JP4753578B2 - 合成抗体ファージライブラリー - Google Patents

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Description

【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般的に、抗体または抗体可変ドメインのライブラリーに関するものである。このライブラリーは、ＣＤＲ領域で多様性を創成することによって生成する、複数の異なる抗体可変ドメインを含む。特に、ＣＤＲ領域の多様性は抗体可変ドメインの多様性を最大にする一方で、構造上の摂動を最小にするようになっている。本発明は、１つまたは複数の抗体可変ドメインと異種タンパク質、例えばウイルスのコートタンパク質との融合ポリペチドにも関するものである。本発明はこの融合ポリペチドをコードしている遺伝子を含む複製可能な発現ベクター、この発現ベクターを含んでいる宿主細胞、ウイルス表面上でこの融合ポリペチドを提示するウイルス、ウイルス表面上で複数の異なる融合ポリペチドを提示するウイルスのライブラリー、およびそれらの組成物を使用する方法にも関する。本発明の方法および組成物は、治療的にまたは試薬として使用することができる新規抗体を同定する上で有用である。
【背景技術】
【０００２】
ファージディスプレイ技術は、抗原のようなリガンドと結合する新規タンパク質を生成して選択するための強力な手段となっている。ファージディスプレイの手法を使うことにより、対象の抗原と高親和性で結合する配列を迅速に選別することができる、大きなタンパク質変異体ライブラリーの作製が可能になる。変異体ポリペチドをコードしている核酸を、ウイルスのコートタンパク質、例えば遺伝子ＩＩＩタンパク質または遺伝子ＶＩＩＩタンパク質をコードしている核酸配列に融合する。このタンパク質またはポリペチドをコードする核酸配列が遺伝子ＩＩＩタンパク質の一部をコードする核酸配列に融合する一価のファージディスプレイ系が開発された。（Ｂａｓｓ，Ｓ．、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、８：３０９頁（１９９０）；ＬｏｗｍａｎおよびＷｅｌｌｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ａ Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、３：２０５頁（１９９１））。一価のファージディスプレイ系では遺伝子融合の発現は低次であり、また野生型遺伝子ＩＩＩタンパク質も発現するので、粒子の感染性は保持される。ペプチドライブラリーを作製してそれらのライブラリーをスクリーニングする方法は、多くの特許で開示されている（例えば、米国特許第５，７２３，２８６号、米国特許第５，４３２，０１８号、米国特許第５，５８０，７１７号、米国特許第５，４２７，９０８号および米国特許第５，４９８，５３０号）。
【０００３】
繊維状ファージ表面でのペプチドの発現、および大腸菌のペリプラズムにおける機能性抗体断片の発現の実証が、抗体ファージディスプレイライブラリーの開発で重要であった。（Ｓｍｉｔｈ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８５）、２２８：１３１５頁；ＳｋｅｒｒａおよびＰｌｕｃｋｔｈｕｍ、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８）、２４０：１０３８頁）。抗体または抗原結合ポリペチドのライブラリーはいくつかの方法で調製され、例えばランダムなＤＮＡ配列を挿入して単一遺伝子を変えることによって、または関連遺伝子のファミリーをクローニングすることによって調製した。ファージディスプレイを使って抗体または抗原結合断片を提示する方法は、米国特許第５，７５０，３７３号、５，７３３，７４３号、５，８３７，２４２号、５，９６９，１０８号、６，１７２，１９７号、５，５８０，７１７号および５，６５８，７２７号で記載されている。このライブラリーは次に、所望の形質を有する抗体または抗原結合タンパク質の発現に関してスクリーニングされる。
【０００４】
ファージディスプレイ技術には、所望の形質を有する抗体を調製するための従来のハイブリドーマ法および組換え方法に勝るいくつかの利点がある。この技術により、多様な配列を有する大きな抗体ライブラリーをより少ない時間で動物を使わずに作製することが可能になる。ハイブリドーマの調製またはヒト化抗体の調製には優に数カ月を要する。さらに免疫化が必要でないことから、ファージ抗体ライブラリーは毒性のある抗原または抗原性の低い抗原に対して作製することができる（Ｈｏｇｅｎｂｏｏｍ、Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９８８）、４：１〜２０頁）。ファージ抗体ライブラリーは、新規ヒト抗体の作製および同定のためにも用いることができる。
【０００５】
ヒト抗体は、多種多様な病態のための治療薬として非常に有効になっている。例えば、腫瘍抗原ＨＥＲ−２に対するヒト化抗体は、癌の診断と治療に役立つ。他の抗体、例えば抗ＩＮＦ−γ抗体は、クローン病のような炎症性病態の治療に役立つ。ファージディスプレイライブラリーは、免疫化されたヒト、免疫化されていないヒト、生殖細胞系配列またはナイーヴなＢ細胞Ｉｇレパートリーからヒト抗体を作製するために使われてきた（Ｂａｒｂａｓ ＆ Ｂｕｒｔｏｎ、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈ（１９９６）、１４：２３０頁；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ他、ＥＭＢＯ Ｊ．（１９９４）、１３：３２４５頁；Ｖａｕｇｈａｎ他、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．（１９９６）、１４：３０９頁；Ｗｉｎｔｅｒ欧州特許第０３６８ ６８４ Ｂ１）。様々なリンパ組織を使って、ナイーヴ、または非免疫化の抗原結合ライブラリーが作製された。これらのライブラリーの一部は市販されており、例えばＣａｍｂｒｉｄｇｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｒｐｈｏｓｙｓが開発したものがある（Ｖａｕｇｈａｎ他、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ １４：３０９頁（１９９６）；Ｋｎａｐｐｉｋ他、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９６：５７頁（１９９９））。しかし、これらのライブラリーの多くは、多様性が限定的である。
【０００６】
高親和性抗体をファージディスプレイライブラリーから同定して分離する能力は、治療用途の新規ヒト抗体を単離する上で重要である。ライブラリーからの高親和性抗体の単離は、ライブラリーの大きさ、細菌細胞内での生産効率およびライブラリーの多様性に依存している。例えば、Ｋｎａｐｐｉｋ他、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９９）、２９６：５７頁を参照。ライブラリーの大きさは、抗体または抗原結合タンパク質の不適当な折畳みおよび終止コドンの存在による生産の非効率性によって減少する。抗体または抗原結合ドメインがきちんと折り畳まれていなければ、細菌細胞の発現は抑制され得る。可変／定常部の境界面で残基を交互に突然変異させるか、または選択されたＣＤＲ残基で突然変異させることによって発現を改善することができる。（Ｄｅｎｇ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９４）、２６９：９５３３頁；Ｕｌｒｉｃｈ他、ＰＮＡＳ（１９９５）、９２：１１９０７〜１１９１１頁；Ｆｏｒｓｂｅｒｇ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９７）、２７２：１２４３０頁）。フレームワーク領域の配列は、抗体ファージライブラリーを細菌細胞内で生成するときに適当な折畳みを提供する一つの要因である。
【０００７】
抗体または抗原結合タンパク質の多様なライブラリーを作製することも、高親和性抗体の単離にとって重要である。様々な手法を使って、限定的なＣＤＲが多様化されたライブラリーが作製された。例えば、Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．（２０００）、１８：９８９〜９９４頁。ＣＤＲ３領域は抗原結合にしばしば関与していることもあり、興味深い。重鎖のＣＤＲ３領域は、大きさ、配列および構造上の高次構造で大きく異なる。
【０００８】
各位置で２０個すべてのアミノ酸を使って可変部の重鎖および軽鎖のＣＤＲ領域をランダム化することによって、多様性を生み出した者もいる。２０個すべてのアミノ酸を使うことが変異体抗体の配列に大きな多様性を生み、新規抗体を同定する可能性を高くすると考えられた。（Ｂａｒｂａｓ、ＰＮＡＳ ９１：３８０９頁（１９９４）；Ｙｅｌｔｏｎ，ＤＥ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１５５：１９９４頁（１９９５）；Ｊａｃｋｓｏｎ，Ｊ．Ｒ．、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１５４：３３１０頁（１９９５）およびＨａｗｋｉｎｓ，ＲＥ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌｏｇｙ、２２６：８８９頁（１９９２））。
【０００９】
一部のＣＤＲでアミノ酸置換の群を制限し、天然抗体におけるアミノ酸分布を反映することによって多様性を生み出す試みもあった。Ｇａｒｒａｒｄ ＆ Ｈｅｎｎｅｒ、Ｇｅｎｅ（１９９３）、１２８：１０３；Ｋｎａｐｐｉｋ他、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９９）、２９６：５７頁を参照。しかし、これらの試みの成功度はまちまちであり、体系的にまた定量的に適用されたものではなかった。ＣＤＲ領域で多様性を生み出しつつアミノ酸変化の数を最小にすることが難題である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
臨床用途、例えば治療および診断の用途のための新規高親和性抗体を単離する必要がある。この必要に応ずるために、細胞内で高収率で発現され得る抗体可変ドメインの非常に多様なライブラリーを作製する必要がまだある。本明細書で記載される本発明はこの必要を満たすもので、他の恩恵も提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、多様化されたＣＤＲを含んでいるポリペチドを体系的に、能率的に生み出す方法を提供する。一実施形態では、本発明は、細胞培養により高収率で容易に生成できる対象抗原に結合する高親和性結合体の迅速な同定法を提供する。対象結合体の十分な多様性は特定のＣＤＲまたはすべてのＣＤＲが多様化された場合にのみ生み出すことができるとする従来の方法と異なり、また、十分な多様性は最も広い範囲のアミノ酸置換（通常、２０個のアミノ酸すべてまたは大部分を用いた置換によって）に依存しているという従来の概念と違って、本発明は、参照ポリペチドまたはソース抗体の特定のＣＤＲおよび特定数のＣＤＲの多様化に必ずしも依存しているわけではない、高品質の対象結合体を生み出すことができる方法を提供する。本発明は、少なくともある程度は、高品質の非常に多様なライブラリーを最小数のアミノ酸位置の最小数のアミノ酸残基による体系的、選択的な置換によって作製することができるという驚くべき、予想外の知見に基づく。本発明の方法は、便利で、客観的、体系的基準に基づき、迅速である。本発明によって作製される結合体ポリペチド候補は高品質の対象結合特性を有し、細胞培養で高収率の生産を可能にする構造上の特性を有する。また、本発明は、ライブラリー形質とその中の融合ポリペチド結合体候補の結合特性をさらに強化する、ユニークな二量体化／多量体化手法を提供する。
【００１２】
特に、多様化されたＣＤＲおよび異種ポリペチド配列（好ましくはウイルスポリペプチドの少なくとも一部の配列）を含んでいる融合ポリペチドが、個々に、また関心の対象への結合体候補である複数のユニークな個々のポリペチドとして作製される。そのようなポリペチドを含んでいる組成物（例えばライブラリー）は、特に関心の対象と結合する免疫グロブリンポリペチド（特に、抗体および抗体断片）候補の大きく多様なプールとして、様々な用途がある。本発明は様々な態様を含み、例えば本発明の方法によるポリペチド、ならびに本発明の方法の実施のためのかつ／または本発明のポリペチドおよび／または組成物を使うための製造システム、キットおよび物品が含まれる。
【００１３】
他の態様において、本発明は変異体ＣＤＲの少なくとも１つ、２つ、３つ、４つまたはすべて（すなわち、ＣＤＲＬ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｈ１およびＨ２からなる群から選択される）を含んでいる１つまたは複数のポリペプチドを作製する方法を提供し、前記ポリペチドは関心の対象抗原と結合することができ、前記ＣＤＲがＣＤＲＨ３ではなく、前記方法は：（ａ）ＣＤＲ中の溶媒に露出した非常に多様な少なくとも１つ（または全数までの任意の数）のアミノ酸位置を同定するステップと；（ｂ）前記溶媒に露出した非常に多様な位置のアミノ酸を、非ランダムコドンセットを使ってＣＤＲの変異体複製物を作製することにより対象アミノ酸（本明細書で定められる）で置換するステップとを含み、前記非ランダムコドンセットによってコードされるアミノ酸の少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはすべてが周知の抗体および／または天然可変ドメインにおけるその位置の対象アミノ酸（本明細書で定められる）である。
【００１４】
他の態様において、本発明はＨ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｌ１、Ｌ２およびＬ３からなる群から選択される少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたはすべての変異体ＣＤＲを含んでいるポリペプチドを作製する方法を提供し、前記ポリペチドは関心の対象抗原と結合することができ、前記方法は：（ａ）Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｈ１およびＨ２に関して、（ｉ）前記変異体ＣＤＲと対応する参照ＣＤＲ中の溶媒に露出した非常に多様な少なくとも１つ（または全数までのいかなる数）のアミノ酸位置を同定するステップと；（ｉｉ）前記溶媒に露出した非常に多様な位置のアミノ酸を、非ランダムコドンセットを使ってＣＤＲの変異体複製物を作製することにより対象アミノ酸で置換するステップとを含み、前記非ランダムコドンセットによってコードされるアミノ酸の少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはすべてが周知の抗体または抗原結合断片（例えば、抗体可変ドメイン）におけるその位置の対象アミノ酸であり；（ｂ）Ｈ３に関しては、少なくとも１つ（または全数までの任意の数）の位置を変異体アミノ酸で置換するステップを含む。
【００１５】
他の態様において、本発明はＬ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｈ１、Ｈ２およびＨ３からなる群から選択される少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたはすべての変異体ＣＤＲを含んでいるポリペプチドを作製する方法を提供し、前記方法は：（ａ）Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｈ１および／またはＨ２の少なくとも１つ（または全数までの任意の数）の溶媒に露出した非常に多様なアミノ酸位置を、非ランダムコドンセットでコードされる変異体アミノ酸で置換するステップであって、前記非ランダムコドンセットによってコードされるアミノ酸の少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはすべてが周知の抗体または抗原結合断片における前記アミノ酸位置の対象アミノ酸であるステップと；（ｂ）Ｈ３の少なくとも１つ（または全数までの任意の数）のアミノ酸位置を変異体アミノ酸で置換するステップとを含む。
【００１６】
本発明の方法の様々な態様および実施形態は、本発明の複数のポリペチドを含んでいるプールの作製および／または使用に有用であり、特に、関心の対象抗原に対する結合体候補の選択および同定に有用である。例えば、本発明はそれぞれがＬ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｈ１、Ｈ２およびＨ３からなる群から選択される少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたはすべての変異体ＣＤＲを含んでいる複数のポリペプチドを含む組成物を作製する方法を提供し、前記方法は：（ａ）Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｈ１および／またはＨ２の少なくとも１つ（または全数までの任意の数）の溶媒に露出した非常に多様なアミノ酸位置を、非ランダムコドンセットでコードされた変異体アミノ酸で置換するステップであって、前記非ランダムコドンセットによってコードされるアミノ酸の少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはすべてが周知の抗体または抗原結合断片における前記アミノ酸位置の対象アミノ酸であるステップと；および／または（ｂ）Ｈ３の少なくとも１つ（または全数までの任意の数）のアミノ酸位置を変異体アミノ酸で置換するステップとを含み；変異体アミノ酸をコードしている配列に縮退を含む一組のオリゴヌクレオチドで鋳型ポリヌクレオチドを増幅することによって複数のポリペチドが作製され、前記縮退は前記非ランダムコドンセットの複数のコドン配列を反映する。
【００１７】
他の実施例では、本発明は、ＣＤＲＬ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｈ１、Ｈ２およびＨ３からなる群から選択される少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたはすべてのＣＤＲを含んでいるソース抗体の軽鎖、重鎖若しくはその両方、軽鎖および重鎖の可変ドメインをコードするポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを構築するステップと、前記ソース抗体のＣＤＲの少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたはすべてを非ランダムコドンセットを用いて少なくとも１つ（または全数までの任意の数）の溶媒に露出した非常に多様なアミノ酸位置で突然変異させるステップとを含み、前記非ランダムコドンセットによってコードされるアミノ酸の少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはすべてが周知のかつ／または天然抗体または抗原結合断片（例えば、抗体可変ドメイン）におけるその位置の対象アミノ酸である方法を提供する。
【００１８】
他の実施例では、本発明は、本発明の複数のポリペチドを提示しているファージまたはファージミド粒子のライブラリーを構築するステップと、前記粒子と対象抗原との結合に適した条件下で前記対象抗原に前記粒子ライブラリーを接触させるステップと、前記対象抗原と結合する粒子を、結合しない粒子から分離するステップとを含む方法を提供する。
【００１９】
本明細書で記載される本発明のいかなる方法においても、溶媒に露出しかつ／または非常に多様なアミノ酸位置は本明細書で記載されている基準に適合するものであればいかなるものでもよく、特に、本明細書で記載されている位置のいかなる組合せでもよく、例えば、本発明のポリペチドに関して記載されている位置のいかなる組合せでもよい（下でさらに詳しく記載されている）。適当な変異体アミノ酸は本明細書で記載されている基準に適合するものであればいかなるものでもよく、例えば、下でさらに詳しく記載されている本発明のポリペプチドの変異体アミノ酸でよい。
【００２０】
ＣＤＲＨ３領域の多様性の設計では、ＣＤＲＨ３の長さ（好ましくは７から１９個のアミノ酸）および／または配列における多様性を設計する。いくつかの実施形態では、ＣＤＲＨ３の一部は４から１４個のアミノ酸長を有し、ＮＮＫ、ＮＮＳ、ＤＶＫ、ＮＶＴ、ＸＹＺまたはその混合物などの、公知のかつ／または天然抗体可変ドメインのＣＤＲＨ３領域で見られるアミノ酸をコードするコドンセットでコードされる１つまたは複数の位置の変異体アミノ酸を有し、ＣＤＲの他の部分は、好ましくはＣ末端（例えば、下で示されるＸ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５およびＸ６のアミノ酸位置）では多様性はかなり限定されている。いくつかの実施形態では、Ｃ末端のアミノ酸配列はＹＡＭＤＹまたはＦＤＹである。
【００２１】
本発明の１つの態様は、以下のアミノ酸配列を含む変異体ＣＤＲＨ３を含んでいるポリペプチド、例えば抗体可変ドメインを提供し、
（Ｘ１）ｎ−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６
式中、Ｘ１は、ＮＮＫ、ＮＮＳ、ＤＶＫ、ＮＶＴ、ＸＹＺのコドンセットによってコードされるいずれかの天然アミノ酸、またはトリプトファンもしくはグリシンもしくはその混合物であり、ｎは４から１４であり、
Ｘ２は、ＫＳＧ、ＤＶＫ、ＤＳＧ、ＮＶＴ、ＫＳＧ、ＮＮＳ、ＸＹＺ、ＮＮＫのコドンセットでコードされるいずれかの天然アミノ酸、またはチロシン、フェニルアラニン、セリン、アラニン、グリシン、ロイシンまたはトリプトファンであり、
Ｘ３はＸ２がフェニルアラニンまたはロイシンのときは存在せず、あるいは存在する場合には、アラニン、バリン、アスパラギン酸またはグリシンであり、
Ｘ４はＸ２がフェニルアラニンまたはロイシンのときは存在せず、あるいは存在する場合はメチオニンであり、
Ｘ５はアスパラギン酸、アラニン、バリンまたはグリシンであり、
Ｘ６はチロシンまたはバリンである。
上記式の変異体ＣＤＲＨ３を有するポリペプチドまたはポリペプチドライブラリーは、図４および図４３で例示されたオリゴヌクレオチドのいずれか１つまたはその組合せを使って作製することができる。
【００２２】
一実施形態では、ＣＤＲＨ３はアミノ酸配列（Ｘ１）ｎ−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６を含み、上式中、Ｘ１は、ＮＮＫ、ＮＮＳ、ＤＶＫ、ＮＶＴ、ＸＹＺのコドンセットによってコードされるいずれかの天然アミノ酸、またはトリプトファンもしくはグリシンもしくはその混合物であり、ｎは４から１４であり、Ｘ２は、ＫＳＧ、ＤＶＫ、ＤＳＧ、ＮＶＴ、ＫＳＧ、ＮＮＳ、ＸＹＺ、ＮＮＫのコドンセットでコードされるいずれかの天然アミノ酸、またはチロシン、フェニルアラニン、セリン、グリシン、アラニン、ロイシンまたはトリプトファンであり、Ｘ３はアラニン、バリン、アスパラギン酸またはグリシンであり、Ｘ４はメチオニンであり、Ｘ５はアスパラギン酸、アラニン、バリンまたはグリシンであり、Ｘ６はチロシンまたはバリンである。
【００２３】
いくつかの実施形態では、ｎは好ましくは４であり、Ｘ１はコドンセットＮＮＫ、ＮＮＳまたはＸＹＺによってコードされ、いずれかの天然アミノ酸であり、Ｘ２は、ＫＳＧ、ＮＮＫ、ＸＹＺによってコードされるいずれかの天然アミノ酸、またはチロシンであり、Ｘ３はアラニン、グリシンまたはバリンであり、Ｘ４はメチオニンであり、Ｘ５はアスパラギン酸であり、Ｘ６はチロシンである。これらの実施形態で変異体ＣＤＲＨ３領域を含んでいる１つまたは複数のポリペプチドは、オリゴヌクレオチドＦ６６ｅおよびＦ６６ｆを少なくとも１つまたは複数個用いて作製することができる。
【００２４】
いくつかの実施形態では、ｎは好ましくは６であり、Ｘ１はコドンセットＤＶＫ、ＮＶＴ、ＮＮＫ、ＮＮＳまたはＸＹＺによってコードされるいずれかの天然アミノ酸、またはトリプトファンまたはグリシンまたはこれらの混合物であり、Ｘ２はＤＳＧ、ＤＶＫ、ＫＳＧ、ＮＮＫ、ＸＹＺによってコードされるいずれかの天然アミノ酸、またはチロシン、グリシン、セリン、アラニンまたはトリプトファンであり、Ｘ３はアラニンであり、Ｘ４はメチオニンであり、Ｘ５はアスパラギン酸であり、Ｘ６はチロシンである。いくつかの実施形態では、Ｘ１は抗体４Ｄ５のＣＤＲＨ３のアミノ酸位置９５に対応し、Ｘ２はアミノ酸位置１００ａに対応し、Ａは１００ｂの位置、Ｍは１００ｃの位置、Ｄは１０１の位置、およびＹは１０２の位置にある。これらの実施形態で変異体ＣＤＲＨ３領域を含んでいる１つまたは複数のポリペプチドは、オリゴヌクレオチドＦ６３、Ｆ６４、Ｆ６５、Ｆ６６、Ｆ１６５、Ｆ１３４、Ｆ１３５、Ｆ１６３ａ、Ｆ１６６、Ｆ１６７、Ｆ６６ａ、Ｆ６６ｂ、Ｆ６６ａ１、Ｆ６６ｂ１、Ｆ１９０ｆおよびＦ１９０ｎを少なくとも１つまたは複数個用いて作製することができる。
【００２５】
他の実施形態では、ＣＤＲＨ３はアミノ酸配列（Ｘ１）ｎ−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６を含み、式中、Ｘ１は、ＮＮＫ、ＮＮＳ、ＤＶＫ、ＮＶＴ、ＸＹＺのコドンセットによってコードされるいずれかの天然アミノ酸、またはトリプトファンもしくはグリシンもしくはその混合物であり、ｎは４から１４であり、Ｘ２はロイシンまたはフェニルアラニンであり、Ｘ３は存在せず、Ｘ４は存在せず、Ｘ５はアスパラギン酸、アラニン、バリンまたはグリシンであり、Ｘ６はチロシンまたはバリンである。いくつかの実施形態では、この変異体ＣＤＲＨ３はアミノ酸配列（Ｘ１）ｎ−Ｘ２−Ｄ−Ｙを含み、式中、Ｘ１は、ＮＮＫ、ＮＮＳ、ＤＶＫ、ＮＶＴ、ＸＹＺのコドンセットによってコードされるいずれかの天然アミノ酸、またはトリプトファンもしくはグリシンもしくはその混合物であり、ｎは４から１４であり、Ｘ２はロイシンまたはフェニルアラニンであり、Ｄはアスパラギン酸、Ｙはチロシンである。他の実施形態では、ｎは好ましくは６であり、Ｘ１は抗体４Ｄ５のＣＤＲＨ３のアミノ酸位置９５に対応し、Ｘ２はアミノ酸位置１００ａに対応し、Ｘ５は１０１の位置、Ｘ６は１０２の位置にある。これらの実施形態で変異体ＣＤＲＨ３領域を含んでいる１つまたは複数のポリペプチドは、オリゴヌクレオチドＦ１７１ｃ、Ｆ１７１ｄ、Ｆ１７１ｅ、Ｆ１７１、Ｆ１８５、Ｆ１８６、Ｆ１８７、Ｆ１８５ａ、Ｆ１８５ｂ、Ｆ１８５ｂ１、Ｆ１８７ａ、Ｆ１８６ａ、Ｆ１８７ｂおよびＦ１８７ｃを少なくとも１つまたは複数個用いて作製することができる。
【００２６】
本発明の他の態様では、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３からなる群から選ばれる１つ、２つまたはすべての変異体ＣＤＲを含む方法およびポリペプチド、例えば抗体可変ドメインが提供され、前記変異体ＣＤＲＨ３は下記アミノ酸配列を含み、
（Ｘ１）ｎ−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６、
式中、Ｘ１は、ＮＮＫ、ＮＮＳ、ＤＶＫ、ＮＶＴ、ＸＹＺのコドンセットによってコードされるいずれかの天然アミノ酸、またはトリプトファンもしくはグリシンもしくはその混合物であり、ｎは４から１４であり、
Ｘ２は、ＫＳＧ、ＤＶＫ、ＤＳＧ、ＮＶＴ、ＫＳＧ、ＮＮＳ、ＸＹＺ、ＮＮＫのコドンセットでコードされるいずれかの天然アミノ酸、またはチロシン、フェニルアラニン、グリシン、セリン、アラニン、ロイシンまたはトリプトファンであり、
Ｘ３はＸ２がフェニルアラニンまたはロイシンのときは存在せず、あるいは存在する場合には、アラニン、バリン、アスパラギン酸またはグリシンであり、
Ｘ４はＸ２がフェニルアラニンまたはロイシンのときは存在せず、あるいは存在する場合はメチオニンであり、
Ｘ５はアスパラギン酸、アラニン、バリンまたはグリシンであり、
Ｘ６はチロシンまたはバリンであり、
前記変異体ＣＤＲＨ１もしくはＣＤＲＨ２、またはその両方は溶媒に露出した非常に多様なアミノ酸位置に少なくとも１つの変異体アミノ酸を有し、前記変異体アミノ酸は非ランダムコドンセットによってコードされ、前記非ランダムコドンセットによってコードされるアミノ酸の少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはすべてが周知の抗体または抗原結合断片（例えば、抗体可変ドメイン）におけるその位置の対象アミノ酸である。
【００２７】
本明細書で記載されるいかなる方法およびポリペプチドのいくつかの実施形態では、Ｈ３中の位置は、カバットナンバリング方法に従う抗体（例えば抗体４Ｄ５）の９５から１０２のいずれかの位置である。例えば、位置９５のアミノ酸は、コドンセットＤＶＫ、ＮＶＴ、ＮＮＳ、ＸＹＺ、ＮＮＫによってコードされる変異体アミノ酸でよく、またはトリプトファンであり、位置９６は、ＤＶＫ、ＮＶＴ、ＮＮＳ、ＸＹＺによってコードされてよく、またはグリシンもしくはトリプトファンであり、位置９７はＤＶＫ、ＮＶＴ、ＮＮＳ、ＸＹＺによってコードされてよく、またはトリプトファンであり、位置９８はＤＶＫ、ＮＶＴ、ＮＮＳ、ＸＹＺによってコードされてよく、またはトリプトファンであり、位置９９はＤＶＫ、ＮＶＴ、ＮＮＳ、ＸＹＺによってコードされてよく、位置１００はＤＶＫ、ＮＶＴ、ＮＮＳ、ＸＹＺによってコードされてよく、またはトリプトファンであり、位置１００ａは、ＤＶＫ、ＤＳＧ、ＫＳＧ、ＮＶＴ、ＮＮＳ、ＸＹＺによってコードされてよく、またはチロシン、グリシン、セリン、アラニン、トリプトファン、アスパラギン酸、メチオニン、フェニルアラニン、ロイシン、バリンでもよく、位置１００ｂは、ＤＳＧ、ＫＳＧ、ＸＹＺによってコードされてよく、またはアラニン、チロシン、グリシン、バリン、アスパラギン酸、メチオニンもしくはフェニルアラニンでもよく、位置１００ｃは、ＫＳＧ、ＸＹＺによってコードされてよく、またはメチオニン、フェニルアラニン、ロイシン、アラニン、グリシン、バリン、チロシン、アスパラギン酸であり、位置１０１は、ＫＳＧ、ＸＹＺによってコードされてよく、またはアスパラギン酸、メチオニン、アラニン、バリン、グリシン、チロシン、フェニルアラニン、ロイシンであり、位置１０２はＫＳＧもしくはＸＹＺによってコードされてよく、またはチロシン、アスパラギン酸、メチオニン、アラニン、バリン、グリシンである。これらの実施形態で変異体ＣＤＲＨ３領域を含んでいる１つまたは複数のポリペプチドは、図４および図４３に例示したオリゴヌクレオチドを少なくとも１つまたは複数個用いて作製することができる。
【００２８】
他の実施形態では、変異体ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２またはＣＤＲＬ３の少なくとも１つまたはすべてを含む方法およびポリペプチド、例えば抗体可変ドメインが提供され、前記変異体ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２またはＣＤＲＬ３、またはその混合物は、溶媒に露出した非常に多様なアミノ酸位置に少なくとも１つの変異体アミノ酸を有し、前記変異体アミノ酸は非ランダムコドンセットによってコードされ、前記非ランダムコドンセットによってコードされるアミノ酸の少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはすべては周知の抗体または抗原結合断片（例えば、抗体可変ドメイン）におけるその位置の対象アミノ酸である。
【００２９】
本発明のポリペプチドは、ポリペプチドの対象結合機能が保持される限り様々な形態をとることができる。いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチドは融合ポリペプチド（すなわち、異種ポリペプチドからの２つ以上の配列の融合）である。本発明による多様化されたＣＤＲを有するポリペプチドは、ウイルスのコートタンパク質の少なくとも一部との融合ポリペプチドとして、ファージディスプレイで用いるために調製することができる。本発明のポリペプチドの提示のために使うことができるウイルスコートタンパク質は、タンパク質ｐＩＩＩ、主要コートタンパク質ｐＶＩＩＩ、Ｓｏｃ（Ｔ４ファージ）、Ｈｏｃ（Ｔ４ファージ）、ｇｐＤ（ラムダファージ）、ｐＶＩまたはこれらの変異体を含む。
【００３０】
多様化されたＣＤＲを有するポリペプチドが１つまたは複数の抗体可変ドメインであるいくつかの実施形態では、この抗体可変ドメインは、ウイルス表面上でＳｃＦｖ、Ｆａｂ、ＳｃＦｖ２、Ｆ（ａｂ’）２およびＦ（ａｂ）２を含む様々な形式で提示することができる。二価の方式によるポリペプチドの提示のためには、融合タンパク質は好ましくは二量体化ドメインを含む。この二量体化ドメインは、二量体化配列の少なくとも１つ、および／または１つまたは複数のシステイン残基を含む配列を含んでいてもよい。この二量体化ドメインは、好ましくは重鎖可変ドメインまたは定常ドメインのＣ末端と連結している。二量体化ドメインは、前記抗体可変ドメインがウイルスのコートタンパク質成分との融合タンパク質成分として作製されている（二量体化ドメインの後にアンバー終止コドンを有さない）かどうかにより、または、前記抗体可変ドメインが主にウイルスコートタンパク質成分を含まずに作製されている（例えば、二量体化ドメインの後にアンバー終止コドンを有す）かどうかにより、様々な構造をとることができる。前記抗体可変ドメインが主にウイルスのコートタンパク質成分との融合タンパク質として作製されるとき、１つまたは複数のジスルフィド結合および／または単一の二量体化配列が二価提示をもたらす。主にウイルスのコートタンパク質成分と融合されずに作製される抗体可変ドメイン（例えば、アンバー終止を有す）の場合、システイン残基と二量体化配列の両方を含んでいる二量体化ドメインを持つことが好ましい。
【００３１】
さらに、融合ポリペプチドは、精製、検出およびスクリーニングのときに役立つタグ、例えばＦＬＡＧ、ｐｏｌｙ−ｈｉｓ、ｇＤタグ、ｃ−ｍｙｃ、蛍光タンパク質またはＢ−ガラクトシダーゼを含んでいてもよい。一実施形態では、融合ポリペプチドは、ポリペプチドタグと融合した軽鎖可変ドメインまたは定常ドメインを含む。
【００３２】
本発明の他の態様では、抗体可変ドメインなどのポリペプチドが単一のソースまたは鋳型分子から得られる。ソースまたは鋳型分子は、好ましくは、原核または真核の細胞培養で生産されるときの好収率と安定性といった特性を考慮して選択または設計され、かつ／または様々な長さのＣＤＲＨ３領域を受け入れできるように選択または設計される。鋳型分子の配列は、ファージコートタンパク質成分を有する融合タンパク質として現れるときの可変ドメインの折畳みおよび／または提示を改善するために改変することができる。例えば、ソース抗体は、ヒト化抗体４Ｄ５の可変ドメインのアミノ酸配列を含んでもよい（軽鎖可変ドメイン、配列番号１；重鎖可変ドメイン、配列番号２）。例えば、重鎖または軽鎖の抗体可変ドメインにおいて、この抗体可変ドメインの折畳み、収率、提示または親和性を改善するために、フレームワーク領域残基はソースまたは鋳型分子から改変または変更することができる。いくつかの実施形態では、ソース分子のフレームワーク位置のアミノ酸が天然抗体またはサブグループコンセンサス配列のその位置で通常見られる１つまたは複数のアミノ酸と異なるときに、フレームワーク残基が選択されてソースまたは鋳型分子から改変される。それらの位置のアミノ酸は、天然抗体またはサブグループ共通配列のその位置で最も一般的に見られるアミノ酸に変えることができる。一実施形態では、重鎖のフレームワーク残基７１は、Ｒ、ＶまたはＡでよい。他の実施例では、重鎖のフレームワーク残基９３は、ＳまたはＡでよい。他の実施例では、フレームワーク残基９４は、Ｒ、ＫまたはＴでよい。他の実施例では、Ｈ鎖のフレームワーク残基４９は、アラニンまたはグリシンでよい。軽鎖では、６６位置のアミノ酸はアルギニンまたはグリシンでよい。
【００３３】
本発明の方法は、ＣＤＲ配列の多様なセットを含んでいる多種多様なポリペプチドを生み出すことができる。例えば、一実施形態において、本発明はＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３からなる群から選択される少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたはすべての変異体ＣＤＲを含んでいるポリペプチドを提供し、（ｉ）ＣＤＲＬ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｈ１およびＨ２のそれぞれは、少なくとも１つ（または全数までの任意の数）の溶媒に露出した非常に多様なアミノ酸位置に変異体アミノ酸を有し、この変異体アミノ酸は非ランダムコドンセットによってコードされ、この非ランダムコドンセットによってコードされるアミノ酸の少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはすべてが周知の抗体または抗原結合断片におけるその位置の対象アミノ酸であり、（ｉｉ）変異体ＣＤＲＨ３は、少なくとも１つ（または全数までの任意の数）のアミノ酸位置に変異体アミノ酸を有する。
【００３４】
他の実施形態において本発明はポリペプチドを提供し、このポリペプチドは（ａ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３、ＣＤＲＨ１およびＣＤＲＨ２からなる群から選択される変異体ＣＤＲの少なくとも１つ、２つ、３つ、４つまたはすべてを含み、ＣＤＲＬ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｈ１およびＨ２のそれぞれは、少なくとも１つ（または全数までの任意の数）の溶媒に露出した非常に多様なアミノ酸位置に変異体アミノ酸を有し、この変異体アミノ酸は非ランダムコドンセットによってコードされ、この非ランダムコドンセットによってコードされるアミノ酸の少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはすべてが周知の抗体または抗原結合断片におけるその位置の対象アミノ酸であり、また（ｂ）少なくとも１つ（または全数までの任意の数）のアミノ酸位置に変異体アミノ酸を含む変異体ＣＤＲＨ３を含む。
【００３５】
一実施形態において、本発明はＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３からなる群から選択される少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたはすべてのＣＤＲを含んでいるポリペプチドを提供し、（ａ）ＣＤＲＬ１は、アミノ酸位置２８、２９、３０、３１および３２の少なくとも１つ、２つ、３つ、４つまたはすべての位置に変異体アミノ酸を含み、（ｂ）ＣＤＲＬ２は、アミノ酸位置５０および５３の少なくとも１つまたは両方の位置に変異体アミノ酸を含み、（ｃ）ＣＤＲＬ３は、アミノ酸位置９１、９２、９３、９４および９６の少なくとも１つ、２つ、３つ、４つまたはすべての位置に変異体アミノ酸を含み、（ｄ）ＣＤＲＨ１は、アミノ酸位置２８、３０、３１、３２および３３の少なくとも１つ、２つ、３つ、４つまたはすべての位置に変異体アミノ酸を含み、（ｅ）ＣＤＲＨ２は、アミノ酸位置５０、５２、５３、５４、５６および５８の少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたはすべての位置に変異体アミノ酸を含み、（ｆ）ＣＤＲＨ３は、抗体４Ｄ５のアミノ酸位置９５、９６、９７、９８、９９、１００および１００ａに対応するアミノ酸位置の少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つまたはすべての位置に変異体アミノ酸を含み、前記アミノ酸位置は、カバットナンバリングシステムに対応し、（ａ）から（ｅ）の変異体アミノ酸のそれぞれは非ランダムコドンセットでコードされ、前記非ランダムコドンセットによってコードされるアミノ酸の少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはすべてが周知の抗体または抗体断片におけるその位置の対象アミノ酸である。これらのポリペプチドのいくつかの実施形態では、（ｆ）の少なくとも１つの変異体アミノ酸は、コドンセットＮＮＫ、ＮＮＳ、ＤＶＫ、ＸＹＺまたはＮＶＴによってコードされる。いくつかの実施形態では、前記ポリペプチドは抗体の重鎖および／または軽鎖可変ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤＲＨ３のアミノ酸位置１００ｂ、１００ｃ、１０１および１０２も変化させられる。
【００３６】
いくつかの実施形態では、本発明は抗体軽鎖と重鎖可変ドメインを含んでいるポリペプチドを提供し、（ａ）ＣＤＲＬ１は、アミノ酸位置２８、２９、３０、３１および３２の少なくとも１つ、２つ、３つ、４つまたはすべての位置に変異体アミノ酸を含み、（ｂ）ＣＤＲＬ２は、アミノ酸位置５０および５３の少なくとも１つまたは両方の位置に変異体アミノ酸を含み、（ｃ）ＣＤＲＬ３は、アミノ酸位置９１、９２、９３、９４および９６の少なくとも１つ、２つ、３つ、４つまたはすべての位置に変異体アミノ酸を含み、（ｄ）ＣＤＲＨ１は、アミノ酸位置２８、３０、３１、３２および３３の少なくとも１つ、２つ、３つ、４つまたはすべての位置に変異体アミノ酸を含み、（ｅ）ＣＤＲＨ２は、アミノ酸位置５０、５２、５３、５４、５６および５８の少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたはすべての位置に変異体アミノ酸を含み、（ｆ）ＣＤＲＨ３は、抗体４Ｄ５のアミノ酸位置９５、９６、９７、９８、９９、１００および１００ａに対応するアミノ酸位置の少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つまたはすべての位置に変異体アミノ酸を含み、前記アミノ酸位置は、カバットナンバリングシステムに対応し、（ａ）から（ｅ）の変異体アミノ酸のそれぞれは非ランダムコドンセットでコードされ、前記非ランダムコドンセットによってコードされるアミノ酸の少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはすべてが周知の抗体または抗体断片におけるそのアミノ酸位置の対象アミノ酸である。いくつかの実施形態では、（ｆ）の変異体アミノ酸はコドンセットＮＮＫ、ＮＮＳ、ＤＶＫ、ＸＹＺまたはＮＶＴによってコードされるか、またはトリプトファンまたはグリシンまたはそれらの混合物である。
【００３７】
いくつかの実施形態において、本発明はＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３からなる群から選択される少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたはすべてのＣＤＲを含んでいるポリペプチドを提供し、（ａ）ＣＤＲＬ１は、アミノ酸位置２８、２９、３０、３１および３２に変異体アミノ酸を含み、（ｂ）ＣＤＲＬ２は、アミノ酸位置５０および５３に変異体アミノ酸を含み、（ｃ）ＣＤＲＬ３は、アミノ酸位置９１、９２、９３、９４および９６に変異体アミノ酸を含み、（ｄ）ＣＤＲＨ１は、アミノ酸位置２８、３０、３１、３２および３３に変異体アミノ酸を含み、（ｅ）ＣＤＲＨ２は、アミノ酸位置５０、５２、５３、５４、５６および５８に変異体アミノ酸を含み、（ｆ）ＣＤＲＨ３は、抗体４Ｄ５のアミノ酸位置９５、９６、９７、９８、９９、１００および１００ａに対応するアミノ酸位置に変異体アミノ酸を含み、前記アミノ酸位置は、カバットナンバリングシステムに対応し、（ａ）から（ｅ）の変異体アミノ酸のそれぞれは非ランダムコドンセットでコードされ、前記非ランダムコドンセットによってコードされるアミノ酸の少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはすべてが周知の抗体または抗体断片におけるそのアミノ酸位置の対象アミノ酸である。いくつかの実施形態では、（ｅ）の変異体アミノ酸はコドンセットＮＮＫ、ＮＮＳ、ＤＶＫ、ＸＹＺまたはＮＶＴによってコードされるか、またはトリプトファンまたはグリシンまたはそれらの混合物である。
