KR20150030755A - 항-바이오틴 항체 및 사용 방법 - Google Patents

항-바이오틴 항체 및 사용 방법 Download PDF

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기 조르쥬
미하엘 그로테
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에프. 호프만-라 로슈 아게
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Abstract

본 발명은 항-바이오틴 항체 및 그의 사용 방법을 제공한다.

Description

항-바이오틴 항체 및 사용 방법 {ANTI-BIOTIN ANTIBODIES AND METHODS OF USE}
본 발명은 항-바이오틴 항체 및 항-바이오틴 유도체 항체 및 그의 사용 방법에 관한 것이다.
합텐-결합 항체는 치료 및 진단 적용에 대한 포획 모듈로서 적용될 수 있다. 예를 들어, 합텐-결합된 부분, 예컨대 형광단, 킬레이트제, 펩티드, 핵산, 단백질, 지질, 나노입자, 및 다수의 기타 작용제가 합텐-결합 항체 및 항체 유도체와 반응할 수 있다. 이것은 이러한 '적재물 (payload)' 뿐 아니라, 포획, 원하는 위치에서의 축적, 가교결합 및 기타 항체-매개된 영향의 효과적인 검출을 가능하게 한다. 합텐의 특징 및 조성이 합텐-결합된 부분의 조성 및 "거동" (크기, 용해도, 활성, 생물물리학적 특성, PK, 생물학적 영향 등 포함) 에 영향을 줄 수 있으므로, 다양한 상이한 합텐-결합 부분을 개발하는 것이 매우 바람직하다. 그렇게 함으로써, 선택된 합텐과 제시된 적재물을 매치시켜 최적화된 합텐 컨쥬게이트를 생성하는 것이 가능하다. 이어서, 최적의 합텐-결합 부분은 상기 컨쥬게이트와 조합하여, 최적의 항체-합텐-적재물 복합체를 생성할 수 있다. 합텐-결합 부분, 예컨대 인간화된 항체 유도체를 갖는 것이 추가로 바람직하다. 이것은 치료 적용에서 면역원성과 같은 간섭의 유의하게 감소된 위험을 갖는 적용을 가능하게 한다.
WO 00/50088 에서, 바이오틴결합-케모카인 항체 복합체가 보고되었다.
Kohen, F. 등의 문헌에서는 항-바이오틴 항체의 제조 및 특성을 보고하고 있다 (Methods Enzymol. 279 (1997) 451-463). 모노클로날 항-바이오틴 항체가 바이오틴의 인식에 있어서 친화성을 조정한다는 점이 Bagci, H. 등의 문헌 (FEBS Lett. 322 (1993) 47-50) 에 보고되어 있다. Cao, Y. 등의 문헌에서는, 바이오틴결합 거대분자 검출을 위한 범용 면역프로브로서의 이중특이적 모노클로날 항체의 개발을 보고한다 (J. Immunol. Meth. 220 (1998) 85-91).
WO 01/34651 에서, 항체 결합 비-자연발생 거울상이성질체 (L-Biotin) 및 표적제로서의 그의 용도가 보고된 바 있다.
Dakshinamurti 등의 문헌에서는, 바이오틴에 대한 모노클로날 항체의 제조 및 특징분석을 보고하고 있다 (Biochem. J. 237 (1986) 477-482). A comparison of the binding of biotin and 바이오틴 및 바이오틴결합 거대분자 리간드의 항-바이오틴 모노클로날 항체 및 스트렙타비딘에 대한 결합의 비교가 Vincent, P. 등의 문헌 (J. Immunol. Meth. 165 (1993) 177-182) 에 보고되어 있다. Berger, M. 등의 문헌 (Biochem. 14 (1975) 2338-2342) 은 바이오틴에 결합하고, 바이오틴 포함 효소를 억제하는 항체의 제조를 보고한다.
개요
본 발명은 항-바이오틴 항체 및 항-바이오틴-유도체 항체 및 그의 사용 방법을 제공한다.
본원에 보고된 하나의 양상은 항체가 (a) SEQ ID NO: 11 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, (b) SEQ ID NO: 15 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3, 및 (c) SEQ ID NO: 10 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2 를 포함하는 인간화된 항-바이오틴 항체이다. 이 항체는 바이오틴에 특이적으로 결합한다.
하나의 구현예에서 항체는 (a) SEQ ID NO: 09 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) SEQ ID NO: 10 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (c) SEQ ID NO: 11 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3 을 추가로 포함한다.
하나의 구현예에서 항체는 (a) SEQ ID NO: 13 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) SEQ ID NO: 14 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) SEQ ID NO: 15 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3 을 추가로 포함한다.
하나의 구현예에서, 항체는 Kabat 에 따라 번호매겨진 중쇄 가변 도메인의 위치 24 에서 아미노산 잔기 세린을 포함하고/하거나 Kabat 에 따라 번호매겨진 중쇄 가변 도메인의 위치 73 에 아미노산 잔기 트레오닌을 포함한다.
한 구현예에서, 항체는 Kabat 에 따라 번호매겨진 위치 60 에 아미노산 잔기 알라닌을, 그리고 Kabat 에 따라 번호매겨진 위치 61 에 아미노산 잔기 글루타민을 포함한다.
한 구현예에서, 항체는 (1) Kabat 에 따라 번호매겨진 중쇄 가변 도메인의 위치 24 에 아미노산 잔기 세린을 포함하고/하거나 Kabat 에 따라 번호매겨진 중괘 가변 도메인의 아미노산 위치 73 에 아미노산 잔기 트레오닌을 포함하고, (2) Kabat 에 따라 번호매겨진 중쇄 가변 도메인의 위치 60 에 아미노산 잔기 알라닌을 포함하고, (3) Kabat 에 따라 번호매겨진 중쇄 가변 도메인의 위치 61 에 아미노산 잔기 글루타민을 포함한다.
한 구현예에서, 항체는 (a) SEQ ID NO: 12 의 아미노산 서열과 95% 이상 서열 일치도를 지닌 VH 서열; (b) SEQ ID NO: 16 의 아미노산 서열과 95% 이상 서열 일치도를 지닌 VL 서열; 또는 (c) (a) 에서와 같은 VH 및 (b) 에서와 같은 VL 을 포함하는데, 여기서 Kabat 에 따라 번호매겨진 중쇄 가변 도메인의 위치 24 의 아미노산 잔기가 세린이고/이거나 Kabat 에 따라 번호매겨진 중쇄 가변 도메인의 아미노산 위치 73 의 아미노산이 트레오닌이고, Kabat 에 따라 번호매겨진 중쇄 가변 도메인의 아미노산 위치 61 의 아미노산이 글루타민이다.
한 구현예에서, 항체는 SEQ ID NO: 12 의 VH 서열을 포함한다.
힌 구현예에서, 항체는 SEQ ID NO: 16 의 VL 서열을 포함한다.
본원에 보고된 한 양상은 SEQ ID NO: 12 의 VH 서열 및 SEQ ID NO: 16 의 VL 서열을 포함하는 항체이다.
한 구현예에서, 항체는 전장 IgG1 항체 또는 전장 IgG4 항체이다.
한 구현예에서, 항체는 모노클로날 항체이다.
한 구현예에서, 항체는 바이오틴에 결합하는 항체 단편이다.
본원에 보고된 한 양상은 본원에 보고된 항체 및 약제학적으로 허용되는 담체를 함유하는 약제학적 제형물이다.
본원에 보고된 한 양상은 의약으로서 사용하기 위한 본원에 보고된 항체이다.
본원에 보고된 한 양상은 의약 제조에서의 본원에 보고된 항체의 용도이다.
도면의 설명
도 1 공유성 적재물 커플링에 대한 cys 돌연변이 존재 및 부재 하에 바이오틴 및 바이오틴 유도체에 결합하는 인간화된 항체의 발현: 환원 및 비환원 SDS PAGE 는 단백질 A 및 SEC 를 이용한 정제 후 인간화된 항체의 조성 및 동종성을 보여준다. 항체 H-사슬 (50k 에서의 상단 밴드) 및 L-사슬 (25k 에서의 하단 밴드) 는 가시적인 양의 추가적 단백질 오염물 부재 하의 두 항체 유도체의 SEC 정제 분획에서 고유의 밴드로서 검출가능하다.
도 2 쥐과동물 항-바이오틴 항체-Fab-단편의 단백질 구조를 바이오틴아미드와의 복합체에서 결정했다: 복합체형성된 합텐은 아미노산의 음으로 하전된 클러스터에 근접한 곳에 위치되어 있으며; 합텐으로서 그의 카르복실기에서 적재물 커플링에 대해 유도체화되어 있는 바이오틴이 (COOH 기의 결핍으로 인해) 그 위치에 전하를 지니지 않은 것과 같은 우수한 효능을 갖고 결합하나; 대조적으로, 유리된 (정상적인) 바이오틴은 그의 카르복실기가 상기 음 전하 클러스터에 가까이 위치하게 되어 반발하게 되기 때문에 항체에 효율적으로 결합할 수 없다.
본 발명의 구현예의 상세한 설명
I. 정의
본원의 목적을 위해 "수용자 인간 골격" 은 하기 정의되는 바와 같이, 인간 면역글로불린 골격 또는 인간 컨센서스 골격 유래의, 경쇄 가변 도메인 (VL) 골격 또는 중쇄 가변 도메인 (VH) 골격의 아미노산 서열을 포함하는 골격이다. 인간 면역글로불린 골격 또는 인간 컨센서스 골격 "유래의" 수용자 인간 골격은 이의 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있거나, 또는 이것은 아미노산 서열 변화를 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 아미노산 변화 수는 10 이하, 9 이하, 8 이하, 7 이하, 6 이하, 5 이하, 4 이하, 3 이하, 또는 2 이하이다. 일부 구현예에서, VL 수용자 인간 골격은 VL 인간 면역글로불린 골격 서열 또는 인간 컨센서스 골격 서열과 서열이 일치한다.
"친화성" 은 분자의 단일 결합 부위 (예를 들어, 항체) 와 그의 결합 파트너 (예를 들어, 항원) 사이에 비-공유 상호작용의 총 합의 강도를 나타낸다. 다르게 표시되지 않는다면, 본원에 사용되는, "결합 친화성" 은 결합 쌍의 일원 사이의 (예를 들어, 항체 및 항원) 1:1 상호작용을 반영하는 고유의 결합 친화성을 나타낸다. 분자 X 의 이의 파트너 Y 에 대한 친화성은 일반적으로 해리 상수 (Kd) 에 의해 나타내질 수 있다. 친화성은 본원에 기재된 것을 비롯하여 당업계에 공지된 통상의 방법에 의해 측정될 수 있다. 결합 친화성을 측정하기 위한 구체적인 설명 및 예시적인 구현예는 하기에 기재된다.
"친화성 성숙된" 항체는 변형을 가지지 않은 부모 항체에 비해, 하나 이상의 과가변 영역 (HVR) 내에 하나 이상의 변형을 가진 항체로서, 이러한 변형이 항체의 항원에 대한 친화성의 개선을 가져오는 것을 말한다.
용어, "항-바이오틴 항체" 및 "바이오틴에 결합하는 항체" 는 항체가 표적 바이오틴에서 진단 및/또는 치료제로서 유용하게 되도록 충분한 친화성을 갖고 바이오틴에 결합할 수 있는 항체를 지칭한다. 한 구현예에서, 미-관련된, 비-바이오틴 단백질에 대한 항-바이오틴 항체의 결합 범위는 예를 들어, 방사선면역검정 (RIA) 에 의해 측정되는 바이오틴에 대한 항체의 결합의 약 10% 미만이다. 특정 구현예에서, 바이오틴에 결합하는 항체는 ≤ 1 μM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, ≤ 0.1 nM, ≤ 0.01 nM, 또는 ≤ 0.001 nM (예를 들어, 10-8 M 이하, 예를 들어, 10-8 M 내지 10-13 M, 예를 들어, 10-9 M 내지 10-13 M) 의 해리 상수 (Kd) 를 갖는다.
본원의 용어 "항체" 는 가장 넓은 의미로 사용되고, 이들이 원하는 항원-결합 활성을 나타내는 한, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 다중특이적 항체 (예를 들어, 이중특이적 항체), 및 항체 단편을 포함하나 이에 제한되지 않는 다양한 항체 구조를 포함한다.
"항체 단편" 은 온전한 항체가 결합하는 항원에 결합하는 온전한 항체의 부분을 포함하는 온전한 항체 이외의 분자를 의미한다. 항체 단편의 예는 Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; 다이아바디; 선형 항체; 단일-사슬 항체 분자 (예를 들어, scFv); 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함하나 그에 제한되지 않는다.
참조 항체로서 "동일한 에피토프에 결합하는 항체" 는 참조 항체의 이의 항원에 대한 결합을 경쟁 검정에서 50% 이상 차단시키는 항체를 말하고, 역으로, 참조 항체는 항체의 이의 항원에 대한 결합을 경쟁 검정에서 50% 이상 차단시킨다. 예시적인 경쟁 검정이 본원에 제공된다.
용어 "키메라성" 항체는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부분은 특정 공급원 또는 종으로부터 유래되는 반면, 중쇄 및/또는 경쇄의 나머지는 상이한 공급원 또는 종으로부터 유래되는 항체를 말한다.
항체의 "클래스" 는 그것의 중쇄에 의해 보유되는 불변 도메인 또는 불변 영역의 유형을 의미한다. 인간에서는 항체의 5 가지 주요 클래스: IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM 가 존재하고, 이들 중 여럿은 서브클래스 (동형), 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, 및 IgA2 로 추가로 분류될 수 있다. 상이한 클래스의 면역글로불린에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 α, δ, ε, γ, 및 μ 로 호칭된다.
본원에 사용되는 용어 "세포독성제" 는 세포 기능을 억제 또는 방지하거나 및/또는 세포 사멸 또는 파괴를 야기하는 성분을 말한다. 세포독성제에는 방사능 동위원소 (예를 들어, At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 및 Lu 의 방사능 동위원소); 화학치료제 또는 약물 (예를 들어, 메토트렉세이트, 아드리아미신, 빈카 알칼로이드 (빈크리스틴, 빈블라스틴, 에토포시드), 독소로비신, 멜팔란, 미토마이신 C, 클로르암부실, 다우노루비신 또는 기타 삽입제); 성장 억제제; 효소 및 이의 단편, 예컨대 핵산분해 효소; 항생제; 박테리아, 진균, 식물 또는 동물 기원의 독소, 예컨대 소 분자 독소 또는 효소적으로 활성인 독소 (이의 단편 및/또는 변이체 포함); 및 하기 기재되는 다양한 항종양제 또는 항암제가 포함된다.
"효과기 기능" 은 항체의 Fc-영역에 기인하는 생물학적 활성이며, 항체 클래스에 따라 다르다. 항체 효과기 기능의 예는 하기를 포함한다: C1q 결합 및 보체 의존적 세포독성 (CDC); Fc 수용체 결합; 항체-의존적 세포-매개되는 세포독성 (ADCC); 식세포작용 (ADCP); 세포 표면 수용체 (예를 들어, B-세포 수용체) 의 하향조절; 및 B-세포 활성화.
작용제, 예를 들어, 약학적 제형의 "유효량" 은 원하는 치료 또는 예방 결과를 달성하기 위한, 필요한 용량 및 시간 기간 동안의 유효량을 말한다.
본원에서의 용어 "Fc-영역" 은 불변 영역의 적어도 일부를 함유하는 면역글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 정의하는데 사용된다. 상기 용어에는 고유의 서열 Fc-영역 및 변이체 Fc-영역이 포함된다. 하나의 구현예에서, 인간 IgG 중쇄 Fc-영역은 Cys226 으로부터, 또는 Pro230 으로부터, 중쇄의 카르복실-말단까지 연장된다. 그러나, Fc-영역의 C-말단 라이신 (Lys447) 은 존재할 수도 존재하지 않을 수도 있다. 본원에 다르게 구체화되지 않는 경우, Fc-영역 또는 불변 영역 내의 아미노산 잔기의 번호지정은 Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91-3242 에 기재된 바와 같은, EU 번호지정 시스템 (또한 EU 인덱스로 불림) 에 따른다.
"골격 영역" 또는 "FR" 은 과가변 영역 (HVR) 잔기 이외의 가변 도메인 잔기를 말한다. 가변 도메인의 FR 은 일반적으로 4 개의 FR 도메인: FR1, FR2, FR3, 및 FR4 로 이루어진다. 따라서, HVR 및 FR 서열은 일반적으로 VH (또는 VL) 내의 하기 서열: FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4 에 나타난다.
용어 "전장 항체", "온전한 항체", 및 "전체 항체" 는 고유의 항체 구조와 실질적으로 유사한 구조를 갖거나 또는 본원에 기재된 바와 같은 Fc-영역을 함유하는 중쇄를 갖는 항체를 말하는 것으로 본원에서 상호교환적으로 사용된다.
용어 "숙주 세포", "숙주 세포주", 및 "숙주 세포 배양물" 은 상호교환적으로 사용되고, 외생 핵산이 도입되는 세포를 말한다 (이러한 세포의 자손을 포함함). 숙주 세포에는 "형질전환체" 및 "형질전환된 세포" 가 포함되며, 여기에는 일차 형질전환된 세포 및 계대 횟수와 관계 없이 이로부터 유래된 자손이 포함된다. 자손은 부모 세포와 핵산 함량이 완전히 일치하지는 않으나, 돌연변이를 함유할 수 있다. 본래 형질전환된 세포에서 스크리닝되거나 이에 대해 선별된 것과 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 돌연변이 자손이 여기에 포함된다.
"인간 항체" 는 인간 항체 레퍼토리 (repertoires) 또는 기타 인간 항체-인코딩 서열을 이용하여 인간 또는 인간 세포에 의해 생성된 또는 비-인간 공급원으로부터 유래된 항체에 상응하는 아미노산 서열을 갖는 것이다. 인간 항체의 상기 정의에는 구체적으로는 비-인간 항원-결합 잔기를 포함하는 인간화된 항체는 배제된다.
"인간 컨센서스 골격" 은 인간 면역글로불린 VL 또는 VH 골격 서열의 선별 시 가장 흔히 발생하는 아미노산 잔기를 나타내는 골격이다. 일반적으로, 인간 면역글로불린 VL 또는 VH 서열의 선택은 가변 도메인 서열의 서브그룹으로부터이다. 일반적으로, 서열의 서브그룹은 문헌 [Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Bethesda MD (1991), NIH Publication 91-3242, Vols. 1-3] 에서와 같은 서브그룹이다. 하나의 구현예에서, VL 의 경우, 서브그룹은 [Kabat et al., supra] 에서와 같은 서브그룹 카파 I 이다. 하나의 구현예에서, VH 의 경우, 서브그룹은 [Kabat et al., supra] 에서와 같은 서브그룹 III 이다.
"인간화된" 항체는 비-인간 HVR 로부터의 아미노산 잔기 및 인간 FR 로부터의 아미노산 잔기를 포함하는 키메라성 항체를 말한다. 특정 구현예에서, 인간화된 항체는 하나 이상의, 전형적으로 2 개의 가변 도메인의 실질적으로 모두를 포함할 것이고, HVR (예를 들어, CDR) 의 모두 또는 실질적으로 모두는 비-인간 항체의 것에 상응하며, FR 의 모두 또는 실질적으로 모두는 인간 항체의 것에 상응한다. 인간화된 항체는 임의로 인간 항체로부터 유래된 항체 불변 영역의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 항체, 예를 들어, 비-인간 항체의 "인간화된 형태" 는 인간화를 겪은 항체를 말한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "과가변 영역" 또는 "HVR" 은 서열 내에서 및/또는 구조적으로 정의된 루프 ("과가변 루프") 로부터 과가변성인 항체 가변 도메인의 각각의 영역을 말한다. 일반적으로, 고유의 4-사슬 항체는 6 개의 HVR; VH 내에 3 개 (H1, H2, H3), 및 VL 내에 3 개 (L1, L2, L3) 를 포함한다. HVR 은 일반적으로 과가변 루프로부터 및/또는 "상보성 결정 영역" (CDR) 으로부터 아미노산 잔기를 포함하며, 상보성 결정 영역은 가장 높은 서열 가변성의 것이고/거나 항원 인지에 관여된다. 예시적인 과가변 루프는 아미노산 잔기 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (H1), 53-55 (H2), 및 96-101 (H3) 에서 발생한다. (Chothia, C. and Lesk, A.M., J. Mol. Biol. 196 (1987) 901-917) 예시적인 CDR (CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3) 은 아미노산 잔기 L1 의 24-34, L2 의 50-56, L3 의 89-97, H1 의 31-35B, H2 의 50-65, 및 H3 의 95-102 에서 발생한다. 참고문헌 (Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91-3242.) VH 내의 CDR1 을 제외하고는, CDR 은 일반적으로 과가변 루프를 형성하는 아미노산 잔기를 포함한다. CDR 은 또한 "특이성 결정 잔기," 또는 "SDR," 을 포함하고, 이것은 항원에 접촉하는 잔기이다. SDR 은 축약된-CDR (abbreviated-CDR), 또는 a-CDR 로 불리는 CDR 의 영역 내에 함유된다. 예시적인 a-CDR (a-CDR-L1, a-CDR-L2, a-CDR-L3, a-CDR-H1, a-CDR-H2, 및 a-CDR-H3) 은 아미노산 잔기 L1 의 31-34, L2 의 50-55, L3 의 89-96, H1 의 31-35B, H2 의 50-58, 및 H3 의 95-102 에서 발생한다. (Almagro, J.C. and Fransson, J., Front. Biosci. 13 (2008) 1619-1633 참조). 다르게 표시되지 않는 경우, 가변 도메인 내의 HVR 잔기 및 기타 잔기 (예를 들어, FR 잔기) 는 본원에서 Kabat 등의 상기 문헌에 따라 번호지정된다.
"면역컨쥬게이트" 는 세포독성제를 포함하나 이에 제한되지 않는 하나 이상의 이종 분자(들) 에 컨쥬게이트된 항체이나, 이에 제한되는 것은 아니다.
용어 "개체" 또는 "대상" 은 포유류를 의미한다. 포유류에는 가축 (예를 들어, 소, 양, 고양이, 개 및 말), 영장류 (예를 들어, 인간 및 비-인간 영장류, 예컨대 원숭이), 토끼 및 설치류 (예를 들어, 마우스 및 랫트) 가 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다. 특정 구현예에서, 개체 또는 대상은 인간이다.
