DE69334095T2

DE69334095T2 - Verfahren zur intrazellulären Bindung von zielgerichteten Molekülen

Info

Publication number: DE69334095T2
Application number: DE69334095T
Authority: DE
Inventors: A. Wayne Wellesley MARASCO; A. William Cambridge HASELTINE
Original assignee: Dana Farber Cancer Institute Inc
Current assignee: Dana Farber Cancer Institute Inc
Priority date: 1992-07-17
Filing date: 1993-07-16
Publication date: 2007-04-12
Anticipated expiration: 2013-07-17
Also published as: AU4775393A; DE69334095D1; US6329173B1; EP0651805A1; PT651805E; WO1994002610A1; AU687010B2; US6004940A; CN1084216A; MX9304363A; CA2137558A1; US5965371A; US6072036A; EP0651805B1; ATE348175T1

Description

Die vorliegende Erfindung richtet sich auf ein Verfahren zur intrazellulären Bindung spezifischer Moleküle, vorzugsweise Proteine. Genauer gesagt betrifft dieses Verfahren die intrazelluläre Expression und nachfolgende Verwendung von Antikörpern, die für ein gewünschtes Molekül spezifisch sind.
Verschiedene Anomalien scheinen das Ergebnis der unerwünschten Expression eines besonderen Moleküls, wie etwa eines Proteins, zu sein. Es wird zum Beispiel vermutet, dass viele Tumoren das Ergebnis einer Überexpression zellulärer Onkogene, wie etwa neu, myc, abl usw., sind. Andere bösartige Geschwülste sind vermutlich das Ergebnis einer Expression eines veränderten Rezeptors. Bestimmte Krankheiten werden von der unerwünschten zellulären Expression viraler Proteine verursacht. Der humane Immunschwächevirus (HIV) verwendet zum Beispiel Säugerzellen für die Herstellung eines viral codierten Proteins, einschließlich Strukturproteine und Regulatorenzyme. Der humane T-Zell-Leukämie-Virus-Typ 1 oder 2, (HTLV-1 oder 2) produziert bei infizierten Individuen Tumore als Ergebnis einer viralen Expression. Solche viral codierten Proteine können zum Assembly von Virionen führen, die ihrerseits andere Zellen infizieren können.
Therapeutische Strategien beinhalteten die Entwicklung von Arzneien zur Targetierung der unerwünschten Proteine, Mittel zur interzellulären Blockierung solcher Proteine, wie zum Beispiel, lösliche CD4, und die Verwendung von Arzneimitteln, welche die Zellen, die die unerwünschten Proteine exprimieren, selektiv töten.
Ein weiteres Behandlungsverfahren, das vorgeschlagen wurde, ist der Transfer genetischen Materials in die Zelle. Zum Beispiel mittels Rezeptor-vermitteltem Gentransport, transkaryotischer Implantation und viralen Shuttle-Vektoren, wie etwa retroviralem Gentransfer. In solchen Verfahren, die im Allgemeinen als Gentherapie bezeichnet werden, hofft man, dass Zellen, denen entweder ein Protein fehlt oder die ein funktionsgestörtes Protein produzieren, repariert werden können, indem DNA in die Zelle eingeführt wird, die für das normale Genprodukt codiert.
Es wurde von In-vivo-Genexpression in Folge direkter Injektion von nicht infektiöser, nicht onkogener DNA berichtet, die in Liposomen [Nicolau, C., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 80: 1068 (1983)] Immunoliposomen [Wang, C. Y., et al., Proc. Natl. Acad. Sci 84: 7851 (1987)] und in einem Liposom/rote-Blutkörperchen-Membranhybrid [Kaneda, Y., et al., Science 243: 375 (1989)] verkapselt ist. Die Expression einer Vielzahl von Calciumphosphat-präzipitierten Gensequenzen wurde in Folge direkter intraperitonealer Injektion [Benvenitsy, N., et al., Proc. Natl. Acad. Sci 83: 9551 (1986); Felgner, P. L., et al., Nature 349: 351 (1991)] oder in Folge transkaryotischer Implementation [Seldon, R. F., et al., Science 242: 714 (1987)] berichtet. Ebenso gelang In-vivo-Gen-Targeting mittels Rezeptor-vermitteltem Gentransport, bei dem ein Komplex zwischen einem Asialoorosomucoid/Polysin-Konjugat und Plasmid-Rezeptorgenen verwendet wurden, um die Expression ausschließlich für die Leber nach intravenöser Verabreichung [Wu, G. Y., et al., J. Biol. Chem. 263: 14621 (1988)] zu targetieren. Es wird berichtet, dass retroviraler Gentransfer eine hohe Effizienz der Infektion, eine stabile Integration und eine Expression in den meisten Zellen [Anderson, W. F., Science 226: 401 (1984)] bietet. Die In-vivo-Gentherapie wurde bei Patienten mit ADA-Mangel begonnen, denen autologe Lymphozyten, die das ADA-Gen tragen, in ihr Blut retransfusioniert wurden, und bei Krebspatienten mit fortgeschrittenem Melanom, denen tumorinfiltrierende Lymphozyten (TIL) retransfusioniert wurden, die das Gen für den Tumor-Nekrose-Faktor (TNF) tragen [Rosenberg, S. A., et al., N. Eng. J. Med. 323: 570 (1990)].
Es wurde die Genmodifikation von Zellen, die kontinuierlich einen viralen Inhibitor exprimieren und zur Inhibition der viralen Infektion führen, vorgeschlagen, und als intrazelluläre Immunisierung bezeichnet. [Baltimore, D., Nature 335: 395196 (1988)]. Zu diesem Zweck wurden verschiedene Ansätze getestet, einschließlich HIV-1-spezifische Ribozyme [Sarver, N., et al., Science 227: 1222 (1990)], Antisense-RNA [Posnansky, M., et al., J. Virol. 65: 532 (1991)], tar-Decoys [Sullenger, B. A., et al., Cell 63: 601 (1990); Lisziewicz, J., et al., VII International Conf. AIDS 2: 28 (1991)], dominante negative Mutanten und andere. [Buonocorel, et al., Nature 345: 625–628 (1990); Hasseloff, J., et al., Nature 334: 585–591 (1988); VanderKrol, A. R., et al., BioTechniques 6: 958–976 (1988); Malim, M. H., et al., Cell 58: 205–214 (1989); und Trono, D., et al., Cell 59: 113–120 (1989)]. Ein Haupthindernis für die Entwicklung effektiver Geninhibitionsprotokolle unter Verwendung solcher Antisense-RNA oder Ribozyme ist die Fähigkeit, einen hohen Expressionslevel des Inhibitors zu erreichen, der die DNA-Matrize in den transformierten Zellen codiert, und dies kann aufgrund der konkurrierenden Eigenschaft der Inhibition auch ein potentielles Problem für die Verwendung dominanter negativer Mutanten sein. Über die Möglichkeit, funktionelle Antikörper im Zytoplasma oder im Nukleus oder in Säugerzellen durch den Ersatz des sekretierenden Kopfs der leichten und der schweren Kette mit zytoplasmischen oder nuklearen Köpfen zu exprimieren und zu targetieren, wurde kürzlich berichtet. [Biocca, S., et al. Cytotechnology 5: 549–50, (1991)].
Es wäre wünschenswert, über ein Verfahren zu verfügen, das verwendet werden kann, um einen hohen Expressionslevel eines Inhibitors für das gewünschte Molekül zu erreichen.
Es wäre wünschenswert, über ein Verfahren zu verfügen, das diese unerwünschten Moleküle spezifisch targetieren kann, und das über ein breites Anwendungsspektrum verfügt.
Es wäre wünschenswert, über ein Verfahren zu verfügen, das keine zytotoxischen Chemikalien in eine Zelle einführt.
Es wäre wünschenswert, über ein Verfahren zu verfügen, das ein fertiges Mittel zum Targeting unerwünschter Proteine bereitstellt.
KURZDARSTELLUNG DER ERFINDUNG
Wir haben jetzt ein Verfahren entdeckt, mit dem sich ein unerwünschtes Molekül (gelegentlich als Targetmolekül oder Targetantigen bezeichnet), vorzugsweise ein Protein, targetieren lässt. Dieses Verfahren umfasst die intrazelluläre Expression eines Antikörpers, der in der Lage ist, an das Target zu binden. Eine DNA-Sequenz, die eine ausreichende Anzahl von Nukleotiden enthält, die für den Teil eines Antikörpers codieren, der in der Lage ist, an das Target zu binden, das operativ mit einem Promoter verknüpft ist, der die Expression des Antikörpers in der/den interessierenden Zelle(n) (Antikörperkassette) ermöglicht, wird zu einer Zelle transportiert. Danach wird der Antikörper intrazellulär exprimiert und bindet an das Target, wodurch das Target von seinen normalen Aktionen abgehalten wird. In einer bevorzugten Ausführungsform würde das „Antikörpergen" der Antikörperkassette eine cDNA verwenden, die variable Domänen der schweren Kette (V_H) und der leichten Kette (V_L) eines Antikörpers codiert, der auf DNA-Level mittels eines geeigneten Oligonukleotids als eine Brücke der zwei variablen Domänen verbunden werden kann, die bei der Translation ein einfaches Polypeptid bilden (das „variables einkettiges Fragment" (sFv) genannt wird), das in der Lage ist, an ein Target, wie etwa ein Protein, zu binden. In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen wird außerdem eine Nukleotidsequenz verwendet, die einen intrazellulären Lokalisationskopf codiert.
Bevorzugte Zelltargets sind retroviral infizierte Zellen, wie etwa HIV-infizierte Zellen, wobei die Targets das viral codierte Protein sind. Zum Beispiel können die Antikörper gegen Strukturproteine, wie das Hüllglykoprotein und das Gag-Protein und/oder gegen tat-, rev-, nef-, vpu- und/oder vpx-Regulatorproteine verwendet werden. In einer bevorzugten Ausführungsform kann ein Antikörper-Cocktail (d. h. eine Mischung von Antikörpern) verwendet werden, um eine Vielzahl viraler Targetproteine zu targetieren. Ein weiteres bevorzugtes Target beinhaltet Onkogene, wie etwa transmembrane Wachstumsfaktorrezeptoren, Rezeptoren, Wachstumsfaktoren, membranassoziierte Guanin-Nukleotid-bindende Proteine usw.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt die Lage der PCR-Primere für die Klonierung der variablen und konstanten Regionen von schwer- und leichtkettigen Immunoglobulingenen.
2 ist ein Diagramm der Strukturen von Fv, sFv und sFv-KDEL eines umfassend neutralisierenden Antikörpers für das Hüllglykoprotein F105. Die drei komplementätsbestimmenden Regionen (CDRs) jeder Kette sind schattiert.
3 sind Autoradiogramme, die einen Pulse-Chase von COS-1-Zellen zeigen, die mit einem Plasmid transfiziert sind, das Fab-Fragmente eines umfassend neutralisierenden Antikörpers zum Hüllglykoprotein exprimiert.
4 ist ein Autoradiogramm eines SDS-Polyacrylamidgels (12,5%), das Proteine zeigt, die aus Zelllysat oder Kulturmedium immunpräzipitiert wurden.
5 zeigt die Immunfluoreszenzfärbung der transformierten Zellen.
6A und 6B sind Autoradiogramme der Polyacrylamidgele, die sFv105 (A) oder sFv105-KDEL (B) zeigen, die mit dem HIV-1-Glykoprotein kopräzipitiert wurden.
7 zeigt die Inhibition der Synzytiumbildung in Zellen, die sFv oder sFV-KDEL exprimieren.
8 zeigt Autoradiogramme eines Einketten-Antikörpers mit einer Lokalisierungssequenz, die die spezifische Bindung an das HIV-1-Glykoprotein in den Zellen zeigt.
9 zeigt Autoradiogramme, die darstellen, dass ein Einketten-Antikörper für ein besonderes Target nicht mit nichtverwandten Proteinen kopräzipitiert wird.
10 zeigt Autoradiogramme, die darstellen, dass ein intrazellulär gehemmter Anti-tat-Antikörper nicht an ein HIV-1-Glykoprotein bindet.
11 zeigt die Produktion infektiöser HIV-1 in Zellen, die sFv oder sFv-KDEL exprimieren.
12 zeigt Virustiter mittels Synzytiumbildung in SupT1-Zellen.
13 zeigt Autoradiogramme, die SupT-Zellen darstellen, die mit einem Einketten-Antikörper unter der Kontrolle eines induzierbaren Promoters oder eines CMV-Promoters stabil transformiert werden.
14 zeigt die Strategie eines Antikörper-vermittelten Gentransfers.
15 zeigt die Synthese von Antikörper-Polylysin-Konjugaten.
16 zeigt Autoradiogramme, die die Expression von sFvF105 in SupT-HIV-infizierte Zellen bei variierender Konzentration des tat-Proteins darstellen.
Die 17A bis 17D zeigen FACS-Analysen der gp120-Expression in CD4-SupT-Zellen, die mit HIV-1 infiziert sind, und mit F105sFv stabil transduziert wurden.
Die 18A bis 18D zeigen die CD4-Oberflächenexpression in HIV-1-infizierten SupT-Zellen, die mit sFvF105 transduziert wurden.
19 zeigt das Ergebnis der Untersuchungen der Synzytia-Bildung nach der Infektion der SupT-Vektorzellen oder der SupT-sFv105-Zellen mit HIV-1.
20 zeigt die Transaktivierung von Zellen, die ein Plasmid exprimieren, das einen HIV-1-LTR-CAT-Reporter enthält, der in variierenden Konzentrationen mit Tat infiziert ist.
21 zeigt die tat-Aktivität in Gegenwart von drei verschiedenen tat-Antikörpern.
22 zeigt die tat-Aktivität für die Antikörper gemäß 21 bei unterschiedlicher Antikörperkonzentration.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Targeting eines bestimmten Moleküls (Targetmolekül), vorzugsweise eines Proteins, wie etwa eines unerwünschten Proteins. Dieses Verfahren umfasst die intrazelluläre Expression eines Antikörpers, der in der Lage ist, an ein spezifisches Target (z. B. ein Targetprotein) zu binden, wobei der Antikörper eine Kopfsequenz aufweist, die eine funktionelle Sekretionssequenz ist, d. h. sie hat die Funktion, zu bewirken, dass der exprimierte Antikörper aus der Zelle abgesondert wird, und wobei der Antikörper ferner eine intrazelluläre Retentionssequenz enthält. Solche Antikörper werden das Target intrazellulär binden. Der Begriff Antikörper, wie er hier verwendet wird, betrifft mindestens den Teil eines Immunoglobulins, der in der Lage ist, selektiv an ein Target, wie etwa ein Protein, zu binden. Der Antikörper wird aus einer DNA-Sequenz exprimiert, die eine ausreichende Anzahl an Nukleotiden enthält, die für den Teil eines Antikörpers codieren, der in der Lage ist, an das Target zu binden, und der hier als Antikörpergen bezeichnet wird. Das Gen ist operativ mit einem Promoter verknüpft, der die Expression des Antikörpers in der/den interessierenden Zelle(n) ermöglicht. Promoter sind nach dem Stand der Technik bekannt und können, in Abhängigkeit davon, welcher Zelltyp targetiert werden soll, leicht ausgewählt werden. Weiterhin ist die Verwendung von induzierbaren Promotern, die nach dem Stand der Technik bekannt sind, in einigen Ausführungsformen bevorzugt. So etwa, wenn die Funktion eines Targetproteins das Ergebnis von dessen Überexpression ist. Dann kann, indem „der Promoter angeschaltet wird", die Expression des Antikörpers selektiv erhalten werden. Die vollständige Sequenz des Antikörpergens und des Promoters wird hier als Antikörper-Kassette beschrieben. Die Kassette wird mittels eines beliebigen aus einer Anzahl von nachfolgend beschriebenen Mitteln, die den intrazellulären Transport eines Gens ermöglichen, zur Zelle transportiert.
Die Kassette führt zu einer intrazellulären Expression des Antikörpers. Der exprimierte Antikörper kann dann an das Target-Antigen binden. Dies ermöglicht eine große Anzahl nützlicher Anwendungen.
Nahezu jede Art von biologischem Molekül kann als Antigen dienen, so zum Beispiel intermediäre Metaboliten, Zucker, Fette, Autacoide und Hormone, sowie Makromoleküle, wie etwa komplexe Kohlenhydrate, Phospholipide, Nukleinsäuren, wie etwa RNA und DNA, und Proteine. Der Fachmann kann Antikörper generieren, die sowohl an die kleinen Moleküle als auch an die Makromoleküle spezifisch binden. Zum Beispiel werden bei kleinen Molekülen üblicherweise die kleinen Moleküle (gelegentlich Hapten genannt) vor der Immunisierung an einem Makromolekül (gelegentlich Träger genannt) befestigt. Der Hapten-Träger-Komplex wirkt als Immunogen. Somit sind Antikörper bekannt, die an eine große Bandbreite von Targets spezifisch binden. Die bevorzugten Target-Moleküle beinhalten Proteine, RNA, DNA und Hapten. Besonders bevorzugt sind die Targets Proteine, RNA und DNA. Noch mehr bevorzugt ist das Target ein Protein.
Es wurde berichtet, dass die Überexpression einer Anzahl von Onkogenen mit bösartiger zellulärer Transformation assoziiert ist. Zum Beispiel wurde über die Amplifikation von myc in COLO-320-Kolonkrebszellkulturen, SKBR3-Brustkrebszelllinien und in Lungenkrebszelllinien berichtet. Über die Amplifikation von N-myc in Neuroblastoma-Zelllinien und Retinoblastom wurde berichtet. Es wurde außerdem über die Amplifikation von c-abl, c-myb und anderen Onkogenen, die mit bösartiger Transformation assoziiert werden, berichtet. Vgl. Kapitel 12 „Human oncogenes", Seiten 487–543, RNA Tumor Viruses. Molecular Biology of Tumor Viruses, 2nd Ed., Weiss, R. et al., Ed. (Cold Spring Harbor Laboratory (1985)).
Es wurde ebenfalls berichtet, dass hohe Level verschiedener Onkogene das Tumorrezidivrisiko beeinflussen. Zum Beispiel wurde über eine Korrelation zwischen dem Level an neu/c-erbB-2 und der Ursache und dem Verlauf von humanem Brustkrebs berichtet. Vgl. Paterson, M. C., et al., Cancer Research 51: 556–567 (1991); hohe Level von myc, int-2 und hst-1 wurden ebenfalls mit Brustkrebs assoziiert. In ähnlicher Weise wurde gezeigt, dass erhöhte Level der Rezeptoren für EGF und EGF-R mit Brustkrebs assoziiert werden. Grimaux, M., et al., Int. J. Cancer 45: 255–262 (1990). Es wurde ebenfalls berichtet, dass die Überexpression dieser und anderer Onkogene mit anderen Krebsarten assoziiert wird.
Viele Onkogene zeigen eine gewisse Homologie zu Genen, die das Zellwachstum betreffen. Vgl. zum Beispiel die nachstehende Tabelle. TABELLE¹

¹ Bearbeitet nach Druker, B. J., et al., N. Eng. J. of Mol. 321: 1383–1392 (1989). PDGF bezeichnet aus Blutplättchen gewonnenen Wachstumsfaktor, FGF Fibroblastenwachstumsfaktor, EGF Epidermis-Wachstumsfaktor und M-CSF einkerniger Phagozyten-Wachstumsfaktor.
² Die Familie beinhaltet. src, fgr, yes, Ick, hck, fyn, lyn und tkl.
³ Die subzelluläre Lage dieser Onkogen-Produkte ist ungewiss.

Es wurde über Antikörper für die meisten dieser Onkogene berichtet. Zusätzlich zur Überexpression von Onkogenen (gelegentlich als Onkos bezeichnet) machen einige Onkogene eine Mutation von einem Proto-Onko (normales Gen für ein normales Protein) zu einem Onko (Gen, dessen Protein bösartige Transformation verursachen kann) durch, was zu einer bösartigen Transformation von Zellen zu führen scheint. Zum Beispiel haben Punktmutationen des ras-Gens an den Condonen für das ras-p21 an den Restpositionen 12, 13 und 61 zu mutierten ras-p21-Proteinen geführt, die mit verschiedenen Krebsarten assoziiert werden. Antikörper, die für viele dieser ras-Mutanten spezifisch sind, sind bekannt.
In ähnlicher Weise kann die Expression der viralen Proteine zu Krankheiten, Leiden und sogar zum Tod führen. Bei dem Virus kann es sich entweder um RNA- oder DNA-Viren handeln. Zum Beispiel wird ein Typ von RNA-Viren, Retroviren, typischerweise als Teil einer von drei Unterfamilien, nämlich Onkoviren, Spumaviren und Lentiviren, klassifiziert. Die Infektion mit Onkoviren wird typischerweise mit bösartigen Erkrankungen assoziiert. Die codierten viralen Proteine beinhalten die gag-, pol- und Hüllproteine. In einigen Fällen enthält der Virus Onkogene, die ein Protein codieren, das in der Lage ist, die bösartige Transformation einer Zelle in Kultur auszulösen. Lentiviren führen zu einer Infektion, die im Allgemeinen langsam erfolgt, und chronische, schwächende Krankheiten nach einer langen Latenzperiode verursacht. Zusätzlich zu den Genen, die die gag-, pol- und Hüllenstrukturproteine codieren, codieren sie auch eine Vielzahl von Regulatorproteinen. Die RNA und/oder DNA des Virus kann den Zellmechanismus übernehmen, um das viral codierte Protein zu produzieren.
Zum Beispiel ist HTLV-1 ein Retrovirus, der ein ätiologisches Agens des adulten T-Zell-Leukämie-Lymphoms (ATLL), einem aggressiven Neoplasma von CD4+T-Zellen [Poiesz, B. J., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 77: 7415–7419 (1980)], ist. Die viralen Proteine, die von einem solchen Virus exprimiert werden, führen zur Transformation der Zelle. Die tax- und rex-Gene und -Genprodukte scheinen im Hinblick auf die tumorerzeugende Wirkung bedeutsam zu sein. Somit sind sie eine bevorzugte Gruppierung der Targetmoleküle.
HIV begründet eine Familie von Lentiviren, einschließlich HIV-1 und HIV-2, die die ätiologischen Agenzien von Immunschwächekrankheiten, wie etwa dem erworbenen Immunschwächesyndrom (AIDS) und verwandten Erkrankungen sind [Barre Sinoussi, et al., Science 220: 868–871 (1983); Gallo, et al., Science 224: 500–503 ()1984); Levy, et al., Science 225: 840–842 (1984); Popovic, et al., Science 224: 497–500 (1984)].
Der Epstein-Barr-Virus wurde mit einer Anzahl von Tumoren verknüpft, wie etwa ausgewählten Ausbrüchen des Burkitt-Lymphoms, von Nasopharygealkrebs und B-Lymphomen bei immunsupprimierten Individuen. [zur Hausen, H., Science 254: 1167–1173 (1991)].
Der Hepatitis-B-Virus wurde mit Leberzellenkrebs [zur Hausen, Science, supra] verknüpft, insbesondere der X-offene Leserahmen des Virus scheint involviert zu sein [Ibid.]. Dementsprechend wäre ein Antikörper, der diese Region oder Expressionsprodukte aus dieser Region targetiert, bei dem vorliegenden Verfahren zu bevorzugen.
Papillomaviren wurden mit Anogenitalkrebs verknüpft [Ibid]. Bei diesen Viren scheinen die E6- und E7-Gene involviert zu sein und würden gute Targets abgeben.
Mittels intrazellulärer Bindung an eine Nukleinsäure, wie etwa einen DNA-Provirus, kann die Integration des Virus in die Zelle verhindert oder die Integration inhibiert werden. Mittels Bindung an die RNA des Virus kann dessen Expression des viralen Proteins beeinflusst werden.
Anti-Nukleotid-Antikörper wurden ausgiebig untersucht [Van Es, J. H., et al., J. of Immun. 149: 2234–2240 (1992); Brigido, M. M. et al., J. of Immun. 150: 469–479 (1993); Stollar, B. D., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 4469–4473 (1986); Eilat, D., et al., J. of Immun. 141: 1745–1753 (1988); Brigido, M. M., et al., J. of Immun. 146: 2005–2009 (1991)] und die Antikörper besitzen die gleichen grundlegenden Merkmale.
Diese Antikörper können produziert oder gescreent werden mittels Standardtechniken, wie etwa der Verwendung einer Nukleotidsequenz, wie etwa RNA, um eine Bibliothek zu screenen, die Antikörper enthält [Tsai, D. E., et al., J. of Immun. 150: 1137–1145 (1993); Okano, Y., et al., J. of Immun. 149: 1093–1098 (1992); Tsai, D. E., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 8864–8868 (1992).
