CN116143918A - 抗聚泛素多特异性抗体 - Google Patents

抗聚泛素多特异性抗体 Download PDF

Info

Publication number
CN116143918A
CN116143918A CN202310104155.9A CN202310104155A CN116143918A CN 116143918 A CN116143918 A CN 116143918A CN 202310104155 A CN202310104155 A CN 202310104155A CN 116143918 A CN116143918 A CN 116143918A
Authority
CN
China
Prior art keywords
seq
antibody
sequence
antibodies
hvr
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202310104155.9A
Other languages
English (en)
Inventor
V·迪克西特
M·马楚莫托
E·卡斯特拉诺斯
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
F Hoffmann La Roche AG
Original Assignee
F Hoffmann La Roche AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by F Hoffmann La Roche AG filed Critical F Hoffmann La Roche AG
Publication of CN116143918A publication Critical patent/CN116143918A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6854—Immunoglobulins
    • G01N33/6857—Antibody fragments
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/40—Immunoglobulins specific features characterized by post-translational modification
    • C07K2317/41—Glycosylation, sialylation, or fucosylation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/526—CH3 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/626—Diabody or triabody
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2440/00—Post-translational modifications [PTMs] in chemical analysis of biological material
    • G01N2440/36—Post-translational modifications [PTMs] in chemical analysis of biological material addition of addition of other proteins or peptides, e.g. SUMOylation, ubiquitination