"단리된" 항체는 이의 자연적인 환경 구성요소로부터 분리된 것이다. 일부 구현예에서, 항체는 예를 들어, 전기영동 (예를 들어, SDS-PAGE, 등전위 초점 (IEF), 모세관 전기영동) 또는 크로마토그래피 (예를 들어, 이온 교환 또는 역상 HPLC) 에 의해 측정되는 바와 같이, 95% 또는 99% 순도 초과로 정제된다. 항체 순도의 측정 방법의 리뷰를 위해서는, 예를 들어, [Flatman, S. et al., J. Chrom. B 848 (2007) 79-87] 을 참조한다.
"단리된" 핵산은 이의 자연적인 환경의 성분으로부터 분리된 핵산 분자를 말한다. 단리된 핵산에는 핵산 분자를 본래 함유하나, 핵산 분자가 염색체외부에 또는 그의 자연적인 염색체 위치와 상이한 염색체 위치에 존재하는 세포 내에 함유된 핵산 분자가 포함된다.
"항-바이오틴 항체를 인코딩하는 단리된 핵산" 은 단일 벡터 또는 개별 벡터 내의 이러한 핵산 분자(들) 을 비롯해, 항체 중쇄 및 경쇄 (또는 이의 단편) 를 인코딩하는 하나 이상의 핵산 분자를 말하며, 이러한 핵산 분자(들) 은 숙주 세포 내의 하나 이상의 위치에 존재한다.
본원에 사용되는 바와 같은 용어 "모노클로날 항체" 는 실질적으로 동종의 항체 집단으로부터 수득되는 항체, 즉, 개별 항체를 포함하는 집단이 동일하고 및/또는, 예를 들어, 자연 발생적 돌연변이를 함유하거나 모노클로날 항체 제제의 제조 동안 발생하는, 가능한 변이체 항체를 제외하고는 (이러한 변이체는 일반적으로 소량으로 존재함), 동일한 에피토프에 결합하는 항체를 말한다. 상이한 결정소 (에피토프) 에 대항하는 상이한 항체를 전형적으로 포함하는 폴리클로날 항체 제제와 반대로, 모노클로날 항체 제제의 각각의 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정소에 대항하는 것이다. 따라서, 수식어 "모노클로날" 은 항체의 실질적으로 동종의 집단으로부터 수득되는 항체의 특성을 나타내고, 임의의 특정 방법에 의한 항체의 제조를 필요로 하는 것으로 이해되지 않는다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용하고자 하는 모노클로날 항체는 하이브리도마 방법, 재조합 DNA 방법, 파지-디스플레이 방법, 및 인간 면역글로불린 유전자좌의 전부 또는 일부를 함유하는 형질전환 동물을 이용하는 방법 (모노클로날 항체를 제조하기 위한 이러한 방법 및 기타 예시적인 방법은 본원에 기재되어 있음) 을 포함하나 이에 제한되지 않는 다양한 기법에 의해 제조될 수 있다.
"노출된 항체" 는 이종 부분 (예를 들어, 세포독성 부분) 또는 방사능라벨에 컨쥬게이트되지 않은 항체를 말한다. 노출된 항체는 약학적 제형에 존재할 수 있다.
"고유의 항체" 는 다양한 구조를 가진 자연 발생적인 면역글로불린 분자를 말한다. 예를 들어, 고유의 IgG 항체는 디술파이드-결합된 2 개의 일치하는 경쇄 및 2 개의 일치하는 중쇄로 구성되는, 약 150,000 달톤의 이종사량체 당단백질이다. N- 에서 C-말단까지, 각각의 중쇄는 가변 중쇄 도메인 또는 중쇄 가변 도메인으로도 불리는 가변 영역 (VH) 에 이어서, 3 개의 불변 도메인 (CH1, CH2, 및 CH3) 을 갖는다. 유사하게는, N- 에서 C-말단까지, 각각의 경쇄는 가변 경쇄 도메인 또는 경쇄 가변 도메인으로도 불리는 가변 영역 (VL) 에 이어서, 불변 경질 (CL) 도메인을 갖는다. 항체의 경쇄는 이의 불변 도메인의 아미노산 서열에 근거하여 카파 (κ) 및 람다 (λ) 라고 불리는 2 개의 유형 중 하나에 할당될 수 있다.
용어 "패키지 삽입물" 은 이러한 치료 제품의 사용과 연관된 표시, 용법, 투여량, 투여, 조합 요법, 사용금지사유 및/또는 주의사항에 관한 정보를 담고 있는 치료 제품의 시판 패키지가 관례상 포함된 지침을 언급하기 위해 사용된다.
기준 폴리펩티드 서열에 대한 "퍼센트 (%) 아미노산 서열 일치성" 은 서열을 정렬하고, 갭을 도입하여 (필요한 경우) 최대 퍼센트 서열 일치성을 획득하고, 임의의 보존적 치환을 서열 일치성의 일부로서 간주하지 않은 후의 기준 폴리펩티드 서열 내의 아미노산 잔기와 일치하는 후보 서열 내의 아미노산 잔기의 백분율로서 정의된다. 퍼센트 아미노산 서열 일치성을 결정하기 위한 목적의 정렬은 당해 기술분야의 통상의 기술에 속하는 다양한 방식으로, 예를 들어, 공개적으로 입수가능한 컴퓨터 소프트웨어, 예컨대 BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 Megalign (DNASTAR) 소프트웨어를 사용하여 달성될 수 있다. 당해 기술분야의 통상의 기술자는 비교되는 서열의 전체 길이에 걸쳐 최대 정렬을 획득하는데 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여, 서열 정렬에 적당한 파라미터를 결정할 수 있다. 본원에서의 목적을 위해, 그러나, % 아미노산 서열 동일성 값은 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2 를 사용하여 생성된다. ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은 저작자가 Genentech, Inc. 이고, 소스 코드는 사용자 문서와 함께 미국 저작권청 (U.S. Copyright Office, Washington D.C., 20559) 에 제출되었고, 미국 저작권 등록 번호 TXU510087 로 등록되어 있다. ALIGN-2 프로그램은 Genentech, Inc., South San Francisco, California 로부터 공개적으로 입수가능하고, 또는 소스 코드로부터 컴파일될 수 있다. ALIGN-2 프로그램은 디지탈 UNIX V4.0D 를 포함하는, UNIX 운영 체제에서 사용하기 위해 컴파일되어야 한다. 모든 서열 비교 파라미터는 ALIGN-2 프로그램에 의해 설정되고, 다르지 않다.
ALIGN-2 가 아미노산 서열 비교에 이용되는 상황에서, 주어진 아미노산 서열 B 와의, 또는 그에 대한 주어진 아미노산 서열 A 의 % 아미노산 서열 일치성 (이는 대안적으로 주어진 아미노산 서열 B 와의, 또는 그에 대한 특정 % 아미노산 서열 일치성을 갖는 또는 포함하는 주어진 아미노산 서열 A 로서 표현될 수 있음) 은 다음과 같이 계산된다:
100 곱하기 분수 X/Y
여기서, X 는 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2 에 의해 그 프로그램의 A 및 B 의 정렬에서 동일한 매치 (match) 로서 채점된 아미노산 잔기의 개수이고, Y 는 B 내의 아미노산 잔기의 총수임. 아미노산 서열 A 의 길이가 아미노산 서열 B 의 길이와 동일하지 않은 경우에, B 에 대한 A 의 % 아미노산 서열 일치성은 A 에 대한 B 의 % 아미노산 서열 일치성과 동일하지 않다고 이해될 것이다. 구체적으로 다르게 언급되지 않으면, 본원에서 사용되는 모든 % 아미노산 서열 동일성 값은 바로 직전 단락에서 기재된 바와 같이 ALIGN-2 컴퓨터 프로그램을 사용하여 수득된다.
용어 "약학적 제형" 은 내부에 함유된 유효 성분의 생물학적 활성이 유요하도록 허용되는 형태이고, 제형을 투여할 대상에 대해 허용가능하지 않게 독성인 부가적인 성분을 함유하지 않는 제제를 말한다.
"약학적으로 허용가능한 담체" 는 대상에게 무독성인, 유효 성분 이외의, 약학적 제형 내의 성분을 의미한다. 약학적으로 허용가능한 담체는 완충액, 부형제, 안정화제, 또는 보존제를 포함하나, 그에 제한되지 않는다.
본원에 사용되는 바와 같은 용어 "바이오틴" 은 5-[(3aS,4S,6aS)-2-옥소헥사히드로-1H-티에노[3,4-d]이미다졸-4-일]펜탄산을 가리킨다. 바이오틴은 또한 비타민 H 또는 코엔자임 R 로도 공지되어 있다.
본원에 사용되는 바와 같은, "치료" (및 이의 문법적 변형, 예컨대 "치료하다" 또는 "치료하기") 는 치료하고자 하는 개체의 자연적 경과를 변형하기 위한 시도의 임상적 개입을 말하고, 예방을 위해 또는 임상 병리학 과정 동안 수행될 수 있다. 원하는 치료 효과에는 질환의 발생 또는 재발 방지, 증상의 경감, 질환의 임의의 직접적 또는 간접적 병리학적 결과의 소실, 전이 방지, 질환 진행 속도의 감소, 질환 상태의 개선 또는 완화, 및 차도 또는 개선된 예후가 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다. 일부 구현예에서, 본 발명의 항체는 질환의 발생을 지연시키거나 질환의 진행을 서행시키기 위해 사용된다.
용어 "가변 영역" 또는 "가변 도메인" 은 항원에 대한 항체의 결합에 관여하는 항체 중쇄 또는 경쇄의 도메인을 말한다. 고유의 항체의 중쇄 및 경쇄 (VH 및 VL, 각각) 의 가변 도메인은 일반적으로 유사한 구조를 가지며, 각각의 도메인은 4 개의 보존된 골격 영역 (FR) 및 3 개의 과가변 영역 (HVR) 을 포함한다 (예를 들어, Kindt, T.J. et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., N.Y. (2007), 페이지 91 참조). 단일 VH 또는 VL 도메인은 항원-결합 특이성을 부여하기에 충분할 수 있다. 게다가, 특정 항원에 결합하는 항체는 상보적 VL 또는 VH 도메인, 각각의 라이브러리를 스크리닝하기 위해 항원에 결합하는 항체로부터의 VH 또는 VL 도메인을 사용하여 단리될 수 있다. 예를 들어, Portolano, S. et al., J. Immunol. 150 (1993) 880-887; Clackson, T. et al., Nature 352 (1991) 624-628) 를 참조한다.
본원에서 사용되는 용어 "벡터" 는 이것이 연결된 또다른 핵산을 증식시킬 수 있는 핵산 분자를 말한다. 상기 용어에는 자가-복제 핵산 구조로서의 벡터 뿐 아니라 내부에 도입된 숙주 세포의 게놈 내에 도입된 벡터가 포함된다. 특정 벡터는 이들이 작동적으로 연결되어 있는 핵산의 발현을 지정할 수 있다. 이러한 벡터는 본원에서 "발현 벡터" 로서 언급된다.
용어 "합텐" 은 큰 운반체, 예컨대 단백질에 부착되는 경우에만 면역 반응을 도출할 수 있는 작은 분자를 표시한다. 예시적인 합텐은 아닐린, o-, m-, 및 p-아미노벤조산, 퀴논, 히드랄라진, 할로탄, 플루오레세인, 바이오틴, 디곡시게닌, 테오필린 및 디니트로페놀이다. 하나의 구현예에서, 합텐은 비오틴 또는 디곡시게닌 또는 테오필린 또는 카르보란이다.
용어 "~ 에 컨쥬게이트된 합텐" 또는 "합테닐화 화합물" 은 폴리펩티드 또는 라벨과 같은 추가의 부분에 공유 연결된 합텐을 나타낸다. 활성화된 합텐 유도체는 종종 그러한 컨쥬게이트의 형성을 위한 출발 재료로서 사용된다. 하나의 구현예에서, 합텐은 디곡시게닌이고, 이것은 링커를 통해 부분에 (하나의 구현예에서는 이의 3-히드록시 기를 통해) 컨쥬게이트된다. 하나의 구현예에서, 링커는 a) 하나 이상의 (하나의 구현예에서는 3 개 내지 6 개의) 메틸렌-카르복시-메틸 기 (-CH2-C(O)-), 및/또는 b) 1 내지 10 개의 (하나의 구현예에서는 1 내지 5 개의) 아미노산 잔기 (하나의 구현예에서는 글라이신, 세린, 글루타메이트, β-알라닌, γ-아미노부티르산, ε-아미노카프로산 또는 라이신으로부터 선택된), 및/또는 c) 하나 이상의 (하나의 구현예에서는 1 또는 2 개의) 구조 화학식 NH2-[(CH2)nO]xCH2-CH2-COOH (식 중, n 은 2 또는 3 이고, x 는 1 내지 10, 하나의 구현예에서는 1 내지 7 임) 를 갖는 화합물을 포함한다. 상기 마지막 요소는 (적어도 부분적으로) 화학식 -NH-[(CH2)nO]xCH2-CH2-C(O)- 의 링커 (부분) 을 야기한다. 이러한 화합물의 하나의 예는 예를 들어, 12-아미노-4,7,10-트리옥사도데칸산 (TEG (트리에틸렌글리콜) 링커를 야기함) 이다. 하나의 구현예에서, 링커는 말레이미도 기를 추가로 포함한다. 링커는 이것이 전하를 함유하고 및/또는 수소 가교를 형성할 수 있으므로 안정화 및 가용화 효과를 갖는다. 또한 이것은 항-합텐 항체의 합텐-컨쥬게이트된 폴리펩티드에 대한 결합을 입체적으로 용이하게 할 수 있다. 하나의 구현예에서, 링커는 폴리펩티드의 아미노산의 측쇄에 위치한다 (예를 들어, 아미노 또는 티올 기를 통해 라이신 또는 시스테인 측쇄에 컨쥬게이트된다). 하나의 구현예에서, 링커는 폴리펩티드의 아미노 말단 또는 카르복시 말단에 위치한다. 폴리펩티드 상의 링커의 위치는 전형적으로 폴리펩티드의 생물학적 활성이 영향을 받지 않는 영역에서 선택된다. 따라서, 링커의 부착 위치는 생물학적 활성을 담당하고 있는 폴리펩티드의 특성 및 관련 구조 요소에 따라 다르다. 합텐이 부착된 폴리펩티드의 생물학적 활성은 시험관 내 검정에서 시험될 수 있다.
용어 "공유성 복합체 형성" 은 예를 들어, 항-바이오틴 항체와 테오필린 사이의 비-공유성 복합체의 형성 후, 공유 결합이 복합체 내의 2 개의 파트너 사이에 형성되는 것을 나타낸다. 공유 결합의 형성은 추가의 반응물을 첨가힐 필요 없이 일어난다.
II. 조성물 및 방법
하나의 양상에서, 본 발명은 바이오틴에 결합하는 항체에 기반한다. 상기 항체는 본원에서 제공된다. 본 발명의 항체는 항체의 범용 적재 특성으로서 바이오틴화 화합물에 대한 결합 특이성을 사용함으로써 예를 들어, 바이오틴화된 화합물의 결합을 위한 모노특이적 항체로서 및 모든 종류의 질환의 진단 또는 치료를 위한 다중특이적 항체로서 유용하다.
A. 예시적 항-바이오틴 항체
하나의 양상에서, 본 발명은 바이오틴에 결합하는 단리된 항체를 제공한다. 특정 구현예에서, 항-바이오틴 항체는 인간화된 항-바이오틴 항체이다. 특정 구현예에서, 본원에 보고되는 바와 같은 항-바이오틴 항체는 바이오틴에 컨쥬게이트되고, 바이오틴 잔기를 통해 항체에 의해 특이적으로 결합되는 화합물의 생물학적 활성을 간섭하지 않으면서 바이오틴화 화합물에 결합된다. 따라서, 상기 항체는 항체가 모노특이적 항체인 경우, 바이오틴에 컨쥬게이트된 화합물 (바이오틴화 화합물) 의 약동학적 특성을 개선시키기 위해 사용될 수 있다. 또한 상기 항체는 항체가 이중특이적 또는 다중특이적 항체인 경우, 하나의 결합 특이성이 바이오틴에 대한 것이고 범용 적재 특이성으로서 사용될 수 있는 반면, 두번째 결합 특이성은 예를 들어, 세포 표면 분자에 특이적으로 결합하고 이중특이적 또는 다중특이적 항체의 표적 특성/성분을 제공하므로, 바이오틴화 화합물의 표적된 전달을 위해 사용될 수 있다.
하나의 양상에서, 본 발명은 (a) SEQ ID NO: 01 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) SEQ ID NO: 02 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) SEQ ID NO:03 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) SEQ ID NO: 05 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) SEQ ID NO: 06 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) SEQ ID NO: 07 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3 으로부터 선택되는 하나 이상의, 2 개의, 3 개의, 4 개의, 5 개의 또는 6 개의 HVR 을 포함하는 항-바이오틴 항체를 제공한다.
하나의 양상에서, 본 발명은 (a) SEQ ID NO: 01 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) SEQ ID NO: 02 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (c) SEQ ID NO: 03 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3 으로부터 선택되는, 하나 이상의, 2 개 이상 또는 모든 3 개의 VH HVR 서열을 포함하는 항-바이오틴 항체를 제공한다. 하나의 구현예에서, 항체는 SEQ ID NO: 03 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3 을 포함한다. 또다른 구현예에서, 항체는 SEQ ID NO: 03 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3 및 SEQ ID NO: 07 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3 을 포함한다. 추가의 구현예에서, 항체는 SEQ ID NO: 03 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, SEQ ID NO: 07 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3, 및 SEQ ID NO: 02 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2 를 포함한다. 추가의 구현예에서, 항체는 (a) SEQ ID NO: 01 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) SEQ ID NO: 02 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (c) SEQ ID NO: 03 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3 을 포함한다.
또다른 양상에서, 본 발명은 (a) SEQ ID NO: 05 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) SEQ ID NO: 06 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) SEQ ID NO: 07 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3 으로부터 선택되는, 하나 이상의, 2 개 이상 또는 모든 3 개의 VL HVR 서열을 포함하는 항-바이오틴 항체를 제공한다. 하나의 구현예에서, 항체는 (a) SEQ ID NO: 05 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) SEQ ID NO: 06 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) SEQ ID NO: 07 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3 을 포함한다.
또다른 양상에서, 본 발명의 항-바이오틴 항체는 (a) (i) SEQ ID NO: 01 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) SEQ ID NO: 02 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (iii) SEQ ID NO: 03 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3 으로부터 선택되는 하나 이상의, 2 개 이상의 또는 모든 3 개의 VH HVR 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 (b) (i) SEQ ID NO: 05 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (ii) SEQ ID NO: 06 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (c) SEQ ID NO: 07 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3 으로부터 선택되는 하나 이상의, 2 개 이상의 또는 모든 3 개의 VL HVR 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함한다.
또다른 양상에서, 본 발명은 (a) SEQ ID NO: 01 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) SEQ ID NO: 02 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) SEQ ID NO: 03 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) SEQ ID NO: 05 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) SEQ ID NO: 06 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) SEQ ID NO: 07 로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3 을 포함하는 항-바이오틴 항체를 제공한다.
하나의 구현예에서, 항-바이오틴 항체는 인간화된다.
하나의 양상에서, 본 발명은 (a) SEQ ID NO: 09 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) SEQ ID NO: 10 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) SEQ ID NO:11 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) SEQ ID NO: 13 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) SEQ ID NO: 14 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) SEQ ID NO: 15 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3 으로부터 선택되는 하나 이상의, 2 개의, 3 개의, 4 개의, 5 개의 또는 6 개의 HVR 을 포함하는 인간화된 항-바이오틴 항체를 제공한다.
하나의 양상에서, 본 발명은 (a) SEQ ID NO: 09 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) SEQ ID NO: 10 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (c) SEQ ID NO: 11 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3 으로부터 선택되는 하나 이상의, 2 개 이상의 또는 모든 3 개의 VH HVR 서열을 포함하는 인간화된 항-바이오틴 항체를 제공한다. 하나의 구현예에서, 항체는 SEQ ID NO: 11 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3 을 포함한다. 또다른 구현예에서, 항체는 SEQ ID NO: 11 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3 및 SEQ ID NO: 15 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3 을 포함한다. 추가의 구현예에서, 항체는 SEQ ID NO: 11 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, SEQ ID NO: 15 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3, 및 SEQ ID NO: 10 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2 를 포함한다. 추가의 구현예에서, 항체는 (a) SEQ ID NO: 09 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) SEQ ID NO: 10 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (c) SEQ ID NO: 11 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3 을 포함한다.
또다른 양상에서, 본 발명은 (a) SEQ ID NO: 13 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) SEQ ID NO: 14 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) SEQ ID NO: 15 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3 으로부터 선택되는 하나 이상의, 2 개 이상의 또는 모든 3 개의 VL HVR 서열을 포함하는 인간화된 항-바이오틴 항체를 제공한다. 하나의 구현예에서, 항체는 (a) SEQ ID NO: 13 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) SEQ ID NO: 14 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) SEQ ID NO: 15 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3 을 포함한다.
또다른 양상에서, 본 발명의 항체는 (a) (i) SEQ ID NO: 09 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) SEQ ID NO: 10 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (iii) SEQ ID NO: 11 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3 으로부터 선택되는 하나 이상의, 2 개 이상의 또는 모든 3 개의 VH HVR 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 (b) (i) SEQ ID NO: 13 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (ii) SEQ ID NO: 14 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (c) SEQ ID NO: 15 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3 으로부터 선택되는 하나 이상의, 2 개 이상의 또는 모든 3 개의 VL HVR 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함한다.
또다른 양상에서, 본 발명은 (a) SEQ ID NO: 09 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) SEQ ID NO: 10 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) SEQ ID NO: 11 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) SEQ ID NO: 13 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) SEQ ID NO: 14 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) SEQ ID NO: 15 로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3 을 포함하는 인간화된 항-바이오틴 항체를 제공한다.
또다른 양상에서, 본 발명은 (a) SEQ ID NO: 01 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) SEQ ID NO: 02 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) SEQ ID NO: 03 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) SEQ ID NO: 05 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) SEQ ID NO: 06 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) SEQ ID NO: 07 로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3를 포함하는 인간화된 항-바이오틴 항체를 제공하며, HVR-H2 내의 위치 60 에서의 아미노산 잔기는 A 이고, HVR-H2 내의 위치 61 에서의 아미노산 잔기는 Q 이다.
하나의 구현예에서, 인간화된 항-바이오틴 항체는 상기 구현예 중 임의의 것에서와 같은 HVR 을 포함하고, 수용자 인간 골격, 예를 들어, 인간 면역글로불린 골격 또는 인간 컨센서스 골격을 추가로 포함한다. 하나의 구현예에서, 인간화된 항-바이오틴 항체는 상기 구현예 중 임의의 것과 같은 HVR 을 포함하고, 하기 중 한가지 이상을 추가로 포함한다:
- 위치 24 에서의 S, 및/또는
- 위치 73 에서의 T.
