CN115297881A - 包含含有il-2蛋白和cd80蛋白的融合蛋白和抗癌药物的用于治疗癌症的药物组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种用于治疗癌症的药物组合物，所述药物组合物包含作为活性成分的含有IL‑2蛋白和CD80蛋白的融合蛋白；以及抗癌剂。作为本发明的一个实施方案的包含CD80片段、免疫球蛋白Fc和IL‑2变体的融合蛋白可以活化免疫细胞，诸如自然杀伤细胞，并且与此同时可以控制调节性T细胞的免疫细胞调节活性。此外，当抗癌剂与所述融合蛋白联合施用时，可以有效地抑制癌症。因此，包含作为活性成分的包含IL‑2蛋白和CD80蛋白的融合蛋白以及抗癌剂的药物组合物可以提高体内的免疫活性，并且不仅可以有效地用于癌症，而且还可以有效地用于传染性疾病，并且因此具有高工业潜力。

Description

包含含有IL-2蛋白和CD80蛋白的融合蛋白和抗癌药物的用于 治疗癌症的药物组合物
技术领域
本发明涉及一种用于治疗癌症的药物组合物，所述药物组合物包含作为活性成分的含有IL-2蛋白和CD80蛋白的融合蛋白；以及抗癌剂。
背景技术
白介素2(IL-2)，也称为T细胞生长因子(TCGF)，是一种球状糖蛋白，其在淋巴细胞的产生、存活和体内平衡中起核心作用。IL-2的蛋白质大小为15.5kDa至16kDa，并且由133个氨基酸组成。IL-2通过与由三个不同亚基构成的IL-2受体结合来介导各种免疫作用。
此外，IL-2主要由活化T细胞合成，特别是由CD4+辅助T细胞合成。IL-2刺激T细胞的增殖和分化，并诱导细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的产生和外周血淋巴细胞分化为细胞毒性细胞和淋巴因子活化的杀伤细胞(LAK细胞)。
同时，CD80，也称为B7-1，是B7膜结合蛋白家族的成员，其通过与其配体结合，以递送共刺激反应和共抑制反应的方式参与免疫调节。CD80是一种在T细胞、B细胞、树突细胞和单核细胞的表面上表达的跨膜蛋白。已知CD80结合CD28、CTLA-4(CD152)、和PD-L1(程序性细胞死亡配体1)。CD80、CD86、CTLA-4和CD28参与共刺激共抑制***。例如，它们调控T细胞的活性并参与其增殖、分化和存活。
此外，最近，免疫检查点抑制剂诸如
Figure BDA0003850098890000011
成为焦点。免疫检查点抑制剂是通过活化身体的免疫***来帮助攻击癌细胞的抗癌剂。迄今为止，癌症疗法已聚焦于杀伤作为癌细胞的特征的快速***细胞，因此它通过作用于正常细胞以及癌细胞中快速增殖的细胞而具有副作用。然而，已知免疫抗癌剂通过利用癌症患者的免疫***来影响癌细胞，因此现有抗癌剂很少表现出典型的副作用。抗PD-1抗体，诸如可瑞达(Keytruda)，与T细胞上的特定受体(PD-1)结合并阻断癌细胞避开活性T细胞监督***的途径，从而通过免疫再活化表现出抗癌效应，所述免疫再活化使人体内的T细胞攻击癌细胞(KR 10-2018-0030580 A)。
发明内容
技术问题
本发明人已研究开发安全且有效的IL-2。结果，本发明人已经确认了一种新颖的融合蛋白，所述融合蛋白在一个分子中包含IL-2蛋白和CD80蛋白以及抗癌剂，表现出优异的抗癌效应，从而完成了本发明。
问题的解决方案
为了实现上述目的，在本发明的一个方面中，提供了一种用于治疗癌症的药物组合物，所述药物组合物包含作为活性成分的含有IL-2蛋白和CD80蛋白的融合蛋白；以及抗癌剂。
本发明的效应
包含IL-2蛋白和CD80蛋白的融合蛋白不仅可以由于IL-2而活化免疫细胞，而且还可以由于CD80而有效调控Treg细胞。此外，其被确认当与抗癌剂联合施用时出现协同效应。因此，包含作为活性成分的含有IL-2蛋白和CD80蛋白的融合蛋白以及抗癌剂的用于治疗癌症的药物组合物往往可用于治疗癌症疾病。
附图说明
图1示出了融合蛋白二聚体的一个实施方案的示意图。
图2示出了融合蛋白二聚体在***中表现出的作用机制的示意图。
图3示出了融合蛋白二聚体在肿瘤微环境中的作用机制的示意图。
图4示出了融合蛋白的结构示意图。在此，GI101和mGI101中的每一者是融合蛋白的一个实施方案，并且GI101C1、GI101C2、和mGI101C1是用于与融合蛋白的活性进行比较的比较例。
图5示出了融合蛋白的各种实施方案。人源性和小鼠源性蛋白可以组合以制备融合蛋白。CD80蛋白和IL-2蛋白可以通过除Fc以外的各种接头彼此结合。
图6示出了通过用SDS-PAGE鉴定所获得的融合蛋白二聚体(GI101)而获得的结果。
图7示出了通过吸光度测量的融合蛋白(GI101)的量。
图8示出了通过尺寸排阻色谱法(SEC)分析所获得的融合蛋白二聚体(GI101)获得的结果。
图9示出了通过用SDS-PAGE鉴定所获得的mGI101融合蛋白二聚体而获得的结果。
图10示出了通过用SDS-PAGE鉴定所获得的GI101C1融合蛋白二聚体而获得的结果。
图11示出了通过用SDS-PAGE鉴定所获得的GI101C2融合蛋白二聚体而获得的结果。
图12示出了通过用SDS-PAGE鉴定所获得的mGI101C1融合蛋白二聚体而获得的结果。
图13示出了通过用SDS-PAGE鉴定所获得的GI102-M45融合蛋白二聚体而获得的结果。
图14示出了通过用SDS-PAGE鉴定所获得的GI102-M61融合蛋白二聚体而获得的结果。
图15示出了通过用SDS-PAGE鉴定所获得的GI102-M72融合蛋白二聚体而获得的结果。
图16示出了hCTLA-4与GI101之间的结合亲和力。
图17示出了hPD-L1与GI101之间的结合亲和力。
图18示出了hPD-L1与hPD-1之间的结合亲和力。
图19示出了mCTLA-4与mGI101之间的结合亲和力。
图20示出了mPD-L1与mGI101之间的结合亲和力。
图21示出了通过鉴定GI101(hCD80-Fc-hIL-2v)与CTLA-4之间的结合能力获得的结果。鉴定出GI101(hCD80-Fc-hIL-2v)对CTLA-4具有高结合能力。
图22示出了通过鉴定GI101与IL-2Rα或IL-2Rβ之间的结合亲和力获得的结果。
图23示出了通过鉴定GI101与IL-2Rα之间的结合亲和力获得的结果。
图24示出了通过鉴定GI101与IL-2Rβ之间的结合亲和力获得的结果。
图25示出了IL-2Rα与GI102-M45之间的结合亲和力。
图26示出了IL-2Rα与GI102-M61之间的结合亲和力。
图27示出了IL-2Rα与GI102-M72之间的结合亲和力。
图28示出了IL-2Rβ与GI102-M45之间的结合亲和力。
图29示出了IL-2Rβ与GI102-M61之间的结合亲和力。
图30示出了IL-2Rβ与GI102-M72之间的结合亲和力。
图31和图32示出了当细胞用相应浓度的GI101、GI101C1、GI101C2、或IL-2处理并一起孵育时，通过测量从所述细胞分泌的IFN-γ的量而获得的结果。
图33示出了通过鉴定GI101、GI101C1、GI101C2和IL-2(普留净(Proleukin))对CD8+T细胞增殖的效应而获得的结果。
图34示出了GI101作用于效应T细胞的机制的示意图。
图35示出了通过鉴定GI101和GI102对CD8+T细胞和CD4+T细胞增殖的效应而获得的结果。在此，图35A示出了CD8+T细胞和CD4+T细胞的比例，图35B示出了CD8+T细胞的增殖能力，并且图35C示出了CD4+/FoxP3+Treg细胞的比例。
图36和图37示出了通过鉴定GI101和GI101w对CD8+T细胞和NK细胞的增殖的效应而获得的结果。
图38和图39示出了通过鉴定GI101对效应T细胞的效应而获得的结果。
图40示出了通过鉴定mGI101和mGI102-M61对小鼠免疫细胞的效应而获得的结果。
图41和图42示出了通过鉴定GI101对表达PD-L1和CTLA-4的癌细胞的T细胞活性抑制效应而获得的结果。
图43示出了通过鉴定mGI101取决于其剂量在移植有小鼠源性结直肠癌细胞(CT26)的小鼠中的肿瘤抑制效应而获得的结果。
图44示出了通过分析在移植有小鼠源性结直肠癌细胞(CT26)的小鼠中，取决于mGI101的施用的小鼠的存活率而获得的结果。
图45示出了通过鉴定GI101在移植有小鼠源性结直肠癌细胞(CT26)的小鼠中的肿瘤抑制效应而获得的结果。
图46示出了通过用hIgG4、抗PD-1抗体、或GI101对移植有小鼠源性结直肠癌细胞(CT26)的小鼠进行处理，然后用FACS分析癌组织中的CD8+T细胞、IFN-γT细胞、CD4+T细胞和Treg细胞而获得的结果。
图47以图表形式示出了通过用hIgG4、抗PD-1抗体、或GI101对移植有小鼠源性结直肠癌细胞(CT26)的小鼠进行处理，然后用FACS分析癌组织中的CD8+T细胞、IFN-γT细胞、CD4+T细胞和Treg细胞而获得的结果。
图48示出了通过用hIgG4、抗PD-1抗体、或GI101对移植有小鼠源性结直肠癌细胞(CT26)的小鼠进行处理，然后用FACS分析癌组织中的巨噬细胞而获得的结果。
图49以图表形式示出了通过用hIgG4、抗PD-1抗体、或GI101对移植有小鼠源性结直肠癌细胞(CT26)的小鼠进行处理，然后用FACS分析癌组织中的巨噬细胞而获得的结果。
图50示出了通过用hIgG4、抗PD-1抗体、或GI101对移植有小鼠源性结直肠癌细胞(CT26)的小鼠进行处理，然后用FACS分析癌组织中的树突细胞而获得的结果。
图51以图表形式示出了通过用hIgG4、抗PD-1抗体、或GI101对移植有小鼠源性结直肠癌细胞(CT26)的小鼠进行处理，然后用FACS分析癌组织中的树突细胞而获得的结果。
图52示出了通过鉴定GI101在移植有小鼠源性肺癌细胞(LL/2)的小鼠中的肿瘤抑制效应而获得的结果。
图53以图表形式示出了通过用hIgG4、抗PD-1抗体、或GI101对移植有小鼠源性肺癌细胞(LL/2)的小鼠进行处理，然后用FACS分析癌组织中的CD8+T细胞、IFN-γT细胞、CD4+T细胞和Treg细胞而获得的结果。
图54以图表形式示出了通过用hIgG4、抗PD-1抗体、或GI101对移植有小鼠源性肺癌细胞(LL/2)的小鼠进行处理，然后用FACS分析癌组织中的巨噬细胞而获得的结果。
图55以图表形式示出了通过用hIgG4、抗PD-1抗体、或GI101对移植有小鼠源性肺癌细胞(LL/2)的小鼠进行处理，然后用FACS分析癌组织中的树突细胞而获得的结果。
图56示出了通过鉴定mGI102-M61在移植有小鼠源性结直肠癌细胞(CT26)的小鼠中的肿瘤抑制效应而获得的结果。
图57示出了通过分析在移植有小鼠源性结直肠癌细胞(CT26)的小鼠中，取决于mGI102-M61的施用的小鼠的存活率而获得的结果。
图58示出了通过鉴定mGI101在移植有小鼠源性结直肠癌细胞(CT26)的小鼠中的肿瘤抑制效应而获得的结果。
图59示出了mGI101在移植有小鼠源性结直肠癌细胞(CT26)的小鼠中的肿瘤抑制率。
图60示出了当在移植有人源性乳腺癌细胞(MDA-MB-231)的小鼠中使用GI101和可瑞达的组合时的肿瘤生长的图表。如与对照(hIgG4)相比，已接受GI101和可瑞达中的各者的组表现出肿瘤生长抑制。如与对照相比，已接受GI101和可瑞达的组合的组表现出肿瘤生长抑制。如与已接受GI101和可瑞达中的各者的组相比，已接受GI101和可瑞达的组合的组表现出肿瘤生长抑制。
图61示出了当在移植有人源性乳腺癌细胞(MDA-MB-231)的小鼠中使用GI-101和可瑞达的组合时的肿瘤生长抑制率。已接受IgG4的组表现出在2只小鼠中30％或更大、在1只小鼠中50％或更大、并且在1只小鼠中80％或更大的肿瘤生长抑制率。已接受GI101的组表现出在5只小鼠中30％或更大、在5只小鼠中50％或更大、并且在2只小鼠中80％或更大的肿瘤生长抑制率。已接受可瑞达的组表现出在7只小鼠中30％或更大、在5只小鼠中50％或更大、并且在3只小鼠中80％或更大的肿瘤生长抑制率。已接受GI101和可瑞达的组合的组表现出在8只小鼠中30％或更大、在8只小鼠中50％或更大、并且在6只小鼠中80％或更大的肿瘤生长抑制率。
图62示出了当在移植有人源性乳腺癌细胞(MDA-MB-231)的小鼠中使用GI101和可瑞达的组合时，每个治疗组的个体实验动物的肿瘤生长程度。
图63示出了在移植有人源性乳腺癌细胞(MDA-MB-231)的小鼠中已接受hIgG4的组的个体实验动物的肿瘤生长程度。
图64示出了在移植有人源性乳腺癌细胞(MDA-MB-231)的小鼠中已接受GI101的组的个体实验动物的肿瘤生长程度。
图65示出了在移植有人源性乳腺癌细胞(MDA-MB-231)的小鼠中已接受可瑞达的组的个体实验动物的肿瘤生长程度。
图66示出了在移植有人源性乳腺癌细胞(MDA-MB-231)的小鼠中已接受GI101和可瑞达的组合的组的个体实验动物的肿瘤生长程度。
图67示出了当mGI101和抗PD-1抗体在移植有啮齿动物源性结直肠癌细胞(MC38)的小鼠中联合施用时的肿瘤生长图。
图68示出了当mGI101和抗PD-1抗体在移植有啮齿动物源性结直肠癌细胞(MC38)的小鼠中联合施用时的肿瘤生长抑制率。
图69示出了当mGI101和抗PD-1抗体在移植有啮齿动物源性结直肠癌细胞(MC38)的小鼠中联合施用时每个治疗组的个体实验动物的肿瘤生长程度。
图70示出了在移植有啮齿动物源性结直肠癌细胞(MC38)的小鼠中已接受hIgG4的组的个体实验动物的肿瘤生长程度。
图71示出了在移植有啮齿动物源性结直肠癌细胞(MC38)的小鼠中已接受mGI101的组的个体实验动物的肿瘤生长程度。
图72示出了在移植有啮齿动物源性结直肠癌细胞(MC38)的小鼠中已接受抗PD-1抗体的组的个体实验动物的肿瘤生长程度。
图73示出了在移植有啮齿动物源性结直肠癌细胞(MC38)的小鼠中已接受mGI101和抗PD-1抗体的组合的组的个体实验动物的肿瘤生长程度。
图74示出了在移植有啮齿动物源性结直肠癌细胞(MC38)的小鼠中已接受mGI101和抗PD-1抗体的组合的组中，在将啮齿动物源性结直肠癌细胞重新注射到显示出完全缓解的实验动物中后个体实验动物的肿瘤生长程度。
图75示出了当mGI101和抗PD-L1抗体在移植有啮齿动物源性结直肠癌细胞(CT26)的小鼠中联合施用时的肿瘤生长图。
图76示出了当mGI101和抗TIGIT抗体在移植有啮齿动物源性结直肠癌细胞(CT26)的小鼠中联合施用时的肿瘤生长图。
图77示出了当mGI101和TGF-βR抑制剂戈鲁尼色特(Galunisertib)在移植有啮齿动物源性结直肠癌细胞(CT26)的小鼠中联合施用时的肿瘤生长图。
图78示出了当mGI101和TGF-βR抑制剂戈鲁尼色特在移植有啮齿动物源性结直肠癌细胞(CT26)的小鼠中联合施用时的肿瘤生长抑制率。
图79示出了当mGI101、TGF-βR抑制剂戈鲁尼色特以及它们的组合在移植有啮齿动物源性结直肠癌细胞(CT26)的小鼠中施用时个体实验动物的肿瘤生长程度。
图80示出了当mGI101和VEGFR抑制剂阿西替尼(Axitinib)在移植有啮齿动物源性结直肠癌细胞(CT26)的小鼠中联合施用时的肿瘤生长图。
图81示出了当mGI101和VEGFR抑制剂阿西替尼在移植有啮齿动物源性结直肠癌细胞(CT26)的小鼠中联合施用时的肿瘤生长抑制率。
图82示出了当mGI101和VEGFR抑制剂阿西替尼在移植有啮齿动物源性结直肠癌细胞(CT26)的小鼠中联合施用时个体实验动物的肿瘤生长程度。
图83示出了当mGI101和VEGFR抑制剂阿西替尼在移植有啮齿动物源性肺癌细胞(LL/2)的小鼠中联合施用时的肿瘤生长图。
图84示出了当mGI101和VEGFR抑制剂阿西替尼在移植有啮齿动物源性肺癌细胞(LL/2)的小鼠中联合施用时的肿瘤生长抑制率。
图85示出了当mGI101和VEGFR抑制剂阿西替尼在移植有啮齿动物源性肺癌细胞(LL/2)的小鼠中联合施用时个体实验动物的肿瘤生长程度。
图86示出了当mGI101和VEGFR抑制剂乐伐替尼(Lenvatinib)在移植有啮齿动物源性结直肠癌细胞(CT26)的小鼠中联合施用时的肿瘤生长图。
图87示出了当mGI101和VEGFR抑制剂乐伐替尼在移植有啮齿动物源性结直肠癌细胞(CT26)的小鼠中联合施用时的肿瘤生长抑制率。
图88示出了当mGI101和VEGFR抑制剂乐伐替尼在移植有啮齿动物源性结直肠癌细胞(CT26)的小鼠中联合施用时个体实验动物的肿瘤生长程度。
图89示出了当mGI101和VEGFR抑制剂乐伐替尼(Lenvatinib)在移植有啮齿动物源性肾癌细胞(Renca)的小鼠中联合施用时的肿瘤生长图。
图90示出了当mGI101和VEGFR抑制剂乐伐替尼在移植有啮齿动物源性肾癌细胞(Renca)的小鼠中联合施用时的肿瘤生长抑制率。
图91示出了当mGI101和VEGFR抑制剂乐伐替尼在移植有啮齿动物源性肾癌细胞(Renca)的小鼠中联合施用时个体实验动物的肿瘤生长程度。
图92示出了当mGI101、作为EGFR抑制剂的西妥昔单抗(Cetuximab)以及它们的组合在人源结直肠癌细胞系(HCT116)中施用时杀伤癌细胞系的效应。
图93示出了当mGI101和PARP抑制剂奥拉帕尼(Olaparib)在移植有啮齿动物源性乳腺癌细胞(4T1)的小鼠中联合施用时的肿瘤生长图。
图94示出了当mGI101和PARP抑制剂奥拉帕尼在移植有啮齿动物源性乳腺癌细胞(4T1)的小鼠中联合施用时的肿瘤生长抑制率。
图95示出了当mGI101和PARP抑制剂奥拉帕尼在移植有啮齿动物源性乳腺癌细胞(4T1)的小鼠中联合施用时个体实验动物的肿瘤生长程度。
图96是在移植有啮齿动物源性结直肠癌细胞(CT26)的小鼠中联合施用mGI101和DNA甲基转移酶抑制剂瓜地西他滨(Guadecitabine)的实验安排的示意图。
图97示出了当mGI101(0.6mpk)和DNA甲基转移酶抑制剂瓜地西他滨在移植有啮齿动物源性结直肠癌细胞(CT26)的小鼠中联合施用时的肿瘤生长图。
图98示出了当mGI101(0.6mpk)和DNA甲基转移酶抑制剂瓜地西他滨在移植有啮齿动物源性结直肠癌细胞(CT26)的小鼠中联合施用时的肿瘤生长抑制率。
图99示出了当mGI101(0.6mpk)和DNA甲基转移酶抑制剂瓜地西他滨在移植有啮齿动物源性结直肠癌细胞(CT26)的小鼠中联合施用时个体实验动物的肿瘤生长程度。
图100示出了当mGI101(3mpk)和DNA甲基转移酶抑制剂瓜地西他滨在移植有啮齿动物源性结直肠癌细胞(CT26)的小鼠中联合施用时的肿瘤生长图。
图101示出了当mGI101(3mpk)和DNA甲基转移酶抑制剂瓜地西他滨在移植有啮齿动物源性结直肠癌细胞(CT26)的小鼠中联合施用时的肿瘤生长抑制率。
图102示出了当mGI101(3mpk)和DNA甲基转移酶抑制剂瓜地西他滨在移植有啮齿动物源性结直肠癌细胞(CT26)的小鼠中联合施用时个体实验动物的肿瘤生长程度。
图103示出了当mGI101、多西紫杉醇(Docetaxel)和抗PD-L1抗体在移植有啮齿动物源性乳腺癌细胞(4T1)的小鼠中联合施用时的肿瘤生长图。
图104示出了当mGI101、多西紫杉醇和抗PD-L1抗体在移植有啮齿动物源性乳腺癌细胞(4T1)的小鼠中联合施用时的肿瘤生长抑制率。
图105示出了当mGI101、多西紫杉醇和抗PD-L1抗体在移植有啮齿动物源性乳腺癌细胞(4T1)的小鼠中联合施用时个体实验动物的肿瘤生长程度。
图106是在移植有啮齿动物源性乳腺癌细胞(EMT6)的小鼠中联合施用mGI101和紫杉醇(Paclitaxel)的实验方案的示意图。
图107示出了当mGI101和紫杉醇在移植有啮齿动物源性乳腺癌细胞(EMT6)的小鼠中联合施用时的肿瘤生长图。
图108示出了当mGI101和紫杉醇在移植有啮齿动物源性乳腺癌细胞(EMT6)的小鼠中联合施用时的肿瘤生长抑制率。
图109示出了当mGI101和紫杉醇在移植有啮齿动物源性乳腺癌细胞(EMT6)的小鼠中联合施用时个体实验动物的肿瘤生长程度。
图110是用于在移植有啮齿动物源性肺癌细胞(TC1)的小鼠中联合施用mGI101、顺铂、培美曲塞(Pemetrexed)和抗PD-1抗体后鉴定抗癌效应的实验安排。此外，上图中还示出了用于鉴定mGI101对维持疗法的影响的实验安排的示意图。
图111示出了当mGI101、顺铂、培美曲塞和抗PD-1抗体联合施用并在移植有啮齿动物源性肺癌细胞(TC1)的小鼠中执行维持疗法时的肿瘤生长图。
图112示出了当mGI101、顺铂、培美曲塞和抗PD-1抗体联合施用并在移植有啮齿动物源性肺癌细胞(TC1)的小鼠中执行维持疗法时个体实验动物的肿瘤生长程度。
图113至图117示出了当mGI101、顺铂、培美曲塞和抗PD-1抗体联合施用并且在移植有啮齿动物源性肺癌细胞(TC1)的小鼠中执行维持疗法时每个实验组的个体实验动物的肿瘤生长程度。
图118示出了当mGI101、顺铂、培美曲塞和抗PD-1抗体联合施用并在移植有啮齿动物源性肺癌细胞(TC1)的小鼠中执行维持疗法后的小鼠存活率。
图119示出了当GI101和曲妥珠单抗(Trastuzumab)在移植有人源性乳腺癌细胞(BT-474)的小鼠中联合施用时的肿瘤生长图。
图120示出了当GI101和曲妥珠单抗在移植有人源性乳腺癌细胞(BT-474)的小鼠中联合施用时的肿瘤生长抑制率。
图121示出了当GI101和曲妥珠单抗在移植有人源性乳腺癌细胞(BT-474)的小鼠中联合施用时个体实验动物的肿瘤生长程度。
图122示出了当在人结直肠癌细胞系(HCT116)中施用GI101、Her2抑制剂帕妥珠单抗(Pertuzumab)以及它们的组合时，取决于GI101的浓度，杀伤癌细胞系的效应。
图123示出了当mGI101和CDK4/6抑制剂阿贝西利(Abemaciclib)在移植有啮齿动物源性乳腺癌细胞(4T1)的小鼠中联合施用时的肿瘤生长图。
图124示出了当mGI101和CDK4/6抑制剂阿贝西利在移植有啮齿动物源性乳腺癌细胞(4T1)的小鼠中联合施用时的肿瘤生长抑制率。
图125示出了当mGI101和CDK4/6抑制剂阿贝西利在移植有啮齿动物源性乳腺癌细胞(4T1)的小鼠中联合施用时个体实验动物的肿瘤生长程度。
图126示出了当GI101、CDK4/6抑制剂瑞博西利(Ribociclib)以及它们的组合在人源性乳腺癌细胞系细胞(MDA-MB-231)中施用时杀伤癌细胞系的效应。
图127示出了在移植有啮齿动物源性结直肠癌细胞(MC38)的小鼠中联合施用mGI101和STING激动剂DMXAA的实验安排的示意图。
图128示出了在移植有啮齿动物源性结直肠癌细胞(MC38)的小鼠中联合施用mGI101和STING激动剂DMXAA后的小鼠存活率。
图129示出了在移植有啮齿动物源性结直肠癌细胞(MC38)的小鼠中联合施用mGI101和STING激动剂DMXAA后个体实验动物的肿瘤生长程度。图130至图133示出了在移植有啮齿动物源性结直肠癌细胞(MC38)的小鼠中联合施用mGI101和STING激动剂DMXAA后，每个实验组的个体实验动物的肿瘤生长程度。
具体实施方式
融合蛋白联合疗法
在本发明的一个方面中，提供了一种用于预防或治疗癌症的药物组合物，所述药物组合物包含作为活性成分的融合蛋白二聚体，所述融合蛋白二聚体包含CD80蛋白或其片段和IL-2蛋白或其变体；以及抗癌剂。
由于包含IL-2蛋白和CD80蛋白的融合蛋白二聚体提高了体内的免疫活性，因此所述融合蛋白二聚体可以与已经常规使用的各种抗癌治疗方法组合使用。具体地，可以组合使用的常规治疗方法可以选自由以下项组成的组：用于化疗的抗癌化疗剂、靶向抗癌剂、抗癌病毒、抗体治疗剂、细胞治疗剂、免疫检查点抑制剂，以及它们的组合。
如本文所用，术语“抗癌化疗剂”也称为抗肿瘤剂或细胞毒性剂。它是主要通过直接作用于DNA以阻断DNA复制、转录和翻译过程，或通过干扰代谢途径中核酸前体的合成，以及通过抑制细胞***而表现出抗癌活性的药物的总称。抗肿瘤剂因不仅作用于肿瘤细胞而且还作用于正常细胞而表现出细胞毒性。抗癌化疗剂可在维持疗法中使用。此外，如本文所用，术语“维持疗法”是指在初始抗癌治疗之后用药物治疗癌症，并且是指为预防或延缓癌症复发而执行的治疗方法。
具体地，抗癌化疗剂可以是选自由以下项组成的组中的任一者：烷化剂、微管抑制剂、抗代谢物、和拓扑异构酶抑制剂。烷化剂可以是选自由以下项组成的组中的任一者：氮芥、环磷酰胺、异环磷酰胺、美法仑、苯丁酸氮芥、噻替哌、六甲蜜胺、丙卡巴肼、白消安、链脲佐菌素、卡莫司汀、洛莫司汀、达卡巴嗪、顺铂、卡铂、和奥沙利铂。微管抑制剂可以是选自由以下项组成的组中的任一者：多西紫杉醇、Velban、安可平(Oncovin)和温诺平(Navebine)。抗代谢药可以是选自由以下项组成的组中的任一者：氟尿嘧啶、卡培他滨、阿糖胞苷、吉西他滨、氟达拉滨、氨甲蝶呤、培美曲塞和巯基嘌呤。拓扑异构酶抑制剂可以是选自由以下项组成的组中的任一者：和美新(Hycamtin)、伊立替康(Camptosar)、依托泊苷(Vepesid)、紫杉醇、博莱霉素(Blenoxane)、阿霉素和柔红霉素(Cerubidine)。
如本文所用，术语“靶向抗癌剂”是通过以下方式来特异性杀伤癌细胞的治疗剂：通过靶向往往仅存在于癌细胞中的特定蛋白质或特定遗传变化阻断参与癌症的生长和发展的信号。所述靶向抗癌剂分为在细胞外反应的单克隆抗体和在细胞内作用的小分子物质。单克隆抗体是阻断癌细胞诱导信号传递至细胞外并作用于与增殖、死亡等相关的起始信号的抗癌剂；并且小分子物质作用于细胞内发生的复杂信号转导。
具体地，待靶向的蛋白质可以是EGFR、VEGFR、CD20、CD38、RNAK-L、BTK、Bcr-abl、PDGFR/FGFR家族、MEK/RAF、HER2/Neu、泛素蛋白、JAK、ALK、PARP、TGFβRI、蛋白酶体、Bcl-2、C-Met、VR1、VR2、VR3、c-kit、AXL、RET、Braf、DNMT、CDK4/6、STING等。
靶向抗癌剂可以是选自由以下项组成的组中的任一者：西妥昔单抗、曲妥珠单抗、帕妥珠单抗、阿西替尼、乐伐替尼、贝伐单抗(Bevacizumab)、雷莫芦单抗(Ramucirumab)、阿柏西普(Aflibercept)、利妥昔单抗(Rituximab)、奥比妥珠单抗(Obinutuzumab)、达雷木单抗(Daratumumab)、地诺单抗(Denosumab)、依鲁替尼(Ibrutinib)、达沙替尼(Dasatinib)、尼罗替尼(Nilotinib)、伊马替尼(Imatinib)、博舒替尼(Bosutinib)、戈鲁尼色特、伐托色替(Vactosertib)、尼达尼布(Nintedanib)、舒尼替尼(Sunitinib)、索拉非尼(Sorafenib)、卡博替尼(Cabozantinib)、瑞戈非尼(Regorafenib)、马赛替尼(Masitinib)、塞马尼布(Semaxanib)、替沃扎尼(Tivozanib)、凡德他尼(Vandetanib)、帕唑帕尼(Pazopanib)、曲美替尼(Trametinib)、达拉菲尼(Dabrafenib)、曲妥珠单抗(Trastuzumab)、阿法替尼(Afatinib)、拉帕替尼(Lapatinib)、来那替尼(Neratinib)、来那度胺(Lenalidomide)、伊沙佐米(Ixazomib)、鲁索替尼(Ruxolitinib)、来他替尼(Lestaurtinib)、帕瑞替尼(Pacritinib)、考比替尼(Cobimethinib)、司美替尼(Selumetinib)、曲美替尼(Trametinib)、比美替尼(Binimetinib)、艾乐替尼(Alectinib)、克唑替尼(Crizotinib)、维奈托克(Venetoclax)、克唑替尼(Crizotinib)、卡博替尼(Cabozantinib)、贝森替尼(Bemcentinib)、吉特替尼(Gilteritinib)、塞尔帕替尼(Selpercatinib)、普拉替尼(Pralsetinib)、维莫非尼(Vemurafenib)、奥拉帕尼(Olaparib)、他拉唑帕尼(Talazoparib)、尼拉帕尼(Niraparib)、芦卡帕尼(Rucaparib)、阿扎胞苷(Azacitidine)、地西他滨(Decitabine)、瓜地西他滨(Guadecitabine)、阿贝西利(Abemaciclib)、瑞博西利(Ribociclib)、帕博西尼(Palbociclib)、CDN、SB11285、和DMXAA。
如本文所用，术语“表皮生长因子受体(EGFR)”是条款细胞生长、***、存活和死亡的细胞膜受体。在各种癌症中，EGFR的表达在肿瘤组织中增加。已知具有增加的EGFR的肿瘤组织是侵袭性的、转移性的并且高度耐抗癌剂的。EGFR抑制剂可以是抑制EGFR的物质。在一个实施方案中，它可以是西妥昔单抗、曲妥珠单抗、帕妥珠单抗、吉非替尼、埃罗替尼(Elotinib)、或帕尼单抗。
如本文所用，术语“血管内皮生长因子受体(VEGFR)”是诱导血管生成的血管内皮生长因子的细胞膜受体，并且VEGFR抑制剂抑制血管生成以抑制肿瘤生长和转移。在一个实施方案中，VEGFR抑制剂可以是阿西替尼、乐伐替尼、贝伐单抗、雷莫芦单抗、或阿柏西普。
如本文所用，术语“CD20(B淋巴细胞抗原CD20)”是在B细胞的表面上表达的蛋白质，并且用作用于治疗B细胞淋巴瘤的靶蛋白。CD20靶抑制剂可以是利妥昔单抗或奥比妥珠单抗。
如本文所用，术语“CD38(分化簇38)”是一种在免疫细胞中充当信号转导受体的同时调控细胞增殖和死亡的蛋白质，并且靶向它的抑制剂可以是达雷木单抗。
如本文所用，术语“RNAK-L(核因子κ-B配体的受体活化剂)”是在破骨细胞的表面上表达的RANK受体，并且当它通过与其配体结合而被活化时，它作用以导致骨破坏。RANK-L抑制剂主要用于患有骨转移或骨质疏松症的癌症患者，并且它具体地可为地诺单抗。
如本文所用，术语“BTK(布鲁顿氏酪氨酸激酶)”是一种参与B细胞增殖的酶，并且当过表达时可能发展为血液恶性肿瘤。在一个实施方案中，BTK靶向抑制剂可以是依鲁替尼。
如本文所用，术语“Bcr-abl”是在慢性髓性白血病患者中高表达的融合蛋白，并且已知诱导血细胞的异常增殖。具体地，所述蛋白的抑制剂可以是达沙替尼、尼罗替尼、伊马替尼、或博舒替尼。
如本文所用，术语“肿瘤生长因子β受体(TGFβR)”是肿瘤生长因子的细胞膜受体，并且调控上皮细胞和造血细胞的生长、迁移、分化、死亡等。TGFβR靶向抑制剂包括但不限于戈鲁尼色特、伐托色替等。
如本文所用，术语“PDGFR(血小板源性生长因子受体)”是PDGF的细胞膜受体，其经常在癌细胞中表达，并且已知通过参与血管生成来调控癌症生长、转移和耐药性。FGFR(Fibroblast growth factor receptor，成纤维细胞生长因子受体)是成纤维细胞生长因子(FGF)的受体，并且调控包括细胞生长、分化、迁移等在内的各种生物学过程。FGFR基因容易突变，并且这些变异通常在乳腺癌、子宫癌、卵巢癌、***等中观察到。靶向PDGFR或FGFR的抑制剂可以是尼达尼布、舒尼替尼、索拉非尼、卡博替尼、乐伐替尼、瑞戈非尼、马赛替尼、塞马尼布、替沃扎尼、凡德他尼、阿西替尼、或帕唑帕尼。
如本文所用，术语“MEK/RAF”是参与细胞增殖、细胞周期调控、细胞存活、血管生成、细胞迁移等的细胞内信号传导介体，并且在癌细胞中被过度活化。靶向MEK/RAF的抑制剂可以是曲美替尼或达拉菲尼。
如本文所用，术语“HER-2/neu(人表皮生长因子受体2)通过活化PI3K/AkT来调控细胞增殖。已知它在转移性乳腺癌和卵巢癌等中过表达，并诱导对抗癌剂的抗性。靶向Her2/neu的抗癌剂可以是曲妥珠单抗、阿法替尼、拉帕替尼、或来那替尼。
如本文所用，术语“泛素蛋白”通过与其他蛋白质结合并通过诱导蛋白酶体(其为蛋白水解酶)进行蛋白水解(泛素-蛋白酶体体系，UPS)来维持细胞稳态。在各种肿瘤中观察到了UPS的异常表达或活性，并且其抑制剂表现出抗癌活性。具体地，靶向泛素蛋白或蛋白酶体的抑制剂可以是来那度胺或伊沙佐米(Ixazomib)。
如本文所用，术语“JAK(Janus激酶)”是STAT的上游蛋白，STAT是调控细胞增殖、细胞存活、细胞迁移和免疫应答的转录因子。已知JAK抑制剂通过抑制STAT的活性来减少细胞增殖并诱导细胞死亡。靶向JAK的抑制剂可以是鲁索替尼、来他替尼或帕瑞替尼。
如本文所用，术语“MAP2K(丝裂原活化蛋白激酶)”是通过磷酸化MAPK参与细胞增殖、细胞周期调控、细胞存活、血管生成、细胞迁移等的细胞内信号传导介体，并且其在癌细胞中被过度活化。靶向MAP2K的抑制剂可以是考比替尼、司美替尼、曲美替尼或比美替尼。
如本文所用，术语“ALK(间变性淋巴瘤激酶)”是促进细胞增殖、细胞迁移和血管生成并抑制细胞死亡的信号传导介体；并且其在各种癌组织中被过度活化。靶向ALK的抑制剂可以是艾乐替尼或克唑替尼。
如本文所用，术语“Bcl-2”是一种抑制细胞死亡的蛋白质，并且其在各种癌组织中过表达或被过度活化。靶向Bcl-2的抑制剂可能是维奈托克(Venetoclax)。
如本文所用，术语“C-Met”是肝细胞生长因子(HGF)的受体，并且化与细胞生长、形成、运动性、存活、血管生成等相关的信号转导。靶向C-Met的抗癌剂可以是克唑替尼或卡博替尼。
如本文所用，术语“VR(香草醛受体)”也被称为TRPV(瞬时受体电位香草醛)，并且以VR1、VR2、VR3、VR4、VR5和VR6的形式存在。已知VR在癌症进展过程中的每个阶段调节癌细胞的增殖、死亡、迁移、浸润和血管生成。
如本文所用，术语“c-kit”也称为CD117，并诱导活化细胞存活、增殖和分化的信号转导。c-kit是原癌基因，并且其基因的过表达或突变与癌症的发生有关。
如本文所用，术语“AXL(酪氨酸蛋白激酶受体UFO)”是存在于细胞表面上的酪氨酸激酶受体，并且介导参与细胞增殖和存活的信号转导。已知其参与抗癌治疗中的抗癌剂抗性。在一个实施方案中，靶向AXL的抗癌剂可以是贝森替尼或吉特替尼。
如本文所用，术语“RET(转染期间重排)”是介导参与细胞增殖、细胞死亡和存活的信号的受体；并且已知RET中的突变参与癌症发展。靶向RET的抑制剂可以是塞尔帕替尼或普拉替尼，但不限于此。
如本文所用，术语“Braf”是参与细胞增殖、细胞周期调控、细胞存活、血管生成、细胞迁移等的MAPK信号传导介体，并且在癌细胞中观察到了基因突变。靶向Braf的抑制剂可以是维莫非尼。
如本文所用，术语“PARP(聚[ADP-核糖]聚合酶)”是蛋白质，所述蛋白质识别细胞核中受损DNA并被活化，然后活化DNA修复相关蛋白。靶向PARP的抑制剂通过抑制癌细胞的DNA修复来抑制癌细胞的增殖。在一个实施方案中，靶向PARP的抑制剂可以是奥拉帕尼、他拉唑帕尼、尼拉帕尼、或芦卡帕尼。
如本文所用，术语“DNA甲基转移酶(DNMT)”是酶，所述酶将甲基转移至DNA，并且通过上述过程抑制基因的表达。靶向DMNT的抑制剂通过抑制抑癌基因的高甲基化并诱导抑癌基因的正常表达而表现出抗癌活性。在一个实施方案中，靶向DNMT的抑制剂可以是阿扎胞苷、地西他滨或瓜地西他滨。
如本文所用，术语“CDK(细胞周期蛋白依赖性激酶)4/6”是调控细胞周期和促进细胞生长的蛋白质，并且在各种恶性肿瘤的发展和进展阶段被过度活化。靶向CDK4/6的抑制剂通过抑制癌细胞的细胞周期、抑制细胞增殖并诱导细胞死亡而表现出抗癌活性。靶向CDK4/6的抑制剂可以是阿贝西利或帕博西尼。
如本文所用，术语“STING(干扰素基因刺激物)”是一种体内传感物，其识别来源于癌细胞的DNA片段，并通过刺激干扰素基因来活化体内的免疫细胞，诸如树突细胞。STING激动剂表现出免疫增强效应和癌症血管生成抑制效应。例如，STING激动剂可以是CDN、SB11285、DMXAA等。
如本文所用，术语“抗癌病毒治疗剂”是通过将靶向癌细胞的特定基因***能够增殖并具有感染性的病毒来杀伤癌症的治疗剂。抗癌病毒治疗剂可以是Talimogenem或Laherparepvec。
如本文所用，术语“抗体治疗剂”是通过使用识别癌细胞的特定蛋白质作为抗原的抗体而表现出抗癌效应的治疗剂。所述抗体治疗剂可以是曲妥珠单抗、Emtansine、Emtansine、利妥昔单抗、替伊莫单抗、托西莫单抗、本妥昔单抗、奥法木单抗、奥比妥珠单抗、耐昔妥珠单抗(Necitumumab)、贝伐单抗、雷莫芦单抗、纳武单抗(Nivolumab)、派姆单抗(Pembrolizumab)、阿特朱单抗(Atezolizumab)、度伐鲁单抗(Durvalumab)、易普利姆玛单抗(Ipilimumab)等。
如本文所用，术语“免疫细胞治疗剂”是通过使用免疫细胞(诸如树突细胞、自然杀伤细胞和T细胞)在体内活化免疫应答而表现出抗癌效应的治疗剂。免疫细胞治疗剂是在提取和增强体内免疫细胞或对所述免疫细胞进行遗传工程化以重新注入体内后使用的。代表性的免疫细胞治疗剂包括经T细胞受体修饰的T细胞(TCR-T)、经嵌合抗原受体修饰的T细胞(CAR-T)等。具体地，所述免疫细胞治疗剂可以是Tisagenlecleucel或阿基仑赛(Axicabtagene Ciloleucel)，但不限于此。
如本文所用，术语“免疫检查点抑制剂”是抑制免疫检查点蛋白的活性的物质，所述免疫检查点蛋白抑制免疫细胞的分化、增殖和活性，并且已知所述免疫检查点抑制剂通过阻止癌细胞发挥逃避免疫***的功能来消除癌细胞。免疫检查点抑制剂可以是选自由以下项组成的组的任一者：抗CTLA-4抗体、抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗PD-L2抗体、抗B7-H4抗体、抗HVEM抗体、抗TIM3抗体、抗GAL9抗体、抗LAG3抗体、抗VISTA抗体、抗KIR抗体、抗BTLA抗体、和抗TIGIT抗体。在一个实施方案中，免疫检查点抑制剂可以是易普利姆玛单抗、派姆单抗、纳武单抗、西米普利单抗(Cemiplimab)、阿特珠单抗、阿维鲁单抗(Avelumab)、德瓦鲁单抗(Duralumab)等，但不限于此。
如本文所用，术语“ADC(抗体药物缀合物)”是一种治疗剂，其化学结合抗体和细胞毒性药物以通过靶向递送而表现出高抗癌效应。它可以是吉妥珠单抗-奥佐米星、本妥昔单抗-韦多汀(Vedotin)、曲妥珠单抗-Emtansine、依托珠单抗-奥佐米星、艾日布林-甲磺酸酯等。
包含IL-2蛋白和CD80蛋白的融合蛋白二聚体可以与抗癌疫苗等组合使用。
另外，抗癌剂不仅可以与上述抗癌剂组合使用，还可以与抗癌疫苗等组合使用。
优选地，所述抗癌剂可以是选自由以下项组成的组中的任一者：顺铂、奥沙利铂、ALTIMA、阿西替尼(VR1、VR2、VR3、PDGFR、c-kit)、戈鲁尼色特(TGFβRI)、乐伐替尼(VR1、VR2、VR3)、雷莫芦单抗(VR2)、卡博替尼(c-Met、VR2、AXL、RET)、奥拉帕尼(PARP)、瓜地西他滨(DNMT)、多西紫杉醇、紫杉醇、培美曲塞、维莫非尼(Braf)、阿贝西利(CD K4/6)、西妥昔单抗(EGFR)、度伐鲁单抗(PD-L1)、曲妥珠单抗(Her2)、DMXAA、NK细胞、T细胞和可瑞达(PD-1)。
