MX2014004426A - Metodos de uso de antagonistas de scd1. - Google Patents

Metodos de uso de antagonistas de scd1.

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Abstract

Se proveen en la presente terapias para el tratamiento de condiciones patológicas, tales como cáncer y métodos de uso de antagonistas de SCD1.

Description

MÉTODOS DE USO DE ANTAGONISTAS DE SCDl CAMPO DE LA INVENCIÓN Se proveen en la presente terapias para el tratamiento de condiciones patológicas tales como cáncer y métodos de usos de antagonista de SCDl .
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El cáncer de vejiga es el quinto cáncer más común en el mundo, con un valor estimativo de 70,980 nuevos casos y 14,330 muertes que ocurren en los Estados Unidos de América en 2009 (34) . La prevalencia de mutaciones de activación de FGFR3 y/o sobreexpresión de FGF3 en cáncer de vejiga y en el cuerpo grande de estudios de pérdida de función preclínicos han implicado a este FGFR3 como un accionador oncogénico importante y un objetivo terapéutico potencial en este ajuste de enfermedad (12, 21-25) . A pesar de los avances recientes hacia el desarrollo clínico de agentes terapéuticos que apuntan a FGFR3 , discernimientos críticos en cuanto a como la señalización de FGFR3 contribuye al desarrollo y avance de cáncer de vejiga sigue siendo a ser elucidado.
FGFR3 precedente a una familia de cuatro cinasas de tirosina de receptor estructural y funcionalmente relacionadas, que transducen señales de muchos de los 22 polipéptidos de FGF identificados en humanos (1-3) . Después del enlace de ligando, FGFR3 se dimeriza y se vuelve autofosforilado en residuos de tirosina específicos. Esto activa en el reclutamiento de proteínas adaptadoras, tales como sustrato 2a de FGFR (FRS2a) , al receptor, dando como resultado la activación de múltiples cascadas de señalización corriente abajo, incluyendo las rutas de Ras-Raf-MAPK y PI3K-Akt-mTOR canónicas (1-3). La señalización de FGFR3 juega papeles críticos durante el desarrollo embriónico y en el mantenimiento de homeóstasis de tejido y regula la proliferación, diferenciación, migración y supervivencia celular de manera dependiente del contexto (3-4) .
La activación aberrante de FGFR3 ha sido implicada en diversas condiciones fisiológicas y patológicas. La mutación de ganancia de función de FGFR3 es una de las alteraciones genéticas más comunes en un espectro de alteraciones esqueletales y craneales congenitales humanas (5-6) . La desregulación de FGFR3 vía mutaciones o sobreexpresión también ha sido enlazada con una variedad de cánceres humanos, incluyendo mieloma múltiple positivo para t (4; 14) (pl6.3;q32) translocación cromosomal (7-10), cáncer de vejiga (11-14) , cáncer de pecho (15) , carcinoma cervical (11, 16) , carcinoma hepatocelular (17) , cáncer de pulmón de célula no pequeña escamoso (18, 19) y tumores testiculares (20) . En particular, mutaciones de activación somática en este FGFR3 han sido identificadas en 60-70% de tumores papilares y 16-20% de tumores de vejiga músculo-invasivos (13-14) . Además, la sobreexpresión de FGFR3 ha sido documentada en una fracción significativa de cánceres de vejiga superficiales también como avanzados (12-13, 21). Importantemente, una plétora de estudio de pérdida de función demuestra que la intervención farmacológica y genética de la función de FGFR3 bloquea la proliferación de células de cáncer de vejiga en cultivo e inhibe el crecimiento del tumor en modelos de animales (12, 22-25). Colectivamente, estos datos indican que un subconjunto de cáncer de vejiga es aditivo a la actividad de FGFR3 subrayando la importancia de este receptor como un objetivo terapéutico en cáncer de vejiga. Por supuesto, tanto anticuerpos monoclonales como inhibidores de molécula pequeña contra FGFR3 han sido desarrollados recientemente como una terapia apuntada potencial en este ajuste de enfermedad (26-28) . A pesar de estos avances recientes hacia el desarrollo clínico de agentes anti-FGFR3 y la caracterización de rutas de señalización canónicas que emanan de FGFR3 de superficie celular, en el presente hay mucha poca información en cuanto a como la señalización de FGFR3 contribuye a la carcinogénesis de vejiga. Las consecuencias moleculares y celulares precisas corriente abajo de la activación de EGFR3 siguen siendo a ser elucidadas.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Se proveen en la presente terapias para tratamiento de condiciones patológicas tales como cáncer y método de uso de antagonistas de SCD1. En un aspecto, se proveen en la presente métodos para inhibir la proliferación celular de una célula de cáncer que comprende poner en contacto la célula de cáncer con una cantidad efectiva de un antagonista de SCD1. También se proveen en la presente métodos para inhibir la proliferación celular de una célula de cáncer en un individuo que comprende administrar al individuo una cantidad efectiva de un antagonista de SCD1.
En otro aspecto, se proveen en la presente métodos para inducir la retención del ciclo celular de una célula de cáncer que comprenden poner en contacto la célula de cáncer con una cantidad efectiva del antagonista de SCD1. Se proveen además en la presente métodos para inducir la parada de ciclo celular de una célula de cáncer en un individuo que comprenden administrar al individuo una cantidad efectiva de un antagonista de SCD1.
En un aspecto, se proveen en la presente métodos para apoptosis de una célula de cáncer, que comprenden poner en contacto la célula con una cantidad efectiva del antagonista de SCD1. También se proveen en la presente métodos para promover la apoptosis de una célula de cáncer en un individuo, que comprenden administrar al individuo una cantidad efectiva de un antagonista de SCD1.
Además, en otro aspecto, se proveen en la presente métodos de tratamiento de una célula de cáncer en un individuo que comprenden administrar al individuo una cantidad efectiva de un antagonista de SCDl.
En algunas modalidades de cualquiera de los métodos, la célula de cáncer es una célula de cáncer endometrial, una célula de cáncer de cabeza y cuello, una célula de cáncer de riñon, una célula de cáncer de ovario, un cáncer de colón, un cáncer de colón, una célula de cáncer pancreático, una célula de cáncer urinario o una célula de cáncer de vejiga. En algunas modalidades, la célula de cáncer es una célula de cáncer de riñon, célula de cáncer pancreático o célula de cáncer de vejiga. En algunas modalidades de cualquiera de los métodos, la célula de cáncer expresa niveles elevados de uno o más biomarcadores en comparación con una muestra de referencia, célula de referencia, tejido de referencia, muestra testigo, célula testigo, tejido testigo o testigo interno (por ejemplo, gen de mantenimiento) .
En otro aspecto, se proveen en la presente, métodos de tratamiento de cáncer en un individuo que comprenden administrar al individuo una cantidad efectiva de un antagonista de SCDl. En algunas modalidades, el cáncer en el individuo expresa niveles elevados de uno o más biomarcadores en comparación con una muestra de referencia, célula de referencia, tejido de referencia, muestra testigo, célula testigo o testigo interno (por ejemplo, gen de mantenimiento) .
En aspecto, se proveen en la presente métodos de tratamiento de cáncer en un individuo que comprenden administrar al individuo una cantidad efectiva de un antagonista de SCDl, en donde el tratamiento está basado en el individuo que tiene cáncer que expresa niveles elevados de uno o más biomarcadores en comparación con una muestra de referencia, célula de referencia, tejido de referencia, muestra testigo, célula testigo, tejido testigo o testigo interno (por ejemplo, gen de mantenimiento) .
En otro aspecto, se proveen en la presente métodos de tratamiento de cáncer en un individuo, a condición de que el individuo haya sido encontrado que tienen cáncer que expresa niveles de uno o más biomarcadores, en comparación con una muestra de referencia, célula de referencia, tejido de referencia, muestra testigo, célula testigo, tejido testigo o testigo interno (por ejemplo, gen de mantenimiento) , el tratamiento comprende administrar al individuo una cantidad efectiva de un antagonista de SCDl.
En otro aspecto, se proveen en la presente métodos de tratamiento de cáncer en un individuo, el método comprende: determinar que una muestra obtenida del individuo expresa niveles elevados de uno o más biomarcadores en comparación con una muestra de referencia, célula de referencia, tejido de referencia, muestra testigo, célula testigo, tejido testigo o testigo interno (por ejemplo, gen de mantenimiento) y administrar una cantidad efectiva de una terapia anti-cáncer que comprende un antagonista de SCDl al individuo, mediante lo cual el cáncer es tratado.
Además, en otro aspecto, se proveen en la presente métodos de tratamiento de cáncer que comprenden: (a) seleccionar un individuo que tiene cáncer, en donde el cáncer expresa niveles elevados de uno o más biomarcadores en comparación con una muestra de referencia, célula de referencia, tejido de referencia, muestra testigo, célula testigo, tejido testigo o testigo interno (por ejemplo, gen de mantenimiento) y (b) administrar al individuo así seleccionado una cantidad efectiva de un antagonista de SCDl, mediante lo cual el cáncer es tratado.
En otro aspecto, se proveen en la presente métodos para identificar un individuo que es más probable de beneficiarse del tratamiento con una terapia anti-cáncer que comprende un antagonista de SCDl o menos probable de beneficiarse del tratamiento con una terapia anti-cáncer que comprende un antagonista de SCDl, el método comprende: determinar los niveles de expresión de uno o más biomarcadores en una muestra obtenida del individuo, en donde los niveles de expresión elevados de uno o más biomarcadores de la muestra, en comparación con una muestra de referencia, células de referencia, tejido de referencia, muestra testigo, célula testigo, tejido testigo o testigo interno (por ejemplo, gen de mantenimiento) indica que el individuo es más probable de beneficiarse del tratamiento con la terapia anti-cáncer que comprende el antagonista de SCDl o niveles de expresión reducidos de uno o más biomarcadores en la muestra en comparación con una muestra de referencia, células de referencia, tejido de referencia, muestra testigo, célula testigo, tejido testigo o testigo interno (por ejemplo, gen de mantenimiento) indica que el individuo es menos probable de beneficiarse del tratamiento con la terapia anti-cáncer que comprende el antagonista de SCDl .
En otro aspecto, se proveen en la presente métodos para predecir si un individuo con cáncer es probable de responder efectivamente al tratamiento con una terapia anti-cáncer que comprende un antagonista de SCDl, el método comprende determinar uno o más biomarcadores, mediante lo cual los niveles de expresión elevados de uno o más biomarcadores, en comparación con una muestra de referencia, células de referencia, tejido de referencia, muestra testigo, célula testigo, tejido testigo o testigo interno (por ejemplo, gen de mantenimiento) indica que el individuo es más probable de responder efectivamente al tratamiento con el antagonista y los niveles de expresión reducidos de uno o más biomarcadores en comparación con una muestra de referencia, células de referencia, tejido de referencia, muestra testigo, célula testigo, tejido testigo o testigo interno (por ejemplo, gen de mantenimiento) indica que el individuo es menos probable de responder efectivamente al tratamiento con el antagonista.
En un aspecto, se proveen en la presente métodos para predecir la respuesta o carencia de respuesta de un individuo a una terapia anti-cáncer que comprende un antagonista de SCD1, que comprenden medir en una muestra obtenida del individuo la expresión de uno o más biomarcadores, en donde los niveles de expresión elevados de uno o más biomarcadores, en comparación con una muestra de referencia, células de referencia, tejido de referencia, muestra testigo, célula testigo, tejido testigo o testigo interno (por ejemplo, gen de mantenimiento) es predictivo de la respuesta del individuo a la terapia anti-cáncer que comprenden el antagonista de SCD1 y los niveles de expresión reducidos de uno o más biomarcadores, en comparación con una muestra de referencia, células de referencia, tejido de referencia, muestra testigo, célula testigo, tejido testigo o testigo interno (por ejemplo, gen de mantenimiento) son predictivos de carencia de respuesta del individuo a la terapia anti-cáncer que comprende el antagonista de SCD1.
En otro aspecto, se proveen en la presente métodos para determinar la probabilidad de que un individuo con cáncer exhibirá beneficios de la terapia anti-cáncer que comprende un antagonista de SCD1, el método comprende: determinar los niveles de expresión de uno o más biomarcadores en una muestra obtenida del individuo, en donde los niveles de expresión elevados de un o más biomarcadores en la muestra, en comparación con una muestra de referencia, indican que el individuo tiene probabilidad incrementada de beneficiarse de la terapia anti-cáncer que comprende el antagonista de SCDl y los niveles de expresión reducidos de uno o más biomarcadores en la muestra, en comparación con una muestra de referencia, células de referencia, tejido de referencia, muestra testigo, célula testigo, tejido testigo o testigo interno (por ejemplo, gen de mantenimiento) indican que el individuo tiene probabilidad disminuida de beneficiarse de la terapia anticáncer que comprende el antagonista de SCDl .
En algunas modalidades de cualquiera de los métodos, el cáncer es célula de cáncer endometrial, cáncer de cabeza y cuello, un cáncer de riñon, un cáncer de ovario, un cáncer de colón, un cáncer pancreático, un cáncer urinario o un cáncer de vejiga. En algunas modalidades, el cáncer es un cáncer de riñon, cáncer pancreático o cáncer de vejiga. En algunas modalidades, el cáncer es cáncer de vejiga.
En algunas modalidades de cualquiera de los métodos, el uno o más biomarcadores es FGFR3. En algunas modalidades de cualquiera de los métodos, el uno o más biomarcadores es FGFR3 fosforilado.
En algunas modalidades de cualquiera de los métodos, el uno o más biomarcadores es uno o más genes de la firma lipogénica FGFR3 -regulada . En algunas modalidades, los uno o más genes de la firma lipogénica FGFR3-regulada comprende, consiste de o consiste esencialmente de uno o más genes del grupo que consiste de SREBF1 , G6PD, AC0T7, PTPLA, PCCB, FADS1, RDH11, ACER3 , PDSS1, MVD, AGPA 5 , HSD17B2 , ACSL4 , EBP, PIGW, LBR, ACLY, AD0RA2B , GPCPD1, CYP24A1, ACSL3 , MVK, ACSS2 , FDPS, EL0VL5, HMGCR, LIPG, ME1, DHCR7 , LSS, ACAT2 , FASN, CYP51A1, IDI1, FDFT1 , FAR2 , H GCS1, SDR16C5, LDLR, MSM01, INSIG1, DHRS9, LRP8, SQLE, PCSK9, SCD1, FABP y combinaciones de los mismos. En algunas modalidades, el uno o más genes de la firma lipogénica FGFR3-regulada comprende, consiste de o consiste esencialmente de uno o más genes del grupo que consiste de ELOVL5 , HMGCR, LIPG, ME1, DHCR7, LSS, ACAT2, FASN, CYP51A1 , IDI1, FDFT1, FAR2 , HMGCS1, SDR16C5 , LDLR, MSMOl, INSIG1, DHRS9, LRP8 , SQLE, PCSK9 , SCD1, FABP y combinaciones de los mismos. En algunas modalidades, el uno o más genes de la firma lipogénica FGFR3-regulada comprende, consiste de o consiste esencialmente de uno o más genes seleccionados del grupo que consiste de CYP51A1, IDI1, FDFT1, FAR2 , HMGCS1, SDR16C5, LDLR, MSMOl, INSIG1, DHRS9, LRP8 , SQLE, PCSK9, SCD1, FABP4 y combinaciones de los mismos. En algunas modalidades, el uno o más genes de la firma lipogénica FGFR3-regulada comprende, consiste de o consiste esencialmente de uno o más genes del grupo que consiste de LDLR, MSM01, INSIG1, DHRS9 , LRP8, SQLE, PCSK9, SCD1, FABP4 y combinaciones de los mismos. En algunas modalidades, el uno o más genes de la firma lipogénica FGFR3-regulada comprende, consiste de o consiste esencialmente de uno o más genes del grupo que consiste de SQLE, PCSK9, SCD1, FABP4 y combinaciones de los mismos. En algunas modalidades, el uno o más genes de la firma lipogénica FGFR3-regulada comprende, consiste de o consiste esencialmente de SC4M0L.
En algunas modalidades de cualquiera de los métodos, el uno o más biomarcadores es SREBP1. En algunas modalidades de cualquiera de los métodos, el uno o más biomarcadores consiste de ácidos grasos ?9 monoinsaturados . En algunas modalidades de cualquiera de los métodos, el uno o más biomarcadores es una proporción de ácidos grasos ?9 monoinsaturados : ácidos grasos saturados .
En algunas modalidades de cualquiera de los métodos, el uno o más biomarcadores consisten de señalización de PI3K, señalización de mTOR, señalización de MEK. En algunas modalidades de cualquiera de los métodos, el uno o más biomarcadores consiste de uno o más polimorfismo en genes seleccionados del grupo que consiste de PI3K, PTEN, p85, TSC1/2 y AKT. En algunas modalidades de cualquiera de los métodos, el uno o más biomarcadores consiste de AKT fosforilado.
En algunas modalidades de cualquiera de los métodos, el nivel de expresión del uno o más biomarcadores es elevado por mayor de alrededor de 1.5 veces, alrededor de 1.75 veces, alrededor de 2 veces, alrededor de 2.25 veces, alrededor de 2.5 veces, alrededor de 2.75 veces, alrededor de 3.0 veces o alrededor de 3.25 veces en comparación con una muestra de referencia, célula de referencia, tejido de referencia, muestra testigo, célula testigo, tejido testigo o testigo interno (por ejemplo, gen de mantenimiento) .
En algunas modalidades de cualquiera de los métodos, el antagonista de SCD1 es un anticuerpo, polipéptido de enlace, molécula pequeña de enlace o polinucleótido . En algunas modalidades, el antagonista de SCD1 es una molécula pequeña G01522403 (A37062) , G0244717 o derivados de los mismos. En algunas modalidades, la molécula pequeña es RG1, RG3 , RG8 o derivados de los mismos.
En algunas modalidades de cualquiera de los métodos, el método adicional comprende un agente terapéutico adicional.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figura 1. Identificación de genes FGFR3 -regulado . Un diagrama de Venn que resume la superposición de genes con cambios de expresión significativos después de la inducción de tres shARN de FGFR3. Los números en rojo representan genes reguladores hacia arriba y los verdes genes regulados hacia abaj o .
Figura 2A-2E. El knockdown de FGFR3 reduce la expresión de genes involucrados en biosíntesis y metabolismo de esterol y ácido graso. (A) Mapa térmico de las sondas que se encuentra que son reguladas por el knockdown de FGFR3. Células de cáncer de vejiga RT112 que expresan tres shAR de FGFR3 inducibles por doxociclina independientes o un shARN testigo (Ctrl) fueron cultivados con o sin 1 g/ml de doxociclina por 2 días antes de la extracción del AR . El AR total fue sometido a estudios de microarreglo. Los genes que son regulados por todos los tres shARN de FGFR3 fueron mostrados en el mapa térmico. El panel superior muestra el nivel de proteína de FGFR3. (B) Un cohorte de genes involucrados en biosíntesis de colesterol y lípido son representados en la célula de knockdown de FGFR3. (C, D) Confirmación de genes lipogénicos FGFR3 -regulados mediante qRT-PCR. El nivel de mARN de genes representativos de rutas de biosíntesis de lípido (C) y esterol (D) fue medido mediante qRT-PCR. Los datos son presentados como +/- SD. (E) El knockdown de FGFR3 reduce la expresión de SREBP1 modestamente, pero no SREBP2. El nivel de mARN de SREBP1 y SREBP2 fueron analizados mediante qRT-PCR. Los datos son presentados como media +/- SD.
Figura 3A-3C. Los siARN de FGFR3 reducen la expresión de genes involucrados en la biosíntesis y metabolismo de esterol y ácido graso en células UMUC-14. Células de cáncer de vejiga UMUC-14 fueron transfectadas con siA N de FGFR3 o un siAR testigo sin apuntamiento (testigo) y el ARN total fue extraído 48 horas después de la transfección. El nivel de mAR de genes representativos de rutas de biosíntesis de lípido (A) y esterol (B) fue medido mediante qRT-PCR. Los datos son presentados como media +/- SD. (C) El knockdown de FGFR3 reduce la expresión de SREBP1 moderadamente, pero no SREBP2. El nivel de mARN de SREBP1 y SREBP2 fue analizado mediante qRT-PCR. Los datos son presentados como media +/-SD.
Figura 4A-4D. La expresión reducida de SREBP1, FASN y SCD1 en células knockdown de FGFR3 se correlaciona con la síntesis y desaturación de ácido graso disminuida. (A) El knockdown de FGFR3 reduce la expresión de SREBP1, FASN y SCD1. Células de cáncer de vejiga RT112 que expresan shARN de FGFR3 doxociclina-inducibles o un shARN testigo (testigo) fueron cultivadas con o sin un 1 pg/ml de doxiciclina por 3 días antes de la cosecha. Los lisados celulares fueron sometidos a análisis de inmunoabsorcion. (B) El knockdown de FGFR3 suprime la biosíntesis de lípido. Las células RT112 fueron cultivadas con o sin 1 g/ml de doxiciclina por 3 días antes de incubación por 4 horas con [1C] acetato. La fracción de lípido fue extraída y [14C] acetato incorporado al lípido fue medido mediante conteo de centelleo. Los datos fueron normalizados al contenido de proteína de la muestra y presentados como media +/- SD. (C, D) El knockdown de FGFR3 bloquea la desaturación de ácido esteárico. Células RT112 fueron cultivadas con o sin 1 g/ml de doxiciclina por 3 días antes de incubación por 6 horas con ácido [14C] esteárico. La desaturación de ácido [14C] esteárico fue analizada mediante cromatografía de capa delgada de argentación (C) y medida mediante conteo de centelleo (D) . Los datos son presentados como media +/- SD y son representativos de tres experimentos independientes .
Figura 5A-5B. El anticuerpo monoclonal anti-FGFR3, R3Mab, reduce la expresión de SREBP1, FASN y SCD1 y la síntesis de ácido graso en células UMUC-14. (A) Células de cáncer de vejiga UMUC-14 fueron cultivadas en medio de FBS al 1% y tratadas con 15 ug/ml de anticuerpo anti-FGFR3, R3Mab o un anticuerpo testigo (Testigo Ab) por 48 horas. Los lisados celulares fueron sometidos a análisis de Western blot. (B) Células UMUC-14 fueron cultivadas en medio de FBS al 1% FBS que contiene 15 g/ml de R3Mab o el anticuerpo testigo por 48 horas, con [14C] acetato agregado a las 4 horas finales. La incorporación de [14C] acetato a la fracción de lípido fue extraída y medida mediante conteo de centelleo. Los datos fueron normalizados a nivel de proteína total en cada muestra y presentados como media +/- SD.
Figura 6A-6C. La señalización de FGFR3 promueve la lipogénesis de manera dependiente de SREBP1. (A) El eje de FGFl-FGFR3 estimula la acumulación de SREBPl madurado y la expresión de FASN y SCDl. Células de cáncer de vejiga Cal29 fueron desprovistas de suero por 20 horas, luego tratadas con FGFl (25 ng/ml) y heparina (10 µ?/???) por el tiempo indicado. Los lisados celulares fueron inmunoprecipitados con el anticuerpo anti-FGFR3 y determinados en cuanto a fosforilación de FGFR3 con un anticuerpo anti-fosfo-tirosina (4G10) . Los lisados fueron también inmunoabsorbidos para detectar las proteínas indicadas como se describe en la sección de métodos. (B) FGFl estimula la síntesis de ácido graso en células Cal29. Las células Cal29 fueron desprovistas de suero por 20 horas, luego incubadas con 25 ng/ml de FGFl y 10 ig/ml de heparina por 24 horas. Se agregó [14C] acetato por otra incubación de 16 horas. La incorporación de 14C al ácido graso total (TFA) , ácidos grasos saturados (SFA) y ácidos grasos insaturados (UFA) fue medida mediante conteo de centelleo. Los datos son normalizados al contenido de proteína de la muestra y presentados como media +/- SD en relación con sin tratamiento de FGFl y son representativos de tres experimentos independientes. (C) FGFl estimula la expresión de SCDl principalmente por medio de SREBPl . Células RT112 fueron transíectadas con siARN que apunta a SREBPl (Srl) , SREBP2 (Sr2) o un siARN testigo sin apuntamiento (testigo) . A 24 horas después de la transfección, las células fueron desprovistas de suero por 20 horas, luego tratadas con FGFl (25 ng/ml) y heparina (10 pg/ml) por 24 horas. Los lisados celulares totales fueron sometidos a análisis de inmunoabsorción .
Figura 7A-7D. FGFl estimula la activación de SREBPl y lipogénesis de células de cáncer de vejiga. (A, B) Dosis-respuesta de la activación de FGFR3 inducida por FGFR1 en células de cáncer de vejiga Cal29 (A) y RT112 (B) . Células Cal29 y RT112 fueron desprovistas de suero por 20 horas, luego tratadas con diferentes dosis de FGFl más 10 g/ml de heparina por 10 minutos. Los lisados celulares fueron sometidos a análisis de inmunoabsorción con los anticuerpos indicados. La fosforilación de FGFR3 fue analizada como se describe en la sección de métodos. Nótese que en las células Cal29, FRS2 fosforilado muestra un desplazamiento de movilidad aparente. (C) FGFl estimula la expresión de SREBPl y maduración y la expresión de FASN y SCDl. Células de cáncer de vejiga RT112 fueron desprovistas de suero por 20 horas, luego tratadas con 30 ng/ml de FGFl más 10 pg/ml de heparina por el tiempo indicado. Los lisados celulares totales fueron sometidos a análisis de Western blot . (D) FGFl estimula la síntesis de ácido graso. Células RT112 fueron desprovistas de suero por 20 horas, luego incubadas con 30 ng/ml de FGFl más 10 µ?/??? de heparina por 24 horas. Se agregó [14C] acetato por las 16 horas finales. La incorporación de [14C] acetato a ácidos grasos saturados (SFA) y ácidos grasos insaturados (UFA) fue medida mediante conteo de centelleo. Los datos son normalizados al nivel de proteína total y presentados como media +/- SD en relación con sin tratamiento de FGFl y son representativos de dos experimentaos independientes.
Figura 8A-8C. La señalización de FGFR3 promueve la acumulación de SREBPl madurado y lipogénesis vía la ruta de PI3K-mT0RCl. (A) Inhibición farmacológica de señalización de FGFR3. Células RT112 fueron desprovistas de suero por 20 horas, luego tratadas con rapamicina (50 nM) , Ly294002 (Ly294, 20 µ?) y PD325901 (PD901, 100 nM) por 2 horas, seguido por estimulación con 30 ng/ml de FGFl más 10 ug/ml de heparina por 10 minutos. Los lisados celulares fueron sometidos a análisis de inmunoabsorción con los anticuerpos indicados. Nótese la fosforilación incrementada de MEK después del tratamiento con PD901, supuestamente debido a un alivio de inhibición de retroalimentación. (B) PI3K-mTORCl e inhibidores de MEK bloquean la inducción de FGFl de SREBPl y SCD1 en células RT112. Células RT112 fueron desprovistas de suero por 20 horas, tratadas con inhibidores de cinasa por 4 horas, seguido por incubación de 24 horas en un medio complementado con 30 ng/ml de FGFl. Los lisados celulares fueron sometidos a inmunoabsorción para detectar la maduración de SREBPl, la expresión de SCD1 y FASN. (C) Los inhibidores de PI3K-mTORCl y MEK bloquean la síntesis de lípido estimulada por FGFl. Células RT112 fueron tratadas de la misma manera como se describe en (B) . Se agregó [14C] acetato por la incubación de 4 horas final. La fracción e lípido fue extraída y el [1C] acetato incorporado a los lípidos fue medido mediante conteo de centelleo. Los datos fueron normalizados al contenido de proteína de muestra y presentados como media +/- SD. Estos datos son representativos de dos experimentados independientes .
Figura 9. La señalización de FGFR3 promueve la acumulación de SREBPl maduro y expresión de SCDl vía la ruta de PI3K-mTORCl pero no la ruta de MEK-MAPK en células Cal29. Células Cal29 fueron desprovistas de suero por 20 horas, tratadas por 4 horas con vehículo (DMSO) , rapamicina 50 nM (Rapa), Ly294002 (Ly294, 20 µ?) y PD325901 (PD901, 100 nM) . Luego las células fueron cultivadas en un medio complementado con 30 ng/ml FGF1 por 24 horas. Los lisados celulares fueron analizados mediante Western blot .
Figura 10A-10E. El knockdown de SCDl inhibe la proliferación celular e induce apoptosis . Células SW780 (A) y UMUC-14 (B) fueron transíectadas con siAR de SCDl de tres siARN testigo sin apuntamiento (testigo) y la proliferación celular fue medida mediante incorporación de [3H] timidina a 72 horas después de la transíección . Los datos son presentados como media +/- SD en relación con células transíectadas con R AiMax solo (Mock) y son representativos de tres experimentos independientes. Panel inferior: western blot representativo muestran el nivel de SCDl en células transfectadas de siARN. (C, D) El knockdown de SCDl conduce a la parada del ciclo celular de Gl (C) y apoptosis (D) en células SW780. Las células fueron analizadas a 48 horas después de la transfeccion como se describe en la sección de métodos. (E) El knockdown de SCDl induce la escisión de activación por caspasa 3/7. Células UMUC-14 fueron transfectadas con siARN de SCDl o tres siARN testigo sin apuntamiento (testigo) , y los Usados celulares fueron sometidos a análisis de inmunoabsorción .
Figura 11A-11D. El knockdown de SCDl induce apoptosis en células de cáncer de vejiga. (A) Efectos de siARN de SCDl sobre la proliferación de células de cáncer de vejiga. Las células fueron transfectadas con siARN de SCDl o tres siARN testigo sin apuntamiento (testigo) y la proliferación celular fue medida mediante incorporación de [3H] timidina a 72 horas después de la transfeccion. Los datos son presentados como media +/- SD en relación con células transfectadas con RNAiMax solo (Mock) . (B) Células UMUC-14 cultivadas en medio FBS al 1% FBS fueron transfectadas con siARN de SCDl o un siARN testigo (testigo) . Análisis de FACS fueron efectuados a 48 horas después de la transfeccion como se describe en la sección de métodos. (C, D) El knockdown de SCDl induce la activación por caspasa 3/7. Células UMUC-14 (C) y células SW780 (D) fueron transfectadas con siARN de SCDl o dos siARN testigo sin apuntamiento (testigo) . A 48 horas co-transfección, las actividades de la caspasa 3 y 7 fueron medidas con el kit de ensayo Caspase-Glo 3/7 (Promega) . Los datos son presentados como media +/- SD y son representativos de dos experimentos independientes .
Figura 12A-12D. El knockdown de SCDl inhibe la proliferación celular de manera dependiente de la desaturación de ácido graso. (A) La regulación hacia abajo del nivel de proteína de por siARN de SCDl. Células SW780 fueron transíectadas con siARN que apuntan a SCDl, FASN o dos siARN testigo sin apuntamiento (testigo) . Los Usados celulares fueron sometidos a inmunoabsorción para determinar la expresión de SCDl y FASN. (B) El knockdown de SCDl bloquea la desaturación de ácido esteárico. Las células SW780 fueron transíectadas como se describe en (A) . A 48 horas post-transfección, el ácido [14C] esteárico fue agregado por 6 horas de incubación adicional. La desaturación de ácido [14C] esteárico fue analizada mediante cromatografía de capa delgada de argentación y medida mediante conteo de centelleo. Los datos son presentados como media +/- SD. (C) El oleato monoinsaturado rescata las células SW780 del knockdown de SCDl. Células SW780 que crecen en un medio que contiene FBS al 1% fueron transíectadas con siARN de SCDl o dos siARN testigo sin apuntamiento (testigo) . A 6 horas después de la transíección, el ácido oleato BSA-acomplejado fue agregado al medio de cultivo a la concentración indicada. La proliferación celular fue medida mediante incorporación de [3H] timidina a 72 horas post-tratamiento . Los datos son presentados como media +/- SD en relación con células transíectadas con RNAiMax solo ( ock) y cultivados en medio complementado con BSA solamente . Estos datos son representativos de tres experimentos independientes. (D) El palmitato saturado no es apto de invertir el efecto de los siARN de SCDl. Las células fueron tratadas similarmente como se describe en (C) , excepto que el palmitato BSA-acomplej ado fue complementado a 6 horas post-transíección con siARN.
Figura 13A-13C. El knockdown de SCDl inhibe la proliferación celular de manera dependiente de la desaturación de ácido graso en células UMUC-14. (A) El knockdown de SCDl bloquea la desaturación de ácido esteárico. Células UMUC-14 fueron transíectadas con siARN de SCDl o dos siARN testigo sin apuntamiento (testigo) . AA 48 horas post-transfección, se agregó ácido [14C] esteárico por 6 horas de incubación adicional. La desaturación del ácido [14C] esteárico fue analizado mediante cromatografía de capa delgada y medida mediante conteo de centelleo. Los datos son presentados como media +/- SD y son representativos de dos experimentos independientes (B) El oleato monoinsaturado rescata las células UMUC-14 del knockdown de SCDl. Células UMUC-14 cultivadas en un medio que contiene FBS al 1% fueron transfectadas con siARN de SCD1 o dos siARN testigo sin apuntamiento (testigo) . A 6 horas después de la transfeccion, el ácido oleato BSA-conjugado fue agregado al medio de cultivo como se indica. La proliferación celular fue medida mediante incorporación de [3H] timidina a 72 horas posttratamiento. Los datos son presentados como media +/- SD en relación con células transfectadas con RNAiMax solo (Mock) y cultivadas en un medio complementado con BSA solamente. Estos datos son representativos de tres experimentos independientes. (C) El palmitato saturado no es apto de invertir los efectos de los siARN de SCD1. Las células fueron tratadas similarmente como se escribe en (B) , excepto que el palmitato BSA-conjugado fue complementado a 6 horas post-transfección con siARN. Nótese que la alta dosis de palmitato redujo la proliferación celular significativamente.
Figura 14A-14D. El knockdown doxiciclina-inducible de SCD1 en células de cáncer de vejiga SW780 suprime el crecimiento del tumor in vivo. Tres diferentes shARN de SCD1 fueron clonados a un vector e expresión lentiviral tet-inducible. Células SW760 que expresan establemente shARN de SCD1 doxiciclina-inducible o un shARN testigo (testigo) fueron establecidos con selección de uromicina. (A) Inmunoabsorciones representativas que muestran la expresión de SCD1 en células estables tratadas con o sin 1 pg/ml de doxiciclina por 3 días. La proporción de Kd indica la eficiencia del knockdown de SCDl en relación con células sin tratamiento con doxiciclina. (B) El knockdown de doxiciclina reduce la incorporación de [3H] timidina . Células SW780 fueron cultivadas con o sin 1 \iq/mi de doxiciclina por 3 días antes de incubación por 16 horas con [3H] timidina. Los conteos de [3H] timidina incorporada fueron presentados como media +/- SD en relación con células sin tratamiento con doxiciclina. (C) El knockdown de SCDl atenúa el crecimiento del tumor en ratones. Células SW780 que expresan shARNl y 3 de SCDl o un shARN testigo (testigo) fueron inoculadas a ratones CB.17 SCID y agrupados en cohortes de 10 para tratamiento. Se administró a los ratones sacarosa al 5% sola o complementada con 1 mg/ml de doxiciclina y el tamaño del tumor fue medido dos veces a la semana. El volumen de tumor es presentado como media +/- SD. En el día 20, para shARNl de SCDl: p<0.0001; para shARN3 de SCDl, p<0.0001. (D) La expresión de proteína de SCDl en lisados de tumor extraídos de testigo o tejidos de xenoinjerto de shARN de SCDl. Los lisados de tumor fueron inmunoprecipitados por anticuerpo anti-SCDl y evaluados en cuanto al nivel de proteína de SCDl mediante inmunoabsorción .
Figura 15A-15G. La inhibición farmacológica de SCDl atenúa el crecimiento del tumor y reduce la desaturación de ácido graso en ratones . (A) El inhibidor de molécula pequeña de SCDl A37062 bloquea la síntesis del ácido graso monoinsaturado . Células UMUC-14 fueron tratadas con A37062 por 4 horas, luego con [14C] acetato por 6 horas. Los ácidos grasos totales fueron extraídos y separados mediante cromatografía de capa delgada. (B) A37062 abóle la fosforilación de AKT y activa las caspasas 3 y 7. Las células UMUC-14 fueron desprovistas de suero por 20 horas, luego tratadas con A37062 por 20 horas. Los ligados celulares fueron sometidos a análisis de Western blot . (C) El oleato monoinsaturado invierte la inhibición de crecimiento por A37062 (100 nM) en células UMUC-14. (D) El palmitato saturado falla en rescatar las células UMUC-14 tratadas con A37062. (E) El inhibidor de SCD1 A37062 retarda el crecimiento de xenoinjerto de tumores UMUC-14 preestablecidos. Se administró a los ratones con vehículo o A37062 (75 mg/kg) oralmente, dos veces al día y el volumen del tumor fue presentado como media +/- SEM. n = 8 por grupo. En el día 20, p = 0.0073. (F, G) A37062 reduce la desaturación de palmitato (F) y estearato (G) en tejidos de tumor xenoinjertados también como en hígado y plasma de ratón al final del estudio. A 2 horas después del último tratamiento, las muestras (n = 5 por grupo) fueron recolectadas y procesadas como se describe en la sección de métodos. Los metil ésteres de ácido graso fueron identificados mediante cromatografía de gases. Los datos son presentados como media +/- SD.
Figura 16A-16B. El inhibidor de SCD1 suprime la proliferación celular de manera dependiente de la desaturación de ácido graso en células SW780. (A) El oleato monoinsaturado rescata las células SW780 del inhibidor de SCD1 A37062. Células SW780 cultivadas en un medio que contiene FBS al 1% fueron tratadas con una concentración 100 nM del inhibidor de SCD1 A37062 o DMSO (No. 37602) . El ácido oleato BSA-conjugado fue agregado al medio de cultivo como se indica. La viabilidad celular fue medida mediante el kit CellTiter Glo (Promega) a 48 horas pos-tratamiento . Los datos son presentados como media +/- SD en relación con las células tratadas con DMSO solo y cultivadas en un medio complementado con BSA solamente. (B) El palmitato saturado no es apto de invertir el efecto del inhibidor de SCD1 A37062. Las células fueron tratadas similarmente como se describe en (A) , excepto que el palmitato BSA-conjugado fue complementado.
Figura 17A-17F. La inhibición farmacológica de SCD1 reduce la viabilidad celular e incrementa la actividad de las caspasas 3/7 en líneas celulares de cáncer de colón humanas, líneas celulares de cáncer pancreático humanas y líneas celulares de cáncer de riñon. (A) El inhibidor de molécula pequeña de SCD1 A37062 reduce la viabilidad celular de células de cáncer de colón. (B) El inhibidor de molécula pequeña de SCD1 A37062 activa las caspasas 3/7 en células de cáncer de colón. (C) El inhibidor de molécula pequeña de SCD1 A37062 reduce la viabilidad celular de células de cáncer pancreáticas. (D) El inhibidor de molécula pequeña de SCD1 A37062 activa las caspasas 3/7 en células de cáncer pancreático. (E) El inhibidor de molécula pequeña de SCD1 A37062 reduce la viabilidad celular de células de cáncer de riñon. (F) El inhibidor de molécula pequeña de SCD1 A37062 activa las caspasas 3/7 en células de cáncer de riñon.
Figura 18A-18E. La inhibición farmacológica de SCD1 reduce la viabilidad celular e incrementa la actividad de las caspasas 3/7 en un panel de líneas de células de cáncer humanas, incluyendo cánceres de colon, próstata, pancreáticos y de vejiga y atenúa el crecimiento del tumor en ratones. (A) El inhibidor de molécula pequeña de SCD1 A37062reduce la viabilidad de células de tumor de cáncer humanas. (B) El inhibidor de molécula pequeña de SCD1 G02447171.1 reduce la viabilidad celular de células de cáncer humana. (C) Los inhibidores de molécula pequeña de SCD1 retardan el crecimiento del xenoinjerto de tumores de colon HCT15 preestablecidos. (D) Los inhibidores de molécula pequeña de SCD1 retardan el crecimiento del xenoinjerto de tumores de vejiga SW780 preestablecidos. (E) Los inhibidores de molécula pequeña de SCD1 retardan el crecimiento del xenoinjerto de tumores pancreáticos de HPAC preestablecidos.
Figura 19A-19D. La inhibición farmacológica de SCD1 por catorce inhibidores de SCD1 de molécula pequeña reduce la viabilidad celular en células de cáncer HCT15 (A, B) y HT29 (C,D) .
Figura 20A-20F. Los inhibidores de SCDl RG1 , RG3 y RG8 suprimen la proliferación celular de manera dependiente de la desaturación de ácido graso en células HTC15. (A-C) El oleato monoinsaturado rescata las células HCT15 de los inhibidores de SCDl. (D-F) El palmitato saturado no es apto de invertir el efecto de los inhibidores de SCDl en células HCT15.
Figura 21A-21F. Los inhibidores de SCDl RG1 , RG3 y RG8 suprimen la proliferación células dependientes de la desaturación de ácido graso en células HT29. (A-C) El oleato monoinsaturado rescata las células HT29 de los inhibidores de SCDl. (D-F) El palmitato saturado no es apto de invertir en defectos de los inhibidores de SCDl en células HT29.
DESCRIPCIÓN DETALLADA 1. I. Definiciones Los términos "estearoil-CoA desaturasa 1" y "SCDl" se refiere en la presente a un polipéptido de SCDl de secuencia natural, variantes y fragmentos de polipéptido de un polipéptido de secuencia natural y variantes de polipéptido de secuencia natural y variantes de polipéptido (que son definidos adicionalmente en la presente) . El polipéptido de SCDl descrito en la presente puede ser aquel que es aislado de una variedad de fuentes, tal como de tipos de tejido humano o de otra fuente o preparados mediante métodos recombinantes o de síntesis.
Un "polipéptido de SCD1 de secuencia natural" comprende un polipéptido que tiene la misma secuencia de aminoácido como el polipéptido de SCD1 correspondiente derivado de la naturaleza. En una modalidad, un polipéptido de SCD1 de secuencia natural comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.
SEQ ID NO: 1 MPAHLLQDDISSSYTTTTTITAPPSRVLQNGGDKLETMPLYLEDDIRPDIKDDIYDPTYK DKEGPSPKVEYVWRNIILMSLLHLGALYGITLIPTCKFYTWLWGVFYYFVSALGITAGAH RL SHRSYKARLPLRLFLIIANTMAFQNDVYEWARDHRAHHKFSETHADPHNSRRGFFFS HVGWLLVRKHPAVKEKGSTLDLSDLEAEKLVMFQRRYYKPGLLMMCFILPTLVPWYFWGE TFQNSVFVATFLRYAWLNATWLVNSAAHLFGYRPYDKNISPRENILVSLGAVGEGFHNY HHSFPYDYSASEYRWHINFTTFFIDCMAALGLAYDRK VSKAAILARIKRTGDGNYKSG "Variante de polipéptido de SCD1" o variaciones del mismo, significa un polipéptido de SCD1, en general un polipéptido de SCD1 activo, como se define en la presente que tiene por lo menos alrededor de 80% de identidad de secuencia de aminoácidos con cualquiera de las secuencias de polipéptidos de SCD1 de secuencia natural como se revelan en la presente. Tales variantes polipéptido de SCD1 incluyen, por ejemplo polipéptidos de SCD1, en donde uno o más residuos de aminoácido son agregados o cancelados, en el término N o término C de una secuencia de aminoácidos natural. Ordinariamente, una variante de polipéptido de SCD1 tendrá por lo menos alrededor de 80% de identidad de secuencia de aminoácidos, alternativamente, por lo menos alrededor de 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% amino de identidad de secuencia de aminoácidos con una secuencia de polipéptidos de SCDl de secuencia natural como se revela en la presente. Ordinariamente, los polipéptidos variantes de SCDl son de por lo menos alrededor de 10 aminoácidos de longitud, alternativamente por lo menos alrededor de 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600 o más. Opcionalmente, los polipéptidos variantes de SCDl tendrán no más que una sustitución de aminoácido conservadora en comparación con una secuencia de polipéptidos de SCDl natural, alternativamente no más de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 sustituciones de aminoácido conservadoras en comparación con la secuencia de polipéptidos de SCDl natural.
El término "antagonista de SCDl" como se define en la presente es cualquier molécula que bloquea parcial o plenamente, inhibe o neutraliza una actividad biológica moderada por un SCDl de secuencia natural. En ciertas modalidades, tal antagonista se enlaza a SCDl. De acuerdo con una modalidad, el antagonista es un polipéptido. De acuerdo con otra modalidad, el antagonista es un anticuerpo anti-SCD1. De acuerdo con otra modalidad, el antagonista es un antagonista de molécula pequeña. De acuerdo con otra modalidad, el antagonista es un antagonista de polinucleótido .
"Polinucleótido" o "ácido nucleico" como se usan intercambiablemente en la presente, se refieren a polímeros de nucleótidos de cualquier longitud e incluyen ADN y ARN. Los nucleótidos pueden ser desoxiribonucleótidos , ribonucleótidos, nucleótidos o bases modificados y/o sus análogos o cualquier sustrato que pueda ser incorporado a un polímero mediante ARN polimerasa o mediante una reacción de síntesis. Un polinucleótido puede comprender nucleótidos modificados, tales como nucleótidos metilados y sus análogos. Si está presente, la modificación a la estructura de nucleótido puede ser impartida antes o después del ensamble del polímero. La secuencia de nucleótidos puede ser interrumpida por componentes sin nucleótido. Un polinucleótido puede ser modificado adicionalmente después de la síntesis, tal como mediante conjugación con un marcador. Otros tipos de modificaciones, incluyen, por ejemplo "tapas", sustituciones de uno o más de los nucleótidos que se presentan en la naturaleza con un análogo, modificaciones de internucleótido tal como por ejemplo aquellas con enlace sin cargar (por ejemplo, metil fosfonatos, fosfotriésteres , fosfoamidatos, carbamatos, etc) y con enlaces cargados (por ejemplo, fosforotioatos , fosforodxtioatos , etc.), aquellos que contienen porciones pendientes, tales como por ejemplo proteínas (por ejemplo, nucleasas, toxinas, anticuerpos, péptidos de señal, ply-L-lisina, etc.), aquellos con intercaladores (por ejemplo, acridina, psoralen, etc.), aquellos que contienen agentes quelantes (por ejemplo, metales, metales radiactivos, boro, metales oxidantes, etc.), aquellos que contienen agentes alquilantes, aquellos con enlaces modificados (por ejemplo, ácidos nucleicos alfa anoméricos, etc.), también como formas sin modificar del (los) polinucleótido (s) . además, cualquiera de los grupos hidroxilo ordinariamente presentes en los azúcares pueden ser reemplazado, por ejemplo, por grupos fosfonato, grupos fosfato, protegidos por grupos protectores estándar o activados para preparar enlaces adicionales a nucleótidos adicionales o pueden ser conjugados a soportes sólidos o semisólidos. El OH 5' y 3' terminal puede ser fosforilado o sustituido con aminas o porciones de grupo de correlación orgánicas de 1 a 20 átomos de carbono. Otros hidroxilos pueden también ser derivados a grupos protectores estándar. Los polinucleótidos pueden también contener formas análogas de ribosa o azúcares de desoxirribosa que son en general conocidos en el arte, incluyendo, por ejemplo 2'-0-metil-, 2'-0-alil, 2'-fluoro- o 21 -acido-ribosa, análogos de azúcar carbocíclicos, azúcares a-anoméricos, azúcares epiméricos tales como arabinosas, xilosas o lixosas, azúcares de piranosa, azucares de furanosa, sedoheptulosas, análogos aciclicos y análogos de nucleósido abásicos tales como metil riboside. Uno o más enlaces de fosfodiéster pueden ser reemplazados por grupos enlazantes alternativos . Estos grupos enlazantes alternativos incluyen pero no están limitados a, modalidades en donde fosfato es reemplazado por P(0) S ("tioato") , P(S)S ("ditioato") , " (0)NR2 ( "amidato" ) , P(0)R, P(0)OR', CO o CH2 ( " formacetal " ) , en los cuales cada R o R' es independientemente H o alquil (1-20 C) sustituido o sin sustituir que contiene opcionalmente un enlace de éter (-0-) arilo, alquenilo, cicloalquilo, cicloalquenilo o aralilo. No todos los enlaces en un polinucleótido necesitan ser idénticos. La descripción precedente se aplica a todos los polipéptidos a los que se hace referencia en la presente, incluyendo ARN y ADN.