Kabat 위치 24 는 SEQ ID NO: 04, 12, 및 20 의 잔기 번호 24 에 해당한다.
Kabat 위치 60 은 SEQ ID NO: 04, 12, 및 20 의 잔기 번호 61 에 해당한다.
Kabat 위치 61 은 SEQ ID NO: 04, 12, 및 20 의 잔기 번호 62 에 해당한다.
Kabat 위치 71 은 SEQ ID NO: 04, 12, 및 20 의 잔기 번호 72 에 해당한다.
그러한 변화들 (전방 돌연변이) 은 인간화된 항-바이오틴 항체의 결합 친화성 증대를 위해 도입되었다.
또다른 양상에서, 항-바이오틴 항체는 SEQ ID NO: 04 의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 일치성을 갖는 중쇄 가변 도메인 (VH) 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 일치성을 갖는 VH 서열은 참조 서열에 관해 치환 (예를 들어, 보존성 치환), 삽입, 또는 결실을 함유하나, 해당 서열을 포함하는 항-바이오틴 항체는 바이오틴에 결합하는 능력을 보유한다. 특정 구현예에서, 총 1 내지 10 개의 아미노산이 SEQ ID NO: 04 내에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 특정 구현예에서, 치환, 삽입, 또는 결실은 HVR 의 외부의 (즉, FR 내의) 영역에서 발생한다. 임의로, 항-바이오틴 항체는 해당 서열의 번역-후 개질을 비롯해, SEQ ID NO: 04 내에 VH 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, VH 는: (a) SEQ ID NO: 01 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) SEQ ID NO: 02 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (c) SEQ ID NO: 03 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3 으로부터 선택되는 1 개, 2 개 또는 3 개의 HVR 을 포함한다.
또다른 양상에서, 항체가 SEQ ID NO: 08 의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 일치성을 갖는 경쇄 가변 도메인 (VL) 을 포함하는 항-바이오틴 항체가 제공된다. 특정 구현예에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 일치성을 갖는 VL 서열은 참조 서열에 관해 치환 (예를 들어, 보존성 치환), 삽입, 또는 결실을 함유하나, 해당 서열을 포함하는 항-바이오틴 항체는 바이오틴에 결합하는 능력을 보유한다. 특정 구현예에서, 총 1 내지 10 개의 아미노산이 SEQ ID NO: 08 내에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 특정 구현예에서, 치환, 삽입, 또는 결실은 HVR 의 외부의 (즉, FR 내의) 영역에서 발생한다. 임의로, 항-바이오틴 항체는 해당 서열의 번역-후 개질을 비롯해, SEQ ID NO: 08 내에 VL 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, VL 은 (a) SEQ ID NO: 05 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) SEQ ID NO: 06 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) SEQ ID NO:07 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3 으로부터 선택되는 1 개, 2 개 또는 3 개의 HVR 을 포함한다.
또다른 양상에서, 항체가 상기 제공된 구현예 중 임의의 것과 같은 VH, 및 상기 제공된 구현예 중 임의의 것과 같은 VL 을 포함하는 항-바이오틴 항체가 제공된다. 하나의 구현예에서, 항체는 해당 서열의 번역-후 개질을 비롯해, 각각 SEQ ID NO: 04 및 SEQ ID NO: 08 내에 VH 및 VL 서열을 포함한다.
또다른 양상에서, 인간화된 항-바이오틴 항체는 SEQ ID NO: 12 의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 일치성을 갖는 중쇄 가변 도메인 (VH) 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 일치성을 갖는 VH 서열은 참조 서열에 관해 치환 (예를 들어, 보존성 치환), 삽입, 또는 결실을 함유하나, 해당 서열을 포함하는 항-바이오틴 항체는 바이오틴에 결합하는 능력을 보유한다. 특정 구현예에서, 총 1 내지 10 개의 아미노산이 SEQ ID NO: 12 내에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 특정 구현예에서, 치환, 삽입, 또는 결실은 HVR 의 외부의 (즉, FR 내의) 영역에서 발생한다. 임의로, 항-바이오틴 항체는 해당 서열의 번역-후 개질을 비롯해, SEQ ID NO: 12 내에 VH 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, VH 는: (a) SEQ ID NO: 09 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) SEQ ID NO: 10 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (c) SEQ ID NO: 11 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3 으로부터 선택되는 1 개, 2 개 또는 3 개의 HVR 을 포함한다.
또다른 양상에서, 항체가 SEQ ID NO: 16 의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 일치성을 갖는 경쇄 가변 도메인 (VL) 을 포함하는 인간화된 항-바이오틴 항체가 제공된다. 특정 구현예에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 일치성을 갖는 VL 서열은 참조 서열에 관해 치환 (예를 들어, 보존성 치환), 삽입, 또는 결실을 함유하나, 해당 서열을 포함하는 항-바이오틴 항체는 바이오틴에 결합하는 능력을 보유한다. 특정 구현예에서, 총 1 내지 10 개의 아미노산이 SEQ ID NO: 16 내에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 특정 구현예에서, 치환, 삽입, 또는 결실은 HVR 의 외부의 (즉, FR 내의) 영역에서 발생한다. 임의로, 항-바이오틴 항체는 해당 서열의 번역-후 개질을 비롯해, SEQ ID NO: 16 내에 VL 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, VL 은 (a) SEQ ID NO: 13 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) SEQ ID NO: 14 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) SEQ ID NO:15 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3 으로부터 선택되는 1 개, 2 개 또는 3 개의 HVR 을 포함한다.
또다른 양상에서, 항체가 상기 제공된 구현예 중 임의의 것과 같은 VH, 및 상기 제공된 구현예 중 임의의 것과 같은 VL 을 포함하는 인간화된 항-바이오틴 항체가 제공된다. 하나의 구현예에서, 항체는 해당 서열의 번역-후 개질을 비롯해, 각각 SEQ ID NO: 12 및 SEQ ID NO: 16 내에 VH 및 VL 서열을 포함한다.
본 발명의 추가의 양상에서, 상기 구현예 중 임의의 것에 따른 항-바이오틴 항체는 키메라성, 인간화된 또는 인간 항체를 비롯한 모노클로날 항체이다. 하나의 구현예에서, 항-바이오틴 항체는 항체 단편, 예를 들어, Fv, Fab, Fab', scFv, 다이아바디, 또는 F(ab')2 단편이다. 또다른 구현예에서, 항체는 전장 항체, 예를 들어, 온전한 IgG1 또는 IgG4 항체 또는 본원에 정의된 기타 항체 클래스 또는 이소형이다.
추가의 양상에서, 상기 구현예 중 임의의 것에 따른 항-바이오틴 항체는 하기 섹션 1-5 에 기재된 것과 같은 특징 중 임의의 것을, 단독으로 또는 조합으로 도입할 수 있다:
1. 항체 친화성
특정 구현예에서, 본원에서 제공되는 항체는 ≤ 1 μM, ≤100 nM, ≤ 10 nM, ≤1 nM, ≤0.1 nM, ≤0.01 nM, 또는 ≤0.001 nM (예를 들어, 10-8 M 이하, 예를 들어, 10-8 M 내지 10-13 M, 예를 들어 10-9 M 내지 10-13 M) 의 해리 상수 (Kd) 를 갖는다.
하나의 구현예에서, Kd 는 하기 검정에 의해 기재되는 바와 같이 관심의 항체의 Fab 버전 및 이의 항원을 이용하여 수행되는 방사능표지된 항원 결합 검정 (RIA) 에 의해 측정된다. 항원에 대한 FAB 의 용액 결합 친화성을 미표지된 항원의 적정 연속물의 존재 하에 최소 농도의 (125I)-표지된 항원으로 Fab 를 평형화시킨 다음, 항-Fab 항체-코팅된 플레이트를 이용해 결합된 항원을 포획함에 의해 측정한다 (예를 들어, Chen, Y. et al., J. Mol. Biol. 293 (1999) 865-881 참조). 검정에 대한 조건을 성립하기 위해, MICROTITER® 멀티-웰 플레이트 (Thermo Scientific) 를 50 mM 탄산나트륨 (pH 9.6) 중의 5 μg/ml 의 포획 항-Fab 항체 (Cappel Labs) 를 이용해 밤새 코팅한 다음, 이어서 PBS 중의 2% (w/v) 소 혈청 알부민으로 2 내지 5 시간 동안 실온 (대략 23℃) 에서 차단한다. 비-흡착 플레이트 (Nunc #269620) 에서, 100 pM 또는 26 pM [125I]-항원을 관심의 Fab (예를 들어, 항-VEGF 항체, Fab-12 의 평가과 일치함, Presta, L.G. et al., Cancer Res. 57 (1997) 4593-4599) 의 연속 희석액과 혼합한다. 관심의 Fab 를 이후 밤새 인큐베이션시킨다; 그러나, 인큐베이션은 평형에 도달하는 것을 확보하기 위해 더 긴 시간 (예를 들어, 약 65 시간) 동안 지속될 수 있다. 이후, 혼합물을 포획 플레이트로 실온에서 (예를 들어, 1 시간 동안) 인큐베이션을 위해 옮겼다. 이후 용액을 제거하고, 플레이트를 PBS 중의 0.1% 폴리소르베이트 20 (TWEEN-20®) 으로 8 회 세척한다. 플레이트가 건조되었을 때, 150 μl/웰의 섬광제 (scintillant) (MICROSCINT-20 TM; Packard) 를 첨가하고, 플레이트를 TOPCOUNT TM 감마 계수기 (Packard) 상에서 10 분 동안 계수한다. 최대 결합의 20% 이하를 산출하는 각각의 Fab 의 농도를 경쟁적 결합 검정에서 사용하기 위해 선택한다.
또다른 구현예에 따르면, Kd 는 25℃ 에 고정화된 항원 CM5 칩으로 ~10 반응 단위 (RU) 에서, BIACORE®-2000 또는 BIACORE ®-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) 을 사용하는 표면 플라즈몬 공명 검정을 사용하여 측정한다. 간략하게는, 카르복시메틸화 덱스트란 바이오센서 칩 (CM5, BIACORE, Inc.) 을 공급처의 지침에 따라 N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드 히드로클로라이드 (EDC) 및 N-히드록시숙신이미드 (NHS) 를 이용하여 활성화시킨다. 항원을 10 mM 나트륨 아세테이트, pH 4.8 를 이용해, 5 μg/ml (~0.2 μM) 로 희석한 후, 대략 10 반응 단위 (RU) 의 커플링된 단백질을 달성하기 위해 5 μl/분의 유속으로 주입한다. 항원의 주입 후에, 1 M 에탄올아민을 주입하여 미반응된 기를 차단한다. 동역학 측정을 위해, Fab 의 2 배 연속 희석액 (0.78 nM 내지 500 nM) 을 대략 25 μl/분의 유속으로 25℃ 에서 0.05% 폴리소르베이트 20 (TWEEN-20TM) 계면활성제 (PBST) 와 함께 PBS 중에 주입한다. 회합 속도 (kon) 및 해리 속도 (koff) 를 연합 및 해리 센서그램에 동시에 피팅시킴으로써 단순한 1 대 1 의 Langmuir 결합 모델 (BIACORE ® Evaluation Software version 3.2) 을 사용하여 계산한다. 평형 해리 상수 (Kd) 를 koff/kon 비율로서 계산한다. 예를 들어, Chen, Y. et al., J. Mol. Biol. 293 (1999) 865-881 을 참조한다. 온-속도 (on-rate) 가 상기 표면 플라즈몬 공명 검정에 의해 106 M-1 s-1 을 초과하는 경우, 온-속도 (on-rate) 는 분광계, 예컨대 정지-흐름 장치 분광광도계 (Aviv Instruments) 또는 교반된 큐벳이 있는 8000-시리즈 SLM-AMINCO TM 분광광도계 (ThermoSpectronic) 에서 측정된 바와 같은 증가하는 농도의 항원의 존재 하에, PBS, pH 7.2 중의 20 nM 항-항원 항체 (Fab 형태) 의 25℃ 에서의 형광 방출 강도 (여기 = 295 nm; 방출 = 340 nm, 16 nm 밴드-pass) 의 증가 또는 감소를 측정하는 형광 켄칭 기법을 사용함으로써 측정될 수 있다.
2. 항체 단편
특정 구현예에서, 본원에서 제공되는 항체는 항체 단편이다. 항체 단편에는 Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, Fv, 및 scFv 단편, 및 하기 기재되는 기타 단편이 포함되나 이에 제한되지 않는다. 특정 항체 단편의 리뷰를 위해, Hudson, P.J., et al., Nat. Med. 9 (2003) 129-134 를 참조한다. scFv 단편의 리뷰를 위해, 예를 들어, Plueckthun, A., In: The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore (eds.), Springer-Verlag, New York (1994), pp. 269-315 를 참조하고; 또한 WO 93/16185; 미국 특허 번호 5,571,894 및 5,587,458 을 참조한다. 구조 (salvage) 수용체 결합 에피토프 잔기를 포함하고 증가된 생체 내 반감기를 갖는 Fab 및 F(ab')2 단편의 논의에 대해서는, 미국 특허 번호 5,869,046 을 참조한다.
다이아바디는 2-원자가 또는 2-특이적일 수 있는 2 개의 항원-결합 부위를 가진 항체 단편이다. 예를 들어, EP 0 404 097; WO 1993/01161; Hudson, P.J., et al., Nat. Med. 9 (2003) 129-134; 및 Holliger, P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 6444-6448 을 참조한다. 트리아바디 및 테트라바디가 또한 Hudson, P.J., et al., Nat. Med. 9 (2003) 129-134) 에 기재된다.
단일-도메인 항체는 항체의, 중쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부 또는 경쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부를 포함하는 항체 단편이다. 특정 구현예에서, 단일-도메인 항체는 인간 단일-도메인 항체이다 (Domantis, Inc., Waltham, MA; 예를 들어, 미국 특허 번호 6,248,516 B1 참조).
항체 단편은 온전한 항체의 단백질가수분해 소화 뿐 아니라 본원에 기재된 바와 같은 재조합 숙주 세포 (예를 들어, E. 콜라이 (E. coli) 또는 파지) 에 의한 생성을 포함하나 이에 제한되지 않는 다양한 기법에 의해 제조될 수 있다.
3. 키메라성 및 인간화된 항체
특정 구현예에서, 본원에 제공되는 항체는 키메라성 항체이다. 특정 키메라성 항체는 예를 들어, 미국 특허 번호 4,816,567; 및 Morrison, S.L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984) 6851-6855) 에 기재되어 있다. 하나의 예에서, 키메라성 항체는 비-인간 가변 영역 (예를 들어, 마우스, 래트, 햄스터, 토끼, 또는 비-인간 영장류, 예컨대 원숭이로부터 유래되는 가변 영역) 및 인간 불변 영역을 포함한다. 추가의 예에서, 키메라성 항체는 클래스 또는 서브클래스가 부모 항체의 것으로부터 변화된 "클래스 전환된" 항체이다. 키메라성 항체에는 이의 항원-결합 단편이 포함된다.
특정 구현예에서, 키메라성 항체는 인간화된 항체이다. 전형적으로, 비-인간 항체는 부모 비-인간 항체의 특이성 및 친화성을 유지하면서, 인간에 대한 면역원성을 감소시키기 위해 인간화된다. 일반적으로, 인간화된 항체는 HVR, 예를 들어, CDR, (또는 이의 일부분) 이 비-인간 항체로부터 유래되고, FR (또는 이의 일부분) 이 인간 항체 서열로부터 유래되는 하나 이상의 가변 도메인을 포함한다. 인간화된 항체는 임의로 또한 인간 불변 영역의 적어도 일부를 포함할 것이다. 일부 구현예에서, 인간화된 항체 내의 일부 FR 잔기는 예를 들어, 항체 특이성 또는 친화성을 복구하거나 개선시키기 위해 비-인간 항체 (예를 들어, HVR 잔기가 유래되는 항체) 로부터의 상응하는 잔기로 치환된다.
인간화된 항체 및 이들의 제조 방법은 예를 들어, 문헌 [Almagro, J.C. and Fransson, J., Front. Biosci. 13 (2008) 1619-1633] 에 리뷰되고, 예를 들어, 문헌 [Riechmann, I. et al., Nature 332 (1988) 323-329]; Queen, C. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 10029-10033; 미국 특허 번호 5, 821,337, 7,527,791, 6,982,321, 및 7,087,409; Kashmiri, S.V. et al., Methods 36 (2005) 25-34 (SDR (a-CDR) 그래프팅을 기재함); Padlan, E.A., Mol. Immunol. 28 (1991) 489-498 ("재포장 (resurfacing)" 을 기재함); Dall'Acqua, W.F. et al., Methods 36 (2005) 43-60 ("FR 셔플링" 을 기재함); 및 문헌 [Osbourn, J. et al., Methods 36 (2005) 61-68 and Klimka, A. et al., Br. J. Cancer 83 (2000) 252-260 (FR 셔플링에 대한 "가이드 선별" 접근법을 기재함)] 에 추가로 기재된다.
인간화를 위해 사용될 수 있는 인간 골격 영역에는: "최고의-핏" 방법을 사용하여 선택되는 골격 영역 (예를 들어, Sims, M.J. et al., J. Immunol. 151 (1993) 2296-2308 참조; 경쇄 또는 중쇄 가변 영역의 특정 서브그룹의 인간 항체의 컨센서스 서열로부터 유래된 골격 영역 (예를 들어, Carter, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 4285-4289; 및 Presta, L.G. et al., J. Immunol. 151 (1993) 2623-2632 참조); 인간 성숙 (체세포적으로 성숙된) 골격 영역 또는 인간 생식선 골격 영역 (예를 들어, Almagro, J.C. and Fransson, J., Front. Biosci. 13 (2008) 1619-1633 참조); 및 스크리닝 FR 라이브러리로부터 유래된 골격 영역 (예를 들어, Baca, M. et al., J. Biol. Chem. 272 (1997) 10678-10684 및 Rosok, M.J. et al., J. Biol. Chem. 271 (1996) 22611-22618 참조) 이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다.
4. 다중특이적 항체
특정 구현예에서, 본원에 제공된 항체는 다중특이적 항체, 예를 들어 이중특이적 항체이다. 다중특이적 항체는 2 개 이상의 상이한 부위에 대한 결합 특이성을 지닌 모노클로날 항체이다. 특정 구현예에서, 결합 특이성 중 하나가 바이오틴에 대한 것이며, 나머지가 임의의 타 항원에 대한 것이다. 특정 구현예에서, 이중특이적 항체는 바이오틴의 2 개의 상이한 에피토프에 결합할 수 있다. 이중특이적 항체는 또한 바이오틴을 발현하는 세포에 대한 세포독성제를 편재화시키는데 이용될 수 있다. 이중특이적 항체는 전장 항체로서 또는 항체 단편으로서 제조될 수 있다.
다중특이적 항체의 제조 기법에는, 이에 제한되지 않으나, 상이한 특이성을 지닌 2 개의 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 재조합적 공동발현 (참고문헌은, Milstein, C. and Cuello, A.C., Nature 305 (1983) 537-540, WO 93/08829, 및 Traunecker, A., et al., EMBO J.10 (1991) 3655-3659), 및 놉-인-홀 조작기법 (knob-in-hole engineering) (참고문헌은, 예를 들어 US 5,731,168) 이 포함된다. 다중특이적 항체는 또한 항체 Fc-이종이량체 분자 제조를 위한 정전기 스티어링 효과 조작 (WO/2009/089004); 2 개 이상의 항체 또는 단편의 가교 (참고문헌은, 예를 들어 US 4,676,980, 및 Brennan, M., et al., Science 229 (1985) 81-83); 이중특이적 항체 제조를 위한 류신 지퍼의 이용 (참고문헌은, 예를 들어 Kostelny, S.A., et al., J. Immunol. 148 (1992) 1547-1553; 이중특이적 항체 단편 제조를 위한 "디아바디 (diabody)" 기법의 이용 (참고문헌은, 예를 들어, Holliger, P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 6444-6448); 및 단일쇄 Fv (sFv) 이량체의 이용 (참고문헌은, 예를 들어 Gruber, M., et al., J. Immunol. 152 (1994) 5368-5374); 및 예를 들어 문헌 [Tutt, A., et al., J. Immunol. 147 (1991) 60-69)] 에 기재된 삼중특이적 항체의 제조법에 의해 제조될 수 있다.
옥토퍼스 (Octopus) 항체를 포함한 셋 이상의 관능성 항원 결합 부위를 이용해 조작된 항체가 또한 본원에 포함된다 (참고문헌은, 예를 들어 US/2006/0025576).
본원에서 항체 또는 단편은 또한 바이오틴 뿐만 아니라 또다른, 상이한 항원에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 Dual Acting Fab 또는 DAF 를 포함한다 (참고문헌은, 예를 들어 US/2008/0069820).
본원에서 항체 또는 단편은 또한 WO/2009/080251, WO/2009/080252, WO/2009/080253, WO/2009/080254, WO/2010/112193, WO/2010/115589, WO/2010/136172, WO/2010/145792, 및 WO 2010/145793 에 기재되어 있는 다중특이적 항체를 포함한다.
5. 항체 변이체
특정 구현예에서, 본원에 제공된 항체의 아미노산 서열 변이체가 고려된다. 예를 들어, 항체의 결합 친화성 및/또는 여타 생물학적 특성을 개선하는 것은 바람직할 수 있다. 항체의 아미노산 서열 변이체는 적절한 개질을 항체를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열에 도입함으로써, 또는 펩티드 합성에 의해 제조될 수 있다. 그러한 개질에는, 예를 들어 항체의 아미노산 서열 내 잔기로부터의 결실 및/또는 항체의 아미노산 서열 내 잔기로의 삽입 및/또는 그의 치환이 포함된다. 결실, 삽입 및 치환의 임의의 조합은, 최종 구축물이 원하는 특징, 예를 들어 항원-결합 특징을 보유하는 한, 최종 구축물에 귀착하도록 할 수 있다.
a) 치환, 삽입 및 결실 변이체
특정 구현예에서, 하나 이상의 아미노산 치환을 지닌 항체 변이체가 제공된다. 치환 돌연변이유발을 위한 관심대상의 부위에는 HVR 및 FR 이 포함된다. 보존성 치환은 표 1 에 "바람직한 치환" 이라는 항목 하에 제시되어 있다. 표 1 에 "예시 치환" 이라는 항목 하에 더 많은 실질적 변화들이 제공되어 있으며, 이는 아미노산 측쇄 클래스와 관련하여 하기에 더 기재되어 있다. 아미노산 치환은 관심대상의 항체 및 원하는 활성, 예를 들어 보존/개선되는 항원 결합, 감소된 면역원성 또는 개선된 ADCC 또는 CDC 에 대해 스크리닝되는 생성물에 도입될 수 있다.