【００３８】
他の実施形態において、本発明はＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３からなる群から選択される少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたはすべてのＣＤＲを含んでいるポリペプチドを提供し、（ａ）ＣＤＲＬ１は、アミノ酸位置２８、２９、３０、３１および３２に変異体アミノ酸を含み、（ｉ）位置２８の変異体アミノ酸はコドンセットＲＤＴによってコードされ、（ｉｉ）位置２９の変異体アミノ酸はコドンセットＲＫＴまたはＲＴＴによってコードされ、（ｉｉｉ）位置３０の変異体アミノ酸はコドンセットＲＶＷによってコードされ、（ｉｖ）位置３１の変異体アミノ酸はコドンセットＲＶＷまたはＡＮＷによってコードされ、（ｖ）位置３２の変異体アミノ酸はコドンセットＤＨＴまたはＴＨＴによってコードされ、（ｂ）ＣＤＲＬ２は、アミノ酸位置５０および５３に変異体アミノ酸を含み、（ｉ）位置５０の変異体アミノ酸はコドンセットＫＢＧによってコードされ、（ｉｉ）位置５３の変異体アミノ酸はコドンセットＡＶＣによってコードされ、（ｃ）ＣＤＲＬ３は、アミノ酸位置９１、９２、９３、９４および９６に変異体アミノ酸を含み、（ｉ）位置９１の変異体アミノ酸はコドンセットＫＭＴまたはＴＭＴまたはコドンセットＴＭＴとＳＲＴの組合せによってコードされ、（ｉｉ）位置９２の変異体アミノ酸はコドンセットＤＨＴまたはＤＭＣによってコードされ、（ｉｉｉ）位置９３の変異体アミノ酸はコドンセットＲＶＴまたはＤＨＴによってコードされ、（ｉｖ）位置９４の変異体アミノ酸はコドンセットＮＨＴまたはＷＨＴによってコードされ、（ｖ）位置９６の変異体アミノ酸はコドンセットＹＨＴ、ＨＷＴ、ＨＴＴまたはＴＤＫまたはコドンセットＹＫＧとＴＷＴの組合せによってコードされ、（ｄ）ＣＤＲＨ１は、アミノ酸位置２８、３０、３１、３２および３３に変異体アミノ酸を含み、（ｉ）位置２８の変異体アミノ酸はコドンセットＡＶＴまたはＷＣＣによってコードされるか、あるいはトレオニンであり、（ｉｉ）位置３０の変異体アミノ酸はコドンセットＲＶＭまたはＡＶＴによってコードされ、（ｉｉｉ）位置３１の変異体アミノ酸はコドンセットＲＶＭ、ＲＶＴまたはＲＲＴによってコードされ、（ｉｖ）位置３２の変異体アミノ酸はコドンセットＷＭＹによってコードされ、（ｖ）位置３３の変異体アミノ酸はコドンセットＫＶＫ、ＲＮＴ、ＤＭＴ、ＫＭＴ、ＫＧＧまたはコドンセットＫＭＴとＫＧＧの組合せによってコードされ、（ｅ）ＣＤＲＨ２は、アミノ酸位置５０、５２、５３、５４、５６および５８に変異体アミノ酸を含み、（ｉ）位置５０の変異体アミノ酸はコドンセットＫＤＫまたはＤＢＧまたはコドンセットＤＧＧとＤＨＴの組合せによってコードされ、（ｉｉ）位置５２の変異体アミノ酸はコドンセットＤＨＴまたはＤＭＴによってコードされ、（ｉｉｉ）位置５３の変異体アミノ酸はコドンセットＮＭＴまたはＤＭＴによってコードされ、（ｉｖ）位置５４の変異体アミノ酸はコドンセットＤＭＫ、ＤＭＴまたはＲＲＣによってコードされ、（ｖ）位置５６の変異体アミノ酸はコドンセットＤＭＫまたはＤＭＴによってコードされ、（ｖｉ）位置５８の変異体アミノ酸はコドンセットＤＭＴまたはＤＡＣによってコードされ、（ｆ）ＣＤＲＨ３は、アミノ酸位置９５、９６、９７、９８、９９、１００および１００ａに変異体アミノ酸を含み、アミノ酸位置９５、９６、９７、９８、９９、１００および１００ａの各位置の変異体アミノ酸はコドンセットＮＮＫ、ＮＮＳ、ＸＹＺ、ＤＶＫまたはＮＶＴによってコードされるか、あるいはトリプトファンまたはグリシンまたはそれらの混合物であり、前記アミノ酸位置は、カバットナンバリングシステムに対応する。いくつかの実施形態では、前記ポリペプチドは抗体の重鎖および／または軽鎖可変ドメインを含む。
【００３９】
変異体ＣＤＲＨ３を含むポリペプチドのいくつかの実施形態では、この変異体ＣＤＲＨ３は、抗体４Ｄ５の９５から１００ａのアミノ酸位置に対応するアミノ酸位置の少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つまたはすべての位置に変異体アミノ酸を含み、アミノ酸位置はカバットナンバリングシステムに対応する。いくつかの実施形態では、変異体ＣＤＲＨ３の変異体アミノ酸は、コドンセットＮＮＫ、ＸＹＺ、ＮＮＳ、ＤＶＫまたはＮＶＴによってコードされるアミノ酸であるか、またはトリプトファンまたはグリシンまたはそれらの混合物である。本発明のポリペプチドのいくつかの実施形態では、ＣＤＲＨ３の位置１００ａの変異体アミノ酸は、ＮＮＳ、ＮＶＴ、ＤＶＫ、ＸＹＺによってコードされるか、またはチロシン、フェニルアラニン、グリシン、セリン、アラニン、トリプトファン、アスパラギン酸、メチオニンもしくはバリンである。いくつかの実施形態では、ＣＤＲＨ３は、抗体４Ｄ５のアミノ酸位置１００ｂ、１００ｃ、１０１および１０２に対応するアミノ酸位置に変異体アミノ酸を有する。
【００４０】
本発明のポリペプチドの様々な実施形態では、好ましくは非ランダムコドンセットによってコードされるアミノ酸には、公知の抗体または抗原結合断片の好ましくは少なくとも約５０％、６０％または７０％の対応する位置で見られるアミノ酸が含まれる（通常はこれらである）。いくつかの実施形態では、前記公知の抗体または抗原結合断片は、米国国立衛生研究所によって出版された「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」（第５版）にあるようなものである。いくつかの実施形態では、前記公知の抗体または抗原結合断片は、カバットのデータベース（ｈｔｔｐ：ｉｍｍｕｎｏ／ｂｍｅ／ｎｗｕ／ｅｄｕ）にあるようなものである。
【００４１】
本発明のポリペプチドのいくつかの実施形態では、非ランダムコドンセットはシステインをコードしない。いくつかの実施形態では、非ランダムコドンセットは終止コドンを含まない。
【００４２】
本明細書で記載されているように、変異体ＣＤＲは、単一の参照ポリペプチド／ソース抗体の対応するＣＤＲと比較して、配列の変異を有するＣＤＲを指す。したがって、本発明の単一のポリペプチドのＣＤＲは、好ましくは単一の参照ポリペプチドまたはソース抗体のＣＤＲセットに対応する。
【００４３】
本発明のポリペプチドは、ポリペプチドの対象結合機能が保持される限り様々な形態をとることができる。いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチドは融合ポリペプチド（すなわち、異種ポリペプチドからの２つ以上の配列の融合）である。いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドはウイルスコートタンパク質、例えばｐＩＩＩ、ｐＶＩＩＩ、Ｓｏｃ、Ｈｏｃ、ｇｐＤ、ｐＶＩおよびその変異体からなる群から選択されるウイルスコートタンパク質の少なくとも一部と融合する。
【００４４】
いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチドは軽鎖および重鎖抗体可変ドメインを含み、この軽鎖可変ドメインはＣＤＲＬ１、Ｌ２およびＬ３からなる群から選択される少なくとも１つ、２つまたは３つの変異体ＣＤＲを含み、重鎖可変ドメインはＣＤＲＨ１、Ｈ２およびＨ３からなる群から選ばれる少なくとも１つ、２つまたは３つの変異体ＣＤＲを含む。
【００４５】
いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチドは、ＳｃＦｖである。いくつかの実施形態では、それはＦａｂ断片である。いくつかの実施形態では、それはＦ（ａｂ）２またはＦ（ａｂ’）２である。したがって、いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチドはさらに二量体化ドメインを含む。いくつかの実施形態では、前記二量体化ドメインは抗体の重鎖または軽鎖の可変ドメインとウイルスコートタンパク質の少なくとも一部との間に位置する。この二量体化ドメインは、二量体化配列の少なくとも１つ、および／または１つまたは複数のシステイン残基を含む配列を含んでいてもよい。この二量体化ドメインは、好ましくは重鎖可変ドメインまたは定常ドメインのＣ末端と連結している。二量体化ドメインは、前記抗体可変ドメインがウイルスのコートタンパク質成分との融合タンパク質成分として作製されている（二量体化ドメインの後にアンバー終止コドンを有さない）かどうかにより、または、前記抗体可変ドメインが主にウイルスコートタンパク質成分を含まずに作製されている（例えば、二量体化ドメインの後にアンバー終止コドンを有す）かどうかにより、様々な構造をとることができる。前記抗体可変ドメインが主にウイルスのコートタンパク質成分との融合タンパク質として作製されるとき、１つまたは複数のジスルフィド結合および／または単一の二量体化配列が二価提示をもたらす。主にウイルスのコートタンパク質成分と融合されずに作製される抗体可変ドメイン（例えば、アンバー終止を有す）の場合、システイン残基と二量体化配列の両方を含んでいる二量体化ドメインを持つことが好ましい。いくつかの実施形態では、Ｆ（ａｂ）２の重鎖は、ヒンジ領域を含まない二量体化ドメインで二量体化する。この二量体化ドメインは、ロイシンジッパー配列（例えば、配列番号３で表されたＧＣＮ４配列）を含んでもよい。
【００４６】
いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチドは軽鎖可変ドメインに融合した軽鎖定常ドメインをさらに含み、いくつかの実施形態ではこのドメインは少なくとも１つ、２つまたは３つの変異体ＣＤＲを含む。本発明のポリペプチドのいくつかの実施形態では、ポリペプチドは重鎖可変ドメインに融合したＨ鎖定常ドメインを含み、いくつかの実施形態ではこのドメインは少なくとも１つ、２つまたは３つの変異体ＣＤＲを含む。
【００４７】
いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチドは抗体軽鎖可変ドメインを含み、変異体ＣＤＲはＣＤＲＬ１であり、多様化されたアミノ酸位置はアミノ酸位置２８、２９、３０、３１および３２に対応する位置である。いくつかの実施形態では、位置２８の変異体アミノ酸はコドンセットＲＤＴによってコードされ、位置２９の変異体アミノ酸はコドンセットＲＫＴまたはＲＴＴによってコードされ、位置３０の変異体アミノ酸はコドンセットＲＶＷによってコードされ、位置３１の変異体アミノ酸はコドンセットＲＶＷまたはＡＮＷによってコードされ、位置３２の変異体アミノ酸はコドンセットＤＨＴまたはＴＨＴによってコードされる。一実施形態では、位置３０のアミノ酸はアスパラギンまたはセリンである。
【００４８】
他の実施形態では、本発明のポリペプチドは抗体軽鎖可変ドメインを含み、変異体ＣＤＲはＣＤＲＬ２であり、多様化されたアミノ酸位置はアミノ酸位置５０および５３に対応する位置である。いくつかの実施形態では、位置５０の変異体アミノ酸はコドンセットＫＢＧによってコードされ、位置５３の変異体アミノ酸はコドンセットＡＶＣによってコードされる。
【００４９】
他の実施形態では、本発明のポリペプチドは抗体軽鎖可変ドメインを含み、変異体ＣＤＲはＣＤＲＬ３であり、多様化されたアミノ酸位置はアミノ酸位置９１、９２、９３、９４または９６に対応する位置から選択される。いくつかの実施形態では、位置９１の変異体アミノ酸はコドンセットＫＭＴ、ＴＭＴまたはコドンセットＴＭＴとＳＲＴの組合せによってコードされ、位置９２の変異体アミノ酸はコドンセットＤＨＴまたはＤＭＣによってコードされ、位置９３の変異体アミノ酸はコドンセットＲＶＴまたはＤＨＴによってコードされ、位置９４の変異体アミノ酸はコドンセットＮＨＴまたはＷＨＴによってコードされ、位置９６の変異体アミノ酸はコドンセットＹＨＴ、ＨＷＴ、ＨＴＴまたはコドンセットＹＫＧとＴＷＴの組合せによってコードされる。一実施形態では、アミノ酸位置９１はヒスチジンまたはセリンである。
【００５０】
他の実施形態では、本発明のポリペプチドは重鎖可変ドメインを含み、変異体ＣＤＲはＣＤＲＨ１であり、多様化されたアミノ酸位置はアミノ酸２８、３０、３１、３２または３３に対応するアミノ酸位置から選択された位置である。いくつかの実施形態では、位置２８の変異体アミノ酸はコドンセットＡＶＴまたはＷＣＣによってコードされるか、あるいはトレオニンであり、位置３０の変異体アミノ酸はコドンセットＲＶＭまたはＡＶＴによってコードされ、位置３１の変異体アミノ酸はコドンセットＲＶＭ、ＲＶＴまたはＲＲＴによってコードされ、位置３２の変異体アミノ酸はコドンセットＷＭＹによってコードされ、位置３３の変異体アミノ酸はコドンセットＫＶＫ、ＲＮＴ、ＤＭＴ、ＫＭＴ、またはコドンセットＫＭＴとＫＧＧの組合せによってコードされる。
【００５１】
他の実施形態では、本発明のポリペプチドは重鎖可変ドメインを含み、変異体ＣＤＲはＣＤＲＨ２であり、多様化されたアミノ酸位置はアミノ酸５０、５２、５３、５４、５６または５８に対応するアミノ酸位置から選択された位置である。いくつかの実施形態では、位置５０の変異体アミノ酸はコドンセットＫＤＫ、ＤＢＧまたはコドンセットＤＧＧとＤＨＴの組合せによってコードされ、位置５２の変異体アミノ酸はコドンセットＤＨＴまたはＤＭＴによってコードされ、位置５３の変異体アミノ酸はコドンセットＮＭＴまたはＤＭＴによってコードされ、位置５４の変異体アミノ酸はコドンセットＤＭＫ、ＤＭＴまたはＲＲＣによってコードされ、位置５６の変異体アミノ酸はコドンセットＤＭＫまたはＤＭＴによってコードされ、位置５８の変異体アミノ酸はコドンセットＤＭＴまたはＤＡＣによってコードされる。
【００５２】
他の実施形態では、本発明のポリペプチドは重鎖可変ドメインを含み、変異体ＣＤＲは、アミノ酸位置９５から１００ａの少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つまたはすべての位置に変異体アミノ酸を含んでいるＣＤＲＨ３であり、この変異体アミノ酸はコドンセットＮＮＫ、ＮＮＳ、ＸＹＺ、ＤＶＫまたはＮＶＴによってコードされるか、あるいはトリプトファンもしくはグリシンもしくはその混合物である。
【００５３】
いくつかの場合には、参照ポリペプチドまたはソース抗体に関して変異体であるように、フレームワーク残基を突然変異させることが好ましいこともある。例えば、重鎖のフレームワーク残基７１は、アミノ酸Ｒ、ＶまたはＡでよい。他の実施例では、重鎖のフレームワーク残基９３は、アミノ酸ＳまたはＡでよい。他の実施例では、重鎖のフレームワーク残基９４は、アミノ酸Ｒ、ＫまたはＴでよく、あるいはＭＲＴでコードされてよい。他の実施例では、重鎖のフレームワーク残基４９は、アミノ酸ＡまたはＧでよい。軽鎖のフレームワーク残基も突然変異させることができる。例えば、軽鎖のフレームワーク残基６６は、アミノ酸ＲまたはＧでよい。
【００５４】
本明細書で記載されている変異体ＣＤＲは、単一の参照ポリペプチド／ソース抗体の対応するＣＤＲと比較して、配列の変異を有するＣＤＲを指す。したがって、本発明の単一のポリペプチドのＣＤＲは、好ましくは単一の参照ポリペプチドまたはソース抗体のＣＤＲセットに対応する。本発明のポリペプチドは、変異体ＣＤＲのいずれか１つまたは組合せを含んでもよい。例えば、本発明のポリペプチドは、変異体ＣＤＲＨ１およびＣＤＲＨ２を含んでもよい。本発明のポリペプチドは、変異体ＣＤＲＨ１、変異体ＣＤＲＨ２および変異体ＣＤＲＨ３を含んでもよい。他の実施例では、本発明のポリペプチドは、変異体ＣＤＲＨ１、Ｈ２、Ｈ３およびＬ３を含んでもよい。他の実施例では、本発明のポリペプチドは、変異体ＣＤＲＬ１、Ｌ２およびＬ３を含む。本発明のいずれのポリペプチドでも、さらに変異体ＣＤＲＬ３を含んでもよい。本発明のいずれのポリペプチドでも、さらに変異体ＣＤＲＨ３を含んでもよい。
【００５５】
本発明のポリペプチドは、互いに複合体を形成してもよい。例えば、本発明は２つのポリペプチドを含んでいるポリペプチド複合体を提供し、各ポリペプチドは本発明のポリペプチドであり、前記ポリペプチドの１つは変異体ＣＤＲＨ１、Ｈ２およびＨ３の少なくとも１つ、２つまたはすべてを含み、他のポリペプチドは変異体ＣＤＲＬ３を含む。ポリペプチド複合体は第１および第２のポリペプチドを含み（第１および第２のポリペプチドは本発明のポリペプチドである）、第１のポリペプチドは軽鎖変異体ＣＤＲの少なくとも１つ、２つまたは３つを含み、第２のポリペプチドは重鎖変異体ＣＤＲの少なくとも１つ、２つまたは３つを含む。本発明は、同じ変異体ＣＤＲ配列を含むポリペプチド複合体も提供する。複合化はいかなる適当な手法によってでも可能であり、これには本明細書で記載されているような二量体化／多量体化ドメインにおける二量体化／多量体化、または共有結合的相互作用（例えばジスルフィド結合を通して）（ある意味合いでは二量体化ドメインの一部であり、例えば二量体化ドメインはロイシンジッパー配列およびシステインを含んでもよい）が含まれる。
【００５６】
他の態様において、本発明は本発明のポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドを含んでいる組成物を提供する。例えば、本発明は本明細書に記載されている本発明のポリペプチドのいずれかを複数含んでいる組成物を提供する。前記複数のポリペプチドは、変異体アミノ酸をコードしている配列に縮退を含む一組のオリゴヌクレオチドで作製された複数のポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチドを含むことができ、前記縮退は前記変異体アミノ酸をコードしている非ランダムコドンセットの複数のコドン配列のそれである。
【００５７】
一態様では、本発明は本明細書で記載されている本発明のポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを提供する。本発明のポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドをコードしている配列を含んでいる複製可能な発現ベクターでもよい。
【００５８】
他の態様において、本発明は本発明の複数のベクターを含んでいるライブラリーを提供し、この複数のベクターは複数のポリペプチドをコードする。
【００５９】
本発明は、本明細書で記載されている本発明のポリヌクレオチドおよび／またはベクターのいずれかを含んでいる宿主細胞も提供する。
【００６０】
他の態様において、本発明は本発明のポリペプチドをその表面で提示するウイルスまたはウイルス粒子（例えば、ファージまたはファージミド粒子）を提供する。本発明は、本発明のポリペプチドをそれぞれ提示している本発明の複数のウイルスまたはウイルス粒子を含んでいるライブラリーも提供する。本発明のライブラリーは異なったポリペプチド（配列）をいくつでも含むことができ、好ましくは少なくとも約１×１０８、好ましくは少なくとも約１×１０９、好ましくは少なくとも約１×１０１０の異なる配列を含むことができる。
【００６１】
本発明は複数のポリペプチドを含んでいるライブラリーも提供し、各種類のポリペプチドは本明細書で記載されている本発明のポリペプチドである。
【００６２】
他の態様において、本発明は特異的対象抗原に対する高親和性結合体を選択する方法を提供し、この対象抗原には成長ホルモン、ウシ成長ホルモン、インスリン様成長因子、ｎ−メチオニルヒト成長ホルモンを含むヒト成長ホルモン、副甲状腺ホルモン、チロキシン、インスリン、プロインスリン、アミリン、リラキシン、プロリラキシン、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）などの糖タンパクホルモン、造血成長因子、線維芽細胞成長因子、プロラクチン、胎盤性ラクトゲン、腫瘍壊死因子、ミュラー管抑制物質、マウスゴナドトロピン関連のポリペプチド、インヒビン、アクチビン、血管内皮細胞増殖因子、インテグリン、ＮＧＦ−βのような神経成長因子、インスリン様成長因子−ＩおよびＩＩ、エリスロポイエチン、骨誘導因子、インターフェロン、コロニー刺激因子、インターロイキン、骨形成タンパク質、ＬＩＦ、ＳＣＦ、ＦＬＴ−３リガンドおよびキット−リガンドが含まれる。
【００６３】
本発明の方法は、１つまたは複数の多様化されたＣＤＲ領域を有するポリペプチド（例えば、抗体可変ドメイン）のライブラリーを提供する。これらのライブラリーは、対象抗原に結合する高親和性結合体を同定するために選別（選択）および／またはスクリーニングが行われる。一態様では、このライブラリーからのポリペプチド結合体は、対象抗原への結合に関し、および親和性に関して選択される。これらの選抜方策の１つまたは複数を使って選択されたポリペプチド結合体は、次に親和性および／または特異性（対象抗原だけに結合して非対象抗原には結合しない性質）に関してスクリーニングしてもよい。
【００６４】
一方法では、１つまたは複数の多様化ＣＤＲ領域を有する複数のポリペプチドを作製し、この複数のポリペプチドを結合にふさわしい条件下で対象抗原と接触させることにより対象抗原に結合する結合体に関してこの複数のポリペプチドを選別し、前記対象抗原に結合する前記結合体を結合しないものから分離し、この結合体を単離し、この高親和性結合体を同定する。対象抗原と結合する結合体の親和性は、本明細書で記載されているような競合ＥＬＩＳＡを使って測定できる。任意選択に、ポリペプチドはポリペプチドタグ、例えば対象抗原の選別と組み合わせて結合体を選別するために使用することができるｇＤ、ｐｏｌｙ ｈｉｓまたはＦＬＡＧと融合させることもできる。
【００６５】
他の実施形態は、抗体可変ドメインのライブラリーからの対象抗原に結合する抗体可変ドメインを選択する方法を提供し、ａ）請求項１から９および１７から４４のいずれかに記載されている複数のポリペプチドを含んでいる複製可能な発現ベクターのライブラリーを作製するステップと、ｂ）このライブラリーを結合に適した条件下で固定化対象抗原と接触させることによって、このライブラリーから対象抗原に結合するポリペプチド結合体を単離するステップと、ｃ）前記ライブラリーのポリペプチド結合体を非結合体から分離して前記対象抗原から結合体を溶出させるステップと、ｄ）前記ポリペプチド結合体を有する複製可能な発現ベクターを増幅するステップと、ｅ）任意選択でａ〜ｄのステップを少なくとも２回繰り返すステップとを含む。
【００６６】
この方法は、さらに、ｆ）ポリペプチド結合体を含んでいる増幅された複製可能な発現ベクターを、結合して混合物を形成するのに適した条件下で、０．１ｎＭから１０００ｎＭの濃度の標識された対象抗原とインキュベートするステップと、ｇ）前記混合物を前記対象抗原上の標識と結合する固定化因子と接触させるステップと、ｈ）標識された対象抗原と結合した前記ポリペプチド結合体を分離して、前記標識された対象抗原からこのポリペプチド結合体を溶出させるステップと、ｉ）前記ポリペプチド結合体を含む複製可能な発現ベクターを増幅するステップと、ｊ）任意選択に、各回より低い濃度の標識された対象抗原を用いてｆ）からｉ）のステップを少なくとも２回繰り返すステップとを含んでもよい。任意選択に、この方法は、前記混合物に過剰な量の非標識対象抗原を加え、標識された対象抗原から低親和性結合体を溶出させるのに十分な時間インキュベートするステップを含んでもよい。
【００６７】
他の実施形態は、対象抗原に結合する高親和性結合体を複製可能な発現ベクターのライブラリーから単離または選択する方法を提供し、この方法は、ａ）請求項１から９および１７から４４のいずれかに記載されている複数のポリペプチドを含んでいる複製可能な発現ベクターのライブラリーを作製するステップと、ｂ）このライブラリーを、対象抗原に結合するポリペプチド結合体を単離するために、少なくとも約０．１ｎＭから１０００ｎＭの濃度の前記対象抗原と接触させるステップと、ｃ）前記ポリペプチド結合体を前記対象抗原から分離してこのポリペプチド結合体を含んでいる複製可能な発現ベクターを増幅するステップと、ｄ）任意選択に、最も低い濃度の対象抗原と結合するポリペプチド結合体を単離するために、各回、より低い濃度の対象抗原でａからｃのステップを少なくとも２回繰り返すステップと、ｅ）前記ポリペプチド結合体をいくつか異なる希釈の前記対象抗原とインキュベートしてこのポリペプチド結合体のＩＣ５０を求めることにより、最も低い濃度の対象抗原と結合するポリペプチド結合体から高親和性のものを選択するステップと、ｆ）約０．１ｎＭから２００ｎＭの対象抗原に対する親和性を有するポリペプチド結合体を同定するステップとを含む。
【００６８】
他の実施形態は、請求項１から９および１７から４４のいずれかに記載されている複数のポリペプチドを含んでいる複製可能な発現ベクターのライブラリーからポリペプチド結合体を選択するための検定法を提供し、この方法は、ａ）前記ライブラリーを、結合してポリペプチド結合体と標識された対象抗原の複合体を形成するのに適した条件下で０．１ｎＭから１０００ｎＭの濃度のこの標識された対象抗原と接触させるステップと、ｂ）複合体を単離して、前記標識された対象抗原から前記ポリペプチド結合体を分離するステップと、ｃ）前記ポリペプチド結合体を含む複製可能な発現ベクターを増幅するステップと、ｄ）任意選択に、各回、より低い濃度の対象抗原を用いてａ）からｃ）のステップを少なくとも２回繰り返すステップとを含む。任意選択に、この方法はさらに、前記ポリペプチド結合体と対象抗原の複合体に過剰な量の非標識対象抗原を加えるステップを含んでもよい。好ましい一実施形態ではこの方法のステップは２回繰り返され、第１回目の選択における対象の濃度は約１００ｎＭから２５０ｎＭであり、第２回目の選択では約２５ｎＭから１００ｎＭであり、第３回目の選択では約０．１ｎＭから２５ｎＭである。
【００６９】
本発明は、請求項１から９および１７から４４のいずれかに記載されている複数のポリペプチドを含んでいる複製可能な発現ベクターのライブラリーをスクリーニングする方法も提供し、この方法は、ａ）まず、前記ポリペプチドと対象抗原との結合に適した条件下で前記ライブラリーの試料をある濃度の対象抗原とインキュベートするステップと、ｂ）前記ライブラリーの第２の試料を、対象抗原を加えないでインキュベートするステップと、ｃ）第１と第２の試料のそれぞれを、前記ポリペプチドと固定化対象抗原との結合に適した条件下でこの固定化対象抗原と接触させるステップと、ｄ）各試料について、固定化対象抗原に結合したポリペプチドの量を検出するステップと、ｅ）第１の試料の結合したポリペプチドの量と第２の試料の結合したポリペプチドの量の比率を計算することによって、前記対象抗原に対するポリペプチドの親和性を測定するステップとを含む。
【００７０】
本明細書で記載されているように作製されたライブラリーは、特異的対象への結合および非対象抗原への非結合に関してスクリーニングすることもできる。一態様では、他の実施形態は抗体可変ドメインのライブラリーから特異的対象抗原に結合する抗体可変ドメインを選抜する方法を提供し、この方法は、ａ）請求項１から９および１７から４４のいずれかに記載されている複数のポリペプチドを含んでいる複製可能な発現ベクターのライブラリーを作製するステップと、ｂ）前記ライブラリーを、結合に適した条件下で対象抗原および少なくとも１つの非対象抗原と接触させるステップと、ｃ）前記ライブラリーのポリペプチド結合体を非結合体から分離するステップと、ｄ）前記対象抗原と結合し、前記非対象抗原とは結合しない結合体を同定するステップと、ｅ）前記結合体を前記対象抗原から溶出するステップと、ｆ）この特異的抗原に結合するポリペプチド結合体を含んでいる複製可能な発現ベクターを増幅するステップとを含む。
【００７１】
前記選別／選択法のいずれの組合せを前記スクリーニング法と組み合わせることができる。例えば、一実施形態ではポリペプチド結合体は、まず固定化対象抗原への結合に関して選択される。前記固定化対象抗原と結合するポリペプチド結合体は、次に増幅して、この対象抗原との結合および非対象抗原への非結合に関してスクリーニングすることができる。特異的に対象抗原と結合するポリペプチド結合体を増幅する。これらのポリペプチド結合体は次に、複合体を形成するある濃度の標識された対象抗原と接触させることにより、より高い親和性に関して選択でき、標識された対象抗原の濃度域は約０．１ｎＭから約１０００ｎＭであり、この複合体は対象抗原上の標識と結合する因子との接触によって単離される。このポリペプチド結合体は次に、標識された対象抗原から溶出され、また各回、より低い濃度の標識された対象抗原を用いて選択を繰り返すこともできる。この選択方法を使用して単離された高親和性ポリペプチド結合体は、次に、例えば実施例８に記載されている溶相ＥＬＩＳＡ検定法、または実施例９に記載されている点競合ＥＬＩＳＡ検定法を用いて高親和性に関してスクリーニングすることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００７２】
本発明は、抗体可変ドメイン配列、および通常多数の多様化された抗体可変ドメイン配列を含むライブラリーを多様化するための、新規で体系的な方法を提供する。そのようなライブラリーは、例えば望ましい活性、例えば結合親和性およびアビディティーのある合成の抗体クローンを選別および／またはスクリーニングするために役立つ、組合せライブラリーを提供する。これらのライブラリーは、多種多様な対象抗原のいずれかと相互作用することのできる免疫グロブリンポリペプチド配列を同定するために有用である。例えば、ファージディスプレイとして発現する本発明の多様化された免疫グロブリンポリペプチドを含んでいるライブラリーは、関心の抗原結合分子の選択および／またはスクリーニングに特に有用であり、またそのための高スループットの、効率的で自動化可能な系を提供する。本発明の方法は、ソースまたは鋳型分子に最小限の変更を加えて対象抗原に結合する高親和性結合体を提供するようになっており、抗体または抗原結合断片が細胞培養で生産されるときに良好な生産効率を可能にする。
【００７３】
定義
アミノ酸は本明細書では１文字コードまたは３文字コード、またはその両方で表記されている。
【００７４】
用語「親和性精製」は、化学物質または結合パートナーへ分子が特異的に誘引または結合され、その結果パートナーに結合または誘引されたままの状態でその分子が不純物から分離されるような組合せまたは複合体の形成に基づく分子の精製を意味する。
【００７５】
用語「抗体」は最も広義で使われており、具体的には、それらが所望の生物学的活性を示す限り、単一のモノクローナル抗体（アゴニストおよびアンタゴニスト抗体を含む）、多エピトープ特異性を有する抗体組成物、親和性成熟抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体ならびに抗原結合断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖおよびＦｖ）をカバーする。
【００７６】
本明細書で使われるように、「抗体可変ドメイン」は相補性決定領域（ＣＤＲ；すなわち、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３）ならびにフレームワーク領域（ＦＲ）のアミノ酸配列を含む、抗体分子の軽鎖および重鎖の部分を指す。ＶＨは重鎖の可変ドメインを指す。ＶＬは軽鎖の可変ドメインを指す。本発明で使用されている方法によると、ＣＤＲとＦＲに割り当てられるアミノ酸位置はカバットに従って規定される（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．、１９８７年および１９９１年）。抗体または抗原結合断片のアミノ酸のナンバリングも、カバットのそれに準じる。
【００７７】
本明細書で使われるように、用語「相補性決定領域（ＣＤＲ；すなわち、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３）は、抗原結合のために存在している必要がある抗体可変ドメインのアミノ酸残基を指す。各可変ドメインは、一般的にＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３と同定される３つのＣＤＲ領域を持つ。各相補性決定領域はカバットが記載しているような「相補性決定領域」からのアミノ酸残基（すなわち、軽鎖可変ドメインの残基約２４〜３４（Ｌ１）、５０〜５６（Ｌ２）、および８９〜９７（Ｌ３）ならびに重鎖可変ドメインの３１〜３５（Ｈ１）、５０〜６５（Ｈ２）および９５〜１０２（Ｈ３）；Ｋａｂａｔ他、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ．（１９９１））、および／または「超可変ループ」からの残基（すなわち、軽鎖可変ドメインの残基約２６〜３２（Ｌ１）、５０〜５２（Ｌ２）および９１〜９６（Ｌ３）ならびに重鎖可変ドメインの２６〜３２（Ｈ１），５３〜５５（Ｈ２）および９６〜１０１（Ｈ３）；ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１〜９１７頁（１９８７））を含んでもよい。いくつかの場合には、相補性決定領域はカバットの記載により定義されているＣＤＲ領域および超可変ループの両方からのアミノ酸を含むことができる。例えば、抗体４Ｄ５の重鎖のＣＤＲＨ１は、アミノ酸２６〜３５を含む。
【００７８】
「フレームワーク領域」（以下ＦＲと称す）は、ＣＤＲ残基以外の可変ドメイン残基である。各可変ドメインは、一般的にＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４と同定される４つのＦＲを持つ。ＣＤＲがカバットの定義に従うならば、軽鎖ＦＲ残基は残基約１〜２３（ＬＣＦＲ１）、３５〜４９（ＬＣＦＲ２）、５７〜８８（ＬＣＦＲ３）および９８〜１０７（ＬＣＦＲ４）に位置し、重鎖ＦＲ残基は重鎖残基の残基約１〜３０（ＨＣＦＲ１）、３６〜４９（ＨＣＦＲ２）、６６〜９４（ＨＣＦＲ３）および１０３〜１１３（ＨＣＦＲ４）に位置する。ＣＤＲが超可変ループからのアミノ酸残基を含むならば、軽鎖ＦＲ残基は軽鎖の残基約１〜２５（ＬＣＦＲ１）、３３〜４９（ＬＣＦＲ２）、５３〜９０（ＬＣＦＲ３）および９７〜１０７（ＬＣＦＲ４）に位置し、重鎖ＦＲ残基は重鎖残基の残基約１〜２５（ＨＣＦＲ１）、３３〜５２（ＨＣＦＲ２）、５６〜９５（ＨＣＦＲ３）および１０２〜１１３（ＨＣＦＲ４）に位置する。いくつかの場合には、ＣＤＲがカバットの定義によるＣＤＲと超可変ループのそれの両方からのアミノ酸を含む場合、ＦＲ残基はそれに応じて調節される。例えば、ＣＤＲＨ１がアミノ酸Ｈ２６−Ｈ３５を含むとき、重鎖ＦＲ１残基は位置１〜２５にあり、ＦＲ２残基は位置３６〜４９にある。
【００７９】
本明細書で使われるように、「コドンセット」は所望の変異体アミノ酸をコードするのに用いられる、一組の異なるヌクレオチドトリプレット配列を指す。一組のオリゴヌクレオチドは、コドンセットによって提供されるヌクレオチドトリプレットの可能な組合せのすべてを表す配列であって所望のアミノ酸群をコードする配列を含み、例えば固相法によって合成することができる。標準的なコドン指定形式はＩＵＢコードのそれであり、このコードは当技術分野で公知であり本明細書で記載されている。コドンセットは、一般的に３つのイタリック大文字、例えばＮＮＫ、ＮＮＳ、ＸＹＺ、ＤＶＫなどで表される。このように、本明細書で使われるように、「非ランダムコドンセット」は、本明細書で記載されているアミノ酸選択のための基準を部分的に、好ましくは完全に満たす選択されたアミノ酸をコードするコドンセットを指す。ある位置の選択されたヌクレオチド「縮退」を有するオリゴヌクレオチドの合成は当技術分野で公知であり、例えば、ＴＲＩＭ手法が知られている（Ｋｎａｐｐｅｋ他、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９９）、２９６：５７〜８６頁）；ＧａｒｒａｒｄおよびＨｅｎｎｅｒ、Ｇｅｎｅ（１９９３）、１２８：１０３頁）。そのようなある種のコドンセットを有しているオリゴヌクレオチドのセットは、市販の核酸シンセサイザー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡなどから入手可能）を使って合成することができ、または市販品を入手することができる（例えば、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤから）。したがって、特定のコドンセットを有する合成オリゴヌクレオチドセットは、一般的に異なる配列の複数のオリゴヌクレオチドを含み、この相違は配列全体の中のコドンセットによるものである。本発明で使用されるように、オリゴヌクレオチドは可変ドメイン核酸テンプレートへのハイブリダイゼーションを可能にする配列を有し、また、そうするとは限らないが、例えばクローニングに役立つ制限酵素部位を含むこともできる。
【００８０】
「Ｆｖ」断片は、完全な抗原認識および結合部位を含む抗体断片である。この領域は、堅く結合した重鎖可変ドメイン１つと軽鎖可変ドメイン１つの二量体から成り、その結合は自然界では例えばｓｃＦｖにおけるように共有結合である。各可変ドメインの３つのＣＤＲが相互作用してＶＨ−ＶＬ二量体の表面の抗原結合部位を確定するのはこの構成である。この６つのＣＤＲまたはそのサブセットは、共同して抗体に抗原結合特異性を賦与する。しかし、単一の可変ドメイン（または抗原に特異的なＣＤＲを３つしか含んでいないＦｖの半分）でさえ、通常は結合部位全体より親和性は低いものの、抗原を認識して結合する能力を有する。
【００８１】
「Ｆａｂ」断片は、軽鎖の可変および定常ドメインと重鎖の可変ドメインおよび第１の定常ドメイン（ＣＨ１）を含む。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片は一対のＦａｂ断片を含み、通常これらはその間にあるヒンジシステインによってそのカルボキシ末端の近くで共有結合により連結される。抗体断片の他の化学的結合も当技術分野で公知である。
【００８２】
「単鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」抗体断片は抗体のＶＨおよびＶＬドメインを含み、これらのドメインは単一のポリペプチド鎖に存在する。通常、ＦｖポリペプチドはＶＨおよびＶＬドメインの間にポリペプチドリンカーをさらに含み、このリンカーはｓｃＦｖが抗原結合にとって望ましい構造を形成するのを可能にする。ｓｃＦｖのレビューに関しては、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ、Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ｖｏｌ．１１３、ＲｏｓｅｎｂｕｒｇおよびＭｏｏｒｅ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、２６９〜３１５頁（１９９４）を参照。
【００８３】
用語「ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）」は、抗原結合部位を２つ備える小さな抗体断片を指し、この抗体断片は同じポリペプチド鎖（ＶＨおよびＶＬ）内で軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に連結した重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。同じ鎖の上の２つのドメインの間で対合させるにはあまりに短いリンカーを用いて、このドメインを他の鎖の相補性ドメインと強制的に対合させ、２つの抗原結合部位をつくる。ダイアボディについては、例えば欧州特許第４０４０９７号；ＷＯ９３／１１１６１号；およびＨｏｌｌｉｎｇｅｒ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０：６４４４〜６４４８頁（１９９３）でさらに詳しく記載されている。
【００８４】
表現「線状抗体」はＺａｐａｔａ他、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．、８（１０）：１０５７〜１０６２頁（１９９５）に記載されている抗体を指す。つまり、これらの抗体は相補性の軽鎖ポリペプチドと共に一対の抗原結合領域を形成する、一対のタンデムＦｄセグメント（ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１）を含む。線状抗体は二重特異性または単一特異性であり得る。
【００８５】
「細胞」、「細胞系」および「細胞培養」は本明細書では同義で使われ、そのような呼称は細胞または細胞系のすべての後代を含む。このように、例えば、「形質転換体」および「形質転換細胞」のような用語は、継代数に関係なくそれらに由来する一次対象細胞および培養物を含む。また、故意または偶発的な突然変異により、すべての後代においてＤＮＡの内容が正確に同一であるというわけではないことが理解される。当初の形質転換細胞でスクリーニングされたような、同じ機能または生物学的活性を有する変異体後代が含まれる。異なった呼称を意図する場合は、前後関係から明白となろう。
【００８６】
発現に言及する場合の「制御配列」は、特定の宿主生物で作用可能に連結したコード配列の発現のために必要なＤＮＡ塩基配列を意味する。例えば原核生物に好適な制御配列は、プロモーター、場合によってはオペレーター配列、リボソーム結合部位、および恐らくはまだよく理解されていない他の配列を含む。真核細胞はプロモーター、ポリアデニル化シグナルおよびエンハンサーを利用することが公知である。
【００８７】
用語「コートタンパク質」はプロテインを意味し、少なくともその一部はウイルス粒子の表面に存在する。機能上の観点からは、コートタンパク質は宿主細胞でのウイルスの構築過程でウイルス粒子と結合する任意のタンパク質であり、ウイルスが他の宿主細胞に感染するまでそれと結合したままである。コートタンパク質は、主要なコートタンパク質であってもよいし、マイナーなコートタンパク質であってもよい。「主要な」コートタンパク質は、通常ウイルスの外殻に存在するコートタンパク質であり、好ましくは少なくとも約５個、より好ましくは少なくとも約７個、より好ましくは少なくとも約１０個かそれ以上のタンパク質コピーが存在する。主要なコートタンパク質は、１ビリオンにつき数十、数百または数千のコピーが存在しうる。主要なコートタンパク質の例は、繊維状ファージのｐ８タンパク質である。
【００８８】
特定の検定におけるある化学物体の「検出限界」は、その検定でバックグラウンドレベルより高く検出されるその物体の最小限の濃度である。例えば、ファージＥＬＩＳＡでは、特定の抗原結合断片を提示している特定のファージの「検出限界」は、その抗原結合断片を提示していない対照ファージによって生じたものよりも多くのＥＬＩＳＡシグナルを特定のファージが生産するファージ濃度である。
【００８９】
「融合タンパク質」および「融合ポリペプチド」は、共有結合で互いに結合した２つの部分を持つポリペプチドを指し、各部分は異なる特性を有するポリペプチドである。この特性は、例えばｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏ活性などの生物学的性質でよい。この特性はまた、単一の化学的または物理的性質、例えば対象抗原との結合、反応の触媒などかもしれない。この２つの部分は単一のペプチド結合によって直接、または１つまたは複数のアミノ酸残基を含んでいるペプチドリンカーを通して結合していてもよい。通常、この２つの部分とリンカーは同じ読み枠に存在する。好ましくは、ポリペプチドの２つの部分は異種または異なるポリペプチドから得られる。
【００９０】
「異種ＤＮＡ」は宿主細胞に導入される任意のＤＮＡである。ＤＮＡは、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡおよびこれらの融合または組合せを含む様々なソースに由来してもよい。ＤＮＡは、宿主または受容細胞と同じ細胞または細胞型からのＤＮＡ、あるいは異なる細胞型、例えば哺乳類または植物からのＤＮＡを含むことができる。ＤＮＡは任意選択にマーカーまたは選択遺伝子、例えば抗生物質耐性遺伝子、耐熱性遺伝子、その他を含むことができる。
【００９１】
