CN103396485B

CN103396485B - 靶向多聚泛蛋白的方法和组合物

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Publication number: CN103396485B
Application number: CN201310313810.8A
Authority: CN
Inventors: 纳撒尼尔.C.戈登; 罗伯特.F.凯利; 安.法姆; 萨拉.希莫威茨
Original assignee: Genentech Inc
Current assignee: Genentech Inc
Priority date: 2005-12-15
Filing date: 2006-12-14
Publication date: 2016-08-10
Anticipated expiration: 2026-12-14
Also published as: US20100267050A1; WO2007120334A3; HK1121471A1; AU2006342025B2; KR20080080635A; US9487578B2; NO20083127L; WO2007120334A2; EP3309170A1; AU2006342025A2; US20070218069A1; IL191617A0; IL191617A; WO2007120334A8; JP2009519716A; EP2325208B1; RU2008128134A; JP2013220104A; CN103396485A; IL251562A0

Abstract

本发明涉及靶向多聚泛蛋白的方法和组合物。提供了抗多聚泛蛋白单克隆抗体以及使用该抗体的方法。

Description

靶向多聚泛蛋白的方法和组合物

本申请是申请日为2006年12月14日、中国申请号为200680052905.7、发明名称为“靶向多聚泛蛋白的方法和组合物”的发明申请的分案申请。

发明领域

本发明涉及抗多聚泛蛋白抗体领域，更具体来说涉及不与单泛蛋白特异性结合并能区分具有不同异肽键(isopeptide linkage)的多聚泛蛋白的抗多聚泛蛋白抗体。

背景

泛蛋白(ubiquitin)是一种在诸多细胞途径中具有重要调节作用的小蛋白质。这些作用中最为人所共知的是泛蛋白在蛋白降解中的作用，在此泛蛋白与靶蛋白共价连接，使得靶蛋白为26S蛋白酶体识别并受之破坏(参见Wilkinson,Semin.Cell Devel.Biol.11(3):141-148(2000))。不同信号传导途径的蛋白激酶调节也与泛蛋白化作用有关(参见Sun和Chen,Curr.Opin.Cell Biol.16:119-126(2004))。例如，经IκB激酶的IκB磷酸化作用使IκB的泛蛋白化作用得以可能，并随后通过26S蛋白酶体而降解；由于IκB是NFκB的抑制剂，因此IκB的降解激活了NFκB(Ghosh和Karin,Cell 109(Suppl.):S81-S96(2002);Palombella等,Cell 78:773-785(1994))。泛蛋白化作用还介导DNA修复(参见Sun和Chen,Curr.Opin.Cell Biol.16:119-126(2004))。在DNA损伤后，增殖细胞核抗原的(PCNA)单泛蛋白化作用激活了不论任何DNA损伤都能合成DNA的耐损伤聚合酶(Stelter和Ulrich,Nature425:188-191(2003)。其它其中已知涉及泛蛋白化作用的生理过程包括细胞***、细胞生长、细胞运动和细胞凋亡/细胞死亡(Johnson,Nat.Cell Biol.4:E295-E298(2002);Pickart,Mol.Cell.8:499-504(2001))。

泛蛋白(一种76个氨基酸的蛋白)与靶蛋白的共价连接是一种三步酶促过程(Pickart,Annu.Rev.Biochem.70:503-533(2001))。首先，在ATP-依赖性反应中泛蛋白激活酶E1形成泛蛋白-E1硫酯。在第二步中，泛蛋白由泛蛋白-E1硫酯转移至泛蛋白蛋白缀合酶(E2)家族的的成员。在第三步中，在泛蛋白蛋白连接酶(E3)的帮助下，在泛蛋白羧基末端和靶蛋白上赖氨酸残基的ε-氨基之间形成异肽键。称为去泛蛋白酶的酶类从靶蛋白上将泛蛋白部分除去(Guterman和Glickman,Curr.Prot.Pep.Sci.5:201-210(2004))。泛蛋白的突出作用在于作为重要的调节分子，人基因组含有许多涉及泛蛋白化作用或去泛蛋白化作用的不同蛋白：迄今为止已鉴定了至少40种不同的E2、500种不同的E3和80种不同的去泛蛋白酶(Wong等,Drug.Discov.Today8:746-754(2003))。

泛蛋白含有7个赖氨酸残基(Lys6、Lys22、Lys27、Lys33、Lys29、Lys48和Lys63)，因此泛蛋白自身可作为靶蛋白用于泛蛋白化作用(Peng等,Nat.Biotechnol.21:921-926(2003);Pickart和Fushman,Curr.Opin.Chem.Biol.8:610-616(2004))。泛蛋白蛋白的泛蛋白化作用后所产生的分子称为多聚泛蛋白分子，并可包含两个或更多个泛蛋白部分。理论上，泛蛋白的泛蛋白化作用可在7个赖氨酸残基中任何一个上发生(Peng等,Nat.Biotechnol.21:921-926(2003))，以致存在具有异肽键合至泛蛋白内不同赖氨酸残基的不同种类的多聚泛蛋白。有可能具有多于两个泛蛋白部分的单个多聚泛蛋白分子可具有多于一种的赖氨酸键。已有研究表明E2酶影响一个泛蛋白分子与另一个泛蛋白分子之间所形成的赖氨酸键的类型(Tenno等,Genes to Cells9:865-875(2004);Deng等(2000);Hofmann和Pickart(2001))。多聚泛蛋白和泛蛋白都能作为游离分子以及与靶蛋白共价连接的形式存在。

像泛蛋白一样，已在许多细胞过程中发现涉及多聚泛蛋白，这些过程包括细胞内运输、细胞内吞作用、基因表达/沉默、蛋白水解、激酶激活作用、翻译和DNA修复(Hoege等,Nature419:135-141(2002);Spence等,Mol.Cell.Biol.15:1265-1273(1995);Hofmann和Pickart,Cell96:645-653(1999)。然而，在相同途径中与单泛蛋白和单泛蛋白化作用相比，多聚泛蛋白和多聚泛蛋白化作用可具有显著不同的生理学作用。例如，当在DNA损伤后PCNA的单泛蛋白化作用导致易错DNA聚合酶激活时，在与单泛蛋白化作用相同残基处的PCNA的多聚泛蛋白化作用则被观察到能导致易错DNA修复的激活(Stelter和Ulrich,Nature425:188-191(2003);Hoege等,Nature419:135-141(2002);Spence等,Mol.Cell.Biol.15:1265-1273(1995);以及Hofmann和Pickart,Cell 96:645-653(1999))。

甚至连具有不同赖氨酸键的多聚泛蛋白都显示具有不同的生理学作用。得到最多研究的两种多聚泛蛋白是Lys48连接的和Lys63连接的多聚泛蛋白，对这两种多聚泛蛋白的结构研究提出不同赖氨酸连接的多聚泛蛋白可采用明显不同的构象，由此容许与所选择的结合伴侣具有不同的相互作用(Tenno等,Genes to Cells9:865-875(2004))。虽然通过Lys48连接的多聚泛蛋白的共价修饰通常标志着靶蛋白能蛋白水解降解，但是存在着一些证据证明Lys48连接的多聚泛蛋白还可通过非蛋白水解方式调节某些蛋白(Chau等,Science243:1576-1583(1989);Finley等,Mol.Cell.Biol.14:5501-5509(1994);Flick等,Nat.Cell.Biol.6:634-641(2004))。与此相反，Lys63连接的多聚泛蛋白已与多种非蛋白水解的细胞内途径相关，包括DNA修复(表达K63R-泛蛋白的酵母细胞是DNA修复缺陷型的)、激酶激活作用、细胞内运输和翻译(Pickart和Fushman,Curr.Opin.Chem.Biol.8:610-616(2004);Hicke 和Dunn,Annu Rev.Cell Dev.Biol.19:141-172(2003);Spece等,Mol.CellBiol.15:1265-1273(1995);Ulrich,Eukaryot.Cell 1:1-10(2002);Spence等,Cell 102:67-76(2000);Seibenhener等,Mol.Cell.Biol.24(18):8055-8068(2004))。在一个特定的例子中，以不依赖于蛋白酶体的方式通过parkin，synphilin-1为K63连接的多聚泛蛋白所正常地泛蛋白化，但synphilin-1亦可为K48连接的多聚泛蛋白的泛蛋白化作用所靶向破坏(Lim等,J.Neurosci.25(8):2002-9(2005))。一项对患有帕金森氏病的受试者的分析显示synphilin-1的K63-多聚泛蛋白化作用可能涉及与疾病相关的Lewy包涵小体(Lewy bodyinclusion)的形成(Lim等,J.Neurosci.25(8):2002-9(2005))。

其它的赖氨酸连接的多聚泛蛋白还未得到详尽、广泛的研究，原因在于它们之间难以区分。迄今为止，研究依赖于表达其中一个或多个赖氨酸已除去的经过诱变的泛蛋白的细胞、酶促合成的具有特定键合的多聚泛蛋白或用于区分一种类型和另一种类型的多聚泛蛋白的诸如质谱法的技术。对于分析特定赖氨酸连接的多聚泛蛋白的正常生理学行为来说，上述那些方法中任何一种都不适合或麻烦重重。虽然存在与单泛蛋白相比特异于多聚泛蛋白的抗体(Fujimoro等,FEBS Lett.349:173-180(1994))，但至今为止仍然没有能区分具有不同赖氨酸键的多聚泛蛋白的抗体。

并不令人吃惊的是，由于已知它们在诸多细胞过程中的重要作用，因此泛蛋白和多聚泛蛋白还与许多疾病有关(参见Argiles,Ubiquitin and Disease,R.G.Landes(1998))。在肌肉萎缩中观察到泛蛋白失调(Mitch和Goldberg,New Engl.J.Med.335:1897-905(1996);Bodine等,Science 294:1704-1708(2001))。已将一些遗传性疾病与异常的泛蛋白活性相关联，包括囊性纤维化(Ward等,Cell83:121-127(1995))、Angelman’s综合征(Kishino等,Nature Genet.15:70-73(1997))和利德尔综合征(Staub等,EMBO J 16:6325-6336(1997))。在免疫和炎症应答中泛蛋白还起作用；例如，已发现细胞外泛蛋白作为一种细胞因子抑制了TNFα对外周血单核细胞中内毒素的应答，并调节内毒素低反应性(Majetschak等,Blood 101:1882-1890(2003);Ciechanover,EMBO J17:7151-7160(1998))。同样地，已发现在人血清中具有泛蛋白和多聚泛蛋白，在具有寄生虫病和变应性疾病的患者血清中观察到这两种分子具有较高的水平(Takada等,Clinical Chem.43:1188-1195(1997))。

一些泛蛋白介导的途径的失调还涉及癌症(Spataro等,Br.J.Cancer77:448-55(1998);Beckmann等,Hum.Mutat.25:507-12(2005))。例如，异二聚泛蛋白连接酶BRCA1-BARD1中的突变就与乳腺癌相关(Hashizume等,J.Biol.Chem.276:14537-40(2001))，破坏Myc要被泛蛋白途径所降解的能力的突变激活了c-Myc的致癌潜力(Salghetti等,EMBOJ.18:717-726(1999))，并且转化的v-Jun无法被泛蛋白化并降解为其非致癌的相关物c-Jun，由此导致不受控制的生长(Ciechanover,EMBO J.17:7151-7160(1998);Trier等,Cell78:787-798(1994))。

在上下文的神经***疾病中已详尽地研究了泛蛋白和多聚泛蛋白(Chung等,TINS24(11Suppl.)S7-S14(2001))。积聚在亨廷顿病、脊髓小脑性共济失调、朊病毒脑病、皮克病、Lewy小体病、帕金森氏病和阿尔茨海默氏病中的包涵物、小体以及神经原纤维缠结对单泛蛋白和/或多聚泛蛋白是免疫染色阳性(Alves-Rodrigues等,Trends Neurosci.21:516-520(1998);Cammarata等,Neurosci Lett.156:96-98(1993);Kalchman等,J.Biol.Chem.271:19385-94(1996);Holmberg等,Human Mol.Genet.7:913-918(1998);Yedidia等,EMBO J.20:5383-91(2001);Mori等,Science 235:1641-44(1987);Leigh等,Acta Neuropathol.(Berl.)79:61-72(1989)；和Kuzuhara等,Acta Neuropathologica75:345-353(1988))。虽然已将一些类型的帕金森氏病与泛蛋白羧基末端水解酶L1(UCH-L1)基因、去泛蛋白酶中的突变相关联(Leroy等,Nature395:451-452(1998))，但是其它类型的帕金森氏病却与Parkin(一种已知与泛蛋白缀合酶UbcH7相互作用并泛蛋白化synphilin-1的E2-依赖性泛蛋白蛋白连接酶)中失活突变相关联(Shimura等,Nature Genet.25:302-305(2000),Zhang等,Proc.Natl.Acad.Sci.97:13354-13359(2000);Lim等,J.Neurosci.25(8):2002-9(2005))。这两种类型的突变都导致异常的蛋白水解加工和不适当的蛋白积聚(参见McNaught等,Nature Rev.Neurosci.2:589-594(2001))。还已发现UCH-L1突变与亨廷顿病是孤立的(Naze等,Neurosci.Lett.328:1:1-4(2002))。已鉴定了阿尔茨海默氏病人脑中的泛蛋白突变体，其非常有效地掺入多聚泛蛋白链中，但一旦形成就很难被去泛蛋白化，潜在地导致正常细胞蛋白水解加工***的支配抑制(Lam等,Proc.Natl.Acad.Sci.97:9902-9906(2000))。

显然不但拥有能区分具有不同赖氨酸键的多聚泛蛋白的组合物和方法，而且拥有能有效地靶向并调节泛蛋白和多聚泛蛋白介导的途径的组合物和方法应当是有益的。在此提供的本发明涉及上述组合物和方法。

所有在此引用的包括专利申请和出版物在内的参考文献以其全文并入作为参考。

发明公开内容

本发明提供了能与多聚泛蛋白结合和/或调节与多聚泛蛋白相关的生物活性的新抗体。

在一个实施方案中，提供了一种与多聚泛蛋白特异性结合的分离的抗体，其中该抗体不与单泛蛋白特异性结合。在一个实施方案中，提供了一种与包含第一赖氨酸键的第一多聚泛蛋白特异性结合的分离的抗体，其中该抗体不与包含第二赖氨酸键的第二多聚泛蛋白特异性结合，以及其中第一赖氨酸键不同于第二赖氨酸键。在一个方面中，抗体进一步与赖氨酸6连接的多聚泛蛋白、赖氨酸11连接的多聚泛蛋白、赖氨酸27连接的多聚泛蛋白、赖氨酸29连接的多聚泛蛋白、赖氨酸33连接的多聚泛蛋白、赖氨酸48连接的多聚泛蛋白或赖氨酸63连接的多聚泛蛋白特异性结合。

在一个实施方案中，提供了一种与第一K48连接的多聚泛蛋白特异性结合的分离的抗体，其中该抗体不与包含不同的多聚泛蛋白的赖氨酸连接形式的第二多聚泛蛋白(即非K48连接的多聚泛蛋白)特异性结合。在一个实施方案中，第二多聚泛蛋白是K63连接的多聚泛蛋白。

在一个实施方案中，提供了一种与第一K63连接的多聚泛蛋白特异性结合的分离的抗体，其中该抗体不与包含不同的多聚泛蛋白的赖氨酸连接形式的第二多聚泛蛋白(即非K63连接的多聚泛蛋白)特异性结合。在一个实施方案中，第二多聚泛蛋白是K48连接的多聚泛蛋白。

在一个实施方案中，提供了一种与包含第一赖氨酸键的第一多聚泛蛋白和包含第二赖氨酸键的第二多聚泛蛋白都特异性结合的分离的抗体，其中第一赖氨酸键不同于第二赖氨酸键，其中该抗体不与单泛蛋白特异性结合，并且其中该抗体与第二多聚泛蛋白的结合具有与该抗体对第一多聚泛蛋白的结合亲和力相比实质上减少的结合亲和力。

在一个实施方案中，提供了一种与赖氨酸-48连接的多聚泛蛋白特异性结合的分离的抗体，其中该抗体不与单泛蛋白特异性结合。在一个实施方案中，抗体进一步包含至少一条选自分别为SEQ ID NOs:1-25、151-175、265-279、392-459和695-704；SEQ ID NOs:27-51、177-201、281-295、461-528和706-715；SEQ ID NOs:53-77、203-227、297-311、530-597和717-726；以及SEQ ID NOs:313-327和728-737任一的HVR-H1、HVR-H2、HVR-H3和HVR-L3的高变区(HVR)序列。在一个实施方案中，抗体进一步包含至少一条选自HVR-H1、HVR-H2、HVR-H3的序列，其中HVR-H1包含氨基酸序列a b c d e f g h i j(SEQ ID NO:825)，其中氨基酸a是甘氨酸；氨基酸b是苯丙氨酸；氨基酸c是天冬酰胺；氨基酸d选自缬氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；氨基酸e选自丝氨酸和酪氨酸；氨基酸f是酪氨酸；氨基酸g选自丝氨酸和酪氨酸；氨基酸h选自丝氨酸和酪氨酸；氨基酸i选自异亮氨酸和甲硫氨酸；和氨基酸j是组氨酸；其中HVR-H2包含氨基酸序列k l mn o p q r s t u v w x y z a’(SEQ ID NO:826)，其中氨基酸k是丝氨酸；氨基酸l是异亮氨酸；氨基酸m选自丝氨酸和酪氨酸；氨基酸n选自脯氨酸和丝氨酸；氨基酸o是酪氨酸；氨基酸p是酪氨酸；氨基酸q选自丝氨酸和甘氨酸；氨基酸r选自丝氨酸和酪氨酸；氨基酸s是苏氨酸，氨基酸t选自丝氨酸和酪氨酸；氨基酸u是酪氨酸；氨基酸v是丙氨酸；氨基酸w是天冬氨酸；氨基酸x是丝氨酸；氨基酸y是缬氨酸；氨基酸z是赖氨酸；和氨基酸a’是甘氨酸；以及其中HVR-H3包含氨基酸序列b’c’d’e’f’g’h’i’j’k’l’，其中氨基酸b’选自谷氨酸、丝氨酸、甘氨酸和酪氨酸；氨基酸c’选自甘氨酸、酪氨酸、丝氨酸和天冬酰胺；氨基酸d’选自酪氨酸、丝氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸和谷氨酸；氨基酸e’选自丝氨酸、酪氨酸、甘氨酸和色氨酸；氨基酸f’选自谷氨酰胺、酪氨酸,、丝氨酸和甘氨酸；氨基酸g’选自甘氨酸、丝氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸和丙氨酸；氨基酸h’选自甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸和异亮氨酸；氨基酸i’选自苯丙氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、丙氨酸和亮氨酸，或不存在；氨基酸j’是苯丙氨酸或不存在；氨基酸k’是天冬氨酸；和氨基酸l’是酪氨酸。在一个实施方案中，抗体进一步包含相应于图10A和10B中对应于克隆apu01、apu02、apu03、apu04、apu05、apu06、apu07、apu08、apu09、apu10、apu11、apu12、apu13、apu14或apu15所列的那些序列的HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3序列。

在一个实施方案中，抗体包含至少一条选自HVR-H1、HVR-H2、HVR-H3的序列，其中HVR-H1包含氨基酸序列a b c d e f g h i j(SEQ ID NO:827)，其中氨基酸a是甘氨酸；氨基酸b是苯丙氨酸；氨基酸c是天冬酰胺；氨基酸d是异亮氨酸；氨基酸e选自丝氨酸和苯丙氨酸；氨基酸f是酪氨酸；氨基酸g选自丝氨酸和甘氨酸；氨基酸h选自丝氨酸和甘氨酸；氨基酸i选自异亮氨酸和甲硫氨酸；和氨基酸j是组氨酸；其中HVR-H2包含氨基酸序列k l m n o pq r s t u v w x y z a’(SEQ ID NO:828)，其中氨基酸k是丝氨酸；氨基酸l是异亮氨酸；氨基酸m是酪氨酸；氨基酸n是丝氨酸；氨基酸o是酪氨酸；氨基酸p是酪氨酸；氨基酸q是丝氨酸；氨基酸r是酪氨酸；氨基酸s是苏氨酸，氨基酸t是丝氨酸；氨基酸u是酪氨酸；氨基酸v是丙氨酸；氨基酸w是天冬氨酸；氨基酸x是丝氨酸；氨基酸y是缬氨酸；氨基酸z’是赖氨酸；和氨基酸a’是甘氨酸；以及其中HVR-H3包含氨基酸序列b’c’d’e’f’g’h’i’j’k’(SEQ ID NO:829)，其中氨基酸b’选自丝氨酸和甘氨酸；氨基酸c’是酪氨酸；氨基酸d’是丝氨酸；氨基酸e’选自酪氨酸和色氨酸；氨基酸f’选自丝氨酸、酪氨酸、精氨酸、苯丙氨酸和组氨酸；氨基酸g’选自谷氨酸、丝氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺和缬氨酸；氨基酸h’选自丙氨酸和甘氨酸；氨基酸i’选自亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸和异亮氨酸；氨基酸j’是天冬氨酸；和氨基酸k’是酪氨酸。在一个实施方案中，抗体进一步包含相应于图16A中对应于克隆apu2.01、apu2.02、apu2.03、apu2.04、apu2.05、apu2.06、apu2.07、apu2.08、apu2.09或apu2.10所列的那些序列的HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3序列。

在一个实施方案中，抗体进一步包含含有氨基酸序列m’n’o’p’q’r’s’t’u’v’w’(SEQ ID NO:830)的HVR-L3序列，其中氨基酸m’是谷氨酰胺；氨基酸n’是谷氨酰胺；氨基酸o’选自丝氨酸和酪氨酸；氨基酸p’选自丝氨酸和酪氨酸；氨基酸q’选自丝氨酸和酪氨酸；氨基酸r’选自丝氨酸和酪氨酸；氨基酸s’选自丝氨酸和酪氨酸；氨基酸t’选自亮氨酸、丝氨酸、脯氨酸和酪氨酸；氨基酸u’是脯氨酸或不存在；氨基酸v’选自苯丙氨酸、异亮氨酸、缬氨酸和亮氨酸；和氨基酸w’是苏氨酸。在一个实施方案中，抗体进一步包含SEQ ID NO:79的HVR-L1序列，SEQ ID NO:80的HVR-L2序列和相应于图10C中对应于克隆apu01、apu02、apu03、apu04、apu05、apu06、apu07、apu08、apu09、apu10、apu11、apu12、apu13、apu14或apu15所列的HVR-L3序列的HVR-L3序列。在一个实施方案中，抗体进一步包含含有氨基酸序列Q-Q-S-S-Y-S-S-L-I-T(SEQ ID NO:728)的HVR-L3序列。在一个实施方案中，抗体进一步包含SEQ ID NO:79的HVR-L1序列，SEQ ID NO:80的HVR-L2序列和相应于图16B中对应于克隆apu2.01、apu2.02、apu2.03、apu2.04、apu2.05、apu2.06、apu2.07、apu2.08、apu2.09或apu2.10所列的HVR-L3序列的HVR-L3序列。

在一个实施方案中，提供了一种与赖氨酸-48连接的多聚泛蛋白特异性结合的分离的抗体，其中所述抗体不与单泛蛋白特异性结合，并且其中该抗体包含SEQ ID NO:269的HVR-H1序列、SEQ ID NO:285的HVR-H2序列、SEQ ID NO:301的HVR-H3序列、SEQ ID NO:79的HVR-L1序列、SEQ ID NO:80的HVR-L2序列和SEQ ID NO:317的HVR-L3序列。在一个实施方案中，提供了一种与赖氨酸-48连接的多聚泛蛋白特异性结合的分离的抗体，其中该抗体不与单泛蛋白特异性结合，并且其中该抗体包含SEQ ID NO:701的HVR-H1序列、SEQ ID NO:712的HVR-H2序列、SEQ ID NO:723的HVR-H3序列、SEQ ID NO:79的HVR-L1序列、SEQ ID NO:80的HVR-L2序列和SEQ ID NO:734的HVR-L3序列。在一个实施方案中，提供了一种与赖氨酸-48连接的多聚泛蛋白特异性结合的分离的抗体，其中该抗体不与单泛蛋白特异性结合，并且其中该抗体包含SEQ ID NO:701的HVR-H1序列、SEQ ID NO:712的HVR-H2序列、SEQ IDNO:723的HVR-H3序列、SEQ ID NO:79的HVR-L1序列、SEQ ID NO:80的HVR-L2序列和SEQ IDNO:734的HVR-L3序列。

在一个实施方案中，提供了一种与赖氨酸-63连接的多聚泛蛋白特异性结合的分离的抗体，其中该抗体不与单泛蛋白特异性结合。在一个实施方案中，抗体进一步包含至少一条选自分别为SEQ ID NOs:81-89、229-239、329-336、599-629和739-748；SEQ ID NOs:91-99、241-251、338-345、631-661和750-759；SEQ ID NOs:101-109、253-263、347-354、663-693和761-770；以及SEQ ID NOs:356-363和772-781任一的HVR-H1、HVR-H2、HVR-H3和HVR-L3的高变区(HVR)序列。在一个实施方案中，抗体包含至少一条选自HVR-H1、HVR-H2、HVR-H3的序列，其中HVR-H1包含氨基酸序列a bc d e f g h i j(SEQ ID NO:831)，其中氨基酸a是甘氨酸；氨基酸b是苯丙氨酸；氨基酸c是天冬酰胺；氨基酸d选自缬氨酸、异亮氨酸和苯丙氨酸；氨基酸e选自丝氨酸和酪氨酸；氨基酸f选自丝氨酸和酪氨酸；氨基酸g选自丝氨酸和酪氨酸；氨基酸h选自丝氨酸和酪氨酸；氨基酸i选自异亮氨酸和甲硫氨酸；和氨基酸j是组氨酸；其中HVR-H2包含氨基酸序列k l m n o p q r s t u v w x y z a’(SEQ IDNO:832)，其中氨基酸k选自丝氨酸和酪氨酸；氨基酸l是异亮氨酸；氨基酸m选自丝氨酸和酪氨酸；氨基酸n选自脯氨酸和丝氨酸；氨基酸o选自丝氨酸和酪氨酸；氨基酸p选自丝氨酸和酪氨酸；氨基酸q选自丝氨酸和甘氨酸；氨基酸r选自丝氨酸和酪氨酸；氨基酸s是苏氨酸，氨基酸t选自丝氨酸和酪氨酸；氨基酸u是酪氨酸；氨基酸v是丙氨酸；氨基酸w是天冬氨酸；氨基酸x是丝氨酸；氨基酸y是缬氨酸；氨基酸z是赖氨酸；和氨基酸a是甘氨酸；以及其中HVR-H3包含氨基酸序列b’c’d’e’f’g’h’i’j’k’l’m’n’o’p’q’r’s’t’u’v’，其中氨基酸b’选自丝氨酸、谷氨酸、甘氨酸和色氨酸；氨基酸c’选自甘氨酸、酪氨酸、异亮氨酸、谷氨酰胺和丝氨酸；氨基酸d’选自酪氨酸、甲硫氨酸、甘氨酸和异亮氨酸；氨基酸e’选自酪氨酸、精氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、丙氨酸和脯氨酸；氨基酸f’选自酪氨酸、色氨酸、丝氨酸和甘氨酸；氨基酸g’选自谷氨酰胺、酪氨酸、丝氨酸、苯丙氨酸和缬氨酸；氨基酸h’选自甘氨酸、苏氨酸、色氨酸、赖氨酸和脯氨酸；氨基酸i’选自酪氨酸、丙氨酸、色氨酸、谷氨酸、脯氨酸和丝氨酸；氨基酸j’选自色氨酸、异亮氨酸、酪氨酸和丙氨酸；氨基酸k’选自色氨酸、酪氨酸、甘氨酸和天冬氨酸，或不存在；氨基酸l’选自酪氨酸、丝氨酸、苯丙氨酸和色氨酸，或不存在；氨基酸m’选自酪氨酸、天冬氨酸和丝氨酸，或不存在；氨基酸n’选自酪氨酸和丙氨酸，或不存在；氨基酸o’选自苏氨酸、丝氨酸、缬氨酸、甘氨酸和酪氨酸，或不存在；氨基酸p’选自甘氨酸、天冬氨酸、丝氨酸、甲硫氨酸和酪氨酸，或不存在；氨基酸q’选自酪氨酸、丙氨酸和甘氨酸，或不存在；氨基酸r’选自酪氨酸、亮氨酸和甘氨酸，或不存在；氨基酸s’是甘氨酸或不存在；氨基酸t’选自甲硫氨酸和亮氨酸，或不存在；氨基酸u’是天冬氨酸；和氨基酸v’是酪氨酸。在一个实施方案中，抗体进一步包含相应于图11A和11B中对应于克隆apu17、apu18、apu19、apu20、apu21、apu22、apu23和apu24所列的那些序列的HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3序列。

在一个实施方案中，抗体包含至少一条选自HVR-H1、HVR-H2、HVR-H3的序列，其中HVR-H1包含氨基酸序列a b c d e f g h i j(SEQ ID NO:833)，其中氨基酸a是甘氨酸；氨基酸b是苯丙氨酸；氨基酸c是天冬酰胺；氨基酸d选自异亮氨酸、缬氨酸和亮氨酸；氨基酸e选自丝氨酸、赖氨酸和缬氨酸；氨基酸f选自丝氨酸、色氨酸、甘氨酸和苏氨酸；氨基酸g选自丝氨酸、天冬酰胺和甘氨酸；氨基酸h选自酪氨酸、异亮氨酸、亮氨酸和苯丙氨酸；氨基酸i选自异亮氨酸和甲硫氨酸；和氨基酸j是组氨酸；其中HVR-H2包含氨基酸序列k l m n o p qr s t u v w x y z a’(SEQ ID NO:834)，其中氨基酸k选自酪氨酸、苯丙氨酸、天冬氨酸、组氨酸和丙氨酸；氨基酸l是异亮氨酸；氨基酸m选自丝氨酸、丙氨酸和谷氨酰胺；氨基酸n是脯氨酸；氨基酸o是酪氨酸；氨基酸p选自亮氨酸,酪氨酸和苯丙氨酸；氨基酸q选自丝氨酸和甘氨酸；氨基酸r选自丝氨酸、苏氨酸和色氨酸；氨基酸s是苏氨酸，氨基酸t选自丝氨酸、天冬酰胺、赖氨酸和异亮氨酸；氨基酸u是酪氨酸；氨基酸v是丙氨酸；氨基酸w是天冬氨酸；氨基酸x是丝氨酸；氨基酸y是缬氨酸；氨基酸z’是赖氨酸；和氨基酸a’是甘氨酸；以及其中HVR-H3包含氨基酸序列b’c’d’e’f’g’h’i’j’k’l’(SEQ ID NO:908)，其中氨基酸b’是谷氨酸；氨基酸c’是酪氨酸；氨基酸d’是酪氨酸；氨基酸e’是精氨酸；氨基酸f’是色氨酸；氨基酸g’是酪氨酸；氨基酸h’是苏氨酸；氨基酸i’是丙氨酸；氨基酸j’是异亮氨酸；氨基酸k’是天冬氨酸；和氨基酸l’是酪氨酸。在一个实施方案中，抗体包含相应于图17A中对应于克隆apu2.11、apu2.12、apu2.13、apu2.14、apu2.15、apu2.16、apu2.17、apu2.18、apu2.19和apu2.20所列的那些序列的HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3序列。

在一个实施方案中，抗体包含至少一条选自HVR-H1、HVR-H2、HVR-H3的序列，其中HVR-H1包含氨基酸序列a b c d e f g h i j(SEQ ID NO:835)，其中氨基酸a是甘氨酸；氨基酸b是苯丙氨酸；氨基酸c是天冬酰胺；氨基酸d选自异亮氨酸、缬氨酸和亮氨酸；氨基酸e选自赖氨酸和甲硫氨酸；氨基酸f选自苏氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺、精氨酸和异亮氨酸；氨基酸g选自甘氨酸、缬氨酸和苯丙氨酸；氨基酸h选自酪氨酸、异亮氨酸、亮氨酸和苯丙氨酸；氨基酸i选自异亮氨酸和甲硫氨酸；和氨基酸j是组氨酸；其中HVR-H2包含氨基酸序列k l mn o p q r s t u v w x y z a’b’(SEQ ID NO:836)，其中氨基酸k是丙氨酸；氨基酸l是酪氨酸；氨基酸m是异亮氨酸；氨基酸n选自丝氨酸、异亮氨酸和苏氨酸；氨基酸o是脯氨酸；氨基酸p是酪氨酸；氨基酸q选自亮氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、丝氨酸和色氨酸；氨基酸r是甘氨酸；氨基酸s选自色氨酸、缬氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、精氨酸和酪氨酸；氨基酸t是苏氨酸，氨基酸u选自精氨酸、天冬酰胺、缬氨酸、苏氨酸、丝氨酸和赖氨酸；氨基酸v是酪氨酸；氨基酸w是丙氨酸；氨基酸x是天冬氨酸；氨基酸y是丝氨酸；氨基酸z是缬氨酸；氨基酸a’是赖氨酸；和氨基酸b’是甘氨酸；以及其中HVR-H3包含氨基酸序列c’d’e’f’g’h’i’j’k’l’m’n’o’(SEQID NO:837)，其中氨基酸c’是丝氨酸；氨基酸d’是精氨酸；氨基酸e’是谷氨酸；氨基酸f’是酪氨酸；氨基酸g’是酪氨酸；氨基酸h’是精氨酸；氨基酸i’是色氨酸；氨基酸j’是酪氨酸；氨基酸k’是苏氨酸；氨基酸l’是丙氨酸；氨基酸m’是异亮氨酸；氨基酸n’是天冬氨酸；和氨基酸o’是酪氨酸。在一个实施方案中，抗体包含相应于图23A和23B中对应于克隆apu3.01、apu3.02、apu3.03、apu3.04、apu3.05、apu3.06、apu3.07、apu3.08、apu3.09、apu3.10和3.11所列的那些序列的HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3序列。

在一个实施方案中，抗体包含含有氨基酸序列w’x’y’z’A B C D E F G的HVR-L3序列，其中氨基酸w’是谷氨酰胺；氨基酸x’是谷氨酰胺；氨基酸y’选自丝氨酸和酪氨酸；氨基酸z’选自丝氨酸和酪氨酸；氨基酸A选自丝氨酸和酪氨酸；氨基酸B选自丝氨酸和酪氨酸；氨基酸C选自脯氨酸、丝氨酸和亮氨酸；氨基酸D选自丝氨酸、脯氨酸和酪氨酸，或不存在；氨基酸E选自亮氨酸和苯丙氨酸，或不存在；氨基酸F选自苯丙氨酸、缬氨酸、苏氨酸和异亮氨酸；和氨基酸G选自精氨酸、苏氨酸和苯丙氨酸。在一个实施方案中，抗体包含SEQ ID NO:79的HVR-L1序列，SEQ ID NO:80的HVR-L2序列和相应于图11C中对应于克隆apu17、apu18、apu19、apu20、apu21、apu22、apu23和apu24所列的HVR-L3序列的HVR-L3序列。在一个实施方案中，抗体包含含有氨基酸序列Q-Q-Y-S-S-Y-S-S-L-F-T(SEQ ID NO:772)的HVR-L3序列。在一个实施方案中，抗体包含SEQ ID NO:79的HVR-L1序列，SEQ ID NO:80的HVR-L2序列和相应于图17B中对应于克隆apu2.11、apu2.12、apu2.13、apu2.14、apu2.15、apu2.16、apu2.17、apu2.18、apu2.19和apu2.20所列的HVR-L3序列的HVR-L3序列。在一个实施方案中，抗体包含SEQ ID NO:79的HVR-L1序列，SEQ ID NO:80的HVR-L2序列和相应于SEQ IDNO:777的HVR-L3序列的HVR-L3序列。

在一个实施方案中，提供了一种与赖氨酸-63连接的多聚泛蛋白特异性结合的分离的抗体，其中该抗体不与单泛蛋白特异性结合，并且其中该抗体包含SEQ ID NO:330的HVR-H1序列，SEQ ID NO:339的HVR-H2序列，SEQ ID NO:348的HVR-H3序列，SEQ ID NO:79的HVR-L1序列，SEQ ID NO:80的HVR-L2序列和SEQ ID NO:357的HVR-L3序列。在一个实施方案中，提供了一种与赖氨酸-63连接的多聚泛蛋白特异性结合的分离的抗体，其中该抗体不与单泛蛋白特异性结合，并且其中该抗体包含SEQ ID NO:739的HVR-H1序列，SEQ ID NO:750的HVR-H2序列，SEQ ID NO:761的HVR-H3序列，SEQ ID NO:79的HVR-L1序列，SEQ ID NO:80的HVR-L2序列和SEQ ID NO:772的HVR-L3序列。在一个实施方案中，提供了一种与赖氨酸-63连接的多聚泛蛋白特异性结合的分离的抗体，其中该抗体不与单泛蛋白特异性结合，并且其中该抗体包含SEQ ID NO:740的HVR-H1序列，SEQ ID NO:751的HVR-H2序列，SEQ IDNO:762的HVR-H3序列，SEQ ID NO:79的HVR-L1序列，SEQ ID NO:80的HVR-L2序列和SEQ IDNO:773的HVR-L3序列。在一个实施方案中，提供了一种与赖氨酸-63连接的多聚泛蛋白特异性结合的分离的抗体，其中该抗体不与单泛蛋白特异性结合，并且其中该抗体包含SEQ IDNO:744的HVR-H1序列，SEQ ID NO:755的HVR-H2序列，SEQ ID NO:766的HVR-H3序列，SEQ IDNO:79的HVR-L1序列，SEQ ID NO:80的HVR-L2序列和SEQ ID NO:777的HVR-L3序列。在一个实施方案中，提供了一种与赖氨酸-63连接的多聚泛蛋白特异性结合的分离的抗体，其中该抗体不与单泛蛋白特异性结合，并且其中该抗体包含SEQ ID NO:795的HVR-H1序列，SEQ IDNO:807的HVR-H2序列，SEQ ID NO:819的HVR-H3序列，SEQ ID NO:79的HVR-L1序列，SEQ IDNO:80的HVR-L2序列和SEQ ID NO:777的HVR-L3序列。

在一个方面中，提供了一种与任一前述抗体结合相同的多聚泛蛋白上抗原决定簇的分离的抗体，其中该抗体不与单泛蛋白特异性结合。在一个方面中，提供了一种与任一前述抗体竞争与多聚泛蛋白结合的分离的抗体，其中该抗体不与单泛蛋白特异性结合。

在一个方面中，任一前述抗体与多聚泛蛋白化蛋白特异性结合。在一个方面中，抗体进一步抑制多聚泛蛋白化蛋白的降解。在一个方面中，抗体进一步调节至少一条多聚泛蛋白介导的信号传导途径。在一个方面中，抗体进一步抑制至少一条多聚泛蛋白介导的信号传导途径。在一个方面中，抗体进一步刺激至少一条多聚泛蛋白介导的信号传导途径。

在一个方面中，提供了一种编码本发明的抗体的核酸分子。在一个方面中，提供了一种包含该核酸的载体。在一个方面中，提供了一种包含该载体的宿主细胞。在一个方面中提供了一种能产生本发明的抗体的细胞系。在一个方面中，提供了一种产生本发明的抗体的方法，包括在其中产生该抗体的条件下培养包含编码该抗体的核酸分子的宿主细胞。在一个方面中，提供了一种包含有效量的本发明的抗体和药学上可接受载体的组合物。

在一个方面中，提供了一种鉴定样品中多聚泛蛋白或多聚泛蛋白化蛋白存在的方法，包括将样品与至少一种的本发明的抗体接触。在一个方面中，提供了一种用于治疗患者中与多聚泛蛋白失调相关的疾病或病症的方法，该方法包括给予患者有效量的至少一种的本发明的抗体。在一个方面中，患者是哺乳动物患者。在一个方面中，患者是人。在一个方面中，疾病选自癌症、肌肉病症、泛蛋白途径相关的遗传性病症、免疫/炎性病症和神经***疾病。在一个方面中，疾病选自癌症(carcinoma)、淋巴瘤(lymphoma)、胚细胞瘤(blastoma)、肉瘤(sarcoma)、白血病(leukemia)、肌肉萎缩症(muscular dystrophy)、多发性硬化(multiple sclerosis)、肌萎缩性脊髓侧索硬化(amyotrophic lateral sclerosis)、囊性纤维化(cystic fibrosis)、Angelman’s综合征(Angelman’s syndrome)、利德尔综合征(Liddle syndrome)、阿尔茨海默氏病(Alzheimer’s disease)、帕金森氏病(Parkinson’sdisease)、皮克病(Pick’s disease)和佩吉特病(Paget’s disease)。

在一个方面中，提供了一种确定怀疑含有多聚泛蛋白或多聚泛蛋白化蛋白的样品中多聚泛蛋白或多聚泛蛋白化蛋白存在的方法，包括将样品暴露于至少一种的本发明的抗体并测定该至少一种抗体与样品中多聚泛蛋白或多聚泛蛋白化蛋白的结合。

