ES2928718T3 - Inmunoconjugados de un anticuerpo anti-PD-1 con una IL-2 mutante o con IL-15 - Google Patents

Inmunoconjugados de un anticuerpo anti-PD-1 con una IL-2 mutante o con IL-15 Download PDF

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Abstract

La presente invención generalmente se refiere a inmunoconjugados, particularmente inmunoconjugados que comprenden un polipéptido de interleucina-2 mutante y un anticuerpo que se une a PD-1. Además, la invención se refiere a moléculas polinucleotídicas que codifican los inmunoconjugados y vectores y células huésped que comprenden dichas moléculas polinucleotídicas. La invención se refiere además a métodos para producir inmunoconjugados mutantes, composiciones farmacéuticas que los comprenden y usos de los mismos. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Inmunoconjugados de un anticuerpo anti-PD-1 con una IL-2 mutante o con IL-15
Campo de la invención
La presente invención se refiere en general a inmunoconjugados, en particular, a inmunoconjugados que comprenden un polipéptido de interleucina-2 mutante y un anticuerpo que se une a PD-1. Además, la invención se refiere a moléculas polinucleotídicas que codifican los inmunoconjugados, y vectores y células huésped que comprenden dichas moléculas polinucleotídicas. La invención se refiere además a procedimientos para producir los inmunoconjugados mutantes, composiciones farmacéuticas que comprenden los mismos y usos de los mismos.
Antecedentes
La interleucina 2 (IL-2), también conocida como factor de crecimiento de linfocitos T (TCGF), es una glucoproteína globular de 15,5 kDa que desempeña un papel principal en la generación, supervivencia y homeostasis de los linfocitos. Tiene una longitud de 133 aminoácidos y consiste en cuatro hélices a anfipáticas antiparalelas que forman una estructura cuaternaria indispensable para su función (Smith, Science 240, 1169-76 (1988); Bazan, Science 257, 410-413 (1992)). Las secuencias de IL-2 de diferentes especies se encuentran bajo la RefSeq de NCBI n.os NP000577 (humano), NP032392 (ratón), NP446288 (rata) o NP517425 (chimpancé).
La IL-2 media su acción uniéndose a los receptores de IL-2 (IL-2R), que consisten en hasta tres subunidades individuales, de las que su diferente asociación puede producir formas receptoras que difieren en su afinidad por IL-2. La asociación de las subunidades a (CD25), p (CD122) y y (Yc, CD132) da como resultado un receptor de alta afinidad trimérico para IL-2. El receptor de IL-2 dimérico que consiste en las subunidades p y Y se denomina IL-2R de afinidad intermedia. La subunidad a forma el receptor de IL-2 de baja afinidad monomérico. Aunque el receptor de IL-2 de afinidad intermedia dimérico se une a IL-2 con una afinidad aproximadamente 100 veces menor que el receptor de alta afinidad trimérico, ambas variantes de receptor de IL-2 dimérico y trimérico pueden transmitir la señal tras la unión a IL-2 (Minami et al., Annu Rev Immunol 11, 245-268 (1993)). Por consiguiente, la subunidad a, CD25, no es esencial para la señalización de IL-2. Esta confiere una unión de alta afinidad a su receptor, mientras que la subunidad p, CD122, y la subunidad Y son fundamentales para la transducción de señales (Krieg et al., Proc Natl Acad Sci 107, 11906-11 (2010)). Los receptores de IL-2 triméricos incluyendo CD25 se expresan por linfocitos T reguladores (Treg) de forkhead box P3 (Foxp3)+ CD4+ (en reposo). También se inducen de forma transitoria en linfocitos T activados convencionales, mientras que en el estado de reposo estas células solo expresan receptores de IL-2 diméricos. Los linfocitos Treg expresan constantemente el mayor nivel de CD25 in vivo (Fontenot et al., Nature Immunol 6, 1142-51 (2005)).
La IL-2 se sintetiza principalmente por linfocitos T activados, en particular linfocitos T cooperadores CD4+. Estimula la proliferación y diferenciación de linfocitos T, induce la generación de linfocitos T citotóxicos (CTL) y la diferenciación de linfocitos de sangre periférica en linfocitos citotóxicos y linfocitos citolíticos activados por linfocinas (LAK), promueve la expresión de moléculas citolíticas y de citocinas por linfocitos T, facilita la proliferación y diferenciación de linfocitos B y la síntesis de inmunoglobulina por linfocitos B, y estimula la generación, proliferación y activación de linfocitos citolíticos naturales (NK) (revisado, por ejemplo, en Waldmann, Nat Rev Immunol 6, 595­ 601 (2009); Olejniczak y Kasprzak, Med Sci Monit 14, RA179-89 (2008); Malek, Annu Rev Immunol 26, 453-79 (2008)).
Su capacidad para expandir poblaciones de linfocitos in vivo y para incrementar las funciones efectoras de estas células confiere efectos antitumorales a IL-2, lo que hace de la inmunoterapia con IL-2 una opción de tratamiento atractiva para determinados cánceres metastásicos. En consecuencia, se ha aprobado el tratamiento con IL-2 de dosis alta para su uso en pacientes con carcinoma de células renales metastásico y melanoma maligno.
Sin embargo, la IL-2 tiene una función doble en la respuesta inmunitaria ya que no solo media en la expansión y actividad de las células efectoras, sino que también está implicada de forma fundamental en el mantenimiento de la tolerancia inmunológica periférica.
Un mecanismo principal subyacente a la autotolerancia periférica es la muerte celular inducida por activación (AICD) inducida por IL-2 en linfocitos T. La AICD es un proceso por el que los linfocitos T totalmente activados experimentan la muerte celular programada a través del acoplamiento de receptores de muerte expresados en la superficie celular tales como CD95 (también conocido como Fas) o el receptor TNF. Cuando los linfocitos T activados por antígeno que expresan el receptor de IL-2 de alta afinidad (después de la exposición previa a IL-2) durante la proliferación se reestimulan con antígeno por medio del complejo receptor de linfocitos T (TCR)/CD3, se induce la expresión del ligando Fas (FasL) y/o factor de necrosis tumoral (TNF), lo que hace que las células sean susceptibles de apoptosis mediada por Fas. Este proceso es dependiente de IL-2 (Lenardo, Nature 353, 858­ 61 (1991)) y está mediado por medio de STAT5. Por el proceso de AICD en linfocitos T, la tolerancia no se puede establecer solo para autoantígenos, sino también para antígenos persistentes que claramente no son parte de la constitución del huésped, tales como antígenos tumorales.
Además, la IL-2 también está implicada en el mantenimiento de los linfocitos T reguladores (Treg) CD4+ CD25+ periféricos (Fontenot et al., Nature Immunol 6, 1142-51 (2005); D'Cruz y Klein, Nature Immunol 6, 1152-59 (2005); Maloy y Powrie, Nature Immunol 6, 1171-72 (2005), que también son conocidos como linfocitos T supresores. Anulan a los linfocitos T efectores para no destruir su (propia) diana, a través del contacto célula-célula inhibiendo la cooperación y activación de los linfocitos T, o bien a través de la liberación de citocinas inmunodepresoras tales como IL-10 o TGF-p. Se demostró que la disminución de linfocitos Treg potencia la inmunidad antitumoral inducida por IL-2 (Imai et al., Cancer Sci 98, 416-23 (2007)).
Por lo tanto, la IL-2 no es óptima para inhibir el crecimiento tumoral, porque en presencia de IL-2 los CTL generados podrían reconocer el tumor como propio y experimentar AICD o bien la respuesta inmunitaria se podría inhibir por linfocitos Treg dependientes de IL-2.
Otra preocupación con relación a la inmunoterapia con IL-2 son los efectos secundarios producidos por el tratamiento con IL-2 humana recombinante. Los pacientes que reciben un tratamiento con IL-2 de dosis alta experimentan con frecuencia acontecimientos adversos cardiovasculares, pulmonares, renales, hepáticos, gastrointestinales, neurológicos, cutáneos, hemáticos y sistémicos graves, que requieren un seguimiento intensivo y abordaje hospitalario. La mayoría de estos efectos secundarios se pueden explicar por el desarrollo del denominado síndrome de filtración vascular (o capilar) (VLS), un incremento patológico en la permeabilidad vascular que da lugar a una extravasación de líquido en múltiples órganos (provocando, por ejemplo, edema pulmonar y cutáneo y daño celular hepático) y disminución de líquido intravascular (provocando un descenso en la tensión arterial e incremento de compensación en la frecuencia cardíaca). No existe ningún tratamiento del VLS aparte de la retirada de IL-2. Se han sometido a prueba pautas posológicas de IL-2 de dosis baja en pacientes para evitar el VLS, sin embargo, a costa de resultados terapéuticos insuficientes. Se creía que el VLS se provocaba por la liberación de citocinas proinflamatorias, tales como el factor de necrosis tumoral (TNF)-a de linfocitos NK activados por IL-2, sin embargo, recientemente se ha demostrado que el edema pulmonar inducido por IL-2 resultó de la unión directa de IL-2 a células endoteliales pulmonares, lo que expresó niveles de bajos a intermedios de receptores de IL-2 apY funcionales (Krieg et al., Proc Nat Acad Sci USA 107, 11906-11 (2010)).
Se han adoptado varios enfoques para superar estos problemas asociados con la inmunoterapia con IL-2. Por ejemplo, se ha descubierto que la combinación de IL-2 con determinados anticuerpos monoclonales anti-IL-2 potencia los efectos del tratamiento de IL-2 in vivo (Kamimura et al., J Immunol 177, 306-14 (2006); Boyman et al., Science 311, 1924-27 (2006)). En un enfoque alternativo, se ha mutado IL-2 de diversas formas para reducir su toxicidad y/o incrementar su eficacia. Hu et al. (Blood 101, 4853-4861 (2003), publicación de patente de EE. UU. n.° 2003/0124678) han sustituido el residuo de arginina en la posición 38 de la IL-2 con triptófano para eliminar la actividad de vasopermeabilidad de IL-2. Shanafelt et al. (Nature Biotechnol 18, 1197-1202 (2000)) han mutado asparagina 88 en arginina para potenciar la selectividad de los linfocitos T sobre los linfocitos NK. Heaton et al. (Cancer Res 53, 2597-602 (1993); patente de EE. UU. n.° 5.229.109) han introducido dos mutaciones, Arg38Ala y Phe42Lys, para reducir la secreción de citocinas proinflamatorias de los linfocitos NK. Gillies et al. (publicación de patente de EE. UU. n.° 2007/0036752) han sustituido tres residuos de IL-2 (Asp20Thr, Asn88Arg y Gln126Asp) que contribuyen a la afinidad por el receptor de IL-2 de afinidad intermedia para reducir el VLS. Gillies et al. (documento WO 2008/0034473) también han mutado la interfase de IL-2 con CD25 por sustitución aminoacídica de Arg38Trp y Phe42Lys para reducir la interacción con CD25 y la activación de linfocitos Treg para potenciar la eficacia. Con el mismo objetivo, Wittrup et al. (documento WO 2009/061853) han producido mutantes de IL-2 que tienen una afinidad potenciada por c D25, pero que no activan el receptor, por tanto actúan como antagonistas. Las mutaciones introducidas tenían como objetivo alterar la interacción con la subunidad p y/o y del receptor.
En el documento WO 2012/107417 se describe un polipéptido de IL-2 mutante particular, diseñado para superar los problemas mencionados anteriormente asociados con la inmunoterapia con IL-2 (toxicidad provocada por la inducción del VLS, tolerancia tumoral provocada por la inducción de AICd e inmunodepresión provocada por la activación de los linfocitos Treg). La sustitución del residuo de fenilalanina en la posición 42 por alanina, el residuo de tirosina en la posición 45 por alanina y el residuo de leucina en la posición 72 de IL-2 por glicina anula esencialmente la unión de este polipéptido de IL-2 mutante a la subunidad a del receptor de IL-2 (CD25).
Además de los enfoques mencionados anteriormente, la inmunoterapia con IL-2 se puede mejorar dirigiendo selectivamente la IL-2 a los tumores, por ejemplo, en forma de inmunoconjugados que comprenden un anticuerpo que se une a un antígeno expresado en las células tumorales. Se han descrito varios de dichos inmunoconjugados (véase, por ejemplo, Ko et al., J Immunother (2004) 27, 232-239; Klein et al., Oncoimmunology (2017) 6 (3), e1277306).
Sin embargo, es posible que los tumores puedan escapar de dicho direccionamiento excretando, mutando o regulando por disminución el antígeno diana del anticuerpo. Además, es posible que la IL-2 dirigida al tumor no entre en contacto óptimo con las células efectoras tales como los linfocitos T citotóxicos (CTL), en microambientes tumorales que excluyen activamente a los linfocitos.
Por tanto, sigue existiendo la necesidad de mejorar adicionalmente la inmunoterapia con IL-2. Un enfoque, que puede eludir los problemas del direccionamiento al tumor, es dirigir la IL-2 directamente a las células efectoras, en particular a los CTL.
Ghasemi et al. han descrito una proteína de fusión de IL-2 y una proteína de unión a NKG2D (Ghashemi et al., Nat Comm (2016) 7, 12878), para dirigir IL-2 a células portadoras de NKG2D tales como los linfocitos citolíticos naturales (NK).
La proteína de muerte celular programada 1 (PD-1 o CD279) es un miembro inhibidor de la familia de receptores CD28, que también incluye c D28, CTLA-4, ICOS y BTLA. PD-1 es un receptor de superficie celular y se expresa en células mieloides, linfocitos T y linfocitos B activados (Okazaki et al. (2002) Curr. Opin. Immunol. 14:391779-82; Bennett et al. (2003) J Immunol 170:711-8). La estructura de PD-1 es una proteína transmembranaria de tipo 1 monomérica, que consiste en un dominio extracelular de tipo variable de inmunoglobulina y un dominio citoplásmico que contiene un motivo inhibidor basado en tirosina del inmunorreceptor (ITIM) y un motivo de intercambio basado en tirosina del inmunorreceptor (ITSM). Se han identificado dos ligandos para PD-1, PD-L1 y PD-L2, que se ha demostrado que regulan por disminución la activación de los linfocitos T tras su unión a PD-1 (Freeman et al. (2000) J Exp Med 192:1027-34; Latchman et al. (2001) Nat Immunol 2:261-8; Carter et al. (2002) Eur J Immunol 32:634-43). Tanto PD-L1 como PD-L2 son homólogos de B7 que se unen a PD-1, pero no se unen a otros miembros de la familia de CD28. Un ligando para PD-1, PD-L1, es abundante en una variedad de cánceres humanos (Dong et al. (2002) Nat. Med 8:787-9). La interacción entre PD-1 y PD-L1 da como resultado una disminución de los linfocitos infiltrantes de tumor, una disminución de la proliferación mediada por el receptor de linfocitos T y la evasión inmunitaria por las células cancerosas (Dong et al. (2003) J. MoI. Med. 81:281-7; Blank et al. (2005) Cancer Immunol. Immunother. 54:307-314; Konishi et al. (2004) Clin. Cancer Res. 10:5094-100). La inmunodepresión se puede invertir inhibiendo la interacción local de PD-1 con PD-L1, y el efecto es aditivo cuando también se bloquea la interacción de PD-1 con PD-L2 (Iwai et al. (2002) Proc. Nat 7. Acad. ScL USA 99:12293-7; Brown et al. (2003) J. Immunol. 170:1257-66).
Los anticuerpos que se unen a PD-1 se describen, por ejemplo, en el documento WO 2017/055443 A1.
Sumario de las enseñanzas técnicas
La presente invención, que se define en las reivindicaciones adjuntas, proporciona un enfoque novedoso para dirigir una forma mutante de IL-2 con propiedades ventajosas para la inmunoterapia directamente a las células efectoras inmunitarias, tales como los linfocitos T citotóxicos, en lugar de las células tumorales. El direccionamiento a las células efectoras inmunitarias se logra por la conjugación de la molécula de IL-2 mutante con un anticuerpo que se une a PD-1.
El mutante de IL-2 usado en la presente invención se ha diseñado para superar los problemas asociados con la inmunoterapia con IL-2, en particular, la toxicidad provocada por la inducción del VLS, la tolerancia tumoral provocada por la inducción de AICD y la inmunodepresión provocada por la activación de los linfocitos Treg. Además de eludir el escape de los tumores del direccionamiento tumoral como se menciona anteriormente, el direccionamiento del mutante de IL-2 a las células efectoras inmunitarias puede incrementar además la activación preferencial de los CTL sobre los linfocitos Treg inmunodepresores. Usando un anticuerpo que se une a PD-1, se puede invertir adicionalmente la supresión de la actividad de los linfocitos T inducida por la interacción de PD-1 con su ligando PD-L1, potenciando además, por tanto, la respuesta inmunitaria.
Una proteína de fusión de IL-2 que comprende el anticuerpo anti-PD-L1 atezolizumab se ha descrito por Chen et al. (Chen et al., Biochem Biophys Res Comm (2016) 480, 160-165).
Cabe destacar que el inmunoconjugado de la invención, que comprende un anticuerpo que se une a PD-1, muestra una eficacia antitumoral significativamente superior in vivo en comparación con un inmunoconjugado similar dirigido a PD-L1 (véase el ejemplo 3 a continuación en el presente documento).
En el presente documento se proporciona un inmunoconjugado que comprende un anticuerpo que se une a PD-1 y un polipéptido de IL-2. En un primer aspecto, la invención proporciona un inmunoconjugado que comprende un polipéptido de IL-2 mutante y un anticuerpo que se une a PD-1, en el que el polipéptido de IL-2 mutante es una molécula de IL-2 humana que comprende las sustituciones aminoacídicas F42A, y 45A y L72G (numeración relativa a la secuencia de IL-2 humana SEQ ID NO: 19).
En otro aspecto, la invención proporciona un inmunoconjugado que comprende un polipéptido de IL-2 mutante y un anticuerpo que se une a PD-1, en el que el polipéptido de IL-2 mutante es una molécula de IL-2 humana que comprende las sustituciones aminoacídicas F42A, Y45A y L72G (numeración relativa a la secuencia de IL-2 humana SEQ ID NO: 19); y en el que el anticuerpo comprende (a) una región variable de la cadena pesada (VH) que comprende una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 y una FR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 en las posiciones 71-73 de acuerdo con la numeración de Kabat, y (b) una región variable de la cadena ligera (VL) que comprende una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 y una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, o en el que el anticuerpo comprende (a) una región variable de la cadena pesada (VH) que comprende una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8, una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 y una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, y (b) una región variable de la cadena ligera (VL) que comprende una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11, una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12 y una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13.
En otro aspecto, la invención proporciona un inmunoconjugado que comprende un polipéptido de IL-2 mutante y un anticuerpo que se une a PD-1, en el que el polipéptido de IL-2 mutante es una molécula de IL-2 humana que comprende las sustituciones aminoacídicas f42A, Y45A y L72G (numeración relativa a la secuencia de iL-2 humana SEQ ID NO: 19); y en el que el anticuerpo comprende (a) una región variable de la cadena pesada (VH) que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14, y (b) una región variable de la cadena ligera (VL) que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17 y SEQ ID NO: 18.
En algunos modos de realización del inmunoconjugado de acuerdo con la invención, el polipéptido de IL-2 mutante comprende además la sustitución aminoacídica T3A y/o la sustitución aminoacídica C125A. En algunos modos de realización, el polipéptido de IL-2 mutante comprende la secuencia de SEQ ID NO: 20. En algunos modos de realización, el inmunoconjugado comprende no más de un polipéptido de IL-2 mutante. En algunos modos de realización, el anticuerpo comprende un dominio Fc compuesto por una primera y una segunda subunidad. En algunos de dichos modos de realización, el dominio Fc es un dominio Fc de clase IgG, en particular, una subclase IgG1, y/o el dominio Fc es un dominio Fc humano. En algunos modos de realización, el anticuerpo es una inmunoglobulina de clase IgG, en particular, una subclase IgG1.
En algunos modos de realización en los que el inmunoconjugado comprende un dominio Fc, el dominio Fc comprende una modificación que promueve la asociación de la primera y la segunda subunidad del dominio Fc. En algunos modos de realización, en el dominio CH3 de la primera subunidad del dominio Fc un residuo aminoacídico se reemplaza por un residuo aminoacídico que tiene un volumen de cadena lateral más grande, generando de este modo una protuberancia dentro del dominio CH3 de la primera subunidad que se puede situar en una cavidad dentro del dominio CH3 de la segunda subunidad, y en el dominio CH3 de la segunda subunidad del dominio Fc un residuo aminoacídico se reemplaza por un residuo aminoacídico que tiene un volumen de cadena lateral más pequeño, generando de este modo una cavidad dentro del dominio CH3 de la segunda subunidad dentro de la que se puede situar la protuberancia dentro del dominio CH3 de la primera subunidad. En algunos modos de realización, en la primera subunidad del dominio Fc, el residuo de treonina en la posición 366 se reemplaza por un residuo de triptófano (T366W), y en la segunda subunidad del dominio Fc, el residuo de tirosina en la posición 407 se reemplaza por un residuo de valina (Y407V) y, opcionalmente, el residuo de treonina en la posición 366 se reemplaza por un residuo de serina (T366S) y el residuo de leucina en la posición 368 se reemplaza por un residuo de alanina (L368A) (numeraciones de acuerdo con el índice EU de Kabat). En algunos de dichos modos de realización, en la primera subunidad del dominio Fc, adicionalmente, el residuo de serina en la posición 354 se reemplaza por un residuo de cisteína (S354C) o el residuo de ácido glutámico en la posición 356 se reemplaza por un residuo de cisteína (E356C), y en la segunda subunidad del dominio Fc, adicionalmente, el residuo de tirosina en la posición 349 se reemplaza por un residuo de cisteína (Y349C) (numeraciones de acuerdo con el índice EU de Kabat). En algunos modos de realización, el polipéptido de IL-2 mutante se fusiona en su aminoácido aminoterminal con el aminoácido carboxiterminal de una de las subunidades del dominio Fc, en particular, la primera subunidad del dominio Fc, opcionalmente a través de un péptido conector. En algunos de dichos modos de realización, el péptido conector tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 21.
En algunos modos de realización en los que el inmunoconjugado comprende un dominio Fc, el dominio Fc comprende una o más sustituciones aminoacídicas, lo que reduce la unión a un receptor de Fc, en particular, un receptor de Fcy, y/o la función efectora, en particular, la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC). En algunos de dichos modos de realización, dichas una o más sustituciones aminoacídicas están en una o más posiciones seleccionadas del grupo de L234, L235 y P329 (numeración del índice EU de Kabat). En algunos modos de realización, cada subunidad del dominio Fc comprende las sustituciones aminoacídicas L234A, L235A y P329G (numeración del índice EU de Kabat).
En algunos modos de realización, el inmunoconjugado de acuerdo con la invención comprende un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de SEQ ID NO: 22, un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de SEQ ID NO: 23 o SEQ ID NO: 24, y un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de SEQ ID NO: 25. En algunos modos de realización, el inmunoconjugado consiste esencialmente en un polipéptido de IL-2 mutante y una molécula de inmunoglobulina IgGi, unidos por una secuencia conectora.
La invención proporciona además uno o más polinucleótidos aislados que codifican un inmunoconjugado de la invención, uno o más vectores (en particular, vectores de expresión) que comprenden dichos polinucleótidos y células huésped que comprenden dicho(s) polinucleótido(s) o dicho(s) vector(es).
También se proporciona un procedimiento de producción de un inmunoconjugado que comprende un polipéptido de IL-2 mutante y un anticuerpo que se une a PD-1, que comprende (a) cultivar la célula huésped de la invención en condiciones adecuadas para la expresión del inmunoconjugado y, opcionalmente, (b) recuperar el inmunoconjugado.
La invención proporciona además una composición farmacéutica que comprende un inmunoconjugado de la invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
En particular, la invención engloba un inmunoconjugado de acuerdo con la invención para su uso como medicamento y para su uso en el tratamiento de una enfermedad, en la que dicha enfermedad es cáncer.
Descripción detallada
Definiciones
Los términos se usan en el presente documento como se usan en general en la técnica, a menos que se defina de otro modo en lo que sigue.
El término "interleucina 2" o "IL-2" como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier IL-2 natural de cualquier fuente de vertebrado, incluyendo mamíferos tales como primates (por ejemplo, seres humanos) y roedores (por ejemplo, ratones y ratas) a menos que se indique de otro modo. El término engloba IL-2 sin procesar así como cualquier forma de IL-2 que resulte del procesamiento en la célula. El término también engloba variantes naturales de IL-2, por ejemplo, variantes de empalme o variantes alélicas. La secuencia de aminoácidos de una IL-2 humana ejemplar se muestra en SEQ ID NO: 19. La IL-2 humana sin procesar comprende adicionalmente un péptido señal de 20 aminoácidos N terminales que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 26, que está ausente en la molécula de IL-2 madura.
El término "mutante de IL-2" o "polipéptido de IL-2 mutante" como se usa en el presente documento pretende englobar cualquier forma mutante de las diversas formas de la molécula de IL-2 incluyendo IL-2 de longitud completa, formas truncadas de IL-2 y formas donde IL-2 se enlaza a otra molécula tal como por fusión o conjugación química. "Longitud completa" cuando se usa en referencia a IL-2 pretende querer decir la molécula de IL-2 de longitud natural madura. Por ejemplo, IL-2 humana de longitud completa se refiere a una molécula que tiene 133 aminoácidos (véase, por ejemplo, SEQ ID NO: 19). Las diversas formas de mutantes de IL-2 se caracterizan por tener al menos una mutación aminoacídica que afecta a la interacción de IL-2 con CD25. Esta mutación puede implicar la sustitución, deleción, truncamiento o modificación del residuo aminoacídico natural localizado normalmente en esa posición. Son preferentes los mutantes obtenidos por sustitución aminoacídica. A menos que se indique de otro modo, un mutante de IL-2 se puede referir, en el presente documento, a una secuencia de péptidos de IL-2 mutante, un polipéptido de IL-2 mutante, una proteína de IL-2 mutante o un análogo de IL-2 mutante.
La designación de las diversas formas de IL-2 se realiza en el presente documento con respecto a la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 19. Se pueden usar diversas designaciones en el presente documento para indicar la misma mutación. Por ejemplo, se puede indicar una mutación de fenilalanina en la posición 42 a alanina como 42A, A42, A42, F42A o Phe42Ala.
Por una "molécula de IL-2 humana", como se usa en el presente documento, se entiende una molécula de IL-2 que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 91 %, al menos aproximadamente un 92 %, al menos aproximadamente un 93 %, al menos aproximadamente un 94 %, al menos aproximadamente un 95 % o al menos aproximadamente un 96 % idéntica a la secuencia de IL-2 humana de SEQ ID NO: 19. En particular, la identidad de secuencia es de al menos aproximadamente un 95 %, más en particular, de al menos aproximadamente un 96 %. En modos de realización particulares, la molécula de IL-2 humana es una molécula de IL-2 de longitud completa.
El término "mutación aminoacídica", como se usa en el presente documento, pretende englobar sustituciones, deleciones, inserciones y modificaciones aminoacídicas. Se puede realizar cualquier combinación de sustitución, deleción, inserción y modificación para llegar a la construcción final, siempre que la construcción final posea las características deseadas, por ejemplo, unión reducida a CD25. Las deleciones e inserciones en la secuencia de aminoácidos incluyen deleciones e inserciones de aminoácidos amino y/o carboxiterminales. Un ejemplo de una deleción terminal es la deleción del residuo de alanina en la posición 1 de la IL-2 humana de longitud completa.
Las mutaciones aminoacídicas preferentes son las sustituciones aminoacídicas. Con el propósito de alterar, por ejemplo, las características de unión de un polipéptido de IL-2, son en particular preferentes las sustituciones aminoacídicas no conservadoras, es decir, el reemplazo de un aminoácido por otro aminoácido que tenga propiedades estructurales y/o químicas diferentes. Las sustituciones aminoacídicas preferentes incluyen reemplazar un aminoácido hidrófobo por uno hidrófilo. Las sustituciones aminoacídicas incluyen el reemplazo por aminoácidos no naturales o por derivados de aminoácidos naturales de los veinte aminoácidos estándar (por ejemplo, 4-hidroxiprolina, 3-metilhistidina, ornitina, homoserina, 5-hidroxilisina). Se pueden generar mutaciones aminoacídicas usando procedimientos genéticos o químicos bien conocidos en la técnica. Los procedimientos genéticos pueden incluir mutagénesis dirigida a sitio, PCR, síntesis génica y similares. Se contempla que también pueden ser útiles procedimientos de alteración del grupo de cadena lateral de un aminoácido por procedimientos distintos de genomanipulación, tales como modificación química.
Como se usa en el presente documento, una forma "natural" de IL-2 es una forma de IL-2 que, de otro modo, es igual al polipéptido de IL-2 mutante, excepto en que la forma natural tiene un aminoácido natural en cada posición de aminoácido del polipéptido de IL-2 mutante. Por ejemplo, si el mutante de IL-2 es la IL-2 de longitud completa (es decir, IL-2 no fusionada ni conjugada con ninguna otra molécula), la forma natural de este mutante es IL-2 natural de longitud completa. Si el mutante de IL-2 es una fusión entre IL-2 y otro polipéptido codificado hacia 3' de IL-2 (por ejemplo, una cadena de anticuerpo), la forma natural de este mutante de IL-2 es IL-2 con una secuencia de aminoácidos natural fusionada con el mismo polipéptido hacia 3'. Además, si el mutante de IL-2 es una forma truncada de IL-2 (la secuencia mutada o modificada dentro de la porción no truncada de IL-2), entonces la forma natural de este mutante de IL-2 es una IL-2 truncada de forma similar que tiene una secuencia natural. Con el propósito de comparar la afinidad de unión al receptor de IL-2 o la actividad biológica de diversas formas de mutantes de IL-2 con la correspondiente forma natural de IL-2, el término natural engloba formas de IL-2 que comprenden una o más mutaciones aminoacídicas que no afectan a la unión al receptor de IL-2 en comparación con la IL-2 natural, tal como, por ejemplo, una sustitución de cisteína en una posición correspondiente al residuo 125 de IL-2 humana por alanina. En algunos modos de realización, la IL-2 natural, para el propósito de la presente invención, comprende la sustitución aminoacídica C125A (véase la SEQ ID NO: 29). En determinados modos de realización de acuerdo con la invención, el polipéptido de IL-2 natural con el que se compara el polipéptido de IL-2 mutante comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 19. En otros modos de realización, el polipéptido de IL-2 natural con el que se compara el polipéptido de IL-2 mutante comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 29.
El término "CD25" o "subunidad a del receptor de IL-2" como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier CD25 natural de cualquier fuente de vertebrado, incluyendo mamíferos tales como primates (por ejemplo, seres humanos) y roedores (por ejemplo, ratones y ratas) a menos que se indique de otro modo. El término engloba CD25 sin procesar "de longitud completa" así como cualquier forma de CD25 que resulta del procesamiento en la célula. El término también engloba variantes naturales de CD25, por ejemplo, variantes de empalme o variantes alélicas. En determinados modos de realización, CD25 es CD25 humano. La secuencia de aminoácidos de CD25 humano se encuentra, por ejemplo, en la entrada de UniProt n.° P01589 (versión 185).
El término "receptor de IL-2 de alta afinidad" como se usa en el presente documento se refiere a la forma heterotrimérica del receptor de IL-2, que consiste en la subunidad y del receptor (también conocida como subunidad y del receptor de citocinas común, Yc, o CD132, véase la entrada de UniProt n.° P14784 (versión 192)), la subunidad p del receptor (también conocida como CD122 o p70, véase la entrada de UniProt n.° P31785 (versión 197)) y la subunidad a del receptor (también conocida como CD25 o p55, véase la entrada de UniProt n.° P01589 (versión 185)). El término "receptor de IL-2 de afinidad intermedia" al contrario se refiere al receptor de IL-2 que incluye solo la subunidad Y y la subunidad p, sin la subunidad a (para una revisión véase, por ejemplo, Olejniczak y Kasprzak, Med Sci Monit 14, RA179-189 (2008)).
"Afinidad" se refiere a la fuerza de la suma total de interacciones no covalentes entre un único sitio de unión de una molécula (por ejemplo, un receptor) y su compañero de unión (por ejemplo, un ligando). A menos que se indique de otro modo, como se usa en el presente documento, "afinidad de unión" se refiere a la afinidad de unión intrínseca que refleja una interacción 1:1 entre miembros de un par de unión (por ejemplo, un resto de unión a antígeno y un antígeno, o un receptor y su ligando). La afinidad de una molécula X por su compañera Y se puede representar en general por la constante de disociación (Kd), que es la proporción de las constantes de velocidad de disociación y asociación (kdis y kas, respectivamente). Por tanto, las afinidades equivalentes pueden comprender diferentes constantes de velocidad, siempre que la proporción de las constantes de velocidad permanezca igual. La afinidad se puede medir por procedimientos bien establecidos conocidos en la técnica, incluyendo los descritos en el presente documento. Un procedimiento particular para medir la afinidad es la resonancia de plasmón superficial (RPS).
Se puede determinar la afinidad del polipéptido de IL-2 mutante o natural por diversas formas del receptor de IL-2 de acuerdo con el procedimiento expuesto en el documento WO 2012/107417 por resonancia de plasmón superficial (RPS), usando instrumentación estándar tal como un instrumento BIAcore (GE Healthcare) y subunidades receptoras tales como las que se pueden obtener por expresión recombinante (véase, por ejemplo, Shanafelt et al., Nature Biotechnol 18, 1197-1202 (2000)). De forma alternativa, se puede evaluar la afinidad de unión de los mutantes de IL-2 por diferentes formas del receptor de IL-2 usando líneas celulares conocidas por expresar una o la otra de dichas formas del receptor. Los modos de realización ilustrativos y ejemplares específicos para medir la afinidad de unión se describen a continuación en el presente documento.
Por "linfocito T regulador" o "linfocito Treg" se quiere decir un tipo especializado de linfocito T CD4+ que puede suprimir las respuestas de otros linfocitos T. Los linfocitos Treg se caracterizan por la expresión de la subunidad a del receptor de IL-2 (CD25) y el factor de transcripción forkhead box P3 (FOXP3) (Sakaguchi, Annu Rev Immunol 22, 531-62 (2004)) y desempeñan un papel crucial en la inducción y el mantenimiento de la autotolerancia periférica a los antígenos, incluyendo los expresados por tumores. Los linfocitos Treg requieren IL-2 para su función y desarrollo e inducción de sus características supresoras.
Como se usa en el presente documento, el término "células efectoras" se refiere a una población de linfocitos que median los efectos citotóxicos de la IL-2. Las células efectoras incluyen linfocitos T efectores tales como linfocitos T citotóxicos CD8+, linfocitos NK, linfocitos citolíticos activados por linfocinas (LAK) y macrófagos/monocitos.
Como se usa en el presente documento, el término "PD1", "PD1 humano", "PD-1" o "PD-1 humano" (también conocido como proteína de muerte celular programada 1 o muerte programada 1) se refiere a la proteína humana PD1 (SEQ ID NO: 27, proteína sin secuencia señal) / (SEQ ID NO: 28, proteína con secuencia señal). Véase también la entrada de UniProt n.° Q15116 (versión 156). Como se usa en el presente documento, un anticuerpo "que se une a PD-1", "que se une específicamente a PD-1", "que se une a PD-1" o "anticuerpo anti-PD-1" se refiere a un anticuerpo que se puede unir a PD-1, especialmente un polipéptido de PD-1 expresado en una superficie celular, con afinidad suficiente de modo que el anticuerpo sea útil como agente de diagnóstico y/o terapéutico para dirigirse a PD-1. En un modo de realización, el grado de unión de un anticuerpo anti-PD-1 a una proteína distinta de PD-1 no relacionada es menos de aproximadamente un 10 % de la unión del anticuerpo a PD-1 medida, por ejemplo, por radioinmunoensayo (RIA) o citometría de flujo (FACS) o por un ensayo de resonancia de plasmón superficial usando un sistema de biosensor tal como un sistema Biacore®. En determinadas modos de realización, un anticuerpo que se une a PD-1 tiene un valor de KD de la afinidad de unión para unirse a PD-1 humano de < 1 |jM, < 100 nM, < 10 nM, < 1 nM, < 0,1 nM, < 0,01 nM o < 0,001 nM (por ejemplo, 10'8 M o menos, por ejemplo, de 10'8 M a 10'13 M, por ejemplo, de 10'9 M a 10'13 M). En un modo de realización, el valor de KD de la afinidad de unión se determina en un ensayo de resonancia de plasmón superficial usando el dominio extracelular (DEC) de PD-1 humano (PD-1-DEC, véase SEQ ID NO: 43) como antígeno.
Por "unión específica" se quiere decir que la unión es selectiva para el antígeno y se puede discriminar de las interacciones no deseadas o no específicas. Se puede medir la capacidad de un anticuerpo para unirse a un antígeno específico (por ejemplo, PD-1) a través de un enzimoinmunoanálisis de adsorción (e LisA) o bien de otras técnicas consabidas para un experto en la técnica, por ejemplo, la técnica de resonancia de plasmón superficial (RPS) (analizada, por ejemplo, en un instrumento BlAcore) (Liljeblad et al., Glyco J 17, 323-329 (2000)) y ensayos de unión tradicionales (Heeley, Endocr Res 28, 217-229 (2002)). En un modo de realización, el grado de unión de un anticuerpo a una proteína no relacionada es menos de aproximadamente un 10 % de la unión del anticuerpo al antígeno medida, por ejemplo, por RPS. El anticuerpo comprendido en el inmunoconjugado descrito en el presente documento se une específicamente a PD-1.