"Oligonucleótido" como se usa en la presente, se refiere a polinucleótidos de una sola hebra cortas que son de alrededor de siete nucleótidos de longitud y menos alrededor de 250 nucleótidos de longitud. Los oligonucleótidos pueden ser sintéticos. Los términos "oligonucleótido" y "polinucleótido" no son mutuamente exclusivos. La descripción anterior para polinucleótidos es igual y plenamente aplicable a los oligonucleótidos .
El término "cebador" se refiere a un polinucleótido de una sola hebra que es apto de hibridización a un ácido nucleico y que permite la polimerización de un ácido nucleico complementario, en general, al proveer un grupo 3' -OH libre.
El término "molécula pequeña" se refiere a cualquiera molécula con un peso molecular de alrededor de 2000 daltons o menos, preferiblemente de alrededor de 500 daltons o menos.
El término "arreglo" o "microarreglo" se refiere a un arreglo ordenado de elementos de arreglo hibridizables , preferiblemente sondas de polinucleótido (por ejemplo, oligonucleótidos) sobre un sustrato. El sustrato puede ser un sustrato sólido, tal como un portaobjetos de vidrio o un sustrato semisólido tal como membrana de nitrocelulosa .
El término "amplificación" se refiere al proceso de producir una o más copias de una secuencia de ácido nucleico de referencia o su complemento. La amplificación puede ser lineal o exponencial (por ejemplo, PCR) . Una "copia" no necesariamente significa complementareidad o identidad de secuencia perfecta en relación con la secuencia de plantilla. Por ejemplo, las copias pueden incluir análogos de nucleótido tal como desoxiinosina, alteraciones de secuencia intencionales (tales como alteraciones de secuencia introducidas por medio de un cebador que comprende una secuencia que es hibridizable pero no plenamente complementaria con la plantilla) y/o errores de secuencia que se presentan durante la amplificación.
Un anticuerpo "aislado" es uno que ha sido separado de un componente de su medio ambiente natural . En algunas modalidades, un anticuerpo es purificado a mayor de 95% o 99% de pureza tal como se determina, por ejemplo mediante medios electroforéticos (por ejemplo, SDS-PAGE, enfoque isoeléctrico (IEF) , electroforesis capilar) o cromatográfico (por ejemplo, HPLC de intercambio iónico o fase inversa) . Para una revisión de métodos para determinación de pureza de anticuerpo, véase, por ejemplo Flatman et al., J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007) .
Un ácido nucleico "aislado" se refiere a una molécula de ácido nucleico que ha sido separada de un componente de su medio ambiente natural. Un ácido nucleico aislado incluye una molécula de ácido nucleico contenida en células que ordinariamente contienen la molécula de ácido nucleico, pero la molécula de ácido nucleico está presente extracromosomalmente o en un sitio cromosomal que es diferente de su ubicación cromosomal natural.
Los términos "célula huésped" , "línea celular huésped" y "cultivo celular huésped" son usados intercambiablemente y se refieren a células en las cuales el ácido nucleico exógeno ha sido introducido, incluyendo la progenie de tales células. Células huésped incluyen "transformantes" y "células transformadas" que incluyen las células transformadas primarias y progenie derivada de la misma sin consideración del número de pasos . La progenie puede no ser completamente idéntica en contenido de ácido nucleico con una célula padre, sino que puede contener mutaciones. La progenie mutante que tiene la misma función o actividad biológica tal como es filtrada de o seleccionada en la célula transformada originalmente es incluida en la presente.
El término "vector", como se usa en la presente, se refiere a una molécula de ácido nucleico apta de propagar otro ácido nucleico al cual está enlazada. El término incluye el vector como una estructura de ácido nucleico auto-replicante también como el vector incorporado al genoma de una célula huésped a la cual ha sido introducido. Ciertos vectores son aptos de dirigir la expresión de ácidos nucleicos a los cuales están enlazados operativamente . Tales vectores son referidos en la presente como "vectores de expresión" .
El término "anticuerpo" en la presente es usado en el sentido más amplio y abarca varias estructuras de anticuerpo, incluyendo pero no limitado a anticuerpos monoclonales , anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecífieos (por ejemplo, anticuerpos bisespecíficos) y fragmentos de anticuerpos en tanto que exhiban la actividad de enlace de antígeno deseada.
Los términos "anticuerpos anti-SCDl" y "un anticuerpo que se enlaza a SCDl" se refieren a un anticuerpo que es apto de enlazarse a SCDl con suficiente afinidad de tal manera que el anticuerpo es útil como agente de diagnóstico y/o terapéutico en el apuntamiento de SCDl. En una modalidad, la extensión de enlace de un anticuerpo anti-SCDl a una proteína sin SCDl no relacionada, es menor de alrededor de 10% del enlace de anticuerpo a SCDl, tal como es medido, por ejemplo, mediante un radioinmunoensayo (RIA). En ciertas modalidades, un anticuerpo anti-SCDl se enlaza a un epítope de SCDl que es conservado entre SCDl de diferentes especies.
Un anticuerpo "bloqueador" o un anticuerpo "antagonista" es uno que inhibe o reduce la actividad biológica del anticuerpo al que se enlaza. Anticuerpos de bloqueo preferidos o anticuerpos antagonistas que inhiben completa o sustancialmente la actividad biológica del antígeno.
"Afinidad" se refiere a la fuerza de la suma total de interacciones no covalentes entre un solo sitio de enlace de una molécula (por ejemplo, un anticuerpo) y su socio de enlace (por ejemplo, un antígeno) . A no ser que se indique de otra manera, como se usa en la presente "afinidad de enlace" se refiere a afinidad de enlace intrínseca que refleja una interacción de 1:1 entre miembros de un par de enlaces (por ejemplo, anticuerpo y antígeno) . La afinidad de una molécula X por su socio Y puede en general ser representada por la constante de disociación (Kd) . La afinidad puede ser medida mediante métodos comunes conocidos en el arte, incluyendo aquellos descritos en la presente. Modalidades ilustrativas y ejemplares especificas para medir la afinidad de enlace son descritas en lo siguiente.
Un anticuerpo "madurado por afinidad" se refiere a un anticuerpo con una o más alteraciones en una o más regiones hipervariables (HVR) , en comparación con anticuerpo padre que no posee tales alteraciones, tales alteraciones dan como resultado una mejora en la afinidad del anticuerpo por el antígeno.
Un "fragmento de anticuerpo" se refiere a una molécula diferente de un anticuerpo intacto que comprende una porción de un anticuerpo intacto que se enlaza al antígeno al cual el anticuerpo intacto se enlaza. Ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen pero no están limitados a Fv, Fab, Fab', Fab' -SH, F(ab')2; diacuerpos; anticuerpos lineales; moléculas de anticuerpo de una sola cadena (por ejemplo, scFv) y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpo.
Un "anticuerpo que se enlaza al mismo epítope" como un anticuerpo de referencia se refiere a un anticuerpo que bloquea el enlace del anticuerpo de referencia a su antígeno en un ensayo de competencia por el 50% o más e inversamente, el anticuerpo de referencia bloquea el enlace del anticuerpo a su antígeno en un ensayo de competencia por 50% o más. Un ensayo de competencia ejemplar es provisto en la presente.
El término anticuerpo "quimérico" se refiere a un anticuerpo en el cual una porción de la cadena pesada y/o cadena ligera es derivada de una fuente o especie particular, mientras que el resto de la cadena pesada y/o ligera es derivada de una fuente o especie diferente.
La "clase" de un anticuerpo se refiere al tipo de dominio constante o región constante poseída por su cadena pesada. Hay cinco clases principales de anticuerpos: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM y varias de estas pueden ser divididas adicionalmente en subclases (isotipos) , por ejemplo, IgGi, IgG2/ IgG3, IgG4/ IgA e IgA2. Los dominios constantes de cadena pesada que corresponden a las diferentes clases de inmunoglobulinas son llamados ot, d, e, ? y µ, respectivamente.
Los términos "anticuerpo de plena longitud" , "anticuerpo intacto" y "anticuerpo entero" son usados en la presente intercambiablemente para referirse a un anticuerpo que tiene una estructura sustancialmente similar a una estructura de anticuerpo natural o que tiene cadenas pesadas que contienen una región de Fe como se define en la presente.
El término "anticuerpo monoclonal" como se usa en la presente, se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, esto es, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos y/o se enlazan al mismo epítope, excepto por posibles anticuerpos variantes, por ejemplo, que contienen mutaciones que se presentan naturalmente o que surgen durante la producción de una preparación de anticuerpo monoclonal, tales variantes en general están presentes en cantidades menores. En contraste con las preparaciones de anticuerpo policlonales que comúnmente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopes) , cada anticuerpo monoclonal de una preparación de anticuerpo monoclonal está dirigido contra un solo determinante sobre un antígeno. Asi, el modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo por ser obtenido de una población sustancialmente homogénea de anticuerpo y no se interpretara que requiere la producción del anticuerpo por algún método particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales a ser usados de acuerdo con la presente invención pueden ser elaborados mediante una variedad de técnicas incluyendo pero no limitado al método de hibridoma. Métodos de ADN recombinante, métodos de despliegue de fago y métodos que utilizan animales transgénicos que contienen todos o parte de los sitios de inmunoglobulina humano, tales métodos y otros métodos ejemplares para elaborar anticuerpos monoclonales son descritos en la presente.
Un "anticuerpo humano" es uno que posee una secuencia de aminoácidos que corresponden a aquella de un anticuerpo producido por un humano o una célula humana o derivado de una fuente no humana que utiliza repertorios de anticuerpo humano u otras secuencias que codifican anticuerpo humano. Esta definición de un anticuerpo humano excluye específicamente un anticuerpo humanizado que comprende residuos de enlace de antígeno no humano.
Un anticuerpo "humanizado" se refiere a un anticuerpo quimérico que comprende residuos de aminoácido de HVR no humanas y residuos de aminoácido de FR humana. En ciertas modalidades, un anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos de por lo menos uno y comúnmente dos dominios variables en los cuales todas o sustancialmente dos las HVR (por ejemplo, CDR) corresponden a aquellas de un anticuerpo no humano y todas o sustancialmente todas las FR corresponden a aquellas de un anticuerpo humano. Un anticuerpo humanizado opcionalmente puede comprender por lo menos una porción de una región constante de anticuerpo derivada de un anticuerpo humano. Una "forma humanizada" de un anticuerpo, por ejemplo un anticuerpo no humano, se refiere a un anticuerpo que ha sufrido humanización.
Un "inmunoconjugado" es un anticuerpo conjugado a una o más moléculas heterólogas, incluyendo pero no limitado a un agente citotóxico.
"Por ciento (%) de identidad de secuencia de aminoácido" con respecto a una secuencia de polipéptido de referencia es definido como el porcentaje de residuos de aminoácido en una secuencia candidata que son idénticos con los residuos de aminoácido en la secuencia de polipéptido de referencia, después de alinear la secuencias e introducir espacios, si es necesario, para obtener el por ciento de identidad de secuencia máximo y no considerando cualesquier sustituciones conservadoras como parte de la identidad de secuencia. La alineación por propósitos de determinar el por ciento de identidad de secuencia de aminoácidos puede ser obtenida de varias maneras que están dentro de la habilidad de aquellos experimentados en el arte, por ejemplo, utilizando elementos de programación de computadora disponibles públicamente tales como elementos de programación BLAST, BLAST-2, ALIGN o Megalign (DNASTAR) . Aquellos experimentados en el arte pueden determinar parámetros apropiados para alinear secuencias, incluyendo cualquier algoritmo necesario para obtener alineación máxima sobre la plena longitud de las secuencias que son comparadas. Por propósitos de la presente, sin embargo, los valores de por ciento de identidad de secuencia de aminoácidos son generados utilizando el programa de computadora de comparación de secuencia ALIGN-2. El autor del programa de computadora de comparación de secuencias ALIGN-2 fue Genentech, Inc. y el código fuente ha sido presentado con documentación del usuario en la oficina de derechos reservados de los Estados Unidos de América, Washington D.C., 20559, en donde está registrado bajo el número de registro de derechos reservados de los Estados Unidos de América TXU510087. El programa ALIGN-2 está disponible públicamente de Genentech, Inc., Sur de San Francisco, California o puede ser compilado del código fuente. El programa ALIGN-2 puede ser compilado para uso en un sistema operativo UNIX, incluyendo UNIX digital V4.0D. Todos los parámetros de comparación de secuencias son establecidos por el programa ALIGN-2 y no varían.
En situaciones en donde se emplea ALIGN-2 para comparaciones de secuencia de aminoácido, el por ciento de identidad de secuencia de aminoácidos de una secuencia de aminoácidos dada A a con o contra una secuencia de aminoácidos dada B (que puede ser denominada alternativamente como una secuencia de aminoácidos dada A que tiene o comprende un cierto por ciento de identidad de secuencia de aminoácidos a, con o contra una secuencia de aminoácidos dada B) es calculado como sigue: 100 veces la fracción X/Y en donde X es el número de residuos de aminoácido puntuados como coincidencia genéticas por el programa de alineación de secuencia ALIGN-2 en aquella alineación del programa de A y B, en donde Y es número total de residuos de aminoácidos en B . Se apreciara que en donde la longitud de secuencia de aminoácidos A no es igual a la longitud de secuencia de aminoácidos B, el por ciento de identidad de secuencia de aminoácidos de A a B no será igual al por ciento de identidad de secuencia de aminoácidos de B a A. A no ser que se afirme especifique específicamente de otra manera, todos los valores de por ciento de identidad de secuencia de aminoácidos usados en la presente son obtenidos como se describe en el párrafo inmediatamente precedente utilizando el programa de computadora ALIGN-2.
El término "detección" incluye cualesquier medios de detección, incluyendo detección directa e indirecta.
El término "biomarcador" como se usa en la presente se refiere a un indicador, por ejemplo predictivo, diagnóstico y/o prognóstico, que puede ser detectado en una muestra. El biomarcador puede servir como indicador de un subtipo particular de una enfermedad o alteración (por ejemplo, cáncer) caracterizada por ciertos elementos moleculares, patológicos, histológicos y/o clínicos. En algunas modalidades, un biomarcador es un gen. Los biomarcadores incluyen pero no están limitados a polinucleótidos (por ejemplo, ADN y/o AR ) , polipéptidos , modificaciones de polipéptido y polinucleótidos (por ejemplo, modificaciones pos-traducción) , carbohidratos y/o marcadores moleculares a base de glicolípido.
Los términos "firma de biomarcador", "firma", "firma de expresión de biomarcador" o "firma de expresión" son usados intercambiablemente en la presente y se refieren a uno o una combinación de biomarcadores cuya expresión es un indicador, por ejemplo predictivo, de diagnóstico y/o prognóstico. La firma de biomarcador puede servir como indicador de un subtipo particular de una enfermedad o alteración (por ejemplo, cáncer) caracterizada por ciertos elementos moleculares, patológicos, histológicos y/o clínicos. En algunas modalidades, la firma de biomarcador es una "firma genética" . El término "firma genética" es usado intercambiablemente con "firma de expresión genética" y se refiere a uno o una combinación de polinucleótidos cuya expresión es un indicador, por ejemplo predictivo, de diagnóstico y/o prognóstico. En algunas modalidades, la firma de biomarcador es una "firma de proteína" . El término "firma de proteína" es usado intercambiablemente con "firma de expresión de proteína" y se refiere a una combinación de polipéptidos cuya expresión es un indicador, por ejemplo predictivo, diagnóstico y/o prognóstico.
La "cantidad" o "nivel" de un biomarcador asociado con un beneficio clínico incrementado a un individuo es un nivel detectable en una muestra biológica. Estos pueden ser medidos mediante métodos conocidos para el experimentado en el arte y también revelados en la presente. El nivel de expresión o calidad de biomarcador determinada puede ser usada para determinar la respuesta al tratamiento.
Los términos "nivel de expresión" o "nivel de expresión" en general son usados intercambiablemente y se refieren en general a la cantidad de un biomarcador en una muestra biológica. "expresión" se refiere en general al proceso mediante la información (por ejemplo, gen-codificada y/o epigenética) es convertida a las estructuras presentes y que operan en la célula. Por consiguiente, como se usa en la presente "expresión" se puede referir a la transcripción a un polinucléotido, traducción a un polipéptido o aun modificaciones de polinucléotido y/o polipéptido (por ejemplo, modificación post-traducción de un polipéptido) . Fragmentos del polinucléotido transcrito, el polinucléotido traducido y/o modificaciones de polinucléotido y/o polipéptido (por ejemplo, modificación pos-traducción de un polipéptido) también serán considerados como expresados, ya sea que se originen de un transcrito generado mediante el empalme alternativo o un transcrito degradado o de un procesamiento post-traducción del polipéptido, por ejemplo mediante proteólisis. "Genes expresados" incluyen aquellos que son transcritos a un polinucléotido como mAR y luego traducidos a un polipéptido y también aquellos que son transcritos a ARN pero no traducidos a un polipéptido (por ejemplo, ARN de transferencia y ribosomales) .
"Expresión elevada" , "niveles de expresión elevadas" o "niveles elevados" se refiere a una expresión incrementada o niveles incrementados de uno biomarcador en un individuo en relación con un testigo, tal como un individuo o individuos que no sufren de la enfermedad o alteración (por ejemplo, cáncer) o un testigo interno (por ejemplo, biomarcador de mantenimiento) .
"Expresión reducida", "niveles de expresión reducidos" o "niveles reducidos" se refiere a una expresión disminuida o niveles disminuidos de un biomarcador en un individuo en relación con un testigo, tal como un individuo o individuos que no están sufriendo de la enfermedad o alteración (por ejemplo, cáncer) o un testigo interno (por ejemplo, biomarcador de mantenimiento) .
El término "biomarcador de mantenimiento" se refiere a un biomarcador o un grupo de biomarcadores (por ejemplo, polinucleótidos y/o polipéptidos) que son comúnmente similares presentes en todos los tipos de células. En algunas modalidades, el biomarcador de mantenimiento es un "gen de mantenimiento" . Un "gen de mantenimiento" se refiere en la presente a un gen o grupo de genes que codifican proteínas cuyas actividades son esenciales para el mantenimiento de función celular y que están comúnmente presentes similarmente en todos los tipos de células .
"Amplificación" , como se usa en la presente se refiere en general al proceso de producir múltiples copias de una secuencia deseada. "Múltiples copias" significa por lo menos dos copias. Una "copia" no necesariamente significa complementariedad de secuencia perfecta o identidad a la secuencia de plantilla. Por ejemplo, las copias pueden incluir análogos de nucleótido tales como desoxiinosina, alteraciones de secuencia intencionales (tales como alteraciones de secuencia introducidas por medio de un cebador que comprende una secuencia que es hibridizable, pero no complementaria a la plantilla) y/o errores de secuencia que ocurren durante la amplificación.
El término "PCR múltiplex" se refiere a una sola reacción de PCR llevada a cabo en ácido nucleico obtenido de una sola fuente (por ejemplo, un individuo) utilizando más de un conjunto de cebadores por el propósito de amplificar dos o más secuencias de ADN en una sola reacción.
"Severidad" de las reacciones de hibridización es fácilmente determinable por aquel de habilidad ordinaria en el arte y en general es un cálculo empírico dependiente de la longitud de sonda, temperatura de lavado y concentración de sal. En general, las sondas más largas requieren temperaturas más altas para el recocido apropiado. En tanto que las sondas más cortas necesitan temperaturas más bajas. La hibridización de gen depende en general de la habilidad del ADN desnaturalizado para recocerse cuando hebras complementarias están presentes en un medio ambiente por debajo de su temperatura de fusión. Mientras más alto es el grado de homología deseada entre las sondas y la secuencia hibridizable, más alta la temperatura relativa que puede ser usada. Como resultado, se sigue que las temperaturas más altas tienden a hacer las condiciones de reacción más severas, mientras que las temperaturas más bajas menos. Por detalles adicionales y explicación de la severidad de las reacciones de hibridización, véase Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995) .
"Condiciones de severidad" o "condiciones de alta severidad" como se define en la presente, pueden ser identificada por aquella que: (1) emplean baja fuerza iónica y alta temperatura para lavado, por ejemplo cloruro de sodio 0.015 M/citrato de sodio 0.0015 M/dodecil sulfato de sodio al 0.1% a 50°C; (2) emplean durante la hibridización un agente desnaturalizante, tal como formamida, por ejemplo, formamida al 50% (v/v) con albúmina de suero bovino al 0.1%/ficol al 0.1%/polivinilpirrolidona al 0.1%/solución reguladora del pH de fosfato de sodio 50 mM a pH 6.5 con cloruro de sodio 750 mM, citrato de sodio 75 mM a 42 °C o (3) hibridización de la noche a la mañana en una solución que emplea formamida al 50%, SSC 5 x (NaCl de 0.75 M, citrato de sodio 0.075 M) , fosfato de sodio 50 mM (pH 6.8), pirofosfato de sodio 0.1% , solución de Denhardt 5 x, ADN de esperma de salmón sonificado (50 ug/ml), SDS al 0.1% y sulfato de dextrana al 10% a 42°C, con un lavado de 10 minutos a 42°C en SSC 0.2 x (cloruro de sodio/citrato de sodio) seguido por un lavado de alta severidad de 10 minutos que consiste de SSC 0.1 x que contiene EDTA al 55°C.
"Condiciones moderadamente severas" pueden ser identificadas como se describe por Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1989 e incluyen el uso de solución de lavado y condiciones de hibridización (por ejemplo, temperatura, fuerza iónica y % de SDS) menos severas que aquellas descritas anteriormente. Un ejemplo de condiciones moderadamente severas e incubación de la noche a la mañana a 37°C en una solución que comprende: formamida al 20%, SSC 5 x (NaCl 150 mM, citrato de trisodio 15 mM) , fosfato de sodio 50 mM (pH 7.6), solución de Denhardt 5 x, sulfato de dextrana al 10% y 20 mg/ml de ADN de esperma de salmón sometido a esfuerzo cortante desnaturalizado, seguido por lavado de los filtros en SSC 1 x a alrededor de 37-50°C. El experimentado en el arte reconocerá como ajustar la temperatura, fuerza iónica, etc. como sea necesario para compensar factores tales como longitud de sonda y los semejantes.
El término "diagnosis" es usado en la presente para referirse a la identificación o clasificación de un estado, enfermedad o condición molecular o patológica (por ejemplo, cáncer) . Por ejemplo, "diagnosis" se puede referir a la identificación de un tipo particular de cáncer. "Diagnosis" también se puede referir a la clasificación de un subtipo particular de cáncer, por ejemplo mediante criterios histopatológicos o mediante elementos moleculares (por ejemplo, un subtipo caracterizado por expresión de uno o una combinación de biomarcadores (por ejemplo, genes o proteínas particulares codificados por dichos genes) ) .
El término "auxiliar de diagnosis" es usado en la presente para referirse a métodos que ayudan a hacer la determinación clínica con respecto a la presencia o naturaleza de un tipo de síntoma o condición particular de una enfermedad o alteración (por ejemplo, cáncer) . Por ejemplo, un método de diagnosis auxiliar de una enfermedad o condición (por ejemplo, cáncer) puede comprender medir ciertos biomarcadores en una muestra biológica de un individuo .
El término "muestra" como se usa en la presente, se refiere a una composición que es obtenida o derivada de un sujeto y/o individuo de interés que contiene una entidad celular y/o u otra entidad molecular que va a ser caracterizada y/o identificada, por ejemplo en base a características físicas, bioquímicas, químicas y/o fisiológicas. Por ejemplo, la frase "muestra enferma" y variaciones de la misma se refiere a cualquier muestra obtenida de un sujeto de interés que es esperaría o que se sabe que contiene la entidad celular y/o molecular que va a ser caracterizada. Las muestras incluyen pero no están limitadas a células primarias o cultivadas o líneas celulares, sobrenadantes celulares, lisados celulares, plaquetas, suero, plasma, fluido vitreo, fluido linfático, fluido sinovial, fluido folicular, fluido seminal, fluido amniótico, leche, células sangre-derivadas, orina, fluido cerebroespinal, saliva, esputo, lagrimas, transpiración, moco, lisados de tumor y medio de cultivo de tejido, extractos de tejido tales como tejido homogeneizado, tejido e tumor, extractos celulares y combinaciones de los mismos.
"Muestra de tejido" o "muestra celular" significa una colección de células similares obtenidas de un tejido de un sujeto o individuo. La fuente de la muestra de tejido o muestra celular puede ser tejido sólido tal como de un órgano, muestra de tejido, biopsia y/o aspirado nuevo, congelado y/o conservado; sangre o cualesquier constituyentes de sangre tales como plasma; fluidos corporales tales como fluido cerebroespinal, fluido amniótico, fluido peritoneal o fluido intersticial, células de cualquier tiempo en gestión o desarrollo del sujeto. La muestra de tejido puede también ser células primarias cultivadas o líneas celulares. Opcionalmente, la muestra de tejido o muestra celular es obtenida de un tejido/órgano enfermo. La muestra de tejido puede contener compuestos que no están naturalmente entremezclados con el tejido en la naturaleza tales como conservadores, anticoagulantes, soluciones reguladoras del pH, agentes fijadores, nutrientes, antibióticos o los semejantes .
Una "muestra de referencia" , "célula de referencia" , "tejido de referencia", "muestra testigo", "célula testigo" o "tejido testigo" como se usa en la presente, se refiere a una muestra, célula, tejido, estándar o nivel que es usado por propósitos de comparación. En una modalidad, una muestra de referencia, célula de referencia, tejido de referencia, muestra testigo, célula testigo o tejido testigo es obtenido de una parte saludable y/o no enferma del cuerpo (por ejemplo, tejido o célula) del mismo sujeto o individuo. Por ejemplo, células o tejidos saludable y/o no enfermo adyacente a las células o tejido enfermo (por ejemplo, células o tejido adyacente a un tumor) . En otra modalidad, una muestra de referencia es obtenida de un tejido y/o célula sin tratar del cuerpo del mismo sujeto o individuo. En todavía otra modalidad, una muestra de referencia, célula de referencia, tejido de referencia, muestra testigo, célula testigo o tejido testigo es obtenido de una parte saludable y/o no enferma del cuerpo (por ejemplo, tejidos o células) de un individuo que no es el sujeto o individuo. En aun otra modalidad, una muestra de referencia, célula de referencia, tejido de referencia, muestra testigo, célula testigo o tejido testigo es obtenido de un tejido y/o célula sin tratar del cuerpo de un individuo que no es el sujeto o individuo.
Por propósitos de la presente, una "sección" de una muestra de tejido significa una sola parte o pieza de una muestra de tejido, por ejemplo una rebanada delgada de tejido o célula cortada de una muestra de tejido. Se comprenderá que múltiples secciones de muestra de tejido pueden ser tomadas y sometidas a análisis, a condición de que se entienda que la misma sección de muestra de tejido puede ser analizada tanto a niveles morfológicos como moleculares o analizada con respecto tanto a polipéptidos como polinucleótidos .
"Correlacionar" o "que correlaciona" significa comparar de alguna manera el desempeño y/o resultados de un primer análisis o protocolo con el desempeño y/o resultado de un segundo análisis o protocolo. Por ejemplo, se pueden usar los resultados de un primer análisis o protocolo para llevar a cabo segundos protocolos y/o se pueden usar los resultados de un primer análisis o protocolo para determinar si un segundo análisis o protocolo debe ser efectuado. Con respecto a la modalidad de análisis o protocolo de polinucleótido, se pueden usar los resultados del análisis o protocolo de expresión de polinucleótidos para determinar si un régimen terapéutico específico debe ser efectuado.
"Respuesta individual" o "respuesta" puede ser determinada utilizando cualquier punto final que indica un beneficio al individuo, incluyendo, sin limitación, (1) inhibición a alguna extensión de avance de la enfermedad (por ejemplo, avance de cáncer) , incluyendo frenado o parada completa; (2) una reducción en el tamaño del tumor, (3) inhibición (esto es, reducción, frenado o parada completa) de infiltración de células de cáncer a órganos y/o tejidos periféricos adyacentes; (4) inhibición (esto es, reducción, frenado o parada completa) de metástasis; (5) alivio a alguna extensión de alguno o más síntomas asociadas con la enfermedad o alteración (por ejemplo, cáncer) ; (6) incremento en la duración de supervivencia libre de avance y/o (9) mortalidad disminuida a un punto del tiempo dado enseguida del tratamiento.
El término "sustancialmente el mismo" , como se usa en la presente, denota un grado suficientemente alto de similaridad entre dos valores numéricos, de tal manera que el experimentado en el arte consideraría la diferencia entre los dos valores que es de poco o ninguna significado biológico y/o estadístico en el contexto de la característica biológica medida por dichos valores (por ejemplo, valores de Kd o expresión) . La diferencia entre dichos dos valores es, por ejemplo menos de alrededor de 50%, menos de alrededor de 40%, menos de alrededor de 30%, menos de alrededor de 20% y/o menos de alrededor de 10% como función del valor de referencia/comparador.
La frase "sustancialmente diferente" , como se usa en la presente, denota un grado suficientemente alto de diferencia entre dos valores numéricos, de tal manera que el experimentado en el arte consideraría la diferencia entre los dos valores ser de significado estadístico en el contexto de la característica biológica medida por dichos valores (por ejemplo, valores de Kd) . La diferencia entre dichos valores es por ejemplo, mayor de alrededor de 10%, mayor de alrededor de 20%, mayor de alrededor de 30%, mayor de alrededor de 40% y/o mayor de alrededor de 50% como función del valor de la molécula de referencia/comparador.
La palabra "marcador" cuando se usa en la presente se refiere a una composición o compuesto detectable. El marcador es comúnmente conjugado o fusionado directa o indirectamente a un reactivo, tal como una sonda de polinucleótido o un anticuerpo y facilita la detección del reactivo al cual es conjugado o fusionado. El marcador puede en sí mismo ser detectable (por ejemplo, marcadores de radioisótopo o marcadores fluorescentes) o en el caso de un marcador enzimático, puede catalizar la alteración química de un compuesto o composición de sustrato que da como resultado un producto detectable .
Una "cantidad efectiva" de un agente se refiere a una cantidad efectiva, a dosificaciones y por períodos de tiempo necesarios para obtener el resultado terapéutico o profiláctico deseado.
Una "cantidad terapéuticamente efectiva" de una sustancia/molécula de la invención, agonista o antagonista puede variar de acuerdo con factores tales como el estado de enfermedad, edad, sexo y peso del individuo y la habilidad de la sustancia/molécula, agonista o antagonista para producir una respuesta deseada en el individuo. Una cantidad terapéuticamente efectiva es también una en la cual cualesquier efectos tóxicos o perjudiciales de la sustancia/molécula, agonista o antagonista son superados por los efectos terapéuticamente benéficos. Una "cantidad profilácticamente efectiva" se refiere a una cantidad efectiva, a dosificaciones por períodos de tiempo necesarios para obtener el resultado profiláctico deseado. Comúnmente aunque no necesariamente, puesto que una dosis profiláctica es usada en sujetos antes de o en una etapa anterior de enfermedad, la cantidad profilácticamente efectiva será menor que la cantidad terapéuticamente efectiva.
El término "formulación farmacéutica" se refiere a una preparación que está en tal forma para permitir que la actividad biológica de un ingrediente activo contenido en la misma sea efectiva y que no contiene componentes tradicionales que sean inaceptablemente tóxicos a un sujeto al cual la formulación sea administrada.
Un "portador aceptable farmacéuticamente" se refiere a un ingrediente en una formulación farmacéutica, diferente del ingrediente activo, que no es tóxico a un sujeto. Un portador aceptable farmacéuticamente incluye pero no está limitado a una solución reguladora del pH, excipiente, estabilizador o conservador .
Como se usa en la presente, "tratamiento" (y variaciones gramaticales del mismo tales como "tratar" o "que trata") se refiere a intervención clínica en un intento por alterar el curso natural del individuo que es tratado y puede ser efectuado ya sea por profilaxis o durante el curso de patología clínica. Efectos de tratamiento deseables incluyen pero no están limitados impedir la presencia o recurrencia de enfermedad, alivio de síntomas, disminución de cualesquier consecuencias patológicas directas o indirectas de la enfermedad, impedir metástasis, disminuir la velocidad de avance de enfermedad, mejora o alivio del estado de enfermedad y remisión o prognosis mejorada. En algunas modalidades, los anticuerpos de la invención son usados para retardar el desarrollo de una enfermedad o para frenar el avance de una enfermedad.
El término "terapia anti-cáncer" se refiere a una terapia útil en el tratamiento de cáncer. Ejemplos de agentes terapéuticos anti-cáncer incluyen pero no están limitados a, por ejemplo, agentes quimioterapéuticos , agentes inhibidores de crecimiento, agentes citotóxicos, agentes usados en terapia de radiación, agentes anti-angiogénesis , agentes apoptóticos, agentes anti-tubulina y otros agentes para tratar cáncer, anticuerpos anti-CD20, inhibidores de factor de crecimiento derivados de plaquetas (por ejemplo, Gleevec (mesilato de imatinib) ) , un inhibidor de COX-2 (por ejemplo, celecoxib) , interferones , citoquinas, antagonistas (por ejemplo, anticuerpos neutralizantes) que se enlazan a uno o más de los siguientes objetivo PDGFR-beta, BlyS, APRIL, receptor (es) de BCMA, TRAIL/Apo2 y otros agentes bioactivos y químicos orgánicos, etc. Combinaciones de los mismos también están incluidas en la invención.
El término "agente citotóxico" como se usa en la presente, se refiere a una sustancia que inhibe o impide la función de células y/o provoca destrucción de células. Se pretende que el término incluya isótopos radioactivos (por ejemplo, At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153 , Bi212, P32 e isótopos de Lu) , agentes quimioterapéuticos, por ejemplo metrotexato, adrimicina, vinca alcaloides (vincristina, vinblastina, etopóside) , doxorubicina, melfalana, mitomicina C, clorambucilo, daunorubicina u otros agentes intercalantes, enzimas y fragmentos de los mismos tales como enzimas nucleolíticas , antibióticos y toxinas tales como toxinas de molécula pequeña o toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fungal, de planta o animal, incluyendo fragmentos y/o variantes de los mismos y los varios agentes antitumor o anticáncer revelados posteriormente en la presente. Otros agentes citotóxicos son descritos posteriormente en la presente. Un agente tumoricida provoca destrucción de las células de tumor.
Un "agente quimioterapéutico" se refiere a un compuesto químico útil en el tratamiento de cáncer. Ejemplos de agentes quimioterapéuticos incluyen agentes alquilantes tales como tiotepa y ciclofosfamida (CYTOXAN®) ; sulfonatos de alquilo tales como busulfán, improsulfán y piposulfán; aziridinas tales como benzodopa, carboquona, meturedopa y uredopa; etileniminas y metilamelaminas incluyendo altretamina, trietilenmelamina, trietilenfosforamida, trietilentiofosforamida y trimetilomelamina; acetogeninas (especialmente bullatacina y bullatacinona) ; delta- 9-tetrahidrocannabinol (dronabinol, MARINOL®) ; beta-lapacona; lapachol; colchicina; ácido betulinico; una camptotecina (incluyendo el análogo sintético topotecan (HYCAMTIN®) , CPT-11 (irinotecán, CAMPTOSAR®) , acetilcamptotecina, escopolectina y 9-aminocamptotecina) ; briostatina; calistatina; CC-1065 (incluyendo sus análogos sintéticos adozelesina, carzelesxna y bizelesina) ; podofilotoxina; ácido podofilínico; tenipóside; criptoficinas (particularmente criptoficina 1 y criptoficina 8) ; dolastatina; duocarmicina (incluyendo los análogos sintéticos, W -2189 y CB1-TM1) ; eleuterobina; pancratistatina; una sarcodictina; esponj istatina; mostazas de nitrógeno tales como clorambucilo, clornafazina, clorofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, clorhidrato de óxido de mecloretamina, melfalán, novembichina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostaza de uracilo; nitrosoureas tales como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina y ranimnustina; antibióticos tales como los antibióticos de enedina (por ejemplo, caliqueamicina, especialmente caliqueamicina gammall y caliqueamicina omegall (véase, por ejemplo, Nicolaou et al., Angew. Chem Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994)); CDP323, un inhibidor de alfa-4-integrina oral; dinemicina, incluyendo dinemicina A; una esperamicina, también como cromóforo de neocarzinostatina y cromóforos de antibióticos de enedina cromoproteína relacionados) , aclacinomisinas , actinomicina, autramicina, azaserina bleomicinas, cactinomicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorubicina, detorubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorubicina (ADRIAMYCIN® incluyendo, morfolino-doxorrubicina, cianomorfolino-doxorrubicina, 2-pirrolino-doxorubicina, inyección de liposomas de doxorubicina HCl (DOXIL®) , doxorrubicina liposomal TLC D-99 (MYOCET®) , doxorrubicina liposomal PEG-iladas (CAELYX®) y desoxidoxorrubicina) , epirubicina, esorrubicina, idarubicina, marcelomicina, mitomicinas tales como mitomicina C, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas , peplomicina, porfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorubicina; anti-metabolitos tales como el metotrexato, gemcitabina (GEMZAR®) , tegafur (UFT®) , capecitabina (XELODA®) , una epotilona y 5-fluorouracilo (5-FU) ; análogos del ácido fólico tales como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos de purina tales como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina tales como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina; andrógenos tales como calusterona, propionato de drornosta olona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; anti-adrenales tales como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; reabastacedor de ácido fólico tal como ácido frolínico; aceglatona; aldofosfamida glicóside; ácido aminolevulínico; eniluracilo; amsacrina; bestrabucilo; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diaziquona; elfornitina; acetato de eliptinio; una epotilona; etoglúcide; nitrato de galio; hidroxiurea; lentinan; lonidainina; maitansinoides tales como maitansina y ansamitocinas ; mitoguazona; mitoxantrona; mopidanmol; nitraerina; pentostatina; fenamet; pirarrubicina; losoxantrona; 2-etilhidrazida; procarbazina; complejo de polisacárido (JHS Natural Products, Eugene, OR) PSK®; razoxano; rizoxina; sizofiran; espirogermanio; ácido tenuazónico; triaziquona; 2 , 21 , 2 ' -triclorotrietilamina; tricotecenos (especialmente toxina T-2, verracurina A, roridina A y anguidina) ; uretan; vindesina (ELDISINE®, FILDESIN®) ; dacarbazina; manomustina; mitobronitol ; mitolactol ; pipobroman; gacitosina; arabinóside ("Ara-C"); tiotepa; taxoide, por ejemplo paclitaxel (TAXOL®) , formulación de nanopartículas albúmina-diseñadas de paclitaxel (ABRAXANE™) y docetaxel (TAXOTERE®) ; cloranbucilo; 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; agentes de platino tales como cisplatino, oxaliplatino (por ejemplo, ELOXATIN®) , y carboplatino; vincas, que impiden la polimerización de tubulina que forme microtúbulos , incluyendo vinblastina (VELBAN®) , vincristina (ONCOVIN®) , vindesina (ELDISINE®, FILDESIN®) y vinorelbina (NAVELBINE®) ; etopóside (VP-16) ; ifosfamida; mitoxantrona; leucovorina; novantrona; edatrexato; daunomicina; aminopterina; ibandronato; inhibidor de topoisomerasa RFS 2000; difluorometilornitina (DMFO) ; retinoides tal como ácido retinoico, incluyendo bexaroteno (TARGRETIN®) ; bifosfonatos tales como clodronato (por ejemplo, BONEFOS® u OSTAC®) , etidronato (DIDROCAL®) , NE-58095, ácido zoledrónico/zoledronato (ZOMETA®) , alendronato (FOSAMAX®) , pamidronato (AREDIA®) , tiludronato (SKELID®) y risedronato (ACTONEL®) ; troxacitabina (un análogo de citosina de nucleósido 1 , 3 -dioxolan) ; oligonucleótidos antisentido, particularmente aquellos que inhiben la expresión de genes en las rutas de señalización implicadas en proliferación celular aberrante, tales como por ejemplo, PKC-alfa, Raf, H-Ras y receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGF-R) ; vacunas tal como vacuna de THERATOPE® y vacunas de terapia genética, por ejemplo vacuna ALLOVECTIN®, vacuna de LEUVECTIN® y vacuna de VAXID®; inhibidor de topoisomerasa 1 (por ejemplo, LURTOTECA ®) ; rmRH (por ejemplo, ABARÉLIX®) ; BAY439006 (sorafenib, Bayer) ; SU-11248 (sunitinib, SUTENT®, Pfizer) ; perifosina, inhibidor de COX-2 (por ejemplo, celecoxib o etoricoxib) , inhibidor de proteosoma (por ejemplo, PS341) ; bortezomib (VELCADE®) ; CCI- 779; tipifarnib (R11577) ; orafenib, ABT510; inhibidor de Bcl-2 tal como oblimersen sodio (Genasense®) ; pixantrona; inhibidores de EGFR (véase definición posteriormente en la presente) ; inhibidores de cinasa de tirosina (véase definición posteriormente en la presente) ; inhibidores de cinasa de serina-treonina, tal como rapamicina (sirolimus, RAPAMU E®) ; inhibidores de farnesiltransferasa tal como lonafarnib (SCH 6636, SARASAR™) y sales, ácidos o derivados aceptables farmacéuticamente de cualquiera de los anteriores; también como combinaciones de dos o más de los anteriores, tales como CHOP, una abreviatura para una terapia combinada de ciclofosfamida, doxorrubicina, vincristina y prednisolona y FOLFOX, una abreviatura para un régimen de tratamiento con oxaliplatino (ELOXATIN ) combinado con 5-FU y leucovorina.
Agentes quimioterapéuticos como se define en la presente incluyen "agentes anti-hormonales" o "terapéuticos endocrinos", que actúan para regular, reducir, bloquear o inhibir los efectos de hormonas que pueden promover el crecimiento de cáncer. Pueden ser hormonas por si mismas, incluyendo pero no limitado a: anti-estrógenos con perfil agonista/antagonista mezclado, incluyendo tamoxifen (NOLVADEX®) , 4-hidroxitamoxifen, toremifen (FARESTON®) , idoxifen, droloxifen, raloxifen (EVISTA®) , trioxifen, keoxifen y moduladores de receptores de estrógeno selectivos (SER ) , tales como SERM3 ; anti-estrógenos puros sin propiedades agonistas tales como fulvestrant (FASLODEX®) , y EM800 (tales agentes pueden bloquear la dimerización de receptor de estrógeno (ER) , inhibir el enlace de ADN, incrementar el rendimiento de ER y/o suprimir los niveles de ER) ; inhibidores de aromatasa, incluyendo inhibidores de aromatasa esteroidales tales como formestaño y exemestano (AROMASIN®) e inhibidores de aromatasa no esteroidales tales como anastrozol (ARIMIDEX®) , letrozol (FEMARA®) y aminoglutetimida y otros inhibidores de aromatasa incluyendo vorozol (RIVISOR®) , acetato de megestrol, fadrozol y 4(5)-imidazoles (MEGASE®) ; agonistas de hormona de liberación de hormona luteinizante, incluyendo leuprolato (LUPRON® y ELIGARD®) , goserelina, buserelina y tripterelina; esteroides sexuales, incluyendo progestinas como acetato de megestrol y acetato de medroxiprogesterona, estrógenos tales como dietilestilbestrol y premarina y andrógenos/retinoides tales como fluoximesterona, ácido completamente transretionico y fenretinide; onapristona; antiprogestágena; reguladores hacia bajo de receptor de estrógeno (ERD) ; anti-andrógenos tales como flutamida, nilutamida y bicalutamida y sales, ácidos o derivados aceptables farmacéuticamente de los anteriores, también como de dos o más de los anteriores .
El término "profármaco" como se usa en esta solicitud se refiere a un precursor o derivado de una sustancia farmacéuticamente activa que es menos citotóxica a células de tumor en comparación con el fármaco original y es apto de ser activado enzimáticamente o convertido a la forma original más activa. Véase, por ejemplo Wilman, "Prodrugs in Cáncer Chemotherapy" Biochemical Society Transactions, 14, pp. 375-382, 615th Meeting Belfast (1986) y Stella et al., "Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery, " Directed Drug Delivery, Borchardt et al., (ed.), pp. 247-267, Humana Press (1985) . Los profármacos de esta invención incluyen pero no están limitados a, profármacos que contiene fosfato, profármacos que tienen tiofosfato, profármacos que contienen sulfato, profármacos que contienen péptido, profármacos D-aminoácidos-modificados, profármacos glicosilados , profármacos que contienen ß-lactama, opcionalmente profármacos que contienen fenoxiacetamida sustituidos o profármacos que contienen fenilacetamida opcionalmente sustituidos, 5-fluorocitoxina y otros profármacos de 5-fluorouridina que pueden ser convertidos al fármaco libre citotóxico más activo. Ejemplos de fármacos citotóxicos que pueden ser derivados a una forma de profármaco para uso en esta invención incluyen pero no están limitados a aquellos agentes quimioterapéuticos descritos anteriormente.
Un "agente inhibidor de crecimiento" cuando se usa en la presente se refiere a un compuesto o composición que inhibe el crecimiento de una célula (por ejemplo, una célula cuyo crecimiento es dependiente de la expresión de SCDl ya sea in vitro o in vivo) . Ejemplos de agentes inhibidores del crecimiento incluyen agentes que bloquean el avance del ciclo celular (en un lugar diferente de la fase S) , tales como agentes que inhiben la parada de Gl o parada de la fase M. bloqueadores de fase M clásicos incluyen las vincas (vincristina y vinblastina) , taxanos e inhibidores de topoisomerasa II tales como doxorubicina, epirubicina, daunorubicina, etoposide y bleomicina. Aquellos agentes que detienen Gl también se derraman sobre la parada de la fase S por ejemplo, agentes alquilantes de ADN tales como tamoxifen, prednisona, dacarbazina, mecloretamina, cisplatino, metrotexato, 5-fluorouracilo y ara-C. Información adicional se puede encontrar en The Molecular Basis of Cáncer, Mendelsohn e Israel, eds., capítulo 1, intitulado "Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs" by Murakami et al. ( B Saunders: Philadelphia, 1995), especialmente p. 13. Los taxanos (paclitaxel y docetaxel) son fármacos anticáncer ambos derivados del árbol de yew. Docetaxel (TAXOTERE®, Rhone-Poulenc Rorer) , derivado del yew europeo es un análogo semisintético de paclitaxel (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb) . Paclitaxel y docetaxel promueven el ensamble de micro túbulos a partir de dímeros de tubulina y estabilizan los micro túbulos al impedir la despolimerización, lo que da como resultado inhibición de mitosis en células.