Bevorzugt können auch Antikörper ausgewählt und/oder designed werden, um eine wichtige Nukleinsäure-Bindungsstelle zu targetieren und zu beeinflussen, zum Beispiel das TAR-Element der Primaten-Immunschwächeviren. Diese Nukleinsäuresequenz ist in der 5'-LTR vorhanden und reagiert auf tat, was zu einer verbesserter Expression des viralen Proteins führt.
Mittels intrazellulärer Bindung an Targetproteine dieser Onkogene und Viren ist es möglich, die normale Funktion eines solchen Proteins zu stören, wobei die disruptive Wirkung des Proteins reduziert oder verringert wird.
Zum Beispiel kann die Bindung an ein Protein, das weiter prozessiert werden muss, wie etwa ein Rezeptor-Protein, ein virales Hüllprotein, z. B. HIV gp160, die Spaltung des Proteins in dessen aktive Komponenten signifikant reduzieren. Als weiteres Beispiel wird das Kapsidprotein, z. B. das HIV-Kapsidprotein, mittels Zugabe von Fettsäure wie Myristin säure kotranslational modifiziert. Es scheint, dass die Myristinsäure in die Anheftung des Kapsidvorläuferproteins an die innere Oberfläche der Zellen involviert ist. In HIV-Proviren, die so verändert wurden, dass sie nicht in der Lage sind, Myristinsäure zuzufügen, ist der Provirus nicht infektiös. Untersuchungen zum Prozess der Myristylierung lassen einen Bedarf an Glyzin an Position zwei des Aminoterminus und auch an Aminosäureresten innerhalb sechs bis zehn Aminosäuren von der Myristylierungsstelle erkennen. Somit kann eine Antikörperbindung an das Protein an und nahe dieser Stellen die Myristylierung stören.
Auf ähnliche Weise kann die Bindung an ein Protein, das eine bedeutende externe Domäne aufweist, die Wirkung des Proteins behindern.
In einer weiteren Ausführungsform lassen sich mittels Bindung an ein funktionsgestörtes Rezeptorprotein die unerwünschten Interaktionen blockieren, die zu einer zellulären Funktionsstörung, wie etwa einer bösartigen Transformation, führen können.
Zum Beispiel werden viele Proteine, wie etwa Oberflächenrezeptoren, transmembrane Proteine usw., durch das endoplasmatische Retikulum (gelegentlich ER-Golgi-Apparat genannt) prozessiert. Beispiele für solche Proteine beinhalten neu, Hüllglykoproteine, wie etwa jene der Primaten-Lentiviren, z. B., HIV-1 oder HIV-2. Durch die Verwendung von Antikörpern, die zu einer solchen Region der Zelle transportiert werden können und die spezifisch für ein bestimmtes Protein sind, lässt sich die Funktion eines solchen Proteins stören, ohne andere zelluläre Funktionen zu stören. Zum Beispiel durchlaufen die PDGF-/2- und FGF-ähnlichen Faktoren, die von sis und int-2 produziert werden, das ER. Diese Faktoren sind bei vielen Krebsarten involviert. Somit lassen sich, zusätzlich zum Targeting des Rezeptors, die Wachstumsfaktoren targetieren, indem deren Antikörper verwendet werden.
Wachstumsfaktoren werden auch von vielen anderen bösartigen Zellen exprimiert, wie etwa von Karzinoidsyndromtumoren, und diese wären ein weiteres Target.
Dieses Verfahren kann auch verwendet werden, um eine Funktion, die zu einem bestimmten Zeitpunkt unerwünscht ist, zu stören. Zum Beispiel sind die Moleküle der MHC-Klasse I und Klasse II für die Erkennung von Antigenen durch das Immunsystem wichtig. [Teyton, L., et al., The New Biologist 4: 441–447 (1992); Cox, J. H., et al., Science 247: 715–718 (1990); Peters, P. J., et al., Nature 349: 669–676 (1991); Hackett, Nature 349: 655–656 (1991)]. Jedoch kann eine solche Immunerkennung, insbesondere von Molekülen der MHC-Klasse II, Probleme verursachen, wie etwa bei der Transplantation von Organen. [Schreiner, G. F., et al., Science 240: 10321033 (1988)]. Somit lässt sich mittels Targeting der Klasse-II-Moleküle die Immunantwort des Wirts bei der Transplantation von Organen herabregulieren. Diese Moleküle können vorzugsweise an verschiedenen Punkten ihres Prozessierungswegs targetiert werden. Vorzugsweise sollte ein induzierbarer Promoter für das Antikörpergen verwendet werden.
Somit kann der Fachmann unter Berücksichtigung des bestimmten Targets viele Variationen dieses Verfahrens designen.
Zum Beispiel lenkt das HIV-1-Hüllgen die Synthese eines Vorläufer-Polyglykoproteins mit dem Namen gp160. Dieses Protein wird durch die Zugabe von multiplen N-gebundenen Zuckern modifiziert, wenn es in das endoplasmatische Retikulum eintritt [Allan, J. S., et al., Science 228: 1091–1094 (1985); Robey, W. G., Science 228: 593–595 (1985); DiMarzo-Veronese, F., et al., Science 229: 1402–1405 (1985); Willey, R. L., Cell Biol. 85: 9580–9584 (1988)]. Der glykosylierte Hüllproteinvorläufer wird dann innerhalb des Golgi-Apparats gespalten, um ein reifes Hüllprotein zu liefern, das aus einem äußeren Glykoprotein, gp120, und einem transmembranen Protein, gp41, besteht [Willey, Cell Biol., supra; Stein, B. S., et al., J. Biol. Chem. 265: 2640–2649 (1990); Earl, P. L., et al., J. Virol. 65: 2047–2055 (1991)]. Der Hüllglykoproteinkomplex wird an der Virionhülle verankert und infiziert Zellmembranen mittels gp41 durch nicht kovalente Interaktionen [DiMarzo Veronese, Science, supra; Gelderblom, H. R., et al., Lancet ll: 1016–1017 (1985)]. Nach der Bindung des äußeren Glykoproteins gp120 an den CD4-Rezeptor ermöglicht die Fusion der viralen Membranen und der Wirtzellmembranen das Eindringen des Virus [Stein, B. S., Cell 49: 659–668 (1987)]. Es wird angenommen, dass die fusogene Domäne des gp120/gp41-Komplexes auf dem Aminoterminus von gp41 liegt, weil diese Region Sequenzhomologie mit einer fusogenen Domäne anderer viraler Proteine aufweist [Gallaher, W. R., Cell 50: 327–328 (1987)]; Gonzalez-Scarano, F., AIDS Res. Hum. Retrovir. 3: 245–252 (1987)] und weil Mutationen in dieser Region den Virus inaktivieren und eine virale Fusion verhindern [Kowalski, M., et al., Science 237: 1351–1355 (1987); Kowalski, M., et al., J. Virol. 65: 281–291 (1991); McCune, J. M., et al., Cell 53: 5567 (1988)].
Während die prozessierten gp120 und gp41 zur Zelloberfläche transportiert und als Teil des Virions des Virus abgesondert werden (gelegentlich als virale Partikel bezeichnet), wird das ungespaltene gp160 zur Degradation an die Lysosomen geliefert. Der Spaltungsprozess ist normalerweise relativ ineffizient. Das Verfahren, bei dem intrazelluläre Antikörper verwendet werden, um im Lumen des endoplasmatischen Retikulums an die soeben synthetisierten gp160 zu binden und deren Transport zum Golgi-Apparat zu inhibieren, reduziert somit beträchtlich die Menge an Protein, die für die Spaltung in gp120 und gp41 verfügbar ist. Dementsprechend haben die produzierten viralen Partikel beträchtlich verringerte Mengen an gp120 und gp41 auf ihrer Oberfläche. Solche Partikel werden als nicht infektiös erachtet. Diese Diskussion über HIV-1-gp160/120/41 Proteine ist exemplarisch für andere Hüllproteine und prozessierte Proteine. Auf der Basis der vorliegenden Offenbarung können die gleichen Techniken, die hier verwendet werden, an bekannte Techniken angepasst werden.
Zusätzlich steht das Hüllprotein der Immunschwächeviren im Zusammenhang mit den anderen Aspekten der Krankheit [DeRossi, A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 83: 4297–4301 (1986)].
Zum Beispiel generiert eine HIV-Infektion von Zellkulturen typischerweise eine akute und/oder eine chronische Infektion. In beiden Fällen wird das Virus produziert und mittels Ausschleusung an der zellulären Membran freigegeben. Eine akute Infektion ist typischerweise durch einen zytopathischen Effekt gekennzeichnet, der sich durch die Vakuolisierung der Zellen und die Bildung von Synzytia und infolgedessen einer Zytolyse manifestiert [Laurent-Crawford, Virol. 185: 829–839 (1991)]. In Gewebekulturen bestehen die zytopathischen Effekte von HIV-1 in der Bildung einer vielkernigen Riesenzelle (Synzytium) und der Lyse der Einzelzellen. [Popovic, M., Science 224: 497–500 (1984); Somasundarin, M., et al., J. Virol. 61: 3114–3119 (1987)]. Die Synzytiumbildung wird nur durch das HIV-1-Hüllprotein vermittelt, das auf der infizierten Zelloberfläche exprimiert ist [Sodroski, J., et al., Nature 322: 470–474 (1986); Lifson, J. D., et al., Nature 323: 725–728 (1986)]. Die Hülle bindet an den CD4-Rezeptor, der auf benachbarten Zellen vorhanden ist, und dann werden mittels einer Fusionsreaktion die analog zu derjenigen verläuft, die beim Eindringen des Virus involviert ist, die angeordneten Zellmembranen fusioniert, so dass Heterokaryone gebildet werden.
Die einfache Zytolyse hängt außerdem von einer effizienten Membranfusion ab, die durch die Hüllglykoproteine induziert wird, so wie einige Mutationen in dem gp41-Aminoterminus zu einer Replikation kompetenter Viren führen, die sowohl für die Synzytiumbildung als auch die einfache Zytolyse abgeschwächt werden [Kowalski, M. L., et al., J. Virol. 65, supra (1991)]. Es wurde auch berichtet, dass Aminosäurever änderungen in gp120, die die Prozessierung des gp160-Vorläufers bewirken, die einfache Zytolyse verringern können [Stevenson, M., et al., J. Virol. 64: 3792–3803 (1990)] und dass eine einfache Zytolyse angemessene Level an CD4-Expression erfordert, unabhängig vom Level der viralen Proteinexpression oder der viralen DNA in der infizierten Zelle [De Rossi, A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci, USA, supra].
Zusätzlich wurde das HIV-Hüllglykoprotein von einer Reihe von Individuen im Zusammenhang mit der Erklärung des Ausbruchs der assoziierten Immunschwäche bei infizierten Individuen angeführt. Siliciano, R. F., et al., [Cell 54: 561–575 (1988)] haben gezeigt, dass ein Subset eines CD4+gp120-spezifischen Klons zytolytische Aktivität manifestiert und nicht infizierte autologe CD4+T-Zellen in Gegenwart von gp120 in einem Prozess lysiert, der strikt von der CD4-vermittelten Aufnahme von gp120 durch T-Zellen abhängig ist. Da gp120 von infizierten Zellen abgetrennt werden kann, kann dieser CD4-abhängige autozytolytische Mechanismus zur starken Auszehrung von CD4+T-Zellen bei AIDS-Patienten beitragen. Kion, T. A., et al., [Science 253: 1138–1140 (1991)] und Hoffman, G. W., et al., [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 3060–3064 (1991)] haben gezeigt, dass sich bei HIV-1-Infektionen ein autoimmunes idiotypisches Netzwerk entwickelt, das zur Entwicklung autoimmuner Antikörper führt, die die CD4+T-Zellen zerstören. Dieser Autoimmun-Mechanismus entwickelt sich aufgrund der Sequenzhomologien zwischen gp120 und den Klasse-II-MHC-Molekülen [Young, J. A. T, Nature 333: 215 (1988)]. Die immununterdrückenden Wirkungen von gp120 auf die CD4+T-Zellproliferation zur antigenen Stimulierung wurden bewiesen [Hoxie, J. A., et al., Science 234: 1123–1127 (1986); Diamond, D. C., et al., J. Immunol. 141: 3715–3717 (1988); Gurley, R. J., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 1993–1997 (1989); Crise, B., et al., J. Virol. 66: 2296–2301 (1992)]. Diese Untersuchungen lassen den Schluss zu, dass Immunschwächekrankheiten, wie etwa HIV-1, den Haupt-Histokompatibilitätskomplex II restringierter Antigenerkennung unab hängig vom Verlust an CD4+T-Zellen beeinträchtigen können. In Nagetierneuronen hat gp120 gezeigt, dass es eine Zunahme an intrazellulärem Calcium und neuronaler Toxizität verursachen kann [Dreyer, E. B., et al., Science 248: 364–367 (1990)], eine Wirkung, die durch die Aktivierung der nuklearen Endonuklease vermittelt sein könnte. Zusätzlich wurde auch vorgeschlagen, dass der Aktivierungs-induzierte T-Zell-Tod oder die Apoptose in vivo stattfindet und für die progressive Auszehrung von CD4+T-Zellen, die zu AIDS führt, verantwortlich gemacht wird [Groux, H., et al., J. Exp. Med. 175: 331–340 (1992); Meyaard, L., et al., Science 257: 217–219 (1992)]. In vitro und in vivo lösliches gp120 kann mit CD4-Rezeptoren auf nicht infizierten Zellen interagieren und zu einer abortiven Zellaktivierung führen und so die Apoptose auslösen [Mcconkey, D. J., et al., Immunol. Today 11: 120–121 (1990); Pinching, A. J., et al., Immunol. Today 11: 256–259 (1990); Newell, M. K., petal., Nature 347: 286–289 (1988)]. Es wurde auch vorgeschlagen, dass das Hüllglykoprotein als eine superantigene Bindung nur in der variablen Region des T-Zell-Antigenrezeptors agieren kann, wobei eine massive Stimulation und Expansion solcher T-Zellen, gefolgt von Deletion oder Anergy, induziert wird. Pantaleo, G., et al., N. Eng. J. of Med. 238: 327–335 (1993). Somit können durch eine Verringerung der Menge an gp120 die Wirkungen, die mit AIDS assoziiert werden, gelindert und verzögert werden.
Wie hier noch genauer diskutiert werden wird, haben wir festgestellt, dass die intrazelluläre Expression eines Antikörpers zu seinem Target, zum Beispiel des Antikörpers zum Hüllglykoprotein oder des Antikörpers zum HIV-tat-Protein, zu einem Antikörper führt, der das Target, z. B. das Hüllglykoprotein bzw. das tat-Protein, in der Zelle bindet und eine weitere Prozessierung verhindert. Das vorliegende Verfahren ist hochspezifisch und beeinträchtigt die zelluläre Funktion nicht. Somit wird ein mutiertes Hüllprotein, das eine Einzelpunktmutation enthält, die die Fähigkeit des Proteins an diesen Antikörper zu binden, abschafft, in den Zellen, die das Protein fortwährend exprimieren, normal prozessiert. Auf ähnliche Weise werden auch Einzelketten-Antikörper zu anderen Proteinen die Prozessierung des Hüllproteins nicht beeinträchtigen. Somit ermöglicht die vorliegende Methodik die Verwendung eines Antikörpers, der spezifisch für ein bestimmtes Protein ist und zu einem Prozess führt, der auf spezifische Krankheiten zugeschnitten werden kann. Zusätzlich kann diese Methodik prophylaktisch verwendet werden. Der Antikörper kann sogar unter der Kontrolle eines Promoters gehalten werden, der durch das Target (z. B. eine HIV-LTR) spezifisch aktiviert wird, wodurch der Antikörper nur angeschaltet wird, wenn das Target vorhanden ist. Andere Arten induzierbarer Promoter sind dem Fachmann bekannt und können auf der Basis der vorliegenden Offenbarung ausgewählt und verwendet werden.
Die Verwendung der vorliegenden Antikörper beeinträchtigt die Prozessierung anderer Proteine nicht. Zum Beispiel bindet der Antikörper zum HIV-Hüllglykoprotein nicht an andere Hüllglykoproteine und verhindert die Prozessierung eines solchen Proteins nicht. Zum Beispiel wird die Prozessierung eines nicht damit zusammenhängenden Hüllglykoproteins, wie etwa eines Bunyavirus-Hüllglykoproteins, nicht beeinträchtigt. Wir haben gezeigt, dass Zellen, die dem vorliegenden Verfahren, zum Beispiel mittels intrazellulärem Transport eines Antikörpers zum Hüllprotein, unterzogen werden, um eine Zelle zu produzieren, die konstitutiv diesen Antikörper exprimiert, bei einem Vergleich mit einem Virus aus parentalen Zellen zu einer 1.000- bis 10.000-fachen Reduktion der Aktivität der produzierten viralen Partikel führt.
Zahlreiche andere Stellen können targetiert werden. Zum Beispiel kann die zytoplasmatische Seite eines Membranrezeptors targetiert werden. Diese Signaltransduktion erfolgt durch das zytoplasmatische Ende. [Luttrell, L. M. et al., Science 259: 1453–1457 (1993); Epstein, R. J., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 10435–10439 (1992)]. Zum Beispiel lässt sich durch die Verwendung des neu/erbB-2-Rezeptors oder des G-Proteinrezeptors der Loop oder das zytoplasmatische Ende targetieren, wodurch eine solche Signaltransduktion verhindert wird. Es werden zum Beispiel vorzugsweise Antikörper zu aktivierten Rezeptoren, wie etwa zu phosphorylierten Aminosäuren, verwendet. Somit kann der Pool der Target-Rezeptoren reduziert werden.
Die Antikörper werden spezifisch an das Target, z. B. ein Protein, binden und können somit wirksam mit anderen Molekülen konkurrieren, die auch Komplexe mit dem Protein bilden werden. Um zu gewährleisten, dass die Antikörper der vorliegenden Erfindung erfolgreich mit anderen Molekülen konkurrieren können, müssen sie mindestens etwa 75% der Bindungseffektivität des vollständigen Antikörpers zu diesem Target erhalten, d. h. über konstante als auch variable Regionen verfügen. Besonders bevorzugt müssen sie über mindestens 85% der Bindungseffektivität des vollständigen Antikörpers verfügen. Noch mehr bevorzugt müssen sie über mindestens 90% der Bindungseffektivität des vollständigen Antikörpers verfügen. Noch viel mehr bevorzugt verfügen sie über eine Bindungseffektivität von mindestens 95%.
Wir haben ein Verfahren entwickelt, das auf zahlreiche Targetmoleküle umfassend anwendbar ist, einschließlich Proteine, RNA, DNA, Haptene, Phospholipide, Kohlenhydrate usw., wie nachfolgend diskutiert werden wird.
Die Targetmoleküle können in einer großen Bandbreite von Wirten vorhanden sein, wie zum Beispiel in Tieren, Vögeln und Pflanzen. Vorzugsweise betrifft das Target Tiere einschließlich Menschen. Besonders bevorzugt handelt es sich um eine Gattung, die von industrieller Bedeutung ist, wie etwa Geflügel, Schweine, Rinder, Kühe, Schafe usw. Am meisten bevorzugt ist die Gattung Mensch.
Obwohl Antikörper über die Fähigkeit verfügen, eine beinahe unbegrenzte Anzahl fremder Moleküle zu erkennen, erkennen Antikörper in der Natur Strukturen von außerhalb der Zelle. [Winter, G., et al., Nature 349: 293 (1991)]. Sobald sie synthetisiert sind, werden Antikörper in das umgebende Fluid abgesondert oder bleiben an die äußere Zellmembran gebunden [Klein, Immunology, Blackwell Scientific Publications, Cambridge, MA 1990]). Wir haben ein Mittel gefunden, um Antikörper zu exprimieren, denen die Fähigkeit erhalten bleibt, sich spezifisch intrazellulär an ein Target zu binden.
Somit kann das Spezifische für ein bestimmtes Target erhalten werden, indem das Immunsystem selbst verwendet wird. Es wird das Target oder ein antigener Teil davon oder ein Hapten-Trägerkomplex verwendet, um einen Antikörper zu generieren. Dies kann mittels Standardtechniken erreicht werden.
Zum Beispiel werden die antigene Bindung oder die variablen Regionen mittels Interaktion der variablen schweren (V_H) und der variablen leichten (V_L) Domänen an den Aminotermini der Ketten gebildet. Das kleinste Fragment, das eine vollständige Bindungsstelle enthält, wird als Fv bezeichnet und ist ein Heterodimer der V_H- und V_L-Domänen. Es ist jedoch möglich, eine Bindung ohne eine vollständige Bindungsstelle zu erhalten. Zum Beispiel lässt sich eine antigene Bindungsaktivität erhalten, indem nur eine Bindungsdomäne der schweren Kette (dAbs, auch single-domain-Antikörper genannt) verwendet wird. Wie oben erwähnt lässt sich in der vorliegenden Erfindung ein Gen verwenden, das für ein solches Antikörperfragment codiert, solange es im Vergleich zum parentalen Antikörper ausreichend Bindungsfähigkeit behält. Vorzugsweise sollten mindestens ein V_H- und V_L-Heterodimer (Fv) verwendet werden.
Die Determination der dreidimensionalen Strukturen der Antikörperfragmente mittels Röntgenkristallographie führte zur Erkenntnis, dass variable Domänen jeweils in eine charakteristische Struktur gefaltet sind, bestehend aus neun Strängen dicht gepackter β-Blätter. Die Struktur bleibt trotz Sequenzvariation in den V_H- und V_L-Domänen erhalten [Depreval, C., et al., J. Mol. Biol. 102: 657 (1976); Padlan, E. A., O. Rev. Biophys. 10: 35 (1977)].
In der Analyse der primären Antikörpersequenzdaten wurde die Existenz von zwei Klassen von Sequenzen der variablen Region festgestellt, nämlich hypervariable Sequenzen und Framework-Sequenzen [Kabat, E. A., et al., Sequences of Protein of Immunological Interests, 4th ed. U.S. Dept. Health und Human Services (1987)]. Die Framework-Sequenzen sind verantwortlich für die korrekte Faltung der β-Blätter der V_H- und V_L-Domänen und für die Interchain-Interaktionen, die die Domänen zusammenbringen. Jede variable Domäne enthält drei hypervariable Sequenzen, die als Loops erscheinen. Die sechs hypervariablen Sequenzen der variablen Region, drei V_H und drei V_L, bilden die antigene Bindungsstelle und werden als komplementätsbestimmende Regionen (CDRs) bezeichnet.
Indem die Gene der variablen Region sowohl für die interessierenden V_H- als auch die V_L-Ketten kloniert werden, ist es möglich, diese Proteine in Bakterien zu exprimieren und ihre Funktion schnell zu testen. Ein Verfahren ist die Verwendung von Hybridom-mRNA oder Milz-mRNA als Matrize für die PCR-Amplifikation solcher Gene [Huse, et al., Science 246: 1276 (1989)]. Somit lässt sich leicht ein Antikörper screenen, um zu gewährleisten, dass er eine ausreichende Bindungsaffinität für das Antigen hat. Die Bindungsaffinität (K_d) sollte mindestens etwa 10^–7 l/M, besonders bevorzugt mindestens etwa 10^–8 l/M betragen.
1 zeigt die Immunoglobulingene und die Lage der PCR-Primere. Die Immunoglobulingene der leichten und der schweren Kette werden mit den deutlichen V-, D- und J-Segmenten sowie den konstanten Regio nen gezeigt. Ebenfalls abgebildet sind die CDR-Regionen. Die Primere für die PCR-Amplifikation können RNA oder genome DNA sein, wie sowohl für die Fv- als auch die Fab-Genamplifikation gezeigt.