此外，抗癌剂可以包括一种或多种抗癌剂。具体地，融合蛋白二聚体通常可以与两种抗癌剂一起使用。例如，所述两种抗癌剂可以是抗癌化疗剂和靶向抗癌剂；抗癌化疗剂和抗癌病毒；靶向抗癌剂和抗体治疗剂；抗癌化疗剂和细胞治疗剂；以及抗癌化疗剂和免疫检查点抑制剂。此外，所述两种抗癌剂可以是靶向抗癌剂和抗癌病毒；靶向抗癌剂和抗体治疗剂；靶向抗癌剂和细胞治疗剂；靶向抗癌剂和免疫检查点抑制剂。此外，所述两种抗癌剂可以是抗癌病毒和抗体治疗剂；抗癌病毒和细胞治疗剂；以及抗癌病毒和免疫检查点抑制剂。此外，所述两种抗癌剂也可以是抗体治疗剂和细胞治疗剂；以及抗体治疗剂和免疫检查点抑制剂。
此外，融合蛋白二聚体可以与三种抗癌剂一起使用。除了两种抗癌剂之外，还可以包括和使用不同的抗癌剂。
在一个实施方案中，所述抗癌剂可以是抗癌化疗剂和靶向抗癌剂；抗癌化疗剂和免疫检查点抑制剂；或抗癌化疗剂、靶向抗癌剂和免疫检查点抑制剂。
融合蛋白二聚体在抗癌维持疗法中的用途
在本发明的另一方面中，提供了一种用于抗癌维持疗法的组合物，所述组合物包含作为活性成分的融合蛋白二聚体，所述融合蛋白二聚体包含CD80蛋白或其片段和IL-2蛋白或其变体。
如上所述，“维持疗法”是指在初始抗癌治疗后治疗癌症。特别地，所述维持疗法是通过预防或延迟癌症的复发来提高癌症治疗效应的治疗方法。
在此，它可以进一步包括至少一种用于维持疗法的抗癌剂。在此，所述抗癌剂如上所述。
包含融合蛋白二聚体的试剂盒
在本发明的另一方面中，提供了一种用于预防或治疗癌症的试剂盒，所述试剂盒包含作为活性成分的融合蛋白二聚体，所述融合蛋白二聚体包含CD80蛋白或其片段和IL-2蛋白或其变体；以及抗癌剂。
在本发明的另一方面中，提供了一种用于抗癌维持疗法的试剂盒，所述试剂盒包含作为活性成分的融合蛋白二聚体，所述融合蛋白二聚体包含CD80蛋白或其片段和IL-2蛋白或其变体；以及抗癌剂。
包含IL-2蛋白和CD80蛋白的融合蛋白
如本文所用，除非另有说明，否则术语“IL-2”或“白介素-2”是指从任何脊椎动物来源获得的任何野生型IL-2，所述脊椎动物来源包括哺乳动物，例如灵长类动物(诸如人类)和啮齿动物(诸如小鼠和大鼠)。IL-2可以从动物细胞获得，并且还包括从能够产生IL-2的重组细胞获得的IL-2。此外，IL-2可以是野生型IL-2或其变体。
在本说明书中，IL-2或其变体可以统称为术语“IL-2蛋白”或“IL-2多肽”。IL-2、IL-2蛋白、IL-2多肽和IL-2变体特异性结合例如IL-2受体。这种特异性结合可以通过本领域技术人员已知的方法来鉴定。
IL-2的一个实施方案可以是SEQ ID NO:35或SEQ ID NO:36的氨基酸序列。在此，IL-2也可以是成熟形式。具体地，成熟的IL-2可以不包含信号序列，并且可以具有SEQ IDNO:10的氨基酸序列。在此，IL-2可以在涵盖野生型IL-2的片段的概念下使用，其中所述野生型IL-2的N末端或C末端的一部分被截短。
此外，IL-2的片段可以是这样的形式，其中1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个或25个连续的氨基酸是从具有SEQ ID NO:35或SEQ ID NO:36的氨基酸序列的蛋白质的N末端截短的。此外，IL-2的片段可以是这样的形式，其中1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个或25个连续的氨基酸是从具有SEQ ID NO:35或SEQ ID NO:36的氨基酸序列的蛋白质的C末端截短的。
如本文所用，术语“IL-2变体”是指这样的形式，其中全长IL-2或IL-2的上述片段中的氨基酸的一部分被取代。也就是说，IL-2变体可以具有不同于野生型IL-2或其片段的氨基酸序列。然而，IL-2变体可具有与野生型IL-2相当或相似的活性。在此，“IL-2活性”可以例如指与IL-2受体特异性结合，所述特异性结合可以通过本领域技术人员已知的方法来测量。
具体地，可以通过取代野生型IL-2中的氨基酸的一部分来获得IL-2变体。通过氨基酸取代获得的IL-2变体的一个实施方案可以通过取代SEQ ID NO:10的氨基酸序列中的第38位、第42位、第45位、第61位和第72位氨基酸中的至少一者而获得。
具体地，IL-2变体可以通过用另一种氨基酸取代SEQ ID NO:10的氨基酸序列中的第38位、第42位、第45位、第61位和第72位氨基酸中的至少一者而获得。此外，当IL-2是SEQID NO:35的氨基酸序列中的N末端的一部分被截短的形式时，在与SEQ ID NO:10的氨基酸序列中的位置互补地对应的位置处的氨基酸可以用另一种氨基酸取代。例如，当IL-2具有SEQ ID NO:35的氨基酸序列时，其IL-2变体可以通过用另一种氨基酸取代SEQ ID NO:35的氨基酸序列中的第58位、第62位、第65位、第81位、或第92位氨基酸中的至少一者而获得。这些氨基酸残基分别对应于SEQ ID NO:10的氨基酸序列中的第38位、第42位、第45位、第61位、和第72位氨基酸残基。根据一个实施方案，一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个氨基酸可以被取代，只要这种IL-2变体维持IL-2活性即可。根据另一个实施方案，可以取代一个至五个氨基酸。
在一个实施方案中，IL-2变体可以是其中两个氨基酸被取代的形式。具体地，IL-2变体可以通过取代SEQ ID NO:10的氨基酸序列中的第38位和第42位氨基酸而获得。此外，在一个实施方案中，IL-2变体可以通过取代SEQ ID NO:10的氨基酸序列中的第38位和第45位氨基酸而获得。此外，在一个实施方案中，IL-2变体可以通过取代SEQ ID NO:10的氨基酸序列中的第38位和第61位氨基酸而获得。此外，在一个实施方案中，IL-2变体可以通过取代SEQ ID NO:10的氨基酸序列中的第38位和第72位氨基酸而获得。此外，在一个实施方案中，IL-2变体可以通过取代SEQ ID NO:10的氨基酸序列中的第42位和第45位氨基酸而获得。此外，在一个实施方案中，IL-2变体可以通过取代SEQ ID NO:10的氨基酸序列中的第42位和第61位氨基酸而获得。此外，在一个实施方案中，IL-2变体可以通过取代SEQ ID NO:10的氨基酸序列中的第42位和第72位氨基酸而获得。此外，在一个实施方案中，IL-2变体可以通过取代SEQ ID NO:10的氨基酸序列中的第45位和第61位氨基酸而获得。此外，在一个实施方案中，IL-2变体可以通过取代SEQ ID NO:10的氨基酸序列中的第45位和第72位氨基酸而获得。此外，在一个实施方案中，IL-2变体可以通过取代SEQ ID NO:10的氨基酸序列中的第61位和第72位氨基酸而获得。
此外，IL-2变体可以是其中三个氨基酸被取代的形式。具体地，IL-2变体可以通过取代SEQ ID NO:10的氨基酸序列中的第38位、第42位和第45位氨基酸而获得。此外，在一个实施方案中，IL-2变体可以通过取代SEQ ID NO:10的氨基酸序列中的第38位、第42位和第61位氨基酸而获得。此外，在一个实施方案中，IL-2变体可以通过取代SEQ ID NO:10的氨基酸序列中的第38位、第42位和第72位氨基酸而获得。此外，在一个实施方案中，IL-2变体可以通过取代SEQ ID NO:10的氨基酸序列中的第38位、第45位和第61位氨基酸而获得。此外，在一个实施方案中，IL-2变体可以通过取代SEQ ID NO:10的氨基酸序列中的第38位、第45位和第72位氨基酸而获得。此外，在一个实施方案中，IL-2变体可以通过取代SEQ ID NO:10的氨基酸序列中的第38位、第61位和第72位氨基酸而获得。此外，在一个实施方案中，IL-2变体可以通过取代SEQ ID NO:10的氨基酸序列中的第42位、第45位和第61位氨基酸而获得。此外，在一个实施方案中，IL-2变体可以通过取代SEQ ID NO:10的氨基酸序列中的第42位、第45位和第72位氨基酸而获得。此外，在一个实施方案中，IL-2变体可以通过取代SEQID NO:10的氨基酸序列中的第45位、第61位和第72位氨基酸而获得。
此外，IL-2变体可以是其中四个氨基酸被取代的形式。具体地，IL-2变体可以通过取代SEQ ID NO:10的氨基酸序列中的第38位、第42位、第45位和第61位氨基酸而获得。此外，在一个实施方案中，IL-2变体可以通过取代SEQ ID NO:10的氨基酸序列中的第38位、第42位、第45位和第72位氨基酸而获得。此外，在一个实施方案中，IL-2变体可以通过取代SEQID NO:10的氨基酸序列中的第38位、第45位、第61位和第72位氨基酸而获得。此外，在一个实施方案中，IL-2变体可以通过取代SEQ ID NO:10的氨基酸序列中的第38位、第42位、第61位和第72位氨基酸而获得。此外，在一个实施方案中，IL-2变体可以通过取代SEQ ID NO:10的氨基酸序列中的第42位、第45位、第61位和第72位氨基酸而获得。
此外，IL-2变体可以是其中五个氨基酸被取代的形式。具体地，IL-2变体可以通过用另一种氨基酸取代SEQ ID NO:10的氨基酸序列中的第38位、第42位、第45位、第61和第72位氨基酸中的各者来获得。
在此，通过取代引入的“另一种氨基酸”可以是选自由以下项组成的组的任一者：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。然而，关于IL-2变体的氨基酸取代，在SEQ ID NO:10的氨基酸序列中，第38位氨基酸不能用精氨酸取代，第42位氨基酸不能用苯丙氨酸取代，第45位氨基酸不能用酪氨酸取代，第61位氨基酸不能用谷氨酸取代，并且第72位氨基酸不能用亮氨酸取代。
关于IL-2变体的氨基酸取代，在SEQ ID NO:10的氨基酸序列中，第38位氨基酸精氨酸可以用除精氨酸以外的氨基酸取代。优选地，关于IL-2变体的氨基酸取代，在SEQ IDNO:10的氨基酸序列中，第38位氨基酸精氨酸可以用丙氨酸(R38A)取代。
关于IL-2变体的氨基酸取代，在SEQ ID NO:10的氨基酸序列中，第42位氨基酸苯丙氨酸可以用除苯丙氨酸以外的氨基酸取代。优选地，关于IL-2变体的氨基酸取代，在SEQID NO:10的氨基酸序列中，第42位氨基酸苯丙氨酸可以用丙氨酸(F42A)取代。
关于IL-2变体的氨基酸取代，在SEQ ID NO:10的氨基酸序列中，第45位氨基酸酪氨酸可以用除酪氨酸以外的氨基酸取代。优选地，关于IL-2变体的氨基酸取代，在SEQ IDNO:10的氨基酸序列中，第45位氨基酸酪氨酸可以用丙氨酸(Y45A)取代。
关于IL-2变体的氨基酸取代，在SEQ ID NO:10的氨基酸序列中，第45位氨基酸谷氨酸可以用除谷氨酸以外的氨基酸取代。优选地，关于IL-2变体的氨基酸取代，在SEQ IDNO:10的氨基酸序列中，第61位氨基酸谷氨酸可以用精氨酸(E61R)取代。
关于IL-2变体的氨基酸取代，在SEQ ID NO:10的氨基酸序列中，第72位氨基酸亮氨酸可以用除亮氨酸以外的氨基酸取代。优选地，关于IL-2变体的氨基酸取代，在SEQ IDNO:10的氨基酸序列中，第72位氨基酸亮氨酸可以用甘氨酸(L72G)取代。
具体地，IL-2变体可以通过在SEQ ID NO:10的氨基酸序列中的至少一个选自由R38A、F42A、Y45A、E61R和L72G组成的组的取代获得。
具体地，IL-2变体可以通过在选自由R38A、F42A、Y45A、E61R和L72G组成的组中的位置中的两个、三个、四个或五个位置处的氨基酸取代而获得。
此外，IL-2变体可以是其中两个氨基酸被取代的形式。具体地，IL-2变体可以通过取代R38A和F42A获得。此外，在一个实施方案中，IL-2变体可以通过取代R38A和Y45A获得。此外，在一个实施方案中，IL-2变体可以通过取代R38A和E61R获得。此外，在一个实施方案中，IL-2变体可以通过取代R38A和L72G获得。此外，在一个实施方案中，IL-2变体可以通过F42A和Y45A的取代获得。此外，在一个实施方案中，IL-2变体可以通过取代F42A和E61R获得。此外，在一个实施方案中，IL-2变体可以通过取代F42A和L72G获得。此外，在一个实施方案中，IL-2变体可以通过取代E61R和L72G获得。
此外，IL-2变体可以是其中三个氨基酸被取代的形式。具体地，IL-2变体可以通过取代R38A、F42A和Y45A获得。此外，在一个实施方案中，IL-2变体可以通过取代R38A、F42A和E61R获得。此外，在一个实施方案中，IL-2变体可以通过取代R38A、F42A和L72G获得。此外，在一个实施方案中，IL-2变体可以通过取代R38A、Y45A和E61R获得。此外，在一个实施方案中，IL-2变体可以通过取代R38A、Y45A和L72G获得。此外，在一个实施方案中，IL-2变体可以通过取代F42A、Y45A和E61R获得。此外，在一个实施方案中，IL-2变体可以通过取代F42A、Y45A和L72G获得。此外，在一个实施方案中，IL-2变体可以通过取代F42A、E61R和L72G的获得。此外，在一个实施方案中，IL-2变体可以通过取代Y45A、E61R和L72G获得。
此外，IL-2变体可以是其中四个氨基酸被取代的形式。具体地，IL-2变体可通过取代R38A、F42A、Y45A和E61R获得。此外，在一个实施方案中，IL-2变体可以通过取代R38A、F42A、Y45A和L72G获得。此外，在一个实施方案中，IL-2变体可以通过取代R38A、F42A、E61R和L72G获得。此外，在一个实施方案中，IL-2变体可以通过取代R38A、Y45A、E61R和L72G获得。此外，在一个实施方案中，IL-2变体可以通过取代F42A、Y45A、E61R和L72G获得。
此外，IL-2变体可以通过取代R38A、F42A、Y45A、E61R和L72G获得。
优选地，IL-2变体的一个实施方案可以在SEQ ID NO:10的氨基酸序列中含有选自以下取代组合(a)至(d)中的任一者：
(a)R38A/F42A
(b)R38A/F42A/Y45A
(c)R38A/F42A/E61R
(d)R38A/F42A/L72G
在此，当IL-2具有SEQ ID NO:35的氨基酸序列时，氨基酸取代可以存在于与SEQID NO:10的氨基酸序列中的位置互补地对应的位置处。此外，即使当IL-2是SEQ ID NO:35的氨基酸序列的片段时，氨基酸取代也可存在于与SEQ ID NO:10的氨基酸序列中的位置互补地对应的位置处。
具体地，IL-2变体可具有SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、或SEQ IDNO:24的氨基酸序列。
此外，IL-2变体的特征可能在于具有低体内毒性。在此，低体内毒性可能是由IL-2与IL-2受体α链(IL-2Rα)结合引起的副作用。已经开发了多种IL-2变体来改善由IL-2与IL-2Rα结合引起的副作用，并且此类IL-2变体可以是美国专利号5,229,109和韩国专利号1667096中公开的那些。特别地，本申请中所述的IL-2变体对IL-2受体α链(IL-2Rα)具有低结合能力，并且因此具有比野生型IL-2更低的体内毒性。
如本文所用，术语“CD80”，也称为“B7-1”，是存在于树突细胞、活化B细胞和单核细胞中的膜蛋白。CD80提供对T细胞的活化和存活至关重要的共刺激信号。CD80被称为存在于T细胞的表面上的两种不同蛋白质CD28和CTLA-4的配体。CD80由288个氨基酸构成，并且具体可具有SEQ ID NO:11的氨基酸序列。此外，如本文所用，术语“CD80蛋白”是指全长CD80或CD80片段。
如本文所用，术语“CD80片段”是指切割形式的CD80。此外，CD80片段可以是CD80的细胞外结构域。CD80片段的一个实施方案可以通过从N末端消除作为CD80的信号序列的第1个至第34个氨基酸而获得。具体地，CD80片段的一个实施方案可以是由SEQ ID NO:11中的第35位至第288位氨基酸构成的蛋白质。此外，CD80片段的一个实施方案可以是由SEQ IDNO:11中的第35位至第242位氨基酸构成的蛋白质。此外，CD80片段的一个实施方案可以是由SEQ ID NO:11中的第35位至第232位氨基酸构成的蛋白质。此外，CD80片段的一个实施方案可以是由SEQ ID NO:11中的第35位至第139位氨基酸构成的蛋白质。此外，CD80片段的一个实施方案可以是由SEQ ID NO:11中的第35位至第242位氨基酸构成的蛋白质。在一个实施方案中，CD80片段可以具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列。
此外，IL-2蛋白和CD80蛋白可以通过接头或载体彼此附接。具体地，IL-2或其变体和CD80(B7-1)或其片段可以通过接头或载体彼此附接。在本说明书中，接头和载体可以互换使用。
接头连接两个蛋白质。接头的一个实施方案可以包含1个至50个氨基酸、白蛋白或其片段、免疫球蛋白的Fc结构域等。在此，免疫球蛋白的Fc结构域是指含有免疫球蛋白的重链恒定区2(CH2)和重链恒定区3(CH3)并且不含有免疫球蛋白的重链和轻链可变区和轻链恒定区1(CH1)的蛋白质。免疫球蛋白可以是IgG、IgA、IgE、IgD或IgM，并且可以优选地是IgG4。在此，野生型免疫球蛋白G4的Fc结构域可以具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列。
此外，免疫球蛋白的Fc结构域可以是Fc结构域变体以及野生型Fc结构域。此外，如本文所用，术语“Fc结构域变体”可以指这样的形式，所述形式在糖基化模式方面与野生型Fc结构域不同、与野生型Fc结构域相比具有高糖基化、或与野生型Fc结构域相比具有低糖基化、或为去糖基化形式。此外，其中包括非糖基化的Fc结构域。通过宿主的培养条件或遗传操纵，Fc结构域或其变体可经调适以具有经调整的数量的唾液酸、岩藻糖基化、或糖基化。
此外，免疫球蛋白的Fc结构域的糖基化可以通过常规方法(诸如化学方法、酶促方法、和使用微生物的遗传工程方法)进行修饰。此外，Fc结构域变体可以是免疫球蛋白IgG、IgA、IgE、IgD和IgM的相应Fc区的混合形式。此外，Fc结构域变体可以是其中Fc结构域的一些氨基酸被其他氨基酸取代的形式。Fc结构域变体的一个实施方案可以具有SEQ ID NO:12的氨基酸序列。
融合蛋白可以具有这样的结构，在所述结构中使用Fc结构域作为接头(或载体)，CD80蛋白和IL-2蛋白、或IL-2蛋白和CD80蛋白分别连接至接头或载体的N末端和C末端。Fc结构域的N末端或C末端与CD-80或IL-2之间的连接可以任选地通过接头肽来实现。
具体地，融合蛋白可以由以下结构式(I)或(II)组成：
N'-X-[接头(1)]n-Fc结构域-[接头(2)]m-Y-C' (I)
N'-Y-[接头(1)]n-Fc结构域-[接头(2)]m-X-C' (II)
在此，在结构式(I)和(II)中，
N'是融合蛋白的N末端，
C'是融合蛋白的C末端，
X是CD80蛋白，
Y是IL-2蛋白，
接头(1)和(2)是肽接头，并且
n和m各自独立地为0或1。
优选地，融合蛋白可以由结构式(I)组成。IL-2蛋白质如上所述。此外，CD80蛋白质如上所述。根据一个实施方案，IL-2蛋白可以是与野生型IL-2相比具有1个至5个氨基酸取代的IL-2变体。CD80蛋白可以是通过从野生型CD80的N末端或C末端截短多达约34个连续氨基酸残基而获得的片段。或者，CD蛋白可以是具有结合T细胞表面受体CTLA-4和CD28的活性的细胞外免疫球蛋白样结构域。
具体地，融合蛋白可以具有SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、或SEQ IDNO:30的氨基酸序列。根据另一个实施方案，融合蛋白包含与SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、或SEQ ID NO:30的氨基酸序列具有85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的多肽。在此，同一性例如是同源性百分比，并且可以通过同源性比较软件诸如国家生物技术信息中心(National Center of Biotechnology Information,NCBI)的BlastN软件来确定。
肽接头(1)可以被包含在CD80蛋白与Fc结构域之间。肽接头(1)可由5个至80个连续氨基酸、20个至60个连续氨基酸、25个至50个连续氨基酸、或30个至40个连续氨基酸组成。在一个实施方案中，肽接头(1)可以由30个氨基酸组成。此外，肽接头(1)可以含有至少一个半胱氨酸。具体地，肽接头(1)可以含有一个、两个或三个半胱氨酸。此外，肽接头(1)可以来源于免疫球蛋白的铰链。在一个实施方案中，肽接头(1)可以是由SEQ ID NO:3的氨基酸序列组成的肽接头。
肽接头(2)可由1个至50个连续氨基酸、3个至30个连续氨基酸、或5个至15个连续氨基酸组成。在一个实施方案中，肽接头(2)可以是(G4S)n(其中n是1至10的整数)。在此，在(G4S)n中，n可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10。在一个实施方案中，肽接头(2)可以是由SEQID NO:5的氨基酸序列组成的肽接头。
在本发明的另一方面中，提供了一种通过结合两种融合蛋白获得的二聚体，所述两种融合蛋白中的每种融合蛋白都包含IL-2蛋白和CD80蛋白。包含IL-2或其变体和CD80或其片段的融合蛋白如上所述。
在此，构成二聚体的融合蛋白之间的结合可以通过但不限于由接头中存在的半胱氨酸形成的二硫键来实现。构成二聚体的融合蛋白可以是彼此相同或不同的融合蛋白。优选地，二聚体可以是同型二聚体。构成二聚体的融合蛋白的一个实施方案可以是具有SEQID NO:9的氨基酸序列的蛋白质。
医药用途
本发明的用于治疗或预防癌症的药物组合物可以增强治疗和/或预防癌症的功效，所述药物组合物包含作为活性成分的含有IL-2蛋白和CD80蛋白的融合蛋白；以及抗癌剂。
包含IL-2蛋白和CD80蛋白的融合蛋白，或其中两个融合蛋白附接的融合蛋白二聚体如上所述。
癌症可以选自由以下项组成的组：胃癌、肝癌、肺癌、结直肠癌、乳腺癌、***癌、卵巢癌、胰腺癌、***、甲状腺癌、喉癌、急性髓性白血病、脑瘤、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、头颈癌、唾腺癌、和淋巴瘤。
所述药物组合物的优选剂量取决于患者的状况和体重、疾病的严重程度、药物形式、施用的途径和持续时间而变化，并且可以由本领域的技术人员适当地选择。在本发明的用于治疗或预防癌症的药物组合物中，活性成分可以取决于应用、剂型、共混目的等以任何量(有效量)被包含，只要所述活性成分能够表现出抗癌活性即可。基于组合物的总重量，其常规有效量将被确定为在按重量计0.001重量％至20.0重量％的范围内。在此，术语“有效量”是指能够诱导抗癌效应的活性成分的量。此类有效量可以在本领域技术人员的常识范围内实验地确定。
如本文所用，术语“治疗”可用于意指治疗性治疗和预防性治疗两者。在此，预防可用于意指个体的病理状况或疾病得到缓解或减轻。在一个实施方案中，术语“治疗”包括用于治疗包括人在内的哺乳动物的疾病的应用或任何形式的施用两者。此外，该术语包括抑制或减缓疾病或疾病进展；并且包括恢复或修复受损或丧失的功能以使疾病被部分或完全缓解；刺激低效过程；或减轻严重疾病的含义。
如本文所用，术语“功效”是指可以由一个或多个参数确定的能力，例如，在诸如一年、五年或十年的特定时间段内的存活率或无病存活率。此外，该参数可以包括对个体中至少一种肿瘤的大小的抑制。
药代动力学参数(诸如生物利用度)和潜在参数(诸如清除率)也可能影响功效。因此，“增强的功效”(例如，功效的改善)可能是由于增强的药代动力学参数和提高的功效，这可以通过比较试验动物或人类受试者中的清除率和肿瘤生长，或通过比较参数(诸如存活率、复发或无病存活率)来测量。
如本文所用，术语“治疗有效量”或“医药上有效的量”是指有效预防或治疗所讨论疾病的化合物或组合物的量，所述量足以以适用于医疗并且不会造成副作用的合理的益处/风险比治疗疾病。有效量的水平可取决于包括患者的健康状况、疾病的类型和严重程度、药物的活性、患者对药物的敏感性、施用模式、施用时间、施用途径和***率、治疗持续时间、制剂或同时使用的药物，以及医学领域中众所周知的其他因素在内的因素来确定。在一个实施方案中，治疗有效量是指有效治疗癌症的药物的量。
在此，药物组合物可以进一步包含药学上可接受的载体。所述药学上可接受的载体可以是任何载体，只要所述载体是适合递送至患者的无毒物质即可。可以含有蒸馏水、醇、脂肪、蜡和惰性固体作为载体。药物组合物中还可含有药学上可接受的佐剂(缓冲剂、分散剂)。
具体地，通过除了活性成分之外还包含药学上可接受的载体，所述药物组合物可以使用本领域中已知的常规方法根据其施用途径制备成肠胃外制剂。在此，术语“药学上可接受的”意指载体不具有比待应用(开处方)的受试者可以适应的更多的毒性，与此同时不抑制活性成分的活性。
当药物组合物被制备成肠胃外制剂时，其可以可以根据本领域中已知的方法用合适的载体制成注射剂、透皮贴剂、经鼻吸入剂或栓剂形式的制备物。在制成注射剂的情况下，可以使用无菌水、乙醇、多元醇(诸如甘油或丙二醇)或它们的混合物作为合适的载体；并且可以优选地使用等渗溶液，诸如林格氏溶液、含有三乙醇胺的磷酸盐缓冲盐水(PBS)或注射用无菌水、和5％右旋糖等。药物组合物的制剂是本领域中已知的，并且可以具体地参考Remington's Pharmaceutical Sciences(第19版，1995)等。此文件被认为是本说明书的一部分。
取决于患者的状况、体重、性别、年龄、患者的严重程度和施用途径，所述药物组合物的优选剂量可以在每天0.01μg/kg至10g/kg、或0.01mg/kg至1g/kg的范围内。剂量可以每天施用一次，或者可以分成一天数次。此类剂量不应被解释为在任何方面限制本发明的范围。
药物组合物可以应用(开处方)于的受试者是哺乳动物和人类，其中人类是特别优选的。除活性成分外，本申请的药物组合物可以进一步含有任何已经过安全性验证并且已知具有抗癌活性或对传染病的治疗效应的化合物或天然提取物，以达到促进或增强抗癌活性的目的。
包含融合蛋白二聚体和抗癌剂的组合物的用途
在本发明的另一方面中，提供了用于联合施用的组合物用于治疗癌症疾病的用途，所述组合物包含含有CD80蛋白或其片段和IL-2蛋白或其变体的融合蛋白二聚体；以及抗癌剂。
在本发明的另一方面中，提供了用于联合施用的组合物用于增强对癌症疾病的治疗效应的用途，所述组合物包含含有IL-2蛋白和CD80蛋白的融合蛋白二聚体；以及抗癌剂。
在本发明的另一方面中，提供了包含CD80蛋白或其片段和IL-2蛋白或其变体的融合蛋白二聚体用于维持疗法的用途。在此，可以进一步包含抗癌剂。
在本发明的另一方面中，提供了一种用于治疗癌症疾病的方法和/或一种用于增强治疗效应的方法，所述方法包括向受试者施用包含IL-2蛋白和CD80蛋白的融合蛋白或其中两种融合蛋白彼此结合的融合蛋白二聚体，以及抗癌剂的步骤。
受试者可以是患有癌症的受试者。此外，受试者可以是哺乳动物，优选人。包含IL-2蛋白和CD80蛋白的融合蛋白或其中两种融合蛋白彼此结合的融合蛋白二聚体如上所述。
融合蛋白或融合蛋白二聚体的施用途径、剂量、和施用频率可以取决于患者的状况和是否存在副作用而变化，并且因此可以将融合蛋白或融合蛋白二聚体以各种方式和量施用于受试者。本领域技术人员可以在适当的范围内选择最佳的施用方法、施用剂量和施用频率。此外，融合蛋白或融合蛋白二聚体可以与其他药物(例如，上述抗癌剂)或对待治疗的疾病的治疗效果已知的生理活性物质联合施用，或者可以与其他药物一起配制成组合制备物的形式。
由于IL-2活性，本发明实施方案中的融合蛋白可以活化免疫细胞，诸如自然杀伤细胞。因此，所述融合蛋白可以有效地用于癌症疾病。具体地，鉴定出如与野生型相比，具有2个至5个氨基酸取代的IL-2变体，特别是在SEQ ID NO:10的氨基酸序列中在选自由R38A、F42A、Y45A、E61R和L72G组成的组的位置中的2个、3个、4个或5个位置处含有氨基酸取代的IL-2变体，具有对IL-2受体α链的低结合能力，并且因此表现出与常规IL-2的药理学副作用相关的改善的特性。因此，此类IL-2变体，当单独使用或以融合蛋白的形式使用时，可以降低血管(或毛细血管)渗漏综合征(VLS)的发生率，VLS是IL-2的常规已知问题。
包含作为活性成分的IL-2蛋白或其变体、CD80蛋白或其变体以及抗癌剂的药物组合物
在本发明的另一方面中，提供了一种用于治疗癌症的组合物，所述组合物包含作为活性成分的IL-2或其变体、CD80蛋白或其变体；以及抗癌剂。
在此，IL-2或其变体如上所述。此外，IL-2或其变体可以进一步包含免疫球蛋白Fc区。在此，IL-2或其变体可以与Fc区的N末端或C末端结合。在一个实施方案中，IL-2或其变体可以结合至Fc区的C末端。另外，如上所述，IL-2的变体可以是2个氨基酸被取代的形式或者3个氨基酸被取代的形式。在此，IL-2或其变体可以直接与Fc区结合，但是也可以通过肽接头结合。在此，肽接头可以是上述接头中的任何一种接头。
此外，CD80蛋白或其变体如上所述。此外，CD80或其变体可以进一步包含免疫球蛋白Fc区。在此，CD80或其变体可以与Fc区的N末端或C末端结合。在此，CD80可以是片段的形式，并且可以是包含V结构域的CD80的片段。在一个实施方案中，CD80或变体可以结合至Fc区的N末端。此外，CD80的变体可以是各种形式的变体，只要维持其活性即可。
此外，抗癌剂可以是选自上述各种类型的抗癌剂中的任一者。
用于实行本发明的模式
在下文中，将通过以下实施例更详细地描述本发明。然而，以下实施例仅用于说明本发明，并且本发明的范围不限于此。
I.融合蛋白的制备
制备例1.hCD80-Fc-IL-2变体(2M)的制备：GI101
为了产生包含人CD80片段、Fc结构域和IL-2变体的融合蛋白，通过ThermoFisherScientific的Invitrogen GeneArt基因合成服务合成多核苷酸。具体地，所述多核苷酸含有核苷酸序列(SEQ ID NO:8)，所述核苷酸序列编码融合蛋白，所述融合蛋白从N末端起以此次序含有信号肽(SEQ ID NO:1)、CD80片段(SEQ ID NO:2)、Ig铰链(SEQ ID NO:3)、Fc结构域(SEQ ID NO:4)、接头(SEQ ID NO:5)和具有两个氨基酸取代的IL-2变体(2M)(R38A、F42A)(SEQ ID NO:6)。将所述多核苷酸***pcDNA3_4载体中。此外，将所述载体导入CHO细胞(Expi-CHOTM)以表达SEQ ID NO:9的融合蛋白。在导入所述载体后，在37℃、125rpm和8％CO2浓度的环境中执行培养7天。然后，收获培养物并从中纯化出融合蛋白。将纯化的融合蛋白命名为“GI101”。
使用含有MabSelect SuRe蛋白A树脂的色谱法进行纯化。所述融合蛋白在25mMTris、25mM NaCl，pH 7.4的条件下与所述树脂结合。然后，用100mM NaCl和pH为3的100mM乙酸执行洗脱。将pH为9的20％1M Tris-HCl置于收集管中，然后收集融合蛋白。对于所收集的融合蛋白，将缓冲液通过用PBS缓冲液透析16小时进行交换。
此后，使用TSKgel G3000SWXL柱(TOSOH Bioscience)，通过尺寸排阻色谱法随时间推移测量280nm波长处的吸光度，以获得高度浓缩的融合蛋白。在此，将经分离且纯化的融合蛋白在还原(R)或非还原(NR)条件下进行SDS-PAGE，并用考马斯亮蓝染色以检查其纯度(图6)。当用NanoDrop检测时，鉴定出融合蛋白以2.78mg/ml的浓度被包含(图7)。此外，通过使用尺寸排阻色谱法分析获得的结果在图8中提供。
制备例2.mCD80-Fc-IL-2变体(2M)：mGI101的制备
为了产生包含小鼠CD80、Fc结构域和IL-2变体的融合蛋白，通过ThermoFisherScientific的Invitrogen GeneArt基因合成服务合成多核苷酸。具体地，所述多核苷酸含有核苷酸序列(SEQ ID NO:14)，所述核苷酸序列编码融合蛋白，所述融合蛋白从N末端起以此次序含有信号肽(SEQ ID NO:1)、mCD80(SEQ ID NO:13)、Ig铰链(SEQ ID NO:3)、Fc结构域(SEQ ID NO:4)、接头(SEQ ID NO:5)和具有两个氨基酸取代的IL-2变体(2M)(R38A、F42A)(SEQ ID NO:6)。将所述多核苷酸***pcDNA3_4载体中。此外，将所述载体导入CHO细胞(Expi-CHOTM)以表达SEQ ID NO:15的融合蛋白。在导入所述载体后，在37℃、125rpm和8％CO2浓度的环境中执行培养7天。然后，收获培养物并从中纯化出融合蛋白。将纯化的融合蛋白命名为“mGI101”。
融合蛋白的纯化和收集以与制备例1相同的方式进行。将经分离且纯化的融合蛋白在还原(R)或非还原(NR)条件下进行SDS-PAGE，并用考马斯亮蓝染色以检查其纯度(图9)。当使用NanoDrop通过280nm处的吸光度检测时，发现融合蛋白以1.95mg/ml的浓度被包含。
制备例3.hCD80-Fc：GI101C1的制备
为了产生包含人CD80片段和Fc结构域的融合蛋白，通过ThermoFisherScientific的Invitrogen GeneArt基因合成服务合成多核苷酸。具体地，所述多核苷酸含有核苷酸序列(SEQ ID NO:16)，所述核苷酸序列编码融合蛋白，所述融合蛋白含有信号肽(SEQ ID NO:1)、CD80片段(SEQ ID NO:2)、Ig铰链(SEQ ID NO:3)和Fc结构域(SEQ ID NO:4)。将所述多核苷酸***pcDNA3_4载体中。此外，将所述载体导入CHO细胞(Expi-CHOTM)以表达SEQ ID NO:17的融合蛋白。在导入所述载体后，在37℃、125rpm和8％CO2浓度的环境中执行培养7天。然后，收获培养物并从中纯化出融合蛋白。将纯化的融合蛋白命名为“GI101C1”。
融合蛋白的纯化和收集以与制备例1相同的方式进行。将经分离且纯化的融合蛋白在还原(R)或非还原(NR)条件下进行SDS-PAGE，并用考马斯亮蓝染色以检查其纯度(图10)。当使用NanoDrop通过280nm处的吸光度检测时，观察到融合蛋白以3.61mg/ml的浓度被包含。
制备例4.Fc-IL-2变体(2M)：GI101C2的制备
为了产生包含Fc结构域和IL-2变体的融合蛋白，通过ThermoFisher Scientific的Invitrogen GeneArt基因合成服务合成多核苷酸。具体地，所述多核苷酸含有核苷酸序列(SEQ ID NO:18)，所述核苷酸序列编码融合蛋白，所述融合蛋白从N末端起以此次序含有信号肽(SEQ ID NO:1)、Fc结构域(SEQ ID NO:4)、接头(SEQ ID NO:5)和具有两个氨基酸取代的IL-2变体(2M)(R38A、F42A)(SEQ ID NO:6)。将所述多核苷酸***pcDNA3_4载体中。此外，将所述载体导入CHO细胞(Expi-CHOTM)以表达SEQ ID NO:19的融合蛋白。在导入所述载体后，在37℃、125rpm和8％CO2浓度的环境中执行培养7天。然后，收获培养物并从中纯化出融合蛋白。将纯化的融合蛋白命名为“GI101C2”。
融合蛋白的纯化和收集以与制备例1相同的方式进行。将经分离且纯化的融合蛋白在还原(R)或非还原(NR)条件下进行SDS-PAGE，并用考马斯亮蓝染色以检查其纯度(图11)。当使用NanoDrop通过280nm处的吸光度检测时，发现融合蛋白以4.79mg/ml的浓度被包含。
制备例5.mCD80-Fc：mGI101C1的制备
为了产生包含小鼠CD80和Fc结构域的融合蛋白，通过ThermoFisher Scientific的Invitrogen GeneArt基因合成服务合成多核苷酸。具体地，所述多核苷酸含有核苷酸序列(SEQ ID NO:20)，所述核苷酸序列编码融合蛋白，所述融合蛋白从N末端起以此次序含有信号肽(SEQ ID NO:1)、小鼠CD80(SEQ ID NO:13)、Ig铰链(SEQ ID NO:3)和Fc结构域(SEQID NO:4)。将所述多核苷酸***pcDNA3_4载体中。此外，将所述载体导入CHO细胞(Expi-CHOTM)以表达SEQ ID NO:21的融合蛋白。在导入所述载体后，在37℃、125rpm和8％CO2浓度的环境中执行培养7天。然后，收获培养物并从中纯化出融合蛋白。将纯化的融合蛋白命名为“mGI101C1”。
融合蛋白的纯化和收集以与制备例1相同的方式进行。将经分离且纯化的融合蛋白在还原(R)或非还原(NR)条件下进行SDS-PAGE，并用考马斯亮蓝染色以检查其纯度(图12)。当使用NanoDrop通过280nm处的吸光度检测时，观察到融合蛋白以2.49mg/ml的浓度被包含。
在制备例1至制备例5中制备的融合蛋白汇总在下表1中。
[表1]
Figure BDA0003850098890000381
制备例6.CD80-Fc-IL-2：GI101w的制备
为了产生包含人CD80片段、Fc结构域和人IL-2的融合蛋白，通过ThermoFisherScientific的Invitrogen GeneArt基因合成服务合成多核苷酸。具体地，所述多核苷酸含有核苷酸序列(SEQ ID NO:31)，所述核苷酸序列编码融合蛋白，所述融合蛋白从N末端起以此次序含有信号肽(SEQ ID NO:1)、CD80片段(SEQ ID NO:2)、Ig铰链(SEQ ID NO:3)、Fc结构域(SEQ ID NO:4)、接头(SEQ ID NO:5)和成熟的人IL-2(SEQ ID NO:10)。将所述多核苷酸***pcDNA3_4载体中。此外，将所述载体导入CHO细胞(Expi-CHOTM)以表达SEQ ID NO:32的融合蛋白。在导入所述载体后，在37℃、125rpm和8％CO2浓度的环境中执行培养7天。然后，收获培养物并从中纯化出融合蛋白。将纯化的融合蛋白命名为“GI101w”。融合蛋白的纯化和收集以与制备例1相同的方式进行。
制备例7.hCD80-Fc-IL-2变体(3M)：GI102-M45的制备
为了产生包含人CD80片段、Fc结构域和具有三个氨基酸取代的IL-2变体(3M)(R38A、F42A和Y45A)的融合蛋白(GI102-M45)，通过ThermoFisher Scientific的Invitrogen GeneArt基因合成服务合成多核苷酸。具体地，所述多核苷酸含有核苷酸序列(SEQ ID NO:25)，所述核苷酸序列编码融合蛋白，所述融合蛋白从N末端起以此次序含有信号肽(SEQ ID NO:1)、CD80片段(SEQ ID NO:2)、Ig铰链(SEQ ID NO:3)、Fc结构域(SEQ IDNO:4)、接头(SEQ ID NO:5)和IL-2变体(SEQ ID NO:22)。将所述多核苷酸***pcDNA3_4载体中。此外，将所述载体导入CHO细胞(Expi-CHOTM)以表达SEQ ID NO:26的融合蛋白。在导入所述载体后，在37℃、125rpm和8％CO2浓度的环境中执行培养7天。然后，收获培养物并从中纯化出融合蛋白。将纯化的融合蛋白命名为“GI102-M45”。