"Terapia de radiación" significa el uso de rayos gama o rayos beta dirigidos para inducir daños suficientes a una célula para limitar su habilidad para funcionar normalmente o para destruir la célula por completo. Se apreciará que habrá muchas maneras conocidas en el arte para determinar la dosificación y duración de tratamiento. Los tratamientos típicos son dados como una administración de una vez y las dosificaciones típicas varían de 10 a 200 unidades (grays) por día.
Un "paciente", un "individuo" o un "sujeto" es un mamífero. Los mamíferos incluyen pero no están limitados a animales domesticados (por ejemplo, vacas, ovejas, gatos, perros y caballos) , primates (por ejemplo, humanos y primates no humanos, tales como monos) , conejos y roedores (por ejemplo, ratones y ratas) . En ciertas modalidades, el paciente, individuo o sujeto es un humano.
El término "concurrente" es usado en la presente para referirse a la administración de dos o más agentes terapéuticos, en donde por lo menos parte de la administración se superponen en el tiempo. Así, la administración concurrente incluye un régimen de dosificación cuando la administración de uno o más agentes continúa después de descontinuar la administración de uno o más otros agentes .
"Reducir o inhibir" significa la habilidad de provocar una disminución global de 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o mayor. Reducir o inhibir se puede referir a los síntomas de la alteración que es tratada, la presencia o tamaño de metástasis o el tamaño del tumor primario.
Un "inserto de empaque" es usado para referirse a instrucciones incluidas acostumbradamente en empaques comerciales de productos terapéuticos o medicamentos que contienen información acerca de las indicaciones, uso, dosificación, administración, contraindicaciones, otros productos terapéuticos a ser combinados con el producto empacado y/o advertencias concernientes con el uso de tales productos terapéuticos o medicamentos y los semejantes.
Un "artículo de manufactura" es cualquier manufactura (por ejemplo, un paquete o recipiente) o kit que comprende por lo menos un reactivo, por ejemplo, un medicamento para tratamiento de una enfermedad o alteración (por ejemplo, cáncer) o una sonda para detectar específicamente un biomarcador descrito en la presente. En ciertas modalidades, la manufactura o kit es promovido, distribuido o vendido como una unidad para efectuar los métodos descritos en la presente .
Una "audiencia objetivo" es un grupo de gente o una institución a quien o a la cual un medicamento particular es promovida o destinada a ser promovida, tal como mediante comercialización o publicidad, especialmente para usos, tratamientos o indicaciones particulares, tales como individuos, poblaciones, lectores de periódicos, literatura médica y revistas, televisión o usuarios de internet, radioescuchas o escuchas de internet, médicos, compañías de medicamentos, etc.
Como se entiende por aquel experimentado en el arte, la referencia a "alrededor" de un valor o parámetro en la presente incluye (y describe) modalidades que están dirigidas a aquel valor o parámetro per se. Por ejemplo, la descripción que se refiere a "alrededor de X" incluye la descripción de "X" .
Se comprenderá que aspectos y modalidades de la invención descritas en la presente incluyen "que consiste" y/o "que consiste esencialmente de" aspectos y modalidades. Como se usa en la presente, la forma singular "uno", "un" y "el" incluye las referencias plurales a no ser que se indique de otra manera.
II . Métodos y usos Se proveen en la presente usos de antagonistas de SCDl como parte de un régimen de tratamiento específico ha destinado a proveer un efecto benéfico. Cualquiera de los antagonistas de SCDl provistos en la presente puede ser usado en métodos terapéuticos. En un aspecto adicional, la invención provee el uso de un antagonista de SCDl en la manufactura o preparación de un medicamento. En una modalidad, el medicamento es para tratamiento de cáncer. En un aspecto adicional, la invención provee un método para tratamiento de cáncer. Además, se provee en la presente métodos y composiciones para identificar individuos que se pueden beneficiar del tratamiento con una terapia anti-cáncer que comprende un antagonista de SCDl. Un "individuo" de acuerdo con cualquiera de las modalidades anteriores es preferiblemente un humano.
Se proveen en la presente métodos para inhibir la proliferación celular de una célula de cáncer que comprenden poner en contacto la célula de cáncer con una cantidad efectiva de un antagonista de SCDl. Se proveen además en la presente métodos para inhibir la proliferación celular de una célula de cáncer en un individuo que comprenden administrar al individuo una cantidad efectiva de un antagonista de SCDl . En algunas modalidades, la proliferación celular es inhibida por mayor de alrededor de cualquiera de 40%, 50%, 60%, 70%, 80% o 90%. En algunas modalidades, la célula de cáncer expresa niveles elevados de uno o más biomarcadores en comparación con una muestra de referencia, célula de referencia, tejido de referencia, muestra testigo, célula testigo, tejido testigo o testigo interno (por ejemplo, gen de mantenimiento) . En algunas modalidades, el antagonista de SCDl es una molécula pequeña, un anticuerpo anti-SCDl, un polipéptido de enlace o polinucleótido . En algunas modalidades, el antagonista de SCDl es una molécula pequeña. En algunas modalidades, la molécula pequeña es SMI37062 (G01522403), G02447171, RG1, RG3 , RG8 o derivados de los mismos. Un "individuo" de acuerdo con cualquiera de las modalidades anteriores es preferiblemente un humano.
Se proveen además en la presente métodos para inducir la parada del ciclo celular de una célula de cáncer que comprenden poner en contacto la célula de cáncer con una cantidad efectiva de un antagonista de SCDl. También se provee en la presente métodos para inducir la parada del ciclo celular de una célula de cáncer en un individuo que comprenden administrar al individuo una cantidad efectiva de un antagonista de SCD1. En algunas modalidades, la parada del ciclo celular es parada del ciclo celular Gl . En algunas modalidades, la célula de cáncer expresa niveles elevados de uno o más biomarcadores en comparación con una muestra de referencia, célula de referencia, tejido de referencia, muestra testigo, célula testigo, tejido testigo o testigo interno (gen de mantenimiento) . En algunas modalidades, el antagonista de SCD1 es una molécula pequeña, un anticuerpo anti-SCDl, un polipéptido de enlace o polinucléotido . En algunas modalidades, el antagonista SCD1 es una molécula pequeña. En algunas modalidades, la molécula pequeña es SMI37062 (G01522403), G02447171, RG1, RG3 , RG8 o derivados de los mismos. Un "individuo" de acuerdo con cualquiera de las modalidades anteriores es preferiblemente un humano.
Se proveen en la presente métodos para promover la muerte de célula de cáncer de una célula de cáncer que comprenden poner en contacto la célula de cáncer con una cantidad efectiva de un antagonista de SCD1. También se provee en la presente métodos para promover la muerte celular de célula de cáncer en un individuo que comprenden administrar al individuo una cantidad efectiva de un antagonista de SCD1. En algunas modalidades, la muerte celular es necrosis. En algunas modalidades, la muerte celular es apoptosis. En algunas modalidades, la apoptosis es apoptosis caspasa-dependiente . En algunas modalidades, la apoptosis es apoptosis caspasa-independiente . En algunas modalidades, la promoción de apoptosis es indicada por un incremento en caspasas activas, por ejemplo caspasa 3 y caspasa 7. En algunas modalidades, la célula de cáncer expresa niveles elevados de uno o más biomarcadores en comparación con una muestra de referencia, célula de referencia, tejido de referencia, muestra testigo, célula testigo, tejido testigo o testigo interno (gen de mantenimiento) . En algunas modalidades, el antagonista de SCD1 es una molécula pequeña, un anticuerpo anti-SCDl, un polipéptido de enlace o polinucléotido . En algunas modalidades, el antagonista de SCD1 es una molécula pequeña. En algunas modalidades, la molécula pequeña es SMI37062 (G01522403), G02447171, RG1, RG3 , RG8 o derivados de los mismos. Un "individuo" de acuerdo con cualquiera de las modalidades anteriores es preferiblemente un humano.
En otro aspecto, se proveen en la presente métodos de tratamiento de una célula de cáncer en un individuo, que comprenden administrar al individuo una cantidad efectiva de un antagonista de SCD1. En algunas modalidades, el cáncer en el individuo expresa niveles elevados de uno o más biomarcadores en comparación con una muestra de referencia, célula de referencia, tejido de referencia, muestra testigo, célula testigo, tejido testigo o testigo interno (gen de mantenimiento) . En algunas modalidades, el antagonista de SCD1 es una molécula pequeña, un anticuerpo anti-SCDl, un polipéptido de enlace o polinucléotido . En algunas modalidades, el antagonista de SCD1 es una molécula pequeña. En algunas modalidades, la molécula pequeña es S I37062 (G01522403), G02447171, RG1, RG3 , RG8 o derivados de los mismos. Un "individuo" de acuerdo con cualquiera de las modalidades anteriores es preferiblemente un humano.
En otro aspecto, se proveen en la presente métodos de tratamiento de cáncer en un individuo que comprenden administrar al individuo una cantidad efectiva de un antagonista de SCD1. en algunas modalidades, el cáncer en el individuo expresa niveles elevados de uno o más biomarcadores en comparación con una muestra de referencia, célula de referencia, tejido de referencia, muestra testigo, célula testigo, tejido testigo o testigo interno (gen de mantenimiento) . En algunas modalidades, el antagonista de SCD1 es una molécula pequeña, un anticuerpo anti-SCDl, un polipéptido de enlace o polinucléotido. En algunas modalidades, el antagonista de SCD1 es una molécula pequeña. En algunas modalidades, la molécula pequeña es SMI37062 (G01522403), G02447171, RG1, RG3 , RG8 o derivados de los mismos. Un "individuo" de acuerdo con cualquiera de las modalidades anteriores es preferiblemente un humano.
Se proveen además en la presente métodos de tratamiento de cáncer en un individuo, que comprenden administrar al individuo una cantidad efectiva de un antagonista de SCDl, en donde el tratamiento está basado en el individuo que tiene cáncer que expresa niveles elevados y/o niveles de expresión reducidos de uno o más biomarcadores en comparación con una muestra de referencia, célula de referencia, tejido de referencia, muestra testigo, célula testigo, tejido testigo o testigo interno (gen de mantenimiento) . Se proveen en la presente también métodos de tratamiento de cáncer en un individuo a condición de que se haya encontrado que el individuo tiene cáncer que expresa niveles elevados de uno o más biomarcadores en comparación con una muestra de referencia, célula de referencia, tejido de referencia, muestra testigo, célula testigo, tejido testigo o testigo interno (gen de mantenimiento) , el tratamiento comprende administrar al individuo una cantidad efectiva de un antagonista de SCDl. En algunas modalidades, el antagonista de SCDl es una molécula pequeña, un anticuerpo anti-SCDl, un polipéptido de enlace o polinucléotido . En algunas modalidades, el antagonista de SCDl es una molécula pequeña. En algunas modalidades, la molécula pequeña es S I37062 (G01522403), G02447171, RG1, RG3 , RG8 o derivados de los mismos. Un "individuo" de acuerdo con cualquiera de las modalidades anteriores es preferiblemente un humano.
En otro aspecto, se proveen en la presente métodos para tratamiento de cáncer en un individuo, el método comprende: (a) determinar que una muestra obtenida del individuo expresa niveles elevados de uno o más biomarcadores en comparación con una muestra de referencia, célula de referencia, tejido de referencia, muestra testigo, célula testigo, tejido testigo o testigo interno (gen de mantenimiento) y (b) administrar una cantidad efectiva de una terapia anti-cáncer que comprende un antagonista de SCDl al individuo, mediante lo cual el cáncer es tratado. En algunas modalidades, el antagonista de SCDl es una molécula pequeña, un anticuerpo anti-SCDl, un polipéptido de enlace o polinucléotido . En algunas modalidades, el antagonista de SCDl es una molécula pequeña. En algunas modalidades, la molécula pequeña es SMI37062 (G01522403), G02447171, RG1 , RG3 , RG8 o derivados de los mismos. Un "individuo" de acuerdo con cualquiera de las modalidades anteriores es preferiblemente un humano.
Se proveen en la presente métodos de tratamiento de cáncer que comprenden: (a) seleccionar un individuo que tiene cáncer, en donde el cáncer expresa niveles elevados de uno o más biomarcadores en comparación con una muestra de referencia, célula de referencia, tejido de referencia, muestra testigo, célula testigo, tejido testigo o testigo interno (gen de mantenimiento) y (b) administrar al individuo así seleccionado una cantidad efectiva de un antagonista de SCDl, mediante lo cual el cáncer es tratado. En algunas modalidades, el antagonista de SCDl es una molécula pequeña, un anticuerpo anti-SCDl, un polipéptido de enlace o polinucléotido . En algunas modalidades, el antagonista de SCDl es una molécula pequeña. En algunas modalidades, la molécula pequeña es SMI37062 (G01522403), G02447171, RG1, RG3, RG8 o derivados de los mismos. Un "individuo" de acuerdo con cualquiera de las modalidades anteriores es preferiblemente un humano.
Se proveen en la presente métodos para identificar un individuo que es más probable de beneficiarse del tratamiento con una terapia anti-cáncer que comprende un antagonista de SCDl o menos probable de beneficiarse del tratamiento con una terapia anti-cáncer que comprende un antagonista de SCDl, el método comprende: determinar los niveles de expresión de uno o más biomarcadores en muestra obtenida del individuo, en donde los niveles de expresión elevados de uno o más biomarcadores de la muestra, en comparación con una muestra de referencia, célula de referencia, tejido de referencia, muestra testigo, célula testigo, tejido testigo o testigo interno (gen de mantenimiento) indica que el individuo es más probable de beneficiarse del tratamiento con la terapia anti-cáncer que comprende al antagonista de SCDl o niveles de expresión reducidos de uno o más biomarcadores en la muestra en comparación con una muestra de referencia, célula de referencia, tejido de referencia, muestra testigo, célula testigo, tejido testigo o testigo interno (gen de mantenimiento) indica que el individuo es menos probable de beneficiarse del tratamiento con la terapia anti-cáncer que comprende al antagonista de SCD1. En algunas modalidades, los niveles de expresión elevados de uno o más biomarcadores en la muestra, en comparación con una muestra de referencia, célula de referencia, tejido de referencia, muestra testigo, célula testigo, tejido testigo o testigo interno (gen de mantenimiento) indica que el individuo es más probable de beneficiarse del tratamiento con la terapia anti-cáncer que comprende el antagonista de SCD1. En algunas modalidades, los niveles de expresión reducidos de uno o más biomarcadores en la muestra, en comparación con una muestra de referencia, célula de referencia, tejido de referencia, muestra testigo, célula testigo, tejido testigo o testigo interno (gen de mantenimiento) indica que el individuo es menos probable de beneficiarse del tratamiento con la terapia anti-cáncer que comprende el antagonista de SCD1. En algunas modalidades, el antagonista de SCD1 es una molécula pequeña, un anticuerpo anti-SCDl, un polipéptido de enlace o polinucléotido . En algunas modalidades, el antagonista de SCD1 es una molécula pequeña. En algunas modalidades, la molécula pequeña es SMI37062 (G01522403), G02447171, RG1 , RG3 , RG8 o derivados de los mismos. Un "individuo" de acuerdo con cualquiera de las modalidades anteriores es preferiblemente un humano.
En otro aspecto, e proveen en la presente métodos para predecir la probabilidad de que un individuo con cáncer responderá efectivamente al tratamiento con una terapia anti-cáncer que comprende un antagonista de SCD1, el método comprende determinar uno o más biomarcadores, mediante lo cual niveles de expresión elevados de uno o más biomarcadores en comparación con una muestra de referencia, célula de referencia, tejido de referencia, muestra testigo, célula testigo, tejido testigo o testigo interno (gen de mantenimiento) indica que el individuo es más probable de responder efectivamente al tratamiento con el antagonista de SCD1 y los niveles de expresión reducidos de uno o más biomarcadores en comparación con una muestra de referencia, célula de referencia, tejido de referencia, muestra testigo, célula testigo, tejido testigo o testigo interno (gen de mantenimiento) indica que el individuo es menos probable de responder efectivamente al tratamiento con el antagonista. En algunas modalidades, los niveles de expresión elevados de uno o más biomarcadores, en comparación con una muestra de referencia, célula de referencia, tejido de referencia, muestra testigo, célula testigo, tejido testigo o testigo interno (gen de mantenimiento) indica que el individuo es más probable de responder efectivamente al tratamiento del antagonista de SCD1. En algunas modalidades, los niveles de expresión reducidos de uno o más biomarcadores, en comparación con una muestra de referencia, célula de referencia, tejido de referencia, muestra testigo, célula testigo, tejido testigo o testigo interno (gen de mantenimiento) indica que el individuo es menos probable de responder efectivamente al tratamiento el antagonista. En algunas modalidades, el antagonista de SCDl es una molécula pequeña, un anticuerpo anti-SCDl, un polipéptido de enlace o polinucléotido. En algunas modalidades, el antagonista de SCDl es una molécula pequeña. En algunas modalidades, la molécula pequeña es SMI37062 (G01522403) , G02447171, RG1, RG3, RG8 o derivados de los mismos. Un "individuo" de acuerdo con cualquiera de las modalidades anteriores es preferiblemente un humano.
Se proveen en la presente también métodos para predecir la respuesta o carencia de respuesta de un individuo a una terapia anti-cáncer que comprende un antagonista de SCDl, que comprenden medir en una muestra obtenida del individuo la expresión de uno o más biomarcadores , en donde los niveles de expresión elevados de un o más biomarcadores en comparación con una muestra de referencia, célula de referencia, tejido de referencia, muestra testigo, célula testigo, tejido testigo o testigo interno (por ejemplo, gen de mantenimiento) son predictivos de la respuesta de un individuo a la terapia anti-cáncer Se proveen en la presente también métodos para predecir la respuesta o carencia de respuesta de un individuo a una terapia anti-cáncer que comprende un antagonista de SCDl, que comprende medir en una muestra obtenida del individuo, la expresión de uno o más biomarcadores, en donde los niveles de expresión elevados de uno o más biomarcadores, en comparación con una muestra de referencia, célula de referencia, tejido de referencia, muestra testigo, célula testigo, tejido testigo o testigo interno (por ejemplo, gen de mantenimiento) son predictivos de respuesta del individuo a la terapia anti-cáncer que comprende el antagonista de SCDl y los niveles de expresión reducidos de uno o más biomarcadores, en comparación con una muestra de referencia, célula de referencia, tejido de referencia, muestra testigo, célula testigo, tejido testigo o testigo interno (por ejemplo, gen de mantenimiento) son predictivos de carencia de respuesta del individuo a la terapia anti-cáncer que comprende el antagonista de SCDl. En algunas modalidades, los niveles de expresión elevados de uno o más biomarcadores, en comparación con una muestra de referencia, célula de referencia, tejido de referencia, muestra testigo, célula testigo, tejido testigo o testigo interno (por ejemplo, gen de mantenimiento) son predictivos de la respuesta del individuo a la terapia anti-cáncer que comprende el antagonista de SCC1. En algunas modalidades, los niveles de expresión reducidos de uno o más biomarcadores, en comparación con una muestra de referencia, célula de referencia, tejido de referencia, muestra testigo, célula testigo, tejido testigo o testigo interno (por ejemplo, gen de mantenimiento) son predictivos de carencia de respuesta del individuo a la terapia anti-cáncer que comprende el antagonista de SCD1. En algunas modalidades, el antagonista de SCD1 es una molécula pequeña, un anticuerpo anti-SCDl, un polipéptido de enlace o polinucléotido . En algunas modalidades, el antagonista de SCD1 es una molécula pequeña. En algunas modalidades, la molécula pequeña es SMI37062 (G01522403), G02447171, RG1, RG3 , RG8 o derivados de los mismos. Un "individuo" de acuerdo con cualquiera de las modalidades anteriores es preferiblemente un humano.
En otro aspecto, se proveen en la presente métodos para determinar la probabilidad de que un individuo con cáncer exhibirá beneficio de la terapia anti-cáncer que comprende un antagonista de SCD1, el método comprende: determinar los niveles de expresión de uno o más biomarcadores de una muestra obtenida del individuo, en donde los niveles de expresión elevados de uno o más biomarcadores, en comparación con una muestra de referencia, indican que el individuo tiene probabilidad incrementada de beneficiarse de la terapia anti-cáncer que comprende el antagonista de SCD1 y los niveles de expresión reducidos de uno o más biomarcadores en la muestra, en comparación con una muestra de referencia, célula de referencia, tejido de referencia, muestra testigo, célula testigo, tejido testigo o testigo interno (por ejemplo, gen de mantenimiento) indican que el individuo tiene probabilidad incrementada de beneficiarse de la terapia anti-cáncer que comprende el antagonista de SCD1. En algunas modalidades, los niveles de expresión elevados de uno o más biomarcadores en la muestra, en comparación con una muestra de referencia, indican que el individuo tiene probabilidad incrementada de beneficiarse de la terapia anti-cáncer que comprende el antagonista de SCD1. En algunas modalidades, los niveles de expresión reducidos de uno o más biomarcadores en la muestra, en comparación con una muestra de referencia, célula de referencia, tejido de referencia, muestra testigo, célula testigo, tejido testigo o testigo interno (por ejemplo, gen de mantenimiento) indican que el individuo tiene probabilidad disminuida de beneficiarse de la terapia anti-cáncer que comprende el antagonista de SCD1. En algunas modalidades, el antagonista de SCD1 es una molécula pequeña, un anticuerpo anti-SCDl, un polipéptido de enlace o polinucléotido . En algunas modalidades, el antagonista de SCD1 es una molécula pequeña. En algunas modalidades, la molécula pequeña es SMI37062 (G01522403), G02447171, RG1, RG3 , RG8 O derivados de los mismos. Un "individuo" de acuerdo con cualquiera de las modalidades anteriores es preferiblemente un humano.
En algunas modalidades de cualquiera de los usos y métodos, el cáncer y/o de células de cáncer es un tumor sólido. Ejemplos de tumores sólidos incluyen pero no están limitados a cáncer de vejiga, cáncer pancreático, cáncer de pulmón, cáncer de pecho, cáncer de colon, cáncer colorrectal, cáncer endometrial, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de riñon, cáncer de ovario, cáncer hipofaringeal, cáncer de próstata, cáncer esofagal, carcinoma hepatocelular y/o cáncer urinario. En algunas modalidades de cualquiera de los usos y métodos, el cáncer y/ o célula de cáncer es un cáncer seleccionado del grupo de cáncer de vejiga, cáncer de pancreático, cáncer de pulmón, cáncer de pecho, cáncer de colon, cáncer colorrectal, cáncer endometrial, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de riñon, cáncer de ovario y/o cáncer urinario. En algunas modalidades de cualquiera de los usos y métodos, el cáncer y/o célula de cáncer es un cáncer seleccionado del grupo de cáncer de vejiga, cáncer pancreático, cáncer de colon, cáncer colorrectal, cáncer de riñon y/o cáncer urinario. En algunas modalidades, el cáncer y/o célula de cáncer es un cáncer seleccionado del grupo de cáncer de vejiga, cáncer pancreático, cáncer endometrial, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de riñon, cáncer de ovario y/o cáncer urinario. En algunas modalidades, el cáncer y/o célula de cáncer el cáncer es cáncer de riñon. En algunas modalidades, el cáncer y/o célula de cáncer es cáncer pancreático. En algunas modalidades, el cáncer y/o célula de cáncer es cáncer de vejiga. En algunas modalidades, el cáncer y/o de célula de cáncer es de etapa I, etapa II, etapa III y/o IV. En algunas modalidades, el cáncer y/o célula de cáncer es localizado. En algunas modalidades, el cáncer y/o célula de cáncer es metastático.
En algunas modalidades de cualquiera de los usos y métodos, el uno o más biomarcadores es FGFR3. En algunas modalidades de cualquiera de los usos y métodos, una muestra del individuo, el cáncer y/o la célula de cáncer tiene niveles elevados de FGFR3 en comparación con una muestra de referencia, célula de referencia, tejido de referencia, muestra testigo, célula testigo, tejido testigo o testigo interno (por ejemplo, gen de mantenimiento) . Por ejemplo, se proveen en la presente métodos de tratamiento de cáncer en un individuo que comprende administrar al individuo una cantidad efectiva de un antagonista de SCD1, en donde el cáncer en el individuo expresa niveles elevados de uno o más biomarcadores, en comparación con una muestra de referencia, célula de referencia, tejido de referencia, muestra testigo, célula testigo, tejido testigo o testigo interno (por ejemplo, gen de mantenimiento) y el uno o más biomarcadores es FGF3. En algunas modalidades, una muestra del individuo, el cáncer y/o la célula de cáncer expresa sustancialmente los niveles de FGFR3 como una muestra de referencia, célula de referencia, tejido de referencia, muestra testigo, célula testigo, tejido testigo o testigo interno (por ejemplo, gen de mantenimiento) . En algunas modalidades de cualquiera de los usos y métodos, el uno o más biomarcadores es FGF3 fosforilado. En algunas modalidades de cualquiera de los métodos y usos, una muestra del individuo, el cáncer y/o la célula de cáncer expresa FGFR3 fosforilado. Por ejemplo, se proveen en la presente métodos de tratamiento de cáncer en un individuo que comprenden administrar al individuo una cantidad efectiva de un antagonista de SCD1, en donde el cáncer en el individuo expresa niveles elevados de uno o más biomarcadores en comparación con una muestra de referencia, célula de referencia, tejido de referencia, muestra testigo, célula testigo, tejido testigo o testigo interno (por ejemplo, gen de mantenimiento) y el uno o más biomarcadores es FGFR3 fosforilado. En algunas modalidades, una muestra del individuo, el cáncer y/o la célula de cáncer expresa niveles elevados de FGFR3 fosforilados en comparación con una muestra de referencia, célula de referencia, tejido de referencia, muestra testigo, célula testigo, tejido testigo o testigo interno (por ejemplo, gen de mantenimiento) . En algunas modalidades, expresión elevada se refiere a un incremento global de cualquiera de 5%, 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o mayor en el nivel del biomarcador (por ejemplo, proteína o ácido nucleico (por ejemplo, gen o mAR ) ) , detectado mediante métodos conocidos en el arte estándares conocidos tales como aquellos descritos en la presente, en comparación con una muestra de referencia, célula de referencia, tejido de referencia, célula de referencia, tejido de referencia, muestra testigo, célula testigo o tejidos testigo. En ciertas modalidades, la expresión elevada se refiere al incremento en nivel y/o cantidad de expresión de un biomarcador, en donde el incremento es de por lo menos cualquiera de alrededor de 1.5X, 1.75X, 2X, 3X, 4X, 5X, 6X, 7X, 8X, 9X, 10X, 25X, 50X, 75X o 100X del nivel de expresión/cantidad del biomarcador respectivo en una muestra de referencia, célula de referencia, tejido de referencia, muestra testigo, célula testigo o tejido testigo. En algunas modalidades, una muestra del individuo, el cáncer y/o la célula de cáncer expresa sustancialmente los mismos niveles de FGFR3 fosforilado como una muestra de referencia, célula de referencia, tejido de referencia, muestra testigo, célula testigo, tejido testigo o tejido interno (por ejemplo, gen de mantenimiento) . En algunas modalidades, la muestra de referencia, célula de referencia, tejido de referencia, muestra testigo, célula testigo o tejido testigo es no canceroso con o sin un nivel de expresión conocido de FGFR3. En algunas modalidades, la muestra de referencia, célula de referencia, tejido de referencia, muestra testigo, célula testigo o tejido testigo es canceroso con o sin un nivel de expresión conocido de FGFR3. En algunas modalidades, la expresión de FGFR3 en una muestra del individuo, el cáncer y/o la célula de cáncer es expresión de superficie celular. En algunas modalidades, la ruta de FGFR3 en una muestra del individuo, el cáncer y/o la célula de cáncer es constitutivamente activa. En algunas modalidades, la ruta de FGFR3 en una muestra del individuo, el cáncer y/o la célula de cáncer es dependiente del ligando. En algunas modalidades, una muestra del individuo, el cáncer y/o la célula de cáncer comprende una mutación en FGFR3. Ejemplos de mutaciones constitutivamente activas en FGFR3 incluyen pero no están limitadas a FGFR3 S249C, FGFR3 R248C, FGFR3 G372C, FGFR3 Y375C, FGFR3 K652E, FGFR3 K652Q y/o FGFR3 K652M. En algunas modalidades, una muestra del individuo, el cáncer y/o la célula de cáncer es tipo silvestre para FGFR3.
En algunas modalidades de cualquiera de los usos y métodos, el uno o más biomarcadores consiste de uno o más genes de la firma lipogénica FGFR3 -regulada . En algunas modalidades de cualquiera de los usos y métodos una muestra del individuo, el cáncer y/o la célula de cáncer expresa uno o más genes de la firma lipogénica FGFR3-regulada . En algunas modalidades, una muestra del individuo, el cáncer y/o la célula de cáncer expresa niveles elevados de uno o más genes de la firma lipogénica FGFR3 -regulada en comparación con una muestra del individuo, el cáncer y/o la célula de cáncer tiene niveles elevados de FGFR3 en comparación con una muestra de referencia, célula de referencia, tejido de referencia, muestra testigo, célula testigo, tejido testigo o testigo interno (por ejemplo, gen de mantenimiento) . Por ejemplo, se proveen en la presente métodos de tratamiento de cáncer en un individuo que comprenden administrar al individuo una cantidad efectiva de un antagonista de SCDl, en donde el cáncer en el individuo expresa niveles elevados de uno o más biomarcadores en comparación con una muestra del individuo, el cáncer y/o la célula de cáncer tiene niveles elevados de FGFR3 en comparación con una muestra de referencia, célula de referencia, tejido de referencia, muestra testigo, célula testigo, tejido testigo o testigo interno (por ejemplo, gen de mantenimiento) y el uno o más biomarcadores es firma lipogénica FGFR3 -regulada . En algunas modalidades, expresión elevada se refiere a un incremento global de alrededor de cualquiera de 5%, 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o mayor en el nivel del biomarcador (por ejemplo, proteína o ácido nucleico (por ejemplo, gen o mARN) ) , detectado mediante métodos conocidos en el arte estándares tales como aquellos descritos en la presente, en comparación con una muestra de referencia, célula de referencia, tejido de referencia, muestra testigo, célula testigo o tejido testigo. En ciertas modalidades, la expresión elevada se refiere al incremento en nivel de expresión/cantidad de un biomarcador, en donde el incremento es de por lo menos alrededor de cualquiera de 1.5X, 1.75X, 2X, 3X, 4X, 5X, 6X, 7X, 8X, 9X, 10X, 25X, 50X, 75X o 10OX del nivel de expresión/cantidad del respectivo biomarcador en una muestra de referencia, célula de referencia, tejido de referencia, muestra testigo, célula testigo o tejido testigo. En algunas modalidades, una muestra del individuo, el cáncer y/o la célula de cáncer expresa sustancialmente los mismos niveles de firma lipogénica de FGFR3-regulada como una muestra de referencia, célula de referencia, tejido de referencia, muestra testigo, célula testigo, tejido testigo o tejido interno (por ejemplo, gen de mantenimiento) . En algunas modalidades, la muestra de referencia, célula de referencia, tejido de referencia, muestra testigo, célula testigo o tejido testigo es no canceroso con o sin un nivel de expresión conocido de uno o más genes de la firma lipogénica FGFR3-regulada. En algunas modalidades, la muestra de referencia, célula de referencia, tejido de referencia, muestra testigo, célula testigo o tejido testigo es canceroso con o sin un nivel conocido de expresión de uno o más genes de la firma lipogénica FGFR3-regulada.
En algunas modalidades, el uno o más genes de la firma lipogénica FGFR3 -regulada comprenden, consisten de o consisten esencialmente de uno más genes del grupo que consiste de SREBF1, G6PD, ACO 7 , PTPLA, PCCB, FADS1, RDH11, ACER3, PDSS1, MVD, AGPAT5 , HSD17B2, ACSL4 , EBP, PIGW, LBR, ACLY, ADORA2B, GPCPD1 , CYP24A1, ACSL3 , MVK, ACSS2 , FDPS, EL0VL5 , HMGCR, LIPG, MEl, DHCR7 , LSS, ACAT2 , FASN, CYP51A1 , IDI1, FDFT1 , FAR2 , H GCS1, SDR16C5 , LDLR, MSM01, INSIG1, DHRS9, LRP8 , SQLE, PCSK9, SCD1, FABP4 y combinaciones de los mismos. En algunas modalidades, el uno o más genes de la firma lipogénica FGFR3 -regulada comprende, consiste de o consiste esencialmente de SC4MOL. En algunas modalidades, expresión elevada se refiere a un incremento global de alrededor de cualquiera de 5%, 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o mayor en el nivel del biomarcador (por ejemplo, protexna o ácido nucleico (por ejemplo, gen o mARN) ) , detectado mediante métodos conocidos en el arte estándares tales como aquellos descritos en la presente, en comparación con una muestra de referencia, célula de referencia, tejido de referencia, muestra testigo, célula testigo o tejido testigo. En ciertas modalidades, la expresión elevada se refiere al incremento en nivel de expresión/cantidad de un biomarcador, en donde el incremento es de por lo menos alrededor de cualquiera de 1.5X, 1.75X, 2X, 3X, 4X, 5X, 6X, 7X, 8X, 9X, 10X, 25X, 50X, 75X o 100X del nivel de expresión/cantidad del biomarcador respectivo en una muestra de referencia, célula de referencia, tejido de referencia, muestra testigo, célula testigo o tejido testigo. En algunas modalidades, expresión elevada se refiere a un incremento global de alrededor de cualquiera de 1.4, 1.5, 1.6 o 1.7 veces o mayor en el nivel del biomarcador (por ejemplo, proteína o ácido nucleico (por ejemplo, gen o mAR ) ) , detectado mediante métodos conocidos en el arte estándares tales como aquellos descritos en la presente, en comparación con una muestra de referencia, célula de referencia, tejido de referencia, muestra testigo, célula testigo o tejido testigo. En algunas modalidades, expresión elevada se refiere a un incremento global medio del cambio logarítmico dos veces de alrededor de cualquiera de -0.5, -0.6, -0.7 o -0.8 o mayor, en el nivel del biomarcador (por ejemplo, proteína o ácido nucleico (por ejemplo, gen o mARN) ) , detectado mediante métodos conocidos en el arte estándares tales como aquellos descritos en la presente, en comparación con una muestra de referencia, célula de referencia, tejido de referencia, muestra testigo, célula testigo o tejido testigo.
En algunas modalidades, el uno o más genes de la firma lipogénica FGFR3-regulada comprenden, consisten de o consisten esencialmente de uno o más genes del grupo que consiste de EL0VL5, HMGCR, LIPG, ME1, DHCR7, LSS, ACAT2 , FASN, CYP51A1, IDI1, FDFT1, FAR2 , HMGCS1, SDR16C5, LDLR, SMOl, INSIG1, DHRS9, LRP8 , SQLE, PCSK , SCD1, FABP4 y combinaciones de los mismos. En algunas modalidades, el uno o más genes de la firma lipogénica FGFR3-regulada comprende, consiste de o consiste esencialmente de SC4MOL. En algunas modalidades, expresión elevada se refiere a un incremento global de alrededor de cualquiera de 1.8, 1.9, 2.0 o 2.1 veces o mayor en el nivel del biomarcador (por ejemplo, proteína o ácido nucleico (por ejemplo, gen o mAR ) ) , detectado mediante métodos conocidos en el arte estándares tales como aquellos descritos en la presente, en comparación con una muestra de referencia, célula de referencia, tejido de referencia, muestra testigo, célula testigo o tejido testigo. En algunas modalidades, expresión elevada se refiere a un incremento global medio logarítmico base dos de veces de cambio de alrededor de cualquiera de -0.9, -1.0, -1.1 o -1.2 o mayor, en el nivel del biomarcador (por ejemplo, proteína o ácido nucleico (por ejemplo, gen o mARN) ) , detectado mediante métodos conocidos en el arte estándares tales como aquellos descritos en la presente, en comparación con una muestra de referencia, célula de referencia, tejido de referencia, muestra testigo, célula testigo o tejido testigo. En algunas modalidades, el uno o más genes de la firma lipogénica FGFR3-regulada comprende, consiste de o consiste esencialmente de uno o más genes del grupo que consiste de CYP51A1, IDI1, FDFT1, FAR2, HMGCS1, SDR16C5, LDLR, MSMOl , INSIG1, DHRS9, LRP8, SQLE, PCSK9, SCD1, FABP4 y combinaciones de los mismos. En algunas modalidades, el uno o más genes de la firma lipogénica FGFR3 -regulada comprende, consiste de o consiste esencialmente de SC4MOL. En algunas modalidades, expresión elevada se refiere a un incremento global de alrededor de cualquiera de 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6 o 2.7 veces o mayor en el nivel del biomarcador (por ejemplo, proteína o ácido nucleico (por ejemplo, gen o mARN) ) , detectado mediante métodos conocidos en el arte estándares tales como aquellos descritos en la presente, en comparación con una muestra de referencia, célula de referencia, tejido de referencia, muestra testigo, célula testigo o tejido testigo. En algunas modalidades, expresión elevada se refiere a un incremento global medio logarítmico base dos de veces de cambio de alrededor de cualquiera de -1.0, -1.1 o -1.2 o mayor, en el nivel del biomarcador (por ejemplo, proteína o ácido nucleico (por ejemplo, gen o mARN) ) , detectado mediante métodos conocidos en el arte estándares tales como aquellos descritos en la presente, en comparación con una muestra de referencia, célula de referencia, tejido de referencia, muestra testigo, célula testigo o tejido testigo.
En algunas modalidades, el uno o más genes de la firma lipogénica FGFR3-regulada comprende, consiste de o consiste esencialmente de uno o más genes del grupo que consiste de LDLR, MSMOl, INSIG1, DHRS9, LRP8 , SQLE, PCSK9, SCD1, FABP4 y combinaciones de los mismos. En algunas modalidades, el uno o más genes de la firma lipogénica FGFR3-regulada comprende, consiste de o consiste esencialmente de SC4M0L. En algunas modalidades, expresión elevada se refiere a un incremento global de alrededor de cualquiera de 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3.0, 3.1 o 3.2 veces o mayor en el nivel del biomarcador (por ejemplo, proteína o ácido nucleico (por ejemplo, gen o mARN) ) , detectado mediante métodos conocidos en el arte estándares tales como aquellos descritos en la presente, en comparación con una muestra de referencia, célula de referencia, tejido de referencia, muestra testigo, célula testigo o tejido testigo. En algunas modalidades, expresión elevada se refiere a un incremento global medio logarítmico base dos de veces de cambio de alrededor de cualquiera de -1.4, -1.5, -1.6 o -1.7 o mayor, en el nivel del biomarcador (por ejemplo, proteína o ácido nucleico (por ejemplo, gen o mARN) } , detectado mediante métodos conocidos en el arte estándares tales como aquellos descritos en la presente, en comparación con una muestra de referencia, célula de referencia, tejido de referencia, muestra testigo, célula testigo o tejido testigo.
En algunas modalidades, el uno o más genes de la firma lipogénica FGFR3-regulada comprenden, consisten de o consisten esencialmente de uno o más genes del grupo que consiste de SQLE, PCSK9, SCD1, FABP4 y combinaciones de los mismos. En algunas modalidades, el uno o más genes de la firma lipogénica FGFR3-regulada comprenden, consisten de o consisten esencialmente de SQLE. En algunas modalidades, el uno o más genes de la firma lipogénica FGFR3 -regulada comprenden, consisten de o consisten esencialmente de PCSK9.
En algunas modalidades, el uno o más genes de la firma lipogénica FGFR3-regulada comprenden, consisten o consisten esencialmente de SCD1. En algunas modalidades, el uno o más genes de la firma lipogénica FGFR3 -regulada comprenden, consisten de o consisten esencialmente de FABP4. En algunas modalidades, expresión elevada se refiere a un incremento global de alrededor de cualquiera de 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7 o 3.8 veces o mayor, en el nivel del biomarcador (por ejemplo, proteína o ácido nucleico (por ejemplo, gen o mAR ) ) , detectado mediante métodos conocidos en el arte estándares tales como aquellos descritos en la presente, en comparación con una muestra de referencia, célula de referencia, tejido de referencia, muestra testigo, célula testigo o tejido testigo. En algunas modalidades, expresión elevada se refiere a un incremento global medio logarítmico base 2 de veces de cambio de alrededor de cualquiera de -1.6, -1.7, -1.8, -1.9 o -2.0 veces o mayor, en el nivel del biomarcador (por ejemplo, proteína o ácido nucleico (por ejemplo, gen o mARN) ) , detectado mediante métodos conocidos en el arte estándares tales como aquellos descritos en la presente, en comparación con una muestra de referencia, célula de referencia, tejido de referencia, muestra testigo, célula testigo o tejido testigo.
En algunas modalidades de cualquiera de los usos y métodos, el uno o más biomarcadores es SREBP1 maduro escindido. En algunas modalidades, la proteína de plena longitud SREBPla es una secuencia de aminoácidos 1-1147 aa de U IPROT P36956-1 y forma madura escindida: 1-490 aa de la secuencia de aminoácidos de UNIPROT P36956-1. En algunas modalidades, la proteína de plena longitud SREBPlc es la secuencia de aminoácidos de 1-1123 aa aminoácidos de UNIPROT P36956-3 la forma madura escindida: 1-466 aa de la secuencia de aminoácidos de UNIPROT P36956-3. En algunas modalidades de cualesquiera de los usos y métodos, una muestra del individuo, el cáncer y/o la célula de cáncer expresa niveles elevados de SREBPl madura en comparación con una muestra de referencia, célula de referencia, tejido de referencia, muestra testigo, célula testigo, tejido testigo o testigo interno (por ejemplo, gen de mantenimiento) . Por ejemplo, se proveen en la presente métodos de tratamiento de cáncer en un individuo que comprenden administrar al individuo una cantidad efectiva de un antagonista de SCD1, en donde el cáncer en el individuo expresa niveles elevados de uno o más biomarcadores en comparación con una muestra de referencia, célula de referencia, tejido de referencia, muestra testigo, célula testigo, tejido testigo o testigo interno (por ejemplo, gen de mantenimiento) y el uno o más biomarcadores es SREBPl maduro. En algunas modalidades de cualquiera de los usos y métodos, una muestra del individuo, el cáncer y/o la célula de cáncer expresan niveles elevados de SREBPl maduro y los niveles de SREBP2 maduro no son sustancialmente elevados (esto es, sustancialmente el mismo nivel de expresión) en comparación con una muestra de referencia, célula de referencia, tejido de referencia, muestra testigo, célula testigo, tejido testigo o testigo interno (por ejemplo, gen de mantenimiento). En algunas modalidades, expresión elevada se refiere a un incremento global y alrededor de cualquiera de 5%, 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o mayor, en el nivel del biomarcador (proteína o ácido nucleico (por ejemplo, gen o mRNA) ) , detectado mediante métodos conocidos en el arte estándares tales como aquellos descritos en la presente, en comparación con una muestra de referencia, célula de referencia, tejido de referencia, muestra testigo, célula testigo, tejido testigo o testigo interno (por ejemplo, gen de mantenimiento) . En algunas modalidades, SREBP1 es SREBP1 isoforma a. En algunas modalidades, SREBP1 es SREBP1 isoforma c. En ciertas modalidades, la expresión elevada se refiere al incremento en nivel de expresión/cantidad de un biomarcador, en donde el incremento es por lo menos alrededor de cualquiera de 1.5X, 1.75X, 2X, 3X, 4X, 5X, 6X, 7X, 8X, 9X, 10X, 25X, 50X, 75X o 100X en nivel de expresión/cantidad del biomarcador respectivo en una muestra de referencia, célula de referencia, tejido de referencia, muestra testigo, célula testigo o tejido testigo. En algunas modalidades, una muestra del individuo, el cáncer y/o la célula de cáncer es no cancerosa con o sin un nivel conocido de expresión de SREBPl maduro y/o SREBP2 maduro. En algunas modalidades, la muestra de referencia, célula de referencia, tejido de referencia, muestra testigo, célula testigo o tejido testigo es canceroso con o sin un nivel de expresión conocido de SREBPl maduro y/o SREBP2 maduro.
En algunas modalidades de cualquiera de los usos y métodos, el uno o más biomarcadores consiste de ácidos grasos ?9 monoinsaturados . En algunas modalidades de cualquiera de los usos y métodos, una muestra del individuo, el cáncer y/o la célula de cáncer expresa niveles elevados de ácidos grasos ?9 monoinsaturados en comparación con una muestra de referencia, célula de referencia, tejido de referencia, muestra testigo, célula testigo, tejido testigo o testigo interno (por ejemplo, gen de mantenimiento) . En algunas modalidades de cualquiera de los usos y métodos, el uno o más biomarcadores es una proporción de ácido grasos ?9 monoinsaturados : ácidos grasos saturados . En algunas modalidades de cualquiera de los usos y métodos, una muestra del individuo, el cáncer y/o la célula de cáncer expresa una proporción elevada de ácidos grasos ?9 monoinsaturados: ácidos grasos saturados en comparación con una muestra de referencia, célula de referencia, tejido de referencia, muestra testigo, célula testigo, tejido testigo o testigo interno (por ejemplo, gen de mantenimiento) . Por ejemplo, se proveen en la presente métodos de tratamiento de cáncer en un individuo que comprenden administrar al individuo una cantidad efectiva de un antagonista de SCD1, en donde el cáncer en el individuo expresan niveles elevados de uno o más biomarcadores en comparación con una muestra de referencia, célula de referencia, tejido de referencia, muestra testigo, célula testigo, tejido testigo o testigo interno (por ejemplo, gen de mantenimiento) y el uno o más biomarcadores es la proporción de ácidos grasos ?9 monoinsaturados: ácidos grasos saturados. En algunas modalidades, la expresión elevada se refiere a un incremento global de alrededor de cualquiera de 5%, 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o mayor, en el nivel del biomarcador (proteína o ácido nucleico (por ejemplo, gen o mRJSíA) ) , detectado mediante métodos conocidos en el arte estándares tales como aquellos descritos en la presente en comparación con la muestra de referencia, célula de referencia, tejido de referencia, muestra testigo, célula testigo o tejido testigo. En ciertas modalidades, la expresión elevada se refiere al incremento de nivel de expresión/cantidad de un biomarcador, en donde el incremento es de por lo menos alrededor de cualquiera de 1.5X, 1.75X, 2X, 3X, 4X, 5X, 6X, 7X, 8X, 9X, 10X, 25X, 50X, 75X o 100X el nivel de expresión/cantidad del respectivo biomarcador en una muestra de referencia, célula de referencia, tejido de referencia, muestra testigo, célula testigo o tejido testigo. En algunas modalidades, muestra de referencia, célula de referencia, tejido de referencia, muestra testigo, célula testigo o tejido testigo es no canceroso con o sin un nivel de expresión conocido de ácidos grasos ?9 monoinsaturados y/o ácidos grasos saturados. En algunas modalidades, la muestra de referencia, célula de referencia, tejido de referencia, muestra testigo, célula testigo o tejido testigo es canceroso con o sin un nivel de expresión conocido de ácidos grasos ?9 monoinsaturados y/o ácidos grasos saturados. Ejemplos de ácidos grasos ?9 monoinsaturados incluyen pero no están limitados a ácido palmitoleico (C16-.1) y ácido oleico (C18:l). Ejemplos de ácidos grasos saturados incluyen pero no están limitados a ácido esteárico (C18:0) y acido palmítico (C16:0). Métodos para medir ácidos grasos ?9 de monoinsaturados y ácidos grasos saturados son conocidos en el arte incluyendo, pero no limitado a espectrometría de masa, cromatografía de gases y cromatografía de capa delgada.
