CN111742219A - 用于新颖靶抗原结合模块的特异性测定法 - Google Patents

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Abstract

本发明一般性涉及使用细胞培养物的特异性测定法,特别是用于测试不同型式的新颖靶抗原结合模块的嵌合抗原受体(CAR)表达性报告T(CAR‑T)细胞测定法。而且,本发明涉及用改造的CAR转染/转导的报告CAR‑T细胞的用途,该改造的CAR能够特异性结合包含标签的识别域。

Description

用于新颖靶抗原结合模块的特异性测定法
发明领域
本发明一般性涉及使用细胞培养物的特异性测定法,特别是用于测试不同型式的新颖靶抗原结合模块的嵌合抗原受体(CAR)表达性报告T(CAR-T)细胞测定法。而且,本发明涉及用改造的CAR转染/转导的报告CAR-T细胞的用途,该改造的CAR能够特异性结合包含标签的识别域。
发明背景
在过去15年里,基于抗体的疗法得到发展,现在在血液学恶性和实体瘤的治疗中代表化疗办法的有价值组合或备选。与化疗不一样,抗体疗法靶向癌细胞上的特定抗原,因而容许更加定点的治疗,由此降低对健康组织的副作用。在开发基于抗体的治疗性试剂的过程中,需要各种测定法来鉴定最好的候选,带入临床试验中并最终推向市场。在第一个早期临床前阶段中,不得不生成抗体并分析它们的靶物特异性,以及它们对靶物的亲和力。
可以使用各种蛋白质-蛋白质相互作用测定法来分析结合特性,诸如基于FRET的方法,表面等离振子共振(SPR)或荧光激活细胞分选(FACS)。然而,可用的测定法型式可能并不总是全面且综合地再现体内情况。例如,用结合细胞表面受体的治疗性抗体靶向癌细胞可能在多个水平上具有影响,例如经由结合和交联表面分子的细胞内信号传导以及标记肿瘤细胞以啮合免疫细胞。而且,自抗原结合至建立效应器功能(例如T细胞细胞毒性)的识别级联需要一系列精心编排的细胞表面相互作用,其中抗原结合模块的结合亲和力是数个因素中的一个。因此,虽然这些测定法对于早期候选开发是非常有价值的工具,但是单纯的蛋白质-蛋白质亲和相互作用测定法可能并不提供完整图片。
仍然需要开发确实在更加全面的设置中提供体内相互作用的有意义预测,尽可能将对靶物-抗体结合的非特异性影响最小化的结合测定法。
本发明的发明人开发了一种新颖的测定法,其适用于极其多种不同癌细胞类型以评估抗体对它们的靶物的结合。该创新的测定法包括经修饰的T细胞作为报告细胞,组合直截了当的读出与全面且包容的结果。
而且,本发明提供组合抗体和抗体样构建物(例如配体)的结合和功能性的评估的测定法。该新颖的测定法例如对于治疗性抗体药物候选的筛选或表征目的是有用的,即以高通量型式。
这种新的测定法代表一种有价值的工具,用于结合天然靶物的抗体的早期和晚期阶段筛选和表征和评估功能性,会容许在药物候选的开发中鉴定最好的结合物。
发明概述
本发明一般性涉及一种用于评估和选择新颖抗原结合模块的方法,特别是在药物开发过程中,而且组合对(例如肿瘤细胞上的)靶抗原的结合的测定与T细胞响应抗体-靶物结合的激活。本文中提供的是一种用于评估能够特异性结合靶抗原的靶抗原结合模块的特异性的方法,方法包含下述步骤:
a)提供包含抗原结合域和识别域的抗原结合分子,其中抗原结合域包含靶抗原结合模块,且其中识别域包含标签；
b)使抗原结合分子与在表面上包含靶抗原的靶细胞接触,特别是其中靶细胞是癌细胞；
c)使抗原结合分子与嵌合抗原受体(CAR)表达性报告T(CAR-T)细胞接触,其中报告CAR-T细胞包含:
i.能够特异性结合包含标签的识别域的CAR,其中CAR与应答元件可操作偶联；
ii.在应答元件控制下的报告基因；和
d)通过测量报告基因的表达来测定T细胞激活以建立靶抗原结合模块的特异性。
在一个实施方案中,抗原结合分子是IgG类抗体,特别是IgG1或IgG4同种型抗体,或其片段。
在一个实施方案中,抗原结合域是Fab片段且识别域是Fc域。
在一个实施方案中,抗原结合域和识别域是相同的域,特别是Fab片段。
在一个实施方案中,标签是半抗原分子。
在一个实施方案中,半抗原分子是洋地黄毒苷(DIG)。
在一个实施方案中,标签是多肽标签。
在一个实施方案中,多肽标签选自由myc标签,HA标签,Avi标签,FLAG标签,His标签,GCN4标签和NE标签组成的组。
在一个实施方案中,靶抗原结合模块是Fab片段,特别是自噬菌体展示文库筛选衍生的Fab片段。
在一个实施方案中,靶抗原结合模块对靶抗原的结合和报告CAR-T细胞对包含靶抗原结合模块的抗原结合分子的结合导致报告基因的表达。
在一个实施方案中,靶抗原是细胞表面抗原或受体。
在一个实施方案中,靶抗原是与人主要组织相容性复合物(MHC)的分子结合的肽。
在一个实施方案中,靶抗原结合模块是T细胞受体样(TCRL)抗原结合模块。
在一个实施方案中,提供的是一种包含锚定跨膜域和包含抗原结合模块的胞外域的嵌合抗原受体(CAR),其中抗原结合模块能够特异性结合包含标签的识别域但不能够特异性结合不包含标签的识别域。
在一个实施方案中,抗原结合模块是scFv,Fab,交叉Fab或scFab,特别是Fab或交叉Fab。
在一个实施方案中,标签是半抗原。
在一个实施方案中,半抗原分子是洋地黄毒苷(DIG)。
在一个实施方案中,标签是多肽标签。
在一个实施方案中,多肽标签选自由myc标签,HA标签,Avi标签,FLAG标签,His标签,GCN4标签和NE标签组成的组。
附图简述
图1描绘依照本发明使用的例示性抗原结合受体(CAR)的构造。图1A显示scFv型式的构造。能够特异性结合识别域的抗原结合模块由可变重(VH)和可变轻(VL)链组成。附着于VL链,Gly4Ser接头连接抗原识别域与CD28跨膜域(TM),其融合至CD28的细胞内共刺激性信号传导域(CSD),其继而融合至CD3z的刺激性信号传导域(SSD)。图1B和1C显示Fab(图1B)和交叉Fab(图1C)型式的构造。抗原结合模块由Ig重链和Ig轻链组成。附着于重链,Gly4Ser接头连接抗原识别域与CD28跨膜域,其融合至CD28的细胞内共刺激性信号传导域,其继而融合至CD3z的刺激性信号传导域。
图2描绘示意图,图示依照本发明使用的CAR的例示性表达构建物的模块构成。图2A描绘scFv型式。图2B描绘Fab型式。图2C描绘交叉Fab型式。
图3描绘洋地黄毒苷(DIG)分子的结构式。
图4描绘能受到抗洋地黄毒苷CAR特异性识别的例示性洋地黄毒苷化IgG1分子。
图5描绘受到抗洋地黄毒苷CAR识别的备选洋地黄毒苷化抗原结合分子。在这个实施方案中,靶抗原结合域和识别域是同一域,即洋地黄毒苷半抗原标签偶联至抗原结合域,其中抗原结合域还发挥识别域的功能。图5A描绘能受到抗洋地黄毒苷CAR识别的洋地黄毒苷化Fab分子。图5B描绘能受到抗洋地黄毒苷CAR识别的洋地黄毒苷化scFv分子。
图6描绘确认抗CD20靶向性抗体GA101的成功洋地黄毒苷化的Western印迹。通过Western印迹分析通过抗洋地黄毒苷-AP Fab片段检测洋地黄毒苷化。
图7描绘Jurkat NFAT报告细胞上的抗洋地黄毒苷-ds-scFv的表面检测。
图8描绘Jurkat NFAT报告CAR-T细胞测定法的示意图。靶抗原结合的在Fc(识别域)处洋地黄毒苷化的IgG能受到抗洋地黄毒苷CAR表达性Jurkat NFAT报告T细胞识别。这种识别导致能通过测量萤光素酶发光(CPS/RLU)来检测的细胞的激活。
图9描绘Jurkat NFAT报告CAR-T细胞测定法,使用CD20表达性SUDHDL4肿瘤细胞作为靶细胞和用10倍摩尔过量的洋地黄毒苷-3-O-甲基羰基-e-氨基己酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯洋地黄毒苷化的抗CD20 IgG抗体(GA101)。抗体一方面识别肿瘤相关抗原且另一方面受到Jurkat NFAT报告CAR-T细胞识别。使用抗洋地黄毒苷-ds-scFv-CD28ATDCD28CSD-CD3zSSD表达性Jurkat NFAT报告CAR-T细胞的分选集合作为效应细胞。
图10描绘抗洋地黄毒苷-ds-scFv-CD28ATDCD28CSD-CD3zSSD表达性Jurkat NFAT报告CAR-T细胞的激活。激活依赖于偶联有不同量的洋地黄毒苷分子的抗CD20 IgG抗体(GA101)。
图11描绘使用CD20表达性SUDHDL4肿瘤细胞作为靶细胞的Jurkat NFAT报告CAR-T细胞测定法。使用平均用大约一个洋地黄毒苷在Fc处洋地黄毒苷化的抗CD20 IgG抗体(GA101)(等摩尔Dig-NHS:抗体比)分子。抗体一方面识别肿瘤相关抗原且另一方面受到Jurkat NFAT报告CAR-T细胞识别。使用抗洋地黄毒苷-ds-scFv-CD28ATDCD28CSD-CD3zSSD表达性Jurkat NFAT报告CAR-T细胞的分选集合作为效应细胞。
图12描绘使用桥接生物素-洋地黄毒苷衔接头的备选Jurkat NFAT报告CAR-T细胞测定法的示意图。经由生物素结合模块与Fc域结合的生物素-洋地黄毒苷衔接头形成这种设置中的识别域。洋地黄毒苷模块能受到抗洋地黄毒苷CAR表达性Jurkat NFAT报告CAR-T细胞识别。
图13描绘使用MCF7细胞作为靶细胞的Jurkat NFAT报告CAR-T细胞测定法。使用抗LeY/生物素抗体和桥接生物素-洋地黄毒苷衔接头。抗体一方面识别肿瘤相关抗原(LeY)且另一方面识别衔接头分子的生物素。衔接头结合的洋地黄毒苷受到Jurkat NFAT报告CAR-T细胞识别。使用抗洋地黄毒苷-ds-scFv-CD28ATDCD28CSD-CD3zSSD表达性Jurkat NFAT报告CAR-T细胞的分选集合作为效应细胞。作为阴性对照,使用非靶向性生物素偶联的抗CD33抗体。
发明详述
定义
“亲和力”指分子(例如抗体或CAR)的单一结合位点与其结合配偶体(例如配体)之间非共价相互作用总和的强度。除非另外指示,如本文中使用的,“结合亲和力”指反映结合对的成员(例如抗原结合模块和抗原和/或受体及其配体)之间1:1相互作用的固有结合亲和力。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可以以解离常数(KD)来表述,其为解离与结合速率常数(分别为K解离和K结合)的比率。如此,相等的亲和力可能包含不同的速率常数,只要速率常数的比率保持相同。亲和力可以通过本领域知道的确立方法来测量,包括本文中描述的那些方法。用于测量亲和力的一种优选方法是表面等离振子共振(SPR)且用于测量的优选温度是25℃。
术语“氨基酸”(“aa”)指天然发生的和合成的氨基酸,以及以与天然发生氨基酸相似的方式发挥功能的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然发生氨基酸是那些由遗传密码编码的,以及那些稍后修饰的氨基酸,例如羟脯氨酸,γ-羧基谷氨酸,和O-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物指具有与天然发生氨基酸相同的基础化学结构(即结合氢,羧基基团,氨基基团,和R基团的α-碳)的化合物,例如高丝氨酸,正亮氨酸,甲硫氨酸亚砜,甲硫氨酸甲基锍。此类类似物具有经过修饰的R基团(例如正亮氨酸)或经过修饰的肽主链,但是保留与天然发生氨基酸相同的基础化学结构。氨基酸模拟物指具有与氨基酸的一般化学结构不同的结构,但以与天然发生氨基酸相似的方式发挥功能的化学化合物。氨基酸在本文中可以通过由IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的它们的公知的三字母符号或一字母符号来提及。
如本文中使用的,术语“氨基酸突变”意为涵盖氨基酸替代,缺失,***和修饰。可以进行取代,缺失,***和修饰的任意组合来实现最终构建体,只要最终构建体拥有期望的特性。氨基酸序列缺失和***包括氨基和/或羧基端缺失和氨基酸***。具体的氨基酸突变是氨基酸替代。氨基酸替代包括由非天然存在的氨基酸或由20种标准氨基酸的天然存在的氨基酸衍生物(例如4-羟脯氨酸,3-甲基组氨酸,鸟氨酸,高丝氨酸,5-羟赖氨酸)替换。可以使用本领域中公知的遗传或化学方法生成氨基酸突变。遗传方法可以包括定点诱变,PCR,基因合成等。涵盖的是通过与遗传工程化不同的方法如化学修饰来改变氨基酸侧链基团的方法也可能可用。
术语“抗体”在本文中以最广义使用且涵盖各种抗体结构,包括但不限于单克隆抗体,多克隆抗体和抗体片段,只要它们展现出期望的抗原结合活性。因而,在本发明的语境中,术语抗体涉及完整免疫球蛋白分子以及此类免疫球蛋白分子的部分。而且,如本文中讨论的,该术语涉及经过修饰和/或改变的抗体分子,特别是经修饰抗体分子。该术语还涉及重组或合成生成的/合成的抗体。在本发明的语境中,术语抗体与术语免疫球蛋白可互换使用。
“抗体片段”指完整抗体外的分子,其包含完整抗体中结合与完整抗体结合的抗原的一部分。抗体片段的例子包括但不限于Fv,Fab,交换Fab,Fab’,Fab’-SH,F(ab’)2,双抗体,线性抗体,单域抗体,单链抗体分子(例如scFv,scFab),和单域抗体。对于某些抗体片段的综述,参见Hudson等,Nat Med 9,129-134(2003)。对于scFv片段的综述,参见例如Plückthun,于The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,vol.113,Rosenburg和Moore编,Springer-Verlag,New York,pp.269-315(1994)；亦参见WO 93/16185；和美国专利No.5,571,894和5,587,458。双抗体是具有两个抗原结合位点的抗体片段,其可以是二价或双特异性的。参见例如EP 404,097；WO 1993/01161；Hudson等,Nat Med 9,129-134(2003)；和Hollinger等,Proc Natl Acad Sci USA 90,6444-6448(1993)。三抗体和四抗体也记载于Hudson等,Nat Med 9,129-134(2003)。单域抗体是包含抗体的整个或部分重链可变域,或整个或部分轻链可变域的抗体片段(Domantis,Inc.,Waltham,MA；参见例如美国专利No.6,248,516 B1)。可以通过各种技术来制备抗体片段,包括但不限于对完整抗体的蛋白水解消化以及通过重组宿主细胞(例如大肠杆菌或噬菌体)产生,如本文中描述的。
如本文中使用的,术语“抗原结合分子”在其最广义上指特异性结合抗原性决定簇的分子。抗原结合分子的例子是抗体/免疫球蛋白及其衍生物,例如其片段。而且,如本文中讨论的,该术语涉及经过修饰和/或改变的抗原结合分子,特别是经修饰抗体分子。该术语还涉及重组或合成生成的/合成的抗体。在本发明的语境中,抗原结合分子优选是抗体或其片段。
如本文中使用的,术语“抗原结合模块”指特异性结合抗原性决定簇的多肽分子。在一个实施方案中,抗原结合模块能够将与其附接的实体(例如免疫球蛋白或CAR)引导至靶部位,例如至特定类型的肿瘤细胞或携有抗原性决定簇的肿瘤基质或至结合肿瘤细胞上的抗原性决定簇的免疫球蛋白。在另一个实施方案中,抗原结合模块能够经由其靶抗原来激活信号传导,例如在抗原性决定簇结合T细胞上的CAR后激活信号传导。在本发明的语境中,抗原结合模块可以包括在如本文中另外定义的抗体及其片段以及抗原结合受体(例如CAR)及其片段中。抗原结合模块包括抗原结合域,例如包含免疫球蛋白重链可变区和免疫球蛋白轻链可变区。
在本发明的语境中,术语“抗原结合受体”涉及包含锚定跨膜域和包含至少一个抗原结合模块的胞外域的分子。抗原结合受体(例如CAR)可以由来自不同来源的各多肽部分构成。因而,它还可以理解为“融合蛋白”和/或“嵌合蛋白”。通常,融合蛋白是经由连接最初编码分开的蛋白质的两个或更多个基因(或优选cDNA)创建的蛋白质。这种融合基因(或融合cDNA)的翻译产生单一多肽,优选具有自每种原始蛋白质衍生的功能特性。重组融合蛋白是为了在生物学研究或治疗中使用通过重组DNA技术人工创建的。在本发明的语境中,CAR(嵌合抗原受体)理解为如下抗原结合受体,其包含包含抗原结合模块的胞外部分,胞外部分通过间隔物序列融合锚定跨膜域,锚定跨膜域自身融合例如CD3z和CD28的胞内信号传导域。
“抗原结合位点”指抗原结合分子上提供与抗原相互作用的位点,即一个或多个氨基酸残基。天然的免疫球蛋白分子通常具有两个抗原结合位点,Fab或scFv分子通常具有单个抗原结合位点。
术语“抗原结合域”指包含特异性结合部分或整个抗原且与其互补的区域的抗体或抗原结合受体(例如CAR)部分。抗原结合域可由例如一个或多个免疫球蛋白可变域(也称为可变区)提供。具体地,抗原结合域包含免疫球蛋白轻链可变区(VL)和免疫球蛋白重链可变区(VH)。
术语“可变区”或“可变域”指免疫球蛋白重链或轻链中牵涉结合抗原的域。天然抗体的重链和轻链的可变域(分别为VH和VL)一般具有类似的结构,每个域包含4个保守的框架区(FR)和3个高变区(HVR)。参见例如Kindt等,Kuby Immunology,第6版,W.H.Freemanand Co.,第91页(2007)。单个VH或VL域通常足以赋予抗原结合特异性。
如本文中使用,术语“ATD”指“锚定跨膜域”,其定义能够在细胞的细胞膜中整合的多肽段。ATD可以融合别的胞外和/或胞内多肽域,其中这些胞外和/或胞内多肽域也会约束于细胞膜。在如本发明中使用的抗原结合受体的语境中,ATD对抗原结合受体,例如依照本发明使用的CAR赋予膜附着和约束。
如依照本发明使用的抗原结合受体(例如CAR)的语境中使用的,术语“结合”限定“抗原相互作用位点”和抗原彼此的结合(相互作用)。术语“抗原相互作用位点”限定多肽中显示与一种或一组特定抗原的特异性相互作用能力的基序。所述结合/相互作用还理解为限定“特异性识别”。依照此发明的术语“特异性识别”意味着抗原结合受体能够与如本文中限定的识别域,即修饰分子特异性相互作用和/或结合,而不识别非修饰分子。抗原结合受体(例如CAR)的抗原结合模块能识别,相互作用和/或结合相同分子上的不同表位。此术语涉及抗原结合受体的特异性,即它在如本文中限定的经修饰分子,即经修饰Fc域的特定区域之间区分的能力。抗原相互作用位点与它的特定抗原的特异性相互作用可导致信号的启动,例如由于诱导包含抗原的多肽的构象的变化,包含抗原的多肽的寡聚化,抗原结合受体的寡聚化,等。如此,作为它们的一级,二级或三级结构的结果以及所述结构的二级修饰的结果,抗原相互作用位点和抗原的氨基酸序列中的特定基序彼此结合。术语结合不仅涉及线性表位而且还可涉及由靶分子或其部分的两个区域组成的构象表位,结构表位或不连续表位。在此发明的语境中,构象表位通过在一级序列中分开的,当多肽折叠成天然蛋白质时在分子的表面上来到一起的两个或更多个离散氨基酸序列来定义(Sela,Science 166(1969),1365和Laver,Cell 61(1990),553-536)。而且,术语“结合”在本发明的语境中与术语“相互作用”可互换使用。CAR的抗原结合模块(例如Fab或scFv域)或抗体结合特定靶抗原性决定簇的能力可以经由酶联免疫吸附测定法(ELISA)或本领域技术人员熟悉的其它技术,例如表面等离振子共振(SPR)技术(在BIAcore仪器上分析)(Liljeblad et al.,GlycoJ 17,323-329(2000))和传统的结合测定法(Heeley,Endocr Res 28,217-229(2002))测量。在一个实施方案中,抗原结合模块结合无关蛋白质的程度小于抗原结合模块对靶抗原的结合的约10％,如特别通过SPR测量的。在某些实施方案中,结合靶抗原的抗原结合模块具有≤1μM,≤100nM,≤10nM,≤1nM,≤0.1nM,≤0.01nM,或≤0.001nM(例如10-8M或更小,例如10-8M至10-13M,例如10-9M至10-13M)的解离常数(KD)。如依照本发明使用的,术语“特异性结合”意味着在本发明中使用的分子并不与相似结构的(多)肽,即未修饰Fc域交叉反应或实质***叉反应。因而,依照本发明使用的抗原结合受体(例如该CAR)与识别域,例如Fc域,优选经修饰Fc域特异性结合/相互作用。可测试一组处于调查中的构建物的交叉反应性,例如通过评估一组抗原结合模块在常规条件(见例如Harlow and Lane,Antibodies:ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,(1988)和UsingAntibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,(1999))下对感兴趣识别域,例如经修饰Fc域以及亲本未非修饰Fc域的结合。只有那些结合感兴趣域但并不或本质上并不结合结构密切相关的域,例如未修饰Fc域的构建物(即Fab片段,scFv等等)认为是对感兴趣识别域特异性的且选择用于依照本文中提供的方法的别的研究。这些方法可格外包含结合研究,与结构上和/或功能上密切相关的域的阻断和竞争研究。结合研究还包含FACS分析,表面等离振子共振(SPR,例如用BIAcore),分析性超速离心,等温滴定热量测定术,荧光各向异性,荧光光谱术或放射性标记的配体结合测定法。
如本文中采用的,术语“CDR”涉及“互补决定区”,其是本领域公知的。CDR是免疫球蛋白或抗原结合受体中决定所述分子的特异性且与特定配体接触的部分。CDR是分子中最可变的部分且对这些分子的抗原结合多样性有贡献。每个V域中有三个CDR区,CDR1,CDR2和CDR3。CDR-H描绘可变重链的CDR区,而CDR-L涉及可变轻链的CDR区。VH意味着可变重链而VL意味着可变轻链。Ig衍生区的CDR区可以如“Kabat”(Sequences of Proteins ofImmunological Interest”,5th edit.NIH Publication no.91-3242 U.S.Department ofHealth and Human Services(1991)；Chothia J.Mol.Biol.196(1987),901-917)或“Chothia”(Nature 342(1989),877-883)中所述确定。
术语“CD3z”指T细胞表面糖蛋白CD3泽塔(ζ)链,还称作“T-细胞受体T3泽塔链”和“CD247”。
术语“嵌合抗原受体”或“嵌合受体”或“CAR”指如下构成的抗原结合受体:抗原结合模块(例如scFv或Fab)的胞外部分,通过间隔物序列融合至胞内信号传导域(例如CD3z和CD28的)。
抗体或免疫球蛋白的“类”指其重链拥有的恒定域或恒定区的类型。抗体有5种主要的类:IgA,IgD,IgE,IgG和IgM,并且这些中数种可以进一步分成亚类(同种型),例如IgG1,IgG2,IgG3,IgG4,IgA1和IgA2。对应于不同免疫球蛋白类的重链恒定域分别称为α,δ,ε,γ和μ。
“交换Fab分子”(亦称为“交叉Fab”或“交换Fab片段”)意指其中交换Fab重链和轻链的可变区或恒定区的Fab分子,即交叉Fab片段包含由轻链可变区和重链恒定区构成的肽链,和由重链可变区和轻链恒定区构成的肽链。为了清楚,在其中交换Fab轻链和Fab重链的可变区的交叉Fab片段中,包含重链恒定区的肽链在本文中称为交换Fab分子的重链。相反,在其中交换Fab轻链和Fab重链的恒定区的交叉Fab片段中,包含重链可变区的肽链在本文中称为交叉Fab片段的重链。因而,交叉Fab片段包含由重链可变和轻链恒定区构成的重或轻链(VH-CL),和由轻链可变和重链恒定区构成的重或轻链(VL-CH1)。与之相反,“Fab”或“常规Fab分子”意指处于它的天然型式的Fab分子,即包含由重链可变和恒定区构成的重链(VH-CH1),和由轻链可变和恒定区构成的轻链(VL-CL)。
如本文中使用的,术语“CSD”指共刺激性信号传导域。
术语“效应器功能”指那些可归于抗体Fc区且随抗体同种型而变化的生物学活性。抗体效应器功能的例子包括:C1q结合和补体依赖性细胞毒性(CDC),Fc受体结合,抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC),抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP),细胞因子分泌,免疫复合物介导的抗原呈递细胞的抗原摄取,细胞表面受体(例如B细胞受体)下调和B细胞活化。
如本文中使用的,术语“工程化”或“改造”视为包括对肽主链的任何操作或对天然存在或重组的多肽或其片段的翻译后修饰。工程化或改造包括对氨基酸序列,糖基化模式或各氨基酸侧链基团的修饰,以及这些办法的组合。
术语“表达盒”指重组或合成生成的,具有一系列允许特定核酸在靶细胞中转录的指定核酸元件的多核苷酸。可以将重组表达盒掺入质粒,染色体,线粒体DNA,质体DNA,病毒或核酸片段中。通常,表达载体的重组表达盒部分包含要转录的核酸序列和启动子等序列。
“Fab分子”指由抗原结合分子的重链VH和CH1域(“Fab重链”)和轻链VL和CL域(“Fab轻链”)组成的蛋白质。
本文中术语“Fc域”或“Fc区”用于定义免疫球蛋白重链中至少含有恒定区的一部分的C端区域。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。虽然IgG重链的Fc区的边界可以略微变化,但是人IgG重链Fc区通常定义为自Cys226或Pro230延伸至重链的羧基端。然而,可以存在或不存在Fc区的C端赖氨酸(Lys447)。除非本文中另外指定,Fc区或恒定区中氨基酸残基的编号方式依照“EU编号***”,也称为EU索引,如记载于Kabat等,Sequences ofProteins of Immunological Interest,第5版Public Health Service,NationalInstitutes of Health,Bethesda,MD,1991的。如本文中使用的,Fc域的亚基指形成二聚体Fc域的两个多肽之一,即包含免疫球蛋白重链中能够稳定自身联合的C端恒定区的多肽。例如,IgG Fc域的亚基包含IgG CH2和IgG CH3恒定域。
“框架”或“FR”指除高变区(HVR)残基外的可变域残基。可变域的FR一般由4个FR域组成:FR1,FR2,FR3和FR4。因而,HVR和FR序列一般以下列顺序出现在VH(或VL)中:FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
术语“全长抗体”表示由两条“全长抗体重链”和两条“全长抗体轻链”组成的抗体。“全长抗体重链”是以N端至C端方向由抗体重链可变域(VH),抗体恒定重链域1(CH1),抗体铰链区(HR),抗体重链恒定域2(CH2),和抗体重链恒定域3(CH3)(缩写为VH-CH1-HR-CH2-CH3)；和在亚类IgE的抗体的情况中任选的抗体重链恒定域4(CH4)组成的多肽。优选地,“全长抗体重链”是以N端至C端方向由VH,CH1,HR,CH2和CH3组成的多肽。“全长抗体轻链”是以N端至C端方向由抗体轻链可变域(VL)和抗体轻链恒定域(CL)(缩写为VL-CL)组成的多肽。抗体轻链恒定域(CL)可以是κ(卡帕)或λ(拉姆达)。两条全长抗体链经由CL域和CH1域之间的和全长抗体重链的铰链区之间的多肽间二硫键连接到一起。典型的全长抗体的例子是天然抗体,像IgG(例如IgG1和IgG2),IgM,IgA,IgD,和IgE。依照本发明使用的全长抗体可来自单一物种,例如人,或者它们可以是嵌合化或人源化抗体。在一些实施方案中,依照本发明使用的全长抗体包含两个抗原结合位点,每个由一对VH和VL形成,均特异性结合相同抗原。在又一些实施方案中,依照本发明使用的全长抗体包含两个抗原结合位点,每个由一对VH和VL形成,其中两个抗原结合位点结合不同抗原,例如其中抗体是双特异性的。所述全长抗体的重或轻链的C端表示所述重或轻链的C端处的最后一个氨基酸。
“融合”意指组分(例如Fab和跨膜域)直接地或经由一种或多种肽接头通过肽键连接。
术语“宿主细胞”,“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可交换使用并指已引入外源核酸的细胞,包括此类细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“经转化的细胞”,其包括初始转化的细胞和自其衍生的后代(不考虑传代数)。后代在核酸内含物上可能与亲本细胞不完全相同,但可以含有突变。本文中包括具有如原始转化细胞中筛选或选择的相同的功能或生物学活性的突变体后代。宿主细胞是能用于生成依照本发明使用的抗体的任何类型的细胞***。宿主细胞包括培养的细胞,例如哺乳动物培养细胞如CHO细胞,BHK细胞,NS0细胞,SP2/0细胞,YO骨髓瘤细胞,P3X63小鼠骨髓瘤细胞,PER细胞,PER.C6细胞或杂交瘤细胞,酵母细胞,昆虫细胞和植物细胞等,而且还包括在转基因动物,转基因植物或培养的植物或动物组织中包含的细胞。
如本文中使用的,术语“高变区”或“HVR”指抗体可变域中序列中高度可变和/或形成结构上定义的环(“高变环”)的每个区域。通常,天然的四链抗体包含六个HVR；三个在VH中(H1,H2,H3),三个在VL中(L1,L2,L3)。HVR一般包含来自高变环和/或来自互补性决定区(CDR)的氨基酸残基,后者具有最高序列变异性和/或涉及抗原识别。除了VH中CDR1外,CDR一般包含形成高变环的氨基酸残基。高变区(HVR)也称为互补性决定区(CDR),并且在述及形成抗原结合区的可变区部分时,这些术语在本文中可交换使用。此特定区域已由Kabat等,U.S.Dept.of Health and Human Services,Sequences of Proteins ofImmunological Interest(1983)及由Chothia等,J Mol Biol 196:901-917(1987)描述,其中定义包括在彼此比较时氨基酸残基的重叠或子集。然而,应用任一种定义来指抗体和/或抗原结合受体或其变体的CDR意图在如本文中定义和使用的术语的范围内。涵盖如由上文引用的每篇参考文献定义的CDR的适宜的氨基酸残基在下表1中列出作为比较。涵盖特定CDR的确切残基数将随着CDR的序列和大小而变化。鉴于抗体的可变区氨基酸序列,本领域技术人员可以常规确定哪些残基构成特定CDR。
表1:CDR定义1
CDR Kabat Chothia AbM<sup>2</sup>
V<sub>H</sub> CDR1 31-35 26-32 26-35
V<sub>H</sub> CDR2 50-65 52-58 50-58
V<sub>H</sub> CDR3 95-102 95-102 95-102
V<sub>L</sub> CDR1 24-34 26-32 24-34
V<sub>L</sub> CDR2 50-56 50-52 50-56
V<sub>L</sub> CDR3 89-97 91-96 89-97
1表1中所有CDR定义的编号方式依照由Kabat等提出的编号惯例(见下文)。
2如表1中使用的具有小写字母“b”的“AbM”指由Oxford Molecular的“AbM”抗体建模软件定义的CDR。
Kabat等还定义针对可变区序列的编号***,其可应用于任何抗体。本领域的普通技术人员可以明确地将此Kabat编号***归入任何可变区序列,不依赖于序列本身外的任何实验数据。如本文中使用的,“Kabat编号方式”指由Kabat等,U.S.Dept.of Health andHuman Services,“Sequence of Proteins of Immunological Interest”(1983)提出的编号***。除非另外说明,提及抗原结合模块可变区中特定氨基酸残基位置的编号方式依照Kabat编号***。序列表的多肽序列并不依照Kabat编号***编号。然而,本领域中普通技术人员完全能将序列表的序列编号方式转变成Kabat编号方式。
“个体”或“受试者”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯养的动物(例如牛,绵羊,猫,犬和马),灵长类(例如人和非人灵长类如猴),家兔和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。具体地,所述个体或受试者是人。
“分离的核酸”分子或多核苷酸意指已从其天然环境取出的核酸分子,DNA或RNA。例如,就本发明目的而言,包含在载体中的编码多肽的重组多核苷酸被视为分离的。分离的多核苷酸的别的例子包括在异源宿主细胞中保持的重组多核苷酸或溶液中的(部分或基本上)纯化的多核苷酸。分离的多核苷酸包括在普遍含有该多核苷酸分子的细胞中含有的多核苷酸分子,但该多核苷酸分子存在于染色体外或在不同于其天然染色***置的染色***置处。分离的RNA分子包括本发明的体内或体外RNA转录本,以及正链和负链形式,和双链形式。依照本发明的分离的多核苷酸或核酸还包括合成生成的此类分子。另外,多核苷酸或核酸可以为或可以包括调节元件如启动子,核糖体结合位点或转录终止子。
与本发明的参照核苷酸序列具有至少例如95％“相同的”核苷酸序列的核酸或多核苷酸意指该多核苷酸的核苷酸序列与参照序列相同,只不过按照参照核苷酸序列的每100个核苷酸,该多核苷酸序列可以包含多达5处点突变。换言之,为了获得与参照核苷酸序列具有至少95％相同的核苷酸序列的多核苷酸,可以删除或用另一种核苷酸取代参照序列中高达5％的核苷酸,或者可以将占参照序列中总核苷酸的高达5％的数目的核苷酸***到参照序列中。参照序列的这些变更可以发生在参照核苷酸序列的5’或3’端位置或那些末端位置之间的任何地方,个别分散在参照序列中的残基间或分散在参照序列内的一或多个连续组中。作为一个实际问题,可以使用已知的计算机程序,如下文针对多肽论述的程序(例如ALIGN-2)来常规确定任何特定的多核苷酸序列是否与本发明的核苷酸序列为至少80％,85％,90％,95％,96％,97％,98％或99％相同。
“分离的多肽”或其变体或衍生物意图为不处于其天然环境中的多肽。不需要特定水平的纯化。例如,分离的多肽可以是从其天然或自然环境中取出。就本发明目的而言,在宿主细胞中表达的重组生成的多肽和蛋白质被视为分离的,已通过任何合适的技术分开,分级,或部分或基本上纯化的天然的或重组的多肽也是如此。
关于参照多肽序列的“百分比(％)氨基酸序列同一性”定义为在比对序列并在必要时引入缺口以获取最大百分比序列同一性后,且不将任何保守性取代视为序列同一性的一部分时,候选序列中与参照多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。为测定百分比氨基酸序列同一性目的比对可以以本领域技术范围内的多种方式进行,例如使用公众可得到的计算机软件,如BLAST,BLAST-2,ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可决定用于比对序列的适宜参数,包括在比较序列的全长里获得最大比对需要的任何算法。然而,就本文中目的而言,使用序列比较计算机程序ALIGN-2来生成％氨基酸序列同一性值。ALIGN-2序列比较计算机程序由Genentech,Inc.创作,并且源代码已与用户文档一起提交到美国版权局(U.S.Copyright Office),Washington D.C.,20559,其在美国版权注册No.TXU510087下注册。ALIGN-2程序可从Genentech,Inc.,South San Francisco,California公开获得,或可从源代码汇编。ALIGN-2程序应当汇编用于UNIX操作***,包括数字UNIX V4.0D。所有序列比较参数均由ALIGN-2程序设定且不改变。在采用ALIGN-2进行氨基酸序列比较的情况下,给定的氨基酸序列A对/与/相对给定的氨基酸序列B的％氨基酸序列同一性(或其可以用短语表示为对/与/相对给定的氨基酸序列B具有或包含特定％氨基酸序列同一性的给定氨基酸序列A)如下计算:
分数X/Y的100倍；
其中X是由序列比对程序ALIGN-2在所述程序对A和B的比对中评为相同匹配的氨基酸残基数,而其中Y是B中氨基酸残基的总数。会领会的是,当氨基酸序列A的长度不等于氨基酸序列B的长度时,A对B的％氨基酸序列同一性将不等于B对A的％氨基酸序列同一性。除非另外明确说明,本文中使用的所有％氨基酸序列同一性值如在上一段中描述的那样使用ALIGN-2计算机程序获得。
术语“核酸分子”涉及多核苷酸包含的包含嘌呤和嘧啶碱基的碱基序列,由此所述碱基代表核酸分子的一级结构。在本文中,术语核酸分子包括DNA,cDNA,基因组DNA,RNA,合成形式的DNA和包含两种或更多种这些分子的混合聚合物。另外,术语核酸分子包括有义和反义链二者。而且,本文中描述的核酸分子可以含有非天然的或衍生化的核苷酸碱基,正如本领域技术人员会容易领会的。
如本文中使用的,“NFAT”指“激活的T细胞的核因子”且是在大多数免疫细胞中表达的一个转录因子家族。NFAT家族的转录因子的激活依赖于钙信号传导。例如,经由T细胞突触的T细胞激活导致钙流入。升高的细胞内钙水平激活钙敏感性磷酸酶,钙依赖磷酸酶,其迅速使NFAT蛋白的氨基端中的富丝氨酸区(SRR)和SP重复脱磷酸化。这导致暴露核定位信号的构象变化,促进NFAT核输入和靶基因激活。
如本文中使用的,“NFAT途径”指导致对NFAT转录因子家族的成员的活性的调控的刺激。NFAT DNA元件是本领域已知的且在本文中还称作“NFAT途径的应答元件”。因此,“NFAT途径的受体”指能触发对NFAT的活性的调控的受体。“NFAT途径的受体”的例子是例如T细胞受体和B细胞受体。
如本文中使用的,“NF-κB”指“激活的B细胞的核因子卡帕轻链增强子”且是牵涉调节编码凋亡,病毒复制,肿瘤发生,各种自身免疫性疾病和炎症应答的介导物的许多基因的转录因子。NFκB存在于几乎所有真核细胞中。一般地,它以无活性状态位于胞质溶胶中,因为它与抑制性κB(IκB)蛋白形成复合物。经由配体与整合膜受体(还称作“NF-κB途径的受体”)的结合,IκB激酶(IKK)得到激活。IKK是由两个激酶和一个调节亚基组成的酶复合物。这种复合物磷酸化IκB蛋白,其导致那些蛋白质遍在蛋白化和因此被蛋白酶体降解。最后,游离的NFκB处于活性状态,易位至核并结合κB DNA元件并诱导靶基因转录。
如本文中使用的,“NF-κB途径”指导致对NF-κB的活性的调控的刺激。例如,Toll样受体信号传导,TNF受体信号传导,T细胞受体和B细胞受体信号传导经由配体或抗体的结合的激活导致NF-κB的激活。随后,磷酸化的NF-κB二聚体结合κB DNA元件并诱导靶基因转录。κB DNA元件是本领域已知的且在本文中还称作“NF-κB途径的应答元件”。因此,“NF-κB途径的受体”指能触发对NF-κB的活性的调控的受体。“NF-κB途径的受体”的例子是Toll样受体,TNF受体,T细胞受体和B细胞受体。
如本文中使用的,“AP-1”指“激活蛋白1”且是牵涉包括分化,增殖,和凋亡在内的一些细胞过程的转录因子。AP-1功能依赖于对AP-1二聚体有贡献的特定Fos和Jun亚基。AP-1结合回文DNA基序(5’-TGA G/C TCA-3’)以调节基因表达。
术语“药物组合物”指其形式使得容许其中含有的活性成分的生物学活性有效,且不含对会接受配制剂施用的受试者有不可接受的毒性的别的成分的制剂。药物组合物通常包含一种或多种药学可接受载体。
“药学可接受载体”指药物组合物中活性成分以外对受试者无毒的成分。药学可接受载体包括但不限于缓冲剂,赋形剂,稳定剂或防腐剂。