融合蛋白的纯化和收集以与制备例1相同的方式进行。将经分离且纯化的融合蛋白在还原(R)或非还原(NR)条件下进行SDS-PAGE，并用考马斯亮蓝染色以检查其纯度(图13)。
制备例8.hCD80-Fc-IL-2变体(3M)：GI102-M61的制备
为了产生包含人CD80片段、Fc结构域和具有三个氨基酸取代的IL-2变体(3M)(R38A、F42A和E61R)的融合蛋白(GI102-M61)，通过ThermoFisher Scientific的Invitrogen GeneArt基因合成服务合成多核苷酸。具体地，所述多核苷酸含有核苷酸序列(SEQ ID NO:27)，所述核苷酸序列编码融合蛋白，所述融合蛋白从N末端起以此次序含有信号肽(SEQ ID NO:1)、CD80片段(SEQ ID NO:2)、Ig铰链(SEQ ID NO:3)、Fc结构域(SEQ IDNO:4)、接头(SEQ ID NO:5)和IL-2变体(SEQ ID NO:23)。将所述多核苷酸***pcDNA3_4载体中。此外，将所述载体导入CHO细胞(Expi-CHOTM)以表达SEQ ID NO:28的融合蛋白。在导入所述载体后，在37℃、125rpm和8％CO2浓度的环境中执行培养7天。然后，收获培养物并从中纯化出融合蛋白。将纯化的融合蛋白命名为“GI102-M61”。
融合蛋白的纯化和收集以与制备例1相同的方式进行。将经分离且纯化的融合蛋白在还原(R)或非还原(NR)条件下进行SDS-PAGE，并用考马斯亮蓝染色以检查其纯度(图14)。
制备例9.hCD80-Fc-IL-3M：GI102-M72的制备
为了产生包含人CD80片段、Fc结构域和具有三个氨基酸取代的IL-2变体(3M)(R38A、F42A和L72G)的融合蛋白(GI102-M72)，通过ThermoFisher Scientific的Invitrogen GeneArt基因合成服务合成多核苷酸。具体地，所述多核苷酸含有核苷酸序列(SEQ ID NO:29)，所述核苷酸序列编码融合蛋白，所述融合蛋白从N末端起以此次序含有信号肽(SEQ ID NO:1)、CD80片段(SEQ ID NO:2)、Ig铰链(SEQ ID NO:3)、Fc结构域(SEQ IDNO:4)、接头(SEQ ID NO:5)和IL-2变体(SEQ ID NO:24)。将所述多核苷酸***pcDNA3_4载体中。此外，将所述载体导入CHO细胞(Expi-CHOTM)以表达SEQ ID NO:30的融合蛋白。在导入所述载体后，在37℃、125rpm和8％CO2浓度的环境中执行培养7天。然后，收获培养物并从中纯化出融合蛋白。将纯化的融合蛋白命名为“GI102-M72”。
融合蛋白的纯化和收集以与制备例1相同的方式进行。将经分离且纯化的融合蛋白在还原(R)或非还原(NR)条件下进行SDS-PAGE，并用考马斯亮蓝染色以检查其纯度(图15)。
制备例10.mCD80-Fc-IL-3M：mGI102-M61的制备
为了产生包含小鼠CD80片段、Fc结构域和具有三个氨基酸取代的IL-2变体(3M)(R38A、F42A和E61R)的融合蛋白(GI102-M61)，通过ThermoFisher Scientific的Invitrogen GeneArt基因合成服务合成多核苷酸。具体地，所述多核苷酸含有核苷酸序列(SEQ ID NO:33)，所述核苷酸序列编码融合蛋白，所述融合蛋白从N末端起以此次序含有信号肽(SEQ ID NO:1)、mCD80片段(SEQ ID NO:13)、Ig铰链(SEQ ID NO:3)、Fc结构域(SEQ IDNO:4)、接头(SEQ ID NO:5)和IL-2变体(SEQ ID NO:23)。将所述多核苷酸***pcDNA3_4载体中。此外，将所述载体导入CHO细胞(Expi-CHOTM)以表达SEQ ID NO:34的融合蛋白。在导入所述载体后，在37℃、125rpm和8％CO2浓度的环境中执行培养7天。然后，收获培养物并从中纯化出融合蛋白。将纯化的融合蛋白命名为“mGI102-M61”。
融合蛋白的纯化和收集以与制备例1相同的方式进行。
II.融合蛋白与其配体之间的结合亲和力的鉴定
为了鉴定融合蛋白与其配体之间的结合亲和力，使用Octet RED 384测量结合亲和力。
实验例1.hCTLA-4与GI101之间的结合亲和力的鉴定
将AR2G生物传感器(胺反应性第2代，ForteBio，目录号：18-5092)预先在96孔微孔板(GreinerBio-one，目录号：655209)中用200μl蒸馏水水合。用10mM乙酸盐缓冲液(pH 5，AR2G试剂盒，ForteBio，目录号：18-5095)将待附接至AR2G生物传感器的配体(CTLA-4，人CTLA-4/CD152，His标签，Sino Biological，目录号：11159-H08H)稀释至5μg/ml的浓度。此外，用1X AR2G动力学缓冲液(AR2G试剂盒，ForteBio，目录号：18-5095)将待附接至配体的GI101稀释至1,000nM、500nM、250nM、125nM、或62.5nM的浓度。通过在蒸馏水中混合20mMEDC和10mM s-NHS(AR2G试剂盒，ForteBio，目录号：18-5095)来制备活化缓冲液。将80μl的每种试剂置于384孔微孔板(GreinerBio-one，目录号：781209)中并设置程序。
结果，如图16所示测量hCTLA-4与GI101之间的结合亲和力。
实验例2.hPD-L1/GI101与hPD-L1/PD-1之间的结合亲和力的鉴定
将Ni-NTA(带镍的Tris-NTA，Ni-NTA生物传感器，ForteBio，18-5101)预先在96孔微孔板中用200μl的1X Ni-NTA动力学缓冲液(10X Kinetics缓冲液，ForteBio，18-1042)水合。用1X Ni-NTA动力学缓冲液将待附接至Ni-NTA生物传感器的配体(人PD-L1/B7-H1蛋白，His-标签，Sino biological，目录号：10084-H08H)稀释至5μg/ml的浓度。用1X Ni-NTA动力学缓冲液将待附接至配体的GI101稀释至1,000nM、500nM、250nM、125nM、或62.5nM的浓度。此外，用1X Ni-NTA动力学缓冲液将待附接至配体的人PD-1/PDCD1(人PD-1/PDCD1，Fc标签，Sino Biological，目录号：10377-H02H)稀释至2,000nM、1,000nM、500nM、250nM、或125nM的浓度。然后，将80μl的每种试剂置于384孔微孔板中并设置程序。
结果，如图17所示测量hPD-L1与GI101之间的结合亲和力。此外，如图18所示测量hPD-L1与hPD-1之间的结合|亲和力。
实验例3.mCTLA-4与mGI101之间的结合亲和力的鉴定
以与实验例1中相同的方式鉴定mCTLA-4与mGI101之间的结合亲和力。在此，所使用的设备如下：生物传感器：AR2G，配体：mCTLA-4(重组小鼠CTLA-4Fc嵌合体，R&D Systems，目录号：434-CT-200)，分析物：mGI101(500nM、250nM、125nM、62.5nM、31.3nM)。
结果，如图19所示测量mCTLA-4与mGI101之间的结合亲和力。
实验例4.mPD-L1与mGI101之间的结合亲和力的鉴定
以与实验例1中相同的方式鉴定mPD-L1与mGI101之间的结合亲和力。在此，所使用的设备如下。生物传感器：AR2G，配体：mPD-L1(重组小鼠B7-H1/PD-L1 Fc嵌合体，R&DSystems，目录号：434-CT-200)，分析物：mGI101(500nM、250nM、125nM、62.5nM、31.3nM)。
结果，如图20所示测量mPD-L1与mGI101之间的结合亲和力。
实验例5.GI-101(hCD80-Fc-hIL-2v)与CTLA-4的结合能力的鉴定
使用Octet RED 384仪器(ForteBio,Pall Life Science)于30℃和1,000rpm下用搅动执行结合动力学测量。使用胺反应性第2代(Amine Reactive 2generation,AR2G)生物传感器芯片测量CTLA-4的结合能力，并使用带镍的Tris-NTA(Ni-NTA)生物传感器芯片测量PD-L1的结合能力。将AR2G生物传感器芯片用400mM EDC和100mM磺基-NHS的组合活化。然后，将人CTLA-4-His标签(Sino Biological，目录号：11159-H08H)用10mM乙酸盐缓冲液(pH5)稀释至5μg/ml，并加载到AR2G生物传感器芯片上达300秒并固定。
然后，测量各种浓度的CTLA-4与GI-101(hCD80-Fc-hIL-2v)、GI-101C1(hCD80-Fc)、易普利姆玛单抗(Bristol-Myers Squibb)和GI-101C2(Fc-hIL-2v)的结合达300秒，并且还测量其解离达300秒。使用由Pall Corporation提供的Octet Data Analysis HT软件第10版执行结合动力学分析。结果在图21中示出。
实验例6.IL-2Rα或IL-2Rβ与GI101之间的结合亲和力的鉴定
使用AR2G生物传感器测量对IL-2Rα的结合能力，使用Ni-NTA生物传感器(带镍的Tris-NTA，Ni-NTA生物传感器，ForteBio，18-5101)测量对IL-2Rβ的结合能力。
用10mM乙酸盐缓冲液(pH 5，AR2G试剂盒，ForteBio，目录号：18-5095)将待附接至AR2G生物传感器的配体(IL-2Rα-His标签，Acro，目录号：ILA-H52H9)稀释至5μg/ml的浓度。用通过混合400mM EDC和100mM磺基-NHS制备的缓冲液活化AR2G生物传感器，然后将经稀释的配体加载到AR2G生物传感器上达300秒并固定。
与此同时，用1X Ni-NTA动力学缓冲液将待附接至Ni-NTA生物传感器的配体(IL-2Rβ-His标签，Acro，目录号：CD2-H5221)稀释至5μg/ml的浓度。将经稀释的配体加载到Ni-NTA生物传感器上达600秒并固定。
此后，将待附接至所述配体的各种浓度的GI101、GI101w或普留净(Novartis，hIL-2)加载到其上达300秒。然后，测量其结合并且还测量其解离达300秒。使用由PallCorporation提供的Octet Data Analysis HT软件第10版执行结合动力学分析。结果示出在图22至图24中。
结果，鉴定出如与GI101w和普留净相比，GI101对IL-2受体IL-2Rα具有低结合能力，而对IL-2Rβ具有高结合能力。
实验例7.融合蛋白与配体之间的结合亲和力的测量
为了鉴定融合蛋白与其配体之间的结合亲和力，使用Octet RED 384测量结合亲和力。
实验例7.1.IL-2α受体与GI101-M45、GI101-M61或GI101-M72之间的结合亲和力的鉴定
将AR2G生物传感器(胺反应性第2代，ForteBio，目录号：18-5092)预先在96孔微孔板(GreinerBio-one，目录号：655209)中用200μl蒸馏水(DW)水合。用10mM乙酸盐缓冲液(pH5)(AR2G试剂盒，ForteBio，目录号：18-5095)将待附接至AR2G生物传感器的配体(人IL-2Rα蛋白，His标签，Acro，目录号：ILA-H52H9)稀释至5μg/ml的浓度。用1X AR2G动力学缓冲液(AR2G试剂盒，ForteBio，目录号：18-5095)将待附接至配体的分析物(GI101-M45、GI101-M61、GI101-M72)分别稀释至500nM、250nM、125nM和62.5nM。通过在DW中混合20mM EDC和10mM s-NHS(AR2G试剂盒，ForteBio，目录号：18-5095)来制备活化缓冲液。将80μl的每种试剂置于384孔微孔板(GreinerBio-one，目录号：781209)中并设置程序。
结果，IL-2α受体与GI101-M45之间的结合亲和力在图25中示出。此外，IL-2α受体与GI101-M61之间的结合亲和力在图26中示出，并且IL-2α受体与GI101-M72之间的结合亲和力在图27中示出。
实验例7.2.GI102-M45、GI102-M61和GI102-M72对IL-2Rβ的结合亲和力的鉴定
将Ni-NTA生物传感器预先在96孔微孔板中用200μl的1X Ni-NTA动力学缓冲液(10X Kinetics缓冲液，ForteBio，18-1042)水合。用1X Ni-NTA动力学缓冲液将待附接至生物传感器的配体(人IL-2Rβ蛋白，His标签，Acro，CD2-H5221)稀释至2μg/ml的浓度。用1XNi-NTA动力学缓冲液将待附接至配体的GI102-M45、GI102-M61或GI102-M72稀释至500nM、250nM、125nM或62.5nM的浓度。将80μl的每种试剂置于384孔微孔板中并设置程序。
结果，如图28所示测量IL-2Rβ与GI102-M45之间的结合亲和力，并且如图29所示测量IL-2Rβ与GI102-M61之间的结合亲和力。此外，如图30所示测量IL-2Rβ与GI102-M72之间的结合亲和力。
III.融合蛋白的免疫活性的鉴定
实验例8.由融合蛋白引起的IFN-γ产生的鉴定
实验例8.1.CFSE标记的PBMC的培养
通过与1μM CellTrace CFSE染料于37℃反应20分钟，用羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记从人类分离出的外周血单核细胞(PBMC)。通过与具有5倍染色反应溶液的体积的培养基反应5分钟，然后通过以1,300rpm离心5分钟来去除未与细胞结合的CFSE。将CFSE标记的PBMC重悬于培养基(含有10％胎牛血清(FBS)、10mM HEPES、100U/ml青霉素/链霉素、1mM丙酮酸钠、55μM 2-巯基乙醇、1mM非必需氨基酸和2mM L-谷氨酰胺的RPMI1640培养基)中，然后以每孔1×105个细胞加入96孔微孔板。执行用5μg/ml的PHA(来自PhaseolusVulgaris的凝集素，红芸豆，Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,USA，目录号L1668-5MG)和GI101、GI101C1、GI101C2或IL-2(阿地白介素；人重组IL-2，Novartis)处理，并于37℃在5％CO2培养箱中执行孵育达6天。
在此，用GI101、GI101C1、GI101C2和IL-2处理是以1nM、10nM或100nM的浓度执行的。通过FACS分析细胞，并使用ELISA试剂盒(Biolegend,San Diego,CA,USA，目录号430103)测量培养基中存在的人IFN-γ。
实验例8.2.FACS分析
将通过去除上清液获得的细胞沉淀用FACS缓冲液(3％胎牛血清、10mM EDTA、1MHEPES、100单位/ml的青霉素、链霉素、1mM丙酮酸钠)洗涤，然后与Fc阻断剂(Biolegend，目录号422302)于4℃反应5分钟。然后，执行用APC抗CD3抗体(Biolegend，目录号300412)和PE抗CD8a抗体(Biolegend，目录号300908)处理，并使反应于4℃进行20分钟。然后，用FACS缓冲液洗涤所得物。将细胞沉淀重悬于FACS缓冲液中，然后使用BD LSR Fortessa(BDbiosciences,San Diego,CA,USA)和FlowJo软件进行分析。
实验例8.3.人IFN-γELISA
使用人IFN-γELISA试剂盒(Biolegend，目录号430103)测量分泌到其中已培养细胞的每个样品的上清液中的人IFN-γ的量。简而言之，将抗人-IFN-γ抗体加入到ELISA板中，并使反应于4℃进行过夜，以便将这些抗体包被在所述ELISA板上。然后，在室温下用已经加入了1％BSA的PBS溶液执行封闭1小时。执行用洗涤缓冲液(0.05％Tween-20的PBS溶液)进行洗涤，然后将标准溶液和各样品适当稀释并加入其中。然后，使反应在室温下进行2小时。
在反应完成后，洗涤板并向其中加入二抗(检测抗体)。使反应在室温下进行1小时。执行用洗涤缓冲液进行洗涤，然后将亲和素-HRP溶液加入其中。使反应在室温下进行30分钟。将底物溶液加入其中并在室温下在黑暗中诱导显色反应达20分钟。最后，将H2SO4加入其中以终止显色反应，并用Epoch微孔板分光光度计(BioTek instruments,Winooski,VT,USA)测量450nm处的吸光度，并计算浓度。
结果，发现如与用GI101C1、GI101C2或IL-2处理的细胞相比，用GI101处理的细胞表现出IFN-γ分泌的显著增加(图31和图32)。
实验例9.GI101对CD8+T细胞的增殖的影响的鉴定
通过与1μM CellTrace CFSE染料于37℃反应20分钟，用CFSE标记从人类分离出的外周血单核细胞(PBMC)。通过与具有5倍染色反应溶液的体积的培养基反应5分钟，然后通过以1,300rpm离心5分钟来去除未与细胞结合的CFSE。将CFSE标记的PBMC重悬于培养基(含有10％胎牛血清、10mM HEPES、100U/ml青霉素/链霉素、1mM丙酮酸钠、55μM 2-巯基乙醇、1mM非必需氨基酸和2mM L-谷氨酰胺的RPMI1640培养基)中，然后以每孔1×105个细胞加入96孔微孔板。
此后，执行用1μg/ml的抗CD3ε抗体(Biolegend，目录号L1668-5MG)和GI101、GI101C1、GI101C2或普留净(Novartis)处理，并于37℃在5％CO2培养箱中执行孵育达6天。在此，将细胞用100nM浓度的GI101、GI101C1、GI101C2和IL-2处理。通过使用APC-TCRαβ和PE-CD8α抗体进行FACS分析，测量尚未用CFSE标记的CD8+T细胞的比例，来检查所孵育的细胞的增殖程度。
结果，发现GI101在体外活化CD8+T细胞增殖到与野生型IL-2普留净相似的程度(图33和图34)。
实验例10.GI101和GI102对CD8+T细胞的增殖的影响的鉴定
人PBMC购自Allcells(批号3014928，USA)。使用1M CellTrace CFSE染料，使所述染料在室温避光条件下与人PBMC反应20分钟。通过于37℃与1μM CellTrace CFSE染料反应20分钟，用CFSE标记细胞。通过与具有5倍染色反应溶液的体积的培养基反应5分钟，然后通过以1,300rpm离心5分钟来去除未与细胞结合的CFSE。将CFSE标记的PBMC重悬于培养基(含有10％胎牛血清、10mM HEPES、100U/ml青霉素/链霉素、1mM丙酮酸钠、55μM 2-巯基乙醇、1mM非必需氨基酸和2mM L-谷氨酰胺的RPMI1640培养基)中，然后以每孔1×105个细胞加入96孔微孔板。
此后，用1μg/ml的抗CD3ε抗体(OKT3,eBioscience,USA)和GI101、GI101C1、GI101C2或普留净(Novartis)处理CFSE标记的PBMC，并于37℃在5％CO2培养箱中执行孵育达7天。在此，将细胞用10μM浓度的GI101、GI101C1、GI101C2和IL-2处理。
通过使用抗人CD4-PE抗体(BioLegend,USA)、抗人CD8-PE/Cy7抗体(BioLegend,USA)和抗人FoxP3-APC抗体(BioLegend,USA)进行FACS分析，测量尚未用CFSE标记的CD8+T细胞的比例，来检查所孵育的细胞的增殖程度。
结果，与对照(无刺激)、单独抗CD3抗体治疗组和GI101C1治疗组相比，GI101、GI102_M61、GI101C2和普留净治疗组表现出CD8+T细胞比例的显著增加。此外，与阴性对照(无刺激)和抗CD3抗体单独治疗组相比，GI101、GI101C2和普留净治疗组表现出CD4+/FoxP3+Treg细胞增殖的显著增加，而GI102和GI101C1治疗组没有表现出CD4+/FoxP3+Treg细胞增殖的显著增加(图35)。
实验例11.GI101或GI101w对CD8+T细胞和NK细胞的增殖的影响的鉴定
将购自Orient Bio(Korea)的7周龄C57BL/6小鼠分为3组，每组包括3只小鼠，并向所述小鼠中腹腔内注射PBS、GI101或GI101w。在此，将GI101和GI101w分别制备成在200μl的PBS中40.5μg，并腹腔内地注射。在注射后五天，从各组小鼠中取出脾脏。从所述脾脏中分离出细胞，并使用血细胞计数器测量细胞总数。使用APC-CD3ε抗体(Biolegend；145-2C11)、PE-NK1.1抗体(Biolegend；PK136)和Pacific blue-CD8α抗体(BD；53-6.7)染色，用FACS分析检查脾细胞中CD8+T细胞和NK细胞的比例。如此，计算脾脏中存在的CD8+T细胞和NK细胞的数量。
结果，鉴定出如与GI101w相比，GI101体内活化了CD8+T细胞和NK细胞的增殖(图36和图37)。
实验例12.GI101对T细胞功能的影响的鉴定
使用CTLA-4阻断生物测定试剂盒(Promega，目录号JA4005)执行实验。实验简述如下。将保存在液氮中的CTLA-4效应细胞于37℃恒温水浴中解冻3分钟，并将0.8ml的CTLA-4效应细胞与3.2ml预热的测定缓冲液(90％RPMI+10％胎牛血清)充分混合。然后，将混合物以每孔25μl加入到96孔白色细胞培养板(SPL，目录号30196)中。然后，向其中加入各种浓度的25μl GI101。对于阴性对照，向其中加入25μl的测定缓冲液。然后，将96孔白色细胞培养板加盖并置于室温直至制备aAPC/Raji细胞。
将保存在液氮中的aAPC/Raji细胞于37℃恒温水浴中解冻3分钟，并将0.8mlaAPC/Raji细胞与3.2ml预热的测定缓冲液充分混合。然后，将25μl的混合物加入到所述板的每个孔中，并使得于37℃在5％CO2培养箱中反应16小时。在反应完成后，将所得物在室温静置15分钟，然后向其中加入Bio-Glo试剂，与此同时注意避免气泡。还将Bio-Glo试剂加入到最外面孔中的三个孔中，并将所述孔用作空白以校正背景信号。使得在室温下进行反应达10分钟，然后用Cytation 3(BioTek仪器，Winooski,VT,USA)测量发光。通过计算RLU(GI101-背景)/RLU(无处理背景)执行最终数据分析。
结果，发现GI101与在效应T细胞上表达的CTLA-4结合，并活化T细胞的功能而不是抑制T细胞的功能(图38和图39)。
实验例13.mGI101和mGI102对免疫细胞的影响的鉴定
将购自Orient Bio(Korea)的7周龄C57BL/6小鼠分为3组，每组包括3只小鼠，并向所述小鼠中静脉内地施用PBS，3mg/kg、6mg/kg或12mg/kg的GI101，或3mg/kg、6mg/kg或12mg/kg的mGI102(mGI102-M61)。在注射后第1天、第3天、第5天、第7天、第14天，从各组小鼠取出脾脏组织。此后，对于脾组织，使用相应的抗体进行FACS分析，来计算效应CD8+T细胞、NK细胞和Treg细胞的数量，并分别计算效应CD8+T细胞和NK细胞相对于Treg细胞的比例。关于每个细胞分析中所使用的抗体的信息如下：
效应CD8+T细胞：PB抗小鼠CD3ε抗体(Biolegend，编号155612；KT3.1.1)、FITC抗小鼠CD8α抗体(BD，编号553031、53-6.7)、PE/Cy7抗小鼠CD44抗体(Biolegend，编号103030；IM7)、APC抗小鼠CD122抗体(Biolegend，编号123214；TM-β1)
NK细胞：PB抗小鼠CD3ε抗体(Biolegend，编号155612；KT3.1.1)、PE抗小鼠NK-1.1(Biolegend，编号108708；PK136)
Treg细胞：FITC抗小鼠CD3抗体(Biolegend，编号100204；17A2)、PB抗小鼠CD4抗体(Biolegend，编号100531；RM4-5)、PE抗小鼠CD25抗体(Biolegend，编号102008；PC61)、APC抗小鼠Foxp3抗体(Invitrogen，编号FJK-16s、17-5773-82)。
结果，如与PBS施用组相比，已接受mGI101或mGI102(mGI102-M61)的组在施用后第3天至第14天的时间点表现出CD8+T细胞和NK细胞的数量的显著增加。此外，如与PBS施用组相比，已接受mGI102的组在施用后第3天至第7天的时间点表现出活化CD8+T细胞/Treg细胞和NK细胞/Treg细胞的比例的显著增加(图40)。
IV.融合蛋白的抗癌效应的鉴定
实验例14.GI101对表达PD-L1和CTLA-4的癌细胞的T细胞活性抑制的影响的鉴定
在含有10μg/ml的丝裂霉素C(Sigma)的培养基中培养表达PD-L1和CTLA-4的NC1-H292癌细胞系3小时，然后通过用培养基洗涤去除丝裂霉素C。此后，将经丝裂霉素C处理的NCl-H292癌细胞系的5×104个细胞与人PBMC的1×105个细胞在96孔微孔板中一起孵育。在此，针对T细胞活性，执行用5μg/ml的PHA(Sigma)处理。此外，将浓度为50nM的GI101C1和GI101与浓度为50nM的IgG1-Fc(Biolegend)或阿巴西普(abatacept)(＝奥瑞希纳(Orencia)；Bristol-Myers Squibb)于4℃反应30分钟，然后将所得物用于治疗NCl-H292癌细胞。在3天后，收集细胞培养物的上清液，并使用ELISA试剂盒(Biolegend)定量IFN-γ的量。
作为阳性对照，使用在没有经丝裂霉素C处理的NCl-H292癌细胞系的情况下用PHA刺激的人PBMC；并且作为阴性对照，使用在经丝裂霉素C处理的NCl-H292癌细胞系存在下用PHA刺激的人PBMC。使用IFN-γELISA试剂盒的实验方法以与实验例9.3相同的方式进行。
结果，GI101有效地活化了已经被过表达PD-L1的癌细胞系抑制的免疫应答。此外，已确定GI101抑制在效应T细胞上表达的CTLA-4的信号传导(图41和图42)。
实验例15.mGI101在移植有小鼠源性结直肠癌细胞的小鼠中的抗癌效应的鉴定
使购自Orient Bio的BALB/c小鼠(雌性，7周龄)经受7天的适应期。然后，将CT-26癌细胞系(ATCC,USA)的5×106个细胞与0.05ml的无酚红MATRIGEL基质(BD)混合，并通过在小鼠的右背侧区域皮下施用0.1ml来执行混合物的同种异体移植。在癌细胞移植后一定时间段，测量肿瘤体积，并选取达到约28mm3的受试者，然后基于肿瘤大小和体重对所选取的小鼠进行平均分组，每组包括10只小鼠。此后，使用一次性注射器(31G，1ml)，以6mg/kg的剂量将hIgG4施用于阴性对照。对于实验组，向其静脉内地施用3mg/kg、6mg/kg或12mg/kg剂量的mGI101。在第一次施用后，每三天一次给予总共三次施用。每天测量肿瘤大小。
结果，发现如与阴性对照相比，已接受6mg/kg和12mg/kg剂量的mGI101的实验组在一些测量时间点和测试结束时表现出显著的肿瘤生长抑制(图43)。此外，作为测量存活率的结果，发现如与阴性对照相比，已接受6mg/kg剂量的mGI101的实验组在一些测量时间点和测试结束时表现出显著改善(图44)。
实验例16.GI101在移植有小鼠源性结直肠癌细胞的小鼠中的抗癌效应的鉴定
实验例16.1.肿瘤抑制效应的鉴定
使购自Orient Bio的BALB/c小鼠(雌性，7周龄)经受7天的适应期。然后，将CT-26癌细胞系(ATCC,USA)的5×106个细胞悬浮在0.1ml的PBS中，并通过在小鼠的右背侧区域皮下施用0.1ml来执行悬浮液的同种异体移植。在癌细胞移植后一定时间段，测量肿瘤体积，并选取达到约50mm3至200mm3的受试者，然后基于肿瘤大小和体重对所选取的小鼠进行平均分组，每组包括10只小鼠。此后，使用一次性注射器(31G，1mL)，阴性对照不施用药物，并且向阳性对照静脉内施用5mg/kg剂量的抗PD-1抗体，或5mg/kg剂量的抗PD-1抗体和5mg/kg剂量的抗CTLA-4抗体。对于实验组，向其静脉内施用0.1mg/kg或1mg/kg剂量的GI101。在第一次施用后，每三天一次给予总共三次施用。每天测量肿瘤大小。
结果，在移植有CT-26癌细胞系的小鼠中，如与阴性对照相比，所有已接受抗PD-1抗体；抗PD-1抗体和抗CTLA-4抗体；或0.1mg/kg或1mg/kg剂量的GI101的组表现出显著的肿瘤生长抑制。特别地，如与已接受抗PD-1抗体的组相比，已接受0.1mg/kg剂量的GI101的实验组表现出显著的肿瘤抑制效应(*p＜0.05)(图45)。
实验例16.2.癌症组织中的免疫细胞分析
将实验例16.1中的各组小鼠在肿瘤体积达到平均200mm3时处死，并收集癌组织。此后，将癌组织分离至单细胞水平以分析其中的免疫细胞，然后使用以下抗体对癌组织中的免疫细胞执行FACS分析：抗小鼠CD3(Biolegend，目录号100320)、抗小鼠CD4(Biolegend，目录号100526)、抗小鼠CD8(Biolegend，目录号100750)、抗小鼠FoxP3(eBioscience，目录号12-5773-82)、抗小鼠CD25(Biolegend，目录号102049)、抗小鼠CD44(eBioscience,目录号61-0441-82)、抗小鼠PD-1(Biolegend，目录号135218)、抗小鼠IFN-gamma(Biolegend，目录号505832)、抗小鼠CD49b(Biolegend，目录号108906)、抗小鼠H2(Invitrogen，目录号A15443)、抗小鼠CD11c(Biolegend，目录号117343)、抗小鼠CD80(eBioscience，目录号47-4801-82)、抗小鼠CD86(Biolegend，目录号104729)、抗小鼠F4/80(eBioscience，目录号47-4801-82)和抗小鼠CD206(eBioscience，目录号17-2061-80)。
结果，如与已接受5mg/kg剂量的单独抗PD-1抗体的阳性对照相比，已接受0.1mg/kg剂量的GI101的实验组表现出CD8+T细胞的显著增加(*p<0.05，图46和图47)。此外，如与阴性对照相比，已接受GI101的所有实验组都表现出T细胞中IFN-γ的表达水平的显著增加(*p<0.05，图46和图47)。此外，与阴性对照和已接受单独的抗PD-1抗体的阳性对照相比，已接受0.1mg/kg剂量的GI101的实验组表现出M1巨噬细胞增加(图48和图49)。此外，已接受GI101的所有实验组都表现出巨噬细胞和树突细胞中CD86表达水平的增加(*p<0.05，图48至图51)。
实验例17.GI101在移植有小鼠源性肺癌细胞的小鼠中的抗癌效应的鉴定
实验例17.1.肿瘤抑制效应的鉴定
使购自Orient Bio的C57BL/6小鼠(雌性，7周龄)经受7天的适应期。然后，将LL/2癌细胞系(ATCC,USA)的5×106个细胞悬浮在0.1ml的PBS中，并通过在小鼠的右背侧区域皮下施用0.1ml来执行悬浮液的同种异体移植。在癌细胞移植后一定时间段，测量肿瘤体积，并选取达到约50mm3至200mm3的受试者，然后基于肿瘤大小和体重对所选取的小鼠进行平均分组，每组包括10只小鼠。此后，使用一次性注射器(31G，1mL)，阴性对照不施用药物，并且向阳性对照静脉内施用5mg/kg剂量的抗PD-1抗体，或5mg/kg剂量的抗PD-1抗体和5mg/kg剂量的抗CTLA-4抗体。对于实验组，向其静脉内施用0.1mg/kg或1mg/kg剂量的GI101。在第一次施用后，每三天一次给予总共三次施用。每天测量肿瘤大小。
结果，如与阴性对照相比，所有实验组都表现出显著的肿瘤抑制效应(*p<0.05)(图52)。
实验例17.2.癌症组织中的免疫细胞分析
将实验例17.1.中的各组小鼠在肿瘤体积达到平均200mm3时处死，并收集癌组织。此后，以与实验例16.2.相同的方式执行FACS分析，以分析癌组织中的免疫细胞。
结果，如与已接受单独抗PD-1抗体的阳性对照相比，已接受0.1mg/kg剂量的GI101的实验组表现出CD8+T细胞的显著增加(*p<0.05，图59)。此外，如与阴性对照相比，已接受GI101的所有实验组都表现出IFN-γ的表达水平的显著增加(*p<0.05，图59)。此外，已接受GI101的所有实验组都表现出巨噬细胞和树突细胞中CD86表达水平的增加(*p<0.05，图53至图55)。
实验例18.mGI102-M61在移植有小鼠源性结直肠癌细胞的小鼠中的抗癌效应的鉴定
使购自Orient Bio的BALB/c小鼠(雌性，7周龄)经受7天的适应期。然后，将CT26癌细胞系(ATCC,USA)的5×106个细胞与0.05ml的无酚红MATRIGEL基质(BD)混合，并通过在小鼠的右背侧区域皮下施用0.1ml来执行混合物的同种异体移植。在癌细胞移植后一定时间段，测量肿瘤体积，并选取达到约28mm3的受试者，然后基于肿瘤大小和体重对所选取的小鼠进行平均分组，每组包括10只小鼠。此后，使用一次性注射器(31G，1mL)，以6mg/kg的剂量将hIgG4施用于阴性对照。对于实验组，向其静脉内地施用3mg/kg、6mg/kg或12mg/kg剂量的mGI102-M61。在第一次施用后，每三天一次给予总共三次施用。每天测量肿瘤大小。
结果，鉴定出如与阴性对照相比，已经接12mg/kg剂量的mGI102-M61的实验组在一些测量时间点和测试结束时表现出显著的肿瘤生长抑制(图56)。此外，作为测量存活率的结果，鉴定出如与阴性对照相比，已接受12mg/kg剂量的mGI102-M61的实验组在一些测量时间点和测试结束时表现出显著改善(图57)。
实验例19.mGI101在移植有小鼠源性结直肠癌细胞的小鼠中的抗癌效应的鉴定
使购自Orient Bio(Korea)的BALB/c小鼠(雌性，7周龄)经受7天的适应期。然后，将CT-26癌细胞系(ATCC,USA)的5×106个细胞与0.05ml的无酚红MATRIGEL基质(BD)混合，并通过在小鼠的右背侧区域皮下施用0.1ml来执行混合物的同种异体移植。在癌细胞移植后一定时间段，测量肿瘤体积，并选取达到约200mm3至250mm3的受试者，然后基于肿瘤大小和体重对所选取的小鼠进行平均分组，每组包括10只小鼠。
此后，使用一次性注射器(31G，1mL)，以4mg/kg的剂量将hIgG4施用于阴性对照。对于实验组，向其静脉内地施用1mg/kg、4mg/kg或6mg/kg剂量的mGI101。此外，将已接受4.9mg/kg的mCD80或2.8mg/kg的Fc-IL-2v(GI101C2)的组设为对照。另外，将已经同时接受4.9mg/kg的mCD80和2.8mg/kg的Fc-IL-2v(GI101C2)的组设为对照。
在肿瘤体积测量中，鉴定出如与阴性对照相比，已接受6mg/kg剂量的mGI101的组在一些测量时间点和测试结束时表现出显著抑制。如与已接受mCD80和Fc-IL-2v(GI101C2)的组合的组相比，观察到了优异的肿瘤生长抑制率(图58和图59)。
综上所述，在对同种异体移植了BALB/c小鼠源性结直肠癌细胞CT-26的BALB/c小鼠的肿瘤生长抑制功效测试中，证明了如与相应的mCD80和IL-2v单一制剂相比，测试物质mGI101在此测试条件下具有肿瘤抑制功效；并且鉴定出如与已接受mCD80和IL-2v的组合的组相比，mGI101表现出优异的抗癌功效(图58和图59)。特别地，如与阴性对照和已接受mCD80和Fc-IL2v(GI101C2)的组合的组相比，已接受6mg/kg剂量的mGI101的组表现出显著的肿瘤大小抑制。
V.根据融合蛋白二聚体与免疫检查点抑制剂的组合的施用的抗癌效应的鉴定
实验例20.对通过在移植有人源性乳腺癌细胞的小鼠中施用GI101和抗PD-1抗体的组合实现的抗癌效应的鉴定
本测试是为了评估在使用通过将人PBMC异种移植到NSGb2m小鼠中制备的人源化小鼠模型，在异种移植有MDA-MB-231细胞(其为人源性乳腺癌细胞)的肿瘤模型中腹膜内施用单独的作为测试物质的GI101或GI101与作为阳性对照物质的抗PD-1抗体可瑞达(派姆单抗，MSD)的组合后的肿瘤生长抑制效应。
表2中所述的测试物质、阴性对照物质和阳性对照物质的储备溶液通过根据每个剂量加入赋形剂来稀释。
[表2]
Figure BDA0003850098890000551
Figure BDA0003850098890000561
人源性乳腺癌细胞MDA-MB-231(智人(Homo sapiens)，人乳腺/***；源自转移性部位：胸腔积液)购自韩国细胞系库(Korea)并用于测试。细胞培养基具有如下表中所示的组成。按100ml将胎牛血清(FBS，16000-044，Thermofisher scientific,USA)、青霉素-链霉素；10,000单位/ml的青霉素和10,000μg/ml的链霉素(15140122，Thermofisherscientific,USA)；和RPMI1640(A1049101，Thermofisher Scientific，USA)混合并使用。
[表3]
名称 组成(ml)
FBS 10
青霉素-链霉素 1
RPMI1640 89
总体积 100
将待用于测试的细胞解冻，置于细胞培养瓶中，并于37℃、5％CO2培养箱(MCO-170M，Panasonic,Japan)中培养。使用胰蛋白酶-EDTA(目录号25200-072，Thermofisherscientific,USA)悬浮细胞。使用离心机通过离心(125×g，5分钟)收集悬浮细胞，转移到新培养基和新烧瓶中，并传代培养。在细胞系移植当天将培养的细胞置于离心管中，然后收集。此后，执行离心(125×g，5分钟)以弃去上清液，并用PBS(目录号LB 001-04,Welgene,KOREA)制备细胞悬液(5×106个细胞/0.05ml)并贮存在冰上直到接种。8周龄雌性NSGb2m(NOD.Cg-B2mtm1UncPrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ)小鼠购自Joongang Bio(Korea)并用于测试。在隔离和驯化期结束后次日测量体重，然后将针对健康动物制备的人源性PBMC细胞悬液(5×106个细胞/0.2ml)装入一次性注射器并施用至动物的尾静脉。在细胞移植后每天一次地观察一般症状。