표 1
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아미노산은 통상적 측쇄 특성에 따라 무리지을 수 있다:
(1) 소수성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) 산성: Asp, Glu;
(4) 염기성: His, Lys, Arg;
(5) 사슬 배향에 영향을 주는 잔기: Gly, Pro;
(6) 방향족: Trp, Tyr, Phe.
비보존성 치환은 그러한 클래스 중 하나의 구성원의 또다른 클래스로의 교체를 수반할 것이다.
한가지 유형의 치환 변이체는 부모 항체 (예를 들어, 인간화 또는 인간 항체) 의 하나 이상의 과가변 영역 잔기의 치환을 수반한다. 일반적으로, 추가 연구를 위해 선별되는 결과로서 제공되는 변이체(들)은 부모 항체와 관련하여 특정 생물학적 특성 (예를 들어, 증대된 친화성, 감소된 면역원성) 에 있어 변경 (예를 들어 개선) 이 있거나 및/또는 부모 항체의 실질적으로 유지되는 특정 생물학적 특성을 지니게 될 것이다. 예시 치환 변이체는 친화성 성숙형 항체로, 이는 예를 들어 본원에 기재된 것과 같은 파지 디스플레이-기반의 친화성 성숙화 기법을 이용해 편리하게 생성될 수 있다. 간략하게, 하나 이상의 HVR 잔기는 돌연변이화되며, 변이체 항체는 파지 상에 디스플레이되고, 특별한 생물학적 활성 (예를 들어, 결합 친화성) 에 대해 스크리닝된다.
예를 들어 항체 친화성 개선을 위해 변경 (예를 들어, 치환) 이 HVR 에서 가해질 수 있다. 그러한 변경은 HVR 핫스팟 (hotspot), 즉 체세포 성숙화 프로세스 동안 높은 빈도로 돌연변이를 겪게 되는 코돈에 의해 인코딩되는 잔기 (참고문헌은, 예를 들어, Chowdhury, P.S., Methods Mol. Biol. 207 (2008) 179-196) 및/또는 SDR (a-CDR) 에서 일어날 수 있어, 결과로서 제공되는 변이체 VH 또는 VL 은 결합 친화성에 대해 시험한다. 2 차 라이브러리로부터의 구축 및 재선별에 의한 친화성 성숙화는 예를 들어 문헌 [Hoogenboom, H.R., et al., Methods in Molecular Biology 178 (2002) 1-37] 에 기재되어 있다. 친화성 성숙화의 일부 구현예에서, 다양한 방법 (예를 들어, 오류-유발 (error-prone) PCR, 사슬 셔플링 (chain shuffling), 또는 올리고뉴클레오티드-지령 돌연변이유발) 중 임의의 것에 의해 성숙화를 위해 선택되는 가변 유전자에 도입된다. 이어서, 2 차 라이브러리를 생성한다. 이어서, 라이브러리를 스크리닝하여 원하는 친화성을 지닌 임의의 항체 변이를 밝혀낸다. 다변성을 도입하는 또다른 방법은 HVR-지령 접근법을 수반하는데, 여기서 여러 HVR 잔기들 (예를 들어, 한 번에 4 내지 6 개의 잔기) 이 무작위로 선택된다. 항원 결합에 관여되는 HVR 잔기들은 예를 들어 알라닌 스캐닝 돌연변이유발 또는 모델링을 이용해 특이적으로 식별될 수 있다. CDR-H3 및 CDR-L3 는 특히 종종 표적이 된다.
특정 구현예에서, 치환, 삽입 또는 결실은, 그러한 변화가 항원에 결합하는 항체의 능력을 실질적으로 경감시키지 않는 한 하나 이상의 HVR 에서 일어날 수 있다. 예를 들어, 결합 친화성을 실질적으로 경감시키지 않는 보존성 변경 (예를 들어 본원에 제공된 보존성 치환) 이 HVR 내에 일어날 수 있다. 그러한 변경은 HVR 핫스팟 또는 SDR 의 외부에 존재할 수 있다. 상기 제공된 변이체 VH 및 VL 서열의 특정 구현예에서, 각 HVR 은 변경되지 않거나, 또는 1, 2 또는 3 개 이하의 아미노산 치환을 포함한다.
돌연변이유발을 위한 표적이 될 수 있는 항체의 잔기 또는 영역의 식별을 위한 유용한 방법은 문헌 [Cunningham, B.C. and Wells, J.A., Science 244 (1989) 1081-1085] 에 기재된 바와 같이 "알라닌 스캐닝 돌연변이유발 (alanine scanning mutagenesis)" 로 지칭된다. 상기 방법에서, 표적 잔기 (예를 들어, 하전된 잔기, 예컨대 asp, his, lys, 및 glu) 가 중성 또는 음으로 하전된 아미노산 (예를 들어, 알라닌 또는 폴리알라닌) 에 의해 식별 및 치환되어 항체의 항원과의 상호적용이 영향을 받는지 여부를 결정하게 된다. 최초 치환에 대한 관능성 민감도를 증명하는 아미노산 위치에 추가의 치환이 도입될 수 있다. 대안적으로, 항체 및 항원 사이의 접촉점을 식별하기 위한 또는 추가적으로, 항원-항체 복합체의 결정 구조. 그러한 접촉 잔기 및 이웃하는 잔기는 치환을 위한 후보자로서 표적이 되거나 또는 제거될 수 있다. 변이체는 그들의 원하는 특성을 포함하는지 여부를 결정하기 위해 스크리닝될 수 있다.
아미노산 서열 삽입은 길이에 있어 1 개의 잔기 내지 수백개 이상의 잔기를 포함하고 있는 폴리펩티드까지의 아미노- 및/또는 카르복실-말단 융합체 뿐만 아니라 단일 또는 다중 아미노산 잔기의 서열내 삽입도 포함한다. 말단 삽입의 예시는, N-말단 메티오닐 잔기를 지닌 항체를 포함한다. 항체 분자의 타 삽입 변이에는 항체의 N- 또는 C-말단의 효소 (예를 들어, ADEPT) 또는, 항체의 혈청 반감기를 증대시키는 폴리펩티드에 대한 융합이 포함된다.
한가지 바람직한 변이체는, 중쇄 가변 도메인 내 Kabat 에 따른 위치 53 에서의 아미노산 잔기가 시스테인인 단일 시스테인 변이체이다.
b) 글리코실화 변이체
특정 구현예에서, 본원에 제공되는 항체는 항체가 글리코실화되는 정도를 늘리거나 또는 줄이도록 변경된다. 글리코실화 부위의 항체에 대한 부가 또는 결실은 하나 이상의 글리코실화 부위가 생겨나거나 또는 제거되도록 아미노산 서열을 변경시킴으로써 편리하게 수행될 수 있다.
항원이 Fc-영역을 포함하는 경우, 그에 부착된 탄수화물이 변경될 수 있다. 포유류 세포에 의해 생산되는 네이티브 항체는 일반적으로 Fc-영역의 CH2 도메인의 Asn297 에 대한 N-연결에 의해 부착되는 분지화된, 바이안테너리 올리고당을 포함한다. 참고문헌은, 예를 들어, [Wright, A. and Morrison, S.L., TIBTECH 15 (1997) 26-32]. 올리고당은 다양한 탄수화물, 예를 들어 만노오스, N-아세틸 글루코사민 (GlcNAc), 갈락토오스, 및 시알산 뿐 아니라 바이안테너리 올리고당 구조의 줄기에서 GlcNAc 에 부착된 프룩토오스를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명의 항체에서의 바이안테너리 올리고당은 특정 개선된 특성을 지닌 항체 변이체를 만들기 위해 제공될 수 있다.
한 구현예에서, Fc-영역에 (직접적으로 또는 간접적으로) 부착된 푸코오스가 결핍되어 있는 탄수화물 구조를 지닌 항체 변이체가 제공된다. 예를 들어, 그러한 항체에서의 푸코오스의 양은 1% 내지 80%, 1% 내지 65%, 5% 내지 65% 또는 20% 내지 40% 일 수 있다. 푸코오스의 양은 예를 들어 WO/2008/077546 에 기재된 MALDI-TOF 질량 분광계로 측정되는 바와 같은, Asn 297 에 결합된 모든 당구조물 (예를 들어, 복합체, 하이브리드 및 고 만노오스 구조) 의 합에 대한 Asn297 에서의 당 사슬 내 푸코오스의 평균적인 양을 산출하여 결정된다. Asn297 은 Fc-영역 내 대략 위치 297 (Fc-영역 잔기의 EU 번호지정) 에 위치된 아스파라긴 잔기를 지칭하나; Asn297 은 또한, 항체에서의 미미한 서열 변화로 인해 위치 297 의 상류 또는 하류로 약 ±3 개 아미노산에 해당하는 위치, 즉 위치 294 내지 300 에 위치할 수 있다. 그러한 푸코실화 변이체는 개선된 ADCC 관능성을 지닐 수 있다. 참고문헌은, 예를 들어, US 2003/0157108; US 2004/0093621. 탈푸코실화 또는 푸코오스-결핍 항체 변이체에 관한 공보의 예시는 다음을 포함한다: US/2003/0157108; WO/2000/61739; WO/2001/29246; US/2003/0115614; US/2002/0164328; US/2004/0093621; US/2004/0132140; US/2004/0110704; US/2004/0110282; US/2004/0109865; WO/2003/085119; WO/2003/084570; WO/2005/035586; WO/2005/035778; WO/2005/053742; WO/2002/031140; Okazaki, A., et al., J.Mol. Biol. 336 (2004) 1239-1249; Yamane-Ohnuki, N., et al., Biotech. Bioeng. 87 (2004) 614-622. 탈푸코실화된 항체 제조가 가능한 세포주의 예시에는, 단백질 푸코실화 결핍 Lec13 CHO 세포 (Ripka, J., et al., Arch. Biochem. Biophys. 249 (1986) 533-545; US 2003/0157108; 및 WO/2004/056312, 특히 실시예 11), 및 넉아웃 세포주, 예컨대 알파-1,6-푸코실트랜스퍼라아제 유전자, FUT8, 넉아웃 CHO 세포 (참고문헌은, 예를 들어, Yamane-Ohnuki, N., et al., Biotech. Bioeng. 87 (2004) 614-622; Kanda, Y., et al., Biotechnol. Bioeng. 94 (2006) 680-688; 및 WO 2003/085107) 가 포함된다.
항체 변이체에, 예를 들어 항체의 Fc-영역에 부착된 바이안테너리 올리고당이 GlcNAc 에 의해 이등분되어 있는, 이등분 올리고당이 추가로 제공된다. 그러한 항체 변이체는 줄어든 푸코실화 및/또는 개선된 ADCC 기능을 지닐 수 있다. 그러한 항체 변이체의 예시는 예를 들어 WO 2003/011878; US 6,602,684; 및 US 2005/0123546 에 기재되어 있다. Fc-영역에 부착되어 있는 올리고당이 줄어든 하나 이상의 갈락토오스를 지닌 항체 변이체가 또한 제공된다. 그러한 항체 변이체는 개선된 CDC 기능을 지닐 수 있다. 그러한 항체 변이체는 예를 들어 WO 1997/30087; WO 1998/58964; 및 WO 1999/22764 에 기재되어 있다.
c) Fc-영역 변이체
특정 구현예에서, 하나 이상의 아미노산 개질이 본원에 제공되는 항체의 Fc-영역에 도입되어, Fc-영역 변이체를 생성할 수 있다. Fc-영역 변이체는 하나 이상의 아미노산 위치에 아미노산 개질 (예를 들어, 치환) 을 포함하는 인간 Fc-영역 서열 (예를 들어, 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 Fc-영역) 을 지닐 수 있다.
특정 구현예에서, 본 발명은 생체내 항체의 반감기가 중요하지만, 특정한 효과기 기능 (예컨대, 보체 및 ADCC) 이 불필요하거나 또는 유해한 적용에 대한 바람직한 후보가 되도록, 효과기 기능의 전부는 아니나 일부를 보유하는 항체 변이체를 포함한다. CDC 및/또는 ADCC 활성의 감소/결실을 확인하기 위해 시험관내 및/또는 생체내 세포독성 검정을 실시할 수 있다. 예를 들어, 항체에 FcγR 결합이 결핍 (따라서, ADCC 활성이 결핍될 공산이 큰) 되어 있으나, FcRn 결합 능력은 유지하고 있음을 확인하기 위해 Fc 수용체 (FcR) 결합 검정이 실시될 수 있다. ADCC, NK 세포를 중재하기 위한 원시 세포들은 FcγRIII 만을 발현하는 반면, 단핵구는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII 을 발현한다. 조혈 세포 상의 FcR 발현은 문헌 [Ravetch, J.V. and Kinet, J.P., Annu. Rev. Immunol. 9 (1991) 457-492] 의 464 페이지에 있는 표 3 에 요약되어 있다. 관심대상의 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위한 시험관내 검정의 비제한적 예시는 US 5,500,362 (참고문헌은, 예를 들어 Hellstrom, I., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 (1986) 7059-7063; 및 Hellstrom, I., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 (1985) 1499-1502); US 5,821,337 (참고문헌은, Bruggemann, M., et al., J.Exp. Med. 166 (1987) 1351-1361) 에 기재되어 있다. 대안적으로, 비-방사활성 검정 방법이 채용될 수 있다 (참고문헌은, 예를 들어 유세포분석을 위한 ACTITM 비-방사활성 세포독성 검정 (CellTechnology, Inc. Mountain View, CA; 및 CytoTox 96® 비-방사활성 검정 (Promega, Madison, WI). 그러한 검정에 유용한 효과기 세포에는 말초혈 단핵 세포 (PBMC) 및 중성 킬러 (Natural Killer) (NK) 세포이다. 대안적으로 또는 추가적으로, 관심대상의 분자의 ADCC 활성은 예를 들어 문헌 [Clynes, R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 (1998) 652-656] 에 개시된 것과 같은 동물 모델에서 생체내에서 검정될 수 있다. 항체가 C1q 에 결합할 수 없으며, 따라서 CDC 활성이 결핍되어 있다는 점을 확인하기 위해 C1q 결합 검정이 또한 실시될 수 있다. 참고문헌은, 예를 들어, WO/2006/029879 및 WO/2005/100402 에서의 C1q 및 C3c 결합 ELISA. 보체 활성화를 평가하기 위해서, CDC 검정이 실행될 수 있다 (참고문헌은, 예를 들어 Gazzano-Santoro, H., et al., J. Immunol. Methods 202 (1996) 163-171; Cragg, M.S., et al., Blood 101 (2003) 1045-1052; 및 Cragg, M.S. and M.J.Glennie, Blood 103 (2004) 2738-2743). FcRn 결합 및 생체내 소거/반감기 결정은 또한 당업계에 공지된 방법을 이용해 실행될 수 있다 (참고문헌은, 예를 들어, Petkova, S.B., et al., Int. Immunol. 18 (2006) 1759-1769).
감소된 효과기 기능을 지닌 항체에는, Fc-영역 잔기들 238, 265, 269, 270, 297, 327 및 329 중 하나 이상의 치환이 있는 것이 포함된다 (US 6,737,056). 그러한 Fc 돌연변이에는, 잔기 265 및 297 의 알라닌으로의 치환이 있는 소위 DANA Fc 돌연변이를 포함한, 아미노산 위치 265, 269, 270, 297 및 327 에 둘 이상의 치환을 지닌 Fc 돌연변이가 포함된다 (US 7,332,581).
FcR 에 대한 결합이 개선되거나 또는 줄어든 특정 항체 변이체가 기재된 바 있다 (참고문헌은, 예를 들어, US 6,737,056; WO 2004/056312, 및 Shields, R.L., et al., J.Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604).
특정 구현예에서, 항체 변이체는 ADCC 를 개선하는 하나 이상의 아미노산 치환, 예를 들어 Fc-영역의 위치 298, 333 및/또는 334 에서의 치환 (잔기의 EU 번호지정) 을 지닌 Fc-영역을 포함한다.
일부 구현예에서, 예를 들어 US 6,194,551, WO 99/51642 및 [Idusogie, E.E., et al., J. Immunol. 164 (2000) 4178-4184] 에 기재된 바와 같이, 변경된 (즉, 개선되거나 또는 감소된) C1q 결합 및/또는 보체 의존성 세포독성 (CDC) 을 초래하는 Fc-영역 내에 변경이 있게 된다.
모체 IgG 의 태아로의 이동에 원인을 제공하는 신생아 Fc 수용체 (FcRn) 에 대한 결합이 개선되고, 반감기가 증대된 항체 (Guyer, R.L., et al., J. Immunol. 117 (1976) 587-593, 및 Kim, J.K., et al., J. Immunol. 24 (1994) 2429-2434) 가 US 2005/0014934 에 기재되어 있다. 그러한 항체는 Fc-영역의 FcRn 에 대한 결합을 개선시키는, 그에게 하나 이상의 치환이 있는 Fc-영역을 포함한다. 그러한 Fc 변이체에는, 다음과 같은 Fc-영역 잔기의 하나 이상에 치환을 지닌 것이 포함된다: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 또는 434, 예를 들어 Fc-영역 잔기 434 의 치환 (US 7,371,826).
Fc-영역 변이체의 타 예시에 관한 참고문헌은, 또한 Duncan, A.R. and Winter, G., Nature 322 (1988) 738-740; US 5,648,260; US 5,624,821; 및 WO 94/29351.
d) 시스테인 조작된 항체 변이체
특정 구현예에서, 항체의 하나 이상의 잔기가 시스테인 잔기로 치환되는 시스테인 조작 항체, 예를 들어 "thioMAbs" 를 만드는 것이 바람직할 수 있다. 특별한 구현예에서, 치환된 잔기는 항체의 접근가능한 부위에 나타난다. 그러한 잔기의 시스테인 치환에 의해, 반응성 티올기가 항체의 접근가능한 부위에 위치하게 되며, 약물 모이어티 또는 링커-약물 모이어티와 같은 타 모이어티에 항체를 컨쥬게이션시켜 본원에 상세히 기술된 면역 컨쥬게이트를 형성할 수 있다. 특정 구현예에서, 하기 잔기들 중 임의의 한가지 이상이 시스테인으로 치환될 수 있다: 경쇄의 V205 (Kabat 번호지정); 중쇄의 A118 (EU 번호지정); 및 중쇄 Fc-영역의 S400 (EU 번호지정). 시스테인 조작 항체는 예를 들어 US 7,521,541 에 기재된 바와 같이 생성될 수 있다.
e) 항체 유도체
특정 구현예에서, 본원에 제공된 항체는 당업계에 공지되어 쉽게 이용가능한 추가적인 비-단백질계 모이어티를 포함하도록 추가로 개질될 수 있다. 항체의 유도체화에 적합한 모이어티에는, 이에 제한되지 않으나, 수용성 중합체가 포함된다. 수용성 중합체의 비제한적 예시에는, 이에 제한되지 않으나, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜의 공중합체, 카르복시메틸셀룰로오스, 덱스트란, 폴리비닐 알코올, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리-1,3-디옥솔란, 폴리-1,3,6-트리옥산, 에틸렌/말레산 무수물 공중합체, 폴리아미노산 (단독중합체 또는 랜덤 공중합체), 및 덱스트란 또는 폴리(n-비닐 피롤리돈)폴리에틸렌 글리콜, 프로프로필렌 글리콜 단독중합체, 폴리프로필렌 옥시드/에틸렌 옥시드 공중합체, 폴리옥시에틸렌화 폴리올 (예를 들어, 글리세롤), 폴리비닐 알코올 및 이들의 혼합물이 포함된다. 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데히히드는 그의 물에서의 안정성으로 인해 제조에서 장점을 가질 수 있다. 중합체는 임의의 분자량으로 존재할 수 있으며, 분지령 또는 비분지형일 수 있다. 항체에 부착된 중합체의 갯수는 가변적일 수 있으며, 1 개 초과의 중합체가 부착되는 경우, 이들은 상동이거나 또는 상이한 분자일 수 있다. 일반적으로, 유도체화에 이용되는 중합체의 수 및/또는 유형은, 이에 제한되지 않으나 개선될 항체의 특별한 특성 또는 관능성, 항체 유도체가 정해진 조건 하에 치료에 이용될 것인지 여부 등을 포함한 고려사항들을 바탕으로 결정될 수 있다.
또다른 구현예에서, 방사선에 대한 노출에 의해 선별적으로 가열될 수 있는 비-단백질계 모이어티 및 항체의 컨쥬게이트가 제공된다. 한 구현예에서, 비-단백질계 모이어티는 탄소 나노튜브이다 (Kam, N.W., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102 (2005) 11600-11605). 조사는 임의의 파장의 것일 수 있으며, 이에 제한되지 않으나, 보통 세포에 해를 가하지 않으며, 항체-비-단백질계 모이어티에 가까운 세포가 살상될 온도로 비-단백질계 모이어티를 가열할 파장이 포함된다.
B. 재조합 방법 및 조성물
항체는 예를 들어 US 4,816,567 에 기재된 바와 같이 재조합 방법 및 조성물을 이용해 제조될 수 있다. 한 구현예에서, 본원에 기재된 항-바이오틴 항체를 인코딩하는 단리된 핵산을 제공한다. 그러한 핵산은 항체의 VL 를 포함하는 아미노산 서열 및/또는 VH 를 포함하는 아미노산 서열 (예를 들어, 항체의 경쇄 및/또는 중쇄) 을 인코딩할 수 있다. 추가 구현예에서, 그러한 핵산을 포함하는 하나 이상의 벡터 (예를 들어, 발현 벡터) 가 제공된다. 추가 구현예에서, 그러한 핵산을 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 한가지 그러한 구현예에서, 숙주 세포는 이하의 것을 포함한다 (예를 들어, 이하의 것으로 형질전환됨): (1) 항체의 VL 를 함유하는 아미노산 서열 및 항체의 VH 를 함유하는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산을 함유하는 벡터, 또는 (2) 항체의 VL 를 함유하는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산을 포함하는 제 1 벡터 및 항체의 VH 를 함유하는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산을 포함하는 제 2 벡터. 한 구현예에서, 여기서 숙주 세포는 진핵성 세포, 예를 들어 중국 햄스터 난소 (Chinese Hamster Ovary) (CHO) 세포 또는 림프구 세포 (예를 들어, Y0, NS0, Sp20 세포) 이다. 한 구현예에서, 항-바이오틴 항체의 제조 방법이 제공되며, 여기서 상기 방법은 상기 기재된 바와 같은 항체를 인코딩하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 항체 발현에 적합한 조건 하에 배양하며, 임의로는 숙주 세포 (또는 숙주 세포 배양 배지) 로부터 항체를 회수하는 단계를 포함한다.
