JP2023541853A - Ｐｄ－１ポリペプチド変異体 - Google Patents

Abstract

ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する細胞外ドメイン、および膜貫通型ドメインまたはそのフラグメントを含むＰＤ－１ポリペプチド変異体が提供される。本開示はまた、免疫グロブリンＦｃ領域、およびＰＤ－１ポリペプチド変異体を含むＰＤ－１Ｆｃ融合タンパク質を提供する。

Description

関連出願の相互参照

本出願は、２０２０年９月８日付で出願された米国特許第６３／０７５，６４１号に基づく優先権を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

発明の背景

癌は、依然として世界の主な死亡原因の１つである。最近の統計によると、世界人口の１３％が癌で亡くなっていることが報告されている。国際がん研究機関（ＩＡＲＣ）の推定によれば、２０１２年には、世界中で１，４１０万件の新しい癌症例と８２０万件の癌による死亡があったとされる。２０３０年には、人口増加と高齢化、喫煙、不健康な食事、運動不足などの危険因子曝露により、全世界的に癌発症件数が２，１７０万人件に上り、１，３００万人の癌死亡者へと拡大すると予想されている。さらに、癌治療による苦痛と医療費は、癌患者とその家族共々生活の質を低下させる原因となる。

プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ－１）は、免疫系をダウンレギュレーションすることによって免疫系応答を調節し、Ｔ細胞の炎症活性を抑制し、自己寛容を促進する役割を果たす免疫チェックポイント受容体である。ＰＤ－１は、癌において過剰発現され、Ｔ細胞の枯渇が増加し、抗腫瘍応答の低下につながるため、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１阻害経路を遮断し、Ｔ細胞の活性化が強化すると癌のような疾患を治療することに大きな潜在力を有する。

本願において、配列番号４、配列番号６、または配列番号８に対して９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むプログラム細胞死１（ＰＤ－１）ポリペプチド変異体が提供され、前記ＰＤ－１ポリペプチド変異体：プログラム細胞死１リガンド（ＰＤ－Ｌ１）に特異的に結合する細胞外ドメイン；および膜貫通型ドメインまたはそのフラグメントを含む。いくつかの実施形態において、ＰＤ－１ポリペプチド変異体は、配列番号４、配列番号６、または配列番号８に対して９７％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＰＤ－１ポリペプチド変異体は、配列番号４、配列番号６、または配列番号８に対して９８％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＰＤ－１ポリペプチド変異体は、配列番号４、配列番号６、または配列番号８のアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、ＰＤ－１ポリペプチド変異体は、配列番号４を含む。いくつかの実施形態では、ＰＤ－１ポリペプチド変異体は、配列番号６を含む。いくつかの実施形態では、ＰＤ－１ポリペプチド変異体は、配列番号８を含む。

本発明で使用される膜貫通型ドメインは、配列番号１１のアミノ酸残基１７１～１９１に対応するＰＤ－１の野生型膜貫通型ドメインまたはそのフラグメントであってもよい。いくつかの実施形態では、膜貫通型ドメインは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、または２１個のアミノ酸残基であって、これらの値によって結合された全ての範囲および下位範囲を含む。例えば、膜貫通型ドメインフラグメントは、少なくとも２個のアミノ酸残基、少なくとも５個のアミノ酸残基、または少なくとも１０個のアミノ酸残基を含むことができる。いくつかの実施形態では、膜貫通型ドメインは、配列番号１１のアミノ酸残基１７１～１７２に対応する２個のアミノ酸残基を有する。いくつかの実施形態では、膜貫通型ドメインは、配列番号１１のアミノ酸残基１７１～１７３に対応する３個のアミノ酸残基を有する。いくつかの実施形態では、膜貫通型ドメインは、配列番号１１のアミノ酸残基１７１～１７４に対応する４個のアミノ酸残基を有する。いくつかの実施形態では、膜貫通型ドメインは、配列番号１１のアミノ酸残基１７１～１７５に対応する５個のアミノ酸残基を有する。

膜貫通型ドメインまたはそのフラグメントの定義に含まれるのは、配列番号１１のアミノ酸残基１７１～１９１に対応するＰＤ－１の野生型膜貫通型ドメインに対して修飾、付加、または置換されていてもよい１、２、３、４、および５個のアミノ酸の整数値を含む１～５個のアミノ酸が付加、欠失、置換によって修飾された配列番号１１のアミノ酸残基１７１～１９１に対応するＰＤ－１の野生型膜貫通型ドメインの変異体である。

本願において、配列番号１１の残基２４～１７２に対して９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むプログラム細胞死１（ＰＤ－１）ポリペプチド変異体が提供され、前記変異体は、Ｄ２６、Ｐ３４、Ｖ４３、Ｔ４５、Ｔ５９、Ｖ６４、Ｌ６５、Ｎ６６、Ｙ６８、Ｍ７０、Ｎ７４、Ｋ７８、Ｃ９３、Ｑ９９、Ｒ１１４、Ｌ１２２、Ａ１２５、Ａ１３２、およびＲ１３９からなる群から選択される少なくとも１つの残基に突然変異を有する。

いくつかの実施形態では、ポリペプチド変異体は、野生型ＰＤ－１ポリペプチドと比較して、ＰＤ－Ｌ１分子への結合親和性が増強している。いくつかの実施形態では、ポリペプチド変異体は、ＰＤ－Ｌ１分子に対して約１×１０^－８～１×１０^－１０Ｍの結合親和性（Ｋ_Ｄ）を有する。いくつかの実施形態では、ポリペプチド変異体は、ＰＤ－Ｌ１分子に対して約１．１０×１０^－９Ｍ、約１．０３７×１０^－９Ｍ、または約７．１４×１０^－１０Ｍの結合親和性（Ｋ_Ｄ）を有する。

また、本願において、免疫グロブリンＦｃ領域；およびペプチド結合またはペプチドリンカー配列によって免疫グロブリンＦｃ領域のカルボキシ－末端に連結されたＰＤ－１ポリペプチド変異体を含むＰＤ－１Ｆｃ融合タンパク質が提供され、ＰＤ－１ポリペプチド変異体が、配列番号４、配列番号６、または配列番号８に対して９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、免疫グロブリンＦｃ領域は、配列番号１０もしくは配列番号１６、または配列番号１０もしくは配列番号１６に対して９５％以上（例えば、９６％以上、９７％以上、９８％以上、または９９％以上）の配列同一性を有する配列を含む。

また、本願において、免疫グロブリンＦｃ領域；およびペプチド結合またはペプチドリンカー配列によって免疫グロブリンＦｃ領域のカルボキシ－末端に連結されたＰＤ－１ポリペプチド変異体を含むＰＤ－１Ｆｃ融合タンパク質が提供され、前記ＰＤ－１ポリペプチド変異体が、配列番号１１の残基２４～１７２に対して９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記変異体が、Ｄ２６、Ｐ３４、Ｖ４３、Ｔ４５、Ｔ５９、Ｖ６４、Ｌ６５、Ｎ６６、Ｙ６８、Ｍ７０、Ｎ７４、Ｋ７８、Ｃ９３、Ｑ９９、Ｒ１１４、Ｌ１２２、Ａ１２５、Ａ１３２、およびＲ１３９からなる群から選択される少なくとも１つの残基に突然変異を有する。

また、本願において、免疫グロブリンＦｃ領域；およびペプチド結合またはペプチドリンカー配列によって免疫グロブリンＦｃ領域のＮ－末端に連結されたＰＤ－１ポリペプチド変異体を含むＦｃ融合ＢｓＡｂ（二重特異性抗体）が提供され、ここでＰＤ－１ポリペプチド変異体は、配列番号４、配列番号６、または配列番号８に対して９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列；およびペプチド結合またはペプチドリンカー配列によって免疫グロブリンＦｃ領域のＣ－末端に連結される抗－４－１ＢＢ抗体に対するｓｃＦｖを含み、ここで抗－４－１ＢＢ抗体に対するｓｃＦｖは、ペプチド結合またはペプチドリンカー配列によって連結された配列番号１７および１８を含むアミノ酸配列に対して９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

また、本願において、免疫グロブリンＦｃ領域；およびペプチド結合またはペプチドリンカー配列によって免疫グロブリンＦｃ領域のＮ－末端に連結されたＰＤ－１ポリペプチド変異体；およびペプチド結合またはペプチドリンカー配列によって免疫グロブリンＦｃ領域のＣ－末端に連結された抗－４－１ＢＢ抗体に対するｓｃＦｖを含むＦｃ融合ＢｓＡｂ（二重特異性抗体）が提供され、ここでＰＤ－１ポリペプチド変異体は、配列番号１１の残基２４～１７２に対して９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記変異体は、Ｄ２６、Ｐ３４、Ｖ４３、Ｔ４５、Ｔ５９、Ｖ６４、Ｌ６５、Ｎ６６、Ｙ６８、Ｍ７０、Ｎ７４、Ｋ７８、Ｃ９３、Ｑ９９、Ｒ１１４、Ｌ１２２、Ａ１２５、Ａ１３２、およびＲ１３９からなる群から選択される少なくとも一つの残基に突然変異を有し、ここで抗－４－１ＢＢ抗体に対するｓｃＦｖは、ペプチド結合またはペプチドリンカー配列によって連結された配列番号１７および１８を含むアミノ酸配列に対して９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、免疫グロブリンＦｃ領域は、配列番号１０もしくは配列番号１６、または配列番号１０もしくは配列番号１６に対して９５％以上（例えば、９６％以上、９７％以上、９８％以上、または９９％以上）の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、抗－４－１ＢＢ抗体に対するｓｃＦｖは、配列番号２２または配列番号２３に対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列である。

本発明におけるＢｓＡｂ抗体は、減少した抗体－依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）および／または補体－依存性細胞傷害（ＣＤＣ）の効果を有するまたは有さない。

本発明におけるＢｓＡｂ抗体は、肝毒性を低下させるまたは低下させないことを示す。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、野生型ＰＤ－１ポリペプチドと比較して、ＰＤ－Ｌ１分子への結合親和性が増強している。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、ＰＤ－Ｌ１分子に対して約１×１０^－８～１×１０^－１０Ｍの結合親和性（Ｋ_Ｄ）を有する。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、ＰＤ－Ｌ１分子に対して約１．１０×１０^－９Ｍ、約１．０３７×１０^－９Ｍ、または約７．１４×１０^－１０Ｍの結合親和性（Ｋ_Ｄ）を有する。

また、本願において、ＰＤ－１ポリペプチド変異体をコードする配列を含む核酸が提供され、ここでポリペプチド変異体は、配列番号３、配列番号５、または配列番号７に対して９５％以上の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、核酸は免疫グロブリンＦｃ領域をコードする配列をさらに含み、ここで免疫グロブリンＦｃ領域をコードする配列は、配列番号９を含む。

また、本願にて提供される核酸のいずれか１つを含む発現ベクターが本願に提供される。いくつかの実施形態では、ベクターはウイルスベクターである。

また、本願にて提供されるＰＤ－１ポリペプチド変異体のいずれか１つまたは本願に提供されるＰＤ－１融合タンパク質のいずれか１つ；および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物が本願に提供される。

また、本願にて提供される医薬組成物のいずれか１つをそれを必要とする被検体に投与することによって、疾患または病態を治療する段階を含む被検体の治療方法が本願に提供される。いくつかの実施形態では、被検体は癌を有する。いくつかの実施形態では、癌は、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、結腸癌、子宮内膜癌、食道癌、卵管癌、胆嚢癌、胃腸癌、頭頸部癌、血液癌、喉頭癌、肝臓癌、肺癌、リンパ腫、黒色腫、中皮腫、卵巣癌、原発性腹膜癌、唾液腺癌、肉腫、胃癌、甲状腺癌、膵臓癌、腎細胞癌、膠芽腫、および前立腺癌から選択される。

ヒトＰＤ－１タンパク質のアミノ酸配列（配列番号１１）を示す。 野生型ＰＤ－１（配列番号２）、ＰＤ－１．ｍ７（配列番号４）、ＰＤ－１．ｍ８（配列番号６）、およびｅｕＰＤ－１の配列アラインメントを示す（配列番号：８）。 ＰＤ－１変異体Ｆｃ融合タンパク質に対する例示的な組換え発現ベクターの構造を示す。 ＰＤ－１変異体Ｆｃ融合タンパク質、ＰＤ－１Ｆｃ融合タンパク質（１）、ＰＤ－１．ｍ７Ｆｃ融合タンパク質（２）、ＰＤ－１．ｍ８Ｆｃ融合タンパク質（３）、およびｅｕＰＤ－１Ｆｃ融合タンパク質（４）によるＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果を示す。 ゲル濾過スタンダード（図５Ａ）、野生型ＰＤ－１Ｆｃ融合タンパク質（図５Ｂ）、ＰＤ－１．ｍ７Ｆｃ融合タンパク質（図５Ｃ）、ＰＤ－ｌ．ｍ８Ｆｃ融合タンパク質（図５Ｄ）、およびｅｕＰＤ－１Ｆｃ融合タンパク質（図５Ｅ）を用いたサイズ排除クロマトグラフィーグラフを示す。 ＰＤ－Ｌ１高発現細胞株ＭＤＡ－ＭＢ－２３１（ヒト乳癌細胞）およびＰＤ－Ｌ１低発現細胞株ＭＣＦ－７（ヒト乳癌細胞）細胞におけるＰＤ－Ｌ１の発現レベルを示す。 図７Ａは、ＰＤ－Ｌ１陽性細胞におけるＰＤ－１Ｆｃ細胞結合のＦＡＣＳ解析を示す。図７Ｂは、ＰＤ－Ｌ１陰性細胞におけるＰＤ－１Ｆｃ細胞結合のＦＡＣＳ解析を示す。 図８Ａおよび図８Ｃは、実施例７のアッセイの方法を示す。図８Ｂは、抗原ＰＤ－Ｌ１に対するｅｕＰＤ－１Ｆｃ融合タンパク質、野生型ＰＤ－１Ｆｃ融合タンパク質、およびテセントリク（ｔｅｃｅｎｔｒｉｑ）の結合を示す。図８Ｄは、抗原ＰＤ－Ｌ２に対するｅｕＰＤ－１Ｆｃ融合タンパク質、野生型ＰＤ－１Ｆｃ融合タンパク質、およびテセントリク（ｔｅｃｅｎｔｒｉｑ）の結合を示す。 実施例８におけるＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１遮断バイオアッセイの結果の結果を示す。 実施例９に対するｉｎ ｖｉｖｏ有効性研究の対照群を示す。 実施例９におけるｅｕＰＤ－１Ｆｃおよびテセントリクに対する腫瘍サイズの観察の結果を示す。 実施例９における肝毒性指数分析（ＡＬＴ：１７～７７Ｕ７Ｌ（図１２Ａおよび図１２Ｅ）、ＡＳＴ：５４～２９８Ｕ／Ｌ（図１２Ｂおよび図１２Ｆ）、ＢＵＮ：８～３３ｍｇ／ｄＬ（図１２Ｃおよび図１２Ｇ）、Ｔ－ＢＩＬ：８～３３ｍｇ／ｄＬ（図１２Ｄおよび図１２Ｈ）を示す。 実施例１０に記載のｅｕＰＤ－１および抗－４－１ＢＢ抗体を用いたＦｃ融合ＢｓＡＢを示す。 実施例１０に記載のｅｕＰＤ－１および抗－４－１ＢＢ抗体を用いたＦｃ融合ＢｓＡＢによるＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果を示す。 実施例１０に記載のｅｕＰＤ－１および抗－４－１ＢＢ抗体を用いたＦｃ融合ＢｓＡＢのゲル濾過スンダードによるサイズ排除クロマトグラフィーグラフを示す。 実施例１０におけるｅｕＰＤ－１ＢｓＡＢ構築物のＳＰＲの結果を示す。 図１７Ａは実施例１１で用いた抗原結合アッセイ法を示す。図１７Ｂは実施例１１における抗原結合の結果を示す。 実施例１２における４－１ＢＢ／ＰＤ－１併用バイオアッセイの結果を示す。

本開示は、ＰＤ－１ポリペプチド変異体について記述し、該ＰＤ－１ポリペプチド変異体は、ＰＤ－Ｌ１分子に対する親和性を増強させる野生型ＰＤ－１タンパク質における突然変異を含む。

定義：
約：「約」という用語は、値に関して本明細書で使用される場合、参照された値に関連して類似する値を指す。一般に、文脈に精通している当業者は、その文脈において、「約」によって包含される関連する変異の程度を認識するであろう。例えば、いくつかの実施形態では、用語「約」は、２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％以下の参照値以内の値の範囲を含んでもよい。

投与：本明細書で使用される「投与」という用語は、典型的には、組成物である、または組成物に含まれる薬剤の送達を達成するための被検体或いはシステムに組成物を投与することを指す。当業者は、適切な環境において、被検体、例えば、ヒトへの投与に利用し得る様々な経路を認知しているであろう。例えば、いくつかの実施形態では、投与は、眼、経口、非経口、局所などであってもよい。いくつかの特定の実施形態では、投与は、気管支（例えば、気管内滴下注入）、頬側、真皮（例えば、真皮への局所、皮内、皮間、経皮などのうちの１つ以上またはそれらを含んでもよい）、腸内、動脈内、皮内、胃内、髄内、筋肉内、鼻腔内、腹腔内、髄腔内、静脈内、脳室内、特定の臓器内（例：肝臓内）、粘膜、鼻腔、経口、直腸、皮下、舌下、局所、気管（例えば、気管内注入）、膣、硝子体などであってもよい。いくつかの実施形態では、投与は単回用量のみを含んでもよい。いくつかの実施形態では、投与は、固定用量の適用を伴うことができる。いくつかの実施形態では、投与は、間欠的（例えば、時間おきに分割された複数の用量）および／または周期的（例えば、共通期間によって分離された個々の用量）投与である投与を含んでもよい。いくつかの実施形態では、投与は、少なくとも選択された期間にわたる連続投薬（例えば、灌流）を含み得る。