将无酚红的MATRIGEL基质(0.05ml，356237，BD，USA)加入所制备的MDA-MB-231细胞悬液(5×106个细胞/0.05ml)中以制成溶液，将所述溶液装入一次性注射器，并通过在移植有人PBMC的动物的右背侧区域这个以0.1ml/头皮下施用来执行所述溶液的移植。在细胞系移植后的植入和生长期期间每天一次地观察一般症状。
在细胞移植后一定时间段，对动物健康状况无异常的动物进行肿瘤体积测量，并选取32名受试者，使每组平均达到40mm3至80mm3。将所选取的动物基于肿瘤体积和体重尽可能均匀地分成总共4组，每组包括8只动物。
如表4所示，配置测试组。使用一次性注射器(31G，1ml)向动物施用测试物质，并且施用频率为2次/周，执行总共4次施用。
[表4]
Figure BDA0003850098890000571
在观察期期间每天一次地观察一般症状诸如外观、行为和***物，并对死亡动物进行鉴定。在细胞系移植当天、每周两次和动物处死当天测量体重。在观察期期间，每周三次使用卡尺(数显卡尺，mitutoyo,Japan)测量肿瘤的长轴(最大长度，L)和短轴(垂直宽度，W)，并通过将它们代入以下等式来计算肿瘤体积(TV)。
[等式1]
TV(mm3)＝(W2×L)/2
[等式2]
％TGI(肿瘤生长抑制)＝(1-(Ti-T0)/(Vi-V0))×100
将每个受试者施用前的肿瘤体积设定为分组时测量的值。
作为分别在肿瘤移植后第21天、第25天、第28天和第31天施用表4所示药物的结果，如与对照(hIgG4)相比，已接受GI101和可瑞达中的各者的组表现出肿瘤生长抑制。如与对照相比，已接受GI101和可瑞达的组合的组表现出肿瘤生长抑制。如与已接受GI101和可瑞达中的各者的组相比，经接受GI101和可瑞达的组合的组表现出肿瘤生长抑制(图60)。
作为计算如与药物治疗第1天(肿瘤移植后，第21天)相比，在实验结束时(肿瘤移植后，第42天)的肿瘤生长抑制率的结果，已接受hIgG4的组表现出在2只小鼠中30％或更大、在1只小鼠中50％或更大、并且在1只小鼠中80％或更大的肿瘤生长抑制率。此外，已接受GI101的组表现出在5只小鼠中30％或更大、在5只小鼠中50％或更大、并且在2只小鼠中80％或更大的肿瘤生长抑制率，而已接受可瑞达的组表现出在7只小鼠为30％或更大、在5只小鼠中50％或更大、并且在3只小鼠中80％或更大的肿瘤生长抑制率。此外，已接受GI101和可瑞达的组合的组表现出在8只小鼠中30％或更大、在8只小鼠中50％或更大、并且在6只小鼠中80％或更大的肿瘤生长抑制率(图61)。
此外，图62至图66中示出了当在移植有人源性乳腺癌细胞的小鼠中使用GI101和可瑞达的组合时，每个治疗组的个体实验动物的肿瘤生长程度。
实验例21.对通过在移植有小鼠源性结直肠癌细胞的小鼠中施用mGI101和抗PD-1抗体的组合实现的抗癌效应的鉴定
本测试是为了评估在将MC38同种异体移植到C57BL/6小鼠中的肿瘤模型中腹膜内施用单独的作为测试物质的mGI101或mGI101与作为阳性对照物质的抗PD-1抗体的组合后的肿瘤生长抑制效应。
啮齿动物源性结直肠癌细胞MC38购自Kerafast(USA)并用于测试。将MC38细胞在含有10％胎牛血清(Gibco)和1％抗生素/抗真菌剂(Gibco)的RPMI1640培养基(Gibco)中培养。使用胰蛋白酶收获所培养的细胞，然后在PBS中悬浮。为了建立同种异体移植肿瘤模型，将1×106个MC38细胞皮下注射到C57BL/6雌性小鼠(7周龄)的右胁腹。
基于肿瘤体积(30mm3)随机分配小鼠，每组包括5只小鼠。大约在细胞接种后第2天鉴定肿瘤移植物。如表5所示，配置测试组并施用测试物质。
[表5]
Figure BDA0003850098890000591
在测试期期间，每天一次地观察临床症状(诸如疾病和行为变化)，并鉴定已死的动物。在测试期结束时，处死动物。使用肿瘤3D扫描仪(TM900,Peria,Belgium)测量MC38实体癌的大小。对于每个实验组，计算体重的平均损失和百分比变化以及平均肿瘤生长抑制。评估与媒介物对照相比的抗肿瘤功效。所有统计计算均使用Prism 8.0(Graph PadSoftware Inc,USA)执行。通过单因素方差分析(在这种测试结束时)之后进行Bonferroni多重比较检验，来进行肿瘤体积测量的比较。p值小于0.05被认为是显著的。
在施用单独的mGI101以及mGI101与抗PD-1抗体的组合后，所有测试动物都维持健康状态，没有病理异常病征。针对MC38肿瘤使用mGI101和/或抗PD-1抗体的联合疗法的结果在图67中示出。如与对照相比，在已接受药物的组中观察到了抗癌效应，并且在16天的测试期期间肿瘤大小的差异是显著的。MC38肿瘤在以往的文献中被称为对抗PD-1抗体有反应的模型，并且在本测试的已接受抗PD-1抗体的组中也观察到了抗癌效应(p>0.01)。在已接受单独的mGI101(6mpk)的组以及已接受抗PD-1抗体的组中也显示出了抗癌效应(p>0.01)。已接受mGI101(0.6mpk)+抗PD-1(5mpk)的组合的组表现出非常优异的抗癌效应(p>0.0001)。
各个测试组的个体肿瘤大小示出在图69至图73中。根据个体肿瘤大小的结果，在已接受抗PD-1抗体的组的一些动物中观察到了轻微的肿瘤消退。如与已接受抗PD-1抗体的组相比，已接受单独的mGI101(6mpk)的组表现出了更优异的肿瘤生长抑制效应。肿瘤大小从第5天至第7天维持在相同大小，但在第7天后重新生长。已接受组合(GI101(0.6mpk)+抗PD-1抗体(5mpk))的组表现出非常优异的肿瘤生长抑制。特别地，已接受该组合的组中的两只小鼠显示出完全缓解(无肿瘤)。
将MC38细胞重新注射到已接受该组合的组中的显示出完全缓解的两只小鼠的左胁腹(与癌细胞的第一注射部位相对的部位)中。这些小鼠维持抗PD-1抗体施用(5mpk，BIW)直到第32天(图74)。在这两只小鼠中的一只小鼠中观察到了具有较小大小(>30mm3)的肿瘤，但是肿瘤大小直到第35天才不再生长(图69)。在另一只小鼠中，在重新注射肿瘤后未观察到肿瘤(图69和图74)。
综上所述，作为在经MC38同种异体移植的肿瘤模型中测试单独的mGI101和mGI101与抗PD-1抗体的组合的抗肿瘤功效的结果，在已接受组合(GI101(0.6mpk)+抗PD-1(5mpk))的组中显示出了最优异的抗肿瘤功效。已接受所述组合的组中的实验动物中的两只实验动物显示出完全缓解，并且重新注射MC38的完全缓解小鼠显示出抗癌效应(表6)。
[表6]
Figure BDA0003850098890000601
Figure BDA0003850098890000611
Figure BDA0003850098890000621
实验例22.对通过在移植有小鼠源性结直肠癌细胞的小鼠中施用mGI101和抗PD-L1抗体的组合实现的抗癌效应的鉴定
本测试是为了评估在将CT26细胞(鼠结肠癌细胞)同种异体移植到BALB/c小鼠中的肿瘤模型中施用单独的作为测试物质的mGI101或mGI101与作为阳性对照物质的抗PD-L1抗体(BioXcell，目录号BE0101)的组合后的肿瘤生长抑制效应。
将CT26细胞在含有10％胎牛血清(Gibco)和1％抗生素/抗真菌剂(Gibco)的RPMI1640培养基(Gibco)中培养。使用胰蛋白酶收获所培养的细胞，然后在PBS中悬浮。为了建立同种异体移植肿瘤模型，将5×105个CT26细胞皮下注射到BALB/c雌性小鼠(7周龄)的右胁腹。
基于肿瘤体积(50mm3至120mm3)随机分配小鼠，每组包括4只小鼠。大约在细胞接种后第2天鉴定肿瘤移植物。如表7所示，配置测试组并施用测试物质。
[表7]
Figure BDA0003850098890000622
Figure BDA0003850098890000631
在测试期期间，每天一次地观察临床症状(诸如疾病和行为变化)，并鉴定已死的动物。在测试期结束时，处死动物。使用肿瘤3D扫描仪(TM900,Peria,Belgium)测量CT26实体癌的大小。对于每个实验组，计算体重的平均损失和百分比变化以及平均肿瘤生长抑制。评估与媒介物对照相比的抗肿瘤功效。所有统计计算均使用Prism 8.0(Graph PadSoftware Inc,USA)执行。通过单因素方差分析(在这种测试结束时)之后进行Bonferroni多重比较检验，来进行肿瘤体积测量的比较。p值小于0.05被认为是显著的。
作为在经CT26同种异体移植的肿瘤模型中测试单独的mGI101和mGI101与抗PD-L1抗体的组合的抗肿瘤功效的结果，在已接受组合(mGI101(3mpk)+抗PD-L1(10mpk))的组中显示出了最优异的抗肿瘤功效(图75)。
实验例23.对通过在移植有小鼠源性结直肠癌细胞的小鼠中施用mGI101和抗TIGIT抗体的组合实现的抗癌效应的鉴定
本测试是为了评估在将CT26细胞(鼠结肠癌细胞)同种异体移植到BALB/c小鼠中的肿瘤模型中施用单独的作为测试物质的mGI101或mGI101与作为阳性对照物质的与TIGIT的细胞外结构域(ECD)特异性结合的抗TIGIT抗体的组合后的肿瘤生长抑制效应。
将CT26细胞在含有10％胎牛血清(Gibco)和1％抗生素/抗真菌剂(Gibco)的RPMI1640培养基(Gibco)中培养。使用胰蛋白酶收获所培养的细胞，然后在PBS中悬浮。为了建立同种异体移植肿瘤模型，将5×105个CT26细胞皮下注射到BALB/c雌性小鼠(7周龄)的右胁腹。
基于肿瘤体积(50mm3至120mm3)随机分配小鼠，每组包括5只小鼠。大约在细胞接种后第2天鉴定肿瘤移植物。如表8所示，配置测试组并施用测试物质。
[表8]
Figure BDA0003850098890000641
在测试期期间，每天一次地观察临床症状(诸如疾病和行为变化)，并鉴定已死的动物。在测试期结束时，处死动物。使用肿瘤3D扫描仪(TM900,Peria,Belgium)测量CT26实体癌的大小。对于每个实验组，计算体重的平均损失和百分比变化以及平均肿瘤生长抑制。评估与媒介物对照相比的抗肿瘤功效。所有统计计算均使用Prism 8.0(Graph PadSoftware Inc,USA)执行。通过单因素方差分析(在这种测试结束时)之后进行Bonferroni多重比较检验，来进行肿瘤体积测量的比较。p值小于0.05被认为是显著的。
作为在经CT26同种异体移植的肿瘤模型中测试单独的mGI101和mGI101与抗TIGIT抗体的组合的抗肿瘤功效的结果，在已接受组合(mGI101(3mpk)+抗TIGIT(20mpk))的组中显示出了最优异的抗肿瘤功效(图76)。如与对照相比，在已接受单独的抗TIGIT抗体的组中未观察到抗肿瘤效应，但如与已接受单独的mGI101的组相比，已接受与mGI101的组合的组表现出非常优异的抗肿瘤效应。
VI.根据融合蛋白二聚体与TGF-βR抑制剂的组合的施用的抗癌效应的鉴定
实验例24.对通过在移植有小鼠源性结直肠癌细胞的小鼠中施用mGI-101和TGF-βR抑制剂(戈鲁尼色特)的组合实现的抗癌效应的鉴定
本测试是为了评估在将CT26(小鼠结肠癌)细胞同种异体移植到小鼠中的肿瘤模型中施用单独的作为测试物质的mGI-101或mGI-101与作为阳性对照物质的戈鲁尼色特的组合后的肿瘤生长抑制效应。
表9中所述的测试物质、阴性对照物质和阳性对照物质的储备溶液通过根据每个剂量加入赋形剂来稀释。
[表9]
Figure BDA0003850098890000651
小鼠源性结直肠癌细胞CT26(小家鼠(Mus musculus)，结肠腺癌)购自ATCC(USA)并用于测试。将待用于测试的细胞解冻，与含有10％FBS(胎牛血清，Gibco，10082-147)的RPMI1640(A1049101，Thermofisher Scientific)培养基混合，然后置于细胞培养瓶中，并于37℃、5％CO2培养箱中培养。用PBS洗涤细胞，然后用胰蛋白酶-EDTA(15090,Gibco)分离细胞，并执行离心(125×g，5分钟)以弃去上清液，然后将细胞悬浮在新培养基中以获得细胞悬液。鉴定细胞的活力，然后通过在培养基中稀释至5.0×106个细胞/mL的浓度来制备细胞系。
购买6周龄的雄性BALB/cAnHsd小鼠并用于测试。在7天的驯化期结束后，将细胞移植到健康动物体内。将细胞悬液(5×106个细胞/mL)分配并装入一次性注射器中，并通过在动物的右背侧区域中以0.1mL/头皮下施用来执行所述悬液的移植。在细胞系移植后的植入和生长期期间每天一次地观察一般症状。
在执行细胞系的接种后，当细胞系移植到的部位的肿瘤大小达到约50mm3时，将各组的肿瘤大小根据肿瘤大小尽可能均匀地分布。
如表10所示，配置测试组。将测试物质口服或腹腔内地施用，并取决于测试组的组成施用3周。在口服施用的情况下，用颈椎皮肤固定法固定动物，并使用用于口服施用的探头直接施用到胃中。在腹腔内施用的情况下，用颈椎皮肤固定法固定动物，并使用配备有26号针头的注射器腹腔内地施用。施用速率不超过200μl/min。
[表10]
Figure BDA0003850098890000661
在施用和观察期期间每天一次地观察包括死亡、发病日期和症状严重程度在内的一般症状的类型，并针对每个受试者进行记录。在分组当天或开始施用测试物质的当天测量体重，之后每周一次地测量体重。
从开始施用测试物质当天起每周三次测量肿瘤大小，持续3周。使用卡尺测量肿瘤的长轴和短轴，并使用以下等式计算肿瘤大小(肿瘤体积，TV)。
[等式1]
TV(mm3)＝(W2×L)/2
使用肿瘤大小测量结果计算肿瘤生长抑制率。如下计算肿瘤生长抑制率。
[等式2]
％TGI(肿瘤生长抑制)＝(1-(Ti-T0)/(Vi-V0))×100
作为测量肿瘤大小的结果，在开始施用测试物质后第4天，G2和G4的肿瘤大小水平在统计学上显著低于G1的肿瘤大小水平(p<0.01，p<0.001)，并且在开始施用测试物质后第7天，G2和G4的肿瘤大小水平在统计学上显著低于G1的肿瘤大小水平(p<0.05或p<0.01)。
从开始施用测试物质后的第2天到第7天，G2和G4的肿瘤大小水平倾向于低于G1的肿瘤大小水平。此外，直到开始施用测试物质后的第7天，G4的肿瘤大小水平都低于G2或G3的肿瘤大小水平(图77和图79)。
[表11]
Figure BDA0003850098890000671
结果表示为平均值±标准偏差。N：动物数量，G1：腹腔注射媒介物对照，G2：腹腔注射3mg/kg的mGI-101，G3：口服75mg/kg的戈鲁尼色特，G4：腹腔注射3mg/kg的mGI-101+口服75mg/kg的戈鲁尼色特
***/**/*相较于G1在p<0.001/p<0.01/p<0.05层级有显著差异
作为计算肿瘤生长抑制率的结果，从开始施用测试物质后的第4天至第7天，G2的肿瘤生长抑制水平在统计学上显著高于G1的肿瘤生长抑制水平。从开始施用测试物质后的第2天至第7天，G4的肿瘤生长抑制水平在统计学上显著高于G1的肿瘤生长抑制水平。此外，在第7天，G4的肿瘤生长抑制水平显著高于G3的肿瘤生长抑制水平。
在实验结束时，肿瘤生长抑制率为30％、50％或80％或更高的小鼠如图78所示。
[表12]
Figure BDA0003850098890000681
结果表示为平均值±标准偏差。N：动物数量，G1：腹腔注射媒介物对照，G2：腹腔注射3mg/kg的mGI-101，G3：口服75mg/kg的戈鲁尼色特，G4：腹腔注射3mg/kg的mGI-101+口服75mg/kg的戈鲁尼色特
***/**/*相较于G1在p<0.001/p<0.01/p<0.05层级有显著差异
$与G3相比，在p<0.05层级有显著差异
实验例25.对mGI-101与TGF-βR抑制剂(伐托色替)的组合在乳腺癌细胞系中实现的抗癌效应的鉴定
本实验是为了评估在体外环境中，通过用单独的测试物质GI-101或GI-101与TGF-β信号抑制剂伐托色替物质的组合处理MDA-MB-231细胞(人乳腺癌细胞)实现的杀伤癌细胞的效应。
MDA-MB-231细胞购自韩国细胞系库，并在含有10％FBS(Gibco)和1％抗生素/抗真菌剂(Gibco)的RPMI1640培养基(Gibco)中培养。为了用于癌细胞杀伤测试中，使用胰蛋白酶(Gibco)收获细胞，然后将所述细胞悬浮在RPMI1640培养基中，然后使用Ficoll(GEHealthcare Life Sciences)溶液去除死细胞和碎片。将悬浮在RPMI1640培养基中的细胞小心地铺在ficoll溶液上。用移液管收集通过在室温下以350×g离心20分钟形成的低比重细胞层，用PBS(Gibco)洗涤，然后在室温下以350×g离心5分钟。用不含FBS的RPMI1640培养基将分离出的细胞层制成2×105个细胞/mL的悬浮液。使用CELLTRACKERTM深红染料(Thermo)将癌细胞悬液于37℃染色1小时，以追踪癌细胞的增殖或增殖抑制。在染色后，将所述癌细胞悬液以1300rpm离心5分钟，然后将其用不含FBS的RPMI1640培养基洗涤，然后在含有5％人AB血清(Sigma)的RPMI1640培养基中悬浮至2×105个细胞/mL的浓度。将癌细胞悬液以50μl(1×104个细胞)加入96孔微孔板(Corning)的各孔中，然后在培养箱(37℃、5％CO2)中稳定化1小时。
使用人外周血单核细胞(PBMC)来鉴定GI-101杀伤癌细胞的效应。人PBMC购自Zen-Bio，并且将冷冻贮存的PBMC置于37℃水浴中并尽快解冻，然后转移至含有10％FBS(Gibco)和1％抗生素/抗真菌剂(Gibco)的RPMI1640培养基(Gibco)中，并以1300rpm离心5分钟。将分离的细胞层在RPMI1640培养基中悬浮，然后以与癌细胞系相同的方式使用Ficoll(GEHealthcare Life Sciences)溶液去除死细胞和碎片。将悬浮在RPMI1640培养基中的细胞小心地铺在ficoll溶液上。用移液管收集通过在室温下以350×g离心20分钟形成的低比重细胞层，用PBS(Gibco)洗涤，然后在室温下以350×g离心5分钟。将分离的细胞层在含有5％人AB血清(Sigma)的RPMI1640培养基中悬浮至5×105个细胞/mL的浓度。取决于条件，将PBMC悬浮液以50μl分配到已分配癌细胞系的96孔微孔板(Corning)的各孔中。
为了鉴定杀伤细胞的效应，以在每1mL含有5％人AB血清(Sigma)的RPMI1640培养基中1μl制备与待杀伤的细胞的DNA结合的CytoTox Green试剂(INCUCYTETMCytoTox Green,Satorius)。将所制备的培养基用于稀释测试物质，并且当测试物质与癌细胞系和PBMC共培养时，可以通过对待杀伤的细胞进行染色来定量地鉴定杀伤细胞的效应。
将伐托色替粉末溶于DMSO(Sigma)中至48.4mM的浓度，并使用含有CytoTox Green试剂的RPMI1640培养基稀释，然后在实验中以96孔微孔板每孔12.1nM(50μL)的终浓度使用。
使用含有CytoTox Green试剂的RPMI1640培养基将GI-101稀释1/3，然后在实验中以0.4nM、1.2nM、3.7nM、11.1nM、33.3nM和100nM的终浓度按96孔微孔板每孔50μl使用。
将所制备的测试物质置于96孔微孔板的各孔中，其中取决于条件分配癌细胞系和PBMC，并在培养箱(37℃，5％CO2)中培养24小时，并且通过实时细胞成像分析设备IncuCyteS3(Satorious)观察癌细胞的增殖或死亡。通过用CytoTox Green试剂染成绿色的细胞的综合强度来定量癌细胞的死亡。
结果，鉴定出如与已接受单独的各种药物的组相比，已接受GI-101和伐托色替的组合的组表现出优异的杀伤癌细胞的效应。
VII.根据融合蛋白二聚体与VEGFR抑制剂的组合的施用的抗癌效应的鉴定
实验例26.对通过施用mGI-101和VEGFR抑制剂(阿西替尼)的组合实现的抗癌效应的鉴定
本测试是为了评估在将CT26细胞(小鼠结肠癌)或LL2细胞(小鼠肺癌)同种异体移植到小鼠中的肿瘤模型中施用单独的作为测试物质的mGI-101或mGI-101与作为阳性对照物质的阿西替尼的组合后的肿瘤生长抑制效应。
表13中所述的测试物质、阴性对照物质和阳性对照物质的储备溶液通过根据每个剂量加入赋形剂来稀释。
[表13]
Figure BDA0003850098890000701
Figure BDA0003850098890000711
小鼠源性结直肠癌细胞CT26(小家鼠，结肠腺癌)和小鼠源性肺癌细胞LL/2(小家鼠，肺腺癌)购自ATCC(USA)并用于测试。将待用于测试的细胞解冻，与含有10％FBS(胎牛血清，Gibco，10082-147)的RPMI1640(A1049101，Thermofisher Scientific)培养基混合，然后置于细胞培养瓶中，并于37℃、5％CO2培养箱中培养。用PBS洗涤细胞，然后用胰蛋白酶-EDTA(15090,Gibco)分离细胞，并执行离心(125×g，5分钟)以弃去上清液，然后将细胞悬浮在新培养基中以获得细胞悬液。鉴定细胞的活力，然后通过在培养基中稀释至5.0×106个细胞/mL的浓度来制备细胞系。
购买6周龄的雄性BALB/cAnHsd小鼠或C57BL/6NHsd小鼠并用于测试。在7天的驯化期结束后，将细胞移植到健康动物体内。将细胞悬液(5×106个细胞/mL)分配并装入一次性注射器中，并通过在动物的右背侧区域中以0.1mL/头皮下施用来执行所述悬液的移植。在细胞系移植后的植入和生长期期间每天一次地观察一般症状。
在执行细胞系的接种后，当细胞系移植到的部位的肿瘤大小达到约50mm3时，将各组的肿瘤大小根据经排名的肿瘤大小尽可能均匀地分布。
如表14所示，配置测试组。将测试物质口服或腹腔内地施用，并取决于测试组的组成施用3周。在口服施用的情况下，用颈椎皮肤固定法固定动物，并使用用于口服施用的探头直接施用到胃中。在腹腔内施用的情况下，用颈椎皮肤固定法固定动物，并使用配备有26号针头的注射器腹腔内地施用。施用速率不超过200μl/min。
[表14]
Figure BDA0003850098890000721
以与实验例24中所述相同的方式测量肿瘤大小。
实验例26.1.同种异体移植有结直肠癌的小鼠肿瘤模型(CT26)
通过将CT26细胞系皮下移植到Balb/c小鼠中制备同基因模型，然后施用测试物质以评估抗癌效应。
作为测量肿瘤大小的结果，在开始施用测试物质后的第18天和第21天，G4的肿瘤大小水平在统计学上显著低于G1和G2的肿瘤大小水平(p<0.0001、p<0.01、或p<0.05)。在开始施用测试物质后的第21天，G4的肿瘤大小水平在统计学上显著低于G3的肿瘤大小水平(p<0.01)。此外，在开始施用测试物质后的第21天，G3的肿瘤大小水平在统计学上显著低于G1和G2的肿瘤大小水平(p<0.001，p<0.01)(图80和图82)。
[表15]
Figure BDA0003850098890000722
Figure BDA0003850098890000731
结果表示为平均值±标准偏差。N：动物数量，G1：腹腔注射媒介物对照，G2：腹腔注射3mg/kg的mGI-101，G3：口服30mg/kg的阿西替尼，G4：腹腔注射3mg/kg的mGI-101+口服30mg/kg的阿西替尼
****/**/*相较于媒介物在p<0.0001/p<0.01/p<0.05层级有显著差异
####/#相较于mGI-101在p<0.0001/p<0.05层级有显著差异
$$$/$$/$相较于阿西替尼在p<0.001/p<0.01/p<0.05层级有显著差异
作为计算肿瘤生长抑制率的结果，从开始施用测试物质后的第2天至第21天，G2和G4的肿瘤生长抑制水平在统计学上显著高于G1的肿瘤生长抑制水平(p<0.0001、p<0.001、p<0.01或p<0.05)，并且从开始施用测试物质后的第9天至第14天，G4的肿瘤生长抑制水平在统计学上显著高于G3的肿瘤生长抑制水平(p<0.05)。此外，在开始施用测试物质后的第19天，G4的肿瘤生长抑制水平显著高于G2的肿瘤生长抑制水平(p<0.05)。
在实验结束时，肿瘤生长抑制率为30％、50％或80％或更高的小鼠如图81所示。
[表16]
Figure BDA0003850098890000741
结果表示为平均值±标准偏差。N：动物数量，G1：腹腔注射媒介物对照，G2：腹腔注射3mg/kg的mGI-101，G3：口服30mg/kg的阿西替尼，G4：腹腔注射3mg/kg的mGI-101+口服30mg/kg的阿西替尼
****/***/**/*相较于媒介物在p<0.0001/p<0.001/p<0.01/p<0.05层级有显著差异
#与3mg/kg的mGI-101相比，在p<0.05层级有显著差异
$与3mg/kg的mGI-101+30mg/kg的阿西替尼相比，在p<0.05层级有显著差异
实验例26.2.同种异体移植有肺癌的小鼠肿瘤模型(LL/2)
通过将LL/2细胞系皮下移植到C57BL/6小鼠中制备同基因模型，然后施用测试物质以评估抗癌效应。
作为测量肿瘤大小的结果，G3和G4维持比G1更低的肿瘤大小水平直到测试结束。此外，在整个测试期期间G4的肿瘤大小水平是所有测试组中最低的水平，并且在开始施用测试物质后第19天G4的肿瘤大小水平显著低于G1(p<0.05)和G2(p<0.01)的肿瘤大小水平。
在开始施用测试物质后第21天G4的肿瘤大小水平在统计学上显著低于G1(p<0.0001)、G2(p<0.0001)和G3(p<0.01)的所有组的肿瘤大小水平。此外，在开始施用测试物质后第21天G3的肿瘤大小水平在统计学上显著低于G1(p<0.01)和G2(p<0.001)的肿瘤大小水平(图83和图85)。
[表17]
Figure BDA0003850098890000751
结果表示为平均值±标准偏差。N：动物数量，G1：腹腔注射媒介物对照，G2：腹腔注射3mg/kg的mGI-101，G3：口服30mg/kg的阿西替尼，G4：腹腔注射3mg/kg的mGI-101+口服30mg/kg的阿西替尼
****/*相较于媒介物在p<0.0001/p<0.05层级有显著差异
####/##与3mg/kg的mGI-101相比，在p<0.0001/p<0.01层级有显著差异
$$与3mg/kg的mGI-101+30mg/kg的阿西替尼相比，在p<0.01层级有显著差异
作为计算肿瘤生长抑制率的结果，在开始施用测试物质后第19天和第21天G4的肿瘤生长抑制水平显著高于G2的肿瘤生长抑制水平(p<0.01、p<0.05)，并在开始施用测试物质后第21天G4的肿瘤生长抑制水平显著高于G1的肿瘤生长抑制水平(p<0.05)。在G4中观察到了最低的肿瘤大小水平，并且肿瘤生长抑制率也趋于最高。
在实验结束时，肿瘤生长抑制率为30％、50％或80％或更高的小鼠如图84所示。
[表18]
Figure BDA0003850098890000761
结果表示为平均值±标准偏差。N：动物数量，G1：腹腔注射媒介物对照，G2：腹腔注射3mg/kg的mGI-101，G3：口服30mg/kg的阿西替尼，G4：腹腔注射3mg/kg的mGI-101+口服30mg/kg的阿西替尼
*与媒介物相比，在p<0.05层级有显著差异
##/#与3mg/kg的mGI-101相比，在p<0.01/p<0.05层级有显著差异
实验例27.对通过施用mGI-101和VEGFR抑制剂(乐伐替尼)的组合实现的抗癌效应的鉴定
实验例27.1.对通过在移植有小鼠源性结直肠癌细胞的小鼠中施用mGI-101和乐伐替尼的组合实现的抗癌效应的鉴定
本实验是为了评估在将CT26细胞(鼠结肠癌细胞)同种异体移植到BALB/c小鼠中的肿瘤模型中施用单独的作为测试物质的mGI-101或mGI-101与乐伐替尼物质的组合后的肿瘤生长抑制效应。
CT26细胞购自ATCC(USA)并在含有10％FBS(Gibco)和1％抗生素/抗真菌剂(Gibco)的RPMI1640培养基(Gibco)中培养。使用胰蛋白酶(Gibco)收获所培养的细胞，然后在PBS中悬浮。为了建立同种异体移植肿瘤模型，将1×106个CT26细胞皮下注射到BALB/c雌性小鼠(7周龄)的右胁腹。在细胞系移植后的植入和生长期期间每天一次地观察一般症状。
细胞移植后一定时间段，对动物健康状况无异常的动物进行肿瘤体积测量，并分配小鼠，使得每组的平均肿瘤体积小于70-100mm3，每组包括10只小鼠。如表19所示，配置测试组并施用测试物质。
在乐伐替尼粉末的情况下，计算剂量并称重，并使用0.5％甲基纤维素赋形剂将所述乐伐替尼粉末制备至剂量浓度。为了最小化测试物质的损失，称量3天或4天的剂量，并在施用当天使用赋形剂制备并注射。
[表19]
Figure BDA0003850098890000771
Figure BDA0003850098890000781
在测试期期间，每天一次地观察临床症状(诸如疾病和行为变化)，并鉴定已死的动物，并且当肿瘤大小达到4,000mm3时处死小鼠。在观察期期间每周两次测量CT26实体癌的大小，并使用卡尺(数显卡尺，mitutoyo,Japan)测量肿瘤的长轴(最大长度，L)和短轴(垂直宽度，W)，并通过将它们代入以下等式来计算肿瘤体积(TV)和肿瘤生长抑制率(TGI)。
[等式1]
TV(mm3)＝(W2×L)/2
[等式2]
％TGI(肿瘤生长抑制)＝(1-(Ti-T0)/(Vi-V0))×100
将每个受试者施用前的肿瘤体积设定为分组时测量的值。
所有统计计算均使用Prism 8.0(Graph Pad Software Inc,USA)执行。肿瘤体积测量值的比较是通过双因素方差分析之后进行Tukey多重比较检验而进行的。p值小于0.05被认为是显著的。
在对CT26肿瘤施用单独的mGI-101或mGI-101与乐伐替尼物质的组合时肿瘤大小的结果在图86中示出。作为测量肿瘤大小的结果，如与对照相比，在已接受单独的乐伐替尼的组和已接受mGI-101+乐伐替尼的组合的组中都观察到了统计学上显著的抗癌效应。已接受单独的乐伐替尼的组在开始施用测试物质后第18天和第21天的肿瘤大小水平在统计学上显著低于对照的肿瘤大小水平(p<0.5、p<0.1)。在开始施用测试物质后第16天、第18天和第21天已接受mGI-101+乐伐替尼的组合的组的肿瘤大小水平在统计学上显著低于对照的肿瘤大小水平(p<0.5、p<0.001、p<0.0001)，并且在第18天和第21天在统计学上显著低于已接受单独的mGI-101的组的肿瘤大小水平(p<0.01、p<0.0001)。
各个测试组的个体肿瘤大小示出在图88中。根据个体肿瘤大小的结果，与已接受单独的mGI-101的组相比，已接受mGI-101+乐伐替尼的组合的组表现出优异的肿瘤生长抑制效应。
在实验结束时，肿瘤生长抑制率为30％、50％或80％或更高的小鼠如图87所示。媒介物对照表现出在4只小鼠中30％或更大、在3只小鼠中50％或更大、并且在1只小鼠中80％或更大的肿瘤生长抑制率。已接受单独的mGI-101的组表现出在6只小鼠中30％或更大、在2只小鼠中50％或更大、并且在1只小鼠中80％或更大的肿瘤生长抑制率。已接受单独的乐伐替尼的组表现出在6只小鼠中30％或更大、在4只小鼠中50％或更大、并且在1只小鼠中80％或更大的肿瘤生长抑制率。已接受mGI-101+乐伐替尼的组合的组表现出在10只小鼠中30％或更大、在6只小鼠中50％或更大、并且没有小鼠中80％或更大的肿瘤生长抑制率。
实验例27.2.对通过在移植有小鼠源性肾癌细胞系的小鼠中施用mGI-101和乐伐替尼的组合实现的抗癌效应的鉴定
本实验是为了评估在将Renca细胞(小鼠肾癌细胞)同种异体移植到BALB/c小鼠中的肿瘤模型中施用单独的作为测试物质的mGI-101或mGI-101与乐伐替尼物质的组合后的肿瘤生长抑制效应。
Renca细胞购自ATCC(USA)并在含有10％FBS(Gibco)和1％抗生素/抗真菌剂(Gibco)的RPMI1640培养基(Gibco)中培养。使用胰蛋白酶(Gibco)收获所培养的细胞，然后在PBS中悬浮。为了建立同种异体移植肿瘤模型，将5×106个Renca细胞皮下注射到BALB/c雌性小鼠(8周龄)的背部中。在细胞系移植后的植入和生长期期间每天一次地观察一般症状。
在小鼠的肿瘤移植物细胞接种后一定时间段，对健康状况无异常的动物进行肿瘤体积测量，并随机选择和分配小鼠，每组包括10只小鼠。如表20所示，配置测试组并施用测试物质。
[表20]
Figure BDA0003850098890000791
Figure BDA0003850098890000801
在测试期期间每天一次地观察小鼠的死亡、一般症状的类型、发病日期和症状的严重程度，并针对每个受试者进行记录。在观察期期间每周两次测量Renca实体癌的大小，并使用游标卡尺测量肿瘤的长轴(最大长度，L)和短轴(垂直宽度，W)，并通过将它们代入以下等式来计算肿瘤体积(TV)和肿瘤生长抑制率(TGI)。
[等式1]
TV(mm3)＝(W2×L)/2
[等式2]
％TGI(肿瘤生长抑制)＝(1-(Ti-T0)/(Vi-V0))×100
将每个受试者施用前的肿瘤体积设定为分组时测量的值，并与媒介物对照相比较来评估抗肿瘤效应。
所有统计计算均使用Prism 8.0(Graph Pad Software Inc,USA)执行。肿瘤体积测量值的比较是通过双因素方差分析之后进行Tukey多重比较检验而进行的。p值小于0.05被认为是显著的。
在对Renca肿瘤施用单独的mGI-101或mGI-101与乐伐替尼物质的组合时肿瘤大小的结果在图89中示出。作为测量肿瘤大小的结果，在开始施用测试物质后第15天已接受mGI-101(BIW)+乐伐替尼的组合的组的肿瘤大小在统计学上显著低于媒介物对照和已接受单独的mGI-101(BIW)的组的肿瘤大小(p<0.05)。
各个测试组的个体肿瘤大小示出在图91中。根据个体肿瘤大小的结果，已接受mGI-101(BIW)+乐伐替尼的组合的组表现出优异的肿瘤生长抑制效应。
图90示出了当在移植有Renca的小鼠中联合施用mGI-101和乐伐替尼时的肿瘤生长抑制率。媒介物对照表现出在4只小鼠中30％或更大、在3只小鼠中50％或更大、并且在2只小鼠中80％或更大的肿瘤生长抑制率。已接受每周一次单独的mGI-101的组表现出在5只小鼠中30％或更大、在2只小鼠中50％或更大、并且在1只小鼠中80％或更大的肿瘤生长抑制率。已接受每周两次单独的mGI-101的组表现出在3只小鼠中30％或更大、在1只小鼠中50％或更大、并且在没有小鼠中80％或更大的肿瘤生长抑制率。已接受单独的乐伐替尼的组表现出在4只小鼠中30％或更大、在2只小鼠中50％或更大、并且在没有小鼠中80％或更大的肿瘤生长抑制率。已接受mGI-101(BIW)+乐伐替尼的组合的组表现出在8只小鼠中30％或更大、在6只小鼠中50％或更大、并且在1只小鼠中80％或更大的肿瘤生长抑制率。
VIII.根据融合蛋白二聚体与EGFR抑制剂的组合的施用的抗癌效应的鉴定
实验例28.mGI-101和EGFR抑制剂(西妥昔单抗)的组合的抗癌效应的鉴定
本实验是为了评估在体外环境中，通过用单独的测试物质GI-101或GI-101与西妥昔单抗物质的组合处理HCT116细胞(人结肠癌细胞)实现的杀伤癌细胞的效应。
HCT116细胞购自韩国细胞系库，并在含有10％FBS(Gibco)和1％抗生素/抗真菌剂(Gibco)的McCoy 5A培养基(ATCC)中培养。为了用于癌细胞杀伤测试中，使用胰蛋白酶(Gibco)收获细胞，然后将所述细胞悬浮在McCoy5A培养基中，然后使用Ficoll(GEHealthcare Life Sciences)溶液去除死细胞和碎片。将悬浮在McCoy 5A培养基中的细胞小心地铺在ficoll溶液上。用移液管收集通过在室温下以350×g离心20分钟形成的低比重细胞层，用PBS(Gibco)洗涤，然后在室温下以350×g离心5分钟。用不含FBS的RPMI1640培养基将分离出的细胞层制成2×105个细胞/mL的悬浮液。使用CELLTRACKERTM深红染料(Thermo)将癌细胞悬液于37℃染色1小时，以追踪癌细胞的增殖或增殖抑制。在染色后，将所述癌细胞悬液以1300rpm离心5分钟，然后将其用不含FBS的RPMI1640培养基洗涤，然后在含有5％人AB血清(Sigma)的RPMI1640培养基中悬浮至2×105个细胞/mL的浓度。将癌细胞悬液以50μl(1×104个细胞)加入96孔微孔板(Corning)的各孔中，然后在培养箱(37℃、5％CO2)中稳定化1小时。
为了鉴定测试物质通过抗体依赖性细胞毒性(ADCC)杀伤癌细胞的效应，使用CD56+CD16+NK细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec)从人外周血单核细胞(PBMC)中分离出自然杀伤细胞(NK细胞)并使用。在分离的NK细胞中，以与癌细胞系相同的方式使用Ficoll(GEHealthcare Life Sciences)溶液去除死细胞和碎片。将悬浮在RPMI1640培养基中的细胞小心地铺在ficoll溶液上。用移液管收集通过在室温下以350×g离心20分钟形成的低比重细胞层，用PBS(Gibco)洗涤，然后在室温下以350×g离心5分钟。将分离的细胞层在含有5％人AB血清(Sigma)的RPMI1640培养基中悬浮至2×105个细胞/mL的浓度。取决于条件，将PBMC悬浮液以50μl分配到已分配癌细胞系的96孔微孔板(Corning)的各孔中。
为了鉴定杀伤细胞的效应，以在每1mL含有5％人AB血清(Sigma)的RPMI1640培养基中1μl制备与待杀伤的细胞的DNA结合的CytoTox Green试剂(INCUCYTETM CytoToxGreen,Satorius)。将所制备的培养基用于稀释测试物质，并且当测试物质与癌细胞系和PBMC共培养时，可以通过对待杀伤的细胞进行染色来定量地鉴定杀伤细胞的效应。
使用含有CytoTox Green试剂的RPMI1640培养基稀释西妥昔单抗，然后在实验中以96孔微孔板每孔68.6nM(50μl)的终浓度使用。使用含有CytoTox Green试剂的RPMI1640培养基将GI-101稀释1/3，然后在实验中按96孔微孔板每孔50μl以100nM的终浓度使用。
将所制备的测试物质置于96孔微孔板的各孔中，其中取决于条件分配癌细胞系和PBMC，并在培养箱(37℃，5％CO2)中培养24小时，并且通过实时细胞成像分析设备IncuCyteS3(Satorious)观察癌细胞的增殖或死亡。通过用CytoTox Green试剂染成绿色的细胞的综合强度来定量癌细胞的死亡。
图92示出了当用100nM浓度的GI-101处理癌细胞时测量的杀伤癌细胞的程度。已接受单独的GI-101、单独的西妥昔单抗和GI-101+西妥昔单抗的组合的所有组均表现出高杀伤癌细胞的水平，并且已接受GI-101+西妥昔单抗的组合的组表现出最优异的杀伤癌细胞的效应。
IX.根据融合蛋白二聚体与PARP抑制剂的组合的施用的抗癌效应的鉴定
实验例29.对通过施用mGI-101和PARP抑制剂(奥拉帕尼)的组合实现的抗癌效应的鉴定