在一个方面中，提供了一种分离样品中多聚泛蛋白化蛋白和非多聚泛蛋白化蛋白的方法，包括将样品与至少一种的本发明的抗体接触。

在一个方面中，提供了一种确定细胞中多聚泛蛋白的功能和/或活性的方法，包括将细胞与至少一种的本发明的抗体接触并评估所述接触步骤对所述细胞的影响。

在一个方面中，提供了一种确定样品中多聚泛蛋白的功能和/或活性的方法，包括将样品与至少一种的本发明的抗体接触并评估所述接触步骤对所述样品的影响。

在另一个实施方案中，提供了一种与赖氨酸-63连接的多聚泛蛋白特异性结合的分离的抗体，其中该抗体结合赖氨酸-63连接的多聚泛蛋白中的表位。在一个方面中，所述表位包括赖氨酸-63连接的多聚泛蛋白的第一泛蛋白亚基和第二泛蛋白亚基中的残基。在另一个上述方面中，所述表位包括至少一个选自Glu-18、Pro-19、Ser-20、Asp-21、Thr-55、Leu-56、Ser-57、Asp-58、Asn-60、Ile-61和Gln-62的第一泛蛋白亚基中的残基。在另一个上述方面中，所述表位包括至少一个选自Leu-8、Thr-9、Glu-34、Gly-35、Ile-36、Pro-37、Asp-39、Gln-40、Leu-71、Arg-72、Leu-73、Arg-74和Gly-75的第二泛蛋白亚基中的残基。在另一个上述方面中，表位包括至少一个选自Glu-18、Pro-19、Ser-20、Asp-21、Thr-55、Leu-56、Ser-57、Asp-58、Asn-60、Ile-61和Gln-62的第一泛蛋白亚基中的残基，和至少一个选自Leu-8、Thr-9、Glu-34、Gly-35、Ile-36、Pro-37、Asp-39、Gln-40、Leu-71、Arg-72、Leu-73、Arg-74和Gly-75的第二泛蛋白亚基中的残基。

在一个实施方案中，提供了一种与包含至少一个异肽键合至在泛蛋白分子的第一氨基酸位置处的第一赖氨酸残基的第一多聚泛蛋白特异性结合的分离的抗体，其中该抗体不与包含至少一个异肽键合至在泛蛋白分子的第二氨基酸位置处的第二赖氨酸残基的第二多聚泛蛋白特异性结合，并且其中第一和第二氨基酸位置是不同的。本发明的抗体可以多种形式存在。例如，本发明的抗体可以是嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。在一个实施方案中，本发明的抗体是人抗体，例如其不是在异种小鼠(xenomouse)中产生的抗体(如WO96/33735中所描述的)。本发明的抗体可以是全长的或其片段(如包含抗原结合部分的片段)。

在另一个实施方案中，本发明提供了一种任一前述抗体的抗原结合片段。

本发明涉及下述各项。

1.一种与多聚泛蛋白特异性结合的分离的抗体，其中该抗体不与单泛蛋白特异性结合。

2.一种与包含第一赖氨酸键的第一多聚泛蛋白特异性结合的分离的抗体，其中该抗体不与包含第二赖氨酸键的第二多聚泛蛋白特异性结合，并且其中第一赖氨酸键不同于第二赖氨酸键。

3.项2的抗体，其中该抗体特异性结合赖氨酸6连接的多聚泛蛋白、赖氨酸11连接的多聚泛蛋白、赖氨酸27连接的多聚泛蛋白、赖氨酸29连接的多聚泛蛋白、赖氨酸33连接的多聚泛蛋白、赖氨酸48连接的多聚泛蛋白或赖氨酸63连接的多聚泛蛋白。

4.项2的抗体，其中第一多聚泛蛋白是赖氨酸-48连接的

5.项4的抗体，其中第二多聚泛蛋白是赖氨酸-63连接的。

6.项2的抗体，其中第一多聚泛蛋白是赖氨酸-63连接的。

7.项6的抗体，其中第二多聚泛蛋白是赖氨酸-48连接的。

8.一种与包含第一赖氨酸键的第一多聚泛蛋白和包含第二赖氨酸键的第二多聚泛蛋白都特异性结合的分离的抗体，其中第一赖氨酸键不同于第二赖氨酸键，其中该抗体不与单泛蛋白特异性结合，并且其中该抗体与第二多聚泛蛋白的结合具有与该抗体对第一多聚泛蛋白的结合亲和力相比实质上减少的结合亲和力。

9.一种与赖氨酸-48连接的多聚泛蛋白特异性结合的分离的抗体，其中该抗体不与单泛蛋白特异性结合。

10.项9的抗体，包含至少一条选自分别为SEQ ID NOs:1-25、151-175、265-279、392-459和695-704；SEQ ID Nos:27-51、177-201、281-295、461-528和706-715；SEQ IDNos:53-77、203-227、297-311、530-597和717-726；以及SEQ ID Nos:313-327和728-737任一的HVR-H1、HVR-H2、HVR-H3和HVR-L3的高变区(HVR)序列。

11.项9的抗体，包含至少一条选自HVR-H1、HVR-H2、HVR-H3的序列，其中HVR-H1包含氨基酸序列a b c d e f g h i j(SEQ ID NO:825)，其中氨基酸a是甘氨酸；氨基酸b是苯丙氨酸；氨基酸c是天冬酰胺；氨基酸d选自缬氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；氨基酸e选自丝氨酸和酪氨酸；氨基酸f是酪氨酸；氨基酸g选自丝氨酸和酪氨酸；氨基酸h选自丝氨酸和酪氨酸；氨基酸i选自异亮氨酸和甲硫氨酸；和氨基酸j是组氨酸；其中HVR-H2包含氨基酸序列k l m n o p q r s t u v w x y z a’(SEQ ID NO:826)，其中氨基酸k是丝氨酸；氨基酸l是异亮氨酸；氨基酸m选自丝氨酸和酪氨酸；氨基酸n选自脯氨酸和丝氨酸；氨基酸o是酪氨酸；氨基酸p是酪氨酸；氨基酸q选自丝氨酸和甘氨酸；氨基酸r选自丝氨酸和酪氨酸；氨基酸s是苏氨酸，氨基酸t选自丝氨酸和酪氨酸；氨基酸u是酪氨酸；氨基酸v是丙氨酸；氨基酸w是天冬氨酸；氨基酸x是丝氨酸；氨基酸y是缬氨酸；氨基酸z是赖氨酸；和氨基酸a’是甘氨酸；以及其中HVR-H3包含氨基酸序列b’c’d’e’f’g’h’I’j’k’l’，其中氨基酸b’选自谷氨酸、丝氨酸、甘氨酸和酪氨酸；氨基酸c’选自甘氨酸、酪氨酸、丝氨酸和天冬酰胺；氨基酸d’选自酪氨酸、丝氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸和谷氨酸；氨基酸e’选自丝氨酸、酪氨酸、甘氨酸和色氨酸；氨基酸f’选自谷氨酰胺、酪氨酸、丝氨酸和甘氨酸；氨基酸g’选自甘氨酸、丝氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸和丙氨酸；氨基酸h’选自甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸和异亮氨酸；氨基酸i’选自苯丙氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、丙氨酸和亮氨酸，或不存在；氨基酸j’是苯丙氨酸或不存在；氨基酸k’是天冬氨酸；和氨基酸l’是酪氨酸。

12.项9的抗体，包含至少一条选自HVR-H1、HVR-H2、HVR-H3的序列，其中HVR-H1包含氨基酸序列a b c d e f g h i j(SEQ ID NO:827)，其中氨基酸a是甘氨酸；氨基酸b是苯丙氨酸；氨基酸c是天冬酰胺；氨基酸d是异亮氨酸；氨基酸e选自丝氨酸和苯丙氨酸；氨基酸f是酪氨酸；氨基酸g选自丝氨酸和甘氨酸；氨基酸h选自丝氨酸和甘氨酸；氨基酸i选自异亮氨酸和甲硫氨酸；和氨基酸j是组氨酸；其中HVR-H2包含氨基酸序列k l m n o p q r st u v w x y z a’(SEQ ID NO:828)，其中氨基酸k是丝氨酸；氨基酸l是异亮氨酸；氨基酸m是酪氨酸；氨基酸n是丝氨酸；氨基酸o是酪氨酸；氨基酸p是酪氨酸；氨基酸q是丝氨酸；氨基酸r是酪氨酸；氨基酸s是苏氨酸，氨基酸t是丝氨酸；氨基酸u是酪氨酸；氨基酸v是丙氨酸；氨基酸w是天冬氨酸；氨基酸x是丝氨酸；氨基酸y是缬氨酸；氨基酸z是赖氨酸；和氨基酸a’是甘氨酸；以及其中HVR-H3包含氨基酸序列b’c’d’e’f’g’h’i’j’k’(SEQ ID NO:829)，其中氨基酸b’选自丝氨酸和甘氨酸；氨基酸c’是酪氨酸；氨基酸d’是丝氨酸；氨基酸e’选自酪氨酸和色氨酸；氨基酸f’选自丝氨酸、酪氨酸、精氨酸、苯丙氨酸和组氨酸；氨基酸g选自谷氨酸、丝氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺和缬氨酸；氨基酸h’选自丙氨酸和甘氨酸；氨基酸i’选自亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸和异亮氨酸；氨基酸j’是天冬氨酸；和氨基酸k’是酪氨酸。

13.项9的抗体，包含含有氨基酸序列m’n’o’p’q’r’s’t’u’v’w’(SEQ ID NO:830)的HVR-L3序列，其中氨基酸m’是谷氨酰胺；氨基酸n’是谷氨酰胺；氨基酸o’选自丝氨酸和酪氨酸；氨基酸p’选自丝氨酸和酪氨酸；氨基酸q’选自丝氨酸和酪氨酸；氨基酸r’选自丝氨酸和酪氨酸；氨基酸s’选自丝氨酸和酪氨酸；氨基酸t’选自亮氨酸、丝氨酸、脯氨酸和酪氨酸；氨基酸u’是脯氨酸或不存在；氨基酸v’选自苯丙氨酸、异亮氨酸、缬氨酸和亮氨酸；和氨基酸w’是苏氨酸。

14.项9的抗体，包含含有SEQ ID NO:728的氨基酸序列的HVR-L3序列。

15.项11的抗体，包含相应于图10A和10B中对应于克隆apu01、apu02、apu03、apu04、apu05、apu06、apu07、apu08、apu09、apu10、apu11、apu12、apu13、apu14或apu15所列的那些序列的HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3序列。

16.项12的抗体，包含相应于图16A中对应于克隆apu2.01、apu2.02、apu2.03、apu2.04、apu2.05、apu2.06、apu2.07、apu2.08、apu2.09或apu2.10所列的那些序列的HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3序列。

17.项13的抗体，包含SEQ ID NO:79的HVR-L1序列，SEQ ID NO:80的HVR-L2序列和相应于图10C中对应于克隆apu01、apu02、apu03、apu04、apu05、apu06、apu07、apu08、apu09、apu10、apu11、apu12、apu13、apu14或apu15所列的HVR-L3序列的HVR-L3序列。

18.项14的抗体，包含SEQ ID NO:79的HVR-L1序列，SEQ ID NO:80的HVR-L2序列和相应于图16B中对应于克隆apu2.01、apu2.02、apu2.03、apu2.04、apu2.05、apu2.06、apu2.07、apu2.08、apu2.09或apu2.10所列的HVR-L3序列的HVR-L3序列。

19.项9的抗体，包含SEQ ID NO:269的HVR-H1序列，SEQ ID NO:285的HVR-H2序列，SEQ ID NO:301的HVR-H3序列，SEQ ID NO:79的HVR-L1序列，SEQ ID NO:80的HVR-L2序列和SEQ ID NO:317的HVR-L3序列。

20.项9的抗体，包含SEQ ID NO:701的HVR-H1序列，SEQ ID NO:712的HVR-H2序列，SEQ ID NO;723的HVR-H3序列，SEQ ID NO:79的HVR-L1序列，SEQ ID NO:80的HVR-L2序列和SEQ ID NO:734的HVR-L3序列。

21.一种与赖氨酸-63连接的多聚泛蛋白特异性结合的分离的抗体，其中该抗体不与单泛蛋白特异性结合。

22.项21的抗体，包含至少一条选自分别为SEQ ID NOs:81-89、229-239、329-336、599-629、739-748和789-799；SEQ ID Nos:91-99、241-251、338-345、631-661、750-759和801-811；SEQ ID Nos:101-109、253-263、347-354、663-693、761-770和813-823；以及SEQID Nos:356-363和772-781任一的HVR-H1、HVR-H2、HVR-H3和HVR-L3的高变区(HVR)序列。

23.项21的抗体，包含至少一条选自HVR-H1、HVR-H2、HVR-H3的序列，其中HVR-H1包含氨基酸序列a b c d e f g h i j(SEQ ID NO:831)，其中氨基酸a是甘氨酸；氨基酸b是苯丙氨酸；氨基酸c是天冬酰胺；氨基酸d选自缬氨酸、异亮氨酸和苯丙氨酸；氨基酸e选自丝氨酸和酪氨酸；氨基酸f选自丝氨酸和酪氨酸；氨基酸g选自丝氨酸和酪氨酸；氨基酸h选自丝氨酸和酪氨酸；氨基酸i选自异亮氨酸和甲硫氨酸；和氨基酸j是组氨酸；其中HVR-H2包含氨基酸序列k l m n o p q r s t u v w x y z a’(SEQ ID NO:832)，其中氨基酸k选自丝氨酸和酪氨酸；氨基酸l是异亮氨酸；氨基酸m选自丝氨酸和酪氨酸；氨基酸n选自脯氨酸和丝氨酸；氨基酸o选自丝氨酸和酪氨酸；氨基酸p选自丝氨酸和酪氨酸；氨基酸q选自丝氨酸和甘氨酸；氨基酸r选自丝氨酸和酪氨酸；氨基酸s是苏氨酸，氨基酸t选自丝氨酸和酪氨酸；氨基酸u是酪氨酸；氨基酸v是丙氨酸；氨基酸w是天冬氨酸；氨基酸x是丝氨酸；氨基酸y是缬氨酸；氨基酸z是赖氨酸；和氨基酸a’是甘氨酸；以及其中HVR-H3包含氨基酸序列b’c’d’e’f’g’h’i’j’k’l’m’n’o’p’q’r’s’t’u’v’，其中氨基酸b’选自丝氨酸、谷氨酸、甘氨酸和色氨酸；氨基酸c’选自甘氨酸、酪氨酸、异亮氨酸、谷氨酰胺和丝氨酸；氨基酸d’选自酪氨酸、甲硫氨酸,、甘氨酸和异亮氨酸；氨基酸e’选自酪氨酸、精氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、丙氨酸和脯氨酸；氨基酸f’选自酪氨酸、色氨酸、丝氨酸和甘氨酸；氨基酸g’选自谷氨酰胺、酪氨酸、丝氨酸、苯丙氨酸和缬氨酸；氨基酸h’选自甘氨酸、苏氨酸、色氨酸、赖氨酸和脯氨酸；氨基酸i’选自酪氨酸、丙氨酸、色氨酸、谷氨酸、脯氨酸和丝氨酸；氨基酸j’选自色氨酸、异亮氨酸、酪氨酸和丙氨酸；氨基酸k’选自色氨酸,、酪氨酸、甘氨酸和天冬氨酸，或不存在；氨基酸l’选自酪氨酸、丝氨酸、苯丙氨酸和色氨酸，或不存在；氨基酸m’选自酪氨酸、天冬氨酸和丝氨酸，或不存在；氨基酸n’选自酪氨酸和丙氨酸，或不存在；氨基酸o’选自苏氨酸、丝氨酸、缬氨酸、甘氨酸和酪氨酸，或不存在；氨基酸p’选自甘氨酸、天冬氨酸、丝氨酸、甲硫氨酸和酪氨酸，或不存在；氨基酸q’选自酪氨酸、丙氨酸和甘氨酸，或不存在；氨基酸r’选自酪氨酸、亮氨酸和甘氨酸，或不存在；氨基酸s’是甘氨酸或不存在；氨基酸t’选自甲硫氨酸和亮氨酸，或不存在；氨基酸u’是天冬氨酸；和氨基酸v’是酪氨酸。

24.项21的抗体，包含至少一条选自HVR-H1、HVR-H2、HVR-H3的序列，其中HVR-H1包含氨基酸序列a b c d e f g h i j(SEQ ID NO:833)，其中氨基酸a是甘氨酸；氨基酸b是苯丙氨酸；氨基酸c是天冬酰胺；氨基酸d选自异亮氨酸、缬氨酸和亮氨酸；氨基酸e选自丝氨酸、赖氨酸和缬氨酸；氨基酸f选自丝氨酸、色氨酸、甘氨酸和苏氨酸；氨基酸g选自丝氨酸,、天冬酰胺和甘氨酸；氨基酸h选自酪氨酸、异亮氨酸、亮氨酸和苯丙氨酸；氨基酸i选自异亮氨酸和甲硫氨酸；和氨基酸j是组氨酸；其中HVR-H2包含氨基酸序列k l m n o p q r s tu v w x y z a’b’(SEQ ID NO:834)，其中氨基酸k是丙氨酸；氨基酸l选自酪氨酸、苯丙氨酸、天冬氨酸、组氨酸和丙氨酸；氨基酸m是异亮氨酸；氨基酸n选自丝氨酸、丙氨酸和谷氨酰胺；氨基酸o是脯氨酸；氨基酸p是酪氨酸；氨基酸q选自亮氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸；氨基酸r选自丝氨酸和甘氨酸；氨基酸s选自丝氨酸、苏氨酸和色氨酸；氨基酸t是苏氨酸，氨基酸u选自丝氨酸、天冬酰胺、赖氨酸和异亮氨酸；氨基酸v是酪氨酸；氨基酸w是丙氨酸；氨基酸x是天冬氨酸；氨基酸y是丝氨酸；氨基酸z是缬氨酸；氨基酸a’是赖氨酸；和氨基酸b’是甘氨酸；以及其中HVR-H3包含氨基酸序列c’d’e’f’g’h’i’j’k’l’m’n’o’(SEQ ID NO:837)，其中氨基酸c’是丝氨酸；氨基酸d’是精氨酸；氨基酸e’是谷氨酸；氨基酸f’是酪氨酸；氨基酸g’是酪氨酸；氨基酸h’是精氨酸；氨基酸i’是色氨酸；氨基酸j’是酪氨酸；氨基酸k’是苏氨酸；氨基酸l’是丙氨酸；氨基酸m’是异亮氨酸；氨基酸n’是天冬氨酸；和氨基酸o’是酪氨酸。

25.项21的抗体，包含含有氨基酸序列w’x’y’z’A B C D E F G的HVR-L3序列，其中氨基酸w’是谷氨酰胺；氨基酸x’是谷氨酰胺；氨基酸y’选自丝氨酸和酪氨酸；氨基酸z’选自丝氨酸和酪氨酸；氨基酸A选自丝氨酸和酪氨酸；氨基酸B选自丝氨酸和酪氨酸；氨基酸C选自脯氨酸、丝氨酸和亮氨酸；氨基酸D选自丝氨酸、脯氨酸和酪氨酸，或不存在；氨基酸E选自亮氨酸和苯丙氨酸，或不存在；氨基酸F选自苯丙氨酸、缬氨酸、苏氨酸和异亮氨酸；和氨基酸G选自精氨酸、苏氨酸和苯丙氨酸。

26.项21的抗体，包含含有氨基酸序列Q-Q-Y-S-S-Y-S-S-L-F-T(SEQ ID NO:772)的HVR-L3序列。

27.项23的抗体，包含相应于图11A和11B中对应于克隆apu17、apu18、apu19、apu20、apu21、apu22、apu23和apu24所列的那些序列的HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3序列。

28.项24的抗体，包含相应于图17A中对应于克隆apu2.11、apu2.12、apu2.13、apu2.14、apu2.15、apu2.16、apu2.17、apu2.18、apu2.19和apu2.20所列的那些序列的HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3序列。

29.项25的抗体，包含SEQ ID NO:79的HVR-L1序列，SEQ ID NO:80的HVR-L2序列和相应于图11C中对应于克隆apu17、apu18、apu19、apu20、apu21、apu22、apu23和apu24所列的HVR-L3序列的HVR-L3序列。

30.项26的抗体，包含SEQ ID NO:79的HVR-L1序列，SEQ ID NO:80的HVR-L2序列和相应于图17B中对应于克隆apu2.11、apu2.12、apu2.13、apu2.14、apu2.15、apu2.16、apu2.17、apu2.18、apu2.19和apu2.20所列的HVR-L3序列的HVR-L3序列。

31.项21的抗体，包含SEQ ID NO:330的HVR-H1序列，SEQ ID NO:339的HVR-H2序列，SEQ ID NO:348的HVR-H3序列，SEQ ID NO:79的HVR-L1序列，SEQ ID NO:80的HVR-L2序列和SEQ ID NO:357的HVR-L3序列。

32.项21的抗体，包含SEQ ID NO:739的HVR-H1序列，SEQ ID NO:750的HVR-H2序列，SEQ ID NO:761的HVR-H3序列，SEQ ID NO:79的HVR-L1序列，SEQ ID NO:80的HVR-L2序列和SEQ ID NO:772的HVR-L3序列。

33.项21的抗体，包含SEQ ID NO:740的HVR-H1序列，SEQ ID NO:751的HVR-H2序列，SEQ ID NO:762的HVR-H3序列，SEQ ID NO:79的HVR-L1序列，SEQ ID NO:80的HVR-L2序列和SEQ ID NO:773的HVR-L3序列。

34.项21的抗体，包含至少一条选自HVR-H1、HVR-H2、HVR-H3的序列，其中HVR-H1包含氨基酸序列a b c d e f g h i j(SEQ ID NO:835)，其中氨基酸a是甘氨酸；氨基酸b是苯丙氨酸；氨基酸c是天冬酰胺；氨基酸d选自异亮氨酸、缬氨酸和亮氨酸；氨基酸e选自赖氨酸和甲硫氨酸；氨基酸f选自苏氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺、精氨酸和异亮氨酸；氨基酸g选自甘氨酸、缬氨酸和苯丙氨酸；氨基酸h选自酪氨酸、异亮氨酸、亮氨酸和苯丙氨酸；氨基酸i选自异亮氨酸和甲硫氨酸；和氨基酸j是组氨酸；其中HVR-H2包含氨基酸序列k l m n o p qr s t u v w x y z a’b’(SEQ ID NO:836)，其中氨基酸k是丙氨酸；氨基酸l是酪氨酸；氨基酸m是异亮氨酸；氨基酸n选自丝氨酸、异亮氨酸和苏氨酸；氨基酸o是脯氨酸；氨基酸p是酪氨酸；氨基酸q选自亮氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、丝氨酸和色氨酸；氨基酸r是甘氨酸；氨基酸s选自色氨酸、缬氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、精氨酸和酪氨酸；氨基酸t是苏氨酸，氨基酸u选自精氨酸、天冬酰胺、缬氨酸、苏氨酸、丝氨酸和赖氨酸；氨基酸v是酪氨酸；氨基酸w是丙氨酸；氨基酸x是天冬氨酸；氨基酸y是丝氨酸；氨基酸z是缬氨酸；氨基酸a’是赖氨酸；和氨基酸b’是甘氨酸；以及其中HVR-H3包含氨基酸序列c’d’e’f’g’h’i’j’k’l’m’n’o’(SEQ IDNO:837)，其中氨基酸c’是丝氨酸；氨基酸d’是精氨酸；氨基酸e’是谷氨酸；氨基酸f’是酪氨酸；氨基酸g’是酪氨酸；氨基酸h’是精氨酸；氨基酸i’是色氨酸；氨基酸j’是酪氨酸；氨基酸k’是苏氨酸；氨基酸l’是丙氨酸；氨基酸m’是异亮氨酸；氨基酸n’是天冬氨酸；和氨基酸o’是酪氨酸。

35.项34的抗体，包含相应于图23A和23B中对应于克隆apu3.01、apu3.02、apu3.03、apu3.04、apu3.05、apu3.06、apu3.07、apu3.08、apu3.09、apu3.10和3.11所列的那些序列的HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3序列。

36.项34或35的抗体，包含SEQ ID NO:79的HVR-L1序列，SEQ ID NO:80的HVR-L2序列和相应于SEQ ID NO:777的HVR-L3序列的HVR-L3序列。

37.项21的抗体，包含SEQ ID NO:744的HVR-H1序列，SEQ ID NO:755的HVR-H2序列，SEQ ID NO:766的HVR-H3序列，SEQ ID NO:79的HVR-L1序列，SEQ ID NO:80的HVR-L2序列和SEQ ID NO:777的HVR-L3序列。

38.项21的抗体，包含SEQ ID NO:795的HVR-H1序列，SEQ ID NO:807的HVR-H2序列，SEQ ID NO:819的HVR-H3序列，SEQ ID NO:79的HVR-L1序列，SEQ ID NO:80的HVR-L2序列和SEQ ID NO:777的HVR-L3序列。

39.项9的抗体，包含SEQ ID NO:701的HVR-H1序列，SEQ ID NO:712的HVR-H2序列，SEQ ID NO:723的HVR-H3序列，和SEQ ID NO:79的HVR-L1序列，和SEQ ID NO:80的HVR-L2序列，以及SEQ ID NO:734的HVR-L3序列。

40.一种与项1-39任一项的抗体结合相同的多聚泛蛋白上抗原决定簇的分离的抗体，其中该抗体不与单泛蛋白特异性结合。

41.一种与项1-39任一项的抗体竞争与多聚泛蛋白结合的分离的抗体，其中该抗体不与单泛蛋白特异性结合。

42.项1-39任一项的抗体，其中该抗体与多聚泛蛋白化蛋白特异性结合。

43.项42的抗体，其中该抗体抑制多聚泛蛋白化蛋白的降解。

44.项42的抗体，其中该抗体调节至少一条多聚泛蛋白介导的信号传导途径。

45.项42的抗体，其中该抗体抑制至少一条多聚泛蛋白介导的信号传导途径。

46.项42的抗体，其中该抗体刺激至少一条多聚泛蛋白介导的信号传导途径。

47.一种编码项1-39任一项的抗体的核酸分子。

48.一种包含项47的核酸的载体。

49.一种包含项48的载体的宿主细胞。

50.一种能产生项1-39任一项的抗体的细胞系。

51.一种产生项1-39任一项的抗体的方法，包括在其中产生该抗体的条件下培养包含编码该抗体的核酸分子的宿主细胞。

52.一种包含有效量的项1-39任一项的抗体和药学上可接受载体的组合物。

53.一种鉴定样品中多聚泛蛋白或多聚泛蛋白化蛋白存在的方法，包括将样品与至少一种的项1-39任一项的抗体接触。

54.一种用于治疗患者中与多聚泛蛋白失调相关的疾病或病症的方法，该方法包括给予患者有效量的至少一种的项1-39任一项的抗体。

55.项54的方法，其中患者是哺乳动物患者。

56.项55的方法，其中患者是人。

57.项54的方法，其中疾病选自癌症、肌肉病症、泛蛋白途径相关的遗传性病症、免疫/炎性病症和神经***疾病。

58.项57的方法，其中疾病选自癌症、淋巴瘤、胚细胞瘤、肉瘤、白血病、肌肉萎缩症、多发性硬化、肌萎缩性脊髓侧索硬化、囊性纤维化、Angelman’s综合征、利德尔综合征、阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、皮克病和佩吉特病。

59.一种确定怀疑含有多聚泛蛋白或多聚泛蛋白化蛋白的样品中多聚泛蛋白或多聚泛蛋白化蛋白存在的方法，包括将样品暴露于至少一种的项1-39任一项的抗体并测定该至少一种抗体与样品中多聚泛蛋白或多聚泛蛋白化蛋白的结合。

60.一种分离样品中多聚泛蛋白化蛋白和非多聚泛蛋白化蛋白的方法，包括将样品与至少一种的项1-39任一项的抗体接触。

61.一种确定细胞中多聚泛蛋白的功能和/或活性的方法，包括将细胞与至少一种的项1-39任一项的抗体接触并评估所述接触步骤对细胞的影响。

62.一种确定样品中多聚泛蛋白的功能和/或活性的方法，包括将样品与至少一种的项1-39任一项的抗体接触并评估所述接触步骤对样品的影响。一种与包含至少一个异肽键合至在泛蛋白分子的第一氨基酸位置处的第一赖氨酸残基的第一多聚泛蛋白特异性结合的分离的抗体，其中该抗体不与包含至少一个异肽键合至在泛蛋白分子的第二氨基酸位置处的第二赖氨酸残基的第二多聚泛蛋白特异性结合，并且其中第一和第二氨基酸位置是不同的。

63.项21的分离的抗体，其中该抗体结合赖氨酸-63连接的多聚泛蛋白中的表位。

64.项63的分离的抗体，其中所述表位包括赖氨酸-63连接的多聚泛蛋白的第一泛蛋白亚基和第二泛蛋白亚基中的残基。

65.项64的分离的抗体，其中所述表位包括至少一个选自Glu-18、Pro-19、Ser-20、Asp-21、Thr-55、Leu-56、Ser-57、Asp-58、Asn-60、Ile-61和Gln-62的第一泛蛋白亚基中的残基。

66.项64的分离的抗体，其中所述表位包括至少一个选自Leu-8、Thr-9、Glu-34、Gly-35、Ile-36、Pro-37、Asp-39、Gln-40、Leu-71、Arg-72、Leu-73、Arg-74和Gly-75的第二泛蛋白亚基中的残基。

67.项64的分离的抗体，其中所述表位包括至少一个选自Glu-18、Pro-19、Ser-20、Asp-21、Thr-55、Leu-56、Ser-57、Asp-58、Asn-60、Ile-61和Gln-62的第一泛蛋白亚基中的残基，和至少一个选自Leu-8、Thr-9、Glu-34、Gly-35、Ile-36、Pro-37、Asp-39、Gln-40、Leu-71、Arg-72、Leu-73、Arg-74和Gly-75的第二泛蛋白亚基中的残基。

68.一种项1-39或63-67任一项的抗体的抗原结合片段。

附图简述

图1A-1B显示了泛蛋白的一级结构和某些多聚泛蛋白异肽键(polyubiquitinisopeptide linkage)的示意图。图1A显示了人泛蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO:377)，赖氨酸残基以粗体、下划线文字显示。图1B显示了在第一泛蛋白分子(a first ubiquitinmolecule)的赖氨酸-48或赖氨酸-63与第二泛蛋白分子(a second ubiquitin molecule)的C-末端甘氨酸残基之间形成的键的示意图。

图2A-2C显示了如实施例1(A)中所描述的，特异性识别K48连接的多聚泛蛋白的抗多聚泛蛋白抗体分子的重链HVR环序列。符号“48”指抗体分子特异性识别K48连接的多聚泛蛋白。符号“两者”指抗体分子识别K48连接的和K63连接的多聚泛蛋白。符号“所有的”指抗体分子识别K48连接的和K63连接的多聚泛蛋白(polyubiquitin)以及单泛蛋白(monoubiquitin)。符号“n.p.”指某些克隆在标明位置处不具有氨基酸。该图显示了重链HVR序列，H1、H2和H3。氨基酸位置根据下述Kabat编号***进行编号。

图3A-3B显示了如实施例1(A)中所描述的，特异性识别K63连接的多聚泛蛋白的抗多聚泛蛋白抗体分子的重链HVR环序列。符号“63”指抗体分子特异性识别K63连接的多聚泛蛋白。符号“两者”指抗体分子识别K63连接的和K48连接的多聚泛蛋白。符号“所有的”指抗体分子识别K63连接的和K48连接的多聚泛蛋白以及单泛蛋白。符号“n.p.”指某些克隆在标明位置处不具有氨基酸。该图显示了重链HVR序列，H1、H2和H3。氨基酸位置根据下述Kabat编号***进行编号。

图4A和4B及图5描绘了具有如下序列标识符的供实施本发明之用的例证性的受体人共有框架区序列：

重链可变区(VH)共有框架区(图4A和4B)

去掉Kabat CDRs的人VH亚组I共有框架区(SEQ ID NOs:111、839、858和877)

去掉延伸的高变区的人VH亚组I共有框架区(SEQ ID NOs:112-114、840-842、859-861和878-880)

去掉Kabat CDRs的人VH亚组II共有框架区(SEQ ID NOs:115、843、862和881)

去掉延伸的高变区的人VH亚组II共有框架区(SEQ ID NOs:116-118、844-846、863-865和882-884)

去掉Kabat CDRs的人VH亚组III共有框架区(SEQ ID NOs:119、847、866和885)

去掉延伸的高变区的人VH亚组III共有框架区(SEQ ID NOs:120-122、848-850、867-869和886-888)

去掉Kabat CDRs的人VH受体框架区(SEQ ID NOs:123、851、870和889)

去掉延伸的高变区的人VH受体框架区(SEQ ID NOs:124-125、852-853、871-872和890-891)

去掉Kabat CDRs的人VH受体2框架区(SEQ ID NOs:126、854、873和892)

去掉延伸的高变区的人VH受体2框架区(SEQ ID NOs:127-129、855-857、874-876和893-895)

轻链可变区(VL)共有框架区(图5)

人VLκ亚组I共有框架区(SEQ ID NOs:130、896、900和904)

人VLκ亚组II共有框架区(SEQ ID NOs:131、897、901和905)

人VLκ亚组III共有框架区(SEQ ID NOs: 132、898、902和906)

人VLκ亚组IV共有框架区(SEQ ID NOs: 133、899、903和907)

图6描绘了huMAb4D5-8轻链和重链的框架区序列。上标/粗体的编号标明根据Kabat的氨基酸位置。

图7描绘了huMAb4D5-8轻链和重链的已经修饰的/变异的框架区序列。上标/粗体的编号标明根据Kabat的氨基酸位置。

图8A-8C显示了如实施例1A中所描述的，特异性识别K48连接的多聚泛蛋白的抗多聚泛蛋白抗体分子的重链HVR环序列。该图显示了重链HVR序列，H1、H2和H3。符号“n.p.”指某些克隆在标明位置处不具有氨基酸。氨基酸位置根据下述Kabat编号***进行编号。

图9A-9B显示了如实施例1A中所描述的，特异性识别K63连接的多聚泛蛋白的抗多聚泛蛋白抗体分子的重链HVR环序列。该图显示了重链HVR序列，H1、H2和H3。符号“n.p.”指某些克隆在标明位置处不具有氨基酸。氨基酸位置根据下述Kabat编号***进行编号。

图10A-10C显示了如实施例1(B)中所描述的，特异性识别K48连接的多聚泛蛋白并为特异性针对五组氨酸(pentahistidine)的抗体所识别的抗多聚泛蛋白抗体分子apu01-apu15的重链和轻链HVR环序列。该图显示了重链HVR序列，H1、H2和H3，以及轻链HVR序列，L3。符号“n.p.”指某些克隆在标明位置处不具有氨基酸。氨基酸位置根据下述Kabat编号***进行编号。

图11A-11C显示了如实施例1(B)中所描述的，特异性识别K63连接的多聚泛蛋白并为特异性针对五组氨酸的抗体所识别的抗多聚泛蛋白抗体分子apu17-apu24的重链和轻链HVR环序列。该图显示了重链HVR序列，H1、H2和H3，以及轻链HVR序列，L3。符号“n.p.”指某些克隆在标明位置处不具有氨基酸。氨基酸位置根据下述Kabat编号***进行编号。

图12描绘了如实施例1(C)中所描述的，使用分析观察到的不同浓度的抗多聚泛蛋白Fab apu09和K48连接的或K63连接的多聚泛蛋白之间的结合相互作用。

图13A-13B描绘了如实施例1(C)中所描述的，使用分析观察到的不同浓度的抗多聚泛蛋白Fab apu18和K48连接的或K63连接的多聚泛蛋白之间的结合相互作用。

图14A-14F显示了如实施例2中所描述的，基于特异性识别K48连接的多聚泛蛋白的Fab apu05的序列的第二代抗多聚泛蛋白抗体分子的重链HVR环序列。该图显示了重链HVR序列，H1、H2和H3。符号“n.p.”指某些克隆在标明位置处不具有氨基酸。氨基酸位置根据下述Kabat编号***进行编号。画阴影文字表示序列与Fab apu05中相应的HVR序列的氨基酸序列相同。粗体文字表示在实施例2所描述的噬菌体ELISA测定中被证实强结合的抗体。

图15A-15C显示了如实施例2中所描述的，基于特异性识别K63连接的多聚泛蛋白的Fab apu18的序列的第二代抗多聚泛蛋白抗体分子的重链HVR环序列。该图显示了重链HVR序列，H1、H2和H3。符号“n.p.”指某些克隆在标明位置处不具有氨基酸。氨基酸位置根据下述Kabat编号***进行编号。画阴影文字表示序列与Fab apu18中相应的HVR序列的氨基酸序列相同。粗体文字表示在实施例2所描述的噬菌体ELISA测定中被证实强结合的抗体。

图16A和16B显示了如实施例2中所描述的，特异性识别K48连接的多聚泛蛋白并为特异性针对五组氨酸的抗体所识别的来源于经过诱变的apu05的Fab分子(apu2.01-apu2.10)的重链高变区的氨基酸序列。该图显示了重链HVR序列，H1、H2和H3，以及轻链HVR序列，L3。符号“n.p.”指某些克隆在标明位置处不具有氨基酸。氨基酸位置根据下述Kabat编号***进行编号。画阴影文字表示序列与Fab apu05中相应的HVR序列的氨基酸序列相同。

图17A和17B显示了如实施例2中所描述的，特异性识别K63连接的多聚泛蛋白并为特异性针对五组氨酸的抗体所识别的来源于经过诱变的apu18的Fab分子(apu2.11-apu2.20)的重链高变区的氨基酸序列。该图显示了重链HVR序列，H1、H2和H3，以及轻链HVR序列，L3。符号“n.p.”指某些克隆在标明位置处不具有氨基酸。氨基酸位置根据下述Kabat编号***进行编号。画阴影文字表示序列与Fab apu18中相应的HVR序列的氨基酸序列相同。

图18描绘了如实施例2中所描述的噬菌体ELISA测定的结果，其中评估了每一种第二代Fab apu2.01-2.20与K48连接的多聚泛蛋白、K63连接的多聚泛蛋白、单泛蛋白和牛血清白蛋白的结合。

图19A和19B描绘了如实施例1中所描述的蛋白质印迹实验的结果。图19A显示了产生自克隆apu01-apu15的Fab与固定化的K48连接的四聚泛蛋白的结合。图19B显示了产生自克隆apu18-apu24的Fab不与固定化的K63连接的多聚泛蛋白结合。

图20A和20B描绘了实施例2中所描述的蛋白质印迹实验的结果。图20A显示了apu2.01-apu2.10与固定化的K48连接的四聚泛蛋白的结合，但不与固定化的K63连接的二聚泛蛋白结合。图20B显示了apu2.11-apu2.20与固定化的K63连接的四聚泛蛋白的结合，但不与固定化的K48连接的二聚泛蛋白结合。

图21A和21B显示了如实施例3中所描述的，来自以检测RIP泛蛋白化作用状态的免疫沉淀实验的蛋白质印迹。图21A中的印迹包括用apu2.16 IgG免疫沉淀以捕捉K63连接的多聚泛蛋白化蛋白的样品。图21B中的印迹包括用apu2.07IgG免疫沉淀以捕捉K48连接的多聚泛蛋白化蛋白的样品。用抗RIP抗体染色这两份印迹。

图22描绘了实施例4中所描述的噬菌体ELISA测定的结果，其中评估了每一种第三代克隆apu3.01-3.12与K48连接的多聚泛蛋白、K63连接的多聚泛蛋白、单泛蛋白和牛血清白蛋白的结合。

图23A和23B显示了如实施例4中所描述的，特异性识别K63连接的多聚泛蛋白的来源于已经过诱变的apu2.16的克隆(apu3.01-apu3.12)的重链高变区的氨基酸序列。该图显示了重链HVR序列，H1、H2和H3。符号“ND.”表示序列没有被检测。氨基酸位置根据下述Kabat编号***进行编号。画阴影文字表示序列与apu2.16中相应的HVR序列的氨基酸序列相同。

图24A-24D描绘了实施例4中所描述的蛋白质印迹实验的结果。图24A显示了apu2.07 IgG与固定化的K48连接的三聚至七聚泛蛋白的结合，但不与固定化的K63连接的三聚至七聚泛蛋白或单泛蛋白结合。图24B显示了apu3.07 IgG与固定化的K63连接的三聚至七聚泛蛋白的结合，但不与固定化的K48连接的三聚至七聚泛蛋白或单泛蛋白结合。图24C显示了apu2.07 IgG与固定化的K48连接的四聚泛蛋白的浓度依赖性结合，但不与固定化的K63连接的四聚泛蛋白结合。图24D显示了apu3.07 IgG与固定化的K63连接的四聚泛蛋白的浓度依赖性结合，但不与固定化的K48连接的四聚泛蛋白结合。

图25描绘了实施例4中所描述的蛋白质印迹实验的结果。该图显示了抗泛蛋白多克隆抗体、apu2.07 IgG和apu3.07 IgG与固定化的来自用Velcade处理(+)或未处理(-)的293T细胞裂解物的结合。

图26A-26C显示了通过晶体学分析所测定的本发明的K63连接的多聚泛蛋白特异的fab与K63连接的多聚泛蛋白之间的相互作用。图26A描绘了在K63连接的多聚泛蛋白特异的fab apu2.16和K63连接的二聚泛蛋白之间所形成的复合物。Apu2.16示于该图底部的带状图中，与此同时K63连接的二聚泛蛋白则示于该图顶部的球状结构中。图26B描绘了K63连接的二聚泛蛋白的表面，那些位于fab的之内的残基着暗灰色并标记了感兴趣的残基。图26C描绘了apu2.16的表面，那些位于K63连接的泛蛋白二聚体的之内的残基着暗灰色。标记了CDR。