항-바이오틴 항체의 재조합적 제조를 위해, 예를 들어 상기 기재된 바와 같은 항체를 인코딩하는 핵산을 단리하여, 숙주 세포에서의 추가적인 클로닝 및/또는 발현을 위한 하나 이상의 벡터에 삽입한다. 그러한 핵산은 쉽게 단리되며, 통상적 과정 (예를 들어, 항체의 중쇄 및 경쇄를 인코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 이용하여) 서열분석할 수 있다.
항체-인코딩 벡터의 클로닝 또는 발현을 위한 적합한 숙주 세포에는 본원에 기재된 원핵 또는 진핵 세포가 포함된다. 예를 들어, 항체는 특히 글리코실화 및 Fc 효과기 기능이 필요하지 않은 경우, 박테리아에서 제조될 수 있다. 박테리아에서 항체 단편 및 폴리펩티드의 발현에 대해, 참고문헌은, 예를 들어, US 5,648,237, US 5,789,199, 및 US 5,840,523. (참고문헌은, 또한 Charlton, K.A., In: Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo, B.K.C. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ (2003), pp. 245-254, 대장균에서의 항체 단편 발현을 설명함). 발현 후, 항체는 가용성 분획 중의 박테리아 세포 페이스트로부터 단리될 수 있으며, 추가로 정제될 수 있다.
원핵생물에 추가하여, 부분적으로 또는 완전한 인간 글리코실화 패턴을 지닌 항체의 제공을 초래하는, 그의 글리코실화 경로가 "인간화된" 균류 및 효모 균주를 포함하는 곰팡이 또는 효모와 같은 진핵 미생물이 항체-인코딩 벡터용의 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이다. 참고문헌으로는, [Gerngross, T.U., Nat. Biotech. 22 (2004) 1409-1414; and Li, H., et al., Nat. Biotech. 24 (2006) 210-215].
글리코실화된 항체의 발현을 위한 적합한 숙주 세포가 또한 다세포 유기체 (무척추동물 및 척추동물) 로부터 유도된다. 무척추동물 세포의 예시에는 식물 및 곤충 세포가 포함된다. 특히 스포돕테라 푸른기페르다 (Spodoptera frugiperda) 세포의 형질주입을 위해 곤충 세포와 함께 사용될 수 있는 수많은 바큘로바이러스 균주가 밝혀진 바 있다.
식물 세포 배양이 또한 숙주로서 이용될 수 있다. 참고문헌은, 예를 들어, US 5,959,177; US 6,040,498; US 6,420,548; US 7,125,978; US 6,417,429 (형질주입 식물에서 항체 제조를 위한 PLANTIBODIESTM 기법을 기록).
척추동물 세포가 또한 숙주로 이용될 수 있다. 예를 들어, 현탁액에서 생장하도록 맞추어진 포유류 세포주가 유용할 수 있다. 유용한 포유류 숙주 세포주의 여타 예시는 SV40 에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주 (COS-7), 인간 배아 신장 세포주 (HEK 293), 아기 햄스터 신장 세포 (BHK), 마우스 정세관 세포 (예를 들어, [Mather, J.P., Biol. Reprod. 23 (1980) 243-252] 에 기재된 TM4 세포), 원숭이 신장 세포 (CV1), 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포 (VERO-76), 인간 자궁경부암 세포 (HELA), 개 신장 세포 (MDCK), 버팔로 래트 간 세포 (BRL 3A), 인간 폐 세포 (W138), 인간 간 세포 (Hep G2), 마우스 유방 종양 세포 (MMT 060562), TRI 세포, 예를 들어, [Mather, J.P., 등, Annals N.Y. Acad. Sci. 383 (1982) 44-68] 에 기재된 것, MRC 5 세포 및 FS4 세포를 포함한다. 여타 유용한 포유류 숙주 세포주에는, 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, 예컨대 DHFR- CHO 세포 (Urlaub, G., 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980) 4216-4220), 및 흑색종 세포주, 예컨대 Y0, NS0 및 Sp2/0 이 포함된다. 항체 제조에 적합한 특정 포유류 숙주 세포주에 대한 개요는, 예를 들어, [Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268 (2003)] 참조.
C. 검정법
본원에 제공된 항-바이오틴 항체는 당업계에 공지된 다양한 검정법에 의해 그의 물리적/화학적 특성 및/또는 생물학적 활성에 대해 식별, 스크리닝 또는 특징분석될 수 있다.
결합 검정 및 여타 검정
한 국면에서, 본 발명의 항체는 예를 들어 ELISA, 웨스턴 블랏 등과 같은 공지된 방법에 의해 그의 항원 결합 활성에 대해 시험한다.
또다른 국면에서, 바이오틴에 대한 결합에 대해 본원에 보고된 바와 같이 항체와 경쟁하는 항체를 식별해 내기 위해 경쟁 검정법이 이용될 수 있다.
예시 경쟁 검정법에서, 고정된 바이오틴이 바이오틴에 결합하는 제 1 표지 항체 및 바이오틴에 결합하는 제 1 항체와 경쟁하는 그의 능력에 대해 시험할 제 2 미표지 항체를 포함하는 용액에서 인큐베이션한다. 제 2 항체는 하이브리도마 상청액 중에 존재할 수 있다. 대조군으로서, 고정화된 바이오틴은 제 1 표지 항체는 포함하나, 제 2 미표지 항체는 포함하지 않는 용액에서 인큐베이션한다. 제 1 항체의 바이오틴에 대한 결합을 허용하는 조건 하의 인큐베이션 후, 과량의 미결합 항체를 제거하고, 고정화된 바이오틴과 회합된 표지의 양을 측정한다. 고정화된 바이오틴과 회합된 표지의 양이 시험 시료에서 대조군 시료에 비해 실질적으로 감소된 경우, 이는 제 2 항체가 바이오틴에 대한 결합에 대해 제 1 항체와 경쟁한다는 것을 나타낸다. 참고문헌은, Harlow, E. and Lane, D., Antibodies: A Laboratory Manual, Chapter 14, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1988).
D. 면역컨쥬게이트
본 발명은 또한 하나 이상의 세포독성제, 예컨대 화학치료제 또는 약물, 성장 저해제, 독소 (예를 들어, 단백질 독소, 박테리아, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소 활성 독소, 또는 이들의 단편) 또는 방사활성 동위원소에 컨쥬게이션되어 있는 본원에서의 항-바이오틴 항체를 함유하는 면역컨쥬게이트가 제공된다.
한 구현예에서, 면역컨쥬게이트는 이에 제한되지 않으나, 메이탄시노이드 (maytansinoid) (참고문헌은, US 5,208,020, US 5,416,064, EP 0 425 235); 오리스타틴 (auristatin), 예컨대 모노메틸오리스타틴 약물 모이어티 DE 및 DF (MMAE 및 MMAF, 참고문헌은, US　5,635,483, US 5,780,588, US 7,498,298), 돌라스타틴 (dolastatin), 칼리테아미신 (calicheamicin) 또는 이들의 유도체 (참고문헌은, US 5,712,374, US 5,714,586, US 5,739,116, US 5,767,285, US 5,770,701, US 5,770,710, US 5,773,001, US 5,877,296, Hinman, L.M., 등, Cancer Res. 53 (1993) 3336-3342, Lode, H.N., 등, Cancer Res. 58 (1998) 2925-2928), 안트라시클린, 예컨대 다우노마이신 또는 독소루비신 (참고문헌은, Kratz, F., 등, Current Med. Chem. 13 (2006) 477-523, Jeffrey, S.C., 등, Bioorg. Med. Chem. Letters 16 (2006) 358-362, Torgov, M.Y., 등, Bioconjug. Chem. 16 (2005) 717-721, Nagy, A., 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97 (2000) 829-834, Dubowchik, G.M., 등, Bioorg. Med. Chem. Lett. 12 (2002) 1529-1532, King, H.D., 등, J.Med. Chem. 45 (2002) 4336-4343, 및 US 6,630,579), 메토트렉세이트, 빈데신, 택산, 예컨대 도세탁셀, 파클리탁셀, 랄로탁셀, 테세탁셀, 및 오르타탁셀, 트리코테센 및 CC1065 을 포함하는 하나 이상의 약물에 항체가 컨쥬게이션되어 있는 항체-약물 컨쥬게이트 (ADC) 이다.
또다른 구현예에서, 면역컨쥬게이트는, 이에 제한되지 않으나, 디프테리아 A 사슬, 디프테리아 독소의 비결합 활성 단편, 외독소 A 사슬 (슈도모나스 아에루기노사 (Pseudomonas aeruginosa) 유래), 리신 A 사슬, 아브린 A 사슬, 모데신 A 사슬, 알파-사르신, 알류라이트 포르디이 (Aleurites fordii) 단백질, 디안틴 단백질 (dianthin protein), 피톨라카 아메리카나 (Phytolaca americana) 단백질 (PAPI, PAPII, 및 PAP-S), 모모르디카 카란티아 (momordica charantia) 저해제, 쿠르신 (curcin), 크로틴 (crotin), 사포나리아 오피시날리스 (Saponaria officinalis) 저해제, 젤로인 (gelonin), 미토겔린 (mitogellin), 레스트릭토신 (restrictocin), 페노마이신 (phenomycin), 에노마이신 (enomycin) 및 트리코테센 (tricothecene) 을 포함하는 효소 활성 독소 또는 그의 단편에 컨쥬게이션되어 있는 본원에 기재된 항체를 함유한다.
또다른 구현예에서, 면역컨쥬게이트는 방사활성 원자에 컨쥬게이션되어 방사성 컨쥬게이트를 형성하는 본원에 기재된 항체를 함유한다. 다양한 방사활성 동위원소가 방사성컨쥬게이트의 제조에 이용가능하다. 예시는 At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212, 및 Lu 의 방사활성 동위원소를 포함한다. 방사컨쥬게이트가 검출용으로 사용되는 경우, 이는 섬광계수 연구용 방사활성 원자, 예를 들어 Tc99m 또는 I123, 또는 핵 자기공명 (NMR) 영상제공을 위한 스핀 라벨 (또한 공지된 자기 공명 영상제공, MRI 을 위한 것), 예컨대 I123 및, I131, In111, F19, C13, N15, O17, 가돌리늄, 망간 또는 철을 포함할 수 있다.
항체 및 세포독성제의 컨쥬게이트는 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오) 프로피오네이트 (SPDP), 숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸) 시클로헥산-1-카르복실레이트 (SMCC), 이미노티올란 (IT), 이미도에스테르의 이관능성 유도체 (예컨대, 디메틸 아디프이미데이트 HCl), 활성 에스테르 (예컨대 디숙신이미딜 수베레이트), 알데히드 (예컨대 글루타르알데히드), 비스-아지도 구성성분 (예컨대, 비스 (p-아지도벤조일) 헥산 디아민), 비스-디아조늄 유도체 (예컨대 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌 디아민), 디이소시아네이트 (예컨대, 톨루엔 2,6-디이소시아네이트), 및 비스-활성 불소 구성성분 (예컨대, 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠) 과 같은 다양한 이관능성 단백질 커플링제를 이용해 제조될 수 있다. 예를 들어, 리신 면역독소가 문헌 [Vitetta, E.S., 등, Science 238 (1987) 1098-1104] 에 기재된 바와 같이 제조될 수 있다. 카본-14-표지된 1-이소티오시아나토벤질-3-메틸디에틸렌 트리아민 펜타 아세트산 (MX-DTPA) 은 항체에 대한 방사핵종의 컨쥬게이션을 위한 예시 킬레이트제이다 (WO 94/11026 참조). 독성 모이어티를 본원에 보고된 복합체에 컨쥬게이션하기 위한 링커는 세포에서 세포독성 약물의 방출을 돕는 절단가능한 링커일 수 있다. 예를 들어 산-반응성 링커, 펩티다아제-감응성 링커, 광반응성 링커, 디메틸 링커, 또는 디설파이드-포함 링커 (Chari, R.V., 등, Cancer Res. 52 (1992) 127-131, US 5,208,020) 가 사용될 수 있다.
본원의 면역컨쥬게이트 또는 ADC 는, 이에 제한되지 않으나 BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, 술포-EMCS, 술포-GMBS, 술포-KMUS, 술포-MBS, 술포-SIAB, 술포-SMCC, 및 술포-SMPB, 및 시판하여 입수가능한 SVSB (숙신이미딜-(4-비닐술폰)벤조에이트) (예를 들어, Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., U.S.A) 을 포함한 가교제를 이용해 제조된 그러한 컨쥬게이트를 명시적으로 포함한다.
E. 진단 및 검출을 위한 방법 및 조성물
본원에 사용된 용어 검출은 정성적 또는 정량적 검출을 포함한다.
한 구현예에서, 진단 또는 검출 방법에 사용하기 위한 항-바이오틴 항체가 제공된다. 그러한 방법은 시험관내 또는 생체내 방법일 수 있다.
특정 구현예에서, 표지된 항-바이오틴 항체가 제공된다. 표지에는, 이에 제한되지 않으나, 직접적으로 검출되는 표지 또는 부분 (예컨대 형광, 발색단, 전자-밀도, 화학발광 및 방사능 표지) 뿐 아니라, 예를 들어, 효소 반응 또는 분자 상호작용을 통해 간접적으로 검출되는 부분, 예컨대 효소 또는 리간드가 포함된다. 예시적인 표지에는 방사능동위원소 32P, 14C, 125I, 3H, 및 131I, 형광단, 예컨대 희토류 킬레이트 또는 플루오레세인 및 이의 유도체, 로다민 및 이의 유도체, 단실, 움벨리페론, 루시페라아제, 예를 들어, 반딧불 루시페라아제 및 박테리아 루시페라아제 (US 4,737,456), 루시페린, 2,3-디히드로프탈라진디온, 호스래디시 퍼옥시다아제 (HRP), 알칼리 포스파타아제, β-갈락토시다아제, 글루코아밀라아제, 라이소자임, 당류 옥시다아제, 예를 들어, 글루코오스 옥시다아제, 갈락토오스 옥시다아제, 및 글루코오스-6-포스페이트 데히드로게나아제, 헤테로시클릭 옥시다아제, 예컨대 헤테로시클릭 옥시다아제, 예컨대 유리카아제 및 잔틴 옥시다아제 (염료 전구체를 산화시키기 위해 과산화수소를 사용하는 효소와 커플링됨), 예컨대 HRP, 락토퍼록시다아제, 또는 마이크로퍼옥시다아제, 비오틴/아비딘, 스핀 라벨, 박테리오파지 표지, 안정한 자유 라디칼 등이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다.
F. 약제학적 제형물
본원에 기재된 항-바이오틴 항체의 약제학적 조성물은 원하는 순도를 갖는 이러한 항체를 하나 이상의 임의의 약학적으로 허용가능한 담체 (Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. (ed.), (1980)) 와 혼합함으로써, 동결건조된 제형 또는 수용액의 형태로 제조된다. 약제학적으로 허용가능한 담체는 일반적으로 사용되는 투여량 및 농도에서 수용자에게 무독성이고, 완충액, 예컨대 포스페이트, 시트레이트 및 기타 유기 산; 아스코르브산 및 메티오닌을 비롯한 항산화제; 보존제 (예컨대, 옥타데실 디메틸벤질 염화암모늄; 염화헥사메토늄; 염화벤즈알코늄; 염화벤제토늄; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 알킬 파라벤, 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레소르시놀; 시클로헥사놀; 3-펜타놀; 및 m-크레솔); 저 분자량 (약 10 개 미만의 잔기) 폴리펩티드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예컨대 폴리 (비닐피롤리돈); 아미노산, 예컨대 글라이신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 라이신; 단당류, 이당류 및 글루코오스, 만노오스 또는 덱스트린을 비롯한 기타 탄수화물; 킬레이트제, 예컨대 EDTA; 당, 예컨대 수크로오스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염-형성 반대-이온, 예컨대 나트륨; 금속 착물 (예를 들어, Zn-단백질 착물); 및/또는 비-이온성 계면활성제, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다. 본원의 예시적인 약제학적으로 허용가능한 담체에는 추가로 사이질 약물 분산액 제제, 예컨대 가용성 중성-활성 히알루로니다아제 당단백질 (sHASEGP), 예를 들어, 인간 가용성 PH-20 히알루로니다아제 당단백질, 예컨대 rhuPH20 (HYLENEX®, Baxter International, Inc.) 이 포함된다. rhuPH20 을 비롯한, 특정의 예시적인 sHASEGP 및 사용 방법은 US 2005/0260186 및 US 2006/0104968 에 기재되어 있다. 한 국면에서, sHASEGP 는 하나 이상의 부가적인 글리코사미노글리카나아제, 예컨대 콘드로이티나아제와 조합된다.
예시적인 동결건조된 항체 제형은 US 6,267,958 에 기재되어 있다. 수성 항체 제형에는 US 6,171,586 및 WO 2006/044908 에 기재된 것들이 포함되고, 상기 제형은 히스티딘-아세테이트 완충액을 포함한다.
본원의 제형은 또한 치료되는 특정 증상에 필요한 것인 1 개 초과의 유효 성분, 바람직하게는 서로에게 악영향을 주지 않는 상보적 활성을 가진 것들을 함유할 수 있다. 예를 들어, 추가로 제공하는 것이 바람직할 수 있다 [[항-바이오틴 항체와 병용가능한 약물 목록]]. 이러한 활성 성분은 의도되는 목적에 유효한 양으로조합하여 적합하게 존재한다.
유효 성분은 예를 들어, 코아세르베이션 (coacervation) 기법에 의해 또는 계면 중합에 의해 제조된 마이크로캡슐, 예를 들어, 각각 콜로이드성 약물 전달 시스템 (예를 들어, 리포좀, 알부민 마이크로스피어, 마이크로에멀젼, 나노-입자 및 나노캡슐) 내에 또는 마크로에멀젼 내에 히드록시메틸셀룰로오스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸 메타크릴레이트) 마이크로캡슐 내에 포획될 수 있다. 이러한 기법은 문헌 Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. (ed.) (1980) 에 기재되어 있다.
서방성 제제가 제조될 수 있다. 서방성 제제의 적합한 예에는 항체를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반-투과성 매트릭스가 포함되며, 상기 매트릭스는 성형품의 형태, 예를 들어, 필름, 또는 마이크로캡슐이다.
생체 내 투여에 사용하고자 하는 제형은 일반적으로 멸균된다. 멸균은, 예를 들어, 멸균 여과 막을 통한 여과에 의해 쉽게 달성될 수 있다.
G. 치료 방법 및 조성물
본원에서 제공하는 임의의 항-바이오틴 항체가 치료 방법에 이용될 수 있다.
한 국면에서, 의약으로 사용하기 위한 항-바이오틴 항체가 제공된다. 특정 구현예에서, 치료 방법에 사용하기 위한 항-바이오틴 항체가 제공된다.
추가 국면에서, 본 발명은 의약의 제조 또는 제작에서의 항-바이오틴 항체의 용도를 제공한다.
추가 국면에서, 본 발명은 본원에서 제공하는 임의의 항-바이오틴 항체를 함유하는 약제학적 제형물을 제공하나. 한 국면에서, 약제학적 제형물은 본원에서 제공하는 항-바이오틴 항체 및 약제학적으로 허용되는 담체를 함유한다.
본 발명의 항체는 단독으로 또는 타 요법과 병용하여 이용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항체는 하나 이상의 추가적인 치료제와 함께 투여될 수 있다.
상기 명시된 이러한 병용 요법은 병용 투여 (2 가지 이상의 치료제가 동일한 또는 별도의 제형 내에 포함됨), 및 개별 투여를 포함하는데, 이 경우 본 발명의 항체의 투여는 부가적인 치료제 및/또는 면역보강제의 투여 전에, 이와 동시에 및/또는 이후에 일어날 수 있다. 본 발명의 항체는 또한 방사선 요법과 병용하여 사용될 수 있다.
본 발명의 항체 (및 임의의 부가적인 치료제) 는 비경구, 폐내, 및 비강내, 및, 국소 치료가 요망되는 경우, 병반내 투여를 비롯한 임의의 적합한 방식에 의해 투여될 수 있다. 비경구 주입에는 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내, 또는 피하 투여가 포함된다. 투여는 임의의 적합한 경로에 의해, 예를 들어 주사, 예컨대 부분적으로는 투여가 간단한지 또는 만성적인지에 따라, 정맥내 또는 피하 주사에 의해 실시될 수 있다. 다양한 시점에 걸친 단일 또는 다중 투여, 일시 투여 및 펄스 주입을 포함하나 이에 제한되지 않는 다양한 투여 스케줄이 본원에서 고려된다.
본 발명의 항체는 양호한 의료적 실시와 일치하는 방식으로 제형화되고, 투약되고, 투여될 것이다. 본 문맥에서 고려되는 인자에는, 치료할 특정 질환, 치료할 특전 포유류, 개별 환자의 임상적 상태, 질환의 원인, 제제의 전달 부위, 투여 방법, 투여 스케쥴, 및 의사에게 공지된 기타 인자가 포함된다. 항체는 반드시 그런 것은 아니지만, 논의되는 질환을 예방하거나 치료하기 위해 현재 사용되는 하나 이상의 작용제와 함께 임의로 제형화될 필요도 있다. 이러한 기타 제제의 유효량은 제형 내에 존재하는 항체의 양, 질환 또는 치료의 유형, 및 상기 논의된 기타 인자에 따라 다르다. 이들은 일반적으로 본원에 기재된 것과 동일한 투여량과 투여 경로로, 또는 본원에 기재된 투여량의 약 1 내지 99% 로, 또는 경함적으로/임상적으로 적합한 것으로 결정되는 임의의 투여량 및 임의의 경로로 사용된다.
질환의 예방 또는 치료를 위해, 본 발명의 항체 (단독으로 또는 하나 이상의 기타 부가적인 치료제와 조합으로 사용되는 경우) 의 적합한 투여량은 치료하고자 할 질환의 유형, 항체의 유형, 질환의 경중도 및 경과, 항체가 예방적 또는 치료적 목적을 위해 투여되는지의 여부, 이전 요법, 환자의 임상적 이력 및 항체에 대한 반응, 및 주치의의 재량에 따라 다를 것이다. 항체는 환자에게 1 회에 또는 일련의 치료에 걸쳐 적합하게 투여된다. 질환의 유형 및 경중도에 따라, 약 1 μg/kg 내지 15 mg/kg (예를 들어, 0.5 mg/kg - 10 mg/kg) 의 항체는, 예를 들어, 1 회 이상의 개별 투여에 의한, 또는 연속 주입에 의한 것이든지 환자에 대한 투여를 위한 초기 후보 투여량일 수 있다. 하나의 전형적인 일일 투여량은 상기 언급되는 인자에 따라, 약 1 μg/kg 내지 100 mg/kg 이상의 범위일 것이다. 상태에 따라, 수 일 또는 그 이상의 기간에 걸친 반복된 투여를 위해서는, 치료는 일반적으로 질환 증상의 원하는 억제가 일어날때까지 지속될 것이다. 항체의 하나의 예시적인 투여량은 약 0.05 mg/kg 내지 약 10 mg/kg 의 범위일 것이다. 따라서, 약 0.5 mg/kg, 2.0 mg/kg, 4.0 mg/kg 또는 10 mg/kg (또는 이의 임의의 조합) 의 1 회 이상의 투여량이 환자에게 투여될 수 있다. 이러한 투여량은 간헐적으로, 예를 들어, 매주 또는 매 3 주 (예를 들어, 환자가 약 2 내지 약 20, 또는 예를 들어, 약 6 투여량의 항체를 수여받는 식) 투여될 수 있다. 초기의 높은 적재 투여량, 후 1 회 이상의 적은 투여량이 투여될 수 있다. 그러한 치료요법의 진행은 통상적인 기법 및 검정법에 의해 용이하게 모니터링된다.