親和性：当技術分野で知られているように「親和性」は、特定のリガンドがそのパートナーに結合する強度の尺度である。親和性は色んな方法で測定することができる。いくつかの実施形態では、親和性は定量的アッセイによって測定される。いくつかの前記実施形態では、結合パートナー濃度は、生理学的条件を模倣するために、過量のリガンド濃度に固定することができる。代替的にまたは追加的に、いくつかの実施形態では、結合パートナー濃度および／またはリガンド濃度を変化させてもよい。いくつかの前記実施形態において、親和性は、同等の条件（例えば、濃度）下で参照と比較することができる。

抗体剤：本明細書で使用される「抗体剤」という用語は、 特定の抗原に特異的に結合する薬剤を指す。いくつかの実施形態では、この用語は、特異的結合を付与するのに十分な免疫グロブリンの構造要素を含む任意のポリペプチドまたはポリペプチド複合体を含む。例示的な抗体剤としては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、およびそれらのフラグメントが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、抗体剤は、当業界で知られているように、ヒト化、霊長類化、キメラなどの１つ以上の配列要素を含むことができる。多くの実施形態において、用語「抗体剤」は、抗体の構造的および機能的特徴を代替的な表現で活用するための当業界に公知または開発された構築物または形式のうちの１つ以上を指すために使用される。例えば、実施形態では、本発明に従って用いられる抗体剤は、無傷のＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、またはＩｇＭ抗体；二重特異性または多重特異性抗体（例えば、Ｚｙｂｏｄｉｅｓ(登録商標)など）；抗体フラグメント、例えば、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｄ’フラグメント、Ｆｄフラグメント、およびその単離されたＣＤＲまたはそれらのセット；単鎖Ｆｖｓ；ポリペプチド－Ｆｃ融合；単一ドメイン抗体（例えば、ＩｇＮＡＲまたはそのフラグメントなどのサメ単一ドメイン抗体）；ラクダ科抗体；マスクされた抗体（例えば、Ｐｒｏｂｏｄｉｅｓ(登録商標)）；小モジュラー免疫薬（「ＳＭＩＰｓ^ＴＭ」）；単鎖またはタンデムダイアボディ（ＴａｎｄＡｂ（登録商標））；ＶＨＨ；Ａｎｔｉｃａｌｉｎｓ（登録商標）；Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標）；ミニボディ；ＢｉＴＥ（登録商標）；アンキリンリピートタンパク質またはＤＡＲＰＩＮｓ（登録商標）；Ａｖｉｍｅｒｓ（登録商標）；ＤＡＲＴ；ＴＣＲ様抗体；Ａｄｎｅｃｔｉｎｓ（登録商標）；Ａｆｆｉｌｉｎｓ（登録商標）；Ｔｒａｎｓ－ｂｏｄｉｅｓ（登録商標）；Ａｆｆｉｂｏｄｉｅｓ（登録商標）；ＴｒｉｍｅｒＸ（登録商標）；微小タンパク質；Ｆｙｎｏｍｅｒｓ（登録商標）、Ｃｅｎｔｙｒｉｎｓ（登録商標）；およびＫＡＬＢＩＴＯＲ（登録商標）から選択されるが、これらに限定されないフォーマットである。いくつかの実施形態では、抗体剤は、天然に産生された場合を有する共有結合修飾（例えば、グリカンの付着）を欠いていてもよい。いくつかの実施形態では、抗体剤は、共有結合修飾（例えば、グリカンの付着、ペイロード［例えば、検出可能な部分、治療部分、触媒部分など］、または他のペンダント基［例えば、ポリエチレングリコールなど]を含むことができる。多くの実施形態において、抗体剤は、アミノ酸配列が相補性決定領域（ＣＤＲ）として当業者によって認識される１種以上の構造要素を含むポリペプチドであるまたは該ポリペプチドを含み；いくつかの実施形態では、抗体剤は、そのアミノ酸配列が、参照抗体に見出されるものと実質的に同一である少なくとも１つのＣＤＲ（例えば、少なくとも１つの重鎖ＣＤＲおよび／または少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲ）を含むポリペプチドであるまたは該ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、含まれるＣＤＲは、参照ＣＤＲと比較して配列が同一または１～５個のアミノ酸の置換を含むという点で、参照ＣＤＲと実質的に同一である。いくつかの実施例形態では、含まれるＣＤＲは、参照ＣＤＲと少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％配列同一性を示すという点で、参照ＣＤＲと実質的に同一である。いくつかの実施形態では、含まれるＣＤＲは、参照ＣＤＲと少なくとも９６％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を示すという点で、参照ＣＤＲと実質的に同一である。いくつかの実施形態で含まれたＣＤＲは、含まれるＣＤＲ内の少なくとも１個のアミノ酸が、参照ＣＤＲと比較して欠失、付加または置換されるという点で、参照ＣＤＲと実質的に同じであるが、そうでなければ、含まれるＣＤＲは参照ＣＤＲのものと同一であるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、含まれるＣＤＲは、含まれるＣＤＲ内の１～５個のアミノ酸が、参照ＣＤＲと比較して欠失、付加または置換される点で、参照ＣＤＲと実質的に同じであるが、そうでなければ、含まれたＣＤＲは参照ＣＤＲと同じアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、含まれるＣＤＲは、含まれるＣＤＲ内の少なくとも１個のアミノ酸が参照ＣＤＲと比較して置換されるという点で、参照ＣＤＲと実質的に同じであるが、そうでなければ、含まれるＣＤＲは、参照ＣＤＲと同じアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、含まれるＣＤＲは、含まれるＣＤＲ内の１～５個のアミノ酸が参照ＣＤＲと比較して欠失、付加または置換されるという点で、参照ＣＤＲと実質的に同じであるが、そうでなければ、含まれるＣＤＲは参照ＣＤＲと同じアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、抗体剤は、そのアミノ酸配列が、免疫グロブリン可変ドメインとして当業者によって認識される構造要素を含むポリペプチドであるまたは該ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、抗体剤は、免疫グロブリン結合ドメインと相同または大部分は相同である結合ドメインを有するポリペプチドタンパク質である。いくつかの実施形態では、抗体剤は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の少なくとも一部を含むまたはそれを含む。

抗原：本明細書で使用される「抗原」という用語は、抗体剤に結合する薬剤を指す。いくつかの実施形態では、抗原は抗体剤に結合し、有機体において特定の生理学的応答を誘導する場合も誘導しない場合もある。一般に、抗原は、例えば、小分子、核酸、ポリペプチド、炭水化物、脂質、重合体（生物学的重合体[例えば、核酸および／またはアミノ酸重合体]および生物学的重合体以外の重合体[例えば、核酸またはアミノ酸重合体以外]を含む）などの任意の化学的実体であってもよく、それを含んでもよい。いくつかの実施形態では、抗原はポリペプチドまたはこれを含む。いくつかの実施形態では、抗原は、グリカンであるまたはグリカンを含む。当業者は、一般に、抗原が単離された形態または純粋な形態で提供されてもよく、または代替として、粗製形態（例えば、細胞抽出物のような他の材料と一緒に抗原含有源の抽出物または他の比較的粗製の調製物）で提供されてもよいことを理解するであろう。いくつかの特定の実施形態では、抗原は細胞のコンテキストに存在する（例えば、抗原は細胞の表面上に発現するか、細胞内に発現する）。いくつかの実施形態では、抗原は組換え抗原である。

抗原結合ドメイン：本明細書で使用される場合、「抗原結合ドメイン」は、標的部分または実体に特異的に結合する抗体剤またはその一部を指す。通常、抗原結合ドメインとその標的間の相互作用は非共有結合である。いくつかの実施形態では、標的部分または実体は、例えば、炭水化物、脂質、核酸、金属、ポリペプチド、または小分子を含む任意の化学クラスのものであってもよい。いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、ポリペプチド（またはその複合体）であるまたはそれを含んでもよい。いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは融合ポリペプチドの一部である。いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の一部である。

関連する：２つのイベントまたは実体は、一つの存在、レベルおよび／または形態が異なるものと相関関係がある場合、本明細書にて使用するように互いに「関連する」。例えば、特定の実体（例えば、ポリペプチド、遺伝子シグネチャー、代謝産物、微生物など）は、その存在、レベルおよび／または形態が（例えば、関連集団全体）疾患、障害、または病態の発病率および／または感受性と関連する場合、特定の疾患、障害または病態と関連するものとして考慮される。いくつかの実施形態では、２つ以上の実体は、それが直接的または間接的に相互作用して、互いに物理的に近接するおよび／または近接を維持する場合、互いに物理的に「関連する」。いくつかの実施形態では、互いに物理的に関連する２つ以上の実体は互いに共有結合し；いくつかの実施形態では、互いに物理的に関連する２つ以上の実体は互いに共有結合せず、例えば、水素結合、ファンデルワールス相互作用、疎水性相互作用、磁性およびそれらの組み合わせによって非共有結合する。

結合：本明細書にて使用する用語「結合」は、通常、２つ以上の実体間またはその間の非共有結合を指すものと理解されるであろう。「直接」結合は、実体または部分間の物理的接触を含み；間接結合は一つ以上の中間実体との物理的接触を介した物理的相互作用を含む。２つ以上の実体間の結合は、典型的に相互作用する実体または部分が(例えば、担体実体と共有結合的にまたはその他の方法で関連づけられている、および／または生物的システムまたは細胞内)単独でまたはより複雑なシステムの状況で研究される場合を含んで様々な状況のいずれから評価されることができる。

癌：本明細書にて使用される用語「癌」、「悪性腫瘍」、「新生物」、「腫瘍」、および「癌腫」は、本明細書にて相対的で異常に制御されない／または／または自律的な増殖を示し、細胞増殖の調節の顕著な喪失を特徴とする異常な成長を表現する表現型を示す細胞を指す。いくつかの実施形態では、腫瘍は、前癌性（例えば、良性）、悪性、前転移性、転移性、および／または非転移性である細胞であるか、またはそれを含んでもよい。本開示は、その教示が特に関連し得る特定の癌を具体的に識別する。いくつかの実施形態では、関連する癌は、固形腫瘍によって特徴付けられ得る。いくつかの実施形態では、関連する癌は、血液腫瘍によって特徴付けられ得る。

一般に、当業界で知られている異なる類型の癌の例には、例えば、白血病、リンパ腫（ホジキンおよび非ホジキン）、骨髄腫および骨髄増殖性疾患を含む造血癌；肉腫、黒色腫、腺腫、固形組織の癌腫、口、のど、喉頭、肺の扁平上皮癌、肝臓癌、泌尿生殖器癌、前立腺癌、子宮頸癌、膀胱癌、子宮内膜癌、腎細胞癌、骨癌、膵臓癌、皮膚癌、皮膚または眼内黒色腫、内分泌系の癌、甲状腺の癌、副甲状腺の癌、頭頸部癌、乳癌、胃腸癌および神経系癌、良性病変、乳頭腺癌などを含む。

化学療法薬：本明細書で使用される「化学療法薬」という用語は、例えば、具体的に好ましくない細胞増殖と関連する１種以上の疾患、障害または病態を治療することに使用するために利用する／利用されない推奨の製剤を含む、一種以上の細胞死滅促進剤、細胞増殖抑制剤および／または細胞毒性剤を指す当業界において理解されている意味を有する。多くの実施形態において、化学療法薬は、癌の治療に有用である。いくつかの実施形態では、化学療法薬は、１つ以上のアルキル化剤、１つ以上のアントラサイクリン、１つ以上の細胞骨格破壊剤（例えば、タキサン、メイタンシンおよびその類似体などの微小管標的化剤）、１つ以上のエポチロン、１つ以上のヒストン脱アセチル化酵素阻害剤ＨＤＡＣ）、１つ以上のトポイソメラーゼ阻害剤（例えば、トポイソメラーゼＩおよび／またはトポイソメラーゼＩＩの阻害剤）、１つ以上のキナーゼ阻害剤、１つ以上のヌクレオチド類似体またはヌクレオチド前駆体類似体、１つ以上のペプチド抗生物質、一つ以上の白金系薬剤、１つ以上のレチノイド、１つ以上のビンカアルカロイド、および／またはいずれか１つ以上の類似体（すなわち、関連する抗増殖活性を共有する）ものであってよい、またはこれを含んでもよい。いくつかの特定の実施形態では、化学療法薬は、アクチノマイシン、オールトランスレチノイン酸、アウリスタチン、アザシチジン、アザチオプリン、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、カルボプラチン、カペシタビン、シスプラチン、クロラムブシル、シクロフォスファミド、クルクミン、シタラビン、ダウノルビシン、ドセタキセル、ドキシフルリジン、ドキソルビシン、エピルビシン、エポチロン、エトポシド、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシウレア、イダルビシン、イマチニブ、イリノテカン、メイタンシンおよび／またはその類似体（例：ＤＭ１）、メクロレタミン、メルカプトプリン、メトトレキサート、ミトキサントロン、メイタンシノイド、オキサリプラチン、パクリタキセル、ぺメトレキシド、テニポシド、チオグアニン、トポテカン、バルビシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、およびそれらの組み合わせのうちの１つ以上であってもよく、またはそれらを含んでもよい。いくつかの実施形態において、化学療法薬は、抗体－薬物コンジュゲートと関連して利用し得る。いくつかの実施形態では、化学療法薬は、ｈＬＬ１－ドキソルビシン、ｈＲＳ７－ＳＮ－３８、ｈＭＮ－１４－ＳＮ－３８、ｈＬＬ２－ＳＮ－３８、ｈＡ２０－ＳＮ－３８、ｈＰＡＭ４－ＳＮ－３８、ｈＬＬ１－ＳＮ－３８、ｈＲＳ７－Ｐｒｏ－２－Ｐ－Ｄｏｘ、ｈＭＮ－１４－Ｐｒｏ－２－Ｐ－Ｄｏｘ、ｈＬＬ２－Ｐｒｏ－２－Ｐ－Ｄｏｘ、ｈＡ２０－Ｐｒｏ－２－Ｐ－Ｄｏｘ、ｈＰＡＭ４－Ｐｒｏ－２－Ｐ－Ｄｏｘ、ｈＬＬ１－Ｐｒｏ－２－Ｐ－Ｄｏｘ、Ｐ４／Ｄ１０－ドキソルビシン、ゲムツズマブオゾガマイシン、ブレンツキシマブベドチン、トラスツズマブエムタンシン、イノツズマブオゾガマイシン、グレンバツムマブベドチン、ＳＡＲ３４１９、ＳＡＲ５６６６５８、ＢＩＩＢ０１５、ＢＴ０６２、ＳＧＮ－７５、ＳＧＮ－ＣＤ１９Ａ、ＡＭＧ－１７２、ＡＭＧ－５９５、ＢＡＹ－９４－９３４３、ＡＳＧ－５ＭＥ、ＡＳＧ－２２ＭＥ、ＡＳＧ－１６Ｍ８Ｆ、ＭＤＸ－１２０３、ＭＬＮ－０２６４、抗－ＰＳＭＡ ＡＤＣ、ＲＧ－７４５０、ＲＧ－７４５８、ＲＧ－７５９３、ＲＧ－７５９６、ＲＧ－７５９８、ＲＧ－７５９９、ＲＧ－７６００、ＲＧ－７６３６、ＡＢＴ－４１４、ＩＭＧＮ－８５３、ＩＭＧＮ－５２９、ボルセツズマブマフォドチンおよびロボツズマブメルタンシンからなる群から選択される抗体-薬物コンジュゲートに見出されるものである。

改変された：一般に、「改変された」という用語は、ヒトの手によって改変された様態を指す。例えば、ポリペプチドは、ポリペプチド配列がヒトの手によって改変されたとき、「改変された」ものとみなされる。例えば、本発明のいくつかの実施形態では、改変されたポリペプチドは、ヒトの手によって参照ポリペプチド配列に導入された１つ以上のアミノ酸変異、欠失および／または挿入を含む配列を含む。いくつかの実施形態では、改変されたポリペプチドは、ヒトの手によって一つ以上の追加ポリペプチドに融合（すなわち、共有結合）され、ｉｎ ｖｉｖｏで自然に発生しない融合ポリペプチドを形成したポリペプチドを含む。同様に、細胞や有機体は、遺伝情報が変更されるように改変された場合（例えば、前は存在しなかった新しい遺伝物質が、例えば、形質転換、交配、体細胞ハイブリダイゼーション、トランスフェクション、形質導入、または他のメカニズムにより導入される場合、または以前に存在した遺伝物質が、例えば、置換または欠失突然変異、または交配プロトコルによって変更または除去される場合）「改変される」とみなされる。一般的な慣行であり、当業者により理解されるように、改変されたポリペプチドまたは細胞の誘導体および／または子孫は、実際の改変が以前の実体に対して行われた場合であっても、典型的には依然として「改変された」と呼ばれる。

医薬組成物：本明細書で使用される場合、「医薬組成物」という用語は、活性剤が１つ以上の薬学的に許容される担体と共に剤形化される組成物を指す。いくつかの実施形態では、組成物は、ヒトまたは動物を被検体として投与するのに適している。いくつかの実施形態では、活性剤は、関連集団に投与されるとき、所定の治療効果を達成する統計的に有意な確率を示す治療レジメンでの投与に適した単位用量で存在する。