En algunas modalidades de cualquiera de los usos y métodos, el uno o más biomarcadores consiste de señalización de PI3K, señalización de mTOR, señalización de MEK. En algunas modalidades de cualquiera de los usos y métodos, el uno o más biomarcadores consiste de uno o más polimorfismos en genes seleccionados del grupo que consiste de PI3K, PTEN, p85, TSC1/2 y AKT. En algunas modalidades, de cualquiera de los usos y métodos, el uno o más biomarcadores consisten de AKT fosforilados . En algunas modalidades de cualquiera de los usos y métodos, una muestra del individuo, el cáncer y/o la célula de cáncer comprenden señalización de PI3K activada (por ejemplo, señalización de PI3K elevada) , señalización de mTOR elevada (por ejemplo, señalización de mTOR elevada) y/o señalización de MEK elevada (por ejemplo, señalización MEK elevada. En algunas modalidades de cualquiera de los métodos y/o usos, una muestra del individuo, el cáncer y/o la célula de cáncer comprende mutaciones de activación de PI3K. En algunas modalidades de cualquiera de los métodos y/o usos, una muestra del individuo, el cáncer y/o la célula de cáncer comprende pérdida de PTEN y/o mutaciones . En algunas modalidades de cualquiera de los métodos y/o usos, una muestra del individuo, el cáncer y/o la célula de cáncer comprende mutaciones p85. En algunas modalidades de cualquiera de los métodos y/o usos, una muestra del individuo, el cáncer y/o la célula de cáncer comprende mutaciones de activación de AKT. En algunas modalidades de cualquiera de los métodos y/o usos, una muestra del individuo, el cáncer y/o la célula de cáncer comprende niveles elevados de AKT elevados (por ejemplo, pAKT473) . En algunas modalidades de cualquiera de los métodos y/o usos, una muestra del individuo, el cáncer y/o la célula de cáncer comprende perdida de TSCl/2 de mutaciones de función.
En algunas modalidades, la expresión elevada se refiere a un incremento global de alrededor de cualquiera de 5%, 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o mayor, en el nivel del biomarcador (por ejemplo, proteína o ácido nucleico (por ejemplo, gen o mR A) ) , detectado mediante métodos conocidos en el arte estándares tales como aquellos descritos en la presente, en comparación con una muestra de referencia, célula de referencia, tejido de referencia, muestra testigo, célula testigo o tejido testigo. En ciertas modalidades, la expresión elevada se refiere al incremento en el nivel de expresión/cantidad de un biomarcador, en donde el incremento es de por lo menos alrededor de cualquiera de 1.5X, 1.75X, 2X, 3X, 4X, 5X, 6X, 7X, 8X, 9X, 10X, 25X, 50X, 75X o 100X en el nivel de exprésion/cantidad del biomarcador efectivo en una muestra de referencia, célula de referencia, tejido de referencia, muestra testigo, célula testigo o tejido testigo. En algunas modalidades, expresión elevada se refiere a un incremento global mayor de alrededor de 1.5 veces, alrededor de 1.75 veces, alrededor de 2 veces, alrededor de 2.25 veces, alrededor de 2.5 veces, alrededor de 2.75 veces, alrededor de 3.0 veces o alrededor de 3.25 veces en comparación con una muestra de referencia, célula de referencia, tejido de referencia, muestra testigo, célula testigo, tejido testigo o testigo interno (por ejemplo, gen de mantenimiento) .
En algunas modalidades, expresión reducida se refiere a una reducción global de alrededor de cualquiera de 5%, 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o mayor en el nivel del biomarcador (por ejemplo, proteína o ácido nucleico (por ejemplo, gen o mARN) ) , detectado mediante métodos conocidos en el arte estándares tales como aquellos descritos en la presente, en comparación con una muestra de referencia, célula de referencia, tejido de referencia, muestra testigo, célula testigo o tejido testigo. En ciertas modalidades, expresión reducida se refiere a la disminución en nivel de expresión/cantidad de un biomarcador, en donde la disminución es por lo menos alrededor de cualquiera de 0.9X, 0.8X, 0.7X, 0.6X, 0.5X, 0.4X, 0.3X, 0.2X, 0.1X, 0.05X o 0.01X en el nivel de exprésión/cantidad del respectivo biomarcador en una muestra de referencia, célula de referencia, tejido de referencia, muestra testigo, célula testigo o tejido testigo.
En algunas modalidades de cualquiera de los usos y/o métodos, el antagonista de SCD1 es cualquier anticuerpo, polipéptido de enlace, molécula pequeña de enlace o polinucleótido descrito en la presente. En algunas modalidades, el antagonista de SCD1 es una molécula pequeña. En algunas modalidades, la molécula pequeña es SMI37062 (G01522403), G02447171 o derivados de los mismos. En algunas modalidades, el antagonista de SCD1 es un anticuerpo. En algunas modalidades, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal . En algunas modalidades, el anticuerpo es un anticuerpo humano, humanizado o quimérico. En algunas modalidades, el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo y el fragmento de anticuerpo se enlaza a SCD1.
En algunas modalidades de cualquiera de los métodos, el individuo de acuerdo con cualquiera de las modalidades anteriores puede ser un humano .
Los niveles/cantidad de expresión de un biomarcador pueden ser determinados cualitativa y/o cuantitativamente en base a cualquier criterio apropiado conocido en el arte, incluyendo pero no limitado a mARN, cADN, proteínas, fragmentos de proteína y/o números de copia genética. En ciertas modalidades, la expresión/cantidad de un biomarcador en una primera muestra es incrementada en comparación con la expresión/cantidad en una segunda muestra. En ciertas modalidades, la expresión/cantidad de un biomarcador en una primera muestra es disminuida en comparación con la expresión/cantidad en una segunda muestra. En ciertas modalidades, la segunda muestra es una muestra de referencia, célula de referencia, tejido de referencia, muestra testigo, célula testigo o tejido testigo. Revelaciones adicionales para determinar el nivel de expresión/cantidad de un gen son descritos en la presente.
Los antagonistas de SCD1 descritos en la presente pueden ser usados ya sea solos o en combinación con otros agentes en una terapia. Un antagonista de SCD1 descrito en la presente puede ser co-administrado con por lo menos un agente terapéutico adicional. En ciertas modalidades, un agente terapéutico adicional es un agente quimioterapéutico . En algunas modalidades, el agente terapéutico adicional es un inhibidor de mTOR. En algunas modalidades, el agente terapéutico adicional es un inhibidor de PI3K. En algunas modalidades, el agente terapéutico adicional es un inhibidor de MEK. En algunas modalidades, el agente terapéutico adicional es un inhibidor de FGFR3.
Tales terapias de combinación indicadas anteriormente abarcan la administración combinada (en donde dos o más agentes terapéuticos son incluidos en la misma formulación o formulaciones separadas) y administración separada, en cuyo caso, la administración del antagonista de SCD1 de la invención puede ocurrir antes de, simultáneamente y/o enseguida del administración del agente terapéutico adicional y/o adyuvante. Los antagonistas de SCD1 descritos en la presente pueden también ser usados en combinación con terapias de radiación.
Un antagonista de SCD1 (por ejemplo, un anticuerpo, polipéptido de enlace y/o moléculas pequeñas) descrito en la presente (y cualquier agente terapéutico adicional) puede ser administrado mediante cualquiera medio apropiado, incluyendo administración parenteral, intrapulmonar e intranasal y si se desea para tratamiento local, administración intralesional . Las infusiones parenterales incluyen administración intramuscular, intravenosa, intraarterial , interaperitoneal o subcutánea. La dosificación puede ser mediante cualquier ruta apropiada, por ejemplo mediante inyecciones, tales como inyecciones intravenosas o subcutáneas, dependiendo en parte de si la administración es breve o crónica. Varios horarios de dosificación incluyendo pero no limitado a una sola administración o múltiples administraciones en varios puntos en el tiempo, administración de bolo e infusión pulsada son contempladas en la presente .
Los antagonistas de SCDl (por ejemplo, anticuerpos, polipéptidos de enlace y/o moléculas pequeñas) descritos en la presente pueden ser formulados, dosificados y administrados de manera consistente con la buena práctica médica. Factores para consideración en este contexto incluyen la alteración particular que es tratada, el mamífero particular que es tratado, la condición clínica del paciente individual, la causa de la alteración, el sitio de administración del agente, el método de administración, el horario de administración y otros factores conocidos para los practicantes médicos. El antagonista de este SCDl no necesita ser pero es formulado opcionalmente con uno o más agentes usados concurrentemente para impedir o tratar la alteración en cuestión. La cantidad efectiva de tales otros agentes dependen de la cantidad del antagonista de SCDl presente en la formulación, el tipo de alteración o tratamiento y otros factores discutidos anteriormente. Son en general usados en las mismas dosificaciones y con rutas de administración como se describe en la presente o alrededor de 1 a 99% de las dosificaciones descritas en la presente o en cualquier dosificación y por cualquier ruta que se determina empírica/clínicamente ser la apropiada.
Para la prevención o tratamiento de enfermedad, la dosificación apropiada de un antagonista de SCDl descrito en la presente (cuando es usado solo o en combinación con uno o más de otros agentes terapéuticos adicionales) dependerá del tipo de enfermedad a ser tratada, la severidad y curso de la enfermedad, el antagonista de SCDl es administrado por propósitos preventivos o terapéuticos, terapia previa, la historia clínica del paciente y respuesta al antagonista de SCDl y la discreción del médico que atiende. El antagonista de SCDl es administrado apropiadamente al paciente en una vez o en una serie de tratamientos. Una dosificación diaria típica podría variar de alrededor de 1 pg/kg a 100 mg/kg o más, dependiendo de factores mencionados anteriormente. Para administraciones repetidas durante varios días o más, dependiendo de la condición, el tratamiento en general sería sostenido hasta que se presenta una supresión deseada de los síntomas de la enfermedad. Tales dosis pueden ser administradas intermitentemente, por ejemplo cada semana o cada tres semanas (por ejemplo, de tal manera que el paciente recibe de alrededor de dos a alrededor de veinte o por ejemplo, alrededor de seis dosis del antagonista de SCD1 descrito en la presente) . Una dosis de carga más alta inicial, seguida por una o más dosis más bajas puede ser administrada. Un régimen de dosificación ejemplar comprende la administración. Sin embargo, otros regímenes de dosificación pueden ser útiles. El avance de esta terapia es monitoreado fácilmente mediante técnicas y ensayos convencionales .
Se comprenderá que cualquiera de las formulaciones anteriores o métodos terapéuticos se pueden llevar a cabo utilizando un inmunoconjugado en lugar o además del antagonista de SCD1.
Los niveles de expresión/cantidad de un biomarcador pueden ser determinados cualitativa y/o cuantitativamente en base a cualquiera criterio apropiado conocido en el arte, incluyendo pero no limitado a mAR , cADN, proteínas, fragmentos de proteína y/o números de copia genética. En ciertas modalidades, la expresión es expresión de proteína. En ciertas modalidades, la expresión es expresión de polinucleótido. En ciertas modalidades, el polinucleótido es ADN. En ciertas modalidades, el polinucleótido es AR . En ciertas modalidades, la expresión de una cantidad de un biomarcador en una primera muestra es incrementada en comparación con la expresión/cantidad en una segunda muestra. En ciertas modalidades, la expresión/cantidad de un biomarcador en una primera muestra es disminuida en comparación con la expresión/cantidad en una segunda muestra. En ciertas modalidades, la segunda muestra es una muestra de referencia, célula de referencia, tejido de referencia, muestra testigo o tejido testigo. Revelaciones adicionales para determinar el nivel de expresión/cantidad de un gen son revelados en la presente .
La expresión de varios biomarcadores en una muestra pueden ser analizadas por un número de metodologías, muchas de las cuales son conocidas en el arte y entendidas por el experimentado en el arte, incluyendo pero no limitado a métodos inmunohistoquímicos (IHC) , análisis de western blot, inmunoprecipitación, ensayo de enlace molecular, ELISA, ELIFA, clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) , MassARRAY, proteomicos, ensayos a base de sangre cualitativos (como por ejemplo ELISA de suero) , ensayos de actividad enzimática bioquímicos, hibridización in situ, análisis de Northern, reacción en cadena de polimerasa (PCR) incluyendo PCR en tiempo real cuantitativa (qRT-PCR) y otros métodos de detección tipo amplificación, tales como por ejemplo ADN ramificado, SISBA, TMA y los semejantes) , RNA-Seq, FISH, análisis de microarreglo, perfilado de expresión genética y/o análisis serial de expresión genética (SAGE) , también como cualquiera de la amplia variedad de ensayos que pueden ser efectuados mediante análisis de proteína, genética y/o análisis de arreglo de tejido. Protocolos típicos para evaluar el estatus de genes y productos genéticos se encuentran, por ejemplo en Ausubel et al. eds . , 1995, Current Protocols In Molecular Biology, Units 2 (Northern Blotting) , 4 (Southern Blotting), 15 ( Immunoblotting) y 18 (PCR Analysis) . Inmunoensayos multiplexados tales como aquellos disponibles de Rules Based Medicine o Meso Scale Discovery (MSD) pueden también ser usados.
En algunas modalidades, el nivel de expresión de un biomarcador es determinado utilizando un método que comprende: (a) efectuar el perfilado de expresión genética, PCR (tal como rtPCR) , ARN-seq, análisis de microarreglo, SAGE, técnica de MassARRAY o FISH en una muestra (como una muestra de cáncer del paciente) y (b) determinar el nivel de expresión de un biomarcador en la muestra. En un aspecto, el nivel de expresión de biomarcador es determinado utilizando un método que comprende: (a) efectuar el análisis de IHC de una muestra (tal como una muestra de cáncer del paciente) con un anticuerpo y (b) determinar el nivel de expresión de un biomarcador en la muestra. En algunas modalidades, la intensidad de teñido de IHC es determinada en relación con un valor de referencia.
De acuerdo con algunas modalidades, la expresión genética es medida al observar los niveles de expresión de proteína de un gen mencionado anteriormente. En algunas modalidades, el nivel de expresión genética es medido mediante un método seleccionado de un método de PCR, un método de microarreglo un método de inmunoensayo . En algunas modalidades, el método de microarreglo comprende el uso de un chip de microarreglo que tiene una o más moléculas de ácido nucleico que se pueden hibridizar bajo condiciones severas bajo una molécula de ácido nucleico que codifica un gen modificado anteriormente o que tiene un o más polipéptidos (tales como péptidos o anticuerpos) que se pueden enlazar a una o más de las proteínas codificadas por los genes mencionados anteriormente. En una modalidad, el método de PCR es qPCR. En una modalidad, el método de PCR es multiplex-PCR. En algunas modalidades, la expresión genética es medida mediante microarreglo. En algunas modalidades, la expresión genética es medida mediante reacción en cadena de polimerasa cuantitativa en tiempo real (qPCR) . En algunas modalidades, la expresión es medida mediante multiplex-PCR.
En ciertas modalidades, el método comprende poner en contacto la muestra biológica con anticuerpos a un biomarcador descrito en la presente bajo condiciones permitidas para el enlace del biomarcador y detectar sin un complejo es formado entre los anticuerpos y el biomarcador. Tal método puede ser un método in vitro o un método in vivo. En una modalidad, se usa un anticuerpo para seleccionar sujetos elegibles para terapia con el antagonista de SCD1, por ejemplo un biomarcador para selección de pacientes.
En ciertas modalidades, las muestras son normalizadas en cuanto a diferencias en la cantidad del biomarcador ensayado como la variabilidad y la calidad de las mezclas usadas y la variabilidad entre corridas de ensayo. Tal normalización se puede llevar a cabo al medir e incorporar la expresión de ciertos biomarcadores de normalización, incluyendo genes de mantenimiento bien conocidos tales como ACTB. Alternativamente, la normalización puede estar basada en la señal media o mediana de todos los genes ensayados o un subconjunto de los mismos (procedimiento de normalización global) . En una base de gen en gen, la cantidad normalizada medida de un mAR de tumor e paciente o proteína es comparada con la cantidad encontrada en un conjunto de referencia. Los niveles de expresión normalizados para cada mARN o proteína por tumor probado por paciente pueden ser expresados como un porcentaje de nivel de expresión medido en el conjunto de referencia. El nivel de expresión medido en una muestra del paciente particular a ser analizada caerá en algún percentil dentro de este intervalo, lo que puede ser determinado mediante métodos bien conocidos en el arte.
En ciertas modalidades, el nivel de expresión relativo de un gen es determinado como sigue: Expresión relativa gen 1 muestra 1= 2 exponencial (Ct de gen de mantenimiento-Ct de gen 1) con Ct determinado en una muestra .
Expresión relativa gen 1 ARN de referencia= 2 exponencial (Ct de gen de mantenimiento-Ct de gen 1) con Ct determinado en la muestra de referencia.
Expresión relativa normalizada gen 1 muestra 1= (expresión relativa gen 1 muestra 1/expresión relativa gen 1 ARN de referencia) x 100 Ct es el ciclo de umbral. El Ct es el número de ciclo al cual la fluorescencia generada dentro de una reacción cruza la línea de umbral.
Todos los experimentos son normalizados a un ARN de referencia, que es una mezcla extensa de ARN de varios fuentes de tejido (por ejemplo, ARN de referencia #636538 de Clontech, Mountain View, CA) . El ARN de referencia idéntico es incluido en cada corrida de qRT-PCR, permitiendo la comparación de resultados entre diferentes corridas experimentales .
En una modalidad, la muestra es una muestra clínica. En otra modalidad, la muestra es usada en un ensayo de diagnóstico. En algunas modalidades, la muestra es obtenida de un tumor primario o metastático. La biopsia de tejido es frecuentemente usada para obtener una pieza representativa de tejidos de tumor. Alternativamente, las células de tumor pueden ser obtenidas indirectamente en forma de tej idos o fluidos que se sabe o se piensa que contienen las células de tumor de interés. Por ejemplo, muestras de lesiones de cáncer de pulmón pueden ser obtenidas mediante resección, broncoscopía, aspiración de aguja fina, cepillados bronquiales o de esputo, fluido pleural o sangre. Los genes o productos genéticos pueden ser detectados de cáncer o de tejido de tumor o de otras muestras de anticuerpo tales como orina, esputo, suero o plasma. Las mismas técnicas discutidas anteriormente para detección de genes objetivo o productos genéticos en muestras cancerosas pueden ser aplicadas a otras muestras corporales . Las células de cáncer pueden ser raspadas de lesiones de cáncer y aparecer en tales muestras corporales. Al seleccionar tales muestras corporales, una simple diagnosis prematura puede ser obtenida para estos canceres. Además, el avance de terapia puede ser monitoreado más fácilmente al probar tales muestras corporales en cuanto a genes objetivo o productos genéticos.
En ciertas modalidades, una muestra de referencia, célula de referencia, tejido de referencia, muestra testigo, célula testigo o tejido testigo es una sola muestra o múltiples muestras combinadas del mismo sujeto o individuo que son obtenidas en uno o más puntos en el tiempo diferentes que cuando la muestra de prueba es obtenida. Por ejemplo, una muestra de referencia, célula de referencia, tejido de referencia, muestra testigo, célula testigo o tejido testigo es obtenido en un punto en el tiempo anterior del mismo sujeto o individuo que cuando la muestra de prueba es obtenida. Tal muestra de referencia, célula de referencia, tejido de referencia, muestra testigo, célula testigo o tejido testigo. Tal muestra de referencia, célula de referencia, tejido de referencia, muestra testigo, célula testigo o tejido testigo puede ser útil si la muestra de referencia es obtenida durante la diagnosis inicial de cáncer y la muestra de prueba es obtenida más tarde cuando el cáncer se vuelve metastático.
En ciertas modalidades, una muestra de referencia, célula de referencia, tejido de referencia, muestra testigo, célula testigo o tejido testigo consiste de múltiples muestras combinadas de uno o más individuos saludables que no son el sujeto o paciente. En ciertas modalidades, una muestra de referencia, célula de referencia, tejido de referencia, muestra testigo, célula testigo o tejido testigo consiste de múltiples muestras combinadas de uno o más individuos con una enfermedad o alteración (por ejemplo, cáncer) que son el sujeto o paciente. En ciertas modalidades, una muestra de referencia, célula de referencia, tejido de referencia, muestra testigo, célula testigo o tejido testigo consiste de muestras de ARN acumuladas de tejidos normales o muestras de plasma o suero acumuladas de un o más individuos que no son el sujeto o paciente. En ciertas modalidades, una muestra de referencia, célula de referencia, tejido' de referencia, muestra testigo, célula testigo o tejido testigo consiste de muestras de ARN acumuladas de tejidos de tumor o muestras de plasma o suero acumuladas de uno o más individuos con una enfermedad o alteración (por ejemplo, cáncer que no son el sujeto o paciente) .
En ciertas modalidades, la expresión de proteínas en una muestra es examinada utilizando inmunohistoquímica ("IHC") y protocolos de teñido. El teñido inmunhistoquímico de secciones de tejido ha mostrado es un método confiable para determinar o detectar la presencia de proteínas en una muestra.
IHC puede ser efectuado en combinación con técnicas adicionales tales como teñido morfológico y/o hibridización in situ de fluorescencia. Dos métodos generales de IHC están disponibles; ensayos directos e indirectos. De acuerdo con el primer ensayo, el enlace del anticuerpo al antígeno objetivo es determinado directamente. Este ensayo directo utiliza un reactivo marcado, tal como una etiqueta fluorescente o un anticuerpo primario enzima-marcado, que puede ser visualizado sin interacción de anticuerpo adicional. En un ensayo indirecto típico, el anticuerpo primario sin conjugar se enlace al antígeno y luego un anticuerpo secundario marcado se enlaza al anticuerpo primario. En donde el anticuerpo secundario es conjugado a un marcador enzimático, se agrega un sustrato cromogénico o fluorogénico para proveer visualización del antígeno. La amplificación de señal ocurre debido a que varios anticuerpos secundarios pueden reaccionar con diferentes epítopes sobre el anticuerpo primario.
El anticuerpo primario y/o secundario usado para inmunohistoquímica comúnmente será marcado con una porción detectable, numerosos marcadores están disponibles que pueden en general ser agrupados en las siguientes categorías: (a) Radioisótopos, tales como 35S, 14C, 125I, 3H y 131I; (b) partículas de oro coloidal; (c) marcadores fluorescentes incluyendo pero no limitados a quelatos de tierras raras (quelatos de europio) , rojo de Texas, rodamina, fluoresceína, dansilo, lisamina, umbeliferona, ficocriterina, ficocianina o fluoróforos disponibles como SPECTRU ORA GE7 y SPECTRUM GREEN7 y/o derivados de cualquiera de uno o más de los anteriores; (d) varios marcadores de enzima-sustrato están disponible y la patente estadounidense 4,275,149 provee una revisión de algunos de estos. Ejemplos e marcadores enzimáticos incluyen luciferasas (por ejemplo, luciferasa de luciérnaga y luciferasa bacteriana; patente estadounidense 4,737,456), luciferina, 2, 3-dihidroftalazinedionas, malato deshidrogenasa, ureasa, peroxidasa tal como peroxidasa de rábano (HRPO) , fosfatasa alcalina, ß-galactosidasa, glucoamilasa, lisozima, sacárido oxidasas (por ejemplo, glucosa oxidasa, galactosa oxidasa y glucosa-6-fosfato deshidrogenasa) , oxidasas heterocíclicas (tal como uricasa y xantina oxidasa) , lactoperoxidasa, microperoxidasa y los semejantes .
Ejemplos de combinaciones de enzima-sustrato incluyen, por ejemplo peroxidasa de rábano (RPO) con peróxido de hidrógeno como sustrato; fosfatasa alcalina (AP) con para-nitrofenil fosfato como sustrato cromogénico y ß-D-galactosidasa (ß-D-Gal) con un sustrato cromogénico (por ejemplo, p-nitrofenil-p-D-galactosidasa) o sustrato fluorogénico (por ejemplo, -metilumbeliferil-ß-?-galactosidasa) . Para una revisión general de esto, véanse patentes estadounidenses 4,275,149 y 4,318,980.
Los especímenes así preparados pueden ser montados y cubiertos con cubreobjetos. Luego se determina la evaluación del portaobjetos, por ejemplo utilizando un microscopio y criterios de intensidad de teñido usados sistemáticamente en el arte pueden ser empleados. En algunas modalidades, una puntuación de patrón de teñido de alrededor de 1+ o mayor es de diagnóstico y/o prognóstico. En ciertas modalidades, una puntuación de patrón de teñido de alrededor de 2+ o mayor en un ensayo de IHC es de diagnóstico y prognóstico. En otras modalidades, una puntuación de patrón de teñido de alrededor de 3 o más alto es de diagnóstico y/o prognóstico. En una modalidad, se entiende que cuando las células y/o tejido de un tumor o adenoma de colon son examinados utilizando IHC, el teñido es en general determinado o indagado en la célula y/o tejido de tumor (en contraposición al tejido estromal o circulante que puede estar presente en la muestra) .
En métodos alternativos, la muestra puede estar en contacto con un anticuerpo específico para dicho biomarcador bajo condiciones suficientes para que se forme el complejo de anticuerpo-marcador y luego detectar dicho complejo. La presencia del biomarcador puede ser detectada de una diversidad de maneras, tal como mediante western blot y procedimientos de ELISA para ensayar una amplia variedad de tejidos y muestras, incluyendo plasma y suero. Un amplio intervalo de técnicas de inmunoensayo que utilizan tal formato de ensayo está disponibles, véanse, por ejemplo patentes estadounidenses 4,016,043, 4,424,279 y 4,018,653. Estas incluyen tanto ensayos de un solo sitio como de dos sitios o de "emparedado" de los tipos no competitivos, también como en los ensayos de enlace competitivos tradicionales. Estos ensayos también incluyen enlace directo de un anticuerpo marcado a un biomarcador objetivo.
Métodos para la evaluación de mARN en células son bien conocidos e incluyen, por ejemplo, ensayos de hibridización utilizando sondas de ADN complementarias (tal como hibridización in situ utilizando ribosondas marcadas específicas para el uno o más genes, Northern blot y técnicas relacionadas) y varios ensayos de amplificación de ácido nucleico (tales como RT-PCR utilizando cebadores complementarios específicos para uno o más de los genes y otros métodos de detección tipo amplificación, tales como por ejemplo ADN ramificado, SISBA, TMA y los semejantes) .
Las muestras de mamíferos pueden ser ensayadas convenientemente en cuanto mARN utilizando Northern, inmunoabsorción o análisis de PCR. Además, tales métodos pueden incluir una o más etapas que permiten determinar los niveles del mARN objetivo en una muestra biológica (por ejemplo, al examinar simultáneamente los niveles de una secuencia de mARN testigo comparativo de un gen de "mantenimiento" tal como un miembro de la familia de actina) . Opcionalmente, la secuencia del cADN objetivo amplificado puede ser determinada.
Métodos opcionales de la invención incluyen protocolos que examinan o detectan mARN, tales como mARN objetivo, en una muestra de tejido o célula mediante tecnologías de microarreglo . Utilizando micro arreglos de ácido nucleico, muestras de mARN de prueba y testigo de muestras de tejido de prueba y testigo son transcritas de manera inversa y marcadas para generar sondas de cADN. Las sondas son luego hibridizadas a un arreglo de ácido nucleico inmovilizado sobre un soporte sólido. El arreglo es configurado de tal manera que la secuencia y porción de cada miembro del arreglo es conocida. Por ejemplo, una selección de genes cuya expresión se correlaciona con beneficio clínico incrementado o reducido de la terapia anti-angiogénica puede ser arreglada sobre un soporte sólido. La hibridización de una sonda marcada con un miembro de arreglo particular indica que la muestra de la cual la sonda fue derivada expresa aquel gen.
La expresión de un biomarcador seleccionada en una muestra de tejidos o célula puede también ser examinada por medio de ensayos funcionales o ensayos a base de actividad. Por ejemplo, si el biomarcador es una enzima, se pueden llevar a cabo ensayos conocidos en el arte para determinar o detectar la presencia de la actividad enzimática dada en la muestra de tejido o muestra de célula.
III . Composiciones terapéuticas Se proveen en la presente antagonistas de SCDl útiles en los métodos descritos en la presente. En algunas modalidades, los antagonistas de SCDl consisten de un anticuerpo, polipéptido de enlace, molécula pequeña de enlace y/o polinucleótido .
A. Anticuerpos En un aspecto, se proveen en la presente anticuerpos aislados que se enlazan a SCD1. En cualquiera de las modalidades anteriores, un anticuerpo es humanizado. En un aspecto adicional de la invención, el anticuerpo anti-SCDl de acuerdo con cualquiera de las modalidades anteriores es un anticuerpo monoclonal, incluyendo un anticuerpo quimérico, humanizado o humano. En una modalidad, el anticuerpo anti-SCDl es de un fragmento de anticuerpo, por ejemplo un fragmento de Fv, Fab, Fab' , scFv, diacuerpo, o F(ab' )2- En otra modalidad, el anticuerpo es un anticuerpo de plena longitud, por ejemplo un anticuerpo IgGl" intacto u otra clase de anticuerpo o isotipo como se define en la presente.
En un aspecto adicional, el anticuerpo anti-SCDl de acuerdo con cualquiera de las modalidades anteriores puede incorporar cualquier fragmento, individualmente o en combinación, como se describe en las secciones posteriormente en la presente: 1. Afinidad de anticuerpo En ciertas modalidades, el anticuerpo provisto en la presente tiene una constante de disociación ( d) de = ?µ?. En una modalidad, Kd es medida mediante un ensayo de enlace de antígeno radiomarcado (RIA) efectuado con la versión de Fab de un anticuerpo de interés y su antígeno como se define por el siguiente ensayo. La afinidad de enlace en solución de los Fab por el antígeno es medida al equilibrar el Fab con una concentración mínima de antígeno (125I) -marcado en presencia de una serie de titulación de antígeno sin marcar, luego facturar el antígeno enlazado con una placa recubierta de anticuerpo anti-Fab (véase, por ejemplo, Chen et al., J. Mol. Biol . 293:865-881(1999)). Para establecer condiciones para el ensayo, placas de multicavidad de MICROTITER5 (Thermo Scientific) son recubiertas de la noche a la mañana con 5 µ?/p?? de un anticuerpo anti-Fab de captura (Cappel Labs) en carbonato de sodio 50 mM (pH 9.6) y subsecuentemente bloqueadas con albúmina de suero bovino al 2% (peso/volumen) en PBS por dos a cinco horas a temperatura ambiente (aproximadamente 23 °C) . En una placa no absorbente (Nunc #269620), [125I] -antígeno 100 pM o 26 pM son mezclados con diluciones seriales de un Fab de interés (por ejemplo, consistente con la determinación del anticuerpo anti-VEGF, Fab-12, en Presta et al., Cáncer Res. 57:4593-4599 (1997)). El Fab de interés es luego incubado de la noche a la mañana; sin embargo, la incubación puede continuar por un período más largo (por ejemplo, alrededor de 65 horas) para asegurar que se alcance el equilibrio. Después de esto, las mezclas son transferidas a la placa de captura para incubación a temperatura ambiente (por ejemplo, por una hora) . Luego, la solución es removida y la placa lavada ocho veces con polisorbate 20 (TWEEN-20®) al 0.1% en PBS. Cuando las placas han secado, se agregan 150 µ?/cavidad de agente de centelleo (MICROSCINT-20™; Packard) y las placas son contadas en un contador gamma TOPCOUNT™ (Packard) por diez minutos. Las concentraciones de cada Fab que dan una concentración menor o igual a 20% de enlace máximo son escogidos para uso en ensayos de enlace competitivo.
De acuerdo con otra modalidad, Kd es medida utilizando ensayos de resonancia de plasmón superficial utilizando un dispositivo BIACORES-2000 o un BIACORE ^-ß??? (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) a 25°C con chips CM5 de antigeno inyectado a -10 unidades de respuesta (RU) . Brevemente, los chips de biosensor de dextrana carboximetilada (CM5, BIACORE, Inc.) son activados con clorhidrato de N-etil-N' - (3-dimetilaminopropil) -carbodiimida (EDC) y N-hidroxisuccinimida (NHS) de acuerdo con las instrucciones del proveedor. El antígeno es diluido con acetato de sodio 10 mM, pH 4.8, a 5 µ?/p?? (-0.2 µ?) antes de la inyección a una velocidad de flujo de 5 µ?/minute para obtener aproximadamente 10 unidades de respuesta (RU) de proteína acoplada. Enseguida de la inyección del antígeno se inyecta etanolamina 1 M para bloquear los grupos sin reaccionar. Para mediciones cinéticas, diluciones seriales dos veces de Fab (0.78 nM a 500 nM) son inyectadas en PBS con surfactante de polisorbate 20 (TWEEN-20™) al 0.05% (PBST) a 25°C a una velocidad de flujo de aproximadamente 25 µ?/min. Las velocidades de asociación (kenCendido) y velocidades de disociación (kapagado) son calculadas utilizando un modelo de enlace de Langmu r de uno a uno simple (elementos de programación de evaluación de BIACORE* versión 3.2) al ajustar simultáneamente los sensogramas de asociación y disociación. La constante de disociación al equilibrio (Kd) es calculada como la proporción kapagado/kencendido- Véase, por ejemplo Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999). Si la velocidad de encendido excede de 106 M"1 s"1 mediante el ensayo de resonancia de plasmón superficial anterior, entonces la velocidad de encendido puede ser determinada al utilizar una técnica de apagado fluorescente que mide el incremento o disminución en intensidad de emisión de fluorescencia (excitación = 295 nm; emisión = 340 nm, paso de banda de 16 nm) a 25°C de un anticuerpo anti-antxgeno 20 nM (forma Fab) en PBS, pH 7.2, en presencia de concentraciones incrementadas de antxgeno tal como se mide en un espectrómetro, tal como un espectrofotómetro equipado con parada de flujo (Aviv Instruments) o un espectrofotómetro SLM-AMINCO™ serie 8000 (ThermoSpectronic) con una cubeta agitada. 2. Fragmentos de anticuerpo En ciertas modalidades, un anticuerpo provisto en la presente es un fragmento de anticuerpo. Los fragmentos de anticuerpo incluyen pero no están limitados a fragmentos de Fab, Fab' , Fab' -SH, F(ab' )2, Fv y fragmentos de scFv y otros fragmentos descritos posteriormente en la presente. Para una revisión de ciertos fragmentos de anticuerpo, véase Hudson et al. Nat. Med. 9:129-134 (2003). Para una revisión de fragmentos scFv, véase, por ejemplo Pluckthün, en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol . 113, Rosenburg y oore eds., (Springer-Verlag, Nueva York), pp. 269-315 (1994) ; véase también WO 93/16185 y patentes estadounidenses 5,571,894 y 5,587,458. Para discusión de Fab y F(ab')2 que comprenden residuos de epítope de enlace de receptor de fragmento y que tienen vida media incrementada, véase patente estadounidense 5,869,046.
Los diacuerpos son fragmentos de anticuerpo con dos sitios de enlace de antígeno que pueden ser bivalentes o bisespecíficos . Véase, por ejemplo EP 404,097; WO 1993/01161; Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003) y Hollinger et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993). Los triacuerpos y tetracuerpos son también descritos por ejemplo en Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003).
Los anticuerpos de un solo dominio son fragmentos de anticuerpo que comprenden todos o una porción del dominio variable de cadena pesada o todo o una porción del dominio variable de cadena ligera de un anticuerpo. En ciertas modalidades, un anticuerpo de un solo dominio es un anticuerpo de un solo dominio humano (Domantis, Inc., Waltham, MA; véase, por ejemplo patente estadounidense 6, 248, 516 Bl) .
Los fragmentos de anticuerpo pueden ser elaborados mediante varias técnicas incluyendo pero no limitado a digestión proteolítica de un anticuerpo intacto, también como producción por células huésped recombinantes (por ejemplo, E. coli o fago), como se describe en la presente. 3. Anticuerpos quiméricos y anticuerpos humanizados En ciertas modalidades, el anticuerpo provisto en la presente es un anticuerpo quimérico. Ciertos anticuerpos quiméricos son descritos, por ejemplo en la patente estadounidense 4,816,567 y Morrison et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)). En un ejemplo, el anticuerpo quimérico comprende una región variable no humana (por ejemplo, una región variable derivada de un ratón, rata, hámster, conejo o primate no humano, tal como un mono) y una región constante humana. En un ejemplo adicional, un anticuerpo quimérico es un anticuerpo de "clase cambiada" en el cual la clase o subclase ha sido cambiada de aquellas del anticuerpo original. Los anticuerpos quiméricos incluyen fragmentos de enlace de antígeno de los mismos.
En ciertas modalidades, el anticuerpo quimérico es un anticuerpo humanizado. Comúnmente, un anticuerpo no humano es humanizado para reducir la inmunogenicidad a humanos, en tanto que retiene la especificidad y afinidad del anticuerpo no humano parental . En general, un anticuerpo humanizado comprende uno o más dominios variables, en los cuales las HVR, por ejemplo CDR (o porciones de las mismas) son derivadas de un anticuerpo no humano y FR (o porciones de las mismas) son derivadas de secuencias de anticuerpo humanas. Un anticuerpo humanizado opcionalmente también comprenderá por lo menos una porción de una región constante humana. En algunas modalidades, algunos residuos de FR en un anticuerpo humanizado son sustituidos con residuos correspondientes de un anticuerpo no humano (por ejemplo, el anticuerpo del cual los residuos de HVR son derivados) , por ejemplo para restaurar o mejorar la especificidad o afinidad de anticuerpo.
Anticuerpos humanizados y métodos para elaborar son revisados, por ejemplo en Almagro y Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008) y son descritas adicionalmente, por ejemplo en Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); Queen et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989); patentes estadounidenses 5, 821,337, 7,527,791, 6,982,321 y 7,087,409; Kashmiri et al., Methods 36:25-34 (2005) (que describen xenoinjerto de SDR (a-CDR) ) ; Padlan, Mol. Immunol . 28:489-498 (1991) (que describe el "retratamiento superficial"); Dall'Acqua et al., Methods 36:43-60 (2005) (que describe "entremezcla de FR") y Osbourn et al., Methods 36:61-68 (2005) y Klimka et al., Br. J. Cáncer, 83:252-260 (2000) (que describe el procedimiento de "selección guiada" a la entremezcla de FR) .
Regiones de estructura humana que pueden ser usadas para humanización incluyen pero no están limitadas a: regiones de estructura seleccionadas utilizando el método de "mejor ajuste" (véase, por ejemplo, Sims et al. J. Immunol . 151:2296 (1993) ) ; regiones de estructura derivadas de la secuencia de consenso de anticuerpos humanos de un subgrupo particular de regiones variables de cadena ligera o cadena pesada (véase, por ejemplo Cárter et al. Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992) y Presta et al. J. Immunol., 151:2623 (1993)); regiones de estructura maduras humanas (mutadas somáticamente) por regiones de estructura de línea terminal humana (por ejemplo, Almagro y Fransson, Front . Biosci. 13:1619-1633 (2008)) y regiones de estructura derivadas de selección de bibliotecas de FR (véase, por ejemplo, Baca et al., J. Biol. Chem. 272:10678-10684 (1997) y Rosok et al., J. Biol. Chem. 271:22611-22618 (1996)). 4. Anticuerpos humanos En ciertas modalidades, el anticuerpo provisto en la presente es un anticuerpo humano. Los anticuerpos humanos pueden ser producidos utilizando varias técnicas conocidas en el arte. Anticuerpos humanos son descritos en general en van Dijk y van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol . 5: 368-74 (2001) y Lonberg, Curr. Opin. Immunol . 20:450-459 (2008) .
Anticuerpos humanos pueden ser preparados al administrar un inmunogeno a un animal transgénico que ha sido modificado para producir anticuerpos humanos intactos o anticuerpos intactos con regiones variables humanas en respuesta al ataque antigénico. Tales animales contienen comúnmente todos o una porción de los sitios de inmunoglobulina humanos, que reemplazan los sitios de inmunoglobulina endógenos o que están presentes extracromosomalmente o integrados aleatoriamente a los cromosomas del animal. En tales ratones transgénicos , los sitios de inmunoglobulina endógenos han sido en general desactivados. Para una revisión de métodos para obtener anticuerpos humanos a partir de animales transgénicos, véase Lonberg, Nat. Biotech. 23:1117-1125 (2005) . Véase, también, por ejemplo patente estadounidense 6,075,181 y 6,150,584 que describe la tecnología de XENOMOUSE™; patente estadounidense 5,770,429 que describe la tecnología de HuMab®; patente estadounidense 7,041,870 que describe la tecnología de K-M MOUSE® y solicitud de patente estadounidense 2007/0061900, que describe la tecnología de VelociMouse®) . Regiones variables humanas de anticuerpos intactos generadas por tales animales pueden ser modificadas adicionalmente, por ejemplo mediante combinación con una región constante humana diferente.
Los anticuerpos humanos pueden también ser elaborados mediante métodos a base de hibridoma. Líneas celulares de mieloma humanas y líneas celulares de heteromieloma de ratón-humanas para la producción de anticuerpos monoclonales humanos han sido descritas. (Véase, por ejemplo, Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., onoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1987) y Boerner et al., J. Immunol., 147: 86 (1991).) Anticuerpos humanos generados vía tecnología de hibridoma de célula B humana son también descritos en Li et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006) . Métodos adicionales incluyen aquellos descritos por ejemplo en la patente estadounidense 7,189,826 (que describe la producción de anticuerpos de IgM humanos monoclonales a partir de líneas de célula de hibridoma) y Ni, Xiandai Mianyixue, 26 (4) : 265-268 (2006) (que describen hibridomas humanos-humanos) . Tecnología de hibridoma humano (tecnología de trioma) es también descrita en Vollmers y Brandlein, Histol. Histopathol . , 20 (3) : 927-937 (2005) y Vollmers y Brandlein, Methods Find Exp. Clin. Pharmacol . , 27 (3) : 185-91 (2005) .
Anticuerpos humanos pueden también ser generados al aislar secuencias de dominio variable de clon de Fv seleccionados de bibliotecas de despliegue de fago humanos-derivadas. Tales secuencias de dominio variable pueden luego ser combinadas con un dominio constante humano deseado. Técnicas para seleccionar anticuerpos humanos de bibliotecas de anticuerpo son descritas posteriormente en la presente . 5. Anticuerpos biblioteca-derivados Anticuerpos de la invención pueden ser aislados al seleccionar bibliotecas combinatoriales en cuanto a anticuerpos con actividad o actividades deseadas . Por ejemplo, una variedad de métodos son conocidos en el arte para generar bibliotecas de despliegue de fago y seleccionar tales bibliotecas en cuanto a anticuerpos que poseen las características de enlace deseadas . Tales métodos son revisadas, por ejemplo en Hoogenboom et al. en Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed. , Human Press, Totowa, NJ, 2001) y descritos adicionalmente , por ejemplo en McCafferty et al., Nature 348:552-554; Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol . 222:581-597 (1992); Marks y Bradbury, en Methods in Molecular Biology 248:161-175 (Lo, ed. , Human Press, Totowa, NJ, 2003); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338 (2) : 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol. 340 (5) : 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc . Nati. Acad. Sci. USA 101 (34) : 12467-12472 (2004) y Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132(2004).
En ciertos métodos de despliegue de fago, repertorios de genes de VH y VL son clonados separadamente mediante reacción en cadena de polimerasa (PCR) y combinados aleatoriamente en bibliotecas de fago, que pueden luego ser seleccionadas en cuanto a fago de enlace de antígeno como se describe en Winter et al., Ann. Rev. Immunol . , 12: 433-455 (1994). El fago comúnmente despliega fragmentos de anticuerpo, ya sea como fragmentos de Fv de una sola cadena (scFv) o como fragmentos de Fab. Las bibliotecas de fuentes inmunizadas proveen anticuerpos de alta afinidad al inmunogeno en el entendimiento de construir hibridomas . Alternativamente, el repertorio naive puede ser clonado (por ejemplo, de humanos) para proveer una sola fuente de anticuerpos a un amplio intervalo de antígenos sin self y también antígenos self sin ninguna inmunización como se describe por Griffiths et al., EMBO J, 12: 725-734 (1993). Finalmente, bibliotecas naive pueden también ser elaboradas sintéticamente mediante clonación de segmentos de gen V sin arreglar a partir de células madre y usando cebadores de PCR que contienen secuencia aleatoria para codificar las regiones de CDR altamente variables y para llevar a cabo el rearreglo in vitro, como se describe por Hoogenboom y Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992). Publicaciones de patente que describen bibliotecas de fago de anticuerpo humanas incluyen, por ejemplo patentes estadounidense 5,750,373 y publicación de patente estadounidense 2005/0079574, 2005/0119455, 2005/0266000, 2007/0117126, 2007/0160598, 2007/0237764, 2007/0292936, y 2009/0002360.
Anticuerpos o fragmentos de anticuerpo aislados de bibliotecas de anticuerpo humanos son considerados anticuerpos humanos o fragmentos de anticuerpo humanos en la presente . 6. Anticuerpos multiespecificos En ciertas modalidades, el anticuerpo provisto en la presente es un anticuerpo multiespecifico, por ejemplo, un anticuerpo bisespecífico . Los anticuerpos multiespecificos son anticuerpos monoclonales que tienen especificidades de enlace por lo menos en dos sitios diferentes. En ciertas modalidades, una de las especificidades de enlace es por SCDl y la otra es por cualquier otro antígeno. En ciertas modalidades, los anticuerpos bisespecíficos se pueden enlazar a dos epítopes diferentes de SCDl. Los anticuerpos bisespecíficos pueden también ser usados para localizar agentes citotóxicos a células que expresan SCDl. Los anticuerpos bisespecíficos pueden ser preparados como anticuerpos de plena longitud o fragmentos de anticuerpo.
Técnicas para fabricar anticuerpos multiespecificos incluyen pero no están limitadas a co-expresión recombinante de dos pares de cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina que tienen especificidades diferentes (véase Milstein y Cuello, Nature 305: 537 (1983)), WO 93/08829 y Traunecker et al., EMBO J. 10: 3655 (1991)) e ingeniería de "protuberancia en agujero" (véase, por ejemplo patente estadounidense 5,731,168). Los anticuerpos multiespecíficos pueden también ser elaborados mediante el diseño de efectos de direccionamiento electrostáticos para elaborar moléculas heterodiméricas de Fe de anticuerpo ( O 2009/089004A1) ; reticulación de dos o más anticuerpos o fragmentos (véase, por ejemplo patente estadounidense 4,676,980 y Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)); utilizando cremalleras de leucina para producir anticuerpos bisespecífieos (véase, por ejemplo Kostelny et al., J. Immunol . , 148 (5) : 1547-1553 (1992)); uso de tecnología de "diacuerpo" para fabricar fragmentos de anticuerpo bisespecífieos (véase, por ejemplo, Hollinger et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)) y el uso de dímeros de Fv de una sola cadena (sFv) (véase, por ejemplo Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994)) y preparación de anticuerpos trisespecífieos como se describe por ejemplo en Tutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991) .