Como se usa en el presente documento, el término "polipéptido" se refiere a una molécula compuesta por monómeros (aminoácidos) enlazados linealmente por enlaces amida (también conocidos como enlaces peptídicos). El término "polipéptido" se refiere a cualquier cadena de dos o más aminoácidos, y no se refiere a una longitud específica del producto. Por tanto, los péptidos, dipéptidos, tripéptidos, oligopéptidos, "proteína", "cadena de aminoácidos" o cualquier otro término usado para referirse a una cadena de dos o más aminoácidos se incluyen dentro de la definición de "polipéptido", y el término "polipéptido" se puede usar en lugar de, o de manera intercambiable con, cualquiera de estos términos. El término "polipéptido" también pretende referirse a los productos de modificaciones posteriores a la expresión del polipéptido, incluyendo sin limitación, glucosilación, acetilación, fosforilación, amidación, derivatización por grupos protectores/bloqueantes conocidos, escisión proteolítica o modificación por aminoácidos no naturales. Un polipéptido se puede derivar de una fuente biológica natural o producir por tecnología recombinante, pero no se traduce necesariamente a partir de una secuencia de ácido nucleico designada. Se puede generar de cualquier manera, incluyendo por síntesis química. Los polipéptidos pueden tener una estructura tridimensional definida, aunque no tienen necesariamente dicha estructura. Los polipéptidos con una estructura tridimensional definida se denominan plegados, y los polipéptidos que no poseen una estructura tridimensional definida, sino que pueden adoptar un gran número de conformaciones diferentes, se denominan desplegados.
Por un polipéptido "aislado" o una variante o derivado del mismo se entiende un polipéptido que no está en su medio natural. No se requiere ningún nivel particular de purificación. Por ejemplo, un polipéptido aislado se puede retirar de su entorno natural. Los polipéptidos y proteínas producidos de forma recombinante expresados en células huésped se consideran aislados para el propósito de la invención, ya que son polipéptidos naturales o recombinantes que se han separado, fraccionado o purificado parcial o sustancialmente por cualquier técnica adecuada.
"Porcentaje (%) de identidad de secuencia de aminoácidos" con respecto a una secuencia polipeptídica de referencia se define como el porcentaje de residuos aminoacídicos en una secuencia candidata que son idénticos a los residuos aminoacídicos en la secuencia polipeptídica de referencia, después de alinear las secuencias e introducir huecos, si fuera necesario, para lograr el porcentaje máximo de identidad de secuencia, y sin considerar ninguna sustitución conservadora como parte de la identidad de secuencia. El alineamiento con propósitos de determinación del porcentaje de identidad de secuencia de aminoácidos se puede lograr de diversas maneras que están dentro de la experiencia en la técnica, por ejemplo, usando un programa informático disponible al público tal como BLAST, BLAST-2, Clustal W, programa informático Megalign (DNASTAR) o el paquete de programas FASTA. Los expertos en la técnica pueden determinar los parámetros apropiados para alinear secuencias, incluyendo cualquier algoritmo necesario para lograr la máxima alineación sobre la longitud completa de las secuencias que se comparan. Sin embargo, para los propósitos en el presente documento, los valores de porcentaje de identidad de secuencia de aminoácidos se generan usando el programa ggsearch del paquete FASTA versión 36.3.8c o posterior con una matriz de comparación BLOSUM50. El paquete de programas FASTA se creó por W. R. Pearson y D. J. Lipman (1988), "Improved Tools for Biological Sequence Analysis", PNAS 85:2444-2448; W. R. Pearson (1996) "Effective protein sequence comparison" Meth. Enzimol. 266:227-258; y Pearson et al. (1997) Genomics 46:24-36, y está disponible al público en http://fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/fasta_down.shtml. De forma alternativa, se puede usar un servidor público accesible en http://fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/index.cgi para comparar las secuencias, usando el programa ggsearch (proteína global:proteína) y las opciones predeterminadas (BLOSUM50; abrir: -10; ext: -2; Ktup = 2) para garantizar que se realice una alineación global, en lugar de local. El porcentaje de identidad de aminoácidos se da en el encabezado de alineación de salida.
El término "polinucleótido" se refiere a una molécula o construcción de ácido nucleico aislada, por ejemplo, ARN mensajero (ARNm), ARN derivado de virus o ADN de plásmido (ADNp). Un polinucleótido puede comprender un enlace fosfodiéster convencional o un enlace no convencional (por ejemplo, un enlace amida, tal como se encuentra en los ácidos peptidonucleicos (APN)). El término "molécula de ácido nucleico" se refiere a cualquiera de uno o más segmentos de ácido nucleico, por ejemplo, fragmentos de ADN o ARN, presentes en un polinucleótido.
Por molécula de ácido nucleico o polinucleótido "aislado" se entiende una molécula de ácido nucleico, ADN o ARN que se ha retirado de su entorno natural. Por ejemplo, un polinucleótido recombinante que codifica un polipéptido contenido en un vector se considera aislado para los propósitos de la presente invención. Otros ejemplos de un polinucleótido aislado incluyen polinucleótidos recombinantes mantenidos en células huésped heterólogas o polinucleótidos (parcial o sustancialmente) purificados en solución. Un polinucleótido aislado incluye una molécula polinucleotídica contenida en células que contienen normalmente la molécula polinucleotídica, pero la molécula polinucleotídica está presente de forma extracromosómica o en una localización cromosómica que es diferente de su localización cromosómica natural. Las moléculas de ARN aisladas incluyen transcritos de a Rn in vivo o in vitro de la presente invención, así como formas de hebras positivas y negativas y formas bicatenarias. Los polinucleótidos o ácidos nucleicos aislados de acuerdo con la presente invención incluyen además dichas moléculas producidas sintéticamente. Además, un polinucleótido o un ácido nucleico puede ser o puede incluir un elemento regulador tal como un promotor, sitio de unión a ribosoma o un finalizador de la transcripción.
"Polinucleótido (o ácido nucleico) aislado que codifica [por ejemplo, un inmunoconjugado de la invención]" se refiere a una o más moléculas polinucleotídicas que codifican cadenas pesadas y ligeras de anticuerpo y/o polipéptidos de IL-2 (o fragmentos de los mismos), incluyendo dicha(s) molécula(s) polinucleotídica(s) en un vector único o vectores separados, y dicha(s) molécula(s) de ácido nucleico presente(s) en una o más localizaciones en una célula huésped.
El término "casete de expresión" se refiere a un polinucleótido generado de forma recombinante o sintética, con una serie de elementos de ácido nucleico especificados que permiten la transcripción de un ácido nucleico particular en una célula diana. El casete de expresión recombinante se puede incorporar en un plásmido, cromosoma, ADN mitocondrial, ADN de plástido, virus o fragmento de ácido nucleico.
Típicamente, la porción de casete de expresión recombinante de un vector de expresión incluye, entre otras secuencias, una secuencia de ácido nucleico que se va a transcribir y un promotor. En determinados aspectos de la divulgación, el casete de expresión comprende secuencias de polinucleótido que codifican inmunoconjugados de la invención o fragmentos de los mismos.
El término "vector" o "vector de expresión" se refiere a una molécula de ADN que se usa para introducir y dirigir la expresión de un gen específico al que se asocia de forma funcional en una célula. El término incluye el vector como una estructura de ácido nucleico autorreplicante así como el vector incorporado en el genoma de una célula huésped en la que se ha introducido. El vector de expresión de la presente invención comprende un casete de expresión. Los vectores de expresión permiten la transcripción de grandes cantidades de ARNm estable. Una vez que el vector de expresión está en el interior de la célula, la molécula de ácido ribonucleico o proteína que se codifica por el gen se produce por el mecanismo de transcripción y/o traducción celular. En un modo de realización, el vector de expresión de la invención comprende un casete de expresión que comprende secuencias polinucleotídicas que codifican inmunoconjugados de la invención o fragmentos de los mismos.
Los términos "célula huésped", "línea de células huésped" y "cultivo de células huésped" se usan de manera intercambiable y se refieren a células en las que se ha introducido ácido nucleico exógeno, incluyendo la descendencia de dichas células. Las células huésped incluyen "transformantes" y "células transformadas", que incluyen la célula transformada principal y la descendencia derivada de la misma, independientemente del número de pases. La descendencia puede no ser completamente idéntica en contenido de ácido nucleico a una célula original, sino que puede contener mutaciones. La descendencia mutante que tiene la misma función o actividad biológica que la que se criba o selecciona en la célula transformada originalmente se incluye en el presente documento. Una célula huésped es cualquier tipo de sistema celular que se puede usar para generar los inmunoconjugados de la presente invención. Las células huésped incluyen células cultivadas, por ejemplo, células cultivadas de mamífero, tales como células HEK, células CHO, células BHK, células NS0, células SP2/0, células de mieloma YO, células de mieloma de ratón P3X63, células PER, células PER.C6 o células de hibridoma, células de levadura, células de insecto y células vegetales, por nombrar solo unas pocas, pero también células comprendidas dentro de un animal transgénico, planta transgénica o tejido animal o vegetal cultivado.
El término "anticuerpo" en el presente documento se usa en el sentido más amplio y engloba diversas estructuras de anticuerpos, incluyendo, pero sin limitarse a, anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos) y fragmentos de anticuerpo siempre que presenten la actividad de unión a antígeno deseada.
El término "anticuerpo monoclonal" como se usa en el presente documento se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales comprendidos en la población son idénticos y/o se unen al mismo epítopo, excepto por posibles anticuerpos variantes, por ejemplo, que contienen mutaciones naturales o surgen durante la producción de una preparación de anticuerpos monoclonales, estando presentes, en general, dichas variantes en cantidades escasas. A diferencia de las preparaciones de anticuerpos policlonales, que típicamente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos frente a diferentes determinantes (epítopos), cada anticuerpo monoclonal de una preparación de anticuerpos monoclonales se dirige frente a un único determinante en un antígeno. Por tanto, el modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo como que se ha obtenido de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos, y no se ha de interpretar como que requiere la producción del anticuerpo por ningún procedimiento particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales que se van a usar de acuerdo con la presente invención se pueden preparar por una variedad de técnicas, incluyendo, pero sin limitarse al procedimiento de hibridoma, procedimientos de ADN recombinante, procedimientos de presentación en fagos y procedimientos que utilizan animales transgénicos que contienen todos o parte de los locus de inmunoglobulina humana; describiéndose en el presente documento dichos procedimientos y otros procedimientos ejemplares para preparar anticuerpos monoclonales.
Un anticuerpo "aislado" es uno que se ha separado de un componente de su entorno natural, es decir, que no está en su medio natural. No se requiere ningún nivel particular de purificación. Por ejemplo, un anticuerpo aislado se puede retirar de su entorno natural. Los anticuerpos producidos de forma recombinante expresados en células huésped se consideran aislados para el propósito de la invención, ya que son anticuerpos naturales o recombinantes que se han separado, fraccionado o purificado parcial o sustancialmente por cualquier técnica adecuada. Como tal, se aíslan los inmunoconjugados de la presente invención. En algunos modos de realización, se purifica un anticuerpo a más de un 95 % o 99 % de pureza, como se determina, por ejemplo, por electroforesis (por ejemplo, SDS-PAGE, isoelectroenfoque (IEF), electroforesis capilar) o cromatografía (por ejemplo, HPLC de intercambio iónico o de fase inversa). Para una revisión de los procedimientos para la valoración de la pureza de los anticuerpos, véase, por ejemplo, Flatman et al., J. Chromatogr. B 848:7987 (2007).
Los términos "anticuerpo de longitud completa", "anticuerpo intacto" y "anticuerpo completo" se usan en el presente documento de manera intercambiable para referirse a un anticuerpo que tiene una estructura sustancialmente similar a una estructura de anticuerpo natural.
Un "fragmento de anticuerpo" se refiere a una molécula distinta de un anticuerpo intacto que comprende una porción de un anticuerpo intacto que se une al antígeno al que se une el anticuerpo intacto. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen, pero no se limitan a, Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, diacuerpos, anticuerpos lineales, moléculas de anticuerpo monocatenarias (por ejemplo, scFv) y anticuerpos de dominio único. Para una revisión de determinados fragmentos de anticuerpo, véase Holliger y Hudson, Nature Biotechnology 23:1126-1136 (2005). Para una revisión de los fragmentos scFv, véase, por ejemplo, Plückthun, en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994); véase también el documento WO 93/16185; y las patentes de EE. UU. n.os 5.571.894 y 5.587.458. Para un análisis de los fragmentos Fab y F(ab')2 que comprenden residuos del epítopo de unión al receptor de rescate y que tienen una semivida in vivo incrementada, véase la patente de EE. UU. n.° 5.869.046. Los diacuerpos son fragmentos de anticuerpo con dos sitios de unión a antígeno que pueden ser bivalentes o biespecíficos. Véase, por ejemplo, el documento EP 404.097; el documento WO 1993/01161; Hudson et al., Nat Med 9, 129-134 (2003); y Hollinger et al., Proc Natl Acad Sci USA 90, 6444-6448 (1993). También se describen triacuerpos y tetracuerpos en Hudson et al., Nat Med 9, 129-134 (2003). Los anticuerpos de dominio único son fragmentos de anticuerpo que comprenden todo o una porción del dominio variable de la cadena pesada o todo o una porción del dominio variable de la cadena ligera de un anticuerpo. En determinados modos de realización, un anticuerpo de dominio único es un anticuerpo de dominio único humano (Domantis, Inc., Waltham, MA; véase por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 6.248.516 B1). Se pueden preparar fragmentos de anticuerpo por diversas técnicas, incluyendo, pero sin limitarse a digestión proteolítica de un anticuerpo intacto, así como producción por células huésped recombinantes (por ejemplo, E. coli o fago), como se describe en el presente documento.
El término "molécula de inmunoglobulina" se refiere a una proteína que tiene la estructura de un anticuerpo natural. Por ejemplo, las inmunoglobulinas de la clase IgG son glucoproteínas heterotetrámeras de aproximadamente 150.000 dalton, compuestas por dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas que se unen con enlaces disulfuro. Desde el extremo N al C, cada cadena pesada tiene un dominio variable (VH), también llamado dominio pesado variable o región variable de la cadena pesada, seguido de tres dominios constantes (CH1, CH2 y CH3), también llamados región constante de la cadena pesada. De forma similar, desde el extremo N al C, cada cadena ligera tiene un dominio variable (VL), también llamado dominio ligero variable o región variable de la cadena ligera, seguido de un dominio constante ligero (CL), también llamado región constante de la cadena ligera. La cadena pesada de una inmunoglobulina se puede asignar a uno de cinco tipos, llamados a (IgA), 5 (IgD), £ (IgE), y (IgG) o |j (IgM), de los que algunos se pueden dividir además en subtipos, por ejemplo, yi (IgGi), Y2 (IgG2), Y3 (IgG3), Y4 (IgG4), ai (IgAi) y a2 (IgA2). La cadena ligera de una inmunoglobulina se puede asignar a uno de dos tipos, llamados kappa (k) y lambda (A), en base a la secuencia de aminoácidos de su dominio constante. Una inmunoglobulina consiste esencialmente en dos moléculas Fab y un dominio Fc, unidos por medio de la región bisagra de inmunoglobulina.
El término "dominio de unión a antígeno" se refiere a la parte de un anticuerpo que comprende el área que se une específicamente a y es complementaria a parte o la totalidad de un antígeno. Se puede proporcionar un dominio de unión a antígeno, por ejemplo, por uno o más dominios variables de anticuerpo (también llamados regiones variables de anticuerpo). En particular, un dominio de unión a antígeno comprende un dominio variable de la cadena ligera (VL) de anticuerpo y un dominio variable de la cadena pesada (VH) de anticuerpo.
El término "región variable" o "dominio variable" se refiere al dominio de una cadena pesada o ligera de anticuerpo que está implicado en la unión del anticuerpo al antígeno. Los dominios variables de la cadena pesada y de la cadena ligera (VH y VL, respectivamente) de un anticuerpo natural, en general, tienen estructuras similares, comprendiendo cada dominio cuatro regiones estructurales (FR) conservadas y tres regiones hipervariables (HVR). Véase, por ejemplo, Kindt et al., Kuby Immunology, 6.a ed., W.H. Freeman and Co., página 91 (2007). Un dominio VH o VL único puede ser suficiente para conferir especificidad de unión a antígeno. Como se usa en el presente documento en relación con secuencias de regiones variables, "numeración de Kabat" se refiere al sistema de numeración expuesto por Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.a ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991).
Como se usa en el presente documento, las posiciones de aminoácidos de todas las regiones y dominios constantes de la cadena pesada y ligera se numeran de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat descrito en Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.a ed., Public Health Service, National Institutes de Health, Bethesda, MD (1991) y se denomina "numeración de acuerdo con Kabat" o "numeración de Kabat" en el presente documento. Específicamente el sistema de numeración de Kabat (véanse las páginas 647-660 de Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.a ed., Public Health Service, National Institutes de Health, Bethesda, MD (1991)) se usa para el dominio constante de la cadena ligera CL del isotipo kappa y lambda y el sistema de numeración del índice EU de Kabat (véanse las páginas 661-723) se usa para los dominios constantes de la cadena pesada (CH1, bisagra, CH2 y CH3), lo que se aclara además en el presente documento refiriéndose a la "numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat" en este caso.
El término "región hipervariable" o "HVR", como se usa en el presente documento, se refiere a cada una de las regiones de un dominio variable de anticuerpo que son hipervariables en secuencia ("regiones determinantes de la complementariedad" o "CDR") y/o forman bucles estructuralmente definidos ("bucles hipervariables") y/o contienen los residuos en contacto con el antígeno ("contactos con el antígeno"). En general, los anticuerpos comprenden seis HVR; tres en el VH (H1, H2, H3) y tres en el VL (L1, L2, L3). Las HVR ejemplares en el presente documento incluyen:
(a) bucles hipervariables que se producen en los residuos aminoacídicos 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26­ 32 (H1), 53-55 (H2) y 96-101 (H3) (Chothia y Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987));
(b) CDR que se producen en los residuos aminoacídicos 24-34 (L1), 50-56 (L2), 89-97 (L3), 31-35b (H1), 50-65 (H2) y 95-102 (H3) (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.a ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991));
(c) contactos con el antígeno que se producen en los residuos aminoacídicos 27c-36 (L1), 46-55 (L2), 89-96 (L3), 30-35b (H1), 47-58 (H2) y 93-101 (H3) (MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262:732-745 (1996)); y
(d) combinaciones de (a), (b) y/o (c), que incluyen los residuos aminoacídicos de HVR 46-56 (L2), 47-56 (L2), 48-56 (L2), 49-56 (L2), 26-35 (H1), 26-35b (H1), 49-65 (H2), 93-102 (H3) y 94-102 (H3).
A menos que se indique de otro modo, los residuos de HVR y otros residuos en el dominio variable (por ejemplo, los residuos de FR) se numeran en el presente documento de acuerdo con Kabat et al., supra.
"Región estructural" o "FR" se refiere a residuos del dominio variable distintos de los residuos de la región hipervariable (HVR). La FR de un dominio variable consiste en general en cuatro dominios de FR: FR1, FR2, FR3 y FR4. En consecuencia, las secuencias de HVR y FR aparecen en general en el siguiente orden en VH (o VL): FR1-H1(L1 )-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.
Un anticuerpo "humanizado" se refiere a un anticuerpo quimérico que comprende residuos aminoacídicos de HVR no humanas y residuos aminoacídicos de FR humanas. En determinados modos de realización, un anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos de al menos uno, y típicamente dos, dominios variables, en los que todas o sustancialmente todas las HVR (por ejemplo, CDR) corresponden a las de un anticuerpo no humano, y todas o sustancialmente todas las FR corresponden a las de un anticuerpo humano. Dichos dominios variables se denominan en el presente documento "región variable humanizada". Un anticuerpo humanizado puede comprender, opcionalmente, al menos una porción de una región constante de anticuerpo derivada de un anticuerpo humano. En algunos modos de realización se sustituyen algunos residuos de FR en un anticuerpo humanizado por los residuos correspondientes de un anticuerpo no humano (por ejemplo, el anticuerpo del que se derivan los residuos de HVR), por ejemplo, para restablecer o mejorar la especificidad o afinidad del anticuerpo. Una "forma humanizada" de un anticuerpo, por ejemplo, de un anticuerpo no humano, se refiere a un anticuerpo que se ha sometido a humanización. Otras formas de "anticuerpos humanizados" englobadas por la presente invención son aquellas en las que la región constante se ha modificado o cambiado adicionalmente con respecto a la del anticuerpo original para generar las propiedades de acuerdo con la invención, en especial con respecto a la unión a C1q y/o unión al receptor de Fc (FcR).
Un "anticuerpo humano" es uno que posee una secuencia de aminoácidos que se corresponde a la de un anticuerpo producido por un ser humano o una célula humana o derivado de una fuente no humana que utiliza repertorios de anticuerpos humanos u otras secuencias que codifican anticuerpos humanos. Esta definición de un anticuerpo humano excluye específicamente un anticuerpo humanizado que comprende residuos de unión a antígeno no humanos. En determinados modos de realización, un anticuerpo humano se deriva de un mamífero transgénico no humano, por ejemplo, un ratón, una rata o un conejo. En determinados modos de realización, un anticuerpo humano se deriva de una línea celular de hibridoma. Los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo aislados de colecciones de anticuerpos humanos también se consideran anticuerpos humanos o fragmentos de anticuerpo humano en el presente documento.
La "clase" de un anticuerpo o inmunoglobulina se refiere al tipo de dominio constante o región constante poseído por su cadena pesada. Existen cinco clases principales de anticuerpos: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y varias de estas se pueden dividir además en subclases (isotipos), por ejemplo, IgGi, IgG2, IgG3, IgG4, IgAi e IgA2. Los dominios constantes de la cadena pesada que corresponden a las diferentes clases de inmunoglobulinas se llaman a, 5, £, Y, y |J, respectivamente.
El término "dominio Fc" o "región Fc" en el presente documento se usa para definir una región C terminal de una cadena pesada de inmunoglobulina que contiene al menos una porción de la región constante. El término incluye regiones Fc de secuencia natural y regiones Fc variantes. Aunque los límites de la región Fc de una cadena pesada de IgG pueden variar ligeramente, la región Fc de la cadena pesada de IgG humana se define normalmente por extenderse de Cys226, o de Pro230, al extremo carboxílico de la cadena pesada. Sin embargo, los anticuerpos producidos por células huésped pueden experimentar escisión postraduccional de uno o más, en particular uno o dos, aminoácidos del extremo C de la cadena pesada. Por lo tanto, un anticuerpo producido por una célula huésped por expresión de una molécula de ácido nucleico específica que codifica una cadena pesada de longitud completa puede incluir la cadena pesada de longitud completa, o puede incluir una variante escindida de la cadena pesada de longitud completa (también denominada en el presente documento "cadena pesada variante escindida"). Este puede ser el caso cuando los dos aminoácidos C terminales finales de la cadena pesada son glicina (G446) y lisina (K447, numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat). Por lo tanto, la lisina C terminal (Lys447), o la glicina (Gly446) y lisina (K447) C terminales, de la región Fc pueden estar presentes o no. Las secuencias de aminoácidos de cadenas pesadas incluyendo dominios Fc (o una subunidad de un dominio Fc como se define en el presente documento) se indican en el presente documento sin dipéptido glicina-lisina C terminal, si no se indica de otro modo. En un aspecto de la divulgación, una cadena pesada que incluye una subunidad de un dominio Fc como se especifica en el presente documento, comprendida en un inmunoconjugado de acuerdo con la invención, comprende un dipéptido glicina-lisina C terminal adicional (G446 y K447, numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat). En un aspecto de la divulgación, una cadena pesada que incluye una subunidad de un dominio Fc como se especifica en el presente documento, comprendida en un inmunoconjugado de acuerdo con la invención, comprende un residuo de glicina C terminal adicional (G446, numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat). Las composiciones de la invención, tales como las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento, comprenden una población de inmunoconjugados de la invención. La población de inmunoconjugados puede comprender moléculas que tienen una cadena pesada de longitud completa y moléculas que tienen una cadena pesada variante escindida. La población de inmunoconjugados puede consistir en una mezcla de moléculas que tienen una cadena pesada de longitud completa y moléculas que tienen una cadena pesada variante escindida, en la que al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 % o al menos un 90 % de los inmunoconjugados tienen una cadena pesada variante escindida. En un aspecto divulgación, una composición que comprende una población de inmunoconjugados de la invención comprende un inmunoconjugado que comprende una cadena pesada que incluye una subunidad de un dominio Fc como se especifica en el presente documento con un dipéptido glicina-lisina C terminal adicional (G446 y K447, numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat). En un aspecto de la divulgación, una composición que comprende una población de inmunoconjugados de la invención comprende un inmunoconjugado que comprende una cadena pesada que incluye una subunidad de un dominio Fc como se especifica en el presente documento con un residuo de glicina C terminal adicional (G446, numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat). En un aspecto de la divulgación, una composición de este tipo comprende una población de inmunoconjugados compuesta de moléculas que comprenden una cadena pesada que incluye una subunidad de un dominio Fc como se especifica en el presente documento; moléculas que comprenden una cadena pesada que incluye una subunidad de un dominio Fc como se especifica en el presente documento con un residuo de glicina C terminal adicional (G446, numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat); y moléculas que comprenden una cadena pesada que incluye una subunidad de un dominio Fc como se especifica en el presente documento con un dipéptido glicina-lisina C terminal adicional (G446 y K447, numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat). A menos que se especifique de otro modo en el presente documento, la numeración de residuos aminoacídicos en la región Fc o región constante es de acuerdo con el sistema de numeración EU, también llamado índice EU, como se describe en Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.a ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991 (véase también anteriormente). Una "subunidad" de un dominio Fc como se usa en el presente documento se refiere a uno de los dos polipéptidos que forman el dominio Fc dimérico, es decir, un polipéptido que comprende regiones constantes C terminales de una cadena pesada de inmunoglobulina, que pueden tener autoasociación estable. Por ejemplo, una subunidad de un dominio Fc de IgG comprende un dominio constante CH2 de IgG y uno CH3 de IgG.
Una "modificación que promueve la asociación de la primera y la segunda subunidad del dominio Fc" es una manipulación del esqueleto peptídico o las modificaciones postraduccionales de una subunidad del dominio Fc que reduce o evita la asociación de un polipéptido que comprende la subunidad del dominio Fc con un polipéptido idéntico para formar un homodímero. Una modificación que promueve la asociación como se usa en el presente documento, en particular, incluye modificaciones separadas realizadas en cada una de las dos subunidades del dominio Fc que se desean asociar (es decir, la primera y la segunda subunidad del dominio Fc), en la que las modificaciones son complementarias entre sí para promover la asociación de las dos subunidades del dominio Fc. Por ejemplo, una modificación que promueve la asociación puede alterar la estructura o carga de una o ambas de las subunidades del dominio Fc para hacer que su asociación sea estérica o electrostáticamente favorable, respectivamente. Por tanto, se produce (hetero)dimerización entre un polipéptido que comprende la primera subunidad del dominio Fc y un polipéptido que comprende la segunda subunidad del dominio Fc, que podría ser no idéntico en el sentido de que otros componentes fusionados con cada una de las subunidades (por ejemplo, restos de unión a antígeno) no son los mismos. En algunos modos de realización, la modificación que promueve la asociación comprende una mutación aminoacídica en el dominio Fc, específicamente una sustitución aminoacídica. En un modo de realización particular, la modificación que promueve la asociación comprende una mutación aminoacídica separada, específicamente una sustitución aminoacídica, en cada una de las dos subunidades del dominio Fc.
El término "funciones efectoras" cuando se usa en referencia a anticuerpos se refiere a las actividades biológicas atribuibles a la región Fc de un anticuerpo, que varían con el isotipo del anticuerpo. Los ejemplos de funciones efectoras de anticuerpo incluyen: unión a C1q y citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), unión al receptor de Fc, citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC), fagocitosis celular dependiente de anticuerpos (ADCP), secreción de citocinas, captación de antígenos mediada por complejo inmunitario por células presentadoras de antígenos, regulación por disminución de receptores de superficie celular (por ejemplo, receptor de linfocitos B) y activación de linfocitos B.
La citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) es un mecanismo inmunitario que da lugar a la lisis de células diana recubiertas de anticuerpo por células efectoras inmunitarias. Las células diana son células a las que se unen específicamente anticuerpos o derivados de los mismos que comprenden una región Fc, en general por medio de la parte proteica que es N terminal a la región Fc. Como se usa en el presente documento, el término "ADCC reducida" se define como una reducción en el número de células diana que se lisan en un tiempo dado, a una concentración de anticuerpo dada en el medio circundante a las células diana, por el mecanismo de ADCC definido anteriormente, y/o bien un incremento en la concentración de anticuerpo en el medio circundante a las células diana, requerido para lograr la lisis de un número dado de células diana en un tiempo dado, por el mecanismo de ADCC. La reducción en la ADCC es relativa a la ADCC mediada por el mismo anticuerpo producido por el mismo tipo de células huésped, usando los mismos procedimientos de producción, purificación, formulación y almacenamiento estándar (que son conocidos para los expertos en la técnica), pero que no se ha genomanipulado. Por ejemplo, la reducción en ADCC mediada por un anticuerpo que comprende en su dominio Fc una sustitución aminoacídica que reduce la ADCC es relativa a la ADCC mediada por el mismo anticuerpo sin esta sustitución aminoacídica en el dominio Fc. Los ensayos adecuados para medir la ADCC son bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, la publicación PCT n.° WO 2006/082515 o la publicación PCT n.° WO 2012/130831).
Un "receptor de Fc activador" es un receptor de Fc que después del acoplamiento por un dominio Fc de un anticuerpo provoca acontecimientos de señalización que estimulan a la célula portadora del receptor para que realice funciones efectoras. Los receptores de Fc activadores humanos incluyen FcYRIIIa (CD16a), FcyRI (CD64), FcYRIIa (CD32) y FcaRI (CD89).
Como se usa en el presente documento, se considera que los términos "genomanipular, genomanipulado, genomanipulación" incluyen cualquier manipulación del esqueleto peptídico o las modificaciones postraduccionales de un polipéptido natural o recombinante o fragmento del mismo. La genomanipulación incluye modificaciones de la secuencia de aminoácidos, del patrón de glucosilación, o del grupo de cadena lateral de aminoácidos individuales, así como combinaciones de estos enfoques.
"Unión reducida", por ejemplo unión reducida a un receptor de Fc o a CD25, se refiere a una disminución en la afinidad para la interacción respectiva, como se mide por ejemplo por RPS. Por claridad, el término también incluye la reducción de la afinidad hasta cero (o por debajo del límite de detección del procedimiento analítico), es decir, la anulación completa de la interacción. A la inversa, "unión incrementada" se refiere a un incremento en la afinidad de unión para la interacción respectiva.
Como se usa en el presente documento, el término "inmunoconjugado" se refiere a una molécula polipeptídica que incluye al menos una molécula de IL-2 y al menos un anticuerpo. La molécula de IL-2 se puede unir al anticuerpo por una variedad de interacciones y en una variedad de configuraciones como se describe en el presente documento. En modos de realización particulares, la molécula de IL-2 se fusiona con el anticuerpo por medio de un conector peptídico. Los inmunoconjugados particulares de acuerdo con la invención consisten esencialmente en una molécula de IL-2 y un anticuerpo unidos por una o más secuencias conectoras.
Por "fusionado" se quiere decir que los componentes (por ejemplo, un anticuerpo y una molécula de IL-2) se enlazan por enlaces peptídicos, directamente o bien por medio de uno o más conectores peptídicos.
Como se usa en el presente documento, los términos "primera" y "segunda" con respecto a las subunidades del dominio Fc, etc., se usan por conveniencia para distinguir cuando existe más de uno de cada tipo de resto. El uso de estos términos no pretende conferir un orden u orientación específicos del inmunoconjugado a menos que así se establezca explícitamente.
Una "cantidad eficaz" de un agente se refiere a la cantidad que es necesaria para dar como resultado un cambio fisiológico en la célula o tejido al que se administra.
Una "cantidad terapéuticamente eficaz" de un agente, por ejemplo, una composición farmacéutica, se refiere a una cantidad eficaz, en dosificaciones y durante períodos de tiempo necesarios, para lograr el resultado terapéutico o profiláctico deseado. Una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente, por ejemplo, elimina, disminuye, retrasa, minimiza o previene efectos adversos de una enfermedad.
Un "individuo" o "sujeto" es un mamífero. Los mamíferos incluyen, pero no se limitan a, animales domésticos (por ejemplo, vacas, ovejas, gatos, perros y caballos), primates (por ejemplo, seres humanos y primates no humanos tales como monos), conejos y roedores (por ejemplo, ratones y ratas). En particular, el individuo o sujeto es un ser humano.
El término "composición farmacéutica" se refiere a una preparación que está en tal forma que permite que la actividad biológica de un ingrediente activo contenido en la misma sea eficaz, y que no contiene componentes adicionales que sean inaceptablemente tóxicos para un sujeto al que se le administraría la composición.
Un "vehículo farmacéuticamente aceptable" se refiere a un ingrediente en una composición farmacéutica, distinto de un ingrediente activo, que no es tóxico para un sujeto. Un vehículo farmacéuticamente aceptable incluye, pero no se limita a, un tampón, excipiente, estabilizante o conservante.
Como se usa en el presente documento, "tratamiento" (y variaciones gramaticales del mismo tales como "tratar" o "que trata") se refiere a la intervención clínica en un intento de alterar la evolución natural de una enfermedad en el individuo que se está tratando, y que se puede realizar para la profilaxis o bien durante el transcurso de análisis clínicos. Los efectos deseables del tratamiento incluyen, pero no se limitan a, prevención de la aparición o recidiva de la enfermedad, alivio de los síntomas, disminución de cualquier consecuencia patológica directa o indirecta de la enfermedad, prevención de metástasis, disminución de la tasa de progresión de la enfermedad, mejora o atenuación del estado de la enfermedad y remisión o pronóstico mejorado. En algunos modos de realización, se usan los inmunoconjugados de la invención para retrasar la aparición de una enfermedad o para ralentizar la progresión de una enfermedad.
Polipéptido de IL-2 mutante
Los inmunoconjugados de acuerdo con la presente invención comprenden un polipéptido de IL-2 mutante que tiene propiedades ventajosas para la inmunoterapia. En particular, se eliminan las propiedades farmacológicas de IL-2 que contribuyen a la toxicidad pero que no son esenciales para la eficacia de iL-2 en el polipéptido de IL-2 mutante. Dichos polipéptidos de IL-2 mutantes se describen en detalle en el documento WO 2012/107417, que se incorpora en el presente documento por referencia en su totalidad. Como se analiza anteriormente, las diferentes formas del receptor de IL-2 consisten en diferentes subunidades y presentan diferentes afinidades por IL-2. El receptor de IL-2 de afinidad intermedia, que consiste en las subunidades de receptores p y y, se expresa en células efectoras en reposo y es suficiente para la señalización de IL-2. El receptor de iL-2 de alta afinidad, que comprende adicionalmente la subunidad a del receptor, se expresa principalmente en linfocitos T reguladores (Treg), así como en células efectoras activadas donde su acoplamiento por IL-2 puede promover la inmunodepresión mediada por linfocitos Treg o la muerte celular inducida por activación (AICD), respectivamente. Por tanto, sin quedar vinculado a ninguna teoría, reducir o anular la afinidad de IL-2 por la subunidad a del receptor de IL-2 debería reducir la regulación por disminución inducida por IL-2 de la función celular efectora por los linfocitos T reguladores y el desarrollo de tolerancia tumoral por el proceso de AICD. Por otra parte, mantener la afinidad por el receptor de IL-2 de afinidad intermedia debería conservar la inducción de la proliferación y activación de células efectoras como linfocitos NK y T por IL-2.
El polipéptido de interleucina 2 (IL-2) mutante comprendido en el inmunoconjugado de acuerdo con la divulgación comprende al menos una mutación aminoacídica que anula o reduce la afinidad del polipéptido de IL-2 mutante por la subunidad a del receptor de IL-2 y conserva la afinidad del polipéptido de IL-2 mutante por el receptor de IL-2 de afinidad intermedia, cada uno comparado con un polipéptido de IL-2 natural.