本明細書で使われるように、「非常に多様な位置」は、公知のかつ／または天然抗体または抗原結合断片のアミノ酸配列を比較した場合に、その位置で提示されるいくつかの異なるアミノ酸を持つ軽鎖および重鎖可変領域上のアミノ酸位置を指す。非常に多様な位置は一般的にＣＤＲ領域にある。一態様では、公知のかつ／または天然抗体の非常に多様な位置を決定する際には、Ｋａｂａｔ、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．、１９８７年および１９９１年）が提供しているデータが有効である。インターネット上のデータベース（ｈｔｔｐ：／ｉｍｍｕｎｏ／ｂｍｅ／ｎｗｕ／ｅｄｕ）は収集された多数のヒト軽鎖および重鎖の配列とその配置を提供し、これらの配列の非常に多様な位置の決定に役立つ。本発明によると、アミノ酸がある位置で好ましくは約２から約１１、好ましくは約４から約９、好ましくは約５から約７個の可能な異なるアミノ酸残基変異を有する場合は、その位置は非常に多様と言える。いくつかの実施形態では、あるアミノ酸位置は、好ましくは少なくとも約２、好ましくは少なくとも約４、好ましくは少なくとも約６、好ましくは少なくとも約８つの可能な異なるアミノ酸残基変異を有するならば非常に多様である。
【００９２】
本明細書で使われるように、「ライブラリー」は複数の抗体もしくは抗体断片配列（例えば本発明のポリペプチド）またはこれらの配列をコードする核酸を指し、これらの配列は、本発明の方法によってこれらの配列に導入される変異体アミノ酸の組合せにおいて異なる。
【００９３】
「ライゲーション」は、２つの核酸断片の間でリン酸ジエステル結合を形成する方法である。この２つの断片のライゲーションのために、断片の末端は互いに適合していなければならない。場合によっては、この末端はエンドヌクレアーゼ消化の後に直ちに適合性を持つようになる。しかし、ライゲーションに適合させるためには、まずエンドヌクレアーゼ消化の後に一般的に形成される付着末端を平滑末端に変える必要がある。平滑末端にするためには、ＤＮＡを適当な緩衝液中で１５℃で少なくとも１５分間、４つのデオキシリボヌクレオチド三燐酸の存在下でＤＮＡポリメラーゼＩまたはＴ４ＤＮＡポリメラーゼのクレノー断片の約１０単位で処理する。次にＤＮＡをフェノールクロロホルム抽出とエタノール沈殿、またはシリカ精製によって精製する。連結すべきＤＮＡ断片を溶液に等モル量入れる。この溶液は、ＡＴＰ、リガーゼ緩衝およびＴ４ＤＮＡリガーゼのようなリガーゼも、ＤＮＡ０．５μｇにつき約１０単位含む。ＤＮＡをベクターに連結する場合は、ベクターは適当な制限エンドヌクレアーゼによる消化作用によってまず線状にする。線状にされた断片は、次に細菌のアルカリホスファターゼまたは仔ウシ腸管のホスファターゼで処理して、ライゲーションのステップの間のセルフライゲーションを予防する。
【００９４】
「突然変異」は、参照ヌクレオチド配列、例えば野生型配列と比較してのヌクレオチドの欠失、挿入または置換である。
【００９５】
本明細書で使われるように、「自然」または「天然」抗体は、非合成源、例えば生体外で得られる分化抗原特異的Ｂ細胞、またはその対応するハイブリドーマ細胞系、あるいは動物の血清から得られる抗体から特定された抗体を指す。これらの抗体には、天然のものであれ誘発されたものであれいかなる種類の免疫応答で生じた抗体も含まれる。自然抗体には、これらの抗体を構成するかコードするアミノ酸配列およびヌクレオチド配列、例えばカバットデータベースで特定されているようなものが含まれる。本明細書で使われるように、自然抗体は、ソース配列または鋳型配列を、例えばある位置でソース抗体配列と異なる抗体配列を提供する異なるアミノ酸を用いて１つまたは複数のアミノ酸の置換、欠失または追加により変更した抗体配列を指す「合成抗体」とは異なる。
【００９６】
核酸に関して「作用可能に連結した」は、その核酸が他の核酸配列と機能的な関係にあることを意味する。例えば、プレシーケンス（ｐｒｅｓｅｑｕｅｎｃｅ）または分泌リーダーのＤＮＡは、あるポリペプチドの分泌に関わっている前駆体タンパク質として発現する場合は、そのポリペプチドのＤＮＡと作動可能的に結合している。プロモーターまたはエンハンサーは、それがあるコード配列の転写に影響する場合はその配列と作用可能に連結している。または、リボソーム結合部は、それが翻訳を容易にする位置にある場合は作用可能にコード配列と連結している。通常、「作用可能に連結した」は、結合したＤＮＡ配列が連続しており、分泌リーダーの場合は連続して読み枠内にあることを意味する。しかし、エンハンサーは連続する必要はない。連結は都合のよい制限部位でライゲーションによって達成される。このような部位が存在しない場合、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーが、従来の慣行に従って使用される。
【００９７】
「ファージディスプレイ」は、変異体ポリペプチドをファージ、例えば繊維状ファージの粒子表面でコートタンパク質の少なくとも一部と融合したタンパク質として提示する手法である。ファージディスプレイの有用さは、ランダム化タンパク質変異体の大きなライブラリーから対象抗原と高親和性で結合する配列を迅速に、効率的に選別できることにある。ファージ上のペプチドおよびタンパク質ライブラリーの提示は、何百万ものポリペプチドを特異的結合特性に関してスクリーニングするために利用されてきた。多価ファージディスプレイ方法は、繊維状ファージの遺伝子ＩＩＩまたは遺伝子ＶＩＩＩとの融合を通して小さなランダムペプチドおよび小タンパク質を提示するために利用されてきた。ＷｅｌｌｓおよびＬｏｗｍａｎ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．、３：３５５〜３６２頁（１９９２）とその中の引用文献。一価のファージディスプレイでは、タンパク質またはペプチドのライブラリーが遺伝子ＩＩＩまたはその一部に融合され、ファージ粒子が融合タンパク質の１個または０個のコピーを提示するように野生型遺伝子ＩＩＩタンパク質の存在下で低レベルで発現される。アビディティー効果は多価のファージと比較して低下しているので、選別は内在性のリガンド親和性に基づいておりファージミドベクターが使われるが、このベクターはＤＮＡ操作を単純化する。ＬｏｗｍａｎおよびＷｅｌｌｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ａ Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、３：２０５〜２１６頁（１９９１）。
【００９８】
「ファージミド」は、細菌の複製起点、例えばＣｏ１Ｅ１およびバクテリオファージの遺伝子間領域のコピーを有するプラスミドベクターである。ファージミドはいかなる公知のバクテリオファージ、例えば繊維状バクテリオファージおよびラムドイドバクテリオファージでも使用できる。プラスミドは、通常、抗生物質耐性の選択マーカーも含む。これらのベクターにクローニングされたＤＮＡセグメントは、プラスミドとして増殖することができる。これらのベクターを備える細胞がファージ粒子の生産のために必要なすべての遺伝子を備えているとき、プラスミドの複製様式はローリングサークル複製に変化し、プラスミドＤＮＡの１つの鎖のコピーとパッケージファージ粒子を生成する。ファージミドは感染性または非感染性ファージ粒子を形成することができる。この用語は、異種ポリペプチドがファージ粒子の表面で提示されるように遺伝子融合としてこの異種ポリペプチドの遺伝子と結合したファージコートタンパク質遺伝子、またはその断片を含むファージミドを含む。
【００９９】
用語「ファージベクター」は、異種遺伝子を含んでいて複製ができるバクテリオファージの二本鎖複製型を意味する。ファージベクターは、ファージ複製およびファージ粒子形成を可能にするファージ複製起点を有する。ファージは好ましくは繊維状バクテリオファージ、例えばＭ１３、ｆ１、ｆｄ、Ｐｆ３ファージもしくはその誘導体、またはラムドイドファージ、例えばラムダ、２１、ｐｈｉ８０、ｐｈｉ８１、８２、４２４、４３４、その他もしくはその誘導体である。
【０１００】
「オリゴヌクレオチド」は、公知の方法（例えば、固相手法、例えば欧州特許第２６６０３２号、１９８８年５月４日公布、に記載されている手法を利用したリン酸トリエステル、亜リン酸塩、またはホスホラミダイト化学、またはＦｒｏｅｓｈｌｅｒ他、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．、１４：５３９９〜５４０７頁（１９８６）に記載されているデオキシヌクレオチドＨ−ホスホン酸塩中間体を通した方法）によって化学的に合成される短い、一本鎖または二本鎖のポリデオキシヌクレオチドである。他の方法には、以下に記載のポリメラーゼ連鎖反応および他のオートプライマー法、および固体担体上のオリゴヌクレオチド合成が含まれる。これらの方法のすべては、Ｅｎｇｅｌｓ他、Ａｇｎｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．、２８：７１６〜７３４頁（１９８９）に記載されている。遺伝子のすべての核酸配列が公知ならば、またはコード鎖と相補的な核酸の配列が利用できるならばこれらの方法が使われる。あるいは、対象アミノ酸配列が公知ならば、各アミノ酸残基の公知で好ましいコード残基を使って可能な核酸配列を推測できよう。オリゴヌクレオチドは、ポリアクリルアミドゲルもしくは分子サイジングカラムで、または沈殿法によって精製することができる。
【０１０１】
ＤＮＡが「精製される」のは、ＤＮＡが非核酸不純物から分離されるときである。不純物は極性、無極性、イオン性、その他である。
【０１０２】
本明細書で使われるように、「ソース抗体」は、その抗原結合配列が本明細書で記載される基準に従う多様化が実行される鋳型配列としての役目をする抗体、または抗原結合断片を指す。抗原結合配列は、通常、抗体可変部、好ましくは少なくとも１つの好ましくはフレームワーク領域を含むＣＤＲを含む。
【０１０３】
本明細書で使われる「溶媒に露出した位置」はソース抗体または抗原結合断片の重鎖および軽鎖の可変部のアミノ酸残基の位置を指し、それは、この抗体または抗原結合断片の構造、構造アンサンブルおよび／またはモデル化された構造に基づき、溶媒露出が可能かつ／または抗体特異性抗原などの分子との接触が可能と判断されるものである。これらの位置は一般的にはＣＤＲで、またタンパク質の外側に見られる。本明細書で定められるように、抗体または抗原結合断片の溶媒に露出した位置は、当技術分野で公知のいくつかのアルゴリズムのいずれかを使って決定できる。好ましくは、溶媒に露出した位置は抗体の三次元モデルからの座標を使い、好ましくはＩｎｓｉｇｈｔＩＩプログラム（Ａｃｃｅｌｒｙｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）のようなコンピュータプログラムを使って決定される。溶媒に露出した位置は、当技術分野で公知のアルゴリズム（例えば、ＬｅｅおよびＲｉｃｈａｒｄｓ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５５、３７９（１９７１）、および、Ｃｏｎｎｏｌｌｙ、Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｃｒｙｓｔ．１６、５４８（１９８３））を使用しても決定することができる。溶媒に露出した位置の決定は、タンパク質モデリングに適したソフトウェアおよび抗体から得られる三次元構造情報を使って行うことができる。このような目的のために利用できるソフトウェアには、ＳＹＢＹＬ生体高分子モジュールソフトウェア（Ｔｒｉｐｏｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ）が含まれる。一般に、また好ましくは、アルゴリズム（プログラム）がユーザーの入力サイズパラメータを必要とする場合は、計算において使われるプローブの「サイズ」は半径約１．４オングストローム以下に設定される。さらに、パーソナルコンピュータ用のソフトウェアを使用した溶媒に露出した領域の決定法が、Ｐａｃｉｏｓ、（１９９４）「ＡＲＶＯＭＯＬ／ＣＯＮＴＯＵＲ：ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｕｒｆａｃｅ ａｒｅａｓ ａｎｄ ｖｏｌｕｍｅｓ ｏｎ Ｐｅｒｓｏｎａｌ Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ」Ｃｏｍｐｕｔ．Ｃｈｅｍ．１８（４）：３７７〜３８６頁；および同（１９９５）「Ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｓｕｒｆａｃｅ Ａｒｅａｓ ａｎｄ Ｖｏｌｕｍｅｓ ｉｎ Ｄｉｓｔｉｎｃｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｕｒｆａｃｅｓ ｏｆ Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ」Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｏｄｅｌ．１：４６〜５３頁に記載されている。
【０１０４】
本明細書で使われる「対象アミノ酸」は、公知のかつ／または天然抗体または抗原結合断片の特定の位置で見られる最も普通のアミノ酸であるアミノ酸の群に属しているアミノ酸を指す。いくつかの実施形態では、「最も普通に見られるアミノ酸」は、公知のかつ／または天然の抗体または抗原結合断片の好ましくは少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約７０％、好ましくは少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも約９０％、好ましくはすべての配列において特定の位置に見られるアミノ酸である。いくつかの実施形態では、「最も普通に見られるアミノ酸」は、公知のかつ／または天然の抗体または抗原結合断片の好ましくは約５０％から約１００％、好ましくは約６０％から約９０％、好ましくは約７０％から約８５％、好ましくは約８０％から約８５％の配列において特定の位置に見られるアミノ酸である。公知の抗体または抗原結合断片とは、その配列が当技術分野で入手可能なもの、例えば一般に開放されているデータベース、例えばＫａｂａｔ（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．、１９８７年および１９９１年）のデータベースおよび／またはインターネットサイトｈｔｔｐ：／ｉｍｍｕｎｏ／ｂｍｅ／ｎｗｕ／ｅｄｕで得られるものである。前記アミノ酸位置は、好ましくはＣＤＲ領域内の位置である。アミノ酸の対象群は、特定の位置の対象アミノ酸の群を指す。好ましくは、対象アミノ酸はシステイン残基でない。軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３および重鎖ＣＤＲ１とＣＤＲ２の位置に関しては、一般的に対象アミノ酸群は、ソース配列の非常に多様で溶媒に露出した特定位置に好ましくは約２個から約１１個、好ましくは約４個から約９個、好ましくは約５個から約７個、好ましくは約６個のアミノ酸を含むことができる。
【０１０５】
「転写調節要素」は、以下の構成成分の１つまたは複数を含む：エンハンサー要素、プロモーター、オペレーター配列、リプレッサー遺伝子および転写終結配列。このような構成成分は当技術分野において公知である。米国特許第５，６６７，７８０号。
【０１０６】
「形質転換体」は、そのＤＮＡと関連する表現型（例えば、そのＤＮＡによってコードされるタンパク質によって付与された抗生物質耐性）の発現によって証明されるような、ＤＮＡを取り込み、維持している細胞である。
【０１０７】
「形質転換」は、細胞がＤＮＡを取り込んで「形質転換体」になる過程を意味する。ＤＮＡ取込みは永久的、または一過性である。
【０１０８】
出発ポリペプチドまたは参照ポリペプチド（例えば、ソース抗体またはその可変ドメイン／ＣＤＲ）の「変異体」または「突然変異体」、例えば融合タンパク質（ポリペプチド）または異種ポリペプチド（ファージに対して異種性）は、１）出発ポリペプチドまたは参照ポリペプチドのそれとは異なるアミノ酸配列を有し、また２）自然または人為の（人工）突然変異を通して出発ポリペプチドまたは参照ポリペプチドから導かれたポリペプチドである。そのような変異体は、例えば関心のポリペプチドのアミノ酸配列内の残基の欠失、および／またはそれへの挿入、および／またはその置換を含む。例えば、変異体アミノ酸（ソース抗体／抗原結合断片の対応する位置で見られるアミノ酸と比較して）を有する配列をコードする非ランダムコドンセットを含んでいるオリゴヌクレオチドを使って作製した本発明の融合ポリペプチドは、ソース抗体または抗原結合断片と比較して変異体ポリペプチドとなる。このように、変異体ＣＤＲは、出発ポリペプチドまたは参照ポリペプチド配列に対する変異体配列（例えば、ソース抗体または抗原結合断片のそれ）を含んでいるＣＤＲを指す。この意味合いでは、変異体アミノ酸は出発ポリペプチドまたは参照ポリペプチド配列の対応する位置のアミノ酸（例えば、ソース抗体または抗原結合断片のそれ）とは異なるアミノ酸を指す。最終的な変異体または突然変異体構築物に到達するには欠失、挿入および置換をいかように組み合わせてもよいが、最終的な構築物は所望の機能的特性を有するものとする。アミノ酸変化はポリペプチドの翻訳後プロセス、例えばグリコシル化部位の数または位置を変えることもできる。ポリペプチドのアミノ酸配列変異体を作製する方法は、本明細書で参照により取り込まれた米国特許第５，５３４，６１５号に記載されている。
【０１０９】
「野生型」または「参照」配列、あるいは、「野生型」または「参照」タンパク質／ポリペプチド、例えばコートタンパク質またはソース抗体のＣＤＲまたは可変ドメインの配列は、突然変異の導入を通してそこから変異体ポリペプチドが導かれる参照配列かもしれない。一般的に、所与のタンパク質の「野生型」配列は、自然界で最も一般的な配列である。同様に、「野生型」遺伝子配列は、その遺伝子の自然界で最も一般的に見られる配列である。突然変異は、自然過程を通してまたは人為的手段を通して「野生型」遺伝子（したがってそれがコードするタンパク質）に導入することができる。そのようなプロセスの産物は、原「野生型」タンパク質または遺伝子の「変異体」または「突然変異体」形態である。
【０１１０】
本明細書で使われるように、「複数」の物質、例えば本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、通常、その物質の２つ以上の種類の集合を指す。ある物質の２つ以上が特定の形質に関して互いと異なるならば、その物質には２種類以上が存在し、例としては特定のアミノ酸位置で見られる変異体アミノ酸がある。例えば、変異体ＣＤＲの配列以外、または特定の溶媒に露出した非常に多様なアミノ酸位置の変異体アミノ酸以外は実質的に同じ、好ましくは同一の配列である本発明の２つ以上のポリペプチドがあるならば、本発明のポリペプチドには複数個存在する。他の実施例では、変異体ＣＤＲをコードする配列以外、または特定の溶媒に露出した非常に多様なアミノ酸位置の変異体アミノ酸をコードする配列以外は実質的に同じ、好ましくは同一の配列である本発明の２つ以上のポリヌクレオチドがあるならば、本発明のポリヌクレオチドには複数個存在する。
【０１１１】
本発明は、好ましくは選ばれた抗原に対して高親和性を有する新規抗体または抗原結合断片を作製し、単離する方法を提供する。ソース抗体軽鎖可変ドメインおよび／または重鎖可変ドメインの１つまたは複数の選ばれたアミノ酸位置を突然変異させる（多様化する）ことによって複数の異なる抗体または抗体可変ドメインが調製され、それらの位置で変異体アミノ酸を有する抗体可変ドメインの多様なライブラリーが作製される。このようなアミノ酸位置は溶媒に露出した位置であり、それは例えばソース抗体の構造を分析することで決定され、かつ／または公知のかつ／または天然免疫グロブリンポリペプチドの中で高い多様性を有する位置である。
【０１１２】
溶媒に露出した非常に多様であるアミノ酸位置は、好ましくは抗体可変ドメインのＣＤＲ領域にあるものであり、それらはＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３およびその混合物からなる群から選ばれる。アミノ酸位置は、各位置で一般に見られるアミノ酸をコードしている非ランダムコドンセットを使ってそれぞれ突然変異させる。いくつかの実施形態では、ＣＤＲ領域の溶媒に露出した非常に多様な位置を突然変異させる場合は、その位置の対象アミノ酸（上で定義されている）の好ましくは少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７０％、好ましくは少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも約９０％、好ましくはすべての対象アミノ酸をコードするコドンセットが選択される。いくつかの実施形態では、ＣＤＲ領域の溶媒に露出した非常に多様な位置を突然変異させる場合は、その位置のすべての対象アミノ酸（上で定義されている）の好ましくは約５０％から約１００％、好ましくは約６０％から約９５％、好ましくは少なくとも約７０％から約９０％、好ましくは約７５％から約９０％の対象アミノ酸をコードするコドンセットが選択される。ＣＤＲＨ３に関しては、異なる長さを有しかつ／またはコドンセット、例えばＮＮＫ、ＮＮＳ、ＮＶＴ、ＤＶＫ、ＸＹＺ、またはトリプトファン、またはグリシン、またはその混合物を使って選ばれた位置でランダム化された変異体ＣＤＲＨ３領域が作製される。
【０１１３】
抗体可変ドメインのライブラリーの多様性は、高親和性抗体を単離する能力を高めて細胞培養で収率の高い抗体を提供するために抗体可変ドメインの構造上の摂動を最小にする一方で、多様性を最大にするようになっている。抗体可変ドメインで突然変異させる位置の数は最小化され、また各位置の変異体アミノ酸は、好ましくは（可能な限り）一般的ではないアミノ酸を排除しつつ、各位置で一般に見られるアミノ酸を含むように設計されている。好ましくは、少なくとも１つのＣＤＲを含む単一の抗体がソース抗体として使われる。驚くことに、配列および大きさが多様な抗体可変ドメインのライブラリーが、単一のソース抗体を鋳型として使い、特定のアミノ酸置換を使って特定の位置を多様性の対象とすることにより作製できる。
【０１１４】
抗体可変ドメインの多様性のデザイン
本発明の一態様では、抗体可変ドメインの高品質のライブラリーが作製される。このライブラリーは、ライブラリーの構成メンバー数、ならびに抗体可変ドメインの異なる配列間に多様性がある。このライブラリーは１つまたは複数の抗原、例えば、インスリン様成長因子−１（ＩＧＦ−１）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）およびＨｅｒ−２などに対する高親和性結合抗体可変ドメインを含む。このライブラリーの多様性は、単一のソース抗体で溶媒に露出しかつ非常に多様であるアミノ酸位置を選択し、非ランダムコドンセットを使って少なくとも１つのＣＤＲのそれらの位置を突然変異させることによって設計される。非ランダムコドンセットは、好ましくは非対象配列、例えばシステインおよび終止コドンを最小化しつつ、それらの位置で一般的なアミノ酸の少なくとも１つのサブセットをコードする。
【０１１５】
好ましいソース抗体はヒト化抗体４Ｄ５であるが、多様性の設計方法は配列が公知の他のソース抗体にも適用することができる。ソース抗体は、天然抗体、合成抗体、組換え抗体、ヒト化抗体、生殖細胞系派生抗体、キメラ抗体、親和性成熟抗体またはそれらの抗原結合断片でよい。抗体は、ヒト、マウスおよびラットを含む様々な種類の哺乳類から得ることができる。いくつかの実施形態では、ソース抗体は最初の１回または複数回の親和性スクリーニングの後で、親和性成熟段階の前に得られる抗体である。細胞培養において高収率で安定した生産を可能にするために、ソース抗体を選択または修飾することができる。
【０１１６】
ソース抗体の１つはヒト化抗体４Ｄ５である。抗体４Ｄ５は、Ｈｅｒ−２（ｅｒｂＢ２）として知られている癌関連の抗原に特異的なヒト化抗体である。この抗体は、コンセンサスフレームワーク領域を有する可変領域を含む。ヒト化抗体の親和性を高める過程で、２、３の位置がマウス配列に戻されている。ヒト化抗体４Ｄ５の配列と結晶構造は、米国特許第６，０５４，２９７号、Ｃａｒｔｅｒ他、ＰＮＡＳ ８９：４２８５頁（１９９２）に記載され、結晶構造はＪ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２９：９６９頁（１９９３）およびインターネットサイトｗｗｗ／ｎｃｂｉ／ｎｉｈ／ｇｏｖ／ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ／ｍｍｄｂ（ＭＭＤＢ＃ｓ−９９０−９９２）で示されている。
【０１１７】
抗体可変ドメインで多様性を生み出す基準は、溶媒に露出した（上で定義される）位置で残基に突然変異を起こさせることである。これらの位置は一般的にはＣＤＲで、またタンパク質の外側に見られる。好ましくは、溶媒に露出した位置は、ＩｎｓｉｇｈｔＩＩプログラム（Ａｃｃｅｌｒｙｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）のようなコンピュータプログラムを用いて、抗体の３次元モデルからの座標を使って決定される。溶媒に露出した位置は、当技術分野で公知のアルゴリズム（例えば、ＬｅｅおよびＲｉｃｈａｒｄｓ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５５、３７９（１９７１）、および、Ｃｏｎｎｏｌｌｙ、Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｃｒｙｓｔ．１６、５４８（１９８３））を使用しても決定することができる。溶媒に露出した位置の決定は、タンパク質モデリングに適したソフトウェアおよび抗体から得られる三次元構造情報を使って行うことができる。このような目的のために利用できるソフトウェアには、ＳＹＢＹＬ生体高分子モジュールソフトウェア（Ｔｒｉｐｏｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ）が含まれる。一般に、また好ましくは、アルゴリズム（プログラム）がユーザーの入力サイズパラメータを必要とする場合は、計算において使われるプローブの「サイズ」は半径約１．４オングストローム以下に設定される。さらに、パーソナルコンピュータ用のソフトウェアを使用した溶媒露出領域およびエリア決定法が、Ｐａｃｉｏｓ、（１９９４）「ＡＲＶＯＭＯＬ／ＣＯＮＴＯＵＲ：ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｕｒｆａｃｅ ａｒｅａｓ ａｎｄ ｖｏｌｕｍｅｓ ｏｎ Ｐｅｒｓｏｎａｌ Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ」Ｃｏｍｐｕｔ．Ｃｈｅｍ．１８（４）：３７７〜３８６頁；および同、「Ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｓｕｒｆａｃｅ Ａｒｅａｓ ａｎｄ Ｖｏｌｕｍｅｓ ｉｎ Ｄｉｓｔｉｎｃｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｕｒｆａｃｅｓ ｏｆ Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ」Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｏｄｅｌ．（１９９５）、１：４６〜５３頁に記載されている。
【０１１８】
いくつかの場合には、溶媒に露出した残基の選択は、協同で最小限の連続するパッチを形成する溶媒露出残基を選ぶことによってさらに洗練され、例えば参照ポリペプチドまたはソース抗体がその三次元折畳み構造の場合がそうである。例えば、図３６で示すように、コンパクト（最小）な連続したパッチは、ヒト化４Ｄ５のＣＤＲＨ１／Ｈ２／Ｈ３／Ｌ１／Ｌ２／Ｌ３に対して選択された残基によって形成される。コンパクト（最小）な連続したパッチは、ＣＤＲの全域の１つのサブセット（例えば２〜５個のＣＤＲ）、例えばＣＤＲＨ１／Ｈ２／Ｈ３／Ｌ３だけを含むことができる。そのようなパッチの形成に貢献しない溶媒に露出した残基は、任意選択に多様化から排除してもよい。この基準による選択の洗練化により、実務者は、希望により多様化する残基数を最小化することができる。例えば、Ｈ１の残基２８はパッチの端にあるので、多様化において任意選択で排除することができる。しかし、この選択基準は、希望により、必ずしも溶媒に露出しているとは考えられない多様化のための残基を選ぶためにも用いることができる。例えば、溶媒に露出していると考えられなくても、溶媒に露出していると考えられる他の残基と共に三次元折畳み構造で連続するパッチを形成する残基は、多様化の対象に選んでもよい。この例はＣＤＲＬ１−２９である。そのような残基の選択は当業者には明らかとなるもので、その適切さも経験的に、また熟練実務者のニーズと希望に応じて決定することができる。
【０１１９】
ヒト化抗体４Ｄ５の結晶構造から特定された、各ＣＤＲの溶媒に露出した位置は次の通りである（残基の位置はカバットに従う）：
ＣＤＲＬ１：２８、３０、３１、３２
ＣＤＲＬ２：５０、５３
ＣＤＲＬ３：９１、９２、９３、９４、９６
ＣＤＲＨ１：２８、３０、３１、３２、３３
ＣＤＲＨ２：５０、５２、５２Ａ、５３、５４、５５、５６、５７、５８。
さらにまた、ＣＤＲＬ１の残基２９は、他の溶媒に露出した残基を含んでいる連続するパッチに含まれているかどうかに基づいて選ばれた。
【０１２０】
突然変異させる位置を選択するための他の基準は、公知のかつ／または天然抗体の配列と比較したときにアミノ酸配列に変異を示す位置である。非常に多様な位置は、公知のかつ／または天然抗体／抗原結合断片のアミノ酸配列を比較した場合に、その位置で提示されるいくつかの異なるアミノ酸を持つ軽鎖または重鎖可変領域上のアミノ酸位置を指す。非常に多様な位置は好ましくはＣＤＲ領域にある。ＣＤＲＨ３の位置はすべて非常に多様であると考えられている。本発明によると、アミノ酸がその位置で好ましくは約２から約１１個（本明細書に記載されているようにこの数字には幅があるが）の可能な異なるアミノ酸残基変異を有する場合は、そのアミノ酸残基は非常に多様と言える。
【０１２１】
一態様では、公知のかつ／または天然抗体の非常に多様な位置を同定する際には、Ｋａｂａｔ、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．、１９８７年および１９９１年）が提供しているデータが有効である。インターネット上のデータベース（ｈｔｔｐ／ｉｍｍｕｎｏ／ｂｍｅ／ｎｗｕ／ｅｄｕ）は収集された多数のヒト軽鎖および重鎖の配列とその配置を提供し、これらの配列の非常に多様な位置の決定に役立つ。公知のかつ／または天然の軽鎖および重鎖のヒト化抗体４Ｄ５の溶媒露出位置における多様性を、図１および２に示す。
【０１２２】
本発明の一態様では、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびその混合物からなる群から選ばれた少なくとも１つのＣＤＲの非常に多様で溶媒に露出した残基を突然変異させる（すなわち、本明細書で記載されているコドンセットを用いてランダム化する）。いくつかの実施形態では、この群にはＣＤＲＨ３も含まれる。例えば、ＣＤＲＬ３およびＣＤＲＨ３の溶媒に露出しかつ／または非常に多様な残基を突然変異させる。したがって、本発明は変異体アミノ酸でソース抗体可変ドメインの少なくとも１つのＣＤＲの溶媒に露出した非常に多様な位置を置換することによって形成された、多数の新規抗体配列を提供する。
【０１２３】
対象アミノ酸群とは、公知のかつ／または天然の抗体／抗原結合断片の配列を比較した場合、好ましくは少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約７０％、好ましくは少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも約９０％の抗体において、ＣＤＲの溶媒に露出した非常に多様な各位置で見られるアミノ酸の群である。変異体アミノ酸は、対象アミノ酸のいくつかまたはすべてを含み、非ランダムコドンセットによってコードされる一群のアミノ酸である。非ランダムコドンセットによってコードされるアミノ酸のうち、好ましくはこれらのアミノ酸の少なくとも約７０％は対象アミノ酸であり、より好ましくはこれらのアミノ酸の少なくとも約８０％は対象アミノ酸である。各位置の非ランダムコドンセットは好ましくは少なくとも２つのアミノ酸をコードし、またシステインをコードしない。各位置の非対象アミノ酸は最小にされ、またシステインと終止コドンは、特にＬ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｈ１およびＨ２の抗体可変ドメインの構造に悪影響を与える可能性があるので、それらは一般的に、また好ましくは排除される。軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３および重鎖ＣＤＲ１とＣＤＲ２の位置に関しては、一般的に対象アミノ酸のセットは、ソース配列の非常に多様で溶媒に露出した特定位置に約２個から約１１個のアミノ酸を含むことができる。
【０１２４】
上で示したように、変異体アミノ酸は非ランダムコドンセットによってコードされる。コドンセットとは、所望のアミノ酸群をコードするのに用いられる一組のオリゴヌクレオチドを形成するのに用いることができる一組の異なるヌクレオチドトリプレット配列である。一組のオリゴヌクレオチドは、コドンセットによって提供されるヌクレオチドトリプレットの可能な組合せのすべてを表す配列であって所望のアミノ酸群をコードする配列を含み、例えば固相法によって合成することができる。ある位置での選ばれたヌクレオチド「縮退」を有するオリゴヌクレオチドの合成は、当技術分野で公知である。そのようなある種のコドンセットを有しているヌクレオチドのセットは、市販の核酸シンセサイザー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡなどから入手可能）を使って合成することができ、または市販品を入手することができる（例えば、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤから）。したがって、特定のコドンセットを有する合成オリゴヌクレオチドセットは、一般的に異なる配列の複数のオリゴヌクレオチドを含み、この相違は配列全体の中のコドンセットによるものである。本発明で使用されるオリゴヌクレオチドは可変ドメイン核酸テンプレートへのハイブリダイゼーションを可能にする配列を有し、また、クローニングに役立つ制限酵素部位を含むこともできる。
【０１２５】
一態様では対象アミノ酸は、ヒト化抗体４Ｄ５のＣＤＲの、溶媒に露出し非常に多様な各位置について同定された。対象アミノ酸は、カバットデータベースの公知のかつ／または天然抗体の配列を使い、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３、ＣＤＲＨ１およびＣＤＲＨ２の溶媒に露出した非常に多様な各位置における異なるアミノ酸を同定することによって特定された。カバットデータベースからの軽鎖多様性および重鎖多様性をそれぞれ図１および２に示す。図１および２で示す多様性に基づいて、各々の位置で特定された対象アミノ酸を図３に示す。
【０１２６】
各位置の対象アミノ酸の好ましくは少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７０％、好ましくは少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも約９０％、好ましくはすべての対象アミノ酸を含むアミノ酸群をコードする非ランダムコドンセットも図３に例示する。図３の「良残基率（％）」は、非ランダムコドンセットによってコードされ、その位置の対象アミノ酸であるアミノ酸の割合を表す。最も好ましくは、コドンセットによってコードされる変異体アミノ酸は、公知のかつ／または天然抗体において最も高い頻度で見られるアミノ酸を含む。高いパーセンテージは非対象アミノ酸の割合が非常に低いことを意味し、このことは非ランダムコドンセットの設計においては対象アミノ酸をより多く持つことよりも重要である。すべての計算にはリダンダンシーが含まれている。
【０１２７】
図３の「再現残基率（％）」は、各位置の設計されたコドンによってコードされる公知のかつ／または天然の抗体配列の割合を表す。例えば、Ｌ３−９１に関しては、アミノ酸ＹＳＡ（チロシン、セリンおよびアラニン）は、公知のかつ／または天然の抗体の位置９１で見られる対象アミノ酸の群に含まれる。このコドンセットはＹＳＡＤ（チロシン、セリン、アラニンおよびアスパラギン酸）をコードするように設計され、これは対象アミノ酸の７５％をコードする。これら３つのアミノ酸はまた、その部位の自然抗体配列１５８０中１１９０で見られ、これは公知のかつ／または天然の抗体の７５％である。コドンセットはＣＤＲ領域の各位置で、公知のかつ／または天然の抗体の少なくとも約５０％、より好ましくは公知のかつ／または天然抗体の少なくとも約６０％、最も好ましくは公知のかつ／または天然の抗体の少なくとも約７０％においてそれらの位置で見られるアミノ酸を含むように設計することが好ましい。
【０１２８】
一実施形態では、変異体ＣＤＲＬ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｈ１、Ｈ２またはその混合物を有するポリペプチドが形成され、少なくとも１つの変異体ＣＤＲは少なくとも１つの溶媒に露出した非常に多様なアミノ酸位置に変異体アミノ酸を有し、前記変異体アミノ酸は非ランダムコドンセットによってコードされ、前記非ランダムコドンセットによってコードされるアミノ酸の少なくとも７０％は周知の抗体可変ドメイン配列におけるその位置の対象アミノ酸である。例えば、抗体可変ドメインは、ＣＤＲＨ１のアミノ酸位置２８、３０、３１、３２および／または３３の１つまたは複数の位置、および／またはＣＤＲＨ２のアミノ酸位置５０、５２、５３、５４、５６および／または５８の１つまたは複数の位置、および／またはＣＤＲＬ１のアミノ酸位置２８、２９、３０および／または３１の１つまたは複数の位置、および／またはＣＤＲＬ２のアミノ酸位置５０および／または５３の１つまたは複数の位置、および／またはアミノ酸位置９１、９２、９３、９４および／または９６の１つまたは複数の位置に変異体アミノ酸を含むことができる。これらの位置の変異体アミノ酸は、好ましくは図３、５〜１３および２４に例示されているコドンセットによってコードされる。
【０１２９】
公知の抗体の重鎖ＣＤＲ３（ＣＤＲＨ３）は多様な配列、高次構造および長さを持つ。ＣＤＲＨ３は抗原結合ポケットの中央でしばしば見られ、抗原接触にしばしば関与する。このようにＣＤＲＨ３の設計は好ましくは他のＣＤＲのそれとは別に構築されるが、それはＣＤＲＨ３の高次構造を予測することが難しく、またこの領域のアミノ酸の多様性は公知の抗体で特に多様なためである。本発明に従って、ＣＤＲＨ３はＣＤＲＨ３内の特定の位置で多様性を生み、ＣＤＲＨ３配列のどの位置でも頻繁には見られないアミノ酸を排除するように設計されている。
【０１３０】
ＣＤＲＨ３で多様性を生み出すために、公知の、一般に自然の抗体のデータベースをガイドラインとして使うことができる。他のＣＤＲと比較して、ＣＤＲＨ３の配列と長さの多様性は最も高いが、配列多様性は完全にはランダムではない（すなわち、一部のアミノ酸の発生頻度は他よりも高い）。一実施形態では、縮退コドンセット、例えば２０個すべてのアミノ酸と終止コドンをコードするＮＮＫなどを有するライブラリーが作製される。ファージ上で機能的に提示するクローンは、その配列が分析される。次に、合成ライブラリーにおけるアミノ酸の頻度を公知の抗体におけるアミノ酸の頻度と比較する。アミノ酸頻度の良い一致が予想されるが、若干の例では公知の抗体と比較して、合成ライブラリーにおいてあるクラスのアミノ酸の頻度が高くなるかもしれない。例えば、ＮＮＫで作製されたライブラリーは、脂肪族／疎水性アミノ酸をより多く利用する配列を含むことが予想され得る。この方法はＣＤＲＨ３の多様性の作出において含めるべきアミノ酸、したがってコドンセットの適切な選択に関する有益な情報を得るために実施することができる。他の実施形態では、ＣＤＲＨ３多様性はコドンセットＮＮＳを使って生成される。ＮＮＳおよびＮＮＫは同じアミノ酸群をコードする。しかし、当技術分野で公知の様々な因子、例えばオリゴヌクレオチド合成化学における結合効率などに従い、あるコドンセットが他に優先することがある。
【０１３１】
いくつかの実施形態では、本発明の方法の実践者はコドンセットの個々のヌクレオチド（Ｇ、Ａ、Ｔ、Ｃ）、例えばＮＮＳにおけるようにコドンセット中のＮヌクレオチドの量／比率を修正することを望むかもしれない。このようなことは図４で示されるＸＹＺコドンとして例示されている。これは、例えば、コドンセットのＮに対して直線的で等しい割合のヌクレオチドを使う代わりに、コドンセット内のヌクレオチドの異なる量をドープすることによって達成することができる。例えば、コドンセットＸＹＺは以下の比率のヌクレオチドを持つ。ＸはＧが３８％、Ａが１９％、Ｔが２６％、Ｃが１７％；ＹはＧが３１％、Ａが３４％、Ｔが１７％、Ｃが１８％、またＺはＧが２４％、Ｃが７６％である。そのような修正は、状況および実践者の希望に従い様々な目的に役立つ。例えば、自然の多様性プロフィール、例えばＣＤＲＨ３のプロフィールで見られるようなアミノ酸の偏りをより忠実に反映するようにそのような修正を加えることができる。
【０１３２】
いくつかの実施形態では、多様化されたＣＤＲＨ３ライブラリーは、１２個のアミノ酸（ＡＣＤＥＧＫＮＲＳＹＴＷ）および１つの終止コドンをコードするＤＶＫのようなコドンセットで作製することができる。ここでは、公知の抗体では稀に見られるアミノ酸は排除される。ＣＤＲＨ３ライブラリーはまた、１１個のアミノ酸（ＡＣＤＧＨＮＰＲＳＴＹ）をコードするが終止コドンおよびトリプトファン（Ｔｒｐ、Ｗ）をコードしないコドンセットＮＶＴを使っても作製することができる。いくつかの実施形態では、ＮＶＴなどのコドンセットの設計では、Ｔｒｐでドープしてもよい。
【０１３３】
上で議論されたように、ＣＤＲＨ３領域はその長さが非常に多様である。自然抗体では、ＣＤＲＨ３の長さは２個から２４個のアミノ酸の範囲であり、最も一般的な長さは１１〜１３残基である。一実施形態では、ＣＤＲＨ３の多様性はいくつかの異なるライブラリーを調製することによって生成され、各ライブラリーは約７個から１９個のアミノ酸の異なる長さのＣＤＲＨ３領域を有する。次に、異なる長さのＣＤＲＨ３領域を有するライブラリーがプールされ、高親和性結合抗体可変ドメインを選択および／またはスクリーニングするために用いられる。ＣＤＲＨ３の配列の長さに変化をもたせるために利用することができるオリゴヌクレオチドの具体例としては、図４および図４３に示すものが含まれる。
【０１３４】
いくつかの実施形態では、ＣＤＲＨ３のＮ末端領域およびＣ末端領域の多様性は最小化される。Ｃ末端では、公知の抗体には２種類の配列が恐らく存在する：Ｙ１００ａＡＭＤ１０１（Ｙ／Ｖ）１０２またはＦ１００ａＤ１０１（Ｙ／Ｖ）１０２。Ｃ末端領域の選択された残基を対象に、限られた多様性を生成することができる。例えば、Ｙ位置１００ａは、より少ないアミノ酸をコードするコドンセット、例えばＤＶＫ、ＤＳＧ、ＫＳＧ、ＤＳＧを使って変更するか、または２０個すべてのアミノ酸をコードするコドンセット、例えばＮＮＫ、ＮＶＴもしくはＸＹＺを使って変更することができる。
【０１３５】
本発明の１つの態様は、以下のアミノ酸配列を含む変異体ＣＤＲＨ３を含んでいるポリペプチド、例えば抗体可変ドメインを提供し、
（Ｘ１）ｎ−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６、
式中、Ｘ１は、ＮＮＫ、ＮＮＳ、ＤＶＫ、ＮＶＴ、ＸＹＺのコドンセットによってコードされるいずれかの天然アミノ酸、またはトリプトファンもしくはグリシンもしくはその混合物であり、ｎは４から１４であり、
Ｘ２は、ＫＳＧ、ＤＶＫ、ＤＳＧ、ＮＶＴ、ＫＳＧ、ＮＮＳ、ＸＹＺ、ＮＮＫのコドンセットでコードされるいずれかの天然アミノ酸、またはチロシン、フェニルアラニン、セリン、アラニン、グリシン、ロイシンもしくはトリプトファンであり、
Ｘ３は、Ｘ２がフェニルアラニンまたはロイシンのときは存在せず、あるいは存在する場合には、アラニン、バリン、アスパラギン酸またはグリシンであり、
Ｘ４は、Ｘ２がフェニルアラニンまたはロイシンのときは存在せず、あるいは存在する場合はメチオニンであり、
Ｘ５はアスパラギン酸、アラニン、バリンまたはグリシンであり、
Ｘ６はチロシンまたはバリンである。