Anticuerpos diseñados con tres o más sitios de enlace de antígeno funcionales, incluyendo "anticuerpos pulpo" son también incluidos en la presente (véase, por ejemplo, US 2006/0025576A1) .
El anticuerpo o fragmento en la presente también incluye un "Fab de acción doble" o "DAF" que comprende un sitio de enlace de antígeno que se enlaza a SCDl también otro antígeno diferente (véase, US 2008/0069820, por ejemplo) . 7. Variantes de anticuerpo a) Variantes de glicosilación En ciertas modalidades, el anticuerpo provisto en la presente es alterado para incrementar o disminuir la extensión a la cual el anticuerpo es glicosilado. La adición o cancelación de sitios de glicosilación a un anticuerpo se pueden llevar a cabo convenientemente al alterar la secuencia de aminoácido, de tal manera que uno o más sitios de glicosilación son creados o removidos.
En donde el anticuerpo comprende una región de Fe, el carbohidrato anexado al mismo puede ser alterado. Los anticuerpos naturales producidos por células mamíferas comúnmente comprenden un oligosacárido biantenario ramificado que es en general anexado mediante un enlace N a Asn297 del dominio de CH2 de la región de Fe. Véase, por ejemplo right et al. TIBTECH 15:26-32 (1997). El oligosacárido puede incluir varios carbohidratos, por ejemplo, mañosa, N-acetil glucosamina (GlcNAc) , galactosa y ácido siálico también como una fucosa anexada a un FlcNAc en el "tallo" de la estructura de oligosacárido biantenaria. En algunas modalidades, se pueden hacer modificaciones del oligosacárido en un anticuerpo de la invención con el fin de crear variantes de anticuerpo con ciertas propiedades mejoradas.
En una modalidad, se proveen variantes de anticuerpo que tienen una estructura de carbohidrato que carece de fucosa anexada (directa o indirectamente) a una región Fe. Por ejemplo, la cantidad de fucosa en tal anticuerpo puede ser de 1% a 80%, de 1% a 65%, de 5% a 65% o de 20% a 40%. La cantidad de fucosa es determinada al calcular la cantidad promedio de fucosa dentro de la cadena de azúcar en Asn297, en relación con la suma de todas las glicoestructuras anexadas a Asn 297 (por ejemplo, estructuras complejas, híbridas y de alto contenido de mañosa) tal como se mide mediante espectrometría de masas de MALDI-TOF como se describe en WO 2008/077546, por ejemplo. Asn297 se refiere al residuo de asparagina ubicado a alrededor de la posición 297 en la región de Fe (numeración de EU de residuos de región de Fe) ; sin embargo, Asn297 puede también estar ubicado a alrededor de ± 3 aminoácidos corriente arriba o corriente abajo de la posición 297, esto es, entre posiciones 294 y 300, debido a variaciones de secuencia menores en anticuerpo. Tales variantes de fucosilación pueden tener función de ADCC mejorada. Véase, por ejemplo publicación de patente estadounidense US 2003/0157108 (Presta, L . ) ; US 2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd) . Ejemplos de publicaciones relacionadas con variantes de anticuerpo "desfocusiladas" o "fucosa-deficientes" incluyen: US 2003/0157108; WO ; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO2005/053742 ; WO2002/031140; Okazaki et al. J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki et al., Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004) . Ejemplos de líneas celulares aptas de producir anticuerpos desfucosilados incluyen células CHO Lecl3 deficientes de fucosilación de proteínas (Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys . 249:533-545 (1986); solicitud de patente estadounidense US 2003/0157108 Al, Presta, L y WO 2004/056312 Al, Adams et al., especialmente el ejemplo 11) y líneas celulares nocaut, tal como el gen de alfa-1,6-fucosiltransferasa, FUT8, células CHO de nocaut (véase, por ejemplo, Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004); Kanda, Y. et al., Biotechnol . Bioeng., 94 (4) : 680-688 (2006) y WO2003/085107) .
Variantes de anticuerpo son provistas adicionalmente con oligosacáridos disectados, por ejemplo en los cuales un oligosacárido biantenario anexado a la región de Fe del anticuerpo es dirigido por GlcNAc . Tales variantes de anticuerpo pueden tener fucosilación reducida y/o función de ADCC mejorada. Ejemplos de tales variantes de anticuerpo se describen por ejemplo en WO 2003/011878 (Jean-Mairet et al.); patente estadounidense 6,602,684 (Umana et al. y US 2005/0123546 (Umana et al.), variantes de anticuerpo con por lo menos un residuo de galactosa en el oligosacárido anexado a la región de Fe son también provistas. Tales variantes de anticuerpo pueden tener función de CDC mejorada. Tales variantes de anticuerpo son descritas por ejemplo en WO 1997/30087 (Patel et al.); WO 1998/58964 (Raju, S.) y WO 1999/22764 (Raju, S. ) . b) Variantes de región de Fe En ciertas modalidades, se pueden introducir una o más modificaciones de aminoácido a la región de Fe de un anticuerpo provisto en la presente, generando mediante esto una variante de región de Fe . La variante de región de Fe puede comprender una secuencia de región de Fe humana (por ejemplo, una región de Fe de IgGl, IgG2, IgG3 o IgG4 humana) que comprende una modificación de aminoácido (por ejemplo, sustitución) en una o más posiciones de aminoácido.
En ciertas modalidades, la invención contempla una variante de anticuerpo que posee algunas pero no todas las funciones efectoras, que lo hacen un candidato deseable para aplicaciones en las cuales la vida media del anticuerpo in vivo es importante y todavía ciertas funciones efectoras (tales como complemento y ADCC) son innecesarias o perjudiciales. Ensayos de citotoxicidad in vitro y/o in vivo se pueden llevar a cabo para confirmar la reducción/agotamiento de actividades de CDC y/o ADCC. Por ejemplo, ensayos de enlace de receptor de Fe (FcR) se pueden llevar a cabo para asegurar que el anticuerpo carece de enlace de FcyR de aquí probablemente carece de actividad de ADCC) , pero retiene la habilidad de enlace FcRn. Las células primarias para moderar ADCC, a células NK, expresan Fc_RIII solamente, mientras que los monocitos expresan Fc~RI, Fc~RII y Fc-RIII. La expresión de FcR sobre células hematopoyéticas es resumida en la tabla 3 de la página 464 de Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol . 9:457-492 (1991). Ejemplos no limitantes de ensayo in vitro para determinar la actividad de ADCC de una molécula de interés son descritos en la patente estadounidense 5,500,362 (véase, por ejemplo, Hellstrom, I. et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986)) y Hellstrom, I et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 82:1499-1502 (1985); 5,821,337 (véase, Bruggemann, M. et al., J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987)). Alternativamente, se pueden emplear métodos de ensayos no radioactivos (véase, por ejemplo el ensayo de citotoxicidad no radioactivo de ACTI™ para citometría de flujo (CellTechnology, Inc. Mountain View, CA; y ensayos de citotoxicidad no radioactivo CytoTox 96* (Promega, Madison, WI) . Células efectoras útiles para tales ensayos incluyen células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y células asesinas naturales (NK) . Alternativa o adicionalmente, la actividad de ADCC de la molécula de interés puede ser determinada in vivo, por ejemplo en un modelo de animal tal como aquel revelado en Clynes et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 95:652-656 (1998). Ensayos de enlace de Clq también se pueden llevar a cabo para confirmar que el anticuerpo no es apto de enlace a Clq y de aquí carece de actividad de C3c, véase, por ejemplo ELISA de enlace de Clq y C3c en WO 2006/029879 y WO 2005/100402. Para determinar la activación de complemento, se puede llevar a cabo un ensayo de CDC (véase, por ejemplo Gazzano-Santoro et al . , J. Immunol. Methods 202:163 (1996); Cragg, M.S. et al., Blood 101:1045-1052 (2003) y Cragg, M.S. y M.J. Glennie, Blood 103:2738-2743 (2004)). El enlace de FcRn y determinaciones de despeje/vida media in vivo pueden también ser efectuados utilizando métodos conocidos en el arte (véase, por ejemplo, Petkova, S.B. et al., Int'l. Immunol. 18 (12) : 1759-1769 (2006) ) .
Anticuerpos con función efectora reducida incluyen aquellos con su fusión de un o más residuos de región de Fe 238, 265, 269, 270, 297, 327 y 329 (patente estadounidense 6,737,056). Tales mutantes de Fe incluyen mutantes de Fe con sustituciones en dos o más de las posiciones de aminoácido 265, 269, 270, 297 y 327, incluyendo el llamado mutante de Fe "DANA" con sustitución de residuo 265 y 297 a alanina (patente estadounidense 7,332,581).
Ciertas variantes de anticuerpo con enlace mejorado o disminuido a FcR son descritas. (Véase, por ejemplo patente estadounidense 6,737,056; WO 2004/056312 y Shields et al., J. Biol . Chem. 9(2): 6591-6604 (2001).) En ciertas modalidades, una variante de anticuerpo comprende una región de Fe con una o más sustituciones de aminoácido que mejoran ADCC, por ejemplo, sustituciones en posiciones 298, 333 y/o 334 de la región de Fe (numeración de EU de residuos) . En algunas modalidades, se hacen alteraciones en la región de Fe que dan como resultado enlace de Clq alterada (esto es, ya sea mejorada o disminuida) y/o citotoxicidad dependiente de complemento (CDC) , por ejemplo, como se describe en la patente estadounidense 6,194,551, WO 99/51642 e Idusogie et al. J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000).
Anticuerpos con vidas medias incrementadas y enlace mejorado al receptor de Fe neonatal (FcRn) , que es responsable por la transferencia de IgG maternas al feto (Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) y Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)), son descritos en US2005/0014934A1 (Hinton et al.). Aquellos anticuerpos comprenden una región de Fe con una o más sustituciones en las mismas que mejoran el enlace de la región de Fe a FcRn. Tales variantes de Fe incluyen aquellas con sustituciones en una o más de los residuos de región de Fe: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 o 434, por ejemplo, sustitución del residuo de región de Fe 434 (patente estadounidense 7,371,826). Véase también, Duncan & inter, Nature 322:738-40 (1988); patente estadounidense 5,648,260; patente estadounidense 5,624,821 y WO 94/29351 concernientes con otros ejemplos de variantes de región de Fe .
Variantes de anticuerpo diseñados por cisteina En ciertas modalidades, puede ser deseable crear anticuerpos diseñados de cisteina, por ejemplo "tioMAb," en los cuales uno o más residuos de un anticuerpo son sustituidos con residuos de cisteina. En modalidades particulares, los residuos sustituidos se presentan en sitios accesibles del anticuerpo. Al sustituir aquellos residuos con cisteina, los grupos tiol reactivos son colocados mediante esto en sitios accesibles del anticuerpo y pueden ser usados para el anticuerpo a otras porciones, tales como porciones de fármaco o porciones de enlazador-fármaco, para crear un inmunoconj gado, como se describe adicionalmente en la presente. En ciertas modalidades, cualquiera de uno o más de los siguientes residuos pueden ser sustituidos con cisteina: V205 (numeración de Kabat) de la cadena ligera; A118 (numeración de EU) de la cadena pesada y S400 (numeración de EU) de la región de Fe de cadena pesada. Los anticuerpos diseñados de cisteina pueden ser numerados como se describe, por ejemplo en la patente estadounidense 7,521,541.
Immunoconjugados Se proveen además en la presente i munoconjugados que comprenden un anticuerpo anti-SCDl en la presente conjugados a uno o más agentes citotóxicos, tales como agentes quimioterapéuticos o fármacos, agentes inhibidores del crecimiento, toxinas (por ejemplo, toxinas de proteína, toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fungal, planta o animal o fragmentos de los mismos) o isótopos radioactivos .
En una modalidad, un inmunoconjugado es un conjugado de anticuerpo-fármaco (ADC) en la cual el anticuerpo es conjugado a uno o más fármacos, incluyendo pero no limitado a un maitansinoide (véase, por ejemplo patentes estadounidenses 5,208,020, 5,416,064 y patente europea EP 0 425 235 Bl) ; una auristatina tal como porciones de fármaco de monometilauristatina DE y DF (MMAE y MMAF) (véanse patentes estadounidenses 5,635,483 y 5,780,588 y 7,498,298); a dolastatina; una calicheamicina y derivados de los mismos (véanse patente estadounidenses 5,712,374, 5,714,586, 5,739,116, 5,767,285, 5,770,701, 5,770,710, 5,773,001 y 5,877,296; Hinman et al., Cáncer Res. 53:3336-3342 (1993) y Lode et al., Cáncer Res. 58:2925-2928 (1998)); una antraciclina tal como una daunomicina o doxorubicina (véase Kratz et al., Current Med. Chem. 13:477-523 (2006); Jeffrey et al., Bioorganic & Med. Chem. Letters 16:358-362 (2006); Torgov et al . , Bioconj . Chem. 16:717-721 (2005); Nagy et al . , Proc. Nati. Acad. Sci. USA 97:829-834 (2000); Dubowchik et al., Bioorg. & Med. Chem. Letters 12:1529-1532 (2002); King et al., J. Med. Chem. 45:4336-4343 (2002) y patente estadounidense 6,630,579); metrotexato ; vindesina; un taxano tal como docetaxel, paclitaxel, larotaxel, tesetaxel y ortataxel; a tricoteceno y CC1065.
En otra modalidad, un inmunoconjugado comprende un anticuerpo como se describe en la presente conjugado a una toxina enzimáticamente activa o fragmento de la misma, incluyendo pero no limitado a cadena de difteria A, fragmento activo sin enlace de toxina de difteria, cadena de exotoxina A (de Pseudomonas aeruginosa) , cadena de ricina A, cadena de abrina A, cadena de modecina A, alfa-sarcina, proteínas Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII y PAP-S) , inhibidor de momordica charantia, curcina, crotina, inhibidor de sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina y los tricotecenos .
En otra modalidad, un inmunoconjugado comprende un anticuerpo como se describe en la presente conjugado a un átomo radioactivo para formar un radioconjugado. Una variedad de isótopos radioactivos están disponibles para la producción de radioconjugados . Ejemplos incluyen At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 e isótopos radioactivos de Lu. Cuando el radioconjugado es usado para detección, puede comprender un átomo radioactivo para estudios cintiográficos, por ejemplo te" o I123 o un marcador de espin para imagen de resonancia magnética nuclear (RM ) (también conocida como imagen de resonancia magnética, mri) , tal como yodo-123 otra vez, yodo-131, indio-111, flúor-19, carbono-13, nitrógeno-15 , oxígeno-17, gadolinio, manganeso o hierro.
Los conjugados de un anticuerpo y agente citotóxico pueden ser elaborado utilizando una variedad de agentes de acoplamiento de proteína bifuncionales tales como propionato de propionato de N-succinimidil-3 - (2-piridilditio) (SPDP) , ciclohexano-1-carboxilato de succinimidil-4- (N-maleimidometil) (SMCC) , iminotiolano (IT) , derivados bifuncionales de imidoésteres (tal como adipimidato de dimetilo HC1) , esteres activos (tal como suberato de disuccinimidiol) , aldehidos (tal como glutaraldehído) , compuestos bis-acido (tal como bis (p-acidobenzoil) hexandiamina) , derivados de bis-diazonio (tales como bis- (p-diazoniobenzoil) -etilendiamina) , diisocianatos (tales como 2 , 6-diisocianato de tolueno) y compuestos de flúor bis-activos (tales como 1, 5-difluoro-2 , 4-dinitrobenceno) . Por ejemplo, una inmunotoxina de resina puede ser preparada como se describe en Vitetta et al., Science 238:1098 (1987). El ácido l-isotiocianatobencil-3-metildietilen triaminpentaacético (MX-DTPA) marcado con carbono 14 es un agente quelante ejemplar para conjugación del radionucleótido al anticuerpo. Véase WO94/11026. El enlazador puede ser un "enlazador escindible" que facilita la liberación de un fármaco citotóxico en la célula. Por ejemplo, un enlazador ácido- lábil, enlazador peptidasa- sensible, enlazador foto lábil, enlazador de dimetilo o enlazador que contiene disulfuro (Chari et al., Cáncer Res. 52:127-131 (1992); patente estadounidense 5,208,020) puede ser usado.
Los inmunoconjugados o ADC en la presente contemplan expresamente pero no están limitados a tales conjugados preparados con reactivos de reticulación incluyendo pero no limitados a B PS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, sulfo-EMCS, sulfo-GMBS , sulfo-KMUS, sulfo-MBS, sulfo-SIAB, sulfo-SMCC y sulfo-SMPB y SVSB (succinimidil- (4-vinilsulfona) benzoato) que están disponible comercialmente de (por ejemplo, de Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL. , Estados Unidos de América).
C . Polipéptidos de enlace Los polipéptidos de enlace son polipéptidos que enlazan, de preferencia específicamente a SCD1 como se describe en la presente. En algunas modalidades, los polipéptidos son antagonista de SCD1. Los polipéptidos de enlace pueden ser sintetizados químicamente utilizando metodología de síntesis de polipéptidos conocidos o pueden ser preparados y purificados utilizando tecnología recombinante . Los polipéptidos de enlace son usualmente de por lo menos alrededor de 5 aminoácidos de longitud, alternativamente por lo menos alrededor de 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 aminoácidos de longitud o más, en donde tales polipéptidos de enlace que son aptos de enlace, de preferencia específicamente a un objetivo, SCD1, como se describe en la presente. Los polipéptidos de enlace pueden ser identificados sin experimentación indebida utilizando técnicas bien conocidas. A este respecto, se notará que técnicas para seleccionar bibliotecas de polipéptido en cuanto a polipéptidos de enlace que son aptos de enlazarse específicamente aun objetivo de polipéptido son bien conocidas en el arte (véanse, por ejemplo patentes estadounidenses 5,556,762, 5,750,373, 4,708,871, 4,833,092, 5,223,409, 5,403,484, 5,571,689, 5,663,143; publicación de PCT WO 84/03506 y WO84/03564; Geysen et al., Proc . Nati. Acad. Sci. U.S.A., 81:3998-4002 (1984); Geysen et al., Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A., 82:178-182 (1985); Geysen et al., in Synthetic Peptides as Antigens, 130-149 (1986) ; Geysen et al., J. Immunol. Meth^, 102:259-274 (1987); Schoofs et al . , J. Immunol^, 140:611-616 (1988), Cwirla, S. E. et al . (1990) Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 87:6378; Lowman, H.B. et al. (1991) Biochemistry, 30:10832; Clackson, T. et al . (1991) Nature, 352: 624; Marks, J. D . et al . (1991), J. Mol. Biol . , 222:581; Kang, A.S. et al . (1991) Proc . Nati . Acad. Sci . USA, 88:8363 y Smith, G. P. (1991) Current Opin. Biotechnol . , 2 : 668) .
A este respecto, el despliegue de bacteriófago (fago) es una técnica bien conocida que permite seleccionar bibliotecas de polipéptidos grandes para identificar miembro (s) de aquellas bibliotecas que son aptos de enlazarse específicamente a un polipéptido objetivo, SCD1. El despliegue de fago es una técnica mediante la cual polipéptidos variantes son desplegados como proteínas de fusión a la proteína de recubrimiento sobre la superficie de partículas de bacteriófago (Scott, J.K. y Smith, G. P. (1990) Science, 249: 386). La utilidad del despliegue de fago radica en el hecho de que bibliotecas grandes de variantes de proteína aleatorizadas selectivamente (o cADN clonados aleatoriamente) pueden ser clasificados rápida y eficientemente en cuanto a aquellas secuencias que se enlazan a una molécula objetivo con alta afinidad. El despliegue de bibliotecas polipéptido (Cwirla, S. E. et al. (1990) Proc.
Nati. Acad. Sci. USA, 87:6378) o proteína (Lowman, H.B. et al. (1991) Biochemistry, 30:10832; Clackson, T. et al. (1991) Nature, 352: 624; Marks, J. D. et al. (1991), J. Mol. Biol . , 222:581; Kang, A.S. et al. (1991) Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 88:8363) sobre fago se han usado para seleccionar millones de polipéptidos u oligo polipéptidos en cuanto a aquellos con propiedades de enlace específicas (Smith, G. P. (1991) Current Opin. Biotechnol . , 2:668). La clasificación de bibliotecas de fago de mutantes aleatorios requiere una estrategia para construir y propagar un gran número de variantes, un procedimiento para purificación por afinidad utilizando el receptor objetivo y medios para evaluar resultados de enriquecimientos de enlace. Patentes estadounidense 5, 223,409, 5, 403,484, 5, 571,689 y 5, 663,143.
Aunque la mayoría de los métodos de despliegue de fago han usado fago filamentoso, sistemas de despliegue de fago lamboides (WO 95/34683; U.S. 5,627,024), sistemas de despliegue de fago T4 (Ren et al., Gene, 215: 439 (1998); Zhu et al., Cáncer Research, 58(15): 3209-3214 (1998); Jiang et al., Infection & Immunity, 65(11): 4770-4777 (1997); Ren et al., Gene, 195 (2) :303-311 (1997); Ren, Protein Sci., 5: 1833 (1996); Efimov et al., Virus Genes, 10: 173 (1995)) y sistemas de despliegue de fago T7 (Smith y Scott, Methods in Enzymology, 217: 228-257 (1993); U.S. 5,766,905) son también conocidos .
Mejoras adicionales realzan la habilidad de los sistemas de despliegue para seleccionar bibliotecas de péptido en cuanto a enlace moléculas objetivo seleccionado y mostrar proteínas funcionales con el potencial de seleccionar estas proteínas en cuanto a propiedades deseadas. Dispositivos de reacción combinatorial para reacciones de despliegue de fago han sido desarrollados (WO 98/14277) y las bibliotecas de despliegue de fago han sido usadas para analizar y controlar interacciones biomoleculares (WO 98/20169; WO 98/20159) y propiedades de los péptidos helicoidales restringidos (WO 98/20036) . WO 97/35196 describe un método para aislar un ligando de afinidad en el cual una biblioteca de despliegue de fago es puesta en contacto con una solución en la cual el ligando se enlazará a una molécula objetivo y una segunda solución en la cual el ligando de afinidad no se enlazará a la molécula objetivo, para aislar selectivamente ligandos de enlace. WO 97/46251 describe un método de bio toma panorámica de una biblioteca de despliegue de fago aleatoria con un anticuerpo purificado por afinidad y luego aislar el fago de enlace, seguido por un proceso de micro toma panorámica utilizando cavidades de micro placa para aislar el fago de enlace de alta afinidad. El uso de proteína A de Staphlylococcus aureus como una etiqueta de afinidad también se ha reportado (Li et al. (1998) Mol Biotech. , 9:187). WO 97/47314 describe el uso de bibliotecas de sustracción de sustrato para distinguir especificidades de enzima utilizando una biblioteca combinatorial que puede ser una biblioteca de despliegue de fago. Un método para seleccionar enzimas apropiadas para uso en detergentes utilizando el despliegue de fago es descrito en WO 97/09446. Métodos adicionales para seleccionar proteínas de enlace especifican son descritos en las patentes estadounidenses 5,498,538, 5,432,018 y WO 98/15833.
Métodos para generar bibliotecas de péptidos y seleccionar estas bibliotecas son también revelados en las patentes estadounidenses 5,723,286, 5,432,018, 5,580,717, 5,427,908, 5,498,530, 5,770,434, 5,734,018, 5,698,426, 5,763,192 y 5,723,323.
D . Moléculas de enlace pequeñas Se proveen en la presente moléculas pequeñas de enlace para uso como antagonistas de molécula pequeña de SCDl .
Moléculas pequeñas de enlace son preferiblemente moléculas orgánicas diferentes de polipéptidos de enlace o anticuerpos como se definen en la presente que se enlazan, de preferencia específicamente, a SCDl como se describe en la presente. Moléculas pequeñas orgánicas de enlace pueden ser identificadas y sintetizadas químicamente utilizando metodología conocida (véanse, por ejemplo publicaciones de PCT WO 00/00823 y O 00/39585) . Las moléculas pequeñas orgánicas de enlace son usualmente menores de alrededor de 2000 Dalton en tamaño, alternativamente menos de alrededor 1500, 750, 500, 250 o 200 Dalton de tamaño, en donde tales moléculas pequeñas orgánicas que son aptas de enlace, de preferencia específicamente, a un polipéptido como se describe en la presente pueden ser identificadas sin experimentación indebida utilizando técnicas bien conocidas. A este respecto, se notará que técnicas para seleccionar bibliotecas de moléculas pequeñas orgánicas en cuanto a moléculas que son aptas de enlace a un objetivo de polipéptido son bien conocidas en el arte (véanse, por ejemplo publicaciones de PCT WO00/00823 y WO00/39585) . Las moléculas pequeñas orgánicas de enlace pueden ser, por ejemplo, aldehidos, cetonas, oximas, hidrazonas, semicarbazonas, carbazidas, aminas primarias, aminas secundarias, aminas terciarias, hidrazinas N-sustituidas , hidrazidas, alcoholes, éteres, tioles, tioéteres, disulfuros, ácidos carboxílieos , ésteres, amidas, ureas, carbamatos, carbonatos, cetales, tiocetales, acétales, tioacetales, haluros de arilo, aril sulfonatos, haluros de alquilo, alquilo sulfonatos, compuestos aromáticos, compuestos heterocíclicos, anilinas, alquenos, alquinos, dioles, amino alcoholes, oxazolidinas , oxazolinas, tiazolidinas , tiazolinas, enaminas, sulfonamidas, epóxidos, aziridinas, isocianatos, cloruros de sulfonilo, compuestos diazo, cloruros de ácido o los semejantes.
En algunas modalidades, el antagonista de molécula pequeña de SCD1 es un compuesto descrito en O 2005/011655 y/o US 2005/0119251, que son incorporados en la presente por referencia en su totalidad. En algunas modalidades, el antagonista de molécula pequeña de SCD1 es un compuesto de formula (I) : en donde: x y y son cada independientemente 1 , 2 o 3 ; W es -C(0)N(R1) -; -C(0)N[C(0)Rla] -, -N (R1) C (O) N (R1) - O N(R1)C(0)-; V es -C(O)-, -C(S)-, o -C(R10)H; cada R1 es seleccionado independientemente del grupo que consiste de hidrógeno; C!-C6 alquilo opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionado del grupo que consiste de halo, metilo o trifluorometilo y C2-C6alquiloo opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionado del grupo que consiste de metoxi e hidroxilo; Rla es seleccionado del grupo que consiste de hidrógeno, Cx-C6 alquilo y cicloalquilo; R2 es seleccionado del grupo que consiste de C!-C12 alquilo, C2-Ci2alquenil, C2-Ci2hidroxialquilo, C2-C12 hidroxialquenilo, Ci-Ci2 alcoxi, C2-Ci2 alcoxialquilo, C3-Ci2cicloalquilo; C4-Ci2cicloalquiloalquilo, arilo, C7-C12 aralquilo, C3-Ci2 heterociclilo, C3-Ci2heterociclilalquilo, Ci-Ci2 heteroarilo y C3-Ci2 heteroarilalquilo o R2 es una estructura de múltiples anillos que tiene 2 a 4 anillos, en donde los anillos son seleccionados independientemente del grupo que consiste de cicloalquilo, heterociclilo, arilo y heteroarilo y en donde algunos o todos los anillos pueden estar fusionados entre sí; R3 es seleccionado del grupo que consiste de Ci-Ci2 alquilo, C2-Ci2 alquenilo, C2-Ci2 hidroxialquilo, C2-Ci2 hidroxialquenilo, C!-C12 alcoxi, C2-Ci2 alcoxialquilo, C3-Ci2 cicloalquilo, C -Ci2 cicloalquilalquilo, arilo, C7-C12 aralquilo, C3-Ci2 heterociclilo, C3-Ci2 heterociclilalquilo, Ci-Ci2 heteroarilo y C3-Ci2 heteroarilalquilo o R3 es una estructura de múltiples anillos que tiene 2 a 4 anillos, en donde los anillos son seleccionados independientemente del grupo que consiste de cicloalquilo, heterociclilo, arilo y heteroarilo y en donde algunos todos los anillos pueden estar fusionados entre sí; R4 y R5 son cada uno seleccionados independientemente de hidrógeno, fluoro, cloro, metilo, metoxi, trifluorometil , ciano, nitro o -N(R12)2; R6, R6a, R7, R7a, R8, R8a, R9 y R9a son cada uno seleccionados independientemente de hidrógeno o Ci-C3 alquilo o R6 y R6a conjuntamente3 o R7 y R7a conjuntamente o R8 y R8a conjuntamente, o R9 y R9 conjuntamente son un grupo oxo, a condición de que cuando V es -C(0)-, R7 y R7a conjuntamente o R8 y R8a conjuntamente no forman un grupo oxo, en tanto que los restantes R6 , R6a, R7, R7a, R8, R8a, R9 y R9a son cada uno seleccionados independientemente de hidrógeno o C1-C3 alquilo o uno de R6 , R6a, R7 y R7a conjuntamente con uno de R8, R8a, R9 y R9a forman un puente de alquileno, en tanto que los restantes R6, R6a, R7, R7a, R8 , R8a, R9 y R9a son cada uno seleccionados independientemente de hidrógeno o C1-C3 alquilo; R10 es hidrógeno o C3.-C3 alquilo y cada R12 es seleccionado independientemente de hidrógeno o Ci-C6 alquilo; un estereoisómero, enantiómero o tautómero del mismo, una sal aceptable farmacéuticamente del mismo, una composición farmacéutica del mismo o un profármaco del mismo. algunas modalidades, el antagonista de molécula pequeña de SCD1 es un compuesto de formula (II) : en donde: x y y son cada uno independientemente 1, 2 o 3; W es seleccionado de -ClOjNfR1)- y -N(R1) C (O) - ; cada R1 es seleccionado independientemente del grupo que consiste de hidrógeno; Ci-C6 alquilo opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionado del grupo que consiste de halo, metilo o trifluorometilo y C2-C6 alquilo opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionado del grupo que consiste de metoxi e hidroxi; R2 es seleccionado del grupo que consiste de C-Ci2 alquilo, C3-C12 alquenilo, C7-C12 hidroxialquilo, C2-Ci2 alcoxialquilo, C3-Ci2 hidroxialquenilo, C3-C12 cicloalquilo, C4-Ci2 cicloalquilalquilo, C13-C19 aralquilo, C3-Ci2 heterociclilalquilo y C3-Ci2 heteroarilalquilo o R2 es una estructura de múltiples anillos que tiene 2 a 4 anillos, en donde los anillos son seleccionados independientemente del grupo que consiste de cicloalquilo, heterociclilo, arilo y heteroarilo, en donde algunos o todos los anillos pueden estar fusionados entre sí; R3 es seleccionado del grupo que consiste de C3-Ci2 alquilo, C3-C12 alquenilo, C3-Ci2 hidroxialquilo, C3-C12 hidroxialquenilo, C3-C12 alcoxi, C3-Ci2 alcoxialquilo, C3-Ci2 cicloalquilo, C4-Ci2 cicloalquilalquilo, arilo, C7-Ci2 aralquilo, C3- Ci2heterociclilo C3-Ci2 heterociclilalquilo, C5-C12 heteroarilo y C3-Cx 2 heteroarilalquilo o R3 es una estructura de múltiples anillos que tiene 2 a 4 anillos, en donde los anillos son seleccionados independientemente del grupo que consiste de cicloalquilo, heterociclilo, arilo y heteroarilo y en donde alguno o todos los anillos pueden estar fusionados entre sí; R4 y R5 son cada uno seleccionados independientemente de hidrógeno, fluoro, cloro, metilo, metoxi y trifluorometilo y R6, R6a, R7, R7a, R8, R8a, R9 y R9a son cada uno seleccionados independientemente de hidrógeno o C3.-C3 alquilo o R6 y R6a conjuntamente o R7 y R7a conjuntamente o R8 y R8a conjuntamente o R9 y R9a conjuntamente son un grupo oxo, a condición que cuando V es -C(0)-, R7 y R7a conjuntamente o R8 y R8a conjuntamente no forman un grupo oxo, en tanto que los restantes R6, R6a, R7, R7a, R8, R8a, R9 y R9a son cada uno seleccionados independientemente de hidrógeno o C1-C3 alquilo o uno de Rs, R6a, R7 y R7a conjuntamente con uno de R8, R8a, R9 y R9a forman un puente de alquileno, en tanto que los restantes R6, R6a, R7, R7a, R8, R8a, R9 y R9a son cada uno seleccionados independientemente de hidrógeno o C1-C3 alquilo; incluyendo un estereoisómero, enantiómero o tautómero del mismo, una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos, una composición farmacéutica de los mismos o un profármaco de los mismos.
En algunas modalidades, el antagonista de molécula pequeña de SCDl es un compuesto de formula (III) : en donde: x y y son cada uno independientemente 1, 2 o 3; A es oxígeno o azufre; W es seleccionado de -CÍOJNÍR1 )- y -N(RX )C(0)-; cada R1 es seleccionado independientemente del grupo que consiste de hidrógeno; Ci-C6 alquilo opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste de halo, metilo o trifluorometilo y C2-C6 alquilo opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionado del grupo que consiste de metoxi e hidroxi; R2 es seleccionado del grupo que consiste de C1-C12 alquilo, C2-C12 alquenilo, C2-Ci2 hidroxialquilo, C2-C12 hidroxialquenilo, Ci-Cg alcoxi, C3-C12 alcoxialquilo, C3-Ci2cicloalquilo, C4-C12 cicloalquilalquilo, arilo, C7-C12 aralquilo, C3-C12 heterociclilo, C3-Ci2heterociclilalquilo, C C12heteroarilo y C3-Ci2heteroariloalquilo o R2 es una estructura de múltiples anillos que tiene 2 a 4 anillos, en donde los anillos son seleccionados independientemente del grupo que consiste de cicloalquilo, heterociclilo, arilo y heteroarilo, en donde algunos o todos los anillos pueden estar fusionados entre sí; R3 es fenilo opcionalmente sustituido por uno o más sustituyentes seleccionado del grupo que consiste de halo, ciano, nitro, hidroxi, Cx- alquilo, Ci-C6 trihaloalquilo, Ci-C6 trihaloalcoxi Ci-C6 alquilosulfonilo, -N(R11)2, -OCÍOR11, -CÍOOR11, -S (0)2N(R11)2í cicloalquilo, heterociclilo, heteroarilo y heteroarilcicloalquilo, a condición de que R3 no es fenilo sustituido con tienilo opcionalmente sustituido; R4 y R5 son cada uno seleccionados independientemente de hidrógeno, fluoro, cloro, metilo, metoxi y trifluorometilo; R6, R6a, R7. R7a, R8, R8a, R9 y R9a son cada uno seleccionados independientemente de hidrógeno o C1-C3 alquilo o Rs y R6a conj •untamente o R7 y R7a conj¦untamente o Rfi y Rfia conj¦untamente o R9 y R9a conjuntamente son un grupo oxo, a condición de que cuando V es -C(0)-, R7 y R7a conjuntamente o R8 y R3 conjuntamente no forman un grupo oxo, en tanto que los restantes R6, R6a, R7, R7a, R8, R8a, R9 y R9a son cada uno seleccionados independientemente de hidrógeno o Cx-C3 alquilo o uno de R6, R6a, R7 y R7a conjuntamente con uno de R8, R8a, R9 y R9a forman un puente de alquileno, en tanto que los restantes R6, R6a, R7, R7a, R8, R8a, R9 y R9a son cada uno seleccionados independientemente de hidrógeno o Ci-C3 alquilo y cada R11 es seleccionado independientemente de hidrógeno, Ci-C6 alquilo, C3-C6 cicloalquilo, arilo o aralquilo; incluyendo un estereoisómero, enantiómero o tautómero del mismo, una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, una composición farmacéutica del mismo o un profármaco del mismo.
En algunas modalidades, el antagonista de molécula pequeña de SCD1 es un compuesto de fórmula (IV) : en donde : x e y son cada uno independientemente 1, 2 o 3; cada R1 es seleccionado independientemente del grupo que consiste de hidrógeno; Ci-C6 alquilo opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste de halo, metilo o trifluorometilo y C2- C6 alquilo opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste de metoxi e hidroxi; R2 es seleccionado del grupo que consiste de C1-C12 alquilo, C2-C12 alquenilo, C2-Ci2 hidroxialquilo, C2-C12 hidroxialquenilo, C2-C12 alcoxialquilo, C3-Ci2 cicloalquilo, C4-C12 cicloalquilalquilo, C3-C12 heterociclilo, C3-C12 heterociclilalquilo, arilo, C7-Ci2 aralquilo, C1-C12 heteroarilo Y C3-Ci2 heteroarilalquilo o R2 es una estructura de múltiples anillos que tiene 2 a 4 anillos, en donde los anillos son seleccionados independientemente del grupo que consiste de cicloalquilo, heterociclilo, arilo y heteroarilo y en donde algunos o todos los anillos pueden estar fusionados entre sí; R3 es seleccionado del grupo que consiste de C1-C12 alquilo, C2-Ci2 alquenilo, C2-Ci2 hidroxialquilo, C2-Ci2 hidroxialquenilo, Ci-C12 alcoxi, C2-Ci2 alcoxialquilo, C3-Ci2 cicloalquilo, C4-Ci2 cicloalquilalquilo, arilo, C7-C12aralquilo, C3-C12 heterociclilo, C3-C12 heterociclilalquilo, Cx-C^ heteroarilo y C3-C12 heteroarilalquilo o R3 es una estructura de múltiples anillos que tiene 2 a 4 anillos, en donde los anillos son seleccionados independientemente del grupo que consiste de cicloalquilo, heterociclilo, arilo y heteroarilo y en donde algunos o todos los anillos pueden estar fusionados entre si; R4 y R5 son cada uno seleccionados independientemente de hidrógeno, fluoro, cloro, metilo, metoxi y trifluorometilo y R6, RÉa, R7, R7a, R8, R8a, R9 y R9a son cada uno seleccionados independientemente de hidrógeno o C1-C3 alquilo o R6 y R6a conjuntamente o R7 y R7a conjuntamente, o R8 nd R8a conjuntamente o R y R conjuntamente son un grupo oxo, a condición de que cuando V es -C(0)-, R7 y R7a conjuntamente o R8 y R8a conjuntamente no forman un grupo oxo, en tanto que los restantes Rs, R6a, R7, R7a, R8, R8a, R9 y R9a son cada uno seleccionados independientemente de hidrógeno o Ci-C3 alquilo o uno de R6, R6a, R7 y R7a conjuntamente con uno de R8, R8a, R9 y R9a forman un puente de alquileno, en tanto que los restantes R6 , R6a, R7, R7a, R8, R8a, R9 y R9 son cada uno seleccionados independientemente de hidrógeno o Ci-C3 alquilo; a estereoisómero, enantiómero o tautómero de los mismos, una sal farmacéuticamente aceptable de los mismo, una composición farmacéutica de los mismos o un profármaco de los mismos.
En algunas modalidades, el antagonista de molécula pequeña de SCD1 es un compuesto de fórmula (Va) : en donde: x e y son cada uno independientemente 1, 2 o 3; W es -CÍOjNfR1) - ; -N (R1) C (O) N (R1) - O -N (R1) C (O) - ; cada R1 es seleccionado independientemente del grupo que consiste de hidrógeno; CrC6 alquilo opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste de halo, metilo o trifluorometilo y C2-C6 alquilo opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste de metoxi e hidroxi; R2 es seleccionado del grupo que consiste de C7-Ci2 alquilo, C2-C12 alquenilo, C7-Ci2 hidroxialquilo, C2-C12 hidroxialquenilo, C1-C12 alcoxi, C2-Ci2alcoxialquilo, C3-Ci2 cicloalquilo, C1-C12 cicloalquilalquilo, C13-C19 aralquilo, Ci-Ci2 heterociclilo, C3-C12 heterociclilalquilo, C1-C12 heteroarilo y C3-C12 heteroarilalquilo; R3 es seleccionado del grupo que consiste de Ci-Ci2 alquilo, C2-Ci2 alquenilo, C2-Ci2 hidroxialquilo, C2-Ci2 hidroxialquenilo, Cx-C^ alcoxi, C2-Ci2 alcoxialquilo, C3-Ci2 cicloalquilo, C4-Ci2 cicloalquilalquilo, arilo, C7-Ci2aralquilo, C3-C12 heterociclilo, C3-C12 heterociclilalquilo, C1-C12 heteroarilo y C3-Ci2 heteroarilalquilo; R4 y R5 son cada uno seleccionados independientemente de hidrógeno, fluoro, cloro, metilo, metoxi, trifluorometilo, ciano, nitro o -N(R 2)2; R6 , R6a, R7, R7a, R8, R8a, R9 y R9a son cada uno seleccionados independientemente de hidrógeno o C1-C3 alquilo o R6 y R6a conjuntamente o R7 y R7a con untamente, o R8 y R8a conjuntamente o R9 y R9a conjuntamente son un grupo oxo, a condición de que cuando V es -C(0)-, R7 y R7a conjuntamente o R8 y R8a conjuntamente no forman un grupo oxo, en tanto que los restantes R6, R6a, R7, R7a, R8, R8a, R9 y R9 son cada uno seleccionados independientemente de hidrógeno o C1-C3 alquilo o uno de Re, R6a, R7 y R7a conjuntamente con uno de R8, R8a, R9 y R9a forman un puente de alquileno, en tanto que los restantes R6, R6a, R7, R7a, R8, R8a, R9 y R9a son cada uno seleccionados independientemente de hidrógeno o C1-C3 alquilo; R10 es hidrógeno o C1-C3 alquilo y cada R12 es seleccionado independientemente de hidrógeno o Ci-C6 alquilo; a condición de que, sin embargo, R2 no puede ser pirazinilo, piridinonilo, pirrolidinonilo o imidazolilo; un estereoisómero, enantiómero o tautómero de los mismos, una sal farmacéuticamente aceptable de los mismo, una composición farmacéutica de los mismos o un profármaco de los mismos.
En algunas modalidades, el antagonista de molécula pequeña de SCD1 es un compuesto de fórmula (Vb) : en donde: x e y son cada uno independientemente 1 , 2 o 3; W es -C(0)N(R1)-; -N (R1) C (0) N (R1) - o -N (R1) C (O) - ; cada R1 es seleccionado independientemente del grupo que consiste de hidrógeno; C!-C6 alquilo opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste de halo, metilo o trifluorometilo y C2-C6 alquilo opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste de metoxi e hidroxi; R2 es seleccionado del grupo que consiste de Ci-Ci2 alquilo, C2-C12 alquenilo, C2-C12 hidroxialquilo, C2-Ci2 hidroxialquenilo, Ci-Ci2 alcoxi, C2-Ci2 alcoxialquilo, C3-Ci2 cicloalquilo, C4-C12 cicloalquilalquilo, arilo, C7-Ci2 aralquilo, C3-Ci2 heterociclilo, C3-C12 heterociclilalquilo, Ci-Ci2 heteroarilo y C3-Ci2 heteroarilalquilo; R3 es seleccionado del grupo que consiste de C7-C12 alquilo, C2-C12 alquenilo, C2-C12 hidroxialquilo, C2-Ci2 hidroxialquenilo, Ci-C12 aleOXl O 2-Ci2 alcoxialquilo; R4 y R5 son cada uno seleccionados independientemente de hidrógeno, fluoro, cloro, metilo, metoxi, trifluorometilo, ciano, nitro o -N(R12)2; R6, R6a, R7, R7a, R8, R8a, R9 y R9a son cada uno seleccionados independientemente de hidrógeno o Ci-C3 alquilo o R6 y R6a conjuntamente o R7 y R7a conjuntamente o R8 y R8a conjuntamente o R9 y R9a conjuntamente son un grupo oxo, a condición de que cuando V es -C(O)-, R7 y R7a conjuntamente o R8 y R8a conjuntamente no forman un grupo oxo, en tanto que los restantes R6, R6a, R7, R7a, R8, R8a, R9 y R9a son cada uno seleccionados independientemente de hidrógeno o Ci-C3-alquilo o uno de R6, R5a, R7 y R7a conjuntamente con uno de R8, R8a, R9 y R9a forman un puente de alquileno, en tanto que los restantes R6 , R6a, R7, R7a, R8, R8a, R9 y R9a son cada uno seleccionados independientemente de hidrógeno o C1-C3 alquilo,-R10 es hidrógeno o C1-C3 alquilo y cada R12 es seleccionado independientemente de hidrógeno o C!-C6 alquilo; como un estereoisómero, enantiómero o tautómero de los mismos, una sal farmacéuticamente aceptable de los mismo, una composición farmacéutica de los mismos o un profármaco de los mismos.
En algunas modalidades, la molécula pequeña de antagonista de SCDl es una molécula pequeña de antagonista de SCDl descrita en US20050119251, WO2006014168, WO2006034441 , WO2006034312, WO2006034315, WO200612519 , WO2007046868 , O2007050124, WO2O06034279, WO2006034338 , WO2006125181 , WO2007044085, WO2007046867 , WO20O6034341 , WO2006101521 , WO2006125179, WO2006034440 , WO2006034446 , O2006125178 , WO2006125180, WO2007136746 , WO2007130075 , O2007143597 , WO2008024390, WO2008036715 , WO2008074835 , WO2008127349 , que son incorporadas en la presente por referencia en su totalidad.
En algunas modalidades, el antagonista de molécula pequeña de SCDl comprende una piridazina/piridina central sustituida por piperazina benzamida funcionalizada en un extremo y una carboxamida en el otro extremo. En algunas modalidades, el antagonista de molécula pequeña de SCDl es el compuesto 1. En algunas modalidades, el antagonista de 2 mSCD1 IO,.,= 100 nM (US2OO5/0119261} En algunas modalidades, el núcleo de piridazina/piridina ha sido reemplazado con otros anillos monocíclicos y biciclos, incluyendo pirimidina (ambos regioisómeros) y pirazina, piridinona, anillo de fenilo, imidazolpiridazina y bencidimidazol, como se muestra a continuación.
En algunas modalidades, el anillo de heteroarilo de seis miembros puede ser reemplazado con los anillos de cinco miembros, tales como as [1, 2 , 4] tiadiazol, pirazol y tiazol como subrogados de piridazina. En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl es el compuesto 3. En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl es el compuesto 4. En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl es el compuesto 5.
En algunas modalidades, el anillo de piridazina es cambiado a una estructura de amidina acíclica. En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl es el compuesto 6. En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl es un derivado de tiazolidindiona piperidina no aromático. En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl es el compuesto 7. En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl es tetrahidro-1, 6-naftiridina fusionada. En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl es tetrahidrofuro [2, 3-] piridina. En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl es el compuesto 8. En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl es el compuesto 9.
En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl comprende una piperazina benzamida. En algunas modalidades, la piperazina benzamida es modificada a una piperidina benzamida. En algunas modalidades, la piperazina benzamida es modificada a una anilina piperidina (nitrógeno en el otro lado) y una 3-azabiciclo [3.1.0] hexan-5-amina bicíclica. En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl comprende un enlazador de doble enlace entre piperidina y anillo de fenilo. En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl es la piperazina modificada a ciclohexano o tetrahidro pirimidina. En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl comprende un dominio mostrado a continuación.