Abstract

本发明提供了对于混合拓扑结构聚泛素比单个拓扑结构聚泛素具有更高亲合性的抗体和多特异性抗聚泛素抗体，以及使用它们的方法。

Description

抗聚泛素多特异性抗体
本申请为申请日为2017年6月23日，发明名称为“抗聚泛素多特异性抗体”的申请201780050175.5的分案申请。
相关申请的交叉引用
本申请要求2016年6月24日提交的美国临时申请号62/354,305的优先权，其通过引用整体并入本文用于任何目的。
技术领域
本发明涉及抗聚泛素多特异性抗体及其制备和使用方法。
背景技术
泛素是一种小蛋白质，其在多种细胞通路中具有重要的调节作用。其中最著名的是泛素在蛋白质降解中的作用，其中泛素与靶蛋白质的共价连接使得靶蛋白被26S蛋白酶体识别和破坏(参见Wilkinson,Semin.Cell Devel.Biol.11(3):141-148(2000))。泛素(一种76个氨基酸的蛋白质)与靶蛋白的共价连接是三步酶促过程(Pickart,Annu.Rev.Biochem.70:503-533(2001))。首先，泛素激活酶E1在ATP依赖性反应中形成泛素-E1硫酯。在第二步中，泛素从泛素-E1硫酯转移到泛素缀合酶(E2)家族的成员。在第三步中，在泛素-蛋白质连接酶(E3)的帮助下，在泛素的羧基末端和靶蛋白上的赖氨酸残基的ε-氨基之间形成异肽键。称为去泛素化酶的酶将泛素部分从靶蛋白移除(Guterman和Glickman,Curr.Prot.Pep.Sci.5:201-210(2004))。
泛素含有七个赖氨酸残基(Lys6、Lys11、Lys27、Lys33、Lys29、Lys48和Lys63)，因此泛素本身可以作为泛素化的靶蛋白(Peng等人,Nat.Biotechnol.21:921-926(2003)；Pickart和Fushman,Curr.Opin.Chem.Biol.8:610-616(2004))。泛素蛋白泛素化后产生的分子称为聚泛素分子，其可包含两个或更多个泛素部分。理论上泛素的泛素化可以发生在七个赖氨酸残基中的任何一个上(Peng等人,Nat.Biotechnol.21:921-926(2003))，因此存在不同种类的聚泛素，其具有与泛素内不同赖氨酸残基的异肽键。已经报道了在所有七个赖氨酸残基上具有内部异肽键的聚泛素链。Iwai和Tokunaga,EMBO Reports 10:706-713(2009)。
另外，其中泛素的C-末端甘氨酸与另一泛素分子的N-末端甲硫氨酸的α-氨基缀合时形成线性聚泛素键。Iwai和Tokunaga,EMBO Reports 10:706-713(2009)。通过线性泛素链装配复合物(LUBAC)形成线性聚泛素，其由两个环指蛋白HOIL-1L和HOIP组成。Tokunaga等人,Nat.Cell Biol.11:123-132(2009)。据信，遗传编码的非锚定的线性聚泛素不存在于细胞中，因为其C-末端易受异肽酶T切割。Iwai和Tokunaga,EMBO Reports 10:706-713(2009)。该观察表明，线性聚泛素装配到翻译后的底物蛋白质上，缀合的线性聚泛素分子是蛋白质活性和功能的潜在调节剂。Id.例如，已表明NF-κB必需调节剂(NEMO)的线性聚泛素化在NF-κB活化中起作用。Id.
包含两个或更多个Ub至Ub键(linkage)(三个或更多个泛素单体)的聚泛素链可具有同质或混合拓扑结构。如果在连续的延伸步骤中相同的残基被修饰，则链是同质的，如在均匀线性(或Met1-)、Lys11-、Lys48-或Lys63-连接链的情况下，而如果在链中的不同位置具有不同的键，则链具有混合拓扑结构。Komander和Rape,Annu.Rev.Biochem.81:203-29(2012)。混合链可以(但不一定)是支链，其中相同的单体具有至少三个不同的键(如与三个其他泛素单体的键、或与底物多肽的键和与两个其他泛素单体的键)。同上。在NF-κB信号传导和蛋白质运输的情况下已经报道了混合拓扑结构链。同上。另见其中的参照文献7-10。另外，相同的蛋白质可以在两个或更多个位置上与至少第一和第二聚泛素聚泛素化，其中第一和第二聚泛素具有不同的键。
用于测定键的胰蛋白酶消化和LC-MS/MS的传统方法被认为对于支链是不可行的。在泛素一级序列的K11和K48之间附加的赖氨酸和精氨酸残基之后的胰蛋白酶切割阻止在单个肽内鉴定修饰的K11和K48。
已经描述了用于检测分支聚泛素链的间接方法。为了证明支链的存在，使用K11R和K48R泛素突变体组合和含有***的TEV切割位点的工程化泛素以及嵌合E2酶来重编程由促后期复合物/细胞周期体合成的键的特异性。参见Meyer,H.J.&Rape,M.Cell 157,910-921(2014)。
结合混合拓扑结构聚泛素和/或对不同聚泛素键具有特异性的多特异性抗体可以提供益处，如简化混合拓扑结构聚泛素链或与具有不同键的聚泛素聚泛素化的蛋白质的检测，促进进一步检查这种链在蛋白质降解和调节、靶向和调节包括其的通路中混合拓扑结构聚泛素的作用，或者至少是有用的选择。
本文提供了多特异性抗聚泛素抗体和免疫缀合物以及使用其的方法。抗体可用于检测方法中，如免疫组化、蛋白质印迹、免疫沉淀、ELISA等，以及功能测定法。
本文提供了对于混合拓扑结构聚泛素比单个拓扑结构聚泛素具有更高亲合性(avidity)的抗体，其中所述混合拓扑结构聚泛素包含第一键和第二键，其中第一键和第二键彼此不同。本文还提供了结合包含第一键和第二键的混合拓扑结构聚泛素的多特异性抗体，该抗体包含对第一键特异的第一抗原识别位点和对第二键特异的第二抗原识别位点，其中第一键和第二键彼此不同。
在一些实施方案中，本文提供的抗体包含对第一键特异的第一VH/VL单元和对第二键特异的第二VH/VL单元。在一些实施方案中，抗体是杵入臼双特异性抗体；包含亮氨酸拉链的双特异性抗体；交联的抗体对；抗体Fc-异二聚体分子；双抗体；三抗体；四抗体；单链Fv二聚体；三特异性抗体；章鱼抗体；或双重作用FAb。
在一些实施方案中，第一键或第二键是K11键。
第一键或第二键是K48键。
第一键或第二键是K63键。
第一键或第二键是C-末端至N-末端的键。
第一键和第二键是：K11键和K48键；K11键和K63键；K11键和C-末端至N-末端的键；K48键和K63键；K48键和C-末端至N-末端的键；或K63键和C-末端至N-末端的键。
在一些实施方案中，抗体包含第一半抗体，其包含：a)(i)包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列的HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列的HVR-H2，(iii)包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列的HVR-H3，(iv)包含SEQ ID NO：12的氨基酸序列的HVR-L1，(v)包含EQ IDNO：13的氨基酸序列的HVR-L2，和(vi)包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列的HVR-L3；b)(i)包含SEQ ID NO：23的氨基酸序列的HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：24的氨基酸序列的HVR-H2，(iii)包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列的HVR-H3，(iv)包含SEQ ID NO：26的氨基酸序列的HVR-L1，(v)包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列的HVR-L2，和(vi)包含SEQ ID NO：28的氨基酸序列的HVR-L3；c)(i)包含SEQ ID NO：37的氨基酸序列的HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：38的氨基酸序列的HVR-H2，(iii)包含SEQ ID NO：39的氨基酸序列的HVR-H3，(iv)包含SEQ IDNO：40的氨基酸序列的HVR-L1，(v)包含SEQ ID NO：41的氨基酸序列的HVR-L2，和(vi)包含SEQ ID NO：42的氨基酸序列的HVR-L3；或d)(i)包含SEQ ID NO：51的氨基酸序列的HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：52的氨基酸序列的HVR-H2，(iii)包含SEQ ID NO：53的氨基酸序列的HVR-H3，(iv)包含SEQ ID NO：54的氨基酸序列的HVR-L1，(v)包含SEQ ID NO：55的氨基酸序列的HVR-L2，和(vi)包含SEQ ID NO：56的氨基酸序列的HVR-L3。
在一些实施方案中，抗体包含第二半抗体，其包含：a)(i)包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列的HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列的HVR-H2，(iii)包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列的HVR-H3，(iv)包含SEQ ID NO：12的氨基酸序列的HVR-L1，(v)包含SEQ IDNO：13的氨基酸序列的HVR-L2，和(vi)包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列的HVR-L3；b)(i)包含SEQ ID NO：23的氨基酸序列的HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：24的氨基酸序列的HVR-H2，(iii)包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列的HVR-H3，(iv)包含SEQ ID NO：26的氨基酸序列的HVR-L1，(v)包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列的HVR-L2，和(vi)包含SEQ ID NO：28的氨基酸序列的HVR-L3；c)(i)包含SEQ ID NO：37的氨基酸序列的HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：38的氨基酸序列的HVR-H2，(iii)包含SEQ ID NO：39的氨基酸序列的HVR-H3，(iv)包含SEQ IDNO：40的氨基酸序列的HVR-L1，(v)包含SEQ ID NO：41的氨基酸序列的HVR-L2，和(vi)包含SEQ ID NO：42的氨基酸序列的HVR-L3；或d)(i)包含SEQ ID NO：51的氨基酸序列的HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：52的氨基酸序列的HVR-H2，(iii)包含SEQ ID NO：53的氨基酸序列的HVR-H3，(iv)包含SEQ ID NO：54的氨基酸序列的HVR-L1，(v)包含SEQ ID NO：55的氨基酸序列的HVR-L2，和(vi)包含SEQ ID NO：56的氨基酸序列的HVR-L3，其中第二半抗体的HVR与第一半抗体的HVR不同。
在一些实施方案中，抗体包含第一和第二半抗体，其中：a)第一和第二半抗体之一包含(i)包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列的HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列的HVR-H2，(iii)包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列的HVR-H3，(iv)包含SEQ ID NO：12的氨基酸序列的HVR-L1，(v)包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列的HVR-L2，和(vi)包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列的HVR-L3，以及第一和第二半抗体中的另一个包含(i)包含SEQ ID NO：23的氨基酸序列的HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：24的氨基酸序列的HVR-H2，(iii)包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列的HVR-H3，(iv)包含SEQ ID NO：26的氨基酸序列的HVR-L1，(v)包含SEQ IDNO：27的氨基酸序列的HVR-L2，和(vi)包含SEQ ID NO：28的氨基酸序列的HVR-L3；b)第一和第二半抗体之一包含(i)包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列的HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列的HVR-H2，(iii)包含SEQ IDNO：11的氨基酸序列的HVR-H3，(iv)包含SEQ IDNO：12的氨基酸序列的HVR-L1，(v)包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列的HVR-L2，和(vi)包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列的HVR-L3，以及第一和第二半抗体中的另一个包含(i)包含SEQID NO：37的氨基酸序列的HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：38的氨基酸序列的HVR-H2，(iii)包含SEQ ID NO：39的氨基酸序列的HVR-H3，(iv)包含SEQ ID NO：40的氨基酸序列的HVR-L1，(v)包含SEQ ID NO：41的氨基酸序列的HVR-L2，和(vi)包含SEQ ID NO：42的氨基酸序列的HVR-L3；c)第一和第二半抗体之一包含(i)包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列的HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列的HVR-H2，(iii)包含SEQ IDNO：11的氨基酸序列的HVR-H3，(iv)包含SEQ ID NO：12的氨基酸序列的HVR-L1，(v)包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列的HVR-L2，和(vi)包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列的HVR-L3，以及第一和第二半抗体中的另一个包含(i)包含SEQ ID NO：51的氨基酸序列的HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：52的氨基酸序列的HVR-H2，(iii)包含SEQ ID NO：53的氨基酸序列的HVR-H3，(iv)包含SEQ ID NO：54的氨基酸序列的HVR-L1，(v)包含SEQ ID NO：55的氨基酸序列的HVR-L2，和(vi)包含SEQ IDNO：56的氨基酸序列的HVR-L3；d)第一和第二半抗体之一包含(i)包含SEQ ID NO：23的氨基酸序列的HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：24的氨基酸序列的HVR-H2，(iii)包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列的HVR-H3，(iv)包含SEQ ID NO：26的氨基酸序列的HVR-L1，(v)包含SEQ IDNO：27的氨基酸序列的HVR-L2，和(vi)包含SEQ ID NO：28的氨基酸序列的HVR-L3，以及第一和第二半抗体中的另一个包含(i)包含SEQ ID NO：37的氨基酸序列的HVR-H1，(ii)包含SEQID NO：38的氨基酸序列的HVR-H2，(iii)包含SEQ ID NO：39的氨基酸序列的HVR-H3，(iv)包含SEQ ID NO：40的氨基酸序列的HVR-L1，(v)包含SEQ ID NO：41的氨基酸序列的HVR-L2，(vi)包含SEQ ID NO：42的氨基酸序列的HVR-L3；e)第一和第二半抗体之一包含(i)包含SEQID NO：23的氨基酸序列的HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：24的氨基酸序列的HVR-H2，(iii)包含SEQ IDNO：25的氨基酸序列的HVR-H3，(iv)包含SEQ ID NO：26的氨基酸序列的HVR-L1，(v)包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列的HVR-L2，和(vi)包含SEQ ID NO：28的氨基酸序列的HVR-L3，以及第一和第二半抗体中的另一个包含(i)包含SEQ ID NO：51的氨基酸序列的HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：52的氨基酸序列的HVR-H2，(iii)包含SEQ ID NO：53的氨基酸序列的HVR-H3，(iv)包含SEQ ID NO：54的氨基酸序列的HVR-L1，(v)包含SEQ ID NO：55的氨基酸序列的HVR-L2，和(vi)包含SEQ ID NO：56的氨基酸序列的HVR-L3；或f)第一和第二半抗体之一包含(i)包含SEQ ID NO：37的氨基酸序列的HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：38的氨基酸序列的HVR-H2，(iii)包含SEQ ID NO：39的氨基酸序列的HVR-H3，(iv)包含SEQ ID NO：40的氨基酸序列的HVR-L1，(v)包含SEQ ID NO：41的氨基酸序列的HVR-L2，和(vi)包含SEQID NO：42的氨基酸序列的HVR-L3，以及第一和第二半抗体中的另一个包含(i)包含SEQ IDNO：51的氨基酸序列的HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：52的氨基酸序列的HVR-H2，(iii)包含SEQ ID NO：53的氨基酸序列的HVR-H3，(iv)包含SEQ ID NO：54的氨基酸序列的HVR-L1，(v)包含SEQ ID NO：55的氨基酸序列的HVR-L2，和(vi)包含SEQ ID NO：56的氨基酸序列的HVR-L3。
在一些实施方案中，抗体包含第一和第二半抗体，其中第一半抗体包含a)与SEQID NO：7具有至少约95％序列同一性的VL序列和与SEQ ID NO：8具有至少约95％序列同一性的VH序列；b)与SEQ ID NO：21具有至少约95％序列同一性的VL序列和与SEQ IDNO：22具有至少约95％序列同一性的VH序列；c)与SEQ ID NO：35具有至少约95％序列同一性的VL序列和与SEQ ID NO：36具有至少约95％序列同一性的VH序列；或d)与SEQ ID NO：49具有至少约95％序列同一性的VL序列和与SEQ ID NO：50具有至少约95％序列同一性的VH序列。
在一些实施方案中，抗体包含第一和第二半抗体，其中第二半抗体包含a)与SEQID NO：7具有至少约95％序列同一性的VL序列和与SEQ ID NO：8具有至少约95％序列同一性的VH序列；b)与SEQ ID NO：21具有至少约95％序列同一性的VL序列和与SEQ IDNO：22具有至少约95％序列同一性的VH序列；c)与SEQ ID NO：35具有至少约95％序列同一性的VL序列和与SEQ ID NO：36具有至少约95％序列同一性的VH序列；或d)与SEQ ID NO：49具有至少约95％序列同一性的VL序列和与SEQ ID NO：50具有至少约95％序列同一性的VH序列；其中第二半抗体的VL和VH序列与第一半抗体的VL和VH序列不同。
在一些实施方案中，抗体包含第一和第二半抗体，其中：a)第一和第二半抗体之一包含与SEQ ID NO：7具有至少约95％序列同一性的VL序列和与SEQ ID NO：8具有至少约95％序列同一性的VH序列，并且第一和第二半抗体中的另一个包含与SEQ ID NO:21具有至少约95％序列同一性的VL序列和与SEQ ID NO：22具有至少约95％序列同一性的VH序列；b)第一和第二半抗体之一包含与SEQ ID NO：7具有至少约95％序列同一性的VL序列和与SEQID NO：8具有至少约95％序列同一性的VH序列，并且第一和第二半抗体中的另一个包含与SEQ ID NO：35具有至少约95％序列同一性的VL序列和与SEQ IDNO：36具有至少约95％序列同一性的VH序列；c)第一和第二半抗体之一包含与SEQ ID NO：7具有至少约95％序列同一性的VL序列和与SEQ ID NO：8具有至少约95％序列同一性的VH序列，并且第一和第二半抗体中的另一个包含与SEQ ID NO：49具有至少约95％序列同一性的VL序列和与SEQ ID NO：50具有至少约95％序列同一性的VH序列；d)第一和第二半抗体之一包含与SEQ ID NO：21具有至少约95％序列同一性的VL序列和与SEQ ID NO：22具有至少约95％序列同一性的VH序列，并且第一和第二半抗体中的另一个包含与SEQ ID NO：35具有至少约95％序列同一性的VL序列和与SEQ ID NO：36具有至少约95％序列同一性的VH序列；e)第一和第二半抗体之一包含与SEQ ID NO：21具有至少约95％序列同一性的VL序列和与SEQ ID NO：22具有至少约95％序列同一性的VH序列，并且第一和第二半抗体中的另一个包含与SEQ ID NO：49具有至少约95％序列同一性的VL序列和与SEQ ID NO：50具有至少约95％序列同一性的VH序列；或f)第一和第二半抗体之一包含与SEQ ID NO：35具有至少约95％序列同一性的VL序列和与SEQ ID NO：36具有至少约95％序列同一性的VH序列，并且第一和第二半抗体中的另一个包含与SEQ ID NO：49具有至少约95％序列同一性的VL序列和与SEQ ID NO：50具有至少约95％序列同一性的VH序列。
在一些实施方案中，抗体包含第一和第二半抗体，其中第一半抗体包含a)SEQ IDNO：7的VL序列和SEQ ID NO：8的VH序列；b)SEQ ID NO：21的VL序列和SEQ ID NO：22的VH序列；c)SEQ ID NO：35的VL序列和SEQ ID NO：36的VH序列；或d)SEQ ID NO：49的VL序列和SEQID NO：50的VH序列。
在一些实施方案中，抗体包含第一和第二半抗体，其中第二半抗体包含a)SEQ IDNO：7的VL序列和SEQ ID NO：8的VH序列；b)SEQ ID NO：21的VL序列和SEQ ID NO：22的VH序列；c)SEQ ID NO：35的VL序列和SEQ ID NO：36的VH序列；或d)SEQ ID NO：49的VL序列和SEQID NO：50的VH序列；其中第二半抗体的VL和VH序列与第一半抗体的VL和VH序列不同。
在一些实施方案中，抗体包含第一和第二半抗体，其中：a)第一和第二半抗体之一包含SEQ ID NO：7的VL序列和SEQ ID NO：8的VH序列，并且第一和第二半抗体中的另一个包含SEQ ID NO：21的VL序列和SEQ ID NO：22的VH序列；b)第一和第二半抗体之一包含SEQ IDNO：7的VL序列和SEQ ID NO：8的VH序列，并且第一和第二半抗体中的另一个包含SEQ IDNO：35的VL序列和SEQ IDNO：36的VH序列；c)第一和第二半抗体之一包含SEQ ID NO：7的VL序列和SEQ ID NO：8的VH序列，并且第一和第二半抗体中的另一个包含SEQ ID NO：49的VL序列和SEQ ID NO：50的VH序列；d)第一和第二半抗体之一包含SEQ ID NO：21的VL序列和SEQ ID NO：22的VH序列，并且第一和第二半抗体中的另一个包含SEQ ID NO：35的VL序列和SEQ ID NO：36的VH序列；e)第一和第二半抗体之一包含SEQ ID NO：21的VL序列和SEQ IDNO：22的VH序列，并且第一和第二半抗体中的另一个包含SEQ ID NO：49的VL序列和SEQ IDNO：50的VH序列；或f)第一和第二半抗体之一包含SEQ IDNO：35的VL序列和SEQ ID NO：36的VH序列，并且第一和第二半抗体中的另一个包含SEQ ID NO：49的VL序列和SEQ ID NO：50的VH序列。
在一些实施方案中，抗体是单克隆抗体。在一些实施方案中，抗体是小鼠、兔、人、人源化或嵌合抗体。在一些实施方案中，抗体是IgG抗体。在一些实施方案中，抗体是IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3或IgG4抗体。在一些实施方案中，抗体是IgG1或IgG4抗体。
在一些实施方案中，抗体包含第一和第二半抗体，其中所述第一半抗体包含含有杵突变的第一重链恒定区，所述第二半抗体包含含有臼突变的第二重链恒定区；或者，其中所述第一半抗体包含含有臼突变的第一重链恒定区，所述第二半抗体包含含有杵突变的第二重链恒定区。
在一些实施方案中，抗体是IgG1抗体，并且其中杵突变包含T366W突变。在一些实施方案中，抗体是IgG1抗体，并且其中臼突变包含选自T366S、L368A和Y407V中的至少一种、至少两种或三种突变。在一些实施方案中，抗体是IgG4抗体，并且其中杵突变包含T366W突变。在一些实施方案中，抗体是IgG4抗体，并且其中臼突变包含选自T366S、L368A和Y407V突变中的至少一种、至少两种或三种突变。
在一些实施方案中，抗体包含第一和第二半抗体，其中第一半抗体包含a)与SEQID NO：2具有至少约95％序列同一性的轻链序列；b)与SEQ ID NO：16具有至少约95％序列同一性的轻链序列；c)与SEQ ID NO：30具有至少约95％序列同一性的轻链序列；或d)与SEQID NO：44具有至少约95％序列同一性的轻链序列。
在一些实施方案中，抗体包含第一和第二半抗体，其中第一半抗体包含a)与SEQID NO：4具有至少约95％序列同一性的重链序列；b)与SEQ ID NO：18具有至少约95％序列同一性的重链序列；c)与SEQ ID NO：32具有至少约95％序列同一性的重链序列；或d)与SEQID NO：46具有至少约95％序列同一性的重链序列，任选地其中一个或多个重链缺失C-末端赖氨酸。
在一些实施方案中，抗体包含第一和第二半抗体，其中第一半抗体包含a)与SEQID NO：2具有至少约95％序列同一性的轻链序列和与SEQ ID NO：4具有至少约95％序列同一性的重链序列；b)与SEQ ID NO：16具有至少约95％序列同一性的轻链序列和与SEQIDNO：18具有至少约95％序列同一性的重链序列；c)与SEQ ID NO：30具有至少约95％序列同一性的轻链序列和与SEQ ID NO：32具有至少约95％序列同一性的重链序列；或d)与SEQID NO：44具有至少约95％序列同一性的轻链序列和与SEQ ID NO：46具有至少约95％序列同一性的重链序列，任选地其中一个或多个重链缺失C-末端赖氨酸。
在一些实施方案中，抗体包含第一和第二半抗体，其中第一半抗体包含a)与SEQID NO：6具有至少约95％序列同一性的重链序列；b)与SEQ ID NO：20具有至少约95％序列同一性的重链序列；c)与SEQ ID NO：34具有至少约95％序列同一性的重链序列；或d)与SEQID NO：48具有至少约95％序列同一性的重链序列，任选地其中一个或多个重链缺失C-末端赖氨酸。
在一些实施方案中，抗体包含第一和第二半抗体，其中第一半抗体包含a)与SEQID NO：2具有至少约95％序列同一性的轻链序列和与SEQ ID NO：6具有至少约95％序列同一性的重链序列；b)与SEQ ID NO：16具有至少约95％序列同一性的轻链序列和与SEQIDNO：20具有至少约95％序列同一性的重链序列；c)与SEQ ID NO：30具有至少约95％序列同一性的轻链序列和与SEQ ID NO：34具有至少约95％序列同一性的重链序列；或d)与SEQID NO：44具有至少约95％序列同一性的轻链序列和与SEQ ID NO：48具有至少约95％序列同一性的重链序列，任选地其中一个或多个重链缺失C-末端赖氨酸。
在一些实施方案中，抗体包含第一和第二半抗体，其中第二半抗体包含a)与SEQID NO：2具有至少约95％序列同一性的轻链序列；b)与SEQ ID NO：16具有至少约95％序列同一性的轻链序列；c)与SEQ ID NO：30具有至少约95％序列同一性的轻链序列；或d)与SEQIDNO：44具有至少约95％序列同一性的轻链序列；其中第二半抗体的轻链和重链序列与第一半抗体的轻链和重链序列不同。
在一些实施方案中，抗体包含第一和第二半抗体，其中第二半抗体包含a)与SEQID NO：4具有至少约95％序列同一性的重链序列；b)与SEQ ID NO：18具有至少约95％序列同一性的重链序列；c)与SEQ ID NO：32具有至少约95％序列同一性的重链序列；或d)与SEQIDNO：46具有至少约95％序列同一性的重链序列；其中第二半抗体的轻链和重链序列与第一半抗体的轻链和重链序列不同，任选地其中一个或多个重链缺失C-末端赖氨酸。
在一些实施方案中，抗体包含第一和第二半抗体，其中第二半抗体包含a)与SEQID NO：2具有至少约95％序列同一性的轻链序列和与SEQ ID NO：4具有至少约95％序列同一性的重链序列；b)与SEQ ID NO：16具有至少约95％序列同一性的轻链序列和与SEQIDNO：18具有至少约95％序列同一性的重链序列；c)与SEQ ID NO：30具有至少约95％序列同一性的轻链序列和与SEQ ID NO：32具有至少约95％序列同一性的重链序列；或d)与SEQID NO：44具有至少约95％序列同一性的轻链序列和与SEQ ID NO：46具有至少约95％序列同一性的重链序列；其中第二半抗体的轻链和重链序列与第一半抗体的轻链和重链序列不同，任选地其中一个或多个重链缺失C-末端赖氨酸。
在一些实施方案中，抗体包含第一和第二半抗体，其中第二半抗体包含a)与SEQID NO：6具有至少约95％序列同一性的重链序列；b)与SEQ ID NO：20具有至少约95％序列同一性的重链序列；c)与SEQ ID NO：34具有至少约95％序列同一性的重链序列；或d)与SEQIDNO：48具有至少约95％序列同一性的重链序列；其中第二半抗体的轻链和重链序列与第一半抗体的轻链和重链序列不同，任选地其中一个或多个重链缺失C-末端赖氨酸。
在一些实施方案中，抗体包含第一和第二半抗体，其中第二半抗体包含a)与SEQID NO：2具有至少约95％序列同一性的轻链序列和与SEQ ID NO：6具有至少约95％序列同一性的重链序列；b)与SEQ ID NO：16具有至少约95％序列同一性的轻链序列和与SEQIDNO：20具有至少约95％序列同一性的重链序列；c)与SEQ ID NO：30具有至少约95％序列同一性的轻链序列和与SEQ ID NO：34具有至少约95％序列同一性的重链序列；或d)与SEQID NO：44具有至少约95％序列同一性的轻链序列和与SEQ ID NO：48具有至少约95％序列同一性的重链序列；其中第二半抗体的轻链和重链序列与第一半抗体的轻链和重链序列不同，任选地其中一个或多个重链缺失C-末端赖氨酸。
在一些实施方案中，抗体包含第一和第二半抗体，其中：a)第一和第二半抗体之一包含与SEQ ID NO：2具有至少约95％序列同一性的轻链序列和与SEQ ID NO：4具有至少约95％序列同一性的重链序列，并且第一和第二半抗体中的另一个包含与SEQ ID NO:16具有至少约95％序列同一性的轻链序列和与SEQ ID NO：20具有至少约95％序列同一性的重链序列；b)第一和第二半抗体之一包含与SEQ ID NO：2具有至少约95％序列同一性的轻链序列和与SEQ ID NO：4具有至少约95％序列同一性的重链序列，并且第一和第二半抗体中的另一个包含与SEQ ID NO：30具有至少约95％序列同一性的轻链序列和与SEQ ID NO：34具有至少约95％序列同一性的重链序列；c)第一和第二半抗体之一包含与SEQ ID NO：2具有至少约95％序列同一性的轻链序列和与SEQ ID NO：4具有至少约95％序列同一性的重链序列，并且第一和第二半抗体中的另一个包含与SEQ ID NO：44具有至少约95％序列同一性的轻链序列和与SEQ ID NO：48具有至少约95％序列同一性的重链序列；d)第一和第二半抗体之一包含与SEQ ID NO：2具有至少约95％序列同一性的轻链序列和与SEQ ID NO：6具有至少约95％序列同一性的重链序列，并且第一和第二半抗体中的另一个包含与SEQ ID NO：16具有至少约95％序列同一性的轻链序列和与SEQ ID NO：18具有至少约95％序列同一性的重链序列；e)第一和第二半抗体之一包含与SEQ ID NO：2具有至少约95％序列同一性的轻链序列和与SEQ ID NO：6具有至少约95％序列同一性的重链序列，并且第一和第二半抗体中的另一个包含与SEQ ID NO:30具有至少约95％序列同一性的轻链序列和与SEQ ID NO：32具有至少约95％序列同一性的重链序列；f)第一和第二半抗体之一包含与SEQ ID NO：2具有至少约95％序列同一性的轻链序列和与SEQ ID NO：6具有至少约95％序列同一性的重链序列，并且第一和第二半抗体中的另一个包含与SEQ ID NO：44具有至少约95％序列同一性的轻链序列和与SEQ ID NO：46具有至少约95％序列同一性的重链序列；g)第一和第二半抗体之一包含与SEQ IDNO：16具有至少约95％序列同一性的轻链序列和与SEQ ID NO：18具有至少约95％序列同一性的重链序列，并且第一和第二半抗体中的另一个包含与SEQ IDNO：30具有至少约95％序列同一性的轻链序列和与SEQ ID NO：34具有至少约95％序列同一性的重链序列；h)第一和第二半抗体之一包含与SEQ ID NO：16具有至少约95％序列同一性的轻链序列和与SEQ ID NO：18具有至少约95％序列同一性的重链序列，并且第一和第二半抗体中的另一个包含与SEQ ID NO：44具有至少约95％序列同一性的轻链序列和与SEQ IDNO：48具有至少约95％序列同一性的重链序列；i)第一和第二半抗体之一包含与SEQ IDNO：30具有至少约95％序列同一性的轻链序列和与SEQ ID NO：32具有至少约95％序列同一性的重链序列，并且第一和第二半抗体中的另一个包含与SEQ ID NO：44具有至少约95％序列同一性的轻链序列和与SEQ IDNO:48具有至少约95％序列同一性的重链序列；j)第一和第二半抗体之一包含与SEQ ID NO：16具有至少约95％序列同一性的轻链序列和与SEQ IDNO：20具有至少约95％序列同一性的重链序列，并且第一和第二半抗体中的另一个包含与SEQ ID NO：30具有至少约95％序列同一性的轻链序列和与SEQ ID NO：32具有至少约95％序列同一性的重链序列；k)第一和第二半抗体之一包含与SEQ ID NO：16具有至少约95％序列同一性的轻链序列和与SEQ ID NO：20具有至少约95％序列同一性的重链序列，并且第一和第二半抗体中的另一个包含与SEQ ID NO：44具有至少约95％序列同一性的轻链序列和与SEQ ID NO：46具有至少约95％序列同一性的重链序列；或l)第一和第二半抗体之一包含与SEQ ID NO：30具有至少约95％序列同一性的轻链序列和与SEQ IDNO：34具有至少约95％序列同一性的重链序列，并且第一和第二半抗体中的另一个包含与SEQ ID NO:44具有至少约95％序列同一性的轻链序列和与SEQ ID NO：46具有至少约95％序列同一性的重链序列，任选地其中一个或多个重链缺少C-末端赖氨酸。
在一些实施方案中，抗体包含第一和第二半抗体，其中第一半抗体包含a)SEQ IDNO：2的轻链序列；b)SEQ ID NO：16的轻链序列；c)SEQ ID NO：30的轻链序列；或d)SEQ IDNO：44的轻链序列。
在一些实施方案中，抗体包含第一和第二半抗体，其中第一半抗体包含a)SEQ IDNO：4的重链序列；b)SEQ ID NO：18的重链序列；c)SEQ ID NO：32的重链序列；或d)SEQ IDNO：46的重链序列，任选地其中一个或多个重链缺失C-末端赖氨酸。
在一些实施方案中，抗体包含第一和第二半抗体，其中第一半抗体包含a)SEQ IDNO：2的轻链序列和SEQ ID NO：4的重链序列；b)SEQ ID NO：16的轻链序列和SEQ ID NO：18的重链序列；c)SEQ ID NO：30的轻链序列和SEQ ID NO：32的重链序列；或d)SEQ ID NO：44的轻链序列和SEQ ID NO：46的重链序列，任选地其中一个或多个重链缺失C-末端赖氨酸。
在一些实施方案中，抗体包含第一和第二半抗体，其中第一半抗体包含a)SEQ IDNO：6的重链序列；b)SEQ ID NO：20的重链序列；c)SEQ ID NO：34的重链序列；或d)SEQ IDNO：48的重链序列，任选地其中一个或多个重链缺失C-末端赖氨酸。
在一些实施方案中，抗体包含第一和第二半抗体，其中第一半抗体包含a)SEQ IDNO：2的轻链序列和SEQ ID NO：6的重链序列；b)SEQ ID NO：16的轻链序列和SEQ ID NO：20的重链序列；c)SEQ ID NO：30的轻链序列和SEQ ID NO：34的重链序列；或d)SEQ ID NO：44的轻链序列和SEQ ID NO：48的重链序列，任选地其中一个或多个重链缺失C-末端赖氨酸。
在一些实施方案中，抗体包含第一和第二半抗体，其中第二半抗体包含a)SEQ IDNO：2的轻链序列；b)SEQ ID NO：16的轻链序列；c)SEQ ID NO：30的轻链序列；或d)SEQ IDNO：44的轻链序列；其中第二半抗体的轻链和重链序列与第一半抗体的轻链和重链序列不同，任选地其中一个或多个重链缺失C-末端赖氨酸。
在一些实施方案中，抗体包含第一和第二半抗体，其中第二半抗体包含a)SEQ IDNO：4的重链序列；b)SEQ ID NO：18的重链序列；c)SEQ ID NO：32的重链序列；或d)SEQ IDNO：46的重链序列；其中第二半抗体的轻链和重链序列与第一半抗体的轻链和重链序列不同，任选地其中一个或多个重链缺失C-末端赖氨酸。
在一些实施方案中，抗体包含第一和第二半抗体，其中第二半抗体包含a)SEQ IDNO：2的轻链序列和SEQ ID NO：4的重链序列；b)SEQ ID NO：16的轻链序列和SEQ ID NO：18的重链序列；c)SEQ ID NO：30的轻链序列和SEQ ID NO：32的重链序列；或d)SEQ ID NO：44的轻链序列和SEQ ID NO：46的重链序列；其中第二半抗体的轻链和重链序列与第一半抗体的轻链和重链序列不同，任选地其中一个或多个重链缺失C-末端赖氨酸。
在一些实施方案中，抗体包含第一和第二半抗体，其中第二半抗体包含a)SEQ IDNO：6的重链序列；b)SEQ ID NO：20的重链序列；c)SEQ ID NO：34的重链序列；或d)SEQ IDNO：48的重链序列；其中第二半抗体的轻链和重链序列与第一半抗体的轻链和重链序列不同，任选地其中一个或多个重链缺失C-末端赖氨酸。
在一些实施方案中，抗体包含第一和第二半抗体，其中第二半抗体包含a)SEQ IDNO：2的轻链序列和SEQ ID NO：6的重链序列；b)SEQ ID NO：16的轻链序列和SEQ ID NO：20的重链序列；c)SEQ ID NO：30的轻链序列和SEQ ID NO：34的重链序列；或d)SEQ ID NO：44的轻链序列和SEQ ID NO：48的重链序列；其中第二半抗体的轻链和重链序列与第一半抗体的轻链和重链序列不同。
在一些实施方案中，抗体包含第一和第二半抗体，其中：a)第一半抗体包含SEQ IDNO：2的轻链序列和SEQ ID NO：4的重链序列，第二半抗体包含SEQ ID NO：16的轻链序列和SEQ ID NO：20的重链序列；b)第一半抗体包含SEQ ID NO：2的轻链序列和SEQ IDNO：4的重链序列，第二半抗体包含SEQ ID NO：30的轻链序列和SEQ ID NO：34的重链序列；c)第一半抗体包含SEQ ID NO：2的轻链序列和SEQ ID NO：4的重链序列，第二半抗体包含SEQ ID NO：44的轻链序列和SEQ ID NO：48的重链序列；d)第一半抗体包含SEQ IDNO：2的轻链序列和SEQ ID NO：6的重链序列，第二半抗体包含SEQ ID NO：16的轻链序列和SEQ ID NO：18的重链序列；e)第一半抗体包含SEQ ID NO：2的轻链序列和SEQ ID NO：6的重链序列，第二半抗体包含SEQ ID NO：30的轻链序列和SEQ ID NO：32的重链序列；f)第一半抗体包含SEQ IDNO：2的轻链序列和SEQ ID NO：6的重链序列，第二半抗体包含SEQ ID NO：44的轻链序列和SEQ ID NO：46的重链序列；g)第一半抗体包含SEQ ID NO：16的轻链序列和SEQ ID NO：18的重链序列，第二半抗体包含SEQ ID NO：30的轻链序列和SEQ ID NO：34的重链序列；h)第一半抗体包含SEQ ID NO：16的轻链序列和SEQ ID NO：18的重链序列，第二半抗体包含SEQ IDNO：44的轻链序列和SEQ ID NO：48的重链序列；i)第一半抗体包含SEQ ID NO：30的轻链序列和SEQ ID NO：32的重链序列，第二半抗体包含SEQ ID NO：44的轻链序列和SEQ ID NO：48的重链序列；j)第一半抗体包含SEQ ID NO：16的轻链序列和SEQ ID NO：20的重链序列，第二半抗体包含SEQ ID NO：30的轻链序列和SEQ ID NO：32的重链序列；k)第一半抗体包含SEQ ID NO：16的轻链序列和SEQ ID NO：20的重链序列，第二半抗体包含SEQ ID NO：44的轻链序列和SEQ IDNO：46的重链序列；或l)第一半抗体包含SEQ ID NO：30的轻链序列和SEQID NO：34的重链序列，第二半抗体包含SEQ ID NO：44的轻链序列和SEQ ID NO：46的重链序列；任选地，其中一个或多个重链缺失C-末端赖氨酸。
在一些实施方案中，抗体包含第一和第二半抗体，其中第一半抗体包含SEQ IDNO：2的轻链序列和SEQ ID NO：4的重链序列，并且第二半抗体包含SEQ ID NO：16的轻链序列和SEQ ID NO：20的重链序列，任选地其中一个或多个重链缺失C-末端赖氨酸。
在一些实施方案中，抗体包含第一和第二半抗体，其中第一半抗体包含SEQ IDNO：2的轻链序列和SEQ ID NO：4的重链序列，并且第二半抗体包含SEQ ID NO：30的轻链序列和SEQ ID NO：34的重链序列，任选地其中一个或多个重链缺失C-末端赖氨酸。
在一些实施方案中，抗体包含第一和第二半抗体，其中第一半抗体包含SEQ IDNO：2的轻链序列和SEQ ID NO：4的重链序列，并且第二半抗体包含SEQ ID NO：44的轻链序列和SEQ ID NO：48的重链序列，任选地其中一个或多个重链缺失C-末端赖氨酸。
在一些实施方案中，抗体包含第一和第二半抗体，其中第一半抗体包含SEQ IDNO：2的轻链序列和SEQ ID NO：6的重链序列，并且第二半抗体包含SEQ ID NO：16的轻链序列和SEQ ID NO：18的重链序列，任选地其中一个或多个重链缺失C-末端赖氨酸。
在一些实施方案中，抗体包含第一和第二半抗体，其中第一半抗体包含SEQ IDNO：2的轻链序列和SEQ ID NO：6的重链序列，并且第二半抗体包含SEQ ID NO：30的轻链序列和SEQ ID NO：32的重链序列，任选地其中一个或多个重链缺失C-末端赖氨酸。
在一些实施方案中，抗体包含第一和第二半抗体，其中第一半抗体包含SEQ IDNO：2的轻链序列和SEQ ID NO：6的重链序列，并且第二半抗体包含SEQ ID NO：44的轻链序列和SEQ ID NO：46的重链序列，任选地其中一个或多个重链缺失C-末端赖氨酸。
在一些实施方案中，抗体包含第一和第二半抗体，其中第一半抗体包含SEQ IDNO：16的轻链序列和SEQ ID NO：18的重链序列，并且第二半抗体包含SEQ ID NO：30的轻链序列和SEQ ID NO：34的重链序列，任选地其中一个或多个重链缺失C-末端赖氨酸。
在一些实施方案中，抗体包含第一和第二半抗体，其中第一半抗体包含SEQ IDNO：16的轻链序列和SEQ ID NO：18的重链序列，并且第二半抗体包含SEQ ID NO：44的轻链序列和SEQ ID NO：48的重链序列，任选地其中一个或多个重链缺失C-末端赖氨酸。
在一些实施方案中，抗体包含第一和第二半抗体，其中第一半抗体包含SEQ IDNO：30的轻链序列和SEQ ID NO：32的重链序列，并且第二半抗体包含SEQ ID NO：44的轻链序列和SEQ ID NO：48的重链序列，任选地其中一个或多个重链缺失C-末端赖氨酸。
在一些实施方案中，抗体包含第一和第二半抗体，其中第一半抗体包含SEQ IDNO：16的轻链序列和SEQ ID NO：20的重链序列，并且第二半抗体包含SEQ ID NO：30的轻链序列和SEQ ID NO：32的重链序列，任选地其中一个或多个重链缺失C-末端赖氨酸。
在一些实施方案中，抗体包含第一和第二半抗体，其中第一半抗体包含SEQ IDNO：16的轻链序列和SEQ ID NO：20的重链序列，并且第二半抗体包含SEQ ID NO：44的轻链序列和SEQ ID NO：46的重链序列，任选地其中一个或多个重链缺失C-末端赖氨酸。
在一些实施方案中，抗体包含第一和第二半抗体，其中第一半抗体包含SEQ IDNO：30的轻链序列和SEQ ID NO：34的重链序列，并且第二半抗体包含SEQ ID NO：44的轻链序列和SEQ ID NO：46的重链序列，任选地其中一个或多个重链缺失C-末端赖氨酸。
本文还提供了与本文公开的抗体竞争结合混合拓扑结构聚泛素的抗体。本文还提供了与本文公开的抗体结合混合拓扑结构聚泛素的相同表位的抗体。
在一些实施方案中，本文提供的抗体是双特异性抗体。在一些实施方案中，抗体是双抗体、三抗体或四抗体。
在一些实施方案中，抗体与标记缀合。在一些实施方案中，标记是荧光标记、酶标记或发色标记。在一些实施方案中，标记是放射性同位素，其任选地是正电子发射体，任选为89Zr。
本文还提供了包含本文公开的抗体的组合物，其中所述组合物基本上不含单特异性抗体、未装配的半抗体，或单特异性抗体和未装配的半抗体。
本文还提供了免疫缀合物，其包含本文公开的抗体和细胞毒性剂。
本文还提供了药物制剂，其包含药学上可接受的载体和本文公开的抗体或免疫缀合物中的至少一种。在一些实施方案中，组合物基本上不含单特异性抗体、未装配的半抗体、或单特异性抗体和未装配的半抗体。
本文还提供了分离的核酸，其编码：本文公开的抗体；本文公开的抗体的第一半抗体；或本文公开的抗体的第二半抗体。本文还提供了包含本文公开的核酸的宿主细胞。本文还提供了产生抗体或半抗体的方法，其包括培养本文公开的宿主细胞，从而产生抗体或半抗体。
本文还提供了制备本文公开的抗体的方法，包括从第一半抗体和第二半抗体形成抗体。