本发明的实施方式

一般技术

除非另有说明，本发明的实施将采用分子生物学（包括重组技术）、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术，这些都在本领域的技术范围内。文献中充分阐述了这些技术，诸如“Molecular Cloning:A Laboratory Manual”,第三版(Sambrook et al.,2001);“Oligonucleotide Synthesis”(M.J.Gait,ed.,1984);“Animal Cell Culture”(R.I.Freshney编,1987);“Methods in Enzymology”(Academic Press,Inc.);“CurrentProtocols in Molecular Biology”(F.M.Ausubel et al.编,1987,and periodicupdates);“PCR:The Polymerase Chain Reaction”,(Mullis et al.编,1994);PCR 2:APractical Approach(M.J.MacPherson,B.D.Hames and G.R.Taylor编(1995));Harlowand Lane编(1988) Antibodies,A Laboratory Manual;“A Practical Guide toMolecular Cloning”(Perbal Bernard V.,1988);及“Phage Display:A LaboratoryManual”(Barbas et al.,2001)。

定义

在用于本文时，术语“泛蛋白(ubiquitin)”（遍在蛋白）和“单泛蛋白(monoubiquitin)”可互换使用，定义为所有种类的天然的人的和合成的泛蛋白，基本上与在第6位、第22位、第27位、第29位、第33位、第48位、和/或第63位氨基酸处具有至少一个赖氨酸残基的76个氨基酸的蛋白质相似。

在用于本文时，术语“多聚泛蛋白(polyubiquitin)”定义为所有种类的天然的人的和合成的泛蛋白聚合链，其落入泛蛋白不同聚合连接方式的人的和合成的类别，包括，但不限于，K6-连接的多聚泛蛋白、K22-连接的多聚泛蛋白、K27-连接的多聚泛蛋白、K29-连接的多聚泛蛋白、K33-连接的多聚泛蛋白、K48-连接的多聚泛蛋白和K63-连接的多聚泛蛋白。多聚泛蛋白可以是任何长度的，包括至少两个泛蛋白模块(moity)。多聚泛蛋白有别于最初作为单一蛋白质表达的泛蛋白串联重复体。

在用于本文时，术语“K*-连接的多聚泛蛋白”和“Lys*-连接的多聚泛蛋白”可互换使用，指在一个泛蛋白模块的C-末端与另一个泛蛋白模块中的第*位赖氨酸之间包含至少一个异肽键的多聚泛蛋白分子。例如，“K63-连接的多聚泛蛋白”与“Lys63-连接的多聚泛蛋白”可互换使用，这两个术语都指在分子中一个泛蛋白模块的C-末端与分子中另一个泛蛋白模块的第63位赖氨酸之间包含异肽键多聚泛蛋白分子。

在用于本文时，表述第一赖氨酸连接“不同”于第二赖氨酸连接指一个泛蛋白模块与另一个泛蛋白模块之间的该第一赖氨酸连接所牵涉的赖氨酸残基(如，K6、K22、K27、K29、K33、K48、和/或K63)不同于一个泛蛋白模块与另一个泛蛋白模块之间的该第二赖氨酸连接。

在用于本文时，术语“泛蛋白途径”指细胞中的或在体外重建的、包括泛蛋白和/或多聚泛蛋白的生化途径。

“分离的”抗体指已经鉴定且自其天然环境的一种成分分开和/或回收的抗体。其天然环境的污染性成分指将会干扰该抗体的研究、诊断或治疗用途的物质，可包括酶、激素、和其它蛋白质性质或非蛋白质性质的溶质。在一个实施方案中，将抗体纯化至(1)根据例如Lowry法的测定，抗体重量超过95%，在有些实施方案中重量超过99%，(2)足以通过使用例如转杯式测序仪获得至少15个残基的N-末端或内部氨基酸序列的程度，或(3)根据还原性或非还原性条件下的SDS-PAGE及使用例如考马斯蓝或银染色，达到同质。既然抗体天然环境的至少一种成分不会存在，那么分离的抗体包括重组细胞内的原位抗体。然而，分离的抗体通常将通过至少一个纯化步骤来制备。

在用于本文时，术语“抗泛蛋白抗体”和“抗单泛蛋白抗体”可互换使用，指能够特异性结合泛蛋白分子的抗体。

在用于本文时，术语“抗多聚泛蛋白抗体”指能够特异性结合多聚泛蛋白分子的抗体。

在用于本文时，术语“抗K48-连接的多聚泛蛋白抗体”指能够特异性结合K48-连接的多聚泛蛋白的抗体。

在用于本文时，术语“抗K63-连接的多聚泛蛋白抗体”指能够结合K63-连接的多聚泛蛋白的抗体。

短语“基本上相似”“基本上(实质上)相同”、“相当”或“基本上(实质上)相当”在用于本文时表示两个数值（例如，一个与某分子相关，另一个与参照/比较分子相关）之间足够高的相似程度，以致本领域技术人员会认为在用所述数值（如，Kd值、抗病毒效应、等）所测量的生物学特性背景内两个数值之间的差异具有很小的或没有生物学和/或统计学显著性。所述两个数值之间的差异为，例如，小于约50%、小于约40%、小于约30%、小于约20%、和/或小于约10%，作为参照/比较分子的数值的函数。

短语“实质性降低(substantially reduced)”或“实质性不同(substantiallydifferent)”在用于本文时表示两个数值（通常，一个与某分子相关，另一个与参照/比较分子相关）之间足够高的差异程度，以致本领域技术人员会认为在用所述数值（如，Kd值）所测量的生物学特性背景内两个数值之间的差异具有统计学显著性。所述两个数值之间的差异为，例如，大于约10%、大于约20%、大于约30%、大于约40%、大于约50%，作为参照/比较抗体该数值的函数。

“结合亲和力”通常指分子（例如抗体）的单一结合位点与其结合配偶体（例如抗原）之间全部非共价相互作用总和的强度。除非另有说明，在用于本文时，“结合亲和力”指反映结合对的成员（例如抗体与抗原）之间1:1相互作用的内在结合亲和力。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可用解离常数(Kd)来表述。亲和力可通过本领域知道的常用方法来测量，包括本文中所描述的。低亲和力抗体通常缓慢的结合抗原且趋于容易解离，而高亲和力抗体通常更快速的结合抗原且趋于保持更长时间的结合。本领域知道测量结合亲和力的多种方法，其中任一种都可用于本发明的目的。下文描述了具体的示例性实施方案。

在一个实施方案中，依照本发明的“Kd”或“Kd值”是通过如下测定法所述使用Fab型式的目的抗体及其抗原进行的放射性标记抗原结合测定法(RIA)来测量的：通过在存在未标记抗原的滴定系列的条件下，用最小浓度的¹²⁵I标记抗原平衡，然后用抗Fab抗体包被的平板捕捉结合的抗原来测量Fab对抗原的溶液结合亲和力(Chen,et al.,J Mol Biol293:865-881(1999))。为了确定测定条件，用50mM碳酸钠(pH9.6)中的5μg/ml捕捉用抗Fab抗体(Cappel Labs)包被微量滴定板(Dynex)过夜，随后用PBS中的2%(w/v)牛血清清蛋白在室温（约23℃）封闭2-5小时。在非吸附平板(Nunc#269620)中，将100pM或26pM[¹²⁵I]-抗原与连续稀释的目的Fab混合（例如与Presta et al.,Cancer Res.57:4593-4599(1997)中抗VEGF抗体，Fab-12的评估一致）。然后将目的Fab保温过夜；不过，保温可持续更长时间（例如65个小时）以保证达到平衡。此后，将混合物转移至捕捉板以进行室温保温（例如1小时）。然后除去溶液，并用含0.1%Tween-20的PBS洗板8次。平板干燥后，加入150μl/孔闪烁液(MicroScint-20;Packard)，然后在Topcount伽马计数器(Packard)上对平板计数10分钟。选择各Fab给出小于或等于最大结合之20%的浓度用于竞争性结合测定法。依照另一实施方案，Kd或Kd值是通过表面等离振子共振测定法使用BIAcore^ＴＭ-2000或BIAcore^ＴＭ-3000(BIAcore,Inc.,Piscataway,NJ)在25℃使用固定化抗原CM5芯片在约10个响应单位(RU)测量的。简而言之，依照供应商的说明书用盐酸N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)-碳化二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化羧甲基化右旋糖苷生物传感器芯片(CM5,BIAcoreInc.)。用10mM乙酸钠pH4.8将抗原稀释至5μg/ml（约0.2μM），然后以5μl/分钟的流速注入至获得约10个响应单位(RU)的偶联蛋白质。注入抗原后，注入1M乙醇胺以封闭未反应基团。为了进行动力学测量，在25℃以约25μl/分钟的流速注入在含0.05%Tween-20的PBS(PBST)中两倍连续稀释的Fab（0.78nM至500nM）。使用简单一对一朗格缪尔(Langmuir)结合模型(BIAcore Evaluation Software version3.2)通过同时拟合结合和解离传感图计算结合速率(k_on)和解离速率(k_off)。平衡解离常数(Kd)以比率k_off/k_on计算。参见例如Chen,Y.,etal.,J Mol Biol293:865-881(1999)。如果根据上文表面等离振子共振测定法，结合速率超过10⁶M^-1S^-1，那么结合速率可使用荧光淬灭技术来测定，即根据分光计诸如配备了断流装置的分光光度计(a stop-flow equipped spectrophometer)(Aviv Instruments)或8000系列SLM-Aminco分光光度计(ThermoSpectronic)中用搅拌比色杯的测量，在存在浓度渐增的抗原的条件下，测量PBS,pH7.2中的20nM抗抗原抗体（Fab形式）在25℃的荧光发射强度（激发=295nm；发射=340nm，16nm带通）的升高或降低。

依照本发明的“结合速率”（on-rate,rate of association,association rate）或“k_on”也可通过上文所述相同的表面等离振子共振技术使用BIAcore^ＴＭ-2000或BIAcore^ＴＭ-3000(BIAcore,Inc.,Piscataway,NJ)在25℃使用固定化抗原CM5芯片在约10个响应单位(RU)来测定。简而言之，依照供应商的说明书用盐酸N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)-碳化二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化羧甲基化右旋糖苷生物传感器芯片(CM5,BIAcore Inc.)。用10mM乙酸钠pH4.8将抗原稀释至5μg/ml（约0.2μM），然后以5μl/分钟的流速注入至获得约10个响应单位(RU)的偶联蛋白质。注入抗原后，注入1M乙醇胺以封闭未反应基团。为了进行动力学测量，在25℃以约25μl/分钟的流速注入在含0.05%Tween-20的PBS(PBST)中两倍连续稀释的Fab（0.78nM至500nM）。使用简单一对一朗格缪尔(Langmuir)结合模型(BIAcore Evaluation Software version3.2)通过同时拟合结合和解离传感图计算结合速率(k_on)和解离速率(k_off)。平衡解离常数(Kd)以比率k_off/k_on计算。参见例如Chen,Y.,et al.,J Mol Biol293:865-881(1999)。然而，如果根据上文表面等离振子共振测定法，结合速率超过10⁶M^-1S^-1，那么结合速率可以使用荧光淬灭技术来测定，即根据分光计诸如配备了断流装置的分光光度计(Aviv Instruments)或8000系列SLM-Aminco分光光度计(ThermoSpectronic)中用搅拌比色杯的测量，在存在浓度渐增的抗原的条件下，测量PBS,pH7.2中的20nM抗抗原抗体（Fab形式）在25℃的荧光发射强度（激发=295nm；发射=340nm，16nm带通）的升高或降低。

术语“载体”在用于本文时意指能够运输与其连接的其它核酸的核酸分子。一类载体是“质粒”，指其中可连接另外的DNA区段的环状双链DNA环。另一类载体是噬菌体载体。另一类载体是病毒载体，其中可将另外的DNA区段连接到病毒基因组中。某些载体能够在其所导入的宿主细胞中自主复制（例如具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体）。其它载体（例如非附加型哺乳动物载体）可在导入宿主细胞后整合到宿主细胞的基因组中，由此随着宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导与其可操作连接的基因表达。此类载体在本文中称为“重组表达载体”（或简称为“重组载体”）。通常，在重组DNA技术中有用的表达载体常常是质粒形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可互换使用，因为质粒是载体的最常用形式。

“多核苷酸”或“核酸”在本文中可互换使用，指任何长度的核苷酸聚合物，包括DNA和RNA。核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、经过修饰的核苷酸或碱基、和/或其类似物，或者是可通过DNA或RNA聚合酶或者通过合成反应掺入聚合物的任何底物。多核苷酸可包含经过修饰的核苷酸，诸如甲基化核苷酸及其类似物。如果有的话，对核苷酸结构的修饰可以在装配聚合物之前或之后进行。核苷酸序列可以由非核苷酸组分中断。多核苷酸可以在合成后进一步修饰，诸如通过与标记物偶联。其它类型的修饰包括例如“帽”，将一个或多个天然存在的核苷酸用类似物替代，核苷酸间修饰诸如例如具有不带电荷连接（例如膦酸甲酯、磷酸三酯、磷酰胺酯(phosphoamidate)、氨基甲酸酯等）和具有带电荷连接（例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等）的修饰，含有悬垂模块(pendant moiety)诸如例如蛋白质（例如核酸酶、毒素、抗体、信号肽、聚L-赖氨酸等）的修饰、具有嵌入剂（例如吖啶、补骨脂素等）的修饰、含有螯合剂（例如金属、放射性金属、硼、氧化性金属等）的修饰、含有烷化剂的修饰、具有经修饰连接（例如α端基异构核酸(anomeric nucleic acid)等）的修饰、以及未修饰形式的多核苷酸。另外，通常存在于糖类中的任何羟基可以用例如膦酸(phosphonate)基团、磷酸(phosphate)基团替换，用标准保护基团保护，或活化以制备与别的核苷酸的别的连接，或者可偶联至固体或半固体支持物。5′和3′末端OH可磷酸化或者用胺或1-20个碳原子的有机加帽基团模块取代。其它羟基也可衍生成标准保护基团。多核苷酸还可含有本领域普遍知道的核糖或脱氧核糖糖类的类似物形式，包括例如2′-氧-甲基、2′-氧-烯丙基、2′-氟-或2′-叠氮-核糖，碳环糖类似物，α-端基异构糖，差向异构糖诸如***糖、木糖或来苏糖、吡喃糖、呋喃糖、景天庚酮糖，无环类似物及脱碱基核苷类似物诸如甲基核糖核苷。可用备选连接基团替换一个或多个磷酸二酯连接。这些备选连接基团包括但不限于以下实施方案，其中磷酸酯用P(O)S（“硫代酸酯”(thioate)）、P(S)S（“二硫代酸酯”(dithioate)）、(O)NR₂（“酰胺酯”(amidate)）、P(O)R、P(O)OR′、CO或CH₂（“甲缩醛”(formacetal)）替代，其中R或R′各自独立为H或者取代或未取代的烷基（1-20个C），任选含有醚(-O-)连接、芳基、烯基、环烷基、环烯基或芳烷基(araldyl)。并非多核苷酸中的所有连接都必需是相同的。前述描述适用于本文中提及的所有多核苷酸，包括RNA和DNA。

“寡核苷酸”在用于本文时一般指短的多核苷酸，一般是单链，一般是合成的，长度一般但不是必需小于约200个核苷酸。术语“寡核苷酸”与“多核苷酸”并不互相排斥。上文关于多核苷酸的描述平等且完全适用于寡核苷酸。

“抗体”(Ab)和“免疫球蛋白”(Ig)是具有相同结构特征的糖蛋白。虽然抗体展现出对特定抗原的结合特异性，但是免疫球蛋白包括抗体和一般缺乏抗原特异性的其它抗体样分子二者。后一类多肽例如由淋巴***以低水平生成而由骨髓瘤以升高的水平生成。

术语“抗体”和“免疫球蛋白”以最广义互换使用，包括单克隆抗体（例如全长或完整单克隆抗体）、多克隆抗体、单价、多价抗体、多特异性抗体（例如双特异性抗体，只要它们展现出期望的生物学活性），而且还可以包括某些抗体片段（如本文中更为详细描述的）。抗体可以是嵌合的、人的、人源化的和/或亲和力成熟的。

抗体的“可变区”或“可变域”指抗体重链或轻链的氨基末端结构域。这些结构域一般是抗体的最易变部分且包含抗原结合位点。

术语“可变的”指可变域中的某些部分在抗体序列间差异广泛且用于每种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性的实情。然而，变异性并非均匀分布于抗体的整个可变域。它集中于轻链和重链可变域中称作互补决定区(CDR)或高变区的三个区段。可变域中较保守的部分称作框架区(FR)。天然重链和轻链的可变域各自包含四个FR，它们大多采取β-折叠片构象，通过形成环状连接且在有些情况中形成β-折叠片结构一部分的三个CDR连接。每条链中的CDR通过FR非常接近的保持在一起，并与另一条链的CDR一起促成抗体的抗原结合位点的形成(参见Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,National Institutes of Health,Bethesda,MD.(1991))。恒定域不直接参与抗体与抗原的结合，但展现出多种效应器功能，诸如抗体依赖性细胞的细胞毒性中抗体的参与。

用木瓜蛋白酶消化抗体产生两个相同的抗原结合片段，称为“Fab”片段，各自具有一个抗原结合位点，及一个剩余的“Fc”片段，其名称反映了它易于结晶的能力。胃蛋白酶处理产生一个F(ab′)₂片段，它具有两个抗原结合位点且仍能够交联抗原。

“Fv”是包含完整抗原识别和结合位点的最小抗体片段。在双链Fv种类中，此区由紧密、非共价结合的一个重链可变域和一个轻链可变域的二聚体组成。在单链Fv种类中，一个重链可变域和一个轻链可变域可以通过柔性肽接头共价相连，使得轻链和重链在与双链Fv种类类似的“二聚体”结构中相结合。正是在这种构造中，各可变域的三个CDR相互作用而在V_H-V_L二聚体表面上确定了抗原结合位点。六个CDR共同赋予抗体以抗原结合特异性。然而，即使是单个可变域（或只包含对抗原特异的三个CDR的半个Fv）也具有识别和结合抗原的能力，只是亲和力低于完整结合位点。

Fab片段还包含轻链的恒定域和重链的第一恒定域(CH1)。Fab′片段与Fab片段的不同之处在于重链CH1结构域的羧基末端增加了少数残基，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab′-SH是本文中对其中恒定域半胱氨酸残基携带游离硫醇基的Fab′的称谓。F(ab′)₂抗体片段最初是作为在Fab′片段之间有铰链半胱氨酸的成对Fab′片段生成的。还知道抗体片段的其它化学偶联。

根据其恒定域的氨基酸序列，来自任何脊椎动物物种的抗体（免疫球蛋白）的“轻链”可归入两种截然不同的型中的一种，称作卡帕(κ)和拉姆达(λ)。

根据其重链恒定域的氨基酸序列，抗体（免疫球蛋白）可归入不同的类。免疫球蛋白有五大类：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中有些可进一步分为亚类（同种型），例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。将与不同类的免疫球蛋白对应的重链恒定域分别称作α、δ、ε、γ和μ。不同类的免疫球蛋白的亚基结构和三维构造是众所周知的，一般记载于例如Abbas et al.,Cellular and Mol.Immunology,第4版(2000)。抗体可以是抗体与一种或多种其它蛋白质或肽共价或非共价关联而形成的更大融合分子的一部分。

术语“全长抗体”和“完整抗体”在本文中可互换使用，指基本上完整形式的抗体而非如下文所定义的抗体片段。该术语具体指重链包含Fc区的抗体。

“抗体片段”只包含完整抗体的一部分，其中所述部分保留该部分存在于完整抗体中时通常与之有关的至少一项、多至大多数或所有功能。在一个实施方案中，抗体片段包含完整抗体的抗原结合位点，如此保留结合抗原的能力。在另一个实施方案中，抗体片段，例如包含Fc区的抗体片段，保留通常与Fc区存在于完整抗体中时通常与之有关的至少一项生物学功能，诸如FcRn结合、抗体半衰期调控、ADCC功能和补体结合。在一个实施方案中，抗体片段是体内半衰期与完整抗体基本上相似的单价抗体。例如，这样的抗体片段可包含一个抗原结合臂且其与能够赋予该片段以体内稳定性的Fc序列相连。

术语“单克隆抗体”在用于本文时指从一群基本上同质的抗体获得的抗体，即构成群体的各个抗体相同，除了可能以极小量存在的可能的天然存在变异外。如此，修饰语“单克隆”指明抗体不是分立的抗体的混合物的特征。此类单克隆抗体典型的包括包含结合靶物的多肽序列的抗体，其中靶物结合多肽序列是通过包括从众多多肽序列中选择单一靶物结合多肽序列在内的过程得到的。例如，选择过程可以是从众多克隆诸如杂交瘤克隆、噬菌体克隆或重组DNA克隆的集合中选择独特克隆。应当理解，选定的靶物结合序列可进一步改变，例如为了提高对靶物的亲和力、将靶物结合序列人源化、提高其在细胞培养物中的产量、降低其在体内的免疫原性、创建多特异性抗体等，而且包含改变后的靶物结合序列的抗体也是本发明的单克隆抗体。与典型的包含针对不同决定簇（表位）的不同抗体的多克隆抗体制备物不同，单克隆抗体制备物的每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。在它们的特异性之外，单克隆抗体制备物的优势在于它们通常未受到其它免疫球蛋白的污染。修饰语“单克隆”指明抗体从基本上同质的抗体群获得的特征，不应解释为要求通过任何特定方法来生产抗体。例如，将依照本发明使用的单克隆抗体可通过多种技术来生成，包括例如杂交瘤法(例如Kohler et al.,Nature 256:495(1975);Harlow et al.,Antibodies:ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,第2版,1988;Hammerlinget al.,于:Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas,563-681,Elsevier,N.Y.,1981)、重组DNA法(参见例如美国专利No.4,816,567)、噬菌体展示技术(参见例如Clacksonet al.,Nature352:624-628(1991);Marks et al.,J.Mol.Biol.222:581-597(1992);Sidhu et al.,J.Mol.Biol.338(2):299-310(2004);Lee et al.,J.Mol.Biol.340(5):1073-1093(2004);Fellouse,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(34):12467-12472(2004);Leeet al.,J.Immunol.Methods284(1-2):119-132(2004))、及用于在具有部分或整个人免疫球蛋白基因座或编码人免疫球蛋白序列的基因的动物中生成人或人样抗体的技术(参见例如WO 98/24893;WO 96/34096;WO 96/33735;WO 91/10741;Jakobovits et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:2551(1993);Jakobovits et al.,Nature362:255-258(1993);Bruggemann et al.,Year in Immunol.7:33(1993);美国专利No.5,545,807;5,545,806;5,569,825;5,625,126;5,633,425;5,661,016;Marks et al.,Bio/Technology10:779-783(1992);Lonberg et al.,Nature368:856-859(1994);Morrison,Nature 368:812-813(1994);Fishwild et al.,Nature Biotechnol.14:845-851(1996);Neuberger,Nature Biotechnol.14:826(1996);Lonberg and Huszar,Intern.Rev.Immunol.13:65-93(1995))。

单克隆抗体在本文中明确包括“嵌合”抗体，其中重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的剩余部分与衍生自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，以及此类抗体的片段，只要它们展现出期望的生物学活性(美国专利No.4,816,567;Morrison etal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6851-6855(1984))。

非人（例如鼠）抗体的“人源化”形式指最低限度包含衍生自非人免疫球蛋白的序列的嵌合抗体。在一个实施方案中，人源化抗体指人免疫球蛋白（受体抗体）中的高变区残基用具有期望特异性、亲和力和/或能力的非人物种（供体抗体）诸如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物的高变区残基替换的免疫球蛋白。在有些情况中，将人免疫球蛋白的框架区(FR)残基用相应的非人残基替换。此外，人源化抗体可包含在受体抗体中或在供体抗体中没有找到的残基。进行这些修饰是为了进一步改进抗体的性能。一般而言，人源化抗体将包含至少一个、通常两个基本上整个如下的可变域，其中所有或基本上所有高变环对应于非人免疫球蛋白的高变环，且所有或基本上所有FR是人免疫球蛋白序列的FR。人源化抗体任选还将包含至少部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常是人免疫球蛋白的恒定区。更多细节参见Jones et al.,Nature 321:522-525(1986);Riechmann et al.,Nature332:323-329(1988);Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992)。还可参见以下综述及其引用的参考文献：Vaswani and Hamilton,Ann.Allergy,Asthma&Immunol.1:105-115(1998);Harris,Biochem.Soc.Transactions23:1035-1038(1995);Hurle and Gross,Curr.Op.Biotech.5:428-433(1994)。

术语“高变区”、“HVR”或“HV”在用于本文时指抗体可变域中序列上高度可变和/或形成结构上定义的环的区域。通常，抗体包含六个高变区：三个在VH中（H1、H2、H3），三个在VL中（L1、L2、L3）。本文中使用且涵盖许多高变区的叙述。Kabat互补决定区(CDR)是以序列变异性为基础的，而且是最常用的(Kabat et al.,Sequences of Proteins ofImmunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,MD.(1991))。Chothia改为指结构环的位置(Chothia and Lesk,J.Mol.Biol.196:901-917(1987))。AbM高变区代表Kabat CDR与Chothia结构环之间的折衷，而且得到Oxford Molecular的AbM抗体建模软件的使用。“接触”高变区是以对可获得的复合物晶体结构的分析为基础的。下文记录了这些高变区中每一个的残基。

高变区可包括如下“延伸的高变区”：VL中的24-36或24-34(L1)、46-56或50-56(L2)和89-97或89-96(L3)及VH中的26-35(H1)、50-65或49-65(H2)和93-102、94-102或95-102(H3)。对于这些定义中的每一个，可变区残基是依照Kabat等,见上文编号的。

“框架”或“FR”残基指可变域中除本文中所定义的高变区残基外的那些残基。

术语“依照Kabat的可变域残基编号”或“依照Kabat的氨基酸位置编号”及其变体指Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.PublicHealth Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD.(1991)中的抗体编辑用于重链可变域或轻链可变域的编号***。使用此编号***，实际的线性氨基酸序列可包含较少或另外的氨基酸，对应于可变域FR或HVR的缩短或***。例如，重链可变域可包含H2残基52后的单一氨基酸***（依照Kabat为残基52a）及重链FR残基82后的***残基（例如依照Kabat为残基82a、82b和82c等）。给定抗体的Kabat残基编号可通过将抗体序列与“标准”Kabat编号序列对比同源区来确定。

“单链Fv”或“scFv”抗体片段包含抗体的V_H和V_L结构域，其中这些结构域存在于一条多肽链上。一般而言，scFv多肽在V_H与V_L结构域之间还包含多肽接头，使得scFv能够形成结合抗原的期望结构。关于scFv的综述参见Pluckthun,于:The Pharmacology ofMonoclonal Antibodies,vol.113,Rosenburg and Moore编,Springer-Verlag,New York,pp.269-315(1994)。

术语“双抗体(diabody)”指具有两个抗原结合位点的小型抗体片段，该片段在同一条多肽链（V_H-V_L）中包含相连的重链可变域(V_H)和轻链可变域(V_L)。通过使用过短的接头使得同一条链上的两个结构域之间不能配对，迫使这些结构域与另一条链的互补结构域配对，从而产生两个抗原结合位点。双抗体更完整的记载于例如EP404,097;WO93/1161;Hollinger et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:6444-6448(1993)。

“人抗体”指拥有与由人生成的抗体的氨基酸序列对应的氨基酸序列和/或使用本文所公开的用于生成人抗体的任何技术生成的抗体。人抗体的这种定义明确排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。

“亲和力成熟的”抗体指在抗体的一个或多个HVR中具有一处或多处改变、导致该抗体对抗原的亲和力与没有这些改变的亲本抗体相比有所改进的抗体。在一个实施方案中，亲和力成熟的抗体具有纳摩尔或甚至皮摩尔量级的对靶抗原的亲和力。亲和力成熟的抗体可通过本领域已知规程来生成。Marks et al.,Bio/Technology10:779-783(1992)记载了通过VH和VL结构域改组进行的亲和力成熟。以下文献记载了CDR和/或框架残基的随机诱变：Barbas et al.,Proc.Nat.Acad.Sci.USA 91:3809-3813(1994);Schier et al.,Gene 169:147-155(1995);Yelton et al.,J.Immunol.155:1994-2004(1995);Jackson etal.,J.Immunol.154(7):3310-9(1995);Hawkins et al.,J.Mol.Biol.226:889-896(1992)。

“阻断性(blocking)”抗体或“拮抗性(antagonist)”抗体指抑制或降低其所结合的抗原的生物学活性的抗体。某些阻断性抗体或拮抗性抗体实质性或完全抑制抗原的生物学活性。

“激动性抗体(agonist antibody)”在用于本文时指模拟目的多肽的至少一项功能性活性的抗体。

“病症”指将会从使用本发明的抗体进行的处理中获益的任何疾患。这包括慢性和急性病症，或者包括那些使哺乳动物趋向于所讨论病症的病理状况的疾病。本文中待治疗病症的非限制性例子包括癌症、肌肉病症、泛蛋白途径相关遗传病症、免疫/炎性病症、神经学病症、和其它泛蛋白途径相关病症。

术语“细胞增殖性病症”和“增殖性病症”指与一定程度的异常细胞增殖有关的病症。在一个实施方案中，细胞增殖性病症指癌症。

“肿瘤”在用于本文时指所有肿瘤性细胞生长和增殖，无论是恶性的还是良性的，及所有癌前(pre-cancerous)和癌性细胞和组织。术语“癌症”、“癌性”、“细胞增殖性紊乱”、“增殖性紊乱”和“肿瘤”在本文中提到时并不互相排斥。

术语“癌症”和“癌性”指向或描述哺乳动物中特征通常为细胞生长/增殖不受调控的生理疾患。癌症的例子包括但不限于癌、淋巴瘤（例如何杰金氏(Hodgkin)淋巴瘤和非何杰金氏淋巴瘤）、母细胞瘤、肉瘤和白血病。此类癌症的更具体例子包括鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺的腺癌、肺的鳞癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃肠癌、胰腺癌、成胶质细胞瘤(glioblastoma)、***、卵巢癌、肝癌(liver cancer)、膀胱癌、肝瘤(hepatoma)、乳腺癌、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、***癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌(hepatic carcinoma)、白血病和其它淋巴增殖性病症、及各种类型的头和颈癌。

术语“肌肉病症”指向或描述含肌肉动物中典型特征为骨骼肌和/或平滑肌衰退或弱化使得正常肌肉功能显著降低的生理疾患。肌肉病症的例子包括，但不限于，肌营养不良(muscular dystrophy)、多发性硬化、肌萎缩侧索硬化(amyotrophic lateralsclerosis)、艾萨克氏综合征(Isaac’s syndrome)、僵人综合征(stiff-personsyndrome)、家族性周期性麻痹(familiar periodic paralyses)、肌病(myopathy)、肌强直(myotonia)、横纹肌溶解(rhabdomyolyses)、肌肉萎缩、及各种类型的肌无力和肌肉强直。

术语“泛蛋白途径相关遗传病症”指向或描述典型特征为或有助于泛蛋白途径异常机能的基于遗传的病症。泛蛋白途径相关遗传病症的例子包括，但不限于，囊性纤维化病(cystic fibrosis)、天使综合征(Angelman’s syndrome)、和利德尔综合征(Liddlesyndrome)。

术语“神经学病症”或“神经学疾病”指向或描述典型特征为神经组织衰退或神经组织的细胞间通讯衰退的哺乳动物中枢和/或周围神经***疾病或病症。神经学病症的例子包括，但不限于，神经变性疾病（包括，但不限于，Lewy体疾病、脊髓灰质炎后综合征、Shy-Draeger综合征、橄榄体脑桥小脑萎缩、帕金森氏病、多***萎缩、纹状体黑质变性、τ病（包括，但不限于，阿耳茨海默病和核上性麻痹）、朊病毒病（包括，但不限于，牛海绵样脑病、绵羊瘙痒病、克罗伊茨费尔特-雅各布综合征、库鲁病、Gerstmann-Straussler-Scheinker病、慢性消耗性疾病、和致命性家族性失眠症)、延髓性麻痹、运动神经元疾病、和神经***异型变性疾病（包括，但不限于，卡纳万病、亨庭顿氏病、神经元蜡样脂褐质沉积症、亚历山大氏病、图雷特氏综合征、Menkes卷发综合征、科凯恩综合征、Halervorden-Spatz综合征、拉福拉病、Rett综合征、肝豆状核变性、Lesch-Nyhan综合征、和Unverricht-Lundborg综合征）、痴呆（包括，但不限于，皮克氏病、和脊髓小脑性共济失调。

术语“炎性病症”和“免疫病症”指向或描述由异常免疫学机制和/或异常细胞因子信号传导引起的病症。炎性和免疫病症的例子包括，但不限于，自身免疫病、免疫学缺陷综合征、和超敏感性。“自身免疫病”在本文中指源于且针对个体自身组织的非恶性疾病或病症。自身免疫病在本文中明确排除恶性或癌性疾病或疾患，尤其排除B细胞淋巴瘤、急性成淋巴细胞白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、毛细胞白血病和慢性成髓细胞白血病。自身免疫性疾病或病症的例子包括但不限于炎性应答，诸如炎性皮肤病，包括银屑病和皮炎（例如特应性皮炎）；***性硬皮病和硬化；与炎性肠病有关的应答（诸如克罗恩氏(Crohn)病和溃疡性结肠炎）；呼吸窘迫综合征（包括成人呼吸窘迫综合症(ARDS)）；皮炎；脑膜炎；脑炎；葡萄膜炎；结肠炎；肾小球肾炎；过敏状况，诸如湿疹和哮喘及牵涉T细胞浸润和慢性炎性应答的其它状况；动脉粥样硬化；白细胞粘着缺陷；类风湿性关节炎；***性红斑狼疮(SLE)（包括但不限于狼疮肾炎、皮肤性狼疮）；糖尿病（例如I型糖尿病或胰岛素依赖性糖尿病）；多发性硬化；雷诺氏(Reynaud)综合征；自身免疫性甲状腺炎；桥本氏(Hashimoto)甲状腺炎；变应性脑脊髓炎；斯耶格伦氏(Sjogren)综合征；幼发型糖尿病；通常在结核病、结节病、多肌炎、肉芽肿病和血管炎中发现的与细胞因子和T-淋巴细胞介导的急性和迟发性超敏感性有关的免疫应答；恶性贫血（阿狄森氏(Addison)病）；牵涉白细胞渗出的疾病；中枢神经***(CNS)炎性病症；多器官损伤综合征；溶血性贫血（包括但不限于冷球蛋白血症或库姆斯氏(Coombs)阳性贫血）；重症肌无力；抗原-抗体复合物介导的疾病；抗肾小球基膜病；抗磷脂综合症；过敏性神经炎；格雷夫斯氏(Graves)病；朗-伊二氏(Lambert-Eaton)肌无力综合症；大疱性类天疱疮；天疱疮；自身免疫性多种内分泌腺病；莱特氏(Reiter)病；僵人综合症；贝切特氏(Behcet)病；巨细胞动脉炎；免疫复合物肾炎；IgA肾病；IgM多神经病；免疫性血小板减少性紫癜(ITP)或自身免疫性血小板减少症等。

免疫学缺陷综合征的例子包括，但不限于，共济失调性毛细血管扩张症、白血病粘着缺陷综合征、淋巴细胞减少、异常丙种球蛋白血症、HIV或δ逆转录病毒感染、常见变异型免疫缺陷、无丙种球蛋白血症、DiGeorge综合征、和Wiskott-Aldrich综合征。超敏感性的例子包括，但不限于，***反应、哮喘、皮炎、荨麻疹、过敏反应、Wissler氏综合征、和血小板减少性紫癜。

在用于本文时，“治疗”或“处理”指试图改变所治疗个体或细胞的自然进程的临床干预，可以是为了预防或在临床病理学的进程中进行。治疗的期望效果包括预防疾病的发生或复发、缓解症状、削弱疾病的任何直接或间接病理学后果、预防或降低炎症和/或组织/器官损伤转移、减缓疾病进展的速率、改善或减轻疾病状态、及免除或改善预后。在有些实施方案中，将本发明的抗体用于延迟疾病或病症的发生/发展。

“个体”指脊椎动物。在某些实施方案中，脊椎动物指哺乳动物。哺乳动物包括，但不限于，牲畜（诸如牛）、运动用动物、宠物（诸如猫、犬、和马）、灵长类动物、小鼠和大鼠。在某些实施方案中，脊椎动物指人。

为了治疗的目的，“哺乳动物”指归入哺乳类的任何动物，包括人，家畜和牲畜，及动物园、运动或宠物动物，诸如犬、马、猫、牛等。在某些实施方案中，哺乳动物指人。

“有效量”指在必需的剂量和时间上有效实现期望的治疗或预防效果的量。

本发明物质/分子的“治疗有效量”可根据诸如个体的疾病状态、年龄、性别和体重及该物质/分子在个体中引发期望应答的能力等因素而变化。治疗有效量还指该物质/分子的治疗有益效果胜过任何有毒或有害后果的量。“预防有效量”指在必需的剂量和时间上有效实现期望的预防效果的量。通常而非必然，由于预防剂量是在疾病发作之前或在疾病的早期用于受试者的，因此预防有效量将低于治疗有效量。

术语“细胞毒剂”在用于本文时指抑制或防止细胞的功能和/或引起细胞破坏的物质。该术语意图包括：放射性同位素，例如At²¹¹、I¹³¹、I¹²⁵、Y⁹⁰、Re¹⁸⁶、Re¹⁸⁸、Sm¹⁵³、Bi²¹²、P³²、Pb²¹²和Lu的放射性同位素；化疗剂，例如甲氨蝶呤(methotrexate)、阿霉素(adriamycin)、长春花生物碱类(vinca alkaloids)（长春新碱(vincristine)、长春碱(vinblastine)、依托泊苷(etoposide)）、多柔比星(doxorubicin)、美法仑(melphalan)、丝裂霉素(mitomycin) C、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、柔红霉素(daunorubicin)或其它嵌入剂；酶及其片段，诸如溶核酶；抗生素；和毒素，诸如小分子毒素或者细菌、真菌、植物或动物起源的酶活毒素，包括其片段和/或变体；及下文披露的各种抗肿瘤药或抗癌药。下文记载了其它细胞毒剂。杀肿瘤药引起肿瘤细胞的破坏。

