KR102157971B1 - 재료에 기초한 세포 치료를 위한 주사 가능한 기공 형성 하이드로겔 - Google Patents

재료에 기초한 세포 치료를 위한 주사 가능한 기공 형성 하이드로겔 Download PDF

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나타니엘 디 휩쉬
크리스토퍼 엠 마들
광원 이
마리아 엠 쉬
데이비드 제이 무니
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프레지던트 앤드 펠로우즈 오브 하바드 칼리지
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Abstract

본 발명은 하이드로겔 주사 후 하이드로겔 내의 계내에서 기공을 형성하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 둘러싼 하이드로겔 내의 희생 포로젠의 분해에 의해 계내에 형성된 기공은 세포의 동원 또는 방출을 촉진한다. 본원에서는, 초기에는 다공성이 아니지만, 시간이 경과함에 따라 매크로다공성이 되는 재료를 개시한다.

Description

재료에 기초한 세포 치료를 위한 주사 가능한 기공 형성 하이드로겔{INJECTABLE, PORE-FORMING HYDROGELS FOR MATERIALS-BASED CELL THERAPIES}
관련 출원
본 출원은 35 U.S.C. § 119(e) 하에 2010년 10월 6일에 출원된 미국 가출원 61/390,594호에 대하여 우선권의 이익을 주장하며, 상기 가출원은 본원에서 그 전체가 참고로 포함된다.
연방정부 지원에 관한 언급
본 발명은 미국 국립보건원에 의해 허여된 NIH R37DE013033 및 미국 국립과학재단에 의해 허여된 MRSEC DMR-0820484 하에 정부 지원에 의해 이루어졌다. 정부는 본 발명에 대하여 일정한 권리를 갖는다.
발명의 분야
본 발명은 생체적합성 하이드로겔 조성물에 관한 것이다.
최근 수십년 동안, 생체적합성 폴리머가 세포 이식을 위한 캐리어로서의 역할을 하는 스캐폴드를 형성하거나 숙주 세포 집단을 디바이스로 동원하기 위해 사용되어 왔다.
본 발명은 다공성 하이드로겔을 형성하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 예를 들어, 대상으로 하이드로겔을 주입한 후 하이드로겔 내의 계내에서(in situ) 기공이 형성된다. 둘러싼 하이드로겔(벌크 하이드로겔) 내의 희생 포로젠(sacrificial porogen)의 분해를 통해 계내에서 형성된 기공은 세포의 동원(recruitment) 및 방출(release)을 촉진한다. 예를 들어, 형성된 기공은 초기 포로젠의 크기의 5% 이내이다.
본원에서는, 초기에는 다공성이지만 포유동물 대상과 같은 수용자 동물의 신체 내에서 시간이 경과함에 따라 매크로다공성이 되어 상주하게 되는 재료를 개시한다. 이러한 조성물은 이전의 스캐폴드 조성물이 비해 중요한 이점들과 관련되어 있다. 본원에 개시된 하이드로겔은 초기에는 이식된 세포를 숙주 염증성 반응으로부터 보호하고 그 후 염증이 진정된 후(예를 들어, 이식 후, 즉 수용자의 신체에 상주한 후 12시간, 또는 1일, 3일, 5일, 7일, 또는 10일 이상이 경과한 후) 이식된 세포를 방출하는 데 매우 적합하다. 본원에 기재된 하이드로겔은 또한 수술용 팽화제(bulking agent)로서 두 배가 되어 숙주에서의 염증을 추가로 최소화하고 그 후 나중에 세포를 방출시킨다.
따라서, 본 발명은 제1 하이드로겔 및 제2 하이드로겔을 포함하는 조성물로서, 상기 제1 하이드로겔은 제2 하이드로겔보다 10% 이상 더 빠르게(예를 들어, 15% 이상, 20% 이상, 25% 이상, 30% 이상, 35% 이상, 40% 이상, 45% 이상, 또는 50% 이상 더 빠르게) 분해하고, 제1 하이드로겔 또는 제2 하이드로겔 (또는 둘 다) 단리된 세포를 포함하는 것인 조성물을 제공한다. 바람직하게는, 제1 하이드로겔은 기공을 그 자리에 남겨두고 분해하는 포로젠을 포함한다. 예를 들어, 제1 하이드로겔은 포로젠이고, 계내에서 분해 후 형성된 기공은 초기 포로젠의 크기의 25% 이내, 예를 들어, 예를 들어, 초기 포로젠의 크기의 20% 이내, 15% 이내, 또는 10% 이내이다. 바람직하게는, 형성된 기공은 초기 포로젠의 크기의 5% 이내이다. 제1 하이드로겔은 제2 하이드로겔보다 더 빨리 분해되는데, 그 이유는 제1 하이드로겔이 물에서 더 잘 용해될 수 있기 때문이다(더 낮은 용해 지수를 포함한다). 다르게는, 제1 하이드로겔이 본원에 참고로 포함된 USSN 10/980,989(Zilla)에 기재된 바와 같은 프로테아제 매개 분해 모티프에 가교결합되기 ??문에 더 빨리 분해된다.
제1 하이드로겔 조성물(포로젠)을 형성하는 데 사용되는 폴리머의 분자량은 약50 킬로달톤(kDa)이고, 제2 하이드로겔 조성물(벌크)을 형성하는 데 사용되는 폴리머의 분자량은 약 250 kDa이다. 더 짧은 폴리머(예를 들어, 포로젠의 폴리머)는 더 긴 폴리머(예를 들어, 벌크 조성물의 폴리머)에 비해 더 빨리 분해된다. 대안적으로, 조성물을 당(sugar) 기(예를 들어, 알기네이트 조성물의 약 3∼10%의 당)의 존재에 의해 가수분해적으로 더 잘 분해될 수 있도록 변경한다. 또 다른 예로서, 포로젠 하이드로겔은 벌크 하이드로겔에 비해 효소적으로 더 잘 분해될 수 있다. 복합(제1 및 제2 하이드로겔) 조성물은 체액이 투과될 수 있어서, 예를 들어, 조성물에 접근 가능한 효소 등이 포로젠 하이드로겔을 분해한다. 몇몇 경우에, 제2 하이드로겔은 제1 하이드로겔을 둘러싸고 가교결합되며, 즉 포로젠(제1 하이드로겔)은 벌크(제2) 하이드로겔에 완전히 물리적으로 가두어진다.
세포 또는 생물활성 인자(예를 들어, 성장 인자, 예컨대 과립구/대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF), 혈관 내피세포 성장 인자(VEGF), 압축된 올리고뉴클레오티드(condensed oligonucleotide), 예를 들어, CpG, 또는 플라스미드 DNA)를 경우에 따라 포로젠상, 벌크 하이드로겔상, 또는 두 상 모두에 캡슐화한다. 포로젠은 사용자가 미리 정한 타임코스에 따라 계내에서 분해된다. 포로젠이 분해되면, 세포가 재료로부터 방출되거나 재료로 이동한다. 그러나, 포로젠은 초기에는 기공이 부족하기 때문에, 기공 형성 하이드로겔은 형성 직후 기계적 지지체를 제공하는 데 유용하다. 적절한 생물활성 인자로는 혈관 내피세포 성장 인자(예를 들어, VEGFA; GenBank 수탁 번호: (aa) AAA35789.1 (GI:181971), (na) NM_001171630.1 (GI:284172472), 본원에 참고로 포함됨), 산성 섬유아세포 성장 인자(aFGF, Genbank 수탁 번호: (aa) AAB29057.2 (GI:13236891), (na) NM_000800.3 (GI:222144219), 본원에 참고로 포함됨), 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF; GenBank 수탁 번호: (aa) AAB21432.2 (GI:8250666), (na) A32848.1 (GI:23957592), 본원에 참고로 포함됨), 태반 성장 인자(PIGF 또는 PLGF; GenBank 수탁 번호: (aa) AAH07789.1 (GI:14043631), (na) NM_002632.4 (GI:56676307), 본원에 참고로 포함됨), 렙틴(Genbank 수탁 번호: (aa) CBI71013.1 (GI:285310289), (na) NM_000230.2 (GI:169790920), 본원에 참고로 포함됨), 조혈 성장 인자(예를 들어, HGF, Genbank 수탁 번호: (aa) AAA64297.1 (GI:337938), (na) NM_000601.4 (GI:58533168), 본원에 참고로 포함됨), VEGF 수용체-1(VEGFR-1, Genbank 수탁 번호: (aa) NP_002010.2 (GI:156104876), 본원에 참고로 포함됨), VEGFR-2(Genbank 수탁 번호: (aa) AAC16450.1 (GI:3132833), (na) EU826563.1 (GI:194318421), 본원에 참고로 포함됨), 형질전환 성장 인자-β(TGF-β, Genbank 수탁 번호: (aa) AAA36738.1 (GI:339564), (na) NM_000660.4 (GI:260655621), 본원에 참고로 포함됨), 뼈형성 단백질(예를 들어, BMP-4, Genbank 수탁 번호: (aa) NP_570912.2 (GI:157276597), (na) NM_001202.3 (GI:157276592), 본원에 참고로 포함됨), 인슐린 유사 성장 인자(IGF-1, Genbank 수탁 번호: (aa) CAA01954.1 (GI:1247519), (na) NM_001111283.1 (GI:163659898), 본원에 참고로 포함됨), 섬유아세포 성장 인자-2(FGF-2), 혈소판 유래 성장 인자(PDGF; GenBank 수탁 번호: (aa) AAA60552.1 (GI:338209), (na) NM_033023.4 (GI:197333759), 본원에 참고로 포함됨), 표피 성장 인자(EGF, Genbank 수탁 번호: (aa) AAH93731.1 (GI:62740195), 본원에 참고로 포함됨), 형질전환 성장 인자-α(TGF-α Genbank 수탁 번호: (na) NM_003236.2 (GI:153791671), 본원에 참고로 포함됨), 신경 성장 인자(NGF, Genbank 수탁 번호: (aa) AAH32517.2 (GI:34192369), (na) NM_002506.2 (GI:70995318), 본원에 참고로 포함됨), 뇌 유래 신경 영양 인자(BDNF, Genbank 수탁 번호: (aa) CAA62632.1 (GI:987872), (na) NM_170731.4 (GI:219842281), 본원에 참고로 포함됨), 뉴로트로핀-3(NT-3, Genbank 수탁 번호: (aa) NP_001096124.1 (GI:156630995), (na) NM_001102654.1 (GI:156630994), 본원에 참고로 포함됨), 섬모 향신경성 인자(CNTF, Genbank 수탁 번호: (aa) AAB31818.1 (GI:633830), (na) NM_000614.3 (GI:209574322), 본원에 참고로 포함됨), 및 신경교 세포주 유래 향신경성 인자(GDNF, Genbank 수탁 번호: (aa) CAG46721.1 (GI:49456801), (na) NM_000514.3 (GI:299473777), 본원에 참고로 포함됨)를 포함한다. 다른 적절한 인자는 항-VEGF 항체, 항-aFGF 항체, 항-bFGF 항체, 항-PIGF 항체, 항-렙틴 항체, 항-HGF 항체, 항-VEGFR-1 항체, 항-VEGFR-2 항체, 바티마스타트(batimastat)(BB-94), 마리마스타트(marimastat)(BB-2516), 탈리도마이드(thalidomide), O-(클로로아세틸카바모일)-푸마길롤(TNP-470), 카복시아미도트리아졸(CAI), 미톡산트론, 독소루비신, SU5416, 항-TGF-β 항체, 항-BMP 항체, 항-IGF-1 항체, 항-FGF-2 항체, 항-PDGF 항체, 항-EGF 항체, 항-TGF-α 항체, 및 항-VEGF 항체를 포함한다. 포로젠상, 벌크 하이드로겔상 또는 둘 모두의 상으로의 캡슐화에 적합한 다른 생물활성 인자는 FMS 유사 타이로신 키나제 3 리간드(Flt3 리간드; Genbank 수탁 번호: (aa) AAI44040 (GI:219519004), (na) NM_004119 (GI: GI:121114303), 본원에 참고로 포함됨), 항-flt3 리간드, 간세포 성장 인자(Genbank 수탁 번호: (aa) AAB20169 (GI:237997), 본원에 참고로 포함됨) 및 기질 유래 인자 1( SDF-1)을 포함한다.
대안적으로, 경우에 따라 아데노바이러스를 포로젠상, 벌크 하이드로겔상 또는 둘 모두의 상으로 캡슐화한다. 예를 들어, 아데노바이러스는 조골세포 분화와 관련된 중요한 전사 인자인 런트(runt) 관련 전사 인자(예를 들어, Runx2; Genbank 수탁 번호: (aa) CAI13532 (GI:55959066), (na) NM_001024630 (GI:226442782), 본원에 참고로 포함됨)를 코딩한다. 또 다른 양태에서, 아데노바이러스는 근육 분화를 조절하는 데 있어서 중요한 역할을 하는 단백질인 MyoD(Genbank 수탁 번호: (aa) CAA40000 (GI:34862), (na) NM_002478 (GI:77695919), 본원에 참고로 포함됨)를 코딩한다. 대안적으로, 아데노바이러스는 뼈형성 단백질, 예를 들어, BMP-2(Genbank 수탁 번호: (aa) AF040249_1 (GI:6649952), (na) NM_001200 (GI:80861484), 본원에 참고로 포함됨) 또는 BMP-4(Genbank 수탁 번호: (aa) NP_570912.2 (GI:157276597), (na) NM_001202.3 (GI:157276592), 본원에 참고로 포함됨)를 코딩한다. BMP-2는 특히 뼈 수복에 관여하는 반면, BMP-4는 심장 조직의 수복에 관여한다. 일 양태에서, Runx를 코딩하는 아데노바이러스 및 BMP-2를 코딩하는 아데노바이러스를 하이드로겔로 캡슐화한다.
포로젠상, 벌크 하이드로겔상 또는 둘 모두의 상으로 캡슐화하기에 적합한 세포는 중간엽 줄기 세포, 근아세포, 혈관 프로제니터 세포(예를 들어, 증식 내피세포(outgrowth endothelial cell), 배아 줄기 세포 또는 유도된 만능(pluripotent) 줄기 세포로부터 유래된 분화된 세포, 또는 유도된 만능 세포, 또는 섬유아세포로부터 분화된 상태로 직접 재프로그래밍된 세포를 포함한다.