本文还提供了检测生物样品中混合拓扑结构聚泛素的方法，其包括在允许抗体与混合拓扑结构聚泛素结合的条件下使生物样品与本文公开的抗体接触，并检测生物样品中抗体和混合拓扑结构聚泛素之间是否形成复合物。在一些实施方案中，混合拓扑结构聚泛素与非泛素多肽共价连接。在一些实施方案中，混合拓扑结构聚泛素是分支的。在一些实施方案中，混合拓扑结构聚泛素是非分支的。在一些实施方案中，混合拓扑结构聚泛素包含第一键和不同于第一键的第二键，并且第一和第二键彼此独立地为K11、K48、K63或C-末端至N-末端的键。在一些实施方案中，混合拓扑结构聚泛素包含K11键和不同于K11键的第二键。在一些实施方案中，混合拓扑结构聚泛素包含K48键和不同于K48键的第二键。在一些实施方案中，混合拓扑结构聚泛素包含K63键和不同于K63键的第二键。在一些实施方案中，混合拓扑结构聚泛素包含C-末端至N-末端的键和不同于C-末端至N-末端的键的第二键。在一些实施方案中，其中所述混合拓扑结构聚泛素包含：K11键和K48键；K11键和K63键；K11键和C-末端至N-末端的键；K48键和K63键；K48键和C-末端至N-末端的键；或K63键和C-末端至N-末端的键。
本文还提供了检测生物样品中聚泛素化蛋白的方法，所述聚泛素化蛋白质在两个或更多个位置上用至少第一和第二聚泛素聚泛素化，其中第一和第二聚泛素具有不同的键，所述方法包括在允许抗体与聚泛素化蛋白质结合的条件下，使生物样品与权利要求1至69中任一项的抗体接触，和检测生物样品中抗体与聚泛素化蛋白质之间是否形成复合物。在一些实施方案中，第一和第二聚泛素分别包含：K11键和不同于K11键的第二键；K48键和不同于K48键的第二键；K63键和不同于K63键的第二键；C-末端至N-末端的键和不同于C-末端至N-末端的键的第二键；K11键和K48键；K11键和K63键；K11键和C-末端至N-末端的键；K48键和K63键；K48键和C-末端至N-末端的键；或K63键和C-末端至N-末端的键。
附图说明
图1a-d双特异性抗K11/K48聚泛素键特异性抗体的工程化、纯化和表征。a，在CHO细胞中分别重组表达杵和臼半抗体，并各自亲和纯化，然后在体外装配。b，纯化后杵和臼半抗体和装配的双特异性抗体的SDS-PAGE分析。在不存在(-)或存在(+)DTT的情况下运行样品。HL标记表示半抗体种类，H2L2标记表示全抗体。在还原的样品中，指明了重链(H)和轻链(L)。c，抗K11杵和抗K48臼半抗体和装配的抗K11/K48双特异性抗体的分析性尺寸排阻分析。d，纯化的抗K11/K48双特异性抗体的质谱分析。上组是没有羧肽酶B(CPB)的情况，下组是用CPB消化后。
图2a-c。半抗体和对照双特异性抗体的表征。a，抗K11臼和抗gD杵半抗体和装配的抗K11/gD和抗K48/gD双特异性对照抗体的分析性尺寸排阻分析。b，亲和纯化的抗K11杵、抗K11臼、抗K48臼和抗gD杵半抗体的质谱分析。对于每种半抗体，上组是不存在羧肽酶B(CPB)的情况，下组是用CPB消化后。上组中的箭头表示CPB处理后消失的，比抗K11杵、抗K11臼和抗gD杵半抗体多的+128Da，表明由于重链羧基末端赖氨酸仍然连接抗体的部分。c，纯化的抗K11/gD和抗K48/gD对照双特异性抗体的质谱分析。每种双特异性的上组是不存在羧肽酶B(CPB)的情况，下组是用CPB消化后。
某些实施方案的详细描述
I.定义
如本文所用，VH是指重链可变结构域，VL是指轻链可变结构域。
用于本文目的的“受体人框架”是包含衍生自人免疫球蛋白框架或人共有框架的VL框架或VH框架的氨基酸序列的框架，如下文所定义。“衍生自”人免疫球蛋白框架或人共有框架的受体人框架可以包含与其相同的氨基酸序列，或者可以包含氨基酸序列的变化。在一些实施方案中，氨基酸变化的数目为10个或更少、9个或更少、8个或更少、7个或更少、6个或更少、5个或更少、4个或更少、3个或更少、或2个或更少。在一些实施方案中，VL受体人框架在序列上与VL人免疫球蛋白框架序列或人共有框架序列相同。
如本文所用，“约”是指比所述值多或少10％的值，其给出与所述值功能等同的结果，或四舍五入到所述值。
“亲和力”是指分子(例如抗体)的单个结合位点与其结合配偶体(例如抗原)之间的非共价相互作用总和的强度。除非另有说明，否则如本文所用，“结合亲和力”是指内在结合亲和力，其反映结合对的成员(例如，抗体和抗原)之间1：1的相互作用。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可由解离常数(Kd)表示。可以通过本领域已知的常规方法测量亲和力，包括本文所述的那些。用于测量结合亲和力的具体说明性和示例性实施方案如下描述。
“亲合性”是指分子(例如，抗体)与其结合配偶体(例如，包含一种或多种抗原的靶分子)之间的非共价相互作用总和的强度。分子X对其配偶体Y的亲合性通常可由解离常数(Kd)表示。双特异性抗体对于包含双特异性抗体的两个抗原结合位点都识别的表位的结合配偶体，通常比对于包含任一个单独表位的结合配偶体具有更高的亲合性。亲合性可以通过本领域已知的常规方法测量，包括本文所述的那些。用于测量结合亲合性的具体说明性和示例性实施方案如下描述。术语“功能亲和力”有时在本领域中用于指亲合性。
“亲和力成熟的”抗体是指在一个或多个高变区(HVR)中具有一个或多个改变的抗体，与不具有这种改变的亲本抗体相比，这种改变导致抗体对抗原亲和力的改善。
术语“抗体”在本文中以最广泛的含义使用并且包括各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗体片段，只要它们表现出所需的抗原结合活性即可。如本文所用的术语“多特异性抗体”是指包含具有多表位特异性的抗原结合结构域的抗体(即，能够结合一个分子上的两个或更多个不同表位或能够结合两个或更多个不同分子上的表位)。
如本文所用的“激动剂抗体”是模拟目标多肽的至少一种功能活性的抗体。
“拮抗剂抗体”或“阻断抗体”是抑制或降低其特异性结合的抗原的生物活性的抗体。某些阻断抗体或拮抗剂抗体基本上或完全抑制抗原的生物活性。
本文使用的术语“抗体药物缀合物”(ADC)等同于术语“免疫缀合物”。
“抗体片段”是指不同于完整抗体的分子，其包含完整抗体的一部分并且结合完整抗体所结合的抗原。抗体片段的实例包括但不限于Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2；双抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如scFv)；和由抗体片段形成的多特异性抗体。
与参照抗体“结合相同表位的抗体”是指在竞争测定法中阻断50％或更多地参照抗体与其抗原结合的抗体，反过来，参照抗体在竞争测定法中阻断50％或更多地该抗体与其抗原结合。本文提供了示例性的竞争测定法。
术语“抗混合拓扑结构聚泛素抗体”和“结合混合拓扑结构聚泛素的抗体”是指能够以足够的亲合性结合混合拓扑结构连接的聚泛素的抗体，使得抗体可用作靶向混合拓扑结构聚泛素的诊断和/或治疗剂。在一些实施方案中，抗混合拓扑结构聚泛素抗体与不相关的、非混合拓扑结构连接的聚泛素蛋白质的结合程度比抗体与混合拓扑结构聚泛素的结合低约10％，如，例如通过放射免疫测定法(RIA)所测量的。在某些实施方案中，结合混合拓扑结构聚泛素的抗体具有≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM或≤0.001nM(例如，10-8M或更低，例如从10-8M至10-13M，例如从10-9M至10-13M)的解离常数(Kd)。在某些实施方案中，抗混合拓扑结构聚泛素抗体结合混合拓扑结构聚泛素的表位，该表位在来自不同物种的混合拓扑结构聚泛素中是保守的。
如本文所用，术语“抗聚泛素抗体”是指能够特异性结合聚泛素分子的抗体。
如本文所用，术语“抗泛素抗体”和“抗单泛素抗体”可互换使用，并且是指能够特异性结合泛素分子的抗体。
术语“癌症”和“癌性”是指或描述哺乳动物中通常以不受调节的细胞生长/增殖为特征的生理状况。癌症的实例包括但不限于癌、淋巴瘤(例如，霍奇金和非霍奇金淋巴瘤)、胚细胞瘤、肉瘤和白血病。这类癌症更具体的例子包括鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌、肺鳞状细胞癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃肠癌、胰腺癌、神经胶质瘤、***、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝癌、乳腺癌、结肠癌、结直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、肝癌、***癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌、白血病和其他淋巴组织增生性疾病、以及各种类型的头颈癌。
术语“嵌合”抗体是指其中重链和/或轻链的一部分衍生自特定来源或物种，而重链和/或轻链的其余部分衍生自不同来源或物种的抗体。
抗体的“类别”是指其重链具有的恒定结构域或恒定区的类型。有五种主要类别的抗体：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中一些可以进一步分为亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同类免疫球蛋白类别的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、γ和μ。
本文所用的术语“细胞毒性剂”是指抑制或阻止细胞功能和/或引起细胞死亡或破坏的物质。细胞毒性剂包括但不限于放射性同位素(例如，At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212和Lu的放射性同位素)；化疗剂或药物(例如甲氨蝶呤、阿霉素、长春花生物碱(长春新碱、长春花碱、依托泊苷)、多柔比星、美法仑、丝裂霉素C、苯丁酸氮芥、柔红霉素或其他嵌入剂)；生长抑制剂；酶及其片段如溶核酶；抗生素；毒素如小分子毒素或细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素，包括其片段和/或变体；以及下面公开的各种抗肿瘤剂或抗癌剂。
“效应功能”是指可归因于抗体Fc区的那些生物活性，其随抗体同种型而变化。抗体效应功能的实例包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如B细胞受体)的下调；和B细胞激活。
药剂(例如药物制剂)的“有效量”是指在必要的剂量和时间段内有效实现所需治疗或预防结果的量。
术语“表位”是指抗体结合的抗原分子上的特定位点。
本文的术语“Fc区”用于定义含有至少一部分恒定区的免疫球蛋白重链的C-末端区域。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。在一些实施方案中，人IgG重链Fc区从Cys226或从Pro230延伸至重链的羧基末端。然而，Fc区的C-末端赖氨酸(Lys447)可以存在或不存在。除非本文另有说明，否则Fc区或恒定区中氨基酸残基的编号根据EU编号***，也称为EU索引，如Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版PublicHealth Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD,1991中所述。
如本文所用，“第一”、“第二”等用于涉及复合结构(例如具有三级/四级结构的蛋白质，如抗体或其他装配，如聚泛素)中的各元件，其指那些元件(例如，单体、链、结构域)，而对该元件的排序或定位没有任何暗示；因此，“第一”元件可以相对于第二元件是C-或N-末端，或者比第二元件更靠近或更远离结构的一端或另一端。因此，例如，涉及双特异性抗体的一半或混合拓扑结构聚泛素中的键时，可任意将一半或一个键指定为第一或第二。
“框架”或“FR”是指除高变区(HVR)残基之外的可变结构域残基。可变结构域的FR通常由四个FR结构域组成：FR1、FR2、FR3和FR4。因此，HVR和FR序列通常以下列顺序出现在VH(或VL)中：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
术语“全长抗体”、“完整抗体”和“整个抗体”在本文中可互换使用，是指具有与天然抗体结构基本相似的结构的抗体或具有含有本文所定义的Fc区的重链的抗体。
术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可互换使用，是指已引入外源核酸的细胞，包括此类细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“转化细胞”，其包括原代转化细胞和由其衍生的后代，而不考虑传代次数。后代可能与亲本细胞的核酸含量不完全相同，但可能含有突变。本文包括具有与在最初转化的细胞中筛选或选择的相同的功能或生物活性的突变后代。
“人抗体”是具有对应于人或人细胞产生的抗体的氨基酸序列、或衍生自利用人抗体库或其他人抗体编码序列的非人源的氨基酸序列的抗体。人抗体的这种定义特异性地排除了包含非人抗原结合残基的人源化抗体。
“兔抗体”是具有对应于兔或兔细胞产生的抗体的氨基酸序列、或衍生自利用兔抗体库或其他兔抗体编码序列的非兔源的氨基酸序列的抗体。
“人共有框架”是代表在选择的人免疫球蛋白VL或VH框架序列中最常出现的氨基酸残基的框架。通常，人免疫球蛋白VL或VH序列的选择来自可变结构域序列的亚组。通常，序列亚组是如Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,NIH Publication 91-3242,Bethesda MD(1991),第1-3卷中所述的亚组。在一些实施方案中，对于VL，亚组是亚组kappa I，如Kabat等人，同上所述。在一些实施方案中，对于VH，亚组是亚组III，如Kabat等人，同上所述。
“人源化”抗体是指嵌合抗体，其包含来自非人HVR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基。在某些实施方案中，人源化抗体将包含至少一个、通常两个可变结构域中的基本上全部，其中全部或基本上全部HVR(例如，CDR)对应于非人抗体的那些，并且FR的全部或基本上全部对应于人抗体的FR。人源化抗体任选地可以包含衍生自人抗体的抗体恒定区的至少一部分。抗体(例如非人抗体)的“人源化形式”是指已经历人源化的抗体。
如本文所用，术语“高变区”或“HVR”是指抗体可变结构域的每个区域，其在序列上是高变的和/或形成结构限定的环(“高变环”)。通常，天然四链抗体包含六个HVR；VH中的三个(H1、H2、H3)和VL中的三个(L1、L2、L3)。HVR通常包含来自高变环和/或来自“互补决定区”(CDR)的氨基酸残基，后者具有最高的序列可变性和/或参与抗原识别。示例性高变环发生在氨基酸残基26-32(L1)、50-52(L2)、91-96(L3)、26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)(Chothia和Lesk,J.Mol.Biol.196:901-917(1987))。示例性CDR(CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3)发生在L1的氨基酸残基24-34、L2的50-56、L3的89-97、H1的31-35B、H2的50-65和H3的95-102(Kabat等人,Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991))。除VH中的CDR1外，CDR通常包含形成高变环的氨基酸残基。CDR还包含“特异性决定残基”或“SDR”，其是与抗原接触的残基。SDR包含在称为缩写CDR或a-CDR的CDR区内。示例性的a-CDR(a-CDR-L1、a-CDR-L2、a-CDR-L3、a-CDR-H1、a-CDR-H2和a-CDR-H3)出现在L1的氨基酸残基31-34、L2的50-55、L3的89-96、H1的31-35B、H2的50-58和H3的95-102(参见Almagro和Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008))。除非另有说明，否则可变结构域中的HVR残基和其他残基(例如，FR残基)在本文中根据Kabat等人(同上)编号。
“免疫缀合物”是与一种或多种异源分子缀合的抗体，异源分子包括但不限于细胞毒性剂。免疫缀合物等同于术语“抗体药物缀合物”(ADC)。
“个体”或“患者”或“受试者”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯养动物(例如，牛、绵羊、猫、狗和马)、灵长类动物(例如，人和非人灵长类动物，如猴子)、兔子和啮齿动物(例如，小鼠和大鼠)。在某些实施方案中，个体或受试者是人。
“分离的抗体”是已经与其天然环境中的组分分离的抗体。在一些实施方案中，例如通过电泳(例如，SDS-PAGE、等电聚焦(IEF)、毛细管电泳)或色谱法(例如，离子交换或反相HPLC)所测定，将抗体纯化至大于95％或99％的纯度。关于评估抗体纯度的方法的综述，参见，例如，Flatman等人,J.Chromatogr.B 848:79-87(2007)。
“分离的核酸”是指已经与其天然环境中的组分分离的核酸分子。分离的核酸包括通常含有核酸分子的细胞中含有的核酸分子，但核酸分子存在于染色体外或与其天然染色***置不同的染色***置。
“混合拓扑结构聚泛素”是指包含两个或更多个不同Ub与Ub键的聚泛素，即在聚泛素的不同位置的不同键，并且其可以是分支的(其中至少一个单体与至少三个其他单体连接或与一个底物多肽和至少两个其他单体连接)或未分支的(其中单体不与多于两个的其他单体连接或不与两个单体和一个底物多肽连接)。因此，在分支的混合拓扑结构聚泛素中，存在这样的在分支点处的泛素，在分支点处该泛素的C-末端例如与之前泛素的赖氨酸11连接，同时，例如，在分支点的该泛素的赖氨酸11和赖氨酸48可以都与随后的泛素连接。在一个未分支的混合拓扑结构聚泛素中，没有一个泛素直接与超过两个的其他泛素连接，但至少一个泛素参与两个不同的泛素与泛素的连接，例如，其C-末端可与之前泛素的赖氨酸11连接，同时其赖氨酸48与随后的泛素连接。
如本文所用的术语“单克隆抗体”是指从基本上同质的抗体群获得的抗体，即，除了可能的变体抗体之外，包含各抗体的群是相同的和/或结合相同的表位，所述变体抗体例如含有天然存在的突变或在单克隆抗体制剂的生产过程中产生的变体，这些变体通常以少量存在。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，单克隆抗体制剂的每种单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。因此，修饰语“单克隆”表示抗体的特征是从基本上同质的抗体群获得的，不应解释为需要通过任何特定方法产生抗体。例如，可以通过多种技术制备单克隆抗体，包括但不限于杂交瘤方法、重组DNA方法、噬菌体展示方法和利用含有全部或部分人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法，这些方法和制备单克隆抗体的其他示例性方法在本文描述了。
“裸抗体”是指未与异源部分(例如，细胞毒性部分)或放射性标记缀合的抗体。裸抗体可以存在于药物制剂中。
“天然抗体”是指具有不同结构的天然存在的免疫球蛋白分子。例如，天然IgG抗体是约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白，其由二硫键键连的两条相同的轻链和两条相同的重链组成。从N-末端到C-末端，每条重链具有可变区(VH)，也称为可变重链结构域或重链可变结构域，接着是三个恒定结构域(CH1、CH2和CH3)。类似地，从N-末端到C-末端，每条轻链具有可变区(VL)，也称为可变轻链结构域或轻链可变结构域，然后是恒定轻链(CL)结构域。基于其恒定结构域的氨基酸序列，抗体的轻链可分配为两种类型中的一种，称为kappa(κ)和lamba(λ)。
除非上下文另有要求，否则“或”以包含性含义使用，即等同于“和/或”。
相对于参照多肽序列的“百分比(％)氨基酸序列同一性”定义为，在比对序列(如果需要，引入间隙)以实现最大百分比序列同一性后，候选序列中与参照多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比，其中不考虑任何保守取代作为序列同一性的一部分。可以以本领域技术范围内的各种方式实现用于确定氨基酸序列同一性百分比的比对，例如，使用公众可获得的计算机软件，如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以确定用于比对序列的适当参数，包括在所比较的序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。然而，为了本文的目的，使用序列比较计算机程序ALIGN-2产生％氨基酸序列同一性值。ALIGN-2序列比较计算机程序由Genentech，Inc.编写，并且源代码已经在美国版权局，华盛顿特区20559中与用户文档一起提交，其在美国版权登记号TXU510087下注册。ALIGN-2程序可从加利福尼亚州南旧金山的Genentech，Inc.公开获得，或者可以从源代码编译。编译ALIGN-2程序以在UNIX操作***上使用，包括数字UNIX V4.0D。所有序列比较参数均由ALIGN-2程序设置，不做改变。
在使用ALIGN-2进行氨基酸序列比较的情况下，给定氨基酸序列A相对于、与、针对给定氨基酸序列B的氨基酸序列同一性％(可以替代地表达为相对于、与、或针对给定氨基酸序列B的氨基酸序列给定氨基酸序列A具有或包含一定的同一性％)，如下计算：
100乘以X/Y的分数
其中X是在该程序的A和B的比对中通过序列比对程序ALIGN-2评分为相同匹配的氨基酸残基的数目，其中Y是B中氨基酸残基的总数。应理解，当氨基酸序列A的长度不等于氨基酸序列B的长度时，A相对于B的％氨基酸序列同一性将不等于B相对于A的％氨基酸序列同一性。除非另有说明，本文使用的所有％氨基酸序列同一性的值均使用ALIGN-2计算机程序如前一段中所述获得。
术语“药物制剂”是指这样的形式的制剂，其允许其中包含的活性成分的生物活性有效，并且不含有对施用该制剂的受试者具有不可接受的毒性的其它成分。
“药学上可接受的载体”是指药物制剂中除活性成分以外的成分，其对受试者无毒。药学上可接受的载体包括但不限于缓冲液、赋形剂、稳定剂或防腐剂。
如本文所用，“基本上不含”是指所涉及的实体不存在，或如果存在的话，是(i)足够低的量以便根据具体情况不显著改变组合物、方法、用途或步骤的功能性质或结果；(ii)通过至少一种适当的分析方法检测不到，所述分析方法如质谱法(例如，MALDI-TOF或实施例中使用的任何MS步骤)、印迹(例如，多肽的蛋白质印记)或电泳(例如用考马斯蓝或银染色的SDS-PAGE)；或(iii)相对于组合物中非溶剂物质总量的质量或摩尔分数，以小于或等于约20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％或0.1％的量存在。
如本文所用，“治疗”(及其语法变体，如“治疗”或“治疗”)是指试图改变所治疗个体的自然病程的临床干预，其可以用于预防或在临床病理学过程中进行。理想的治疗效果包括但不限于预防疾病的发生或复发、缓解症状、减轻疾病的任何直接或间接病理结果、预防转移、降低疾病进展的速率、改善或缓解疾病状态、缓解或改善预后。在一些实施方案中，本文公开的抗体用于延迟疾病的发展或减缓疾病的进展。
术语“可变区”或“可变结构域”是指抗体重链或轻链的结构域，其参与抗体与抗原的结合。天然抗体的重链和轻链的可变结构域(分别为VH和VL)通常具有相似的结构，每个结构域包含四个保守构架区(FR)和三个高变区(HVR)。(参见，例如Kindt等人KubyImmunology,第6版,W.H.Freeman and Co.,第91页(2007))。单个VH或VL结构域可足以赋予抗原结合特异性。此外，可以使用来自结合抗原的抗体的VH或VL结构域分离结合特定抗原的抗体，以分别筛选互补VL或VH结构域的文库。参见，例如，Portolano等人,J.Immunol.150:880-887(1993)；Clarkson等人,Nature 352:624-628(1991)。
如本文所用，术语“载体”是指能够繁殖与其连接的另一核酸的核酸分子。该术语包括作为自我复制核酸结构的载体以及掺入其所导入的宿主细胞基因组中的载体。某些载体能够指导与其可操作地连接的核酸的表达。此类载体在本文中称为“表达载体”。
II.组合物和方法
在一些方面，提供了与混合拓扑结构聚泛素链结合的抗体。此类抗体可用于例如检测混合拓扑结构聚泛素链、调节混合拓扑结构聚泛素链的活性或免疫沉淀混合拓扑结构聚泛素链。
A.示例性抗体
在一些实施方案中，抗体对于混合拓扑结构聚泛素比对于单个拓扑结构聚泛素具有更高的亲合性，其中混合拓扑结构聚泛素包含第一键和第二键，其中第一键和第二键彼此不同。在一些实施方案中，抗体是结合混合拓扑结构聚泛素的多特异性抗体，所述混合拓扑结构聚泛素包含第一键和第二键，所述抗体包含对第一键特异的第一VH/VL单元，和对第二键特异的第二VH/VL单元，其中第一键和第二键彼此不同。例如，抗体可包含第一抗原识别位点和第二抗原识别位点，其中第一抗原识别位点对第一键特异，第二抗原识别位点对第二键特异。因为两个抗原识别位点可以特异性地结合(engage)混合拓扑结构聚泛素，而只有一个抗原识别位点可以特异性地结合单个拓扑结构聚泛素，所以该抗体对于混合拓扑结构聚泛素具有更高的亲合性。
在一些实施方案中，第一键是K11、K48、K63或C-末端至N-末端的键。在一些实施方案中，第二键是K11、K48、K63或C-末端至N-末端的键。在一些实施方案中，第一和第二键独立地为K11、K48、K63或C-末端至N-末端的键。除非另有说明，否则第一和第二键是不同的。
美国专利号7,763,245中公开的抗体、抗体序列和序列表通过引用并入本文。在一些实施方案中，第一或第二半抗体包含美国专利号7,763,245中公开的结合聚泛素的抗体的HVR-H1、HVR-H2、HVR-H3、HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3。在一些实施方案中，第一或第二半抗体包含选自美国专利号7,763,245中公开的HVR的HVR-H1、HVR-H2、HVR-H3、HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3的组合，其中半抗体结合聚泛素。
美国专利号8,133,488中公开的抗体、抗体序列和序列表通过引用并入本文。在一些实施方案中，第一或第二半抗体包含美国专利号8,133,488中公开的结合聚泛素的抗体的HVR-H1、HVR-H2、HVR-H3、HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3。在一些实施方案中，第一或第二半抗体包含选自美国专利号8,133,488中公开的HVR的HVR-H1、HVR-H2、HVR-H3、HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3的组合，其中半抗体结合聚泛素。
美国专利号8,992,919中公开的抗体、抗体序列和序列表通过引用并入本文。在一些实施方案中，第一或第二半抗体包含美国专利号8,992,919中公开的结合聚泛素的抗体的HVR-H1、HVR-H2、HVR-H3、HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3。在一些实施方案中，第一或第二半抗体包含选自美国专利号8,992,919中公开的HVR的HVR-H1、HVR-H2、HVR-H3、HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3的组合，其中半抗体结合聚泛素。
美国专利号9,321,844中公开的抗体、抗体序列和序列表通过引用并入本文。在一些实施方案中，第一或第二半抗体包含美国专利号9,321,844中公开的结合聚泛素的抗体的HVR-H1、HVR-H2、HVR-H3、HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3。在一些实施方案中，第一或第二半抗体包含选自美国专利号9,321,844中公开的HVR的HVR-H1、HVR-H2、HVR-H3、HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3的组合，其中半抗体结合聚泛素。
除非另有说明，否则第二半抗体的HVR中的至少一个与第一半抗体的相应HVR不同。在一些实施方案中，第二半抗体的HVR的至少两个与第一半抗体的相应HVR不同。在一些实施方案中，第二半抗体的HVR的至少三个与第一半抗体的相应HVR不同。在一些实施方案中，第二半抗体的HVR的至少四个与第一半抗体的相应HVR不同。在一些实施方案中，第二半抗体的HVR的至少五个与第一半抗体的相应HVR不同。在一些实施方案中，第二半抗体的六个HVR与第一半抗体的HVR不同。
在一些实施方案中，第一半抗体包含分别包含SEQ ID NO：9、10、11、12、13和14的氨基酸序列的HVR-H1、HVR-H2、HVR-H3、HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3。在一些实施方案中，第一半抗体包含分别包含SEQ ID NO：23、24、25、26、27和28的氨基酸序列的HVR-H1、HVR-H2、HVR-H3、HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3。在一些实施方案中，第一半抗体包含分别包含SEQ IDNO：37、38、39、40、41和42的氨基酸序列的HVR-H1、HVR-H2、HVR-H3、HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3。在一些实施方案中，第一半抗体包含分别包含SEQ IDNO：51、52、53、54、55和56的氨基酸序列的HVR-H1、HVR-H2、HVR-H3、HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3。
在一些实施方案中，第二半抗体包含分别包含SEQ ID NO：9、10、11、12、13和14的氨基酸序列的HVR-H1、HVR-H2、HVR-H3、HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3。在一些实施方案中，第二半抗体包含分别包含SEQ ID NO：23、24、25、26、27和28的氨基酸序列的HVR-H1、HVR-H2、HVR-H3、HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3。在一些实施方案中，第二半抗体包含分别包含SEQ IDNO：37、38、39、40、41和42的氨基酸序列的HVR-H1、HVR-H2、HVR-H3、HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3。在一些实施方案中，第二半抗体包含分别包含SEQ IDNO：51、52、53、54、55和56的氨基酸序列的HVR-H1、HVR-H2、HVR-H3、HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3。
在一些实施方案中，第一和第二半抗体之一包含
(i)包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列的HVR-H1，
(ii)包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列的HVR-H2，
(iii)包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列的HVR-H3，
(iv)包含SEQ ID NO：12的氨基酸序列的HVR-L1，
(v)包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列的HVR-L2，和
(vi)包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列的HVR-L3，并且第一和第二半抗体中的另一个包含
(i)包含SEQ ID NO：23的氨基酸序列的HVR-H1，
(ii)包含SEQ ID NO：24的氨基酸序列的HVR-H2，
(iii)包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列的HVR-H3，
(iv)包含SEQ ID NO：26的氨基酸序列的HVR-L1，
(v)包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列的HVR-L2，和
(vi)包含SEQ ID NO：28的氨基酸序列的HVR-L3。
在一些实施方案中，第一和第二半抗体之一包含
(i)包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列的HVR-H1，
(ii)包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列的HVR-H2，
(iii)包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列的HVR-H3，
(iv)包含SEQ ID NO：12的氨基酸序列的HVR-L1，
(v)包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列的HVR-L2，和
(vi)包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列的HVR-L3，并且第一和第二半抗体中的另一个包含
(i)包含SEQ ID NO：37的氨基酸序列的HVR-H1，
(ii)包含SEQ ID NO：38的氨基酸序列的HVR-H2，
(iii)包含SEQ ID NO：39的氨基酸序列的HVR-H3，
(iv)包含SEQ ID NO：40的氨基酸序列的HVR-L1，
(v)包含SEQ ID NO：41的氨基酸序列的HVR-L2，和
(vi)包含SEQ ID NO：42的氨基酸序列的HVR-L3。
在一些实施方案中，第一和第二半抗体之一包含
(i)包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列的HVR-H1，
(ii)包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列的HVR-H2，
(iii)包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列的HVR-H3，
(iv)包含SEQ ID NO：12的氨基酸序列的HVR-L1，
(v)包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列的HVR-L2，和
(vi)包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列的HVR-L3，并且第一和第二半抗体中的另一个包含
(i)包含SEQ ID NO：51的氨基酸序列的HVR-H1，
(ii)包含SEQ ID NO：52的氨基酸序列的HVR-H2，
(iii)包含SEQ ID NO：53的氨基酸序列的HVR-H3，
(iv)包含SEQ ID NO：54的氨基酸序列的HVR-L1，
(v)包含SEQ ID NO：55的氨基酸序列的HVR-L2，和
(vi)包含SEQ ID NO：56的氨基酸序列的HVR-L3；
在一些实施方案中，第一和第二半抗体之一包含
(i)包含SEQ ID NO：23的氨基酸序列的HVR-H1，
(ii)包含SEQ ID NO：24的氨基酸序列的HVR-H2，
(iii)包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列的HVR-H3，
(iv)包含SEQ ID NO：26的氨基酸序列的HVR-L1，
(v)包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列的HVR-L2，和
(vi)包含SEQ ID NO：28的氨基酸序列的HVR-L3，并且第一和第二半抗体中的另一个包含
(i)包含SEQ ID NO：37的氨基酸序列的HVR-H1，
(ii)包含SEQ ID NO：38的氨基酸序列的HVR-H2，
(iii)包含SEQ ID NO：39的氨基酸序列的HVR-H3，
(iv)包含SEQ ID NO：40的氨基酸序列的HVR-L1，
(v)包含SEQ ID NO：41的氨基酸序列的HVR-L2，和
(vi)包含SEQ ID NO：42的氨基酸序列的HVR-L3；
在一些实施方案中，第一和第二半抗体之一包含
(i)包含SEQ ID NO：23的氨基酸序列的HVR-H1，
(ii)包含SEQ ID NO：24的氨基酸序列的HVR-H2，
(iii)包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列的HVR-H3，
(iv)包含SEQ ID NO：26的氨基酸序列的HVR-L1，
(v)包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列的HVR-L2，和
(vi)包含SEQ ID NO：28的氨基酸序列的HVR-L3，并且第一和第二半抗体中的另一个包含
(i)包含SEQ ID NO：51的氨基酸序列的HVR-H1，
(ii)包含SEQ ID NO：52的氨基酸序列的HVR-H2，
(iii)包含SEQ ID NO：53的氨基酸序列的HVR-H3，
(iv)包含SEQ ID NO：54的氨基酸序列的HVR-L1，
(v)包含SEQ ID NO：55的氨基酸序列的HVR-L2，和
(vi)包含SEQ ID NO：56的氨基酸序列的HVR-L3；或者
在一些实施方案中，第一和第二半抗体之一包含
(i)包含SEQ ID NO：37的氨基酸序列的HVR-H1，
(ii)包含SEQ ID NO：38的氨基酸序列的HVR-H2，
(iii)包含SEQ ID NO：39的氨基酸序列的HVR-H3，
(iv)包含SEQ ID NO：40的氨基酸序列的HVR-L1，
(v)包含SEQ ID NO：41的氨基酸序列的HVR-L2，和
(vi)包含SEQ ID NO：42的氨基酸序列的HVR-L3，并且第一和第二半抗体中的另一个包含
(i)包含SEQ ID NO：51的氨基酸序列的HVR-H1，
(ii)包含SEQ ID NO：52的氨基酸序列的HVR-H2，
(iii)包含SEQ ID NO：53的氨基酸序列的HVR-H3，
(iv)包含SEQ ID NO：54的氨基酸序列的HVR-L1，
(v)包含SEQ ID NO：55的氨基酸序列的HVR-L2，和
(vi)包含SEQ ID NO：56的氨基酸序列的HVR-L3。
在一些实施方案中，第一或第二半抗体包含与SEQ ID NO：7具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的VL序列，和与SEQ ID NO：8具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的VH序列。在一些实施方案中，第一或第二半抗体包含与SEQ ID NO：21具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的VL序列，和与SEQ ID NO：22具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的VH序列。在一些实施方案中，第一或第二半抗体包含与SEQ ID NO：35具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的VL序列，和与SEQ ID NO：36具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的VH序列。在一些实施方案中，第一或第二半抗体包含与SEQ IDNO：49具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的VL序列，和与SEQ ID NO：50具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的VH序列。
除非另有说明，否则第二半抗体的VL和VH序列中的至少一个与其在第一半抗体中的对应部分不同。在一些实施方案中，第二半抗体的VL序列与第一半抗体的VL序列不同。在一些实施方案中，第二半抗体的VH序列与第一半抗体的VH序列不同。在一些实施方案中，第二半抗体的VL和VH序列与第一半抗体的VL和VH序列不同。
在一些实施方案中，a)第一和第二半抗体之一包含与SEQ ID NO：7具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的VL序列，和与SEQ ID NO：8具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的VH序列，并且第一和第二半抗体的另一个包含与SEQ ID NO：21具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的VL序列，和与SEQ ID NO：22具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的VH序列。在一些实施方案中，第一和第二半抗体之一包含与SEQ ID NO：7具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的VL序列，和与SEQ ID NO：8具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的VH序列，并且第一和第二半抗体的另一个包含与SEQ ID NO：35具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的VL序列，和与SEQ ID NO：36具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的VH序列。在一些实施方案中，第一和第二半抗体之一包含与SEQ ID NO：7具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的VL序列，和与SEQ ID NO：8具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的VH序列，并且第一和第二半抗体的另一个包含与SEQ ID NO：49具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的VL序列，和与SEQ ID NO：50具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的VH序列。在一些实施方案中，第一和第二半抗体之一包含与SEQ ID NO：21具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的VL序列，和与SEQ ID NO：22具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的VH序列，并且第一和第二半抗体的另一个包含与SEQ ID NO：35具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的VL序列，和与SEQ IDNO：36具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的VH序列。在一些实施方案中，第一和第二半抗体之一包含与SEQ ID NO：21具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的VL序列，和与SEQ ID NO：22具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的VH序列，并且第一和第二半抗体的另一个包含与SEQ ID NO：49具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的VL序列，和与SEQ ID NO：50具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的VH序列。在一些实施方案中，第一和第二半抗体之一包含与SEQ ID NO：35具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的VL序列，和与SEQ ID NO：36具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的VH序列，并且第一和第二半抗体的另一个包含与SEQ ID NO：49具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的VL序列，和与SEQ ID NO：50具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的VH序列。
在一些实施方案中，第一或第二半抗体包含与美国专利号7,763,245中公开的结合聚泛素的抗体的VH和VL序列至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的VH和VL序列。在一些实施方案中，第一或第二半抗体包含美国专利号7,763,245中公开的VH和VL序列的组合，其中半抗体结合聚泛素。
在一些实施方案中，第一或第二半抗体包含与美国专利号8,133,488中公开的结合聚泛素的抗体的VH和VL序列至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的VH和VL序列。在一些实施方案中，第一或第二半抗体包含美国专利号8,133,488中公开的VH和VL序列的组合，其中半抗体结合聚泛素。
在一些实施方案中，第一或第二半抗体包含与美国专利号8,992,919中公开的结合聚泛素的抗体的VH和VL序列至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的VH和VL序列。在一些实施方案中，第一或第二半抗体包含美国专利号8,992,919中公开的VH和VL序列的组合，其中半抗体结合聚泛素。
在一些实施方案中，第一或第二半抗体包含与美国专利号9,321,844中公开的结合聚泛素的抗体的VH和VL序列至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的VH和VL序列。在一些实施方案中，第一或第二半抗体包含美国专利号9,321,844中公开的VH和VL序列的组合，其中半抗体结合聚泛素。
在一些实施方案中，第一或第二半抗体包含美国专利号7,763,245中公开的结合聚泛素的抗体的VH和VL序列。在一些实施方案中，第一或第二半抗体包含美国专利号7,763,245中公开的VH和VL序列的组合，其中半抗体结合聚泛素。