Los mutantes de IL-2 humana (hIL-2) con afinidad disminuida por CD25 se pueden generar, por ejemplo, por sustitución aminoacídica en la posición de aminoácido 35, 38, 42, 43, 45 o 72 o combinaciones de las mismas (numeración relativa a la secuencia de IL-2 humana SEQ ID NO: 19). Las sustituciones aminoacídicas ejemplares incluyen K35E, K35A, R38A, R38E, R38N, R38F, R38S, R38L, R38G, R38Y, R38W, F42L, F42A, F42G, F42S, F42T, F42Q, F42E, F42N, F42D, F42R, F42K, K43E, Y45A, Y45G, Y45S, Y45T, Y45Q, Y45E, Y45N, Y45D, Y45R, Y45K, L72G, L72A, L72S, L72T, L72Q, L72E, L72N, L72D, L72R y L72K. Los mutantes de IL-2 particulares útiles en los inmunoconjugados de la invención comprenden una mutación aminoacídica en una posición de aminoácido correspondiente al residuo 42, 45 o 72 de IL-2 humana o una combinación de los mismos. En un modo de realización, dicha mutación aminoacídica es una sustitución aminoacídica seleccionada del grupo de F42A, F42G, F42S, F42T, F42Q, F42E, F42N, F42D, F42R, F42K, Y45A, Y45G, Y45S, Y45T, Y45Q, Y45E, Y45N, Y45D, Y45R, Y45K, L72G, L72A, L72S, L72T, L72Q, L72E, L72N, L72D, L72R y L72K, más específicamente una sustitución aminoacídica seleccionada del grupo de F42A, Y45A y L72G. Estos mutantes presentan una afinidad de unión sustancialmente similar por el receptor de IL-2 de afinidad intermedia y tienen una afinidad sustancialmente reducida por la subunidad a del receptor de IL-2 y el receptor de IL-2 de alta afinidad en comparación con una forma natural del mutante de IL-2.
Otras características de mutantes útiles pueden incluir la capacidad de inducir la proliferación de linfocitos T y/o NK portadores del receptor de IL-2, la capacidad de inducir la señalización de IL-2 en linfocitos T y/o NK portadores del receptor de IL-2, la capacidad de generar el interferón (IFN)-y como una citocina secundaria por linfocitos NK, una capacidad reducida para inducir la elaboración de citocinas secundarias, en particular IL-10 y TNF-a, por leucocitos monomorfonucleares en la sangre periférica (PBMC), una capacidad reducida para activar linfocitos T reguladores, una capacidad reducida para inducir apoptosis en linfocitos T y un perfil de toxicidad reducido in vivo.
Los polipéptidos de IL-2 mutantes particulares útiles comprenden tres mutaciones aminoacídicas que anulan o reducen la afinidad del polipéptido de IL-2 mutante por la subunidad a del receptor de IL-2 pero conservan la afinidad del polipéptido de IL-2 mutante por el receptor de IL-2 de afinidad intermedia. En un aspecto de la divulgación, dichas tres mutaciones aminoacídicas están en posiciones correspondientes a los residuos 42, 45 y 72 de IL-2 humana. En un modo de realización, dichas tres mutaciones aminoacídicas son sustituciones aminoacídicas. En un modo de realización, dichas tres mutaciones aminoacídicas son sustituciones aminoacídicas seleccionadas del grupo de F42A, F42G, F42S, F42T, F42Q, F42E, F42N, F42D, F42R, F42K, Y45A, Y45G, Y45S, Y45T, Y45Q, Y45E, Y45N, Y45D, Y45R, Y45K, L72G, L72A, L72S, L72T, L72Q, L72E, L72N, L72D, L72R y L72K. En un modo de realización específico, dichas tres mutaciones aminoacídicas son las sustituciones aminoacídicas F42A, Y45A y L72G (numeración relativa a la secuencia de IL-2 humana de SEQ ID NO: 19).
En determinados aspectos de la divulgación, dicha mutación aminoacídica reduce la afinidad del polipéptido de IL-2 mutante por la subunidad a del receptor de IL-2 en al menos 5 veces, específicamente al menos 10 veces, más específicamente al menos 25 veces. En un aspecto de la divulgación donde existe más de una mutación aminoacídica que reduce la afinidad del polipéptido de IL-2 mutante por la subunidad a del receptor de IL-2, la combinación de estas mutaciones aminoacídicas puede reducir la afinidad del polipéptido de IL-2 mutante por la subunidad a del receptor de IL-2 en al menos 30 veces, al menos 50 veces o incluso al menos 100 veces. En un aspecto de la divulgación, dicha mutación aminoacídica o combinación de mutaciones aminoacídicas anula la afinidad del polipéptido de IL-2 mutante por la subunidad a del receptor de IL-2 de modo que no es detectable ninguna unión por resonancia de plasmón superficial.
Una unión sustancialmente similar al receptor de afinidad intermedia, es decir, la conservación de la afinidad del polipéptido de IL-2 mutante por dicho receptor, se logra cuando el mutante de IL-2 presenta más de aproximadamente un 70 % de la afinidad de una forma natural del mutante de IL-2 por el receptor de IL-2 de afinidad intermedia. Los mutantes de IL-2 de la invención pueden presentar más de aproximadamente un 80 % e incluso más de aproximadamente un 90 % de dicha afinidad.
La reducción de la afinidad de IL-2 por la subunidad a del receptor de IL-2 en combinación con la eliminación de la O-glucosilación de IL-2 da como resultado una proteína iL-2 con propiedades mejoradas. Por ejemplo, la eliminación del sitio de O-glucosilación da como resultado un producto más homogéneo cuando el polipéptido de IL-2 mutante se expresa en células de mamífero tales como células CHO o HEK.
Por tanto, en determinados modos de realización, el polipéptido de IL-2 mutante comprende una mutación aminoacídica adicional que elimina el sitio de O-glucosilación de IL-2 en una posición correspondiente al residuo 3 de IL-2 humana. En un modo de realización, dicha mutación aminoacídica adicional que elimina el sitio de O-glucosilación de IL-2 en una posición correspondiente al residuo 3 de IL-2 humana es una sustitución aminoacídica. Las sustituciones aminoacídicas ejemplares incluyen T3A, T3G, T3Q, T3E, T3N, T3D, T3R, T3K y T3P. En un modo de realización específico, dicha mutación aminoacídica adicional es la sustitución aminoacídica T3A.
En determinados aspectos de la divulgación, el polipéptido de IL-2 mutante es esencialmente una molécula de IL-2 de longitud completa. En determinados aspectos de la divulgación, el polipéptido de IL-2 mutante es una molécula de IL-2 humana. En un aspecto de la divulgación, el polipéptido de IL-2 mutante comprende la secuencia de SEQ ID NO: 19 con al menos una mutación aminoacídica que anula o reduce la afinidad del polipéptido de IL-2 mutante por la subunidad a del receptor de IL-2 pero conserva la afinidad del polipéptido de IL-2 mutante por el receptor de IL-2 de afinidad intermedia, en comparación con un polipéptido de IL-2 que comprende la SEQ ID NO: 19 sin dicha mutación. En otro aspecto de la divulgación, el polipéptido de IL-2 mutante comprende la secuencia de SEQ ID NO: 29 con al menos una mutación aminoacídica que anula o reduce la afinidad del polipéptido de IL-2 mutante por la subunidad a del receptor de IL-2 pero conserva la afinidad del polipéptido de IL-2 mutante por el receptor de IL-2 de afinidad intermedia, en comparación con un polipéptido de IL-2 que comprende la SEQ ID NO: 29 sin dicha mutación.
En un aspecto específico de la divulgación, el polipéptido de IL-2 mutante puede provocar una o más de las respuestas celulares seleccionadas del grupo que consiste en: proliferación en una célula linfocitaria T activada, diferenciación en una célula linfocitaria T activada, actividad de linfocitos T citotóxicos (CTL), proliferación en un linfocito B activado, diferenciación en un linfocito B activado, proliferación en un linfocito citolítico natural (NK), diferenciación en un linfocito NK, secreción de citocinas por un linfocito T activado o un linfocito NK, y citotoxicidad antitumoral de linfocitos NK/linfocitos citolíticos activados por linfocinas (LAK).
En un aspecto de la divulgación, el polipéptido de IL-2 mutante tiene una capacidad reducida para inducir la señalización de IL-2 en linfocitos T reguladores, en comparación con un polipéptido de IL-2 natural. En un modo de realización, el polipéptido de IL-2 mutante induce menos muerte celular inducida por activación (AICD) en linfocitos T, en comparación con un polipéptido de IL-2 natural. En un aspecto de la divulgación, el polipéptido de IL-2 mutante tiene un perfil de toxicidad reducido in vivo, en comparación con un polipéptido de IL-2 natural. En aspecto de la divulgación, el polipéptido de IL-2 mutante tiene una semivida en suero prolongada, en comparación con un polipéptido de IL-2 natural.
Un polipéptido de IL-2 mutante particular útil en la invención comprende cuatro sustituciones aminoacídicas en las posiciones correspondientes a los residuos 3, 42, 45 y 72 de IL-2 humana. Las sustituciones aminoacídicas específicas son T3A, F42A, Y45A y L72G. Como se demuestra en el documento WO 2012/107417, dicho polipéptido de IL-2 mutante cuádruple presenta ninguna unión detectable a CD25, capacidad reducida para inducir apoptosis en linfocitos T, capacidad reducida para inducir la señalización de IL-2 en linfocitos Treg y un perfil de toxicidad reducido in vivo. Sin embargo, conserva la capacidad de activar la señalización de IL-2 en células efectoras, para inducir la proliferación de células efectoras, y para generar IFN-y como una citocina secundaria por linfocitos NK.
Además, dicho polipéptido de IL-2 mutante tiene otras propiedades ventajosas, tales como hidrofobia superficial reducida, buena estabilidad y buen rendimiento de expresión, como se describe en el documento WO 2012/107417. De forma inesperada, dicho polipéptido de IL-2 mutante también proporciona una semivida en suero prolongada, en comparación con IL-2 natural.
Los mutantes de IL-2 útiles en la invención, además de tener mutaciones en la región de IL-2 que forma la interfase de IL-2 con CD25 o el sitio de glucosilación, también pueden tener una o más mutaciones en la secuencia de aminoácidos fuera de estas regiones. Dichas mutaciones adicionales en IL-2 humana pueden proporcionar ventajas adicionales tales como una expresión o estabilidad incrementadas. Por ejemplo, la cisteína en la posición 125 se puede reemplazar por un aminoácido neutro tal como serina, alanina, treonina o valina, proporcionando IL-2 C125S, IL-2 C125a, IL-2 C125T o IL-2 C125V respectivamente, como se describe en la patente de EE. UU. n.° 4.518.584. Como se describe en la misma, también se puede delecionar el residuo de alanina N terminal de IL-2 proporcionando dichos mutantes como des-A1 C125S o des-A1 C125A. De forma alternativa o conjunta, el mutante de IL-2 puede incluir una mutación con lo que la metionina que se produce normalmente en la posición 104 de IL-2 humana natural se reemplaza por un aminoácido neutro tal como alanina (véase la patente de EE. UU. n.° 5.206.344). Los mutantes resultantes, por ejemplo, IL-2 des-A1 M104A, IL-2 des-A1 M1o4a C125S, IL-2 M104A, IL-2 M104A C125A, IL-2 des-A1 M104A C125A o IL-2 M104A C125S (estos y otros mutantes se pueden encontrar en la patente de EE. UU. n.° 5.116.943 y en Weiger et al., Eur J Biochem 180, 295-300 (1989)) se pueden usar junto con las mutaciones de IL-2 particulares de la invención.
Por tanto, en determinados modos de realización, el polipéptido de IL-2 mutante comprende una mutación aminoacídica adicional en una posición correspondiente al residuo 125 de IL-2 humana. En un modo de realización, dicha mutación aminoacídica adicional es la sustitución aminoacídica C125A.
El experto en la técnica podrá determinar qué mutaciones adicionales pueden proporcionar ventajas adicionales para el propósito de la invención. Por ejemplo, apreciará que las mutaciones aminoacídicas en la secuencia de IL-2 que reducen o anulan la afinidad de IL-2 por el receptor de IL-2 de afinidad intermedia, tales como D20T, N88R o Q126D (véase, por ejemplo, el documento US 2007/0036752), pueden no ser adecuadas para incluirse en el polipéptido de IL-2 mutante de acuerdo con la invención.
En un modo de realización, el polipéptido de IL-2 mutante comprende no más de 12, no más de 11, no más de 10, no más de 9, no más de 8, no más de 7, no más de 6 o no más de 5 mutaciones aminoacídicas en comparación con la secuencia de IL-2 natural correspondiente, por ejemplo, la secuencia de IL-2 humana de SEQ ID NO: 19. En un modo de realización particular, el polipéptido de IL-2 mutante comprende no más de 5 mutaciones aminoacídicas en comparación con la secuencia de IL-2 natural correspondiente, por ejemplo, la secuencia de IL-2 humana de SEQ ID No: 19.
En un modo de realización, el polipéptido de IL-2 mutante comprende la secuencia de SEQ ID NO: 20. En un modo de realización, el polipéptido de iL-2 mutante consiste en la secuencia de SEQ ID NO: 20.
Inmunoconjugados
Los inmunoconjugados como se describe en el presente documento comprenden una molécula de IL y un anticuerpo. Dichos inmunoconjugados incrementan significativamente la eficacia del tratamiento con IL-2 dirigiendo directamente la IL-2, por ejemplo, hacia un microentorno tumoral. De acuerdo con la invención, un anticuerpo comprendido en el inmunoconjugado puede ser una inmunoglobulina o anticuerpo completos, o una porción de una variante de los mismos que tiene una función biológica tal como afinidad de unión específica a antígeno.
Los beneficios generales del tratamiento con inmunoconjugados son fácilmente evidentes. Por ejemplo, un anticuerpo comprendido en un inmunoconjugado reconoce un epítopo específico de tumor y da como resultado el direccionamiento de la molécula de inmunoconjugado al sitio del tumor. Por lo tanto, se pueden suministrar concentraciones altas de IL-2 en el microentorno tumoral, dando como resultado de este modo la activación y proliferación de una variedad de células efectoras inmunitarias mencionadas en el presente documento usando una dosis mucho menor del inmunoconjugado de la que se requeriría para la IL-2 no conjugada. Además, puesto que la aplicación de IL-2 en forma de inmunoconjugados permite dosis menores de la propia citocina, se restringe la posibilidad de efectos secundarios indeseables de IL-2, y dirigir la IL-2 a un sitio específico en el cuerpo por medio de un inmunoconjugado también puede dar como resultado una reducción de la exposición sistémica y, por tanto, menos efectos secundarios que los obtenidos con la IL-2 no conjugada. Además, la semivida en circulación incrementada de un inmunoconjugado en comparación con la IL-2 no conjugada contribuye a la eficacia del inmunoconjugado. Sin embargo, esta característica de los inmunoconjugados de IL-2 puede agravar de nuevo los potenciales efectos secundarios de la molécula de IL-2: debido a la semivida en circulación significativamente más larga del inmunoconjugado de IL-2 en la circulación sanguínea en relación con la IL-2 no conjugada, se incrementa la probabilidad de que la IL-2 u otras porciones de la molécula de proteína de fusión activen componentes en general presentes en la vasculatura. La misma preocupación se aplica a otras proteínas de fusión que contienen IL-2 fusionada con otro resto tal como Fc o albúmina, dando como resultado una semivida prolongada de IL-2 en la circulación. Por lo tanto, un inmunoconjugado que comprende un polipéptido de IL-2 mutante como se describe en el presente documento y en el documento WO 2012/107417, con toxicidad reducida en comparación con las formas naturales de IL-2, es en particular ventajoso.
Como se ha descrito anteriormente en el presente documento, dirigir la IL-2 directamente a las células efectoras inmunitarias en lugar de a las células tumorales puede ser ventajoso para la inmunoterapia con IL-2.
En consecuencia, la invención proporciona un polipéptido de IL-2 mutante como se describe anteriormente en el presente documento, y un anticuerpo que se une a PD-1. En un modo de realización, el polipéptido de IL-2 mutante y el anticuerpo forman una proteína de fusión, es decir, el polipéptido de IL-2 mutante comparte un enlace peptídico con el anticuerpo. En algunos modos de realización, el anticuerpo comprende un dominio Fc compuesto por una primera y una segunda subunidad. En un modo de realización específico, el polipéptido de IL-2 mutante se fusiona en su aminoácido aminoterminal al aminoácido carboxiterminal de una de las subunidades del dominio Fc, opcionalmente, a través de un péptido conector. En algunos modos de realización, el anticuerpo es un anticuerpo de longitud completa. En algunos modos de realización, el anticuerpo es una molécula de inmunoglobulina, en particular una molécula de inmunoglobulina de clase IgG, más en particular una molécula de inmunoglobulina de subclase IgG1. En un modo de realización de este tipo, el polipéptido de IL-2 mutante comparte un enlace peptídico aminoterminal con una de las cadenas pesadas de inmunoglobulina. En determinados modos de realización, el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo. En algunos modos de realización, el anticuerpo es una molécula Fab o una molécula scFv. En un modo de realización, el anticuerpo es una molécula Fab. En otro modo de realización, el anticuerpo es una molécula scFv. El inmunoconjugado también puede comprender más de un anticuerpo. Cuando el inmunoconjugado comprende más de un anticuerpo, por ejemplo, un primer y un segundo anticuerpo, cada anticuerpo se puede seleccionar independientemente de diversas formas de anticuerpos y fragmentos de anticuerpo. Por ejemplo, el primer anticuerpo puede ser una molécula Fab y el segundo anticuerpo puede ser una molécula scFv. En un modo de realización específico, cada uno de dicho primer y dicho segundo anticuerpos es una molécula scFv o cada uno de dicho primer y dicho segundo anticuerpos es una molécula Fab. En un modo de realización particular, cada uno de dicho primer y dicho segundo anticuerpos es una molécula Fab. En un modo de realización, cada uno de dicho primer y dicho segundo anticuerpos se une a PD-1.
Formatos de inmunoconjugados
Los formatos de inmunoconjugados ejemplares se describen en la publicación PCT n.° WO 2011/020783, que se incorpora en el presente documento por referencia en su totalidad. Estos inmunoconjugados comprenden al menos dos anticuerpos. Por tanto, en un modo de realización, el inmunoconjugado de acuerdo con la presente invención comprende un polipéptido de IL-2 mutante como se describe en el presente documento, y al menos un primer y un segundo anticuerpo. En un modo de realización particular, dicho primer y segundo anticuerpo se seleccionan independientemente del grupo que consiste en una molécula Fv, en particular una molécula scFv, y una molécula Fab. En un modo de realización específico, dicho polipéptido de IL-2 mutante comparte un enlace peptídico aminoo carboxiterminal con dicho primer anticuerpo y dicho segundo anticuerpo comparte un enlace peptídico amino- o carboxiterminal con i) el polipéptido de IL-2 mutante o bien ii) el primer anticuerpo. En un modo de realización particular, el inmunoconjugado consiste esencialmente en un polipéptido de IL-2 mutante y primer y segundo anticuerpos, en particular moléculas Fab, unidos por una o más secuencias conectoras. Dichos formatos tienen la ventaja de que se unen con alta afinidad al antígeno diana (PD-1), pero proporcionan unión solo monomérica al receptor de IL-2, evitando, por tanto, dirigir el inmunoconjugado a las células inmunitarias portadoras del receptor de IL-2 en otras localizaciones distintas del sitio diana. En un modo de realización particular, un polipéptido de IL-2 mutante comparte un enlace peptídico carboxiterminal con un primer anticuerpo, en particular una primera molécula Fab, y además comparte un enlace peptídico aminoterminal con un segundo anticuerpo, en particular una segunda molécula Fab. En otro modo de realización, un primer anticuerpo, en particular una primera molécula Fab, comparte un enlace peptídico carboxiterminal con un polipéptido de IL-2 mutante, y además comparte un enlace peptídico aminoterminal con un segundo anticuerpo, en particular una segunda molécula Fab. En otro modo de realización, un primer anticuerpo, en particular una primera molécula Fab, comparte un enlace peptídico aminoterminal con un primer polipéptido de IL-2 mutante, y además comparte un péptido carboxiterminal con un segundo anticuerpo, en particular una segunda molécula Fab. En un modo de realización particular, un polipéptido de IL-2 mutante comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una primera región variable de la cadena pesada y además comparte un enlace peptídico aminoterminal con una segunda región variable de la cadena pesada. En otro modo de realización, un polipéptido de IL-2 mutante comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una primera región variable de la cadena ligera y además comparte un enlace peptídico aminoterminal con una segunda región variable de la cadena ligera. En otro modo de realización, una primera región variable de la cadena pesada o ligera se une por un enlace peptídico carboxiterminal a un polipéptido de IL-2 mutante y se une además por un enlace peptídico aminoterminal a una segunda región variable de la cadena pesada o ligera. En otro modo de realización, una primera región variable de la cadena pesada o ligera se une por un enlace peptídico aminoterminal a un polipéptido de IL-2 mutante y se une además por un enlace peptídico carboxiterminal a una segunda región variable de la cadena pesada o ligera. En un modo de realización, un polipéptido de IL-2 mutante comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una primera cadena pesada o ligera de Fab y además comparte un enlace peptídico aminoterminal con una segunda cadena pesada o ligera de Fab. En otro modo de realización, una primera cadena pesada o ligera de Fab comparte un enlace peptídico carboxiterminal con un polipéptido de IL-2 mutante y además comparte un enlace peptídico aminoterminal con una segunda cadena pesada o ligera de Fab. En otros modos de realización, una primera cadena pesada o ligera de Fab comparte un enlace peptídico aminoterminal con un polipéptido de IL-2 mutante y además comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una segunda cadena pesada o ligera de Fab. En un modo de realización, el inmunoconjugado comprende un polipéptido de IL-2 mutante que comparte un enlace peptídico aminoterminal con una o más moléculas scFv y que además comparte un enlace peptídico carboxiterminal con una o más moléculas scFv.
Los formatos en particular adecuados para los inmunoconjugados de acuerdo con la presente invención, sin embargo, comprenden una molécula de inmunoglobulina como anticuerpo. Dichos formatos de inmunoconjugados se describen en el documento WO 2012/146628, que se incorpora en el presente documento por referencia en su totalidad.
En consecuencia, en modos de realización particulares, el inmunoconjugado comprende un polipéptido de IL-2 mutante como se describe en el presente documento y una molécula de inmunoglobulina que se une a PD-1, en particular una molécula de IgG, más en particular una molécula de IgG1. En un modo de realización, el inmunoconjugado comprende no más de un polipéptido de IL-2 mutante. En un modo de realización, la molécula de inmunoglobulina es humana. En un modo de realización, la molécula de inmunoglobulina comprende una región constante humana, por ejemplo, un dominio CH1, CH2, CH3 y/o CL humano. En un modo de realización, la inmunoglobulina comprende un dominio Fc humano, en particular un dominio Fc de IgG1 humana. En un modo de realización, el polipéptido de IL-2 mutante comparte un enlace peptídico amino- o carboxiterminal con la molécula de inmunoglobulina. En un modo de realización, el inmunoconjugado consiste esencialmente en un polipéptido de IL-2 mutante y una molécula de inmunoglobulina, en particular una molécula de IgG, más en particular una molécula de IgG1, unida por una o más secuencias conectoras. En un modo de realización específico, el polipéptido de IL-2 mutante se fusiona en su aminoácido aminoterminal al aminoácido carboxiterminal de una de las cadenas pesadas de inmunoglobulina, opcionalmente, a través de un péptido conector.
El polipéptido de IL-2 mutante se puede fusionar con el anticuerpo directamente o a través de un péptido conector, que comprende uno o más aminoácidos, típicamente, aproximadamente 2-20 aminoácidos. Los péptidos conectores son conocidos en la técnica y se describen en el presente documento. Los péptidos conectores no inmunógenos adecuados incluyen, por ejemplo, (G4S)n, (SG4)n, (G4S)n o G4(SG4)n péptidos conectores, "n" es, en general, un número entero de 1 a 10, típicamente de 2 a 4. En un modo de realización, el péptido conector tiene una longitud de al menos 5 aminoácidos, en un modo de realización una longitud de 5 a 100, en otro modo de realización de 10 a 50 aminoácidos. En un modo de realización particular, el péptido conector tiene una longitud de 15 aminoácidos. En un modo de realización, el péptido conector es (GxS)n o (GxS)nGm con G=glicina, S=serina y (x=3, n= 3, 4, 5 o 6 y m=0, 1, 2 o 3) o (x=4, n=2, 3, 4 o 5 y m = 0, 1, 2 o 3), en un modo de realización x=4 y n=2 o 3, en otro modo de realización x=4 y n=3. En un modo de realización particular, el péptido conector es (G4S)3 (SEQ ID NO: 21). En un modo de realización, el péptido conector tiene (o consiste en) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 21.
En un modo de realización particular, el inmunoconjugado comprende una molécula de IL-2 mutante y una molécula de inmunoglobulina, en particular una molécula de inmunoglobulina de subclase IgG1, que se une a PD-1, en el que la molécula de IL-2 mutante se fusiona en su aminoácido aminoterminal con el aminoácido carboxiterminal de una de las cadenas pesadas de inmunoglobulina a través del péptido conector de SEQ ID NO: 21.
En un modo de realización particular, el inmunoconjugado comprende una molécula de IL-2 mutante y un anticuerpo que se une a PD-1, en el que el anticuerpo comprende un dominio Fc, en particular un dominio Fc de IgG1 humana, compuesto por una primera y una segunda subunidad, y la molécula de IL-2 mutante se fusiona en su aminoácido aminoterminal con el aminoácido carboxiterminal de una de las subunidades del dominio Fc a través del péptido conector de SEQ ID NO: 21.
Anticuerpos frente a PD-1
El anticuerpo comprendido en el inmunoconjugado de la invención se une a PD-1, en particular a PD-1 humano, y puede dirigir el polipéptido de IL-2 mutante a un sitio diana donde se expresa PD-1, en particular a un linfocito T que expresa PD-1, por ejemplo, asociado a un tumor.
Los anticuerpos frente a PD-1 adecuados que se pueden usar en el inmunoconjugado de la invención se describen en el documento WO 2017/055443 A1.
El inmunoconjugado de la invención puede comprender dos o más anticuerpos, que se pueden unir al mismo o a diferentes antígenos. Sin embargo, en modos de realización particulares, cada uno de estos anticuerpos se une a PD-1. En un modo de realización, el anticuerpo comprendido en el inmunoconjugado de la invención es monoespecífico. En un modo de realización particular, el inmunoconjugado comprende un único anticuerpo monoespecífico, en particular una molécula de inmunoglobulina monoespecífica.
El anticuerpo puede ser cualquier tipo de anticuerpo o fragmento del mismo que conserva la unión específica a PD-1, en particular PD-1 humano. Los fragmentos de anticuerpos incluyen, pero no se limitan a, moléculas Fv, molécula scFv, molécula Fab y moléculas F(ab')2. En modos de realización particulares, sin embargo, el anticuerpo es un anticuerpo de longitud completa. En algunos modos de realización, el anticuerpo comprende un dominio Fc compuesto por una primera y una segunda subunidad. En algunos modos de realización, el anticuerpo es una inmunoglobulina, en particular una inmunoglobulina de clase IgG, más en particular una de subclase IgG1.
En algunos modos de realización, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.
En algunos modos de realización, el anticuerpo comprende una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, una FR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 en las posiciones 71-73 de acuerdo con la numeración de Kabat, una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 y una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6.
En algunos modos de realización, el anticuerpo comprende (a) una región variable de la cadena pesada (VH) que comprende una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 y una FR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 en las posiciones 71-73 de acuerdo con la numeración de Kabat, y (b) una región variable de la cadena ligera (VL) que comprende una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 y una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6. En algunos modos de realización, la región variable de la cadena pesada y/o ligera es una región variable humanizada. En algunos modos de realización, la región variable de la cadena pesada y/o ligera comprende regiones estructurales (FR) humanas.
En algunos modos de realización, el anticuerpo comprende una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8, una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9, una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11, una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12 y una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13.
En algunos modos de realización, el anticuerpo comprende (a) una región variable de la cadena pesada (VH) que comprende una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8, una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 y una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, y (b) una región variable de la cadena ligera (VL) que comprende una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11, una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12 y una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13. En algunos modos de realización, la región variable de la cadena pesada y/o ligera es una región variable humanizada. En algunos modos de realización, la región variable de la cadena pesada y/o ligera comprende regiones estructurales (FR) humanas.
En algunos modos de realización, el anticuerpo comprende una región variable de la cadena pesada (VH) que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14. En algunos modos de realización, el anticuerpo comprende una región variable de la cadena ligera (VL) que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17 y SEQ ID NO: 18. En algunos modos de realización, el anticuerpo comprende (a) una región variable de la cadena pesada (VH) que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14, y (b) una región variable de la cadena ligera (VL) que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17 y SEQ ID NO: 18.
En un modo de realización particular, el anticuerpo comprende (a) una región variable de la cadena pesada (VH) que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14 y (b) una región variable de la cadena ligera (VL) que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15.
En algunos modos de realización, el anticuerpo es un anticuerpo humanizado. En un modo de realización, el anticuerpo es una molécula de inmunoglobulina que comprende una región constante humana, en particular una molécula de inmunoglobulina de clase IgG que comprende un dominio CH1, CH2, CH3 y/o CL humano. Se dan secuencias ejemplares de dominios constantes humanos en SEQ ID NO 31 y 32 (dominios CL kappa y lambda humanos, respectivamente) y SEQ ID NO: 33 (dominios constantes de la cadena pesada de IgG1 humana CH1-CH2-CH3). En algunos modos de realización, el anticuerpo comprende una región constante de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 31 o SEQ ID NO: 32, en particular la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 31. En algunos modos de realización, el anticuerpo comprende una región constante de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 33. En particular, la región constante de la cadena pesada puede comprender mutaciones aminoacídicas en el dominio Fc como se describe en el presente documento.
Dominio Fc
En modos de realización particulares, el anticuerpo comprendido en los inmunoconjugados de acuerdo con la invención comprende un dominio Fc, compuesto por una primera y una segunda subunidad. El dominio Fc de un anticuerpo consiste en un par de cadenas polipeptídicas que comprenden los dominios de la cadena pesada de una molécula de inmunoglobulina. Por ejemplo, el dominio Fc de una molécula de inmunoglobulina G (IgG) es un dímero, del que cada subunidad comprende los dominios constantes de la cadena pesada de IgG CH2 y CH3. Las dos subunidades del dominio Fc pueden tener asociación estable entre sí. En un modo de realización, el inmunoconjugado de la invención comprende no más de un dominio Fc. En un modo de realización, el dominio Fc del anticuerpo comprendido en el inmunoconjugado es un dominio Fc de IgG. En un modo de realización particular, el dominio Fc es un dominio Fc de IgG1. En otro modo de realización, el dominio Fc es un dominio Fc de IgG4. En un modo de realización más específico, el dominio Fc es un dominio Fc de IgG4 que comprende una sustitución aminoacídica en la posición S228 (numeración del índice EU de Kabat), en particular la sustitución aminoacídica S228P. Esta sustitución aminoacídica reduce el intercambio en el brazo Fab in vivo de los anticuerpos IgG4 (véase Stubenrauch et al., Drug Metabolism and Disposition 38, 84-91 (2010)). En otro modo de realización particular, el dominio Fc es un dominio Fc humano. En un modo de realización incluso más particular, el dominio Fc es un dominio Fc de IgG1 humana. Una secuencia ejemplar de una región Fc de IgG1 humana se da en SEQ ID NO: 30.
Modificaciones en el dominio Fc que promueven la heterodimerización
Los inmunoconjugados de acuerdo con la invención comprenden un polipéptido de IL-2 mutante, en particular, un único (no más de uno) polipéptido de IL-2 mutante, fusionado con una u otra de las dos subunidades del dominio Fc, por tanto, las dos subunidades del dominio Fc están típicamente comprendidas en dos cadenas polipeptídicas no idénticas. La coexpresión recombinante de estos polipéptidos y la posterior dimerización dan lugar a varias combinaciones posibles de los dos polipéptidos. Para mejorar el rendimiento y la pureza del inmunoconjugado en la producción recombinante, será ventajoso, por tanto, introducir en el dominio Fc del anticuerpo una modificación que promueva la asociación de los polipéptidos deseados.
En consecuencia, en modos de realización particulares, el dominio Fc del anticuerpo comprendido en el inmunoconjugado de acuerdo con la invención comprende una modificación que promueve la asociación de la primera y la segunda subunidad del dominio Fc. El sitio de interacción proteína-proteína más extensa entre las dos subunidades de un dominio Fc de IgG humana es en el dominio CH3 del dominio Fc. Por tanto, en un modo de realización, dicha modificación está en el dominio CH3 del dominio Fc.
Existen varios enfoques para las modificaciones en el dominio CH3 del dominio Fc para garantizar la heterodimerización, que se describen bien, por ejemplo, en los documentos WO 96/27011, W o 98/050431, EP 1870459, WO 2007/110205, WO 2007/147901, WO 2009/089004, WO 2010/129304, WO 2011/90754, WO 2011/143545, WO 2012058768, WO 2013157954, WO 2013096291. Típicamente, en todos de dichos enfoques, el dominio CH3 de la primera subunidad del dominio Fc y el dominio CH3 de la segunda subunidad del dominio Fc se genomanipulan ambos de manera complementaria de modo que cada dominio CH3 (o la cadena pesada que lo comprende) ya no se puede homodimerizar consigo mismo sino que se fuerza a heterodimerizarse con el otro dominio CH3 genomanipulado de forma complementaria (de modo que el primer y segundo dominio CH3 se heterodimerizan y no se forman homodímeros entre los dos primeros o los dos segundos dominios CH3).
En un modo de realización específico, dicha modificación que promueve la asociación de la primera y la segunda subunidad del dominio Fc es una modificación denominada "botón en ojal", que comprende una modificación de "botón" en una de las dos subunidades del dominio Fc y una modificación de "ojal" en la otra de las dos subunidades del dominio Fc.
La tecnología de botón en ojal se describe, por ejemplo, en el documento US 5.731.168; el documento US 7.695.936; Ridgway et al., Prot Eng 9, 617-621 (1996) y Carter, J Immunol Meth 248, 7-15 (2001). En general, el procedimiento implica introducir una protuberancia ("botón") en la interfase de un primer polipéptido y una cavidad ("ojal") correspondiente en la interfase de un segundo polipéptido, de modo que la protuberancia se puede situar en la cavidad para promover la formación de heterodímeros y dificultar la formación de homodímeros. Las protuberancias se construyen reemplazando cadenas laterales de aminoácidos pequeñas de la interfase del primer polipéptido por cadenas laterales más grandes (por ejemplo, tirosina o triptófano). Se crean cavidades compensadoras de tamaño idéntico o similar a las protuberancias en la interfase del segundo polipéptido reemplazando cadenas laterales de aminoácidos grandes por otras más pequeñas (por ejemplo, alanina o treonina).
En consecuencia, en un modo de realización particular, en el dominio CH3 de la primera subunidad del dominio Fc del anticuerpo comprendido en el inmunoconjugado, un residuo aminoacídico se reemplaza por un residuo aminoacídico que tiene un volumen de cadena lateral más grande, generando, de este modo, una protuberancia en el dominio CH3 de la primera subunidad que se puede situar en una cavidad en el dominio CH3 de la segunda subunidad, y en el dominio CH3 de la segunda subunidad del dominio Fc un residuo aminoacídico se reemplaza por un residuo aminoacídico que tiene un volumen de cadena lateral más pequeño, generando, de este modo, una cavidad en el dominio CH3 de la segunda subunidad en el que se puede situar la protuberancia en el dominio CH3 de la primera subunidad.
Preferentemente, dicho residuo aminoacídico que tiene un volumen de cadena lateral más grande se selecciona del grupo que consiste en arginina (R), fenilalanina (F), tirosina (Y) y triptófano (W).
Preferentemente dicho residuo aminoacídico que tiene un volumen de cadena lateral más pequeño se selecciona del grupo que consiste en alanina (A), serina (S), treonina (T) y valina (V).
La protuberancia y la cavidad se pueden realizar alterando el ácido nucleico que codifica los polipéptidos, por ejemplo, por mutagénesis específica de sitio o por síntesis peptídica.
En un modo de realización específico, en el dominio CH3 de la primera subunidad del dominio Fc (la subunidad "botones") el residuo de treonina en la posición 366 se reemplaza por un residuo de triptófano (T366W), y en el dominio CH3 de la segunda subunidad del dominio Fc (la subunidad "ojal") el residuo de tirosina en la posición 407 se reemplaza por un residuo de valina (Y407V). En un modo de realización, en la segunda subunidad del dominio Fc adicionalmente el residuo de treonina en la posición 366 se reemplaza por un residuo de serina (T366S) y el residuo de leucina en la posición 368 se reemplaza por un residuo de alanina (L368A) (numeraciones de acuerdo con el índice EU de Kabat).
Aún en otro modo de realización, en la primera subunidad del dominio Fc, adicionalmente se reemplaza el residuo de serina en la posición 354 por un residuo de cisteína (S354C) o se reemplaza el residuo de ácido glutámico en la posición 356 por un residuo de cisteína (E356C) (en particular el residuo de serina en la posición 354 se reemplaza por un residuo de cisteína), y en la segunda subunidad del dominio Fc, adicionalmente se reemplaza el residuo de tirosina en la posición 349 por un residuo de cisteína (Y349C) (numeraciones de acuerdo con el índice EU de Kabat). La introducción de estos dos residuos de cisteína da como resultado la formación de un puente disulfuro entre las dos subunidades del dominio Fc, estabilizando adicionalmente el dímero (Carter, J Immunol Methods 248, 7-15 (2001)).