“化疗剂”指可用于治疗癌症的化学化合物。化疗剂的例子包括烷化剂类(alkylating agents)，诸如塞替派(thiotepa)和CYTOXAN环磷酰胺(cyclophosphamide)；磺酸烷基酯类(alkyl sulfonates)，诸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶类(aziridines)，诸如苯佐替派(benzodepa)、卡波醌(carboquone)、美妥替派(meturedepa)和乌瑞替派(uredepa)；乙撑亚胺类(ethylenimines)和甲基蜜胺类(methylamelamines)，包括六甲蜜胺(altretamine)、三乙撑蜜胺(triethylenemelamine)、三乙撑磷酰胺(triethylenephosphoramide)、三乙撑硫代磷酰胺(triethylenethiophosphoramide)和三羟甲蜜胺(trimethylolomelamine)；番荔枝内酯类(acetogenin)（尤其是布拉他辛(bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone)）；δ-9-四氢***酚(tetrahydrocannabinol)（屈***酚(dronabinol)，MARINOL）；β-拉帕醌(lapachone)；拉帕醇(lapachol)；秋水仙素类(colchicines)；白桦脂酸(betulinic acid)；喜树碱(camptothecin)（包括合成类似物托泊替康(topotecan)（HYCAMTINCPT-11（伊立替康(irinotecan)，CAMPTOSAR）、乙酰喜树碱、东莨菪亭(scopoletin)和9-氨基喜树碱）；苔藓抑素(bryostatin)；callystatin；CC-1065（包括其阿多来新(adozelesin)、卡折来新(carzelesin)和比折来新(bizelesin)合成类似物）；鬼臼毒素(podophyllotoxin)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；替尼泊苷(teniposide)；隐藻素类(cryptophycins)（特别是隐藻素1和隐藻素8）；多拉司他汀(dolastatin)；duocarmycin（包括合成类似物，KW-2189和CB1-TM1）；艾榴塞洛素(eleutherobin)；pancratistatin；sarcodictyin；海绵抑素(spongistatin)；氮芥类(nitrogen mustards)，诸如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、胆磷酰胺(cholophosphamide)、雌莫司汀(estramustine)、异环磷酰胺(ifosfamide)、双氯乙基甲胺(mechlorethamine)、盐酸氧氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法仑(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥胆甾醇(phenesterine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥(uracil mustard)；亚硝脲类(nitrosoureas)，诸如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimustine)；抗生素类，诸如烯二炔类抗生素(enediyne)（如加利车霉素(calicheamicin)，尤其是加利车霉素γ1I和加利车霉素ωI1（参见例如Agnew,Chem.Intl.Ed.Engl.33:183-186(1994)）；蒽环类抗生素(dynemicin)，包括dynemicin A；埃斯波霉素(esperamicin)；以及新制癌素(neocarzinostatin)发色团和相关色蛋白烯二炔类抗生素发色团）、阿克拉霉素(aclacinomycin)、放线菌素(actinomycin)、氨茴霉素(anthramycin)、偶氮丝氨酸(azaserine)、博来霉素(bleomycin)、放线菌素C (cactinomycin)、carabicin、洋红霉素(carminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycin)、放线菌素D(dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-二氮-5-氧-L-正亮氨酸、ADRIAMYCIN多柔比星(doxorubicin)（包括吗啉代多柔比星、氰基吗啉代多柔比星、2-吡咯代多柔比星和脱氧多柔比星）、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊达比星(idarubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素类(mitomycins)诸如丝裂霉素C、霉酚酸(mycophenolic acid)、诺拉霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycin)、培洛霉素(peplomycin)、potfiromycin、嘌呤霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑菌素(streptonigrin)、链佐星(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代谢物类，诸如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，诸如二甲叶酸(denopterin)、甲氨蝶呤、蝶酰三谷氨酸(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物，诸如氟达拉滨(fludarabine)、6-巯基嘌呤(mercaptopurine)、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鸟嘌呤(thioguanine)；嘧啶类似物，诸如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、双脱氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)；雄激素类，诸如卡鲁睾酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)、表硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾内酯(testolactone)；抗肾上腺类，诸如氨鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂，诸如亚叶酸(folinic acid)；醋葡醛内酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamideglycoside)；氨基乙酰丙酸(aminolevulinic acid)；恩尿嘧啶(eniluracil)；安吖啶(amsacrine)；bestrabucil；比生群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；地磷酰胺(defosfamide)；地美可辛(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；elfornithine；依利醋铵(elliptinium acetate)；埃坡霉素(epothilone)；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟脲(hydroxyurea)；香菇多糖(lentinan)；氯尼达明(lonidamine)；美登木素生物碱类(maytansinoids)，诸如美登素(maytansine)和美登醇(maytansinol)；安丝菌素(ansamitocin)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌达醇(mopidamol)；二胺硝吖啶(nitracrine)；喷司他丁(pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；2-乙基酰肼(ethylhydrazide)；丙卡巴肼(procarbazine)；PSK多糖复合物（JHS Natural Products, Eugene, OR）；雷佐生(razoxane)；根霉素(rhizoxin)；西索菲兰(sizofiran)；螺旋锗(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亚胺醌(triaziquone)；2,2′,2″-三氯三乙胺；单端孢菌素类(trichothecenes)（尤其是T-2毒素、疣孢菌素(verrucarin)A、杆孢菌素(roridin)A和蛇行菌素(anguidin)）；乌拉坦(urethan)；长春地辛(vindesine)（ELDISINEFILDESIN）；达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露醇氮芥(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；gacytosine；阿糖胞苷(arabinoside)（“Ara-C”）；塞替派(thiotepa)；类紫杉醇(taxoids)，例如TAXO紫杉醇(paclitaxel)（Bristol-Myers Squibb Oncology,Princeton, N.J.）、ABRAXANE^TM不含克列莫佛(Cremophor)，清蛋白改造的纳米颗粒剂型紫杉醇（American Pharmaceutical Partners,Schaumberg, Illinois）和TAXOTERE多西他塞(doxetaxel)（Rorer,Antony, France）；苯丁酸氮芥(chlorambucil)；吉西他滨(gemcitabine)（GEMZAR）；6-硫鸟嘌呤(thioguanine)；巯基嘌呤(mercaptopurine)；甲氨蝶呤(methotrexate)；铂类似物，诸如顺铂(cisplatin)和卡铂(carboplatin)；长春碱(vinblastine)（VELBAN）；铂；依托泊苷(etoposide)（VP-16）；异环磷酰胺(ifosfamide)；米托蒽醌(mitoxantrone)；长春新碱(vincristine)（ONCOVIN）；奥沙利铂(oxaliplatin)；亚叶酸(leucovorin)；长春瑞滨(vinorelbine)（NAVELBINE）；能灭瘤(novantrone)；依达曲沙(edatrexate)；道诺霉素(daunomycin)；氨基蝶呤(aminopterin)；伊本膦酸盐(ibandronate)；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；类维A酸(retinoids)，诸如维A酸(retinoic acid)；卡培他滨(capecitabine)（XELODA）；任何上述物质的药学可接受盐、酸或衍生物；以及两种或多种上述物质的组合，诸如CHOP（环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和***龙联合疗法的缩写）和FOLFOX（奥沙利铂（ELOXATIN^TM）联合5-FU和亚叶酸的治疗方案的缩写）。

该定义还包括作用为调节、降低、阻断、或抑制可促进癌生长的激素效果的抗激素剂，且常常是***或全身治疗的形式。它们自身可以是激素。实例包括抗***类和选择性***受体调节剂类(SERM)，包括例如他莫昔芬(tamoxifen)（包括NOLVADEX他莫昔芬）、EVISTA雷洛昔芬(raloxifene)、屈洛昔芬(droloxifene)、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬(trioxifene)、那洛昔芬(keoxifene)、LY117018、奥那司酮(onapristone)和FARESTON托瑞米芬(toremifene)；抗孕酮类；***受体下调剂类(ERD)；功能为抑制或关闭卵巢的药剂，例如促黄体生成激素释放激素(LHRH)激动剂，诸如LUPRON和ELIGARD醋酸亮丙瑞林(leuprolide acetate)、醋酸戈舍瑞林(goserelin acetate)、醋酸布舍瑞林（buserelinacetate）和曲普瑞林(triptorelin)；其它抗雄激素类，诸如氟他米特(flutamide)、尼鲁米特(nilutamide)和比卡米特(bicalutamide)；及抑制在肾上腺中调节***生成的芳香酶的芳香酶抑制剂，诸如例如4(5)-咪唑、氨鲁米特(aminoglutethimide)、MEGASE醋酸甲地孕酮(megestrol acetate)、AROMASIN依西美坦(exemestane)、福美坦(formestane)、法倔唑(fadrozole)、RIVISOR伏罗唑(vorozole)、FEMARA来曲唑(letrozole)和ARIMIDEX阿那曲唑(anastrozole)。另外，化疗剂的这种定义包括二膦酸盐类(bisphosphonates)，诸如氯膦酸盐(clodronate)（例如BONEFOS或OSTAC）、DIDROCAL依替膦酸钠(etidronate)、NE-58095、ZOMETA唑来膦酸/唑来膦酸盐(zoledronic acid/zoledronate)、FOSAMAX阿伦膦酸盐(alendronate)、AREDIA帕米膦酸盐(pamidronate)、SKELID替鲁膦酸盐(tiludronate)或ACTONEL利塞膦酸盐(risedronate)；以及曲沙他滨(troxacitabine)（1,3-二氧戊环核苷胞嘧啶类似物）；反义寡核苷酸，特别是抑制牵涉粘着细胞增殖的信号途经中的基因表达的反义寡核苷酸，诸如例如PKC-α、Raf、H-Ras和表皮生长因子受体(EGF-R)；疫苗，诸如THERATOPE疫苗和基因疗法疫苗，例如ALLOVECTIN疫苗、LEUVECTIN疫苗和VAXID疫苗；LURTOTECAN拓扑异构酶1抑制剂；ABARELIXrmRH；lapatinib ditosylate（ErbB-2和EGFR双重酪氨酸激酶小分子抑制剂，也称为GW572016）；及任何上述物质的药学可接受盐、酸或衍生物。

组合物及制备上述物质的方法

本发明提供了与多聚泛蛋白而非单泛蛋白特异性结合的抗体。更具体来说，提供了能与包含第一赖氨酸键的多聚泛蛋白特异性结合而不与包含第二不同的赖氨酸键的多聚泛蛋白特异性结合的抗体。

在一个方面中，本发明提供了一种包含含有至少一条SEQ ID NOs:1-25、81-89、151-175、229-239、265-279、329-336、392-459、599-629、695-704、739-748和789-799的序列的HVR-H1区的抗体。在一个方面中，本发明提供了一种包含选自SEQ ID NOs:26、90、176、240、280、337、460、630、705、749和800的HVR-H1区共有序列的抗体。在一个方面中，本发明提供了一种包含含有至少一条SEQ ID NOs:27-51、91-99、177-201、241-251、281-295、338-345、461-528、631-661、706-715、750-759和801-811的序列的HVR-H2区的抗体。在一个方面中，本发明提供了一种包含选自SEQ ID NOs:52、100、202、252、296、346、529、662、716、760和812的HVR-H2区共有序列的抗体。在一个方面中，本发明提供了一种包含含有至少一条SEQ ID NOs:53-77、101-109、203-227、253-263、297-311、347-354、530-597、663-693、717-726、761-770和813-823的序列的HVR-H3区的抗体。在一个方面中，本发明提供了一种包含选自SEQ ID NOs:78、110、228、264、312、355、598、694、727、771和824的HVR-H3区共有序列的抗体。

在一个方面中，本发明提供了一种包含含有至少一条SEQ ID NOs:1-26、81-90、151-176、229-240、265-280、329-337、392-460、599-630、695-705、739-749和789-800的序列的HVR-H1区和含有至少一条SEQ ID NOs:27-52、91-100、177-202、241-252、281-296、338-346、461-529、631-662、706-716、750-760和801-812的序列的HVR-H2区的抗体。在一个方面中，本发明提供了一种包含含有至少一条SEQ ID NOs:1-26、81-90、151-176、229-240、265-280、329-337、392-460、599-630、695-705、739-749和789-800的序列的HVR-H1区和含有至少一条SEQ ID NOs:53-78、101-110、203-228、253-264、297-312、347-355、530-598、663-694、717-727、761-771和813-824的序列的HVR-H3区的抗体。在一个方面中，本发明提供了一种包含含有至少一条SEQ ID NO:27-52、91-100、177-202、241-252、281-296、338-346、461-529、631-662、706-716、750-760和801-812中的序列的HVR-H2区和含有至少一条SEQ ID NOs:53-78、101-110、203-228、253-264、297-312、347-355、530-598、663-694、717-727、761-771和813-824中的序列的HVR-H3区的抗体。

在一个方面中，本发明提供了一种包含含有至少一条SEQ ID NOs:313-327、356-363、728-737和772-781中的序列的HVR-L3区的抗体。在一个方面中，本发明提供了一种包含选自SEQ ID NOs:328、364、738和782的HVR-L3区共有序列的抗体。在一个实施方案中，本发明提供了一种包含含有至少一条SEQ ID NOs:313-328、356-364、728-738和772-782中的序列的HVR-L3区，并进一步包含至少一条分别选自SEQ ID NOs:1-26、81-90、151-176、229-240、265-280、329-337、392-460、599-630、695-705、739-749和789-800；SEQ ID NOs:27-52、91-100、177-202、241-252、281-296、338-346、461-529、631-662、706-716、750-760和801-812；以及SEQ ID NOs:53-78、101-110、203-228、253-264、297-312、347-355、530-598、663-694、717-727、761-771和813-824的HVR-H1、HVR-H2或HVR-H3序列的抗体。

在一个方面中，本发明提供了一种包含至少一条、至少两条、至少三条或所有四条如下序列的抗体：

(i)包含至少一条SEQ ID NOs:1-26、81-90、151-176、229-240、265-280、329-337、392-460、599-630、695-705、739-749和789-800中的序列的HVR-H1序列，

(ii)包含至少一条SEQ ID NOs:27-52、91-100、177-202、241-252、281-296、338-346、461-529、631-662、706-716、750-760和801-812中的序列的HVR-H2序列；

(iii)包含至少一条SEQ ID NOs:53-78、101-110、203-228、253-264、297-312、347-355、530-598、663-694、717-727、761-771和813-824中的序列的HVR-H3序列；

(iv)包含至少一条SEQ ID NOs:313-328、356-364、728-738和772-782中的序列的HVR-L3序列。

在一个方面中，本发明提供了一种包含至少一条、至少两条、至少三条或所有四条如下序列的与K48连接的多聚泛蛋白具有高亲和力的特异性结合但与K63连接的多聚泛蛋白则具有实质上减少(substantially reduced)的亲和力的结合的抗体：

(i)包含至少一条SEQ ID NOs:1-26、151-176、265-280、392-460和695-705中的序列的HVR-H1序列；

(ii)包含至少一条SEQ ID NOs:27-52、177-202、281-296、461-529和706-716中的序列的HVR-H2序列；

(iii)包含至少一条SEQ ID NOs:53-78、203-228、297-312、530-598和717-727中的序列的HVR-H3序列；和

(iv)包含至少一条SEQ ID NOs:313-328和728-738中的序列的HVR-L3序列。

在一个方面中，本发明提供了一种包含至少一条、至少两条、至少三条或所有四条如下序列的与K63连接的多聚泛蛋白具有高亲和力的特异性结合但与K48连接的多聚泛蛋白则具有实质上减少的亲和力的结合的抗体：

(i)包含至少一条SEQ ID NOs:81-90、229-240、329-337、599-630、739-749和789-800中的序列的HVR-H1序列；

(ii)包含至少一条SEQ ID NOs:91-100、241-252、338-346、631-662、750-760和801-812中的序列的HVR-H2序列；

(iii)包含至少一条SEQ ID NOs:101-110、253-264、347-355、663-694、761-771和813-824中的序列的HVR-H3序列；

(iv)包含至少一条SEQ ID NOs:356-364和772-782中的序列的HVR-L3序列。

如图2A-2C、3A-3B、8A-8C、9A-9B、10A-10C、11A-11C、14A-14F、15A-15C、16A-16B、17A-17B和22中所示，SEQ ID NOs:1-78、81-106-149、151-364、392-782和789-824的氨基酸序列是相对于单个HVR(即H1、H2、H3、L3)进行编号的，该编号与下述Kabat编号***相一致。在一个实施方案中，本发明的抗体包含一条、两条、三条或所有的上述(i)-(iv)的HVR序列，并且HVR-L1和/或HVR-L2包含Kabat共有序列(例如SEQ ID NO:79(HVR-L1)和80(HVR-L2))。

在一个方面中，本发明提供了包含如图2A-2C、3A-3B、8A-8C、9A-9B、10A-10C、11A-11C、14A-14F、15A-15C、16A-16B、17A-17B和22中所示的重链HVR序列的抗体。在一个实施方案中，抗体进一步包含如图10A-10C、11A-11C、16A-16B和17A-17B中所示的轻链HVR序列。

本发明的抗体的某些实施方案包含如以下SEQ ID NO:783中所示的人源化的4D5抗体(huMAb4D5-8)(HERCEPTINGenentech,Inc.,South San Francisco,CA,USA)(也参见美国专利号6,407,213和Lee等,J.Mol.Biol.(2004),340(5):1073-93)的轻链可变区。

1 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp ArgVal Thr Ile Thr Cys Trp Tyr Gln GlnLys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile TyrGly Val ProSer Arg Phe Ser Gly Ser Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser LeuGln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys PheGly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 107 (SEQ ID NO:783) (HVR残基是加下划线的)

在一个实施方案中，huMAb4D5-8轻链可变区序列在第28、30、31、53、66和91位(分别如以上粗斜体中所示的Asp、Asn、Thr、Phe、Arg和His)的一个或多个位置处被修饰。在一个实施方案中，修饰的huMAb4D5-8序列在第28位包含Ser，在第30位包含Ser，在第31位包含Ser，在第53位包含Ser，在第66位包含Gly和/或在第91位包含Ser。因此，在一个实施方案中，本发明的抗体包含含有以下SEQ ID NO:784所示序列的轻链可变区：

1 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp ArgVal Thr Ile Thr Cys Trp Tyr Gln Gln LysPro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile TyrGly Val ProSer Arg Phe Ser Gly Ser Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser LeuGln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr CysPhe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 107 (SEQ ID NO:784) (HVR残基是加下划线的)

相对于huMAb4D5-8，取代的残基用如上的粗斜体标明。

本发明的抗体可包含任何合适的框架可变区序列，前提条件是基本上保留了与包括特定赖氨酸键的多聚泛蛋白的结合活性。例如，在某些实施方案中，本发明的抗体包含人亚组III重链框架区共有序列。在这些抗体的一个实施方案中，框架区共有序列包含在第71、73和/或78位的取代。在这些抗体的某些实施方案中，第71位是A、第73位是T和/或第78位是A。在一个实施方案中，这些抗体包含huMAb4D5-8(Genentech,Inc.,South San Francisco,CA,USA)(也参见美国专利号6,407,213和5,821,337，和Lee等,J.Mol.Biol.(2004),340(5):1073-93)的重链可变区框架区序列。在一个实施方案中，这些抗体进一步包含人κI轻链框架区共有序列。在一个实施方案中，这些抗体包含至少一条、两条或所有的SEQ ID NOs:79、80、313-328、356-364、728-738和772-78的轻链HVR序列。在一个实施方案中，这些抗体包含如美国专利号6,407,213&5,821,337中所描述的huMAb4D5-8的轻链HVR序列。在一个实施方案中，这些抗体包含huMAb4D5-8(Genentech,Inc.,South San Francisco,CA,USA)的轻链可变区序列(SEQ ID NO:783和784)(也参见美国专利号6,407,213&5,821,337，和Lee等,J.Mol.Biol.(2004),340(5):1073-93)。

在一个实施方案中，本发明的抗体包含重链可变区，其中框架区序列包含至少一条SEQ ID NOs:111-129、138-141、146-149和839-895中的序列，并且HVR H1、H2和H3序列分别选自如下三组中至少一条：SEQ ID NOs:1-26、81-90、151-176、229-240、265-280、329-337、392-460、599-630、695-705、739-749和789-800；27-52、91-100、177-202、241-252、281-296、338-346、461-529、631-662、706-716、750-760和801-812；以及53-78、101-110、203-228、253-264、297-312、347-355、530-598、663-694、717-727、761-771和813-824。在一个实施方案中，本发明的抗体包含轻链可变区，其中框架区序列包含至少一条SEQ ID NOs:130-133、134-137、142-145和896-907中的序列，HVR-L1序列为SEQ ID NO:79，HVR-L2序列为SEQ ID NO:80以及HVR-L3序列选自如下至少一条：SEQ ID NOs:313-328、356-364、728-738和772-782。

在一个实施方案中，本发明的抗体包含重链可变区，其中框架区序列包含至少一条SEQ ID NOs:111-129和839-895中的序列，以及HVR H1、H2和H3序列分别为SEQ ID NO:1、27和53(克隆48-1)。类似地，在其它实施方案中，每一个克隆48-2至48-118、克隆63-1至63-51、Fab apu01-apu24、Fab apu2.01-apu2.20和克隆apu3.01-3.11中的抗体均包含重链可变区,其中框架区序列包含至少一条SEQ ID NOs:111-129和839-895中的序列，以及HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3序列为对于图2A-2C、3A-3B、8A-8C、9A-9B、10A-10C、11A-11C、14A-14F、15A-15C、16A-16B、17A-17B和22中每一个克隆或Fab所明确列举的那些序列。在一个实施方案中，本发明的抗体包含轻链可变区，其中框架区序列包含至少一条SEQ ID NOs:130-133和896-907中的序列，以及HVR L1、L2和L3序列分别为SEQ ID NOs:79、80和313(Fabapu01)。类似地，在其它实施方案中，Fab apu01-apu24和Fab apu2.01-apu2.20中的每一个抗体均包含轻链可变区，其中框架区序列包含至少一条SEQ ID NOs:130-133和896-907中的序列，以及HVR-L1为SEQ ID NO:79，HVR-L2为SEQ ID NO:80和HVR-L3序列为对于图10A-10C、11C、16B和17B中每一个Fab所明确列举的那些序列。

在一个实施方案中，本发明的抗体包含重链可变区，其中框架区序列包含至少一条SEQ ID NOs:138-141中的序列，以及HVR H1、H2和H3序列分别为SEQ ID NO:1、27和53(克隆48-1)。类似地，在其它实施方案中，克隆48-2至48-118、克隆63-1至63-51、Fab apu01-apu24、Fab apu2.01-apu2.20和克隆apu3.01-3.11中的每一个抗体均包含重链可变区，其中框架区序列包含SEQ ID NOs:138-141的至少一条序列，以及HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3序列为对于图2A-2C、3A-3B、8A-8C、9A-9B、10A-10C、11A-11C、14A-14F、15A-15C、16A-16B、17A-17B和22中每一个克隆或Fab所明确列举的那些序列。在一个实施方案中，本发明的抗体包含轻链可变区，其中框架区序列包含至少一条SEQ ID NOs:134-137中的序列，以及HVRL1、L2和L3序列分别为SEQ ID NOs:79、80和313(Fab apu01)。类似地，在其它实施方案中，Fab apu01-apu24和Fab apu2.01-apu2.20中的每一个抗体均包含轻链可变区，其中框架区序列包含至少一条SEQ ID NOs:134-137中的序列，以及HVR-L1为SEQ ID NO:79，HVR-L2为SEQ ID NO:80和HVR-L3序列为对于图10A-10C、11C、16B和17B中每一个Fab所明确列举的那些序列。

在一个实施方案中，本发明的抗体包含重链可变区，其中框架区序列包含至少一条SEQ ID NOs:146-149中的序列，HVR H1、H2和H3序列分别为SEQ ID NO:1、27和53(克隆48-1)。类似地，在其它实施方案中，每一个克隆48-2至48-118、克隆63-1至63-51、Fabapu01-apu24、Fab apu2.01-apu2.20和克隆apu3.01-3.11中的抗体均包含重链可变区，其中框架区序列包含至少一条SEQ ID NOs:146-149中的序列，以及HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3序列为对于图2A-2C、3A-3B、8A-8C、9A-9B、10A-10C、11A-11C、14A-14F、15A-15C、16A-16B、17A-17B和22中每一个克隆或Fab所明确列举的那些序列。在一个实施方案中，本发明的抗体包含轻链可变区，其中框架区序列包含至少一条SEQ ID NOs:142-145中的序列，以及HVRL1、L2和L3序列分别为SEQ ID NOs:79、80和313(Fab apu01)。类似地，在其它实施方案中，Fab apu01-apu24和Fab apu2.01-apu2.20中的每一个抗体均包含轻链可变区，其中框架区序列包含至少一条SEQ ID NOs:142-145中的序列，以及HVR-L1为SEQ ID NO:79，HVR-L2为SEQ ID NO:80和HVR-L3序列为对于图10A-10C、11C、16B和17B中每一个Fab所明确列举的那些序列。

在一个实施方案中，本发明的抗体进行了亲和力成熟以获得期望的靶结合亲和力。在一个例子中，与K48连接的多聚泛蛋白具有高亲和力的特异性结合但与K63连接的多聚泛蛋白则具有实质上减少的亲和力的结合的本发明亲和力成熟的抗体包含在HVR-H1第29、30、33和34位氨基酸处的取代。在另一个例子中，与K48连接的多聚泛蛋白具有高亲和力的特异性结合但与K63连接的多聚泛蛋白则具有实质上减少的亲和力的结合的本发明亲和力成熟的抗体包含在HVR-H2第52和52a位氨基酸处的取代。在另一个例子中，与K48连接的多聚泛蛋白具有高亲和力的特异性结合但与K63连接的多聚泛蛋白则具有实质上减少的亲和力的结合的本发明亲和力成熟的抗体包含在HVR-H3第99、100、100a和100b位氨基酸处的取代。在另一个例子中，与K48连接的多聚泛蛋白具有高亲和力的特异性结合但与K63连接的多聚泛蛋白则具有实质上减少的亲和力的结合的本发明亲和力成熟的抗体包含在HVR-H3第95-100、100a和100b位氨基酸处的取代。在另一个例子中，与K48连接的多聚泛蛋白具有高亲和力的特异性结合但与K63连接的多聚泛蛋白则具有实质上减少的亲和力的结合的本发明亲和力成熟的抗体包含在HVR-L3第91和96位氨基酸处的取代。在另一个例子中，与K63连接的多聚泛蛋白具有高亲和力的特异性结合但与K48连接的多聚泛蛋白则具有实质上减少的亲和力的结合的本发明亲和力成熟的抗体包含在HVR-H1第29-34位氨基酸处的取代。在另一个例子中，与K63连接的多聚泛蛋白具有高亲和力的特异性结合但与K48连接的多聚泛蛋白则具有实质上减少的亲和力的结合的本发明亲和力成熟的抗体包含在HVR-H2第50、52、52a、53-56和58位氨基酸处的取代。在另一个例子中，与K63连接的多聚泛蛋白具有高亲和力的特异性结合但与K48连接的多聚泛蛋白则具有实质上减少的亲和力的结合的本发明亲和力成熟的抗体包含在HVR-H3第95-100、100a、100b和100c位氨基酸处的取代。在另一个例子中，与K63连接的多聚泛蛋白具有高亲和力的特异性结合但与K48连接的多聚泛蛋白则具有实质上减少的亲和力的结合的本发明亲和力成熟的抗体包含在HVR-L3第91-95、95a和95b位氨基酸处的取代。

在另一个例子中，与K63连接的多聚泛蛋白具有高亲和力的特异性结合但与K48连接的多聚泛蛋白则具有实质上减少的亲和力的结合的本发明亲和力成熟的抗体包含在HVR-H1第29-34位氨基酸处的取代。在另一个例子中，与K63连接的多聚泛蛋白具有高亲和力的特异性结合但与K48连接的多聚泛蛋白则具有实质上减少的亲和力的结合的本发明亲和力成熟的抗体包含在HVR-H2第50、52、54、56和58位氨基酸处的取代。在另一个例子中，K63连接的多聚泛蛋白具有高亲和力的特异性结合但与K48连接的多聚泛蛋白则具有实质上减少的亲和力的结合的本发明亲和力成熟的抗体包含在HVR-H3第95-100、100a、100b和100c位氨基酸处的取代。

在一个实施方案中，本发明的抗体包含含有SEQ ID NOs:265、281和297的序列的重链可变区。在一个实施方案中，本发明的抗体包含含有SEQ ID NOs:79、80和313的序列的轻链可变区。在一个实施方案中，本发明的抗体包含含有SEQ ID NOs:265、281和297的序列的重链可变区，以及还包含含有SEQ ID NOs:79、80和313的序列的轻链可变区。在其它实施方案中，相应于特定克隆编号的本发明的抗体包含含有对于该克隆编号如图2A-2C、3A-3B、8A-8C、9A-9B、10A-10C、11A-11C、14A-14F、15A-15C、16A-16B、17A-17B和22中所示的HVR-H1,HVR-H2和HVR-H3序列的重链可变区。在其它实施方案中，相应于特定克隆编号的本发明的抗体包含含有SEQ ID NO:79的HVR-L1序列、SEQ ID NO:80HVR-L2序列和对于该克隆编号如图10A-10C、11A-11C、16A-16B和17A-17B中所示的HVR-L3序列的轻链可变区。在其它实施方案中，相应于特定克隆编号的本发明的抗体包含含有对于该克隆编号如图2A-2C、3A-3B、8A-8C、9A-9B、10A-10C、11A-11C、14A-14F、15A-15C、16A-16B、17A-17B和22中所示的HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3序列的重链可变区，以及还包含含有SEQ ID NO:79的HVR-L1序列、SEQID NO:80HVR-L2序列和对于该克隆编号如图10A-10C、11A-11C、16A-16B和17A-17B中所示的HVR-L3序列的轻链可变区。

在一个方面中，本发明提供了一种与任一前述抗体竞争与多聚泛蛋白结合的抗体。在一个方面中，本发明提供了一种与任一前述抗体结合相同的多聚泛蛋白上抗原决定簇的抗体。

如本文中所示，本发明的抗体与具有特定赖氨酸键的分离的多聚泛蛋白特异性结合。如本文中所示，本发明的抗体还与当该多聚泛蛋白与异源蛋白连接时具有特定赖氨酸键的多聚泛蛋白特异性结合(参见如实施例3和4)。

提供了包含至少一种抗多聚泛蛋白抗体或包含至少一种编码抗多聚泛蛋白抗体的序列的多核苷酸的组合物。在某些实施方案中，该组合物可以是药物组合物。如本文中所使用的，所述组合物包含一种或多种与一种或多种多聚泛蛋白结合的抗体和/或一种或多种包含编码一种或多种与一种或多种多聚泛蛋白结合的抗体的序列的多核苷酸。这些组合物可进一步包含合适的载体，例如本领域众所周知的包括缓冲剂在内的药学上可接受的赋形剂。

还提供了分离的抗体和多核苷酸。在某些实施方案中，分离的抗体和多核苷酸是基本上纯的。

在一个实施方案中，抗多聚泛蛋白抗体是单克隆抗体。在另一个实施方案中，提供了抗多聚泛蛋白抗体的片段(如Fab、Fab’-SH和F(ab’)2片段)。可通过传统的方法例如酶消化或通过重组技术产生这些抗体片段。上述抗体片段可以是嵌合的、人源化的或人的。这些片段具有下列诊断和治疗用途。

使用噬菌体展示文库产生抗多聚泛蛋白抗体

多种用于产生可获得目的抗体的噬菌体展示文库的方法是本领域已知的。一种产生目的抗体的方法是通过使用如Lee等,J.Mol.Biol.(2004),340(5):1073-93中所描述的噬菌体抗体文库。

可通过使用组合文库来筛选具有期望活性的合成的抗体克隆从而制备本发明的抗多聚泛蛋白抗体。原则上，通过筛选含有展示融合至噬菌体外壳蛋白的抗体可变区(Fv)的不同片段的噬菌体的噬菌体文库选择合成的抗体克隆。通过针对期望抗原的亲和层析淘选上述噬菌体文库。表达能结合期望抗原的Fv片段的克隆为该抗原所吸附，并因此与文库中非结合克隆相分离。然后将结合的克隆从抗原上洗脱下，并通过额外的抗原吸附/洗脱循环进一步富集。可通过设计合适的抗原筛选方法来选择目的噬菌体克隆，然后使用来自目的噬菌体克隆的Fv序列和Kabat等,Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,第5版,NIH出版物91-3242,Bethesda MD(1991),vols.1-3中描述的合适的恒定区(Fc)序列构建全长抗多聚泛蛋白抗体克隆，从而获得任何一种本发明的抗多聚泛蛋白抗体。

抗体的抗原结合区由来自于两个可变(V)区(分别来自轻链(VL)和重链(VH))的约110个氨基酸所组成，所述两个可变区都存在3个高变环或互补决定区(CDRs)。如Winter等,Ann.Rev.Immunol.,12:433-455(1994)中所描述的，可变区可作为其中VH和VL通过短的、柔性肽共价连接的单链Fv(scFv)片段或作为其中VH和VL各自融合至恒定区并非共价相互作用的Fab片段在噬菌体上被功能性地展示。如本文中所使用的，scFv编码噬菌体克隆和Fab编码噬菌体克隆共同地被称为“Fv噬菌体克隆”或“Fv克隆”。

可通过聚合酶链反应(PCR)分别克隆VH和VL基因库并在噬菌体文库中随机重组，然后可如Winter等,Ann.Rev.Immunol.,12:433-455(1994)中所描述的搜寻抗原结合克隆。免疫来源的文库提供了针对免疫原的高亲和力抗体，无需构建杂交瘤。可选地，可克隆天然库以提供针对各种非自身以及自身抗原的单一来源的人抗体，而无需任何如Griffiths等,EMBO J,12:725-734(1993)中所描述的免疫接种。最后，还可通过从干细胞中克隆未重排的V-基因区段并使用含有随机序列的PCR引物来编码高变CDR3区并如Hoogenboom和Winter,J.Mol.Biol.,227:381-388(1992)所描述的完成体外重排，从而合成天然文库。

丝状噬菌体通过与小外壳蛋白pIII融合用于展示抗体片段。如Marks等,J.Mol.Biol.,222:581-597(1991)所描述的，抗体片段可展示为单链Fv片段，其中VH和VL区在同一多肽链上通过柔性间隔多肽连接，或如Hoogenboom等,Nucl.Acids Res.,19:4133-4137(1991)中所描述的，抗体可展示为Fab片段，其中一条链融合至pIII，另一条链则分泌到细菌宿主细胞周质中，在此通过取代某些野生型外壳蛋白，该Fab-外壳蛋白结构装配体展示在噬菌体表面上。

一般而言，编码抗体基因片段的核酸是从收获自人或动物的免疫细胞处获得的。如果期望文库偏向抗多聚泛蛋白克隆，则用多聚泛蛋白免疫接种受试者以产生抗体应答，并回收脾细胞和/或循环的B细胞或其它外周血淋巴细胞(PBLs)用于文库构建。在一个实施方案中，通过在携带有功能性人免疫球蛋白基因阵列(并缺少功能性内源抗体产生***)的转基因小鼠中产生抗人多聚泛蛋白抗体应答，使得多聚泛蛋白免疫接种引起了产生针对多聚泛蛋白的人抗体的B细胞，从而获得偏向抗人多聚泛蛋白克隆的人抗体基因片段文库。产生人抗体的转基因小鼠的产生描述于如下的第(III)(b)节中。

可通过使用合适的筛选方法来分离表达多聚泛蛋白特异性膜结合抗体的B细胞，如通过使用多聚泛蛋白亲和层析来分离细胞或用荧光染料标记多聚泛蛋白接着通过荧光激活细胞分选(FACS)来吸附细胞，从而获得额外的抗多聚泛蛋白反应性细胞群体的富集。

可选地，来自未经免疫的供体的脾细胞和/或B细胞或其它PBLs的使用提供了较佳的可能的抗体库，并且还容许使用任何其中多聚泛蛋白为非抗原性的动物物种(人或非人)构建抗体文库。对于在体外整合抗体基因的文库构建，从受试者中收获干细胞以提供编码未重排抗体基因区段的核酸。目的免疫细胞可获得自多种动物物种，如人、小鼠、大鼠、兔、luprine、犬、猫、猪、牛、马和鸟类物种等。

从目的细胞回收编码抗体可变区基因区段(包括VH和VL区段)的核酸并扩增。在重排VH和VL基因文库的情况下，可通过如Orlandi等,Proc.Natl.Acad.Sci.(USA),86:3833-3837(1989)中所描述的，通过从淋巴细胞中分离基因组DNA或mRNA，接着使用与重组VH和VL基因的5′和3′末端相匹配的引物进行聚合酶链反应(PCR)获得期望的DNA，由此使不同的V基因库得以表达。如Orlandi等(1989)以及Ward等,Nature,341:544-546(1989)中所描述的，可使用处于编码成熟的V-区的外显子5′末端的反向引物和基于J-区中的正向引物从cDNA和基因组DNA扩增V基因。然而，对于从cDNA扩增，反向引物还可基于如Jones等,Biotechnol.,9:88-89(1991)中所描述的先导外显子，以及正向引物是如Sastry等,Proc.Natl.Acad.Sci.(USA),86:5728-5732(1989)中所描述的处于恒定区中。为了使互补性最大化，可如Orlandi等(1989)或Sastry等(1989)中所描述的将简并性并入引物中。在某些实施方案中，如Marks等,J.Mol.Biol.,222:581-597(1991)的方法或Orum等,NucleicAcids Res.,21:4491-4498(1993)的方法中所描述的，通过使用靶向每一V-基因家族的PCR引物使文库多样性得以最大化，以便扩增所有可得到的存在于免疫细胞核酸样品中的VH和VL排列。为了将扩增的DNA克隆入表达载体中，如Orlandi等(1989)中所描述的，可将罕见的限制酶切位点导入PCR引物中作为在一末端的标签，或如Clackson等,Nature,352:624-628(1991)中所描述的，通过使用标记的引物进行进一步的PCR扩增。

合成重排的V基因库可在体外来源于V基因区段。大部分的人VH-基因区段已被克隆和测序(报道于Tomlinson等,J.Mol.Biol.,227:776-798(1992)中)，并被作图(报道于Matsuda等,Nature Genet.,3:88-94(1993)中)；如Hoogenboom和Winter,J.Mol.Biol.,227:381-388(1992)中所描述的，使用编码不同序列和长度的H3环的PCR引物，这些克隆的区段(包括H1和H2环的所有主要构象)可用于产生不同的VH基因库。如Barbas等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4457-4461(1992)中所描述的，也可使用所有的序列多样性都集中于单一长度的长H3环制备VH库。人Vκ和Vλ区段已被克隆和测序(报道于Williams和Winter,Eur.J.Immunol.,23:1456-1461(1993)中)并可用于制备合成的轻链库。基于不同的VH和VL折叠(fold)以及L3和H3长度的合成的V基因库会编码具相当大的结构多样性的抗体。在V-基因编码DNAs扩增后，可根据Hoogenboom和Winter,J.Mol.Biol.,227:381-388(1992)的方法在体外重排种系V-基因区段。

可以几种方式通过将VH和VL基因库组合在一起构建抗体片段库。可在不同的载体中创建每个库，并且如Hogrefe等,Gene,128:119-126(1993)中所描述的在体外重组载体，或如Waterhouse等,Nucl.Acids Res.,21:2265-2266(1993)中所描述的loxP***在体内通过组合感染重组载体。该体内重组方法利用了Fab片段的两条链的特性来克服大肠杆菌转化效率所造成的对文库大小的限制。分别克隆天然VH和VL库，一个库克隆入噬菌粒中，另一个库克隆入噬菌体载体中。然后通过噬菌体感染含噬菌粒细菌组合这两个文库，使得每个细胞都含有不同的组合并且文库大小仅受限于所存在细胞的数目(约10¹²个克隆)。这两个载体都含有体内重组信号，使得VH和VL基因在单个复制子上重组并共包装进噬菌体颗粒。这些巨大的文库提供了大量具有良好亲和力(约10^-8M的K_d ^-1)的不同抗体。

可选地，如Barbas等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88:7978-7982(1991)中所描述的，可将库顺序克隆入同一载体中，或如Clackson等,Nature,352:624-628(1991)中所描述的，通过PCR装配在一起并接着克隆。PCR装配还可用于将VH和VL DNAs与编码柔性间隔肽的DNA连接以形成单链Fv(scFv)库。在又一种技术中，如Embleton等,Nucl.Acids Res.,20:3831-3837(1992)中所描述的，“细胞中PCR装配”用于通过PCR组合淋巴细胞中的VH和VL基因，并接着克隆所连接的基因的库。

可通过任何本领域已知的技术完成文库的筛选。例如，多聚泛蛋白可用于包被吸附平板上的孔，在附着于吸附平板的宿主细胞上表达或在细胞分选中使用，或缀合至生物素供链霉抗生物素蛋白包被的珠子捕捉，或用于任何其它本领域已知的淘选噬菌体展示文库的方法中。

在适于噬菌体颗粒的至少一部分与吸附剂结合条件下，将噬菌体文库样品与固定化的多聚泛蛋白接触。一般地，选择包括pH、离子强度、温度等的条件来模拟生理状态。洗涤与固相结合噬菌体，然后如Barbas等,Proc.Natl.Acad.Sci USA,88:7978-7982(1991)中所描述的通过酸或如Marks等,J.Mol.Biol.,222:581-597(1991)中所描述的通过碱，或如在类似于Clackson等,Nature,352:624-628(1991)的抗原竞争方法的方法中通过多聚泛蛋白抗原竞争来洗脱。在单轮选择中噬菌体可富集20-1,000倍。此外，富集的噬菌体可在细菌培养物中生长并接受更多轮的选择。

选择的有效性依赖于许多因素，包括洗涤过程中的解离动力学和处于单个噬菌体上的多个抗体片段是否能同时与抗原结合。通过利用短洗涤、多价噬菌体展示和固相中高的抗原包被密度，从而具有快解离动力学(以及弱结合亲和力)的抗体能被保留。高密度并不仅仅通过多价相互作用稳定噬菌体，还有利于重新结合已解离的噬菌体。可通过利用长洗涤以及如Bass等,Proteins,8:309-314(1990)和WO 92/09690中所描述的单价噬菌体、和如Marks等,Biotechnol.,10:779-783(1992)中所描述的低的抗原包被密度展示促进选择具有慢解离动力学(以及良好的结合亲和力)的抗体。

即使对多聚泛蛋白的亲和力稍有差异，也是有可能选择不同亲和力的噬菌体抗体。然而，经选择抗体的随机突变(如在上述某些亲和力成熟技术中所进行的)可能会产生许多突变体，大多数结合抗体，而少部分具有更高亲和力。由于多聚泛蛋白有限，因此稀少的高亲和力噬菌体能够脱颖而出。为保留所有更高亲和力的突变体，可将噬菌体与过量的生物素化多聚泛蛋白温育，但生物素化多聚泛蛋白则处于比多聚泛蛋白的靶摩尔亲和常数更低的摩尔浓度的浓度。接着可通过链霉抗生物素蛋白包被的顺磁性珠子捕捉高亲和力结合的噬菌体。上述“平衡捕捉”使得抗体能根据它们的结合亲和力被选择，具有容许仅具有2倍更高的亲和力的突变体克隆与大量具有更低亲和力的噬菌体相分离的灵敏度。还可控制用于洗涤结合在固相上的噬菌体的条件以基于解离动力学进行区分。

可基于活性选择抗多聚泛蛋白克隆。在一个实施方案中，本发明提供了阻断多聚泛蛋白配体与多聚泛蛋白结合，但不阻断多聚泛蛋白配体与第二种蛋白结合的抗多聚泛蛋白抗体。相应于上述抗多聚泛蛋白抗体的Fv克隆可通过以下步骤选择：(1)由如上述B(I)(2)节所述的噬菌体文库分离抗多聚泛蛋白克隆，并任选地通过在合适的细菌宿主中培养所分离的噬菌体克隆群体从而扩增该群体；(2)分别相对于所期望的阻断和非阻断活性选择多聚泛蛋白和第二种蛋白；(3)将抗多聚泛蛋白噬菌体克隆吸附到固定化的多聚泛蛋白上；(4)使用过量的所述第二种蛋白来洗脱任何非期望的识别与第二种蛋白的结合决定区相重叠或共享有该结合决定区的多聚泛蛋白结合决定区的克隆；和(5)洗脱步骤(4)之后仍然吸附的克隆。任选地，具有期望阻断/非阻断特性的克隆可进一步通过重复一次或多次本文所描述的选择步骤得到富集。

使用常规技术易于分离并测序编码本发明的Fv克隆的DNA(如通过利用设计用来由杂交瘤或噬菌体DNA模板特异性扩增目的重链和轻链编码区的寡核苷酸引物)。一旦分离，就可将DNA置于表达载体中，然后将表达载体转染入不另外产生免疫球蛋白的宿主细胞如大肠杆菌细胞、猿COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞中，以在重组的宿主细胞中获得期望单克隆抗体的合成。用于在细菌中重组表达抗体编码DNA的综述文献包括Skerra等,Curr.Opinion in Immunol.,5:256(1993)和Pluckthun,Immunol.Revs,130:151(1992)。