몇몇 예에서, 포로젠 조성물은 세포를 포함하고, 다른 예에서, 벌크 조성물은 세포를 포함한다. 세포가 조성물 중에 존재할 경우(예를 들어, 제조 과정에서 시딩됨), 이 세포는 포유동물 대상으로 투여된 후 조성물 밖으로 전개된다. 대안적으로, 조성물은 세포를 포함하지 않지만, 포유동물 대상의 조직으로 투여된 후(예를 들어, 인간 환자로 이식된 후), 세포가 조성물 내로 동원된다. 포유동물은 임의의 포유동물, 예를 들어, 인간, 영장류, 마우스, 랫트, 개, 고양이, 말뿐만 아니라, 가축 또는 식량 소비를 위해 기른 동물, 예를 들어, 소, 양, 돼지, 닭 및 염소일 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 포유동물은 인간인다. 대안적으로, 대상은 비포유동물, 예컨대 개구리(xenopus), 도룡뇽(salamander) 또는 영원(newt)일 수 있다.
본 발명은 스캐폴드로부터 포유동물 대상의 조직으로 세포를 전개시키는 방법을 제공하며, 이 방법은 제1 하이드로겔 및 제2 하이드로겔을 포함하는 조성물을 대상에게 투여하는 단계로서, 상기 제1 하이드로겔은 제2 하이드로겔보다 10% 이상 더 빨리 분해하고, 상기 조성물은 투여 시점에 기공이 없으며, 상기 조성물은 상기 대상에 상주한 후 기공을 포함하고, 제1 하이드로겔 또는 제2 하이드로겔은 단리된 세포를 포함하는 것인 단계를 포함한다.
생체내에서 세포를 스캐폴드로 동원하는 방법은 제1 하이드로겔 및 제2 하이드로겔을 포함하는 조성물을 대상에게 투여함으로써 수행되며, 여기서 제1 하이드로겔은 제2 하이드로겔보다 10% 이상 더 빨리 분해되고, 상기 조성물은 투여 시점에 기공이 없으나, 대상에서 상주한 후 기공을 포함한다. 예를 들어, 기공은 제2 하이드로겔 조성물과 비교한 제1 하이드로겔 조성물의 상대 분해도 또는 용해도, 예를 들어, 벌크 조성물과 비교한 포로젠 조성물의 상대 분해도 또는 용해도로 인해 생성된다.
다공도는 조성물로의 세포의 동원 및/또는 조성물로부터의 세포의 배출에 영향을 준다. 기공은 나노다공성, 마이크로다공성, 또는 매크로다공성이다. 예를 들어, 나노기공의 직경은 약 10 nm 미만이다. 마이크로기공은 직경이 약 100 nm∼약 20 ㎛의 범위이다. 매크로기공은 약 20 ㎛보다 크다(예를 들어, 약 100 ㎛ 초가 또는 약 400 ㎛ 초과). 예시적인 매크로기공 크기는 50 ㎛, 100 ㎛, 150 ㎛, 200 ㎛, 250 ㎛, 300　㎛, 350 ㎛, 400 ㎛, 450 ㎛, 500 ㎛, 550 ㎛ 및 600 ㎛를 포함한다. 매크로기공은 진핵생물 세포를 조성물 안으로 또는 밖으로 관통시키도록 하는 크기를 갖는 것이다. 한 예에서, 매크로다공성 조성물은 직경이 약 400 ㎛∼500 ㎛인 기공을 갖는다. 바람직한 기공 크기는 용도에 따라 다르다. 예를 들어, 세포 전개(deployment) 및 세포 방출(release)의 경우, 바람직한 기공 직경은 50 ㎛ 초과이다.
포로젠의 크기는 전체 복합 재료의 크기와 관련되어 있다. 예를 들어, 재료가 완전하게 유지되기 위해서는, 포로젠 직경은 전체 복합체의 최소 치수의 10% 미만이다. 포로젠의 밀도는 복합 조성물의 전체 부피의 10∼80%이다. 예를 들어, 포로젠의 밀도는 전체 부피의 15%∼75%, 20%∼70%, 25%∼65%, 30%∼60%, 또는 35%∼55%이다. 바람직하게는, 포로젠의 밀도는 하이드로겔로의 최적의 세포 동원 또는 하이드로겔로부터의 최적의 세포 방출을 달성하기 위해 전체 부피의 50% 이상이다.
하이드로겔은 약 10∼약 1,000,000 파스칼(예를 들어, 약 10∼약 100,000 Pa, 약 10∼약 150,000 Pa, 약 10∼약 200,000 Pa, 약 10∼약 300,000 Pa, 약 10∼약 400,000 Pa, 약 10∼약 500,000 Pa, 약 10∼약 600,000 Pa, 약 10∼약 700,000 Pa, 약 10∼약 800,000 Pa, 또는 약 10∼약 900,000 Pa)의 탄성률(elastic modulus)을 갖는다. 바람직하게는, 천천히 분해하는 하이드로겔은 약 20 킬로 Pa∼60 kPa, 예를 들어, 25 kPa∼55　kPa, 30 kPa∼50 kPa, 또는 35 kPa∼45 kPa의 탄성률을 갖는다. 빠르게 분해하는 하이드로겔은 분해 전 캡슐화 중에 완전성을 유지하기 위해 초기에는 40 kPa 이상의 탄성률을 포함한다.
바람직하게는, 천천히 분해하는 하이드로겔(즉, 제2 하이드로겔 또는 "벌크")은 세포 부착 단백질을 모방하는 RGD의 아미노산 서열을 갖는 고분자량 펩티드를 포함한다. 대안적으로, 천천히 분해하는 하이드로겔은 상이한 부착성 펩티드 아미노산 모티프, 예컨대 PHSRN 또는 DGEA를 포함한다. 예를 들어, 천천히 분해하는 하이드로겔은 바람직하게는 2-10 RGD 펩티드/폴리머(예를 들어, 알기네이트 폴리머)로 변형된다.
"하이드로겔"은 친수성인 폴리머 사슬을 포함하는 조성물을 의미한다. 예시적인 하이드로겔은 세포 캡슐화에 적합한 재료, 예컨대 알기네이트, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), PEG-아크릴레이트, 아가로스 및 합성 단백질(예를 들어, 콜라겐 또는 조작된(engineered) 단백질(즉, 자기조립 펩티드에 기초한 하이드로겔)을 포함한다. 예를 들어, 상업적으로 이용 가능한 하이드로겔은 BDTM PuraMatrixTM를 포함한다. BDTM PuraMatrixTM 펩티드 하이드로겔은 세포 배양을 위한 정해진 3차원(3D) 미세환경을 생성하기 위해 사용되는 합성 매트릭스이다.
예를 들어, 하이드로겔은 전체적으로 또는 부분적으로 생분해 가능한 생체적합성 폴리머 매트릭스이다. 하이드로겔을 형성할 수 있는 재료의 예로는 알기네이트 및 알기네이트 유도체, 폴리락트산, 폴리글리콜산, 폴리(락틱-코-글리콜산)(PLGA) 폴리머, 젤라틴, 콜라겐, 아가로스, 천연 및 합성 다당류, 폴리아미노산, 예컨대 폴리펩티드, 특히 폴리(리신), 폴리에스테르, 예컨대 폴리하이드록시부티레이트 및 폴리-엡실론-카프로락톤, 폴리안하이드라이드; 폴리포스파진, 폴리(비닐 알코올), 폴리(알킬렌 옥시드), 특히 폴리(에틸렌 옥시드), 폴리(알릴아민)(PAM), 폴리(아크릴레이트), 변성 스티렌 폴리머, 예컨대 폴리(4-아미노메틸스티렌), 플루로닉 폴리올, 폴록사머, 폴리(우론산), 폴리(비닐피롤리돈), 및 그래프트 코폴리머를 비롯한 상기한 것들의 코폴리머를 포함한다. 콜라겐, 피브린, 하이알루론산, 아가로스 및 라미닌 풍부 겔을 들 수 있으나 이들에 한정되지 않는 합성 폴리머 및 천연 폴리머도 사용될 수 있다.
하이드로겔에 바람직한 재료는 알기네이트 또는 변성 알기네이트 재료이다. 알기네이트 분자는 (1-4)-결합 β-D-만누론산(M 단위) 및 α L-굴루론산(G 단위) 모노머로 이루어지며, 이 모노머는 폴리머 사슬을 따라 그 비율 및 순차적 분포가 다를 수 있다. 알기네이트 다당류는 2가 양이온(예를 들어, Ca+2, Mg+2, Ba+2)에 대한 강한 친화력을 가지고 이들 분자에 노출될 때 안정한 하이드로겔을 형성하는 고분자전해질 시스템이다.
본원에 기재된 조성물은 임상 용도, 예를 들어, 뼈 수복, 재생, 또는 형성; 근육 수복, 재생, 또는 형성; 및 피부 수복, 재생, 또는 형성에 적합한다. 예를 들어, 조성물은 단독으로 또는 골 접착제(시멘트) 또는 아교와 함께 골절에 적용되거나 질병이 있는 또는 손상된 근육 조직에 적용된다. 하이드로겔(세포가 시딩되거나 또는 세포가 없는)을 질병, 손상, 또는 파손이 있는 부위에 주사한다(골 또는 연골의 경우). 예를 들어, 하이드로겔을 뼈 내로 또는 뼈 위로 주사한다. 골 또는 연골 수복, 재생 또는 형성을 촉진하는 데 사용하기 위한 예시적인 생물활성 인자는 BMP-2, BMP-4, 또는 RunX를 포함한다.
몇몇 경우에, 조성물은 골 또는 연골 수복, 재생 또는 형성을 촉진하기 위해 세포를 동원한다. 대안적으로, 제1 하이드로겔 또는 제2 하이드로겔은 조골세포, 골세포, 파골세포 및 골전구세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 단리된 골세포를 포함한다. 대안적으로, 제1 하이드로겔 또는 제2 하이드로겔은 단리된 연골 세포를 포함하며, 이때 단리된 연골 세포는 연골아세포를 포함한다. 단리된 골세포 또는 단리된 연골 세포는 자가 세포 또는 동종이계 세포이다.
근육에의 적용을 위해서는(예를 들어, 근육 파열, 근육 좌상 또는 근육 당김), 하이드로겔(세포가 시딩되거나 세포가 없는)을 손상 부위에 주사한다. 근육 적용을 위한 적합한 조성물은 제1 하이드로겔 및 제2 하이드로겔을 포함하는 조성물로서, 제1 하이드로겔은 제2 하이드로겔보다 10% 이상 빨리 분해되고, 제1 하이드로겔 또는 제2 하이드로겔은 근육 수복, 재생 또는 형성에 사용하기 위한 생물활성 인자를 포함하는 것인 조성물을 포함한다. 예를 들어, 생물활성 인자는 MyoD를 포함한다.
몇몇 경우에, 조성물은 근육 또는 연골 수복, 재생 또는 형성을 촉진하기 위해 세포를 동원한다. 대안적으로, 제1 하이드로겔 또는 제2 하이드로겔은 골격근 세포, 심근 세포, 평활근 세포 및 근육 전구세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 단리된 근육 세포를 포함한다. 단리된 근육 세포는 자가 세포 또는 동종이계 세포이다.
피부에의 적용을 위해서는(예를 들어, 화상, 찰과상, 열상 또는 피부병), 하이드로겔(세포가 시딩되거나 세포가 없는)을 습포제(poultice) 또는 상처 드레싱으로서해당 부위에 직접 적용한다. 바람직하게는, 벌크 하이드로겔 내의 포로젠의 대부분(예를 들어, 50% 초과, 60% 초과, 70% 초과, 80% 초과 또는 90% 초과)이 해당 부위에 직접 적용될 때(예를 들어, 화상) 피부 표면을 향해 또는 피부 조직 내로 향한다. 이러한 방식으로, 생물활성 인자 또는 세포가 피부 표면으로 또는 피부 아래의 층으로 방출되고, 피부 또는 타겟 조직으로부터 멀리 이동하지 않는다. 피부 수복, 재생 또는 형성에 사용하기 위한 예시적인 생물활성 인자는 FGF이다.
몇몇 경우에, 조성물은 피부 또는 연골 수복, 재생 또는 형성을 촉진하기 위해 세포를 동원한다. 대안적으로, 제1 하이드로겔 또는 제2 하이드로겔은 섬유아세포, 진피 세포, 표피 세포, 또는 피부 프로제니터 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 단리된 피부 세포를 포함한다. 단리된 피부 세포는 자가 세포 또는 동종이계 세포이다.
생물활성 인자, 예컨대 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드, 또는 다른 작용물질을 정제 및/또는 단리한다. 특히, 본원에서 사용될 때, "단리된" 또는 "정제된" 핵산 분자, 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드 또는 단백질은 다른 세포 물질, 또는 재조합 기법에 의해 제조된 경우 배양 배지, 또는 화학적으로 합성된 경우 화학적 전구체 또는 다른 화학물질을 실질적으로 포함하지 않는 것이다. 정제된 화합물은 목적하는 화합물이 60 중량% 이상(건조 중량)인 것이다. 바람직하게는, 제조물은 목적하는 화합물이 중량 기준으로 75% 이상, 더 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 99% 이상이다. 예를 들어, 정제된 화합물은 중량 기준으로 원하는 화합물이 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 98%, 99%, 또는 100%(w/w)인 것이다. 순도는 임의의 적절한 표준 방법에 의해, 예를 들어, 컬럼 크로마토그래피, 박층 크로마토그래피 또는 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 분석에 의해 측정된다. 정제 또는 단리된 폴리뉴클레오티드(리보핵산(RNA) 또는 데옥시리보핵산(DNA))는 그 천연 상태에서 이것에 접해 있는(flank) 서열 또는 유전자가 없는 것이다. "정제된"이란 인간 대상에게 투여하기에 안전한 멸균도를 정의하며, 예를 들어, 감염성 물질 또는 독성 물질이 없는 것을 말한다.