En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl comprende un enlazador, tal como oxígeno, grupo amino y/o carbonilo, insertado entre la piradizina y el anillo de piperidina. En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl es el compuesto 10. En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl es un derivado de heteroarilpiperazina conectado directamente. En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl es el compuesto 11. En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl es un inhibidor de SCDl tricíclico. En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl es el compuesto 12. 12 En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl es una imidazolina. En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl es un oxadiazol (tres regioisómeros diferentes) . En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl es imidazopiridina . En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl es urea cíclica. En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl comprende un dominio mostrado a continuación.
En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl es carboxamida movida a un arreglo 1,4 a un arreglo 1,3 sobre la plantilla de pirimidina. En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl es el compuesto 13. En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl es la oxazepinona fusionada tricíclica En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl es el compuesto 14. En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl es ciclizada al anillo de fenilo para generar un tipo ftalimida. En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl es el compuesto 15. En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl es un macrociclo que se cicliza en ambos extremos el compuesto. En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl es el compuesto 16. 15 16 En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl es tiazol carboxamida. En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl es el compuesto 17. En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl es un derivado de 2-oxopiridin-l (2H) -il tiazol carboxamida. En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl es el compuesto 18. En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl tiene un valor de IC50 de 50 nM. En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl es el compuesto 19. En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl tiene un valor de IC50 de 30 nM.
En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl es un derivado 2- (pirazin-2-il) -tiazol . En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl un derivado 2- (lH-pirazol-3-il) -tiazol . En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl es el compuesto 21. En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl tiene un valor de IC50 de 42 nM. En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl es el compuesto 22. En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl tiene un valor IC50 de 49 nM. En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl es una tiazolil pirrolidinona e inhibidor de SCDl a base de piperidinona . En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl es un inhibidor de SCDl a base triazolil tiazol. En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl es el compuesto 22. En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl tiene un valor IC50 de 120 nM. En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl es el compuesto 23. En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl tiene un valor IC50 de 10 nM. En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl es una dihidroimidazolinona. En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl es una imidazolidinona . En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl es el compuesto 26. En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl es el compuesto 27.
En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl es una molécula pequeña antagonista de SCDl descrita en WO2006130986, WO2007009236 , WO2007056846 , WO2008017161 WO2008141455, WO2007134457 , WO2007143823 , WO2007143824 , O2008046226, WO2008064474 , y/o WO2008128335 , que son incorporadas por referencia en su totalidad. En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl es un derivado de azaciclohexano .
En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl es un compuesto de tiazolil oxadiazol . En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl es el compuesto 26. En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl es el compuesto 27.
En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl es un derivado de piridazina con diferentes bioisoésteres de carboxamida. En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl es el compuesto 28. En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl es el compuesto 29.
En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl es un compuesto con heteroarilos bicíclicos fusionados. En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl es una tiazolopirimidinona con heteroarilos bicíclicos fusionados. En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl es una tiazoloprimidina con heteroarilos bicíclicos fusionados. En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl es una purina con heteroarilos bicíclicos fusionados. En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl es lH-imidazo [4 , 5-c] piridin-4-amina (por ejemplo, que reemplaza el núcleo de piridazina) con heteroarilos bicíclicos fusionados. En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl es el compuesto 30. En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl es el compuesto 31. En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl es el compuesto 32. En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl es el compuesto 33.
En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl es bicíclica. En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl es el compuesto 34. En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl es el compuesto 35. En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl comprende un anillo de piridazina. En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl no comprende un anillo de piridazina. En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl es el compuesto 36. En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl es el compuesto 37.
En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl comprende una piperidina de seis miembros. En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl comprende una azetidina de cuatro miembros . En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl es el compuesto 38. En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl es el compuesto 39.
En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl comprende un anillo de pirrolidina de cinco miembros. En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl es el compuesto 40. En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl es el compuesto 41. En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl es el compuesto 42. 42 En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl es el compuesto 43. En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl es el compuesto 44. En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl comprende un ácido tetrazol acético. En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl comprende un ácido tetrazol acético que comprende además una porción alifática. En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl es el compuesto 45. En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl es el compuesto 46.
En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl es un molécula pequeña antagonista de SCD1 descrita en Liu G. et al., J Med Chem (2007) ; 50 : 3086-100 , Zhao H. et al., Bioorg Med Chem Lett (2007) ; 17 : 3388-91, Xin Z. et al., Bioorg Med Chem Lett (2008) ; 18 : 4298-302 y/o Liu G. Stearoyl-CoA desaturase-1 (SCDl) Inhibítors: Discovery and in vivo evaluation. Emerging Targets for Type 2 Diabetes Symposium, The 233th ACS National Meeting, Chicago, IL, Marzo 2007, MEDI-382, que son incorporadas por referencia en su totalidad. En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl es el compuesto 46. En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl está biodisponible oralmente. En algunas modalidades, la molécula pequeña de antagonista tiene valores de IC50 de 4.5 y 26 nM en ratón y humanos, respectivamente. En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl inhibe la desaturación del ácido graso-CoA de cadena larga en células HepG2 con un valor de IC50 de 6.8 nM tal como es medido mediante [13C] -C16 : 1/ [13C] -C16 : 0. En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl tiene una PK in vivo de (CL = 0.28 (1 h)/kg, Vss = 0.71 1/kg, AUC = 10.66 h) /mi and F = 59%).
En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl comprende una glicina amida piridina. En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl es el compuesto 48. En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl inhibe SCDl humano con un valor de IC50 de 90 nM. En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl es un compuesto de pirazina. En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl es el compuesto 49. En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl tiene un valor de IC50 de 37 nM contra SCDl humano .
En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl es un piperidina urea. En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl es el compuesto 50. En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl tiene un IC50 < 4 nM versus mSCDl, 37 nM versus hSCDl) y propiedades de PK (CL = 0.4 (1 h) /kg, Vss = 0.4 1/kg, oral AUC = 13.3 (ug h) /mi, oral F = 102%).
En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl es una molécula pequeña antagonista de SCDl descrita en WO2008123891, WO2008043087 , O2008127615 , y/o Koltun DO et al. inhibidores de estearoil-CoA desaturasa (SCD) potentes, selectivos y metabólicamente estables para el tratamiento potencial de obesidad y diabetes. The 236th ACS National Meeting, Filadelfia, PA, agosto de 2008, MEDI-198, que son incorporadas por referencia en su totalidad. En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl es un derivado de pteridinona. En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl es un derivado de pteridinona que comprende una modificación sistemática de la plantilla del núcleo que conduce a mejora tanto en potencia como porciones de IDME in vitro como se demuestra en O2008043087 y/o WO2008127615. En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl es el compuesto 51. En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl es un análogo de pteridona. En algunas modalidades, la molécula pequeña de antagonista tiene valores de IC50 de 250 y 280 nM contra SCDl de rata y humano, respectivamente. En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl es un 3-oxopirido [3 , 2-b] pirazina . En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl es el compuesto 52. El compuesto 52 es A37602 (G01522403) usado en los ejemplos. En algunas modalidades, la molécula pequeña de antagonista de SCDl tiene un IC50 de hSCDl de 37 nM. En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl tiene una IC50 en ratas de 7.8 nM. En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl es el análogo de 2-oxopirido [3,4 -b] pirazina. En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl es el compuesto 53. En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl consiste de inhibidores de SCDl a base de 2-oxoquinoxalina. En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl es el compuesto 54. En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl tiene una IC50 subnanomolar para ser selectiva contra ?5 y ?6 desaturasas y para tener una estabilidad mayor de 50% en HLM y RLM (incubación de 30 minutos) .
En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl es una molécula pequeña de SCDl descrita en WO2008074824 , WO20080074832 , WO2008074833 , WO2008074834 , WO2008104524 y/o WO2009010560 , que son incorporadas por referencia en su totalidad. GSK publicó un número de solicitud de patente con respecto a inhibidores de SCDl . En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl es una pirazolil 4-amida. En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl es el compuesto 55. En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl tiene un valor de pIC50 (-log IC50) < 5.5 contra SCDl de rata.
En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl es un pirazolil 3-amide. En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl es el compuesto 56. En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl inhibe SCDl de rata con una pIC50 mayor de 5.5. En algunas modalidades, el pirazol es modificado a tiadiazol. En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl es el compuesto 57. En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl inhibe SCDl de rata con un pIC50 mayor de 5.5. En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl es el compuesto 58. En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl tiene una potencia in vitro y celular (pIC50 entre 7.00 and 7.25, respectivamente).
En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl es una molécula pequeña antagonista de SCDl descrita en WO2008044767 y/o WO2008096746, que son incorporadas por referencia en su totalidad. En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl es derivado de amina aromática. En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl es el compuesto 59. En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl a 10 µ? inhibe el 100% de la actividad de SCDl microsomal . En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl es un plantilla de piridazina. En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl es el compuesto 60. En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl reduce DI (C18 :1/C18 : 0) en ratones DIO.
En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl es una molécula pequeña antagonista de SCDl descrita en WO2008056687, JP2009019013 y/o WO2008139845 , que son incorporadas por referencia en su totalidad. En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl es un derivado de espiropiperidina . En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl es el compuesto 61. En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl tiene valores de IC50 menores de 0.2 µ? contra SCDl humano transfectado en células HEK293. En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl es el compuesto 62. En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl es una azolé amida. En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl es el compuesto 63. En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl inhibe SCDl humano con un valor de IC50 < 1 µ?.
En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl es una molécula pequeña antagonista de SCDl descrita en WO2008120744 , WO2008123469 y/o WO2008029266 , que son incorporadas por referencia en su totalidad. En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl consiste de derivados de tiofeno/furano 2 , 5-disustituidos . En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl es el compuesto 64. En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl tiene un valor de IC50 menor de 0.1 µ?. En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl es un anillo de arilo de seis miembros modificado. En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl es un análogo de benzamida. En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl es el compuesto 65. En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl tiene un valor de IC50 menor 0.1 µ? contra SCDl de rata. En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl ha sido modificada a piperidina. En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl es un derivado de urea. En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl es el compuesto 66. En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl tiene un valor de IC50 menor de 0.1 µ? contra SCDl de rata.
En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl es una molécula pequeña antagonista de SCDl descrita en WO2008029266 y/o WO2008062276 , que son incorporadas por referencia en su totalidad. En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl consiste de piridiniloxazolanonas . En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl es el compuesto 67. En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl inhibe SCDl humano al 99% a 10 µ?. En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl es consiste de piridazinas/piridinas que contienen acetileno. En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl es el compuesto 68. En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl inhibe SCDl humano al 100% a 10 µ?.
En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl es una molécula pequeña antagonista de SCDl descrita en WO2008003753 y/o O2008116898 , que son incorporadas por referencia en su totalidad. En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl consiste de derivados de pirazolo [1 , 5 -a] pirimidina . En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl es el compuesto 69. En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl tiene un valor de IC50 de 140 nM. En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl es el compuesto 70. En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl tiene un valor de IC50 de 22 nM.
En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl es una molécula pequeña antagonista de SCDl descrita en WO2008157844 , que es incorporada por referencia en su totalidad. En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl consiste de inhibidores de SCDl a base de piperazina. En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl es el compuesto 71. En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl es el compuesto 72. En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl inhibe SCDl de rata con valores de IC50 < 10 mM.
En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl es una molécula pequeña antagonista de descrita en WO2008135141, que es incorporada por referencia en su totalidad. En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl es un andamio de núcleo de pirrólo [3,4-c] pirrólo diamina bicíclico. En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl es el compuesto 73. En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl es el compuesto 74. En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl inhibe SCDl de rata al 100% a 10 µ?. En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl es el compuesto 75. En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl es el compuesto 76.
En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl es el compuesto 19b. En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl es el compuesto 24b. El compuesto 24b es G02447171.1 (G02447171) usado en los ejemplos .
En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl es una molécula pequeña antagonista de SCDl descrita en WO2011011872, WO2011011506 , WO2011047481 , WO2011011508 , WO2011039358, WO2011030312 , WO2010025553 , WO2010094120 , WO2010112520, WO2009060452 , WO2009019566 , WO2009010560 , WO2009016216 y/o WO2009056556 , que son incorporadas por referencia en su totalidad. En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl es un compuesto espirocíclico . En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl es un compuesto espiro. En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl es un compuesto de oxazepina benzo-fusionado . En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl es un derivado de pirazol. En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl es un derivado de triazol . En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl es un derivado de N-tiazolil-1 ,2,3, 4 -tetrahidro-6-isoquinolincarboxamida. En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl es un 939572 (4- (2-clorofenoxi) -N- (3- (metilcarbamoil) -fenil) iperidina-l-carboxamida) . En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl es CVT-11,127. En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl es MF-438. En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl es una quinoxalinona. En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl es CVT-13,036. En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl es 11,563. En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl es CVT-12,012. En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl es CVT-12,805. En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl es una molécula pequeña antagonista de SCDl en http : //caocao .myipcn. org/science?_ob=MImg&_cid=273013&_user=4 861547&__pii=S0065774310450071&_2one=rslt_list_item&_coverDat= 12%2F31%2F2010&wchp=dGLzVlt-zSkWz&_valck=l&md5=117298fb3b239424e814148d8b4bae32&ie=/sdart icle.pdf, que es incorporada por referencia en su totalidad.
En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl es un compuesto de formula (I) : (Ha) en donde: Ri representa un grupo alquilo, un cicloalquilo, un arilo o un grupo heteroarilo en C5 a Ci4, en particular en Ce, dicho arilo o heteroarilo está opcionalmente sustituido con uno o más grupos Ra; - Ra representa un átomo de halógeno, un grupo hidroxilo, -N02/ - CN, -NH2, -N (C!_6alquilo) 2, un ??_6 alquilo, un Ci_s alcoxi, un -C (O) -Ci-6 alquilo, C2-s alquenilo, C3-s cicloalquilo, arilo, C3-S heterociclilo o heteroarilo, dicho alquilo, alcoxi, alquenilo, cicloalquilo, arilo, heterociclilo o heteroarilo está opcionalmente sustituido con uno o más de átomos de halógeno, Ci-6 alquilo, Ci-S alcoxi, -C(0)-Ci-s alquilo, -N02, -CF3, -OCF3, -CN, -NH2, y/o -N(C1-6alquilo) 2; -n representa 0, 1, 2, o 3;- R2 representa un grupo alquilo, un cicloalquilo, un arilo o un heteroarilo en C5 a Clit en particular en C6, dicho arilo o heteroarilo es opcionalmente sustituido con uno o más grupos Rb; - ¾ representa un átomo de halógeno, un grupo hidroxilo, N02, -CN, -CF3, -OCF3, a Ci_6 alquilo, Ci-6 alcoxi, -C(0)-Ci-e alquilo, -NH2, -N (C1-6alquilo) 2 , C3-6 cicloalquilo, C3-6 heterociclilo, arilo, heteroarilo, dicho alquilo, alcoxi, cicloalquilo, heterociclilo, arilo, heteroarilo es opcionalmente sustituido con uno o más grupos hidroxilo, -CF3, -OCF3, -NH2, -N02, y/o -CN, o una de sus sales con forma de enantiomero.
En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCD1 es una molécula pequeña antagonista de descrita en la solicitud de patente estadounidense 7,652,013, que es incorporada en la presente por referencia. En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCD1 es un compuesto de formula (II) : En donde: R1 y R5, independientemente entre sí, son hidrógeno, alquilo interior sin sustituir, halógeno, trifluorometilo, hidroxi, arilo, alcoxi o N02; R1 y R2, opcionalmente, junto con los átomos de carbono a los cuales están anexados, forman un anillo de nueve miembros que tiene 1 o 2 heteroátomos ; R2 y R4, independientemente entre sí, son hidrógeno, alquilo inferior sin sustituir, alquinilo inferior, alcoxi, halógeno, ciano, trifluorometilo, O-trifluorometilo o N02 y R3 es hidrógeno, alquilo inferior sin sustituir, alcoxi o halógeno; en donde por lo menos uno de R1, R2, R3, R4 o R5 es hidrogeno y sales aceptables farmacéuticamente de los mismos. En algunas modalidades, R1 es halógeno, R4 es alcoxi y R5 es hidroxi. En algunas modalidades, R1, R4 y R5 son cada uno hidrógeno. En algunas modalidades, R2 es halógeno, R4 es halógeno y R5 es hidroxi. En algunas modalidades, tanto R2 como R3 son alquilo inferior sin sustituir. En algunas modalidades, tanto R2 y R5 son trifluorometilo. En algunas modalidades, tanto R3 y R4 son halógeno. En algunas modalidades, tanto R4 y R5 son halógeno. En algunas modalidades, R2 es halógeno y R3 es hidroxi. En algunas modalidades, R2 es halógeno y R5 es N02. En algunas modalidades, R2 es —O-trifluorometilo y R5 es hidroxi . En algunas modalidades, R3 es halógeno. En algunas modalidades, R4 es alquilo inferior sin sustituir. En algunas modalidades, R5 es alquilo inferior sin sustituir. En algunas modalidades, R5 es trifluorometilo. En algunas modalidades, R5 es halógeno. En algunas modalidades, R5 es N02. En algunas modalidades, el compuesto es 6- [4- (3-bromo-bencil) -piperazin-l-il] -3H-pirimidin-4 -ona; 6- [4- (5-Bromo-2-hidroxi-bencil) -piperazin-1-il] -3H-pirimidin-4-ona; 6- [4- (3-cloro-bencil) -piperazin-l-il] -3H-pirimidin-4-ona; 6- [4- (5-cloro-2-nitro-bencil) -piperazin-l-il] -3H-pirimidin-4 -ona; 6- [4 - (2 , 3-dicloro-bencil) -piperazin-l-il] -3H-pirimidin-4-ona; 6- [4- (3 , 5-Dicloro-2-hidroxi-bencil) -piperazin-l-il] -3H-pirimidin-4-ona; 6- [4- (2, 6-dimetilo-bencil) -piperazin-l-il] -3H-pirimidin-4 -ona; 6- [4- (2-hidroxi-5-trifluorometoxi-bencil) -piperazin-l-il] -3H-pirimidin-4-ona; 6- [4- (2 -nitro-bencil) -piperazin-l-il] -3H-pirimidin-4 -ona; o 6- [4- (2-trifluorometilo-bencil) -piperazin-l-il] -3H-pirimidin-4-ona.
En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl es el compuesto 77 (RG1 de los ejemplos; ejemplo 24 de la solicitud de patente estadounidense 7,652,013). En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl es el compuesto 78 (RG2 de los ejemplos; ejemplo 51 de la solicitud de patente estadounidense 7,652,013). En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl es el compuesto 79 (RG3 de los ejemplos; ejemplo 50 de la solicitud de patente estadounidense 7,652,013). En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl es el compuesto 80 (RG4 de los ejemplos; ejemplo 44 de la solicitud de patente estadounidense 7,652,013). En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl es el compuesto 81 (RG5 de los ejemplos; ejemplo 45 de la solicitud de patente estadounidense 7,652,013). En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl es el compuesto 82 (RG6 de los ejemplos; ejemplo 46 de la solicitud de patente estadounidense 7,652,013). En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl es el compuesto 83 (RG7 de los ejemplos; ejemplo 28 de la solicitud de patente estadounidense 7,652,013). En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl es el compuesto 84 (RG8 de los ejemplos; ejemplo 49 de la solicitud de patente estadounidense 7,652,013). En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl es el compuesto 85 (RG9 de los ejemplos; ejemplo 48 de la solicitud de patente estadounidense 7,652,013). En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl es el compuesto 86 (RG10 de los ejemplos; ejemplo 25 de la solicitud de patente estadounidense 7,652,013). En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl es el compuesto 87 (RG11 de los ejemplos; ejemplo 38 de la solicitud de patente estadounidense 7,652,013). En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl es el compuesto 88 (RG12 de los ejemplos; ejemplo 47 de la solicitud de patente estadounidense 7,652,013). En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl es el compuesto 89 (RG13 de los ejemplos; ejemplo 35 de la solicitud de patente estadounidense 7,652,013). En algunas modalidades, la molécula pequeña antagonista de SCDl es el compuesto 90 (RG14 de los ejemplos; ejemplo 31 de la solicitud de patente estadounidense 7,652,013).
E. Polinucleótidos antagonistas Se proveen en la presente antagonistas de polinucléotido . El polinucleótido puede ser un ácido nucleico antisentido y/o una ribozima. Los ácidos nucleicos antisentido comprenden una secuencia complementaria a por lo menos una porción de un transcrito de ARN de un gen de SCD1. Sin embargo, la complementareidad absoluta aunque es preferida no es requerida.
Una secuencia "complementaria a por lo menos una porción de un ARN", como se refiere en la presente, signifia una secuencia que tiene suficiente complementareidad para ser apta de hibridizarse con el ARN, formando bucles estables, en el caso de ácidos nucleicos antisentido de SCD1 de doble hebra, una sola hebra del ADN dúplex puede así ser probada o la formación triplex puede ser ensayada. La habilidad para hibridizarse dependerá tanto del grado de complementariedad como de la longitud del ácido nucleico antisentido. En general, mientras más grande es el ácido nucleico hibridizante , más desajustes de base con un AR de SCD1 pueden contener y todavía formar un dúplex estable (o triplex como puede ser el caso) . Aquel de habilidad en el arte puede indagar un grado tolerable de desajuste mediante el uso de procedimientos estándar para determinar el punto de fusión del complejo hibridizado.
En algunas modalidades, los antagonistas de polinucleótido comprenden 5 ' -GATCCCCCTACAAGAGTG GCTGAGTTTTCAAGAGAAACTCAGCCACTCTTGTAGTTTTTTGGAAA-3 ' (SEQ ID NO: 2) ; 5' -GA TCCCCCTACGGCTCTTTCTGATCATTCAAGAGATGATCAGAAAGAGCCGTAGTTTTTTGGA AA-3' (SEQ ID NO: 3); O 5'- GATCCCCGCACATCAACTTCACCACATTCAAGAGATGTGGTGAAGTTG ATGTGCTTTTTTGGAAA-3 ' (SEQ ID NO : 4) .
Los polinucleótidos que son complementarios al extremo 5' del mensaje, por ejemplo, la secuencia sin traducir 5' hacia arriba a e incluyendo el codón de inicio de AUG, deben funcionar más eficientemente para inhibir la traducción. Sin embargo, se ha demostrado que secuencias complementarias a la secuencia sin traducir 3' de mARN son efectivas para inhibir la traducción de mARN también. Véase en general, Wagner, R., 1994. Nature 372:333-335. Así, los oligonucleótidos complementarios ya sea a las regiones sin codificación 51 - o 3 '-sin traducir del gen de SCD1 podrían ser usados en un procedimiento antisentido para inhibir la traducción del mARN de SCD1 endógeno. Los polinucleótidos complementarios a la región sin traducir 5' del mARN deben incluir el complemento del codón de inicio de AUG. Los polinucléotidos antisentido complementarios a regiones de codificación mARN son inhibidores de los eficientes de traducción pero podrían ser usados de acuerdo con la invención. Ya sea diseñados para hibridizarse a la región 5', 3' o de codificación del mARN de SCD1 los ácidos nucleicos antisentido deben ser de por lo menos seis nucleótidos de longitud y son preferiblemente oligonucleótidos que varían de 6 a alrededor de 50 nucleótidos de longitud. En aspectos específicos, el oligonucleótido es de por lo menos 10 nucleótidos, es de por lo menos 17 nucleótidos, por los menos 25 nucleótidos o por lo menos 50 nucleótidos.
En una modalidad, el ácido nucleico antisentido de SCD1 de la invención es producido intracelularmente mediante transcripción de una secuencia exógena. Por ejemplo, un vector o una porción del mismo, es transcrito, produciendo un ácido nucleico antinsentido (ARN) del gen de SCD1. Tal vector contendría una secuencia que codifica el ácido nucleico antisentido de SCDl. Tal vector puede permanecer episomal o volverse integrado cromosomalmente, en tanto que pueda ser transcrito para producir el AR antisentido deseado. Tales vectores pueden ser sustituidos mediante métodos de tecnología de ADN recombinantes estándares en el arte. Los vectores pueden ser plásmidos, virales u otros conocidos en el arte, usados para replicación y expresión en células de vertebrado. La expresión de la secuencia que codifica SCDl o fragmentos del mismo, pueden ser mediante cualquier promotor conocido en el arte para actuar en células de vertebrados, preferiblemente células humanas . Tales promotores pueden ser inducibles o constitutivos. Tales promotores incluyen pero no está limitados a la región de promotor prematura de SV40 (Bernoist y Chambón, Nature 29:304-310 (1981), el promotor contenido en la repetición terminal larga 3' el virus de sarcoma de Rous (Yamamoto et al., Cell 22:787-797 (1980), el promotor de timidina de herpes (Wagner et al., Proc . Nati. Acad. Sci. U.S.A. 78:1441-1445 (1981), la secuencias reguladoras del gen de metalotioneina (Brinster, et al., Nature 296:39-42 (1982)), etc.
F. Anticuerpo y variantes de polipeptidos de enlace En ciertas modalidades, variantes de secuencia de aminoácidos de los anticuerpos y/o los polipeptidos de enlace en la presente son contempladas. Por ejemplo, puede ser deseable mejorar la afinidad de enlace y/u otras propiedades biológicas del anticuerpo y/o polipéptido de enlace. Variantes de secuencia de aminoácido de un anticuerpo y/o polipéptido de enlace pueden ser preparadas al introducir modificaciones apropiadas a la secuencia de nucleótidos que codifica el anticuerpo y/o polipéptido de enlace mediante síntesis de péptido. Tales modificaciones incluyen, por ejemplo cancelaciones y/o inserciones a y/o sustituciones de residuos dentro de las secuencias de aminoácidos del anticuerpo y/o polipéptido de enlace . Cualquier combinación de cancelación, inserción y sustitución se puede hacer para llegar a la construcción o constructo final, a condición de que la construcción o constructo final posea las características deseadas, por ejemplo, enlace objetivo.
En ciertas modalidades, variantes de anticuerpo y/o variantes de polipéptido de enlace que tienen una o más sustituciones de aminoácido son provistas. Sitios de interés para mutagénesis sustitucional incluyen las HVR y FR. Las sustituciones conservadoras son mostradas en la tabla 1 bajo el encabezado de "sustituciones conservadoras" . Cambios más sustanciales son provistos en la tabla 1 bajo el encabezado de "sustituciones ejemplares" y como se describe adicionalmente a continuación con referencia a clases de cadena lateral de aminoácidos. Sustituciones de aminoácido pueden ser introducidas a un anticuerpo y/o polipéptido de enlace de interés y los productos seleccionados en cuanto a una actividad deseada, por ejemplo enlace de antígeno retenido/mejorada, inmunogenicidad disminuida o ADCC o CDC mejorada.
Tabla 1 Los aminoácidos pueden ser agrupados de acuerdo con las propiedades de cadena lateral comunes : (1) hidrofóbicos : Norleucina, Met, Ala, Val, Leu, lie; (2) hidrofílicos neutros: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln; (3) ácidos: Asp, Glu; (4) básicos: His, Lys, Arg; (5) residuos que influencian la orientación de cadena: Gly, Pro; (6) aromáticos: Trp, Tyr, Phe.
Las sustituciones no conservadoras abarcaran intercambiar un miembro de una de estas clases por otra clase .
Un tipo de variante sustitucional involucra sustituir uno o más residuos de región hipervariable e un anticuerpo original (por ejemplo, un anticuerpo humanizado o humano) . En general, la (s) variante (s) resultante (s) seleccionada (s) para estudio adicional tendrá (n) modificaciones (por ejemplo, mejoras) en ciertas propiedades biológicas (por ejemplo, afinidad incrementada, inmunogenicidad reducida) en relación con un anticuerpo original y/o tendrá ciertas propiedades biológicas sustancialmente retenidas del anticuerpo original. Una variante sustitucional ejemplar es un anticuerpo madurado por afinidad, que puede ser generado convenientemente, por ejemplo utilizando técnicas de maduración por afinidad a base de despliegue de fago tales como aquellas descritas en la presente. Brevemente, uno o más residuos de HVR son mutados y los anticuerpos variantes desplegados sobre fago y seleccionados en cuanto a una actividad biológica particular (por ejemplo, afinidad de enlace) .
Se pueden hacer alteraciones (por ejemplo, sustituciones) en HVR, por ejemplo para mejorar la afinidad de anticuerpo. Tales alteraciones se pueden hacer "puntos calientes" de HVR, esto es, residuos codificados por codones que sufren mutación a alta frecuencia durante el proceso de maduración somático (véase, por ejemplo, Chowdhury, Methods Mol. Biol. 207:179-196 (2008)) y/o SDR (a-CDR) , la VH o VL variante resultante siendo probada en cuanto a afinidad de enlace. La maduración por afinidad al construir y reseleccionar bibliotecas primarias será descrito, por ejemplo, en Hoogenboom et al. en ethods en Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed. , Human Press, Totowa, NJ, (2001).) En algunas modalidades de maduración por afinidad, se introduce diversidad a los genes variables escogidos para maduración mediante cualquiera de una variedad de métodos (por ejemplo, PCR propensa a error, entremezcla de cadena o mutagénesis oligonucleótido-dirigida) . Una biblioteca secundaria es luego creada. La biblioteca es luego seleccionada para identificar cualquier variantes de anticuerpo con la afinidad deseada. Otro método para introducir diversidad involucra procedimientos HVR-dirigidos, en los cuales varios residuos de HVR (por ejemplo, 4-6 residuos a la vez) son aleatorizados . Los HVR involucrados en el enlace de antígeno pueden ser identificados específicamente, por ejemplo utilizando mutagénesis de barrido de alanina o modelado. CDR-H3 y CDR-L3 en particular son frecuentemente apuntadas.
En ciertas modalidades, sustituciones, inserciones o cancelaciones pueden ocurrir dentro de una o más HVR en tanto que tales alteraciones no reduzcan sustancialmente la habilidad del anticuerpo para enlazarse al antígeno. Por ejemplo, alteraciones conservadoras (por ejemplo, sustituciones conservadoras como se proveen en la presente) que no reducen sustancialmente la afinidad de enlace se pueden hacer en las HVR. Tales alteraciones pueden estar fuera de los "puntos calientes" de HVR o SDR. En ciertas modalidades de las secuencias de VH y VL variantes provistas anteriormente, cada HVR está ya sea sin alterar o contienen no más de una, dos o tres sustituciones de aminoácido.
Un método útil para identificación de residuos por regiones del anticuerpo y/o el polipéptido de enlace que pueden ser apuntados para mutagénesis es llamado "mutagénesis de barrido de alanina" como se describe por Cunningham y Wells (1989) Science, 244:1081-1085. En este método, un residuo o grupo de residuos objetivo (por ejemplo, residuos cargados tales como arg, asp, his, lys y glu) son identificados y reemplazados por un aminoácido neutro o cargado negativamente (por ejemplo, alanina o polialanina) para determinar si la infracción es afectada. Sustituciones adicionales pueden ser introducidas en sitios de aminoácidos que demuestran sensibilidad funcional a las sustituciones iniciales. Alternativa o adicionalmente, una estructura cristalina de un complejo de antígeno-anticuerpo para identificar puntos de contacto entre el anticuerpo y antígeno. Tales residuos de contacto y residuos vecinos pueden ser apuntados o eliminados como candidatos para sustitución. Las variantes pueden ser seleccionadas para determinar si contienen las propiedades deseadas.
Inserciones de secuencia de aminoácido incluyen fusiones amino- y/o carboxilo-terminal que varían de longitud desde un residuo a polipéptidos que contienen cien o más residuos, también como inserciones intrasecuencia de un solo o múltiples residuos de aminoácido. Ejemplos de inserciones terminales incluyen n anticuerpo por un residuo de metionilo N-terminal. Otras variantes insercionales del anticuerpo incluyen la fusión del término N o término C del anticuerpo a una enzima (por ejemplo, para ADEPT) o un polipéptido que incrementa la vida media en el suero del anticuerpo.
G. Derivados del anticuerpo y polipéptido de enlace En ciertas modalidades, un anticuerpo y/o polipéptido de enlace provisto en la presente puede ser modificado adicionalmente para contener porciones no proteináceas adicionales que son conocidas en el arte y están disponibles fácilmente. Las porciones apropiadas para derivación del anticuerpo y/o polipéptido de enlace incluyen pero no están limitadas a polímeros solubles en agua. Ejemplos no limitantes de polímeros solubles en agua incluyen pero no están limitados a polietilenglicol (PEG) , copolímeros de etilenglicol/propilenglicol, carboximetilcelulosa, dextrana, alcohol polivinílico, polivinilpirrolidona, poli-1, 3-dioxolano, poli-1 , 3 , 6-trioxano, copolímero de etileno/anhídrido maleico, poliaminoácidos (ya sea homopolímeros o copolímeros aleatorios) y dextrana o poli (n-vinil pirrolidona) polietilenglicol , homopolímeros de propilenglicol , copolímeros de óxido de prolipropileno/óxido de etileno, polioles polioxietilados (por ejemplo, glicerol) , alcohol polivinílico y mezclas de los mismos. El polietilenglicol propionaldehído puede tener ventajas en la manufactura debido a su estabilidad en agua. El polímero puede ser de cualquier peso molecular y puede ser ramificado o sin ramificar. El número de polímeros anexados al anticuerpo y/o polipéptido de enlace puede variar y si más de un polímero es anexado, pueden ser las mismas o diferentes moléculas. En general, el número y/o tipo de polímeros usados para derivación puede ser determinado en base a consideraciones que incluyen pero no están limitadas a las propiedades o funciones particulares del anticuerpo y/o polipéptido de enlace a ser mejoradas, si el derivado de anticuerpo y/o de derivado de polipéptido de enlace será usado en una terapia bajo condiciones definidas, etc.
En otra modalidad, conjugados de anticuerpo y/o polipéptidos de enlace a una porción no proteinácea que pueden ser calentados selectivamente mediante exposición a radiación son provistos. En una modalidad, la porción no proteinácea es un nanotubo de carbono (Kam et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 102: 11600-11605 (2005)). La radiación puede ser de cualquiera longitud de onda e incluye pero no está limitada a longitudes de onda que dañan a las células ordinarias, pero que calientan la porción no proteinácea a una temperatura a la cual las células próximas al anticuerpo y/o polipéptido de enlace-porción no proteinácea son asesinadas.
IV. Métodos recombinantes y composiciones Los anticuerpos y/o polipéptidos de enlace pueden ser producidos utilizando métodos y composiciones recombinantes, por ejemplo como se describe en la patente estadounidense 4,816,567. En una modalidad, el ácido nucleico aislado codifica un anticuerpo anti-SCDl. Tal ácido nucleico puede codificar una secuencia de aminoácidos que comprenden la VL y/o una secuencia de aminoácidos que comprende la VH el anticuerpo (por ejemplo, las cadenas ligeras y/o pesadas del anticuerpo) . En una modalidad adicional, uno o más vectores (por ejemplo, vectores de expresión) que comprenden tal ácido nucleico que codifica el anticuerpo y/o polipéptido de enlace son provistos. En una modalidad adicional, la célula huésped que comprende tal ácido nucleico es provista. En una de tales modalidades, la célula huésped comprende (por ejemplo, ha sido transformada con) : (1) un vector que comprende un ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácido que comprende la VL del anticuerpo en una secuencia de aminoácido que comprende la VH del anticuerpo o (2) un primer vector que comprende un ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende la VL del anticuerpo y un segundo vector que comprende un ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende la VH del anticuerpo. En una modalidad, la célula huésped es eucarióntica, por ejemplo una célula de ovario de hámster chino (CHO) o célula linfoide (por ejemplo, célula YO, NSO, SP20) . En una modalidad, se provee un método de fabricación de un anticuerpo anti-SCDl y/o polipéptido de enlace de anti-SCDl, en donde el método comprende cultivar una célula huésped que comprende un ácido nucleico que codifica el anticuerpo y/o polipéptido de enlace, como se provee anteriormente, bajo condiciones apropiados para expresión de un anticuerpo y/o polipéptido de enlace y opcionalmente recuperar el anticuerpo y/o polipéptido de la célula huésped (o medio de cultivo de célula huésped) .
Para la producción recombinante de un anticuerpo y/o polipéptido de enlace anti-SCDl, el ácido nucleico que codifica el anticuerpo y/o el polipéptido de enlace, como se describe anteriormente, es aislado e insertado a uno o más vectores para clonación y/o expresión adicional en una célula huésped. Tal ácido nucleico puede ser fácilmente aislado y secuenciado utilizando procedimientos convencionales (por ejemplo, utilizando sondas de oligonucleótido que son aptas de enlazarse específicamente a genes que codifican las cadenas ligeras y pesadas del anticuerpo) .
Células huésped apropiadas para clonación o expresión de vectores incluyen células procariónticas o eucariónticas descritas en la presente. Por ejemplo, los anticuerpos pueden ser producidos en bacterias, en particular cuando la glicosilación y función efectora de Fe no son necesarias. Para expresión de fragmentos de anticuerpo y polipéptidos en bacterias, véanse, por ejemplo, patentes estadounidenses Nos. 5,648,237, 5,789,199, y 5,840,523. (Véase también Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed. , Humana Press, Totowa, NJ, 2003), páginas 245-254, que describen la expresión de fragmentos de anticuerpo en E. coli) . Después de la expresión, el anticuerpo y/o polipéptidos de enlace pueden ser aislados de la pasta de célula bacteriana en una fracción soluble y puede ser purificado adicionalmente .
Además de procariontes, microbios eucariónticos tales como hongos filamentosos o levadura son huéspedes de clonación o expresión apropiados para vectores, incluyendo hongos y cepas de levadura cuyas rutas de glicosilación han sido "humanizadas" , dando como resultado la producción de un anticuerpo con un patrón de glicosilación parcial o plenamente humano. Véase Gerngross, Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004), y Li et al., Nat. Biotech. 24:210-215 (2006).
Células huésped apropiadas para la expresión de anticuerpo glicosilado y/o polipéptidos de enlace glicosilados son también derivadas de organismos multicelulares (invertebrados y vertebrados) . Ejemplos de células de invertebrado incluyen plantas y células de insecto. Numerosas cepas baculovirales han sido identificadas que pueden ser usadas en conjunción con células de insecto, particularmente para transfección de células de Spodoptera frugiperda .
Cultivos de células de plantas pueden también ser utilizados como huéspedes. Véanse, por ejemplo, patentes estadounidenses Nos. 5,959,177, 6,040,498, 6,420,548, 7,125,978, y 6,417,429 (que describe la tecnología de PLANTIBODIES™ para producir anticuerpos en plantas transgénicas) .
Las células de vertebrados pueden también ser usadas como huéspedes. Por ejemplo, líneas celulares mamíferas que son adaptadas para crecer en suspensión pueden ser útiles. Otros ejemplos de líneas celulares huéspedes mamíferas útiles son líneas CV1 de riñon de mono transformada por SV40 (COS-7) ; línea de riñon embriónica humana (293 o células 293 como se describe, por ejemplo, en Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)); células de riñon de hámster bebé (BHK) ; células sertoli de ratón (células TM4 como se describe, por ejemplo, en Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)); células de riñon de mono (CV1) ; células de riñon de mono verde africano (VERO-76) ; células de carcinoma cervical humano (HELA) ; células de riñon canino (MDCK; células de hígado de rata de búfalo (BRL 3A) ,- células de pulmón humano ( 138) ,-células de hígado humano (Hep G2) ; tumor mamario de ratón (MMT 060562) ; células TRI, como se describe, por ejemplo, en Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982); células MRC 5; y células FS4. Otras líneas celulares huéspedes mamíferas útiles incluyen células de ovario de hámster chino (CHO) , incluyendo células DHFR" CHO (Urlaub et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)); y líneas celulares de mieloma tales como YO, NSO y Sp2/0. Para una revisión de ciertas líneas celulares huéspedes mamíferas apropiadas para producción de anticuerpo y/o producción de polipéptido de enlace, véase, por ejemplo, Yazaki y u, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed. , Humana Press, Totowa, NJ) , pp. 255-268 (2003).
En tanto que la descripción es concerniente principalmente con la producción de anticuerpos y/o polipéptidos de enlace al cultivar células transformadas o transíectadas con un vector que contiene ácido nucleico que codifica anticuerpo y polipéptidos de enlace, por supuesto, se contempla que métodos alternativos que son bien conocidos en el arte pueden ser empleados para preparar anticuerpos y/o polipéptidos de enlace. Por ejemplo, la secuencia de aminoácidos apropiada o porciones de la misma pueden ser producidos mediante síntesis de péptido directa utilizando técnicas en fase sólida [véase, por ejemplo, Stewart et al., Solid-Phase Peptide Synthesis, W.H. Freeman Co. , San Francisco, CA (1969); Merrifield, J. Am. Chem. Soc, 85:2149-2154 (1963)]. Síntesis de proteína in vitro puede ser efectuada utilizando técnicas manuales o mediante automatización. La síntesis automatizada se puede llevar a cabo, por ejemplo, utilizando un dispositivo sintetizador de péptido de Applied Biosystems (Foster City, CA) utilizando las instrucciones del fabricante. Varias porciones del anticuerpo y/o polipéptido de enlace pueden ser sintetizadas químicamente de manera separada y combinadas utilizando métodos químicos o enzimáticos para producir un anticuerpo y/o polipéptido de enlace deseado.
Formas del anticuerpo y/o polipéptido de enlace pueden ser recuperadas del medio de cultivo o de lisados de célula huésped. Si están enlazados a membrana, pueden ser liberados de membrana utilizando una dilución de detergente apropiado (por ejemplo, Triton-X 100) o mediante escisión enzimática. Las células empleadas en la expresión del anticuerpo y/o polipéptido de enlace pueden ser sometidas a disrupción mediante varios medios físicos o químicos, tales como ciclos de congelación-deshielo, sonificación, disrupción mecánica o agentes de lisis celular.
Puede ser deseable purificar el anticuerpo y/o polipéptido de enlace de proteínas de célula recombinante o polipéptidos . Los siguientes procedimientos son ejemplares de procedimientos de purificación apropiados: mediante fraccionamiento sobre una columna de intercambio iónico; precipitación de etanol; HPLC de fase inversa; cromatografía sobre sílice o sobre una resina de intercambio catiónico tal como DEAE; cromatoenfoque ; SDS-PAGE; precipitación de sulfato de amonio; filtración de gel utilizando, por ejemplo, Sephadex G-75; columnas de proteína A Sepharose para remover contaminantes tales como IgG; y columnas quelantes de metal para enlazar las formas epítopo-etiquetadas del anticuerpo y/o polipéptido de enlace. Varios métodos de purificación de proteína pueden ser empleados y tales métodos son conocidos en el arte y descritos por ejemplo en Deutscher, Methods in Enzymology, 182 (1990) ; Scopes, Protein Purification : Principies and Practice, Springer-Verlag, New York (1982) . La(s) etapa(s) de purificación seleccionada (s) dependerá (n) , por ejemplo, de la naturaleza del proceso de producción utilizado y el anticuerpo y/o polipéptido de enlace particular producido.
Cuando se usan técnicas recombinantes , el anticuerpo y/o polipéptido de enlace puede ser producido intracelularmente, en el espacio periplásmico o secretado directamente al medio. Si el anticuerpo y/o polipéptido de enlace es producido intracelularmente, como una primera etapa, los desechos de partículas, ya sea células huésped o fragmentos sometidos a lisis, son removidos, por ejemplo, mediante centrifugación o ultrafiltración. Cárter et al., Bio/'Technology 10:163-167 (1992) describen un procedimiento para aislar anticuerpos que son secretados al espacio periplásmico de E. coli. Brevemente, la pasta celular es helada en presencia de acetato de sodio (pH 3.5), EDTA y fenilmetilsulfonilfluoruro (PMSF) durante alrededor de 30 minutos. Los desechos celulares pueden ser removidos mediante centrifugación. En donde el anticuerpo y/o polipéptido de enlace es secretado al medio, los sobrenadantes de tales sistemas de expresión son en general concentrados primero utilizando un filtro de concentración de proteína disponible comercialmente , por ejemplo, una unidad de ultrafiltración Amicon o Millipore Pellicon. Un inhibidor de proteasa tal como PMSF puede ser incluido en cualquiera de las etapas anteriores para inhibir la proteólisis y se pueden incluir antibióticos para impedir el crecimiento de contaminantes adventicios.
La composición de anticuerpo y/o polipéptido de enlace preparado de las células puede ser purificada utilizando por ejemplo, cromatografía de hidroxilapatita, electroforesis de gel, diálisis y cromatografía de afinidad, cromatografía de afinidad es la técnica de purificación preferida. La conveniencia de la proteína A como ligando de afinidad depende de la especie y isotipo de cualquier dominio de Fe de inmunoglobulina que está presente en el anticuerpo. Se puede usar proteína A para purificar anticuerpos que están basados en cadenas pesadas ??, ?2 o ?4 humanas (Lindmark et al., J. Immunol. Meth. 62:1-13 (1983)). La proteína G es recomendada para todos los isotipos de ratón y para ?3 humana (Guss et al., EMBO J. 5:15671575 (1986)). La matriz a la cual el ligando de afinidad es anexado es más frecuentemente agarosa, pero otro matrices están disponibles . Matrices estables mecánicamente tales como vidrio de poro controlado o poli (estirendivinil) benceno permiten velocidades de flujo más rápidas y tiempos de procesamiento más cortos que los que se pueden obtener con agarosa. En donde el anticuerpo comprende un dominio de CH3 , la resina ABX™ de Bakerbond (J. T. Baker, Phillipsburg, NJ) es útil para purificación. Otras técnicas para purificación de proteína tales como fraccionamiento sobre una columna de intercambio iónico, precipitación de etanol, HPLC de fase inversa, cromatografía sobre sílice, cromatografía sobre SEPHAROSE™, cromatografía sobre una resina de intercambio aniónico o catiónico (tal como una columna de ácido poliaspártico) , cromatoenfoque, SDS-PAGE y precipitación de sulfato de amonio están también disponibles dependiendo del anticuerpo y/o polipéptido de enlace a ser recuperado .
Enseguida de cualquier etapa de purificación preliminar, la mezcla que comprende el anticuerpo y/o polipéptido de enlace de interés y contaminantes pueden ser sometidas a cromatografía de interacción hidrofóbica de bajo pH utilizando una solución reguladora del pH de elución a un pH de entre alrededor de 2.5-4.5, preferiblemente efectuada a bajas concentraciones de sal (por ejemplo, sal de alrededor de 0-0.25 M) .
V. Métodos para Seleccionar y/o Identificar Antagonistas de SCD1 con Función Deseada Técnicas para generar antagonistas de SCD1 tales como anticuerpos, polipéptidos de enlace y/o moléculas pequeñas han sido descritas anteriormente. Antagonistas de SCD1 adicionales tales como anticuerpos anti-SCDl, polipéptidos de enlace y/o moléculas pequeñas de enlace provistas en la presente pueden ser identificados, seleccionados o caracterizados en cuanto a sus propiedades físicas/químicas y/o actividades biológicas mediante varios ensayos conocidos en el arte.