상기 임의의 제형물 또는 치료 방법은 항-바이오틴 항체 대신에 또는 이에 더해 본 발명의 면역컨쥬게이트를 사용하여 실시될 수 있다는 것으로 이해된다.
III. 제조품
본 발명의 또다른 국면에서, 상기 기재된 질환의 치료, 예방 및/또는 진단에 유용한 물질을 함유하는 제조품이 제공된다. 제조품은 용기 및 용기 상의 또는 용기와 연관된 라벨 또는 패키지 삽입물을 포함한다. 적합한 용기에는, 예를 들어, 병, 바이알, 주사기, IV 용액 백 등이 포함된다. 상기 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 물질로 형성될 수 있다. 용기는 조성물 그 자체 또는 상태의 치료, 예방 및/또는 진단에 효과적인 또다른 조성물과 조합된 조성물을 담고 있으며, 멸균 접근 포트 (예를 들어, 용기는 피하 (hypodermic) 주사 바늘에 의해 관통가능한 마개를 가진 정맥내 용액 백 또는 바이알일 수 있음) 를 가질 수 있다. 조성물 내 하나 이상의 활성제는 본 발명의 항체이다. 라벨 또는 패키지 삽입물은 조성물이 선택되는 상태를 치료하기 위해 사용되는 것을 표시한다. 게다가, 제조품은 하기 요소를 포함할 수 있다: (a) 내부에 함유된 조성물이 있는 제 1 용기, 상기 조성물은 본 발명의 항체를 포함함; 및 (b) 내부에 함유된 조성물이 있는 제 2 용기, 상기 조성물은 추가의 세포독성제 또는 그렇지 않으면 치료제를 포함함. 본 발명의 상기 구현예에서 제조품은 조성물이 특정 상태를 치료하기 위해 사용될 수 있다는 것을 나타내는 패키지 삽입물을 추가로 포함할 수 있다. 대안적으로, 또는 부가적으로는, 제조품은 약학적으로-허용가능한 완충액, 예컨대 세균발육저지 주사용수 (BWFI), 인산염-완충 식염수, 링거 (Ringer) 용액 및 덱스트로오스 용액을 포함하는 제 2 (또는 제 3) 용기를 추가로 포함할 수 있다. 이것은 기타 완충액, 희석제, 필터, 바늘, 및 주사기를 비롯해서, 판매자 및 사용자 관점으로부터 바람직한 기타 물질을 추가로 포함할 수 있다.
임의의 상기 제조품에 항-바이오틴 항체 대신에 또는 이 외에도 본 발명의 면역접합체가 포함될 수 있는 것으로 이해된다.
IV. 실시예
이하의 내용은 본 발명의 방법 및 조성물의 실시예이다. 상기 제시된 일반적인 설명에 제공된 것에 대한 다양한 여타 구현예가 실시될 수 있음을 이해할 것이다.
실시예 1
마우스 하이브리도마 유래의 카파 경쇄가 있는 IgG1 클래스의 쥐과동물 항-바이오틴 항체의 VH 및 VL 도메인을 인코딩하는 cDNA 의 단리 및 특징분석
쥐과동물 합텐-바이오틴 항체의 VH 및 VL 도메인의 단백질 및 (DNA) 서열 정보는 하이브리도마 클론으로부터 직접 수득했다. 후속하여 실행된 실험 단계들은 (i) 항체 생성 하이브리도마 세포로부터 RNA 의 단리, (ii) 상기 RNA 의 cDNA 로의 변환, VH 및 VL 보유 PCR 단편으로의 이동, 및 (iii) 대장균에서의 증식을 위한 상기 PCR 단편의 플라스미드로 벡터 내로의 통합, 및 그들의 DNA (및 도출되는 단백질) 서열의 결정이었다.
하이브리도마 세포로부터 RNA 제조:
RNA 는 5x106 항체 발현 하이브리도마 세포로부터 RNeasy-Kit (Qiagen) 를 이용하여 제조했다. 간략하게, 침강된 세포를 PBS 에서 1 회 세척하고 침강시킨 후, 후속하여 500 ㎕ RLT-Puffer (+β-ME) 에서의 해리를 위해 재현탁시켰다. 세포를 Qiashredder (Qiagen) 에 통과시켜 완전히 해리시킨 후, 제조사에 매뉴얼에 기재된 바와 같이 매트릭스-중재 정제 과정 (ETOH, RNeasy 컬럼) 에 적용시켰다. 최종 세척 단계 후, RNA 를 50 ㎕ RNAse-없는 물에서 컬럼으로부터 회수했다. 회수된 RNA 의 농도는 1:20 희석 시료의 A260 및 A280 를 정량하여 결정했다. 단리된 RNA 시료의 통합성 (품질, 분해 정도) 은 Formamide-Agarose 겔 상의 변성 RNA 겔 전기영동으로 분석했다 (Maniatis Manual 를 참조). 온전한 18s 및 28s 리보솜 RNA 를 나타내는 분리된 밴드가 수득되며, 그러한 밴드의 무결성 (및 약 2:1 강도 비율) 은 RNA 제제의 우수한 품질을 표시한다. 하이브리도마 유래의 단리된 RNA 는 냉동시켜, 분취물로 -80℃ 에서 저장했다.
RACE PCR 에 의한 VH 및 VL 을 인코딩하는 DNA 단편의 생성, 그러한 DNA 단편의 플라스미드로의 클로닝, 및 그들의 DNA- 및 아미노산 서열의 결정:
후속 (RACE-) PCR 반응을 위한 cDNA 를 국제 특허 출원 PCT/EP2011/074273 에 기재된 기법을 적용하여 RNA 제제로부터 제조했다. 후속하여, VH 및 VL-인코딩 PCR 단편을 아가로스 겔 추출에 의해 단리하고, 후속하여 표준 분자생물학 기법에 의해 정제했다. PWO-생성 정제된 PCR 단편을 제조사의 지시사항을 엄격히 준수하여 pCR bluntII topo Kit (Invitrogen) 을 적용해 벡터 pCR bluntII topo 에 삽입했다. Topo-라이게이션 반응물을 대장균 Topo10-one-shot 컴피턴트 세포로 형질전환했다. 이후, VL- 또는 VH 포함 삽입물을 지닌 벡터를 포함한 대장균 클론을 LB-Kanamycin 아가 플레이트 상의 콜로니로서 식별해냈다. 플라스미드를 상기 콜로니로부터 제조하고, 벡터 내 원하는 삽입물의 존재여부를 EcoRI 를 이용한 제한효소 소화에 의해 확인했다. 벡터 골격이 삽입물의 각 측면에 인접해 EcoRI 제한효소 부위를 포함하기 때문에, 삽입물을 보유한 플라스미드는 약 800bp (VL 에 해당) 또는 600 bp (VH 에 해당) 의 EcoRI-방출가능 삽입물을 지닌 것으로 지정했다. VL 및 VH 의 DNA 서열 및 도출되는 단백질 서열을 VH 및 VL 에 대한 다중 클론 상의 자동화된 DNA 서열분석에 의해 결정했다.
항-바이오틴 항체의 쥐과동물 VL 서열은 SEQ ID NO: 08 에 제시한다. 항-바이오틴 항체의 쥐과동물 VH 서열을 SEQ ID NO: 04 에 제시한다.
실시예 2
쥐과동물 항-바이오틴 항체의 VH 및 VL 도메인의 인간화
쥐과동물 바이오틴-결합 항체 muM33 은 다음과 같이 인간화되었다: 카파 경쇄를 지닌 IgG1 클래스의 쥐과동물 항-바이오틴 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하는 아미노산 서열 및 인코딩 서열의 생성 및 특징분석이 WO/2011/003557 및 WO 2011/003780 에 기재되어 있다. 그러한 정보를 바탕으로, 상응하는 인간화된 항-바이오틴 항체 (huM33) 를 인간 생식세포 프레임워크 IGHV1-69-02 및 IGKV1-27-01 조합을 기반으로 생성했다. VL 에 대해, 인간 IGKV1-27-01 의 프레임워크 및 IGKJ2-01 생식세포의 인간 J 구성요소에서의 임의의 백뮤테이션 (backmutation) 을 통합하는 것이 필요하지 않다. 인간화된 VH 는 인간 IGHV1-69-02 생식세포 및 IGHJ4-01-3 생식세포의 인간 J 구성요소를 기반으로 한다. 위치 24 에서의 프레임워크 영역 (A24S) 및 위치 73 에서의 프레임워크 영역 3 (K73T) 에서의 두가지 백뮤테이션이 도입되었다. 인간화된 VH 의 아미노산 서열을 SEQ ID NO: 12 에 제공하며, 인간화된 VL 의 아미노산 서열을 SEQ ID NO: 16 에 제공한다.
실시예 3
바이오틴 존재 하의 쥐과동물 항-바이오틴 Fv 영역의 결합 부위의 결정화 및 X-선 구조 결정
쥐과동물 항-바이오틴 항체의 구조를 결정했다. 따라서, Fab 단편이 정제된 IgG 의 프로테아제 소화에 의해 생성되었고, 후속하여 정제되었으며, 당업계의 널리 공지된 방법에 적용했다 (파파인 소화).
apo Fab 단편 (정제된 Fab) 의 20 mM His-HCl 에서의 결정화를 위해, 140 mM NaCl, pH 6.0 를 13 mg/ml 로 농축했다. 결정화 액적을 증기 확산 시팅 드롭 실험 (vapor diffusion sitting drop experiment) 에서 0.2 ㎕ 의 단백질 용액을 0.2 ㎕ 용기 용액과 혼합하여 21℃ 로 설정했다. 0.1 M Tris pH 8.5, 0.01 M 코발트 클로라이드, 20% 폴리비닐피롤리돈 K15 에서 5 일 내에 결정이 나타났으며, 0.3 mm x 0.06 mm x 0.03 mm 의 최종 크기까지 8 일 내 성장했다.
동결보호제로서의 15% 글리세롤을 이용해 결정을 수확한 후, 액체 N2 에서 급속 냉동시켰다. 100K 의 온도에서 빔 라인 (beam line) X10SA 의 Swiss Light Source 에서 Pilatus 6M 검출기를 이용해 회절 영상을 수집하고, 프로그램 XDS [Kabsch, W., J.Appl. Cryst. 26 (1993) 795-800] 을 이용해 가공했으며, SCALA 을 이용해 스케일하여 [BRUKER AXS 로부터 수득함], 해상도 2.22Å 의 데이터를 수득했다. 그러한 Fab 단편 결정은 a=90.23Å, b=118.45Å, c=96.79Å 및 β=117.53°의 셀 크기를 지닌 모노클리닉 공간 그룹 (monoclinit space) P21 에 속하며, 결정학상 비대칭 단위체 당 4개의 Fab 분자를 포함한다 (표 2 참조).
CCP4 소프트웨어 제품군으로부터의 표준 결정학적 프로그램이 검색 모델로서의 PDB entry 3PQP 를 이용한 분자 치환에 의한 구조 규명, 전자 밀도 산출 및 x-선 구조의 재정비에 이용되었다 [CCP4 (Collaborative Computational Project, N. The CCP4 suite: programs for protein crystallography. Acta Crystallogr.D (1994) 760-763]. 구조 모델은 COOT (Emsley, P., et al., Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 60 (2010) 486-501) 을 이용해 전자 밀도로 리빌트했다. 좌표는 REFMAC5 (Murshudov, G.N., et al., Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 53 (1997) 240-255) 및 autoBUSTER (Global Phasing Ltd.) 을 이용해 재정비했다.
표 2: 모노클리닉 muM33 Fab 단편 아포-결정 (apo-crystal) 에 대한 데이터 집합 및 구조 재정비 통계
Figure pct00002
1 괄호 안의 값은 최고 해상도 빈 (resolution bins).
2 Rmerge=∑│I-<I>│/∑I (식 중, I 는 통합성임).
3 Rcryst=∑│Fo-<Fc>│/∑Fo (식 중, Fo 는 실측값이고, Fc 는 산출된 구조 인자 진폭임).
4 Rfree 은 재정비 동안 생략된 전체 데이터의 5% 를 근거로 산출되었음.
5 PROCHECK 을 이용해 산출됨[Laskowski, R.A., MacArthur, M.W., Moss, D.S. & Thornton, J.M. PROCHECK: a program to check the stereochemical quality of protein structure. J.Appl. Crystallogr. 26, 283-291 (1993)].
침지 실험에 사용된 Fab 의 바이오틴-유도체 apo 결정을 지닌 복합체 내 Fab-단편의 결정화를 위해 단편을 스크리닝 후 3 일 내에 0.8 M 숙신산으로부터 유도해 냈고, 5 일 내에 최종 크기 0.25 mm x 0.04 mm x 0.04 mm 로 생장시켰다. 바이오시틴아미드를 물에 100 mM 로 녹였다. 후속하여, 화합물을 결정화 용액 중에 10 mM 작용 농도로 희석했으며, 결정화 액적 내 결정에 적용했다. 결정을 2 ㎕ 의 10 mM 화합물 용액으로 3 회 세척하고, 최종적으로 바이오시틴아미드와 함께 21℃ 에서 16 시간 동안 인큐베이션했다.
결정을 동결보호제로서의 15% 글리세롤을 이용해 수합하고, 이어서 액체 N2 에서 신속 냉동시켰다. Pilatus 6M 검출기를 이용해 100 K 의 온도에서 Swiss Light Source 의 빔 라인 (beam line) X10SA 에서 상이한 이미지를 수집하고, 프로그램 XDS 를 이용해 가공하고 [Kabsch, W., J.Appl. Cryst. 26 (1993) 795-800], SCALA [BRUKER AXS 로부터 입수] 를 이용해 측정하여, 2.35 Å 해상도로 데이터를 수득했다. 그러한 Fab 단편 결정은 a=89.09Å, b=119.62Å, c=96.18Å 및 β=117.15 의 셀 치수를 지닌 모노클리닉 스페이스 그룹 P21 에 속하며, 결정학 비대칭 단위 마다 4 개의 Fab 분자를 포함한다 (표 3 참조).
CCP4 소프트웨어 제품군으로부터의 표준 결정학 프로그램을 검색 모델로서의 apo Fab 단편의 좌표를 이용한 분자 치환에 의한 구조 규명, 전자 밀도의 산출, 및 x-선 구조의 해상도 2.5Å 의 재정비에 이용했다 [CCP4 (Collaborative Computational Project)]. 구조 모델은 COOT (Emsley, P., et al., Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 60 (2010) 486-501) 를 이용해 전자 밀도로 리빌트했다. 좌표는 REFMAC5 (Murshudov, G.N., et al., Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 53 (1997) 240-255) 및 autoBUSTER (Global Phasing Ltd.) 을 이용하여 재정비했다.
표 3: 모노클리닉 muM33 Fab 단편 바이오시티딘아미드 복합체 결정에 대한 데이터 집합 및 구조 재정비
Figure pct00003
1 괄호 안의 값은 최고 해상도 빈 (resolution bins).
2 Rmerge=∑│I-<I>│/∑I (식 중, I 는 통합성임).
3 Rcryst=∑│Fo-<Fc>│/∑Fo (식 중, Fo 는 실측값이고, Fc 는 산출된 구조 인자 진폭임).
4 Rfree 은 재정비 동안 생략된 전체 데이터의 5% 를 근거로 산출되었음.
5 PROCHECK 을 이용해 산출됨 [Laskowski, R.A., et al., J.Appl. Crystallogr. 26 (1993) 283-291].
복합체의 결정 형태는 모든 Fab 분자에 의해 유사하게 결합되어 있는 바이오시틴아미드가 있는, 비대칭 단위체 중의 4 개의 독립적인 바이오시틴아미드:항-바이오틴 Fab 복합체를 포함했다. 바이오시티딘아미드는 중쇄의 CDR 1 및 3 및 모든 3 개의 경쇄 CDR 에 의해 형성되는 포켓 내에 결합되어 있다. 리간드의 결합 포켓은 중쇄 유래의 잔기 ASN29, ASP31, THR32, PHE33, GLN35, TRP99 및 TRP106, 및 경쇄 유래의 ASN31, TYR32, LEU33, SER34, TYR49, SER50, PHE91 및 TYR96 에 의해 정해진다. 바이오틴 헤드 기는 포켓의 한 말단에서 CDR2 및 CDR1 의 잔기와 수소 결합을 형성하고: 바이오시틴아미드의 N3 은 Ser50 의 히드록실-산소와 상호작용하는 반면, O22 는 동일 잔기의 골격-아미드 질소와 접촉한다. 추가로, 바이오시틴아미드의 O22 가 또한 Ser34 의 히드록실기 산소에 수소-결합되어 있다. 그에 추가하여, 소수성 상호작용이 결합 포켓을 잇는 바이오시틴아미드 및 방향족 측쇄 사이에서 관찰된다. 바이오틴의 (CH2)4 지방족 테일 말단의 아미드 결합은 중쇄 CDR1 의 PHE33 상에 쌓이며, PHE33 의 골격 아미드 질소 및 Asp31 에 대한 추가적인 수소 결합에 의해 안정화된다. 이는 아미드 질소에 위치하는데, 이는 활성 본체에 대한 연결 부위이고, 질소 이후에 존재하는 원자들이 결합 포켓으로부터 용매를 향하게 된다.
2.5Å 의 해상도에서의 결합 영역의 실험적 결정 결과는 리간드의 그의 항체에 대한 결합 방식의 특징분석을 가능케 하는데, 이는 더욱 상세한 모델구현 및 재조합 바이오틴 결합 모듈의 단백질 조작을 통한 추가적인 개선을 위한 전제조건이다.
실시예 4
재조합 항-바이오틴 항체의 조성, 발현 및 정제
쥐과동물 및 인간화된 항-바이오틴 항체 가변 영역을 인간 기원의 불변 영역과 조합하여, 단일- 또는 이중특이적 키메라 또는 인간화된 항체를 제공했다.
바이오틴 뿐만 아니라 상이한 비-바이오틴 표적 (예를 들어, 수용체 타이로신 키나아제 또는 IGF-1R) 에 특이적으로 결합하는 단일특이적 인간화된 항-바이오틴 항체 및 이중특이적 인간화된 항-바이오틴 항체의 생성은 다음과 같은 조건을 필요로 한다: (i) 해당 분자에 대한 아미노- 및 뉴클레오티드 서열의 고안 및 정의, (ii) 형질주입된 배양된 포유류 세포에서의 그러한 분자들의 발현, 및 (iii) 형질 주입된 세포 상청액으로부터의 그러한 분자들의 정제. 그러한 단계들이 PCT/EP2011/074273 에 기재된 선행기술과 같이 수행되었다.
일반적으로, (원래의) 쥐과동물 항-바이오틴 항체의 결합 특이성을 지닌 IgG 클래스의 인간화된 항체 생성을 위해서는, 인간화된 VH 서열을 프레임 내에서 서브클래스 IgG1 의 인간 Fc-영역의 CH1-hinge-CH2-CH3 의 N-말단에 융합했다. 유사하게, 인간화된 VL 서열을 프레임 내에서 인간 CLkappa 불변 영역의 N-말단에 융합했다.
바이오틴-결합 특이성 뿐만 아니라 타 표적에 대한 특이성도 포함하는 이중특이적 항체 유도체 생성을 위해서는, 항-바이오틴 항체, scFv 또는 Fab 단편을 프레임 내에서 선행기술에서 기재된 항체의 중쇄의 C-말단에 융합했다. 많은 경우에, 적용된 항-합텐 scFv 은 선행기술에 기술된 바 있는 VH44-VL100 디설파이드 결합의 도입에 의해 추가로 안정화했다 (예를 들어, Reiter, Y., et al., Nature biotechnology 14 (1996) 1239-1245).
발현 플라스미드:
발현 플라스미드는 포유류 세포 발현 벡터에서 따로따로 어셈블되는 중쇄 및 경쇄의 발현을 위한 발현 카셋트를 포함한다.
이에, 개별 구성요소를 인코딩하는 유전자 분절을 상기 개요한 바와 같이 합했다.
코돈 이용이 추정될 수 있는 인간 경쇄 및 중쇄의 뉴클레오티드 서열에 관한 일반적κ인 정보는 다음의 참고문헌에 제시되어 있다: Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication No 91-3242-.
경쇄의 전사 단위체는 이하의 구성요소를 포함하여 이루어진다:
- 인간 싸이토메갈로바이러스 (hCMV) 유래의 극초기 인핸서 (immediate early enhancer) 및 프로모터,
- Kozak 서열을 포함하는 합성 5'-UT,
- 신호 서열 인트론을 포함하는, 쥐과동물 면역글로불린 중쇄 신호 서열,
- 5' 말단의 고유의 BsmI 제한효소 부위 및 스플라이스 공여자 부위 및 3' 말단의 고유의 NotI 제한효소 부위가 정렬되어 있는 클로닝된 가변 경쇄 cDNA,
- 인트론 2 마우스 Ig-κ인핸서를 포함한 유전체 인간 κ-유전자 불변 영역 (Picard, D., and Schaffner, W. Nature 307 (1984) 80-82), 및
- 인간 면역글로불린 κ-폴리아데닐화 ("poly A") 신호 서열.
γl-중쇄의 전사 단위는 다음과 같은 구성요소를 포함하여 이루어진다:
- 인간 싸이토메갈로바이러스 (hCMV) 유래의 극초기 인핸서 (immediate early enhancer) 및 프로모터,
- Kozak 서열을 포함하는 합성 5'-UT,
- 신호 서열 인트론을 포함하는, 개질된 쥐과동물 면역글로불린 중쇄 신호 서열,
- 5' 말단의 고유의 BsmI 제한효소 부위 및 스플라이스 공여자 부위 및 3' 말단의 고유의 NotI 제한효소 부위가 정렬되어 있는 클로닝된 단일특이적 가변 중쇄 cDNA 또는 클로닝된 이중특이적 융합 scFv-가변 중쇄 cDNA,
- 마우스 Ig μ-인핸서를 포함하는, 유전체 인간 γl- 중쇄 유전자 불변 영역 (Neuberger, M.S., EMBO J.2 (1983) 1373-1378), 및
- 인간 γl-면역글로불린 폴리아데닐화 ("polyA") 신호 서열.