本实验是为了评估在将4T1细胞(小鼠乳腺癌细胞)同种异体移植到BALB/c小鼠中的肿瘤模型中施用单独的作为测试物质的mGI-101或mGI-101与PARP抑制剂奥拉帕尼的组合后的肿瘤生长抑制效应。
4T1细胞购自ATCC(USA)并在含有10％FBS(Gibco)和1％抗生素/抗真菌剂(Gibco)的RPMI1640培养基(Gibco)中培养。使用胰蛋白酶(Gibco)收获所培养的细胞，然后在PBS中悬浮。为了建立同种异体移植肿瘤模型，将1×105个4T1细胞皮下注射到BALB/c雌性小鼠(8周龄)的背部中。在细胞系移植后的植入和生长期期间每天一次地观察一般症状。
在小鼠的肿瘤移植物细胞接种后一定时间段，对健康状况无异常的动物进行肿瘤体积测量，并随机选择和分配小鼠，每组包括11只小鼠。如表21所示，配置测试组并施用测试物质。
[表21]
Figure BDA0003850098890000831
Figure BDA0003850098890000841
在测试期期间，每天一次地观察临床症状(诸如疾病和行为变化)，并鉴定已死的动物，并且当肿瘤大小达到4,000mm3时处死小鼠。在观察期期间每周两次测量4T1实体癌的大小，并使用卡尺(数显卡尺，mitutoyo,Japan)测量肿瘤的长轴(最大长度，L)和短轴(垂直宽度，W)，并通过将它们代入以下等式来计算肿瘤体积(TV)和肿瘤生长抑制率(TGI)。
[等式1]
TV(mm3)＝(W2×L)/2
[等式2]
％TGI(肿瘤生长抑制)＝(1-(Ti-T0)/(Vi-V0))×100
将每个受试者施用前的肿瘤体积设定为分组时测量的值，并与媒介物对照相比较来评估抗肿瘤效应。
所有统计计算均使用Prism 8.0(Graph Pad Software Inc,USA)执行。肿瘤体积测量值的比较是通过双因素方差分析之后进行Tukey多重比较检验而进行的。p值小于0.05被认为是显著的。
在对4T1肿瘤施用单独的mGI-101或mGI-101与奥拉帕尼物质的组合时肿瘤大小的结果在图94中示出。作为测量肿瘤大小的结果，与对照相比，在已接受药物的组中观察到了抗癌效应，并且根据肿瘤大小水平的结果，与已接受单独的mGI-101的组相比，已接受单独的mGI-101和mGI-101与奥拉帕尼物质的组合的组表现出优异的肿瘤生长抑制效应。
实验例30.对通过施用mGI-101和PARP抑制剂(他拉唑帕尼)的组合实现的抗癌效应的鉴定
本实验是为了评估在体外环境中，通过用单独的测试物质GI-101或GI-101与PARP抑制剂他拉唑帕尼物质的组合处理MDA-MB-231细胞(人乳腺癌细胞)实现的杀伤癌细胞的效应。
MDA-MB-231细胞购自韩国细胞系库，并在含有10％FBS(Gibco)和1％抗生素/抗真菌剂(Gibco)的RPMI1640培养基(Gibco)中培养。为了用于癌细胞杀伤测试中，使用胰蛋白酶(Gibco)收获细胞，然后将所述细胞悬浮在RPMI1640培养基中，然后使用Ficoll(GEHealthcare Life Sciences)溶液去除死细胞和碎片。将悬浮在RPMI1640培养基中的细胞小心地铺在ficoll溶液上。用移液管收集通过在室温下以350×g离心20分钟形成的低比重细胞层，用PBS(Gibco)洗涤，然后在室温下以350×g离心5分钟。用不含FBS的RPMI1640培养基将分离出的细胞层制成2×105个细胞/mL的悬浮液。使用CELLTRACKERTM深红染料(Thermo)将癌细胞悬液于37℃染色1小时，以追踪癌细胞的增殖或增殖抑制。在染色后，将所述癌细胞悬液以1300rpm离心5分钟，然后将其用不含FBS的RPMI1640培养基洗涤，然后在含有5％人AB血清(Sigma)的RPMI1640培养基中悬浮至2×105个细胞/mL的浓度。将癌细胞悬液以50μl(1×104个细胞)加入96孔微孔板(Corning)的各孔中，然后在培养箱(37℃、5％CO2)中稳定化1小时。
使用人外周血单核细胞(PBMC)来鉴定GI-101杀伤癌细胞的效应。人PBMC购自Zen-Bio，并且将冷冻贮存的PBMC置于37℃水浴中并尽快解冻，然后转移至含有10％FBS(Gibco)和1％抗生素/抗真菌剂(Gibco)的RPMI1640培养基(Gibco)中，并以1300rpm离心5分钟。将分离的细胞层在RPMI1640培养基中悬浮，然后以与癌细胞系相同的方式使用Ficoll(GEHealthcare Life Sciences)溶液去除死细胞和碎片。将悬浮在RPMI1640培养基中的细胞小心地铺在ficoll溶液上。用移液管收集通过在室温下以350×g离心20分钟形成的低比重细胞层，用PBS(Gibco)洗涤，然后在室温下以350×g离心5分钟。将分离的细胞层在含有5％人AB血清(Sigma)的RPMI1640培养基中悬浮至5×105个细胞/mL的浓度。取决于条件，将PBMC悬浮液以50μl分配到已分配癌细胞系的96孔微孔板(Corning)的各孔中。
为了鉴定杀伤细胞的效应，以在每1mL含有5％人AB血清(Sigma)的RPMI1640培养基中1μl制备与待杀伤的细胞的DNA结合的CytoTox Green试剂(INCUCYTETM CytoToxGreen,Satorius)。将所制备的培养基用于稀释测试物质，并且当测试物质与癌细胞系和PBMC共培养时，可以通过对待杀伤的细胞进行染色来定量地鉴定杀伤细胞的效应。
使用含有CytoTox Green试剂的RPMI1640培养基稀释他拉唑帕尼测试物质，然后在实验中以96孔微孔板每孔0.57nM(50μl)的终浓度使用。使用含有CytoTox Green试剂的RPMI1640培养基将GI-101稀释1/3，然后在实验中以0.4nM、1.2nM、3.7nM、11.1nM、33.3nM和100nM的终浓度按96孔微孔板每孔50μl使用。
将所制备的测试物质置于96孔微孔板的各孔中，其中取决于条件分配癌细胞系和PBMC，并在培养箱(37℃，5％CO2)中培养24小时，并且通过实时细胞成像分析设备IncuCyteS3(Satorious)观察癌细胞的增殖或死亡。通过用CytoTox Green试剂染成绿色的细胞的综合强度来定量癌细胞的死亡。
结果，鉴定出如与已接受单独的各种药物的组相比，已接受GI-101和他拉唑帕尼的组合的组表现出优异的杀伤癌细胞的效应。
X.根据融合蛋白二聚体与DNA甲基转移酶抑制剂的组合的施用的抗癌效应的鉴定
实验例31.对通过在移植有小鼠源性结直肠癌细胞的小鼠中施用mGI-101和瓜地西他滨的组合实现的抗癌效应的鉴定
本实验是为了评估在将CT26细胞(鼠结肠癌细胞)同种异体移植到BALB/c小鼠中的肿瘤模型中施用单独的作为测试物质的mGI-101或mGI-101与抑制DNA甲基化的瓜地西他滨物质的组合后的肿瘤生长抑制效应。
CT26细胞购自ATCC(USA)并在含有10％FBS(Gibco)和1％抗生素/抗真菌剂(Gibco)的RPMI1640培养基(Gibco)中培养。使用胰蛋白酶(Gibco)收获所培养的细胞，然后在PBS中悬浮。为了建立同种异体移植肿瘤模型，将5×105个CT26细胞皮下注射到BALB/c雌性小鼠(8周龄)的右胁腹(图97)。
在细胞接种后大约第7天鉴定小鼠的肿瘤移植物，并基于肿瘤体积(50-120mm3)随机分配小鼠，每组包括13只小鼠。如表22所示，配置测试组并施用测试物质。
[表22]
Figure BDA0003850098890000871
在测试期期间，每天一次地观察临床症状(诸如疾病和行为变化)，并鉴定已死的动物，并且当肿瘤大小达到4,000mm3时处死小鼠。使用肿瘤3D扫描仪(TM900,Peria,Belgium)测量CT26实体癌的大小。对于每个实验组，计算体重的平均损失和百分比变化以及平均肿瘤生长抑制。评估与媒介物对照相比的抗肿瘤功效。所有统计计算均使用Prism8.0(Graph Pad Software Inc,USA)执行。肿瘤体积测量值的比较是通过双因素方差分析之后进行Tukey多重比较检验而进行的。p值小于0.05被认为是显著的。
在对CT26肿瘤施用单独的mGI-101或mGI-101与瓜地西他滨物质的组合时肿瘤大小的结果在图97和图100中示出。作为测量肿瘤大小的结果，与对照相比，在已接受药物的组中观察到了抗癌效应，并且与已接受单独的mGI-101的组相比，已接受mGI-101与瓜地西他滨的组合的组表现出更优异的肿瘤生长抑制效应。已接受mGI-101(3mg/kg)+瓜地西他的组合的组在开始施用测试物质后第7天的肿瘤大小在统计学上显著低于对照的肿瘤大小(p<0.05)。在开始施用测试物质后第10天，已接受单独的mGI-101(0.6mg/kg)的组的肿瘤大小水平趋于低于对照的肿瘤大小水平，并且已接受单独的mGI-101(3mg/kg)的组的肿瘤大小水平在统计学上显著低于对照的肿瘤大小水平(p<0.05)。已接受mGI-101(0.6mg/kg)+瓜地西他滨的组合的组和已接受mGI-101(3mg/kg)+瓜地西他滨的组合的组的肿瘤大小水平在统计学上显著低于对照的肿瘤大小水平(p<0.01、p<0.001)。
各个测试组的个体肿瘤大小示出在图99和图102中。根据个体肿瘤大小的结果，已接受单独的mGI-101的组也表现出肿瘤生长抑制效应，并且已接受mGI-101和瓜地西他滨物质的组合的组表现出最优异的肿瘤生长抑制效应。
在实验结束时，肿瘤生长抑制率为30％、50％或80％或更高的小鼠如图99和图101所示。鉴定出肿瘤生长抑制率为30％、50％、80％或更高的受试者在已接受mGI-101(3mg/kg)+瓜德西他滨的组合的组中最多。
XI.IX.根据融合蛋白二聚体与抗癌化疗剂(抗肿瘤剂或细胞毒性剂)的组合的施用的抗癌效应的鉴定
实验例32.对通过在移植有小鼠源性乳腺癌细胞的小鼠中施用mGI-101、抗PD-L1抗体和多西紫杉醇的组合实现的抗癌效应的鉴定
本实验是为了评估根据在将4T1细胞(小鼠乳腺癌细胞)同种异体移植到BALB/c小鼠中的肿瘤模型中施用单独的测试物质mGI-101或其与多西紫杉醇(Selleck Chemicals，目录号S1148)和抗PD-L1抗体(BioXcell，目录号BE0101)的组合的抗癌功效。
4T1细胞购自ATCC(USA)并在含有10％FBS(Gibco)和1％抗生素/抗真菌剂(Gibco)的RPMI1640培养基(Gibco)中培养。使用胰蛋白酶(Gibco)收获所培养的细胞，然后用PBS制备细胞悬液并贮存在冰上直至注射到小鼠体内。为了建立同种异体移植肿瘤模型，在鉴定出BALB/c雌性小鼠(8周龄)腹侧区域的右上方第二个乳腺脂肪垫的位置后，将在所述乳腺脂肪垫内制备的4T1细胞系以4×104个细胞/40μl/头注射。
在小鼠的肿瘤移植物细胞接种后一定时间段，对健康状况无异常的动物进行肿瘤体积测量，并选取受试者，使得每组的平均值达到低于70-100mm3，并将所选取的动物基于肿瘤体积和体重尽可能均匀地分配，每组包括10只动物。如表23所示，配置测试组并施用测试物质。
将多西紫杉醇溶于100％DMSO中，然后用5％的DMSO、30％的PEG300、5％的Tween80和60％的注射用蒸馏水(DMSO:PEG300:Tween 80:注射用蒸馏水＝5％:30％:5％:60％(v:v:v:v))调整体积并准备好。
考虑到剂量的量和体积，使用1X PBS制备和施用抗PD-L1抗体。
[表23]
Figure BDA0003850098890000891
在测试期期间，每天一次地观察临床症状(诸如疾病和行为变化)，并鉴定已死的动物，并且当肿瘤大小达到4,000mm3时处死小鼠。在观察期期间每周两次测量4T1实体癌的大小，并使用卡尺(数显卡尺，mitutoyo,Japan)测量肿瘤的长轴(最大长度，L)和短轴(垂直宽度，W)，并通过将它们代入以下等式来计算肿瘤体积(TV)和肿瘤生长抑制率(TGI)。
[等式1]
TV(mm3)＝(W2×L)/2
[等式2]
％TGI(肿瘤生长抑制)＝(1-(Ti-T0)/(Vi-V0))×100
将每个受试者施用前的肿瘤体积设定为分组时测量的值，并与媒介物对照相比较来评估抗肿瘤效应。
所有统计计算均使用Prism 8.0(Graph Pad Software Inc,USA)执行。肿瘤体积测量值的比较是通过双因素方差分析之后进行Tukey多重比较检验而进行的。p值小于0.05被认为是显著的。
在将单独的mGI-101或其与多西紫杉醇和抗PD-L1抗体的组合施用于移植有小鼠源性乳腺癌细胞的小鼠后，测量肿瘤大小的结果在图103中示出。作为测量肿瘤大小的结果，在开始施用测试物质后第14天，与对照相比，在已接受多西紫杉醇的组和已接受多西紫杉醇+mGI-101+aPD-L1的组合的组中观察到了是统计学上显著的抗癌效应(p<0.05、p<0.01)。
各个测试组的个体肿瘤大小示出在图105中。
图104示出了当在移植有4T1的小鼠中单独施用mGI-101或其与多西紫杉醇和抗PD-L1抗体的组合时，在测试结束时的肿瘤生长抑制率。媒介物对照表现为在没有小鼠有30％或更大、50％或更大的肿瘤生长抑制率。已接受mGI-101+aPD-L1的组合的组表现出在1只小鼠中30％或更大，并且在没有小鼠中50％或更大的肿瘤生长抑制率。已接受多西紫杉醇的组表现出在5只小鼠中30％或更大、并且在1只小鼠中50％或更大的肿瘤生长抑制率。已接受多西紫杉醇+mGI-101+aPD-L1的组合的组表现出在6只小鼠中30％或更大、并且在2只小鼠中50％或更大的肿瘤生长抑制率。
实验例33.对通过在移植有小鼠源性乳腺癌细胞的小鼠中施用mGI-101和紫杉醇的组合实现的抗癌效应的鉴定
本实验是为了评估在将EMT6细胞(小鼠乳腺癌细胞)同种异体移植到BALB/c小鼠中的肿瘤模型中施用单独的作为测试物质的mGI-101或mGI-101与紫杉醇物质的组合后的肿瘤生长抑制效应。
EMT6细胞购自ATCC(USA)并在含有10％FBS(Gibco)和1％抗生素/抗真菌剂(Gibco)的Waymouth MB 751/1培养基(WELGENE)中培养。使用胰蛋白酶(Gibco)收获所培养的细胞，然后用PBS制备10只小鼠的高浓度细胞悬液(2×106个细胞/0.4mL)并贮存在冰上直至注射到小鼠体内。为了建立同种异体移植肿瘤模型，从BALB/c雌性小鼠(7周龄)的腹侧区域右上方的第4个***位置稍微远离地切开皮肤，并确定切开部位的***脂肪垫的位置，然后将在所述***脂肪垫内制备的EMT6细胞系以2×105个细胞/40ul/头注射。
在小鼠的肿瘤移植物细胞接种后一定时间段，对健康状况无异常的动物进行肿瘤体积测量，并选取受试者，使得每组的平均值达到低于70-100mm3，并将所选取的动物基于肿瘤体积和体重尽可能均匀地分配，每组包括10只动物。如表24和图106所示，配置测试组并施用测试物质。
[表24]
Figure BDA0003850098890000911
Figure BDA0003850098890000921
在测试期期间，每天一次地观察临床症状(诸如疾病和行为变化)，并鉴定已死的动物，并且当肿瘤大小达到4,000mm3时处死小鼠。在观察期期间每周两次测量EMT6实体癌的大小，并使用卡尺(数显卡尺，mitutoyo,Japan)测量肿瘤的长轴(最大长度，L)和短轴(垂直宽度，W)，并通过将它们代入以下等式来计算肿瘤体积(TV)和肿瘤生长抑制率(TGI)。
[等式1]
TV(mm3)＝(W2×L)/2
[等式2]
％TGI(肿瘤生长抑制)＝(1-(Ti-T0)/(Vi-V0))×100
将每个受试者施用前的肿瘤体积设定为分组时测量的值，并与媒介物对照相比较来评估抗肿瘤效应。
所有统计计算均使用Prism 8.0(Graph Pad Software Inc,USA)执行。肿瘤体积测量值的比较是通过双因素方差分析之后进行Tukey多重比较检验而进行的。p值小于0.05被认为是显著的。
在对EMT6肿瘤施用单独的mGI-101或mGI-101与紫杉醇物质的组合时肿瘤大小的结果在图107中示出。作为测量肿瘤大小的结果，与对照相比，在已接受药物的组中观察到了抗癌效应，并且已接受单独的mGI-101以及其与紫杉醇物质的组合的组在开始施用所述物质后第11天的肿瘤大小水平在统计学上显著低于对照的肿瘤大小水平(p<0.01、p<0.001)。所有已接受紫杉醇的组、已接受单独的mGI-101的组和已接受mGI-101与紫杉醇物质的组合的组在开始施用所述物质后第13天的肿瘤大小在统计学上显著低于对照的肿瘤大小(p<0.05、p<0.01、p<0.0001)。
各个测试组的个体肿瘤大小示出在图109中。根据个体肿瘤大小的结果，在开始施用测试物质后第13天，已接受单独的mGI-101的组表现出在2只小鼠中完全缓解，并且已接受mGI-101与紫杉醇的组合的组表现出在1只小鼠中完全缓解。
图108示出了当在移植有EMT6的小鼠中联合施用mGI-101和紫杉醇时的肿瘤生长抑制率。媒介物对照表现出在2只小鼠中30％或更大、在1只小鼠中50％或更大、并且在没有小鼠中80％或更大的肿瘤生长抑制率。已接受mGI-101的组表现出在6只小鼠中30％或更大、在5只小鼠中50％或更大、并且在5只小鼠中80％或更大的肿瘤生长抑制率。已接受紫杉醇的组表现出在7只小鼠中30％或更大、在4只小鼠中50％或更大、并且在2只小鼠中80％或更大的肿瘤生长抑制率。已接受mGI-101+紫杉醇的组合的组表现出在7只小鼠中30％或更大、在5只小鼠中50％或更大、并且在4只小鼠中80％或更大的肿瘤生长抑制率。
XII.根据以下组合的施用的抗癌效应的鉴定：mGI-101+抗PD-1+培美曲塞+顺铂(化疗，维持疗法)
实验例34.对通过在移植有小鼠源性肺癌细胞的小鼠中施用mGI-101与抗癌化疗剂和抗PD-1抗体的组合实现的抗癌效应的鉴定
本实验是为了评估在将TC1细胞、肺癌细胞系同种异体移植到C57BL/6小鼠中的肿瘤模型中腹腔施用单独的作为测试物质的mGI-101或其与抗癌化疗剂顺铂(SelleckChemicals，目录号S1166)、培美曲塞(Selleck Chemicals，目录号S1135)和作为标准治疗剂的抗PD-1抗体(BioXcell，目录号BE0146)的组合后的肿瘤生长抑制效应。小鼠源性肺癌细胞系TC1购自ATCC(USA)并用于测试。
将TC1细胞在含有10％FBS(Gibco)和1％抗生素/抗真菌剂(Gibco)的RPMI1640培养基(Gibco)中培养。使用胰蛋白酶(Gibco)收获所培养的细胞，然后将1×106个TC1细胞皮下注射到C57BL/6雌性小鼠(7周龄)的右胁腹中，以建立同种异体移植肿瘤模型。
基于肿瘤体积(约100mm3)随机分配小鼠，每组包括13只至19只小鼠。大约在细胞接种后第2天鉴定肿瘤移植物。将测试组如表25所示配置，并将测试物质按照图110所示的安排施用。
将测试分成一线处理和抗癌维持疗法。对于一线处理，分别每周两次腹腔施用5mg/kg的顺铂(CDDP)、100mg/kg的培美曲塞和10mg/kg的抗PD-1抗体，并且在已接受与mGI-101的组合的组的情况下，将mGI-101以3mg/kg每周1次，即共3次地腹腔施用。
在抗癌维持疗法中，单独施用mGI-101，或将mGI-101与抗癌化疗剂和抗PD-1抗体联合施用。
[表25]
Figure BDA0003850098890000941
Figure BDA0003850098890000951
在测试期期间，每天一次地观察临床症状(诸如疾病和行为变化)，并鉴定已死的动物，并且当肿瘤大小达到4,000mm3时处死小鼠。使用肿瘤3D扫描仪(TM900,Peria,Belgium)测量TC1实体癌的大小。对于每个实验组，计算体重的平均损失和百分比变化以及平均肿瘤生长抑制。评估与小鼠IgG4对照相比的抗肿瘤功效。所有统计计算均使用Prism8.0(Graph Pad Software Inc,USA)执行。肿瘤体积测量值的比较是通过双因素方差分析之后进行Bonferroni多重比较检验而进行的。p值小于0.05被认为是显著的。
针对TC1肿瘤施用单独的mGI-101或其与抗癌化疗剂和抗PD-1抗体的组合的结果在图111中示出。如与对照相比，在已接受药物的组中观察到了抗癌效应，并且在24天的测试期期间肿瘤大小的差异是显著的。在一线处理的情况下，已接受mGI-101与抗癌化疗剂和抗PD-1抗体的组合的组表现出比已仅接受抗癌化疗剂和抗PD-1抗体的组更优异的肿瘤生长抑制效应。在抗癌维持疗法的情况下，已接受单独的mGI-101的组表现出与已接受抗癌化疗剂和抗PD-1抗体的组同样多的抗癌效应，并且已接受mGI-101与抗癌化疗剂和抗PD-1抗体的组合的组表现出更优异的肿瘤生长抑制效应。
各个测试组的个体肿瘤大小示出在图112至图117中。根据个体肿瘤大小的结果，在一线处理和抗癌维持疗法中，已接受与mGI-101的组合的组表现出最优异的肿瘤生长抑制效应。
图118示出了通过分析根据在移植有TC1细胞的小鼠中的一线处理和抗癌维持疗法期间施用与mGI-101的组合的小鼠的存活率而获得的结果。在一线疗法和抗癌维持疗法期间，在已接受与mGI-101的组合的组中鉴定出了100％的存活率。各测试组的平均体重在表26中显示。
[表26]
Figure BDA0003850098890000961
Figure BDA0003850098890000971
XIII.根据融合蛋白二聚体与抗HER抗体的组合的施用的抗癌效应的鉴定
实验例35.对通过施用GI-101和曲妥珠单抗的组合实现的抗癌效应的鉴定
本实验是为了评估在将BT-474细胞(人乳腺癌细胞)异种移植到BALB/cnu/nu小鼠中的肿瘤模型中施用单独的作为测试物质的mGI-101或mGI-101与赫赛汀(曲妥珠单抗)物质的组合后的肿瘤生长抑制效应。
BT-474细胞购自ATCC(USA)并在含有10％FBS(Gibco)和1％抗生素/抗真菌剂(Gibco)的RPMI1640培养基(Welgene)中培养。使用胰蛋白酶(Gibco)收获所培养的细胞，然后通过在培养基中稀释至5.0×106个细胞/0.05mL的浓度来制备细胞系。
为了建立BT-474细胞的异种移植肿瘤模型，通过使用颗粒移植套针(MP-182，Innovative Research of America,USA)拉动小鼠毛皮以营造空间，使得所述空间位于BALB/c nu/nu雌性小鼠(7周龄)的左胁腹的皮肤下来将所述BT-474细胞皮下注射到所述左胁腹中。在注射***颗粒后7天，分配所制备的BT-474细胞悬液(5×106个细胞/0.05mL)并加入0.05mL无酚红的MATRIGEL基质(356237，BD)，并且将所制备的溶液装入一次性注射器中，并通过在动物的右背侧区域中以0.1mL/头皮下施用来执行溶液的移植。
在小鼠的肿瘤移植物细胞接种后一定时间段，对健康状况无异常的动物进行肿瘤体积测量，并选取受试者，使得每组的平均值达到低于60-120mm3，并将所选取的动物基于肿瘤体积和体重尽可能均匀地分配，每组包括10只动物。如表27所示，配置测试组并施用测试物质。
[表27]
Figure BDA0003850098890000981
Figure BDA0003850098890000991
在测试期期间，每天一次地观察临床症状(诸如疾病和行为变化)，并鉴定已死的动物，并且当肿瘤大小达到4,000mm3时处死小鼠。在观察期期间每周两次测量实体癌的大小，并使用卡尺(数显卡尺，mitutoyo,Japan)测量肿瘤的长轴(最大长度，L)和短轴(垂直宽度，W)，并通过将它们代入以下等式来计算肿瘤体积(TV)和肿瘤生长抑制率(TGI)。
[等式1]
TV(mm3)＝(W2×L)/2
[等式2]
％TGI(肿瘤生长抑制)＝(1-(Ti-T0)/(Vi-V0))×100
将每个受试者施用前的肿瘤体积设定为分组时测量的值。
所有统计计算均使用Prism 8.0(Graph Pad Software Inc,USA)执行。肿瘤体积测量值的比较是通过双因素方差分析之后进行Tukey多重比较检验而进行的。p值小于0.05被认为是显著的。
在将单独的mGI-101或其与赫赛汀的组合施用于移植有人源性乳腺癌细胞的小鼠后测量肿瘤大小的结果在图119中示出。在已接受单独的mGI-101的组的情况下，与媒介物对照相比，在开始施用测试物质后第28天显示出肿瘤大小的统计学显著减小(p<0.05)。在已接受单独的赫赛汀的组的情况下，与媒介物对照相比，在开始施用测试物质后的第14天、第18天和第21天显示出肿瘤大小的统计学上显著的减小(在第14天和第18天的情况下，p<0.05；在第21天的情况下，p<0.01)，但是肿瘤大小趋于在第25天和第28天迅速增大。在已接受mGI-101+赫赛汀的组合的组的情况下，与媒介物对照相比，在开始施用测试物质后的第14天至第28天显示出肿瘤大小的统计学上显著的减小，并且与已接受单独的赫赛汀的组相比，在开始施用测试物质后第28天显示出肿瘤大小的统计学上显著的减小(p<0.01)。
各个测试组的个体肿瘤大小示出在图121中。根据个体肿瘤大小的结果，与媒介物对照相比，已接受测试物质的组表现出肿瘤生长抑制效应，并且特别地，与已接受单独的mGI-101的组相比，已接受mGI-101+赫赛汀的组合的组表现出优异的肿瘤生长抑制效应。
图120示出了当在异种移植有BT-474的肿瘤小鼠中施用单独的mGI-101或其与赫赛汀的组合时，在测试结束时的肿瘤生长抑制率。媒介物对照表现出在3只小鼠中30％或更大、在3只小鼠中50％或更大、并且在没有小鼠中80％或更大的肿瘤生长抑制率。已接受单独的mGI-101的组表现出在5只小鼠中30％或更大、在1只小鼠中50％或更大、并且在没有小鼠中80％或更大的肿瘤生长抑制率。已接受单独的赫赛汀的组表现出在3只小鼠中30％或更大、在2只小鼠中50％或更大、并且在1只小鼠中80％或更大的肿瘤生长抑制率。已接受mGI-101+赫赛汀的组合的组表现出在5只小鼠中30％或更大、在4只小鼠中50％或更大、并且在没有小鼠中80％或更大的肿瘤生长抑制率。
实验例36.对通过施用GI-101和帕妥珠单抗的组合实现的抗癌效应的鉴定
本实验是为了评估在体外环境中，通过用单独的测试物质GI-101或GI-101与帕妥珠单抗物质的组合处理HCT116细胞(人结肠癌细胞)实现的杀伤癌细胞的效应。
HCT116细胞购自韩国细胞系库，并在含有10％FBS(Gibco)和1％抗生素/抗真菌剂(Gibco)的McCoy 5A培养基(ATCC)中培养。为了用于癌细胞杀伤测试中，使用胰蛋白酶(Gibco)收获细胞，然后将所述细胞悬浮在McCoy 5A培养基中，然后使用Ficoll(GEHealthcare Life Sciences)溶液去除死细胞和碎片。将悬浮在McCoy 5A培养基中的细胞小心地铺在ficoll溶液上。用移液管收集通过在室温下以350×g离心20分钟形成的低比重细胞层，用PBS(Gibco)洗涤，然后在室温下以350×g离心5分钟。用不含FBS的RPMI1640培养基将分离出的细胞层制成2×105个细胞/mL的悬浮液。使用CELLTRACKERTM深红染料(Thermo)将癌细胞悬液于37℃染色1小时，以追踪癌细胞的增殖或增殖抑制。在染色后，将所述癌细胞悬液以1300rpm离心5分钟，然后将其用不含FBS的RPMI1640培养基洗涤，然后在含有5％人AB血清(Sigma)的RPMI1640培养基中悬浮至2×105个细胞/mL的浓度。将癌细胞悬液以50μl(1×104个细胞)加入96孔微孔板(Corning)的各孔中，然后在培养箱(37℃、5％CO2)中稳定化1小时。
为了鉴定测试物质通过抗体依赖性细胞毒性(ADCC)杀伤癌细胞的效应，使用CD56+CD16+NK细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec)从人外周血单核细胞(PBMC)中分离出自然杀伤细胞(NK细胞)并使用。在分离的NK细胞中，以与癌细胞系相同的方式使用Ficoll(GEHealthcare Life Sciences)溶液去除死细胞和碎片。将悬浮在RPMI1640培养基中的细胞小心地铺在ficoll溶液上。用移液管收集通过在室温下以350×g离心20分钟形成的低比重细胞层，用PBS(Gibco)洗涤，然后在室温下以350×g离心5分钟。将分离的细胞层在含有5％人AB血清(Sigma)的RPMI1640培养基中悬浮至2×105个细胞/mL的浓度。取决于条件，将PBMC悬浮液以50μl分配到已分配癌细胞系的96孔微孔板(Corning)的各孔中。
为了鉴定杀伤细胞的效应，以在每1mL含有5％人AB血清(Sigma)的RPMI1640培养基中1μl制备与待杀伤的细胞的DNA结合的CytoTox Green试剂(INCUCYTETM CytoToxGreen,Satorius)。将所制备的培养基用于稀释测试物质，并且当测试物质与癌细胞系和PBMC共培养时，可以通过对待杀伤的细胞进行染色来定量地鉴定杀伤细胞的效应。
使用含有CytoTox Green试剂的RPMI1640培养基稀释帕妥珠单抗，然后在实验中以96孔微孔板每孔16.9nM(50μl)的终浓度使用。
使用含有CytoTox Green试剂的RPMI1640培养基将GI-101稀释1/3，然后在实验中以0.4nM、1.2nM、3.7nM、11.1nM、33.3nM和100nM的终浓度按96孔微孔板每孔50μl使用。
将所制备的测试物质置于96孔微孔板的各孔中，其中取决于条件分配癌细胞系和PBMC，并在培养箱(37℃，5％CO2)中培养24小时，并且通过实时细胞成像分析设备IncuCyteS3(Satorious)观察癌细胞的增殖或死亡。通过用CytoTox Green试剂染成绿色的细胞的综合强度来定量癌细胞的死亡。
图122示出了通过测量在用浓度分别为0.4nM、1.2nM、3.7nM、11.1nM、33.3nM和100nM的GI-101处理HCT116细胞后杀伤癌细胞的程度获得的结果。在仅共培养癌细胞和NK细胞的情况下并且在使用单独的帕妥珠单抗处理的情况下，没有显示出与仅培养癌细胞的情况下相同的杀伤癌细胞的效应。在用单独的GI-101以及用GI-101+帕妥珠单抗的组合处理的情况下，显示出了优异的杀伤癌细胞的效应，并且在用GI-101+帕妥珠单抗的组合处理的情况下，显示出了最优异的杀伤癌细胞的效应。
XIV.根据融合蛋白二聚体与CDK4/6抑制剂的组合的施用的抗癌效应的鉴定
实验例37.对通过施用GI-101和阿贝西利的组合实现的抗癌效应的鉴定
本实验是为了评估在将4T1细胞(小鼠乳腺癌细胞)同种异体移植到BALB/c小鼠中的肿瘤模型中施用单独的作为测试物质的mGI-101或mGI-101与阿贝西利物质的组合后的肿瘤生长抑制效应。
4T1细胞购自ATCC(USA)并在含有10％FBS(Gibco)和1％抗生素/抗真菌剂(Gibco)的RPMI1640培养基(Gibco)中培养。使用胰蛋白酶(Gibco)收获所培养的细胞，然后在PBS中悬浮。为了建立同种异体移植肿瘤模型，将1×105个4T1细胞皮下注射到BALB/c雌性小鼠(8周龄)的背部中。在细胞系移植后的植入和生长期期间每天一次地观察一般症状。
在小鼠的肿瘤移植物细胞接种后一定时间段，对健康状况无异常的动物进行肿瘤体积测量，并随机选择和分配小鼠，每组包括11只小鼠。如表28所示，配置测试组并施用测试物质。
[表28]
Figure BDA0003850098890001031
在测试期期间每天一次地观察小鼠的死亡、一般症状的类型、发病日期和症状的严重程度，并针对每个受试者进行记录。在观察期期间每周两次测量Renca实体癌的大小，并使用游标卡尺测量肿瘤的长轴(最大长度，L)和短轴(垂直宽度，W)，并通过将它们代入以下等式来计算肿瘤体积(TV)和肿瘤生长抑制率(TGI)。
[等式1]
TV(mm3)＝(W2×L)/2
[等式2]
％TGI(肿瘤生长抑制)＝(1-(Ti-T0)/(Vi-V0))×100
将每个受试者施用前的肿瘤体积设定为分组时测量的值，并与媒介物对照相比较来评估抗肿瘤效应。
所有统计计算均使用Prism 8.0(Graph Pad Software Inc,USA)执行。肿瘤体积测量值的比较是通过双因素方差分析之后进行Tukey多重比较检验而进行的。p值小于0.05被认为是显著的。
在移植有小鼠源性乳腺癌细胞的小鼠中施用单独的mGI-101或其与阿贝西利物质的组合后测量肿瘤大小的结果在图123中示出。在已接受mGI-101(BIW)+阿贝西利组合的组的情况下，肿瘤生长抑制趋于最高。
各个测试组的个体肿瘤大小示出在图125中。根据个体肿瘤大小的结果，已接受mGI-101(BIW)+阿贝西利的组合的组表现出最大的肿瘤生长抑制效应。
图124示出了当在移植有4T1的小鼠中联合施用mGI-101和阿贝西利时的肿瘤生长抑制率。媒介物对照表现出在3只小鼠中30％或更大、并且在没有小鼠中50％或更大和80％或更大的肿瘤生长抑制率。已接受mGI-101(BIW)的组表现出在3只小鼠中30％或更大、在1只小鼠中50％或更大、并且在没有小鼠中80％或更大的肿瘤生长抑制率。已接受阿贝西利的组表现出在4只小鼠中30％或更大、在1只小鼠中50％或更大、并且在1只小鼠中80％或更大的肿瘤生长抑制率。已接受mGI-101(BIW)+阿贝西利的组合的组表现出在7只小鼠中30％或更大、在5只小鼠中50％或更大、并且在1只小鼠中80％或更大的肿瘤生长抑制率。
实验例38.对通过施用GI-101和瑞博西利的组合实现的抗癌效应的鉴定
本实验是为了评估在体外环境中，通过用单独的测试物质GI-101或GI-101与瑞博西利物质的组合处理MDA-MB-231细胞(人乳腺癌细胞)实现的杀伤癌细胞的效应。
MDA-MB-231细胞购自韩国细胞系库，并在含有10％FBS(Gibco)和1％抗生素/抗真菌剂(Gibco)的RPMI1640培养基(Gibco)中培养。为了用于癌细胞杀伤测试中，使用胰蛋白酶(Gibco)收获细胞，然后将所述细胞悬浮在RPMI1640培养基中，然后使用Ficoll(GEHealthcare Life Sciences)溶液去除死细胞和碎片。将悬浮在RPMI1640培养基中的细胞小心地铺在ficoll溶液上。用移液管收集通过在室温下以350×g离心20分钟形成的低比重细胞层，用PBS(Gibco)洗涤，然后在室温下以350×g离心5分钟。用不含FBS的RPMI1640培养基将分离出的细胞层制成2×105个细胞/mL的悬浮液。使用CELLTRACKERTM深红染料(Thermo)将癌细胞悬液于37℃染色1小时，以追踪癌细胞的增殖或增殖抑制。在染色后，将所述癌细胞悬液以1300rpm离心5分钟，然后将其用不含FBS的RPMI1640培养基洗涤，然后在含有5％人AB血清(Sigma)的RPMI1640培养基中悬浮至2×105个细胞/mL的浓度。将癌细胞悬液以50μl(1×104个细胞)加入96孔微孔板(Corning)的各孔中，然后在培养箱(37℃、5％CO2)中稳定化1小时。
使用人外周血单核细胞(PBMC)来鉴定GI-101杀伤癌细胞的效应。人PBMC购自Zen-Bio，并且将冷冻贮存的PBMC置于37℃水浴中并尽快解冻，然后转移至含有10％FBS(Gibco)和1％抗生素/抗真菌剂(Gibco)的RPMI1640培养基(Gibco)中，并以1300rpm离心5分钟。将分离的细胞层在RPMI1640培养基中悬浮，然后以与癌细胞系相同的方式使用Ficoll(GEHealthcare Life Sciences)溶液去除死细胞和碎片。将悬浮在RPMI1640培养基中的细胞小心地铺在ficoll溶液上。用移液管收集通过在室温下以350×g离心20分钟形成的低比重细胞层，用PBS(Gibco)洗涤，然后在室温下以350×g离心5分钟。将分离的细胞层在含有5％人AB血清(Sigma)的RPMI1640培养基中悬浮至5×105个细胞/mL的浓度。取决于条件，将PBMC悬浮液以50μl分配到已分配癌细胞系的96孔微孔板(Corning)的各孔中。
为了鉴定杀伤细胞的效应，以在每1mL含有5％人AB血清(Sigma)的RPMI1640培养基中1μl制备与待杀伤的细胞的DNA结合的CytoTox Green试剂(INCUCYTETM CytoToxGreen,Satorius)。将所制备的培养基用于稀释测试物质，并且当测试物质与癌细胞系和PBMC共培养时，可以通过对待杀伤的细胞进行染色来定量地鉴定杀伤细胞的效应。
使用含有CytoTox Green试剂的RPMI1640培养基稀释瑞博西利测试物质，然后在实验中以96孔微孔板每孔913nM(50μl)的终浓度使用。使用含有CytoTox Green试剂的RPMI1640培养基将GI-101稀释1/3，然后在实验中按96孔微孔板每孔50μl以100nM的终浓度使用。
将所制备的测试物质置于96孔微孔板的各孔中，其中取决于条件分配癌细胞系和PBMC，并在培养箱(37℃，5％CO2)中培养24小时，并且通过实时细胞成像分析设备IncuCyteS3(Satorious)观察癌细胞的增殖或死亡。通过用CytoTox Green试剂染成绿色的细胞的综合强度来定量癌细胞的死亡。
图126示出了在100nM的GI-101的条件下杀伤癌细胞的效应。在仅共培养癌细胞和PBMC的情况下，鉴定出了杀伤癌细胞的效应，并且趋于高于使用单独GI-101处理的杀伤癌细胞的效应。在用单独的瑞博西利处理和用GI-101+瑞博西利的组合处理的情况下，与仅共培养癌细胞和PBMC的情况相比显示出了优异的杀伤癌细胞的效应，并且在用GI-101+瑞博西利的组合处理的情况下，显示出了最优异的杀伤癌细胞的效应。
XV.根据融合蛋白二聚体与STING激动剂的组合的施用的抗癌效应的鉴定
实验例39.对通过施用mGI-101和DMXAA的组合实现的抗癌效应的鉴定
本实验是为了评估根据在将MC38细胞(小鼠结肠癌细胞)同种异体移植到C57BL/6小鼠中的肿瘤模型中施用单独的作为测试物质的mGI-101或其与STING激动剂DMXAA物质的组合的抗癌功效。
为了建立同种异体移植肿瘤模型，将5×105个MC38细胞皮下注射到C57BL/6小鼠中。在细胞接种后大约第10天鉴定出小鼠的肿瘤移植物大小为100-200mm3，并分配小鼠，每组包括5只小鼠。将测试组如表29所示配置，并将测试物质按照图127所示的安排施用。
[表29]
Figure BDA0003850098890001061
Figure BDA0003850098890001071
在观察期期间每周三次测量MC38实体癌的大小，用卡尺测量肿瘤的长轴(最大长度，L)和短轴(垂直宽度，W)，并通过将它们代入以下等式来计算肿瘤体积(TV)，并且一旦肿瘤大小不小于2cm，就处死小鼠。
[等式1]
TV(mm3)＝(W2×L)/2
在对MC38肿瘤施用单独的mGI-101或其与DMXAA物质的组合时的存活率在图128中示出。在媒介物对照的情况下，所有小鼠在肿瘤注射后40天前死亡。在已接受单独的mGI-101的组的情况下，在肿瘤注射后第60天的存活率为20％；并且在已接受单独的STING激动剂DMXAA的组的情况下，在肿瘤注射后第60天的存活率为60％；并且在已接受mGI-101+DMXAA的组合的组的情况下，在肿瘤注射后第60天的存活率为80％，表明存活率高于其他组的存活率。