如本文中使用的,术语“多肽”指由通过酰胺键(也称为肽键)线性连接的单体(氨基酸)构成的分子。术语多肽指具有两个或更多个氨基酸的任何链,并且不指特定长度的产物。如此,肽,二肽,三肽,寡肽,蛋白质,氨基酸链或任何其它用于指两个或更多个氨基酸的链的术语均包括在多肽的定义中,而且术语多肽可以代替这些术语中任一个或与其交换使用。术语多肽还意图指多肽的表达后修饰的产物,包括但不限于糖基化,乙酰化,磷酸化,酰化,通过已知的保护性/封闭性基团衍生化,蛋白水解切割,或通过非天然存在的氨基酸的修饰。多肽可以自天然的生物学来源衍生或通过重组技术生成,但不必从指定的核酸序列翻译。它可以以任何方式来生成,包括通过化学合成。本发明的多肽大小可以是约3个或更多,5个或更多,10个或更多,20个或更多,25个或更多,50个或更多,75个或更多,100个或更多,200个或更多,500个或更多,1,000个或更多,或2,000个或更多氨基酸。多肽可以具有限定的三维结构,尽管它们不必具有此类结构。具有限定的三维结构的多肽被称为折叠的,而不具有限定的三维结构而可以采用大量不同构象的多肽被称为未折叠的。
术语“多核苷酸”指分离的核酸分子或构建体,例如信使RNA(mRNA),病毒衍生的RNA或质粒DNA(pDNA)。多核苷酸可以包含常规的磷酸二酯键或非常规的键(例如酰胺键,如在肽核酸(PNA)中发现的)。术语核酸分子指任何一种或多种存在于多核苷酸中的核酸区段,例如DNA或RNA片段。
术语“具有固有荧光的蛋白质”指能够经由蛋白质内的内部氨基酸的环化和氧化或经由酶促添加荧光辅因子而形成高度发荧光的,固有发色团的蛋白质。术语“具有固有荧光的蛋白质”包括野生型荧光蛋白和展现改变的光谱或物理特性的突变体。该术语不包括仅仅凭借蛋白质内的非修饰的酪氨酸,色氨酸,组氨酸和苯丙氨酸基团的荧光贡献而展现弱荧光的蛋白质。具有固有荧光的蛋白质是本领域已知的,例如绿色荧光蛋白(GFP),红色荧光蛋白(RFP),蓝色荧光蛋白(BFP,Heim et al.1994,1996),称作CFP的青色荧光变体(Heim et al.1996；Tsien 1998)；称作YFP的黄色荧光变体(Ormo et al.1996；Wachter etal.1998)；称作Sapphire的紫色可激发绿色荧光变体(Tsien 1998；Zapata-Hommer etal.2003)；和称作增强型绿色荧光蛋白或EGFP的青色可激发绿色荧光变体(Yang etal.1996),而且可以例如通过活细胞成像(例如Incucyte)或荧光分光光度法来测量。
“降低的结合”指相应相互作用的亲和力降低,如例如通过SPR测量的。为了清楚,该术语还包括亲和力降低至0(或低于分析方法的检测限),即完全消除相互作用。相反,“升高的结合”指相应相互作用的结合亲和力升高。
术语“调节序列”指实现与它们连接的编码序列表达所必需的DNA序列。此类控制序列的性质随生物体而不同。在原核生物中,控制序列一般包括启动子,核糖体结合位点,和终止子。在真核生物中,控制序列一般包括启动子,终止子和一些情况中的增强子,反式激活子(transactivator)或转录因子。术语“控制序列”意图最低限度包括其存在是表达所必需的所有成分,而且还可以包括另外的有利成分。
如本文中使用的,“报告基因”意味着其表达可以测定的基因。在一个优选的实施方案中,“报告基因”是编码使用其生成和检测作为替代品来间接检测要测试的抗体或配体的活性的蛋白质的基因。报告蛋白是由报告基因编码的蛋白质。优选地,报告基因编码其催化活性可以通过简单的测定方法来检测的酶或具有诸如固有荧光或发光等特性,使得报告基因的表达可以在需要最低限度的样品制备的简单且快速的测定法中检测的蛋白质。其催化活性可以检测的酶的非限制性例子是萤光素酶,β-半乳糖苷酶,碱性磷酸酶。萤光素酶是具有61kDa的分子量(MW)的单体酶。它起催化剂的作用且能够在三磷酸腺苷(ATP)和Mg2+存在下将D-萤光素转变成萤光素腺苷酸。另外,作为副产物生成焦磷酸(PPi)和腺苷单磷酸(AMP)。然后将中间体萤光素腺苷酸氧化成氧化萤光素,二氧化碳(CO2)和光。氧化萤光素是生物发光产物,能通过自反应释放的光在发光计中定量测量。萤光素酶报告测定法可商购且是本领域已知的,例如萤光素酶1000测定***和ONE-GloTM萤光素酶测定***。
“应答元件”指在某种转录因子结合时可激活或沉默的特定转录因子结合元件,或顺式作用元件。在一个实施方案中,应答元件是位于在转录因子结合时驱动报告基因表达的最小限度启动子(例如TATA盒启动子)上游的顺式作用增强子元件。
如本文中使用的,术语“单链”指包含通过肽键线性连接的氨基酸单体的分子。在某些实施方案中,抗原结合模块之一是scFv片段,即通过肽接头连接的VH域和VL域。在某些实施方案中,抗原结合模块之一是单链Fab分子,即其中通过肽接头连接Fab轻链和Fab重链以形成单一肽链的Fab分子。在一个具体的此类实施方案中,在单链Fab分子中Fab轻链的C端连接于Fab重链的N端。
如本文中使用的,术语“SSD”指刺激性信号传导域。
如本文中使用的,“治疗/处理”(及其语法变体)指试图改变治疗个体中疾病的自然进程,并且可以是为了预防或在临床病理学的过程期间实施的临床干预。治疗的期望效果包括但不限于预防疾病的发生或复发,缓解症状,降低疾病的任何直接或间接病理学后果,预防转移,减缓疾病进展率,改善或减轻疾病状态,及消退或改善的预后。
在本发明的语境中,术语“标签”指附着或嫁接至生物分子,诸如蛋白质,特别是抗原结合分子或到其上的分子。标签的功能是标记或标志“带标签的”蛋白质(例如免疫球蛋白或其片段),使得它能受到能够结合该标签但不能够结合不带标签的蛋白质的特定抗原结合模块识别。该术语与“分子标签”同义且包含但不限于荧光标签,蛋白质标签,亲和标签,增溶标签,层析标签,表位标签和小分子标签,诸如半抗原标签。可以将小分子标签(例如半抗原)共价或非共价化学偶联至生物分子,而“蛋白质标签”或“多肽标签”是能遗传嫁接到蛋白质上且随后受到能够结合标签但不能够结合不带标签的蛋白质的特定抗原结合模块识别的肽序列。半抗原标签在附着于载体蛋白质时能够引发免疫应答,且因此适合于生成能够识别载体,诸如蛋白质上的标签的特定抗原结合模块。在本发明的优选的实施方案中,标签是半抗原标签或多肽标签。
如本文中使用的,术语“靶抗原性决定簇”与“靶抗原”,“靶表位”和“靶细胞抗原”同义,并且指多肽大分子上与抗体结合,从而形成抗原结合模块-抗原复合物的位点(例如氨基酸的连续区段或由不连续氨基酸的不同区构成的构象性构造)。可用的抗原性决定簇可以在例如肿瘤细胞表面上,病毒感染的细胞的表面上,其它患病细胞的表面上,免疫细胞的表面上,游离在血液血清中和/或在胞外基质(ECM)中找到。除非另外指示,本文中称为抗原的蛋白质(例如CD20,CD38,CD138,CEA,EGFR,FolR1,HER2,LeY,MCSP,STEAP1,TYRP,和WT1)可以是来自任何脊椎动物来源,包括哺乳动物如灵长类(例如人)和啮齿类(例如小鼠和大鼠)的任何天然形式的蛋白质。在一个具体的实施方案中,靶抗原是人蛋白。在对本文中的特定靶蛋白质进行提述的情况下,该术语涵盖“全长”,未加工的靶蛋白质以及起因于靶细胞中加工的靶蛋白质的任何形式。该术语还涵盖靶蛋白质的天然存在变体,例如剪接变体或等位变体。可用作抗原的例示性人靶蛋白包括但不限于:CD20,CD38,CD138,CEA,EGFR,FolR1,HER2,LeY,MCSP,STEAP1,TYRP,和WT1。
抗体可以具有一个,两个,三个或更多个结合域且可以是单特异性的,双特异性的或多特异性的。抗体可以是来自单一物种的全长,或是嵌合化的或人源化的。对于具有多于两个抗原结合域的抗体,一些结合域可以是相同的和/或具有相同的特异性。
如本文中使用的,“T细胞活化”指T淋巴细胞,特别是细胞毒性T淋巴细胞的一种或多种细胞应答,其选自:增殖,分化,细胞因子分泌,细胞毒性效应分子释放,细胞毒性活性和活化标志物的表达。合适的测量T细胞活化的测定法是本领域已知的和本文中描述的。
依照本发明,术语“T细胞受体”或“TCR”是本领域普遍知道的。特别是,本文中术语“T细胞受体”指任何T细胞受体,前提是满足下面的三项标准:(i)肿瘤特异性,(ii)识别(大多数)肿瘤细胞,这意味着抗原或靶物应当在(大多数)肿瘤细胞中表达,和(iii)TCR与要治疗的受试者的HLA型匹配。在此语境中,满足上文所述三项标准的合适的T细胞受体是本领域已知的,诸如识别NY-ESO-1(序列信息见例如PCT/GB2005/001924)和/或HER2neu(序列信息见WO-A1 2011/0280894)的受体。主要组织相容性复合物(MHC)I类分子将来自内源抗原的肽呈递至CD8+细胞毒性T细胞,而且因此,MHC肽复合物是免疫治疗办法的合适靶物。可以通过重组T细胞受体(TCR)靶向MHC肽复合物。然而,大多数TCR可能具有对于免疫疗法而言太低的亲和力,而具有TCR特异性的高亲和力结合模块会是有益的。为此目的,可以例如通过生成噬菌体展示文库(例如组合文库)和筛选此类文库来生成具有TCR样特异性的高亲和力可溶性抗体分子,如本文中进一步描述的。如本文中描述的具有TCR样特异性的这些可溶性抗原结合模块(例如scFv或Fab)称作“T细胞受体样抗原结合模块”或“TCRL抗原结合模块”。
药剂例如药物组合物的“治疗有效量”指有效实现期望的治疗或预防结果的量(以必要的剂量且持续必要的时间)。治疗有效量的药剂例如消除,降低,延迟,最小化或预防疾病的不良作用。
术语“载体”或“表达载体”与“表达构建体”同义,并指用于在靶细胞中导入与其可操作联合的特定基因及指导其表达的DNA分子。该术语包括作为自主复制核酸结构的载体以及掺入到已经接受其导入的宿主细胞的基因组中的载体。本发明的表达载体包含表达盒。表达载体允许转录大量稳定的mRNA。一旦表达载体在靶细胞内,就通过细胞转录和/或翻译装置生成由基因编码的核糖核酸分子或蛋白质。在一个实施方案中,本发明的表达载体包含表达盒,其包含编码本发明的抗原结合受体或其片段的多核苷酸序列。
在此语境中,本文中提供的是用于选择新颖靶抗原结合模块的方法,特别是体外方法,用于进一步的开发,其依照它们的特异性,特别是关于接触靶细胞后报告细胞(例如T细胞)的激活。在本文中描述的方法和测定法中,靶抗原结合模块介导靶细胞(特别是癌细胞)和报告细胞(特别是T细胞)之间的接触。在此语境中,如本文中描述的方法对于依照结合靶物(例如癌细胞上的)的特异性和效应细胞(例如T细胞)的激活选择候选靶抗原结合模块是有用的。
因而,在一个实施方案中,提供的是用于评估能够特异性结合靶抗原的靶抗原结合模块的特异性的方法,该方法包含下述步骤:
a)提供包含抗原结合域和识别域的抗原结合分子,其中该抗原结合域包含该靶抗原结合模块,且其中该识别域包含标签；
b)使该抗原结合分子与在表面上包含该靶抗原的靶细胞接触,特别是其中该靶细胞是癌细胞；
c)使该抗原结合分子与嵌合抗原受体(CAR)表达性报告T(CAR-T)细胞接触,其中该报告CAR-T细胞包含:
i)能够特异性结合该包含标签的识别域的CAR,其中该CAR与应答元件可操作偶联；
ii)在该应答元件控制下的报告基因；和
d)通过测量该报告基因的表达来测定T细胞激活以建立该靶抗原结合模块的特异性。
在此语境中,关于本发明的方法进一步描述和使用的是能够特异性结合包含(候选)靶抗原结合模块的抗原结合分子的识别域的抗原结合受体(例如CAR)。识别域可以是能够稳定折叠成能通过分子标签,例如半抗原标签或多肽标签来标记的蛋白域的任何多肽域。在某些实施方案中,识别域是免疫球蛋白域。免疫球蛋白典型地包含能够稳定折叠的可变和恒定域,其中可变域赋予免疫球蛋白分子针对靶抗原的特异性。因而,可变域是免疫球蛋白中具有最高程度的序列变异的部分。另一方面,恒定域是同类免疫球蛋白中变异最少的部分且因此在本发明的语境中特别适合于作为用于本发明的方法的识别域。然而,尽可能缩小抗原结合分子的尺寸也可能是有利的,在此类实施方案中,赋予对靶抗原的特异性的免疫球蛋白的可变域也能发挥识别域的功能,即,抗原结合域和识别域可以是同一域,例如,可以偶联可变域与例如半抗原标签或多肽标签,或者,偶联半抗原标签与Fab片段的恒定区。
包含(新颖)靶抗原结合模块的抗原结合分子优选是IgG类抗体,特别是IgG1或IgG4同种型抗体,或其片段。然而,抗原结合分子可以是任何类的免疫球蛋白或其它抗原结合蛋白,只要它能够为包含靶抗原结合模块和识别域的抗原结合域提供稳定的支架。在一个实施方案中,抗原结合分子包含Fc域,特别是IgG Fc区,最特别是IgG1 Fc区。在一个优选实施方案中,抗原结合分子包含经修饰Fc区,特别是包含供CAR特异性识别的标签(例如半抗原标签或多肽标签)的Fc区。在此类实施方案中,依照本发明使用的CAR能够特异性结合经修饰Fc区,即包含标签的Fc区。
在另一个实施方案中,抗原结合分子包含Fab域,特别是IgG Fab域,最特别是IgG1Fab域。在一个优选实施方案中,抗原结合分子包含经修饰Fab域,特别是包含供CAR特异性识别的标签(例如半抗原标签或多肽标签)的Fab域。在例示性实施方案中,包含靶抗原结合模块和识别域的抗原结合域是相同的域且依照本发明使用的CAR能够特异性结合经修饰Fab域,即包含标签的Fab域。
本发明进一步描述T细胞,诸如CD8+ T细胞,CD4+ T细胞,CD3+ T细胞,γδT细胞或天然杀伤(NK)T细胞和永生化细胞系,例如Jurkat细胞的转导和用途,用于引入如本文中描述的报告***和如本文中描述的CAR和它们通过包含靶抗原结合模块和识别域,优选Fc域或Fab域,例如如本文中描述的经修饰(带标签的)Fc域或Fab片段的抗原结合分子的靶向募集和激活。在一个实施方案中,抗原结合分子,例如带标签的IgG1抗体或带标签的Fab片段能够特异性结合天然存在于靶细胞,例如癌细胞的表面上的肿瘤特异性抗原。
在包含靶抗原结合模块(例如自噬菌体展示筛选衍生的)的抗原结合分子结合靶细胞和CAR结合识别域(例如带标签的IgG1抗体或带标签的Fab片段)后,报告CAR-T细胞变成激活的且报告基因表达。因此,在由针对靶抗原(例如肿瘤细胞上的)的抗原结合分子诱导的T细胞激活的背景中,报告基因的表达指示靶抗原结合模块的(特异性)结合。
本发明的办法具有胜过常规结合测定法的显著优点,因为不受理论束缚,如本文中描述的基于T细胞的体外方法更加密切地类似例如啮合T细胞的治疗性抗体(例如T细胞双特异性抗体)遭遇的体内情况。
因而,本发明提供一种通用筛选平台,其中可以使用包含靶抗原结合模块的抗体,特别是IgG型抗体来标记或标示靶细胞(例如肿瘤细胞)作为免疫细胞(例如T细胞)的指导,特别是其中通过包含靶抗原结合模块的抗体将T细胞特异性靶向肿瘤细胞。在CAR结合识别域上的标签和靶抗原结合模块结合肿瘤细胞的表面上的靶抗原之后,报告T细胞变成激活的,其中可以例如通过荧光或发光信号的读出来测量激活。通过容许使用多种多样新开发的靶抗原结合模块或共应用具有不同抗原特异性但包含相同识别域的多种抗体,该平台具有灵活性和特异性。
在某些实施方案中,靶抗原结合模块是常规Fab片段,即由Fab轻链和Fab重链组成的Fab分子。这种筛选型式的一项特定优点是直截了当整合新颖的文库衍生的靶抗原结合模块,无需改变型式,例如,可以以如本文中描述的Fab和/或交叉Fab抗原结合分子免疫球蛋白型式包括自筛选噬菌体展示文库衍生的Fab抗原结合物。因而,可以在用于筛选的抗体中包括自Fab展示噬菌体文库衍生的靶抗原结合模块,而不改变可能负面影响文库衍生结合物的结合特性的型式。在一个优选的实施方案中,靶抗原结合模块是Fab片段,特别是自噬菌体展示文库筛选衍生的Fab片段。在一个优选实施方案中,靶抗原结合模块是Fab片段,特别是自噬菌体展示文库筛选衍生的Fab片段。如上文指出的,此类实施方案具有不必将结合物的型式(Fab)自Fab片段(型式)噬菌体展示文库筛选贯穿特异性的评估和最终变成啮合T细胞的治疗性抗体(例如T细胞双特异性抗体)的优点。
在又一些实施方案中,靶抗原结合模块是交叉Fab片段,即由Fab轻链和Fab重链组成的Fab分子,其中Fab重和轻链的可变区或恒定区任一是交换的。
在本发明的语境中,CAR包含并不在T细胞中或上天然发生的胞外域。如此,CAR能够提供特制的对识别域,例如用于依照本发明的筛选的治疗性抗体型式的(经修饰)Fc域的结合特异性。用CAR转导且依照本发明使用的细胞,例如T细胞变成能够特异性结合识别域。对识别域的特异性由包含能够特异性结合识别域的抗原结合模块的CAR的胞外域提供。在一个优选实施方案中,识别域是可结晶片段(Fc)区。在具体实施方案中,识别域是IgG1或IgG4 Fc域。在一个实施方案中,识别域是人IgG1 Fc域。在又一些实施方案中,识别域是经修饰Fc域,例如包含标签。在此类实施方案中,如本文中描述的CAR能够特异性结合包含标签的识别域但不能够特异性结合不包含标签的识别域。
因而,本发明还涉及包含包含至少一个能够特异性结合经修饰Fc域的抗原结合模块的胞外域的CAR的用途,其中该至少一个抗原结合模块并不能够特异性结合非经修饰Fc域。在此类实施方案中,CAR能够特异性结合抗原结合分子,例如抗体的经修饰Fc域。在一个优选的实施方案中,经修饰Fc域包含与Fc域偶联的标签,例如半抗原标签或Fc域中包含的蛋白质标签。
CAR能够特异性结合包含标签的经修饰免疫球蛋白域但不能够特异性结合不包含标签的非经修饰亲本免疫球蛋白域,其中该修饰是引入半抗原标签或多肽标签。
在本发明的一个方面,本文中提供的是包含至少一个能够特异性结合经修饰免疫球蛋白域的抗原结合模块的CAR的用途。表达此类CAR的转导细胞,例如T细胞能够特异性结合抗原结合分子,即治疗性抗体的经修饰免疫球蛋白域。本发明格外提供一种直截了当的筛选平台来评估治疗上有意义的抗原结合分子型式的新颖靶抗原结合模块的特异性。依照本发明的方法在一种高通量测定法型式中整合已知的或潜在的效应细胞的激活级联的有关细胞和分子成分。
可以通过例如哺乳动物免疫***的免疫接种来生成能够特异性结合靶抗原,例如肿瘤抗原或识别域,例如经修饰Fc域的抗原结合模块。此类方法是本领域已知的且例如描述于Burns,Methods in Molecular Biology 295:1-12(2005)。或者,可以通过对组合文库筛选具有一种或多种期望活性的抗体来分离具有期望活性的抗原结合模块。用于筛选组合文库的方法综述于例如Lerner et al.,Nature Reviews 16:498-508(2016)。例如,多种方法是本领域已知的,用于生成噬菌体展示文库和对此类文库筛选拥有期望结合特征的抗原结合模块。此类方法综述于例如Frenzel et al.,mAbs 8:1177-1194(2016)；Bazan etal.,Human Vaccines and Immunotherapeutics 8:1817-1828(2012)和Zhao et al.,Critical Reviews in Biotechnology 36:276-289(2016)以及Hoogenboom et al.,Methods in Molecular Biology 178:1-37(O’Brien et al.,ed.,Human Press,Totowa,NJ,2001)且进一步描述于例如McCafferty et al.,Nature 348:552-554；Clackson etal.,Nature 352:624-628(1991)；Marks et al.,J.Mol.Biol.222:581-597(1992)和Marksand Bradbury in Methods in Molecular Biology 248:161-175(Lo,ed.,Human Press,Totowa,NJ,2003)；Sidhu et al.,J.Mol.Biol.338(2):299-310(2004)；Lee et al.,J.Mol.Biol.340(5):1073-1093(2004)；Fellouse,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(34):12467-12472(2004)；和Lee et al.,J.Immunol.Methods 284(1-2):119-132(2004)。在某些噬菌体展示方法中,通过聚合酶链式反应(PCR)分开克隆VH和VL基因的全集并在噬菌体文库中随机重组,然后能对其筛选抗原结合性噬菌体,如描述于Winter et al.,AnnualReview of Immunology 12:433-455(1994)。噬菌体典型地或是作为单链Fv(scFv)片段或是作为Fab片段展示抗体片段。来自经免疫来源的文库提供针对免疫原的高亲和力抗原结合模块,不需要构建杂交瘤。或者,可以(例如自人)克隆未免疫全集以提供针对广泛非自身,还有自身抗原的抗原结合模块的单一来源,无需任何免疫接种,如描述于Griffiths etal.,EMBO Journal 12:725-734(1993)。最后,还可以通过克隆来自干细胞的未重排V基因区段,和使用含有随机序列以编码高度可变的CDR3区和实现体外重排的PCR引物来合成生成未免疫文库,如描述于Hoogenboom and Winter,Journal of Molecular Biology 227:381-388(1992)。描述人抗体噬菌体文库的专利公开文本包括例如美国专利No.5,750,373；7,985,840；7,785,903和8,679,490以及美国专利公开文本No.2005/0079574,2007/0117126,2007/0237764,2007/0292936和2009/0002360。本领域已知的用于对组合文库筛选具有一种或多种期望活性的抗原结合模块的方法的别的例子包括核糖体和mRNA展示,以及用于细菌,哺乳动物细胞,昆虫细胞或酵母细胞上的抗体展示和选择的方法。用于酵母表面展示的方法综述于例如Scholler et al.,Methods in Molecular Biology 503:135-56(2012)和Cherf et al.,Methods in Molecular biology 1319:155-175(2015)以及Zhaoet al.,Methods in Molecular Biology 889:73-84(2012)。用于核糖体展示的方法描述于例如He et al.,Nucleic Acids Research 25:5132-5134(1997)和Hanes et al.,PNAS94:4937-4942(1997)。
在本发明的例示性实施方案中,作为概念证明,提供包含胞外域的CAR,胞外域包含至少一个抗原结合模块,其中该至少一个抗原结合模块能够特异性结合经修饰免疫球蛋白域(例如Fc域或Fab域)但不能够特异性结合非经修饰免疫球蛋白域,其中经修饰免疫球蛋白域包含半抗原标签或多肽标签。
在本发明的一个例示性实施方案中,作为概念证明,提供的是能够特异性结合包含半抗原标签洋地黄毒苷(DIG)的经修饰免疫球蛋白域的CAR。
在一个实施方案中,能够特异性结合包含半抗原标签DIG的免疫球蛋白域的CAR包含SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3的重链互补决定区(CDR)和SEQ ID NO:4,SEQID NO:5和SEQ ID NO:6的轻链CDR。
在一个优选实施方案中,能够特异性结合包含半抗原标签DIG的免疫球蛋白域的CAR包含重链可变区,其包含:
(a)重链互补决定区(CDR H)1氨基酸序列DYAMS(SEQ ID NO:1)；
(b)CDR H2氨基酸序列SINIGATYIYYADSVKG(SEQ ID NO:2)；
(c)CDR H3氨基酸序列PGSPYEYDKAYYSMAY(SEQ ID NO:3)；
和轻链可变区,其包含:
(d)轻链(CDR L)1氨基酸序列RASQDIKNYLN(SEQ ID NO:4)；
(e)CDR L2氨基酸序列YSSTLLS(SEQ ID NO:5)；和
(f)CDR L3氨基酸序列QQSITLPPT(SEQ ID NO:6)。
在一个实施方案中,能够特异性结合包含半抗原标签DIG的免疫球蛋白域的CAR包含包含与选自SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:32的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的重链可变区(VH)和包含与选自SEQ ID NO:9和SEQ IDNO:33的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的轻链可变区(VL)。
在一个实施方案中,能够特异性结合包含半抗原标签DIG的免疫球蛋白域的CAR包含包含选自SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:32的氨基酸序列的重链可变区(VH)和包含选自SEQID NO:9和SEQ ID NO:33的氨基酸序列的轻链可变区(VL)。
在一个实施方案中,能够特异性结合包含半抗原标签DIG的免疫球蛋白域的CAR包含包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列的重链可变区(VH)和包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的轻链可变区(VL)。
在一个优选实施方案中,能够特异性结合包含半抗原标签DIG的免疫球蛋白域的CAR包含包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的重链可变区(VH)和包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的轻链可变区(VL)。
在一个实施方案中,至少一个抗原结合模块是scFv,Fab,交叉Fab或scFab片段。在一个实施方案中,能够特异性结合包含半抗原标签DIG的免疫球蛋白域的CAR包含Fab片段。在一个优选实施方案中,能够特异性结合包含半抗原标签DIG的免疫球蛋白域的CAR包含包含SEQ ID NO:30的重链和SEQ ID NO:31的轻链的Fab片段。
在一个实施方案中,能够特异性结合包含半抗原标签DIG的免疫球蛋白域的CAR包含scFv片段,其是由重链可变域(VH),轻链可变域(VL)和接头组成的多肽,其中所述可变域和所述接头以N端至C端方向具有下面的构造之一:a)VH-接头-VL或b)VL-接头-VH。在一个优选实施方案中,该scFv片段具有构造VH-接头-VL。
在一个优选实施方案中,能够特异性结合包含半抗原标签DIG的免疫球蛋白域的CAR包含包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的scFv片段。
在本发明的另一个例示性实施方案中,作为概念证明,提供的是能够特异性结合包含半抗原标签异硫氰酸荧光素(FITC)的经修饰免疫球蛋白域的CAR。
在一个实施方案中,能够特异性结合包含半抗原标签FITC的免疫球蛋白域的CAR包含SEQ ID NO:42,SEQ ID NO:43和SEQ ID NO:44的重链互补决定区(CDR)和SEQ ID NO:45,SEQ ID NO:46和SEQ ID NO:47的轻链CDR。
在一个优选实施方案中,能够特异性结合包含半抗原标签FITC的免疫球蛋白域的CAR包含重链可变区,其包含:
(a)重链互补决定区(CDR H)1氨基酸序列HYWMN(SEQ ID NO:42)；
(b)CDR H2氨基酸序列QFRNKPYNYETYYSDSVKG(SEQ ID NO:43)；
(c)CDR H3氨基酸序列ASYGMEY(SEQ ID NO:44)；
和轻链可变区,其包含:
(d)轻链(CDR L)1氨基酸序列RSSQSLVHSNGNTYLR(SEQ ID NO:45)；
(e)CDR L2氨基酸序列KVSNRVS(SEQ ID NO:46)；和
(f)CDR L3氨基酸序列SQSTHVPWT(SEQ ID NO:47)。
在一个实施方案中,能够特异性结合包含半抗原标签FITC的免疫球蛋白域的CAR包含包含与SEQ ID NO:60的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的重链可变区(VH)和包含与SEQ ID NO:61的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的轻链可变区(VL)。
在一个实施方案中,能够特异性结合包含半抗原标签FITC的免疫球蛋白域的CAR包含包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列的重链可变区(VH)和包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列的轻链可变区(VL)。
在一个实施方案中,至少一个抗原结合模块是scFv,Fab,交叉Fab或scFab片段。
在一个实施方案中,能够特异性结合包含半抗原标签FITC的免疫球蛋白域的CAR包含scFv片段,其是由重链可变域(VH),轻链可变域(VL)和接头组成的多肽,其中所述可变域和所述接头以N端至C端方向具有下面的构造之一:a)VH-接头-VL或b)VL-接头-VH。在一个优选实施方案中,该scFv片段具有构造VH-接头-VL。
在一个优选实施方案中,能够特异性结合包含半抗原标签FITC的免疫球蛋白域的CAR包含包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列的scFv片段。
在本发明的另一个例示性实施方案中,作为概念证明,提供的是能够特异性结合包含来自流感血凝素(HA)糖蛋白的多肽标签的经修饰免疫球蛋白域的CAR。在一个实施方案中,该来自HA蛋白的多肽标签包含该氨基酸序列YPYDVPDYA(SEQ ID NO:100)。
在一个实施方案中,能够特异性结合包含HA标签的免疫球蛋白域的CAR包含SEQID NO:52,SEQ ID NO:53和SEQ ID NO:54的重链互补决定区(CDR)和SEQ ID NO:55,SEQ IDNO:56和SEQ ID NO:57的轻链CDR。
在一个优选实施方案中,能够特异性结合包含HA标签的免疫球蛋白域的CAR包含重链可变区,其包含:
(a)重链互补决定区(CDR H)1氨基酸序列NYDMA(SEQ ID NO:52)；
(b)CDR H2氨基酸序列TISHDGRNTNYRDSVKG(SEQ ID NO:53)；
(c)CDR H3氨基酸序列PGFAH(SEQ ID NO:54)；
和轻链可变区,其包含:
(d)轻链(CDR L)1氨基酸序列RSSKTLLNTRGITSLY(SEQ ID NO:55)；
(e)CDR L2氨基酸序列RMSNLAS(SEQ ID NO:56)；和
(f)CDR L3氨基酸序列AQFLEFPLT(SEQ ID NO:57)。
在一个实施方案中,能够特异性结合包含HA标签的免疫球蛋白域的CAR包含包含与选自SEQ ID NO:60和SEQ ID NO:65的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的重链可变区(VH)和包含与选自SEQ ID NO:61和SEQ ID NO:66的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的轻链可变区(VL)。
在一个实施方案中,能够特异性结合包含HA标签的免疫球蛋白域的CAR包含包含选自SEQ ID NO:60和SEQ ID NO:65的氨基酸序列的重链可变区(VH)和包含选自SEQ IDNO:61和SEQ ID NO:66的氨基酸序列的轻链可变区(VL)。
在一个实施方案中,能够特异性结合包含HA标签的免疫球蛋白域的CAR包含包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列的重链可变区(VH)和包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列的轻链可变区(VL)。
在一个优选实施方案中,能够特异性结合包含HA标签的免疫球蛋白域的CAR包含包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列的重链可变区(VH)和包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列的轻链可变区(VL)。
在一个实施方案中,至少一个抗原结合模块是scFv,Fab,交叉Fab或scFab片段。在一个实施方案中,能够特异性结合包含HA标签的免疫球蛋白域的CAR包含Fab片段。在一个优选实施方案中,能够特异性结合包含HA标签的免疫球蛋白域的CAR包含包含SEQ ID NO:63的重链和SEQ ID NO:64的轻链的Fab片段。
在一个实施方案中,能够特异性结合包含HA标签的免疫球蛋白域的CAR包含scFv片段,其是由重链可变域(VH),轻链可变域(VL)和接头组成的多肽,其中所述可变域和所述接头以N端至C端方向具有下面的构造之一:a)VH-接头-VL或b)VL-接头-VH。在一个优选实施方案中,该scFv片段具有构造VH-接头-VL。
在一个优选实施方案中,能够特异性结合包含HA标签的免疫球蛋白域的CAR包含包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列的scFv片段。
在本发明的另一个例示性实施方案中,作为概念证明,提供的是能够特异性结合包含来自人c-myc蛋白的多肽标签的经修饰免疫球蛋白域的CAR。在一个实施方案中,该来自人c-myc蛋白的多肽标签包含该氨基酸序列EQKLISEEDL(SEQ ID NO:101)。
在一个实施方案中,能够特异性结合包含myc标签的免疫球蛋白域的CAR包含SEQID NO:77,SEQ ID NO:78和SEQ ID NO:79的重链互补决定区(CDR)和SEQ ID NO:80,SEQ IDNO:81和SEQ ID NO:82的轻链CDR。
在一个优选实施方案中,能够特异性结合包含myc标签的免疫球蛋白域的CAR包含重链可变区,其包含:
(a)重链互补决定区(CDR H)1氨基酸序列HYGMS(SEQ ID NO:77)；
(b)CDR H2氨基酸序列TIGSRGTYTHYPDSVKG(SEQ ID NO:78)；
(c)CDR H3氨基酸序列RSEFYYYGNTYYYSAMDY(SEQ ID NO:79)；
和轻链可变区,其包含:
(d)轻链(CDR L)1氨基酸序列RASESVDNYGFSFMN(SEQ ID NO:80)；
(e)CDR L2氨基酸序列AISNRGS(SEQ ID NO:81)；和
(f)CDR L3氨基酸序列QQTKEVPWT(SEQ ID NO:82)。
在一个实施方案中,能够特异性结合包含myc标签的免疫球蛋白域的CAR包含包含与SEQ ID NO:86的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的重链可变区(VH)和包含与SEQ ID NO:87的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的轻链可变区(VL)。
在一个实施方案中,能够特异性结合包含myc标签的免疫球蛋白域的CAR包含包含SEQ ID NO:86的氨基酸序列的重链可变区(VH)和包含SEQ ID NO:87的氨基酸序列的轻链可变区(VL)。
在一个实施方案中,至少一个抗原结合模块是scFv,Fab,交叉Fab或scFab片段。在一个实施方案中,能够特异性结合包含myc标签的免疫球蛋白域的CAR包含Fab片段。在一个优选实施方案中,能够特异性结合包含myc标签的免疫球蛋白域的CAR包含包含SEQ ID NO:84的重链和SEQ ID NO:85的轻链的Fab片段。
在一个实施方案中,能够特异性结合包含myc标签的免疫球蛋白域的CAR包含scFv片段,其是由重链可变域(VH),轻链可变域(VL)和接头组成的多肽,其中所述可变域和所述接头以N端至C端方向具有下面的构造之一:a)VH-接头-VL或b)VL-接头-VH。在一个优选实施方案中,该scFv片段具有构造VH-接头-VL。
在本发明的另一个例示性实施方案中,作为概念证明,提供的是能够特异性结合包含半抗原标签生物素的经修饰免疫球蛋白域的CAR。
在一个实施方案中,能够特异性结合包含半抗原标签生物素的免疫球蛋白域的CAR包含SEQ ID NO:67,SEQ ID NO:68和SEQ ID NO:69的重链互补决定区(CDR)和SEQ IDNO:70,SEQ ID NO:71和SEQ ID NO:72的轻链CDR。
在一个优选实施方案中,能够特异性结合包含半抗原标签生物素的免疫球蛋白域的CAR包含重链可变区,其包含:
(a)重链互补决定区(CDR H)1氨基酸序列GFNNKDTFFQ(SEQ ID NO:67)；
(b)CDR H2氨基酸序列RIDPANGFTKYAQKFQG(SEQ ID NO:68)；
(c)CDR H3氨基酸序列WDTYGAAWFAY(SEQ ID NO:69)；
和轻链可变区,其包含:
(d)轻链(CDR L)1氨基酸序列RASGNIHNYLS(SEQ ID NO:70)；
(e)CDR L2氨基酸序列SAKTLAD(SEQ ID NO:71)；和
(f)CDR L3氨基酸序列QHFWSSIYT(SEQ ID NO:72)。
在一个实施方案中,能够特异性结合包含半抗原标签生物素的免疫球蛋白域的CAR包含包含与SEQ ID NO:75的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的重链可变区(VH)和包含与SEQ ID NO:76的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的轻链可变区(VL)。
在一个实施方案中,能够特异性结合包含半抗原标签生物素的免疫球蛋白域的CAR包含包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列的重链可变区(VH)和包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列的轻链可变区(VL)。
在一个实施方案中,至少一个抗原结合模块是scFv,Fab,交叉Fab或scFab片段。
在一个实施方案中,能够特异性结合包含半抗原标签生物素的免疫球蛋白域的CAR包含scFv片段,其是由重链可变域(VH),轻链可变域(VL)和接头组成的多肽,其中所述可变域和所述接头以N端至C端方向具有下面的构造之一:a)VH-接头-VL或b)VL-接头-VH。在一个优选实施方案中,该scFv片段具有构造VH-接头-VL。
在一个优选实施方案中,能够特异性结合包含半抗原标签生物素的免疫球蛋白域的CAR包含包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列的scFv片段。
在本发明的另一个例示性实施方案中,作为概念证明,提供的是能够特异性结合包含来自人GCN4蛋白的多肽标签的经修饰免疫球蛋白域的CAR。在一个实施方案中,该来自人GCN4蛋白的多肽标签包含氨基酸序列YHLENEVARLKK(SEQ ID NO:102)。
在一个实施方案中,能够特异性结合包含GCN4标签的免疫球蛋白域的CAR包含SEQID NO:90,SEQ ID NO:91和SEQ ID NO:92的重链互补决定区(CDR)和SEQ ID NO:93,SEQ IDNO:94和SEQ ID NO:95的轻链CDR。