Se proveen además métodos para seleccionar y/o identificar un antagonista de SCD1 que induce el cese del ciclo de célula de cáncer, inhibe la proliferación de célula de cáncer y/o promueve la muerte de célula de cáncer, dicho método comprende: (a) poner en contacto una célula de cáncer, tejido de cáncer y/o muestra de cáncer con un antagonista candidato de SCD1, (b) determinar la distribución de etapa de ciclo celular, nivel de proliferación celular y/o nivel de muerte de célula de cáncer a la célula de cáncer, tejido de cáncer y/o muestra de cáncer en ausencia del antagonista candidato de SCDl, mediante lo cual una diferencia en la distribución de la etapa de ciclo celular, nivel disminuido de proliferación celular y/o nivel incrementado de muerte de célula de cáncer entre la célula de cáncer, tejido de cáncer y/o muestra de cáncer en presencia de un antagonista candidato de SCDl y la célula de cáncer, tejido de cáncer y/o muestra de cáncer en ausencia de un antagonista candidato de SCDl identifica el antagonista candidato de SCDl como un antagonista de SCDl que induce el cese del ciclo de la célula de cáncer, inhibe la proliferación de la célula de cáncer y/o promueve la muerte de célula de cáncer. En algunas modalidades de cualquiera de los métodos de seleccionar y/o identificar un antagonista de SCDl, el antagonista candidato de SCDl induce el cese del ciclo de la célula de cáncer. En algunas modalidades de cualquiera de los métodos de selección para y/o identificar un antagonista de SCDl, el antagonista candidato de SCDl inhibe la proliferación de célula de cáncer. En algunas modalidades de cualquiera de los métodos para seleccionar y/o identificar un antagonista de SCDl, el antagonista candidato de SCDl promueve la muerte de célula de cáncer. En algunas modalidades, la muerte de célula de cáncer es apoptosis. En algunas modalidades, la muerte de célula de cáncer es necrosis.
En algunas modalidades de cualquiera de los métodos para seleccionar y/o identificar un antagonista de SCDl, la célula de cáncer, tejido de cáncer o muestra de cáncer es cáncer de vejiga, cáncer pancreático, cáncer de pulmón, cáncer de pecho, cáncer de colon, cáncer colorrectal, cáncer endometrial, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de riñon, cáncer de ovario, cáncer hipofaríngeo, cáncer de próstata, esofagal, carcinoma hepatocelular y/o cáncer urinario. En algunas modalidades de cualquiera de los métodos para seleccionar y/o identificar un antagonista de SCDl, la célula de cáncer, tejido de cáncer o muestra de cáncer es de un cáncer seleccionado del grupo de cáncer de vejiga, cáncer pancreático, cáncer de pulmón, cáncer de pecho, cáncer de colon, cáncer colorrectal, cáncer endometrial, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de riñon, cáncer de ovario y/o cáncer urinario. En algunas modalidades, la célula de cáncer, tejido de cáncer o muestra de cáncer es de un cáncer seleccionado del grupo de cáncer de vejiga, cáncer pancreático, cáncer endometrial, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de riñon, cáncer de ovario y/o cáncer urinario. En algunas modalidades, la célula de cáncer, tejido de cáncer o muestra de cáncer es cáncer de vejiga.
En algunas modalidades de cualquiera de los métodos para seleccionar y/o identificar un antagonista de SCDl, la célula de cáncer, tejido de cáncer y/o muestra de cáncer expresa FGFR3. En algunas modalidades, la célula de cáncer, tejido de cáncer y/o muestra de cáncer expresa niveles elevados de FGFR3 en comparación con una muestra de referencia, célula de referencia, tejido de referencia, muestra testigo, célula testigo, tejido testigo o testigo interno (por ejemplo, gen de mantenimiento) . En algunas modalidades, la célula de cáncer de referencia expresa sustancialmente los mismos niveles de FGFR3 como una muestra de referencia, célula de referencia, tejido de referencia, muestra testigo, célula testigo, tejido testigo o testigo interno (por ejemplo, gen de mantenimiento) . En algunas modalidades de cualquiera de los métodos para seleccionar y/o identificar un antagonista de SCD1, la célula de cáncer, tejido de cáncer y/o muestra de cáncer expresa FGFR3 fosforilado. En algunas modalidades, la célula de cáncer, tejido de cáncer y/o muestra de cáncer expresa niveles elevados de FGFR3 fosforilado en comparación con una muestra de referencia, célula de referencia, tejido de referencia, muestra testigo, célula testigo, tejido testigo o testigo interno (por ejemplo, gen de mantenimiento) . En algunas modalidades, la célula de cáncer de referencia expresa sustancialmente los mismos niveles de FGFR3 fosforilado como una muestra de referencia, célula de referencia, tejido de referencia, muestra testigo, célula testigo, tejido testigo o testigo interno (por ejemplo, gen de mantenimiento) . En algunas modalidades, la muestra de referencia, célula de referencia, tejido de referencia, muestra testigo, célula testigo o tejido testigo es no canceroso con o sin un nivel de expresión conocido de FGFR3 y/o FGFR3 fosforilado. En algunas modalidades, la muestra de referencia, célula de referencia, tejido de referencia, muestra testigo, célula testigo o tejido testigo es canceroso con o sin un nivel de expresión conocido de FGFR3 y/o FGFR3 fosforilado. En algunas modalidades, la expresión de FGFR3 en la célula de cáncer, tejido de cáncer y/o muestra de cáncer es expresión de superficie celular. En algunas modalidades, la ruta de FGFR3 en la célula de cáncer, tejido de cáncer y/o muestra de cáncer es constitutivamente activa. En algunas modalidades, la ruta de FGFR3 de la célula de cáncer, tejido de cáncer y/o muestra de cáncer es dependiente de ligando. En algunas modalidades, la célula de cáncer, tejido de cáncer y/o muestra de cáncer comprende una mutación en FGFR3. Ejemplos de mutaciones constitutivamente activas en FGFR3 incluyen, pero no están limitados a, S249C de FGFR3. En algunas modalidades, la célula de cáncer, tejido de cáncer y/o muestra de cáncer es tipo silvestre para FGFR3.
En algunas modalidades de cualquiera de los métodos para seleccionar y/o identificar un antagonista de SCDl, la célula de cáncer, tejido de cáncer y/o muestra de cáncer expresa uno o más genes de la firma lipogenica FGFR3 -regulada . En algunas modalidades, la célula de cáncer, tejido de cáncer y/o muestra de cáncer expresa niveles elevados de uno o más genes de la firma lipogénica FGFR3-regulada en comparación con una muestra de referencia, célula de referencia, tejido de referencia, muestra testigo, célula testigo, tejido testigo, o testigo interno (por ejemplo, gen de mantenimiento) . En algunas modalidades, la célula de cáncer, tejido de cáncer y/o muestra de cáncer expresa sustancialmente los mismos niveles de firma lipogénica FGFR3 -regulada como una muestra de referencia, célula de referencia, tejido de referencia, muestra testigo, célula testigo, tejido testigo o testigo interno (por ejemplo, gen de mantenimiento) . En algunas modalidades, la muestra de referencia, célula de referencia, tejido de referencia, muestra testigo, célula testigo o tejido testigo es no canceroso con o sin un nivel de expresión conocido de uno o más genes de la firma lipogénica FGFR3 -regulada. En algunas modalidades, la muestra de referencia, célula de referencia, tejido de referencia, muestra testigo, célula testigo o tejido testigo es canceroso con o sin un nivel de expresión conocido de uno o más genes de la firma lipogénica FGFR3 -regulada . En algunas modalidades, el uno o más genes de la firma lipogénica FGFR3-regulada comprende, consiste o consiste esencialmente de uno o más genes del grupo que consiste de SREBF1, G6PD, ACOT7, PTPLA, PCCB, FADS1, RDH11, ACER3 , PDSS1, VD, AGPAT5, HSD17B2, ACSL4, EBP, PIGW, LBR, ACLY, AD0RA2B, GPCPD1, CYP24A1, ACSL3, MVK, ACSS2 , FDPS, EL0VL5 , HMGCR, LIPG, ME1, DHCR7, LSS, ACAT2, FASN, CYP51A1, IDI1, FDFT1, FAR2 , HMGCS1, SDR16C5, LDLR, MSM01 , INSIG1, DHRS9, LRP8, SQLE, PCSK9 , SCD1, FABP4, y combinaciones de los mismos. En algunas modalidades, el uno o más genes de la firma lipogénica FGFR3 -regulada comprende, consiste o consiste esencialmente de uno o más genes del grupo que consiste de ELOVL5, HMGCR, LIPG, ME1, DHCR7, LSS, ACAT2, FASN, CYP51A1, IDI1, FDFT1, FAR2 , HMGCS1, SDR16C5, LDLR, MSMOl, INSIG1, DHRS9, LRP8 , SQLE, PCSK9, SCD1, FABP4, y combinaciones de los mismos. En algunas modalidades, el uno o más genes de la firma lipogénica FGFR3-regulada comprende, consiste de o consiste esencialmente de uno o más genes del grupo que consiste de CYP51A1, IDI1, FDFT1, FAR2, HMGCS1, SDR16C5, LDLR, MSMOl, INSIG1, DHRS9, LRP8, SQLE, PCSK9, SCD1, FABP4, y combinaciones de los mismos. En algunas modalidades, el uno o más genes de la firma lipogénica FGFR3-regulada comprende, consiste de o consiste esencialmente de uno o más genes del grupo que consiste de LDLR, MSMOl, INSIGl, DHRS9 , LRP8 , SQLE, PCSK9 , SCD1, FABP , y combinaciones de los mismos. En algunas modalidades, el uno o más genes de la firma lipogénica FGFR3-regulada comprende, consiste de o consiste esencialmente de uno o más genes del grupo que consiste de SQLE, PCSK9, SCD1, FABP4 , y combinaciones de los mismos. En algunas modalidades, el uno o más genes de la firma lipogénica FGFR3-regulada comprende, consiste de o consiste esencialmente de SQLE. En algunas modalidades, el uno o más genes de la firma lipogénica FGFR3-regulada comprende, consiste de o consiste esencialmente de PCSK9. En algunas modalidades, el uno o más genes de la firma lipogénica FGFR3-regulada comprende, consiste de o consiste esencialmente de SCDl. En algunas modalidades, el uno o más genes de la firma lipogénica FGFR3 -regulada comprende, consiste de o consiste esencialmente de FABP4.
En algunas modalidades de cualquiera de los métodos para seleccionar y/o identificar un antagonista de SCDl, la célula de cáncer, tejido de cáncer o muestra de cáncer expresa niveles elevados de SREBP1 maduro en comparación con una muestra de referencia, célula de referencia, tejido de referencia, muestra testigo, célula testigo, tejido testigo, o testigo interno (por ejemplo, gen de mantenimiento) . En algunas modalidades de cualquiera de los métodos para seleccionar y/o identificar un antagonista de SCDl, la célula de cáncer, tejido de cáncer o muestra de cáncer expresa niveles elevados de SREBP1 maduro y los niveles de SREBP2 maduro no son sustancialmente elevados (esto es, sustancialmente el mismo nivel de expresión) en comparación con una muestra de referencia, célula de referencia, tejido de referencia, muestra testigo, célula testigo, tejido testigo, o testigo interno (por ejemplo, gen de mantenimiento). En algunas modalidades, la muestra de referencia, célula de referencia, tejido de referencia, muestra testigo, célula testigo o tejido testigo es no canceroso con o sin un nivel de expresión conocido de SREBPl maduro y/o SREBP2 maduro. En algunas modalidades, la muestra de referencia, célula de referencia, tejido de referencia, muestra testigo, célula testigo, o tejido testigo es canceroso con o sin un nivel de expresión conocido de SREBPl maduro y/o SREBP2 maduro.
En algunas modalidades de cualquiera de los métodos para seleccionar y/o identificar un antagonista de SCDl, la célula de cáncer, tejido de cáncer o muestra de cáncer expresa niveles elevados de ácidos grasos ?9 monoinsaturados en comparación con una muestra de referencia, célula de referencia, tejido de referencia, muestra testigo, célula testigo, tejido testigo, o testigo interno (por ejemplo, gen de mantenimiento) . En algunas modalidades de cualquiera de los métodos para seleccionar y/o identificar un antagonista de SCDl, la célula de cáncer, tejido de cáncer o muestra de cáncer expresa una proporción elevada de ácidos grasos ?9 monoinsaturados : cidos grasos saturados en comparación con una muestra de referencia, célula de referencia, tejido de referencia, muestra testigo, célula testigo, tejido testigo, o testigo interno (por ejemplo, gen de mantenimiento) . En algunas modalidades, la muestra de referencia, célula de referencia, tejido de referencia, muestra testigo, célula testigo o tejido testigo es no canceroso con o sin un nivel conocido de expresión de ácidos grasos ?9 monoinsaturados y/o ácidos grasos saturados. En algunas modalidades, la muestra de referencia, célula de referencia, tejido de referencia, muestra testigo, célula testigo o tejido testigo es canceroso con o sin un nivel conocido de expresión de ácidos grasos ?9 monoinsaturados y/o ácidos grasos saturados. Ejemplos de ácidos grasos ?9 monoinsaturados incluyen, pero no están limitados a, ácido palmitoleico (C16:l) y ácido oleico (C18:l). Ejemplos de ácidos grasos saturados incluyen, pero no están limitados a, ácido esteárico (C18:0) y ácido palmítico (C16:0).
En algunas modalidades de cualquiera de los métodos para seleccionar y/o identificar un antagonista de SCD1, la célula de cáncer, tejido de cáncer y/o muestra de cáncer comprende señalización de PI3K activada, señalización de mTOR activada y/o señalización de MEK activada. En algunas modalidades de cualquiera de los métodos para seleccionar y/o identificar un antagonista de SCD1, la célula de cáncer, tejido de cáncer y/o muestra de cáncer comprende mutaciones de activación de PI3K. En algunas modalidades de cualquiera de los métodos para seleccionar y/o identificar un antagonista de SCD1, la célula de cáncer, tejido de cáncer y/o muestra de cáncer comprende pérdida y/o mutaciones de PTEN. En algunas modalidades de cualquiera de los métodos para seleccionar y/o identificar un antagonista de SCD1, la célula de cáncer, tejido de cáncer y/o muestra de cáncer comprende mutaciones p85. En algunas modalidades de cualquiera de los métodos para seleccionar y/o identificar un antagonista de SCD1, la célula de cáncer, tejido de cáncer y/o muestra de cáncer comprende mutaciones de activación de AKT. En algunas modalidades de cualquiera de los métodos para seleccionar y/o identificar un antagonista de SCD1, la célula de cáncer, tejido de cáncer y/o muestra de cáncer comprende niveles elevados de AKT fosforilado (por ejemplo, pAKT S473) . En algunas modalidades de cualquiera de los métodos para seleccionar y/o identificar un antagonista de SCD1, la célula de cáncer, tejido de cáncer y/o muestra de cáncer comprende pérdida de TSC1/2 de mutaciones de función.
En algunas modalidades de cualquiera de los métodos para seleccionar y/o identificar un antagonista de SCD1, expresión elevada se refiere a un incremento global de alrededor de cualquiera de 5%, 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o mayor, en el nivel del biomarcador (por ejemplo, proteína o ácido nucleico (por ejemplo, gen o mARN) ) , detectado mediante métodos conocidos en el arte estándares tales como aquellos descritos en la presente, en comparación con una muestra de referencia, célula de referencia, tejido de referencia, muestra testigo. célula testigo o tejido testigo. En ciertas modalidades, expresión elevada se refiere al incremento en nivel de expresión/cantidad de un biomarcador en la muestra, en donde el incremento es de por lo menos alrededor de cualquiera de 1.5X, 1.75X, 2X, 3X, 4X, 5X, 6X, 7X, 8X, 9X, 10X, 25X, 50X, 75X, o 10OX el nivel de expresión/cantidad del biomarcador respectivo en una muestra de referencia, célula de referencia, tejido de referencia, muestra testigo, célula testigo o tejido testigo. En algunas modalidades, expresión elevada se refiere a un incremento global mayor de alrededor de 1.5 veces, alrededor de 1.75 veces, alrededor de 2 veces, alrededor de 2.25 veces, alrededor de 2.5 veces, alrededor de 2.75 veces, alrededor de 3.0 veces, o alrededor de 3.25 veces en comparación con una muestra de referencia, célula de referencia, tejido de referencia, muestra testigo, célula testigo, tejido testigo o testigo interno (por ejemplo, gen de mantenimiento) .
En algunas modalidades de cualquiera de los métodos para seleccionar y/o identificar un antagonista de SCDl, expresión reducida se refiere a una reducción global de alrededor de cualquiera de 5%, 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o mayor, en el nivel del biomarcador (por ejemplo, proteína o ácido nucleico (por ejemplo, gen o mARN) ) , detectado mediante métodos conocidos en el arte estándares tales como aquellos descritos en la presente, en comparación con una muestra de referencia, célula de referencia, tejido de referencia, muestra testigo, célula testigo o tejido testigo. En ciertas modalidades, expresión reducida se refiere a la disminución en nivel de expresión/cantidad de un biomarcador en la muestra, en donde la disminución es por lo menos alrededor de cualquiera de 0.9X, 0.8X, 0.7X, 0.6X, 0.5X, 0.4X, 0.3X, 0.2X, 0.1X, 0.05X, o 0.01X el nivel de expresión/cantidad del biomarcador respectivo en una muestra de referencia, célula de referencia, tejido de referencia, muestra testigo, célula testigo o tejido testigo.
Los efectos inhibidores de crecimiento de un antagonista de SCDl descrito en la presente pueden ser determinados mediante métodos conocidos en el arte, por ejemplo, utilizando células que expresan SCDl ya sea endógenamente o enseguida de la transfección con el (los) gen (es) respectivo (s) . Por ejemplo, líneas celulares de tumor apropiadas y células polipéptido de SCDl-transfectadas puede ser tratado con un antagonista de SCDl descrito en la presente a varias concentraciones por unos pocos días (por ejemplo, 2-7) días y teñido con violeta cristalino o MTT o analizado mediante algún otro ensayo colorimétrico . Otro método para medir la proliferación sería al comparar la absorción de 3H-timidina por las células tratadas en presencia o ausencia un anticuerpo, polipéptido de enlace o molécula pequeña de enlace de la invención. Después del tratamiento, las células son cosechadas y la cantidad de radioactividad incorporada al ADN cuantificada en un contador de centelleo. Testigos positivos apropiados incluyen tratamiento de una linea celular seleccionada con un antagonista inhibidor de crecimiento si se sabe que inhibe el crecimiento de aquella línea celular. La inhibición de crecimiento de células de tumor in vivo puede ser determinada en varias maneras conocidas en el arte .
Métodos para determinar la distribución de la etapa de ciclo celular, nivel de proliferación celular y/o nivel de muerte celular son conocidos en el arte y son descritos en los ejemplos de la presente. En algunas modalidades, el cese del ciclo de célula de cáncer es cese en Gl .
En algunas modalidades, el antagonista de SCD1 inhibirá la proliferación de célula de cáncer de la célula de cáncer, tejido de cáncer o muestra de cáncer in vitro o in vivo por alrededor de 25-100% en comparación con la célula de cáncer, tejido de cáncer, o muestra de cáncer sin tratar, más preferiblemente, por alrededor de 30-100% y aún más preferiblemente por alrededor de 50-100% o alrededor de 70-100%. Por ejemplo, la inhibición de crecimiento puede ser medida a una concentración de antagonista de SCD1 de alrededor de 0.5 a alrededor de 30 g/ml o alrededor de 0.5 nM a alrededor de 200 nM en cultivo celular, en donde la inhibición del crecimiento es determinada 1-10 días después de la exposición de las células de tumor al antagonista candidato de SCD1. El antagonista de SCD1 es inhibidor de crecimiento in vivo si la administración del antagonista candidato de SCD1 a alrededor de 1 ug/kg a alrededor de 100 mg/kg de peso corporal da como resultado una reducción en tamaño de tumor o reducción de proliferación de célula de tumor en alrededor de 5 días a 3 meses desde la primera administración del antagonista candidato de SCD1, preferiblemente en el transcurso de alrededor de 5 a 30 días.
Para seleccionar un antagonista de SCD1 que induce muerte de célula de cáncer, la pérdida de integridad de membrana como se indica mediante, por ejemplo, yoduro de propidio (PI) , azul de tripan o absorción de 7AAD puede ser determinada en relación con una referencia. El ensayo de absorción de PI puede ser efectuado en ausencia de complemento y células efectoras inmunes . Células de tumor que expresan SCD1 son incubadas con el medio solo o el medio que contiene el antagonista de SCD1 apropiado. Las células son incubadas por un período de tiempo de 3 días . Enseguida de cada tratamiento, las células son lavadas y se toman alícuotas en tubos de 35 mm de 12 x 75 tapados por coladera (1 mi por tubo, 3 tubos por grupo de tratamiento) para remoción de los grupos de células. Los tubos reciben luego PI (10 µg/ml) . Las muestras pueden ser analizadas utilizando un citómetro de flujo FACSCAN® y elementos de programación CellQuest FACSCO VERT® (Becton Dickinson) . Aquellos anticuerpos, polipéptidos de enlace o moléculas pequeñas de enlace que inducen niveles estadísticamente significativos de muerte celular son determinados por la absorción de PI pueden ser seleccionados como anticuerpos que inducen muerte celular, polipéptidos de enlace o moléculas pequeñas de enlace. En algunas modalidades, la apoptosis de célula de cáncer es indicada por la activación de caspasa 3 y/o caspasa 7.
Para seleccionar un antagonista de SCDl que se enlaza a un epítope o interactúa sobre un polipéptido enlazando por un anticuerpo de interés, se puede efectuar un ensayo de bloqueo cruzado de rutina tal como aquel descrito en Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lañe (1988) . Este ensayo puede ser usado para determinar si un antagonista de SCDl de prueba se enlaza al mismo sitio o epítope como un anticuerpo conocido. Alternativa o adicionalmente, se puede efectuar el mapeo de epítope mediante métodos conocidos en el arte. Por ejemplo, la secuencia de anticuerpo o polipéptido de enlace puede ser mutagenizada tal como mediante barrido de alanina, para identificar residuos de contacto. El anticuerpo mutante y/o polipéptido de enlace mutante es probado inicialmente en cuanto a enlace con el anticuerpo policlonal o polipéptido de enlace para asegurar el plegado apropiado. En un método diferente, péptidos correspondientes a regiones diferentes de un polipéptido pueden ser usados en ensayos de competencia con los anticuerpos de prueba o polipéptidos de enlace de prueba o con un anticuerpo de prueba o un polipéptido de enlace de prueba y un anticuerpo con un epítope caracterizado o conocido.
En algunas modalidades de cualquiera de los métodos de selección y/o identificación, el antagonista de SCDl candidato es un anticuerpo, polipéptido de enlace, molécula pequeña de enlace o polinucleótido . En algunas modalidades, el antagonista candidato de SCDl es un anticuerpo. En algunas modalidades, el antagonista de SCDl es una molécula pequeña.
En un aspecto, un antagonista de SCDl es probado en cuanto a su actividad de enlace (por ejemplo, actividad de enlace de antígeno) mediante métodos conocidos tales como ELISA, Western blot, etc.
VI. Formulaciones farmacéuticas Formulaciones farmacéuticas de un antagonista de SCDl como se describe en la presente son preparadas al mezclar tales antagonista de SCDl que tienen el grado deseado de pureza con uno o más portadores aceptables farmacéuticamente opcionales (Remington 's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)), en forma de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. En algunas modalidades, el antagonista de SCD1 es una molécula pequeña de enlace, un anticuerpo, polipéptido de enlace y/o polinucleótido . Portadores aceptables farmacéuticamente son en general no tóxicos a los receptores a las dosificaciones y concentraciones empleadas, e incluyen, pero no están limitados a: soluciones reguladoras del pH tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes incluyendo ácido ascórbico y metionina; conservadores (tales como cloruro de octadecildimetilbencil , amonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio; cloruro de bencetonio; fenol, alcohol butílico o bencílico; alquil parabenes tales como metil o propil paraben; catecol; resorcinol; ciclohexanol ; 3-pentanol; y m-cresol) ; polipéptidos de bajo peso molecular (menos de alrededor de 10 residuos) ,- proteínas, tales como albúmina de suero, gelatina, o inmunoglobulinas; polímeros hidrofílieos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina,-monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos incluyendo glucosa, mañosa o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; azúcares tales como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contraiones que forman sal tales como sodio; complejos de metal (por ejemplo, complejos de Zn-proteína) ; y/o surfactantes no iónicos tales como polietilenglicol (PEG) . Portadores aceptables farmacéuticamente ejemplares en la presente incluyen además agentes de dispersión de fármaco intersticiales tales como glucoproteínas de hialuronidasa neutra-activa solubles (sHASEGP) , por ejemplo, glicoproteína de hialuronidasa PH-20 soluble humana, tales como rHuPH20 (HYLENEX®, Baxter International, Inc.). Ciertos sHASEGP ejemplares y métodos de uso, incluyendo rHuPH20, son descritos en la solicitud de patente No. 2005/0260186 y 2006/0104968. En un aspecto, una sHASEGP es combinada con una o más glucosaminoglicanasas adicionales tales como condroitinasas .
Formulaciones liofilizadas ejemplares son descritas en la patente estadounidense No. 6,267,958. Formulaciones acuosas incluyen aquellas descritas en la patente estadounidense No. 6,171,586 y WO2006/044908 , las últimas formulaciones incluyen una solución reguladora del pH de histidina-acetato .
La formulación en la presente puede también contener más de un ingrediente activo como sea necesario para la indicación particular que es tratada, preferiblemente aquellos con actividades complementarias que no se afectan adversamente entre sí. Tales ingredientes activos están apropiadamente presentes en combinación en cantidades que son efectivas para el propósito planeado.
Los ingredientes activos pueden estar atrapados en microcápsulas preparadas por ejemplo mediante técnicas de coacervación o mediante polimerización interfacial, por ejemplo, hidroximetilcelulosa o microcápsulas de gelatina y microcápsulas de poli- (metilmetacrilato) , respectivamente, en sistemas de administración de fármaco coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones , nano-partículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones . Tales técnicas son reveladas en Remington' s Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980) .
Se pueden preparar preparaciones de liberación sostenida. Ejemplos apropiados de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrofóbicos sólidos que contienen el anticuerpo y/o polipéptido de enlace, tales matrices están en forma de artículos formados, por ejemplo películas o microcápsulas.
Las formulaciones a ser usadas para administración in vivo son en general estériles. La esterilidad se puede llevar a cabo fácilmente, por ejemplo, mediante filtración a través de membranas de filtración estériles.
VII. Artículos de Manufactura En otro aspecto de la invención, se provee un artículo de manufactura que contiene materiales útiles para el tratamiento, prevención y/o diagnosis de las alteraciones descritas anteriormente. El artículo de manufactura comprende un recipiente y una etiqueta o inserto de empaque sobre o asociado con el recipiente. Recipientes apropiados incluyen, por ejemplo, botellas, frascos, jeringas, bolsas de solución IV, etc. Los recipientes pueden ser formados de una variedad de materiales tales como vidrio o plástico. El recipiente contiene una composición que es sí misma o combinada con otra composición efectiva para el tratamiento, prevención y/o diagnosis de condición y puede tener una compuerta de acceso estéril (por ejemplo el recipiente puede ser una bolsa de solución intravenosa o un frasco que tiene un tapón perforable por una aguja de inyección hipodérmica) . Por lo menos un agente activo en la composición es un antagonista de SCD1 de la invención. La etiqueta o inserto de empaque indica que la composición es usada para tratar la condición de elección. Además, el artículo de manufactura puede comprender (a) un primer recipiente con una composición contenida en el mismo, en donde la composición comprende un antagonista de SCDl; y (b) un segundo recipiente con una composición contenida en el mismo, en donde la composición comprende un agente citotóxico adicional o de otra manera agente terapéutico.
En algunas modalidades, el artículo de manufactura comprende un recipiente, una etiqueta sobre dicho recipiente, y una composición contenida dentro de dicho recipiente; en donde la composición incluye uno o más reactivos (por ejemplo, anticuerpos primarios que se enlazan a uno o más biomarcadores o sondas y/o cebadores a uno o más de los biomarcadores descritos en la presente) , la etiqueta sobre el recipiente indica que la composición puede ser usada para evaluar la presencia de uno o más biomarcadores en una muestra, e instrucciones para usar los reactivos para evaluar la presencia de uno o más biomarcadores en una muestra. El artículo de manufactura puede comprender además un conjunto de instrucciones y materiales para preparar la muestra y utilizar los reactivos. En algunas modalidades, el artículo de manufactura puede incluir reactivos tales tanto como un anticuerpo primario como secundario, en donde el anticuerpo secundario es conjugado a un marcador, por ejemplo, un marcador enzimático. En algunas modalidades, el artículo de manufactura consiste de una o más sondas y/o cebadores a uno o más de los biomarcadores descritos en la presente.
En algunas modalidades de cualquiera de los artículos de manufactura, el uno o más biomarcadores es FGFR3. En algunas modalidades de cualquiera de los artículos de manufactura, el uno o más biomarcadores es FGFR3 fosforilado.
En algunas modalidades de cualquiera de los artículos de manufactura, el uno o más biomarcadores consiste de uno o más genes de la firma lipogénica FGFR3-regulada. En algunas modalidades, el uno o más genes de la firma lipogénica FGFR3-regulada comprende, consiste de o consiste esencialmente de uno o más genes del grupo que consiste de SREBF1, G6PD, AC0T7, PTPLA, PCCB, FADS1, RDH11, ACER3 , PDSS1, MVD, AGPAT5 , HSD17B2 , ACSL4 , EBP, PIGW, LBR, ACLY, AD0RA2B, GPCPD1, CYP24A1, ACSL3 , MVK, ACSS2 , FDPS, EL0VL5 , HMGCR, LIPG, ME1, DHCR7, LSS, ACAT2, FASN, CYP51A1, IDI1, FDFT1, FAR2 , HMGCS1, SDR16C5 , LDLR, MSMOl, INSIG1, DHRS9, LRP8 , SQLE, PCSK9 , SCD1, FABP4 , y combinaciones de los mismos. En algunas modalidades, el uno o más genes de la firma lipogénica FGFR3-regulada comprende, consiste de o consiste esencialmente de uno o más genes del grupo que consiste de ELOVL5, HMGCR, LIPG, ME1, DHCR7, LSS , ACAT2 , FASN, CYP51A1, IDI1, FDFT1, FAR2 , HMGCS1, SDR16C5 , LDLR, MSMOl, INSIG1, DHRS9, LRP8, SQLE, PCSK9, SCD1, FABP , y combinaciones de los mismos. En algunas modalidades, el uno o más genes de la firma lipogénica FGFR3 -regulada comprende, consiste de o consiste esencialmente de uno o más genes del grupo que consiste de CYP51A1, IDI1, FDFT1, FAR2 , HMGCS1, SDR16C5, LDLR, MSMOl, INSIG1, DHRS9, LRP8, SQLE, PCSK9, SCD1, FABP4, y combinaciones de los mismos. En algunas modalidades, el uno o más genes de la firma lipogénica FGFR3-regulada comprende, consiste de o consiste esencialmente de uno o más genes del grupo que consiste de LDLR, MSMOl, INSIG1, DHRS9, LRP8 , SQLE, PCSK9 , SCD1, FABP4 , y combinaciones de los mismos. En algunas modalidades, el uno o más genes de la firma lipogénica FGFR3-regulada comprende, consiste de o consiste esencialmente de uno o más genes del grupo que consiste de SQLE, PCSK9 , SCD1, FABP4 , y combinaciones de los mismos. En algunas modalidades, el uno o más genes de la firma lipogénica FGFR3-regulada comprende, consiste de o consiste esencialmente de SC4M0L.
En algunas modalidades de cualquiera de los artículos de manufactura, el uno o más biomarcadores es SREBP1 maduro. En algunas modalidades de cualquiera de los artículos de manufactura, el uno o más biomarcadores consiste de ácidos grasos ?9 monoinsaturados . En algunas modalidades de cualquiera de los artículos de manufactura, el uno o más biomarcadores es una proporción de ácidos grasos ?9 monoinsaturados : ácidos grasos saturados. En algunas modalidades de cualquiera de los artículos de manufactura, el uno o más biomarcadores consisten de señalización de PI3K, señalización de mTOR, señalización de EK. En algunas modalidades de cualquiera de los artículos de manufactura, el uno o más biomarcadores es uno o más polimorfismos en genes seleccionados del grupo que consiste de PI3K, PTEN, p85, TSC1/2, y AKT. En algunas modalidades de cualquiera de los artículos de manufactura, el uno o más biomarcadores es AKT fosforilado.
Otros componentes opcionales en el artículo de manufactura incluyen una o más soluciones reguladoras del pH (por ejemplo, solución reguladora del pH de bloqueo, solución reguladora del pH de lavado, solución reguladora del pH de sustrato, etc) , otros reactivos tales como sustrato (por ejemplo, cromógeno) que es químicamente alterado por un marcador enzimático, solución de recuperación de epítope, muestras testigo (testigos positivos y/o negativos) , portaobjeto (s) testigo, etc.
En algunas modalidades de cualquiera de los artículos de manufactura, el antagonista de SCD1 es un anticuerpo, polipéptido de enlace, molécula pequeña de enlace, o polinucleótido. En algunas modalidades, el antagonista de SCD1 es una molécula pequeña. En algunas modalidades, el antagonista de SCD1 es un anticuerpo. En algunas modalidades, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal. En algunas modalidades, el anticuerpo es un anticuerpo humano, humanizado o quimérico. En algunas modalidades, el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo y el fragmento de anticuerpo se enlaza a SCD1.
El artículo de manufactura en esta modalidad de la invención puede comprender además un inserto de empaque que indica que las composiciones pueden ser usadas para tratar una condición particular. Alternativa o adicionalmente, el artículo de manufactura puede comprender además un segundo (o tercer) recipiente que comprende una solución reguladora del pH aceptable farmacéuticamente, tal como agua bacteriostática para inyección (BWFI) , solución salina de pH regulado de fosfato, solución de Ringer y solución de dextrosa. Puede incluir además otros materiales deseables desde el punto de vista comercial y del usuario, incluyendo otras soluciones reguladoras del pH, diluyentes, filtros, agujas y jeringas.
Se comprenderá que cualquiera de los artículos de manufactura anteriores pueden incluir un inmunoconjugado descrito en la presente en lugar de o además de un antagonista de SCD1.
EJEMPLOS Los siguientes son ejemplos de métodos y composiciones de la invención. Se comprenderá que varias otras modalidades se pueden llevar a la práctica, dada la descripción general provista anteriormente.
Materiales y métodos para los ejemplos Cultivo celular, transfección de siARN y reactivos Las líneas celulares de cáncer de vejiga humanas SW780, BFTC-905 y Cal29 fueron obtenidas de ATCC. Las células RT112 fueron compradas de la Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos celulares (DSMZ, Alemania) . Las células RT112 expresan establemente shARN doxiciclina-inducibles que apuntan a FGFR3 o EGFP fueron descritas previamente en (24) . La línea celular de cáncer de vejiga UMUC-14 fue obtenida del Dr. H.B. Grossman (Actualmente en la Universidad de Texas M. D. Anderson Cáncer Center, TX) de la Universidad de Michigan. La línea celular de cáncer de vejiga TCC-97-7 fue una donación del Dr. Margret Knowles del Hospital de la Universidad de St. James' s (Leeds, Reino Unido de la Gran Bretaña) . Las células fueron mantenidas con el medio RPMI complementado con suero bovino fetal al 10% (FBS) (Sigma) , 100 U/ml de penicilina, 0.1 mg/ml de estreptomicina y L-glutamina bajo condiciones de 5% de C02 a 37 °C.
Rapamicina y el inhibidor de PI3K LY294002 fueron obtenidos de Cell Signaling Technology (Danvers, MA) . Un inhibidor de MEKl/1 potente y selectivo PD0325901 (Pfizer) fue comprado de Synthesis Med Chem (San Diego, CA) . El inhibidor de molécula pequeña de SCD1 A37062 fue comprado de BioFine International (Vancouver, Canadá) .
Todos los experimentos de interferencia de ARN se llevaron a cabo con ON-TARGET más siRNA (50nM, Dharmacon, Lafayette, CO) . Las células fueron transíectadas con Lipofectamine RNAiMax (Invitrogen, Carlsbad, CA) , y la proliferación celular o apoptosis fueron determinadas 48 hr o 72 hr después de la transíección.
Arreglo de expresión genética y análisis Células RT112 que expresan shARN doxiciclina-inducible que apuntan a FGFR3 o EGFP fueron cultivadas en placas de 10 cm en presencia o ausencia de doxiciclina (1 µg/ml) por 48 hr. El ARN total de cultivos celulares sub-confluentes fue aislado utilizando el kit RNAeasy (Qiagen) . La calidad de ARN fue verificada al hacer correr las muestras en un dispositivo Agilent Bioanalyzer 2100, y las muestras de calidad suficiente fueron perfilada sobre chips Affymetrix HGU133-Plus_2.0. Estudios de microarreglo fueron efectuados utilizando muestras de ARN por triplicado. La preparación del ARN complementario, hibridizaciones de arreglo, escaneo y análisis de datos de imagen de arreglo subsecuente se hicieron siguiendo el protocolo del fabricante. Los valores de resumen de expresión para todos los conjuntos de sonda fueron calculados utilizando el algoritmo de RMA tal como es implementado en el paquete affy de Bioconductor. Los análisis estadísticos de genes expresados diferencialmente fueron efectuados utilizando modelos lineales y estadísticas moderadas de Bayes empíricas tal como se implementan en el paquete de limma de Bioconductor. Para obtener los procesos biológicos que son sobre-representados por los genes expresados diferencialmente, pruebas hipergeométricas para asociación de categorías de proceso biológico de Ontología Genética (GO) y genes fueron efectuados utilizando los paquetes GOstats y Category. El agrupamiento jerárquico del perfil de expresión fue efectuado utilizando (1 - correlación de Pearson) como la distancia medida y el método de varianza mínima de Ward como el método de aglomeración.
Análisis de RT-PCR Cuantitativos y nivel de expresión de mARN Para detectar transcriptos de SREBP1, SREBP2 , FASN, SCD1, SQLE, y HMGCoA sintasa, se efectuó RT-PCR cuantitativa con ensayos de expresión genética de Taqman pre-diseñado (Applied Biosystems) . Todas las reacciones fueron efectuadas por lo menos por duplicado. La cantidad relativa de todos los mAR fue calculada utilizando el método de CT comparativo después de normalización a RPL19 humano.
Análisis de síntesis de ácido graso total La actividad lipogénica fue determinada al monxtorear la incorporación de [1,2-14C] acetato (Perkin Elmer, Waltham, MA) a ácidos grasos como se reporta (39). [1,2-14C] acetato (0.5 µ??/??? en medio de DMEM con BSA al 0.1%) fue agregado a las células e incubado a 37°C por 4 horas. Las células fueron lavadas dos veces con PBS helado, raspada y sometidas a lisis en KOH al 2%. Los lisados fueron transferidos a un tubo de ensayo y saponificados de la noche a la mañana a 80°C. Esterol y otros lípidos neutros fueron extraídos dos veces con éter dietílico. La fase inferior fue luego neutralizada con HC1 6 N, y mezclada con hexano dos veces para extraer los ácidos grasos. Las fracciones de ácidos grasos fueron recolectados, secadas bajo una corriente de nitrógeno y analizadas mediante conteo de centelleo. La radioactividad de [14C] fue normalizada al contenido de proteína de la muestra.
Ensayo de actividad de SCD1 La actividad de SCD1 fue determinada al monitorear la desaturación de [1-14C] 18:0 estearato (American Radiolabeled Chemicals, St. Louis, MO) o la incorporación de [1,2-14C] acetato a ácidos grasos monoinsaturados . Las células fueron incubadas con los sustratos marcados por 6-8 horas. Los lípidos totales fueron aislados como se describe anteriormente, disueltos en 1 mi de trifluoruro de boro al 14% en metanol, e incubados a 64°C por 6 horas. Después de la adición de 1 mL de agua, los metil ésteres fueron extraídos con 2 mi de hexano y separados mediante cromatografía de capa fina (TLC) sobre una placa de gel de sílice impregnada con argent al 10% utilizando una fase de solvente que consiste de hexano/éter dietílico (85:15, v/v) siguiendo el procedimiento de Wilson y Seargent . Después de la separación, las placas secadas por aire fueron expuestas a la película de rayos X, y los puntos de ácidos grasos en la TLC fueron raspados y contados en cuanto a radioactividad utilizando un espectrómetro de centelleo de líquido. La actividad de SCD1 fue expresada como la proporción de ácido oleico o ácidos de metil éster esteáricos o ácidos palmitoleico sobre ácidos de metil éster palmítico.
Preparación de oleato y palmitato BSA-acomplejado Una solución concentrada de oleato o palmitato 50 mM fue preparada en NaOH 4 mM utilizando la sal de sodio de oleato o palmitato (Sigma-Aldrich) . BSA libre de ácido graso (Sigma-Aldrich) fue preparada en H20 destilada a una concentración final de 4 mM. Un volumen de solución concentrada 50 mM de oleato o palmitato fue combinado con 1.5 volúmenes de BSA 4 mM y calentado a 55 °C por 1 hora para obtener una solución concentrada 20 mM de oleato o palmitato BSA-acomplejado a una proporción de ácido graso/BSA de -8.3:1.
Generación de células estables SW780 que expresan shRNA de SCD1 Tres shARN de SCD1 independientes fueron clonados vector lentiviral pG-pHUSH revelado por Genentech. Información detallada del vector sería provista a petición. La secuencia para shARN de SCD1 usados en los estudios es como sigue: shR Al : 5 ' - GATCCCCCTACAAGAGTGGCTGAGTTTTCAAGAGAAACTCAGCCACTCTTGTAGTTTTTTG GAAA-3 ' (SEQ ID N0:2); shRNA2 : 5'-GATCCCCCTACGGCTCTTTCTGATCATTCAAGAGATGATCAGAAAGAGCCGTAGTTTTTTG GAAA-3' (SEQ ID NO: 3); shRNA3 : 5'- GATCCCCGCACATCAACTTCACCACATTCAAGAGATGTGGTGAAGTTGATGTGCTTTTTTG GAAA-3' (SEQ ID NO: 4) . Todos los constructos fueron confirmados mediante secuenciación. El shARN testigo de EGFP fue descrito previamente (24) . El lentivirus que contiene shAR fue producido al co-transíectar células GNE 293T con empaque de plásmido delta 8.9, plásmido de envolvente VSV-G y constructos de pG-pHUSH-shRNA. Los sobrenadantes virales fueron cosechados 48 y 72 horas después de la transfeccion, y despejados de desechos celulares mediante filtración a través de un filtro de jeringa de 0.45 pm. La transducción lentiviral y selección de células estables fue efectuada como se describe (24) .
Proliferación celular y estudios de apoptosis Para experimentos de AR interferentes pequeños, a 72 horas después de la transfeccion, las células fueron procesadas para incorporación de [Metil-3H] timidina. Para experimentos de shARN doxiciclina- inducibles, las células fueron tratadas con o sin 1 µ9/??1 de doxiciclina por 72 horas antes de incubación adicional con [3H] timidina por 16 horas. Para el experimento inhibidor de moléculas pequeñas de SCD1, las células fueron tratadas con la concentración indicada de A37062 en DMSO o DMSO solo pro 48 horas. La viabilidad celular fue determinada con CellTiter-Glo (Promega) . La activación de caspasa 3 y caspasa 7 fue medida con el kit de ensayo Caspase-Glo 3/7 (Promega) . Los valores son presentados como media +/- SD de cuadrupletes . Los datos son representativos de por lo menos tres experimentos independientes .
Para el análisis de ciclo celular, las suspensiones celulares fueron fijas en etanol al 70% y teñidas con 0.5 mi de yoduro de propidio y solución reguladora del pH de teñido R asa (BD Pharmingen) por 15 minutos a temperatura ambiente. Para análisis de citometría de flujo análisis de apoptosis, se usaron Rojo de MitoTracker y Anexina V Alexa Fluor 488-conjugada para teñir células siguiendo las instrucciones del fabricante (Invitrogen) . El análisis de datos citométricos de flujo y visualización se llevaron a cabo utilizando los elementos de programación FlowJo v8.4 (Tree Star, Inc.) .
Análisis de proteína.
Las células fueron tratadas como se describe en las leyendas de las figuras. Para lisados celulares totales, las células fueron lavadas dos veces con PBS helado y extraídas en solución reguladora del pH RIPA (Millapore, Billerica, MA) complementado con coctel inhibidor de fosfatasa PhosSTOP y cóctel inhibidor de proteasa completo (Roche Applied Science, Indianapolis, IN) . Los lisados fueron despejados de materiales insolubles mediante centrifugación. Para el análisis de expresión de proteína en xenoinjertos de tumor, El lisado de tejidos de tumor fue extraído con solución reguladora del pH de lisis (que consistía de cloruro de sodio 150 mM, Tris 20 mM (pH 7.5), EDTA 2 M, Tritón X-100 al 1%, fluoruro de sodio 10 mM, complementado con inhibidores de proteasa e inhibidores de fosfatasa) al pulverizar los tejidos congelados utilizando el homogenizador FastPrep-24 como se describe por el fabricante (MP Biomedicals, Irvine, CA) .
Para detectar pFGFR3 , FGFR3 fue inmunoprecipitado utilizando un anticuerpo policlonal de conejo (sc-123, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) y analizado mediante electroforesis de gel de dodecil sodio-poliacrilamida (SDS-PAGE) y Western blot . El FGFR3 fosforilado fue determinado con un anticuerpo monoclonal contra fosfo-tirosina (4G10, illipore) o pFGFRY653/645 (#3476, Cell Signaling Technology, Danvers, MA) . Para detectar SCD1 en tejidos de tumor, SCD1 fue inmunoprecipitado de una cantidad igual de lisados utilizando un anticuerpo monoclonal de ratón (GTX19862, GeneTex, Irvine, CA) y sondeado con un anticuerpo de SCD1 de conejo (#2438, Cell Signaling Technology).
Los anticuerpos de absorción primarios usados son FGFR3 (sc-13121, Santa Cruz Biotechnology), SREBP1 (sc-13551, Santa Cruz Biotechnology), SREBP2 (557037, BD Pharmingen) , FRS2 total (sc-8318, Santa Cruz Biotechnology), pAKTT308 (#2214-1, Epitomics) . Los siguientes anticuerpos primarios fueron comprados de Cell Signaling Technology: pFRS2 Y196 (#3864), FASN (#3189), pAKTS473 (#4060), AKT total (#9272), pMAPK (#9101), MAP total (#4695), pS6 (#2211), caspasa 3 escindida (# 9664) , caspasa 3 total (#9665) , caspasa 7 escindida (#9491) , caspasa 7 total (#9492) , y PARP (#9542) . Las inmunoabsorciones fueron visualizadas utilizando un sustrato quimioluminiscente (ECL Plus, Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) .
Estudios de xenolnjerto Ratones con inmunodeficiencia combinada severa CB17 hembra (SCID) , de 6-8 semanas de edad, fueron comprados de Charles River Laboratory (Hollister, CA) . Ratones desnudos atímicos hembra fueron obtenidos de Harían Laboratory (Hayward, CA) . Los ratones fueron mantenidos bajo condiciones libres de patógeno específicas. Células estables shARN SW780 (7 x 106) fueron implantadas subcutáneamente al flanco de ratones CB17.SCID en un volumen de 0.2 mi en HBSS/matrigel (1:1 v/v, BD Biosciences) . Células UMUC-14 (5 xlO6) y células HCT-15 (5 xlO6) fueron implantadas a ratones desnudos atímicos sin matrigel. Para estudios de eficacia, ratones con tumores de un volumen medio de 150 a 200 mm3 fueron agrupados aleatoriamente a cohortes de tratamiento de 8 ó 10. Para estudios de shARN, se administró a los ratones sacarosa H20 o sola o complementada con 1 mg/ml de doxiciclina. El inhibidor de SCD1 A37062 (75 mg/kg) o el testigo de vehículo fue administrado dos veces al día mediante administración por sonda oral por 21 días. Para los experimentos de la Figura 18A-E, diferentes dosis de inhibidores de SCD1 G02447171 y A37062 o el testigo de vehículo fue administrado dos veces al día mediante administración por sonda oral por 21 días. Los resultados de volumen de tumor son presentados como volumen de tumor medio +/- SEM y los datos fueron analizados por la prueba t de Student . Los pesos corporales y medición de calibre fueron tomados dos veces a la semana, y el volumen de tumor fue calculado utilizando la fórmula: V=0.5 a x b2, en donde a y b son la longitud y ancho del tumor, respectivamente. Los resultados de volumen de tumor son presentados como volumen de tumor medio +/- SEM y los datos fueron analizados por la prueba t de Student.