유사하게, "실질적으로 순수한"이란 자연에서 동반되는 성분들로부터 분리된 뉴클레오티드 또는 폴리펩티드를 의미한다. 일반적으로, 뉴클레오티드 및 폴리펩티드는 이들에 자연적으로 관련되어 있는 단백질 및 천연 유기 분자를 중량 기준으로 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 심지어 99% 포함하지 않을 때 실질적으로 순수한 것이다.
"단리된 핵산"은 그 구조가 임의의 천연 핵산의 구조와 동일하지 않거나 3개 초과의 별개의 유전자에 걸쳐 있는 천연 게놈 핵산의 임의의 단편의 구조와 동일하지 않은 핵산이다. 이 용어는, 예를 들어, (a) 천연 게놈 DNA 분자의 일부이지만, 이것이 자연적으로 발생하는 유기체의 게놈 내의 분자의 그 부분에 접해 있는 양쪽의 핵산 서열에 접해 있지 않은 DNA; (b) 생성된 분자가 임의의 천연 벡터 또는 게놈 DNA와 동일하지 않도록 하는 방식으로 원핵생물 또는 진핵생물의 게놈 DNA로 또는 벡터로 도입된 핵산; (c) cDNA, 게놈 단편, 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)에 의해 생성된 단편, 또는 제한 단편과 같은 분리된 분자; 및 (d) 하이브리드 유전자, 예를 들어 융합 단백질을 코딩하는 유전자의 일부인 재조합 뉴클레오티드 서열을 커버한다. 본 발명에 따른 단리된 핵산 분자는 합성에 의해 제조된 분자뿐만 아니라 화학적으로 변경되고/되거나 변경된 백본을 갖는 임의의 핵산을 추가로 포함한다.
소분자는 질량이 2,000 달톤 미만인 화합물이다. 소분자의 분자량은 바람직하게는 1,000 달톤 미만, 더 바람직하게는 600 달톤 미만이고, 예를 들어, 이 화합물은 500 달톤, 400 달톤, 300 달톤, 200 달톤, 또는 100 달톤 미만이다.
연결어 "포함하는"은 "포괄하는", "함유하는" 또는 "특징으로 하는"과 동의어로서, 포괄적이거나 개방형 연결어이며, 추가적인 언급되지 않은 요소 또는 방법 단계를 배제하지 않는다. 이와는 달리, 연결어 "이루어지는"는 청구범위에서 명시되지 않은 임의의 요소, 단계 또는 성분을 배제한다. 연결어 "실질적으로 이루어지는"은 청구범위를 명시된 재료 또는 단계 및 청구된 발명의 "기본적이고 신규한 특징(들)에 실질적으로 영향을 미치지 않는 것들)로 한정한다.
본 발명의 다른 특징 및 이점은 이하에 기술하는 바람직한 실시형태의 설명 및 청구범위로부터 명백해질 것이다. 달리 정의하지 않는다면, 본원에서 사용되는 모든 기술 용어 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 분야의 통상의 기술자가 일반적으로 이해하고 있는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기재된 것과 유사하거나 동등한 방법 및 재료가 본 발명의 실시 또는 테스트에 사용될 수 있지만, 적절한 방법 및 재료는 이하에 설명하는 것들이다. 본원에서 인용된 모든 발행된 외국 특허 및 특허 출원은 본원에 참고로 포함된다. 본원에서 인용된 수탁 번호에 의해 표시되는 Genbank 및 NCBI 기탁은 본원에 참고로 포함된다. 충돌이 있는 경우 정의를 비롯한 본 명세서는 조정될 것이다. 또한, 재료, 방법 및 예는 단지 예시를 위한 것이며 한정을 의도한 것은 아니다.
도 1은, 이미지화 및 기계적 특성 테스트를 통해 입증된, 하이드로겔 내에서의 계내의 기공 형성을 보여주는 일련의 개략도, 사진, 막대 그래프 및 선 그래프이다. 도 1a는 하이드로겔의 형성을 예시하는 개략도이다. 왼쪽: 빠르게 분해 가능한 하이드로겔(빨간색 원) 및 중간엽 줄기 세포(MSC; 녹색)로 이루어진 마이크로비드. 중간: 마이크로비드 및 MSC를 제2 하이드로겔과 혼합하여 폴리머 재료("벌크 겔"; 회색)를 형성하며, 이것은 비드를 둘러싸서 가교결합된다. 오른쪽: 계내에서의 마이크로비드의 분해 후, MSC가 방출되는 기공의 네트워크를 가지면서 온전한 하이드로겔 네트워크가 유지된다. 도 1b는 제조 직후의 플루오레세인(녹색) 표지 포로젠의 형광 현미경 사진이다. 도 1c는 알기네이트 하이드로겔 네트워크로 캡슐화된 후의 플루오레세인(녹색) 표지 포로젠의 형광 현미경 사진이다. 도 1d는 표준 하이드로겔(청색 막대) 또는 기공 형성 하이드로겔(적색 막대)의 탄성률 측정을 예시하는 막대 그래프이다. 0일째, 기공 형성 복합체와 표준 하이드로겔의 전체 강성률(rigidity)에 있어서 통계적으로 유의적인 차이는 없었는데, 그 이유는 기공이 형성되지 않았기 때문이다. 그러나, 4일 후, 복합체의 모듈러스가 기공 형성으로 인해 상당히 떨어졌다. 도 1e는 전체적으로 온전한 네트워크를 보여주는 형성 직후(0일), 제조 5일 후, 또는 제조 10일 후(이 시점에 유의적인 기공 형성이 관찰되었다)의 기공 형성 하이드로겔을 도시하는 일련의 주사 전자현미경 사진이다. 도 1f 및 1g는 복합 재료(50% 포로젠 부피 비율)의 탄성률이 표준 하이드로겔(포로젠 없음)의 탄성률과 크게 다르지 않지만, 보이드(void)가 형성됨에 따라 복합체의 탄성률이 크게 떨어진다는 것을 확인시켜 준다. 1주째의 복합체 탄성률의 감소는 보이드 밀도에 상응하며, 낮은 포로젠 밀도에서는, 보이드 밀도와 복합체 탄성률의 감소 사이에 선형의 관계가 있다. 도 1h 및 1i는 복합체 재료(25% 포로젠 부피 비율)의 파괴 인성이 초기에는 포로젠이 없는 표준 하이드로겔의 파괴 인성과 유사하지만, 곧 초기 값의 비율로 감소한다는 것을 예시한다. 탄성률과 마찬가지로, 포로젠의 밀도에 따라 파괴 인성이 비선형의 형태이긴 하나 비례적으로 감소한다. 스케일 바: (B, C 및 E): 1 mm.
도 2는 시험관내에서의 중간엽 줄기 세포 전개를 예시하는 일련의 사진, 선 그래프 및 개략도이다. 구체적으로, 도 2는 시험관내에서의 기공 형성 하이드로겔로부터의 줄기 세포 방출을 보여주며, 또한, 방출이 포로젠의 조성과 벌크에 대한 포로젠 내의 세포의 구획화를 변경하는 것에 의해 조정될 수 있음을 보여준다. 도 2a는 모세관 어세이로 측정한 상호연결된 보이드 형성의 키네틱(kinetic)을 보여주는 선 그래프이다(오차 막대는 평균의 표준 오차이다, n = 3∼4). 매우 높은 비율의 포로젠이 존재하지 않았다면(삼투 한계 80% 초과), 상호연결된 보이드가 처음 7일에 걸쳐 형성되었다. 삼투 포로젠 밀도 이하에서는 실질적인 상호연결된 보이드 형성이 관찰되지 않았다. 도 2b는 기공 형성 하이드로겔 전체에 분포된 칼세인-AM 염색 세포의 3차원 재구성을 보여주는 일련의 개략도 및 사진이다. 세포 모폴로지에 있어서의 실질적인 변화는 세포가 기공 형성 하이드로겔 내에서는 이동하고 증식할 수 있는 반면, 세포가 표준 하이드로겔 내에서는 드문드문 둥글게 유지되어 있음을 보여준다. 표준 하이드로겔에 비해 기공 형성 하이드로겔 내에서, Ki-67 면역형광(녹색)은 증가된 증식을 나타낸 한편, 핵 대비염색(Hoescht, 청색)은 더 큰 세포충실도(cellularity)를 나타낸다. 도 2c는 기공 형성 하이드로겔 내에서 보이드 형성이 세포충실도 및 세포 모폴로지에 미치는 영향을 보여주는 형광 현미경 사진 세트이다. 구체적으로, 기공 형성 하이드로겔의 형광 현미경 사진을 생 중간엽 줄기 세포(MSC)(칼세인-AM, 녹색) 또는 사 세포(에티듐 호모다이머, 적색)에 대해 시험관내에서의 4∼10일 후 염색하였다. 구형의 세포 모폴로지는 나노다공성 재료 내에 갇힌 세포를 나타내며, 양 재료에서 짧은 시간 프레임에 존재하지만, 표준 하이드로겔에서만 더 긴 시간 프레임에 걸쳐 존재한다. 도 2d는 포로젠 부피 밀도의 함수로서의 12일 후에 방출된 MSC의 누적수를 보여주는 선 그래프이다. 도 2e는 벌크상, 기공 형성 스캐폴드의 포로젠상, 또는 표준 하이드로겔로 캡슐화된 MSC에 대한 전개의 키네틱을 예시하는 선 그래프 및 개략도이다. 포로젠은 7.5% 산화 알기네이트로 제조하였고 100 mM CaCl2 중에서 가교결합시켰다. 도 2f는 포로젠으로 캡슐화된 D1 세포에 대한 포로젠 제조 조건의 함수로서의 기공 형성 하이드로겔의 포로젠상으로부터의 MSC 전개의 키네틱을 보여주는 선 그래프이다. 도 2g는 3H-티미딘 도입의 정량적 분석이 RGD 의존적 방식으로 증대된 세포 증식을 나타낸다는 것을 보여주는 막대 그래프이다. 도 2h는 알기네이트 산화도가 세포 방출에 미치는 영향을 보여주는 일련의 선 그래프이다. 포로젠을 가교결합시키기 위한 일정한 칼슘 수준(100 mM)에서, 3∼7.5%로부터 산화도를 증가시키자 방출된 세포의 총수가 크게 증가한 반면, 산화도를 낮추자 세포 방출이 약간 지연되었다. 일정한 정도의 포로젠 산화도(7.5%)에서, 25∼100 mM로부터 포로젠을 가교결합시키는 데 사용되는 칼슘의 농도를 증가시키자 방출된 세포의 총수가 감소되었고 세포 방출의 개시가 약간 지연되었다. 스케일 바: (A): 100 ㎛.
도 3은 생체내에서의 중간엽 줄기 세포 전개, 생착 및 증식을 제어하는 결과를 보여주는 일련의 사진 및 선 그래프이다. 구체적으로, 도　3은 누드 마우스의 피하 공간 내의 생체내에서의 기공 형성 하이드로겔로부터의 줄기 세포 방출을 보여준다. 도 3a는 표준 하이드로겔(왼쪽), 포로젠이 100 mM CaCl2(중간) 또는 식염수(오른쪽)에 의해 가교결합된 기공 형성 하이드로겔 내에 넣어 주사한 지 7일 또는 30일 후의 2 x 106개의 mCherry 발현 MSC가 전개된 누드 마우스의 대표적인 이미지를 보여주는 사진이다. 하이드로겔의 벌크 성분을 2 RGD/폴리머 사슬로 변경하였다. 초기에는, 더 많은 세포가 식염수 단독 조건에서 생착하였으나, 시간이 더 지난 시점에는, 이 조건에서는 세포가 거의 없었고, 기공 형성 하이드로겔로부터 방출되었을 때 실질적으로 더 많은 세포가 궁극적으로 생착하였다. 도 3b는 기공 형성 하이드로겔, 표준 하이드로겔, 또는 식염수 중에서 주입된 mCherry-MSC의 상대 방사 효율(radiant efficiency)(세포 밀도에 비례함)의 정량을 보여주는 선 그래프이다. 도 3c는 포로젠을 가교결합시키는 데 사용되는 칼슘의 밀도를 감소시키는 것이 방출된 세포의 총 밀도를 상당히 감소시켰고, 전개 키네틱을 약간 지연시켰다는 것을 보여주는 선 그래프이다(오차 막대는 SEM, n = 4∼6). 도 3d는 인간 중간엽 줄기 세포를 증강시킬 수 있는 기공 형성 하이드로겔의 능력이 누드 랫트 두개골 결손 모델을 이용한 골재생을 매개하였다는 것을 보여주는 일련의 사진이다. 임계적 크기의 결손이 누드 랫트(Charles River)의 두개골 내에 형성되었다. 결손 형성 직후, 상업적으로 입수 가능한 인간 중간엽 줄기 세포(Lonza)를 식염수("세포 단독"), 표준 하이드로겔(2 RGD/알기네이트 폴리머, 60 kPa), 또는 기공 형성 하이드로겔 내에 넣어 결손 공간에 이식하였다. 이식한 지 4주 후 두개골 결손 내의 새로운 골 형성의 미세전산화 단층촬영술 분석의 대표적인 횡단면. 세포가 기공 형성 하이드로겔을 통해 전달된 결손 부위에서 실질적으로 더 많은 골이 형성되었다.
도 4는 상이한 시점에 상이한 집단을 방출시키기 위해 기공 형성 하이드로겔을 사용하는 것을 도시하는 일련의 현미경 사진이다. 도 4a∼도 4c는, 포로젠을 형성하는 데 사용되는 화학물질을 변경하고 초기에 상이한 세포 유형을 상이한 구획에 배치한, 기공 형성 하이드로겔 내에서의 4일 간의 배양 후 조직 배양 플라스틱에 부착하는 GFP 발현 근아세포 및 증식 내피세포(OEC)의 형광 현미경 사진이다: (도 4a): 비드 성분 중의 근아세포, 포로젠 성분 중의 OEC; (도 4b): 비드 성분 중의 근아세포, 포로젠 성분 중의 OEC; (도 4c): 벌크 성분 중의 근아세포 및 OEC 둘 다. 도 4d는 동일한 수의 GFP-근아세포 및 OEC를 시딩한 플라스틱 기재 상의 대표적인 현미경 사진이다. 근아세포는 OEC를 성장시켰다. 세포를 에티듐 호모다이머(적색)로 염색하였으며, 이로써 GFP-근아세포는 황색으로 보였고 OEC는 적색으로 보였다. 10x 확대배율에서 찍은 이미지.