In einer bevorzugten Ausführungsform codieren die Gene, die die leichte Kette und die schwere Kette codieren, einen Linker, um einen Einzelketten-Antikörper (sFv) herzustellen. Der sFv wird sich, sogar unter den Reduktionsbedingungen, die gelegentlich intrazellulär angetroffen werden, richtig falten. Der sFv umfasst typischerweise ein Einfachpeptid mit der Sequenz V_H-Linker-V_L oder V_L-Linker-V_H. Der Linker wird gewählt, um es der schweren Kette und der leichten Kette zu ermöglichen, sich in ihrer richtigen Konformationsorientierung zusammenzubinden. Vgl. zum Beispiel, Huston, J. S., et al., Methods in Enzym. 203: 46–121 (1991). Somit sollte der Linker in der Lage sein, den Abstand von 3,5 nm zwischen seinen Fusionspunkten und den variablen Domänen ohne Distortion der nativen Fv-Konformation, zu überbrücken. Die Aminosäurereste, die den Linker bilden, müssen dergestalt sein, dass sie diesen Abstand überbrücken können und sollten 5 Aminosäuren lang oder länger sein. Die gewählten Aminosäuren müssen auch so ausgewählt sein, dass der Linker hydrophil ist, damit er nicht in dem Antikörper versenkt wird. Vorzugsweise sollte der Linker mindestens etwa 10 Reste lang sein. Noch mehr bevorzugt sollte er etwa 15 Reste lang sein. Der Linker sollte nicht zu kurz sein, aber er sollte auch nicht zu lang sein, das dies zu sterischer Interferenz mit der Bindungsstelle führen kann. Somit sollte er bevorzugt 25 Reste oder weniger lang sein. Der Linker (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)₃ (SEQ ID NO: 1) ist ein bevorzugter Linker, der auf viele Antikörper anwendbar ist, da er ausreichende Flexibilität bietet. Andere Linker beinhalten Glu Ser Gly Arg Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser (SEQ ID NO: 2), Glu Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Ser Thr (SEQ ID NO: 3), Glu Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Ser Thr Gln (SEQ ID NO: 4), Glu Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Val Asp (SEQ ID NO: 5), Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Ser Ser Glu Gly Lys Gly (SEQ ID NO: 6), Lys Glu Ser Gly Ser Val Ser Ser Glu Gln Leu Ala Gln Phe Arg Ser Leu Asp (SEQ ID NO: 7), und Glu Ser Gly Ser Val Ser Ser Glu Glu Leu Ala Phe Arg Ser Leu Asp (SEQ ID NO: 8). Alternativ kann auch ein 15-mer, wie etwa der Linker (Gly-Gly-Gly Gly-Ser)₃ (SEQ ID NO: 1) genommen werden, obwohl jede Sequenz verwendet werden kann, und durch Mutagenese können die Aminosäuren in dem Linker zufallsverändert werden, dann können die Antikörper mit den verschiedenen Linkern mit Phagendisplayvektoren herausgezogen und nach dem generierten Einketten-Antikörper mit der höchsten Affinität gescreent werden.
Vorzugsweise sollten keine Nukleotide verwendet werden, die die gesamte konstante Region der Antikörper codieren. Besonders bevorzugt codiert das Gen weniger als sechs Aminosäuren der konstanten Region.
Wie oben diskutiert, kann das Immunsystem den Antikörper, der an ein spezifisches Molekül, wie etwa ein Targetprotein binden wird, mittels immunologischer Standardtechniken herstellen, zum Beispiel indem das Protein oder ein immunogenes Fragment davon oder ein chemisch synthetisiertes Peptid, das auf einem solchen Protein basiert, verwendet wird. Jede dieser Sequenzen kann, wenn gewünscht, zu Keyhole Limpet Hemocyanin (KLH) konjugiert werden und verwendet werden, um einen Antikörper in Tieren, wie z. B. Mäusen, Kaninchen, Ratten und Hamstern zu ziehen. Danach werden die Tiere geopfert und ihre Milzen entnommen. Monoklonale Antikörper werden produziert, indem Standardfusionstechniken zur Bildung von Hybridom-Zellen verwendet werden. Vgl. Kohler, G., et al. Nature 256: 495 (1975). Dies umfasst typischerweise die Fusion einer Antikörper-produzierenden Zelle (d. h. Milz) mit einer unsterblichen Zelllinie, wie etwa einer Myelomzelle, um die Hybridzelle zu produzieren.
Ein weiteres Verfahren zur Herstellung von Antikörpern ist die In-vitro- Immunisierungstechnik, wie etwa die Verwendung von Milzzellen, z. B., einer Kultur von Milzzellen von Mäusen, denen ein Antigen injiziert wird und dann nach einem Antikörper gescreent wird, der für dieses Antigen produziert wurde. Mit diesem Verfahren reichen 0,1 Mikrogramm des Antigens aus, obwohl etwa 1 Mikrogramm/Milliliter bevorzugt ist. Für die In-vitro-Immunisierung werden Milzzellen, zum Beispiel Mäusemilzzellen, gewonnen und in der gewünschten Menge inkubiert, zum Beispiel, 1 × 107 Zellen/Milliliter in Medium plus mit dem gewünschten Antigen bei einer Konzentration von typischerweise ungefähr 1 Mikrogramm/Milliliter. Danach wird der Zellkultur einer von mehreren Hilfsstoffen zugegeben, in Abhängigkeit von den Ergebnissen des Filter-Immunoplaque-Assays. Diese Hilfsmittel beinhalten N-Acetylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutamin [Boss, Methods in Enzymology 121: 27–33 (1986)]. Salmonella-Typhimurium-Mytogen [Technical Bulletin, Ribi ImmunoChem. Res. Inc., Hamilton, Montana] oder T-Zell-Kondition, die mittels herkömmlicher Techniken produziert werden kann [Vgl. Borrebaeck, C. A. K., Mol. Immunol. 21: 841–845 (1984); Borrebaeck, C. A. K., J. Immunol. 136: 3710–3715 (1986) oder im Handel erhältlich ist, zum Beispiel von Hannah Biologics, Inc. oder Ribi ImmunoChem. Research Inc. Die Milzzellen werden mit dem Antigen vier Tage lang inkubiert und dann gewonnen.
Einzelzellensuspensionen der in vitro immunisierten Mäusemilzzellen werden dann inkubiert, zum Beispiel auf Antigen-Nitrozellulosemembranen in Mikrofilterplatten, wie etwa jene, die von Millipore, Corp. erhältlich sind. Die produzierten Antikörper werden unter Verwendung eines Markers für Antikörper, wie etwa eines mit Meerettichperoxidase markierten zweiten Antikörpers, wie etwa Kaninchen-Anti-Maus IgA, IgG und IgM, detektiert. Für die Determination des Isotyps des abgesonderten Antikörpers kann biotinylierter Kaninchen-Anti-Maus Antikörper, der für schwere Ketten spezifisch ist, wie etwa von Zymed Lab., Inc., verwendet werden, gefolgt von einem Meerettichperoxidase-Avidin- Reagens, wie es etwa von Vector Lab erhältlich ist.
Die unlöslichen Produkte der enzymatischen Reaktion werden als blaue Plaques auf der Membran sichtbar gemacht. Diese Plaques werden zum Beispiel unter Verwendung einer 25-fachen Vergrößerung gezählt. Die Nitrozellulosemembran der Mikrofilterplaques absorbiert leicht eine Vielzahl der Antigene, und die Filtereinheit, die für den Waschschritt verwendet wird, wird bevorzugt, weil sie den Plaqueassay erleichtert.
Dann werden die Antikörper mittels Standardtechniquen gescreent, um den interessierenden Antikörper zu finden. Kulturen, die die interessierenden Antikörper enthalten, werden gezüchtet und induziert und die Überstände werden durch einen Filter passiert, zum Beispiel einen Filter mit 0,45 Mikrometer und dann durch eine Säule, zum Beispiel eine Antigen-Affinitätssäule oder eine Anti-Tag-Peptidsäule. Die Bindungsaffinität wird unter Verwendung einer Minigel-Filtertechnik getestet. Vgl. zum Beispiel Niedel, J., Biol. Chem. 256: 9295 (1981). Es kann auch ein zweiter Assay, wie etwa ein Radioimmunassay verwendet werden, bei dem Magnetperlen verwendet werden, die, zum Beispiel mit Anti-Kaninchen-IgG gekoppelt sind, um freies ¹²⁵I-markiertes Antigen aus dem ¹²⁵I-markierten Antigen, das mittels Kaninchen-Anti-Tag-Peptid-Antikörper gebunden ist, zu separieren. In einer bevorzugten Alternative können „on"- und „off"-Raten gemessen werden, zum Beispiel unter Verwendung eines Biosensor-basierten Analysesystems, wie etwa „BIA-core" von Pharmacia Biosensor AB [Vgl. Nature 361: 186–187 (1993)].
Letztere Technik wird gegenüber der In-vivo-Immunisierung bevorzugt, weil das In-vivo-Verfahren typischerweise etwa 50 Mikrogramm Antigen pro Maus pro Injektion benötigt und weil es üblicherweise zwei Boosts nach der primären Immunisierung beim In-vivo-Verfahren gibt.
Alternativ kann ein bekannter Antikörper für das Targetprotein verwen det werden. Somit können Antikörper für das gewünschte Targetprotein erhalten werden. Danach wird ein Gen für mindestens den antigenbindenden Teil des Antikörpers synthetisiert, wie nachfolgend beschrieben. In einigen bevorzugten Ausführungsformen wird das Gen auch eine intrazelluläre Lokalisierungssequenz für das endoplasmatische Retikulum usw. codieren. Wenn eine Expression im ER, dem normalen Antikörper-Absonderungssystem, wie etwa dem Golgi-Apparat für das endoplasmatische Retikulum gewünscht wird, sollte eine Kopfsequenz verwendet werden. Um derartige Antikörper an einem spezifischen Ort zu halten, wird eine Lokalisierungssequenz, wie etwa die KDEL-Sequenz verwendet.
Antikörpergene können auf der Basis der vorliegenden Offenbarung unter Verwendung bekannter Techniken hergestellt werden.
Unter Verwendung eines jeden dieser Antikörper können V_H- und V_L-Gene konstruiert werden. Zum Beispiel können V_H- und V_L-Bibliotheken aus Mäusemilzzellen geschaffen werden, die immunisiert wurden, entweder durch die oben beschriebene In-vitro-Immunisierungstechnik oder durch herkömmliche In-vivo-Immunisierung und aus Hybridom-Zelllinien, die bereits produziert wurden oder im Handel erhältlich sind. Es können auch im Handel erhältliche V_H- und V_L-Bibliotheken verwendet werden. Ein Verfahren betrifft die Verwendung der Milzzellen, um mRNA zu erhalten, die für die Synthese durch cDNA verwendet wird. Doppelsträngige cDNA kann hergestellt werden, indem PCR verwendet wird, um die variable Region mit einem degenerativen N-terminalen V-Region-Primer und einem J-Region-Primer oder mit spezifischen Primeren der V_H-Familie, z. B., Maus-12, Human-7, zu amplifizieren.
Zum Beispiel können die Gene der V_H- und V_L-Domänen eines umfassend neutralisierenden Antikörpers für das Hüllglykoprotein von HIV-1, wie etwa F105 [Olshevsky, et al., J. Virol. 64: 5701–5707 (1990); Thali, et al., J. Virol. 65: 6188–6193 (1991); und Posner, et al., J. Immunol. 146: 4325–4332 (1991)] kloniert und sequenziert werden. Die Erst-Strang-cDNA kann aus totaler RNA synthetisiert werden, unter Verwendung von Oligo-dT-Priming und der Moloney-murinen-Leukämie-Virus-Umkehrtranskriptase gemäß bekannter Verfahren. Die Erst-Strang-cDNA wird dann verwendet, um die PCR-Reaktionen auszuführen. Es sollten typische PCR-Bedingungen, zum Beispiel 25 bis 30 Zyklen, verwendet werden, um die cDNA der Immunoglobulingene zu amplifizieren. Eine DNA-Sequenzanalyse wird dann ausgeführt. [Sanger, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 5463–5467 (1977)].
Primerpaare von schweren Ketten bestehen aus einem Vorwärtsprimer V_H und einem Rückwärtsprimer J_H, wobei beide für die Klonierung geeignete Restriktionsorte enthalten. Es kann zum Beispiel die Kabat-Datenbank für Immunoglobuline [Kabat, et al., supra] verwendet werden, um die Aminosäuren und die Codon-Distribution zu analysieren, die in den sieben verschiedenen humanen V_H-Familien zu finden sind. Daraus wird der 35-Basenpaar-Universal-5'-V_H-Primer designed. Es kann ein Primer wie etwa TTTGCGGCCGCTCAGGTGCA(G/A)CTGCTCGAGTC(T/C)GG (SEQ ID NO: 9), verwendet werden, der für zwei verschiedene Nukleotide an zwei Positionen degeneriert ist und die 5'-Enden der FR1-Sequenzen annealen wird. Ein Restriktionsort, wie etwa die 5'-Not-I-Stelle (links-unterstrichen) kann für das Klonieren der amplifizierten DNA eingeführt werden, und liegt 5' zum ersten Codon zum V_H-Gen. Auf ähnliche Weise kann auch ein zweiter Restriktionsort, wie etwa eine interne XhoI-Stelle, eingeführt werden (rechts-unterstrichen).
Auf ähnliche Weise kann ein 66-Basenpaar-J_H-Region-Oligonukleotid für das Rückwärtspriming am 3'-Ende des variablen Gens der schweren Kette designed werden, z. B. AGATCCGCCGCCACCGCTCCCACCACCTCCGGAGCCACCGCCACCTGAGGTGACC GTGACC(A/G)(G/T)GGT (SEQ ID NO: 10). Dieser Primer enthält zusätzlich eine 45-Nukleotidsequenz, die einen Linker, wie etwa den reziproken Translokationslinker (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)₃ (SEQ ID NO: 1) codiert. Dieser Primer enthält zwei degenerative Positionen mit zwei Nukleotiden an jeder Position, basierend auf der Nukleotidsequenz der sechs humanen J_H-Region-Minigene. Restriktionsorte können verwendet werden, zum Beispiel wird eine BspEI-Stelle (links-unterstrichen) in den reziproken Translokationslinker für die kohäsive Endligation mit dem überlappenden Vorwärtsprimer V_kappa eingeführt. Eine interne BsTEII-Stelle (rechts-unterstrichen) wird ebenfalls für weitere Linker-Austauschverfahren eingeführt.
Eine ähnliche Strategie, die den reziproken 45-Nukleotid-Translokationslinker verwendet, wird in das Design des humanen 69-Nukleotid-V_kappa-Primers inkorporiert. Es gibt vier Familien der humanen V_kappa-Gene. Der 5'-V_kappa-Primer GGTGGCGGTGGCTCCGGAGGTGGTGGGAGCGGTGGCGGCGGATCTGAGCTC(G/C)(T/A)G(A/C)TGACCCAGTCTCCA (SEQ ID NO: 11), der am 5'-Ende der FR1-Sequenz annealed wird, ist an drei Positionen degeneriert (jeweils 2 Nukleotide). Der reziproke Translokationslinker-Teil kann eine BspEI-Stelle enthalten, zum Klonieren des kohäsiven Endes mit dem Rückwärtsprimer J_H, es können auch andere Restriktionsorte verwendet werden. Eine interne SacI-Stelle (rechts-unterstrichen) kann ebenfalls eingeführt werden, um weitere Linker-Austauschverfahren zu ermöglichen.
Der 47-Nukleotid-C_kappa-Rückwärtsprimer (Kabatpositionen 109–113) GGGTCTAGACTCGAGGATCCTTATTAACGCGTTGGTGCAGCCACAGT (SEQ ID NO: 12) wird designed, um komplementär zu den konstanten Regionen der Kappa-Ketten zu sein (Kabatpositionen 109–113). Dieser Primer wird zum äußersten 5'-Ende der konstanten kappa-Region annealen. Der Primer enthält eine interne MluI-Stelle (rechts-unterstrichen), die zwei Stoppcodone vorrückt. Zusätzlich kön nen multiple Restriktionsorte, etwa BamHI XhoI/XbaI (links-unterstrichen) nach den Tandem-Stoppcondonen eingeführt werden. Ein ähnlicher Nukleotid-C_kappa-Rückwärtsprimer, wie etwa ein 59-Nukleotidprimer kann auch designed werden, der ein Signal für eine bestimmte intrazelluläre Stelle enthalten wird, wie etwa ein Carboxyterminales Retentionssignal des endoplasmatischen Retikulums, Ser-Glu-Lys-Asp-Glu-Leu (SEQ ID NO: 13) (SEKDEL), GGGTCTAGACTCGAGGATCCTTATTACAGCTCGTCCTTTTCGCTTGGTGCAGCCACAGT (SEQ ID NO: 14). Ähnliche multiple Restriktionsorte, etwa (BamHI XhoI/XbaI) können nach den Tandem-Stoppcondonen eingeführt werden können.
Nachdem die primäre Nukleotidsequenz sowohl für die Gene der schweren Kette als auch der Kappa-Kette determiniert wurde und die Keimbahngene determiniert sind, kann dann ein PCR-Primer designed werden, basierend auf der Kopfsequenz des V_H-71-4 Keimbahngens. Zum Beispiel, enthält der V_H-71-4-Kopfprimer TTTACCATGGAACATCTGTGGTTC (SEQ ID NO: 15) eine 5'-NcoI-Stelle (unterstrichen). Der Kopfprimer (P-L) wird in Konjunktion mit einem zweiten J_H-Primer für PCR-Amplifikationsversuche verwendet. Das 35-Basenpaar-J_H Region-Oligonukleotid wird designed, um die gleiche Sequenz zum Rückwärtspriming an den 3'-Enden der variablen Gene der schweren Kette zu enthalten, TTAGCGCGCTGAGGTGACCGTGACC(A/G)(G/T)GGT (SEQ ID NO: 16). Dieser Primer enthält zwei degenerierte Positionen mit zwei Nukleotiden an jeder Position. Eine BssHII-Stelle (links-unterstrichen) 3' zu und unmittelbar benachbart zum Codon, der die letzte Aminosäure der J-Region determiniert, ermöglicht eine geeignete Klonierung am 3'-Ende des V_H-Gens. Eine interne BstEII-Stelle (rechts-unterstrichen) wird ebenfalls eingeführt. Diese Sequenz wird verwendet, um die V_L-Sequenz zu amplifizieren. Die mittels P-L (Kopfprimer) und P-Linker (Rückwärtsprimer) und P-K (V₂ Primer) und P-CK-Primeren (Rückwärts CK-Primer) amplifizierten Fragmente werden dann in einen Expressionsvektor, wie etwa dem pRc/CMV (Invitrogen), kloniert, und die resultierende Kombinante enthält ein Signalpeptid, einen Interchain-Linker V_H- und V_L-Sequenzen unter der Kontrolle eines Promoters, wie etwa dem CMV-Promoter. Der Fachmann kann leicht andere Promoter auswählen, die das Gen im Zellsystem nach Wahl, zum Beispiel in einer Säugerzelle, bevorzugt in humanen Zellen, exprimieren.
Dieser Einketten-Antikörper kann auf der Basis der vorliegenden Offenbarung mittels eines beliebigen aus einer Reihe bekannter Mittel hergestellt werden. Zum Beispiel werden die V_H/J_H-ICL Und ICL-V_kappa/C_kappa, PCR-Fragmente mit NotI/BspEI bzw. BspEI/XbaI verdaut und in ein Plasmid, wie etwa pSL1180 (Pharmacia), kloniert unter Verwendung von SURE-Bakterien (Strategy) als Wirte. Das resultierende sFv wird mit Restriktionsenzym verdaut und das NotI/BgIII-Fragment wird in die NotI/BamHI-Stelle kloniert, die 3' zum peIB-Signalpeptid in einem pET-Expressionsvektor liegt. Das resultierende Plasmid wird dann in den geeigneten Wirt, wie etwa BL21 (DE3) transformiert. Plasmidfragmente werden nach angemessener Zeit, zum Beispiel, 2 bis 4 Stunden nach der Induktion bei 24° mit 0,2 mM IPTG erhalten und auf ihre Fähigkeit, ihre Targets zu binden, getestet, z. B. gp120-Bindungsaktivität, mittels Standardtechniken, z. B., ELISA, unter Verwendung von mit gp120 (American Biotechnology, Inc.) überzogenen ELISA-Platten (Dynatech Labs) und Detektion mit einem mit alkalischer Phosphatase gekoppeltem Affinitätssäulen-gereinigten Ziegen-Anti-Human-Kappa-Ketten-Antikörper. Das sFv-B-gebundene gp120 wird blockiert durch lösliche CD4 und wird absorbiert zu und eluiert aus einer gp120-Affinitätssäule (Affi-Gel, BioRad, Inc.)
Der V_H-71-4-Kopf und ein J_H-BssHII-Primer werden verwendet, um ein intronloses Fragment mittels PCR zu amplifizieren, das das Kopfpeptid und ein rearrangiertes Gen einer schweren Kette enthält. Das Fragment wird am glatten Ende in Vorwärtsrichtung in eine Eco-RV-Stelle in einem Plasmid, zum Beispiel pSL1180, kloniert. Anschließend wird ein NcoI/BstEII-Fragment erhalten und mit dem BstEII/SphI-Fragment kombiniert, z. B. einem F105sFv von pSL1180 in einer dreiteiligen Ligation mit NcoI/SpHI-verdautem pSL1180, um V_H-71-4/SCA zu produzieren. Ein V_H-71-4-SCA, das die Carboxyl-terminale SEKDEL-Sequenz enthält, kann konstruiert werden unter Verwendung eines ICL-V_kappa-SEKDEL-PCR-Produkts, das am glatten Ende in Vorwärtsrichtung in eine Eco-RV-Stelle in pSL1180 kloniert wurde. Das Fragment wird mittels BspEI/XbaI-Verdauung entfernt und mit dem NcoI/BspEI-Fragment von V_H-71-4/SCA in einer dreiteiligen Ligation mit NcoI/XbaI-verdautem pSL1180 kombiniert, um V_H-71-4/KDEL zu produzieren. Vor der Klonierung in pRC/CMV (Invitrogen)) wird ein EcoRI zu HindIII-Konversionslinker in das EcoRI-verdaute pSL1180 eingeführt, der die zwei Einketten-Antikörper enthält. Anschließend wird ein HindIII/XbaI-Fragment von beiden Einketten-Antikörpern erhalten und in HindIII/XbaI-verdautes pRC/CMV kloniert, um pRC/SCA und pRC/KDEL zu produzieren.
Vgl. 2, die ein Diagramm der Strukturen von Fv, sFv und sFv-KDEL eines umfassend neutralisierenden Antikörpers, F105, darstellt. Die drei komplementätsbestimmenden Regionen (CDRs) jeder Kette sind schattiert.
Ähnliche Strategien können verwendet werden, um praktisch jeden anderen Antikörper herzustellen. Zum Beispiel kann unter Verwendung einer Kombination aus mRNA-Reinigung, Einzelstrang-cDNA-Synthese und PCR-Amplifikation unter Verwendung der oben diskutierten degenerativen V_H- und J_H-Primere ein ungefähr 350 bp-Produkt aus Milzzellen erhalten werden, die gegen tat- und anti-tat-Hybridom-Zelllinien immunisiert wurden. Unter Verwendung der selben Techniken, wie sie für schwere Ketten beschrieben wurden, kann ein 320 bp-V_kappa-Genprodukt aus Milzzellen, die gegen tat- und anti-tat-Hybridom-Zelllinien immuni siert sind, unter Verwendung der oben diskutierten degenerativen V_kappa- und J_kappa-Primere erhalten werden. Sobald sie erhalten wurden, können die V_H- und V_L-Domänen verwendet werden, um sFv, Fv oder Fab-Fragmente zu konstruieren.
Ein bevorzugtes Target ist eines, das durch das endoplasmatische Retikulum, wo die Proteine typischerweise erzeugt werden, prozessiert wurde.
Es gibt jedoch Fälle, in denen ein höherer Grad an intrazellulärer Spezifizität erwünscht ist, zum Beispiel, wenn nukleare Proteine, RNA, DNA oder zelluläre Proteine oder Nukleinsäuren targetiert werden, die anschließend prozessiert werden.
Zum Beispiel werden Strukturproteine typischerweise mit viral codierten Proteinen, wie etwa Lentiviren, zytoplasmisch exprimiert, während Regulatorproteine in oder nahe dem Nukleus exprimiert werden können. Somit sollten bevorzugt Lokalisierungssequenzen für solche Targets verwendet werden. Unsere Antikörper können intrazellulär transportiert und dort exprimiert werden und an ein Targetprotein binden.