可将编码本发明Fv克隆的DNA与已知的编码重链和/或轻链恒定区(如可获得自Kabat等，同上的适当的DNA序列)的DNA序列组合以形成编码全长或部分长度的重链和/或轻链的克隆。应当理解的是任何同种型的恒定区都可用于该目的，包括IgG、IgM、IgA、IgD和IgE恒定区，并且上述恒定区可获得自任何人或动物物种。一种Fv克隆来源于一种动物(如人)物种的可变区DNA，并接着被融合至另一种动物物种的恒定区DNA以形成“杂种”抗体的编码序列，全长重链和/或轻链包括在如本文中所使用的“嵌合”和“杂种”抗体的定义中。在一个实施方案中，将来源于人可变区DNA的Fv克隆融合至人恒定区DNA以形成全人全长或部分长度的重链和/或轻链的编码序列。

产生自天然(naive)文库(天然或合成的)的抗体可具有适中的亲和力(约10⁶-10⁷M^-1的K_d ^-1)，但还可如Winter等(1994),同上所描述的在体外通过构建并重选择第二文库模拟亲和力成熟。例如，在Hawkins等,J.Mol.Biol.,226:889-896(1992)的方法中或在Gram等,Proc.Natl.Acad.Sci USA,89:3576-3580(1992)的方法中，通过使用易错聚合酶(报道于Leung等,Technique,1:11-15(1989)中)可在体外随机导入突变。此外，如在经选择的单个Fv克隆及筛选更高亲和力的克隆中，利用具有携带跨越目的CDR的随机序列的引物的PCR，可通过随机突变一个或多个CDRs进行亲和力成熟。WO9607754(公开于1996年3月14日)描述了一种用于在免疫球蛋白轻链的互补决定区中诱导突变以创建轻链基因文库的方法。另一种有效的方法是如Marks等,Biotechnol.,10:779-783(1992)中所描述的，重组通过使用获得自未经免疫的供体的天然存在的V区变体库经噬菌体展示，并在几轮链改组中筛选根据更高亲和力所选择的VH或VL区。该技术使具有10^-9M范围内的亲和力的抗体和抗体片段能得以产生。

产生抗多聚泛蛋白抗体的其它方法

产生抗体和评估抗体亲和力的其它方法是本领域众所周知的，并描述于如Kohler等,Nature256:495(1975);美国专利号4,816,567;Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,pp.59-103(Academic Press,1986;Kozbor,J.Immunol.,133:3001(1984);Brodeur等,Monoclonal Antibody Production Techniques andApplications,pp.51-63(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987;Munson等,Anal.Biochem.,107:220(1980);Engels等,Agnew.Chem.Int.Ed.Engl.,28:716-734(1989);Abrahmsen等,EMBO J.,4:3901 (1985);Methods in Enzymology,vol.44(1976);Morrison等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855(1984)中。

一般方法

一般而言，本发明提供了具有其中期望部分或全部封闭一种或多种多聚泛蛋白活性的治疗多聚泛蛋白介导的疾病用途的抗多聚泛蛋白抗体。在一个实施方案中，本发明的抗多聚泛蛋白抗体用于治疗癌症。在另一个实施方案中，在此提供的抗多聚泛蛋白抗体用于治疗肌肉病症，例如上述的那些病症。在另一个实施方案中，在此提供的抗多聚泛蛋白抗体用于治疗神经***疾病，例如上述的那些疾病。在另一个实施方案中，在此提供的抗多聚泛蛋白抗体用于治疗遗传性疾病。在另一个实施方案中，在此提供的抗多聚泛蛋白抗体用于治疗免疫/炎性病症。

本发明抗多聚泛蛋白抗体的独特特性使得其尤其能用于在细胞***中区分多聚泛蛋白的不同赖氨酸连接形式，而无需借助于麻烦且昂贵的遗传操作或生物物理方法如质谱法。本发明的抗多聚泛蛋白抗体可用于在体外以及在体内鉴定特定赖氨酸连接的多聚泛蛋白的功能和活性。本发明的抗多聚泛蛋白抗体还可用于确定特定赖氨酸连接的多聚泛蛋白在疾病发展和发病机理中的作用。本发明的抗多聚泛蛋白抗体可进一步用于治疗其中一种或多种特定赖氨酸连接的多聚泛蛋白异常调节或异常功能的疾病，而不干扰对该抗多聚泛蛋白抗体而言非特异的多聚泛蛋白的正常活性。

在另一方面中，本发明的抗多聚泛蛋白抗体具有作为用于检测和分离特定赖氨酸键的多聚泛蛋白的效用，例如检测不同的细胞类型和组织中的多聚泛蛋白，包括测定多聚泛蛋白密度和在细胞群体和给定细胞中的分布，以及基于多聚泛蛋白存在或数量的细胞分选。

在又一方面中，本发明的抗多聚泛蛋白抗体用于开发具有类似于本发明受试抗体的阻断活性模式的多聚泛蛋白拮抗剂。例如，本发明的抗K48连接的多聚泛蛋白的抗体可用于测定并鉴定其它具有相同的K48连接的多聚泛蛋白结合特性和/或阻断K48连接的多聚泛蛋白介导的途径能力的抗体。类似地，本发明的抗K63连接的多聚泛蛋白抗体可用于测定并鉴定其它具有相同的K63连接的多聚泛蛋白结合特性和/或阻断K63连接的多聚泛蛋白介导的途径能力的抗体。

作为更进一步的例子，本发明的抗多聚泛蛋白抗体可用于鉴定与本文所举例说明的抗体基本上结合相同的多聚泛蛋白抗原决定簇的其它抗多聚泛蛋白抗体，所述抗原决定簇包括线性和构象表位。

本发明的抗多聚泛蛋白抗体可用于基于生理学途径的测定法，其中多聚泛蛋白涉及筛选具有一个或多个特定赖氨酸键的多聚泛蛋白的小分子拮抗剂，所述小分子拮抗剂在阻断一种或多种结合伴侣与具有那些一个或多个赖氨酸键的多聚泛蛋白结合中将具有类似的药理学效应。例如，已知K48连接的多聚泛蛋白涉及某些蛋白的靶向蛋白酶体降解(参见如Chau等,Science 243:1576-1583(1989);Finley等,Mol.Cell.Biol.14:5501-5509(1994);Flick等,Nat.Cell.Biol.6:634-641(2004))；因此通过比较一种或多种可能的小分子拮抗剂与抗K48连接的多聚泛蛋白抗体在该途径中的活性，抗K48连接的多聚泛蛋白抗体可用于筛选鉴定K48连接的多聚泛蛋白介导的靶向蛋白酶体降解的小分子拮抗剂。类似地，在另一个例子中，已知K63连接的多聚泛蛋白涉及DNA修复(参见如Pickart和Fushman,Curr.Opin.Chem.Biol.8:610-616(2004))，因此可将抗K63连接的多聚泛蛋白抗体拮抗DNA修复途径的活性与在相同的DNA修复途径中K63连接的多聚泛蛋白的一种或多种可能的小分子拮抗剂的活性相比较。类似地，在另一个例子中，已知K63连接的多聚泛蛋白涉及帕金森氏病中Lewy小体的形成(参见如Lim等,J.Neurosci.25(8):2002-9(2005))，因此可将抗K63连接的多聚泛蛋白抗体拮抗Lewy小体形成的活性与在拮抗Lewy小体形成中K63连接的多聚泛蛋白的一种或多种可能的小分子拮抗剂的活性相比较。

可使用本领域常规技术获得候选抗体，包括那些在本文中所描述的技术如杂交瘤技术和使用结合分子(binder molecules)筛选噬菌体展示文库。这些方法是本领域众所周知的。

简言之，可通过利用组合文库来筛选具有期望活性的合成的抗体克隆，制备本发明的抗多聚泛蛋白抗体。原则上，通过筛选含有展示融合至噬菌体外壳蛋白的不同的抗体可变区(Fv)片段的噬菌体的噬菌体文库，选择合成的抗体克隆。通过针对期望抗原的亲和层析淘选上述噬菌体文库。能与期望抗原结合的表达Fv片段的克隆吸附在抗原上，并因此与文库中非结合克隆相分离。然后从抗原上洗脱结合的克隆，并可通过额外的抗原吸附/洗脱循环进一步富集。可通过设计合适的抗原筛选方法来筛选目的噬菌体克隆，接着使用来自目的噬菌体克隆的Fv序列和Kabat等,Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,第5版,NIH出版物91-3242,Bethesda MD(1991),vols.1-3中所描述的合适的恒定区(Fc)序列构建全长抗多聚泛蛋白抗体克隆，从而获得任何一种本发明的抗多聚泛蛋白抗体。还参见PCT公开号WO03/102157及其中引用的文献。

在一个实施方案中，本发明的抗多聚泛蛋白抗体是单克隆抗体。还包括在本发明范围中的是本文所提供的抗多聚泛蛋白抗体的抗体片段如Fab、Fab′、Fab′-SH和F(ab′)₂片段及其变体。可通过传统方法如酶消化或可通过重组技术产生这些抗体片段。上述抗体片段可以是嵌合的、人的或人源化的。这些片段具有本文所列的实验、诊断以及治疗用途。

单克隆抗体可获得自一群基本上均质的抗体，即除有可能天然存在的少量突变之外，这一群体所包含的个体抗体是相同的。因此，修饰语“单克隆”指同一抗体的混合物的抗体特性。

可使用多种本领域已知方法制备本发明的抗多聚泛蛋白单克隆抗体，包括为Kohler等,Nature,256:495(1975)所首先描述的杂交瘤法，或可选地可通过重组DNA法(如美国专利号4,816,567)制备它们。

载体、宿主细胞和重组方法

为了重组生产本发明的抗体，分离编码它的核酸，并将其***可复制载体，用于进一步克隆（DNA扩增）或表达。可使用常规流程容易的分离编码抗体的DNA并测序（如使用能够与编码抗体重链和轻链的基因特异结合的寡核苷酸探针）。可利用许多载体。载体的选择部分取决于将要使用的宿主细胞。宿主细胞包括但不限于原核或真核（通常是哺乳动物）起源的。应当领会，任何同种型的恒定区可用于此目的，包括IgG、IgM、IgA、IgD和IgE恒定区，而且此类恒定区可以从任何人或动物物种获得。

使用原核宿主细胞生成抗体：

载体构建

可使用标准重组技术来获得编码本发明抗体多肽构件的多核苷酸序列。可从抗体生成细胞诸如杂交瘤细胞分离期望的多核苷酸序列并测序。或者，可使用核苷酸合成仪或PCR技术合成多核苷酸。一旦得到，将编码多肽的序列***能够在原核宿主中复制并表达异源多核苷酸的重组载体。为了本发明，可使用本领域可获得的且知道的许多载体。适宜载体的选择将主要取决于将要***载体的核酸的大小和将要用载体转化的具体宿主细胞。根据其功能（扩增或表达异源多核苷酸，或二者兼之）及其与它在其中驻留的具体宿主细胞的相容性，每种载体含有多种构件。载体构件通常包括但不限于复制起点、选择标志基因、启动子、核糖体结合位点(RBS)、信号序列、异源核酸***片段、和转录终止序列。

一般而言，与宿主细胞一起使用的质粒载体包含衍生自与这些宿主相容物种的复制子和控制序列。载体通常携带复制位点，以及能够在转化细胞中提供表型选择的标志序列。例如，通常用衍生自大肠杆菌物种的质粒pBR322转化大肠杆菌。pBR322包含编码氨苄青霉素(Amp)和四环素(Tet)抗性的基因，由此提供轻松鉴定转化细胞的手段。pBR322、其衍生物、或其它微生物质粒或噬菌体还可包含或经修饰而包含可被微生物生物体用于表达内源蛋白质的启动子。Carter等人，美国专利5,648,237中详细记载了用于表达特定抗体的pBR322衍生物的实例。

另外，可将包含与宿主微生物相容的复制子和控制序列的噬菌体载体用作这些宿主的转化载体。例如，可使用噬菌体诸如λGEM.TM.-11来构建可用于转化易感宿主细胞诸如大肠杆菌LE392的重组载体。

本发明的表达载体可包含两种或多种启动子-顺反子对，它们编码每一种多肽构件。启动子是位于顺反子上游（5′）的非翻译调控序列，它调控顺反子的表达。原核启动子通常分成两类，诱导型的和组成性的。诱导型启动子指响应培养条件的变化（如营养物的存在与否或温度变化）而启动受其控制的顺反子的升高水平转录的启动子。

众所周知受到多种潜在宿主细胞识别的大量启动子。通过限制酶消化切下源DNA中的启动子并将分离的启动子序列***本发明的载体，由此可将选择的启动子与编码轻链或重链的顺反子DNA可操作连接。天然启动子序列和许多异源启动子都可用于指导靶基因的扩增和/或表达。在有些实施方案中，使用异源启动子，因为与天然靶多肽启动子相比，它们通常容许所表达靶基因的更高转录和更高产量。

适用于原核宿主的启动子包括PhoA启动子、β-半乳糖苷酶和乳糖启动子***、色氨酸(trp)启动子***、和杂合启动子诸如tac或trc启动子。然而，在细菌中有功能的其它启动子（诸如其它已知的细菌或噬菌体启动子）也是合适的。它们的核苷酸序列已经发表，由此熟练工作人员能够使用提供任何所需限制位点的接头或衔接头将它们与编码靶轻链和重链的顺反子可操作连接（Siebenlist et al.,Cell 20:269(1980)）。

在本发明的一个方面，重组载体内的每个顺反子都包含指导所表达多肽穿膜转运的分泌信号序列构件。一般而言，信号序列可以是载体的构件，或者它可以是***载体的靶多肽DNA的一部分。为了本发明而选择的信号序列应当是受到宿主细胞识别并加工（即被信号肽酶切除）的信号序列。对于不识别并加工异源多肽的天然信号序列的原核宿主细胞，将信号序列用选自例如下组的原核信号序列替代：碱性磷酸酶、青霉素酶、Ipp、或热稳定的肠毒素II(STII)前导序列、LamB、PhoE、PelB、OmpA和MBP。在本发明的一个实施方案中，表达***的两个顺反子中都使用的信号序列是STII信号序列或其变体。

在另一方面，依照本发明的免疫球蛋白的生成可在宿主细胞的细胞质中发生，因此不需要在每个顺反子内存在分泌信号序列。在那点上，免疫球蛋白轻链和重链在细胞质内表达、折叠和装配而形成功能性免疫球蛋白。某些宿主菌株（如大肠杆菌trxB-菌株）提供有利于二硫键形成的细胞质条件，从而容许所表达蛋白质亚基的正确折叠和装配。Probaand Pluckthun,Gene159:203(1995)）。

本发明的抗体可使用如下表达***来生成，其中所表达多肽构件的数量比率可以受到调控，从而将分泌且正确装配的本发明抗体的产量最大化。这种调控是至少部分通过同时调控多肽构件的翻译强度而实现的。

Simmons等人，美国专利5,840,523中公开了用于调控翻译强度的一种技术。它在顺反子内利用翻译起始区(TIR)的变体。对于指定TIR，可创建具有一定范围翻译强度的一系列氨基酸或核苷酸序列变体，由此提供针对特定链的期望表达水平调节此因素的方便手段。可通过常规诱变技术导致能改变氨基酸序列的密码子变化来生成TIR变体。在某些实施方案中，核苷酸序列中的变化是沉默的。TIR中的改变可包括例如Shine-Dalgarno序列的数目或间距的改变，及信号序列中的改变。用于生成突变型信号序列的一种方法是在编码序列的开端生成不改变信号序列氨基酸序列的“密码子库”（即变化是沉默的）。这可通过改变每个密码子的第三个核苷酸位置来实现；另外，有些氨基酸，诸如亮氨酸、丝氨酸、和精氨酸，具有多种第一个和第二个位置，这可在建库中增加复杂性。Yansura et al.,METHODS:ACompanion to Methods in Enzymol.4:151-158(1992)中详细记载了这种诱变方法。

在一个实施方案中，对于载体中的每个顺反子，生成具有一定范围TIR强度的一组载体。这个有限集合提供了每条链的表达水平以及期望抗体产物的产量在各种TIR强度组合下的比较。可通过量化报道基因的表达水平来测定TIR强度，Simmons等人，美国专利5,840,523中有详细描述。根据翻译强度的比较，选择期望的个别TIR在本发明的表达载体构建物中进行组合。

适于表达本发明抗体的原核宿主细胞包括古细菌（Archaebacteria）和真细菌（Eubacteria），诸如革兰氏阴性或革兰氏阳性生物体。有用细菌的实例包括埃希氏菌属（Escherichia）（如大肠埃希氏菌E.coli）、芽孢杆菌属（Bacillus）（如枯草芽孢杆菌B.subtilis）、肠杆菌属（Enterobacteria）、假单胞菌属（Pseudomonas）（如铜绿假单胞菌P.aeruginosa）物种、鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）、粘质沙雷氏菌（Serratia marcescans）、克雷伯氏菌属（Klebsiella）、变形菌属（Proteus）、志贺氏菌属（Shigella）、根瘤菌属（Rhizobium）、透明颤菌属（Vitreoscilla）、或副球菌属（Paracoccus）。在一个实施方案中，使用革兰氏阴性细胞。在一个实施方案中，使用大肠杆菌细胞作为本发明的宿主。大肠杆菌菌株的实例包括菌株W3110（Bachmann,Cellular andMolecular Biology，第2卷，Washington,D.C.，美国微生物学学会，1987，第1190-1219页；ATCC保藏号27,325）及其衍生物，包括具有基因型W3110ΔfhuA(ΔtonA)ptr3lac Iq lacL8ΔompTΔ(nmpc-fepE)degP41 kanR的菌株33D3（美国专利号5,639,635）。其它菌株及其衍生物，诸如大肠杆菌294（ATCC 31,446）、大肠杆菌B、大肠杆菌λ1776（ATCC 31,537）和大肠杆菌RV308（ATCC 31,608）也是合适的。这些实例只是例示而非限制。本领域知道用于构建具有指定基因型的任何上述细菌衍生物的方法，参见例如Bass et al.,Proteins8:309-314(1990)。通常必需考虑复制子在细菌细胞中的可复制性来选择适宜的细菌。例如，在使用众所周知的质粒诸如pBR322、pBR325、pACYC177或pKN410来提供复制子时，大肠杆菌、沙雷氏菌属、或沙门氏菌属物种可能适于用作宿主。通常，宿主细胞应当分泌最小量的蛋白水解酶，而且可能希望在细胞培养中掺入额外的蛋白酶抑制剂。

抗体生成

用上述表达载体转化宿主细胞，并在为了诱导启动子、选择转化子或扩增编码期望序列的基因而适当改动的常规营养培养基中进行培养。

转化即将DNA导入原核宿主，使得DNA能够进行复制，或是作为染色体外元件或是通过染色体成分。根据所用宿主细胞，使用适于这些细胞的标准技术进行转化。采用氯化钙的钙处理通常用于具有坚固细胞壁屏障的细菌细胞。另一种转化方法采用聚乙二醇/DMSO。使用的还有一种技术是电穿孔。

在本领域知道的且适于培养选定宿主细胞的培养基中培养用于生成本发明多肽的原核细胞。合适培养基的实例包括添加了必需营养补充物的LB培养基(Luria broth)。在有些实施方案中，培养基还含有根据表达载体的构建而选择的选择剂，以选择性容许包含表达载体的原核细胞生长。例如，向用于培养表达氨苄青霉素抗性基因的细胞的培养基中添加氨苄青霉素。

除了碳、氮、和无机磷酸盐来源以外，还可含有适当浓度的任何必需补充物，或是单独加入或是作为与另一种补充物或培养基的混合物，诸如复合氮源。任选的是，培养基可含有一种或多种选自下组的还原剂：谷胱甘肽、半胱氨酸、胱胺、巯基乙酸盐/酯、二硫赤藓糖醇和二硫苏糖醇。

在合适的温度培养原核宿主细胞。例如，对于培养大肠杆菌，进行培养的温度范围包括但不限于约20℃至约39℃、约25℃至约37℃、和约30℃。主要取决于宿主生物体，培养基的pH可以是范围为约5至约9的任何pH。对于大肠杆菌，pH可以是约6.8至约7.4、或约7.0。

如果本发明的表达载体中使用诱导型启动子，那么在适于激活启动子的条件下诱导蛋白质表达。在本发明的一个方面，使用PhoA启动子来控制多肽的转录。因此，为了诱导，在磷酸盐限制培养基中培养经过转化的宿主细胞。在一个实施方案中，磷酸盐限制培养基是C.R.A.P培养基（参见例如Simmons et al.,J.Immunol.Methods263:133-147(2002)）。根据所采用的载体构建物，可采用多种其它诱导物，正如本领域所知道的。

在一个实施方案中，所表达的本发明多肽分泌到宿主细胞的周质中并从中回收。蛋白质回收通常牵涉破坏微生物，通常通过诸如渗压震扰(osmotic shock)、超声处理或裂解等手段。一旦细胞遭到破坏，可通过离心或过滤清除细胞碎片或整个细胞。可以通过例如亲和树脂层析进一步纯化蛋白质。或者，蛋白质可能转运到培养液中并从中分离。可从培养液清除细胞，并将培养物上清液过滤和浓缩，用于进一步纯化所生成蛋白质。可使用普遍知道的方法诸如聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)和Western印迹分析进一步分离和鉴定所表达蛋白质。

在本发明的一个方面，通过发酵过程大量进行抗体生产。多种大规模补料-分批发酵流程可用于生产重组蛋白。大规模发酵具有至少1000升的容量，例如约1,000至100,000升的容量。这些发酵罐使用搅拌器叶轮来分配氧和养分，尤其是葡萄糖（常用的碳源/能源）。小规模发酵通常指在体积容量不超过约100升的发酵罐中进行的发酵，范围可以是约1升至约100升。

在发酵过程中，通常在将细胞在合适条件下培养至期望密度（如OD550约180-220，在此阶段细胞处于早期稳定期）后启动蛋白质表达的诱导。根据所采用的载体构建物，可使用多种诱导物，正如本领域知道的和上文描述的。可在诱导前将细胞培养更短的时间。通常将细胞诱导约12-50小时，但是可使用更长或更短的诱导时间。

为了提高本发明多肽的产量和质量，可修改多项发酵条件。例如，为了改善所分泌抗体多肽的正确装配和折叠，可使用过度表达伴侣蛋白诸如Dsb蛋白（DsbA、DsbB、DsbC、DsbD和/或DsbG）或FkpA（具有伴侣活性的一种肽基脯氨酰-顺式,反式-异构酶）的额外载体来共转化宿主原核细胞。已经证明伴侣蛋白促进在细菌宿主细胞中生成的异源蛋白质的正确折叠和溶解度。Chen et al.,J.Biol.Chem.274:19601-19605(1999);Georgiou等人，美国专利6,083,715;Georgiou等人，美国专利6,027,888;Bothmann and Pluckthun,J.Biol.Chem.275:17100-17105(2000);Ramm and Pluckthun,J.Biol.Chem.275:17106-17113(2000);Arie et al.,Mol.Microbiol.39:199-210(2001)）。

为了将所表达异源蛋白质（尤其是对蛋白水解敏感的异源蛋白质）的蛋白水解降至最低，可将蛋白水解酶缺陷的某些宿主菌株用于本发明。例如，可修饰宿主细胞菌株，在编码已知细菌蛋白酶的基因中进行遗传突变，诸如蛋白酶III、OmpT、DegP、Tsp、蛋白酶I、蛋白酶Mi、蛋白酶V、蛋白酶VI及其组合。可以获得有些大肠杆菌蛋白酶缺陷菌株，参见例如Joly et al.,(1998)见上文;Georgiou等人，美国专利5,264,365;Georgiou等人，美国专利5,508,192;Hara et al.,Microbial Drug Resistance2:63-72(1996)。

在一个实施方案中，在本发明的表达***中使用蛋白水解酶缺陷且经过过度表达一种或多种伴侣蛋白的质粒转化的大肠杆菌菌株作为宿主细胞。

抗体纯化

在一个实施方案中，进一步纯化本文中生成的抗体蛋白质以获得基本上同质的制品，用于进一步的测定和使用。可采用本领域知道的标准蛋白质纯化方法。下面的流程是合适纯化流程的例示：免疫亲和或离子交换柱上的分馏、乙醇沉淀、反相HPLC、硅土或阳离子交换树脂诸如DEAE上的层析、层析聚焦、SDS-PAGE、硫酸铵沉淀、和使用例如Sephadex G-75的凝胶过滤。

在一个方面，将固定在固相上的蛋白A用于本发明抗体产物的免疫亲和纯化。蛋白A是来自金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureas）的41kD细胞壁蛋白质，它以高亲和力结合抗体Fc区。Lindmark et al.,J.Immunol.Meth.62:1-13(1983)）。蛋白A固定其上的固相可以是具有玻璃或石英表面的柱子，或者可控孔径玻璃柱或硅酸柱。在有些应用中，柱子以诸如甘油等试剂包被，用以有可能防止污染物的非特异粘附。

作为纯化的第一步，可以将衍生自如上所述细胞培养物的制备物施加到蛋白A固定化固相上，使得目的抗体特异结合蛋白A。然后清洗固相以清除与固相非特异结合的污染物。最后通过洗脱从固相回收目的抗体。

使用真核宿主细胞生成抗体：

载体构件通常包括但不限于如下一种或多种：信号序列、复制起点、一种或多种标志基因、增强子元件、启动子、和转录终止序列。

(i)信号序列构件

在真核宿主细胞中使用的载体还可在目的成熟蛋白质或多肽的N端包含信号序列或具有特异切割位点的其它多肽。一般选择受到宿主细胞识别并加工（即被信号肽酶切除）的异源信号序列。在哺乳动物细胞表达中，可利用哺乳动物信号序列以及病毒分泌前导，例如单纯疱疹病毒gD信号。

将这些前体区的DNA连接到编码抗体的DNA的读码框中。

(ii)复制起点

通常，哺乳动物表达载体不需要复制起点构件。例如，SV40起点通常可能只因包含早期启动子才使用。

(iii)选择基因构件

表达和克隆载体可包含选择基因，也称为选择标志。典型的选择基因编码如下蛋白质：(a)赋予对抗生素或其它毒素的抗性，如氨苄青霉素、新霉素、甲氨蝶呤或四环素；(b)补足相应的营养缺陷；或(c)提供不能从复合培养基获得的关键营养物。

选择方案的一个实例利用药物来阻滞宿主细胞的生长。经异源基因成功转化的那些细胞生成赋予药物抗性的蛋白质，因而幸免于选择方案。此类显性选择的实例使用药物新霉素、霉酚酸和潮霉素。

适于哺乳动物细胞的选择标志的另一个实例是能够鉴定有能力摄取抗体核酸的细胞的选择标志，诸如DHFR、胸苷激酶、金属硫蛋白I和II（例如灵长类金属硫蛋白基因）、腺苷脱氨酶、鸟氨酸脱羧酶等。

例如，可以首先通过将所有转化子在含有甲氨蝶呤（Mtx，DHFR的一种竞争性拮抗剂）的培养基中进行培养来鉴定经DHFR选择基因转化的细胞。在采用野生型DHFR时，适宜的宿主细胞包括例如DHFR活性缺陷的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系（如ATCC CRL-9096）。

或者，可通过在含有针对选择标志的选择剂诸如氨基糖苷抗生素如卡那霉素、新霉素或G418的培养基中培养细胞来选择经编码抗体、野生型DHFR蛋白、和另一种选择标志诸如氨基糖苷3′-磷酸转移酶(APH)的DNA序列转化或共转化的宿主细胞（特别是包含内源DHFR的野生型宿主）。参见美国专利4,965,199。

(iv)启动子构件

表达和克隆载体通常包含受到宿主生物体识别的启动子，且与编码感兴趣多肽（例如抗体）的核酸可操作连接。已知真核细胞的启动子序列。事实上，所有真核基因都具有富含AT区，它位于起始转录的位点上游约25至30个碱基处。在许多基因的转录起点上游70至80个碱基处发现的另一种序列是CNCAAT区，其中N可以是任何核苷酸。在大多数真核基因的3′端是AATAAA序列，它可能是向编码序列的3′端添加聚腺苷酸(polyA)尾的信号。所有这些序列合适的***真核表达载体中。

在哺乳动物宿主细胞中由载体转录抗体多肽可以受到例如从病毒（诸如多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒（诸如2型腺病毒）、牛***瘤病毒、禽类肉瘤病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒、乙肝病毒、和猿猴病毒40(SV40)）基因组获得的、来自异源哺乳动物启动子（如肌动蛋白启动子或免疫球蛋白启动子）的、或来自热休克启动子的启动子的控制，倘若这些启动子与宿主细胞***相容的话。

方便的以SV40限制性片段的形式获得SV40病毒的早期和晚期启动子，该片段还包含SV40病毒复制起点。方便的以HindIII E限制性片段的形式获得人巨细胞病毒的立即早期启动子。美国专利4,419,446中公开了使用牛***瘤病毒作为载体在哺乳动物宿主中表达DNA的***。美国专利4,601,978中记载了该***的一种修改。关于在小鼠细胞中在来自单纯疱疹病毒的胸苷激酶启动子的控制下表达人β-干扰素cDNA还可参见Reyes et al.,Nature297:598-601(1982)。或者，可使用劳氏肉瘤病毒长末端重复序列作为启动子。

(v)增强子元件构件

常常可以通过在载体中***增强子序列来提高高等真核细胞对编码本发明抗体多肽的DNA的转录。现在知道来自哺乳动物基因（球蛋白、弹性蛋白酶、清蛋白、α-胎蛋白和胰岛素）的许多增强子序列。然而，通常使用来自真核细胞病毒的增强子。实例包括SV40复制起点晚期侧的增强子（bp 100-270）、巨细胞病毒早期启动子增强子、多瘤病毒复制起点晚期侧的增强子、和腺病毒增强子。关于激活真核启动子的增强元件还可参见Yaniv,Nature 297:17-18(1982)。增强子可剪接到载体中，位于抗体多肽编码序列的5′或3′位置，但是一般位于启动子的5′位点。

(vi)转录终止构件

在真核宿主细胞中使用的表达载体通常还包含终止转录和稳定mRNA所必需的序列。此类序列通常可从真核或病毒DNA或cDNA非翻译区的5′端和偶尔的3′端获得。这些区域包含在编码抗体的mRNA的非翻译区中转录成聚腺苷酸化片段的核苷酸区段。一种有用的转录终止构件是牛生长激素聚腺苷酸化区。参见WO94/11026及其中公开的表达载体。

(vii)宿主细胞的选择和转化

适于克隆或表达本文载体中的DNA的宿主细胞包括本文描述的高等真核细胞，包括脊椎动物宿主细胞。脊椎动物细胞在培养（组织培养）中的繁殖已经成为常规流程。有用哺乳动物宿主细胞系的实例有经SV40转化的猴肾CV1系（COS-7，ATCC CRL1651）、人胚肾系（293细胞或为悬浮培养而亚克隆的293细胞，Graham et al.,J.Gen.Virol.36:59(1977)）、幼仓鼠肾细胞（BHK，ATCC CCL10）、中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR（CHO，Urlaub et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA77:4216(1980)）、小鼠塞托利(Sertoli)细胞（TM4，Mather,Biol.Reprod.23:243-251(1980)）、猴肾细胞（CV1，ATCC CCL70）、非洲绿猴肾细胞（VERO-76，ATCC CRL1587）、人***细胞（HELA，ATCC CCL 2）、犬肾细胞（MDCK，ATCC CCL34）、牛鼠(buffalo rat)肝细胞（BRL 3A，ATCC CRL 1442）、人肺细胞（W138，ATCC CCL 75）、人肝细胞（Hep G2，HB 8065）、小鼠乳瘤（MMT 060562，ATCC CCL 51）、TRI细胞（Mather et al.,Annals N.Y.Acad.Sci.383:44-68(1982)）、MRC 5细胞、FS4细胞和人肝细胞瘤(hepatoma)系（Hep G2）。

为了生成抗体，用上文所述表达或克隆载体转化宿主细胞，并在为了诱导启动子、选择转化子或扩增编码期望序列的基因而适当改动的常规营养培养基中进行培养。

(viii)宿主细胞的培养

可在多种培养基中培养用于生成本发明抗体的宿主细胞。商品化培养基诸如Ham氏F10（Sigma）、极限必需培养基（MEM，Sigma）、RPMI-1640（Sigma）、和Dulbecco氏修改Eagle氏培养基（DMEM，Sigma）适于培养宿主细胞。另外，可使用下列文献中记载的任何培养基作为宿主细胞的培养基：Ham et al.,Meth.Enz.58:44(1979);Barnes et al.,Anal.Biochem.102:255(1980);美国专利4,767,704;4,657,866;4,927,762;4,560,655;5,122,469;WO 90/03430;WO 87/00195;或美国专利复审30,985。任何这些培养基可根据需要补充激素和/或其它生长因子（诸如胰岛素、运铁蛋白或表皮生长因子）、盐（诸如氯化钠、钙、镁和磷酸盐）、缓冲剂（诸如HEPES）、核苷酸（诸如腺苷和胸苷）、抗生素（诸如GENTAMYCIN^TM药物）、痕量元素（定义为通常以微摩尔范围的终浓度存在的无机化合物）、和葡萄糖或等效能源。还可以适宜浓度含有本领域技术人员知道的任何其它必需补充物。培养条件诸如温度、pH等即为表达而选择的宿主细胞先前所用的，这对于普通技术人员是显然的。

(ix)抗体的纯化

在使用重组技术时，可在细胞内生成抗体，或者直接分泌到培养基中。如果在细胞内生成抗体，那么首先一般通过例如离心或超滤清除微粒碎片，或是宿主细胞或是裂解片段。如果抗体分泌到培养基中，那么通常首先使用商品化蛋白质浓缩滤器（例如Amicon或Millipore Pellicon超滤单元）浓缩来自这些表达***的上清液。可在任何上述步骤中包括蛋白酶抑制剂诸如PMSF以抑制蛋白水解，而且可包括抗生素以防止外来污染物的生长。

可使用例如羟磷灰石层析、凝胶电泳、透析和亲和层析（一般可接受的纯化技术是亲和层析）来纯化从细胞制备的抗体组合物。亲和试剂诸如蛋白A作为亲和配体的适宜性取决于抗体中存在的任何免疫球蛋白Fc结构域的种类和同种型。蛋白A可用于纯化基于人γ1、γ2、或γ4重链的抗体（Lindmark et al.,J.Immunol.Meth.62:1-13(1983)）。蛋白G推荐用于所有小鼠同种型和人γ3（Guss et al.,EMBO J.5:1567-1575(1986)）。亲和配体所附着的基质最常用的是琼脂糖，但是可使用其它基质。物理稳定的基质诸如可控孔径玻璃或聚(苯乙烯二乙烯)苯能获得比琼脂糖更快的流速和更短的加工时间。若抗体包含CH3结构域，则可使用Bakerbond ABX^TM树脂（J.T.Baker，Phillipsburg，NJ）进行纯化。根据待回收的抗体，也可使用其它蛋白质纯化技术诸如离子交换柱上的分馏、乙醇沉淀、反相HPLC、硅土上的层析、肝素SEPHAROSE^TM上的层析、阴离子或阳离子交换树脂（诸如聚天冬氨酸柱）上的层析、层析聚焦、SDS-PAGE和硫酸铵沉淀。

在任何初步纯化步骤之后，可将含有目的抗体和污染物的混合物在必要时进行进一步的纯化步骤，例如低pH疏水相互作用层析，使用pH约2.5-4.5的洗脱缓冲液，一般在低盐浓度（如约0-0.25M盐）进行。

应当注意，一般而言，用于制备供研究、测试和临床使用的抗体的技术和方法是本领域已完善建立的，与上文是一致的和/或本领域技术人员认为对于特定的感兴趣抗体是适宜的。

活性测定法

可通过本领域知道的多种测定法对本发明的抗体鉴定它们的物理/化学特性和生物学功能。

可通过一系列测定法进一步表征纯化的抗体，包括但不限于N端测序、氨基酸分析、非变性大小排阻高压液相层析(HPLC)、质谱、离子交换层析和木瓜蛋白酶消化。

在必要时，对抗体分析它们的生物学活性。在有些实施方案中，对本发明的抗体测试它们的抗原结合活性。本领域知道的且可用于本文的抗原结合测定法包括但不限于使用诸如Western印迹、放射免疫测定法、ELISA（酶联免疫吸附测定法）、“三明治”免疫测定法、免疫沉淀测定法、荧光免疫测定法和蛋白A免疫测定法等技术的任何直接或竞争性结合测定法。

在一个实施方案中，本发明设想了具有一些但非所有效应器功能的改良抗体，这使得它在抗体体内半衰期是重要的但某些效应物功能（诸如补体和ADCC）是不必要的或有害的许多应用中成为期望的候选物。在某些实施方案中，测量抗体的Fc活性以确保只保留了期望的特性。可进行体外和/或体内细胞毒性测定法以确认CDC和/或ADCC活性的降低/消减。例如，可进行Fc受体(FcR)结合测定法以确认抗体缺乏FcγR结合（因此有可能缺乏ADCC活性）但保留FcRn结合能力。介导ADCC的主要细胞，NK细胞，只表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。Ravetch and Kinet,Annu.Rev.Immunol.9:457-92(1991)第464页表3总结了造血细胞上的FcR表达。美国专利5,500,362或5,821,337中记载了用于评估目的分子的ADCC活性的体外测定法的实例。可用于此类测定法的效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。或者/另外，可在体内评估目的分子的ADCC活性，如在动物模型中，诸如Clynes et al.,PNAS(USA)95:652-656(1998)中所公开的。还可进行C1q结合测定法以确认抗体不能结合C1q且因此缺乏CDC活性。为了评估补体激活，可进行CDC测定法，例如如Gazzano-Santoro et al.,J.Immunol.Methods202:163(1996)中所述。还可使用本领域知道的方法进行FcRn结合和体内清除/半衰期测定。

抗体片段

本发明涵盖抗体片段。在某些情况中，使用抗体片段有优势，而不是完整抗体。片段的较小尺寸容许快速清除，而且可导致更易于接近实体瘤。

已经开发了用于生成抗体片段的多种技术。传统上，通过蛋白水解消化完整抗体来衍生这些片段(参见例如Morimoto et al.,Journal of Biochemical and BiophysicalMethods24:107-117(1992);Brennan et al.,Science229:81(1985))。然而，现在可直接由重组宿主细胞生成这些片段。Fab、Fv和scFv抗体片段都可在大肠杆菌中表达及由大肠杆菌分泌，如此容许容易的生成大量的这些片段。可从上文讨论的噬菌体抗体库中分离抗体片段。或者，可直接从大肠杆菌回收Fab′-SH片段并化学偶联以形成F(ab′)2片段(Carter etal.,Bio/Technology10:163-167(1992))。依照另一种方法，可直接从重组宿主细胞培养物分离F(ab′)2片段。包含补救受体结合表位残基、具有延长的体内半衰期的Fab和F(ab′)2片段记载于美国专利No.5,869,046。用于生成抗体片段的其它技术对于熟练从业人员将是显而易见的。在其它实施方案中，选择的抗体是单链Fv片段(scFv)。参见WO 93/16185;美国专利No.5,571,894;及5,587,458。Fv和sFv是具有完整结合位点、缺少恒定区的唯一类型；如此，它们适于在体内使用时降低非特异性结合。可构建sFv融合蛋白以生成效应器蛋白质在sFv的氨基或羧基末端的融合。参见Antibody Engineering,Borrebaeck编,supra。抗体片段还可以是“线性抗体”，例如如美国专利No.5,641,870中所记载的。此类线性抗体片段可以是单特异性的或双特异性的。

人源化抗体

本发明涵盖人源化抗体。本领域知道用于人源化非人抗体的多种方法。例如，人源化抗体可具有一个或多个从非人来源引入的氨基酸残基。这些非人氨基酸残基常常称为“输入”残基，它们通常取自“输入”可变区。基本上可遵循Winter及其同事的方法进行人源化（Jones et al.,Nature321:522-525(1986);Riechmann et al.,Nature332:323-327(1988);Verhoeyen et al.,Science 239:1534-1536(1988)），即用非人高变区序列替代人抗体的对应序列。因此，此类“人源化”抗体是嵌合抗体（美国专利4,816,567），其中显著少于完整的人可变区用非人物种的相应序列替代。在实践中，人源化抗体通常是如下人抗体，其中有些高变区残基和可能的有些FR残基用啮齿类抗体类似位点的残基替代。

用于制备人源化抗体的人轻链和重链可变区的选择对于降低抗原性可能是非常重要的。依照所谓的“最适(best-fit)”方法，用啮齿类抗体的可变区序列对已知人可变区序列的整个文库进行筛选。然后选择与啮齿类最接近的人序列作为人源化抗体的人框架（Sims et al.,J.Immunol.151:2296(1993);Chothia et al.,J.Mol.Biol.196:901(1987)）。另一种方法使用由特定轻链或重链亚类(subgroup)的所有人抗体的共有序列衍生的特定框架。相同框架可用于几种不同的人源化抗体（Carter et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:4285(1992);Presta et al.,J.Immunol.151:2623(1993)）。

一般进一步希望抗体在人源化后保留对抗原的高亲和力和其它有利的生物学特性。为了达到此目的，依照一种方法，通过使用亲本序列和人源化序列的三维模型分析亲本序列和各种概念性人源化产物的过程来制备人源化抗体。通常可获得免疫球蛋白三维模型，这是本领域技术人员所熟悉的。还可获得图解和显示所选候选免疫球蛋白序列的可能三维构象结构的计算机程序。通过检查这些显示图像能分析残基在候选免疫球蛋白序列发挥功能中的可能作用，即分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基。这样，可以从受体序列和输入序列中选出FR残基并组合，从而得到期望的抗体特征，诸如对靶抗原的亲和力升高。一般而言，高变区残基直接且最实质的牵涉对抗原结合的影响。

人抗体

本发明的人抗多聚泛蛋白抗体可以通过如上所述联合选自人衍生噬菌体展示库的Fv克隆可变域序列与已知的人恒定域序列来构建。或者，可以通过杂交瘤方法来生成本发明的人单克隆抗多聚泛蛋白抗体。用于生成人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系已有记载，例如Kozbor J.Immunol.,133:3001(1984);Brodeur et al.,Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,pp.51-63(MarcelDekker,Inc.,New York,1987);及Boerner et al.,J.Immunol.,147:86(1991).