在一个优选实施方案中,能够特异性结合包含GCN4标签的免疫球蛋白域的CAR包含重链可变区,其包含:
(a)重链互补决定区(CDR H)1氨基酸序列DYGVN(SEQ ID NO:90)；
(b)CDR H2氨基酸序列VIWGDGITDHNSALKS(SEQ ID NO:91)；
(c)CDR H3氨基酸序列GLFDY(SEQ ID NO:92)；
和轻链可变区,其包含:
(d)轻链(CDR L)1氨基酸序列RSSTGAVTTSNYAS(SEQ ID NO:93)；
(e)CDR L2氨基酸序列GTNNRAP(SEQ ID NO:94)；和
(f)CDR L3氨基酸序列VLWYSNHWV(SEQ ID NO:95)。
在一个实施方案中,能够特异性结合包含GCN4标签的免疫球蛋白域的CAR包含包含与SEQ ID NO:98的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的重链可变区(VH)和包含与SEQ ID NO:99的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的轻链可变区(VL)。
在一个实施方案中,能够特异性结合包含GCN4标签的免疫球蛋白域的CAR包含包含SEQ ID NO:98的氨基酸序列的重链可变区(VH)和包含SEQ ID NO:99的氨基酸序列的轻链可变区(VL)。
在一个实施方案中,至少一个抗原结合模块是scFv,Fab,交叉Fab或scFab片段。在一个实施方案中,能够特异性结合包含GCN4标签的免疫球蛋白域的CAR包含Fab片段。
在一个实施方案中,能够特异性结合包含GCN4标签的免疫球蛋白域的CAR包含scFv片段,其是由重链可变域(VH),轻链可变域(VL)和接头组成的多肽,其中所述可变域和所述接头以N端至C端方向具有下面的构造之一:a)VH-接头-VL或b)VL-接头-VH。在一个优选实施方案中,该scFv片段具有构造VL-接头-VH。
经由CL域和CH1域之间的天然二硫键稳定Fab和scFab片段。可以通过引入VH和VL域之间的链间二硫桥来进一步稳定包含重链可变域(VH)和轻链可变域(VL)的抗原结合模块,诸如如本文中描述的Fab,交叉Fab,scFv和scFab片段。因而,在一个实施方案中,可以经由***半胱氨酸残基(例如依照Kabat编号方式可变重链中的位置44和可变轻链中的位置100)通过生成链间二硫键来进一步稳定依照本发明的抗原结合受体中包含的Fab片段,交叉Fab片段,scFv片段和/或scFab片段。在本文中通过术语“ds”来提及此类稳定化抗原结合模块。
可以依照本领域已知方法将半抗原共价或非共价偶联至识别域。例如,生物素化在本领域广泛用于将半抗原生物素偶联至多肽,例如免疫球蛋白。典型地经由伯胺(例如赖氨酸)将生物素缀合至蛋白质。对于IgG抗体,通常每个抗体分子缀合3至6个生物素分子。或者,可以依照本领域已知方法生物素化碳水化合物。
在一个实施方案中,使用定点偶联将半抗原分子偶联至识别域。在一个实施方案中,将在抗原结合分子中引入多肽标签与将半抗原分子定点偶联至多肽标签组合。在本发明的此类实施方案中,可以控制偶联至抗原结合分子的半抗原分子的数目,例如通过在多肽标签中提供限定数目的偶联位点。定点偶联技术的一个例子是本领域已知的Avi标签***。多肽标签Avi标签GLNDIFEAQKIEWH(SEQ ID NO:103)包含天然生物素化位点,其可以使用BirA生物素-蛋白质连接酶选择性生物素化。在一个实施方案中,识别域包含限定数目的半抗原分子。在一个实施方案中,识别域不包含多于1,2,3或4个半抗原分子。在一个优选的实施方案中,识别域包含两个半抗原分子,例如,识别域是由每个包含一个半抗原分子的两个多肽分子构成的Fc域。在另一个优选的实施方案中,识别域包含一个半抗原分子,例如,识别域是包含偶联至重链或轻链片段的半抗原分子的Fab片段。
在一个实施方案中,识别域包含多于一个种类的半抗原分子。在此类实施方案中,多于一个种类的半抗原分子可以分开或作为一个包含多于一个半抗原分子的单元,例如桥接衔接头偶联至识别域。作为概念证明,在实施例6和图13中提供本发明的此类实施方案的一个非限制性例子。在此类实施方案中,半抗原分子之一可以受到依照本发明提供和使用的各自抗半抗原CAR识别,而另一半抗原分子可以非共价或共价偶联至识别域。在一个实施方案中,半抗原分子经由能够特异性结合半抗原分子的抗原结合模块非共价偶联至识别域。在一个实施方案中,桥接衔接头包含第一半抗原分子和第二半抗原分子,其中第一半抗原分子能够与能够特异性结合第一半抗原分子的CAR相互作用,且其中第二半抗原分子能够与识别域相互作用,其中识别域包含能够特异性结合第二半抗原分子的抗原结合模块。在一个实施方案中,在靶抗原结合模块结合靶抗原后或之后,CAR结合第一半抗原分子且附着至识别域的抗原结合模块结合第二半抗原分子。因而,在包含靶抗原结合模块的抗原结合分子结合靶细胞且CAR经由桥接域(例如生物素-洋地黄毒苷桥)结合识别域后,报告CAR-T细胞变成激活的且报告基因表达。因此,在由针对靶抗原(例如肿瘤细胞上的)的抗原结合分子诱导的T细胞激活的背景中,报告基因的表达指示靶抗原结合模块的(特异性)结合。因而,在一个实施方案中,提供的是供依照本发明使用的桥接生物素-洋地黄毒苷衔接头。
如本文中提供和使用的CAR包含包含能够特异性结合识别域的抗原结合模块的胞外域,锚定跨膜域和至少一个细胞内信号传导和/或至少一个共刺激性信号传导域。锚定跨膜域介导将CAR局限于效应细胞,例如T细胞的细胞膜。细胞内信号传导和/或至少一个共刺激性信号传导域将CAR对识别域的结合转移至细胞内信号,例如T细胞激活,这可以通过测量报告基因表达来评估。在本发明的语境中,如本文中描述的报告基因的表达指示靶抗原结合模块对靶抗原的结合和导致的T细胞激活,如本文中描述的。
CAR的锚定跨膜域可以特征在于并不具有哺乳动物蛋白酶的切割位点。蛋白酶指能够水解包含蛋白酶的切割位点的跨膜域的氨基酸序列的蛋白水解酶。术语蛋白酶包括内肽酶和外肽酶二者。在本发明的语境中,可以使用如通过CD命名法等等规定的跨膜蛋白的任何锚定跨膜域来生成依照本发明合适的CAR,其在结合如本文中定义的识别域,例如经修饰免疫球蛋白域后激活T细胞。
因而,在本发明的语境中,锚定跨膜域可以包含鼠/小鼠或优选人跨膜域的一部分。此类锚定跨膜域的一个例子是CD28的跨膜域,例如具有如本文中在SEQ ID NO:11中显示的氨基酸序列(如由在SEQ ID NO:24中显示的DNA序列编码的)。在本发明的语境中,CAR的跨膜域可以包含如SEQ ID NO:11中显示的氨基酸序列(如由SEQ ID NO:24中显示的DNA序列编码的)/由其组成。
在本发明的一个例示性实施方案中,作为概念证明,使用包含包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列(如由SEQ ID NO:22中显示的DNA序列编码的)的抗原结合模块,和如本文中作为SEQ ID NO:95(如由SEQ ID NO:108中显示的DNA序列编码的)显示的CD28的片段/多肽部分(人CD28的Uniprot条目号是P10747(该序列的版本号173和版本1))的CAR。或者,可以使用具有如通过CD命名法等等提供的跨膜域的任何蛋白作为本发明中提供和使用的CAR的锚定跨膜域。如上文描述的,CAR可以包含CD28的锚定跨膜域,其位于如SEQ ID NO:109中显示的人全长CD28蛋白(如由SEQ ID NO:108中显示的cDNA编码的)的氨基酸153至179,154至179,155至179,156至179,157至179,158至179,159至179,160至179,161至179,162至179,163至179,164至179,165至179,166至179,167至179,168至179,169至179,170至179,171至179,172至179,173至179,174至179,175至179,176至179,177至179或178至179。因而,在本发明的语境中,锚定跨膜域可以包含如SEQ ID NO:11中显示的氨基酸序列(如由SEQ IDNO:24中显示的DNA序列编码的)或由其组成。
如本文中描述的,依照本发明使用的CAR包含至少一个刺激性信号传导和/或共刺激性信号传导域。刺激性信号传导和/或共刺激性信号传导域将包含靶抗原结合模块的抗原结合分子的结合转导至报告CAR-T细胞中的细胞内信号。因而,CAR优选包含刺激性信号传导域,其提供T细胞激活。在一个优选的实施方案中,靶抗原结合模块对靶抗原的结合和报告CAR-T细胞对包含靶抗原结合模块的抗原结合分子的结合导致细胞内信号传导和/或共信号传导域的激活。在某些实施方案中,本文中提供的CAR包含刺激性信号传导域,其是鼠/小鼠或人CD3z(人CD3z的UniProt条目是P20963(版本号177及序列号2；鼠/小鼠CD3z的UniProt条目是P24161(主要可引用登录号)或Q9D3G3(次要可引用登录号)版本号143和序列号1)),FCGR3A(人FCGR3A的UniProt条目是P08637(版本号178及序列号2)),或NKG2D(人NKG2D的UniProt条目是P26718(版本号151及序列号1)；鼠/小鼠NKG2D的UniProt条目是O54709(版本号132及序列号2))的片段/多肽部分。如此,CAR中包含的刺激性信号传导域可以是全长CD3z,FCGR3A或NKG2D的片段/多肽部分。鼠/小鼠全长CD3z的氨基酸序列在本文中作为SEQ ID NO:106显示(鼠/小鼠,如由SEQ ID NO:107中显示的DNA序列编码的)。人全长CD3z的氨基酸序列在本文中作为SEQ ID NO:104显示(人,如由SEQ ID NO:105中显示的DNA序列编码的)。依照本发明提供和使用的CAR可以包含CD3z,FCGR3A或NKG2D的片段作为刺激域,前提是包含至少一个信号传导域。特别是,CD3z,FCGR3A,或NKG2D的任何部分/片段作为刺激域是合适的,只要包含至少一个信号传导基序。然而,更加优选地,CAR包含自人起源衍生的多肽。优选地,CAR包含如本文中作为SEQ ID NO:104(CD3z)显示的氨基酸序列(人,如由SEQ ID NO:105(CD3z)中显示的DNA序列编码的)。例如,可以在CAR中包含的人CD3z的片段/多肽部分可以包含在SEQ ID NO:13中显示的氨基酸序列(如由SEQ ID NO:26中显示的DNA序列编码的)或由其组成。因而,在一个实施方案中,CAR包含如SEQ ID NO:13中显示的序列或与SEQ ID NO:13相比具有多至1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,23,24,25,26,27,28,29或30处替代,删除或***且特征在于具有刺激性信号传导活性的序列。在本文中下文和在实施例和图中提供包含刺激性信号传导域的CAR的具体构造。可以测定刺激性信号传导活性；例如通过增强的细胞因子释放(如通过ELISA测量的(IL-2,IFNγ,TNFα)),增强的增殖活性(如通过升高的细胞数目测量的),或增强的裂解活性(如通过LDH释放测定法测量的)。
CAR优选包含至少一个共刺激性信号传导域,其对报告CAR-T细胞提供另外的活性。CAR可以包含共刺激性信号传导域,其是鼠/小鼠或人CD28(人CD28的UniProt条目是P10747(版本号173及序列号1)；鼠/小鼠CD28的UniProt条目是P31041(版本号134及序列号2)),CD137(人CD137的UniProt条目是Q07011(版本号145及序列号1)；鼠/小鼠CD137的UniProt条目是P20334(版本号139及序列号1)),OX40(人OX40的UniProt条目是P23510(版本号138及序列号1)；鼠/小鼠OX40的UniProt条目是P43488(版本号119及序列号1)),ICOS(人ICOS的UniProt条目是Q9Y6W8(版本号126及序列号1))；鼠/小鼠ICOS的UniProt条目是Q9WV40(主要可引用登录号)或Q9JL17(次要可引用登录号)版本号102和序列版本2)),CD27(人CD27的UniProt条目是P26842(版本号160及序列号2)；鼠/小鼠CD27的UniProt条目是P41272(版本号137及序列版本1)),4-1-BB(鼠/小鼠4-1-BB的UniProt条目是P20334(版本号140及序列版本1)；人4-1-BB的UniProt条目是Q07011(版本号146及序列版本)),DAP10(人DAP10的UniProt条目是Q9UBJ5(版本号25及序列号1)；鼠/小鼠DAP10的UniProt条目是Q9QUJ0(主要可引用登录号)或Q9R1E7(次要可引用登录号)版本号101和序列号1))或DAP12(人DAP12的UniProt条目是O43914(版本号146和序列号1)；鼠/小鼠DAP12的UniProt条目是O054885(主要可引用登录号)或Q9R1E7(次要可引用登录号)版本号123和序列号1)的片段/多肽部分。在某些实施方案中,CAR可以包含一个或多个,即1,2,3,4,5,6或7个本文中定义的共刺激性信号传导域。因而,在本发明的语境中,CAR可以包含鼠/小鼠或优选人CD28的片段/多肽部分作为第一共刺激性信号传导域且第二共刺激性信号传导域选自由鼠/小鼠或优选人CD27,CD28,CD137,OX40,ICOS,DAP10和DAP12,或其片段组成的组。优选,CAR包含自人起源衍生的共刺激性信号传导域。如此,更加优选地,CAR中包含的共刺激性信号传导域可以包含如SEQ ID NO:12中显示的氨基酸序列(如由SEQ ID NO:25中显示的DNA序列编码的)或由其组成。
如此,可以任选地在CAR中包含的共刺激性信号传导域是全长CD27,CD28,CD137,OX40,ICOS,DAP10和DAP12的片段/多肽部分。鼠/小鼠全长CD28的氨基酸序列在本文中作为SEQ ID NO:111显示(鼠/小鼠,如由SEQ ID NO:110中显示的DNA序列编码的)。然而,因为在本发明的语境中最优选人序列,所以可以任选地在CAR蛋白中包含的共刺激性信号传导域是人全长CD27,CD28,CD137,OX40,ICOS,DAP10或DAP12的片段/多肽部分。人全长CD28的氨基酸序列在本文中作为SEQ ID NO:109显示(人,如由SEQ ID NO:108中显示的DNA序列编码的)。
在一个优选的实施方案中,CAR包含CD28或其片段作为共刺激性信号传导域。CAR可以包含CD28的片段作为共刺激性信号传导域,前提是包含至少一个CD28的信号传导域。特别是,CD28的任何部分/片段对于CAR是合适的,只要包含至少一个CD28的信号传导基序。例如,CAR中包含的CD28多肽可以包含SEQ ID NO:12中显示的氨基酸序列(如由SEQ ID NO:25中显示的DNA序列编码的)或由其组成。在本发明中,作为共刺激性信号传导域发挥功能的CD28的胞内域可以包含具有序列YMNM(SEQ ID NO:112)和/或PYAP(SEQ ID NO:113)的自CD28多肽的胞内域衍生的序列。优选地,CAR包含自人起源衍生的多肽。例如,在CAR中可以包含的人CD28的片段/多肽部分可以包含SEQ ID NO:12中显示的氨基酸序列(如由SEQ IDNO:25中显示的DNA序列编码的)或由其组成。因而,在一个实施方案中,CAR包含如SEQ IDNO:12中显示的序列或与SEQ ID NO:12相比具有多至1,2,3,4,5,6,7,8,9或10处替代,删除或***且特征在于具有共刺激性信号传导活性的序列。在本文中下文和在实施例和图中提供包含共刺激性信号传导域(CSD)的CAR的具体构造。可以测定共刺激性信号传导活性；例如通过增强的细胞因子释放(如通过ELISA测量的(IL-2,IFNγ,TNFα)),增强的增殖活性(如通过升高的细胞数目测量的),或增强的裂解活性(如通过LDH释放测定法测量的)。
如上文提到的,在本发明的一个实施方案中,CAR的共刺激性信号传导域可以衍生自人CD28基因(UniProt条目号:P10747(登录号及该序列的条目版本:173和版本1))且提供CD28活性,定义为本文中描述的转导细胞,像转导T细胞的细胞因子生成,增殖和裂解活性。可以如下测量CD28活性,即通过细胞因子的释放,通过细胞因子,诸如干扰素伽马(IFN-γ)或白介素2(IL-2)的ELISA或流式细胞术,T细胞的增殖,例如通过ki67测量来测量,细胞量化,通过流式细胞术,或裂解活性,如通过靶细胞的实时阻抗测量评估的(通过使用例如ICELLligence仪器,如描述于例如Thakur et al.,Biosens Bioelectron.35(1)(2012),503-506；Krutzik et al.,Methods Mol Biol.699(2011),179-202；Ekkens et al.,Infect Immun.75(5)(2007),2291-2296；Ge et al.,Proc Natl Acad Sci U S A.99(5)(2002),2983-2988；Düwell et al.,Cell Death Differ.21(12)(2014),1825-1837；Erratum,Cell Death Differ.21(12)(2014),161)。共刺激性信号传导域PYAP和YMNM对于CD28多肽的功能和上文列举的功能效果是有益的。YMNM域的氨基酸序列在SEQ ID NO:112中显示；PYAP域的氨基酸序列在SEQ ID NO:113中显示。因而,在如本文中提供和使用的CAR中,CD28多肽优选包含具有序列YMNM(SEQ ID NO:112)和/或PYAP(SEQ ID NO:113)的自CD28多肽的胞内域衍生的序列。这些信号传导基序可以存在于CAR的胞内域内的任何位点。
包含至少一个能够特异性结合识别域的抗原结合模块的胞外域,并不具有哺乳动物蛋白酶的切割位点的锚定跨膜域,共刺激性信号传导域和刺激性信号传导域可以包含在单链多功能多肽中。单链融合构建物可以例如由一种或多种多肽组成,其包含包含至少一个能够特异性结合经修饰免疫球蛋白域的抗原结合模块的一个或多个胞外域,一个或多个锚定跨膜域,一个或多个共刺激性信号传导域和/或一个或多个刺激性信号传导域。在备选的实施方案中,CAR包含并非单链融合构建物的抗原结合模块,即能够特异性结合经修饰免疫球蛋白的抗原结合模块是Fab或交叉Fab片段。在此类实施方案中,并非单链融合构建物的CAR包含仅仅一条多肽链。优选地,此类构建物会包含与免疫球蛋白轻链组合的单链重链融合多肽,例如重链融合多肽包含一个或多个免疫球蛋白重链,一个或多个锚定跨膜域,一个或多个共刺激性信号传导域和/或一个或多个刺激性信号传导域且与一个或多个免疫球蛋白轻链组合。因而,胞外域,锚定跨膜域,共刺激性信号传导域和刺激性信号传导域可以通过一个或多个相同或不同的肽接头连接。例如,包含至少一个能够特异性结合识别域的抗原结合模块的胞外域和锚定跨膜域之间的接头可以包含如SEQ ID NO:17中显示的氨基酸序列或由其组成。因而,锚定跨膜域,共刺激性信号传导域和/或刺激域可以通过肽接头或通过域的直接融合而彼此连接。
在一些实施方案中,胞外域中包含的抗原结合模块是单链可变片段(scFv),其是用10至约25个氨基酸的短接头肽连接的抗体的重(VH)和轻链(VL)的可变区的融合蛋白。接头通常富含甘氨酸(为了柔性),以及丝氨酸或苏氨酸(为了溶解度),而且可以连接VH的N端与VL的C端,或反之。例如,接头可以具有如SEQ ID NO:16中显示的氨基酸序列。scFv抗原结合模块保留原始抗体的特异性,尽管去除恒定区和引入接头。scFv抗体例如描述于Houston,J.S.,Methods in Enzymol.203(1991)46-96。
CAR或其部分可以包含信号肽。此类信号肽会将蛋白质带至T细胞膜的表面。例如,信号肽可以具有如SEQ ID NO:114中显示的氨基酸序列(如由SEQ ID NO:115中显示的DNA序列编码的)。
CAR的各成分可以以多种构造彼此融合以生成T细胞激活性CAR。
在一些实施方案中,CAR包含由与锚定跨膜域连接的重链可变域(VH)和轻链可变域(VL)构成的胞外域。在一些实施方案中,VH域在C端融合至VL域的N端,任选经由肽接头。在其它实施方案中,CAR进一步包含刺激性信号传导域和/或共刺激性信号传导域。在一个具体的此类实施方案中,CAR本质上由通过一个或多个肽接头连接的VH域和VL域,锚定跨膜域,和任选的刺激性信号传导域组成,其中VH域在C端融合至VL域的N端,且VL域在C端融合至锚定跨膜域的N端,其中锚定跨膜域在C端融合至刺激性信号传导域的N端。任选地,CAR进一步包含共刺激性信号传导域。在一个此类具体的实施方案中,抗原结合受体本质上由通过一个或多个肽接头连接的VH域和VL域,锚定跨膜域,刺激性信号传导域和共刺激性信号传导域组成,其中VH域在C端融合至VL域的N端,且VL域在C端融合至锚定跨膜域的N端,其中锚定跨膜域在C端融合至刺激性信号传导域的N端,其中刺激性信号传导域在C端融合至共刺激性信号传导域的N端。在一个备选的实施方案中,共刺激性信号传导域连接锚定跨膜域代替刺激性信号传导域。在一个优选的实施方案中,CAR本质上由通过一个或多个肽接头连接的VH域和VL域,锚定跨膜域,共刺激性信号传导域和刺激性信号传导域组成,其中VH域在C端融合至VL域的N端,且VL域在C端融合至锚定跨膜域的N端,其中锚定跨膜域在C端融合至共刺激性信号传导域的N端,其中共刺激性信号传导域在C端融合至刺激性信号传导域的N端。
在优选的实施方案中,结合模块之一是Fab片段或交叉Fab片段。在一个优选的实施方案中,抗原结合模块在Fab或交叉Fab重链的C端融合至锚定跨膜域的N端,任选地经由肽接头。在一个备选的实施方案,抗原结合模块在Fab或交叉Fab轻链的C端融合至锚定跨膜域的N端,任选地经由肽接头。在其它实施方案中,CAR进一步包含刺激性信号传导域和/或共刺激性信号传导域。在一个具体的此类实施方案中,CAR本质上由通过一个或多个肽接头连接的Fab或交叉Fab片段,锚定跨膜域,和任选地刺激性信号传导域组成,其中Fab或交叉Fab片段在重或轻链的C端融合至锚定跨膜域的N端,其中锚定跨膜域在C端融合至刺激性信号传导域的N端。优选地,CAR进一步包含共刺激性信号传导域。在一个此类实施方案中,CAR本质上由通过一个或多个肽接头连接的Fab或交叉Fab片段,锚定跨膜域,刺激性信号传导域和共刺激性信号传导域组成,其中Fab或交叉Fab片段在重或轻链的C端融合至锚定跨膜域的N端,其中刺激性信号传导域在C端融合至共刺激性信号传导域的N端。在一个优选的实施方案中,共刺激性信号传导域连接锚定跨膜域代替刺激性信号传导域。在一个最优选的实施方案中,CAR本质上由Fab或交叉Fab片段,锚定跨膜域,共刺激性信号传导域和刺激性信号传导域组成,其中Fab或交叉Fab片段经由肽接头在重链的C端融合至锚定跨膜域的N端,其中锚定跨膜域在C端融合至共刺激性信号传导域的N端,其中共刺激性信号传导域在C端融合至刺激性信号传导域的N端。
抗原结合模块,锚定跨膜域和刺激性信号传导和/或共刺激性信号传导域可以直接地或经由包含一个或多个氨基酸,典型地约2-20个氨基酸的一个或多个肽接头彼此融合。肽接头是本领域已知的且在本文中有描述。合适的非免疫原性肽接头包括例如(G4S)n,(SG4)n,(G4S)n或G4(SG4)n肽接头,其中“n”一般是1和10之间,典型地2和4之间的数目。用于连接抗原结合模块和锚定跨膜模块的一种优选肽接头是依照SEQ ID NO 17的GGGGS(G4S)。适合于连接可变重链(VH)和可变轻链(VL)的一种例示性肽接头是依照SEQ ID NO 16的GGGSGGGSGGGSGGGS(G4S)4。
另外,接头可以包含免疫球蛋白铰链区(的一部分)。特别是在抗原结合模块融合至锚定跨膜域的N端的情况中,它可以是经由免疫球蛋白铰链区或其部分融合的,有或没有另外的肽接头。
如本文中描述的,依照本发明提供和使用的CAR包含包含至少一个抗原结合模块的胞外域。具有一个能够特异性结合识别域的抗原结合模块的CAR是有用的且优选的,特别是在需要CAR的高表达的情况中。在此类情况中,多于一个对靶细胞抗原特异性的抗原结合模块的存在可能限制CAR的表达效率。然而,在其它情况中,具有包含对靶细胞抗原特异性的两个或更多个抗原结合模块的CAR会是有利的,例如为了优化对靶位点的靶向或容许靶细胞抗原的交联。
在依照本发明的方法的语境中,使包含靶抗原结合模块的抗原结合分子与在表面上包含靶抗原的靶细胞接触和使抗原结合分子与包含能够特异性结合识别域的抗原结合模块的CAR接触导致如本文中描述的报告基因的表达。因而,在一个实施方案中,如本文中描述的细胞内信号传导和/或共信号传导域的激活导致如本文中描述的应答元件的激活。在一个优选的实施方案中,应答元件控制报告基因的表达。在一个实施方案中,在靶抗原结合模块结合靶抗原之时或之后,CAR结合识别域,例如经修饰免疫球蛋白域,其中应答元件激活如本文中描述的报告基因的表达。在一个优选的实施方案中,应答元件的激活导致报告基因的表达。因而,在靶抗原结合模块结合靶抗原且CAR结合包含(候选)靶抗原结合模块的分子的识别域时报告细胞(例如报告CAR-T细胞)中的报告基因表达。在一个实施方案中,报告基因的表达指示靶抗原结合模块对靶抗原的结合。在此语境中,抗原结合分子对CAR的结合引发细胞应答,其导致对应答元件的活性的调控,或是直接地或是经由细胞信号传导的级联。应答元件是能受到转录因子等等沉默或激活的DNA元件。应答元件是本领域已知的且可商购的,例如在报告载体中。通常,应答元件包含DNA重复元件且是位于在转录因子结合时驱动报告基因表达的最小限度启动子上游的顺式作用增强子元件。
CAR对识别域,例如经修饰Fc域或Fab片段的结合激活应答元件。在一个实施方案中,应答元件是位于细胞核中的核应答元件。在另一个实施方案中,所述应答元件位于报告细胞中的质粒上。在一个实施方案中,测定法包含用包含编码在应答元件控制下的报告基因的DNA序列的表达载体转染报告细胞,例如CAR-T细胞的预备步骤。另外,可以用包含编码CAR的DNA序列的表达载体转染报告细胞。可以用包含信号传导级联的所有元件的表达载体或用分别表达不同成分的不同载体转染报告细胞。在一个实施方案中,报告细胞包含编码在应答元件控制下的报告基因的DNA序列,和编码CAR的DNA序列。
因而,如本文中描述的,CAR功能性连接应答元件。在一个实施方案中,应答元件控制报告基因的表达。在一个实施方案中,应答元件是NFAT途径,NF-κB途径或AP-1途径,优选NFAT途径的一部分。
在一个实施方案中,报告基因选自编码荧光蛋白的基因或编码其催化活性能检测的酶的基因。在一个实施方案中,报告基因编码发光蛋白。在又一个实施方案中,荧光蛋白选自由绿色荧光蛋白(GFP),黄色荧光蛋白(YFP),红色荧光蛋白(RFP),蓝色荧光蛋白(BFP,Heim et al.1994,1996),称作CFP的青色荧光变体(Heim et al.1996；Tsien 1998)；称作YFP的黄色荧光变体(Ormo et al.1996；Wachter et al.1998)；称作Sapphire的紫色可激发绿色荧光变体(Tsien 1998；Zapata-Hommer et al.2003)；和称作增强型绿色荧光蛋白或EGFP的青色可激发绿色荧光变体(Yang et al.1996)增强型绿色荧光蛋白(EGFP)组成的组且可以例如通过活细胞成像(例如Incucyte)或荧光分光光度法来测量。在一个实施方案中,其催化活性能检测的酶选自由萤光素酶,β-半乳糖苷酶和碱性磷酸酶组成的组。在一个实施方案中,报告基因编码GFP。在一个优选的实施方案中,报告基因编码萤光素酶。可以通过可商购的测定法,例如通过萤光素酶1000测定***或ONE-GloTM萤光素酶测定***(均来自Promega)来检测萤光素酶的活性。在作为底物的萤光素以外,萤光素酶1000测定***含有辅酶A(CoA),导致持续至少一分钟的强光强度。对于测定细胞内萤光素酶,必须在检测前裂解细胞。通过发光计自整个可见光谱收集作为反应的副产物生成的光。在本文中显示的实施例中,信号与所生成的萤光素酶的量成比例且因此与NFAT启动子的激活的强度成比例。在另一个实施方案中,使用萤光素酶测定法,其中萤光素酶是自细胞分泌的。因此,可以在不裂解细胞的情况下实施测定法。
如本文中描述的,可以直接关联报告基因的表达与要测试的靶抗原结合模块的结合和所得T细胞,例如报告CAR-T细胞的激活。例如,当使用编码萤光素酶的基因作为报告基因时,当与适宜的对照情形比较时,自细胞检测的光的量与靶抗原结合直接关联且指示要测试的靶抗原结合模块的特异性。在一个实施方案中,以不同浓度应用包含靶抗原结合模块的抗原结合分子并确定报告基因激活的半最大有效浓度(EC50)。EC50指在规定暴露时间之后抗原结合分子将报告基因激活或抑制到介于基线和最大值之间的半途时抗原结合分子(例如抗体)或配体的浓度。因此,剂量响应曲线的EC50代表观察到对靶抗原的最大激活性或抑制性效果的50％时靶抗原结合模块的浓度。
在一个实施方案中,靶抗原是细胞表面抗原或受体。在一个实施方案中,靶抗原选自由CD20,CD38,CD138,CEA,EGFR,FolR1,HER2,LeY,MCSP,STEAP1,TYRP,和WT1,或其片段组成的组。然而,靶抗原不限于位于细胞表面上的蛋白质,而且还可以衍生自暂时或永久位于细胞内的多肽或蛋白质。在此类情况中,衍生自细胞内多肽或蛋白质的靶抗原可以由主要组织相容性复合物(MHC)的一种或数种分子呈递在细胞表面上。在一个实施方案中,靶抗原是MHC的分子结合的肽。在一个实施方案中,MHC是人MHC。在一个实施方案中,MHC的分子结合的肽具有介于8和100个之间,优选介于8和30个之间,更加优选介于8和16个之间氨基酸的总体长度。在一个实施方案中,靶抗原衍生自唯独或主要在肿瘤组织中表达的蛋白质。在一个实施方案中,蛋白质是细胞内蛋白质且肽是通过MHC-I或MHC-II途径生成并由MHC I类或MHC II类复合物呈递的。在一个实施方案中,肽是通过MHC-I途径生成并由MHC I类复合物呈递的。在一个实施方案中,靶抗原结合模块是T细胞受体样(TCRL)抗原结合模块。TCRL抗原结合模块能够特异性结合唯独或主要在肿瘤组织中表达的肽抗原,其中肽抗原结合位于细胞,特别是癌细胞的表面上的MHC的分子。在此语境中,本发明的方法适合于以高通量测定法型式评估已建立的或新颖的TCRL靶抗原结合模块的特异性。
可以定性或定量,即通过报告基因的表达的存在或缺失测定包含靶抗原结合模块的抗原结合分子对靶抗原的结合；任何荧光或发光的缺失指示没有结合。对于结合和激活的定量测量,可以与参照比较报告基因激活的量。因而,如本文中描述的方法可以另外包含比较报告基因的表达的水平与参照的步骤。合适的参照通常包含阴性对照,其与参考测定法实质性相同,省略测定法或方法的一种或数种本质成分。对于本发明的方法,省略的成分可以是例如省略添加抗原结合分子或省略靶细胞。或者,可以使用不能结合抗原结合分子识别域的报告CAR-T细胞。在一个优选的实施方案中,参照是在抗原结合分子缺失下报告基因的表达。在具体的实施方案中,报告基因的表达与在抗原结合分子缺失下报告基因的表达相比要高至少2倍,3倍,4倍,5倍,10倍,100倍,1000倍,或10000倍。
或者,可以通过某个阈来定义报告基因表达的缺失,即在扣除背景信号之后。通常通过用除了要测试的抗原结合分子以外的所有试剂或在靶细胞缺失下实施测定法来测定背景信号。可以例如依照本发明的方法选择新颖靶抗原结合模块,其通过为报告基因表达的基线激活定义阈并如果在抗原结合分子存在下报告基因的表达的水平相对于在抗原结合分子缺失下报告基因的表达比预先确定的阈值要高的话选择新颖靶抗原结合模块。因而,如本文中描述的方法可以另外包含如果在抗原结合分子存在下报告基因的表达的水平相对于在抗原结合分子缺失下报告基因的表达比预先确定的阈值要高的话选择新颖靶抗原结合模块的步骤。在具体的实施方案中,阈值是2,3,4,5,10,100,1000,或10000。
如本文中描述的新颖测定法是稳健的,适合于以高通量型式使用且就完成测定法需要的动手时间而言是有效的。而且,本发明的测定法耐受要分析的样品中死细胞的存在。这与其中通过测量细胞存活力或细胞死亡来测定抗原结合分子的结合和功能性的细胞测定法,例如杀伤测定法形成对比。
本文中描述的新测定法的一项别的优点是不需要清洗步骤。可以以任一次序或在相同时间将要测试的抗原结合分子和报告细胞添加至靶细胞,例如肿瘤细胞。在一个实施方案中,在细胞培养培养基中稀释抗原结合分子并在合适的细胞培养型式中,例如在24孔板的孔中或在96孔板的孔中将肿瘤样品添加至含有稀释的抗原结合分子的细胞培养培养基。优选地,测试培养基是为细胞提供可存活长至48小时的条件的培养基。在一个实施方案中,在微量滴定板中实施测定法。在一个实施方案中,微量滴定板适合于高通量筛选。可以以容许快速制备,加工,和分析多个反应的任何型式实施本发明的测定法。这可以是例如在多孔测定板中(例如24孔,96孔或384孔)。可以手工或以机器人生成各种药剂的储液,并且可以使用可商购的分析软件,机器人,和能够检测荧光和/或发光信号的检测仪器以机器人进行所有后续移液,稀释,混合,分配,清洗,温育,样品读出,数据收集和分析。
在一个实施方案中,在步骤c)中提供约100000至约1000000个报告CAR-T细胞每个24孔板的孔。在一个优选的实施方案中,在步骤c)中提供约300000至约700000个细胞或约400000至约600000个报告CAR-T细胞每个24孔板的孔。在一个实施方案中,在步骤c)中提供约500000个报告CAR-T细胞每个24孔板的孔。在一个实施方案中,在步骤c)中提供约10000至约100000个报告CAR-T每个96孔板的孔。在一个优选的实施方案中,在步骤c)中提供约30000至约70000个报告CAR-T或约40000至约60000个报告CAR-T每个96孔板的孔。在一个实施方案中在步骤c)中提供约50000个报告CAR-T每个96孔板的孔。在一个实施方案中,在步骤c)中提供约3000至约30000个报告CAR-T细胞每个384孔板的孔。在一个优选的实施方案中,在步骤c)中提供约5000至约15000个细胞或约8000至约12000个报告CAR-T细胞每个384孔板的孔。在一个实施方案中,在步骤c)中提供约10000个报告CAR-T细胞每个384孔板的孔。在一个实施方案中,在步骤c)中提供约200000至约2000000个报告CAR-T每ml细胞培养培养基。在一个优选的实施方案中,在步骤c)中提供约600000至约1400000个报告CAR-T或约800000至约1200000个报告CAR-T每ml细胞培养培养基。在一个实施方案中,在步骤c)中提供约1000000个报告CAR-T每ml细胞培养培养基。
在一个实施方案中,在步骤b)中提供抗原结合分子以实现约0.1fg/ml至10μg/ml的最终浓度。在又一个实施方案中,在步骤b)中提供抗原结合分子以实现约1fg/ml至约1μg/ml或约1pg/ml至约1μg/ml的最终浓度。在又一个实施方案中,在步骤b)中提供抗原结合分子以实现约0.1ng/ml的最终浓度。在一个实施方案中,在步骤b)中提供抗原结合分子以实现约1nM至约1000nM的最终浓度。在又一个实施方案中,在步骤b)中提供抗原结合分子以实现约5nM至约200nM或约10nM至约100nM的最终浓度。在又一个实施方案中,在步骤b)中提供抗原结合分子以实现约50nM的最终浓度。可以在细胞培养培养基中稀释抗原结合分子。在添加报告细胞之前或之后将稀释至如本文中描述的最终浓度的抗原结合分子添加至靶细胞。在一个实施方案中,在添加报告细胞之前将稀释至如本文中描述的最终浓度的抗原结合分子添加至靶细胞。在一个实施方案中,在细胞培养物***物中提供靶细胞。在一个实施方案中,在Matrigel中包埋靶细胞,例如肿瘤细胞。
在某些实施方案中,可以使用本发明的方法来评估要在T细胞双特异性(TCB)型式中包括的新颖靶抗原结合模块的特异性。依照本发明的方法特别适合于为TCB评估和选择新颖靶抗原结合模块,因为本发明的方法测量T细胞激活。本领域已知的测定法(例如结合测定法)的一项缺点是测量的亲和力并不总是反映TCB型式的特异性。TCB是高度有力的分子,早就能够经由微摩尔范围中的结合亲和力介导T细胞激活和杀伤。因此,包含新颖靶抗原结合模块的TCB需要是高度选择性的以避免非特异性反应性,例如杀伤靶细胞或同种异体反应性。如本发明中描述的方法满足此类型式的高要求,因为测定法基于T细胞激活,即相当的作用机制。因而,提供的是一种如本文中描述的方法,其中在抗原结合分子存在下高水平的报告基因的表达和在抗原结合分子缺失下低水平的报告基因的表达指示靶抗原结合模块的高特异性,特别是当将靶抗原结合模块转移入T细胞双特异性(TCB)抗体型式时。而且,提供的是一种用于生成TCB抗体的方法,其中TCB抗体型式包含对靶抗原特异性的第一抗原结合模块和能够特异性结合T细胞激活性受体的第二抗原结合模块,其中第一抗原结合模块是依照如本文中描述的方法选择的,即在本发明的方法中作为(候选)靶抗原结合模块测定和选择第一抗原结合模块。在优选的实施方案中,T细胞激活性受体是CD3。
在一个此类实施方案中,TCB抗体包含
(a)第一抗原结合模块,其是能够特异性结合靶细胞抗原的Fab分子；
(b)第二抗原结合模块,其是能够特异性结合CD3的Fab分子。
在一个例示性实施方案中,作为概念证明,TCB抗体包含
(a)第一抗原结合模块,其是能够特异性结合靶细胞抗原的Fab分子；
(b)第二抗原结合模块,其是能够特异性结合CD3的Fab分子,且其包含SEQ ID NO:118,SEQ ID NO:119和SEQ ID NO:120的重链互补决定区(CDR)和SEQ ID NO:121,SEQ IDNO:122,SEQ ID NO:123的轻链CDR。
具有一个能够特异性结合靶细胞抗原的抗原结合模块的TCB抗体是有用的,特别是在其中在高亲和力抗原结合模块的结合后预期靶细胞抗原的内在化的情况中。在此类情况中,多于一个对靶细胞抗原特异性的抗原结合模块的存在可能增强靶细胞抗原的内在化,由此降低它的可用度。
然而,在许多其它情况中,具有包含两个或更多个对靶细胞抗原特异性的抗原结合模块的双特异性抗体会是有利的,例如为了优化对靶位点的靶向。
因而,在某些实施方案中,TCB抗体包含能够特异性结合靶细胞抗原的第三抗原结合模块。在又一个实施方案中,第三抗原结合模块是常规Fab分子,或交换Fab分子,其中Fab轻链和Fab重链的可变或恒定区任一是交换的。在一个实施方案中,第三抗原结合模块能够与第一抗原结合模块特异性结合相同靶细胞抗原。在一个特定的实施方案中,第二抗原结合模块能够特异性结合CD3,且第一和第三抗原结合模块能够特异性结合靶细胞抗原。在一个特定的实施方案中,第一和该第三抗原结合模块是相同的(即它们包含相同的氨基酸序列)且是依照如本文中描述的方法选择的。
另外提供的是能够表达如本文中描述的CAR的转导T细胞,即报告CAR-T细胞及其在依照本发明的方法中的用途。CAR涉及一种分子,其并不天然包含在T细胞中和/或表面上且其并不在正常(非转导)T细胞中或上(内源)表达。如此,将T细胞中和/或上如本文中使用的CAR人工引入T细胞。人工引入且随后呈递在所述T细胞,例如报告CAR-T细胞中和/或表面上的CAR分子包含如下域,其包含(Ig衍生的)免疫球蛋白,优选抗体,特别是依照本发明使用的抗原结合分子的Fc域或Fab片段可及(体外或体内)的一个或多个抗原结合模块。在此语境中,这些人工引入的分子在如本文中下文描述的转导之后呈递在所述T细胞中和/或表面上。因而,在转导之后,依照本公开的T细胞可以被免疫球蛋白,优选包含抗原结合域和识别域的(治疗性)抗体激活。