薬学的に許容される担体：本明細書で使用される「薬学的に許容される担体」という用語は、一般に、薬学的に許容可能な物質、組成物または担体、例えば、意図した機能を果たすために、本発明における有用な化合物を患者内または患者に運搬または輸送することに関与する、液体または固体充填剤、安定化剤、分散剤、懸濁剤、希釈剤、賦形剤、増粘剤、溶媒またはカプセル化物質の当業界で認識された意味を有する。典型的には、そのような構築物は、身体のある器官または部分から身体の他の臓器または部分に運搬されたり輸送される。各担体は、本発明で有用な化合物を含む製剤の他の成分と両立可能であり、患者に害を及ぼさないという意味で「許容可能」であるべきである。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」は、また、本発明内で有用な化合物の活性と両立でき、患者に生理学的に許容される、任意のおよびあらゆるコーティング剤、抗菌剤および抗真菌剤、吸収遅延剤なども含まれる。用語「薬学的に許容される担体」は、本発明内で有用な化合物の薬学的に許容される塩をさらに含んでもよい。本発明の実施において使用される医薬組成物に含まれ得る他の追加の成分としては、例えば、文献［Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｇｅｎａｒｏ，Ｅｄ．， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，１９８５，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．）］に記載されており、本願に参照により組み込まれている。「薬学的に許容される担体」は、一般に組成物の他の成分と互換性があり、受容者に有害ではなく、生物学的にも他の方法でも好ましくない医薬組成物の調製に有用である。「薬学的に許容される担体」には、１つ以上の担体が含まれる。実施形態は、局所、眼、非経口、静脈内、腹腔内、筋肉内、舌下、鼻腔または経口投与のための担体を含む。「薬学的に許容される担体」は、さらに水性分散液および注射用滅菌粉末または分散液を調製するための製剤を含む。

薬学的に許容される塩：本明細書で使用される「薬学的に許容される塩」という用語は、一般に、当業界で認識される意味を有し、本明細書に提供された化合物の誘導体を指し、ここで、親化合物は存在する酸または塩基部分をその塩形態に変換することによって修飾される。薬学的に許容される塩の例としては、アミンなどの塩基性残基の無機酸塩または有機酸塩；カルボン酸などの酸性残基のアルカリ塩または有機塩；などを含むが、これに制限されない。本明細書で提供される化合物の薬学的に許容される塩は、例えば、無毒の無機酸または有機酸から形成された親化合物の従来の無毒の塩を含む。本明細書で提供される化合物の薬学的に許容される塩は、塩基性または酸性部分を含む親化合物から従来の化学的方法によって合成することができる。

一般に、このような塩は、これらの化合物の遊離酸または塩基形態を、水または有機溶媒、またはこれら２つの混合物で化学量論量の適切な塩基または酸と組み合わせることによって調製することができ；一般に、エーテル、エチルアセテート、エタノール、イソプロパノール、またはアセトニトリルなどの非水性媒体を使用することができる。適切な塩の目録は、文献[Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１７^ｔｈｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９８５， ｐ．１４１８ ａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，６６，２（１９７７）］に記載されており、これはそれぞれその内容全体が本願において参照により組み込まれている。

賦形剤：本明細書で使用される「賦形剤」という用語は、一般に、当業界で認識された意味を有し、医薬組成物の調製に有用な生理学的に適合する添加剤を指す。薬学的に許容される担体および賦形剤の例としては、例えば、文献［Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，１６^ｔｈ Ｅｄ]に記載されている。

ポリペプチド：本明細書で使用される「ポリペプチド」という用語は、一般に、少なくとも３個のアミノ酸の重合体の当該分野で認識された意味を有する。当業者は「ポリペプチド」という用語が、本明細書において引用された完全な配列を有するポリペプチドを含むだけでなく、このような完全なポリペプチドの機能的フラグメント（すなわち、少なくとも一つの活性を保有するフラグメント）を示すポリペプチドを含むように十分に一般的なものと理解されるであろう。また、当業者は、タンパク質配列が一般的に活性を破壊することなく、一部の置換を容認することが理解されよう。したがって、一般に同一部類の他のポリペプチドと共に活性を維持し、少なくとも約３０～４０％の全体的な配列同一性、しばしば約５０％、６０％、７０％、または８０％よりも大きい全体的な配列同一性を共有し、一般的に一つ以上の高度に保存された領域で９０％または９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を超える、より高い同一性の少なくとも一つの領域をさらに含み、少なくとも３～４個およびしばしば２０個以上のアミノ酸を含む任意のポリペプチドは、本明細書にて使用される用語「ポリペプチド」内に含まれる。ポリペプチドは、Ｌ－アミノ酸、Ｄ－アミノ酸、またはその両方を含むことができ、当業界で知られている任意の様々なアミノ酸修飾または類似体を含むことができる。有用な修飾には、例えば、末端アセチル化、アミド化、メチル化などが含まれる。いくつかの実施形態では、タンパク質は、天然アミノ酸、非天然アミノ酸、合成アミノ酸、およびそれらの組み合わせを含んでもよい。「ペプチド」という用語は、一般に、約１００個未満のアミノ酸、約５０個未満のアミノ酸、２０個未満のアミノ酸、または１０個未満のアミノ酸の長さを有するポリペプチドを指すために使用される。いくつかの実施形態では、タンパク質は、抗体剤、抗体フラグメント、その生物学的活性部分、および／またはその特性部分である。

組み換え体：本明細書で使用される「組換え体」は、組換え手段によって設計、改変、調製、発現、作成、製造、および／または単離されたポリペプチド宿主細胞にトランスフェクトされた組換え発現ベクターを使用して発現されるポリペプチド；組み換え、組み換えコンビナトリアルヒトポリペプチドライブラリーから単離されたポリペプチド；遺伝子または遺伝子ら、またはその１つ以上の構成要素(ら)、部分(ら)、要素(ら)、またはドメイン(ら)をコードするおよび／またはその発現を指示する遺伝子成分に対してトランスジェニックであるか、またはこれを発現するように改変された、動物(例えば、マウス、ウサギ、羊、魚類など)から単離されたポリペプチド；および／または選択された核酸配列要素を互いにスプライシングまたはライゲーションする、または選択された配列要素を化学的に合成するおよび／またはポリペプチドまたはその一つ以上の成分(ら)、部分(ら)、要素(ら)、またはドメイン(ら)をコードするおよび／またはその発現を指示する核酸を生成することを伴う任意の他の手段によって製造、発現、生成または単離されたポリペプチドを指すものと意図される。いくつかの実施形態では、そのような選択された配列要素のうちの１つ以上は自然界に存在する。いくつかの実施形態では、そのような選択された配列要素の１つ以上はインシリコで設計される。いくつかの実施形態では、１つ以上のそのような選択された配列要素は、関心供給源有機体（例えば、ヒト、マウスなど）の生殖系列でのような、例えば、天然または合成供給源からの公知の配列要素の（例えば、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏ）突然変異誘発から生成される。

特異的結合：本明細書で使用される「特異的結合」という用語は、結合が起こる環境において可能な結合パートナーを識別する能力を指す。他の潜在的な標的が存在する場合に１つの特定の標的と相互作用する結合剤は、それが相互作用する標的に「特異的に結合する」と称する。いくつかの実施形態では、特異的結合は、結合剤とそのパートナーとの間の会合の程度を検出または決定することによって評価され；いくつかの実施形態において、特異的結合は、結合剤－パートナー複合体の解離の程度を検出または決定することによって評価される。いくつかの実施形態では、特異的結合は、そのパートナーと別の実体との間の代替的相互作用と競合する結合剤の能力を検出または決定することによって評価される。いくつかの実施形態において、特異的結合は、濃度範囲にわたってこのような検出または決定を行うことによって評価される。

被検体：本明細書で使用される「被検体」という用語は、有機体、典型的には哺乳動物（例えば、ヒト、いくつかの実施形態において出生前のヒト形態を含む）を指す。いくつかの実施形態では、被検体は、関連する疾患、障害または病態を患っている。いくつかの実施形態では、被検体は、疾患、障害、または病態に患いやい。いくつかの実施形態では、被検体は、疾患、障害または病態の１つ以上の症状または徴候を示す。いくつかの実施形態では、被検体は、疾患、障害、または病態の何らかの症状や徴候を示さない。いくつかの実施形態では、被検体は、疾患、障害、または病態への感受性またはリスクに特徴的な１つ以上の特徴を有するヒトである。いくつかの実施形態では、被検体は患者である。いくつかの実施形態では、被検体は、診断および／または治療が施されるおよび／または施されてきている個体である。

治療薬：本明細書で使用される「治療薬」という用語は、一般に、有機体に投与される際、所望の薬理学的効果を導き出す任意の薬剤を指す。いくつかの実施形態では、薬剤は、適切な母集団にわたって統計的に有意な効果を奏する場合、治療薬であるとみなされる。いくつかの実施形態では、適切な母集団は、モデル有機体の母集団であってもよい。いくつかの実施形態では、適切な母集団は、特定の年齢層、性別、遺伝的背景、既存の臨床状態などのさまざまな基準によって定義され得る。いくつかの実施形態では、治療薬は、疾患、障害、および／または病態の１つ以上の症状または徴候の緩和、改善、軽減、抑制、予防、発症の遅延、重症度の軽減、および／または発病率の減少に用いられることができる物質である。いくつかの実施形態では、「治療剤」は、ヒトへの投与のために市販される前に、政府機関によって承認されたまたは承認が必要な薬剤である。いくつかの実施形態において、「治療薬」は、ヒトへの投与のために処方箋が必要とされる薬剤である。

治療上有効な量：本明細書で使用される場合「治療上有効な量」という用語は、治療投薬レジメンに従って、疾患、障害、および／または病態に罹患している、または罹患しやすい集団に投与された場合に、疾患、障害、および／または状態を治療するのに十分な量を意味する。いくつかの実施形態では、治療上有効な量は、疾患、障害、および／または病態の１つ以上の症状の発病率および／または重症度を軽減させ、その１つ以上の特徴を安定化し、および／または発症を遅延する量である。当業者は「治療上有効な量」という用語は、特定の個体において成功した治療が達成されることを実際には必要としないことを理解するであろう。むしろ、治療上有効な量は、そのような治療を必要とする患者に投与した場合に、かなりの数の被検体において特定の所望の薬理学的応答を提供する量であってもよい。例えば、いくつかの実施形態では、「治療上有効な量」という用語は、本発明における治療状況においてそれを必要とする個体に投与される場合、前記個体から発生する癌支持プロセスを遮断、安定化、弱毒化、または逆転させる量を指す。癌治療の状況において「治療上有効な量」は、癌と診断された個体に投与される場合、個体における癌のさらなる進行を予防、安定化、阻害、または軽減する量である。本明細書に記載の組成物の特に好ましい「治療上有効な量」は（治療処置において）、膵臓癌などの悪性腫瘍の進行を逆転させたり、悪性腫瘍の寛解を達成したりなど延長に役立つ。その個体の癌を治療するため、個体に投与される治療上有効な量は、寛解を促進するまたは転移を阻害するために投与される治療上有効な量と同じであっても異なっていてもよい。大概の癌治療と同様に、本明細書に記載の治療法は、癌に対する「治療」として解釈されたり、制限されたり、または限定されるべきではない。むしろ、治療方法は、癌を「治療する」ための、すなわち、癌を患う個体の健康に望ましいまたは有益な変化をもたらすための、記載された組成物の使用に関するものである。このような利点は、腫瘍学分野の熟練した医療提供者によって認識されており、患者の病態の安定化、腫瘍サイズの縮小（腫瘍退縮）、生命機能の改善（例えば、癌組織または器官の機能の改善）、さらに転移の減少または抑制、日和見感染の減少、生存率の増加、痛みの減少、運動機能の改善、認知機能の改善、エネルギー感の改善（活力、倦怠感の減少）、ウエルビーイング感の改善、正常な食欲の回復、健康的な体重増加の回復、およびこれらの組み合わせを含むが、これらに制限されない。さらに（例えば、本明細書に記載の治療の結果として）、個体における特定の腫瘍の退行はまた（例えば、治療の結果として）、膵臓腺癌などの腫瘍の部位から癌細胞のサンプルを採取することによって、そして癌細胞の状態を監視するために、代謝およびシグナル伝達マーカーのレベルについて癌細胞をテストし、分子レベルで癌細胞の悪性度の低い表現型へ退行するか否かを検証することによって評価することができる。例えば、本発明の方法を用いることによって誘導された腫瘍退行は、前記にて議論した任意の血管新生促進マーカーの減少、本明細書に記載の抗血管新生マーカーの増加、代謝経路の正常化（すなわち、癌にかからない健常人から発見される状態への変化）、細胞間シグナル伝達経路、または癌診断を受けた固体において異常な活性を示す細胞内シグナル伝達経路を発見することによって表示される。当業者は、いくつかの実施形態において、治療上有効な量を単回用量で剤形化および／または投与できることを理解するであろう。いくつかの実施形態では、治療上有効な量を、例えば、投薬計画の一部として、複数の用量で剤形化および／または投与することができる。

変異体：本明細書で使用される、分子、例えば、核酸、タンパク質、または小分子の文脈で用語「変異体」は、いわゆる、参照実体と比較して、１つ以上の化学部分の存在または非存在またはレベルで参照分子と有意な構造的同一性を示すが、参照分子とは構造的に異なる分子を指す。いくつかの実施形態では、変異体はまた、その参照分子とは機能的に異なる。一般に、特定の分子が参照分子の「変異体」であると適切に考えられるかどうかは、参照分子との構造的同一性の程度に基づいて決定される。当業者の認識通り、任意の生物学的または化学的参照分子は、特定の特徴的な構造要素を有する。定義上、変異体は、１つ以上のそのような特徴的な構造要素を共有するが、参照分子とは少なくとも１つの様態で異なる別個の分子である。単にいくつかの例を挙げると、ポリペプチドは、線形空間若しくは三次元空間において、互いに対して指定された位置を有するおよび／または特定の構造モチーフおよび／または生物学的機能に寄与する複数のアミノ酸から構成される特徴的な配列要素を有することができ；核酸は、線形または三次元空間において他のものに対して指定された位置を有する複数のヌクレオチド残基から構成された特徴的な配列要素を有することができる。いくつかの実施形態では、変異ポリペプチドまたは核酸は、アミノ酸またはヌクレオチド配列における１つ以上の相違の結果として、参照ポリペプチドまたは核酸とは異なり得る。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドまたは核酸は、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、または９９％である、参照ポリペプチドまたは核酸との全体的な配列同一性を示す。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドまたは核酸は、参照ポリペプチドまたは核酸と少なくとも一つの特徴的な配列要素を共有しない。いくつかの実施形態では、参照ポリペプチドまたは核酸は、１つ以上の生物学的活性を有する。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドまたは核酸は、参照ポリペプチドまたは核酸の生物学的活性のうちの１つ以上を共有する。

ベクター：本明細書で使用される「ベクター」は、連結された別の核酸を輸送することができる核酸分子を指す。ベクターの１つのタイプは「プラスミド」であり、これは追加のＤＮＡセグメントがライゲーションされ得る環状二本鎖ＤＮＡループを指す。別のタイプのベクターは、ウイルスベクターであり、追加のＤＮＡセグメントがウイルスゲノムにライゲーションされている場合がある。特定のベクターは、それらが導入される宿主細胞で自律複製が可能である（例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノムに組み込むことができ、それによって宿主ゲノムと共に複製される。さらに、特定のベクターは、作動可能に連結された遺伝子の発現を指示することができる。このようなベクターは、本明細書では「発現ベクター」と称する。組換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチド合成、組織培養および形質転換（例えば、エレクトロポレーション、リポフェクション）には標準的な技術を使用することができる。酵素反応および精製技術は、製造業者の仕様に従って、または当業界で一般的に達成される、または本明細書の記載のように実施することができる。前述の技術および手順は、一般に、当業界で周知の従来の方法に従って、および本明細書全体で引用および議論される様々な一般的およびより具体的な参考文献に記載されているように実行することができる。例えば、文献［Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９））］を参照し、これは本願に任意の目的のために組み込まれる。

プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ－１）
プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ－１）は、活性化中にすべてのＴ細胞によって発現される抑制性受容体である。ＰＤ－１は、従来のＴ細胞によって発現されるだけでなく、制御性Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、および一部の骨髄細胞集団によっても発現される。ＰＤ－１は、急性および慢性感染症、癌、自己免疫、および免疫恒常性を含むさまざまな生理学的応答中のエフェクターＴ細胞の機能を調節する。また、ＰＤ－１は、抗原との遭遇中に高い持続的な発現レベルを示すことがよくあり、これは慢性感染症や癌の環境で発生する可能性があり、防御免疫を制限することができる。

腫瘍微小環境では、ＰＤ－１とそのリガンドであるプログラム細胞死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）は、腫瘍中和免疫監視を回避することにより、腫瘍の進行と生存に重要な役割を果たす。ＰＤ－１およびＰＤ－Ｌ１阻害経路を遮断することで、Ｔ細胞の活性化を強化すると、広範な癌患者のサブセットで有益な抗腫瘍応答と長期寛解が得られることが示される。したがって、ＰＤ－Ｌ１とＰＤ－１の相互作用をブロックする阻害剤の使用すると（例えば、Ｔ細胞に対する）、ＰＤ－１刺激を防止し、それによってＴ細胞機能シグナルと免疫細胞応答を増加させることに役立つ。

いくつかの実施形態では、野生型ＰＤ－１に対する特異的突然変異を導入し、ＰＤ－１ポリペプチド変異体を生成し、ここで特異的突然変異は、ＰＤ－Ｌ１への優先的結合を誘導する。いくつかの実施形態では、ＰＤ－１ポリペプチド変異体は、可溶性ＰＤ－１タンパク質である。いくつかの実施形態では、ＰＤ－１ポリペプチド変異体は、細胞外ドメインおよび膜貫通型ドメインまたはそのフラグメントを含む。膜貫通型ドメインまたはそのフラグメントは、本願において前記に述べられている。