在一些实施方案中，第一或第二半抗体包含美国专利号8,133,488中公开的结合聚泛素的抗体的VH和VL序列。在一些实施方案中，第一或第二半抗体包含美国专利号8,133,488中公开的VH和VL序列的组合，其中半抗体结合聚泛素。
在一些实施方案中，第一或第二半抗体包含美国专利号8,992,919中公开的结合聚泛素的抗体的VH和VL序列。在一些实施方案中，第一或第二半抗体包含美国专利号8,992,919中公开的VH和VL序列的组合，其中半抗体结合聚泛素。
在一些实施方案中，第一或第二半抗体包含美国专利号9,321,844中公开的结合聚泛素的抗体的VH和VL序列。在一些实施方案中，第一或第二半抗体包含美国专利号9,321,844中公开的VH和VL序列的组合，其中半抗体结合聚泛素。
在某些实施方案中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VH序列相对于参照序列含有取代(例如，保守取代)、***或缺失，但包含该序列的抗体保留结合聚泛素的能力。在某些实施方案中，在VH序列中已经取代、***和/或缺失总共1至10个氨基酸。在某些实施方案中，取代、***或缺失发生在HVR外部的区域中(即，在FR中)。任选地，抗体包含上文讨论的VH序列，包括该序列的翻译后修饰。
在某些实施方案中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VL序列相对于参照序列含有取代(例如，保守取代)、***或缺失，但包含该序列的抗体保留结合聚泛素的能力。在某些实施方案中，在VL序列中已经取代、***和/或缺失总共1至10个氨基酸。在某些实施方案中，取代、***或缺失发生在HVR外部的区域中(即，在FR中)。任选地，抗体包含上文讨论的VL序列，包括该序列的翻译后修饰。
在一些实施方案中，抗体是人源化的。在一些实施方案中，抗体包含如任何上述实施方案中的HVR，并且还包含人受体框架，例如，人免疫球蛋白框架或人共有框架。在一些实施方案中，抗体包含如任何上述实施方案中的HVR和兔框架区。
在一些方面，提供了与本文提供的双特异性抗体结合相同表位的抗体。例如，在某些实施方案中，提供了与包含第一和第二半抗体的抗体结合相同表位的抗体，其中：
a)第一和第二半抗体之一包含SEQ ID NO：7的VL序列和SEQ ID NO：8的VH序列，
并且第一和第二半抗体中的另一个包含SEQ ID NO：21的VL序列和SEQ ID NO：22的VH序列；
b)第一和第二半抗体之一包含SEQ ID NO：7的VL序列和SEQ IDNO：8的VH序列，
并且第一和第二半抗体中的另一个包含SEQ ID NO：35的VL序列和SEQ ID NO：36的VH序列；
c)第一和第二半抗体之一包含SEQ ID NO：7的VL序列和SEQ IDNO：8的VH序列，
并且第一和第二半抗体中的另一个包含SEQ ID NO：49的VL序列和SEQ ID NO：50的VH序列；
d)第一和第二半抗体之一包含SEQ ID NO：21的VL序列和SEQ IDNO：22的VH序列，
并且第一和第二半抗体中的另一个包含SEQ ID NO：35的VL序列和SEQ ID NO：36的VH序列；
e)第一和第二半抗体之一包含SEQ ID NO：21的VL序列和SEQ IDNO：22的VH序列，
并且第一和第二半抗体中的另一个包含SEQ ID NO：49的VL序列和SEQ ID NO：50的VH序列；或者
f)第一和第二半抗体之一包含SEQ ID NO：35的VL序列和SEQ IDNO：36的VH序列，
并且第一和第二半抗体中的另一个包含SEQ ID NO：49的VL序列和SEQ ID NO：50的VH序列。
在一些实施方案中，提供了与双特异性抗体竞争结合混合拓扑结构聚泛素的抗体，所述双特异性抗体包含前面段落a)至f)之一中的VH和VL序列。
在一些实施方案中，抗体是单克隆抗体，包括嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。在一些实施方案中，抗体是抗体片段，例如二聚体scFv、双抗体或F(ab')2片段。在另一个实施方案中，抗体是基本上全长的抗体，例如IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3或IgG4抗体，或如本文定义的其他抗体类别或同种型。
在一些实施方案中，抗体包含至少一个具有C-末端赖氨酸的重链。在一些实施方案中，抗体包含至少一个缺乏C-末端赖氨酸的重链。在一些实施方案中，抗体仅包含不含C-末端赖氨酸的重链。C-末端赖氨酸可以例如，如通过羧肽酶处理酶促除去，或如通过重链编码序列3'末端的赖氨酸密码子的缺失或取代遗传地除去。重链C-末端赖氨酸远离抗原结合位点并且对于结合活性是非必要的，除去它们可以提供更同质的抗体制剂。
在一些实施方案中，抗体包含第一和第二半抗体，其中第一或第二半抗体包含
a)与SEQ ID NO：2具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的轻链序列和与SEQ ID NO：4具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的重链序列；
b)与SEQ ID NO：16具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的轻链序列和与SEQ ID NO：18具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的重链序列；
c)与SEQ ID NO：30具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的轻链序列和与SEQ ID NO：32具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的重链序列；或者
d)与SEQ ID NO：44具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的轻链序列和与SEQ ID NO：46具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的重链序列，
任选地，其中一个或多个重链缺失C-末端赖氨酸。
在一些实施方案中，抗体包含第一和第二半抗体，其中第一或第二半抗体包含
a)与SEQ ID NO：2具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的轻链序列和与SEQ ID NO：6具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的重链序列；
b)与SEQ ID NO：16具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的轻链序列和与SEQ ID NO：20具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的重链序列；
c)与SEQ ID NO：30具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的轻链序列和与SEQ ID NO：34具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的重链序列；或者
d)与SEQ ID NO：44具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的轻链序列和与SEQ ID NO：48具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的重链序列，
任选地，其中一个或多个链缺失C-末端赖氨酸；
在一些实施方案中，抗体包含第一和第二半抗体，其中
a)第一和第二半抗体之一包含与SEQ ID NO：2具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的轻链序列和与SEQ ID NO：4具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的重链序列，
并且第一和第二半抗体中的另一个包含与SEQ ID NO：16具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的轻链序列和与SEQID NO：20具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的重链序列；
b)第一和第二半抗体之一包含与SEQ ID NO：2具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的轻链序列和与SEQ ID NO：4具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的重链序列，
并且第一和第二半抗体中的另一个包含与SEQ ID NO：30具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的轻链序列和与SEQID NO：34具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的重链序列；
c)第一和第二半抗体之一包含与SEQ ID NO：2具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的轻链序列和与SEQ ID NO：4具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的重链序列，
并且第一和第二半抗体中的另一个包含与SEQ ID NO：44具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的轻链序列和与SEQID NO：48具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的重链序列；
d)第一和第二半抗体之一包含与SEQ ID NO：2具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的轻链序列和与SEQ ID NO：6具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的重链序列，
并且第一和第二半抗体中的另一个包含与SEQ ID NO：16具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的轻链序列和与SEQID NO：18具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的重链序列；
e)第一和第二半抗体之一包含与SEQ ID NO：2具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的轻链序列和与SEQ ID NO：6具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的重链序列，
并且第一和第二半抗体中的另一个包含与SEQ ID NO：30具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的轻链序列和与SEQID NO：32具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的重链序列；
f)第一和第二半抗体之一包含与SEQ ID NO：2具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的轻链序列和与SEQ ID NO：6具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的重链序列，
并且第一和第二半抗体中的另一个包含与SEQ ID NO：44具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的轻链序列和与SEQID NO：46具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的重链序列；
g)第一和第二半抗体之一包含与SEQ ID NO：16具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的轻链序列和与SEQ ID NO：18具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的重链序列，
并且第一和第二半抗体中的另一个包含与SEQ ID NO：30具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的轻链序列和与SEQID NO：34具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的重链序列
h)第一和第二半抗体之一包含与SEQ ID NO：16具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的轻链序列和与SEQ ID NO：18具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的重链序列，
并且第一和第二半抗体中的另一个包含与SEQ ID NO：44具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的轻链序列和与SEQID NO：48具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的重链序列；
i)第一和第二半抗体之一包含与SEQ ID NO：30具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的轻链序列和与SEQ ID NO：32具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的重链序列，
并且第一和第二半抗体中的另一个包含与SEQ ID NO：44具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的轻链序列和与SEQID NO：48具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的重链序列；
j)第一和第二半抗体之一包含与SEQ ID NO：16具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的轻链序列和与SEQ ID NO：20具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的重链序列，
并且第一和第二半抗体中的另一个包含与SEQ ID NO：30具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的轻链序列和与SEQID NO：32具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的重链序列；
k)第一和第二半抗体之一包含与SEQ ID NO：16具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的轻链序列和与SEQ ID NO：20具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的重链序列，
并且第一和第二半抗体中的另一个包含与SEQ ID NO：44具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的轻链序列和与SEQID NO：46具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的重链序列；或者
l)第一和第二半抗体之一包含与SEQ ID NO：30具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的轻链序列和与SEQ ID NO：34具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的重链序列，
并且第一和第二半抗体中的另一个包含与SEQ ID NO：44具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的轻链序列和与SEQID NO：46具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的重链序列，
任选地，其中一个或多个链缺失C-末端赖氨酸。
在一些实施方案中，抗体包含第一和第二半抗体，其中第一半抗体包含SEQ IDNO：2的轻链序列和SEQ ID NO：4的重链序列，并且第二半抗体包含SEQ ID NO：16的轻链序列和SEQ ID NO：20的重链序列，并且任选地其中一个或多个重链缺失C-末端赖氨酸。
在一些实施方案中，抗体包含第一和第二半抗体，其中第一半抗体包含SEQ IDNO：2的轻链序列和SEQ ID NO：4的重链序列，并且第二半抗体包含SEQ ID NO：30的轻链序列和SEQ ID NO：34的重链序列，并且任选地其中一个或多个重链缺失C-末端赖氨酸。
在一些实施方案中，抗体包含第一和第二半抗体，其中第一半抗体包含SEQ IDNO：2的轻链序列和SEQ ID NO：4的重链序列，并且第二半抗体包含SEQ ID NO：44的轻链序列和SEQ ID NO：48的重链序列，并且任选地其中一个或多个重链缺失C-末端赖氨酸。
在一些实施方案中，抗体包含第一和第二半抗体，其中第一半抗体包含SEQ IDNO：2的轻链序列和SEQ ID NO：6的重链序列，并且第二半抗体包含SEQ ID NO：16的轻链序列和SEQ ID NO：18的重链序列，并且任选地其中一个或多个重链缺失C-末端赖氨酸。
在一些实施方案中，抗体包含第一和第二半抗体，其中第一半抗体包含SEQ IDNO：2的轻链序列和SEQ ID NO：6的重链序列，并且第二半抗体包含SEQ ID NO：30的轻链序列和SEQ ID NO：32的重链序列，并且任选地其中一个或多个重链缺失C-末端赖氨酸。
在一些实施方案中，抗体包含第一和第二半抗体，其中第一半抗体包含SEQ IDNO：2的轻链序列和SEQ ID NO：6的重链序列，并且第二半抗体包含SEQ ID NO：44的轻链序列和SEQ ID NO：46的重链序列，并且任选地其中一个或多个重链缺失C-末端赖氨酸。
在一些实施方案中，抗体包含第一和第二半抗体，其中第一半抗体包含SEQ IDNO：16的轻链序列和SEQ ID NO：18的重链序列，并且第二半抗体包含SEQ ID NO：30的轻链序列和SEQ ID NO：34的重链序列，并且任选地其中一个或多个重链缺失C-末端赖氨酸。
在一些实施方案中，抗体包含第一和第二半抗体，其中第一半抗体包含SEQ IDNO：16的轻链序列和SEQ ID NO：18的重链序列，并且第二半抗体包含SEQ ID NO：44的轻链序列和SEQ ID NO：48的重链序列，并且任选地其中一个或多个重链缺失C-末端赖氨酸。
在一些实施方案中，抗体包含第一和第二半抗体，其中第一半抗体包含SEQ IDNO：30的轻链序列和SEQ ID NO：32的重链序列，并且第二半抗体包含SEQ ID NO：44的轻链序列和SEQ ID NO：48的重链序列，并且任选地其中一个或多个重链缺失C-末端赖氨酸。
在一些实施方案中，抗体包含第一和第二半抗体，其中第一半抗体包含SEQ IDNO：16的轻链序列和SEQ ID NO：20的重链序列，并且第二半抗体包含SEQ ID NO：30的轻链序列和SEQ ID NO：32的重链序列，并且任选地其中一个或多个重链缺失C-末端赖氨酸。
在一些实施方案中，抗体包含第一和第二半抗体，其中第一半抗体包含SEQ IDNO：16的轻链序列和SEQ ID NO：20的重链序列，并且第二半抗体包含SEQ ID NO：44的轻链序列和SEQ ID NO：46的重链序列，并且任选地其中一个或多个重链缺失C-末端赖氨酸。
在一些实施方案中，抗体包含第一和第二半抗体，其中第一半抗体包含SEQ IDNO：30的轻链序列和SEQ ID NO：34的重链序列，并且第二半抗体包含SEQ ID NO：44的轻链序列和SEQ ID NO：46的重链序列，并且任选地其中一个或多个重链缺失C-末端赖氨酸。
在另一个方面，根据任何上述实施方案的抗体可以单独或组合包括如下文第1-7节中所述的任何特征。
1.抗体亲和力
在某些实施方案中，本文提供的抗体具有≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM或≤0.001nM的解离常数(Kd)，并且任选地≥10-13M(例如10-8M或更低，例如从10-8M至10-13M，例如从10-9M至10-13M)。
在一些实施方案中，如以下测定法所述，使用目标抗体的Fab形式及其抗原通过放射性标记的抗原的结合测定法(RIA)测量Kd。通过在滴定系列未标记抗原的存在下用最小浓度的(125I)标记的抗原平衡Fab，然后用抗Fab抗体包被的板捕获结合的抗原来测量Fab对抗原的溶液结合亲和力(参见，例如，Chen等人,J.Mol.Biol.293:865-881(1999))。为了建立测定条件，用含5μg/ml捕获抗Fab抗体(Cappel Labs)的50mM碳酸钠(pH 9.6)溶液过夜包被
Figure BDA0004074180330000531
多孔板(Thermo Scientific)，随后在室温下(约23℃)用含有2％(w/v)牛血清白蛋白的PBS阻断2至5小时。在非吸附板(Nunc#269620)中，将100pM或26pM[125I]-抗原与目标Fab的系列稀释液混合(例如，与Presta等人,Cancer Res.57:4593-4599(1997)中的抗VEGF抗体Fab-12的评估一致)。然后将目标Fab过夜孵育；然而，孵育可以持续更长的时间(例如，约65小时)以确保达到平衡。此后，将混合物转移到捕获板中，在室温下孵育(例如，1小时)。然后除去溶液，用含有0.1％聚山梨醇酯/>
Figure BDA0004074180330000532
的PBS洗涤板8次。当板干燥后，加入150μl/孔的闪烁剂(MICROSCINT-20TM；Packard)，并将板在TOPCOUNT TM伽马计数器(Packard)上计数10分钟。选择产生小于或等于20％最大结合的各Fab的浓度用于竞争性结合测定法。
在一些实施方案中，使用
Figure BDA0004074180330000533
或/>
Figure BDA0004074180330000534
(BIAcore,Inc.,Piscataway,NJ)在25℃下使用表面等离子共振测定法测量Kd，其中固定的抗原CM5芯片为～10反应单位(RU)。简言之，根据供应商的说明，用N-乙基-N'-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化羧甲基化葡聚糖生物传感器芯片(CM5，BIACORE，Inc.)。将抗原用10mM乙酸钠，pH4.8稀释至5μg/ml(～0.2μM)，然后以5μl/分钟的流速注射，以获得约10个反应单位(RU)的偶联蛋白。注射抗原后，注射1M乙醇胺以阻断未反应的基团。对于动力学测量，在25℃下以约25μl/min的流速注射含有0.05％聚山梨醇酯20(TWEEN-20TM)表面活性剂的PBS(PBST)中的Fab的两倍系列稀释液(0.78nM至500nM)。通过同时拟合结合和解离传感图，使用简单一对一Langmuir结合模型(
Figure BDA0004074180330000541
评估软件版本3.2)计算结合速率(kon)和解离速率(koff)。平衡解离常数(Kd)计算为比率koff/kon。参见，例如，Chen等人,J.Mol.Biol.293:865-881(1999)。如果通过上述表面等离子体共振测定法的结合速率(on-rate)超过106M-1s-1，则可以通过使用荧光猝灭技术测定结合速率，该技术在25℃下、在递增浓度的抗原存在下测量含有20nM抗-抗原的抗体(Fab形式)的PBS，pH7.2中的荧光发射强度的增加或减少(激发＝295nm；发射＝340nm，16nm带通)，如在光谱仪(如配备停流的分光光度计(Aviv Instruments)或8000系列SLM-AMINCOTM分光光度计(ThermoSpectronic)，带有搅拌比色杯)中所测量的。
2.抗体片段
在某些实施方案中，本文提供的抗体是抗体片段。抗体片段包括但不限于F(ab')2片段、二聚体单链Fv和下文描述的其他片段。有关某些抗体片段的综述，参见Hudson等人，Nat.Med.9:129-134(2003)。关于scFv片段的综述，参见例如Pluckthün,The Pharmacologyof Monoclonal Antibodies,第113卷,Rosenburg和Moore编辑,(Springer-Verlag,NewYork),第269-315页(1994)；还参见WO93/16185；和美国专利号5,571,894和5,587,458。对于包含补救受体结合表位残基并具有增加的体内半衰期的Fab和F(ab')2片段的讨论，参见美国专利号5,869,046。
在一些实施方案中，抗体是双抗体。双抗体是具有两个抗原结合位点的抗体片段，其可以是二价或双特异性的。参见，例如，EP404,097；WO 1993/01161；Hudson等人,Nat.Med.9:129-134(2003)；和Hollinger等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448(1993)。
单结构域抗体是包含抗体的全部或部分重链可变结构域或全部或部分轻链可变结构域的抗体片段。在某些实施方案中，单结构域抗体是人单结构域抗体(Domantis,Inc.,Waltham,MA；参见例如美国专利号6,248,516B1)。
抗体片段可以通过各种技术制备，包括但不限于完整抗体的蛋白质水解消化以及通过重组宿主细胞(例如大肠杆菌或噬菌体)产生，如本文所述。
3.嵌合和人源化抗体
在某些实施方案中，本文提供的抗体是嵌合抗体。某些嵌合抗体描述于例如美国专利号4,816,567；和Morrison等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855(1984))。在一些实施方案中，嵌合抗体包含非人可变区(例如，衍生自小鼠、大鼠、仓鼠、兔或非人灵长类动物如猴的可变区)和人恒定区。在另一个实施例中，嵌合抗体是“类别转换的”抗体，其中类或亚类已经从亲本抗体的类或亚类改变。嵌合抗体包括其抗原结合片段。
在某些实施方案中，嵌合抗体是人源化抗体。通常，将非人抗体人源化以降低对人的免疫原性，同时保留亲本非人抗体的特异性和亲和力。通常，人源化抗体包含一个或多个可变结构域，其中HVR，例如CDR(或其部分)衍生自非人抗体，FR(或其部分)衍生自人抗体序列。人源化抗体任选还包含人恒定区的至少一部分。在一些实施方案中，人源化抗体中的一些FR残基被来自非人抗体(例如，衍生HVR残基的抗体)的相应残基取代，例如，以恢复或改善抗体特异性或亲和力。
人源化抗体及其制备方法在例如Almagro and Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008)中进行了综述，并且进一步描述在，例如，Riechmann等人,Nature 332:323-329(1988)；Queen等人,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 86:10029-10033(1989)；美国专利号5,821,337,7,527,791,6,982,321和7,087,409；Kashmiri等人,Methods 36:25-34(2005)(描述了SDR(a-CDR)接枝)；Padlan,Mol.Immunol.28:489-498(1991)(描述了“再表面化”)；Dall’Acqua等人,Methods 36:43-60(2005)(描述了“FR改组”)；和Osbourn等人Methods 36:61-68(2005)和Klimka等人,Br.J.Cancer,83:252-260(2000)(描述了FR改组的“引导”方法)。
可用于人源化的人框架区包括但不限于：使用“最佳拟合”方法选择的框架区(参见，例如，Sims等人J.Immunol.151:2296(1993))；衍生自轻链或重链可变区的特定亚组的人抗体共有序列的框架区(参见，例如，Carter等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4285(1992)；和Presta等人J.Immunol.,151:2623(1993))；人成熟(体细胞突变)框架区或人种系框架区(参见例如，Almagro和Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008))；来自筛选FR文库的框架(参见，例如，Baca等人,J.Biol.Chem.272:10678-10684(1997)和Rosok等人,J.Biol.Chem.271:22611-22618(1996))。
4.人抗体
在某些实施方案中，本文提供的抗体是人抗体。可以使用本领域已知的各种技术产生人抗体。人抗体一般描述于van Dijk和van de Winkel,Curr.Opin.Pharmacol.5:368-74(2001)和Lonberg,Curr.Opin.Immunol.20:450-459(2008)。
可以通过向转基因动物施用免疫原来制备人抗体，所述转基因动物已被修饰以响应抗原攻击产生完整人抗体或具有人可变区的完整抗体。这些动物通常含有全部或部分人免疫球蛋白基因座，这些人免疫球蛋白基因座取代内源性免疫球蛋白基因座，或者存在于动物染色体外或随机整合到动物染色体中。在这种转基因小鼠中，内源性免疫球蛋白基因座通常被灭活。关于从转基因动物获得人抗体的方法的综述，参见Lonberg,Nat.Biotech.23:1117-1125(2005)。还参见例如描述XENOMOUSETM技术的美国专利号6,075,181和6,150,584；描述
Figure BDA0004074180330000561
技术的美国专利号5,770,429；描述K-M/>
Figure BDA0004074180330000562
技术的美国专利号7,041,870和描述/>
Figure BDA0004074180330000563
技术的美国专利申请公开号US2007/0061900。可以进一步修饰由这些动物产生的完整抗体的人可变区，例如通过与不同的人恒定区组合。
也可以通过基于杂交瘤的方法制备人抗体。已经描述了用于产生人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系(参见，例如，Kozbor J.Immunol.,133:3001(1984)；Brodeur等人,Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,第51-63页(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987)；和Boerner等人,J.Immunol.,147:86(1991))。通过人B细胞杂交瘤技术产生的人抗体也描述于Li等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,103:3557-3562(2006)。其他方法包括例如美国专利号7,189,826(描述从杂交瘤细胞系产生单克隆人IgM抗体)和Ni,Xiandai Mianyixue,26(4):265-268(2006)(描述人-人杂交瘤)中描述的那些方法。人杂交瘤技术(Trioma技术)也描述于Vollmers和Brandlein,Histology and Histopathology,20(3):927-937(2005)，以及Vollmers和Brandlein,Methods and Findings in Experimental and ClinicalPharmacology,27(3):185-91(2005)中。
还可以通过分离选自人源噬菌体展示文库的Fv克隆可变结构域序列来产生人抗体。然后可以将这种可变结构域序列与期望的人恒定结构域组合。从抗体文库中选择人抗体的技术如下描述。
5.文库来源抗体
可以通过筛选组合文库获得具有一种或多种所需活性的抗体来分离抗体。例如，本领域已知多种方法用于产生噬菌体展示文库并筛选这些文库以获得具有所需结合特征的抗体。例如，在Hoogenboom等人的Methods in Molecular Biology 178:1-37(O’Brienet al.,ed.,Human Press,Totowa,NJ,2001)中对这些方法进行了综述，并进一步描述在例如McCafferty等人,Nature 348:552-554；Clackson等人,Nature352:624-628(1991)；Marks等人,J.Mol.Biol.222:581-597(1992)；Marks和Bradbury,Methods in MolecularBiology 248:161-175(Lo,ed.,Human Press,Totowa,NJ,2003)；Sidhu等人J.Mol.Biol.338(2):299-310(2004)；Lee等人,J.Mol.Biol.340(5):1073-1093(2004)；Fellouse,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(34):12467-12472(2004)；和Lee等人,J.Immunol.Methods 284(1-2):119-132(2004)中。
在某些噬菌体展示方法中，通过聚合酶链反应(PCR)分别克隆VH和VL基因的库，并在噬菌体文库中随机重组，然后如Winter等人,Ann.Rev.Immunol.,12:433-455(1994)所述从中筛选抗原结合噬菌体。噬菌体通常展示抗体片段，即单链Fv(scFv)片段或Fab片段。来自免疫来源的文库提供针对免疫原的高亲和力抗体，而不需要构建杂交瘤。或者，可以(例如，从人)克隆天然库以提供针对多种非自身和自身抗原的单一抗体来源，而无需任何免疫，如Griffiths等人，EMBO J,12:725-734(1993)所述。最后，如Hoogenboom和Winter,J.Mol.Biol.,227:381-388(1992)所述，也可以通过克隆来自干细胞的未重排V基因区段、并使用含有编码高度可变的CDR3区的随机序列的PCR引物并完成体外重排，合成地制备天然文库。描述人抗体噬菌体文库的专利出版物包括，例如：美国专利号5,750,373和美国专利公开号2005/0079574、2005/0119455、2005/0266000、2007/0117126、2007/0160598、2007/0237764、2007/0292936和2009/0002360。
从人抗体文库分离的抗体或抗体片段在本文中被认为是人抗体或人抗体片段。
6.多特异性抗体
在某些实施方案中，本文提供的抗体是多特异性抗体，例如，双特异性抗体。多特异性抗体是对至少两个不同位点具有结合特异性的单克隆抗体。双特异性抗体可以制备成全长抗体或抗体片段。
制备多特异性抗体的技术包括但不限于具有不同特异性的两个免疫球蛋白重链-轻链对的重组共表达(参见Milstein和Cuello,Nature 305:537(1983))、WO 93/08829,和Traunecker等人,EMBO J.10:3655(1991))和“杵入臼”工程化(参见例如美国专利号5,731,168)。在一些实施方案中，抗体包含第一和第二半抗体，其中第一半抗体包含含有杵突变的第一重链恒定区，第二重链包含含有臼突变的第二重链恒定区；或者，其中第一半抗体包含含有臼突变的第一重链恒定区，第二重链包含含有杵突变的第二重链恒定区。在一些实施方案中，抗体是IgG1抗体，并且杵突变包含T366W突变。在一些实施方案中，抗体是IgG1抗体，并且臼突变包含选自T366S、L368A和Y407V的至少一个、至少两个或三个突变。在一些实施方案中，抗体是IgG4抗体，并且杵突变包含T366W突变。在一些实施方案中，抗体是IgG4抗体，并且臼突变包含选自T366S、L368A和Y407V突变的至少一个、至少两个或三个突变。上述突变位置的编号是EU编号。重链序列中突变的实际位置可以变化，例如，取决于之前可变区的长度，例如变化多达10个位置。
还可以通过如下方法制备多特异性抗体：用于制备抗体Fc-异二聚体分子的工程化静电转向效应(WO2009/089004A1)；交联两个或更多个抗体或片段(参见例如，美国专利号4,676,980和Brennan等人,Science,229:81(1985))；使用亮氨酸拉链产生双特异性抗体(参见例如，Kostelny等人,J.Immunol.,148(5):1547-1553(1992))；使用“双抗体”技术制备双特异性抗体片段(参见例如，Hollinger等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993))；使用单链Fv(sFv)二聚体(参见例如Gruber等人,J.Immunol.,152:5368(1994))；和例如，如Tutt等人J.Immunol.147:60(1991)描述的制备三特异性抗体。在一些实施方案中，抗体是双抗体(diabody)。双抗体是具有两个抗原结合位点的抗体片段，其可以是二价或双特异性的。参见，例如，EP 404,097；WO 1993/01161；Hudson等人,Nat.Med.9:129-134(2003)；和Hollinger等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448(1993)。
在Hudson等人,Nat.Med.9:129-134(2003)中描述了三抗体(triabody)和四抗体(tetrabody)。在一些实施方案中，抗体是三抗体。在一些实施方案中，三抗体包含第一抗原识别位点、第二抗原识别位点和第三抗原识别位点，其中至少一个抗原识别位点不同于其他抗原识别位点。在一些实施方案中，三抗体包含结合三种不同聚泛素的第一、第二和第三抗原识别位点。在一些实施方案中，三抗体包含结合选自K11连接的聚泛素、K48连接的聚泛素、K63连接的聚泛素和C-末端至N-末端连接的聚泛素的任何三种聚泛素的第一、第二和第三抗原识别位点。每个抗原识别位点可包含HVR或上文讨论的VL和VH的组合。
在一些实施方案中，抗体是四抗体。在一些实施方案中，四抗体包含第一抗原识别位点、第二抗原识别位点、第三抗原识别位点和第四抗原识别位点，其中至少一个或至少两个抗原识别位点不同于另外的抗原识别位点。在一些实施方案中，四抗体包含结合三种不同聚泛素的第一、第二和第三抗原识别位点。在一些实施方案中，四抗体包含结合选自K11连接的聚泛素、K48连接的聚泛素、K63连接的聚泛素和C-末端至N-末端连接的聚泛素中的任何三种聚泛素的第一、第二和第三抗原识别位点。在一些实施方案中，四抗体包含结合四种不同聚泛素的第一、第二、第三和第四抗原识别位点。在一些实施方案中，四抗体包含结合K11连接的聚泛素、K48连接的聚泛素、K63连接的聚泛素和C-末端至N-末端连接的聚泛素的第一、第二、第三和第四抗原识别位点。每个抗原识别位点可包含HVR的组合或上文讨论的VL和VH的组合。
本文还包括具有三个或更多个功能性抗原结合位点的工程化抗体，包括“章鱼抗体”(参见例如US 2006/0025576A1)。术语章鱼抗体以US 2006/0025576A1中讨论的那些意义使用，并不意指由章鱼产生或从章鱼获得的抗体。
本文的抗体或片段还包括“双重作用FAb”或“DAF”，其包含结合两种不同抗原的两个抗原结合位点(例如，参见US2008/0069820)。例如，两种不同的抗原可以是上面讨论的任何聚泛素，如K11-、K48-、K63-或C-末端至N-末端连接的聚泛素。
7.抗体变体
在某些实施方案中，涵盖本文提供的抗体的氨基酸序列变体。例如，可能期望改善抗体的结合亲和力和/或其他生物学特性。可以通过将适当的修饰引入编码抗体的核苷酸序列中、或通过肽合成来制备抗体的氨基酸序列变体。此类修饰包括例如抗体氨基酸序列内残基的缺失、和/或***和/或取代。可以制备缺失、***和取代的任何组合以获得最终构建体，只要最终构建体具有期望的特征，例如抗原结合。
a)取代、***和缺失变体
在某些实施方案中，提供了具有一个或多个氨基酸取代的抗体变体。用于取代诱变的目标位点包括HVR和FR。表1中在“优选取代”的标题下显示了保守取代。表1中在“示例性取代”的标题下提供了更多实质性变化，并且下文中参照氨基酸侧链类别进行了进一步的描述。可以将氨基酸取代引入目标抗体中，并筛选产物的期望活性，例如保留/改善的抗原结合、降低的免疫原性，或改善的ADCC或CDC。
表1
Figure BDA0004074180330000611
Figure BDA0004074180330000621
可根据共有的侧链性质对氨基酸进行分组：
(1)疏水性：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；
(2)中性亲水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；
(3)酸性：Asp、Glu；
(4)碱性：His、Lys、Arg；
(5)影响链方向的残基：Gly、Pro；
(6)芳香性：Trp、Tyr、Phe。
非保守取代需要将这些类别之一的成员交换为另一类别。
一种类型的取代变体包括取代亲本抗体(例如人源化或人抗体)的一个或多个高变区残基。通常，选择用于进一步研究的所得变体相对于亲本抗体具有某些生物学特性的修饰(例如，改善)(例如，增加的亲和力、降低的免疫原性)和/或基本上保留了亲本抗体的某些生物学特性。示例性的取代变体是亲和力成熟的抗体，例如，其可以使用如本文所述的那些基于噬菌体展示的亲和力成熟技术方便地产生。简言之，突变一个或多个HVR残基并在噬菌体上展示变体抗体并筛选特定的生物活性(例如结合亲和力)。
可以在HVR中进行改变(例如，取代)，例如，以改善抗体亲和力。这种改变可以在HVR“热点”中进行，该“热点”即在体细胞成熟过程中经历高频突变的密码子编码的残基(参见，例如，Chowdhury,Methods Mol.Biol.207:179-196(2008))，和/或SDR(a-CDR)，测试所得变体VH或VL的结合亲和力。通过构建和从二级文库中重新选择的亲和力成熟已经描述在例如Hoogenboom等人Methods in Molecular Biology 178:1-37(O’Brien等人编辑，HumanPress,Totowa,NJ,(2001))中。在亲和力成熟的一些实施方案中，通过多种方法中的任何一种(例如，易错PCR、链改组或寡核苷酸定向诱变)将多样性引入选择用于成熟的可变基因中。然后创建二级文库。然后筛选文库以鉴定具有期望亲和力的任何抗体变体。引入多样性的另一种方法包括HVR定向的方法，其中几个HVR残基(例如，每次4-6个残基)被随机化。例如可以使用丙氨酸扫描诱变或建模特异性地鉴定参与抗原结合的HVR残基。具体地通常靶向CDR-H3和CDR-L3。
在某些实施方案中，取代、***或缺失可以在一个或多个HVR内发生，只要这种改变不实质上降低抗体结合抗原的能力。例如，可以在HVR中进行基本上不降低结合亲和力的保守改变(例如，如本文提供的保守取代)。这种改变可以在HVR“热点”或SDR以外。在上文提供的变体VH和VL序列的某些实施方案中，每个HVR未改变、或含有不超过一个、两个或三个氨基酸取代。
用于鉴定可以靶向诱变的抗体残基或区域的有用的方法称为“丙氨酸扫描诱变”，如Cunningham和Wells(1989)Science,244:1081-1085所述。在该方法中，鉴定残基或一组靶残基(例如带电荷的残基，如arg、asp、his、lys和glu)并用中性或带负电荷的氨基酸(例如丙氨酸或聚丙氨酸)代替以确定抗体与抗原的相互作用是否受到影响。可以在证明对初始取代是功能敏感的氨基酸位置上引入进一步的取代。或者，或另外地，抗原-抗体复合物的晶体结构用于鉴定抗体和抗原之间的接触点。可以作为取代候选物靶向或消除这种接触残基和邻近残基。可以筛选变体以确定它们是否含有期望的性质。
氨基酸序列***包括氨基-和/或羧基-末端融合(长度范围从一个残基到含有一百个或更多个残基的多肽)，以及单个或多个氨基酸残基的序列内***。末端***的实例包括具有N-末端甲硫氨酰残基的抗体。抗体分子的其他***变体包括抗体的N-或C-末端与酶(例如对于ADEPT)或多肽的融合，所述多肽增加抗体的血清半衰期。
b)糖基化变体
在某些实施方案中，改变本文提供的抗体以增加或降低抗体糖基化的程度。可以通过改变氨基酸序列以产生或除去一个或多个糖基化位点而方便地完成抗体糖基化位点的添加或缺失。
当抗体包含Fc区时，可以改变与其连接的碳水化合物。由哺乳动物细胞产生的天然抗体通常包含支链的双触角寡糖，其通常通过N-键连接至Fc区的CH2结构域的Asn297。参见，例如，Wright等人TIBTECH 15:26-32(1997)。寡糖可包括各种碳水化合物，例如甘露糖、N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖和唾液酸、以及与双触角寡糖结构的“茎”中的GlcNAc连接的岩藻糖。在一些实施方案中，可以对抗体中的寡糖进行修饰以产生具有某些改善的性质的抗体变体。
在一些实施方案中，提供了具有碳水化合物结构的抗体变体，所述碳水化合物结构缺乏(直接或间接)与Fc区连接的岩藻糖。例如，这种抗体中岩藻糖的量可以是1％至80％、1％至65％、5％至65％或20％至40％。通过计算相对于与Asn 297连接的所有糖结构(例如复合、杂合和高甘露糖结构)的总和，计算Asn297中糖链内岩藻糖的平均量来确定岩藻糖的量，如通过MALDI-TOF质谱法测量，例如，如WO2008/077546中所述。Asn297是指位于Fc区约297位的天冬酰胺残基(Fc区残基的Eu编号)；然而，由于抗体中的微小序列变异，Asn297也可位于297位上游或下游的约±3个氨基酸，即294位和300位之间。此类岩藻糖基化变体可具有改善的ADCC功能。参见，例如，美国专利公开号US 2003/0157108(Presta,L.)；US 2004/0093621(Kyowa Hakko Kogyo Co.,Ltd)。与“去岩藻糖基化”或“岩藻糖缺陷”抗体变体相关的出版物的实例包括：US 2003/0157108；WO 2000/61739；WO2001/29246；US2003/0115614；US 2002/0164328；US 2004/0093621；US2004/0132140；US 2004/0110704；US 2004/0110282；US 2004/0109865；WO 2003/085119；WO 2003/084570；WO 2005/035586；WO 2005/035778；WO2005/053742；WO2002/031140；Okazaki等人，J.Mol.Biol.336:1239-1249(2004)；Yamane-Ohnuki等人Biotech.Bioeng.87:614(2004)。能够产生去岩藻糖基化抗体的细胞系的实例包括蛋白岩藻糖基化缺陷的Lec13CHO细胞(Ripka等人Arch.Biochem.Biophys.249:533-545(1986)；美国专利申请号US 2003/0157108 A1,Presta,L；和WO 2004/056312A1,Adams等人，特别是实施例11)、和基因敲除细胞系，如α-1,6-岩藻糖基转移酶基因，FUT8敲除的CHO细胞(参见，例如，Yamane-Ohnuki等人Biotech.Bioeng.87:614(2004)；Kanda,Y.等人,Biotechnol.Bioeng.,94(4):680-688(2006)；和WO2003/085107)。