本文中还提供的是表达由编码如本文中描述的CAR的一种或多种核酸分子编码的CAR的转导T细胞。因而,在本发明的语境中,转导细胞可以包含编码如本文中提供和使用的CAR的核酸分子。
在本发明的语境中,术语“转导T细胞”涉及遗传修饰的T细胞(即其中已经有意引入核酸分子的T细胞)。特别是,可以通过使用逆转录病毒或慢病毒转导将编码如本文中描述的CAR的核酸分子稳定整合入T细胞的基因组。CAR的胞外域可以包含如本文中描述的抗原结合模块的整个胞外域,但是也可以是其部分。所需要的最小大小是CAR中的抗原结合模块的抗原结合位点。在细胞表面上能检测到CAR的胞外部分(即包含抗原结合模块的胞外域),同时在细胞表面上检测不到细胞内部分(即共刺激性信号传导域和刺激性信号传导域)。可以通过使用特异性结合这种胞外域的抗体或通过胞外域能够结合的识别域,例如经修饰免疫球蛋白域来进行CAR的胞外域的检测。可以使用这些抗体或识别域通过流式细胞术或显微术来检测胞外域。
转导细胞可以是任何免疫细胞。这些包括但不限于B细胞,T细胞,天然杀伤(NK)细胞,天然杀伤(NK)T细胞,γδT细胞,先天性淋巴样细胞,巨噬细胞,单核细胞,树突细胞,或嗜中性细胞及其永生化细胞系。优选地,所述免疫细胞会是淋巴细胞,优选NK或T细胞。所述T细胞包括CD4 T细胞和CD8 T细胞。联合包含识别域,例如经修饰免疫球蛋白域的抗原结合分子,例如治疗性抗体,触发白细胞的表面上的CAR会使得细胞针对靶细胞是响应性的,不管细胞起源的谱系。会发生激活,不管为CAR选择的刺激性信号传导域或共刺激性信号传导域且不依赖于另外的细胞因子的外源供应。
可以用别的核酸分子,例如编码如本文中描述的应答元件的核酸分子共转导转导细胞。
具体地,本公开涉及一种用于生成表达一种或多种CAR和一种或多种应答元件和报告基因的报告CAR-T细胞的方法,其包含用一种或数种如本文中描述的载体转导T细胞和在容许在所述转导细胞中或上表达抗原结合受体的条件下培养转导T细胞的步骤。
用于转导细胞的方法是本领域已知的且包括但不限于(在转导核酸或重组核酸的情况中)例如电穿孔方法,磷酸钙方法,阳离子脂质方法或脂质体方法。可以例如通过使用可商购的转染试剂,例如Lipofectamine(由Invitrogen制造,目录号:11668027)转导要转导的核酸。在使用载体的情况中,可以以与上文所述核酸相同的方式转导载体,只要载体是质粒载体(即不是病毒载体的载体)。
优选转导细胞在受控条件下,在它们的天然环境之外生长。特别是,术语“培养”意味着细胞(例如转导细胞)在体外。培养细胞是保持与它们的原始组织来源分开的细胞活着的实验室技术。在本文中,在容许导入的基因在所述转导细胞中或上表达的条件下培养依照本发明使用的转导细胞。容许表达转基因的条件是本领域普通知道的。
本公开的又一个方面是编码依照本发明使用的一种或数种CAR的核酸和载体。核酸分子可以在调节序列控制下。例如,可以采用启动子,转录增强子和/或容许CAR的诱导表达的序列。在本发明的语境中,核酸分子在组成性或可诱导启动子控制下表达。合适的启动子是例如CMV启动子(Qin et al.,PLoS One 5(5)(2010),e10611),UBC启动子(Qin etal.,PLoS One 5(5)(2010),e10611),PGK(Qin et al.,PLoS One 5(5)(2010),e10611),EF1A启动子(Qin et al.,PLoS One 5(5)(2010),e10611),CAGG启动子(Qin et al.,PLoSOne 5(5)(2010),e10611),SV40启动子(Qin et al.,PLoS One 5(5)(2010),e10611),COPIA启动子(Qin et al.,PLoS One 5(5)(2010),e10611),ACT5C启动子(Qin et al.,PLoS One 5(5)(2010),e10611),TRE启动子(Qin et al.,PLoS One 5(5)(2010),e10611),Oct3/4启动子(Chang et al.,Molecular Therapy 9(2004),S367-S367(doi:10.1016/j.ymthe.2004.06.904)),或Nanog启动子(Wu et al.,Cell Res.15(5)(2005),317-24)。在本文中,术语载体涉及能在它所引入的细胞中(即在转导细胞中)自主复制的环状或线性核酸分子。分子生物学的技术人员知道许多合适的载体,其选择会取决于想要的功能且包括质粒,粘粒,病毒,噬菌体和遗传工程中常规使用的其它载体。可以使用本领域技术人员公知的方法来构建各种质粒和载体；见例如Sambrook et al.(同上)和Ausubel,CurrentProtocols in Molecular Biology,Green Publishing Associates and WileyInterscience,N.Y.(1989),(1994)中描述的技术。或者,可以将本发明的多核苷酸和载体重建入脂质体用于投递至靶细胞。如下文更为详细讨论的,使用克隆载体来分离DNA的各个序列。在需要特定多肽的表达的情况中,可以将有关序列转移入表达载体。典型的克隆载体包括pBluescript SK,pGEM,pUC9,pBR322,pGA18和pGBT9。典型的表达载体包括pTRE,pCAL-n-EK,pESP-1,pOP13CAT。
在本发明的语境中,载体可以是多顺反子。此类调节序列(控制元件)是技术人员已知的且可以包括启动子,剪接盒,翻译起始密码子,用于将***物引入载体的翻译和***位点。在本发明的语境中,所述核酸分子可操作连接所述表达控制序列,容许在真核或原核细胞中表达。涵盖的是所述载体是包含编码如本文中定义的CAR的核酸分子的表达载体。可操作连接指其中所描述的成分处于允许它们以它们的预定方式发挥功能的相互关系的并列。控制序列可操作连接编码序列是如下方式的连接,使得在与控制序列相容的条件下实现编码序列的表达。在控制序列是启动子的情况中,对技术人员显而易见的是优选使用双链核酸。
在本发明的语境中,所述载体是表达载体。表达载体是可用于转化选定的细胞并在选定的细胞中提供编码序列的表达的构建物。例如,表达载体可以是克隆载体,二元载体或整合载体。表达包含核酸分子的转录,优选转录成可翻译mRNA。确保在原核生物和/或真核细胞中表达的调节元件是本领域技术人员公知的。在真核细胞的情况中,它们在正常情况下包含确保起始转录的启动子和任选地确保终止转录和稳定转录物的polyA信号。允许在原核宿主细胞中表达的可能的调节元件包含例如大肠杆菌中的PL,lac,trp或tac启动子,而允许在真核宿主细胞中表达的调节元件的例子是酵母中的AOX1或GAL1启动子或哺乳动物和其它动物细胞中的CMV,SV40,RSV启动子(劳斯肉瘤病毒),CMV增强子,SV40增强子或珠蛋白内含子。
在负责起始转录的元件之外,此类调节元件还可以包含多核苷酸下游的转录终止信号,诸如SV40-polyA位点或tk-polyA位点。而且,取决于使用的表达***,可以将编码能够将多肽指导至细胞隔室或将它分泌入培养基的信号肽的前导序列添加至所述核酸序列的编码序列且是本领域公知的；还见例如所附实施例。
将前导序列以适宜状态与翻译起始和终止序列组装在一起,而且优选地,前导序列能够指导翻译的蛋白质或其部分分泌入周质空间或胞外培养基。任选地,异源序列可以编码CAR,其包括赋予期望特征的N端鉴定肽,例如稳定表达的重组产物或简化其纯化；见上文。在此语境中,合适的表达载体是本领域已知的,诸如Okayama-Berg cDNA表达载体pcDV1(Pharmacia),pCDM8,pRc/CMV,pcDNA1,pcDNA3(Invitrogene),pEF-DHFR,pEF-ADA或pEF-neo(Raum et al.Cancer Immunol Immunother 50(2001),141-150)或pSPORT1(GIBCOBRL)。
在T细胞或它的前体细胞中引入的所描述的核酸分子或载体可以或是整合入细胞的基因组或是可以在染色体外维持。
例示性实施方案
1.一种用于评估能够特异性结合靶抗原的靶抗原结合模块的特异性的方法,该方法包含下述步骤:
a)提供包含抗原结合域和识别域的抗原结合分子,其中该抗原结合域包含该靶抗原结合模块,且其中该识别域包含标签；
b)使该抗原结合分子与在表面上包含该靶抗原的靶细胞接触,特别是其中该靶细胞是癌细胞；
c)使该抗原结合分子与嵌合抗原受体(CAR)表达性报告T(CAR-T)细胞接触,其中该报告CAR-T细胞包含:
i.能够特异性结合该包含标签的识别域的CAR,其中该CAR与应答元件可操作偶联；
ii.在该应答元件控制下的报告基因；和
d)通过测量该报告基因的表达来测定T细胞激活以建立该靶抗原结合模块的特异性。
2.实施方案1的方法,其中该抗原结合域和该识别域是免疫球蛋白域或其片段。
3.实施方案1或2任一项的方法,其中该抗原结合域和该识别域各自选自由抗体,Fc域,Fab片段,交换Fab片段,单链Fab片段,Fv片段,scFv片段,单域抗体,aVH,或其片段组成的组。
4.实施方案1至3任一项的方法,其中该抗原结合分子是IgG类抗体,特别是IgG1或IgG4同种型抗体,或其片段。
5.实施方案1至4任一项的方法,其中该抗原结合域是Fab片段且该识别域是Fc域。
6.实施方案1至5任一项的方法,其中该抗原结合域和该识别域是相同的域,特别是Fab片段。
7.实施方案1至6任一项的方法,其中该CAR能够特异性结合包含该标签的识别域但不能够特异性结合不包含该标签的识别域。
8.实施方案1至7任一项的方法,其中该标签是半抗原分子。
9.实施方案8的方法,其中该半抗原分子与该识别域偶联。
10.实施方案1至9任一项的方法,其中该半抗原分子与该识别域共价偶联。
11.实施方案1至10任一项的方法,其中该半抗原分子与该识别域非共价偶联。
12.实施方案1至11任一项的方法,其中该识别域包含限定数目的半抗原分子。
13.实施方案1至12任一项的方法,其中该识别域并不包含多于1,2,3或4个半抗原分子。
14.实施方案1至13任一项的方法,其中该识别域包含多于一个种类的半抗原分子。
15.实施方案1至14任一项的方法,其中该半抗原分子选自由生物素,洋地黄毒苷(DIG)和荧光素(FITC)组成的组。
16.实施方案1至7任一项的方法,其中该标签是多肽标签。
17.实施方案16的方法,其中该多肽标签具有1至30个氨基酸,1至25个氨基酸,1至20个氨基酸,1至15个氨基酸或1至10个氨基酸的长度。
18.实施方案16或17任一项的方法,其中该多肽标签在C端连接至该识别域的N端,任选经由肽接头。
19.实施方案16或17任一项的方法,其中该多肽标签在N端连接至该识别域的C端,任选经由肽接头。
20.实施方案16至19任一项的方法,其中该多肽标签选自由myc标签,HA标签,Avi标签,FLAG标签,His标签,GCN4标签,和NE标签组成的组。
21.实施方案1至20任一项的方法,其中该靶抗原结合模块是Fab片段,特别是自噬菌体展示文库筛选衍生的Fab片段。
22.实施方案1至21任一项的方法,其中该CAR包含至少一个细胞内刺激性信号传导和/或共刺激性信号传导域。
23.实施方案22的方法,其中该靶抗原结合模块对该靶抗原的结合和该报告CAR-T细胞对包含该靶抗原结合模块的抗原结合分子的结合导致该报告基因的表达。
24.实施方案22的方法,其中该靶抗原结合模块对该靶抗原的结合和该报告CAR-T细胞对包含该靶抗原结合模块的抗原结合分子的结合导致该细胞内信号传导和/或共信号传导域的激活。
25.实施方案22或24任一项的方法,其中该细胞内信号传导和/或共信号传导域的激活导致该响应元件的激活。
26.实施方案1至25任一项的方法,其中该响应元件控制该报告基因的表达。
27.实施方案1至26任一项的方法,其中该响应元件的激活导致该报告基因的表达。
28.实施方案1至27任一项的方法,其中该响应元件是NFAT途径,NF-κB途径或AP-1途径的一部分。
29.实施方案1至28任一项的方法,其中该报告基因编码发光蛋白。
30.实施方案1至29任一项的方法,其中该报告基因编码绿色荧光蛋白(GFP)或萤光素酶。
31.实施方案1至30任一项的方法,其中该靶抗原是细胞表面抗原或受体。
32.实施方案1至31任一项的方法,其中该靶抗原选自由CD20,CD38,CD138,CEA,EGFR,FolR1,HER2,LeY,MCSP,STEAP1,TYRP,和WT1,或其片段组成的组。
33.实施方案1至32任一项的方法,其中该靶抗原是与人主要组织相容性复合物(MHC)的分子结合的肽。
34.实施方案33的方法,其中该靶抗原结合模块是T细胞受体样(TCRL)抗原结合模块。
35.实施方案1至34任一项的方法,其另外包含下述步骤:
e)将该报告基因的表达与参照比较。
36.实施方案35的方法,其中该参照是在该抗原结合分子缺失下该报告基因的表达。
37.实施方案36的方法,其中在该抗原结合分子存在下该报告基因的表达与在该抗原结合分子缺失下该报告基因的表达相比要高至少2倍,3倍,4倍,5倍,10倍,100倍,1000倍,或10000倍。
38.实施方案35的方法,其另外包含下述步骤:
f)如果在该抗原结合分子存在下该报告基因的表达相对于在该抗原结合分子缺失下该报告基因的表达比预先确定的阈值要高的话,选择该靶抗原结合模块。
39.实施方案38的方法,其中该阈值是2,3,4,5,10,100,1000,或10000。
40.实施方案1至39任一项的方法,其中在该抗原结合分子存在下高水平的该报告基因的表达和在该抗原结合分子缺失下低水平的该报告基因的表达指示该靶抗原结合模块的高特异性。
41.实施方案1至40任一项的方法,其中在该抗原结合分子存在下高水平的该报告基因的表达和在该抗原结合分子缺失下低水平的该报告基因的表达指示包含该靶抗原结合模块的T细胞双特异性(TCB)抗体的高特异性。
42.一种用于生成TCB抗体的方法,其中该TCB抗体包含对靶抗原特异性的第一抗原结合模块和能够特异性结合T细胞激活性受体的第二抗原结合模块,其中该第一抗原结合模块是依照实施方案1至41任一项的方法选择的。
43.实施方案42的方法,其中该T细胞激活性受体是CD3。
44.实施方案1至43任一项的方法,其中该方法是体外方法。
45.一种包含锚定跨膜域和包含抗原结合模块的胞外域的嵌合抗原受体(CAR),其中该抗原结合模块能够特异性结合包含标签的识别域但不能够特异性结合不包含该标签的该识别域。
46.实施方案45的CAR,其中该标签是半抗原分子。
47.实施方案46的CAR,其中该半抗原分子选自由生物素,洋地黄毒苷(DIG)和荧光素(FITC)组成的组。
48.实施方案46的CAR,其中该半抗原分子是生物素或DIG。
49.实施方案46的CAR,其中该半抗原分子是DIG。
50.实施方案45的CAR,其中该标签是多肽标签。
51.实施方案50的CAR,其中该多肽标签选自由myc标签,HA标签,Avi标签,FLAG标签,His标签,GCN4标签,和NE标签组成的组。
52.实施方案51的CAR,其中该多肽标签选自由myc标签,HA标签,GCN4标签和His标签组成的组。
53.实施方案45至52任一项的CAR,其中该锚定跨膜域是选自由CD8,CD3z,FCGR3A,NKG2D,CD27,CD28,CD137,OX40,ICOS,DAP10或DAP12跨膜域或其片段组成的组的跨膜域,特别是其中该锚定跨膜域是CD28跨膜域或其片段。
54.实施方案45至53任一项的CAR,其进一步包含至少一个刺激性信号传导域和/或至少一个共刺激性信号传导域。
55.实施方案45至54任一项的CAR,其中该至少一个刺激性信号传导域个别地选自由CD3z,FCGR3A和NKG2D的胞内域或其片段组成的组,特别是其中该至少一个刺激性信号传导域是CD3z胞内域或其片段。
56.实施方案45至55任一项的CAR,其中该至少一个共刺激性信号传导域个别地选自由CD27,CD28,CD137,OX40,ICOS,DAP10和DAP12的胞内域或其片段组成的组,特别是其中该至少一个共刺激性信号传导域是CD28胞内域或其片段。
57.实施方案45至56任一项的CAR,其中该抗原结合受体包含一个包含CD28的胞内域或其片段的刺激性信号传导域,且其中该抗原结合受体包含一个包含CD3z的胞内域或其片段的共刺激性信号传导域。
58.实施方案45至57任一项的CAR,其中该抗原结合模块是scFv片段,其中该scFv片段在C端连接至该锚定跨膜域的N端,任选经由肽接头。
59.实施方案45至57任一项的CAR,其中该抗原结合模块是Fab或交叉Fab片段,其中该Fab或交叉Fab片段在重链的C端连接至该锚定跨膜域的N端,任选经由肽接头。
60.实施方案45至49或53至59任一项的CAR,其中该半抗原分子是DIG。
61.实施方案60的CAR,其中能够特异性结合包含DIG的识别域但不能够特异性结合不包含DIG的识别域的CAR包含:
(i)重链可变区(VH),其包含
(a)重链互补决定区(CDR H)1氨基酸序列DYAMS(SEQ ID NO:1)；
(b)CDR H2氨基酸序列SINIGATYIYYADSVKG(SEQ ID NO:2)；和
(c)CDR H3氨基酸序列PGSPYEYDKAYYSMAY(SEQ ID NO:3)；和
(ii)轻链可变区(VL),其包含
(d)轻链互补决定区(CDR L)1氨基酸序列RASQDIKNYLN(SEQ ID NO:4)；
(e)CDR L2氨基酸序列YSSTLLS(SEQ ID NO:5)；和
(f)CDR L3氨基酸序列QQSITLPPT(SEQ ID NO:6)。
62.实施方案45至47或53至59任一项的CAR,其中该半抗原分子是FITC。
63.实施方案62的CAR,其中能够特异性结合包含FITC的识别域但不能够
特异性结合不包含FITC的识别域的CAR包含:
(i)重链可变区(VH),其包含
(a)重链互补决定区(CDR H)1氨基酸序列HYWMN(SEQ ID NO:42)；
(b)CDR H2氨基酸序列QFRNKPYNYETYYSDSVKG(SEQ ID NO:43)；和
(c)CDR H3氨基酸序列ASYGMEY(SEQ ID NO:44)；和
(ii)轻链可变区(VL),其包含
(d)轻链互补决定区(CDR L)1氨基酸序列RSSQSLVHSNGNTYLR(SEQ ID NO:45)；
(e)CDR L2氨基酸序列KVSNRVS(SEQ ID NO:46)；和
(f)CDR L3氨基酸序列SQSTHVPWT(SEQ ID NO:47)。
64.实施方案45至48或53至59任一项的CAR,其中该半抗原分子是生物素。
65.实施方案64的CAR,其中能够特异性结合包含生物素的识别域但不能
够特异性结合不包含生物素的识别域的CAR包含:
(i)重链可变区(VH),其包含
(a)重链互补决定区(CDR H)1氨基酸序列GFNNKDTFFQ(SEQ ID NO:67)；
(b)CDR H2氨基酸序列RIDPANGFTKYAQKFQG(SEQ ID NO:68)；和
(c)CDR H3氨基酸序列WDTYGAAWFAY(SEQ ID NO:69)；和
(ii)轻链可变区(VL),其包含
(d)轻链互补决定区(CDR L)1氨基酸序列RASGNIHNYLS(SEQ ID NO:70)；
(e)CDR L2氨基酸序列SAKTLAD(SEQ ID NO:71)；和
(f)CDR L3氨基酸序列QHFWSSIYT(SEQ ID NO:72)。
66.实施方案45或50至59任一项的CAR,其中该多肽标签是HA标签。
67.实施方案66的CAR,其中能够特异性结合包含HA标签的识别域但不能够特异性结合不包含HA标签的识别域的CAR包含:
(i)重链可变区(VH),其包含
(a)重链互补决定区(CDR H)1氨基酸序列NYDMA(SEQ ID NO:52)；
(b)CDR H2氨基酸序列TISHDGRNTNYRDSVKG(SEQ ID NO:53)；和
(c)CDR H3氨基酸序列PGFAH(SEQ ID NO:54)；和
(ii)轻链可变区(VL),其包含
(d)轻链互补决定区(CDR L)1氨基酸序列RSSKTLLNTRGITSLY(SEQ ID NO:55)；
(e)CDR L2氨基酸序列RMSNLAS(SEQ ID NO:56)；和
(f)CDR L3氨基酸序列AQFLEFPLT(SEQ ID NO:57)。
68.实施方案45或50至59任一项的CAR,其中该多肽标签是myc标签。
69.实施方案68的CAR,其中能够特异性结合包含myc标签的识别域但不能够特异性结合不包含myc标签的识别域的CAR包含:
(i)重链可变区(VH),其包含
(a)重链互补决定区(CDR H)1氨基酸序列HYGMS(SEQ ID NO:77)；
(b)CDR H2氨基酸序列TIGSRGTYTHYPDSVKG(SEQ ID NO:78)；和
(c)CDR H3氨基酸序列RSEFYYYGNTYYYSAMDY(SEQ ID NO:79)；和
(ii)轻链可变区(VL),其包含
(d)轻链互补决定区(CDR L)1氨基酸序列RASESVDNYGFSFMN(SEQ ID NO:80)；
(e)CDR L2氨基酸序列AISNRGS(SEQ ID NO:81)；和
(f)CDR L3氨基酸序列QQTKEVPWT(SEQ ID NO:82)。
70.实施方案45或50至59任一项的CAR,其中该多肽标签是GCN4标签(SEQ ID NO:102)。
71.实施方案70的CAR,其中能够特异性结合包含GCN4标签的识别域但不能够特异性结合不包含GCN4标签的识别域的CAR包含:
(i)重链可变区(VH),其包含
(a)重链互补决定区(CDR H)1氨基酸序列DYGVN(SEQ ID NO:90)；
(b)CDR H2氨基酸序列VIWGDGITDHNSALKS(SEQ ID NO:91)；和
(c)CDR H3氨基酸序列GLFDY(SEQ ID NO:92)；和
(ii)轻链可变区(VL),其包含
(d)轻链互补决定区(CDR L)1氨基酸序列RSSTGAVTTSNYAS(SEQ ID NO:93)；
(e)CDR L2氨基酸序列GTNNRAP(SEQ ID NO:94)；和
(f)CDR L3氨基酸序列VLWYSNHWV(SEQ ID NO:95)。
72.如本文中之前描述的方法。
实施例
下面是本发明的方法和组合物的实施例。理解的是,鉴于上文提供的一般性描述,可以实践多种其它实施方案。
重组DNA技术
使用标准方法来操作DNA,如Sambrook et al.,Molecular cloning:Alaboratory manual；Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NewYork,1989中描述的。依照制造商的说明书使用分子生物学试剂。关于人免疫球蛋白轻和重链的核苷酸序列的一般信息在Kabat,E.A.et al.,(1991)Sequences of Proteins ofImmunological Interest,Fifth Ed.,NIH Publication No 91-3242中给出。
DNA测序
通过双链测序来测定DNA序列。
基因合成
想要的基因区段或是使用适宜的模板通过PCR来生成或是由Geneart AG(Regensburg,Germany)自合成的寡核苷酸和PCR产物通过自动化基因合成来合成。将侧翼为单一限制性内切核酸酶切割位点的基因区段克隆入标准克隆/测序载体。自转化细菌纯化质粒DNA并通过UV光谱术测定浓度。通过DNA测序确认亚克隆基因片段的DNA序列。基因区段设计成具有合适的限制性位点以容许亚克隆入相应的表达载体。所有构建物均设计成具有编码在真核细胞中将蛋白质靶向分泌的前导肽的5’端DNA序列。
蛋白质纯化
参考标准方案,自经过过滤的细胞培养物上清液纯化蛋白质。简言之,将抗体应用于蛋白A Sepharose柱(GE Healthcare)并用PBS清洗。于pH 2.8实现抗体的洗脱,继以立即中和样品。在PBS中或在20mM组氨酸,150mM NaCl,pH 6.0中通过大小排阻层析术(Superdex200,GE Healthcare)将聚集的蛋白质与单体抗体分开。合并单体抗体级分,使用例如MILLIPORE Amicon Ultra(30MWCO)离心浓缩机浓缩(在需要时),冷冻并贮存于-20℃或-80℃。提供部分样品用于后续蛋白质分析和分析性表征,例如通过SDS-PAGE和大小排阻层析术(SEC)。
SDS-PAGE
依照制造商的说明书使用
Figure BDA0002644189030000581
预制凝胶***(Invitrogen)。特别地,使用10％或4-12％
Figure BDA0002644189030000582
Bis-TRIS预制凝胶(pH 6.4)和
Figure BDA0002644189030000583
MES(还原凝胶,具有
Figure BDA0002644189030000584
抗氧化剂运行缓冲液添加剂)或MOPS(非还原凝胶)运行缓冲液。
分析性大小排阻层析术
通过HPLC层析术实施大小排阻层析术(SEC),用于测定抗体的聚集和寡聚状态。简言之,将经过蛋白A纯化的抗体应用于Agilent HPLC 1100***上的300mM NaCl,50mMKH2PO4/K2HPO4,pH 7.5中的Tosoh TSKgel G3000SW柱或Dionex HPLC***上的2x PBS中的Superdex 200柱(GE Healthcare)。通过UV吸光度和峰面积积分量化洗脱的蛋白质。BioRad凝胶过滤标准品151-1901充当标准品。
抗体生成
使用聚乙撑亚胺通过用哺乳动物表达载体共转染HEK293-EBNA细胞来生成相应的抗体。以1:1比用重和轻链的相应表达载体转染细胞。
Jurkat NFAT CAR-T细胞的慢病毒转导
为了生成慢病毒载体,在慢病毒多核苷酸载体中在组成性有活性的人巨细胞病毒立即早期启动子(CMV)下同框克隆CAR的正确装配体的相应DNA序列。逆转录病毒载体含有旱獭肝炎病毒转录后调节元件(WPRE),中央多聚嘌呤束(cPPT)元件,pUC复制起点和编码用于推进细菌中的繁殖和选择的抗生素抗性的基因。
为了生成功能性病毒颗粒,使用60-70％汇合的Hek293T细胞(ATCC CRL3216)和含有CAR的载体以及pCMV-VSV-G:pRSV-REV:pCgpV转移载体以3:1:1:1比实施基于Lipofectamine LTXTM的转染。48小时后收集上清液,以250g离心5分钟以去除细胞碎片并穿过0.45μm或0.22μm聚醚砜滤器过滤。使用浓缩的病毒颗粒(Lenti-x-Concentrator,Takara)来转导Jurkat NFAT细胞(Signosis)。使用FACS-ARIA分选仪(BD Bioscience)作为集合或单一克隆分选阳性转导细胞。在细胞扩充至适宜密度之后将Jurkat NFAT报告CAR-T细胞用于实验。
实施例1
将抗CD20抗体GA101洋地黄毒苷化并通过Western印迹分析验证洋地黄毒苷(DIG)分子的掺入。为了抗体和洋地黄毒苷的偶联反应,首先使用ZebaTM旋转脱盐柱(ThermoFisher,目录号89889)将在20mM His,140mM NaCl,pH6中溶解的抗体脱盐并缓冲液交换至0.1M碳酸氢钠(pH8)缓冲液。将等摩尔或更高(1:3比)量的抗体和洋地黄毒苷-3-O-甲基羰基-e-氨基己酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯(Sigma Aldrich,目录号11333054001)在摇床上以300rpm于室温温育1小时。再次将抗体-洋地黄毒苷缀合物脱盐并将缓冲液交换至20mMHis,140mM NaCl,pH6。在同一步骤中去除未缀合的Dig-NHS(截留7kDa)。
在Western印迹中通过抗洋地黄毒苷-AP Fab片段(Sigma Aldrich,目录号11093274910)检测洋地黄毒苷化。将1μg相应的(未)缀合的抗体与NuPAGETM LDS样品缓冲液(4X)(ThermoFisher,目录号NP0007)以20μl的总体积混合并于95℃煮沸5分钟。将10μl加载到NuPAGETM 4-12％Bis-Tris蛋白质凝胶,1.0mm,10孔(ThermoFisher目录号NP0321)上并在1x NuPAGETM MES SDS运行缓冲液(目录号NP0002)中以170V运行1小时。随后,使用
Figure BDA0002644189030000591
TurboTM转移***(Bio-Rad,目录号1704150,混合分子量标准方案)将凝胶印迹到0.2μm PVDF膜(
Figure BDA0002644189030000592
TurboTM Pack,Bio-Rad,目录号1704156)上。将膜在定轨摇床上用含5％牛奶的1x TBS-T缓冲液于室温封闭1小时。将抗洋地黄毒苷-AP Fab片段在5％牛奶/TBS-T中1:2000稀释并在定轨摇床上于室温温育1小时。将膜用1x TBS-T清洗三次,每次10分钟。然后将膜在2ml
Figure BDA0002644189030000601
/用于膜的NBT-蓝色液体底物***(SigmaAldrich,目录号B3804)中温育1分钟。用双蒸水清洗三次后,将膜干燥并记录(图6)。
实施例2
通过FACS确认Jurkat NFAT报告CAR-T细胞中抗洋地黄毒苷-ds-scFv-CD28ATD-CD28CSDCD3zSSD的表达和洋地黄毒苷-Cy5对CAR的结合。将经抗洋地黄毒苷-ds-scFv-CD28ATD-CD28CSDCD3zSSD转导的Jurkat NFAT报告CAR-T细胞于室温以300g成团粒3分钟并在适宜体积的新鲜的RPMI-1640+10％FCS+1％Glutamax(生长培养基)中重悬浮。然后将3x105个细胞添加至96孔板中每个孔,以300g旋转下来一次5分钟并以100μl在含2％FCS的PBS中重悬浮。添加Dig-Cy5至20nM的终浓度并在冰上温育45分钟。然后使细胞成团粒并在冰冷的PBS中重悬浮。将清洗步骤再重复两次。然后经由流式细胞术对细胞分析Cy5信号(APC通道)(图7)。作为阴性对照,同样处理和分析未转导的Jurkat NFAT细胞。
实施例3
本文中描述的是报告CAR-T细胞测定法,使用CD20表达性SUDHDL4肿瘤细胞作为靶细胞和抗洋地黄毒苷-ds-scFv-CD28ATD-CD28CSDCD3zSSD表达性Jurkat NFAT报告CAR-T细胞的分选集合作为报告细胞(图9)。使用洋地黄毒苷化GA101 IgG(抗体:Dig-NHS比1:10)作为IgG,其一方面识别肿瘤抗原且另一方面受到经转导的Jurkat NFAT报告CAR-T细胞识别。作为阳性对照,将96孔板(Cellstar Greiner-bio-one,目录号655185)在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中用10μg/ml CD3抗体(来自
Figure BDA0002644189030000602
)或是于4℃包被过夜或是于37℃包被至少1小时。将CD3包被的孔用PBS清洗两次,在最终的清洗步骤之后完全去除PBS。对报告细胞或Jurkat NFAT野生型细胞计数并使用Cedex HiRes检查它们的存活力。将细胞数目调节至1x106个可存活细胞/ml。因此,将细胞悬浮液的适宜小份于室温(RT)以210g成团粒5分钟并在新鲜的RPMI-1640+10％FCS+1％Glutamax(生长培养基)中重悬浮。对表达感兴趣抗原的靶细胞计数并同样检查它们的存活力。在生长培养基中将细胞数目调节至1x106个可存活细胞/ml。在96孔悬浮培养板(Greiner-bio-one)中一式三份以5:1E:T比(总共110,000个细胞每孔)分配靶细胞和报告(效应)细胞。作为下一步,使用2ml深孔板
Figure BDA0002644189030000603
在生长培养基中制备靶向感兴趣抗原的洋地黄毒苷化GA101抗体的连续稀释液。为了获得200μl每孔的最终体积中范围为1μg/ml至0.01pg/ml的最终浓度,将不同稀释液的50μl小份移液至相应的孔。将96孔板以190g于室温离心2分钟。用
Figure BDA0002644189030000611
密封,将板在5％CO2潮湿气氛中于37℃温育。在20小时温育之后通过使用多通道移液器上下移液10次来混合每个孔的内容。将100μl细胞悬浮液转移至新的白色透明平底96孔板(Greiner-bio-one)并添加100μlONE-GloTM萤光素酶测定法(Promega)。在黑暗中以300rpm在旋转摇床上于室温温育15分钟之后使用
Figure BDA0002644189030000612
Spark10M读板仪测量发光,1秒/孔作为检测时间。在靶和报告细胞以5:1的比(灰色点)共培养20小时后,图显示当使用洋地黄毒苷化GA101 IgG作为抗体时抗洋地黄毒苷-ds-scFv-CD28ATD-CD28CSDCD3zSSD表达性Jurkat NFAT报告CAR-T细胞的剂量依赖性激活(图9)。当使用没有洋地黄毒苷化的GA101 IgG(图9,以灰色方形描绘)时,检测不到经转导的Jurkat NFAT报告CAR-T细胞的激活。而且,在有1μg/ml洋地黄毒苷化GA101但无靶细胞的情况下温育的Jurkat NFAT野生型细胞不显示任何激活(图9,黑色方形)。与之对比,在有1μg/ml洋地黄毒苷化GA101 IgG但无靶细胞的情况下温育的抗洋地黄毒苷-ds-scFv-CD28ATD-CD28CSDCD3zSSD表达性Jurkat NFAT报告CAR-T细胞显示激活(图9,黑色三角形)。
每个点代表技术上的一式三份的均值。在基线修正后描绘所有值。通过误差棒指示标准偏差。
实施例4
本文中描述的是报告CAR-T细胞测定法,使用抗洋地黄毒苷-ds-scFv-CD28ATD-CD28CSDCD3zSSD表达性Jurkat NFAT报告CAR-T细胞的分选集合(图10)作为报告细胞和偶联有不同量的洋地黄毒苷(DIG)分子的抗CD20IgG抗体(GA101)。对效应细胞计数并使用Cedex HiRes检查它们的存活力。将细胞数目调节至1x106个可存活细胞/ml。因此将细胞悬浮液的适宜小份于室温(RT)以210g成团粒5分钟并在新鲜的RPMI-1640+10％FCS+1％Glutamax(生长培养基)中重悬浮。在96孔悬浮培养板(Greiner-bio-one)中一式三份分配1x105个报告细胞。使用2ml深孔板
Figure BDA0002644189030000613
在生长培养基中制备抗GA101抗体的连续稀释液。所使用的抗GA101抗体特征是平均一个(1:1GA101-Dig),三个(1:3GA101-Dig)或十个(1:10GA101-Dig)洋地黄毒苷分子。作为对照,使用非洋地黄毒苷化的抗体(GA101 wt)。
抗体终浓度范围为1μg/ml至1pg/ml,终体积200μl每孔,将不同稀释液的100μl小份移液至装有报告细胞的相应的孔。将96孔板以190g于室温离心2分钟。用
Figure BDA0002644189030000621
密封,将板在5％CO2潮湿气氛中于37℃温育。在20小时温育之后通过使用多通道移液器上下移液10次来混合每个孔的内容。将100μl细胞悬浮液转移至新的白色透明平底96孔板(Greiner-bio-one)并添加100μl ONE-GloTM萤光素酶测定法(Promega)。在黑暗中以300rpm在旋转摇床上于室温温育15分钟之后使用
Figure BDA0002644189030000622
Spark10M读板仪测量发光,1秒/孔作为检测时间。
图显示当使用洋地黄毒苷化GA101 IgG作为抗体时抗洋地黄毒苷-ds-scFv-CD28ATD-CD28CSDCD3zSSD表达性Jurkat NFAT报告CAR-T细胞的剂量依赖性激活(图10)。图进一步显示偶联至抗体的洋地黄毒苷分子越多,抗洋地黄毒苷-ds-scFv-CD28ATD-CD28CSDCD3zSSD表达性Jurkat NFAT报告CAR-T细胞的激活越强。如果使用没有洋地黄毒苷化的GA101 IgG(图10,以黑色三角形描绘)的话,检测不到经转导的Jurkat NFAT报告CAR-T细胞的激活。
每个点代表技术上的一式三份的均值。在基线修正后描绘所有值。
实施例5
本文中描述的是报告CAR-T细胞测定法,使用CD20表达性SUDHDL4肿瘤细胞作为靶细胞和抗洋地黄毒苷-ds-scFv-CD28ATD-CD28CSDCD3zSSD表达性Jurkat NFAT报告CAR-T细胞的分选集合(图11)作为靶细胞。使用1:1洋地黄毒苷化GA101 IgG作为IgG,其一方面识别肿瘤抗原且另一方面受到经转导的Jurkat NFAT报告CAR-T细胞识别。对效应细胞计数并使用Cedex HiRes检查它们的存活力。将细胞数目调节至1x106个可存活细胞/ml。将细胞悬浮液的适宜小份于室温以210g成团粒5分钟并在新鲜的RPMI-1640+10％FCS+1％Glutamax(生长培养基)中重悬浮。同样对表达感兴趣抗原的靶细胞计数并检查它们的存活力。与关于报告细胞所述类似地在生长培养基中将细胞数目调节至1x106个可存活细胞/ml。在96孔悬浮培养板(Greiner-bio-one)中一式三份以5:1E:T比(总共110,000个细胞每孔)分配靶细胞和报告效应细胞。作为下一步,使用2ml深孔板
Figure BDA0002644189030000623
在生长培养基中制备靶向感兴趣抗原的洋地黄毒苷化GA101抗体的连续稀释液。为了获得200μl每孔的最终体积中范围为0.01μg/ml至0.1fg/ml的最终浓度,将不同稀释液的50μl小份移液至相应的孔。将96孔板以190g于室温离心2分钟。用
Figure BDA0002644189030000631
密封,将板在5％CO2潮湿气氛中于37℃温育。在20小时温育之后通过使用多通道移液器上下移液10次来混合每个孔的内容。将100μl细胞悬浮液转移至新的白色透明平底96孔板(Greiner-bio-one)并添加100μl ONE-GloTM萤光素酶测定法(Promega)。在黑暗中以300rpm在旋转摇床上于室温温育15分钟之后使用
Figure BDA0002644189030000632
Spark10M读板仪测量发光,1秒/孔作为检测时间。在靶和报告细胞以5:1(图11,黑色三角形)的比共培养20小时后,图显示当使用1:1洋地黄毒苷化GA101 IgG作为抗体时抗洋地黄毒苷化-ds-scFv-CD28ATD-CD28CSDCD3zSSD表达性Jurkat NFAT报告CAR-T细胞的剂量依赖性激活。如果使用没有洋地黄毒苷化的GA101 IgG(图11,以黑色点描绘)的话,检测不到经转导的Jurkat NFAT报告CAR-T细胞的激活。
每个点代表技术上的一式三份的均值。在基线修正后描绘所有值。通过误差棒指示标准偏差。
实施例6
本文中描述的是报告CAR-T细胞测定法,使用LeY表达性MCF7肿瘤细胞作为靶细胞和抗洋地黄毒苷-ds-scFv-CD28ATD-CD28CSDCD3zSSD表达性Jurkat NFAT报告CAR-T细胞的分选集合。使用两种抗LeY/生物素抗体(2+1,2+2)和桥接生物素-洋地黄毒苷衔接头。抗体一方面识别肿瘤相关抗原且另一方面识别生物素化衔接头分子。衔接头结合的洋地黄毒苷受到依照本发明的Jurkat NFAT报告CAR-T细胞表达性CAR识别(图13)。