各个测试组的个体肿瘤大小示出在图129至图133中。已接受mGI-101+DMXAA的组合的组表现出最大的肿瘤生长抑制效应。
SEQUENCE LISTING
<110> GI 医诺微新
<120> 包含含有IL-2蛋白和CD80蛋白的融合蛋白和抗癌药物的用于治疗癌症的药物
组合物
<130> P22115892WP
<150> KR 10-2020-0033233
<151> 2020-03-18
<150> KR 10-2021-0020708
<151> 2021-02-16
<160> 39
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 信号肽 (TPA)
<400> 1
Met Asp Ala Met Leu Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly
1 5 10 15
Ala Val Phe Val Ser Pro Ser His Ala
20 25
<210> 2
<211> 208
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> hB7-1:35-242
<400> 2
Val Ile His Val Thr Lys Glu Val Lys Glu Val Ala Thr Leu Ser Cys
1 5 10 15
Gly His Asn Val Ser Val Glu Glu Leu Ala Gln Thr Arg Ile Tyr Trp
20 25 30
Gln Lys Glu Lys Lys Met Val Leu Thr Met Met Ser Gly Asp Met Asn
35 40 45
Ile Trp Pro Glu Tyr Lys Asn Arg Thr Ile Phe Asp Ile Thr Asn Asn
50 55 60
Leu Ser Ile Val Ile Leu Ala Leu Arg Pro Ser Asp Glu Gly Thr Tyr
65 70 75 80
Glu Cys Val Val Leu Lys Tyr Glu Lys Asp Ala Phe Lys Arg Glu His
85 90 95
Leu Ala Glu Val Thr Leu Ser Val Lys Ala Asp Phe Pro Thr Pro Ser
100 105 110
Ile Ser Asp Phe Glu Ile Pro Thr Ser Asn Ile Arg Arg Ile Ile Cys
115 120 125
Ser Thr Ser Gly Gly Phe Pro Glu Pro His Leu Ser Trp Leu Glu Asn
130 135 140
Gly Glu Glu Leu Asn Ala Ile Asn Thr Thr Val Ser Gln Asp Pro Glu
145 150 155 160
Thr Glu Leu Tyr Ala Val Ser Ser Lys Leu Asp Phe Asn Met Thr Thr
165 170 175
Asn His Ser Phe Met Cys Leu Ile Lys Tyr Gly His Leu Arg Val Asn
180 185 190
Gln Thr Phe Asn Trp Asn Thr Thr Lys Gln Glu His Phe Pro Asp Asn
195 200 205
<210> 3
<211> 30
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 铰链
<400> 3
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
1 5 10 15
Ser Ala Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro
20 25 30
<210> 4
<211> 216
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 免疫球蛋白 fc
<400> 4
Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
1 5 10 15
Pro Lys Asp Gln Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
20 25 30
Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr
35 40 45
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
50 55 60
Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
65 70 75 80
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
85 90 95
Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
100 105 110
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met
115 120 125
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
130 135 140
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
145 150 155 160
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
165 170 175
Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val
180 185 190
Phe Ser Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
195 200 205
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly
210 215
<210> 5
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 接头
<400> 5
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 6
<211> 133
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> hIL-2M
<400> 6
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Ala Met Leu Thr Ala Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr
130
<210> 7
<211> 617
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 包含IL-2变体和CD80片段的融合蛋白
<400> 7
Met Asp Ala Met Leu Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly
1 5 10 15
Ala Val Phe Val Ser Pro Ser His Ala Val Ile His Val Thr Lys Glu
20 25 30
Val Lys Glu Val Ala Thr Leu Ser Cys Gly His Asn Val Ser Val Glu
35 40 45
Glu Leu Ala Gln Thr Arg Ile Tyr Trp Gln Lys Glu Lys Lys Met Val
50 55 60
Leu Thr Met Met Ser Gly Asp Met Asn Ile Trp Pro Glu Tyr Lys Asn
65 70 75 80
Arg Thr Ile Phe Asp Ile Thr Asn Asn Leu Ser Ile Val Ile Leu Ala
85 90 95
Leu Arg Pro Ser Asp Glu Gly Thr Tyr Glu Cys Val Val Leu Lys Tyr
100 105 110
Glu Lys Asp Ala Phe Lys Arg Glu His Leu Ala Glu Val Thr Leu Ser
115 120 125
Val Lys Ala Asp Phe Pro Thr Pro Ser Ile Ser Asp Phe Glu Ile Pro
130 135 140
Thr Ser Asn Ile Arg Arg Ile Ile Cys Ser Thr Ser Gly Gly Phe Pro
145 150 155 160
Glu Pro His Leu Ser Trp Leu Glu Asn Gly Glu Glu Leu Asn Ala Ile
165 170 175
Asn Thr Thr Val Ser Gln Asp Pro Glu Thr Glu Leu Tyr Ala Val Ser
180 185 190
Ser Lys Leu Asp Phe Asn Met Thr Thr Asn His Ser Phe Met Cys Leu
195 200 205
Ile Lys Tyr Gly His Leu Arg Val Asn Gln Thr Phe Asn Trp Asn Thr
210 215 220
Thr Lys Gln Glu His Phe Pro Asp Asn Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
225 230 235 240
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Glu Ser Lys Tyr Gly
245 250 255
Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser
260 265 270
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Gln Leu Met Ile Ser Arg
275 280 285
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro
290 295 300
Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
305 310 315 320
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
325 330 335
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
340 345 350
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr
355 360 365
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
370 375 380
Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
385 390 395 400
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
405 410 415
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
420 425 430
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser
435 440 445
Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Leu His Glu Ala
450 455 460
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Gly
465 470 475 480
Gly Gly Gly Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu
485 490 495
Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile
500 505 510
Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Ala Met Leu Thr Ala Lys Phe
515 520 525
Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu
530 535 540
Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys
545 550 555 560
Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile
565 570 575
Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala
580 585 590
Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe
595 600 605
Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr
610 615
<210> 8
<211> 1857
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 编码融合蛋白（GI101）的核苷酸
<400> 8
atggatgcta tgctgagagg cctgtgttgc gtgctgctgc tgtgtggcgc tgtgttcgtg 60
tctccttctc acgctgtgat ccacgtgacc aaagaagtga aagaggtcgc cacactgtcc 120
tgcggccaca acgtttcagt ggaagaactg gcccagacca ggatctactg gcagaaagaa 180
aagaaaatgg tgctgaccat gatgtccggc gacatgaaca tctggcctga gtacaagaac 240
cggaccatct tcgacatcac caacaacctg tccatcgtga ttctggccct gaggccttct 300
gatgagggca cctatgagtg cgtggtgctg aagtacgaga aggacgcctt caagcgcgag 360
cacctggctg aagtgacact gtccgtgaag gccgactttc ccacaccttc catctccgac 420
ttcgagatcc ctacctccaa catccggcgg atcatctgtt ctacctctgg cggctttcct 480
gagcctcacc tgtcttggct ggaaaacggc gaggaactga acgccatcaa caccaccgtg 540
tctcaggacc ccgaaaccga gctgtacgct gtgtcctcca agctggactt caacatgacc 600
accaaccaca gcttcatgtg cctgattaag tacggccacc tgagagtgaa ccagaccttc 660
aactggaaca ccaccaagca agagcacttc cctgacaatg gatctggcgg cggaggttct 720
ggcggaggtg gaagcggagg cggaggatct gctgagtcta agtatggccc tccttgtcct 780
ccatgtcctg ctccagaagc tgctggcgga ccctctgtgt tcctgtttcc tccaaagcct 840
aaggaccagc tcatgatctc tcggacaccc gaagtgacct gcgtggtggt ggatgtgtct 900
caagaggacc ctgaggtgca gttcaattgg tacgtggacg gcgtggaagt gcacaacgcc 960
aagaccaagc ctagagagga acagttcaac tccacctaca gagtggtgtc cgtgctgacc 1020
gtgctgcacc aggattggct gaacggcaaa gagtacaagt gcaaggtgtc caacaagggc 1080
ctgccttcca gcatcgaaaa gaccatctcc aaggctaagg gccagcctag ggaaccccag 1140
gtttacaccc tgcctccaag ccaagaggaa atgaccaaga accaggtgtc cctgacctgc 1200
ctggtcaagg gcttctaccc ttccgacatt gccgtggaat gggagtccaa tggccagcct 1260
gagaacaact acaagaccac acctcctgtg ctggactccg acggctcctt ctttctgtac 1320
tctcgcctga ccgtggacaa gtctagatgg caagagggca acgtgttctc ctgctctgtg 1380
ctgcacgagg ccctgcacaa tcactacacc cagaagtccc tgtctctgtc tcttggaggt 1440
ggtggcggtt ctgcccctac cagctcctct accaagaaaa cccagctcca gttggagcat 1500
ctgctgctgg acctccagat gattctgaac gggatcaaca actataagaa ccccaagctg 1560
accgccatgc tgaccgctaa gttctacatg cccaagaagg ccaccgagct gaagcacctc 1620
cagtgcctgg aagaagaact gaagcccctg gaagaggtgc tgaatctggc ccagtccaag 1680
aacttccacc tgaggccacg ggacctgatc agcaacatca acgtgatcgt gctggaactg 1740
aagggctccg agacaacctt tatgtgcgag tacgccgacg agacagccac catcgtggaa 1800
tttctgaacc ggtggatcac cttctgccag agcatcatct ccacactgac ctgatga 1857
<210> 9
<211> 592
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 融合蛋白 (GI101)
<400> 9
Val Ile His Val Thr Lys Glu Val Lys Glu Val Ala Thr Leu Ser Cys
1 5 10 15
Gly His Asn Val Ser Val Glu Glu Leu Ala Gln Thr Arg Ile Tyr Trp
20 25 30
Gln Lys Glu Lys Lys Met Val Leu Thr Met Met Ser Gly Asp Met Asn
35 40 45
Ile Trp Pro Glu Tyr Lys Asn Arg Thr Ile Phe Asp Ile Thr Asn Asn
50 55 60
Leu Ser Ile Val Ile Leu Ala Leu Arg Pro Ser Asp Glu Gly Thr Tyr
65 70 75 80
Glu Cys Val Val Leu Lys Tyr Glu Lys Asp Ala Phe Lys Arg Glu His
85 90 95
Leu Ala Glu Val Thr Leu Ser Val Lys Ala Asp Phe Pro Thr Pro Ser
100 105 110
Ile Ser Asp Phe Glu Ile Pro Thr Ser Asn Ile Arg Arg Ile Ile Cys
115 120 125
Ser Thr Ser Gly Gly Phe Pro Glu Pro His Leu Ser Trp Leu Glu Asn
130 135 140
Gly Glu Glu Leu Asn Ala Ile Asn Thr Thr Val Ser Gln Asp Pro Glu
145 150 155 160
Thr Glu Leu Tyr Ala Val Ser Ser Lys Leu Asp Phe Asn Met Thr Thr
165 170 175
Asn His Ser Phe Met Cys Leu Ile Lys Tyr Gly His Leu Arg Val Asn
180 185 190
Gln Thr Phe Asn Trp Asn Thr Thr Lys Gln Glu His Phe Pro Asp Asn
195 200 205
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
210 215 220
Ser Ala Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
225 230 235 240
Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
245 250 255
Asp Gln Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
260 265 270
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
275 280 285
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
290 295 300
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
305 310 315 320
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
325 330 335
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
340 345 350
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
355 360 365
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
370 375 380
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
385 390 395 400
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
405 410 415
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
420 425 430
Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
435 440 445
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Ser Ala Pro Thr Ser Ser
450 455 460
Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu
465 470 475 480
Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr
485 490 495
Ala Met Leu Thr Ala Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu
500 505 510
Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val
515 520 525
Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu
530 535 540
Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr
545 550 555 560
Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe
565 570 575
Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr
580 585 590
<210> 10
<211> 133
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> hIL-2
<400> 10
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr
130
<210> 11
<211> 288
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD80
<400> 11
Met Gly His Thr Arg Arg Gln Gly Thr Ser Pro Ser Lys Cys Pro Tyr
1 5 10 15
Leu Asn Phe Phe Gln Leu Leu Val Leu Ala Gly Leu Ser His Phe Cys
20 25 30
Ser Gly Val Ile His Val Thr Lys Glu Val Lys Glu Val Ala Thr Leu
35 40 45
Ser Cys Gly His Asn Val Ser Val Glu Glu Leu Ala Gln Thr Arg Ile
50 55 60
Tyr Trp Gln Lys Glu Lys Lys Met Val Leu Thr Met Met Ser Gly Asp
65 70 75 80
Met Asn Ile Trp Pro Glu Tyr Lys Asn Arg Thr Ile Phe Asp Ile Thr
85 90 95
Asn Asn Leu Ser Ile Val Ile Leu Ala Leu Arg Pro Ser Asp Glu Gly
100 105 110
Thr Tyr Glu Cys Val Val Leu Lys Tyr Glu Lys Asp Ala Phe Lys Arg
115 120 125
Glu His Leu Ala Glu Val Thr Leu Ser Val Lys Ala Asp Phe Pro Thr
130 135 140
Pro Ser Ile Ser Asp Phe Glu Ile Pro Thr Ser Asn Ile Arg Arg Ile
145 150 155 160
Ile Cys Ser Thr Ser Gly Gly Phe Pro Glu Pro His Leu Ser Trp Leu
165 170 175
Glu Asn Gly Glu Glu Leu Asn Ala Ile Asn Thr Thr Val Ser Gln Asp
180 185 190
Pro Glu Thr Glu Leu Tyr Ala Val Ser Ser Lys Leu Asp Phe Asn Met
195 200 205
Thr Thr Asn His Ser Phe Met Cys Leu Ile Lys Tyr Gly His Leu Arg
210 215 220
Val Asn Gln Thr Phe Asn Trp Asn Thr Thr Lys Gln Glu His Phe Pro
225 230 235 240
Asp Asn Leu Leu Pro Ser Trp Ala Ile Thr Leu Ile Ser Val Asn Gly
245 250 255
Ile Phe Val Ile Cys Cys Leu Thr Tyr Cys Phe Ala Pro Arg Cys Arg
260 265 270
Glu Arg Arg Arg Asn Glu Arg Leu Arg Arg Glu Ser Val Arg Pro Val
275 280 285
<210> 12
<211> 215
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Fc变体
<400> 12
Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
1 5 10 15
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
20 25 30
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
35 40 45
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
50 55 60
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
65 70 75 80
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
85 90 95
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
100 105 110
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
115 120 125
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
130 135 140
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
145 150 155 160
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
165 170 175
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
180 185 190
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
195 200 205
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
210 215
<210> 13
<211> 306
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> mCD80
<400> 13
Met Ala Cys Asn Cys Gln Leu Met Gln Asp Thr Pro Leu Leu Lys Phe
1 5 10 15
Pro Cys Pro Arg Leu Ile Leu Leu Phe Val Leu Leu Ile Arg Leu Ser
20 25 30
Gln Val Ser Ser Asp Val Asp Glu Gln Leu Ser Lys Ser Val Lys Asp
35 40 45
Lys Val Leu Leu Pro Cys Arg Tyr Asn Ser Pro His Glu Asp Glu Ser
50 55 60
Glu Asp Arg Ile Tyr Trp Gln Lys His Asp Lys Val Val Leu Ser Val
65 70 75 80
Ile Ala Gly Lys Leu Lys Val Trp Pro Glu Tyr Lys Asn Arg Thr Leu
85 90 95
Tyr Asp Asn Thr Thr Tyr Ser Leu Ile Ile Leu Gly Leu Val Leu Ser
100 105 110
Asp Arg Gly Thr Tyr Ser Cys Val Val Gln Lys Lys Glu Arg Gly Thr
115 120 125
Tyr Glu Val Lys His Leu Ala Leu Val Lys Leu Ser Ile Lys Ala Asp
130 135 140
Phe Ser Thr Pro Asn Ile Thr Glu Ser Gly Asn Pro Ser Ala Asp Thr
145 150 155 160
Lys Arg Ile Thr Cys Phe Ala Ser Gly Gly Phe Pro Lys Pro Arg Phe
165 170 175
Ser Trp Leu Glu Asn Gly Arg Glu Leu Pro Gly Ile Asn Thr Thr Ile
180 185 190
Ser Gln Asp Pro Glu Ser Glu Leu Tyr Thr Ile Ser Ser Gln Leu Asp
195 200 205
Phe Asn Thr Thr Arg Asn His Thr Ile Lys Cys Leu Ile Lys Tyr Gly
210 215 220
Asp Ala His Val Ser Glu Asp Phe Thr Trp Glu Lys Pro Pro Glu Asp
225 230 235 240
Pro Pro Asp Ser Lys Asn Thr Leu Val Leu Phe Gly Ala Gly Phe Gly
245 250 255
Ala Val Ile Thr Val Val Val Ile Val Val Ile Ile Lys Cys Phe Cys
260 265 270
Lys His Arg Ser Cys Phe Arg Arg Asn Glu Ala Ser Arg Glu Thr Asn
275 280 285
Asn Ser Leu Thr Phe Gly Pro Glu Glu Ala Leu Ala Glu Gln Thr Val
290 295 300
Phe Leu
305
<210> 14
<211> 1848
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 编码融合蛋白（mGI101）的核苷酸
<400> 14
atggatgcta tgctgagagg cctgtgttgc gtgctgctgc tgtgtggcgc tgtgttcgtg 60
tctccttctc acgctgtgga cgagcagctc tccaagtccg tgaaggataa ggtcctgctg 120
ccttgccggt acaactctcc tcacgaggac gagtctgagg accggatcta ctggcagaaa 180
cacgacaagg tggtgctgtc cgtgatcgcc ggaaagctga aagtgtggcc tgagtacaag 240
aacaggaccc tgtacgacaa caccacctac agcctgatca tcctgggcct cgtgctgagc 300
gatagaggca cctattcttg cgtggtgcag aagaaagagc ggggcaccta cgaagtgaag 360
cacctggctc tggtcaagct gtccatcaag gccgacttca gcacccctaa catcaccgag 420
tctggcaacc cttccgccga caccaagaga atcacctgtt tcgcctctgg cggcttccct 480
aagcctcggt tctcttggct ggaaaacggc agagagctgc ccggcatcaa taccaccatt 540
tctcaggacc cagagtccga gctgtacacc atctccagcc agctcgactt taacaccacc 600
agaaaccaca ccatcaagtg cctgattaag tacggcgacg cccacgtgtc cgaggacttt 660
acttgggaga aacctcctga ggaccctcct gactctggat ctggcggcgg aggttctggc 720
ggaggtggaa gcggaggcgg aggatctgct gagtctaagt atggccctcc ttgtcctcca 780
tgtcctgctc cagaagctgc tggcggaccc tctgtgttcc tgtttcctcc aaagcctaag 840
gaccagctca tgatctctcg gacccctgaa gtgacctgcg tggtggtgga tgtgtctcaa 900
gaggaccctg aggtgcagtt caattggtac gtggacggcg tggaagtgca caacgccaag 960
accaagccta gagaggaaca gttcaactcc acctatagag tggtgtccgt gctgaccgtg 1020
ctgcaccagg attggctgaa cggcaaagag tacaagtgca aggtgtccaa caagggcctg 1080
ccttccagca tcgaaaagac catcagcaag gctaagggcc agcctaggga accccaggtt 1140