进一步提供具有二等分寡糖的抗体变体，例如，其中与抗体Fc区连接的双触角寡糖被GlcNAc二等分。此类抗体变体可具有降低的岩藻糖基化和/或改善的ADCC功能。此类抗体变体的实例描述于例如WO 2003/011878(Jean-Mairet等人)；美国专利号6,602,684(Umana等人)；和US 2005/0123546(Umana等人)。还提供了与Fc区连接的寡糖中具有至少一个半乳糖残基的抗体变体。此类抗体变体可具有改善的CDC功能。此类抗体变体描述于例如WO 1997/30087(Patel等人)；WO1998/58964(Raju,S.)；和WO 1999/22764(Raju,S.)。
c)Fc区变体
在某些实施方案中，可以将一个或多个氨基酸修饰引入本文提供的抗体Fc区，从而产生Fc区变体。Fc区变体可包含人Fc区序列(例如，人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc区)，其在一个或多个氨基酸位置包含氨基酸修饰(例如取代)。
在某些实施方案中，抗体变体具有一些但不是所有的效应功能，这使得理想候选者用于其中抗体体内半衰期是重要的但某些效应功能(如补体和ADCC)是不必要的或是有害的应用中。可以进行体外和/或体内细胞毒性测定法以确认CDC和/或ADCC活性的减少/消耗。例如，可以进行Fc受体(FcR)结合测定法以确保抗体缺乏FcγR结合(因此可能缺乏ADCC活性)，但保留FcRn结合能力。介导ADCC的原代细胞(NK细胞)仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。在Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol.9:457-492(1991)的第464页的表3中总结了造血细胞上的FcR表达。用于评估目标分子ADCC活性的体外测定法的非限制性实例描述于美国专利号5,500,362(参见，例如Hellstrom,I.等人Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 83:7059-7063(1986))和Hellstrom,I等人,Proc.Nat’lAcad.Sci.USA 82:1499-1502(1985)；5,821,337(参见Bruggemann,M.等人,J.Exp.Med.166:1351-1361(1987))。或者，可以使用非放射性测定方法(参见，例如，用于流式细胞术的ACTITM非放射性细胞毒性测定法(CellTechnology,Inc.Mountain View,CA；和CytoTox
Figure BDA0004074180330000661
非放射性细胞毒性测定法(Promega,Madison,WI)。用于此类测定法的有用效应细胞包括外周血单个核细胞(PBMC)和自然杀伤(NK)细胞。或者，或另外地，可在体内评估目的分子的ADCC活性，例如在动物模型中，如Clynes等人Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 95:652-656(1998)所公开的动物模型。还可以进行C1q结合测定法以确认抗体不能结合C1q并因此缺乏CDC活性。参见例如WO2006/029879和WO 2005/100402中的C1q和C3c结合ELISA。为了评估补体激活，可以进行CDC测定法(参见，例如，Gazzano-Santoro等人,J.Immunol.Methods 202:163(1996)；Cragg,M.S.等人,Blood101:1045-1052(2003)；以及Cragg,M.S.和M.J.Glennie,Blood103:2738-2743(2004))。还可以使用本领域已知的方法进行FcRn结合和体内清除/半衰期测定(参见，例如，Petkova,S.B.等人,Int’l.Immunol.18(12):1759-1769(2006))。
具有降低的效应功能的抗体包括具有Fc区残基238、265、269、270、297、327和329中的一个或多个的取代的抗体(美国专利号6,737,056)。此类Fc突变体包括在氨基酸位置265、269、270、297和327中的两处或更多处具有取代的Fc突变体，包括所谓的“DANA”Fc突变体，其残基265和297取代为丙氨酸(美国专利号7,332,581)。
描述了具有改善或减弱的与FcR结合的某些抗体变体。(参见，例如，美国专利号6,737,056；WO 2004/056312，和Shields等人,J.Biol.Chem.9(2):6591-6604(2001)。
在某些实施方案中，抗体变体包含具有一个或多个改善ADCC的氨基酸取代的Fc区，例如Fc区的298、333和/或334位的取代(EU残基编号)。
在一些实施方案中，在Fc区中进行改变，其导致改变(即，改善或减少)的C1q结合和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)，例如，如美国专利号6,194,551、WO 99/51642和Idusogie等人J.Immunol.164:4178-4184(2000)所述。
具有增加的半衰期和改善的与新生儿Fc受体(FcRn)(其负责将母体IgG转移至胎儿(Guyer等人,J.Immunol.117:587(1976)and Kim等人,J.Immunol.24:249(1994)))结合的抗体描述于US2005/0014934A1(Hinton等人)中。那些抗体包含其中具有一个或多个取代的Fc区，这些取代改善Fc区与FcRn的结合。此类Fc变体包括在以下一个或多个Fc区残基中具有取代的那些变体：238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434，例如，Fc区残基434的取代(美国专利号7,371,826)。
关于Fc区变体的其他实例，还参见Duncan&Winter,Nature 322:738-40(1988)；美国专利号5,648,260；美国专利号5,624,821；和WO 94/29351。
d)半胱氨酸工程化的抗体变体
在某些实施方案中，可能期望产生半胱氨酸工程化的抗体，例如“thioMAb”，其中抗体的一个或多个残基被半胱氨酸残基取代。在特定的实施方案中，取代的残基发生在抗体的可及位点。通过用半胱氨酸取代那些残基，由此将反应性硫醇基团定位在抗体的可及位点，并且可以用于将抗体与其他部分(如药物部分或接头-药物部分)缀合，以产生免疫缀合物，如本文进一步描述的。在某些实施方案中，以下残基中的任何一个或多个可以被半胱氨酸取代：轻链的V205(Kabat编号)；轻链的K149(Kabat编号)；重链的A118(EU编号)；和重链Fc区的S400(EU编号)。可以如例如美国专利号7,521,541中所述产生半胱氨酸工程化的抗体。
e)抗体衍生物
在某些实施方案中，可以进一步修饰本文提供的抗体以包含本领域已知且易于获得的其他非蛋白质部分。适于抗体衍生化的部分包括但不限于水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性实例包括但不限于聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇的共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1,3-二氧戊环、聚-1,3,6-三噁烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或无规共聚物)、和葡聚糖或聚(N-乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇及其混合物。聚乙二醇丙醛由于其在水中的稳定性而在制造中具有优势。聚合物可以是任何分子量，并且可以是支链或非支链的。与抗体连接的聚合物的数量可以变化，并且如果连接了多于一种聚合物，这些聚合物可以是相同或不同的分子。通常，用于衍生化的聚合物的数量和/或类型可以基于以下考虑因素来确定，包括但不限于待改善抗体的特定性质或功能、抗体衍生物是否将用于明确条件下的治疗中，等等。
在另一个实施方案中，提供了抗体与非蛋白质部分的缀合物，所述非蛋白质部分可以通过暴露于辐射而选择性加热。在一些实施方案中，非蛋白质部分是碳纳米管(Kam等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102:11600-11605(2005))。辐射可以是任何波长，包括但不限于这样的波长，其不损害正常细胞但是将非蛋白质部分加热到抗体-非蛋白质部分附近的细胞被杀死的温度。
B.重组方法和组合物
可以使用重组方法和组合物产生抗体，例如，如美国专利号4,816,567中所述。在一些实施方案中，提供了编码本文所述抗体的分离的核酸。此类核酸可编码包含VL的氨基酸序列和/或包含抗体VH的氨基酸序列(例如抗体的轻链和/或重链)。在进一步的实施方案中，提供了包含此类核酸的一种或多种载体(例如，表达载体)。在进一步的实施方案中，提供了包含此类核酸的宿主细胞。在一些这样的实施方案中，宿主细胞包含(例如，已转化有):(1)包含核酸的载体，所述核酸编码包含抗体VL的氨基酸序列和包含抗体VH的氨基酸序列，或(2)第一载体和第二载体，所述第一载体包含编码包含抗体VL的氨基酸序列的核酸，所述第二载体包含编码包含抗体VH的氨基酸序列的核酸。在一些实施方案中，宿主细胞是真核细胞，例如，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或淋巴样细胞(例如，Y0、NS0、Sp20细胞)。在一些实施方案中，提供了制备本文公开的抗体的方法，其中所述方法包括在适于表达抗体的条件下培养包含编码上述抗体的核酸的宿主细胞，和任选地从宿主细胞(或宿主细胞培养基)中回收抗体。
在一些实施方案中，多特异性抗体(例如，第一半抗体和第二半抗体)的组分在分开的细胞或细胞培养物中表达，然后在体外组合。在其他实施方案中，多特异性抗体的所有组分在相同的细胞或细胞培养物中表达。
为了重组产生抗体，分离例如如上所述的编码抗体的核酸，并将其***一个或多个载体中，用于在宿主细胞中进一步克隆和/或表达。可以使用常规方法容易地分离和测序这种核酸(例如，通过使用能够与编码抗体重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)。
用于克隆或表达编码抗体的载体的合适宿主细胞包括本文所述的原核或真核细胞。例如，可以在细菌中产生抗体，特别是当不需要糖基化和Fc效应功能时。对于在细菌中表达抗体片段和多肽，参见例如美国专利号5,648,237、5,789,199和5,840,523。(还参见Charlton,Methods in Molecular Biology,第248卷(B.K.C.Lo,编辑,Humana Press,Totowa,NJ,2003)，第245-254页，描述了抗体片段在大肠杆菌中的表达)。表达后，可以从细菌细胞糊中以可溶性级分分离抗体，并且可以进一步纯化。
除原核生物外，真核微生物如丝状真菌或酵母是编码抗体的载体的合适的克隆或表达宿主，包括其糖基化通路已被“人源化”的真菌和酵母菌株，导致产生具有部分或完全人糖基化模式的抗体。参见Gerngross,Nat.Biotech.22:1409-1414(2004),和Li等人,Nat.Biotech.24:210-215(2006)。
用于表达糖基化抗体的合适宿主细胞也来自多细胞生物(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的实例包括植物和昆虫细胞。已经鉴定了许多杆状病毒株，其可以与昆虫细胞结合使用，特别是用于转染草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞。
植物细胞培养物也可用作宿主。参见，例如，美国专利号5,959,177、6,040,498、6,420,548、7,125,978和6,417,429(描述了用于在转基因植物中产生抗体的PLANTIBODIESTM技术)。
脊椎动物细胞也可用作宿主。例如，适于在悬浮液中生长的哺乳动物细胞系可能是有用的。有用的哺乳动物宿主细胞系的其他实例是由SV40转化的猴肾CV1细胞系(COS-7)；人胚肾细胞系(293或293细胞，如，例如Graham等人,J.Gen Virol.36:59(1977))所述)；小仓鼠肾细胞(BHK)；小鼠睾丸支持细胞(TM4细胞，如，例如Mather,Biol.Reprod.23:243-251(1980)中所述)；猴肾细胞(CV1)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76)；人***细胞(HELA)；犬肾细胞(MDCK；大鼠(buffalo rat)肝细胞(BRL 3A)；人肺细胞(W138)；人肝细胞(Hep G2)；小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562)；TRI细胞，如例如Mather等人,Annals N.Y.Acad.Sci.383:44-68(1982)所述；MRC 5细胞；和FS4细胞。其他有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括DHFR-CHO细胞(Urlaub等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216(1980))；和骨髓瘤细胞系如Y0、NS0和Sp2/0。对于适合抗体产生的某些哺乳动物宿主细胞系的综述，参见，例如，Yazaki和Wu,Methods in Molecular Biology,Vol.248(B.K.C.Lo,ed.,HumanaPress,Totowa,NJ),第255-268(2003)页。
C.测定法
可通过本领域已知的各种测定法鉴定、筛选或表征本文提供的抗体的物理/化学性质和/或生物活性。
在一些方面，测试抗体的抗原结合活性，例如通过已知方法，如ELISA、FACS或蛋白质印迹。
在另一个方面，可使用竞争测定法鉴定与本文所述的任何抗体竞争结合混合拓扑结构聚泛素的抗体。在某些实施方案中，这种竞争性抗体结合与本文所述抗体结合的表位相同的表位(例如，线性或构象表位)。用于绘制抗体结合的表位的详细示例性方法在Morris(1996)“Epitope Mapping Protocols,”in Methods in Molecular Biologyvol.66(Humana Press,Totowa,NJ)中提供。
在示例性竞争测定法中，将固定的混合拓扑结构聚泛素与包含第一标记抗体和第二未标记抗体的溶液孵育，所述第一标记抗体(例如，本文所述的任何抗体)与混合拓扑结构聚泛素结合，测试所述第二未标记抗体与第一抗体竞争结合混合拓扑结构聚泛素的能力。第二抗体可以存在于杂交瘤上清液中。作为对照，将混合拓扑结构聚泛素在包含第一标记抗体但不包含第二未标记抗体的溶液中孵育。在允许第一抗体与混合拓扑结构聚泛素结合的条件下孵育后，除去过量的未结合抗体，并测量与固定的混合拓扑结构聚泛素结合的标记的量。如果相对于对照样品，测试样品中与固定的混合拓扑结构聚泛素结合的标记的量实质上减少，则表明第二抗体与第一抗体竞争结合混合拓扑结构聚泛素。参见Harlow和Lane(1988)Antibodies:A Laboratory Manual ch.14(Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY)。
D.免疫缀合物
提供了免疫缀合物，其包含与一种或多种细胞毒性剂缀合的本文公开的抗体，所述细胞毒性剂如化疗剂或药物、生长抑制剂、毒素(例如，蛋白质毒素，细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素，或其片段)、或放射性同位素(即放射性缀合物)。
免疫缀合物允许将药物部分靶向递送至肿瘤或其他患病细胞或组织，并且在一些实施方案中允许其中的细胞内积累，而全身施用未缀合的药物可导致对正常细胞不可接受的毒性水平(Polakis P.(2005)Current Opinion in Pharmacology 5:382-387)。
抗体-药物缀合物(ADC)是靶向化疗分子，其通过将有效的细胞毒性药物靶向表达抗原的肿瘤细胞而组合抗体和细胞毒性药物的性质(Teicher,B.A.(2009)Current CancerDrug Targets 9:982-1004)，从而通过最大化功效和最小化脱靶毒性来增强治疗指数(Carter,P.J.and Senter P.D.(2008)The Cancer Jour.14(3):154-169；Chari,R.V.(2008)Acc.Chem.Res.41:98-107。
ADC化合物包括具有抗癌活性的化合物。在一些实施方案中，ADC化合物包括与药物部分缀合(即共价连接)的抗体。在一些实施方案中，抗体通过接头共价连接至药物部分。抗体-药物缀合物(ADC)可以选择性地将有效剂量的药物递送至肿瘤组织，由此可以在增加治疗指数(“治疗窗”)的同时实现更高的选择性，即更低的有效剂量。
抗体-药物缀合物(ADC)的药物部分(D)可包括具有细胞毒性或细胞抑制作用的任何化合物、部分或基团。药物部分可通过以下机制给予其细胞毒性和细胞抑制作用：包括但不限于微管蛋白结合、DNA结合或***、以及抑制RNA聚合酶、蛋白质合成和/或拓扑异构酶。示例性药物部分包括但不限于美登木素(maytansinoid)、多拉司他汀(dolastatin)、奥瑞他汀(auristatin)、加利车霉素(calicheamicin)、吡咯并苯并二氮杂卓(PBD)、奈莫柔比星(nemorubicin)及其衍生物、PNU-159682、蒽环霉素(anthracycline)、多卡米星(duocarmycin)、长春花生物碱、紫杉烷、单端孢菌素、CC1065、喜树碱、依利奈法德、及具有细胞毒活性的其立体异构体、等排物、类似物和衍生物。
E.用于诊断和检测的方法和组合物
在某些实施方案中，本文提供的任何抗体可用于检测生物样品中混合拓扑结构聚泛素的存在。如本文所用的术语“检测”包括定量或定性检测。“生物样品”包括例如细胞或组织(例如，活检材料，包括癌性或潜在癌性结肠、结直肠、小肠、子宫内膜、胰腺、乳腺、肺、***或卵巢组织)。
在一些实施方案中，本文公开的抗体用于诊断或检测方法中。在另一方面，提供了一种检测生物样品中混合拓扑结构聚泛素的存在的方法。在某些实施方案中，该方法包括在允许抗体与混合拓扑结构聚泛素结合的条件下使生物样品与如本文所述的抗体接触，以及检测在生物样品中抗体和混合拓扑结构聚泛素之间是否形成复合物。这种方法可以是体外或体内方法。在一些实施方案中，抗体用于选择适合用抗混合拓扑结构聚泛素抗体治疗的受试者，例如，其中混合拓扑结构聚泛素是选择患者的生物标志物。在一些实施方案中，生物样品是细胞或组织(例如，活检材料，包括癌性或潜在癌性组织)。
在一些实施方案中，提供了检测生物样品中聚泛素化蛋白的方法，所述聚泛素化蛋白在两个或更多个位置上与至少第一和第二聚泛素聚泛素化，其中第一和第二聚泛素具有不同的键。在某些实施方案中，该方法包括在允许抗体与聚泛素化蛋白质结合的条件下使生物样品与如本文所述的抗体接触，以及检测在生物样品中抗体和聚泛素化蛋白质之间是否形成复合物。这种方法可以是体外或体内方法。在一些实施方案中，抗体用于选择适合用本文公开的抗体治疗的受试者，例如，其中在两个或更多个位置上与至少第一和第二聚泛素聚泛素化的聚泛素化蛋白质是用于选择患者的生物标志物，其中至少第一和第二聚泛素具有不同的键。在一些实施方案中，生物样品是细胞或组织(例如，活检材料，包括癌性或潜在癌性组织)。
在进一步的实施方案中，例如，出于诊断、预后或分期疾病、确定适当的治疗过程、或监测对治疗的反应的目的，本文公开的抗体用于体内(例如通过体内成像)检测受试者中在两个或更多个位置上与具有不同键的至少第一和第二聚泛素聚泛素化的混合拓扑结构聚泛素或聚泛素化蛋白质。本领域已知的用于体内检测的一种方法是免疫-正电子发射断层扫描(免疫-PET)，如例如Dongen等人,The Oncologist12:1379-1389(2007)和Verel等人,J.Nucl.Med.44:1271-1281(2003)所述。在此类实施方案中，提供了用于检测受试者中的混合拓扑结构聚泛素的方法，该方法包括向受试者施用标记的抗体，以及检测受试者中标记的抗混合拓扑结构聚泛素抗体。在某些这样的实施方案中，标记的抗体包含(例如，缀合)正电子发射体，如68Ga、18F、64Cu、86Y、76Br、89Zr和124I。在一个特定的实施方案中，正电子发射体是89Zr。制备和使用89Zr标记的抗体的非限制性示例性方法描述于例如PCT公开号WO2011/056983中。在一些实施方案中，标记的抗体是与一种或多种锆复合物缀合的半胱氨酸工程化的抗体。参见，例如，WO2011/056983。
在进一步的实施方案中，诊断或检测方法包括使固定在基质上的本文公开的第一抗体与待测试(测试混合拓扑结构聚泛素或在两个或更多个位置上与具有不同键的至少第一和第二聚泛素聚泛素化的聚泛素化蛋白质的存在)生物样品接触，使基质暴露于结合混合拓扑结构聚泛素或聚泛素化蛋白质的第二抗体，以及检测第二抗体是否与第一抗体和生物样品中的混合拓扑结构聚泛素或聚泛素化蛋白质之间的复合物结合(有时称为夹心测定法)。基质可以是任何支持性介质，例如玻璃、金属、陶瓷、聚合物珠、载玻片、芯片和其他基质。在某些实施方案中，生物样品包含细胞或组织(例如，活检材料，包括癌性或潜在癌性结肠、结直肠、小肠、子宫内膜、胰腺或卵巢组织)。在某些实施方案中，第一或第二抗体是本文描述的任何抗体。
在某些实施方案中，本文公开的抗体是标记的。标记包括但不限于直接检测的标记或部分(如荧光、发色、电子致密、化学发光和放射性标记)，以及例如通过酶促反应或分子相互作用间接检测的部分，如酶或配体。示例性标记包括但不限于放射性同位素32P、14C、125I、3H和131I，荧光团如稀土螯合物或荧光素及其衍生物，罗丹明及其衍生物，丹酰基，伞形酮，荧光素酶(luceriferases)例如萤火虫荧光素酶和细菌荧光素酶(美国专利号4,737,456)，荧光素，2,3-二氢酞嗪二酮，辣根过氧化物酶(HRP)，碱性磷酸酶，β-半乳糖苷酶，葡糖淀粉酶，溶菌酶，糖氧化酶，例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，杂环氧化酶如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶，与使用过氧化氢的酶偶联以氧化染料前体如HRP，乳过氧化物酶或微过氧化物酶，生物素/抗生物素蛋白，旋转标记，噬菌体标记，稳定的自由基，等等。在另一个实施方案中，标记是正电子发射体。正电子发射体包括但不限于68Ga、18F、64Cu、86Y、76Br、89Zr和124I。在一个具体实施方案中，正电子发射体是89Zr。
可以使用本文公开的抗体通过许多方法分析样品中混合拓扑结构聚泛素或在两个或更多个位置上与具有不同键的至少第一和第二聚泛素聚泛素化的聚泛素化蛋白的存在，其中的许多方法是本领域已知并且是技术人员理解的，包括但不限于免疫组化(“IHC”)、蛋白质印迹分析、免疫沉淀、分子结合测定法、ELISA、ELIFA、荧光激活的细胞分选(“FACS”)、基于定量血液的测定法(例如血清ELISA)。用于评估蛋白质状态的典型方案例如在Ausubel等人,编辑,1995,Current Protocols In Molecular Biology,Unit 15(Immunoblotting)中找到。也可以使用多重免疫测定法，例如可从Rules Based Medicine或Meso Scale Discovery(“MSD”)中获得的那些。
在一些实施方案中，提供了基本上不含单特异性抗体、未装配的半抗体或单特异性抗体和未装配的半抗体的组合物。单特异性抗体是不包含一种以上类型的抗原识别位点的抗体，例如，仅具有一组六个CDR的抗体或其中每组六个CDR相同的抗体。这样的抗体也被认为是单特异性抗体：例如，其中对于少量氨基酸残基，第一组CDR仅与任何其他组CDR稍微不同，这些不同并不导致优先结合不同的抗原。未装配的半抗体与另一半抗体不稳定结合(共价或非共价)，例如，当通过适当的技术(如尺寸排阻色谱法、质谱或电泳)分析时，显示为单个重/轻链单元。
F.药物制剂
通过将具有所需纯度的抗体或免疫缀合物与一种或多种任选的药学上可接受的载体混合以冻干制剂或水溶液的形式来制备如本文所述的抗体或免疫缀合物的药物制剂(Remington's Pharmaceutical Sciences第16版,Osol,A.编辑(1980))。药学上可接受的载体通常在所用剂量和浓度下对接受者无毒，其包括但不限于：缓冲液，如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；六甲基氯化铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；酚醇、丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯，如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)的多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂如EDTA；糖类，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐抗衡离子如钠；金属配合物(例如锌-蛋白配合物)；和/或非离子表面活性剂，如聚乙二醇(PEG)。本文的示例性药学上可接受的载体还包括间隙药物分散剂，如可溶性中性活性透明质酸酶糖蛋白(sHASEGP)，例如人可溶性PH-20透明质酸酶糖蛋白，如rHuPH20(
Figure BDA0004074180330000761
Baxter International,Inc.)。某些示例性sHASEGP和使用方法，包括rHuPH20，描述于美国专利公开号2005/0260186和2006/0104968中。在一些方面，sHASEGP与一种或多种另外的糖胺聚糖酶如软骨素酶组合。
示例性的冻干抗体或免疫缀合物制剂描述于美国专利号No.6,267,958中。水性抗体或免疫缀合物制剂包括美国专利号6,171,586和WO2006/044908中描述的那些，后者的制剂包括组氨酸-乙酸盐缓冲液。
本文的制剂还可含有一种以上所治疗的具体适应症所必需的的活性成分，优选那些具有互补活性但不相互产生不利影响的活性成分。
可以将活性成分包埋在微胶囊中，所述微胶囊例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备，例如分别在胶体药物递送***(例如，脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米颗粒和纳米胶囊)或在粗乳液中的羟甲基纤维素或明胶-微胶囊和聚-(甲基-甲基丙烯酸酯)微胶囊。这些技术公开于Remington's Pharmaceutical Sciences第16版,Osol,A.编辑(1980)。
可以制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适实例包括含有抗体或免疫缀合物的固体疏水聚合物的半透性基质，该基质是成型制品的形式，例如，薄膜或微胶囊。
用于体内施用的制剂通常是无菌的。例如，通过无菌过滤膜过滤可以容易地实现无菌。
G.治疗方法和组合物
本文提供的任何抗体或免疫缀合物可用于方法中，例如用于治疗方法中。
在另一个方面，提供了用作药物的本文公开的抗体或免疫缀合物。在其他方面，提供了用于治疗方法中的本文公开的抗体或免疫缀合物。在某些实施方案中，提供了用于治疗混合拓扑结构聚泛素阳性癌症的本文公开的抗体或免疫缀合物。
在另一方面，提供了本文公开的抗体或免疫缀合物在生产或制备药物中的用途。
根据任何上述实施方案的“个体”可以是人。
在另一方面，提供了药物制剂，其包含本文提供的任何抗体或免疫缀合物，例如，用于任何上述治疗方法中。在一些实施方案中，药物制剂包含本文提供的任何抗体或免疫缀合物和药学上可接受的载体。
本文提供的抗体或免疫缀合物可单独使用或与治疗中的其他药剂组合使用。例如，本文提供的抗体或免疫缀合物可与至少一种另外的治疗剂共同施用。
上述组合治疗包括组合施用(其中两种或更多种治疗剂包括在相同或分开的制剂中)和分开施用，在分开施用的情况下，本文提供的抗体或免疫缀合物的施用可以在施用另外的治疗剂和/或佐剂之前发生、同时发生和/或在其之后发生。
抗体或免疫缀合物(和任何另外的治疗剂)可以通过任何合适的方式施用，包括肠胃外、肺内和鼻内，并且如果需要局部治疗、病灶内施用。肠胃外输注包括肌内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下施用。可以通过任何合适的途径给药，例如，通过注射(如静脉内或皮下注射)给药，其部分取决于施用是短暂的还是长期的。本文考虑了各种给药方案，包括但不限于在各种时间点上的单次或多次施用、推注施用和脉冲输注。
抗体或免疫缀合物将以符合良好医学实践的方式配制、给药和施用。在此背景下考虑的因素包括所治疗的特定疾患、所治疗的特定哺乳动物、个体患者的临床状况、疾患的原因、药剂的递送部位、施用的方法、施用方案、以及医生所知的其他因素。抗体或免疫缀合物不必是、但任选地与一种或多种目前用于预防或治疗所讨论疾患的药剂配制。这些其他药剂的有效量取决于制剂中存在的抗体或免疫缀合物的量、疾患或治疗的类型、以及上面讨论的其他因素。这些通常以与本文所述相同的剂量和施用途径使用，或者以本文所述剂量的约1％至99％、或以任何经验/临床确定为合适的剂量和途径使用。
为了预防或治疗疾病，抗体或免疫缀合物的适当剂量(当单独使用或与一种或多种其他另外的治疗剂组合使用时)将取决于待治疗疾病的类型、抗体或免疫缀合物的类型、疾病的严重程度和病程(无论抗体或免疫缀合物的施用是为了预防还是治疗目的)、先前的治疗、患者的临床病史和对抗体或免疫缀合物的反应、以及主治医师的判断。抗体或免疫缀合物适合一次或在一系列治疗中施用于患者。
应理解，可使用免疫缀合物和抗体进行任何上述制剂或治疗方法。
H.制品
在另一方面，提供了含有可用于治疗、预防和/或诊断上述疾患的物质的制品。制品包括容器和容器上或与容器相关的标签或包装说明书。合适的容器包括例如瓶子、小瓶、注射器、IV溶液袋等。容器可以由多种材料制成，如玻璃或塑料。所述容器容纳组合物，所述组合物本身或与另一种组合物组合以有效治疗、预防和/或诊断疾患，并且所述容器可具有无菌进入口(例如，所述容器可以是静脉内溶液袋或具有皮下注射针头可刺穿的塞子的小瓶)。组合物中的至少一种活性剂是本文公开的抗体或免疫缀合物。标签或包装说明书表明该组合物用于治疗所选择的病症。此外，制品可包含(a)其中含有组合物的第一容器，其中所述组合物包含抗体或免疫缀合物；和(b)其中含有组合物的第二容器，其中所述组合物包含另外的细胞毒性剂或其他治疗剂。该实施方案中的制品可进一步包含包装说明书，其指示该组合物可用于治疗特定病症。或者，或另外地，制品还可包含第二(或第三)容器，其包含药学上可接受的缓冲液，如抑菌性注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液或右旋糖溶液。还可以包括从商业和用户角度所需的其他材料，包括其他缓冲液、稀释剂、过滤器、针头和注射器。
具体实施方案
1.一种对于混合拓扑结构聚泛素比单个拓扑结构聚泛素具有更高亲合性的抗体，其中所述混合拓扑结构聚泛素包含第一键和第二键，其中所述第一键和所述第二键彼此不同。
2.一种结合包含第一键和第二键的混合拓扑结构聚泛素的多特异性抗体，所述抗体包含对第一键特异的第一抗原识别位点和对第二键特异的第二抗原识别位点，其中所述第一键和所述第二键彼此不同。
3.根据前述实施方案中任一项所述的抗体，其包含对第一键特异的第一VH/VL单元和对第二键特异的第二VH/VL单元。
4.根据前述实施方案中任一项所述的抗体，所述抗体是杵入臼双特异性抗体；包含亮氨酸拉链的双特异性抗体；交联的抗体对；抗体Fc-异二聚体分子；双抗体；三抗体；四抗体；单链Fv二聚体；三特异性抗体；章鱼抗体；或双重作用FAb。
5.根据前述实施方案中任一项所述的抗体，其中第一键或第二键是K11键。
6.根据前述实施方案中任一项所述的抗体，其中第一键或第二键是K48键。
7.根据前述实施方案中任一项所述的抗体，其中第一键或第二键是K63键。
8.根据前述实施方案中任一项所述的抗体，其中第一键或第二键是C-末端至N-末端的键。
9.根据前述实施方案中任一项所述的抗体，其中第一键和第二键是：
a)K11键和K48键；
b)K11键和K63键；
c)K11键和C-末端至N-末端的键；
d)K48键和K63键；
e)K48键和C-末端至N-末端的键；或者
f)K63键和C-末端至N-末端的键。
10.根据前述实施方案中任一项所述的抗体，其包含第一半抗体，所述第一半抗体包含：
a)(i)包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列的HVR-H1，
(ii)包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列的HVR-H2，
(iii)包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列的HVR-H3，
(iv)包含SEQ ID NO：12的氨基酸序列的HVR-L1，
(v)包含EQ ID NO：13的氨基酸序列的HVR-L2，和
(vi)包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列的HVR-L3；
b)(i)包含SEQ ID NO：23的氨基酸序列的HVR-H1，
(ii)包含SEQ ID NO：24的氨基酸序列的HVR-H2，
(iii)包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列的HVR-H3，
(iv)包含SEQ ID NO：26的氨基酸序列的HVR-L1，
(v)包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列的HVR-L2，和
(vi)包含SEQ ID NO：28的氨基酸序列的HVR-L3；
c)(i)包含SEQ ID NO：37的氨基酸序列的HVR-H1，
(ii)包含SEQ ID NO：38的氨基酸序列的HVR-H2，
(iii)包含SEQ ID NO：39的氨基酸序列的HVR-H3，
(iv)包含SEQ ID NO：40的氨基酸序列的HVR-L1，
(v)包含SEQ ID NO：41的氨基酸序列的HVR-L2，和
(vi)包含SEQ ID NO：42的氨基酸序列的HVR-L3；或
d)(i)包含SEQ ID NO：51的氨基酸序列的HVR-H1，
(ii)包含SEQ ID NO：52的氨基酸序列的HVR-H2，
(iii)包含SEQ ID NO：53的氨基酸序列的HVR-H3，
(iv)包含SEQ ID NO：54的氨基酸序列的HVR-L1，
(v)包含SEQ ID NO：55的氨基酸序列的HVR-L2，和
(vi)包含SEQ ID NO：56的氨基酸序列的HVR-L3。
11.根据前述实施方案中任一项所述的抗体，其包含第二半抗体，所述第二半抗体包含：
a)(i)包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列的HVR-H1，
(ii)包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列的HVR-H2，
(iii)包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列的HVR-H3，
(iv)包含SEQ ID NO：12的氨基酸序列的HVR-L1，
(v)包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列的HVR-L2，和
(vi)包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列的HVR-L3；
b)(i)包含SEQ ID NO：23的氨基酸序列的HVR-H1，
(ii)包含SEQ ID NO：24的氨基酸序列的HVR-H2，
(iii)包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列的HVR-H3，
(iv)包含SEQ ID NO：26的氨基酸序列的HVR-L1，
(v)包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列的HVR-L2，和
(vi)包含SEQ ID NO：28的氨基酸序列的HVR-L3；
c)(i)包含SEQ ID NO：37的氨基酸序列的HVR-H1，
(ii)包含SEQ ID NO：38的氨基酸序列的HVR-H2，
(iii)包含SEQ ID NO：39的氨基酸序列的HVR-H3，
(iv)包含SEQ ID NO：40的氨基酸序列的HVR-L1，
(v)包含SEQ ID NO：41的氨基酸序列的HVR-L2，和
(vi)包含SEQ ID NO：42的氨基酸序列的HVR-L3；或
d)(i)包含SEQ ID NO：51的氨基酸序列的HVR-H1，
(ii)包含SEQ ID NO：52的氨基酸序列的HVR-H2，
(iii)包含SEQ ID NO：53的氨基酸序列的HVR-H3，
(iv)包含SEQ ID NO：54的氨基酸序列的HVR-L1，
(v)包含SEQ ID NO：55的氨基酸序列的HVR-L2，和
(vi)包含SEQ ID NO：56的氨基酸序列的HVR-L3，
其中第二半抗体的HVR与第一半抗体的HVR不同。
12.根据前述实施方案中任一项所述的抗体，其包含第一和第二半抗体，其中：
a)第一和第二半抗体之一包含
(i)包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列的HVR-H1，
(ii)包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列的HVR-H2，
(iii)包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列的HVR-H3，
(iv)包含SEQ ID NO：12的氨基酸序列的HVR-L1，
(v)包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列的HVR-L2，和
(vi)包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列的HVR-L3，和第一和第二半抗体中的另一个包含
(i)包含SEQ ID NO：23的氨基酸序列的HVR-H1，
(ii)包含SEQ ID NO：24的氨基酸序列的HVR-H2，
(iii)包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列的HVR-H3，
(iv)包含SEQ ID NO：26的氨基酸序列的HVR-L1，
(v)包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列的HVR-L2，和
(vi)包含SEQ ID NO：28的氨基酸序列的HVR-L3；
b)第一和第二半抗体之一包含
(i)包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列的HVR-H1，
(ii)包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列的HVR-H2，
(iii)包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列的HVR-H3，
(iv)包含SEQ ID NO：12的氨基酸序列的HVR-L1，
(v)包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列的HVR-L2，和
(vi)包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列的HVR-L3，和第一和第二半抗体中的另一个包含
(i)包含SEQ ID NO：37的氨基酸序列的HVR-H1，
(ii)包含SEQ ID NO：38的氨基酸序列的HVR-H2，
(iii)包含SEQ ID NO：39的氨基酸序列的HVR-H3，
(iv)包含SEQ ID NO：40的氨基酸序列的HVR-L1，
(v)包含SEQ ID NO：41的氨基酸序列的HVR-L2，和
(vi)包含SEQ ID NO：42的氨基酸序列的HVR-L3；
c)第一和第二半抗体之一包含
(i)包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列的HVR-H1，
(ii)包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列的HVR-H2，
(iii)包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列的HVR-H3，
(iv)包含SEQ ID NO：12的氨基酸序列的HVR-L1，
(v)包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列的HVR-L2，和
(vi)包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列的HVR-L3，和第一和第二半抗体中的另一个包含
(i)包含SEQ ID NO：51的氨基酸序列的HVR-H1，
(ii)包含SEQ ID NO：52的氨基酸序列的HVR-H2，
(iii)包含SEQ ID NO：53的氨基酸序列的HVR-H3，
(iv)包含SEQ ID NO：54的氨基酸序列的HVR-L1，
(v)包含SEQ ID NO：55的氨基酸序列的HVR-L2，和
(vi)包含SEQ ID NO：56的氨基酸序列的HVR-L3；
d)第一和第二半抗体之一包含
(i)包含SEQ ID NO：23的氨基酸序列的HVR-H1，
(ii)包含SEQ ID NO：24的氨基酸序列的HVR-H2，
(iii)包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列的HVR-H3，
(iv)包含SEQ ID NO：26的氨基酸序列的HVR-L1，
(v)包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列的HVR-L2，和
(vi)包含SEQ ID NO：28的氨基酸序列的HVR-L3，和第一和第二半抗体中的另一个包含
(i)包含SEQ ID NO：37的氨基酸序列的HVR-H1，
(ii)包含SEQ ID NO：38的氨基酸序列的HVR-H2，
(iii)包含SEQ ID NO：39的氨基酸序列的HVR-H3，
(iv)包含SEQ ID NO：40的氨基酸序列的HVR-L1，
(v)包含SEQ ID NO：41的氨基酸序列的HVR-L2，和
(vi)包含SEQ ID NO：42的氨基酸序列的HVR-L3；
e)第一和第二半抗体之一包含
(i)包含SEQ ID NO：23的氨基酸序列的HVR-H1，
(ii)包含SEQ ID NO：24的氨基酸序列的HVR-H2，
(iii)包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列的HVR-H3，
(iv)包含SEQ ID NO：26的氨基酸序列的HVR-L1，
(v)包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列的HVR-L2，和
(vi)包含SEQ ID NO：28的氨基酸序列的HVR-L3，和第一和第二半抗体中的另一个包含
(i)包含SEQ ID NO：51的氨基酸序列的HVR-H1，
(ii)包含SEQ ID NO：52的氨基酸序列的HVR-H2，
(iii)包含SEQ ID NO：53的氨基酸序列的HVR-H3，
(iv)包含SEQ ID NO：54的氨基酸序列的HVR-L1，
(v)包含SEQ ID NO：55的氨基酸序列的HVR-L2，和
(vi)包含SEQ ID NO：56的氨基酸序列的HVR-L3；或
f)第一和第二半抗体之一包含
(i)包含SEQ ID NO：37的氨基酸序列的HVR-H1，
(ii)包含SEQ ID NO：38的氨基酸序列的HVR-H2，
(iii)包含SEQ ID NO：39的氨基酸序列的HVR-H3，
(iv)包含SEQ ID NO：40的氨基酸序列的HVR-L1，
(v)包含SEQ ID NO：41的氨基酸序列的HVR-L2，和
(vi)包含SEQ ID NO：42的氨基酸序列的HVR-L3，和第一和第二半抗体中的另一个包含
(i)包含SEQ ID NO：51的氨基酸序列的HVR-H1，
(ii)包含SEQ ID NO：52的氨基酸序列的HVR-H2，
(iii)包含SEQ ID NO：53的氨基酸序列的HVR-H3，
(iv)包含SEQ ID NO：54的氨基酸序列的HVR-L1，
(v)包含SEQ ID NO：55的氨基酸序列的HVR-L2，和
(vi)包含SEQ ID NO：56的氨基酸序列的HVR-L3。
13.根据前述实施方案中任一项所述的抗体，其包含第一和第二半抗体，其中所述第一半抗体包含
a)与SEQ ID NO：7具有至少约95％序列同一性的VL序列和与SEQ ID NO：8具有至少约95％序列同一性的VH序列；
b)与SEQ ID NO：21具有至少约95％序列同一性的VL序列和与SEQ ID NO：22具有至少约95％序列同一性的VH序列；
c)与SEQ ID NO：35具有至少约95％序列同一性的VL序列和与SEQ ID NO：36具有至少约95％序列同一性的VH序列；或
d)与SEQ ID NO：49具有至少约95％序列同一性的VL序列和与SEQ ID NO：50具有至少约95％序列同一性的VH序列。
14.根据前述实施方案中任一项所述的抗体，其包含第一和第二半抗体，其中所述第二半抗体包含
a)与SEQ ID NO：7具有至少约95％序列同一性的VL序列和与SEQ ID NO：8具有至少约95％序列同一性的VH序列；
b)与SEQ ID NO：21具有至少约95％序列同一性的VL序列和与SEQ ID NO：22具有至少约95％序列同一性的VH序列；
c)与SEQ ID NO：35具有至少约95％序列同一性的VL序列和与SEQ ID NO：36具有至少约95％序列同一性的VH序列；或
d)与SEQ ID NO：49具有至少约95％序列同一性的VL序列和与SEQ ID NO：50具有至少约95％序列同一性的VH序列；