Para analizar la desaturación de ácido graso en tejidos de tumor y plasma de ratón e hígado, las muestras fueron recolectadas al final del estudio de eficacia (2 horas después de la última dosis) y tomados congelados. El perfilado de ácido graso fue efectuado por Microbial ID, Inc (Newark, DE) utilizando un método de preparación de muestra estándar para saponificación y tnetilación. Los metil ésteres de ácido graso fueron extraídos y cargado sobre el cromatógrafo de gases para el análisis. El índice de desaturación fue expresado como la proporción de ácidos de metil éster oleico sobre esteárico o ácidos de metil éster palmitoleico sobre palmítico.
Estadísticas Los datos acumulados fueron expresados como media +/-SEM. Se usaron la prueba t de Student sin aparear (2 colas) por comparación entre dos grupos. Un valor de P<0.05 fue considerado estadísticamente significativo en todos los experimentos .
Ensayos de ¦viabilidad celular y ensayos de actividad de caspasa 3/7 Para el experimento de inhibidor de molécula pequeña de SCD1, las células fueron tratadas con la concentración indicada de A37062 (compuesto de Abbott 4c) o G02447171.1 (compuesto de Daichii 24) en DMSO o DMSO solo por 48-72 horas. La viabilidad celular fue determinada con CellTiter-Glo a 72 horas post-tratamiento (Promega) . La activación de caspasa 3 y caspasa 7 fue medida con el kit de ensayo de Caspase-Glo 3/7 a 48 horas después del tratamiento (Promega) . Los valores son presentados como media +/- SD de cuadrupletes . Los datos son representativos de por lo menos tres experimentos independientes .
Ejemplo 1 : El knockdown de FGFR3 suprime la expresión de genes involucrados en biosíntesis y metabolismo de esterol y ácido graso Utilizando shARN doxiciclina-inducible, el knockdown de FGFR3 en la línea de célula de cáncer de vejiga RT112 atenuó significativamente el crecimiento del tumor in vitro e in vivo como se demuestra previamente en Qing et al. J. Clin. Invest. 119 (5) : 1216-1229 (2009). Para identificar objetivos de FGFR3 potenciales-corriente abajo, el perfil transcripcional de líneas celulares RT112-derivadas que expresan ya sea el shARN testigo o tres shARN de FGFR3 independientes fue comparado. El uso de tres líneas celulares RT112-derivadas que expresan diferentes shARN de FGFR3 proporcionó un testigo para la diferencia no específica en estas líneas celulares establecidas independientemente. Todas las líneas celulares fueron con o sin doxiciclina por 48 horas para agotar la proteína de FGFR3 antes del aislamiento del mARN para el análisis de microarreglo (Figura 2A) . Los genes que fueron expresados diferencialmente (proporción de descubrimiento falso < 0.1, veces de cambio > 2) después de la inducción de doxiciclina en toda las tres líneas celulares de shARN de FGFR3 pero no en las células shARN testigo fueron consideradas genes FGFR3-regulado potenciales (Figura 1) . Entre los 19,701 genes representados en el arreglo, 313 genes mostraron expresión diferencial consistente en respuesta a al knockdown de FGFR3, con 196 regulados hacia arriba y 117 regulados hacia abajo (Figura 2A y Figura 1; véase también Tabla 2) .
La clasificación funcional de estos genes FGFR3-modulados reveló que una gran fracción de los genes significativamente regulados hacia abajo (con un valor p < 0.01) codifican un cohorte de enzimas y proteínas que están involucradas en la biosíntesis y metabolismo de ácido graso y esterol (Figura 2B) . SCD1, una enzima limitante de velocidad que cataliza la conversión de ácidos grasos saturados a ácidos grasos monoinsaturados , estuvo entre los genes que muestran el mayor decline (hasta 3.85 veces, Figura 2B) . Este grupo también incluyó ácido graso sintasa (FASN) , hidroximetilglutaril-coenzima A sintasa 1 (HMGCS1) , y escualeno epoxidasa (SQLE) (Figura 2B) . Los resultados del microarreglo fueron confirmados adicionalmente utilizando análisis de RT-PCR cuantitativa (qRT-PCR) del nivel de abundancia de mAR de genes representativos (Figura 2C y D) . Además, la regulación FGFR3-dependiente de estos genes lipogénicos fue también verificada en la línea celular de cáncer de vejiga UMUC-14 con el knockdown de FGFR3 AR interferente corto (siAR ) -moderado (Figura 3A y B) . Conjuntamente, estos datos sugieren un efecto mayor de la señalización de FGFR3 sobre las rutas de biosíntesis y metabolismo de esterol y lípido.
Además, un anticuerpo anti-FGFR3 específico, R3 ab, redujo la expresión de genes lipogénicos en el xenoinjerto de tumor UMUC-14. Los tumores de xenoinjerto UMUC-14 fueron tratados con un anticuerpo testigo (Ctrl Ab) o R3Mab, y los te idos de tumor fueron cosechados al día 5. El ARN total fue aislado de tejidos de tumor para el análisis de microarreglo. Los genes muestran modulación significativa por R3Mab en comparación con Ab testigo fueron analizados adicionalmente . Todos los genes e incluyendo además SC4M0L fueron regulados hacia abajo similarmente al usar knockdown de FGFR3 si-ARN-moderado .
Puesto que un gran número de estos genes de lipogenesis identificados en el estudio de arreglo de expresión son regulados por la familia de SREBP de factores transcripcionales principales, el nivel de mAR de SREBP1 y SREBP2 fueron examinados utilizando qRT-PCR y se encontró que el knockdown de FGFR3 en células RT112 reducía moderadamente el nivel de mARN de SREBP1 por alrededor de 50%, y no tuvo ningún efecto sobre el nivel de SREBP2 (Figura 2E) . Se observaron resultados similares en células UMUC-14 transfectadas con siARN de FGFR3 (Figura 3C) . Estos datos elevaron la posibilidad de que la señalización de FGFR3 puede regular de novo la lipogenesis en parte por medio de SREBP1.
Ejemplo 2: El knockdown de FGFR3 inhibe la síntesis y desatTiración de ácido graso En base al microarreglo y resultado de qRT-PCR, el papel de la señalización de FGFR3 en la regulación de lipogenesis y la consecuencia celular fue investigada. Primero, la expresión de SREBP1 y activación después del knockdown de FGFR3 fue examinada. Es conocido que en respuesta a la privación de colesterol y ácido graso, SREBP1 sufre escisión proteolítica N- erminal y subsecuente translocación nuclear para producir la inducción transcripcional de enzimas lipogénicas. La inducción de shARN de FGFR3 mediante doxiciclina disminuyó el nivel de proteína de FGFR3 (Figura 4A) . El tratamiento con doxiciclina también redujo la plena longitud también como la forma madura escindida de SREBP1, pero no tuvo ningún efecto sobre la plena longitud de SREBP2 procesado (Figura 4A) . Una reducción moderada en FASN y una disminución pronunciada en el nivel de SCDl fueron observados en células que expresan shARN de FGFR3 , pero no en células shARN testigo (Figura 4A) . El análisis adicional de células RT112 incubadas con [1,2-14C] acetato reveló que el knockdown de FGFR3 redujo notablemente la síntesis de ácido graso (Figura 4B) . Consistente con esta observación, un tratamiento de 24 horas de células UMUC-14 con el anticuerpo específico anti-FGFR3, R3Mab (véase WO 2010/111367, que es incorporada por referencia en su totalidad) , también redujo el nivel de la forma de plena longitud y forma activa procesada de SREBP1, también como la expresión de FASN y SCDl (Figura 5A) . Similarmente, la síntesis de ácido graso total fue reducida por R3Mab en células UMUC-14 (Figura 5B) .
Puesto que el knockdown de FGFR3 casi abolió la expresión de SCDl y SCDl es la enzima limitante de la velocidad en la biosíntesis del ácido graso monoinsaturado, el efecto de shARN de FGFR3 sobre la desaturación de ácido graso fue examinado utilizando ácido esteárico [14C] -marcado. shARN de FGFR3 bloqueó la producción de ácido oleico insaturado del precursor de ácido esteárico saturado, mientras que el shARN testigo no tuvo ningún efecto (Figura 4C y D) . Conjuntamente, estos resultados sugieren que la inhibición de FGFR3 provocó una reducción marcada de la síntesis y desaturación de ácido graso de novo, acompañada por una expresión de SREBP1 disminuida y/o escisión también como una reducción de enzimas lipogénicas clave incluyendo FASN y SCD1.
Ejemplo 3: La señalización de FGFR3 activa SREBP1 y promueve la síntesis de ácido graso de novo por medio de PI3K-mTORCl Para disectar los circuitos moleculares subyacentes a la regulación de FGFR3 de la lipogenesis de novo, la señalización de FGFR3 en células de cáncer de vejiga fue activada con FGF1 y la expresión y escisión de SREBP1 fue analizada. La línea de célula de cáncer de vejiga Cal29 expresa un alto nivel de FGFR3 endógenamente y el tratamiento con FGF1 indujo una fosforilación robusta y activación de FGFR3 y efectores de señalización corriente debajo de manera dependiente del tiempo y la dosis (Figura 6A y Figura 7A) . En tanto que FGF1 no afectó el nivel de proteína de 1SREBP1 inactiva de plena longitud, la forma activa escindida de SREBPl fue sustancialmente alta después de tratamiento con 2 horas y la acumulación sostenida por todo el curso del experimento a 24 horas (Figura 6A) . En contraste, ni SREBP2 de plena longitud ni el SREBP2 procesado fue afectado. Similarmente, el nivel de proteína de SCDl y FASN a una menor extensión, fueron inducidos por FGF1 (Figura 6A) . Consistente con estos cambios, FGF1 incrementó la síntesis de ácido graso total después de incubación 24 horas (Figura 6B) . El análisis de fraccionamiento reveló que tanto los ácidos grasos saturados como insaturados eran inducidos por FGF1 (Figura 6B) . Resultados similares fueron observados en células RT112 con una cinética más lenta, con incremento moderado en SREBPl de plena longitud y la acumulación de SREBPl activo se proyectó alrededor de 24 horas post-tratamiento (Figura 7B, C y D) .
Para determinar si la inducción de enzimas lipogénicas tales como SCDl mediante estimulación de FGF1 depende del SREBPl activo procesado, la expresión de SREBPl o SREBP2 fue agotada utilizando siARN en células RT112. El siARN que apunta a SREBPl redujo marcadamente tanto la expresión de SCDl basal como FGF1-inducido, mientras que el knockdown de de SREBP2 solo no tuvo ningún efecto (Figura 6C) . De interés, el apuntamiento tanto de SREBPl como de SREBP2 casi abolió completamente la expresión de SCDl (Figura 6C) , sugiriendo que aunque que SREBP1 juega un papel dominante en regular la expresión de SCDl , tanto SREBP1 como SREBP2 contribuyen a la inducción máxima de SCDl después de la estimulación de FGFl. Similarmente , la inducción de FASN también depende tanto de SREBP1 como de SREBP2, SREBP1 juega un papel más prominente (datos no mostrados) .
Para determinar la implicación de las cascadas de señalización corriente debajo de FGFR3 en la regulación de lipogenesis, la señalización de FGFR3 canónica fue bloqueada farmacológicamente en múltiples nodos con el inhibidor de PI3K Ly294002, el inhibidor de mTORCl rapamicina, y un inhibidor de MEKl/2 potente y selectivo PD325901. En células de cáncer de vejiga RT112, cada inhibidor detuvo la activación FGFl-inducida de su objetivo propuesto, tal como se determina por la fosforilación de AKT, S6 y MAPK respectivamente (Figura 8A) . En tanto que los inhibidores produjeron un efecto mínimo sobre la expresión de la proteína de SREBP1 de plena longitud, todos redujeron tanto el nivel basal como el FGFl-inducido del SREBP1 activo escindido (Figura 8B) . Coordinadamente, la expresión de SCDl fue disminuida significativamente por cada uno de los inhibidores, el inhibidor de PI3K Ly294002 muestra la inhibición más fuerte. La expresión de FASN fue reducida solo moderadamente por cada uno de los inhibidores (Figura 8B) . El tratamiento de las células RT112 con los inhibidores suprimió notablemente la síntesis de ácido graso total estimulada por FGF1, Ly294002 y PD325901 muestran el efecto inhibidor más potente (Figura 8C) . Es valioso notar que en células de cáncer de vejiga Cal29, rapamicina y Ly294002 bloquearon la acumulación de SREBP1 activo y la expresión de SCD1, consistente con los resultados observados de células RT112 (Figura 9) . Sin embargo, en células Cal29, el inhibidor de MEK1/2 selectivo PD325901 solo redujo parcialmente la acumulación FGF1- inducida de SREBP1 activo y no tuvo mucho efecto sobre la inducción de SCD1 (Figura 9) . Así, en células de cáncer de vejiga, FGFR3 principalmente señala por medio del eje PI3K-mTORCl para promover la escisión y activación de SREBP1, dando como resultado lipogenesis de novo elevada y desaturación de ácido graso. La contribución de la ruta de MEK-MAPK puede ser dependiente de la línea celular y/o dependiente del contexto.
Ejemplo 4: El knockdown siARN-moderado de SCD1 bloquea el avance del ciclo celular e induce apoptosis en células de cáncer de vejiga con señalización de FGFR3 activo La lipogenesis de novo es necesaria para células que proliferan rápidamente para formar nuevas membranas y organelos, un pre-requisito para el crecimiento y proliferación celular. Los lípidos y su intermediario metabólico pueden también regular la transducción de señal por medio de lipidación de moléculas de señalización, modulación de localización celular de proteínas, o sirviendo como segundos mensajeros. Así, se ha postulado que en ciertos tipos de cáncer, incluyendo pecho, próstata y glioblastomas , depende de la síntesis de ácido graso de novo para la proliferación celular incontrolada y supervivencia (33) . Para examinar la importancia de lipogenesis FGFR3 -estimulada en el crecimiento del tumor de vej iga y para explorar el potencial de la ruta lipogénica como objetivo terapéutico, la proliferación celular enseguida del knockdown siARN-moderado de SREBP1, FASN y SCDl fue determinado. Los estudios iniciales revelaron que los siARN de SCDl producían el efecto anti-proliferativo más fuerte y por consiguiente, SCDl fue investigado adicionalmente (datos no mostrados) .
Un panel de líneas celulares de cáncer de vejiga fue usado en este estudio (Tabla 3) . Células UMUC-14 y TCC-97-7 albergan FGFR3S249C, la mutación de activación más frecuente en FGFR3 (24) . Aunque la línea celular SW780 contiene FGFR3 tipo silvestre, muestra activación de FGFR3 -FRS2 -AKT constitutiva (datos no mostrados) . Múltiples siARN de SCDl redujeron el nivel de proteína de SCDl, siARN4 siendo menos efectivo (Figura 10A y B) . El knockdown de SCDl suprimió marcadamente la incorporación de [3H] timidina por las células con FGFR3 constitutivamente activado, incluyendo células SW780, UMUC-14 y TCC-97-7 (Figura 10A y B; Figura 11A) . En contraste, las células RT112 y BFTC-905 contienen FGFR3 tipo silvestre, y los siARN de SCDl no tuvieron ningún efecto evidente sobre su proliferación (Figura 11A) . Estos resultados sugieren que la célula con señalización de FGFR3 constitutivamente activa pueden depender más de la actividad de SCDl para la proliferación y supervivencia.
Tabla 3. Estatus mutacional de F6FR3 en lineas celulares de cáncer de vejiga en respuesta al knockdown de SCDl Análisis adicionales de células SW780 que crecen exponencialmente reveló que a 48 horas post-knockdown de SCDl, el porcentaje de células en fase G2 y S del sitio celular fue sustancialmente y específicamente reducido, con incremento concomitante de células en fase Gl (Figura 10C) . Puesto que una población sub-diploide inició aparecer a 72 horas post-knockdown de SCDl (datos no mostrados) , el efecto de los siARN de SCDl sobre la apoptosis fue analizado. El knockdown de SCDl incrementó significativamente las poblaciones celulares teñidas positivas por Anexina-V en células SW780 (Figura 10D) y células UMUC-14 (Figura 11B) . Estudios adicionales de la caspasa efectora revelaron que el knockdown de SCDl dio como resultado la escisión y activación de caspasas 3 y 7, también como su objetivo corriente abajo PARP (Figura 10E) . Consistente con esta observación, los siARN de SCDl provocaron una actividad enzimática más alta de las caspasas 3 y 7 en estas células (Figura 11C y D) . De aquí, el efecto inhibidor del knockdown de SCDl sobre las células de cáncer de vejiga con señalización de FGFR3 activada es debido tanto el bloqueo de avance del ciclo celular como la inducción de apoptosis.
Ejemplo 5: Los siARN de SCDl inhiben la proliferación celular de manera dependiente de la desaturacion de ácido graso Puesto que SCDl es la enzima limitante de la velocidad en la biosíntesis del ácido graso monoinsaturado, el efecto de los siARN de SCDl sobre la desaturación de ácido graso fue determinada. Usando cromatografía de capa delgada de argentación, se encontró que el knockdown de SCDl bloqueaba marcadamente la conversión de [14C] -estearato a oleato (Figura 12A y B) , mientras que los siARN testigo no específicos o FASN no tuvieron ningún efecto. La inhibición sobre la proliferación celular puede ser debida a la deficiencia de la producción de ácido graso monoinsaturado, el oleato provisto exógenamente puede ser apto de rescatar las células . Por supuesto, el oleato complementa la inhibición de crecimiento moderada por siARN de SCDl inversa de manera dependiente de la dosis tanto en células SW780 como UMUC-14, mientras que la adición de regreso de palmitato falló en el rescate (Figura 12C y D; Figura 13A-C) . Es valioso notar que la alta concentración de palmitato (20 µ?) es perjudicial a la viabilidad de estas células (Figura 12D; Figura 13C) . De aquí, la desaturación de ácido graso moderada por SCDl es esencial para la proliferación y supervivencia de cáncer de vejiga.
Ejemplo 6: El knockdotm doxiciclina-inducible de SCDl atenuó el crecimiento del tumor in vivo Con el fin de evaluar el efecto de SCDl sobre el crecimiento del tumor en modelos de animales, células SW780 estables que expresan shARN de SCDl doxiciclina-inducible fueron establecidas . La inducción de tres shARN de SCDl independientes mediante doxiciclina disminuyó la expresión de SCDl, mientras que la expresión de un shARN testigo que apunta a EGFP no tuvo ningún efecto (Figura 14A) . El tratamiento con doxiciclina redujo la incorporación de [3H] timidina por las células que expresan shARN de SCDl, pero no shARN testigo (Figura 14B) , confirmando que el knockdown de SCDl inhibe la proliferación celular.
El efecto de los shARN de SCDl sobre el crecimiento de xenoinjertos de tumor pre-establecidos SW780 en ratones fue evaluado. El knockdown de SCDl suprimió sustancial y específicamente el crecimiento del tumor en comparación con células que expresan el shARN testigo (Figura 14C) . El análisis de muestras de tumor del día 20 confirmaron el knockdown de SCDl efectivo sobre la inducción por doxiciclina de shARN de SCDl (Figura 14D) . Estos resultados demuestran que SCDl es críticamente importante tanto in vitro como in vivo para el crecimiento de células de cáncer de vejiga de SW780.
Ejemplo 7: Inhibición farmacológica de SCDl atenuó el crecimiento del tumor y redujo la desaturación de ácido graso en ratones Para examinar adicionalmente la importancia de desaturación de ácido graso en el crecimiento del tumor, la actividad enzimática de SCDl fue bloqueada farmacológicamente con un inhibidor de molécula pequeña A37062. Este compuesto bloqueó la conversión de ácido [1C] esteárico a ácido oleico (datos no mostrados) , y suprimió la síntesis del ácido graso monoinsaturado de [14C] acetato, con un valor de IC50 de 30 nM (Figura 15A) . El tratamiento de las células UMUC-14 con el inhibidor de SCDl dio como resultado la reducción de AKT fosforilado y la escisión y activación de caspasas efectoras 3 y 7, también como su objetivo PARP (Figura 15B) .
La especificidad y selectividad de A37062 fue también evaluada. Bajo condición de crecimiento normal, A37062 suprimió la proliferación de múltiples líneas de células de cáncer de vejiga e indujo apoptosis en el cultivo (datos no mostrados) . A37062 100 nM redujo la viabilidad de las células UMUC-14 por aproximadamente 85% (Figura 15C y D) . El oleato complementado exógenamente invirtió el efecto inhibidor de crecimiento de manera dependiente de la dosis (Figura 15C) , mientras que el palmitato falló en rescatar las células (Figura 15D) . Resultados similares fueron observados en células SW780 (Figura 16A-B) . Estos datos sugieren fuertemente que el inhibidor A37062 es SCDl-específico, y su efecto inhibidor sobre la proliferación celular y supervivencia es debido a la deficiencia en la generación del ácido graso monoinsaturado .
Enseguida, el efecto de A37062 sobre el crecimiento de células de cáncer de vejiga in vivo fue examinado. Ratones desnudos atímicos fueron inoculados con células UMUC-14, se permite que los tumores crezcan a un volumen medio de -150 mm3, y se dosificó a los animales dos veces al día con vehículo o A37062 (75 mg/kg) por 20 días. En comparación con el testigo de vehículo el día 20, A37062 suprimió el crecimiento del tumor por alrededor de 60% (Figura 15E) . El análisis de los lisados de tumor recolectados a 2 horas después del último tratamiento demostró que A37062 disminuyó notablemente la proporción de ácido graso monoinsaturado a ácido graso saturado (Figura 15F y G) . Similarmente , la desaturación de ácido graso en hígado y plasma de ratón fue significativamente reducida demasiado (Figura 15F y G) . Así, A37062 inhibe el crecimiento de xenoinjertos de tumor de U UC-14 en conjunción con un bloqueo en desaturación de ácido graso. En el curso de los experimentos, no se observó ninguna pérdida de peso significativa u otra anormalidades gruesas en los ratones desnudos .
Ejemplo 8 : Estudios de eficacia in vivo utilizando inhibidores de molécula pequeña de SCDl Para investigar el efecto de antagonistas de molécula pequeña de SCDl sobre líneas de células de cáncer de colon, pancreático y de riñon, líneas de célula de cáncer de colon, líneas de células de cáncer pancreática y líneas de células de cáncer de riñon fueron tratadas con A37062 diluido serialmente por 72 horas y la viabilidad celular fue medida mediante CellTiter-Glo (Promega) como se describe anteriormente. Además, líneas de células de cáncer de colon, líneas de células de cáncer pancreático y líneas de células de cáncer de riñon fueron tratadas con A37062 diluido serialmente por 48 horas y la actividad de caspasas 3/7 fue medida mediante el kit de ensayo Caspase-Glo 3/7 (Promega) como se describe anteriormente . La inhibición farmacológica de SCD1 redujo la viabilidad celular e incremento la actividad de caspasa 3/7 en líneas de células de cáncer de colon humanas (figuras 17A y B) en líneas de células de cáncer de pancreático humanas (figuras 17C y D) y en líneas de células de cáncer de riñon humanas (figuras 17E y F) . Los datos fueron representados como media +/- SD y son representativos de dos experimentos independientes.
Para investigar el efecto de antagonistas de molécula pequeña de SCD1 adicionales, líneas de células de cáncer humano, incluyendo cáncer de colon, próstata, pancreático y vejiga fueron tratadas con A37062 diluido serialmente o G02447171.1 por 72 horas y la viabilidad celular fue medida mediante CellTiter-Glo (Promega) . La inhibición farmacológica de SCD1 utilizando A37062 o G02447171.1 redujo la viabilidad celular e incremento la actividad de caspasa 3/7 en un panel de líneas de células de cáncer humanas, incluyendo cáncer de colon, próstata, pancreático y vejiga (figura 18A y B, respectivamente) . Los datos son representados como media +/-SD y son representativos de dos experimentos independientes .
Para investigar el efecto de antagonista de molécula pequeña de SCD1 sobre líneas de células de cáncer fueron tratadas con A37062 diluidos serialmente por 72 horas el titulo celular IC50 (nm) y la viabilidad celular fue medida mediante CellTiter-Glo (Promega) como se describe anteriormente . Véase tabla 4.
Tabla 4 Para investigar el efecto de antagonistas de molécula pequeña de SCD1 sobre crecimiento del tumor en ratones, se administró a los ratones con vehículo o inhibidores de molécula pequeña de SCD1 G01522403 (A37062) y G02447171 oralmente, dos veces al día como se describe anteriormente. La inhibición farmacológica de SCD1 retardo el crecimiento del xenoinjerto de tumores de colon HCT15 colon preestablecidos, tumores de vejiga SW780 pre-establecidos y tumores pancreáticos de HPAC preestablecidos (figuras 18C, D, y E, respectivamente) . El volumen del tumor fue presentado como media +/- SEM. Véase también tabla 5.
Tabla 5 Ejemplo 9: Inhibición farmacológica de SCD1 atenuó la viabilidad de célula de tumor Para investigar el efecto de antagonista de molécula pequeña de SCD1 adicionales, HT29 y HCT15 fueron tratadas con inhibidores de molécula pequeña diluidos serialmente RG1-14 y G02447171 (G7171) por 72 horas y la viabilidad celular fue medida mediante CellTiter-Glo (Promega) . La especificidad y selectividad de los inhibidores de molécula pequeña de SCD1 fue también evaluada. Véanse tablas 6-9. Bajo condición de crecimiento normal, los antagonistas de SCD1 de molécula pequeña suprimieron la proliferación de células HT29 y HCT15 (figura 19A-D) . El oleato complementado exogenamente invirtió el efecto inhibidor de crecimiento de manera dependiente de la dosis (figura 20A-C y 21A-C) , mientras que el palmitato fallo en rescatar a las células (figura 20D-F y 21D-F) .
Tabla 6-Experimento 1 HCT15 5 10 15 Tabla 7-Experimento 2 HCT 15 25 5 Tabla 8-Experimento 1 HT29 15 20 25 Tabla 9-Experimento 2 HT29 Discusión de los ejemplos Los ejemplos muestran que FGFR3 señala por medio de PI3K-mTORCl para activar SREBP1 y sus objetivos corriente abajo para promover la lipogénesis del novo y desaturación de ácidos grasos en células de cáncer de vejiga humanas. Además, la intervención genética o farmacológica para bloquear la desaturación de ácido graso catalizada por SCD1 se encontró que inhibe profundamente el crecimiento del tumor en cultivo celular y en ratones xenoinj ertados . Estos resultados revelan por primera vez la importancia del metabolismo de l pido FGFR3-regulado en el mantenimiento del crecimiento del tumor de vejiga y supervivencia, proporcionando un enlace mecánico entre la señalización del factor del crecimiento oncogénico con metabolismo celular alterado.
Un hallazgo sorprendente del análisis de expresión sin procesar es que un gran cohorte de genes involucrados en la síntesis y metabolismo de esterol y ácidos graso están entre los genes más prominentemente regulados hacia abajo como resultado del knockdown de FGFR3 en células de cáncer de vejiga. Los ejemplos demuestran adicionalmente que la activación de la señalización de FGFR3 incremento la cantidad de SREBPl escindido, transcripcionalmente activo, que a su vez indujo la expresión de enzimas lipogénicas clave y promovió la síntesis de novo de ácido graso, incluyendo ambas clases saturadas e insaturadas . Estos resultados son reminiscentes con un reporte reciente que muestra la señalización de EGFR activada en glioblastoma promueve la lipogénesis vía estimulación del proceso de SREBPl (35) . Estos hallazgos son consistentes con y extienden estudios anteriores que muestran que la activación de EGFR y Her2 inducen la expresión de FASN en líneas celulares de cáncer de pecho (36-38) . Dado que los factores de crecimiento tales como EGF y PDGF son aptos de promover la activación y lipogénesis de SREBPl en fibroblastos (39) y células epiteliales (40-41) , es concebible que la lipogénesis estimulada por la señalización del receptor del factor de crecimiento oncogénico podría ser un mecanismo común subyacente a la síntesis de ácido graso elevada en muchos tipos de cáncer.
En respuesta al bajo nivel de esterol intracelular o estimulación de insulina, SREBPl es activado por la escisión proteolítica y el fragmento N-terminal maduro que transloca al núcleo para activar la transición de una cascada de genes lipogénicos (32) . Los factores de crecimiento y sus receptores potencialmente pueden activar SREBPl por medio de múltiples mecanismos, incluyendo regulación hacia arriba transicional , procesamiento proteolítico incrementado o SREBPl escindido estabilizado al inhibir la ubiquitinación moderada por GSK3-Fbw7 y degradación proteasomal (33) . Los ejemplos demuestran que la activación de FGFR3 ligando-inducida solamente tiene un efecto menor en la inducción del SREBPl inactivo de plena longitud, mientras que la forma activa escindida de SERBP1 acumula significativamente. Además, la inhibición farmacológica aguda de la señalización de FGFR3 canónica ya sea por uno u otro del inhibidor de PI3K o mTORCl disminuye marcadamente el nivel de SREBPl madurado sin afectar aquel del SREBPl inactivo de plena longitud. Estos datos sugieren que la activación impulsada por FGFR3 de SREBPl se articula principalmente sobe el incremento selectivo de SREBPl madurado mediante PI3K o mTORCl. Este hallazgo es consistente con varios estudios recientes en células que sobreexpresan myr-AKT (42. o fibroblastos embriónicos de ratón con hiperactivación constitutiva de mTORC vía ablación genética de TSC (43) . Otra observación notable de este estudio es la contribución diferencial de MEK-MAPK a la activación de SREBPl FGF1-estimulada en diferentes líneas celulares. Esto es consistente con estudios previos que muestran resultados aparentemente contradictorios de la implicación de MEK-MAPK en la activación de SREBPl por receptores de factor de crecimiento, sugiriendo que la regulación por MEK-MAPK de SREBPl podría ser altamente dependiente del contexto (37, 39-41) . Los mecanismos exactos de como la señalización de FGFR3 regula el procesamiento de SREBPl y/o estabilidad espera investigaciones adicionales.
Un hallazgo importante del estudio actual es que SCD1, la enzima limitante de la velocidad en la desaturación de ácido graso, está entre los genes que demostraron maduración más dramática mediante knockdown de FGFR3 en células de cáncer de vejiga. Así, FGF1 indujo un incremento pronunciado en expresión de SCD1 y la síntesis de ácidos grasos insaturados . Esta regulación es moderada principalmente por medio de SREBPl, puesto que el siARN de SREBPl redujo notablemente la expresión de SCD1 basal y la expresión de SCD1 inducida por FGF1, mientras que el knockdown de SREBP2 solo no tuvo ningún efecto aparente sobre la expresión de SCDl. Además, los ejemplos indican que SCDl es esencial para mantener la proliferación y supervivencia de células de cáncer de vejiga con FGFR3 constitutivamente activado. La inhibición de SCDl por medio de interferencia de ARN o intervención farmacológica bloqueo la desaturación de ácido graso, dando como resultado en el cese del ciclo celular de Gl y apoptosis subsecuente. Además, el ácido oleico complementado exogenamente es apto de rescatar las células de la inhibición de SCDl, confirmando la importancia de la desaturación del ácido graso en la proliferación y supervivencia celular. Finalmente, la inhibición de SCDl atenuó marcadamente el crecimiento de varios xenoinjertos de cáncer de vejiga en ratones. Así, la importancia de la función de SCDl en mantener el crecimiento del tumor de vejiga sugiere como un nuevo objetivo terapéutico potencial en este ajuste de enfermedad. Aunque los ejemplos con un panel de líneas celulares limitado sugiere que las células con FGFR3 constitutivamente activado son más sensibles a la inhibición de SCDl, no es claro si el estatus de activación de FGFR3 per se puede predecir la respuesta a la terapia a base de SCDl. Puesto que el eje de PI3K-AKT-mTORCl y a una menor extensión, MEK-MAPK, fueron aptos de promover la lipogénesis y actividad de SCDl, alteraciones en las rutas de señalización corriente abajo de FGFR3 o la desregulación en otras cinasa de tirosina de receptor pueden impactar la respuesta a la terapia SCDl-apuntada .
Varios estudios recientes han reportado que este SCDl es sobreexpresado y esencial para el crecimiento del tumor en otras malignidades, incluyendo cáncer de pulmón y cáncer de próstata (44-46) y el índice de desaturación de ácido graso en cáncer de próstata se correlaciona con el avance de enfermedad (45) . Aunque los mecanismos fundamentales de la regulación hacia arriba de SCDl en estas enfermedades todavía no han sido delineados (45-48) , esto datos sugieren que SCDl puede jugar un papel más amplio en tumorigénesis, en parte al controlar la biogénesis de membrana durante la división celular y transducción de señal en diversas rutas importantes para la proliferación, supervivencia celular y adaptación a esfuerzo.
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Aunque la invención anterior ha sido descrita en algún detalle a manera de ilustración y ejemplo por propósito de calidad y entendimiento, la descripción y ejemplos no deben ser interpretados como limitantes del alcance de la invención. Las revelaciones de todas las solicitudes de patentes y científicas citadas en la presente son incorporadas expresamente en su totalidad por referencia.
Tabla 3 · Cohorte de genes involucrados en biosintesis de coleslerol y lípido reprimidos en células Knockdown FGFR2 GEN Acceso Refseq Acceso Genbank GEN Acceso Refseq ; Acceso Genbank GEN Acceso efs«q Acceso Genbank GEN Acceso Refseq Acceso Genbank

Claims (42)

REIVINDICACIONES
1. Un método para inhibir la proliferación celular de una célula de cáncer que comprende poner en contacto la célula de cáncer con una cantidad efectiva de un antagonista de SCDl.
2. Un método para inhibir la proliferación celular de una célula de cáncer que comprende administrar al individuo una cantidad efectiva de un antagonista de SCDl.
3. Un método para inducir el cese del ciclo celular de una célula de cáncer, que comprende poner en contacto la célula de cáncer con una cantidad efectiva del antagonista de SCDl.
4. Un método para inducir el cese de ciclo celular de una célula de cáncer en un individuo, que comprende administrar al individuo una cantidad efectiva de un antagonista de SCDl
5. Un método para promover apoptosis de una célula de cáncer, que comprende poner en contacto la célula de cáncer con una cantidad efectiva del antagonista de SCDl.
6. Un método para promover la apoptosis de cuna célula de cáncer en un individuo, que comprende administrar al individuo una cantidad efectiva de un antagonista de SCDl.
7. Un método para tratamiento de una célula de cáncer en un individuo, que comprende administrar al individuo una cantidad efectiva de un antagonista de SCDl.
8. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en donde la célula de cáncer es una célula endometrial, una célula de cáncer de cabeza y cuello, una célula de cáncer de riñon, una célula de riñon de ovario, una cáncer de colon, una célula de cáncer pancreático, una célula de cáncer urinario o una célula de cáncer de vejiga.
9. El método de la reivindicación 8, en donde la célula de cáncer es una célula de cáncer de riñon, célula de cáncer pancreático o célula de cáncer de vejiga.
10. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en donde la célula de cáncer expresa niveles elevados de uno o más biomarcadores en comparación con una muestra de referencia, célula de referencia, tejido de referencia, muestra testigo, célula testigo, tejido testigo o testigo interno (por ejemplo, gen de mantenimiento) .
11. Un método para tratamiento de cáncer en un individuo, que comprende administrar al individuo una cantidad efectiva de un antagonista de SCDl .
12. El método de la reivindicación 11, en donde el cáncer en el individuo expresa niveles elevados de uno o más biomarcadores en comparación con una muestra de referencia, célula de referencia, tejido de referencia, muestra testigo, célula testigo, tejido testigo o testigo interno (por ejemplo, gen de mantenimiento) .
13. Un método para el tratamiento de cáncer en un individuo, que comprende administrar al individuo una cantidad efectiva de un antagonista de SCDl, en donde el tratamiento está basado en el individuo que tiene niveles elevados que expresan cáncer de uno o más biomarcadores en comparación con una muestra de referencia, célula de referencia, tejido de referencia, muestra testigo, célula testigo, tejido testigo o testigo interno (por ejemplo, gen de mantenimiento) .
14. Un método para el tratamiento de cáncer en un individuo, a condición de que se haya encontrado que el individuo tiene cáncer que expresa niveles elevados de un o más biomarcadores en comparación con una muestra de referencia, célula de referencia, tejido de referencia, muestra testigo, célula testigo, tejido testigo o testigo interno (por ejemplo, gen de mantenimiento) , el tratamiento comprende administrar al individuo una cantidad efectiva de un antagonista de SCDl .
15. Un método para el tratamiento de cáncer en un individuo, el método comprende: determinar que una muestra obtenida del individuo expresa niveles elevados de uno o más biomarcadores en comparación con una muestra de referencia, célula de referencia, tejido de referencia, muestra testigo, célula testigo, tejido testigo o testigo interno (por ejemplo, gen de mantenimiento, y administra una cantidad efectiva de una terapia anti-cáncer que comprende un antagonista de SCDl al individuo, mediante el cual el cáncer es tratado.
16. Un método para tratamiento de cáncer que comprende: (a. seleccionar un individuo que tiene cáncer, en donde el cáncer expresa niveles elevados de uno o más biomarcadores en comparación con una muestra de referencia, célula de referencia, tejido de referencia, muestra testigo, célula testigo, tejido testigo o testigo interno (por ejemplo, gen de mantenimiento) y (b) administrar al individuo así seleccionado una cantidad efectiva de un antagonista de SCDl, mediante lo cual el cáncer es tratado.
17. Un método para identificar un individuo que es más probable de beneficiarse del tratamiento con una terapia anti-cáncer, que comprende un antagonista de SCDl o menos probable de beneficiarse del tratamiento con una terapia anti-cáncer de un antagonista de SCDl, el método comprende: determinar los niveles de expresión de uno o más biomarcadores en una muestra obtenida del individuo, en donde los niveles de expresión elevados de uno o más biomarcadores en la muestra, en comparación con una muestra de referencia, célula de referencia, tejido de referencia, muestra testigo, célula testigo, tejido testigo o testigo interno (por ejemplo, gen de mantenimiento) indican que el individuo es más probable de beneficiarse del tratamiento con la terapia anti-cáncer que comprende el antagonista de SCDl o niveles de expresión reducidos de uno o más biomarcadores en la muestra en comparación con una muestra de referencia, célula de referencia, tejido de referencia, muestra testigo, célula testigo, tejido testigo o testigo interno (por ejemplo, gen de mantenimiento) indican que el individuo es menos probable de beneficiarse del tratamiento con la terapia anti-cáncer que comprende el antagonista de SCD1.
18. Un método para predecir que un individuo con cáncer es probable de responder efectivamente al tratamiento con una terapia anti-cáncer, que comprende un antagonista de SCD1, el método comprende determinar uno o más biomarcadores, mediante los cual los niveles de expresión elevados de uno o más biomarcadores, en comparación con una muestra de referencia, célula de referencia, tejido de referencia, muestra testigo, célula testigo, tejido testigo o testigo interno (por ejemplo, gen de mantenimiento) , indican que el individuo es más probable de responder efectivamente al tratamiento con el antagonista y los niveles de expresión reducidos de uno o más biomarcadores, en comparación con una muestra de referencia, célula de referencia, tejido de referencia, muestra testigo, célula testigo, tejido testigo o testigo interno (por ejemplo, gen de mantenimiento) , indican que el individuo es menos probable de responder efectivamente al tratamiento con el antagonista.
19. Un método para predecirla respuesta o carencia de respuesta de un individuo a una terapia anti-cáncer que comprende un antagonista de SCDl, que comprende medir en una muestra obtenida del individuo, la expresión de uno o más biomarcadores, en donde los niveles de expresión elevados de uno o más biomarcadores, en comparación con una muestra de referencia, célula de referencia, tejido de referencia, muestra testigo, célula testigo, tejido testigo o testigo interno (por ejemplo, gen de mantenimiento) son predictivos de la repuesta del individuo a la terapia anti-cáncer que comprende el antagonista de SCDl y los niveles de expresión reducidos de uno o más biomarcadores, en comparación con una muestra de referencia, célula de referencia, tejido de referencia, muestra testigo, célula testigo, tejido testigo o testigo interno (por ejemplo, gen de mantenimiento) son predictivos de carencia de respuesta del individuo a la terapia anti-cáncer que comprende el antagonista de SCDl.
20. Un método para determinar la probabilidad de que un individuo con cáncer exhibirá beneficio de la terapia anticáncer que comprende un antagonista de SCDl el método comprende: determinar los niveles de expresión de uno o más biomarcadores en una muestra obtenida del individuo, en donde los niveles de expresión elevados de uno o más biomarcadores en la muestra, en comparación con una muestra de referencia, indican que el individuo tiene probabilidad incrementada de beneficiarse de la terapia anti-cáncer que comprende el antagonista de SCD1 y los niveles de expresión reducidos de uno o más biomarcadores en la muestra, en comparación con una muestra de referencia, célula de referencia, tejido de referencia, muestra testigo, célula testigo, tejido testigo o testigo interno (por ejemplo, gen de mantenimiento) indican que el individuo tiene probabilidad disminuida de beneficiarse de la terapia anti-cáncer que comprende el antagonista de SCD1.
21. El método de cualquiera de las reivindicaciones 11-20, en donde el cáncer es célula de cáncer endometrial, cáncer de cabeza y cuello, un cáncer de riñon, un cáncer de ovario, un cáncer de colon, un cáncer pancreático, un cáncer urinario o un cáncer de vejiga.
22. El método de la reivindicación 21, en donde el cáncer es un cáncer de riñon, cáncer pancreático o cáncer de vej iga .
23. El método de la reivindicación 22, en donde el cáncer es cáncer de vejiga.
24. El método de cualquiera de la reivindicaciones 10 y 11-23, en donde el uno más biomarcadores es FGFR3.
25. El método de cualquiera de la reivindicaciones 10 y 11-24, en donde el uno más biomarcadores consisten de FGFR3 fosforilado.
26. El método de cualquiera de la reivindicaciones 10 y 11-25, en donde el uno más biomarcadores consisten de uno o más genes de la firma lipogénica FGFR3 -regulada .
27. El método de la reivindicación 26, en donde el uno o más genes de la firma lipogénica FGFR3 -regulada comprenden, consisten o consisten esencialmente de uno o más genes del grupo que consiste de SREBF1, G6PD, AC0T7, PTPLA, PCCB, FADS1, RDH11 , ACER3 , PDSS1, MVD, AGPAT5 , HSD17B2 , ACSL4 , EBP, PIGW, LBR, ACLY, ADORA2B, GPCPD1, CYP24A1, ACSL3 , MVK, ACSS2, FDPS, ELOVL5, HMGCR, LIPG, ME1, DHCR7 , LSS, ACAT2, FASN, CYP51A1, IDI1, FDFT1, FAR2 , HMGCS1, SDR16C5, LDLR, MSMOl, INSIG1, DHRS9, LRP8 , SQLE, PCSK9 , SCD1, FABP4 y combinaciones de los mismos .
28. El método de la reivindicación 27, en donde el uno o más genes de la firma lipogénica FGFR3-regulada comprende, consisten o consisten esencialmente de uno o más genes del grupo que consiste de ELOVL5, HMGCR, LIPG, ME1, DHCR7, LSS, ACAT2 , FASN, CYP51A1, IDI1, FDFT1 , FAR2 , HMGCS1, SDR16C5, LDLR, MSMOl, INSIG1, DHRS9, LRP8 , SQLE, PCSK9, SCD1, FABP4 y combinaciones de los mismos .
29. El método de la reivindicación 28, en donde el uno o más genes de la firma lipogénica FGFR3-regulada comprende, consisten o consisten esencialmente de uno o más genes del grupo que consiste de CYP51A1, IDI1, FDFT1, FAR2, HMGCS1, SDR16C5 , LDLR, MSMOl, INSIG1, DHRS9, LRP8 , SQLE, PCS 9, SCD1, FABP4 y combinaciones de los mismos .
30. El método de la reivindicación 29, en donde el uno o más genes de la firma lipogénica FGFR3-regulada comprende, consisten o consisten esencialmente de uno o más genes del grupo que consiste de LDLR, MSMOl, INSIG1, DHRS9 , LRP8 , SQLE, PCSK9, SCD1, FABP4 y combinaciones de los mismos.
31. El método de la reivindicación 29, en donde el uno o más genes de la firma lipogénica FGFR3-regulada comprende, consisten o consisten esencialmente de uno o más genes del grupo que consiste de SQLE, PCSK9, SCD1, FABP4 y combinaciones de los mismos .
32. El método de cualquiera de las reivindicaciones 10 y 11-31, en donde uno o más biomarcadores consiste de SREBP1 maduro .
33. El método de cualquiera de las reivindicaciones 10 y 11-32, en donde uno o más biomarcadores consiste de ácidos grasos ?9 monoinsaturados .
34. El método de cualquiera de las reivindicaciones 10 y 11-33, en donde uno o más biomarcadores es una proporción de ácidos grasos ?9 monoinsaturados: ácidos grasos saturados.
35. El método de cualquiera de las reivindicaciones 10 y 11-34, en donde uno o más biomarcadores consiste de la señalización de PI3K, señalización de mTOR y señalización de MEK.
36. El método de cualquiera de las reivindicaciones 10 y 11-35, en donde uno o más biomarcadores consisten de uno o más polimorfismos en genes seleccionados del grupo que consiste de PI3K, PTEN, p85, TSCl/2 y AKT.
37. El método de cualquiera de las reivindicaciones 10 y 11-36, en donde uno o más biomarcadores consisten de AKT fosforilado.
38. El método de cualquiera de las reivindicaciones 10 y 11-37, en donde el nivel de expresión de uno o más biomarcadores es elevado por mayor de alrededor de 1.5 veces, alrededor de 1.75 veces, alrededor de 2 veces, alrededor de 2.25 veces, alrededor de 2.5 veces, alrededor de 2.75 veces, alrededor de 3.0 veces o alrededor de 3.5 veces en comparación con una muestra de referencia, célula de referencia, tejido de referencia, muestra testigo, célula testigo, tejido testigo o testigo interno (por ejemplo, gen de mantenimiento) .
39. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-38, en donde el antagonista de SCDl es un anticuerpo, polipéptido de enlace, molécula pequeña de enlace o polinucleótido.
40. El método de la reivindicación 39, en donde el antagonista de SCDl es una molécula pequeña.
41. El método de la reivindicación 40, en donde la molécula pequeña es G01522403 (A37062) , G02447171 o derivados de los mismos.
42. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-41, en donde el método comprende además un agente terapéutico adicional.
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