いくつかの実施形態では、ＰＤ－１ポリペプチド変異体は、配列番号４、配列番号６，または配列番号８に対して９５％以上（例えば、９６％以上、９７％以上、９８％以上、または９９％以上）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。ここで、ＰＤ－１ポリペプチド変異体は、ＰＤ－Ｌ１および膜貫通型ドメインまたはそのフラグメントに特異的に結合する細胞外ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＰＤ－１ポリペプチド変異体は、配列番号４、配列番号６、または配列番号８のアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、ＰＤ－１ポリペプチド変異体は、野生型ＰＤ－１ポリペプチドと比較して、ＰＤ－Ｌ１分子に対する結合親和性が増強している。いくつかの実施形態では、ポリペプチド変異体は、ＰＤ－Ｌ１分子に対して約１×１０^－８～１×１０^－１０Ｍ、好ましくは約１×１０^－９～１×１０^－１０Ｍの結合親和性（Ｋ_Ｄ）を有する。いくつかの実施形態では、ポリペプチド変異体は、ＰＤ－Ｌ１分子に対して約１．１０×１０^－９Ｍ、約１．０３７×１０^－９Ｍ、または約７．１４×１０^－１０Ｍの結合親和性（Ｋ_Ｄ）を有する。

本明細書で使用される「核酸」は、ポリヌクレオチドを含む任意の化合物および／または物質を含むために使用される。例示的な核酸またはポリヌクレオチドは、リボ核酸（ＲＮＡ）および／またはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）が含まれるが、これらに限定されない。

いくつかの実施形態では、核酸は、ＰＤ－１ポリペプチド変異体をコードする配列を含み、ここでＰＤ－１ポリペプチド変異体は、配列番号３、配列番号５、または配列番号７に対して９５％以上（９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上）の配列同一性を有する少なくとも一つのヌクレオチド配列を含む。

本明細書に記載のすべての実施形態において、ＰＤ－１変異体は、クローニングに使用される制限エンドヌクレアーゼの選択から生じるＣ－末端にさらなる残基を含んでもよい。クローニング選択から生じるさらなる残基が、１個、２個、３個、または４個の残基に制限され、ジペプチド添加、好ましくはアラニン－セリンジペプチドに与えられたることが好ましい。例えば、ＰＤ－１ポリペプチド変異体それ自体または融合構築物の一部として使用される場合、ｅｕＰＤ－１の場合、配列番号８の配列とＣ－末端ＡＳジペプチドが本発明に含まれる。このような配列は、本発明のＰＤ－１ポリペプチド変異体について定義されたレベルのアミノ酸配列同一性によって想定され、含まれる。

いくつかの実施形態では、本発明のＰＤ－１ポリペプチド変異体は、配列番号１１の残基２４～１７２に対して９５％以上（例えば、９６％以上、９７％以上、９８％以上、または９９％以上）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＰＤ－１変異体を含み、ここで前記変異体は、Ｄ２６、Ｐ３４、Ｖ４３、Ｔ４５、Ｔ５９、Ｖ６４、Ｌ６５、Ｎ６６、Ｙ６８、Ｍ７０、Ｎ７４、Ｋ７８、Ｃ９３、Ｑ９９、Ｒ１１４、Ｌ１２２、Ａ１２５、Ａ１３２、およびＲ１３９からなる群から選択される少なくとも１つの残基に突然変異を有する。本発明には、この実施形態のＰＤ－１ポリペプチド変異体をコードする核酸、核酸を含むベクター、この実施形態のＰＤ－１ポリペプチド変異体を含む医薬組成物、および医薬組成物を投与することによって治療を必要とする被検体の疾患または病態（例えば、癌）を治療する方法が含まれる。

この実施形態の変異体において、本発明のＰＤ－１ポリペプチド変異体は、配列番号１１の残基２４～１７２に対して９５％以上（例えば、９６％以上、９７％以上、９８％以上、または９９％以上）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＰＤ－１変異体を含み、ここで前記変異体は、Ｄ２６、Ｐ３４、Ｖ４３、Ｔ４５、Ｔ５９、Ｖ６４、Ｌ６５、Ｎ６６、Ｙ６８、Ｍ７０、Ｎ７４、Ｋ７８、Ｑ９９、Ｌ１２２、Ａ１２５、Ａ１３２、およびＲ１３９に突然変異を有する。本発明には、この実施形態のＰＤ－１ポリペプチド変異体をコードする核酸、核酸を含むベクター、この実施形態のＰＤ－１ポリペプチド変異体を含む医薬組成物、および医薬組成物を投与することによって、治療を必要とする被検体の疾患または病態（例えば、癌）を治療する方法が含まれる。

いくつかの実施形態では、本発明のＰＤ－１ポリペプチド変異体は、配列番号１１の残基２４～１７２に対して９５％以上（例えば、９６％以上、９７％以上、９８％以上、または９９％以上）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＰＤ－１変異体を含み、ここで前記変異体は、Ｄ２６、Ｐ３４、Ｖ４３、Ｔ４５、Ｔ５９、Ｖ６４、Ｌ６５、Ｎ６６、Ｙ６８、Ｍ７０、Ｎ７４、Ｋ７８、Ｃ９３、Ｑ９９、Ｒ１１４、Ｌ１２２、Ａ１２５、Ａ１３２、およびＲ１３９に突然変異を有する。本発明には、この実施形態のＰＤ－１ポリペプチド変異体をコードする核酸、核酸を含むベクター、この実施形態のＰＤ－１ポリペプチド変異体を含む医薬組成物、および医薬組成物を投与することによって治療を必要とする被検体の疾患または病態（例えば、癌）を治療する方法が含まれる。

好ましい突然変異には、Ｄ２６Ｅ、Ｐ３４Ａ、Ｖ４３Ｌ、Ｔ４５Ａ、Ｔ５９Ａ、Ｖ６４Ｈ、Ｌ６５Ｖ、Ｎ６６Ｖ、Ｙ６８Ｈ、Ｍ７０Ｅ、Ｎ７４Ｇ、Ｋ７８Ｔ、Ｃ９３Ｈ、Ｑ９９Ｒ、Ｒ１１４Ｑ、Ｌ１２２Ｙ、Ａ１２５Ｖ、Ａ１３２Ｉ、Ｒ１３９Ｇが含まれる。

Ｆｃ融合タンパク質およびコード化ヌクレオチド配列
本明細書で使用される「Ｆｃ融合タンパク質」は、関心ポリペプチドまたはタンパク質に連結されたＩｇＧのＦｃドメインから構成される改変タンパク質を指す。Ｆｃ融合ポリペプチドまたはタンパク質の例には、単一ペプチド、細胞表面受容体結合時に活性化されるリガンド、シグナル伝達分子（例えば、サイトカイン）、二量体化時に活性化される受容体の細胞外ドメイン、およびタンパク質マイクロアレイの結合パートナーを識別することに使用されるｂａｉｔタンパク質を含むが、これに制限されない。いくつかの実施形態では、Ｆｃ融合タンパク質は、抗原結合ドメインを介して特定の抗原に特異的に結合する抗体剤として作用する。いくつかの実施形態では、Ｆｃ融合タンパク質は、特異的結合を付与するのに十分な免疫グロブリン構造要素を含むポリペプチドまたはポリペプチド複合体を含む。

Ｆｃは、ＩｇＧ１またはその変異体、ＩｇＧ２またはその変異体、ＩｇＧ４またはその変異体、ならびにヒト化ＩｇＧ１／２またはその変異体から選択される定常ドメインである。Ｆｃは、ＩｇのＹ字型構造の形成と構造維持のための二量体化、およびＦｃ媒介エフェクター機能と血清半減期の延長において複数の役割を果たす。いくつかの実施形態では、モノマーＦｃには２つのドメイン、第２の定常ドメイン（ＣＨ２）および第３の定常ドメイン（ＣＨ３）が存在する。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、Ｆｃドメインと特定のペプチドまたはタンパク質を一緒に融合するリンカーを含む。いくつかの実施形態では、免疫グロブリンＦｃ領域は、ペプチド結合によって特定のペプチドまたはタンパク質に連結される。いくつかの実施形態では、免疫グロブリンＦｃ領域は、ペプチドリンカー配列によって特定のペプチドまたはタンパク質に連結される。いくつかの実施形態では、リンカー配列は（Ｇ_４Ｓ）_２（配列番号１９）、（Ｇ_４Ｓ）_３リンカー（配列番号２０）、または２１８リンカー（配列番号２１）を含む。

いくつかの実施形態では、特定のペプチドまたはタンパク質は、免疫グロブリンＦｃ領域のカルボキシ－末端に連結される。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインは、配列番号１０若しくは配列番号１６、または配列番号１０若しくは配列番号１６に対して９５％以上（例えば、９６％以上、９７％以上、９８％以上、または９９％以上）の配列同一性を有する配列を含む。

いくつかの実施形態において、ＰＤ－１ポリペプチド変異体は、ＰＤ－１融合タンパク質を産生するために使用される。いくつかの実施形態では、ＰＤ－１融合タンパク質は、ＰＤ－１ポリペプチド変異体および免疫グロブリンＦｃ領域を含んでもよい。いくつかの実施形態では、ＰＤ－１Ｆｃ融合タンパク質は、免疫グロブリンＦｃ領域、およびペプチド結合またはペプチドリンカー配列によって免疫グロブリンＦｃ領域のカルボキシ－末端に連結されたＰＤ－１ポリペプチド変異体を含み、ここでＰＤ－１ポリペプチド変異体は、配列番号４、配列番号６、または配列番号８に対して９５％以上（例えば、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、免疫グロブリンＦｃ領域は、配列番号１０または配列番号１６に対して９５％以上（例えば、９６％以上、９７％以上、９８％以上、または９９％以上）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、ＰＤ－１Ｆｃ融合タンパク質は、野生型ＰＤ－１ポリペプチドと比較して、ＰＤ－Ｌ１分子に対する結合親和性が増強している。いくつかの実施形態では、ＰＤ－１Ｆｃ融合タンパク質は、ＰＤ－Ｌ１分子に対して約１×１０^－８～１×１０^－１０Ｍ、好ましくは約１×１０^－９～１×１０^－１０Ｍの結合親和性（Ｋ_Ｄ）を有する。いくつかの実施形態では、ＰＤ－１Ｆｃ融合タンパク質は、ＰＤ－Ｌ１分子に対して約１．１０×１０^－９Ｍ、約１．０３７×１０^－９Ｍ、または約７．１４×１０^－１０Ｍの結合親和性（Ｋ_Ｄ）を有する。

本明細書で使用される「核酸」は、ポリヌクレオチドを含む任意の化合物および／または物質を含むために使用される。例示的な核酸またはポリヌクレオチドは、リボ核酸（ＲＮＡ）および／またはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）が含まれるが、これらに限定されない。

いくつかの実施形態では、核酸構築物は、免疫グロブリンＦｃ領域およびＰＤ－１ポリペプチド変異体をコードする領域を含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインをコードする配列は、配列番号９に対して９５％以上（例えば、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、または９９％以上）の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。

前で説明したように、本明細書に記載のすべての実施形態において、ＰＤ－１変異体は、クローニングに使用される制限エンドヌクレアーゼの選択から発生するＣ－末端にさらなる残基を含んでもよい。クローニング選択から発生するさらなる残基は、ジペプチド添加、好ましくはアラニン－セリンジペプチドと共に１個、２個、３個、または４個の残基に限定されることが好ましい。例えば、ＰＤ－１ポリペプチド変異体それ自体または融合構築物の一部として使用される時、ｅｕＰＤ－１の場合、配列番号８の配列とＣ－末端ＡＳジペプチドが本発明に含まれる。このような配列は、本発明のＰＤ－１ポリペプチド変異体について定義されたレベルのアミノ酸配列同一性によって想定され、含まれる。したがって、この実施形態の融合構築物において、クローニングから発生する残基は、リンカーの前に位置し得る。

また、ＰＤ－１Ｆｃ融合タンパク質が本発明により含まれ、ここでＰＤ－１ポリペプチド変異体の多重コピーがそれぞれがリンカーによって分離され、存在する。用語「ＰＤ－１ポリペプチド変異体の多重コピー」は、２個、３個、または４個のＰＤ－１ポリペプチド変異体が存在し得ることを意味し、ここで存在する変異体は同じであっても異なっていてもよい。また、それぞれのＰＤ－１ポリペプチド変異体を分離するリンカーは、同じであっても異なっていてもよい。また、ＰＤ－１ポリペプチド変異体間のリンカーは、ＰＤ－１ポリペプチド変異体と関心ポリペプチドまたはタンパク質との間のリンカーとは異なり得る。

いくつかの実施形態では、ＰＤ－１Ｆｃ融合タンパク質のＰＤ－１ポリペプチド変異体は、配列番号１１の残基２４～１７２に対して９５％以上（例えば、９６％以上、９７％以上、９８％以上、または９９％以上）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで前記変異体は、Ｄ２６、Ｐ３４、Ｖ４３、Ｔ４５、Ｔ５９、Ｖ６４、Ｌ６５、Ｎ６６、Ｙ６８、Ｍ７０、Ｎ７４、Ｋ７８、Ｃ９３、Ｑ９９、Ｒ１１４、Ｌ１２２、Ａ１２５、Ａ１３２、およびＲ１３９からなる群から選択される少なくとも１つの残基に突然変異を有する。本発明には、この実施形態のＰＤ－１ポリペプチド変異体をコードする核酸、核酸を含むベクター、この実施形態のＰＤ－１ポリペプチド変異体を含む医薬組成物、および医薬組成物を投与することによって治療を必要とする被検体の疾患または病態（例えば、癌）を治療する方法が含まれる。

この実施形態の変異体において、ＰＤ－１Ｆｃ融合タンパク質のＰＤ－１ポリペプチド変異体は、配列番号１１の残基２４～１７２に対して９５％以上（例えば、９６％以上、９７％以上、９８％以上、または９９％以上）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで前記変異体は、Ｄ２６、Ｐ３４、Ｖ４３、Ｔ４５、Ｔ５９、Ｖ６４、Ｌ６５、Ｎ６６、Ｙ６８、Ｍ７０、Ｎ７４、Ｋ７８、Ｑ９９、Ｌ１２２、Ａ１２５、Ａ１３２、およびＲ１３９に突然変異を有する。本発明には、この実施形態のＰＤ－１ポリペプチド変異体をコードする核酸、核酸を含むベクター、この実施形態のＰＤ－１ポリペプチド変異体を含む医薬組成物、および医薬組成物を投与することによって治療を必要とする被検体の疾患または病態(例えば、癌)を治療する方法が含まれる。

いくつかの実施形態では、ＰＤ－１Ｆｃ融合タンパク質のＰＤ－１ポリペプチド変異体は、配列番号１１の残基２４～１７２に対して９５％以上（例えば、９６％以上、９７％以上、９８％以上、または９９％以上）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで前記変異体は、Ｄ２６、Ｐ３４、Ｖ４３、Ｔ４５、Ｔ５９、Ｖ６４、Ｌ６５、Ｎ６６、Ｙ６８、Ｍ７０、Ｎ７４、Ｋ７８、Ｃ９３、Ｑ９９、Ｒ１１４、Ｌ１２２、Ａ１２５、Ａ１３２、およびＲ１３９に突然変異を有する。本発明には、この実施形態のＰＤ－１ポリペプチド変異体をコードする核酸、核酸を含むベクター、この実施形態のＰＤ－１ポリペプチド変異体を含む医薬組成物、および医薬組成物を投与することによって治療を必要とする被検体の疾患または病態（例えば、癌）を治療とする方法が含まれる。

好ましい突然変異は、Ｄ２６Ｅ、Ｐ３４Ａ、Ｖ４３Ｌ、Ｔ４５Ａ、Ｔ５９Ａ、Ｖ６４Ｈ、Ｌ６５Ｖ、Ｎ６６Ｖ、Ｙ６８Ｈ、Ｍ７０Ｅ、Ｎ７４Ｇ、Ｋ７８Ｔ、Ｃ９３Ｈ、Ｑ９９Ｒ、Ｒ１１４Ｑ、Ｌ１２２Ｙ、Ａ１２５Ｖ、Ａ１３２Ｉ、Ｒ１３９Ｇが含まれる。

上述の通り、いくつかの実施形態では、免疫グロブリンＦｃ領域は、配列番号１０または配列番号１６に対して９５％以上（例えば、９６％以上、９７％以上、９８％以上、または９９％以上）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

４－１ＢＢ
４－１ＢＢ（ＣＤ１３７、ＴＮＦＲＳＦ９と称する場合がある ）は、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーに属する受容体である。４－ＩＢＢは、活性化Ｔリンパ球で一般的に発現し、免疫および自己免疫疾患に関与する共刺激分子である（文献[Ｋｗｏｎ ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ ８４：２８９６，１９８７；Ｋｗｏｎ ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ ８６：１９６３，１９８９；Ｓｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２８６（１－２）：１８７－２０１，２００４]、これら各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。ヒト４－１ＢＢは、２５５個のアミノ酸のタンパク質であり、細胞表面に単量体（３０ｋＤａ）および二量体（５５ｋＤａ）の形で発現し、４－１ＢＢリガンドと三量体化してシグナルを伝達する。

さらに、４－１ＢＢは、低レベルではあるが、Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇおよび樹状細胞（ＤＣ）を含む多くの細胞で構成的に発現される。サイトカイン（例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－４）、ポリクローナル活性化因子（例えば、Ｃｏｎ ＡおよびＰＨＡ）、細胞表面分子（例えば、抗ＣＤ３、抗ＣＤ２８）およびＣａ２＋誘導およびＰＫＣ活性プロモーター（例えば、イオノマイシン、ホルボールミリステートアセテート）のような多数のアゴニストによる活性化は、４－１ＢＢの発現をさらに向上させる。