其中第二半抗体的VL和VH序列与第一半抗体的VL和VH序列不同。
15.根据前述实施方案中任一项所述的抗体，其包含第一和第二半抗体，其中：
a)第一和第二半抗体之一包含与SEQ ID NO：7具有至少约95％序列同一性的VL序列和与SEQ ID NO：8具有至少约95％序列同一性的VH序列，
和第一和第二半抗体中的另一个包含与SEQ ID NO：21具有至少约95％序列同一性的VL序列和与SEQ ID NO：22具有至少约95％序列同一性的VH序列；
b)第一和第二半抗体之一包含与SEQ ID NO：7具有至少约95％序列同一性的VL序列和与SEQ ID NO：8具有至少约95％序列同一性的VH序列，
和第一和第二半抗体中的另一个包含与SEQ ID NO：35具有至少约95％序列同一性的VL序列和与SEQ ID NO：36具有至少约95％序列同一性的VH序列；
c)第一和第二半抗体之一包含与SEQ ID NO：7具有至少约95％序列同一性的VL序列和与SEQ ID NO：8具有至少约95％序列同一性的VH序列，
和第一和第二半抗体中的另一个包含与SEQ ID NO：49具有至少约95％序列同一性的VL序列和与SEQ ID NO：50具有至少约95％序列同一性的VH序列；
d)第一和第二半抗体之一包含与SEQ ID NO：21具有至少约95％序列同一性的VL序列和与SEQ ID NO：22具有至少约95％序列同一性的VH序列，
和第一和第二半抗体中的另一个包含与SEQ ID NO：35具有至少约95％序列同一性的VL序列和与SEQ ID NO：36具有至少约95％序列同一性的VH序列；
e)第一和第二半抗体之一包含与SEQ ID NO：21具有至少约95％序列同一性的VL序列和与SEQ ID NO：22具有至少约95％序列同一性的VH序列，
和第一和第二半抗体中的另一个包含与SEQ ID NO：49具有至少约95％序列同一性的VL序列和与SEQ ID NO：50具有至少约95％序列同一性的VH序列；或
f)第一和第二半抗体之一包含与SEQ ID NO：35具有至少约95％序列同一性的VL序列和与SEQ ID NO：36具有至少约95％序列同一性的VH序列，
和第一和第二半抗体中的另一个包含与SEQ ID NO：49具有至少约95％序列同一性的VL序列和与SEQ ID NO：50具有至少约95％序列同一性的VH序列。
16.根据前述实施方案中任一项所述的抗体，其包含第一和第二半抗体，其中所述第一半抗体包含
a)SEQ ID NO：7的VL序列和SEQ ID NO：8的VH序列；
b)SEQ ID NO：21的VL序列和SEQ ID NO：22的VH序列；
c)SEQ ID NO：35的VL序列和SEQ ID NO：36的VH序列；或
d)SEQ ID NO：49的VL序列和SEQ ID NO：50的VH序列。
17.根据前述实施方案中任一项所述的抗体，其包含第一和第二半抗体，其中所述第二半抗体包含
a)SEQ ID NO：7的VL序列和SEQ ID NO：8的VH序列；
b)SEQ ID NO：21的VL序列和SEQ ID NO：22的VH序列；
c)SEQ ID NO：35的VL序列和SEQ ID NO：36的VH序列；或
d)SEQ ID NO：49的VL序列和SEQ ID NO：50的VH序列；
其中第二半抗体的VL和VH序列与第一半抗体的VL和VH序列不同。
18.根据前述实施方案中任一项所述的抗体，其包含第一和第二半抗体，其中：
a)第一和第二半抗体之一包含SEQ ID NO：7的VL序列和SEQ IDNO：8的VH序列，
和第一和第二半抗体中的另一个包含SEQ ID NO：21的VL序列和SEQ ID NO：22的VH序列；
b)第一和第二半抗体之一包含SEQ ID NO：7的VL序列和SEQ IDNO：8的VH序列，
和第一和第二半抗体中的另一个包含SEQ ID NO：35的VL序列和SEQ ID NO：36的VH序列；
c)第一和第二半抗体之一包含SEQ ID NO：7的VL序列和SEQ IDNO：8的VH序列，
和第一和第二半抗体中的另一个包含SEQ ID NO：49的VL序列和SEQ ID NO：50的VH序列；
d)第一和第二半抗体之一包含SEQ ID NO：21的VL序列和SEQ IDNO：22的VH序列，
和第一和第二半抗体中的另一个包含SEQ ID NO：35的VL序列和SEQ ID NO：36的VH序列；
e)第一和第二半抗体之一包含SEQ ID NO：21的VL序列和SEQ IDNO：22的VH序列，
和第一和第二半抗体中的另一个包含SEQ ID NO：49的VL序列和SEQ ID NO：50的VH序列；或
f)第一和第二半抗体之一包含SEQ ID NO：35的VL序列和SEQ IDNO：36的VH序列，
和第一和第二半抗体中的另一个包含SEQ ID NO：49的VL序列和SEQ ID NO：50的VH序列。
19.根据前述实施方案中任一项所述的抗体，其是单克隆抗体。
20.根据前述实施方案中任一项所述的抗体，其是小鼠、兔、人、人源化或嵌合抗体。
21.根据前述实施方案中任一项所述的抗体，其中所述抗体是IgG抗体。
22.根据前述实施方案中任一项所述的抗体，其中所述抗体是IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3或IgG4抗体。
23.根据前述实施方案中任一项所述的抗体，其中所述抗体是IgG1或IgG4抗体。
24.根据前述实施方案中任一项所述的抗体，其包含第一和第二半抗体，其中所述第一半抗体包含含有杵突变的第一重链恒定区，所述第二半抗体包含含有臼突变的第二重链恒定区；或者，其中所述第一半抗体包含含有臼突变的第一重链恒定区，所述第二半抗体包含含有杵突变的第二重链恒定区。
25.根据实施方案24所述的抗体，其中所述抗体是IgG1抗体，并且其中杵突变包含T366W突变。
26.根据实施方案24或实施方案25所述的抗体，其中所述抗体是IgG1抗体，并且其中臼突变包含选自T366S、L368A和Y407V中的至少一种、至少两种或三种突变。
27.根据实施方案24所述的抗体，其中所述抗体是IgG4抗体，并且其中杵突变包含T366W突变。
28.根据实施方案24或实施方案27所述的抗体，其中所述抗体是IgG4抗体，并且其中臼突变包含选自T366S、L368A和Y407V突变中的至少一种、至少两种或三种突变。
29.根据前述实施方案中任一项所述的抗体，其包含第一和第二半抗体，其中所述第一半抗体包含
a)与SEQ ID NO：2具有至少约95％序列同一性的轻链序列；
b)与SEQ ID NO：16具有至少约95％序列同一性的轻链序列；
c)与SEQ ID NO：30具有至少约95％序列同一性的轻链序列；或
d)与SEQ ID NO：44具有至少约95％序列同一性的轻链序列。
30.根据前述实施方案中任一项所述的抗体，其包含第一和第二半抗体，其中所述第一半抗体包含
a)与SEQ ID NO：4具有至少约95％序列同一性的重链序列；
b)与SEQ ID NO：18具有至少约95％序列同一性的重链序列；
c)与SEQ ID NO：32具有至少约95％序列同一性的重链序列；或者
d)与SEQ ID NO：46具有至少约95％序列同一性的重链序列，任选地，其中一个或多个重链缺失C-末端赖氨酸。
31.根据前述实施方案中任一项所述的抗体，其包含第一和第二半抗体，其中所述第一半抗体包含
a)与SEQ ID NO：2具有至少约95％序列同一性的轻链序列和与SEQ ID NO：4具有至少约95％序列同一性的重链序列；
b)与SEQ ID NO：16具有至少约95％序列同一性的轻链序列和与SEQ ID NO：18具有至少约95％序列同一性的重链序列；
c)与SEQ ID NO：30具有至少约95％序列同一性的轻链序列和与SEQ ID NO：32具有至少约95％序列同一性的重链序列；或
d)与SEQ ID NO：44具有至少约95％序列同一性的轻链序列和与SEQ ID NO：46具有至少约95％序列同一性的重链序列，
任选地其中一个或多个重链缺失C-末端赖氨酸。
32.根据实施方案1至30中任一项所述的抗体，其包含第一和第二半抗体，其中所述第一半抗体包含
a)与SEQ ID NO：6具有至少约95％序列同一性的重链序列；
b)与SEQ ID NO：20具有至少约95％序列同一性的重链序列；
c)与SEQ ID NO：34具有至少约95％序列同一性的重链序列；或
d)与SEQ ID NO：48具有至少约95％序列同一性的重链序列，任选地其中一个或多个重链缺失C-末端赖氨酸。
33.根据实施方案1至29中任一项所述的抗体，其包含第一和第二半抗体，其中所述第一半抗体包含
a)与SEQ ID NO：2具有至少约95％序列同一性的轻链序列和与SEQ ID NO：6具有至少约95％序列同一性的重链序列；
b)与SEQ ID NO：16具有至少约95％序列同一性的轻链序列和与SEQ ID NO：20具有至少约95％序列同一性的重链序列；
c)与SEQ ID NO：30具有至少约95％序列同一性的轻链序列和与SEQ ID NO：34具有至少约95％序列同一性的重链序列；或
d)与SEQ ID NO：44具有至少约95％序列同一性的轻链序列和与SEQ ID NO：48具有至少约95％序列同一性的重链序列，
任选地其中一个或多个重链缺失C-末端赖氨酸。
34.根据前述实施方案中任一项所述的抗体，其包含第一和第二半抗体，其中所述第二半抗体包含
a)与SEQ ID NO：2具有至少约95％序列同一性的轻链序列；
b)与SEQ ID NO：16具有至少约95％序列同一性的轻链序列；
c)与SEQ ID NO：30具有至少约95％序列同一性的轻链序列；或
d)与SEQ ID NO：44具有至少约95％序列同一性的轻链序列；
其中第二半抗体的轻链和重链序列与第一半抗体的轻链和重链序列不同。
35.根据实施方案1至29或32至34中任一项所述的抗体，其包含第一和第二半抗体，其中所述第二半抗体包含
a)与SEQ ID NO：4具有至少约95％序列同一性的重链序列；
b)与SEQ ID NO：18具有至少约95％序列同一性的重链序列；
c)与SEQ ID NO：32具有至少约95％序列同一性的重链序列；或
d)与SEQ ID NO：46具有至少约95％序列同一性的重链序列；
其中第二半抗体的轻链和重链序列与第一半抗体的轻链和重链序列不同，任选地其中一个或多个重链缺失C-末端赖氨酸。
36.根据实施方案1至29或32至34中任一项所述的抗体，其包含第一和第二半抗体，其中所述第二半抗体包含
a)与SEQ ID NO：2具有至少约95％序列同一性的轻链序列和与SEQ ID NO：4具有至少约95％序列同一性的重链序列；
b)与SEQ ID NO：16具有至少约95％序列同一性的轻链序列和与SEQ ID NO：18具有至少约95％序列同一性的重链序列；
c)与SEQ ID NO：30具有至少约95％序列同一性的轻链序列和与SEQ ID NO：32具有至少约95％序列同一性的重链序列；或
d)与SEQ ID NO：44具有至少约95％序列同一性的轻链序列和与SEQ ID NO：46具有至少约95％序列同一性的重链序列；
其中第二半抗体的轻链和重链序列与第一半抗体的轻链和重链序列不同，任选地其中一个或多个重链缺失C-末端赖氨酸。
37.根据实施方案1至31或34中任一项所述的抗体，其包含第一和第二半抗体，其中所述第二半抗体包含
a)与SEQ ID NO：6具有至少约95％序列同一性的重链序列；
b)与SEQ ID NO：20具有至少约95％序列同一性的重链序列；
c)与SEQ ID NO：34具有至少约95％序列同一性的重链序列；或
d)与SEQ ID NO：48具有至少约95％序列同一性的重链序列；
其中第二半抗体的轻链和重链序列与第一半抗体的轻链和重链序列不同，任选地其中一个或多个重链缺失C-末端赖氨酸。
38.根据实施方案1至31或34中任一项所述的抗体，其包含第一和第二半抗体，其中所述第二半抗体包含
a)与SEQ ID NO：2具有至少约95％序列同一性的轻链序列和与SEQ ID NO：6具有至少约95％序列同一性的重链序列；
b)与SEQ ID NO：16具有至少约95％序列同一性的轻链序列和与SEQ ID NO：20具有至少约95％序列同一性的重链序列；
c)与SEQ ID NO：30具有至少约95％序列同一性的轻链序列和与SEQ ID NO：34具有至少约95％序列同一性的重链序列；或
d)与SEQ ID NO：44具有至少约95％序列同一性的轻链序列和与SEQ ID NO：48具有至少约95％序列同一性的重链序列；
其中第二半抗体的轻链和重链序列与第一半抗体的轻链和重链序列不同，任选地其中一个或多个重链缺失C-末端赖氨酸。
39.根据前述实施方案中任一项所述的抗体，其包含第一和第二半抗体，其中：
a)第一和第二半抗体之一包含与SEQ ID NO：2具有至少约95％序列同一性的轻链序列和与SEQ ID NO：4具有至少约95％序列同一性的重链序列，
和第一和第二半抗体中的另一个包含与SEQ ID NO：16具有至少约95％序列同一性的轻链序列和与SEQ ID NO：20具有至少约95％序列同一性的重链序列；
b)第一和第二半抗体之一包含与SEQ ID NO：2具有至少约95％序列同一性的轻链序列和与SEQ ID NO：4具有至少约95％序列同一性的重链序列，
和第一和第二半抗体中的另一个包含与SEQ ID NO：30具有至少约95％序列同一性的轻链序列和与SEQ ID NO：34具有至少约95％序列同一性的重链序列；
c)第一和第二半抗体之一包含与SEQ ID NO：2具有至少约95％序列同一性的轻链序列和与SEQ ID NO：4具有至少约95％序列同一性的重链序列，
和第一和第二半抗体中的另一个包含与SEQ ID NO：44具有至少约95％序列同一性的轻链序列和与SEQ ID NO：48具有至少约95％序列同一性的重链序列；
d)第一和第二半抗体之一包含与SEQ ID NO：2具有至少约95％序列同一性的轻链序列和与SEQ ID NO：6具有至少约95％序列同一性的重链序列，
和第一和第二半抗体中的另一个包含与SEQ ID NO：16具有至少约95％序列同一性的轻链序列和与SEQ ID NO：18具有至少约95％序列同一性的重链序列；
e)第一和第二半抗体之一包含与SEQ ID NO：2具有至少约95％序列同一性的轻链序列和与SEQ ID NO：6具有至少约95％序列同一性的重链序列，
和第一和第二半抗体中的另一个包含与SEQ ID NO：30具有至少约95％序列同一性的轻链序列和与SEQ ID NO：32具有至少约95％序列同一性的重链序列；
f)第一和第二半抗体之一包含与SEQ ID NO：2具有至少约95％序列同一性的轻链序列和与SEQ ID NO：6具有至少约95％序列同一性的重链序列，
和第一和第二半抗体中的另一个包含与SEQ ID NO：44具有至少约95％序列同一性的轻链序列和与SEQ ID NO：46具有至少约95％序列同一性的重链序列；
g)第一和第二半抗体之一包含与SEQ ID NO：16具有至少约95％序列同一性的轻链序列和与SEQ ID NO：18具有至少约95％序列同一性的重链序列，
和第一和第二半抗体中的另一个包含与SEQ ID NO：30具有至少约95％序列同一性的轻链序列和与SEQ ID NO：34具有至少约95％序列同一性的重链序列；
h)第一和第二半抗体之一包含与SEQ ID NO：16具有至少约95％序列同一性的轻链序列和与SEQ ID NO：18具有至少约95％序列同一性的重链序列，
和第一和第二半抗体中的另一个包含与SEQ ID NO：44具有至少约95％序列同一性的轻链序列和与SEQ ID NO：48具有至少约95％序列同一性的重链序列；
i)第一和第二半抗体之一包含与SEQ ID NO：30具有至少约95％序列同一性的轻链序列和与SEQ ID NO：32具有至少约95％序列同一性的重链序列，
和第一和第二半抗体中的另一个包含与SEQ ID NO：44具有至少约95％序列同一性的轻链序列和与SEQ ID NO：48具有至少约95％序列同一性的重链序列；
j)第一和第二半抗体之一包含与SEQ ID NO：16具有至少约95％序列同一性的轻链序列和与SEQ ID NO：20具有至少约95％序列同一性的重链序列，
和第一和第二半抗体中的另一个包含与SEQ ID NO：30具有至少约95％序列同一性的轻链序列和与SEQ ID NO：32具有至少约95％序列同一性的重链序列；
k)第一和第二半抗体之一包含与SEQ ID NO：16具有至少约95％序列同一性的轻链序列和与SEQ ID NO：20具有至少约95％序列同一性的重链序列，
和第一和第二半抗体中的另一个包含与SEQ ID NO：44具有至少约95％序列同一性的轻链序列和与SEQ ID NO：46具有至少约95％序列同一性的重链序列；或
l)第一和第二半抗体之一包含与SEQ ID NO：30具有至少约95％序列同一性的轻链序列和与SEQ ID NO：34具有至少约95％序列同一性的重链序列，
和第一和第二半抗体中的另一个包含与SEQ ID NO：44具有至少约95％序列同一性的轻链序列和与SEQ ID NO：46具有至少约95％序列同一性的重链序列，
任选地其中一个或多个重链缺少C-末端赖氨酸。
40.根据前述实施方案中任一项所述的抗体，其包含第一和第二半抗体，其中所述第一半抗体包含
a)SEQ ID NO：2的轻链序列；
b)SEQ ID NO：16的轻链序列；
c)SEQ ID NO：30的轻链序列；或
d)SEQ ID NO：44的轻链序列。
41.根据实施方案1至31、34或37至40中任一项所述的抗体，其包含第一和第二半抗体，其中所述第一半抗体包含
a)SEQ ID NO：4的重链序列；
b)SEQ ID NO：18的重链序列；
c)SEQ ID NO：32的重链序列；或
d)SEQ ID NO：46的重链序列，
任选地其中一个或多个重链缺失C-末端赖氨酸。
42.根据实施方案1至31、34或37至40中任一项所述的抗体，其包含第一和第二半抗体，其中所述第一半抗体包含
a)SEQ ID NO：2的轻链序列和SEQ ID NO：4的重链序列；
b)SEQ ID NO：16的轻链序列和SEQ ID NO：18的重链序列；
c)SEQ ID NO：30的轻链序列和SEQ ID NO：32的重链序列；或
d)SEQ ID NO：44的轻链序列和SEQ ID NO：46的重链序列，任选地其中一个或多个重链缺失C-末端赖氨酸。
43.根据实施方案1至29、32至36或39至40中任一项所述的抗体，其包含第一和第二半抗体，其中所述第一半抗体包含
a)SEQ ID NO：6的重链序列；
b)SEQ ID NO：20的重链序列；
c)SEQ ID NO：34的重链序列；或
d)SEQ ID NO：48的重链序列，
任选地其中一个或多个重链缺失C-末端赖氨酸。
44.根据实施方案1至29、32至36或39至40中任一项所述的抗体，其包含第一和第二半抗体，其中所述第一半抗体包含
a)SEQ ID NO：2的轻链序列和SEQ ID NO：6的重链序列；
b)SEQ ID NO：16的轻链序列和SEQ ID NO：20的重链序列；
c)SEQ ID NO：30的轻链序列和SEQ ID NO：34的重链序列；或
d)SEQ ID NO：44的轻链序列和SEQ ID NO：48的重链序列，任选地其中一个或多个重链缺失C-末端赖氨酸。
45.根据前述实施方案中任一项所述的抗体，其包含第一和第二半抗体，其中所述第二半抗体包含
a)SEQ ID NO：2的轻链序列；
b)SEQ ID NO：16的轻链序列；
c)SEQ ID NO：30的轻链序列；或
d)SEQ ID NO：44的轻链序列；
其中第二半抗体的轻链和重链序列与第一半抗体的轻链和重链序列不同，任选地其中一个或多个重链缺失C-末端赖氨酸。
46.根据实施方案1至31、34、37至40或43至45中任一项所述的抗体，其包含第一和第二半抗体，其中所述第二半抗体包含
a)SEQ ID NO：4的重链序列；
b)SEQ ID NO：18的重链序列；
c)SEQ ID NO：32的重链序列；或
d)SEQ ID NO：46的重链序列；
其中第二半抗体的轻链和重链序列与第一半抗体的轻链和重链序列不同，任选地其中一个或多个重链缺失C-末端赖氨酸。
47.根据实施方案1至31、34、37至40或43至45中任一项所述的抗体，其包含第一和第二半抗体，其中所述第二半抗体包含
a)SEQ ID NO：2的轻链序列和SEQ ID NO：4的重链序列；
b)SEQ ID NO：16的轻链序列和SEQ ID NO：18的重链序列；
c)SEQ ID NO：30的轻链序列和SEQ ID NO：32的重链序列；或
d)SEQ ID NO：44的轻链序列和SEQ ID NO：46的重链序列；
其中第二半抗体的轻链和重链序列与第一半抗体的轻链和重链序列不同，任选地其中一个或多个重链缺失C-末端赖氨酸。
48.根据实施方案1至31、34、37至42或45中任一项所述的抗体，其包含第一和第二半抗体，其中所述第二半抗体包含
a)SEQ ID NO：6的重链序列；
b)SEQ ID NO：20的重链序列；
c)SEQ ID NO：34的重链序列；或
d)SEQ ID NO：48的重链序列；
其中第二半抗体的轻链和重链序列与第一半抗体的轻链和重链序列不同，任选地其中一个或多个重链缺失C-末端赖氨酸。
49.根据实施方案1至31、34、37至42或45中任一项所述的抗体，其包含第一和第二半抗体，其中所述第二半抗体包含
a)SEQ ID NO：2的轻链序列和SEQ ID NO：6的重链序列；
b)SEQ ID NO：16的轻链序列和SEQ ID NO：20的重链序列；
c)SEQ ID NO：30的轻链序列和SEQ ID NO：34的重链序列；或
d)SEQ ID NO：44的轻链序列和SEQ ID NO：48的重链序列；
其中第二半抗体的轻链和重链序列与第一半抗体的轻链和重链序列不同。
50.根据前述实施方案中任一项所述的抗体，其包含第一和第二半抗体，其中：
a)第一半抗体包含SEQ ID NO：2的轻链序列和SEQ ID NO：4的重链序列，
和第二半抗体包含SEQ ID NO：16的轻链序列和SEQ ID NO：20的重链序列；
b)第一半抗体包含SEQ ID NO：2的轻链序列和SEQ ID NO：4的重链序列，
和第二半抗体包含SEQ ID NO：30的轻链序列和SEQ ID NO：34的重链序列；
c)第一半抗体包含SEQ ID NO：2的轻链序列和SEQ ID NO：4的重链序列，
和第二半抗体包含SEQ ID NO：44的轻链序列和SEQ ID NO：48的重链序列；
d)第一半抗体包含SEQ ID NO：2的轻链序列和SEQ ID NO：6的重链序列，
和第二半抗体包含SEQ ID NO：16的轻链序列和SEQ ID NO：18的重链序列；
e)第一半抗体包含SEQ ID NO：2的轻链序列和SEQ ID NO：6的重链序列，
和第二半抗体包含SEQ ID NO：30的轻链序列和SEQ ID NO：32的重链序列；
f)第一半抗体包含SEQ ID NO：2的轻链序列和SEQ ID NO：6的重链序列，
和第二半抗体包含SEQ ID NO：44的轻链序列和SEQ ID NO：46的重链序列；
g)第一半抗体包含SEQ ID NO：16的轻链序列和SEQ ID NO：18的重链序列，
和第二半抗体包含SEQ ID NO：30的轻链序列和SEQ ID NO：34的重链序列；
h)第一半抗体包含SEQ ID NO：16的轻链序列和SEQ ID NO：18的重链序列，
和第二半抗体包含SEQ ID NO：44的轻链序列和SEQ ID NO：48的重链序列；
i)第一半抗体包含SEQ ID NO：30的轻链序列和SEQ ID NO：32的重链序列，
和第二半抗体包含SEQ ID NO：44的轻链序列和SEQ ID NO：48的重链序列；
j)第一半抗体包含SEQ ID NO：16的轻链序列和SEQ ID NO：20的重链序列，
和第二半抗体包含SEQ ID NO：30的轻链序列和SEQ ID NO：32的重链序列；
k)第一半抗体包含SEQ ID NO：16的轻链序列和SEQ ID NO：20的重链序列，
和第二半抗体包含SEQ ID NO：44的轻链序列和SEQ ID NO：46的重链序列；或
l)第一半抗体包含SEQ ID NO：30的轻链序列和SEQ ID NO：34的重链序列，
和第二半抗体包含SEQ ID NO：44的轻链序列和SEQ ID NO：46的重链序列；
任选地，其中一个或多个重链缺失C-末端赖氨酸。
51.根据前述实施方案中任一项所述的抗体，其包含第一和第二半抗体，其中所述第一半抗体包含SEQ ID NO：2的轻链序列和SEQ IDNO：4的重链序列，所述第二半抗体包含SEQ ID NO：16的轻链序列和SEQ ID NO：20的重链序列，任选地其中一个或多个重链缺失C-末端赖氨酸。
52.根据实施方案1-50之一所述的抗体，其包含第一和第二半抗体，其中所述第一半抗体包含SEQ ID NO：2的轻链序列和SEQ ID NO：4的重链序列，所述第二半抗体包含SEQID NO：30的轻链序列和SEQ IDNO：34的重链序列，任选地其中一个或多个重链缺失C-末端赖氨酸。
53.根据实施方案1-50之一所述的抗体，其包含第一和第二半抗体，其中所述第一半抗体包含SEQ ID NO：2的轻链序列和SEQ ID NO：4的重链序列，所述第二半抗体包含SEQID NO：44的轻链序列和SEQ IDNO：48的重链序列，任选地其中一个或多个重链缺失C-末端赖氨酸。
54.根据实施方案1-50之一所述的抗体，其包含第一和第二半抗体，其中所述第一半抗体包含SEQ ID NO：2的轻链序列和SEQ ID NO：6的重链序列，所述第二半抗体包含SEQID NO：16的轻链序列和SEQ IDNO：18的重链序列，任选地其中一个或多个重链缺失C-末端赖氨酸。
55.根据实施方案1-50之一所述的抗体，其包含第一和第二半抗体，其中所述第一半抗体包含SEQ ID NO：2的轻链序列和SEQ ID NO：6的重链序列，所述第二半抗体包含SEQID NO：30的轻链序列和SEQ IDNO：32的重链序列，任选地其中一个或多个重链缺失C-末端赖氨酸。
56.根据实施方案1-50之一所述的抗体，其包含第一和第二半抗体，其中所述第一半抗体包含SEQ ID NO：2的轻链序列和SEQ ID NO：6的重链序列，所述第二半抗体包含SEQID NO：44的轻链序列和SEQ IDNO：46的重链序列，任选地其中一个或多个重链缺失C-末端赖氨酸。
57.根据实施方案1-50之一所述的抗体，其包含第一和第二半抗体，其中所述第一半抗体包含SEQ ID NO：16的轻链序列和SEQ ID NO：18的重链序列，所述第二半抗体包含SEQ ID NO：30的轻链序列和SEQ ID NO：34的重链序列，任选地其中一个或多个重链缺失C-末端赖氨酸。
58.根据实施方案1-50之一所述的抗体，其包含第一和第二半抗体，其中所述第一半抗体包含SEQ ID NO：16的轻链序列和SEQ ID NO：18的重链序列，所述第二半抗体包含SEQ ID NO：44的轻链序列和SEQ ID NO：48的重链序列，任选地其中一个或多个重链缺失C-末端赖氨酸。
59.根据实施方案1-50之一所述的抗体，其包含第一和第二半抗体，其中所述第一半抗体包含SEQ ID NO：30的轻链序列和SEQ ID NO：32的重链序列，所述第二半抗体包含SEQ ID NO：44的轻链序列和SEQ ID NO：48的重链序列，任选地其中一个或多个重链缺失C-末端赖氨酸。
60.根据实施方案1-50之一所述的抗体，其包含第一和第二半抗体，其中所述第一半抗体包含SEQ ID NO：16的轻链序列和SEQ ID NO：20的重链序列，所述第二半抗体包含SEQ ID NO：30的轻链序列和SEQ ID NO：32的重链序列，任选地其中一个或多个重链缺失C-末端赖氨酸。
61.根据实施方案1-50之一所述的抗体，其包含第一和第二半抗体，其中所述第一半抗体包含SEQ ID NO：16的轻链序列和SEQ ID NO：20的重链序列，所述第二半抗体包含SEQ ID NO：44的轻链序列和SEQ ID NO：46的重链序列，任选地其中一个或多个重链缺失C-末端赖氨酸。
62.根据实施方案1-50之一所述的抗体，其包含第一和第二半抗体，其中所述第一半抗体包含SEQ ID NO：30的轻链序列和SEQ ID NO：34的重链序列，所述第二半抗体包含SEQ ID NO：44的轻链序列和SEQ ID NO：46的重链序列，任选地其中一个或多个重链缺失C-末端赖氨酸。
63.一种抗体，其与前述实施方案中任一项所述的抗体竞争结合混合拓扑结构聚泛素。
64.一种抗体，其与前述实施方案中任一项所述的抗体结合相同的混合拓扑结构聚泛素的表位。
65.根据前述实施方案中任一项所述的抗体，其是双特异性抗体。
66.根据前述实施方案中任一项所述的抗体，其是双抗体、三抗体或四抗体。
67.根据前述实施方案中任一项所述的抗体，其与标记缀合。
68.根据实施方案67所述的抗体，其中所述标记是荧光标记、酶标记或发色标记。
69.根据实施方案67所述的抗体，其中所述标记是放射性同位素，其任选地是正电子发射体，任选为89Zr。
70.包含实施方案1至69中任一项所述的抗体的组合物，其中所述组合物基本上不含单特异性抗体、未装配的半抗体，或单特异性抗体和未装配的半抗体。
71.一种免疫缀合物，其包含实施方案1至69中任一项所述的抗体和细胞毒性剂。
72.一种药物制剂，其包含药学上可接受的载体和以下中的至少一种：
a)实施方案1至69中任一项所述的抗体；或者
b)实施方案71所述的免疫缀合物；
任选地，其中所述组合物基本上不含单特异性抗体、未装配的半抗体，或单特异性抗体和未装配的半抗体。
73.一种分离的核酸，其编码：
a)实施方案1至66中任一项所述的抗体；
b)实施方案40至66中任一项所述的抗体的第一半抗体；或者
c)实施方案46至66中任一项所述的抗体的第二半抗体。
74.一种宿主细胞，其包含实施方案73所述的核酸。
75.一种产生抗体或半抗体的方法，其包括培养实施方案73所述的宿主细胞，从而产生抗体或半抗体。
76.一种制备实施方案1至66中任一项所述的抗体的方法，其包括从第一半抗体和第二半抗体形成抗体。
77.一种检测生物样品中混合拓扑结构聚泛素的方法，其包括在允许抗体与混合拓扑结构聚泛素结合的条件下使生物样品与实施方案1至69中任一项所述的抗体接触，并检测生物样品中抗体和混合拓扑结构聚泛素之间是否形成复合物。
78.根据实施方案77所述的方法，其中所述混合拓扑结构聚泛素与非泛素多肽共价连接。
79.根据实施方案77或实施方案78所述的方法，其中所述混合拓扑结构聚泛素是分支的。
80.根据实施方案77或78所述的方法，其中所述混合拓扑结构聚泛素是非分支的。
81.根据实施方案77至80中任一项所述的方法，其中所述混合拓扑结构聚泛素包含第一键和不同于第一键的第二键，并且第一和第二键彼此独立地为K11、K48、K63或C-末端至N-末端的键。
82.根据实施方案77至81中任一项所述的方法，其中所述混合拓扑结构聚泛素包含K11键和不同于K11键的第二键。
83.根据实施方案77至81中任一项所述的方法，其中所述混合拓扑结构聚泛素包含K48键和不同于K48键的第二键。
84.根据实施方案77至81中任一项所述的方法，其中所述混合拓扑结构聚泛素包含K63键和不同于K63键的第二键。
85.根据实施方案77至81中任一项所述的方法，其中所述混合拓扑结构聚泛素包含C-末端至N-末端的键和不同于C-末端至N-末端的键的第二键。
86.根据实施方案77至81中任一项所述的方法，其中所述混合拓扑结构聚泛素包含：
a)K11键和K48键；
b)K11键和K63键；
c)K11键和C-末端至N-末端的键；
d)K48键和K63键；
e)K48键和C-末端至N-末端的键；或
f)K63键和C-末端至N-末端的键。
87.一种检测生物样品中聚泛素化蛋白的方法，所述聚泛素化蛋白在两个或更多个位置上与至少第一和第二聚泛素聚泛素化，其中第一和第二聚泛素具有不同的键，所述方法包括在允许抗体与聚泛素化蛋白结合的条件下，使生物样品与实施方案1至69中任一项所述的抗体接触，和检测生物样品中抗体与聚泛素化蛋白之间是否形成复合物。
88.根据实施方案87所述的方法，其中所述第一和第二聚泛素分别包含：
a)K11键和不同于K11键的第二键；
b)K48键和不同于K48键的第二键；
c)K63键和不同于K63键的第二键；
d)C-末端至N-末端的键和不同于C-末端至N-末端的键的第二键；
e)K11键和K48键；
f)K11键和K63键；
g)K11键和C-末端至N-末端的键；
h)K48键和K63键；
i)K48键和C-末端至N-末端的键；或
j)K63键和C-末端至N-末端的键。
III.实施例
以下是本文提供的方法和组合物的实施例。应当理解，在给出以上提供的一般描述的情况下，可以实践各种其他实施方案。
A.分析方法
尺寸排阻色谱法-多角度光散射。使用Agilent 1260Infinity HPLC和20mM组氨酸乙酸盐、300mM NaCl，pH 5.5作为流动相将50μ0抗体以1mL/min注射到3.5μm、7.8mm x300mm XBridge Protein BEH分析型
Figure BDA0004074180330001051
柱(Waters)上。将从分析型SEC柱洗脱的蛋白质直接注射到Wyatt DAWN HELEOS II/Optilab T-rEX多角度光散射检测器上以测量摩尔质量和多分散性。
质谱。在质谱分析之前，在存在或不存在2单位羧肽酶B(Roche)的情况下，在37℃下将30μg抗体用2单位PNGaseF(NEB)过夜去糖基化。然后使用Agilent 1290InfinityUHPLC，以1mL/min将2μg抗体注射到3μm、4.6x 50mm反相色谱PLRP-S柱(Agilent)上。用含有0.05％三氟乙酸(TFA)的水溶液(缓冲液A)和含有0.05％TFA的乙腈溶液(缓冲液B)进行3分钟0-100％缓冲液B梯度，然后用100％缓冲液B洗涤1分钟。将从反相柱洗脱的蛋白质直接注射到Agilent 6230电喷雾电离飞行时间质谱仪(ESI-TOF)上以进行完整的质量测量。
B.抗体克隆、表达和退火
使用杵入臼异二聚化方法产生双特异性抗体。关于这种方法的一般性讨论，参见Merchant,A.M.等人An efficient route to human bispecific IgG.Nat Biotechnol16,677-681,doi:10.1038/nbt0798-677(1998)。
将T366W(杵)或T366S、L368A和Y407V(臼)突变引入抗K11和抗K48聚泛素键特异性抗体的CH3结构域。作为对照，使用识别无关蛋白质的抗gD抗体。选择杵和臼突变以允许抗体的相应重链的优先异二聚化。
重链可变结构域是SEQ ID NO：8(对于抗K11聚泛素键特异性)、SEQ ID NO：22(对于抗K48聚泛素键特异性)和非特异性抗gD对照抗体的那些。将这些可变结构域亚克隆到修饰的pRK载体(Genentech)中，该载体含有人IgG1重链恒定结构域，其在CH3结构域中具有杵(T366W)或臼(T366S、L368A和Y407V)突变。
由于可变区的长度，杵和臼突变的实际位置可以略微变化，例如变化1至10个位置。例如，在SEQ ID NO：4和6中，T至W和T至S取代分别显示在第369位而不是第366位氨基酸残基上。应当理解，提及的在重链位置如366、368和407上的杵和臼突变将被解释在适当的情况下根据可变区的长度调整。
类似地将轻链可变结构域亚克隆到含有人κ轻链恒定结构域的修饰的pRK载体(Genentech)中。pRK载体携带组成型强信号肽，用于哺乳动物细胞中的细胞外表达。将抗K11抗体克隆为杵和臼突变体(分别编码包含SEQ ID NO：4和6的重链)、将抗K48克隆为臼突变体(编码包含SEQ ID NO：20的重链)，并将抗gD克隆为杵突变体。
序列表格还提供了抗K11抗体的杵突变体(SEQ ID NO：18)；抗K63重链的杵和臼突变体(分别为SEQ ID NO：32和34)；抗线性聚泛素重链的杵和臼突变体(分别为SEQ ID NO：46和48)。
为了保持同源轻链和重链的配对，我们分别在CHO细胞中表达杵或臼重链突变体与其相应的轻链，并各自地亲和纯化它们(图1a)。如前所述，使用PEI将用于给定杵或臼的半抗体的轻链和重链质粒瞬时共转染到CHO细胞中(参见Wong,A.W.,Baginski,T.K.&Reilly,D.E.Enhancement of DNA uptake in FUT8-deleted CHO cells for transientproduction of afucosylated antibodies.Biotechnol Bioeng 106,751-763,doi:10.1002/bit.22749(2010))。用MabSelect SuRe树脂(GE Healthcare)纯化半抗体，用50mM柠檬酸钠、150mM NaCl，pH 3.0洗脱，然后用10％(v/v)200mM精氨酸、137mM琥珀酸盐pH9.0调节pH至5.0。
亲和纯化的杵和臼抗体是单体(半抗体)和同二聚体的混合物，如通过SDS-PAGE、分析型尺寸排阻色谱法(SEC)、多角度光散射(MALS)和液相色谱-质谱(LC-MS)所见(图1b、1c、2a、2b、表2、3)，与先前描述的杵和臼抗体一致。参见，例如，Shatz,W.等人Knobs-into-holes antibody production in mammalian cell lines reveals that asymmetricafucosylation is sufficient for full antibody-dependent cellularcytotoxicity.MAbs 5,872-881,doi:10.4161/mabs.26307(2013)；Elliott,J.M.等人Antiparallel conformation of knob and hole aglycosylated half-antibodyhomodimers is mediated by a CH2-CH3hydrophobic interaction.J Mol Biol 426,1947-1957,doi:10.1016/j.jmb.2014.02.015(2014)；Spiess,C.等人Bispecificantibodies with natural architecture produced by co-culture of bacteriaexpressing two distinct half-antibodies.Nat Biotechnol 31,753-758,doi:10.1038/nbt.2621(2013)。单体、同二聚体和异二聚体峰在图1c和2a中显示，用光散射验证了分子量(参见表1)。
抗K48臼/抗K11杵双特异性的理论质量为144,613.19Da，对应于图1d中的主峰。抗K48臼和抗K11杵同二聚体的预测峰位置分别基于其的理论质量144,485.90Da和144,740.48Da表示。用CPB处理导致144,745.26Da峰的丢失，表明其不是抗K11杵同二聚体，而是仍然连接有羧基末端赖氨酸残基的双特异性抗体的一部分。抗K11/gD双特异性抗体的理论质量为145,623.14Da，抗K48/gD双特异性为145,701.11Da，对应于图2c的相应组中的主峰。抗K11臼同二聚体、抗K48臼同二聚体和抗gD杵同二聚体的预测峰位置分别基于其理论质量144,329.96Da、144,485.90和146,916.32Da表示。
表2.纯化的半抗体和装配的双特异性抗体的摩尔质量。
Figure BDA0004074180330001081
将抗体注射到XBridge Protein BEH分析型SEC柱上，该柱与DAWN HELEOS II多角度光散射检测器偶联，用于摩尔质量和多分散性测量。各峰从SEC柱上的洗脱时间以分钟给出。
表3.半抗体和装配的双特异性抗体的质谱分析。
Figure BDA0004074180330001082
Figure BDA0004074180330001091
用PNGaseF将抗体去糖基化，并通过液相色谱-质谱(LC-MS)分析。理论质量用于非还原、去糖基化的抗体，并假设在哺乳动物细胞表达期间完全除去羧基末端赖氨酸残基。质量差异报告为实验质量与理论质量之间的差异。N/Oa，没有观察到。
通过SEC-MALS，抗K48臼抗体显示约20％的同二聚体和80％的单体(图1c、表2)。抗K11杵抗体的比例不太清楚，因为由含有滞后边缘肩的宽洗脱峰所证明的同二聚体和单体在SEC上共洗脱，通过MALS显示出高的多分散性(图1c、表2)。杵和臼同二聚体本质上是非共价的(即不形成铰链二硫键)，因为它们在LC-MS的反相色谱步骤中被破坏，导致通过MS仅检测到单体(图2b、表3)。这与在同二聚体的X-射线晶体结构中看到的杵/杵或臼/臼Fc结构域的反平行方向一致。参见Elliott,J.M.等人Antiparallel conformation of knob andhole aglycosylated half-antibody homodimers is mediated by a CH2-CH3hydrophobic interaction.J Mol Biol 426,1947-1957,doi:10.1016/j.jmb.2014.02.015(2014)。
使用退火、还原和氧化在体外从半抗体装配双特异性抗体。使用先前描述的退火、还原和氧化方法的修改形式，从亲和纯化的抗K11杵和抗K48臼抗体体外装配抗K11/K48双特异性抗体(Shatz,W.等人Knobs-into-holes antibody production in mammalian celllines reveals that asymmetric afucosylation is sufficient for full antibody-dependent cellular cytotoxicity.MAbs 5,872-881,doi:10.4161/mabs.26307(2013))(图1a)。简言之，将所需的杵和臼半抗体以1：1的质量比混合，用15％(v/v)800mM精氨酸，pH10.0将混合物的pH调节至8.5。加入200倍摩尔过量的还原型谷胱甘肽(Sigma Aldrich)的800mM精氨酸(pH 10.0)溶液，并将装配反应在室温下孵育72小时，同时暴露于空气中以使杵和臼半抗体退火并形成铰链二硫化物。类似地装配抗K11/gD和抗K48/gD对照双特异性抗体。
使用疏水相互作用(HIC)和阳离子交换(CEX)色谱法进一步纯化得到的异二聚体，以除去任何过量的半抗体和同二聚体。双特异性抗体在SDS-PAGE上作为～150kDa条带迁移，在分析型SEC上作为尖峰洗脱，并且是单分散的，其摩尔质量与完整抗体的摩尔质量一致(图1b、1c、2a、表2)。
C.抗体纯化和表征
通过疏水相互作用色谱法(HIC)纯化装配的双特异性抗体。简言之，将装配反应用3体积的缓冲液A(25mM磷酸钠、1M硫酸铵，pH6.5)调节至0.75M硫酸铵的终浓度。过滤装配反应，加载到5μm、7.8×75mm ProPac HIC-10柱(Dionex)上，然后用缓冲液A洗涤。经40个柱体积(CV)进行0-100％缓冲液B(25mM磷酸钠，pH6.5，25％异丙醇)的线性梯度，以从任何未反应的半抗体或聚集蛋白中分离双特异性抗体。通过SDS-PAGE和质谱监测洗脱峰的身份(参见下面的方法细节)。
通过阳离子交换色谱法(CEX)进一步纯化双特异性抗体。简言之，将HIC合并的物质透析到20mM乙酸钠(pH 5.0)中，加载到10μm MonoS 5/50GL柱(GE Healthcare)上，并用缓冲液A(20mM乙酸钠，pH 5.0)洗涤。进行40个CV的0-100％缓冲液B(20mM乙酸钠，pH 5.0，1M NaCl)的线性梯度，合并所需的级分。将纯化的双特异性抗体配制在20mM组氨酸乙酸盐、240mM蔗糖、0.02％Tween-20，pH5.5中。
LC-MS用于证实纯化的退火种类的身份(图1d、2c、表3)。为了减少异质性，在分析之前用PNGaseF将抗体去糖基化。抗K11/K48装配中的主要种类确实是双特异性的，观察到的质量为144,617.30Da，其比理论质量(144,613.19Da)多4.11Da。
没有观察到理论质量为144,485.90Da的抗K48臼同二聚体。观察到另外的144,745.26Da的峰，其接近抗K11杵同二聚体(144,740.48Da)的理论质量。该另外的峰比针对抗K11/K48异二聚体观察到的144,617.30Da的实验质量大128Da。从哺乳动物细胞纯化的重组抗体通常由于在表达过程中羧肽酶的活性而除去了重链上的羧基末端赖氨酸残基。参见Harris,R.J.Processing of C-terminal lysine and arginine residues of proteinsisolated from mammalian cell culture.JChromatogr A 705,129-134(1995)；Harris,R.J.,Wagner,K.L.&Spellman,M.W.Structural characterization of a recombinantCD4-IgG hybrid molecule.Eur J Biochem 194,611-620(1990)。
此处计算的重组抗体的理论质量假定完全除去了羧基末端赖氨酸。如果该赖氨酸的除去不完全导致一部分双特异性中的一个重链含有另外的残基，我们也预期在+128Da处看到对应于赖氨酸残基质量的峰。对半抗体的进一步分析表明，抗K11杵、抗K11臼和抗gD杵都含有一小部分羧基末端仍连接赖氨酸的抗体(图2b)。
为了证明在纯化的抗K11/K48双特异性抗体中观察到的144,745.26Da处的峰不是由于污染了抗K11杵同二聚体，而是一部分双特异性抗体的一个重链仍然连接羧基末端赖氨酸残基，我们用羧肽酶B(CPB)处理抗体。这导致144,745.26Da峰的缺失，证实它是由于羧基末端赖氨酸残基的存在。因此，抗K11/K48双特异性抗体是高纯度的并且不含任何同二聚体。
D.抗体的荧光标记
使用Alexa
Figure BDA0004074180330001121
蛋白标记试剂盒(ThermoFisher)、根据制造商的说明分别用Alexa/>
Figure BDA0004074180330001122
488和Alexa/>
Figure BDA0004074180330001123
546标记抗K11单特异性抗体和抗K11/K48双特异性抗体。通过大量透析除去未反应的游离染料。分别以每摩尔抗体6和8摩尔的Alexa/>
Figure BDA0004074180330001124
488和Alexa/>
Figure BDA0004074180330001125
546进行缀合。
尽管出于清楚理解的目的通过说明和实施例详细描述了前述发明，但是描述和实施例不应被解释为限制本发明的范围。
序列的表格
Figure BDA0004074180330001126
/>
Figure BDA0004074180330001131
/>
Figure BDA0004074180330001141
/>
Figure BDA0004074180330001151
/>
Figure BDA0004074180330001161
/>
Figure BDA0004074180330001171
/>
Figure BDA0004074180330001181
HC＝重链；LC＝轻链；HCVR＝重链可变区；LCVR＝轻链可变区；HVR＝高变区。