Lokalisierungssequenzen wurden aufgeteilt in Routing-Signale, Sorting-Signale, Retentions- oder Salvage-Signale und Membran-Topologie-Stop-Transfer-Signale. [Pugsley, A. P., Protein Targeting, Academic Press, Inc. (1989)]. Zum Beispiel können zum Lenken des Antikörpers an einen spezifischen Ort spezifische Lokalisierungssequenzen verwendet werden, zum Beispiel Signale, wie etwa Lys Asp Glu Leu (SEQ ID NO: 17) [Munro, et al., Cell 48: 899–907 (1987)] Asp Asp Glu Leu (SEQ ID NO: 18), Asp Glu Glu Leu (SEQ ID NO: 19), Gln Glu Asp Leu (SEQ ID NO: 20) und Arg Asp Glu Leu (SEQ ID NO: 21) [Hangejorden, et al., J. Biol. Chem. 266: 6015 (1991), für das endoplasmatische Retikulum; Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val (SEQ ID NO: 22) [Lanford, et al. Cell 46: 575 (1986)]; Pro Gln Lys Lys Ile Lys Ser (SEQ ID NO: 23) [Stanton, L. W., et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 83: 1772 (1986); Gln Pro Lys Lys Pro (SEQ ID NO: 24) [Harlow, et al., Mol. Cell Biol. 5: 1605 (1985)]; Arg Lys Lys Arg (SEQ ID NO: 56), für den Nukleus, und Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Ala His Gln (SEQ ID NO: 25), [Seomi, et al., J. Virology 64: 1803 (1990)], Arg Gln Ala Arg Arg Asn Arg Arg Arg Arg Trp Arg Glu Arg Gln Arg (SEQ ID NO: 26) [Kubota, et al., Biochem. und Biophy, Res. Comm. 162: 963 (1989)], Met Pro Leu Thr Arg Arg Arg Pro Ala Ala Ser Gln Ala Leu Ala Pro Pro Thr Pro (SEQ ID NO: 27) [Siomi, et al., Cell 55: 197 (1988)] für die Nukleolusregion; Met Asp Asp Gln Arg Asp Leu Ile Ser Asn Asn Glu Gln Leu Pro (SEQ ID NO: 28), [Bakke, et al., Cell 63: 707–716 (1990)] für das endosomale Kompartment. Vgl. Letourneur, et al., Cell 69: 1183 (1992) für das Targeting von Liposomen. Myristylierungssequenzen können verwendet werden, um den Antikörper zu der Plasmamembran zu lenken. Die Tabelle 1 stellt die aminoterminalen Sequenzen für bekannte N-Myristoylproteine und deren subzellulären Ort dar. Zusätzlich, wie in der untenstehenden Tabelle 1 gezeigt, können Myristylierungssequenzen verwendet werden, um die Antikörper zu den verschiedenen subzellulären Orten, wie etwa der nuklearen Region, zu lenken. Lokalisierungssequenzen können auch verwendet werden, um Antikörper zu Organellen, wie etwa den Mitochondrien und dem Golgi-Apparat zu dirigieren. Die Sequenz Met Leu Phe Asn Leu Arg Xaa Xaa Leu Asn Asn Ala Ala Phe Arg His Gly His Asn Phe Met Val Arg Asn Phe Arg Cys Gly Gln Pro Leu Xaa (ID NO: 29) kann verwendet werden, um den Antikörper zur Mitochondrienmatrix zu lenken (Pugsley, supra). Vgl. Tang, et al., J. Bio. Chem. 207: 10122 betreffend die Lokalisierung von Proteinen zum Golgi-Apparat.
Wir haben gezeigt, dass unter Verwendung von Lokalisierungssequenzen die Antikörper exprimiert und/oder an einer intrazellulären Region gehalten werden können, an der sie gewöhnlich nicht erscheinen. Zum Beispiel haben wir nach der Expression einen tat-Antikörper im ER gehalten. Auf ähnliche Weise haben wir Anti-HIV-Hüllen und anti-tat- Antikörper im Zytoplasma exprimiert.
Um zu beweisen, dass Einketten-Antikörper an einer interzellulären Region exprimiert werden können, an der sie normalerweise nicht erscheinen, haben wir Antikörper in das Zytoplasma exprimiert, zum Beispiel unter Verwendung von zytoplasmatisch exprimierten Antikörpern, die an den 3'-Enden modifiziert wurden, um zusätzliche Lokalisierungssignale einzuschließen, zum Beispiel das nukleare Lokalisierungssignal SV40 für die Expression im Nukleus oder die Translokation in den Nukleus. Zum Beispiel wurde der F105 Einketten-Antikörper, der typischerweise im ER exprimiert wird, reamplifiziert, so dass er einen neuen 5'-Primer enthält, der zur Framework-1-Region des Antikörpers annealed. Er enthält daher kein Kopfpeptid, sondern er enthält ein starkes Initiations-Startsignal mit einem extra Methionin am 5'-Ende als Startcodon. Dieser Primer hat eine HindIII-Stelle am 5'-Ende, gefolgt von der NcoI-Stelle, die den Met-Startcodon enthält. TTT-AAG-CTT-ACC-ATG-GCC-CAG-GTG-CAG-CTG-CAG-GAG-TCG-GG (SEQ ID NO: 57) und Codes für Met Ala Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly (SEQ ID NO: 58). Zusätzlich zu diesem Methionin, das sich direkt in der Mitte der NcoI-Stelle befindet, gibt es eine zusätzliche Aminosäure, Ala. Am Carboxy-Ende des Signalpeptids für die bakterielle Expression gibt es eine Ala-Met-Ala-Spaltung. Die Spaltung in das Periplasma geschieht direkt nach dem zweiten Ala und vor der ersten Aminosäure des Frameworks. Diese ist also ein vielseitiger Primer, der verwendet oder modifiziert werden und bei vielen Gelegenheiten verwendet werden kann. Zum Beispiel kann mit der NcoI-Stelle mit geeigneter Endonuklease begonnen werden und dann in einen bakteriellen Expressionsvektor kloniert werden. Der selbe Primer kann zur Amplifikation wiederverwendet werden, oder kann verwendet werden, um das amplifizierte Material zu nehmen, das noch immer die HindIII-Stelle aufweist, und es mit HindIII zu verdauen. Somit wird ein Einketten-Antikörper mit dem zusätzlichen Methionin erhalten, sowie ein Ala am 5'-Ende, das in einen Vektor kloniert, wie etwa den pRC/CMV-Expressionsvektor, mit Lipofektion transfiziert, mit S³⁵-Methionin radioaktiv markiert und mit Anti-Kappa-Antikörper immunopräzipitiert werden kann. Wir haben die Technik verwendet und die Expression eines Antikörpers zur Hülle im Zytoplasma erhalten. Diese Basisstrategie kann verwendet werden und der Antikörper kann modifiziert werden, um außerdem ein Lokalisationssignal zu haben, um den exprimierten Antikörper zu einem gewünschten Target zu transportieren, zum Beispiel durch Verwendung eines Einketten-Antikörpers, wie etwa tat, und Reamplifizieren desselben am 5'-Ende mit einem Primer, der zur Framework-1-Region der variablen Region annealed, und über einen Methioninrest für einen Startcodon und eine HindIII-Stelle für die Klonierung verfügt. Dieses Antikörpergen wird dann zum Klonieren und zur Expression in pRC/CMV reamplifiziert. Zusätzlich wird dieser Antikörper weiter modifiziert, so dass zusätzlich zur Verwendung dieses neuen 5'-Primers für die zytoplasmische Expression der C-Terminus das Nuklearlokalisierungssignal SV40 enthält. Somit kann der Antikörper in das Zytoplasma exprimiert werden, wo wir zum Beispiel auch das nukleare Lokalisiserungssignal SV40 verwendet haben, und in den Nukleus transportiert werden.
Wir haben diese zwei Formen der Antikörper sowie zwei negative Kontrollen verwendet. Die negativen Kontrollen beinhalten verschiedene Kappa-Ketten, die aus dem gleichen Myelom amplifiziert wurden. Wir haben verschiedene Anti-tat-Einketten-Antikörper-Konstrukte gemacht, die in der Lage sind, im Zytoplasma exprimiert zu werden. Aus der Myelom-Zelllinie, die den anti-tat-monoklonalen Antikörper produziert, wurden zwei verschiedene Einketten-Antikörper, die die verschiedenen Kappa-Ketten enthalten, auch mit der nuklearen Lokalisierungssequenz SV40 amplifiziert. Somit haben wir Einketten-Antikörper hergestellt, die im Zytoplasma exprimiert werden sollen, mit oder ohne ein nukleares Lokalisierungssignal. Um die Spezifizität des Antikörpers zu zeigen, wurde auch die inkorrekte leichte Kette verwendet. Alle vier Formen dieses Antikörpers wurden in eukaryotischen Zellen exprimiert. In diesen Versuchen wurden die vier verschiedenen Plasmide in COS-Zellen transfiziert, und diese Versuche wurden mit und ohne Koexpression eines tat-Expressorplasmids ausgeführt. Der KDEL-Hüllantikörper war instabil, bis der Ligand oder das gp120 daran gebunden wurde, so dass wir bestätigten, dass das Gleiche auch im Zytoplasma auftreten kann. Alle vier Antikörper wurden mit und ohne tat exprimiert. Beim Immunopräzipitieren dieser radioaktiv markierten Lysate von COS-Zellen mit einem Pool von Kaninchen-Anti-Maus-Immunoglobulinen und mittels Autoradiographie scheint es, dass in Gegenwart des tat-Proteins eine stärkere Immunopräzipitation des Antikörper stattfindet als in Abwesenheit von tat.
Wir haben gezeigt, dass tat-Antikörper die tat-Aktivität inhibieren können. Zum Beispiel kann in HeLa-Zellen, die ein Plasmid exprimieren, das einen HIV-1-LTR-CAT-Reporter enthält, nur 0,01 μg eines tat-exprimierenden Plasmids zu einer 25-fachen Transaktivierung führen. Das Hinzufügen von 10 oder 5 μg von Anti-tat-SCA (V_K), Anti-tat-SCA mit nuklearem Lokalisierungssignal SV40 (V_K SV40) und Anti-tat-SCA-Antikörper mit einer Immunoglobulin-Kopfsequenz zur Lenkung des Antikörpers in das ER, die mit 0,1 μg eines tat-exprimierenden Plasmids kotransfiziert wurden, in derartige HeLa-Zellen zeigte, dass die intrazelluläre Expression der tat-Antikörper die tat-Aktivität signifikant reduzieren kann (vgl. 21 und 22). Der tat-Antikörper mit dem Immunoglobulinkopf dient als negative Kontrolle dieser Versuche. Bei 10 μg zeigt der Anti-tat V_K nur 4% der Aktivität des Anti-tat-SCA, der im ER exprimiert ist, wo tat nicht vorhanden ist.
Die Lokalisierungssignale können überall auf dem Antikörper lokalisiert werden, solange das Signal im Antikörper exponiert ist und dessen Platzierung die Bindungsfähigkeit des Antikörpers nicht stört. Zum Beispiel kann er auf dem Carboxy- oder Aminoterminus oder sogar auf dem Linker zwischen der schweren und der leichten Kette eines sFv-Antikörpers platziert werden, vorausgesetzt, er erfüllt die oben genannten Bedingungen. TABELLE 1

⁴ Um die Lesbarkeit zu erhöhen, wird der Standard-Einbuchstabencode für Aminosäuren in der Tabelle verwendet, die Aminosäuresequenzen, die den Dreibuchstabencode verwenden, werden im Sequenzprotokoll dargestellt.
⁵ Die Abkürzungen bedeuten PM, Plasmamembran, G. Golgi; N, Nuklear; C, Zytoskelett; s, Zytoplasma (löslich); M, Membran.

⁶ Um die Lesbarkeit zu erhöhen, wird der Standard-Einbuchstabencode für Aminosäuren in der Tabelle verwendet, die Aminosäuresequenzen, die den Dreibuchstabencode verwenden, werden im Sequenzprotokoll dargestellt.
⁷ Die Abkürzungen bedeuten PM, Plasmamembran, G. Golgi; N, Nuklear; C, Zytoskelett; s, Zytoplasma (löslich); M, Membran.

⁸ Um die Lesbarkeit zu erhöhen, wird der Standard-Einbuchstabencode für Aminosäuren in der Tabelle verwendet, die Aminosäuresequenzen, die den Dreibuchstabencode verwenden, werden im Sequenzprotokoll dargestellt.
⁹ Die Abkürzungen bedeuten PM, Plasmamembran, G. Golgi; N, Nuklear; C, Zytoskelett; s, Zytoplasma (löslich); M, Membran.

Um diese Antikörper in der Zelle zu halten, ist es bevorzugt, dass der exprimierte Antikörper nicht die gesamten Domänen der konstanten Region enthält. Wir glauben, dass es diese Region ist, in der es spezifische Sequenzen gibt, die bei der Absonderung des Antikörpers von der Zelle helfen. Wir haben zum Beispiel einen umfassend neutralisierenden sFv Antikörper zu einem Hüllglykoprotein konstruiert, das nur sechs Aminosäuren der konstanten Region enthält und nicht in einer größeren Menge durch die Zelle abgesondert wird, während der unveränderte Fab-Antikörper zu solch einem Protein abgesondert wird. Diese Ausführung, bei der solche Sequenzen ausgelassen werden, kann leicht mit der Auswahl und Auslassung von Nukleotiden, die für den Antikörper codieren, erreicht werden. Obwohl ein umfassend neutralisierender Antikörper in diesem Beispiel diskutiert wurde, müssen die verwendeten Antikörper nicht umfassend neutralisierend sein. Die Neutralisierung ist nicht erforderlich, vielmehr muss der Antikörper an das Target binden. Somit sollte bevorzugt auf ein Epitop auf dem Molekül geachtet werden, das konserviert und zugänglich ist.
Alternativ sollte, wo das sekretorische Signal erhalten wird, die Verwendung intrazellulärer Retentionssequenzen wie etwa KDEL für das endoplasmatische Retikulum, die meisten Antikörper innerhalb der Zelle exprimiert halten.
Wir haben herausgefunden, dass der exprimierte sFv-Antikörper weiter an das BiP-Protein binden wird, was dabei helfen kann, den resultierenden Antikörper-Targetkomplex innerhalb der Zelle zu halten.
Zum Beispiel wird das F105 Fab an das Hüllglykoprotein an verschiedenen Orten innerhalb und außerhalb der Zelle binden, wenn sie abgesondert werden. Dementsprechend, wenn das Targetmolekül, in diesem Beispiel das Hüllglykoprotein, nicht ganz an einen Ort gebunden ist, ermöglicht die Verwendung eines solchen sekretierbaren Antikörpers das Targetieren des Proteins an multiplen Orten.
Wir haben herausgefunden, dass wir durch die Verwendung von Zellen wie etwa COS-Zellen, die durch das F105-Fab-Antikörpergen stabil transformiert werden, die konstitutive Expression von F105 Fabs erhalten können. Diese Zelllinien sondern die Fabs bei etwa 1–3 pg/ml ab. Diese Menge kann, je nach Bedarf des Fachmanns, unter Verwendung verschiedener Enhancer und Promoter verändert werden. Wie oben erwähnt, kann das sekretierte Fab das Molekül an verschiedenen intrazellulären Orten targetieren, wenn es abgesondert wird. Zusätzlich kann das Fab auch jedes Molekül extrazellulär targetieren, das aus der Zelle entkommen sein könnte. Indem es zum Beispiel das Hüllglykoprotein targetiert, wenn es prozessiert wird, wobei es die Menge des prozessierten Proteins außerordentlich reduziert, kann es auch an gp120 auf dem freien Virion binden und es von der Infektion eines weiteren CD4- Rezeptors oder einer nicht infizierten Zelle abhalten. Zum Beispiel hat die Verwendung dieser F105-Fabs in HIV-infizierten COS-Zellen die Synzytiabildung inhibiert.
So wie der Begriff hier verwendet wird, kann das Gen für den Antikörper Gene für die Regionen der schweren und der leichten Kette umfassen. Zusätzlich ist das Gen operativ mit einem Promoter oder Promotern verknüpft, was zu seiner Expression führt. Promoter, die die Expression in Säugerzellen ermöglichen, sind gut bekannt und beinhalten CMV, eine virale LTR, wie etwa eine Rous-Sarkom-Virus-LTR, HIV-LTR, HTLV-1 LTR, den frühen Promoter SV40, E. coli lac-UVS-Promoter und den Herpes-Simplex-tk-Viruspromoter. Diese DNA-Sequenz wird als Antikörperkassette beschrieben.
Die Antikörperkassette wird mittels jedes bekannten Mittels zur Zelle transportiert. Vgl. zum Beispiel, Miller, A. D., Nature 357: 455–460 (1992); Anderson, W. F., Science 256: 808–813 (1992); Wu, et al, J. of Biol. Chem. 263: 14621–14624 (1988). Zum Beispiel kann eine Kassette, die diese Antikörpergene enthält, wie etwa die sFv-Gene, zu einer bestimmten Zelle mittels einer Reihe von Techniken targetiert werden. In der nachfolgenden Erörterung werden wir die sFv-Gene diskutieren, die Gene für HIV-Antikörper codieren, welche man bevorzugt in CD4⁺T-Zellen einführen würde. Jedoch können die beschriebenen Techniken leicht verwendet werden, um die Antikörpergene in andere Zellen, bevorzugt humane Zellen, einzuführen, zum Beispiel unter Verwendung eines Säugerexpressionsvektors, wie etwa eines Herpesvektors, eines Adenovirusvektors oder eines Pockenvektors, eines retroviralen Vektors, eines Plasmids, das an einen Antikörper gebunden ist, usw. Diese Vektoren können verwendet werden, um die Zellen mittels Standardtechniken zu transduzieren, die dem Fachmann bekannt sind. Vorzugsweise wird diese Kassette unter Verwendung eines viralen HIV-Vektors in die Zelle eingeführt, welcher defektiv ist bei der Verpackung von HIV-Sequenzen, der aber vorzugsweise HIV-anfällige Zellen targetiert. Zusätzlich kann ein Promoter verwendet werden, der das Gen in der gewünschten Targetzelle differenziell exprimieren wird, zum Beispiel unter Verwendung eines HIV-LTR als Promoter, in dem das Target HIV-infizierte Zellen sind. In einem solchen Fall können im Vergleich mit nicht infizierten Zellen die viralen HIV-Proteine in der Zelle, wie etwa tat, zu einer verbesserten Expression des Antikörpers führen. In einer weiteren Ausführungsform können Zellen transduziert werden, die ein größeres Risiko für eine virale Infektion, wie etwa CD4-Zellen, darstellen.
Die intrazelluläre Expression des Antikörpers ermöglicht die Bindung des Targets. Dies stört die Funktion des Targets, z. B., eines Proteins, das die unerwünschte Funktion aufweist. Zum Beispiel kann die Expression von sFv eines umfassend neutralisierenden Antikörpers zum Hüllglykoprotein den Transport und die Interaktion mit den CD4-Molekülen des HIV-1-Glykoproteins sowie die Spaltung des Proteins intrazellulär blockieren. Wir haben sowohl sFv ohne jedes Targeting-Signal als auch diesen sFv-Antikörper mit einem Retentionssignal des endoplasmatischen Retikulums (KDEL) cloniert. Diese wurden dann intrazellulär in Säugerzellen eingeführt, zum Beispiel unter Verwendung eines Säugerzell-Expressionsvektors, obwohl ein retroviraler Vektor für dieses Antikörperkonstrukt bevorzugt ist. Als ein weiteres Beispiel kann die Verwendung eines Antikörpers, der spezifisch ist für neu, welches auf Brustgewebe targetiert ist, helfen, das neu-Protein in der Zelle zu halten.
Die Expression dieser Antikörper sollte die Zellen nicht schädigen. In der Tat kann, wenn der „Ligand"-Target-Antikörper nicht vorhanden ist, der Antikörper so designed werden, dass er abgebaut wird. Zum Beispiel wurde der Antikörper zum Hüllglykoprotein mit einer KDEL-Retentionssequenz bald nach der Synthese abgebaut, außer wenn das HIV-1-Hüllglykoprotein vorhanden war, um einen Antikörper-Ligandkomplex zu bilden. Im Gegensatz dazu wurde der Einketten-Antikörper für das Hüllglykoprotein, der ohne das Retentionssignal exprimiert wurde, nicht auf ähnliche Weise abgebaut, sondern konnte vielmehr nach der radioaktiven Markierung einer Immunopräzipitation mit polyklonalem Antikörper zur humanen Immunoglobulin-K-Kette oder zur schweren Kette in den transfizierten Zellen detektiert werden. In beiden Fällen scheinen die transformierten Zellen normale Morphologie- und Wachstumsraten zu haben. Vgl. zum Beispiel 4, welche die transformierten COS-Zellen zeigt, welche mittels Neomycinselektion festgestellt wurden und entweder den Einketten-Antikörper exprimieren oder die Einkette mit der KDEL-Sequenz, die in dem endoplasmatischem Retikulum gehalten wird. Dieser Antikörper ist an das HIV-1-gp160-Protein gebunden und könnte sowohl mit dem Anti-K als auch dem Anti-gp120 kopräzipitiert werden. Es wurde nur sehr wenig gp120 detektiert, selbst in einer Vier-Stunden-Chase-Probe der sFv-transformierten Zellen, während eine Fraktion von gp120 in den Vektor-transformierten Zellen detektiert wurde und in einem geringeren Anteil in sFv-KDEL-transformierten Zellen (vgl. 5). Somit wird gezeigt, dass der exprimierte sFv-Antikörper an das Protein gp160 bindet und verhindert, dass das gp160-Protein weiter prozessiert. In einer bevorzugten Ausführungsform würde ein Antikörper zu gp41 auch zu solch einer Zelle transportiert werden, um jedes gp160-Protein, das gespalten wurde, zu targetieren.
Eine alternative Strategie ist es, die Expression des Antikörpers unter der Kontrolle eines induzierbaren Promoters zu haben. Vorzugsweise wird der Promoter durch eine Wirkung des Targets induzierbar. Zum Beispiel kann eine virale LTR, wie etwa eine HIV-LTR, als Promoter verwendet werden. Das HIV-Virus produziert Proteine, z. B. tat, die den Promoter „anschalten".
Wie oben erklärt, schien das sFv-KDEL-Produkt, obwohl es ohne vorhandenes Target schnell abgebaut wird, nicht schnell abgebaut zu wer den, wenn das HIV-1-Glykoprotein vorhanden war. Somit wurde ein sFv-KDEL-Band in einem Polyacrylamidgel nach radioaktiver Markierung und Immunopräzipitation sichtbar. Dieses Protein kopräzipitierte auch mit dem HIV-1-Glykoprotein, obwohl ein kleiner Teil von gp120 detektiert wurde, was auf einen unvollständigen Block zum Glykoproteintransport schließen lässt, der möglicherweise auf den schnellen Abbau von kürzlich synthetisierten Antikörpern vor der Bindung an einen Liganden zurückzuführen ist. Die Immunfluoreszenzfärbung für sFv-KDEL in den transformierten Zellen, die ein HIV-1-Glykoprotein koexprimieren, zeigte ein Färbungsmuster des endoplasmatischen Retikulums, aus dem sich schließen lässt, dass der Antikörper nach der Bindung zu seinem Liganden stabil wurde und im endoplasmatischen Retikulum verblieb.
Das Vorhandensein von Targetprotein unterstützt den Antikörper auch bei der Faltung in den korrekten konformationalen Zustand. Wie oben erwähnt, verhindern diese Antikörper-Ligand-Komplexe, dass das Target in seiner typischen Weise arbeitet. Zum Beispiel wird die zytopathische Fusion, die durch das HIV-1-gp120/41 vermittelt wird, in den Zellen inhibiert. Dies wird gezeigt, indem die CD4⁺-Hela-Zellen mit dem HIV-1-Glykoprotein-Expressor pSVIII env und sFv oder dem sFv-KDEL-Plasmid-DNAs in einem Verhältnis von 1:5 kotransfiziert werden oder die transformierten Zellen mit pSVIII transfiziert werden. Zellen, die den intrazellulären Antikörper aufwiesen, zeigten eine signifikante Reduktion der Synzytiumbildung, während keine signifikante Reduktion der Synzytiumbildung bei Zellen beobachtet wurde, die mit dem Vektor, der den Antikörper nicht exprimierte, transformiert oder transfiziert wurden, was anzeigt, dass intrazelluläre Antikörper die zytopathische Fusion inhibieren können, indem sie den Transport des HIV-Glykoproteins zur Plasmidmembran und/oder die Interaktion des HIV-1-Glykoproteins mit den CD4-Molekülen auf benachbarten Zellen blockieren, sogar dann, wenn die sFvgp120-Komplexe in der Lage waren, die Zelloberfläche zu erreichen.
Überdies wurden nur sehr wenige infektiöse HIV-1-Partikel aus diesen intrazelluläre Antikörper enthaltenden Zellen produziert. Die Zellen, die den intrazellulären Antikörper exprimieren, wurden mit infektiöser proviraler HIV-1-DNA transfiziert, und die Überstände aus den transfizierten Zellen können verwendet werden, um das humane CD4-Lymphozyt SupT1 zu infizieren. Eine dramatisch verlangsamte Kinetik der Infektionen wird bei solchen Zellen im Vergleich mit derjenigen vektortransformierter Zellen beobachtet, obwohl vergleichbare Mengen an p24-Aktivität der Überstände aller dieser Zellen beobachtet wurden, was darauf hinweisen kann, dass nicht infektiöse HIV-1-Partikel in Abwesenheit des HIV-1-Glykoproteins produziert werden können.
Die SupT-sFv105-Zellen erhalten den parentalen Phänotyp, können angemessen auf externe Stimuli reagieren, sind resistent gegen die zytopathischen Wirkungen der HIV-1-Infektion, und die infizierten Zellen produzieren HIV-1-Viruspartikel, die eine deutlich verringerte Infektiosität aufweisen.