例如，现在有可能生成在缺乏内源免疫球蛋白生成的情况下能够在免疫后生成人抗体完整全集的转基因动物（例如小鼠）。例如，已经记载了嵌合和种系突变小鼠中抗体重链连接区(JH)基因的纯合删除导致内源抗体生成的完全抑制。在此类种系突变小鼠中转移大量人种系免疫球蛋白基因将导致在抗原攻击后生成人抗体。参见例如Jakobovits etal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:2551(1993);Jakobovits et al.,Nature362:255-258(1993);Bruggermann et al.,Year in Immunol.7:33(1993)。

基因改组也可用于在体外自非人（例如啮齿类）抗体衍生人抗体，其中人抗体具有与起始非人抗体相似的亲和力和特异性。依照此方法，它也称为“表位印记”(epitopeimprinting)，如上所述通过噬菌体展示技术得到的非人抗体片段的重链或轻链可变区用人V结构域基因全集替换，产生非人链-人链scFv或Fab嵌合物群。用抗原进行的选择导致非人链/人链嵌合scFv或Fab的分离，其中人链在一级噬菌体展示克隆中消除相应的非人链后恢复了抗原结合位点，即表位决定（印记，imprint）人链配偶体的选择。在重复该过程以替换剩余非人链时，得到人抗体（参见PCT WO93/06213，公开于1993年4月1日）。与传统的通过CDR移植进行的非人抗体的人源化不同，此技术提供完全人的抗体，它们不含非人起源的FR架或CDR残基。

双特异性抗体

双特异性抗体指对至少两种不同抗原具有结合特异性的单克隆抗体。在某些实施方案中，双特异性抗体是人抗体或人源化抗体。在某些实施方案中，结合特异性之一针对包含特定赖氨酸连接的多聚泛蛋白，结合特异性之另一针对任何其它抗原。在某些实施方案中，双特异性抗体可结合具有不同赖氨酸连接的两种不同多聚泛蛋白。可将双特异性抗体制备成全长抗体或抗体片段（例如F(ab′)₂双特异性抗体）。

用于构建双特异性抗体的方法是本领域已知的。传统的是，双特异性抗体的重组生产基于两对免疫球蛋白重链-轻链的共表达，其中两种重链具有不同的特异性(Millstein and Cuello,Nature305:537(1983))。由于免疫球蛋白重链和轻链的随机分配，这些杂交瘤（四源杂交瘤(quadroma)）生成10种不同抗体分子的潜在混合物，其中只有一种具有正确的双特异性结构。通常通过亲和层析步骤进行的正确分子的纯化相当麻烦且产物产量低。类似的规程披露于1993年5月13日公开的WO 93/08829及Traunecker et al.,EMBO J.10:3655(1991)。

依照一种不同的实施方案，将具有期望结合特异性（抗体-抗原结合位点）的抗体可变域与免疫球蛋白恒定域序列融合。例如，与包含至少部分铰链、CH2和CH3区的免疫球蛋白重链恒定域进行融合。在某些实施方案中，在至少一种融合物中存在包含轻链结合所必需的位点的第一重链恒定区(CH1)。将编码免疫球蛋白重链融合物和，在需要时，免疫球蛋白轻链的DNA***分开的表达载体，并共转染到合适的宿主生物体中。在用于构建的三种多肽链比例不等时提供最佳产量的实施方案中，这为调整三种多肽片段的相互比例提供了极大的灵活性。然而，在至少两种多肽链以相同比例表达导致高产量时或在该比例没有特别意义时，有可能将两种或所有三种多肽链的编码序列***一个表达载体。

在该方法的一个实施方案中，双特异性抗体由一个臂上具有第一结合特异性的杂合免疫球蛋白重链，和另一个臂上的杂合免疫球蛋白重链-轻链对（提供第二结合特异性）构成。由于免疫球蛋白轻链仅在半个双特异性分子中的存在提供了便利的分离途径，因此发现这种不对称结构便于将期望的双特异性复合物与不想要的免疫球蛋白链组合分开。该方法披露于WO 94/04690。关于生成双特异性抗体的进一步详情参见例如Suresh et al.,Methods in Enzymology121:210(1986)。

依照另一种方法，可改造一对抗体分子间的界面，以将从重组细胞培养物回收的异二聚体的百分比最大化。界面包含至少部分抗体恒定域CH3结构域。在该方法中，将第一抗体分子界面的一个或多个小氨基酸侧链用较大侧链（例如酪氨酸或色氨酸）替换。通过将大氨基酸侧链用较小氨基酸侧链（例如丙氨酸或苏氨酸）替换，在第二抗体分子的界面上产生与大侧链相同或相似大小的补偿性“空腔”。这提供了较之其它不想要的终产物诸如同二聚体提高异二聚体产量的机制。

双特异性抗体包括交联或“异源偶联”抗体。例如，异源偶联物中的一种抗体可与亲合素偶联，另一种抗体与生物素偶联。例如，此类抗体已经建议用于将免疫***细胞靶向不想要的细胞(美国专利No.4,676,980)，及用于治疗HIV感染(WO 91/00360,WO 92/00373和EP03089)。可使用任何便利的交联方法来制备异源偶联抗体。合适的交联剂是本领域众所周知的，连同许多交联技术一起披露于美国专利No.4,676,980。

文献中还记载了由抗体片段生成双特异性抗体的技术。例如，可使用化学连接来制备双特异性抗体。Brennan et al.,Science229:81(1985)记载了通过蛋白水解切割完整抗体以生成F(ab′)2片段的规程。将这些片段在存在二硫醇络合剂***的情况下还原，以稳定邻近的二硫醇并防止分子间二硫键的形成。然后将产生的Fab’片段转变为硫代硝基苯甲酸酯(TNB)衍生物。然后将Fab′-TNB衍生物之一通过巯基乙胺的还原重新恢复成Fab′-硫醇，并与等摩尔量的另一种Fab′-TNB衍生物混合，以形成双特异性抗体。产生的双特异性抗体可用作酶的选择性固定化试剂。

最新的进展便于从大肠杆菌直接回收Fab′-SH片段，这些片段可化学偶联以形成双特异性抗体。Shalaby et al.,J.Exp.Med.175:217-225(1992)记载了完全人源化的双特异性抗体F(ab′)2分子的生成。由大肠杆菌分开分泌每种Fab′片段，并在体外进行定向化学偶联以形成双特异性抗体。如此形成的双特异性抗体能够结合过表达HER2受体的细胞和正常人T细胞，以及触发人细胞毒性淋巴细胞针对人乳瘤靶物的溶解活性。

还记载了从重组细胞培养物直接生成和分离双特异性抗体片段的多种技术。例如，已使用亮氨酸拉链生成双特异性抗体。Kostelny et al.,J.Immunol.148(5):1547-1553(1992)。将来自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉链肽通过基因融合与两种不同抗体的Fab′部分连接。抗体同二聚体在铰链区还原以形成单体，然后重新氧化以形成抗体异二聚体。这种方法也可用于生成抗体同二聚体。Hollinger et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448(1993)记载的“双抗体”技术提供了构建双特异性抗体片段的替代机制。该片段包含通过接头相连的重链可变域(VH)和轻链可变域(VL)，所述接头太短使得同一条链上的两个结构域之间不能配对。因此，迫使一个片段上的VH和VL结构域与另一个片段上的互补VL和VH结构域配对，由此形成两个抗原结合位点。还报道了通过使用单链Fv(sFv)二聚体构建双特异性抗体片段的另一种策略。参见Gruber et al.,J.Immunol.152:5368(1994)。

设想了具有超过两个效价的抗体。例如，可制备三特异性抗体。Tutt et al.,J.Immunol.147:60(1991)。

多价抗体

多价抗体可以比二价抗体更快的受到表达该抗体所结合抗原的细胞的内在化（和/或异化）。本发明的抗体可以是可容易的通过编码抗体多肽链的核酸的重组表达而生成的、具有三个或更多抗原结合位点（例如四价抗体）的多价抗体（IgM类别以外的）。多价抗体可包含二聚化结构域和三个或更多抗原结合位点。二聚化结构域包含（或由其组成）例如Fc区或铰链区。在这种情况中，抗体将包含Fc区及Fc区氨基末端的三个或更多抗原结合位点。在一个实施方案中，多价抗体包含（或由其组成）例如三个至约八个，或者四个抗原结合位点。多价抗体包含至少一条多肽链（例如两条多肽链），其中所述多肽链包含两个或多个可变域。例如，多肽链可包含VD1-(X1)n-VD2-(X2)n-Fc，其中VD1是第一可变域，VD2是第二可变域，Fc是Fc区的一条多肽链，X1和X2代表氨基酸或多肽，而n是0或1。例如，多肽链可包含：VH-CH1-柔性接头-VH-CH1-Fc区链；或VH-CH1-VH-CH1-Fc区链。本文中的多价抗体可进一步包含至少两条（例如四条）轻链可变域多肽。本文中的多价抗体可包含例如约两条至约八条轻链可变域多肽。本文设想的轻链可变域多肽包含轻链可变域，且任选进一步包含CL结构域。

抗体变体

在有些实施方案中，设想了本文所述抗体的氨基酸序列修饰。例如，可能希望改进抗体的结合亲和力和/或其它生物学特性。抗体的氨基酸序列变体是通过将适宜的核苷酸变化引入抗体核酸或通过肽合成制备的。此类修饰包括例如抗体氨基酸序列内的残基删除和/或***和/或替代。可进行任何删除、***和替代组合以获得最终的构建物，倘若最终的构建物具有期望的特征。可在制备序列时将氨基酸改变引入主题抗体氨基酸序列。

可用于鉴定抗体中作为优选诱变位置的某些残基或区域的方法有“丙氨酸扫描诱变”，如Cunningham and Wells,Science 244:1081-1085(1989)中所述。这里，鉴定一个残基或一组靶残基（如带电荷的残基，诸如精氨酸、天冬氨酸、组氨酸、赖氨酸和谷氨酸）并用中性或带负电荷的氨基酸（例如丙氨酸或多聚丙氨酸）替代，以影响氨基酸与抗原的相互作用。然后通过在或对替代位点引入更多或其它变体，推敲对替代展示功能敏感性的氨基酸位置。由此，尽管用于引入氨基酸序列变异的位点是预先决定的，然而突变本身的本质不必预先决定。例如，为了分析指定位点处突变的后果，在靶密码子或区域进行丙氨酸扫描或随机诱变，并对所表达免疫球蛋白筛选期望的活性。

氨基酸序列***包括氨基和/或羧基末端的融合，长度范围由一个残基至包含上百或更多残基的多肽，以及单个或多个氨基酸残基的序列内***。末端***的例子包括具有N端甲硫氨酰残基的抗体或与细胞毒性多肽融合的抗体。抗体分子的其它***变体包括将抗体的N或C端与酶（如用于ADEPT）或延长抗体血清半衰期的多肽融合。

另一类变体是氨基酸替代变体。这些变体在抗体分子中有至少一个氨基酸残基用不同残基替代。最有兴趣进行替代诱变的位点包括高变区，但是也设想了FR改变。表A中“优选替代”栏显示了保守替代。如果此类替代导致生物学活性变化，那么可导入表A中称为“例示替代”的更实质变化，或如下文参照氨基酸分类进一步所述，并筛选产物。

表A

原始残基	例示替代	优选替代
			Ala(A)	Val;Leu;Ile	Val
Arg(R)	Lys;Gln;Asn	Lys
			Asn(N)	Gln;His;Asp,Lys;Arg	Gln
Asp(D)	Glu;Asn	Glu
			Cys(C)	Ser;Ala	Ser
Gln(Q)	Asn;Glu	Asn
			Glu(E)	Asp;Gln	Asp
Gly(G)	Ala	Ala
			His(H)	Asn;Gln;Lys;Arg	Arg
Ile(I)	Leu;Val;Met;Ala;Phe;正亮氨酸	Leu
			Leu(L)	正亮氨酸;Ile;Val;Met;Ala;Phe	Ile
Lys(K)	Arg;Gln;Asn	Arg
			Met(M)	Leu;Phe;Ile	Leu
Phe(F)	Trp;Leu;Val;Ile;Ala;Tyr	Tyr
			Pro(P)	Ala	Ala
Ser(S)	Thr	Thr
			Thr(T)	Val;Ser	Ser
Trp(W)	Tyr;Phe	Tyr
			Tyr(Y)	Trp;Phe;Thr;Ser	Phe
Val(V)	Ile;Leu;Met;Phe;Ala;正亮氨酸	Leu

对抗体生物学特性的实质性修饰可通过选择对维持以下方面的效果差异显著的替代来实现：(a)替代区域中多肽主链的结构，例如（折叠）片或螺旋构象，(b)靶位点处分子的电荷或疏水性，或(c)侧链的体积。根据其侧链特性的相似性，氨基酸可如下分组（A.L.Lehninger，《Biochemistry》，第2版，第73-75页，Worth Publishers，New York，1975）：

(1)非极性的：Ala(A)、Val(V)、Leu(L)、Ile(I)、Pro(P)、Phe(F)、Trp(W)、Met(M)

(2)不带电荷、极性的：Gly(G)、Ser(S)、Thr(T)、Cys(C)、Tyr(Y)、Asn(N)、Gln(Q)

(3)酸性的：Asp(D)、Glu(E)

(4)碱性的：Lys(K)、Arg(R)、His(H)

或者，根据共同的侧链特性，天然发生残基可如下分组：

(1)疏水性的：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；

(2)中性、亲水性的：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；

(3)酸性的：Asp、Glu；

(4)碱性的：His、Lys、Arg；

(5)影响链取向的残基：Gly、Pro；

(6)芳香族的：Trp、Tyr、Phe。

非保守替代需要用这些类别之一的成员替换另一个类别的。还可将此类替代残基引入保守替代位点，或者引入剩余（非保守）位点。

一类替代变体牵涉替代亲本抗体（例如人源化或人抗体）的一个或多个高变区残基。通常，选择用于进一步开发的所得变体相对于产生它们的亲本抗体将具有改变（例如改进）的生物学特性。用于生成此类替代变体的一种便利方法牵涉使用噬菌体展示的亲和力成熟。简而言之，将数个高变区位点（例如6-7个位点）突变，在各个位点产生所有可能的氨基酸替代。如此生成的抗体展示在丝状噬菌体颗粒上，作为与各个颗粒内包装的至少部分噬菌体外壳蛋白（例如M13基因III产物）的融合物。然后如本文所公开的对噬菌体展示的变体筛选其生物学活性（例如结合亲和力）。为了鉴定用于修饰的候选高变区位点，可进行扫描（例如丙氨酸扫描）诱变以鉴定对抗原结合具有重要贡献的高变区残基。或者/另外，分析抗原-抗体复合物的晶体结构以鉴定抗体和抗原之间的接触点可能是有益的。所述接触残基及邻近残基是依照本领域已知的技术（包括本文详述的技术）进行替代的候选位点。一旦产生这样的变体，使用本领域已知的技术（包括本文所述的技术）对该组变体进行筛选，可选择在一种或多种相关测定法中具有优良特性的抗体用于进一步的开发。

编码抗体氨基酸序列变体的核酸分子可通过本领域知道的多种方法来制备。这些方法包括但不限于从天然来源分离（在天然发生氨基酸序列变体的情况中），或者通过对较早制备的变体或非变异型式的抗体进行寡核苷酸介导的（或定点）诱变、PCR诱变和盒式诱变来制备。

可能希望在本发明抗体的Fc区中引入一处或多处氨基酸修饰，由此生成Fc区变体。Fc区变体可包括在一个或多个氨基酸位置（包括铰链半胱氨酸）包含氨基酸修饰（如替代）的人Fc区序列（如人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc区）。

依照此描述和本领域的教导，设想了在有些实施方案中，本发明的抗体与野生型对应抗体相比可在例如Fc区中包含一处或多处改变。与它们的野生型对应物相比，这些抗体仍将基本上保留治疗功效所需要的相同特性。例如，认为可在Fc区中进行将会导致C1q结合和/或补体依赖性细胞毒性（CDC）改变（即或是增强或是削弱）的某些改变，例如WO99/51642中所述。还可参见关注Fc区变体其它实例的Duncan and Winter,Nature322:738-40(1988);美国专利5,648,260;美国专利5,624,821;及WO94/29351。

一方面，本发明提供了在构成Fc区的Fc多肽的界面中包含修饰的抗体，其中所述修饰便于和/或促进异型二聚化。这些修饰包括在第一Fc多肽中引入***(protuberance)，在第二Fc多肽中引入空穴(cavity)，其中所述***可位于所述空穴中，从而促进第一和第二Fc多肽的复合。用于生成具有这些修饰的抗体的方法是本领域已知的，例如美国专利No.5,731,168中所记载的。

免疫偶联物

一方面，本发明提供了包含偶联有细胞毒剂的抗体的免疫偶联物或抗体-药物偶联物(ADC)，所述细胞毒剂诸如化疗剂、药物、生长抑制剂、毒素（如细菌、真菌、植物或动物起源的酶活性毒素或其片段）或放射性同位素（即放射偶联物）。

抗体-药物偶联物在癌症治疗中用于局部投递毒害细胞剂或抑制细胞试剂（即用于杀死或抑制肿瘤细胞的药物）的用途（Syrigos and Epenetos,Anticancer Research19:605-614(1999);Niculescu-Duvaz and Springer,Adv.Drg.Del.Rev.26:151-172(1997);美国专利4,975,278）容许将药物部分靶向投递至肿瘤，并在那儿进行细胞内积累，而***施用这些未经偶联的药物试剂可能在试图消除的肿瘤细胞以外导致不可接受的对正常细胞的毒性水平（Baldwin et al.,Lancet603-05(1986年5月15日);Thorpe，“AntibodyCarriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy:A Review”，在《MonoclonalAntibodies′84:Biological And Clinical Applications》中，A.Pinchera等人编，第475-506页，1985）。由此试图获得最大功效及最小毒性。多克隆抗体和单克隆抗体皆有报道可用于这些策略（Rowland et al.,Cancer Immunol.Immunother.21:183-87(1986)）。这些方法中所使用的药物包括道诺霉素(daunomycin)、多柔比星(doxorubicin)、甲氨蝶呤(methotrexate)和长春地辛(vindesine)（Rowland et al.,1986,见上文）。抗体-毒素偶联物中所使用的毒素包括细菌毒素诸如白喉毒素、植物毒素诸如蓖麻毒蛋白、小分子毒素诸如格尔德霉素(geldanamycin)（Mandler et al.,Jour.of the Nat.Cancer Inst.92(19):1573-1581(2000);Mandler et al.,Bioorganic&Med.Chem.Letters 10:1025-1028(2000);Mandler et al.,Bioconjugate Chem.13:786-791(2002)）、美登木素生物碱类（EP1391213;Liu et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:8618-8623(1996)）、和加利车霉素（Lode et al.,Cancer Res.58:2928(1998);Hinman et al.,Cancer Res.53:3336-3342(1993)）。毒素可通过包括微管蛋白结合、DNA结合或拓扑异构酶抑制在内的机制发挥其毒害细胞和抑制细胞的效果。有些细胞毒药物在与大的抗体或蛋白质受体配体偶联时趋于失活或活性降低。

ZEVALIN（ibritumomab tiuxetan，Biogen/Idec）是由针对在正常和恶性B淋巴细胞表面上发现的CD20抗原的鼠IgG1 κ单克隆抗体与通过硫脲接头-螯合剂所结合的111In或90Y放射性同位素构成的抗体-放射性同位素偶联物（Wiseman et al.,Eur.Jour.Nucl.Med.27(7):766-77(2000)；Wiseman et al.,Blood 99(12):4336-42(2002);Witzig et al.,J.Clin.Oncol.20(10):2453-63(2002);Witzig et al.,J.Clin.Oncol.20(15):3262-69(2002)）。尽管ZEVALIN具有针对B细胞非何杰金氏(Hodgkin)淋巴瘤(NHL)的活性，然而施药在大多数患者中导致严重且长时间的血细胞减少。MYLOTARG^TM（gemtuzumab ozogamicin，Wyeth Pharmaceuticals），即由人CD33抗体与加利车霉素连接而构成的抗体-药物偶联物，在2000年批准用于经注射治疗急性骨髓性白血病（Drugs of the Future 25(7):686(2000);美国专利4970198;5079233;5585089;5606040;5693762;5739116;5767285;5773001）。Cantuzumab mertansine （ImmunogenInc.），即由huC242抗体经二硫化物接头SPP与美登木素生物碱药物部分DM1连接而构成的抗体-药物偶联物，在测试用于治疗表达CanAg的癌症诸如结肠癌、胰腺癌、胃癌和其它癌。MLN-2704（Millennium Pharm.,BZL Biologics,Immunogen Inc.），即由抗***特异膜抗原(PSMA)单克隆抗体与美登木素生物碱药物部分DM1连接而构成的抗体-药物偶联物，在测试用于***肿瘤潜在治疗。将多拉司他汀(dolastatin)的合成类似物auristatin肽、auristatin E(AE)和单甲基auristatin(MMAE)与嵌合单克隆抗体cBR96（对癌上的Lewis Y特异）和cAC10（对恶性血液肿瘤上的CD30特异）偶联（Doronina et al.,NatureBiotechnology21(7):778-784(2003)），且正在进行治疗性开发。

本文中（上文）描述了可用于生成免疫偶联物的化疗剂。可使用的酶活性毒素及其片段包括白喉毒素A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链（来自铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa）、蓖麻毒蛋白(ricin)A链、相思豆毒蛋白(abrin)A链、蒴莲根毒蛋白(modeccin)A链、α-帚曲霉素(sarcin)、油桐(Aleutites fordii)毒蛋白、香石竹(dianthin)毒蛋白、美洲商陆(Phytolaca americana)毒蛋白（PAPI、PAPII和PAP-S）、苦瓜(Momordica charantia)抑制物、麻疯树毒蛋白(curcin)、巴豆毒蛋白(crotin)、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制物、白树毒蛋白(gelonin)、丝林霉素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、依诺霉素(enomycin)和单端孢菌素(trichothecenes)。参见例如1993年10月28日公开的WO 93/21232。多种放射性核素可用于生成放射偶联抗体。实例包括212Bi、131I、131In、90Y和186Re。抗体和细胞毒剂的偶联物可使用多种双功能蛋白质偶联剂来制备，诸如N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、亚氨基硫烷(IT)、亚氨酸酯（诸如盐酸己二酰亚氨酸二甲酯）、活性酯类（诸如辛二酸二琥珀酰亚氨基酯）、醛类（诸如戊二醛）、双叠氮化合物（诸如双(对-叠氮苯甲酰基)己二胺）、双重氮衍生物（诸如双(对-重氮苯甲酰基)己二胺）、二异氰酸酯（诸如甲苯2,6-二异氰酸酯）、和双活性氟化合物（诸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯）的双功能衍生物。例如，可如Vitetta et al.,Science238:1098(1987)中所述制备蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14标记的1-异硫氰酸苯甲基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于将放射性核苷酸与抗体偶联的例示性螯合剂。参见WO 94/11026。

本文还设想了抗体与一种或多种小分子毒素诸如加利车霉素(calicheamicin)、美登木素生物碱类(maytansinoids)、多拉司他汀类(dolostatins)、aurostatins、单端孢霉素(trichothecene)和CC1065及这些毒素具有毒素活性的片段的偶联物。

美登素和美登木素生物碱类

在有些实施方案中，免疫偶联物包含偶联有一个或多个美登木素生物碱分子的本发明抗体。

美登木素生物碱类是通过抑制微管蛋白多聚化来发挥作用的有丝***抑制剂。美登素最初从东非灌木齿叶美登木（Maytenus serrata）分离得到（美国专利3,896,111）。随后发现某些微生物也生成美登木素生物碱类，诸如美登醇和C-3美登醇酯（美国专利4,151,042）。例如下列美国专利公开了合成美登醇及其衍生物和类似物：4,137,230;4,248,870;4,256,746;4,260,608;4,265,814;4,294,757;4,307,016;4,308,268;4,308,269;4,309,428;4,313,946;4,315,929;4,317,821;4,322,348;4,331,598;4,361,650;4,364,866;4,424,219;4,450,254;4,362,663;及4,371,533。

美登木素生物碱类药物模块在抗体药物偶联物中是有吸引力的药物模块，因为它们：(i)相对易于通过发酵或发酵产物的化学修饰、衍生化来制备；(ii)易于用适于通过非二硫化物接头的偶联的官能基衍生化；(iii)在血浆中稳定；且(iv)有效针对多种肿瘤细胞系。

美登木素生物碱类药物模块的例示性实施方案包括DM1、DM3和DM4。例如下列专利公开了包含美登木素生物碱类的免疫偶联物及其制备方法和治疗用途：美国专利5,208,020;5,416,064;及欧洲专利EP0425235B1，明确将其公开内容收入本文作为参考。Liu etal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA93:8618-8623(1996)记载了包含与针对人结肠直肠癌的单克隆抗体C242连接的称为DM1的美登木素生物碱的免疫偶联物。发现该偶联物具有针对培养的结肠癌细胞的高度细胞毒性，而且在体内肿瘤生长测定法中显示抗肿瘤活性。Chariet al.,Cancer Research52:127-131(1992)记载了其中美登木素生物碱经二硫化物接头与结合人结肠癌细胞系上抗原的鼠抗体A7或结合HER-2/neu癌基因的另一种鼠单克隆抗体TA.1偶联的免疫偶联物。在体外在人乳癌细胞系SK-BR-3上测试了TA.1-美登木素生物碱偶联物的细胞毒性，该细胞系每个细胞表达3x105个HER-2表面抗原。药物偶联物达到了与游离美登木素生物碱药物相似的一定程度的细胞毒性，这可通过增加每个抗体分子偶联的美登木素生物碱分子数目来提高。A7-美登木素生物碱偶联物在小鼠中显示低***性细胞毒性。

抗体-美登木素生物碱偶联物可通过将抗体与美登木素生物碱分子化学连接且不显著削弱抗体或美登木素生物碱分子的生物学活性来制备。参见例如美国专利No.5,208,020，明确将其公开内容收入本文作为参考。每个抗体分子偶联平均3-4个美登木素生物碱分子在增强针对靶细胞的细胞毒性中显示功效，且对抗体的功能或溶解度没有负面影响，尽管预计甚至一个分子的毒素/抗体也将较之裸抗体的使用增强细胞毒性。美登木素生物碱类在本领域是众所周知的，而且可通过已知技术合成或从天然来源分离。例如美国专利5,208,020和上文提及的其它专利及非专利发表物中公开了合适的美登木素生物碱类。美登木素生物碱类包括但不限于美登醇和美登醇分子的芳香环或其它位置经过修饰的美登醇类似物，诸如各种美登醇酯。

本领域知道许多连接基团可用于制备抗体-美登木素生物碱偶联物，包括例如美国专利5,208,020或欧洲专利0425235B1;Chari et al.,Cancer Research52:127-131(1992);2004年10月9日提交的美国专利申请No.10/960,602中所公开的，明确将其公开内容收入本文作为参考。包含接头构件SMCC的抗体-美登木素生物碱类偶联物可以如2004年10月8日提交的美国专利申请No.10/960,602中所披露的来制备。连接基团包括二硫化物基团、硫醚基团、酸不稳定基团、光不稳定基团、肽酶不稳定基团、或酯酶不稳定基团，正如上文所述专利中所公开的。本文中描述和例示了别的连接基团。

可使用多种双功能蛋白质偶联剂来制备抗体和美登木素生物碱的偶联物，诸如N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亚氨基-4-(N-马来酰亚氨基甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)、亚氨基硫烷(IT)、亚氨酸酯（诸如盐酸己二酰亚氨酸二甲酯）、活性酯类（诸如辛二酸二琥珀酰亚氨基酯）、醛类（诸如戊二醛）、双叠氮化合物（诸如双(对-叠氮苯甲酰基)己二胺）、双重氮衍生物（诸如双(对-重氮苯甲酰基)-乙二胺）、二异氰酸酯（诸如甲苯2,6-二异氰酸酯）、和双活性氟化合物（诸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯）的双功能衍生物。偶联剂包括但不限于N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)（Carlsson et al.,Biochem.J.173:723-737(1978)）和N-琥珀酰亚氨基-4-(2-吡啶基硫代)戊酸酯(SPP)，由此提供二硫键连接。

根据连接的类型，可将接头附着于美登木素生物碱分子的多个位置。例如，可使用常规偶联技术通过与羟基的反应来形成酯键。反应可发生在具有羟基的C-3位置、经羟甲基修饰的C-14位置、经羟基修饰的C-15位置、和具有羟基的C-20位置。在一个实施方案中，在美登醇或美登醇类似物的C-3位置形成键连接。

Auristatin和多拉司他汀

在有些实施方案中，免疫偶联物包含与多拉司他汀类(dolastatins)或多拉司他汀肽类似物及衍生物、auristatin类偶联的本发明抗体(美国专利No.5,635,483;5,780,588)。多拉司他汀类和auristatin类已经显示出干扰微管动力学、GTP水解、及核和细胞***(Woyke et al(2001)Antimicrob.Agents and Chemother.45(12):3580-3584)且具有抗癌(US5,663,149)和抗真菌活性(Pettit et al(1998)Antimicrob.Agents Chemother.42:2961-2965)。多拉司他汀或auristatin药物模块可经由肽药物模块的N（氨基）末端或C（羧基）末端附着于抗体(WO02/088172)。

例示性的auristatin实施方案包括N-末端连接的单甲基auristatin药物模块DE和DF，披露于“Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands”,U.S.Ser.No.10/983,340,filed Nov.5,2004，明确将其公开内容完整收入本文作为参考。

例示性的auristatin实施方案包括MMAE和MMAF。包含MMAE或MMAF和各种接头构件（本文中进一步描述的）的别的例示性的实施方案包括Ab-MC-vc-PAB-MMAF、Ab-MC-vc-PAB-MMAE、Ab-MC-MMAE和Ab-MC-MMAF。

典型的是，基于肽的药物模块可通过在两个或多个氨基酸和/或肽片段之间形成肽键来制备。此类肽键可依照例如肽化学领域众所周知的液相合成法来制备(参见E.and K.The Peptides,volume1,pp76-136,1965,Academic Press)。auristatin/多拉司他汀药物模块可依照以下文献中的方法来制备：US 5,635,483;US 5,780,588;Pettit et al(1989)J.Am.Chem.Soc.111:5463-5465;Pettit et al(1998)Anti-Cancer Drug Design13:243-277;Pettit,G.R.,et al.Synthesis,1996,719-725;Pettitet al(1996)J.Chem.Soc.Perkin Trans.1 5:859-863;及Doronina(2003)Nat Biotechnol21(7):778-784;“Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands”,美国流水号No.10/983,340,2004年11月5日提交，将其完整收入本文作为参考（披露了例如制备诸如MMAE和MMAF偶联至接头的单甲基缬氨酸化合物的接头和方法）。

加利车霉素

在其它实施方案中，免疫偶联物包含偶联有一个或多个加利车霉素分子的本发明抗体。加利车霉素抗生素家族能够在亚皮摩尔浓度生成双链DNA断裂。关于加利车霉素家族偶联物的制备参见美国专利5,712,374;5,714,586;5,739,116;5,767,285;5,770,701;5,770,710;5,773,001;和5,877,296（都授予美国Cyanamid公司）。可用的加利车霉素结构类似物包括但不限于γ1I、α2I、α3I、N-乙酰基-γ1I、PSAG和θI1（Hinman et al.,CancerResearch53:3336-3342(1993);Lode et al.,Cancer Research58:2925-2928(1998);及上述授予美国Cyanamid公司的美国专利）。可与抗体偶联的另一种抗肿瘤药物是QFA，它是一种抗叶酸药物。加利车霉素和QFA都具有胞内作用位点，且不易穿过质膜。因此，这些试剂经由抗体介导的内在化的细胞摄取大大增强了它们的细胞毒效果。

其它细胞毒剂

可与本发明抗体偶联的其它抗肿瘤剂包括BCNU、链佐星(streptozoicin)、长春新碱(vincristine)、5-氟尿嘧啶、美国专利5,053,394、5,770,710中记载的统称为LL-E33288复合物的试剂家族、及埃斯波霉素类(esperamicins)（美国专利5,877,296）。

可用的酶活性毒素及其片段包括白喉毒素A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链（来自铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa）、蓖麻毒蛋白(ricin)A链、相思豆毒蛋白(abrin)A链、蒴莲根毒蛋白(modeccin)A链、α-帚曲霉素(sarcin)、油桐(Aleutitesfordii)毒蛋白、香石竹(dianthin)毒蛋白、美洲商陆(Phytolaca americana)毒蛋白（PAPI、PAPII和PAP-S）、苦瓜(Momordica charantia)抑制物、麻疯树毒蛋白(curcin)、巴豆毒蛋白(crotin)、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制物、白树毒蛋白(gelonin)、丝林霉素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、依诺霉素(enomycin)和单端孢菌素(trichothecenes)。参见例如1993年10月28日公布的WO93/21232。

本发明还设想了抗体和具有核酸降解活性的化合物（如核糖核酸酶或DNA内切核酸酶，诸如脱氧核糖核酸酶；DNA酶）之间形成的免疫偶联物。

为了选择性破坏肿瘤，抗体可包含高度放射性原子。多种放射性同位素可用于生成放射偶联抗体。实例包括At²¹¹、I¹³¹、I¹²⁵、Y⁹⁰、Re¹⁸⁶、Re¹⁸⁸、Sm¹⁵³、Bi²¹²、P³²、Pb²¹²和Lu的放射性同位素。在将偶联物用于检测时，可包含放射性原子用于闪烁照相研究，例如Tc^99m或I¹²³，或是包含自旋标记物用于核磁共振（NMR）成像（也称为磁共振成像，MRI），诸如碘-123、碘-131、铟-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、钆、锰或铁。

可以已知方式将放射性或其它标记物掺入偶联物。例如，可生物合成肽，或是通过化学氨基酸合成法合成肽，其中使用牵涉例如氟-19代替氢的合适氨基酸前体。可经肽中的半胱氨酸残基来附着标记物，诸如Tc^99m或I¹²³、Re¹⁸⁶、Re¹⁸⁸和In¹¹¹。可以经赖氨酸残基来附着钇-90。IODOGEN法（Fraker et al.(1978)Biochem.Biophys.Res.Commun.80:49-57）可用于掺入碘-123。《Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy》（Chatal,CRC Press,1989）详细记载了其它方法。

可使用多种双功能蛋白质偶联剂来制备抗体和细胞毒剂的偶联物，诸如N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亚氨基-4-(N-马来酰亚氨基甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)、亚氨基硫烷(IT)、亚氨酸酯（诸如盐酸己二酰亚氨酸二甲酯）、活性酯类（诸如辛二酸二琥珀酰亚氨基酯）、醛类（诸如戊二醛）、双叠氮化合物（诸如双(对-叠氮苯甲酰基)己二胺）、双重氮衍生物（诸如双(对-重氮苯甲酰基)-乙二胺）、二异硫氰酸酯（诸如甲苯2,6-二异氰酸酯）、和双活性氟化合物（诸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯）的双功能衍生物。例如，可如Vitetta et al.,Science238:1098(1987)中所述制备蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14标记的1-异硫氰酸苯甲基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于将放射性核苷酸与抗体偶联的例示性螯合剂。参见WO94/11026。接头可以是便于在细胞中释放细胞毒药物的“可切割接头”。例如，可使用酸不稳定接头、肽酶敏感接头、光不稳定接头、二甲基接头、或含二硫化物接头（Chari et al.,Cancer Research52:127-131(1992);美国专利5,208,020）。

本发明的化合物明确涵盖但不限于用下列交联剂制备的ADC：商品化（如购自Pierce Biotechnology Inc.,Rockford,IL,U.S.A.）的BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、sulfo-EMCS、sulfo-GMBS、sulfo-KMUS、sulfo-MBS、sulfo-SIAB、sulfo-SMCC和sulfo-SMPB、和SVSB（琥珀酰亚胺基-(4-乙烯基砜)苯甲酸酯）。见2003-2004年度应用手册和产品目录(Applications Handbook and Catalog)第467-498页。

抗体-药物偶联物的制备

在本发明的抗体-药物偶联物(ADC)中，将抗体(Ab)经接头(L)与一个或多个药物部分(D)缀合，例如每个抗体偶联约1个至约20个药物部分。可采用本领域技术人员知道的有机化学反应、条件和试剂通过数种路径来制备通式I的ADC，包括：(1)抗体的亲核基团经共价键与二价接头试剂反应，形成Ab-L，随后与药物部分D反应；和(2)药物部分的亲核基团经共价键与二价接头试剂反应，形成D-L，随后与抗体的亲核基团反应。本文中描述了用于制备ADC的别的方法。

Ab-(L-D)_p I

接头可以由一种或多种接头构件构成。例示性的接头构件包括6-马来酰亚胺己酰基(″MC″)、马来酰亚胺丙酰基(″MP″)、缬氨酸-瓜氨酸(″val-cit″)、丙氨酸-苯丙氨酸(″ala-phe″)、对氨基苄氧羰基(″PAB″)、4-(2-吡啶基硫代)戊酸N-琥珀酰亚氨基酯(″SPP″)、4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1羧酸N-琥珀酰亚氨基酯(″SMCC′)、和(4-碘-乙酰基)氨基苯甲酸N-琥珀酰亚氨基酯(″SIAB″)。本领域知道别的接头构件，本文也描述了一些。还可参见“Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands”,美国流水号No.10/983,340,2004年11月5日提交，将其完整内容收入本文作为参考。

在有些实施方案中，接头可包含氨基酸残基。例示性的氨基酸接头构件包括二肽、三肽、四肽或五肽。例示性的二肽包括：缬氨酸-瓜氨酸（vc或val-cit）、丙氨酸-苯丙氨酸（af或ala-phe）。例示性三肽包括：甘氨酸-缬氨酸-瓜氨酸（gly-val-cit）和甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸（gly-gly-gly）。构成氨基酸接头构件的氨基酸残基包括那些天然存在的氨基酸，以及次要的氨基酸和非天然存在的氨基酸类似物，诸如瓜氨酸。氨基酸接头构件可以在它们的特定酶（例如肿瘤相关蛋白酶，组织蛋白酶B、C和D，或纤溶酶蛋白酶）的酶促切割的选择性方面进行设计和优化。

例示性的接头构件结构显示如下（其中波浪线指示共价附着至ADC其它组分的位点）：

别的例示性的接头构件和缩写包括（其中描绘了抗体(Ab)和接头，而且p为1到约8）：

抗体的亲核基团包括但不限于：(i)N末端氨基；(ii)侧链氨基，如赖氨酸；(iii)侧链巯基，如半胱氨酸；和(iv)糖基化抗体中糖的羟基或氨基。氨基、巯基、和羟基是亲核的，能够与接头部分上的亲电子基团反应而形成共价键，而接头试剂包括：(i)活性酯类，诸如NHS酯、HOBt酯、卤代甲酸酯、和酸性卤化物；(ii)烷基和苯甲基卤化物，诸如卤代乙酰胺；(iii)醛类、酮类、羧基和马来酰亚胺基团。某些抗体具有可还原的链间二硫键，即半胱氨酸桥。可通过还原剂诸如DTT（二硫苏糖醇）处理使抗体具有与接头试剂缀合的反应活性。每个半胱氨酸桥理论上将形成两个反应性硫醇亲核体。可经由赖氨酸与2-亚氨基硫烷（Traut氏试剂）的反应，导致胺转变为硫醇，从而将额外亲核基团引入抗体。可以通过导入一个、两个、三个、四个、或更多个半胱氨酸残基（例如制备包含一个或多个非天然半胱氨酸氨基酸残基的突变型抗体）而将反应性硫醇基导入抗体（或其片段）。

还可通过修饰抗体来生成本发明的抗体-药物偶联物，即引入可与接头试剂或药物上的亲核取代基反应的亲电子部分。可用例如高碘酸盐氧化剂氧化糖基化抗体的糖，从而形成可与接头试剂或药物部分的胺基团反应的醛或酮基团。所得亚胺Schiff碱基可形成稳定的键，或者可用例如硼氢化物试剂还原而形成稳定的胺连接。在一个实施方案中，糖基化抗体的碳水化合物部分与半乳糖氧化酶或偏高碘酸钠的反应可在蛋白质中生成羰（醛和酮）基团，它可与药物上的适宜基团反应（Hermanson，Bioconjugate Techniques）。在另一个实施方案中，包含N末端丝氨酸或苏氨酸残基的蛋白质可与偏高碘酸钠反应，导致在第一个氨基酸处生成醛（Geoghegan&Stroh,Bioconjugate Chem.3:138-146(1992);US5362852）。此类醛可与药物部分或接头亲核体反应。