도 5는 케모카인 매개 세포 동원을 위해 기공 형성 하이드로겔을 사용하는 것을 도시하는 일련의 현미경 사진이다. 구체적으로, 도 5는 생체내에서 기공 형성 하이드로겔에 의해 케모카인 매개 세포 동원을 제어하는 것을 도시한다. 먼저 알기네이트를 산화시킨 후, 나트륨 보로하이드라이드로 환원시켜서 알코올 기를 만들며, 이것이 원래 당이었던 것을 치환한다. 도 5a 및 5b는 (도 5a) 표준, 주사 가능한 알기네이트 겔 및 (도 5b) 기공 형성 하이드로겔로의 수지상 세포의 동원을 보여주는 형광 현미경 사진이다. 두 세트의 하이드로겔에 2 pg의 과립구/대식세포 콜로니 자극 인자를 로딩하였다. 도 5c 및 5d는 (도 5c) 산화 또는 (도 5d) 환원 포로젠으로 제조한 기공 형성 하이드로겔로의 수지상 세포의 동원을 보여주는 형광 현미경 사진이다. 케모카인은 첨가하지 않았다. 조직학적 분석을 위해, 수지상 세포를 CD11c(녹색) 및 NIHC-II(적색)에 대해, Hoescht 핵 대비염색(청색)으로 염색하였다. 도 5c 및 도 5에서는, 단지 핵 염색(백색)만 수행되었다. 이 도면은 산화 알기네이트로부터 형성된 포로젠을 사용한 재료에 의한 숙주 세포 동원과, 환원 알기네이트를 사용한 경우의 숙주 세포 동원에 있어서의 차이를 보여준다. 스케일 바: 10 pm.
도 6은 벌크상 조성물을 변경시키는 것에 의한 기공 형성 하이드로겔 내에서의 줄기 세포 증식, 하이드로겔로부터의 전개 및 골 재생 능력의 제어를 보여주는 일련의 선 그래프, 막대 차트 및 사진이다. 도 6a 및 도 6b는 중간엽 줄기 세포에 의한 24 시간 3H-티미딘 도입(DNA 합성에 비례함)의 분석(D1; 적색 곡선) 또는 (도 6a) 60 kPa 탄성률을 갖는 벌크 겔 내에서의 RGD 펩티드의 밀도 또는 (도 6b) 10 RGD 펩티드/알기네이트 폴리머를 나타내는 벌크 하이드로겔의 탄성률의 함수로서의 배양 7일 후의 기공 형성 하이드로겔로부터의 누적 MSC 전개(청색 곡선)를 보여주는 선 그래프이다(데이터는 평균 ± SEM, n = 3∼5). RGD 밀도는 세포 증식에 현저한 영향을 미친 반면, 탄성률은 중식과 방출에 영향을 미쳤다(p < 0.05, ANOVA). 도 6c는 기공 형성의 함수로서의 DNA 합성의 분석을 보여주는 막대 그래프이다. 도 6d는 배양 50일 후의 동결절편 기공 형성 하이드로겔에서의 D1 세포 내의 Ki-67(증식 마커, 녹색)에 대한 염색을 보여주는 일련의 사진이다. 도 6e 및 6f는 생체내에서의 중간엽 줄기 세포 전개, 생착 및 증식의 제어를 보여주는 막대 그래프이다. 도 6e는 벌크상이 알기네이트 폴리머당 2(◆), 또는 10(■) RGD 펩티드로 변형된 기공 형성 하이드로겔에 넣어 주입된 mCherry-MSC의 상대 방사 효율(세포 밀도에 비례함)의 정량을 보여주는 선 그래프이다. 대안적으로, 세포를 2 RGD 펩티드/알기네이트 폴리머(▲)를 갖는 표준 하이드로겔에 넣어 주입하였다. 도 6f는 MSC 전달 방법의 함수로서의 치유 비율(%)(두개골 결손 누드 랫트로 이식된 인간 MSC로 인한 새로운 뼈 형성)의 정량을 보여준다. 오차 막대는 SEM, n = 4∼6.
도 7은 이원성 알기네이트로부터 형성된 하이드로겔의 시험관내 분해 및 기계적 특성을 보여주는 일련의 선 그래프 및 바 빈도 차트이다. 도 7a 및 7b는 비변형 고분자량 알기네이트에 의해 20 mg/mL의 일정한 밀도로 산화 알기네이트(이론적 산화도 5%)의 이원성 조합을 가교결합시킴으로써 형성한 벌크 하이드로겔의 탄성률(도 7a) 및 분해(도 7b)를 도시한다. 분해는, 초기 건조 질량에, 시험관내에서의 4일 후의 건조 질량을 비교함으로써 평가하였다. 도 7c는 20 mg/mL의 산화 알기네이트와 7.5 mg/mL의 비변형 알기네이트의 이원성 혼합물로부터 형성된 포로젠 직경의 히스토그램이다. 포로젠 직경은 아미노플루오레세인 표지 알기네이트로부터 제조된 포로젠의 형광 현미경 사진을 처리함으로써 측정하였다. 오차 막대는 SD, n = 3∼4.
도 8은 이식된 프로제니터 세포를 활성화시켜 증식시키고 이들이 손상된 조직으로 이동하여 재생에 참여하는 세포로 분화되도록 프로그래밍한다는 점에서 줄기 세포의 지위의 특정한 측면을 모방하는 이식 가능한 생체재료의 개략도이다.
도 9는, 특정한 단서의 제시를 통해 이식된 세포의 운명을 제어하지만, 이식된 세포가 재료 밖으로 이동하거나 숙주 세포가 재료 안으로 이동하는 것을 방지하는, 하이드로겔 스캐폴드의 개략도(왼쪽 상단)이다. 아래에는, 중간엽 줄기 세포의 운명을 제어하는(이 경우, 탄성률을 통해) 나노다공성 하이드로겔의 능력을 보여주는 실시예 데이터가 있다. 오른쪽 상단: 특정한 단서의 제시를 통해 이식된 세포의 운명을 제어하는 한편, 숙주 세포가 재료 내로 이동하거나 이식된 세포가 재료 밖으로 이동하는 것을 방지하는 매크로다공성 해면의 개략도.
도 10은 매크로다공성 하이드로겔을 제조하기 위한 대안적 전략을 도시하는 일련의 이미지이다. 개략도(중간, 왼쪽)에 도시된 바와 같이, 포로젠은 "벌크" 하이드로겔로 임베딩되거나, 벌크 하이드로겔의 비가교결합 영역이 제공되로록 포토리쏘그래피 기법이 적용된다. 벌크 하이드로겔을 가교결합한 후, 하이드로겔 및 포로젠의 비가교결합 부분을 아세톤과 같은 용매를 사용하여 제거한다. 왼쪽: 매크로다공성 하이드로겔의 이미지.
도 11은 빠르게 분해하는 알기네이트에 기초한 하이드로겔 포로젠을 생성하기 위한 전략법을 도시하는 개략도 및 막대 차트이다. 상단 왼쪽: NaIO4를 사용하여 알기네이트를 알기네이트 디알데하이드로 산화시키기 위한 화학 반응식. 상단 오른쪽: 알기네이트의 가교결합 가능한 굴루론산 풍부 부분의 손실(짧은 직선 세그먼트) 및 과요오드산나트륨 산화로 인한 폴리머 분자량의 전체적인 감소를 도시하는 개략도. 아래쪽: 20 mg/mL의 비변형 알기네이트(사각형), 20 mg/mL의 알기네이트 디알데하이드(산화도: 5%; 다이아몬드) 또는 20 mg/mL의 알기네이트 디알데하이드와 7.5 mg/mL의 비변형 알기네이트의 이원성 혼합물(삼각형)로부터 제조된 하이드로겔로부터의 시간 경과에 따른 건조 질량 손실을 도시하는 데이터.
도 12는 포로젠 제조 및 특성부여를 예시하는 개략도이다.
도 13은 기공 형성 하이드로겔에 의한 숙주 세포 동원의 제어를 보여주는 개략도이다. 특히, 이 도면에는, 감염의 미세환경을 모방하여, 잠재적 항종양 반응에 참여하도록, 활성화된 항원 제시 수지상 세포를 림프절로 동원, 프로그래밍 및 후속 타겟팅하도록 하는 이식 가능한 생체재료 시스템의 개략도가 도시되어 있다.
도 14는 포로젠상을 포함하도록 사용된 폴리머가 어떻게 포로젠의 분해 및 처리에 영향을 주는지를 보여주는 일련의 현미경 사진이다. 구체적으로, 이 도면에는, 플루오레세인 표지 알기네이트 디알데하이드를 사용하여 형성한 포로젠의 형광 현미경사진이 도시되어 있다. 100 mM의 CaCl2 중에서의 가교결합 직후(상단), 포로젠은, 20 mg/mL의 알기네이트 디알데하이드(상단 왼쪽)를 사용하든지 20 mg/mL의 알기네이트 디알데하이드와 7.5 mg/mL의 비변형 알기네이트의 혼합물을 사용하든지 간에 전체적으로 온전한 상태로 있다. 그러나, 포로젠을 정제하고 과잉 CaCl2를 제거하기 위해 사용된 처리 단계 후, 순수하게 알기네이트 디알데하이드에 의해 제조된 포로젠은 손상되었고, 그 결과 플루오레세인 표지 폴리머의 모폴로지 및 방출에 상당한 변화가 초래되어 상당한 수준의 백그라운드 플루오레세인 형광을 생성하였다(왼쪽 아래). 대조적으로, 20 mg/mL의 알기네이트 디알데하이드와 7.5 mg/mL의 비변형 알기네이트의 이원성 혼합물은 처리 단계를 견딜 수 있는 포로젠을 생성하였다.
최근 수십년 동안, 세포 이식을 위한 캐리어로서의 역할을 하는 스캐폴드를 형성하거나 숙주 세포 집단을 디바이스로 동원하기 위해 생체적합성 폴리머가 사용되어 왔다. 일반적으로, 해면, 예컨대 폴리(락티드-코-글리콜리드)(PLGA), 또는 합성 하이드로겔, 예컨대 알기네이트가 사용된다. 그러나, 두 세트의 재료 모두 단점을 갖고 있다. 예를 들어, 해면은 일반적으로 혈청 단백질을 흡수하기 때문에, 재료로부터 부착성 단백질 또는 펩티드(예를 들어, RGD)의 제시를 제어하기가 어렵다. 해면 재료는 또한 일반적으로 주사에 적합하지 않고, 이식을 위해 침습성 수술을 요하며, 또한 이식된 세포 또는 숙주 세포를 초기에는 유해할 수 있는 숙주 환경(예를 들어, 염증이 형성되는 동안 존재하는 호중구가 줄기 세포를 공격할 수 있다)에 노출시킨다. 그 반면, 합성 하이드로겔인 일반적으로 주사가 가능해서, 최소 침습으로 전달이 가능하고, 단백질과 상호작용하지 않는다. 그러나, 본원에 기재된 발명 이전에, 하이드로겔 내의 기공 크기는 일반적으로 진핵생물 세포의 직경보다 훨씬 더 적어서, 이식된 세포 집단을 증식시키거나 이식된 세포를 방출시켜 이들이 손상된 조직을 수복하도록 하거나 숙주 세포를 디바이스 내로 동원하는 것을 어렵게 한다.
본 발명은 하이드로겔 주사 후 하이드로겔 내의 계내에서 기공을 형성하는 방법을 포함한다. 기공은 둘러싼 하이드로겔 내에 캡슐화된 희생 포로젠의 분해를 통해 계내에서 형성된다. 기공 형성의 키네틱 및 개시는 포로젠을 형성하는 데 사용된 재료를 조작함으로써 제어하고, 세포는 포로젠 그 자체 또는 이들을 둘러싼 하이드로겔로 캡슐화한다. 실시예는 줄기 세포의 시험관내 전개, 증식 및 분화뿐만 아니라 생체내 줄기 세포 전개 및 케모카인 매개 세포 동원을 입증한다. 이 시스템은 폴리머 매트릭스 내에서의 기공의 형성을 통해 폴리머 매트릭스 밖으로 세포의 제어된 전개 또는 폴리머 매트릭스 안으로의 제어된 국소적 세포 동원을 매개한다. 기공의 크기, 분포 및 형성 키네틱은 사용자에 의해 미리 결정되는 반면, 기공을 둘러싼 매트릭스의 완전성과 이 매트릭스 내에서의 세포 또는 생물학적 인자는 변화되지 않는다.
따라서, 본원에서는 1) 주사 가능하고; 2) 사용자가 불용성 단서(insoluble cue)를 이용하여 세포 운명을 제어할 수 있도록 하고; 3) 시간이 경과함에 따라 기공을 형성하여 세포를 전개 또는 동원하는 재료를 생성하기 위해 하이드로겔 부착 리간드 제시 및/또는 탄성률(즉, 강성)와 같은 불용성 단서를 사용하는 것에 관해 기재한다. 구?l거으로, 본원에 기재된 방법은 세포가 기공 형성 상(이하에서는, "포로젠"이라 칭함) 또는 분해하지 않거나 천천히 분해하는 상(이하에서는, "벌크"라 칭함) 내로 캡슐화되도록 하는 방법을 이용하여 기공 형성 하이드로겔을 생성한다.