Dies beweist, dass das vorliegende Verfahren verwendet werden kann, um bei einer viralen Infektion, wie etwa einer HIV-1-Infektion, einzugreifen, unter Verwendung eines intrazellulär exprimierten Antikörpers, wie etwa eines gentechnisch hergestellten Einketten-Antikörpers, und dass mittels Bindung an die funktionsgestörten oder unerwünschten Genprodukte die unerwünschten Wirkungen gemildert werden könnten. Unter Verwendung der gleichen Basisstrategie sollte es möglich sein, bei anderen viralen und metabolischen Krankheiten, wie etwa Infektionen durch einen DNA-Virus, wie etwa Herpes simplex, und RNA-Viren, wie etwa HTLV-1 und 2, einzugreifen. Vorzugsweise sollte dieses Verfahren gegen Viren verwendet werden, die langlebig sind, und/oder nicht leicht auf andere Arten der Behandlung ansprechen.
Das vorliegende Verfahren ermöglicht zahlreiche Ansätze, sogar gegen die gleiche Krankheit. Zum Beispiel können Antikörper gegen Umkehrtranskriptase die Matrizenbindungsfunktionen des Proteins beeinflussen [DeVico, A. L., et al. J. of Biol. Chem. 266: 6774–6779 (1991)]. Antikörper gegen dieses Protein sind bekannt und beinhalten C2003, das an eine Sequenz in dem C-terminalen Teil der p66-Komponente bindet [Ibid]. Dieser Antikörper bindet auch an HIV-2 [DeVico, A. L., AIDS Res & H. Retro. 5: 51–60 (1989)]. Nach solchen Antikörpern kann in Patientenseren gescreent werden, und die Antikörper können, wie oben beschrieben, kloniert werden.
Ein weiterer Ansatz ist es, eine kritische Nukleinsäuresequenz im Virus, wie etwa das TAR-Element, zu targetieren. Das tar-Element, das auf tat reaktionsfähig ist, liegt auf dem 5'-Ende der viralen Messenger-RNA. Es hat sich herausgestellt, dass die tat-Bindung an dieses tar-Element zu einer Derepression der tar-Inhibition der In-vitro-Translation führt. Zusätzlich erhöht das tar-Element die Transkription und die Initiation, und wirkt auch als Anti-Attenuator der Transkriptionselongation. Indem ein Antikörper gegen die tar-Sequenz gerichtet wird, wird eine Inhibition der tat-Bindung stattfinden, und es wird eine dramatische Abnahme der Transkriptionseffizenz geben. Dies wird letztlich zu einer Inhibition oder Reduktion der Virusproduktion führen. Ein ähnlicher Ansatz kann verwendet werden, um Antikörper gegen das rev Responsive Element (RRE) zu produzieren. Rev kontrolliert die Synthese viraler Strukturproteine, einschließlich des Kapsidproteins, replikativer Enzyme und des Hüllglykoproteins. Das rev-Protein kontrolliert die Virionprotein-Expression, indem es die Zytoplasmaakkumulation von RNA-Arten kontrolliert. In Abwesenheit von rev-Aktivität akkumulieren kleine, mehrfach gespleißte virale RNA-Arten, in Gegenwart von rev, akkumulieren Volllängen- und teilweise gespleißte Hüllglykoprotein-Messenger-RNAs. Antikörper, die gegen das RRE gelenkt werden, sollten die rev- Bindung an das RRE und damit die biologische Hauptwirkung von rev. inhibieren. Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass das rev-Protein die Synthese des Kapsids, replikativer Enzyme und die Hüllglykoproteinproduktion reguliert, indem es die Akkumulation von Messenger-RNA-Arten reguliert, aus denen sie gemacht sind. Strukturprotein-Messenger-RNAs erfordern die Bindung des rev-Proteins an die gefaltete RNA-Struktur, RRE genannt, zur Translokation vom Nukleus zum Zytoplasma. Die Inhibition einer rev-Bindung durch einen Anti-rev-Antikörper sollte die Virusexpression von infizierten Zellen verhindern. Solche TAR- oder RRE-Antikörper können unter Verwendung bekannter Technologien auf der Basis der Offenbarung synthetisiert werden. Zum Beispiel kann eine RNA-Bibliothek mit einem Antikörper gescreent werden, um den gewünschten Antikörper zu erhalten.
Es wurde vorgeschlagen, dass die Tumor- und Metastasenbildung von der Angiogenese abhängt (d. h., der Bildung neuer kapillarer Blutgefäße). [Folkman, et al., Origins of Human Cancer: A Comprehensive Review, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1991)]. Zum Beispiel wurde herausgefunden, dass das humane Melanom mehrere Proteine mit angiogener Aktivität produziert, einschließlich des Fibroblastenwachstumsfaktors (bFGF), des transformierenden Wachstumsfaktors Alpha (TGFa) und des transformierenden Wachstumsfaktors Beta. [Herlyn, et al., Lab. Invest. 56: 461 (1987)]. Indem solche Proteine als Targets für intrazelluläre Antikörper verwendet werden, kann die Tumor- und Metastasenbildung begrenzt werden.
Es wurde angedeutet, dass Änderungen an den Positionen 12, 13 oder 61 der ras p21-Proteine zur Tumorbildung führen. Die Verwendung des mutierten Proteins als Target für einen intrazellulären Antikörper, der das onkogene ras von dem Proto-ras unterscheiden kann, sollte die Tumorbildung begrenzen. Antikörper, die eine solche spezifische Bindung eingehen können, sind den Fachleuten bekannt.
Es ist bevorzugt, einen „Cocktail"-Ansatz (d. h. eine Mischung von Antikörpern) zu verwenden, wenn es um unerwünschte virale Proteine geht, wodurch eine Vielzahl viraler Proteine gleichzeitig targetiert werden und es für Mutanten, die ein funktionelles Targetproteien produzieren werden, das in der Lage ist, den Antikörper zu vermeiden, schwieriger wird, sich zu entfalten. Zum Beispiel ist ein Cocktail von Antikörpern für mindestens das Hüllglykoprotein und tat bevorzugt. Andere Cocktails beinhalten Antikörper für die Umkehrtranskriptase, TAR, RRE usw. Solche „Cocktails" können gemeinsam oder mittels Kotransfektionen verabreicht werden. Es wird bevorzugt, dass nicht mehr als etwa drei Proteine in der selben intrazellulären Region targetiert werden, vorzugsweise nicht mehr als zwei, zum Beispiel Targeting von gp160 und gp41 im endoplasmatischen Retikulum. Solange ein anderes intrazelluläres Target sich in einer unterschiedlichen zellulären Region befindet, d. h. Nukleus gegen endoplasmatisches Retikulum, kann es auch targetiert werden, ohne eine schädliche Wirkung auf die Antikörperproduktion zu haben. Ein bevorzugter Antikörper-Cocktail wären Antikörper für mindestens ein virales Strukturprotein, wie etwa ein Kapsid- oder ein Hüll-protein, und eines für Regulatorproteine, wie etwa HIV rev, tat, HTLV-1 oder tax oder für eine Nukleinsäuresequenz, wie etwa TAR oder RRE.
Ein weiterer bevorzugter Cocktail bestünde aus Antikörpern für das gleiche Target, aber an verschiedenen intrazellulären Orten. Dies könnte durchgeführt werden, indem verschiedene Lokalisierungssequenzen verwendet werden. Somit kann ein bestimmtes Target, wenn es nicht an den Antikörper an einem Ort gebunden ist, zum Beispiel, wenn es weiter prozessiert wird, an einem nachfolgenden Ort targetiert werden. Zum Beispiel könnten mit dem Hüllglykoprotein Lokalisierungssequenzen verwendet werden, um das Protein an einer Anzahl von Punkten in dessen Processing-Pfad zu targetieren. Alternativ könnten multiple Antikörper verwendet werden, um verschiedene Epitope von Molekülen zu targetieren. Zum Beispiel kann ein Antikörper verwendet werden, um die CD4-Bindungsregion eines Hüllglykoproteins zu targetieren und ein zweiter Antikörper, um die fusogene Domäne von gp41 zu targtieren.
Für HIV-codierte Proteine wäre es ein bevorzugter Vektor, zwei Antikörper zu den Kapsid- oder Hüllproteinen und mindestens einen zu einem Regulatorprotein zu haben, zum Beispiel zu gp160, gp41, tat und rev. Ein weiterer Cocktail würde Antikörper sowohl für die virale mRNA und das Protein, das sie codiert, umfassen.
Andere bevorzugte HIV-codierte Targetproteine sind nef, vpr und für HIV-1 vpu, und für HIV-2 vpx. Besonders bevorzugt sind nef und vpu. Zum Beispiel existiert das nef-Protein im Zytoplasma sowie angeheftet an die innere Oberfläche der Plasmamembran. Das Protein wird kotranslational modifiziert durch die Zugabe von Myristinsäure zum vorletzten Glyzinrest des Aminoterminus. Das vpr-Protein wurde in dem Kapsidvirus inkorporiert vorgefunden. Das vpu-Protein liegt innerhalb des Zytoplasmas der Zellen und kann mit sub-zellulären Organellen assoziiert werden. Antikörper für diese Proteine können mittels der hier beschriebenen Methodik hergestellt werden. Ferner können diese Proteine von einem Fachmann auf der Basis dieser Offenbarung durch die Auswahl der geeigneten Lokalisierungssequenzen spezifischer targetiert werden.
Somit können durch die Verwendung der oben beschriebenen Methodik Säuger, bevorzugt Menschen, behandelt werden, die an einem Gebrechen leiden, das durch die Expression oder die Überexpression spezifischer Proteine verursacht wird. Dieses Verfahren kann verwendet werden, um virale und metabolische Krankheiten zu behandeln. Individuen, die mit viralen Krankheiten, wie etwa HIV, HTLV-1, HTLV-2 oder Herpes infiziert sind, können behandelt werden. Auf ähnliche Weise können Individuen behandelt werden, die bösartige Tumore haben oder anfällig für bösartige zelluläre Transformation sind, die durch einen hohen Level eines oder mehrere Proteine, eines veränderten Proteins oder veränderter Proteine oder einer Kombination daraus verursacht werden. Zum Beispiel kann mindestens eines der Antigene mit einem Antikörper targetiert werden, der sich spezifisch an ein solches Antigen binden wird. Es wird eine wirksame Menge eines Gens transportiert, das in der Lage ist, den Antikörper unter Bedingungen zu exprimieren, die dessen intrazelluläre Expression zu Zellen ermöglichen, die anfällig sind für die Expression des unerwünschten Target-Antigens. Dieses Verfahren kann als prophylaktische Behandlung verwendet werden, um zu verhindern oder es zu erschweren, dass solche Zellen durch das unerwünschte Antigen geschädigt werden, zum Beispiel, indem das Processing des Proteins, die Interaktion des unerwünschten Proteins mit anderen Proteinen, die Integration des Virus in die Wirtszelle usw. verhindert werden. Wenn es eine Reihe von Targets gibt, sind bevorzugte Targets Proteine, die durch das endoplasmatische Retikulum prozessiert werden. Der intrazelluläre Transport aller Antikörpergene kann erreicht werden, indem Gentherapietechniken, wie etwa die oben beschriebenen, angewendet werden. Als Antikörper kommt jeder beliebige der oben diskutierten Antikörper in Frage. Wir diskutieren hier die Verwendung dieses Systems, um Antikörpergene zu einem viral infizierten Säuger zu transportieren, zum Beispiel einem Menschen, der mit dem HIV-Virus infiziert ist, aber es versteht sich, dass auf der Basis der vorliegenden Offenbarung ein solcher Ansatz leicht an andere Systeme angepasst werden kann, zum Beispiel an ein Individuum mit bösartig transformierten Zellen.
HIV infiziert CD4-positive humane Lymphozyten und andere Immunzellen. Indem solche Zellen mit einem Antikörper targetiert werden, der sich an mindestens ein HIV-codiertes Targetmolekül, z. B. ein Protein, bindet, ist es möglich, ein Individuum zu behandeln, das mit dem Virus infiziert ist, die Ausbreitung der Infektion zu verlangsamen und/oder aufzuhalten oder solche Zellen prophylaktisch zu behandeln, um deren Infizierung zu erschweren.
Es kann jede der bekannten Formen der Gentherapie verwendet werden, um Gene an CD4-positive Lymphozyten zu transportieren. Zum Beispiel kann ein zellspezifischer Gentransfermechanismus verwendet werden, der Rezeptor-vermittelte Endozytose verwendet, um RNA- oder DNA-Moleküle in Zellen zu tragen (vgl. zum Beispiel, Wu & Wu, J. Biol. Chem. 262: 4429–4432 (1987)). Ein Protein, das als Ligand wirkt, wird an ein Poly-L-Lysin gekoppelt, das sich dann mit RNA oder DNA (dem Gen) kombiniert, um mittels starker elektrostatischer Interaktion lösliche Komplexe zu bilden, wobei die Gene (d. h. die RNA oder DNA) zu den interessierenden Zellen, wie etwa den CD4-Zellen, transportiert werden können. Zum Beispiel können solche Zellen spezifisch targetiert werden, wenn ein Antikörper gegen gp120 oder CD4 als Ligand verwendet wird. In der Tat würde ein solches In-vivo-Gentransfer-Verfahren, neben dessen Funktion als Vektor, um ein therapeutisches Gen in HIV-infizierte Zellen zu transportieren oder in Zellen, die anfällig für eine HIV-Infektion sind, auch dessen neutralisierende Aktivität erhalten. Wir haben herausgefunden, dass die Internalisierung von Antikörpern nach der Bindung von gp120 oder CD4, die auf der Zelloberfläche exprimiert sind, höchst effizient ist.
Die Antikörper, die verwendet werden, um die Zellen zu targetieren, können an das Polylysin gekoppelt werden, um mittels Ligation durch Disulfidbindungen nach der Modifikation mit einem Reagens, wie etwa Succinimidyl-3 (2-pyridyldithio)Proprionat (SPDP), ein Antikörper-Polylysin-Konjugat zu bilden. Die Antikörper-Polylysin-Genkomplexe werden produziert, indem die Antikörper-Polylysin-Konjugate mit einer Komponente gemischt werden, die die Antikörperkassette trägt, d. h. die DNA-Sequenz, die die Antikörper enthält, die operativ an einen Promoter, wie etwa ein Plasmid oder einen Vektor gekoppelt sind (14). Vorzugsweise werden Polylysine verwendet, die eine durchschnittliche Kettenlänge von etwa 60 bis 500 Lysinmonomeren aufweisen. Besonders bevorzugt weist das Polylysin eine durchschnittliche Kettenlänge von etwa 90 bis 450 Lysinmonomeren auf.
Wie oben erwähnt, kann die Ligation mit den Antikörpern unter Verwendung von SPDP erreicht werden. Zuerst werden Dithiopyridin-Gruppen sowohl in den Antikörper als auch in das Polylysin mittels SPDP eingeführt, und dann können die Gruppen im Polylysin reduziert werden, um freie Sulfhydryl-Compounds zu ergeben, welche nach Mischen mit dem Antikörper, der wie oben beschrieben modifizert wurde, reagieren, um die gewünschten Disulfidbindungskonjugate zu ergeben. Diese Konjugate können mittels herkömmlicher Techniken, wie etwa der Kationenaustauschchromatographie, gereinigt werden, zum Beispiel mit einer Pharmacia Mono S-Säule, HR 10/10 (vgl. zum Beispiel 15). Diese Konjugate werden dann mit der Antikörperkassette unter Bedingungen gemischt, die eine Bindung ermöglichen, zum Beispiel einstündiges Inkubieren bei 25°C und dann 24igstündige Dialyse gegen 0,15 M Kochsalzlösung durch eine Membran mit einem Soll-Molekulargewichtslimit. Solche Membranen können zum Beispiel von Spectrum Medical Industries, Los Angeles, Kalifornien, bezogen werden.
Um die targetierten Zellen zu behandeln, können diese Vektoren in die Zellen mit den in den Säugerwirt injizierten transduzierten Zellen in vitro eingeführt werden, oder der Vektor kann in den Säugerwirt, wie etwa einen Menschen, injiziert werden, wo er an eine CD4-Zelle binden und dann aufgenommen werden wird. Um die Effizienz der Genexpression in vivo zu erhöhen, kann die Antikörperkassette Teil eines episomalen Säuger-Expressionsvektors sein, zum Beispiel eines Vektors, der den humanen Pappova-Virus-(BK)-Replikationsstartpunkt und das große BK-T-Antigen für extra-chromosomale Replikation in Säugerzellen enthält, eines Vektors, der einen Epstein-Barr-Virus-(EB)-Replikationsstartpunkt und ein nukleares Antigen (EBNA-1) enthält, um eine episomale Replikation mit hoher Kopienzahl zu erlauben. Andere Säugerexpressionsvek toren, wie etwa Herpesviren-Expressionsvektoren oder Pockenvirus-Expressionsvektoren, können ebenfalls verwendet werden. Solche Vektoren sind über eine große Anzahl von Quellen zu beziehen, darunter Invitrogen Corp. Die Antikörperkassette wird in die Expressionsvektoren mittels Standardtechniken eingeführt, zum Beispiel unter Verwendung einer Restriktionsendonuklease und deren Einführung in eine spezifische Stelle in einem solchen Säuger-Expressionsvektor. Diese Expressionsvektoren können mit den Antikörper-Polysin-Konjugaten gemischt werden und der resultierende Antikörper-Polysin-Expressionsvektor, der die Antikörperkassettenkomplexe enthält, kann auf der Basis der hier enthaltenen Offenbarung leicht hergestellt werden. Es kann eine ausreichende Menge dieser Vektoren injiziert werden, um eine Serumkonzentration zu erhalten, die sich zwischen etwa 0,05 μg/ml und 20 μg/ml Antikörperkonjugat bewegt, besonders bevorzugt zwischen etwa 0,1 μg/ml und 10 μg/ml. Noch mehr bevorzugt zwischen etwa 0,5 μg/ml und 10 μg/ml.
Diese Vektoren können durch ein beliebiges aus einer Vielzahl von Mitteln verabreicht werden, zum Beispiel parenterale Injektion (intramuskulär (I. M.), intraperitoneal (I. P.), intravenös (I. V.), intrakranial (I. C.) oder subkutan (S. C.)), oral oder mittels anderer bekannter Verabreichungswege. Die parenterale Injektion ist typischerweise bevorzugt.
Die Materialien können in jedem geeigneten Mittel verabreicht werden, zum Beispiel, können sie mit einem inaktiven Träger, wie etwa Saccharose, Laktose oder Stärke gemischt werden. Sie können in Form von Tabletten, Kapseln und Pillen vorliegen. Bei einer parenteralen Verabreichung werden sie typischerweise in eine sterile wässrige oder nicht wässrige Lösung, Suspension oder Emulsion injiziert, in Verbindung mit einem pharmazeutisch akzeptablen parenteralen Träger, wie etwa physiologischer Kochsalzlösung.
Die vorliegende Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter veranschaulicht. Diese Beispiele werden bereitgestellt, um das Verständnis der Erfindung zu fördern und sind nicht als Beschränkung derselben zu verstehen.
BEISPIELE
A. KONSTRUKTION UND EXPRESSION EINES UMFASSEND NEUTRALISIERENDEN ANTIKÖRPERS FÜR DAS HÜLLGLYKOPROTEIN
1. cDNA-Synthese und PCR-Amplifikation von F105-Immunoglobulingenen.
Das F105-Hybridom wurde abgeleitet mittels Fusion von EBV-Transformanten mit der HMMA2.11TG/O-Zelllinie, einem nicht sekretierenden Human-Maus-Myelom-Analogon [Posner, et al., J. Immunol. 146: 4325–4332 (1991)]. Erst-Strang-cDNA wurde in einer 25-μl-Reaktion von 5 μg totaler RNA synthetisiert unter Verwendung von Oligo(dT)-Priming und der Moloney-Mäuse-Leukämie-Virus-Umkehrtranskriptase, gemäss den veröffentlichten Protokollen [Gusler, et al., Gene 25: 263–269(1983)]. Fünf bis zehn Prozent der Erst-Strang-cDNA wurden verwendet, um die PCR-Reaktionen auszuführen. Die für die PCR verwendeten Temperaturen betrugen: Schmelzen: 94°C, 1 Min.; Primer-Annealing: 52°C, 2 Min; Primer-Extension: 72°C, 2 Min. Es wurde eine Rampenzeit von einer Minute verwendet, abgesehen von einer 2-minütigen Rampenzeit zwischen Annealing und Extension. 25–30 Thermalzyklen wurden ausgeführt. Ethidiumbromid-gefärbte Agarosegele (2%) wurden verwendet, um die PCR-Fragmente zu separieren. Das geeignete Band wurde exzidiert, Gen-gereinigt (Bio 101, La Jolla, CA), Klenow-repariert, Restriktionsenzym-verdaut und für die Klonierung verwendet. Mindestens drei separate Transformanten jedes PCR-Fragments wurden sequenziert unter Verwendung sowohl von Vorwärts- als auch Rückwärts-sequenzierenden Primeren. Die DNA-Sequenzanalyse wurde mittels des Sanger-Verfahrens ausgeführt [Sanger, et al., J. Mol. Biol. 183: 161–178 (1980)].
2. PCR-Primer-Design.
Das Primerpaar einer schweren Kette besteht aus einem Vorwärtsprimer V_H und einem Rückwärtsprimer J_H, wobei beide für die Klonierung geeignete Restriktionsorte aufweisen. Die Kabat-Datenbank für Immunoglobuline wurde verwendet, um die Aminosäuren und die Codondistribution zu analysieren, die in den sechs verschiedenen humanen V_H-Familien zu finden sind [Kabat, et al., supra]. Auf der Basis dieser Analyse wurde der 35-Basenpaar-universal-5'-V_H-Primer designed TTTGCGGCCGCTCAGGTGCA(G/A)CTGCTCGAGTC(T/C)GG (SEQ ID NO: 9), der für zwei verschiedene Nukleotide an zwei Positionen degeneriert ist, und zu den 5'-Enden der FR1-Sequenzen annealen wird. Eine 5'-NotI-Stelle (links-unterstrichen) wurde für die Klonierung der amplifizierten DNA eingeführt und liegt an 5' zum ersten Codon des V_H-Gens. Eine interne XhoI-Stelle wurde ebenfalls eingeführt (rechts-unterstrichen).
Auf ähnliche Weise wurde ein 66-Basenpaar-J_H-Region-Oligonukleotid für das Rückwärtspriming am 3'-Ende des variablen Gens der schweren Kette designed, AGATCCGCCGCCACCGCTCCCACCACCTCCGGAGCCACCGCCACCTGAGGTGACCGTGACC(A/G)(G/T)GGT (SEQ ID NO: 10). Dieser Primer enthält zusätzlich eine 45-Nukleotidsequenz, die den Interchain-Linker (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)₃ (SEQ ID NO: 1) codiert. Basierend auf der Nukleotidsequenz der sechs humanen J_H-Region-Minigene enthält dieser Primer zwei degenerierte Positionen mit zwei Nukleotiden an jeder Position. Eine BspEI-Stelle (links-unterstrichen) wurde in den Interchain-Linker für die kohäsive Endligation mit dem überlappenden V_kappa-Primer eingeführt. Eine interne BstEII-Stelle (rechts-unterstrichen) wurde ebenfalls für künftige Linker-Austauschversuche eingeführt.
Eine ähnliche Strategie, die den 45-Nukleotid-Interchain-Linker verwendet, wird in das Design des humanen 69-Nukleotid-V_kappa-Primers inkorporiert. Es gibt vier Familien der humanen V_kappa-Gene. Der 5'-V_kappa-Primer GGTGGCGGTGGCTCCGGAGGTGGTGGGAGCGGTGGCGGCGGATCTGAGCTC(G/C)(T/A)G(A/C)TGACCCAGTCTCCA (SEQ ID NO: 11), der zum 5'-Ende der FR1-Sequenzen annealen wird, ist an drei Positionen degeneriert (jeweils zwei Nukleotide). Der Interchain-Linker-Abschnitt enthält eine BspEI-Stelle für die kohäsive Endklonierung mit dem Rückwärtsprimer J_H. Eine interne SacI-Stelle (rechts-unterstrichen) wurde ebenfalls für künftige Linker-Austausch-Versuche eingeführt.
Der 47-Nukleotid-C_kappa-Rückwärtsprimer (Kabatpositionen 109–113) GGGTCTAGACTCGAGGATCCTTATTAACGCGTTGGTGCAGCCACAGT (SEQ ID NO: 12) wurde so designed, dass er komplementär zu der konstanten Region der Kappa-Ketten ist (Kabatpositionen 109–113) (Kabat). Dieser Primer wird zum äußersten 5'-Ende der konstanten Kappa-Region annealen. Der Primer enthält eine interne MluI-Stelle (rechts-unterstrichen), die zwei Stoppcodone vorrückt. Zusätzlich wurden multiple Restriktionsorte (BamHI/XhoI/XbaI) (links-unterstrichen) nach den Tandem-Stoppcondonen eingeführt. Es wurde ebenfalls ein ähnlicher 59-Nukleotid-C_kappa-Rückwärtsprimer designed, der ein Carboxy-terminales Retentionssignal des endoplasmatischen Retikulums enthält: Ser-Glu-Lys-Asp Glu-Leu (SEQ ID NO: 13) (SEKDEL) GGGTCTAGACTCGAGGATCCTTATTACAGCTCGTCCTTTTCGCTTGGTGCAGCCACAGT (SEQ ID NO: 14). Ähnliche multiple Restriktionsorte (BamHI/XhoI/XbaI) (unterstrichen) wurden nach den Tandem-Stoppcondonen eingeführt.