在第0天对靶细胞计数并使用
Figure BDA0002644189030000633
Model TTC检查它们的存活力。在96孔板中分配细胞(20,000个细胞/孔,100μl)。将细胞悬浮液的适宜小份于室温(RT)以300g成团粒3分钟并在适宜量的新鲜的RPMI-1640+10％FCS+1％Glutamax(生长培养基)中重悬浮。
在第1天使用2ml深孔板
Figure BDA0002644189030000634
在生长培养基中制备靶向感兴趣抗原的LeY/生物素抗体衍生物的连续稀释液和等摩尔量的生物素-洋地黄毒苷衔接头分子。为了获得范围为0.01nM至10nM的最终浓度,将所需体积移液至相应的孔。
于37℃和5％CO2温育1小时后,去除包括未结合的抗体/衔接头的培养基。对报告(效应)细胞计数并使用
Figure BDA0002644189030000635
Modell TTC检查它们的存活力并将细胞悬浮液调节至1x106个细胞/ml。将细胞悬浮液的适宜小份于室温(RT)以300g成团粒3分钟并在适宜量的新鲜的RPMI-1640+10％FCS+1％Glutamax(生长培养基)中重悬浮。将100μl报告细胞悬浮液(1x105个细胞/孔(5:1E:T比))添加至每个孔。
将板在5％CO2潮湿气氛中于37℃温育。在20小时温育之后添加100μl ONE-GloTM萤光素酶测定法(Promega)。在黑暗中以300rpm在旋转摇床上于室温温育5分钟之后使用
Figure BDA0002644189030000641
Infinite F200 Pro测量发光,1秒/孔作为检测时间。在靶和报告细胞以5:1的比(图13)共培养20小时后,图显示当使用衔接头分子和靶向性LeY抗体衍生物时抗洋地黄毒苷-ds-scFv-CD28ATD-CD28CSDCD3zSSD表达性Jurkat NFAT报告CAR-T细胞的剂量依赖性激活。如果使用非靶向性CD33/生物素抗体+衔接头,或单独的衔接头的话,检测不到经转导的Jurkat NFAT报告CAR-T细胞的激活。
例示性序列
表2:抗DIG-ds-scFv氨基酸序列
Figure BDA0002644189030000642
Figure BDA0002644189030000651
表3:抗DIG-ds-scFv DNA序列
Figure BDA0002644189030000652
Figure BDA0002644189030000661
Figure BDA0002644189030000671
表4:抗DIG-Fab氨基酸序列
Figure BDA0002644189030000672
Figure BDA0002644189030000681
表5:抗DIG-Fab DNA序列
Figure BDA0002644189030000682
Figure BDA0002644189030000691
Figure BDA0002644189030000701
表6:抗FITC-scFv氨基酸序列
Figure BDA0002644189030000702
表7:抗HA-scFv氨基酸序列
Figure BDA0002644189030000703
Figure BDA0002644189030000711
表8:抗HA-Fab氨基酸序列
Figure BDA0002644189030000712
Figure BDA0002644189030000721
表9:抗生物素-scFv氨基酸序列
Figure BDA0002644189030000722
表10:抗myc-Fab氨基酸序列
Figure BDA0002644189030000723
Figure BDA0002644189030000731
表11:抗GCN4-scFv氨基酸序列
Figure BDA0002644189030000732
Figure BDA0002644189030000741
表12:多肽标签序列抗GCN4-scFv氨基酸序列
构建物 氨基酸序列 SEQ ID NO
HA标签 YPYDVPDYA 100
Myc标签 EQKLISEEDL 101
GCN4标签 YHLENEVARLKK 102
Avi标签 GLNDIFEAQKIEWH 103
表13
Figure BDA0002644189030000742
Figure BDA0002644189030000751
序列表
<110> 豪夫迈·罗氏有限公司（F.Hoffmann-La Roche）
<120> 用于新颖靶抗原结合模块的特异性测定法
<130> P34622
<160> 123
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗DIG CDR H1 Kabat
<400> 1
Asp Tyr Ala Met Ser
1 5
<210> 2
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗DIG CDR H2 Kabat
<400> 2
Ser Ile Asn Ile Gly Ala Thr Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 3
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗DIG CDR H3 Kabat
<400> 3
Pro Gly Ser Pro Tyr Glu Tyr Asp Lys Ala Tyr Tyr Ser Met Ala Tyr
1 5 10 15
<210> 4
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗DIG CDR L1 Kabat
<400> 4
Arg Ala Ser Gln Asp Ile Lys Asn Tyr Leu Asn
1 5 10
<210> 5
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗DIG CDR L2 Kabat
<400> 5
Tyr Ser Ser Thr Leu Leu Ser
1 5
<210> 6
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗DIG CDR L3 Kabat
<400> 6
Gln Gln Ser Ile Thr Leu Pro Pro Thr
1 5
<210> 7
<211> 437
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗DIG-ds-scFv-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD融合物
<400> 7
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Asn Ile Gly Ala Thr Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Pro Gly Ser Pro Tyr Glu Tyr Asp Lys Ala Tyr Tyr Ser Met
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
130 135 140
Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val
145 150 155 160
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Lys Asn
165 170 175
Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu
180 185 190
Ile Tyr Tyr Ser Ser Thr Leu Leu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
195 200 205
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln
210 215 220
Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ile Thr Leu Pro
225 230 235 240
Pro Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly
245 250 255
Ser Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser
260 265 270
Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg
275 280 285
Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro
290 295 300
Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe
305 310 315 320
Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro
325 330 335
Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly
340 345 350
Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro
355 360 365
Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr
370 375 380
Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly
385 390 395 400
Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln
405 410 415
Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln
420 425 430
Ala Leu Pro Pro Arg
435
<210> 8
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗DIG-ds VH
<400> 8
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Asn Ile Gly Ala Thr Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Pro Gly Ser Pro Tyr Glu Tyr Asp Lys Ala Tyr Tyr Ser Met
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 9
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗DIG-ds VL
<400> 9
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Lys Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Ser Ser Thr Leu Leu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ile Thr Leu Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 10
<211> 252
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗DIG-ds-scFv
<400> 10
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Asn Ile Gly Ala Thr Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Pro Gly Ser Pro Tyr Glu Tyr Asp Lys Ala Tyr Tyr Ser Met
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
130 135 140
Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val
145 150 155 160
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Lys Asn
165 170 175
Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu
180 185 190
Ile Tyr Tyr Ser Ser Thr Leu Leu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
195 200 205
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln
210 215 220
Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ile Thr Leu Pro
225 230 235 240
Pro Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
245 250
<210> 11
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD28ATD
<400> 11
Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu
1 5 10 15
Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val
20 25
<210> 12
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD28CSD
<400> 12
Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr
1 5 10 15
Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro
20 25 30
Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
35 40
<210> 13
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3zSSD
<400> 13
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 14
<211> 180
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD
<400> 14
Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu
1 5 10 15
Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser
20 25 30
Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly
35 40 45
Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala
50 55 60
Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala
65 70 75 80
Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg
85 90 95
Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu
100 105 110
Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn
115 120 125
Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met
130 135 140
Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly
145 150 155 160
Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala
165 170 175
Leu Pro Pro Arg
180
<210> 15
<211> 238
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> eGFP
<400> 15
Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val
1 5 10 15
Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly Glu
20 25 30
Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys
35 40 45
Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Leu
50 55 60
Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Gln
65 70 75 80
His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg
85 90 95
Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val
100 105 110
Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile
115 120 125
Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn
130 135 140
Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly
145 150 155 160
Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser Val
165 170 175
Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro
180 185 190
Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu Ser
195 200 205
Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe Val
210 215 220
Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys
225 230 235
<210> 16
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> (G4S)4接头
<400> 16
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser
20
<210> 17
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> G4S接头
<400> 17
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 18
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> T2A接头
<400> 18
Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn
1 5 10 15
Pro Gly Pro
<210> 19
<211> 1245
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗DIG-ds-scFv-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD融合物
<400> 19
atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtagcaacag ctaccggtgt gcattcccag 60
gtgcagctcg tggagtcagg gggaggcctg gtcaagcctg gcggctccct gagactgtct 120
tgcgccgcct ctggcttcac attctccgac tacgccatga gctggatcag acaggctccc 180
ggcaaatgcc tcgagtgggt gtccagcatc aacatcggcg ccacctacat ctactatgcc 240
gactccgtga agggccggtt caccatctcc agagacaacg ccaagaatag cctctatctc 300
cagatgaact ccctgcgggc cgaagatacc gctgtgtatt actgcgccag acccggcagc 360
ccctacgagt acgacaaggc ctactacagc atggcctact ggggccaggg caccaccgtg 420
acagtgtcat ctggaggggg cggaagtggt ggcgggggaa gcggcggggg tggcagcgga 480
gggggcggat ctgacatcca gatgacccag tccccaagca gcctgagcgc cagcgtgggc 540
gacagagtga ccatcacctg tcgggccagc caggacatca agaactacct gaattggtat 600
cagcagaaac ctggcaaagc ccctaagctg ctcatctact acagctccac cctgctgagc 660
ggcgtgccca gcagattttc cggcagcggg agcggcacag atttcacact gacaatctcc 720
agcctgcagc ctgaggactt cgccacctac tattgtcagc agagcatcac cctgcccccc 780
acctttggct gtggcacaaa agtcgagatc aagggagggg gcggatcctt ctgggtgctg 840
gtggtggtgg gcggcgtgct ggcctgctac agcctgctgg tgaccgtggc cttcatcatc 900
ttctgggtga gggtgaagtt cagcaggagc gccgacgccc ccgcctacca gcagggccag 960
aaccagctgt ataacgagct gaacctgggc aggagggagg agtacgacgt gctggacaag 1020
aggaggggca gggaccccga gatgggcggc aagcccagga ggaagaaccc ccaggagggc 1080
ctgtataacg agctgcagaa ggacaagatg gccgaggcct acagcgagat cggcatgaag 1140
ggcgagagga ggaggggcaa gggccacgac ggcctgtacc agggcctgag caccgccacc 1200
aaggacacct acgacgccct gcacatgcag gccctgcccc ccagg 1245
<210> 20
<211> 374
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗DIG-ds VH
<400> 20
aggtgcagct cgtggagtca gggggaggcc tggtcaagcc tggcggctcc ctgagactgt 60
cttgcgccgc ctctggcttc acattctccg actacgccat gagctggatc agacaggctc 120
ccggcaaatg cctcgagtgg gtgtccagca tcaacatcgg cgccacctac atctactatg 180
ccgactccgt gaagggccgg ttcaccatct ccagagacaa cgccaagaat agcctctatc 240
tccagatgaa ctccctgcgg gccgaagata ccgctgtgta ttactgcgcc agacccggca 300
gcccctacga gtacgacaag gcctactaca gcatggccta ctggggccag ggcaccaccg 360
tgacagtgtc atct 374
<210> 21
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗DIG-ds VL
<400> 21
gacatccaga tgacccagtc cccaagcagc ctgagcgcca gcgtgggcga cagagtgacc 60
atcacctgtc gggccagcca ggacatcaag aactacctga attggtatca gcagaaacct 120
ggcaaagccc ctaagctgct catctactac agctccaccc tgctgagcgg cgtgcccagc 180
agattttccg gcagcgggag cggcacagat ttcacactga caatctccag cctgcagcct 240
gaggacttcg ccacctacta ttgtcagcag agcatcaccc tgccccccac ctttggctgt 300
ggcacaaaag tcgagatcaa g 321
<210> 22
<211> 813
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗DIG-ds-scFv
<400> 22
atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtagcaacag ctaccggtgt gcattcccag 60
gtgcagctcg tggagtcagg gggaggcctg gtcaagcctg gcggctccct gagactgtct 120
tgcgccgcct ctggcttcac attctccgac tacgccatga gctggatcag acaggctccc 180
ggcaaatgcc tcgagtgggt gtccagcatc aacatcggcg ccacctacat ctactatgcc 240
gactccgtga agggccggtt caccatctcc agagacaacg ccaagaatag cctctatctc 300
cagatgaact ccctgcgggc cgaagatacc gctgtgtatt actgcgccag acccggcagc 360
ccctacgagt acgacaaggc ctactacagc atggcctact ggggccaggg caccaccgtg 420
acagtgtcat ctggaggggg cggaagtggt ggcgggggaa gcggcggggg tggcagcgga 480
gggggcggat ctgacatcca gatgacccag tccccaagca gcctgagcgc cagcgtgggc 540
gacagagtga ccatcacctg tcgggccagc caggacatca agaactacct gaattggtat 600
cagcagaaac ctggcaaagc ccctaagctg ctcatctact acagctccac cctgctgagc 660
ggcgtgccca gcagattttc cggcagcggg agcggcacag atttcacact gacaatctcc 720
agcctgcagc ctgaggactt cgccacctac tattgtcagc agagcatcac cctgcccccc 780
acctttggct gtggcacaaa agtcgagatc aag 813
<210> 23
<211> 717
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> eGFP
<400> 23
gtgagcaagg gcgaggagct gttcaccggg gtggtgccca tcctggtcga gctggacggc 60
gacgtaaacg gccacaagtt cagcgtgtcc ggcgagggcg agggcgatgc cacctacggc 120
aagctgaccc tgaagttcat ctgcaccacc ggcaagctgc ccgtgccctg gcccaccctc 180
gtgaccaccc tgacctacgg cgtgcagtgc ttcagccgct accccgacca catgaagcag 240
cacgacttct tcaagtccgc catgcccgaa ggctacgtcc aggagcgcac catcttcttc 300
aaggacgacg gcaactacaa gacccgcgcc gaggtgaagt tcgagggcga caccctggtg 360
aaccgcatcg agctgaaggg catcgacttc aaggaggacg gcaacatcct ggggcacaag 420
ctggagtaca actacaacag ccacaacgtc tatatcatgg ccgacaagca gaagaacggc 480
atcaaggtga acttcaagat ccgccacaac atcgaggacg gcagcgtgca gctcgccgac 540
cactaccagc agaacacccc catcggcgac ggccccgtgc tgctgcccga caaccactac 600
ctgagcaccc agtccgccct gagcaaagac cccaacgaga agcgcgatca catggtcctg 660
ctggagttcg tgaccgccgc cgggatcact ctcggcatgg acgagctgta caagtga 717
<210> 24
<211> 81
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CD28ATD
<400> 24
ttttgggtgc tggtggtggt tggtggagtc ctggcttgct atagcttgct agtaacagtg 60
gcctttatta ttttctgggt g 81
<210> 25
<211> 123
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CD28CSD
<400> 25
aggagtaaga ggagcaggct cctgcacagt gactacatga acatgactcc ccgccgcccc 60
gggcccaccc gcaagcatta ccagccctat gccccaccac gcgacttcgc agcctatcgc 120
tcc 123
<210> 26
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3zSSD
<400> 26
agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtacc agcagggcca gaaccagctc 60
tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120
cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 180
gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 240
cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 300
tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgc 336
<210> 27
<211> 540
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD
<400> 27
ttctgggtgc tggtggtggt gggcggcgtg ctggcctgct acagcctgct ggtgaccgtg 60
gccttcatca tcttctgggt gaggagcaag aggagcaggc tgctgcacag cgactacatg 120
aacatgaccc ccaggaggcc cggccccacc aggaagcact accagcccta cgcccccccc 180
agggacttcg ccgcctacag gagcagggtg aagttcagca ggagcgccga cgcccccgcc 240
taccagcagg gccagaacca gctgtataac gagctgaacc tgggcaggag ggaggagtac 300
gacgtgctgg acaagaggag gggcagggac cccgagatgg gcggcaagcc caggaggaag 360
aacccccagg agggcctgta taacgagctg cagaaggaca agatggccga ggcctacagc 420
gagatcggca tgaagggcga gaggaggagg ggcaagggcc acgacggcct gtaccagggc 480
ctgagcaccg ccaccaagga cacctacgac gccctgcaca tgcaggccct gccccccagg 540
<210> 28
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> T2A元件
<400> 28
tccggagagg gcagaggaag tcttctaaca tgcggtgacg tggaggagaa tcccggccct 60
agg 63
<210> 29
<211> 413
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗DIG-Fab-重链-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD融合物pETR17594
<400> 29
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Asn Ile Gly Ala Thr Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Pro Gly Ser Pro Tyr Glu Tyr Asp Lys Ala Tyr Tyr Ser Met
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr
115 120 125
Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser
130 135 140
Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu
145 150 155 160
Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His
165 170 175
Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser
180 185 190
Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys
195 200 205
Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu
210 215 220
Pro Lys Ser Cys Gly Gly Gly Gly Ser Phe Trp Val Leu Val Val Val
225 230 235 240
Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile
245 250 255
Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr
260 265 270
Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln
275 280 285
Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys
290 295 300
Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln
305 310 315 320
Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu
325 330 335
Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg
340 345 350
Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met
355 360 365
Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly
370 375 380
Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp
385 390 395 400
Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
405 410
<210> 30
<211> 228
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗DIG-Fab重链
<400> 30
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Asn Ile Gly Ala Thr Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Pro Gly Ser Pro Tyr Glu Tyr Asp Lys Ala Tyr Tyr Ser Met
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr
115 120 125
Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser
130 135 140
Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu
145 150 155 160
Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His
165 170 175
Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser
180 185 190
Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys
195 200 205
Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu
210 215 220
Pro Lys Ser Cys
225
<210> 31
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗DIG-Fab轻链
<400> 31
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Lys Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Ser Ser Thr Leu Leu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ile Thr Leu Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 32
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗DIG VH
<400> 32
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Asn Ile Gly Ala Thr Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Pro Gly Ser Pro Tyr Glu Tyr Asp Lys Ala Tyr Tyr Ser Met
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 33
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗DIG VL
<400> 33
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Lys Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Ser Ser Thr Leu Leu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ile Thr Leu Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 34
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CL
<400> 34
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 35
<211> 103
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CH1 (人)
<400> 35
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
100
<210> 36
<211> 3319
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗DIG-Fab-重链-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD融合物pETR17176
<400> 36
atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtagcaacag ctaccggtgt gcactccgat 60
attcagatga cccagagccc gagcagcctg agcgcgagcg tgggcgatcg cgtgaccatt 120
acctgccgcg cgagccagga tattaaaaac tatctgaact ggtatcagca gaaaccgggc 180
aaagcgccga aactgctgat ttattatagc agcaccctgc tgagcggcgt gccgagccgc 240
tttagcggca gcggcagcgg caccgatttt accctgacca ttagcagcct gcagccggaa 300
gattttgcga cctattattg ccagcagagc attaccctgc cgccgacctt tggcggcggc 360
accaaagtgg aaattaaacg cactgtcgcc gctccctctg tgttcatttt tcctccaagt 420
gatgagcagc tcaaaagcgg taccgcatcc gttgtgtgcc tgcttaacaa cttctatccc 480
cgggaagcca aggtccaatg gaaggtggac aatgctctgc agtcaggaaa cagtcaggag 540
agcgtaaccg agcaggattc caaagactct acttactcat tgagctccac cctgacactc 600
tctaaggcag actatgaaaa gcataaagtg tacgcctgtg aggttaccca ccagggcctg 660
agtagccctg tgacaaagtc cttcaatagg ggagagtgct agaatagaat tccccgaagt 720
aacttagaag ctgtaaatca acgatcaata gcaggtgtgg cacaccagtc ataccttgat 780
caagcacttc tgtttccccg gactgagtat caataggctg ctcgcgcggc tgaaggagaa 840
aacgttcgtt acccgaccaa ctacttcgag aagcttagta ccaccatgaa cgaggcaggg 900
tgtttcgctc agcacaaccc cagtgtagat caggctgatg agtcactgca acccccatgg 960
gcgaccatgg cagtggctgc gttggcggcc tgcccatgga gaaatccatg ggacgctcta 1020
attctgacat ggtgtgaagt gcctattgag ctaactggta gtcctccggc ccctgattgc 1080
ggctaatcct aactgcggag cacatgctca caaaccagtg ggtggtgtgt cgtaacgggc 1140
aactctgcag cggaaccgac tactttgggt gtccgtgttt ccttttattc ctatattggc 1200
tgcttatggt gacaatcaaa aagttgttac catatagcta ttggattggc catccggtgt 1260
gcaacagggc aactgtttac ctatttattg gttttgtacc attatcactg aagtctgtga 1320
tcactctcaa attcattttg accctcaaca caatcaaacg ccaccatggg atggagctgt 1380
atcatcctct tcttggtagc aacagctact ggtgtgcatt cccaggtgca gctggtggaa 1440
agcggcggcg gcctggtgaa accgggcggc agcctgcgcc tgagctgcgc ggcgagcggc 1500
tttaccttta gcgattatgc gatgagctgg attcgccagg cgccgggcaa aggcctggaa 1560
tgggtgagca gcattaacat tggcgcgacc tatatttatt atgcggatag cgtgaaaggc 1620
cgctttacca ttagccgcga taacgcgaaa aacagcctgt atctgcagat gaacagcctg 1680
cgcgcggaag ataccgcggt gtattattgc gcgcgcccgg gcagcccgta tgaatatgat 1740
aaagcgtatt atagcatggc gtattggggc cagggcacca ccgtgaccgt gagcagcgcg 1800
tcgactaagg gcccttcagt ttttccactc gcccccagta gcaagtccac atctgggggt 1860
accgctgccc tgggctgcct tgtgaaagac tatttccctg aaccagtcac tgtgtcatgg 1920
aatagcggag ccctgacctc cggtgtacac acattccccg ctgtgttgca gtctagtggc 1980
ctgtacagcc tctcctctgt tgtgaccgtc ccttcaagct ccctggggac acagacctat 2040
atctgtaacg tgaatcataa gccatctaac actaaagtag ataaaaaagt ggagcccaag 2100
agttgcggag ggggcggatc cttctgggtg ctggtggtgg tgggcggcgt gctggcctgc 2160
tacagcctgc tggtgaccgt ggccttcatc atcttctggg tgagggtgaa gttcagcagg 2220
agcgccgacg cccccgccta ccagcagggc cagaaccagc tgtataacga gctgaacctg 2280
ggcaggaggg aggagtacga cgtgctggac aagaggaggg gcagggaccc cgagatgggc 2340
ggcaagccca ggaggaagaa cccccaggag ggcctgtata acgagctgca gaaggacaag 2400
atggccgagg cctacagcga gatcggcatg aagggcgaga ggaggagggg caagggccac 2460
gacggcctgt accagggcct gagcaccgcc accaaggaca cctacgacgc cctgcacatg 2520
caggccctgc cccccaggtc cggagagggc agaggaagtc ttctaacatg cggtgacgtg 2580
gaggagaatc ccggccctag ggtgagcaag ggcgaggagc tgttcaccgg ggtggtgccc 2640
atcctggtcg agctggacgg cgacgtaaac ggccacaagt tcagcgtgtc cggcgagggc 2700
gagggcgatg ccacctacgg caagctgacc ctgaagttca tctgcaccac cggcaagctg 2760
cccgtgccct ggcccaccct cgtgaccacc ctgacctacg gcgtgcagtg cttcagccgc 2820
taccccgacc acatgaagca gcacgacttc ttcaagtccg ccatgcccga aggctacgtc 2880
caggagcgca ccatcttctt caaggacgac ggcaactaca agacccgcgc cgaggtgaag 2940
ttcgagggcg acaccctggt gaaccgcatc gagctgaagg gcatcgactt caaggaggac 3000
ggcaacatcc tggggcacaa gctggagtac aactacaaca gccacaacgt ctatatcatg 3060
gccgacaagc agaagaacgg catcaaggtg aacttcaaga tccgccacaa catcgaggac 3120
ggcagcgtgc agctcgccga ccactaccag cagaacaccc ccatcggcga cggccccgtg 3180
ctgctgcccg acaaccacta cctgagcacc cagtccgccc tgagcaaaga ccccaacgag 3240
aagcgcgatc acatggtcct gctggagttc gtgaccgccg ccgggatcac tctcggcatg 3300
gacgagctgt acaagtgat 3319
<210> 37
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗DIG VL
<400> 37
gatattcaga tgacccagag cccgagcagc ctgagcgcga gcgtgggcga tcgcgtgacc 60
attacctgcc gcgcgagcca ggatattaaa aactatctga actggtatca gcagaaaccg 120
ggcaaagcgc cgaaactgct gatttattat agcagcaccc tgctgagcgg cgtgccgagc 180
cgctttagcg gcagcggcag cggcaccgat tttaccctga ccattagcag cctgcagccg 240
gaagattttg cgacctatta ttgccagcag agcattaccc tgccgccgac ctttggcggc 300
ggcaccaaag tggaaattaa a 321
<210> 38
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CL
<400> 38
cgcactgtcg ccgctccctc tgtgttcatt tttcctccaa gtgatgagca gctcaaaagc 60
ggtaccgcat ccgttgtgtg cctgcttaac aacttctatc cccgggaagc caaggtccaa 120
tggaaggtgg acaatgctct gcagtcagga aacagtcagg agagcgtaac cgagcaggat 180
tccaaagact ctacttactc attgagctcc accctgacac tctctaaggc agactatgaa 240
aagcataaag tgtacgcctg tgaggttacc caccagggcc tgagtagccc tgtgacaaag 300
tccttcaata ggggagagtg c 321
<210> 39
<211> 375
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗DIG VH
<400> 39
caggtgcagc tggtggaaag cggcggcggc ctggtgaaac cgggcggcag cctgcgcctg 60
agctgcgcgg cgagcggctt tacctttagc gattatgcga tgagctggat tcgccaggcg 120
ccgggcaaag gcctggaatg ggtgagcagc attaacattg gcgcgaccta tatttattat 180
gcggatagcg tgaaaggccg ctttaccatt agccgcgata acgcgaaaaa cagcctgtat 240
ctgcagatga acagcctgcg cgcggaagat accgcggtgt attattgcgc gcgcccgggc 300
agcccgtatg aatatgataa agcgtattat agcatggcgt attggggcca gggcaccacc 360
gtgaccgtga gcagc 375
<210> 40
<211> 309
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CH1
<400> 40
gcgtcgacta agggcccttc agtttttcca ctcgccccca gtagcaagtc cacatctggg 60
ggtaccgctg ccctgggctg ccttgtgaaa gactatttcc ctgaaccagt cactgtgtca 120
tggaatagcg gagccctgac ctccggtgta cacacattcc ccgctgtgtt gcagtctagt 180
ggcctgtaca gcctctcctc tgttgtgacc gtcccttcaa gctccctggg gacacagacc 240
tatatctgta acgtgaatca taagccatct aacactaaag tagataaaaa agtggagccc 300
aagagttgc 309
<210> 41
<211> 647
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IRES EV71, 内部核糖体进入位点
<400> 41
cccgaagtaa cttagaagct gtaaatcaac gatcaatagc aggtgtggca caccagtcat 60
accttgatca agcacttctg tttccccgga ctgagtatca ataggctgct cgcgcggctg 120
aaggagaaaa cgttcgttac ccgaccaact acttcgagaa gcttagtacc accatgaacg 180
aggcagggtg tttcgctcag cacaacccca gtgtagatca ggctgatgag tcactgcaac 240
ccccatgggc gaccatggca gtggctgcgt tggcggcctg cccatggaga aatccatggg 300
acgctctaat tctgacatgg tgtgaagtgc ctattgagct aactggtagt cctccggccc 360
ctgattgcgg ctaatcctaa ctgcggagca catgctcaca aaccagtggg tggtgtgtcg 420
taacgggcaa ctctgcagcg gaaccgacta ctttgggtgt ccgtgtttcc ttttattcct 480
atattggctg cttatggtga caatcaaaaa gttgttacca tatagctatt ggattggcca 540
tccggtgtgc aacagggcaa ctgtttacct atttattggt tttgtaccat tatcactgaa 600
gtctgtgatc actctcaaat tcattttgac cctcaacaca atcaaac 647
<210> 42
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗FITC CDR H1 Kabat
<400> 42
His Tyr Trp Met Asn
1 5
<210> 43
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗 FITC CDR H2 Kabat
<400> 43
Gln Phe Arg Asn Lys Pro Tyr Asn Tyr Glu Thr Tyr Tyr Ser Asp Ser
1 5 10 15
Val Lys Gly
<210> 44
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗FITC CDR H3 Kabat
<400> 44
Ala Ser Tyr Gly Met Glu Tyr
1 5
<210> 45
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗FITC CDR L1 Kabat
<400> 45
Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Arg
1 5 10 15
<210> 46
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗FITC CDR L2 Kabat
<400> 46
Lys Val Ser Asn Arg Val Ser
1 5
<210> 47
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗FITC CDR L3 Kabat
<400> 47
Ser Gln Ser Thr His Val Pro Trp Thr
1 5
<210> 48
<211> 436
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗FITC-scFv-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD融合物
<400> 48
Gly Val Lys Leu Asp Glu Thr Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ala Met Lys Leu Ser Cys Val Thr Ser Gly Phe Thr Phe Gly His Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Gln Phe Arg Asn Lys Pro Tyr Asn Tyr Glu Thr Tyr Tyr Ser Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ser
65 70 75 80
Val Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Arg Val Glu Asp Thr Gly Ile Tyr
85 90 95
Tyr Cys Thr Gly Ala Ser Tyr Gly Met Glu Tyr Leu Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Val Met Thr Gln
130 135 140
Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser
145 150 155 160
Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu
165 170 175
Arg Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Val Leu Ile Tyr
180 185 190
Lys Val Ser Asn Arg Val Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser
195 200 205
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Asn Arg Val Glu Ala Glu
210 215 220
Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser Thr His Val Pro Trp Thr
225 230 235 240
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Gly Gly Gly Gly Ser
245 250 255
Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu
260 265 270
Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser
275 280 285
Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly
290 295 300
Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala
305 310 315 320
Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala
325 330 335
Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg
340 345 350
Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu
355 360 365
Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn
370 375 380
Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met
385 390 395 400
Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly
405 410 415
Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala
420 425 430
Leu Pro Pro Arg
435
<210> 49
<211> 250
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗FITC-scFv
<400> 49
Gly Val Lys Leu Asp Glu Thr Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ala Met Lys Leu Ser Cys Val Thr Ser Gly Phe Thr Phe Gly His Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Gln Phe Arg Asn Lys Pro Tyr Asn Tyr Glu Thr Tyr Tyr Ser Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ser
65 70 75 80
Val Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Arg Val Glu Asp Thr Gly Ile Tyr
85 90 95
Tyr Cys Thr Gly Ala Ser Tyr Gly Met Glu Tyr Leu Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Val Met Thr Gln
130 135 140
Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser
145 150 155 160
Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu
165 170 175
Arg Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Val Leu Ile Tyr
180 185 190
Lys Val Ser Asn Arg Val Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser
195 200 205
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Asn Arg Val Glu Ala Glu
210 215 220
Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser Thr His Val Pro Trp Thr
225 230 235 240
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
245 250
<210> 50
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗FITC VH
<400> 50
Gly Val Lys Leu Asp Glu Thr Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ala Met Lys Leu Ser Cys Val Thr Ser Gly Phe Thr Phe Gly His Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Gln Phe Arg Asn Lys Pro Tyr Asn Tyr Glu Thr Tyr Tyr Ser Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ser
65 70 75 80
Val Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Arg Val Glu Asp Thr Gly Ile Tyr
85 90 95
Tyr Cys Thr Gly Ala Ser Tyr Gly Met Glu Tyr Leu Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Ser Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 51
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗FITC VL
<400> 51
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Arg Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Val Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Val Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Asn Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser
85 90 95
Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 52
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗HA CDR H1 Kabat
<400> 52
Asn Tyr Asp Met Ala
1 5
<210> 53
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗HA CDR H2 Kabat
<400> 53
Thr Ile Ser His Asp Gly Arg Asn Thr Asn Tyr Arg Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 54
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗HA CDR H3 Kabat
<400> 54
Pro Gly Phe Ala His
1 5
<210> 55
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗HA CDR L1 Kabat
<400> 55
Arg Ser Ser Lys Thr Leu Leu Asn Thr Arg Gly Ile Thr Ser Leu Tyr
1 5 10 15
<210> 56
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗HA CDR L2 Kabat
<400> 56
Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser
1 5
<210> 57
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗HA CDR L3 Kabat
<400> 57
Ala Gln Phe Leu Glu Phe Pro Leu Thr
1 5
<210> 58
<211> 431
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗HA-scFv-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD融合物
<400> 58
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Met Lys Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Ile Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Asp Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Lys Lys Cys Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser His Asp Gly Arg Asn Thr Asn Tyr Arg Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Gly Ser Arg Asp Ser Ala Gln Ser Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Gly Pro Gly Phe Ala His Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
100 105 110
Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Leu Thr Gln Ala Pro Leu Ser
130 135 140
Val Ser Val Ser Pro Gly Glu Ser Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser
145 150 155 160
Lys Thr Leu Leu Asn Thr Arg Gly Ile Thr Ser Leu Tyr Trp Tyr Leu
165 170 175
Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn
180 185 190
Leu Ala Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Glu Thr
195 200 205
His Phe Thr Leu Gln Ile Ser Lys Val Glu Thr Glu Asp Val Gly Ile
210 215 220
Tyr Tyr Cys Ala Gln Phe Leu Glu Phe Pro Leu Thr Phe Gly Cys Gly
225 230 235 240
Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Phe Trp Val Leu Val
245 250 255
Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala
260 265 270
Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser
275 280 285
Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His
290 295 300
Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg
305 310 315 320
Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln
325 330 335
Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp
340 345 350
Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro
355 360 365
Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp
370 375 380
Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg
385 390 395 400
Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr
405 410 415
Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
420 425 430
<210> 59
<211> 246
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗HA-scFv
<400> 59
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Met Lys Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Ile Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Asp Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Lys Lys Cys Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser His Asp Gly Arg Asn Thr Asn Tyr Arg Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Gly Ser Arg Asp Ser Ala Gln Ser Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Gly Pro Gly Phe Ala His Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
100 105 110
Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Leu Thr Gln Ala Pro Leu Ser
130 135 140
Val Ser Val Ser Pro Gly Glu Ser Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser
145 150 155 160
Lys Thr Leu Leu Asn Thr Arg Gly Ile Thr Ser Leu Tyr Trp Tyr Leu
165 170 175
Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn
180 185 190
Leu Ala Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Glu Thr
195 200 205
His Phe Thr Leu Gln Ile Ser Lys Val Glu Thr Glu Asp Val Gly Ile
210 215 220
Tyr Tyr Cys Ala Gln Phe Leu Glu Phe Pro Leu Thr Phe Gly Cys Gly
225 230 235 240
Thr Lys Leu Glu Ile Lys
245
<210> 60
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗HA VH
<400> 60
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Met Lys Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Ile Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Asp Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Lys Lys Cys Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser His Asp Gly Arg Asn Thr Asn Tyr Arg Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Gly Ser Arg Asp Ser Ala Gln Ser Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Gly Pro Gly Phe Ala His Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
100 105 110
Ser Ser
<210> 61
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗HA VL
<400> 61
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ala Pro Leu Ser Val Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Ser Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Thr Leu Leu Asn Thr
20 25 30
Arg Gly Ile Thr Ser Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Lys Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Glu Thr His Phe Thr Leu Gln Ile
65 70 75 80
Ser Lys Val Glu Thr Glu Asp Val Gly Ile Tyr Tyr Cys Ala Gln Phe
85 90 95
Leu Glu Phe Pro Leu Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 62
<211> 402
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗HA-Fab-重链-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD融合物
<400> 62
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Met Lys Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Ile Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Asp Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Lys Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser His Asp Gly Arg Asn Thr Asn Tyr Arg Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Gly Ser Arg Asp Ser Ala Gln Ser Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Gly Pro Gly Phe Ala His Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
100 105 110
Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser
115 120 125
Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys
130 135 140
Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu
145 150 155 160
Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu
165 170 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr
180 185 190
Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val
195 200 205
Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Gly Gly Gly Gly Ser Phe Trp
210 215 220
Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val
225 230 235 240
Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu
245 250 255
Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr
260 265 270
Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr
275 280 285
Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln
290 295 300
Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu
305 310 315 320
Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly
325 330 335
Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu
340 345 350
Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly
355 360 365
Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser
370 375 380
Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro
385 390 395 400
Pro Arg
<210> 63
<211> 217
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗HA-Fab重链
<400> 63
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Met Lys Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Ile Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Asp Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Lys Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser His Asp Gly Arg Asn Thr Asn Tyr Arg Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Gly Ser Arg Asp Ser Ala Gln Ser Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Gly Pro Gly Phe Ala His Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
100 105 110
Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser
115 120 125
Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys
130 135 140
Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu
145 150 155 160
Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu
165 170 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr
180 185 190
Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val
195 200 205
Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215
<210> 64
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗HA-Fab轻链
<400> 64
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ala Pro Leu Ser Val Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Ser Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Thr Leu Leu Asn Thr
20 25 30
Arg Gly Ile Thr Ser Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Lys Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Glu Thr His Phe Thr Leu Gln Ile
65 70 75 80
Ser Lys Val Glu Thr Glu Asp Val Gly Ile Tyr Tyr Cys Ala Gln Phe
85 90 95
Leu Glu Phe Pro Leu Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 65
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗HA VH
<400> 65
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Met Lys Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Ile Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Asp Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Lys Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser His Asp Gly Arg Asn Thr Asn Tyr Arg Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Gly Ser Arg Asp Ser Ala Gln Ser Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Gly Pro Gly Phe Ala His Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
100 105 110
Ser Ser
<210> 66
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗HA VL
<400> 66
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ala Pro Leu Ser Val Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Ser Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Thr Leu Leu Asn Thr
20 25 30
Arg Gly Ile Thr Ser Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Lys Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Glu Thr His Phe Thr Leu Gln Ile
65 70 75 80
Ser Lys Val Glu Thr Glu Asp Val Gly Ile Tyr Tyr Cys Ala Gln Phe
85 90 95
Leu Glu Phe Pro Leu Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 67
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗生物素CDR H1 Kabat
<400> 67
Gly Phe Asn Asn Lys Asp Thr Phe Phe Gln
1 5 10
<210> 68
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗生物素CDR H2 Kabat
<400> 68
Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Phe Thr Lys Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 69
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗生物素CDR H3 Kabat
<400> 69
Trp Asp Thr Tyr Gly Ala Ala Trp Phe Ala Tyr
1 5 10
<210> 70
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗生物素CDR L1 Kabat
<400> 70
Arg Ala Ser Gly Asn Ile His Asn Tyr Leu Ser
1 5 10
<210> 71
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗生物素CDR L2 Kabat
<400> 71
Ser Ala Lys Thr Leu Ala Asp
1 5
<210> 72
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗生物素CDR L3 Kabat
<400> 72
Gln His Phe Trp Ser Ser Ile Tyr Thr
1 5
<210> 73
<211> 433
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗生物素-scFv-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD融合物
<400> 73
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ser Ser Gly Phe Asn Asn Lys Asp Thr
20 25 30
Phe Phe Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Cys Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Phe Thr Lys Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Trp Asp Thr Tyr Gly Ala Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met
130 135 140
Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr
145 150 155 160
Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gly Asn Ile His Asn Tyr Leu Ser Trp Tyr
165 170 175
Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Lys
180 185 190
Thr Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
195 200 205
Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Val Ala
210 215 220
Thr Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Ser Ser Ile Tyr Thr Phe Gly Cys
225 230 235 240
Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Gly Gly Gly Gly Ser Phe Trp Val
245 250 255
Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr
260 265 270
Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu
275 280 285
His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg
290 295 300
Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg
305 310 315 320
Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln
325 330 335
Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu
340 345 350
Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly
355 360 365
Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln
370 375 380
Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu
385 390 395 400
Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr
405 410 415
Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro
420 425 430
Arg
<210> 74
<211> 247
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗生物素-scFv
<400> 74
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ser Ser Gly Phe Asn Asn Lys Asp Thr
20 25 30
Phe Phe Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Cys Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Phe Thr Lys Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Trp Asp Thr Tyr Gly Ala Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met
130 135 140
Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr
145 150 155 160
Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gly Asn Ile His Asn Tyr Leu Ser Trp Tyr
165 170 175
Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Lys
180 185 190
Thr Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
195 200 205
Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Val Ala
210 215 220
Thr Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Ser Ser Ile Tyr Thr Phe Gly Cys
225 230 235 240
Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
245
<210> 75
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗生物素VH
<400> 75
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ser Ser Gly Phe Asn Asn Lys Asp Thr
20 25 30
Phe Phe Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Cys Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Phe Thr Lys Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Trp Asp Thr Tyr Gly Ala Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 76
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗生物素VL
<400> 76
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gly Asn Ile His Asn Tyr
20 25 30
Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Lys Thr Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Ser Ser Ile Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 77
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗myc CDR H1 Kabat
<400> 77
His Tyr Gly Met Ser
1 5
<210> 78
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗myc CDR H2 Kabat
<400> 78
Thr Ile Gly Ser Arg Gly Thr Tyr Thr His Tyr Pro Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 79
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗myc CDR H3 Kabat
<400> 79
Arg Ser Glu Phe Tyr Tyr Tyr Gly Asn Thr Tyr Tyr Tyr Ser Ala Met
1 5 10 15
Asp Tyr
<210> 80
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗myc CDR L1 Kabat
<400> 80
Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr Gly Phe Ser Phe Met Asn
1 5 10 15
<210> 81
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗myc CDR L2 Kabat
<400> 81
Ala Ile Ser Asn Arg Gly Ser
1 5
<210> 82
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗myc CDR L3 Kabat
<400> 82
Gln Gln Thr Lys Glu Val Pro Trp Thr
1 5
<210> 83
<211> 414
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗myc-Fab-重链-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD融合物
<400> 83
Glu Val His Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser His Tyr
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Asp Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Gly Ser Arg Gly Thr Tyr Thr His Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Asp Lys Asn Ala Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Ser Glu Phe Tyr Tyr Tyr Gly Asn Thr Tyr Tyr Tyr Ser
100 105 110
Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Ala Ser Val Thr Val Ser Ser Ala
115 120 125
Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala
130 135 140
Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe
145 150 155 160
Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly
165 170 175
Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser
180 185 190
Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val Thr
195 200 205
Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile
210 215 220
Val Pro Arg Asp Cys Gly Gly Gly Gly Ser Phe Trp Val Leu Val Val
225 230 235 240
Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe
245 250 255
Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp
260 265 270
Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr
275 280 285
Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val
290 295 300
Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn
305 310 315 320
Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val
325 330 335
Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg
340 345 350
Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys
355 360 365
Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg
370 375 380
Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys
385 390 395 400
Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
405 410
<210> 84
<211> 229
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗myc-Fab重链
<400> 84
Glu Val His Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser His Tyr
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Asp Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Gly Ser Arg Gly Thr Tyr Thr His Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Asp Lys Asn Ala Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Ser Glu Phe Tyr Tyr Tyr Gly Asn Thr Tyr Tyr Tyr Ser
100 105 110
Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Ala Ser Val Thr Val Ser Ser Ala
115 120 125
Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala
130 135 140
Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe
145 150 155 160
Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly
165 170 175
Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser
180 185 190
Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val Thr
195 200 205
Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile
210 215 220
Val Pro Arg Asp Cys
225
<210> 85
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗myc-Fab轻链
<400> 85
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr
20 25 30
Gly Phe Ser Phe Met Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ile Ser Asn Arg Gly Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Asn Ile His
65 70 75 80
Pro Val Glu Glu Asp Asp Pro Ala Met Tyr Phe Cys Gln Gln Thr Lys
85 90 95
Glu Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105 110
Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln
115 120 125
Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr
130 135 140
Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln
145 150 155 160
Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
165 170 175
Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg
180 185 190
His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro
195 200 205
Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
210 215
<210> 86
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗myc VH
<400> 86
Glu Val His Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser His Tyr
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Asp Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Gly Ser Arg Gly Thr Tyr Thr His Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Asp Lys Asn Ala Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Ser Glu Phe Tyr Tyr Tyr Gly Asn Thr Tyr Tyr Tyr Ser