본 발명은 세포 캡슐화를 가능하게 하는 기공 형성 하이드로겔을 생성하기 위한 일반화된 접근법 및 하이드로겔 밖으로의 세포 전개 또는 하이드로겔 내로의 세포 동원의 키네틱을 제어하기 위한 수단을 제공한다. 하이드로겔 바이크로비드 "포로젠"이 형성되어, 그 다음으로 제2의 "벌크" 하이드로겔 내로 캡슐화된다. 포로젠 및 벌크 하이드로겔을 형성하는 데 사용되는 폴리머의 조성은 변경될 수 있으나, 포로젠은 벌크 하이드로겔보다 더 빨리(예를 들어, 10%, 20%, 50%, 2X, 5X, 10X, 20X 또는 그보다 빨리) 분해되어야 한다. 세포 또는 생물활성 인자(예를 들어, 성장 인자, 예컨대 과립구/대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF), 혈관 내피세포 성장 인자(VEGF), 압축 올리고뉴클레오티드, 예를 들어, CpG, 또는 플라스미드 DNA)가 경우에 따라 포로젠상, 벌크 하이드로겔상, 또는 두 상 모두로 캡슐화된다. 포로젠은 사용자가 미리 정한 시간 코스에 따라 계내에서 분해되고, 이 시점에 세포는 방출되거나, 또는 재료 내로 이동할 수 있다. 그러나, 기공 형성 하이드로겔은 초기에는 기공이 없기 때문에, 이 하이드로겔은 형성 직후 기계적 지지체를 제공하는 데 유용하다(도 1).
세포 방출 또는 동원은 포로젠 분해의 키네틱을 제어함으로써 조작한다. 예를 들어, 알기네이트 폴리머를 산화시켜 알기네이트 디알데하이드를 생성하며, 방출된 세포의 총수는 산화도가 증가함에 따라 증가한다(도 2, 도 3). 대안적으로, 포로젠을 가교결합시키기 위해 사용되는 조건은 유의적인 포로젠 분해 및 세포 방출이 발생하기 시작하는 시점을 조작하도록 변경된다(도 2). 숙주 단백질과의 상호작용을 촉진하거나 억제하기 위해 포로젠 화학작용을 추가로 변경시킬 수 있다(도 5).
세포 방출 및 세포 운명은 벌크 하이드로겔의 생물물리적 및 생화학적 특성(예를 들어, RGD)와 같은 인테그린 결합 부착 펩티드의 탄성률과 밀도)을 조작함으로써 제어한다. 예를 들어, 기공 형성, 벌크 하이드로겔 RGD 밀도 및 벌크 하이드로겔 탄성은 모두 이들 재료 내에서의 세포 증식에 영향을 준다(도 2, 도 6). 서로 분리된 포로젠 및 벌크의 오쏘고날 처리(orthogonal processing)는 세포 방출 및 세포 운명을 조작할 수 있도록 시스템을 조정하는 능력을 증대시킨다. 예를 들어, 줄기 세포 계통 연루는 기공 형성의 키네틱에 관계 없이 탄성률 또는 RGD 밀도를 변경하는 것에 의해 조절된다. 대조적으로, 매크로다공성 재료를 형성하는 데 이용되는 다른 기법(예를 들어, 포로젠의 용매에 기초한 추출)은 세포 캡슐화와 양립될 수 없으며, 일반적으로 포로젠상과 벌크상 둘 다의 물리적 특성에 영향을 미친다. 빠르게 분해하는 벌크 하이드로겔 재료의 물리적 특성 및 생화학적 특성은 분해가 진행됨에 따라 지속적으로 변화된다. 이들 파라미터는 세포 운명을 조절하기 위해 벌크상을 디자인하는 데 이용된다.
하이드로겔 조성물
하이드로겔은 친수성인 폴리머 사슬의 네트워크를 포함한다. 하이드로겔(아쿠아겔이라고도 칭함)은 종종 물이 분산매인 콜로이드 겔로서 존재한다. 하이드로겔은 흡수성이 큰(하이드로겔은 99.9%의 물을 함유할 수 있음) 천연 또는 합성 폴리머이다. 하이드로겔은 또한 이것의 유의적인 수함량으로 인해 천연 조직과 매우 유사한 유연도를 보유한다. 하이드로겔은 가교결합된 폴리머를 포함한다. 예시적인 하이드로겔은 세포 캡슐화와 양립할 수 있는 재료, 예컨대 알기네이트, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), PEG-아크릴레이트, 아가로스 및 합성 단백질(예를 들어, 콜라겐 또는 조작된 단백질(즉, 자기 조립 펩티드에 기초한 하이드로겔)를 포함한다. 예를 들어, 상업적으로 이용 가능한 하이드로겔은 BD™ PuraMatrix™ 펩티드 하이드로겔을 포함하며, 이것은 세포 배양을 위한 한정된 3차원(3D) 미세환경을 생성하기 위해 사용되는 합성 매트릭스이다.
예를 들어, 하이드로겔은 전체적으로 또는 부분적으로 생분해 가능한 생체적합성 폴리머 매트릭스이다. 하이드로겔을 형성할 수 있는 재료의 예로는 알기네이트 및 알기네이트 유도체, 폴리락트산, 폴리글리콜산, 폴리(락틱-코-글리콜산)(PLGA) 폴리머, 젤라틴, 콜라겐, 아가로스, 천연 및 합성 다당류, 폴리아미노산, 예컨대 폴리펩티드, 특히 폴리(리신), 폴리에스테르, 예컨대 폴리하이드록시부티레이트 및 폴리-엡실론-카프로락톤, 폴리안하이드라이드; 폴리포스파진, 폴리(비닐 알코올), 폴리(알킬렌 옥시드), 특히 폴리(에틸렌 옥시드), 폴리(알릴아민)(PAM), 폴리(아크릴레이트), 변성 스티렌 폴리머, 예컨대 폴리(4-아미노메틸스티렌), 플루로닉 폴리올, 폴리옥사머, 폴리(우론산), 폴리(비닐피롤리돈), 및 그래프트 코폴리머를 비롯한 상기한 것들의 코폴리머를 포함한다. 콜라겐, 피브린, 하이알루론산, 아가로스 및 라미닌 풍부 겔을 들 수 있으나 이들에 한정되지 않는 합성 폴리머 및 천연 폴리머도 사용될 수 있다.
하이드로겔에 바람직한 재료는 알기네이트 또는 변성 알기네이트 재료이다. 알기네이트 분자는 (1-4)-결합 β-D-만누론산(M 단위) 및 α L-굴루론산(G 단위) 모노머로 이루어지며, 이 모노머는 폴리머 사슬을 따라 그 비율 및 순차적 분포가 다를 수 있다. 알기네이트 다당류는 2가 양이온(예를 들어, Ca+2, Mg+2, Ba+2)에 대한 강한 친화력을 가지고 이들 분자에 노출될 때 안정한 하이드로겔을 형성하는 고분자전해질 시스템이다.
합성 하이드로겔은 일반적으로 주사가 가능하고 최소 침습성 전달을 가능하게 하며 단백질과 상호작용하지 않는다. 따라서, 부착 단백질 또는 펩티드의 제시가 정확히 제어된다. 또한, 합성 하이드로겔은 일반적으로 세포보다 훨씬 더 작은 기공 메쉬 크기를 가지며(< 10 nm, 반면 세포는 > 10 ㎛), 이는 숙주 세포가 이식된 세포를 공격하는 것을 막는다. 그러나, 이러한 작은 기공 크기는 이식된 세포가 재료 내에서 광범위하게 증식하는 것을 막기도 하고, 또 세포가 궁극적으로 방출되어 다양한 기능(예를 들어, 기능성 조직의 재생 또는 병든 조직의 파괴)에 영향을 미치는 것을 막는다.
하이드로겔과 해면의 바람직한 특징을 결합하기 위해 여러 기법이 도입되었다. 예를 들어, 강성 마이크로구를 하이드로겔로 캡슐화하고, 그 후 용매(예를 들어,아세톤)로 추출하여 매크로다공성 하이드로겔을 남기고, 동결건조를 적용하여 매크로다공성 하이드로겔을 생성하였다. 하이드로겔이 생체내에서 신속히 분해되어 숙주 세포를 방출하도록 변형시킬 수 있다. 그러나, 본원에 기재된 발명 이전에, 어떠한 접근법도 비분해성(또는 천천히 분해하는) 재료와 세포 캡슐화의 결합을 가능하지 못하였다. 하이드로겔 재료의 기계적 특성과 생화학적 조성은 세포 운명에 큰 영향을 미쳐서, 분해 그 자체가 세포 운명을 본질적으로 조절할 수 있다.
기공 형성 조성물
하이드로겔 마이크로비드("포로젠")를 형성한다. 그 후, 포로젠을 비분해성이거나 포로젠에 비해 느린 속도로 분해되는 "벌크" 하이드로겔로 캡슐화한다. 경우에 따라 세포를 포로젠 또는 벌크 구획으로 캡슐화한다. 하이드로겔 형성 직후 또는 생체내의 원하는 곳에 주사한 직후에는, 복합 재료에는 기공이 없고 외과적 팽화제로서 작용한다. 그 후, 포로젠이 분해되어 계내에 기공을 형성시키고, 캡슐화된 세포는 복합 재료로부터 떨어져 신체 내의 주변 조직 또는 원거리의 조직, 예를 들어 림프절로 전개된다. 기공의 크기 및 분포는 포로젠 형성 및 벌크 하이드로겔을 형성하는 폴리머와의 혼합 과정에서 제어된다.
대안적으로, 하이드로겔을 캡슐화된 세포 없이 주사하며, 기공 형성은 벌크 또는 포로젠 성분으로부터 방출된 케모카인과 함께 또는 이와는 독립적으로 숙주 세포를 동원하기 위한 수단으로서 이용된다. 포로젠은, "벌크" 하이드로겔을 형성하는 데 사용되는 재료보다 더 빨리 분해되고, 초기에는 벌크 하이드로겔상을 형성하는 폴리머와 혼합되는 것을 견디기에 충분히 기계적으로 안정하다. "벌크"는 임의의 하이드로겔 형성 폴리머로 이루어진다.
알기네이트 조성물
조성물 및 방법에 이용되는 폴리머는 천연 폴리머이거나 합성에 의해 제조된 폴리머이다. 한 예에서, 포로젠과 벌크 하이드로겔이 둘 다 알기네이트로부터 형성된다. 여기서 사용되는 "알기네이트"란 용어는 알긴산의 임의의 수의 유도체(예를 들어, 칼슘, 나트륨 또는 칼륨 염, 또는 프로필렌 글리콜 알기네이트)를 의미한다. 예를 들어, 본원에서 참고로 포함하는 PCT/US97/16890을 참조할 수 있다.
포로젠 형성에 적합한 알기네이트 폴리머는 달톤 분자량이 5,000∼500,000 Da이다. 이 폴리머는 신속한 분해를 촉진하기 위해 경우에 따라(예를 들어, 과요오드산나트륨에 의한 산화에 의해(Bouhadir et al., 2001, Biotech. Prog. 17:945-950, 본원에 참고로 포함됨) 추가로 변형된다. 이하에 기재하는 예에서, 폴리머를 2가 양이온(예를 들어, Ca2+ 또는 Ba2+) 배쓰로의 동축 공기흐름을 갖는 네블라이저를 통한 압출에 의해 가교결합시켜 하이드로겔 마이크로비드를 형성하였다. 공기흐름 속도가 빠를수록 포로젠 직경은 작아진다.
포로젠을 형성하는 데 사용되는 2가 이온의 농도는 5∼500 mM로 다양할 수 있으며, 폴리머의 농도는 1 중량%∼5 중량%로 다양할 수 있다. 그러나, 벌크상보다 현저히 더 작은 포로젠을 제조하는 임의의 방법이 적합하다. 숙주 단백질 및 세포와 약간의 상호작용을 하는 포로젠을 제조하거나(예를 들어, 당 잔기의 5%를 초과하는 정도까지 산화된 알기네이트는 숙주 세포와 유의적으로 상호작용한다, 도 5),이러한 상호작용을 억제하기 위해(예를 들어, NaBH4에 의해 환원된 산화 알기네이트는 단백질 또는 숙주 세포와 최소한의 상호작용을 나타낸다, 도 5) 추가로 조작될 수 있다.
벌크 하이드로겔의 형성에 적합한 알기네이트 폴리머는 5,000∼500,000 Da의 달톤 분자량을 갖는다. 폴리머는, 벌크 하이드로겔이 포로젠보다 더 천천히 분해되는 한, 분해를 촉진하도록 추가로 변형될 수 있다(예를 들어, 과요오드산나트륨에 의한 산화에 의해). 폴리머는 또한 세포 반응을 제어하기 위해 생물학적 단서(예를 들어, 인테그린 결합 부착 펩티드, 예컨대 RGD)를 제시하도록 변형될 수 있다. 포로젠 또는 벌크 하이드로겔은 또한 세포 반응을 추가로 제어하기 위해 생물활성 인자, 예컨대 올리고뉴클레오티드, 성장 인자 또는 약물을 캡슐화할 수 있다. 벌크 하이드로겔을 형성하는 데 사용되는 2가 이온의 농도는 5∼500 mM로 다양할 수 있으며, 폴리머의 농도는 1 중량%∼5 중량%로 다양할 수 있다. 벌크 폴리머의 탄성률을, 예를 들어, 캡슐화된 세포의 운명을 제어하기 위해 조정한다.
실시예 1: 하이드로겔 내의 계내에서 기공을 형성함
이미지화 및 기계적 특성 테스트를 통해 입증된 바와 같은 하이드로겔 내의 계내에서의 기공 형성이 도 1에 도시되어 있다. 도 1a에 도시된 바와 같이, 빠르게 분해 가능한 하이드로겔(적색 구)로 이루어진 마이크로비드를 제2 하이드로겔 형성 폴리머 재료와 혼합하였고, 이것은 비드를 둘러싸고 가교결합된다. 계내에서 마이크로비드가 분해된 후, 온전한 하이드로겔 네트워크(분홍)가 기공의 네트워크와 함께 유지되었다. 표준 하이드로겔(왼쪽 막대) 또는 기공 형성 하이드로겔(오른쪽 막대)의 탄성률을 측정하였다(도 1d). 0일째, 기공 형성 복합체와 표준 하이드로겔의 전체 강성률에 있어서 통계적으로 유의적인 차이가 없었는데, 그 이유는 기공이 형성되지 않았기 때문이다. 그러나, 4일 후, 복합체의 모듈러스는 기공 형성으로 인하여 크게 감소된다.