En un modo de realización particular, la primera subunidad del dominio Fc comprende las sustituciones aminoacídicas S354C y T366W, y la segunda subunidad del dominio Fc comprende las sustituciones aminoacídicas Y349C, T366S, L368A e Y407V (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat).
En algunos modos de realización, la segunda subunidad del dominio Fc comprende adicionalmente las sustituciones aminoacídicas H435R e Y436F (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat).
En un modo de realización particular, el polipéptido de IL-2 mutante se fusiona (opcionalmente a través de un péptido conector) con la primera subunidad del dominio Fc (que comprende la modificación de "botón"). Sin quedar vinculado a ninguna teoría, la fusión del polipéptido de IL-2 mutante con la subunidad que contiene el botón del dominio Fc minimizará (adicionalmente) la generación de inmunoconjugados que comprenden dos polipéptidos de IL-2 mutantes (choque estérico de dos polipéptidos que contienen el botón).
Otras técnicas de modificación de CH3 para garantizar la heterodimerización se contemplan como alternativas de acuerdo con la invención y se describen, por ejemplo, en los documentos WO 96/27011, WO 98/050431, EP 1870459, WO 2007/110205, WO 2007/147901, WO 2009/089004, WO 2010/129304, WO 2011/90754, WO 2011/143545, WO 2012/058768, WO 2013/157954, WO 2013/096291.
En un modo de realización, de forma alternativa se usa el enfoque de heterodimerización descrito en el documento EP 1870459. Este enfoque se basa en la introducción de aminoácidos cargados con cargas opuestas en posiciones de aminoácidos específicas en la interfase CH3/dominio CH3 entre las dos subunidades del dominio Fc. Un modo de realización preferente para el anticuerpo comprendido en el inmunoconjugado de la invención son las mutaciones aminoacídicas R409D; K370E en uno de los dos dominios CH3 (del dominio Fc) y las mutaciones aminoacídicas D399K; E357K en el otro de los dominios CH3 del dominio Fc (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat).
En otro modo de realización, el anticuerpo comprendido en el inmunoconjugado de la invención comprende la mutación aminoacídica T366W en el dominio CH3 de la primera subunidad del dominio Fc y las mutaciones aminoacídicas T366S, L368A, Y407V en el dominio CH3 de la segunda subunidad del dominio Fc, y adicionalmente las mutaciones aminoacídicas R409D; K370E en el dominio CH3 de la primera subunidad del dominio Fc y las mutaciones aminoacídicas D399K; E357K en el dominio CH3 de la segunda subunidad del dominio Fc (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat).
En otro modo de realización, el anticuerpo comprendido en el inmunoconjugado de la invención comprende las mutaciones aminoacídicas S354C, T366w en el dominio CH3 de la primera subunidad del dominio Fc y las mutaciones aminoacídicas Y349C, T366S, L368A, Y407V en el dominio CH3 de la segunda subunidad del dominio Fc, o dicho anticuerpo comprende las mutaciones aminoacídicas Y349C, T366W en el dominio CH3 de la primera subunidad del dominio Fc y las mutaciones aminoacídicas S354C, T366S, L368A, Y407V en los dominios CH3 de la segunda subunidad del dominio Fc y adicionalmente las mutaciones aminoacídicas R409D; K370E en el dominio CH3 de la primera subunidad del dominio Fc y las mutaciones aminoacídicas D399K; E357K en el dominio CH3 de la segunda subunidad del dominio Fc (todas las numeraciones de acuerdo con el índice EU de Kabat).
En un modo de realización, de forma alternativa se usa el enfoque de heterodimerización descrito en el documento WO 2013/157953. En un modo de realización, un primer dominio CH3 comprende la mutación aminoacídica T366K y un segundo dominio CH3 comprende la mutación aminoacídica L351D (numeraciones de acuerdo con el índice EU de Kabat). En otro modo de realización, el primer dominio CH3 comprende otra mutación aminoacídica L351K. En otro modo de realización, el segundo dominio CH3 comprende otra mutación aminoacídica seleccionada de Y349E, Y349D y L368E (preferentemente L368E) (numeraciones de acuerdo con el índice EU de Kabat).
En un modo de realización, de forma alternativa se usa el enfoque de heterodimerización descrito en el documento WO 2012/058768. En un modo de realización, un primer dominio CH3 comprende las mutaciones aminoacídicas L351Y, Y407A y un segundo dominio CH3 comprende las mutaciones aminoacídicas T366A, K409F. En otro modo de realización, el segundo dominio CH3 comprende otra mutación aminoacídica en la posición T411, D399, S400, F405, N390 o K392, por ejemplo, seleccionada de a) T411N, T411R, T411Q, T411K, T411D, T411E o T411W, b) D399R, D399W, D399Y o D399K, c) S400E, S400D, S400R o S400K, d) F405I, F405M, F405T, F405S, F405V o F405W, e) N390R, N390K o N390D, f) K392V, K392M, K392R, K392L, K392F o K392E (numeraciones de acuerdo con el índice EU de Kabat). En otro modo de realización, un primer dominio CH3 comprende las mutaciones aminoacídicas L351Y, Y407A y un segundo dominio CH3 comprende las mutaciones aminoacídicas T366V, K409F. En otro modo de realización, un primer dominio CH3 comprende la mutación aminoacídica Y407A y un segundo dominio CH3 comprende las mutaciones aminoacídicas T366A, K409F. En otro modo de realización, el segundo dominio CH3 comprende además las mutaciones aminoacídicas K392E, T411E, D399R y S400R (numeraciones de acuerdo con el índice EU de Kabat).
En un modo de realización, de forma alternativa se usa el enfoque de heterodimerización descrito en el documento WO 2011/143545, por ejemplo, con la modificación aminoacídica en una posición seleccionada del grupo que consiste en 368 y 409 (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat).
En un modo de realización, de forma alternativa se usa el enfoque de heterodimerización descrito en el documento WO 2011/090762, que también usa la tecnología de botones en ojales descrita anteriormente. En un modo de realización, un primer dominio CH3 comprende la mutación aminoacídica T366W y un segundo dominio CH3 comprende la mutación aminoacídica Y407A. En un modo de realización, un primer dominio CH3 comprende la mutación aminoacídica T366Y y un segundo dominio CH3 comprende la mutación aminoacídica Y407T (numeraciones de acuerdo con el índice EU de Kabat).
En un modo de realización, el anticuerpo comprendido en el inmunoconjugado o su dominio Fc es de la subclase IgG2 y de forma alternativa se usa el enfoque de heterodimerización descrito en el documento WO 2010/129304.
En un modo de realización alternativo, una modificación que promueve la asociación de la primera y la segunda subunidad del dominio Fc comprende una modificación que media en los efectos de conducción electrostática, por ejemplo, como se describe en la publicación PCT WO 2009/089004. En general, este procedimiento implica el reemplazo de uno o más residuos aminoacídicos en la interfase de las dos subunidades del dominio Fc por residuos aminoacídicos cargados de modo que la formación de homodímeros se vuelve electrostáticamente desfavorable pero la heterodimerización electrostáticamente favorable. En un modo de realización de este tipo, un primer dominio CH3 comprende la sustitución aminoacídica de K392 o N392 con un aminoácido cargado negativamente (por ejemplo, ácido glutámico (E), o ácido aspártico (D), preferentemente K392D o N392D) y un segundo dominio CH3 comprende la sustitución aminoacídica de D399, E356, D356 o E357 con un aminoácido cargado positivamente (por ejemplo, lisina (K) o arginina (R), preferentemente D399K, E356K, D356K o E357K, y más preferentemente D399K y E356K). En otro modo de realización, el primer dominio CH3 comprende además la sustitución aminoacídica de K409 o R409 con un aminoácido cargado negativamente (por ejemplo, ácido glutámico (E), o ácido aspártico (D), preferentemente K409D o R409D). En otro modo de realización, el primer dominio CH3 comprende además o de forma alternativa la sustitución aminoacídica de K439 y/o K370 con un aminoácido cargado negativamente (por ejemplo, ácido glutámico (E), o ácido aspártico (D)) (todas las numeraciones de acuerdo con el índice EU de Kabat).
Aún en otro modo de realización, de forma alternativa se usa el enfoque de heterodimerización descrito en el documento WO 2007/147901. En un modo de realización, un primer dominio CH3 comprende las mutaciones aminoacídicas K253E, D282K y K322D y un segundo dominio CH3 comprende las mutaciones aminoacídicas D239K, E240K y K292D (numeraciones de acuerdo con el índice EU de Kabat).
Todavía en otro modo de realización, de forma alternativa se puede usar el enfoque de heterodimerización descrito en el documento WO 2007/110205.
En un modo de realización, la primera subunidad del dominio Fc comprende las sustituciones aminoacídicas K392D y K409D, y la segunda subunidad del dominio Fc comprende las sustituciones aminoacídicas D356K y D399K (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat).
Modificaciones en el dominio Fc que reducen la unión al receptor de Fc y/o la función efectora
Un dominio Fc confiere al inmunoconjugado propiedades farmacocinéticas favorables, incluyendo una semivida en suero larga, lo que contribuye a una buena acumulación en el tejido diana y una proporción de distribución tejidosangre favorable. Al mismo tiempo, sin embargo, puede dar lugar a un direccionamiento indeseable del inmunoconjugado a células que expresan receptores de Fc en lugar de a las células portadoras de antígenos preferentes. Además, la coactivación de las vías de señalización del receptor de Fc puede dar lugar a la liberación de citocinas que, en combinación con el polipéptido de IL-2 y la semivida larga del inmunoconjugado, da como resultado una activación excesiva de receptores de citocinas y efectos secundarios graves tras la administración sistémica. De acuerdo con esto, se ha descrito que los inmunoconjugados IgG-IL-2 convencionales se asocian con reacciones a la infusión (véase, por ejemplo, King et al., J Clin Oncol 22, 4463-4473 (2004)).
En consecuencia, en modos de realización particulares, el dominio Fc del anticuerpo comprendido en el inmunoconjugado de acuerdo con la invención presenta una afinidad de unión reducida por un receptor de Fc y/o una función efectora reducida, en comparación con un dominio Fc de IgG1 natural. En un modo de realización de este tipo, el dominio Fc (o el anticuerpo que comprende dicho dominio Fc) presenta menos de un 50 %, preferentemente menos de un 20 %, más preferentemente menos de un 10 % y lo más preferentemente menos de un 5 % de la afinidad de unión por un receptor de Fc, en comparación con un dominio Fc de IgG1 natural (o un anticuerpo que comprende un dominio Fc de IgG1 natural), y/o menos de un 50 %, preferentemente menos de un 20 %, más preferentemente menos de un 10 % y lo más preferentemente menos de un 5 % de la función efectora, en comparación con un dominio Fc de IgG1 natural (o un anticuerpo que comprende un dominio Fc de IgG1 natural). En un modo de realización, el dominio Fc (o un anticuerpo que comprende dicho dominio Fc) no se une sustancialmente a un receptor de Fc y/o induce función efectora. En un modo de realización particular, el receptor de Fc es un receptor de Fcy. En un modo de realización, el receptor de Fc es un receptor de Fc humano. En un modo de realización, el receptor de Fc es un receptor de Fc activador. En un modo de realización específico, el receptor de Fc es un receptor de Fcy humano activador, más específicamente FcYRIIIa, FcyRI o FcYRIIa humano, lo más específicamente FcYRIIIa humano. En un modo de realización, la función efectora es una o más seleccionada del grupo de CDC, ADCC, ADCP y secreción de citocinas. En un modo de realización particular, la función efectora es ADCC. En un modo de realización, el dominio Fc presenta una afinidad de unión sustancialmente similar al receptor de Fc neonatal (FcRn) en comparación con un dominio Fc de IgGi natural. Se logra una unión sustancialmente similar a FcRn cuando el dominio Fc (o un anticuerpo que comprende dicho dominio Fc) presenta más de aproximadamente un 70 %, en particular más de aproximadamente un 80 %, más en particular más de aproximadamente un 90 % de la afinidad de unión de un dominio Fc de IgGi natural (o un anticuerpo que comprende un dominio Fc de IgGi natural) por FcRn.
En determinados modos de realización, el dominio Fc se genomanipula para tener afinidad de unión reducida por un receptor de Fc y/o función efectora reducida, en comparación con un dominio Fc no genomanipulado. En modos de realización particulares, el dominio Fc del anticuerpo comprendido en el inmunoconjugado comprende una o más mutaciones aminoacídicas que reducen la afinidad de unión del dominio Fc por un receptor de Fc y/o la función efectora. Típicamente, las mismas una o más mutaciones aminoacídicas están presentes en cada una de las dos subunidades del dominio Fc. En un modo de realización, la mutación aminoacídica reduce la afinidad de unión del dominio Fc por un receptor de Fc. En un modo de realización, la mutación aminoacídica reduce la afinidad de unión del dominio Fc por un receptor de Fc en al menos 2 veces, al menos 5 veces o al menos 10 veces. En modos de realización donde existe más de una mutación aminoacídica que reduce la afinidad de unión del dominio Fc por el receptor de Fc, la combinación de estas mutaciones aminoacídicas puede reducir la afinidad de unión del dominio Fc por un receptor de Fc en al menos 10 veces, al menos 20 veces o incluso al menos 50 veces. En un modo de realización, el anticuerpo que comprende un dominio Fc genomanipulado presenta menos de un 20 %, en particular menos de un 10 %, más en particular menos de un 5 % de la afinidad de unión por un receptor de Fc en comparación con un anticuerpo que comprende un dominio Fc no genomanipulado. En un modo de realización particular, el receptor de Fc es un receptor de Fcy. En algunos modos de realización, el receptor de Fc es un receptor de Fc humano. En algunos modos de realización, el receptor de Fc es un receptor de Fc activador. En un modo de realización específico, el receptor de Fc es un receptor de Fcy humano activador, más específicamente FcYRIIIa, FcyRI o FcYRIIa humano, lo más específicamente FcYRIIIa humano. Preferentemente, se reduce la unión a cada uno de estos receptores. En algunos modos de realización también se reduce la afinidad de unión por un componente del complemento, específicamente la afinidad de unión por C1q. En un modo de realización, no se reduce la afinidad de unión por el receptor de Fc neonatal (FcRn). Se logra una unión sustancialmente similar a FcRn, es decir, la conservación de la afinidad de unión del dominio Fc por dicho receptor, cuando el dominio Fc (o un anticuerpo que comprende dicho dominio Fc) presenta más de aproximadamente un 70 % de la afinidad de unión de una forma no genomanipulada del dominio Fc (o un anticuerpo que comprende dicha forma no genomanipulada del dominio Fc) por FcRn. El dominio Fc, o el anticuerpo comprendido en el inmunoconjugado de la invención que comprende dicho dominio Fc, puede presentar más de aproximadamente un 80 % e incluso más de aproximadamente un 90 % de dicha afinidad. En determinados modos de realización, se genomanipula el dominio Fc del anticuerpo comprendido en el inmunoconjugado para que tenga una función efectora reducida, en comparación con un dominio Fc no genomanipulado. La función efectora reducida puede incluir, pero no se limita a, una o más de las siguientes: citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) reducida, citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) reducida, fagocitosis celular dependiente de anticuerpos (ADCP) reducida, secreción de citocinas reducida, captación de antígenos mediada por inmunocomplejos por células presentadoras de antígenos reducida, unión a linfocitos NK reducida, unión a macrófagos reducida, unión a monocitos reducida, unión a células polimorfonucleares reducida, señalización directa que induce apoptosis reducida, reticulación de anticuerpos unidos a diana reducida, maduración de células dendríticas reducida o activación de linfocitos T reducida. En un modo de realización, la función efectora reducida es una o más seleccionadas del grupo de CDC reducida, ADCC reducida, ADCP reducida y secreción de citocinas reducida. En un modo de realización particular, la función efectora reducida es ADCC reducida. En un modo de realización, la ADCC reducida es menor de un 20 % de la ADCC inducida por un dominio Fc no genomanipulado (o un anticuerpo que comprende un dominio Fc no genomanipulado).
En un modo de realización, la mutación aminoacídica que reduce la afinidad de unión del dominio Fc por un receptor de Fc y/o la función efectora es una sustitución aminoacídica. En un modo de realización, el dominio Fc comprende una sustitución aminoacídica en una posición seleccionada del grupo de E233, L234, L235, N297, P331 y P329 (numeraciones de acuerdo con el índice EU de Kabat). En un modo de realización más específico, el dominio Fc comprende una sustitución aminoacídica en una posición seleccionada del grupo de L234, l235 y P329 (numeraciones de acuerdo con el índice EU de Kabat). En algunos modos de realización, el dominio Fc comprende las sustituciones aminoacídicas L234A y L235A (numeraciones de acuerdo con el índice EU de Kabat). En un modo de realización de este tipo, el dominio Fc es un dominio Fc de IgG1, en particular un dominio Fc de IgG1 humana. En un modo de realización, el dominio Fc comprende una sustitución aminoacídica en la posición P329. En un modo de realización más específico, la sustitución aminoacídica es P329A o P329G, en particular P329G (numeraciones de acuerdo con el índice EU de Kabat). En un modo de realización, el dominio Fc comprende una sustitución aminoacídica en la posición P329 y otra sustitución aminoacídica en una posición seleccionada de E233, L234, L235, N297 y P331 (numeraciones de acuerdo con el índice EU de Kabat). En un modo de realización más específico, la otra sustitución aminoacídica es E233P, L234A, L235A, L235E, N297A, N297D o P331S. En modos de realización particulares, el dominio Fc comprende sustituciones aminoacídicas en las posiciones P329, L234 y L235 (numeraciones de acuerdo con el índice EU de Kabat). En modos de realización más particulares, el dominio Fc comprende las mutaciones aminoacídicas L234A, l235A y P329G ("P329G LALA", "PGLALA" o "LALAPG"). Específicamente, en modos de realización particulares, cada subunidad del dominio Fc comprende las sustituciones aminoacídicas L234A, L235A y P329G (numeración del índice EU de Kabat), es decir, en cada una de la primera y la segunda subunidad del dominio Fc, se reemplaza el residuo de leucina en la posición 234 por un residuo de alanina (L234A), se reemplaza el residuo de leucina en la posición 235 por un residuo de alanina (L235A) y se reemplaza el residuo de prolina en la posición 329 por un residuo de glicina (P329G) (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat). En un modo de realización de este tipo, el dominio Fc es un dominio Fc de IgG1, en particular un dominio Fc de IgG1 humana. La combinación "P329G LALA" de sustituciones aminoacídicas anula casi por completo la unión al receptor Fcy (así como al complemento) de un dominio Fc de IgG1 humana, como se describe en la publicación PCT n.° WO 2012/130831, que se incorpora en el presente documento por referencia en su totalidad. El documento WO 2012/130831 también describe procedimientos de preparación de dichos dominios Fc mutantes y procedimientos para determinar sus propiedades tales como unión al receptor de Fc o funciones efectoras.
Los anticuerpos IgG4 presentan afinidad de unión reducida por receptores de Fc y funciones efectoras reducidas en comparación con anticuerpos IgG1. Por consiguiente, en algunos modos de realización, el dominio Fc del anticuerpo comprendido en el inmunoconjugado de la invención es un dominio Fc de IgG4, en particular, un dominio Fc de IgG4 humana. En un modo de realización, el dominio Fc de IgG4 comprende sustituciones aminoacídicas en la posición S228, específicamente la sustitución aminoacídica S228P (numeraciones de acuerdo con el índice EU de Kabat). Para reducir además su afinidad de unión por un receptor de Fc y/o su función efectora, en un modo de realización, el dominio Fc de IgG4 comprende una sustitución aminoacídica en la posición L235, específicamente la sustitución aminoacídica L235E (numeraciones de acuerdo con el índice EU de Kabat). En otro modo de realización, el dominio Fc de IgG4 comprende una sustitución aminoacídica en la posición P329, específicamente la sustitución aminoacídica P329G (numeraciones de acuerdo con el índice EU de Kabat). En un modo de realización particular, el dominio Fc de IgG4 comprende sustituciones aminoacídicas en las posiciones S228, L235 y P329, específicamente las sustituciones aminoacídicas S228P, L235E y P329G (numeraciones de acuerdo con el índice EU de Kabat). Dichos mutantes del dominio Fc de IgG4 y sus propiedades de unión al receptor de Fcy se describen en la publicación PCT n.° WO 2012/130831, incorporada en el presente documento por referencia en su totalidad.
En un modo de realización particular, el dominio Fc que presenta afinidad de unión reducida por un receptor de Fc y/o función efectora reducida, en comparación con un dominio Fc de IgG1 natural, es un dominio Fc de IgG1 humana que comprende las sustituciones aminoacídicas L234A, L235A y opcionalmente P329G, o un dominio Fc de IgG4 humana que comprende las sustituciones aminoacídicas S228P, L235E y opcionalmente P329G (numeraciones de acuerdo con el índice EU de Kabat).
En determinados modos de realización se ha eliminado la N-glucosilación del dominio Fc. En un modo de realización de este tipo, el dominio Fc comprende una mutación aminoacídica en la posición N297, en particular una sustitución aminoacídica que reemplaza asparagina por alanina (N297A) o ácido aspártico (N297D) (numeraciones de acuerdo con el índice EU de Kabat).
Además de los dominios Fc descritos anteriormente en el presente documento y en la publicación PCT n.° WO 2012/130831, los dominios Fc con unión al receptor de Fc y/o función efectora reducidas también incluyen aquellos con sustitución de uno o más de los residuos de dominio Fc 238, 265, 269, 270, 297, 327 y 329 (patente de EE. UU. n.° 6.737.056) (numeraciones de acuerdo con el índice EU de Kabat). Dichos mutantes de Fc incluyen mutantes de Fc con sustituciones en dos o más de las posiciones de aminoácidos 265, 269, 270, 297 y 327, incluyendo el mutante de Fc denominado "DANA" con sustitución de los residuos 265 y 297 por alanina (patente de EE. UU. n.° 7.332.581).
Se pueden preparar dominios Fc mutantes por deleción, sustitución, inserción o modificación de aminoácidos usando procedimientos genéticos o químicos bien conocidos en la técnica. Los procedimientos genéticos pueden incluir mutagénesis específica de sitio de la secuencia de ADN codificante, PCR, síntesis génica y similares. Los cambios de nucleótidos correctos se pueden verificar, por ejemplo, por secuenciación.
La unión a receptores de Fc se puede determinar fácilmente, por ejemplo, por ELISA, o por resonancia de plasmón superficial (RPS) usando instrumentación estándar tal como un instrumento BIAcore (GE Healthcare), y receptores de Fc tales como los que se pueden obtener por expresión recombinante. De forma alternativa, se puede evaluar la afinidad de unión de dominios Fc o anticuerpos que comprenden un dominio Fc por los receptores de Fc usando líneas celulares conocidas por expresar receptores de Fc particulares, tales como linfocitos NK humanos que expresan el receptor de FcYllla.
La función efectora de un dominio Fc, o un anticuerpo que comprende un dominio Fc, se puede medir por procedimientos conocidos en la técnica. Los ejemplos de ensayos in vitro para valorar la actividad ADCC de una molécula de interés se describen en la patente de EE. UU. n.° 5.500.362; Hellstrom et al. Proc Natl Acad Sci USA 83, 7059-7063 (1986) y Hellstrom et al., Proc Natl Acad Sci USA 82, 1499-1502 (1985); la patente de EE. UU. n.° 5.821.337; Bruggemann et al., J Exp Med 166, 1351-1361 (1987). De forma alternativa, se pueden emplear procedimientos de ensayo no radioactivos (véanse, por ejemplo, el ensayo de citotoxicidad no radioactivo ACTI™ para citometría de flujo (CellTechnology, Inc. Mountain View, CA); y el ensayo de citotoxicidad no radioactivo CytoTox 96® (Promega, Madison, WI)). Las células efectoras útiles para dichos ensayos incluyen leucocitos monomorfonucleares en la sangre periférica (PBMC) y linfocitos citolíticos naturales (NK). De forma alternativa, o adicionalmente, la actividad ADCC de la molécula de interés se puede valorar in vivo, por ejemplo, en un modelo animal tal como el divulgado en Clynes et al., Proc Natl Acad Sci USA 95, 652-656 (1998).
En algunos modos de realización, se reduce la unión del dominio Fc a un componente del complemento, específicamente a C1q. En consecuencia, en algunos modos de realización en los que el dominio Fc se genomanipula para tener una función efectora reducida, dicha función efectora reducida incluye una CDC reducida. Se pueden llevar a cabo ensayos de unión a C1q para determinar si el dominio Fc, o anticuerpo que comprende el dominio Fc, se puede unir a C1q y por consiguiente tiene actividad CDC. Véase, por ejemplo, ELISA de unión a C1q y C3c en los documentos wO 2006/029879 y WO 2005/100402. Para valorar la activación del complemento se puede realizar un ensayo de CDC (véanse, por ejemplo, Gazzano-Santoro et al., J Immunol Methods 202, 163 (1996); Cragg et al., Blood 101, 1045-1052 (2003); y Cragg y Glennie, Blood 103, 2738-2743 (2004)).
También se pueden realizar determinaciones de unión a FcRn y aclaramiento/semivida in vivo usando procedimientos conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Petkova, S.B. et al., Int'l. Immunol. 18(12):1759-1769 (2006); documento WO 2013/120929).
Aspectos particulares de la invención
En un aspecto, la invención proporciona un inmunoconjugado que comprende un polipéptido de IL-2 mutante y un anticuerpo que se une a pD-1, en el que el polipéptido de IL-2 mutante es una molécula de IL-2 humana que comprende las sustituciones aminoacídicas F42A, Y45A y L72G (numeración relativa a la secuencia de iL-2 humana SEQ ID NO: 19); y en el que el anticuerpo comprende (a) una región variable de la cadena pesada (VH) que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14, y (b) una región variable de la cadena ligera (VL) que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15.
En un aspecto, la invención proporciona un inmunoconjugado que comprende un polipéptido de IL-2 mutante y un anticuerpo que se une a pD-1, en el que el polipéptido de IL-2 mutante es una molécula de IL-2 humana que comprende las sustituciones aminoacídicas t3a, F42A, Y45A, L72G y C125A (numeración relativa a la secuencia de iL-2 humana SEQ ID NO: 19); y en el que el anticuerpo comprende (a) una región variable de la cadena pesada (VH) que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14, y (b) una región variable de la cadena ligera (VL) que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15.
En un aspecto, la invención proporciona un inmunoconjugado que comprende un polipéptido de IL-2 mutante y un anticuerpo que se une a PD-1, en el que el polipéptido de IL-2 mutante comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20; y en el que el anticuerpo comprende (a) una región variable de la cadena pesada (VH) que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14, y (b) una región variable de la cadena ligera (VL) que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15.
En un modo de realización de acuerdo con cualquiera de los aspectos anteriores de la invención, el anticuerpo es una inmunoglobulina de clase IgG, que comprende un dominio Fc de IgG1 humana compuesto por una primera y una segunda subunidad, en el que en la primera subunidad del dominio Fc el residuo de treonina en la posición 366 se reemplaza por un residuo de triptófano (T366W), y en la segunda subunidad del dominio Fc el residuo de tirosina en la posición 407 se reemplaza por un residuo de valina (Y407V) y, opcionalmente, el residuo de treonina en la posición 366 se reemplaza por un residuo de serina (T366S) y el residuo de leucina en la posición 368 se reemplaza por un residuo de alanina (L368A) (numeraciones de acuerdo con el índice EU de Kabat), y en el que además cada subunidad del dominio Fc comprende las sustituciones aminoacídicas L234A, L235A y P329G (numeración del índice EU de Kabat).
En este modo de realización, el polipéptido de IL-2 mutante se puede fusionar en su aminoácido aminoterminal con el aminoácido carboxiterminal de la primera subunidad del dominio Fc, a través de un péptido conector de SEQ ID NO: 21.
En un aspecto, la invención proporciona un inmunoconjugado que comprende un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 9o %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de SEQ ID NO: 22, un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de SEQ Id NO: 23 o SEQ ID NO: 24, y un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de SEQ ID NO: 25.
Polinucleótidos
La invención proporciona además polinucleótidos aislados que codifican un inmunoconjugado como se describe en el presente documento o un fragmento del mismo. En algunos modos de realización, dicho fragmento es un fragmento de unión a antígeno.
Los polinucleótidos que codifican inmunoconjugados de la invención se pueden expresar como un único polinucleótido que codifica todo el inmunoconjugado o como múltiples (por ejemplo, dos o más) polinucleótidos que se expresan conjuntamente. Los polipéptidos codificados por polinucleótidos que se expresan conjuntamente se pueden asociar, por ejemplo, a través de enlaces disulfuro u otros medios para formar un inmunoconjugado funcional. Por ejemplo, la porción de la cadena ligera de un anticuerpo se puede codificar por un polinucleótido separado de la porción del inmunoconjugado que comprende la porción de la cadena pesada del anticuerpo y el polipéptido de IL-2 mutante. Cuando se expresan conjuntamente, los polipéptidos de la cadena pesada se asociarán con los polipéptidos de la cadena ligera para formar el inmunoconjugado. En otro ejemplo, la porción del inmunoconjugado que comprende una de las dos subunidades del dominio Fc y el polipéptido de IL-2 mutante se podría codificar por un polinucleótido separado de la porción del inmunoconjugado que comprende la otra de las dos subunidades del dominio Fc. Cuando se expresen conjuntamente, las subunidades del dominio Fc se asociarán para formar el dominio Fc.
En algunos modos de realización, el polinucleótido aislado codifica todo el inmunoconjugado de acuerdo con la invención como se describe en el presente documento. En otros modos de realización, el polinucleótido aislado codifica un polipéptido comprendido en el inmunoconjugado de acuerdo con la invención como se describe en el presente documento.
En un modo de realización, un polinucleótido aislado de la invención codifica la cadena pesada del anticuerpo comprendido en el inmunoconjugado (por ejemplo, una cadena pesada de inmunoglobulina) y el polipéptido de IL-2 mutante. En otro modo de realización, un polinucleótido aislado de la invención codifica la cadena ligera del anticuerpo comprendido en el inmunoconjugado.
En determinados modos de realización, el polinucleótido o ácido nucleico es ADN. En otros modos de realización, un polinucleótido de la presente invención es ARN, por ejemplo, en forma de ARN mensajero (ARNm). El ARN de la presente invención puede ser monocatenario o bicatenario.
Procedimientos recombinantes
Se pueden preparar polipéptidos de IL-2 mutantes útiles en la invención por deleción, sustitución, inserción o modificación usando procedimientos genéticos o químicos bien conocidos en la técnica. Los procedimientos genéticos pueden incluir mutagénesis específica de sitio de la secuencia de ADN codificante, PCR, síntesis génica y similares. Los cambios de nucleótidos correctos se pueden verificar, por ejemplo, por secuenciación. A este respecto, se ha descrito la secuencia de nucleótidos de IL-2 natural por Taniguchi et al., (Nature 302, 305-10 (1983)) y el ácido nucleico que codifica IL-2 humana está disponible en depósitos públicos tales como American Type Culture Collection (Rockville MD). La secuencia de la IL-2 humana natural se muestra en la SEQ ID NO: 19. La sustitución o inserción puede implicar residuos aminoacídicos naturales así como no naturales. La modificación aminoacídica incluye procedimientos bien conocidos de modificación química tales como la adición de sitios de glucosilación o fijaciones de carbohidratos y similares.
Se pueden obtener inmunoconjugados de la invención, por ejemplo, por síntesis de péptidos en estado sólido (por ejemplo, síntesis en fase sólida de Merrifield) o producción recombinante. Para la producción recombinante, uno o más polinucleótidos que codifican el inmunoconjugado (fragmento), por ejemplo, como se describe anteriormente, se aíslan e insertan en uno o más vectores para su clonación y/o expresión adicional en una célula huésped. Dicho polinucleótido se puede aislar y secuenciar fácilmente usando procedimientos convencionales. En un modo de realización, se proporciona un vector, preferentemente un vector de expresión, que comprende uno o más de los polinucleótidos de la invención. Se pueden usar procedimientos que sean bien conocidos por los expertos en la técnica para construir vectores de expresión que contengan la secuencia codificante de un inmunoconjugado (fragmento) junto con señales de control de la transcripción/traducción apropiadas. Estos procedimientos incluyen técnicas de ADN recombinante in vitro, técnicas sintéticas y recombinación in vivo/recombinación genética. Véanse, por ejemplo, las técnicas descritas en Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1989); y Ausubel et al., Current Protocols In Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y (1989). El vector de expresión puede ser parte de un plásmido, virus, o puede ser un fragmento de ácido nucleico. El vector de expresión incluye un casete de expresión en el que el polinucleótido que codifica el inmunoconjugado (fragmento) (es decir, la región codificante) se clona en asociación funcional con un promotor y/u otros elementos de control de transcripción o traducción. Como se usa en el presente documento, una "región codificante" es una porción de ácido nucleico que consiste en codones traducidos en aminoácidos. Aunque un "codón de terminación" (TAG, TGA o TAA) no se traduce en un aminoácido, se puede considerar que es parte de una región codificante, si está presente, pero cualquier secuencia flanqueante, por ejemplo, promotores, sitios de unión a ribosomas, finalizadores de la transcripción, intrones, regiones no traducidas 5' y 3' y similares, no es parte de una región codificante. Dos o más regiones codificantes pueden estar presentes en una única construcción polinucleotídica, por ejemplo, en un único vector, o en construcciones polinucleotídicas separadas, por ejemplo, en vectores separados (diferentes). Además, cualquier vector puede contener una única región codificante, o puede comprender dos o más regiones codificantes, por ejemplo, un vector de la presente invención puede codificar uno o más polipéptidos, que se separan de forma pos o cotraduccional en las proteínas finales por medio de escisión proteolítica. Además, un vector, polinucleótido o ácido nucleico de la invención puede codificar regiones codificantes heterólogas, fusionadas o bien sin fusionar con un polinucleótido que codifica el inmunoconjugado de la invención, o variante o derivado del mismo. Las regiones codificantes heterólogas incluyen sin limitación elementos o motivos especializados, tales como un péptido señal secretor o un dominio funcional heterólogo. Una asociación funcional es cuando una región codificante para un producto génico, por ejemplo, un polipéptido, se asocia con una o más secuencias reguladoras de tal forma que dispone la expresión del producto génico bajo la influencia o control de la(s) secuencia(s) reguladora(s). Dos fragmentos de ADN (tales como una región codificante de polipéptido y un promotor asociado con la misma) se "asocian de forma funcional" si la inducción de la función promotora da como resultado la transcripción de ARNm que codifica el producto génico deseado y si la naturaleza del enlace entre los dos fragmentos de ADN no interfiere con la capacidad de las secuencias reguladoras de la expresión de dirigir la expresión del producto génico ni interfiere con la capacidad del molde de ADN para transcribirse. Por tanto, una región promotora se asociaría de forma funcional con un ácido nucleico que codifica un polipéptido si el promotor puede efectuar la transcripción de ese ácido nucleico. El promotor puede ser un promotor específico de célula que dirige la transcripción sustancial del ADN solo en células predeterminadas. Otros elementos de control de la transcripción, además de un promotor, por ejemplo potenciadores, operadores, represores y señales de finalización de la transcripción, se pueden asociar de forma funcional con el polinucleótido para dirigir la transcripción específica de célula. Los promotores adecuados y otras regiones de control de la transcripción se divulgan en el presente documento. Una variedad de regiones de control de la transcripción son conocidas por los expertos en la técnica. Estas incluyen, sin limitación, regiones de control de la transcripción, que funcionan en células de vertebrados, tales como, pero sin limitarse a, segmentos promotores y potenciadores de citomegalovirus (por ejemplo, el promotor temprano inmediato, junto con intrón-A), virus de simio 40 (por ejemplo, el promotor temprano) y retrovirus (tales como, por ejemplo, el virus del sarcoma de Rous). Otras regiones de control de la transcripción incluyen las derivadas de genes de vertebrados tales como actina, proteína de choque térmico, hormona del crecimiento bovina y p-globina de conejo, así como otras secuencias que pueden controlar la expresión génica en células eucariotas. Las regiones de control de la transcripción adecuadas adicionales incluyen promotores y potenciadores específicos de tejido así como promotores inducibles (por ejemplo, promotores inducibles por tetraciclinas). De forma similar, una variedad de elementos de control de la traducción son conocidos por los expertos en la técnica. Estos incluyen, pero no se limitan a sitios de unión a ribosomas, codones de iniciación y finalización de la traducción y elementos derivados de sistemas víricos (en particular, un sitio de entrada al ribosoma interno o IRES, también denominado secuencia CITE). El casete de expresión también puede incluir otros rasgos característicos tales como un origen de replicación y/o elementos de integración cromosómica tales como repeticiones terminales largas (RTL) retrovíricas o repeticiones terminales invertidas (RTI) víricas adenoasociadas (VAA).