tacaccctgc ctccaagcca agaggaaatg accaagaacc aggtgtccct gacctgcctg 1200
gtcaagggct tctacccttc cgacattgcc gtggaatggg agtccaatgg ccagcctgag 1260
aacaactaca agaccacacc tcctgtgctg gactccgacg gctccttctt tctgtactct 1320
cgcctgaccg tggacaagtc taggtggcaa gagggcaacg tgttctcctg ctctgtgctg 1380
cacgaggctc tgcacaacca ctacacccag aagtccctgt ctctgtctct tggaggtggt 1440
ggcggttctg cccctacctc cagctctacc aagaaaaccc agctccagtt ggagcatctg 1500
ctgctggacc tccagatgat cctgaatggc atcaacaatt acaagaaccc caagctgacc 1560
gccatgctga ccgctaagtt ctacatgccc aagaaggcca ccgagctgaa gcacttgcag 1620
tgcctggaag aggaactgaa gcccctggaa gaagtgctga atctggccca gtccaagaac 1680
ttccacctga ggcctaggga cctgatctcc aacatcaacg tgatcgtgct ggaactgaaa 1740
ggctccgaga caaccttcat gtgcgagtac gccgacgaga cagccaccat cgtggaattt 1800
ctgaaccggt ggatcacctt ctgccagagc atcatctcca cactgacc 1848
<210> 15
<211> 616
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 融合蛋白 (mGI101)
<400> 15
Met Asp Ala Met Leu Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly
1 5 10 15
Ala Val Phe Val Ser Pro Ser His Ala Val Asp Glu Gln Leu Ser Lys
20 25 30
Ser Val Lys Asp Lys Val Leu Leu Pro Cys Arg Tyr Asn Ser Pro His
35 40 45
Glu Asp Glu Ser Glu Asp Arg Ile Tyr Trp Gln Lys His Asp Lys Val
50 55 60
Val Leu Ser Val Ile Ala Gly Lys Leu Lys Val Trp Pro Glu Tyr Lys
65 70 75 80
Asn Arg Thr Leu Tyr Asp Asn Thr Thr Tyr Ser Leu Ile Ile Leu Gly
85 90 95
Leu Val Leu Ser Asp Arg Gly Thr Tyr Ser Cys Val Val Gln Lys Lys
100 105 110
Glu Arg Gly Thr Tyr Glu Val Lys His Leu Ala Leu Val Lys Leu Ser
115 120 125
Ile Lys Ala Asp Phe Ser Thr Pro Asn Ile Thr Glu Ser Gly Asn Pro
130 135 140
Ser Ala Asp Thr Lys Arg Ile Thr Cys Phe Ala Ser Gly Gly Phe Pro
145 150 155 160
Lys Pro Arg Phe Ser Trp Leu Glu Asn Gly Arg Glu Leu Pro Gly Ile
165 170 175
Asn Thr Thr Ile Ser Gln Asp Pro Glu Ser Glu Leu Tyr Thr Ile Ser
180 185 190
Ser Gln Leu Asp Phe Asn Thr Thr Arg Asn His Thr Ile Lys Cys Leu
195 200 205
Ile Lys Tyr Gly Asp Ala His Val Ser Glu Asp Phe Thr Trp Glu Lys
210 215 220
Pro Pro Glu Asp Pro Pro Asp Ser Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
225 230 235 240
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Glu Ser Lys Tyr Gly Pro
245 250 255
Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val
260 265 270
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Gln Leu Met Ile Ser Arg Thr
275 280 285
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu
290 295 300
Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
305 310 315 320
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
325 330 335
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
340 345 350
Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile
355 360 365
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
370 375 380
Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
385 390 395 400
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
405 410 415
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
420 425 430
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
435 440 445
Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu
450 455 460
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Gly Gly
465 470 475 480
Gly Gly Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln
485 490 495
Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn
500 505 510
Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Ala Met Leu Thr Ala Lys Phe Tyr
515 520 525
Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu
530 535 540
Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn
545 550 555 560
Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val
565 570 575
Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp
580 585 590
Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys
595 600 605
Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr
610 615
<210> 16
<211> 1437
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 编码融合蛋白（GI101C1）的核苷酸
<400> 16
atggatgcta tgctgagagg cctgtgttgc gtgctgctgc tgtgtggcgc tgtgttcgtg 60
tctccttctc acgctgtgat ccacgtgacc aaagaagtga aagaggtcgc cacactgtcc 120
tgcggccaca acgtttcagt ggaagaactg gcccagacca ggatctactg gcagaaagaa 180
aagaaaatgg tgctgaccat gatgtccggc gacatgaaca tctggcctga gtacaagaac 240
cggaccatct tcgacatcac caacaacctg tccatcgtga ttctggccct gaggccttct 300
gatgagggca cctatgagtg cgtggtgctg aagtacgaga aggacgcctt caagcgcgag 360
cacctggctg aagtgacact gtccgtgaag gccgactttc ccacaccttc catctccgac 420
ttcgagatcc ctacctccaa catccggcgg atcatctgtt ctacctctgg cggctttcct 480
gagcctcacc tgtcttggct ggaaaacggc gaggaactga acgccatcaa caccaccgtg 540
tctcaggacc ccgaaaccga gctgtacgct gtgtcctcca agctggactt caacatgacc 600
accaaccaca gcttcatgtg cctgattaag tacggccacc tgagagtgaa ccagaccttc 660
aactggaaca ccaccaagca agagcacttc cctgacaatg gatctggcgg cggaggttct 720
ggcggaggtg gaagcggagg cggaggatct gctgagtcta agtatggccc tccttgtcct 780
ccatgtcctg ctccagaagc tgctggcgga ccctctgtgt tcctgtttcc tccaaagcct 840
aaggaccagc tcatgatctc tcggacaccc gaagtgacct gcgtggtggt ggatgtgtct 900
caagaggacc ctgaggtgca gttcaattgg tacgtggacg gcgtggaagt gcacaacgcc 960
aagaccaagc ctagagagga acagttcaac tccacctaca gagtggtgtc cgtgctgacc 1020
gtgctgcacc aggattggct gaacggcaaa gagtacaagt gcaaggtgtc caacaagggc 1080
ctgccttcca gcatcgaaaa gaccatctcc aaggctaagg gccagcctag ggaaccccag 1140
gtttacaccc tgcctccaag ccaagaggaa atgaccaaga accaggtgtc cctgacctgc 1200
ctggtcaagg gcttctaccc ttccgacatt gccgtggaat gggagtccaa tggccagcct 1260
gagaacaact acaagaccac acctcctgtg ctggactccg acggctcctt ctttctgtac 1320
tctcgcctga ccgtggacaa gtctaggtgg caagagggca acgtgttctc ctgctctgtg 1380
ctgcacgagg ccctgcacaa tcactacacc cagaagtccc tgtctctgtc cctgggc 1437
<210> 17
<211> 454
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 融合蛋白 (GI101C1)
<400> 17
Val Ile His Val Thr Lys Glu Val Lys Glu Val Ala Thr Leu Ser Cys
1 5 10 15
Gly His Asn Val Ser Val Glu Glu Leu Ala Gln Thr Arg Ile Tyr Trp
20 25 30
Gln Lys Glu Lys Lys Met Val Leu Thr Met Met Ser Gly Asp Met Asn
35 40 45
Ile Trp Pro Glu Tyr Lys Asn Arg Thr Ile Phe Asp Ile Thr Asn Asn
50 55 60
Leu Ser Ile Val Ile Leu Ala Leu Arg Pro Ser Asp Glu Gly Thr Tyr
65 70 75 80
Glu Cys Val Val Leu Lys Tyr Glu Lys Asp Ala Phe Lys Arg Glu His
85 90 95
Leu Ala Glu Val Thr Leu Ser Val Lys Ala Asp Phe Pro Thr Pro Ser
100 105 110
Ile Ser Asp Phe Glu Ile Pro Thr Ser Asn Ile Arg Arg Ile Ile Cys
115 120 125
Ser Thr Ser Gly Gly Phe Pro Glu Pro His Leu Ser Trp Leu Glu Asn
130 135 140
Gly Glu Glu Leu Asn Ala Ile Asn Thr Thr Val Ser Gln Asp Pro Glu
145 150 155 160
Thr Glu Leu Tyr Ala Val Ser Ser Lys Leu Asp Phe Asn Met Thr Thr
165 170 175
Asn His Ser Phe Met Cys Leu Ile Lys Tyr Gly His Leu Arg Val Asn
180 185 190
Gln Thr Phe Asn Trp Asn Thr Thr Lys Gln Glu His Phe Pro Asp Asn
195 200 205
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
210 215 220
Ser Ala Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
225 230 235 240
Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
245 250 255
Asp Gln Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
260 265 270
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
275 280 285
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
290 295 300
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
305 310 315 320
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
325 330 335
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
340 345 350
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
355 360 365
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
370 375 380
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
385 390 395 400
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
405 410 415
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
420 425 430
Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
435 440 445
Leu Ser Leu Ser Leu Gly
450
<210> 18
<211> 1176
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 编码融合蛋白 (GI101C2)的核苷酸
<400> 18
atggatgcta tgctgagagg cctgtgttgc gtgctgctgc tgtgtggcgc tgtgttcgtg 60
tctccatctc acgccgctga gtctaagtac ggccctcctt gtcctccatg tcctgctcca 120
gaagctgctg gcggaccctc tgtgttcctg tttcctccaa agcctaagga ccagctcatg 180
atctctcgga cccctgaagt gacctgcgtg gtggtggatg tgtctcaaga ggaccctgag 240
gtgcagttca attggtacgt ggacggcgtg gaagtgcaca acgccaagac caagcctaga 300
gaggaacagt tcaactccac ctacagagtg gtgtccgtgc tgaccgtgct gcaccaggat 360
tggctgaacg gcaaagagta caagtgcaag gtgtccaaca agggcctgcc ttccagcatc 420
gaaaagacca tctccaaggc taagggccag cctagggaac cccaggttta caccctgcct 480
ccaagccaag aggaaatgac caagaaccag gtgtccctga cctgcctggt caagggcttc 540
tacccttccg acattgccgt ggaatgggag tccaatggcc agcctgagaa caactacaag 600
accacacctc ctgtgctgga ctccgacggc tccttctttc tgtactctcg cctgaccgtg 660
gacaagtcta ggtggcaaga gggcaacgtg ttctcctgct ctgtgctgca cgaggccctg 720
cacaatcact acacccagaa gtccctgtct ctgtctcttg gcggaggcgg aggatctgct 780
cctacctcca gctccaccaa gaaaacccag ctccagttgg agcatctgct gctggacctc 840
cagatgatcc tgaatggcat caacaattac aagaacccca agctgaccgc catgctgacc 900
gctaagttct acatgcccaa gaaggccacc gagctgaagc acctccagtg cctggaagag 960
gaactgaagc ccctggaaga agtgctgaat ctggcccagt ccaagaactt ccacctgagg 1020
cctagggacc tgatctccaa catcaacgtg atcgtgctgg aactgaaagg ctccgagaca 1080
accttcatgt gcgagtacgc cgacgagaca gccaccatcg tggaatttct gaaccggtgg 1140
atcaccttct gccagtccat catctccaca ctgacc 1176
<210> 19
<211> 367
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 融合蛋白 (GI101C2)
<400> 19
Ala Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
1 5 10 15
Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
20 25 30
Gln Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
35 40 45
Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
50 55 60
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn
65 70 75 80
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
85 90 95
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro
100 105 110
Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
115 120 125
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn
130 135 140
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
145 150 155 160
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
165 170 175
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg
180 185 190
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys
195 200 205
Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
210 215 220
Ser Leu Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser
225 230 235 240
Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln
245 250 255
Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Ala
260 265 270
Met Leu Thr Ala Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys
275 280 285
His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu
290 295 300
Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile
305 310 315 320
Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr
325 330 335
Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu
340 345 350
Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr
355 360 365
<210> 20
<211> 1434
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 编码融合蛋白 (mGI101C1)的核苷酸
<400> 20
atggatgcta tgctgagagg cctgtgttgc gtgctgctgc tgtgtggcgc tgtgttcgtg 60
tctccttctc acgctgtgga cgagcagctc tccaagtccg tgaaggataa ggtcctgctg 120
ccttgccggt acaactctcc tcacgaggac gagtctgagg accggatcta ctggcagaaa 180
cacgacaagg tggtgctgtc cgtgatcgcc ggaaagctga aagtgtggcc tgagtacaag 240
aacaggaccc tgtacgacaa caccacctac agcctgatca tcctgggcct cgtgctgagc 300
gatagaggca cctattcttg cgtggtgcag aagaaagagc ggggcaccta cgaagtgaag 360
cacctggctc tggtcaagct gtccatcaag gccgacttca gcacccctaa catcaccgag 420
tctggcaacc cttccgccga caccaagaga atcacctgtt tcgcctctgg cggcttccct 480
aagcctcggt tctcttggct ggaaaacggc agagagctgc ccggcatcaa taccaccatt 540
tctcaggacc cagagtccga gctgtacacc atctccagcc agctcgactt taacaccacc 600
agaaaccaca ccatcaagtg cctgattaag tacggcgacg cccacgtgtc cgaggacttt 660
acttgggaga aacctcctga ggaccctcct gactctggat ctggcggcgg aggttctggc 720
ggaggtggaa gcggaggcgg aggatctgct gagtctaagt atggccctcc ttgtcctcca 780
tgtcctgctc cagaagctgc tggcggaccc tctgtgttcc tgtttcctcc aaagcctaag 840
gaccagctca tgatctctcg gacccctgaa gtgacctgcg tggtggtgga tgtgtctcaa 900
gaggaccctg aggtgcagtt caattggtac gtggacggcg tggaagtgca caacgccaag 960
accaagccta gagaggaaca gttcaactcc acctatagag tggtgtccgt gctgaccgtg 1020
ctgcaccagg attggctgaa cggcaaagag tacaagtgca aggtgtccaa caagggcctg 1080
ccttccagca tcgaaaagac catcagcaag gctaagggcc agcctaggga accccaggtt 1140
tacaccctgc ctccaagcca agaggaaatg accaagaacc aggtgtccct gacctgcctg 1200
gtcaagggct tctacccttc cgacattgcc gtggaatggg agtccaatgg ccagcctgag 1260
aacaactaca agaccacacc tcctgtgctg gactccgacg gctccttctt tctgtactct 1320
cgcctgaccg tggacaagtc taggtggcaa gagggcaacg tgttctcctg ctctgtgctg 1380
cacgaggctc tgcacaacca ctacacccag aagtccctgt ctctgtccct gggc 1434
<210> 21
<211> 478
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 融合蛋白 (mGI101C1)
<400> 21
Met Asp Ala Met Leu Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly
1 5 10 15
Ala Val Phe Val Ser Pro Ser His Ala Val Asp Glu Gln Leu Ser Lys
20 25 30
Ser Val Lys Asp Lys Val Leu Leu Pro Cys Arg Tyr Asn Ser Pro His
35 40 45
Glu Asp Glu Ser Glu Asp Arg Ile Tyr Trp Gln Lys His Asp Lys Val
50 55 60
Val Leu Ser Val Ile Ala Gly Lys Leu Lys Val Trp Pro Glu Tyr Lys
65 70 75 80
Asn Arg Thr Leu Tyr Asp Asn Thr Thr Tyr Ser Leu Ile Ile Leu Gly
85 90 95
Leu Val Leu Ser Asp Arg Gly Thr Tyr Ser Cys Val Val Gln Lys Lys
100 105 110
Glu Arg Gly Thr Tyr Glu Val Lys His Leu Ala Leu Val Lys Leu Ser
115 120 125
Ile Lys Ala Asp Phe Ser Thr Pro Asn Ile Thr Glu Ser Gly Asn Pro
130 135 140
Ser Ala Asp Thr Lys Arg Ile Thr Cys Phe Ala Ser Gly Gly Phe Pro
145 150 155 160
Lys Pro Arg Phe Ser Trp Leu Glu Asn Gly Arg Glu Leu Pro Gly Ile
165 170 175
Asn Thr Thr Ile Ser Gln Asp Pro Glu Ser Glu Leu Tyr Thr Ile Ser
180 185 190
Ser Gln Leu Asp Phe Asn Thr Thr Arg Asn His Thr Ile Lys Cys Leu
195 200 205
Ile Lys Tyr Gly Asp Ala His Val Ser Glu Asp Phe Thr Trp Glu Lys
210 215 220
Pro Pro Glu Asp Pro Pro Asp Ser Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
225 230 235 240
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Glu Ser Lys Tyr Gly Pro
245 250 255
Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val
260 265 270
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Gln Leu Met Ile Ser Arg Thr
275 280 285
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu
290 295 300
Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
305 310 315 320
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
325 330 335
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
340 345 350
Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile
355 360 365
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
370 375 380
Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
385 390 395 400
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
405 410 415
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
420 425 430
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
435 440 445
Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu
450 455 460
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly
465 470 475
<210> 22
<211> 133
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IL-2变体 (3M, M45)
<400> 22
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Ala Met Leu Thr Ala Lys Phe Ala Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr
130
<210> 23
<211> 133
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IL-2变体 (3M, M61)
<400> 23
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Ala Met Leu Thr Ala Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Arg Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr
130
<210> 24
<211> 133
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IL-2变体 (3M, M72)
<400> 24
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Ala Met Leu Thr Ala Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Gly Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr
130
<210> 25
<211> 1851
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 编码融合蛋白 (GI102-M45)的核苷酸
<400> 25
atggatgcta tgctgagagg cctgtgttgc gtgctgctgc tgtgtggcgc tgtgttcgtg 60
tctccttctc acgctgtgat ccacgtgacc aaagaagtga aagaggtcgc cacactgtcc 120
tgcggccaca acgtttcagt ggaagaactg gcccagacca ggatctactg gcagaaagaa 180
aagaaaatgg tgctgaccat gatgtccggc gacatgaaca tctggcctga gtacaagaac 240
cggaccatct tcgacatcac caacaacctg tccatcgtga ttctggccct gaggccttct 300
gatgagggca cctatgagtg cgtggtgctg aagtacgaga aggacgcctt caagcgcgag 360
cacctggctg aagtgacact gtccgtgaag gccgactttc ccacaccttc catctccgac 420
ttcgagatcc ctacctccaa catccggcgg atcatctgtt ctacctctgg cggctttcct 480
gagcctcacc tgtcttggct ggaaaacggc gaggaactga acgccatcaa caccaccgtg 540
tctcaggacc ccgaaaccga gctgtacgct gtgtcctcca agctggactt caacatgacc 600
accaaccaca gcttcatgtg cctgattaag tacggccacc tgagagtgaa ccagaccttc 660
aactggaaca ccaccaagca agagcacttc cctgacaatg gatctggcgg cggaggttct 720
ggcggaggtg gaagcggagg cggaggatct gctgagtcta agtatggccc tccttgtcct 780
