폴리뉴클레오타이드를 더 포함하는, 제 18항, 제 19항, 및 제 21항 내지 제 23항 중 어느 한 항에 따른 분리된 T-세포.
  28. 제 18항, 제 19항, 및 제 21항 내지 제 23항 중 어느 한 항에 따른 적어도 하나의 분리된 T-세포를 포함하는 약학적 조성물.
  29. 코르티코스테로이드를 더 포함하는 제 28항에 따른 약학적 조성물.
  30. 치료적(therapeutic) 항-CD52 항체를 더 포함하는 제 28항에 따른 약학적 조성물.
  31. 제 18항, 제 19항, 및 제 21항 내지 제 23항 중 어느 한 항에 따른 분리된 T-세포들을 포함하는 세포들의 집단(population).
  32. 의약으로서 사용을 위한, 제 18항, 제 19항, 및 제 21항 내지 제 23항 중 어느 한 항에 따른 분리된 T-세포.
  33. 의약으로서 사용을 위한, 제 31항에 따른 세포들의 집단.
  34. 암의 치료의 방법에서 사용을 위한 제 28항에 따른 약학적 조성물.
  35. 암의 치료의 방법에서 사용을 위한 제 31항에 따른 세포들의 집단(population).
  36. 제 34항에 있어서,
    상기 분리된 T-세포는 환자의 면역 시스템에 의한 상기 세포들의 거부를 피하기 위하여 GR 또는 CD52를 표적으로 하는 면역억제제로 치료되는 환자에서 투여되는, 약학적 조성물.
  37. 제 35항에 있어서,
    상기 세포들의 집단은 환자의 면역 시스템에 의한 상기 세포들의 거부를 피하기 위하여 GR 또는 CD52를 표적으로 하는 면역억제제로 치료되는 환자에서 투여되는, 세포들의 집단.
  38. 면역요법에 의한 치료의 방법에서 사용을 위한 제 35항에 따른 세포들의 집단이며, 이때 kg 체중 당 104-109 세포들이 환자 내로 투여되는, 세포들의 집단.
  39. 적어도 CD52 유전자가 적어도 하나의 레어-커팅 엔도뉴클레아제로 불활성화된 분리된 T-세포주.
  40. 적어도 GR 유전자가 적어도 하나의 레어-커팅 엔도뉴클레아제로 불활성화된 분리된 T-세포주.
  41. 제 1항 또는 제 2항에 있어서,
    T-세포들은 상기 면역억제제의 부존재 하 단계 (b)에서 확장되는, 방법.
  42. 제 10항에 있어서,
    상기 메가뉴클레아제는 I-Crel, I-Onul, 또는 그것의 기능적 변형체인, 방법.
  43. 제 25항에 있어서,
    상기 메가뉴클레아제는 I-Crel, I-Onul 또는 그것의 기능적 변형체인, 분리된 T-세포.
  44. 면역 요법에서 사용을 위한, 제 18항, 제 19항, 및 제 21항 내지 제 23항 중 어느 한 항에 따른 분리된 T-세포.
  45. 면역 요법에서 사용을 위한, 제 31항에 따른 세포들의 집단.
  46. 림프종 또는 백혈병의 치료의 방법에서 사용을 위한 제 28항에 따른 약학적 조성물.
  47. 림프종 또는 백혈병의 치료의 방법에서 사용을 위한 제 31항에 따른 세포들의 집단.
  48. 면역요법에 의한 치료의 방법에서 사용을 위한 제 35항에 따른 세포들의 집단이며, 이때 kg 체중 당 105 - 106 세포들이 환자 내로 투여되는, 세포들의 집단.



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