Se pueden asociar regiones codificantes de polinucleótidos y ácidos nucleicos de la presente invención con regiones codificantes adicionales que codifican péptidos secretores o señal, que dirigen la secreción de un polipéptido codificado por un polinucleótido de la presente invención. De acuerdo con la hipótesis de señal, las proteínas secretadas por células de mamífero tienen un péptido señal o secuencia líder secretora que se escinde de la proteína madura una vez que se ha iniciado la exportación de la cadena de proteína en crecimiento a través del retículo endoplásmico rugoso. Los expertos en la técnica saben que los polipéptidos secretados por células de vertebrado, en general, tienen un péptido señal fusionado con el extremo N del polipéptido, que se escinde del polipéptido traducido para producir una forma secretada o "madura" del polipéptido. Por ejemplo, la IL-2 humana se traduce con una secuencia señal de 20 aminoácidos en el extremo N del polipéptido, que posteriormente se escinde para producir la IL-2 humana madura de 133 aminoácidos. En determinados modos de realización, se usa el péptido señal natural, por ejemplo el péptido señal de IL-2 o un péptido señal de la cadena pesada o la cadena ligera de inmunoglobulina, o un derivado funcional de esa secuencia que conserva la capacidad para dirigir la secreción del polipéptido que se asocia de forma funcional con él. De forma alternativa, se puede usar un péptido señal de mamífero heterólogo, o un derivado funcional del mismo. Por ejemplo, la secuencia líder natural se puede sustituir por la secuencia líder del activador tisular del plasminógeno (TPA) humano o p-glucuronidasa de ratón.
El ADN que codifica una secuencia proteica corta que se podría usar para facilitar la purificación posterior (por ejemplo, un marcador de histidina) o ayudar a marcar el inmunoconjugado se puede incluir dentro o en los extremos del polinucleótido que codifica el inmunoconjugado (fragmento).
En otro modo de realización, se proporciona una célula huésped que comprende uno o más polinucleótidos de la invención. En determinados modos de realización se proporciona una célula huésped que comprende uno o más vectores de la invención. Los polinucleótidos y vectores pueden incorporar cualquiera de los rasgos característicos, individualmente o en combinación, descritos en el presente documento en relación con polinucleótidos y vectores, respectivamente. En un modo de realización de este tipo, una célula huésped comprende (por ejemplo, se ha transformado o transfectado con) uno o más vectores que comprenden uno o más polinucleótidos que codifican el inmunoconjugado de la invención. Como se usa en el presente documento, el término "célula huésped" se refiere a cualquier clase de sistema celular que se pueda genomanipular para generar los inmunoconjugados de la invención o fragmentos de los mismos. Las células huésped adecuadas para replicar y para soportar la expresión de inmunoconjugados son bien conocidas en la técnica. Dichas células se pueden transfectar o transducir según sea apropiado con el vector de expresión particular y se pueden cultivar grandes cantidades de células que contienen vectores para sembrar fermentadores a gran escala para obtener cantidades suficientes de los inmunoconjugados para aplicaciones clínicas. Las células huésped adecuadas incluyen microorganismos procariotas, tales como E. coli, o diversas células eucariotas, tales como células de ovario de hámster chino (CHO), células de insecto o similares. Por ejemplo, se pueden producir polipéptidos en bacterias, en particular cuando no es necesaria la glucosilación. Después de la expresión, se puede aislar el polipéptido a partir de la pasta de células bacterianas en una fracción soluble y se puede purificar adicionalmente. Además de procariotas, los microbios eucariotas tales como hongos filamentosos o levaduras son huéspedes de clonación o expresión adecuados para vectores que codifican polipéptidos, incluyendo cepas de hongos y levaduras con vías de glucosilación que se han "humanizado", dando como resultado la producción de un polipéptido con un patrón de glucosilación parcial o completamente humano. Véanse Gerngross, Nat Biotech 22, 1409-1414 (2004) y Li et al., Nat Biotech 24, 210-215 (2006). Las células huésped adecuadas para la expresión de polipéptidos (glucosilados) también se derivan de organismos pluricelulares (invertebrados y vertebrados). Los ejemplos de células de invertebrado incluyen células vegetales y de insecto. Se han identificado numerosas cepas de baculovirus, que se pueden usar junto con células de insecto, en particular, para la transfección de células de Spodoptera frugiperda. También se pueden utilizar cultivos de células vegetales como huéspedes. Véanse, por ejemplo, las patentes de EE. UU. n.os 5.959.177, 6.040.498, 6.420.548, 7.125.978 y 6.417.429 (que describen la tecnología PLANTIBODIES™ para producir anticuerpos en plantas transgénicas). También se pueden usar células de vertebrado como huéspedes. Por ejemplo, pueden ser útiles líneas celulares de mamífero que se adaptan para cultivar en suspensión. Otros ejemplos de líneas de células huésped de mamífero útiles son la línea CV1 de riñón de mono transformada por SV40 (COS-7); línea de riñón embrionario humano (células 293 o 293T como se describe, por ejemplo, en Graham et al., J Gen Virol 36, 59 (1977)), células de riñón de cría de hámster (BHK), células de Sertoli de ratón (células TM4 como se describe, por ejemplo, en Mather, Biol Reprod 23, 243-251 (1980)), células de riñón de mono (CV1), células de riñón de mono verde africano (VERO-76), células de carcinoma de cuello uterino humano (HELA), células de riñón canino (MDCK), células de hígado de rata búfalo (BRL 3A), células de pulmón humano (W138), células de hígado humano (Hep G2), células de tumor mamario de ratón (MMT 060562), células TRI (como se describe, por ejemplo, en Mather et al., Annals N.Y. Acad Sci 383, 44-68 (1982)), células MRC5 y células FS4. Otras líneas de células huésped de mamífero útiles incluyen células de ovario de hámster chino (CHO), incluyendo células CHO-DHFR-(Urlaub et al., Proc Natl Acad Sci USA 77, 4216 (1980)); y líneas celulares de mieloma tales como YO, NS0, P3X63 y Sp2/0. Para una revisión de determinadas líneas de células huésped de mamífero adecuadas para la producción de proteínas, véase, por ejemplo, Yazaki y Wu, Methods in Molecular Biology, vol.
248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268 (2003). Las células huésped incluyen células cultivadas, por ejemplo, células cultivadas de mamífero, células de levadura, células de insecto, células bacterianas y células vegetales, por nombrar solo unas pocas, pero también células comprendidas en un animal transgénico, planta transgénica o tejido animal o vegetal cultivado. En un modo de realización, la célula huésped es una célula eucariota, preferentemente una célula de mamífero, tal como una célula de ovario de hámster chino (CHO), una célula de riñón embrionario humano (HEK) o una célula linfoide (por ejemplo, célula Y0, NS0, Sp20).
Las tecnologías estándar son conocidas en la técnica por expresar genes exógenos en estos sistemas. Las células que expresan un polipéptido de IL-2 mutante fusionado con la cadena pesada o bien la ligera de un anticuerpo se pueden genomanipular para expresar también la otra de las cadenas del anticuerpo de modo que el producto de fusión de IL-2 mutante expresado es un anticuerpo que tiene tanto una cadena pesada como una ligera.
En un modo de realización, se proporciona un procedimiento de producción de un inmunoconjugado de acuerdo con la invención, en el que el procedimiento comprende cultivar una célula huésped que comprende uno o más polinucleótidos que codifican el inmunoconjugado, como se proporciona en el presente documento, en condiciones adecuadas para la expresión del inmunoconjugado, y recuperar, opcionalmente, el inmunoconjugado de la célula huésped (o del medio de cultivo de células huésped).
En el inmunoconjugado de la invención, el polipéptido de IL-2 mutante se puede fusionar genéticamente con el anticuerpo, o se puede conjugar químicamente con el anticuerpo. La fusión genética del polipéptido de IL-2 con el anticuerpo se puede diseñar de modo que la secuencia de IL-2 se fusiona directamente con el polipéptido o indirectamente a través de una secuencia conectora. La composición y longitud del conector se pueden determinar de acuerdo con procedimientos bien conocidos en la técnica y se pueden someter a prueba para determinar su eficacia. En el presente documento se describen péptidos conectores particulares. También se pueden incluir secuencias adicionales para incorporar un sitio de escisión para separar los componentes individuales de la fusión si se desea, por ejemplo, una secuencia de reconocimiento de endopeptidasas. Además, una proteína de fusión de IL-2 también se puede sintetizar químicamente usando procedimientos de síntesis polipeptídica como es bien conocido en la técnica (por ejemplo, síntesis en fase sólida de Merrifield). Los polipéptidos de IL-2 mutantes se pueden conjugar químicamente con otras moléculas, por ejemplo, anticuerpos, usando procedimientos de conjugación química bien conocidos. Se pueden usar reactivos de reticulación bifuncionales tales como reactivos de reticulación homofuncionales y heterofuncionales bien conocidos en la técnica para este propósito. El tipo de reactivo de reticulación a usar depende de la naturaleza de la molécula que se va a acoplar a IL-2 y se puede identificar fácilmente por los expertos en la técnica. De forma alternativa, o además, la IL-2 mutante y/o la molécula a la que se pretende conjugar se puede derivatizar químicamente de modo que se pueden conjugar las dos en una reacción separada como también es bien conocido en la técnica.
Los inmunoconjugados de la invención comprenden un anticuerpo. Los procedimientos para producir anticuerpos son bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Harlow y Lane, "Antibodies, a laboratory manual", Cold Spring Harbor Laboratory, 1988). Los anticuerpos no naturales se pueden construir usando síntesis peptídica en fase sólida, se pueden producir de forma recombinante (por ejemplo, como se describe en la patente de EE. UU. n.° 4.186.567) o se pueden obtener, por ejemplo, cribando colecciones combinatorias que comprenden cadenas pesadas variables y cadenas ligeras variables (véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 5.969.108 concedida a McCafferty). Los inmunoconjugados, los anticuerpos y los procedimientos para producir los mismos también se describen en detalle, por ejemplo, en las publicaciones p Ct n.os WO 20ll/020783, WO 2012/107417 y WO 2012/146628, de las que cada una se incorpora en el presente documento por referencia en su totalidad.
Se puede usar cualquier especie animal de anticuerpo en los inmunoconjugados de la invención. Los anticuerpos no limitantes útiles en la presente invención pueden ser de origen murino, de primate o humano. Si el inmunoconjugado está destinado para uso humano, se puede usar una forma quimérica de anticuerpo en la que las regiones constantes del anticuerpo procedan de un ser humano. También se puede preparar una forma humanizada o completamente humana del anticuerpo de acuerdo con procedimientos bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 5.565.332 concedida a Winter). La humanización se puede lograr por diversos procedimientos incluyendo, pero sin limitarse a (a) injertar las CDR no humanas (por ejemplo, anticuerpo donante) en regiones estructurales y constantes humanas (por ejemplo, anticuerpo receptor) con o sin retención de los residuos estructurales cruciales (por ejemplo, los que son importantes para conservar buena afinidad de unión a antígeno o funciones de anticuerpo), (b) injertar solo las regiones determinantes de especificidad no humanas (SDR o a-CDR; los residuos cruciales para la interacción anticuerpo-antígeno) en regiones estructurales y constantes humanas, o (c) trasplantar todos los dominios variables no humanos, pero "enmascararlos" con una sección similar a humana por reemplazo de residuos de superficie. Los anticuerpos humanizados y los procedimientos para prepararlos se revisan, por ejemplo, en Almagro y Fransson, Front. Biosci.
13:1619-1633 (2008), y se describen además, por ejemplo, en Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); Queen et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989); patentes de EE. UU. n.os 5.821.337, 7.527.791, 6.982.321 y 7.087.409; Kashmiri et al., Methods 36:25-34 (2005) (que describe el injerto de región determinante de la especificidad (SDR)); Padlan, Mol. Immunol. 28:489-498 (1991) (que describe el "rebarnizado"); Dall'Acqua et al., Methods 36:43-60 (2005) (que describe el "reordenamiento de Fr "); y Osbourn et al., Methods 36:61-68 (2005) y Klimka et al., Br. J. Cancer, 83:252-260 (2000) (que describen el enfoque de "selección guiada" para el reordenamiento de FR). Las regiones estructurales humanas que se pueden usar para la humanización incluyen, pero no se limitan a: regiones estructurales seleccionadas usando el procedimiento de "mejor ajuste" (véase, por ejemplo, Sims et al. J. Immunol. 151:2296 (1993)); regiones estructurales derivadas de la secuencia consenso de anticuerpos humanos de un subgrupo particular de regiones variables de la cadena ligera o la pesada (véase, por ejemplo, Carter et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); y Presta et al. J. Immunol., 151:2623 (1993)); regiones estructurales maduras humanas (mutadas somáticamente) o regiones estructurales de la línea germinal humana (véase, por ejemplo, Almagro y Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)); y regiones estructurales derivadas del cribado de colecciones de FR (véase, por ejemplo, Baca et al., J. Biol. Chem. 272:10678-10684 (1997) y Rosok et al., J. Biol. Chem. 271:22611-22618 (1996)).
Se pueden producir anticuerpos humanos usando diversas técnicas conocidas en la técnica. Los anticuerpos humanos se describen, en general, en van Dijk y van de Winkel, Curr Opin Pharmacol 5, 368-74 (2001) y Lonberg, Curr Opin Immunol 20, 450-459 (2008). Se pueden preparar anticuerpos humanos administrando un inmunógeno a un animal transgénico que se ha modificado para producir anticuerpos humanos intactos o anticuerpos intactos con regiones variables humanas en respuesta a una exposición antigénica. Dichos animales típicamente contienen todos o una porción de los locus de inmunoglobulina humana, que remplazan los locus de inmunoglobulina endógena, o que están presentes de forma extracromosómica o integrados aleatoriamente en los cromosomas del animal. En dichos ratones transgénicos, los locus de inmunoglobulina endógena, en general, se han inactivado. Para una revisión de los procedimientos para obtener anticuerpos humanos de animales transgénicos, véase Lonberg, Nat. Biotech. 23:1117-1125 (2005). Véanse también, por ejemplo, las patentes de EE. UU. n.os 6.075.181 y 6.150.584 que describen la tecnología XENOMOUSE™; la patente de EE. UU. n.° 5.770.429 que describe la tecnología HuMab®; la patente de EE. UU. n.° 7.041.870 que describe la tecnología K-M MOUSE® y la publicación de solicitud de patente de EE. UU. n.° US 2007/0061900, que describe la tecnología VelociMouse®). Las regiones variables humanas de anticuerpos intactos generados por dichos animales se pueden modificar además, por ejemplo, por combinación con una región constante humana diferente.
También se pueden preparar anticuerpos humanos por procedimientos basados en hibridoma. Se han descrito líneas celulares de mieloma humano y de heteromieloma ratón-humano para la producción de anticuerpos monoclonales humanos. (Véanse, por ejemplo, Kozbor J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987); y Boerner et al., J. Immunol., 147:86 (1991)). Los anticuerpos humanos generados por medio de la tecnología de hibridoma de linfocitos B humanos también se describen en Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006). Los procedimientos adicionales incluyen los descritos, por ejemplo, en la patente de EE. UU. n.° 7.189.826 (que describe la producción de anticuerpos IgM humanos monoclonales a partir de líneas celulares de hibridoma) y Ni, Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268 (2006) (que describe hibridomas humano-humano). La tecnología de hibridoma humano (tecnología de trioma) también se describe en Vollmers y Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3):927-937 (2005) y Vollmers y Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3): 185-91 (2005).
Los anticuerpos humanos también se pueden generar por aislamiento a partir de colecciones de anticuerpos humanos, como se describe en el presente documento.
Los anticuerpos útiles en la invención se pueden aislar cribando colecciones combinatorias para determinar anticuerpos con la actividad o actividades deseadas. Los procedimientos para cribar colecciones combinatorias se revisan, por ejemplo, en Lerner et al. en Nature Reviews 16:498-508 (2016). Por ejemplo, una variedad de procedimientos son conocidos en la técnica para generar colecciones de presentación en fagos y cribar dichas colecciones para determinar los anticuerpos que poseen las características de unión deseadas. Dichos procedimientos se revisan, por ejemplo, en Frenzel et al. en mAbs 8:1177-1194 (2016); Bazan et al. en Human Vaccines and Immunotherapeutics 8:1817-1828 (2012) y Zhao et al. en Critical Reviews in Biotechnology 36:276-289 (2016), así como en Hoogenboom et al. en Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001) y en Marks y Bradbury en Methods in Molecular Biology 248:161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003).
En determinados procedimientos de presentación en fagos, los repertorios de genes de VH y VL se clonan por separado por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y se recombinan aleatoriamente en colecciones de fagos, que a continuación se pueden cribar para detectar fagos de unión a antígeno como se describe en Winter et al. en Annual Review of Immunology 12:433-455 (1994). Los fagos típicamente presentan fragmentos de anticuerpo, como fragmentos Fv monocatenarios (scFv) o bien como fragmentos Fab. Las colecciones de fuentes inmunizadas proporcionan anticuerpos de alta afinidad con respecto al inmunógeno sin el requisito de construir hibridomas. De forma alternativa, se puede clonar el repertorio indiferenciado (por ejemplo, de un ser humano) para proporcionar una única fuente de anticuerpos para una amplia gama de antígenos no propios y también propios sin ninguna inmunización como se describe por Griffiths et al. en EMBO Journal, 12:725-734 (1993). Finalmente, las colecciones indiferenciadas también se pueden preparar sintéticamente clonando segmentos del gen V no reordenados de células madre, y usando cebadores de PCR que contienen una secuencia aleatoria para codificar las regiones CDR3 altamente variables y para lograr el reordenamiento in vitro, como se describe por Hoogenboom y Winter en Journal of Molecular Biology 227:381-388 (1992). Las publicaciones de patente que describen colecciones de fagos con anticuerpos humanos incluyen, por ejemplo: las patentes de Ee. UU. n.os 5.750.373; 7.985.840; 7.785.903 y 8.679.490, así como las publicaciones de patentes de EE. UU. n.os 2005/0079574, 2007/0117126, 2007/0237764 y 2007/0292936. Otros ejemplos de procedimientos conocidos en la técnica para cribar colecciones combinatorias para detectar anticuerpos con una actividad o actividades deseadas incluyen presentación en ribosomas y ARNm, así como procedimientos para presentación y selección de anticuerpos en bacterias, células de mamífero, células de insecto o células de levadura. Se revisan los procedimientos para presentación en la superficie de levaduras, por ejemplo, en Scholler et al. en Methods in Molecular Biology 503:13556 (2012) y en Cherf et al. en Methods in Molecular Biology 1319:155-175 (2015), así como en Zhao et al. en Methods in Molecular Biology 889:73-84 (2012). Se describen los procedimientos para la presentación en ribosomas, por ejemplo, en He et al. en Nucleic Acids Research 25:5132-5134 (1997) y en Hanes et al. en PNAS 94:4937-4942 (1997).
Puede ser deseable una modificación química adicional del inmunoconjugado de la invención. Por ejemplo, se pueden mejorar los problemas de inmunogenicidad y semivida corta por conjugación con polímeros de cadena sustancialmente lineal tales como polietilenglicol (PEG) o polipropilenglicol (PPG) (véase, por ejemplo, el documento WO 87/00056).
Los inmunoconjugados preparados como se describe en el presente documento se pueden purificar por técnicas conocidas en la técnica tales como cromatografía de líquidos de alto rendimiento, cromatografía de intercambio iónico, electroforesis en gel, cromatografía de afinidad, cromatografía de exclusión por tamaño y similares. Las condiciones reales usadas para purificar una proteína particular dependerán, en parte, de factores tales como carga neta, hidrofobia, hidrofilia, etc., y serán evidentes para los expertos en la técnica. Para la purificación por cromatografía de afinidad se puede usar un anticuerpo, ligando, receptor o antígeno al que se une el inmunoconjugado. Por ejemplo, se puede usar un anticuerpo que se une específicamente al polipéptido de IL-2 mutante. Para la purificación por cromatografía de afinidad de inmunoconjugados de la invención, se puede usar una matriz con proteína A o proteína G. Por ejemplo, se pueden usar cromatografía de afinidad de proteína A o G y cromatografía de exclusión por tamaño secuenciales para aislar un inmunoconjugado esencialmente como se describe en los ejemplos. La pureza del inmunoconjugado se puede determinar por cualquiera de una variedad de procedimientos analíticos bien conocidos que incluyen electroforesis en gel, cromatografía de líquidos a alta presión y similares.
Composiciones, formulaciones y vías de administración
En otro aspecto, la invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden un inmunoconjugado como se describe en el presente documento, por ejemplo, para su uso en cualquiera de los procedimientos terapéuticos a continuación. En un modo de realización, una composición farmacéutica comprende cualquiera de los inmunoconjugados proporcionados en el presente documento y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En otro modo de realización, una composición farmacéutica comprende cualquiera de los inmunoconjugados proporcionados en el presente documento y al menos un agente terapéutico adicional, por ejemplo, como se describe a continuación.
Otro aspecto de la divulgación es un procedimiento de producción de un inmunoconjugado de la invención en una forma adecuada para su administración in vivo, comprendiendo el procedimiento (a) obtener un inmunoconjugado de acuerdo con la invención, y (b) formular el inmunoconjugado con al menos un vehículo farmacéuticamente aceptable, con lo que se formula una preparación de inmunoconjugado para su administración in vivo.
Las composiciones farmacéuticas de la presente invención comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz de inmunoconjugado disuelto o disperso en un vehículo farmacéuticamente aceptable. La expresión "farmacéutica o farmacológicamente aceptable" se refiere a entidades moleculares y composiciones que son en general no tóxicas para los receptores en las dosificaciones y concentraciones empleadas, es decir, no producen una reacción adversa, alérgica u otra reacción indeseable cuando se administran a un animal, tal como, por ejemplo, un ser humano, según sea apropiado. La preparación de una composición farmacéutica que contiene inmunoconjugado y, opcionalmente, un ingrediente activo adicional se conocerá por los expertos en la técnica a la vista de la presente divulgación, como se ejemplifica por Remington's Pharmaceutical Sciences, 18.a ed. Mack Printing Company, 1990, incorporada en el presente documento por referencia. Además, para administración animal (por ejemplo, humana), se entenderá que las preparaciones deben cumplir las normas de esterilidad, pirogenicidad, seguridad general y pureza como se requiere por la Oficina de Normas biológicas de la FDA o las autoridades correspondientes en otros países. Las composiciones preferentes son formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. Como se usa en el presente documento, "vehículo farmacéuticamente aceptable" incluye cualquiera y todos los disolventes, tampones, medios de dispersión, recubrimientos, tensioactivos, antioxidantes, conservantes (por ejemplo, agentes antibacterianos, agentes antifúngicos), agentes isotónicos, agentes retardantes de la absorción, sales, conservantes, antioxidantes, proteínas, fármacos, estabilizantes de fármacos, polímeros, geles, aglutinantes, excipientes, agentes disgregantes, lubricantes, agentes edulcorantes, agentes saborizantes, tintes, tales como materiales y combinaciones de los mismos, como se conocerá por un experto en la técnica (véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18.a ed. Mack Printing Company, 1990, pp. 1289-1329, incorporada en el presente documento por referencia). Excepto en la medida en que cualquier vehículo convencional sea incompatible con el ingrediente activo, se contempla su uso en las composiciones terapéuticas o farmacéuticas.
Un inmunoconjugado de la invención (y cualquier agente terapéutico adicional) se puede administrar por cualquier medio adecuado, incluyendo administración parenteral, intrapulmonar e intranasal y, si se desea para tratamiento local, intralesional. Las infusiones parenterales incluyen administración intramuscular, intravenosa, intrarterial, intraperitoneal o subcutánea. La dosificación puede ser por cualquier vía adecuada, por ejemplo, por inyecciones, tales como inyecciones intravenosas o subcutáneas, dependiendo en parte de si la administración es breve o crónica.
Las composiciones parenterales incluyen las diseñadas para administración por inyección, por ejemplo, inyección subcutánea, intradérmica, intralesional, intravenosa, intraarterial, intramuscular, intratecal o intraperitoneal. Para inyección, los inmunoconjugados de la invención se pueden formular en soluciones acuosas, preferentemente en tampones fisiológicamente compatibles tales como solución de Hank, solución de Ringer o tampón salino fisiológico. La solución puede contener agentes de formulación tales como agentes de suspensión, estabilización y/o dispersión. De forma alternativa, los inmunoconjugados pueden estar en forma de polvo para su constitución con un vehículo adecuado, por ejemplo, agua apirógena estéril, antes de su uso. Las soluciones inyectables estériles se preparan incorporando los inmunoconjugados de la invención en la cantidad requerida en el disolvente apropiado con diversos de los otros ingredientes enumerados a continuación, según se requiera. La esterilidad se puede lograr fácilmente, por ejemplo, por filtración a través de membranas de filtración estériles. En general, se preparan dispersiones incorporando los diversos ingredientes activos esterilizados en un vehículo estéril que contiene el medio de dispersión básico y/o los otros ingredientes. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones, suspensiones o emulsiones inyectables estériles, los procedimientos preferentes de preparación son técnicas de secado al vacío o liofilización que proporcionan un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente deseado adicional de un medio líquido previamente filtrado estéril del mismo. El medio líquido se debe tamponar de forma adecuada si es necesario y el diluyente líquido se debe volver isotónico en primer lugar antes de la inyección con solución salina o glucosa suficiente. La composición debe ser estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento, y conservarse frente a la acción contaminante de microorganismos, tales como bacterias y hongos. Se apreciará que la contaminación por endotoxinas se debe mantener al mínimo a un nivel seguro, por ejemplo, menos de 0,5 ng/mg de proteína. Los vehículos farmacéuticamente aceptables adecuados incluyen, pero no se limitan a: tampones tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes que incluyen ácido ascórbico y metionina; conservantes (tales como cloruro de octadecildimetilbencilamonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio; cloruro de bencetonio; fenol, alcohol butílico o bencílico; alquilparabenos tales como metil o propilparabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; y m-cresol); polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos); proteínas, tales como seroalbúmina, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos que incluyen glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; glúcidos tales como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contraiones formadores de sales tales como sodio; complejos metálicos (por ejemplo, complejos Znproteína); y/o tensioactivos no iónicos tales como polietilenglicol (PEG). Las suspensiones inyectables acuosas pueden contener compuestos que incrementan la viscosidad de la suspensión, tales como carboximetilcelulosa de sodio, sorbitol, dextrano o similares. Opcionalmente, la suspensión también puede contener estabilizantes o agentes adecuados que incrementan la solubilidad de los compuestos para permitir la preparación de soluciones altamente concentradas. Adicionalmente, se pueden preparar suspensiones de los compuestos activos como suspensiones inyectables oleosas apropiadas. Los disolventes o vehículos lipófilos adecuados incluyen aceites grasos tales como aceite de sésamo, o ésteres de ácidos grasos sintéticos, tales como oleatos de etilo o triglicéridos, o liposomas.
Se pueden atrapar ingredientes activos en microcápsulas preparadas, por ejemplo, por técnicas de coacervación o por polimerización interfacial, por ejemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulosa o gelatina y microcápsulas de poli(metacrilato de metilo), respectivamente, en sistemas de suministro de fármaco coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones. Dichas técnicas se divulgan en Remington's Pharmaceutical Sciences (18.a ed. Mack Printing Company, 1990). Se pueden preparar preparaciones de liberación mantenida. Los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación mantenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrófobos sólidos que contienen el polipéptido, matrices que están en forma de artículos conformados, por ejemplo, películas o microcápsulas. En modos de realización particulares, la absorción prolongada de una composición inyectable se puede conseguir por el uso en las composiciones de agentes retardantes de la absorción, tales como, por ejemplo, monoestearato de aluminio, gelatina o combinaciones de los mismos.
Además de las composiciones descritas previamente, los inmunoconjugados también se pueden formular como una preparación de liberación lenta. Dichas formulaciones de acción prolongada se pueden administrar por implantación (por ejemplo, por vía subcutánea o intramuscular) o por inyección intramuscular. Por tanto, por ejemplo, los inmunoconjugados se pueden formular con materiales poliméricos o hidrófobos adecuados (por ejemplo, como emulsión en un aceite aceptable) o resinas de intercambio iónico, o como derivados escasamente solubles, por ejemplo, como una sal escasamente soluble.
Las composiciones farmacéuticas que comprenden los inmunoconjugados de la invención se pueden fabricar por medio de procedimientos convencionales de mezclado, disolución, emulsión, encapsulación, atrapamiento o liofilización. Las composiciones farmacéuticas se pueden formular de manera convencional usando uno o más vehículos, diluyentes, excipientes o coadyuvantes fisiológicamente aceptables que facilitan el procesamiento de las proteínas en preparaciones que se pueden usar farmacéuticamente. La formulación apropiada depende de la vía de administración elegida.
Los inmunoconjugados se pueden formular en una composición en forma de ácido o base libre, neutra o sal. Las sales farmacéuticamente aceptables son sales que conservan sustancialmente la actividad biológica del ácido o base libre. Estas incluyen las sales de adición de ácido, por ejemplo, las formadas con los grupos amino libres de una composición proteica, o que se forman con ácidos inorgánicos tales como, por ejemplo, ácidos clorhídrico o fosfórico, o dichos ácidos orgánicos como ácido acético, oxálico, tartárico o mandélico. Las sales formadas con los grupos carboxilo libres también se pueden derivar de bases inorgánicas tales como, por ejemplo, hidróxidos de sodio, potasio, amonio, calcio o férrico; o dichas bases orgánicas como isopropilamina, trimetilamina, histidina o procaína. Las sales farmacéuticas tienden a ser más solubles en disolventes acuosos y otros disolventes próticos que las correspondientes formas de base libre.
Composiciones y procedimientos terapéuticos
Cualquiera de los inmunoconjugados proporcionados en el presente documento se puede usar en procedimientos terapéuticos. Los inmunoconjugados de la invención se pueden usar como agentes inmunoterápicos, por ejemplo, en el tratamiento de cánceres.
Para su uso en los procedimientos terapéuticos, los inmunoconjugados de la invención se formularán, dosificarán y administrarán de una manera consistente con la buena práctica médica. Los factores que se deben tener en consideración en este contexto incluyen el trastorno particular que se trata, el mamífero particular que se trata, la afección clínica del paciente concreto, la causa del trastorno, el sitio de suministro del agente, el procedimiento de administración, la pauta de administración y otros factores conocidos por los médicos de cabecera.
Los inmunoconjugados de la invención pueden ser en particular útiles en el tratamiento de cuadros clínicos donde la estimulación del sistema inmunitario del huésped es beneficiosa, en condiciones particulares donde es deseable una respuesta inmunitaria celular potenciada. Estos pueden incluir cuadros clínicos donde la respuesta inmunitaria del huésped es insuficiente o deficiente. Los cuadros clínicos para los que se pueden administrar los inmunoconjugados de la invención comprenden, por ejemplo, un tumor o infección donde una respuesta inmunitaria celular sería un mecanismo crucial para la inmunidad específica. Los inmunoconjugados de la invención se pueden administrar por sí mismos o en cualquier composición farmacéutica adecuada.
En un aspecto, se proporcionan inmunoconjugados de la invención para su uso como un medicamento. En otros aspectos, se proporcionan inmunoconjugados de la invención para su uso en el tratamiento de una enfermedad. En determinados modos de realización, se proporcionan inmunoconjugados de la invención para su uso en un procedimiento de tratamiento. En un aspecto de la divulgación, se proporciona un inmunoconjugado como se describe en el presente documento para su uso en el tratamiento de una enfermedad en un individuo que necesita el mismo, en el que la enfermedad es cáncer. En determinados modos de realización, la invención proporciona un inmunoconjugado para su uso en un procedimiento de tratamiento de un individuo que tiene una enfermedad que comprende administrar al individuo una cantidad terapéuticamente eficaz del inmunoconjugado, en el que la enfermedad es cáncer. En determinados modos de realización, el procedimiento comprende además administrar al individuo una cantidad terapéuticamente eficaz de al menos un agente terapéutico adicional, por ejemplo, un agente antineoplásico si la enfermedad que se va a tratar es cáncer. En otros aspectos de la divulgación se proporciona un inmunoconjugado para su uso en la estimulación del sistema inmunitario. En determinados aspectos de la divulgación se proporciona un inmunoconjugado para su uso en un procedimiento de estimulación del sistema inmunitario en un individuo que comprende administrar al individuo una cantidad eficaz del inmunoconjugado para estimular el sistema inmunitario. Un "individuo" de acuerdo con cualquiera de los modos de realización anteriores es un mamífero, preferentemente un ser humano. "Estimulación del sistema inmunitario" de acuerdo con cualquiera de los modos de realización o aspectos anteriores puede incluir uno cualquiera o más de un incremento general en la función inmunitaria, un incremento en la función de los linfocitos T, un incremento en la función de los linfocitos B, un restablecimiento de la función de los linfocitos, un incremento en la expresión de los receptores de IL-2, un incremento en el grado de respuesta de los linfocitos T, un incremento en la actividad de los linfocitos citolíticos naturales o actividad de los linfocitos citolíticos activados por linfocinas (LAK) y similares.
En otro aspecto de la divulgación, se proporciona el uso de un inmunoconjugado de la invención en la fabricación o preparación de un medicamento. En un aspecto de la divulgación, el medicamento es para el tratamiento de una enfermedad en un individuo que lo necesita. En un aspecto de la divulgación, el medicamento es para su uso en un procedimiento de tratamiento de una enfermedad que comprende administrar a un individuo que tiene la enfermedad una cantidad terapéuticamente eficaz del medicamento. En determinados aspectos de la divulgación, la enfermedad que se va a tratar es un trastorno proliferativo. En un aspecto particular de la divulgación, la enfermedad es cáncer. En un aspecto de la divulgación, el procedimiento comprende además administrar al individuo una cantidad terapéuticamente eficaz de al menos un agente terapéutico adicional, por ejemplo, un agente antineoplásico si la enfermedad que se va a tratar es cáncer. En otro aspecto de la divulgación, el medicamento es para estimular el sistema inmunitario. En otro aspecto de la divulgación, el medicamento es para su uso en un procedimiento de estimulación del sistema inmunitario en un individuo que comprende administrar al individuo una cantidad eficaz del medicamento para estimular el sistema inmunitario. Un "individuo" de acuerdo con cualquiera de los aspectos anteriores de la divulgación puede ser un mamífero, preferentemente un ser humano. "Estimulación del sistema inmunitario" de acuerdo con cualquiera de los aspectos de la divulgación anteriores puede incluir uno cualquiera o más de un incremento general en la función inmunitaria, un incremento en la función de los linfocitos T, un incremento en la función de los linfocitos B, un restablecimiento de la función de los linfocitos, un incremento en la expresión de los receptores de IL-2, un incremento en el grado de respuesta de los linfocitos T, un incremento en la actividad de los linfocitos citolíticos naturales o actividad de los linfocitos citolíticos activados por linfocinas (LAK) y similares.
En otro aspecto, la divulgación proporciona un procedimiento para tratar una enfermedad en un individuo. En un aspecto de la divulgación, el procedimiento comprende administrar a un individuo que padece dicha enfermedad una cantidad terapéuticamente eficaz de un inmunoconjugado de la invención. En un aspecto de la divulgación se administra una composición a dicho individuo, que comprende el inmunoconjugado de la invención en una forma farmacéuticamente aceptable. En determinados aspectos de la divulgación, la enfermedad que se va a tratar es un trastorno proliferativo. En un aspecto particular de la divulgación, la enfermedad es cáncer. En determinados aspectos de la divulgación, el procedimiento comprende además administrar al individuo una cantidad terapéuticamente eficaz de al menos un agente terapéutico adicional, por ejemplo, un agente antineoplásico si la enfermedad que se va a tratar es cáncer. En otro aspecto, la divulgación proporciona un procedimiento para estimular el sistema inmunitario en un individuo, que comprende administrar al individuo una cantidad eficaz de un inmunoconjugado para estimular el sistema inmunitario. Un "individuo" de acuerdo con cualquiera de los aspectos anteriores de la divulgación puede ser un mamífero, preferentemente un ser humano. "Estimulación del sistema inmunitario" de acuerdo con cualquiera de los aspectos de la divulgación anteriores puede incluir uno cualquiera o más de un incremento general en la función inmunitaria, un incremento en la función de los linfocitos T, un incremento en la función de los linfocitos B, un restablecimiento de la función de los linfocitos, un incremento en la expresión de los receptores de IL-2, un incremento en el grado de respuesta de los linfocitos T, un incremento en la actividad de los linfocitos citolíticos naturales o actividad de los linfocitos citolíticos activados por linfocinas (LAK) y similares.
En determinados modos de realización o aspectos de la invención, la enfermedad que se va a tratar en un trastorno proliferativo, en particular, cáncer. Los ejemplos no limitantes de cánceres incluyen cáncer de vejiga, cáncer de cerebro, cáncer de cabeza y cuello, cáncer pancreático, cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer ovárico, cáncer uterino, cáncer de cuello uterino, cáncer endometrial, cáncer esofágico, cáncer de colon, cáncer colorrectal, cáncer rectal, cáncer gástrico, cáncer de próstata, neoplasia hemática, cáncer de piel, carcinoma de células escamosas, cáncer de huesos y cáncer de riñón. Otros trastornos de proliferación celular que se pueden tratar usando un inmunoconjugado de la presente invención incluyen, pero no se limitan a neoplasias localizadas en: abdomen, hueso, mama, aparato digestivo, hígado, páncreas, peritoneo, glándulas endocrinas (suprarrenales, paratiroideas, hipófisis, testículos, ovario, timo, tiroides), ojo, cabeza y cuello, sistema nervioso (central y periférico), sistema linfático, pelvis, piel, tejidos blandos, bazo, región torácica y aparato genitourinario. También se incluyen afecciones o lesiones precancerosas y metástasis de cáncer. En determinados modos de realización, el cáncer se elige del grupo que consiste en cáncer de riñón, cáncer de piel, cáncer de pulmón, cáncer colorrectal, cáncer de mama, cáncer de cerebro, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de próstata y cáncer de vejiga. Un experto en la técnica reconoce fácilmente que en muchos casos puede ser que los inmunoconjugados no proporcionen una cura sino que solo proporcionen un beneficio parcial. En algunos modos de realización, un cambio fisiológico que tiene algún beneficio también se considera terapéuticamente beneficioso. Por tanto, en algunos modos de realización, una cantidad de inmunoconjugado que proporciona un cambio fisiológico se considera una "cantidad eficaz" o una "cantidad terapéuticamente eficaz". El sujeto, paciente o individuo que necesita tratamiento es típicamente un mamífero, más específicamente un ser humano.