본원에 기재된 하이드로겔을 생성하는 데 적합한 추가적인 방법은 다음과 같다. Bouhadir 등의 문헌[Polymer 1999; 40: 3575-84](본원에 참고로 포함됨)은 과요오드산나트륨에 의한 알기네이트의 산화에 대해 기재하고, 반응을 특성화한다. Bouhadir 등의 문헌[Biotechnol. Prog. 2001; 17: 945-50](본원에 참고로 포함됨)은 알기네이트 디알데하이드를 형성하기 위한 고분자량 알기네이트의 산화(알기네이트 디알데하이드는, 알기네이트의 당의 특정 비율(예를 들어, 5%)이 산화되어 알데하이드를 형성하는, 고분자량 알기네이트임) 및 하이드로겔을 빠르게 분해시키기 위한 용도를 기재한다. Kong 등의 문헌[Polymer 2002; 43: 6239-46](본원에 참고로 포함됨)은 굴루론산(GA) 함량을 실질적으로 감소시키지 않고 GA 풍부 알기네이트의 중량 평균 분자량(Mw)을 감소시키기 위해 감마 방사선을 이용하는 것(예를 들어, 감마 방사선은 만누론산, 알기네이트의 MA 블록을 공격한다)에 관해 기재한다. 알기네이트는 GA 블록 및 MA 블록으로 이루어지고, GA 불록이 알기네이트에 그 강성률(탄성률)을 제공한다. Kong 등의 문헌[Polymer 2002; 43: 6239-46](본원에 참고로 포함됨)은 고분자량의 GA 풍부 알기네이트와 방사선 조사된 저분자량의 고 GA 알기네이트와의 이원성 조합물이 칼슘에 의하 가교결합되어 강성 하이드로겔을 형성하지만, 이것은 더 빠르게 분해되고, 또, 동일한 총 중량 농도의 고분자량의 GA 풍부 알기네이트 단독으로부터 제조된 하이드로겔보다 더 낮은 용액 점도를 갖는다는 것을 보여준다. Alsberg 등의 문헌[J Dent Res 2003; 82(11): 903-8](본원에 참고로 포함됨)은 방사선 조사된 저분자량 GA 풍부 알기네이트로부터 제조된 하이드로겔의 분해 프로필과, 골조직 공학에서의 용도를 개시한다. Kong 등의 문헌[Adv. Mater 2004; 16(21): 1917-21](본원에 참고로 포함됨)은 감마 방사선 조사법과 산화 반응을 조합함으로써 하이드로겔 분해 프로필을 제어하는 것과 연골 공학에의 적용을 개시한다.
하이드로겔 생체재료의 분해를 제어하기 위한 기법은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, Lutolf MP 등의 문헌[Nat Biotechnol.2003; 21: 513-8](본원에 참고로 포함됨)은 포유동물 효소(MMP)를 통해 분해되도록 조작된 폴리(에틸렌 글리콜)에 기초한 재료에 관해 기재한다. Bryant SJ 등의 문헌[Biomaterials 2007; 28(19): 2978-86 (US 7,192,693 B2; 본원에 참고로 포함됨)]은 매크로스케일의 기공을 갖는 하이드로겔을 제조하는 방법을 개시한다. 기공 템플릿(예를 들어, 폴리-메틸메타크릴레이트 비드)을 벌크 하이드로겔 내에 캡슐화하고, 그 후, 벌크 하이드로겔은 온전하게 남겨두면서 아세톤 및 메탄올을 사용하여 포로젠을 추출한다. Silva 등의 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci USA 2008; 105(38): 14347-52](본원에 참고로 포함됨; US 2008/0044900)은 알기네이트 해면으로부터의 내피 전구세포의 전개를 개시한다. 해면은 알기네이트 하이드로겔을 형성한 후 이를 동결건조시킴으로써(얼음 결정이 기공을 형성함) 제조한다. 이러한 재료는 (단독으로 전달된 세포에 비해) 세포의 치료 효과를 개선시키지만, 이들 재료는 외과수술로 이식하여야 하고(즉, 주사가 불가능함), 세포 캡슐화에 적합하지 않으며(동결건조되면 세포는 사멸함), 이러한 전략은 탄성률을 제어함으로써 세포 운명을 제어하는 것을 어렵게 한다. Ali 등의 문헌[Nat Mater 2009](본원에 참고로 포함됨)은 수지상 세포를 동원하여 이들이 항종양 반응을 유발하도록 프로그래밍하기 위해 다공성 스캐폴드를 사용하는 것에 관해 기재한다. Huebsch 등의 문헌[Nat Mater 2010; 9: 518-26](본원에 참고로 포함됨)은 캡슐화된 중간엽 줄기 세포의 분화를 제어하기 위해 하이드로겔 탄성률을 이용하는 것에 관해 기재한다.
본원에서는, 1) 주사가 가능하고; 2) 사용자가 불용성 단서를 이용함으로써 세포 운명을 제어할 수 있게 하고; 3) 세포를 전개 또는 동원할 수 있도록 시간이 경과함에 따라 기공을 형성하는 재료를 생성하기 위한 하이드로겔 부착 리간드 제시 및/또는 탄성률(즉, 강성률)과 같은 불용성 단서를 이용하는 것에 관해 개시한다. 특히, 본원에 기재된 방법은 세포가 포로젠 형성 상(이하에서는, "포로젠"이라 칭함) 또는 분해되지 않거나 천천히 분해되는 상(이하에서는, "벌크"라 칭함)으로 캡슐화되도록 하는 방법을 이용하여 기공 형성 하이드로겔을 생성한다. 본원에 기재된 방법에서는, 포로젠이 용매보다는 가수분해에 의해 분해되는데, 이는 세포가 포로젠 또는 이를 둘러싼 벌크 겔 내로 캡슐화되고, 겔 내로 캡슐화된 단백질 또는 다른 생물활성 화합물이 변성되는 기회가 거의 없다는 것을 의미한다.
이하에 더 상세히 기술하는 바와 같이, 포로젠은 캡슐화 중에 온전한 상태로 유지되었지만, 빠르게 분해되어 주사 전자현미경에 의해 식별가능한 기공을 형성하였으며, 그 결과 복합 재료의 탄성률과 파괴 인성의 손실이 초래되었다. 구체적으로, 주사 전자현미경 사진(SEM)은 기공 형성 하이드로겔이 형성 직후(0일) 전체적으로 온전한 네트워크를 보유하였지만, 제조 후 10일 경에, 현저한 기공 형성이 관찰되었음을 보여주었다(도 1e). 복합 재료의 탄성률(50% 포로젠 부피 비율)은 표준 하이드로겔의 탄성률과 크게 다르지 않았지만, 보이드가 형성됨에 따라, 복합 재료의 탄성률은 크게 감소한다(도 1f 및 도 1g). 1주째의 복합 재료의 탄성률 감소는 보이드 밀도에 상응하며, 낮은 포로젠 밀도에서는, 보이드 밀도와 복합 재료 탄성률 감소 간에 선형의 관계가 존재한다. 복합 재료의 파괴 인성(25% 포로젠 부피 비율)은 초기에는 포로젠이 없는 표준 하이드로겔의 파괴 인성과 유사하였지만, 이것은 초기 값의 비율로 감소한다(도 1h 및 1i). 탄성률과 함께, 파괴 인성도, 비선형의 형태이긴 하나, 포로젠의 밀도에 따라 비례적으로 감소한다. 이러한 결과들은 캡슐화 중에 포로젠이 온전하게 유지되고 계내에서 분해되어 보이드를 형성한다는 것을 입증한다.
실시예 2: 시험관내 및 생체내 세포 방출
골수 기질 줄기 세포(D1)와 함께 분해 가능한 알기네이트 포로젠을 고분자량 알기네이트 겔로 캡슐화함으로써 기공 형성 하이드로겔을 형성하였다. 20 mg/mL의 알기네이트 디알데하이드(이론적 산화도: 고분자량 고굴루론산 함량 알기네이트 내의 알기네이트 당 잔기의 7.5%)과 7.5 mg/mL의 고분자량 고굴루론산(GA) 함량 알기네이트의 이원성 혼합물로 포로젠을 형성하였다. 이 폴리머 혼합물을, 0.1 M의 CaCl2 및 0.1 M의 HEPES의 배쓰로의 동축 질소 공기흐름을 갖는 유리 네블라이저를 통해 압출시켜 폴리머를 가교결합시켰다. 포로젠을 무혈청 세포 배양 배지로 철저히 세척하였다. 알기네이트 폴리머당 2개의 RGD 펩티드로 변형시킨 20 mg/mL의 고분자량 고굴루론산 함량 알기네이트로 벌크 하이드로겔을 형성하였다. D1 세포와 포로젠을 시린지를 사용하여 벌크 하이드로겔 재료로 혼입하고, 그 후 복합 재료를 황산칼슘으로 가교결합시켰다. 시험관내에서 경시적으로 이 시스템으로부터 방출된 D1 세포의 수를 도 2에 도시하였다. 방출 키네틱은 1) 포로젠을 형성하는 데 사용된 CaCl2의 농도를 제어하고, 2) 포로젠의 조성(산화도)를 변경하고, 3) (포로젠 내 또는 벌크 겔 내에서의) 세포의 구획화를 변경함으로써 조정할 수 있다.
특히, 시험관내에서의 중간엽 줄기 세포 전개가 도 2에 예시되어 있다. 줄기 세포는 시험관내에서 기공 형성 하이드로겔로부터 방출되었고, 이 방출은 벌크에 비교한 포로젠 내에서의 세포의 구획화와 포로젠의 조성을 변경함으로써 조정할 수 있다. 포로젠 밀도(0∼80 부피%)가 세포충실도 및 기공 형성 하이드로겔로부터의 유출에 미치는 효과가 도 2c에 도시되어 있다. 특히, 시험관내에서 4∼10일 후 생 중간엽 줄기 세포(MSC)(칼세인-AM, 녹색) 또는 사세포(에티듐 호모다이머, 적색)에 대해 기공 형성 하이드로겔의 형광 현미경 사진을 염색하였다. 구형의 세포 모폴로지는 세포가 나노다공성 재료 내에 갇혀 있음을 나타내고, 양 재료에 있어서 짧은 시간 프레임에는 존재하지만, 더 긴 시간 프레임에서는 표준 하이드로겔에서만 존재한다. 포로젠 부피 밀도의 함수로서의 12일 후에 방출된 MSC의 누적수가 도 2d에 도시되어 있다.
도 2d에 도시된 바와 같이, 포로젠의 크기는 전체 복합 재료의 크기와 관련이 있다. 특히, 재료가 온전하게 유지되기 위해서는, 포로젠 직경이 전체 복합 재료의 최소 치수의 10% 미만이어야 한다. 포로젠의 밀도는 세포 동원과 세포 방출 둘 다에 있어서 전체 부피의 10∼80%이며, 예를 들어, 전체 부피의 15%∼75%, 20%∼70%, 25%∼65%, 30%∼60%, 또는 35%∼55%이다. 바람직하게는, 포로젠의 밀도는 전체 부피의 50% 이상이다.
상호연결된 보이드 형성의 키네틱 및 중간엽 줄기 세포 방출의 상응하는 키네틱을 측정하기 위해 물리적 및 시험관내 연구를 수행하였다(각각 도 2a 및 도 2e). 클론 유래의 상업적으로 입수 가능한 마우스 중간엽 줄기 세포주(D1)를 이들 시험관내 연구에 사용하였다. 보이드 형성을 측정하기 위해 모세관 어세이를 이용하였다. 요약하면, 먼저 완충제로 포화된 복합 기공 형성 겔을 칭량한 후 종이 타월로 겔 표면을 가볍게 눌러 물을 제거함으로써 상호연결된 보이드의 밀도를 측정하였다. 보이드 비율은 질량의 상대 변화에 기초하여 계산하였다. 시험관내 세포 방출 어세이의 경우, 기공 형성 하이드로겔의 벌크 성분을 2개의 RGD 펩티드/알기네이트 폴리머로 변형시켰으며, 60 kPa의 탄성률을 가졌다. 포로젠 비율이 매우 높지 않다면(삼투 한계 70% 초과), 처음 7일 동안 상호연결된 보이드가 형성되었다. 삼투 포로젠 밀도 이하에서는 실질적인 상호연결된 보이드 형성이 관찰되지 않았다. 포로젠으로 캡슐화된 D1 세포에 대한 포로젠 제조 조건의 함수로서의, 기공 형성 하이드로겔의 포로젠상으로부터의 MSC 전개의 키네틱은 도 2f에 예시되어 있다.
후속으로, 마우스 MSC 세포주를 사용하여 방출 연구를 수행하였다. 세포 방출은 전체 기공 밀도 및 세포 모폴로지에 있어서의 점진적인 변화에 비례하여 관찰되었는데, 이는 마이크론 스케일 구획의 손실을 반영한다. 기공 형성이 하이드로겔 내에서의 세포충실도와 세포 증식에 미치는 영향을 판단하기 위한 실험을 수행하였다. 세포충실도는 칼세인-AM 염색을 이용하여 정량적으로 측정하였고, 증식은 Ki-67 발현에 대한 면역염색에 의해 정성적으로 또는 3H-티미딘 도입을 측정함으로써 정량적으로 측정하였다. 기공 형성 하이드로겔 전체에 분포된 칼세인-AM 염색 세포의 3차원 재구성은 도 2b에 도시되어 있다. 세포 모폴로지에 있어서의 실질적인 변화는 세포가 기공 형성 하이드로겔 내에서 이동하고 증식할 수 있는 능력을 나타내는 반면, 세포는 표준 하이드로겔 내에서는 드문드문 구형으로 유지되었다. Ki67 면역형광은 표준 하이드로겔에 비해 기공 형성 하이드로겔 내에서의 더 큰 세포충실도 및 증가된 증식을 나타내었다. 3H-티미딘 도입의 정량적 분석은 RGD 의존적 방식으로의 향상된 세포 증식을 나타내었다(도 2g).