同样，药物部分上的亲核基团包括但不限于：胺、硫醇、羟基、酰肼、肟、肼、缩氨基硫脲、肼羧酸酯、和芳基酰肼基团，它们能够与接头部分上的亲电子基团反应而形成共价键，而接头试剂包括：(i)活性酯类，诸如NHS酯、HOBt酯、卤代甲酸酯、和酸性卤化物；(ii)烷基和苯甲基卤化物，诸如卤代乙酰胺；(iii)醛类、酮类、羧基、和马来酰亚胺基团。

或者，可通过例如重组技术或肽合成来制备包含抗体和细胞毒剂的融合蛋白。DNA的长度可包含各自编码偶联物两个部分的区域，或是彼此毗邻或是由编码接头肽的区域分开，该接头肽不破坏偶联物的期望特性。

在又一个实施方案中，可将抗体与“受体”（诸如链霉亲和素）偶联从而用于肿瘤预先靶向，其中对患者施用抗体-受体偶联物，接着使用清除剂由循环中清除未结合的偶联物，然后施用与细胞毒剂（如放射性核苷酸）偶联的“配体”（如亲合素）。

如下用MC-MMAE通过偶联本文中提供的任何抗体来制备抗体(Ab)-MC-MMAE。用过量的100mM二硫苏糖醇(DTT)处理溶于500mM硼酸钠和500mM氯化钠pH 8.0的抗体。于37C温育约30分钟后，通过Sephadex G25树脂上的洗脱更换缓冲液并用含1mM DTPA的PBS洗脱。通过溶液在280nm处的吸光度测定还原的抗体浓度，并通过与DTNB(Aldrich,Milwaukee,WI)的反应及412nm处的吸光度测定硫醇浓度，由此检查硫醇/抗体值。使溶于PBS中的还原的抗体在冰上变冷。将溶于DMSO的药物接头试剂马来酰亚胺己酰基-单甲基auristatin E(MMAE)即MC-MMAE在乙腈和水中稀释至已知浓度，并加至冷却的PBS中的还原的抗体2H9。约1小时后，加入过量的马来酰亚胺以淬灭反应并覆盖任何未反应的抗体硫醇基团。通过离心超滤将反应混合液浓缩，通过PBS中的G25树脂的洗脱将2H9-MC-MMAE纯化和脱盐，在无菌条件下通过0.2μm滤器过滤，并冷冻供贮存。

抗体-MC-MMAF可以遵循为制备Ab-MC-MMAE而提供的方案通过用MC-MMAF偶联本文中提供的任何抗体来制备。

抗体-MC-val-cit-PAB-MMAE可以遵循为制备Ab-MC-MMAE而提供的方案通过用MC-val-cit-PAB-MMAE偶联本文中提供的任何抗体来制备。

抗体-MC-val-cit-PAB-MMAF可以遵循为制备Ab-MC-MMAE而提供的方案通过用MC-val-cit-PAB-MMAF偶联本文中提供的任何抗体来制备。

如下用SMCC-DM1通过偶联本文中提供的任何抗体来制备抗体-SMCC-DM1。将纯化的抗体用4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚氨基酯(SMCC,PierceBiotechnology,Inc)衍生化以引入SMCC接头。具体而言，用7.5个摩尔当量的SMCC(20mM,在DMSO中,6.7mg/ml)处理50mM磷酸钾/50mM氯化钠/2mM EDTA,pH6.5中的20mg/ml抗体。在氩气下于环境温度搅动2小时后，将反应混合液通过用50mM磷酸钾/50mM氯化钠/2mM EDTA,pH6.5平衡的Sephadex G25柱过滤。合并并测定含有抗体的级分。

将如此制备的抗体-SMCC用50mM磷酸钾/50mM氯化钠/2mM EDTA,pH6.5稀释至终浓度约10mg/ml，并与DM1在二甲基乙酰胺中的10mM溶液反应。将反应液在氩气下于环境温度搅动16.5小时。然后将偶联反应混合液通过用1x PBS pH6.5平衡的Sephadex G25凝胶过滤柱(1.5x4.9cm)过滤。根据252nm和280nm处的吸光度的测量，DM1药物/抗体比率(p)可以是约2-5。

如下用SPP-DM1通过偶联本文中提供的任何抗体来制备Ab-SPP-DM1。将纯化的抗体用4-(2-吡啶基硫代)戊酸N-琥珀酰亚氨基酯衍生化以引入二硫代吡啶基。用SPP(2.3ml乙醇中的5.3个摩尔当量)处理44.7ml含NaCl(50mM)和EDTA(1mM)的50mM磷酸钾缓冲液(pH6.5)中的抗体(376.0mg,8mg/mL)。在氩气下于环境温度温育90分钟后，将反应混合液通过用35mM柠檬酸钠,154mM NaCl和2mM EDTA缓冲液平衡的Sephadex G25柱凝胶过滤。然后合并并测定含有抗体的级分。抗体的修饰程度如上所述测定。

将抗体-SPP-Py(约10μmol可释放的2-硫代吡啶基团)用上文35mM柠檬酸钠缓冲液pH6.5稀释至终浓度约2.5mg/ml。然后向抗体溶液中加入3.0mM二甲基乙酰胺(DMA,在最终的反应混合液中为3%v/v)中的DM1(1.7个当量,17μmol)。让反应在氩气下于环境温度进行约20小时。将反应液加载至用35mM柠檬酸钠,154mM NaCl,pH6.5平衡的Sephacryl S300凝胶过滤柱(5.0cmx90.0cm,1.77L)。流速可以为约5.0ml/min，收集了65份级分(各20.0ml)。合并并检测各级分，其中通过测量252nm和280nm处的吸光度来测定每个抗体分子连接的DM1药物分子的数目(p′)，可以是每个2H9抗体约2-4个DM1药物模块。

如下用BMPEO-DM1通过偶联本文中提供的任何抗体来制备抗体-BMPEO-DM1。可以用双马来酰亚胺试剂BM(PEO)4(Pierce Chemical)修饰抗体，在抗体的表面上留下未反应的马来酰亚胺基团。这可如下来实现，将BM(PEO)4在50%乙醇/水混合液中溶解至浓度10mM，以10倍摩尔过量加至在磷酸盐缓冲盐水中以大约1.6mg/ml(10微摩尔)的浓度含有抗体的溶液，并让其反应1小时以形成抗体-接头中间体，2H9-BMPEO。通过在30mM柠檬酸盐pH6及150mM NaCl缓冲液中凝胶过滤(HiTrap column,Pharmacia)来除去过量的BM(PEO)4。将大约10倍摩尔过量的DM1溶于二甲基乙酰胺(DMA)并加至2H9-BMPEO中间体。也可采用二甲基甲酰胺(DMF)来溶解药物模块试剂。让反应混合液反应过夜，然后在PBS中凝胶过滤或透析以除去未反应的DM1。通过在PBS中的S200柱上凝胶过滤来除去高分子量聚集体并供应纯化的2H9-BMPEO-DM1。

抗体衍生物

可进一步修饰本发明的抗体以包含本领域知道的且易于获得的额外非蛋白质性质部分。在一个实施方案中，适于抗体衍生化的部分是水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性实例包括但不限于聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纤维素、右旋糖苷、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1,3-二氧戊环、聚-1,3,6-三噁烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸（均聚物或随机共聚物）、和右旋糖苷或聚(n-乙烯吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化多元醇（如甘油）、聚乙烯醇及其混合物。由于其在水中的稳定性，聚乙二醇丙醛在生产中可能具有优势。聚合物可以是任何分子量，而且可以是分支的或不分支的。附着到抗体上的聚合物数目可以变化，而且如果附着了超过一个聚合物，那么它们可以是相同或不同的分子。一般而言，可根据下列考虑来确定用于衍生化的聚合物的数目和/或类型，包括但不限于待改进抗体的具体特性或功能、抗体衍生物是否将用于指定条件下的治疗等。

在另一个实施方案中，提供了抗体与可通过暴露于辐射而选择性加热的非蛋白质性质模块的偶联物。在一个实施方案中，该非蛋白质性质模块是碳纳米管(Kam et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.102:11600-11605(2005))。辐射可以是任何波长的，包括但不限于对普通细胞无害但将非蛋白质性质模块加热至接近抗体-非蛋白质性质模块的细胞被杀死的温度的波长。

药用配制剂

可通过将具有期望纯度的抗体与任选的生理学可接受载体、赋形剂或稳定剂混合来制备包含本发明抗体的治疗用配制剂，以水溶液、冻干或其它干燥剂型的形式贮存（《Remington′s Pharmaceutical Sciences》，第16版，Osol,A.编，1980）。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所采用的剂量和浓度对接受者是无毒的，而且包括缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂（诸如氯化十八烷基二甲基苄基铵；氯化己烷双胺；苯扎氯铵、苯索氯铵；酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚）；低分子量（少于约10个残基）多肽；蛋白质，诸如血清清蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖类，诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐相反离子，诸如钠；金属复合物（如Zn-蛋白质复合物）；和/或非离子表面活性剂，诸如TWEEN^TM、PLURONICS^TM或聚乙二醇(PEG)。

本文中的配制剂还可含有超过一种所治疗具体适应症所必需的活性化合物，包括但不限于那些活性互补且彼此没有不利影响的。合适的是，此类分子以对于预定目的有效的量组合。

活性成分还可包载于例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊中（例如分别是羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊）、在胶状药物传递***中（例如脂质体、清蛋白微球体、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊）、或在粗滴乳状液中。此类技术公开于例如《Remington′sPharmaceutical Sciences》，第16版，Osol,A.编，1980。

用于体内施用的配制剂必须是无菌的。这可容易的通过使用无菌滤膜过滤来实现。

可制备持续释放配制剂。持续释放配制剂的合适例子包括含有本发明免疫球蛋白的固体疏水性聚合物半透性基质，该基质以定型产品的形式存在，如薄膜或微胶囊。持续释放基质的例子包括聚酯、水凝胶（例如聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇)）、聚交酯（美国专利3,773,919）、L-谷氨酸和γ-乙基-L-谷氨酸酯的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物诸如LUPRON DEPOT^TM（由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林构成的可注射微球体）及聚-D-(-)-3-羟基丁酸。虽然诸如乙烯-乙酸乙烯和乳酸-乙醇酸等聚合物能够持续释放分子100天以上，但是某些水凝胶释放蛋白质的时间较短。当胶囊化抗体在体内长时间维持时，它们可能由于暴露于37℃的潮湿环境而变性或聚集，导致生物学活性损失和免疫原性可能改变。可根据相关机制来设计合理的稳定化策略。例如，如果发现聚集机制是经由硫醇-二硫化物互换而形成分子间S-S键，那么可通过修饰巯基残基、由酸性溶液冻干、控制湿度、采用适宜添加剂和开发特定的聚合物基质组合物来实现稳定。

用途

本发明的抗体可用于例如体外、离体和体内治疗方法。本发明的抗体可用作为一种拮抗剂以在体外、离体和/或体内部分或完全封闭特异性抗原活性。此外，至少一些的本发明的抗体可中和来自其它物种的抗原活性。因此，本发明的抗体可用于例如在含有抗原的细胞培养物中、在具有与本发明的抗体交叉反应的抗原的人受试者或其它哺乳动物受试者(如黑猩猩、狒狒、狨猴、猕猴和恒河猴、猪或小鼠)中抑制特异性抗原活性。在一个实施方案中，通过将抗体与抗原接触以致抗原活性被抑制，本发明的抗体可用于抑制抗原活性。在一个实施方案中，所述抗原是人蛋白分子。

在一个实施方案中，本发明的抗体可用于抑制患有其中抗原活性是有害的病症的受试者中该抗原的方法，所述方法包括给予受试者本发明的抗体，使得受试者中该抗原活性得以抑制。在一个实施方案中，抗原是人蛋白分子并且受试者是人受试者。可选地，受试者可以是表达本发明的抗体所结合抗原的哺乳动物。更进一步地，受试者可以是一种抗原已导入(如通过给予抗原或通过表达抗原转基因)的哺乳动物。可将本发明的抗体给予人受试者用于治疗目的。此外，可将本发明的抗体给予表达该抗体交叉反应的抗原的非人哺乳动物(如灵长类动物、猪或小鼠)用于兽医用目的或作为人疾病的动物模型。关于后者，上述动物模型可用于评价本发明的抗体的治疗效果(如测试给药剂量和时程)。本发明的抗体可用于治疗、抑制、延迟进展、预防/延迟复发、改善或预防与多聚泛蛋白和多聚泛蛋白化蛋白异常表达和/或活性有关的疾病、病症或状况，包括但不限于癌症、肌肉病症、泛蛋白途径相关的遗传性病症、免疫/炎性病症、神经***疾病和其它的泛蛋白途径相关病症。

在一个方面中，本发明的封闭抗体特异于具有特定赖氨酸键的多聚泛蛋白，并通过封闭或干扰具有特定赖氨酸键的多聚泛蛋白和与该多聚泛蛋白相互作用的蛋白之间的相互作用抑制正常的多聚泛蛋白活性，由此抑制相应的信号传导途径以及其它相关的分子或细胞事件。

在某些实施方案中，给予患者包含缀合有细胞毒剂的抗体的免疫缀合物。在某些实施方案中，免疫缀合物和/或其结合的抗原为细胞所内在化，从而在杀死该免疫缀合物所结合的靶细胞中增强了该免疫缀合物的治疗效能。在一个实施方案中，细胞毒剂靶向或干扰靶细胞中的核酸。上述细胞毒剂的例子包括任何一种本文中提及的化学治疗剂(如美登素(maytansinoid)或刺孢霉素(calicheamicin))、放射性同位素或核糖核酸酶或DNA核酸内切酶。

在治疗中本发明的抗体可单独或与其它组合物联合使用。例如，本发明的抗体可与另一种抗体和/或佐剂/治疗剂(例如类固醇)联合给药。例如，在治疗方案如在治疗任何一种本文所描述的疾病包括癌症、肌肉病症、泛蛋白途径相关的遗传性病症、免疫/炎性病症、神经***疾病和其它泛蛋白途径相关的病症中，本发明的抗体可与抗炎剂和/或杀菌剂联合给药。标注于上的这样的联合治疗包括联合给药(其中两种或更多种药物包括在同一或不同的制剂中)以及单独给药，在这样的情况下，可在附加治疗给予之前和/或之后给予本发明的抗体。

本发明的抗体(以及附加的治疗剂)可通过任何适合的方式给药，包括肠胃外、皮下、腹膜内、肺内和鼻内给药，以及视局部治疗需要，损伤区给药。肠胃外输注包括肌内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下给药。此外，抗体适于通过脉冲式输注给药，特别是使用递减剂量的抗体。部分取决于给药是否是短期或长期的，可以是任何适合的途径如通过注射，例如静脉或皮下注射。部分取决于给药是否是短期或长期的，可通过任何适合的途径给予剂量，如通过注射例如静脉内或皮下注射。

在制备及给予抗体中要考虑本发明的抗体的结合靶的位置。当结合靶为细胞内分子时，对于要被导入其中结合靶所处的细胞中的抗体或其抗原结合片段提供了本发明的某些实施方案。在一个实施方案中，本发明的抗体可以作为胞内抗体在细胞内表达。如本文中所使用的，术语“胞内抗体”指如Marasco,Gene Therapy4:11-15(1997);Kontermann,Methods34:163-170(2004);美国专利号6,004,940和6,329,173;美国专利申请公开号2003/0104402和PCT公开号WO2003/077945中所述的，一种在细胞内表达并且能与靶分子选择性结合的抗体或其抗原结合部分。胞内抗体的细胞内表达受将编码期望抗体或其抗原结合部分的核酸(缺少野生型前导序列和通常与编码抗体或抗原结合片段的基因相关的分泌信号)导入靶细胞中的影响。可使用任何将核酸导入细胞中的标准方法，包括但不限于显微注射，弹道式注射(ballistic injection)，电穿孔，磷酸钙沉淀，脂质体以及使用携带有目的核酸的逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒和痘苗病毒载体进行转染。可将一种或多种编码本发明的抗多聚泛蛋白抗体的全部或部分的核酸递送给靶细胞，使得一种或多种胞内抗体(intrabody)得以表达，从而能在细胞内与多聚泛蛋白结合并调节一条或多条多聚泛蛋白介导的细胞途径。

在另一个实施方案中，提供了内在化的抗体。抗体可具有某些增强将抗体递送入细胞中的特性，或可被修饰以具有上述特性。用于实现其的技术是本领域已知的。例如，已知抗体的阳离子化能促进其被细胞摄取(参见如美国专利号6,703,019)。脂质转染或脂质体也可用于将抗体递送入细胞中。在使用抗体片段的情况下，与靶蛋白结合域特异性结合的最小抑制性片段通常是有利的。例如，基于抗体的可变区序列，可设计保留与靶蛋白序列结合能力的的肽分子。上述肽可化学合成和/或通过重组DNA技术产生。参见如Marasco等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:7889-7893(1993)。

可通过本领域已知的方法增加调节多肽进入靶细胞。例如，某些序列如来源于HIVTat或触角足(Antennapedia)同源结构域蛋白的那些序列能指导异源蛋白穿过细胞膜从而有效地摄入。参见如Chen等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1999),96:4325-4329。

当结合的靶位于脑中时，某些本发明的实施方案提供了穿过血脑屏障的抗体或其抗原结合片段。某些神经变性疾病与增加的血脑屏障透过性有关，使得抗体或抗原结合片段能容易地导入脑中。当血脑屏障保持完整时，存在着一些用于转运分子穿过该血脑屏障的本领域已知的方法，包括但不限于物理方法、基于脂质的方法以及基于受体和通道的方法。

将抗体或抗原结合片段转运穿过血脑屏障的物理方法包括但不限于完全绕过血脑屏障或通过在血脑屏障中产生开口。绕过方法包括但不限于直接注射入脑中(参见如Papanastassiou等,Gene Therapy9:398-406(2002))、间质输注/对流增强的递送(convection-enhanced delivery)(参见如Bobo等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:2076-2080(1994))和在脑中***递送装置(参见如Gill等,Nature Med.9:589-595(2003)；和Gliadel Wafers^TM,Guildford Pharmaceutical)。在屏障中产生开口的方法包括但不限于超声波(参见如美国专利公开号2002/0038086)、渗透压(如通过给予高渗的甘露醇(Neuwelt,E.A.,Implication of the Blood-Brain Barrier and its Manipulation,Vols 1&2,Plenum Press,N.Y.(1989)))、通过如缓激肽或透化剂A-7透化(参见如美国专利号5,112,596,5,268,164,5,506,206和5,686,416)和用含有编码抗体或抗原结合片段的基因的载体转染跨越血脑屏障的神经细胞(参见如美国专利公开号2003/0083299)。

基于脂质的将抗体或抗原结合片段转运穿过血脑屏障的方法包括但不限于将抗体或抗原结合片段包囊入连接有与血脑屏障的血管内皮上受体结合的抗体结合片段的脂质体中(参见如美国专利申请公开号20020025313)，以及将抗体或抗原结合片段包被在低密度脂蛋白颗粒(参见如美国专利申请公开号20040204354)或载脂蛋白E(参见如美国专利申请公开号20040131692)中。

基于受体和通道的将抗体或抗原结合片段转运穿过血脑屏障的方法包括但不限于使用糖皮质激素阻断剂来增加血脑屏障的透过性(参见如美国专利申请公开号2002/0065259,2003/0162695和2005/0124533)；激活钾通道(参见如美国专利申请公开号2005/0089473)，抑制ABC药物运载体(参见如美国专利申请公开号2003/0073713)；用转铁蛋白包被抗体并调节一种或多种转铁蛋白受体的活性(参见如美国专利申请公开号2003/0129186)，以及阳离子化抗体(参见如美国专利号5,004,697)。

本发明的抗体组合物应当以一种符合良好的医学实践的方式配制、确定剂量及给药。关于这一点考虑的因素包括在治疗的特定病症、在治疗的特定哺乳动物、患者个体的临床状态、病因、药物递送部位、给药方法、服药日程以及其它为开业医生所知的因素。抗体无需但可任选地与一种或多种目前用于预防或治疗所述病症的药物一起配制。上述其它药物的有效量取决于配方中所存在的本发明的抗体的量、所治疗病症的类型、以及其它上述讨论的因素。这些药物通常以相同的剂量使用并具有本文中所描述的给药途径，或以约1-99%的本文所描述的剂量使用，或以任何剂量并通过任何途径使用，所述剂量和途径是凭经验确定的/经临床测定合适的。

为了预防或治疗疾病，本发明的抗体(当单独或与其它药物如化学治疗剂联合使用时)的合适剂量应取决于所要治疗的疾病的类型、抗体的种类、疾病的严重性和病程、所给予抗体的预防或治疗目的、之前的治疗、患者的临床史和对抗体的应答、以及主治医师的斟酌决定。抗体适合于在一次或一系列的治疗中给予患者。取决于疾病的类型和严重性，约1μg/kg-15mg/kg(例如0.1mg/kg-10mg/kg)的抗体可作为首次候选用量给予患者，无论是例如通过一次或多次单独的给药或通过连续输注。取决予上述提及的因素，一个典型的日剂量可在约1μg/kg-100mg/kg或更多的范围内。对于几天或更长时间的重复给药，取决于病情，治疗应通常持续直至出现病症得到期望的抑制为止。抗体的一个例证性的剂量应为约0.05mg/kg-约10mg/kg。因此，可将一个或多个约0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg或10mg/kg(或它们的任何组合)的剂量给予患者。上述剂量可间歇给予，如每周或每三周给予一次(如使得患者得到约2-约20个，或例如约6个剂量的抗体)。可给予初始较高的负荷剂量，接着给予一个或多个较低的剂量。一个例证性的给药方案包括给予约4mg/kg的初始负荷剂量，继之以约2mg/kg抗体的周维持剂量。然而，可使用其它给药方案。通过常规技术和测定方法易于监测该治疗的进展。

制品

在本发明的另一个方面，提供了包含可用于治疗、预防和/或诊断上文所述紊乱的物质的制品。制品包括容器和贴在所述容器上或与其相关连的标签或包装插页。合适的容器包括例如瓶子、小管、注射器等。容器可用各种材料制成，诸如玻璃或塑料。容器中装有其自身或在联合其它组合物时有效治疗、预防和/或诊断疾患的组合物，而且可具有无菌存取口（例如容器可以是具有皮下注射针头可刺穿的塞子的静脉内溶液袋或小管）。组合物中的至少一种活性剂是本发明的抗体。标签或包装插页指示该组合物用于治疗选择的疾患。此外，制品可包括(a)其中装有组合物的第一容器，其中所述组合物包含本发明的抗体；和(b)其中装有组合物的第二容器，其中所述组合物包含其它细胞毒剂或其它类型的治疗剂。本发明此实施方案中的制品还可包括指示该组合物可用于治疗特定疾患的包装插页。或者/另外，制品还可包括第二（或第三）容器，其中装有制药学可接受的缓冲剂，诸如注射用抑菌水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏(Ringer)溶液和右旋糖溶液。它还可包括商业和用户立场上所需的其它物质，包括其它缓冲剂、稀释剂、滤器、针头和注射器。

以下是本发明的方法和组合物的实施例。应当理解，根据上文提供的一般描述，可以实施各种其它实施方案。

实施例

实施例1：分离并鉴定第一代抗多聚泛蛋白抗体

A)文库分选

让来自天然体文库的噬菌体经受针对固定化的模拟K48连接的多聚泛蛋白或K63连接的多聚泛蛋白的包括异肽键的合成肽的结合选择。在6轮选择后没有观察到富集。加长合成肽，并再次筛选天然抗体文库。再一次，在6轮的结合选择没有观察到富集。

让来自天然YS-B抗体文库的噬菌体经受4轮针对具有不同的已知泛蛋白异肽键的多聚泛蛋白链的结合选择。YS-B抗体文库含有在所有三个重链CDR和轻链CDR3中随机化的并且是基于人源化抗体4D5的氨基酸(参见美国专利申请公开号2005-0106667)。

将长度为3-7单位的酶合成的全长K48连接的或K63连接的多聚泛蛋白链(BostonBiochem)固定在96-孔Maxisorp免疫平板上(NUNC)。用溶于50mM碳酸盐缓冲液，pH 9.6中的5μg/ml的K48或K63连接的多聚泛蛋白包被平板过夜。包被的平板用磷酸缓冲盐溶液(PBS)洗涤并用0.2%的牛血清白蛋白(BSA)或酪蛋白PBS溶液封闭。然后在25℃用含0.05% Tween20的PBS(PBST)洗涤平板。在室温，每个孔都用100μl的10¹²个噬菌体/ml的分选缓冲液(0.2%BSA或酪蛋白PBST溶液)温育2小时。每个孔都再PBST中洗涤8次以除去未结合的噬菌体。通过与0.1 M HCl温育10分钟抽提结合的噬菌体，并用2M Tris碱中和抽提液。将所抽提的噬菌体在添加M13-KO7辅助噬菌体(New England Biolabs)的大肠杆菌XL1-blue(Stratagene)中增殖。

将扩增的噬菌体用于额外轮次的针对在之前轮次中所使用的相同靶的选择。对于第2-4轮选择，10μg/ml泛蛋白包含在分选缓冲液中作为反选择(counterselection)第3和4轮也同时使用或不使用额外的反选择进行分选：在K48连接的多聚泛蛋白选择中用10μg/mlK63连接的多聚泛蛋白反选择，或在K63连接的多聚泛蛋白选择中用10μg/ml K48连接的多聚泛蛋白反选择。

对于在其中缺少多聚泛蛋白反选择的第2-4轮选择中的那些克隆，于96-孔板的400μl的补充有羧苄青霉素和M13-KO7辅助噬菌体的2YT肉汤中培养单个克隆。将来自那些培养物的上清液用于高通量噬菌体ELISA来筛选与K48连接的多聚泛蛋白、K63连接的多聚泛蛋白、泛蛋白和BSA结合的克隆。对所有的克隆进行DNA序列分析。对包括HVR的重链的一部分进行测序，供重链高变区分析之用。识别K48连接的多聚泛蛋白或既识别K48连接的多聚泛蛋白也识别K63连接的多聚泛蛋白的克隆的重链高变区示于图2A-2C中。识别K63连接的多聚泛蛋白或既识别K48连接的多聚泛蛋白也识别K63连接的多聚泛蛋白的克隆的重链高变区示于图3A和3B中。对于每个克隆的轻链HVR没有进行测序，但基于YS-B文库的特性，预计HVR-L1和HVR-L2的序列是不变的，而HVR-L3序列则预计是克隆特异的。根据文库设计，HVR-L1序列为RASQSVSSAVA(SEQ ID NO:79)，HVR-L2序列为SASSLYS(SEQ ID NO:80)。所有的克隆具有相同的重链和轻链框架区序列(参见图6)。

一组不同的克隆包括了在第2-4轮选择中用10μg/ml不同赖氨酸键的多聚泛蛋白(K48连接的多聚泛蛋白或K63连接的多聚泛蛋白)进行的反选择。将10μl洗脱自第四轮选择的噬菌体用于感染生长着的大肠杆菌CJ23620分钟，然后在含有羧苄青霉素的固体琼脂上培养过夜。将15ml补充有羧苄青霉素和氯霉素的2YT肉汤添加到平板中以重悬含有噬菌粒的CJ236细胞。添加M13-KO7辅助噬菌体。在37℃搅拌温育1小时后，添加2.5ml的悬浮液到补充有羧苄青霉素和卡那霉素的250ml的2YT肉汤中。让悬浮液培养过夜。

通过聚乙二醇沉淀收获噬菌体，并使用M13spin试剂盒(Qiagen)分离Kunkel DNA。使用寡核苷酸F1560-2

(TCTTGTGACAAAACTCACCATCACCATCACCATCACTA

GGGCGGTGGCTCTGGTTCCGGTGATTTT)(SEQ ID NO:150)，将1μg的Kunkel模板用于Kunkel诱变处理(参见Kunkel,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:488(1985))。将诱变反应物转化入大肠杆菌XL1-blue中并在含有羧苄青霉素的固体琼脂上培养过夜。然后如上挑选并培养单个克隆，并如上所述在噬菌体ELISA中筛选抗K48和K63连接的多聚泛蛋白、单泛蛋白、BSA和抗五组氨酸抗体（anti-pentaHis antibody）(Qiagen)的克隆。对鉴定为特异于K48连接的多聚泛蛋白或K63连接的多聚泛蛋白的克隆进行DNA序列分析。高变区HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3的氨基酸序列示于图8A-8C(特异于K48连接的多聚泛蛋白)以及9A和9B(特异于K63连接的多聚泛蛋白)中。对于每个克隆的轻链HVR没有进行测序，但基于YS-B文库的特性，预计HVR-L1和HVR-L2的序列是不变的，而HVR-L3序列则预计是克隆特异的。根据文库设计，HVR-L1序列为RASQSVSSAVA(SEQ ID NO:79)，HVR-L2序列为SASSLYS(SEQ ID NO:80)。所有的克隆具有相同的重链和轻链框架区序列(参见图6)。

(B)产生Fab

为了产生Fab，将来自针对五组氨酸标签阳性的独特克隆的噬菌体上清液用于感染大肠杆菌FF34B8(一种其中通过用XL1交配并在选择性固体培养基中培养从而将F’附加体添加到34B8菌株中的细胞系)。将感染的细胞在含羧苄青霉素的固体琼脂上划线并培养过夜。从平板中挑出含噬菌粒的FF34B8的单一克隆并在含羧苄青霉素的LB中于37℃培养过夜。然后将那些培养物用于接种500ml含羧苄青霉素的完全CRAP培养基(3.57g(NH₄)₂SO₄,0.71g柠檬酸钠·2H₂O,1.07g KCl,5.36g酵母抽提物(经过检验的),5.36g Hycase SF(Sheffield)，通过添加KOH调pH至7.3并用超纯水调体积至872mL，高压蒸汽处理，冷却至55℃，向其(每L)添加110mL 1M MOPS pH7.3、11mL50%葡萄糖和7mL 1M MgSO₄)，并在30℃搅拌培养24小时。通过离心分离收获细胞并将细胞沉淀贮藏于-20℃。通过将每一细胞沉淀重悬于35ml冷的含0.2mg/ml溶菌酶和0.3U/mL DNA酶I的洗涤缓冲液(PBS+150mM NaCl)中纯化Fab。将重悬的细胞沉淀转移到50ml离心管中并在25℃快速涡旋45分钟。离心沉淀并将溶胞产物加载到1ml在4℃用洗涤缓冲液预平衡的蛋白G-琼脂糖柱。用50ml冷的洗涤缓冲液洗涤柱子，用3ml0.1M乙酸洗脱，并用150μl的2M Tris碱中和。将洗脱的Fab缓冲液交换入PBS中并使用Centriprep10离心过滤器(Millipore)进行浓缩。通过分光光度法测定所得到的Fab浓度(1OD_280nm=1.55mg/mL)。将浓缩的Fab贮藏于4℃。

如上所述，将每个Fab都包括于ELSA蛋白测定中以测定其对K48连接的和K63连接的多聚泛蛋白的相对亲和力，以及用以确认Fab没有与单泛蛋白或BSA反应。与对K63连接的多聚泛蛋白相比，Fab apu01-15对K48连接的多聚泛蛋白具更高的特异性。在ELISA中Fabapu17-apu24被证实与对K48连接的多聚泛蛋白相比对K63连接的多聚泛蛋白具更高的特异性。Apu16不作为Fab产生。

对所有的Fab进行DNA序列分析。每个与K48连接的多聚泛蛋白特异性结合的Fab的高变区HVR-H1、HVR-H2、HVR-H3和HVR-L3的氨基酸序列示于图10A-10C中。每个与K63连接的多聚泛蛋白特异性结合的Fab的高变区HVR-H1、HVR-H2、HVR-H3和HVR-L3的氨基酸序列示于图11A-11C中。对于每个Fab，重链和轻链框架区序列示于图6中。根据文库设计，对于每个克隆头两个轻链高变区HVR-L1和HVR-L2是相同的(参见以上SEQ ID NOs:79和80)。

(C)分离的Fab的亲和力分析

使用3000***(Biacore)通过表面等离振子共振测定经选择的Fab(参见上述(B)节)对泛蛋白及其赖氨酸连接的形式的亲和力。使用厂商提供的胺偶联方案，将大约100共振单位的泛蛋白、K48或K63连接的二聚泛蛋白、或K48或K63连接的多聚泛蛋白(链长3-7)固定在CM5芯片的不同流动池(flow cell)上。在每次实验中，激活并用乙醇胺封闭没有固定蛋白的流动池1，用作为参考扣除。将连续稀释的apu01-apu24中每一种的Fab蛋白(1.6-100nM)注射(以25μl/min的流速总共注射50μl)溢出每一流动池(flow cell)。记录每一流动池的信号并扣除参考信号。在解离期(5分钟)后，用13μl的20mM HCl再生芯片表面。例证性的Fab apu09和apu18的结合曲线示于图12和13A-13B中。如图12中所示，Apu09与K48连接的多聚泛蛋白结合，但不与K63连接的多聚泛蛋白结合。图13A显示了apu18与K48连接的多聚泛蛋白的结合曲线。虽然观察到了某些结合，但是其基本上小于对K63连接的多聚泛蛋白所观察到的结合(图13B)。对每个Fab进行类似的分析。

利用厂商提供的软件通过非线性回归分析同时计算动力学常数和结合常数，并示于表B中。表B中文字“NB”指对于所指示的相互作用没有检测到结合。表B中文字“nd”指对于所指示的相互作用没有测量数据。结果显示特定Fab与二聚泛蛋白结合的动力学常数非常类似于与多聚泛蛋白结合的那些动力学常数。因此，Fab看来似乎识别两个泛蛋白部分之间的特定异肽键(isopeptide linkage)。

表B：通过分析所测定的抗多聚泛蛋白Fab的动力学常数

*Apu18的第二次Biacore分析证实了之前所获得的对K63连接的二聚泛蛋白相互作用的动力学常数。

(D)蛋白质印迹

在聚丙烯酰胺凝胶中分离四聚泛蛋白(在适当情况下K48连接的或K63连接的)和二聚泛蛋白(K48连接的或K63连接的)(Boston Biochem)并通过电印迹转移到硝酸纤维膜上。通过于0.5%Qiagen封闭试剂(Qiagen)中在4℃温育膜过夜封闭膜上的非特异性结合位点。将封闭的膜放置于miniblotter装置中。将Fab克隆(1μg/ml)施加于处于0.5%Qiagen封闭试剂(Qiagen)中的膜连续切片上。在温育1小时后，洗涤膜。根据厂商说明书，使用缀合HRP的抗五组氨酸抗体(Qiagen)显影结合膜的抗泛蛋白抗体。

克隆apu01-apu15产生的K48连接的多聚泛蛋白特异性Fab与固定在硝酸纤维膜上的K48连接的四聚泛蛋白特异性结合(参见图19B)。没有观察到克隆apu17-apu24产生的K63连接的多聚泛蛋白特异性Fab与固定在硝酸纤维膜上的K63连接的多聚泛蛋白的结合(参见图19A)。

实施例2：分离并鉴定第二代抗多聚泛蛋白抗体

由编码之前所鉴定的克隆apu05(K48连接的多聚泛蛋白选择性的)和apu18(K63连接的多聚泛蛋白选择性的)噬菌粒构建用于Fab展示的第二代文库(参见图10A-10C和11A-11C)。将来自那些克隆的噬菌体用于感染CJ236细胞以制备Kunkel DNA模板。随后，诱变处理那些模板以***终止密码子，并将含终止密码子的模板用于如下的文库构建。

根据两个不同方案诱变处理Fab apu05以创建两个不同的apu05衍生的文库。在第一个文库中，仅诱变处理HVR-H3。首先修饰HVR-H3以将终止密码子包含在Kunkel模板中，接着利用四条诱变的寡核苷酸进行诱变。在所有的情况下，终止密码子编码寡核苷酸均为

CGTCTATTATTGTGCTCGCTAATAAGACTACTGGGGTCAAGG(SEQ ID NO:365)。头三条诱变的寡核苷酸是相同的期望序列的三种改变

(permutation)，其中一个酪氨酸残基被固定，并利用NNS混合密码子组(其中N相应于G、C、A或T，以及S相应于G或C)随机化每个剩余的酪氨酸残基；从苯丙氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸和异亮氨酸中选择第100b位的氨基酸；第100a位的氨基酸选自甘氨酸和丙氨酸；并将剩余的氨基酸进行温和随机化。在上下文中温和随机化指某些核苷酸位置70%的时间为所指示的碱基所占据，而其它三种碱基的每一种则占据10%的时间。对于那些其中在特定碱基处包括上述温和随机化的那些寡核苷酸，通过在该碱基位置处数字的存在指示了温和随机化的存在。数字“5”指在该位置处碱基腺嘌呤占据70%的时间，而碱基鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶则分别占据10%的时间。类似地，数字“6”指鸟嘌呤，“7”指胞嘧啶，以及“8”指胸腺嘧啶，在所有的情况下，其它三种碱基中的每一种仅占据10%的时间。头三条诱变的寡核苷酸序列为：

CGTCTATTATTGTGCTCGC567TAC567NNSNNS567GSTWTSGACTACTGGGGTCAAGG(SEQ IDNO:367)、

CGTCTATTATTGTGCTCGC567NNS567TACNNS567

GSTWTSGACTACTGGGGTCAAGG(SEQ ID NO:368)和CGTCTATTATTGTGCTCGC567

NNS567NNSTAC567GSTWTSGACTACTGGGGTCAAGG(SEQ ID NO:369)。第四条诱变的寡核苷酸包括利用NNS混合密码子组对第96、98和99位酪氨酸的随机化；从苯丙氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸和异亮氨酸中选择第100b位的氨基酸；从甘氨酸和丙氨酸中选择第100a位的氨基酸，以及与上述温和随机化命名法相一致地在每个其它位置进行温和随机化。第四条寡核苷酸的序列为

CGTCTATTATTGTGCTCGC567NNS567NNSNNS567GSTWTSGACTACTGGGGTCAAGG(SEQ IDNO:370)。

在第二个apu05文库中，诱变处理HVR-H1、HVR-H2、HVR-H3和HVR-L3。利用NNS混合密码子组(其中N相应于G、C、A或T，以及S相应于G或C)修饰HVR-H1使得第30和33位的丝氨酸被随机化；从氨基酸苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸中选择第29位的氨基酸；以及从异亮氨酸和甲硫氨酸中选择第34位的氨基酸。用于诱变处理apu05 HVR-H1的寡核苷酸为

GCAGCTTCTGGCTTCAACTAATAACACTGGGTGCGTCAGG(SEQ ID NO:371)和

GCAGCTTCTGGCTTCAACNTCNNSTACTCTNNSATSCACTGGGTGC

GTCAGG(SEQ ID NO:372)。利用NNS混合密码子组修饰HVR-H2使得第52位的酪氨酸被随机化，以及从脯氨酸和丝氨酸中选择第52a位的氨基酸。用于诱变处理HVR-H2的寡核苷酸为：

GGCCTGGAATGGGTTGCATAATAATATGCCGATAGCGTCAAGG(SEQ ID NO:373)和

GGCCTGGAATGGGTTGCATCTATCNNSYCTTACTACTCTTACACCTCTTATGCCGATAGCGTCAAGG(SEQ ID NO:374)。利用NNS混合密码子组修饰HVR-H3使得第99位的酪氨酸和第100位的丝氨酸被随机化；从甘氨酸和丙氨酸中选择第100a位的氨基酸；以及从苯丙氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸和异亮氨酸中选择第100b位的氨基酸。用于诱变处理HVR-H3的寡核苷酸为：

CGTCTATTATTGTGCTCGCTAATAAGACTACTGGGGTCAAGG(SEQ ID NO:365)和

CGTCTATTATTGTGCTCGCTCTTACTCTTACNNSNNSGSTWTSGACTACTGGGGTCAAGG(SEQ IDNO:375)。根据NNS混合密码子组修饰HVR-L3使得第S91位被随机化，以及从苯丙氨酸、异亮氨酸和缬氨酸中选择第I96位。用于诱变处理HVR-L3的寡核苷酸为：

CGCAACTTATTACTGTCAGCAATAATAAACGTTCGGACAGGGTACC(SEQ ID NO:376)和

CGCAACTTATTACTGTCAGCAANNSTCTTACTCTTCTCTGDTTACGTTCGGACAGGGTACC(SEQ IDNO:378)。

通过六个不同的apu18诱变方案制备六个不同的apu18-衍生的文库。在第一个文库中，仅诱变处理HVR-H3。首先修饰HVR-H3以将终止密码子包括在Kunkel模板中，接着利用七条诱变的寡核苷酸进行诱变。在所有的情况下，终止密码子编码寡核苷酸均为

CGTCTATTATTGTGCTCGCTAATAAGACTACTGGGGTCAAGG(SEQ ID NO:366)。头六条诱变的寡核苷酸为相同的期望序列的六种改变，其中两个酪氨酸或色氨酸残基被固定，并利用NNS混合密码子组(其中N相应于G、C、A或T，以及S相应于G或C)随机化每个剩余的酪氨酸和色氨酸残基；从苯丙氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸和异亮氨酸中选择第100c位的氨基酸；从甘氨酸和丙氨酸中选择第100b位的氨基酸；以及与上述温和随机化命名法相一致地温和随机化剩余的氨基酸。头六条诱变的寡核苷酸序列为：