Nachdem die primäre Nukleotidsequenz sowohl für die F105-Gene der schweren Kette als auch für die Kappa-Kette determiniert wurde, und die Genliniengene identifiziert waren, wurde ein PCR-Primer auf der Basis der Kopfsequenzen der V_H-71-4-Keimbahngene designed (Lee, et al., J. Mol. Biol. 195: 761–768 (1987). Der V_H-71-4-Kopfprimer TTTACCATGGAACATCTGTGGTTC (SEQ ID NO: 15) enthält eine 5' NcoI-Stelle (unterstrichen). Der Kopfprimer wurde in Konjunktion mit einem zweiten J_H-Primer für PCR-Amplifikationsversuche verwendet. Das 35-Basenpaar-J_H-Region-Oligonukleotid wurde so designed, dass es die gleiche Sequenz zum Rückwärtspriming an den 3'-Enden der variablen Gene der schweren Kette aufweist, TTAGCGCGCTGAGGTGACCGTGACC(A/G)(G/T)GGT (SEQ ID NO: 16). Dieser Primer enthält zwei degenerierte Positionen mit zwei Nukleotiden an jeder Position. Eine BssHII-Stelle (links-unterstrichen) 3' zum und unmittelbar benachbart dem Codon, der die letzte Aminosäure der J-Region determiniert, ermöglicht eine geeignete Klonierung am 3'-Ende des V_H-Gens. Eine interne BstEII-Stelle (rechts-unterstrichen) wurde ebenfalls eingeführt.
3. Konstruktion und bakterielle Expression von F105-Einketten-Antikörpern.
Für die Konstruktion des initialen F105sFv für die bakterielle Expression wurden die PCR-Fragmente V_H/J_H-ICL und ICLV_kappa/C_kappa mit NotI/BspEI bzw. BspEI/XbaI verdaut und in das Plasmid pSL1180 kloniert (Pharmacia LKB, Biotech. Inc., Piscataway, N. J.) unter Verwendung von SURE-Bakterien (Stratagenem, La Jolla, Ca) als Wirten. Das resultierende F105sFv wurde Restriktionsenzym-verdaut und das NotI/BglII-Fragment wurde in die NotI/BamHI-Stelle kloniert, die an 3' zum pel B-Signalpeptid in einem pET-Expressionsvektor liegt. Das resultierende pETpelB F105sFv-Plasmid wurde in BL21(DE3)-Wirte transformiert. Das sFv105-Protein wird durch ein Antiserum sowohl für die schweren als auch die leichten humanen Kappa-Ketten erkannt. Das Protein bindet an gereinigte gp120, wie determiniert, unter Verwendung eines ELISA-Assays, bei dem gp120 an eine plastische Oberfläche fixiert wird. Periplasmafraktionen wurden zwei bis vier Stunden nach Induktion bei 24°C mit 0,2 mM IPTG erhalten und auf gp120-Bindungsaktivität mittels ELISA unter Verwendung von mit gp120 (American Biotechnology, Inc.) beschichteten ELISA-Platten (Dynatech Labs, Inc., Chantilly, VA) und auf Detektion mittels mit alkalischer Phosphatase gekoppelten Affinitätssäulen-gereinigten Ziegen-Anti-Human-Kappa-Ketten-Antikörpern (Fisher Scientific) getestet. Das F105sFv-gebundene gp120 wurde durch lösliche CD4 blockiert, wobei sich zeigte, dass CD4 konkurriert, und wurde absorbiert zu und eluiert aus einer gp120-Affinitätssäule (Affi-Gel, BioRad, Inc.)
4. Konstruktion und eukaryotische Expression von F105-Einketten-Antikörpern mit und ohne SEKDEL-endoplasmatisches Retentionssignal.
Die V_H-71-4-Köpfe und J_H-BssHII-Primere wurden verwendet, um ein intronloses Fragment, das das Kopfpeptid und ein rearrangiertes Gen einer schweren Kette enthält, mittels PCR zu amplifizieren. Das Fragment wurde am glatten Ende in Vorwärtsrichtung in eine EcoRV-Stelle in pSL1180 kloniert. Anschließend wurde ein NcoI/BstEII-Fragment erhalten und mit dem BstEII/SphI-Fragment von F105sFv von pSL1180 in einer Dreistück-Ligation mit NcoI/SpHI-verdautem pSL1180 kombiniert, um V_H-71-4/SCA zu produzieren. Für die Konstruktion von V_H-71-4/SCA, das die Carboxy-terminale SEKDEL-Sequenz a ICL-V_kappa-SEKDEL enthält, wurde das PCR-Produkt am glatten Ende in Vorwärtsrichtung in eine EcoRV-Stelle in pSL1180 kloniert. Das Fragment wurde mittels BspEI/XbaI-Verdauung entfernt und mit dem NcoI/BspEI-Fragment von V_H 71-4/SCA in einer Dreistück-Ligation mit NcoI/XbaI-verdautem pSL1180 kombiniert, um V_H-71-4/KDEL zu produzieren. Vor der Klonierung in pRC/CMV (Invitrogen)) wurde ein EcoRI-zu-HindIII- Konversionslinker in das EcoRI-verdaute pSL1180 eingeführt, der die zwei Einketten-Antikörper enthält. Anschließend wurde ein HindIII/XbaI-Fragment von beiden Einketten-Antikörpern erhalten und in HindIII/XbaI-verdautes pRC/CMV kloniert, um pRC/SCA und pRC/KDEL zu produzieren.
Vgl. 2, die ein Diagramm der Strukturen von Fv, sFv und sFv-KDEL darstellt. Die drei komplementätsbestimmenden Regionen (CDRs) jeder Kette sind schattiert.
5. Konstruktion und Expression anderer Hüllantikörper
Es wurden zwei weitere umfassend neutralisierende Einketten-Antikörper für das Hüllglykoprotein produziert und unter Verwendung des gleichen Basisverfahrens exprimiert. Diese PCR-Primere gehen, was VH betrifft, vorwärts, und was V_kappa betrifft, rückwärts und als Ergebnis wird ein Innerchain-Linker, der nun über 24 Aminosäuren von J_H, 24 Nukleotide und 24 Basenpaare von V-kappa verfügt, amplifiziert.
Ein solcher Antikörper war ein Einketten-Antikörper, abgeleitet von dem 1.7b humanen monoklonalen Antikörper, der sich gegen ein CD4-anreicherndes Epitop auf gp120 richtet. Unsere Genanalyse hat ergeben, dass die rearrangierte schwere Kette des 1.7b monoklonalen Antikörpers aus dem V_H1263-Keimbahngen abgeleitet war. Es wurde ein Primer einer schweren Kette, dass sich gegen die Kopfsequenz des V_H1263-Kopfpeptids richtete, verwendet. Dieser Primer, TTT-AAG-CTT-ACC-ATG-GAC-TGG-ACC-TGG-AGG (SEQ ID NO: 59) wurde in Konjunktion mit einem J_H-Primer einer schweren Kette mit einem glatten Ende für das 3'-Ende verwendet, TGA-GGT-GAC-CGT-GAC-CAG-GGT (SEQ ID NO: 60), um die rearrangierte schwere Kette einschließlich ihrer Kopfsequenz zu amplifizieren. Die Kappa-Kette wurde auf ähnliche Weise amplifiziert. Unter Verwendung des oben beschriebenen Verfahrens der Über lappungsextension haben wir einen Einketten-Antikörper gegen die CD4-anreichernde Stelle auf gp120 assembliert.
Zusätzlich haben wir einen Kopfprimer verwendet, der gegen die Kopfsequenz des DP-35-Keimbahngens gerichtet war. Dieses rearrangierte Keimbahngen wird von dem monoklonalen Antikörper 21H verwendet, der sich auch gegen die CD4-Bindungsstelle auf gp120 richtet.
Der 21H-Kopfprimer wurde in Konjunktion mit dem J_H-Primer verwendet. Der J_H-Primer mit glattem Ende, TTT-AAG-CTT-ACC-ATG-GAG-TTT-GGG-CTG-AGC-TGG (SEQ ID NO: 61) wurde verwendet, um die rearrangierte schwere Kette des monoklonalen Antikörpers 21H zu amplifizieren. Zusätzlich wurden leichtkettige Lambda-Primere von geeignetem Design verwendet, um die rearrangierte leichte Kette des monoklonalen Antikörpers 21H zu amplifizieren. Die zwei gereinigten PCR-Produkte wurden für die Überlappungsextension mit einem geeigneten Interchain-Linker verwendet, der so modifiziert wurde, dass er die Lambda-Sequenz für die Assembly der 21H-Einketten-Antikörper, die in eukaryotische Zellen exprimiert werden sollen, enthält. CTG-CGT CAA-CAC-AGA-CTG-AGA-TCC-GCC (SEQ ID NO: 62) ist der Vorwärtsprimer, der für die Amplifikation der 21H-Lambda-Kette verwendet wurde. CGA-GGG GGY-RGC-CTT-GGG-CTG (SEQ ID NO: 63) ist der Rückwärtsprimer, der gegen die proximalste konstante Lambda-Region gerichtet ist, d. h. der 3'-Primer für die 21H-Lambda-Kette. TTT-TCT-AGA-TCY-TMT-GAA-CTG-ACT-CAG (SEQ ID NO: 64) ist der Primer, der verwendet wird, um den Interchain-Linker von F105 zu reamplifizieren, um eine variable Lambda-Region anstelle der variablen Kappa-Region auf ihm zu platzieren.
Wie nämlich im vorhergehenden Beispiel gezeigt, nahmen wir ein Kopfpeptid, ein Kopfprimer und ein J_H-Primer mit glattem Ende, um die rearrangierten schweren Ketten, die das Kopfpeptid an einem Ende und das J_H-Segment mit glattem Ende an dem anderen Ende hatten, zu amplifizieren. Das Kopfpeptid wies eine HindIII-Stelle auf.
Die rearrangierte schwere Kette zusammen mit dem Interchain-Linker wurde unter Verwendung der Primere GGA-ACC-CTG-GTC-ACG-GTC-ACC-TCA (SEQ ID NO: 65) an dem 5'-Ende und TGG-AGA-CTG-CGT-CAT-CTC-GAG-TTC (SEQ ID NO: 66) an dem 3'-Ende geschaffen. Diese rearrangierte schwere Kette wurde in Konjunktion mit der Kappa-Kette im Falle von 1.7b verwendet, um den Einketten-Antikörper mit der Kopfsequenz zu produzieren. Die für das 1.7b verwendeten Primere sind GAA-CTC-GAG-WTG-ACG-CAG-TCT-CCA (SEQ ID NO: 67), der zur V_kappa-Region annealed und GG-GTC-TAG--ACT-CGA-GGA-TCC TTA-TTA-ACG-CGT-TGG-TGC-AGC-CAC-AGT (SEQ ID NO: 68), der zum konstantesten Abschnitt der Kappa-Kette annealen wird.
Nachdem die drei Stücke zusammengefügt und mittels Überlappungsextension assembliert wurden, haben die Einketten-Antikörper auf dem 5'-Ende eine HindIII-Klonierungsstelle und auf dem 3'-Ende die XbaI-Klonierungsstelle. Das PCR-assemblierte Fragment wird unter Verwendung eines geeigneten Restriktionsenzyms gemäß den Angaben des Herstellers verdaut und dann direkt in das Plasmid, etwa pRC/CMV, kloniert.
6. Konstruktion und Expression mutierender Antikörper
Mutierende Antikörper können unter Verwendung jeder dieser umfassend neutralisierenden Antikörper generiert werden. Es können Standardmutagenesetechniken verwendet werden, um eine cDNA zu erhalten, die für verschiedene Aminosäuren in den variablen Regionen der schweren Kette, wie etwa der CDR3-Region, codiert.
Der F105-Einketten-Antikörper, der das Immunoglobulin-Kopfpeptid der schweren Kette enthielt, wurde, wie oben beschrieben, zunächst in den pSL1180 Klonierungsvektor kloniert. Um diesen Antikörper auf den CDR3-Ersatz vorzubereiten, wurde folgendes Verfahren durchgeführt. Da der Antikörper in eine NcoI/SphI-Stelle kloniert wurde, war das Entfernen gewisser Füll-DNA erforderlich. Somit wurde der Vektor mit SpeI und NheI verdaut, um die NotI-Stelle zu entfernen. Nach der Selbst-Ligation wurden mittels Screening Kolonien ausgewählt, bei denen diese Füll-DNA entfernt war. Das resultierende Plasmid enthielt den F105-Einketten-Antikörper mit dem Kopfpeptid in Rückwärtsorientierung mit zwei einmaligen Restriktionsorten, die die CDR3-Region der schweren Kette flankierten. An dem 5'-Ende von CDR3 gab es eine einmalige EagI-Stelle ACG-GCC-GTG-TAT-TAC TGT-GCG CGA (SEQ ID NO: 69) und an dem 3'-Ende der schweren Kette von CDR3 war eine BstEII-Stelle vorhanden TGG GGC CAG GGA ACC-CYG-GTC ACS GTN WCC (SEQ ID NO: 70). Der Vektor wurde mit EagI und BstEII verdaut, und eine Bibliothek der CDR3-Regionen wurde hineinkloniert. Die resultierenden Transformanten wurden mit PVU2 verdaut und mutierende Antikörper wurden von Wildtyp-Antikörpern unterschieden durch die Änderung des Musters nach der PVU2-Verdauung. Es gibt in der CDR3 der schweren Kette eine einmalige PVU2-Stelle, daher wird diese Stelle in den mutierenden Antikörpern zerstört. Somit würde sich das Muster von demjenigen des Wildtyps unterscheiden, der die PVU2-Stelle aufweisende Wildtyp-CDR3 enthielte.
Für die Konstruktion synthetischer CDR3 wurden drei Primere verwendet. Das 5'-Primer enthält eine EagI-Stelle CGC-ACA-GTA-ATA-CAC (SEQ ID NO: 71). Das 3'-Primer enthält eine BstEII-Stelle GT-GAC-CGT-GAC-CGG GGT (SEQ ID NO: 72). Die CDR3 umfasst die degenerative Sequenz von NNS × 15, wobei N ein beliebiges Nukleotid ist und S C oder G ist. Das minimiert die Anzahl der Stoppcodone und alle 20 Aminosäuren können an jeder der 15 Positionen exprimiert werden G-GCC-GTG-TAT-TAC-TGT-GCG-CGA-NNS-TGG GGC-CAG-GGA- ACC-CCG-GTC (SEQ ID NO: 73). Nach der Kinase dieser drei Peptide sowie dem Annealing mittels dem oben beschriebenen Verfahren verfügte das resultierende Peptid über Doppelsträngigkeit auf den Framework-Nukleotiden, die die CDR3 flankieren, und enthielt offene Restriktionsorte. Die CDR3 selbst blieb einzelsträngig. Bakterielle Polymerase konnte die Lücken füllen. Vgl. Cwirla, S. E., et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 6378–6382 (1990).
Ein alternatives Verfahren, mit dem dies erreicht werden kann, wäre die PCR-Amplifikation dieses gleichen Oligos, das wir geschaffen haben, unter Verwendung der zwei kurzen Polymere als Annealing-Polymere für das lange Oligonukleotid, das die CDR3 nach der Amplifikation überbrückt, das große Oligonukleotid würde mit EAGI und BstEII verdaut und dann unter Verwendung molekularbiologischer Standardtechniken ligiert werden.
Die einmaligen CDR3-Mutanten wurden mittels PVU2-Verdauung gebildet. Dann wurde die gesamte Antikörperkassette mittels HindIII-XbaI-Verdauung entfernt, wodurch die gesamte Antikörperkassette zusammen mit den Klonierungsstellen entfernt wurde. Diese mutierenden Antikörper wurden dann Gel-gereinigt, Gen-gesäubert und mit pRC/CMV kloniert, das mit HindIII und XbaI verdaut worden war. Diese resultierenden Plasmide wurden dann mittels Lipofektion in COS-Zellen transfiziert, wie zuvor beschrieben. Danach wurde nach Mutanten gescreent, die unterschiedliche Bindungsaffinitäten zum Hüllglykoprotein aufweisen.
Unter Verwendung der oben beschriebenen Technik wurden sechs mutierende Fv105-Antikörper produziert, in denen die Aminosäuren in der CDR3-Region der schweren Kette durch beliebige Aminosäuren ersetzt wurden. Einer der sechs Mutanten, der mit R bezeichnet wird, hatte eine CDR3-Region, die für (SEQ ID NO: 74) Leu-Thr-Leu-Ile-Ser-Ser-Arg- Leu-Arg-Leu-Ile-Ala-Val-Arg-Met kodierte.
Diese sechs Mutanten banden nicht an das HIV-1-Hüllprotein.
7. Konstruktion des Fab-neutralisierenden Antikörpers zum Hüll-glykoprotein.
Ein eukaryotischer Expressionsvektor, der in der Lage ist, hohe Titer von humanen Fab-Fragmenten in COS-1-Zellen herzustellen, wurde ebenfalls produziert. Dieser Vektor basiert auf dem oben beschriebenen pRC/CMV-Vektor, die schwere Kette und die leichte Kette von Fd werden jedoch im Tandem kloniert, und jede Kette steht unter der Kontrolle eines separaten CMV-Promoters. Der Vektor enthält auch ein Neomycin-Gen für eine stabile Transfektion. 3 zeigt Pulse-Chase von COS-1-Zellen, die mit einem Plasmid transfiziert wurden, das Fab-Fragmente von F105-schweren (H) und -leichten (L) Ketten exprimiert. In 3 sind die ersten drei Spuren das Zell-Lysat, und der zweite Satz mit drei Spuren stammt von dem Zellmedium. Die Spuren für jeden Satz entstanden nach zwei-, drei- und vierstündiger Inkubationszeit. Nach 30 Minuten Markieren mit ³⁵S-Met, wurden die Zell-Lysate (I) und das Medium (M) nach Ablauf der angegebenen Inkubationszeiten gewonnen, und es wurden Radioimmunpräzipitate erhalten mit einer Mischung aus Anti-Human-IgG₁ und Anti-Human-Kappa-KettenAntikörpern. Das in 3 gezeigte Pulse-Chase-Experiment zeigt, dass hohe Level an Fab-Fragmenten von F105 intrazellulär in Beiden gefunden werden, und zusätzlich werden die Fab-Fragmente aktiv in das Medium abgesondert. Zell-Lysate und Kulturüberstände von diesen F105-Fab-transfizierten COS-1-Zellen binden gp120 in einem ELISA-Assay, und sowohl schwere als auch leichte Ketten können leicht immunpräzipitiert werden, entweder mit Anti-IgG₁-Schwere-Kette-Antikörper (Fab H in 3) oder Anti-Kappa-Kette-Antikörper (Fab K in 3).
B. KONSTRUKTION UND EXPRESSION VON ANTI-TAT-EINKETTEN-ANTIKÖRPERN
Das gleiche allgemeine Verfahren wurde verwendet, um Einketten-Antikörper zu anderen Antigenen zu exprimieren. Ein Einketten-Antikörper zum HIV-1-tat-Protein wurde wie folgt generiert.
1. Schwere-Kette-Primer.
Der 5'-Vorwärtsprimer V_H bestand aus einem 55-Basenpaar-Oligonukleotid mit der folgenden Sequenz:
Der murine Rückwärtsprimer J_H, der am 5'-Ende begann, hatte die folgende Sequenz:
2. Murine-Kappa-Ketten-Primere.
Für die PCR-Amplifikation einer murinen Kappa-Kette, die den Intrachain-Linker für die Produktion eines Einketten-Antikörpers enthält, wurde das folgende Vkappa-Primer produziert.
Für die Verwendung in Konjunktion mit dem oben genanten Vorwärts primer V_kappa wurden zwei verschiedene Rückwärtsprimere C_kappa produziert. Einer war ein 44-Nukleotid-Primer mit der folgenden Sequenz: GGGTCTAGACTCGAGGATCCTTATTATACAGTTGGTGCAGCATC (SEQ ID NO: 52). Dieser Primer wird von den Kabatpositionen 110 bis 115 annealen.
Der zweite Rückwärtsprimer C_kappa wurde für die Amplifikation der C_kappa-Kette verwendet, die ein nukleares Lokalisierungssignal SV40 an ihrem 3'-Ende hat. Der Primer wies die folgende Sequenz auf:
Dieser Primer wird von den Kabatpositionen 110 bis 115 annealen und wird dann nachgefolgt von dem nuklearen Lokalisierungssignal SV40, das die folgenden Aminosäuresequenz hat:
Thr-Pro-Pro-Lys-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val (SEQ ID NO: 54)
PCR-AMPLIFIKATION
2–3 μg von totaler RNA, isoliert von Anti-tat-III-Hybridomen, wurden verwendet, um mittels eines beliebigen Primers, der in einer 25 μg-Reaktion annealed, cDNA zu produzieren. Fünf bis zehn Prozent der einzelsträngigen cDNA wurden kombiniert mit V_H-Primer und dem V_J-Primer, und die PCR wurde, wie in Beispiel 1, beschrieben, ausgeführt. Die Annealing-Temperatur für die PCR-Reaktion betrug 56°C.
Für die PCR-Amplifikation der leichten Kette wurde der V_kappa-Primer, der den Interchain-Linker enthält, entweder mit dem C_kappa-Primer allein, oder mit dem C_kappa-Primer, der das nukleare Lokalisierungssignal SV40, enthält, kombiniert. Die Annealing-Temperatur für diese Reaktion betrug 56°C.
Für die Amplifikation sowohl der leichten als auch der schweren Kette wurden 30 PCR-Runden verwendet. Diese PCR-Produkte wurden auf einem Agarosegel (2%) mit niedrigem Schmelzpunkt Gel-gereinigt. Da die vorausgehende Sequenzanalyse der Kappa-Kette eine interne BstEII-Stelle zeigte, war ein Mehrschritt-Klonierungsverfahren notwendig. Zuerst wurde das Schwere-Kette-PCR-Produkt mittels Klenow-Kinase behandelt, um die Enden zu reparieren und zu gewährleisten, dass glatte Enden produziert wurden. Das Schwere-Kette-Fragment wurde dann mit XbaI verdaut. Ebenso wurden die beiden verschiedenen Kappa-Kettenkonstrukte mit und ohne nukleares Lokalisierungssignal SV40 mittels Klenow-Kinase behandelt, gefolgt von einer Verdauung mit XhoI. Gleiche Molmengen dieser beiden Fragmente wurden mit dem PSK+-Vektor gemischt, der mit XbaI und XhoI verdaut worden war. Dadurch konnten die klebrigen Enden an den äußersten 5'- und 3'-Enden kloniert und die glatten Enden zwischen den beiden PCR-Produkten kloniert werden.
Nach der erfolgreichen Klonierung der schweren und der leichten Ketten wurde die Plasmid-DNA mit BstE-II verdaut und das ungefähr 120-Basenpaare umfassende BstEII-Fragment wurde wieder gewonnen und in den gleichen Vektor rekloniert. Dies war notwendig, um fremde Nukleotide an der Stelle der glatten Enden zu entfernen. Es wurden mehrere Klone erhalten, und die Orientierung des BstEII-Fragments wurde mittels PCR-Amplifikation bestätigt unter Verwendung der Primere V_H, V_kappa oder der Primere V_kappa, C_kappa, die oben dargestellt sind.
Für das Klonen in den eukaryotischen Expressionsvektor pRc/CMV (Invitrogen), wurde ein XbaII/ApaI-Fragment von dem PSK+-Vektor erhalten und in den PRC-CMV-Vektor kloniert, der mit den gleichen Restriktionsenzymen verdaut worden war. Um die biologische Aktivität der Anti-tat-Einketten-Antikörper zu bestätigen, die aus diesem Kon strukt erhalten wurden, wurde der Einketten-Antikörper mit einem neuen 3'-Primer reamplifiziert, um in den P-10-1-Phagemid-Vektor zu klonieren. Zusammen mit dem ursprünglichen Primer V_H wurde ein neuer Rückwärtsprimer C_kappa verwendet (ATT AGC GGC CGC TAC AGT TGG TGCAGC ATC) (SEQ ID NO: 55).
Der PRC-CMV-Anti-tat-Einketten-Antikörper wurde in COS-Zellen unter Verwendung von Lipofektion transfiziert. Expression des Einketten-Antikörpers wurde festgestellt.