上記式の変異体ＣＤＲＨ３を有するポリペプチドまたはポリペプチドライブラリーは、図４および図４３で例示されたオリゴヌクレオチドのいずれか１つまたはその組合せを使って作製することができる。
【０１３６】
一実施形態では、ＣＤＲＨ３はアミノ酸配列（Ｘ１）ｎ−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６を含み、式中、Ｘ１は、ＮＮＫ、ＮＮＳ、ＤＶＫ、ＮＶＴ、ＸＹＺのコドンセットによってコードされるいずれかの天然アミノ酸、またはトリプトファンもしくはグリシンもしくはその混合物であり、ｎは４から１４であり、Ｘ２は、ＫＳＧ、ＤＶＫ、ＤＳＧ、ＮＶＴ、ＫＳＧ、ＮＮＳ、ＸＹＺ、ＮＮＫのコドンセットでコードされるいずれかの天然アミノ酸、またはチロシン、フェニルアラニン、セリン、グリシン、アラニン、ロイシンまたはトリプトファンであり、Ｘ３はアラニン、バリン、アスパラギン酸またはグリシンであり、Ｘ４はメチオニンであり、Ｘ５はアスパラギン酸、アラニン、バリンまたはグリシンであり、Ｘ６はチロシンまたはバリンである。
【０１３７】
いくつかの実施形態では、ｎは好ましくは４であり、Ｘ１はコドンセットＮＮＫ、ＮＮＳまたはＸＹＺによってコードされるいずれかの天然アミノ酸であり、Ｘ２はＫＳＧ、ＮＮＫ、ＸＹＺによってコードされるいずれかの天然アミノ酸、またはチロシンであり、Ｘ３はアラニン、グリシンまたはバリンであり、Ｘ４はメチオニンであり、Ｘ５はアスパラギン酸であり、Ｘ６はチロシンである。これらの実施形態で変異体ＣＤＲＨ３領域を含んでいる１つまたは複数のポリペプチドは、オリゴヌクレオチドＦ６６ｅおよびＦ６６ｆを少なくとも１つまたは複数個用いて作製することができる。
【０１３８】
いくつかの実施形態では、ｎは好ましくは６であり、Ｘ１はコドンセットＤＶＫ、ＮＶＴ、ＮＮＫ、ＮＮＳまたはＸＹＺによってコードされるいずれかの天然アミノ酸、あるいはトリプトファンまたはグリシンまたはこれらの混合物であり、Ｘ２はＤＳＧ、ＤＶＫ、ＫＳＧ、ＮＮＫ、ＸＹＺによってコードされるいずれかの天然アミノ酸、またはチロシン、グリシン、セリン、アラニンもしくはトリプトファンであり、Ｘ３はアラニンであり、Ｘ４はメチオニンであり、Ｘ５はアスパラギン酸であり、Ｘ６はチロシンである。いくつかの実施形態では、Ｘ１は抗体４Ｄ５のＣＤＲＨ３のアミノ酸位置９５に対応し、Ｘ２はアミノ酸位置１００ａに対応し、Ａは１００ｂの位置、Ｍは１００ｃの位置、Ｄは１０１の位置、およびＹは１０２の位置にある。これらの実施形態で変異体ＣＤＲＨ３領域を含んでいる１つまたは複数のポリペプチドは、オリゴヌクレオチドＦ６３、Ｆ６４、Ｆ６５、Ｆ６６、Ｆ１６５、Ｆ１３４、Ｆ１３５、Ｆ１６３ａ、Ｆ１６６、Ｆ１６７、Ｆ６６ａ、Ｆ６６ｂ、Ｆ６６ａ１、Ｆ６６ｂ１、Ｆ１９０ｆおよびＦ１９０ｎを少なくとも１つまたは複数個用いて作製することができる。
【０１３９】
他の実施形態では、ＣＤＲＨ３はアミノ酸配列（Ｘ１）ｎ−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６を含み、式中、Ｘ１はＮＮＫ、ＮＮＳ、ＤＶＫ、ＮＶＴ、ＸＹＺのコドンセットによってコードされるいずれかの天然アミノ酸、またはトリプトファンもしくはグリシンもしくはその混合物であり、ｎは４から１４であり、Ｘ２はロイシンまたはフェニルアラニンであり、Ｘ３は存在せず、Ｘ４は存在せず、Ｘ５はアスパラギン酸、アラニン、バリンまたはグリシンであり、Ｘ６はチロシンまたはバリンである。いくつかの実施形態では、変異体ＣＤＲＨ３はアミノ酸配列（Ｘ１）ｎ−Ｘ２−Ｄ−Ｙを含み、式中、Ｘ１はＮＮＫ、ＮＮＳ、ＤＶＫ、ＮＶＴ、ＸＹＺのコドンセットによってコードされるいずれかの天然アミノ酸、またはトリプトファンもしくはグリシンもしくはその混合物であり、ｎは４から１４であり、Ｘ２はロイシンまたはフェニルアラニンであり、Ｄはアスパラギン酸、Ｙはチロシンである。他の実施形態では、ｎは好ましくは６であり、Ｘ１は抗体４Ｄ５のＣＤＲＨ３のアミノ酸位置９５に対応し、Ｘ２はアミノ酸位置１００ａに対応し、Ｘ５は１０１の位置、Ｘ６は１０２の位置にある。これらの実施形態で変異体ＣＤＲＨ３領域を含んでいる１つまたは複数のポリペプチドは、オリゴヌクレオチドＦ１７１ｃ、Ｆ１７１ｄ、Ｆ１７１ｅ、Ｆ１７１、Ｆ１８５、Ｆ１８６、Ｆ１８７、Ｆ１８５ａ、Ｆ１８５ｂ、Ｆ１８５ｂ１、Ｆ１８７ａ、Ｆ１８６ａ、Ｆ１８７ｂおよびＦ１８７ｃを少なくとも１つまたは複数個用いて作製することができる。
【０１４０】
本発明の他の態様では、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３からなる群から選ばれる１つ、２つまたはすべての変異体ＣＤＲを含む方法およびポリペプチド、例えば抗体可変ドメインが提供され、前記変異体ＣＤＲＨ３は下記アミノ酸配列を含み、
（Ｘ１）ｎ−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６、
式中、Ｘ１はＮＮＫ、ＮＮＳ、ＤＶＫ、ＮＶＴ、ＸＹＺのコドンセットによってコードされるいずれかの天然アミノ酸、またはトリプトファンもしくはグリシンもしくはその混合物であり、ｎは４から１４であり、
Ｘ２はＫＳＧ、ＤＶＫ、ＤＳＧ、ＮＶＴ、ＫＳＧ、ＮＮＳ、ＸＹＺ、ＮＮＫのコドンセットでコードされるいずれかの天然アミノ酸、またはチロシン、フェニルアラニン、グリシン、セリン、アラニン、ロイシンもしくはトリプトファンであり、
Ｘ３は、Ｘ２がフェニルアラニンまたはロイシンのときは存在せず、あるいは存在する場合には、アラニン、バリン、アスパラギン酸またはグリシンであり、
Ｘ４は、Ｘ２がフェニルアラニンまたはロイシンのときは存在せず、あるいは存在する場合はメチオニンであり、
Ｘ５はアスパラギン酸、アラニン、バリンまたはグリシンであり、
Ｘ６はチロシンまたはバリンであり、
前記変異体ＣＤＲＨ１もしくはＣＤＲＨ２、またはその両方は溶媒に露出した非常に多様なアミノ酸位置に少なくとも１つの変異体アミノ酸を有し、前記変異体アミノ酸は非ランダムコドンセットによってコードされ、前記非ランダムコドンセットによってコードされるアミノ酸の少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはすべてが周知の抗体または抗原結合断片（例えば、抗体可変ドメイン）におけるその位置の対象アミノである。
【０１４１】
本明細書で記載されるいかなる方法およびポリペプチドのいくつかの実施形態では、Ｈ３中の位置は、カバットナンバリング方法に従う抗体（例えば抗体４Ｄ５）の９５から１０２のいずれかの位置である。例えば、位置９５のアミノ酸は、コドンセットＤＶＫ、ＮＶＴ、ＮＮＳ、ＸＹＺ、ＮＮＫによってコードされる変異体アミノ酸を持つことができ、またはトリプトファンであり、位置９６は、ＤＶＫ、ＮＶＴ、ＮＮＳ、ＸＹＺによってコードされてよく、またはグリシンもしくはトリプトファンであり、位置９７はＤＶＫ、ＮＶＴ、ＮＮＳ、ＸＹＺによってコードされてよく、またはトリプトファンであり、位置９８はＤＶＫ、ＮＶＴ、ＮＮＳ、ＸＹＺによってコードされてよく、またはトリプトファンであり、位置９９は、ＤＶＫ、ＮＶＴ、ＮＮＳ、ＸＹＺによってコードされてよく、位置１００はＤＶＫ、ＮＶＴ、ＮＮＳ、ＸＹＺによってコードされてよく、またはトリプトファンであり、位置１００ａは、ＤＶＫ、ＤＳＧ、ＫＳＧ、ＮＶＴ、ＮＮＳ、ＸＹＺによってコードされてよく、またはチロシン、グリシン、セリン、アラニン、トリプトファン、アスパラギン酸、メチオニン、フェニルアラニン、ロイシン、バリンでもよく、位置１００ｂは、ＤＳＧ、ＫＳＧ、ＸＹＺによってコードされてよく、またはアラニン、チロシン、グリシン、バリン、アスパラギン酸、メチオニンもしくはフェニルアラニンでもよく、位置１００ｃは、ＫＳＧ、ＸＹＺによってコードされてよく、またはメチオニン、フェニルアラニン、ロイシン、アラニン、グリシン、バリン、チロシン、アスパラギン酸であり、位置１０１は、ＫＳＧ、ＸＹＺによってコードされてよく、またはアスパラギン酸、メチオニン、アラニン、バリン、グリシン、チロシン、フェニルアラニン、ロイシンであり、位置１０２はＫＳＧもしくはＸＹＺによってコードされてよく、またはチロシン、アスパラギン酸、メチオニン、アラニン、バリン、グリシンである。これらの実施形態で変異体ＣＤＲＨ３領域を含んでいる１つまたは複数のポリペプチドは、図４および図４３に例示したオリゴヌクレオチドを少なくとも１つまたは複数個用いて作製することができる。
【０１４２】
ＣＤＲＨ３への変異体アミノ酸の導入によってつくられるライブラリーの配列多様性は、これらのＣＤＲＨ３変異を抗体の他の領域、特に軽鎖または重鎖の可変配列の他のＣＤＲにおける変異と組み合わせることによって高めることができると考える。このセットの構成メンバーをコードする核酸配列は、コドンセットを通して、軽鎖または重鎖の配列のＣＤＲにおける他の変異体アミノ酸の導入によってさらに多様化することができると考える。このように、例えば、一実施形態では、対象抗原と結合する融合ポリペプチドからのＣＤＲＨ３配列は、多様化されたＣＤＲＬ３、ＣＤＲＨ１またはＣＤＲＨ２配列、あるいは多様化されたＣＤＲのいかなる組合せとも組み合わせることができる。
【０１４３】
いくつかの例では、例えばコンセンサス配列を反映させるため、または安定性を向上させるため、または提示するために、フレームワーク残基をソース抗体または抗原結合断片の配列に対して変化させることができる点に留意する必要がある。例えば、重鎖のフレームワーク残基４９、９３、９４または７１は変化させることができる。重鎖フレームワーク残基９３は、セリンまたはアラニン（その位置のヒトコンセンサス配列アミノ酸）でもよい。重鎖フレームワーク残基９４は、フレームワークコンセンサス配列を反映するためにトレオニンからアルギニンまたはリジンに変更してもよい。変えることができるフレームワーク残基の他の例は重鎖フレームワーク残基７１であり、カバットデータベースで見られるようにそれは約１９７０のポリペプチドではＲ、約６２７のポリペプチドではＶ、約５２７のポリペプチドではＡである。重鎖のフレームワーク残基４９は、アラニンまたはグリシンでよい。さらに、任意選択に、Ｈ鎖可変ドメインの３つのＮ末端アミノ酸は取り除くことができる。軽鎖では、任意選択に、アミノ酸位置６６のアルギニンはグリシンに変更することができる。
【０１４４】
一態様では、本発明は潜在的なリガンドに顕著な親和性で結合する融合ポリペプチドを生成するためのベクター構築物を提供する。これらの構築物は、融合ポリペプチドに存在するとき重鎖が二量体化してＦａｂまたはＦａｂ’の抗体断片／部分の二量体を形成する傾向を強める二量体化可能なドメインを含む。これらの二量体化ドメインは、例えば、融合ポリペプチドに存在してもよい重鎖ヒンジ配列を含むことができる。融合ファージポリペプチドの二量体化ドメインは２組の融合ポリペプチド（ＬＣ／ＨＣ−ファージタンパク質／断片（例えばｐＩＩＩ））で構成され、こうして２組の融合ポリペプチド間で適当な結合（例えば重鎖間ジスルフィド架橋）の形成を可能にする。そのような二量体化ドメインを含んでいるベクター構築物を用いて、ファージ上で抗体可変ドメイン、例えば、本明細書で記載される多様化された融合タンパク質の二価提示を達成することができる。好ましくは、各単量体抗体断片（融合ポリペプチド）の内在性親和性は、二量体化ドメインとの融合によって著しく変更されることはない。好ましくは、二量体化は、著しく低下した解離速度でファージ結合のアビディティーを高める二価ファージディスプレイをもたらし、このことは当技術分野で公知の方法により、また本明細書で記載されているように測定することができる。本発明の二量体化ドメイン含有ベクターは、二量体化ドメインの後ろにアンバー終止コドンを含んでもよいし含まなくてもよい。ベクターの具体例を図３４に示す。
【０１４５】
異なる提示特性を達成するために二量体化を変更することができる。二量体化ドメインは、システイン残基、完全長抗体からのヒンジ領域、ロイシンジッパー配列もしくはＧＣＮ４ジッパー配列のような二量体化配列またはその混合物を含んでいる配列を含むことができる。二量体化配列は当技術分野で公知であり、例えば、ＧＣＮ４ジッパー配列（ＧＲＭＫＱＬＥＤＫＶＥＥＬＬＳＫＮＹＨＬＥＮＥＶＡＲＬＫＫＬＶＧＥＲＧ）（配列番号３）などが含まれる。この二量体化ドメインは、好ましくは重鎖可変ドメインまたは定常ドメインの配列のＣ末端、および／あるいは重鎖可変ドメインまたは定常ドメインの配列とウイルスコートタンパク質成分の配列との間に位置する。アンバー終止コドンも、二量体化ドメインのＣ末端またはその後に存在してもよい。アンバー終止コドンが存在する一実施形態では、二量体化ドメインは少なくとも１つのシステインおよびロイシンジッパーなどの二量体化配列をコードする。アンバー終止コドンが存在しない他の実施形態では、二量体化ドメインは単一のシステイン残基を含む。
【０１４６】
本発明のポリペプチドは、変異体ポリペプチドの提示のために、または前記ポリペプチドの精製、スクリーニングもしくは選別および検出のために他の種類のポリペプチドと融合することもできる。ファージディスプレイを含む実施形態に関しては、本発明のポリペプチドはウイルスコートタンパク質のすべてまたは一部と融合される。ウイルスコートタンパク質の例としては、タンパク質ＰＩＩＩ、主コートタンパク質、ｐＶＩＩＩ、Ｓｏｃ、Ｈｏｃ、ｇｐＤ、ｐＶＩおよびその変異体が含まれる。さらに、本発明の方法によって生成される変異体ポリペプチドは、ポリペプチドマーカーまたはタグ、例えばＦＬＡＧ、ポリヒスチジン、ｇＤ、ｃ−ｍｙｃ、β−ガラクトシダーゼなどと任意選択に融合することができる。
【０１４７】
ランダム化可変ドメインライブラリー作製法
鋳型核酸に選択されたアミノ酸を置換する方法は当技術分野で確立されており、その幾つかは本明細書で記載されている。例えば、キュンケル方法を使用し、少なくとも１つのＣＤＲ領域の溶媒に露出しかつ／または非常に多様な位置を対象に変異体アミノ酸でアミノ酸を置換することによってライブラリーを作製することができる。例えば、Ｋｕｎｋｅｌ他、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８７）、１５４：３６７〜３８２頁を参照。ランダム化された配列の生成は、下の実施例でも後述する。
【０１４８】
オリゴヌクレオチド配列は、異なる長さのＣＤＲＨ３のためにまたはＣＤＲの溶媒に露出し非常に多様な位置のために設計されたコドンセットの１つまたは複数を含む。コドンセットは所望の変異体アミノ酸をコードするのに用いられる、一組の異なるヌクレオチドトリプレット配列である。コドンセットは、ＩＵＢコードによって下で示すように、特定のヌクレオチドまたはヌクレオチドの等モル混合物を示すために符号を使って表される。コドンセットは、一般的に３つの大文字、例えばＮＮＫ、ＮＮＳ、ＤＶＫなどで表される。
【０１４９】
ＩＵＢコード
Ｇ グアニン
Ａ アデニン
Ｔ チミン
Ｃ シトシン
Ｒ（ＡまたはＧ）
Ｙ（ＣまたはＴ）
Ｍ（ＡまたはＣ）
Ｋ（ＧまたはＴ）
Ｓ（ＣまたはＧ）
Ｗ（ＡまたはＴ）
Ｈ（ＡまたはＣまたはＴ）
Ｂ（ＣまたはＧまたはＴ）
Ｖ（ＡまたはＣまたはＧ）
Ｄ（ＡまたはＧまたはＴ）
Ｎ（ＡまたはＣまたはＧまたはＴ）
【０１５０】
例えば、コドンセットＤＶＫでは、ＤはヌクレオチドＡまたはＧまたはＴであり、ＶはＡまたはＧまたはＣであり、ＫはＧまたはＴである。このコドンセットは１８個の異なるコドンを表し、アミノ酸Ａｌａ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、ＧｌｙおよびＣｙｓをコードすることができる。
【０１５１】
オリゴヌクレオチドまたはプライマーのセットは、標準の方法を使って合成できる。一組のオリゴヌクレオチドは、例えば、コドンセットによって提供されるヌクレオチドトリプレットの可能な組合せのすべてを代表し、所望のアミノ酸群をコードする配列を含む固相法によって合成することができる。ある位置での選ばれたヌクレオチド「縮退」を有するオリゴヌクレオチドの合成は、当技術分野で公知である。そのようなある種のコドンセットを有しているヌクレオチドのセットは、市販の核酸シンセサイザー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡなどから入手可能）を使って合成することができ、または市販品を入手することができる（例えば、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤから）。したがって、特定のコドンセットを有する合成オリゴヌクレオチドセットは、一般的に異なる配列の複数のオリゴヌクレオチドを含み、この相違は配列全体の中のコドンセットによるものである。本発明で使用されるように、オリゴヌクレオチドは可変ドメイン核酸鋳型へのハイブリダイゼーションを可能にする配列を有し、また、クローニングに役立つ制限酵素部位を含むこともできる。
【０１５２】
１つの方法では、変異体アミノ酸をコードしている核酸配列は、４Ｄ５の抗体可変ドメインなどのソースまたは鋳型ポリペプチドをコードしている核酸配列のオリゴヌクレオチドを媒介した突然変異生成によって作製することができる。この手法はＺｏｌｌｅｒ他、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１０：６４８７〜６５０４頁（１９８７）が記載しているように、当技術分野で公知である。つまり、変異体アミノ酸をコードしている核酸配列は所望のコドンセットをコードしているオリゴヌクレオチドセットをＤＮＡ鋳型とハイブリダイズすることによって作製され、前記鋳型は可変部核酸鋳型配列を含むプラスミドの一本鎖型である。ハイブリダイゼーションの後、ＤＮＡポリメラーゼを用いて鋳型の二次相補鎖すべてを合成し、この相補鎖はオリゴヌクレオチドプライマーを取り込み、前記オリゴヌクレオチドセットによって提供されるコドンセットを含むようになる。他のソースまたは鋳型分子をコードしている核酸は公知であるか、または容易に決定することができる。
【０１５３】
通常、長さが少なくとも２５ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドが使われる。最適オリゴヌクレオチドは、突然変異体をコードするヌクレオチドの両側が鋳型と完全に相補性である１２から１５個のヌクレオチドを持つ。これにより、オリゴヌクレオチドが正しく一本鎖ＤＮＡ鋳型分子にハイブリダイズするようになる。オリゴヌクレオチドは、当技術分野で公知の手法、例えばＣｒｅａ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７５：５７６５頁（１９７８）に記載の手法を使って容易に合成される。
【０１５４】
ＤＮＡ鋳型はバクテリオファージＭ１３ベクター（市販のＭ１３ｍｐ１８およびＭ１３ｍｐ１９ベクターが適当）に由来するベクター、またはＶｉｅｒａ他、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５３：３頁（１９８７）に記載されている一本鎖ファージ複製起点を含むベクターによって生成される。このように、突然変異させるべきＤＮＡは、一本鎖鋳型を生成するためにこれらのベクターの１つに挿入することができる。一本鎖鋳型の生産は、前記Ｓａｍｂｒｏｏｋ他のセクション４．２１〜４．４１で記載されている。
【０１５５】
未変性のＤＮＡ配列を変えるために、オリゴヌクレオチドが適当なハイブリダイゼーション条件の下で一本鎖鋳型にハイブリダイズされる。ＤＮＡ重合酵素、通常、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼまたはＤＮＡポリメラーゼＩのクレノー断片を次に加え、合成のためのプライマーとしてオリゴヌクレオチドを使って鋳型の相補鎖を合成する。こうしてＤＮＡの１つの鎖は遺伝子１の突然変異した形態をコードし、他の鎖（元の鋳型）は遺伝子１の未変性、未変更の配列をコードするようにヘテロ二本鎖分子が形成される。このヘテロ二本鎖分子は、次に適当な宿主細胞、通常大腸菌ＪＭ１０１のような原核生物に形質転換される。細胞を増殖させた後にアガロースプレートの上へプレートし、突然変異したＤＮＡを含む細菌コロニーを同定するために３２リン酸塩で放射性標識されたオリゴヌクレオチドプライマーを使ってスクリーニングする。
【０１５６】
この上で記載されている方法は、プラスミドの両方の鎖が突然変異を含むホモ二本鎖分子が作製されるように修正することができる。この修正は以下の通りである。一本鎖オリゴヌクレオチドを先に述べたように一本鎖鋳型にアニールする。３つのデオキシリボヌクレオチド、デオキシリボアデノシン（ｄＡＴＰ）、デオキシリボグアノシン（ｄＧＴＰ）およびデオキシリボチミジン（ｄＴＴ）の混合物を、ｄＣＴＰ−（ａＳ）と呼ばれる修飾されたチオデオキシリボシトシン（Ａｍｅｒｓｈａｍから入手できる）と合わせる。この混合物を鋳型−オリゴヌクレオチド複合体に加える。ＤＮＡポリメラーゼをこの混合物へ追加すると、突然変異した塩基以外は鋳型と同一のＤＮＡ鎖が生成する。さらに、この新しいＤＮＡ鎖はｄＣＴＰの代わりにｄＣＴＰ−（ａＳ）を含み、これはＤＮＡ鎖を制限酵素による消化作用から保護するのに役立つ。二本鎖ヘテロ二本鎖の鋳型鎖に適当な制限酵素でニックを入れた後、突然変異を起こさせる部位を含む領域の後方で鋳型鎖はＥｘｏＩＩＩヌクレアーゼまたは適当な他のヌクレアーゼで消化することができる。反応を終了すると、部分的にだけ一本鎖の分子が残る。次に、完全な二本鎖ＤＮＡホモ二本鎖が、４つのデオキシリボヌクレオチド三燐酸のすべて、ＡＴＰおよびＤＮＡリガーゼの存在下でＤＮＡポリメラーゼを使って形成される。このヘテロ二本鎖分子は、次に適当な宿主細胞に形質転換することができる。
【０１５７】
前に示したように、オリゴヌクレオチドセットの配列の長さは鋳型核酸にハイブリダイズするために十分な長さであり、また、必須ではないが制限部位を含むこともできる。ＤＮＡ鋳型はバクテリオファージＭ１３ベクターに由来するベクター、またはＶｉｅｒａ他（（１９８７）、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５３：３頁）に記載されている一本鎖ファージ複製起点を含むベクターによって生成される。このように、突然変異させるべきＤＮＡは、一本鎖鋳型を生成するためにこれらのベクターの１つに挿入する必要がある。一本鎖鋳型の生産は、前記Ｓａｍｂｒｏｏｋ他のセクション４．２１〜４．４１で記載されている。
【０１５８】
他の方法によると、ライブラリーは上流および下流のオリゴヌクレオチドセットを提供することによって生成することができ、各セットは、オリゴヌクレオチドの配列内で提供されたコドンセットによって確立された異なる配列を有する複数のオリゴヌクレオチドを持つ。上流および下流のオリゴヌクレオチドセットは、可変ドメイン鋳型核酸配列と共に、ＰＣＲ産物の「ライブラリー」を作製するためにＰＣＲ法で使うことができる。ＰＣＲ産物は確立された分子生物学的手法を使って他の関連した、または無関係な核酸配列、例えばウイルスのコートタンパク質構成成分および二量体化ドメインと融合することができるので、「核酸カセット」と呼ぶこともある。
【０１５９】
ＰＣＲプライマー配列は、ＣＤＲ領域の溶媒に露出し非常に多様な位置のために設計されたコドンセットの１つまたは複数を含む。前記したように、コドンセットは所望の変異体アミノ酸をコードするのに用いられる、一組の異なるヌクレオチドトリプレット配列である。
【０１６０】
オリゴヌクレオチドセットは、核酸カセットを作製するための鋳型として可変部核酸鋳型配列を使ってＰＣＲ法で使うことができる。可変部核酸鋳型配列は、対象核酸配列（すなわち、置換の対象となるアミノ酸をコードしている核酸配列）を含む免疫グロブリンの軽鎖または重鎖のいかなる部分でもよい。可変部核酸鋳型配列は、第１の核酸鎖および相補性の第２の核酸鎖を有する二本鎖ＤＮＡ分子の一部である。可変部核酸鋳型配列は、少なくとも可変ドメインの一部を含み、また少なくとも１つのＣＤＲを持つ。場合によっては、可変部核酸鋳型配列は複数のＣＤＲを含む。可変部核酸鋳型配列の上流部および下流部は、上流域のオリゴヌクレオチドセットおよび下流域のオリゴヌクレオチドセットの構成メンバーによるハイブリダイゼーションの対象とすることができる。
【０１６１】
上流のプライマーセットの第１のオリゴヌクレオチドは第１の核酸鎖にハイブリダイズすることができ、下流のプライマーセットの第２のオリゴヌクレオチドは第２の核酸鎖にハイブリダイズすることができる。オリゴヌクレオチドプライマーは１つまたは複数のコドンセットを含むことができ、可変部核酸鋳型配列の一部にハイブリダイズするように設計することができる。これらのオリゴヌクレオチドの使用により、ＰＣＲ後に２つ以上のコドンセットをＰＣＲ産物（すなわち核酸カセット）に導入することができる。抗体可変ドメインをコードしている核酸配列の領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマーは、アミノ酸置換の対象となるＣＤＲ残基をコードする部分を含む。
【０１６２】
上流域および下流域のオリゴヌクレオチドセットは、オリゴヌクレオチド配列内に制限部位を含むように合成することもできる。これらの制限部位は、さらなる抗体配列を有している発現ベクターへの核酸カセット（すなわちＰＣＲ反応生成物）の挿入を容易にする。好ましくは、制限部位は外来の核酸配列を導入することなく、または元のＣＤＲまたはフレームワーク核酸配列を取り除くことなく核酸カセットのクローニングを容易にするようになっている。
【０１６３】
核酸カセットは、作製した対象アミノ酸置換を含む軽鎖または重鎖の配列の一部またはすべての発現のために、いかなる適当なベクターにもクローニングすることができる。本発明で詳述される方法によると、核酸カセットはウイルスコートタンパク質のすべてまたは一部と融合した軽鎖または重鎖配列の一部またはすべて（すなわち、融合タンパク質を形成）の生産を可能にしているベクターにクローニングされるか、あるいは、粒子または細胞の表面で提示される。数種類のベクターが入手でき、それらは本発明の実施に用いることができるが、ファージミドベクターが本明細書での使用には好ましいベクターであり、その訳はそれらが相対的に容易に構築し、また容易に増幅することができるからである。当業者に公知のように、ファージミドベクターは、通常、プロモーター、シグナル配列、表現型選択遺伝子、複製起点部位および他の必要な構成成分を含む様々な構成成分を含む。
【０１６４】
特定の変異体アミノ酸の組合せが発現される他の実施形態では、核酸カセットは、重鎖または軽鎖の可変ドメインのすべてまたは一部をコードすることができ、また変異体アミノ酸の組合せをコードすることができる配列を含む。ライブラリーの場合のようにこれらの変異体アミノ酸または変異体アミノ酸の組合せを含んでいる抗体の作製のために、核酸カセットは、さらなる抗体配列、例えば軽鎖および重鎖可変部の可変または定常ドメインのすべてまたは一部を含んでいる発現ベクターに挿入することができる。これらのさらなる抗体配列は他の核酸配列、例えばウイルスコートタンパク質構成成分をコードしている配列と融合することができ、したがって融合タンパク質の生産を可能にする。
【０１６５】
ベクター
本発明の１つの態様は遺伝子融合をコードしている核酸配列を含んでいる複製可能な発現ベクターを含み、前記遺伝子融合は、ウイルスコートタンパク質のすべてまたは一部と融合し、１つの抗体可変ドメイン、または１つの抗体可変ドメインと１つの定常ドメインを含む融合タンパク質をコードする。先に述べたように多様な配列で生成された複数の抗体可変ドメインを含む複数の異なる融合タンパク質をコードする複数の遺伝子融合を含む、多様で複製可能な発現ベクターのライブラリーも含まれる。ベクターは様々な構成成分を含むことができ、好ましくは異なるベクターの間で抗体可変ドメインが移動できるように、かつ／または異なるフォーマットで融合タンパク質が提示されるように構築される。
【０１６６】
ベクターの例としてはファージベクターが含まれる。ファージベクターは、ファージ複製およびファージ粒子形成を可能にするファージ複製起点を有する。ファージは好ましくは繊維状バクテリオファージ、例えばＭ１３、ｆ１、ｆｄ、Ｐｆ３ファージもしくはその誘導体、またはラムドイドファージ、例えばラムダ、２１、ｐｈｉ８０、ｐｈｉ８１、８２、４２４、４３４、その他、もしくはその誘導体である。
【０１６７】
ウイルスコートタンパク質の例には、感染性タンパク質ＰＩＩＩ、主コートタンパク質ＰＶＩＩＩ、ｐ３、Ｓｏｃ（Ｔ４）、Ｈｏｃ（Ｔ４）、ｇｐＤ（バクテリオファージλ）、マイナーバクテリオファージコートタンパク質６（ｐＶＩ）（繊維状ファージ；Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．１９９９年１２月１０日；２３１（１〜２）：３９〜５１頁）、Ｍ１３バクテリオファージ主コートタンパク質変異体（Ｐ８）（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ ２０００年４月；９（４）：６４７〜５４頁）が含まれる。融合タンパク質はファージの表面で提示されるが、適当なファージ系にはＭ１３ＫＯ７ヘルパーファージ、Ｍ１３Ｒ４０８、Ｍ１３−ＶＣＳおよびＰｈｉ Ｘ １７４、ｐＪｕＦｏファージ系（Ｊ Ｖｉｒｏｌ．２００１年８月；７５（１５）：７１０７〜１３頁．ｖ）、ハイパーファージ（Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００１年１月；１９（１）：７５〜８頁）が含まれる。好ましいヘルパーファージはＭ１３ＫＯ７であり、好ましいコートタンパク質はＭ１３ファージ遺伝子ＩＩＩコートタンパク質である。好ましい宿主は大腸菌、および大腸菌のプロテアーゼ欠損株である。ベクター、例えばｆｔｈ１ベクター（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２００１年５月１５日；２９（１０）：Ｅ５０−０）は、融合タンパク質の発現に役立つことがある。
【０１６８】
発現ベクターは、抗体の各サブユニットまたはその断片をコードしているＤＮＡと融合した分泌シグナル配列も持つことができる。この配列は典型的には融合タンパク質をコードしている遺伝子の直ぐ５’側に位置し、したがって融合タンパク質のアミノ末端で転写される。しかし、あるケースでは、シグナル配列は分泌されるべきタンパク質をコードしている遺伝子の５’以外の位置にあることが証明された。この配列は、それが細菌細胞の内膜を横切って結合するタンパク質を対象とする。シグナル配列をコードしているＤＮＡは、シグナル配列を持つタンパク質をコードしている遺伝子のいずれかから、制限エンドヌクレアーゼ断片として得られる。原核生物の適当なシグナル配列は、例えば、ＬａｍＢまたはＯｍｐＦ（Ｗｏｎｇ他、Ｇｅｎｅ，６８：１９３１頁（１９８３））、ＭａｌＥ、ＰｈｏＡをコードしている遺伝子および他の遺伝子から得られるかもしれない。本発明の実施のための好ましい原核生物シグナル配列は、Ｃｈａｎｇ他、Ｇｅｎｅ ５５：１８９頁（１９８７）、に記載されている大腸菌耐熱性エンテロトキシンＩＩ（ＳＴＩＩ）シグナル配列およびｍａｌＥである。
【０１６９】
ベクターは、一般的に、融合タンパク質の発現を促進するためにプロモーターを含む。原核生物ベクターで最も一般的に使われるプロモーターには、ｌａｃ Ｚプロモーター系、アルカリホスファターゼｐｈｏ Ａプロモーター（Ａｐ）、バクテリオファージλＰＬプロモーター（温度感受性プロモーター）、ｔａｃプロモーター（ｌａｃリプレッサーによって制御されるハイブリッドｔｒｐ−ｌａｃプロモーター）、トリプトファンプロモーターおよびバクテリオファージＴ７プロモーターが含まれる。プロモーターの総説に関しては、前出Ｓａｍｂｒｏｏｋ他のセクション１７を参照。これらが最も一般的に使用されるプロモーターであるが、他の適当な微生物プロモーターも同様に使うことができる。
【０１７０】
ベクターは、また、他の核酸配列、例えば、ｇＤタグ、ｃ−Ｍｙｃエピトープ、ポリ−ヒスチジンタグ、蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ）またはファージまたは細胞の表面で発現する融合タンパク質の検出または精製に役立つβ−ガラクトシダーゼタンパク質をコードしている配列を含むことができる。例えばｇＤタグをコードしている核酸配列は、また、融合タンパク質を発現する細胞またはウイルスの正または負の選択を可能にする。いくつかの実施形態では、ｇＤタグは好ましくはウイルスコートタンパク質構成成分に融合していない抗体可変ドメインと融合する。例えば、ポリヒスチジン標識をコードしている核酸配列は、免疫組織化学手法を使って特異的抗原と結合する抗体可変ドメインを含む融合タンパク質を同定するために役立つ。抗原結合の検出に役立つタグは、ウイルスコートタンパク質構成成分に融合していない抗体可変ドメイン、またはウイルスコートタンパク質構成成分に融合した抗体可変ドメインに融合することができる。
【０１７１】
本発明を実践するのに用いられるベクターの他の有用構成成分は、表現型選択遺伝子である。典型的表現型選択遺伝子は、宿主細胞に抗生物質耐性を与えるタンパク質をコードしている遺伝子である。実例として、アンピシリン耐性遺伝子（ａｍｐｒ）およびテトラサイクリン耐性遺伝子（ｔｅｔｒ）はこの目的のために容易に使用される。
【０１７２】
ベクターは、独特の制限部位および抑制性終止コドンを含んでいる核酸配列も含むことができる。独特の制限部位は異なるベクターおよび発現系の間で抗体可変ドメインを移動させるために役立ち、特に細胞培養による完全長抗体または抗原結合断片の生産に役立つ。抑制性終止コドンは融合タンパク質の発現レベルを調節するのに役立ち、可溶性抗体断片の精製を容易にする。例えば、アンバー終止コドンはファージディスプレイを可能にするｓｕｐＥ宿主ではＧｌｎと解釈することができるが、非ｓｕｐＥ宿主ではそれはファージコートタンパク質と融合していない可溶性抗体断片を産生する終止コドンと解釈される。これらの合成配列は、ベクター内の１つまたは複数の抗体可変ドメインと融合させることができる。
【０１７３】
関心の抗体配列、例えば変異体アミノ酸を有するＣＤＲをコードしている核酸がベクター系から容易に取り出されて他のベクター系に入れられるようにするベクター系を使うことが好ましい。例えば、変異体アミノ酸を有する抗体または抗体可変ドメインをコードしている核酸配列の取り出しを容易にするために、適当な制限部位をベクター系に組み込むことができる。制限配列は、通常、効率的な切出しおよび新しいベクターへのライゲーションを容易にするために、ベクター内でユニークなものが選ばれる。抗体または抗体可変ドメインは、その後外来の融合配列、例えばウイルスコートタンパク質または他の配列タグなしでベクターから発現され得る。
【０１７４】
抗体可変ドメインまたは定常ドメインをコードしている核酸（遺伝子１）とウイルスのコートタンパク質構成成分（遺伝子２）との間に、終結または終止コドンをコードしているＤＮＡを挿入することができ、そのような終結コドンにはＵＡＧ（アンバー）、ＵＡＡ（オーカー）およびＵＧＡ（オペル）が含まれる。（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ｄａｖｉｓ他、Ｈａｒｐｅｒ ＆ Ｒｏｗ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８０年、２３７頁、２４５〜４７頁および３７４頁）。野生型宿主細胞で発現する終結または終止コドンは、遺伝子２タンパク質が結合しない遺伝子１タンパク質産物の合成をもたらす。しかし、抑制宿主細胞での増殖は検出可能な量の融合タンパク質の合成をもたらす。そのような抑制宿主細胞は公知であり、大腸菌抑制遺伝子株（Ｂｕｌｌｏｃｋ他、Ｂｉｏ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ５：３７６〜３７９頁（１９８７））などが記載されている。そのような終結コドンを融合ポリペプチドをコードしているｍＲＮＡに入れるために、許容できるいかなる方法でも用いることができる。
【０１７５】
抑制性コドンは、抗体可変または定常ドメインをコードしている第１の遺伝子とファージコートタンパク質の少なくとも一部をコードしている第２の遺伝子との間に挿入することができる。あるいは、抑制性終結コドンは、抗体可変ドメインの最後のアミノ酸トリプレットまたはファージコートタンパク質の最初のアミノ酸を置換することによって融合部位に隣接して挿入することができる。抑制性終結コドンは、二量体化ドメインのＣ末端またはその後に位置してもよい。抑制性コドンを含んでいるプラスミドがサプレッサー宿主細胞で増殖された場合、ポリペプチドおよびコートタンパク質を含んでいる融合ポリペプチドの検出可能な量が生産される。プラスミドが非サプレッサー宿主細胞で増殖された場合、抗体可変ドメインは挿入された抑制性トリプレットＵＡＧ、ＵＡＡまたはＵＧＡにおける終結のために、実質的にファージコートタンパク質と融合せずに合成される。非サプレッサー細胞では、抗体可変ドメインはそれを宿主メンブランに固定する融合ファージコートタンパク質が存在しないために、合成された後に宿主細胞から分泌される。
【０１７６】
いくつかの実施形態では、多様化される（ランダム化される）ＣＤＲは、鋳型配列（本明細書では「終止鋳型」と呼ぶ）に組み込まれた終止コドンを持つことができる。この特徴は、関心の変異体アミノ酸の配列を含むオリゴヌクレオチドの取り込みのために、鋳型配列における終止コドンの修復の成功に基づき、多様化が成功した配列の検出と選択を可能にする。この特徴は、下記の実施例でさらに例示される。
【０１７７】
軽鎖および／または重鎖抗体可変または定常ドメインはさらなるペプチド配列に融合することもでき、このさらなるペプチド配列はウイルス粒子または細胞の表面での１つまたは複数の融合ポリペプチドの相互作用を可能にする。これらのペプチド配列は、本明細書では「二量体化ドメイン」と称す。二量体化ドメインは、少なくとも１つまたは複数の二量体化配列、またはシステイン残基を含んでいる配列を少なくとも１つ、あるいはこの両方共含むことができる。適当な二量体化配列には、疎水残基が一定の間隔をあけて存在し、各タンパク質の疎水残基の相互作用による二量体の形成を可能にする両親媒性のαヘリックスを有するタンパク質のそれらが含まれる。そのようなタンパク質およびタンパク質部分には、例えばロイシンジッパー領域が含まれる。二量体化ドメインは、また、１つまたは複数のシステイン残基を含むことができる（例えば、二量体化ドメイン内に抗体ヒンジ配列を含むことにより提供される）。システイン残基は、１つまたは複数のジスルフィド結合の形成による二量体化を可能にする。終止コドンが二量体化ドメインの後方に存在する一実施形態では、二量体化ドメインは少なくとも１つのシステイン残基を含む。二量体化ドメインは、好ましくは抗体可変または定常ドメインとウイルスコートタンパク質構成成分との間に位置する。
【０１７８】
場合によっては、ベクターは、例えばコートタンパク質に融合した重鎖および軽鎖可変部を含んでいる単鎖形態の単一の抗体ファージポリペプチドをコードする。これらのケースでは、ベクターは、ある種のプロモーターの制御下で１つの転写産物を発現する「一シストロン性」と考えられる。そのようなベクターの実例を図３４ＣおよびＤに示す。図３４Ｃでは、ＶＬおよびＶＨドメインの間にリンカーペプチドを有し、ＶＬおよびＶＨドメインをコードしている一シストロン性配列の発現を促進するためにアルカリホスファターゼ（ＡＰ）またはＴａｃプロモーターを利用するベクターを示す。このシストロン配列は、５’末端で大腸菌のｍａｌＥまたは耐熱性エンテロトキシンＩＩ（ＳＴＩＩ）シグナル配列に連結し、３’末端でウイルスコートタンパク質（図３４ではｐＩＩＩタンパク質として示す）のすべてまたは一部に連結する。このベクターによってコードされる融合ポリペプチドは、本明細書では「ＳｃＦｖ−ｐＩＩＩ」と称す。いくつかの実施形態では、図３４Ｄで例示するように、ベクターは第２の可変ドメイン配列（図３４ＤのＶＨ）とウイルスコートタンパク質配列との間のその３’末端に、二量体化ドメイン（例えばロイシンジッパー）をコードしている配列をさらに含むことができる。この二量体化ドメインを含んでいる融合ポリペプチドは、二量体化により２つのｓｃＦｖポリペプチドの複合体（本明細書では「（ＳｃＦｖ）２−ｐＩＩＩ」と称す）を形成することができる。
【０１７９】
その他の場合、重鎖および軽鎖の可変部は別々のポリペプチドとして発現され、このようにベクターは「二シストロン性」であり、別々の転写産物の発現を可能にする。二シストロン性ベクターの例を図３４Ａおよび４Ｂに図式的に示す。これらのベクターでは、適当なプロモーター、例えばＰｔａｃまたはＰｈｏＡプロモーターは二シストロン性メッセージの発現を促すために利用できる。例えば軽鎖可変および定常ドメインをコードしている第１のシストロンは、５’末端で大腸菌のｍａｌＥまたは耐熱性エンテロトキシンＩＩ（ＳＴＩＩ）シグナル配列に連結し、３’末端でｇＤタグをコードしている核酸配列に連結している。例えば重鎖可変および定常ドメインＣＨ１をコードしている第２のシストロンは、５’末端で大腸菌のｍａｌＥまたは耐熱性エンテロトキシンＩＩ（ＳＴＩＩ）シグナル配列に連結し、３’末端でウイルスコートタンパク質のすべてまたは一部に連結している。
【０１８０】
二シストロン性メッセージを提供し、Ｆ（ａｂ’）２−ｐＩＩＩの提示のためのベクターを図３４Ｂに示す。このベクターでは、適当なプロモーター、例えばＰｔａｃまたはＰｈｏＡ（ＡＰ）プロモーターは、５’末端で大腸菌ｍａｌＥまたは耐熱性エンテロトキシンＩＩ（ＳＴＩＩ）シグナル配列と作用可能に連結し、３’末端でｇＤタグをコードしている核酸配列と連結した軽鎖可変および定常ドメインをコードしている第１のシストロンの発現を促進する。第２のシストロンは、例えば５’末端で大腸菌のｍａｌＥまたは耐熱性エンテロトキシンＩＩ（ＳＴＩＩ）シグナル配列と作用可能に連結した重鎖可変および定常ドメインをコードし、３’末端にはＩｇＧヒンジ配列およびロイシンジッパー配列、さらにその後方に少なくとも一部のウイルスコートタンパク質を含む二量体化ドメインを持つ。
【０１８１】
融合ポリペプチドの提示
抗体可変ドメインの融合ポリペプチドは、細胞、ウイルスまたはファージミド粒子の表面で様々な形式で提示することができる。これらの形式には、単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）、Ｆ（ａｂ）断片およびこれらの断片の多価の形態が含まれる。多価の形態は、好ましくはＳｃＦｖ、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）の二量体であり、これらは本明細書では（ＳｃＦｖ）２、Ｆ（ａｂ）２およびＦ（ａｂ’）２とそれぞれ称す。多価の形態の提示が好まれる理由の一部は、それらが、通常低親和性クローンの同定をもたらし、また選択過程で稀なクローンのより効率的な選別を可能にする複数の抗原結合部位を有することによる。
【０１８２】
バクテリオファージの表面で抗体断片を含んでいる融合ポリペプチドを提示する方法は当技術分野で公知であり、例えばＷＯ９２／０１０４７号および本明細書で記載されている。他の公開特許公報ＷＯ９２／２０７９１号；ＷＯ９３／０６２１３号；ＷＯ９３／１１２３６号および国際出願第９３／１９１７２号は関連した方法を記載しており、参照によりすべて本明細書に組み込まれている。他の刊行物は、ファージ表面で提示された様々な抗原に対する、人工的に再配置されたＶ遺伝子レパートリーによる抗体の同定を示した（例えば、Ｈ．Ｒ．Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ＆ Ｇ．Ｗｉｎｔｅｒ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７、３８１〜３８８頁、１９９２年；またＷＯ９３／０６２１３号およびＷＯ９３／１１２３６号で開示されている）。
【０１８３】
ベクターがｓｃＦｖ形式での提示のために構築される場合、このベクターは抗体可変軽鎖ドメインおよび抗体可変重鎖可変ドメインをコードしている核酸配列を含む。一般的には、抗体重鎖可変ドメインをコードする核酸配列は、ウイルスコートタンパク質構成成分に融合する。抗体可変ドメインの一方または両方は、少なくとも１つのＣＤＲ領域に変異体アミノ酸を持つことができる。抗体可変軽鎖をコードしている核酸配列は、ペプチドリンカーをコードしている核酸配列によって抗体可変重鎖ドメインに連結される。ペプチドリンカーは、一般的に約５から１５個のアミノ酸を含む。任意選択に、例えば精製または検出に役立つ標識をコードしている他の配列を、抗体可変軽鎖もしくは抗体可変重鎖ドメインのいずれかまたは両方をコードしている核酸配列の３’末端に融合することができる。