κ-경쇄 및 γl-중쇄 발현 카셋트 이외에, 상기 플라스미드는 이하의 것을 포함한다:
- 히그로마이신 내성 유전자,
- Epstein-Barr 바이러스 (EBV) 의 복제의 기원, oriP,
- 대장균에서 상기 플라스미드의 복제를 가능케 하는, 벡터 pUC18 유래의 복제의 기원, 및
- 대장균에 앰피실린 내성을 부여하는 β-락타마아제 유전자.
재조합 DNA 기법:
클로닝은 문헌 [Sambrook, J., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)] 에 기재된 표준 클로닝 기법을 이용해 실행했다. 모든 분자 생물학 시약은 (달리 기재되지 않더라도) 시판하여 입수가능하며, 제조사의 지시사항에 따라 사용했다.
코딩 서열, 돌연변이 또는 추가 유전자 구성요소를 포함하는 DNA 는 Geneart AG 사 (Regensburg 소재) 에서 합성했다.
DNA 서열은 SequiServe (SequiServe GmbH, 독일) 에서 수행한 이중 가닥 서열분석에 의해 결정했다.
DNA 및 단백질 서열 분석 및 서열 데이터 관리:
Vector NTI Advance 제품군 버젼 9.0 을 서열 생성, 맵핑, 분석, 주석첨삭 및 설명에 이용했다.
항-바이오틴 항체 및 유도체의 발현:
항-바이오틴 항체를 현탁액 중의 인간 태아 신장 293 (HEK293) 세포의 일시적 형질주입에 의해 발현했다. 이를 위해, 해당하는 단일- 또는 이중특이적 항체의 경쇄 및 중쇄를 상기 개요한 바와 같은 원핵 및 진핵 선별 마커를 보유한 발현 벡터에서 구축했다. 그러한 플라스미드를 대장균에서 증폭하고, 정제하고, 후속하여 일시적 형질주입에 적용했다. 문헌 [Current Protocols in Cell Biology (2000), Bonifacino, J.S., Dasso, M., Harford, J.B., Lippincott-Schwartz, J.and Yamada, K.M. (eds.), John Wiley & Sons, Inc.] 에 기재된 바와 같은 표준 세포 배양 기법을 세포 취급에 이용했다.
세포를 37℃C/8% CO2 의 적절한 발현 배지에서 배양했다. 형질주입일에, 세포를 1-2 x 106 개의 살아있는 세포/ml 의 밀도로 새로운 배지에 시딩했다. 형질주입 시약과의 DNA-복합체를 최종 형질주입 부피 250 ml 에 대해 250 ㎍ 의 중쇄 및 경쇄 플라스미드 DNA 를 1:1 몰비로 함유하는 Opti-MEM I 배지 (Invitrogen, USA) 에서 제조했다. 세포 배양 상청을 포함하는 단일특이적 또는 이중특이적 항체는 14,000 g 에서 30 분간 원심분리에 의한 형질주입 및 멸균 필터 (0.22 ㎛) 를 통한 여과 후 7 일간 정화했다.
세포 배양 상청에서의 항체 및 유도체의 농도 결정을 위해, 친화성 HPLC 크로마토그래피를 적용했다. 이를 위해, 단백질-A 에 결합하는 단일특이적- 또는 이중특이적 항체 또는 그의 유도체를 포함하는 세포 배양 상청을 200 mM KH2PO4, 100 mM 소듐 시트레이트, pH 7.4 를 포함하는 용액 중의 Applied Biosystems Poros A/20 컬럼에 적용했다. 크로마토그래피 재료로부터의 용리는, 200 mM NaCl, 100 mM 시트르산, pH 2.5 을 함유하는 용액을 적용하여 실행했다. UltiMate 3000 HPLC system (Dionex) 를 이용했다. 용리된 단백질을 UV 흡광 및 피크 면적의 적분에 의해 정량했다. 정제된 IgG1 항체를 표준으로 제공했다.
항-바이오틴 항체의 정제:
형질주입 후 7 일째에 HEK 293 세포 상청액을 수합했다. 그에 포함된 재조합 항체를 A-SepharoseTM 친화성 크로마토그래피 (GE Healthcare, 스웨덴) 및 Superdex200 크기 배제 크로마토그래피를 이용하는 치환성 크로마토그래피에 의해 2 단계에서 상청액으로부터 정제했다. 간략하게, 항체 포함 정화 세포 상청액을, PBS 완충액 (10 mM Na2HPO4, 1 mM KH2PO4, 137 mM NaCl 및 2.7 mM KCl, pH 7.4) 을 이용해 평형화시킨 MabSelectSuRe Protein A (5-50 ml) 컬럼 상에 적용했다. 결합되지 않은 단백질을 평형화 완충액을 이용해 세척해 냈다. 항체 (또는 -유도체) 를 50 mM 시트레이트 완충액, pH 3.2 을 이용해 용리했다. 단백질 포함 분획을 0.1 ml 2 M Tris 완충액, pH 9.0 을 이용해 중화했다. 이어서, 용리된 단백질 분획을 모으고, Amicon Ultra centrifugal 필터 기기 (MWCO: 30 K, Millipore) 를 이용해 농축하고, 20 mM 히스티딘, 140 mM NaCl, pH 6.0 을 이용해 평형화된 Superdex200 HiLoad 26/60 겔 여과 컬럼 (GE Healthcare, 스웨덴) 상에 로오딩했다. 정제된 항체 및 유도체의 단백질 농도를, 문헌 [Pace, et al., Protein Science 4 (1995) 2411-2423] 에 따라 아미노산 서열 상에서 산출된 몰 흡수 계수를 이용하여, 배경 보정으로서 320 nm 에서의 OD 를 이용한 280 nm 에서의 광학 밀도 (OD) 를 결정에 의해 결정했다. 단량체 항체 분획을 모으고, 스냅-냉동 (snap-frozen) 시키고, -80℃ 에서 저장했다. 시료 중 일부를 후속 단백질 분석 및 특징분석에 제공했다.
항체의 동종성은 환원제 (5 mM 1,4-디티오트레이톨) 의 존재 및 부재 하의 SDS-PAGE 및 Coomassie 블릴런트 블루를 이용한 염색으로 확인했다. NuPAGE Pre-Cast 겔 시스템 (Invitrogen, USA) 은 제조사의 지시사항에 따라 사용했다 (4-20% Tris-Glycine 겔).
환원 조건 하에, IgG 와 관련된 폴리펩티드 사슬이 SDS-PAGE 상에서 산출된 분자량과 명확히 유사한 분자 크기로 나타났다. 모든 구축물의 발현 수준은 단백질-A 로 분석했다. 평균 단백질 수율은 그러한 비-최적화 일시적 발현 실험에서 세포-배양 상청액 리터 당 정제된 단백질 6 mg 내지 35 mg 였다.
도 1 은 바이오틴 및 바이오틴 유도체에 결합하는 인간화된 항체의 발현 및 정제 결과를 보여준다. 환원 및 비-환원 SDS PAGE 는 단백질 A (MabSelect) 및 SEC 를 이용한 정제 후 Kabat 에 따른 위치 53 에 시스테인이 존재 및 부재하는 인간화된 항체의 조성 및 동종성을 보여준다. 분자량 마커는 비-표지 레인에 있다. 항체 Antibody H-사슬 (50k 의 상단 밴드) 및 L-사슬 (25k 의 하단 밴드) 는 환원 조건 하에 가시적인 양의 추가적인 단백질 불순물 없이도 고유의 밴드로서 검출가능하다.
실시예 5
재조합 인간화된 항-바이오틴 항체의 바이오틴-표지 화합물 (바이오틴화된 화합물) 에 대한 결합
Kabat 의 번호지정에 따라 HVR-H2 에서 위치 53 에 시스테인을 지닌 재조합 키메라 및 인간화된 항-바이오틴 항체 및 이들의 변이체의 결합 특성은 Octet QK 장치 (Fortebio Inc.) 를 이용하는 바이오레이어 간섭법 (biolayer interferometry) (BLI) 기법에 의해 분석했다. 상기 시스템은 분자 상호작용의 연구용으로 확립되어 있다. BLi-기법은 바이오센서 팁의 표면 및 내부 표준으로부터 반사되는 백색광의 간섭 패턴의 측정을 기반으로 한다. 분자의 바이오센서 팁에 대한 결합은 측정가능한 간섭 패턴의 변동을 가져온다. 상기 기재된 인간과 과정이 항-바이오틴 항체의 바이오틴에 결합하는 능력을 감퇴시키는지 여부를 분석하기 위해, 키메라 및 인간화된 버젼의 항체의 바이오틴결합된 단백질에 결합하는 그들의 능력에서의 특성을 직접 비교했다. 결합 조사는 anti-huIgG Fc antibody Capture (AHC) Biosensors (Fortebio Inc.) 상에서 항-바이오팅 항체를 포획하여 실시했다. 먼저, 바이오센서를 20 mM 히스티딘, 140 mM NaCl, pH 6.0 중에서 0.5 mg/ml 의 농도로 1 분간 항체 용액에서 인큐베이션했다. 이후, 바이오센서를 1 분간 1x PBS pH 7.4 에서 인큐베이션하여 안정한 기준선에 도달했다. 결합은 20 mM 히스티딘, 140 mM NaCl, pH 6.0 중에 0.06 mg/ml 의 농도로 5 분간 바이오틴결합된 단백질을 포함하는 용액에서 항체-코팅된 바이오센서를 인큐베이션하여 측정했다. 해리는 5 분간 1x PBS pH 7.4 에서 모니터링했다. 키메라 및 인간화된 항-바이오틴 항체에 대한 결과로서 수득한 결합 곡선을 직접 비교했다.
인간화된 버젼의 항체는 키메라 항체와 동등하거나 또는 그보다 더 나은 바이오틴결합된 항원의 결합을 나타냈다. Kabat 위치 VH53 에 Cys 돌연변이를 지닌 인간화된 항체에 대해서도 동일했다. 바이오틴결합된 단백질은 바이오센서를 Herceptin 으로 코팅한 경우 감소되는 바이오센서에 대한 잔류된 비특이적인 결합을 나타냈으며, 이는 바이오틴에 결합하지 않는다. 따라서, 항-바이오틴 항체의 관능성은 그의 인간화된 변이체 (SEQ ID NO: 12 및 16, SEQ ID NO: 20 및 24 로 제시되는 서열로 정의됨) 에서 유지되었다.
표면 플라스몬 공명:
표면 플라스몬 공명 측정을 BIAcore T200 기기 (GE Healthcare Biosciences AB, Sweden) 상에서 25℃ 에서 실행했다. 포획 시스템 (Human Antibody Capture Kit, BR-1008-39 (GE Healthcare Biosciences AB 사제, 스웨덴) 으로부터의 10 ㎍/ml Anti-human Capture (IgG Fc)) 의 대략 4300 공명 단위 (RU) 를 GE Healthcare 사에서 공급하는 표준 아민 커플링 키트 (BR-1000-50) 를 이용해 pH 5.0 에서 CM3 chip (GE Healthcare, BR-1005-36) 상에서 커플링했다. 아민 커플링을 위한 전개용 완충액은 HBS-N (10 mM HEPES, pH 7.4, 150 mM NaCl, GE Healthcare, BR-1006-70) 였다. 하기의 결합 조사를 위한 전개용 및 희석용 완충액은 PBS-T (0.05% Tween 20 을 함유하는 10 mM 포스페이트 완충 식염수) pH 7.4 였다. 인간화된 항-바이오틴 항체는 2 nM 용액을 60 초간 5 ㎕/min 의 유속으로 주입해 포획했다. 바이오틴결합된 siRNA 를 PBS-T 을 이용해 0.14 내지 100 nM 의 농도 (1:3 희석 시리즈) 로 희석했다. 결합은 30 ㎕/min 의 유속으로 180 초간 각 농축물을 주입하고, 해리 시간을 600 초로 하여 측정했다. 표면은 5 ㎕/min 의 유속으로 3 M MgCl2 용액을 이용해 30 초간 세척하여 재생시켰다. 데이터는 BIAevaluation 소프트웨어 (GE Healthcare Biosciences AB, 스웨덴) 를 이용해 평가했다. 벌크 굴절율 차이 (Bulk refractive index differences) 를 항-인간 IgG Fc 표면으로부터 수득되는 응답을 차감하여 정정했다. 블랭크 주입값을 또한 차감했다 (= 이중 참조). KD 및 동역학 파라미터 산출을 위해, Langmuir 1:1 모델을 이용했다.
표면 플라스몬 공명 (SPR) 에 의한 동역학 결합 분석은 인간화된 항-바이오틴 항체 SEQ ID NO: 12 및 16 및 인간화된 항-바이오틴 항체 VH53C SEQ ID NO: 20 및 24 에 대해 실행했다. 2 nM 의 농도의 항-바이오틴 항체를 CM3 센서 칩에 결합되어 있는 항-인간 IgG Fc 항체에 의해 포획했다. 바이오틴결합된 siRNA (Mw: 13868 Da) 의 결합은 0.41, 1.23, 3.7, 11.1, 33.3, 100 및 300 nM 의 농도에서 기록했다. 측정을 2 회씩 실시했다. 인간화된 항-바이오틴 항체 및 인간화된 항-바이오틴 항체 VH53C 에 대해 산출된 KD 는 각각 0.633 nM 및 0.654 nM 였다.
실시예 6
바이오틴결합된 화합물의 항-바이오틴 항체를 이용한 비-공유 복합체의 생성
일반적인 방법:
항-바이오틴 항체의 바이오틴결합된 화합물을 이용한 복합체 (= 적재물에 컨쥬게이션된 바이오틴) 의 생성은 정해진 복합체를 결과물로 제공할 것이며, 그러한 복합체 중의 화합물 (=적재물) 이 그의 활성을 유지하도록 해 준다. 바이오틴결합된 화합물의 항-바이오틴 항체를 이용한 복합체의 생성을 위해, 바이오틴결합딘 화합물을 H2O 에 최종 농도가 1 mg/ml 이 되도록 녹였다. 항체를 20 mM 히스티딘 완충액, 140 mM NaCl, pH=6.0 중에 1 mg/ml (4.85 μM) 의 최종 농도로 농축했다. 바이오틴결합된 적재물 및 항체를 피펫의 상하작용에 의해 2:1 몰비 (화합물 대 항체) 로 만들고, 15 분간 RT 에서 인큐베이션했다.
대안적으로, 바이오틴결합된 화합물을 100% DMF 중에 10 mg/ml 의 최종 농도로 녹였다. 항체는 50 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH=8.2 중에 10 mg/ml 의 최종 농도로 농축했다. 바이오틴결합 화합물 및 항체를 피펫 상하작용에 의해 2.5:1 몰비 (화합물 대 항체) 로 혼합하고, 60 분간 RT 및 350 rpm 에서 인큐베이션했다.
바이오틴결합된 형광 염료 및 항-바이오틴 항체 - Biotin-Cy5 /키메라 항-바이오틴 항체 (인간 IgG 서브클래스) 복합체의 복합체 형성을 위한 예시 방법:
시스테인닐화 링커를 포함하는 바이오틴-유도체화-Cy5 (Biotin-Cys-Cy5) 의 복합체 생성을 위해, 0.16 mg 의 Biotin-Cys-Cy5 을 100% DMF 중에 10 mg/ml 의 최종 농도로 녹였다. 1 mg 의 항체를 50 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.2 로 이루어진 완충액 중에 10.1 mg/ml (약 69 μM) 의 농도로 사용했다. Biotin-Cys-Cy5 및 항체를 2.5:1 몰비 (Biotin-Cys-Cy5 대 항체) 로 혼합하고, 60 분간 RT 에서 인큐베이션하고, 350 rpm 에서 진탕시켰다. 결과로서 수득한 컨쥬게이트는 실시예 7 에 기재된 바와 같이 SDS-PAGE 로 분석했다. 형광의 검출은 실시예 7 에 기재된 바와 같이 실시했다.
바이오틴결합된 형광 염료 및 항-바이오틴 항체 - Biotin-Cys-Cy5/ 인간화된 항-바이오틴 항체의 복합체 형성을 위한 예시 방법:
시스테이닐화된 링커를 포함하는 바이오틴-유도체화된-Cy5 (Biotin-Cys-Cy5) 의 복합체의 생성을 위해, 0.16 mg 의 Biotin-Cys-Cy5 를 100% DMF 에 10 mg/ml 의 농도로 녹였다. 1 mg 의 항체를 50 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.2 로 이루어진 완충액 중에 5.5 mg/ml (약 38 μM) 의 농도로 사용했다. Biotin-Cys-Cy5 및 항체를 2.5:1 몰비 (Biotin-Cys-Cy5 대 항체) 로 혼합하고, 60 분간 RT 에서 인큐베이션하고, 350 rpm 에서 진탕했다. 결과로서 수득한 컨쥬게이트를 실시예 7 에 기재된 바와 같이 SDS-PAGE 로 분석했다. 형광을 검출은 실시예 7 에 기재된 바와 같이 실시했다.
바이오틴결합된 폴리펩티드 및 항-바이오틴 항체 - Ac-PYY-PEG3-Cys-β-Ala-Biotin /키메라 항-바이오틴 항체 복합체의 복합체 형성을 위한 예시 방법:
시스테이닐화된 링커를 포함하는 바이오틴결합된-PYY-폴리펩티드의 비-공유성 복합체의 생성을 위해, 0.19 mg 의 Ac-PYY-PEG3-Cys-β-Ala-Biotin 를 100% DMF 에 10 mg/ml 의 농도로 녹였다. 항체는 50 mM Tris-HCl, 1mM EDTA, pH 8.2 로 이루어진 완충액에 5.5 mg/ml (약 38 μM) 의 농도로 사용되었다. Ac-PYY-PEG3-Cys-β-Ala-Biotin 및 항체를 2.5:1 몰비 (Ac-PYY-PEG3-Cys-β-Ala-Biotin 대 항체) 로 혼합하고, 60 분간 RT 및 350 rpm 에서 인큐베이션했다. 결과로서 수득한 복합체는 크기 배제 크로마토그래피 (95% 단량체) 에서의 단일 정점의 발생을 통해 단량체 IgG-형 분자로서 정해졌다. 결과로서 수득한 복합체는 SDS-PAGE 및 후속 Western Blot 분석에 의해 추가로 분석되었다. 10 g 의 복합체를 4x LDS 시료 완충액 (Invitrogen) 과 혼합하고, 95℃에서 5 분간 인큐베이션했다. 시료를 200V 및 120 mA 에서 전개시키는 4 내지 12% Bis-Tris 폴리아크릴아미드-겔 (NuPAGE, Invitrogen) 에 적용했다. 폴리아크릴아미드-겔에서 분리되는 분자들을 PVDF 멤브레인 (0.2 ㎛ 포어 크기, Invitrogen) 로 40 분간 25V 및 160 mA 에서 옮겼다. 멤브레인은 1x PBST (1x PBS + 0.1 % Tween20) 중의 1% (w/v) 전지유에서 1h 동안 RT 로 블로킹했다. 멤브레인은 1x PBST 에서 5 분간 3 회 세척하고, 후속하여 1:2000 희석으로 사용한 스트렙타비딘-POD-컨쥬게이트 (2900 U/ml, Roche) 와 함께 인큐베이션했다. 멤브레인 상의 바이오틴에 결합된 스트렙타비딘-POD 의 검출은 Lumi-Light Western Blotting Substrate (Roche) 를 이용해 실시했다.
바이오틴결합된 폴리펩티드 및 항-바이오틴 항체 - Ac-PYY-PEG3-Cys-PEG2-Biotin /키메라 항-바이오틴 항체 복합체의 복합체 형성을 위한 예시 방법:
시스테이닐화된 링커를 포함하는 바이오틴결합된-PYY-폴리펩티드의 비-공유성 복합체 생성을 위해, 0.16 mg 의 Ac-PYY-PEG3-Cys-PEG2-Biotin 을 100% DMF 에 10 mg/ml 의 농도로 녹였다. 항체는 50 mM Tris-HCl, 1mM EDTA, pH 8.2 로 이루어진 완충액 중에 10.7 mg/ml (약 73 μM) 의 농도로 사용되었다. Ac-PYY-PEG3-Cys-PEG2-Biotin 및 항체를 2.5:1 몰비 (Ac-PYY-PEG3-Cys-PEG2-Biotin 대 항체) 로 혼합하고, 60 분간 RT 및 350 rpm 에서 인큐베이션했다. 결과로서 수득한 복합체를 크기 배제 크로마토그래피를 통해 63% 단량체 IgG-형 분자 및 37% 이량체 가용성 응집물로 정해졌다. 결과로서 수득한 복합체는 SDS-PAGE 및 후속 Western Blot 분석에 의해 더 분석했다. 10 ㎍ 의 복합체를 4x LDS 시료 완충액 (Invitrogen) 과 혼합하고, 95℃ 에서 5 분간 인큐베이션했다. 시료를 35 분 동안 200V 및 120 mA 에서 전개시킨 4-12% Bis-Tris 폴리아크릴아미드-겔 (NuPAGE, Invitrogen) 에 적용했다. 폴리아크릴아미드-겔에서 전개시킨 분자들을 40 분 동안 25V 및 160 mA 에서 PVDF 멤브레인 (0.2 ㎛ 포어 크기, Invitrogen) 로 옮겼다. 멤브레인을 1x PBST (1x PBS + 0.1% Tween20) 중의 1 % (w/v) 전지유에서 1 시간 동안 RT 로 블로킹했다. 멤브레인을 1x PBST 에서 5 분간 3 회 세척하고, 후속하여 1:2000 희석으로 사용된 스트렙타비딘-POD-컨쥬게이트 (2900 U/ml, Roche) 와 인큐베이션했다. 멤브레인 상의 바이오틴에 결합되어 있는 스트렙타비딘-POD 의 검출은 Lumi-Light Western Blotting Substrate (Roche) 을 이용하여 실시했다.