マウスおよびヒトＴ細胞についての数多くの研究は、４－１ＢＢが向上された細胞増殖、生存、およびサイトカイン産生を促進することを示す。研究によると、一部の４－ＩＢＢアゴニストモノクローナル抗体は、共刺激分子の発現を増加させ、細胞溶解性Ｔリンパ球応答を著しく向上させ、予防および治療環境で抗腫瘍効果をもたらす。また、４－１ＢＢ単独療法および併用療法の腫瘍モデルは、耐久性のある抗腫瘍保護Ｔ細胞の記憶応答を確立した。４－ＩＢＢアゴニストは、また当業界で認められた多様な自己免疫モデルにおいて自己免疫反応を阻害することも示された。４－１ＢＢのこのような二重の活動は、免疫療法のアプローチに関連する自己免疫の副作用を抑えながら、抗腫瘍活性を提供する可能性を呈する。

本願におけるいくつかの実施形態では、融合タンパク質は、免疫グロブリンＦｃ領域として抗－４－１ＢＢ抗体ドメインを含んでもよい。具体的には、抗－４－１ＢＢ抗体ドメインは、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として抗－４－１ＢＢ抗体ドメイン（９４ｋｖｔ）を保有する９４ｋｖｔクローン（国際公開ＷＯ２０１８－１２７７８７号、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる）を使用して産生され得る。抗－４－１ＢＢ抗体に適したｓｃＦｖの例としては、ＶＨ－２１８リンカー－ＶＬ（ＨＬＣ２１８）およびＶＬ－２１８リンカー－ＶＨ（ＬＨＣ２１８）がある。９４ｋｖｔ ＶＨ配列が、配列番号１７に示されているのに対し、９４ｋｖｔ ＶＬ配列は配列番号１８に示されており、２１８リンカーは配列番号２１に提示されている。また、ｓｃＦｖ変異体９４ｋｖｔ ＨＬＣ ２１８は、配列番号２２に提示されており、ｓｃＦｖ変異体９４ｋｖｔ ＬＨＣ ２１８は、配列番号２３に提示されている。

いくつかの実施形態では、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）としての抗－４－１ＢＢ抗体ドメイン（９４ｋｖｔ）は、配列番号２２または配列番号２３と少なくとも７０％同一（例えば、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、 少なくとも９６％同一、 少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、 少なくとも９９％同一、または１００％同一）配列を含む。

したがって、本発明の一実施形態は、免疫グロブリンＦｃ領域；およびペプチド結合またはペプチドリンカー配列によって免疫グロブリンＦｃ領域のＮ－末端に連結されたＰＤ－１ポリペプチド変異体を含むＦｃ融合ＢｓＡｂ（二重特異性抗体）であり、ここでＰＤ－１ポリペプチド変異体は、配列番号４、配列番号６、または配列番号８に対して９５％以上（例えば、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上）の配列同一性を有するアミノ酸配列；およびペプチド結合またはペプチドリンカー配列によって免疫グロブリンＦｃ領域のＣ－末端に連結された抗－４－１ＢＢ抗体に対するｓｃＦｖを含み、ここで抗－４－１ＢＢ抗体に対するｓｃＦｖは、ペプチド結合またはペプチドリンカー配列によって連結された配列番号１７および１８を含むアミノ酸配列に対して９５％以上（例えば、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

また、免疫グロブリンＦｃ領域；およびペプチド結合またはペプチドリンカー配列によって免疫グロブリンＦｃ領域のＮ－末端に連結されたＰＤ－１ポリペプチド変異体を含むＦｃ融合ＢｓＡｂ（二重特異性抗体）が提供され、ここでＰＤ－１ポリペプチド変異体は、配列番号１１の残基２４～１７２に対して９５％以上（例えば、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上）の配列同一性を有するアミノ酸配列；およびペプチド結合またはペプチドリンカー配列によって免疫グロブリンＦｃ領域のＣ－末端に連結された抗－４－１ＢＢ抗体に対するｓｃＦｖを含み、ここで前記変異体は、Ｄ２６、Ｐ３４、Ｖ４３、Ｔ４５、Ｔ５９、Ｖ６４、Ｌ６５、Ｎ６６、Ｙ６８、Ｍ７０、Ｎ７４、Ｋ７８、Ｃ９３、Ｑ９９、Ｒ１１４、Ｌ１２２、Ａ１２５、Ａ１３２、およびＲ１３９からなる群から選択される少なくとも１つの残基に突然変異を有し、ここで抗－４－１ＢＢ抗体に対するｓｃＦｖは、ペプチド結合またはペプチドリンカーによって連結された配列番号１７および１８を含むアミノ酸配列に対して９５％以上（例えば、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、免疫グロブリンＦｃ領域は、配列番号１０または配列番号１６に対して９５％以上（例えば、９６％以上、９７％以上、９８％以上、または９９％以上）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、抗－４－１ＢＢ抗体に対するｓｃＦｖは、配列番号２２または配列番号２３と少なくとも７０％同一（例えば、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、または１００％同一）のアミノ酸配列である。

リンカー配列の例には、（Ｇ_４Ｓ）_２（配列番号１９）、（Ｇ_４Ｓ）_３リンカー（配列番号２０）、または２１８リンカー（配列番号２１）が含まれる。

本明細書に記載の二重特異性抗体は、野生型ＰＤ－１ポリペプチドと比較してＰＤ－Ｌ１分子に対する増強された結合親和性および４－１ＢＢに対する特異的結合親和性を有する。

本発明のＢｓＡｂ抗体は、減少した抗体－依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）および／または補体－依存性細胞傷害（ＣＤＣ）効果を有するまたは全く有さない。

本発明のＢｓＡｂ抗体は、肝毒性が減少しているまたは全く毒性がないことを示す。

ベクター
いくつかの実施形態では、前記に記載の核酸構築物は、当業界に公知の方法によって発現ベクターまたはウイルスベクターに挿入され得、核酸分子は発現制御配列に作動可能に連結され得る。発現ベクターの非限定的な例としては、プラスミドベクター、トランスポゾンベクター、コスミドベクター、およびウイルス由来ベクター（例えば、任意のアデノウイルス由来ベクター（ＡＶ）、サイトメガロウイルス由来（ＣＭＶ）ベクター、サル由来ウイルス（ＳＶ４０）ベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、レンチウイルスベクター、およびレトロウイルスベクター）を含む。いくつかの実施形態では、発現ベクターはウイルスベクターである。

クローニングおよび／または発現におけるそれらの機能を最適化する、ポリヌクレオチドの単離を助ける、またはポリヌクレオチドの細胞への導入を改善するために、さらなる配列がこのようなクローニングおよび／または発現配列に付加することができる。クローニングベクター、発現ベクター、アダプター、およびリンカーの使用は、当業界で広く知られている。

いくつかの実施形態では、核酸分子は、適切な細胞に導入されるとき、本開示内容のＰＤ－１ポリペプチド変異体またはＰＤ－１Ｆｃ融合タンパク質を発現できるベクターに挿入される。

治療への使用
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＰＤ－１ポリペプチド変異体、ＰＤ－１Ｆｃ融合タンパク質、または核酸構築物は、それを必要とする被検体を治療するために使用され得る。いくつかの実施形態では、被検体は、ＰＤ－Ｌ１関連疾患と診断される。いくつかの実施形態では、被検体は、ＰＤ－Ｌ１関連癌と診断される。いくつかの実施形態では、ＰＤ－１ポリペプチド変異体またはＰＤ－１Ｆｃ融合タンパク質、および薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物は、ＰＤ－Ｌ１関連疾患と診断された被検体に投与することができる。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、電離放射線、化学療法薬、治療用抗体、およびチェックポイント阻害剤を含むが、これらに限定されない１つ以上の追加の抗癌療法とともに投与することができる。

ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１経路は、内因性免疫抗腫瘍活性に応答し、腫瘍細胞によって使用される適応免疫抵抗メカニズムを示す。腫瘍細胞に発現するＰＤ－Ｌ１は、活性化Ｔ細胞のＰＤ－１受容体に結合し、細胞傷害性Ｔ細胞を阻害する。いくつかの実施形態では、ＰＤ－１ポリペプチド変異体は、非小細胞肺癌、肺腺癌、胃癌、および乳癌を含むことができるが、これらに限定されない癌を治療するためのＰＤ－Ｌ１阻害剤として使用される。
癌は、身体の異常な細胞の制御されない増殖を特徴とする幅広い疾患群を指す場合がある。調節されない細胞***および増殖は、隣接する組織を侵入する悪性腫瘍を形成し、リンパ系や血流を介して身体の離れた部分に転移することもある。癌または癌組織は、腫瘍が含まれることがある。

本開示の方法による治療に適した癌は、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、結腸癌、子宮内膜癌、食道癌、卵管癌、胆嚢癌、胃腸癌、頭頸部癌、血液癌、喉頭癌、肝臓癌、肺癌、リンパ腫、黒色腫、中皮腫、卵巣癌、原発性腹膜癌、唾液腺癌、肉腫、胃癌、甲状腺癌、膵臓癌、および前立腺癌を含むことができるが、これに制限されない。いくつかの実施形態では、本開示の方法による治療のための癌には、癌腫、リンパ腫（例えば、ホジキンおよび非ホジキンリンパ腫）、芽細胞腫、肉腫、および白血病を含むことができるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、癌には、扁平上皮癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌、肺の扁平上皮癌、腹膜癌、肝細胞癌、胃癌、膵臓癌、神経膠腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝細胞癌、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌または子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、肝臓癌、白血病およびその他のリンパ増殖性疾患、並びにさまざまな種類の頭頸部癌を含むことができる。

いくつかの実施形態では、癌は、胎児性腫瘍（ウィルムス腫瘍、肝芽腫、ラブドイド、神経芽腫）、胚細胞性腫瘍（卵黄嚢腫瘍、未熟奇形腫、および胎児性癌）、癌腫（肝細胞癌および肺扁平上皮癌）、肉腫（悪性ラブドイド腫瘍およびＲＭＳ）、または悪性黒色腫であってもよい。

本発明の融合タンパク質および二重特異性抗体は、減少した抗体－依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）および／または補体－依存性細胞傷害（ＣＤＣ）効果を有するまたは全く有さないというさらなる利点を有する。さらに、本発明の融合タンパク質および二重特異性抗体は、肝毒性が減少するまたは肝毒性がない。

本明細書の文脈において、本明細書で言及されるすべての刊行物、特許出願、特許、およびその他の参考文献は、別段の断りがない限り、あたかも完全に記述されているかのようにすべての目的のためにその内容全体が参照により本明細書に明瞭に組み込まれ、その全体内容が本開示内容の一部としてみなされるべきである。

特に断りがない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本開示が属する技術分野における当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。矛盾があり場合、定義を含めて本明細書が優先される。

本発明の前記の説明は、当業者が同じものを製造し、使用できるように、それを製造し使用する方法およびプロセスを提供し、このような可能性は、特に原明細書の一部を構成する添付の特許請求の主題について提供される。

本明細書で使用される場合、語句「からなる群から選択される」、「から選択される」などの文句は、特定物質の混合物を含む。

本明細書に数値限界または範囲が明示されている場合、エンドポイントが含まれる。また、数値の制限または範囲内のすべての値と下位範囲は、明示的に書き出されたかのように明確に含まれる。

前記の説明は、当業者が本発明を製造し使用できるようにするために提示されており、特定の使用およびその要求事項に関連して提供される。好ましい実施形態に対する様々な修正は、当業者には明らかであり、本明細書で定義される一般的な原理は、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、他の実施形態および使用に適用され得る。したがって、本発明は、提示される実施形態に限定されることを意図するものではなく、本明細書に開示される原理および特徴と一致する最も広い範囲が与えられるべきである。

以下の特定の実施形態に拘束されることなく、本発明は以下によって例示される：
（１） 配列番号４、配列番号６、または配列番号８に対して９５％以上（例えば、９６％以上、９７％以上、９８％以上、または９９％以上）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むプログラム細胞死１（ＰＤ－１）ポリペプチド変異体であって、
前記ＰＤ－１ポリペプチド変異体は：
プログラム細胞死１リガンド（ＰＤ－Ｌ１）に特異的に結合する細胞外ドメイン；および
膜貫通型ドメインまたはそのフラグメント
を含む、プログラム細胞死１リガンド（ＰＤ－Ｌ１）ポリペプチド変異体。

（２）（１）に記載の、ここでＰＤ－１ポリペプチド変異体は、配列番号４、配列番号６、または配列番号８に対して９７％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、ＰＤ－１ポリペプチド変異体。

（３）（１）または（２）において、ここでＰＤ－１ポリペプチド変異体は、配列番号４、配列番号６、または配列番号８に対して９８％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、ＰＤ－１ポリペプチド変異体。

（４）（１）～（３）のいずれかに記載の、ここでＰＤ－１ポリペプチド変異体は、配列番号４、配列番号６、または配列番号８のアミノ酸配列を含む、ＰＤ－１ポリペプチド変異体。

（５）（１）に記載の、ここでＰＤ－１ポリペプチド変異体は、配列番号４を含む、ＰＤ－１ポリペプチド変異体。

（６）（１）に記載の、ここでＰＤ－１ポリペプチド変異体は、配列番号６を含む、ＰＤ－１ポリペプチド変異体。

（７）（１）に記載の、ここでＰＤ－１ポリペプチド変異体は、配列番号８を含む、ＰＤ－１ポリペプチド変異体。

（８）（１）～（７）のいずれかに記載の、ここで膜貫通型ドメインは少なくとも２個のアミノ酸残基を含む、ＰＤ－１ポリペプチド変異体。

（９）（１）～（８）のいずれかに記載の、ここで膜貫通型ドメインは少なくとも５個のアミノ酸残基を含む、ＰＤ－１ポリペプチド変異体。

（１０）（１）～（９）のいずれかに記載の、ここで膜貫通型ドメインは少なくとも１０個のアミノ酸残基を含む、ＰＤ－１ポリペプチド変異体。

（１１）（１）～（１０）のいずれかに記載の、ここでポリペプチド変異体は、野生型ＰＤ－１ポリペプチドと比較してＰＤ－Ｌ１分子に対する増強した結合親和性を有する、ＰＤ－１ポリペプチド変異体。

（１２）（１）～（１１）のいずれかに記載の、ここでポリペプチド変異体は、ＰＤ－Ｌ１分子に対して約１×１０^－８～１×１０^－１０Ｍの結合親和性（Ｋ_Ｄ）を有する、ＰＤ－１ポリペプチド変異体。

（１３）（１）～（１２）のいずれかに記載の、ここでポリペプチド変異体は、ＰＤ－Ｌ１分子に対して約１．１０×１０^－９Ｍ、約１．０３７×１０^－９Ｍ、または約７．１４×１０^－１０Ｍの結合親和性（Ｋ_Ｄ）を有する、ＰＤ－１ポリペプチド変異体。

（１４）免疫グロブリンＦｃ領域；および
ペプチド結合またはペプチドリンカー配列によって免疫グロブリンＦｃ領域のカルボキシ－末端に連結されたＰＤ－１ポリペプチド変異体を含むＰＤ－１ Ｆｃ融合タンパク質であって、ここでＰＤ－１ポリペプチド変異体は、配列番号４、配列番号６、または配列番号８に対して９５％以上（例えば、９６％以上、９７％以上、９８％以上、または９９％以上）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、ＰＤ－１Ｆｃ融合タンパク質。

（１５）（１４）に記載の、ここで免疫グロブリンＦｃ領域は、配列番号１０または配列番号１６に対して９５％以上（例えば、９６％以上、９７％以上、９８％以上、または９９％以上）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、ＰＤ－１Ｆｃ融合タンパク質。

（１６）（１４）～（１５）のいずれかに記載の、ここで融合タンパク質は野生型ＰＤ－１ポリペプチドと比較してＰＤ－Ｌ１分子に対する増強された結合親和性を有する、ＰＤ－１Ｆｃ融合タンパク質。

（１７）（１４）～（１６）のいずれかに記載の、ここで融合タンパク質は、 ＰＤ－Ｌ１分子に対して約１×１０^－８～１×１０^－１０Ｍの結合親和性（Ｋ_Ｄ）を有する、ＰＤ－１ Ｆｃ 融合タンパク質。

（１８）（１４）～（１７）のいずれかにおいて、ここで融合タンパク質は、 ＰＤ－Ｌ１分子に対して約１．１０×１０^－９Ｍ、約１．０３７×１０^－９Ｍ、または約７．１４×１０^－１０Ｍの結合親和性（Ｋ_Ｄ）を有する、ＰＤ－１Ｆｃ融合タンパク質。

（１９）（１４）～（１８）のいずれかに記載の、ここでＰＤ－１ポリペプチド変異体は、ペプチドリンカー配列によって免疫グロブリンＦｃ領域のカルボキシ－末端に連結される、ＰＤ－１Ｆｃ融合タンパク質。

（２０）（１４）～（１９）のいずれかに記載の、ここでペプチドリンカー配列は、配列番号１９、配列番号２０、および配列番号２１からなる群より選択される、ＰＤ－１Ｆｃ融合タンパク質。

（２１）（１４）～（２０）のいずれかに記載の、ここでＰＤ－１ポリペプチド変異体の１つ以上のコピーが存在し、ここで前記コピーは同じであってもよく異なってもよい、ペプチドリンカー配列によって連結されるＰＤ－１Ｆｃ融合タンパク質。

（２２）（２１）に記載の、ＰＤ－１ポリペプチド変異体の２つのコピーが存在する、ＰＤ－１Ｆｃ融合タンパク質。

（２３）（２１）または（２２）に記載の、ここでペプチドリンカー配列は、配列番号１９、配列番号２０、および配列番号２１からなる群から選択される、ＰＤ－１Ｆｃ融合タンパク質。