【０１８４】
ベクターがＦ（ａｂ）提示のために構築される場合、このベクターは抗体可変ドメインおよび抗体定常ドメインをコードしている核酸配列を含む。軽鎖可変ドメインをコードする核酸は、軽鎖定常ドメインをコードする核酸配列に融合される。抗体重鎖可変ドメインをコードする核酸配列は、重鎖定常ＣＨ１ドメインをコードする核酸配列に融合される。一般的には、重鎖可変および定常ドメインをコードしている核酸配列は、ウイルスコートタンパク質のすべてまたは一部をコードしている核酸配列に融合される。抗体軽鎖または重鎖の可変ドメインの一方または両方は、少なくとも１つのＣＤＲ領域に変異体アミノ酸を持つことができる。重鎖可変および定常ドメインは好ましくはウイルスコートタンパク質の少なくとも一部との融合体として発現され、軽鎖可変および定常ドメインは重鎖ウイルスコート融合タンパク質とは別々に発現される。重鎖および軽鎖は互いと結合し、その結合は共有結合でも非共有結合でもよい。任意選択に、例えば精製または検出に役立つポリペプチド標識をコードしている他の配列を、抗体軽鎖定常ドメインもしくは抗体重鎖定常ドメインのいずれかまたは両方をコードしている核酸配列の３’末端に融合することができる。
【０１８５】
好ましくは、二価の成分、例えばＦ（ａｂ）２二量体またはＦ（ａｂ’）２二量体が、粒子表面で変異体アミノ酸置換を有する抗体断片を提示するために使用される。Ｆ（ａｂ’）２二量体は溶相抗原結合検定でＦ（ａｂ）二量体と同じ親和性を持つことが分かっているが、Ｆ（ａｂ’）２の解離速度は高アビディティーのため低下している。したがって、二価の形態（例えばＦ（ａｂ’）２）は低親和性クローンの同定を可能にし、また選択過程で稀なクローンのより効率的な選別を可能にするので、特に有用な形態である。
【０１８６】
宿主細胞へのベクターの導入
本発明に従って記載されているように構築されたベクターは、増幅および／または発現のために宿主細胞に導入される。ベクターは、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿などを含む標準の形質転換法を使って、宿主細胞に導入することができる。ベクターがウイルスのような感染性の粒子であるならば、ベクター自体が宿主細胞に侵入する。遺伝子融合をコードする複製可能な発現ベクターを含んでいる宿主細胞のトランスフェクションおよび標準手法によるファージ粒子の生産は、融合タンパク質がファージ粒子の表面で提示されるファージ粒子を提供する。
【０１８７】
複製可能な発現ベクターは、様々な方法を使用して宿主細胞に導入される。一実施形態では、ベクターはＷＯ００／１０６７１７号で記載されているようにエレクトロポレーション法を使って細胞に導入することができる。細胞は標準の培養液中で任意に約６〜４８時間（またはＯＤ６００＝０．６〜０．８になるまで）、３７℃で培養し、次にブロースを遠心分離して上清を取り出す（例えばデカンテーションにより）。初期の精製では、好ましくは緩衝液（例えば１．０ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４）の中に細胞ペレットを再懸濁し、次に再遠心分離を行い、上清を取り出す。得られた細胞ペレットを希釈したグリセリン（例えば５〜２０％Ｖ／Ｖ）の中に再懸濁し、再度再遠心分離をして細胞ペレットを形成し、上清を取り除く。最終的な菌体濃度は、所望の濃度に細胞ペレットを水または希釈したグリセリンの中に再懸濁することによって得られる。
【０１８８】
特に好ましい受容細胞は本発明のエレクトロポレーション応答能のある大腸菌株ＳＳ３２０である（Ｓｉｄｈｕ他、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．（２０００）、３２８：３３３〜３６３頁）。大腸菌株ＳＳ３２０は、稔性エピソーム（Ｆ’プラスミド）またはＸＬ１−ＢＬＵＥをＭＣ１０６１細胞に移転するのに十分な条件の下で、ＭＣ１０６１細胞をＸＬ１−ＢＬＵＥ細胞と交接させて調製した。大腸菌株ＳＳ３２０は、１９９８年６月１８日、アメリカ基準株保存機構（ＡＴＣＣ）、１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖｉｒｇｉｎｉａ ＵＳＡに寄託され、寄託番号９８７９５が割り当てられた。この菌株でのファージ複製を可能にするいかなるＦ’エピソームでも、本発明で用いることができる。適当なエピソームはＡＴＣＣに預けられている株から入手可能であるし、または市販品を入手できる（ＣＪ２３６、ＣＳＨ１８、ＤＨＦ’、ＪＭ１０１、ＪＭ１０３、ＪＭ１０５、ＪＭ１０７、ＪＭ１０９、ＪＭ１１０、ＫＳ１０００、ＸＬ１−ＢＬＵＥ、７１−１８、その他）。
【０１８９】
エレクトロポレーションでより高いＤＮＡ濃度（約１０倍）を使用すると、形質転換率が向上し、宿主細胞に形質転換されるＤＮＡの量が増加する。高い菌体濃度の使用も効率を高める（約１０倍）。移転されたＤＮＡ量の増加により、より大きな多様性を有し、複合ライブラリーのより多くの独特なメンバーを示すより大きなライブラリーが生じる。形質転換細胞は、通常、抗生物質を含む培地上の増殖によって選択される。
【０１９０】
選ばれた対象への結合体の選択（選別）とスクリーニング
方法論に様々な置換および変更を加えた、対象抗原結合体を同定するためのファージディスプレイの使用は、当技術分野で確立されている。一手法では、融合ポリペプチドをコードしている遺伝子融合体と作用可能に連結した転写調節要素を含む複製可能な変異体ベクターのファミリーを構築し、適当な宿主細胞に形質転換し、この形質転換細胞を培養して前記融合ポリペプチドをファージ粒子表面で提示するファージ粒子を形成し、その後選択の過程で結合しない粒子と比較して結合する粒子のサブセットを増加させる目的で、少なくとも粒子集団の一部が対象と結合するように組換え体ファージ粒子を対象抗原と接触させることによる選択または選別を伴うプロセスを行う。選択されたプールは、異なるかまたは同じストリンジェンシーで同じ対象をさらに１回選別するために、宿主細胞、例えば新鮮なＸＬ１−Ｂｌｕｅ細胞を感染させて増幅することができる。得られた変異体のプールは、次に新規高親和性結合タンパク質を同定するために、対象抗原に対してスクリーニングされる。これらの新規高親和性結合タンパク質は、アンタゴニストまたはアゴニストなどの治療薬として、かつ／または診断薬および研究試薬として有用であり得る。
【０１９１】
変異体アミノ酸を含んでいる抗体可変ドメインのような融合ポリペプチドは、ファージ、ファージミド粒子または細胞の表面で発現され、次に融合ポリペプチド群の構成メンバーの、一般的に関心の抗原である対象抗原に結合する能力について選択および／またはスクリーニングをすることができる。対象結合体についての選択の方法は、タンパク質Ｌまたはファージ上で提示される抗体もしくは抗体断片と結合する標識特異抗体のような抗体可変ドメインと親和性を有する一般的なタンパク質上での選別も含み、これは正しくフォールドされた抗体断片（融合ポリペプチド）を提示するライブラリーメンバーを豊富にするために使うことができる。
【０１９２】
対象タンパク質、例えば受容体は、天然源から単離することができ、または当技術分野で公知の手法による組換え方法により調製することができる。対象抗原としては、治療上関心のある多くの分子が含まれる。
【０１９３】
図４５で図式的に表されているように、親和性のための選択（選別）のために２つの主な方策を使うことができる。第１の方策（図の左）は固体担体方法またはプレート選別または固定化対象選別である。第２の方策は、溶液−結合法（右）である。
【０１９４】
固体担体方法については、対象タンパク質は当技術分野で公知である適当な固体または半固体マトリックス、例えばアガロースビーズ、アクリルアミドビーズ、ガラスビーズ、セルロース、様々なアクリルコポリマー、メタクリル酸ヒドロキシアルキルゲル、ポリアクリルおよびポリメタクリルコポリマー、ナイロン、中性およびイオン性担体などに結合してもよい。マトリックスへの対象タンパク質の結合は、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、４４（１９７６）に記載されている方法、または当技術分野で公知の他の手段で達成することができる。
【０１９５】
マトリックスへの対象抗原の結合の後、固定化された対象をファージ粒子集団の少なくとも１サブセットと固定化対象抗原との結合に適した条件下で、融合ポリペプチドを発現しているライブラリーと接触させる。通常、ｐＨ、イオン強度、温度などを含む条件は、生理学的条件を模倣する。前記固定化対象と結合する粒子（「結合体」）は、水洗により対象と結合しない粒子から分離する。洗浄条件は、高親和性結合体以外のすべてが取り除かれるように調節することができる。結合体は様々な方法によって固定化された対象から解離させることができる。これらの方法には野生型リガンド（例えば過剰な対象抗原）を使う競合的解離、ｐＨおよび／またはイオン強度の変更、ならびに当技術分野で公知の方法が含まれる。結合体の選択は、一般的に０．１ＭのＨＣｌなどの酸またはリガンドのような、適当な溶出材料によるアフィニティーマトリックスからの溶出を含む。リガンドの濃度を上昇させて溶出すると、提示されたより親和性の高い結合分子を溶出させることができた。
【０１９６】
結合体は単離してから細胞を結合体であるウイルス粒子（および、例えばウイルス粒子がファージミド粒子である場合は必要に応じてヘルパーファージ）に感染させることによって、適当な宿主細胞で再増幅させることができ、この宿主細胞は所望の融合ポリペプチドを提示する粒子の増幅に適した条件下で培養される。次にファージ粒子を採取し、対象抗原の結合体がいくらか豊富になるまで選択工程を１回または複数回繰り返し、選択または選別は何回でも利用できる。選択または選別方法の１つは、タンパク質Ｌまたは提示されるポリペプチドに存在するポリペプチドタグに対する抗体、例えばｇＤタンパク質またはポリヒスチジンタグに対する抗体のような一般の親和性タンパク質と結合する結合体を単離することを含むこともできる。
【０１９７】
本発明の１つの態様は、図４５（右パネル）で図示されている「溶液−結合方法」と呼ばれる新規選択法を含む。本発明は、従来の溶液選別方法よりも効率が非常に改善された溶相選別を可能にする。ランダムなライブラリーから元の結合体を見つけるため、あるいは特定の結合クローンまたはクローン群の親和性を改善することを目的としたライブラリーから改善された結合体を見つけるために溶液結合方法が使われた。この方法は、複数のポリペプチド、例えばファージまたはファージミド粒子（ライブラリー）上で提示されるポリペプチドを、タグ分子で標識されたか融合された対象抗原と接触させることを含む。タグはビオチンまたは他の特異的結合体が入手できる部分でよい。溶相のストリンジェンシーは、第１の溶液結合相で濃度を段階的に低くした標識された対象抗原を用いて変化させることができる。さらにストリンジェンシーを高めるために、第１の溶液結合相の後に、第１の溶相での最初の標識された対象との結合の後に高濃度の標識されていない対象抗原を有する第２の溶相が続いてもよい。通常、標識対象の１００から１０００倍の非標識対象が第２相で使われる（含まれるならば）。第１の溶相のインキュベーション時間は、平衡に達するまで２、３分から１、２時間またはそれ以上の範囲である。結合速度の速い結合体には、この第１相において結合時間を短くする傾向がある、または短くすることが選択されうる。第２相のインキュベーションの時間および温度は、ストリンジェンシーを高めるために変化させることができる。これにより、対象から離れる速度（解離速度）が遅い結合体に対する選択の偏りが生じる。複数のポリペプチド（ファージ／ファージミド粒子上で提示された）を対象抗原と接触させた後に、標識対象と結合したファージまたはファージミド粒子を結合しないファージから分離する。結合の溶相からの粒子−対象混合物は、それを標識対象分子成分と接触させて短時間（例えば２〜５分間）標識対象分子と結合する分子との結合を可能にすることによって単離する。標識対象抗原の初期濃度の範囲は、約０．１ｎＭから約１０００ｎＭまでである。結合粒子を溶出して、次回の選別のために増殖させることができる。各回低い濃度の標識対象抗原を用いて選別を複数回繰り返すのが好ましい。
【０１９８】
例えば、約１００から２５０ｎＭの標識対象抗原を使った最初の選別または選択は広範囲の親和性を捕えるのに十分なはずであるが、この因子は経験的にかつ／または実践者の希望に沿うように決定することができる。２回目の選択では、約２５から１００ｎＭの標識対象抗原を使える。３回目の選択では、約０．１から２５ｎＭの標識対象抗原を使える。例えば、１００ｎＭの結合体の親和性を改善するためには、２０ｎＭの標識対象から始めて５および１ｎＭへと進め、次にさらに低い濃度、例えば約０．１ｎＭの標識対象抗原へ進めるのが望ましい。
【０１９９】
従来の溶液選別法ではストレプトアビジンをコーティングしたビーズのようなビーズを使用するが、これは使用するのが非常に厄介であり、またファージ結合体の回収の効率が非常に低いことが多い。ビーズによる従来の溶液選別法は２〜５分よりもかなり長い時間を要し、高スループットの自動操作に適応させるのが上述の本発明より困難である。
【０２００】
本明細書で記載されているように、固体担体と溶液選別方法の組合せは、所望の特性を有している結合体を単離するために有利に使うことができる。対象抗原に対して２、３回選択／選別を繰り返した後、所望の性質／特性を有する特異的結合体を同定するために選択されたプールからの個々のクローンのスクリーニングを通常実行する。好ましくは、スクリーニングのプロセスは、ライブラリー候補物質の高スループットスクリーニングを可能にする自動化システムによって実行される。
【０２０１】
２つの主なスクリーニング方法を以下で記載する。しかし、当技術分野で公知の他の方法も本発明の方法で用いることができる。第１のスクリーニング法は固定化された対象抗原によるファージＥＬＩＳＡ検定を含み、この方法は非結合クローンからの特異的結合クローンの同定を可能にする。特異性は、対象でコーティングされたウェルおよびＢＳＡ、または他の非対象タンパク質でコーティングしたウェル上のクローンの同時検定で測定することができる。この検定は高スループットスクリーニングが自動化可能である。
【０２０２】
一実施形態は、抗体可変ドメインのライブラリーから特異的対象抗原に結合する抗体可変ドメインを選択する方法を提供し、この方法は複数のポリペプチドを含む複製可能な発現ベクターのライブラリーを作製するステップと、前記ライブラリーを、結合に適した条件下で対象抗原および少なくとも１つの非対象抗原と接触させるステップと、前記ライブラリーのポリペプチド結合体を非結合体から分離するステップと、前記対象抗原と結合し、前記非対象抗原とは結合しない結合体を同定するステップと、この結合体を前記対象抗原から溶出するステップと、特異的抗原に結合する前記ポリペプチド結合体を含んでいる複製可能な発現ベクターを増幅するステップとを含む。
【０２０３】
第２のスクリーニング検定はこの出願で具現化される発明であり、それは低親和性クローンからの高親和性クローンの高スループット選別を可能にする親和性スクリーニング検定法である。この検定では、各クローンはまずある濃度の対象抗原とある時間（例えば３０〜６０分）インキュベートするかまたはしないで、その後対象でコーティングしたウェルへ短時間（例えば５〜１５分）塗布する。次に結合したファージを通常のファージＥＬＩＳＡ法、例えば抗Ｍ１３ ＨＲＰコンジュゲートを用いて測定する。１つは対象でプリインキュベーションされ他のウェルは対象抗原でプリインキュベーションされていないが、この２つのウェルの結合シグナルの比率は親和性の指標である。第１のインキュベーションのための対象濃度の選択は、関心の親和性の範囲に依存する。例えば、１０ｎＭを超える親和性の結合体が所望であるならば、第１のインキュベーションでは１００ｎＭの対象がしばしば使われる。この方法の一実施形態の詳述については、図４７および実施例９を参照。一旦結合体が特定の回の選別（選択）で検出されると、より高い親和性の結合体を同定するためにこれらのクローンは親和性スクリーニング検定でスクリーニングすることができる。
【０２０４】
前記選別／選択法のいずれの組合せをこのスクリーニング法と組み合わせることができる。例えば、一実施形態ではポリペプチド結合体は、まず固定化対象抗原への結合に関して選択される。前記固定化対象抗原と結合するポリペプチド結合体は、次に増幅して、この対象抗原との結合および非対象抗原への非結合に関してスクリーニングすることができる。特異的に対象抗原と結合するポリペプチド結合体を増幅する。これらのポリペプチド結合体は、次に複合体を形成するためにある濃度の標識された対象抗原と接触させることにより、より高い親和性に関して選択でき、この標識された対象抗原の濃度域は約０．１ｎＭから約１０００ｎＭであり、この複合体は対象抗原上の標識と結合する因子との接触によって単離される。このポリペプチド結合体は、次に標識された対象抗原から溶出され、また各回より低い濃度の標識された対象抗原を用いて選択を繰り返すこともできる。この選択方法を使用して単離された高親和性ポリペプチド結合体は、次に、例えば実施例８に記載されている溶相ＥＬＩＳＡ検定法、または実施例９に記載されている点競合ＥＬＩＳＡ検定法を用いて高親和性に関してスクリーニングすることができる。
【０２０５】
これらの方法は、多数のクローンに対する長く、複雑な競合親和性検定を必要としないで、高親和性のクローンの検出を容易にする。多くのクローンに対して複雑な検定を行うことは手間が掛かり、選択による最良のクローンの検出に対してしばしば著しい障害となる。この方法は、類似した親和性の複数の結合体が選択プロセスから回収される場合の親和性の改善に特に役立つ。異なるクローンは、ファージまたはファージミド粒子上の発現／提示の効率が非常に異なることがある。より多く発現するクローンは、回収される可能性が高い。つまり、選択は変異体の提示または発現の量によって一方に偏らせることができる。本発明の溶液−結合選別方法は、高親和性結合体を見つけるための選択プロセスを改善することができる。この方法は、最良の結合体を迅速かつ容易にスクリーニングする際に著しく有利な親和性スクリーニング検定法である。
【０２０６】
結合体が対象抗原への結合により同定された後、核酸を抽出することができる。抽出されたＤＮＡは次に大腸菌宿主細胞を形質転換するのに直接用いることができ、あるいは、コード配列を例えばＰＣＲで適当なプライマーを使って増幅し、典型的シークエンシング方法によって配列決定をすることができる。結合体の可変ドメインＤＮＡは制限酵素で消化し、次にタンパク質発現のためにベクターに挿入することができる。
【０２０７】
一実施形態では、本発明はｍＶＥＧＦ（マウスの血管内皮細胞増殖因子）と結合する新規抗体および抗体断片の単離手段を提供する。好ましくは、抗体可変ドメインはｍＶＥＧＦとＩＣ５０値１０μＭ未満、より好ましくは１μＭ未満で結合する。一実施形態では、ｍＶＥＧＦと結合する抗体には、重鎖可変部のＣＤＲＬ３の残基およびＣＤＲＨ３領域の残基９５〜１００ａのアミノ酸をＤＶＫコドンセットまたはＤＶＫおよびＮＮＫコドンセットの組合せで置換することにより作製したライブラリーの構成メンバーが含まれる。上で作製されたようなライブラリーの一部のメンバーは、ｍＶＥＧＦに対して特に高い親和性を有することが発見された。
【０２０８】
特に、重鎖ＣＤＲ３配列ＳＲＮＡＷＡＦ（配列番号５；アミノ酸位置９３〜１００ｃ）、ＳＲＮＬＳＥＮＳＹＡＭ（配列番号６；アミノ酸位置９３〜１００ｃ）、ＳＲＡＧＷＡＧＷＹＡＭ（配列番号７；アミノ酸位置９３〜１００ｃ）、ＳＲＡＡＫＡＧＷＹＡＭ（配列番号８；アミノ酸位置９３〜１００ｃ）およびＳＲＳＤＧＲＤＳＡＹＡＭ（配列番号９；アミノ酸位置９３〜１００ｃ）を含む抗体は、ｍＶＥＧＦに対する高い親和性結合を示す。Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｈ１およびＨ２のようなＣＤＲの他の位置のアミノ酸を置換することによって作製した、ｍＶＥＧＦと結合する新規抗体可変ドメインも、本明細書で記載される方法によって作製することができる。
【０２０９】
いくつかのケース、例えば新規ＣＤＲＨ１／Ｈ２／Ｈ３結合体では、配列は、コドンセットを通して変異体アミノ酸を、例えば２段プロセスにより他のＬ鎖ＣＤＲに導入することによって作製される他の配列と組み合わせることができる。２段プロセスの実施例では、まず１つまたは複数のＣＤＲをランダム化することによって作製された１つまたは複数のライブラリー内の結合体（通常、低親和性結合体）を確定するが、各ライブラリーでランダム化されるＣＤＲは異なるか、あるいは、同じＣＤＲがランダム化される場合はこのＣＤＲがランダム化されて異なる配列を生成する。重鎖ライブラリーからの結合体は、次にキュンケル突然変異生成によりまたは新しい軽鎖ライブラリーを定常軽鎖だけを有する既存の重鎖結合体にクローニングすることによって（カットアンドペースト（例えば、異なるＣＤＲ配列をライゲーションすることによって））、軽鎖ＣＤＲにおけるＣＤＲ多様性でＣＤＲをランダム化することができる。プールは次に親和性の向上した結合体を同定するために、対象に対してさらに選別することができる。例えば、Ｌ３／Ｈ３ライブラリー、Ｈ１／Ｈ２／Ｈ３ライブラリーまたはＬ３／Ｈ１／Ｈ２／Ｈ３ライブラリーの選別から得られた結合体（例えば低親和性結合体）は、Ｌ１／Ｌ２／Ｈ１／Ｈ２多様性またはＬ１／Ｌ２／Ｌ３多様性のライブラリーと融合させて元の定常Ｌ１／Ｌ２／Ｈ１／Ｈ２またはＬ１／Ｌ２／Ｌ３と置き換えることができ、新しいライブラリーは次に他の結合体セット（例えば高親和性結合体）を得るために関心の対象に対してさらに選別される。ＩＧＦ１またはｍＶＥＧＦ抗原に対してより高い結合親和性を示す新規抗体配列を同定することができる。
【０２１０】
いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチドを含んでいるライブラリーは複数回選別され、各選別では前回の選別から得られた結合体を前回の対象抗原とは別の対象抗原と接触させる。望ましくは、しかし必ずしもそうとは限らないが、対象抗原は配列が相同的であり、例えば関連するが異なるポリペプチドのファミリーのメンバーであり、例えばそれには限定されないがサイトカイン（例えばαインターフェロン亜型）が含まれる。
【０２１１】
抗体可変ドメインライブラリーの作製
抗体可変ドメインの少なくとも１つのＣＤＲの溶媒に露出しかつ／または非常に多様な位置を突然変異させて、抗体ライブラリーを作製することができる。いくつかまたはすべてのＣＤＲは、本発明の方法を使用して突然変異させることができる。いくつかの実施形態では、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３の位置を突然変異させて単一のライブラリーを形成することにより、またはＣＤＲＬ３およびＣＤＲＨ３の位置を突然変異させて単一のライブラリーを形成することにより、またはＣＤＲＬ３、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３の位置を突然変異させて単一のライブラリーを形成することにより多様な抗体ライブラリーを作製することが好ましいかもしれない。
【０２１２】
例えばＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３の溶媒に露出しかつ／または非常に多様な位置に突然変異を有する、抗体可変ドメインのライブラリーを作製することができる。ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３で突然変異を有する他のライブラリーを作製することができる。所望の親和性の結合体を作製するために、これらのライブラリーを互いに一緒に使うこともできる。例えば、対象抗原への結合により重鎖ライブラリーを１回または複数回選択した後、軽鎖ライブラリーは結合体の親和性を増やすために、さらなる選択のために重鎖結合体の集団に戻すことができる。
【０２１３】
一実施形態では、重鎖配列の可変部のＣＤＲＨ３領域において、元のアミノ酸を変異体アミノ酸で置換することによってライブラリーは作製される。本発明によると、このライブラリーは複数の抗体配列を含むことができ、その配列多様性は主に重鎖配列のＣＤＲＨ３領域にある。
【０２１４】
一態様では、このライブラリーはヒト化抗体４Ｄ５配列またはヒト化抗体４Ｄ５配列のフレームワークアミノ酸配列に関連して作製される。好ましくは、このライブラリーは少なくとも重鎖の残基９５〜１００ａをＤＶＫコドンセットによってコードされるアミノ酸で置換することによって作製され、ＤＶＫコドンセットはこれらの位置のあらゆる位置に対して一組の変異体アミノ酸をコードするために用いられる。これらの置換を形成するために役立つオリゴヌクレオチドセットの例には、配列（ＤＶＫ）７が含まれる。この配列を持つオリゴヌクレオチドセットの例は、オリゴヌクレオチド（Ｆ６３）（配列番号１０）である。いくつかの実施形態では、ＤＶＫおよびＮＮＫコドンセットによってコードされるアミノ酸による残基９５〜１００ａの置換によってライブラリーが作製される。これらの置換を形成するために役立つオリゴヌクレオチドセットの例には、配列（ＤＶＫ）６（ＮＮＫ）が含まれる。この配列を持つオリゴヌクレオチドセットの例は、オリゴヌクレオチド（Ｆ６５）（配列番号１１）である。他の実施形態では、ＤＶＫおよびＮＮＫコドンセットによってコードされるアミノ酸による少なくとも残基９５〜１００ａの置換によってライブラリーが作製される。これらの置換を形成するために役立つオリゴヌクレオチドセットの例には、配列（ＤＶＫ）５（ＮＮＫ）が含まれる。この配列を持つオリゴヌクレオチドセットの例は、オリゴヌクレオチド（Ｆ６４）（配列番号１２）である。これらの置換を形成するために役立つオリゴヌクレオチドセットの他の例には、配列（ＮＮＫ）６が含まれる。この配列を持つオリゴヌクレオチドセットの例は、オリゴヌクレオチド（Ｆ６６）（配列番号１３）である。適当なオリゴヌクレオチド配列の他の例は図４および図４３にリストされ、本明細書で記載される基準に従って当業者が決定することができる。
【０２１５】
他の実施形態では、異なるＣＤＲＨ３デザインを利用して高親和性結合体を単離し、また様々なエピトープのために結合体を単離する。このライブラリーで生成されるＣＤＲＨ３の長さの範囲は１１から１３個のアミノ酸であるが、これとは異なる長さの生成も可能である。Ｈ３多様性はコドンセットＮＮＫ、ＤＶＫおよびＮＶＫ、ならびにＮおよび／またはＣ末端のより限られた多様性を用いて拡張することができる。多様性はＣＤＲＨ１およびＣＤＲＨ２でも作製することができる。
【０２１６】
ライブラリーの一実施形態では、Ｈ１およびＨ２の多様性は以下のオリゴヌクレオチドを用いて作製される。
【０２１７】
Ｈ１用オリゴヌクレオチド：
Ｆ１５１（ＧＣＡ ＧＣＴ ＴＣＴ ＧＧＣ ＴＴＣ ＡＣＣ ＡＴＴ ＡＶＴ ＲＲＴ ＷＭＹ ＫＭＴ ＡＴＡ ＣＡＣ ＴＧＧ ＧＴＧ ＣＧＴ ＣＡＧ；配列番号１４）、Ｆ１５２（ＧＣＡ ＧＣＴ ＴＣＴ ＧＧＣ ＴＴＣ ＡＣＣ ＡＴＴ ＡＶＴ ＲＲＴ ＷＭＹ ＫＧＧ ＡＴＡ ＣＡＣ ＴＧＧ ＧＴＧ ＣＧＴ ＣＡＧ；配列番号１５）、Ｆ１７５（ＧＣＡ ＧＣＴ ＴＣＴ ＧＧＣ ＴＴＣ ＡＣＣ ＡＴＴ ＡＶＴ ＲＶＭ ＷＭＹ ＫＭＴ ＡＴＡ ＣＡＣ ＴＧＧ ＧＴＧ ＣＧＴ ＣＡＧ；配列番号１６）およびＦ１７６（ＧＣＡ ＧＣＴ ＴＣＴ ＧＧＣ ＴＴＣ ＡＣＣ ＡＴＴ ＡＶＴ ＲＶＭ ＷＭＹ ＫＧＧ ＡＴＡ ＣＡＣ ＴＧＧ ＧＴＧ ＣＧＴ ＣＡＧ；配列番号１７）をプールし、Ｈ２には、オリゴヌクレオチドＦ１５３（ＡＡＧ ＧＧＣ ＣＴＧ ＧＡＡ ＴＧＧ ＧＴＴ ＧＳＴ ＤＧＧ ＡＴＴ ＷＭＴ ＣＣＴ ＤＭＴ ＲＲＣ ＧＧＣ ＤＭＴ ＡＣＴ ＤＡＣ ＴＡＴ ＧＣＣ ＧＡＴ ＡＧＣ ＧＴＣ ＡＡＧ ＧＧＣ；配列番号１８）、Ｆ１５４（ＡＡＧ ＧＧＣ ＣＴＧ ＧＡＡ ＴＧＧ ＧＴＴ ＧＳＴ ＤＨＴ ＡＴＴ ＷＭＴ ＣＣＴ ＤＭＴ ＲＲＣ ＧＧＣ ＤＭＴ ＡＣＴ ＤＡＣ ＴＡＴ ＧＣＣ ＧＡＴ ＡＧＣ ＧＴＣ ＡＡＧ ＧＧＣ；配列番号１９）、Ｆ１７３（ＡＡＧ ＧＧＣ ＣＴＧ ＧＡＡ ＴＧＧ ＧＴＴ ＧＳＴ ＤＧＧ ＡＴＴ ＤＭＴ ＣＣＴ ＮＭＴ ＲＲＣ ＧＧＣ ＤＭＴ ＡＣＴ ＤＡＣ ＴＡＴ ＧＣＣ ＧＡＴ ＡＧＣ ＧＴＣ ＡＡＧ ＧＧＣ；配列番号２０）およびＦ１７４（ＡＡＧ ＧＧＣ ＣＴＧ ＧＡＡ ＴＧＧ ＧＴＴ ＧＳＴ ＤＨＴ ＡＴＴ ＤＭＴ ＣＣＴ ＮＭＴ ＲＲＣ ＧＧＣ ＤＭＴ ＡＣＴ ＤＡＣ ＴＡＴ ＧＣＣ ＧＡＴ ＡＧＣ ＧＴＣ ＡＡＧ ＧＧＣ；配列番号２１）をプールした。
【０２１８】
ＣＤＲＨ３の多様性のために、複数のライブラリーを異なる長さのＨ３で別々に構築し、次に組み合わせて対象抗原への結合体を選択することができる。任意選択に、１つのライブラリーで、ＤＶＫコドンセットがプールされた（すなわち、オリゴヌクレオチドが単一のプールとして使われる）オリゴヌクレオチドＦ１６３ａ、Ｆ１６４ａ、Ｆ１６４６、Ｆ１６５およびＦ１６６（図４を参照）に即して利用される。第２のライブラリーは第１のライブラリーと同じオリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドＦ１２５（ＣＧＲ ＴＴＣ ＡＣＴ ＡＴＡ ＡＧＣ ＣＧＴ ＧＡＣ ＡＣＡ ＴＣＣ ＡＡＡ ＡＡＣ；配列番号２２）を使うことができる。第３のライブラリーは、オリゴヌクレオチドＦ１６５ａおよびＦ１６５６を使うことができる。第４のライブラリーの構築は、プール配列Ｆ１０３、Ｆ１３４、Ｆ１３５、Ｆ１５５、Ｆ１５６、Ｆ１５７、Ｆ１６０、Ｆ１６０ｇおよびＦ１６７がトリプトファンでドープされたＮＶＴオリゴヌクレオチドのプールを使って行える。第５のライブラリーは、オリゴヌクレオチドＦ６６ａおよびＦ６６ｂでコドンセットＮＮＳを使って構築することができる。
【０２１９】
前に記載したようにまた図４４および図４５で示したように、複数のライブラリーをプールして、固体担体選択および溶液選別方法を使用して選別することができる。複数の選別方策を使用してもよい。例えば、１つの変更は固体に結合した対象に対する選別、続いて融合ポリペプチド（例えば、抗ｇＤタグ）上に存在しているかもしれないタグに対する選別、続いて固体に結合した対象に対する他の選別を含む。別法として、ライブラリーをまず固体表面に結合した対象上で選別し、次に溶相結合法を濃度を段階的に下げた対象抗原を用いて行うことにより溶出した結合体を選別する。異なる選別方法を組み合わせて利用すると、高発現の配列だけが選択されるのを極小化して、いくつかの異なる高親和性クローンの選択を可能にする。
【０２２０】
対象抗原のための高親和性結合体は、ライブラリーから単離することができる。Ｈ１／Ｈ２領域の多様性を限定すると変性は約１０４から１０５倍減少し、Ｈ３の多様性を高めさせると高親和性結合体が多くなる。ＣＤＲＨ３に異なる型の多様性を有するライブラリーを利用すると（例えば、ＤＶＫまたはＮＶＴを利用すると）、対象抗原の異なるエピトープと結合することができる結合体の単離がもたらされる。
【０２２１】
先に述べたようなプールされたライブラリーから単離された結合体では、軽鎖の多様性を制限することにより親和性がさらに改善されることが発見された。軽鎖の多様性は、この実施形態では次のように生成される。ＣＤＲＬ１：アミノ酸位置２８はＲＤＴによってコードされ、アミノ酸位置２９はＲＫＴによってコードされ、アミノ酸位置３０はＲＶＷによってコードされ、アミノ酸位置３１はＡＮＷによってコードされ、アミノ酸位置３２はＴＨＴによってコードされ、任意選択にアミノ酸位置３３はＣＴＧによってコードされ、ＣＤＲＬ２では：アミノ酸位置５０はＫＢＧによってコードされ、アミノ酸位置５３はＡＶＣによってコードされ、任意選択にアミノ酸位置５５はＧＭＡによってコードされ、ＣＤＲＬ３では：アミノ酸位置９１はＴＭＴまたはＳＲＴまたは両方によってコードされ、アミノ酸位置９２はＤＭＣによってコードされ、アミノ酸位置９３はＲＶＴによってコードされ、アミノ酸位置９４はＮＨＴによってコードされ、アミノ酸位置９６はＴＷＴまたはＹＫＧまたは両方によってコードされる。
【０２２２】
他の実施形態では、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３領域の多様性を有する１つまたは複数のライブラリーが作製される。ＣＤＲＨ１およびＣＤＲＨ２の多様性に関しては、以下のオリゴヌクレオチドが用いられる。Ｆ１５１（５’−ＧＣＡ ＧＣＴ ＴＣＴ ＧＧＣ ＴＴＣ ＡＣＣ ＡＴＴ ＡＶＴ ＲＲＴ ＷＭＹ ＫＭＴ ＡＴＡ ＣＡＣ ＴＧＧ ＧＴＧ ＣＧＴ ＣＡＧ−３’；配列番号１４）およびＦ１５２（５’−ＧＣＡ ＧＣＴ ＴＣＴ ＧＧＣ ＴＴＣ ＡＣＣ ＡＴＴ ＡＶＴ ＲＲＴ ＷＭＹ ＫＧＧ ＡＴＡ ＣＡＣ ＴＧＧ ＧＴＧ ＣＧＴ ＣＡＧ−３’；配列番号１５）をプール、Ｈ２には、オリゴヌクレオチド１７３（５’−ＡＡＧ ＧＧＣ ＣＴＧ ＧＡＡ ＴＧＧ ＧＴＴ ＧＳＴ ＤＧＧ ＡＴＴ ＤＭＴ ＣＣＴ ＮＭＴ ＲＲＣ ＧＧＴ ＤＭＴ ＡＣＴ ＤＡＣ ＴＡＴ ＧＣＣ ＧＡＴ ＡＧＣ ＧＴＣ ＡＡＧ ＧＧＣ−３’；配列番号２０）およびＦ１７４（５’−ＡＡＧ ＧＧＣ ＣＴＧ ＧＡＡ ＴＧＧ ＧＴＴ ＧＳＴ ＤＨＴ ＡＴＴ ＤＭＴ ＣＣＴ ＮＭＴ ＲＲＣ ＧＧＣ ＤＭＴ ＡＣＴ ＤＡＣ ＴＡＴ ＧＣＣ ＧＡＴ ＡＧＣ ＧＴＣ ＡＡＧ ＧＧＣ−３’；配列番号２１）をプールした。
【０２２３】
この実施形態では、ＣＤＲＨ３の多様性は様々な長さのＨ３領域、および主にコドンセットＸＹＺとＮＮＫまたはＮＮＳを使って生成される。使われるオリゴヌクレオチドには、Ｆ６６ｂ、Ｆ６６ｄ、Ｆ６６ｆ、Ｆ６６ａ１、Ｆ６６ｂ１、Ｆ６６ｇ、Ｆ６６ｈ、Ｆ６６ｉ、Ｆ６６ｊ、Ｆ１７１ｃ、Ｆ１７１ｄ、Ｆ１７１ｅ、Ｆ１７１、Ｆ１８５、Ｆ１８６、Ｆ１８７、Ｆ１９０、Ｆ１９０ａ、Ｆ１９０ｂ、Ｆ１９０ｃ、Ｆ１９０ｄおよびＦ１９０ｅが含まれる。（図４ｃを参照。）ライブラリーは個々のオリゴヌクレオチドを使って形成し、プールすることができ、またはオリゴヌクレオチドをプールしてライブラリーのサブセットを形成することができる。この実施形態のライブラリーは、固体に結合した対象に対して選別することができる。複数の選別から単離されたクローンは、ＥＬＩＳＡ検定を使って特異性および親和性についてスクリーニングすることができる。特異性については、クローンは他の非対象抗原と同様に所望の対象抗原に対してスクリーニングすることができる。この所望の対象抗原に対するバインダーは、次に、実施例８に記載されている溶液結合競合ＥＬＩＳＡ検定法、または実施例９に記載されている点競合検定法で親和性に関してスクリーニングすることができる。対象抗原に対する高親和性結合体は、上で記載したように調製されたＸＹＺコドンセットを用いてライブラリーから単離することができる。これらの結合体は、抗体または抗原結合断片として細胞培養により高収率で容易に生成することができる。
【０２２４】
いくつかの実施形態では、ＣＤＲＨ３領域の長さの多様性がより大きいライブラリーを生成することが望ましいかもしれない。例えば、約７から１９個のアミノ酸までのＣＤＲＨ３領域を有するライブラリーを生成することが望ましいかもしれない。この目的に役立つオリゴヌクレオチドの具体例を図４３に示す。
【０２２５】
これらの実施形態のライブラリーから単離される高親和性結合体は、細菌および真核の細胞培養により高収率で容易に生成される。ベクターの設計により配列、例えばｇＤタグ、ウイルスコートタンパク質構成成分配列などの配列を容易に取り除き、かつ／または定常部配列に追加して完全長抗体または抗原結合断片が高収率で生産されるようにすることができる。
【０２２６】
ＣＤＲＨ３の突然変異を有するライブラリーは、他のＣＤＲ、例えばＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３、ＣＤＲＨ１および／またはＣＤＲＨ２の変異体版を含んでいるライブラリーと組み合わせることができる。このように、例えば、一実施形態では、ＣＤＲＨ３ライブラリーは、図３に記載したコドンセットを使って、変異体アミノ酸を位置２８、２９、３０、３１および／または３２に持つヒト化４Ｄ５抗体配列に即して作製されたＣＤＲＬ３ライブラリーと組み合わされる。これらの置換を形成する際に役立つオリゴヌクレオチドの例には、これらのコドンセットを取り込んだものが含まれる。他の実施形態では、ＣＤＲＨ３への突然変異を有するライブラリーを、変異体ＣＤＲＨ１および／またはＣＤＲＨ２の重鎖可変ドメインを含んでいるライブラリーと組み合わせることができる。一実施形態では、ＣＤＲＨ１ライブラリーは図３に記載したコドンセットを使って、変異体アミノ酸を位置２８、３０、３１、３２および３３に持つヒト化抗体４Ｄ５配列で作製される。これらの置換を形成する際に役立つオリゴヌクレオチドセットの例には、これらのコドンセットを取り込んだものが含まれる。ＣＤＲＨ２ライブラリーは図３に記載したコドンセットを使って、変異体アミノ酸を位置５０、５２、５３、５４、５６および５８に持つヒト化抗体４Ｄ５配列で作製することができる。これらの置換を形成する際に役立つオリゴヌクレオチドセットの例には、これらのコドンセットを取り込んだものが含まれる。
【０２２７】
コドンセットおよびＣＤＲのいかなる組合せも、本明細書で記載されているアミノ酸位置選択基準に従って多様化することができる。様々なＣＤＲの組合せにおける適当なコドンの例は、図５〜１３で例示される。図５〜７は、示されているＣＤＲおよびアミノ酸位置で使われるコドンセットの選択に従って作製されたライブラリーの設計多様性値の計算例も含む。
【０２２８】
以上本発明を一般的に説明したが、本発明は限定的なものではなく例示的なものとして提供されている以下の実施例を参考にするとより容易に理解されよう。
【実施例１】
【０２２９】
変異ＣＤＲを含む融合ポリペプチドをコードするベクターを以下のように構築した。
【０２３０】
ｐＳ１６０７に基づく抗体ファージディスプレイベクター
抗体ファージディスプレイのためのベクターを、ｐＳ１６０７ベクターを改変して構築した（Ｓｉｄｈｕ他、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（２０００）、２９６：４８７〜４９５頁）。ｐＴａｃプロモーター配列とｍａｌＥ分泌シグナル配列を有するｐＳ１６０７ベクターは、ｇｅｎｅ−３マイナーコートタンパク質（ｐ３）のＣ末端ドメインに融合したヒト成長ホルモンの配列を含んでいた。ｈＧＨをコードするこの配列を除去し、生成したベクター配列を、抗ｈｅｒ２ヒト化抗体４Ｄ５の軽鎖および重鎖の可変ドメイン配列を次の形式でコードするＤＮＡ断片を含む本発明のベクターを構築するためのベクターバックボーンとして使用した。
【０２３１】
（ｉ）一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）（配列番号２３；図１４）
（ｉｉ）ジッパードメインを備えた一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖｚｉｐ）（配列番号２４；図１５）
（ｉｉｉ）Ｆａｂ断片（Ｆａｂ）（配列番号２５；図１６）
（ｉｖ）ジッパードメインを備えたＦａｂ断片（Ｆａｂｚｉｐ）（配列番号２６。図１７）
【０２３２】
上記ヒト化抗体４Ｄ５は、大部分がヒトのコンセンサス配列である重鎖および軽鎖のフレームワーク領域と、マウスＨｅｒ−２特異的モノクローナル抗体由来のＣＤＲ領域を有する抗体である。上記抗Ｈｅｒ−２抗体の作製方法および同定された可変ドメイン配列は、米国特許第５，８２１，３３７号および第６，０５４，２９７号に記載されている。上記の生成したベクター（図３４Ａ〜Ｄに図式的に示す）は、ＩＰＴＧ誘発Ｐｔａｃプロモーター（図１４〜図１７に配列を示す）またはアルカリホスファターゼｐｈｏＡプロモーター（米国特許第５，７５０，３７３号に記載）で制御された、ヒト化抗体４Ｄ５可変ドメインを含む。
【０２３３】
Ｆａｂ−ｚｉｐ構築体の構築とファージディスプレイにおけるその機能の特徴づけ
あるベクター例の構築を、Ｆａｂ−ｚｉｐについて以下にかなり詳細に説明する。ジッパー領域を含めることで、ＳｃＦｖおよびＦ（ａｂ）の二量体の形成と提示が容易になり、それぞれｓｃＦｖ２およびＦ（ａｂ’）２を形成する。
【０２３４】
以下に記述し、また図３４Ｂに示すように、Ｆａｂ−ｚｉｐベクターを構築した。
【０２３５】
方法と材料
抗Ｈｅｒ２Ｆ（ａｂ’）２ベクターの構築：上記のように、バックボーンとしてｐＳ１６０７を使用し、Ｐｔａｃプロモーターの制御下で抗Ｈｅｒ２ポリペプチドをコードする配列を含むファージミド構築体を生成した。まずｍａｌＥ分泌シグナル配列を軽鎖（ＬＣ）のＮ末端配列に融合し、細菌細胞のペリプラズムへＬＣの合成を指令するようにした。ｇＤタグをＬＣのＣ末端に加えた。ＬＣの終止コドンに続き、別のリボソーム結合部位とＳＴＩＩシグナル配列を重鎖（ＨＣ）のＮ末端配列に融合し、Ｍ１３ファージのマイナーコートタンパク質であるｐＩＩＩのＣ末端ドメインが後に続いた。
【０２３６】
ファージ上に提示されるＦ（ａｂ’）２を生成するため、二量体化が可能なロイシンジッパーＧＣＮ４の配列を使用した。カセット変異法を行い、まず全長ＩｇＧ１抗体由来のヒンジ配列（ＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧ（配列番号２７））を、続いてＧＣＮ４配列（ＧＲＭＫＱＬＥＤＫＶＥＥＬＬＳＫＮＹＨＬＥＮＥＶＡＲＬＫＫＬＶＧＥＲＧ（配列番号３））を、ＨＣとｐＩＩＩの間に挿入した。このＧＣＮ４ロイシンジッパーは、２組のＬＣ／ＨＣ−ｐＩＩＩ融合ポリペプチドを大腸菌ペリプラズム内で組み合わせると予想され、それによりヒンジ領域のジスルフィド結合が形成され、大腸菌ペリプラズムから抜け出る前後の二量体形成を確実にする。
【０２３７】
図３４Ｂに図式的に示したベクターの２つの型を作製した。１つはＧＣＮ４ジッパー配列の後にアンバー終止コドン（ＴＡＧ）があり、もう１つはそれがないものであった。これら２つの構築体は、図１８に示す二価提示するファージの一方または両方を、理論上は産生するであろう。上記のアンバーなしの構築体は、（Ｃ）型だけを産生するであろう。（Ｃ）型は、ファージ上に５コピーあるｐＩＩＩのうち２コピーを、ヒンジ部ジスルフィド結合とＧＣＮ４ジッパーの両方で安定化された融合ポリペプチドとして有している。上記のアンバーを有する構築体は、ＸＬ−１菌株でのアンバー終止コドンの抑止効率に依存し、ファージの（Ｂ）型か（Ｃ）型のどちらかを産生可能なはずである。
【０２３８】
ファージ上でのＦ（ａｂ’）２の形成：ファージ上でのＦ（ａｂ’）２の形成、すなわちＦ（ａｂ’）の二価提示を実証するため、二価提示の予想される機能を測定した。ファージのリガンド改変固相への結合は、支持固相上のリガンドが二価結合を可能にするに十分な高密度であれば、二価提示のアビディティー効果により、解離速度すなわちファージが固相から解離する速度の著しい低下を示すはずである。二価の相互作用がプレートから解離するには、ファージが離れるよう両方の相互作用が同時に断たれなければならず、このことが起きる頻度はかなり低いと予想される。
【０２３９】
提示ファージを産生するため、最初にＦ（ａｂ）またはジッパー結合したＦ（ａｂ’）２ファージ、次にＶＣＳヘルパーファージ（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ社、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を感染させた大腸菌株ＸＬ−１ブルー（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ社、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を、２ＹＴ培養液にて３７℃で２０時間培養し、既報（Ｓｉｄｈｕ他、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．（２０００）、３２８：３３３〜３６３頁）に従いファージを収集した。簡単に説明すると、ポリエチレングリコールを加えた培地でまず一晩沈殿させてファージを精製し、ＰＢＳに再懸濁した。分光光度計の２６８ｎｍでの読み取り値でファージを定量した（１ＯＤ＝１．１３×１０１３／ｍｌ）。まず、ファージＥＬＩＳＡ結合バッファー（０．５％ＢＳＡと０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ）でファージを滴定してファージＥＬＩＳＡ（Ｓｉｄｈｕ他、上記）を行い、ＨＲＰ標識（コンジュゲート）抗Ｍ１３抗体とその後に加えたペルオキシターゼ基質、Ｈ２０２および波長４５０ｎｍで読み取り可能なＴＭＢ（Ｋｉｒｋｇａａｄ社）により、９６ウェルプレートにコートしたリガンド（Ｈｅｒ−２細胞外ドメイン、Ｈｅｒ−２ＥＣＤ）へのファージの結合度を定量した。プレートは２μｇ／ｍｌのＨｅｒ−２ＥＣＤを含むＰＢＳで、室温で２時間もしくは４℃で一晩コートしたが、これは二価結合を可能にするに十分である。ファージ希釈液をウェルに加える前に、プレートを０．５％ＢＳＡそして０．２％Ｔｗｅｅｎ２０で１時間ブロックした。