En algunos aspectos de la divulgación se administra una cantidad eficaz de un inmunoconjugado de la invención a una célula. En otros aspectos de la divulgación se administra una cantidad terapéuticamente eficaz de un inmunoconjugado de la invención a un individuo para el tratamiento de la enfermedad.
Para la prevención o tratamiento de la enfermedad, la dosificación apropiada de un inmunoconjugado de la invención (cuando se usa solo o en combinación con uno o más agentes terapéuticos adicionales) dependerá del tipo de enfermedad que se va a tratar, la vía de administración, el peso corporal del paciente, el tipo de molécula (por ejemplo, que comprende un dominio Fc o no), la gravedad y evolución de la enfermedad, si el inmunoconjugado se administra con propósitos preventivos o terapéuticos, intervenciones terapéuticas previas o coincidentes, anamnesis del paciente y respuesta al inmunoconjugado, y el criterio del médico especialista. El profesional responsable para su administración determinará, en cualquier caso, la concentración del/de los ingrediente(s) activo(s) en una composición y la(s) dosis apropiada(s) para el sujeto concreto. En el presente documento se contemplan diversas pautas posológicas incluyendo, pero sin limitarse a administraciones únicas o múltiples durante diversos puntos temporales, administración por inyección intravenosa rápida e infusión pulsada.
El inmunoconjugado se administra de forma adecuada al paciente de una vez o durante una serie de tratamientos. Dependiendo del tipo y de la gravedad de la enfermedad, de aproximadamente 1 |jg/kg a 15 mg/kg (por ejemplo, 0,1 mg/kg-10 mg/kg) de inmunoconjugado puede ser una dosificación inicial candidata para su administración al paciente, ya sea, por ejemplo, por una o más administraciones separadas o por infusión continua. Una dosificación diaria típica podría variar de aproximadamente 1 jg/kg a 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores mencionados anteriormente. Para administraciones repetidas durante varios días o más, dependiendo de la afección, en general, se mantendría el tratamiento hasta que se produjera una supresión deseada de los síntomas de la enfermedad. Una dosificación ejemplar del inmunoconjugado estaría en el intervalo de aproximadamente 0,005 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg. En otros ejemplos no limitantes, una dosis también puede comprender de aproximadamente 1 microgramo/kg/peso corporal, aproximadamente 5 microgramos/kg/peso corporal, aproximadamente 10 microgramos/kg/peso corporal, aproximadamente 50 microgramos/kg/peso corporal, aproximadamente 100 microgramos/kg/peso corporal, aproximadamente 200 microgramos/kg/peso corporal, aproximadamente 350 microgramos/kg/peso corporal, aproximadamente 500 microgramos/kg/peso corporal, aproximadamente 1 miligramo/kg/peso corporal, aproximadamente 5 miligramos/kg/peso corporal, aproximadamente 10 miligramos/kg/peso corporal, aproximadamente 50 miligramos/kg/peso corporal, aproximadamente 100 miligramos/kg/peso corporal, aproximadamente 200 miligramos/kg/peso corporal, aproximadamente 350 miligramos/kg/peso corporal, aproximadamente 500 miligramos/kg/peso corporal, a aproximadamente 1000 mg/kg/peso corporal o más por administración, y cualquier intervalo derivable en los mismos. En ejemplos no limitantes de un intervalo derivable de los números enumerados en el presente documento, se puede administrar un intervalo de aproximadamente 5 mg/kg/peso corporal a aproximadamente 100 mg/kg/peso corporal, de aproximadamente 5 microgramos/kg/peso corporal a aproximadamente 500 miligramos/kg/peso corporal, etc., en base a los números descritos anteriormente. Por tanto, se pueden administrar al paciente una o más dosis de aproximadamente 0,5 mg/kg, 2,0 mg/kg, 5,0 mg/kg o 10 mg/kg (o cualquier combinación de las mismas). Dichas dosis se pueden administrar de forma intermitente, por ejemplo, cada semana o cada tres semanas (por ejemplo, de modo que el paciente reciba de aproximadamente dos a aproximadamente veinte, o por ejemplo, aproximadamente seis dosis del inmunoconjugado). Se puede administrar una mayor dosis de carga inicial, seguido de una o más dosis menores. Sin embargo, pueden ser útiles otras pautas de dosificación. La progresión de este tratamiento se sigue fácilmente por técnicas y ensayos convencionales.
Los inmunoconjugados de la invención se usarán, en general, en una cantidad eficaz para lograr el propósito pretendido. Para su uso para tratar o prevenir una enfermedad, los inmunoconjugados de la invención, o composiciones farmacéuticas de los mismos, se administran o aplican en una cantidad terapéuticamente eficaz. La determinación de una cantidad terapéuticamente eficaz está dentro de las capacidades de los expertos en la técnica, en especial en vista de la divulgación detallada proporcionada en el presente documento.
Para la administración sistémica, se puede estimar inicialmente una dosis terapéuticamente eficaz a partir de ensayos in vitro, tales como ensayos de cultivo celular. A continuación se puede formular una dosis en modelos animales para lograr un intervalo de concentraciones en circulación que incluye la CI50 como se determina en cultivo celular. Se puede usar dicha información para determinar con más exactitud dosis útiles en seres humanos.
También se pueden estimar dosificaciones iniciales a partir de datos in vivo, por ejemplo, modelos animales, usando técnicas que son bien conocidas en la técnica. Un experto en la técnica podría optimizar fácilmente la administración a seres humanos en base a los datos en animales.
Se pueden ajustar individualmente la cantidad e intervalo de dosificación para proporcionar niveles plasmáticos de los inmunoconjugados que sean suficientes para mantener el efecto terapéutico. Las dosificaciones de paciente habituales para administración por inyección varían de aproximadamente 0,1 a 50 mg/kg/día, típicamente de aproximadamente 0,5 a 1 mg/kg/día. Se pueden lograr niveles plasmáticos terapéuticamente eficaces administrando dosis múltiples cada día. Los niveles en plasma se pueden medir, por ejemplo, por HPLC.
En los casos de administración local o captación selectiva, la concentración local eficaz de los inmunoconjugados puede no estar relacionada con la concentración plasmática. Un experto en la técnica podrá optimizar dosificaciones locales terapéuticamente eficaces sin experimentación excesiva.
Una dosis terapéuticamente eficaz de los inmunoconjugados descritos en el presente documento proporcionará en general beneficio terapéutico sin provocar toxicidad sustancial. La toxicidad y la eficacia terapéutica de un inmunoconjugado se pueden determinar por procedimientos farmacéuticos estándar en cultivos celulares o animales de experimentación. Se pueden usar ensayos de cultivo celular y estudios con animales para determinar la DL50 (la dosis letal para un 50 % de una población) y la DE50 (la dosis terapéuticamente eficaz en un 50 % de una población). La proporción de dosis entre los efectos tóxicos y terapéuticos es el índice terapéutico, que se puede expresar como la proporción DL50/DE50. Los inmunoconjugados que presentan índices terapéuticos grandes son preferentes. En un modo de realización, el inmunoconjugado de acuerdo con la presente invención presenta un índice terapéutico alto. Los datos obtenidos a partir de ensayos de cultivo celular y estudios con animales se pueden usar en la formulación de un intervalo de dosificaciones adecuadas para su uso en seres humanos. Preferentemente, la dosificación se encuentra dentro de un intervalo de concentraciones en circulación que incluyen la DE50 con poca o ninguna toxicidad. La dosificación puede variar dentro de este intervalo dependiendo de una variedad de factores, por ejemplo, la forma de dosificación empleada, la vía de administración utilizada, la afección del sujeto y similares. La formulación exacta, vía de administración y dosificación se pueden elegir por el médico concreto en vista de la afección del paciente. (Véase, por ejemplo, Fingl et al., 1975, en: The Pharmacological Basis of Therapeutics, cap. 1, pág. 1, incorporado en el presente documento por referencia en su totalidad).
El médico especialista para pacientes tratados con inmunoconjugados de la invención sabrá cómo y cuándo finalizar, interrumpir o ajustar la administración debido a toxicidad, disfunción orgánica y similares. A la inversa, el médico especialista también sabrá ajustar el tratamiento a niveles mayores si la respuesta clínica no fuera adecuada (excluyendo la toxicidad). La magnitud de una dosis administrada en el abordaje del trastorno de interés variará con la gravedad de la afección que se va a tratar, con la vía de administración y similares. La gravedad de la afección, por ejemplo, se puede evaluar, en parte, por procedimientos de evaluación de pronóstico estándar. Además, la dosis y quizás la frecuencia de dosis también variarán de acuerdo con la edad, peso corporal y respuesta del paciente concreto.
La dosis terapéutica máxima de un inmunoconjugado que comprende un polipéptido de IL-2 mutante como se describe en el presente documento se puede incrementar con respecto a las usadas para un inmunoconjugado que comprende IL-2 natural.
Otros agentes y tratamientos
Los inmunoconjugados de acuerdo con la invención se pueden administrar en combinación con uno o más de otros agentes en el tratamiento. Por ejemplo, se puede coadministrar un inmunoconjugado de la invención con al menos un agente terapéutico adicional. El término "agente terapéutico" engloba cualquier agente administrado para tratar un síntoma o enfermedad en un individuo que necesita dicho tratamiento. Dicho agente terapéutico adicional puede comprender cualquier ingrediente activo adecuado para la indicación particular que se está tratando, preferentemente el que tiene actividades complementarias que no se ven afectadas de manera adversa entre sí. En determinados modos de realización, un agente terapéutico adicional es un agente inmunomodulador, un agente citostático, un inhibidor de la adhesión celular, un agente citotóxico, un activador de la apoptosis celular o un agente que incrementa la sensibilidad de las células por los inductores apoptóticos. En un modo de realización particular, el agente terapéutico adicional es un agente antineoplásico, por ejemplo, un alterador de los microtúbulos, un antimetabolito, un inhibidor de topoisomerasas, un intercalador de a Dn , un agente alquilante, un tratamiento hormonal, un inhibidor de cinasas, un antagonista de receptores, un activador de la apoptosis de células tumorales o un agente antiangiogénico.
Dichos otros agentes están presentes de forma adecuada en combinación en cantidades que son eficaces para el propósito pretendido. La cantidad eficaz de dichos otros agentes depende de la cantidad de inmunoconjugado usada, el tipo de trastorno o tratamiento y otros factores analizados anteriormente. Los inmunoconjugados se usan, en general, en las mismas dosificaciones y por las vías de administración que se describen en el presente documento, o aproximadamente de un 1 a un 99 % de las dosificaciones descritas en el presente documento, o en cualquier dosificación y por cualquier vía que se determine empíricamente/clínicamente que sea apropiada.
Dichas politerapias indicadas anteriormente engloban la administración combinada (donde se incluyen dos o más agentes terapéuticos en la misma composición o en composiciones separadas) y la administración separada, caso en el que la administración del inmunoconjugado de la invención se puede producir antes, simultáneamente y/o después de la administración del adyuvante y/o agente terapéutico adicional. Los inmunoconjugados de la invención también se pueden usar en combinación con radioterapia.
Artículos de fabricación
En otro aspecto de la divulgación, se proporciona un artículo de fabricación que contiene materiales útiles para el tratamiento, prevención y/o diagnóstico de los trastornos descritos anteriormente. El artículo de fabricación comprende un recipiente y una ficha técnica o prospecto del envase en o asociado con el recipiente. Los recipientes adecuados incluyen, por ejemplo, frascos, viales, jeringuillas, bolsas de solución i.v., etc.
Los recipientes se pueden formar a partir de una variedad de materiales tales como vidrio o plástico. El recipiente contiene una composición que por sí misma o combinada con otra composición es eficaz para tratar, prevenir y/o diagnosticar la afección y que puede tener una vía de acceso estéril (por ejemplo, el recipiente puede ser una bolsa de solución intravenosa o un vial que tiene un tapón perforable por una aguja de inyección hipodérmica). Al menos un agente activo en la composición es un inmunoconjugado de la invención. La ficha técnica o prospecto del envase indica que la composición se usa para tratar la afección de elección. Además, el artículo de fabricación puede comprender (a) un primer recipiente con una composición contenida en el mismo, en el que la composición comprende un inmunoconjugado de la invención; y (b) un segundo recipiente con una composición contenida en el mismo, en el que la composición comprende un agente citotóxico o de otro modo terapéutico adicional. El artículo de fabricación en este modo de realización de la invención puede comprender además un prospecto del envase que indique que las composiciones se pueden usar para tratar una afección particular. De forma alternativa, o adicionalmente, el artículo de fabricación puede comprender además un segundo (o tercer) recipiente que comprenda un tampón farmacéuticamente aceptable, tal como agua bacteriostática para inyectables (BWFI), solución salina tamponada con fosfato, solución de Ringer y solución de dextrosa. Puede incluir además otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y de usuario, incluyendo otros tampones, diluyentes, filtros, agujas y jeringuillas.
Breve descripción de los dibujos
Figura 1. Representación esquemática del formato de inmunoconjugado IgG-IL-2 que comprende el polipéptido de IL-2 mutante.
Figura 2. Unión de PD1-IL2v a linfocitos T CD4 (A) y linfocitos T CD8 (B) dentro de PBMC activadas con PHA, en comparación con IgG frente a PD1 y CEA-IL2v.
Figura 3. Proliferación de linfocitos NK (A), linfocitos T CD8 (B) y linfocitos T CD4 (C) dentro de PBMC con PD1-IL2v, CEA-IL2v y la combinación de IgG frente a PD1 más CEA-IL2v. Se incluyó IgG frente a PD1 como control.
Figura 4. Activación de linfocitos NK (A), linfocitos T CD8 (B) y linfocitos T CD4 (C) dentro de PBMC con PD1-IL2v, CEA-IL2v y la combinación de IgG frente a PD1 más CEA-IL2v. Se incluyó IgG frente a PD1 como control. Se usó la expresión de CD25 en linfocitos NK, linfocitos T CD4 y linfocitos T CD8 como marcador de activación.
Figura 5. Proliferación de linfocitos T CD4 (B) y linfocitos T CD8 activados previamente con PHA (A) dentro de PBMC con PD1-IL2v, CEA-IL2v y la combinación de IgG frente a PD1 más CEA-IL2. Se incluyó IgG frente a PD1 como control.
Figura 6. Activación de linfocitos T CD4 (B) y linfocitos T CD8 estimulados previamente con PHA (A) dentro de PBMC con PD1-IL2v, CEA-IL2v y la combinación de IgG frente a PD1 más c Ea -IL2v . Se incluyó IgG frente a PD1 como control. Se usó la expresión de CD25 en linfocitos T CD4 y linfocitos T CD8 como marcador de activación.
Figura 7. Proliferación de la línea de linfocitos NK humana NK92 inducida por PD-L1-IL2v en comparación con CEA-IL2v (A), o por PD-L1-IL2v en comparación con PD1-IL2v (B), medida después de 2 días.
Figura 8. Unión de PD-L1-muIL2v y muIgG1 frente a PD-L1 a la línea de linfocitos T de ratón positivos para PD-L1 CTLL2.
Figura 9. Proliferación de la línea de linfocitos T positivos para PD-L1 murina CTLL2 inducida por PD1-muIL2v en comparación con CEA-muIL2v (A), o por PD1-muIL2v en comparación con PD-L1-muIL2v (B), determinada después de 3 días.
Figura 10. Resultados de un experimento de eficacia con anticuerpos frente a PD1-IL2v, PD-L1-IL2v o PD1 y PD-L1 como agentes individuales. Se inyectó la línea celular de carcinoma pancreático transfectante Panc02-H7-Fluc en el páncreas de ratones Black 6 para estudiar la supervivencia en un modelo singénico ortotópico pancreático.
Figura 11. Resultados de un experimento de eficacia con anticuerpos frente a PD1-IL2v, PD-L1-IL2v o PD1 y PD-L1 como agentes individuales. Se inyectó la línea celular de carcinoma pancreático transfectante Panc02-H7-Fluc en el páncreas en ratones Black 6 para estudiar la supervivencia en un modelo singénico ortotópico pancreático por medio de bioluminiscencia.
Figura 12. Capacidad de los linfocitos T CD4 para secretar IL-2 (A), IL-2 e IFN-y (B) o IFN-y (C) tras 48 horas de recuperación con la proteína inmunógena pp65 de CMV en presencia de anti-PD-1 o bien anti-PD-LI solo, en combinación con IL-2v, o como proteínas de fusión.
Figura 13. Estado de diferenciación de los linfocitos T CD4 específicos de virus que secretan solo IL-2 (A), tanto IL-2 como IFN-y (B) o solo IFN-y (C y D) tras 48 horas de recuperación con proteína inmunógena pp65 de CMV en presencia de anti-PD-1 o bien anti-PD-LI solo, en combinación con IL-2v, o como proteínas de fusión.
Figura 14. Ensayo de unión competitiva de PD1 y PD1-IL2v a linfocitos T reguladores y convencionales activados. Delta de la frecuencia unida en Tconv frente a Treg (figura 14A) y de unión a Tconv y Treg (figura 14B).
Figura 15. Inversión de PD1-IL2v de la supresión de Treg de Tconv. Porcentaje de supresión por Treg de granzima B (figura 15A) e interferón-Y (figura 15B) secretados por Tconv después de 5 días de cocultivo.
Figura 16. Resultados de un experimento de eficacia que compara los anticuerpos frente a muPD1-IL2v con respecto a muFAP-IL2v y muPD-1 como agentes individuales y en combinación.
Figura 17. Resultados de un experimento de eficacia que compara muPD1-IL2v con respecto a FAP-IL2v, muPDI y su combinación.
Figura 18A y 18B. Imágenes inmunohistoquímicas de tumores de páncreas teñidos para anti-CD3 de ratón (figura 18A) y el análisis de cuantificación de linfocitos T (figura 18B).
Figura 19. Imágenes inmunohistoquímicas de tumores de páncreas teñidos para anti-PD1 de ratón.
Figura 20. Imágenes inmunohistoquímicas de tumores de páncreas teñidos para anti-ICOS de ratón.
Figura 21. Resultados de un experimento de eficacia que compara muPD1-IL2v con respecto a FAP-IL2v y muPD1 como agentes individuales y en combinación.
Figura 22. Resultados de un experimento de eficacia que compara muPD1-IL2v con respecto a FAP-IL2v, muPD1 y su combinación con dos dosis diferentes.
Figura 23. Imágenes inmunohistoquímicas de tumores de páncreas teñidos para anti-CD3 de ratón.
Figura 24A y 24B. Imágenes inmunohistoquímicas de tumores de páncreas teñidos para anti-CD8 de ratón (figura 24A) y el análisis de cuantificación de linfocitos T (figura 24B).
Figura 25A y 25B. Imágenes inmunohistoquímicas de tumores de páncreas teñidos para análisis de cuantificación del área de marcador anti-granzima B (figura 25A) y granzima B (figura 25B).
Figura 26A y 26B. Imágenes inmunohistoquímicas de tumores de páncreas teñidos para anti-PD1 de ratón (figura 26A) y el análisis de cuantificación de células positivas para PD1 (figura 26B).
Figura 27A-D. Capacidad de los linfocitos T CD4 para secretar IL-2 (A), IL-2 e IFN-y(B) o IFN-y(C) y para proliferar (D) tras 48 horas de recuperación con la proteína inmunógena pp65 de CMV en presencia de anti-PD-1 solo, en combinación con IL-2v o bien como proteína de fusión.
Figura 28. Estado de diferenciación, según la expresión de CD45RO y CD62L, de linfocitos T CD4 específicos de virus que secretan IFN-y tras 48 horas de recuperación con proteína inmunógena pp65 de CMV en presencia de anti-PD-1 solo, en combinación con IL-2v o como proteína de fusión.
Figura 29A-D. Ensayo STAT5 en PBMC en reposo de un primer donante (linfocitos T CD8 (A), linfocitos NK (B), linfocitos T CD4 (C) y linfocitos T reguladores (D)).
Figura 30A-D. Ensayo STAT5 en PBMC en reposo de un segundo donante (linfocitos T CD4 (A), linfocitos T CD8 (B), linfocitos T reguladores (C) y linfocitos NK (D)).
Figura 31A-D. Ensayo STAT5 en PBMC en reposo de un tercer donante (linfocitos T CD8 (A), linfocitos NK (B), linfocitos T CD4 (C) y linfocitos T reguladores (D)).
Figura 32A-D. Ensayo STAT5 en PBMC en reposo de un cuarto donante (linfocitos T CD8 (A), linfocitos NK (B), linfocitos T CD4 (C) y linfocitos T reguladores (D)).
Secuencias de aminoácidos
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Ejemplos
Los siguientes son ejemplos de procedimientos y composiciones de la invención. Se entiende que se pueden poner en práctica otros modos de realización diversos, dada la descripción general proporcionada anteriormente.
Ejemplo 1
Ejemplo 1A. Preparación de proteínas de fusión PD1-IL2v
El casete de expresión para la proteína de fusión de la cadena pesada del anticuerpo - interleucina-2 (IL-2) [región variable de la cadena pesada del anticuerpo anti-PD-1 humano, cadena pesada de IgG1 humana (portadora de las mutaciones L234A, L235A y P329G (numeración EU) para la eliminación de las funciones efectoras y las mutaciones S354C y T366W (numeración EU) para la heterodimerización ("botón")), conector (G4S)3 e IL-2v humana (portadora de las mutaciones T3A, F42A, Y45A, L72G y C125A)], el casete de expresión para la cadena pesada del anticuerpo [región variable de la cadena pesada del anticuerpo anti-PD-1 humano y cadena pesada de IgG1 humana (portadora de las mutaciones L234A, L235A y P329G (numeración EU) para la eliminación de las funciones efectoras, las mutaciones Y349C, T366S, L368A e Y410V (numeración EU) para la heterodimerización ("ojal") y, opcionalmente, las mutaciones H435R e Y436F (numeración EU)] y el casete de expresión para la cadena ligera del anticuerpo [región variable de la cadena ligera del anticuerpo anti-PD-1 humano y región constante Ckappa humana] y se produjo por síntesis de genes.
Cada uno de ellos se clonó por medio de digestión con HindIII y NheI en un vector de expresión bajo el control del promotor de CMV seguido de Intrón A y se finalizó por la señal de BGH-poli A. El vector contenía además un gen bacteriano de resistencia a la ampicilina y un origen de replicación de E. coli.
La proteína de fusión PD1-IL-2v humana (SEQ ID NO 22, 24 y 25) se generó por cotransfección de células HEK293F (Invitrogen) con los vectores descritos anteriormente en una proporción de 1:1:1 en matraces de agitación. Después de una semana, se recogió el sobrenadante y se filtró a través de filtros estériles.
Se purificó la proteína de fusión del sobrenadante por una combinación de cromatografía de afinidad con proteína A y cromatografía de exclusión por tamaño. Se caracterizó el producto obtenido para determinar su identidad por espectrometría de masas y propiedades analíticas tales como pureza por electroforesis capilar (CE-SDS), contenido de monómero y estabilidad.
La proteína de fusión PD1-IL2v sustituta murina (SEQ ID NO 34-36) se produjo de forma análoga. La molécula sustituta comprende un anticuerpo murino IgG1 anti-PD-1 de ratón (portador de mutaciones en Fc para la eliminación de la función efectora y para la heterodimerización) e interleucina-2 murina con mutaciones análogas a la molécula humana.
Ambas proteínas de fusión se pudieron producir con buenos rendimientos y son estables.
Ejemplo 1B. Preparación de proteínas de fusión PD-L1-IL2v
El casete de expresión para la proteína de fusión de la cadena pesada del anticuerpo - interleucina-2 (IL-2) [región variable de la cadena pesada del anticuerpo anti-PD-L1 humano, cadena pesada de IgG1 humana (portadora de las mutaciones L234A, L235A y P329G (numeración EU) para la eliminación de las funciones efectoras y las mutaciones S354C y T366W (numeración EU) para la heterodimerización ("botón")), conector (G4S)3 e IL-2v humana (portadora de las mutaciones T3A, F42A, Y45A, L72G y C125A)], el casete de expresión para la cadena pesada del anticuerpo [región variable de la cadena pesada del anticuerpo anti-PD-L1 humano y cadena pesada de IgG1 humana (portadora de las mutaciones L234A, L235A y P329G (numeración EU) para la eliminación de las funciones efectoras, las mutaciones Y349C, T366S, L368A e Y410V (numeración EU) para la heterodimerización ("ojal"))] y el casete de expresión para la cadena ligera del anticuerpo [región variable de la cadena ligera del anticuerpo anti-PD-L1 humano y región constante Ckappa humana] se produjeron por síntesis de genes. La expresión del anticuerpo se impulsó por un promotor MPSV quimérico y una secuencia señal poliA sintética se localizó en el extremo 3' de la CDS. Además, cada vector contenía una secuencia OriP de EBV.
Se produjeron las moléculas cotransfectando células HEK293-EBNA que crecen en suspensión con los vectores de expresión de mamífero usando polietilenimina. Se transfectaron las células con los vectores de expresión correspondientes en una proporción 1:1:2 ("vector cadena pesada (VH-CH1-CH2-CH3-IL2v)": "vector cadena pesada (VH-CH1-CH2-CH3)": "vector cadena ligera (VL-CL)").
Para la transfección, se cultivaron células HEK293 EBNA en suspensión en medio de cultivo Excell sin suero que contenía L-glutamina 6 mM y 250 mg/l de medio de cultivo G418. Para la producción en matraces TubeSpin de 600 ml (volumen de trabajo máx. de 400 ml), se sembraron 600 millones de células HEK293 EBNA 24 horas antes de la transfección. Para la transfección, se centrifugaron las células durante 5 min por 210 x g y se reemplazó el sobrenadante por 20 ml de medio CD CHO precalentado. Se mezclaron los vectores de expresión en 20 ml de medio CD CHO hasta una cantidad final de 400 |jg de ADN. Después de la adición de 1080 |jl de solución PEI (2,7 jg/ml), se agitó con vórtex la mezcla durante 15 s y posteriormente se incubó durante 10 min a temperatura ambiente. Después de esto, se mezclaron las células con la solución de ADN/PEI, se transfirieron a un matraz TubeSpin de 600 ml y se incubó durante 3 horas a 37 °C en una estufa de incubación con una atmósfera de CO2 al 5 %. Después del tiempo de incubación, se añadieron 360 ml de medio Excell L-glutamina 6 mM 5 g/l de Pepsoy VPA 1,0 mM y se cultivaron las células durante 24 horas. Un día después de la transfección, se añadió un 7 % de Feed 7. Después de 7 días de cultivo, se recogió el sobrenadante para purificación por centrifugación durante 20 - 30 min a 3600 x g (centrífuga Sigma 8K), se filtró de forma estéril la solución (filtro de 0,22 mm) y se añadió acida de sodio en una concentración final de un 0,01 % (p/v). Se mantuvo la solución a 4 °C.
Se purificó la construcción PD-L1-IL2v humana (SEQ ID NO 37-39) por una etapa de afinidad con proteína A (MabSelectSure, GE Healthcare) seguido de cromatografía de exclusión por tamaño (HiLoad 16/60 Superdex 200, GE Healthcare). Para la cromatografía de afinidad, se cargó sobrenadante en una columna de proteína A HiTrap HP (VC=5 ml, GE Healthcare) equilibrada con 25 ml de fosfato de sodio 20 mM, citrato de sodio 20 mM, pH 7,5. Se retiró la proteína no unida lavando con al menos 10 volúmenes de columna de fosfato de sodio 20 mM, citrato de sodio 20 mM, pH 7,5, y se eluyó la proteína diana en 6 volúmenes de columna de citrato de sodio 20 mM, cloruro de sodio 100 mM, glicina 100 mM, Tween20 al 0,01 %, pH 3,0. Se neutralizó la solución de proteína añadiendo 1/10 de fosfato de sodio 0,5 M, pH 8,0. Se concentró la proteína diana y se filtró antes de su carga en una columna HiLoad Superdex 200 (GE Healthcare) equilibrada con histidina 20 mM, cloruro de sodio 140 mM, pH 6,0, Tween20 al 0,01 %.
Se purificó igualmente la construcción PD-L1-IL2v murina (SEQ ID NO 40-42) por una etapa de afinidad con proteína A (MabSelectSure, GE Healthcare) seguido de cromatografía de exclusión por tamaño (HiLoad 16/60 Superdex 200, GE Healthcare). Para la cromatografía de afinidad, se mezcló el sobrenadante 1:1 con glicina 2 M, NaCl 0,6 M, pH 8,6 y se cargó en una columna de proteína A HiTrap HP (VC=5 ml, GE Healthcare) equilibrada con 25 ml de glicina 1 M, NaCl 0,3 M, pH 8,6. Se retiró la proteína no unida lavando con al menos 10 volúmenes de columna de glicina 1 M, NaCl 0,3 M, pH 8,6 y se eluyó la proteína diana en 6 volúmenes de columna de glicina 1 M, NaCl 0,3 M, pH 4,0. Se neutralizó la solución de proteína añadiendo 1/10 de fosfato de sodio 0,5 M, pH 8,0. Se concentró la proteína diana y se filtró antes de su carga en una columna HiLoad Superdex 200 (GE Healthcare) equilibrada con histidina 20 mM, cloruro de sodio 140 mM, pH 6,0, Tween20 al 0,01 %.
La preparación final de PD-L1-IL2v humana contenía un 99 % de monómero (determinado en una columna analítica de exclusión por tamaño TSKgel G3000 SW XL (Tosoh) en K2HPO4 25 mM, NaCl 125 mM, monoclorhidrato de L-arginina 200 mM, NaN3 al 0,02 % (p/v), tampón de migración, pH 6,7 a 25 °C) y tenía una pureza de un 100 % (determinada por electroforesis capilar SDS no reducida en un sistema Caliper LabChip GXII (Caliper lifescience) usado de acuerdo con las instrucciones del fabricante). El rendimiento de producción fue de 23 mg/l. El análisis de espectrometría de masas reveló una molécula ensamblada en su mayoría correctamente con trazas (<5 %) de moléculas sin interleucina-2 (espectrometría de masas realizada en un sistema CL-EM Agilent (Agilent Technologies) con una columna NUCLEOGEL RP1000-8, 250 mm x 4,6 mm (MACHEREY-NAGEL GmbH) y un gradiente de acetonitrilo-ácido fórmico).
Para la PD-L1-IL2v sustituta murina, el contenido de monómero fue de un 96 %, la pureza de un 100 % y el rendimiento de producción de 3,8 mg/l.
Ejemplo 1C. Preparación de CEA-IL2v sustituta murina y FAP-IL2v sustituta murina
Se generó una molécula sustituta murinizada de la inmunocitocina de variante de IL-2 dirigida a CEA CEA-IL2v, denominada muCEA-muIL2v (también denominada muCEA-IL2v), para su uso en modelos de tumor in vivo en ratones completamente inmunocompetentes para reducir la formación de anticuerpos antifármaco (AAF). Además, se generó una versión quimérica murinizada de la inmunocitocina de variante de IL-2 dirigida a FAP FAP-IL2v, denominada muFAP-muIL2v (también denominada muFAP-IL2v), respectivamente, para su uso en modelos de tumor in vivo en ratones completamente inmunocompetentes para reducir la formación de anticuerpos antifármaco (AAF). En las moléculas sustitutas murinizadas, las mutaciones de botón en ojal en el dominio Fc se reemplazaron por mutaciones DDKK en muIgG1 y las mutaciones LALA P329G se reemplazaron por mutaciones DAPG en muIgG1 (como se divulga en la solicitud PCT WO 2016/0330350 A1, que se incorpora por referencia en su totalidad).
Por ejemplo, muCEA-muIL2v se caracteriza por los siguientes rasgos característicos. Como anticuerpo original, se aplica un anticuerpo IgG1 quimérico humano-murino con regiones variables humanas (humanizadas), pero regiones constantes murinas. Para evitar la inmunogenicidad potencial, se usó el alotipo de Black 6 correspondiente (secuencia publicada por Mouse Genomes Project). Se anuló la unión a muIL2Ra por tres mutaciones homólogas a las identificadas en IL-2v humana y se retiró el sitio de O-glucosilación respectivo: T23A (O-gluco), F76A, Y79A, L106G. Además, como en la aldesleucina, el residuo de cisteína se mutó para evitar la agregación por una mutación C160A (numeración en base a ID P04351 de UniProt, que incluye el péptido señal). Aunque mulgGI ya tiene unión a FcyR reducida, la unión a FcyR murinos se anuló completamente por la introducción de las mutaciones DAPG (D265A, P329G), mientras que la unión a muFcRn se conserva. Se fusionó muIL-2v por medio de un conector (G4S)2 no inmunógeno solo al extremo C de una cadena pesada del anticuerpo mulgGI. Para lograr esto, se genomanipuló la inmunocitocina usando conducción electrostática por medio de mutaciones DDKK en el dominio Fc para permitir la heterodimerización en el entorno del ratón.
Las secuencias de polipéptidos de muCEA-muIL2v son como sigue:
Cadena pesada con mutación DD y con muIL2v fusionada (SEQ ID NO: 44):
QVQLVQS GAE VKKPGAS VK VSCK A S GYTFTEF GMNW VRQ APGQGLE WMGWINTKTG
EATYVEEFKGRVTFTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARWDFAYYVEAMDYWGQ
GTTVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVH
TFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSQTVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTV
PEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVAISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTKPREE
QINSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFGAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPK
EQMAKDKVSLTCMITNFFPEDITVEWQWNGQPAENYDNTQPIMDTDGSYFVYSDLNVQ
KSN WE AGNTFTC S VLHEGLHNHHTEK SL SHSPGGGGGSGGGGSGGGGS AP AS S STS S S T
AEAQQQQQQQQQQQQHLEQLLMDLQELLSRMENYRNLKLPRMLTAKFALPKQATELK
DLQCLEDELGPLRHVLDGTQSKSFQLEDAENFISNIRVTVVKLKGSDNTFECQFDDESAT
VVDFLRRWIAFAQSTTSTSPQ
Cadena pesada con mutación KK (SEQ ID NO: 45):
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTEFGMNWVRQAPGQGLEWMGWINTKTG EATYVEEFKGRVTFTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARWDFAYYVEAMDYWGQ GTT VT VSS AKTTPPS V YPFAPGS AAQTN SMVTFGCFVKGYFPEP VT VTW NSGSES SGVH TFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSQTVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTV PEVSS VFIFPPKPKD VETITETPKVTC V V V AISKDDPE VQF S WF VDD VEVHT AQTKPREE QINSTFRSVSEFPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFGAP1EKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPK KQMAKDKVSLTCMITNFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMKTDGSYFVYSKENV QKSNWEAGNTFTCSVLHEGFHNHHTEKSFSHSPGK
Cadena ligera (SEQ ID NO: 46):
DIQMTQSPSSFSASVGDRVTITCKASAAVGTYVAWYQQKPGKAPKLL1YSASYRKRGVP SRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCHQYYTYPLFTFGQGTKLEIKRADAAPTVSEFPP SSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDTNVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTL TLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC
Las secuencias de polipéptidos de muFAP-muIL2v son como sigue:
Cadena pesada con mutación DD y con muIL2v fusionada (SEQ ID NO: 47):
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAIIGSGASTY YADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGWFGGFNYWGQGTLVTVS SAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQ SDLYTLSSSVTVPSSTWPSQTVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFI FPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVAISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTKPREEQINSTFRS VSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFGAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKD K VSLT CMITNFFPEDIT VEW QWNGQP AENYDNT QPIMDTDGS YF V Y SDLNV QKSNWEA GNTFTC S VLFIEGLHNF1HTEKSLSHSPGGGGGSGGGGSGGGGS AP AS S STS S ST AE AQQQ QQQQQQQQQHLEQLLMDLQELLSRMENYRNLKLPRMLTAKFALPKQATELKDLQCLE DELGPLRHVLDGTQSKSFQLEDAENFISNIRVTVVKLKGSDNTFECQFDDESATVVDFLR RWIAFAQSIISTSPQ
Cadena pesada con mutación KK (SEQ ID NO: 48):
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAIIGSGASTY YADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGWFGGFNYWGQGTLVTVS SAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQ SDLYTLSSSVTVPSSTWPSQTVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFI FPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVAISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTKPREEQINSTFRS VSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFGAPIEKTTSKTKGRPKAPQVYTIPPPKKQMAKD KVSLTCMITNFFPEDTTVEWQWNGQPAENYKNTQPIMKTDGSYFVYSKLNVQKSNWEA GNTFTCSVLHEGLHNF1HTEKSLSHSPGK
Cadena ligera (SEQ ID NO: 49):
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVTSSYLAWYQQKPGQAPRLLINVGSRRATGEPD RFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQG1MLPPTFGQGTKVE1KRADAAPTVSIFPPSS EQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLT LTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC
Las secuencias de polipéptidos de muPD1 son como sigue:
Cadena pesada (SEQ ID NO: 50):
EVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCSVTGYSITSSYRWNW1RKFPGNRLEWMGYINSAGISNY NPSLKRRISITRDTSKNQFFLQVNSVTTEDAATYYCARSDNMGTTPFTYWGQGTLVTVS SASTTAPSVYPLAPVCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPEPVTLTWNSGSLSSGVHTFPAVLQS DLYTLSSSVTVTSSTWPSQSITCNVAHPASSTKVDKKIEPRGPTIKPCPPCKCPAPNAAGG PSVF1FPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYN STLRVVSALP1QHQDWMSGKEFKCKVNNKDLGAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEE MTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEK KNW VERNSYSCSVVFTEGLHNFTHT TKSFSRTPGK
Cadena ligera (SEQ ID NO: 51):
DIV'MTQGTLPNP VTSGES V SITCRS SK SLL Y SDGKTYLNW YLQRPGQ SPQLLIYWMSTRA SGVSDRFSGSüSGTDFTT.KÍSGVF.AEDVGIYYCQQGI.FFPTFGGGTKI F.lKRTDAAPTVS IFPPSSrQETSGGASVVCFI-NNFYPKDINVKWKIDGSr.RQNGVENSWTDQDSKDSTYSVI SSILTLTKDEYERHNSYICEAIHKTSTSPIVKSFNRNEC:
Los inmunoconjugados preparados en este ejemplo se usaron además en los siguientes ejemplos.