（２４）（１４）～（２３）のいずれかに記載の、ここでＰＤ－１Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５からなる群から選択される、ＰＤ－１Ｆｃ融合タンパク質。

（２５）ＰＤ－１ポリペプチド変異体をコードする配列を含む核酸であって、ここでポリペプチド変異体は、配列番号３、配列番号５、配列番号７に対して９５％以上（例えば、９６％以上、９７％以上、９８％以上、または９９％以上）の配列同一性を有する配列を含む、核酸。

（２６）（２５）に記載の、
免疫グロブリンＦｃ領域をコードする配列をさらに含み、ここで免疫グロブリンＦｃ領域をコードする配列は、配列番号９を含む核酸。

（２７）前記（２５）または（２６）のいずれかに記載の核酸を含む発現ベクター。

（２８）（２７）に記載の、ここでベクターはウイルスベクターである、ベクター。

（２９）（１）～（１３）のいずれかに記載のＰＤ－１ポリペプチド変異体または（１４）～（２４）のいずれかに記載のＰＤ－１融合タンパク質；および
薬学的に許容される担体。

（３０）治療を必要とする被検体における疾患または病態を治療する方法であって、
（２９）の医薬組成物を被検体に投与し、疾患または病態を治療する段階を含む、方法。

（３１）（３０）に記載の、ここで被検体は癌を有する、方法。

（３２）（３１）に記載の、ここで癌は、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、結腸癌、子宮内膜癌、食道癌、卵管癌、胆嚢癌、胃腸癌、頭頸部癌、血液癌、喉頭癌、肝臓癌、肺癌、リンパ腫、黒色腫、中皮腫、卵巣癌、原発性腹膜癌、唾液腺癌、肉腫、胃癌、甲状腺癌、膵臓癌、腎細胞癌、膠芽腫、および前立腺癌から選択される、方法。

（３３）（３０）～（３２）のいずれかに記載の、医薬組成物が（１４）～（２４）のいずれかに記載のＰＤ－１融合タンパク質を含む場合、減少した抗体－依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）および／または補体－依存性細胞傷害（ＣＤＣ）効果が観察されるまたは効果が観察されない、方法。

（３４）（３０）～（３３）のいずれかに記載の、医薬組成物が（１４）～（２４）のいずれかに記載のＰＤ－１融合タンパク質を含む場合、減少した肝毒性が観察されるまたは肝毒性が観察されない、方法。

（３５）配列番号１１の残基２４～１７２に対して９５％以上（例えば、９６％以上、９７％以上、９８％以上、または９９％以上）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むプログラム細胞死１（ＰＤ－１）ポリペプチド変異体であって、ここで前記変異体は、Ｄ２６、Ｐ３４、Ｖ４３、Ｔ４５、Ｔ５９、Ｖ６４、Ｌ６５、Ｎ６６、Ｙ６８、Ｍ７０、Ｎ７４、Ｋ７８、Ｃ９３、Ｑ９９、Ｒ１１４、Ｌ１２２、Ａ１２５、Ａ１３２、およびＲ１３９からなる群から選択される少なくとも１つの残基に変異を有する、プログラム細胞死１（ＰＤ－１）ポリペプチド変異体。

（３６）（３５）に記載の、ここで前記変異体は、Ｄ２６、Ｐ３４、Ｖ４３、Ｔ４５、Ｔ５９、Ｖ６４、Ｌ６５、Ｎ６６、Ｙ６８、Ｍ７０、Ｎ７４、Ｋ７８、Ｑ９９、Ｌ１２２、Ａ１２５、Ａ１３２、およびＲ１３９に突然変異を含む、ＰＤ－１ポリペプチド変異体。

（３７）（３５）に記載の、ここで前記変異体は、Ｄ２６、Ｐ３４、Ｖ４３、Ｔ４５、Ｔ５９、Ｖ６４、Ｌ６５、Ｎ６６、Ｙ６８、Ｍ７０、Ｎ７４、Ｋ７８、Ｃ９３、Ｑ９９、Ｒ１１４、Ｌ１２２、Ａ１２５、Ａ１３２、およびＲ１３９に変異を含む、ＰＤ－１ポリペプチド変異体。

（３８）（３５）～（３７）のいずれかに記載の、ここで前記突然変異は、Ｄ２６Ｅ、Ｐ３４Ａ、Ｖ４３Ｌ、Ｔ４５Ａ、Ｔ５９Ａ、Ｖ６４Ｈ、Ｌ６５Ｖ、Ｎ６６Ｖ、Ｙ６８Ｈ、Ｍ７０Ｅ、Ｎ７４Ｇ、Ｋ７８Ｔ、Ｃ９３Ｈ、Ｑ９９Ｒ、Ｒ１１４Ｑ、Ｌ１２２Ｙ、Ａ１２５Ｖ、Ａ１３２Ｉ、またはＲ１３９Ｇである、ＰＤ－１ポリペプチド変異体。

（３９）（３５）～（３８）のいずれかに記載の、ここでＰＤ－１ポリペプチド変異体は、配列番号１１の残基２４～１７２と同一性に対して９７％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで前記変異体は、Ｄ２６、Ｐ３４、Ｖ４３、Ｔ４５、Ｔ５９、Ｖ６４、Ｌ６５、Ｎ６６、Ｙ６８、Ｍ７０、Ｎ７４、Ｋ７８、Ｃ９３、Ｑ９９、Ｒ１１４、Ｌ１２２、Ａ１２５、Ａ１３２、およびＲ１３９からなる群から選択される少なくとも１つの残基に突然変異を有する、ＰＤ－１ポリペプチド変異体。

（４０）（３５）～（３９）のいずれかに記載の、ここでＰＤ－１ポリペプチド変異体は、配列番号１１の残基２４～１７２と同一性に対して９８％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで前記変異体は、Ｄ２６、Ｐ３４、Ｖ４３、Ｔ４５、Ｔ５９、Ｖ６４、Ｌ６５、Ｎ６６、Ｙ６８、Ｍ７０、Ｎ７４、Ｋ７８、Ｃ９３、Ｑ９９、Ｒ１１４、Ｌ１２２、Ａ１２５、Ａ１３２、およびＲ１３９からなる群から選択される少なくとも１つの残基に変異を有する、ＰＤ－１ポリペプチド変異体。

（４１）（３５）～（４０）のいずれかに記載の、ここでポリペプチド変異体は、野生型ＰＤ－１ポリペプチドと比較して、ＰＤ－Ｌ１分子に対して増強した結合親和性を有する、ＰＤ－１ポリペプチド変異体。

（４２）（３５）～（４１）のいずれかに記載の、ここでポリペプチド変異体は、ＰＤ－Ｌ１分子に対して約１×１０^－８～１×１０^－１０の結合親和性（Ｋ_Ｄ）を有する、ＰＤ－１ポリペプチド変異体。

（４３）免疫グロブリンＦｃ領域；および
ペプチド結合またはペプチドリンカー配列によって免疫グロブリンＦｃ領域のカルボキシ－末端に連結された（３５）～（４２）のいずれかに記載のＰＤ－１ポリペプチド変異体を含むＰＤ－１Ｆｃ融合タンパク質。

（４４）（４３）に記載の、ここで免疫グロブリンＦｃ領域は、配列番号１０または配列番号１６に対して９５％以上（例えば、９６％以上、９７％以上、９８％以上、または９９％以上）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、ＰＤ－１Ｆｃ融合タンパク質。

（４５）（４３）または（４４）に記載の、ここで融合タンパク質は、野生型ＰＤ－１ポリペプチドと比較して、ＰＤ－Ｌ１分子に対して増強した結合親和性を有する、ＰＤ－１Ｆｃ融合タンパク質。

（４６）（４３）～（４５）のいずれかに記載の、前記融合タンパク質は、ＰＤ－Ｌ１分子に対して約１×１０^－８～１×１０^－１0Ｍの結合親和性（Ｋ_Ｄ）を有する、ＰＤ－１Ｆｃ融合タンパク質。

（４７）（４３）～（４６）のいずれかに記載の、ここでＰＤ－１ポリペプチド変異体は、ペプチドリンカー配列によって免疫グロブリンＦｃ領域のカルボキシ－末端に連結される、ＰＤ－１Ｆｃ融合タンパク質。

（４８）（４３）～（４７）のいずれかに記載の、ここでペプチドリンカー配列は、配列番号１９、配列番号２０、および配列番号２１からなる群から選択される、ＰＤ－１Ｆｃ融合タンパク質。

（４９）（４３）～（４８）のいずれかに記載の、ここでＰＤ－１ポリペプチド変異体の複数のコピーが存在し、ここで前記コピーは同一であってもよく異なっていてもよく、ペプチドリンカー配列によって連結される、ＰＤ－１Ｆｃ融合タンパク質。

（５０）（４９）に記載の、ＰＤ－１ポリペプチド変異体の２つのコピーが存在する、ＰＤ－１Ｆｃ融合タンパク質。

（５１）（４９）または（５０）に記載の、ここでペプチドリンカー配列は、配列番号１９、配列番号２０、および配列番号２１からなる群から選択される、ＰＤ－１Ｆｃ融合タンパク質。

（５２）（３５）～（５１）のいずれかに記載のＰＤ－１ポリペプチド変異体をコードする配列を含む、核酸。

（５３）（５２）に記載の、
免疫グロブリンＦｃ領域をコードする配列をさらに含む、核酸。

（５４）（５２）または（５３）に記載の核酸を含む発現ベクター。

（５５）（５４）に記載の、ここでベクターはウイルスベクターである、ベクター。

（５６）（３５）～（４２）のいずれかに記載のＰＤ－１ポリペプチド変異体または（４３）～（５１）のいずれかに記載のＰＤ－１融合タンパク質；および
薬学的に許容される担体
を含む医薬組成物。

（５７）治療を必要とする被検体における疾患または病態を治療する方法であって、
（５６）の医薬組成物を被検体に投与し、疾患または病態を治療する段階を含む、方法。

（５８）（５７）に記載の、ここで被検体は癌を有する、方法。

（５９）（５８）に記載の、ここで癌は、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、結腸癌、子宮内膜癌、食道癌、卵管癌、胆嚢癌、胃腸癌、頭頸部癌、血液癌、喉頭癌、肝臓癌、肺癌、リンパ腫、黒色腫、中皮腫、卵巣癌、原発性腹膜癌、唾液腺癌、肉腫、胃癌、甲状腺癌、膵臓癌、腎細胞癌、膠芽腫、および前立腺癌から選択される、方法。

（６０）（５７）～（５９）のいずれかに記載の、医薬組成物が（４３）～（５１）のいずれに記載のＰＤ－１融合タンパク質を含む場合、減少した抗体－依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）および／または補体－依存性細胞傷害（ＣＤＣ）の効果が観察されるまたは観察されない、方法。

（６１）（５７）～（６０）のいずれかに記載の、医薬組成物が（４３）～（５１）のいずれかに記載のＰＤ－１融合タンパク質を含む場合、肝毒性の減少が観察されるまたは肝毒性が観察されない、方法。

（６２）免疫グロブリンＦｃ領域；
ペプチド結合またはペプチドリンカー配列によって免疫グロブリンＦｃ領域のＮ－末端に連結されるＰＤ－１ポリペプチド変異体であって、ここでＰＤ－１ポリペプチド変異体は、配列番号４、配列番号６、または配列番号８に対して９５％以上（例えば、９６％以上、９７％以上、９８％以上、または９９％以上）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、ＰＤ－１ポリペプチド変異体；および
ペプチド結合またはペプチドリンカー配列によって免疫グロブリンＦｃ領域のＣ－末端に連結される抗－４－１ＢＢ抗体に対するｓｃＦｖであって、ここで抗－４－１ＢＢ抗体に対するｓｃＦｖは、ペプチド結合またはペプチドリンカー配列によって連結される配列番号１７および１８を含むアミノ酸配列に対して９５％以上(例えば、９６％以上、９７％以上、９８％以上、または９９％以上）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、抗－４－１ＢＢ抗体に対するｓｃＦｖ
を含む二重特異性抗体。

（６３）（６２）に記載の、ここで免疫グロブリンＦｃ領域は、配列番号１０または配列番号１６に対して９５％以上（例えば、９６％以上、９７％以上、９８％以上、または９９％以上）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、二重特異性抗体。

（６４）（６２）または（６３）に記載の、ここでＰＤ－１ポリペプチド変異体は、ペプチドリンカー配列によって免疫グロブリンＦｃ領域のＮ－末端に連結される、二重特異性抗体。

（６５）（６２）～（６４）のいずれかに記載の、ここで抗－４－１ＢＢ抗体に対するｓｃＦｖは、ペプチドリンカー配列によって免疫グロブリンＦｃ領域のＣ－末端に連結される、二重特異性抗体。

（６６）（６２）～（６５）のいずれかに記載の、ここでペプチドリンカー配列は、配列番号１９、配列番号２０、および配列番号２１からなる群から選択される、二重特異性抗体。

（６７）（６２）～（６６）のいずれかに記載の、ここで抗－４－１ＢＢ抗体に対するｓｃＦｖは、配列番号２２もしくは配列番号２３、または配列番号２２もしくは配列番号２３と少なくとも７０％同一（例えば、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、または１００％同一）の配列番号を含む、二十特異的抗体。

（６８）（６２）～（６７）のいずれかに記載の、ここで二重特異的抗体は、野生型ＰＤ－１ポリペプチドと比較してＰＤ－Ｌ１分子に対して増強した結合親和性を有し、４－１ＢＢへの特異的結合親和性を有する、二重特異性抗体。

（６９）（６２）～（６８）のいずれかに記載の二重特異性抗体；および
薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。

（７０）治療を必要とする被検体における疾患または病態を治療する方法であって、
（６９）の医薬組成物を被検体に投与し、疾患または病態を治療する段階を含む、方法。

（７１）（７０）に記載の、ここで被検体が癌を有する、方法。

（７２）（７１）に記載の、ここで癌は、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、結腸癌、子宮内膜癌、食道癌、卵管癌、胆嚢癌、胃腸癌、頭頸部癌、血液癌、喉頭癌、肝臓癌、肺癌、リンパ腫、黒色腫、中皮腫、卵巣癌、原発性腹膜癌、唾液腺癌、肉腫、胃癌、甲状腺癌、膵臓癌、腎細胞癌、膠芽腫、および前立腺癌から選択される、方法。

（７３）（７０）～（７２）のいずれかに記載の、減少した抗体－依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）および／または補体－依存性細胞傷害（ＣＤＣ）の効果が観察されるまたは効果が観察されない、方法。

（７４）（７０）～（７３）のいずれかに記載の、減少した肝毒性が観察されるまたは肝毒性が観察されない、方法。

（７５）免疫グロブリンＦｃ領域；
ペプチド結合またはペプチドリンカー配列によって免疫グロブリンＦｃ領域のＮ－末端に連結されたＰＤ－１ポリペプチド変異体であって、ここでＰＤ－１ポリペプチド変異体は、配列番号１１の残基２４～１７２に対して９５％以上（例えば、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで前記変異体は、Ｄ２６、Ｐ３４、Ｖ４３、Ｔ４５、Ｔ５９、Ｖ６４、Ｌ６５、Ｎ６６、Ｙ６８、Ｍ７０、Ｎ７４、Ｋ７８、Ｃ９３、Ｑ９９、Ｒ１１４、Ｌ１２２、Ａ１２５、Ａ１３２、およびＲ１３９からなる群から選択される少なくとも１つの残基に突然変異を有する、 ＰＤ－１ポリペプチド変異体；および
ペプチド結合またはペプチドリンカー配列によって免疫グロブリンＦｃ領域のＮ－末端に連結された抗－４－１ＢＢ抗体に対するｓｃＦｖであって、ここで抗－４－１ＢＢ抗体に対するｓｃＦｖは、ペプチド結合またはペプチドリンカー配列によって連結された配列番号１７および１８を含むアミノ酸配列に対して９５％以上（例えば、９６％以上、９７％以上、９８％以上、または９９％以上）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、抗－４－１ＢＢ抗体に対するｓｃＦｖ
を含む二重特異的抗体。

（７６）（７５）に記載の、ここで免疫グロブリンＦｃ領域は、配列番号１０または配列番号１６に対して９５％以上（例えば、９６％以上、９７％以上、９８％以上、または９９％以上）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、二重特異性抗体。

（７７）（７５）または（７６）に記載の、ここでＰＤ－１ポリペプチド変異体は、ペプチドリンカー配列によって免疫グロブリンＦｃ領域のＮ－末端に連結される、二重特異性抗体。

（７８）（７５）～（７７）のいずれかに記載の、ここで抗－４－１ＢＢ抗体に対するｓｃＦｖは、ペプチドリンカー配列によって免疫グロブリンＦｃ領域のＣ－末端に連結される、二重特異性抗体。

（７９）（７５）～（７８）のいずれかに記載の、ここでペプチドリンカー配列は、配列番号１９、配列番号２０、および配列番号２１からなる群から選択される、二重特異性抗体。

（８０）（７５）～（７９）のいずれかに記載の、ここで抗－４－１ＢＢ抗体に対するｓｃＦｖは、配列番号２２もしくは配列番号２３、または配列番号２２もしくは配列番号２３と少なくとも７０％同一（例えば、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、または１００％同一）の配列を含む、二重特異的抗体。

（８１）（７５）～（８０）のいずれかに記載の、ここで二重特異性抗体は、野生型ＰＤ－１ポリペプチドと比較してＰＤ－Ｌ１分子に対して増強した結合親和性を有し、４－１ＢＢへの特異的結合親和性を有する、二重特異性抗体。

（８２）（７５）～（８１）のいずれかに記載の二重特異性抗体；および
薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。