Claims (13)

1.一种对于混合拓扑结构聚泛素比单个拓扑结构聚泛素具有更高亲合性的抗体，其中所述混合拓扑结构聚泛素包含第一键和第二键，其中所述第一键和所述第二键彼此不同。
2.一种结合包含第一键和第二键的混合拓扑结构聚泛素的多特异性抗体，所述抗体包含对第一键特异的第一抗原识别位点和对第二键特异的第二抗原识别位点，其中所述第一键和所述第二键彼此不同。
3.一种抗体，其与前述权利要求中任一项所述的抗体竞争结合混合拓扑结构聚泛素。
4.一种抗体，其与前述权利要求中任一项所述的抗体结合相同的混合拓扑结构聚泛素的表位。
5.包含权利要求1至4中任一项所述的抗体的组合物，其中所述组合物基本上不含单特异性抗体、未装配的半抗体，或单特异性抗体和未装配的半抗体。
6.一种免疫缀合物，其包含权利要求1至4中任一项所述的抗体和细胞毒性剂。
7.一种药物制剂，其包含药学上可接受的载体和以下中的至少一种：
a)权利要求1至4中任一项所述的抗体；或者
b)权利要求6所述的免疫缀合物；
任选地，其中所述组合物基本上不含单特异性抗体、未装配的半抗体，或单特异性抗体和未装配的半抗体。
8.一种分离的核酸，其编码权利要求1至4中任一项所述的抗体。
9.一种宿主细胞，其包含权利要求8所述的核酸。
10.一种产生抗体或半抗体的方法，其包括培养权利要求9所述的宿主细胞，从而产生抗体或半抗体。
11.一种制备权利要求1至4中任一项所述的抗体的方法，其包括从第一半抗体和第二半抗体形成抗体。
12.一种检测生物样品中混合拓扑结构聚泛素的方法，其包括在允许抗体与混合拓扑结构聚泛素结合的条件下使生物样品与权利要求1至4中任一项所述的抗体接触，并检测生物样品中抗体和混合拓扑结构聚泛素之间是否形成复合物。
13.一种检测生物样品中聚泛素化蛋白的方法，所述聚泛素化蛋白在两个或更多个位置上与至少第一和第二聚泛素聚泛素化，其中第一和第二聚泛素具有不同的键，所述方法包括在允许抗体与聚泛素化蛋白结合的条件下，使生物样品与权利要求1至4中任一项所述的抗体接触，和检测生物样品中抗体与聚泛素化蛋白之间是否形成复合物。
CN202310104155.9A 2016-06-24 2017-06-23 抗聚泛素多特异性抗体 Pending CN116143918A (zh)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201662354305P 2016-06-24 2016-06-24
US62/354,305 2016-06-24
CN201780050175.5A CN109563160B (zh) 2016-06-24 2017-06-23 抗聚泛素多特异性抗体
PCT/US2017/038940 WO2017223405A1 (en) 2016-06-24 2017-06-23 Anti-polyubiquitin multispecific antibodies