CGTCTATTATTGTGCTCGC655TACTAC565NNSNNS577GSTWTSGACTACTGGGGTCAAGG(SEQID NO:379)、

CGTCTATTATTGTGCTCGC655NNSNNS565TGGTAC577GSTWTSGACTACTGGGGTCAAGG(SEQID NO:380)、

CGTCTATTATTGTGCTCGC655TACBBS565NNSTAC577GSTWTSGACTACTGGGGTCAAGG(SEQID NO:381)、

CGTCTATTATTGTGCTCGC655NNSTAC565TGGNNS577GSTWTSGACTACTGGGGTCAAGG(SEQID NO:382)、

CGTCTATTATTGTGCTCGC655TACNNS565TGGNNS577GSTWTSGACTACTGGGGTCAAGG(SEQID NO:383)和

CGTCTATTATTGTGCTCGC655NNSTAC565NNSTAC577GSTWTSGACTACTGGGGTCAAGG(SEQID NO:384)。第七条诱变的寡核苷酸包括利用NNS混合密码子组随机化第96、97和100位的酪氨酸和第99位的色氨酸；从苯丙氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸和异亮氨酸中选择第100b位的氨基酸；从苯丙氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸和异亮氨酸中选择第100c位的氨基酸；从甘氨酸和丙氨酸中选择第100b位的氨基酸，以及与上述温和随机化命名法相一致地在每个其它位置处进行温和随机化。第七条寡核苷酸的序列为：

CGTCTATTATTGTGCTCGC655NNSNNS565NNSNNS577GSTWTSGACTACTGGGGTCAAGG(SEQID NO:385)。

在第二个apu18文库中，仅诱变处理HVR-H2。首先修饰HVR-H2以将终止密码子包括在Kunkel模板中，接着利用四条诱变的寡核苷酸进行诱变。在所有的情况下，终止密码子编码寡核苷酸均为

GGCCTGGAATGGGTTGCATAATAATATGCCGATAGCGTCAAGG(SEQ ID NO:373)。头三条诱变的寡核苷酸为相同的期望序列的三种改变，其中一个酪氨酸残基被固定，并利用NNS混合密码子组(其中N相应于G、C、A或T，以及S相应于G或C)随机化每个剩余的酪氨酸和第52位的丝氨酸；从脯氨酸和丝氨酸中选择第52a位的氨基酸；从甘氨酸和丝氨酸中选择第55位的氨基酸；固定第51位的异亮氨酸以及第57位的苏氨酸；以及与上述温和随机化命名法相一致地温和随机化剩余的氨基酸。头三条诱变的寡核苷酸序列为：

GGCCTGGAATGGGTTGCATACATCNNSYCTNNSNNSRGC567ACC567TATGCCGATAGCGTCAAGG(SEQ ID NO:386)、

GGCCTGGAATGGGTTGCANNSATCNNSYCTTACNNSRGC567ACC567TATGCCGATAGCGTCAAGG(SEQ ID NO:387)和

GGCCTGGAATGGGTTGCANNSATCNNSYCTNNSTACRGC567ACC567TATGCCGATAGCGTCAAGG(SEQ ID NO:388)。第四条诱变的寡核苷酸包括利用NNS混合密码子组随机化第50、53和54位的酪氨酸；从苯丙氨酸和丝氨酸中选择第52a位的氨基酸；从甘氨酸和丝氨酸中选择第55位的氨基酸；分别固定第51和57位的异亮氨酸和苏氨酸残基；以及与上述温和随机化命名法相一致地在每个其它位置处进行温和随机化。第四条寡核苷酸的序列为：

GGCCTGGAATGGGTTGCANNSATCNNSYCTNNSNNSRGC567ACC567TATGCCGATAGCGTCAAGG(SEQ ID NO:389)。

在第三个apu18文库中，诱变处理HVR-H2和HVR-H3。与在第二个apu18文库中对HVR-H2所进行的修饰一样，利用相同的四条诱变的寡核苷酸修饰HVR-H2。与在第一个apu18文库中对HVR-H3所进行的修饰一样，利用相同的头六条诱变的寡核苷酸修饰HVR-H3。

在第四个apu18文库中，诱变处理HVR-H3和HVR-L3。与在第一个apu18文库中对HVR-H3所进行的修饰一样，利用相同的头六条诱变的寡核苷酸修饰HVR-H3。首先修饰HVR-L3以将终止密码子包括在Kunkel模板中，接着利用诱变寡核苷酸的进行诱变。在HVR-L3中，利用NNS混合密码子组随机化第91和94位的酪氨酸以及第95a位的丝氨酸；从苯丙氨酸、异亮氨酸和缬氨酸中选择第95b位的亮氨酸；以及与上述温和随机化命名法相一致地温和随机化第92、93和95位的丝氨酸。用于HVR-L3诱变处理的寡核苷酸为

CGCAACTTATTACTGTCAGCAATAATAAACGTTCGGACAGGGTACC(SEQ ID NO:376)和

CGCAACTTATTACTGTCAGCAANNS567567NNS567NNSCTGDTTACGTTCGGACAGGGTACC(SEQID NO:390)。

在第五个apu18文库中，诱变处理HVR-H1和HVR-H2。与在第二个apu18文库中对HVR-H2所进行的修饰一样，利用相同的四条诱变的寡核苷酸修饰HVR-H2。修饰HVR-H1以包括终止密码子；利用NNS混合密码子组随机化第30位的丝氨酸和第33位的酪氨酸；从苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸中选择第29位的氨基酸；从异亮氨酸和甲硫氨酸中选择第34位的氨基酸，以及与上述温和随机化命名法相一致地温和随机化第31和32位的氨基酸。用于HVR-H1诱变处理的寡核苷酸为：

GCAGCTTCTGGCTTCAACTAATAACACTGGGTGCGTCAGG(SEQ ID NO:371)和

GCAGCTTCTGGCTTCAACNTCNNS567567NNSATSCACTGGGTGCGTCAGG(SEQ ID NO:391)。

在第六个apu18文库中，诱变处理HVR-H1、HVR-H2和HVR-L3。与在第五个apu18文库中对HVR-H1所进行的修饰一样，利用相同的诱变的寡核苷酸修饰HVR-H1。与在第二个apu18文库中对HVR-H2所进行的修饰一样，利用相同的四条诱变的寡核苷酸修饰HVR-H2。与在第四个apu18文库中对HVR-L3所进行的修饰一样，利用相同的诱变的寡核苷酸修饰HVR-L3。

通过电穿孔将对两个apu5衍生的文库和六个apu18衍生的文库中的每一个的诱变反应转化到电感受态的大肠杆菌XL-1中。在SOC培养基中让细胞在37℃搅拌复原30分钟。保留20μL含细胞的SOC培养基用于测定转化体的数目，然后将剩余的SOC培养基转移到500ml含羧苄青霉素和每毫升10¹⁰个M13K07辅助噬菌体的2YT中。在37℃搅拌45分钟后，向肉汤补充卡那霉素并在37℃搅拌培养过夜。每个文库的转化体数目为>10⁹。通过离心和PEG沉淀从肉汤中收获并浓缩噬菌体，并用于随后的选择轮次中。

如以上实施例1(A)中所描述的，将K48连接的多聚泛蛋白和K63连接的多聚泛蛋白固定在不同的Maxisorp平板(NUNC)上。每个文库分别针对其相应的靶(对于两个apu05衍生的文库为K48连接的多聚泛蛋白，对于六个apu18衍生的文库为K63连接的多聚泛蛋白)分选一轮，在分选缓冲液中外加3μM单泛蛋白。扩增并汇集洗脱的噬菌体(两个库，每种赖氨酸连接的多聚泛蛋白靶分别一个)用于进一步的分选轮次。

随后的选择轮次是溶液相分选。在室温于溶液分选缓冲液(含0.5%Superblock(Pierce)的PBST)中将噬菌体库与生物素化的(磺基-NHS-生物素,Pierce)多聚泛蛋白链温育1-2小时。将混合物在溶液分选缓冲液中稀释5-10倍并添加到中性抗生物素蛋白(neutravidin)包被的孔中用于生物素化的多聚泛蛋白的短暂(5分钟)捕捉。含有未生物素化的多聚泛蛋白链的反应用作对照来监测背景噬菌体结合。用PBST洗涤平板并用0.1M HCl洗脱10分钟。

以三种方式调节严紧度：通过生物素化的多聚泛蛋白的浓度；在于中性抗生物素蛋白包被的孔上捕捉之前，通过添加过量的未生物素化的多聚泛蛋白来竞争结合；以及通过竞争的持续时间。对于每轮分选，在第一次温育步骤期间以30μg/ml的浓度添加带其它键的单泛蛋白和多聚泛蛋白到分选缓冲液中。第一轮溶液分选使用了20nM生物素化的多聚泛蛋白与噬菌体在室温温育1小时。然后在溶液分选缓冲液中将混合物稀释10倍，并使用中性抗生物素蛋白包被的孔捕捉5分钟。对于第二轮，与第一轮中的一样用20nM生物素化的多聚泛蛋白平衡噬菌体，但是含30μg/ml未生物素化的多聚泛蛋白(对于K48选择用K48连接的，对于K63选择用K63连接的)的溶液分选缓冲液中稀释10倍用于15分钟的解离速率选择，随后在中性抗生物素蛋白包被的孔上捕捉。第三轮溶液分选与第二轮所描述的一样，但进一步包括5nM生物素化的多聚泛蛋白和30分钟的解离速率选择。在一轮平板分选和三轮溶液分选后，将选自第二代的各个克隆在所描述的96孔板中培养。通过噬菌体ELISA筛选各个克隆并测序。

在第一轮溶液分选后，对于基于apu05的文库和基于apu18的文库分别观察到了多达40倍和多达7倍的富集(参见表C)。在第二轮选择(对慢解离速率的溶液分选)后，对于K48特异性克隆获得了额外的11倍富集，对于K63特异性克隆则获得额外的3倍富集(参见表C)。第三轮选择(亲和力分选及解离速率(off-rate)分选)对K48特异性克隆产生18倍富集，对K63特异性克隆则产生4倍富集(参见表C)。

表C：第二代抗多聚泛蛋白抗体文库溶液分选结果

鉴定得到68个特异性结合K48连接的多聚泛蛋白的不同克隆；还对那些克隆进行DNA序列分析。那些克隆的HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3序列示于图14A-14F中。鉴定得到31个特异性结合K63连接的多聚泛蛋白的不同克隆；还对那些克隆进行序列分析。那些克隆的HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3序列示于图15A-15C中。对于每个K48连接的多聚泛蛋白和K63连接的多聚泛蛋白特异性克隆，轻链HVR没有测序，但就apu05和apu18来说，HVR-L1和HVR-L2的序列预期是不变的，同时HVR-L3序列预期是克隆特异的。根据文库设计，HVR-L1序列为RASQSVSSAVA(SEQ ID NO:79)以及HVR-L2序列为SASSLYS(SEQ ID NO:80)。所有克隆都具有相同的重链和轻链框架区序列(参见图6)。

如实施例1中所描述的，20个具有观察到最大结合的克隆(10个K48连接的多聚泛蛋白特异性的和10个K63连接的多聚泛蛋白特异性的)被作为Fab产生。对Fab apu2.01-apu2.20进行DNA序列分析。那些克隆的HVR-H1、HVR-H2、HVR-H3和HVR-L3序列示于图16A和16B(K48特异的Fab)以及图17A和17B(K63特异的Fab)中。

将Fab apu2.01-apu2.20都包括在ELISA蛋白测定中以测定它们对K48连接的和K63连接的多聚泛蛋白的相对亲和力，以及用以确认Fab没有与单泛蛋白或BSA反应(参见图18)。在该测定中，Apu克隆2.11和2.12分别被证实与对K48连接的多聚泛蛋白相比，对K63连接的多聚泛蛋白具有高约300倍的亲和力。在与K48连接的多聚泛蛋白相比对K63连接的多聚泛蛋白的亲和力中，Apu2.20和2.16具有较小的，但仍然显著的差异(分别为高约30倍和高约10倍)。没有检测到克隆apu2.01-apu2.10与K63连接的多聚泛蛋白或二聚泛蛋白的结合。

还通过如之前实施例1(C)中所描述的BIAcore分析每一种Fab。所得到的动力学常数和结合常数示于表D中。表D中文字“NB”指对于所指示的相互作用没有检测到结合。

表D：通过BIAcore分析测定的抗多聚泛蛋白Fab的动力学常数

基于apu05的几个Fab对K48连接的二聚泛蛋白具有较相应于apu05的Fab更低的K_d，表明与多聚泛蛋白结合更紧密。apu2.11-2.20Fab中的每一种不但与K63连接的多聚泛蛋白结合，还在较小程度上与K48连接的二聚泛蛋白结合。虽然与apu18相比仅apu2.13具有更低的Kd，但较apu18其对K48连接的二聚泛蛋白的Kd要大。apu 2.11、2.12、2.16和2.20中的每一种较apu18都具有更好的对K63连接的多聚泛蛋白的Kd与对K48连接的二聚泛蛋白的Kd的比率。对于基于apu18的Fab与K63连接的多聚泛蛋白的结合所观察到的动力学常数类似于对于与K63连接的二聚泛蛋白的结合所观察到那些动力学常数。

还通过如之前实施例1(D)中所描述的蛋白质印迹评价了每一种Fab特异性结合固定在硝酸纤维膜上的多聚泛蛋白的能力。将含有K48键或K63键的四聚泛蛋白、含有与四聚泛蛋白相反的赖氨酸键的二聚泛蛋白(例如当K48连接的四聚泛蛋白使用时用K63连接的二聚泛蛋白，或当K63连接的四聚泛蛋白使用时用K48连接的二聚泛蛋白)和单泛蛋白固定在硝酸纤维膜上，并评价Fab apu2.01-2.20识别所有三种固定化的分子的能力(图20A和20B)。没有一种Fab特异性识别单泛蛋白。Apu2.01-apu2.10中的每一种都特异性识别固定化的K48连接的四聚泛蛋白，但都不识别固定化的K63连接的二聚泛蛋白(参见图20A)。印迹上所见到的一些其它条带代表了K48连接的四聚泛蛋白制备物中的污染物三聚、五聚和八聚泛蛋白物质。Apu2.11-apu2.20均特异性识别固定化的K63连接的四聚泛蛋白，且都不识别固定化的K48连接的二聚泛蛋白(参见图20B)。

实施例3：抗多聚泛蛋白抗体与内源性多聚泛蛋白化蛋白的结合

先前的实验已证实了受体相互作用蛋白(RIP)(一种140kD的邻近的TNF受体1(TNFR1)信号传导复合物的必需介质)的活性受多聚泛蛋白化作用调节(Wertz等,Nature430:694-699(2004))。当RIP为K63连接的多聚泛蛋白链所多聚泛蛋白化时，促进了通过TNFR1的信号传导。通过去泛蛋白化A20的N-末端从RIP上除去K63连接的多聚泛蛋白链，并通过A20C末端的泛蛋白连接酶功能用K48连接的多聚泛蛋白链取代，从而失活了RIP并使其靶向蛋白酶体降解。该机制已通过使用表达能只形成K48连接的或K63连接的多聚泛蛋白的突变泛蛋白的细胞系得以阐明。

评价了在TNF处理后于不同时间点处，本发明的两种抗K48和抗K63连接的多聚泛蛋白结合蛋白特异性识别存在于HeLa S3细胞中的不同的多聚泛蛋白化形式的RIP的能力。用21μM MG-132处理4升约1.5x10⁶个细胞/毫升的HeLa S3细胞。在处理后，立即从总培养物中移取1升的细胞，通过离心收获，用200mL PBS洗涤，并再次离心。将该样品用作为计时起点时间点。用100ng/mL TNF处理剩余的3升细胞培养物。移取、收获1升细胞并用200mL PBS洗涤，并在用TNF处理后各自再次离心5、15和25分钟。在30mL的IP裂解缓冲液(LB)(20mMTris pH7.5,150mM NaCl,1%Triton x-100,1mM EDTA,25μM MG-132,10mM NEM,30μL的每种蛋白酶抑制剂混合物1和2(Sigma)和1片完全蛋白酶抑制剂(Complete proteaseinhibitor)(Roche))中裂解来自每个时间点的细胞并在4℃下旋转温育20-60分钟。将每种溶胞产物转移到50mL离心管中并在10,000xg下离心5分钟再次沉淀。估计来自每个时间点的溶胞产物的蛋白浓度。在4℃下将每种溶胞产物(具有归一化的蛋白浓度的30mL用于每个时间点)与1mL未封闭的蛋白A/G珠子温育1.25-1.5小时。通过在2000rpm下离心5分钟将珠子和碎屑与溶胞产物相分离。从每种溶胞产物中取样用于直接的蛋白质印迹分析，并将剩余的在-80℃下冷冻。

采集每种溶胞产物的四份16mL样品。向每种样品添加25mM MG-132和20μL NEM。将两份样品各自与2.4μg/mL的抗TNFR1抗体组合。将另外两份样品各自与2.4μg/mL的对照抗体(抗-myc)组合。所有样品都在4℃下旋转温育2小时，然后添加150μL的50%未封闭的蛋白A珠子淤浆。在4℃下将样品旋转温育额外的5小时。通过离心沉淀样品，珠子用15mL LB洗涤一次、用10mL含1M NaCl的LB洗涤两次以及用10mL LB洗涤两次。将洗涤的珠子重悬于1.25mL LB中，并转移到微量离心管中。对每种样品抽液，使得该管含有950μL的总体积，并添加360mg固体尿素到每种样品中使每种样品中尿素的终浓度为6M。在室温轻度振荡样品温育15分钟。通过离心沉淀每种样品中的珠子。保留每种上清液的一部分用于蛋白质印迹分析，并用解离稀释缓冲液(1%Triton-X100,0.5%脱氧胆酸盐,120mM NaCl,50mM HEPES pH7.2和完全蛋白酶抑制剂混合物(Complete protease inhibitor cocktail)(Roche))稀释来自每种样品的剩余的上清液(大约每种样品1mL)到10mL。

将每种样品分成两个5mL的部分。一个部分用2.5μg的已从fab形式重排为IgG形式的apu2.16处理，另一部分用2.5μg的已从fab形式重排为IgG形式的apu2.07处理。向这两个样品中添加50μL蛋白A珠子，并在4℃下温育样品5小时。沉淀并在TNFR1 LB中洗涤蛋白A珠子3次，在洗涤处理过程中已将珠子转移到微量离心管中。将样品缓冲液添加到所有样品中，每种样品(包括之前为蛋白质印迹分析所保存的样品)都被还原并在 10%tris/gly 1.5mm 10-孔Novex凝胶(Invitrogen)上跑胶。跑胶后，根据厂商的使用说明书将凝胶中的蛋白转移到Invitrolon^TMPVDF膜(Invitrogen)上。在室温用5% PBS-T封闭膜并用抗-RIP单克隆抗体(Becton Dickinson)探测过夜。然后洗涤印迹，用缀合HRP的山羊抗小鼠第二抗体(Cappel)探测，洗涤，暴露于试剂以激发化学发光，并曝光于胶片。结果示于图21A和21B中。

图21A描绘了含有首先用TNFR1或抗-myc免疫沉淀并接着用apu2.16 IgG(K63连接的多聚泛蛋白选择性的)免疫沉淀的样品的印迹。如图21A中所示，在抗-myc对照样品或时间零点样品中未见到RIP。RIP条带在5分钟样品中最强，随后在15和25分钟样品中显著减弱。图21B描绘了含有首先用TNFR1或抗-myc免疫沉淀并接着用apu2.07 IgG (K48连接的多聚泛蛋白选择性的)免疫沉淀的样品的印迹。如图21B中所示，在抗-myc对照泳道中没有观察到RIP。在该印迹中RIP水平随时间过去而增加，并在25分钟时间点样品中最强。该数据与较早的发现是相关的，所述发现是刚一通过TNFR1传导信号，RIP就首先被K63连接的多聚泛蛋白化，随后去泛蛋白化并通过A20被K48连接的多聚泛蛋白化。因此，本发明的抗体能特异性结合并区分在细胞中已多聚泛蛋白化的K63连接的多聚泛蛋白化多肽和K48连接的多聚泛蛋白化多肽。

实施例4：分离并鉴定第三代抗多聚泛蛋白抗体

由编码之前所鉴定的克隆apu2.16(K63连接的多聚泛蛋白选择性的)的噬菌粒构建用于Fab展示的第三代文库(参见实施例2以及图17A和17B)。将来自该克隆的噬菌体用于感染CJ236细胞以制备Kunkel DNA模板。随后诱变处理该模板以***终止密码子，并将含终止密码子的模板用于如下的文库构建。

根据三个不同的方案诱变处理Fab apu2.16以创建三个不同的apu2.16-衍生的文库。在第一个文库中，诱变处理HVR-H1和HVR-H2。诱变处理HVR-H1以将终止密码子包括在Kunkel模板中，然后利用一条诱变的寡核苷酸进行诱变处理。终止密码子编码寡核苷酸序列为：GCAGCTTCTGGCTTCAACTAATAACACTGGGTGCGTCAGG(SEQ ID NO:371)。诱变的寡核苷酸使得第29位的异亮氨酸可选自苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸；利用NNS混合密码子组(其中N相应于G、C、A或T，以及S相应于G或C)，第34位的异亮氨酸可选自甲硫氨酸和异亮氨酸；并温和随机化氨基酸K30、T31、G32和L33。在上下文中温和随机化指某些核苷酸位置70%的时间为所指示的碱基所占据，而其它三种碱基中的每一种则占据10%的时间。对于那些其中在特定碱基处包括上述温和随机化的那些寡核苷酸，通过在该碱基位置处数字的存在指示了温和随机化的存在。数字“5”指在该位置处碱基腺嘌呤占据70%的时间，而碱基鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶则分别占据10%的时间。类似地，数字“6”指鸟嘌呤，“7”指胞嘧啶，以及“8”指胸腺嘧啶，在所有的情况下，其它三种碱基中的每一种仅占据10%的时间。用于诱变处理apu3.16HVR-H1的寡核苷酸序列为：GCAGCTTCTGGCTTCAACNTC556577668788ATSCACTGGGTGCGTCAGG(SEQ ID NO:785)。

还修饰HVR-H2以将终止密码子包括在Kunke模板中，然后利用三条诱变的寡核苷酸进行诱变。在所有的情况下，终止密码子编码寡核苷酸均为GGCCTGGAATGGGTTGCATAATAATATGCCGATAGCGTCAAGG(SEQ ID NO:373)。三条诱变的寡核苷酸为第一条期望序列的两种改变(permutation)，以及第二条期望序列的一种改变(permutation)。第一条期望的序列包括：固定一个第50和54位任一的酪氨酸残基，利用NNS混合密码子组(上述的)随机化另一个酪氨酸残基；在第51(异亮氨酸)、52a(脯氨酸)、53(酪氨酸)、55(甘氨酸)和57(苏氨酸)位固定残基；以及温和随机化第S52、S56和S58位(根据上述温和随机化方案)。第二条期望的序列包括：在第51位(异亮氨酸)、第52a位(脯氨酸)、第53位(酪氨酸)、第55位(甘氨酸)和第57位(苏氨酸)固定的残基；利用NNS混合密码子组(上述的)猛烈诱变第50和54位的酪氨酸，以及温和随机化第S52、S56和S58位(根据上述温和诱变方案)。

用于诱变处理apu2.16HVR-H2的寡核苷酸为：

GGCCTGGAATGGGTTGCANNSATC567CCGTACTACGGT567ACC567TATGCCGATAGCGTCAAGG(SEQ ID NO:786)、

GGCCTGGAATGGGTTGCATACATC567CCGTACNNSGGT567ACC567TATGCCGATAGCGTCAAGG(SEQ ID NO:787)和

GGCCTGGAATGGGTTGCANNS

ATC567CCGTACNNSGGT567ACC567TATGCCGATAGCGTCAAGG(SEQ ID NO:788)。

在第二个apu2.16文库中，诱变处理HVR-H2和HVR-H3。与在第一个apu2.16文库中对HVR-H2所进行的修饰一样，利用相同的含终止密码子的寡核苷酸和相同的三条诱变的寡核苷酸诱变处理HVR-H2。与在第一个apu18文库中对HVR-H3所进行的修饰一样(描述于实施例2中)，利用相同的含终止密码子的寡核苷酸和相同的六条诱变的寡核苷酸诱变处理HVR-H3。

在第三个apu2.16文库中，诱变处理HVR-H1和HVR-H3。与在第一个apu2.16文库中对HVR-H1所进行的修饰一样，利用相同的含终止密码子的寡核苷酸和相同的诱变的寡核苷酸诱变处理HVR-H1。与在第一个apu18文库中对HVR-H3所进行的修饰一样(描述于实施例2中)，利用相同的含终止密码子的寡核苷酸和相同的六条诱变寡核苷酸诱变处理HVR-H3。

通过电穿孔将对三个apu2.16衍生的文库中的每一个的诱变反应转化到电感受态的大肠杆菌XL-1中。在SOC培养基中让细胞在37℃搅拌复原30分钟。保留20μl含有细胞的SOC培养基用于测定转化体数量，然后将剩下的培养基转移到500ml含羧苄青霉素和每毫升10¹⁰个M13K07辅助噬菌体的2YT中。在37℃下搅拌温育45分钟后，向肉汤补充卡那霉素并在37℃下搅拌培养过夜。每个文库的转化体数目为>10⁹。通过离心和PEG沉淀从肉汤中收获并浓缩噬菌体，并用于随后的选择轮次中。

如实施例1(A)中所描述的，分别针对固定在Maxisorp平板(NUNC)上的K63连接的多聚泛蛋白对三个第三代文库进行各自分选。以三种方式调节严紧度：通过生物素化的多聚泛蛋白的浓度；在于中性抗生物素蛋白包被的孔上捕捉之前，通过添加过量的未生物素化的多聚泛蛋白来竞争结合；以及通过竞争的持续时间。在温育步骤期间，每一轮的溶液分选在分选缓冲液中都包括3μM单泛蛋白和30μg/mL K48连接的多聚泛蛋白。扩增并汇集洗脱的噬菌体用于进一步的分选轮次。随后的选择轮次是溶液相分选。第一轮溶液分选包括在室温将100nM生物素化的(磺基-NHS-生物素,Pierce)多聚泛蛋白与噬菌体库温育1小时。然后在溶液分选缓冲液(含0.5%Superblock(Pierce)的PBST)中将混合物稀释10倍，并使用中性抗生物素蛋白包被的孔捕捉5分钟。含有未生物素化的多聚泛蛋白链的反应用作为对照来监测背景噬菌体结合。用PBST洗涤平板并用0.1M HCl洗脱10分钟。对于第2轮溶液分选，如第1轮中的用30nM生物素化的多聚泛蛋白平衡噬菌体，但对于5分钟的解离速率选择是在含30μg/mL未生物素化的多聚泛蛋白(K63连接的)的溶液分选缓冲液中稀释10倍，接着在中性生物素蛋白包被的孔上捕捉。

在第一轮溶分选后，对于基于apu2.16的组合文库观察到了6.5倍富集(参见表E)。对于慢解离速率，在第二轮溶液分选后获得了额外的10倍富集(参见表E)。

表E：第三代抗多聚泛蛋白抗体文库溶液分选结果

在一轮平板分选和两轮溶液分选后，在96-孔板中培养选自第三代的单个克隆并通过如上述实施例2中所描述的噬菌体ELISA进行筛选。通过测序鉴定了72个不同的克隆。在那些克隆中，在噬菌体ELISA测定中有12个克隆被证实具有最高水平的针对K63连接的多聚泛蛋白的特异性(图22)。那些12个克隆被命名为apu3.01-3.12，它们的HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3序列示于图23A和23B中。对于每一个K63连接的多聚泛蛋白特异性克隆的轻链HVR没有进行测序，但HVR-L1和HVR-L2序列应该是不变的，同时HVR-L3序列应该是与apu2.16相同的。根据文库设计，HVR-L1序列为RASQSVSSAVA(SEQ ID NO:79)，HVR-L2序列为SASSLYS(SEQID NO:80)。所有的克隆都具有相同重链和轻链框架区序列(参见图6)。

在CHO或293细胞中将Apu2.07(参见实施例2以及图16A和16B))和apu3.07(参见以上以及图23A和23B)作为人IgG表达。通过合适的编码人IgG的重链和轻链的pRK哺乳动物表达载体的Kunkel诱变制备表达构建体(Gorman等,DNA Prot.Eng.Tech.2:3-10(1990))。使用标准方法通过亲和层析纯化IgG。

通过蛋白质印迹评价每一种IgG与固定在硝酸纤维膜上的具合适的键的多聚泛蛋白特异性结合的能力。将K48或K63连接的多聚泛蛋白和单泛蛋白(Boston Biochem)在4-20%Tris-甘氨酸聚丙烯酰胺凝胶(Invitrogen)上进行跑胶。通过电印迹将凝胶内含物转移到硝酸纤维膜。在溶解5%脱脂奶粉的含0.1%Tween-20的Tris-缓冲盐水(TBST)中封闭硝酸纤维膜上非特异性结合位点1小时。然后将K48特异性或K63特异性抗体以2μg/mL(apu2.07IgG)或1μg/mL(apu3.07 IgG)浓度添加到印迹中，并温育1小时以使结合得以发生。作为阳性对照，一份印迹与兔抗泛蛋白抗体(Sigma)温育。在TBST中洗涤印迹并通过在含5%脱脂奶粉的TBST中以1:10,000稀释的缀合过氧化物酶的山羊抗人Ig Fc(ICN)或缀合过氧化物酶的抗兔Ig(Amersham)检测结合的抗体。1小时后，在TBST中洗涤印迹并使用SuperSignal West Dura试剂(Pierce)显影以揭示过氧化物酶活性。结果示于图24A-24D中。

正如所料，apu2.07 IgG特异性识别固定化的K48连接的四聚泛蛋白和K48连接的三聚至七聚泛蛋白(图24A)，但不与任何一种固定化的K63连接的多聚泛蛋白样品结合。同样地，apu3.07 IgG特异性识别固定化的K63连接的四聚泛蛋白和K63连接的三聚至七聚泛蛋白(图24B)，但不与任何一种固定化的K48连接的多聚泛蛋白样品结合。这两种IgG都不与固定化的单泛蛋白结合。为评价每种IgG的灵敏度，使用不同浓度的固定化的K48连接的和K63连接的四聚泛蛋白(25-1000ng/泳道)进行了额外蛋白质印迹分析(图24C和24D)。Apu2.07 IgG检测出仅50ng的固定化的K48连接的四聚泛蛋白，并再次不与固定化的K63连接的四聚泛蛋白特异性结合(图24C)。Apu3.07 IgG检测出仅50ng的固定化的K63连接的四聚泛蛋白，并再次不与固定化的K48连接的四聚泛蛋白特异性结合(图24D)。在这两种情况下，增加固定化的四聚泛蛋白的数量就造成了所观察到的结合的增加。

为确定IgG是否能检测内源性的多聚泛蛋白化蛋白，由使用或未使用20μM蛋白酶体抑制剂Velcade(bortezomib)处理4小时的人胚肾细胞系293T制备蛋白溶胞产物。在4-20% Tris-甘氨酸聚丙烯酰胺凝胶(Invitrogen)中通过SDS-PAGE分辨溶胞产物，并如上所述进行蛋白质印迹。结果示于图25中。在存在及不存在Velcade处理的情况下，多克隆抗泛蛋白抗体(Sigma)都检测到了大量高分子量蛋白(最左的泳道)。apu2.07 IgG结合具有不同分子量的众多蛋白(最右的泳道)，并且与固定化的未处理的溶胞产物相比，对于固定化的velcade处理的溶胞产物所观察到的结合更多。使用应当能结合K63-多聚泛蛋白化蛋白的apu3.07 IgG观察到了总体上明显更少的结合(中间的泳道)，并且在velcade处理的和未处理的泳道之间没有显著的差异。已知K48连接的多聚泛蛋白化作用使细胞内蛋白靶向蛋白水解降解(Chau等,Science 243:1576-1583(1989);Finley等,Mol.Cell.Biol.14:5501-5509(1994);Flick等,Nat.Cell.Biol.6:634-641(2004))。因此，一种对于apu2.07 IgG结果的解释是当蛋白水解加工被阻止时，增加量的K48-多聚泛蛋白化蛋白就保留在溶胞产物中，导致超过未处理样品的增加的apu2.07 IgG结合。并不知道K63连接的多聚泛蛋白化靶向蛋白用于降解(Pickart和Fushman,Curr.Opin.Chem.Biol.8:610-616(2004);Hicke和Dunn,Annu.Rev.Cell Dev.Biol.19:141-172(2003);Spece等,Mol.Cell Biol.15:1265-1273(1995);Ulrich,Eukaryot.Cell 1:1-10(2002);Spence等,Cell 102:67-76(2000);Seibenhener等,Mol.Cell.Biol.24(18):8055-8068(2004))。因此，一种对于apu 3.07 IgG结果的解释是蛋白酶体的抑制并不导致K63-多聚泛蛋白化蛋白的积聚。

实施例5:与抗K63-连接的多聚泛蛋白结合的FAB的结构分析

为了更好地理解抗K63连接的多聚泛蛋白fab与多聚泛蛋白之间的相互作用，将抗K63连接的多聚泛蛋白fab apu2.16与K63连接的二聚泛蛋白共结晶。使用1μL apu2.16溶液(15mg/mL，溶于10mM Tris,75mM NaCl pH 8.0中)和1μL池液(cell solution)(0.1M LiCl,0.1MTris pH8.2,1M柠檬酸盐)，在悬滴中生长晶体。向每滴悬滴添加0.5μL 0.1M氯化铜，并向每滴悬滴中and each drop was streak seeded.在几天的过程中生长出晶簇并进行操作以获得衍射单晶。通过分子置换测定结构。在100K下收集天然数据并用HKL2000处理。晶体属于C2空间群，具有晶胞大小和β=107，在一个不对称单位中含有两个复合物(complexes)。使用程序Phaser以及人源化的4d5fab片段变体(对于PDB中的4d5：DB code 1FVE)的坐标通过分子置换解析结构。在程序Coot中进行模建并用Refmac5精修结构。该结构的分辨率为该复合物已被精修至24.5%的R和30.4%的R_free。

apu2.16和K63连接的二聚泛蛋白之间的相互作用示于图26A-26C中。结构表位是在与fab结合的情况下包埋至少25%的其溶剂可及表面积和/或在fab的重链或轻链的之内具有多于一个原子的残基的组合。贡献K63的泛蛋白链是链A以及贡献C-末端的泛蛋白链是链B。Fab轻链残基属于链L以及fab重链残基属于链H。在下表中残基编号前为链编号，以及fab残基连续编号。

表F：位于apu2.16-K63连接的二聚泛蛋白结合界面中的残基

泛蛋白残基	Fab残基
		A18 Glu
A19 Pro	L31 Ser
		A20 Ser	L49 Tyr
A21 Asp	L50 Ser
		A55 Thr	L51 Ala
A56 Leu	L52 Ser
		A57 Ser	L53 Ser
A58 Asp	L66 Arg
		A60 Asn	L98 Phe
A61 Ile
		A62 Gln	H30 Lys
	H31 Thr
		B8 Leu	H32 Gly
B9 Thr	H33 Leu
		B34 Glu	H50 Tyr
B35 Gly	H52 Ser

B36 Ile	H54 Tyr
		B37 Pro	H55 Tyr
B39 Asp	H99 Glu
		B40 Gln	H100 Tyr
B71 Leu	H101 Tyr
		B72 Arg	H102 Arg
B73 Leu	H104 Tyr
		B74 Arg	H105 Thr
B75 Gly

如表F和图26B中暗灰色区域所示，当与apu2.16结合时，在位于apu2.16的之内存在着11个K63-二聚泛蛋白A链中的残基以及13个K63-二聚泛蛋白B链中的残基。如表F中所示，以及如图26C中暗灰色区域所示，当与K63连接的二聚泛蛋白结合时，在位于K63连接的二聚泛蛋白的之内存在着8个apu2.16轻链中的残基以及14个apu2.16重链中的残基。基于该数据，位于K63连接的二聚泛蛋白上的可能调节apu2.16和K63连接的二聚泛蛋白两者之间的相互作用的残基包括A链中的Glu-18、Ser-20、Leu-57和Asp-58以及B链中的Pro-37、Arg-74和Gly-75。有趣的是，该抗体不与K63-Gly76键密切地相互作用，但却通过与邻接该键的二聚泛蛋白复合物表面的相互作用获得特异性。

Claims

1.一种分离的与赖氨酸-63连接的多聚泛蛋白结合的抗体，其中该抗体包含选自图11中apu18和apu22，和图17中apu2.11,apu2.12,apu2.13,apu2.14,apu2.15,apu2.16,apu2.17,apu2.18,apu2.19和apu2.20，和图23中apu3.01,apu3.02,apu3.03,apu3.04,apu3.05,apu3.06,apu3.07,apu3.08,apu3.09,apu3.10和apu3.11的一种抗体的HVR-H1、HVR-H2、HVR-H3和HVR-L3序列，且其中该抗体包含HVR-L1序列SEQ ID NO:79和HVR-L2序列SEQ ID NO:80。

2.权利要求1的抗体，其包含HVR-H1序列SEQ ID NO:330、HVR-H2序列SEQ ID NO:339、HVR-H3序列SEQ ID NO:348、HVR-L1序列SEQ ID NO:79、HVR-L2序列SEQ ID NO:80和HVR-L3序列SEQ ID NO:357。

3.权利要求1的抗体，其包含HVR-H1序列SEQ ID NO:739、HVR-H2序列SEQ ID NO:750、HVR-H3序列SEQ ID NO:761、HVR-L1序列SEQ ID NO:79、HVR-L2序列SEQ ID NO:80和HVR-L3序列SEQ ID NO:772。

4.权利要求1的抗体，其包含HVR-H1序列SEQ ID NO:740、HVR-H2序列SEQ ID NO:751、HVR-H3序列SEQ ID NO:762、HVR-L1序列SEQ ID NO:79、HVR-L2序列SEQ ID NO:80和HVR-L3序列SEQ ID NO:773。

5.权利要求1的抗体，其包含HVR-H1序列SEQ ID NO:744、HVR-H2序列SEQ ID NO:755、HVR-H3序列SEQ ID NO:766、HVR-L1序列SEQ ID NO:79、HVR-L2序列SEQ ID NO:80和HVR-L3序列SEQ ID NO:777。

6.权利要求1的抗体，其包含HVR-H1序列SEQ ID NO:795、HVR-H2序列SEQ ID NO:807、HVR-H3序列SEQ ID NO:819、HVR-L1序列SEQ ID NO:79、HVR-L2序列SEQ ID NO:80和HVR-L3序列SEQ ID NO:777。

7.权利要求1至6中任一项的抗体，其中该抗体以高亲和力结合赖氨酸-63连接的多聚泛蛋白但以降低的亲和力结合赖氨酸-48连接的多聚泛蛋白。

8.权利要求1至6中任一项的抗体，其中该抗体与多聚泛蛋白化蛋白特异性结合。

9.权利要求7的抗体，其中该抗体与多聚泛蛋白化蛋白特异性结合。

10.一种核酸分子，其编码权利要求1至7中任一项的抗体。

11.一种载体，其包含权利要求10的核酸。

12.一种宿主细胞，其包含权利要求11的载体。

13.一种细胞系，其能够生成权利要求1至7中任一项的抗体。

14.一种生成权利要求1至7中任一项的抗体的方法，其包括在其中生成该抗体的条件下培养包含编码该抗体的核酸分子的宿主细胞。

15.一种组合物，其包含有效量的权利要求1至7中任一项的抗体和药学可接受载体。

16.一种制品，其包含有效量的权利要求1至7中任一项的抗体或权利要求15的组合物。

17.一种鉴定样品中赖氨酸-63连接的多聚泛蛋白或赖氨酸-63连接的多聚泛蛋白化蛋白存在的非诊断方法，其包括将样品与至少一种的权利要求1至7中任一项的抗体接触。

18.一种确定怀疑含有赖氨酸-63连接的多聚泛蛋白或赖氨酸-63连接的多聚泛蛋白化蛋白的样品中赖氨酸-63连接的多聚泛蛋白或赖氨酸-63连接的多聚泛蛋白化蛋白存在的非诊断方法，其包括将样品暴露于至少一种的权利要求1至7中任一项的抗体并测定该至少一种抗体与该样品中赖氨酸-63连接的多聚泛蛋白或赖氨酸-63连接的多聚泛蛋白化蛋白的结合。

19.一种分离样品中赖氨酸-63连接的多聚泛蛋白化蛋白和非多聚泛蛋白化蛋白的方法，其包括将样品与至少一种的权利要求1至7中任一项的抗体接触。

20.权利要求1至7中任一项的抗体的抗原结合片段，其中该抗原结合片段为Fab、F(ab’)₂、Fv、scFv、或Fab’片段。

21.至少一种的权利要求1至7中任一项的抗体在制备用于鉴定样品中赖氨酸-63连接的多聚泛蛋白或赖氨酸-63连接的多聚泛蛋白化蛋白存在的制品中的用途，所述鉴定包括将样品与至少一种的权利要求1至7中任一项的抗体接触。

22.至少一种的权利要求1至7中任一项的抗体在制备用于确定怀疑含有赖氨酸-63连接的多聚泛蛋白或赖氨酸-63连接的多聚泛蛋白化蛋白的样品中赖氨酸-63连接的多聚泛蛋白或赖氨酸-63连接的多聚泛蛋白化蛋白存在的制品中的用途，所述确定包括将样品暴露于至少一种的权利要求1至7中任一项的抗体并测定该至少一种抗体与该样品中赖氨酸-63连接的多聚泛蛋白或赖氨酸-63连接的多聚泛蛋白化蛋白的结合。

23.至少一种的权利要求1至7中任一项的抗体在制备用于分离样品中赖氨酸-63连接的多聚泛蛋白化蛋白和非多聚泛蛋白化蛋白的制品中的用途，所述分离包括将样品与至少一种的权利要求1至7中任一项的抗体接触。