100 105 110
Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Ala Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 87
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗myc VL
<400> 87
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr
20 25 30
Gly Phe Ser Phe Met Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ile Ser Asn Arg Gly Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Asn Ile His
65 70 75 80
Pro Val Glu Glu Asp Asp Pro Ala Met Tyr Phe Cys Gln Gln Thr Lys
85 90 95
Glu Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 88
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C卡帕
<400> 88
Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu
1 5 10 15
Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg
35 40 45
Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu
65 70 75 80
Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser
85 90 95
Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
100 105
<210> 89
<211> 102
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CH1 (小鼠)
<400> 89
Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala
1 5 10 15
Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu
50 55 60
Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val
65 70 75 80
Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys
85 90 95
Ile Val Pro Arg Asp Cys
100
<210> 90
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗GCN4 CDR H1 Kabat
<400> 90
Asp Tyr Gly Val Asn
1 5
<210> 91
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗GCN4 CDR H2 Kabat
<400> 91
Val Ile Trp Gly Asp Gly Ile Thr Asp His Asn Ser Ala Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210> 92
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗GCN4 CDR H3 Kabat
<400> 92
Gly Leu Phe Asp Tyr
1 5
<210> 93
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗GCN4 CDR L1 Kabat
<400> 93
Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Ser
1 5 10
<210> 94
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗GCN4 CDR L2 Kabat
<400> 94
Gly Thr Asn Asn Arg Ala Pro
1 5
<210> 95
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗GCN4 CDR L3 Kabat
<400> 95
Val Leu Trp Tyr Ser Asn His Trp Val
1 5
<210> 96
<211> 428
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗GCN4-scFv-CD28ATD-CD28CSD-CD3zSSD融合物
<400> 96
Asp Ala Val Val Thr Gln Glu Ser Ala Leu Thr Ser Ser Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
20 25 30
Asn Tyr Ala Ser Trp Val Gln Glu Lys Pro Asp His Leu Phe Thr Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Asn Asn Arg Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Ile Gly Asp Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala
65 70 75 80
Gln Thr Glu Asp Glu Ala Ile Tyr Phe Cys Val Leu Trp Tyr Ser Asn
85 90 95
His Trp Val Leu Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly Gly
100 105 110
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Asp Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro
130 135 140
Ser Gln Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr
145 150 155 160
Asp Tyr Gly Val Asn Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu
165 170 175
Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Asp Gly Ile Thr Asp His Asn Ser Ala
180 185 190
Leu Lys Ser Arg Leu Ser Val Thr Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val
195 200 205
Phe Leu Lys Met Ser Ser Leu Gln Ser Gly Asp Ser Ala Arg Tyr Tyr
210 215 220
Cys Val Thr Gly Leu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr
225 230 235 240
Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly
245 250 255
Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile
260 265 270
Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met
275 280 285
Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro
290 295 300
Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe
305 310 315 320
Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu
325 330 335
Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp
340 345 350
Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys
355 360 365
Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala
370 375 380
Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys
385 390 395 400
Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr
405 410 415
Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
420 425
<210> 97
<211> 243
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗GCN4-scFv
<400> 97
Asp Ala Val Val Thr Gln Glu Ser Ala Leu Thr Ser Ser Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
20 25 30
Asn Tyr Ala Ser Trp Val Gln Glu Lys Pro Asp His Leu Phe Thr Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Asn Asn Arg Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Ile Gly Asp Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala
65 70 75 80
Gln Thr Glu Asp Glu Ala Ile Tyr Phe Cys Val Leu Trp Tyr Ser Asn
85 90 95
His Trp Val Leu Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly Gly
100 105 110
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Asp Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro
130 135 140
Ser Gln Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr
145 150 155 160
Asp Tyr Gly Val Asn Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu
165 170 175
Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Asp Gly Ile Thr Asp His Asn Ser Ala
180 185 190
Leu Lys Ser Arg Leu Ser Val Thr Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val
195 200 205
Phe Leu Lys Met Ser Ser Leu Gln Ser Gly Asp Ser Ala Arg Tyr Tyr
210 215 220
Cys Val Thr Gly Leu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr
225 230 235 240
Val Ser Ser
<210> 98
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗GCN4 VH
<400> 98
Asp Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asp Tyr
20 25 30
Gly Val Asn Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val Ile Trp Gly Asp Gly Ile Thr Asp His Asn Ser Ala Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Leu Ser Val Thr Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu
65 70 75 80
Lys Met Ser Ser Leu Gln Ser Gly Asp Ser Ala Arg Tyr Tyr Cys Val
85 90 95
Thr Gly Leu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser
100 105 110
Ser
<210> 99
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗GCN4 VL
<400> 99
Asp Ala Val Val Thr Gln Glu Ser Ala Leu Thr Ser Ser Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
20 25 30
Asn Tyr Ala Ser Trp Val Gln Glu Lys Pro Asp His Leu Phe Thr Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Asn Asn Arg Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Ile Gly Asp Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala
65 70 75 80
Gln Thr Glu Asp Glu Ala Ile Tyr Phe Cys Val Leu Trp Tyr Ser Asn
85 90 95
His Trp Val Leu Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 100
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HA标签
<400> 100
Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala
1 5
<210> 101
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Myc标签
<400> 101
Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu
1 5 10
<210> 102
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GCN4标签
<400> 102
Tyr His Leu Glu Asn Glu Val Ala Arg Leu Lys Lys
1 5 10
<210> 103
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Avi标签
<400> 103
Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His
1 5 10
<210> 104
<211> 164
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 104
Met Lys Trp Lys Ala Leu Phe Thr Ala Ala Ile Leu Gln Ala Gln Leu
1 5 10 15
Pro Ile Thr Glu Ala Gln Ser Phe Gly Leu Leu Asp Pro Lys Leu Cys
20 25 30
Tyr Leu Leu Asp Gly Ile Leu Phe Ile Tyr Gly Val Ile Leu Thr Ala
35 40 45
Leu Phe Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr
50 55 60
Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg
65 70 75 80
Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met
85 90 95
Gly Gly Lys Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn
100 105 110
Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met
115 120 125
Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly
130 135 140
Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala
145 150 155 160
Leu Pro Pro Arg
<210> 105
<211> 492
<212> DNA
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 105
atgaagtgga aggcgctttt caccgcggcc atcctgcagg cacagttgcc gattacagag 60
gcacagagct ttggcctgct ggatcccaaa ctctgctacc tgctggatgg aatcctcttc 120
atctatggtg tcattctcac tgccttgttc ctgagagtga agttcagcag gagcgcagag 180
ccccccgcgt accagcaggg ccagaaccag ctctataacg agctcaatct aggacgaaga 240
gaggagtacg atgttttgga caagagacgt ggccgggacc ctgagatggg gggaaagccg 300
agaaggaaga accctcagga aggcctgtac aatgaactgc agaaagataa gatggcggag 360
gcctacagtg agattgggat gaaaggcgag cgccggaggg gcaaggggca cgatggcctt 420
taccagggtc tcagtacagc caccaaggac acctacgacg cccttcacat gcaggccctg 480
ccccctcgct aa 492
<210> 106
<211> 164
<212> PRT
<213> 小鼠（Mus musculus）
<400> 106
Met Lys Trp Lys Val Ser Val Leu Ala Cys Ile Leu His Val Arg Phe
1 5 10 15
Pro Gly Ala Glu Ala Gln Ser Phe Gly Leu Leu Asp Pro Lys Leu Cys
20 25 30
Tyr Leu Leu Asp Gly Ile Leu Phe Ile Tyr Gly Val Ile Ile Thr Ala
35 40 45
Leu Tyr Leu Arg Ala Lys Phe Ser Arg Ser Ala Glu Thr Ala Ala Asn
50 55 60
Leu Gln Asp Pro Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg
65 70 75 80
Glu Glu Tyr Asp Val Leu Glu Lys Lys Arg Ala Arg Asp Pro Glu Met
85 90 95
Gly Gly Lys Gln Gln Arg Arg Arg Asn Pro Gln Glu Gly Val Tyr Asn
100 105 110
Ala Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Thr
115 120 125
Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly
130 135 140
Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Thr
145 150 155 160
Leu Ala Pro Arg
<210> 107
<211> 495
<212> DNA
<213> 小鼠（Mus musculus）
<400> 107
atgaagtgga aagtgtctgt tctcgcctgc atcctccacg tgcggttccc aggagcagag 60
gcacagagct ttggtctgct ggatcccaaa ctctgctact tgctagatgg aatcctcttc 120
atctacggag tcatcatcac agccctgtac ctgagagcaa aattcagcag gagtgcagag 180
actgctgcca acctgcagga ccccaaccag ctctacaatg agctcaatct agggcgaaga 240
gaggaatatg acgtcttgga gaagaagcgg gctcgggatc cagagatggg aggcaaacag 300
cagaggagga ggaaccccca ggaaggcgta tacaatgcac tgcagaaaga caagatggca 360
gaagcctaca gtgagatcgg cacaaaaggc gagaggcgga gaggcaaggg gcacgatggc 420
ctttaccagg gtctcagcac tgccaccaag gacacctatg atgccctgca tatgcagacc 480
ctggcccctc gctaa 495
<210> 108
<211> 660
<212> DNA
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 108
atgctgcgcc tgctgctggc gctgaacctg tttccgagca ttcaggtgac cggcaacaaa 60
attctggtga aacagagccc gatgctggtg gcgtatgata acgcggtgaa cctgagctgc 120
aaatatagct ataacctgtt tagccgcgaa tttcgcgcga gcctgcataa aggcctggat 180
agcgcggtgg aagtgtgcgt ggtgtatggc aactatagcc agcagctgca ggtgtatagc 240
aaaaccggct ttaactgcga tggcaaactg ggcaacgaaa gcgtgacctt ttatctgcag 300
aacctgtatg tgaaccagac cgatatttat ttttgcaaaa ttgaagtgat gtatccgccg 360
ccgtatctgg ataacgaaaa aagcaacggc accattattc atgtgaaagg caaacatctg 420
tgcccgagcc cgctgtttcc gggcccgagc aaaccgtttt gggtgctggt ggtggtgggc 480
ggcgtgctgg cgtgctatag cctgctggtg accgtggcgt ttattatttt ttgggtgcgc 540
agcaaacgca gccgcctgct gcatagcgat tatatgaaca tgaccccgcg ccgcccgggc 600
ccgacccgca aacattatca gccgtatgcg ccgccgcgcg attttgcggc gtatcgcagc 660
<210> 109
<211> 220
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 109
Met Leu Arg Leu Leu Leu Ala Leu Asn Leu Phe Pro Ser Ile Gln Val
1 5 10 15
Thr Gly Asn Lys Ile Leu Val Lys Gln Ser Pro Met Leu Val Ala Tyr
20 25 30
Asp Asn Ala Val Asn Leu Ser Cys Lys Tyr Ser Tyr Asn Leu Phe Ser
35 40 45
Arg Glu Phe Arg Ala Ser Leu His Lys Gly Leu Asp Ser Ala Val Glu
50 55 60
Val Cys Val Val Tyr Gly Asn Tyr Ser Gln Gln Leu Gln Val Tyr Ser
65 70 75 80
Lys Thr Gly Phe Asn Cys Asp Gly Lys Leu Gly Asn Glu Ser Val Thr
85 90 95
Phe Tyr Leu Gln Asn Leu Tyr Val Asn Gln Thr Asp Ile Tyr Phe Cys
100 105 110
Lys Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser
115 120 125
Asn Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro
130 135 140
Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly
145 150 155 160
Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile
165 170 175
Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met
180 185 190
Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro
195 200 205
Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
210 215 220
<210> 110
<211> 654
<212> DNA
<213> 小鼠（Mus musculus）
<400> 110
atgaccctgc gcctgctgtt tctggcgctg aactttttta gcgtgcaggt gaccgaaaac 60
aaaattctgg tgaaacagag cccgctgctg gtggtggata gcaacgaagt gagcctgagc 120
tgccgctata gctataacct gctggcgaaa gaatttcgcg cgagcctgta taaaggcgtg 180
aacagcgatg tggaagtgtg cgtgggcaac ggcaacttta cctatcagcc gcagtttcgc 240
agcaacgcgg aatttaactg cgatggcgat tttgataacg aaaccgtgac ctttcgcctg 300
tggaacctgc atgtgaacca taccgatatt tatttttgca aaattgaatt tatgtatccg 360
ccgccgtatc tggataacga acgcagcaac ggcaccatta ttcatattaa agaaaaacat 420
ctgtgccata cccagagcag cccgaaactg ttttgggcgc tggtggtggt ggcgggcgtg 480
ctgttttgct atggcctgct ggtgaccgtg gcgctgtgcg tgatttggac caacagccgc 540
cgcaaccgcc tgctgcagag cgattatatg aacatgaccc cgcgccgccc gggcctgacc 600
cgcaaaccgt atcagccgta tgcgccggcg cgcgattttg cggcgtatcg cccg 654
<210> 111
<211> 218
<212> PRT
<213> 小鼠（Mus musculus）
<400> 111
Met Thr Leu Arg Leu Leu Phe Leu Ala Leu Asn Phe Phe Ser Val Gln
1 5 10 15
Val Thr Glu Asn Lys Ile Leu Val Lys Gln Ser Pro Leu Leu Val Val
20 25 30
Asp Ser Asn Glu Val Ser Leu Ser Cys Arg Tyr Ser Tyr Asn Leu Leu
35 40 45
Ala Lys Glu Phe Arg Ala Ser Leu Tyr Lys Gly Val Asn Ser Asp Val
50 55 60
Glu Val Cys Val Gly Asn Gly Asn Phe Thr Tyr Gln Pro Gln Phe Arg
65 70 75 80
Ser Asn Ala Glu Phe Asn Cys Asp Gly Asp Phe Asp Asn Glu Thr Val
85 90 95
Thr Phe Arg Leu Trp Asn Leu His Val Asn His Thr Asp Ile Tyr Phe
100 105 110
Cys Lys Ile Glu Phe Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Arg
115 120 125
Ser Asn Gly Thr Ile Ile His Ile Lys Glu Lys His Leu Cys His Thr
130 135 140
Gln Ser Ser Pro Lys Leu Phe Trp Ala Leu Val Val Val Ala Gly Val
145 150 155 160
Leu Phe Cys Tyr Gly Leu Leu Val Thr Val Ala Leu Cys Val Ile Trp
165 170 175
Thr Asn Ser Arg Arg Asn Arg Leu Leu Gln Ser Asp Tyr Met Asn Met
180 185 190
Thr Pro Arg Arg Pro Gly Leu Thr Arg Lys Pro Tyr Gln Pro Tyr Ala
195 200 205
Pro Ala Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Pro
210 215
<210> 112
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD28 YMNM
<400> 112
Tyr Met Asn Met
1
<210> 113
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD28 PYAP
<400> 113
Pro Tyr Ala Pro
1
<210> 114
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 信号肽
<400> 114
Ala Thr Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala
1 5 10 15
Thr Gly Val His Ser
20
<210> 115
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 信号肽DNA序列
<400> 115
atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtagcaacag ctaccggtgt gcactcc 57
<210> 116
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD20 (GA101)重链
<400> 116
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Tyr Ser
20 25 30
Trp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
Lys
<210> 117
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD20 (GA101)轻链
<400> 117
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gln Met Ser Asn Leu Val Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Gln Asn
85 90 95
Leu Glu Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 118
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD3 HCDR1 Kabat
<400> 118
Thr Tyr Ala Met Asn
1 5
<210> 119
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD3 HCDR2 Kabat
<400> 119
Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser
1 5 10 15
Val Lys Gly
<210> 120
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD3 HCDR3 Kabat
<400> 120
His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe Ala Tyr
1 5 10
<210> 121
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD3 LCDR1 Kabat
<400> 121
Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn
1 5 10
<210> 122
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD3 LCDR2 Kabat
<400> 122
Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro
1 5
<210> 123
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD3 LCDR3 Kabat
<400> 123
Ala Leu Trp Tyr Ser Asn Leu Trp Val
1 5

Claims (15)

1.一种用于评估能够特异性结合靶抗原的靶抗原结合模块的特异性的方法,方法包含下述步骤:
a)提供包含抗原结合域和识别域的抗原结合分子,其中抗原结合域包含靶抗原结合模块,且其中识别域包含标签；
b)使抗原结合分子与在表面上包含靶抗原的靶细胞接触,特别是其中靶细胞是癌细胞；
c)使抗原结合分子与嵌合抗原受体(CAR)表达性报告T(CAR-T)细胞接触,其中报告CAR-T细胞包含:
i.能够特异性结合包含标签的识别域的CAR,其中CAR与应答元件可操作偶联；
ii.在应答元件控制下的报告基因；和
d)通过测量报告基因的表达来测定T细胞激活以建立靶抗原结合模块的特异性。
2.权利要求1的方法,其中抗原结合分子是IgG类抗体,特别是IgG1或IgG4同种型抗体,或其片段。
3.权利要求1或2任一项的方法,其中抗原结合域是Fab片段且识别域是Fc域。
4.权利要求1或2任一项的方法,其中抗原结合域和识别域是相同的域,特别是Fab片段。
5.权利要求1至4任一项的方法,其中标签是半抗原分子。
6.权利要求1至5任一项的方法,其中半抗原分子是洋地黄毒苷(DIG)。
7.权利要求1至4任一项的方法,其中标签是多肽标签。
8.权利要求7的方法,其中多肽标签选自由myc标签,HA标签,Avi标签,FLAG标签,His标签,GCN4标签,和NE标签组成的组。
9.权利要求1至8任一项的方法,其中靶抗原是细胞表面抗原或受体。
10.权利要求1至9任一项的方法,其中靶抗原是与人主要组织相容性复合物(MHC)的分子结合的肽,其中靶抗原结合模块是T细胞受体样(TCRL)抗原结合模块。
11.一种用于生成TCB抗体的方法,其中TCB抗体包含对靶抗原特异性的第一抗原结合模块和能够特异性结合T细胞激活性受体的第二抗原结合模块,其中第一抗原结合模块是依照权利要求1至10任一项的方法选择的。
12.权利要求11的方法,其中T细胞激活性受体是CD3。
13.一种包含锚定跨膜域和包含抗原结合模块的胞外域的嵌合抗原受体(CAR),其中抗原结合模块能够特异性结合包含标签的识别域但不能够特异性结合不包含标签的识别域。
14.权利要求13的CAR,其中标签是半抗原分子。
15.权利要求14的CAR,其中半抗原分子是洋地黄毒苷(DIG)。
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