【０２４０】
解離速度プレート結合実験または溶液結合競合ＥＬＩＳＡのため、コートされたプレートへの最大結合度の約９０％を与えたＦ（ａｂ）またはジッパー結合したＦ（ａｂ’）２のファージ濃度を使用した。アビディティーの役割が比較的低い場合に、Ｆ（ａｂ’）２ファージがまだ同程度の結合親和性を維持していることを示すため、溶液中の濃度を段階的に増加させたＨｅｒ−２ＥＣＤ（０．１ｎＭから５００ｎＭ）と共に、Ｆ（ａｂ）またはジッパー結合したＦ（ａｂ’）２ファージを３７℃で５時間インキュベートし、競合ＥＬＩＳＡを行った。結合しなかったファージは、ＨＥＲ−２ＥＣＤでコートしたプレートに短時間（１５分間）捕獲させ、ＨＲＰ−抗Ｍ１３コンジュゲートを用い測定した。Ｆ（ａｂ）ファージを５０％阻害するＨｅｒ−２ＥＣＤ濃度であるＩＣ５０は親和性を表す（図１９参照）。
【０２４１】
解離速度実験のために、Ｈｅｒ−２ＥＣＤでコートしたウェルにＦ（ａｂ）またはジッパー結合したＦ（ａｂ’）２ファージをまず結合させ、次いで洗浄し過剰なファージを除去した。段階希釈したＨｅｒ−２ＥＣＤ（０．１ｎＭから５００ｎＭ）をウェルに加え、３７℃で５時間インキュベートした。その間ファージはプレートから解離することが可能であり、またその再結合は溶液中の上記Ｈｅｒ−２ＥＣＤにより阻害された。次に、ＨＲＰ−抗１３コンジュゲートを用い、プレート上にまだ残存しているファージを定量した。Ｈｅｒ−２ＥＣＤのある特定の濃度でのＯＤをＨｅｒ−２ＥＣＤ不在時のＯＤで割ることにより残存ファージの相対量を計算し、図２０に百分率で示した。
【０２４２】
Ｆ（ａｂ’）２ファージの二価性を実証する別の方法は、二価でないものと比較して、リガンドでコートされた支持固相への結合が標準ファージＥＬＩＳＡ法で検出可能となるために必要なファージ量の違いを示すことであった。低親和性結合体の検知可能性についても調べた。Ｆ（ａｂ）およびジッパー結合したＦ（ａｂ’）２両方の形式で、Ｋｕｎｋｅｌ（Ｋｕｎｋｌｅ他、１９８５）の部位特異的変異誘発法により重鎖中のアルギニン５０をアラニンに変化させた（Ｒ５０Ａ）ヒト化抗体４Ｄ５変異体を生成した。段階希釈したファージに対してＨｅｒ−２ＥＣＤをコートしたプレートへの結合シグナルを調べる標準的ファージＥＬＩＳＡを行った（図２１および図２２）。ｇＤタグへ結合する抗体への結合度から判断して、この２つの形式では変異体の提示レベルは同等であった。
【０２４３】
結果
結合特性：ジッパー結合したＦ（ａｂ’）２を提示しているファージの溶液中の親和性（１ｎＭ）は、Ｆ（ａｂ）ファージと本質的に違いがない（図１９）。これは、ヒンジとＧＣＮ４ジッパーをＨＣのＣ末端に挿入したことは、このファージの結合能力に変動を与えなかったことを意味する。しかし、プレート結合実験における一価のＦ（ａｂ）ファージとの大きく異なる挙動により、ジッパー結合したこの二価Ｆ（ａｂ’）２のアビディティー効果は明白に実証された（図２０および図２１）。図２０において、ロイシンジッパー後にアンバー終止コドンがある構築体とない構築体のどちらによるジッパー結合したＦ（ａｂ’）２も、リガンドがコートされたプレートからの解離速度がＦ（ａｂ）ファージよりもはるかに低い。図２１において、同レベルの結合シグナルを与えるためには、ファージ濃度に一貫して４０〜５０倍の違いがあることがわかった。二価のＦ（ａｂ’）２を提示しているファージを用いて、４０〜５０倍低いファージ濃度で低親和性Ｒ５０Ａ（６５０ｎＭ）結合体の結合を検出し捕獲することが可能である（図２２）。この違いは例えばＦ（ａｂ）対Ｍ（ａｂ）など一価と二価の相互作用を比較するとき一般に見られる。
【０２４４】
ｐＳ０６４３ベクターに基づくファージディスプレイベクター
抗Ｈｅｒ２ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２ファージミドの構築：ｐＳ０６４３ファージミドベクター（ｐｈＧＨａｍ−ｇ３としても知られる、例えば米国特許第５，６８８，６６６号）は、ｐＢＲ３２２およびｆ１複製起点、アンピシリン耐性遺伝子、大腸菌アルカリホスファターゼ（ｐｈｏＡ）プロモーター（Ｂａｓｓ他、（１９９０）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ８：３０９〜３１４頁）、そして、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）の第１〜第１９１残基に融合したｓｔＩＩ分泌シグナル配列をコードする配列、およびＭ１３ファージ（以下ｃＰ３）のタンパク質ＩＩＩのＣ末端の第２６７〜４２１残基をコードする配列を含む。このｐＳ０６４３ファージミドは、ｈＧＨの第１９１残基の後にＸｂａＩ部位とアンバー終止コドンも含んでいる。上記ｓｔＩＩ分泌シグナル配列は、タンパク質を細菌細胞のペリプラズムへ運ぶ出すことが可能である（例えば抗体の軽鎖領域（ＬＣ））。上記ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）をコードする配列をｐＳ０６４３ベクターから除去し、フレーム内で上記ｓｔＩＩ分泌シグナルと連結するヒト化抗Ｈｅｒ２Ｆａｂ断片（「ｈ４Ｄ５」配列）をコードするＮｓｉＩ／ＸｂａＩ核酸断片（ｈｕｍＡｂ４Ｄ５−８、配列についてはＣａｒｔｅｒ他、（１９９２）ＰＮＡＳ ８９：４２８５〜４２８９頁、同文献中の表１および図１、または米国特許第５，８２１，３３７号を参照）で置換した。
【０２４５】
上記ｈ４Ｄ５抗体は既報のように開発されたヒト化抗体で、Ｈｅｒ−２（ｅｒｂＢ２）として知られる癌関連抗原を特異的に認識する。ｈｕｍＡｂ４Ｄ５ ８型（「ｈｕｍＡｂ４Ｄ５−８」）の配列と、ＰＣＲ生成物に５’ＮｓｉＩ部位と３’ＸｂａＩ部位を与えるよう操作作製したプライマーとを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応でｈ４ｄ５を作製した（Ｃａｒｔｅｒ他、（１９９２）ＰＮＡＳ ８９：４２８５〜４２８９頁）。ＰＣＲ生成物をＮｓｉＩとＸｂａＩを用いて切断し、上記ｐＳ０６４３ファージミドベクター内に連結した。
【０２４６】
ヒト化４Ｄ５（８型）を含むｐＳ０６４３プラスミドをさらに改変した。ＬＣの第３０、第６６および第９１残基を部位特異的変異誘発法で変異させた。具体的には、第３０残基はアスパラギンからセリンへ、第６６残基はアルギニンからグリシンへ、そして第９１残基はヒスチジンからセリンへ変化させた。これらの変化は、Ｆａｂの発現すなわちファージ上への提示を増加させライブラリーの実績を向上させるためと、フレームワーク（第６６残基）をヒトのコンセンサスフレームワークに戻すために行った。最後に、重鎖Ｃ末端から上記アンバー終止コドンおよびＸｂａＩ部位を除去した。
【０２４７】
１型単純ヘルペスウイルス糖タンパク質Ｄエピトープタグ（ｇＤタグ）を、部位特異的変異誘発法を用いてフレーム内のＬＣのＣ末端に加えた。ＬＣの下流の終止コドンの後で、リボソーム結合部位と、ＳＴＩＩシグナル配列をコードする核酸分子を、ＨＣ配列のＮ末端にライゲーションした。この結果ＨＣ配列は、Ｍ１３ファージのマイナーコートタンパク質であるｐ３（ｃＰ３）のＣ末端ドメインを含み、フレーム内である。以上のように、ファージ上に提示されるＦａｂを１つの構築体から産生することができる。ＦａｂファージミドベクターをｐＶ０３５０−２ｂと呼ぶ。このベクターの配列を配列番号２８として図３７に示す。
【０２４８】
ファージ上に提示されるＦ（ａｂ’）２を生成するため、上記ＰＶ０３５０−２ｂベクターをさらに改変し、二量体化が可能なロイシンジッパーＧＣＮ４の配列（ＧＲＭＫＱＬＥＤＫＶＥＥＬＬＳＫＮＹＨＬＥＮＥＶＡＲＬＫＫＬＶＧＥＲＧ）（配列番号３）を上記ＨＣとｃＰ３の間にカセット変異法により挿入した。このＧＣＮ４ロイシンジッパーは、２組のＬＣ／ＨＣ−ｃＰ３融合ポリペプチドを大腸菌ペリプラズム内で組み合わせ、その二量体をファージ表面上に提示する。このＦ（ａｂ’）２ファージミドベクターをｐＶ０３５０−４と呼ぶ。このベクターの配列を配列番号２９として図３８に示す。
【０２４９】
ｐｓ１６０７とｐｓ０６４３のどちらに基づいたベクターも、ウイルス性Ｐ３配列、ロイシンジッパー、およびｇＤタグを除去することを考慮し、制限酵素部位を含めて設計されている。そして、Ｆａｂ断片または抗体全長として可変領域ドメインを発現することを考慮して、重鎖と軽鎖の可変領域を定常領域の配列と組み合わせることができる。定常領域配列の情報源は分野で知られている。
【実施例２】
【０２５０】
二量体化ドメインの改変
一連の変異を二量体化ドメインに施した。二量体化ドメインには、例えば実施例１に記したように、Ｆａｂ−ｚｉｐなどの構築のためのヒンジ領域およびＧＣＮ４ロイシンジッパーが含まれる。Ｆ（ａｂ’）２またはＳｃＦＶ２の提示に、ジスルフィド結合とジッパー領域の両方が重要であるかどうかを判定するため、変異を二量体化ドメインに施した。
【０２５１】
一連の変異（図３９）を二量体化ドメインすなわちヒンジ領域およびＧＣＮ４ロイシンジッパーに施し、それらのアビディティーへの影響を調べた（図４０）。アルカリホスファターゼ（ｐｈｏＡ）プロモーターを備えたファージミドベクターｐｈＧＨａｍ．ｇ３を既報のように使用したが、それはＰｔａｃプロモーターを備えたベクターと比較して、細菌細胞への毒性が低いためと、ファージ収量を増加させるためである（Ｃ．Ｖ．Ｌｅｅ、未公表観察結果）。まずすべての構築体の溶液中結合を調べ、構築体の改変がＦａｂのフォールディングと機能を損なっていないことを確かめた。すべての変異体のＩＣ５０は、室温で測定して０．０５ｎＭ〜０．０７ｎＭであり、これはｈ４Ｄ５のＫｄ（０．１ｎＭ）とよく一致した。
【０２５２】
Ｆａｂ’−ｚｉｐファージのヒンジ領域およびロイシンジッパーの二価性としての機能を調べるため、変異を設計した。構築体には以下のような構築体がある。１）ヒンジ領域およびロイシンジッパーを有するもの、Ｆａｂ’−ｚｉｐ、２）ヒンジ領域のシステインを２つともアラニンに変異させたもの（Ｆａｂ’（Ｃ→Ａ）−ｚｉｐ）、３）ヒンジ領域をすべて除去したもの、Ｆａｂ−ｚｉｐ、４）最初のシステインを残してヒンジを除去しもの（Ｆａｂ−Ｃ−ｚｉｐ）、または５）システインを１つ残してヒンジおよびジッパーの両方を除去したもの（Ｆａｂ−Ｃ）。以上すべての構築体について、ｃＰ３（ウイルスコートタンパク質ｐ３のＣ末端領域）の前にアンバー終止コドンのあるものとないものを作製した。終止コドンの有無により、２つのＦａｂ間の鎖間共有結合に対するアビディティーの依存性を調べることが可能となるからである。アビディティー検定を実施例１に記したように行った。アビディティー指数は、各構築体の機能しているアビディティーの測定値を表し、５００ｎＭのｅｒｂＢ２を追い固定化抗原に結合したファージ百分率と定義する。高アビディティーはファージ１個につき２コピーのＦａｂを提示していることが機能している結果である。
【０２５３】
アンバー終止コドンなしでは、すべての構築体はＦａｂファージよりも著しく高いアビディティーでＦａｂを提示する（図４０）。この結果は、ファージコート上に２コピーのｃＰ３融合体を取り入れる確率は、以下のものが存在するとき増加することを示している。ヒンジおよびジッパー（Ｆａｂ’−ｚｉｐ）、システインのないヒンジ、およびジッパー（Ｆａｂ’（Ｃ→Ａ）−ｚｉｐ）、ジッパーのみ（Ｆａｂ−ｚｉｐ）、システイン１つおよびジッパー（Ｆａｂ−Ｃ−ｚｉｐ）、またはＦａｂとｃＰ３の間にただ１つのシステイン（Ｆａｂ−Ｃ）。Ｆａｂ’もしくはＦａｂ融合体が２つともｃＰ３に共有結合していると（アンバー終止コドンなし）、二価提示するために上記ヒンジ部ジスルフィド結合によるさらなる共有結合は必要ない。しかし、Ｆａｂ’（Ｃ→Ａ）−ｚｉｐやＦａｂ−ｚｉｐ（終止コドンなし）などシステイン残基を欠く構築体は、Ｆａｂファージより著しく高いアビディティーを実際有しているにもかかわらず、Ｆａｂ’−ｚｉｐや、リンカー部にジスルフィド結合を有する他の構築体と比較して、アビディティーの減少を示すことから、鎖間共有結合が１つ存在すると、ファージ１個につき２コピーの融合体を組み込む頻度は実際増加するようである。
【０２５４】
アンバー終止コドンがｃＰ３の前に存在すると、大部分のタンパク質はペリプラズムに発現され、ロイシンジッパーおよび／またはジスルフィド結合を介してｃＰ３融合タンパク質と結合した。アンバー抑止因子株であるＸＬ−１ブルーにおいて、アンバー終止コドンの読み過ごしは約１０％の頻度で起こるためである。二量体は図１８に示されているように１体のｃＰ３を介してファージに結合し、二価性は鎖間共有結合を１つ形成することにより形成されるものと予想する。なぜなら、細菌培地へしみ出るファージの濃度はナノモル以下の範囲であり、したがってロイシンジッパー相互作用の結合エネルギーは、３７℃で一晩の間二量体を維持するには十分ではないだろうからである。実際のところ、ヒンジにジスルフィド結合を有していないか（Ｆａｂ’（Ｃ→Ａ）−ｚｉｐ）ヒンジが除去された（Ｆａｂ−ｚｉｐ）構築体は、アンバー終止コドンが存在すると二価性依存のアビディティーを失うことが観察された。ＦａｂとｃＰ３の間にジスルフィド結合を複数持つ構築体は、アンバー終止コドンが存在しても二価性の高アビディティーを維持した。
【０２５５】
例外はＦａｂ−Ｃである。ＦａｂとｃＰ３の間にただ１つのシステインしかないＦａｂ−Ｃが、ヒンジ部すべてとロイシンジッパーを備えた元のＦａｂ’−ｚｉｐファージと比較して、より高いことはないにしても大変高いアビディティーを示したことは、驚くべきことであった。この結果は、ｃＰ３融合体としてのＦａｂ−Ｃは、別のｃＰ３融合体と結合しファージコートに二量体として組み込まれる確率が高いことを示唆している。しかし、Ｆａｂ−Ｃ構築体のシステインとｃＰ３の間にアンバー終止コドンが存在すると、アビディティーはＦａｂファージのレベルにまで低下した。これは大部分のタンパク質は遊離Ｆａｂ−Ｃとして発現され、ペリプラズム内の遊離Ｆａｂ−ＣがＦａｂ−Ｃ−ｃＰ３融合体と二量体を形成する確率は大変低くなるようだからである。
【０２５６】
二価提示のための最小要素は、ロイシンジッパーのみ（Ｆａｂ−ｚｉｐ）またはジスルフィド結合が１つ（Ｆａｂ−Ｃ）のどちらかである。Ｆａｂ−ＣとＦａｂ−ｚｉｐを比較した結果は、ある状況ではこのジスルフィド結合はロイシンジッパーのみよりもアビディティーを増加させるために効果的であることを示している。
【０２５７】
ウェスタンブロット解析
以上の構築体が共有結合した二量体として提示されたかを調べるため、ウェスタンブロットを用いた。Ｆａｂ、Ｆａｂ’−ｚｉｐ、Ｆａｂ’（Ｃ→Ａ）−ｚｉｐ、Ｆａｂ−ｚｉｐ、Ｆａｂ−Ｃ−ｚｉｐまたはＦａｂ−Ｃのファージ構築体を、アンバー終止コドンがあるものとないもので解析した。ファージ試料（３×１０１１）を変性し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、ＰＶＤＦフィルターに転写し、次いで軽鎖Ｃ末端に融合したｇＤタグを認識する抗体（図４１ＡおよびＣ）またはファージコートタンパク質Ｐ３に対する抗体（Ｍｏｂｉ−Ｔｅｃｈ社）（図４１ＢおよびＤ）を用いてプローブした。
【０２５８】
還元条件下（＋ＤＴＴ）では、軽鎖と重鎖融合体を結合するジスルフィド結合は還元され、抗ｇＤブロット（図４１Ｃ）は見かけ上の分子量（ＭＷ）が約２５ｋＤａの一本のバンドを示したが、これは軽鎖とｇＤタグの計算された分子量（２６ｋＤａ）とよく一致した。抗Ｐ３でブロットしたときは、還元条件でヘルパーファージと重鎖−ｃＰ３（構築体によりＭＷ４３〜４５ｋＤａ）融合体が供給された全長Ｐ３（ＭＷ４８ｋＤａ）を予想した。図４１Ｄの結果は、Ｋ０７単体（データ略）との比較に基づくと、Ｐ３を表す６０ｋＤａの主バンドと、それより低い上記融合体を表す５０〜５２ｋＤａのバンドを示した。つまり、予想された主な２種について計算されたＭＷよりも両方とも大きかった。しかし、Ｐ３はＳＤＳ−ＰＡＧＥ条件下で異常に高いＭＷを示すことが知られている（Ｇｒａｙ他、１９８１、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４６：６２１〜６２７頁；Ｃｒｉｓｓｍａｎ、１９８４、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １３２：４４５〜４５５頁）。さらに、５０〜５２ｋＤａバンドの相対位置は、種々の挿入を伴った各構築体の予想される重鎖−ｃＰ３融合体のＭＷと関連しているようである。興味深いことであるが、抗Ｐ３を用いブロットした非還元ゲルで同じ５０〜５２ｋＤａのバンドを観察した（図４１Ｂ）。これは、重鎖−ｃＰ３融合タンパク質で、その軽鎖に共有結合していないものが一部あることを示唆している。共有結合していない軽鎖（２５ｋＤａ）も抗ｇＤ抗体を用いブロットした非還元ゲルで観察した（図４１Ａ参照）。還元ゲルでの抗Ｐ３ブロットにおける５０〜５２ｋＤａのバンドと抗ｇＤブロットにおける軽鎖のバンドの強度は、各構築体についてのＦａｂ融合体の提示レベルを示している。
【０２５９】
アンバー抑止因子株ではアンバー終止コドンの読み過ごしは稀であるから、アンバー終止コドンを加えると、予想されるように一般にすべての構築体で提示が減少した。Ｆａｂ’−ｚｉｐのように二量体化ドメイン（ヒンジとジッパー）をすべて挿入すると提示が減少するが、その原因はヒンジ領域の２つのジスルフィド結合にあるようである。なぜならＦａｂ’（Ｃ→Ａ）−ｚｉｐのようにシステインを変異させるか、またはヒンジをすべて除去（Ｆａｂ−ｚｉｐ）すると、大部分の提示がＦａｂファージのレベルまで増加したからである。Ｆａｂ−Ｃ−ｚｉｐやＦａｂ−Ｃ構築体のように、二量体化ドメインにシステインがただ１つ存在することは十分許容され、提示もよくするようである。以上の結果は、ジスルフィド結合の数を１または０に減少させると、融合タンパク質の発現が増加したことを示す。
【０２６０】
非還元条件（−ＤＴＴ）では、鎖間ジスルフィド結合は保存され、各構築体により異なったバンドのパターンが観察された（図４１ＡおよびＢ）。ファージ調製物のウェスタンブロットでよくあるように（Ｇｒａｙ、１９８１、上記；Ｃｒｉｓｓｍａｎ、１９８４、上記）、タンパク質分解が原因で複数のバンドを観察する可能性はある。しかし、各レーンで最もＭＷが高い主バンドを比較すれば、これらの構築体の上記の異なった生成物は、分解されていない上記ｃＰ３融合体であることが示されるはずである。Ｆａｂファージは抗ｇＤと抗Ｐ３のどちらの抗体でも検出された見かけ上のＭＷが９５ｋＤａのバンドを与えたが、これはＦａｂ−ｃＰ３融合体の計算されたＭＷの７５ｋＤａとよく一致する。ここでもまたＰ３融合タンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥシステム上での移動に影響を与えているようである。対してＦａｂ’−ｚｉｐファージ（アンバー終止なし）は、見かけ上のＭＷが約１８０ｋＤａと約２００ｋＤａの一組のバンドを含んでいたが、これは二量体のＦａｂ’−ｚｉｐ−ｃＰ３融合体の計算されたＭＷ（１５５ｋＤａ）とほぼ一致する。興味深いことであるが、アンバー終止コドンありの同構築体は、１８０ｋＤａのバンドのみを示した。これは予想された二量体が、図１８に示されている一価提示している二量体複合体として、１つのｃＰ３に融合したものを表している可能性がある。いずれにしても、アンバー終止コドンの存在にかかわらず共有結合した二量体は形成される。これは、ファージコートとの共有結合の有無とは独立に、ペリプラズム内でロイシンジッパーが二量体の形成を促進し、また機能面で、この組の構築体ではアビディティーが認められたことから、予想されることである。より低いＭＷのバンドもいくつか見られたが、これらはタンパク質分解が原因か、あるいはジスルフィド結合した型でありうる。９８ｋＤａの位置に強いバンドがあり、Ｆａｂ−ｃＰ３よりは若干高く移動したが、Ｆａｂ’（Ｃ→Ａ）−ｚｉｐ構築体の強いバンドとは同じ移動度であり、これはＦａｂ’−ｚｉｐ−ｃＰ３融合体の単量体であろう。予想されるように、これは抗ｇＤと抗Ｐ３で染色される。このように、Ｆａｂ’−ｚｉｐ融合体の発現はＦａｂに比べて減少し、またジスルフィド結合を形成しなかったかなりの割合の融合タンパク質が存在する。
【０２６１】
Ｆａｂ’（Ｃ→Ａ）−ｚｉｐおよびＦａｂ−ｚｉｐについては、Ｆａｂ−ｃＰ３より若干高く、９８ｋＤａもしくは９７ｋＤａにそれぞれ移動した１本の強いバンドが観察された。これらのバンドは、２つのＦａｂ領域がジスルフィド結合で共有結合される可能性はないため、アンバー終止があるかまたはない構築体の予想された生成物である。ジスルフィド結合を欠くため、Ｆａｂ’（Ｃ→Ａ）−ｚｉｐおよびＦａｂ−ｚｉｐファージ上の二量体化したＦａｂの存在は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで観察され得ない。しかし、機能しているアビディティーにより、２コピーの融合体を含むファージの割合は、ロイシンジッパーが存在するためＦａｂファージより高いことが示唆されている。
【０２６２】
Ｆａｂ−Ｃ−ｚｉｐおよびＦａｂ−Ｃ構築体は１つの鎖間ジスルフィド結合を含み、ＭＷ１８０〜２００のバンドで表されるように、ヒンジ連結部に２つのジスルフィド結合を持つＦａｂ’−ｚｉｐよりも、共有結合した二量体を多く発現する。この共有結合した二量体の増加は、９７ｋＤａと９５ｋＤａのバンドで示される単量体を含む融合体全体の発現の増加と相関関係がある。興味深いことであるが、二量体の割合はＦａｂ−Ｃ−ｚｉｐの方がＦａｂ−Ｃより高い。これは、ロイシンジッパーは必要とはされてはいないが、融合体の結合と鎖間ジスルフィド結合の形成を実際に促進させることを示唆している。しかし、Ｆａｂ−Ｃ−ｃＰ３融合体の正味の発現量は、Ｆａｂ−Ｃ−ｚｉｐ構築体よりも若干大きい。
【０２６３】
以上のようにウェスタンブロットは、Ｆａｂ’−ｚｉｐ、Ｆａｂ−Ｃ−ｚｉｐ、およびＦａｂ−Ｃファージ上に提示された二価部分の存在を示唆し、これはアビディティー検定で機能面について観察されることを反映している。Ｆａｂ’（Ｃ→Ａ）−ｚｉｐやＦａｂ−ｚｉｐのようにＳＤＳ−ＰＡＧＥでその二量体を観察できない構築体については、その二価性を実証するためには上記アビディティー検定に依存する。このアビディティー検定は、ファージ粒子１つにつき２コピーのＦａｂを提示している結果を示す。これは、すべての構築体は同じ溶液中の結合親和性を示し、またアビディティーは提示レベルにより影響されないからである。Ｆａｂ’−ｚｉｐの正味の発現は、二量体化ドメインを最小化することにより著しく向上させることができる。二量体の異なる程度の提示とこれら種々の構築体のアビディティーは、異なる程度の提示とアビディティーを必要とするかもしれない応用への有効な手段を提供する可能性がある。
【実施例３】
【０２６４】
特定対象抗原への高親和性結合体を単離および単離のためスクリーニングするために、抗体可変ドメインライブラリーを生成した。重鎖および／またはＬ鎖可変ドメインのＣＤＲ領域に、抗体可変ドメインの多様性を好ましく生成した。重鎖ＣＤＲ領域での多様性の生成を以下に記す。ＣＤＲ領域に多様性を生成するために、単独の鋳型分子をバックボーンとして使用することが好ましい。なぜならその単独の鋳型は、提示およびフォールディングを向上させるために改変でき、また種々の大きさのＨ３領域を収容することが可能だからである。
【０２６５】
ライブラリー設計：Ｈ１、Ｈ２
抗体可変ドメインライブラリーを、抗体可変ドメイン構造の変動を最小にしつつ重鎖ＣＤＲ領域の多様性を最大化するよう設計した。抗体可変ドメイン構造の変動は、例えば、細菌細胞内で産生したとき、一般に不適切にフォールドした抗体ドメインと関係し、低収量および不安定な生成物の原因となる。低収量はスクリーニングで検出される結合体の数を減少させる。不適切にフォールドし不安定な抗体構造はまた、培養細胞で抗体がＦａｂ断片または抗体全長として産生されたときの、低収量と低親和性の原因となり得る。培養細胞で適切にフォールドした抗体を高収量で産生することは、特に治療上有益な抗体の場合、望ましいことである。
【０２６６】
鋳型分子のＣＤＲＨ１およびＨ２の各ＣＤＲにおいて、溶媒に露出し非常に多様な位置を同定することにより、また、少なくとも１つのＣＤＲ領域における非常に多様な位置の、少なくとも１つの溶媒露出残基位置に対応するアミノ酸位置の変異アミノ酸をコードする、少なくとも１つの調整した（すなわちランダムでない）コドンセットを含むオリゴヌクレオチドを設計することにより、ＣＤＲ領域の多様性を生成した。調整したコドンセットとは、既知の自然抗体の溶媒露出残基に対応する位置で最もよく発生するアミノ酸を優先的にコードする、縮重した核酸配列である。
【０２６７】
抗体可変ドメイン鋳型分子のＣＤＲにおける溶媒露出残基を、鋳型分子の結晶構造を解析することにより同定した。ヒト化抗体４Ｄ５は、細菌培養細胞を含む種々の宿主細胞で産生させると、効率よく産生されまた適切に折り畳まれる。ヒト化抗体４Ｄ５可変領域の結晶構造は既知であり、ｗｗｗ／ｒｃｓｂ／ｏｒｇで公に利用できる（アクセスコードＩＦＶＣ）。
【０２６８】
軽鎖のＣＤＲおよび重鎖のＣＤＲＨ１とＣＤＲＨ２における溶媒露出位置は、ＩｎｓｉｇｈｔＩＩプログラム（Ａｃｃｅｌｒｙｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用し同定した。
【０２６９】
ＣＤＲにおいてどの位置の非常に多様かを判定するためにも、ＣＤＲ残基を解析した。Ｋａｂａｔデータベースにある既知の天然抗体の配列を調べることにより、重鎖のＣＤＲ領域において非常に多様な位置を同定した。Ｋａｂａｔデータベースはｉｍｍｕｎｏ／ｂｍｅ／ｎｗｅ／ｅｄｕで利用できる。Ｋａｂａｔデータベースには約１５４０個のヒト軽鎖の配列と３６００個のヒト重鎖の配列があった。Ｋａｂａｔによる説明（ｉｍｍｕｎｏ／ｂｍｅ／ｎｗｅ／ｅｄｕを参照）に従い、ＣＤＲ部位を整列し番号付けした。各ＣＤＲ残基について、最も頻繁に使用されているものからあまり使用されていないものまでアミノ酸の使用度を並べて順位付けすることにより、非常に多様なアミノ酸位置を同定した。例えば、Ｈ１−３０（すなわち重鎖ＣＤＲ１の第３０残基）は、Ｋａｂａｔデータベースの３６１７抗体配列のうち２４５１配列でＳ（セリン）と判明した。これはこの位置で最も頻繁に見出されるアミノ酸である。頻度リストで次に来るのはスレオニン（６５５配列に発生）、次いでアスパラギン（１５４配列）、アルギニン（７０配列）、グリシン（６７配列）、そして残りの１２８配列では上記以外のアミノ酸の１つある。多様な部位の事例を、対応するアミノ酸の多様性リストと共に図２に（重鎖について）示す。
【０２７０】
ある特定の位置に見出されるいくつかのアミノ酸で、それらが全体として既知の自然抗体配列において最も頻繁に発生するアミノ酸を構成するものを、ライブラリー設計の基盤として選択する。最も頻繁に発生するアミノ酸とは、その位置でのアミノ酸多様性リストの上位９０％に入る、最もよく見出されるアミノ酸とした（このアミノ酸群を本明細書では「対象アミノ酸群」と呼ぶ）。しかし本明細書に記すように、ある対象アミノ酸群を選ぶ基準の上記割合は変更可能であり、それは上に述べたように、完成したい多様性ライブラリーの状況と目的に依存する。
【０２７１】
ヒト化抗体４Ｄ５について、溶媒に露出し非常に多様と同定された位置は、
重鎖
ＣＤＲ１ ２８、３０、３１、３２
ＣＤＲ２ ５０、５２、５３、５４、５６、５８
であった。
自然（すなわち既知の自然抗体配列での）多様性において高頻度で発生するアミノ酸（図３において「対象グループ」または「自然多様性」と呼ぶ）と、それらの各位置でのＤＮＡコドンによる設計アミノ酸多様性（「多様性＜ＤＮＡコドン＞」）の例を、図３に示す。
【０２７２】
ある特定のグループのアミノ酸をコードするコドンセットは、既知の自然配列における少なくともある一定の割合（図３において「再現残基率」と呼ぶ）のアミノ酸を含むように設計した。あるコドンセットがコードするアミノ酸のうち、少なくとも約４０％のアミノ酸が、溶媒に露出し非常に多様なある特定の位置について同定された対象アミノ酸であり（図３において「良残基率」と呼び、また、あるコドンセットがコードするアミノ酸でそれが対象アミノ酸であるものを、図３第３列に太字で示す）、より好ましくは４０％から１００％までのいずれかの値であり、さらに好ましくは７０％である。しかし、本明細書に記すように、この良残基率値は状況と目的に依存し変更可能である。コドンセットは、ある特定の位置で最も高い発生度のアミノ酸を優先的にコードするように選択した。ある特定の位置でコドンセットがコードする非対象アミノ酸数は最小化した。コドンセットの選択／設計の効率は、部分的には「良残基率」値に基づいて評価した。高割合は大変低い非対象アミノ酸を意味した。ある特定のコドンセットがコードするアミノ酸について、より数多くの対象アミノ酸を含んでいることよりも、「良残基率」が高い値であることをより重要であるとみなした。「良残基率」値の計算には重複度も取り入れた。評価のために、「再現残基率」値も計算した。この値は、ある特定のコドンセットがコードする「良い」すなわち対象アミノ酸が再現する自然多様性の割合を表す。例えばＨ−３０については、コドンセット＜ＲＭＶ＞を使用すると、「良い」アミノ酸はＳＴＮＲＤＧであり、これはこのコドンセットがコードするアミノ酸の７３％（良残基率）である。ＳＴＮＲＤＧは、このアミノ酸位置で既知の自然抗体３６１７配列中３４８９配列を再現するアミノ酸である。３４８９／３６１７は９６％であり、これが「再現残基率」値である。このようにＨ−３０で＜ＲＭＶ＞を使用する設計では、ライブラリーの７３％が、ＣＤＲＨ１の３０番目位置での自然多様性の９６％を再現する。
【０２７３】
可能ならば、システインおよび終止コドンを排除するようにも、コドンセットを設計した。システイン残基の存在はフォールディング問題の原因となりやすく、また終止コドンは実効ライブラリーの大きさを減少させる可能性がある。コドンセットの設計においては、非対象アミノ酸数を最小化することも望ましいとみなした。
【０２７４】
ヒト化抗体４Ｄ５において、溶媒に露出し多様性の高い各残基のために設計したコドンセットを図３に示す。どの特定の残基でも、同定された対象アミノ酸に依り、１つまたは複数のコドンセットを使用してもよい。例えば、１つはＨ１−３３残基が＜ＫＭＴ＞であり、もう１つはＨ１−３３残基が＜ＫＧＧ＞である２つのＨ１オリゴヌクレオチドを組み合わせることにより、Ｈ１−３３のために使用される１００％のコドンが、Ｈ１−位置３３での自然多様性の８６％（５０％＋３６％）を再現することになる。２つのコドンセットを有益に使用することができる他の例には、Ｈ２−５０での＜ＤＧＧ＞および＜ＤＨＴ＞コドンの使用がある。
【０２７５】
ＣＤＲＨ１およびＣＤＲＨ２を含む１つまたは複数のＣＤＲ領域に多様性を備えた多様なライブラリーを生成するため、種々のコドンセットを使用してもよい。例えば、図５〜図１３および図２４に、多様性を生成するために使用可能なコドンセット設計の種々の具体的な例を示す。図３Ａおよび３Ｂには、これらの設計におけるアミノ酸の再現状況をまとめて示す。一般に、自然多様性をより多く再現し、また「非対象」アミノ酸を可能な限り排除するよう多様性の幅を狭める設計をすることが、必要ではないが、好ましい。
【０２７６】
ライブラリー設計：Ｈ３
他のＣＤＲと比較して、重鎖ＣＤＲ３（Ｈ３）領域は、配列と長さにおいて最も大きい多様性を示す。もっとも、配列の多様性は完全にはランダムではない。（すなわち、ある特定のアミノ酸位置において、あるアミノ酸は他のアミノ酸よりもより頻繁に発生することがわかった。）配列と配列の長さにおけるこの多様性のため、Ｈ３領域に多様性を準備する方策を考案することは困難である。単独の抗体鋳型分子を使用することにより、異なった長さのＨ３を含む方策が可能になる。ライブラリーを最初に設計するときに、種々の長さのＨ３領域を収容するように鋳型を選択し設計できるからである。鋳型は、フォールディングおよび安定性に関して良好な構造特性を維持しつつ、異なった長さのＨ３領域を収容するよう選択する。Ｈ３領域の多様性は、好ましくは自然多様性を模倣するように調整するが、対象抗原の種々の異なったエピトープに結合する抗体を開発するため、または独特のＨ３配列を有するより多くの結合体を単離するため、異なったコドンセットを用いた異なったライブラリーを使用してもよい。
【０２７７】
Ｈ３の各位置でのアミノ酸の傾向を評価する予備解析として、ヒト化抗体４Ｄ５のＨ３領域の第９５〜第１００ａ残基について、＜ＮＮＫ＞コドンセットを使用して多様なＨ３を備えたライブラリーを生成した。この＜ＮＮＫ＞コドンセットは２０アミノ酸すべてと終止コドンをコードする。このライブラリーをＦａｂファージディスプレイ形式で生成し、ファージ上に機能的に提示された４００クローンを同定し配列決定した。＜ＮＮＫ＞ライブラリーのＨ３領域に見出されるアミノ酸配列を、Ｋａｂａｔデータベースに見出される配列と比較した。これらのアミノ酸の比較を図２３に示す。＜ＮＮＫ＞ライブラリーとＫａｂａｔデータベースのアミノ酸配列を解析したところ、このライブラリー配列とＫａｂａｔの配列間で、アミノ酸使用状況についてよく一致すると判定した。興味深いことであるが、既知の天然配列より、＜ＮＮＫ＞ライブラリーにはアリファティックな／疎水性のアミノ酸が多いようであった。図２３を参照のこと。
【０２７８】
Ｈ３の多様性を、＜ＤＶＫ＞および＜ＸＹＺ＞コドンセットを使用することによっても判定した。上記のように、＜ＤＶＫ＞もしくは＜ＸＹＺ＞を用いてランダム化したＨ３領域の各アミノ酸のアミノ酸頻度を同定し、Ｋａｂａｔデータベースの天然抗体のアミノ酸頻度と比較した。その結果を図４２に示す。この結果は、＜ＤＶＫ＞および＜ＸＹＺ＞ライブラリーのどちらも、天然抗体と基本的によく一致したアミノ酸使用状況であったことを示している。＜ＤＶＫ＞ライブラリーは実際に、チロシン、ロイシン、バリン、およびイソロイシンの使用減少を示した。＜ＸＹＺ＞ライブラリーもまたチロシンについてより低い使用度を示した。
【０２７９】
コドンセットを３つの斜体大文字で同定する（例えば＜ＤＶＴ＞、＜ＮＮＫ＞、＜ＮＶＴ＞など）。この文字は一般的なコドン表記と以下のように関係する。Ｒは５０％Ａ／５０％Ｇ、Ｍは５０％Ａ／５０％Ｃ、Ｋは５０％Ｇ／５０％Ｔ、Ｓは５０％Ｇ／５０％Ｃ、Ｗは５０％Ａ／５０％Ｔ、Ｈは３３％Ａ／３３％Ｔ／３３％Ｃ、Ｂは３３％Ｇ／３３％Ｔ／３３％Ｃ、Ｖは３３％Ｇ／３３％Ａ／３３％Ｃ、Ｄは３３％Ｇ／３３％Ａ／３３％Ｔ、Ｎはどの核酸でもよい、Ｘは３８％Ｇ／１９％Ａ／２６％Ｔ／１７％Ｃ、Ｙは３１％Ｇ／３４％Ａ／１７％Ｔ／１８％Ｃ、そしてＺは２４％Ｇ／７６％Ｃである。
【０２８０】
次に、自然多様性と比較してＨ３において同様なアミノ酸使用状況を生じたコドンセットを、多様化Ｈ３を含むライブラリーの設計のために使用した。これらのコドンセットには＜ＮＮＫ＞、＜ＮＮＳ＞、＜ＮＶＴ＞、＜ＤＶＫ＞および＜ＸＹＺ＞が含まれる。ある実施形態では、＜ＮＮＫ＞または＜ＮＮＳ＞など、ある位置で２０アミノ酸すべてをコードするコドンセットを図４に示すように利用した。
【０２８１】
上記コドンセットの１つは＜ＤＶＫ＞であった。＜ＤＶＫ＞はＡＣＤＥＧＫＮＲＳＴＹＷと終止コドンをコードする。既知の自然抗体配列に頻繁に発生しないアミノ酸、例えばＬＰＨＱＦＩＭＶなどは除外した。＜ＤＶＫ＞を利用し種々の長さのＨ３領域をコードするオリゴヌクレオチドを図４に示す。ある実施形態では、Ｆ５９、Ｆ６３、Ｆ６４、Ｆ６５、Ｆ６６およびＦ７８を含む一群のオリゴヌクレオチドをプールしたものを利用し、Ｈ３に多様性を備えた分子のライブラリーを形成した。
【０２８２】
使用した別のコドンセットは＜ＮＶＴ＞であった。＜ＮＶＴ＞はＡＣＤＮＧＨＰＲＳＴＹをコードし、Ｗ（トリプトファン）と終止コドンを除外する。トリプトファンはファージディスプレイで多く現れ、大部分を占める傾向がある。終止コドンはライブラリーの多様性を減少させ得る。ある実施例では、アミノ酸残基全体にわたりＷを動かすことによりＷを＜ＮＶＴ＞の設計にドープした。オリゴヌクレオチドのＨ３領域をコードする、Ｆ１３４、Ｆ１３６、ＦＦ１３７、Ｆ１３８、Ｆ１４２、Ｆ１５５、Ｆ１５６、Ｆ１５７、Ｆ１５８、Ｆ１６０、およびＦ１６０ｇを含むオリゴヌクレオチドを利用し、Ｈ３に多様性を備えた分子のライブラリーを形成した。
【０２８３】
別の実施形態では、図４および図４３に表すオリゴヌクレオチドで示すように、コドンセット＜ＸＹＺ＞を使用した。このコドンセット＜ＸＹＺ＞は２０個アミノ酸すべてをコードする。
【０２８４】
Ｈ３においてどの残基を多様化するかということに関して、Ｈ３のＣ末端はそれほど多様化しなくてよいと判定した。ある実施形態ではＨ３のＣ末端は一定に保たれた。ＫａｂａｔデータベースにはＨ３のＣ末端として主に２種類の配列があった。すなわちその配列は
Ｙ１００ａＡＭＤ１０１（Ｙ／Ｖ）１０２（Ｙ１００ａは若干変化することも時々ある）
またはＦ１００ａＤ１０１（Ｙ／Ｖ）１０２
のどちらかであった。ヒト化抗体４Ｄ５ではＨ３のＣ末端はＹＡＭＤＹである。このライブラリーは、Ｙ１００ａを変異させた以外は、この部分を多くの場合一定に保つよう設計した。Ｙ１００ａは、＜ＤＶＫ＞、＜ＤＳＧ＞、＜ＫＳＧ＞、＜ＮＶＴ＞および＜ＸＹＺ＞などの種々のコドンセットを使用して変異させた。別法として、Ｙをグリシン、セリン、アラニン、トリプトファン、バリンまたはアスパラギン酸と置換して、この残基の単独アミノ酸置換を行ってもよい。
【０２８５】
Ｈ３領域を異なった配列の長さにコードするオリゴヌクレオチドを使用して、ライブラリーを生成した。天然抗体のＨ３の長さは、約２アミノ酸から約２４アミノ酸に渡る。図４３に示すように、約７アミノ酸から約１９アミノ酸までの種々の長さのＨ３領域をコードする一連のオリゴヌクレオチドを調製した。これらのオリゴヌクレオチドについても、Ｃ末端には限定された変異を準備した。Ｃ末端にはより少ない多様性が見出されるが、オリゴヌクレオチドはＣ末端にＹＡＭＤ（Ｙ／Ｖ）またはＦＤ（Ｙ／Ｖ）の変異を準備した。１００ａおよび／または１００ｂの位置にも変異を入れた。変異させたＨ３の残基は、コドンセット＜ＮＮＫ＞、＜ＮＮＳ＞、および＜ＸＹＺ＞、またはそれらの混合物を使用して変異させた。種々の長さのＨ３領域を含む他の例を、図４に示す。図４において、ＨＣ領域は約１１残基から１３残基に渡り、一部の実施形態は、より一定したＣ末端、ＹＡＭＤＹを有している。１００ａ（Ｙ）の残基位置には、ある程度の変異を付与する。ＣＤＲＨ３アミノ酸位置は、＜ＤＶＫ＞、＜ＮＶＴ＞、＜ＮＮＫ＞、＜ＸＹＺ＞、および＜ＮＮＳ＞などのコドンセット、またはそれらの混合物を使用して変異させた。
【０２８６】
ある実施形態では、図４３に示す各オリゴヌクレオチドを使用して、Ｈ３に配列と長さの両方の多様性を備えた複数のライブラリーを調製した。これらのライブラリーはＨ３領域の配列と長さの多様性を付与する。上記のように、Ｈ１／Ｈ２領域にも多様性を生成した。ライブラリーをプールし、そして対象抗体であるマウスまたはヒトＶＥＧＦについて選別した。高親和性でありまた特異的な結合体を単離し配列決定した。結合体を単離し配列決定することにより、マウスまたはヒトＶＥＧＦへの結合体のＨ３の最適長は、約１１アミノ酸から１３アミノ酸であると同定することが可能である。（データ略）。
【０２８７】
一部の設計では、自然のコンセンサスを反映するよう、フレームワークの第９３残基をアラニンに変異した（ヒト化抗体４Ｄ５はマウスの残基セリンを有する）。フレームワークの第９４残基（最初のＨ３残基の直前）を、自然のコンセンサス配列を反映するよう、アルギニン、あるいは（ＡＲＡコドンを用い）アルギニンおよびリシンと設計した。さらに一部の実施形態では、重鎖Ｎ末端の３アミノ酸を分泌シグナルの直後で除去した。
【実施例４】
【０２８８】
ライブラリー設計：Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３
抗体可変ドメインのライブラリーを、抗体可変ドメイン構造の変動を最小にしつつ軽鎖ＣＤＲ領域の多様性を最大化するように設計した。抗体可変ドメイン構造の変動は一般に不適切に折り畳まれた抗体ドメインと関係し、低収量の原因となる。細菌細胞内で産生したときが例である。低収量はスクリーニングで検出される結合体の数を減少させる。ＣＤＲＬ１、Ｌ２およびＬ３の各ＣＤＲにおいて、溶媒に露出し非常に多様な位置を同定することにより、また、少なくとも１つのＣＤＲ領域における非常に多様な位置の、少なくとも１つの溶媒露出残基位置に対応するアミノ酸位置の変異アミノ酸をコードする、少なくとも１つの調整した（すなわちランダムでない）コドンセットを含むオリゴヌクレオチドを設計することにより、ＣＤＲ領域の多様性を生成した。調整したコドンセットとは、既知の自然抗体の溶媒露出残基に対応する位置で最もよく発生するアミノ酸を優先的にコードする、縮重した核酸配列である。
【０２８９】
抗体可変ドメイン鋳型分子のＣＤＲにおける溶媒露出残基を、鋳型分子の結晶構造を解析することにより同定した。ヒト化抗体４Ｄ５は、細菌培養細胞を含む種々の宿主細胞で産生させると、効率よく産生されまた適切に折り畳まれる。ヒト化抗体４Ｄ５可変領域の結晶構造は既知であり、ｗｗｗ／ｒｃｓｂ／ｏｒｇで公に利用できる（アクセスコードＩＦＶＣ）。
【０２９０】
軽鎖のＣＤＲおよび重鎖のＣＤＲ１とＣＤＲ２における溶媒露出位置は、ＩｎｓｉｇｈｔＩＩプログラム（Ａｃｃｅｌｒｙｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用し同定した。
【０２９１】
ＣＤＲにおいてどの位置の非常に多様かを判定するためにも、ＣＤＲ残基を解析した。Ｋａｂａｔデータベースにある既知の天然抗体の配列を調べることにより、重鎖および軽鎖のＣＤＲ領域において非常に多様な位置を同定した。Ｋａｂａｔデータベースはｉｍｍｕｎｏ／ｂｍｅ／ｎｗｅ／ｅｄｕで利用できる。Ｋａｂａｔデータベースには約１５４０個のヒト軽鎖の配列と３６００個のヒト重鎖の配列があった。Ｋａｂａｔによる説明（ｉｍｍｕｎｏ／ｂｍｅ／ｎｗｕ／ｅｄｕを参照）に従い、ＣＤＲ部位を整列し番号付けした。各ＣＤＲ残基について、最も頻繁に使用されているものからあまり使用されていないものまでアミノ酸の使用度を並べて順位付けすることにより、非常に多様なアミノ酸位置を同定した。例えば、Ｌ３−９１（すなわち軽鎖ＣＤＲ３の第９１残基）は、Ｋａｂａｔデータベースの１５８２抗体配列のうち８４９配列でＹ（チロシン）と判明した。これはこの位置で最も頻繁に見出されるアミノ酸である。頻度リストで次に来るのはセリン（１９６配列に発生）、次いでアルギニン（１６９配列）、アラニン（１１８配列）、グリシン（６１配列）、ヒスチジン（４１配列）、そして残りの３５配列では上記以外のアミノ酸の１つである。多様な部位の事例を、対応するアミノ酸の多様性リストと共に図１に（Ｌ鎖について）示す。上記の非常に多様な位置またそれらの位置で最も頻出するアミノ酸は、データベースにより多くの配列が登録されるにつれ、時と共に変わる可能性がある。
【０２９２】
ある特定の位置に見出されるいくつかのアミノ酸残基で、それらが全体として既知の自然抗体配列において最も頻繁に発生するアミノ酸を構成するものを、ライブラリー設計の基盤として選択する。最も頻繁に発生するアミノ酸とは、アミノ酸多様性リストの上位９０％に入る、最もよく見出されるアミノ酸とした（このアミノ酸群を本明細書では「対象アミノ酸群」と呼ぶ）。しかし本明細書に記すように、ある対象アミノ酸群を選ぶ基準の上記割合は変更可能であり、それは上に述べたように、完成したい多様性ライブラリーの状況と目的に依存する。
【０２９３】
ヒト化抗体４Ｄ５について、溶媒に露出し非常に多様と同定された位置は、
軽鎖
ＣＤＲ１ ２８、２９、３０、３１、３２
ＣＤＲ２ ５０、５３
ＣＤＲ３ ９１、９２、９３、９４、９６
であった。
自然（すなわち既知の自然抗体配列での）多様性において高頻度で発生するアミノ酸（図３において「対象群」または「自然多様性」と呼ぶ）と、それらの各位置でのＤＮＡコドンによる設計アミノ酸多様性（「多様性＜ＤＮＡコドン＞」）の例を、図３に示す。
【０２９４】