（８３）治療を必要とする被検体における疾患または病態を治療する方法であって、
（８２）の医薬組成物を被検体に投与し、疾患または病態を治療する段階を含む、方法。

（８４）（８３）に記載の、ここで被検体は癌を有する、方法。

（８５）（８４）に記載の、ここで癌は、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、結腸癌、子宮内膜癌、食道癌、卵管癌、胆嚢癌、胃腸癌、頭頸部癌、血液癌、喉頭癌、肝臓癌、肺癌、リンパ腫、黒色腫、中皮腫、卵巣癌、原発性腹膜癌、唾液腺癌、肉腫、胃癌、甲状腺癌、膵臓癌、腎細胞癌、膠芽腫、および前立腺癌から選択される、方法。

（８６）（８３）～（８５）のいずれかに記載の、減少した抗体－依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）および／または補体－依存性細胞傷害（ＣＤＣ）の効果が観察されるまたは効果が観察されない、方法。

（８７）（８３）～（８６）のいずれかに記載の、減少した肝毒性が観察されるまたは肝毒性が観察されない、方法。

本開示は、以下の実施例においてさらに説明するが、これらは特許請求の範囲に記載された開示の範囲を限定しない。

実施例１．ＰＤ－１の変異体
ＰＤ－１ポリペプチド変異体を含むＰＤ－１Ｆｃ融合タンパク質は、ＰＤ１－Ｇ４Ｓリンカー－Ｆｃ＿ｐｃＤＮＡ３．３プラスミドを使用して生成された。ヒトＰＤ－１タンパク質のトポロジーを表１に示す。ヒトＰＤ－１およびＰＤ－１ポリペプチド変異体の配列を図１および図２に示す。また、各ＰＤ－１ポリペプチド変異体に対する突然変異を表２に列挙し、ここでアミノ酸残基番号は、図１に示す完全長ヒトＰＤ－１野生型配列（配列番号１１）に関連する。ＰＤ－１ポリペプチド変異体は、図１に示す完全長ヒトＰＤ－１野生型配列（配列番号１１）の細胞外ドメイン(２４～１７０)および膜貫通型ドメインの一部(１７１～１７２)を含むように設計された。具体的には、ＰＤ－１Ｆｃ融合タンパク質は、動物細胞発現ベクターｐｃＤＮＡ３．３を用いて生成され、ここで制限酵素ＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩが制限酵素部位に挿入された。ヒトＰＤ－１シグナルペプチド（配列：Ｑ１５１１６、１～２３）をシグナルペプチドに使用し、２０７ａａ～２３０ａａ ＩＭＧＴ対立遺伝子ＩＧＨＧ１＊０３、２３１ａａ～４５７ａａ ＩＭＧＴ対立遺伝子ＩＧＨＧ２＊０１をＦｃ領域に使用した。ＰＤ－１Ｆｃ融合タンパク質をコードするＤＮＡ構築物を図３に示す。

実施例２．ＰＤ－１ポリペプチド変異体の分析および特性評価
ＰＤ－１ポリペプチド変異体をプラスミドに挿入し、Ｅｘｐｉ２９３発現システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、ＰＤ－１Ｆｃ融合タンパク質を生成するのに用いた。次いで、ポリペプチド変異体を、ＡｋｔａＰｕｒｅ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）およびＦｉｂｒｏＰｒｉｓｍＡカラム（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号１７－０６１８－０１）を使用して精製した。精製されたポリペプチド変異体を脱塩カラム（ＧＥヘルスケア、カタログ番号１７－１４０８－０１）に通過させ、Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ ＧＯ（Ｔｈｅｒｍｏ）を使用してタンパク質濃度を測定した。

結果を表３に示す。

実施例３．ＳＤＳ－ＰＡＧＥによるＰＤ－１ポリペプチド変異体の分析
ＰＤ－１ポリペプチド変異体をＬＤＳサンプルバッファー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ｂ０００７）に添加し、ここでサンプル還元剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ｂ０００４）を還元条件群に添加し、７０℃で１０分間インキュベートした。ＳＤＳランニングバッファー（Ｂｉｏ－ｒａｄ、カタログ番号１６１０７３２）を調製したサンプルに添加し、Ｍｉｎｉ－タンパク質ＴＧＸＳｔａｉｎ－Ｆｒｅｅ Ｇｅｌ（Ｂｉｏ－ｒａｄ、カタログ番号４５６－８０９６）を使用してサンプルを３０分間ランニングした。結果は、Ｃｈｅｍｉｄｏｃ（Ｂｉｏ－ｒａｄ）を使用して分析した（図４）。

実施例４．ＰＤ－Ｌ１分子に対する親和性の分析
ＰＤ－Ｌ１分子に対するＰＤ－１ポリペプチド変異体の親和性は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を使用して分析した。ＰＤ－１ポリペプチド変異体を２ｕｇ／ｍＬの濃度に希釈した後、ＣＭ５チップ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号ＢＲ－１００５－３０）上に固定した。ＰＤ－Ｌ１分子（Ｓｉｎｏ、カタログ番号１００８４－Ｈ０８Ｈ）を１００、５０、２５、１２．５、６．２５、３．１２５ｎＭの濃度で、会合時間１５０秒、解離時間２４０秒で注入した。Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００（ＧＥヘルスケア）を使用して、各ＰＤ－１ポリペプチド変異体の親和性を測定および分析した。結果は、ＰＤ－１ポリペプチド変異体ｅｕＰＤ－１がＰＤ－Ｌ１に対して最も高い結合親和性を有することを示す（表４）。

実施例５．サイズ排除クロマトグラフィー
ＰＤ－１ポリペプチド変異体は、ＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、１２６０ ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＩＩ ＬＣシステム）およびサイズ排除カラム（Ｔｏｓｏｈ、ＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ ＳＷＸＬ、７．８×３００ｍｍ、部品番号０００８５４１、カラム番号００４Ｅ０４３２０Ｅ）を使用して分析した。ゲル濾過スタンダード（ＢＩＯ－ＲＡＤ、カタログ番号１５１－１９０１）を対照群として使用した（図５ａ～５ｅ）。

実施例６．ＰＤ－１融合タンパク質の細胞結合アッセイ
ＰＤ－Ｌ１高発現細胞株ＭＤＡ－ＭＢ－２３１（ヒト乳癌細胞）およびＰＤ－Ｌ１低発現細胞株ＭＣＦ－７（ヒト乳癌細胞）細胞を使用した。図６は、各細胞株におけるＰＤ－Ｌ１の発現レベルを示す。図６においてＰＤ－Ｌ１は、ＭＣＦ７ではないＭＤＡ－ＭＢ－２３１で高発現していることが確認された。

１．５×１０^５個の細胞を抗体処理しながら４℃で２０分間インキュベートした。ｅｕＰＤ－１Ｆｃ、ＰＤ－１Ｆｃ、およびテセントリク（Ｇｅｎｅｔｅｃｈ、アテゾリズマブ、抗－ＰＤ－Ｌ１抗体）の処理濃度を、８７７．１９ｎＭで合計１２ポイントまで２倍段階希釈した。ＦＡＣＳ洗浄バッファー（ＤＰＢＳ中０．５％ＦＢＳ＋０．１％ＮａＮ_３）で１回洗浄後、抗ｈＦＣ－ＡＦ４８８二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を１μｌ／ウェルで２０分間処理した。さらに２回洗浄した後、ＦＡＣＳ解析を行った。

ＦＡＣＳ解析の結果、二次抗体によるバックグラウンドシグナルはほとんどないことが確認された。図７ａに示すように、ＰＤ－１Ｆｃは、実験濃度範囲においてＰＤ－Ｌ１陽性細胞に接着しなかったのに対し、ｅｕＰＤ－１Ｆｃおよびテセントリクは、ＰＤ－Ｌ１陽性細胞に用量依存的に接着した。ＦＡＣＳ解析の結果、図７ｂに示すように、３つの抗体は全部ＰＤ－Ｌ１陰性細胞に接着しなかった。

実施例７．ＰＤ－１融合タンパク質抗原結合アッセイ
ｅｕＰＤ－１Ｆｃが抗原ＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－Ｌ２に結合するかどうかを確認するために、抗原結合アッセイを実施した。

アッセイ方法は、図８ａおよび８ｃに示すように実施した。簡略に、ＰＤ－Ｌ１抗原またはＰＤ－Ｌ２抗原を１μg／ｍＬの濃度で９６－ウェルイムノプレートに４℃で一晩コーティングした後、１５０μｌの１×アッセイバッファー（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を１時間処理し、非特異的結合を遮断した。ｅｕＰＤ－１Ｆｃ、ＰＤ－１Ｆｃ、およびテセントリクのそれぞれを１００ｕＬで処理し、２時間インキュベートした。抗原ＰＤ－Ｌ１コートプレートの処理濃度は、３０μg／ｍＬで３倍段階希釈し、合計１５ポイントとし、抗原ＰＤ－Ｌ２コートプレートでの処理濃度を１００μg／ｍＬで合計１２ポイントまで３倍段階希釈した。抗ｈＦｃ－ＨＲＰ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を０．４μg／ｍＬの濃度で１００μｌで処理した。１時間インキュベートした後、ＴＭＢで発色させ、３分後に硫酸で反応を止めた。ＴＭＢ処理後の工程以外を除くすべて工程において、洗浄バッファーを用いて３回洗浄をし、抗原コーティング工程を除くすべての工程は室温で行った。実験の結果、図８ｂに示すように、抗原ＰＤ－Ｌ１に対するｅｕＰＤ－１Ｆｃおよびテセントリクの結合は、用量依存的な方法で確認された。そして、図８ｄにおいて、ＰＤ－１Ｆｃのみが用量依存的に抗原ＰＤ－Ｌ２に結合し、ｅｕＰＤ－１Ｆｃおよびテセントリクは結合しなかった。

実施例８．ＰＤ－１融合タンパク質遮断バイオアッセイ
ＰＤ－１およびＰＤ－Ｌ１（Ｂｉｃｙｔｏｇｅｎ）の結合阻害効果を確認するために、遮断バイオアッセイを実施した。

使用したバイオアッセイ製品（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｊ１２５０）は、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１の結合が阻害される条件でルシフェラーゼを発現する。バイオアッセイおよびルシフェラーゼアッセイは、プロメガのプロトコルに従った。標的細胞を９６ウェル白色プレートに４×１０^４個細胞／１００μＬ／ウェルで 播種した。３７℃のＣＯ_２インキュベーターで一晩インキュベートした後、抗体およびエフェクター細胞を処理した。抗体としては、ｅｕＰＤ－１Ｆｃ、ＰＤ－１Ｆｃ、テセントリク、Ｋｅｙｔｒｕｄａ（Ｍｅｒｃｋ、ペムブロリズマブ、抗ＰＤ－１抗体）を使用した。処理濃度を２１７．３９ｎＭで２．５倍段階希釈し、合計１０ポイントとした。３７℃のＣＯ_２インキュベーターで６時間インキュベーターした後、ルシフェリンを処理し、ルシフェラーゼアッセイを行った。ルシフェラーゼアッセイの結果、図９ａに示すように、ｅｕＰＤ－１Ｆｃ、テセントリク、およびＫｅｙｔｒｕｄａは、用量依存的に阻害効果を示し、図９ｂに示すように、ｅｕＰＤ－１Ｆｃは、ＰＤ－１Ｆｃよりも２．４～４．９倍以上の阻害効果を示した。

実施例９．ＰＤ－１融合タンパク質のｉｎ ｖｉｖｏ有効性の研究
ｅｕＰＤ－１Ｆｃの有効性を検証するために、ｉｎ ｖｉｖｏの腫瘍増殖阻害試験を実施した。実験は、ｈＰＤ－１にノックインした雌のＣ５７ＢＬ／６マウスを用いて行った。

腫瘍細胞としては、ヒトＰＤ－Ｌ１を発現するＭＣ３８細胞を図１０に示すように用いた。１個あたり８×１０^６個の腫瘍細胞を皮下投与した。投与１週間後、腫瘍の大きさを測定し、平均値と標準偏差が同程度（すなわち、約１００ｍｍ^３）になるように投与群を割り付けた。抗体ｅｕＰＤ－１Ｆｃ、ＰＤ－１Ｆｃ、およびテセントリクの３つを静脈内注射した。陰性対照群として、賦形剤ＤＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）を使用した。抗体の投与量はｅｕＰＤ－１Ｆｃを基準に５ｍｇ／ｋｇおよび２ｍｇ／ｋｇとし設定し、ＰＤ－１ｆｃおよびテセントリク５ｍｇ／ｋｇの場合は、分子量を考慮して８．７７ｐＭの濃度を使用した。投与は１００μｌで行い、３日間隔で５回投与した。腫瘍サイズも３日または４日間おきに測定し、最後の投与から２日後まで腫瘍サイズを測定した。また、実験終了日には採血を行って毒性を確認し、ＡＬＴ（アラニンアミノトランスフェラーゼ）、ＡＳＴ（アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ）、ＢＵＮ（血中尿素窒素）、Ｔ－ＢＩＬ（総ビリルビン）の濃度を生化学分析装置を用いて確認した。

腫瘍の大きさを観察したところ、図１１ａおよび図１１ｂに示すように、ｅｕＰＤ－１Ｆｃ（８．７７μＭ）およびテセントリク（８．７７μＭ）の両方共に陰性対照群の投与に比べて腫瘍増殖が阻害され；ＰＤ－１Ｆｃ（８．７７μＭ）は、陰性対照群と同等の増殖がみられた。また、図１１ｃおよび図１１ｂに示すように、ｅｕＰＤ－１Ｆｃは、低濃度（２ｍｇ／ｋｇ）投与群で陰性対照群の投与に比べて腫瘍サイズが３３．９％縮小し、高グレード（５ｍｇ／ｋｇ）投与群において６６．１％の腫瘍サイズの縮小が観察されており、用量依存的阻害効果を示した。

さらに、肝毒性指数分析を行い、図１２に示した。肝毒性指数解析の場合、図１２に示すように、ｅｕＰＤ－１Ｆｃ投与群において、４つの指標全部において正常範囲内であり（ＡＬＴ：１７～７７Ｕ／Ｌ（図１２ａおよび図１２ｅ）、ＡＳＴ：５４～２９８Ｕ／Ｌ（図１２ｂおよび図１２ｆ）、ＢＵＮ：８～３３ｍｇ／ｄＬ（図１２ｃおよび図１２ｇ）、Ｔ－ＢＩＬ：８～３３ｍｇ／ｄＬ（図１２ｄおよび図１２ｈ））、実験条件内で肝毒性が確認されなかった。

したがって、ｅｕＰＤ－１およびＩｇＧ１変異体を含む融合タンパク質および二重特異性抗体は肝毒性を示さないことが確認された。さらに、本発明の抗体は、ＡＤＣＣおよびＣＤＣ効果に欠けている。

実施例１０．ＰＤ－１融合タンパク質ｅｕＰＤ－１ＢｓＡｂの設計、製造、および特徴評価
ｅｕＰＤ－１および抗－４－１ＢＢ抗体を使用するＦｃ融合ＢｓＡｂは、図１３に示すように設計された。ｅｕＰＤ－１とＦｃを連結するために、（Ｇ_４Ｓ）_２リンカーを使用しており、ＢｓＡｂに使用されるＦｃ領域にはＩｇＧ１で修飾されたＦｃ領域を使用した（Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｋ３２２Ａ、Ｄ３５６Ｅ、Ｌ３５８Ｍ）。

２個のｅｕＰＤ－１ｓを連結する形態のＢｓＡｂも設計され、２つのｅｕＰＤ－１を連結するために、（Ｇ_４Ｓ）_３リンカーを使用しており、ｅｕＰＤ－１．２と称した。

Ｃ－末端側では、抗－４－１ＢＢ抗体は、ｓｃＦｖの形態でＦｃに結合され；このとき、（Ｇ_４Ｓ）_２リンカーで連結され、抗－４－ＩＢＢ抗体に対する２種類のｓｃＦｖ、ＶＨ－２１８リンカー－ＶＬ（ＨＬＣ２１８）およびＶＬ－２１８リンカー－ＶＨ（ＬＨＣ２１８）を使用した。

表５または図１３の構築物を作製した。また、前述した配列も提供される。

一過性トランスフェクションをＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞で行い、ｅｕＰＤ－１ＢｓＡｂ（二重特異性抗体）を生成し；プロテインＡカラムで精製を行った。

ＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析の結果、非還元状態において、１個のｅｕＰＤ－１を有するｅｕＰＤ－１×９４ｋｖｔ ＨＬＣ２１８およびｅｕＰＤ－１×９４ｋｖｔ ＬＨＣ２１８は、約１６０ｋＤａであることが観察され；還元状態では、約８０ｋＤａであることが観察された。ｅｕＰＤ－１倍加型、ｅｕＰＤ－１．２×９４ｋｖｔ ＨＬＣ２１８およびｅｕＰＤ－１．２×９４ｋｖｔ ＬＨＣ２１８は、約２５０ｋＤａであることが観察され；還元状態では、約１２５ｋＤａであることが観察された。サイズ排除クロマトグラフィー分析の結果、純度９０％以上のシングルピークが観察された（図１５参照）。

実施例４に記述されたことと同様の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析を行った。具体的には、２５μg／ｍＬの抗ヒトＦｃ抗体をＣＭ５チップに固定化した。２５μg／ｍＬの抗ヒトＦｃ抗体をＣＭ５チップに固定化した。その後、４種類のｅｕＰＤ－１ＢｓＡｂを１０μg／ｍＬ、１０μｌ／ｍｉｎの流速で６０秒間流して捕捉し、１００、５０、２５、１２．５、３．２５、３．１２５、０ｎＭのＰＤ－Ｌ１抗原を用いて、Ｋ_Ｄ解析を行った。図１６は、ｅｕＰＤ－１ＢｓＡｂ構築物のＳＰＲ結果を示す。