Ejemplo 2
Ejemplo 2A. Unión de PD1-IL2v a linfocitos T CD8 y CD4 activados
Las PBMC recién aisladas de donantes humanos sanos se estimularon durante la noche con CD3 y CD28 para inducir la regulación por incremento de PD1 en los linfocitos T. Las PBMC se sembraron en medio (RPMI1640, FCS al 10 %, glutamina 2 mM) en matraces de cultivo celular que se recubrieron durante 1 h a 37 °C con 1 |jg/ml de CD3 (clon OKT3, n.° 317304, BioLegend). Se añadió CD28 en solución a las PBMC a una concentración de 2 jg/m l (clon CD28.2, n.° 302914, BioLegend). Al día siguiente, se recogieron las PBMC y se transfirieron a una placa de fondo redondo de 96 pocilios (200.000 células por pocilio). Se lavaron las células con tampón FACS (PBS, FBS al 2 %, EDTA 5 mM, N aN al 0,025 %) y se tiñeron con 40 |jl de las moléculas indicadas (IgG frente a PD1, PD1-IL2v y CEA-IL2v) en tampón FACS durante 30 min a 4 °C. Se lavaron las células dos veces con tampón FACS para retirar las moléculas no unidas. A continuación, se añadieron a las células 40 j l del anticuerpo secundario específico anti-Fc humano de PE diluido (n.° 109-116-170, Jackson ImmunoResearch). Después de 30 min de incubación a 4 °C, se lavaron las células dos veces con tampón FACS. Para detectar linfocitos T, se tiñeron las PBMC con 40 j l de una mezcla de CD3 FITC (clon UCHT1, n.° 300406, BioLegend), CD4 APC (clon RPA-T4, 300514, BioLegend) y CD8 BV421 (clon RPA-T8, n.° 301036, BioLegend) durante 30 min a 4 °C. Se retiraron los anticuerpos no unidos lavando dos veces con tampón FACS. Finalmente, se fijaron las células con PFA al 1 % en tampón FACS y se midieron usando una selección BD Fortessa de células CD3+CD4+ (linfocitos T CD4) y células CD3+CD8+ (linfocitos T CD8).
Como se muestra en la figura 2, PD1-IL2v y la IgG frente a PD1 correspondiente se unen de forma similar a los linfocitos T CD4 y CD8. Una inmunocitocina análoga: CEA-IL2v, dirigida a CEA en células tumorales en lugar de PD1 sirvió como un control no dirigido para comparar el efecto de la inmunocitocina basada en IL2v sola que no está dirigida a PD1.
Ejemplo 2B. Activación y proliferación de linfocitos T y linfocitos NK con PD1-IL2v
Se incubaron las PBMC recién aisladas de donantes humanos sanos durante la noche y a continuación se marcaron con CFSE (éster N-succinimidílico de diacetato de 5(6)-carboxifluoresceína, n.° 21888, Sigma-Aldrich). En resumen, se lavaron 30 millones de PBMC una vez con PBS. Paralelamente, se diluyó la solución madre de CSFE (2 mM en DMSO) 1:20 en PBS. Se volvieron a suspender las PBMC en 30 ml de PBS precalentado, se añadieron 30 j l de la solución de CFSE y se mezclaron las células de inmediato. Para un marcaje óptimo, se incubaron las células durante 15 min a 37 °C. A continuación, se añadieron 10 ml de medio precalentado (RPMI1640, FCS al 10 %, glutamina al 1 %) para detener la reacción de marcaje. Se centrifugaron las células durante 10 min a 400 x g y se volvieron a suspender en 20 ml de medio nuevo y se incubaron durante 30 min adicionales a 37 °C. Finalmente, se lavaron las células una vez con medio y se volvieron a suspender en medio nuevo a razón de 1 millón de células por ml. Se sembraron las PBMC marcadas en una placa de fondo redondo de 96 pocillos (200.000 células por pocillo) y se trataron durante 5 días con las moléculas indicadas (PD1-IL2v, CEA-lL2v, IgG frente a PD1 y la combinación de IgG frente a PD1 más CEA- IL2v). Después de la incubación, se lavaron las células una vez con tampón FACS y se tiñeron con 20 j l de una mezcla de CD3 APC/Cy7 (clon UCHT1, n.° 300426, BioLegend), CD56 APC (clon HCH56, 3#18310, BioLegend), CD4 PE (clon RPA-T4, n.° 300508, BioLegend) y CD25 Bv 421 (clon M-A251, BioLegend) en tampón FACS durante 30 min a 4 °C. Después de esto, se lavaron las PBMC dos veces con tampón FACS antes de fijarlas con PFA al 1 % en tampón FACS y medir la fluorescencia con un BD Fortessa. Se determinó la proliferación midiendo la dilución con CFSE de linfocitos T CD8 (CD3+CD4-), linfocitos T CD4 (CD3+CD4+) y linfocitos NK (CD3-CD56+).
Como se muestra en la figura 3, la actividad de PD1-IL2v es comparable a la actividad de CEA-IL2v y CEA-IL2v en combinación con IgG frente a PD1. La IgG frente a PD1 sola no tiene actividad en este entorno.
La figura 4 muestra que PD1-IL2v induce la activación (medida por la regulación por incremento de CD25) de linfocitos NK, linfocitos T CD8 y linfocitos T CD4. La activación inducida por CEA-IL2v y la combinación de CEA-IL2v con IgG frente a PD1 es similar. La IgG frente a PD1 sola no induce la activación en este entorno.
Ejemplo 2C. Activación y proliferación de linfocitos T CD8 y CD4 activados previamente con PD1-IL2v
Se marcaron las PBMC recién aisladas de donantes humanos sanos con CFSE (éster N-succinimidílico de diacetato de 5(6)-carboxifluoresceína, n.° 21888, Sigma-Aldrich). En resumen, se lavaron 30 millones de PBMC una vez con PBS. Paralelamente, se diluyó la solución madre de CSFE (2 mM en DMSO) 1:20 en PBS. Se volvieron a suspender las PBMC en 30 ml de PBS precalentado, se añadieron 30 j l de la solución de CFSE y se mezclaron las células de inmediato. Para un marcaje óptimo, se incubaron las células durante 15 min a 37 °C. A continuación, se añadieron 10 ml de medio precalentado (RPMI1640, FCS al 10 %, glutamina al 1 %) para detener la reacción de marcaje. Se centrifugaron las células durante 10 min a 400 x g y se volvieron a suspender en 20 ml de medio nuevo y se incubaron durante 30 min adicionales a 37 °C. Finalmente, se lavaron las células una vez con medio y se volvieron a suspender en medio nuevo a razón de 1 millón de células por ml. Se activaron previamente las PBMC marcadas con CFSE durante la noche con 1 jg/m l de PHA (n.° L8902, Sigma-Aldrich) para inducir la regulación por incremento de PD-1 en los linfocitos T. Al día siguiente se recogieron y contaron las PBMC activadas previamente. A continuación, se sembraron las PBMC en una placa de fondo redondo de 96 pocillos (200.000 células por pocillo) y se trataron durante 4 días con las moléculas indicadas (PD1-IL2v, CEA-IL2v, IgG frente a PD1 y la combinación de IgG frente a PD1 más CEA-IL2v). Después de la incubación, se lavaron las células una vez con tampón FACS y se tiñeron con 20 j l de una mezcla de CD3 APC/Cy7 (clon UCHT1, n.° 300426, BioLegend), Cd 8 APC (clon SK1, BioLegend) y CD25 BV421 (clon M-A251, BioLegend) en tampón FACS durante 30 min a 4 °C. Después de esto, se lavaron las PBMC dos veces con tampón FACS antes de fijarlas con PFA al 1 % en tampón FACS y medir la fluorescencia con un BD Fortessa. Se determinó la proliferación midiendo la dilución con CFSE de linfocitos T CD8 (CD3+CD8+) y linfocitos T CD4 (CD3+CD8-).
La figura 5 muestra que PD1-IL2v induce la proliferación de linfocitos T CD8 y CD4 activados por PHA que expresan PD-1. La actividad es comparable a CEA-IL2v y la combinación de CEA-IL2v con IgG frente a PD1. La IgG frente a PD1 sola no tiene actividad en este entorno. No se puede observar ningún efecto adicional de bloqueo de PD-1 en este entorno, probablemente debido a la ausencia de células tumorales positivas para PD-L1.
Como se muestra en la figura 6, PD1-IL2v induce la activación de linfocitos T CD8 y CD4 activados por PHA que expresan PD-1 (usando la expresión de CD25 como marcador de activación). CEA-IL2v y la combinación de c Ea -IL2v con IgG frente a PD1 inducen una activación comparable de los linfocitos T. La IgG frente a PD1 sola no tiene actividad en este entorno. No se puede observar ningún efecto adicional de bloqueo de PD-1 en este entorno, probablemente debido a la ausencia de células tumorales positivas para PD-L1.
Ejemplo 2D. Proliferación de NK92 con PD1-IL2v y PD-L1-IL2v
Se recogieron, se contaron y se valoró la viabilidad de las células NK92. Se lavaron las células tres veces con PBS para retirar la IL-2 residual y se volvieron a suspender en medio (RPMI1640, FCS al 10 %, glutamina al 1 %) sin IL-2. Se incubaron las células NK92 lavadas durante dos horas en una estufa de incubación de células (privación de IL-2). Después de la privación, se volvieron a suspender las células en medio nuevo sin IL2, hasta 200.000 células por ml y se transfirieron 50 |jl de la suspensión celular a una placa de fondo plano tratada con cultivo celular de 96 pocillos y se complementó con 50 j l de los anticuerpos diluidos (en medio sin IL-2), Proleukin (concentración final de 1,5 jg/m l) o medio (pocillos de control) hasta alcanzar un volumen final de 100 j l por pocillo. Se incubó la placa durante 2 días en la estufa de incubación. Después de 2 días, los reactivos CellTiter-Glo (Promega) y la placa de cultivo celular se equilibraron hasta temperatura ambiente. La solución CellTiter-Glo se preparó como se describe en las instrucciones del fabricante y se añadieron 100 j l de la solución a cada pocillo. Después de 10 min de incubación, se volvieron a suspender los agregados restantes por pipeteo y se transfirieron 150 j l de la mezcla a una placa blanca de fondo plano. Se midió la luminiscencia con un lector multimodal Tecan Spark 10M.
La figura 7A muestra que PD-L1-IL2v induce la proliferación de células NK92 tan eficazmente como CEA-IL2v. La figura 7B muestra que PD-L1-IL2v y PD1-IL2v tienen la misma actividad en la inducción de la proliferación de células NK92. Las células NK92 son negativas para PD1.
Ejemplo 2E. Unión de PD-L1-IL2v a células CTLL2
La línea de linfocitos T murinos CTLL2 expresa PD-L1. Estas células se usaron para someter a prueba la unión de PD-L1-IL2v (sustituta murina) a PD-L1. Se recogieron las células, se comprobó la viabilidad y se transfirieron a una placa de fondo redondo de 96 pocillos (200.000 células por pocillo). Se lavaron las células con tampón FACS (PBS, FBS al 2 %, EDTA 5 mM, NaN3 al 0,025 %) y se tiñeron con 40 j l de las moléculas indicadas en tampón Fa CS durante 30 min a 4 °C. Se lavaron las células dos veces con tampón FACS para retirar las moléculas no unidas. A continuación, se añadieron a las células 40 j l del anticuerpo secundario específico anti-Fc de ratón de APC diluido (n.° 115-136-071, Jackson ImmunoResearch). Después de 30 min de incubación a 4 °C, se lavaron las células dos veces con tampón FACS. Se analizaron las células con un BD LSR Fortessa.
La figura 8 muestra que PD-L1-IL2v se une tan bien como muIgG1 frente a PD-L1 correspondiente a las células CTLL2. Estas células son negativas para PD1.
Ejemplo 2F. Proliferación de células CTLL2 con PD1-IL2v y PD-L1-IL2v
Se recogieron, se contaron y se valoró la viabilidad de las células CTLL2. Se lavaron las células tres veces con PBS (para retirar la IL-2 residual), se volvieron a suspender en medio (RPMI1640, FCS al 10 %, glutamina al 1 %) sin IL-2 y se incubaron durante dos horas en una estufa de incubación de células (privación de IL-2). Después de la privación, se volvieron a suspender 200.000 células CTLL2 por ml en medio nuevo sin IL2 y se transfirieron 50 j l de suspensión celular a una placa de fondo plano tratada con cultivo celular de 96 pocillos. Se añadieron 50 j l de PD1-IL2v sustituta murina diluida, PD-L1-IL2v sustituta murina, CEA-IL2v sustituta murina, Proleukin diluida (concentración final de 1,5 jg/m l) o medio solo (usando todos medio sin IL-2) a pocillos hasta un volumen final de 100 jl/pocillo. Se incubaron las muestras durante 3 días en una estufa de incubación de células y se valoró la proliferación usando CellTiter-Glo de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En resumen, se añadieron 100 j l de reactivos a cada pocillo y se incubaron durante 10 min. Se volvieron a suspender los agregados restantes por pipeteo y se transfirieron 150 j l de la mezcla a una placa blanca de fondo plano. Se midió la luminiscencia con un lector multimodal Tecan Spark 10M.
La figura 9A muestra que PD-L1-IL2v induce la proliferación de células CTLL2. La actividad parece ser mayor en comparación con CEA-IL2v, probablemente debido a la expresión de PD-L1 en las células CTLL2.
La figura 9B nuevamente muestra que PD1-IL2v induce la proliferación de células CTLL2. La actividad parece ser menor en comparación con PD-L1-IL2v, probablemente porque estas células expresan solo PD-L1 pero no PD1.
Ejemplo 3
Eficacia in vivo de PD1-IL2v y PD-L1-IL2v en un modelo de tumor de ratón singénico
Los inmunoconjugados PD1-IL2v y PD-L1-IL2v (sustitutos murinos) se sometieron a prueba solos y en comparación con los anticuerpos frente a PD1 y PD-L1 correspondientes para determinar su eficacia antitumoral en el modelo singénico Panc02-Fluc.
Las células Panc02-H7 (carcinoma pancreático de ratón) se obtuvieron originalmente del MD Anderson Cancer Center (Texas, EE. UU.) y después de la expansión se depositaron en el banco de células interno de Roche-Glycart. Se produjo internamente la línea celular Panc02-H7-Fluc por técnicas de transfección y subclonación con calcio. Se cultivó Panc02-H7-Fluc en medio RPMI que contenía FCS al 10 % (Sigma), 500 |jg/ml de higromicina y 1 % de Glutamax. Se cultivaron las células a 37 °C en una atmósfera saturada de agua con CO2 al 5 %. Se usó el pase 23 para el trasplante. La viabilidad celular fue de un 90,4 %. Se inyectaron 1x105 células por animal en el páncreas de ratones Black 6 usando una jeringuilla con 0,3 ml de tuberculina (BD Biosciences, Alemania). Para esto se realizó una pequeña incisión en el sitio abdominal izquierdo de los ratones anestesiados. Se abrió la pared peritoneal y se aisló cuidadosamente el páncreas con fórceps. Se inyectaron diez microlitros (1x105 células Panc02-H7-Fluc en medio RPMI) de suspensión celular en la cola del páncreas. La pared peritoneal y las heridas de la piel se cerraron usando hilos de sutura reabsorbibles 5/0.
Se mantuvieron ratones hembra Black 6 de 10-12 semanas de edad al inicio del experimento (Charles Rivers, Lyon, Francia) en condiciones libres de patógenos específicos con ciclos diarios de 12 h de luz/12 h de oscuridad de acuerdo con las directrices acordadas (GV-Solas; Felasa; TierschG). El protocolo del estudio experimental se revisó y aprobó por el gobierno local (ZH193/2014).
Después de su llegada, se mantuvo a los animales durante una semana para que se acostumbraran al nuevo entorno y para su observación. Se llevó a cabo un seguimiento de salud continuo con regularidad.
Se les inyectaron por vía intrapancreática a los ratones el día del estudio 0 1x105 células Panc02-Fluc, se aleatorizaron y se pesaron. Una semana después de la inyección de células tumorales, se les inyectaron i.v. a los ratones anticuerpos frente a PD1-IL2v, PD-L1-IL2v o PD1 y PD-L1, una vez a la semana durante cuatro semanas.
Se les inyectaron i.v. a todos los ratones 200 |jl de la solución apropiada. Se les inyectó a los ratones del grupo vehículo tampón de histidina y a los grupos de tratamiento los conjugados PD1-IL2v y PD-L1-IL2v sustitutos murinos o los anticuerpos frente a PD1 y PD-L1 correspondientes, diluidos con tampón de histidina según fuera apropiado. La cantidad de anticuerpos inyectados por ratón en mg/kg fue la siguiente: 1,5 mg/kg de anticuerpos frente a PD1-IL2v y PD-L1-IL2v, 10 mg/kg de anticuerpos frente a PD1 y PD-L1.
La figura 10 y la tabla 1 muestran que PD1-IL2v medió una eficacia significativamente superior en términos de la mediana de la supervivencia y la supervivencia global potenciadas en comparación con todos los demás agentes individuales sometidos a prueba, incluyendo de forma destacada PD-L1-IL2v.
Tabla 1. Mediana de la supervivencia y supervivencia global de ratones Black 6 tratados con PD1-IL2v, PD-L1-IL2v, anticuerpo frente a PD1 o PD-L1, en el modelo de tumor singénico Panc02-Fluc.
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Para la formación de imágenes de bioluminiscencia por ESPECTRO IVIS®, se les inyectaron por vía intraperitoneal a los ratones 150 mg/kg de D-luciferina 10 minutos antes de la adquisición de imágenes de bioluminiscencia (BLI) y más tarde se anestesiaron con isoflurano al 4 %. Posteriormente, se transfirieron los ratones a una cámara de aislamiento, que se sitúa en el espectro IVIS®. Las adquisiciones de BLI in vivo se realizaron adquiriendo la señal de luminiscencia durante 10-50 segundos. Los datos se almacenaron como radiancia (fotones)/s/cm2/sr. El análisis de datos de BLI in vivo se realizó con el programa informático Living Image® 4.4 y se representó por una curva de inhibición de tumor.
La figura 11 muestra una eficacia superior de PD1-IL2v en términos de disminución de la señal de bioluminiscencia (fotones/segundo) en comparación con todos los demás grupos, incluyendo de forma destacada PD-L1-IL2v. Tan pronto como después de la primera administración del tratamiento el día 7, se detectó una reducción en la señal de bioluminiscencia de Panc02-Fluc por espectro IVIS® en varios grupos tratados, pero solo PD1-IL2v muestra una desaparición completa de la señal de BLI en la mayoría de los ratones que duraron toda la duración del experimento, indicativo de una respuesta completa en 7 de 8 ratones.
Ejemplo 4
Efecto del suministro de IL-2v a los linfocitos T específicos de virus agotados a través del bloqueo de PD-1 o bien de PD-L1
La expresión de PD-1 se ha descrito por primera vez en linfocitos T específicos de virus agotados como consecuencia de la exposición prolongada a antígenos víricos y se ha asociado con la incapacidad de los linfocitos T para aumentar una respuesta antivírica eficaz. Los linfocitos T CD4 específicos de virus que pueden secretar simultáneamente IL-2 e IFN-y confieren protección contra la reactivación vírica en infecciones crónicas. De hecho, el distintivo polifuncional de los linfocitos T CD4 se ha asociado con el control vírico en individuos sanos infectados por citomegalovirus (CMV), virus de Epstein-Barr (VEB) y virus del herpes simple (VHS), así como en aquellos individuos infectados con el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) que permanecen sin síntomas durante varios años.
Por lo tanto, en el contexto de las infecciones víricas crónicas, se desarrolló un ensayo in vitro para evaluar el efecto del direccionamiento a PD-1 y PD-L1 para suministrar una versión mutada de IL-2 (IL-2v) a los linfocitos T específicos de antígeno disfuncionales. Para evitar restricciones en la cantidad de donantes adecuados para este ensayo, se optó por una proteína vírica inmunógena de CMV (pp65) como antígeno de recuperación para los linfocitos T dado que aproximadamente un 80 % de la población es seropositiva para CMV. Por consiguiente, se estimularon los leucocitos monomorfonucleares en la sangre periférica (PBMC) de donantes humanos sanos con CMV-pp65 durante un par de horas antes de añadir las presentes construcciones a la concentración de 10 |jg/ml.
43 horas más tarde, se bloqueó el transporte de proteínas del aparato de Golgi añadiendo Golgi Plug (brefeldin A) y Golgi Stop (monensina) y se incubaron las células a 37 °C durante 5 horas adicionales. A continuación, se lavaron las células, se tiñeron en la superficie con anticuerpos anti-CD3, CD4, CD8, CD62L y CD45RO humanos antes de fijarse/permeabilizarse con tampón Fix/Perm (BD Bioscience). Finalmente, se realizó una tinción intracelular para lL-2, IFN-y y Ki67 (ambos de eBioscience).
Se observó que tanto PD1-IL2v como PD-L1-IL2v, así como la combinación de los anticuerpos IgG correspondientes con IL-2v, incrementaron, a niveles comparables, las frecuencias de linfocitos T CD4 polifuncionales (figura 12B) y monofuncionales para IL-2 e IFN-y (figura 12A y 12C, respectivamente), proporcionando un efecto potenciado en comparación con el bloqueo anti-PD-1 y anti-PD-LI, respectivamente. Las poblaciones expandidas en los linfocitos T CD4 polifuncionales (figura 13B) y monofuncionales para IFN-y (figura 13C y 13D) muestran una memoria efectora (CD45RO+ CD62L') y perfil efector diferenciado terminalmente (CD45RO' CD62L'). Por el contrario, los linfocitos T CD4 monofuncionales para IL-2 inducidos por antagonismo de PD-L1 y expandidos además por el suministro conjunto de IL-2v, presentan un distintivo indiferenciado (CD62L+ CD45RO-) (figura 13A).
Se puede concluir que el suministro de IL-2v a linfocitos T CD4 específicos de CMV agotados a través de la proteína de fusión PD1-IL-2v dio como resultado la expansión de una población específica de virus protectora de larga duración caracterizada por la capacidad de secretar conjuntamente IL-2 e IFN-y.
Ejemplo 5
Ejemplo 5A. Unión preferencial de PD1-IL2v a linfocitos T convencionales activados sobre linfocitos T reguladores activados
Se valoraron las propiedades de unión de PD1-IL2v a los linfocitos T reguladores y convencionales activados en un ensayo de unión competitiva. Se aislaron linfocitos T reguladores (Treg) CD4+ CD25+ CD127dimcon el kit de aislamiento de linfocitos T reguladores de dos etapas (Miltenyi, n.° 130-094-775). En paralelo, se aislaron los linfocitos T convencionales (Tconv) CD4+ CD25- recogiendo la fracción negativa de una selección positiva de CD25 (Miltenyi, n.° 130-092-983) seguido de una de enriquecimiento de CD4+ (Miltenyi, n.° 130-045-10 l ). Se marcaron los Tconv con CFSE (eBioscience, n.° 65-0850-84) y se marcaron los Treg con Cell Trace Violet (ThermoFisher Scientific, C34557) para rastrear la proliferación de ambas poblaciones. Se sembraron juntos Tconv y Treg en una placa de cultivo que se recubrió durante la noche a 4 °C con 1 jg/m l de CD3 (clon OKT3, n.° 317315, BioLegend). Se añadió CD28 en solución a una concentración de 1 jg/m l de CD28 (clon CD28.2, n.° 302923, BioLegend). Después de 5 días de estimulación, se realizó un ensayo de unión con PD1 (0376) y PD1-IL2v (0590), etiquetándose ambos internamente con AF647.
El anticuerpo biespecífico frente a PD1-IL2v muestra un perfil de unión comparable al de PD1 (figura 14A y 14B). La figura 14A muestra el delta de la frecuencia de un anticuerpo dado unido a Tconv frente a Treg dentro de la misma muestra. Cada símbolo representa un donante separado, las líneas horizontales indican medianas con N=4. Ambas moléculas muestran una mayor capacidad de unión a Tconv sobre Treg debido a niveles de expresión mayores de PD-1 en Tconv que en Treg (figura 14B; datos de un donante representativo que muestran la unión a Tconv (línea negra) y Treg (gris)). Por consiguiente, el anticuerpo biespecífico frente a PD1-IL2v mantiene las propiedades de unión de PD1 a pesar de que IL2v está acoplado al anticuerpo.
Ejemplo 5B. Recuperación de la función efectora de T conv tras el tratamiento con PD1-IL2v en un ensayo de supresión de T reg
En una etapa siguiente se sometió a prueba si el PD1-IL2v puede invertir la supresión de Treg de Tconv. Por lo tanto, se estableció un ensayo de función supresora, donde Tconv y Treg se cultivan juntos durante 5 días, con o sin anticuerpos bloqueadores, en presencia de CD4- CD25- de un donante inconexo para estimulación aloespecífica. Para este propósito se aislaron Tconv y Treg y se marcaron como se describe anteriormente. La acumulación de citocinas en el aparato de Golgi se potenció aplicando inhibidores del transporte de proteínas (GolgiPlug n.° 555029, BD y GolgiStop n.° 554724, BD) durante 5 horas antes de la tinción con FACS.
Se midió la capacidad de los Tconv proliferados para secretar granzima B (GrzB; figura 15A) e interferón gamma (IFNy; figura 15B) en presencia y ausencia de Treg. Se calculó la supresión de Treg con la siguiente fórmula:
% de supresión de citocinas = 100-(% de citocinasTconv-Treg±anticuerpo bloqueador)/(% de CitOCinaSTconv sin tratar) *100)
donde % de citocinasTconv+Treg±anticuerpo bloqueador es el nivel de citocinas secretadas por Tconv en presencia de Treg ± anticuerpo bloqueador, % de citocinasTconv sin tratar es el nivel de citocinas secretadas por Tconv en ausencia de Treg. En la figura 15A y 15B, cada símbolo representa un donante separado, las líneas horizontales indican las medianas con N=5, las líneas punteadas a 0 % representan que no hay supresión por Treg. P se calculó usando ANOVA unifactorial (*p<0,05,**p<0,01,***p<0,001,****p<0,0o0l).
La figura 15A muestra que el tratamiento con el anticuerpo frente a PD1 (0376) da como resultado una mediana de un 47,7 % de supresión de la función de Tconv, en comparación con una mediana de supresión de un 68,6 % en el grupo no tratado (sin significación estadística). Asimismo, el bloqueo de la interacción de PD-1/PD-L1 con atezolizumab, nivolumab y pembrolizumab mostró la misma tendencia que para el anticuerpo frente a PD1. De forma interesante, DP47-IL2v (mediana = -11,3 %, p = 0,0011) y PD1-IL2v (mediana = -43,6 %, p < 0,0001) rescataron la función efectora de GrzB de Tconv de la supresión de Treg. Además, PD1-IL2v fue incluso significativamente (p = 0,0026) más potente que el anticuerpo frente a PD1 solo.
Paralelamente se realizaron los mismos análisis para la supresión de INFy de Tconv por Treg (figura 15B). DP47-IL2v (mediana= 51,77 %, p= 0,0251) y PD1-IL2v (mediana= 31,23 %, p= <0,0001) rescataron la función efectora de IFNy de T conv de la supresión de Treg.
Ejemplo 6
Eficacia in vivo de los inmunoconjugados PD1-IL2v en un modelo singénico de líneas celulares de tumor de ratón en comparación con los anticuerpos frente a PD1 y FAP-IL2v como agentes individuales y en combinación
Se sometió a prueba el inmunoconjugado PD1-IL2v sustituto murino (muPD1-IL2v) en comparación con una combinación de PD1 sustituto murino y FAP-IL2v sustituta murina (muFAP-IL2v) para determinar su eficacia antitumoral en un modelo singénico. El modelo singénico usado fue el modelo singénico pancreático Panc02-Fluc.
Se sometió a prueba el inmunoconjugado PD1-IL2v sustituto murino en la línea celular transfectante pancreática de ratón Panc02-Fluc inyectado por vía intrapancreática en ratones Black 6. Las células Panc02-H7 (carcinoma pancreático de ratón) se obtuvieron originalmente del MD Anderson Cancer Center (Texas, EE. UU.) y después de la expansión se depositaron en el banco de células interno de Roche-Glycart. Se produjo internamente la línea celular Panc02-H7-Fluc por técnicas de transfección y subclonación con calcio. Se cultivó Panc02-H7-Fluc en medio RPMI que contenía FCS al 10 % (Sigma), 500 |jg/ml de higromicina y 1 % de Glutamax. Se cultivaron las células a 37 °C en una atmósfera saturada de agua con CO2 al 5 %. Se usó el pase 23 para el trasplante. La viabilidad celular fue de un 87,5 %. Se inyectaron 1x105 células por animal en el páncreas de los ratones usando una jeringuilla con 0,3 ml de tuberculina (Bd Biosciences, Alemania). Para esto se realizó una pequeña incisión en el sitio abdominal izquierdo del ratón Black 6 anestesiado. Se abrió la pared peritoneal y se aisló cuidadosamente el páncreas con fórceps. Se inyectaron diez microlitros (1x105 células Panc02-H7-Fluc en medio RPMI) de suspensión celular en la cola del páncreas. La pared peritoneal y las heridas de la piel se cerraron usando hilos de sutura reabsorbibles 5/0.
Se mantuvieron ratones hembra Black 6 de 10-12 semanas de edad al inicio del experimento (Charles Rivers, Lyon, Francia) en condiciones libres de patógenos específicos con ciclos diarios de 12 h de luz/12 h de oscuridad de acuerdo con las directrices acordadas (GV-Solas; Felasa; TierschG). El protocolo del estudio experimental se revisó y aprobó por el gobierno local (ZH193/2014). Después de su llegada, se mantuvo a los animales durante una semana para que se acostumbraran al nuevo entorno y para su observación. Se llevó a cabo un seguimiento de salud con regularidad.
Se les inyectaron por vía intrapancreática a los ratones el día del estudio 0 1x105 células Panc02-Fluc, se aleatorizaron y se pesaron. Una semana después de la inyección de células tumorales, se les inyectaron por vía intravenosa a los ratones dos dosis diferentes de PD1-IL2v y se compararon con la combinación de anticuerpos frente a PD1 y FAP-IL2v, una vez por semana durante cuatro semanas.
Se les inyectaron por vía intravenosa a todos los ratones 200 |jl de la solución apropiada. Se les inyectó a los ratones del grupo vehículo tampón de histidina y a los grupos de tratamiento los anticuerpos frente a PD1-IL2v (0,5 mg/kg o 1 mg/kg), PD1 (10 mg/kg) y FAP-lL2v (2,5 mg/kg) o la combinación de anticuerpos frente a PD1 y FAP-IL2v (10 mg/kg de PD1 y 2,5 mg/kg de FAP-IL2v). Para obtener la cantidad apropiada de inmunoconjugados por 200 |jl, se diluyeron las soluciones madre con tampón histidina cuando fue necesario de acuerdo con la tabla 2.
Tabla 2. Compuestos, dosis, tampones de formulación y concentración de solución madre.
Figure imgf000057_0001
Para la formación de imágenes de bioluminiscencia por ESPECTRO IVIS®, se inyectan por vía intraperitoneal a los ratones 150 mg/kg de D-luciferina 10 minutos antes de la adquisición de imágenes de bioluminiscencia (BLI) y más tarde se anestesian con isoflurano al 4 %. Posteriormente, se transfieren los ratones a una cámara de aislamiento, que se sitúa en el espectro IVIS®. Las adquisiciones de BLI in vivo se realizan adquiriendo la señal de luminiscencia durante 10-50 segundos. Los datos se almacenan como radiación (fotones)/s/cm2/sr. El análisis de datos de BLI in vivo se realiza con el programa informático Living Image® 4.4 y se representa por una curva de inhibición de tumor.
Para evaluar la inmunofarmacodinámica por histología, se sacrificaron 3 ratones por grupo 4 días después del primer tratamiento por luxación del cuello. Se recogieron los tumores de páncreas y se fijaron de inmediato en formol al 10 %. El tejido se dejó en solución de formol durante la noche y más tarde se procesó para FFPET (Leica 1020, Alemania). Posteriormente se cortaron cortes en parafina de 4 jm en un micrótomo (Leica RM2235, Alemania). La inmunohistoquímica de CD3, PD1 e ICOS de ratón se realizó en el sistema de tinción automática Leica (Leica ST5010, Alemania) siguiendo los protocolos del fabricante. Se obtuvieron las imágenes con el escáner Olympus.
La figura 16 muestra los resultados de un experimento de eficacia que compara los anticuerpos frente a PD1-IL2v sustituta murina con respecto a FAP-IL2v sustituta murina y PD-1 sustituto murino como agentes individuales y en combinación. Se inyectó la línea celular de carcinoma pancreático transfectante Panc02-H7-Fluc en el páncreas en ratones Black 6 para estudiar la supervivencia en un modelo singénico ortotópico pancreático. La cantidad de anticuerpos inyectados por ratón en mg/kg es la siguiente: 0,5 y 1 mg/kg de anticuerpos frente a PD1-IL2v sustituta murina, 10 mg/kg de anticuerpos frente a PD1 sustituto murino y 2,5 mg/kg de anticuerpos frente a FAP-IL2v sustituta murina. Los anticuerpos se inyectaron por vía intravenosa una vez por semana durante 4 semanas. Se observó una mediana de la supervivencia y una supervivencia global significativamente superiores en la PD1-IL2v sustituta murina a 0,5 y 1 mg/kg en comparación con todos los demás agentes individuales y la combinación de PD-1 sustituto murino y FAP-IL2v sustituta murina. La figura 16 y la tabla 3 muestran que ambas dosis de PD1-IL2v mediaron una eficacia superior en términos de una mediana de la supervivencia y supervivencia global potenciadas en comparación con todos los demás agentes individuales, así como con la combinación de PD1 y FAP-IL2v.
Tabla 3: Mediana de la supervivencia y supervivencia global de ratones Black 6 tratados con PD1-IL2v, PD1, FAP-IL2v y una combinación de anticuerpo frente a PD-1 y FAP-IL2v, en el modelo de tumor singénico Panc02-Fluc.
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La figura 17 muestra los resultados de un experimento de eficacia que compara PD1-IL2v sustituta murina con FAP-IL2v, PD1 sustituto murino y su combinación. Se inyectó la línea celular de carcinoma pancreático transfectante Panc02-H7-Fluc en el páncreas en ratones Black 6 para estudiar la supervivencia en un modelo singénico ortotópico pancreático por medio de bioluminiscencia. Tan pronto como después de la primera administración del tratamiento el día 7, se detectó una reducción en la señal de bioluminiscencia de Panc02-Fluc por espectro IVIS® en varios grupos tratados, pero solo PD1-IL2v muestra una desaparición completa de la señal de BLI en la mayoría de los ratones que duraron la duración total del experimento, indicativo de una respuesta completa en 4 de 7 ratones para la dosis de 0,5 mg/kg y 7 de 7 ratones para la dosis de 1 mg/kg. La figura 17 muestra que ambas dosis de PD1-IL2v mediaron una eficacia superior en términos de disminución de la señal de bioluminiscencia (fotones/segundo) en comparación con todos los demás agentes individuales y el grupo de combinación.