ccatgtcctg ctccagaagc tgctggcgga ccctctgtgt tcctgtttcc tccaaagcct 840
aaggaccagc tcatgatctc tcggacaccc gaagtgacct gcgtggtggt ggatgtgtct 900
caagaggacc ctgaggtgca gttcaattgg tacgtggacg gcgtggaagt gcacaacgcc 960
aagaccaagc ctagagagga acagttcaac tccacctaca gagtggtgtc cgtgctgacc 1020
gtgctgcacc aggattggct gaacggcaaa gagtacaagt gcaaggtgtc caacaagggc 1080
ctgccttcca gcatcgaaaa gaccatctcc aaggctaagg gccagcctag ggaaccccag 1140
gtttacaccc tgcctccaag ccaagaggaa atgaccaaga accaggtgtc cctgacctgc 1200
ctggtcaagg gcttctaccc ttccgacatt gccgtggaat gggagtccaa tggccagcct 1260
gagaacaact acaagaccac acctcctgtg ctggactccg acggctcctt ctttctgtac 1320
tctcgcctga ccgtggacaa gtctagatgg caagagggca acgtgttctc ctgctctgtg 1380
ctgcacgagg ccctgcacaa tcactacacc cagaagtccc tgtctctgtc tcttggaggt 1440
ggtggcggtt ctgcccctac cagctcctct accaagaaaa cccagctcca gttggagcat 1500
ctgctgctgg acctccagat gattctgaac gggatcaaca actataagaa ccccaagctg 1560
accgccatgc tgaccgctaa gttcgccatg cccaagaagg ccaccgagct gaagcacctc 1620
cagtgcctgg aagaagaact gaagcccctg gaagaggtgc tgaatctggc ccagtccaag 1680
aacttccacc tgaggccacg ggacctgatc agcaacatca acgtgatcgt gctggaactg 1740
aagggctccg agacaacctt tatgtgcgag tacgccgacg agacagccac catcgtggaa 1800
tttctgaacc ggtggatcac cttctgccag agcatcatct ccacactgac c 1851
<210> 26
<211> 592
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 融合蛋白 (GI102-M45)
<400> 26
Val Ile His Val Thr Lys Glu Val Lys Glu Val Ala Thr Leu Ser Cys
1 5 10 15
Gly His Asn Val Ser Val Glu Glu Leu Ala Gln Thr Arg Ile Tyr Trp
20 25 30
Gln Lys Glu Lys Lys Met Val Leu Thr Met Met Ser Gly Asp Met Asn
35 40 45
Ile Trp Pro Glu Tyr Lys Asn Arg Thr Ile Phe Asp Ile Thr Asn Asn
50 55 60
Leu Ser Ile Val Ile Leu Ala Leu Arg Pro Ser Asp Glu Gly Thr Tyr
65 70 75 80
Glu Cys Val Val Leu Lys Tyr Glu Lys Asp Ala Phe Lys Arg Glu His
85 90 95
Leu Ala Glu Val Thr Leu Ser Val Lys Ala Asp Phe Pro Thr Pro Ser
100 105 110
Ile Ser Asp Phe Glu Ile Pro Thr Ser Asn Ile Arg Arg Ile Ile Cys
115 120 125
Ser Thr Ser Gly Gly Phe Pro Glu Pro His Leu Ser Trp Leu Glu Asn
130 135 140
Gly Glu Glu Leu Asn Ala Ile Asn Thr Thr Val Ser Gln Asp Pro Glu
145 150 155 160
Thr Glu Leu Tyr Ala Val Ser Ser Lys Leu Asp Phe Asn Met Thr Thr
165 170 175
Asn His Ser Phe Met Cys Leu Ile Lys Tyr Gly His Leu Arg Val Asn
180 185 190
Gln Thr Phe Asn Trp Asn Thr Thr Lys Gln Glu His Phe Pro Asp Asn
195 200 205
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
210 215 220
Ser Ala Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
225 230 235 240
Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
245 250 255
Asp Gln Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
260 265 270
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
275 280 285
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
290 295 300
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
305 310 315 320
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
325 330 335
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
340 345 350
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
355 360 365
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
370 375 380
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
385 390 395 400
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
405 410 415
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
420 425 430
Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
435 440 445
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Ser Ala Pro Thr Ser Ser
450 455 460
Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu
465 470 475 480
Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr
485 490 495
Ala Met Leu Thr Ala Lys Phe Ala Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu
500 505 510
Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val
515 520 525
Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu
530 535 540
Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr
545 550 555 560
Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe
565 570 575
Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr
580 585 590
<210> 27
<211> 1851
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 编码融合蛋白 (GI102-M61)的核苷酸
<400> 27
atggatgcta tgctgagagg cctgtgttgc gtgctgctgc tgtgtggcgc tgtgttcgtg 60
tctccttctc acgctgtgat ccacgtgacc aaagaagtga aagaggtcgc cacactgtcc 120
tgcggccaca acgtttcagt ggaagaactg gcccagacca ggatctactg gcagaaagaa 180
aagaaaatgg tgctgaccat gatgtccggc gacatgaaca tctggcctga gtacaagaac 240
cggaccatct tcgacatcac caacaacctg tccatcgtga ttctggccct gaggccttct 300
gatgagggca cctatgagtg cgtggtgctg aagtacgaga aggacgcctt caagcgcgag 360
cacctggctg aagtgacact gtccgtgaag gccgactttc ccacaccttc catctccgac 420
ttcgagatcc ctacctccaa catccggcgg atcatctgtt ctacctctgg cggctttcct 480
gagcctcacc tgtcttggct ggaaaacggc gaggaactga acgccatcaa caccaccgtg 540
tctcaggacc ccgaaaccga gctgtacgct gtgtcctcca agctggactt caacatgacc 600
accaaccaca gcttcatgtg cctgattaag tacggccacc tgagagtgaa ccagaccttc 660
aactggaaca ccaccaagca agagcacttc cctgacaatg gatctggcgg cggaggttct 720
ggcggaggtg gaagcggagg cggaggatct gctgagtcta agtatggccc tccttgtcct 780
ccatgtcctg ctccagaagc tgctggcgga ccctctgtgt tcctgtttcc tccaaagcct 840
aaggaccagc tcatgatctc tcggacaccc gaagtgacct gcgtggtggt ggatgtgtct 900
caagaggacc ctgaggtgca gttcaattgg tacgtggacg gcgtggaagt gcacaacgcc 960
aagaccaagc ctagagagga acagttcaac tccacctaca gagtggtgtc cgtgctgacc 1020
gtgctgcacc aggattggct gaacggcaaa gagtacaagt gcaaggtgtc caacaagggc 1080
ctgccttcca gcatcgaaaa gaccatctcc aaggctaagg gccagcctag ggaaccccag 1140
gtttacaccc tgcctccaag ccaagaggaa atgaccaaga accaggtgtc cctgacctgc 1200
ctggtcaagg gcttctaccc ttccgacatt gccgtggaat gggagtccaa tggccagcct 1260
gagaacaact acaagaccac acctcctgtg ctggactccg acggctcctt ctttctgtac 1320
tctcgcctga ccgtggacaa gtctagatgg caagagggca acgtgttctc ctgctctgtg 1380
ctgcacgagg ccctgcacaa tcactacacc cagaagtccc tgtctctgtc tcttggaggt 1440
ggtggcggtt ctgcccctac cagctcctct accaagaaaa cccagctcca gttggagcat 1500
ctgctgctgg acctccagat gattctgaac gggatcaaca actataagaa ccccaagctg 1560
accgccatgc tgaccgctaa gttctacatg cccaagaagg ccaccgagct gaagcacctc 1620
cagtgcctgg aaagggaact gaagcccctg gaagaggtgc tgaatctggc ccagtccaag 1680
aacttccacc tgaggccacg ggacctgatc agcaacatca acgtgatcgt gctggaactg 1740
aagggctccg agacaacctt tatgtgcgag tacgccgacg agacagccac catcgtggaa 1800
tttctgaacc ggtggatcac cttctgccag agcatcatct ccacactgac c 1851
<210> 28
<211> 592
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 融合蛋白 (GI102-M61)
<400> 28
Val Ile His Val Thr Lys Glu Val Lys Glu Val Ala Thr Leu Ser Cys
1 5 10 15
Gly His Asn Val Ser Val Glu Glu Leu Ala Gln Thr Arg Ile Tyr Trp
20 25 30
Gln Lys Glu Lys Lys Met Val Leu Thr Met Met Ser Gly Asp Met Asn
35 40 45
Ile Trp Pro Glu Tyr Lys Asn Arg Thr Ile Phe Asp Ile Thr Asn Asn
50 55 60
Leu Ser Ile Val Ile Leu Ala Leu Arg Pro Ser Asp Glu Gly Thr Tyr
65 70 75 80
Glu Cys Val Val Leu Lys Tyr Glu Lys Asp Ala Phe Lys Arg Glu His
85 90 95
Leu Ala Glu Val Thr Leu Ser Val Lys Ala Asp Phe Pro Thr Pro Ser
100 105 110
Ile Ser Asp Phe Glu Ile Pro Thr Ser Asn Ile Arg Arg Ile Ile Cys
115 120 125
Ser Thr Ser Gly Gly Phe Pro Glu Pro His Leu Ser Trp Leu Glu Asn
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165 170 175
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Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
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Ser Ala Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
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Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
245 250 255
Asp Gln Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
260 265 270
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Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 编码融合蛋白 (GI102-M72)的核苷酸
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<213> Artificial Sequence
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 编码融合蛋白 (GI101w)的核苷酸
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 编码融合蛋白 (mGI102-M61)的核苷酸
<400> 33
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<220>
<223> 融合蛋白 (mGI102-M61)
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195 200 205
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565 570 575
Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp
580 585 590
Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys
595 600 605
Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr
610 615
<210> 35
<211> 153
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 野生型 hIL-2
<400> 35
Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu
1 5 10 15
Val Thr Asn Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu
20 25 30
Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile
35 40 45
Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe
50 55 60
Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu
65 70 75 80
Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys
85 90 95
Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile
100 105 110
Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala
115 120 125
Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe
130 135 140
Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr
145 150
<210> 36
<211> 158
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 含信号序列的IL-2
<400> 36
Met Asp Ala Met Leu Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly
1 5 10 15
Ala Val Phe Val Ser Pro Ser His Ala Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr
20 25 30
Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met
35 40 45
Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met
50 55 60
Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His
65 70 75 80
Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn
85 90 95
Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser
100 105 110
Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe
115 120 125
Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn
130 135 140
Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr
145 150 155
<210> 37
<211> 474
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 编码含信号序列的IL-2的核苷酸
<400> 37
atggatgcta tgctgagagg cctgtgttgc gtgctgctgc tgtgtggcgc tgtgttcgtg 60
tctccttctc acgctgcccc taccagctcc tctaccaaga aaacccagct ccagttggag 120
catctgctgc tggacctcca gatgattctg aacgggatca acaactataa gaaccccaag 180
ctgacccgca tgctgacctt taagttctac atgcccaaga aggccaccga gctgaagcac 240
ctccagtgcc tggaagaaga actgaagccc ctggaagagg tgctgaatct ggcccagtcc 300
aagaacttcc acctgaggcc acgggacctg atcagcaaca tcaacgtgat cgtgctggaa 360
ctgaagggct ccgagacaac ctttatgtgc gagtacgccg acgagacagc caccatcgtg 420
gaatttctga accggtggat caccttctgc cagagcatca tctccacact gacc 474
<210> 38
<211> 591
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> mGI-101
<400> 38
Val Asp Glu Gln Leu Ser Lys Ser Val Lys Asp Lys Val Leu Leu Pro
1 5 10 15
Cys Arg Tyr Asn Ser Pro His Glu Asp Glu Ser Glu Asp Arg Ile Tyr
20 25 30
Trp Gln Lys His Asp Lys Val Val Leu Ser Val Ile Ala Gly Lys Leu
35 40 45
Lys Val Trp Pro Glu Tyr Lys Asn Arg Thr Leu Tyr Asp Asn Thr Thr
50 55 60
Tyr Ser Leu Ile Ile Leu Gly Leu Val Leu Ser Asp Arg Gly Thr Tyr
65 70 75 80
Ser Cys Val Val Gln Lys Lys Glu Arg Gly Thr Tyr Glu Val Lys His
85 90 95
Leu Ala Leu Val Lys Leu Ser Ile Lys Ala Asp Phe Ser Thr Pro Asn
100 105 110
Ile Thr Glu Ser Gly Asn Pro Ser Ala Asp Thr Lys Arg Ile Thr Cys
115 120 125
Phe Ala Ser Gly Gly Phe Pro Lys Pro Arg Phe Ser Trp Leu Glu Asn
130 135 140
Gly Arg Glu Leu Pro Gly Ile Asn Thr Thr Ile Ser Gln Asp Pro Glu
145 150 155 160
Ser Glu Leu Tyr Thr Ile Ser Ser Gln Leu Asp Phe Asn Thr Thr Arg
165 170 175
Asn His Thr Ile Lys Cys Leu Ile Lys Tyr Gly Asp Ala His Val Ser
180 185 190
Glu Asp Phe Thr Trp Glu Lys Pro Pro Glu Asp Pro Pro Asp Ser Gly
195 200 205
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
210 215 220
Ala Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
225 230 235 240
Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
245 250 255
Gln Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
260 265 270
Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
275 280 285
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn
290 295 300
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
305 310 315 320
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro
325 330 335
Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
340 345 350
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn
355 360 365
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
370 375 380
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
385 390 395 400
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg
405 410 415
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys
420 425 430
Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
435 440 445
Ser Leu Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser
450 455 460
Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln
465 470 475 480
Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Ala
485 490 495
Met Leu Thr Ala Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys
500 505 510
His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu
515 520 525
Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile
530 535 540
Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr
545 550 555 560
Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu
565 570 575
Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr
580 585 590
<210> 39
<211> 120
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TIGIT ECD
<400> 39
Met Met Thr Gly Thr Ile Glu Thr Thr Gly Asn Ile Ser Ala Glu Lys
1 5 10 15
Gly Gly Ser Ile Ile Leu Gln Cys His Leu Ser Ser Thr Thr Ala Gln
20 25 30
Val Thr Gln Val Asn Trp Glu Gln Gln Asp Gln Leu Leu Ala Ile Cys
35 40 45
Asn Ala Asp Leu Gly Trp His Ile Ser Pro Ser Phe Lys Asp Arg Val
50 55 60
Ala Pro Gly Pro Gly Leu Gly Leu Thr Leu Gln Ser Leu Thr Val Asn
65 70 75 80
Asp Thr Gly Glu Tyr Phe Cys Ile Tyr His Thr Tyr Pro Asp Gly Thr
85 90 95
Tyr Thr Gly Arg Ile Phe Leu Glu Val Leu Glu Ser Ser Val Ala Glu
100 105 110
His Gly Ala Arg Phe Gln Ile Pro
115 120

Claims (23)

1.一种用于预防或治疗癌症的药物组合物，所述药物组合物包含以下物质作为活性成分：
包含CD80蛋白或其片段和IL-2蛋白或其变体的融合蛋白二聚体；以及
抗癌剂。
2.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述CD80蛋白或其片段和所述IL-2蛋白或其变体通过接头彼此结合。
3.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述IL-2蛋白具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列。
4.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述CD80具有SEQ ID NO:11的氨基酸序列。
5.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述抗癌剂是选自由以下项组成的组的任一者：抗癌化疗剂、靶向抗癌剂、抗癌病毒、抗体治疗剂、细胞治疗剂和免疫检查点抑制剂。
6.根据权利要求5所述的药物组合物，其中所述抗癌化疗剂是选自由以下项组成的组中的任一者：烷化剂、微管抑制剂、抗代谢物、和拓扑异构酶抑制剂。
7.根据权利要求6所述的药物组合物，其中所述抗癌化疗剂是选自由以下项组成的组中的任一者：氮芥、环磷酰胺、异环磷酰胺、美法仑、苯丁酸氮芥、噻替哌、六甲蜜胺、丙卡巴肼、白消安、链脲佐菌素、卡莫司汀、洛莫司汀、达卡巴嗪、顺铂、卡铂、奥沙利铂、多西紫杉醇、Velban、安可平、温诺平、氟尿嘧啶、卡培他滨、阿糖胞苷、吉西他滨、氟达拉滨、氨甲蝶呤、培美曲塞、和美新、伊立替康、依托泊苷、紫杉醇、博莱霉素、阿霉素和柔红霉素。
8.根据权利要求5所述的药物组合物，其中所述靶向抗癌剂靶向选自由以下项组成的组中的任一种蛋白质：EGFR、VEGFR、CD20、CD38、RNAK-L、BTK、Bcr-abl、PDGFR/FGFR家族、MEK/RAF、HER2/Neu、泛素蛋白、JAK、ALK、PARP、TGFβR、蛋白酶体、Bcl-2、C-Met、VR1、VR2、VR3、c-kit、AXL、RET、Braf、DNMT、CDK4/6、和STING。
9.根据权利要求8所述的药物组合物，其中所述靶向抗癌剂是选自由以下项组成的组中的任一者：西妥昔单抗、曲妥珠单抗、帕妥珠单抗、阿西替尼、乐伐替尼、贝伐单抗、雷莫芦单抗、阿柏西普、利妥昔单抗、奥比妥珠单抗、达雷木单抗、地诺单抗、依鲁替尼、达沙替尼、尼罗替尼、伊马替尼、博舒替尼、戈鲁尼色特、伐托色替、尼达尼布、舒尼替尼、索拉非尼、卡博替尼、瑞戈非尼、马赛替尼、塞马尼布、替沃扎尼、凡德他尼、帕唑帕尼、曲美替尼、达拉菲尼、曲妥珠单抗、阿法替尼、拉帕替尼、来那替尼、来那度胺、伊沙佐米、鲁索替尼、来他替尼、帕瑞替尼、考比替尼、司美替尼、曲美替尼、比美替尼、艾乐替尼、克唑替尼、维奈托克、克唑替尼、卡博替尼、贝森替尼、吉特替尼、塞尔帕替尼、普拉替尼、维莫非尼、奥拉帕尼、他拉唑帕尼、尼拉帕尼、芦卡帕尼、阿扎胞苷、地西他滨、瓜地西他滨、阿贝西利、瑞博西利、帕博西尼、CDN、SB11285、和DMXAA。
10.根据权利要求5所述的药物组合物，其中所述抗癌病毒是选自由以下项组成的组中的任一者：Talimogenem和Laherparepvec。
11.根据权利要求5所述的药物组合物，其中所述抗体治疗剂是选自由以下项组成的组中的任一者：西妥昔单抗、曲妥珠单抗、帕妥珠单抗、帕尼单抗、Emtansine、利妥昔单抗、达雷木单抗、地诺单抗、替伊莫单抗、托西莫单抗、本妥昔单抗、奥法木单抗、奥比妥珠单抗、耐昔妥珠单抗、贝伐单抗、雷莫芦单抗、纳武单抗、派姆单抗、阿特朱单抗、度伐鲁单抗和易普利姆玛单抗。
12.根据权利要求5所述的药物组合物，其中所述细胞治疗剂是选自由以下项组成的组中的任一者：Tisagenlecleucel和阿基仑赛。
13.根据权利要求5所述的药物组合物，其中所述免疫检查点抑制剂是选自由以下项组成的组中的任一者：抗CTLA-4抗体、抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗PD-L2抗体、抗B7-H4抗体、抗HVEM抗体、抗TIM3抗体、抗GAL9抗体、抗LAG3抗体、抗VISTA抗体、抗KIR抗体、抗BTLA抗体、和抗TIGIT抗体。
14.根据权利要求13所述的药物组合物，其中所述免疫检查点抑制剂是选自由以下项组成的组中的任一者：易普利姆玛单抗、派姆单抗、纳武单抗、西米普利单抗、阿特朱单抗、阿维鲁单抗和度伐鲁单抗。
15.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述癌症是选自由以下项组成的组中的任一者：胃癌、肝癌、肺癌、结直肠癌、乳腺癌、***癌、卵巢癌、胰腺癌、***、甲状腺癌、喉癌、急性髓性白血病、脑瘤、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、头颈癌、唾腺癌、和淋巴瘤。
16.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述抗癌剂是抗癌化疗剂和靶向抗癌剂；抗癌化疗剂和免疫检查点抑制剂；或抗癌化疗剂、靶向抗癌剂和免疫检查点抑制剂。
17.一种用于抗癌维持疗法的组合物，所述组合物包含以下物质作为活性成分：
包含CD80蛋白或其片段和IL-2蛋白或其变体的融合蛋白二聚体。
18.根据权利要求17所述的组合物，其中所述组合物进一步包含抗癌剂。
19.一种用于预防或治疗癌症的试剂盒，所述试剂盒包含以下物质作为活性成分：
包含CD80蛋白或其片段和IL-2蛋白或其变体的融合蛋白二聚体；以及
抗癌剂。
20.一种用于抗癌维持疗法的试剂盒，所述试剂盒包含以下物质作为活性成分：
包含CD80蛋白或其片段和IL-2蛋白或其变体的融合蛋白二聚体；以及
抗癌剂。
21.一种用于预防或治疗癌症的方法，所述方法包括：
向受试者施用包含CD80蛋白或其片段和IL-2蛋白或其变体的融合蛋白二聚体以及抗癌剂。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述融合蛋白二聚体和所述抗癌剂同时和/或顺序地施用。
23.包含含有CD80蛋白或其片段和IL-2蛋白或其变体的融合蛋白二聚体以及抗癌剂的组合物用于预防或治疗癌症的用途。
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