実施例１１．ｅｕＰＤ－１ＢｓＡｂ構築物を用いた抗原結合アッセイ
ｅｕＰＤ－１ＢｓＡｂｓが抗原ＰＤ－Ｌ１に結合するかどうかを確認するために、抗原結合アッセイを実施した。

アッセイ方法は、図１７ａに示す通りに実施した。簡単にいえば、ＰＤ－Ｌ１抗原を１μg／ｍＬの濃度で９６ウェルイムノプレートに４℃で一晩コーティングした後、１５０μｌの１×アッセイバッファー（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を１時間処理し、非特異的結合を遮断した。ｅｕＰＤ－１ＢｓＡｂは、１００Ｌで処理した後、２時間インキュベートした。処理濃度を１０μg／ｍＬで合計３ポイントまで１０倍段階希釈した。１μg／ｍＬの濃度の１００μｌのビオチン化した４－ＩＢＢを１時間処理した。アビジン－ＨＲＰ（Ｂｉｏｇｌｅｎｄ）をプロトコールに示した濃度の１００μｌで３０分間処理した。ＴＭＢで発色させた後、３分後に硫酸で反応を止めた。ＴＭＢ処理後の工程を除くすべての工程において、洗浄バッファーを用いて３回洗浄を行い；ＰＤ－Ｌ１コーティング工程を除いたすべてのプロセスは室温で行った。

実験の結果、図１７ｂに示すように、抗原ＰＤ－Ｌ１に対するｅｕＰＤ－１ＢｓＡｂの結合が用量依存的に確認された。

実施例１２．４－１ＢＢ／ＰＤ－１組み合わせのバイオアッセイ
ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との結合阻害効果および４－１ＢＢ活性効果を確認するために、４－１ＢＢ／ＰＤ－１組み合わせのバイオアッセイを行った。

この実験では、バイオアッセイ製品（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＣＳ１９７８Ｉ１０）は、４－１ＢＢ抗体刺激によって４－１ＢＢが活性化されると同時にＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１の相互作用が阻害されるときにルシフェラーゼを発現するアッセイシステムである。バイオアッセイおよびルシフェラーゼアッセイは、プロメガのプロトコルに従った。ＰＤ－Ｌ１を発現するＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を９６ウェル白色プレートに４×１０^４個細胞／１００μＬ／ｗｅｌｌで播種した。３７℃のＣＯ_２インキュベーターでＯ／Ｎインキュベーションした後、抗体およびＰＤ１＋４－１ＢＢエフェクター細胞を処理した。抗体としては、ｅｕＰＤ－１×９４ｋｖｔ ＨＬＣ２１８およびｅｕＰＤ－１×９４ｋｖｔ ＬＨＣ２１８を使用した。処理濃度は６０ｎｇ／ｍｌから４倍段階希釈し、合計４ポイントとした。３７℃のＣＯ_２インキュベーターで６時間培養後、ルシフェリンを処理し、ルシフェラーゼアッセイを行った。

ルシフェラーゼアッセイの結果、図１８に示すように、ｅｕＰＤ－１×９４ｋｖｔ ＨＬＣ２１８およびｅｕＰＤ－１×９４ｋｖｔ ＬＨＣ ２１８は、４－１ＢＢを活性化させ、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１を用量依存的な方法で阻害した。

Claims (56)

1. 配列番号４、配列番号６、または配列番号８に対して９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むプログラム細胞死１（ＰＤ－１）ポリペプチド変異体であって、
   プログラム細胞死１リガンド（ＰＤ－Ｌ１）に特異的に結合する細胞外ドメイン；および
   膜貫通型ドメインまたはそのフラグメント
   を含む、ＰＤ－１ポリペプチド変異体。
2. 配列番号４、配列番号６、または配列番号８のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のＰＤ－１ポリペプチド変異体。
3. 前記膜貫通型ドメインが少なくとも２個のアミノ酸残基を含む、請求項１に記載のＰＤ－１ポリペプチド変異体。
4. 野生型ＰＤ－１ポリペプチドと比較してＰＤ－Ｌ１分子に対して増強した結合親和性を有する、請求項１に記載のＰＤ－１ポリペプチド変異体。
5. ＰＤ－Ｌ１分子に対して約１×１０^－８～１×１０^－１０Ｍの結合親和性（Ｋ_Ｄ）を有する、請求項４に記載のＰＤ－１ポリペプチド変異体。
6. 配列番号１１の残基２４～１７２に対して９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むプログラム細胞死１（ＰＤ－１）ポリペプチド変異体であって、Ｄ２６、Ｐ３４、Ｖ４３、Ｔ４５、Ｔ５９、Ｖ６４、Ｌ６５、Ｎ６６、Ｙ６８、Ｍ７０、Ｎ７４、Ｋ７８、Ｃ９３、Ｑ９９、Ｒ１１４、Ｌ１２２、Ａ１２５、Ａ１３２、およびＲ１３９からなる群から選択される少なくとも１つの残基に突然変異を有する、ＰＤ－１ポリペプチド変異体。
7. Ｄ２６、Ｐ３４、Ｖ４３、Ｔ４５、Ｔ５９、Ｖ６４、Ｌ６５、Ｎ６６、Ｙ６８、Ｍ７０、Ｎ７４、Ｋ７８、Ｑ９９、Ｌ１２２、Ａ１２５、Ａ１３２、およびＲ１３９に突然変異を含む、請求項６に記載のＰＤ－１ポリペプチド変異体。
8. Ｄ２６、Ｐ３４、Ｖ４３、Ｔ４５、Ｔ５９、Ｖ６４、Ｌ６５、Ｎ６６、Ｙ６８、Ｍ７０、Ｎ７４、Ｋ７８、Ｃ９３、Ｑ９９、Ｒ１１４、Ｌ１２２、Ａ１２５、Ａ１３２、およびＲ１３９に突然変異を含む、請求項６に記載のＰＤ－１ポリペプチド変異体。
9. 前記突然変異が、Ｄ２６Ｅ、Ｐ３４Ａ、Ｖ４３Ｌ、Ｔ４５Ａ、Ｔ５９Ａ、Ｖ６４Ｈ、Ｌ６５Ｖ、Ｎ６６Ｖ、Ｙ６８Ｈ、Ｍ７０Ｅ、Ｎ７４Ｇ、Ｋ７８Ｔ、Ｃ９３Ｈ、Ｑ９９Ｒ、Ｒ１１４Ｑ、Ｌ１２２Ｙ、Ａ１２５Ｖ、Ａ１３２Ｉ、またはＲ１３９Ｇである、請求項６に記載のＰＤ－１ポリペプチド変異体。
10. 免疫グロブリンＦｃ領域；および
    ペプチド結合またはペプチドリンカー配列によって前記免疫グロブリンＦｃ領域のカルボキシ末端に連結された請求項１に記載のＰＤ－１ポリペプチド変異体
    を含む、ＰＤ－１Ｆｃ融合タンパク質。
11. 前記免疫グロブリンＦｃ領域が、配列番号１０もしくは配列番号１６に対して９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１０に記載のＰＤ－１Ｆｃ融合タンパク質。
12. 前記ＰＤ－１ポリペプチド変異体の２つのコピーが存在し、ここで前記コピーは同じであってもよく異なっていてもよい、ペプチドリンカーによって連結される、請求項１０に記載のＰＤ－１Ｆｃ融合タンパク質。
13. 野生型ＰＤ－１ポリペプチドと比較してＰＤ－Ｌ１分子に対して増強した結合親和性を有する、請求項１０に記載のＰＤ－１Ｆｃ融合タンパク質。
14. ＰＤ－Ｌ１分子に対して約１×１０^－８～１×１０^－１０Ｍの結合親和性（Ｋ_Ｄ）を有する、請求項１３に記載のＰＤ－１Ｆｃ融合タンパク質。
15. 免疫グロブリンＦｃ領域；および
    ペプチド結合またはペプチドリンカー配列によって前記免疫グロブリンＦｃ領域のカルボキシ末端に連結された請求項６に記載のＰＤ－１ポリペプチド変異体
    を含む、ＰＤ－１Ｆｃ融合タンパク質。
16. 前記ＰＤ－１ポリペプチド変異体の２つのコピーが存在し、ここで、前記コピーは同じであってもよく異なっていてもよく、ペプチドリンカーによって連結される、請求項１５に記載のＰＤ－１Ｆｃ融合タンパク質。
17. ＰＤ－１ポリペプチド変異体をコードする配列を含む核酸であって、ここで、ポリペプチド変異体が、配列番号３、配列番号５、または配列番号７に対して９５％以上の配列同一性を有する配列を含む、核酸。
18. 免疫グロブリンＦｃ領域をコードする配列をさらに含み、ここで、免疫グロブリンＦｃ領域をコードする配列が配列番号９を含む、請求項１７に記載の核酸。
19. 請求項１７に記載の核酸を含む、発現ベクター。
20. ウイルスベクターである、請求項１９に記載のベクター。
21. 請求項１に記載のＰＤ－１ポリペプチド変異体、または免疫グロブリンＦｃ領域および該免疫グロブリンＦｃ領域のカルボキシ末端にペプチド結合またはペプチドリンカー配列によって連結される前記ＰＤ－１ポリペプチド変異体を含む融合タンパク質；および
    薬学的に許容される担体
    を含む、医薬組成物。
22. 治療を必要とする被検体の疾患または病態を治療する方法であって、
    請求項２１に記載の医薬組成物を被検体に投与し、これにより疾患または病態を治療する工程を含む、方法。
23. 前記被検体が癌を有する、請求項２２に記載の方法。
24. 前記癌が、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、結腸癌、子宮内膜癌、食道癌、卵管癌、胆嚢癌、胃腸癌、頭頸部癌、血液癌、喉頭癌、肝臓癌、肺癌、リンパ腫、黒色腫、中皮腫、卵巣癌、原発性腹膜癌、唾液腺癌、肉腫、胃癌、甲状腺癌、膵臓癌、腎細胞癌、膠芽腫、および前立腺癌から選択される、請求項２３に記載の方法。
25. 前記医薬組成物が前記融合タンパク質を含む場合、減少した抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）および／または補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）の効果が観察されるか、または該効果が観察されない、請求項２２に記載の方法。
26. 前記医薬組成物が前記融合タンパク質を含む場合、減少した肝毒性が観察されるか、または肝毒性が観察されない、請求項２２に記載の方法。
27. 請求項６に記載のＰＤ－１ポリペプチド変異体、または免疫グロブリンＦｃ領域および該免疫グロブリンＦｃ領域のカルボキシ末端にペプチド結合またはペプチドリンカー配列によって連結される前記ＰＤ－１ポリペプチド変異体を含む融合タンパク質；および
    薬学的に許容される担体
    を含む、医薬組成物。
28. 治療を必要とする被検体の疾患または病態を治療する方法であって、
    請求項２７に記載の医薬組成物を被検体に投与し、これにより疾患または病態を治療する工程を含む、方法。
29. 前記被検体が癌を有する、請求項２８に記載の方法。
30. 前記癌が、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、結腸癌、子宮内膜癌、食道癌、卵管癌、胆嚢癌、胃腸癌、頭頸部癌、血液癌、喉頭癌、肝臓癌、肺癌、リンパ腫、黒色腫、中皮腫、卵巣癌、原発性腹膜癌、唾液腺癌、肉腫、胃癌、甲状腺癌、膵臓癌、腎細胞癌、膠芽腫、および前立腺癌から選択される、請求項２９に記載の方法。
31. 前記医薬組成物が前記融合タンパク質を含む場合、減少した抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）および／または補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）の効果が観察されるか、または該効果が観察されない、請求項２８に記載の方法。
32. 前記医薬組成物が前記融合タンパク質を含む場合、減少した肝毒性が観察されるか、または肝毒性が観察されない、請求項２８に記載の方法。
33. 免疫グロブリンＦｃ領域；
    ペプチド結合またはペプチドリンカー配列によって前記免疫グロブリンＦｃ領域のＮ末端に連結される請求項１に記載のＰＤ－１ポリペプチド変異体；および
    ペプチド結合またはペプチドリンカー配列によって前記免疫グロブリンＦｃ領域のＣ末端に連結される抗－４－１ＢＢ抗体に対するｓｃＦｖであって、ここで抗－４－１ＢＢ抗体に対するｓｃＦｖは、ペプチド結合またはペプチドリンカー配列によって連結される配列番号１７および１８を含むアミノ酸配列に対して９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、抗－４－１ＢＢ抗体に対するｓｃＦｖ
    を含む、二重特異性抗体。
34. 前記免疫グロブリンＦｃ領域が、配列番号１０または配列番号１６に対して９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項３３に記載の二重特異性抗体。
35. 前記ＰＤ－１ポリペプチド、ｓｃＦｖ、またはその両方が、配列番号１９、配列番号２０および配列番号２１からなる群から選択されるペプチドリンカーによって免疫グロブリンＦｃ領域に連結される、請求項３３に記載の二重特異性抗体。
36. 前記抗－４－１ＢＢ抗体に対するｓｃＦｖが、配列番号２２または配列番号２３と少なくとも９０％同一である配列を含む、請求項３３に記載の二重特異性抗体。
37. 前記抗－４－１ＢＢ抗体に対するｓｃＦｖが、配列番号２２または配列番号２３を含む、請求項３３に記載の二重特異性抗体。
38. 野生型ＰＤ－１ポリペプチドと比較してＰＤ－Ｌ１分子に対して増強した結合親和性を有し、４－１ＢＢに対する特異的結合親和性を有する、請求項３３に記載の二重特異性抗体。
39. 請求項３３に記載の二重特異性抗体；および
    薬学的に許容される担体
    を含む、医薬組成物。
40. 治療を必要とする被検体の疾患または病態を治療する方法であって、
    請求項３９に記載の医薬組成物を被検体に投与し、これにより疾患または病態を治療する工程を含む、方法。
41. 前記被検体が癌を有する、請求項４０に記載の方法。
42. 前記癌が、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、結腸癌、子宮内膜癌、食道癌、卵管癌、胆嚢癌、胃腸癌、頭頸部癌、血液癌、喉頭癌、肝臓癌、肺癌、リンパ腫、黒色腫、中皮腫、卵巣癌、原発性腹膜癌、唾液腺癌、肉腫、胃癌、甲状腺癌、膵臓癌、腎細胞癌、膠芽腫、および前立腺癌から選択される、請求項４１に記載の方法。
43. 前記医薬組成物が前記融合タンパク質を含む場合、減少した抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）および／または補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）の効果が観察されるか、または該効果が観察されない、請求項４０に記載の方法。
44. 前記医薬組成物が前記融合タンパク質を含む場合、減少した肝毒性が観察されるか、または肝毒性が観察されない、請求項４０に記載の方法。
45. 免疫グロブリンＦｃ領域；
    ペプチド結合またはペプチドリンカー配列によって前記免疫グロブリンＦｃ領域のＮ末端に連結される請求項６に記載のＰＤ－１ポリペプチド変異体；および
    ペプチド結合またはペプチドリンカー配列によって前記免疫グロブリンＦｃ領域のＣ末端に連結される抗－４－１ＢＢ抗体に対するｓｃＦｖであって、ここで抗－４－１ＢＢ抗体に対するｓｃＦｖは、ペプチド結合またはペプチドリンカー配列によって連結される配列番号１７および１８を含むアミノ酸配列に対して９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、抗－４－１ＢＢ抗体に対するｓｃＦｖ
    を含む、二重特異性抗体。
46. 前記免疫グロブリンＦｃ領域が、配列番号１０または配列番号１６に対して９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項４５に記載の二重特異性抗体。
47. 前記ＰＤ－１ポリペプチド、ｓｃＦｖ、またはその両方が、配列番号１９、配列番号２０および配列番号２１からなる群から選択されるペプチドリンカーによって免疫グロブリンＦｃ領域に連結される、請求項４５に記載の二重特異性抗体。
48. 前記抗－４－１ＢＢ抗体に対するｓｃＦｖが、配列番号２２または配列番号２３と少なくとも９０％同一である配列を含む、請求項４５に記載の二重特異性抗体。
49. 前記抗－４－１ＢＢ抗体に対するｓｃＦｖが、配列番号２２または配列番号２３を含む、請求項４５に記載の二重特異性抗体。
50. 野生型ＰＤ－１ポリペプチドと比較してＰＤ－Ｌ１分子に対して増強した結合親和性を有し、４－１ＢＢに対する特異的結合親和性を有する、請求項４５に記載の二重特異性抗体。
51. 請求項４５に記載の二重特異性抗体；および
    薬学的に許容される担体
    を含む、医薬組成物。
52. 治療を必要とする被検体の疾患または病態を治療する方法であって、
    請求項５１に記載の医薬組成物を被検体に投与し、これにより疾患または病態を治療する工程を含む、方法。
53. 前記被検体が癌を有する、請求項５２に記載の方法。
54. 前記癌が、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、結腸癌、子宮内膜癌、食道癌、卵管癌、胆嚢癌、胃腸癌、頭頸部癌、血液癌、喉頭癌、肝臓癌、肺癌、リンパ腫、黒色腫、中皮腫、卵巣癌、原発性腹膜癌、唾液腺癌、肉腫、胃癌、甲状腺癌、膵臓癌、腎細胞癌、膠芽腫、および前立腺癌から選択される、請求項５３に記載の方法。
55. 前記医薬組成物が前記融合タンパク質を含む場合、減少した抗体－依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）および／または補体－依存性細胞傷害（ＣＤＣ）の効果が観察されるか、または該効果が観察されない、請求項５４に記載の方法。
56. 前記医薬組成物が前記融合タンパク質を含む場合、減少した肝毒性が観察されるか、または肝毒性が観察されない、請求項５４に記載の方法。

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