Ein zweiter Anti-tat-sFv, der dem oben beschriebenen tat-Antikörper ähnlich ist, abgesehen davon, dass er eine ER-Lokalisierungs-Kopfsequenz hat, wurde wie folgt konstruiert:
Die Gene von V_H- und V_L-Domänen einer murinen Anti-HIV-1-tat-Hybridom-Zelllinie wurden, wie beschrieben, kloniert und DNA-sequenziert. Ein Schwere-Kette-Kopfprimer (P-L) mit der zusätzlichen Restriktionsenzymstelle 5'-TTTAAGCTTACCATGAACTTCGGGCTC-3' (SEQ ID NO: 75), und einem Rückwärtsprimer (P-J), der dem 3'-Ende der variablen Region der schweren Kette entspricht, 5'-TG(A/C) GGAGACGGTGACC(A/G)(A/T)GGTCCCT-3' (SEQ ID NO: 76), wurden verwendet, um die Kopfsequenz zu amplifizieren und die Schwere-Ketten-Sequenzen mittels Polymerase-Kettenreaktion, wie oben beschrieben, zu rearrangieren. Ein Primer V_L (P-K), der der 5'-Ende-Sequenz von V_L entspricht, 5'-GAGCTCGTGCTCAC(C/A)CA(G/A)(T/A)CTCCA-3' (SEQ ID NO: 77), und ein Rückwärtsprimer Ck (P-Ck), der dem Beginn der konstanten Region der Kappa-Kette mit einem Stoppcondon entspricht, 5'-GGGTCTAGACTCGAGGATCCTTATTATACAGTTGGTGCAGCATC-3' (SEQ ID NO: 78) oder ohne 5'-GGGTCTAGACTCGAGGATCCTTATTATACAGTTGGTGCAGCATC-3' (SEQ ID NO: 53), und das nukleare Lokalisierungssignal SV40 wurden verwendet, um die V_L-Sequenz zu amplifizieren.
Ein 93 bp-Interchain-Linker wurde amplifiziert unter Verwendung von Primeren, die perfekt komplementär waren zu den Primeren (P-J) und (P-K) und die interne Interchainlinkersequenz (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)3 (SEQ ID NO: 1) enthielten. Die drei Fragmente wurden Gel-gereinigt und der Anti-tat-sFv wurde mittels Überlappungsextension mittels der Methode von Clackson, T., et al. [Nature 352: 624 (1991)] produziert. Die assemblierte Anti-tat-sFv-Signalsequenz wurde in pRC/CMV kloniert und die DNA-Sequenz wurde bestätigt [Sanger, F., et al. Proc. Natl. Acad. Sci USA 74: 5463 (1977)]. Die Einketten-Antikörper wurden dann reamplifiziert unter Verwendung eines Framework-1-Vorwärtsprimers mit 5'-HindIII-Stelle 5 '-TTTAAGCTTACCATGGACGTGAAGCTGGTGGAGTCT-3' (SEQ ID NO: 79)
C. INHIBITION DER FUNKTION MITTELS INTRAZELLULÄREM ANTIKÖRPER
1. Die Fähigkeit von Antikörpern, in Säugerzellen exprimiert zu werden.
Die Fähigkeit dieser Proteine, in Säugerzellen exprimiert zu werden, wurde determiniert mittels kurzzeitiger Transfektion von COS-1-Zellen und einer HeLa-Zelllinie, die das CD4-Protein konstitutiv exprimieren, HeLa-CD4 [Madden, P. J., et al., Cell 47: 333–348 (1986); McDougal, J. S., et al., J. Immunol. 137: 2937–2944 (1986)], wie nachfolgend dargestellt. Es wurde herausgefunden, dass, während ergiebige Mengen des sFv105-Proteins von Anti-Human-Antikörpern der schweren und leichten Kette präzipitiert werden, nur eine sehr geringe Menge des sFv105-KDEL-Proteins im kurzzeitigen Expressionsassay detektiert wird.
Zellen, die die sFv105- und sFv105-KDEL-Proteine (COS sFv105 und COS sFv105-KDEL) konstitutiv exprimieren, wurden mittels Transfektion von COS-1-Zellen mit den zwei Plasmiden, gefolgt von der Auswahl nach Neomycin-Resistenz, hergestellt.
COS-1-Zellen auf 35 mm-Tellern wurden mit 10 μg pCMV-sFv oder pCMV-sFv-KDEL oder Vektorplasmid-DNAs transfiziert, die ein Neomycin-Resistenzgen enthalten, unter Verwendung von Lipofektion (BRL Corp), wie beschrieben von Chen, S. Y., et al., J. Virol. 65: 5902–5909 (1991). Zwei Stunden nach der Transfektion wurde 1,5 ml Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), angereichert mit 10% fötalem Rinderserum, den Zellen zugefügt und 48 Stunden lang inkubiert. Die transformierten Zellen wurde in DMEM mit 10% fötalem Rinderserum, das 500 μg/ml G418 (BRL) enthielt, ausgewählt. Die transformierten Zellen wurden dann auf Platten mit 6 Vertiefungen gezüchtet und metabolisch markiert mittels Inkubation während 30 Minuten in 0,5 ml Zystein-freiem Serum, das 100 μci³⁵S-Zystein enthielt. Die Zellen wurden dann gewaschen und in DMEM inkubiert, das 10 mM unmarkiertes Zystein enthielt. Die Proteine wurden aus den Zelllysaten oder dem Medium immunpräzipitiert und mittels Elektrophorese analysiert. (vgl. 4). Diese Zellen wurden 30 Minuten lang Pulse-markiert, gechased und mit Anti-Human-Immunoglobulin-K-Ketten-Antikörper von dem Zelllysat oder der Kultur immunopräzipitiert. Die Proteine wurden mittels Elektrophorese auf einem SDS-Polyacrylamidgel 12,5%) aufgelöst und mittels Autoradiographie sichtbar gemacht. (Laemmli, U. K., Nature 227: 680–684 (1970)). Die Position der Proteinmarker wird in der Figur gezeigt: Spur 1, CMV-COS-1-Zellen, Chase 60 Minuten, Spuren 2–5 aus Zelllysaten von COS-sFv105 immunopräzipitierte Proben, Spuren 6–9 aus dem Medium von sFv105-COS präzipitiert, Spuren 2 und 6 Chase 30 Minuten, Spuren 3 und 7 Chase 60 Minuten, Spuren 4 und 8 Chase 120 Minuten, Spuren 5 und 7 Chase 360 Minuten.
Die Immunofluoreszenzfärbung von sFv oder Vektor-transformierter Zellen wurde auf 15 mM-Durchmesser Deckgläsern erreicht, die in Lösung, die 95% Ethanol und 5% Essigsäure enthielt, bei –20°C 5 Minuten lang fixiert wurden (vgl. 5A–D). Die sFv105-allein-(A) oder Vektor-allein-(D)-transformierte Zellen oder sFv-KDEL-transformierte Zellen (B) kotransfiziert mit 10 μg des HIV-1-Glykoprotein-Expressorplasmids pSVIII env, beschrieben von Helseth, E. M., et al., J. Virol. 64: 2416–2420 (1990) wurden gefärbt mit Anti-Human-κ-Kette-Antikörper, gefolgt von Inkubation mit Fluoreszein-(FITC)-konjugiertem anti-Kaninchen-IgG. Für die ER-Färbung wurden die Vektor-transformierten Zellen mit Anti-BIP-Antikörper, gefolgt von Anti-Maus-IgG-FITC (C) inkubiert. Die Vektor-transformierten Zellen wurden mit Anti-Bip-Antikörper bei 37°C 30 Minuten lang inkubiert, gefolgt von Anti-Kaninchen-IgG-FITC oder Anti-Maus-IgG-FITC nach der Wäsche mit phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS).
Nach der letzten Wäsche wurden die Zellen hergestellt und auf einem Nikkon-Mikroskop mit Fluoreszenzoptik bei einer 1100-fachen Vergrößerung beobachtet.
Somit konnte die Lage des sFv105-Proteins innerhalb der Zelle determiniert werden. Dieser Antikörper färbt ein röhrenförmiges Netzwerk über das Zytoplasma, das für ein ER-residentes Protein (5A) typisch ist. Dieses Muster ist das Gleiche wie dasjenige, das erhalten wird, wenn ein Antikörper zu einem ER-residenten Protein, Immunoglobulin-Schwere-Kette-Bindungsproteinen, BiP [Wu, G. E., et al. Cell 33: 77–83 (1983); Bole, D. G., et al., J. Cell Biol. 102: 1558–1566 (1986); Dul, J. L, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 8135–8139 (1990); Knittler, M. R., et al., The EMBO J. 11: 1573–1581 (1992)] in der parentalen Zelle (5c). verwendet wird.
2. Fähigkeit des Antikörpers zu einem Hüllglykoprotein, die Hüllprotein-Biosynthese und -aktivität zu inhibieren.
Die Fähigkeit von Zelllinien, die konstitutiv die sFv105- oder sFv105- KDEL-Proteine exprimieren, die HIV-1-Hüllprotein-Biosynthese und -aktivität zu inhibieren, wurde mittels Transfektion der COS-sFv105 und COS-sFv105-KDEL-Zellen mit einem Vektor determiniert, der hohe Level des Hüllproteins exprimiert. Die Pulse-Chase-Analyse, gefolgt von Immunopräzipitation des Hüllproteins, zeigt, dass eine signifikante Fraktion von gp160 zu gp120 in der parentalen Zellinie während des vierstündigen Chase gespalten wird (6). Obwohl ähnliche Mengen von gp160 in den parentalen und COS-sFv105-Zellen produziert werden, ist nur sehr wenig gp120 nach dem vierstündigen Chase sichtbar (6). Das gp160-Protein, das in den COS-sFv105-Zellen vorhanden ist, kann unter Verwendung eines Anti-Human-Kappa-Ketten-Antikörpers kopräzipitiert werden. Dieser Antikörper präzipitiert nicht das gp160 Protein, das in der parentalen COS-1-Zellline produziert wird. Ein Antikörper zum HIV-1 Hüllglykoprotein kopräzipitiert ebenfalls das sFv105-Protein in Zellen, die gp160 exprimieren (6).
Die transformierten Zellen wurden mit 10 μg pSVIIIenv Plasma-DNA und 2 μg pSVIII tat-exprimierendes tat transfiziert (Vgl. Helseth, E. M., J. Virol., supra) und mit ³⁵S-Zystein 30 Minuten lang Pulse-markiert und 4 Stunden lang gechased. Die Zelllysate wurden immunopräzipitiert mit Anti-K-Antikörper oder polyklonalem Schaf- oder Kaninchen-Anti-gp120-Serum (AIDS Research and Reference Program). Wie oben beschrieben wurden Proteine mittels Elektrophorese auf SDS-Polyacrylamidgelen (1%) aufgelöst und mittels Autoradiographie, wie oben beschrieben, sichtbar gemacht (vgl. 6). 6A zeigt Zelllysate, die mit polyklonalem Schaf-Anti-gp120-Serum immunopräzipitiert wurden, und 6B zeigt Zelllysate, die mit Kaninchen-Anti-gp120-Serum immunopräzipitiert wurden: 6A, Spur 1: Mock-transfiziertes sFv105-COS-1 unter Verwendung von Anti-κ-und Anti-gp120, immunopräzipitiert von HIV-1; Spuren 2–4: präzipitiert von Hülle-transfiziertem sFv105-COS-1; Spur 2: präzipitiert mittels Anti-gp120. Spur 3: präzipitiert mittels Ketten-Antikörper-Anti-κ; Spur 4: präzipi tiert mittels Anti-κ- und Anti-gp120-Antikörpern (AIDS Research und Reference Program); 6B: Spur 1: immunopräzipitiert von Mock-transfiziertem COS-1, unter Verwendung von Anti-κ2-Ketten- und Anti-gp120-Protein-Antikörpern; Spuren 2–3: präzipitiert von Hülle-transfiziertem sFv105-KDEL; Spur 2: präzipitiert mittels Anti-gp120-Antikörper; Spur 3: präzipitiert mittels Anti-κ-Ketten-Antikörpern; Spur 4: präzipitiert von sFv105-KDEL-Zellen, unter Verwendung von Anti-κ-Ketten- und Anti-gp120-Antikörpern.
In den COS-sFv105-KDEL-Zellen ist das Processing von gp160 zu gp120 teilweise inhibiert (8). 8 zeigt eine sFv105-KDEL-spezifische Bindung an das HIV-1-Glykoprotein in Zellen mittels Autoradiogrammen von Polyacrylamidgelen, die zeigen, dass das sFv105-KDEL-Protein mit dem HIV-1-Glykoprotein kopräzipitiert. Spur 1 zeigt Lysate von Mock-transfizierten COS-1-Zellen, die mit einer Mischung von Anti-gp120 und Anti-Kappa-Kette-Antiseren präzipitiert wurden. Die Spuren 2–3 zeigen Lysate von COS sFv105-KDEL-Zellen, die mit dem Hüllenexpressorplasmid pSVIIIENV transfiziert wurden. Spur 2 wurde mit einem Anti-gp120-Antiserum präzipitiert. Spur 3 wurde mit einem Anti-Kappa-Ketten-Antiserum präzipitiert. Spur 4 zeigt Lysate von COS-sFv105 KDEL-Zellen, die mit einer Mischung von Anti-gp120- und Anti-Kappa-Ketten-Antiseren präzipitiert wurden. Die Menge an sFv105-KDEL-Protein, das von einem Anti-Human-Kappa-Ketten-Antikörper präzipitiert wurde, wurde durch das Vorhandensein von gp160 erhöht. Das gp160-Protein, das in den COS-sFv105-KDEL-Zellen vorhanden ist, wird ebenfalls mittels eines Anti-Kappa-Ketten-Antikörpers präzipitiert. Das Antiserum, das gp160 exprimiert, gleicht der Distribution des sFv105-Proteins in COS-sFv105-Zellen (5B). Offenkundig wird das sFv105-KDEL-Protein durch eine Bindung von gp160 stabilisiert.
Koimmunopräzipitationsversuche wurden mit Antiserum zum ER- Chaperon-Protein, BiP, ausgeführt. Das sFv105-Protein wird präzipitiert unter Verwendung eines Antiserums zum BiP-Protein. Obwohl bekannt ist, dass schwere und leichte Immunoglobulin-Ketten an BiP binden (Wu, G. E., et al., Cell 33: 77–83 (1983); Bole, D. G., et al., J. Cell Biol. 102: 1558–1566 (1986); Dul, J. L., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 8135–8139 (1990); Knittler, M. R., et al., The EMBO J. 11: 1573–1581 (1992)] wurden mehrere zusätzliche Versuche ausgeführt, um die Möglichkeit auszuschließen, dass die Inhibition von gp160-Processing auf die nicht spezifische Aktivität des sFv105-Antikörper zurückzuführen ist.
Die Fähigkeit von Zellen, die einen Einketten-Antikörper exprimieren, der in der Lage ist, sFv105 zu binden, um das Processing eines Mutanten des env-Proteins zu inhibieren, wurde überprüft. Zu diesem Zweck wurden die COS-sFV105-Zellen mit einem Plasmid transfiziert, das einen Mutanten des Hüllproteins exprimiert, bei dem an Position 370 Glutaminsäure durch Glutamin substituiert wurde. Bei dieser Mutation wurde bereits zuvor nachgewiesen, dass damit die detektierbare Bindung des Hüllproteins durch den parentalen sFv105-Antikörper beseitigt werden kann [Thali, M. C., et al., J. Virol. 66: 5635–5641 (1992)]. Die Spezifität der sFv105-Bindung an das HIV-1-Hüllprotein wurde ebenfalls überprüft mittels Transfektion der COS-sFv105-Zellen mit einem Hüllprotein des Punta-Toro-Virus, einem Bunyavirus oder mit dem Hemaglutinin des WSN-Strangs des Influenza-A-Virus, einem Orthomyxovirus. Bei diesen beiden viralen Proteinen wurde bereits zuvor nachgewiesen, dass sie im ER und Golgi-Apparat prozessiert werden können (Chen, S. Y., et al., J. Virol. 65: 5902–5909 (1991); Hughey, P. G., et al., J. Virol. 66: 5542–5552 (1992)]. Weder die Punta-Toro- noch die Influenzavirusproteine wurden mit Anti-Human-Kappa-Ketten-Antikörpern präzipitiert, bei denen nachgewiesen wurde, dass sie den sFv105-HIV-1-gp160-Komplex kopräzipitieren. 9 (Spuren 1 und 2) zeigt, dass im Gegensatz zu dem Block beim Processing des parentalen Hüllproteins in COS-sFv105-Zellen, das mutierende gp160-Hüllprotein normal in gp120 prozessiert wird. Somit zeigt 9, dass sFv105 nicht mit nicht verwandten Proteinen kopräzipitiert. Die COS-sFv-Zellen wurden mit 10 μg von mutierendem HIV-1-Glykoproteinexpressor 370E/D transfiziert, der nicht durch F105 gebunden ist [Thali, M. C., et al. J. Virol. supra], mit ³⁵S-Zystein 30 Minuten lang Pulse-markiert und dann 4 Stunden lang gechased. Die Proteine wurden sowohl mit einem anti-HIV-1-Glykoprotein (Spur 1) als auch mit einem Anti-Kappa-Ketten-Antikörper (Spur 2) immunopräzipitiert. Die COS-sFv-Zellen wurden 2 Stunden lang mit 5 M. O. I des Vakziniavirus, der T7-Polymerase codiert, infiziert und dann transfiziert mit 10 μg Plasmid-DNAs PTV-G1–G2, welches die Gene der G1- und G2-Glykoproteine des Punta-Toro-Virus unter der Kontrolle des T7-Promoters enthält, (Chen, S. Y., et al., J. Virol., supra], oder mit Plasmid T7-HA, welches das HA-Gen des WSN-Strangs des Influenza-A-Virus unter der Kontrolle des T7-Promoters enthält [Chen, supra]. Die Zellen wurden dann 30 Minuten lang mit ³⁵S-Zystein Pulsemarkiert und 4 Stunden lang gechased. Spuren 3 und 4: Lysate von PTV G1–G2-transfizierten Zellen immunopräzipitiert mit anti-PTV-Glykoprotein (Chen, supra) (Spur 3) oder Anti-Kappa-Kette (Spur 4). 9 zeigt ebenfalls, dass das Processing des Punta-Toro-Hüllproteins nicht durch die Expression des sFv105-Antikörpers beeinträchtigt wird (Spuren 3–6).
Die Fähigkeit anderer Einketten-Antikörper, die nicht an das gp160 binden, das Processing des Hüllproteins zu beeinflussen, wurde überprüft. Es wurden zwei verschiedene Einketten-Antikörper verwendet. Ein solcher Antikörper ist der Einketten-Antikörper, der abgeleitet ist von einem murinen monoklonalen Antikörper, der das HIV-1-tat-Protein erkennt. Dieser Anti-tat-Einketten-Antikörper wurde gegenüber dem normalen intrazellulären Target des tat-Antikörpers so verändert, dass er eine Kopfsequenz erhält, die den ER targetieren wird. In einem kurzzeitigen Expressionsassay wird dieser Antikörper außerdem in COS-Zellen intrazellulär stabil gehalten und nicht in das Medium abgesondert. Das Processing von gp160 zu gp120 in COS-Zellen wurde nicht durch Kotransfektion eines Plasmids beeinträchtigt, welches das HIV-1-Glykoprotein exprimierte, mit dem Plasmid, welches das Anti-tat-sFv exprimierte. Überdies kopräzipitiert ein Anti-Immunoglobulin-Antiserum, das das Anti-tat-sFv präzipitiert, das HIV-1-Hüllprotein nicht (Vgl. 10). 10 zeigt, dass ein intrazellulär gehaltenes Anti-tat-sFv nicht an ein HIV-1-Glykoprotein bindet. Die COS-Zellen wurden kotransfiziert mit 10 μg pSVIIIenv und 10 μg pRC/CMV-sFvtat-Plasmid-DNA, mit ³⁵S-Zystein 30 Minuten lang Pulse-markiert und vier Stunden lang gechased. Die Proteine wurden mit Anti-Maus-Immunoglobulin-Antiseren (Spur 1) oder Schaf-Anti-gp120 (Spur 2) immunopräzipitiert und mittels SDS-PAGE analysiert. Die sechs produzierten Mutanten von sFv105, bei denen alle Aminosäuren in der CDR3-Region der schweren Kette durch beliebige Aminosäuren ersetzt wurden und die das Protein nicht binden, wurden ebenfalls verwendet. Das Processing von gp160 zu gp120 in COS-Zellen wurde durch die Kotransfektion der Plasmide, die diese mutierenden Proteine exprimieren, nicht beeinträchtigt. Die Anti-Immunoglobulin-Antiseren haben das HIV-1 Hüllprotein nicht kopräzipitiert.
Die Fähigkeit der sFv105- und sFv105-KDEL-Proteine, die Funktion des Hüllproteins zu inhibieren, wurde determiniert mittels Messung der Fähigkeit von Zellen, die mit dem Hüllgen transfiziert wurden, um die Synzytiumbildung von CD4⁺-Zellen zu induzieren. In einer Versuchsreihe wurden die parentalen COS-Vektorzellen sowie die COS-sFv105- und COS-sFv105-KDEL-Zellen mit einem Plasmid transfiziert, das ein funktionelles Hüllglykoprotein exprimiert. Zwei Tage nach der Transfektion wurden die Zellen in einem Verhältnis von etwa 1 zu 10 mit einer humanen CD4⁺-T-Zelllinie, SupT1, gemischt, die anfällig ist für Hülle-vermittelte Fusion. Der Umfang der Hülle-vermittelten Synzytiumbildung wurde um 80–90% reduziert in Zellen, die entweder das sFv105- oder das sFv105-KDEL Protein exprimieren (7). Ähnliche Mengen von gp160 wurden in allen drei Linien produziert, wie mittels metabolischer Markierung und Präzipitation der transfizierten Kulturen bestimmt wurde. Die Reduktion der Synzytiumbildung wurde ebenfalls beobachtet bei der Kotransfektion der HeLa-CD4⁺-Zellline mit einem Plasmid, das ein funktionelles Hüllglykoprotein exprimiert, zusammen mit einem zweiten Plasmid, das entweder das sFv105- oder das sFv105-KDEL-Protein exprimiert (7). Im Gegensatz dazu gab es keine signifkante Reduktion bei der Synzytiumbildung, wenn das zweite Plasmid, das das Anti-tat sFv exprimiert (7), verwendet wurde.
CD4⁺-HeLa-Zellen wurden kotransfiziert mit 3 μg pSFIIIenv und 15 μg Vektor oder pCMV-sFv oder pCMV-sFv-KDEL. Synzytia wurden 30 Stunden nach der Transfektion gezählt. Die transformierten Zellen wurden transfiziert mit 3 μg pSVIIIenv, die 48 Stunden lang inkubiert, dann in PBS gespült und mit 50 mM EDTA bei 37°C 40 Minuten lang inkubiert wurden. Die Zellen wurden von der Platte entfernt, mit PBS gewaschen und in 2 ml DMEM, angereichert mit 10% fötalem Kälberserum, resuspendiert. Zu den Zellen wurden dann etwa zwei Mal 106 SupT1-Lymphozyten zugefügt und bei 37°C 12 Stunden lang inkubiert, und Synzytia wurden verzeichnet. Um die Produktion von infektiösem HIV-1 durch die transformierten Zellen zu überprüfen, wurden COS-, COS-sFv105 und COS-sFv105-KDEL-Zellen mit 5 μg infektiöser pSVIIIB-DNA transfiziert.
Die Überstände von den Zellen wurden dann am vierten Tag nach der Transfektion geerntet und 1 ml von jedem der Überstände wurde dann mit etwa zwei Mal 106 SupT1-Zellen 12 Stunden lang inokuliert. Die SupT1-Zellen wurden dann mit DMEM zweimal gewaschen und nach 12 Stunden in das RPMI-Medium gegeben, das mit 10% fötalem Rinderserum angereichert war. Die Überstände der SupT1-Zellen wurden dann gewonnen, und die Produktion der viralen Partikel wurde unter Verwen dung eines empfindlichen Radioimmunoassayserums für das HIV-1-p24-Kapsid-Antigen-Protein (DuPont-NEN Inc.) gemäß den Angaben des Herstellers gemessen. 7 zeigt eine signifikante Reduktion der Synzytiumbildung in den CD4⁺-HeLa-Zellen und den transformierten COS-Zellen, die sFv oder sFv-KDEL exprimieren. Die Prozentsätze der Synzytiawerte, die in den CD4⁺-HeLa-Zellen beobachtet wurden, oder die Vektor-transformierten Zellen, die mit pSVIIIenv transfiziert wurden, werden gezeigt.