ある特定の群のアミノ酸（多様性）をコードするコドンセットは、既知の自然配列における少なくともある一定の割合（図３において「再現残基率」と呼ぶ）のアミノ酸を含むように設計した。あるコドンセットがコードするアミノ酸のうち、少なくとも約４０％の、好ましくは７０％のアミノ酸は、溶媒に露出し非常に多様なある特定の位置で同定される対象アミノ酸である（図３において「良残基率」と呼び、また、あるコドンセットがコードするアミノ酸でそれが対象アミノ酸であるものを、図３第３列に太字で示す）。しかし、本明細書に記すように、この良残基率値は状況と目的に依存し変更可能である。コドンセットは、ある特定の位置で最も高い発生度のアミノ酸を優先的にコードするように選択した。ある特定の位置でコドンセットがコードする非対象アミノ酸数は最小化した。コドンセットの選択／設計の効率は、部分的には「良残基率」値に基づいて評価した。高割合は大変低い非対象アミノ酸を意味した。ある特定のコドンセットがコードするアミノ酸について、より数多くの対象アミノ酸を含んでいることよりも、「良残基率」が高い値であることをより重要であるとみなした。「良残基率」が高い値であることをより重要であるとみなした。「良残基率」値の計算には重複度も取り入れた。評価のために、「再現残基率」値も計算した。この値は、（ある特定のコドンセットがコードするアミノ酸のうちで）「良い」アミノ酸が再現する自然多様性の割合を表す。例えばＬ３−９１については、コドンセットＫＭＴを使用すると、「良い」アミノ酸はＹＳＡであり、これはこのコドンセットがコードするアミノ酸ＹＳＡＤの７５％である。ＹＳＡは、このアミノ酸位置で既知の自然抗体１５８０配列中１１９０配列を再現するアミノ酸である。１１９０／１５８０は７５％であり、これが「再現残基率」値である。このようにＬ３−９１でＫＭＴを使用する設計では、ライブラリーの７５％が、ＣＤＲＬ３の９１番目位置での自然多様性の７５％を再現する。
【０２９５】
可能ならば、システインおよび終止コドンを排除するようにも、コドンセットを設計した。システイン残基の存在はフォールディング問題の原因となりやすく、また終止コドンは実効ライブラリーの大きさを減少させる可能性がある。コドンセットの設計においては、非対象アミノ酸数を最小化することも望ましいとみなした。
【０２９６】
ヒト化抗体４Ｄ５において、溶媒に露出し非常に多様な各残基のために設計したコドンセットを図３に示す。どの特定の残基でも、同定された対象アミノ酸に依り、１つまたは複数のコドンセットを使用してもよい。コドンセット＜ＹＫＧ＞および＜ＴＷＴ＞を、Ｌ３−９６の多様性を生成するために使用してもよい。
【０２９７】
ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３を含む１つまたは複数のＣＤＲ領域に多様性を備えた多様なライブラリーを生成するため、種々のコドンセットを使用してもよい。例えば、図５〜図１３および図２４に、多様性を生成するために使用可能なコドンセット設計の種々の具体的な例を示す。図３Ａおよび３Ｂには、これらの設計におけるアミノ酸の再現状況をまとめて示す。一般に、自然多様性をより多く再現し、また「非対象」アミノ酸を可能な限り排除するよう多様性の幅を狭める設計をすることが、必要ではないが、好ましい。
【実施例５】
【０２９８】
ＳｃＦｖライブラリーの構築、選別および解析
実施例１に記したように、ｐＳ１６０７ベクターにｓｃＦｖまたはｓｃＦｖ−ｚｉｐの形式で４Ｄ５可変領域を含むベクターを用いて、多様化したＣＤＲを備えたライブラリーを生成した。合計５つのライブラリーを生成し、ライブラリーの特性は以下のようであった。
Figure 0004753578
【０２９９】
Ｋｕｎｋｅｌ（Ｋｕｎｋｅｌ他、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８７）、１５４、３６７〜３８２頁）の方法を既報（Ｓｉｄｈｕ他、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．（２０００）、３２８、３３３〜３６３頁）の方法と共に用い、ライブラリーを構築した。それぞれのライブラリーには、ｓｃＦｖまたはｓｃＦｖ−ｚｉｐ表示ベクターの「終止鋳型」型を用いた、つまり各々の場合に、ＴＡＡ終止コドンを備えた終止鋳型をランダム化する各ＣＤＲ内に使用した。ＣＤＲの多様性を導入すると同時に終止コドンを修復するため、多様化する位置に縮重コドンを備えた変異誘発オリゴヌクレオチドを使用した。例えばｓｃＦｖ−１ライブラリーの構築については、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３に多様性を導入するため、３つのオリゴヌクレオチドを同時に使用した。すべての変異誘発オリゴヌクレオチドをうまく取り入れることで、各位置に設計した多様性が導入され、また同時に終止コドンが修復され、したがってｇｅｎｅ−３マイナーコートタンパク質のＣ末端ドメインに融合したｓｃＦｖまたはｓｃＦｖ−ｚｉｐの一方をコードするオープンリーディングフレームが生成された。（実施例２および３で記したように）自然抗体のＫａｂａｔデータベースにおける残基の溶媒露出度と多様性の程度に基づき、各ＣＤＲ内において多様化のための残基を選んだ。ＣＤＲＨ１およびＨ２について、多様化のために選んだ残基と各位置で導入された多様性を図２４に示す。ＣＤＲ−Ｈ３については、等モル濃度の４つの変異誘導オリゴヌクレオチド（図４におけるＦ５９、Ｆ６３、Ｆ６４、およびＦ６５）混合物を使用して多様性を導入した。
【０３００】
上記変異誘発反応物を電気穿孔法により大腸菌ＳＳ３２０に導入し（Ｓｉｄｈｕ他、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．（２０００）、３２８、３３３〜３６３頁）、この形質転換した細胞をヘルパーファージＭ１３−ＶＣＳの存在下で一晩培養し、ファージミドＤＮＡを含みそしてｓｃＦｖまたはｓｃＦｖ−ｚｉｐを表面に提示するファージ粒子を産生した。２×１０１０を超える独立したメンバーが各ライブラリーに含まれた。
【０３０１】
１．ナイーブライブラリーからの特異的抗体の選別
上述各ライブラリーのファージについて結合選別操作を繰り返して、目的の対象に結合するクローンを濃縮した。３つの対象タンパク質、Ｈｅｒ２、ＩＧＦ−１およびｍＶＥＧＦを解析した。この結合選別は既報（Ｓｉｄｈｕ他、上記）の方法に従い行った。
【０３０２】
捕獲対象（５ｕｇ／ｍＬ）でＮＵＮＣ９６ウェルイムノプレートを４℃で一晩コートし、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（Ｓｉｇｍａ社）で２時間ブロックした。既報（Ｓｉｄｈｕ他、上記）に従い、ファージを一晩３７℃で培養した後、ＰＥＧ／ＮａＣｌで沈殿させて濃縮し、ＰＢＳ、０．５％ＢＳＡ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０（Ｓｉｇｍａ）に再懸濁した。上記コートしたイムノプレートにファージ溶液（１０１３ファージ／ｍＬ）を加えた。２時間インキュベートしてファージを結合させた後、ＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０でプレートを１０回洗浄した。０．１ＭＨＣｌで結合したファージを１０分間溶出し、１．０Ｍ Ｔｒｉｓ塩基で溶出物を中和した。溶出したファージを大腸菌ＸＬ１ブルーで増幅し、さらなる選別操作のために使用した。
【０３０３】
ライブラリーを各対象タンパク質（Ｈｅｒ２、ＩＧＦ−１またはｍＶＥＧＦ）に対して２回選別操作を行い、続いて抗ｇＤエピトープ抗体に対して１回選別操作を行い（２ａラウンド）、ｓｃＦｖまたはｓｃＦｖ−ｚｉｐを提示しているクローンを濃縮した（ｓｃＦｖの軽鎖と重鎖領域間のリンカーにはｇＤエピトープが存在する）。この抗ｇＤ濃縮に続き、各ライブラリーについて対象タンパク質に対し３回目の選別操作を行った。
【０３０４】
各選別操作からの独立したクローンを、カルベニシリンとＭ１３−ＶＣＳを補った２ＹＴ培養液５００ｕＬにより９６ウェル形式で培養し、そして培養上清をファージＥＬＩＳＡ（Ｓｉｄｈｕ他、上記）に直接使用して、ファージに提示され対象タンパク質をコートしたプレートに結合したｓｃＦｖを検出した。各対象タンパク質に対する各ライブラリーの３回の選別操作の結果を図２５に示す。各ライブラリーは各対象タンパク質に対する結合体を産生したことがわかる。
【０３０５】
上記３つのｓｃＦｖ−ｚｉｐライブラリー（ｓｃＦｖ−１、ｓｃＦｖ−２、およびｓｃＦｖ−３）をさらに詳しく解析した。対象への特異的結合について解析するため、ＩＧＦ−１またはｍＶＥＧＦに対する３回目の選別操作で得られたファージクローンについて、ＩＧＦ−１とｍＶＥＧＦ両方に対するファージＥＬＩＳＡを行った。自身が選別された対象にだけ結合したクローンを特異的と分類し、両方の対象に結合したものを非特異的と分類した。各選別で得られたクローンで対象に結合したものの割合（合計）と、自身が選別された対象だけに結合したクローンの割合（特異的）を示した結果を、図２６に掲げる。ＳｃＦｖ−３ライブラリーはｓｃＦｖ−１およびｓｃＦｖ−２ライブラリーより著しく少ない特異的抗体を産生したものの、３つのライブラリーはすべて対象に対する特異的結合体を産生した。
【０３０６】
ＳｃＦｖ−１ライブラリーについては、２回目の選別操作で得られたクローンについてもスクリーニングした。ＩＧＦ−１に対する選別では、スクリーニングした９６０クローンのうち１４０クローン（１５％）が陽性だった。ｍＶＥＧＦに対する選別では、スクリーニングした１１５２クローンのうち２４クローン（２％）が陽性だった。
【０３０７】
１つのｓｃＦＶライブラリー（ｓｃＦｖ−４）については、ＩＧＦ−１またはｍＶＥＧＦに対する３回目の結合選択から得られた数百のクローンについて、特異的結合体を求めスクリーニングした。この場合、ＩＧＦ−１に対する選別では３５％の特異的結合体が得られ、ｍＶＥＧＦに対する選別では４０％の特異的結合体が得られた。
【０３０８】
ｓｃＦｖおよびｓｃＦｖ−ｚｉｐライブラリーから得られた陽性結合体の配列と親和性の一部を図２９に示す。
【０３０９】
２．抗原特異的結合体の配列決定
上記のように特徴づけられた特異的結合クローンの代表的なものを、標準的方法を用い配列決定した。その結果を図２７に示す。
【０３１０】
ＩＧＦ−１特異的結合体については、合計２５５クローンを配列決定し、その内１９２配列が独特であった。ｍＶＥＧＦ特異的抗体については、２０２クローンを配列決定し、その内８６配列が独特であった。これらの結果により、ＣＤＲ多様性を生成し抗原特異的結合体を選別する本発明の方法により、異なった配列を持つ抗原特異的抗体の可変ドメインが複数生成したことを確認した。
【０３１１】
ライブラリー設計において多様化させた重鎖アミノ酸残基の多様性を調べるため、約４５０の結合クローンの全配列を解析した。その結果は、設計したすべての変異はアミノ酸の種類がよく分布して起こったことを示した（データ略）。
【０３１２】
ＣＤＲ−Ｈ３領域の配列解析により、図２８に示すように、ナイーブライブラリーに含めた４つの異なった設計（図４におけるＦ５９、Ｆ６３、Ｆ６４およびＦ６５）は、選別された結合クローンにも存在することが示された。しかしこの４つのＣＤＲ設計は、選別された結合体の中で等しい割合ではなかった。これはあるＣＤＲの設計は、特定対象に対する陽性結合クローンを生成するのにより適合している可能性があることを示している。特に、Ｆ６４の設計は最も多くを占め（５２％）、一方Ｆ６３の設計は最も少なかった（５％）（図２８）。
【実施例６】
【０３１３】
Ｌ３／Ｈ３の多様性を備えたＦ（ａｂ’）２ライブラリー
Ｆａｂ−ｚｉｐ４Ｄ５ベクターｐＳ１６０７鋳型を用い、実施例１に記したようにＣＤＲＬ３およびＨ３に多様性を備えたライブラリーを生成した。ＣＤＲＬ３については、オリゴヌクレオチドＦ６１（Ｆ６１：ＧＣＡ ＡＣＴ ＴＡＴ ＴＡＣ ＴＧＴ ＣＡＧ ＣＡＡ ＮＲＴ ＮＲＴ ＲＶＭ ＮＮＫ ＣＣＴ ＴＤＫ ＡＣＧ ＴＴＣ ＧＧＡ ＣＡＧ ＧＧＴ ＡＣＣ；下線の付いたヌクレオチドは多様化させたアミノ酸残基／位置をコードする；配列番号３０）。ＣＤＲＨ３については、使用したヌクレオチドを、Ｆ５９、Ｆ６３、Ｆ６４、Ｆ６５、Ｆ６６、およびＦ７８と名付けた（図４参照）。１回のＫｕｎｋｌｅ変異誘発法につきＬ３およびＨ３のオリゴヌクレオチド１組を使用し、実施例４に記したようにライブラリーを作製し大腸菌で増幅した。異なったＨ３の多様性を備えた合計６つのライブラリー（上記のように６つの異なったオリゴヌクレオチドを用い生成された）を作製し、対象について選別するため、増幅後組み合わせた。選別は実施例４のように行ったが、このライブラリーについては２つの選別過程を行った点が異なった。つまり選別前に抗ｇＤに対し予備選別する過程としない過程である。ライブラリーを直接対象について選別（すなわち予備選別なし）するか、または対象について選別する前に、予備選別ライブラリーとしてまず抗ｇＤについて選別した。１回の予備選別の後、ライブラリーを対象について２回選別し、次に抗ｇＤについて１回選別した後、もう１回対象について選別した。予備選別を行わないライブラリーは、対象選別を２回経て、次に抗ｇＤで１回濃縮し、もう１回対象について選別した。
【０３１４】
ｍＶＥＧＦまたはＩＧＦ−１について選別し、予備選別を行ったライブラリーのヒット率は著しくよかった。ＨＥＲ２ＥＣＤが対象の場合、予備選別を行った選別も行わなかった選別もうまくいった。２回の対象選別と１回の抗ｇＤ選別の後のヒット率は約１４％であった。抗ｇＤ選別後の最終対象選別により９０％を超えるヒット率を得た。ヒット率は、スクリーニングした１００クローン当たりの検出された特異的結合体数として計算した。特異的結合体クローンは実施例５で定義した。
【０３１５】
陽性クローンについて、そのＨ３の配列を配列決定しＩＣ５０（親和性）を既報（Ｓｉｄｈｕ他、上記）のように解析した。図２９に各クローンの解析結果を示す。クローンは種々の配列で得られ、親和性はマイクロモル以下の領域にあった。大部分の結合体はＨ３で＜ＤＶＫ＞設計を用いたライブラリーから得られた。図２９第２列で下線の付いた残基は、クローンの元ライブラリーで固定された残基を表す。大部分の結合クローンはＹ１００ａ位置を固定したライブラリーから得られた。
【０３１６】
いくつかのクローンの結合エピトープについても、競合的結合ＥＬＩＳＡにより解析を行った。対象（マウスＶＥＧＦ）を９６ウェルＮＵＮＣ−ｍａｘｉｓｏｒｂプレート上にコートした。ｍＶＥＧＦ上のある特定のエピトープに結合したブロック試薬の存在下で、対象に結合するファージクローンを測定した。Ｆｌｔ−Ｄ２（Ｗｉｅｓｍａｎｎ他、Ｃｅｌｌ（１９９７）、９１：６９５〜７０４頁）またはＫＤＲ１−７−ｉｇｇ（Ｆｕｈ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９８）、２７３：１１１９７〜１１２０４頁）の２つのｍＶＥＧＦ受容体断片を使用した。ＫＤＲ１−７−ｉｇｇと互いに競合したことから（図３０）、解析したすべての結合体はＫＤＲ１−７−ｉｇｇと類似したエピトープに結合したことをその結果は示した。ｍＶＥＧＦ上により小さいエピトープを持つＦｌｔ−Ｄ２（Ｆｌｔ−１のドメイン２）は１つのクローンをブロックしただけであり、他のクローンはブロックしなかった（図３１）。
【０３１７】
上記の結合ファージがＦａｂ抗体断片になり得るＦａｂポリペプチド配列を実際に提示したことを実証するため、いくつかの上記クローンからＦａｂタンパク質を生成した。結合クローンから得たファージ構築体を、アンバー終止抑止因子のない大腸菌株２７Ｃ７に形質転換し、細菌を培養しＦａｂタンパク質を産生させた。図３２にこれらのクローンの特性をまとめて示す。Ｆａｂタンパク質はＶ２、Ｖ５、およびＶ８クローンから無事に生成された。
【実施例７】
【０３１８】
Ｈ１／Ｈ２／Ｈ３の多様性を備えたＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２ライブラリー
ライブラリーを上記のように生成した。鋳型構築体はＦａｂ用にｐＶ０１１６ｂ、またはＦ（ａｂ’）２用にｐＶ０１１６ｇであった。これらのベクターは、ヒトのコンセンサス配列を反映するため、４Ｄ５の第３０および第６６の位置の残基を変異した（Ｎ３０Ｓ；Ｒ６６Ｓ）軽鎖可変ドメインをコードする。これらのベクターは両方とも、ｐｈｏＡプロモーターとｓｔＩＩシグナル配列を軽鎖と重鎖の両方について有していた。ＦａｂのＨ１／Ｈ２／Ｈ３ライブラリーを作製するため、各変異誘発反応にはＨ１，Ｈ２、およびＨ３の多様性をコードするオリゴヌクレオチドを使用した。このランダム化設計に３つのＣＤＲすべてが取り入れられることを確実にするため、多様化を意図した各ＣＤＲに終止コドン（ＴＡＡ）を取り入れた。３つのＣＤＲオリゴヌクレオチドすべてを取り入れたクローンのみが、上記終止コドンが変異されたわけだから、陽性の提示をするであろう。各ＣＤＲを多様化する素材として、異なる多様性を備えたオリゴヌクレオチドをまず組み合わせた。
【０３１９】
この実験のために、２つのＨ１オリゴヌクレオチド、Ｆ１５１（ＧＣＡ ＧＣＴ ＴＣＴ ＧＧＣ ＴＴＣ ＡＣＣ ＡＴＴ ＡＶＴ ＲＲＴ ＷＭＹ ＫＭＴ ＡＴＡ ＣＡＣ ＴＧＧ ＧＴＧ ＣＧＴ ＣＡＧ；配列番号１６）、およびＦ１５２（ＧＣＡ ＧＣＴ ＴＣＴ ＧＧＣ ＴＴＣ ＡＣＣ ＡＴＴ ＡＶＴ ＲＲＴ ＷＭＹ ＫＧＧ ＡＴＡ ＣＡＣ ＴＧＧ ＧＴＧ ＣＧＴ ＣＡＧ；配列番号１４）（図１３も参照のこと）をプールし、またＨ２については、オリゴヌクレオチドＦ１５３（ＡＡＧ ＧＧＣ ＣＴＧ ＧＡＡ ＴＧＧ ＧＴＴ ＧＳＴ ＤＧＧ ＡＴＴ ＷＭＴ ＣＣＴ ＤＭＴ ＲＲＣ ＧＧＴ ＤＭＴ ＡＣＴ ＤＡＣ ＴＡＴ ＧＣＣ ＧＡＴ ＡＧＣ ＧＴＣ ＡＡＧ ＧＧＣ；配列番号１８）およびＦｌ５４（ＡＡＧ ＧＧＣ ＣＴＧ ＧＡＡ ＴＧＧ ＧＴＴ ＧＳＴ ＤＨＴ ＡＴＴ ＷＭＴ ＣＣＴ ＤＭＴ ＲＲＣ ＧＧＴ ＤＭＴ ＡＣＴ ＤＡＣ ＴＡＴ ＧＣＣ ＧＡＴ ＡＧＣ ＧＴＣ ＡＡＧ ＧＧＣ；配列番号１９）（図１３も参照のこと）をプールした。
【０３２０】
Ｈ３については、オリゴヌクレオチドの＜ＤＶＫ＞プール（Ｆ１６５、Ｆ１６６）および＜ＮＶＴ＞プール（Ｆ１３４、Ｆ１３６、Ｆ１３７、Ｆ１３８、Ｆ１４２、Ｆ１５５、Ｆ１５６、Ｆ１５７、Ｆ１５８、Ｆ１６０、Ｆ１６０ｇ）を使用した。図４に多様化させたＨ３の位置を示す。Ｆａｂライブラリーを２つ生成した。１つは＜ＤＶＫ＞Ｈ３プールを用いてであり、もう１つは＜ＮＶＴ＞Ｈ３プールを用いてである。対象について選別するため組み合わせる前に、この２つのライブラリーを大腸菌で増幅した。
【０３２１】
変異誘発したＤＮＡを使い大腸菌株ＳＳ３２０を電気穿孔法で形質転換した。ライブラリーの大きさは１０９のオーダーであった。形質転換した細菌細胞を、ヘルパーファージＫＯ７の存在下で一晩培養し、実施例４で記したように、まだ他の細菌細胞に感染することが可能な提示ファージを産生した。
【０３２２】
マウス血管内皮細胞成長因子（ｍＶＥＧＦ）およびヒトＩｇＧ１−Ｆｃ（ｈＦｃ）についての選別
＜ＤＶＫ＞および＜ＮＶＴ＞ライブラリーを対象に対する選別のためプールした。選別は他のライブラリーについて上述したように行った。この組み合わせたライブラリーをまず対象について１回選別し、次に非提示クローンを除去可能な抗ｇＤ抗体について選別し、そして次に対象（Ｓ３、Ｓ４）について２回選別した。Ｓ３、Ｓ４から得た約９６クローンをスクリーニングした。陽性クローンとは、バックグラウンド以上に対象に結合したクローン（結合体）であり、また他の無関係なタンパク質に結合しなかったクローン（特異的結合体）である。ｍＶＥＧＦが対象の場合、Ｓ４が陽性特異的結合体の最も高いヒット率を与えた。ヒトＦｃについては、Ｓ３およびＳ４は特異的結合体を高率で与えた。
Figure 0004753578
【０３２３】
結合体のＤＮＡ配列および独特な結合体の結合親和性を解析した。図３３に結合体の配列と結合親和性の例を示す。特異的ｈＦｃ結合体については、多くの独特なＦａｂクローンが得られ、その中にはそれぞれ４０ｎＭ、２ｕＭ、さらに５ｕＭを超えたところで結合するものがあった。Ｆ（ａｂ’）２ライブラリーからは、親和性が４１ｎＭ、４７ｎＭおよび１１０ｎＭのクローンを得た。ＶＥＧＦ結合体の追加配列を図３５に示す。
【実施例８】
【０３２４】
溶液結合競合ＥＬＩＳＡ
選別された抗Ｈｅｒ２Ｆ（ａｂ）およびＦ（ａｂ’）２ファージの結合親和性を測定するため、下記のように競合ＥＬＩＳＡを行った。この溶液結合競合検定法は、図４６に示すようにＦａｂタンパク質の親和性Ｋｄと相関関係があることを既に示した。上記ライブラリーからの対象抗原に対するクローンの親和性を同定するための効果的な方法として、この溶液結合検定を使用した。
【０３２５】
最初に、ファージを増殖し精製した。クローンの１つを感染させた１０ｕｌのＸＬ−１細菌を、カルベニシリンプレートで、３７℃で３０分間培養した。コロニーを１つ採取し、２ｍｌ（２ＹＴ、および５０ｕｇ／ｍｌのカルベニシリン）中で、３７℃で３〜４時間培養した。ＫＯ７またはＶＣＳ（ＶＣＳはＫ０７の変異体）ヘルパーファージを最終濃度１０１０ｐｆｕ／ｍｌの培養液に加え、さらに３７℃で１時間培養した。２０ｍｌの培地（５０ｕｇ／ｍｌのカルベニシリンを含む２ＹＴ／ＣＲＡＰ ５０：５０）を上記培養液に加え、３７℃で一晩培養した。ファージを既述のように精製した。
【０３２６】
２番目に、次の競合ＥＬＩＳＡ検定法での使用に最適となる精製ファージの濃度（すなわち、コートしたプレートでの最大結合能力の約９０％）を測定した。Ｈｅｒ−２細胞外ドメイン（ＰＢＳ中に２ｕｇ／ｍｌ）で、９６ウェルＮｕｎｃ Ｍａｘｉｓｏｒｐプレートを４℃で一晩または室温で２時間コートした。ウェルを６５ｕｌの１％ＢＳＡを加えて３０分間、続いて４０ｕｌの１％Ｔｗｅｅｎ２０でさらに３０分間ブロックした。次にウェルをＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で５回洗浄した。ＥＬＩＳＡバッファー（ＰＢＳ−０．１％ＢＳＡおよび０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で少なくとも０．１Ｏ．Ｄ．／ｍｌまで種々の濃度に希釈したＦ（ａｂ）またはＦ（ａｂ’）２を、室温で１５分間ウェルに加えた。ウェルをＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で少なくとも３回洗浄した。１ウェルにつき７５ｕｌのＨＲＰ標識抗Ｍ１３抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ社、ＥＬＩＳＡバッファーで１／５０００に希釈）を加え、室温で３０分間インキュベートした。ウェルをＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で少なくとも５回再び洗浄した。次に、１：１比の３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）ペルオキシダーゼ基質およびペルオキシダーゼ溶液Ｂ（Ｈ２Ｏ２）（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ−Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ））１００ｕｌ／ウェルを、ウェルに加え、室温で５分間インキュベートした。１Ｍリン酸（Ｈ３ＰＯ４）（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ−Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ））１００ｕｌを各ウェルに加えることにより、反応を停止させた。標準ＥＬＩＳＡプレート読み取り装置を４５０ｎｍで使用して、各ウェルの色の光学密度を測定した。Ｏ．Ｄ．の読み取り値に対し、ファージ希釈度をプロットした。
【０３２７】
３番目に、競合ＥＬＩＳＡを行った。ヒトＨｅｒ−２ＥＣＤで（ＰＢＳ中に２ｕｇ／ｍｌ）、９６ウェルＮｕｎｃ Ｍａｘｉｓｏｒｐプレートを４℃で一晩または室温で２時間コートした。ウェルを６５ｕｌの１％ＢＳＡで３０分間、続いて４０ｕｌの１％Ｔｗｅｅｎ２０でさらに３０分間ブロックした。ウェルをＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で５回洗浄した。上記の結合検定に基づき、コートした上記プレートへの結合最大値の約９０％を生じたファージ希釈液５０ｕｌを、種々の濃度のヒトＨｅｒ−２ＥＣＤ（０．１ｎＭから５００ｎＭ）を含むＥＬＩＳＡバッファー溶液５０ｕｌと、室温で１時間、ウェル内でインキュベートした。ヒトＨｅｒ−２ＥＣＤであらかじめコートした２枚目の９６ウェルプレートに７５ｕｌのウェル混合物を移し、室温で１５分間インキュベートすることにより、結合しなかったファージを検定した。この２枚目のプレートのウェルをＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で少なくとも３回洗浄した。１ウェルにつき７５ｕｌのＨＲＰ標識抗Ｍ１３抗体（ＥＬＩＳＡバッファーで１／５０００に希釈）を加え、室温で３０分間インキュベートした。ウェルをＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で少なくとも５回再び洗浄した。次に、１：１比の３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）ペルオキシダーゼ基質およびペルオキシダーゼ溶液Ｂ（Ｈ２Ｏ２）（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ−Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ））１００ｕｌ／ウェルを、ウェルに加え、室温で５分間インキュベートした。１Ｍリン酸（Ｈ３ＰＯ４）（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ−Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ））１００ｕｌを各ウェルに加えることにより、反応を停止させた。標準ＥＬＩＳＡプレート読み取り装置を４５０ｎｍで使用して、各ウェルの色の光学密度を測定した。Ｏ．Ｄ．の読み取り値に対し、競合体の濃度をプロットした。Ｆ（ａｂ）ファージもしくはＦ（ａｂ’）２−ファージを５０％阻害するＨｅｒ−２ＥＣＤの濃度であるＩＣ５０が親和性を表す。図１９も参照のこと。
【実施例９】
【０３２８】
本明細書の記述に従い生成するどのようなライブラリーについても、異なった選別およびスクリーニングの方法を組み合わせて使用できる。固相に結合した対象を利用する検定法および液相検定法は下記のように利用可能である。
【０３２９】
親和性の選別
選別方法とハイスループット親和性スクリーニング検定法の組合せは、一価（Ｆａｂ）または多価Ｆ（ａｂ’２）ポリペプチドのライブラリーから高親和性の結合体を選択するために効果的であることが示されている。（図４５）高親和性のクローンを見つける手段として、いくつかの異なった選別方法をこのスクリーニング検定法と組み合わせて使用できる。以下に述べるのは、溶液選別法と、ハイスループット親和性スクリーニング検定法である。
【０３３０】
最初の選別操作では、結合クローンを捕獲するのにより効率的であるから、プレートを使う普通の選択／選別法が好ましい。（図４４も参照のこと。）１〜３ＯＤ（２７０ｎＭ）のファージライブラリーを含むＰＢＳ／ＢＳＡバッファー１００ｕｌ／ウェルを、対象をコートしたＭａｘｉｓｏｒｂウェルに室温で１時間加える。ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０でプレートを約５回洗浄する。０．１ＮＨＣｌを用い室温で２０分間溶出させる。４ウェルから力価測定し増殖する。幅広い範囲の親和性を持った結合体を大部分捕獲する目的のため、上記洗浄はゆるやかに行う。
【０３３１】
溶液選別にはビオチン化対象抗原を使うことができる。（図４５も参照のこと。）対象タンパク質をビオチン化するには、対象タンパク質は好ましくはアミンの存在しないバッファー（例えば、Ｔｒｉｓやグリシンあるいは第一級アミンを含む他のどんなバッファーもしくは遊離アミノ酸を含まない）に含まれ、ｐＨは好ましくは７．０より高く、またタンパク質の濃度は好ましくは０．５ｍｇ／ｍｌより高いようにする（例ＰＢＳ）。必要ならば、バッファー交換をＮＡＰ−５（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）も用いて行ってもよい。貯蔵ＮＨＳ−ビオチン試薬（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）をＰＢＳ（１００×）で、好ましくは使用前に新しく調製する。約３：１のモル比で対象タンパク質に加え、室温で３０分間から１時間インキュベートする。未反応のＮＨＳをクエンチするため、ｐＨ７．５のＴｒｉｓまたはエチルアミンを１００ｍＭに３０分間加える。遊離ビオチン試薬を除去するため、ＮＡＰ−５を用いたバッファー交換を使用してもよい。これは大抵の場合必要ではない。なぜなら、残存ビオチン量は大変少なく、またタンパク質濃度はビオチン化の後、希釈して計算することが出来るからである。ビオチン化が機能を損なわなかったことを確かめるため、可能ならば、自然な結合相手（例えば受容体および／または抗体）への結合能力について、ビオチン化したタンパク質を試験してみるべきである。
【０３３２】
２〜５ｕｇ／ｍｌのｎｅｕｔｒａｖｉｄｉｎ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）を含む１００ｕｌ／ウェルのＰＢＳで、プレートを４℃でもしくは室温で２時間コートする。Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋ（Ｐｉｅｒｃｅ社）を含むＰＢＳで３０分間プレートをブロックし、次いで０．２％になるまでＴｗｅｅｎ２０を加えさらに３０分間ブロックする。
【０３３３】
Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋ０．５％と０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むバッファー１２０〜１５０ｕｌ中の適当な濃度のビオチン化対象タンパク質と、０．５〜１ＯＤのファージを３０分間から１時間インキュベートする。結合バッファーで５〜１０倍に希釈し、１００ｕｌ／ウェルをｎｅｕｔｒａｖｉｄｉｎでコートしたウェルに加え、穏やかに振盪しながら室温で５分間、ファージと結合したビオチン化対象を捕獲させる。ＰＢＳ／ｔｗｅｅｎ２０で何回か、例えば８回、プレートを洗浄する。バックグラウンド結合を測定するために、ビオチン化対象抗原とインキュベートしていないファージも、ｎｅｕｔｒａｖｉｄｉｎでコートしたプレートで捕獲する。他に可能な対照は、ｎｅｕｔｒａｖｉｄｉｎでコートしていないウェルで捕獲されたファージと混ぜたビオチン化対象抗原に基づくものである。結合したファージを０．１ＮＨＣｌを用い２０分間溶出させ、中和、力価測定し、次の操作のために増殖する。
【０３３４】
使用するビオチン化試薬の濃度は状況に依存する。ある例では、１００〜２５０ｎＭの対象濃度は厳密さの点でプレート選別に匹敵する。例えば、１００ｎＭの結合体の親和性を向上させるためには、最初の溶液選別は２０ｎＭで始め、２回目の選別で５および１ｎＭへ進めるのがよい。複数の濃度を含めるべきである。スクリーニング検定には、濃縮に用いた濃度を使用すべきである。３回目の選別には、競合選別（下記）として過剰の非ビオチン化対象を加えることが必要かもしれない。低濃度（例えば２ｎＭ未満）のビオチン化対象を使用するときは、捕獲前に１０倍でなく５倍に希釈するのが好ましい。投入したファージは後の選別操作で０．１ＯＤにまで減少するかもしれず、これはさらに選択圧を高めることになろう。
【０３３５】
選択圧を高めるために競合選別を行ってもよい。ファージおよびビオチン化対象の３０分間から１時間のインキュベーション（上記）の後、捕獲のため希釈する前に、１０００倍の過剰な非ビオチン化対象を加えて異なった温度で異なった時間インキュベートしてもよい。長時間と高温（例えば、室温に対し３７℃）は選択圧を高める。例として１ｎＭの抗ＶＥＧＦ結合体の親和性を向上させる場合を挙げる。溶液選別の最初の操作では、１ｎＭのビオチン化対象を選別に使用する。捕獲のため希釈する前に、高解離速度の結合体と競合し切るため１ｕＭの非ビオチン化対象を室温で１５分間加える。溶液操作の次の操作では、より強い結合体を選別するため０．１ｎＭのビオチン化対象を使用し、捕獲のため希釈する前に、１００ｎＭの非ビオチン化対象を３７℃で３０分間、あるいはより厳密にするため２時間加え、低解離速度の結合体を選別する。
【０３３６】
ハイスループット親和性スクリーニング検定法
この検定法を図式的に図４７に示す。（新たに培養した）コロニーを採取し、５０ｕｇ／ｍｌのカルベニシリンと１ｎ／ｍｌのＫ０７を含んだ２ＹＴ／ＣＲＡＰ（１：１）を入れた９６ウェルプレート（１５０ｕｌ／ウェル）またはラック（３００ｕｌ／チューブ）で、３７℃で一晩培養した。培養後、コロニーを遠心分離しファージ上清を得た。
【０３３７】
ファージ上清を、プレートでの培養なら１：６〜１０倍に、またはラックでの培養なら１：３〜５倍に、対象抗原ありまたはなしの総容量１５０ｕｌのＥＬＩＳＡ結合バッファー（ＰＢＳ、０．５％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で希釈し、室温で１時間インキュベートした。この結合実験での対象の最終濃度は、予想するまたは希望する親和性に依存する。ナノモル以下の親和性の結合体をスクリーニングするには、１０〜２５ｎＭを使った。１〜１００ｎＭの結合体をスクリーニングするには、１００〜１５０ｎＭの対象濃度が好ましい。
【０３３８】
プレートを５ｕｇ／ｍｌの対象抗原で、一晩または室温で２時間コートし、そして上記のようにブロックした。対象抗体ありまたはなしの約７０〜１００ｕｌのファージを、試料（対象抗体ありまたはなし）を隣り合ったウェルに同時に移しながら、上記のコートしたプレートに移した。プレートを１０〜１５分間穏やかに振盪して、結合していないファージをプレートに捕獲させた。プレートを洗浄バッファーで素早く６回洗浄した。ＨＲＰ標識抗Ｍ１３抗体を含んだ結合バッファー（１：５０００）をプレートに加え、３０分間インキュベートし、プレートを６回洗浄し、基質であるＴＭＢ／Ｈ２Ｏ２を５〜１０分間加え、４５０ｎＭで吸光度を測定した。
【０３３９】
対象なしの試料に対する対象ありの試料のＯＤ比を計算することにより、結合阻害割合を計算した。この割合が低いほど、そのクローンが有している親和性は高い。グラフは約４０クローンをスクリーニングしたデータを示す。高親和性（低い比）から低親和性（高い比）に渡る、実に様々な親和性がこの４０クローンに存在したことを、この結果は示している。
【０３４０】
本明細書に引用したすべての公表物（特許および特許申請を含む）を、これによりそれら全体として参照援用する。
【０３４１】
配列表
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【図面の簡単な説明】
【０３４２】
【図１】カバットデータベースからのヒト抗体軽鎖ＣＤＲ配列におけるアミノ酸（１文字コードで同定されている）の頻度を示す図である。特定のアミノ酸位置の各アミノ酸の頻度は、その位置で最も頻度の高いアミノ酸が左に示され、右に行くに従い最も頻度の低いアミノ酸へと続く。アミノ酸の下の番号は、カバットデータベースにおいて、その位置でそのアミノ酸を有する天然配列の数を表す。
【図２】カバットデータベースからのヒト抗体重鎖ＣＤＲ配列におけるアミノ酸（１文字コードで同定されている）の頻度を示す図である。特定のアミノ酸位置の各アミノ酸の頻度は、その位置で最も頻度の高いアミノ酸が左に示され、右に行くに従い最も頻度の低いアミノ酸へと続く。アミノ酸の下の番号は、カバットデータベースにおいて、その位置でそのアミノ酸を有する天然配列の数を表す。フレームワークアミノ酸位置７１、９３および９４も示す。
【図３】ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３、ＣＤＲＨ１およびＣＤＲＨ２におけるアミノ酸位置に適当なコドンセット設計の具体例を示す図である。このコドンセットは３つのイタリック大文字で同定され、＜＞で括られている（例えば＜ＲＤＴ＞）。このコドンセットによってコードされるアミノ酸は、「多様性＜ＤＮＡコドン＞」と標識された欄の下に１文字コードによって示される。「自然多様性」と標識された欄は、カバットデータベースにおいて、天然抗体可変ドメインのそれらの位置で最も一般的に見られるアミノ酸を示す。良残基率（％）は、コドンセットによってコードされ、その位置の対象アミノ酸であるアミノ酸の割合（％）である。再現残基率（％）は、その位置のコドンセットによってコードされるアミノ酸を持つ、カバットデータベースにおける天然抗体の割合（％）である。
【図４Ａ】設計されたＣＤＲＨ３多様性の具体例を示す図である。異なるオリゴヌクレオチドは、ＣＤＲＨ３のアミノ酸位置の多様性、ならびに配列長の多様性をコードする。これらのオリゴヌクレオチドは、左側の欄にＦ５９、Ｆ６３およびＦ６４などのように同定される。各オリゴヌクレオチドのＣＤＲＨ３の各アミノ酸位置におけるアミノ酸配列を示す。ソース抗体４Ｄ５のＣＤＲＨ３配列は上端に示す：Ｓ９３、Ｒ９４、Ｗ９５、Ｇ９６、Ｇ９７、Ｄ９８、Ｇ９９、Ｆ１００、Ｙ１００ａ、Ａ１００ｂ、Ｍ１００ｃ、Ｄ１０１およびＹ１０２。アミノ酸位置９３および９４はフレームワーク位置と考えられている。いくつかの実施形態では、ある種の位置は１文字コードで示される固定されたアミノ酸を持つことができ、例えば、位置９３はＳ（セリン）であり；アミノ酸位置９４は、Ｒ／Ｋ／Ｔ（アルギニン／リジン／トレオニン）でよく；アミノ酸位置１００ａはＧ／Ｓ／Ａ／Ｗ（グリシン／セリン／アラニン／トリプトファン）でよい。他のアミノ酸位置は、３つのイタリック大文字で同定されたコドンセット、例えばＤＶＫ、ＮＶＴ、ＤＳＧ、ＫＳＧを用いて多様化される。ＣＤＲＨ３の長さは右の欄に示す。ＣＤＲＨ３領域の長さは、７から１５の範囲である。各オリゴヌクレオチドに対して示した、この方策で作製されたライブラリーの多様性も右に示す。単一のオリゴヌクレオチドを使うこともでき、または複数のオリゴヌクレオチドをプールしてライブラリーを作製することもできる。（配列番号：１０−１３、配列番号：３１−７６及び配列番号：１６２）
【図４Ｂ】引き続き設計されたＣＤＲＨ３多様性の具体例を示す図である。異なるオリゴヌクレオチドは、ＣＤＲＨ３のアミノ酸位置の多様性、ならびに配列長の多様性をコードする。これらのオリゴヌクレオチドは、左側の欄にＦ５９、Ｆ６３およびＦ６４などのように同定される。各オリゴヌクレオチドのＣＤＲＨ３の各アミノ酸位置におけるアミノ酸配列を示す。ソース抗体４Ｄ５のＣＤＲＨ３配列は上端に示す：Ｓ９３、Ｒ９４、Ｗ９５、Ｇ９６、Ｇ９７、Ｄ９８、Ｇ９９、Ｆ１００、Ｙ１００ａ、Ａ１００ｂ、Ｍ１００ｃ、Ｄ１０１およびＹ１０２。アミノ酸位置９３および９４はフレームワーク位置と考えられている。いくつかの実施形態では、ある種の位置は１文字コードで示される固定されたアミノ酸を持つことができ、例えば、位置９３はＳ（セリン）であり；アミノ酸位置９４は、Ｒ／Ｋ／Ｔ（アルギニン／リジン／トレオニン）でよく；アミノ酸位置１００ａはＧ／Ｓ／Ａ／Ｗ（グリシン／セリン／アラニン／トリプトファン）でよい。他のアミノ酸位置は、３つのイタリック大文字で同定されたコドンセット、例えばＤＶＫ、ＮＶＴ、ＤＳＧ、ＫＳＧを用いて多様化される。ＣＤＲＨ３の長さは右の欄に示す。ＣＤＲＨ３領域の長さは、７から１５の範囲である。各オリゴヌクレオチドに対して示した、この方策で作製されたライブラリーの多様性も右に示す。単一のオリゴヌクレオチドを使うこともでき、または複数のオリゴヌクレオチドをプールしてライブラリーを作製することもできる。（配列番号：１０−１３、配列番号：３１−７６及び配列番号：１６２）
【図４Ｃ】引き続き設計されたＣＤＲＨ３多様性の具体例を示す図である。異なるオリゴヌクレオチドは、ＣＤＲＨ３のアミノ酸位置の多様性、ならびに配列長の多様性をコードする。これらのオリゴヌクレオチドは、左側の欄にＦ５９、Ｆ６３およびＦ６４などのように同定される。各オリゴヌクレオチドのＣＤＲＨ３の各アミノ酸位置におけるアミノ酸配列を示す。ソース抗体４Ｄ５のＣＤＲＨ３配列は上端に示す：Ｓ９３、Ｒ９４、Ｗ９５、Ｇ９６、Ｇ９７、Ｄ９８、Ｇ９９、Ｆ１００、Ｙ１００ａ、Ａ１００ｂ、Ｍ１００ｃ、Ｄ１０１およびＹ１０２。アミノ酸位置９３および９４はフレームワーク位置と考えられている。いくつかの実施形態では、ある種の位置は１文字コードで示される固定されたアミノ酸を持つことができ、例えば、位置９３はＳ（セリン）であり；アミノ酸位置９４は、Ｒ／Ｋ／Ｔ（アルギニン／リジン／トレオニン）でよく；アミノ酸位置１００ａはＧ／Ｓ／Ａ／Ｗ（グリシン／セリン／アラニン／トリプトファン）でよい。他のアミノ酸位置は、３つのイタリック大文字で同定されたコドンセット、例えばＤＶＫ、ＮＶＴ、ＤＳＧ、ＫＳＧを用いて多様化される。ＣＤＲＨ３の長さは右の欄に示す。ＣＤＲＨ３領域の長さは、７から１５の範囲である。各オリゴヌクレオチドに対して示した、この方策で作製されたライブラリーの多様性も右に示す。単一のオリゴヌクレオチドを使うこともでき、または複数のオリゴヌクレオチドをプールしてライブラリーを作製することもできる。（配列番号：１０−１３、配列番号：３１−７６及び配列番号：１６２）
【図５】ＣＤＲＬ１、Ｌ２およびＬ３の設計された多様性の具体例を示す図である。各位置のコドンセットを示す。各位置のコドンセットによってコードされるアミノ酸（１文字コードで示す）は、下の欄に示す。この設計で作製された多様性により、２．９×１０９配列のライブラリーが生じる。
【図６】ＣＤＲＬ１、Ｌ２およびＬ３のアミノ酸位置の非ランダムコドンセットを使って設計された多様性の具体例を示す図である。各位置のコドンセットによってコードされるアミノ酸（１文字コードで示す）は、下の欄に示す。この設計で作製された多様性により、６．１×１０８個の配列が生じる。
【図７】ＣＤＲＬ３アミノ酸位置の非ランダムコドンセットを使って設計された多様性の具体例を示す図である。各位置のコドンセットによってコードされるアミノ酸（１文字コードで示す）は、下の欄に示す。
【図８】ＣＤＲＬ１、Ｌ２およびＬ３の非ランダムコドンセットを使って設計された多様性の具体例を示す図である。いくつかの位置では、コドンセットは１つまたは複数のアミノ酸を多めにコードすることができる。例えば、ＣＤＲＬ３の位置９３では、コドンセットＲＶＭはアラニン（Ａ２）、グリシン（Ｇ２）およびトレオニン（Ｔ２）を多めにコードする。各位置のコドンセットによってコードされるアミノ酸（１文字コードで示す）は、下の欄に示す。
【図９】ＣＤＲＨ１、Ｈ２およびＨ３のアミノ酸位置の非ランダムコドンセットを使って設計された多様性の具体例を示す図である。各位置のコドンセットによってコードされるアミノ酸（１文字コードで示す）は、下の欄に示す。
【図１０】ＣＤＲＨ１、Ｈ２およびＨ３のアミノ酸位置の非ランダムコドンセットを使って設計された多様性の具体例を示す図である。各位置のコドンセットによってコードされるアミノ酸（１文字コードで示す）は、下の欄に示す。
【図１１】ＣＤＲＨ１、Ｈ２、Ｈ３およびＬ３のアミノ酸位置の非ランダムコドンセットを使って設計された多様性の具体例を示す図である。各位置のコドンセットによってコードされるアミノ酸（１文字コードで示す）は、下の欄に示す。
【図１２】ＣＤＲＨ１、Ｈ２、Ｈ３およびＬ３のアミノ酸位置の非ランダムコドンセットを使って設計された多様性の具体例を示す図である。各位置のコドンセットによってコードされるアミノ酸（１文字コードで示す）は、下の欄に示す。
【図１３】ＣＤＲＨ１、Ｈ２、Ｈ３およびＬ３のアミノ酸位置の非ランダムコドンセットを使って設計された多様性の具体例を示す図である。各位置のコドンセットによってコードされるアミノ酸（１文字コードで示す）は、下の欄に示す。
【図１４Ａ】ＳｃＦｖの提示のためのＰｔａｃプロモータードライバーカセットのヌクレオチド配列を示す図である（配列番号２３）。ｍａｌＥ分泌シグナル、ヒト化抗体４Ｄ５軽鎖可変ドメイン、リンカー、ｇＤタグ、ヒト化４Ｄ５重鎖可変ドメインおよびｐ３（ｃＰ３）のＣ末端ドメインをコードしている配列を示す。
【図１４Ｂ】引き続きＳｃＦｖの提示のためのＰｔａｃプロモータードライバーカセットのヌクレオチド配列を示す図である（配列番号２３）。ｍａｌＥ分泌シグナル、ヒト化抗体４Ｄ５軽鎖可変ドメイン、リンカー、ｇＤタグ、ヒト化４Ｄ５重鎖可変ドメインおよびｐ３（ｃＰ３）のＣ末端ドメインをコードしている配列を示す。