산화환원제의 부재 하에 합테닐화된 염료 및 항-합텐 항체 VH53C 가 있는 폴리펩티드의 정의된 공유성 컨쥬게이트의 생성
공유성 항-바이오틴 항체/바이오틴결합된 폴리펩티드 또는 바이오틴결합된 염료 디설파이드-연결 컨쥬게이트의 생성을 위해, (i) 폴리펩티드에 대한 링커를 포함하는 적합한 반응성 기 (예를 들어, 시스테인, 말레이미드) 또는 폴리펩티드가 항체 표면에 노출되도록 하여 그의 활성을 유지하도록 해 주는 염료를 통해 바이오틴을 커플링하고, (ii) 바이오틴결합된 폴리펩티드의, 폴리펩티드의 생물학적 활성이 유지되는 시스테인 돌연변이를 지닌 항-바이오틴 항체 (= 항체 VH52bC/VH53C) 와의 공유성 부위 특이적 컨쥬게이트를 생성하고, (iii) 항체 사슬간 디설파이드 가교의 환원을 피하도록 환원제 부재 하에 반응을 실시하는 것이 필요하다.
일반적인 방법:
바이오틴결합된 화합물을 지닌 항-바이오틴 항체의 컨쥬게이트의 생성은 정해진 화학량론의 컨쥬게이트를 결과물로 제공할 것이며, 그러한 컨쥬게이트 내 화합물이 그의 활성을 보유할 것으로 예상된다. 바이오틴결합된 화합물의 항-바이오틴 항체를 이용한 컨쥬게이트의 생성을 위해, 바이오틴결합된 화합물을 100% DMF 에 최종 농도가 10 mg/ml 이 되도록 녹였다. 항-바이오틴 항체 VH52bC/VH53C 를 50 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH=8.2 중에 10 mg/ml 의 농도로 만들었다. 피펫을 상하로 작동함으로써 바이오틴결합된 화합물 및 항-바이오틴 항체 VH52bC/VH53C 를 2.5:1 몰비 (화합물 대 항체) 로 혼합하고, 60 분간 RT 및 350 rpm 에서 인큐베이션했다.
시스테인 포함 링커를 통해 바이오틴에 컨쥬게이션된 폴리펩티드는 하기에서 바이오틴-Cys-폴리펩티드 또는 폴리펩티드-Cys-바이오틴으로 지칭된다. 폴리펩티드는 유리된 N-말단 또는 캡핑된 N-말단을 지닐 수 있는데, 예를 들어 아세틸기 (Ac-폴리펩티드-Cys-바이오틴) 또는 PEG-잔기 (PEG-폴리펩티드-Cys-바이오틴) 이 존재할 수 있다.
시스테인 포함 링커를 통해 바이오틴에 컨쥬게이션된 형광 염료는 이하에서 염료-Cys-바이오틴 또는 바이오틴-Cys-염료로 지칭된다.
바이오틴결합된 형광 염료 및 항-바이오틴 항체 - Biotin-Ser-Cy5/ 인간화된 항-바이오틴 항체의 컨쥬게이트 형성을 위한 예시 방법:
링커 내 세린 잔기를 포함하고 있는 바이오틴-유도체화된-Cy5 (Biotin-Ser-Cy5) 의 복합체의 생성을 위해, 0.61 mg 의 Biotin-Ser-Cy5 를 20 mM 히스티딘, 140 mM NaCl, pH 6.0 에 10 mg/ml 의 농도로 녹였다. 18.5 mg 의 인간화된 항-바이오틴 항체를 50 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.2 로 이루어진 완충액 중에 10 mg/ml (약 69 μM) 의 농도로 사용했다. Biotin-Ser-Cy5 및 항체를 2.5:1 몰비 (Biotin-Ser-Cy5 대 항체) 로 혼합하고, 60 분간 RT 로 인큐베이션하고, 350 rpm 에서 진탕시켰다. 이어서, 시료를 1.5 ml/min 의 유속으로 20 mM 히스티딘, 140 mM NaCl, pH 6.0 을 이동상으로 이용하며, Superdex 200 16/60 고하중 제조 등급 컬럼 (GE Healthcare) 을 이용하는 크기 배제 크로마토그래피에 적용했다. 정점 분획을 수집하고, 순도에 대해서는 SDS-PAGE 로 분석했다. 염료 대 항체 비율은 다음과 같이 결정되었다: (1) 파장 280 nm (단백질) 및 650 nm (Cy5) 에서의 시료의 흡광도 측정; (2) 하기 공식의 이용: 표지된 단백질/(Cy5) 의 A650*단백질 농도 (M) = 단백질 분자 당 염료 몰 수, 여기서 ε(Cy5) = 250000 M-1cm-1, 복합체의 A650 = 47.0 그리고 단백질 농도는 86.67 μM. 결과로서 수득한 염료 대 항체 분자의 비율은 2.17 여서, 모든 단백질 파라토프가 Biotin-Cy5 분자를 이용해 구조형성되어 있음을 시사한다.
바이오틴결합된 형광 염료 및 항-바이오틴 항체 - Biotin-Cys-Cy5/ 키메라 항-바이오틴 항체 VH53C 의 컨쥬게이트의 형성을 위한 예시 방법:
시스테이닐화된 링커를 포함하는 바이오틴-유도체화-Cy5 의 컨쥬게이트의 생성을 위해, 0.16 mg 의 Biotin-Cys-Cy5 를 100% DMF 에 10 mg/ml 의 농도로 용해시켰다. 1 mg 의 항-바이오틴 항체 VH53C 를 50 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.2 로 이루어진 완충액 내에 9.7 mg/ml (약 68 μM) 의 농도로 사용했다. Biotin-Cys-Cy5 및 항체를 2.5:1 몰비 (Ac-Biotin-Cys-Cy5 대 항체) 로 혼합하고, 60 분간 RT 에서 인큐베이션하고, 350 rpm 에서 진탕시켰다. 결과로서 수득한 컨쥬게이트를 실시예 7 에 기재된 바와 같이 SDS-PAGE 로 분석했다. 형광의 검출은 실시예 7 에 기재된 바와 같이 실시했다.
바이오틴결합된 형광 염료 및 항-바이오틴 항체 Biotin-Cys-Cy5/ 인간화된 항-바이오틴 항체 VH53C 의 컨쥬게이트의 형성을 위한 예시 방법:
시스테이닐화된 링커를 포함하는 바이오틴-유도체화된-Cy5 의 컨쥬게이트의 형성을 위해, 0.16 mg 의 Biotin-Cys-Cy5 르 100% DMF 에 10 mg/ml 의 농도로 녹였다. 1 mg 의 인간화된 항-바이오틴 항체 VH53C 를 50 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.2 로 이루어진 완충액 중에 7.4 mg/ml (약 51 μM) 의 농도로 사용했다. Biotin-Cys-Cy5 및 항체를 2.5:1 몰비 (Ac-Biotin-Cys-Cy5 대 항체) 로 혼합하고, 60 분간 RT 에서 인큐베이션하고, 350 rpm 에서 진탕했다. 결과로서 수득한 컨쥬게이트를 실시예 7 에 기재된 바와 같이 SDS-PAGE 로 분석했다. 형광의 검출은 실시예 7 에 기재된 바와 같이 실시했다.
바이오틴결합된 폴리펩티드 및 항-바이오틴 항체 Ac-PYY(PEG3-Cys-βAla-Biotin)/키메라 항-바이오틴 항체 VH53C 의 컨쥬게이트의 형성을 위한 예시 방법:
시스테이닐화된 링커를 포함하는 바이오틴-유도체화된-PYY-폴리펩티드의 컨쥬게이트의 생성을 위해, 0.19 mg 의 Ac-PYY(PEG3-Cys-βAla-Biotin) 를 100% DMF 에 10 mg/ml 의 농도로 녹였다. 1 mg 의 키메라 항-바이오틴 항체 VH53C 를 50 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.2 로 이루어진 완충액에 9.7 mg/ml (약 67 μM) 의 농도로 사용했다. Ac-PYY(PEG3-Cys-βAla-Biotin) 및 항체를 2.5:1 몰비 (Ac-PYY(PEG3-Cys-βAla-Biotin) 대 항체) 로 혼합하고, 60 분간 RT 에서 인큐베이션하고 350 rpm 에서 진탕했다. 결과로서 수득한 컨쥬게이트를 질량 분광계로 분석했다. 검출된 종의 87.7% 는 2 펩티드 분자에 커플링되어 있는 항체로 식별되었으며, 12.3% 는 1 펩티드 분자에 커플링되어 있는 항체로 식별되었다.
바이오틴결합된 폴리펩티드 및 항-바이오틴 항체 - Ac-PYY(PEG3-Cys-PEG2-Biotin)/키메라 항-바이오틴 항체 VH53C 의 컨쥬게이트 형성을 위한 예시 방법:
시스테인화된 링커를 포함하는 바이오틴-유도체화된-PYY-폴리펩티드의 컨쥬게이트 생성을 위해, 0.16 mg 의 Ac-PYY(PEG3-Cys-PEG2-Biotin) 를 100% DMF 에 10 mg/ml 의 농도로 녹였다. 1 mg 의 키메라 항-바이오틴 항체 VH53C 를 50 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.2 로 이루어진 완충액 중에 9.9 mg/ml (약 68 μM) 의 농도로 사용했다. Ac-PYY(PEG3-Cys-PEG2-Biotin) 및 항체를 2.5:1 몰비 (Ac-PYY(PEG3-Cys-PEG2-Biotin) 대 항체) 로 혼합하고, 60 분간 RT 에서 인큐베이션하고, 350 rpm 에서 진탕시켰다. 결과로서 수득한 컨쥬게이트는 질량 분광계로 분석했다. 검출된 종들의 100% 를 2 펩티드 분자에 커플링된 항체로서 식별했다.
바이오틴결합된 폴리펩티드 및 항-바이오틴 항체 - Ac-PYY(PEG3-Cys-βAla-Biotin)/인간화된 항-바이오틴 항체 VH53C 의 컨쥬게이트의 형성을 위한 예시 방법:
시스테이닐화된 링커를 포함하는 바이오틴-유도체화-PYY-폴리펩티드의 생성을 위해, 0.06 mg 의 Ac-PYY(PEG3-Cys-βAla-Biotin) 를 10 mg/ml 의 농도로 100% DMF 에 녹였다. 0.8 mg 의 인간화된 항-바이오틴 항체 VH53C 를 50 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.2 로 이루어진 완충액 중에 9 mg/ml (약 62 μM) 의 농도로 사용했다. Ac-PYY(PEG3-Cys-βAla-Biotin) 및 항체를 2.5:1 몰비 (Ac-PYY(PEG3-Cys-βAla-Biotin) 대 항체) 로 혼합하고, 60 분간 RT 에서 인큐베이션하고, 350 rpm 에서 진탕시켰다. 결과로서 수득한 컨쥬게이트를 질량 분광계로 분석했다. 검출된 종들의 62.2% 가 2 펩티드 분자에 커플링된 항체로서 식별되었으며, 33.9% 는 1 펩티드 분자에 컨쥬게이션된 항체로서 식별되었고, 3.9% 는 커플링되지 않은 항체로 식별되었다.
바이오틴결합된 펩티드 및 항-바이오틴 항체 - Ac-PYY(PEG3-Cys-PEG2-Biotin)/인간화된 항-바이오틴 항체 VH53C 의 컨쥬게이트의 형성을 위한 예시적인 방법
시스테인화된 링커를 포함하는 바이오틴-유도체화-PYY-폴리펩티드의 컨쥬게트의 생성을 위해, 0.08 mg 의 Ac-PYY(PEG3-Cys-PEG2-Biotin) 를 100% DMF 중에 10 mg/ml 의 농도로 녹였다. 0.8 mg 의 인간화된 항-바이오틴 항체 VH53C 를 50 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.2 로 이루어진 완충액 중에 9 mg/ml (약 62 μM) 의 농도로 사용했다. Ac-PYY(PEG3-Cys-PEG2-Biotin) 및 항체를 2.5:1 몰비 (Ac-PYY(PEG3-Cys-PEG2-Biotin) 대 항체) 로 혼합했고 60 분간 RT 에서 인큐베이션하고, 350 rpm 에서 진탕시켰다. 결과로서 수득한 컨쥬게이트를 질량 분광계로 분석했다. 검출된 종들의 71.4% 는 2 개의 펩티드 분자에 커플링된 항체로 식별되었으며, 26% 는 1 개의 펩티드 분자에 커플링된 항체로 식별되었고, 2.5% 는 커플링되지 않은 항체로 식별되었다.
실시예 7
검출 방법
SDS-겔 전기영동:
SDS 겔 전기영동을 위해, 4x LDS 시료 완충액 (Invitrogen) 을 시료에 첨가했다. 각 시료에 대해, 10x NuPAGE 시료 환원제 (Invitrogen) 를 첨가하여 환원된 버젼을 제조했다. 모든 시료를 70℃ 에서 5 분간 인큐베이션한 후, 1x MOPS 완충액 (Invitrogen) 을 이용한 4-12% Bis-Tris 폴리아크릴아미드 겔 (NuPAGE, Invitrogen) 상에서 전기영동했다.
형광 검출:
겔 중의 Cy5-관련 형광을 LumiImager F1 기기 (Roche) 를 이용해 645 nm 의 여기 파장에서 검출했다. 형광의 검출 후, 겔을 SimplyBlue SafeStain (Invitrogen) 로 염색했다.
실시예 8
혈청 안정성
바이오틴화된 Cy5 의 인간화된 항-바이오틴 항체와의 복합체의, 바이오틴결합된 Cy5 의 인간화된 항-바이오틴 항체 VH53C 와의 공유적 컨쥬게이트 대비 혈청 안정성.
기술된 펩티드 개질 기법의 목적은 펩티드의 치료 적용성을 개선하는 것이다. 펩티드의 치료 적용에 대한 주된 애로사항은 현재는 제한되어 있는 생체내 안정성 및/또는 짧은 혈청 반감기 및 빠른 청소율이다. 형광소의 항체 컨쥬게이트의 PK 파라미터는 생체내에서 결정했고, 비-공유성 항체-형광소 복합체와 비교했다. 따라서, (i) 항-바이오틴 항체 VH53C 는 바이오틴결합된 형광소 Biot-Cys-Cy5 에 공유적으로 컨쥬게이션되어 있고, (ii) 항-바이오틴 항체의 바이오틴결합된 형광소 Biot-Cy5 와의 비-공유성 복합체가 생성되었으며, (iii) 공유적으로 컨쥬게이션되고, 비-공유적으로 복합체형성된 화합물을 동물에 적용하고, (iv) 그러한 동물에서의 경시적인 화합물의 혈청 농도를 분석했다.
실험 과정:
소형 형광 기질의 항체-복합체형성의 PK 파라미터에 대한 영향을 분석하기 위해, 20 mM 히스티틴/140 mM NaCl, pH 6.0 중의 13 nmol 의 Cy5-바이오틴/인간화된 항-바이오틴 항체 디설파이드-연결 컨쥬게이트 또는 상응하는 항체 비-공유성 복합체형성 화합물을 각 물질에 대해 여섯마리의 암컷 마우스 (계열 NRMI) 에 적용했다. 약 0.1 ml 혈액 시료를 하기 시점에 수집했다: 마우스 1 및 2 에 대해서는 0.08 h, 8 h 및 48 h, 마우스 3 및 4 에 대해서는 0.08 h, 24 h 및 48 h, 마우스 5 및 6 에 대해서는 0.08h, 36 h 및 48h. 40 ㎕ 이상의 혈청 시료를 RT 에서 1 시간 후 원심분리 (9,300 x g, 3 분, 4℃) 에 의해 수득했다. 혈청 시료는 -80℃ 에서 저장했다.
주어신 시점에 혈청 중 화합물의 양을 결정하기 위해, Cy5 의 형광 특성을 이용했다: 혈청 시료 중의 Cy5 관련 형광을 120 ㎕ 석영 큐벳에서 실온에서 Cary Eclipse Fluorescence Spectrophotometer (Varian) 를 이용해 측정했다. 여기 파장은 649 nm 이며, 발광은 670 nm 에서 측정했다. 혈청 시료를 1 x PBS 에서 희석하여, 적정 범위의 발광 강도에 이르게 했다. 각 시료와 동일하게 1 x PBS 에 희석 중인 미처리 마우스의 혈액 혈청을 블랭크 프로브로 이용했다.
명확한 이해를 목적으로 설명 및 예시의 수단으로 상기 본 발명은 좀더 상세시 기술했지만, 그러한 기술 및 설명이 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 본원에 인용된 모든 특허 및 과학 문헌의 개시내용이 참고문헌으로 전부 본원에 명시적으로 포함된다.
실시예 9
바이오시틴아미드와의 복합체에서의 쥐과동물 항-바이오틴 항체-Fab-단편의 X-선 구조 결정
쥐과동물 항-바이오틴 항체 Fab-단편의 단백질 구조를 바이오시틴아미드와의 복합체에서 결정했다. 따라서, Fab-단편의 결정을 0.8 M 숙신산에서 성장시킨 후, 바이오시티아미드를 지닌 항체 결정을 채워 넣었다 (결정화 용액 중 10 mM 작용 용액으로 희석하고, 결정화 액적 내 결정에 적용). 결정을 2 ㎕ 의 10 mM 바이오시틴아미드 용액으로 3 회 세척하고, 최종적으로 바이오시틴아미드와 21℃ 로 16 시간 동안 인큐베이션하고, 동결보호제로서의 15% 글리세롤을 이용해 수합하고, 액체 질소에서 급속냉동했다. 가공된 회절 이미지는 2.5Å 해상도에서 단백질 구조를 제공했다. 바이오틴-결합 가변 영역의 구조 및 전하 조성을 도 2 에 제시한다: 바이오틴은 CDR 영역 유래의 아미노산을 포함하여 이루어진 하전된 영역이 측면에 있는 표면 포켓 내에 결합한다. 복합체가 된 합텐은 아미노산의 음으로 하전된 클러스터에 가까운 곳에 위치한다. "합텐" 으로서 그의 카르복실기에 대한 적재물 커플링을 위해 유도체화된 바이오틴은 (COOH 기의 결핍으로 인해) 그 지점에 전하 반발이 없는 것처럼 양호한 효능을 지니고 결합한다. 대조적으로, 유리된 (정상적인) 바이오틴은, 그의 카르복실기가 그의 음전하 클러스터에 근접하여 위치해 반발성이 되므로, 항체에 효율적으로 결합하지 못한다.
SEQUENCE LISTING <110> F. Hoffmann-La Roche AG <120> ANTI-BIOTIN ANTIBODIES AND METHODS OF USE <130> 31086 WO <150> EP12174957.6 <151> 2012-07-04 <160> 33 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 1 Asp Thr Phe Phe Gln 1 5 <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 2 Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Phe Thr Lys Tyr Asp Pro Lys Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 3 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 3 Trp Asp Thr Tyr Gly Ala Ala Trp Phe Ala Tyr 1 5 10 <210> 4 <211> 120 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 4 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ser Ser Gly Phe Asn Asn Lys Asp Thr 20 25 30 Phe Phe Gln Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Glu Cys Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Phe Thr Lys Tyr Asp Pro Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Val Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Trp Asp Thr Tyr Gly Ala 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Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 225 230 235 240 Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 <210> 30 <211> 330 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 30 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 225 230 235 240 Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 <210> 31 <211> 327 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 31 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro 100 105 110 Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 115 120 125 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 130 135 140 Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp 145 150 155 160 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe 165 170 175 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 180 185 190 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu 195 200 205 Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 210 215 220 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys 225 230 235 240 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 245 250 255 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 260 265 270 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 275 280 285 Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser 290 295 300 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 305 310 315 320 Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 325 <210> 32 <211> 327 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 32 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 100 105 110 Glu Phe Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 115 120 125 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 130 135 140 Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp 145 150 155 160 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe 165 170 175 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 180 185 190 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu 195 200 205 Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 210 215 220 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys 225 230 235 240 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 245 250 255 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 260 265 270 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 275 280 285 Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser 290 295 300 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 305 310 315 320 Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 325 <210> 33 <211> 327 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 33 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 100 105 110 Glu Phe Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 115 120 125 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 130 135 140 Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp 145 150 155 160 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe 165 170 175 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 180 185 190 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu 195 200 205 Gly Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 210 215 220 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys 225 230 235 240 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 245 250 255 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 260 265 270 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 275 280 285 Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser 290 295 300 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 305 310 315 320 Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 325

Claims (15)

  1. 항체가 (a) SEQ ID NO: 11 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, (b) SEQ ID NO: 15 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3, 및 (c) SEQ ID NO: 10 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2 를 함유하는, 인간화된 항-바이오틴 항체.
  2. 제 1 항에 있어서, (a) SEQ ID NO: 09 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) SEQ ID NO: 10 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (c) SEQ ID NO: 11 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3 을 함유하는 항체.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, (a) SEQ ID NO: 13 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) SEQ ID NO: 14 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) SEQ ID NO: 15 의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3 을 함유하는 항체.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, Kabat 의 방법에 따라 번호매겨진 중쇄 가변 도메인의 위치 24 에 아미노산 잔기 세린을 포함하고, Kabat 의 방법에 따라 번호매겨진 중쇄 가변 도메인의 위치 73 에 아미노산 잔기 트레오닌을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, Kabat 의 방법에 따라 번호매겨진 중쇄 가변 도메인의 위치 60 에 아미노산 잔기 알라닌을 포함하고, Kabat 의 방법에 따라 번호매겨진 중쇄 가변 도메인의 위치 61 에 아미노산 잔기 글루타민을 포함하는 특징으로 하는 항체.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 하기를 함유하는 항체:
    (a) SEQ ID NO: 12 의 아미노산 서열과 95% 이상 서열 일치성을 지닌 VH 서열;
    (b) SEQ ID NO: 16 의 아미노산 서열과 95% 이상의 서열 일치성을 지닌 VL 서열; 또는
    (c) (a) 에서와 같은 VH 서열 및 (b) 에서와 같은 VL 서열,
    여기서, Kabat 의 방법에 따라 번호매겨진 중쇄 가변 도메인의 위치 24 의 아미노산 잔기가 세린이고/이거나 Kabat 의 방법에 따라 번호매겨진 중쇄 가변 도메인의 위치 73 의 아미노산 잔기가 트레오닌인 항체.
  7. 제 4 항에 있어서, SEQ ID NO: 12 의 VH 서열을 포함하는 항체.
  8. 제 4 항 또는 제 7 항에 있어서, SEQ ID NO: 16 의 VL 서열을 포함하는 항체.
  9. SEQ ID NO: 12 의 VH 서열 및 SEQ ID NO: 16 의 VL 서열을 함유하는 항체.
  10. 제 1 항에 있어서, 전장 IgG1 항체 또는 전장 IgG4 항체인 항체.
  11. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 모노클로날 항체인 항체.
  12. 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, 바이오틴에 결합하는 항체 단편인 항체.
  13. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항의 항체 및 약제학적으로 허용되는 담체를 함유하는 약제학적 제형물.
  14. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서, 의약으로 사용하기 위한 항체.
  15. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항의 항체의 의약으로서의 용도.
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