Las figuras 18A y 18B muestran los resultados de imágenes inmunohistoquímicas de tumores de páncreas teñidos para anti-CD3 de ratón (figura 18A) y el análisis de cuantificación de linfocitos T (figura 18B). La tinción inmunohistoquímica de los linfocitos T CD3 se realizó en tumores de páncreas de ratón Black 6 derivados de los grupos de tratamiento indicados. Se prepararon muestras de tejido para la tinción inmunohistoquímica: se recogieron los tumores de los animales después de la administración del tratamiento, se fijaron en formol al 10 % (Sigma, Alemania) y más tarde se procesaron para FFPET (Leica 1020, Alemania). Posteriormente se cortaron cortes en parafina de 4 |jm en un micrótomo (Leica RM2235, Alemania). La inmunohistoquímica de CD3 de ratón se realizó con anti-CD3 de ratón (Diagnostic Biosystem, Alemania) en el sistema de tinción automática Leica (Leica ST5010, Alemania) siguiendo los protocolos del fabricante. Se obtuvieron las imágenes con el escáner Olympus. La cuantificación de linfocitos T positivos para muCD3 se realizó con el programa informático Definiens (Definiens, Alemania). Las estadísticas se analizaron por ANOVA unifactorial con pruebas de comparación múltiple. Tan pronto como después de la primera administración del tratamiento, el día 4, se detectó un incremento significativo en el número de linfocitos T positivos para CD3 en los grupos tratados con PD1-IL2v en comparación con el grupo vehículo. También se observó una tendencia al incremento de células positivas para CD3 en la combinación de PD1 sustituto murino y FAP-IL2v sustituta murina con respecto al vehículo, pero no fue significativa. Las figuras 18A y 18B muestran que PD1-IL2v provocó un incremento en la infiltración de CD3 en el tumor pancreático 4 días después del primer tratamiento en comparación con todos los grupos.
La figura 19 muestra los resultados de imágenes inmunohistoquímicas de tumores de páncreas teñidos para anti-PD1 de ratón. La tinción inmunohistoquímica de linfocitos T positivos para PD1 se realizó en tumores de páncreas de ratón Black 6 derivados de los grupos de tratamiento indicados. Se prepararon muestras de tejido para la tinción inmunohistoquímica: se recogieron los tumores de los animales después de la administración del tratamiento, se fijaron en formol al 10 % (Sigma, Alemania) y más tarde se procesaron para FFPET (Leica 1020, Alemania). Posteriormente se cortaron cortes en parafina de 4 jm en un micrótomo (Leica RM2235, Alemania). La inmunohistoquímica de PD1 de ratón se realizó con anti-PD1 de ratón (R&D System, Alemania) en el sistema de tinción automática Leica (Leica ST5010, Alemania) siguiendo los protocolos del fabricante. Se obtuvieron las imágenes con el escáner Olympus. Tan pronto como después de la primera administración del tratamiento, el día 4, se detectó un incremento muy alto en el número de linfocitos T positivos para PD1 en los grupos tratados con PD1-IL2v en comparación con el grupo vehículo. También se observó un incremento moderado de células positivas para PD1 en la combinación de PD1 sustituto murino y FAP-IL2v sustituta murina en comparación con el vehículo. La figura 19 muestra que PD1-IL2v provocó un incremento en la infiltración de linfocitos T positivos para PD1 en el tumor pancreático 4 días después del primer tratamiento en comparación con todos los grupos.
La figura 20 muestra los resultados de imágenes inmunohistoquímicas de tumores de páncreas teñidos para anti­ ICOS de ratón. La tinción inmunohistoquímica de linfocitos T positivos para ICOS se realizó en tumores de páncreas de ratón Black 6 derivados de los grupos de tratamiento indicados. Se prepararon muestras de tejido para la tinción inmunohistoquímica: se recogieron los tumores de los animales después de la administración del tratamiento, se fijaron en formol al 10 % (Sigma, Alemania) y más tarde se procesaron para FFPET (Leica 1020, Alemania). Posteriormente se cortaron cortes en parafina de 4 jm en un micrótomo (Leica RM2235, Alemania). La inmunohistoquímica de ICOS de ratón se realizó con anti-ICOS de ratón (My Biosource, Alemania) en el sistema de tinción automática Leica (Leica ST5010, Alemania) siguiendo los protocolos del fabricante. Se obtuvieron las imágenes con el escáner Olympus. Tan pronto como después de la primera administración del tratamiento, el día 4, se detectó una disminución en el número de linfocitos T positivos para ICOS en los grupos tratados con PD1-IL2v en comparación con el grupo vehículo. La figura 20 muestra que PD1-IL2v provocó una disminución en la infiltración de linfocitos T positivos para ICOS en el tumor pancreático 4 días después del primer tratamiento en comparación con todos los grupos.
Ejemplo 7
Eficacia in vivo de los inmunoconjugados PD1-IL2v en un modelo singénico de líneas celulares de tumor de ratón en comparación con los anticuerpos frente a PD1 y FAP-IL2v (dos dosis diferentes) como agentes individuales y en combinación.
Se sometió a prueba el inmunoconjugado PD1-IL2v en comparación con la combinación de PD1 sustituto murino más FAP-IL2v sustituta murina con dos dosis diferentes para determinar su eficacia antitumoral en un modelo singénico. El modelo singénico usado fue el modelo singénico pancreático Panc02-Fluc. Se sometió a prueba el inmunoconjugado PD1-IL2v sustituto murino en la línea celular transfectante pancreática de ratón Panc02-Fluc inyectado por vía intrapancreática en ratones Black 6. Las células Panc02-H7 (carcinoma pancreático de ratón) se obtuvieron originalmente del MD Anderson Cancer Center (Texas, EE. UU.) y después de la expansión se depositaron en el banco de células interno de Roche-Glycart. Se produjo internamente la línea celular Panc02-H7-Fluc por técnicas de transfección y subclonación con calcio. Se cultivó Panc02-H7-Fluc en medio RPMI que contenía FCS al 10 % (Sigma), 500 |jg/ml de higromicina y 1 % de Glutamax. Las células se cultivaron a 37 °C en una atmósfera saturada de agua con CO2 al 5 %. Se usó el pase 16 para el trasplante. La viabilidad celular fue de un 83,3 %. Se inyectaron 1x105 células por animal en el páncreas de los ratones usando una jeringuilla con 0,3 ml de tuberculina (BD Biosciences, Alemania). Para esto se realizó una pequeña incisión en el sitio abdominal izquierdo del ratón Black 6 anestesiado. Se abrió la pared peritoneal y se aisló cuidadosamente el páncreas con fórceps. Se inyectaron diez microlitros (1x105 células Panc02-H7-Fluc en medio RPMI) de suspensión celular en la cola del páncreas. La pared peritoneal y las heridas de la piel se cerraron usando hilos de sutura reabsorbibles 5/0.
Se mantuvieron ratones hembra Black 6 de 10-12 semanas de edad al inicio del experimento (Charles Rivers, Lyon, Francia) en condiciones libres de patógenos específicos con ciclos diarios de 12 h de luz/12 h de oscuridad de acuerdo con las directrices acordadas (GV-Solas; Felasa; TierschG). El protocolo del estudio experimental se revisó y aprobó por el gobierno local (ZH193/2014). Después de su llegada, se mantuvo a los animales durante una semana para que se acostumbraran al nuevo entorno y para su observación. Se llevó a cabo un seguimiento de salud continuo con regularidad.
Se les inyectaron por vía intrapancreática a los ratones el día del estudio 0 1x105 células Panc02-Fluc, se aleatorizaron y se pesaron. Una semana después de la inyección de células tumorales, se les inyectó por vía intravenosa a los ratones PD1-IL2v y se comparó con la combinación de Mab frente a PD1 FAP-IL2v con dos dosis diferentes, una vez por semana durante tres semanas.
Se les inyectaron por vía intravenosa a todos los ratones 200 |jl de la solución apropiada. Se les inyectó a los ratones del grupo vehículo tampón de histidina y a los grupos de tratamiento los anticuerpos frente a PD1-IL2v (1 mg/kg), PD1 (10 mg/kg) y FAP-IL2v (0,625 mg/kg o 1,25 mg/kg) o la combinación de anticuerpos frente a PD1 FAP-lL2v (10 mg/kg 1,25 mg/kg o 10 mg/kg 0,625 mg/kg). Para obtener la cantidad apropiada de inmunoconjugados por 200 jl, se diluyeron las soluciones madre con tampón histidina cuando fue necesario de acuerdo con la tabla 4.
Tabla 4. Compuestos, dosis, tampones de formulación y concentración de solución madre.
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Para la formación de imágenes de bioluminiscencia por ESPECTRO IVIS®, se inyectan por vía intraperitoneal a los ratones 150 mg/kg de D-luciferina 10 minutos antes de la adquisición de imágenes de bioluminiscencia (BLI) y más tarde se anestesian con isoflurano al 4 %. Posteriormente, se transfieren los ratones a una cámara de aislamiento, que se sitúa en el espectro IVIS®. Las adquisiciones de BLI in vivo se realizan adquiriendo la señal de luminiscencia durante 10-50 segundos. Los datos se almacenan como radiación (fotones)/s/cm2/sr. El análisis de datos de BLI in vivo se realiza con el programa informático Living Image® 4.4 y se representa por una curva de inhibición de tumor.
Para evaluar la inmunofarmacodinámica por histología, se sacrificaron 3 ratones de grupos seleccionados 4 días después del primer tratamiento por luxación del cuello. Se recogieron los tumores de páncreas y se fijaron de inmediato en formol al 10 %. El tejido se dejó en solución de formol durante la noche y más tarde se procesó para FFPET (Leica 1020, Alemania). Posteriormente se cortaron cortes en parafina de 4 jm en un micrótomo (Leica RM2235, Alemania). La inmunohistoquímica de CD3, CD8, PD1 y granzima B de ratón se realizó en el sistema de tinción automática Leica (Leica ST5010, Alemania) siguiendo los protocolos del fabricante. Se obtuvieron las imágenes con el escáner Olympus.
La figura 21 y la tabla 5 muestran los resultados de un experimento de eficacia que compara los anticuerpos frente a muPD1-IL2v con respecto a muFAP-IL2v y muPD-1 como agentes individuales y en combinación. Se inyectó la línea celular de carcinoma pancreático transfectante Panc02-H7-Fluc en el páncreas en ratones Black 6 para estudiar la supervivencia en un modelo singénico ortotópico pancreático. La cantidad de anticuerpos inyectados por ratón en mg/kg es la siguiente: 1 mg/kg de anticuerpos frente a muPD1-IL2v, 10 mg/kg de anticuerpos frente a muPD1 y 0,625 o 1,25 mg/kg de anticuerpos frente a muFAP-IL2v. Los anticuerpos se inyectaron por vía intravenosa una vez por semana durante 4 semanas. Se observó una mediana de la supervivencia y supervivencia global significativamente superior en el muPD1-IL2v a 1 mg/kg en comparación con todos los demás agentes individuales y la combinación de muPD-1 muFAP-IL2v en ambas dosis sometidas a prueba. Por tanto, se puede concluir que PD1-IL2v medió una eficacia superior en términos de la mediana de la supervivencia y supervivencia global potenciadas en comparación con todos los demás agentes individuales, así como las combinaciones de PD1 FAP-IL2v en ambas dosis sometidas a prueba.
Tabla 5: Mediana de la supervivencia y supervivencia global de ratones Black 6 tratados con PD1-IL2v, PD1, FAP-IL2v y una combinación de anticuerpo frente a PD-1 y FAP-IL2v, en el modelo de tumor singénico Panc02-Fluc.
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La figura 22 muestra los resultados de un experimento de eficacia que compara muPD1-IL2v con respecto a FAP-IL2v, muPD1 y su combinación con dos dosis diferentes. Se inyectó la línea celular de carcinoma pancreático transfectante Panc02-H7-Fluc en el páncreas en ratones Black 6 para estudiar la supervivencia en un modelo singénico ortotópico pancreático por medio de bioluminiscencia. Durante el transcurso del estudio, se detectó una reducción en la señal de bioluminiscencia de Panc02-Fluc por espectro IVIS® en varios grupos tratados, pero solo el tratamiento con muPD1-IL2v mostró una desaparición completa de la señal de BLI en todos los ratones que duró la duración total del experimento, indicativo de una respuesta completa en los 6 ratones. La figura 22 muestra que PD1-IL2v medió una eficacia superior en términos de disminución de la señal de bioluminiscencia (fotones/segundo) en comparación con todos los demás agentes individuales y los grupos de combinación.
La figura 23 muestra los resultados de imágenes inmunohistoquímicas de tumores de páncreas teñidos para anti-CD3 de ratón. La tinción inmunohistoquímica de los linfocitos T CD3 se realizó en tumores de páncreas de ratón Black 6 derivados de los grupos de tratamiento indicados. Se prepararon muestras de tejido para la tinción inmunohistoquímica: se recogieron los tumores de los animales después de la administración del tratamiento, se fijaron en formol al 10 % (Sigma, Alemania) y más tarde se procesaron para FFPET (Leica 1020, Alemania). Posteriormente se cortaron cortes en parafina de 4 |jm en un micrótomo (Leica RM2235, Alemania). La inmunohistoquímica de CD3 de ratón se realizó con anti-CD3 de ratón (Diagnostic Biosystem, Alemania) en el sistema de tinción automática Leica (Leica ST5010, Alemania) siguiendo los protocolos del fabricante. Se obtuvieron las imágenes con el escáner Olympus. Tan pronto como después de la primera administración del tratamiento, el día 4, se detectó un incremento muy alto en el número de linfocitos T positivos para CD3 en los grupos tratados con muPD1-IL2v en comparación con el grupo vehículo. También se observó un incremento moderado de células positivas para CD3 en todos los demás grupos terapéuticos en comparación con el vehículo. La figura 23 muestra que PD1-IL2v provocó un incremento en la infiltración de linfocitos T positivos para CD3 en el tumor pancreático 4 días después del primer tratamiento en comparación con todos los grupos.
Las figuras 24A y 24B y la tabla 6 muestran los resultados de imágenes inmunohistoquímicas de tumores de páncreas teñidos para anti-CD8 de ratón (figura 24A) y el análisis de cuantificación de linfocitos T (figura 24B). La tinción inmunohistoquímica de los linfocitos T CD8 se realizó en tumores de páncreas de ratón Black 6 derivados de los grupos de tratamiento indicados. Se prepararon muestras de tejido para la tinción inmunohistoquímica: se recogieron los tumores de los animales después de la administración del tratamiento, se fijaron en formol al 10 % (Sigma, Alemania) y más tarde se procesaron para FFPET (Leica 1020, Alemania). Posteriormente se cortaron cortes en parafina de 4 jm en un micrótomo (Leica RM2235, Alemania). La inmunohistoquímica de CD8 de ratón se realizó con anti-CD8 de ratón (Serotec, Alemania) en el sistema de tinción automática Leica (Leica ST5010, Alemania) siguiendo los protocolos del fabricante. Se obtuvieron las imágenes con el escáner Olympus. La cuantificación de linfocitos T positivos para muCD8 se realizó con el programa informático Definiens (Definiens, Alemania). Las estadísticas se analizaron por ANOVA unifactorial con pruebas de comparación múltiple. Tan pronto como después de la primera administración del tratamiento, el día 4, se detectó un incremento significativo en el número de linfocitos T positivos para CD8 en los grupos tratados con muPD1-IL2v en comparación con todos los demás grupos. También se observó una tendencia al incremento de células positivas para CD8 en todos los demás grupos terapéuticos sometidos a prueba, pero no fue significativa.
Por tanto, las figuras 24A y 24B muestran que PD1-IL2v provocó un incremento en la infiltración de CD8 en el tumor pancreático 4 días después del primer tratamiento en comparación con todos los grupos.
Tabla 6. Linfocitos T positivos para CD8.
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Las figuras 25A y 25B y la tabla 7 muestran los resultados de imágenes inmunohistoquímicas de tumores de páncreas teñidos para el análisis de cuantificación del área de marcador anti-granzima B (5A) y granzima B (5B). La tinción inmunohistoquímica de granzima B se realizó en tumores de páncreas de ratón Black 6 derivados de los grupos de tratamiento indicados. Se prepararon muestras de tejido para la tinción inmunohistoquímica: se recogieron los tumores de los animales después de la administración del tratamiento, se fijaron en formol al 10 % (Sigma, Alemania) y más tarde se procesaron para FFPET (Leica 1020, Alemania). Posteriormente se cortaron cortes en parafina de 4 |jm en un micrótomo (Leica RM2235, Alemania). La inmunohistoquímica de granzima B de ratón se realizó con anti-granzima B de ratón (Abeam, Alemania) en el sistema de tinción automática Leica (Leica ST5010, Alemania) siguiendo los protocolos del fabricante. Se obtuvieron las imágenes con el escáner Olympus. La cuantificación del área de marcador de granzima B se realizó con el programa informático Definiens (Definiens, Alemania). Las estadísticas se analizaron por ANOVA unifactorial con pruebas de comparación múltiple. Tan pronto como después de la primera administración del tratamiento, el día 4, se detectó un incremento significativo de granzima B en los grupos tratados con muPD1-IL2v en comparación con todos los demás grupos. También se observó una tendencia al incremento en el área de marcador de granzima B en todos los demás grupos terapéuticos sometidos a prueba, pero no fue significativa. Por tanto, la figura 25A y 25B muestran que PD1-IL2v provocó un incremento en el área positiva para granzima B en el tumor pancreático 4 días después del primer tratamiento en comparación con todos los grupos.
Tabla 7. Área positiva para granzima B.
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La figura 26A y 26B y la tabla 8 presentan los resultados de imágenes inmunohistoquímicas de tumores de páncreas teñidos para anti-PD1 de ratón (figura 26A) y el análisis de cuantificación de células positivas para PD1 (figura 26B). La tinción inmunohistoquímica de células PD1 se realizó en tumores de páncreas de ratón Black 6 derivados de los grupos de tratamiento indicados. Se prepararon muestras de tejido para la tinción inmunohistoquímica: se recogieron los tumores de los animales después de la administración del tratamiento, se fijaron en formol al 10 % (Sigma, Alemania) y más tarde se procesaron para FFPET (Leica 1020, Alemania). Posteriormente se cortaron cortes en parafina de 4 jm en un micrótomo (Leica RM2235, Alemania). La inmunohistoquímica de PD1 de ratón se realizó con anti-PD1 de ratón (Serotec, Alemania) en el sistema de tinción automática Leica (Leica ST5010, Alemania) siguiendo los protocolos del fabricante. Se obtuvieron las imágenes con el escáner Olympus. La cuantificación de células positivas para muPD1 se realizó con el programa informático Definiens (Definiens, Alemania). Las estadísticas se analizaron por ANOVA unifactorial con pruebas de comparación múltiple. Tan pronto como después de la primera administración del tratamiento, el día 4, se detectó un incremento significativo en el número de células positivas para PD1 en los grupos tratados con muPD1-IL2v en comparación con todos los demás grupos. También se observó una tendencia al incremento de células positivas para PD1 en todos los demás grupos terapéuticos sometidos a prueba, pero no fue significativa. Por tanto, la figura 26A y 26B muestran que PD1-IL2v provocó un incremento de células positivas para PD1 en el tumor pancreático 4 días después del primer tratamiento en comparación con todos los grupos.
Tabla 8. Células positivas para PD1.
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Ejemplo 7
Efecto del suministro de IL-2v a linfocitos T específicos de virus agotados a través del bloqueo de PD-1
La expresión de PD-1 se ha descrito por primera vez en linfocitos T específicos de virus agotados como resultado de la exposición prolongada a antígenos víricos y se ha asociado con la incapacidad de los linfocitos T para aumentar una respuesta antivírica eficaz. Los linfocitos T CD4 específicos de virus que pueden secretar simultáneamente IL-2 e IFN-y confieren protección contra la reactivación vírica en infecciones crónicas. De hecho, el distintivo polifuncional de los linfocitos T CD4 se ha asociado con el control vírico en individuos sanos infectados por citomegalovirus (CMV), virus de Epstein-Barr (VEB) y virus del herpes simple (VHS), así como en aquellos individuos infectados con el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), que permanecen sin síntomas durante varios años.
Por lo tanto, en el contexto de las infecciones víricas crónicas, se desarrolló un ensayo in vitro para evaluar el efecto del direccionamiento a PD-1 para suministrar una versión mutada de IL-2 (IL-2v) a los linfocitos T específicos de antígeno disfuncionales. Para evitar restricciones en la cantidad de donantes adecuados para este ensayo, se optó por una proteína vírica inmunógena de CMV (pp65) como antígeno de recuperación para los linfocitos T dado que aproximadamente un 80 % de la población es seropositiva para CMV. Por consiguiente, se estimularon leucocitos monomorfonucleares en la sangre periférica (PBMC) de donantes humanos sanos con CMV-pp65 (Miltenyi) en presencia de las presentes construcciones a la concentración de 10 |jg/ml. 43 horas más tarde, se bloqueó el transporte de proteínas del aparato de Golgi añadiendo Golgi Plug (BD Bioscience, brefeldin A) y Golgi Stop (BD Bioscience, monensina) y se incubaron las células a 37 °C durante 5 horas adicionales. A continuación, se lavaron las células, se tiñeron en la superficie con anticuerpos anti-CD3, CD4, CD8, CD62L y CD45RO humanos antes de fijarse/permeabilizarse con el conjunto de tampones de tinción del factor de transcripción FoxP3 (eBioscience). Finalmente, se realizó una tinción intracelular para IL-2, IFN-y y Ki67 (todos de eBioscience) para medir la proliferación celular.
La figura 27 muestra la capacidad de los linfocitos T CD4 para secretar IL-2 (A), IL-2 e IFN-y (B) o IFN-y (C) y para proliferar (D) tras 48 horas de recuperación con proteína inmunógena pp65 de CMV en presencia de anti-PD-1 solo, en combinación con IL-2v o bien como proteína de fusión. Se observó una tendencia en la capacidad de PD1-IL2v para incrementar las frecuencias de linfocitos T CD4 polifuncionales que pueden secretar conjuntamente IL-2 e IFN-y (figura 21B), y un incremento significativo en la población secretora única de IFN-y (figura 21C), en comparación con las muestras tratadas con pp65 y anti-PD1. Por el contrario, la combinación de pp65 e IL-2v no diana (DP47-IL2v) incrementó las frecuencias de los linfocitos T CD4 monofuncionales para IL-2 (figura 21 A). Como se esperaba, todas las células tratadas con IL-2v dirigida o no dirigida proliferaron como se indica por la positividad para la tinción con Ki67.
La figura 28 muestra el estado de diferenciación, según la expresión de CD45RO y CD62L, de linfocitos T CD4 específicos de virus que secretan IFN-y tras 48 horas de recuperación con proteína inmunógena pp65 de CMV en presencia de anti-PD-1 solo, en combinación con IL-2v o bien como proteína de fusión. Una caracterización del fenotipo de los linfocitos T CD4 específicos de virus secretores de IFN-y expandidos (figura 22) reveló un perfil de memoria efectora (CD45RO+CD62L-). Se puede concluir que el suministro de IL-2v a linfocitos T CD4 específicos de CMV agotados a través de la proteína de fusión PD1-IL2v da como resultado la expansión de una población específica de virus protectora de larga duración caracterizada por un perfil de memoria diferenciado y la capacidad de secretar tanto IL-2 como IFN-y.
Ejemplo 8
Ejemplo 8A. Activación celular de los donantes 1 y 2 (ensayo pSTAT5)
Se sembraron PBMC recién aisladas de donantes sanos en medio tibio (RPMI1640, FCS al 10 %, glutamina 2 mM) en una placa de fondo redondo de 96 pocilios (200.000 células/pocillo). Se centrifugaron las placas a 300 g durante 10 min y se retiró el sobrenadante. Se volvieron a suspender las células en 50 |jl de medio que contenía las moléculas de IL2 y se estimularon durante 20 min a 37 °C. Para preservar el estado de fosforilación, se fijaron de inmediato las células después de la estimulación con la misma cantidad de tampón Cytofix precalentado (554655, BD Bioscience) durante 10 min a 37 °C. Después de esto, se centrifugaron las placas durante 10 min a 300 g y se retiró el sobrenadante. Para permitir la tinción intracelular, se permeabilizaron las células en 200 j l de tampón Phosflow Perm III (558050, b D Bioscience) durante 30 min a 4 °C. A continuación, se lavaron las células dos veces con 150 j l de tampón de FACS frío y se dividieron en dos placas de fondo redondo de 96 pocillos y se tiñeron cada una con 20 j l de la mezcla de anticuerpos I o II durante 60 min en el frigorífico. La mezcla de anticuerpos I se usó para teñir pSTAT5 en linfocitos T CD4 y linfocitos T reguladoras y la mezcla de anticuerpos II se usó para teñir pSTAT5 en linfocitos T CD8 y linfocitos NK. Después de esto, se lavaron las células dos veces con tampón de FACS y se volvieron a suspender en 200 |jl de tampón de FACS que contenía PFA al 2 % por pocillo. Se realizó el análisis usando un citómetro de flujo BD Fortessa.
Se usaron las mezclas de anticuerpos de FACS de acuerdo con la tabla 9 y la tabla 10.
Tabla 9. Mezcla de anticuerpos de FACS I (linfocitos T CD4 y linfocitos T reguladores)
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Tabla 10. Mezcla de anticuerpos de FACS II (linfocitos T CD8 y linfocitos NK)
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La figura 29 muestra la fosforilación de STAT5 en linfocitos T CD8 (A), linfocitos NK (B), linfocitos T CD4 (C) y linfocitos T reguladores (D) tras el tratamiento de PBMC en reposo del donante 1 con PD1-IL2v, FAP-IL2v y FAP-IL2wt. Las tres moléculas sometidas a prueba son igualmente potentes en los linfocitos T CD8, los linfocitos NK y los linfocitos T CD4 (excluyendo los Treg). FAP-IL2wt es más potente para inducir la fosforilación de STAT5 en Treg seguido de PD1-IL2v. FAP-IL2v tiene la actividad más baja en Treg.
La figura 30 muestra la fosforilación de STAT5 en linfocitos T CD4 (A), linfocitos T CD8 (B), linfocitos T reguladores (C) y linfocitos NK (D) tras el tratamiento de PBMC en reposo del donante 2 con FAP-iL2v , PD1-IL2c, FAP-IL2wt y PD1-TIM3-IL2v. Las cuatro moléculas sometidas a prueba son comparablemente activas en los linfocitos T CD8, los linfocitos NK y los linfocitos T CD4 (excluyendo los Treg). FAP-IL2wt es más potente para inducir la fosforilación de STAT5 en Treg seguido de PD1-IL2v. FAP-IL2v tiene la actividad más baja en Treg.
Ejemplo 8B. Activación celular de los donantes 3 y 4 (ensayo pSTAT5)
Se descongelaron PBMC congeladas aisladas de donantes sanos y se cultivaron durante la noche a 37 °C. Al día siguiente, se sembraron las células en medio tibio (RPMI1640, f Cs al 10 %, glutamina 2 mM) en una placa de fondo redondo de 96 pocillos (200.000 células/pocillo). Se centrifugaron las placas a 300 g durante 10 min y se retiró el sobrenadante. Se volvieron a suspender las células en 50 j l de medio que contenía las moléculas de IL2 y se estimularon durante 20 min a 37 °C. Para preservar el estado de fosforilación, se fijaron de inmediato las células después de la estimulación con la misma cantidad de tampón Cytofix precalentado (554655, BD Bioscience) durante 10 min a 37 °C. Después de esto, se centrifugaron las placas durante 10 min a 300 g y se retiró el sobrenadante. Para permitir la tinción intracelular, se permeabilizaron las células en 200 j l de tampón Phosflow Perm III (558050, b D Bioscience) durante 30 min a 4 °C. A continuación, se lavaron las células dos veces con 150 j l de tampón de FACS frío y se dividieron en dos placas de fondo redondo de 96 pocillos y se tiñeron cada una con 20 j l de la mezcla de anticuerpos I o II durante 60 min en el frigorífico. La mezcla de anticuerpos I se usó para teñir pSTAT5 en linfocitos T CD4 y linfocitos T reguladoras y la mezcla de anticuerpos II se usó para teñir pSTAT5 en linfocitos T CD8 y linfocitos NK. Después de esto, se lavaron las células dos veces con tampón de FACS y se volvieron a suspender en 200 j l de tampón de FACS que contenía PFA al 2 % por pocillo. Se realizó el análisis usando un citómetro de flujo b D Fortessa. Se usaron las mezclas de anticuerpos de FACS de acuerdo con la tabla 11 y la tabla 12.
Tabla 11. Mezcla de anticuerpos de FACS I (linfocitos T CD4 y linfocitos T reguladores)
Figure imgf000064_0001
Tabla 12. Mezcla de anticuerpos de FACS II (linfocitos T CD8 y linfocitos NK)
Figure imgf000064_0002
La figura 31 muestra la fosforilación de STAT5 en linfocitos T CD8 (A), linfocitos NK (B), linfocitos T CD4 (C) y linfocitos T reguladores (D) tras el tratamiento de PBMC en reposo del donante 3 con FAP-IL2v, PD1-IL2v, FAP-IL2wt, PD1-TIM3-IL2v. Las cuatro moléculas sometidas a prueba son comparablemente activas en los linfocitos T CD8, los linfocitos NK y los linfocitos T CD4 (excluyendo los Treg). FAp-IL2wt es más potente para inducir la fosforilación de STAT5 en Treg seguido de PD1-IL2v. FAP-IL2v tiene la actividad más baja en Treg.
La figura 32 muestra la fosforilación de STAT5 en linfocitos T CD8 (A), linfocitos NK (B), linfocitos T CD4 (C) y linfocitos T reguladores (D) tras el tratamiento de PBMC en reposo del donante 4 con FAP-IL2v, PD1-IL2v, FAP-IL2wt, PD1-TIM3-IL2v. Las cuatro moléculas sometidas a prueba son comparablemente activas en los linfocitos T CD8, los linfocitos NK y los linfocitos T CD4 (excluyendo los Treg). FAp-IL2wt es más potente para inducir la fosforilación de STAT5 en Treg seguido de PD1-IL2v. FAP-IL2v tiene la actividad más baja en Treg.
Aunque la invención anterior se ha descrito con cierto detalle a modo de ilustración y ejemplo con propósitos de claridad de entendimiento, las descripciones y ejemplos no se deben interpretar como limitantes del alcance de la invención, que se define por las reivindicaciones adjuntas.

Claims (29)

REIVINDICACIONES
1. Un inmunoconjugado que comprende (i) un anticuerpo que se une a PD-1 y (ii) un polipéptido de IL-2 mutante,
en el que el polipéptido de IL-2 mutante es un polipéptido de IL-2 humana que comprende las sustituciones aminoacídicas F42A, Y45A y L72G, siendo la numeración relativa a la secuencia de IL-2 humana SEQ ID NO: 19.
2. Un inmunoconjugado de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el polipéptido de IL-2 es un polipéptido de IL-2 mutante,
en el que el polipéptido de IL-2 mutante es una molécula de IL-2 humana que comprende las sustituciones aminoacídicas F42A, Y45A y L72G, siendo la numeración relativa a la secuencia de IL-2 humana SEQ ID NO: 19; y
en el que el anticuerpo comprende (a) una región variable de la cadena pesada (VH) que comprende una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 y una FR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 en las posiciones 71-73 de acuerdo con la numeración de Kabat, y (b) una región variable de la cadena ligera (VL) que comprende una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 y una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6.
3. Un inmunoconjugado de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el polipéptido de IL-2 es un polipéptido de IL-2 mutante,
en el que el polipéptido de IL-2 mutante es una molécula de IL-2 humana que comprende las sustituciones aminoacídicas F42A, Y45A y L72G, siendo la numeración relativa a la secuencia de IL-2 humana SEQ ID NO: 19; y
en el que el anticuerpo comprende (a) una región variable de la cadena pesada (VH) que comprende una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8, una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 y una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, y (b) una región variable de la cadena ligera (VL) que comprende una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11, una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12 y una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13.
4. Un inmunoconjugado de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el polipéptido de IL-2 es un polipéptido de IL-2 mutante,
en el que el polipéptido de IL-2 mutante es una molécula de IL-2 humana que comprende las sustituciones aminoacídicas F42A, Y45A y L72G, siendo la numeración relativa a la secuencia de IL-2 humana SEQ ID NO: 19; y
en el que el anticuerpo comprende (a) una región variable de la cadena pesada (VH) que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14, y (b) una región variable de la cadena ligera (VL) que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17 y SEQ ID NO: 18.
5. El inmunoconjugado de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el polipéptido de IL-2 mutante comprende además la sustitución aminoacídica T3A y/o la sustitución aminoacídica C125A.
6. El inmunoconjugado de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el polipéptido de IL-2 mutante comprende la secuencia de SEQ ID NO: 20.
7. El inmunoconjugado de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el inmunoconjugado comprende no más de un polipéptido de IL-2 mutante.
8. El inmunoconjugado de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el anticuerpo comprende un dominio Fc compuesto por una primera y una segunda subunidad.
9. El inmunoconjugado de la reivindicación 8, en el que el dominio Fc es un dominio Fc de clase IgG, en particular una subclase IgG1.
10. El inmunoconjugado de la reivindicación 8 o 9, en el que el dominio Fc es un dominio Fc humano.
11. El inmunoconjugado de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que el anticuerpo es una inmunoglobulina de clase IgG, en particular una subclase IgG1.
12. El inmunoconjugado de una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11, en el que el dominio Fc comprende una modificación que promueve la asociación de la primera y la segunda subunidad del dominio Fc.
13. El inmunoconjugado de una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 12, en el que en el dominio CH3 de la primera subunidad del dominio Fc se reemplaza un residuo aminoacídico por un residuo aminoacídico que tiene un volumen de cadena lateral más grande, generando de este modo una protuberancia dentro del dominio CH3 de la primera subunidad que se puede situar en una cavidad dentro del dominio CH3 de la segunda subunidad, y en el dominio CH3 de la segunda subunidad del dominio Fc se reemplaza un residuo aminoacídico por un residuo aminoacídico que tiene un volumen de cadena lateral más pequeño, generando de este modo una cavidad dentro del dominio c H3 de la segunda subunidad dentro de la que se puede situar la protuberancia dentro del dominio CH3 de la primera subunidad.
14. El inmunoconjugado de una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 13, en el que en la primera subunidad del dominio Fc, el residuo de treonina en la posición 366 se reemplaza por un residuo de triptófano (T366W), y en la segunda subunidad del dominio Fc, el residuo de tirosina en la posición 407 se reemplaza por un residuo de valina (Y407V) y, opcionalmente, el residuo de treonina en la posición 366 se reemplaza por un residuo de serina (T366S) y el residuo de leucina en la posición 368 se reemplaza por un residuo de alanina (L368A), siendo la numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat.
15. El inmunoconjugado de la reivindicación 14, en el que en la primera subunidad del dominio Fc, adicionalmente, el residuo de serina en la posición 354 se reemplaza por un residuo de cisteína (S354C) o el residuo de ácido glutámico en la posición 356 se reemplaza por un residuo de cisteína (E356C), y en la segunda subunidad del dominio Fc, adicionalmente, el residuo de tirosina en la posición 349 se reemplaza por un residuo de cisteína (Y349C), siendo la numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat.
16. El inmunoconjugado de una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 15, en el que el polipéptido de IL-2 mutante se fusiona en su aminoácido aminoterminal con el aminoácido carboxiterminal de una de las subunidades del dominio Fc, en particular, la primera subunidad del dominio Fc, opcionalmente a través de un péptido conector.
17. El inmunoconjugado de la reivindicación 16, en el que el péptido conector tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 21.
18. El inmunoconjugado de una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 16, en el que el dominio Fc comprende una o más sustituciones aminoacídicas que reducen la unión a un receptor de Fc, en particular un receptor de Fcy, y/o la función efectora, en particular la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC).
19. El inmunoconjugado de la reivindicación 18, en el que dichas una o más sustituciones aminoacídicas son en una o más posiciones seleccionadas del grupo de L234, L235 y P329, siendo la numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat.
20. El inmunoconjugado de una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 19, en el que cada subunidad del dominio Fc comprende las sustituciones aminoacídicas L234A, L235A y P329G, siendo la numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat.
21. El inmunoconjugado de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, que comprende un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de SEQ ID NO: 22, un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de SEQ ID NO: 23 o SEQ ID NO: 24, y un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de SEQ ID NO: 25.
22. El inmunoconjugado de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21, que consiste esencialmente en un polipéptido de IL-2 mutante y una molécula de inmunoglobulina IgG1, unidos por una secuencia conectora.
23. Uno o más polinucleótidos aislados que codifican el inmunoconjugado de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22.
24. Uno o más vectores, en particular un vector de expresión, que comprenden el/los polinucleótido(s) de la reivindicación 23.
25. Una célula huésped que comprende el/los polinucleótido(s) de la reivindicación 23 o el/los vector(es) de la reivindicación 24.
26. Un procedimiento de producción de un inmunoconjugado que comprende un polipéptido de IL-2 mutante y un anticuerpo que se une a PD-1, que comprende (a) cultivar la célula huésped de la reivindicación 25 en condiciones adecuadas para la expresión del inmunoconjugado y, opcionalmente, (b) recuperar el inmunoconjugado.
27. Una composición farmacéutica que comprende el inmunoconjugado de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
28. El inmunoconjugado de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22 para su uso como medicamento.
29. El inmunoconjugado de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22 para su uso en el tratamiento de una enfermedad, en el que dicha enfermedad es cáncer.
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