Um die Fähigkeit der sFv105-Proteine, die Produktion infektiöser Viren zu inhibieren, zu überprüfen, wurden COS-Vektor-, COS-sFv105- und COS-sFv105-KDEL-Zellen mit einem Plasmid transfiziert, das eine Kopie des vollständigen viralen Genoms enthält [Fisher, A. G., et al., Nature 316: 262–265 (1985); Helseth, E. M., et al., J. Virol. 64: 2416–2420 (1990)]. Vier Tage nach der Transfektion wurde der Virus in den Kultur-Überstandsfluiden verwendet, um die Infektion einer empfindlichen Indikator-Zelllinie SupT1 zu initiieren. Es zeigte sich, dass die Überstände aller drei transfizierten Zelllinien ähnliche Mengen des viralen Kapsidproteins, p24, enthielten. Es wurde bereits zuvor nachgewiesen, dass die Freigabe der Kapsidproteine in den Zellüberstand stattfindet in Abwesenheit der Synthese des Hüllglykoproteins sowie in Gegenwart von Hüllglykoproteinen, die Processing-Defekte enthalten und daher im ER gehalten werden [McCune, J. M., et al., Cell 53: 55–67 (1988); Ratner, L. N., et al., AIDS Research und Human Retroviruses 7: 287–294 (1991)].
11 zeigt, dass die Virusreplikation in SupT1-Zellen, die durch die Überstände der transfizierten COS-sFV105- oder COS-sFv105-KDEL-Zellen initiiert wurde, um etwas fünf Tage verzögert ist im Vergleich zur Virusreplikation, die durch einen Virus initiert wurde, der von einer Kontroll-COS-1-Zelllinie, die den Vektor, aber nicht die sFV105-Sequenzen enthält, produziert wurde. 11 zeigt die Virusausbeute durch die infizierten SupT1-Zellen. Die infektiöse pSVIIIB-DNA ist eine infektiöse provirale HIV-I-DNA des HXBc2-Strangs [Fisher, A. G., et al. Nature 315: 262–265 (1985)]. Die sFv105- oder sFv105-KDEL- oder Vektor-transformierten Zellen wurden transfiziert mit 5 μg pSVIIIB-Plasmid-DNA, die eine infektiöse provirale HIV-I-DNA des HXBc2-Strangs enthielt. Vier Tage nach der Transfektion wurden die Überstände der transfizierten Zellen mit SupT1-Zellen 16 Stunden lang inokuliert und dann gewaschen, in ein frisches Medium gegeben, auf die Konzentration von viralem Kapsid-Protein p24 hin mittels gag-p24-Aktivität im Kulturmedium überprüft. Die mittleren Mengen, die aus den Überständen der transfizierten Zellen detektiert wurden, lagen bei 1,2 ng/ml (Vektor-COS), 1,0 ng/ml (COS-sFv105) bzw. 1,4 ng (COS-sFv105-KDEL). Die Symbole in 11 stellen die Ergebnisse dar, die unter Verwendung der Überstände erhalten wurden, die von der COS-Kontroll-Zelllinie, die nur den Vektor enthält (O), einer COS-Zelllinie, die das sFv105-Protein konstitutiv exprimiert (☐), und einer COS-Zelllinie, die das sFv105-KDEL-Protein exprimiert (Δ), gewonnen wurden.
Wenn eine Reihe von verdünnten Überständen verwendet wurde, um die SupT1-Zellen zu infizieren, dann gab es eine mehr als 10³-fache Reduktion bei der Synzytiumbildung (12). 12 zeigt Virustiter mittels Synzytiumbildung in SupT1-Zellen. Die transformierten COS-Vektor- und COS-sFv105-Zellen wurden transfiziert mit 4 μg pSVIIIB-Plasmid-DNA, die eine infektiöse provirale HIV-I-DNA des HXBc2-Strangs [Ratner, supra] enthielt. 48 Stunden nach der Transfektion wurden die Überstände der transfizierten Zellen gewonnen und in einer Reihe von Verdünnungen verwendet, um die SupT1-Zellen 16 Stunden lang zu infizieren und dann zu waschen. Nach 8 Tagen wurden die Synzytia gezählt. Die Angaben betreffen die Anzahl der Synzytiapositiven Vertiefungen/Anzahl der gezählten Vertiefungen. Fünf High Power Fields (HPF) wurden in jeder Vertiefung gezählt. Ein oder mehrere Synzytia in fünf HPFs zählen als (+) für die Dilution. Die Verzögerung bei der Replikation von Viren, die von COS-sFv105-Zellen produ ziert werden, und die Abnahme des infektiösen Titers wird der niedrigen Infektiosität des Virus im Vergleich zu derjenigen des von der Kontroll-Zelllinie produzierten Virus zugeschrieben. Die Ergebnisse dieser Versuche beweisen, dass Zellen Antikörper produzieren können, die intrazellulär funktionieren. Der Antikörper wird stabil exprimiert und im endoplasmatischen Retikulum gehalten und ist für die Zellen nicht toxisch. Der Antikörper bindet an das Hüllprotein innerhalb der Zelle und inhibiert die Reifung und Funktion dieses kritischen Virusproteins. Die Infektiosität der HIV-1-Partikel, die von den Zellen produziert werden, die den Einketten-Antikörper exprimieren, ist stark reduziert.
Ein Transkomplementations-Assay wurde verwendet, der zwei Plasmide verwendet, wobei eines rev und Hüllproteine (pSVIIIenv) unter der Kontrolle von HIV-1-LTR codiert, und das andere einen HIV-1-Provirus enthält, mit einer Deletion im env-Gen (pHXBenvCAT), und ein Chloramphenicol-Acetytransferase-Gen (CAT), das das nef-Gen ersetzt [Helseth, J. Virol. 64: 2416 (1990)]. Beide Plasmide wurden in COS-1-Zellen transfiziert und die Überstände der Zellen, die Viruspartikel mit „single round"-Infektiosität enthielten, wurden verwendet, um parentale SupT-, SupT-Vektor- oder SupT-sFv105-Zellen zu infizieren. Die CAT-Aktivität wurde determiniert aus den Lysaten der infizierten Zellen, welche die „single-round"-Infektiosität der Viruspartikel widerspiegelt. In diesen Versuchen wurden vergleichbare Mengen an CAT-Aktivität von den parentalen SupT-, SupT-Vektor- und SupT-sFv105-Zellen beobachtet, die mit den Überständen von den kotransfizierten COS-Zellen infiziert wurden, während keine detektierbare CAT-Aktivität beobachtet wurde von den parentalen SupT-, SupT-Vektor- oder SupT-sFv105-Zellen, die mit den Überständen der COS-Zellen infiziert wurden, die entweder nur mit dem pSVIIIenv- oder dem pHXBenvCAT-Pasmid transfiziert wurden. Diese Versuchsergebnisse zeigen an, dass die SupT-sFv105-Zellen anfällig sind für eine HIV-1-Infektion, und dass der beobachtete Block sowohl der zytopathischen Wirkungen als auch der Produktion des infektiösen Virus zurückzuführen ist auf ein spätes Ereignis im Lebenszyklus des Virus (Assembly infektiöser Virionen). Dieser Versuch bestätigt, dass die gestörte Fähigkeit, die HIV-1-Replikation in den SupT-sFv105-Zellen zu unterstützen, nicht auf den Verlust der CD4-Rezeptor-Funktion oder andere unbeobachtete Änderungen zurückzuführen ist, die als Ergebnis der intrazellulären Antikörperproduktion auftraten.
Die Expression von Fv105 beeinflusst die Expression mehrerer Zelloberflächen-Moleküle nicht. Wir haben nachgewiesen, dass sich die Oberflächenexpression von CD4 nach der HIV-1-Infektion in sFv105-produzierenden SupT-Zellen normalisiert. Wir haben eine FACS-Analyse auf zusätzlichen Oberflächenmarkern, einschließlich CD3, CDS, CD7, CD8, β₂M, CD20 und HLA-DR, durchgeführt. Es gab keinen Unterschied bei der Fluoreszenzintensität zwischen SupT-Vektor- und SupT-sFv105-Zellen, wenn die Oberflächenlevel von CD3, CDS, CD7, CD8 und β₂M verglichen wurden. Es gab keine Oberflächenexpression von CD20 oder HLA-DR in irgendeiner Zelllinie. Diese Marker stimmen mit dem publizierten Phänotyp der SupT-Zellen überein.
Transduzierte Zellen sind in der Lage, auf geeignete Stimuli mit erhöhten Leveln induzierbarer Proteine zu antworten. Mehrere PHA-Stimulationsversuche, bei denen die Level von ³H-Thymidin-Inkorporation zwischen SupT-Vektor- und SupT-sFv105-Zellen verglichen wurden, wurden durchgeführt. Nach sechs Stunden Inkubationszeit mit oder ohne 8 mM PHA und Markierung mit ³H-Thymidin, gab es einen mehr als 10-fachen Anstieg der Thymidininkorporation in beiden Zelllinien, während nicht stimulierte Level äquivalent waren (SupT-Vektor stimuliert 1485 cpm/nicht stimuliert 139 cpm; SupT-sFv105-Zellen stimuliert 3330 cpm/nicht stimuliert 263 cpm). Folglich scheinen diese transduzierten Zellen auf die mitogene Reaktion bei äquivalenten Leveln zu reagieren.
Aus diesen zusätzlichen Daten schließen wir, dass die SupT-sFv105-Zellen den parentalen Phänotyp aufrecht erhalten, angemessen auf externe Stimuli reagieren können, resistent sind gegen die zyopathischen Wirkungen der HIV-1-Infektion, und die infizierten Zellen HIV-1-Viruspartikel produzieren, die eine deutlich verringerte Infektiosität aufweisen. Diese Wirkungen sind ein Ergebnis der intrazellulären Bindungsaktivität der Fv105-Moleküle mit gp160.
4. Fähigkeit des Antikörpers zum Tat-Protein, die Trans-Aktivierung zu inhibieren.
Das tat-Protein von HIV-1 transaktiviert Gene, die von der HIV-1-langen terminalen Wiederholung (LTR) exprimiert werden. Ein Assay zum Nachweis des Vorhandenseins von tat in der Zelle wurde entwickelt, indem tat in Zellen eingeführt wurde, die ein Plasmid exprimieren, das HIV-1-LTR-CAT-Reporter enthält.
Chloramphenicol-Acetyl-Transferase (CAT)-Assay.
H3TI (NIAID Aids Reagent Program), eine HeLa-Zelllinie, die ein integriertes LTR-CAT-Plasmid enthält, wurde in Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), angereichert mit 10% fötalem Kälberserum (FCS) gezüchtet. Die Zellen wurden zu 50% Konfluenz auf Nunc Gewebekulturplatten mit 6 Vertiefungen gezüchtet.
Verschiedene Konzentrationen von Anti-tat-SCA mit Kopf, Anti-tat-SCA ohne SV40 (VK) und Anti-tat-SCA mit SV40 (VKSV40) wurden zwei Stunden lang koinfiziert in H3TI mit 0,1 Mikrogramm pSVIIIenv, einem tat-exprimierenden Plasmid, unter Verwendung von Lipofektion.
Die CAT-Aktivität wurde, wie beschrieben, [Gorman, et al., Mol. Cell. Biol. 2: 1044–1051 (1982)] 72 Stunden nach der Transfektion gemessen.
Die Transfektion der HeLa-Zellen, die das HIV-1-LTR-CAT-Reporter-Plasmid enthalten, zeigt signifikante Transaktivierung (25×) mit der Transfektion von nur 0,01 Mikrogramm des tat-exprimierenden Plasmids (20).
Inhibition der Tat-Aktivität.
Die Wirkung des Vorhandenseins von Anti-tat-Einketten-Antikörpern (SCA), die intrazellulär exprimiert wurden, auf die Transaktivierung wurde wie folgt bestimmt:
10 Mikrogramm Anti-tat SCA (VK), Anti-tat-SCA mit SV40-nuklearem Lokalisierungssignal (V_KSV40) und Anti-tat-SCA mit einer Immunoglobulin-Kopfsequenz, um die SCA in das endoplasmatische Retikulum zu lenken, wurden mit 0,1 Mikrogramm pSVIIIenv-tat-Expressor-Plasmid in HeLa-Zellen exprimiert, die das HIV-1-LTR-CAT-Plasmid enthielten. Da die Kopfsequenz den Einketten-Antikörper in das ER lenkt, sollte sie keine Wirkung auf das tat haben, das nur im Zytoplasma und im Nukleus vorhanden ist. Die Ergebnisse, die in 21 zusammengefasst sind, zeigen, dass das Vorhandensein von Anti-tat-SCA-VK und Anti-tat-SCA-V_KSV40 zu einer Abnahme der Transaktivierung von HIV-1-LTR-CAT durch tat führt, im Vergleich zur Aktivität des gleichen Antikörpers, der zu einem anderen Abschnitt in der Zelle gelenkt wird. Anti-tat-V_K zeigt nur 4% der Aktivität von Anti-tat-SCA mit Kopf während Anti-tat-V_KSV40 18,4% zeigt.
Wenn die Menge an Antikörper, die den Zellen zugefügt wird, um die Hälfte reduziert wird (22), zeigt die Aktivität von tat in Zellen, die mit Anti-tat-V_K transfiziert wurden, 15% der gesamten Aktivität, während anti-tat V_KSV40 28% zeigt.
5. Induzierbare Expression eines intrazellulären Antikörpers
Wir klonierten F105-sFv unter der Kontrolle von HIV-1-5'-LTR und stellten stabile Zelllinien in SupT-Zellen fest. Wie in 13, Spur 1, zu sehen ist, wird das F105-sFv exprimiert nach der Transfektion von stabilen F105-sFv-LTR-SupT-Zellen mit dem tat exprimierenden Plasmid pSVIIItat. 13 zeigt SupT-Zellen, die mit pLTR-F105sFv (Spur 1) oder pRC/CMV-F105-sFv (Spur 2) stabil transformiert wurden. SupT-LTR-F105-sFv-Zellen wurden zusätzlich mit pSVIIItat transfiziert. Beide Zellen wurden mit 35^SCys 3 Stunden lang markiert, und es wurden Zelllysate hergestellt. Eine Radioimmunopräzipitation erfolgte mit Anti-Human-Kappa-Kette-Antiseren, gefolgt von SDS-PAGE (15%). Kein F105-sFv wurde in Abwesenheit von tat-Proteinexpression festgestellt. Der Promoter und die Zell-Interdependenz dieser Expression werden in Spur 2 von 13 gezeigt, wobei der CMV-Promoter verwendet wird. Viele Klone wurden gescreened, und praktisch keiner produzierte detektierbare Antikörper. Jurkat-Zellen führten zu ähnlichen Ergebnissen.
Die oben beschriebenen stabil-transformierten SupT-Zellen, die mit F105-sFv unter der Kontrolle von HIV-1-LTR stabil transformiert wurden, wurden mit variierenden Konzentrationen des tat-Proteins induziert. 16 zeigt, dass F105-sFv mit nur 0,1 μg des tat-Proteins induzierbar exprimiert wurde. Spur 1 zeigt die Verabreichung von 10 μg tat-Protein; Spur 2 zeigt 1 μg tat-Protein; Spur 3 zeigt 0,5 μg Protein; Spur 4 zeigt 0,1 μg Protein und Spur 5 zeigt 0 μg Protein. Es gibt einen Marker, der die Lage von sFv-105 anzeigt. Die transformierten SupT-Zellen halten die normale Morphologie und die Replikationsrate aufrecht und können transduziert werden, um hohe Level von F105-sFv zu exprimieren.
SupT-Zellen wurden, wie oben beschrieben, mit HIV-1 infiziert. Sie wurden dann, wie oben beschrieben, mit pLTRF105-sFv stabil transdu ziert. 17 zeigt eine FACS-Analyse der SupT-Zellen. 17A zeigt eine negative Kontrolle, die eine SupT1-Zelle, die nicht infiziert ist, darstellt. 17B zeigt eine positive Kontrolle der HIV-infizierten SupT-Zellen, die nicht transduziert wurden. 17C zeigt eine FACS-Analyse der SupT-HIV-LTR-sFv105-transduzierten HIV-infizierten SupT-Zellen, und 17D zeigt die HIV-infizierte SupT-Zelle, Mock-infiziert mit einem Vektor, der zwar HIV-LTR enthält, aber nicht das sFv105-Antikörpergen.
17B–D zeigt Oberflächenfärbung von gp120, unter Verwendung von FITC-Anti-gp120 (ABT Inc.) acht Tage nach der Infektion mit dem 20 M. O. I. HXB2-Strang von HIV-1. Wie aus der Analyse ersichtlich, zeigt 17D das gleiche allgemeine Färbungsmuster der SupT-Zellen wie die positive Kontrolle (17B). Im Gegensatz dazu zeigt die HIV-infizierte Zelle, die mit dem Antikörper gemäß der vorliegenden Erfindung transduziert ist (17C), eine Hintergrundfärbung, die der negativen Kontrolle ähnelt (17A), wodurch bewiesen wird, dass die gp120-oberfächenexprimierten SupT-sFv105-Zellen deutlich verringert sind.
18A–D betrachtet die CD4-Oberflächenexpression in solchen Zellen. 18A zeigt die Hintergrundfärbung in einer negativen Kontrolle, während 18B die Oberflächenfärbung von CD4 unter Verwendung von FITC-anti-CD4 (ABT, Inc.) acht Tage nach der Infektion mit dem 20 M. O. I. HXB2-Strang von HIV-1 (positive Kontrolle) zeigt. 18D zeigt die deutliche Herabregulierung (Down-Regulation) der CD4-Expression auf HIV-infizierten SupT-Zellen, die mit dem HIV-LTR-Vektor acht Tage nach einer solchen Infektion Mock-infiziert sind. Im Gegensatz dazu zeigt 18C, dass die CD4-Oberflächenexpression in den HIV-infizierten SupT-Zellen, die mit sFv105 transduziert sind, unter der Kontrolle von HIV-LTR acht Tage nach der Infektion beinahe normal ist. Somit beweisen diese Versuche, dass die CD4-Oberflächenexpression in Zellen nicht signifikant herabreguliert ist, in denen das HIV-Protein gemäß der vorliegenden Erfindung targetiert wurde. Der Versuch zeigt ferner, dass die intrazellulären Komplexe von CD4-gp160, von denen bekannt ist, dass sie sich im ER bilden, durch das vorliegende Verfahren gestört werden können.
19 zeigt die zytopathischen Wirkungen der HIV-1-Virus-Inhibition in HIV-infizierten CD4-SupT-Zellen, die F105-sFv exprimieren. Die (⊙)-Linie zeigte eine Mock-transfizierte SupT-Zelle. (Δ) stellt eine positive Kontrolle dar, die eine SupT-Zelle zeigt, die unter den oben beschriebenen Bedingungen mit HIV infiziert wurde. (☐) zeigt die SupT-Zelle, die unter den oben beschriebenen Bedingungen infiziert wurde und mit dem sFv105-Antikörper unter der Kontrolle von HIV-LTR, wie oben diskutiert, transduziert wurde. Diese Figur zeigt die Ergebnisse der Synzytiabildung nach der Infektion der SupT-Vektorzellen oder der SupT-sFv105-Zellen mit dem 20 M. O. I. HXBC2-Strang von HIV-1, wie oben beschrieben. 11 Tage nach der Infektion hatten sich praktisch keine Synzytia in den SupT-sFv105-Zellen gebildet. Im Gegensatz dazu konnte in den SupT-Zellen ein Synzytia-Spitzenwert nach 4–5 Tagen festgestellt werden. Diese Versuche stimmen überein mit dem oben diskutierten Fehlen von Oberflächenexpression von gp120, was darauf schließen lässt, dass die vorliegenden interzellulären Antikörper zur Resistenz der zytopathischen Wirkungen von gp120 führen.
Diese Erfindung wurde, einschließlich der zugehörigen bevorzugten Ausführungsformen, ausführlich beschrieben. Es ist jedoch erwünscht, dass Fachleute unter Berücksichtigung dieser Offenbarung, Modifikationen und Verbesserungen einbringen, ohne von der Erfindung, wie sie in den Ansprüchen definiert ist, abzuweichen.

Claims

Verwendung eines Vektors oder Vektorsystems zur intrazellulären Expression eines Antikörpers in einer Tier-, Vogel- oder Pflanzenzelle zur Herstellung einer Zusammensetzung für die Erzeugung intrazellulär bindender Antikörper an ein Target-Antigen in der Tier-, Vogel- oder Pflanzenzelle, umfassend eine Nukleotid-Sequenz, die einen für die Expression in der Tier-, Vogel oder Pflanzenzelle geeigneten Promotor enthält, der operativ verknüpft ist mit einem den Antikörper codierenden Antikörper-Gen, wobei der Antikörper eine Kopfsequenz aufweist, die die Funktion hat, zu bewirken, dass der exprimierte Antikörper aus der Zelle abgesondert wird, und wobei der Antikörper ferner eine intrazelluläre Retentionssequenz enthält.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Target-Antigen ausgewählt ist aus der Gruppe von Antigenen bestehend aus intermediären Metaboliten, Zuckern, Fetten, Autacoiden, Hormonen, komplexen Kohlenhydraten, Phospholipiden, Nukleinsäuren und Proteinen.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Target-Antigen im endoplasmatischen Retikulum oder im Golgi-Apparat vorhanden ist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei der operativ mit dem Antikörper-Gen verknüpfte Promotor einer ist, der die Expression in Säugetierzellen erlaubt.
Verwendung nach Anspruch 1 oder 4, wobei das Target-Antigen ein viral codiertes Protein oder ein Protein, dessen Expression in bösartigen Zelltransformationen resultiert, ist.
Verwendung nach Anspruch 1 oder 4, wobei das Target-Antigen ist (i) ein virales Protein eines Lentivirus, eines Papillomavirus, eines Hepatitis B Virus, eines Eppstein-Barr Virus, eines HTLV-1 oder HTLV-2; (ii) codiert durch sis, int-2, erb B, neu, fms, ros, kit, abl, src, ras, N-myc, fes, fps, raf, mos, erbA, c-myc, L-myc, fos, jun, myb, ets, ski, fgr, yes, lck, hck, fyn, lyn, thl, bcl-2, bcl-1, int-1, 2 oder ein Retinoblastoma; (iii) ein Oberflächenrezeptor oder ein transmembranes Protein; oder (iv) ein MHC Klasse I oder MHC Klasse II Molekül.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Nukleotid-Sequenz Gene enthält, die die Antikörper für mehr als ein Target-Antigen codieren.
Verwendung nach Anspruch 7, wobei das virale Protein ausgewählt ist aus der Gruppe von viralen Proteinen enthaltend die Sequenzen HIV tat, HIV rev, HTLV-1 tax, HTLV-1 rex, HTLV-2 tax und HTLV-2 rex.
Verwendung nach Anspruch 1 oder 4, wobei der der codierte Antikörper ein Einketten-Antikörper, ein single-domain heavy-chain oder ein Fab ist.
Verwendung nach Anspruch 1 oder 4, wobei das Antikörper-Gen eine intrazelluläre Retentionssequenz codiert und (1), wenn die intrazelluläre Retentionssequenz spezifisch für das endoplasmatische Retikulum ist, diese Sequenz ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nr. 17, SEQ ID Nr. 18, SEQ ID Nr. 19, SEQ ID Nr. 21 und SEQ ID Nr. 22; oder (2), wenn die intrazelluläre Retentionssequenz spezifisch für eine Plasmamembran ist, diese Sequenz ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nr. 30, SEQ ID Nr. 31, SEQ ID Nr. 32, SEQ ID Nr. 33, SEQ ID Nr. 34, SEQ ID Nr. 35, SEQ ID Nr. 36, SEQ ID Nr. 37, SEQ ID Nr. 38, SEQ ID Nr. 39, SEQ ID Nr. 40, SEQ ID Nr. 41, SEQ ID Nr. 42, SEQ ID Nr. 43, SEQ ID Nr. 44, SEQ ID Nr. 45, SEQ ID Nr. 46, SEQ ID Nr. 47, und SEQ ID Nr. 48.
Antikörper, der sowohl ein funktionelles sekretorisches Signal wie auch eine intrazelluläre Retentionssequenz zur Bindung eines Target-Antigens in einer tierischen oder Vogelzelle enthält und der keine cytotoxische Chemikalie enthält.
Antikörper nach Anspruch 11, wobei die intrazelluläre Retentionssequenz eine Lokalisierungssequenz für das endoplamatische Retikulum ist.
Antikörper nach Anspruch 12, der die Zelle nicht verletzt.
Antikörper nach Anspruch 11, wobei der Antikörper ein Fab oder ein Einketten-Antikörper ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 oder 10, wobei die Zusammensetzung eine pharmazeutische Zusammensetzung ist, die den Vektor oder das Vektorsystem, definiert in diesen Ansprüchen, enthält zusammen mit einem dafür pharmazeutisch akzeptablen Träger, wobei der Antikörper intrazellulär als funktioneller Antikörper exprimiert ist, bei dem die Funktion bestimmt wird durch die Möglichkeit des Antikörpers, intrazellulär an dieses Antigen zu binden.
Pharmazeutische Zusammensetzung enthaltend den Antikörper nach Anspruch 11, 12, 13 oder 14 zusammen mit einem dafür pharmazeutisch akzeptablen Träger.