【図１５Ａ】ＳｃＦｖ−ｚｉｐの提示のためのＰｔａｃプロモータードライバーカセットのＤＮＡ配列を示す図である（配列番号２４）。ｍａｌＥ分泌シグナル、ヒト化４Ｄ５軽鎖可変ドメイン、リンカー、ｇＤタグ、ヒト化４Ｄ５重鎖可変ドメイン、ジッパー配列およびｐ３（ｃＰ３）のＣ末端ドメインをコードしている配列を示す。
【図１５Ｂ】引き続きＳｃＦｖ−ｚｉｐの提示のためのＰｔａｃプロモータードライバーカセットのＤＮＡ配列を示す図である（配列番号２４）。ｍａｌＥ分泌シグナル、ヒト化４Ｄ５軽鎖可変ドメイン、リンカー、ｇＤタグ、ヒト化４Ｄ５重鎖可変ドメイン、ジッパー配列およびｐ３（ｃＰ３）のＣ末端ドメインをコードしている配列を示す。
【図１６Ａ】Ｆａｂの提示のためのＰｔａｃプロモータードリブンカセットのＤＮＡ配列を示す図である（配列番号２５）。２つの読取り枠を示す。第１の読取り枠は、ｍａｌＥ分泌シグナル、ヒト化４Ｄ５軽鎖可変ドメインおよび定常ドメインをコードする。第２の読取り枠は、ｓｔＩＩ分泌シグナル、ヒト化重鎖可変ドメイン、ヒト化４Ｄ５重鎖第１定常領域（ＣＨ１）およびｐ３のＣ末端ドメインをコードする。
【図１６Ｂ】引き続きＦａｂの提示のためのＰｔａｃプロモータードリブンカセットのＤＮＡ配列を示す図である（配列番号２５）。２つの読取り枠を示す。第１の読取り枠は、ｍａｌＥ分泌シグナル、ヒト化４Ｄ５軽鎖可変ドメインおよび定常ドメインをコードする。第２の読取り枠は、ｓｔＩＩ分泌シグナル、ヒト化重鎖可変ドメイン、ヒト化４Ｄ５重鎖第１定常領域（ＣＨ１）およびｐ３のＣ末端ドメインをコードする。
【図１７Ａ】Ｆａｂ−ｚｉｐの提示のためのＰｔａｃプロモータードリブンカセットのＤＮＡ配列を示す図である（配列番号２６）。２つの読取り枠を示す。第１の読取り枠は、ｍａｌＥ分泌シグナル、ヒト化４Ｄ５軽鎖可変ドメインおよび定常ドメインをコードする。第２の読取り枠は、ｓｔＩＩ分泌シグナル、ヒト化４Ｄ５重鎖可変ドメイン、ヒト化４Ｄ５重鎖第１定常ドメイン（ＣＨ１）、ジッパー配列およびｐ３（ｃＰ３）のＣ末端をコードする。
【図１７Ｂ】引き続きＦａｂ−ｚｉｐの提示のためのＰｔａｃプロモータードリブンカセットのＤＮＡ配列を示す図である（配列番号２６）。２つの読取り枠を示す。第１の読取り枠は、ｍａｌＥ分泌シグナル、ヒト化４Ｄ５軽鎖可変ドメインおよび定常ドメインをコードする。第２の読取り枠は、ｓｔＩＩ分泌シグナル、ヒト化４Ｄ５重鎖可変ドメイン、ヒト化４Ｄ５重鎖第１定常ドメイン（ＣＨ１）、ジッパー配列およびｐ３（ｃＰ３）のＣ末端をコードする。
【図１８】Ｆ（ａｂ）およびＦ（ａｂ’）２を含む異なる構築物の提示の概略を示す図である。（Ａ）は、軽鎖ならびに少なくともウイルスコートタンパク質の一部と融合した重鎖可変およびＣＨ１ドメインを有するＦａｂを示し、（Ｂ）は、２つの軽鎖、および少なくともウイルスコートタンパク質の一部と融合した二量体化ドメイン（ｚｉｐ）を有する１つの重鎖を有するＦ（ａｂ’）２を示し、アンバー終止コドンが二量体化ドメインの後に存在し、（Ｃ）は、２つの軽鎖、ならびにそれぞれ二量体化ドメインを有しそれぞれ少なくともウイルスコートタンパク質の一部と融合した重鎖可変ドメインとＣＨ１ドメインの両方を有するＦ（ａｂ’）２を示す。
【図１９】ＨＥＲ−２ｅｃｄ（対象抗原）が増加する中でのＦａｂファージ構築物の結合率（％）を示すグラフである。構築物は、Ｆａｂファージ（−○−）またはジッパー結合したＦ（ａｂ’）２ファージ（−●−）である。このＦ（ａｂ）ファージまたはジッパー結合したＦ（ａｂ’）２ファージのそれぞれは、次第に高くなる濃度のＨｅｒ−２ＥＣＤ（０．００１〜１０００ｎＭ）溶液中で、３７℃で５時間インキュベートした。結合を解かれたファージはＨｅｒ−２ＥＣＤでコーティングしたプレートで捕獲し、ＨＲＰ−抗−Ｍ１３結合体で測定した。
【図２０】Ｆａｂファージ（−○−）またはジッパー結合したＦ（ａｂ’）２ファージ（−●−）間の解離速度の相違を示す図である。連続希釈のＨｅｒ−２ＥＣＤ（０．０１ｎＭ〜１０００ｎＭ）を、Ｈｅｒ−２ＥＣＤでコーティングしたウェルに結合したＦａｂまたはジッパー結合したＦ（ａｂ’）２ファージに加えた。プレートに結合したままになっているファージは、ＨＲＰ−抗−Ｍ１３結合体を用いて定量された。百分率で表した残りの結合ファージの相対比率は、特定のＨｅｒ−２ＥＣＤ濃度におけるＯＤをＨｅｒ−２ＥＣＤがない場合のＯＤで割ることによって計算した。
【図２１】リガンドでコーティングした支持体上の標準ファージＥＬＩＳＡにより検出可能な結合を得るのに必要なファージＦ（ａｂ）（−○−）またはジッパー結合したファージＦ（ａｂ’）２（−●−）の量の相違を示す図である。異なる濃度にファージを希釈し、Ｈｅｒ−２ＥＣＤでコーティングされたプレート上の結合シグナルを、Ｏ．Ｄ．４５０ｎＭで測定してＨＲＰ抗Ｍ１３で検出した。
【図２２】二価提示を使って低親和性結合体を検出する能力を示す図である。ヒト化４Ｄ５変異体は、アルギニン５０をＦ（ａｂ）ファージ（−○−）またはジッパー結合したＦ（ａｂ’）２（−●−）フォーマットのアラニン（Ｒ５０Ａ）に変えて調製した。ファージを希釈し、Ｈｅｒ−２ＥＣＤでコーティングされたプレート上の結合を、ＨＲＰ抗Ｍ１３で検出した。
【図２３】天然抗体のＣＤＲＨ３領域（べた塗りのバー）およびＮＮＫコドンセットで作製された多様化を有する抗体可変ドメイン（点状のバー）におけるアミノ酸の種類の頻度の比較を示す図である。アミノ酸は以下のように分類される：フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）およびチロシン（Ｙ）は芳香族アミノ酸であり、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、バリン（Ｖ）、アラニン（Ａ）およびメチオニン（Ｍ）は脂肪族アミノ酸、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）およびヒスチジン（Ｈ）は塩基性アミノ酸、アスパラギン酸（Ｄ）およびグルタミン酸（Ｅ）は酸性アミノ酸、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、アスパラギン（Ｎ）およびグルタミン（Ｑ）は極性アミノ酸、プロリン（Ｐ）、グリシン（Ｇ）およびシステイン（Ｃ）は配座アミノ酸である。
【図２４】ＣＤＲＨ１、Ｈ２およびＨ３のアミノ酸位置の非ランダムコドンセットを使って設計された多様性の具体例を示す図である。その位置のコドンセットによってコードされるアミノ酸（１文字コードで示す）は、下の欄に示す。
【図２５】対象抗原Ｈｅｒ−２、ＩＧＦ−２およびｍＶＥＧＦと結合するかどうかでＳｃＦｖライブラリーを選別した結果を示す図である。ＳｃＦｖ−１ライブラリーは、ジッパー配列を有しているベクターとＣＤＲＨ１、Ｈ２およびＨ３の多様性を用いて作製した。ＳｃＦｖ−２は、ジッパー配列を有しているベクターとＣＤＲＨ１、Ｈ２、Ｈ３およびＬ３の多様性を用いて作製した。ＳｃＦｖ−３は、ジッパー配列を有しているベクターとＣＤＲＨ３およびＬ３の多様性を用いて作製した。ＳｃＦｖ−４はジッパー領域を持たず、ＣＤＲ多様性はＣＤＲＨ１、Ｈ２およびＨ３で作製した。ＳｃＦｖ−５は、ジッパー配列を使用せず、ＣＤＲＨ１、Ｈ２、Ｈ３およびＬ３のＣＤＲ多様性を用いて作製した。選別を３回繰り返した後の各ライブラリーの結果は、対象抗原と結合したクローンの百分率（％）で示す。
【図２６】ＳｃＦｖ−１、ＳｃＦｖ−２およびＳｃＦｖ−３ライブラリーから単離された特異的結合体の結果を示す図である。ＩＧＦ−１またはｍＶＥＧＦに対して選択を３回繰り返して得られたファージクローンは、ＥＬＩＳＡ検定法でＩＧＦ−１およびｍＶＥＧＦを使用して特異的結合を示すか分析した。それに対して選択された対象と結合し、他の抗原とは結合しなかったクローンは特異的と鑑定された。各選択から得られた対象と結合したクローン（全体の）の百分率、およびそれに対して選択された対象だけに結合したクローン（特異的）の百分率を示す。
【図２７】配列の総数、またそれらの配列の中で、選別を２、３回繰り返した後にｓｃＦｖ−１およびｓｃＦｖ−４の各ライブラリーから同定された抗ＶＥＧＦまたは抗ＩＧＦ抗体可変ドメインの特有な配列の数を示す図である。
【図２８】結合体の１セットにおけるＣＤＲＨ３コドン／アミノ酸利用の分布を示す図である。「Ｘ」は図４に示した各オリゴヌクレオチドのコドンセットの利用を表す。ライブラリーから単離された結合体配列におけるオリゴヌクレオチドそれぞれのＣＤＲ−Ｈ３デザインの百分率を示す。
【図２９】Ｆ（ａｂ’）２Ｌ３／Ｈ３ライブラリーに由来するいくつかの抗ＩＧＦ１および抗ＶＥＧＦ結合体のＨ３配列と親和性を示す図である。下線を引いた残基は、クローンのソースライブラリーで固定された残基を表す。（配列番号：７７−７９）
【図３０】クローンの一部に結合したエピトープの同一性を示す図である。ネズミのＶＥＧＦをプレートにコーティングし、ＫＤＲ−７ｉｇｇの存在下で競合的に抑制されるファージクローンを同定した。クローンＶ１（−●−）、Ｖ２（−○−）、Ｖ４（−◆−）、Ｖ５（−▲−）、Ｖ６（−＋−）、Ｖ７（−△−）、Ｖ８（− −）、Ｖ９（−■−）、Ｖ１０（−▼−）を試験した。
【図３１】クローンの一部に結合したエピトープの同一性を示す図である。ネズミのＶＥＧＦをプレートにコーティングし、Ｆ１ｔ１−Ｄ２の存在下で競合的に抑制されるファージクローンを同定した。クローンＶ１（−●−）、Ｖ２（−○−）、Ｖ４（−◆−）、Ｖ５（−▲−）、Ｖ６（−＋−）、Ｖ７（−△−）、Ｖ８（− −）、Ｖ９（−■−）、Ｖ１０（−▼−）を試験した。
【図３２】クローンＶ１、Ｖ２、Ｖ３およびＶ８の細胞培養におけるＦａｂポリペプチドファージＣＤＲＨ３アミノ酸配列、親和性、エピトープ特異性およびＦａｂの生産を示す図である。
【図３３】Ｆ（ａｂ）またはＦ（ａｂ’）２ライブラリーに由来する重鎖可変ドメインＣＤＲアミノ酸配列およびｍＶＥＧＦおよびヒトＦｃ受容体と結合する結合体の親和性を示す図である。重鎖フレームワークアミノ酸位置４９、７１、９３および９４のアミノ酸配列も示す。（配列番号：８０−１１５）
【図３４Ａ】ファージミド構築物の概略を示す図であり、Ｆａｂの提示のために別々の転写産物の発現を可能にする二シストロン性ベクターを示す。適当なプロモーター、例えばＰｔａｃまたはＰｈｏＡプロモーターは二シストロン性メッセージの発現を促す。第１のシストロンは、軽鎖可変および定常ドメインとｇＤタグをコードしている配列に連結したｍａｌＥまたは耐熱性エンテロトキシンＩＩ（ｓｔＩＩ）分泌シグナルをコードする。第２のシストロンは、分泌シグナル配列、重鎖可変ドメインと定常ドメイン１（ＣＨ１）およびウイルスコートタンパク質の少なくとも一部をコードする。
【図３４Ｂ】ファージミド構築物の概略を示す図であり、Ｆ（ａｂ’）２の提示のための二シストロン性メッセージを示す。適当なプロモーターは、第１および第２のシストロンの発現を促進する。第１のシストロンは、分泌シグナル配列（ｍａｌＥまたはｓｔＩＩ）、軽鎖可変および定常ドメインとｇＤタグをコードする。第２のシストロンは、分泌シグナル、重鎖可変ドメインと定常ドメイン１（ＣＨ１）および二量体化ドメインをコードする配列ならびにウイルスコートタンパク質の少なくとも一部をコードする。
【図３４Ｃ】ファージミド構築物の概略を示す図であり、ＳｃＦｖの提示のための一シストロン性ベクターである。適当なプロモーターは、ペプチドリンカーと結合したＶＬおよびＶＨドメインの発現を促進する。シストロン配列は、５’末端で分泌シグナル配列に連結し、３’末端でウイルスコートタンパク質（ｐＩＩＩ）の少なくとも一部に連結する。
【図３４Ｄ】ファージミド構築物の概略を示す図であり、ＳｃＦｖ２の提示のためのベクターを示す。このベクターは図３４Ｃと類似しているが、ＶＨとコートタンパク質の間に二量体化ドメインを含む。
【図３５】ＳｃＦｖおよびＳｃＦｖ２ライブラリーからの重鎖可変ＣＤＲ配列のアミノ酸配列ならびに抗ＶＥＧＦ結合体の親和性を示す図である。（配列番号：１１６−１４３）
【図３６】連続するパッチを形成するＣＤＲ残基を示しているヒト化４Ｄ５の三次元モデル化構造を示す図である。連続するパッチはＣＤＲＬ１のアミノ酸残基２８、２９、３０、３１および３２、ＣＤＲＬ２のアミノ酸残基５０および５３、ＣＤＲＬ３のアミノ酸残基９１、９２、９３、９４および９６、ＣＤＲＨ１のアミノ酸残基２８、３０、３１、３２および３３、ならびに、ＣＤＲＨ２のアミノ酸残基５０、５２、５３、５４、５６および５８によって形成される。
【図３７Ａ】ｐＶ３０５０−２ｂベクターのＤＮＡ（配列番号２８）とアミノ酸配列を示す図である。この配列は、４Ｄ５のｓｔＩＩ分泌シグナル配列、軽鎖可変と定常ドメイン、およびｇＤタグ、４Ｄ５の他のｓｔＩＩ分泌シグナル配列重鎖可変ドメイン配列、ＣＨＩ重鎖定常ドメインならびにｐ３のＣ末端ドメインを示す。
【図３７Ｂ】引き続きｐＶ３０５０−２ｂベクターのＤＮＡ（配列番号２８）とアミノ酸配列を示す図である。この配列は、４Ｄ５のｓｔＩＩ分泌シグナル配列、軽鎖可変と定常ドメイン、およびｇＤタグ、４Ｄ５の他のｓｔＩＩ分泌シグナル配列重鎖可変ドメイン配列、ＣＨＩ重鎖定常ドメインならびにｐ３のＣ末端ドメインを示す。
【図３７Ｃ】引き続きｐＶ３０５０−２ｂベクターのＤＮＡ（配列番号２８）とアミノ酸配列を示す図である。この配列は、４Ｄ５のｓｔＩＩ分泌シグナル配列、軽鎖可変と定常ドメイン、およびｇＤタグ、４Ｄ５の他のｓｔＩＩ分泌シグナル配列重鎖可変ドメイン配列、ＣＨＩ重鎖定常ドメインならびにｐ３のＣ末端ドメインを示す。
【図３７Ｄ】引き続きｐＶ３０５０−２ｂベクターのＤＮＡ（配列番号２８）とアミノ酸配列を示す図である。この配列は、４Ｄ５のｓｔＩＩ分泌シグナル配列、軽鎖可変と定常ドメイン、およびｇＤタグ、４Ｄ５の他のｓｔＩＩ分泌シグナル配列重鎖可変ドメイン配列、ＣＨＩ重鎖定常ドメインならびにｐ３のＣ末端ドメインを示す。
【図３７Ｅ】引き続きｐＶ３０５０−２ｂベクターのＤＮＡ（配列番号２８）とアミノ酸配列を示す図である。この配列は、４Ｄ５のｓｔＩＩ分泌シグナル配列、軽鎖可変と定常ドメイン、およびｇＤタグ、４Ｄ５の他のｓｔＩＩ分泌シグナル配列重鎖可変ドメイン配列、ＣＨＩ重鎖定常ドメインならびにｐ３のＣ末端ドメインを示す。
【図３７Ｆ】引き続きｐＶ３０５０−２ｂベクターのＤＮＡ（配列番号２８）とアミノ酸配列を示す図である。この配列は、４Ｄ５のｓｔＩＩ分泌シグナル配列、軽鎖可変と定常ドメイン、およびｇＤタグ、４Ｄ５の他のｓｔＩＩ分泌シグナル配列重鎖可変ドメイン配列、ＣＨＩ重鎖定常ドメインならびにｐ３のＣ末端ドメインを示す。
【図３８Ａ】ベクターｐＶ０３５０−４のＤＮＡ（配列番号２９）とアミノ酸配列を示す図である。ｐＶ０３５０−２ｂベクターは、重鎖定常ＣＨ１ドメインとｐ３配列の間に二量体化ドメインを挿入することによって修飾された。
【図３８Ｂ】引き続きベクターｐＶ０３５０−４のＤＮＡ（配列番号２９）とアミノ酸配列を示す図である。ｐＶ０３５０−２ｂベクターは、重鎖定常ＣＨ１ドメインとｐ３配列の間に二量体化ドメインを挿入することによって修飾された。
【図３８Ｃ】引き続きベクターｐＶ０３５０−４のＤＮＡ（配列番号２９）とアミノ酸配列を示す図である。ｐＶ０３５０−２ｂベクターは、重鎖定常ＣＨ１ドメインとｐ３配列の間に二量体化ドメインを挿入することによって修飾された。
【図３８Ｄ】引き続きベクターｐＶ０３５０−４のＤＮＡ（配列番号２９）とアミノ酸配列を示す図である。ｐＶ０３５０−２ｂベクターは、重鎖定常ＣＨ１ドメインとｐ３配列の間に二量体化ドメインを挿入することによって修飾された。
【図３８Ｅ】引き続きベクターｐＶ０３５０−４のＤＮＡ（配列番号２９）とアミノ酸配列を示す図である。ｐＶ０３５０−２ｂベクターは、重鎖定常ＣＨ１ドメインとｐ３配列の間に二量体化ドメインを挿入することによって修飾された。
【図３８Ｆ】引き続きベクターｐＶ０３５０−４のＤＮＡ（配列番号２９）とアミノ酸配列を示す図である。ｐＶ０３５０−２ｂベクターは、重鎖定常ＣＨ１ドメインとｐ３配列の間に二量体化ドメインを挿入することによって修飾された。
【図３９】異なる二量体化ドメインを有する構築物の概略を示す図である。ヒンジ領域とロイシンジッパーを有するＦａｂ’−ｚｉｐ、システインフリーのヒンジプラスジッパー（Ｆａｂ’（Ｃ→Ａ）−ｚｉｐ）、ジッパーのみ（Ｆａｂ−ｚｉｐ）、システイン１個プラスジッパー（Ｆａｂ−Ｃ−ｚｉｐ）、ＦａｂとｃＰ３との間に単独のシステインが１個（Ｆａｂ−Ｃ）。
【図４０】二量体化ドメインの後のアンバー終止コドンの存在下（斜線）、またはアンバー終止コドンの非存在下（べた塗りバー）における、二量体化ドメインの変異を有する変異体のアビディティー指数を示す図である。検定は図２０のように３反復で行い、アビディティー指数は、ＥｒｂＢ２−ＥＣＤなしでインキュベートした試料中の結合したファージと比較した、５００ｎＭのＥｒｂＢ２−ＥＣＤによるインキュベーションの後にも結合したままのファージの百分率である。相違の有意差は、ｔ検定で分析した。アスタリスク１つ（＊）はアンバー終止状態の等しいＦａｂファージと比較した場合の有意差を表す（ｐ値＜０．００１、但しＦａｂ’（Ｃ→Ａ）−ｚｉｐおよびＦａｂ−ｚｉｐ（−アンバー）はｐ値０．００１〜０．００３を持つ）。アスタリスク２つ（＊＊）は、アンバー終止コドンがある場合とない場合を比較した場合の有意差を表す（ｐ＜０．０１）。アスタリスク３つ（＊＊＊）は、Ｆａｂ’（Ｃ→Ａ）−ｚｉｐおよびＦａｂ−ｚｉｐのアンバーのない構築物をＦａｂ’−ｚｉｐファージと比較した場合の有意差を示す（ｐ＝０．００３〜０．００７）。
【図４１】還元条件（パネルＣおよびＤ）と非還元条件（パネルＡおよびＢ）の下での、異なる二量体化ドメインを有する構築物のウェスタンブロットを示す図である。ファージ試料は各レーンの底に表示され、ＭＷマーカーは左に表示されている。すべての構築物は、軽鎖のＣ末端に融合したｇＤタグを含む。ウェスタンブロット試料は非還元（−ＤＴＴ；パネルＡおよびＢ）または還元（＋ＤＴＴ；パネルＣおよびＤ）条件下で用い、タンパク質は抗ｇＤ標識抗体（パネルＡおよびＣ）または抗ｐ３抗体（パネルＢおよびＤ）で検出された。ファージ感染したＸＬ−１Ｂｌｕｅ細胞は２ＹＴ培地で３０℃で一晩培養し、ファージはＰＥＧ／ＮａＣｌを用いて沈降により２回精製し、１ｍＬの１０ｍＭ ＴＲＩＳ、１．０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０で再懸濁した。ファージ試料（３×１０１１、１ＯＤ２６８＝１．３×１０１３）は、９５℃で５分間、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液（２％ＳＤＳ、２０ｍＭトリスｐＨ６．８、１０％グリセリン）中で、２ｍＭのＤＴＴを添加してまたは添加しないでインキュベートした。変性試料は４〜２０％のトリス−グリシンゲル上を流し、ＰＶＤＦフィルターへ電気移動させた。ＰＶＤＦフィルターは、２％ミルクおよび０．１％Ｔｗｅｅｎ２０の入ったトリスｐＨ７．５、０．１５ ＭのＮａＣｌ（ブロッキング緩衝）で２時間ブロックし、次にブロッキング緩衝中で２ｎＭの抗ｇＤタグ（左）または抗ｐ３（右）抗体と１時間インキュベートした。フィルターはＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼ／ウサギ抗マウスＦａｂ複合体と３０分間インキュベートし、ＥＣＬ（商標）ウェスタンブロット法検出試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）で視覚化した。
【図４２】天然抗体のＣＤＲＨ３におけるアミノ酸の頻度の比較を示す図である（べた塗りバー）。コドンセット（Ａ）ＤＶＫ（斜線バー）；（Ｂ）ＸＹＺ（斜線バー）；および（Ｃ）ＮＮＫ（斜線バー）によってコードされたアミノ酸。アミノ酸は以下のように分類される：フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）およびチロシン（Ｙ）は芳香族アミノ酸であり、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、バリン（Ｖ）、アラニン（Ａ）およびメチオニン（Ｍ）は脂肪族アミノ酸、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）およびヒスチジン（Ｈ）は塩基性アミノ酸、アスパラギン酸（Ｄ）およびグルタミン酸（Ｅ）は酸性アミノ酸、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、アスパラギン（Ｎ）およびグルタミン（Ｑ）は極性アミノ酸、プロリン（Ｐ）、グリシン（Ｇ）およびシステイン（Ｃ）は配座アミノ酸である。
【図４３】ＣＤＲＨ３の配列の多様性および長さの多様性をコードしているオリゴヌクレオチドの実施形態を示す図である。これらのオリゴヌクレオチドは、左側の欄にＦ１７１、Ｆ１８５、Ｆ１８５ａなどと示されている。各オリゴヌクレオチドを用いたＣＤＲＨ３の各アミノ酸位置におけるアミノ酸配列を示す。ソース抗体４Ｄ５におけるＣＤＲＨ３配列は、Ｓ９３、Ｒ９４、Ｗ９５、Ｇ９６、Ｇ９７、Ｄ９８、Ｇ９９、Ｆ１００、Ｙ１００ａ、Ａ１００ｂ、Ｍ１００ｃ、Ｄ１０１およびＹ１０２である。アミノ酸位置９３および９４はフレームワーク位置と考えられている。いくつかの実施形態では、ある種の位置は１文字コードで示される固定されたアミノ酸を持つことができ、例えば、位置９３はＡ（アラニン）であり；アミノ酸位置９４は、Ｒ／Ｋ（アルギニン／リジン）でよく；アミノ酸位置１００ａは、Ａ／Ｇ／Ｖ／Ｄ（アラニン／グリシン／バリン／アスパラギン酸）でよい。他のアミノ酸位置は、３つのイタリック大文字で同定されたコドンセット、例えばＮＮＫ、ＸＹＺ、ＮＮＳ、ＫＳＧを用いて多様化される。ＣＤＲＨ３の長さは右の欄に示す。（配列番号：１４４−１６１）
【図４４】実施例９で記載されている固体担体結合対象（−−−）または溶相対象結合を使って、高親和性抗ＶＥＧＦ抗体可変ドメインをライブラリーから選択する選別方策の概略を示す図である。
【図４５】高親和性抗体可変ドメインを選ぶための２種類の選別方策を図解した図である。選別または選択は、実施例９で記載されているように、固体基質に結合した対象に対して選別すること、および／または溶相対象抗原に対して選別することを含む。
【図４６】実施例８に記載されている競合ＥＬＩＳＡからのＩＣ５０に基づく親和性測定と、同じクローンのＫＤとの相関を示す図である。
【図４７】結合体の単一点競合ＥＬＩＳＡの概略を示す図である。グラフは、約４０のクローンをスクリーニングした結果を示す。結合阻害率は、試料足す対象と試料引く対象とのＯＤ比率を計算することによって算出した。百分率（％）が低いほど潜在的な親和性は高い。結果は、４０のクローンの間で、様々な親和性が観察された。クローンの約１０％は非常に高い親和性であった。

Claims (50)

  1. それぞれが以下のアミノ酸配列を含む変異体ＣＤＲＨ３領域を含んでなる重鎖可変ドメインをそれぞれ含む、異なるポリペプチド配列を複数含むライブラリーであって、
    （Ｘ１）ｎ−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６、
    式中、Ｘ１は、ＮＮＫ、ＮＮＳ、ＤＶＫ、ＮＶＴ、ＸＹＺのコドンセットによってコードされるいずれかの天然アミノ酸、またはトリプトファンもしくはグリシンもしくはその混合物であり、ｎは４から１４であり、
    Ｘ２は、ＫＳＧ、ＤＶＫ、ＤＳＧ、ＮＶＴ、ＫＳＧ、ＮＮＳ、ＸＹＺ、ＮＮＫのコドンセットでコードされるいずれかの天然アミノ酸、またはチロシン、フェニルアラニン、セリン、アラニン、グリシン、ロイシンもしくはトリプトファンであり、
    Ｘ３は、Ｘ２がフェニルアラニンまたはロイシンのときは存在せず、あるいは存在する場合には、アラニン、バリン、アスパラギン酸またはグリシンであり、
    Ｘ４は、Ｘ２がフェニルアラニンまたはロイシンのときは存在せず、あるいは存在する場合はメチオニンであり、
    Ｘ５はアスパラギン酸、アラニン、バリンまたはグリシンであり、
    Ｘ６はチロシンまたはバリンであり；
    少なくとも一つの変異体ＣＤＲは、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２もしくはその双方から選択され、少なくとも一つの変異体ＣＤＲは、少なくとも一つの溶媒に露出した非常に多様なアミノ酸位置に変異体アミノ酸を有し、変異体アミノ酸は、非ランダムコドンセットによってコードされ、該非ランダムコドンセットによってコードされるアミノ酸の少なくとも７０％が既知の抗体可変ドメイン内のその位置の対象アミノ酸である、ライブラリー。
  2. Ｘ３がアラニンであり、Ｘ４がメチオニンであり、Ｘ５がアスパラギン酸であり、Ｘ６がチロシンである請求項１に記載のライブラリー。
  3. Ｘ２がチロシンである請求項１に記載のライブラリー。
  4. Ｘ２がロイシンまたはフェニルアラニンであり、Ｘ３およびＸ４が存在せず、Ｘ５がアスパラギン酸であり、Ｘ６がチロシンである請求項１に記載のライブラリー。
  5. ｎが６である請求項２に記載のライブラリー。
  6. ｎが６である請求項４に記載のライブラリー。
  7. ｎが６、７または８である請求項１ないし６の何れか一項に記載のライブラリー。
  8. 抗体４Ｄ５のＣＤＲＨ３においてＸ１がアミノ酸位置９５に対応し、ｎが６であり、Ｘ２がアミノ酸位置１００ａに対応し、Ｘ３がアミノ酸位置１００ｂに対応する、請求項１ないし７の何れか一項に記載のライブラリー。
  9. 前記非ランダムコドンセットによってコードされるアミノ酸が少なくとも５０％の公知の抗体可変ドメインの対応する位置で見られるアミノ酸を含む、請求項１ないし８の何れか一項に記載のライブラリー。
  10. 前記変異体ＣＤＲがＣＤＲＨ１およびＣＤＲＨ２である、請求項１ないし９の何れか一項に記載のライブラリー。
  11. ＣＤＲＨ１がアミノ酸位置２８、３０、３１、３２および３３の少なくとも１つ、２つ、３つ、４つまたはすべての位置に変異体アミノ酸を含み、ＣＤＲＨ２がアミノ酸位置５０、５２、５３、５４、５６および５８の少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたはすべての位置に変異体アミノ酸を含む、請求項１０に記載のライブラリー。
  12. ＣＤＲＨ１およびＣＤＲＨ２の各変異体アミノ酸位置が変異体アミノ酸を有し、
    １）ＣＤＲＨ１において、
    ａ）位置２８の変異体アミノ酸はコドンセットＡＶＴおよびＷＣＣの組み合わせ、もしくはコドンセットＷＣＣによってコードされるか、あるいはトレオニンであり、
    ｂ）位置３０の変異体アミノ酸はコドンセットＲＶＭまたはＡＶＴによってコードされ、
    ｃ）位置３１の変異体アミノ酸はコドンセットＲＶＭ、ＲＶＴまたはＲＲＴによってコードされ、
    ｄ）位置３２の変異体アミノ酸はコドンセットＷＭＹによってコードされ、
    ｅ）位置３３の変異体アミノ酸はコドンセットＫＶＫ、ＲＮＴ、ＤＭＴ、ＫＭＴまたはＫＧＧまたはコドンセットＫＭＴとＫＧＧの組合せによってコードされ、
    また、
    ２）ＣＤＲＨ２において、
    ａ）位置５０の変異体アミノ酸はコドンセットＫＤＴまたはＤＢＧまたはコドンセットＤＧＧとＤＨＴの組合せによってコードされ、
    ｂ）位置５２の変異体アミノ酸はコドンセットＤＨＴおよびＤＭＴの組み合わせ、もしくはコドンセットＤＭＴによってコードされ、
    ｃ）位置５３の変異体アミノ酸はコドンセットＮＭＴまたはＤＭＴによってコードされ、
    ｄ）位置５４の変異体アミノ酸はコドンセットＲＲＣ、もしくはコドンセットＤＭＫおよびＲＲＣの組み合わせ、もしくはコドンセットＤＭＴおよびＲＲＣの組み合わせ、もしくはコドンセットＲＲＣ、ＤＭＫおよびＤＭＴの組み合わせによってコードされ、
    ｅ）位置５６の変異体アミノ酸はコドンセットＤＭＫまたはＤＭＴによってコードされ、
    ｆ）位置５８の変異体アミノ酸はコドンセットＤＭＴまたはＤＡＣによってコードされる、請求項１１に記載のライブラリー。
  13. 異なるポリペプチドがそれぞれ、
    ａ）請求項１ないし１２のいずれかに記載の重鎖抗体可変ドメイン、および
    ｂ）変異体ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３またはその混合物を含む軽鎖抗体可変ドメインを含む、少なくとも２つの抗体可変ドメインを含み、
    ｉ）少なくとも１つの変異体ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２またはＣＤＲＬ３またはその混合物は少なくとも１つの溶媒に露出した非常に多様なアミノ酸位置に変異体アミノ酸を有し、前記変異体アミノ酸は非ランダムコドンセットによってコードされ、前記非ランダムコドンセットによってコードされるアミノ酸の少なくとも７０％は既知の抗体可変ドメインにおけるその位置の対象アミノ酸である、請求項１ないし１２の何れか一項に記載のライブラリー。
  14. ＣＤＲＬ１がアミノ酸位置２８、２９、３０、３１および３２の１つまたは複数の位置に変異体アミノ酸を含み、
    ＣＤＲＬ２がアミノ酸位置５０および５３の１つまたは複数の位置に変異体アミノ酸を含み、
    ＣＤＲＬ３がアミノ酸位置９１、９２、９３、９４および９６の１つまたは複数の位置に変異体アミノ酸を含む、請求項１３に記載のライブラリー。
  15. 各ＣＤＲの各変異体アミノ酸位置が変異体アミノ酸を有し、
    １）ＣＤＲＬ１において、
    ａ）位置２８の変異体アミノ酸はＲＤＴによってコードされ、
    ｂ）位置２９の変異体アミノ酸はＲＫＴまたはＲＴＴによってコードされ、
    ｃ）位置３０の変異体アミノ酸はＲＶＷによってコードされ、
    ｄ）位置３１の変異体アミノ酸はコドンセットＲＶＷまたはＡＮＷによってコードされ、
    ｅ）位置３２の変異体アミノ酸はコドンセットＴＨＴ、もしくはコドンＤＨＴおよびＴＨＴの組み合わせによってコードされ、
    ２）ＣＤＲＬ２において、
    ａ）位置５０の変異体アミノ酸はコドンセットＫＢＧによってコードされ、
    ｂ）位置５３の変異体アミノ酸はコドンセットＡＶＣによってコードされ、
    ３）ＣＤＲＬ３において、
    ａ）位置９１の変異体アミノ酸はコドンセットＫＭＴまたはＴＭＴまたはコドンセットＴＭＴとＳＲＴの組合せによってコードされ、
    ｂ）位置９２の変異体アミノ酸はコドンセットＤＭＣ、もしくはコドンＤＨＴおよびＤＭＣの組み合わせによってコードされ、
    ｃ）位置９３の変異体アミノ酸はコドンＲＶＴまたはＤＨＴによってコードされ、
    ｄ）位置９４の変異体アミノ酸はＮＨＴまたはＷＨＴによってコードされ、
    ｅ）位置９６の変異体アミノ酸はコドンセットＨＴＴ、ＴＤＫ、もしくはコドンセットＹＫＧおよびＴＷＴの組み合わせ、コドンセットＹＨＴと、ＨＴＴ、ＹＫＧおよびＴＷＴのうちの少なくとも一つとの組み合わせ、もしくは、コドンセットＨＷＴと、ＨＴＴ、ＹＫＧおよびＴＷＴのうちの少なくとも一つとの組み合わせ、によってコードされる、請求項１４に記載のライブラリー。
  16. それぞれがＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３を含んでなる重鎖可変ドメインをそれぞれ含む、異なるポリペプチド配列を複数含むライブラリーであって、
    （ａ）ＣＤＲＨ１は、アミノ酸位置２８、３０、３１、３２および３３の少なくとも１つ、２つ、３つ、４つまたはすべての位置に変異体アミノ酸を含み、
    （ｂ）ＣＤＲＨ２は、アミノ酸位置５０、５２、５３、５４、５６および５８の少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたはすべての位置に変異体アミノ酸を含み、
    （ｃ）ＣＤＲＨ３は、アミノ酸位置９５、９６、９７、９８、９９、１００、１００ａ、１００ｂ、１００ｃ、１０１および１０２の少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つまたはすべての位置に変異体アミノ酸を含み、
    前記アミノ酸位置は、カバットナンバリングシステムに対応し、（ａ）から（ｃ）の変異体アミノ酸のそれぞれは非ランダムコドンセットでコードされ、前記非ランダムコドンセットによってコードされるアミノ酸の少なくとも５０％から９０％、またはすべてが抗体可変ドメインにおけるそのアミノ酸位置の対象アミノ酸であり、（ｃ）の少なくとも１つの変異体アミノ酸は、コドンセットＮＮＫ、ＮＮＳ、ＤＶＫ、ＸＹＺまたはＮＶＴまたはその混合体によってコードされる、ライブラリー。
  17. 異なるポリペプチドがそれぞれ重鎖抗体可変ドメインおよび軽鎖抗体可変ドメインを含む、請求項１６に記載のライブラリー。
  18. 異なるポリペプチドがそれぞれウイルスコートタンパク質の少なくとも一部と融合している重鎖可変ドメインを含む、請求項１ないし１７の何れか一項に記載のライブラリー。
  19. 前記ウイルスコートタンパク質がタンパク質ｐＩＩＩ、主コートタンパク質ｐＶＩＩＩ、Ｓｏｃ、Ｈｏｃ、ｇｐＤ、ｐｖ１およびその変異体からなる群から選択される、請求項１８に記載のライブラリー。
  20. 前記重鎖可変ドメインとウイルスコートタンパク質との間に二量体化ドメインをさらに含む、請求項１８に記載のライブラリー。
  21. ペプチドタグと融合した軽鎖可変ドメインをさらに含む、請求項１ないし２０の何れか一項に記載のライブラリー。
  22. 前記ペプチドタグがｇＤ、ｃ−ｍｙｃ、ｐｏｌｙ−ｈｉｓ、蛍光タンパク質およびβ−ガラクトシダーゼからなる群から選択される、請求項２１に記載のライブラリー。
  23. 異なるポリペプチドがそれぞれ、さらに重鎖抗体可変ドメインのＣ末端領域と結合した二量体化ドメインを含む、請求項１ないし２２の何れかに記載のライブラリー。
  24. 前記二量体化ドメインがロイシンジッパードメインまたは少なくとも１つのシステイン残基を含む配列を含む、請求項２３に記載のライブラリー。
  25. 前記二量体化ドメインが抗体からのヒンジ領域およびロイシンジッパーを含む、請求項２４に記載のライブラリー。
  26. 前記二量体化ドメインが単一のシステインである、請求項２３に記載のライブラリー。
  27. それぞれの異なるポリペプチドからの重鎖可変ドメインが、さらに単一の抗体鋳型からのＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３またはＦＲ４を含む、請求項１ないし２６の何れかに記載のライブラリー。
  28. 各ＦＲが抗体４Ｄ５の配列（配列番号１）を有する、請求項２７に記載のライブラリー。
  29. 抗体４Ｄ５の重鎖のアミノ酸位置４９、９３、９４または９７の１つ、２つ、３つまたはすべての位置の重鎖ＦＲ残基が変更された、請求項２８に記載のライブラリー。
  30. 位置４９の重鎖ＦＲがアラニンまたはグリシンであり、位置９３ではアラニンまたはセリンであり、位置９４ではアルギニンまたはリジンまたはトレオニンであり、位置７１ではアルギニン、バリンまたはアラニンである、請求項２９に記載のライブラリー。
  31. それぞれの核酸が請求項１ないし３０の何れか一項に記載のライブラリーの異なるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子を含む、核酸のライブラリー。
  32. それぞれのベクターが、請求項３１に記載のライブラリーの核酸を含む、ベクターのライブラリー。
  33. それぞれのベクターが複製可能な発現ベクターである、請求項３２に記載のベクターのライブラリー。
  34. 前記複製可能な発現ベクターがＭ１３、ｆ１、ｆｄ、Ｐｆ３ファージもしくはその誘導体、またはラムドイドファージ、例えばラムダ、２１、ｐｈｉ８０、ｐｈｉ８１、８２、４２４、４３４など、もしくはその誘導体である、請求項３３に記載のベクターのライブラリー。
  35. それぞれのウィルスが、その表面に提示された請求項１ないし３０の何れか一項に記載のライブラリーの異なるポリペプチドを含む、ウィルスのライブラリー。
  36. 請求項１ないし３０の何れか一項に記載のライブラリーであって、少なくとも１×１０８の異なる重鎖可変ドメイン配列を有するライブラリー。
  37. 請求項３３または請求項３４に記載のベクターのライブラリーを含む、単離された宿主細胞。
  38. 複数のポリペチドを含むライブラリーを作製する方法であって、
    ａ）ＣＤＲＨ１またはＣＤＲＨ２またはその双方、およびＣＤＲＨ３、またはそれらの混合物の少なくとも１つの変異体ＣＤＲを含む複数のポリペプチドを作製するステップを含み、
    ｉ）変異体ＣＤＲＨ３を含む複数のポリペプチドは、下記アミノ酸配列の１つまたは複数のアミノ酸位置を置換することによって形成され、
    （Ｘ１）ｎ−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６、
    式中、Ｘ１は、ＮＮＫ、ＮＮＳ、ＤＶＫ、ＮＶＴ、ＸＹＺのコドンセットによってコードされるいずれかの天然アミノ酸、またはトリプトファンもしくはグリシンもしくはその混合物であり、ｎは４から１４であり、
    Ｘ２は、ＫＳＧ、ＤＶＫ、ＤＳＧ、ＮＶＴ、ＫＳＧ、ＮＮＳ、ＸＹＺ、ＮＮＫのコドンセットでコードされるいずれかの天然アミノ酸、またはチロシン、フェニルアラニン、セリン、アラニン、グリシン、ロイシンもしくはトリプトファンであり、
    Ｘ３は、Ｘ２がフェニルアラニンまたはロイシンのときは存在せず、あるいは存在する場合には、アラニン、バリン、アスパラギン酸またはグリシンであり、
    Ｘ４は、Ｘ２がフェニルアラニンまたはロイシンのときは存在せず、あるいは存在する場合はメチオニンであり、
    Ｘ５はアスパラギン酸、アラニン、バリンまたはグリシンであり、
    Ｘ６はチロシンまたはバリンであり、
    ｉｉ）少なくとも１つの溶媒に露出した非常に多様な位置に少なくとも１つの変異体アミノ酸を含む複数の変異体ＣＤＲＨ１またはＣＤＲＨ２またはその両方を形成するステップを含み、前記変異体アミノ酸は非ランダムコドンセットによってコードされ、前記非ランダムコドンセットによってコードされるアミノ酸の少なくとも７０％は既知の抗体可変ドメインにおけるその位置の対象アミノ酸である方法。
  39. さらに、
    ｉ）変異体ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２またはＣＤＲＬ３またはその混合物を含む複数のポリペプチドを生成するステップを含み、前記変異体ＣＤＲは溶媒に露出し非常に多様な位置の少なくとも１つの変異体アミノ酸で形成され、前記変異体アミノ酸は非ランダムコドンセットによってコードされ、前記非ランダムコドンセットによってコードされるアミノ酸の少なくとも７０％は既知の抗体可変ドメインにおけるその位置の対象アミノ酸である、請求項３８に記載の方法。
  40. 対象抗原に結合する抗原結合可変ドメインを選択する方法であって、
    ａ）請求項１ないし３０の何れかに記載の複数のポリペプチドのライブラリーを作製するステップと、
    ｂ）ライブラリーから対象抗原に結合するポリペプチド結合体を選択するステップと、
    ｃ）前記ポリペプチド結合体を非結合体から単離するステップと、
    ｅ）単離されたポリペプチド結合体から高親和性結合体を同定するステップとを含む方法。
  41. 抗体可変ドメインのライブラリーから対象抗原に結合する抗原結合可変ドメインを選択する方法であって、
    ａ）請求項１ないし３０の何れかに記載の抗体可変ドメインのライブラリーを対象抗原と接触させて結合体を形成するステップと、
    ｂ）前記結合体を非結合体から分離し、この結合体を前記対象抗原から溶出させ、この結合体を濃度を段階的に０．１ｎＭから１０００ｎＭまで下げた前記対象抗原の溶液でインキュベートするステップと、
    ｃ）最も低い濃度の前記対象抗原と結合することができ、０．１ｎＭから２００ｎＭの親和性を有する結合体を選択するステップとを含む方法。
  42. 前記対象抗原がＶＥＧＦ、ＩＧＦ−１またはＨｅｒ−２である、請求項４０または４１に記載の方法。
  43. 前記対象抗原の濃度が約１００から２５０ｎＭである、請求項４１に記載の方法。
  44. 前記対象抗原の濃度が約２５から１００ｎＭである、請求項４１に記載の方法。
  45. 前記混合物に過剰な量の非標識対象抗原を加え、標識された対象抗原から低親和性結合体を溶出させるのに十分な時間インキュベートするステップをさらに含む、請求項４０ないし４４の何れか一項に記載の方法。
  46. 前記ステップが２回繰り返され、対象の濃度が、第１回目の選択では１００ｎＭから２５０ｎＭであり、第２回目の選択では２５ｎＭから１００ｎＭであり、第３回目の選択では０．１ｎＭから２５ｎＭである、請求項４１ないし４５の何れか一項に記載の方法。
  47. 請求項１ないし３０の何れかに記載の複数のポリペプチドを含んでいるライブラリーをスクリーニングする方法であって、
    ａ）前記ポリペプチドと対象抗原との結合に適した条件下で、前記ライブラリーの第１の試料をある濃度の前記対象抗原とインキュベートするステップと、
    ｂ）前記ライブラリーの第２の試料を、対象抗原を加えないでインキュベートするステップと、
    ｃ）第１と第２の試料のそれぞれを、前記ポリペプチドと固定化された対象抗原との結合に適した条件下で、この固定化対象抗原と接触させるステップと、
    ｄ）各試料について、固定化された対象抗原に結合したポリペプチドを検出するステップと、
    ｅ）第１の試料の結合したポリペプチドの量と第２の試料の結合したポリペプチドの量の比率を計算することによって、前記対象抗原に対するポリペプチドの親和性を決定するステップとを含む方法。
  48. ａ）ＣＤＲＬ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｈ１、Ｈ２およびＨ３からなる群から選択されるソース抗体の少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたはすべてのＣＤＲを含むソース抗体の軽鎖可変ドメイン、重鎖可変ドメインまたはその両方をコードするポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを構築するステップと、
    ｂ）非ランダムコドンセットを用いて前記ソース抗体の少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたはすべてのＣＤＲを少なくとも１つの溶媒に露出する、非常に多様なアミノ酸位置で突然変異させるステップであって、前記非ランダムコドンセットによってコードされるアミノ酸の少なくとも５０％は天然抗体におけるその位置の対象アミノ酸であるステップ；および
    ｃ）アミノ酸配列：
    （Ｘ１）ｎ−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｄ−Ｘ５
    を含み、少なくとも１つのアミノ酸位置で突然変異されたＣＤＲＨ３に突然変異させるステップであって、
    該突然変異は、
    Ｘ１は、ＮＮＫ、ＮＮＳ、ＤＶＫ、ＮＶＴ、ＸＹＺのコドンセットによってコードされるいずれかの天然アミノ酸、またはトリプトファンもしくはグリシンもしくはその混合物であり、ｎは４から１４であり、
    Ｘ２は、ＫＳＧ、ＤＶＫ、ＤＳＧ、ＮＶＴ、ＫＳＧ、ＮＮＳ、ＸＹＺ、ＮＮＫのコドンセットでコードされるいずれかの天然アミノ酸、またはチロシン、フェニルアラニン、セリン、アラニン、グリシン、ロイシンもしくはトリプトファンであり、
    Ｘ３はＸ２がフェニルアラニンまたはロイシンのときは存在せず、あるいは存在する場合には、アラニン、バリン、アスパラギン酸またはグリシンであり、
    Ｘ４はＸ２がフェニルアラニンまたはロイシンのときは存在せず、あるいは存在する場合はメチオニンであり、
    Ｘ５はアスパラギン酸、アラニン、バリンまたはグリシンであり、
    Ｘ６はチロシンまたはバリンである
    からなる群から選択される、ステップを含む、方法。
  49. ＣＤＲＨ１を抗体４Ｄ５のアミノ酸２８、３０、３１、３２および３３に対応するアミノ酸位置で突然変異させ、ＣＤＲＨ２を抗体４Ｄ５のアミノ酸位置５０、５２、５３、５４、５６および５８に対応するアミノ酸位置で突然変異させる、請求項４８に記載の方法。
  50. Ｘ１が抗体４Ｄ５のアミノ酸位置９５に対応しｎが６であり、Ｘ２が抗体４Ｄ５のアミノ酸位置１００ａに対応し、Ｘ３が抗体４Ｄ５のアミノ酸位置１００ｂに対応し、Ｘ４が抗体４Ｄ５のアミノ酸位置１００ｃに対応し、Ｘ５が抗体４Ｄ５のアミノ酸位置１０２に対応する、請求項４９に記載の方法。
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