포로젠을 형성하는 데 이용되는 화학적 조성 또는 가교결합 조건을 변경하는 것이 세포 방출의 키네틱을 조절할 수 있는지를 확인하기 위한 연구를 수행하였다[Bouhadir KH, Lee KY, Alsberg E, Damm KL, Anderson KW, Mooney DJ. Degradation of Partially Oxidized Alginate and Its Potential Application for Tissue Engineering. Biotechnol. Prog. 2001; 17: 945-50). 도 2h는 세포 방출 키네틱이 포로젠 또는 이를 둘러싼 벌크 겔로의 세포의 구획화에 의해 제어되었으며, 더 낮은 농도의 칼슘에 의해 가교결합된 포로젠이 더 천천히 분해되어 더 나중 시점에 세포를 방출시킨다는 것을 보여준다. 포로젠 제조에 더 낮은 칼슘 농도를 이용할수록 더 균질한 가교결합이 얻어졌다.
포로젠 조성은 바꾸면서, 일정한 벌크 성분(2 RGD/폴리머, 60 kPa) 및 일정한 포로젠 밀도(50%)로 기공 형성 하이드로겔을 형성하였다. 포로젠의 화학적 조성은 알기네이트 폴리머의 이론적 산화도를 변경함으로써 조작하였다. 산화도는 산화 반응 중에 과요오드산나트륨 대 알기네이트의 비를 변경함으로써 제어하였다[Bouhadir 2001]. 20 mg/mL의 산화 알기네이트와 5 mg/mL의 비변형 고분자량 알기네이트의 이원성 혼합물을 포로젠을 형성하는 데 사용하였다. 포로젠은 25∼100 mM의 CaCl2의 배쓰에서 가교결합시켜 형성하였다. 세포 방출에 미치는 알기네이트 산화도의 영향은 도 2h에 도시되어 있다. 포로젠을 가교결합시키기 위한 일정한 농도(100 mM)에서, 3∼7.5%로부터 산화도를 증가시키자 방출된 세포의 총수가 증가한 반면, 산화도를 낮추자 세포 방출이 약간 지연되었다. 일정한 포로젠 산화도(7.5%)에서는, 25∼100 mM로부터 포로젠을 가교결합시키는 데 사용되는 칼슘의 농도를 증가시키자 방출된 세포의 총수가 감소되었고 세포 방출 개시가 약간 지연되었다.
실시예 3: 생체내에서의 중간엽 줄기 세포 전개, 생착 및 증식의 제어
마지막으로, 기공 형성 하이드로겔이 생체내에서 MSC의 방출 키네틱을 조작하기 위해 사용될 수 있는지를 확인하기 위해 생체내 연구를 수행하였다. 이를 위해, mCherry를 발현하는 마우스 MSC를 누드 마우스의 피하에 이식하였다. 세포 생착, 증식 및 전개를 비침습성 형고아 이미지화로 관찰하였다. 이는 기공 형성 겔이 식염수로 전달된 세포에 비해 생착을 지연시킬 뿐만 아니라 이 재료가 궁극적으로 더 많은 증식을 유도하였음을 보여주었다. 하이드로겔은 기공이 형성된 후 증식에 적합한 미세환경을 제공한다. 마지막으로, 이들 재료가 생체내에서 MSC 방출 및 증식을 촉진하는 데 유용하였기 때문에, 인간 MSC를 누드 랫트의 두개골 결손을 재생시키기 위해 투여하였다. 그 결과 이른 시점에도 불구하고 무기질화된 뼈의 재생이 개선되었다.
특히, 생체내 연구를 위해, 검출 가능한 마커, 예를 들어, mCherry 또는 녹색 형광 단백질(GFP)을 구성적으로 발현하도록 D1 세포를 조작하여, 포로젠이 없는 표준 벌크 겔 또는 기공 형성 하이드로겔로 캡슐화하거나, 식염수화 혼합하였다. IVIS 시스템(Caliper Life Sciences) 상에서 관찰된 mCherry 형광을 통해 시간 경과에 따른 세포 방출 및 증식을 모니터링하였다. 이러한 데이터는 표준 하이드로겔보다 기공 형성 하이드로겔로부터 유의적으로 더 많은 세포 방출과 증식이 일어났음을 나타내었다(도 3). 또한, 세포가 간단한 식염수 주사에 의해 전달될 경우에도 세포가 증식하였지만, 기공 형성 하이드로겔로부터의 전개는 1) 국소적 세포 전달 및 증식의 키네틱을 변경하였고, 2) 궁극적으로 전달된 세포의 수를 크게 증가시켰다(도 3).
특히, 포로젠의 조성을 변경함으로써 생체내에서의 세포 방출의 키네틱을 조작할 수 있는 능력을 확인하기 위한 실험을 수행하였다. 도 3에 도시된 바와 같이, 누드 마우스의 피하 공간 내의 생체내에서 기공 형성 하이드로겔로부터 줄기 세포가 방출되었다. 표준 하이드로겔(왼쪽), 포로젠을 100 mM 또는 50 mM CaCl2로 가교결합시킨 기공 형성 하이드로겔(중간) 또는 식염수(오른쪽) 중에서 주사한 후 7일 또는 30일째 2 x 106개의 mCherry 발현 MSC를 누드 마우스로 전개시켰다. 하이드로겔의 벌크 성분은 2 RGD/폴리머 사슬로 변형시켰다. 초기에는, 식염수 단독 조건에서 더 많은 세포가 생착하였으나, 더 나중의 시점에는 이 조건에서는 세포가 거의 없었고, 궁극적으로 기공 형성 하이드로겔로부터 방출될 때 실질적으로 더 많은 세포가 생착하였다. 기공 형성 하이드로겔, 표준 하이드로겔, 또는 식염수 중에서 주사된 mCherry-MSC의 상대 방사 효율(세포 밀도에 비례함)의 정량이 도 3b에 도시되어 있다. 포로젠을 가교결합시키는 데 사용되는 칼슘 밀도를 감소시키자 방출된 세포의 전체 밀도가 감소되었고 전개 키네틱이 약간 지연되었다(도 3c; 오차 막대는 SEM, n = 4∼6). 인간 중간엽 줄기 세포 매개 골재생을 향상시킬 수 있는 기공 형성 하이드로겔의 능력은 누드 랫트 두개골 결손 모델에서 입증되었다(도 3d). 임계적 크기의 결손이 누드 랫트(Charles River)의 두개골 내에 형성되었다. 결손 형성 직후, 상업적으로 입수 가능한 인간 중간엽 줄기 세포(Lonza)를 식염수("세포 단독"), 표준 하이드로겔(2 RGD/알기네이트 폴리머, 60 kPa), 또는 기공 형성 하이드로겔 내에 넣어 결손 공간에 이식하였다. 도 3d는 이식한 지 4주 후 두개골 결손 내의 새로운 골 형성의 미세전산화 단층촬영술 분석의 대표적인 횡단면을 도시한다. 세포가 기공 형성 하이드로겔을 통해 전달된 결손 부위에서 실질적으로 더 많은 골이 형성되었다. 이식한 지 12주째 새로이 형성된 골로 독시사이클린을 도입한 것은(녹색) 기공 형성 하이드로겔이 피하 조직의 거짓양성 염색이 아니라 조직 내에서의 양성의 독시사이클린 염색을 유도하였음을 입증한다.
실시예 4: 상이한 시점에서의 2개의 상이한 세포 집단의 시험관내 방출
실시예 1 및 2에 기재된 바와 같이 기공 형성 하이드로겔을 형성하였다. 동일한 수(복합 기공 형성 하이드로겔 1 mL당 약 106개 세포)의 GFP 발현 근아세포 및 증식내피세포(OEC, 혈관 프로제니터 세포)를 재료의 상이한 구획 내로 캡슐화하였다. 시험관내에서 5일 동안 배양한 후, 방출되어 조직 배양 플라스틱에 부착한 세포를 에티듐 호모다이머(EtD-1; 적색)로 염색하였다. 도 4에 도시된 바와 같이, 벌크 겔 내로 캡슐화된 세포 유형은 더 빨리 전개되었다. 이러한 전개 패턴은, GFP 근아세포보다 더 천천히 이동하고 덜 광범위하게 증식하는 OEC의 경우에도 발생하였다(동일한 수의 두 세포 유형을 첨가한 기재의 분석에 기초함, 도 4d).
특히, 상이한 시점에 상이한 집단을 방출시키기 위해 기공 형성 하이드로겔을 사용하는 것이 도 4에 도시되어 있다. 포로젠을 형성하는 데 사용된 화학작용을 변경하고 상이한 세포 유형을 초기에 상이한 구획에 배치한 기공 형성 하이드로겔 내에서 4일 간 배양한 후 조직 배양 플라스틱에 부착하는 GFP 발현 근아세포 및 증식 내피세포(OEC)의 형광 현미경 사진이 도 4a∼4c에 도시되어 있다. 도 4a는 벌크 성분 내의 근아세포, 포로젠 성분 내의 OEC를 도시하는 한편, 도 4b는 비드 성분 내의 근아세포, 포로젠 성분 내의 OEC를 도시한다. 도 4c는 벌크 성분 내의 근아세포와 OEC를 둘 다 도시한다. 동일한 수의 GFP-근아세포와 OEC가 플라스틱 기재 상에 시딩되었다(도 4d). 근아세포는 OEC를 성장시켰다. 세포를 에티듐 호모다이머(적색)로 염색하였으며, 이로써 GFP-근아세포는 황색으로 보였고 OEC는 적색으로 보였다.
실시예 5: 상이한 포로젠 제제를 갖는 기공 형성 하이드로겔에 의한 피하 조직으로부터 숙주 림프구의 동원
실시예 1 및 2에 기재된 바와 같이 기공 형성 하이드로겔을 형성하였다. 포로젠상을 형성하기 위해, 7.5 mg/mL의 고분자량 GA 풍부 알기네이트 폴리머를 20 mg/mL의 알기네이트 디알데하이드(이론적 산화도 7.5%), 또는 알데하이드 기가 알코올 기로 환원된 알기네이트 디알데하이드와 혼합하였다. 그 후, 캡슐화 세포가 없는 기공 형성 하이드로겔을 C57/BL6 또는 Balb/c 마우스의 등에 주사하였다. 14일 후, 조직학적 분석에 의해 숙주 수지상 세포의 동원을 관찰하였다.
이하에 더 상세히 설명하는 바와 같이, 케모카인 매개 세포 동원을 위해 기공 형성 하이드로겔을 이용하였다. 먼저, 알기네이트를 산화시키고, 그 후 나트륨 보로하이드라이드로 환원시켜 알코올 기를 형성하였으며, 이것이 원래 당이었던 것을 치환하였다. 도 5a 및 도 5b는 표준 분해성 알기네이트 하이드로겔과 기공 형성 알기네이트 하이드로겔에 의한 수지상 세포(DC) 동원을 비교한 것을 도시한다. 두 세트의 하이드로겔에 2 ㎍의 과립구-대섹세포 콜로니 자극 인자를 로딩하였다. 이것은 하이드로겔에 인접한 조직(이미지의 가장자리 부근의 세포가 많은 영역)으로부터 기공 형성 하이드로겔로 실질적으로 더 많은 세포가 침투함을 나타낸다. 도 5c 및 5d는, GM-CSF 없이 포로젠이 알기네이트 디알데하이드로부터 형성되거나(도 5c) 환원 알기네이트 디알데하이드로부터 형성된(도 5d) 기공 형성 하이드로겔로의 베이스라인 DC 침습을 비교한 것을 도시한다. GM-CSF 부재 시 베이스라인 세포 침투는 실질적으로 거의 발생하지 않았다. 조직학적 분석을 위해, Hoescht 핵 대비염색(청색)을 이용하여 수지상 세포를 CD11c(녹색) 및 NIHC-II(적색)에 대해 염색하였다. 이 도면은 산화 알기네이트와 환원 알기네이트로부터 형성된 포로젠을 갖는 재료에 의한 숙주 세포 동원에 있어서의 차이를 보여준다.
실시예 6: 벌크상 조성물을 변경하는 것에 의한 기공 형성 하이드로겔 내에서의 줄기 세포 증식의 제어
이 접근법의 목적은 불용성 단서를 이용하여 세포 증식 및 방출을 조작하기 위한 것이다. 따라서, 부착 리간드의 밀도 및 포로젠을 둘러싼 비분해성 하이드로겔의 기계적 특성이 세포에 영향을 미치는지를 확인하였다. 도 6에 도시된 바와 같이, 리간드의 밀도가 DNA 합성을 크게 변화시킨 반면, 탄성률 변경은 1주에 걸쳐 DNA 합성과 세포 방출을 둘 다 변화시켰다. 부착 리간드 밀도와 같은 불용성 단서는 도 6d에서의 조직학적 분석에 의해 도시된 바와 같이 긴 시간 프레임에 걸쳐 세포에 영향을 미쳤다.
특히, 기공 형성 하이드로겔의 벌크 성분의 조성이 생체내에서의 세포 증식 및 생착을 조절할 수 있는지를 확인하기 위한 연구를 수행하였다. 중간엽 줄기 세포에 의한 24 hr 3H-티미딘 도입(DNA 합성에 비례함)(D1; 적색 곡선) 또는 60 kPa의 탄성률을 갖는 벌크 겔 내의 RGD 펩티드의 밀도의 함수로서의 배양 7일 후의 기공 형성 하이드로겔로부터의 누적 MSC 전개(청색 곡선), 또는 10 RGD 펩티드/알기네이트 폴리머를 제시하는 벌크 하이드로겔의 탄성률(데이터는 평균±SEM, n = 3∼5)이 도 6a 및 6b에 도시되어 있다. RGD는 세포 증식에 유의적인 영향을 미친 반면, 탄성률은 증식과 방출 둘 다에 영향을 미쳤다(p < 0.05, ANOVA). 기공 형성의 함수로서의 DNA 합성의 분석이 도 6c에 도시되어 있다. 배양 50일 후의 냉동절편 기공 형성 하이드로겔에서의 D1 세포에서의 Ki-67(증식 마커, 녹색)에 대한 염색은 도 6d에 도시되어 있다.