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201780050175.5A Division CN109563160B (zh) 2016-06-24 2017-06-23 抗聚泛素多特异性抗体

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN116143918A true CN116143918A (zh) 2023-05-23

Family

ID=59276894

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201780050175.5A Active CN109563160B (zh) 2016-06-24 2017-06-23 抗聚泛素多特异性抗体
CN202310104155.9A Pending CN116143918A (zh) 2016-06-24 2017-06-23 抗聚泛素多特异性抗体

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201780050175.5A Active CN109563160B (zh) 2016-06-24 2017-06-23 抗聚泛素多特异性抗体

Country Status (5)

Country Link
US (2) US11274145B2 (zh)
EP (1) EP3475298A1 (zh)
JP (2) JP7133477B2 (zh)
CN (2) CN109563160B (zh)
WO (1) WO2017223405A1 (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11187700B1 (en) * 2021-01-28 2021-11-30 Eckhard Kemmann Closed system for enlarging viral and bacterial particles for identification by diffraction scanning
WO2023034750A1 (en) * 2021-08-30 2023-03-09 Genentech, Inc. Anti-polyubiquitin multispecific antibodies

Family Cites Families (88)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4737456A (en) 1985-05-09 1988-04-12 Syntex (U.S.A.) Inc. Reducing interference in ligand-receptor binding assays
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
US6548640B1 (en) 1986-03-27 2003-04-15 Btg International Limited Altered antibodies
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
DE3883899T3 (de) 1987-03-18 1999-04-22 Sb2 Inc Geänderte antikörper.
JP2919890B2 (ja) 1988-11-11 1999-07-19 メディカル リサーチ カウンスル 単一ドメインリガンド、そのリガンドからなる受容体、その製造方法、ならびにそのリガンドおよび受容体の使用
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
US5959177A (en) 1989-10-27 1999-09-28 The Scripps Research Institute Transgenic plants expressing assembled secretory antibodies
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
ATE164395T1 (de) 1990-12-03 1998-04-15 Genentech Inc Verfahren zur anreicherung von proteinvarianten mit geänderten bindungseigenschaften
US5571894A (en) 1991-02-05 1996-11-05 Ciba-Geigy Corporation Recombinant antibodies specific for a growth factor receptor
DK0590058T3 (da) 1991-06-14 2004-03-29 Genentech Inc Humaniseret heregulin-antistof
GB9114948D0 (en) 1991-07-11 1991-08-28 Pfizer Ltd Process for preparing sertraline intermediates
WO1993006217A1 (en) 1991-09-19 1993-04-01 Genentech, Inc. EXPRESSION IN E. COLI OF ANTIBODY FRAGMENTS HAVING AT LEAST A CYSTEINE PRESENT AS A FREE THIOL, USE FOR THE PRODUCTION OF BIFUNCTIONAL F(ab')2 ANTIBODIES
US5587458A (en) 1991-10-07 1996-12-24 Aronex Pharmaceuticals, Inc. Anti-erbB-2 antibodies, combinations thereof, and therapeutic and diagnostic uses thereof
WO1993008829A1 (en) 1991-11-04 1993-05-13 The Regents Of The University Of California Compositions that mediate killing of hiv-infected cells
EP1997894B1 (en) 1992-02-06 2011-03-30 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Biosynthetic binding protein for cancer marker
CA2163345A1 (en) 1993-06-16 1994-12-22 Susan Adrienne Morgan Antibodies
US5789199A (en) 1994-11-03 1998-08-04 Genentech, Inc. Process for bacterial production of polypeptides
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US5840523A (en) 1995-03-01 1998-11-24 Genetech, Inc. Methods and compositions for secretion of heterologous polypeptides
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US6267958B1 (en) 1995-07-27 2001-07-31 Genentech, Inc. Protein formulation
GB9603256D0 (en) 1996-02-16 1996-04-17 Wellcome Found Antibodies
US6171586B1 (en) 1997-06-13 2001-01-09 Genentech, Inc. Antibody formulation
WO1998058964A1 (en) 1997-06-24 1998-12-30 Genentech, Inc. Methods and compositions for galactosylated glycoproteins
US6040498A (en) 1998-08-11 2000-03-21 North Caroline State University Genetically engineered duckweed
WO1999022764A1 (en) 1997-10-31 1999-05-14 Genentech, Inc. Methods and compositions comprising glycoprotein glycoforms
US6610833B1 (en) 1997-11-24 2003-08-26 The Institute For Human Genetics And Biochemistry Monoclonal human natural antibodies
ES2375931T3 (es) 1997-12-05 2012-03-07 The Scripps Research Institute Humanización de anticuerpo murino.
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
JP2002510481A (ja) 1998-04-02 2002-04-09 ジェネンテック・インコーポレーテッド 抗体変異体及びその断片
EP2261229A3 (en) 1998-04-20 2011-03-23 GlycArt Biotechnology AG Glycosylation engineering of antibodies for improving antibody-dependent cellular cytotoxicity
JP2003512019A (ja) 1999-01-15 2003-04-02 ジェネンテック・インコーポレーテッド 変化したエフェクター機能を有するポリペプチド変異体
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
ES2420835T3 (es) 1999-04-09 2013-08-27 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Procedimiento para controlar la actividad de las moléculas inmunofuncionales
US7125978B1 (en) 1999-10-04 2006-10-24 Medicago Inc. Promoter for regulating expression of foreign genes
MXPA02003456A (es) 1999-10-04 2002-10-23 Medicago Inc Metodo para regular la transcripcion de genes foraneos.
JP4668498B2 (ja) 1999-10-19 2011-04-13 協和発酵キリン株式会社 ポリペプチドの製造方法
WO2001044463A1 (en) 1999-12-15 2001-06-21 Genentech, Inc. Shotgun scanning, a combinatorial method for mapping functional protein epitopes
JP2003531588A (ja) 2000-04-11 2003-10-28 ジェネンテック・インコーポレーテッド 多価抗体とその用途
CA2953239A1 (en) 2000-10-06 2002-04-18 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Antibody composition-producing cell
US7064191B2 (en) 2000-10-06 2006-06-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Process for purifying antibody
US6946292B2 (en) 2000-10-06 2005-09-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cells producing antibody compositions with increased antibody dependent cytotoxic activity
US6596541B2 (en) 2000-10-31 2003-07-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
CN101940189A (zh) 2000-11-30 2011-01-12 米德列斯公司 用于生产人类抗体的转基因转染色体啮齿动物
EP1423510A4 (en) 2001-08-03 2005-06-01 Glycart Biotechnology Ag ANTIBODY GLYCOSYLATION VARIANTS WITH INCREASED CELL CYTOTOXICITY DEPENDENT OF ANTIBODIES
ES2326964T3 (es) 2001-10-25 2009-10-22 Genentech, Inc. Composiciones de glicoproteina.
US20040093621A1 (en) 2001-12-25 2004-05-13 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd Antibody composition which specifically binds to CD20
ATE503829T1 (de) 2002-04-09 2011-04-15 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd Zelle mit erniedrigter oder deletierter aktivität eines am gdp-fucosetransport beteiligten proteins
WO2003085119A1 (fr) 2002-04-09 2003-10-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Procede d'amelioration de l'activite d'une composition d'anticorps de liaison avec le recepteur fc$g(g) iiia
CA2481920A1 (en) 2002-04-09 2003-10-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Antibody composition-containing medicament
CA2481837A1 (en) 2002-04-09 2003-10-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Production process for antibody composition
AU2003236019A1 (en) 2002-04-09 2003-10-20 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Drug containing antibody composition appropriate for patient suffering from Fc Gamma RIIIa polymorphism
BR0309145A (pt) 2002-04-09 2005-02-01 Kyowa Hakko Kogyo Kk Células das quais o genoma é modificado
AU2003239966B9 (en) 2002-06-03 2010-08-26 Genentech, Inc. Synthetic antibody phage libraries
US7361740B2 (en) 2002-10-15 2008-04-22 Pdl Biopharma, Inc. Alteration of FcRn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis
PL212899B1 (pl) 2002-12-16 2012-12-31 Genentech Inc Humanizowane przeciwcialo, kompozycja zawierajaca to przeciwcialo, wyrób fabryczny, przeciwcialo lub jego fragment do zastosowania w sposobie indukowania apoptozy, izolowany kwas nukleinowy, wektor ekspresji, komórka gospodarza, sposób wytwarzania przeciwciala lub jego fragmentu, plynny preparat i zastosowanie przeciwciala do wytwarzania leku
EP1585767A2 (en) 2003-01-16 2005-10-19 Genentech, Inc. Synthetic antibody phage libraries
US20060104968A1 (en) 2003-03-05 2006-05-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminogly ycanases
US7871607B2 (en) 2003-03-05 2011-01-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminoglycanases
CA2542046A1 (en) 2003-10-08 2005-04-21 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Fused protein composition
CA2542125A1 (en) 2003-10-09 2005-04-21 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Process for producing antibody composition by using rna inhibiting the function of .alpha.1,6-fucosyltransferase
HUE031632T2 (en) 2003-11-05 2017-07-28 Roche Glycart Ag Antigen binding molecules with enhanced Fc receptor binding affinity and effector function
JPWO2005053742A1 (ja) 2003-12-04 2007-06-28 協和醗酵工業株式会社 抗体組成物を含有する医薬
JP5128935B2 (ja) 2004-03-31 2013-01-23 ジェネンテック， インコーポレイテッド ヒト化抗ＴＧＦ−β抗体
US7785903B2 (en) 2004-04-09 2010-08-31 Genentech, Inc. Variable domain library and uses
EP2360186B1 (en) 2004-04-13 2017-08-30 F. Hoffmann-La Roche AG Anti-P-selectin antibodies
TWI309240B (en) 2004-09-17 2009-05-01 Hoffmann La Roche Anti-ox40l antibodies
NZ580115A (en) 2004-09-23 2010-10-29 Genentech Inc Cysteine engineered antibody light chains and conjugates
US20100111856A1 (en) 2004-09-23 2010-05-06 Herman Gill Zirconium-radiolabeled, cysteine engineered antibody conjugates
JO3000B1 (ar) 2004-10-20 2016-09-05 Genentech Inc مركبات أجسام مضادة .
EP1957531B1 (en) 2005-11-07 2016-04-13 Genentech, Inc. Binding polypeptides with diversified and consensus vh/vl hypervariable sequences
EP1973951A2 (en) 2005-12-02 2008-10-01 Genentech, Inc. Binding polypeptides with restricted diversity sequences
ZA200804680B (en) * 2005-12-15 2009-10-28 Genentech Inc Methods and compositions for targeting polyubiquitin
US7763245B2 (en) * 2005-12-15 2010-07-27 Genentech, Inc. Methods and compositions for targeting polyubiquitin
TW200812616A (en) 2006-05-09 2008-03-16 Genentech Inc Binding polypeptides with optimized scaffolds
PL2059533T3 (pl) 2006-08-30 2013-04-30 Genentech Inc Przeciwciała wieloswoiste
US20080226635A1 (en) 2006-12-22 2008-09-18 Hans Koll Antibodies against insulin-like growth factor I receptor and uses thereof
CN100592373C (zh) 2007-05-25 2010-02-24 群康科技(深圳)有限公司 液晶显示面板驱动装置及其驱动方法
US8592562B2 (en) 2008-01-07 2013-11-26 Amgen Inc. Method for making antibody Fc-heterodimeric molecules using electrostatic steering effects
EP2247617B1 (en) * 2008-01-18 2013-02-27 Genentech, Inc. Methods and compositions for targeting polyubiquitin
KR20130062264A (ko) * 2010-04-15 2013-06-12 제넨테크, 인크. 항-폴리유비퀴틴 항체 및 사용 방법
BR112014002716A2 (pt) * 2011-08-05 2017-06-13 Genentech Inc anticorpos anti-poliubiquitina e métodos de uso
WO2015187428A1 (en) * 2014-06-06 2015-12-10 Redwood Bioscience, Inc. Anti-her2 antibody-maytansine conjugates and methods of use thereof
EP3448874A4 (en) * 2016-04-29 2020-04-22 Voyager Therapeutics, Inc. COMPOSITIONS FOR TREATING A DISEASE

Also Published As

Publication number Publication date
JP7133477B2 (ja) 2022-09-08
JP2019528040A (ja) 2019-10-10
CN109563160B (zh) 2023-02-28
JP2022130392A (ja) 2022-09-06
CN109563160A (zh) 2019-04-02
US20220242938A1 (en) 2022-08-04
EP3475298A1 (en) 2019-05-01
US11274145B2 (en) 2022-03-15
WO2017223405A1 (en) 2017-12-28
US20190169278A1 (en) 2019-06-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10889651B2 (en) Anti-Ly6E antibodies and methods of use
RU2584597C2 (ru) Антитела против а2 тенасцина с и способы их применения
JP7141336B2 (ja) 抗ミオスタチン抗体および使用方法
EA037977B1 (ru) Антитела к fap, способы их получения и применения
JP2021184714A (ja) 多重特異性抗体のスクリーニング方法
US8993249B2 (en) Anti-neuropilin antibodies and methods of use
MX2014008157A (es) Anticuerpos anti-lrp5 y metodos de uso.
KR102193080B1 (ko) 항-jagged 항체 및 사용 방법
US20220242938A1 (en) Anti-Polyubiquitin Multispecific Antibodies
WO2012010582A1 (en) Anti-cxcr5 antibodies and methods of use
KR20170026362A (ko) 항-ｂｒｄｕ 항체 및 사용 방법
JP2018520658A (ja) ヒト化抗エボラウイルス糖タンパク質抗体及びその使用
WO2013083497A1 (en) Antibody formulation
TW201605903A (zh) 結合至ｈｅｒ１貝他－髮夾的ｈｅｒ１抗原結合蛋白
JP2019518012A (ja) 修飾された抗テネイシン抗体及び使用方法
WO2023034750A1 (en) Anti-polyubiquitin multispecific antibodies
CN117480184A (zh) 抗ddr2抗体及其用途

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: DE

Ref document number: 40094440

Country of ref document: HK