벌크 하이드로겔의 조성물을 통한 전개된 줄기 세포 운명의 제어
실시예 1에 기재된 바와 같이 기공 형성 하이드로겔을 형성하였다. 벌크 하이드로겔의 조성(인테그린 결합 RGD 펩티드의 밀도 및 탄성률)을 조작하는 것에 의해, 시험관내에서의 중간엽 줄기 세포(MSC) 증식 및 방출을 제어하는 것이 가능하였다. 생체내에서, 피하 공간으로 전개된 mCherry 표지 마우스 MSC는 RGD 펩티드의 밀도를 알기네이트 폴리머 사슬당 2개 펩티드에서 10개 펩티드로 증가시키는 것에 의해 증가시킬 수 있었다(도 6e). 치료 연구를 위해, 인간 MSC를 두개골 결손 누드 랫트로 전개시켰다. 4주 후, 랫트를 안락시키고, (새로운 골 형성으로 인한) 치유 정도를 헤마톡실린/에오신 염색에 의해 평가하였다. 요약하면, 결손 부위 내에 새로 형성된 골 면적을 총 결손 면적으로 나누어, "치유율(%)" 메트릭(metric)을 생성하였다. 이 정량적 메트릭을 이용하여, 기공 형성 하이드로겔로 MSC를 전달하는 것이 포준 하이드로겔 또는 식염수를 통해 전달하는 것보다 새로운 골 형성을 유도할 수 있는 능력의 측면에서 훨씬 더 우수하였음이 확인되었다(도 6f). 또한, 벌크 하이드로겔 성분의 탄성률은 4주째 새로운 골 형성에 상당한 영향을 미쳤는데, 60 kPa, 10 RGD/알기네이트 폴리머 벌크상을 갖는 기공 형성 하이드로겔로부터의 전개가, 8 kPa, 10 RGD/알기네이트 폴리머 벌크상을 갖는 기공 형성 하이드로겔로부터의 전개보다 현저히 더 많은 골 형성을 유도하였기 때문이다(p < 0.05, 양측 t-검정).
따라서, mCherry 표지 D1이 기공 형성 하이드로겔을 통해 누드 마우스의 피하 조직으로 전개되었을 때, 벌크 성분의 RGD 밀도를 2∼10개 RGD 펩티드/알기네이트 폴리머로 증가시키는 것이, 세포 전개 키네틱에 실질적으로 영향을 미치지 않으면서 생착된 세포의 총수를 크게 증가시켰다.
여기에서의 실시예는 본원에 기재된 바와 같이 세포 매개 조직 재생에 대한 벌크 하이드로겔 탄성률의 영향을 입증하였지만, 벌크 하이드로겔상의 다른 많은 측면들, 예를 들어, 매트릭스 결합 성장 인자 또는 이의 펩티드 모방체의 제시도 세포 매개 조직 재생에 영향을 주도록 조작될 수 있다.
실시예 7: 이원성 알기네이트로부터 형성된 하이드로겔의 기계적 특성 및 시험관내 분해
20 mg/mL의 일정한 농도로 산화 알기네이트(이론적 산화도 5%)의 이원성 조합물을 비변형 고분자량 알기네이트에 의해 가교결합시킴으로써 형성한 벌크 하이드로겔의 탄성률 및 분해가 도 7a 및 도 7b에 도시되어 있다. 분해는 초기 건조 질량에 대한 시험관내에서 4일 후의 건조 질량을 비교함으로써 평가하였다. 7.5 mg/mL의 비변형 알기네이트와 20 mg/mL의 산화 알기네이트의 이원성 혼합물로부터 형성된 포로젠의 직경이 도 7c에 도시되어 있다. 포로젠 직경은 아미노플루오레세인 표지 알기네이트로부터 제조된 포로젠의 형광 현미경 사진을 프로세싱함으로써 측정하였다.
다른 실시형태
지금까지 본 발명을 상세한 설명과 관련하여 기술하였지만, 전술한 설명은 본 발명을 예시하기 위한 것으로 첨부된 청구범위에 의해 정해되는 본 발명의 범위를 한정하려는 것은 아니다. 다른 양태, 이점 및 변경도 하기 청구범위 내에 속한다.
본원에서 인용된 특허 문헌 및 과학 문헌은 당업자의 통상의 지식을 확립하는 것이다. 본원에서 인용된 모든 미국 특허 및 공개 또는 비공개 미국 특허 출원은 본원에 참고로 포함된다. 본원에 인용된 수탁 번호로 표시되는 Genbank 및 NCBI 기탁은 본원에 참고로 포함된다. 본원에 인용된 다른 모든 간행물, 문서, 원고 및 과학 문헌도 본원에 참고로 포함된다.
본 발명은 바람직한 실시형태와 관련하여 특별히 제시되고 설명되었지만, 당업자라면 첨부된 청구범위에 포함되는 본 발명의 범위로부터 벗어나지 않도록 형태와 세부사항에 있어서 다양한 변경이 가능함을 이해할 것이다.

Claims (42)

  1. 희생 포로젠 하이드로겔 마이크로비드 및 벌크 하이드로겔을 포함하는 복합 조성물로서, 상기 복합 조성물은 투여 시점에 매크로기공이 없고, 상기 희생 포로젠 하이드로겔 마이크로비드는 대상에 체류한 후 상기 벌크 하이드로겔보다 10% 이상 더 빨리 가수분해에 의해 분해되어 그 자리에 매크로기공의 네트워크를 남기는 것인 조성물.
  2. 제1항에 있어서, (a) 상기 희생 포로젠 하이드로겔 마이크로비드가 산화된 알기네이트를 포함하고, 및/또는 (b) 상기 희생 포로젠 하이드로겔 마이크로비드가 상기 벌크 하이드로겔보다 더 짧은 폴리머를 포함하는 것인 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 희생 포로젠 하이드로겔 마이크로비드, 상기 벌크 하이드로겔, 또는 상기 희생 포로젠 하이드로겔 마이크로비드 및 상기 벌크 하이드로겔 둘다 단리된 세포를 포함하는 것인 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 벌크 하이드로겔이 상기 희생 포로젠 하이드로겔 마이크로비드 둘레로 가교결합되거나 또는 상기 희생 포로젠 하이드로겔 마이크로비드가 상기 벌크 하이드로겔 내에 물리적으로 가두어지는 것인 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 종양 항원을 포함하는 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 프로그래밍 인자를 포함하는 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 프로그래밍 인자가 압축 올리고뉴클레오티드를 포함하는 것인 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 압축 올리고뉴클레오티드가 CpG 또는 플라스미드 DNA를 포함하는 것인 조성물.
  9. 제1항에 있어서, 상기 희생 포로젠 하이드로겔 마이크로비드가 3∼7.5%의 산화된 알기네이트를 포함하는 것인 조성물.
  10. 제1항에 있어서, 상기 희생 포로젠 하이드로겔 마이크로비드가 알기네이트 디알데하이드를 포함하는 것인 조성물.
  11. 제1항에 있어서, 상기 매크로기공의 직경이 50 ㎛보다 큰 것인 조성물.
  12. 제1항에 있어서, 세포 동원 인자를 포함하는 조성물.
  13. 제12항에 있어서, 상기 동원 인자가 케모카인을 포함하는 것인 조성물.
  14. 제13항에 있어서, 상기 케모카인이 과립구/대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF)를 포함하는 것인 조성물.
  15. 제1항에 있어서, 혈관 내피세포 성장 인자(VEGF), 산성 섬유아세포 성장 인자(aFGF), 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF), 태반 성장 인자(PIGF), 혈소판 유래 성장 인자(PDGF), 렙틴, 조혈 성장 인자(HGF), VEGF 수용체-1(VEGFR-1), VEGFR-2, 뼈형성 단백질(BMP) 패밀리의 멤버, 과립구/대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF), FMS 유사 타이로신 키나제 3 리간드(Flt3 리간드), 간세포 성장 인자, 기질 유래 인자 1(SDF-1), 인슐린 유사 성장 인자(IGF), 항-VEGF 항체, 항-aFGF 항체, 항-bFGF 항체, 항-PIGF 항체, 항-렙틴 항체, 항-HGF 항체, 항-VEGFR-1 항체, 항-VEGFR-2 항체, 항-PDGF 항체, 항-BMP 항체, 항-Flt3 리간드 및 항-IGF 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는 생물활성 인자를 추가로 포함하는 조성물.
  16. 제3항에 있어서, 상기 세포가 중간엽 줄기 세포, 근아세포, 혈관 전구세포, 배아 줄기 세포 또는 유도된 만능(pluripotent) 줄기 세포로부터 유래된 분화된 세포, 유도된 만능 세포, 또는 섬유아세포로부터 분화된 상태로 직접 재프로그래밍된 세포인 조성물.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 희생 포로젠 하이드로겔 마이크로비드가 20 kPa∼60 kPa의 탄성률(elastic modulus)을 갖는 것인 조성물.
  18. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 벌크 하이드로겔이 PHSRN, DGEA 또는 RGD의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드를 포함하는 것인 조성물.
  19. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 벌크 하이드로겔이 알기네이트 폴리머 사슬, 및 알기네이트 폴리머 사슬당 2∼10개의 RGD 펩티드 밀도를 갖는 것인 조성물.
  20. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 벌크 하이드로겔이 40 kPa 이상의 초기 탄성률을 갖는 것인 조성물.
  21. 제3항에 있어서, 상기 희생 포로젠 하이드로겔 마이크로비드가, 벌크 하이드로겔 내에 포함된 단리된 세포와 상이한 단리된 세포를 포함하고, 상기 조성물은 스캐폴드로부터 포유동물 대상의 조직으로 세포를 전개하는 방법에 사용하기 위한 것인 조성물.
  22. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 생체내 스캐폴드로 세포를 동원하는 방법에 사용하기 위한 것인 조성물.
  23. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 희생 포로젠 하이드로겔 마이크로비드가 생물활성 인자를 포함하거나 또는 상기 벌크 하이드로겔이 생물활성 인자를 포함하고, 상기 조성물은 골 또는 연골 수복, 재생 또는 형성을 촉진하는데 사용하기 위한 것인 조성물.
  24. 제23항에 있어서, 상기 생물활성 인자가 BMP-2, BMP-4 또는 RunX를 포함하는 것인 조성물.
  25. 제23항에 있어서, 상기 희생 포로젠 하이드로겔 마이크로비드가 조골세포, 골세포, 파골세포 및 골전구세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 단리된 골세포를 포함하고, 및/또는 상기 벌크 하이드로겔이 조골세포, 골세포, 파골세포 및 골전구세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 단리된 골세포를 포함하는 것인 조성물.
  26. 제23항에 있어서, 상기 희생 포로젠 하이드로겔 마이크로비드가 단리된 연골 세포를 포함하고, 및/또는 상기 벌크 하이드로겔이 단리된 연골 세포를 포함하고, 상기 단리된 연골 세포는 연골아세포를 포함하는 것인 조성물.
  27. 제25항에 있어서, 상기 단리된 골세포가 자가 세포 또는 동종이계 세포인 조성물.
  28. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 희생 포로젠 하이드로겔 마이크로비드가 생물활성 인자를 포함하고 및/또는 상기 벌크 하이드로겔이 생물활성 인자를 포함하고, 상기 조성물은 근육 수복, 재생 또는 형성에 사용하기 위한 것인 조성물.
  29. 제28항에 있어서, 상기 생물활성 인자가 MyoD를 포함하는 것인 조성물.
  30. 제28항에 있어서, 상기 희생 포로젠 하이드로겔 마이크로비드가 골격근 세포, 심근 세포, 평활근 세포 및 근육 전구세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 단리된 근육 세포를 포함하고, 및/또는 상기 벌크 하이드로겔이 골격근 세포, 심근 세포, 평활근 세포 및 근육 전구세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 단리된 근육 세포를 포함하는 것인 조성물.
  31. 제30항에 있어서, 상기 단리된 근육 세포가 자가 세포 또는 동종이계 세포인 조성물.
  32. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 희생 포로젠 하이드로겔 마이크로비드가 생물활성 인자를 포함하고 및/또는 상기 벌크 하이드로겔이 생물활성인자를 포함하고, 상기 조성물은 피부 수복, 재생 또는 형성에 사용하기 위한 것인 조성물.
  33. 제32항에 있어서, 상기 생물활성 인자가 FGF를 포함하는 것인 조성물.
  34. 제32항에 있어서, 상기 희생 포로젠 하이드로겔 마이크로비드가 섬유아세포, 진피 세포, 표피 세포 또는 피부 전구세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 단리된 피부 세포를 포함하고, 및/또는 상기 벌크 하이드로겔이 섬유아세포, 진피 세포, 표피 세포 또는 피부 전구세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 단리된 피부 세포를 포함하는 것인 조성물.
  35. 제34항에 있어서, 상기 단리된 피부 세포가 자가 세포 또는 동종이계 세포인 조성물.
  36. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 희생 포로젠 하이드로겔 마이크로비드의 밀도가 조성물 총 부피의 50% 이상인 조성물.
  37. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 희생 포로젠 하이드로겔 마이크로비드가, 분자량이 5,000∼500,000 달톤(Da)인 산화된 알기네이트 폴리머를 포함하는 것인 조성물.
  38. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 벌크 하이드로겔은 분자량이 5,000∼500,000 Da인 알기네이트 다당류를 포함하는 것인 조성물.
  39. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 희생 포로젠 하이드로겔 마이크로비드는, 복합 조성물의 총 부피의 50% 내지 80%의 밀도로 존재하는 것인 조성물.
  40. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 희생 포로젠 하이드로겔 마이크로비드 및 상기 벌크 하이드로겔이 생체분해성인 조성물.
  41. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 매크로기공의 네트워크는 직경이 20㎛, 100㎛, 또는 400㎛ 보다 더 큰 매크로기공을 포함하는 것인 조성물.
  42. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 희생 포로젠 하이드로겔 마이크로비드는, 복합 조성물의 가장 작은 치수의 10% 미만의 직경을 갖는 것인 조성물.



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